(57)【要約】本発明は、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａを含む組み合わせを提供する。かかる組み合わせは、癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）などの高増殖性障害の治療に特に有用である。本発明のある実施形態は、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるキナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態の治療方法を対象とする。【選択図】なし
2016502974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高増殖性障害の治療のための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせ。
【請求項２】
前記高増殖性障害が癌である、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
前記癌がＰＴＥＮ変異に関連している、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
前記癌がＡＫＴの変異、過剰発現又は増幅に関連している、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項５】
前記癌がＰＩ３Ｋ変異に関連している、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項６】
癌が中皮腫、子宮内膜癌、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、胃癌、結腸癌、腎癌、頭頸部癌、及び神経膠腫から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項７】
前記癌が乳癌である、請求項６に記載の組み合わせ。
【請求項８】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項７に記載の組み合わせ。
【請求項９】
ＧＤＣ−００６８又はその薬理学的に許容される塩がＭＥＨＤ７９４５Ａと組み合わせて投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項１０】
ＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩がＭＥＨＤ７９４５Ａと組み合わせて投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項１１】
ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩がＭＥＨＤ７９４５Ａと同時に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項１２】
ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａが順次投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項１３】
高増殖性障害患者の生活の質を改善するために治療的に使用する、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせ。
【請求項１４】
高増殖性障害を治療するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの前記組み合わせ。
【請求項１５】
キナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態を治療するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせ。
【請求項１６】
哺乳類における高増殖性障害を治療するための薬剤の調製における、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせの使用。
【請求項１７】
哺乳類におけるキナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態を治療するための薬剤の調製における、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせの使用。
【請求項１８】
高増殖性障害を治療するために、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩と、ＭＥＨＤ７９４５Ａと、容器と、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの投与を指示する添付文書若しくはラベルと、を含むキット。
【請求項１９】
高増殖性障害の治療において個別、同時又は順次に使用するために、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとを組み合わせ調製物として含む製品。
【請求項２０】
哺乳類にＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせを投与することを含む、哺乳類における高増殖性障害の治療方法。
【請求項２１】
哺乳類にＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩、及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせを投与することを含む、哺乳類におけるキナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態の治療方法。
【請求項２２】
前記哺乳類が、ＥＧＦＲを高発現しているＴＮＢＣとしての治療に選択された、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）のヒトである、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＥＲ３の発現を治療後に測定し、ＨＥＲ３発現の比較的高値は腫瘍の完全退縮に欠けるリスクが高いことを示す、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年１２月０７日に提出した米国出願第６１／７３４，７９６号及び２０１３年１０月０９日に提出した米国出願第６１／８８８，８９２号の優先権を主張するものであり、該出願は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表
本発明は、アスキー形式の電子形式で提出した配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。２０１３年１２月５日作成のかかるアスキーファイルのコピーファイル名は０１０００．０５６ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは８，６７５バイトである。
【０００３】
本発明は、一般に、癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）などの高増殖性障害に対する活性を有する化合物の医薬組合せであり、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路をブロックする化合物とＨＥＲ３／ＥＧＦＲを遮断する化合物との組み合わせを含む医薬組合せに関する。本発明は、また、かかる組み合わせを、哺乳類細胞のインビトロ、インサイチュ、及びインビボによる診断若しくは治療、又は関連する病理状態に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
プロテインキナーゼ（ＰＫ）は、タンパク質のチロシン、セリン及びスレオニンの各残基にあるヒドロキシ基のリン酸化を、ＡＴＰの末端（γ位）のリン酸を転移することにより触媒する酵素である。これらの酵素は、シグナル伝達経路を通して、細胞の成長、分化及び増殖、すなわち細胞生命の事実上すべての面をＰＫ活性に応じた何らかの形で調節している（Ｈａｒｄｉｅ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｈａｎｋｓ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）。さらに、異常なＰＫ活性は、乾癬のような比較的生命を脅かすことはない疾患から膠芽腫（脳腫瘍）のように極めて悪性の疾患まで、各種障害に関連してきた。プロテインキナーゼは、治療的に調節するための重要な標的クラスである（Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １：３０９）。
【０００５】
現在、癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌などの高増殖性疾患の治療に使用できる、改善された方法及び組成物が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｒｄｉｅ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｈａｎｋｓ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １：３０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
高増殖性障害の治療法について、インビトロ及びインビボにおける、癌細胞の成長を阻害する改善された作用を、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを投与することにより達成可能であることが判明した。このような組み合わせや方法は癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌などの高増殖性障害の治療において有用となるであろう。ある実施形態では、組み合わせの投与により相乗作用が得られる。
したがって、本発明のある実施形態は、低分子ＡＴＰ競合的ＡＫＴ阻害剤ＧＤＣ−００６８（式Ｉ）又はその薬理学的に許容される塩（国際公開第２００８／００６０４０号を参照）、
【化１】
2016502974.tif 000003
又はＣＡＳ登録番号９５７０５４−３０−７、化合物名４−（２−（１Ｈ−ンダゾール−４−イル）−６−（（４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル）メチル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル）モルホリンであり、下記構造を有する、ピクチリシブ（ｐｉｃｔｉｌｉｓｉｂ）としても知られる低分子ＡＴＰ競合的ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤ＧＤＣ−０９４１（式ＩＩ）
【化２】
2016502974.tif 000004
又はその薬理学的に許容される塩（米国特許第７，７８１，４３３号；米国特許第８，２４７，３９７号、Ｆｏｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１，  ５５２２−５５３２  （２００８）を参照）を、同一の抗原結合ドメインを２つ含み、それぞれがＨＥＲ３とＥＧＦＲとの双方に特異的に結合する二重作用型抗体（国際公開第２０１０／１０８１２７号ＤＬ１１ｆ（例えば、図３３）及びＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  ２０，  ４７２−４８６  （２０１１）を参照）であるＭＥＨＤ７９４５Ａと組み合わせる、又は頭頸部癌及び結腸直腸癌の治療に現在適応とされている、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗薬ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）と組み合わせる、又は進行疾患を有する、あるいはフルオロピリミジン、オキサリプラチン、イリノテカンによる化学療法レジメン後の、転移性結腸直腸癌腫治療用単剤として現在適応とされている、上皮成長因子受容体拮抗薬Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）と組み合わせることを含む、治療的組み合わせを提供する。
【０００８】
したがって、本発明のある実施形態は、高増殖性障害の治療のためのＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを対象とする。
【０００９】
ある実施形態では、高増殖性障害は癌である。
【００１０】
ある実施形態では、癌はＰＴＥＮ変異に関連している。
【００１１】
ある実施形態では、癌はＡＫＴの変異、過剰発現又は増幅に関連している。
【００１２】
ある実施形態では、癌はＰＩ３Ｋ変異に関連している。
【００１３】
ある実施形態では、癌は中皮腫、子宮内膜癌、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、胃癌、結腸癌、腎癌、頭頸部癌、及び神経膠腫から選択される。
【００１４】
ある実施形態では、癌は乳癌である。
【００１５】
ある実施形態では、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。
【００１６】
ある実施形態では、ＧＤＣ−００６８又はその薬理学的に許容される塩をＭＥＨＤ７９４５Ａと組み合わせて投与する。
【００１７】
ある実施形態では、ＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩ＭＥＨＤ７９４５Ａと組み合わせて投与する。
【００１８】
ある実施形態では、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩をＭＥＨＤ７９４５Ａと同時に投与する。
【００１９】
ある実施形態では、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａを順次投与する。
【００２０】
本発明のある実施形態は、高増殖性障害患者の生活の質を改善するために治療で使用する、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを対象とする。
【００２１】
本発明のある実施形態は、高増殖性障害を治療するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを対象とする。
【００２２】
本発明のある実施形態は、キナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態を治療するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを対象とする。
【００２３】
本発明のある実施形態は、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを、哺乳類における高増殖性障害を治療するための薬剤の調製物において使用することを対象とする。
【００２４】
本発明のある実施形態は、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを、哺乳類におけるキナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態を治療するための薬剤の調製に使用することを対象とする。
【００２５】
本発明のある実施形態は、高増殖性障害（例えば、癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌））を治療するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとを含むキット、容器、及びＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの投与指示が記載された添付文書又はラベルを対象とする。
