(57)【要約】  本発明は、超音波が補助する連続的水性抽出を使用して、大型藻類から抗酸化物質抽出物を得るための方法に関する。該方法は、生の藻類または乾燥藻類を使用して、水にそれを再懸濁した後に行うことができる。藻類の水懸濁液を固体濃度が１０〜３０％で調製する。混合物を超音波破砕システムに供給する。抽出物を、ろ過し、凍結乾燥して、ビフルカリア・ビフルカタについては凍結乾燥物のフロログルシノール／ｇが６２．４ｍｇ当量であり、アスコフィラム・ノドサムについては凍結乾燥物のフロログルシノール／ｇが４４ｍｇ当量の全ポリフェノール濃度を得る。抽出物は化粧品製剤および食品製剤における有効成分として使用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を特徴とする、大型褐藻類から得られた凍結乾燥された抗酸化物質抽出物：
ａ）炭水化物含有量は、凍結乾燥物のグルコース／ｇが３３〜１５６ｍｇであり、
ｂ）フコイダン含有量は、凍結乾燥物の硫酸塩／ｇが４４〜１１８ｍｇであり、ここで該フコイダンは試料の消化後の全硫酸塩として表され、
ｃ）フロロタンニン含有量は、凍結乾燥物のフロログルシノール／ｇが１２〜６２．４ｍｇ当量であり、ここで該フロロタンニンはフロログルシノールとして表され、かつ
ｄ）アルギン酸塩含有量は、凍結乾燥物のグルクロン酸／ｇが１０〜５５ｍｇ当量である。
【請求項２】
紫外領域における最大吸光度が２６０〜２８０ｎｍである、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
ＤＰＰＨラジカルの阻害能力のＥＣ５０値が、抽出物の１７．７〜２３．７ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
大型褐藻類が、ビフルカリア・ビフルカタ（Bifurcaria bifurcata）、アスコフィラム・ノドサム（Ascophyllum nodosum）、サコリザ・ポリスキデス（Saccorhiza polyschides）、およびタマハハキモク（Sargassum muticum）である、請求項１〜３に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の凍結乾燥された抗酸化物質抽出物を、生のまたは乾燥大型褐藻類から得るための方法であって、
ａ）生の大型藻類を使用する場合、大型藻類を水で洗浄すること、
ｂ）液体／固体（Ｌ／Ｓ）比が３〜５ｇ／ｇで、大型藻類を水と混合すること、
ｃ）混合物を粉砕して、粒子径が３ｍｍ未満の粉砕された大型藻類を得ること、
ｄ）生の大型藻類から出発した場合に５〜１５（ｇ／ｇ）、乾燥大型藻類から出発した場合に５０〜１５０（ｇ／ｇ）の液体／固体（Ｌ／Ｓ）比で、粉砕された大型藻類を、純エタノールまたはエタノール：水混合物（１：１（ｖ／ｖ）比）を含む液体溶媒と混合すること、
ｅ）電力密度が３〜１３Ｗ／ｃｍ３の範囲の超音波を連続的に適用することによる細胞破砕工程に混合物を付すこと、
ｆ）沈殿、およびその後の遠心分離またはろ過によって、前工程で得られた固体の藻類残渣を分離すること、
ｇ）４０℃未満の温度で真空下、エタノールまたは５０％の水を除去して、濃縮抽出物を得ること、ならびに
ｈ）濃縮抽出物を凍結乾燥して、凍結乾燥された抽出物を得ること
を含む、方法。
【請求項６】
粉砕粒子径が、乾燥大型藻類については０．５〜２ｍｍであり、生の大型藻類については０．５〜３ｍｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化粧品製剤および食品製剤の有効成分としての、請求項１〜４に記載の抗酸化物質抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は大型藻類からの化合物の抽出に関する。より具体的には、本発明は大型褐藻類からの抗酸化物質の抽出に関する。
【０００２】
背景技術
抗酸化物質は、大型藻類、植物および特に果物中に存在する二次代謝産物である。それらは物質の酸化を阻害または妨げる化合物である。食品、医薬品および化粧品産業において、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピルまたはブチロヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｒｏｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、ＢＨＡ）のような合成抗酸化物質化合物を主に使用している。ブドウ抽出物、ローズマリー抽出物、カカオ抽出物等に由来するもののような天然の抗酸化物質は、それらの低い毒性および高い抗酸化活性によってより好ましく許容されている。大きな抗酸化物質化合物ファミリーは、優れた抗酸化活性を示す大型藻類中に存在するフロロタンニンである。
