(57)【要約】本発明は、修飾コラーゲン分子、特に、修飾コラーゲン−グリコサミノグリカン複合材に関する。本発明は、コラーゲン分子の安定化方法およびこれらのコラーゲン分子の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３本の鎖を含むコラーゲン分子であって、
少なくとも１本の鎖が一般式：
（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎ
（式中、
Ｘ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；
Ｇは、グリシンであり；および
ｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である）
の少なくとも１つの繰り返し単位を含む、前記コラーゲン分子。
【請求項２】
ｎが少なくとも２、または少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも５０、または少なくとも１００、または少なくとも２００、または少なくとも５００、または少なくとも１０００である、請求項１に記載のコラーゲン分子。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカン部分が、少なくとも１つの二糖単位から成る、請求項１または２に記載のコラーゲン分子。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカン部分が、少なくとも１つの負荷電基を含有する、請求項３に記載のコラーゲン分子。
【請求項５】
前記負荷電基が、スルファートまたはカルボキシラートである、請求項４に記載のコラーゲン分子。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロナン、ケラタン硫酸および非硫酸化コンドロイチンから成る群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項７】
前記コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｕ、コンドロイチン硫酸Ｋおよびコンドロイチン硫酸Ｌから成る群より選択される、請求項６に記載のコラーゲン分子。
【請求項８】
前記コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａまたはコンドロイチン硫酸Ｕである、請求項７に記載のコラーゲン分子。
【請求項９】
前記アミノ酸が、正荷電アミノ酸である、請求項１から８のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１０】
前記正荷電アミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから成る群より選択される、請求項９に記載のコラーゲン分子。
【請求項１１】
前記コラーゲン鎖の少なくとも１本が、
Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ｕ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＯＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２
（これらの式中、
Ａｃは、アセチルであり；
Ｐは、プロリンであり；
Ｇは、グリシンであり；
ＣＳ−Ｕは、非硫酸化コンドロイチン硫酸であり；
ＣＳ−Ａは、コンドロイチン硫酸Ａであり；
Ｋは、リシンであり；
Ｒは、アルギニンであり；および
Ｘは、ヒドロキシプロリンである）
から成る群より選択される一般式を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１２】
（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）が、下記式：
2016520585.tif 000013
を有する、請求項１１に記載のコラーゲン分子。
【請求項１３】
（ＰＸＧ）が、下記式：
2016520585.tif 000014
を有する、請求項１１または１２に記載のコラーゲン分子。
【請求項１４】
治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子を投与することを含む、治療を必要とする患者を処置する方法。
【請求項１６】
化粧品に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１７】
組織工学に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１８】
前記組織工学が、皮膚組織工学である、請求項１７に記載のコラーゲン分子。
【請求項１９】
足場の構築に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子と１つ以上の賦形剤とを含む組成物。
【請求項２１】
グリコサミノグリカンに基づく薬学に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２２】
組織工学用の生体材料として使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２３】
薬物送達または創傷治癒に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月９日出願のシンガポール出願第２０１３０３５９７−７号の優先権の恩典を主張するものであり、前記シンガポール出願の内容は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
技術分野
本発明は、生体材料およびそれらの合成、特にコラーゲン分子の分野に存する。
【背景技術】
【０００３】
生体材料は、生体系内で相互作用することができる天然または合成材料である。生体材料の重要な用途は、組織工学のための足場である。最も一般的な足場の１つは、コラーゲンに基づく足場である。
【０００４】
コラーゲンは、哺乳類の組織の重要な構成成分であり、非常に多くの生体内プロセスを媒介する。高い存在度とともに、そのユニークな階層的自己組織化性が、コラーゲンをバイオミメティクス分野において魅力的な足場にした。コラーゲンに加えて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）も組織の必須要素として役立つ。これらの高負荷電高分子は、多くの重要な生理プロセス、およびコラーゲンに基づく足場の機械的特性を調節する。しかし、天然材料に由来するコラーゲン−ＧＡＧ複合材には欠点がある。例えば、天然材料に関連した免疫原性、ロットによるばらつきおよび複雑な精製。これらの欠点が、細胞外環境を操作するための被定義分子ツールを作り出す努力を妨げてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、改善されたコラーゲン足場の提供に努める。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の態様では、３本の鎖を含むコラーゲン分子であって、
少なくとも１本の鎖が一般式：
（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎ
（式中、
Ｘ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；
Ｇは、グリシンであり；および
ｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である）
の少なくとも１つの繰り返し単位を含む、前記コラーゲン分子を提供する。
【０００７】
第二の態様では、治療に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【０００８】
第三の態様では、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子の投与を含む、治療を必要とする患者を処置する方法を提供する。
【０００９】
第四の態様では、化粧品に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【００１０】
第五の態様では、組織工学に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【００１１】
第六の態様では、足場の構築に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【００１２】
第七の態様では、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子と１つ以上の賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００１３】
第八の態様では、グリコサミノグリカンに基づく薬学に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【００１４】
第九の態様では、組織工学用の生体材料として使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【００１５】
第十の態様では、薬物送達または創傷治癒に使用するための、本明細書で定義するとおりのコラーゲン分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明は、「発明を実施するための形態」を参照して、それを非限定的実施例および添付の図面と併せて考慮すると、よりよく理解されるであろう。
【００１７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂから成り、本明細書に開示するコラーゲン分子の概要例を示す図である。図１Ａは、１本の鎖が繰り返し単位を含む、３本の鎖を有するコラーゲン分子の略図を示す。図１Ｂは、２または３本の鎖が繰り返し単位を含む、３本の鎖を有するコラーゲン分子の略図を示す。図１は、繰り返し単位が、鎖内でまたは鎖間で、同じであってもよく、または異なってもよいことを例示する。図１は、繰り返し単位が、所定の鎖内でまたは鎖間で、同じ回数繰り返されていてもよく、または異なる回数繰り返されていてもよいことも例示する。
【００１８】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂから成る図である。図２Ａは、当技術分野において公知のコラーゲン−ＧＡＧペプチドの略図を示す。図２Ｂは、本発明のコラーゲン−ＧＡＧペプチドの略図を示す。図２に示すようなＧＡＧ部分は、いずれのＧＡＧ部分であってもよい。図２に示すアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、いずれのアミノ酸であってもよく、またはいずれのアミノ酸誘導体であってもよい。
【００１９】
【図３】ＧＡＧ部分の不均一鎖と、均一ＧＡＧ部分を含む本明細書に開示の均一コラーゲン鎖との差を示す図である。
【００２０】
【図４】本発明に使用することができる様々なＧＡＧ部分の例を示す図である。
【００２１】
【図５】図５Ａおよび５Ｂから成る図である。図５Ａは、コラーゲン模倣ペプチド内でのＣＳ−Ａ二糖と正荷電アミノ酸との静電相互作用の略図を示す。図５Ｂは、使用したペプチドの構造を示す。
【００２２】
【図６】図６Ａ〜６Ｆから成る図である。図６Ａは、ペプチド１のＣＤスペクトルを示す。図６Ｂは、ペプチド２および３のＣＤスペクトルを示す。図６Ｃおよび６Ｄは、ペプチド１−２の１：２混合物についての熱変性曲線および温度に対する一次導関数プロットを示す。図６Ｅおよび６Ｆは、ペプチド１−３の１：２混合物についての熱変性曲線および温度に対する一次導関数プロットを示す。
【００２３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂから成り、ペプチド１−２の１：２コポリマーについてのＣＤスペクトル（図７Ａ）およびペプチド１−３の１：２コポリマーについてのＣＤスペクトル（図７Ｂ）を示す図である。
【００２４】
【図８】図８Ａ〜８Ｄから成り、ペプチド４の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル（図８Ａ）、ペプチド１−４の１：２混合物の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル（図８Ｂ）、ＣＳ−Ａ二糖とペプチド４の４：１混合物の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル（図８Ｃ）、ペプチド１−３の１：２アニール混合物についてのＤＳＣ融解プロファイル（図８Ｄ）を示す図である。
【００２５】
【図９】図９Ａ〜９Ｂから成り、ＣＳ−Ａ二糖とペプチド４の４：１混合物の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル（図９Ａ）、ＣＳ−Ａ二糖とペプチド４の１０：１混合物の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル（図９Ｂ）を示す図である。
【００２６】
【図１０】ペプチド１の分析ＨＰＬＣトレース（上部）およびＥＳＩ質量データ（下部）を示す図である。
【００２７】
【図１１】ペプチド２の分析ＨＰＬＣトレース（上部）およびＥＳＩ質量データ（下部）を示す図である。
【００２８】
【図１２】ペプチド３の分析ＨＰＬＣトレース（上部）およびＥＳＩ質量データ（下部）を示す図である。
【００２９】
【図１３】ペプチド４の分析ＨＰＬＣトレース（上部）およびＥＳＩ質量データ（下部）を示す図である。
【００３０】
【図１４】ペプチド５の分析ＨＰＬＣトレース（上部）およびＥＳＩ質量データ（下部）を示す図である。
【００３１】
【図１５】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、トリクロロアセトイミダート４からの変換後の、完全保護二糖５の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３２】
【図１６】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、トリクロロアセトイミダート４からの変換後の、完全保護二糖５の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３３】
【図１７】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ｎ−トリブチルスタンナンおよびＡＩＢＮでのＮ−トリクロロアセチル（Ｎ−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｙｔｌ）基のＮ−アセチル同族体へのラジカル媒介還元後のアセトアミド６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３４】
【図１８】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ｎ−トリブチルスタンナンおよびＡＩＢＮでのＮ−トリクロロアセチル（Ｎ−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｙｔｌ）基のＮ−アセチル同族体へのラジカル媒介還元後のアセトアミド６の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３５】
【図１９】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、６のベンジリデンアセタールの加水分解、それに続くＴＭＳ基の除去後の、ジオール７の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３６】
