(57)【要約】  本発明は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の定量バイオマーカーとしてのミトコンドリアＤＮＡの使用に関する。本発明は、また、このバイオマーカーを用いて、この疾患を予知する方法及びキットに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の診断及び／又は予知をする定量バイオマーカーとしてミトコンドリアＤＮＡを用いることを特徴とするミトコンドリアＤＮＡの使用。
【請求項２】
前記ミトコンドリアＤＮＡが、細胞外であることを特徴とする請求項１に記載のミトコンドリアＤＮＡの使用。
【請求項３】
ａ）被験者から採取された生体試料中のミトコンドリアＤＮＡを定量する、
ｂ）ａ）のステップで得た値を、標準値と比較する、
のステップで行うことを特徴とするアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項４】
さらに、
ｃ）前記ａ）のステップで得た値が標準値より有意に少ないとき、アルツハイマー病の前兆がある患者又はアルツハイマー病の患者とする、のステップを行うことを特徴とする請求項３に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項５】
前記採取された生体試料が、唾液、汗、涙、尿、脳脊髄液、血液、血清及び血漿から選ばれることを特徴とする請求項３又は４に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項６】
前記採取された生体試料が、脳脊髄液であることを特徴とする請求項５に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項７】
前記採取された生体試料が、血液、血清又は血漿であることを特徴とする請求項５に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項８】
前記採取された生体試料が、血清であることを特徴とする請求項７に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項９】
前記ａ）のステップが、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、又はサザンブロットにより行われることを特徴とする請求項３乃至８のいずれか１項に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項１０】
前記ａ）のステップが、定量ＰＣＲ、又は液滴デジタルＰＣＲにより行われることを特徴とする請求項９に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項１１】
前記ａ）のステップが、液滴デジタルＰＣＲにより行うことを特徴とする請求項９又は１０に記載のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項１２】
前記ミトコンドリアＤＮＡが、細胞外であることを特徴とする請求項３乃至１１のいずれか１項に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項１３】
前記被験者が、ヒトであることを特徴とする請求項３乃至１２のいずれか１項に記載のアルツハイマー病のインビトロ診断及び／又は予知方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号１、配列番号４、
ｂ）配列番号１、配列番号２、及び任意に配列番号８、
ｃ）配列番号３、配列番号４、
ｄ）配列番号６、配列番号７、及び任意に配列番号５、又は
ｅ）配列番号９、配列番号１０、
のプライマー又はプローブのセットの少なくとも１つを有することを特徴とするアルツハイマー病の診断及び／又は予知キット。
【請求項１５】
前記プライマーが、配列番号３と配列番号４、又は配列番号９と配列番号１０であることを特徴とする請求項１４に記載のアルツハイマー病の診断及び／又は予知キット。
【請求項１６】
ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブを有し、アルツハイマー病の診断及び／又は予知をすることを特徴とするアルツハイマー病の診断及び／又は予知キットの使用。
【請求項１７】
前記診断及び／又は予知キットが、請求項１４又は１５のいずれかに記載された診断及び／又は予知キットであることを特徴とする請求項１６に記載のアルツハイマー病の診断及び／又は予知キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患に関し、特に神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の診断及び／又は予知の方法に関するものであり、採取された生体試料中にあるバイオマーカーの定量に基づいている。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究では、アルツハイマー病（ＡＤ：ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ（ＥＡ））は、発症前長期間に亘る脳の生化学的、構造的及び機能的な異常変化で進行するとされている。これらの変化は、痴呆の病的症状が現れるかなり前に、ＡＤの神経変性プロセスが始まることが示されている。従って、この疾患の症状が現れる前に新しいバイオマーカーで同定することが、ＡＤを理解する上での進歩と共に、可能な診断及び／又は予知方法と、早期のかつ効率的な治療を開発するに不可欠である。
【０００３】
現在、痴呆の発症前、すなわち病的症状が出る前にＡＤを診断するに２つのバイオマーカーが使用されている。これらのバイオマーカーは、診断キット形態で、抗体を用いてβ−アミロイド蛋白質（Ａβ）、及び総タウ蛋白質（ｔ−タウ：ｔａｕ  ｔｏｔａｌ）とリン酸化タウ蛋白質（ｆ−タウ：ｔａｕ  ｆｏｓｆｏｒｉｌａｄｏ）のレベルを検出している。脳でのＡβの蓄積、又は脳脊髄液（ＣＳＦ：ｌｉｑｕｉｄｏ  ｃｅｆａｌｏｒｒａｑｕｉｄｅｏ（ＬＣＲ））中のＡβ１−４２の濃度低下、又はＣＳＦ中のｔ−タウとｆ−タウのレベル上昇は、ＡＤに対して陽性と診断される（Ｊａｃｋ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．９，１１９−１２８）。これら２つのバイオマーカーを組合わせることで、ＡＤを否定する診断に良好な予知となる。然しながら、ＡＤの診断は、未だ可能性だけで、病的症状があることが必要である。さらに、ＡＤでは、総タウ蛋白質とリン酸化タウ蛋白質などのＣＳＦ中蛋白質のレベルは相関しているが、Ａβレベルは、脳内での蓄積及びＣＳＦ中での低濃度と相関しておらず、脳とＣＳＦ中の蛋白質レベルの関係は単純ではない。脳内でのＡβ蓄積がＣＳＦ中のＡβ１−４２低濃度と関連する理由は、脳からＣＳＦに放出されるＡβ１−４２が減ることによるものであるかもしれないが、明白でない（Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３０，１７７４）。一方、ＣＳＦ中の総タウ蛋白質の高濃度は、脳内でのタウ蛋白質の蓄積と関連した神経細胞機能障害を反映していると考えられる。然しながら、脳内神経のからまりにタウ蛋白質が集まる別のタウ蛋白質異常には、ＣＳＦ中の総タウ蛋白質に対応した増加がみられない（Ｂｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７０，１８２７−１８３５）。
【０００４】
ミトコンドリア機能不全は、ＡＤの病態生理に関与していると考えられるが、この機能不全が神経変性プロセスの前なのか後なのかがまだ明白でない。さらに、神経細胞がミトコンドリアからの好気性エネルギーに大きく依存していると仮定すると、ＡＤは、生体エネルギーとミトコンドリアの機能不全と関連している（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｓｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．，２０１０，２９３−３１０）。
【０００５】
従来技術では、ＡＤ患者は、脳内のＬ−鎖の転写とＨ−鎖の複写が関与していると知られる部位でのミトコンドリアＤＮＡ（ＡＤＮ  ｍｉｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ）のコントロール領域に突然変異がある確率が高いとの記載がある（ＷＯ２００７０１１３２２Ａ２）。文献ＷＯ２００７０１１３２２Ａ２では、個人の組織中又は細胞中のミトコンドリアＤＮＡの突然変異を定量又は検出することによって、β−アミロイドデポジット及び／又は繊維状β−アミロイドの形成と関連した神経変性疾患の発症前または発症後の診断及び分析システムが記載されている。別の方法では、文献ＷＯ９４０９１６２Ａ１には、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異又は挿入を検出するＡＤの診断または前兆の予知が記載されている。
【０００６】
他の研究では、多型をＡＤと関連付けている。この疾患に関連して１３８の多型があるとしている（“アルツハイマー病のニューロイメージングイニシアティブ”）。ラカトス（Ｌａｋａｔｏｓ）らは、白人３５８人からの１３８のミトコンドリア多型におけるミトコンドリアハプログループの役割を研究し、ＡＤと関連している可能性がある既に述べた多型の他に、さらに５つの多型を挙げている（Ｌａｋａｔｏｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，２０１０，３１（８），１３５５−１３６３）。一方、ＡＤ患者３，２５０人とコントロール１，２２１人での、１３８の単一核酸ヌクレオチドの研究で、ミトコンドリアＤＮＡの変化とＡＤの相関性に一貫した証拠がないことが結論されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／０１１３２２号
【特許文献２】国際公開第９４／０９１６２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ジャック  Ｃ．Ｒ．（Ｊａｃｋ，Ｃ．Ｒ．）ら、２０１０年、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．９巻、ｐ．１１９−１２８．
【非特許文献２】マウエニエガ  Ｋ．Ｇ．（Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ，Ｋ．Ｇ．）ら、２０１０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３０巻、ｐ．１７７４・
【非特許文献３】ビアン  Ｈ．（Ｂｉａｎ，Ｈ．）ら、２００８年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７０巻、ｐ．１８２７−１８３５．
【非特許文献４】スエルドロウ  Ｒ．Ｈ．（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，Ｒ．Ｈ．）ら、Ｊ．Ａｌｓｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１０年、ｐ．２９３−３１０．
