(57)【要約】本発明は、細胞分化を調節するための、Ｄｕｂ３タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸分子、又は前記タンパク質の活性及び／又は発現の阻害剤の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分化、特にインビトロ細胞分化を調節するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／若しくは発現の阻害剤
の使用。
【請求項２】
前記細胞が全能性又は多能性細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
分化細胞の脱分化を誘導するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
の使用であって、分化細胞の脱分化から得られる細胞がｉＰＳ細胞である、使用。
【請求項４】
前記細胞Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質をコードする前記核酸分子が少なくともＯｃｔファミリーメンバータンパク質及びＳｏｘファミリーメンバータンパク質と結合している、分化細胞の脱分化を誘導するための請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｄｕｂ３タンパク質が、前記ｉＰＳ細胞において、全能性細胞における前記Ｄｕｂ３タンパク質の発現よりも少なくとも２倍低いレベルで発現される、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
全能性又は多能性細胞の自然分化を誘導するための、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントの活性及び／又は発現の阻害剤の使用であって、前記タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、任意の前記タンパク質のバリアントが前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する、使用。
【請求項７】
細胞集団に属する細胞の分化状態を決定するための、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、又は前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアントの使用。
【請求項８】
幹細胞を非腫よう細胞集団から単離する方法であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、又は前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアントの存在又は量の測定と、任意に前記Ｄｕｂ３タンパク質を発現する細胞を単離するステップとを含む、方法。
【請求項９】
治療抵抗性腫ようの治療に使用するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性及び／若しくは発現の阻害剤
を含む組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質の活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／又は発現の阻害剤を含み、前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアンチセンス、ＤＮＡアンチセンス、抗体又は化学物質から選択される、請求項９に記載のその使用のための組成物。
【請求項１１】
前記阻害剤が、以下のアミノ酸配列：配列番号４１又は配列番号４２を含むｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載のその使用のための組成物。
【請求項１２】
分化性幹細胞の細胞死を誘導するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分化マーカー、特に全能性／多能性幹細胞マーカー、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞は、ＤＮＡ損傷や複製ストレスによって細胞周期進行を停止するチェックポイントを発達させた。２つの異なる経路、すなわちａ）ＣＤＫ２リン酸化の増加をもたらすＣｄｃ２５Ａホスファターゼの急速な破壊、及びｂ）とりわけ、強力なＣＤＫ２阻害剤ｐ２１の発現を活性化するｐ５３媒介性転写反応の遅延は、ＣＤＫ２活性を直接抑制することによってＧ１／Ｓチェックポイントに関係する。重要なことには、低ＵＶ線量曝露後に認められる急速なｐ２１の分解は、最適なＤＮＡ修復に重要かもしれず、Ｃｄｃ２５Ａ分解後のＣＤＫ２活性の阻害は、細胞周期停止に十分である。Ｃｄｃ２５Ａタンパク質レベルは、２種のＥ３ユビキチンリガーゼ、すなわち細胞の有糸分裂終了後は後期促進複合体／サイクロソーム（ＡＰＣ：Ａｎａｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ／ＣＣｄｈ１）によって、Ｓ期とＧ２期の両方及びＤＮＡ損傷後はＳｋｐ１−カリン１−Ｆｂｏｘ（ＳＣＦβ−ＴｒＣＰ）によって、厳格に調節される。
【０００３】
体細胞に比べて、マウス胚性幹（ＥＳ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞は、Ｇ１／Ｓチェックポイントが厳しくないように見える。この特徴の根底にある分子機構は依然として不明である。さらに、マウスＥＳ細胞周期は、Ｇ１及びＧ２期が著しく短く、Ｓ期の長さはほとんど変わらない。これは、基質レベルの周期的変動を制限する高いＣＤＫ２／サイクリンＥ活性及び低いＡＰＣ／Ｃ活性によって裏付けられる。興味深いことに、ＣＤＫ２タンパク質のノックダウンは、Ｇ１を長くすることが示されたが、ＤＮＡ損傷に依存したＣｄｃ２５Ａ分解は、ＣＤＫ２活性に影響せず、Ｇ１停止も誘導しないことが報告された。
【０００４】
多能性の維持は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４などの転写因子の制御ネットワークの組み合わせ制御下における多能性遺伝子の発現に依存する。ＥＳ細胞の分化は、より長いＧ１及びＧ２期の出現を含めて、細胞周期の再構築を引き起こすが、この調節がどのように生じるかは不明である。さらに、多能性制御ネットワークが細胞周期調節に対してどのように影響するかもあいまいなままである。体細胞周期におけるその周知の役割を除いては、ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａの機能についてはほとんど知られていない。ヒトＥＳ細胞においては、Ｃｄｃ２５Ａ発現は、Ｎａｎｏｇによって調節されることが示された。最近の報告によれば、マウスＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇのノックダウンは、未知の機序によってＧ１／Ｓ移行の遅延をもたらす。同様に、ＥＳ細胞のＧ１／Ｓ  ＤＮＡ損傷チェックポイントにおけるｐ５３の役割は、依然として議論の余地がある。ｐ５３は、その豊富な量にもかかわらず、細胞質分布が支配的であるため、ＥＳ細胞においては不活性であると提唱されてきた。
【０００５】
しかし、多能性細胞に対して特異性の高い多能性マーカーはまだ同定されず、幹細胞又は全能性／多能性細胞の同種集団の精製は依然として困難である。
【０００６】
したがって、分化細胞の細胞集団中で最も未分化な細胞の単離を可能にする新しい多能性／全能性マーカーを提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一目的は、未分化細胞において発現される新しい分化マーカーを提供することである。
【０００８】
本発明の別の一目的は、多能性／全能性細胞の細胞分化を調節することである。
【０００９】
本発明の更に別の一目的は、かかる分化マーカーを発現する細胞、及びそれを得るプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞分化、特にインビトロ細胞分化を調節するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性及び／若しくは発現の阻害剤の使用に関する。
【００１１】
本発明は、Ｄｕｂ３タンパク質の存在又は量によって細胞分化状態を調節することができるという本発明者らによって成された予想外の観察に基づく。
【００１２】
換言すれば、本発明者らは、Ｄｕｂ３タンパク質、若しくは前記タンパク質のバリアント、又はそれらをコードする核酸、又は前記タンパク質及びバリアントの阻害剤が、確定細胞（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｃｅｌｌｓ）の分化状態を調節できることを示した。
【００１３】
標的タンパク質の可逆的ユビキチン修飾は、プロテアソームの分解によって、又は成分タンパク質の活性及び／若しくは局在化を変えることによって、一分類のシグナル伝達経路を調節する。ユビキチン結合は、Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３カスケードによって媒介されるのに対して、ユビキチンの除去は、脱ユビキチン化酵素（Ｄｕｂ：ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）によって触媒される。脱結合反応は、単量体ユビキチンを種々のＣ末端付加体から生成する特異的システインプロテアーゼによって行われる。脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）は、多様な機能を有するユビキチン系の酵素の最大ファミリーであり、ユビキチン媒介性経路の重要な制御因子であり、しばしば、プロテアソームと直接又は間接的に結合することによって機能する。ＤＵＢの活性は、細胞増殖、発癌、ニューロン疾患及び転写調節を含めて、幾つかの重要な経路に関係している。ＤＵＢは、未変性複合体、ユビキチンＣ末端伸長ペプチド及び線状ポリユビキチン融合又は前駆体タンパク質からのユビキチンの除去を触媒する。ＤＵＢは、２つの異なるファミリー、すなわちユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）及びユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ／ＵＢＰ）に分類される。ＵＣＨは、ユビキチンのＣ末端からのペプチド及び小分子の除去を触媒する比較的小さい酵素（２０〜３０ｋＤａ）である。大部分のＵＣＨは、タンパク質複合体から単量体ユビキチンを生成することができず、又はポリユビキチン鎖を分解することができない。
【００１４】
ヒトＤｕｂ３は、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１７様ファミリーメンバー２とも呼ばれ、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる。
【００１５】
本発明においては、「細胞分化を調節するための」という表現は、「分化を誘導するための」と「細胞分化を維持する」の両方を意味する。
【００１６】
本発明によれば、「細胞分化を調節する」は、「細胞分化状態を調節する」とも解釈すべきである。細胞分化状態を調節することは、分化の確定状態にある確定細胞が、
−  細胞分化を阻害することによって、前記分化状態で維持することができること、
−  又は、細胞分化を活性化することによって、分化に向かって関与することができることを意味する。
【００１７】
換言すれば、細胞分化状態を調節することによって、本発明による化合物は、
−  細胞分化を刺激することができ、すなわち、より分化していない細胞がより分化した細胞型になり、
−  又は、細胞分化を阻害することができ、すなわち、細胞分化を誘導する細胞外又は細胞内シグナルにもかかわらず、細胞は確定した分化状態で維持され、
−  又は、細胞分化を逆戻りさせることができる、すなわち、脱分化によって、より分化した細胞型がより分化していない細胞型になる。
【００１８】
本発明によれば、アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有するＤｕｂ３タンパク質の任意のバリアントも細胞分化状態を調節することができる。
【００１９】
少なくとも４３％同一とは、本発明に包含されるバリアントが、アミノ酸配列の配列番号１と４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であり得ることを意味する。
【００２０】
本発明による有利なＤｕｂ３バリアントは、配列番号２から配列番号１９、すなわち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる。
【００２１】
上記バリアントは、ユビキチン加水分解酵素活性、特に脱ユビキチン化酵素活性も有する。この活性は、バローズ（Ｂｕｒｒｏｗｓ）ら、２００４年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢＣ）、２７９（１４）、１３９９３〜１４０００に記載のように測定することができる。手短に述べると、脱ユビキチン化アッセイは、ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ（基質）融合タンパク質の開裂に基づく。Ｄｕｂ３オープンリーディングフレーム（配列番号１のアミノ酸１から５３０）又は前記タンパク質のバリアント、及び触媒作用的に不活性な変異体Ｄｕｂ３Ｃ／Ｓ（Ｃ８９Ｓ）を含む等価なオープンリーディングフレーム又は前記タンパク質のバリアントをＰＣＲによって生成し、ｐＧＥＸベクターのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼエピトープと同じ読み枠内にインフレーム挿入する。Ｕｂ−Ｍｅｔ−β−ガラクトシダーゼは、ｐＡＣＹＣ１８４系プラスミドから発現される。プラスミドは、ＭＣ１０６１大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）染色（ｓｔａｉｎ）に同時転換される。プラスミドを含む大腸菌ＭＣ１０６１細胞を溶解し、基質を検出するウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いた免疫ブロットによってタンパク質を分析する。高密度ビスアクリルアミド−アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥによってタンパク質を分離して、Ｕｂ−Ｍｅｔ−β−ガラクトシダーゼ（非開裂）基質と−β−ガラクトシダーゼ（開裂）基質を識別する。手順は、パパ（Ｐａｐａ）ら、１９９３年、３６６巻、３１３〜３１９からも入手可能である。
【００２２】
したがって、当業者は、Ｕｂ−Ｍｅｔ−β−ガラクトシダーゼ基質を脱ユビキチン化するバリアントの能力を測定することによって、Ｄｕｂ３のバリアントが脱ユビキチン化酵素活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性を有することを容易に判定することができる。
【００２３】
本発明によれば、前記タンパク質又は前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子は、遺伝コード縮重を考慮して、前記タンパク質又は前記タンパク質のバリアントへの翻訳を可能にする核情報を含む核酸である。
【００２４】
有利には、配列番号１からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２０に記載の核酸配列を含む。
【００２５】
有利には、配列番号２からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２１に記載の核酸配列を含む。
【００２６】
有利には、配列番号３からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２に記載の核酸配列を含む。
【００２７】
有利には、配列番号４からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２３に記載の核酸配列を含む。
【００２８】
有利には、配列番号５からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の核酸配列を含む。
【００２９】
有利には、配列番号６からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２５に記載の核酸配列を含む。
【００３０】
有利には、配列番号７からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２６に記載の核酸配列を含む。
【００３１】
有利には、配列番号８からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２７に記載の核酸配列を含む。
【００３２】
有利には、配列番号９からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２８に記載の核酸配列を含む。
【００３３】