【００２６】
本発明のある実施形態は、高増殖性障害の治療において個別、同時又は順次に使用するための、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとを組み合わせ調製物として含む製品を対象とする。
【００２７】
本発明のある実施形態は、哺乳類における高増殖性障害（例えば、癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌））の治療方法を対象とし、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを哺乳類に投与することを含む。
【００２８】
本発明のある実施形態は、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩とＭＥＨＤ７９４５Ａとの組み合わせを哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるキナーゼＡＫＴによる調節を受けた疾患又は状態の治療方法を対象とする。
【００２９】
ある実施形態では、哺乳類は、ＥＧＦＲを高発現しているＴＮＢＣとしての治療に選択された、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）のヒトである。
【００３０】
ある実施形態では、治療後にＨＥＲ３の発現を測定し、これにおいてＨＥＲ３発現の比較的高値が腫瘍の完全退縮に欠けるリスクが高いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】（図１Ａ）  図１Ａは、ＴＮＢＣ前臨床モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻害（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の治療活性を示す。図１Ａは、表示された治療を２４時間行った後のＥＧＦＲ、ＨＥＲ３および下流シグナル伝達経路の発現および活性化を示すウェスタンブロットを示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａを１０ｎＭで使用し、一方、ＧＤＣ−００６８およびＧＤＣ−０９４１はどちらも１ｕＭで使用した。  （図１Ｂ）  図１Ｂは、ＴＮＢＣ前臨床モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻害の治療活性を示す。図１Ｂは、表示されたとおりに処理したＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨＣＣ７０細胞の５日増殖分析を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａを１０ｎＭで使用し、一方、ＧＤＣ−００６８およびＧＤＣ−０９４１をどちらも１ｕＭで使用した。  （図１Ｃ）  図１Ｃは、ＴＮＢＣ前臨床モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻害の治療活性を示す。図１Ｃは、示されたとおりに処理されたＴＮＢＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の腫瘍成長曲線を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａを１０ｍｇ／Ｋｇ１週間に２回投与し、ＧＤＣ−０９４１を７５ｍｇ／Ｋｇで毎日投与し、そしてＧＤＣ−００５８を４０ｍｇ／Ｋｇで毎日投与した。  （図１Ｄ）  図１Ｄは、ＴＮＢＣ前臨床モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻害の治療活性を示す。図１Ｄは、示されたとおりに処理されたＰＤＸにおける活性および全ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３のＣＥＥＲ分析を示す。腫瘍を最後の薬物投与の２時間後に収集した。タンパク質を全サイトケラチンの量に対して正規化して、シグナルの間質汚染を回避し、コンピュータユニット（ＣＵ）によって定量化した。エラーバーは、単剤に対するＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａ組み合わせのＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。両側スチューデントｔ検定を使用してＰ値を算出した。
【図２】（図２Ａ）  図２Ａは、ＰＩ３Ｋ阻害と組み合わせたＭＥＨＤ７９４５Ａまたはセツキシマブの有効性を示す。図２Ａ左は、示されたように処理されたＨＣＣ７０細胞の５日増殖分析を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブを１０ｎＭで使用し、一方、ＧＤＣ−００６８およびＧＤＣ−０９４１をどちらも１ｕＭで使用した。右は、示されたように処理されたＨＣＣ７０細胞においてｐＥＧＦＲおよびｐＨＥＲ３の発現を示すウェスタンブロットを示す。  （図２Ｂ）  図２Ｂは、ＰＩ３Ｋ阻害と組み合わせたＭＥＨＤ７９４５Ａまたはセツキシマブの有効性を示す。図２Ｂは、示されたように処理されたＨＣＣ７０異種移植片の腫瘍成長曲線を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブを１０ｍｇ／Ｋｇで１週間に２回投与し、ＧＤＣ−０９４１を７５ｍｇ／Ｋｇで毎日投与した。エラーバーは、単剤または組み合わせＧＤＣ−０９４１およびセツキシマブに対する組み合わせＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５ＡのＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５。  （図２Ｃ）  図２Ｃは、ＰＩ３Ｋ阻害と組み合わせたＭＥＨＤ７９４５Ａまたはセツキシマブの有効性を示す。図２Ｃは、示されたように処理されたＨＣＣ７０異種移植片における活性および全ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３のＣＥＥＲ分析を示す。エラーバーは、ｐＥＧＦＲについては対照に対するすべての条件（＊＊ｐ＜０．０１）ならびにＧＤＣ−０９４１およびセツキシマブの組み合わせまたはセツキシマブ単剤に対するＧＤＣ−００６８およびＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせ（＊ｐ＜０．０５）のＳＥＭを示す。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を用いて算出した。
【図３】（図３Ａ）  図３Ａは、ＴＮＢＣ患者におけるＥＧＦＲ発現および抗ＥＧＦＲ療法に対する応答を示す。図３Ａは、パニツムマブに基づく療法で治療された４０人のＴＮＢＣ患者におけるベースラインＥＧＦＲ発現と病理学的完全奏功（ｐＣＲ）との間の相関関係を示す。  （図３Ｂ）  図３Ｂは、ＴＮＢＣ患者におけるＥＧＦＲ発現および抗ＥＧＦＲ療法に対する応答を示す。図３Ｂは、パニツムマブに基づく療法で治療してｐＣＲを達成しなかった患者のベースラインと残存腫瘍との間のＥＧＦＲ発現における変化を示す。左側のバーは前であり、右側のバーは後である。  （図３Ｃ）  図３Ｃは、ＴＮＢＣ患者におけるＥＧＦＲ発現および抗ＥＧＦＲ療法に対する応答を示す。図３Ｃは、ベースライン試料（治療前）に対して残存腫瘍（治療後）においてＥＧＦＲ発現の減少を示す代表的なＩＨＣを示す。
【図４】（図４Ａ）  図４Ａは、ＴＮＢＣ患者におけるＨＥＲ３発現および抗ＥＧＦＲ療法に対する応答を示す。図４Ａは、パニツムマブに基づく療法での治療によりｐＣＲを達成しなかった患者のベースラインと残存腫瘍との間のＨＥＲ３発現における変化を示す。左側ｗのバーは前であり、右側のバーは後である。  （図４Ｂ）  図４Ｂは、ＴＮＢＣ患者におけるＨＥＲ３発現および抗ＥＧＦＲ療法に対する応答を示す。図４Ｂは、ベースライン試料（治療前）に対する残存腫瘍（治療後）におけるＨＥＲ３発現の増加を示す代表的なＩＨＣを示す。
【図５】図５は、二重ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ阻害剤としてのＭＥＨＤ７９４５Ａを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
例示的実施形態の詳細な説明および定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、記載された特徴、整数、構成要素、またはステップの存在を特定することが意図されるが、それらは、１以上の他の特徴、整数、構成要素、ステップ、またはそれらの群の存在または添加を排除するものではない。
【００３３】
「治療する」および「治療」という語は、目的が、望ましくない生理学的変化または障害、例えばガンの成長、進行または転移を予防または減速（減弱）することである、治療的処置を指す。本発明のために、有益または所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能を問わず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化した（すなわち、さらに悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わない）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することも意味し得る。治療を必要とする者としては、状態または障害にすでに罹っている者、例えばトリプルネガティブ乳癌の患者が挙げられる。
【００３４】
「治療的有効量」という慣用句は、（ｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害を治療する量、（ｉｉ）特定の疾患、状態、または障害の１以上の症状を減弱、寛解、もしくは除去する量、または（ｉｉｉ）本明細書中に記載される特定の疾患、状態、もしくは障害の１以上の症状の開始を防止もしくは遅延させる量を意味する。ガンの場合、治療的有効量は、ガン細胞の数を減少させる；腫瘍サイズを減少させる；末梢器官へのガン細胞浸潤を阻害する（例えば、ある程度まで減速し、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（例えば、ある程度まで減速し、好ましくは停止させる）；腫瘍成長をある程度まで阻害する；および／またはガンに関連する１以上の症状をある程度まで軽減する可能性がある。組み合わせが成長を防止および／または既存のガン細胞を殺すことができる程度まで、細胞分裂停止および／または細胞毒性であり得る。ガン療法のために、有効性は、例えば疾患が進行するまでの時間（ＴＴＰ）の評価および／または応答速度（ＲＲ）を評価することによって測定することができる。
【００３５】
「ガン」および「ガン性」という語は、典型的には未制御の細胞成長によって特徴づけられる、哺乳類における生理学的状態を指すかまたは説明する。「腫瘍」は、１以上のガン性細胞を含む。ガンの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなガンのさらに詳細な例としては、扁平細胞ガン（例えば、扁平上皮細胞ガン）、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌および肺の扁平上皮ガンを含む肺ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃腸ガンを含む胃ガン（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓ガン、膠芽腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、結腸ガン、直腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜または子宮ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭頸部ガンが挙げられる。胃ガンは、本明細書で用いられる場合、胃のどの部分でも発症する可能性があり、そして胃全体から他の器官、特に食道、肺、リンパ節、および肝臓に広がり得る胃ガンを含む。
【００３６】
「化学療法薬」は、作用機序に関係なくガンの治療で有用な生物学的（例えば、大分子）または化学的（例えば、小分子）化合物である。
【００３７】
「プラチナ剤」は、白金を含む化学療法薬、例えばカルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンである。
【００３８】
「哺乳類」という語は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、および家禽を包含する。患者という語は哺乳類を指し、１つの実施形態では、患者は男性または女性のヒトである。
【００３９】
「添付文書」という語は、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌についての情報および／またはそのような治療薬の使用に関する警告を含む、治療薬の市販のパッケージ中に通例含まれる使用説明書を湿すために用いられる。
【００４０】
「薬理学的に許容される塩」という慣用句は、本明細書で用いられる場合、化合物の薬理学的に許容される有機または無機塩を指す。塩の例としては、ビスメシル酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシラート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。薬理学的に許容される塩は、酢酸塩イオン、コハク酸塩イオンまたは他の対イオンなどの別のイオンを含むことを含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、薬理学的に許容される塩は、その構造中に複数の荷電した原子を有していてもよい。複数の荷電した原子が薬理学的に許容される塩の一部である例は、複数の対イオンを有し得る。したがって、薬理学的に許容される塩は１以上の荷電した原子および／または１以上の対イオンを有し得る。
【００４１】
所望の薬理学的に許容される塩は、当該技術分野で利用可能な任意の好適な方法によって調製することができる。例えば、遊離塩基を、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸などと、あるいは有機酸、例えば酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸（ｐｙｒａｎｏｓｉｄｙｌ  ａｃｉｄ）、例えば、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸、アルファヒドロキシ酸、例えばクエン酸もしくは酒石酸、アミノ酸、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、芳香酸、例えば安息香酸もしくは桂皮酸、スルホン酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸、またはその他での処理によって調製することができる。塩基性医薬化合物からの薬剤的に有用または許容される塩の形成に好適と一般的に考えられる酸は、例えば、Ｐ．  Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  （ｅｄｓ．）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ．  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ．  （２００２）  Ｚｕｒｉｃｈ：  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；  Ｓ．  Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９７７）  ６６（１）  １  １９；  Ｐ．  Ｇｏｕｌｄ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  （１９８６）  ３３  ２０１  ２１７；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９６），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  （１９９５）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ；  ａｎｄ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ  （Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｗｅｂｓｉｔｅ）によって検討されている。これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４２】