【非特許文献５】ラカトス  Ａ．（Ｌａｋａｔｏｓ  Ａ．）ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，２０１０年、３１巻（８）、ｐ．１３５５−１３６３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまで簡略にβ−アミロイドと総タウ蛋白質及びリン酸化タウ蛋白質などのバイオマーカーのレベルを測定するＡＤの診断及び／又は予知、及びミトコンドリアＤＮＡの突然変異や多型について記載してきた。ＣＳＦは、脳組織に直接接触し、これにより、脳代謝での起こり得る異常を識別するに最も良い流体と考えられている。しかしながら、これらの方法は、診断及び／又は予知が、組織又はＣＳＦの生体試料で行われるが、これらの生体試料が患者から侵襲的手段で得る必要があり、さらにこの疾患の早期の診断及び／又は予知に信頼性がない方法であるという欠点がある。従って、患者に侵襲的方法を行わない生体試料を用いて、ＡＤの早期の診断及び／又は予知ができる他の方法を開発する必要がある。さらに、これらの手段が、現在利用可能なＡＤの診断キットで使用されている抗体での蛋白質レベルの測定より、実施するに簡単で、精度が高く、特異的で、研究室間で再現性があり、そして変動が少ないことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知に、定量バイオマーカーとしてミトコンドリアＤＮＡを使用することである。
【００１１】
本発明の第２の態様は、被験者から採取された生体試料中のミトコンドリアＤＮＡ定量に基づいた、神経変性疾患、好ましくはＡＤのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での診断及び／又は予知方法に関するものである。
【００１２】
本発明の第３の態様は、プライマー又はプローブの少なくとも１つのセットを用いて、ミトコンドリアＤＮＡを定量することを特徴とする神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知キットに関するものである。
【００１３】
本発明の第４の態様は、ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブを含むキットを用いた神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知キットの使用に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アルツハイマー病発症前被験者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のミトコンドリアＤＮＡ濃度の低下を示している。ＣＳＦ（ＬＣＲ）試料中のミトコンドリアＤＮＡ濃度は、ヒトミトコンドリアＤＮＡシーケンスの１４４１８塩基と１４９３２塩基の間の領域を対象としたｑＰＣＲプライマーで測定した。（Ａ）  ３つの異なるプライマーの組み合わせ、そのうち２つは互いに近くにある、を用いて、ＣＳＦ中で増幅したミトコンドリアＤＮＡの特異性を確認した。２つのＰＣＲプライマーペア（配列番号１／配列番号２と配列番号３／配列番号４）は、５１５塩基対の長いシーケンス（ｍｔＤＮＡ−５１５（ＡＤＮ  ｍｉｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ−５１５））の両末端に位置して、２つの短いシーケンス（ミトコンドリアＤＮＡ−１５３（ｍｔＤＮＡ−１５３）とミトコンドリアＤＮＡ−８５（ｍｔＤＮＡ−８５）、それぞれ１５３塩基対と８５塩基対）を増幅するようにデザインされている。長いシーケンスは、それぞれフォワードとリバースプライマーの組合せ、及び第２のプライマーペア（配列番号１／配列番号４）で増幅する。（Ｂ）  Ｃ１グループのナンバー２被験者のＣＳＦ試料中で異なる３つのプライマーペアから得られた生成物のアガロースゲルの代表画像であり、ＤＮＡサイズを示すＤＮＡサイズマーカー（Ｍ）、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３（１レーン）、ミトコンドリアＤＮＡ−８５（２レーン）とミトコンドリアＤＮＡ−５１５（３レーン）である。（Ｃ）、（Ｄ）  ＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡの定量で、（Ｃ）は、ＡＤ疾患のリスクがある被験者（ＬＡβ）、症状のあるＡＤ患者（ＥＡ）、ＦＴＬＤと診断された患者であり、（Ｄ）は、ＰＳＥＮ１突然変異があり、発症前の患者の結果である。数値は、ＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡの量を平均値±ＳＥＭｆｇ／ｍＬで表している。エラーバーの上の数字は、各グループの被験者数である。＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１で、対応する年齢のコントロールグループから有意に異なっている（ダン事後比較したクラスカル・ワリス検定）、＃；Ｐ＜０．０５で、対応する年齢のコントロールグループから有意に異なっている（２標本、マン−ホイットニーのＵ検定）。
【図２】ＡＤグループとＦＴＬＤグループの間の受信者操作特性（ＲＯＣ：ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａ  ｏｐｅｒａｔｉｖａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）曲線を用いた診断の差異分析を示している。ミトコンドリアＤＮＡ−１５３プライマーの生成物をｆｇ／ｍＬで表わし、ｑＰＣＲにより評価したＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡ量の敏感度（感度、ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｄａｄ）と特異度（特異性、ｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｄａｄ）を、ＲＯＣ分析により決定して患者を正確に分類した。（Ａ）は、認知正常者であるコントロールＣ１（ｎ＝１０）と、散発的ＡＤと診断された患者、ＡＤ（ｎ＝１３）との比較で、曲線下面積＝０．９４６、ｐ＜０．００１であり、（Ｂ）は、散発的ＡＤと診断された患者ＡＤ（ｎ＝１３）と、ＡＤバイオマーカーが正常で、前頭側頭葉変性症（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｉｏｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ）と診断された患者ＦＴＬＤ（ｎ＝１５）との比較で、曲線下面積＝０，９５９、ｐ＜０．００１である。
【図３】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの皮質神経細胞培養中、シナプス損傷前でのミトコンドリアＤＮＡコピー数減少を示している。野生マウス（ＷＴ）とトランスジェニックマウスＡＰＰ／ＰＳ１の皮質神経細胞培養中で、ミトコンドリアＤＮＡとシナプス蛋白質のコピー数を測定した。（Ａ）  皮質神経細胞培養が１４日（ＤＩＶ）で、ミトコンドリアＤＮＡを測定した。ミトコンドリアＤＮＡのコピー数と１８ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を、増幅されたシーケンスを含む参照プラスミドと比較して決定した。ミトコンドリアＤＮＡとして、２つの異なったプライマーの組み合わせ、すなわち、それぞれ１１５塩基対と６９９塩基対の生成物を増幅するミトコンドリアＤＮＡ−１１５とミトコンドリアＤＮＡ−６９９を使用した。これらの数値は、ｎ＝動物数で、ミトコンドリアＤＮＡコピー数／ｒＲＮＡ１８Ｓのコピー数の平均値±ＳＥＭである。ＷＴ（ｎ＝８）、ＡＰＰ／ＰＳ１（ｎ＝１６）、＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、対応するコントロールグループと有意に異なる（２標本に対応のないスチューデントｔ−検定）。（Ｂ）  コントロールマウスＷＴとトランスジェニックマウスＡＰＰ／ＰＳ１について、大脳皮質神経細胞の１４ＤＩＶと２１ＤＩＶでの培養液中のＰＳＤ９５とシナプトフィジン（ｓｙｎ）蛋白質レベルを示すウェスタンブロットである。蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜を通した。（Ｃ）〜（Ｄ）  ＰＳＤ９５とシナプトフィジン蛋白質の定量分析である。ＰＳＤ９５（Ｃ）又はシナプトフィジン（Ｄ）の免疫活性を示すバンドの写真濃度値を、対応するアクチンの免疫活性バンドの値で正規化した。この値は、ＰＳＤ９５の平均値±ＳＥＭ（１４ＤＩＶと２１ＤＩＶのそれぞれで、ＷＴがｎ＝１１と１１、ＡＰＰ／ＰＳ１がｎ＝９と１０）と、シナプトフィジンの平均値±ＳＥＭ（１４ＤＩＶと２１ＤＩＶのそれぞれで、ＷＴがｎ＝１２と１０、ＡＰＰ／ｐｓ１がｎ＝９と１０）である。＊＊；Ｐ＜０．０１で、対応するコントロールと有意に異なる（２標本に対応のないスチューデントｔ−検定）。
【図４】ＣＳＦからＰＣＲ反応の阻害ファクターを除く限外濾過を示している。（Ａ）  ミトコンドリアＤＮＡ−８５、（Ｂ）  ミトコンドリアＤＮＡ−１５３、及び（Ｃ）  ミトコンドリアＤＮＡ−５１５のｑＰＣＲ増幅曲線は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の精製ヒトミトコンドリアＤＮＡ（１００コピー）の校正用の標準（標準）、ＣＳＦ、又は限外濾過していないＣＳＦ（ＵＦＣＳＦ）のいずれかで行って得た。ＣＳＦ中でのミトコンドリアＤＮＡ直接増幅は、その増幅曲線が、ヒトミトコンドリアＤＮＡの校正で得られたものより有意に低い傾斜であり、ＰＣＲ反応の効率を下げ、正確な定量を行う上での阻害物の存在を示唆している。ＣＳＦ試料を、０．５ｍＬの１０，０００ＭＷＣＯアミコンウルトラフィルター（１０，０００  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒ）で限外濾過することで、ＰＣＲ増幅の阻害物が完全に除かれ、増幅曲線の勾配と増幅生成物全てのＰＣＲ反応効率は、標準ミトコンドリアＤＮＡで観察されたものと同等になった。  ＰＣＲ増幅曲線の勾配の定量的分析は、蛍光相対閾値である２０〜８０ユニット（ＣＴ８０〜ＣＴ２０）間のサイクル数で表され、ミトコンドリアＤＮＡ生成物それぞれについて右側のグラフに示している。この数値は、ｎ＝３の独立したｑＰＣＲ反応の相対蛍光ユニット（左側図面）又は閾値２０と８０の間のＰＣＲサイクル数（右側図面）の平均値±ＳＥＭである。＊＊；Ｐ＜０．０１、対応する標準ＨＥＫ２９３Ｔと有意に異なる（ボンフェローニ法事後比較を用いた一元配置分析）。