有利には、配列番号１０からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号２９に記載の核酸配列を含む。
【００３４】
有利には、配列番号１１からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３０に記載の核酸配列を含む。
【００３５】
有利には、配列番号１２からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３１に記載の核酸配列を含む。
【００３６】
有利には、配列番号１３からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３２に記載の核酸配列を含む。
【００３７】
有利には、配列番号１４からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３３に記載の核酸配列を含む。
【００３８】
有利には、配列番号１５からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３４に記載の核酸配列を含む。
【００３９】
有利には、配列番号１６からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３５に記載の核酸配列を含む。
【００４０】
有利には、配列番号１７からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３６に記載の核酸配列を含む。
【００４１】
有利には、配列番号１８からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３７に記載の核酸配列を含む。
【００４２】
有利には、配列番号１９からなるタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８に記載の核酸配列を含む。
【００４３】
本発明によれば、Ｄｕｂ３又は前記タンパク質のバリアントの活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性の阻害剤は、かかる活性を阻害する周知の化合物から選択することができる。有利な阻害剤は、以下の式ＩのＰＲ−６１９阻害剤であり、
【００４４】
【化１】
2016533356.tif 000002
【００４５】
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（参照番号：ＳＭＬ０４３０）。ＰＲ−６１９は、細胞透過性広域性脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ：ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）阻害剤である。ＰＲ−６１９は、プロテアソーム活性に直接影響を及ぼさずに、細胞中でポリユビキチン化タンパク質の蓄積を引き起こす。
【００４６】
かかる阻害剤の阻害効果は、上述したように測定することができる。
【００４７】
例えば、Ｄｕｂ３又は前記タンパク質のバリアントの触媒ドメインを認識する特異抗体を、本発明の目的のために使用することもできる。配列番号３９からなるペプチドで動物を免疫化して得られたモノクローナル又はポリクローナル抗体が有利である。
【００４８】
本発明によれば、Ｄｕｂ３又は前記タンパク質のバリアントの発現の阻害剤は、Ｄｕｂ３又は前記タンパク質のバリアントの配列に特異的なｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンス核酸分子から選択される。
【００４９】
本発明の別の一態様は、分化状態の改変が必要な細胞に有効量の
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性及び／若しくは発現の阻害剤
を導入するステップを含む、細胞分化を、特にインビトロで、調節する方法に関する。
【００５０】
有利には、本発明は、前記細胞が全能性又は多能性細胞である、上で定義した使用に関する。したがって、本発明は、有利には、全能性及び多能性細胞の分化、特にインビトロでの全能性及び多能性細胞の分化を調節するための、上で定義した使用に関する。
【００５１】
全能性幹細胞は、胚細胞型及び胚外細胞型に分化することができる。多能性幹細胞は、全能性細胞から生じ、３種類の胚葉、すなわち、中胚葉、外胚葉及び内胚葉の誘導体である子孫を生じることができる。
【００５２】
本発明の別の一態様は、分化状態の改変が必要な細胞に有効量の
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性及び／若しくは発現の阻害剤
を導入するステップを含む、全能性又は多能性細胞の分化を、特にインビトロで、調節する方法に関する。
【００５３】
本発明は、分化細胞の脱分化を誘導するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
の使用であって、分化細胞の脱分化から得られる細胞がｉＰＳ細胞である、使用にも関する。
【００５４】
本発明者らは、Ｄｕｂ３タンパク質が幹細胞中で発現され、分化過程中に次第に消失することを認めた。本発明者らは、Ｄｕｂ３の強制的な発現は、別の遺伝子と共同して、体細胞の脱分化を誘導すると推論した。
【００５５】
人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略記され、特異的遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、非多能性細胞、一般には成体体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一タイプである。人工多能性幹細胞は、ある種の幹細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、効力、分化能などの多くの面で胚性幹（ＥＳ）細胞などの天然多能性幹細胞に類似している。
【００５６】
有利には、本発明は、前記細胞Ｄｕｂ３タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアント、又は前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする前記核酸分子が、少なくともＯｃｔファミリーメンバータンパク質及びＳｏｘファミリーメンバータンパク質と結合している、分化細胞の脱分化を誘導するための上で定義した使用に関する。
【００５７】
この実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、体部の分化細胞において、Ｄｕｂ３タンパク質と一緒に、少なくともＯｃｔ４タンパク質及びＳｏｘ２タンパク質の発現を可能にすることによって得られる。
【００５８】
有利には、ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２及びＤｕｂ３遺伝子を発現する、特にＯｃｔ４／Ｓｏｘ２／ｃＭｙｃ及びＤｕｂ３遺伝子を発現する分化細胞から得ることができる。
【００５９】
有利な一実施形態においては、本発明は、前記Ｄｕｂ３タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアント、又は前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする前記核酸分子が、前記ｉＰＳ細胞において、全能性又は多能性細胞における前記Ｄｕｂ３タンパク質の発現よりも少なくとも２倍低いレベルで発現される、上で定義した使用に関する。
【００６０】
その一例を図７Ａに示すＲＴ−ＰＣＲによってＤｕｂ３  ｍＲＮＡ存在量を定量することによって、及び／又は図１１Ｅに記載のものなどの特異抗体を用いたウエスタンブロットによるＤｕｂ３タンパク質の検出によって、Ｄｕｂ３の発現を測定することができる。
【００６１】
この発現レベルの利点は、前記ｉＰＳ細胞が、ＤＮＡ損傷、及び／又は前記ｉＰＳ細胞の生成に必要なｃ−ｍｙｃ若しくはＯｃｔファミリータンパク質などの因子の異所性発現によって生じる複製ストレスに効率的に反応することができるようになり、それによってＣＤＫ２活性の低下とその結果として生じる細胞周期のＧ１期の遅延によりゲノム安定性を保持できることである。
【００６２】
かかる効果を図４Ｆに例示する。したがって、かかるｉＰＳ細胞は、「チェックポイントコンピテント」多能性ｉＰＳと呼ばれ、現在使用されているｉＰＳとは異なり、その催奇形性が大きく低下しているので細胞療法への使用に有利であると考えられる。
【００６３】
本発明は、全能性又は多能性細胞の自然分化を誘導するための、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントの活性及び／又は発現の阻害剤の使用であって、前記タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、又は任意の前記タンパク質のバリアントが前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する、使用にも関する。
【００６４】
本発明者らは、Ｄｕｂ３活性及び／又は発現の阻害が、全能性又は多能性細胞の自然分化を誘導するという予想外の観察をした。使用することができる阻害剤は、上述したものである。
【００６５】
本発明は、細胞集団に属する細胞の分化状態を決定するための、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、又は前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアントの使用に関する。
【００６６】
本発明者らは、Ｄｕｂ３タンパク質が、分化過程中に急速に抑制される（Ｄｕｂ３発現が、分化過程中に停止する）という予想外の観察もした。実際、実施例に示すように、Ｄｕｂ３タンパク質レベルは、分化中の極めて早期に、Ｏｃｔ４よりもはるかに早く、大きく低下した。
【００６７】
したがって、Ｏｃｔ４は、現在まで、細胞の分化状態を判定するのに最も一般的に使用されている分化マーカーであるので、上記定義による使用は、より正確な細胞分化状態を与えるので有利である。
【００６８】
本発明は、細胞におけるＤｕｂ３タンパク質又は任意の前記タンパク質のバリアントの存在又は量を測定するステップを含む、細胞集団に属する細胞の分化状態を決定する方法にも関し、前記タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、前記タンパク質のバリアントは、前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する。その結果、
−  Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントが存在する場合、細胞は全能性又は多能性細胞であり、
−  Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントが存在しない場合、細胞は分化細胞又は分化性細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）である。
【００６９】
「分化性細胞」とは、本発明では、形態学的には全能性又は多能性細胞であるように見えるが、分化の分子的徴候を有する細胞を意味する。分化の分子的徴候は、例えば、内胚葉マーカーＳｏｘ７、神経外胚葉マーカーＳｏｘ１及びネスチンなどの特異的遺伝子の発現、並びに多能性ネットワークの転写因子Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４などの特異的遺伝子の抑制であり得る。
【００７０】
さらに、本発明は、幹細胞を非腫よう細胞集団から単離する方法であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、又は前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアントの存在又は量の測定と、場合によっては前記Ｄｕｂ３タンパク質を発現する細胞を単離するステップとを含む、方法に関する。
【００７１】
フローサイトメトリーなどの当業者に知られている一般的技術、及び免疫学的材料（すなわち、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントに対する適切な抗体）を使用することによって、前記Ｄｕｂ３タンパク質を発現する細胞を特異的に標識し、その結果、それらをＤｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントを発現しない他の細胞から単離することができる。
【００７２】
本発明は、治療抵抗性腫よう、又は癌の治療に使用するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／又は発現の阻害剤
を含む組成物にも関する。
【００７３】
癌の薬剤耐性及び再発に関与する腫よう開始細胞又は癌幹細胞（ＣＳＣ：ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と呼ばれる小グループの癌細胞の性質は、腫よう治療に大きく影響し得る。重要なことには、腫ようの薬剤耐性は、静止状態、特異的形態、ＤＮＡ修復能力及び抗アポトーシスタンパク質の過剰発現、薬物排出輸送体及び解毒酵素などのＣＳＣの多数の内因性又は後天性の性質と密接に関連しているように思われる。特異的微小環境（ニッチ）及び低酸素安定性は、抗癌治療に対してＣＳＣを更に保護するものである。したがって、ＣＳＣに焦点をおいた療法は、あらゆる有効な抗癌戦略の核となるものである。
【００７４】
したがって、本発明者らは、癌の耐性の問題の解決を意図し、この目的のために新しい薬剤組成物を提案する。
【００７５】
一態様においては、Ｄｕｂ３タンパク質若しくは上で定義した前記タンパク質のバリアント、又はかかるタンパク質若しくはバリアントをコードする核酸分子を含む組成物は、癌幹細胞における分化過程を誘導し、分化型癌細胞に適合した療法に対するかかる細胞の感受性を高めると考えられる。特定の実施形態においては、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントを発現する癌幹細胞は、Ｄｕｂ３タンパク質を異所的に発現するので、アポトーシスによって死滅する。
【００７６】
別の一態様においては、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントの活性又は発現の阻害剤を含む組成物は、癌幹細胞の自然分化を誘導し、分化型癌細胞に適合した療法に対するかかる細胞の感受性を高めると考えられる。
【００７７】
したがって、本発明による組成物は、化学療法などの従来の癌療法に耐性のある特定のタイプの癌を治療することができる。
【００７８】
本発明は、治療抵抗性腫よう又は癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に以下を含む有効量の組成物を投与することを含む方法にも関する。
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／若しくは発現の阻害剤。
【００７９】
有利には、本発明は、前記Ｄｕｂ３タンパク質の活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／又は発現の阻害剤を含み、前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアンチセンス、ＤＮＡアンチセンス、抗体又は化学物質から選択される、上で定義したその使用のための組成物、又は上で定義した方法に関する。
【００８０】
配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによる動物の免疫処置から得られる抗体。
【００８１】
上で定義した式Ｉ化合物も有利である。
【００８２】
より有利には、本発明は、前記阻害剤が、配列番号４１又は配列番号４２に記載の以下のアミノ酸配列を含むｓｉＲＮＡである、上で定義したその使用のための組成物、又は上で定義した方法に関する。
【００８３】
配列番号４２のｓｉＲＮＡは、５’−ＵＡＧＣＡＣＡＣＡＵＣＵＵＡＣＡＧＣＣ−３’である。
【００８４】
したがって、本発明による最も有利なｓｉＲＮＡは、配列番号４１及びその相補配列を含む若しくはそれらからなるセンス鎖、又は配列番号４２を含む若しくはそれからなるアンチセンス鎖を含む、ｓｉＲＮＡである。
【００８５】
上記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ構造を安定化する化合物の添加によって改変することもできる。例えば、上記ｓｉＲＮＡは、その３’末端にジヌクレオチド：ジチミジン（ＴＴ）を含む。
【００８６】
他の有利な一実施形態においては、本発明は、前記ｓｈＲＮＡが、配列の配列番号４１とそれに続く配列の配列番号４２を含む又はそれらで構成される核酸分子を含み、又は該核酸分子からなり、配列番号４１の３’末端が配列番号４２の５’末端にリンカーによって連結されている、上で定義したその使用のための組成物に関する。本発明によるリンカーは、以下のリンカーから選択することができる。
