(57)【要約】  本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体反応を誘発するための免疫原に広く関する。より詳細には、本開示はＲＳＶ Ｆタンパク質を含んでいるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにその使用方法に関する。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は乳児および幼児における下気道疾患の主要な要因であり（Hall et al., NEJM, 360:5888-598, 2009; and Nair et al., Lancet, 375:1545-1555, 2010）、この若年の集団を防御するためのワクチンは優先度が高いものである。
2016517440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでいる抗原組成物であって、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、上記融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である、抗原組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原組成物およびアジュバントを含んでいる、ワクチン。
【請求項３】
有効量の、請求項１に記載の抗原組成物を哺乳類に投与する工程を包含している、ＲＳＶ反応性の抗体反応を誘発させる方法。
【請求項４】
最初の免疫化および一回以上のそれに続く免疫化を包含する好適なワクチン投与計画に従って、請求項２に記載の有効量の上記ワクチンを上記哺乳類に投与する工程を包含している、それを必要とする哺乳類における、ＲＳＶ感染を低減させるためまたはＲＳＶ疾患を予防するための、方法。
【請求項５】
以下を包含する、抗ＲＳＶ抗体をスクリーニングするための方法：
ａ）ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原への抗体またはその断片の結合を測定する工程であって、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、上記融合タンパク質は、ハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合している工程、および
ｂ）ＲＳＶ Ｆポリペプチドを欠いているウッドチャックヘパドナウイルスＶＬＰへの抗体またはその断片の結合を測定する工程、および
ｃ）上記抗体またはその断片が上記ハイブリッドＶＬＰに結合しているが、上記ＲＳＶ Ｆポリペプチドを欠いている上記ウッドチャックヘパドナウイルスＶＬＰには結合していない場合に、上記抗体またはその断片が上記ＲＳＶ Ｆポリペプチドに特異的であると決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連する出願への相互参照〕
本願は、本願明細書にその全文が参照によって援用されている、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８０２，２４０号の優先権を主張する。
【０００２】
〔技術分野〕
本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体反応を誘発するための免疫原に広く関する。より詳細には、本開示はＲＳＶ Ｆタンパク質を含んでいるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにその使用方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は乳児および幼児における下気道疾患の主要な要因であり（Hall et al., NEJM, 360:5888-598, 2009; and Nair et al., Lancet, 375:1545-1555, 2010）、この若年の集団を防御するためのワクチンは優先度が高いものである。ＲＳＶワクチンの開発は、ホルマリン不活性化全粒子ワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）のワクチン接種後の亢進性呼吸器疾患（enhanced respiratory disease、ＥＲＤ）の発生によって妨げられている（Fulginiti et al., Am J Epidemiol, 89:435-448, 1969; Kapikian et al., Am J Epidemiol, 89:405-421, 1969; and Kim et al., Am J Epidemiol, 89:422-434, 1969）。特に、乳児および小児に投与されるＦＩ−ＲＳＶは、ＲＳＶ感染に対し防御しておらず、それに続くＲＳＶの流行期の間にＲＳＶの感染に続く重症の呼吸器疾患のリスクが実際に増加していた。ワクチン誘導性のＥＲＤは、ＲＳＶ感染の動物モデルにおいてくり返され、このことによって、ゆがめられたＴｈ２ Ｔ細胞反応および非機能的な抗ＲＳＶ抗体（すなわち、低結合活性、非中和性、非機能阻害性および非防御性）の防御がＥＲＤの発症へ関与する重要な因子であり、ＲＳＶワクチンの候補の開発において回避されるべきであるという、一般的に受け入れられている見解が導かれている。
【０００４】
以下を含む多数のＳＶワクチンの候補が次々と開発されてきた：低温死滅を伴う（cp）生ワクチン、温度感受性（ts）変異体；欠失変異を有する組み換えウイルスrecombinant virus with deletion mutations （ＳＨ、 ＮＳＩまたはＮＳ２）;およびそれらの組み合わせ。一般的に、これらの生ワクチンは臨床試験において、残存した毒性、遺伝的な不安定性、および／または不十分な免疫原性を示した（Schickli et al., Human Vaccines, 5:582-591, 2009; Wright et al., J Infect Dis, 182:1331-1342, 2000; and Karron et al., J Infect Dis, 191:1093-1104, 2005）。また、サブユニットワクチン（精製したＦ 糖タンパク質（Groothuis et al., J Infect Dis, 177:467-469, 1998）、組み換えキメラＦ／Ｇ糖タンパク質（Prince et al., J Virol, 77:13256-13160, 2003）、Ｆ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ（Bembridge et al., J Gen Virol, 81:2519-2523, 2000; and Li et al., Virology, 269:54-65, 2000）およびＧタンパク質ペプチド（De Waal et al., Vaccine, 22:915-922, 2004）が挙げられる）が開発された。しかし、非複製型のＲＳＶワクチンの候補は、免疫学的に未処置の乳児において試験されておらず、ＦＩ−ＲＳＶ試験が失敗していために、動物モデルにおいて強制的な安全性プロファイルを必要とするであろう。さらに、ＲＳＶのＦ糖タンパク質（Murphy et al., Vaccine, 8:497-502, 1990）およびＧ糖タンパク質（Hancock et al., J Virol, 70:7783-7791, 1996; and Johnson et al., J Virol, 72:2871-2880, 1998）は、ＥＲＤを誘導することが報告されている。
【０００５】
したがって、当技術分野では、ＲＶ中和抗体を誘発するための、より良好な安全性プロファイルを有する免疫原を必要としている。特に、ＥＲＤ誘導のリスクが低減した、ＲＳＶ免疫原が望まれる。
【０００６】
〔発明の概要〕
本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体反応を誘発するための免疫原に広く関する。より詳細には、本開示はＲＳＶ Ｆタンパク質を含んでいるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにその使用方法に関する。
【０００７】
本開示は、ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでいる抗原組成物であって、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、当該融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である、抗原組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドはパリビズマブのエピトープである（例えば、パリビズマブによって結合可能）。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３、配列番号８６〜１１１のうちの１つを含んでいるか、配列番号８６〜１１１のうちの１つと少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、２０〜６０アミノ酸の長さであるか、２０〜３０、４０または５０アミノ酸の間の任意の整数の長さであり得る。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号１に従って番号付けされているＮ末端、４４、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、８１、８２、８３、８４、８５、９２、１４９およびＣ末端からなる群から選択されるウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原中の位置に挿入される。他の実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、Ｎ末端、７４、８１、８２，１４９およびＣ末端からなる群から選択されるウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原中の位置に挿入される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドコア抗原のアミノ酸配列は、配列番号７〜８５のうちの１つを含んでいるか、配列番号７〜８５のうちの１つと少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰはパリビズマブに結合する。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、パリビズマブに結合する、および／またはＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０２３、ＶＬＰ０２７，ＶＬＰ０３３、ＶＬＰ０４５、ＶＬＰ０４６、ＶＬＰ０４８、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５０、ＶＬＰ０５２、ＶＬＰ０５３、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０６１、ＶＬＰ０６２、ＶＬＰ０６３、ＶＬＰ０６４、ＶＬＰ０６８、ＶＬＰ０７２、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７６、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０８９、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９１、ＶＬＰ０９２、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９４、ＶＬＰ０９５、ＶＬＰ０９６、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ０９８、ＶＬＰ０９９、ＶＬＰ１１１、ＶＬＰ１１２、ＶＬＰ１１３、ＶＬＰ１２０、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２４、ＶＬＰ１２５、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１２９、ＶＬＰ１３０、ＶＬＰ１３１、ＶＬＰ１３２、ＶＬＰ１３３、ＶＬＰ１３４およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態おいて、ハイブリッドＶＬＰは高力価の、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ反応を誘発する。さらなる実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、高力価の、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ反応を誘発する、および／またはＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０２３、ＶＬＰ０２７，ＶＬＰ０３３、ＶＬＰ０４５、ＶＬＰ０４６、ＶＬＰ０４８、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５０、ＶＬ��０５２、ＶＬＰ０５３、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０６１、ＶＬＰ０６２、ＶＬＰ０６３、ＶＬＰ０６４、ＶＬＰ０６８、ＶＬＰ０７２、ＶＬＰ０７３、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７６、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０８９、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９１、ＶＬＰ０９２、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９４、ＶＬＰ０９５、ＶＬＰ０９６、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ０９８、ＶＬＰ０９９、ＶＬＰ１１１、ＶＬＰ１１２、ＶＬＰ１１３、ＶＬＰ１２０、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２４、ＶＬＰ１２５、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１２９、ＶＬＰ１３０、ＶＬＰ１３１、ＶＬＰ１３２、ＶＬＰ１３３、ＶＬＰ１３４およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、測定可能な、ＲＳＶのサブタイプＡに対する中和抗体反応およびＲＳＶのサブタイプＡに対する防御免疫反応のうちの１つまたは両方を誘発する。さらなる実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、測定可能な、ＲＳＶのサブタイプＡに対する中和抗体反応およびＲＳＶのサブタイプＡに対する防御免疫反応のうちの１つまたは両方を誘発する、および／またはＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５０、ＶＬＰ０５２、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０６２、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９１、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９６、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ０９８、ＶＬＰ１１３、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１３０、ＶＬＰ１３１、ＶＬＰ１３２、ＶＬＰ１３３、ＶＬＰ１３４およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、測定可能な、ＲＳＶのサブタイプＡに対する中和抗体反応およびＲＳＶのサブタイプＡに対する防御免疫反応を誘発する。