【図５】ｄｄＰＣＲによるＣＳＦ中に循環する細胞外ミトコンドリアＤＮＡのコピー数定量を示している。ミトコンドリアＤＮＡのコピー数は、バイオ−ラッドＱＸ１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００）デジタル液滴ＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ）プラットフォームを使用し、ｄｄＰＣＲによりＣＳＦ試料中で直接測定した。ｍｔＤＮＡ−１５３の増幅は、プライマー配列番号１と配列番号２、及びＦＡＭ標識のプローブ（配列番号８）で行い、その結果を、クァンタソフト（Ｑｕａｎｔａ  Ｓｏｆｔ）プログラムによって解析した。数値は、ＣＳＦｍＬあたりのミトコンドリアＤＮＡのコピー数の平均値±ＳＥＭとして表わされる。Ｃ１は、コントロールグループでｎ＝９、ＡＤ（ＥＡ）は、ＣＳＦ中のＡβ１−４２が低く、ｔ−タウとｆ−タウが高く、散発的アルツハイマー病と診断された患者でｎ＝２０、ＦＴＬＤは、前頭側頭葉変性症と診断され、ＣＳＦ中のＡＤ関連バイオマーカーが正常レベルである患者でｎ＝１１である。＊；Ｐ＜０．０１、Ｃ１とは有意に異なる（ダン法事後比較を用いたクラスカル−ウォリス検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、神経変性疾患、好ましくはＡＤの早期診断及び／又は予知の定量バイオマーカーとしてミトコンドリアＤＮＡの使用、そして、このバイオマーカーを用いた神経変性疾患、好ましくはＡＤの改善された診断及び／又は予知する方法を提案するものである。
【００１６】
本発明に記載した方法は、神経変性疾患の早期診断及び／又は予知、つまり、この疾患に関連した病的症状が出る前に診断及び／又は予知が出来る長所がある。これにより、患者に対して早期の効果的な治療及び／又は予防が可能になる。
【００１７】
さらに、この方法は、制限するものではないが、研究被験者の血液、血清又は血漿など幅広い生体試料で、その信頼性と再現性を下げることなく行うことができる。したがって、本発明の方法は、脳組織又は脳髄液を得る必要がある今日知られている他の診断方法で起きるような、患者に対しての侵襲手段が必ずしも必要ない。さらに、この方法は、ミトコンドリアＤＮＡの定量が、例えば、限定するものではないが、ＰＣＲのような核酸の定量に広く使用されている技術で行うことができるので、実施するに簡単である。ここに記載した方法は、神経変性疾患の診断に現在利用可能なキットで使用されている抗体を用いての、高感度、特異的、研究室間での再現性があり、変動が少ない蛋白質量の測定方法である。
【００１８】
従って、本発明は、神経変性疾患、好ましくはＡＤの早期診断及び／又は予知する改善された方法の必要性を解決するものである。
【００１９】
そこで、本発明の第１の態様は、神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知をするバイオマーカーとしてミトコンドリアＤＮＡの使用に関するものである。
【００２０】
用語「診断」は、被験者に、この疾患、好ましくは神経変性疾患、より好ましくはＡＤの有無を判定する方法である。用語「予知（ｐｒｏｎｏｓｔｉｃｏ）」は、この疾患、好ましくは神経変性疾患、より好ましくはＡＤの、限定するものではないが、その疾患の発症する前兆、発症、又は特定の治療に対しての応答を予測するなど、この疾患の進行又は経過を予測することを指している。
【００２１】
本発明で使用される用語「早期（ｐｒｅｃｏｚ）」は、この疾患、好ましくは神経変性疾患、より好ましくはＡＤが、最初の段階、すなわち臨床的症状が現れる前の被験者の診断又は予知を指している。
【００２２】
本発明で使用される用語「バイオマーカーの定量」は、この疾患、好ましくは神経変性疾患、より好ましくはＡＤのインジケーター、及びその進行状態のインジケーターとして使用するミトコンドリアＤＮＡの量又は濃度を指している。
【００２３】
本発明における用語「ミトコンドリアＤＮＡ」は、細胞内、及び細胞外、つまり循環するミトコンドリアの遺伝子物質である。細胞内遺伝子物質は細胞内にある。細胞外つまり循環する遺伝子物質は、限定するものではないが、脳脊髄液、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、又は汗の中など細胞の外にある。従って、好ましい実施形態では、本発明に関するミトコンドリアＤＮＡは、細胞外、つまり循環するミトコンドリアＤＮＡである。
【００２４】
より好ましい実施形態では、本発明で定量されるミトコンドリアＤＮＡの領域は、ヒトのｍｔＤＮＡ−５１５（ＡＤＮｍｔ−５１５）、ｍｔＤＮＡ−８５（ＡＤＮｍｔ−８５）、ｍｔＤＮＡ−１５３（ＡＤＮｍｔ−１５３）、又はｍｔＤＮＡ−１２３（ＡＤＮｍｔ−１２３）の少なくとも１つである。最初の３つの領域は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの完全ケンブリッジ参照シーケンス（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿０１２９２０．１）の塩基１４４１８と１４９３２の間のシーケンス（正確な位置を、表５に示す）である。これら３つの領域は、ミトコンドリア遺伝子ＮＤ６、ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ及びＣＹＴＢをコードする。ｍｔＤＮＡ−１２３の領域は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの完全ケンブリッジ参照シーケンス（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿０１２９２０．１）の塩基８０５と９２７の間にある。別の好ましい実施形態では、本発明で定量するミトコンドリアＤＮＡの領域は、マウスのｍｔＤＮＡ−１１５又はｍｔＤＮＡ−６９９の少なくとも１つであり、これらは、マウスミトコンドリアＤＮＡの完全参照シーケンス（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿００５０８９．１）による塩基２１４と９１２の間のシーケンスであり、１２ＳリボソームＲＮＡミトコンドリア遺伝子をコードする（正確な位置を表５に示す）。
【００２５】
この明細書で、用語「神経変性疾患」は、例えば、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病及び多発性硬化症の、認知障害を伴うタイプの疾患として分類される疾患である。これらの認知障害は、細胞死プロセスの増加によるもので、神経細胞数が減少し、行動上の変化を伴う。本発明における神経変性疾患の定義は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ：ｄｅｍｅｎｃｉａ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ（ＤＦＴ））を除外する。本発明で使用される用語「アルツハイマー病」、すなわち「ＡＤ」は、認知機能障害と行動障害を示す神経変性疾患を指している。その典型的な形態は、神経細胞の衰弱及び／又は死、及び脳の別領域での衰えなど、記憶及びその他精神的能力の喪失が進行することに特徴付けられる。
【００２６】
本発明で使用される用語「アルツハイマー病（ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）」、すなわち「ＡＤ（ＥＡ）」は、認知機能障害と行動障害を示す神経変性疾患を指している。その典型的な形態は、神経細胞の衰弱及び／又は死、及び脳の別領域での衰えなど、記憶及びその他精神的能力の喪失が進行することに特徴付けられる。
【００２７】
本発明では、用語「前頭側頭型認知症（ｄｅｍｅｎｃｉａ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ」、すなわち「ＦＴＤ（ＤＦＴ）」は、ヒトの脳の前頭側頭葉部の変性によって引き起こされる病的シンドロームである。これは、前頭側頭葉変性に起因する３つのシンドロームの１つであり、アルツハイマー病に次ぐ早期痴呆の２番目の最も一般的な原因ある。
【００２８】
第２の態様で本発明は、神経変性疾患、好ましくはＡＤのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）診断及び／又は予知方法に関するものである。以降、「発明の方法」は、
ａ）被験者から採取された生体試料中のミトコンドリアＤＮＡを定量する、
ｂ）ａ）ステップで得た値を、標準値と比較する、
のステップを含んでなる。
【００２９】
好ましい実施形態で、本発明の方法のａ）ステップでのミトコンドリアＤＮＡは、被験者がヒトである場合、ｍｔＤＮＡ−５１５、ｍｔＤＮＡ−８５、ｍｔＤＮＡ−１２３及び／又はｍｔＤＮＡ−１５３であり、被験者がマウスである場合には、ｍｔＤＮＡ−１１５及び／又はｍｔＤＮＡ−６９９である。より好ましい形態では、本発明の方法のａ）ステップでのミトコンドリアＤＮＡは、細胞外ミトコンドリアＤＮＡである。
【００３０】
本発明で使用される被験者から採取された生体試料中のミトコンドリアＤＮＡを「定量する」は、量又は濃度の測定を指している。測定は、細胞内と細胞外の両方のミトコンドリアＤＮＡの量又は濃度を、ＤＮＡの測定技術によって測定することを指している。このＤＮＡの測定技術は、例えば、限定するものではないが、ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、デジタル液滴（ｄｉｇｉｔａｌ  ｅｎｇｏｔａｓＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、又はサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）である。好ましくは、本発明で定量される量は、ミトコンドリアＤＮＡのコピー数で表される。
【００３１】
好ましい形態では、本発明の方法のａ）ステップは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ又はサザンブロットによって行われる。より好ましくは、ａ）のステップは、ｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲで行われ、更により好ましくは、ａ）のステップは、ｄｄＰＣＲで行われる。
【００３２】
この発明で用語「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応と理解される。これは、分子生物学的手法で、その目的は、最小から始めて、大きいコピー数の特定のＤＮＡフラグメントを得ることにある。この技術は、鎖の両末端に結合しているプライマーから始めてＤＮＡ鎖を複製するＤＮＡポリメラーゼの自然の性質に基づいており、すなわち、高温と低温を繰り返すサイクルを使用して、各複製フェーズの後に新しく形成されたＤＮＡ鎖を分離し、プライマーを加え、次いで、ポリメラーゼを結合して鎖を複製していく。本発明では、ＰＣＲを使用して生体試料中でミトコンドリアＤＮＡを増幅し、次いで定量する。好ましくは、被験者がヒトである場合、ｍｔＤＮＡ−５１５、ｍｔＤＮＡ−８５、ｍｔＤＮＡ−１２３及び／又はｍｔＤＮＡ−１５３のシーケンスを、被験者がマウスである場合には、ｍｔＤＮＡ−１１５及び／又はｍｔＤＮＡ−６９９のシーケンスを増幅する。リアルタイムＰＣＲ、つまり定量的ＰＣＲ、及びデジタル液滴ＰＣＲなどいくつかのＰＣＲタイプがある。ｑＰＣＲの大きな特徴は、オリジナル試料中にあるＤＮＡを定量し、又は非常に高い確率でその融点（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒａ  ｄｅ  ｆｕｓｉｏｎ）から特定ＤＮＡの試料を同定することである。ｄｄＰＣＲは、従来のポリメラーゼ連鎖反応の改良であり、核酸の含有量を一分子の解像レベルで直接に定量し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を増幅（クローン的増幅）するに使用できる。本発明では、これら２つの変形ＰＣＲを使用して、生体試料中のミトコンドリアＤＮＡ、好ましくは細胞外ミトコンドリアＤＮＡを定量することができる。