１）ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（ブルメルカンプ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ），Ｔ．Ｒ．、２００２年サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９６（５５６７）：５５０〜３）、
２）ＡＡＧＵＵＣＵＣＵ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、
３）ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ（シェル（Ｓｃｈｅｒｒ），Ｍ．、カレント・メディシナル・ケミストリー（Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、２００３年２月；１０（３）：２４５〜５６）、
４）ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号４３）（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）Ｄ．Ｓ．、２００３年、セル（Ｃｅｌｌ）、１１５（２）：１９９〜２０８）、及び
５）ＣＵＣＧＡＧ。
【００８７】
前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸分子（すなわち、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、本発明に包含される。
【００８８】
本発明は、分化性幹細胞、全能性細胞及び／又は多能性幹細胞の細胞死を好ましくはインビトロで誘導するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
の使用に関する。
【００８９】
実施例の項で述べるように、本発明者らは、Ｄｕｂ３タンパク質又は上で定義した前記タンパク質のバリアントの強制的な発現が、幹細胞（又は全能性若しくは多能性細胞）における分化過程とアポトーシスによる細胞死の両方を誘導することを示した。
【００９０】
本発明は、全能性及び又は多能性幹細胞の細胞死を誘導する方法であって、前記細胞に有効量の
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
を投与することを含む方法に関する。
【００９１】
本発明は、以下の図を参照して、以下の実施例から更に理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｉは、Ｇ１におけるＤＮＡ損傷が早期Ｓ期において過渡的な細胞周期停止を誘導し、Ｇ１／Ｓ移行においては誘導しないことを示す図である。図１Ａは、様々なＵＶ線量で処理したＥＳ細胞のＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。漸増するＵＶ線量（０、２、４、６又は１０Ｊ／ｍ２−Ｚ軸）に曝露された、非同期的に成長したＥＳ細胞の細胞周期プロファイル。ＦＡＣＳ分析のためのＵＶ照射から６時間後に細胞を収集した。Ｘ軸は細胞数であり、ｙ軸は、ヨウ化プロピジウム蛍光によって測定したＤＮＡ含有量である。
【図１Ｂ】時間内にＵＶで処理したＥＳ細胞のＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析結果である。漸増するＵＶ線量に曝露された、非同期的に成長したＥＳ細胞の細胞周期プロファイル（０、２、４、６又は１０Ｊ／ｍ２）。非同期的に成長したＥＳ細胞を、６Ｊ／ｍ２のＵＶ照射に曝露し、示した時点（０、２、４又は６時間、Ｚ軸）でＦＡＣＳ分析用に収集した。Ｘ軸は細胞数であり、ｙ軸は、ヨウ化プロピジウム蛍光によって測定したＤＮＡ含有量である。
【図１Ｃ】ＮＩＨ−３ｔ３細胞系におけるＤＡＰＩを用いたＤＮＡ含有量の蛍光検出を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｄ】ＥＳ細胞におけるＤＡＰＩを用いたＤＮＡ含有量の蛍光検出を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｅ】ＮＩＨ−３ｔ３細胞系における特異抗体を用いたＯｃｔ４タンパク質の免疫蛍光検出を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｆ】ＥＳ細胞における特異抗体を用いたＯｃｔ４タンパク質の免疫蛍光検出を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｇ】示した時点で収集した、ノコダゾール停止が解除された未処理又はＧ１においてＵＶ照射された（解除から２時間後）ＥＳ細胞の可溶性（ａ）及び不溶性（クロマチン結合、ｂ）画分中のサイクリンＡ（＃１）、ヒストンＨ３（＃２）、γＨ２ＡＸ（＃３）、ＤＮＡポリメラーゼα（＃４）及びＣｄｃ４５（＃５）タンパク質の発現を示すウエスタンブロットである。ｔ：時間。
【図１Ｈ】示した時点で収集した、ノコダゾール停止が解除され、Ｇ１において偽照射又はＵＶ照射されたＥＳ細胞由来の複数の参照遺伝子に対して規準化されたサイクリンｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。点線はＧ１におけるレベルである。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。
【図１Ｉ】示した時点で収集した、ノコダゾール停止が解除され、Ｇ１において偽照射又はＵＶ照射されたＥＳ細胞由来の複数の参照遺伝子に対して規準化されたサイクリンＡ２  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。点線はＧ１におけるレベルである。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｆは、Ｇ１におけるＤＮＡ損傷が早期Ｓ期において過渡的なＥＳ細胞周期停止を誘導し、Ｇ１／Ｓ移行においては誘導しないことを示す図である。図２Ａは、実験計画の模式的概要である。矢印は、細胞を収集した時点を示す。
【図２Ｂ】ノコダゾール停止が解除された偽のＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す図である。示した時点においてヨウ化プロピジウムで染色された総ＤＮＡ含有量の分析。
【図２Ｃ】ノコダゾール停止が解除された、Ｇ１において６Ｊ／ｍ２のＵＶ光に曝露されたＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す図である。示した時点においてヨウ化プロピジウムで染色された総ＤＮＡ含有量の分析。
【図２Ｄ】Ｇ１において偽照射及びＵＶ照射された（６Ｊ／ｍ２）同期ＥＳ細胞のＳ期開始の動力学のＦＡＣＳ分析結果を示す図である。細胞周期分布をＢｒｄＵ取り込みと、それに続くＦＡＣＳ分析によって測定した。
【図２Ｅ】図２Ｄを要約した曲線である。Ｘ軸は時間（ｈ）であり、Ｙ軸はＢｒｄＵ陽性細胞の割合である。黒丸印の曲線は未処理細胞であり、白四角印の曲線はＵＶ処理細胞である。
【図２Ｆ】Ｇ１においてそれぞれ６及び１０Ｊ／ｍ２のＵＶ光に曝露されたＥＳ及びＮＩＨ−３ｔ３細胞のＢｒｄＵ免疫反応性の分析によるＳ期開始の代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す図である。四角い枠は、全事象に差が認められた領域を示す。ＢｒｄＵ陽性細胞の平均蛍光強度を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｆは、ｐ５３がＤＮＡ損傷後のＥＳ細胞において転写的に活性であることを示す図である。図３Ａは、示した時点（ＵＶ処理後の時間（ｈ））で収集した、ＵＶ照射されたＥＳ細胞の細胞成分分画におけるＭＣＭ２（＃１）、Ｃｈｋ１（＃２）、ｐ５３Ｓ１５Ｐ（＃３）、γＨ２ＡＸ（＃４）及びヒストンＨ３（＃５）の発現を示すウエスタンブロットである。細胞を溶解し、可溶性（ｂ）及び不溶性（クロマチン結合、ａ）画分に分画した。
【図３Ｂ】未処理（−）又はＵＶ照射された（＋）、（１３ｘ  ｐ５３応答配列を含む）ｐＧ１３−ｌｕｃプロモーターが導入されたＥＳ細胞の相対ルシフェラーゼ活性（ホタル／ウミシイタケ）を示すヒストグラムである。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図３Ｃ】未処理（−）又はＵＶ照射された（＋）、ｐ２１−ｌｕｃ（白色バー）及び（ｐ５３応答配列のない）ｐ２１−ΔＲＥｐ５３−ｌｕｃ（黒色バー）が導入されたＥＳ細胞の相対ルシフェラーゼ活性（ホタル／ウミシイタケ）を示すヒストグラムである。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図３Ｄ】野生型（白色バー）及びｐ５３ノックアウト（ｎ．ｄ．（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）：未検）ＥＳ細胞におけるｐ５３遺伝子のｑＰＣＲによって測定された相対ｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞をＵＶ照射し、示した時点で収集した（Ｘ軸：ＵＶ後の時間（ｈ））。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図３Ｅ】野生型（白色バー）及びｐ５３ノックアウト（黒色バー）ＥＳ細胞におけるｐ２１遺伝子のｑＰＣＲによって測定された相対ｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞をＵＶ照射し、示した時点で収集した（Ｘ軸：ＵＶ後の時間（ｈ））。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図３Ｆ】野生型（白色バー）及びｐ５３ノックアウト（黒色バー）ＥＳ細胞におけるＭｄｍ２遺伝子のｑＰＣＲによって測定された相対ｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞をＵＶ照射し、示した時点で収集した（Ｘ軸：ＵＶ後の時間（ｈ））。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｆは、Ｇ１におけるＤＮＡ損傷後にＣｄｃ２５Ａが残るとＥＳ細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイントバイパスが持続することを示す図である。図４Ａは、示した時間（ＵＶ後の時間（ｈ））で収集した、１０Ｊ／ｍ２のＵＶ光に曝露された非同期的に成長したＥＳ（ｂ）及びＮＩＨ−３ｔ３（ａ）細胞におけるＣｄｃ２５Ａ（＃１、暗露光（ｄａｒｋ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）及び＃２明露光（ｌｉｇｈｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ））、Ｃｄｋ２（＃３）及びβ−アクチン（＃４、対照）の発現レベルを示すウエスタンブロットである。
【図４Ｂ】Ｇ１において同期され、Ｓ期を通過したＥＳ（ａ）及びＮＩＨ−３ｔ３（ｂ）細胞におけるＣｄｃ２５Ａ（＃１、暗露光及び＃２明露光）、Ｈ３Ｓ１０Ｐ（＃３）、Ｈ３（＃４）及びβ−アクチン（＃５、対照）の発現レベルを示すウエスタンブロットである。ＥＳ細胞をノコダゾールによって同期させ、解除後の示した時点で収集した（解除時間（ｈ））。ＮＩＨ−３ｔ３細胞をコンフルエンスによって同期させ、解除し、解除から６時間（Ｇ１）及び１８時間（Ｓ）後に収集した。Ｃｄｃ２５Ａの翻訳後修飾（ＰＴＭ：ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、アステリスク）を観察するために、暗露光を示す。
【図４Ｃ】１時間のＭＧ１３２処理後のＥＳ（ａ）及びＮＩＨ−３ｔ３細胞（ｂ）においてＨＡ−ユビキチンと同時導入されたＦｌａｇ免疫沈降され、異所的に発現されたＦｌａｇ−Ｃｄｃ２５Ａのウエスタンブロットである。Ｃｄｃ２５Ａ（＃２、暗露光及び＃３明露光）及びＨＡ（＃１）の存在を示す。免疫グロブリン（＃４）も示す。
【図４Ｄ】ＥＳ細胞におけるＤＮＡ損傷による急速なＣｄｃ２５Ａ破壊がＣｈｋ１に依存することを示すウエスタンブロットである。細胞をＵＶ照射し、Ｃｈｋ１阻害剤ＳＢ２１８０７８の非存在又は存在下でシクロヘキシミド（Ｃｘ）と一緒にインキュベートし、示した時間（ｍｉｎ）で収集し、ウエスタンブロット法によって分析した。Ｃｄｃ２５Ａ発現（＃１）及びβ−アクチン（＃２、対照）を示す。
【図４Ｅ】Ｇ１においてＤＮＡ損傷による阻害性ＣＤＫ２Ｔｙｒ１５リン酸化の増加をもたらす、ＲＮＡｉによるＣｄｃ２５Ａ発現の減少を示すウエスタンブロットである。対照（ａ）及びＣｄｃ２５Ａ（ｂ）ＲＮＡｉ導入細胞をノコダゾールから開放し、Ｇ１においてＵＶ光に曝露した。試料を、示した時間で収集し、示した抗体、すなわちＣｄｃ２５Ａ（＃１）、Ｃｄｋ２Ｙ１５Ｐ（＃２）、サイクリンＢ１（＃３）、Ｃｈｋ１Ｓ３４５Ｐ（＃４）、Ｃｈｋ１（＃５）及びβ−アクチン（＃６、対照）を用いたウエスタンブロット法によって分析した。
【図４Ｆ】ＤＮＡ損傷によるＧ１遅延におけるＣｄｃ２５Ａの減少を示すヒストグラムである。対照（ａ）及びＣｄｃ２５Ａ（ｂ）ＲＮＡｉ導入細胞をノコダゾールから開放し、Ｇ１（ｔ＝２）においてＵＶ光に曝露し、ＵＶ照射（＋）又は偽照射（−）から２時間後（ｔ＝４）に収集した。収集前に細胞をＢｒｄＵで瞬間標識した。二倍体ＢｒｄＵ陰性細胞の（％で表される）画分をプロットした（データを平均±ＳＤで表す）。Ｐ＜０．０５の統計学的差を１個のアステリスク（＊）で示す。Ｙ軸は、Ｇ１における細胞の割合である。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｈは、Ｇ１におけるＤＮＡ損傷後の残留Ｃｄｃ２５ＡホスファターゼがＥＳ細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイントを阻害することを示す図である。図５Ａは、図４Ａに示したウエスタンブロットシグナルの定量化を示すヒストグラムである。Ｃｄｃ２５Ａ（暗露光）のウエスタンブロットシグナル（レーン１（黒色バー）及びレーン７（白色バー））を濃度測定走査によって定量化し、添加対照としてのβ−アクチンシグナルに対する相対光学濃度（ＲＯＤ：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）として表した（Ｙ軸）。
【図５Ｂ】図４Ｂに示したウエスタンブロットシグナルの定量化を示すヒストグラムである。Ｃｄｃ２５Ａのウエスタンブロットシグナルを濃度測定走査によって定量化し、添加対照としてのβ−アクチンシグナルに対する相対光学濃度（ＲＯＤ）として表した（Ｙ軸）。黒色バーはＮＩＴ−３ｔ３細胞であり、白色（ｗｈｉｔ）バーはＥＳ細胞である。
【図５Ｃ】漸増濃度（μＭ、Ｚ軸）のロスコビチンで処理した非同期的に成長したＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析結果である。ロスコビチンは、ＥＳ細胞のＧ１期の延長に依存したサイクリン依存性キナーゼの強力な選択的阻害剤である。Ｘ軸は（ヨウ化プロピジウム蛍光で表される）ＤＮＡ含有量であり、Ｙ軸は細胞数である。
【図５Ｄ】撹乱されていない細胞周期中のＣＤＫ２リン酸化状態（Ｙ１５Ｐ）を示すウエスタンブロットである。ＥＳ細胞をノコダゾール停止から開放し、Ｇ１及びＳ期において示した時点で収集した。タンパク質Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）、Ｗｅｅ１（＃２）、Ｃｄｋ２Ｙ１５Ｐ（＃３）、Ｃｄｋ２（＃４）、サイクリンＡ（＃５）、Ｈ３Ｓ１０Ｐ（＃６）、Ｈ３（＃７）及びβ−アクチン（＃８、対照）をウエスタンブロット法によって検出した。
【図５Ｅ】Ｗｅｅ１及びＣｄｃ２５ＡによるＣｄｋ２のリン酸化の調節の略図である。図５Ｄのウエスタンブロットシグナルを濃度測定走査によって定量化し、添加対照としてのβ−アクチンシグナルに対する相対光学濃度（ＲＯＤ）として表した。右のＸ軸は、β−アクチンに比べたＣｄｃ２５Ａ及びＷｅｅ１タンパク質レベルであり、左のＸ軸は、Ｃｄｋ２Ｙ１５Ｐ発現レベルである。黒丸印の曲線はＣｄｃ２５Ａ発現レベルであり、三角印の曲線はＣｄｋ２Ｙ１５Ｐ発現レベルであり、ｘ印の曲線はＷｅｅ１発現レベルである。Ｙ軸は、解放後の時間（ｈ）である。
【図５Ｆ】対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたＣｄｃ２５Ａ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（ａ）ＲＮＡｉ又はＣｄｃ２５Ａ（ｂ）ＲＮＡｉ配列を導入した。バーは複数の観察の平均±ＳＤである。
【図５Ｇ】対照（ａ）又はＣｄｃ２５Ａ（ｂ）ＲＮＡｉ配列を導入したＥＳ細胞のウエスタンブロット解析である。Ｃｄｃ２５ＡのＣｄｃ２５Ａ（＃１、暗露光及び＃２明露光）及びβ−アクチン（＃２、対照）の発現を示す。