「薬理学的に許容される」という慣用句は、物質または組成物が、配合物を構成する他の製剤および／またはそれで治療される哺乳類と化学的および／または毒物学的に適合性であることを意味する。
【００４３】
「相乗的」という語は、本明細書で用いられる場合、２以上の単剤の相加効果よりも有効である治療組み合わせを指す。相乗的相互作用の決定は当該技術分野で公知のアッセイから得られる結果に基づく可能性がある。これらのアッセイの結果は、組み合わせ指数を得るために、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ組み合わせ法およびＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアでの用量効果分析を用いて分析することができる（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，  １９８４，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．  ２２：２７−５５）。本明細書で提供される組み合わせは、抗ガン剤間の相乗作用、相加作用（ａｄｄｉｔｉｖｉｓｍ）、および拮抗作用を定量化するための標準的プログラムを利用して分析した。プログラムの一例は、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙによって、“Ｎｅｗ  Ａｖｅｎｕｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２で記載されているものである。０．８未満の組み合わせ指数値は相乗作用を意味し、１．２を超える値は拮抗作用を意味し、０．８〜１．２の値は相加効果を意味する。併用療法は、「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」、すなわち使用する活性成分を合わせた場合に達成される効果が、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計よりも大きいと判明する可能性がある。相乗的効果は、活性成分が：（１）同時処方され、組み合わされた単位投与処方で同時に投与または送達される場合；（２）別個の処方として交互または並行して送達される場合；または（３）ある他のレジメンによって、達成される可能性がある。交互療法で送達される場合、相乗的効果は、化合物が連続して、例えば別個のシリンジでの異なる注射により投与または送達される場合に達成することができる。概して、交互療法の間、各活性成分の有効投薬量を逐次、すなわち順次投与し、一方、併用療法では、２以上の活性成分の有効投薬量をあわせて投与する。組み合わせ効果を、ＢＬＩＳＳ独立モデルおよび最高単剤（ＨＳＡ）モデルの両方を使用して評価した（Ｌｅｈaｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：８０）。ＢＬＩＳＳスコアは単剤から得られる相乗作用の程度を定量化し、正のＢＬＩＳＳスコア（０より大）は、単純な相加性を上回ることを示唆する。２５０を超える累積的な正のＢＬＩＳＳスコアは、試験した濃度範囲内で観察される強力な相乗作用とみなされる。ＨＳＡスコア（０より大）は、対応する濃度での単剤応答の最大値よりも大きな組み合わせ効果を示唆する。ガン細胞の突然変異状態は、ガン細胞が異なる治療プロトコルにどのように反応するかのバイオマーカーであり得る。例えば、ＰＩ３Ｋ経路（例えばＰＩ３ＫまたはＡＫＴ）突然変異を有するガン細胞は、本明細書に記載する組み合わせ治療に対して陽性（例えば、相乗的）応答を示し得る。さらに、ガン細胞のＰＴＥＮ状態もバイオマーカーであり得る。したがって、本発明のある実施形態は、これらのバイオマーカーの組み合わせを有するガン細胞のこれらの組み合わせ治療での治療方法（インビトロまたはインビボ）を含む。本発明のある実施形態は、これらのバイオマーカーの組み合わせを有する組み合わせ治療について患者を選択することを含む。
【００４４】
所定の過増殖性障害に対して改善された治療を提供することに加えて、本発明のある組み合わせの投与は、患者の生活の質を、異なる治療を受けた同じ患者が経験する生活の質と比べて改善することができる。例えば、患者に対する組み合わせの投与は、同じ患者が個々の薬剤の１つだけを治療薬として投与される場合に経験するであろう生活の質と比べて改善された生活の質を提供することができる。例えば、本明細書に記載する組み合わせとの複合療法は、必要な治療剤の用量を減らすことができる。併用療法はまた、化学療法薬の使用の必要性および高用量化学療法薬に関連する副作用（例えば、吐き気、嘔吐、脱毛、発疹、食欲減退、体重減少など）を減少または除去する可能性もある。組み合わせはまた、腫瘍量および関連する有害事象、例えば疼痛、臓器不全、体重減少などの軽減をもたらす可能性もある。したがって、本発明の１つの態様は、本明細書に記載する組み合わせで過増殖性障害について治療された患者の生活の質を改善するための治療用の組み合わせを提供する。
【００４５】
１つの態様は、本明細書に記載する組み合わせを患者に投与することを含む、例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴまたはＰＴＥＮ突然変異を含むガンに苦しんでいる患者の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）の方法を提供する。ある実施形態において、組み合わせは相乗効果を提供する。
【００４６】
ある実施形態において、組み合わせのＴＧＩは、ＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１またはＭＥＨＤ７９４５Ａ単独のいずれか１つのＴＧＩよりも大きい。ある実施形態において、組み合わせのＴＧＩは、薬剤単独のＴＧＩよりも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５パーセント大きい。
【００４７】
ＴＧＩを測定する方法は、当該技術分野で公知である。１つの方法例では、平均腫瘍体積を測定し、治療前および治療後の患者から比較した。腫瘍体積は当該技術分野のいずれかの方法、例えばＵｌｔｒａＣａｌ  ＩＶキャリパー（Ｆｒｅｄ  Ｖ．  Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、またはＰＥＴ（ポジトロン放出型断層撮影）によって、またはある他の方法によって、２次元（長さおよび幅）で測定することができる。式
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）×０．５
を使用できる。複数の期間にわたる腫瘍体積の測定は、混合モデルＬｉｎｅａｒ  Ｍｉｘｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ（ＬＭＥ）法（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）を使用して実施できる。この方法は、両反復測定（および複数の患者）を対象とすることができる。三次回帰スプラインを使用して、非線形プロファイルを各服用レベルでの腫瘍体積の時間的経過に適合させることができる。これらの非線形プロファイルは次いで混合型モデル内での用量と関連づけることができる。ビヒクルのパーセントとしての腫瘍成長阻害は、次式：
【数１】
2016502974.tif 000005
を用いて、ビヒクルに関連した１日当たりの適合曲線下の面積（ＡＵＣ）パーセントとして算出することができる。この式を使用して、１００％のＴＧＩ値は、腫瘍静止状態を意味し、約１％を超え約１００％未満は腫瘍成長阻害を意味し、約１００％超は腫瘍退縮を意味する。
【００４８】
ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａの調製
小分子ＡＴＰ競合的ＡＫＴ阻害剤ＧＤＣ−００６８（式Ｉ）、またはその薬理学的に許容される塩は、例えば国際公開第２００８／００６０４０号で記載されているようにして調製することができる：
【化３】
2016502974.tif 000006
【００４９】
小分子ＡＴＰ競合的汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＧＤＣ−０９４１（式ＩＩ）、またはその薬理学的に許容される塩は、例えば、米国特許第７，７８１，４３３号、米国特許出願第２０１０／０２９２４６８号、またはＦｏｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１，  ５５２２−５５３２  （２００８）で記載されているようにして調製することができる。
【化４】
2016502974.tif 000007
【００５０】
２つの同じ抗原結合ドメインであって、それぞれがＨＥＲ３およびＥＧＦＲの両方に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重作用抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａを国際公開第２０１０／１０８１２７号（ＤＬ１１ｆ、例えば図３３を参照のこと）およびＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  ２０，  ４７２−４８６  （２０１１）で記載されているようにして調製することができる。重鎖可変ドメインについてのＭＥＨＤ７９４５Ａのアミノ酸配列は配列番号１として提示され、軽鎖可変ドメインは配列番号２として提示される。重鎖ドメインについてのＭＥＨＤ７９４５Ａのアミノ酸配列は配列番号３として提示され、軽鎖可変ドメインは配列番号４として提示される。
分離方法
【００５１】
化合物を調製する合成方法のいずれにおいても、それぞれの反応生成物を個々に及び／又は出発原料から分離するのが有利であり得る。各ステップ又は一連のステップの所望の生成物を所望の程度の均一性まで従来の一般的な方法により分離及び／又は精製する。一般に、そのような分離では、一溶媒若しくは混合溶媒での多相抽出や晶析、蒸留、昇華、又はクロマトグラフィーを行う。クロマトグラフィーは、例えば：逆相及び順相；サイズ排除；イオン交換；高圧、中圧及び低圧液体クロマトグラフィーの方法と装置；小規模分析；疑似移動床（ＳＭＢ）及び分取薄層又は厚層クロマトグラフィー、並びに小規模薄層及びフラッシュクロマトグラフィー法を含む、数多くの方法で行うことができる。
【００５２】
別の種類の分離方法では、反応混合物を、所望の生成物、未反応の出発原料、反応副生成物などに結合させる又は別の方法で分離可能にするよう選択した試薬で処理することが行われる。このような試薬には、活性炭などの吸着剤又は吸収剤、分子篩、イオン交換媒体などのようなものが含まれる。別の方法では、試薬は、塩基性物質用の酸、酸性物質用の塩基、抗体、結合タンパク質などの結合試薬、クラウンエーテル、液／液イオン抽出試薬（ＬＩＸ）などの選択的キレート剤等であり得る。
【００５３】
適切な分離方法としてどれを選択するかは、対象とする物質の性質に応じて決定する。例えば、蒸留や昇華では沸点及び分子量、クロマトグラフィーでは極性官能基の有無、多相抽出における酸性及び塩基性媒体中での物質の安定性などである。当業者であれば所望の分離を達成する可能性が高い技術を適用するであろう。
【００５４】
ジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィー及び／又は分別結晶など当業者に周知の方法により、各ジアステレオマーの物理化学的違いに基づいて個々のジアステレオマーに分離することができる。エナンチオマーは、適切な光学活性化合物（例えば、キラルアルコール又はモッシャーの酸塩化物などのキラル補助剤）と反応させ、ジアステレオマーを分離し、個々のジアステレオ異性体をその対応する純粋なエナンチオマーに変換させる（例えば、加水分解）ことで、エナンチオマー混合物をジアステレオマー混合物に変換させて分離できる。また、本発明の化合物のいくつかは、アトロプ異性体（例えば、置換ビアリール）であってよく、本発明に含まれるものとみなす。エナンチオマーは、また、キラル用ＨＰＬＣカラムを使用して分離することもできる。
【００５５】
その立体異性体を実質的に含まない単一の立体異性体、例えば、エナンチオマーは、光学活性な分割剤を用いるジアステレオマーの形成などの方法を用いてラセミ混合物を分割して得てよい（Ｅｌｉｅｌ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．  ”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４；  Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，  （１９７５）  １１３（３）：２８３−３０２）。本発明のキラル化合物のラセミ混合物は、（１）キラル化合物を用いるイオン性ジアステレオマー塩の形成及び分別結晶又はほかの分離方法、（２）キラル誘導体化試薬を用いるジアステレオマー化合物の形成、ジアステレオマーの分離、及び純粋な立体異性体への変換、並びに（３）キラル条件下での実質的に純粋又は濃縮された立体異性体の直接的な分離を含む、任意の好適な方法により分離及び単離することができる。”Ｄｒｕｇ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，”  Ｉｒｖｉｎｇ  Ｗ．  Ｗａｉｎｅｒ，  Ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）を参照。
【００５６】
方法（１）では、ジアステレオマー塩は、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ、α−メチル−β−フェニルエチルアミン（アンフェタミン）などのエナンチオマーとして純粋なキラル塩基と、カルボン酸及びスルホン酸などの酸性官能基を担持する不斉化合物との反応により形成することができる。ジアステレオマー塩は、分別結晶又はイオンクロマトグラフィーで分離するよう誘導してよい。アミノ化合物の光学異性体を分離するには、キラルなカルボン酸若しくはスルホン酸、カンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸、又は乳酸などを添加するとジアステレオマー塩の形成をもたらすことができる。
【００５７】