さらなる実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、ＲＳＶサブタイプＡに対する高力価の中和抗体反応までの中間を誘発する、および／またはＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１３０、ＶＬＰ１３１、ＶＬＰ１３２およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、ＲＳＶサブタイプＡの感染からの高レベルの防御までの中間を誘発する。さらなる実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、ＲＳＶサブタイプＡの感染からの高レベルの防御までの中間を誘発する、および／またはＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５０、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０６２、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９３およびＶＬＰ０９６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１３��、ＶＬＰ１３２およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、２つ、３つ、４つまたは５つの異なるハイブリッドＶＬＰの組み合わせを含んでいる。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、単一のハイブリッドＶＬＰとして会合可能な２つ、３つ、４つまたは５つの異なる融合タンパク質を含んでいる。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、単一のハイブリッドＶＬＰとして会合可能な２つ、３つ、４つまたは５つの異なる融合タンパク質を含んでいる。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＶＬＰは、ＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０１９、ＶＬＰ０２３、ＶＬＰ０２７，ＶＬＰ０３３、ＶＬＰ０４５、ＶＬＰ０４６、ＶＬＰ０４８、ＶＬＰ０４９、ＶＬＰ０５０、ＶＬＰ０５２、ＶＬＰ０５３、ＶＬＰ０５９、ＶＬＰ０６０、ＶＬＰ０６１、ＶＬＰ０６２、ＶＬＰ０６３、ＶＬＰ０６４、ＶＬＰ０６８、ＶＬＰ０７２、ＶＬＰ０７４、ＶＬＰ０７５、ＶＬＰ０７６、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８０、ＶＬＰ０８７、ＶＬＰ０８８、ＶＬＰ０８９、ＶＬＰ０９０、ＶＬＰ０９１、ＶＬＰ０９２、ＶＬＰ０９３、ＶＬＰ０９４、ＶＬＰ０９５、ＶＬＰ０９６、ＶＬＰ０９７、ＶＬＰ０９８、ＶＬＰ０９９、ＶＬＰ１１１、ＶＬＰ１１２、ＶＬＰ１１３、ＶＬＰ１２０、ＶＬＰ１２３、ＶＬＰ１２４、ＶＬＰ１２５、ＶＬＰ１２８、ＶＬＰ１２９、ＶＬＰ１３０、ＶＬＰ１３１、ＶＬＰ１３２、ＶＬＰ１３３、ＶＬＰ１３４およびＶＬＰ１３５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の１つ、２つまたは３つ以上のコピーを含んでいる。さらなる実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質のそれぞれのコピーは、ウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原中の異なる位置に挿入される。さらなる実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質の２つまたは３つのコピーは、ウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原中の単一の位置にタンデムで挿入されている。また、いくつかの実施形態において本開示は、本開示の抗原組成物およびアジュバントを含んでいるワクチンを提供する。
【０００８】
さらなる実施形態において、本開示は、哺乳類の、有効量の本開示の抗原組成物を投与する工程を包含する、免疫反応を誘発させるための方法を提供する。簡潔には、抗原組成物は、ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでおり、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、当該融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、パリビズマブのエピトープを含んでいる（例えばパリビズマブによって結合可能）。当該方法に使用するための種々のハイブリッドコア抗原は、前述の段落の概要に詳細に記載されている。いくつかの実施形態において、免疫反応はＲＳＶ反応性の抗体反応を含んでいる。いくつかの実施形態において、本開示は、最初の免疫化およびそれに続く一回以上の免疫化を包含する、好適なワクチン投与計画に従って、本開示の有効量の抗原組成物（例えばワクチン）を哺乳類に投与する工程を包含している、それを必要とする哺乳類における、ＲＳＶを低減させるためまたはＲＳＶ疾患を予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳類はヒトである。いくつかの実施形態において、ヒトは乳児である（早期の小児期の免疫化方法に対して）。いくつかの実施形態において、ヒトは、妊娠している女性である（妊婦の免疫化方法に対して）。いくつかの実施形態において、本開示は仔を有している妊娠している女性に有効量の抗原組成物を投与して、妊娠している女性のＲＳＶ特異的な抗体を増加させる、ＲＳＶ感染またはＲＳＶ疾患に対して仔を防御する方法であって、当該特異的な抗体の部分は、妊娠期間中に女性の胎盤を介して仔へ移送され、および／または誕生後の仔への母乳を介して移送され、それによりＲＳＶ感染またはＲＳＶ疾患に対して仔を防御する方法を提供する。仔は胎児（例えば胎児）、新生児（例えば１か月未満の新生児）または乳児（例えば１２か月齢までのもの）である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ特異的な抗体は、誕生時またはその後の仔の血清において検出可能である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ特定的な抗体は、ＩｇＧ抗体を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ特定的な抗体は、ＲＳＶ中和抗体である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ感染に対する仔の防御は、ＲＳＶに感染した仔と比較してＲＳＶへの曝露後に仔の鼻分泌物中のＲＳＶ力価を低減させることを包含している。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ感染に対する仔の防御は、ＲＳＶ誘導性の細気管支炎を有する仔と比較してＲＳＶによる下気道感染症の発生率または重症度を低減させることを包含する。いくつかの局面において、連続する免疫化は、１回の免疫追加内である。ほかの局面において、連続する免疫化は２回の免疫追加内である。
【０００９】
さらなる実施形態において、本開示は、以下を包含する、抗ＲＳＶ抗体をスクリーニングするための方法を提供する：ａ）ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原への抗体またはその断片の結合を測定する工程であって、ハイブリッドコア抗原は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、当該融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合している工程、およびｂ）ＲＳＶ Ｆポリペプチドを欠いているウッドチャックヘパドナウイルスＶＬＰへの抗体またはその断片の結合を測定する工程、およびｃ）上記抗体またはその断片が上記ハイブリッドＶＬＰに結合しているがＲＳＶ Ｆポリペプチドを欠いている上記ウッドチャックヘパドナウイルスＶＬＰには結合していない場合に、上記抗体またはその断片が上記ＲＳＶ Ｆポリペプチドに特異的であると決定する工程。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドはパリビズマブのエピトープである（例えば、パリビズマブによって結合可能）。当該方法に使用するための種々のハイブリッドコア抗原は、前述の段落の概要に詳細に記載されている。
【００１０】
さらに、本開示は、ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原をコードしているポリヌクレオチドであって、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質である、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドはパリビズマブのエピトープである（例えば、パリビズマブによって結合可能）。当該方法に使用するための種々のハイブリッドコア抗原は、前述の段落の概要に詳細に記載されている。さらなる実施形態において、本開示は、プロモーターとの作動可能な組み合わせにおいて本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含んでいる発現構築物を提供する。さらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている発現構築物を含んでいる発現ベクターを提供する。さらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
【００１１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、エピトープ挿入に対する位置的な耐性を図示している、ウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原（ＷＨｃＡｇ）の概略図を示す。丸は以下の位置を含む粒子会合に耐性である挿入位置を示す：１（Ｎ末端）、４４、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、８１、８２、８３、８４、８５、９２および１８７（Ｃ−末端）。１４９番目の残基（１５０〜１８８番目の残基を欠いている）においてトランケートされたＷＨｃＡｇのＣ末端もまた、粒子の会合に耐性である。対照的に、四角は以下の位置を含む粒子会合に非耐性である：２１、６６、７９、８０、８６および９１。位置の番号付けは、配列番号１として記載されている全長のＷＨｃＡｇアミノ酸配列に基づいている。１４９番目の位置においてトランケートされているＷＨｃＡｇは、配列番号２として記載されている。ＲＳＶ Ｆ２５４−２７７エピトープ（配列番号３）は、この図においてＷＨｃＡｇの７８番目の位置に挿入されている。
【００１２】
図２は、ハイブリッド（ＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）試験のフローチャートを示している。
【００１３】
図３Ａは、パリビズマブへの結合に対する固相の抗原としてのハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶの抗原性を示している。図３Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質へ結合するパリビズマブの阻害剤としての溶液中のハイブリッドＶＬＰの抗原性を示している。
【００１４】
図４Ａ〜４Ｄは、４つのＲＳＶ反応性モノクローナル抗体への結合に対する固相の抗原としてのハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの抗原性を示している。
【００１５】
図５は、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰがＲＳＶのパリビズマブ中和を阻害可能であることを示している。
【００１６】
図６Ａは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの免疫原性を示している。図６Ｂは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰに対する抗体が固相のＲＳＶ組み換えＦ（ｒＦ）タンパク質へのパリビズマブの結合を阻害可能であることを示している。
【００１７】
図７Ａおよび図７Ｂは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの免疫原性を示している。図７Ｃおよび図７ＤはハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの防御効果を示している。
【００１８】
図８Ａ〜図８Ｆは、ＶＬＰ０１９血清によるＲＳＶ−Ａ、ＲＳＶ−Ｂおよびパリビズマブエスケープ変異体（ＭＡＲＭ Ｓ２７５Ｆ）の中和を示している。熱不活性化した血清またはパリビズマブの希釈液を１００〜２００ＰＦＵのＲＳＶと混合し、プラークアッセイによって力価を測定する前に１時間インキュベートした。抗ＶＬＰ１９血清は、野生型のＲＳＶ  Ａ２（図８Ａ）、いくつかの近年のＲＳＶ Ａの臨床的な単離物（図８Ｂ）２つのＲＳＶ Ｂの臨床的な単離物（図８Ｃおよび図８Ｄ）およびいくつかの抗体エスケープ変異体（図８Ｅおよび図８Ｆ）を中和した。
【００１９】
図９は、マウスにおけるアルミニウムおよび不完全フロインドアジュバント中のハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ  ＶＬＰの防御効果の比較を示している。
【００２０】
図１０は、ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示している。極低温電子顕微鏡解析を、ＰＢＳ中のパリビズマブＦａｂでインキュベートしたＷＨｃＡｇ、ＶＬＰ−１９およびＶＬＰ−１９において行った。サンプルを液体エタン中でガラス化し、NanoImaging Services, Inc において、FEI Tecnai T12電子顕微鏡でイメージングした。
【００２１】
図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＷＨｃＡｇおよびＷＨｃＡｇと比較した、ＶＬＰ１９のインビトロ解析の結果を図示している（レーン１、３および５）；およびＷＨｃＡｇ（２、４および６）。総タンパク質を、Sypro Ruby stainによって可視化した（レーン１および２）。ウェスタンブロットは、抗ＷＨｃＡｂ（レーン３および４）または抗ＲＳＶ Ｆパリビズマブ（レーン５および６）で検出した。図１１Ｂにおいて、ＥＬＩＳＡプレートをパリビズマブの希釈液でインキュベートする前にＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇでコーティングした。図１１Ｃにおいて、ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇ／ｍｌのパリビズマブと混合した競合剤（ＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇ）の希釈液でインキュベートする前に、ｓＦでコーティングした。図１１Ｄにおいて、ヒト血漿の希釈液でインキュベートする前にＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇでコーティングした。すべてのＥＬＩＳＡアッセイについて、結合したＩｇＧをＨＲＰコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧＡｂ、それに続くテトラメチルベンジジンを用いたインキュベーションによって検出した。反応を０．１ＮのＨＣｌで停止させ、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍにおいて読み取った。各ＥＬＩＳＡアッセイを３連で行い、示されたデータは単一のアッセイを示している。
【００２２】