【０００３】
フロロタンニン抽出のための幾つかの手順が提案されており、そのうち、クロマトグラフィーカラムでの精製に加えて、メタノール、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールのような有機溶媒を主に使用する連続的な液−液分配を挙げることができ、例えば、イシゲ（Ｉｓｈｉｇｅ  ｏｋａｍｕｒａｅ）から単離されたフロロタンニンの抗酸化効果としては、「Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｙａｎｐｉｎｇ，Ｚ．，Ｚｈｏｎｇ−Ｊｉ  Ｑ．，Ｙｏｎｇ  Ｌ．，Ｍｏｏｎ−Ｍｏｏ  Ｋ．，Ｓａｎｇ−Ｈｏｏｎ，Ｌ．およびＳｅ−Ｋｗｏｎ  Ｋ（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５６，７００１−７００９，２００８）、「Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒｏｗｎ  Ｓｅａｗｅｅｄ  Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ：Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」（Ａｕｄｉｂｅｒｔ，Ｌ．，Ｆａｕｃｈｏｎ，Ｍ．，Ｂｌａｎｃ，Ｎ．，Ｈａｕｃｈａｒｄ，Ｄ．およびＡｒ  Ｇａｌｌａ，Ｅ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，２１，３９９−４０５，２０１０））、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａｎ  ｅｄｉｂｌｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｂｒｏｗｎ  ａｌｇａ  Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｃａｖａ」（Ｌｉ，Ｙ．，Ｑｉａｎ，Ｚ．Ｊ．，Ｒｙｕ，Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｍ．およびＫｉｍ，Ｓ．Ｋ．（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １７，１９６３−１９７３，２００９））、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）」（Ｂｒｅｔｏｎ，Ｆ．，Ｃｅｒａｎｔｏｌａ，Ｓ．およびＡｒ  Ｇａｌｌ  Ｅ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，３９９，１６７−１７２，２０１１））を挙げることができる。しかしながら、これらの方法は、メタノールまたは有機ハロゲン化合物のような、食品および化粧品には許容されない残渣をもたらす。更に、水よりも低い極性が必要な場合、石油系溶媒とは対照的な水アルコール混合物が選択される。
【０００４】
７０％アセトンおよび酢酸エチルの溶媒としての使用は、「Ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎｓ  ａｓ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｒｉｎｇｇｏｌｄｉａｎｕｍ」（Ｎａｋａｉ，Ｍ．，Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｎ．，Ｎａｋａｈａｒａ，Ｋ．およびＭｉｋｉ，Ｗ．（Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，４０９−４１４，２００６））で報告された。ヘキサンを用いる最初の脂肪性物質の除去段階、続く７０％のアセトン−水を用いるフロロタンニンの抽出は、「Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｒｏｗｎ  ａｌｇａ  Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ」（Ｋｏｉｖｉｋｋｏ，Ｒ．，Ｌｏｐｏｎｅｎ，Ｊ．，Ｐｉｈｌａｊａ，Ｋ．およびＪｏｒｍａｌａｉｎｅｎ，Ｖ．（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．１８，ｐｐ．３２６−３３２，２００７））で使用された。