【図５Ｈ】図４Ｅに示したウエスタンブロットシグナルの定量化を示すヒストグラムである。図４Ｅのウエスタンブロットシグナルを濃度測定走査によって定量化し、添加対照としてのＣｈｋ１シグナルに対する相対光学濃度（ＲＯＤ）として表した。黒色バーはＣｄｃ２５Ａ  ＲＮＡｉで処理した細胞であり（ａ）、白色バーは対照ＲＮＡｉで処理した細胞である（ｂ）。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｊは、ＥＳ細胞における脱ユビキチン化酵素Ｄｕｂ３の増加が多量のＣｄｃ２５Ａをもたらすことを示す図である。図６Ａは、ＮＩＨ−３ｔ３細胞において、示した時間（ｍｉｎ）中のシクロヘキシミド（Ｃｘ）の存在下におけるＣｄｃ２５Ａ代謝回転率の測定に用いられる代表的なウエスタンブロットシグナルを示す図である。示した時点に細胞を収集した。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）及びβ−アクチン（＃２、対照）の発現を示す。
【図６Ｂ】ＥＳ細胞において、示した時間（ｍｉｎ）中のシクロヘキシミド（Ｃｘ）の存在下におけるＣｄｃ２５Ａ代謝回転率の測定に用いられる代表的なウエスタンブロットシグナルを示す図である。示した時点に細胞を収集した。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）及びβ−アクチン（＃２、対照）の発現を示す。
【図６Ｃ】ＥＳ及びＮＩＨ−３ｔ３細胞においてシクロヘキシミド（Ｃｘ）の存在下におけるＣｄｃ２５Ａ代謝回転率を示すグラフである。Ｃｄｃ２５Ａのウエスタンブロットシグナルを濃度測定走査によって定量化し、添加対照としてのβ−アクチンシグナルに対する相対光学濃度（ＲＯＤ）として表した。未処理細胞におけるシグナルを１００％に設定し、Ｃｄｃ２５Ａの半減期（ｔ１／２）を測定した（データを平均±ＳＤで表す）。黒丸印の曲線はＥＳ細胞であり、白四角印の曲線はＮＩＨ−３ｔ３細胞である。Ｙ軸はパーセント表示のＣｄｃ２５Ａタンパク質レベルであり、Ｘ軸は時間（ｍｉｎ）である。
【図６Ｄ】Ｄｕｂ３の過剰発現がＣｄｃ２５Ａ存在量を増加させることを示す図である。ＮＩＨ−３ｔ３細胞に空ベクター（ａ）又はＭｙｃ６−Ｄｕｂ３をコードするｐＬＰＣ（ｂ）を導入した。ピューロマイシン選択後に細胞を収集し、ウエスタンブロット解析用に加工した。タンパク質をｍｙｃ（＃１）、Ｃｈｋ１（＃２）、Ｃｄｃ２５Ａ（＃３）及びβ−アクチン（＃４、対照）抗体を用いて検出した。
【図６Ｅ】空ベクター（ａ）又はＭｙｃ６−Ｄｕｂ３をコードするｐＬＰＣ（ｂ）を発現するＮＩＨ−３ｔ３細胞においてＤＮＡ損傷によるＣｄｃ２５Ａ分解を示すウエスタンブロットである。細胞を、示した時点で収集し（ＵＶ処理後のｍｉｎ）、ウエスタンブロット法によって分析した。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）、Ｍｙｃ（＃２）、Ｃｈｋ１（＃３）、Ｃｈｋ１Ｓ３４５Ｐ（＃４）及びβ−アクチン（＃４、対照）の発現を示す。
【図６Ｆ】対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたβ−ＴｒＣＰのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｌｕｃ）、β−ＴｒＣＰ（１）、Ｃｄｈ１（２）又はＤｕｂ３（３）ＲＮＡｉ配列を導入し、導入から４８時間後に収集した。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図６Ｇ】対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたＤｕｂ３のｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｌｕｃ）、β−ＴｒＣＰ（１）、Ｃｄｈ１（２）又はＤｕｂ３（３）ＲＮＡｉ配列を導入し、導入から４８時間後に収集した。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図６Ｈ】対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたＣｄｈ１のｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｌｕｃ）、β−ＴｒＣＰ（１）、Ｃｄｈ１（２）又はＤｕｂ３（３）ＲＮＡｉ配列を導入し、導入から４８時間後に収集した。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図６Ｉ】対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたＣｄｃ２５ＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｌｕｃ）、β−ＴｒＣＰ（１）、Ｃｄｈ１（２）又はＤｕｂ３（３）ＲＮＡｉ配列を導入し、導入から４８時間後に収集した。バーは３つ組での観察の平均±ＳＤである。
【図６Ｊ】ルシフェラーゼ（ａ）、β−ＴｒＣＰ（ｂ）及びＣｄｈ１（ｃ）ＲＮＡｉ導入細胞におけるＣｄｃ２５Ａタンパク質発現のウエスタンブロット解析結果を示す図である。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）及びβ−アクチン（＃２）の発現を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｆは、ＥＳ細胞中の脱ユビキチン化酵素Ｄｕｂ３の増加によってＣｄｃ２５Ａ存在量が増加することを示す図である。図７Ａは、ＥＳ（白色バー）及びＮＩＨ−３ｔ３（黒色バー）細胞において複数の参照遺伝子に対して規準化されたＯｃｔ４（１）、Ｃｄｃ２５Ａ（２）、Ｃｄｈ１（３）、β−ＴｒＣＰ（４）及びＤｕｂ３（５）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。統計学的差をアステリスクＰ＜０．０５で示す。左のＹ軸はＯｃｔ４  ｍＲＮＡ発現であり、右のＹ軸は３個の別の遺伝子のｍＲＮＡ発現である。
【図７Ｂ】複数の参照遺伝子に対して規準化されたＤｕｂ３  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（１）、Ｄｕｂ３（２）又はＣｄｃ２５Ａ（３）ＲＮＡｉ配列を導入した。
【図７Ｃ】複数の参照遺伝子に対して規準化されたＣｄｃ２５Ａ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（１）、Ｄｕｂ３（２）又はＣｄｃ２５Ａ（３）ＲＮＡｉ配列を導入した。
【図７Ｄ】Ｄｕｂ３（カラム１）、（カラム３）Ｃｄｃ２５Ａ又は対照（カラム２）ＲＮＡｉ配列を導入したＥＳ細胞のウエスタンブロット解析結果を示す図である。ＣＤＣ２５Ａ（＃１）、Ｃｄｃ２５Ｃ（＃２）及びβ−アクチン（＃３、対照）の発現を示す。
【図７Ｅ】ＤＡＰＩで染色されたＥＳ細胞の核を示す図である。
【図７Ｆ】ＥＳ細胞におけるｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３の細胞局在を示す細胞の図である。スケールバーは１０μＭである。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｇは、Ｄｕｂ３が、オーファン受容体Ｅｓｒｒｂの標的遺伝子であることを示す図である。図８Ａは、マウスにおけるＤｕｂ３近位プロモーター（６ｋｂ）の模式的概要を示す図である。Ｅｓｒｒｂ（陰影をつけた枠）及びＳｏｘ２（黒色の枠）コンセンサス結合部位（ＲＥ）を示す。
【図８Ｂ】対照の％として表した、複数の参照遺伝子に対して規準化されたＥｓｒｒｂ（１）、Ｄｕｂ３（２）及びＮａｎｏｇ（３）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｃｒｔｌ）ＲＮＡｉ（白色バー）又はＥｓｒｒｂ特異的ＲＮＡｉ配列（黒色バー）を導入した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。Ｐ＜０．０５の統計学的差を１個のアステリスク（＊）で示し、有意差なしを（ｎｓ：ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）として示す。
【図８Ｃ】空ベクター（白色バー）、Ｅｓｒｒｂ（黒色バー）又はＥｓｒｒｂ−ΔＣｔｅｒ（斜線バー）発現プラスミドを導入したＥＳ細胞における内在性Ｅｓｒｒｂ（ａ）又はＤｕｂ３（ｂ）発現のｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。Ｐ＜０．０５の統計学的差を１個のアステリスク（＊）で示す。
【図８Ｄ】Ｄｕｂ３プロモーター上のＥｓｒｒｂのＣｈＩＰを示すヒストグラムである。Ｅｓｒｒｂ及びＳｏｘ２占有についてＤｕｂ３プロモーターを走査するための６ｋｂ近位プロモーター（図８Ａ）に沿ったプライマー対の位置。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。アミラーゼはここでは対照となる。二元配置ＡＮＯＶＡを用いた統計解析を実施した。１：アミラーゼ、２：ｐｐ１、３：ｐｐ２、４：ｐｐ３、５：ｐｐ４、６：ｐｐ５。
【図８Ｅ】Ｄｕｂ３プロモーター上のＳｏｘ２のＣｈＩＰを示すヒストグラムである。Ｅｓｒｒｂ及びＳｏｘ２占有についてＤｕｂ３プロモーターを走査するための６ｋｂ近位プロモーター（図８Ａ）に沿ったプライマー対の位置。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。アミラーゼはここでは対照となる。二元配置ＡＮＯＶＡを用いた統計解析を実施した。１：アミラーゼ、２：ｐｐ１、３：ｐｐ２、４：ｐｐ３、５：ｐｐ４、６：ｐｐ５。
【図８Ｆ】ＣＶ１細胞においてルシフェラーゼアッセイを用いてＤｕｂ３プロモーター活性を示すヒストグラムである。細胞にプロモーター構築物と示した遺伝子を同時導入し、導入から４８時間後のルシフェラーゼ活性を評価した。バーは複数の観察の誘導倍率±ＳＤである。統計学的差をＰ＜０．０５では１個のアステリスク（＊）で、Ｐ＜０．００１では（＊＊）で示す。黒色バーはｐＧＬ４．１０＿５’ｆａｒであり、白色バーはｐＧＬ４．１０＿３．２ｋｂである。１：空ベクター、２：Ｓｏｘ２、３：Ｅｓｓｒｂ及び４：Δ−Ｃｔｅｒ。
【図８Ｇ】ＥＳ細胞における１ｋｂ近位プロモーター及び変異配列の基本的な転写活性を示すヒストグラムである。３つの変異をＥｓｒｒｂコンセンサス結合部位に導入した。ＴＣＡＡＧＧＴＣＡはＴＣＡＴＴＴＴＣＡに変異した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。１：ｗｔ、２：変異。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、Ｄｕｂ３が、オーファン受容体Ｅｓｒｒｂの標的遺伝子であることを示す図である。図９Ａは、漸増濃度の選択的Ｅｓｒｒｂ及びＥｓｒｒｇ作動物質ＤＹ１３１（μＭ単位の示した用量）で１６時間処理したＥＳ細胞における、Ｃｄｃ２５Ａ（黒四角印の曲線）及びＤｕｂ３（三角印の曲線）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。バーは３つ組での観察の誘導倍率±ＳＤである。
【図９Ｂ】漸増濃度（μＭ）のＤＹ１３１作動物質で１６時間処理したＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａタンパク質レベルのウエスタンブロット解析結果を示す図である。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１）及びβ−アクチン（＃２、対照）タンパク質の発現を示す。
【図９Ｃ】ＤＹ１３１の存在下での対照の割合として表される複数の参照遺伝子に対して規準化されたＥｓｒｒｂ（１）及びＤｕｂ３（２）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。ＥＳ細胞に対照（Ｃｒｔｌ）ＲＮＡｉ（白色バー）又はＥｓｒｒｂ特異的ＲＮＡｉ配列（黒色バー）を導入した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。
【図９Ｄ】ＣｈＩＰ分析前のＤＮＡ断片サイズを示す図である。超音波処理によって５００ｂｐより小さいＤＮＡ断片が生成した。１：ＩＰ入力、２：ゲノムＤＮＡ。
【図９Ｅ】Ｅｓｒｒｂ抗体の特異性を示すウエスタンブロットである。空ベクター（Ｅｖ：ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ、＃２）又はＦｌａｇ−Ｅｓｒｒｂ（＃１）発現プラスミドを導入した２９３Ｔ−ＨＥＫ細胞の免疫沈降。Ｆｌａｇ又はＥｓｒｒｂ（ｂ）抗体を用いた免疫沈降を並行して実施した。どちらの抗体もＦｌａｇ−Ｅｓｒｒｂタンパク質を特異的に免疫沈降させた。ａ：入力。ａ１：ＩｇＧ、ａ２：Ｅｓｒｒｂ及びａ３：β−アクチン。
【図９Ｆ】導入から４８時間後の空ベクター（レーン１）、Ｆｌａｇ−Ｅｓｒｒｂ（レーン２）、Ｆｌａｇ−Ｅｓｒｒｂ−Δ−Ｃｔｅｒ（レーン３）又はＳｏｘ２（レーン４）を導入したＣＶ１細胞の発現レベルのウエスタンブロット解析結果である。ａ１：ＦＬＡＧ、ａ２：Ｅｓｒｒｂ及びａ３：β−アクチン、＃１：Ｅｓｒｒｂ及び＃２：Δ−Ｃｔｅｒ。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｋは、発生時のＣｄｃ２５Ａタンパク質存在量の調節がＤｕｂ３発現と相関することを示す図である。図１０Ａは、ＥＳ細胞の位相差写真である。
【図１０Ｂ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導されるＥＳ細胞から神経への変化の１日目の位相差写真である。
【図１０Ｃ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導されるＥＳ細胞から神経への変化の３日目の位相差写真である。
【図１０Ｄ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導されるＥＳ細胞から神経への変化の７日目の位相差写真である。
【図１０Ｅ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導されるＥＳ細胞から神経への変化の神経分化状態における位相差写真である。
【図１０Ｆ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される神経分化中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＤｕｂ３（三角印の曲線）、Ｓｏｘ２（白四角印の曲線）及びＥｓｒｒｂ（逆三角印の曲線）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。値は複数の観察の平均±ＳＤである。
【図１０Ｇ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される神経分化中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＤｕｂ３（三角印の曲線）、Ｃｄｃ２５Ａ（四角印の曲線）、Ｃｄｈ１（丸印の曲線）及びβ−ＴｒＣＰ（ｘ印の曲線）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。値は複数の観察の平均±ＳＤである。
【図１０Ｈ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される神経分化中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＤｕｂ３（三角印の曲線）、ＵＳＰ４８（四角印の曲線）、ＵＳＰ１３（ひし形印の曲線）及びＵＳＰ２９（逆三角印の曲線）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。値は複数の観察の平均±ＳＤである。
【図１０Ｉ】ＥＳ細胞から神経幹細胞（ＮＳＣ：ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）への分化を通して収集された細胞抽出物のウエスタンブロット解析を示す図である。免疫ブロットされたＤｕｂ３（＃１）、Ｏｃｔ４（＃２）、Ｃｄｃ２４Ａ（＃３）、ＲｈｏＡ（＃４）Ｓｕｄｓ３（＃５）及びβ−アクチン（＃６、対照）抗体。
【図１０Ｊ】非同期的に成長したＥＳ（ａ）とＮＳＣ（ｂ）のウエスタンブロット解析結果を示す図である。細胞を６Ｊ／ｍ２のＵＶ光に曝露し、示した時間で収集した。Ｃｄｃ２５Ａ（＃１、暗露光及び＃２明露光）及びβ−アクチン（＃３、対照）の発現を示す。
【図１０Ｋ】ＮＩＨ−３ｔ３（ａ）細胞及びＥＳ（ｂ）細胞におけるＤｕｂ３遺伝子の３つの異なるプロモーター長さの基本的な転写活性を示すヒストグラムである。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。黒色バー：１ｋｂ、白色バー：１．７ｋｂ及び斜線バー：３．２ｋｂ。Ｘ軸は、ルシフェラーゼ誘導倍率として表されるＤｕｂ３プロモーター活性である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｊは、発生時のＣｄｃ２５Ａタンパク質存在量の調節がＤｕｂ３発現レベルと相関することを示す図である。図１１Ａは、ＥＳ細胞から神経への変化中の多能性マーカー（Ｏｃｔ４：白丸印の曲線、Ｎａｎｏｇ：黒ひし形印の曲線、及びＫｌｆ４：白四角印の曲線）のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。データを複数の参照遺伝子に対して規準化した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。左のＹ軸はＮａｎｏｇ又はＫｌｆ４  ｍＲＮＡ発現であり、右のＹ軸はＯｃｔ４  ｍＲＮＡ発現である。