図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＶＬＰ１９を用いた免疫化によって曝露からマウスが防御され、中和ＡｂおよびＦ特異的ＩｇＧが誘発されることを示している。BALB/cマウス（ｎ＝５）を０日目および１４日目に不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）または）ＰＢＳ単独の何れかにおいて調合した４０μｇのＶＬＰ１９の１００μＬを投与するか、または０日目に１０６ＰＦＵの野生型ＲＳＶ Ａ２で感染させた。２８日目に、血清をサンプリングし、マウスを１０６ＰＦＵの野生型ＲＳＶ Ａ２で曝露した。３２日目に肺を回収した。図１２Ｂは、熱不活性化血清のＲＳＶマイクロ中和力価を示す。図１２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって決定されたｓＦ特異的なＩｇＧの力価の血清を示す。各動物に対するデータポイントは平均を通った線で示されている。Ｔ−ｔｅｓｔは、ｐ値を決定するために行われ、“ｎs”は、“有意差なし”を示している。示したデータはＩＦＡによる免疫化からのものであった。独自のアジュバントを用いた免疫化により、類似の結果を得た。
【００２３】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、マウス抗ＶＬＰ１０血清が、ＲＳＶを中和し、ｓＦへの結合に対してパリビズマブと競合することを図示している。図１３Ａは、パリビズマブと比較した、ＶＬＰ１９免疫化マウスから得た熱不活性化血清を用いて行ったＲＳＶのＰＲＮＴ中和アッセイの結果を示している。図１３Ｂは、ＶＬＰ１９免疫化マウスから得た血清が、ｓＦへの結合に対してパリビズマブと競合することを示している。ＥＬＩＳＡプレートを、ｓＦでコーティングし、ネガティブコントロールの血清か抗ＶＬＰ１９血清の何れかの希釈液と混合した一定量のパリビズマブの混合物とインキュベートした。結合したパリビズマブをＨＲＰコンジュゲートした抗ヒトＡｂで検出した。洗浄の後、色を０．１Ｎ ＨＣｌを伴うテトラメチルベンジジンで発色させた。光学濃度を４５０ｎｍにおいて読み取り、％阻害をネガティブコントロールとの比較によって算出した。示したデータは３回の独立した実験の典型例である。
【００２４】
図１４Ａおよび図１４Ｂハアジュバントの非存在下において投与されたＶＬＰ１９の免疫原性および有効性を示している。３つのB10xB10.S F1マウスの群は第０週および第６週目にｐＢＳ中のＶＬＰ１９の、示された投与によって腹腔内に免疫化した。マウスを出血させ、貯めた血清を試験した。図１４Ａは、抗ＶＬＰ１９血清の抗ＲＳＶタンパク質のＩｇＧ力価を示している。図１４Ｂは、抗ＶＬＰ１９血清のＲＳＶ中和力価を示している。
【００２５】
〔発明の詳細な説明〕
本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体反応を誘発するための免疫原に広く関する。より詳細には、本開示はＲＳＶ Ｆタンパク質を含んでいるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにその使用方法に関する。
【００２６】
（パリビズマブエピトープ）
全ウイルスまたはＲＳＶサブユニットへの選択的なアプローチは、当該全ウイルスまたはＲＳＶサブユニットへの防御的免疫反応が産生され得る、ＲＳＶタンパク質またはペプチドの重要な中和の同定に関与する。１９８０年代後半に、ＲＳＶの融合タンパク質（Ｆ）に対するマウスのモノクローナル抗体が、広範なＲＳＶ株への強力なＲＳＶ中和能を有することが見いだされた（Beeler et al., J Virol, 63:2941-2945, 1989）。強く中和されているマウスのＭａｂ１１２９は、続いてヒト化され、パリビズマブと命名された。パリビズマブ（MedImmune, LLC によって製造されたＳＹＮＡＧＩＳ  ＲＳＶ Ｆタンパク質阻害剤のモノクローナル抗体（Gaithersburg, MD））の受動的な移送は、ＲＳＶによって生じる重症の下気道疾患の予防のための小児の受動免疫化として、米国食品医薬品局によって承認された。詳細には、ＳＹＮＡＧＩＳの安全性および有効性は、気管支肺形成異常を有する小児、未熟児（３６週未満の妊娠期間中の誕生）、および重症の先天的な心疾患を有する小児において確立された。パリビズマブは、ＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質と結合し、遺伝的なサブタイプＡおよびＢの両方を中和する（Blanco et al., Hum Vaccine, 6:482-492, 2012）。
【００２７】
パリビズマブの使用は一般的な集団または成人へ拡大されておらず、予防的には有効であるが、治療的には有効ではなかった。抗体予防法は高コストであるために、米国は、大多数の高リスクの乳児へのこの薬剤を投与する唯一の国家である。したがって、活性化ワクチンはＲＳＶの抑制に望ましい。
【００２８】
パリビズマブの投与がＲＳＶ疾患の発生を減少させることができるため、パリビズマブによって標的化したエピトープは、防御免疫反応を誘発し得る抗原を持続すると考えられる（Impact-RSV Study Group, Pediatrics, 102:531-537, 1998; Meissner et al., Am Acad Ped News, 30:1, 2009; and Wu et al., Curr Top Microbiol Immunol, 317:103-123, 2008）。パリビズマブによって標的化される抗原は大規模に研究されているが、全長のＲＳＶ Ｆにおいてその提示を正確に模倣する形態において配列を発現することには困難性がある。以前に、パリビズマブの結合サイトはサイトＡまたはサイトＩＩに関してＦの連続する領域であることが決定された。防御的免疫反応を誘発可能なペプチドワクチンを産生する試みがなされた。Ｆ２５５−２７５を含んでいる、種々の２１−残基、４１−残基および６１−残基のペプチドが試験された（Lopez et al., J Gen Virol, 74:2567-2577, 1993）。スカシガイヘモシアニン結合ペプチドは、マウスにおいてペプチドを認識する抗体を生成できたが、血清は全長のＦタンパク質を不十分に認識したのみであり、ＲＳＶウイルスを中和しなかった。これらの結果は、ペプチドワクチンとの関連においてではなく、ネイティブのＦとの関連における高次構造を必要とすることを示唆している。
【００２９】
さらに近年、ＲＳＶ ＦのサイトＡに対するＭａｂを中和する他のＲＳＶである、Ｍａｂ１９を用いて、ペプチドライブラリーがスクリーニングされた（Chargelegue et al., Immunology Letters, 57:15-17, 1997）。８ｍｅｒがはしかウイルス由来のＴｈエピトープと結合され、樹脂中で調合された場合、マウスにおいて中和抗体を誘発した。ワクチンは、野生型のＲＳＶ曝露力価において７７倍の減少を示した（Chargelegue et al., J Virol, 72:2040-2046, 1998）。興味深いことに、ミモトープはネイティブＲＳＶのＦ タンパク質と配列相動性を有していなかった。
【００３０】
ＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープの種々の担体への融合を伴う限定的な成功例の報告があった。詳細には、F255-278がＴｈ１バイアスによって粘膜反応を誘発することができるアジュバントであるコレラトキシンに融合された。不完全フロイントアジュバントにおける融合タンパク質の３回の投与による鼻腔内の免疫化したマウスの８０％は、野生型のＲＳＶによる曝露から防御された（Singh et al., Viral Immunol, 20:261-275, 2007）。他の群は、ヒトパピローマウイルスのＬ１カプシドタンパク質から構成されるキャプソメアにおける同一のＦタンパク質エピトープを発現した。キャプソマーは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する抗体によって認識され、Ｆタンパク質特異的抗体は、免疫化マウスから得た血清において検出されたが、免疫血清はＲＳＶを中和することができず、ＲＳＶ防御データは報告されなかった（Murata et al., Virol J, 20:261-275, 2007）。
【００３１】
エピトープのスカフォールドは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のモタビズマブエピトープを示すために設計された。ペプチドのスカフォールドは、重要な結合サイトの予測された構造および曝露を維持しているように思われ、免疫化マウスから得た血清はＦタンパク質結合活性を有していたが、血清はＲＳＶを中和することができなかった（McLellan et al., J Mol Biol, 409:853-866, 2011; and WO 2011/050168of McLellan et al.）。
【００３２】
本開示の革新的な手法は、受動的に投与されたパリビズマブが、それに続くＲＳＶの曝露においてＥＲＤの要因となることなく重症のＲＳＶ疾患から乳児を防御するという観察において拡大する。このことは、ＥＲＤに関連するＴｈ２反応を誘導することなく中和抗体反応の誘発を含むＲＳＶワクチンの開発についての報告された目標と一致する（Graham et al., Immunol Rev, 239:149-166, 2011）。パリビズマブによって認識されたＲＳＶ Ｆ糖タンパク質におけるＢ細胞のサイトＡエピトープは、へリックス−ループ−へリックスの構造的にではあるが２４残基（Ｆ２５４−２７７）連続的配列として十分に性質決定されている（Beeler, J Virol, 63:2941-2945, 1989; Lopez et al., J Gen Virol, 74:2567-2577, 1993; and Arbiza et al., J Gen Virol, 73:2225-2234, 1992）。全長のＲＳＶ Ｆタンパク質におおけるパリビズマブエピトープと結合するＭａｂは２４残基のペプチドと６０００倍以下で良好に結合する（McLellan et al., Nat Struct Biol, 17:248-250, 2009）が、このことは、エピトープの構造的な性質を示している。さらに、エピトープはネイティブの３量体中のサブユニットの境界面に位置しているが、このことは、なぜそのような強力に中和するエピトープがＲＳＶ株に非常に高く保存されているのかということを説明し得るものであり、インタクトのウイルスにおける半潜在性のエピトープを構成し得る。
【００３３】
（ウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原（ＷＨｃＡｇ））
ＷＨｃＡｇは一つには、多量体の自己会合ウイルス様粒子であるために、担体として選択された。コア粒子の基本サブユニットは、直径約３４ｎｍの２４０個のサブユニットの粒子上の構造に自然に会合する、２１ｋＤａのポリペプチドのモノマーである。ヘパドナコア粒子の３次構造および４次構造が解明されており（Conway et al., Nature, 386:91-94, 1997）図１に概略的に示されている。ＷＨｃＡｇにおける免疫優性Ｂ細胞のエピトープは、６〜８２番目のアミノ酸の周辺に局在し（Schodel et al., J Exp Med, 180:1037-1046, 1994）、隣接するαへリックスを結合しているループを形成している。この観察は、ＨＢｃＡｇの７６〜８２番目のループ領域中に挿入されている異種抗原がＮ末端またはＣ末端に挿入されている抗原よりも著しく抗原性および免疫原性であって、重要なことには、ネイティブのタンパク質の関連における抗原よりも免疫原性であったことと一致している（Schodel et al., J Virol, 66:106-114, 1992）。
【００３４】
本開示の手法は、一般的に、ＷＨｃＡｇＶＬＰ担体にパリビズマブのエピトープを含むポリペプチドを挿入することであり、当該担体は、合成ペプチドよりも著しく免疫原性のマトリックスアレイの形式においてＶＬＰごとにパリビズマブの多数の複製を運搬する。本開示の組成物および方法は、高価かつ労力を要する受動的なパリビズマブの免疫化に対して、活性化した免疫化によりパリビズマブ様中和抗体を誘発することに関する。この目標は、パリビズマブのエピトープは立体配置的であり、挿入されたエピトープはインタクトのＲＳＶに示される抗原性の構造に近似しなければならないため、実際的には挑戦的なものであることを示した。このことは、ＲＳＶ中和抗体を誘発するのに好適な方法においては、他の担体（いわゆるエピトープのスカフォールドなど）におけるＦ２５４〜２７７を提示するための失敗した試みを説明し得る。
【００３５】
しかし、本明細書に示されているように、本開示は、パリビズマブに結合し、高力価の中和抗体を誘発し、ＲＳＶ曝露からマウスを効果的に防御する、多数のＷＨｃＡｇＲＳＶ  ＶＬＰの設計および産生を可能にした。理論に縛られることなく、本成功は、ＷＨｃＡｇ担体の免疫優性ドメインはパリビズマブのエピトープのものに匹敵するヘリックス−ループ−へリックスを有するという事実に部分的には起因しているかもしれない。
【００３６】
組み合わせの技術
ＶＬＰ遺伝子への異種のエピトープ配列の挿入に内在する問題は、このような操作が自己会合性を消滅させ得ることである。この会合の問題は非常に深刻であり、ＨＢｃＡｇまたは他のＶＬＰ技術（例えば、ヒトパピローマウイルスのＬＩタンパク質およびＱβファージ）について研究しているいくつかのグループは、組み換え法によって粒子中にエピトープを挿入するよりも、ＶＬＰへ外来にエピトープを化学的に結合させて、至適化させている。異種抗原を化学的にコンジュゲートさせる必要性は、組み換え技術の発展によって回避された（Billaud et al., J Virol, 79:13656-13666, 2005）。このことは、キメラ粒子の所望の会合ならびに多数のさらなる改良の同定に伴う、ＷＨｃＡｇのＣ末端１７個の異なる挿入部位および２８個の改変体を決定することによって達成された（例えば、米国特許７，１４４，７１２号；米国特許７，３２０，７９５号および米国特許７，８８３，８４３号を参照のこと）。粗細菌可溶化液を用いて、発現レベル、ＶＬＰの会合および挿入物の免疫原性を測定する、ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングシステムが開発され、大きな労働力を要する、十分に発現および／または会合しないハイブリッドＶＬＰに対して精製工程を用いる必要性が回避された。
【００３７】
Δ２〜Δ７変異体および表Ｉに列挙されているいくつかの変異体を、ｍＷＨｃＡｇ特異的な免疫原性および／または免疫原性を低下させるように設計した。新規な改変したＷＨｃＡｇ担体のプラットフォームは、ＲＳＶ Ｆエピトープの提示に有益なシステムを提供する。
【００３８】
【表１】
2016517440.tif 000003
【００３９】
融合タンパク質およびハイブリッド粒子の開発
図１に図示されているように、ループ領域（７６〜８２番目の位置）ならびにループの外側の多数のＲＳＶ Ｆタンパク質の挿入部位がＷＨｃＡｇによって耐性であった。候補のＦタンパク質エピトープが好結果のパリビズマブ抗体のエピトーププロファイルに基づいて開発された。本開示のハイブリッドＶＬＰは、表ＩＩに記載されているように、いくつかのカテゴリにグループ分けすることができる。
【００４０】
【表２】
2016517440.tif 000004
【００４１】
ハイブリッドＷＨｃＡｇ ＲＳＶ ＶＬＰの抗原性および免疫原性の性質決定
Ａ，抗原性
免疫原性の試験の前に、ハイブリッドＷＨｃＡｇ ＲＳＶ ＶＬＰを、発現、粒子会合性、およびＲＳＶ特異的抗体（例えばパリビズマブ）への結合能について性質決定した。細菌可溶化液中のハイブリッドＶＬＰを検出するために用いた同一の捕捉ＥＬＩＳＡシステムを、精製した粒子に用いることが可能である。簡潔には、粒子の会合性および抗体結合性をＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを、各候補のハイブリッド種のサイズおよび抗原性を評価するために用い得る。
【００４２】
Ｂ．免疫原性
ハイブリッドＶＬＰの免疫反応を評価する。抗挿入物、抗タンパク質および抗ＷＨｃＡｇ抗体のエンドポイント力価に加え、抗体の正確な特異性、アイソタイプの分布、抗体の持続性および抗体の親和性のうちの１つ以上を監視する。これらのアッセイの例は以下に記載されている。免疫反応を種々の哺乳類の種（例えばマウスおよびコットンラットのようなげっ歯類、非ヒトの霊長類、ヒトなど）においてインビトロで試験する。
【００４３】
（組成物）