純エタノールおよび６０％エタノールは、アスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）およびヒバマタ（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）のような種のフロロタンニンの抽出に使用され、続いて石油エーテルまたはジクロロメタンを用いて液−液分配されている（「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  ａｌｇａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ」Ｐａｒｙｓ，Ｒ．，Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ，Ａ．，Ｋｅｈｒａｕｓ，Ｓ．，Ｒｅｈｅｒ，Ｇ．，Ｇｌｏｍｂｉｔｚａ，Ｋ−ＷおよびＫｏｎｉｇ，Ｇ．Ｍ．（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１８６５−１８７０，２００７））。
【発明の概要】
【０００５】
ビフルカリア・ビフルカタ（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉａ  ｂｉｆｕｒｃａｔａ）およびアスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）のような大型褐藻類の処理から得られる抽出物は、それらのフコイダンおよびフロロタンニン含有量により、食品、化粧品および／または医薬品で使用することができる。高いフコイダン含有量が皮膚に対する湿潤能力をこれらの抽出物にもたらし、一方、抗酸化力はフロロタンニンの存在に起因する。
【０００６】
特有の強い香りを持たない天然生成物を得ることは、他の所望の使用を妨げないために、化粧品有効成分としての使用に望ましく、これは有機溶媒を使用するのではなく、水性抽出によることが好ましい。抽出物の抽出方法の別の望ましい特徴は、安価で、再生可能な、毒性がわずかまたは全くなく、かつその取扱いが危険ではない使用溶媒に関する。粗抽出物または単離された分画は、ＢＨＡ（ブチロヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｒｏｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ））またはＢＨＴ（ブチロヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｒｏｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ））のような合成抗酸化物質よりも、しばしば強い抗酸化活性を示す。
【０００７】
本発明の方法の目的は、取扱いおよび異なる製品への添加が容易で、ならびに痕跡量の溶媒を含まない安定な生成物を得るために、水の使用を可能にすることである。
【０００８】
大型褐藻類からの抗酸化物質の抽出方法は以下を含む。
ａ）生の大型藻類を使用する場合、流水での洗浄に付して、砂および着生植物を除去し、次いで吸収紙で乾燥する。乾燥藻類を使用する場合、水での洗浄工程は必要ではない。
ｂ）次いで、液体／固体（Ｌ／Ｓ）比が３〜５ｇ／ｇで、乾燥または生の藻類を水と混合する。
ｃ）前工程の混合物を、乾燥大型藻類については０．５〜２ｍｍ、生の大型藻類については０．５〜３ｍｍに粒子径が小さくなるまで、粉砕工程、好ましくはブレイド・グラインダーに付す。
ｄ）生の大型藻類から出発した場合は５〜１５（ｇ／ｇ）、乾燥大型藻類から出発した場合は５０〜１５０（ｇ／ｇ）の液体／固体（Ｌ／Ｓ）比で、粉砕された大型藻類を、純エタノールまたはエタノール：水混合物（１：１（ｖ／ｖ）比）を含む液体溶媒と混合する。
ｅ）超音波を連続的に適用することによる細胞破砕工程に混合物を付す。
ｆ）沈殿、およびその後の遠心分離またはろ過によって、前工程で得られた固体の藻類残渣を分離する。
ｇ）４０℃を超えない温度で真空下、エタノール、または水を使用した場合のみ５０％の水を除去する。
ｈ）濃縮抽出物を凍結乾燥して、固体抽出物を得る。
【０００９】
生成物を５℃未満に冷やして保管し、変容することを防ぐために光から保護する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、大型褐藻類、より具体的には、ビフルカリア・ビフルカタ（Ｂｉｆｕｒｃａｒｉａ  ｂｉｆｕｒｃａｔａ）、アスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）、サコリザ・ポリスキデス（Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ  ｐｏｌｙｓｃｈｉｄｅｓ）およびタマハハキモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｍｕｔｉｃｕｍ）種の大型藻類の処理から得られる、安定な抗酸化物質抽出物に関する。