【図２０】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、６のベンジリデンアセタールの加水分解、それに続くＴＭＳ基の除去後の、ジオール７の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３７】
【図２１】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ジオール７のＣ６ヒドロキシル基の選択的ベンゾイル化後の二糖８の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３８】
【図２２】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ジオール７のＣ６ヒドロキシル基の選択的ベンゾイル化後の二糖８の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００３９】
【図２３】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ＳＯ３−トリメチルアミン錯体での８の処理後の硫酸化二糖モチーフの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００４０】
【図２４】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ＳＯ３−トリメチルアミン錯体での８の処理後の硫酸化二糖モチーフの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００４１】
【図２５】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ＬｉＯＯＨおよびＮａＯＨでの逐次的処理後の所望のＣＳ−Ａ二糖９の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【００４２】
【図２６】上で定義したとおりのＧＡＧ含有コラーゲンペプチド１のスキーム１に図示するような合成方法の一実施形態における、ＬｉＯＯＨおよびＮａＯＨでの逐次的処理後の所望のＣＳ−Ａ二糖９の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
コラーゲンは、非常に多くの生体内プロセスを媒介する、哺乳類の組織の主要構造成分である。現在、２８の異なる型のコラーゲンが公知であり、これらの例としては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲンが挙げられるがこれらに限定されない。これらのうち、Ｉ型コラーゲンは、体内に最も多く存在し、皮膚中で見つけられる。Ｉ型コラーゲンは、組織工学に最も一般的に用いられるコラーゲンでもある。天然に存在するコラーゲンは、３本のタンパク質ストランドまたは鎖で構成された三重らせん構造を有する。異なる型のコラーゲンが異なるタイプのタンパク質鎖で構成されていることは、当業者には理解されるであろう。例えば、Ｉ、ＩＶおよびＶＩＩＩ型コラーゲンは、２本のα１鎖および１本のα２鎖から成り、ＩＩ、ＩＩ  ＶＩＩおよびＸ型コラーゲンは、３本のα１鎖から成り、ＶＩ型コラーゲンは、１本のα１、１本のα２および１本のα３鎖から成る。本明細書に開示のコラーゲン分子に対する修飾は、コラーゲン分子の１本以上のストランドに対して行うことができる。一例では、ＶＩ型コラーゲンの１本のα１鎖を修飾する。別の例では、Ｘ型コラーゲンの２本のα１鎖を修飾する。
【００４４】
コラーゲンの１つの顕著な特徴は、コラーゲン分子の各鎖またはストランド内のアミノ酸の繰り返し単位の存在である。この繰り返しアミノ酸単位は、ＧＬｙ−Ｐｒｏ−ＸまたはＧｌｙ−Ｘ−Ｈｙｐであり、ここでのＸは、任意のアミノ酸であり、Ｈｙｐは、ヒドロキシプロリン、プロリンの誘導体、である。
【００４５】
安定性、コラーゲン分子の１本のストランドの全電荷、および他の分子との相互作用などの所望の特性を付与するようにコラーゲン分子を修飾または合成することができる。
【００４６】
したがって、第一の態様では、本発明は、３本の鎖を含むコラーゲン分子であって、
少なくとも１本の鎖が一般式：
（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎ
（式中、
Ｘ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；
Ｇは、グリシンであり；および
ｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である）
の少なくとも１つの繰り返し単位を含む、前記コラーゲン分子を提供する。
【００４７】
例えば、ｎは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００または少なくとも１０００であってもよい。一例では、ｎは、１と１０の間、２と５の間、２と４の間、または１０と５０の間である。一例では、ｎは４である。上述の値のいずれかを含む任意の範囲も可能である。したがって、ｎには上限がないことは、一般に理解されるであろう。
【００４８】
本明細書において用いる場合、用語「アミノ酸」は、荷電、非荷電、極性、非極性、芳香族、非芳香族のものを指し、天然に存在するアミノ酸はもちろん、天然に存在しないアミノ酸も含み得る。天然に存在するアミノ酸、標準または正規アミノ酸は、タンパク質新生アミノ酸を指す。これらの例としては、２０の必須アミノ酸、例えば、プロリン、バリン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、チロシンおよびアスパラギンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないアミノ酸、非正規アミノ酸または非天然アミノ酸の例は、前記２０の必須アミノ酸以外のアミノ酸を指し、非タンパク質新生アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、ジアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、グリシン誘導体ならびに修飾されたアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において用いる場合、用語「アミノ酸誘導体」は、１つ以上の官能基の付加もしくは除去によって修飾されたアミノ酸、またはキラリティーが修飾されたアミノ酸を指す。アミノ酸誘導体の例としては、ヒドロキシプロリン、ならびに保護アミノ酸、例えばＦｍｏｃおよびＢｏｃ保護アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書に開示するコラーゲン分子の一例では、コラーゲン分子は、少なくとも１つの繰り返し単位が１本の鎖内にある、３本の鎖を有する。繰り返し単位を含む鎖の残部がアミノ酸またはアミノ酸誘導体から成ることは理解されるであろう。残りの鎖が、アミノ酸、アミノ酸誘導体またはそれらの混合物から専ら成ることも理解されるであろう。本明細書に開示するコラーゲン分子の別の例では、コラーゲン分子は、少なくとも１つの繰り返し単位が２本の鎖内にある、３本の鎖を有する。繰り返し単位を含む鎖の残部がアミノ酸またはアミノ酸誘導体から成ることは理解されるであろう。残りの鎖が、アミノ酸、アミノ酸誘導体またはそれらの混合物から専ら成ることも理解されるであろう。本明細書に開示するコラーゲン分子のさらに別の例では、コラーゲン分子は、少なくとも１つの繰り返し単位が３本すべての鎖内にある、３本の鎖を有する。それらの鎖の残部がアミノ酸またはアミノ酸誘導体から成ることは理解されるであろう。さらに、鎖内の繰り返し単位が異なってもよいこと、またはｎが異なってもよいことは、当業者には容易に理解されるであろう。繰り返し単位が鎖間で異なってもよいこと、またはｎが鎖間で異なってもよいことも、当業者には容易に理解されるであろう。例えば、１つのコラーゲン分子の任意の所定の鎖内で、ある繰り返し単位が５回繰り返されることがあると同時に異なる繰り返し単位が１０回繰り返されることがある一方で、同じ分子の第二の鎖内で第一の繰り返し単位もしくはさらに別の繰り返し単位が２０回繰り返されることがあり、そして第三の鎖は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体から専ら成る。
【００５１】
理解しやすいように、本明細書に開示するコラーゲン分子の例を図１に模式的に提示する。図１Ａは、少なくとも１つの繰り返し単位が１本の鎖上にある、本明細書に開示するコラーゲン分子の例を示す。繰り返し単位が同じであってもよく、または異なってもよいこと、およびｎが同じであってもよく、または異なってもよいことは、図１Ａから理解されるであろう。図１Ｂは、少なくとも１つの繰り返し単位が２または３本の鎖上にある、本明細書に開示するコラーゲン分子の例を示す。繰り返し単位が鎖間で同じであってもよく、または異なってもよいことは理解されるであろう。ｎが鎖間で同じであってもよく、または異なってもよいことも理解されるであろう。図１が、本明細書に開示するコラーゲン分子の例を代表するものであり、請求項記載の分子の範囲を決して限定しないことは、理解されるであろう。本明細書において用いる場合、コラーゲンは、ネイティブコラーゲンまたはゼラチン化コラーゲンであることがある。ゼラチン化コラーゲンは、例えば熱的または化学的手段によって、変性されたコラーゲンを指す。ネイティブコラーゲンは、変性されていないコラーゲンを指す。変性が、コラーゲンなどのタンパク質の四次構造の喪失を指し、可逆的であることもあり、または不可逆的であることもあることは、一般に理解されるであろう。
【００５２】
本明細書において用いる場合、コラーゲンは、天然源から得られることもあり、または合成品であることもある。コラーゲンの天然源としては、動物の組織、例えば哺乳類の組織および鳥類の組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
天然源に由来するコラーゲンには免疫原性、ロットによるばらつきなどの多数の欠点があり、合成コラーゲンの場合に存在しない複雑な精製が必要である。したがって、本発明は、合成コラーゲンの使用を含む。合成コラーゲンとしては、コラーゲン模倣ペプチドおよび合成自己組織化コラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。合成自己組織化コラーゲンが、天然コラーゲンの自己組織化を模倣するように自己組織化する合成ペプチド鎖を指すことは、一般に理解されるであろう。例えば、ペプチドの三重らせんへの組織化、三重らせんの線維およびヒドロゲルへの組織化。合成コラーゲンの一例は、コラーゲン模倣ペプチド（ＣＭＰ）である。
【００５４】
本明細書において用いる場合、用語「模倣ペプチド」は、ネイティブペプチドと同様の特性を有する合成ペプチドを指す。合成ペプチドは、動物源から単離されたのではなく人造であるペプチドを意味すると一般に解釈されるであろう。ネイティブペプチドと同様である、合成ペプチドが有する特性としては、標的タンパク質に対する結合親和性、および機械的特性が挙げられる。合成ペプチドには多数の利点があり、例えば、合成ペプチドは、アミノ酸配列のカスタマイズを可能にする。合成ペプチドを合成方法に基づいてネイティブペプチドと区別することもできる。例えば、合成ペプチドを固相ペプチド合成によって合成してもよく、または液相ペプチド合成によって合成してもよい。
【００５５】
模倣ペプチドの例としては、コラーゲン模倣ペプチドおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）模倣ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。模倣ペプチドのもう１つの例は、コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドである。
【００５６】
模倣ペプチドが様々な長さであること、および模倣ペプチドの長さが、標的にする生体系に依存することは、当業者には理解されるであろう。例えば、模倣ペプチドは、長さが少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００および少なくとも１０００アミノ酸からの範囲であり得る。例えば、模倣ペプチドは、２４アミノ酸長であり得る。
【００５７】
本発明は、コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドを開示する。用語「コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチド」または「コラーゲン−ＧＡＧ複合材」は、当技術分野において現在公知であるように、荷電対相互作用によって互いに相互作用するコラーゲン模倣ペプチドとＧＡＧ模倣ペプチドとを含むコラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチド（図２Ａ）を指す。したがって、コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドまたはコラーゲン−ＧＡＧ複合材は、当技術分野において公知であるように、互いに別々であり異なる、１本以上のコラーゲンペプチドストランドと１本以上のＧＡＧペプチドストランドとから成る。
【００５８】
しかし、本発明に関連して本明細書において用いる場合、用語「コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチド」または「コラーゲン−ＧＡＧ複合材」は、コラーゲンペプチドの中にＧＡＧ部分を含む、コラーゲンペプチド（図２Ｂ）を指す。例えば、本明細書に開示のコラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドは、一般式（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎを有し、式中のＸ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；Ｇは、グリシンであり；およびｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である。したがって、本発明のコラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドまたはコラーゲン−ＧＡＧ複合材は、コラーゲンペプチドの同じ鎖に組み込まれたＧＡＧ部分を有する、コラーゲンペプチドを含む。
【００５９】
天然源に由来するペプチドが不均一であることは、当業者には容易に理解されるであろう。したがって、本明細書において提供するペプチドの１つの利点は、これらのペプチドをそれらが均一であるようにカスタマイズできることである。
【００６０】
本明細書において用いる場合、用語「不均一（な）」は、ランダムに異なる単位を有するペプチドまたはペプチド鎖を指す。例えば、天然由来のＧＡＧ鎖は、ランダムに異なる二糖単位を有するであろう。これらの二糖単位は、１つ以上の硫酸基またはカルボン酸基の存在または不在の点で異なることがある。ペプチドの不均一性の結果として、ペプチドの特性にばらつきが生ずる。この欠点は、ペプチド間のロットによるおよびバッチのばらつきである。したがって、本発明の「コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチド」または「コラーゲン−ＧＡＧ複合材」の利点は、これらが均一であることである。本明細書において用いる場合、用語「均一（な）」は、任意の所定のペプチド鎖の単位が非ランダムであることを意味する。例えば、本明細書に開示の均一コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドまたは均一コラーゲン鎖もしくはストランドは、非ランダムパターンで繰り返される同じ繰り返し単位を有することになる。例えば、本明細書に開示する均一コラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドは、非ランダムパターンで繰り返される異なる繰り返し単位を有することもある。繰り返し単位の回数はｎで表され、これも非ランダムである。