本開示の組成物は、ハイブリッドウッドチャックヘパドナコア抗原またはハイブリッドコア抗原をコードしているポリヌクレオチドを含んでおり、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチドおよびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、当該融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆポリペプチドはパリビズマブのエピトープを含んでいる（例えば、パリビズマブによって結合可能）。好ましい実施形態において、組成物は、抗原性の組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいる。“担体”という用語は、その中で、ハイブリッドコア抗原または抗原をコードしているポリヌクレオチドが哺乳類の対象に投与される、ビヒクルを指す。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容可能な担体は当技術分野においてよく知られている（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences by Martin, 1975を参照）。
【００４４】
例示的な“希釈剤”としては、滅菌水、滅菌生理食塩水、および滅菌バッファー等の滅菌液が挙げられる。例示的な“賦形剤”は、挿入物質（ポリマー（例えばポリエチレングリコール）、炭水化物（例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、セルロースなど）およびアルコール（例えばグリセロール、ソルビトール、キシリトールなど）が挙げられるがこれに限定されない）である。
【００４５】
アジュバントはそれらの作用の第一の機構に基づいて２つのクラスに広く分離される：
抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ相互作用した抗原を標的とするワクチン運搬システム（例えばエマルジョン、ミクロ粒子、iscom、リポソームなど）；および内生の免疫反応を直接活性化する免疫賦活アジュバント（例えば、LPS、MLP、CpGなど）。ＷＨｃＡｇプラットフォームは、抗原特異的Ｂ細胞および他の最初のＡＰＣ並びに抗原特異的Ｂ細胞を助ける有効なＴ細胞を標的化する運搬システムを提供する。簡潔には、ネイティブの休止Ｂ細胞におけるＢ７．１およびＢ７．２の共刺激分子発現の誘導のための、交差結合性膜免疫グロブリン（ｍＩｇ）の利点によって、抗原特異的なＢ細胞を直接活性化することにより免疫賦活活性アジュバントとして機能する（Ｍilich et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:14648-14653, 1997）。ヘパドナコア粒子は、ＴＬＲ７リガンドとして作用するｓｓＲＮＡを結合する、プロタミン様配列を含む（Lee et al., J Immunol, 182:6670-6681, 2009）。
【００４６】
（Ａ．従来のアジュバントおよび分子アジュバント）
アジュバントはＷＨｃＡｇ運搬システムを用いた場合は必要ではないが、本開示のいくつかの実施形態では、従来のアジュバントおよび／または分子アジュバントを用いる。詳細には、生理食塩水中の免疫化は効果的に抗挿入物抗体の産生を誘発する。しかし、非炎症剤（ミネラルオイル、スクアレンおよびアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど）など）における調合物は免疫原性を向上させる。重要なことに、ＷＨｃＡｇの投与は、いずれのアジュバントを用いるかを考慮することなく４つすべてのＩｇＧアイソタイプの産生をもたらした。ＣｐＧモチーフの包含もまた、最初の反応を増強させた。さらに、Ｒｉｂｉ調合物などの抗炎症アジュバントの使用は非炎症剤から得たもの以下の有益性であり、このことは、アジュバントの有益性は、非特異的な炎症からよりも、貯蔵効果から生じるものであることを示している。したがって、コアプラットフォームは、アプリケーションおよび所望の抗体の質に依存してアジュバントなしまたは非炎症性アジュバントなしで用いられる。本開示のいくつかの実施形態において、ＩＦＡは、マウスの研究において用いられるがアルミニウムまたはスクアレンはヒトの研究に用いられる。生理食塩水中の単回用量におけるハイブリッドＷＨｃＡｇ粒子を輸送するための好ましい例において、分子アジュバントが用いられる。多数の分子アジュバントが、標的Ｂ細胞または他のＡＰＣを標的化するための共に刺激物質をもたらすことによって、内生の免疫および適応性免疫の間のギャップを橋渡しするために用いられる。
【００４７】
Ｂ．他の分子アジュバント
マウスのＣＤ４０Ｌ（６５５および４７０核酸のバージョンの両方）をコードしている遺伝子は、ＷＨｃＡｇのＣ末端においてこれらのリガンドを発現するために、好結果で用いられた（国際公開第ＷＯ  ２００５／０１１５７１号公報を参照のこと）。さらに、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＣＤ４０Ｌ粒子を用いたマウスの免疫化は、ＷｈｃＡｇ粒子によるマウスの免疫化よりも、高いコア抗体力価の生成を生じる。しかし、所望の収量より低い、精製した粒子しか得られなかった。従って、１００％未満のＣＤ４０Ｌ融合ポリペプチドを含んでいるモザイク粒子は、この問題を解決ために製造される。ＷＨｃＡｇ中に挿入された、Ｃ３ｄ断片、ＢＡＦＦおよびＬＡＧ−３を含む他の分子アジュバントは、Ｃ末端に挿入されたときに内在化する傾向を有する。したがって、分子アジュバントのタンデムリピートが、内在化を阻止するために用いられる。あるいは、コア粒子の会合ドメインとＤＮＡ／ＲＮＡ結合領域の間にあるＷＨｃＡｇのいわゆるヒンジ領域中に種々の変異がＣ末端配列の内在化を防ぐために作られる。しかし、内在化は、ＡＰＣ／Ｂ細胞膜において機能する、ＣＤ４０Ｌ、Ｃ３ｄ、ＢＡＦＦおよびＬＡＧ−３などのこれらの分子アジュバントに対して問題を示す。対照的に、ＣｐＧ ＤＮなどの分子アジュバントの内在化は、細胞質の受容体のレベルにおいて機能する、これらの種類のアジュバントとして問題にはならない。
【００４８】
他の種類の分子アジュバントまたは免疫エンハンサーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、好ましくは、大半のＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞の５０％を超える、好ましくは６０％を超えるより好ましくは７０％を超える、最も好ましくは８０％より大きいなど）に認識される、“普遍的な”ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのハイブリッドコア粒子中の包含物である。一実施形態において普遍的な”ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子の変種に結合し、ヘルパーＴ細胞を刺激することができる。別の実施形態において、普遍的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、当該抗原にヒトの集団が、天然の感染またはワクチン接種の何れかによって頻繁に曝露される抗原に好ましくは由来する（Falugi et al., Eur J Immunol, 31:3816-3824, 2001）。多数の当該普遍的なＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープは、以下に記載されているがこれらに限定されない：破傷風毒素（ＴＴ）632〜651番目の残基; TTの950〜969番目の残基; TTの947〜967番目の残基、ＴＴの830〜843番目の残基、ＴＴの1084〜1099番目の残基、ＴＴの1174〜1189番目の残基（Demotz et al., Eur JImmunol, 23:425-432, 1993）; ジフテリア毒素（ＤＴ）271〜290番目の残基; DT321〜340番目の残基; DT331〜350番目の残基; DT411〜430番目の残基; DT351〜370番目の残基; DT431〜450番目の残基（Diethelm-Okita et al., J Infect Dis, 1818:1001-1009, 2000）; Plasmodium falciparum circumsporozoite（CSP）321〜345番目の残基およびCSP378〜395番目の残基（Hammer et al., Cell, 74:197-203, 1993）; Ｂ型肝炎 B抗原（HBsAg） 19〜33番目の残基（Greenstein et al., J Immunol, 148:3970-3977, 1992）; インフルエンザヘマグルチニン307〜319番目の残基; インフルエンザマトリックス17-31番目の残基（Alexander et al., J Immunol, 164:1625-1633, 2000）およびはしかウイルスvirus fusion protein （ＭＶＦ）288〜302番目の残基（Dakappagari et al., J Immunol, 170:4242-4253, 2003）。
【００４９】
（免疫反応を誘導する方法）
本開示は、それを必要とする動物において、免疫反応を誘発する方法であって、有効量の、ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでいる抗原組成物を投与する工程を包含しており、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチド（例えばパリビズマブエピトープ）およびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、上記融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である、方法を提供する。また、本開示によって、提供されるのは、それを必要とする動物において、免疫反応を誘発する方法であって、有効量の、ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、抗原組成物を動物へ投与得する工程を包含しており、当該ハイブリッドコア抗原は、ＲＳＶＦポリペプチド（例えばパリビズマブエピトープ）およびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、上記融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能である、方法を提供する。
【００５０】
本開示の方法によって上昇する免疫反応は、抗体反応、好ましくは中和抗体反応、好ましくは防御抗体反応を広く包含する。抗原性組成物の投与（免疫化またはワクチン接種）後の抗体反応を評価する方法は、当技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態において、免疫反応はＴ細胞を介する反応（例えば、ＲＳＶ Ｆ特異的反応（増殖反応、サイトカイン反応など）を含む。好ましい実施形態において、免疫反応は、Ｂ細胞反応およびＴ細胞反応の両方を含んでいる。抗原性組成物は、多数の好適な方法（筋肉内注射、皮下注射、および皮内投与）において投与され得る。投与のさらなる様式としては、鼻腔内投与および経口投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５１】
抗原性組成物は、妊娠している女性を包含している小児および成人の両方の処置に用いられ得る。したがって、対象は、１歳、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳未満であり得る。ワクチンを受容するための好ましい対象は、高齢者（例えば５５歳を超える、６０歳を超える、好ましくは６５歳を超える）および若年者（例えば、６歳未満、１〜５歳未満、１歳未満）である。
【００５２】
投与は、単回投与または複数回投与の投与計画であり得る。複数回投与は、最初の免疫投与計画および／または追加免疫の免疫化投与計画において用いられ得る。複数回投与の投与計画において種々の用量が同一または異なる経路によって与えられ得る（例えば、腸管外プライムおよび粘膜ブースト、粘膜プライムおよび腸管外ブーストなど）。１回以上投薬の投与（典型的に２回の投与）は、免疫学的に感受性の高い対象または反応低下の対象の集団において特に有効である（例えば糖尿病患者、慢性腎疾患を有する対象など）。複数回の投与は典型的に少なくとも１週間間隔をあけて投与される（、例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間、およびその類似。好ましくは複数回投与は、１か月、２か月、３か月、４か月または５か月間隔で投与される。本開示の抗原組成物は、他のワクチンを実質的に同時に（例えば同一の医療的な診察または医療従事者の訪問の間）患者に投与され得る。
【００５３】
一般的に抗原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、対象における著しい逆の副作用の要因となることなく、対象における免疫反応を誘導するのに有効な量として選択される。好ましくは、誘発される免疫反応は、中和抗体であり、好ましくは防御免疫反応である。この関連における防御は、対象が感染に対して完全に防御されることを必ずしも意味しておらず、対象が疾患（特に、異種抗原に対応する病原に関連する重症の疾患）の症状の進行から防御することを意味する。
【００５４】
ハイブリッドコア抗原（例えばＶＬＰ）の量は、どの抗原組成物が用いられるかに依存して異なる。一般的に、各ヒトの用量は、１〜１５００μｇ（約１μｇ〜約１０００μｇ、例えば、約１μｇ〜約５００μｇまたは約１μｇ〜約１００μｇ）のタンパク質（例えば、ハイブリッドコア抗原）を含むことが予測される。いくつかの実施形態において、タンパク質の量は、下限値が上限未満である場合に、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０μｇの下限値および１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００または２５０μｇの独立して選択される上限値を有する任意の範囲内である。一般的にヒトの用量は、０．１ｍｌ〜１ｍｌの用量内であり、好ましくは０．２５ｍｌ〜０．５ｍｌの用量内である。免疫原性組成物中に使用される量は、対象の集団に基づいて選択される。特定の組成物に対する適切な量は、対象における抗体力価および他の反応（例えば、抗原誘導性のサイトカインの分泌）の観察に関与する標準的な研究によって確認され得る。最初のワクチン接種に続いて、対象は、約４〜１２週間において追加免疫を受けることができる。
【００５５】
（キット）
また、本開示によって提供されるのは，ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでいるキットおよびウッドチャックのヘパドナウイルスのコア抗原であって、当該ハイブリッドコア抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆのポリペプチド（例えばパリビズマブエピトープ）およびウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原を含んでいる融合タンパク質であり、上記融合タンパク質はハイブリッドウイルス様粒子（ＶＬＰ）として会合可能であり、当該コア抗原はＲＳＶ Ｆポリペプチドを欠損している。いくつかの実施形態において、キットはＲＳＶ Ｆポリペプチド特異的抗体を測定するための指示書をさらに含む。いくつかの実施形態において、抗体はハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原を含んでいる抗原組成物によって免疫化された対象の血液サンプルから得た血清において存在する。
【００５６】