あるいは、方法（２）により、分割すべき基質をキラル化合物の１つのエナンチオマーと反応させてジアステレオマー対を形成する（Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．  ”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９４，  ｐ．３２２）。ジアステレオマー化合物は、不斉化合物をメンチル誘導体などのエナンチオマーとして純粋なキラル誘導体化試薬と反応させ、その後、ジアステレオマーの分離及び加水分解を行って純粋な又は濃縮されたエナンチオマーを得ることにより形成することができる。光学純度を測定する方法は、メンチルエステル、例えば、塩基存在下での（−）メンチルクロロホルマート、又はモッシャーエステルであるα−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸（Ｊａｃｏｂ  ＩＩＩ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９８２）  ４７：４１６５）などの、ラセミ混合物のキラルエステルを作製すること、及び２つのアトロプ異性体エナンチオマー又はジアステレオマーの存在について１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを解析することを含む。アトロプ異性化合物の安定安定なジアステレオマーは、アトロプ異性体ナフチル−イソキノリンの分離方法（国際公開第９６／１５１１１号）にしたがって順相及び逆相クロマトグラフィーにより分離及び単離することができる。方法（３）により、２つのエナンチオマーのラセミ混合物を、キラル固定相を用いたクロマトグラフィーで分離することができる（”Ｃｈｉｒａｌ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”  （１９８９）  Ｗ．  Ｊ．  Ｌｏｕｇｈ，  Ｅｄ．，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，  （１９９０）  ５１３：３７５−３７８）。濃縮又は精製したエナンチオマーは、旋光度及び円偏光二色性など、不斉炭素原子を有するほかのキラル分子を区別するために使用される方法により区別することができる。
医薬組成物
【００５８】
本発明の医薬組成物又は製剤は本明細書に記載する組み合わせを含む。
【００５９】
本明細書に記載する化合物又はその薬理学的に許容される塩は、水、エタノールなどの薬理学的に許容される溶媒との溶媒和、非溶媒和の形態で存在してよく、本発明は、溶媒和及び非溶媒和の両形態とも包含することを意図している。
【００６０】
化合物又はその薬理学的に許容される塩は、また、異なる互変異性体形態で存在してもよく、かかる形態はすべて本発明の範囲内に包含される。「互変異性体」又は「互変異性体形態」という用語は、エネルギーの低い障壁を介して相互変換可能な、エネルギーの異なる構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピック互変異性体としても知られる）は、ケト−エノール及びイミン−エナミン異性化など、プロトンの移動による相互変換を含む。原子価互変異性体は、結合電子の一部の再配列による相互変換を含む。
【００６１】
医薬組成物は、バルク組成物と、１種以上の（例えば、２種）薬理学的に活性な薬剤を任意の薬理学的に不活性な添加物、希釈剤、担体、又は流動化剤とともに含む個々の投与単位とを包含する。バルク組成物及び個々の投与単位各々は、一定量の上記の薬理学的に活性な薬剤を含有してよい。バルク組成物は、これまでに個別投与単位として形成されたことのない物質である。例示的な投与単位は、錠剤、丸剤、カプセル剤などの経口投与単位である。同様に、本発明の医薬組成物を投与することにより患者を治療する本明細書記載の方法は、また、バルク組成物及び個々の投与単位を投与することを包含することも意図している。
【００６２】
医薬組成物は、本明細書で記述した、同位体で標識した化合物と同一のものも包含する。ただし、化合物の１以上の原子が、通常天然に存在する原子の質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する一原子で置換されている。いかなる具体的な原子又は元素もその同位体はすべて、定めたとおり、本発明の化合物及びその使用の範囲内であることを意図するものである。化合物に組み込み可能な例示的な同位体は、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ及び１２５Ｉなどの、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素及びヨウ素の同位体を含む。同位体で標識した本発明のある化合物（例えば、３Ｈ及び１４Ｃで標識したもの）は、化合物及び／又は基質の組織分布アッセイに有用である。同位体のトリチウム（３Ｈ）及び炭素１４（１４Ｃ）は、調製及び検出が用意であるため有用である。さらに、重水素（２Ｈ）などの重い同位体で置換すると、代謝安定性が大きいことにより特定の治療に有利になる可能性があり（例えば、インビボ半減期の延長又は必要投与量の減量）、そのため、状況によっては好ましくなり得る。１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ及び１８Ｆなどの陽電子放出性同位体は、基質受容体占有率を調べるための陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）検査に有用である。
【００６３】
化合物の薬理学的に許容される塩を、ヒト（ヒトの男性又は女性など）を含む哺乳類における高増殖性障害（癌、などのトリプルネガティブ乳癌など）を治療するための治療的組み合わせで使用するため、標準的薬務に従い製剤化する。本発明は、１以上の薬理学的に許容される担体、流動化剤、溶剤、又は添加物に関連した、本明細書に記載の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
好適な担体、希釈剤及び添加物は当業者に周知であり、炭水化物、ワックス、水溶性及び／又は水膨潤性ポリマー、親水性又は疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水などの物質を含む。使用する特定の担体、希釈剤又は添加物は、本発明の化合物を適用する手段及び目的に応じて決められる。溶媒は、一般に、哺乳類への投与において安全であると当業者に認知されている溶媒（ＧＲＡＳ）を基に選択される。一般に、安全な溶媒は、水などの非毒性水溶性溶媒及び水に可溶性又は混和性のほかの非毒性溶媒である。好適な水溶性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）等及びそれらの混合物を含む。製剤は、見た目の上品な薬物（すなわち、本発明の化合物又はその医薬組成物）を提供するため、又は医薬品（すなわち、薬剤）の製造を支援するために、１以上の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、抗酸化剤、不透明化剤、流動化剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、矯味剤など公知の添加剤を含んでもよい。
【００６５】
製剤は、従来の溶解及び混合手順を使用して調製してよい。例えば、バルク原薬（すなわち、本発明の化合物又は安定化された形態の化合物（例えば、シクロデキストリン誘導体又はその他の公知の錯化剤との錯体）を１以上の上記添加物の存在下で好適な溶媒に溶解させる。本発明の化合物を、一般に、薬物投与量の管理を行いやすくし、患者が処方レジメンで服薬遵守できるようにするため、医薬剤形に製剤化する。
【００６６】
投与用医薬組成物（又は製剤）を、薬物投与に使用する方法に応じ多種多様な方法で包装してよい。一般に、流通用物品には、中に医薬製剤を適切な形態で収めてある容器を含む。好適な容器は当業者には周知であり、ボトル（プラスチック及びガラス）、小袋、アンプル、プラスチック袋、金属円筒などの材料が含まれる。容器は、包装内容物がいたずらに開封されることのないよう不正開封防止用に組み立てた物を含んでもよい。さらに、容器の上には、その容器の内容物を記載したラベルが貼付される。かかるラベルは適切な警告を含んでもよい。
【００６７】
化合物の医薬製剤を、さまざまな投与経路及び投与タイプに合わせて調製してよい。例えば、所望の程度の純度を有する化合物又はその薬理学的に許容される塩を、薬理学的に許容される希釈剤、担体、添加物又は安定剤と、凍結乾燥製剤、粉砕粉末、又は水溶液の形態で必要に応じ混合してよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９５）  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）。製剤化は、適切なｐＨかつ所望の程度の純度で室温にて、生理学的に許容される担体、すなわち、受容者に対し使用する投与量及び濃度で非毒性である担体と混合して行ってよい。製剤のｐＨは主に具体的な使用及び化合物濃度に依存するが、約３〜約８の範囲であってよい。
【００６８】
医薬製剤は好ましくは無菌である。特に、インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このような滅菌は無菌化濾過膜でろ過することにより容易に達成され。
【００６９】
医薬製剤は、通常、固体組成物、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存可能である。
【００７０】
医薬製剤は、適切な医療行為を行うための基準に従った方法、例えば、量、濃度、スケジュール、コース、ビヒクル及び投与経路での用量決定され投与される。これにおいて考慮する因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の日程計画、及び医師に公知の他の因子が含まれる。投与すべき「治療的有効量」は、こうした因子を考慮して決定されることになり、それは障害を予防、改善、又は治療するのに必要な最小量である。この必要最小量は好ましくは宿主に対し毒性のある量又は宿主を有意に出血しやすい状態にさせる量を下回る量である。
【００７１】
許容される希釈剤、担体、添加物及び安定剤は、使用される投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルボトル酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ‐クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及びほかの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。活性医薬成分を、例えば、コアセルベーション法又は界面重合法により、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルを、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマクロエマルジョン中に調製したマイクロカプセルに封入してもよい。かかる方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９９５）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに開示されている。
【００７２】
徐放性調製物を調製してよい。徐放性製剤の好適な実施例には、化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態をしている。徐放性マトリックスの実施例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタマートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体などのＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注入可能なマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ（−）３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００７３】
医薬製剤は、本明細書で詳述する投与経路に好適な製剤を含む。製剤を単位剤形で好都合に提供でき、製薬において周知の任意の方法により調製してよい。技術及び製剤は一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  Ｅｄ．  （１９９５）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに記載されている。かかる方法は、有効成分と１以上の副成分を構成する担体とを会合させる工程を含む。一般に製剤は、有効成分を均一かつ均質に、液体担体若しくは細かく分割した固体担体又はその両方と会合させ、その後、必要に応じ、その生成物を成形することにより調製される。
【００７４】
経口投与に好適な組み合わせの製剤は、各々所定量のＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａを含有する、丸剤、ハード若しくはソフトな、例えば、ゼラチンカプセル剤、カシェ、トローチ剤、薬用ドロップ、水溶性若しくは油性懸濁液、散剤若しくは顆粒剤、エマルション、シロップ又はエリキシル剤などの個別単位として調製してよい。その量のＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａは、丸剤、カプセル剤、溶液又は懸濁液にして組み合わせ製剤として処方してよい。あるいは、投与方法を変更するために、組み合わせを、丸剤、カプセル剤、溶液又は懸濁液で別々に処方してよい。
【００７５】
製剤は、医薬組成物の製造として当業者に公知の任意の方法にしたがって調製してよく、かかる組成物は、口当たりのよい調製物を提供するために甘味料、矯味剤、着色剤及び防腐剤を含む１種以上の薬剤を含有してよい。圧縮錠剤は、必要に応じ結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤又は分散剤と混合した粉末又は顆粒などの自由流動形態の有効成分を好適な機械で圧縮することにより調製してよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末有効成分の混合物を好適な機械で成形することにより調製してよい。
【００７６】
錠剤は、必要に応じ、コーティングを行ったり刻み目をつけたりしてよく、有効成分が緩徐に制御されつつ放出されるよう製剤化される。医薬製剤の錠剤用添加物としては：錠剤を形成する粉末薬物のバルク容積を増大させる賦形剤（又は希釈剤）；摂取時に、錠剤を小断片に、理想的には個々の薬物粒子に崩壊させ、薬物の短時間での溶解及び吸収を促進する崩壊剤；顆粒及び錠剤が必要な機械的強度で確実に形成され、圧縮後も錠剤の形を保持し、包装、輸送及び日常的な取り扱い時に砕けて成分粉末にならないようにする結合剤；製造中、錠剤を形成する粉末の流動性を向上させる流動化剤；製造中、錠剤のプレスに使用する装置に錠剤形成用粉末が付着しないようにする滑沢剤が含まれる。流動化剤は、プレス中の粉末混合物の流れを改善し、最終錠剤が装置から吐き出される際の摩擦及び損壊を最小限に抑える；流動化剤と同様の機能を有し、製造中、錠剤用形成用粉末と錠剤成型用の打ち出し機械との間の粘着を低下させる粘着防止剤（Ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔ）；口当たりのよい味を与える、又は不快な味をマスキングするために錠剤に組み込まれる香味剤、及び識別のしやすさと患者の服薬遵守を助ける着色剤が上げられる。
【００７７】
錠剤の製造に好適な、非毒性の薬理学的に許容される添加物を混合した有効成分を含有する錠剤は許容される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシデンプン又はアルギン酸などの造粒剤及び崩壊剤；デンプン、ゼラチン又はアラビアゴムなどの結合剤；及び、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの潤滑剤であってよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、又は消化管での崩壊及び吸着を遅らせて長期間にわたる持続的作用を提供するためのマイクロカプセル化を含む公知の技術によってコーティングしてよい。例えば、時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを単独で又はワックスと共に使用してもよい。
【００７８】