【００６１】
本明細書において用いる場合、均一（な）は、少なくとも１本の鎖が均一であるコラーゲン分子を指すために用いることもある。例えば、３本の鎖を有する均一コラーゲン分子は、１本の均一鎖と２本の不均一鎖を有することがある。例えば、均一コラーゲン分子は、２本の均一鎖と１本の不均一鎖を有することがある。さらに別の例では、３本の鎖を有する均一コラーゲン分子は、均一である３本すべての鎖を有することがある。２本の均一鎖を有する均一コラーゲン分子における均一鎖が、同じまたは異なることがあることは、容易に理解されるであろう。３本の均一鎖を有する均一コラーゲン分子において、これらの鎖の各々が互いに異なるまたは互いに同一であることがあることも容易に理解さるであろう。例えば、本明細書に開示するコラーゲン分子は、鎖の少なくとも１本がアミノ酸−ＧＡＧ鎖である、３本の鎖から成ることがあり得る。これは、少なくとも１本の鎖がアミノ酸−ＧＡＧ鎖であり、他の鎖（単数または複数）が純粋なアミノ酸鎖であることを意味する。本明細書に開示するコラーゲン分子の別の例は、３本の鎖の各々がアミノ酸−ＧＡＧ鎖である、３本の鎖から成るコラーゲン分子であることがある。アミノ酸−ＧＡＧ鎖内の繰り返し単位が同じまたは異なることがあることは、当業者には明らかであろう。
【００６２】
本明細書において用いる場合、用語「均一（な）」は、コラーゲン−ＧＡＧペプチド鎖内のまたは繰り返し単位内のＧＡＧ部分の均一性を指すこともある。例えば、繰り返し単位（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎにおいて、Ｘ１は、同じＧＡＧ部分から成り、またはＸ１は、１つのＧＡＧ部分であり、およびＸ２は、異なるＧＡＧ部分である。さらに別の例では、コラーゲン−ＧＡＧ鎖内のすべてのＧＡＧ部分が同じである。ＧＡＧ部分が非ランダムであることは理解されるであろう。
【００６３】
したがって、均一合成ペプチド鎖を次のように表すことができるだろう：Ａ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ｂ−ＢまたはＢ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＡまたはＡ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ（ここで、Ａは、任意の所定のペプチド鎖内の繰り返し単位を表すことがあり、Ｂは、そのペプチド鎖内の任意のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表すことがある）。ＡがあるＧＡＧ部分を表し、Ｂが異なるＧＡＧ部分を表す、繰り返し単位内のまたはコラーゲン−ＧＡＧペプチド内のＧＡＧ部分にも上に示した表現を当てはめることができる。上の表現が、均一ペプチド鎖の単なる模式的な例であることは、当業者には明らかであろう。前記単位がランダムでないことも、この模式的表現から当業者には理解されるであろう。図３は、均一な非ランダムＧＡＧ部分を含む、本明細書に開示の均一コラーゲン分子の一例を例示する。図３は、コラーゲン分子のＧＡＧ部分が同じである、均一コラーゲン分子の一例を提供する。図３は、ＧＡＧ部分の不均一鎖も例示する。不均一ＧＡＧ部分がランダムであることは、図３から容易に理解されるであろう。
【００６４】
既に述べたように、本発明は、３本の鎖を含むコラーゲン分子であって、
少なくとも１本の鎖が一般式：
（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎ
（式中、
Ｘ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；
Ｇは、グリシンであり；および
ｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である）
の少なくとも１つの繰り返し単位を含む、前記コラーゲン分子を提供する。
【００６５】
したがって、本明細書に開示のコラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドの例としては、Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ｕ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２およびＡｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＯＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（これらの式中、Ａｃはアセチルであり；Ｐはプロリンであり；Ｇはグリシンであり；ＣＳ−Ｕは非硫酸化コンドロイチン硫酸であり；ＣＳ−Ａはコンドロイチン硫酸Ａであり；Ｋはリシンであり；Ｒはアルギニンであり；およびＸはヒドロキシプロリンである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
非修飾分子中に存在しないまたは天然分子には存在しない所望の特性を付与するようにコラーゲン分子の修飾または合成を行うことができる。例えば、コラーゲン三重らせんのストランド間の安定性を向上させるようにコラーゲン分子を修飾することができる。本明細書において用いる場合、用語「修飾された」、「修飾」、「修飾すること」およびこれらの他の文法上の変形は、コラーゲンの改変を指す。コラーゲン分子の修飾の例は、コラーゲン分子の１本以上のストランドへのまたは全コラーゲン分子への化合物の付加である。例えば、コラーゲン分子の１本のストランドへの炭水化物の付加。コラーゲン分子の１本以上のストランドへの炭水化物の付加を加えて、コラーゲン分子の１本以上のストランドの電荷を修飾することができる。詳細には、コラーゲン分子の１本以上のストランドへの炭水化物分子の付加は、コラーゲン分子に負電荷を付与する。
【００６７】
修飾の他の例としては、コラーゲン分子の１本以上のストランドの電荷の改変、コラーゲン分子の全電荷の改変、コラーゲン分子の物理的および化学的特性、例えば融解温度、熱安定性、タンパク質高次構造および光吸収の改変が挙げられるが、これらに限定されない。修飾の例としては、コラーゲン三重らせんの１本以上のストランドの置換、コラーゲン三重らせん分子の１本以上のストランド内の１つ以上のアミノ酸の修飾、コラーゲン分子の１本以上のストランド間またはコラーゲン分子間の相互作用の修飾、コラーゲン分子の１本以上のストランドのアセチル化、ならびにコラーゲン分子の１本以上のストランドのアミド化も挙げられる。コラーゲン三重らせん分子の１本以上のストランドの修飾の結果として、コラーゲンヘテロ三量体またはコラーゲンホモ三量体が得られることもある。
【００６８】
既に述べたように、コラーゲンは、三重らせん構造を有する。コラーゲン分子に関連して本明細書において用いる場合、用語「ヘテロ三量体」は、３本のストランドが同一でないことを意味する。例えば、１本のα２鎖および２本のα１鎖から成るＩ型コラーゲンの場合、α２鎖は、２本のα１鎖と異なることがあり、α２鎖、およびα１鎖の１本は、第三のα１鎖と異なり、または鎖の各々が互いに異なる。コラーゲンヘテロ三量体の他の例としては、１本のα２鎖および２本のα１鎖から成るＩＶおよびＶＩＩＩ型コラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの型のコラーゲンは、ヘテロ三量体ＡＡＢコラーゲンとしても公知である。ヘテロ三量体コラーゲンのさらに他の例としては、１本のα１鎖、１本のα２鎖および１本のα３鎖から成るＶＩ型コラーゲンが挙げられるが、これに限定されない。この型のコラーゲン分子は、ヘテロ三量体ＡＢＣコラーゲンとしても公知である。
【００６９】
コラーゲン分子に関連して本明細書において用いる場合、用語「ホモ三量体」は、コラーゲン分子のα鎖の各々が互いに同一であることを意味する。例えば、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩおよびＸ型コラーゲンは、３本のα１鎖を含み、ホモ三量体である。修飾コラーゲン分子の一例は、１本の鎖が正に荷電しており、他の２本の鎖が負に荷電しているコラーゲン分子である。修飾コラーゲン分子の別の例は、１本の鎖が負に荷電しており、他の２本の鎖が正に荷電しているコラーゲン分子である。修飾コラーゲン分子のさらに他の例は、正味中性電荷を有するコラーゲン分子である。
【００７０】
本明細書において用いる場合、用語「正味中性（の）」は、コラーゲン分子の全電荷が中性であることを意味する。
【００７１】
電荷中性は、例えば、正に荷電している第一のα２コラーゲン鎖と、両方が負に荷電している第二および第三のα１コラーゲン鎖とによって、負に荷電している第一のα２コラーゲン鎖と、両方が正に荷電している第二および第三のα１コラーゲン鎖によって、１つ以上の炭水化物分子を含む、第一のα２コラーゲン鎖、第二のα１コラーゲン鎖および／もしくは第三のα１コラーゲン鎖によって、または１つ以上の正もしくは負荷電アミノ酸残基を含む、第一のα２コラーゲン鎖、第二のα１コラーゲン鎖および／もしくは第三のα１コラーゲン鎖によって達成されることがある。修飾コラーゲン分子の一例は、１本以上のストランド内のアミノ酸の少なくとも１つが正荷電アミノ酸で置換されているコラーゲン分子である。正荷電アミノ酸の例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾コラーゲン分子の一例は、コラーゲン分子の１本以上のストランド上の１つ以上のアミノ酸がリシンまたはアルギニンで置換されているコラーゲン分子である。
【００７２】
修飾コラーゲン分子の一例は、三重らせんの１本のストランド上のアミノ酸がリシンで置換されており、三重らせんの１本のストランド上のアミノ酸がアルギニンで置換されており、および炭水化物が三重らせんの第三のストランドに付加されている、コラーゲン分子である。修飾コラーゲン分子の別の例は、三重らせんの２本のストランド上でアミノ酸がリシンで置換されており、炭水化物が三重らせんの第三のストランドに付加されている、コラーゲン分子である。修飾コラーゲン分子の別の例は、三重らせんの２本のストランド上でアミノ酸がアルギニンで置換されており、炭水化物が三重らせんの第三のストランドに付加されている、コラーゲン分子である。修飾コラーゲン分子の別の例は、グリコサミノグリカン含有コラーゲン模倣ペプチドである。
【００７３】
修飾コラーゲン分子のさらに別の例は、コラーゲン分子の１本以上のストランド内のアミノ酸が放射性標識によって修飾されているコラーゲン分子である。かかる修飾アミノ酸の例は、１５Ｎ濃縮グリシンである。コラーゲン分子上の放射性標識アミノ酸を使用して、コラーゲン分子の物理的特性、例えば、コラーゲン分子のヘテロ三量体形成を判定することができる。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて、１５Ｎ濃縮グリシン標識コラーゲン分子のヘテロ三量体形成を判定することができる。
【００７４】
本明細書において述べるように、コラーゲン分子の少なくとも１本の鎖内へのＧＡＧ部分の組み込みによってコラーゲン分子を修飾することもある。コラーゲン三重らせんの１本以上のストランド内へのＧＡＧ部分の付加は、コラーゲン三重らせんの同じストランド内の負荷電ＧＡＧ部分と正荷電アミノ酸の間のまたはコラーゲン三重らせんの１本以上のストランド間の静電荷対相互作用のため、分子に安定性を付与する。正荷電アミノ酸は、コラーゲンストランド内に天然に存在することもあり、またはコラーゲン分子の１本以上のストランド上の１つ以上のアミノ酸の正荷電アミノ酸での置換の結果であることもある。本明細書において用いる場合、「グリコサミノグリカン」（ＧＡＧ）または「ＧＡＧ部分」は、繰り返し二糖単位から成る非分岐多糖を指す。グリコサミノグリカンは、組織の主要構成成分の１つであり、組織の必須要素であると一般に理解されている。
【００７５】
本明細書において用いる場合、「二糖」は、２つの単糖単位を有する分子を指す。ＧＡＧの最小単位が二糖であることは、当業者には理解されるであろう。ＧＡＧが次のように表されることがあることも理解されるであろう：（二糖）ｎ（ここでのｎは任意の整数であり得る）。ＧＡＧ内の繰り返し二糖単位が同じであってもよいし、または異なってもよいことも、当業者には明らかであろう。
【００７６】
ＧＡＧの例としては、へパラン硫酸（ヘパリン）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸およびヒアルロン酸（ヒアルロナン）が挙げられるが、これらに限定されない。ＧＡＧの一例は、コンドロイチン硫酸である。コンドロイチン硫酸の例としては、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ−Ｃ）、コンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳ−Ｄ）、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ−Ｅ）、コンドロイチン硫酸Ｕ（ＣＳ−Ｕ）、コンドロイチン硫酸Ｋ（ＣＳ−Ｋ）、コンドロイチン硫酸Ｌ（ＣＳ−Ｌ）および非硫酸化コンドロイチンが挙げられるが、これらに限定されない。コンドロイチン硫酸の一例は、コンドロイチン硫酸Ａまたはコンドロイチン硫酸Ｕである。様々なタイプのＧＡＧの例を図４に示す。
【００７７】
本明細書に開示するような、コラーゲン分子の少なくとも１本の鎖へのＧＡＧ部分の組み込みを、いずれのカップリング反応によって達成してもよい。当業者はカップリング反応が分かるであろう。例えば、ＧＡＢ部分をコラーゲン分子の少なくとも１本の鎖に、クリック反応、アミンデーション（ａｍｉｎｄａｔｉｏｎ）またはアルドネーション（ａｌｄｏｎａｔｉｏｎ）によって組み込むことができる。
【００７８】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を「アルキン官能化」して、ＧＡＧの共有結合性修飾を可能にすることができる。本明細書において用いる場合、用語「アルキン官能化（された）」は、分子へのアルキン官能基の付加を指す。アルキン官能基を末端炭素に付加させてもよいし、または中間炭素に付加させてもよい。アルキン官能化され得る分子クラスの一例は、炭水化物、例えばコンドロイチン硫酸Ａである。アルキン官能化コンドロイチン硫酸Ａは、
トリメチルシリルトリフラートを使用して、トリクロロアセトイミダート４
2016520585.tif 000002
を完全保護二糖５
2016520585.tif 000003
に変換する工程；
Ｎ−トリクロロアセチル（Ｎ−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｙｔｌ）基をｎ−トリブチルスタンナンおよびＡＩＢＮでＮ−アセチル同族体（ｃｏｇｎｅｒ）に還元して、アセトアミド６
2016520585.tif 000004
を得る工程；
ベンジリデンアセタールを加水分解し、続いてＴＭＳ基を脱保護してジオール７
2016520585.tif 000005
を生成する工程；
シアン化ベンゾイルを使用してＣ６ヒドロキシル基を選択的にベンゾイル化して作用物質８：