本明細書に用いられるとき、“指示書”という用語は、抗体力価の測定のためのキットに含まれる試薬（例えばハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスのコア抗原）を用いるための指示を指す。いくつかの実施形態において指示書は、インビトロの診断用製品の表示において米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって要求される、意図した使用の記載を含んでいる。ＦＤＡは、インビトロ診断薬を医療用具として分類しており、５１０（ｋ）の手順を通じて承認され得る。５１０（ｋ）下でアプリケーションにおいて要求される情報は以下を含んでいる：１）インビトロ診断薬の名称（商業用または商標登録された名称、一般名称または通常の名称、および装置の分類名が挙げられる）；２）製品の意図された使用；３）適用可能な場合、５１０（ｋ）陳述書を提出している所有者または操作者の設定登録番号；FD&C Actの部局５１３、もし既知である場合は、その適切な小委員会下で設置された分類またはもし所有者または操作者が、装置が当該部局下で分類されないと決定した場合は、インビトロ診断製品がそのように分類されないという決定およびその根拠の陳述書；４）適用可能な場合、写真または技術図面を含む、インビトロ診断製品その意図された使用および使用のための指示を説明するのに十分な、提案された表示、表示および公示、；５）陳述を支持するためのデータが付随された、装置が、米国における商業的な分配において比較可能な他のインビトロ診断製品と類似するおよび／または異なることを示す陳述書；６）実質的に同等の決定に基づく、安全性および効果の５１０（ｋ）の要約；または実質的な同等性についてのＦＤＡの知見を支持する、５１０（ｋ）の安全性および効果の情報が、文書による要求の３０日以内に任意の人に利用可能となるという陳述書；７）陳述者が、その最大限の知見に対し、販売前の告知において提出されたすべてのデータおよび情報は事実かつ正確であり、重要な事実が削除されていないと考えるという陳述書；および８）実質的な同等性の決定をするために、ＦＤＡにとっての必要性を要求されたインビトロ診断製品に関する任意の追加情報。
【００５７】
〔定義〕
本明細書において用いられるとき、単数形「“１つの”（a、anおよびthe）」は、他に示していなければ複数の参照を包含する。たとえば、“１つの（an）”賦形剤は１つ以上の賦形剤を包含する。“複数（plurality）”という用語は２つ以上を指す。
【００５８】
本明細書において用いられるとき、“含んでいる（包含している）（comprising）”という語句は無制限であり、当該実施形態がさらなる要素を含み得ることを示している。対照的に、“からなる（consisting of）”という語句は、限定されており、当該実施形態は追加の要素を含まないことを示している（トレースの不純物を除く）。“本質的に〜からなる（consisting essentially of）”という語句は、部分的に限定されており、当該実施形態は当該実施形態の基本的な性質と実質的に変更しない要素を含んでいる。
【００５９】
本開示の実施は、他に示していなければ、当技術分野の技術範囲である、分子生物学の従来技術（組み換え技術を包含する）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学を用いるであろう。当該技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989）; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987）; PCR: The Polyｍｅｒase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994）; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Freshney, 1987）; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow et al., 1988）; and Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds., 1991）等の文献において十分に説明されている。
【００６０】
“Ｆタンパク質” “融合タンパク質”および“Ｆポリペプチド”という用語は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＲＳＶ融合糖タンパク質を指す。多数のＲＳＶ Ｆタンパク質が記載され、当業者に知られている。典型的なＦタンパク質はGENBANK アクセッション番号AAB59858.1.に記載されている。
【００６１】
本明細書において用いられるとき、“ウイルス様粒子”および“ＶＬＰ”は、ウイルスに類似している構造を指す。本開示のＶＬＰはウイルスのゲノムを欠損しており、それゆえに非感染性である。本開示の好ましいＶＬＰはウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原（ＷＨｃＡｇ）ＶＬＰである。
【００６２】
ヘパドナウイルスコア抗原に関して“ハイブリッド”および“キメラ”という用語は、ヘパドナウイルスおよび無関係の抗原の融合タンパク質を指す（配列番号３、８６〜１１４のうちの１つ以上およびそのバリアント）などのＲＳＶ Ｆポリペプチド）。例えば、いくつかの実施形態において、“ハイブリッドＷＨｃＡｇ”という用語は、ＷＨｃＡｇ成分（全長または部分）および異種の抗原またはその断片の両方を含んでいる融合タンパク質を指す。
【００６３】
核酸またはポリペプチドに対して“異種の（heterologous）”という用語は、成分が、通常天然に見いだされない場合および／または異なる資源または種に由来する場合に生じることを示す。
【００６４】
“有効量”または“十分な量”の物質は有益または所望の結果（臨床結果が挙げられる）に影響するのに必要な量であり、“有効量”は適用される状況に依存する。免疫原性組成物を投与する状況において有効量は十分な抗原（例えば、ハイブリッド、ＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ Ｆ ＶＬＰ）を含み、免疫反応（好ましくは測定可能なレベルのＲＳＶ中和抗体）を誘発する。有効量は一回以上の投薬において投与され得る。
【００６５】
免疫原性組成物に関して本明細書に用いられるとき、“用量（dose）”という用語は任意の一回において対象に摂取される（投与または受容される）の測定された部分を指す。
【００６６】
値に関して本明細書に用いられるとき、“約”という用語はその値の９０％〜１１０％を包含する（例えば約２０μｇのＶＬＰは１８μｇ〜２２μｇのＶＬＰを指す）。
【００６７】
本明細書において用いられるとき、“免疫化”という用語は、抗原に対する生物の反応が増大し、感染へのその抵抗能または回復能が向上することを指す。
【００６８】
本明細書において用いられるとき、“ワクチン接種”という用語は、生物の体内へのワクチンの導入を指す。
【００６９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えばＲＳＶ Ｆポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す場合、“バリアント”という用語は、参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。通常、バリアントと参照との相違は、参照と比較して比較的少数の相違を構成する（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一）。いくつかの実施形態において、本開示はＶＬＰのＷＨｃＡｇまたはＲＳＶ Ｆ部分のうちの１つまたは両方において、少なくとも１つの付加、挿入または置換を有する、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ Ｆ ＶＬＰを提供する。
【００７０】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して用いられる場合、“野生型”という用語は、天然に生じる資源から単離されたときそのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの性質を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。野生型のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、集団において最も頻繁に観察されるものであり、それゆえ“正常の（normal）形態のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして任意に設計される。
【００７１】
アミノ酸は、共通の側鎖の特性によってグループ分けされ得る：疎水性の（Met、Ala、Val、Leu、Ile）；中性親水性（Cys、Ser、Thr、Asn、Gln）；酸性（Asp、Glu）；塩基性（His、Lys、Arg）；芳香族（Trp、Tyr、Phe）；および配向性（Gly、Pro）。側鎖の特性による他のグループ分けは以下のとおりである：脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）；脂肪族−ヒドロキシル（セリンおよびスレオニン）；アミド（アスパラギンおよびグルタミン）；芳香族（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）；酸性（グルタミン酸およびアスパラ銀酸）；塩基性（リジン、アルギニンおよびヒスチジン）；硫黄（システインおよびメチオニン）；および環状（プロリン）いくつかの実施形態において、アミノ酸の置換は同一の分類の他のメンバーに対する一つの分類のメンバーの交換に関する保存的な置換である。別の実施形態においてアミノ酸の置換は異なる分類のメンバーに対する一つの分類のメンバーの交換に関する非保存的な置換である。
【００７２】
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適のアライメントに導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較に対して、典型的に一つの配列が参照配列として働き、それにテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要な場合は配列の候補が設計され、配列アルゴリズムのパラメータが設計される。デフォルトのプログラムパラメータが使用されてもよく、または、選択的なパラメータが設計されてもよい。配列比較アルゴリズムは続いて、プログラムパラメータに基づいた参照配列と比較した試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。同一性について２つの配列を比較する場合、配列は連続的である必要はないが、任意のギャップは、全体のパーセント同一性を低下させるペナルティを当該配列にもたらす。blastnについては、デフォルトのパラメータはＧａｐオープニングペナルティ＝５でありギャップ拡張ペナルティ＝２である。blastpについては、デフォルトのパラメータはオープニングペナルティ＝１１およびＧａｐ拡張ペナルティ＝１である。
【００７３】
“組み換え”核酸は天然には生じない配列であるか、２つの、そうでなければ分離したセグメントの配列の組み合わせによって作製される。この人工的な組み合わせは化学合成またはより一般的には、核酸の単離したセグメントの人工的な操作によって成し遂げられる（例えば、遺伝子工学技術による）。“組み換え”タンパク質は、宿主細胞（細菌細胞または真核細胞など）に導入された異種（例えば組み換え）核酸によってコードされている。核酸は、導入された核酸によってコードされているタンパク質を発現可能なシグナルを有している発現ベクターにおいて導入され得るか、核酸は宿主参謀の染色体にくみ込まれ得る。
【００７４】
“抗原”は、対象中の抗体および／またはＴ細胞反応の産生を刺激可能な化合物、組成物または物質であり、対象中へ注入されるか、吸収されるか、またはその他の場合は対象中に導入される組成物が挙げられる。“抗原”という用語は、すべての関連する抗原性のエピトープを含んでいる。“エピトープ”または“抗原決定基” という用語は、当該部位にＢ細胞および／またはＴ細胞が反応するための部位を指す。“優性抗原エピトープ”または“優性エピトープ”は、当該エピトープに機能的に重要な宿主免疫反応（例えば抗体反応またはＴ細胞反応）が作られるエピトープである。したがって、病原に対する防御的な免疫反応に関して、優性抗原エピトープは、病原によって引き起こされる疾患からの防御をもたらす宿主免疫システムによって認識される場合、それらの抗原部分である。“Ｔ細胞エピトープ”という用語は適切なＭＧＣ分子に結合される場合にＴ細胞によって（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープを指す。“Ｂ細胞エピトープ”は抗体（またはＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００７５】
“アジュバント”は、抗原を含む組成物に添加される場合に、曝露を受けた受容者において抗原への免疫反応を非特異的に向上または増強する物質を指す。一般的なアジュバントとしては、当該無機物の上に抗原が吸着される無機物（アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムの懸濁物が挙げられる）；乳剤（油状物中の水および水中の油状物が挙げられる）（およびそのバリアント（複乳剤および可逆性乳剤を含む）、リポサッカライド、免疫賦活性核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチド等）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アンタゴニスト（特にＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）および当該成分の種々の組みあわせが挙げられる。
【００７６】
“抗体”または“免疫グロブリン”は抗原に特異的に結合する４つのポリペプチドからなる血漿タンパク質である。抗体分子は、ジスルフィド結合によって結合されている、互いに２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチド（またはその複合体）からなる。ヒトにおいて抗体は５つのアイソタイプまたはクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥで定義されている。ＩｇＧ抗体は４つのサブクラスにさらに分類され得る（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）。“中和”抗体はウイルスの感染性を阻害可能な抗体である。したがって、ＲＳＶ特異的な中和抗体はＲＳＶの感染性を阻害されるか低減させることが可能である。
【００７７】
“免疫原性”の組成物は、特異的な免疫反応を誘発可能なＲＳＶ等の例えば病原に対するヒトまたは動物の対象への投与に好適な物質の組成物である（例えば実験的または臨床的な設定における）。したがって、免疫原性組成物は、１つ以上の抗原（例えばポリペプチド抗原）または抗原性のエピトープを含む。免疫原性の組成物は免疫反応を誘発または向上させることが可能な１つ以上の成分（賦形剤、担体および／またはアジュバント等）を含んでいてもよい。特定の例において免疫原性組成物は病原によって誘導される症状または状態に対して対象を防御する免疫反応を誘発させるために投与される。いくつかの場合において、病原によって生じる症状または疾患は病原への対象の曝露に続いて病原（例えばＲＳＶ）の複製の阻害によって予防（または低減もしくは改善）される。本開示の関連において、免疫原性組成物という用語はＲＳＶに対して防御的または対症的な免疫反応を誘発させる目的のための、対象または対象の集団への投与を意図される（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）。
【００７８】