【００３３】
本発明で使用する用語「サザンブロット」は、生体試料中の核酸の複合混合物中のＤＮＡシーケンスの存在を検出し、ＤＮＡを定量することができる分子生物学的方法を指している。これには、アガロースゲルでの電気泳動法の技術が用いられ、ＤＮＡフラグメントを長さで分け、その後、膜に移してプローブとハイブリダイゼーションさせる。
【００３４】
明細書で使用する用語「量」は、限定するものではないが、ミトコンドリアＤＮＡの絶対量又は相対量、好ましくはミトコンドリアＤＮＡのコピー数、さらにこれから発生した関連するその他の数値又はパラメーターを指している。これらの数値又はパラメーターは、例えば、質量スペクトル又は核磁気共鳴分光の強度の数値など直接測定で得られたミトコンドリアＤＮＡの物理的又は化学的特性のシグナル強度値がある。さらに、これらの値又はパラメーターは、ｍｔＤＮＡでコード化された蛋白質の生成、フリーラジカルの発生、又はエネルギーの生産など間接測定で得られたもの全てを含んでいる。
【００３５】
明細書で使用する用語「採取された生体試料」は、有機体、すなわち、有機体の生理学的流体及び／又は細胞又は組織から採取された試料を指している。好ましい形態では、ａ）ステップで採取された生体試料は、唾液、汗、涙、尿、脳脊髄液、血液、血清及び血漿からなるリストから選ばれる。より好ましい形態で生体試料は、脳脊髄液である。別の好ましい形態で、生体試料は、血液、血清又は血漿である。より好ましい形態で、生体試料は血清である。
【００３６】
本明細書で使用する「脳脊髄液」は、脳と脊髄に存在する有色透明液体を指している。多くの疾患では、脳脊髄液の組成が変わり、その研究は重要で、中枢神経系又は末梢神経系の疾患では、しばしば組成が測定される。これらの疾患には、アルツハイマー病などの神経変性疾患が含まれる。
【００３７】
用語「標準値」は、健康な個人からのコントロール生体試料中、又はコントロールグループからの混合生体試料中のミトコンドリアＤＮＡの定量で得られた数値の平均値又は数値範囲である。
【００３８】
この明細書で「コントロールグループ」は、研究の被験者と同じ年齢又は近い年齢の健康な個人のグループであり、このグループからのミトコンドリアＤＮＡの量又は濃度の数値又は数値範囲は、これら健康な個人から集めた生体試料中のミトコンドリアＤＮＡを定量して得られ、本発明の方法が適用される集団を代表している。ミトコンドリアＤＮＡの定量は、本発明の方法のａ）ステップにおける被験者からの生体試料と同じタイプの生体試料から、同じ方法で行わなければならない。
【００３９】
本発明における用語「健康」、「健康な個人」又は「健康な被験者」は、神経変性疾患、好ましくはＡＤを患っていない被験者又は個人である。
【００４０】
本発明における「健康集団」は、神経変性疾患、好ましくはＡＤを患っていない個人又は被験者の一団である。
【００４１】
用語「本発明の方法が適用される集団を代表する健康な個人」は、分析される生体試料が採取された時、神経変性疾患、好ましくはＡＤを患っておらず、制限するものではないが人種、年齢や性別分布で本発明の方法が適用される患者又は被験者の集団と同じパターンのグループである被験者を意味している。
【００４２】
本発明で使用する用語「比較」は、制限するものではないが、ａ）ステップの生体試料中のミトコンドリアＤＮＡ量を、標準値と比較することである。本発明方法のｂ）ステップに記載した比較は、手動又はコンピューター支援で実施できる。
【００４３】
別の好ましい形態で発明の方法は、さらに、ｃ）  ａ）のステップで得た値が標準値より有意に低いとき、ａ）のステップの被験者を、神経変性疾患、好ましくはＡＤの前兆がある患者グループ、又は神経変性疾患、好ましくはＡＤの患者グループとする、ステップを含んでいる。
【００４４】
標準値より「有意に低い」量は、この分野の専門家によって種々の統計手段を用いて確立されている。この統計手段には、例えば、制限するものではないが、ダン事後多重比較検定を用いたクルスカル−ウォリス分析（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）、ボンフェローニ事後多重比較一元配置検定（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）、又はクラスカル−ウォリスＵ検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｕ  ｔｅｓｔ）を用いての、信頼範囲の決定、ｐ値の決定、２標本スチューデント検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）、フィッシャー判別関数（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）などがある。
【００４５】
発明の方法のａ）ステップでの被験者は、ヒトであることができるが、ヒトでない哺乳類、例えば、制限するものではないが、齧歯類動物、反芻動物、猫又は犬などであることができる。従って、別の好ましい形態では、本発明方法のａ）ステップの生体試料の被験者は哺乳動物であり、より好ましい形態では哺乳類はヒトである。
【００４６】
第３の態様で、本発明は、神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知のためのキットに関するものである。以降、「本発明のキット」は、以下のプライマー又はプローブのセットのうちの少なくとも１つを含んでいる。
ａ）配列番号１と配列番号４、
ｂ）配列番号１と配列番号２、及び必要に応じて配列番号８、
ｃ）配列番号３と配列番号４、
ｄ）配列番号６と配列番号７、及び必要に応じて配列番号５、又は
ｅ）配列番号９と配列番号１０。
【００４７】
好ましい実施形態で本発明のキットは、配列番号３と配列番号４、又は配列番号９と配列番号１０のプライマーを含んでなる。
【００４８】
第４の態様で本発明は、ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブを含み、神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知のためのキットの使用に関するものである。好ましい実施形態で、ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブは、ヒトのｍｔＤＮＡ−５１５、ｍｔＤＮＡ−８５、ｍｔＤＮＡ−１２３及び／又はｍｔＤＮＡ−１５３、又はマウスのｍｔＤＮＡ−１１５又はｍｔＤＮＡ−６９９である。本発明の第４の態様の好ましい実施形態で、このキットは、上記した本発明のキットである。
【００４９】
本発明のキットは、制限するものではないが、標識された又は標識されていないプライマー、標識された又は標識されていないプローブ、バッファーなど、汚染を防ぐ薬剤を含んでおり、標識化合物は、例えば、制限するものではないが、螢光物などである。さらに、本発明のキットは、その実施と最適化に必要な全ての媒体と容器を含むことができる。本発明のキットは、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｏｓ）と陰性（ｎｅｇａｔｉｖｏｓ）のコントロールを含めることができる。好ましくは、このキットは、本発明の記載によるミトコンドリアＤＮＡの定量を行う説明書を含むものである。
【００５０】
好ましい形態で、本発明のキットのプライマー又はプローブの少なくとも１つのセットは、標識されている又は固定化されている。より好ましい形態で、発明のプライマー又はプローブの少なくとも１つのセットは、ラジオアイソトープ、蛍光又は発光マーカー、抗体、抗体フラグメント、親和性標識、酵素及び酵素基質のリストから選択された標識剤で標識される。さらにより好ましい形態では、本発明のプライマー又はプローブの少なくとも１つのセットは、例えば、制限するものではないが、ナイロンマトリックス、プラスチック担体又はビーズなどの担体上に固定化される。
【００５１】
この明細書で、用語「プライマー（ｃｅｂａｄｏｒ）」は、ＤＮＡ増幅の開始点として機能する核酸鎖である。プライマーは、フリーの３’−ヒドロキシルグループを有する短い核酸シーケンスで、鋳型鎖と相補的な塩基対を形成し、鋳型鎖をコピーし、増幅するための核酸付加の開始点として機能する。この発明でプライマーは、ミトコンドリアＤＮＡの両端に結合し、例えば、限定するものではないが、ＰＣＲにより増幅及び検出する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「プローブ（ｓｏｎｄａ）」は、レーザーによって検知できる信号を発する蛍光標識した小さいＤＮＡフラグメントであり、例えば、限定するものではないが、生体試料中のミトコンドリアＤＮＡを定量するｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲの手段として使用される。
【００５３】
ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブは、好ましくはヒトのミトコンドリアＤＮＡであるｍｔＤＮＡ−５１５、ｍｔＤＮＡ−８５、ｍｔＤＮＡ−１２３及び／又はｍｔＤＮＡ−１５３、マウスのミトコンドリアＤＮＡであるｍｔＤＮＡ−１１５及び／又はｍｔＤＮＡ−６９９であり、従来技術で広く知られたプライマー及び／又はプローブをデザインする技術でデザインすることができる。好ましくは、本発明のプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０から選ばれる。好ましくは、本発明のプローブは、配列番号５と配列番号８から選ばれる。
【００５４】
明細書と特許請求項を通して、用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｅｎｄｅ）」とそのバリエーションは、その他の技術的特徴、添加物、成分又はステップを排除するものではない。この分野の専門家にとって、その他の目的、利点及び発明の特徴は、本説明の記載の一部及び本発明の実施の一部から成し得るものである。以下の実施例と図面は、説明の目的にのみ供されるもので、本発明を制限する意図はない。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を、発明者が行ったテストで説明する。テストは、神経変性疾患、好ましくはＡＤの診断及び／又は予知を行う定量バイオマーカーとしてミトコンドリアＤＮＡ使用の有効性を示す。ここに示す例は、本発明を説明するもので、単に説明をする目的で挙げたものであるので、クレームにある本発明を制限すると解釈されるべきものではない。したがって、以下の例では、本発明を適用範囲に制限を加えることなく記載している。
【００５６】
〔実施例１：実施例に用いた研究グループと技術〕