【図１１Ｂ】ＥＳ細胞から神経への変化中の細胞運命特定マーカー（ネスチン：ひし形印の曲線、Ｓｏｘ７：黒四角印の曲線、及びＳｏｘ１：白四角印の曲線）のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。データを複数の参照遺伝子に対して規準化した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。左のＹ軸はＳｏｘ７発現であり、右のＹ軸はＳｏｘ１又はネスチンｍＲＮＡ発現である。
【図１１Ｃ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される分化の１日目におけるネスチンの免疫蛍光検出を示す図である。核をＤＡＰＩによって対比染色した。スケールバー５０μＭ。
【図１１Ｄ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される分化の６日目におけるネスチンの免疫蛍光検出を示す図である。核をＤＡＰＩによって対比染色した。スケールバー５０μＭ。
【図１１Ｅ】マウスＤｕｂ３に対する抗体の特異性を示すウエスタンブロットである。ヒト２９３Ｔ細胞に空ベクター（ＥＶ：ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ、レーン２及び４）又はＨＡ−Ｄｕｂ３発現ベクター（レーン３又は５）を導入した。導入から２４時間後に細胞を収集し、抽出物を免疫前（ＰＩ：ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ、レーン１）、Ｄｕｂ３（レーン２及び３）又はＨＡ（レーン４又は４）抗体を用いて免疫ブロットした。Ｄｕｂ３抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて免疫前血清では認識されない６０ｋＤａの特定のポリペプチド（矢印）を認識する。
【図１１Ｆ】マウスＤｕｂ３に対する抗体の検証（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を示すウエスタンブロットである。対照（レーン１）又はＤｕｂ３（レーン２）ＲＮＡｉ配列を導入したＥＳ細胞のウエスタンブロット解析結果。導入から４８時間後に細胞を収集し、抽出物をＤｕｂ３精製抗体（＃１）及びβ−アクチン（＃２）を用いて免疫ブロットした。
【図１１Ｇ】Ｎ２Ｂ２７細胞から神経への変化（Ｄ１からＤ７）中のＤｕｂ３基質及び別のタンパク質（＃１：Ｏｃｔ４、＃２：Ｃｄｃ２５Ａ、＃３：Ｃｄｃ２５Ｂ、＃４：Ｃｄｃ２５Ｃ、＃５：ＰＣＮＡ及び＃６：β−アクチン）のウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図１１Ｈ】ＥＳ細胞から神経への変化中のＳｕｄｓ３、ＲｈｏＡ及びＥｓｒｒγのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。データを複数の参照遺伝子に対して規準化した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。
【図１１Ｉ】ＥＳ及び神経幹細胞（ＮＳＣ）において複数の参照遺伝子に対して規準化されたネスチン、Ｎａｎｏｇ、Ｃｄｃ２５Ａ及びＤｕｂ３  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ定量化を示すヒストグラムである。バーは複数の観察の平均±ＳＤである。
【図１１Ｊ】ＥＳ細胞から神経への変化中のＧ１サイクリン化学量論のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。データを複数の参照遺伝子に対して規準化した。データを複数の観察の平均±ＳＤ（エラーバー）として表す。左のＹ軸はサイクリンＤ１発現であり、右のＹ軸はサイクリンＥ１  ｍＲＮＡ発現である。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｏは、構成的Ｄｕｂ３発現が、分化によって誘導される細胞周期再構築に付随した多量のアポトーシスをもたらすことを示す図である。図１２Ａは、ＤＡＰＩ染色によって標識された、空ベクター（ＥＶ）を発現するＥＳ細胞の蛍光検出を示す図である。
【図１２Ｂ】空ベクター（ＥＶ）を発現するＥＳ細胞の免疫蛍光検出を示す図である。ｅＧＦＰ発現を示す。
【図１２Ｃ】ＤＡＰＩ染色によって標識されたｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の蛍光検出を示す図である。
【図１２Ｄ】ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の免疫蛍光検出を示す図である。ｅＧＦＰ発現を示す。ＥＳ細胞はすべて類似レベルのｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３を発現する。
【図１２Ｅ】示した分化０日目におけるＬＩＦの除去後の空ベクター（ＥＶ）ＥＳ細胞の位相差写真である。
【図１２Ｆ】示した分化２日目におけるＬＩＦの除去後の空ベクター（ＥＶ）ＥＳ細胞の位相差写真である。
【図１２Ｇ】示した分化４日目におけるＬＩＦの除去後の空ベクター（ＥＶ）ＥＳ細胞の位相差写真である。
【図１２Ｈ】示した分化０日目におけるＬＩＦの除去後のｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の位相差写真である。
【図１２Ｉ】示した分化２日目におけるＬＩＦの除去後のｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の位相差写真である。矢印は、アポトーシスの形態を有する分離細胞を示す。
【図１２Ｊ】示した分化４日目におけるＬＩＦの除去後のｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の位相差写真である。矢印は、アポトーシスの形態を有する分離細胞を示す。
【図１２Ｋ】空ベクター（ａ）又はｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞（ｂ）からＬＩＦを除去した後に毎日調製された細胞抽出物のウエスタンブロットである。（＊）は非特異的バンドを示す。ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞における高カスパーゼ３活性はアポトーシスを示す。ＧＦＰ−Ｄｕｂ３（＃１）、Ｏｃｔ４（＃２）、活性カスパーゼ３（＃３）及びＭＣＭ２（＃４）の発現を示す。
【図１２Ｌ】分化によって誘導される細胞周期再構築を示す図である。細胞を、示した日に収集し、ヨウ化プロピジウム染色後にＦＡＣＳによって分析した。細胞死は、低二倍体（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）ＤＮＡ含有量の細胞によって示される（Ｓｕｂ−Ｇ１）。上のレーンは空ベクター発現細胞であり、下のレーンはｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞である。第１列は分化０日目であり、第２列は分化１日目であり、第３列は分化２日目であり、第４列は分化３日目であり、第５列は分化４日目である。
【図１２Ｍ】長期対照（１）、Ｄｕｂ３（２）又はＣｄｃ２５ａ（３）を標的にしたＲＮＡｉ配列に対するＥＳ細胞のクローン原性アッセイを示すヒストグラムである。細胞をＬＩＦ含有血清中でクローン形成密度（ｃｌｏｎａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）で平板培養し、７日後にＡＰ染色した。柱は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ：ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）陽性（暗灰色）又は陰性（明灰色）コロニーの割合を示す。少なくとも１５０個のコロニーを調べた。
【図１２Ｎ】対照を標的にしたＲＮＡｉ配列を導入し、ＡＰ活性について分析した細胞の代表的写真である。
【図１２Ｏ】Ｄｕｂ３を標的にしたＲＮＡｉ配列を導入し、ＡＰ活性について分析した細胞の代表的写真である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜ＡＦは、構成的Ｄｕｂ３発現が、分化によって誘導される細胞周期再構築に付随した多量のアポトーシスをもたらすことを示す図である。図１３Ａは、ＦＡＣＳによって分析した空ベクター発現ＥＳ細胞の細胞周期分布及びＢｒｄＵ取り込みを示す図である。
【図１３Ｂ】ＦＡＣＳによって分析したｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の細胞周期分布及びＢｒｄＵ取り込みを示す図である。
【図１３Ｃ】分化０日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｄ】分化０日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｅ】分化０日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｆ】分化０日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｇ】分化１日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｈ】分化１日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｉ】分化１日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｊ】分化１日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｋ】分化２日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｌ】分化２日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｍ】分化２日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｎ】分化２日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｏ】分化３日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｐ】分化３日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｑ】分化３日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｒ】分化３日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｓ】分化４日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｔ】分化４日目における空ベクター発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｕ】分化４日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中のＤＮＡの免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｖ】分化４日目におけるｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞におけるＬＩＦ除去中の活性カスパーゼ３の免疫蛍光検出結果を示す図である。
【図１３Ｗ】空ベクター発現細胞系の位相差写真である。
【図１３Ｘ】ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞系の位相差写真である。
【図１３Ｙ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＮａｎｏｇのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである（Ｘ軸、日）。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３Ｚ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＫｌｆ４のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３ＡＡ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＯｃｔ４のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３ＡＢ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＲｅｘ１のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３ＡＣ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＳｏｘ７のｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３ＡＤ】ＬＩＦ除去中の複数の参照遺伝子に対して規準化されたＮｏｘａのｑＰＣＲ定量化を示すグラフである。丸印の曲線：空ベクター、四角印の曲線：ＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞。
【図１３ＡＥ】Ｎ２Ｂ２７によって誘導される空ベクター（ｂ）又はｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３（ａ）発現ＥＳ細胞からＮＳＣへの分化過程を通して毎日収集された細胞抽出物のウエスタンブロット解析結果を示す図である。Ｎ２Ｂ２７媒介性分化から４日後に、ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞はすべて、高いカスパーゼ３活性によって示されるようにアポトーシスによって死滅した。ＧＦＰ−Ｄｕｂ３（＃１）、Ｏｃｔ４（＃２）、活性カスパーゼ３（＃３）及びＭＣＭ２（＃４）の発現を示す。
【図１３ＡＦ】空ベクター又はＨＡ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞からＮＳＣへの分化過程を通して毎日収集された細胞抽出物のウエスタンブロット解析結果を示す図である。ＨＡ−Ｄｕｂ３発現細胞の分子及び細胞表現型は、ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞に極めて類似しており、表現型がＮ末端タグと無関係であることを示している。ＨＡ−Ｄｕｂ３（＃１）、Ｏｃｔ４（＃２）、活性カスパーゼ３（＃３）及びＭＣＭ２（＃４）の発現を示す。
【実施例】
【００９３】
実施例１  実験手順
１−  細胞抽出物、ウエスタンブロット法及び抗体
細胞をこすり取る前にＰＢＳで１回リンスし、次いで氷冷溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  β−グリセロ−ホスファート、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤）と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。細胞全体の抽出物を遠心分離によって１２０００ｒｃｆで４℃で１０分間浄化した。浄化溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって推定した。等量のタンパク質をウエスタンブロット解析に使用した。全抗体を１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で４℃で終夜インキュベートした。使用抗体：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製：Ｃｈｋ１Ｓ３４５Ｐ（２３４１）、ｐ５３Ｓ１５Ｐ（９２８４）、γＨ２ＡＸ（２５７７）、ＣＤＫ２Ｙ１５Ｐ（９１１１）、Ｍｙｃ−Ｔａｇ（２２７６）；活性カスパーゼ３（９９６１）。Ａｂｃａｍ製：ＤＮＡ  ｐｏｌα（ａｂ３１７７７）、Ｈ３（ａｂ１７９１）、ＣＤＫ２（ａｂ６５３８）、ＰＳＴＡＩＲ（ａｂ１０３４５）、ＧＦＰ（ａｂ２９０）、ＭＣＭ２（ａｂ４４６１）；Ｓｕｄｓ３（ａｂ３７４０）。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製：Ｃｄｃ４５（ｓｃ−２０６８５）、Ｃｄｃ２５Ａ（ｓｃ−７３８９）、Ｃｈｋ１（ｓｃ−８４０８）、サイクリンＢ１（ｓｃ−２４５）、Ｃｄｃ２５Ｃ（ｓｃ−３２７）、Ｃｄｃ２５Ｂ（ｓｃ−６５５０４）、ｐ２１（ｓｃ−６２４６）、ＲｈｏＡ（ｓｃ−４１８）；抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｓｃ−２０２０）。Ｓｉｇｍａ製：（ＰＣ１０）、β−アクチン（Ａ１９７８）、サイクリンＡ（Ｃ７４１０）、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２（Ｆ１８０４）、Ｏｃｔ４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ３２０９）。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製：ネスチン（Ａｂ３５３）、Ｈ３Ｓ１０Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０９−７９７）。Ｗｅｅ１（Ｔ．ロルカ（Ｌｏｒｃａ）、ＣＲＢＭモンペリエの好意により提供された）。