【００１１】
図面に詳細に示される実施態様は、非限定的な例として示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、大型藻類の連続供給システムにおける超音波が補助する細胞破砕のための図を示す。
【図２】図２は、Ｃ１８逆相カラムＨＰＬＣによるフロロタンニンの検出を示す。
【図３】図３は、フロログルシノールのものと類似する、特徴的なフロロタンニンプロファイルを有するビフルカリア・ビフルカタ抽出物の紫外線プロファイルを示す。
【発明の具体的説明】
【００１３】
具体的な実施態様において、本発明は、ａ）炭水化物含有量は、凍結乾燥物のグルコース／ｇが３３〜１５６ｍｇであり、ｂ）フコイダン含有量は、凍結乾燥物の硫酸塩／ｇが４４〜１１８ｍｇであり、ここで該フコイダンは試料の消化後の全硫酸塩として表され、ｃ）フロロタンニン含有量は、凍結乾燥物のフロログルシノール／ｇが１２〜６２．４ｍｇ当量であり、ここで該フロロタンニンはフロログルシノールとして表され、かつｄ）アルギン酸塩含有量は、凍結乾燥物のグルクロン酸／ｇが１０〜５５ｍｇ当量、であることを特徴とする、大型褐藻類から得られる水性抗酸化物質抽出物に関する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、本発明の目的物である抗酸化物質抽出物を含む化粧品組成物および／または食品組成物に関する。
【００１５】
ビフカリア・ビフルカタ（Ｂｉｆｕｃａｒｉａ  Ｂｉｆｕｒｃａｔａ）からの抗酸化物質の抽出方法の応用例を、実施例によって述べるが、保護の範囲を限定するものではない。抽出は、抽出された化合物の抗酸化力または抗酸化物質の量の減少を防ぐために、４０℃未満の温度条件で連続的に行われる。
【００１６】
図１は、フロースルーセル（１０４）内に配置されたソノトロード（１０５）を含む超音波発生ユニットで構成される、大型藻類の連続供給システムにおける超音波が補助する細胞破砕のための図を示し、これは、主の蠕動ポンプ(peristaltic pump)（１０２）および別の再循環ポンプ（１０３）によって供給される。
【００１７】
本発明の具体的な実施態様において、水性抗酸化物質化合物の抽出方法は以下の工程を含む。
ａ）１２０ｇの生の大型藻類を、飲用水、続いて蒸留水で洗浄した。
ｂ）３００ｍｌの水を添加した。
ｃ）大型藻類を、１０分間ブレードミキサーを作動させることによって予備粉砕し、３ｍｍ未満の粒子径を得た。
ｄ）前工程で得られた調製物にＬ／Ｓ比が１０になるまで水を添加し、それを供給タンク（１００）に導入して、撹拌機（１０１）によって混合した。４つの中心点を含む２２の階乗の実験設計をまとめた表１に記載の抽出条件の１つを選択した。
ｅ）連続的な超音波抽出条件として、出力（適用される名目出力の大きさまたは割合）、およびソノトロード（１０５）が３〜１３Ｗ／ｃｍ３の範囲の電力密度で混合物に超音波を連続的に適用するフロースルーセル（超音波処理セルまたは超音波セル）（１０４）への藻類の培養液の流入割合のうちの再循環の間の比率についてのパラメータを検討した。表１に実験設計のために行われた処理の組み合わせをまとめる。抽出設定には、図１に示すもののような超音波が補助する抽出システムを必要とする。
ｆ）沈降可能な固体残渣を沈殿させ、デカンテーションにより上澄みから分離した。
ｇ）次の工程は遠心分離および再度の上澄みの分離から構成された。上澄みは体積１２００ｍｌであり、これを３０℃または室温での真空蒸発によって５００ｍｌに減らした。
ｈ）この具体的な実施態様において、全体積１４００ｍｌの凍結乾燥された抽出物（１０６）を得て、最終的に固体の乾燥抽出物を得た。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
生の大型藻類のウェット基準の抽出収率は、２．９〜６．６％（Ｗ／Ｗ）の範囲内であり、一方、乾燥藻類の抽出収率は、２７．７〜５７．３％（Ｗ／Ｗ）の範囲内であり、分析した藻類種それぞれの収率を表２に示す。
【００２０】
水ブランクに対する、凍結乾燥し、その後水に再溶解したこの抽出物の最大吸光度は、図３に示すように２５０ｎｍ〜２８０ｎｍである。
【００２１】
全ポリフェノール含有量
用語「ポリフェノール」は、植物中に存在する化合物のファミリー全体を意味すると理解され、これは、フェノール基（安息香酸誘導体、桂皮酸誘導体、フラボノイド等）を含むか、または誘導される。
【００２２】