“免疫反応”は、免疫システムの細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球等）の、病原または抗原等の刺激への反応である（例えば免疫原性組成物またはワクチンとして調合された）。免疫反応は、抗原特異的な中和抗体等の特異的な抗体の産生を生じる、Ｂ細胞反応であり得る。免疫反応は、ＣＤ４＋反応またはＣＤ８＋反応等のＴ細胞反応であり得る。Ｂ細胞およびＴ細胞反応は”細胞性”免疫反応の側面である。免疫反応は、抗体によって仲介される“体液性”免疫反応であり得る。いくつかの場合において反応は特定の抗原に特異的である（すなわち、“抗原特異的反応”）。抗原が病原由来である場合、抗原特異的反応は“病原特異的反応”である。”防御免疫反応”は、病原による感染から生じる、有害な機能または病原の活性を阻害するか、病原による感染を減少させるか、症状（死を包含する）を低減させる免疫反応である。防御免疫反応は、例えば、溶血斑減少アッセイまたはＥＬＩＳＡ融和アッセイにおけるウイルスの複製またはプラークの形成の阻害によって、またはインビボにおける病原体の攻撃への耐性を測定することによって測定され得る。免疫刺激物質（例えば病原または抗原（例えば免疫原性の組成物またはワクチンとして調合された））への対象の曝露は刺激物質に対する特異的な最初の免疫反応を誘発する。すなわち、曝露は免疫反応を“開始させる（prime）”。続く刺激物質への曝露（例えば免疫化）は、特異的な免疫反応の程度（または持続期間または両方）を増加または“追加（boost）”させ得る。したがって、免疫原性組成物を投与することによって既存の免疫反応を“追加すること（boosting）”は、抗原（または病原性）特異的反応の程度を（例えば、抗体力価および／または親和性を増加させることによって、Ｂ細胞またはＴ細胞特異的な抗原の頻度を増加させることによって、成熟エフェクターの機能を誘導することによってまたはそれらの任意の組み合わせによって）、増加する。
【００７９】
“減少（低減）する”という用語は反応または状態が薬剤の投与に伴って定量的に減少した場合、または参照の薬剤と比較して当該薬剤の投与に伴ってそれが減少した場合に、薬剤が反応または状態が低減したという、相対的な用語である。同様に、”防御する”という用語は、反応または状態の少なくとも１つの性質が実質的にまたは著しく低減されるまたは排除される限り、薬剤が感染によって生じる感染または疾患のリスクを完全に排除するということを必ずしも意味するものではない。したがって、感染または疾患またはそれらの症状に対して防御するまたは低減する、免疫原性の組成物は、疾患の感染の発生もしくは重症度、または疾患の発生または重症度が、薬剤の非存在下または参照薬剤との比較において、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約５０％、例えば、測定可能に低減される限り、すべての対象における感染または疾患を必ずしも予防または排除するものではない。特定の例において減少とは低気道感染（ＬＲＴＴ）または発生または重症のＬＲＴＩの発生またはＲＳＶ疾患による入院またはＲＳＶによって生じる疾患の重症度に関する。
【００８０】
“対象”は、生体の多細胞の脊椎動物の生物である。本開示の文脈において、対象は、非ヒトの動物（例えばマウス、ラットまたは非ヒトの霊長類など）の実験対象であり得る。あるいは対象はヒト対象であり得る。
【００８１】
核酸またはタンパク質に関して用いられる場合、“に由来する”または”〜の”という用語は、その配列が対象の生物のものと実質的に同一であることを示している。
【００８２】
生物学的な機能（例えば酵素活性、化合物の産生、タンパク質の発現など）に関して用いられるとき“増加する”“減少する”“減少”という用語は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の、機能における測定可能な損失を指す。機能に依存して減少は１０％〜１００％であり得る。“実質的な減少"という用語およびその類似の用語は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または１００％の減少を指す。
【００８３】
生物学的な機能（例えば酵素活性、化合物の産生、タンパク質の発現など）に関して用いられるとき“増加する”“上昇する”“上昇”という用語は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の、機能における測定可能な増加を指す。機能に依存して上昇は１０％〜１００％、少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍〜１００倍、１０００倍またはそれ以上であり得る。“実質的な上昇"という用語およびその類似の用語は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または１００％の上昇を指す。
【００８４】
本明細書で用いられるとき、“単離した”および“精製した”という用語は天然に会合した少なくとも１つの成分から除去されている（例えばその元の環境から除去された）物質を指す。組み換えタンパク質に関して用いられるとき“単離された”という用語は、タンパク質を産生した細菌の培養培地から除去されたタンパク質を指す。当該単離されたタンパク質としては、外来の化合物（例えば培養培地、細菌の成分など）がないものである。
【００８５】
〔実施例〕
略語：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）；ＥＲＤ（亢進性呼吸器疾患）；ＦＩ（ホルマリン不活性化）；ＩＦＡ  （不完全風呂インドアジュバント）；ＭＡｂまたはｍＡｂ（モノクローナル抗体）；ＯＤ（光学濃度）；ＰＢＳ（リン酸緩衝液）；ｐｆｕまたはＰＦＵ（プラーク形成ユニット）；ＰＲＮＴ（プラーク減少中和力価）；ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）；ｓＦ（可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質）；ＶＬＰ（ウイルス様粒子）；およびＷＨｃＡｇ（ウッドチャックヘパドナコア抗原）。
【００８６】
（実施例１−ハイブリッドウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原−呼吸器合胞体ウイルス Ｆポリペプチドウイルス様粒子）
本実施例は、ハイブリッドＷｈｃＡｇＶＬＰの産生および性質決定のための典型的な方法を提供する。簡潔には、ＷｈｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰを、治療用のＲＳＶモノクローナル抗体の公知および推測されたエピトープから構築した。ハイブリッドＶＬＰを、抗原性および免疫原性について試験した。また、ハイブリッドＶＬＰをＲＳＶ−中和抗体を誘発する能力について試験した。
【００８７】
（材料および方法）
組み換えハイブリッドＷＨｃＡｇ粒子の構築および発現。ウッドチャック肝炎ウイルスのゲノムは以前に記載されている（Cohen et al., Virology, 162:12-20, 1998）, GENBANK Accession No. NC_004107 （配列番号４））。ＷＨｃＡｇ全長（１８８アミノ酸）をＬａｃオペロンプロモーターの制御下でｐＵＣ−ＷＨｃＡｇベクターから発現させた。ＲＳＶ Ｆの配列を、単独の酵素切断部位をまたは重複オリゴヌクレオチド含むように設計して、ｐＵＣ−ＷＨｃＡｇベクターにＲＳＶ配列を挿入した（Billaud et al., J Virol, 79:13656-13666, 2005; and Billaud et al., Vaccine 25:1593-1606, 2007）。ＲＳＶ融合配列およびＲＳＶ置換配列については、重複するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって挿入を行った。７６、７８、８１および８２番目の位置に挿入されたＶＬＰについては、制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用い、異種のポリペプチドの挿入物を配置しているＮ末端およびＣ末端リンカーを包含させた。したがって、本開示のＶＬＰの標準的なリンカーの組み合わせは、ＧＩＬＥ−Ｘｎ−１であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは６０以下である（配列番号５）。７４番目の位置に挿入されたＶＬＰについては、存在しているＳａｃＩの制限酵素切断部位を用いた。Ｃ末端の融合は、連結部分にアスパラ銀酸およびイソロイシンを付加するＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位を付与することによって行った。Ｎ末端の融合は、ＷＬＷＧリンカーの上流のＮｃｏＩ制限酵素切断部位を付加することによって行った（配列番号６）。
【００８８】
いくつかのハイブリッドＷＨｃＡＧ−ＲＳＶ ＶＬＰを全長（配列番号１）またはトランケートしたＷＨｃＡＧコア（配列番号２）において構築し、他のものは改変を含んでいる全長またはトランケートしたＷＨｃＡＧコアにおいて構築した。いくつかのＷＨｃＡｇの改変は、米国特許第７，３２０，７９５号において以前に記載されている。他のＷＨｃＡｇの改変は、担体特異的な抗原性を低減するように作製され、
Δ２−ＷＨｃＡｇ、Δ３−ＷＨｃＡｇ、Δ４−ＷＨｃＡｇ、Δ５−ＷＨｃＡｇ、Δ６−ＷＨｃＡｇ、Δ６．１−ＷＨｃＡｇ、Δ７−ＷＨｃＡｇおよびΔ７．１−ＷＨｃＡｇ（表Ｉにおいて上記されている。）を含んでいる。
【００８９】
プラスミドを製造業者のプロトコルに従ってコンピテントTOP10またはDH5alpha E. coli宿主細胞に化学的に形質転換した。細菌を一晩増殖させ、リゾチーム塩溶液中で可溶化し、３０分間２０，０００ｘＧで遠心することによって分離した。得られた上清を２５％硫酸アンモニウムによる冷却中で一晩沈殿させた。可溶化液を、各ＶＬＰの３つの特性：１）ＷＨｃＡＧの１２９〜１４０番目の残基中のエピトープに対して特異的な、２２２１ＭＡｂの使用による、ＷＨｃＡｇポリペプチドのタンパク質発現（Institute for Immunology, Tokyo University, Japan）；２）ＷＨｃＡｇにおける立体配置的エピトープに対して特異的な抗体を用いた粒子会合性；および３）パリビズマブの使用によるＲＳＶサイトＡのエピトープの提示および正しい構造；を評価するために設計された、捕捉酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）においてスクリーニングした。捕捉抗体はペプチド特異的であり抗体の検出と非競合的であった。３つの特性についてポジティブであった構築物を、ヒドロキシアパタイトおよびそれに続くSEPHAROSE 4Bカラムでゲル濾過クロマトグラフィーによるさらなる精製のために選択した。各ハイブリッドのサイズおよび抗原性、ＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ Ｆタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで確認した。収率は全般に７５ｍｇ／Ｌを超えた。ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ VLPであるVLP-19は極低温電子顕微鏡によっても評価した。
【００９０】
ＥＬＩＳＡアッセイ。高結合ＥＬＩＳＡプレート（Costar）を１０μｇ／ｍｌのペプチド、１μｇ／ｍｌのＶＬＰまたは０．２μｇ／ｍｌの可溶性のＲＳＶ Ｆ（ｓＦ）で一晩コーティングした。さらなる試験において、ＥＬＩＳＡプレートをポジティブコントロールとして、０．２μｇ／ｍｌの試験ＶＬＰ、ＶＬＰ−１９、可溶性のＲＳＶ Ｆ（ｓＦ）で一晩コーティングするか、またはネガティブコントロールとしてＷＨｃＡｇで一晩コーティングした。プレートをSuperBlock（Thermoscientific）またはＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングした。５倍希釈のマウス抗血清またはパリビズマブ（１ｍｇ／ｍｌにおいて開始している）または２倍希釈のヒト血清サンプルを作製し、ウェルあたり５０μｌをプレートに１時間注入した。さらなる試験において、パリビズマブまたはヒト血漿サンプルを、SuperBlock中で２倍希釈し、１時間プレートに注入した。ＰＢＳバッファー中の０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄後、１：５０００で希釈されたＨＲＰ−コンジュゲート２次抗ヒトＩｇＧＡｂまたは抗マウスＩｇＧを１時間注入した。洗浄後、ウェルあたり１００μｌのテトラメチルベンジジン（Sigma）で色を発色させた。反応をウェルあたり１００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌの添加によって停止し、４５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）をＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。ｓＦコートしたウェルについてのＯＤは１．５〜２．５の間であった。ＩｇＧアイソタイプの解析に対し、種々のＩｇＧアイソタイプ特異的２次抗体を用いた。
【００９１】
ＶＬＰを用いた競合ＥＬＩＳＡアッセイについて、１００ｎｇ／ｍｌの一定濃度のパリビズマブを５倍または２倍希釈のＶＬＰ（例えばＶＬＰ１９、ＷＨｃＡｇ担体またはｓＦ）と混合し、混合物をＥＬＩＳＡのウェルに注入した。検出を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒト抗体を用いて行い、パリビズマブへの結合を検出した。データを阻害％としてプロットした。マウス血清ＥＬＩＳＡアッセイに対し、２倍希釈のマウス血清をＰＢＳ中の３％ＢＳＡにおいて調製した。エンドポイント力価をブランクの２倍以上上昇したＯＤを有する最も高い希釈として算出した。抗ＶＬＰ血清を用いた競合ＥＬＩＳＡに対し、５倍または２倍希釈の抗ＶＬＰ１９またはコントロールの血清を１０ｎｇ／ｍｌのパリビズマブと混合して、ｓＦコートしたＥＬＩＳＡプレートに注入した。検出をＨＲＰコンジュゲート抗ヒト抗体を用いて行った。結合パーセントの計算について、０．５μｇ／ｍｌのパリビズマブを注入した、ＶＬＰコートしたウェルとｓＦコートしたウェルとを比較した。ｓＦコートしたウェルに対するＯＤを１００％に設定し、ＶＬＰコートしたウェルに対するＯＤを１００％マークと相対して算出した。
【００９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング。１μｇの物質を、１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥ ＴＲＩＳグリシンゲルで分離し、Sypro Ruby（Invitrogen）で染色した。複製のゲルをＰＶＤＦ膜（Invitrogen）に転写し、パリビズマブ（MedImmune）およびそれに続くＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＡｂ（Dako）または抗ＷＨｃウサギＡｂ（VLP BiOtech）およびそれに続くＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＡＨＲＰ（Dako）の何れかで調査した。シグナルを電気化学発光溶液（Thermoscientific）で検出した。バンドをGE ImageQuant LAS 4000 analyzerで視覚化した。
【００９３】
電子顕微鏡（ＥＭ）。NanoImaging Services, Inc.において、極低温電子顕微鏡解析を、ＰＢＳバッファー中のパリビズマブＦａｂを有するＷＨｃＡｇ、ＶＬＰ−１９およびＶＬＰ−１９で行った。パリビズマブ ＦａｂをImmunopure Fab kit (Thermoscientific）を用いて生成した。２０μLの１．０ｍｇ／ｍｌのＶＬＰ−１９をＰＢＳバッファー中の１．０ｍｇ／ｌにおけるＦａｂ２０μＬと混合し、ＥＭ解析の前に室温で４時間インキュベートした。間欠には、３μＬのサンプルバッファーの液滴を４００メッシュの銅の格子上の穴の開いた炭素フィルムに置き、液体エタン中でガラス化させた。格子を、＜１７０ＣにおけるFEI Eagle 4k X 4k CCDカメラを備えた、１２０ｅＶで操作する、FEI Tecnai T12電子顕微鏡を用いたイメージングの前に液体窒素下で保存した。
【００９４】
マウス免疫化および曝露。え免疫原性試験について、B10xB10.S F1マウスをＩＦＡ中で乳化した２０μｇのＶＬＰによって、腹腔内で免疫化し、ＩＦＡ中の１０μｇで８週目に増加させた。ＲＳＶの曝露実験について、Balb/cマウスを２５０μｇのアルミニウムを有する１００μｇのＶＬＰ、０．５％の水中の油状物を有する４０μｇＶＬＰのエマルジョンまたはＩＦＡ中で乳化した２０μｇＶＬＰで、０日目および１４日目に腹腔内で免疫化した。２８日目に、血清を回収し、マウスを鼻腔内経由で１０μｌ中の10６ＰＦＵの野生型ＲＳＶ（ｗｔＲＳＶ）を曝露した。曝露の４日後に、肺組織を回収し、計量し、プラークアッセイによって力価測定した。