【００９４】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結されたマウスＤｕｂ３Ｃ末端から設計された合成ペプチド（ＮＨ２−ＭＳＰＧＱＬＣＳＱＧＧＲ−ＣＯＯＨ配列番号３９）でウサギを免疫してマウスＤｕｂ３ポリクローナル抗体を産生した。Ｄｕｂ３ペプチドをＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でカップリングすることによって抗体を精製した。
【００９５】
２−  細胞培養及び導入
ＥＳ細胞（ＣＧＲ８）をゼラチン被覆皿上で支持細胞の非存在下で１．０００Ｕ  ＬＩＦ／ｍｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一緒に培養した。細胞を５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で増殖させた。一過性発現のために、製造者の指示に従って、ＮＩＨ−３ｔ３とＥＳ細胞の両方をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクトし、ＣＶ１にＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を導入した。感染のために、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅエコトロピックパッケージング細胞系にＭｙｃ６−Ｄｕｂ３バリアントをコードするレトロウイルス発現ベクター（ｐＬＰＣ）を自家製ＰＥＩ試薬を用いて導入することによってレトロウイルス粒子を作製した。
【００９６】
手短に述べると、ＥＳ細胞を１０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｈｅｔｈａｎｏｌ）を補充したＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ  ＢＨＫ−２１（ＧＭＥＭ）中に維持した。ＮＩＨ−３ｔ３細胞を１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン及び抗生物質を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中に維持した。ウイルス含有馴化培地を指数増殖ＮＩＨ−３ｔ３細胞上でポリブレン（１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で２４時間インキュベートした。感染から４８時間後、細胞をピューロマイシン（２．５μｇ／ｍＬ）含有培地中で使用前に８〜１０日間選択した。ＥＳ細胞のリバーストランスフェクションをＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いて製造者の指示に従って実施した。分析のために細胞をトランスフェクションから２４、３６又は４８時間後に収集した。Ｃｄｃ２５Ａ  ＲＮＡｉ配列は、
５’−ＧＡＡＡＵＵＵＣＣＣＵＧＡＣＧＡＧＡＡ−３’配列番号４０である。
【００９７】
Ｄｕｂ３  ＲＮＡｉ配列は、
５’−ＧＧＣＵＧＵＡＡＧＡＵＧＵＧＵＧＣＵＡ−３’配列番号４１である。
【００９８】
Ｅｓｒｒｂは、フェン（Ｆｅｎｇ）ら、２００９年、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）１１、１９７〜２０３に記載されている。Ｃｄｈ１及びβ−ＴｒＣＰノックダウンのためのＲＮＡｉをＤａｒｍａｃｏｎ（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ）５７３７１（Ｃｄｈ１）及び１２２３４（β−ＴｒＣＰ）から購入した。
【００９９】
３−  細胞同期
ＥＳ細胞を前中期にノコダゾール（Ｓｉｇｍａ）によって４〜８時間停止させた。有糸分裂シェイクオフ後に細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、全ＥＳ増殖培地に溶解させた。細胞を５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で４５分間インキュベートし、３０℃で１時間置いて、Ｓ期への移行を抑制した。細胞を偽照射又はＵＶ照射し（６Ｊ／ｍ２）、収集前に３７℃でインキュベートした。ＮＩＨ−３ｔ３細胞をＧ０において同期させるために、細胞をコンフルエントまで増殖させ、２〜３日間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、再懸濁させ、３０％コンフルエントで分割した。解放から６時間後、細胞にＵＶ照射した。
【０１００】
４−  ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷及び薬物
２５４ｎｍのＵＶ−Ｃ照射をマイクロプロセッサ制御架橋装置（ＢＩＯ−ＬＩＮＫ（登録商標））又はＵＶ灯（Ｈａｎｏｖｉａ）を用いて実施した。シクロヘキシミド及びＤＹ１３１（ＧＷ４７１６）はＳｉｇｍａ製であり、Ｃｈｋ１阻害剤ＳＢ２１８０７８はＣａｌｂｏｃｈｉｅｍ製であった。
【０１０１】
５−  フローサイトメトリー
単一細胞懸濁液をトリプシン処理によって調製し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を氷冷７０％エタノール（−２０℃）中で固定し、−２０℃で終夜貯蔵した。リボヌクレアーゼＡ処理後、全ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（２５μｇ／ｍｌ）で染色した。ＢｒｄＵ取り込み分析のために、ＥＳ細胞及びＮＩＨ−３ｔ３細胞を１０μＭ  ＢｒｄＵの存在下でそれぞれ１０及び３０分間増殖させた。ＢｒｄＵ含有量をフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）抱合抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との反応によって測定した。細胞をＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターによって分析した。
【０１０２】
６−  ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。逆転写をランダムヘキサヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。定量的ＰＣＲをＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ）上でＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。使用したプライマーはすべてイントロンが介在した（ｉｎｔｒｏｎｓｐａｎｎｉｎｇ）（依頼に応じて入手可能なプライマー配列）。標的ｃＤＮＡの相対量を複数の内部標準遺伝子（ＡＣＴＢ、ＨＰＲＴ、ＨＭＢＳ、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ）の幾何平均を用いた規準化によって得た。
【０１０３】
７−  クロマチン免疫沈降
ＥＳ細胞をホルムアルデヒドで架橋し、Ｍｉｓｏｎｉｘ超音波処理器Ｓ−４０００を用いて超音波処理した。細胞を氷冷溶解緩衝剤に溶解させた（補足情報）。Ｄｕｂ３ネズミプロモーターのプロモータースキャニングのためのプライマー対（転写開始点（ＴＳＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）の６ｋｂ上流）を約１ｋｂごとに設計した。
【０１０４】
細胞を氷冷溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭβ−グリセロ−ホスファート、１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤）に氷上で３０分間溶解した。５μｇのＥｓｒｒｂ（Ｓｉｇｍａ  ＳＡＢ２１００７１５）、Ｓｏｘ２（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３０１−７３９）又は対照抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ５００−Ｐ００）を溶解物に添加し、回転させながら４℃で終夜インキュベートして、免疫沈降を実施した。ＢＳＡ及びサケ精子でブロックされたプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ビーズを溶解物に添加した。
【０１０５】
８−  ＥＳ細胞から神経外胚葉（ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）前駆体への単層分化
ＥＳ細胞を解離させ、０．１％ゼラチン被覆皿上のＮ２Ｂ２７培地に密度１．１０４細胞／ｃｍ２で蒔いた。Ｎ２Ｂ２７培地は、改変Ｎ２（２５μｇ／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌアポトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、１６μｇ／ｍｌプトレシン（Ｓｉｇｍａ）、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ））を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）の１：１混合物である。Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）及びグルタマート（０．２ｍＭ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地も添加した。培地を７日目まで２日ごとに交換した。
【０１０６】
９−  ＣＧＲ８  ＥＳ細胞からのＮＳＣ細胞の単離及び増幅
上記手順に従って、ＥＳ細胞からＮＳＣへの分化を誘導した。６日目に、細胞を０．０１％トリプシン−ＥＤＴＡ中で解離させ、ポリＬ−オルニチン／ラミニン被覆皿上の１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦとｂＦＧＦの両方を含むＤＭＥＭ／Ｎ２培地（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に蒔いた。ポリＬ−オルニチン／ラミニンプレートを調製するために、ポリＬ−オルニチンの０．０１％溶液（Ｓｉｇｍａ）を皿に少なくとも２０分間添加した。溶液を除去し、皿をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中のラミニンの１μｇ／ｍｌ溶液（Ｓｉｇｍａ）を塗布し、３７℃で少なくとも３時間インキュベートした。次いで、細胞をこれらの条件下で培養し、幾つかの継代培養（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）のために神経幹細胞の性質を失わずに増幅することができる。
【０１０７】
１０−  モノクローナルｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の樹立
野生型ＥＳ細胞にｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰＤｕｂ３を導入し、クローン形成密度で平板培養し、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）を用いて選択した。ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３陽性クローンをＧ４１８の連続存在下で拡大させ、免疫蛍光及びウエスタンブロット法によって検証した。
【０１０８】
１１−  プラスミド
ネズミＤｕｂ３遺伝子（遺伝子ＩＤ：６２５５３０）をＰＣＲ増幅し、ｐＬＰＣ−Ｍｙｃ６、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ及びｐｃＤＮＡ３−ＨＡ中にクローン化した。全構築物をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。マウスＥｓｒｒｂ（ｐＳＧ５ＦＩ−ｍＥｓｒｒｂ）及びＣ末端切断型ｐＳＧ５ＦＩ−ｍＥｓｒｒｂ−ΔＣｔｅｒは既述されている。Ｄｕｂ３プロモーターのゲノム配列をＰＣＲ増幅し、ルシフェラーゼ活性のためにｐＧＬ４．１０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。ｐＣＥＰ４−Ｓｏｘ２は、Ｆ．ポウラト（Ｐｏｕｌａｔ）（ＩＧＨ−ＣＮＲＳ）の好意により提供された。
【０１０９】
１２−  ルシフェラーゼアッセイ
ＥＳ細胞に以下のレポーター構築物、すなわちｐＧ１３−ルシフェラーゼ、ｐ２１−ルシフェラーゼ及びｐ２１−ΔＲＥｐ５３−ｌｕｃ（Ｊ．バスボウス（Ｂａｓｂｏｕｓ）、ＩＧＨ、モンペリエの好意により提供された）を導入した。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを内部標準として同時導入した。細胞を導入から２４時間後に収集し、偽照射又はＵＶ照射した。ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷から６時間後、細胞を収集し、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＡＴＧ開始コドンの１ｋｂ上流の近位プロモーターをｐＧＬ４．１０プラスミドに挿入した。Ｅｓｒｒｂコンセンサス結合部位（ＴＣＡＡＧＧＴＣＡ）の３つの変異をＰＣＲによって導入して、変異結合部位（ＴＣＡＴＴＴＴＣＡ）を作製した。全構築物の配列を確認した。
【０１１０】
１３−  免疫蛍光顕微鏡検査
ネスチン、Ｏｃｔ４及び活性カスパーゼ３染色のために、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。固定後、細胞を３％ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中でブロックし、抗体と一緒に終夜インキュベートした。Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドを封止した。Ｄｕｂ３の細胞局在を測定するために、マウスＥＳ細胞をｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ−Ｄｕｂ３に導入し、直接固定した。全スライドをＬｅｉｃａ  ＤＭ６０００落射蛍光顕微鏡を用いて分析した。Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＨＱ  ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）及びＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて画像を得た。
【０１１１】
１４−  細胞成分分画実験
クロマチン濃縮可溶性画分をＣＳＫ抽出手順を用いて調製した。手短に述べると、ペレット化細胞をＣＳＫ緩衝剤（１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤）に氷上で１０分間溶解した。３０００ｒｐｍで４℃で３分間遠心分離後、上清（Ｔｒｉｔｏｎ可溶性画分）を回収し、ペレット（Ｔｒｉｔｏｎ不溶性画分）をＣＳＫ緩衝剤に再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレット（クロマチン濃縮画分）をＬａｅｍｍｌｉ緩衝剤に再懸濁させた。等量の可溶性画分とクロマチン画分を免疫ブロットによって分析した。
【０１１２】
１５−  統計解析
二元配置ＡＮＯＶＡ又はスチューデントｔ検定によりＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してグループ間の差を評価した。Ｐ＜０．０５を有意とみなし、＊で示した。Ｐ＜０．００１を＊＊で示した。
【０１１３】
実施例２  実験結果
Ｇ１におけるＤＮＡ損傷の誘発によってＥＳ細胞は早期Ｓ期に停止する。
【０１１４】
詳細なデータは、ＥＳ細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイントの障害を示唆している。本発明者らは、ＥＳ細胞を照射するＵＶ線量が増加するとＧ１細胞数が減少することを認めた（図１Ａ）。単一のＵＶ線量（６Ｊ／ｍ２）を用いた経時的解析は、Ｇ１／Ｓ境界における細胞周期の遅延をもたらした（図１Ｂ、ｔ＝２）。本発明者らは、後期Ｇ１（ＢｒｄＵ陰性）と早期Ｓ期（ＢｒｄＵ陽性）を正確に識別することができるようにノコダゾール同期細胞をＢｒｄＵ（ヌクレオチド類似体）で瞬間標識した（図２Ａ）。総ＤＮＡ含有量の分析はＧ１停止を示唆しているが（図２Ｂ）、ＢｒｄＵ取り込みの分析によれば、未処理細胞（偽）とＵＶ照射細胞（＋ＵＶ）のどちらも極めて類似した動力学でＳ期に入った（図２Ｃ〜Ｄ）。それに対して、Ｏｃｔ４陰性分化細胞（図１Ｃ〜Ｆ）である同期マウス胎仔線維芽細胞（ＮＩＨ−３ｔ３）は、厳密なＧ１／Ｓチェックポイントの存在と一致して、Ｇ１におけるＵＶ照射後にＳ期に進まなかった（図２Ｅ）。