2016520585.tif 000006
を得る工程；
作用物質８をＳＯ３−トリメチルアミン錯体で処理する工程；および
得られた混合物をＬｉＯＯＨおよびＮａＯＨで処理する工程
によって合成することができる。
【００７９】
アルキン官能基を保護することもある。本明細書において用いる場合、「保護」、「保護すること」、「保護の」もしくは「保護された」またはこれらの文法上の変形は、分子への機能性保護基の付加を指す。保護基の付加は、その後の化学反応での官能基選択性をもたらすか、または所定の反応中に分子を特定の反応条件から保護する。官能基選択性は、官能基の優先反応性を指す。アルキン官能基を脱保護することもある。本明細書において用いる場合、「脱保護」、「脱保護された」およびこれらの文法上の変形は、分子内の官能基の除去を指す。
【００８０】
アルキン官能化分子は、官能化分子を別の標的分子に「クリック」することができるクリック反応に特に有用である。例えば、アルキン官能化炭水化物、例えばコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）をクリック反応に付してコラーゲンペプチドまたは分子に付加させることができる。
【００８１】
本明細書において用いる「クリックケミストリー」または「クリック反応」は、Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって最初に記載されたヘテロ原子結合（Ｃ−Ｘ−Ｃ）による化合物の合成を指す。反応条件が出発および最終生成物に依存して変わることは、当業者には理解されるであろう。例えば、クリック反応を溶媒中、周囲温度で、ヨウ化銅、塩基およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）の存在下、アルゴン雰囲気下で行うことができる。塩基の一例は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。溶媒の一例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。クリック反応の一例は、１つ以上の炭水化物分子がコラーゲン分子に組み込まれる反応である。
【００８２】
本明細書において用いる場合、用語「周囲温度」は、環境の温度を指す。周囲温度が室温を指すことは、当業者には理解されるであろう。周囲温度または室温が例えば約５℃〜約５０℃の温度範囲を含むことも、当業者には理解されるであろう。例えば、約５℃〜約４５℃、約５℃〜約４０℃、約５℃〜約３０℃、約５℃〜約２９℃、約５℃〜約２８℃、約５℃〜約２７℃、約５℃〜約２６℃、約５℃〜約２５℃、約５℃〜約２４℃、約５℃〜約２３℃、約５℃〜約２２℃、約５℃〜約２１℃、約５℃〜約２０℃、約５℃〜約１９℃、約５℃〜約１８℃、約５℃〜約１７℃、約５℃〜約１６℃、約５℃〜約１５℃、約５℃〜約１４℃、約５℃〜約１３℃、約５℃〜約１２℃、約５℃〜約１１℃、約５℃〜約１０℃、約５℃〜約９℃、約５℃〜約８℃、約５℃〜約７℃、約５℃〜約６℃。
【００８３】
前に述べたように、本明細書に開示のコラーゲン−ＧＡＧ模倣ペプチドの例としては、Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ｕ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２およびＡｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＯＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（これらの式中、Ａｃはアセチルであり；Ｐはプロリンであり；Ｇはグリシンであり；ＣＳ−Ｕは非硫酸化コンドロイチン硫酸であり；ＣＳ−Ａはコンドロイチン硫酸Ａであり；Ｋはリシンであり；Ｒはアルギニンであり；およびＸはヒドロキシプロリンである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
したがって、コラーゲン分子の一例は、（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）が次の式：
2016520585.tif 000007
を有し、および（ＰＸＧ）が次の式
2016520585.tif 000008
を有する、コラーゲン分子である。
【００８５】
修飾コラーゲン分子の一例は、１本のコラーゲン鎖が式Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＯＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を有し、第二および第三のコラーゲン鎖が式Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＰＲＧ）４−（ＰＸＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を有する、コラーゲン分子である。
【００８６】
コラーゲン分子の別の例は、１本のコラーゲン鎖が式Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＯＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を有し、第二および第三のコラーゲン鎖が式Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＰＫＧ）４−（ＰＸＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を有する、コラーゲン分子である。
【００８７】
本明細書に開示するように、コラーゲン分子を修飾して安定性を向上させることができる。
【００８８】
コラーゲン分子に関連して本明細書において用いる場合、用語「安定性」、「安定化された」、「安定化」またはこれらの文法上の変形は、コラーゲン三重らせんのストランドがアンフォールドする容易さを指す。安定性を融解温度（Ｔｍ）に基づいて測定してもよく、この場合のＴｍは、コラーゲン分子のストランドの５０％が解離する温度を指す。したがって、より高いＴｍは、分子のより高い安定性を示す。例えば、４２．３℃、４２．３℃または４１．３℃のＴｍを有するコラーゲン分子は、３９．４℃のＴｍを有するコラーゲン分子より安定しており、そしてまた３９．４℃のＴｍを有するコラーゲン分子は、１６．９℃または１７．４℃のＴｍを有するコラーゲン分子より安定している。円偏光二色性（ＣＤ）または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて安定性を測定してもよい。円偏光二色性は、示差吸収または左および右円偏光を指す。様々な温度で行うＣＤ分光法によって、コラーゲンペプチドのらせんプロファイルについての情報が得られる。例えば、２５℃でのＣＤ分光法によって判定したとき、そのポリプロリンＩＩ型らせんプロファイルを維持するコラーゲンペプチドは、２５℃でランダムコイル高次構造を示すコラーゲンペプチドより安定している。ＤＳＣは、試料の温度を上昇させるために要した熱の量と参照物の温度を上昇させるために要した熱の量との差を測定する、タンパク質の安定性の測定方法を指す。例えば、その温度を上昇させるために要する熱量が多いコラーゲンのほうが、要する熱が少ないものより安定している。
【００８９】
ペプチドの安定性を判定するための絶対温度も基準もないことは、一般に理解されるであろう。もっと正確に言えば、安定性を判定する温度または基準が標的生体系に基づくことは理解されるであろう。
【００９０】
コラーゲン分子の安定性は、コラーゲン分子のストランド間の相補的静電相互作用によって付与されることもある。したがって、１つ以上のＧＡＧ部分と正もしくは負荷電アミノ酸残基の間の電荷対相互作用または１つ以上ＧＡＧ部分と正荷電アミノ酸残基との電荷対相互作用によってコラーゲン分子を安定させる、コラーゲン分子の安定性を向上させる方法も提供する。本明細書に開示するように、修飾コラーゲン分子は、天然源に由来することもあり、または合成源に由来することもある。したがって、本発明が提供する、コラーゲン分子の安定性を向上させる方法は、アミド樹脂を使用して固体支持体上でペプチド誘導体を調製するステップ、Ｆｍｏｃケミストリーを適用するステップ、およびトリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン混合物での処理により前記樹脂から所望のコラーゲン分子を切断すると同時に脱保護するステップをさらに含む。
【００９１】
Ｆｍｏｃケミストリーを用いてペプチドおよびそれらの誘導体を合成することができる。本明細書において用いる場合、用語「Ｆｍｏｃ」は、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（ｆｌｕｏｒｏｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を指し、「Ｆｍｏｃケミストリー」は、Ｆｍｏｃ保護基を使用してα−アミノ基を保護する、固相ペプチド合成（ＳＳＰＳ）を指す。固相結合ペプチドの遊離Ｎ末端アミンを単一のＮ保護アミノ酸単位にカップリングさせ、次いでそれを脱保護して、さらなるアミノ酸が結合され得る新たなＮ末端アミンを露出させる、カップリング−洗浄−脱保護の反復サイクルの結果として、成長ペプチド鎖が得られる。成長ペプチド鎖は、固体支持体に固定されている。
【００９２】
既に前に述べたように、「保護」および「脱保護」は、官能基の付加または除去を指す。ペプチド合成に関連して、保護および脱保護に使用することができるだろう官能基としては、アセチル基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、ベンゾイル、メチルエステル基、ベンジル、カルバマート、ケタールおよびジチアニン（ｄｉｔｈｉａｎｉｎｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において用いる場合、用語「固体支持体」は、固相ペプチド合成中、ペプチドが固定されている構造を指す。固体支持体は、成長ペプチド分子のアンカーになる。固体支持体が様々な物理的特性を有し得ること、ならびに合成されるペプチドおよびペプチド合成反応条件によって固体支持体の選択が決まることになることは、理解されるであろう。固体支持体の例としては、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール樹脂、上記のものの複合材、セルロース繊維、ガラス、ゲルタイプのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体の一例は、アミド樹脂である。
【００９３】
ここで合成したペプチドは、炭水化物ＧＡＧ部分を組み込むためのクリック反応を受け、その反応を逆相ＨＰＬＣによってモニターする。反応混合物をテトラヒドロフラン／メタノールから沈殿させ、それらのナトリウム塩形態に変換し、その塩をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【００９４】
本明細書において用いる場合、用語「クロマトグラフィー」は、混合物を分離する技術を指す。クロマトグラフ分離が、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む（しかしこれらに限定されない）ことは、当業者には理解されるであろう。クロマトグラフィーの一例は、サイズ排除クロマトグラフィーである。
【００９５】
本明細書に開示するコラーゲン分子は、治療に使用することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示のコラーゲン分子を投与することを含む、治療を必要とする患者を処置する方法を提供する。
【００９６】
本明細書において用いる場合、用語「治療」、「処置」またはこれらの文法上の変形は、病気に随伴する症状の緩和を指す。
【００９７】
本明細書において用いる場合、用語「投与」または「投与する」は、創傷治癒、薬物送達および治療を目的とする生物への本発明の修飾コラーゲン分子もしくはその医薬的に許容され得る塩のまたは修飾コラーゲン分子もしくはその医薬的に許容され得る塩を含有する医薬組成物の送達を指す。
【００９８】
適切な投与経路としては、限定ではないが、経口、直腸、経粘膜もしくは腸管投与、または筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内もしくは眼内注射を挙げることができる。あるいは、コラーゲン分子を全身的にではなく局所的に、例えば、組織への化合物の直接注射によって投与することができる。
【００９９】
本明細書に開示するコラーゲン分子を化粧品にも使用することができる。本明細書において用いる場合、用語「化粧品」は、対象の身体構造または機能に影響を及ぼすことなく対象の外観を変えるために利用され得る製品を指す。化粧品に対象の治癒または処置などの医療効果がないことは、一般に理解されるであろう。例えば、化粧品を使用して、シワ、シミまたは瘢痕の外観を減少させることができる。
【０１００】
本明細書に開示するコラーゲン分子を組織工学にも使用することができる。本明細書において用いる場合、用語「組織工学」は、インビトロ組織合成を指す。組織工学を用いて、組織置換または修復用の組織を合成することができる。例えば、組織工学を用いて、コラーゲン、骨、血管、皮膚および軟骨を合成することができる。組織工学の重要な構成要素は、足場である。組織工学は、皮膚の合成に最もよく用いられる。したがって、本明細書に開示するコラーゲン分子を皮膚組織工学に使用することができる。
【０１０１】
したがって、本明細書に開示するコラーゲン分子を足場の構築にも使用することができる。本明細書において用いる場合、「足場」は、細胞接着のための支持体となる構造を指す。足場は、細胞外マトリックスなどの組織を模倣する３次元構造を指すこともある。足場は、天然源に由来することもあり、または合成品であることもあり、およびセラミック、合成ポリマーまたは天然ポリマーであることがある。足場は、様々なタイプの生体材料から成る複合材であることもある。足場の例としては、ポリスチレン、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲンおよびコラーゲン複合材が挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン複合材足場の一例は、コラーゲン−グリコサミノグリカン複合材足場である。
【０１０２】
本明細書に開示するコラーゲン分子は、組織工学用の生体材料として使用することもできる。本明細書において用いる場合、用語「生体材料」は、生体系内で相互作用する物質、構造または表面を指す。生体材料は、天然源から得られることもあり、または合成品であることもある。生体材料の例としては、ヒドロゲル、ポリマーおよびセラミックが挙げられるが、これらに限定されない。生体材料の一例は、コラーゲンに基づく足場である。
【０１０３】
本発明は、本明細書に開示のコラーゲン分子と１つ以上の賦形剤とを含む組成物も提供する。
【０１０４】
本明細書において用いる場合、「組成物」または「医薬組成物」は、本明細書に記載する１つ以上の化合物またはそれらの生理的に／医薬的に許容され得る塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分、例えば生理的に／医薬的に許容され得る担体および賦形剤、との混合物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与の助長である。
【０１０５】
本発明の組成物は、当技術分野において周知の製法によって、例えば、従来の混合物、溶解、造粒、糖衣錠作製、水簸、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥法によって、製造することができる。