方法の若干の改良として、リンモリブデン・リンタングステン酸試薬を用いる全フェノール類の比色法が提案された。「Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ＆Ｒｏｓｓｉ」（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｖ．Ｌ．、Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．（Ｊ．Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．，１６，１４４−１５８，１９６５））を使用して、得られた抽出物のポリフェノール含有量を測定した。従って、水に溶解した試料５００μｌを使用し、これに２．５ｍｌのフォリン−チオカルト試薬および２．０ｍｌのＮａ２ＣＯ３を添加した。試料を４５℃で１５分間保温した後、吸光度を７６５ｎｍで読み取った。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ｂｒａｎｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｗ，Ｃｕｖｅｌｉｅｒ  ＭＥ，Ｂｅｒｓｅｔ  Ｃ．，ＬＷＴ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：５−３０  １８（１９９５））で提案されたＤＰＰＨラジカルの阻害アッセイを使用し、抽出物のプロトン供与能力を測定した。記載のような若干の改良を該方法に適用し、２０μｌの抽出物の水溶液を、９８０μｌのラジカルのメタノール溶液（６．９×１０−５ｍｏｌ／ｌ）に添加した。１６分後、吸光度の低下を５１５ｎｍで記録した。ＤＰＰＨラジカルの阻害割合を、記録されたブランクに対して計算した。アスコフィラム・ノドサム抽出物およびビフルカリア・ビフルカタ抽出物を５〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で評価して、ＥＣ５０を決定し、その結果は、それぞれ、２３．７３±３．８３ｍｇ抽出物／ｍｌおよび１７．６８±２．２ｍｇ抽出物／ｍｌであった。没食子酸当量（ＧＡＥ）としてこれらの同じ値を表すと、それぞれ１．０８±０．１６および１．０４±０．１３ｍｇＧＡＥ／ｍｌに相当する。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
多糖類含有量
用語「多糖類」は、糖類（主に六炭糖および／または五炭糖）から形成されるポリマーを意味すると理解され、これは、植物中の構造成分およびエネルギー源として機能する。
【００２７】
多糖類含有量を、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ」（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｋ．Ａ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．、Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５６，１９５６））で提案されたフェノール−硫酸法によって測定した。大型藻類のビフルカリア・ビフルカタから得られた抽出物の凍結乾燥物のグルコース／ｇの平均炭水化物含有量１５６．７ｍｇを得、同様の条件でアスコフィラム・ノドサムから得られたものより２９％高かった。
【００２８】
フコイダンは藻類の特徴的な多糖類のファミリーを意味すると理解され、これは硫酸化糖であるフコース誘導体の重合によって形成される。
【００２９】
平均フコイダン含有量は、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｅｓｔｅｒｓ」（Ｄｏｄｇｓｏｎ，Ｄｏｄｇｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７８，ｐｐ．３１２−３１７，１９６１））に記載された方法によって測定し、試料の消化後の全硫酸塩として表される。ビフルカリア・ビフルカタ抽出物における平均値は、凍結乾燥物の硫酸塩／ｇが１１８ｍｇであり、同様の条件で得られたアスコフィラム・ノドサム抽出物より１３４％高い。ＩＣＰ−ＯＥＳ技術（平均で、凍結乾燥物の３６．３ｍｇ  Ｓ／ｇ）によって測定された硫黄レベルは、アスコフィラム・ノドサム（平均で１８．１４ｍｇ／ｇ）から得られたものの２倍であった。
【００３０】
藻類における主な多糖類は、いわゆるアルギン酸塩であり、主にグルクロン酸の重合によって形成される。
【００３１】