以下、本発明の研究に使用した被験者グループと、下記の実施例を行うに使用した技術を詳細に説明する。
【００５７】
〔被験者（Ｓｕｊｅｔｏｓ）〕
これらの研究の被験者は、バルセロナ病院の神経学科アルツハイマー病及びその他認知障害病棟から２８２人を選んだ。全ての被験者は、臨床的及び神経心理学的治療を受け、腰椎穿刺を行った。被験者は、認知症の有無、及びＣＳＦでのＡβ１−４２、微小管タウ蛋白質（ｔ−タウ）とトレオニン１８１リン酸化タウ蛋白質（ｐ−タウ）量により分類した（表１〜４）。研究には６つのグループを選んだ。  １）ＡＤ：ＮＩＮＣＤＡＳ／ＡＤＲＤＡ基準と、バイオマーカーでＡβ１−４２レベルが低く、ｔ−タウとｐ−タウレベルが高いＡＤに典型的なバイオマーカープロファイルをもつＡＤらしいと診断された患者。  ２）ＬＡβ：認知障害がなく、ＣＳＦ中のＡβ１−４２レベルが低いだけの散発的ＡＤ発症リスクのある無症状被験者。  ３）ＦＴＬＤ：失語症と意味痴呆を含む前頭側頭葉変性症型痴呆シンドロームがありと診断され、ＣＳＦ中のＡＤバイオマーカーレベルが正常な微症状患者。  ４）ＰＳＥＮ１：優性突然変異ＰＳＮ１（Ｍ１３９Ｔ、Ｋ２３９Ｎ、又はＩ４３９Ｓ）のキャリアで、ＣＳＦ中のバイオマーカーが正常、認識が正常な発症前患者。  ５）Ｃ１：認識欠如がなく、ＣＳＦ中のバイオマーカーが正常、ＬＡβグループ及びＡＤグループと同年齢である健康被検者からのコントロールグループ。  ６）Ｃ２：ＰＳＮ１優性突然変異グループと同年齢で、臨床的、遺伝的又は生化学的に異常がない健康被検者のコントロールグループ。  用いた病理学的カットオフ値は、Ａβ１−４２＜５００ｐｇ／ｍＬ、ｔ−タウ＞４５０ｐｇ／ｍＬ、ｐ−タウ＞７５ｐｇ／ｍＬである。  全グループの被験者は、グループ間に有意な年齢差をなくしてバランスをとった（表１〜４）。本研究には、バイオマーカーに異常がない７５歳以上の健康なコントロールがないので、７５歳未満の被験者のみとした。最後に、血液汚染の兆候がある試料、ＣＳＦ中の全蛋白質が０．７ｍｇ／ｍＬ以上の被験者はこの研究から除外した。
【００５８】
【表１】
2016502406.tif 000002
【００５９】
【表２】
2016502406.tif 000003
【００６０】
【表３】
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【００６１】
【表４】
2016502406.tif 000005
【００６２】
ｑＰＣＲ研究での被験者は、ｄｄＰＣＲによるＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡコピー数測定に充分な量のＣＳＦ試料を有していた。ＡＤグループには追加の被験者を加えた。ｑＰＣＲ研究では、７５歳以上の年齢の健康なコントロールがなかったので、この研究には７５歳未満の被験者だけとした。Ｃ１：認識欠損がなく、ＣＳＦ中のバイオマーカーが正常で、ＡＤとＦＴＬＤと診断された患者グループと同年齢である健康被験者のコントロールグループ。ＡＤ：ＣＳＦ中のＡβ１−４２レベルが低く、ｔ−タウとｐ−タウレベルが高く、散発的なアルツハイマー病と診断された患者。ＦＴＬＤ：前頭側頭葉変性症と診断され、ＣＳＦ中のＡＤ関連バイオマーカーレベルが正常な患者。  ＊＊；対応するコントロールグループと有意な差異がある（ボンフェローニ事後比較の一元配置分散分析、ｐ＜０．０１）。
【００６３】
〔ＣＳＦ試料の入手〕
ＣＳＦ（ＬＣＲ）の全試料は、バルセロナ病院倫理委員会の承認下、神経学科のアルツハイマー病とその他認知障害の病棟でのインフォームドコンセントを行い、以下の手順で得た。ＣＳＦ試料は、午前中の９：００と１２：００の間に腰椎穿刺によって得た。最初の少量のＣＳＦを別にして細胞の存在確認と、その他生化学的測定をし、その後にＣＳＦ１０ｍＬを採取した。  腰部穿刺で付着したと考えられる血液細胞の混入を避けるため、ＣＳＦ試料は、採取後直ちに２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ポリプロピレンチューブ中、−８０℃で２時間以内保存し、その後抽出した。バイオマーカーＡβ１−４２、ｔ−タウ及びｐ−タウは、酵素抗体法（イノゲネティックス；ゲント、ベルギー）で測定した。  １８ＳリボソームＲＮＡのような高コピー数での核遺伝子増幅を意図したプライマーを用いるＰＣＲ増幅から、我々の実験に使用したＣＳＦ試料には、試料あたり０．６ゲノムの検出限界以上の核ＤＮＡを含有しておらず、ＣＳＦに末梢血液細胞からのＤＮＡ混在の可能性が排除できることが示された。
【００６４】
〔リアルタイムの定量ＰＣＲ〕
最初に、ＣＳＦ試料中に循環するミトコンドリアＤＮＡの量を、標準校正曲線を用い、ｑＰＣＲで評価した。  反応は、コルベット・ローター・ジェネ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００）（コルベット：モルトレイク、ＮＳＷ、２１３７、オーストラリア）で、１０以上のレプリケートで行った。それぞれ、１Ｘソー・ファスト・エバーグリーン（１Ｘ  ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ：ハーキュレス、カリフォルニア州  ９４５４７、アメリカ合衆国）に、それぞれのプライマーを３００ｎＭ、ＣＳＦ試料を６．２μＬを加えてなるＰＣＲ反応２０μＬである。  ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡを検出するために、ＰＣＲプライマーは、それぞれヒトミトコンドリアＤＮＡのケンブリッジ参照シーケンス（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿０１２９２０．１）に合わせて、ミトコンドリア遺伝子ＮＤ６、ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ及びｃｙｔＢをコードする１４４１８塩基と１４９３２塩基の間の領域を増幅するようにデザインされている。  単一の既知ヌクレオチド多型と関連しないプライマーを選んだ。ＰＣＲ反応でのＤＮＡ増幅の特異性を確認するため、３つの異なるプライマーの組み合わせは、ミトコンドリアＤＮＡの同じ領域を意図した（図１Ａ、Ｂ）。  プライマー５’〜３’のシーケンスは、配列番号１  ＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＴＣＡ、配列番号２  ＧＣＧＧＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴ−、配列番号３  ＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＣＣ−、配列番号４  ＧＧＣＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧ、である。  １つのプライマーの組み合わせ“配列番号１／配列番号４”は、５１５塩基対の長い領域を増幅することを意図した。他の２つのプライマーペア“配列番号１／配列番号２”と“配列番号３／配列番号４”は、５１５塩基対の長い領域内での２つの短いシーケンス（それぞれ、１５３塩基対のミトコンドリアＤＮＡ−１５３と、８５塩基対のミトコンドリアＤＮＡ−８５）の増幅を意図した（図１Ａ参照）。  さらに、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡの検出を確証するため、異なるミトコンドリア遺伝子に作用するプライマー組合せを用いたタクマン（ＴａｑＭａｎ）プローブに基づく別のＰＣＲ技術を用いた。  これらの研究は、それぞれ、１Ｘソー・ファスト・スーパーミックス（１ＸＳｓｏＦａｓｔ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ、ハーキュレス、カリフォルニア州  ９４５４７、アメリカ合衆国）に、それぞれのプライマーを１００ｎＭ、プローブ配列番号５（５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧ−ＭＧＢ−３’）を１２５ｎＭ、ＣＳＦ試料を６．２μＬ加えてなるＰＣＲ反応２０μｌである。  ＰＣＲ反応に用いるプライマーは、ミトコンドリア１２ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアゲノムの８０５塩基と９２７塩基の間の領域を増幅するように意図している。１２３塩基の生成物（ミトコンドリアＤＮＡ−１２３）を増幅したこのプライマー組合せのシーケンスは、フォワード（配列番号６）、５’−ＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’；リバース（配列番号７）５’−ＣＴＡＴＴＧＡＣＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＣＧＴＧＴＧＡ−３’である。
【００６５】
ミトコンドリアＤＮＡは、酸化的又は構造的な損傷が蓄積し、ミトコンドリアＤＮＡのシーケンスが長い程、塩基の損傷を受け易く、ＰＣＲ反応中でのポリメラーゼによる増幅を妨げる。  最初の２つのプライマー組み合わせ（ミトコンドリアＤＮＡ−８５とミトコンドリアＤＮＡ−１５３）での２つの異なる短いシーケンスのＰＣＲ増幅は、ミトコンドリアＤＮＡターゲットの特異性を確認するものであった。長いシーケンス（ｍｔＤＮＡ−５１５）の増幅は、ＰＣＲ反応中のミトコンドリアＤＮＡに与える構造上の損傷の影響を評価し、ターゲットの特異性について追加の確認を行うために行った。  ｑＰＣＲの条件は、融解温度曲線を解析して最適化した。増幅生成物のサイズと均質性は、ゲル電気泳動法によって推定した。  増幅は、９５℃で２分、その後で、９５℃で５秒と、６５℃でミトコンドリアＤＮＡ−８５、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３、ミトコンドリアＤＮＡ−５１５のそれぞれに対し１０秒、２０秒及び６０秒を繰り返して４５サイクル行うサイクル条件で行った。サイクル閾値（Ｃｔ）の測定は、指数範囲内で行った。
【００６６】
ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡの定量は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製したヒトミトコンドリアＤＮＡの標準校正曲線で実施した。精製ヒトミトコンドリアＤＮＡは、サブ細胞分別とパーコールグラジエントで分離したミトコンドリアから得た。ミトコンドリアは、１×１０７のＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離した。細胞は、洗浄し、２ｍＬの分離バッファー（Ｈｅｐｅｓ；２０ｍＭ、サッカロース；３００  ｍＭ、ＥＤＴＡ；１ｍＭ、ＤＴＴ；１ｍＭ、ｐＨ；７．４）で集め、ポッター−エルベージェムガラス／テフロン（登録商標）組織グラインダー（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ  ｇｌａｓｓ／ｔｅｆｌｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｉｎｄｅｒ）で均質化した。  粗ホモジネートを、１，０００ｇで１０分間１回遠心分離して、未溶解細胞と核を除いた。粗ミトコンドリアフラクションを含む上清分を、分離バッファー中で不連続パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）グラジエント２３／１５／１０／３％（ｖ／ｖ）に置き、３１，０００ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ，  ｒｏｔｏｒ  ＦＩＢＥＲＬｉｔｅ  Ｆ２１）で５分間遠心分離した。パーコール層の１５％と２３％間にあるミトコンドリア含有フラクションを、１．５ｍＬミクロ遠心チューブに移し、分離バッファーで希釈１：１（ｖ：ｖ）した。穏やかに混合した後、ミトコンドリアを、２００００ｇで２０分間遠心分離した。その上清分を廃棄し、アルカリ溶解プロトコル（ウィザード・プラス・ミニプレップ、プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）により、ミトコンドリア析出分からＤＮＡを抽出した。  ミトコンドリアＤＮＡ抽出液中のミトコンドリアＤＮＡ含有量は、いくつかの方法で評価した。  （ａ）３つのプライマー組み合わせを用いたｑＰＣＲによる方法で、プライマーの１つの組み合わせ配列番号１／配列番号４でｍｔＤＮＡ−５１５の領域を増幅し、組み合わせ配列番号１／配列番号２でｍｔＤＮＡ−１５３の領域を増幅し、組み合わせ配列番号３／配列番号４でｍｔＤＮＡ−８５の領域を増幅し、プラスミドｐＪＥＴ１．２中で増殖した対応するクローン化生成物の標準曲線に対して評価した。  （ｂ）ｄｄＰＣＲによる。ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡの量を、ミトコンドリアＤＮＡの１つのコピーが１８．１６［ａｇ］に相当する計算に基づいて計算した。特性研究では、ミトコンドリアＤＮＡが、２〜３００ｆｇ／ｍＬの範囲に対応する２９〜３５Ｃｔ間で、ヒトＣＳＦ試料に検出できることが示された。  この結果、実験で使用したミトコンドリアＤＮＡの標準校正曲線の量の範囲は、反応毎にミトコンドリアＤＮＡの１〜２００コピーであった。ＰＣＲの反応効率は、分析した全試料で０．９５を超えていた。
【００６７】
下記の表５は、デザインしたプライマーと、増幅された対応するシーケンスを示している。
【００６８】
【表５】
2016502406.tif 000006
【００６９】
〔デジタルＰＣＲ〕
リアルタイムｑＰＣＲで得られた結果を検証するため、いくつかのグループのＣＳＦ試料中に循環するミトコンドリアＤＮＡを、バイオ−ラッド・ＱＸ１００・ドロップレット・デジタルＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ）（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ、ハーキュレス、カリフォルニア州  ９４５４７、アメリカ合衆国）を用いて、ｄｄＰＣＲにより更なる定量を行った（表３と４）。  ミトコンドリアＤＮＡは、ＦＡＭ標識プローブ（配列番号８）と、前記ｑＰＣＲ分析で使用したミトコンドリアＤＮＡ−１５３フラグメントの増幅を行ったプライマーＦ１とＲ１を用いて、ＣＳＦ試料中で直接に増幅させた。  この反応は、配列番号１と配列番号２それぞれのプライマーを９００ｎＭと、ＦＡＭ標識プローブを２５０ｎＭ加えた１Ｘ  ｄｄＰＣＲマスターミックスでなっている。プローブのシーケンスは配列番号８：６−カルボキシフルオレッセン−（ＦＡＭ）−５’−ＣＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣ−３’−ＢＨＱ−１である。  液滴形成は、ＰＣＲ２０μＬと油６０μＬの混合物でエマルションを形成し、ＱＸ１００マイクロ液滴形成カートリッジ（ＱＸ１００  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｒｏｐ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を使用して液滴とした。  ＰＣＲによる増幅は、Ｃ１０００サーマルサイクラー（Ｃ１０００  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を用い、９５℃で１０分、その後９４℃で１分と５９℃で３０秒を４０回繰り返し、最後に９８℃で１０分保持する、の条件で行った。  ＰＣＲ条件は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製したミトコンドリアのＤＮＡを使用して予め最適化した。  液滴中での増幅の有無は、ＱＸ１００液滴リーダー（ＱＸ１００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて評価（ＦＡＭチャンネル）し、その結果をクヮンタソフト（ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ）プログラムで解析した。結果を、ＣＳＦｍＬあたりのミトコンドリアＤＮＡのコピーで表した（図５）。
【００７０】
下記の表６は、デザインしたプローブである。
【００７１】
【表６】
2016502406.tif 000007
【００７２】
〔ＣＳＦの限外濾過〕
最初の特性研究で、我々は、ＣＳＦ試料中のミトコンドリアＤＮＡの直接増幅では、ＰＣＲ反応の効率の低いことを観測し（図４）、これは、ヒト体液中の他のｑＰＣＲ試験で既に記載したように、ＣＳＦにはＰＣＲによるＤＮＡの検出を抑制する分子が含まれ、正確な定量を危うくすることを示唆するものである。  ミトコンドリアＤＮＡを正確に定量するために、我々は、ＣＳＦを種々の手段でこの阻害物を除き、標準精製ミトコンドリアＤＮＡで得られたものに等しいＰＣＲ効率を得た。種々の方法の中で、我々は、ＣＳＦの限外濾過が、ＣＳＦから阻害物質を完全に除き、ＰＣＲ反応を、標準ミトコンドリアＤＮＡ（図４）で観測されたと等しい効率で行うことができることを見出した。これは、ＣＳＦ中の阻害物質が、溶解性で低分子量であることが示している。  ＣＳＦ試料を、１０，０００ＭＷＣＯので、アミコンウルトラ０．５ｍＬフィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ  ｆｉｌｔｅｒｓ）（ミリポア、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を用いて限外濾過した。試料は、水で１０倍容量に希釈し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離して最初の容量に迄濃縮した。この限外濾過を２回行った。
【００７３】
〔マウスの遺伝子型判別〕
ジャックソン・ラボラトリーズ・プロトコル（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（バーハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）に従って、尾からゲノムＤＮＡの遺伝子型を判別した。  尾を１ｍｍの長さに切り取り、ＫＣｌを５０ｍＭ、ｐＨ８．３トリス塩酸を１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを２．５ｍＭ、ノニデットＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）を０．４５％（ｖ／ｖ）、トゥウィーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を０．４５％（ｖ／ｖ）、プロテナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ）を１５０μｇ／ｍＬ含むバッファー中、５５℃で培養した。  組織を消化した後、試料を、９５℃で５分間保持してプロテナーゼＫを不活化し、この試料２μＬを用いてＰＣＲにより遺伝子型の分析をした。動物は、ソー・アドバンスト・スーパーミックス（ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ）を用いて、プライマーをトランスジェニックＡＰＰと、ポジティブコントロールとしてのＩＬ−ＩＩ遺伝子に直接反応させる多重ＰＣＲ反応で遺伝子型の判別をした。  プライマーは、ＡＰＰに対してはフォワード（配列番号１６）の５’−ＣＡＴＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴＴＧＴＣＡＴＣ−３’とリバース（配列番号１７）の５’−ＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＣＧＴＴＣＴＧＣ−３’であり、ＩＬ−ＩＩに対してはフォワード（配列番号１８）の５’−ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣＴ−３’とリバース（配列番号１９）の５’−３’ＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣである。  ＰＣＲの条件は、９８℃、２分で初期変性し、その後、９８℃、５秒で変性、６０℃、３０秒でのプライマーのハイブリダイゼーション（ｈｉｂｒｉｄａｃｉｏｎ）とエクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を繰り返して４５サイクル行った。遺伝子型は、ＰＣＲ生成物の変性曲線を解析して決定した。
【００７４】
〔トランスジェニックマウスの大脳皮質神経細胞培養〕
大脳皮質神経細胞の一次培養は、両方の性のＢ６．ＣＧ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｍｍｊａｘ（ＡＰＰ／ＰＳ１）マウス（ジャックソン  ラボラトリース：バーハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）Ｅ１７胚の脳スライスから調製した。  細胞は、トリプシンとディーエヌエースＩ（ＤＮＡｓｅ  Ｉ）の存在下で解離し、Ｂ２７を２％、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を０．１ｍｇ／ｍＬ、グルタマックス（ＧｌｕｔａＭａｘ）を０．５ｍＭで補充したニューロベイサル・メディウム（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）中、２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、ポリ−Ｄ−リジンでカバーした（１００μｇ／ｍＬ）ウエルに接種した。メディアムの容積の３分の１を３〜４日毎に変えた。細胞は、ＣＯ２が５％と空気が９５％の雰囲気下の加湿インキュベーター中で３７℃に保った。培養物は、実験を行う日まで静置し、この日迄の期間を、本発明ではインビトロ培養日数（ＤＩＶ）とした。  動物の手順とケアの全ては、バルセロナ大学倫理委員会によって承認され、国内法（カタルーニャ地域庁）及び国際法（実験動物のケアと使用上のガイド、ナショナル・アカデミー・プレス、ワシントンＤＣ、１９９６）に従って行った（図４）。
【００７５】
〔培養皮質神経細胞中のミトコンドリアＤＮＡコピー数の決定〕