眼又は他の外部組織、例えば口及び皮膚の治療のために、製剤を、活性成分を例えば０．０７５〜２０％ｗ／ｗの量で含有する局所軟膏又はクリームとして塗布することが好ましい。軟膏として製剤化する場合は、活性成分をパラフィン系又は水混和性の軟膏基剤と共に使用してよい。あるいは、活性成分を水中油型クリーム基剤と共にクリームに製剤化してよい。
【００７９】
所望であれば、クリーム基剤の水相は、多価アルコール、すなわちプロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００を含む）などのヒドロキシル基を２つ又はそれ以上有するアルコール、並びにそれらの混合物を含んでよい。局所製剤は、望ましくは、皮膚などの患部を介した活性成分の吸収又は浸透を促進する化合物を含んでよい。そのような皮膚浸透促進剤の例には、ジメチルスルホキシド及び関連する類似体が含まれる。
【００８０】
本発明のエマルジョンの油相を、公知の成分から公知の方法で構成してよく、少なくとも１つの乳化剤と、脂肪若しくは油、又は脂肪と油の両方との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤を、安定剤として作用する親油性乳化剤と共に含める。油と脂肪の両方を含むことも好ましい。まとめると、安定剤（複数可）を伴う又は伴わない乳化剤（複数可）で乳化ワックスを作製し、そのワックスは油脂と共に、クリーム製剤の油性分散相を形成する、乳化軟膏基剤を構成する。製剤での使用に好適な乳化剤及び乳化安定剤には、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル及びラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【００８１】
医薬製剤の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合させた形で活性物質を含む。そのような賦形剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメローゼ、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガムなどの懸濁剤、並びに、天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアラート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導した部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液は、また、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾアートなどの１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及びスクロース又はサッカリンなどの１つ以上の甘味料を含んでもよい。
【００８２】
医薬組成物は、無菌の注入可能な水性又は油性懸濁液など無菌の注入可能調製物の形態であってよい。この懸濁液は、上述した好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して公知の技術に従い製剤化することができる。無菌の注入可能調製物は、１，３−ブタンジオール溶液又は凍結乾燥粉末で調製したもののように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒に入れた溶液又は懸濁液であってもよい。用いてよい許容可能なビヒクル及び溶媒は水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。また、無菌の不揮発性油を溶媒又は懸濁媒として従来通り使用してよい。それを目的とする場合、合成のモノ−又はジグリセリドを含め、任意のブランドの不揮発性油を用いることができる。また、オレイン酸のような脂肪酸も注入可能調製物を調製する際に同様に使用してよい。
【００８３】
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ可能な活性成分（複数可）の量（複数可）は、治療される宿主及び個別の投与方法に応じて異なる。例えば、ヒトへの経口投与のための時間放出型製剤は、全組成物のおよそ５からおよそ９５％（重量：重量）まで量が異なる、適切かつ簡便な量の担体物質と共に、およそ１〜１０００ｍｇの活性物質を含有してよい。医薬組成物を、投与のために容易に計量できるよう調製することができる。例えば、静脈点滴用水溶液は、約３０ｍＬ／時間の速度で好適な容量の点滴を行えるよう、溶液１ミリリットル当たり約３〜５００μｇの活性成分を含有してよい。
【００８４】
非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を対象受容者の血液と等張にする溶質を含む、水性及び非水性の無菌注入溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含む、水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。
【００８５】
眼への局所投与に好適な製剤には、活性成分を、好適な担体、特に活性成分用の水性溶媒に溶解又は懸濁させた点眼液も含む。活性成分は、好ましくは、かかる製剤中に０．５〜２０％ｗ／ｗ、例えば、約０．５〜１０％ｗ／ｗ、例えば、約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【００８６】
口への局所投与に好適な製剤には、香味基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含む薬用ドロップ；ゼラチンとグリセリン、又はスクロースとアカシアといった不活性基剤に活性成分を含む香錠；並びに好適な液体担体に活性成分を含むうがい薬が含まれる。
【００８７】
直腸投与用製剤は、例えばココアバター又はサリチレートを含む好適な基剤を用いた坐剤として提供してよい。
【００８８】
肺内又は経鼻投与に好適な製剤は、例えば０．１〜５００ミクロン（０．５、１、３０ミクロン、３５ミクロン等のような増分ミクロンで０．１〜５００ミクロンの範囲の粒径を含む）の範囲の粒径を有し、これを鼻経路を介した短時間吸入又は肺胞嚢に到達するよう口からの吸入により投与する。好適な製剤には、活性成分の水性又は油性溶液が含まれる。エアゾール又は乾燥粉末での投与に好適な製剤は、従来の方法に従い調製することができ、以下に記載するような疾患の治療又は予防にこれまで使用されている化合物のような、他の治療剤と共に送達することができる。
【００８９】
膣投与に好適な製剤を、活性成分に加えて、当該分野で適切であることが知られている担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤として提供してよい。
【００９０】
製剤を、単位投用量又は複数用量入り容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装してよく、用時に注入用の無菌液体担体、例えば水を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注入用溶液及び懸濁液は、先に記載した種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製する。好ましい単位投与製剤は、上述のような、１日あたりの用量若しくは１日用量を分割した用量、又はその適切な分割用量の、活性成分を含む製剤である。
【００９１】
本発明は、さらに、本明細書に記載の組み合わせを、かかる組み合わせ用の獣医学的担体と共に含む獣医学的組成物を提供する。獣医学的担体は、組成物を投与するために有用な物質であり、不活性又は獣医学分野で許容され、かつ、活性成分と相容性がある、固形、液体又は気体物質であってよい。これらの獣医学的組成物は、非経口、経口又は任意の他の所望の経路で投与することができる。
併用療法
【００９２】
組み合わせは、腫瘍、癌、及び腫瘍組織を含む、高増殖性の疾患又は障害を治療するために化学療法剤と組み合わせて使用することができる。ある実施形態では、組み合わせを、併用療法としての投与レジメンにおいて、抗高増殖特性を有する、又は高増殖性疾患の治療に有用な別の化合物と組み合わせる。投与レジメンのこの別の化合物は、好ましくは、組み合わせに対して相補的な活性を有し、それらが互いに悪影響を及ぼさないようにする。このような化合物を、意図する目的に効果的な量で投与してよい。ある実施形態では、治療的組み合わせの投与を、治療的有効量の化合物ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩を１日２回から３週間おき（ｑ３ｗｋ）の範囲で投与し、治療的有効量のＭＥＨＤ７９４５Ａを１日２回から３週間おきの範囲で投与する、という投与レジメンで行う。
【００９３】
併用療法は、同時又は順次レジメンとして投与してよい。逐次的に投与される場合は、組合せを２回又はそれ以上の投与で投与し得る。順次投与する場合は、組合せを２回以上に分けて投与してよい。併用投与には、別々の製剤を使用する同時投与、及び何れかの順序で行う連続投与が含まれ、ここで好ましくは、両方（又は全部）の活性薬剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間が存在する。
【００９４】
本発明の１つの具体的な態様では、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１又はその薬理学的に許容される塩を、ＭＥＨＤ７９４５Ａの投与開始後約１〜約１０日の期間投与することができる。本発明の別の具体的な態様では、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩を、ＭＥＨＤ７９４５Ａの投与開始前、約１〜１０日の期間投与することができる。本発明の別の具体的な態様では、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩の化合物の投与とＭＥＨＤ７９４５Ａの投与を同日に開始する。
【００９５】
本発明の１つの具体的な態様では、ＭＥＨＤ７９４５Ａを、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩の投与開始後約１〜約１０日の期間投与することができる。本発明の別の具体的な態様では、ＭＥＨＤ７９４５Ａを、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩の投与開始前約１〜約１０日の期間投与することができる。本発明の別の具体的な態様では、ＭＥＨＤ７９４５Ａの投与とＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩の投与を同日に開始する。
【００９６】
上記の同時投与薬剤の好適な用量はいずれも現在使用されている用量であり、治療係数上昇又は毒性軽減又はその他の副作用若しくは結果といった、新たに同定された薬剤及び他の化学療法剤又は治療との組み合せ作用（相乗作用）により減量してよい。
【００９７】
抗癌治療の特定の実施形態では、治療的組み合わせを、外科的治療及び放射線治療と組み合わせてよい。組み合わせの量とそれに関連する投与時期は、所望の併用療法効果の達成を目指して選択されるであろう。
【００９８】
医薬組成物の投与
化合物は、治療すべき状態に適した任意の経路で投与してよい。好適な経路には、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、吸入、皮内、髄腔内、硬膜外、及び点滴法を含む）、経皮、直腸、経鼻、局所（口内及び舌下を含む）、膣、腹腔内、肺内及び鼻腔内が含まれる。局所投与は、経皮パッチなどの経皮投与又はイオン泳動装置を使用して行うことができる。
【００９９】
薬物の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  （１９９５）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに考察されている。製剤の他の例は、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｖｏｌ  ３，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹに記載されている。局所免疫抑制治療に関しては、化合物を、移植前に阻害剤を灌流させる又は移植片を阻害剤と接触させることを含む、病巣内投与によって投与してよい。好ましい経路は、例えば受容者の状態によって異なる場合があることは認識されよう。化合物を経口投与する場合は、薬理学的に許容される担体、流動化剤、又は賦形剤と共に丸剤、カプセル、錠剤等として製剤化してよい。化合物を非経口投与する場合は、薬理学的に許容される非経口ビヒクル又は希釈剤と共に、以下で詳述するような、注入可能な単位剤形で製剤化してよい。
【０１００】
ヒト患者を治療する用量は、式Ｉ若しくはＩＩの化合物又はその薬理学的に許容される塩が約２０ｍｇ〜約１６００ｍｇの範囲であってよい。一般的な用量は、化合物約５０ｍｇ〜約８００ｍｇであってよい。用量は、１日１回（ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、又はそれ以上の頻度で投与してよく、特定の化合物の吸収、分布、代謝及び排泄を含む薬物動態（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）特性に応じて決まる。また、毒性因子も投与量及び投与レジメンに影響を及ぼし得る。経口投与される場合、丸剤、カプセル又は錠剤を、特定の期間、１日２回、連日、又は１週間に１回若しくは２週間もしくは３週間に１回などのより少ない頻度で摂取してよい。レジメンを多数の治療サイクルで繰り返してよい。
【０１０１】
ヒト患者をＭＥＨＤ７９４５Ａなどの抗体で治療するための用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、又は３０ｍｇ／ｋｇの用量を１以上（又はその任意の組み合わせ）患者に投与してよい。かかる用量を、連日又は間欠的、例えば、毎週、２週間おき、又は３週間おきに投与してよい。
【０１０２】
治療方法
治療的組み合わせは、疾患、状態及び／又は障害の治療に有用であり、これらには哺乳類においてキナーゼＡＫＴによる調節を受けたものを含むが、これに限定されない。本発明の方法により治療可能な癌には、中皮腫、子宮内膜癌、神経膠腫、膵癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、胃癌、結腸癌、及び頭頸部癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明の組み合わせは、ある種の癌の表現型に対し改善された作用を提供し得る。例えば、本発明の特定の組み合わせは、ＰＴＥＮ変異（又は低若しくはヌルのステータス）、ＡＫＴ変異（又はｐＡＫＴ発現若しくは増幅レベルが高い）、ＰＩ３Ｋ変異、又はこれらの組み合わせに関連した癌に対し改善された作用を提供し得る。
【０１０４】
したがって、本明細書に記載する特定の組み合わせは、これらの型の癌に対し特に有用であり得る。
【０１０５】
ある実施形態では、本明細書に記載する組み合わせは、トリプルネガティブ乳癌の治療に有用である。トリプルネガティブ乳癌は、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−を特徴とする癌である。トリプルネガティブ乳癌は全乳癌の約１０〜２０％を占め、若い女性に発症する傾向がある。トリプルネガティブ乳癌は非常に侵攻性であり、治療の選択肢が限られている。
【０１０６】