アルギン酸塩含有量は、「Ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ」（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚら，Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．およびＡｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４，ｐｐ．４８４−４８９，１９７３））で提案された方法に従ってウロン酸含有量から見積もった。ビフルカリア・ビフルカタ抽出物は、標準としてグルクロン酸を使用して、ウロン酸として表される、平均アルギン酸塩含有量が、凍結乾燥物の５５．１ｍｇ／ｇを示し、同様の条件で得られたアスコフィラム・ノドサム抽出物より１５％高かった。
【００３２】
全ポリフェノールの分光光度測定
全ポリフェノールを測定するために、フォリン−チオカルト法を使用し、標準としてフロログルシノールを使用した。ビフルカリア・ビフルカタ抽出物におけるポリフェノールは主にフロロタンニンである、全ポリフェノールの平均含有量は、凍結乾燥物のフロログルシノール／ｇが６２．４ｍｇ当量であり、アスコフィラム・ノドサムから得られたものより７．３％高かった。
【００３３】
フロロタンニンのクロマトグラフィー測定
用語「フロロタンニン」は、フロログルシノール（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン）の重合によって形成されるポリマーを意味すると理解され、カテキン／エピカテキンおよび誘導体の重合によって形成される名称「タンニン」と類似する。タンニンは植物の細胞壁の成分であり、フロロタンニンは大型藻類の細胞壁の成分である。
【００３４】
フロロタンニンは、ヘキサンでの洗浄工程を除いて、「Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｒｏｗｎ  ａｌｇａ  Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ」（Ｋｏｉｖｉｋｋｏら，２００７，Ｋｏｉｖｉｋｋｏ，Ｒ．，Ｌｏｐｏｎｅｎ，Ｊ．，Ｐｉｈｌａｊａ，Ｋ．およびＪｏｒｍａｌａｉｎｅｎ，Ｖ．（Ａｎａｌ．１８，ｐｐ．３２６−３３２，２００７））で提案された方法論に従って、凍結乾燥された抽出物から抽出した。
【００３５】
９５ｍｇのビフルカリア・ビフルカタ抽出物を秤量し、２５ｍｌの水に溶解し、続いて、フロロタンニンを１０ｍｌのアセトン／水：７／３混合物で４回抽出した。試料を遠心分離し、上澄みを分離した。上澄み部分を集め、Ｎ２気流を用いてアセトンを除去した。残渣を水に再懸濁し、続いて凍結乾燥した。凍結乾燥物を１ｍｌの蒸留水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー装置に注入する準備を行った。クロマトグラフィー分離方法は「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｓ」（Ｚａｒａｇｏｚａ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｄ．，Ｓａｉｚ，Ｍ．Ｐ．，Ｐｏｑｕｅｔ，Ｍ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．，Ｐｕｉｇ−Ｐａｒｅｌｌａｄａ，Ｐ．，Ｍａｒｍｏｌ，Ｆ．，Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｇａｒｄａｎａ，Ｃ．，Ｌｅｒａｔ，Ｙ．，Ｂｕｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｉｎｉｓａｎ，Ｃ．，Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｉ．，Ｂｅｓｎａｒｄ，Ｍ．およびＭｉｔｊａｖｉｌａ，Ｍ．Ｔ．（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，５６，ｐｐ．７７７３−７７８０，２００８））で提案されたものであった。
【００３６】
図２は、２５〜２６分、３０分および３７分にそれぞれ検出されたシグナルの主要ピーク（５〜６、１１および１８）を示す。フロロタンニン混合物の最大吸光度は、図３に示すように２７３ｎｍで観察される。ＵＶ−可視スペクトルのプロファイルは、フロログルシノール分子の標準のプロファイルと一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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