全ＤＮＡは、培養した皮質神経細胞を、ＳＤＳバッファー（トリス塩酸が１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１０ｍＭ、ＳＤＳが０．５％、ＲＮａｓｅＡが２０μｇ／ｍＬ、ｐＨ；８．０）に３７℃で１時間保持して、１０００細胞あたり約１μＬの抽出容量で抽出した。抽出物を、プロテナーゼＫ（１００μｇ／ｍＬ）に５６℃で１時間保持した後，９５℃で１０分間保持してこの酵素を不活化させた。ｑＰＣＲ反応は、カラム精製中にミトコンドリアＤＮＡのロスを最小限に抑えるため、抽出バッファー中で直接に行った。特性研究で、１：５００に希釈した抽出バッファーは、ＰＣＲ反応の効率を阻害しないことを示した。
ミトコンドリアＤＮＡの増幅にハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のミトコンドリアゲノム完全シーケンス参照ＮＣ＿００５０８９．１、１２ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の２１４塩基と９１２塩基の間の互いに近い生成物を増幅する２つのプライマー組み合わせを用いた。このプライマーは、１１５塩基対のフラグメントを生成するミトコンドリアＤＮＡ−１１５と、６９９塩基対のフラグメントを生成するミトコンドリアＤＮＡ−６９９である。  それぞれの反応は、２Ｘソー・アドバンスト・スーパーミックス（２Ｘ  ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ、ハーキュレス、カリフォルニア州  ９４５４７、アメリカ合衆国）を１０μＬ、それぞれのプライマーを０．３ｍＭ、抽出試料の１：２５０希釈物を１０μＬで、最終容量２０μＬとして行った。  プライマーのシーケンスは、ミトコンドリアＤＮＡ−１１５は、フォワードが（配列番号１１）５’−ＣＴＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡ−３’と、リバースが（配列番号１２）５’−ＣＧＴＡＴＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＧ−３’であり、ミトコンドリアＤＮＡ−６９９は、フォワードがミトコンドリアＤＮＡ−１１５のプライマーである（配列番号１１）と、リバースが（配列番号１３）５’−３−ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＡＣＴＴ’である。  ＰＣＲの条件は、ミトコンドリアＤＮＡ−１１５とミトコンドリアＤＮＡ−６９９のそれぞれについて、９５℃、２分で初期変性した後、９５℃、５秒の変性と、６０℃又は６５℃、１２秒又は６０秒でプライマーのハイドレーションとエクステンションを繰り返しての４５サイクルとした。  核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）の定量に、我々は、ゲノム内の多重コピーがある１８ｓリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の２１９塩基対のシーケンスを用いた。プライマーのシーケンスは、フォワードが（配列番号１４）５’−ＣＧＣＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＧＴ−３’、リバースが（配列番号１５）５’−ＡＧＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＣ−３’である。  ＰＣＲ条件は、９５℃、２分で初期変性の後、９５℃、５秒での変性と、５７℃、２０分でのプライマーハイブリダイゼーションとエクステンションを繰り返しての４５サイクルとした。全ての反応を３回行った。サイクル閾値（Ｃｔ）の測定は、指数範囲で決めた。効率が９０％以上の反応のみを考慮に入れた。変性曲線の分析とゲル電気泳動により、特異な生成物がないことを確認できた。  ミトコンドリアＤＮＡと、ｎＤＮＡの１８ｓリボソームＲＮＡのコピーの定量は、予めｐＪＥＴ１．２プラスミドで複製したそれぞれの増幅生成物の標準曲線により行った。結果を、ミトコンドリアＤＮＡのコピー数を１８ＳｒＮＡのコピー数で割った値で表す。  引き続いての特性実験で、我々は、培養皮質神経細胞のゲノム中にある１８ＳｒＲＮＡのコピー数を、ｐＪＥＴ１．２プラスミド中で複製したシングルコピー（ＩＬ−ＩＩとＮＰ１）をもつ２つの異なる遺伝子フラグメントの標準曲線との関係で決定した。結果は、培養皮質神経細胞は、１８ＳリボソームＲＮＡの凡そ５０コピーであり、細胞１個あたりミトコンドリアＤＮＡを３００〜６００範囲のコピーを有していることを示している（図４）。
【００７６】
〔統計解析〕
この結果を、平均値±ＳＥＭで表す。統計的な有意差は、サンプルの特性に依り、ダン事後多重比較検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）を用いたクラスカル−ウォリス分析（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ボンフェローニ多重比較検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）、又は２標本スチューデント検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）、又はクラスカル−ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｕ  ｔｅｓｔ）をを使用する一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いた。  受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）の解析と曲線下面積の解析は、グラフパッド・プリズム・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。
【００７７】
〔実施例２：ＣＳＦ中に循環する細胞外ミトコンドリアＤＮＡの検出〕
先ず、ＣＳＦ中に循環する細胞外ミトコンドリアＤＮＡの検出可能性について調べた。
特性研究では、ＰＣＲ増幅により、ヒトＣＳＦの少容量（１０μＬ）中の細胞外ミトコンドリアＤＮＡを検出することが可能であることが示された。  ＤＮＡ増幅の特異性を確認するのに、３つの異なるプライマー組み合わせを用いた（図１）。第１のプライマーペア（配列番号１／配列番号４）は、５１５塩基対の長さ（ミトコンドリアＤＮＡ−５１５）範囲を増幅する。他の２つのプライマーペア（それぞれ、配列番号３／配列番号４と配列番号１／配列番号２）は、それぞれ８５塩基（ミトコンドリアＤＮＡ−８５）と１５３塩基（ミトコンドリアＤＮＡ−１５３）を増幅する範囲で、互に近くにある（図１Ａ、Ｂ）。  ＣＳＦ中の細胞外ミトコンドリアＤＮＡの量は、ＣＳＦ試料について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離したヒトミトコンドリアＤＮＡの広い量範囲に亘る外部標準を使用し、ｑＰＣＲによる分析で測定した。この結果は、ミトコンドリアＤＮＡが、ＣＦＳ中、２９〜３５Ｃｔの間の範囲に検知され、これは、循環するミトコンドリアＤＮＡ量２〜３００ｆｇ／ｍＬに対応することを示している。  同様の結果が、タクマン（ＴａｑＭａｎ）プローブと、１２ＳリボソームＲＮＡミトコンドリアＤＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡ領域を意図した異なるプライマー組み合わせを使用した別のｑＰＣＲ分析技術で得られた。
【００７８】
〔実施例３：ＡＤ進行の危険がある無症状個人及び散発的ＡＤと診断された患者のＣＳＦに循環するミトコンドリアＤＮＡレベルの分析〕
次に、ＡＤ発症前患者（ＣＳＦ中のＡβレベルが低かったということで選ぶ）と、既に散発的ＡＤと診断された患者のＣＳＦ中にある細胞外ミトコンドリアＤＮＡの量を測定した（表１）。  ミトコンドリアＤＮＡ−８５の領域の増幅は、両グループの患者からのＣＳＦ試料中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量に顕著な減少が見られた。  ＡＤの危険がある無症状の被験者は、ＣＳＦ中のＡβレベルが低く（ＬＡβ＝２８±４ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝７）、ＡＤと診断された症状のある患者は、（ＡＤ＝４８±７ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１３）で、同じ年齢のコントロールグループＣ１（Ｃ１＝１８８±４９ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）と比較して、それぞれ８５±２％と７４±３％の減少であった。  ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡの量を、他の２つのプライマー組み合わせ（配列番号１／配列番号２と、配列番号１／配列番号４）で調べたとき、同様の影響が認められた。すなわち、ｑＰＣＲによるミトコンドリアＤＮＡ−１５３の生成物増幅は、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量が、ＬＡβグループ（６±１ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝７）、ＡＤグループ（２３±６ｆｇ／ｍＬ，ｎ＝１３）であり、Ｃ１グループ（１４２±４４ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）に比較して、それぞれ９６±１％と８４±４％減少していた。  同様に、ｑＰＣＲによるミトコンドリアＤＮＡ−５１５生成物の増幅は、ＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡの量が、ＬＡβグループ（３±１ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝７）、ＡＤグループ（１１±３ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１３）であり、Ｃ１グループ（３７±４ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）に比較して、それぞれ９２±３％と７０±７％の減少であった（図１Ｃ）。  ＡＤ患者グループは、３つのプライマー組み合わせ（配列番号１／配列番号２、配列番号１／配列番号４、配列番号３／配列番号４）で、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量が、ＬＡβグループより高い傾向にある。しかし、この差は統計的に有意ではない。  一般に、長いフラグメント（ｍｔＤＮＡ−５１５）の生成物と短いフラグメント（ミトコンドリアＤＮＡ−８５とミトコンドリアＤＮＡ−１５３）の生成物で、ミトコンドリアＤＮＡ増幅の減少割合では、グループ間に有意な差が観察されなかった。ミトコンドリアＤＮＡ増幅の減少は、ミトコンドリアＤＮＡのコピー数が小さい、又はＤＮＡ完全状態の欠落が指摘され得る。  後者の場合、長いフラグメント程、ＰＣＲによる増幅の減少が大きいことを示す。これは、長いＤＮＡフラグメントは、損傷した塩基を蓄積し易く、ポリメラーゼによる増幅を抑えることにある。  したがって、長さの異なる３つのフラグメントに、ＬＡβグループとＡＤグループで同じミトコンドリアＤＮＡ増幅の減少がみられたことは、ミトコンドリアＤＮＡ完全状態の違いでなく、これら３つのグループでのコピー数に減少があることを示している。  まとめると、これらの結果は、ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量が、ＡＤの発症前に減少しており、ミトコンドリアＤＮＡのレベルが低い程、ＡＤ進行の危険性と関連付けられることを示している。