ＰＴＥＮのヌル（又は低）ステータスは、当該分野で公知である任意の好適な手段で測定できる。１実施例では、ＩＨＣを使用する。別の方法では、ウェスタンブロット解析を使用できる。ＰＴＥＮの抗体は市販されている（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ウィンチェスター））。ＰＴＥＮステータス用ＩＨＣ及びウェスタンブロット解析の実施例手順は、Ｎｅｓｈａｔ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＰＴＥＮ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８，  １０３１４−１０３１９  （２００１）、及びＰｅｒｒｅｎ，  Ａ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＴＥＮ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｕｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １５５，  Ｎｏ．  ４，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９９に記載されている。また、ＡＫＴ変異又はＰＩ３Ｋ変異に関連した癌は、当該分野で公知の技術を使用して同定可能である。
【０１０７】
被験試料の、非活性化又は非リン酸化ＡＫＴのレベルと比較した場合のＡＫＴの活性化又はリン酸化（「ｐＡＫＴ」）レベルは、当該分野で公知の方法により測定可能である。ｐＡＫＴステータスは、比（例えば、腫瘍細胞内のｐＡＫＴ量を同種の非腫瘍細胞ｐＡＫＴ量で割った値）又は減法（例えば、腫瘍細胞のｐＡＫＴの量から同種の細胞又は非腫瘍細胞のｐＡＫＴ量を引いた値）で表すことができる。ｐＡＫＴプロファイルは、ＡＫＴ下流のリン酸化された標的の量（例えば、ｐＧＳＫ又はＰＲＡＳ４０）を測定することにより、経路の活性化レベルとして表すこともできる。ｐＡＫＴの高値は、試料のＡＫＴ全体の活性化又はリン酸化レベルが、ベースライン値より高いことを指す。１つの実施例では、ベースライン値は、被験細胞種のｐＡＫＴ基礎レベルである。別の実施例では、ベースライン値は、試料細胞、例えば非癌性又は細胞のある母集団のｐＡＫＴ平均又は平均レベルである。別の実施例では、ｐＡＫＴ高値は、同種哺乳類又は患者母集団の正常で健常な（例えば、非腫瘍）同じ型の細胞の平均と比較した場合に、過剰に発現又は増幅し、細胞内でＡＫＴがリン酸化又は活性化している腫瘍細胞を指す。ｐＡＫＴプロファイルは、特定のＰＩ３ｋ／ＡＫＴキナーゼ経路阻害剤の有効性を予測するために、ほかのマーカー、例えばＦＯＸＯ３ａ局在プロファイルと併用することもできる。ＰＩ３ｋ、ＫＲＡＳ及びＡＫＴ変異の有無を試験するキットが市販されている（Ｑｉａｇｅｎ）．
【０１０８】
１つの具体的な態様では、本発明は、本発明の組み合わせを患者に投与することを含む、ＰＴＥＮ変異若しくは発現の喪失、ＡＫＴ変異若しくは増幅、ＰＩ３Ｋ変異若しくは増幅、又はそれらの組み合わせに関連した癌患者の治療方法を提供する。別の態様では、本発明は、患者の癌がＰＴＥＮ変異若しくは発現の喪失、ＡＫＴ変異若しくは増幅、ＰＩ３Ｋ変異若しくは増幅、又はそれらの組み合わせに関連しているかどうかを判定することを含む、本発明の組み合わせを用いて治療可能な癌患者を同定する方法であって、ＰＴＥＮ変異若しくは発現の喪失、ＡＫＴ変異若しくは増幅、ＰＩ３Ｋ変異若しくは増幅、又はそれらの組み合わせに患者の癌が関連していることが、本発明の組み合わせを用いて治療可能な癌であることを示す、癌患者を同定する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明の組み合わせを用いる治療に該当すると同定された患者を治療することをさらに含む方法を提供する。ある実施形態では、癌は卵巣癌、乳癌、黒色腫、結腸癌又は非小細胞肺癌である。
【０１０９】
製造物品
本発明の別の実施形態において、上述した疾患及び障害の治療に有用な組み合わせを有する製造物品、つまり「キット」を提供する。ある実施形態では、キットは本明細書に記載する容器及び組み合わせを含む。
【０１１０】
キットは、容器上又は容器に関連付けられて、ラベル又は添付文書をさらに含んでよい。用語「添付文書」を使用する場合、かかる治療的製品の適応、用法、用量、投与、禁忌及び／または使用に関する警告についての情報を含有する、通例、治療的製品の商品包装に含まれる説明書を指す。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多種多様な材料で形成してよい。容器は、状態の治療に有効な組み合わせ、又はその製剤を保持してよく、無菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈用溶液バッグ又はバイアルであってよい）を有してよい。ラベル又は添付文書は、癌など選択状態の治療用にその組成物を使用することを示す。ある実施形態では、ラベルまたは添付文書は、異常な細胞成長による障害を治療するために組み合わせを含む組成物を使用できることを示す。ラベル又は添付文書は、ほかの障害の治療に組成物を使用できることを示してもよい。あるいは、又はさらには、製造物品は、薬理学的に許容される注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液などの緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでよい。また、さらに、ほかの緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商用及び使用者の観点から望ましいほかの物質を含んでよい。
【０１１１】
キットは、組み合わせを投与するための指示書、及び存在する場合は、第２の医薬製剤をさらに含んでよい。例えば、キットがＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩を含有する第１の組成物と、ＭＥＨＤ７９４５Ａを含む第２の医薬製剤とを含む場合、それを必要とする患者への、第１及び第２の医薬組成物を同時、順次又は別々に投与するための指示書をキットにさらに含んでよい。
【０１１２】
別の実施形態において、キットは、錠剤又はカプセルなど固形経口用形態の組み合わせの送達に好適である。このようなキットは、好ましくは多くの単位用量を含む。このようなキットには、それらの意図する使用の順序で配された投与量を有するカードが含まれる。このようなキットの一例は「ブリスターパック」である。ブリスターパックは包装業界で周知であり、医薬単位剤形を放送するために広く使用されている。所望であれば、例えば数字、文字又は他の印の形態で、または用量を投与することができる治療スケジュールの日を指定する差し込み日程表を付けて、記憶補助を提供することができる
【０１１３】
ある実施形態によると、キットは、（ａ）ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩を中に含む第１の容器；（ｂ）ＭＥＨＤ７９４５Ａを含む第２の容器、及び（ｃ）抗高増殖性活性を有する別の化合物を含む、第３の医薬製剤を中に含む第３の容器を含んでよい。あるいは、又はさらには、キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液などの薬理学的に許容される緩衝液を含む別の容器を含んでよい。また、さらに、ほかの緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商用及び使用者の観点から望ましいほかの物質を含んでよい。
【０１１４】
キットに、ＧＤＣ−００６８若しくはＧＤＣ−０９４１、又はその薬理学的に許容される塩及びＭＥＨＤ７９４５Ａの組成物を含む場合、かかるキットは、分割型ボトルまたは分割型ホイルパケットなど、別個の組成物を収めるための容器を含んでよいが、別個の組成物を単一の非分割型容器内に収めてもよい。一般に、キットには、別個の成分を投与するための指示書を含む。キット形態は、別個の成分を、異なる剤形で（例えば、経口及び非経口）好ましく投与する場合、異なる投与間隔で投与する場合、または組み合せの個々の成分を滴定することを処方医師が望む場合に、特に有利である。
【０１１５】
本発明の具体的な態様
本発明の１つの具体的な態様では、高増殖性障害は癌である。
【０１１６】
本発明の１つの態様では、癌はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の高活性化に関連している．
【０１１７】
本発明の１つの具体的な態様では、癌はＰＴＥＮ変異に関連している。
【０１１８】
本発明の１つの具体的な態様では、癌はＡＫＴの変異、過剰発現又は増幅に関連している。
【０１１９】
本発明の１つの具体的な態様では、癌はＰＩ３Ｋ変異に関連している。
【０１２０】
本発明の１つの具体的な態様では、癌はＰＴＥＮ、ＡＫＴ及び／又はＰＩ３Ｋの変異の組み合わせに関連している。１つの実施例では、癌は卵巣、乳癌、黒色腫、頭頸部癌、結腸又は非小細胞肺癌である。
【０１２１】
本発明の１つの具体的な態様では、癌は中皮腫、子宮内膜癌、膵癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、肺癌、卵巣癌、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌）、黒色腫、胃癌、結腸癌、腎癌、頭頸部癌、及び神経膠腫から選択される。
【実施例】
【０１２２】
本発明を説明するために、以下の実施例が含まれる。しかしながら、これらの実施例は発明を限定するのではなく、発明の実施の方法を示唆することを意図するだけであると理解されるべきである。
【０１２３】
実施例１  ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＨＥＲ３／ＥＧＦＲの複合阻止（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ）は、トリプルネガティブ乳癌における抗腫瘍活性を増強する。
６０％までのトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は高レベルのＥＧＦＲを発現する。さらに、ＴＮＢＣは、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路の過剰活性化に至る高頻度のホスファターゼおよびテンシンホモログ（ｔｅｎｓｉｏｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（ＰＴＥＮ）機能喪失に関連する。これにより、この患者サブセットでＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ阻害剤を使用する根拠が得られる。しかしながら、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えばＨＥＲ３の代償性発現（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ阻害剤の有効性を限定する可能性がある。両ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３ならびにＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の複合標的化が、ＴＮＢＣにおいて単剤と比較して優れた抗腫瘍活性をもたらすかどうかを評価した。
【０１２４】
いくつかのＴＮＢＣ細胞系を、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の両方を標的とする二重作用性抗体）、ＡＫＴ阻害剤ＧＤＣ−００６８、および汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＧＤＣ−０９４１で処理した。細胞生存性を、細胞Ｔｉｔｅｒ−ＧｌｏおよびＣｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔによって測定した。ＴＮＢＣの細胞系由来異種移植編モデルおよび患者由来異種移植片モデルの両方をＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１、またはＭＥＨＤ７９４５ＡとＧＤＣ−００６８もしくはＧＤＣ−０９４１のいずれかとの組み合わせで治療した。腫瘍サイズおよび組織構造を調べた。タンパク質発現をウェスタンブロット、質量分析、ＣＥＥＲおよび免疫組織化学によって測定した。
【０１２５】
ＧＤＣ−００６８およびＧＤＣ−０９４１治療の結果、全ＴＮＢＣ細胞系にわたってＩＣ５０が１７０ｎＭから１μＭ未満に及ぶ、細胞生存性の様々な阻害が得られた。ＥＧＦまたはヘレグリンのいずれかで刺激された細胞において、ＭＥＨＤ７９４５ＡはＨＥＲ３／ＥＧＦＲ受容体リン酸化を防止し、ＰＩ３Ｋ阻害剤の抗増殖活性を改善した。
【０１２６】
これらの化合物のインビボでの活性を試験するために、ＴＮＢＣの３つの異なるモデル、すなわち、２つの細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨＣＣ７０）に基づくもの、ならびに患者由来異種移植片を使用した。ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＧＤＣ−０９４１またはＧＤＣ−００６８の投与は、腫瘍成長において様々な遅延を示し、一方、ＭＥＨＤ７９４５ＡとＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１のいずれかとの組み合わせは、単剤治療よりも優れていた。両組み合わせは、腫瘍成長を防止するかまたは腫瘍縮小に至り、各コホート中のマウスの１／２で完全奏功が達成された。特に、すべての治療（９週間までの治療的暴露）は耐容性良好であった。治療された腫瘍の分析によって、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の強力な阻害が明らかになり、ホスホ−ＰＲＡＳ４０およびホスホ−Ｓ６レベルが減少した。さらに、ＭＥＨＤ７９４５ＡはＰＩ３Ｋ阻害の結果として起こるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３リン酸化を有効に防止した。
【０１２７】
本明細書で提供するのは、ＨＥＲ３がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤および抗ＥＧＦＲ剤の両方の抗腫瘍活性の制限に関与することの証拠である。ＭＥＨＤ７９４５ＡによるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の同時標的化は、ＥＧＦＲ陽性ＴＮＢＣの前臨床モデルにおけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害の有効性を増強する。さらに、ＨＥＲ３発現は、抗ＥＧＦＲ療法によって腫瘍退縮を達成する可能性が低いＴＮＢＣ患者において誘導されるようである。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻害は、標的化療法から恩恵を受けることができるＴＮＢＣ患者のパーセンテージを大幅に拡大する可能性がある。
【０１２８】
したがって、ＭＥＨＤ７９４５ＡとＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１のいずれかとの複合療法は、ＴＮＢＣの前臨床モデルにおいて単剤療法よりも優れていた。
【０１２９】
結果
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害と組み合わせたＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の阻止の結果、優れた抗腫瘍活性が得られる
ＥＧＦＲの上昇したレベルおよびＰＴＥＮ発現の喪失を特徴とするＨＣＣ７０およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＴＮＢＣ細胞系を、ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、およびこれらの阻害剤の組み合わせで治療した。ＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１での治療の結果、ＨＥＲ３の発現が増大し、ＨＣＣ７０細胞において、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の両方が活性化された（図１Ａ）。ＭＥＨＤ７９４５Ａの添加は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３リン酸化の誘発を防止し、両細胞系におけるＰＩ３ＫおよびＥＲＫ下流経路の阻害を増強した（図１Ａ）。特に、ＧＤＣ−００６８はＡｋｔのＡＴＰ結合部位について競合し、その２つの調節部位で酵素の過剰リン酸化を引き起こし得る（Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３（Ｏｋｕｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５，  ４８４  （２００９））。