【０１１５】
本発明者らは、ＵＶ照射によってＢｒｄＵ取り込みが偽照射細胞よりもわずかに減少したことに気づいた。これは、ＢｒｄＵ陽性細胞の平均蛍光シグナルを計算することによって確認され（図１Ｅ、緑の枠）、極早期のＳ期にＤＮＡ合成が減速することを示唆している。クロマチン結合タンパク質の分析によれば、２種の複製フォーク関連因子であるＣｄｃ４５とＤＮＡポリメラーゼ−αの両方の動員は、ＵＶ照射によってかなり減少したが、消滅せず（図１Ｇ、レーン２〜４と５〜７を比較されたい）、後期複製起点発火を防止するＳ期チェックポイントの活性化を示唆している。この可能性と一致して、リン酸化Ｈ２ＡＸヒストン変異体（γＨ２ＡＸ）、ＡＴＲ基質が、クロマチン上に蓄積した。さらに、ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷は、サイクリンＡ２及びＥ１産生によってモニターされるように（図１Ｈ〜Ｉ）、Ｓ期開始に必要なＥ２Ｆ転写因子によって駆動される転写プログラムをさほど変化させなかった。本発明者らは、クロマチン上のＵＶ損傷依存性ｐ５３リン酸化（図３Ａ）、及びｐ２１遺伝子発現の（とりわけ）トランス活性化（図３Ｂ〜Ｄ）も認めた。これは、機能的ｐ５３転写反応を示している。
【０１１６】
ＥＳ細胞中の持続的な高レベルのＣｄｃ２５Ａは、Ｓ期進行を調節するチロシン１５（ＣＤＫ２Ｙ１５Ｐ）上の抑制的リン酸化を除くことによって、重要なＣＤＫ２制御因子としてＧ１／ＳチェックポイントバイパスＣｄｃ２５Ａ機能を維持する。本発明者らは、ＥＳ細胞とＮＩＨ−３ｔ３細胞のＣｄｃ２５Ａ及びＣＤＫ２タンパク質存在量を比較した（図４Ａ）。際立つことには、ＣＤＫ２存在量は、ＥＳ細胞がわずかに高いが、非同期的に成長したＥＳ細胞のＣｄｃ２５Ａレベルは、ＮＩＨ−３ｔ３細胞よりも極めて高い。予想どおり、ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷によって、Ｃｄｃ２５Ａは、両方の細胞系で分解した（図４Ａ）。しかし、照射から１時間後、Ｃｄｃ２５Ａレベルは、撹乱されていないＮＩＨ−３ｔ３細胞に比べてＥＳ細胞の方が約４倍高いままであり（レーン１及び７並びに図５Ａ）、ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷によっても高レベルのＣｄｃ２５Ａが持続することを示している。非同期的に成長したＥＳ細胞とＮＩＨ−３ｔ３細胞の細胞周期分布は異なるので、本発明者らは、同期細胞のＣｄｃ２５Ａ存在量を分析した（図４Ｂ）。本発明者らは、Ｇ１において、ＥＳ細胞がＮＩＨ−３ｔ３細胞よりも約７倍多いＣｄｃ２５Ａタンパク質を含むことを認めた（レーン３及び１１並びに図５Ｂ）。Ｅ３ユビキチンリガーゼＡＰＣＣｄｈ１によって媒介されるＣｄｃ２５Ａのタンパク質分解は、有糸分裂停止時に起こる。ポリユビキチン化された形態は、非修飾タンパク質よりも高分子量のポリペプチドラダーとして出現する。Ｇ１及びＳ期において同期されたＮＩＨ−３ｔ３細胞において、本発明者らは、特異的Ｃｄｃ２５Ａ抗体を用いたウエスタンブロットによってかかるラダーを観察することができた（図４Ｂ、暗部）。際立つことには、同期ＥＳ細胞においては、これらのアイソフォームがはるかに少ない一方で、非修飾Ｃｄｃ２５ＡレベルはＮＩＨ−３ｔ３細胞よりも７倍高い（図５Ｂ）。ＧＦＰ−Ｃｄｃ２５ＡとＨＡタグ付きユビキチンを同時導入したＥＳ又はＮＩＨ−３ｔ３細胞からのＣｄｃ２５Ａ免疫沈降では、Ｃｄｃ２５Ａポリユビキチン化形態の存在がＥＳ細胞よりもＮＩＨ−３ｔ３細胞においてはるかに多いことを確認した（図４Ｃ）。
【０１１７】
次に、本発明者らは、不完全なＣｄｃ２５Ａ分解がＡＴＲ−Ｃｈｋ１経路の機能障害に起因し得るかどうか試験した。このために、本発明者らは、細胞をＣｈｋ１阻害剤で処理し、ＵＶ照射後のＣｄｃ２５Ａタンパク質レベルを分析した。Ｃｄｃ２５Ａの分解が、Ｃｈｋ１阻害剤とＣｈｋ２阻害剤の両方によって影響されなかった以前の報告とは対照的に、本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａ分解がＣｈｋ１活性に全面的に依存することを認めた（図４Ｄ）。
【０１１８】
非同期的に成長したＥＳ細胞をロスコビチン（選択的ＣＤＫ阻害剤）で処理すると、Ｇ１細胞の線量依存的な増加が誘発され、Ｓ期細胞画分が減少した（図５Ｃ）。これは、体細胞と同様に、ＥＳ細胞においては、ＣＤＫ活性がＧ１／Ｓ移行に必要であることを示している。抑制的ＣＤＫ２Ｙ１５リン酸化は、Ｗｅｅ１キナーゼによって媒介され、Ｃｄｃ２５Ａによる脱リン酸化によって軽減される。したがって、本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＧ１／Ｓ移行中のＷｅｅ１、Ｃｄｃ２５Ａ及びＣＤＫ２Ｙ１５Ｐのタンパク質レベルの変化を分析した。ＢｒｄＵ取り込み実験によれば、Ｇ１／Ｓ移行は、ノコダゾール開放から２〜３時間後に起こる（図２Ｃ）。有糸分裂停止を、セリン１０（Ｈ３Ｓ１０Ｐ）におけるヒストンＨ３リン酸化、並びにＨ３及びサイクリンＡ産生によるＳ期開始によってモニターした。興味深いことに、Ｗｅｅ１レベルは、細胞周期に依存して大きく変化することはなかったが、Ｃｄｃ２５Ａレベルは減少し、ＣＤＫ２Ｙ１５Ｐ存在量と逆相関した（図５Ｄ〜Ｅ）。これは、ＥＳ細胞においては、Ｃｄｃ２５Ａレベルの細胞周期依存的変動がＣＤＫ２Ｙ１５Ｐを特異的に調節し得ることを示唆している。
【０１１９】
Ｇ１／ＳチェックポイントにおけるＣｄｃ２５Ａの特異的役割を更に正確に示すために、本発明者らは、ＲＮＡｉによるＣｄｃ２５Ａレベルの干渉が、ＤＮＡ損傷後のＳ期開始に影響を及ぼすかどうか調べた（図５Ｆ〜Ｇ）。この実験の解釈を妨げ得るＣｄｃ２５Ａの減少によるＧ１期の延長に起因するＥＳ細胞の望ましくない分化を回避するために（下記参照及び図１２Ｅ〜Ｆ）、ノックダウンを短期間（２４時間）実施した。興味深いことに、Ｃｄｃ２５Ａノックダウン（図４Ｅ）は、ＢｒｄＵ陰性細胞のかなりのＵＶ依存的増加をもたらし、２Ｎ  ＤＮＡ含有量（図４Ｆ）はＣＤＫ２Ｙ１５Ｐレベルの増加に反映された（図４Ｅ、レーン３とレーン６の比較、及び図５Ｈ）。重要なことには、開放から２から４時間後のＣＤＫ２Ｙ１５Ｐレベルのわずかな増加は（図４Ｅ、レーン３）、Ｓ期に入った同期非損傷細胞でも認められ（図５Ｄ）、対照ＲＮＡｉを導入した偽処理細胞とＵＶ処理細胞におけるＳ期開始に明白な差はなかった（図４Ｆ）。要するに、これらのデータは、ＥＳ細胞が高レベルのＣｄｃ２５Ａを含み、そのノックダウンによってＵＶ依存的なＧ１遅延が生じることを示している。
【０１２０】
ＥＳ細胞は、高いＤｕｂ３脱ユビキチン化酵素を発現する。
【０１２１】
Ｃｄｃ２５Ａタンパク質レベルの増加は、遺伝子発現の増加、翻訳の増加、又はタンパク質分解の減少によって説明することができる。本発明者らは、新規タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミドの存在下でタンパク質代謝回転を分析した（図６Ａ〜Ｃ）。この手法を用いて、本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａの半減期（ｔ１／２＝２４分）がＮＩＨ−３ｔ３細胞（ｔ１／２＝８分）よりも３倍長いことを見いだした。なお、非同期細胞を使用したので、認められた差が、両方の細胞型の異なる細胞周期分布にある程度起因することを本発明者らは排除し得ない。しかし、このデータは、図４Ｂ〜Ｃに示したデータによれば、ポリユビキチン化と加水分解によるユビキチン除去（脱ユビキチン化）の差を反映し得る、タンパク質安定性の変化を強く示唆している。このポイントに取り組むために、本発明者らは、ＥＳ細胞とＮＩＨ−３ｔ３細胞の間のＣｄｃ２５Ａ、Ｃｄｈ１、β−ＴｒＣＰの遺伝子発現及び最近記述されたＤｕｂ３脱ユビキチン化酵素の遺伝子発現を比較した。ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａ、Ｃｄｈ１及びβ−ＴｒＣＰのｍＲＮＡレベルはＮＩＨ−３ｔ３細胞とほとんど異ならないが、Ｄｕｂ３  ｍＲＮＡレベルは、ＥＳ細胞の方が４倍高かった（図７Ａ）。さらに、ＥＳ細胞においてＲＮＡｉによって媒介されるＤｕｂ３のノックダウン（図７Ｂ）は、Ｃｄｃ２５Ａ  ｍＲＮＡレベルに影響しなかったが（図７Ｃ）、Ｃｄｃ２５Ａタンパク質存在量が１／３になった（図７Ｄ）。これらのデータは、ヒト細胞における以前の研究と一致しており、Ｃｄｃ２５Ａタンパク質安定性を調節するＤｕｂ３機能がマウスＥＳ細胞において類似していることを示している。さらに、本発明者らは、撹乱されていない損傷を受けたＮＩＨ−３ｔ３細胞のＣｄｃ２５Ａ安定性におけるＤｕｂ３の役割も観察した（図６Ｄ〜Ｅ）。注目すべきことに、ＧＦＰタグ付きＤｕｂ３は、ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａで以前に認められた全面的な核移行を示す（図７Ｅ〜Ｆ）。最後に、ＥＳ細胞においてＣｄｃ２５Ａレベルの調節におけるＣｄｈ１及びβ−ＴｒＣＰの役割を検討するために、本発明者らは、ＲＮＡｉによって媒介されるノックダウン実験を実施した。Ｄｕｂ３ノックダウンとは対照的に、Ｃｄｈ１の減少もβ−ＴｒＣＰの減少も、Ｃｄｃ２５Ａ  ｍＲＮＡ発現に影響せず、Ｃｄｃ２５Ａ安定性も大きく変えなかった（図６Ｆ〜Ｊ）。これらの観察は、ＡＰＣ／Ｃｄｈ１活性がＥＳ細胞において高レベルのＥｍｉ１阻害剤によって低下することを示した以前の研究と一致する。
【０１２２】
オーファン受容体Ｅｓｒｒｂは、Ｄｕｂ３遺伝子発現を調節する。
【０１２３】
初期化に関与する重要な転写因子の結合モチーフの既報のコンセンサス配列に基づいて、本発明者らは、Ｄｕｂ３遺伝子の近位プロモーター（６ｋｂ）を分析した。際立つことには、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｓｍａｄ１、Ｓｔａｔ３、ｃ−Ｍｙｃコンセンサス部位もｎ−Ｍｙｃコンセンサス部位も検出できなかったが、本発明者らは、最初に（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）最高７つのエストロゲン関連受容体ｂ（Ｅｓｒｒｂ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂ）推定結合モチーフ（コンセンサス：５’−ＴＮＡＡＧＧＴＣＡ−３’）及び２つのＳｏｘ２推定応答配列（コンセンサス：５’−ＣＡＴＴＧＴＴ−３’）を見いだした。しかし、このゲノム配列の最新のもの（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）は、３つのＥｓｒｒｂ部位しか示さない（図８Ａ、Ｅｓｒｒｂ−ＲＥ）。Ｅｓｒｒｂは、核ホルモン受容体のスーパーファミリーに属する核内受容体である。Ｓｏｘ２と一緒に、Ｅｓｒｒｂは、核の自己複製機構の一部である。以前に検証されたＲＮＡｉ配列を用いたＥｓｒｒｂノックダウンによって、既述のＥｓｒｒｂ標的遺伝子Ｎａｎｏｇと同程度に内在性Ｄｕｂ３転写レベルが大きく低下した（図８Ｂ）。逆に、ＥＳ細胞においては、活性化機能２（ＡＦ２：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ２）領域のないＣ末端切断型（Δ−Ｃｔｅｒ）ではないＥｓｒｒｂの異所性発現は、内在性Ｄｕｂ３  ｍＲＮＡレベルをかなり増加させる（図８Ｃ）。さらに、既述の選択的Ｅｓｒｒｂ及びＥｓｒｒｇ作動物質であるＤＹ１３１の用量を増しながらＥＳ細胞を処理すると、Ｄｕｂ３遺伝子発現が増加し、Ｃｄｃ２５Ａ転写レベルに影響を及ぼさずにＣｄｃ２５Ａタンパク質存在量が増加した（図９Ａ〜Ｂ）。逆に、Ｅｓｒｒｂノックダウンは、ＤＹ１３１によって媒介されるＤｕｂ３転写を４０％減少させ（図９Ｃ）、以前に発表されたＲＮＡｉ配列を用いたＳｏｘ２ノックダウンは、Ｄｕｂ３発現に大きく影響せず、わずかに増加させただけであった（発明者らの未発表の知見）。
【０１２４】
次に、本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）実験を行って、ＥＳ細胞においてＤｕｂ３プロモーターに結合したＥｓｒｒｂ及びＳｏｘ２を位置づけた。このために、本発明者らは、開始コドン（ＡＴＧ＋１）の６ｋｂ上流内のＥｓｒｒｂ及びＳｏｘ２によるプロモーター占有率を走査するための約１ｋｂ分離された５つのプライマー対（図８Ａ、ｐｐ：ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ）を設計した。クロマチンの超音波処理によって５００ｂｐ未満の断片が生成し、プライマー間のシグナル重複を制限した（図９Ｄ）。抗Ｅｓｒｒｂ抗体を用いたＣｈＩＰ分析（図９Ｅ）によれば、Ｅｓｒｒｂは、３個のＥｓｒｒｂコンセンサス結合モチーフを含む領域における近位Ｄｕｂ３プロモーターと結合し（図８Ｄ、ｐｐ３〜５）、Ｅｓｒｒｂ結合部位を含まない上流領域にはＥｓｒｒｂ結合は認められなかった（ｐｐ１〜２）。それと反対に、抗Ｓｏｘ２抗体を用いたＣｈＩＰ分析は、プライマー対３の周囲のＤｕｂ３プロモーターにおける２個のコンセンサス部位の１個においてしか高濃縮を示さず（Ｓｏｘ２−ＲＥ２）、第２の部位を含む領域においては（Ｓｏｘ２−ＲＥ１、ｐｐ４〜５）、Ｓｏｘ２ははるかに低いレベルで結合した。
【０１２５】
上記ＣｈＩＰデータを実証するために、本発明者らは、Ｄｕｂ３近位プロモーター（３．２ｋｂ）をクローン化し、レポーターアッセイにおいてルシフェラーゼ活性を読み取りに用いてその転写活性を分析した。この目的のために、本発明者らは、内在性ステロイド受容体の発現が極めて少ない細胞を用いた（ＣＶ１細胞）。予測したとおり、本発明者らは、全３個のＥｓｒｒｂ結合部位を含む３．２ｋｂ  Ｄｕｂ３プロモーターを同時導入した細胞においてＥｓｒｒｂ発現によるルシフェラーゼ活性の強力な誘導を認め（図８Ｅ、Ｅｓｒｒｂ、白色バー）、Ｅｓｒｒｂコンセンサス結合部位のないＤｕｂ３プロモーター領域（５’ｆａｒ）上ではバックグラウンド活性しか観測しなかった（Ｅｓｒｒｂ、黒色バー）。同様に、Ｅｓｒｒｂ  Δ−Ｃｔｅｒの発現は、空ベクター（ＥＶ、図８Ｅ及び図９Ｆ）の発現によって認められたものと類似した基本プロモーター活性をもたらした。興味深いことに、本発明者らは、Ｓｏｘ２の発現によるルシフェラーゼ活性の刺激を認めなかったが、基本プロモーター活性の小さい有意な抑制を認めた（図８Ｅ）。重要なことには、１ｋｂ  Ｄｕｂ３ゲノム断片における独特なＥｓｒｒｂ結合部位の変異によって転写活性が低下した（図８Ｆ）。要するに、これらの観察は、Ｄｕｂ３がＤｕｂ３遺伝子の転写の調節に積極的な役割を有する直接Ｅｓｒｒｂ標的遺伝子であり、Ｓｏｘ２が、そのままでは、Ｄｕｂ３転写を刺激するのに不十分であることを示唆している。
【０１２６】
Ｄｕｂ３発現の発生調節及びＣｄｃ２５Ａ安定性
Ｅｓｒｒｂは、ＥＳ細胞において高度に発現される多能性因子であり、Ｓｏｘ２とは異なり、ＥＳ分化によって大きく減少する。Ｄｕｂ３は、Ｅｓｒｒｂ標的であるので、本発明者らは、ＥＳ細胞から神経への変化中のＤｕｂ３の発現をインビトロで分析した。Ｎ２Ｂ２７培地におけるＥＳ細胞の平板培養は、ロゼット構造として顕微鏡的に見ることができる神経上皮前駆体への変化を誘導する（図１０Ａ〜Ｅ、７日目、特に図１０Ｅ）。多能性の喪失をＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４などの特異的マーカーの発現分析によってモニターし、神経系の独自性の取得をネスチン及びＳｏｘ１の発現によってモニターした。確立された内胚葉マーカーであるＳｏｘ７発現の分析によって特異性を制御した（図１１Ａ〜Ｄ）。重要なことには、ネスチンは、６日目に分化性集団のほぼ個々の細胞において検出可能であり、同種神経への変化を示した。Ｅｓｒｒｂ  ｍＲＮＡ発現の短時間（２４時間以内）の減少は、Ｄｕｂ３発現の著しい劇的な減少に時間的に先行した（図１０Ｆ〜Ｈ）。Ｓｏｘ２の発現も２４時間後に減少したが、わずか５０％であり、その後に増加した。対照的に、Ｃｄｃ２５Ａ転写レベルもＣｄｈ１及びβ−ＴｒＣＰ転写レベルも、分化中にかなり変化した（図１０Ｇ）。Ｃｄｃ２５Ａの安定性に関係した３種の別の脱ユビキチン化酵素、すなわちＵＳＰ１３、２９及び４８の発現分析によれば、ＵＳＰ４８のみが分化後２４時間以内に減少し（図１０Ｈ）、Ｓｏｘ２の発現を反映した。重要なことには、本発明者らは、コンセンサスＥｓｒｒｂ結合部位をＵＳＰ４８近位プロモーター内に見つけることができなかった。それに対して、ＵＳＰ１３遺伝子の発現は、分化中にさほど変化せず、ＵＳＰ２９の発現は、神経への変化中に大きく増加した。
【０１２７】