【００７９】
〔実施例４：前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と診断された患者とＡＤ患者のミトコンドリアＤＮＡレベルの差異解析〕
ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量減少が、アルツハイマータイプでない他の痴呆でも起きるかどうかを評価するために、我々は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と診断された患者のＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量を分析した（表１）。  ｑＰＣＲ分析から、異なる３つのプライマー組み合わせ（ミトコンドリアＤＮＡ−８５＝１３２±３５ｆｇ／ｍＬ、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３＝２３４±１６０ｆｇ／ｍＬ、ミトコンドリアＤＮＡ−５１５＝７７±２７ｆｇ／ｍＬ，ｎ＝１５）で測定したこれら患者のＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡ量は、コントロールＣ１で観察されたものと有意な差異がなかったが、ＬＡβグループとＡＤグループで観察されたものより有意に高いことが示され（図１Ｃ）、ＡＤとＦＴＬＤは、ＣＳＦ中の細胞外ミトコンドリアＤＮＡ量の減少が同じでないことを示している。
【００８０】
散発的ＡＤ患者と、コントロール又はＦＴＬＤ患者との間に、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量で差異があるかどうかをみるために、ＤＮＡミトコンドリア−１５３を用いたときのＣＳＦ媒体中のミトコンドリアＤＮＡ量について、受信者操作特性統計分析（ＲＯＣ分析）を行った（図２）。  この結果では、ＡＤ患者は、認識正常コントロール被験者とは、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量のカットオフ値＜５１ｆｇ／ｍＬで、敏感度と特異度がそれぞれ８５％と８０％、ＲＯＣ曲線下面積が０．９４６（９５％信頼区間＝０．８６〜１）で偶然よりも有意に高く（ｐ＜０．００１）、差別できる（図２Ａ）。  さらに、ＲＯＣ分析では、ＡＳと診断された患者は、ＦＴＬＤと診断された患者とは、ＣＳＦ中の細胞外ミトコンドリアＤＮＡ量のカットオフ値＜５１ｆｇ／ｍＬで、敏感度が８５％と特異度が８７％、ＲＯＣ曲線下面積が０．９５９（９５％信頼区間０．８９５〜１）で偶然より有意に高く（ｐ＜０．００１）、差別できる（図２Ｂ）。  他のミトコンドリアＤＮＡフラグメントのデータで、異なるグループ間のミトコンドリアＤＮＡ量をＲＯＣ分析したとき、又は３つのプライマーペアでの増幅データを正規化し組み合わせたとき、同様の結果が得られた。これらの結果は、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量が低レベルであることが、ＡＤと特異的に関連している追加の証拠となるものである。
【００８１】
〔実施例５：認知障害がなく、タウ蛋白質とβ−アミロイドのバイオマーカーが無しで、ＰＳＥＮ１の病原性変異のある若年患者のミトコンドリアＤＮＡの分析〕
ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量の減少が、ＡＤの発症前初期段階に起きるかをみるため、我々は、ＡＤを発生させる遺伝子突然変異があり、ＡＤに関連したバイオマーカーに変化が表われる前の若年発症前患者のＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡ量を分析した。  そこで、我々は、Ａβとタウ蛋白質バイオマーカーに何ら異常が認められないが、平均で少なくとも１０年後にＡＤの病的症状が完全に現れるであろう病原性ＰＳＥＮ１（Ｍ１３９Ｔ、Ｋ２３９Ｎ又はＩ４３９Ｓ）突然変異をもつ若年認知正常被験者グループから得たＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡを定量した。  これら発症前被験者のＣＳＦ分析から、ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量は、同年齢のコントロールグループに比較して顕著な減少が見られた。  突然変異のある被験者のミトコンドリアＤＮＡ量は、コントロールに比較して、その減少割合が３つの異なるプライマーペアでの増幅において同様であった。すなわち、減少割合は、ミトコンドリアＤＮＡ−８５、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３、ミトコンドリアＤＮＡ−５１５のそれぞれで、５４±１０％（ＰＳＥＮ１＝２７±６ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝６；Ｃ２＝５９±９ｆｇ／ｍＬ，ｎ＝７）、６８±１１％（ＰＳＥＮ１＝１４±５ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝６；Ｃ２＝４３±１２ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝７）、及び６６±１１％（ＰＳＥＮ１＝４±１ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝５；Ｃ２＝１３±３ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝７）であった（図１Ｄ）。  これら発症前被験者ＰＳＥＮ１で得た結果は、ＡＤ発症の危険がある被験者に見られたと同じであり（図１Ｃ）、ＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量の減少は、ＡＤの初期発症前状態に既に起きていることを示す更なる証拠であることを示唆している。  患者グループのＣＳＦで観察されたミトコンドリアＤＮＡ量の減少とは対照的に、プライマーの全ての組合せで、高年齢コントロールグループＣ１のＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡ量（ミトコンドリアＤＮＡ−８５＝１８８±４９、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３＝１４２±４４、及びミトコンドリアＤＮＡ−５１５＝３７±４ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）は、若年齢コントロールグループＣ２（ミトコンドリアＤＮＡ−８５＝５９±９、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３＝４３±１２、及びミトコンドリアＤＮＡ−５１５＝１３±３ｆｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）と比べて有意に高かった（ｐ＜０．０１）。これは、ＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量は、年齢と共に増加し、ＡＤ発症前及びＡＤと診断された被験者で見られたのと反対になっていることを示している。
【００８２】
〔実施例６：散発的ＡＤと診断された患者での、ｄｄＰＣＲによるＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡレベルの分析〕
次に、我々は、実験で見出されたＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡ量の差異が、単核酸量を一分子解析レベルで直接定量可能にした、液滴デジタルＰＣＲとして知られている新しいＰＣＲ方法で確認できるかを調べた。  プライマーペア（配列番号１／配列番号２）と、ミトコンドリアＤＮＡ−１５３を増幅するプローブ、配列番号８を用いた新しいｄｄＰＣＲ技術でＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡのコピー数を測定して、散発的ＡＤと診断された患者は、ＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡのコピー数（ＡＤ＝９１５±１９２コピー数／ｍＬ、ｎ＝２０）が、同年齢のコントロールグループＣ１及び前頭側頭葉変性症と診断された患者グループＦＴＬＤのコピー数（Ｃ１＝２０９２±３９９コピー数／ｍＬ、ｎ＝９；ＦＴＬＤ＝２０５３±６６６コピー数／ｍＬ、ｎ＝１１）に比べて、顕著に少ないことを確認した。この効果は、ＡＤ患者におけるミトコンドリアＤＮＡが、コントロールグループＣ１と比較して５６±９％減少していることに対応している（図５）。  これらの結果は、ｑＰＣＲを使用して得られた結果と同じであり、ＡＤと診断された患者のＣＳＦ中ミトコンドリアＤＮＡの量が、ＦＴＬＤと診断されたヒトのものより少ないことを示すこれまでの実験からのデータを確証している。
【００８３】
〔実施例７：ＡＤの動物モデルとしてトランスジェニックマウスＡＰＰ／ＰＳ１の皮質神経細胞培養における細胞１個あたりのミトコンドリアＤＮＡコピー数の分析〕
これまでの研究では、ＡＤ患者の死後の脳でのミトコンドリアＤＮＡコピー数に減少があることを示したが、ヒトの脳組織では、この効果が何時始まり、そして神経変性プロセスによって引き起こされているかどうかを決定することができない。  ＡＤと関連したＣＳＦ中のミトコンドリアＤＮＡ量の減少が、中枢神経障害が現れる前に中枢神経システムに生じることを確認するために、我々は、突然変異ＡＰＰ／ＰＳ１ヒト遺伝子を表すトランスジェニックマウスの培養皮質神経細胞でのミトコンドリアＤＮＡのコピー数を測定した。  マウスの中枢神経では、２つの異なるプライマー組み合わせ（配列番号１１／配列番号１２と、配列番号１１／配列番号１３）で測定して、細胞１個あたりのミトコンドリアＤＮＡのコピー数に有意な減少を示した（〜２８％）（図３Ａ）。  ミトコンドリアＤＮＡのコピー数のこの減少は、シナプスの損傷が現れるずっと前の皮質神経細胞の培養１４ＤＩＶに起因し、シナプトフィジンとＰＳＤ９５蛋白質のレベルによって測定された（図３Ｂ〜Ｄ）。  これらの結果から、ＡＤ患者のＣＳＦ中に循環するミトコンドリアＤＮＡ量の減少は、神経システムの神経細胞中の細胞１個あたりのミトコンドリアＤＮＡのコピー数が少いことを反映し、ミトコンドリアＤＮＡの減少がＡＤの神経変性プロセスの初期に表われると解釈できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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