【０１３０】
ＭＥＨＤ７９４５ＡとＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１との組み合わせが抗増殖活性を増強するかどうかをＨＣＣ７０およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の両方で試験した。５日間治療した細胞において、単剤ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａに対する様々な感受性が観察された。しかしながら、抗ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ剤およびＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせは、単剤と比較して細胞増殖／生存性の優れた阻害をもたらした（図１Ｂ）。
【０１３１】
これらのインビボでの発見を拡大するために、ＭＥＨＤ７９４５Ａの有効性を、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８由来およびＨＣＣ７０由来の異種移植片の両方において、ＡｋｔまたはＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかとの組み合わせで試験した。腫瘍は、単剤ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａに対して軽度にしか反応しなかったが、ＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａの組み合わせは、単剤療法と比べて有意に優れた腫瘍成長阻害をもたらした（０．０１未満のｐ、Ｐ値は両側スチューデントｔ検定を用いて算出した）。さらに、組み合わせコホートにおける１９匹のマウス中９匹が完全腫瘍縮小を達成し、治療中止後９０日に再発は観察されなかった。
【０１３２】
実験の最後（３９日）に集めたＨＣＣ７０腫瘍におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３発現／活性化のレベルを調査した。免疫組織化学（ＩＨＣ）および組み合わせレジメンで治療された腫瘍から得られる比較的少量の組織により信頼性のあるホスホ−ＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）検出を得るのは技術的に困難なので、別の方法を用いてＨＥＲ３発現およびリン酸化の両方の測定した。凍結した組織を、共同的増強酵素免疫反応性（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ、ＣＥＥＲ）、ナノグラムの量のタンパク質の逆相検出を利用するプラットフォームによって分析した。ＡｋｔまたはＰＩ３Ｋ阻害は、両ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３発現の増加ならびにリン酸化の全体的な増加に至った（０．０５未満のｐ、Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を用いて算出した）。この解釈に限定されることを意図しないが、ＧＤＣ−００６８後のＥＧＦＲリン酸化における上昇は、全体的な状態レベルの変化が観察されなかったので、増大したＥＧＦＲ／ＨＥＲ３ヘテロ二量化の結果である可能性が高かった。ＭＥＨＤ７９４５ＡをＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１のいずれかに添加することによって、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔによって誘導される受容体リン酸化が減少した。
【０１３３】
ＴＮＢＣの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）における同じ治療の活性を次いで試験した。これらの腫瘍はＩＨＣによって特性化し、検出不可能なレベルのＰＴＥＮ、高レベルのＥＧＦＲおよびＫｉ６７について約７０％の染色が見いだされた。これらの特徴から、未治療腫瘍異種移植片の急速な成長によって確認される、特に悪性の表現型を予測された（図１Ｃ、対照アーム）。単剤ＧＤＣ−０９４１およびＭＥＨＤ７９４５Ａはどちらも腫瘍成長を遅らせた。組み合わせで、それらは耐久性腫瘍静止状態を引き起こした（図１Ｃ）。細胞に基づく異種移植片と一致して、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの活性および全体的レベルはどちらもＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害により増加し、ＭＥＨＤ７９４５Ａは受容体リン酸化を防止した（図１Ｄ）。興味深いことに、ＧＤＣ−００６８単剤療法はＧＤＣ−０９４１と比較して優れた抗腫瘍活性を示した。この効果は、このモデルでＥＧＦＲおよびＨＥＲ３リン酸化を誘発する能力が低いことによる可能性がある（図１Ｄ）。それでも、その有効性はＭＥＨＤ７９４５Ａの添加によってさらに増強された。
【０１３４】
腫瘍細胞増殖は、実験エンドポイントで集められた異種移植片からの試料のＫｉ６７指数を用いて測定した。Ｋｉ６７陽性細胞のパーセンテージは、組み合わせコホート中でのみ有意に低かった。これらの結果は、１ｃｍ３を超える体積を有する確立された患者由来の腫瘍有し、６日間ＧＤＣ−０９４１、ＭＥＨＤ７９４５Ａまたは両薬剤の組み合わせで治療したマウスにおけるＫｉ６７陽性循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数を測定してさらに確認された。治療は実験の期間全体について耐性良好であり、完全腫瘍退縮を経験したマウスにおいて腫瘍再発は検出されなかった。まとめると、これらのデータは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３両方を標的とすることで、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤の抗腫瘍効果が増強されることを示す。
【０１３５】
ＨＥＲ３抑制は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害が介在する最適抗腫瘍活性のために必要である。
これらのモデルにおけるＨＥＲ３阻害の役割を分析するために、ＧＤＣ−００６８またはＧＤＣ−０９４１のいずれかと組み合わせた、ＥＧＦＲのみを標的とする抗体であるセツキシマブと、ＭＥＨＤ７９４５Ａの、ＨＣＣ７０細胞における活性を測定した。両抗体は、上皮成長因子（ＥＧＦ）で刺激された細胞においてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害が介在する抗増殖活性を増強した。しかしながら、ＭＥＨＤ７９４５Ａは、ヘレグリン（ＨＲＧ）で刺激された細胞においてＧＤＣ−００６８およびＧＤＣ−０９４１の高増殖活性との共同でセツキシマブよりも優れていた（図２Ａ）。
【０１３６】
ＨＣＣ７０由来の異種移植片におけるＧＤＣ−０９４１と組み合わせたセツキシマブおよびＭＥＨＤ７９４５Ａの抗腫瘍活性を測定した。セツキシマブとＧＤＣ−０９４１との組み合わせは、単剤治療と比べて腫瘍成長のさらなる阻害には至らなかったが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋを同時に標的とすることで腫瘍縮小に至り（図２Ｂ）、９例中４例で異種移植片が完全退縮した。生化学的に、ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブはどちらもこれらの異種移植片におけるＥＧＦＲリン酸化をブロックした；しかしながら、ＭＥＨＤ７９４５ＡだけはＨＥＲ３活性化を減少させた（図２Ｃ）。これらの結果は、ＨＥＲ３が、この設定でＰＩ３Ｋ阻害の有効性の制限において重要な役割を果たすことを裏付ける。
【０１３７】
ＥＧＦＲ減少調節およびＨＥＲ３増加調節は、ＴＮＢＣ患者における抗ＥＧＦＲ療法に対する低い応答に関連する。
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３における変化が、臨床で標的療法に対する応答に影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、これらの受容体の発現を、標準的化学療法と組み合わせた抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ（４０人の患者）およびセツキシマブ（３０人の患者）の抗腫瘍活性を試験する２つのパイロット新補助臨床試験に登録したＴＮＢＣ患者由来のサンプルで測定した。
【０１３８】
４つの標準的細胞毒性剤と組み合わせたパニツムマブ試験に登録した４０人の患者のうち、１９人（４７．５％）が病理学的完全奏功（ｐＣＲ）を達成し（２４週）、そして２１人（５２．５％）が外科手術時に残存疾患を示した。細胞毒性に基づく新補助化学療法のみで治療したＴＮＢＣ患者と比較して、ｐＣＲにおけるこのような２倍の増加（Ｃ．  Ｌｉｅｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６，  １２７５  （２００８））は、この設定で抗ＥＧＦＲ療法を加える利点を強調する。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３発現のＩＨＣ評価を、治療前試料すべて、および外科手術で摘出された２１の残存浸潤性腫瘍において実施した。治療前ＥＧＦＲヒストスコア（ｈｉｓｔｏｓｃｏｒｅ）が７０を超える患者群は、５８％（２６人中１５人）のｐＣＲ率を示し、一方、治療前ＥＧＦＲヒストスコアが７０以下の患者では、完全腫瘍退縮は２８％（１４人中４人）に限られた（図３Ａ）。しかしながら、おそらくは分析した患者の人数が少ないことを反映して、この傾向は、統計的有意性（ｐ＝０．０８）には達しなかった。
【０１３９】
ｐＣＲを経験しなかった患者由来の残存（治療後）腫瘍のＥＧＦＲのレベルを治療前の対応物と比較した。ＥＧＦＲレベルは、対になったベースライン試料と比較した場合、２１人の非ｐＣＲ患者中７人の残存腫瘍で減少した（図３ＢおよびＣ、ｐ＝０．０７）。
【０１４０】
ＨＥＲ３のレベルを、治療前対応物に対して、ｐＣＲを経験しなかった患者由来の残存（治療後）腫瘍で測定した。１３人の無反応患者に利用可能なＨＥＲ３免疫染色は、１３人の非ｐＣＲ患者中７人の残存病変で、対になった治療前サンプルよりも高いＨＥＲ３発現を示した（図４ＡおよびＢ、ｐ＝０．０１０）。
【０１４１】
ドセタキセルと組み合わせたセツキシマブの抗腫瘍活性を試験する実験に登録した３０人の患者のうち、９人がｐＣＲを経験した。一貫して、ＨＥＲ３発現は、ベースラインの対になった試料と比較した場合、１９人の非ｐＣＲ患者中１１人の残存腫瘍で増加調節されることが判明した（ｐ＝０．１０３）。
【０１４２】
これらの結果は、１）高いＥＧＦＲ発現が抗ＥＧＦＲ治療抗体に対する最適応答に必要であり得ること、２）ＨＥＲ３発現は、完全腫瘍退縮を経験しない患者において抗ＥＧＦＲ療法後に増加すること、を意味する。このように、これらの発見は、治療的処置のバイオマーカーを提供する。例えば、患者の選択は、療法による経路阻害および可能なＲＴＫ増加調節の両方を評価するための「実際の治療に基づく（ｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」生検での高いＥＧＦＲ発現に基づく可能性がある。ＴＮＢＣを有する患者をＥＧＦＲ発現についてスクリーニングすることができ、比較的高いＥＧＦＲ発現を有する患者を、本明細書に記載する治療のために選択することができる。ＨＥＲ３発現も、治療を受けた患者において、比較的高いＨＥＲ３発現を有する患者を完全腫瘍退縮がないリスクが高いと特定するために判定することができる。
【０１４３】
材料および方法
実験の設計
この実験の目的は、ＴＮＢＣの前臨床モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の同時阻止の活性を試験することであった。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の両方の発現が、ＴＮＢＣ患者における抗ＥＧＦＲ療法に対する臨床的反応に影響を及ぼすかどうかを評価した。
【０１４４】
検出力（ｐｏｗｅｒ）８０％およびｐ値０．０１で、２５％のプラセボと治療群との平均差を測定するために、動物群のサイズを計算した。異種移植片を保有する宿主マウスを無作為に等しく対照群または治療群に割り当てた。動物実験は、対照のある非盲検方式で実施した。患者サンプルにおけるｐＳ６（２４０−４）の定量化を盲検方式で実施した。インビトロ実験を少なくとも２回実施し、各レプリカについて３連で実施した。
【０１４５】
細胞系および化合物
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨＣＣ７０をＡＴＣＣから購入し、湿気のある環境および５％のＣＯ２中、それぞれ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／Ｌの１−グルタミン、２０単位／ｍｌのペニシリンおよび２０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ハムＦ−１２  １：１およびＲＰＭＩ１６４０中、３７℃にて維持した。汎ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＧＤＣ−０９４１をＳＵ２Ｃ／ＰＩ３Ｋ  Ｄｒｅａｍ  Ｔｅａｍ  ｍｏｕｓｅ  ｐｈａｒｍａｃｙから入手した。Ａｋｔ阻害剤であるＧＤＣ−００６８および二重ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３阻害剤であるＭＥＨＤ７９４５Ａは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの好意によって提供された。すべての化合物をインビトロ実験のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。
【０１４６】
細胞生存性および増殖
増殖のために、５×１０５細胞を９６ウェルプレートに播種し、表示された濃度のＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１、および／またはＭＥＨＤ７９４５Ａで処理した。５日後、細胞を固定し、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔで染色した。細胞増殖も、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造業者によって記載されているようにして分析した。ヘレグリン（ＨＲＧ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）誘発性増殖について、５×１０５細胞を４ｎｇ／ｍｌのリガンド存在下、ＧＤＣ−００６８、ＧＤＣ−０９４１、および／またはＭＥＨＤ７９４５Ａで５日間処理し、次いでＣｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔで染色した。
【０１４７】
ウェスタンブロッティング