【０１０６】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を助長する賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理的に許容され得る担体を使用して従来の手法で製剤することができる。妥当な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１０７】
注射のために、本発明の化合物を水溶液中で、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液または生理食塩水緩衝液中で、製剤することができる。経粘膜投与のために、透過させるバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。かかる浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。
【０１０８】
経口投与のために、当技術分野において周知の医薬的に許容され得る担体と活性化合物を併せることによって化合物を製剤することができる。かかる担体によって、患者による経口摂取用の錠剤、ピル、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして本発明の化合物を製剤することが可能になる。固体賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、その顆粒混合物を、所望される場合には他の適切な助剤の添加後に、加工して錠剤または糖衣錠コア得ることによって、経口用の医薬品を製造することができる。有用な賦形剤は、特に、増量剤、例えば糖（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）、セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプンおよび馬鈴薯デンプンなど、ならびに他の材料、例えばゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望される場合には、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸を添加してもよい。アルギン酸ナトリウムなどの塩も使用してよい。
【０１０９】
経口使用することができる組成物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とで造られた密封軟カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および場合により安定剤との混合物で含有することができる。軟カプセルの場合、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁されることがある。
【０１１０】
本明細書に開示するコラーゲン分子をグリコサミノグリカンに基づく薬学に使用することもできる。本明細書において用いる用語「グリコサミノグリカンに基づく薬学」は、医薬、薬物および医薬化合物の開発におけるグリコサミノグリカン系化合物の使用を指す。
【０１１１】
したがって、本発明は、薬物送達に使用するための、本明細書に開示のコラーゲン分子も開示する。本明細書において用いる用語「薬物送達」は、本明細書で定義するとおりの適切な経路による組成物、化合物、医薬、薬物または薬剤の投与を指す。
【０１１２】
コラーゲンは、皮膚などの線維組織における主要タンパク質であるので、本明細書に開示するコラーゲン分子を創傷治癒にも使用することができる。
【０１１３】
本明細書において用いる場合、用語「創傷治癒」は、皮膚または結合組織の外傷の修復を指す。創傷は、傷害に起因することがあり、例えば、外科手術、穿刺、切断、火傷または断裂に起因することがある。したがって、本明細書に開示のコラーゲン分子は、皮膚置換または皮膚修復に使用することができる。皮膚置換および皮膚修復は、美容的であることもあり、または治療的であることもある。
【０１１４】
本明細書において例示的に説明する本発明は、本明細書に具体的に開示していない何らかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の不在下で適切に実施されることもある。したがって、例えば、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有すること」などは、拡張的におよび制限なく読まれるものとする。加えて、本明細書において用いる用語および表現は、説明の用語として使用しており、限定の用語として使用しておらず、かかる用語および表現の使用には、示す特徴および記載する特徴またはそれらの一部についてのいずれの等価物も排除する意図がなく、様々な修飾形態が請求項記載の本発明の範囲内で可能であると認識している。したがって、本発明を好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書に開示する本発明内で実施される本発明の修飾形態および変形形態に当業者が頼ることもあること、ならびにかかる修飾形態および変形形態が本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。
【０１１５】
本発明を本明細書において広くおよび包括的に説明してきた。この包括的開示内に入るより狭義の種および亜属分類の各々も、本発明の一部を構成する。これは、削除される材料が本明細書中で具体的に挙げられているか否かにかかわらず、その属から何らかの主題を除去するという条件または否定による制限付きで、本発明の包括的説明を含む。
【０１１６】
他の実施形態は、後続の特許請求の範囲の範囲内であり、非限定的な例である。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、本発明がマーカッシュ群の任意の個々の構成員または構成員の亜群によっても記載されていることは、当業者には分かるであろう。
【０１１７】
実験セクション
特定の実施例を参照することによって、本発明の非限定的な例および比較例をさらにより詳細に説明することにする。これらの特定の実施例を、いかなる点においても、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０１１８】
【実施例１】
【０１１９】
この実施例は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有コラーゲン模倣ペプチド（ＣＭＰ）の設計を説明するものである。
【０１２０】
ＧＡＧ含有ＣＭＰを、ペプチド鎖にコンドロイチン硫酸（ＣＳ）Ａ二糖モチーフを組み込むように設計した。このＣＳ−Ａモチーフは、関節の機械的特性、タンパク質機能の修飾およびコラーゲン線維のタンパク質分解耐性を含むユニークな生物学的特性を軟骨組織にもたらす。それ故、２つの異なるＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａドメインから成る配列特異的ペプチドを設計した。これらのペプチドは、ペプチド鎖の中核に荷電残基を有する、異なる反復トリプレットを含有した（図５Ｂ）。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ配列における荷電残基の位置優先度に基づいて、ＣＳ−Ａ二糖単位をＸａａ位置（１）におよびＬｙｓまたはＡｒｇのいずれかをＹａａ位置（２および３）に導入した。２本の異なる鎖内に存在する負荷電基と塩基性残基間の相補的静電相互作用は、ホモ三量体構築よりヘテロ三量体らせんの形成を助長することになった（図５Ａ）。核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いるコラーゲン三重らせん（ＣＴＨ）の組成分析のために、１５Ｎ濃縮グリシンを含有するペプチド４も設計した。すべての場合、側鎖との相互作用を回避するためにＣおよびＮ末端をアミド化またはアセチル化した（図５Ｂ）。
【０１２１】
【実施例２】
【０１２２】
この実施例は、ペプチドの合成を説明するものである。
【０１２３】
アルキン官能化ＣＳ−Ａ二糖単位を先ず合成した。簡単に言うと、ＴＭＳ保護アルキンを含有する完全保護二糖５に４を変換した後、Ｎ−トリクロロアセチル基をｎ−トリブチルスタンナンおよび２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）でＮ−アセチル同族体（ｃｏｇｎｅｒ）に還元した。ベンジリデンアセタール６の加水分解、続いてＴＭＳ基の脱保護により、ジオール７を得た。手持ちのこの重要な中間体を用いて合成を継続し、シアン化ベンゾイルを使用してＣ６ヒドロキシル基を選択的にベンゾイル化して作用物質８を得た。ＳＯ３−トリメチルシラン錯体の処理、続いてＬｉＯＯＨおよびＮａＯＨの逐次的処理によって、所望のＣＳ−Ａ二糖９の生成に成功した（スキーム１Ａ）。
2016520585.tif 000009
【０１２４】
スキーム１．Ａ）アルキン官能化ＣＳ−Ａ二糖の合成、Ｂ）ペプチド１の合成のためのクリック反応
【０１２５】
固体支持体を用いる標準Ｆｍｏｃケミストリーによってすべてのペプチド誘導体を調製した。所望のペプチドをトリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ）カクテル［で樹脂から切断し、逆相ＨＰＬＣによって均質に精製し、質量分析によって特性評価した。クリック反応をヨウ化銅（Ｉ）の存在下で行い、アジドペプチドの消費を分析逆相ＨＰＬＣによってモニターした。得られた反応混合物をテトラヒドロフラン／メタノール（ＴＨＦ／メタノール）から沈殿させ、そのナトリウム塩に変換した。サイズ排除クロマトグラフィーによる精製によって、ＣＳ−Ａ二糖単位を含有する所望のペプチド１を得た（スキーム１Ｂ）。
【０１２６】
【実施例３】
【０１２７】
この実施例は、合成されたペプチドの特性評価を説明するものである。
【０１２８】
調製に成功したペプチドを用いて、円偏光二色性（ＣＤ）研究を行ってそれらのホモ三量体特性を特性評価した。５℃での３つすべてのペプチドのＣＤトレースは、２２４〜２２６ｎｍの最大ポジティブバンドおよび１９８〜２０１ｎｍの最小ネガティブバンドを有するポリプロリンＩＩ型（ＰＰＩＩ）らせんプロファイルを表示した。しかし、２５℃で、ペプチド３はＰＰＩＩらせん構造を保持したが、１と２は両方とも、約２０２ｎｍの最小ネガティブピークしか有さないランダムコイル高次構造を呈示した（図６Ａおよび６Ｂ）。熱アンフォールディング実験を５℃〜８０℃の範囲でさらに行った。おそらく荷電残基間のらせん間静電反発力（ｒｅｐｌｕｓｉｏｎ）のため、１と２は両方とも、弱いＰＰＩＩらせんまたは楕円率が直線的に減少する不規則構造であると判明した（図６Ｃおよび６Ｄ）。その一方で、ペプチド３については協調的三重らせんアンフォールディングが観察され、Ｔｍ値は３９．４℃であった（図６Ｃおよび６Ｄ）。この結果は、Ａｒｇ側鎖が隣接鎖内の主鎖カルボニル基と相互作用し、それによって三重らせん安定性を向上させる、以前の研究によって支持される。
【０１２９】
全電荷を中性にするための１：２のモル比での１−２のヘテロ三量体構築を次に評価した。２２４ｎｍの最大ポジティブバンドおよび１９８ｎｍの最小ネガティブバンドを有する典型的なＰＰＩＩらせん高次構造が低温で同定された（図７）。熱アンフォールディング実験は、アンフォールディング曲線の一次導関数が単一の転移を表示したので、１６．９℃のＴｍを有する主ヘテロ三量体種の存在を示した。
【０１３０】
アニーリングも行って、動力学的に捕捉された一切の種を解離させることにより熱力学的に最も好適な三重らせんを動作させ、アニールされていない三量体類似した１７．４℃のＴｍを有する同一のアンフォールディングプロファイルが観察された。これらの結果により、負荷電ＣＳ−Ａ二糖が隣接鎖内のＬｙｓ残基との相互作用によってＣＴＨ鎖内に十分収容されている（ａｃｃｏｍｏｄａｔｅｄ）が、両方の個々のペプチド成分がホモ三量体を形成しないことが実証された。この結果は、単一のプロリン残基であっても嵩高い単位でのその置換はＣＴＨを不安定化させ得るので、ペンダント糖の寸法を大いに考えさせるものである。しかし、このヘテロマー構築の実証にもかかわらず、低い熱安定性がその実際的応用を制限することになった。
【０１３１】
それ故、Ａｒｇ残基を含有する１−３の組み合わせを調査した。Ｌｙｓ組み合わせの結果から予想してこの混合物についての典型的なＰＰＩＩらせん高次構造を同定した（図７Ｂ）。予熱して／せずに熱アンフォールディング実験をさらに行い、同一の単一協調転移曲線が両方の場合に観察され、Ｔｍ値は、ホモ三量体３のＴｍよりわずかに高いおおよそ４２℃であった（図６Ｅおよび６Ｆ）。加えて、観察された平均残基楕円率（ＭＲＥ）は、１−３の加重平均よりほぼ４０％高かった。これは、１の無秩序ＰＰＩらせん高次構造から組織的ＰＰＩＩらせん高次構造への変換を示唆している（図６Ｅ）。注目すべきこととして、１−３のＴｍは、Ｌｙｓ残基を含有するものより著しく（ΔＴｍが２４．９℃）高かった。この結果は、（ＥＯＧ）１０−２（ＰＲＧＰＯＧ）５混合物のＴｍ値と（ＥＯＧ）１０−２（ＰＫＧＰＯＧ）５混合物のＴｍ値が中性リン酸緩衝液中ではたった７．５℃のわずかな差しかないので、ＣＴＨを安定させる点でのスルファート−グアニジニウム相互作用の有意性を強調する。それにもかかわらず、組成情報の欠如によりヘテロ三量体構築を確証する能力は制限された。ＣＤ試験では構築されたペプチドのフォールディングおよび安定性について概要しかつかめないからである。特に、ペプチド３の融解曲線は、１−３の混合物とまったく同様であり、これが互いの区別を困難にした。
【０１３２】
それ故、１−３のヘテロ三量体形成をさらに明らかにするために２Ｄ分解能ＮＭＲ測定を行った。ＷＧ−（ＰＯＧ）２−（ＰＲＧ）４−（ＰＯＧ）２ペプチドの５番目のトリプレットのグリシン残基を１５Ｎ同位体で標識した。すべての試料をアニールし、その後４℃でインキュベート、そして試料溶液中でのペプチドの単量体状態を回避するために１５℃で分析した。ホモ三量体４の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣ（異核種単一量子相関）スペクトルは、同様の集団に関する２つの異なる化学シフトを表示した（図８）。これは、ＣＴＨ内の異なる化学的環境に起因し得る。ペプチド４は鎖内に２セットのドメイン、ＰＯＧおよびＰＲＧトリプレット、を含有するからである。その一方で、１と３の混合物は、ヘテロ三量体構築物における主レジスタに対応する１つのピークと副レジスタからの追加の小さい交差ピークとを示した。ホモ三量体４からのピークが観察されなかったことは注目に値する（図８）。ペンダントＣＳ−Ａ二糖と主鎖アミドの相互作用によって生じる偏りのある結果の可能性を排除するために、本発明者らは、次に、４の溶液に過剰な一価ＣＳ−Ａ二糖を添加することによって化学シフトに対するペンダント糖の影響を検査したが、ＨＳＱＣで化学シフトの変化を示すピークは検出されなかった（図８および図９）。最後に、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、ヘテロ三量体１−３の熱力学的性質を解明した（図８）。１つの主吸熱転移が２５〜４７℃の範囲で同定され、Ｔｍが約４１．３℃と判定され、これにより円偏光二色性およびＨＳＱＣ研究での前の観察、１−３のＣＴＨ内の単一主レジスタの存在、が裏付けられた。
【０１３３】
上で述べたホモおよびヘテロ三量体の融解温度を表１に提示する。
表１．ホモおよびヘテロ三量体の融解温度
2016520585.tif 000010