Ｄｕｂ３タンパク質レベルを分析するために、本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて６０ｋＤａポリペプチドを予想どおりに認識する特異抗体を産生させた（図１１Ｅ〜Ｆ）。Ｄｕｂ３タンパク質レベルは、分化中に極めて早く、Ｏｃｔ４よりもはるかに早く、Ｄｕｂ３  ｍＲＮＡレベルと高度に相関して大きく低下した（図１０Ｉ）。際立つことには、２日目と３日目の間の分化系列決定によって、Ｓｏｘ１の発現によってモニターされるように、Ｃｄｃ２５Ａタンパク質レベルが著しく連続的に減少し、一方、２つの別のＣｄｃ２５ファミリーメンバーＣｄｃ２５Ｂ及びＣｄｃ２５Ｃのタンパク質レベルは、分化中に一定であった（図１１Ｇ）。本発明者らは、分化中の２つの別のＤｕｂ３基質ＲｈｏＡ及びＳｕｄｓ３の発現を更に分析した。遺伝子発現（図１１Ｈ）にもタンパク質安定性（図１０Ｉ）にも大きな変化が認められないが、Ｓｕｄｓ３レベルの小幅な減少が分化後７日目に見られた。最後に、本発明者らは、ＥＳ細胞において分化中に更に増加したＥｓｒｒｇ（サブファミリーの別のメンバー）の極めて低い発現を見いだした（図１１Ｈ）。これは、ＥｓｒｒｂによるＤｕｂ３遺伝子調節の特異性を裏付けるものである。要するに、これらの知見は、神経分化中のＣｄｃ２５Ａタンパク質存在量の減少が翻訳後レベルで支配される可能性があることを示唆している。
【０１２８】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、自己複製特性を維持しながら、ＥＳ細胞から誘導される多能性幹細胞であり、分化後７日目に単離され、増幅される。Ｃｄｃ２５Ａ存在量の定量化によれば、非同期的に成長したＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５ＡはＮＳＣよりも８倍多かった（図１０Ｊ）。ＮＩＨ−３ｔ３細胞と同様に、本発明者らは、ＮＳＣにおける極めて低いＤｕｂ３転写レベルを検出した（図１１Ｉ）。最後に、本発明者らは、Ｄｕｂ３プロモーターの３つの異なるゲノム断片を単離し、分析し、ＮＩＨ−３ｔ３とＥＳ細胞における基本的な転写活性を比較した。本発明者らは、ＥＳ細胞における全３個のプロモーター配列の高い転写活性、すなわちＮＩＨ−３ｔ３細胞よりも約１０倍高い転写活性を認めた（図１０Ｋ）。これは、分化中のｍＲＮＡ発現を更に裏付けるものである（図１０Ｆ−Ｈ）。
【０１２９】
Ｄｕｂ３発現は、分化中の多能性の維持及び細胞周期再構築に重要である。
【０１３０】
ＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂの安定な導入は、ＬＩＦの非存在下で多能性を維持するのに十分であることが示された。したがって、本発明者らは、ＥＳ細胞における強制的なＤｕｂ３発現が、ＬＩＦの非存在下で多能性を維持するＥｓｓｒｂの機能の代わりをすることができるかどうか検討した。このために、本発明者らは、構成的な強いプロモーターの制御下でｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３を発現する、単一のＥＳコロニーから拡大された安定なＥＳ細胞系を作製した（図１２Ａ〜Ｄ）。意外なことに、著者らは、高いＤｕｂ３発現がヒト体細胞性Ｕ２ＯＳ細胞におけるＳ−Ｇ２／Ｍの停止を誘導するが、Ｄｕｂ３を過剰発現するＥＳ細胞は、対照細胞系に比べて細胞周期分布の有意差なしに増殖できることを報告したが、これは、ＥＳ細胞においては、構成的Ｄｕｂ３発現が有毒ではないことを示している（図１３Ａ〜Ｂ及びＷ〜Ｘ）。ＬＩＦの除去は、両方の細胞系において明白な極めて類似した形態学的分化プログラムをもたらすが、意外にも、２日後にｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現ＥＳ細胞の大量死をもたらし、核が収縮した分離細胞として顕微鏡的に見ることができた（図１２Ｅ〜Ｊ、矢印）。注目すべきことには、ＬＩＦ除去から５日後には、ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞系において生存する細胞はほとんどなかった。適切な分化に不可欠であるカスパーゼ３活性は、３〜４日目においてｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞が空ベクターより高く、アポトーシスを強く示している（図１２Ｋ及び図１３Ｃ〜Ｖ）。最後に、多能性分化マーカーのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは、両方の細胞系で極めて類似しているが、本発明者らは、２日目以降にｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３発現細胞においてアポトーシスマーカーＮｏｘａの発現増加を認めた（図１３Ｙ〜ＡＤ）。
【０１３１】
意外なことに、ＬＩＦ除去から２〜３日後、ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３タンパク質レベルの大きな低下が明白であり（図１２Ｋ）、転写後レベルにおける追加の制御、恐らくはタンパク質分解が分化中に生じていることを示唆している。同様の表現型は、Ｎ２Ｂ２７によって媒介される神経への変化後にも認められ、同様の結果は、ＨＡ  Ｎ末端タグ付きＤｕｂ３を発現するＥＳ細胞系でも認められ（図１３ＡＥ〜ＡＦ）、ＧＦＰタグ及び用いた分化手順の非特異的効果を除外するものである。分化中の３日目に始まる低二倍体（２Ｎ未満）細胞片の存在を示し、４日目に優勢になるアポトーシスの発生は、ＦＡＣＳ分析によっても同様に認められた（図１２Ｌ）。興味深いことに、ｅＧＦＰ−Ｄｕｂ３を発現するＥＳ細胞におけるｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の出現は、Ｓｏｘ１及びネスチン発現（図１１Ａ〜Ｂ）並びに対照細胞系（空ベクター）において３日目に始まる細胞周期再構築によってモニターされるように、細胞分化系列決定と同時であり、Ｇ１期の延長をもたらす（図１２Ｌ）。要するに、これらの結果は、高いＤｕｂ３発現が、分化中の細胞周期再構築が生じる時間において致死的であることを強く示唆している。
【０１３２】
最後に、本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＤｕｂ３又はＣｄｃ２５Ａノックダウンの効果を分析した。興味深いことに、ＲＮＡｉによって媒介されるＤｕｂ３のノックダウンが長引くと（７日間）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陰性コロニーが増加し、ＬＩＦの存在下でもＥＳ細胞の異質な形態学的な分化が増加し、Ｄｕｂ３発現が多能性の維持に重要であることを示唆した（図１２Ｍ〜Ｏ）。極めて類似した結果が、Ｃｄｃ２５Ａノックダウンの延長によっても認められた。つまり、これらのデータは、Ｅｓｓｒｂを介したＥＳ細胞の自己複製機構を、マスター細胞周期制御因子Ｃｄｃ２５Ａ、及びＤｕｂ３発現の調節による分化中の細胞周期の再構築と結びつけるものである。
【０１３３】
考察
この試験においては、本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイントシグナル伝達経路を精査した。本発明者らは、ＥＳ細胞が、Ｇ１において高レベルのＣｄｃ２５Ａホスファターゼを維持し、それがＤＮＡ損傷後でも持続することを見いだした。Ｃｄｃ２５Ａ発現のノックダウンは、Ｇ１の遅延、及びＲＮＡｉ処理から２４時間以内に、ＵＶ損傷後のＣＤＫ２Ｙ１５Ｐの増加をもたらした（ＥＳ細胞の分化に起因する自然なＧ１期の拡大を回避するのに必要な条件）。実際、長期のＣｄｃ２５Ａ減少（又はＤｕｂ３）は、ＬＩＦの存在下での細胞分化をもたらし、Ｇ１期の延長、及びＣＤＫ２活性の調節解除が分化と関連するという考えと一致する。これらの知見は、ＥＳ細胞においてＤＮＡ損傷によるＣＤＫ２活性の調節が欠けていることを説明するものである。このモデルは、癌細胞においてＣｄｃ２５Ａ発現の増加をＧ１／Ｓ停止の障害とそれに続く放射線抵抗性ＤＮＡの合成と関連づける既存の証拠とも一致する。
【０１３４】
興味深いことに、Ｃｄｃ２５Ａに加えて、本発明者らは、サイクリンＥの減少も認めた（図１１Ｊ）。サイクリンＥは、Ｇ１／Ｓ移行中の律速であり、未処理ＥＳ細胞の自然分化に対抗する、別のＣＤＫ２制御因子である。さらに、サイクリンＥ存在量をインビボで制御するＳＣＦＦｂｗ７媒介性分解経路の消失は、分化障害、ゲノム不安定性及び過剰増殖を招き、マウスの発育におけるサイクリンＥ調節の重要性を示している。総合すると、ＥＳ細胞の分化中のＣｄｃ２５ＡとサイクリンＥの両方の存在量の減少は、ＣＤＫ活性及び結果的にＧ１の延長を制御する重要な分子的適応を具現する可能性がある。重要なことには、Ｇ１が拡大した結果として、ｐ５３に依存した反応がＣＤＫ２阻害においてより有効になる可能性がある。というのは、これには、ＣＤＫ阻害剤ｐ２１タンパク質レベルの転写依存的誘導を遅くする必要があるからである。ｐ２１は、ＥＳ細胞においてＣＤＫ２調節における役割が実質的にないと予測される。というのは、これらの細胞は、その時間の大部分をＳ期で過ごし、ｐ２１は、Ｓ期を通して、また、ＤＮＡ損傷後も、ＰＣＮＡ依存的ＣＲＬ４Ｃｄｔ２ユビキチンリガーゼによって効率的に分解されるからである。
【０１３５】
本発明者らは、ＥＳ細胞におけるＣｄｃ２５Ａ存在量の転写後調節がＤｕｂ３脱ユビキチン化酵素に依存する証拠を示した。Ｃｄｈ１でもβ−ＴｒＣＰでもなく、Ｄｕｂ３の発現は、ＥＳ細胞が分化細胞よりも高く、Ｃｄｈ１又はβ−ＴｒＣＰのノックダウンは、Ｃｄｃ２５ＡがＥＳ細胞において既に高度に安定化されているので、その安定性をさほど変化させなかった。これらの観察は、ＥＳ細胞のＡＰＣ活性が低く、分化中に増加するという知見と一致する。ヒト細胞におけるＣｄｃ２５Ａ安定性に関係する４種の別の脱ユビキチン化酵素（ＵＳＰ１３、２９、４８及びＤｕｂ２Ａ）のうち、本発明者らは、ＵＳＰ４８  ｍＲＮＡレベルのみが分化中にかなり減少するが、その発現が、高いままであり、Ｓｏｘ２の発現を反映して、分化の終わりに向かって増加することを見いだした。したがって、本発明者らは、分化中のＣｄｃ２５Ａ安定性におけるＤｕｂ２Ａ及びＵＳＰ４８に対する重複した役割を排除することはできないが、本発明者らのデータは、以前に体細胞において示されたように、このプロセスにおけるＤｕｂ３に対する重要な役割を裏づけるものであり、ＥＳ細胞において、Ｃｄｃ２５Ａの定常状態レベルを微調整するユビキチン化活性と脱ユビキチン化活性のバランスが、高いＤｕｂ３発現のために脱ユビキチン化側に移動することを示唆している。
【０１３６】
本発明者らは、Ｅｓｒｒｂの減少が、以前に特徴づけられたＥｓｒｒｂ標的遺伝子Ｎａｎｏｇに近い程度に、Ｄｕｂ３遺伝子の内在発現にネガティブに影響することを示した。しかし、別のＥｓｒｒｂ標的であるＯｃｔ４の発現がＥｓｒｒｂノックダウンによって大きく影響されることは見られなかった。これらの差は、ＥＳ細胞においては多能性遺伝子の発現が多能性遺伝子制御ネットワークの転写因子の組み合わせ制御下にあるので、存在する可能性がある。この転写制御は、極めて複雑で、遺伝子特異的であるように見え、これから更に解明されねばならない。
【０１３７】
強制的なＤｕｂ３発現は、ＬＩＦ除去後の分化を阻害することはできないが、意外にも、分化系列決定、及びＧ１期延長などの細胞周期再構築と同時に分化中の多量のアポトーシスを誘導することを本発明者らは認めた。これらの観察は、非分解性Ｃｄｃ２５Ａ変異体の発現がマウスにおける早期の胚致死をもたらす（Ｅ３．５）最近の知見と一致しており、既に卵母細胞及び桑実期にあるＣｄｃ２５Ａの発現レベルを微調整する重要性を示している。本発明者らは、Ｃｄｃ２５ＡがＥＳ細胞における重要なＤｕｂ３基質であることを示したが、本発明者らは、分化中の強制的なＤｕｂ３発現によって認められた毒性における他のＤｕｂ３基質の関連を排除することができない。Ｃｄｃ２５Ａは、増殖性の自己複製分裂を起こす前駆細胞中で発現されるので、胚形成中の厳格なＣｄｃ２５Ａ調節の重要性は、ＥＳ細胞の多能性と分化の調節におけるその機能によっても強調される。本発明者らは、この発生調節が、Ｅｓｒｒｂの制御下で細胞周期動力学を改変するＤｕｂ３によって支配され得ると推測している。
【０１３８】
結論として、本発明者らの結果は、Ｃｄｃ２５Ａ−ＣＤＫ２細胞周期シグナル伝達経路を、ＥＳ細胞におけるＤｕｂ３のＥｓｒｒｂ依存的調節を介した自己複製機構と結びつけ、幹細胞及び発生生物学における脱ユビキチン化酵素の重要性を強調するものである。細胞周期調節は、初期化プロセスにおける律速段階であるので、これらの知見は、Ｄｕｂ３及びＣｄｃ２５Ａを細胞初期化における興味深い候補遺伝子とするものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2016533356.tif 000009
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１２Ｍ】
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【図１２Ｎ】
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【図１２Ｏ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｖ】
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【図１３Ｗ】
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【図１３Ｘ】
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【図１３Ｙ】
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【図１３Ｚ】
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【図１３ＡＡ】
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【図１３ＡＢ】
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【図１３ＡＣ】
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【図１３ＡＤ】
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【図１３ＡＥ】
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【図１３ＡＦ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｆ】
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【図５Ｅ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月9日(2016.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分化、特にインビトロ細胞分化を調節するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントの活性、すなわちユビキチン加水分解酵素活性及び／若しくは発現の阻害剤
の使用。
【請求項２】
前記細胞が全能性又は多能性細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
分化細胞の脱分化を誘導するための、
−  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、若しくは前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一である任意の前記タンパク質のバリアント、又は
−  前記タンパク質若しくは前記タンパク質のバリアントをコードする核酸分子
の使用であって、分化細胞の脱分化から得られる細胞がｉＰＳ細胞である、使用。
【請求項４】
前記細胞Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質をコードする前記核酸分子が少なくともＯｃｔファミリーメンバータンパク質及びＳｏｘファミリーメンバータンパク質と結合している、分化細胞の脱分化を誘導するための請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｄｕｂ３タンパク質が、前記ｉＰＳ細胞において、全能性細胞における前記Ｄｕｂ３タンパク質の発現よりも少なくとも２倍低いレベルで発現される、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
全能性又は多能性細胞の自然分化を誘導するための、Ｄｕｂ３タンパク質又は前記タンパク質のバリアントの活性及び／又は発現の阻害剤の使用であって、前記タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、任意の前記タンパク質のバリアントが前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する、使用。
【請求項７】
細胞集団に属する細胞の分化状態を決定するための、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＤｕｂ３タンパク質、又は前記アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも４３％同一であり、ユビキチン加水分解酵素活性を有する任意の前記タンパク質のバリアントの使用。
【国際調査報告】
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