細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，  ａｎｄ  ＰｈｏｓｐｈｏＳｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ））を添加した氷冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中に掻き落とした。溶解物を１３，０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって清澄化し、上清を除去し、そしてＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度について分析した。３５マイクログラムの全溶解物をＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分割し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動で移した。膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５％の脱脂粉乳中で１時間ブロックし、次いで５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中以下の一次抗体を使用してハイブリダイズさせた：ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、Ａｋｔ、ホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ（２４０／４）、ホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／６）、Ｓ６、ホスホ−ＰＲＡＳ４０（Ｔｈｒ２４６）、ＰＲＡＳ４０、ホスホ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ｅｒｋ、ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ＥＧＦＲ、ホスホ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）、ＨＥＲ３（１：５００−１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ベータ−アクチンをローディング対照（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）として、５％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で使用した。マウスおよびウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型二次抗体（１：５０，０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中２％脱脂粉乳で希釈した。タンパク質−抗体錯体をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ＦｅｍｔｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた化学発光によって検出し、そして画像をＧ−ＢＯＸカメラシステムで取り込んだ。
【０１４８】
腫瘍異種移植片の確立およびインビボ治療
全てのマウス実験は、機関実験動物委員会（Ｉｉｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ）で認可された動物プロトコルにより、機関のガイドラインにしたがって実施した。６週令のメス無胸腺ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、エアフィルター付層流キャビネット中で、１２時間の光サイクルで、食餌および水を自由に与えて飼育した。
【０１４９】
細胞系由来の異種移植片実験のために、マウスに、４：１の比で１５０μＬの培養培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁させた１×１０７のＨＣＣ７０またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８を皮下注射した。１μｍｏｌ／Ｌの１７β−エストラジオールを記載されているようにマウス飲料水に添加した（Ｇａｒｃｉａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，  ２６０３  （２０１２））。
【０１５０】
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試験のために、腫瘍を６週令のメス無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。異種移植片が成長したら、腫瘍組織をレシピエントマウスに再移植し、インプラントが成長したら無作為化した。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の収集のために、腫瘍を無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体（ｍａｍｍａｒｙ  ｐａｄ）に移植した。
【０１５１】
腫瘍が約１５０〜２５０ｍｍ３の平均体積に達したら、マウスをｎ＝７−１１腫瘍／群で無作為に治療アームに分けた。ＧＤＣ−００６８［４０ｍｇ／ｋｇ］またはＧＤＣ−０９４１［７５ｍｇ／ｋｇ］を０．５％メチルセルロースおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ＭＣＴ）溶液中に溶解させ、強制経口投与（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）により１日１回投与した。ＭＥＨＤ７９４５Ａ［１０ｍｇ／ｋｇ］およびセツキシマブ［１０ｍｇ／ｋｇ］をＰＢＳ中で希釈し、１週間に２回腹腔内注射した。腫瘍をデジタルキャリパーで全治療期間にわたって測定した。腫瘍体積は、式：
（長さ幅×幅２）×（π／６）
を用いて決定した。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとしてプロットした。
【０１５２】
共同的増強酵素免疫反応性（ＣＥＥＲ）アッセイ
異種移植片における経路タンパク質発現レベルおよびそれらの活性化をＣＥＥＲによって測定した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｐ２−０６−１３，  （２０１０））。ＣＥＥＲは、ニトロセルロースミクロアッセイ表面上にプリントされた捕捉抗体間の特有の免疫錯体の形成、スライドと反応した細胞溶解物中の標的分子、および２つの独立したディテクター−抗体を利用する。ディテクター−抗体の一方をグルコースオキシダーゼと結合させ、他方をホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させる。標的検出（コンピュータユニット、ＣＵとして表す）は両ディテクター−抗体の存在を必要とし、グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼとの間の酵素チャネリング事象は、両抗体がごく接近していなければ起こらない
【０１５３】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をすでに記載されているようにしてニシン骨片上で捕捉し、固定し、透過処理した（Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，  １８３９２  （２０１０））。捕捉のために、ニシン骨片を抗ＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）抗体でコーティングした。ＣＴＣを有する小片を、広域サイトケラチン（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ４５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＫｉ６７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する一次抗体ならびにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）と結合させた二次抗体とともにインキュベートした。核をＤＡＰＩで染色した。自動蛍光顕微鏡走査システム（ＢｉｏＶｉｅｗ）を使用して、Ｋｉ６７陽性ＣＴＣ（ＣＫ＋／ＣＤ４５−／Ｋｉ６７＋）、Ｋｉ６７陰性ＣＴＣ（ＣＫ＋／ＣＤ４５−／Ｋｉ６７−）および汚染白血球（ＣＤ４５＋）を同定した。
【０１５４】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
異種移植片：切開した組織を除去直後に１０％緩衝ホルマリン溶液中で最大２４時間、室温（ＲＴ）にて固定した後、脱水し、真空条件下でパラフィン包埋した。サンプルを正常ヤギ血清でブロックし、そしてＫｉ６７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＰＴＥＮ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体とともにインキュベートした。抗原−抗体反応は、基質としてのＤＡＢ（Ｄａｋｏ）とＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）Ｂｏｏｓｔ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ８１１４）によって明らかになった。
【０１５５】
患者サンプル：腫瘍組織を１０％緩衝ホルマリン中で４８時間固定し、さらにパラフィン中に包埋した。４ミクロンの切片をキシレン中で脱パラフィンし、そして等級品アルコール中で水和させた。ＥＧＦＲ検出のために、抗原をプロテアーゼ処理（３７℃で８分）によって回復させ、切片を３７℃で１時間、あらかじめ希釈した、すぐに使用できるマウスモノクローナル抗ＥＧＦＲ（クローン３Ｃ６、Ｖｅｎｔａｎａ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）とともにさらにインキュベートした。抗原−抗体反応をＢｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＩＨＣ  ｓｔａｉｎｅｒ中ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  ＤＡＢｒｅｖｅａｌ  ｓｙｓｔｅｍ（すべてＶｅｎｔａｎａから得られる）により可視化した。ＨＥＲ３については、切片を、ＰＴ−Ｌｉｎｋ装置（Ｄａｋｏ）中、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ（Ｄａｋｏ）中で９７℃にて２０分間加熱することによって、抗原回復を実施した。組織を次いで、３７℃にて２時間、１：５０で希釈したマウスモノクローナル抗ＨＥＲ３（クローンＤＡＫ−Ｈ３−ＩＣ、Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｋ）とともにインキュベートした。Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ  ａｕｔｏｍａｔｅ中ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｆｌｅｘ  ＤＡＢシステムを用いて抗原−抗体反応を回復した。各患者について、治療前および治療後腫瘍サンプルを一緒に実験した。ＩＨＣ染色は、患者情報を知らされていない専門の病理学者が解釈した。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３発現はどちらも、染色強度増加の尺度として０、０．５、１、１．５、２、２．５および３を有する任意単位を用いて定量化した。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３ヒストスコアは、色強度に染色された細胞のパーセンテージをかけることによって得られた積の合計として定義された。
【０１５６】
患者サンプル
ＰＤＸ確立のために、新鮮な組織を機関審査委員会の承認と患者のインフォームドコンセントの下でＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。トリプルネガティブ状態は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙによって確認された。
【０１５７】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３発現のＩＨＣ分析のためのＦＦＰＥ試料を、ＴＮＢＣ第ＩＩ〜ＩＩＩＡ病期ｐｔｓにおいて化学療法と組み合わせた抗ＥＧＦＲ抗体の有効性を試験した２つのフレンチマルチセンター試験段階ＩＩ新補助試験に参加する機関から入手した。１つの試験レジメンは、３週間ごとに投与する８サイクルから構成されていた。最初の４サイクルは、５００ｍｇ／ｍ２の各５−フルオロウラシルと組み合わせた９ｍｇ／ｋｇのパニツムマブおよびシクロホスファミド＋１００ｍｇ／ｍ２のエピルビシンを含有していた。最後の４サイクルは、先に記載した３つの細胞毒性剤の代わりに１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルとパニツムマブを有していた。別の試験レジメンは、３週間ごとに合計６サイクル投与される１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルと組み合わせた毎週のセツキシマブ（４００ｍｇ／ｍ２の初回用量と、その後の用量はすべて２５０ｍｇ／ｍ２）を含有していた。すべての患者は治療完了時に外科手術を受けた。病理学的完全奏功（ｐＣＲ）は臨床的反応のある一次エンドポイントと、二次エンドポイントとしての毒性であった。４０人の患者がパニツムマブ試験における病理学的奏功評価およびバイオマーカー研究に適格であり、一方、セツキシマブ試験は３０適格ｐｔｓで終了した。腫瘍組織サンプルを新補助治療の前および最後で系統的に集め、そして収集物をＪｅａｎ  Ｐｅｒｒｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒに集め、ここで分子および病理学的分析を実施した。ｐＣＲは、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ分類（Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，  ２２３  （１９９３））およびＳａｔａｌｏｆｆ分類（Ｓａｔａｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ  １８０，  ２９７  （１９９５））を使用して評価した。
【０１５８】
統計分析
両側ｔ検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべてのインビトロ実験を少なくとも３回繰り返した。すべてのインビボ実験を各治療アームについて少なくともｎ＝７実施した。
【０１５９】
本明細書で言及されるすべての文書は参照により組み込まれる。本発明のある実施形態を記載し、多くの詳細を説明のために記載してきたが、詳細のいくつかは、発明の基本的原理から逸脱することなく異なり得る。多くの修飾および変更が当業者には容易に明らかになるので、本発明を本明細書にまさに記載する構造および方法に限定することは望ましくない。したがって、全ての好適な修飾および等価物は、以下の特許請求の範囲で定義される範囲内に含まれるとみなすことができる。
【図１】
2016502974.tif 000008
【図２】
2016502974.tif 000009
【図３】
2016502974.tif 000010
【図４】
2016502974.tif 000011
【図５】
2016502974.tif 000012
【配列表】
2016502974000001.app
【国際調査報告】
2016502974.tif 000013
2016502974.tif 000014
2016502974.tif 000015
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