［ａ］フォールディングされている画分の導関数プロットの最小値を用いて融解温度（Ｔｍ）を示す；［ｂ］ペプチドを１：２の比で混合した；［ｃ］ペプチドを予熱して確実に平衡させた；［ｄ］予熱した１−３のＴｍをＤＳＣによって判定した。
【０１３４】
ペプチド１〜５についての分析ＨＰＬＣトレースおよびＥＳＩ質量データを図１０〜１４にそれぞれ示す。
【０１３５】
【実施例４】
【０１３６】
この実施例は、アルキン官能化ＣＳ−Ａ二糖合成手順を説明するものである。
【０１３７】
別段の記述がない限り、反応は、火炎乾燥したガラス器具で、アルゴン雰囲気下、無水溶媒を使用して行った。すべての市販試薬は、別段の断りがない限り、受け取ったまま使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ２５４プレコートプレート（０．２５ｍｍ）を使用して行った。展開クロマトグラムの可視化は、必要に応じてＵＶ、モリブデン酸アンモニウムセリウム、またはニンヒドリン染色剤によって行った。Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（粒径０．０４０〜０．０６３ｍｍ）をフラッシュクロマトグラフィーに使用した。ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５ウルトラファイン）を用いてペプチド１の精製を果たした。
【０１３８】
１Ｈ  ＮＭＲおよびプロトンデカップリング実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩＩ  ４００（４００ＭＨｚ）分光計で記録した。それらをＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ（４．８７ｐｐｍ）、Ｄ２Ｏ（４．８０ｐｐｍ）、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ（１：１）（３．４９ｐｐｍ）およびＣＤＣｌ３／ＣＤ２Ｃｌ２（０．５％ＴＭＳを含有）／ＣＤ３ＯＤ（１：４．５：４．５）（３．４９ｐｐｍ）に対する百万分率（δ）で報告する［１］。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは、次のように報告する：化学シフト（δ  ｐｐｍ）、多重度（ｓ＝一重線、ｂｓ＝広幅一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線）、Ｈｚでのカップリング定数、そして積分値。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩＩ  ４００（１００ＭＨｚ）分光計で得た。それらを化学シフトで報告する。質量スペクトルは、Ｎａｉｔｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｒｅから得た。
【０１３９】
３−トリメチルシリルプロパルギルＯ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロナート）−（１→３）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド５：ドナー４（０．５００ｇ、０．５７３ｍｍｏｌ）をトルエン（３×５ｍＬ）と共蒸発させ、真空下で一晩乾燥させた。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（７．３５ｍＬ）中の４および３−トリメチルシリルプロパルギルアルコール（０．４２５ｍＬ、２．８６３ｍｏｌ）の溶液に４Å粉末モレキュラーシーブを添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、−７８℃に冷却し、その後、さらに３０分間撹拌した。−７８℃のトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２２７ｍＭ、０．１１５ｍｍｏｌ、５００μＬ）を反応物に滴下した。反応物を−１５℃に温め、２時間撹拌し、トリエチルアミンで失活させた。反応混合物をＣｅｌｉｔｅに通して濾過し、濃縮して黄色シロップを得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１％→２％２−プロパノール：ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、やや不純な５を薄黄色固体として得た。その後、その不純な５をフラッシュクロマトグラフィー（２％→５％ＴＨＦ：［１：２  ヘキサン：ＣＨ２Ｃｌ２］）によってもう一度精製して、純粋な５（０．２９５ｇ、６１％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．４５（６：３：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン：ＴＨＦ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．５３（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．３８−７．３３（ｍ，３Η，ＡｒＨ），６．９７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ），５．５９（ｓ，１Ｈ，ＰｈＣＨ），５．２３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ’），５．２３（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），５．１６（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．０４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．９０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ），４．７７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．４６（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．４０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．３３（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），４．１０（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），４．０３（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），３．８３−３．７７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．７２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．５５（ｓ，１Η，Η−５’），２．０１（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．０１（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．００（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），１．９９（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），０．１６（ｓ，９Η，Ｓｉ（ＣＨ３）３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７０．２０，１６９．５７，１６９．３２，１６７．３２，１６２．２７，１３７．８０，１２８．９９，１２８．２４，１２６．３３，１００．８３，１００．４０，１００．１７，９６．１０，９２．５４，９２．４８，７５．７６，７４．２２，７２．５７，７２．１２，７１．４０，６９．２２，６９．１４，６６．７６，５６．５３，５５．０３，５３．０４，２０．９７，２０．７２，２０．６３，−０．０６；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ３４Ｈ４２Ｃｌ３ＮＯ１５Ｓｉ＋Ｎａ］＋につ���ての計算値：８６０．１２８２、実測値：８６０．１２９６。
【０１４０】
３−トリメチルシリルプロパルギルＯ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロナート）−（１→３）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド６：Ｂｅｌｏｔら［２］から変更した手順を用いてトリクロロアセトアミド基の反応を行った。二糖５（０．３５３ｇ、０．４２１ｍｍｏｌ）をトルエン（８．７ｍＬ）に溶解し、トリブチルスタンナン（１１３２μＬ、４．２１ｍｍｏｌ）および２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（３４．５ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を８０℃に加熱し、さらに４時間３０分間撹拌した。その後、反応物を室温に冷却し、濃縮して白色固体を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（３→１１％ＴＨＦ：ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、所望のアセトアミド６（０．２８１ｇ、９１％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．２５（４％ＴＨＦ：ＣＨ２Ｃｌ２）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．５３（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．３７−７．３２（ｍ，３Η，ＡｒＨ），５．８１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ），５．５６（ｓ，１Ｈ，ＰｈＣＨ），５．２５−５．１８．（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−１’），５．０１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．９２−４．８８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１，Ｈ−３’），４．４３−４．３６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．３０（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６’），４．０８−４．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−６’），３．７０（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．５３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５’），３．４７−３．４１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．０２（ｓ，６５Ｈ，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．００（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），１．９８（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），０．１８（ｓ，９Η，Ｓｉ（ＣＨ３）３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８１７１．３１，１７０．２９，１６９．５９，１６９．１８，１６７．４７，１３７．９０，１２８．９２，１２６．３７，１００．８５，１００．８１，１００．５７，９７．０７，９１．８８，７５．９８，７５．１６，７２．５２，７２．０３，７１．７４，６９．２９，６９．１８，６６．６０，５６．７５，５４．３１，５２．９８，２３．９８，２０．８６，２０．７５，２０．６５，−０．０７；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ３４Ｈ４５ＮＯ１５Ｓｉ＋Ｎａ］＋についての計算値：７５８．２４５６、実測値：７５８．２４６９。
【０１４１】
２−プロパルギルＯ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロナート）−（１→３）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド７：アセトアミド６（０．３５３ｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ／水（４：１、３．０ｍＬ）に溶解し、８０℃で撹拌した。３０分後、反応混合物を冷却し、濃縮した。得られた濃縮物をＡｃＯＨの完全除去のためにトルエン（３×３ｍＬ）と共蒸発させた。
【０１４２】
ＴＨＦ（３．７ｍＬ）中の粗製ジオール（０．２４２ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）の溶液にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、０．４４８ｍｍｏｌ、４４８μＬ）を添加し、混合物を０℃で１．５時間撹拌した。この時点で、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＩＲ−１２０樹脂の添加を行い、反応物をさらに３０分間撹拌した。濾過後、混合物を濃縮して薄黄色固体を得た。その残留物をフラッシュクロマトグラフィー（５→７％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、所望の化合物（０．１４７ｇ、５３％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．３０（１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ５．３５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．１１（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），５．００（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，９．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．９１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ），４．６６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Η−１’），４．４３−４．３７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．２９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．００−５３．９８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．９１−３．８９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３＊），３．８１−３．７２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’），３．７５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．５４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），２．８７（ｔ，Ｊ’＝２．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ≡ＣＨ），２．０６（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３），２．０３（ｓ，３Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．００（ｓ，３Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１７３．４１，１７１．４８，１７１．２１，１６９．３１，１０２．６０，１００．５０，８１．３６，８０．１４，７６．４７，７６．１３，７３．４５，７２．９５，７２．５７，７０．８４，６９．１７，６２．４０，５６．４３，５３．４１，５２．５６，２３．４０，２０．９７，０２０．７７，２０．４９，２０．４１；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ２４Ｈ３３ＮＯ１５＋Ｎａ］＋についての計算値：５９８．１７４８、実測値：５９８．１７６０。