【００９５】
さらなる試験において、メスのBalb/cマウス６〜８週齢を無作為に５つのコホートに分類し、ＩＡＣＵＣの手順にしたがって、MedImmuneにおける動物保護施設において連続的に番号付けした。０日目および１４日目において、５０μｌのImject IFA（Pierce）中の、５０μｌの試験するＶＬＰ４０μｇまたはＰＢＳので、筋肉内で免疫化した。最後のコホートのマウスに、０日目に１００μｌにおいて鼻腔内経由で、単回用量の１０６ ＰＦＵのｗｔＲＳＶを投与した。２８日目に血清を回収し、マウスを１００μｌにおいて鼻腔経由で１０６ＰＦＵのｗｔＲＳＶ−Ａ２を曝露した。曝露の４日後に、肺組織を回収し、氷上に保持し、計量し、取得の３時間以内に２ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ中で破砕した。５分間の１５００ｒｐｍにおける低速遠心の後、肺の上清をプラークアッセイによって力価測定した。
【００９６】
正常な分布および予測された０．５以下の標準偏差を有するため、５個体のマウスを各コホートに包含させ、５つのデータはおよそ４ｌｏｇ１０ ＰＦＵ／ｇのプラシーボの力価と比較して、ＲＳＶの肺の力価を２以上のｌｏｇ１０の減少によって、ＶＬＰの免疫化によって生じる防御かどうかを識別するのに十分であることが予測される。
【００９７】
別個の試験において、３５個体のマウスを独自のアジュバント中で調合した２０μｇ／用量のＶＬＰ１９で２週間間隔における４回投与で免疫化した。最終的な投与の２週間後、血清をすべてのマウスから回収し、混合した。
【００９８】
コットンラットの免疫化および曝露。コットンラットのＲＳＶ曝露実験について、動物を２５０μｇのアルミニウムを含む０．５μｇのｓＦタンパク質、２５０μｇのアルミニウムまたはＰＢＳを含む１００μｇのＶＬＰ１９で０、４および７週目に筋肉内に免疫化した。１０週目に血清を回収し、コットンラットを鼻腔内経由の１０μｌ中の、１０６ ＰＦＵの野生型のＲＳＶで曝露した。曝露の４日後に肺組織を回収し、計量し、プラークアッセイによって力価測定した。
【００９９】
ＲＳＶプラークアッセイ。肺サンプル中のウイルスの希釈をｏｐｔｉＭＥＭ中で作製した。１０倍希釈、１００倍希釈および１０００倍希釈のウイルスを、単層のＶｅｒｏ細胞ＴＣ６−ウェルプレートに注入した。Ｖｅｒｏ細胞は、ＡＴＣＣから購入し、MedImmuneの細胞培養施設においてマイコプラズマについて試験した。１時間後、接種物をメチルセルロース添加培地（２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン[Gibco]を含む、２％のウシ胎児血清、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび２００Ｕのペニシリンを添加した、２ＸL―１５／ＥＭＥＭ [SAFC]と１：１で混合した２％メチルセルロース）で置換し、４〜５日間３５℃でインキュベートした。外層を吸引し、細胞をヤギ抗ＲＳＶ抗体（Chemicon 1128）、それに続くＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Dako）で免疫染色した。赤色のプラークを３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｄａｋｏ）で発色させた。力価をユニット（ＰＦＵ）／グラムの肺組織を形成しているプラークとして記録した。
【０１００】
ＲＳＶ ＰＲＮＴ中和アッセイ。血清を５０分間５６℃で熱不活性化した。血清の希釈液をｏｐｔｉＭＥＭ中で１５０ＰＦＵ（１００〜２００ＰＦＵ）のＲＳＶと合わせ、Ｔｃ６ウェルプレート中の８０％コンフルエントの単層のＶｅｒｏ細胞に注入する前に１時間３５℃でインキュベートした。細胞を１時間、血清−ウイルス混合物でインキュベートした。接種物を吸引し、細胞をメチルセルロース添加培地で表面を覆い、５日間インキュベートし、ヤギ抗ＲＳＶ抗体（Chemicon 1128）およびそれに続く、ＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Dako）で免疫染色した。赤色のプラークを３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Dako）で発色させた。プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）を、血清の非存在下でインキュベートしたコントロールと比較して５０％のＲＳＶが中和された希釈液として算出した。
【０１０１】
ＲＳＶマイクロ中和アッセイ。血清を５０分間５６℃で熱不活性化させた。血清の希釈液を、５００ＰＦＵのＧＦＰ−発現ＲＳＶ（ＲＳＶ／ＧＦＰ）と混合し、３連で９６ウェルのプレート中の単層のＶｅｒｏ細胞に注入する前に１時間３３℃でインキュベートした。２２時間インキュベーション後、蛍光フォーカスユニット（ＦＦＵ）をIsocyte imagerによって列挙した。報告された中和力価は５０％の入力ＲＳＶ／ＧＦＰウイルスが中和された補間希釈である。
【０１０２】
（結果）
多数のハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰを設計し試験した。異種タンパク質の担体としてのＷＨｃＡｇ構造（Ｂ細胞エピトープを含んでいるＲＳＶＦ断片等）の概略図が図１として示されている。免疫原性のＷＨｃ−ＲＳＶ ＶＬＰを選択するための典型的な方法のグローチャートを図２として示しており、結果は表１〜１０に列挙している。本開示の開発の間に設計され試験されたハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの概要は表１−１Ａに示されている。結合せず、ｓｓＲＮＡキャプシド形成した（例えばＴＬＲ７アジュバント）ハイブリッドＶＬＰは以下を包含する：ＶＬＰ０１８、ＶＬＰ０２１．１、ＶＬＰ０２９、ＶＬＰ０３１、ＶＬＰ０４１、ＶＬＰ０４６、ＶＬＰ０５１、ＶＬＰ０７８、ＶＬＰ０８１およびＶＬＰ０８７。ハイブリッドＶＬＰのＲＳＶ Ｆポリペプチド挿入物の概要は表１−Ｂとして示されている。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
大多数のハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰは効果的に会合した。試みられたハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの７０％は、種々の改変の大部分によって発現および会合した。本開示の開発の間に設計し、試験したハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの性質の概要は表１−１Ｃとして示されている。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
パリビズマブの結合に対するハイブリッドＶＬＰの抗原性。精製したハイブリッドＶＬＰを２つの方法によってパリビズマブに対する抗原性について試験した。図３Ａに示す異なる有効性にもかかわらず、パリビズマブは、固相のハイブリッドＶＬＰのすべてに実質的に結合した。パリビズマブは、ＶＬＰ１９並びにインタクトＲＳＶ組み換えＦ（ｒＦ）タンパク質に結合した。しかし、パリビズマブは、２４アミノ酸の挿入物を含んでいるｒＦタンパク質およびハイブリッドＶＬＰと比較してＦ２５４−２７７２４アミノ酸のペプチドには非常にわずかにしか結合しなかった。このことは、正しいパリビズマブのエピトープの構造の必要性を示している。また、このアッセイによって、ＲＳＶのＢ細胞エピトープを正しく提示するためのハイブリッドＶＬＰの能力が示しされた。また、正しい構造はｒＲＳＶ曝露したヒトＦタンパク質およびＶＬＰ１９にから得たヒト血漿におけるＩｇＧが同様に結合するという事実によっても示されている（表１−２）。ネイティブのタンパク質と同様の結合効果を有するＲＳＶ ｒＦタンパク質由来のパリビズマブエピトープを模倣するためのハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの能力は、これらのＶＬＰは転園に感染した個体並びにＲＳＶ Fタンパク質を含むワクチンを受けた個体のパリビズマブ様の抗体反応の測定において使用するために利用され得る。
【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
図３Ｂに示されているように、溶液中のハイブリッドＶＬＰもまたパリビズマブに効果的に結合し、比較的低濃度のハイブリッドＶＬＰにおいて固相のｒＦタンパク質の結合からパリビズマブを阻害した（８〜４０ｎｇ／ｍｌにおいて５０％の阻害）。図４Ａ〜Ｄに示されているようにいくつかの他のＲＳＶ Ｍａｂは、固相のハイブリッドＶＬＰに結合した。図５において示されているように、多数のハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰもまた、パリビズマブのＲＳＶ中和活性を阻害可能である。
【０１１１】
マウスにおけるハイブリッドＶＬＰの免疫原性。すべてのハイブリッドＶＬＰはマウスにおいて免疫原性であり、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２０μｇのＶＬＰを用いた免疫化は、種々のレベルの２４アミノ酸のペプチドに結合する抗Ｆ２５４―２７７抗体を誘発した。しかし、より重要なことには図６Ａに示されているように、１０μｇのＶＬＰによる単回の免疫追加後に２．５ ｘ１０４〜１．２ｘ１０６のエンドポイント希釈を有するインタクトのｒＦタンパク質と結合した。抗Ｆ抗体は、等しいまたは高いＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１の比率から構成されていた。ｒＦタンパク質におけるパリビズマブエピトープに対するＶＬＰ抗血清の正確な特異性を測定するために、抗ＶＬＰ抗血清を固相のｒＦタンパク質に結合するパリビズマブをブロックする能力を試験した。図６Ｂに示されているように、１：１０００の希釈率でパリビズマブの結合を５０％阻害する抗ＶＬＰ１８血清および抗ＶＬＰ１９血清の能力は、インタクトｒＦタンパク質への結合に対するパリビズマブとの競合可能なパリビズマブ様抗体を含んでいたことを示している。ほとんどのハイブリッドＶＬＰに対する抗血清ハ、様々な程度についてのｒＦタンパク質へのパリビズマブ結合の阻害を実証した。全長のＷＨｃＡｇ ＶＬＰの７８番目の残基に挿入されたＲＳＶ Ｆ２５４〜２７７を含んでおり、ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７ リガンド）をキャプシド形成している、ＶＬＰ１９は、以下に記載されているように、ＲＳＶ感染に対して高レベルの防御を誘発することを示した。
【０１１２】
ＷＨｃＡｇ ＶＬＰはその表面においてＲＳＶ Ｆ２５４〜２７７番目のアミノ酸を提示する。極低温顕微鏡解析をＶＬＰ１９を視覚的に性質決定するために行った。５，２０００Ｘの拡大において、挿入物を保持している粒子は、空の担体のＷＨｃＡｇ粒子と比較して、粗い表面の外観を有していた（図１０）。Nanoimaging Services (La Jolla, CA）によって行われた平均化によって、表面は球状のおよそ２９ｎｍの直径の粒子の表面から２〜４ｎｍ伸長したスパイクによって均一に被覆されていた。スパイクが実際に適切な構造において２４ｍｅｒを含んでいたかどうか決定するために、パリビズマブＦａｂをＶＬＰに結合し、電子顕微鏡解析を再び行った、その結果得られた画像（図１０）は、ＶＬＰの表面のスパイクに結合しているパリビズマブのＦａｂと一致している。これらの結果は、ＲＳＶのＦタンパク質の２５４〜２７７番目のアミノ酸を包含している２４ｍｅｒは、完全に形成されたＷＨｃＡｇ ＶＬＰの表面に良好に発現されたことを証明している。
【０１１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析をＶＬＰ１９および担体ＷＨｃＡｇにおいて行った。タンパク質を視覚化するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの染色によって、ＶＬＰ１９の単量体および空のＷＨｃＡｇの担体それぞれに対する約２５ｋＤおよび約２２ｋＤのバンドは、ＶＬＰ１９の単量体が予測されたサイズの挿入物を含んでいることを証明している（図１１、レーン１および２）。ＰＶＤＦ膜への転写の後、ＶＬＰ１９およびＷＨｃＡｇの両方は、ＷＨｃＡｇに対するウサギポリクローナル抗血清によって認識された（図１１Ａレーン３および４）が、ＶＬＰ１９のみがパリビズマブによって認識された（図１１Ａ、レーン５および６）。
【０１１４】
競合ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＥＬＩＳＡプレートに結合する固相および溶液におけるＶＬＰ１９を認識するためのパリビズマブの能力を試験した。ダイレクトＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡの形式の両方において、ＶＬＰに対するパリビズマブの結合曲線は、精製された組み換え可溶性ＲＳＶ Ｆ（ｓＦ）について得られたものに匹敵していた（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。まとめると、これらのデータは、パリビズマブ特異的ＲＳＶＦ２５４〜２７７エピトープの抗原性はＶＬＰ１９の関連において維持されることを示している。
【０１１５】
ヒトＩｇＧｇはＶＬＰを認識する。ＶＬＰ１９に提示されるＲＳＶ Ｆアミノ酸２５〜２７７のエピトープは、天然のＲＳＶ感染の間に存在するエピトープに抗原的に関係するのかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡによって、ヒト血漿を、ＶＬＰ１９に対して特異的な抗体に対して試験した。ほとんどすべての人々が、２歳までにＲＳＶに対して血清反応陽性であり、生涯を通じて再曝露されるため、正常なヒトの血漿ハＲＳＶ抗体を含んでいる（Walsh and Falsey, J Med Virol, 73:295-299, 2004）。４２個体の成人の血漿サンプルにおけるヒトＩｇＧは、ＶＬＰ１９に効果的に結合した（表１〜２および図１１Ｄ）。ｓＦは、ＶＬＰ１９よりも多様なＦ特異的エピトープを有しているが、ＥＬＩＳＡにおいて、ｓＦに対するエンドポイントはＶＬＰ１９と比較した場合２loｇ２未満高かった。したがってＲＳＶ感染に対する反応において上昇するヒトＩｇＧはＶＬＰ１９において発現されるときＦ２５４〜２６６エピトープを効果的に認識する。
【０１１６】
ＲＳＶ中和抗体を誘発するハイブリッドＶＬＰの能力。すべての会合したハイブリッドＶＬＰは、高力価のＩｇ抗ｒＦタンパク質抗体を誘発したが、ハイブリッドＶＬＰは、図７Ａ〜図７Ｃに示されているように、高力価のＲＳＶ特異的中和抗体の誘発能において劇的に異なる。この実験において、マウスを免疫化し、アルミニウム調合物における１００μｇのハイブリッドＶＬＰで１回免疫追加した。免疫追加後、血清をｒＦタンパク質に結合するＩｇＧについてのＥＬＩＳＡ（図７Ａ）、Ｔｈ１およびＴｈ２様抗体の測定としての抗ｒＦタンパク質のＩｇＧアイソタイプの分布（図７Ｂ）、および中和抗体を測定するためのＲＳＶプラーク減少マイクロ中和アッセイ（図７Ｃ）によって試験した。
【０１１７】
ほとんどのＶＬＰは、すべてのマウス／群のおける高レベルのＩｇＧ、ｒＦタンパク質結合抗体（図７Ａ）にもかかわらず、各郡のマウスと半数以下のみにおいて顕著な中和抗体を誘発した(図７Ｃ）。すべてのハイブリッドＶＬＰは、比較的バランス化したＴｈ１／Ｔｈ２様反応を誘発した（図７Ｂ）。［ＩｇＧ抗Ｇタンパク質］／[中和抗ＲＳＶ]抗体の比率は、ほとんどの抗ＶＬＰ血清において非常に高く、このことは、機能的な中和抗体は、わずかな抗挿入物反応を示し得ることを示していた。しかし、ハイブリッドＶＬＰ様ＶＬＰ９３は、このハイブリッドＶＬＰが、注入したマウスの１００％において高い中和ならびに高いＩｇＧ結合抗体を誘発することができるという点において、例外を示している。このことは中和活性ならびにＥＬＩＳＡによるｇＧ結合のスクリーニングの重要性を示している。ハイブリッドＶＬＰの免疫学的プロファイルの概要は、表１−３および表１−４に示されている（＾説明：nd、実施していない。平均中和力価 （log2）:高＞７、中５〜７、低４〜５、または０＝検出限界以下；平均防御（ＲＳＶ肺力価におけるｌｏｇ１０の減少）：高＞２．０、中１．０〜２．０、低０．５〜１．０またはｎｄ＝実施していない；および＊＝ＴＬＲ７リガンドに結合しないＶＬＰ）。