【０１４３】
２−プロパルギルＯ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロナート）−（１→３）−６−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド８：二糖７（３０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２．１ｍＬ）に溶解し、これにシアン化ベンゾイル（２０．６ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１０．２ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３時間撹拌し、その後、濃縮して黄色固体を得た。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１→４％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、所望の化合物８（２７．８ｍｇ、７８％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．４５（１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ３／ＣＤ３ＯＤ（１：１））：δ８．１９−８．１７（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．７６−７．７０（ｍ，１Η，ＡｒＨ），７．６３−７．５９（ｍ，２Η，ＡｒＨ），５．４５（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．２７（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），５．００（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ’），４．９７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ），４．７２−４．６５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６’），４．５２−４．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．３５−４．３０（ｍ，３Η，Η−５，Η−３’，Η−４’），４．０５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），４．０１−３．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．８３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．３２（ｔ，Ｊ＝２．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ≡ＣＨ），２．２１（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３），２．１９（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．１７（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．１４（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１７４．０８，１７２．３１，１７１．９９，１７１．９５，１６９．８６，１６８．６２，１３５．１８，１３１．６６，１３１．４８，１３０．３６，１０３．２４，１００．２６，８１．１６，８０．５３，７６．９１，７４．１４，７３．９１，７３．５７，７３．０８，７１．３７，６９．７５，６５．４３，５７．４５，５４．７１，５３．７９，２４．６２，２２．０７，２２．００；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ３１Ｈ３７ＮＯ１６＋Ｎａ］＋についての計算値：７０２．２００５、実測値：７０２．２０２７。
【０１４４】
２−プロパルギルＯ−（ナトリウム−β−Ｄ−グルコピラノシルウロナート）−（１→３）−４−Ｏ−ナトリウムスルホナト−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド９：無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物８（０．０２０ｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）の溶液に三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＳＯ３・ＴＭＡ）（０．０２５ｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で３６時間撹拌し、その後、室温に冷却した。生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（５０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）、続いてシリカゲルクロマトグラフィー（５％→１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、硫酸化二糖（０．０１６ｇ、７３％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．１８（１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，１：４．５：４．５ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ：ＣＤ２Ｃｌ２  ０．０５％ｖ／ｖＴＭＳ含有）：δ８．１６−８．１２（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．６９−７．６５（ｍ，１Η，ＡｒＨ），７．５６−７．５２（ｍ，２Η，ＡｒＨ），５．４０（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．２７（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），５．２１（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），４．９８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．９１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Η−１’），４．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ），４．７９−４．６９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６’），４．４２−４．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．３０−４．２１（ｍ，２Η，Η−５，Η−３’），４．１０−４．０５（ｍ，１Η，Η−５’），３．９４−３．８６（ｍ，１Η，Η−２’），３．８１（ｓ，３Η，ＯＣＨ３），２．６３（ｔ，Ｊ＝２．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ≡ＣＨ），２．１７（ｓ，３Η，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３），２．１２（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．０９（ｓ，３Η，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１７４．３４，１７２．７３，１７２．１４，１７２．０４，１７０．７７，１６８．５７，１３５．０１，１３１．８３，１３１．４８，１３０．２７，１０２．７９，９９．９１，８０．３９，７９．５７，７８．９６，７６．８３，７４．０７，７３．７２，７３．６８，７２．９２，７１．２９，６６．０２，５７．３３，５５．６１，５５．５３，５５．３４，５５．０７，５４．９８，５３．９２，５１．１７，５０．９５，５０．７４，５０．５３，２４．５６，２２．２５，２２．０７，２２．０１；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ３１Ｈ３７ＮＯ１９Ｓ＋Ｎａ］＋についての計算値：７８２．１５７３、実測値：７８２．１５８８。
【０１４５】
その硫酸化化合物（１６０ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６８４μＬおよびＨ２Ｏ（３３８μＬ）に溶解し、０℃に冷却した。これに１Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（２７０μＬ）および３０％Ｈ２Ｏ２（１３５μＬ）を添加した。反応物を０℃で１時間、そして室温で１２時間撹拌した。この時点で、４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（２０３μＬ）およびＭｅＯＨ（１００８μＬ）を添加し、反応物をさらに１２時間撹拌した。その後、それをＡｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＩＲ−１２０樹脂で中和し、濾過し、凍結乾燥させて橙色固体を得た。その生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５（１００％Ｈ２Ｏ）によって精製し、凍結乾燥させて、９を白色固体として得た（１０３ｍｇ、８７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．８６（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．７７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ’），４．５１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−ｌ），４．４５（ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ），４．１４−４．０４（ｍ，２Η，Η−２’，Η−３’），３．８７−３．７９（ｍ，３Η，Η−５’，Η−６’，Η−６’），３．７４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），３．５７（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），３．４９（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），３．３８（ｄｄ，Ｊ＝９．２，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），２．９３（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ≡ＣＨ），２．０５（ｓ，３Η，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２０）：δ１７５．２２，１７４．９０，１０３．３０，９９．３７，７８．６９，７６．３０，７６．２１，７６．０１，７５．０３，７４．８８，７４．６０，７２．４５，７１．６５，６０．９５，５６．７０，５１．５３．２２．２７；ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ１７Ｈ２５ＮＯ１５Ｓ−Ｈ］−についての計算値：５１４．０８６７，実測値：５１４．０８６７．
【０１４６】
化合物５、６、７、８および９の１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図１５〜２６に示す。
【０１４７】
【実施例５】
【０１４８】
この実施例は、固相ペプチド合成の一般手順を説明するものである。
【０１４９】
自動合成装置Ｔｉｔａｎ  ３５７（ＡＡＰＰＴＥＣ）を使用することによりペプチドライブラリーの合成を行った。５０ｇのＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂（０．４８ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器（ＲＶ）の中で５分間、ＮＭＰ（１ｍＬ）に膨潤させた。排液して、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン（１ｍｌ、体積／体積）を添加し、ＲＶを３分間、ボルテックスにかけた。排液し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンの新たな溶液（１ｍＬ、体積／体積）を添加し、ＲＶをさらに１２分間、ボルテックスにかけた。得られたビーズをＮＭＰ（１ｍＬ×２）、メタノール（１ｍＬ×２）およびＤＣＭ（１ｍＬ×２）によって入念に洗浄した。得られた樹脂を１５分間、ＮＭＰ（１ｍＬ）で膨潤させて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．５当量、ＮＭＰ中０．２Ｍ溶液）をそのＲＶに添加し、ＴＢＴＵ（２．５当量、ＮＭＰ中０．２Ｍ溶液）およびＤＩＥＡ（５．０当量、ＮＭＰ中０．５Ｍ）も添加した。得られた混合物を４５分間、ボルテックスにかけた。排液して、得られたビーズをＮＭＰ（１ｍＬ×３）によって入念に洗浄した。所望のペプチド配列に到達するまでカップリング工程を繰り返した。１０分間の無水酢酸（１０当量、０．５Ｍ溶液）およびＤＩＥＡ（２０当量、ＮＭＰ中０．５Ｍ）の処理によってＮ末端をＮアセチル基で修飾した。樹脂をＮＭＰ（１ｍＬ×３）によって洗浄し、ＤＣＭ（２ｍＬ×３）を使用して、フィルターを装着した４ｍＬ反応器に移した。樹脂を減圧下で２時間乾燥させた後、１８０度シェーカを用いてＴＦＡ−水−ＴＩＳ（１．５ｍＬ、９４／３／３、体積／体積）の切断カクテルでペプチドを切断し、同時に残基の酸不安定性保護基も外した。溶液を回収し、連続窒素流の中で濃縮し、その粗製ペプチドをジエチルエーテル中で沈殿させた。その後、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリルを移動相として使用するＣ−１８逆相分取カラム（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）、２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ）での分取ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ）によってその得られた白色固体を＞９８％に精製し、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣおよび質量分析（ＵＰＬＣ／ＭＳ）で特性評価した。
【０１５０】
ペプチド１〜５のＨＰＬＣ条件およびＥＳＩ質量データを表２および３にそれぞれ提供する。
表２．ペプチドの分析ＨＰＬＣ条件
2016520585.tif 000011
＊Ａ：ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
表３．ペプチドのＥＳＩ−ＭＳデータ
2016520585.tif 000012
【０１５１】
【実施例６】
【０１５２】
この実施例は、クリック反応によるペプチド１の合成手順を説明するものである。
【０１５３】
小バイアルにアルゴン雰囲気下でアルキン官能化ＣＳ−Ａ二糖（４．６ｍｇ、４．４当量、８．５５９μｍｏｌ）、ペプチド５（４．６ｍｇ、１．０当量、１．９４１μｍｏｌ）、トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ、アジド当たり０．３当量）および小型撹拌子を投入した。その混合物を脱気ＤＭＳＯ（１５０μＬ）に溶解し、所望の量のヨウ化銅（Ｉ）保存溶液（ＤＭＳＯ中７．８７６ｍＭ保存（ｓｏｔｃｋ）溶液３μＬ、アジド当たり０．３ｍｏｌ％）およびＤＩＰＥＡ（１８μＬ、５３当量、０．１０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５日間撹拌した。Ｃ−１８カラムを装着した分析逆相ＨＰＬＣによってペプチド５の消費をモニターした。完了後、溶媒を除去し、白色沈殿を２００μＬの６Ｍ  ＮａＣｌ水溶液に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラム（１００％Ｈ２Ｏ）によって精製して、凍結乾燥によりペプチド１を白色固体として得た。
【０１５４】
【実施例７】
【０１５５】
この実施例は、円偏光二色性（ＣＤ）分析を説明するものである。
【０１５６】
温度コントローラを装着したＡｖｉｖ  ４１０偏光二色性分光計でＣＤスペクトルを記録した。２００μＭの濃度のペプチド溶液を使用した。１０ｍＭ  二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で作ったすべての試料を２４時間、４℃で平衡させた後、ＣＤ測定した。１ｍｍ路長の石英セルを使用した。波長スキャンのために、温度を１０℃／時の速度で所望の点まで上昇させ、試料溶液を１０分間平衡させた後、測定した。２６０〜１９０ｎｍでスペクトルを記録し、次のように平均残基楕円率（θ）を計算した：
［θ］＝θ／（１０・Ｎ・ｃ・ｌ）
θは、ミリ度での楕円率を表し、Ｎは、アミノ酸残基数を表し、ｃは、ｍｏｌ・Ｌ−１でのモル濃度を表し、ｌは、ｃｍでのセル路長を表す。０．２ｍＭの最終ペプチド濃度で熱変性曲線を得、２２５ｎｍでのモル楕円率を、１０℃／時の加熱速度で５〜８０℃の範囲の温度の関数として測定した。アニールされたすべての試料を３０分間８５℃で加熱し、続いて１℃／分の速度で４℃に冷却し、続いて２４時間、４℃で平衡させた後、測定した。融解曲線の一次導関数の最小点から融解温度を決定した。
【０１５７】
【実施例８】
【０１５８】
この実施例は、１Ｈ，１５Ｎ−異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）実験を説明するものである。
【０１５９】
温度ユニットとＣｒｙｏＰｒｏｂｅとを装着したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ８００分光計で１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣ実験を記録した。５％Ｄ２Ｏを含有する１０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２００μＭの全ペプチド濃度で、すべての試料溶液を調製した。ホモ三量体試料とヘテロ三量体試料両方を３０分間８５℃で加熱し、その後、１℃／分の速度で４℃に冷却し、続いて２４時間、４℃で平衡させた後、測定した。試料溶液中でのペプチドの単量体状態を回避するために１５℃で測定を行った。水素次元で１１１６０Ｈｚおよび窒素次元で１６２１Ｈｚのスペクトルウィンドウを用いる１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣ実験について、４スキャンで合計１２８０×１２８の複合点を得た。ＮＭＲｐｉｐｅを使用してスペクトルを加工し、Ｓｐａｒｋｙを使用して分析した。二乗余弦釣鐘型窓関数（Ｓｑｕａｒｅ  Ｃｏｓｉｎｅ  ｂｅｌｌ  ｗｉｎｄｏｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）をアポダイゼーション関数として使用し、データを両方の次元で次の２のべき乗にゼロ充填した。必要な場合にはベースライン補正を適用した。
【０１６０】
【実施例９】
【０１６１】
この実施例は、示差走査熱量測定（ＤＳＥ）実験を説明するものである。
【０１６２】
ＤＳＣ実験は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣシステムで行った。ペプチド混合物１−３および緩衝液濃度は、ＣＤ実験の場合と同じであった：２００μＭ全ペプチド濃度および１０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）。ペプチド混合物１−３を３０分間８５℃で加熱し、その後、１℃／分の速度で４℃に冷却し、続いて２４時間４℃で平衡させた後、測定した。測定は、１０℃／時の加熱速度で５〜８０℃の温度範囲で行った。ペプチド曲線を緩衝液の曲線に基づいてベースラインサブトラクションした後にデータ分析を行った。データ分析は、ＭｉｃｒｏＣａｌ−ｅｎａｂｌｅｄ  Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアで行った。
【０１６３】
コラーゲン−ＧＡＧ複合材は、それらのインビボでの生理的有意性を考えると、組織を置換するための生体模倣足場の増えつつある蓄積の重要な部分を占めている。それにもかかわらず、天然材料に関連した欠点が、より洗練された生体材料を開発する努力を妨げている。本明細書において実証するように、相補的静電相互作用に基づいてＧＡＧ含有コラーゲンペプチドを操作することに成功した。負荷電コンドロイチン硫酸モチーフをＣＴＨに効率的に導入し、それによって大量のヘテロ三量体を生成できることも実証した。この設計は、単一フレームワーク内での２つの異なる生体成分のハイブリッド形成を意味する。このアプローチは、合成的に達成可能で生物学的にプログラム可能な模倣構造をもたらす、複雑なＧＡＧ−コラーゲンに基づく足場の構築を大いに単純化することになる。
【図１Ａ】
2016520585.tif 000015
【図１Ｂ】
2016520585.tif 000016
【図２Ａ】
2016520585.tif 000017
【図２Ｂ】
2016520585.tif 000018
【図３】
2016520585.tif 000019
【図４】
2016520585.tif 000020
【図５】
2016520585.tif 000021
【図６Ａ】
2016520585.tif 000022
【図６Ｂ】
2016520585.tif 000023
【図６Ｃ】
2016520585.tif 000024
【図６Ｄ】
2016520585.tif 000025
【図６Ｅ】
2016520585.tif 000026
【図６Ｆ】
2016520585.tif 000027
【図７Ａ】
2016520585.tif 000028
【図７Ｂ】
2016520585.tif 000029
【図８Ａ】
2016520585.tif 000030
【図８Ｂ】
2016520585.tif 000031
【図８Ｃ】
2016520585.tif 000032
【図８Ｄ】
2016520585.tif 000033
【図９Ａ】
2016520585.tif 000034
【図９Ｂ】
2016520585.tif 000035
【図１０】
2016520585.tif 000036
【図１１】
2016520585.tif 000037
【図１２】
2016520585.tif 000038
【図１３】
2016520585.tif 000039
【図１４】
2016520585.tif 000040
【図１５】
2016520585.tif 000041
【図１６】
2016520585.tif 000042
【図１７】
2016520585.tif 000043
【図１８】
2016520585.tif 000044
【図１９】
2016520585.tif 000045
【図２０】
2016520585.tif 000046
【図２１】
2016520585.tif 000047
【図２２】
2016520585.tif 000048
【図２３】
2016520585.tif 000049
【図２４】
2016520585.tif 000050
【図２５】
2016520585.tif 000051
【図２６】
2016520585.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月12日(2015.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３本の鎖を含むコラーゲン分子であって、
少なくとも１本の鎖が一般式：
（Ｘ１−Ｘ２−Ｇ）ｎ
（式中、
Ｘ１またはＸ２は、いずれのアミノ酸またはアミノ酸誘導体であってもよいが、但し、Ｘ１またはＸ２の少なくとも一方がグリコサミノグリカン部分であることを条件とし；
Ｇは、グリシンであり；および
ｎは、正の整数であり、かつ少なくとも１である）
の少なくとも１つの繰り返し単位を含む、前記コラーゲン分子。
【請求項２】
ｎが少なくとも２、または少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも５０、または少なくとも１００、または少なくとも２００、または少なくとも５００、または少なくとも１０００である、請求項１に記載のコラーゲン分子。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカン部分が、少なくとも１つの二糖単位から成る、請求項１または２に記載のコラーゲン分子。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカン部分が、少なくとも１つの負荷電基を含有する、請求項３に記載のコラーゲン分子。
【請求項５】
前記負荷電基が、スルファートまたはカルボキシラートである、請求項４に記載のコラーゲン分子。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロナン、ケラタン硫酸および非硫酸化コンドロイチンから成る群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項７】
前記コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｕ、コンドロイチン硫酸Ｋおよびコンドロイチン硫酸Ｌから成る群より選択される、請求項６に記載のコラーゲン分子。
【請求項８】
前記コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸Ａまたはコンドロイチン硫酸Ｕである、請求項７に記載のコラーゲン分子。
【請求項９】
前記アミノ酸が、正荷電アミノ酸である、請求項１から８のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１０】
前記正荷電アミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから成る群より選択される、請求項９に記載のコラーゲン分子。
【請求項１１】
前記コラーゲン鎖の少なくとも１本が、
Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ｕ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
Ａｃ−（ＰＸＧ）３−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）２−（ＰＸＧ）３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
Ａｃ−（ＰＸＧ）２−（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）４−（ＰＸＧ）２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２
（これらの式中、
Ａｃは、アセチルであり；
Ｐは、プロリンであり；
Ｇは、グリシンであり；
ＣＳ−Ｕは、非硫酸化コンドロイチン硫酸であり；
ＣＳ−Ａは、コンドロイチン硫酸Ａであり；および
Ｘは、ヒドロキシプロリンである）
から成る群より選択される一般式を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１２】
（ＣＳ−Ａ−ＸＧ）が、下記式：
2016520585.tif 000053
を有する、請求項１１に記載のコラーゲン分子。
【請求項１３】
（ＰＸＧ）が、下記式：
2016520585.tif 000054
を有する、請求項１１または１２に記載のコラーゲン分子。
【請求項１４】
治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子を投与することを含む、治療を必要とする患者を処置する方法。
【請求項１６】
化粧品に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１７】
組織工学に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項１８】
前記組織工学が、皮膚組織工学である、請求項１７に記載のコラーゲン分子。
【請求項１９】
足場の構築に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子と１つ以上の賦形剤とを含む組成物。
【請求項２１】
グリコサミノグリカンに基づく薬学に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２２】
組織工学用の生体材料として使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【請求項２３】
薬物送達または創傷治癒に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコラーゲン分子。
【国際調査報告】
2016520585.tif 000055
2016520585.tif 000056
2016520585.tif 000057