【０１１８】
【表８】
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【０１１９】
【表９】
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【０１２０】
ＲＳＶ曝露に対してマウスを防御するハイブリッドＶＬＰの能力。免疫化したマウスはまた、最終的な採血の２週間後に１０５ ＰＦＵのＲＳＶで曝露した。破砕した肺から得たＲＳＶの回復をインビボにおけるハイブリッドＶＬＰの免疫化の防御潜在能力の測定としてプラークアッセイによって決定した（図７Ｄ）。プラシーボと比較した２ｌｏｇ１０の肺におけるＲＳＶ力価の減少は非常に重要であると考えられた。標準的なＶＬＰ１９は、４／５マウスにおけるＲＳＶ肺力価の２ｌｏｇ１０の減少を誘発し、ＶＬＰ８７は、５０％のマウスにおいて完全な防御（ＲＳＶが検出されなかった）、および残りの５０％のマウスにおいて２ｌｏｇ１０の減少を誘発した。ＶＬＰ９０は、４／５マウスにおいて完全な防御を誘発した。ＶＬＰ１２８を除いて最も高い中和抗体反応を誘発したＶＬＰ９３は、ＲＳＶ曝露から１００％のマウスを防御し、このれは、野生型のＲＳＶによって誘発されるレベルの防御と等しかった（図７Ｄ）。
【０１２１】
さらにＶＬＰ０１９抗血清は、ＲＳＶ−Ａ、ＲＳＶ−Ｂおよびパリビズマブエスケープ変異体（ＭＡＲＭ Ｓ２７５Ｆ）を中和することを見出した。抗血清またはパリビズマブの希釈液を１００〜２００ＰＦＵのＲＳＶウイルス（相補なし）と混合し、１時間インキュベートし、プラークアッセイによって力価測定した。図８Ａは、ＲＳＶＡ２の中和を示しており、図８Ｂは、いくつかのＲＳＢＡ株の中和を示しており、図８Ｃは、ＲＳＶＢ１５の中和を示しており、図８Ｄは、ＲＳＶＢ７７の中和を示しており、図８Ｅはパリビズマブエスケープ変異体（ＭＡＲＭ Ｓ２７５Ｆ）を中和を示しており、図８Ｆは、さらなるエスケープ変異体の中和を示している。挿入物の領域におけるＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りで以下の通りである：ＲＳＶ−Ａ（配列番号３）；ＲＳＶ Ｂ（配列番号８６）；およびＲＳＶ  ＭＡＲＭ Ｓ２７５Ｆ（配列番号８７）。これらの結果は、高ＶＬＰ０１９抗血清のポリクローナルの性質の例示である。２つ以上の異なるハイブリッドＷＨｃＡｇ ＲＳＶ ＶＬＰの使用は、より広い範囲へポリクローナル反応の多様性を増大させるはずである。
【０１２２】
ＲＳＶ曝露に対するコットンラットを防御するためのＶＬＰ１９の能力。表１−５に示すように、アルミニウム中のＶＬＰ１９で免疫化した７個体のコットンラットのうち４個体がＲＳＶ防御に対して顕著な防御を示した。７個体中の３個体のラットがポジティブコントロールのＲＳＶ Ｆタンパク質を用いて免疫化したラットと同レベルの防御（ＲＳＶ力価＜１．０ｌｏｇ１０）を示したことに留意されたい。このことは、ＲＳＶ Ｆタンパク質が多数の中和Ｂ細胞エピトープを含んでいるがＶＬＰ１９は単一のＲＳＶ Ｆタンパク質Ｂ細胞エピトープ（例えばパリビズマブエピトープ）のみを含んでいることが知られていることを考慮すると、驚くべきことである。また、中和力価は防御に相関したが全体の抗ＲＳＶ Ｆタンパク質力価は相関しなかったことに留意されたい。種々のハイブリッドＷＨｃＡｇ-ＲＳＶ ＶＬＰによる免疫化したマウスにおいて観察された変化と同様に、中和／防御においてラット間の変化が存在していた。このことは、コットンラットにおける抗ＷＨｃＡｇ、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質および抗ＲＳＶ Ｆペプチドはそれほど不安定ではないという点で際立っている。
【０１２３】
【表１０】
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【０１２４】
第１のハイブリッドＶＬＰを２回投与した場合に中和抗体非反応体であった個体が、一度に第２の（異なる）ハイブリッドＶＬＰを投与した場合に中和抗体反応体となるかどうかを決定するためにマウスにおいて小試験を行った。表１−６に示されているように、すべての非反応体は、単一のＶＬＰ１９の追加免疫を受容後に反応体となった。このことは異なるＷＨｃＡＧ担体の関連において異なる構造を考慮する同一の２４ｍｅｒのエピトープと一致している。さらに、２つ以上のＷＨｘｃＡｇ ＲＳＶ ＶＬＰの組み合わせは対象内の変化を阻止すること有益である。このことは、非交系の個体（例えばヒト対象）の集団を免疫化する場合に重要な懸念事項である。
【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
防御効果における対象内の変化を軽減する他の方法は、免疫化のためにアルミニウムより強力なアジュバントを使用することである。図９に示しているように、ＩＦＡ中のＶＬＰ０１９またはＶＬＰ０９７の何れかで免疫化したマウスの１００％がＲＳＶ曝露に対して防御された。この防御のレベルは野生型ＲＳＶによって誘発される防御のレベルと同等である。
【０１２７】
ＶＬＰ１９は防御を誘発する。Balb/cマウスを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて調合した４０μｇのＶＬＰ１９の２回投与で免疫化し、ネガティブコントロール群およびポジティブコントロール群にいずれも、ＰＢＳ単独か、生体の野生型ＲＳＶＡ２の一回の鼻腔内投与を行った。２回目の投与の２週間後、血清をＩｇＧ抗体およびＲＳＶ中和について解析し、続いてマウスを１０６ＰＦＵの野生型ＲＳＶＡ２に曝露した。曝露４日後のマウスの肺の力価（ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｇ）は、それぞれ、プラシーボ群において３．９＋／−０．２であり、野生型ＲＳＶ群およびＶＬＰ１９群に対してそれぞれ１．１＋／−０．１および０．９＋／−０．１であった（図１２Ａ）。曝露の当日における血清中のＲＳＶマイクロ中和力価は、野生型ＲＳＶに感染した、およびＶＬＰ１９で免疫化したマウスに対してそれぞれ、６．７  ＋／−０．４および７．７＋／−１．２ｌｏｇ２であり、統計学的に異なっていなかった（ｐ＝０．２）（図１２Ｂ）。ｓＦ特異的ＩｇＧ力価は両方の群に対して高く、野生型ＲＳＶに感染した、およびＶＬＰ１９で免疫化したマウスに対してそれぞれ、１６．８＋／−０．８および１７．６＋／−０．０ｌｏｇ２を測定した（図１２Ｃ）。したがって、ＶＬＰ１９の２回投与によるマウスの免疫化は、肺力価における１００倍の減少およびＲＳＶ Ａ２による感染後のマウスと同様の血清中和およびＲＳＶＦ特異的ＩｇＧ力価を誘発した。調査試験をＩＦＡを用いて行っている一方で、同時にＶＬＰ１９を生理食塩水中で注入した。ＶＬＰ１９によって誘発される抗Ｆタンパク質ＡｂおよびＲＳＶ中和Ａｂ力価をアジュバント依存性に対して抗原投与量依存性であることを決定した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
【０１２８】
抗ＶＬＰ１９血清は広範に中和する。ＲＳＶプラーク減少中和アッセイを抗ＶＬＰ１９マウス血清およびパリビズマブの２倍希釈液を用いて行った。抗ＶＬＰ１９血清については、ＩＣ５０によって測定されるＲＳＶ中和力価が７．２ｌｏｇ２であり、これは血清のおよそ１：１５０希釈に対応している（図１３Ａ）。パリビズマブについては、ＩＣ５０の点によって測定されるＰＲＮＴは約０．５μｇ／ｍｌの濃度であった。したがって、抗ＶＬＰ１０血清は、このインビトロアッセイにおいて約７５μｇ／ｍｌのパリビズマブと同等の中和性能を示した。
【０１２９】
抗ＶＬＰ１９血清をさらに評価し、いくつかのＲＳＶＡおよびＢの臨床的な単離物ならびにパリビズマブ抗体耐性変異体（ＭＡＲＭｓ）Ｓ２７５ＦおよびＳ２７５Ｌを中和することを見出した（図８Ａ〜８Ｆ）。しかし、抗ＶＬＰ１９血清は、Ｋ２７２Ｑ ＭＡＲＭまたはＫ２７２Ｅ ＭＡＲＭを中和しなかった。これらの結果は、抗ＶＬＰ１９のポリクローナルの性質およびパリビズマブと比較して正確な特異性における相違を例証している。
【０１３０】
抗ＶＬＰ抗体およびパリビズマブがＲＳＶ Ｆタンパク質における同一のエピトープに関するものであるかどうか調ベルために、競合ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートをｓＦでコーティングした。ＶＬＰ１９免疫化マウスから得た血清またはネガティブコントロールの血清の希釈液を一定濃度のパリビズマブと混合し、ｓＦコート下プレートに結合させた。結合したパリビズマブを測定した。抗ＶＬＰ１９血清は、ｓＦへの結合に対してパリビズマブと競合した（図１３Ｂ）。抗ＶＬＰ１９血清に対する結合曲線のＩＣ５０は１０ｌｏｇ２であり、一回の抗血清投与および２回の抗血清投与後に対してそれぞれ１０ｌｏｇ２および１３ｌｏｇ２であり、追加免疫後のパリビズマブ競合抗体の力価における増加を示唆していた。
【０１３１】
ＶＬＰ１９挿入物の配向の効果。エピトープＲＳＶＦ２５４〜２７７はヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフおよびヘリックスとモタビズマブとの間の接点を有しており、抗パリビズマブ由来の抗体が記載されている（McLellan et al., Nat Struct Mol Biol, 17:248-250, 2010）。この研究は、２つのへリックスの相関する配向がＲＳＶ Ｆエピトープの正しい提示に不可欠であることを示唆している。ＶＬＰ１９挿入物のαへリックスが好ましい提示において拘束される場合、挿入物とＶＬＰとの間のアミノ酸は、挿入物への抗体反応に影響することが予測される。ＲＳＶ ＦエピトープはＣ末端において３つの残基まで漸増的に伸長され、得られたＶＬＰ構築物について機能的な抗ＲＳＶ反応を誘発するためのそれらの能力を試験した。３つの残基は、αへリックスのおおよそ一巡りを理論的に包含する。
【０１３２】
ＶＬＰ１９は、記載されている通り、ＷＨｃＡｇ遺伝子に標的配列をクローニングするために用いられる制限酵素切断部位を調整するために２４ｍｅｒの挿入物を配置するリンカー領域を有している。このＶＬＰのセットについて、リンカー領域を、ＲＳＶ ＦエピトープのアルファへリックスをＷＨｃＡＧのものより近くに並列させるために、最初に除去した。続いて挿入されたＲＳＶ ＦエピトープをＣ末端における１つ、２つまたは３つのアミノ酸で伸長した。得られたＶＬＰをインビトロにおけるパリビズマブの結合およびインビボにおける防御および免疫原性について試験した（表１−７）。短いリンカー領域の除去によっては、類似したＲＳＶのｓＦ特異的ＩＧＧ力価が得られた（ＶＬＰ５９対ＶＬＰ１９）が、ＶＬＰを検出するためのパリビズマブの能力は低下し、防御および中和力価が低下した。挿入物のＣ末端への１残基の付加（ＶＬＰ９７）は、ＶＬＰを検出するためのパリビズマブの能力を増大させ、ＶＬＰ５９と比較して防御を向上させた。しかし、挿入物のＣ末端ヘの２残基の付加（ＶＬＰ９８）は、ＶＬＰを検出するためのパリビズマブの能力を低下させ、曝露への防御を低下させた。血清のＲＳＶ中和およびｓＦ特異的なＩｇＧ力価も、ＶＬＰ９８に対して低かった。最後に、３つの残基の付加（ＶＬＰ９９）はｗｔＲＳＶ  Ａ２による曝露からの防御を誘発する能力を消滅させた。特に、インビトロにおけるＶＬＰ９９を検出するためのパリビズマブの能力は高かった（９５％）が、ＶＬＰ９９はｗｔＲＳＶ Ａ２による曝露からマウスを防御することができなかった。ＶＬＰ９９については、パリビズマブ結合は、当該モチーフが、インビボにおいては達成されないインビトロの構造を誘導することが可能であり得る。ＶＬＰ９９はマウスにおいてｓＦ特異的なＡｂ誘発することができたが、抗ＶＬＰ９９血清はＲＳＶを中和することができなかった。
【０１３３】
まとめると、これらの結果は、へリックス−ループ−へリックスモチーフにおける互いに関連するαへリックスの配向が、ＲＳＶ Ｆエピトープが防御免疫反応を誘発させる形式でＶＬＰを提示するために当該ＲＳＶ Ｆエピトープにとって不可欠であることを示している。また、これらの結果は、パリビズマブによって検出される能力および中和抗体を誘発するための能力の両方に影響する提示においてわずかな相違を有するＶＬＰの中の特異的挿入物によってわずかしか影響されないことを示している。さらに、ＶＬＰ１９、ＶＬＰ９８およびＶＬＰ９９の比較は、パリビズマブの結合がＲＳＶ中和反応を誘発する能力に必ずしも相関しないことを証明している。
【０１３４】
【表１２】
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【０１３５】
結論。多数の興味深い観察がなされた。まず、全ＲＳＶＩｇＧ力価は、ＲＳＶ中和力価と相関しなかった。一方、高力価の抗Ｆタンパク質ＩｇＧを誘発したすべてのＶＬＰは、２４％のハイブリッドＶＬＰのみが中間〜高力価ＲＳＶ中和抗体を誘発した。第２に、ＲＳＶ中和抗体を誘発したＶＬＰ間でも、同系交配のげっ歯類系統の使用にも関わらず著しい動物間の変種が存在した。ＲＳＶの曝露に対して大多数（８０〜１００％）の免疫化動物を防御するためのいくつかのハイブリッドＶＬＰ（例えばＶＬＰ０９３およびＶＬＰ９０）の能力は、パリビズマブエピトープがハイブリッドのＷＨｃＡｇＲＳＶのＶＬＰのサブセットにおいて野生型のＲＳＶと類似している構造をとることを示している。この発見は、好適な免疫原を同定するためのハイブリッドＶＬＰのライブラリーのスクリーニングの有用性を裏付けるものである。
【０１３６】
さらに、異なるハイブリッドＶＬＰの組み合わせ、ならびに単一のモザイクＶＬＰ中で会合する異なる融合タンパク質は、ＲＳＶワクチンの候補において好ましいと考えられる。さらに、ＶＬＰ０１２８におけるものような、複合的に改変された単一のＶＬＰにおける改変の統合は、非反応体の頻度を低下させるために好ましいと考えられる。ＶＬＰの組み合わせおよび統合は、相当する抗挿入物および抗担体抗体力価による広範な、機能的な抗体反応を誘発するための抗原組成物の産生を可能にする。
【０１３７】
本明細書に記載されているＲＳＶワクチンの設計の手法は、不可欠な二次構造が維持されるようにＶＬＰにおけるエピトープを提示した。ＷＨｃＡｇＶＬＰの免疫優性領域において提示されるアミノ酸２５４〜２７７を包含するＶＬＰ１９による免疫化は、野生型ＲＳＶＡ２を曝露したマウスにおける肺の力価における１０００倍の低減をもたらし、ＲＳＶ  Ｆへの結合に対しパリビズマブと競合する中和抗体を誘発した。本開示の開発の間に決定された通り、エピトープは、抗原的に正しいものであり得る（例えば、Ｆに対する抗体によって認識され、Ｆを認識する抗体を誘発し得る）が、それにもかかわらず中和Ａｂ（例えば、ＲＳＶを中和しない、ＲＳＶＦを誘発する抗体）を産生することに失敗する。このことは、ＲＳＶ  Ｆアミノ酸２５４〜２７８または２５４〜２８０をそれぞれ包含するＶＬＰ９７およびおよび９９にもっともよく例示されている。パリビズマブが両方のＶＬＰに同様に結合する一方で、ＶＬＰ９７は強力なＲＳＶ中和反応を産生しマウスを防御するが、ＶＬＰ９９は検出可能なＲＳＶ中和力価を誘発することに失敗し、防御を示さなかった。この観察は、Ｆエピトープスカフォールドが免疫原に結合するＡｂを誘発した場合でさえ、正しいＲＳＶＦ２５４〜２７８の構造が中和Ａｂ反応を誘発するとは限らなかったという近年の報告と一致する（Correia et al., Nature, 2014 epub ahead of print, doi: 10.1038/nature12966）。
【０１３８】
本明細書に提供されているのは、中和抗体を産生し、ＲＳＶ感染に対する防御を提供するために選択されたキメラＶＬＰの能力の機能的な解析である。これは、ＲＳＶＦ２５４〜２７７のみを提示する組み換えエピトープ集束型免疫原によって得られた強力な中和およびＲＳＶ曝露からの防御の初めての実証を示すものであると考えられる。この達成はまた、特異的な構造を必要とするエピトープの提示へのＷＨｃＡｇＶＬＰ技術の適用を拡大する。複数の防御的ＶＬＰの生成は、ＷＨｃＡｇの組み合わせ技術の力を例示する。さらに、予備的な証明は、種々のＶＬＰによって誘発される中和抗体は、Ｆ２５４〜Ｆ２７７エピトープに対する正確な特異性において異なることを示している。したがって、複数のＶＬＰの混合はエピトープベースのワクチンによって誘発される中和抗体の多様性を増加させる手段であり得る。
【０１３９】
ＷＨｃＡｇＶＬＰは、Ｆ２５４〜２７７エピトープに対するプラットフォームとして唯一好適であり得る。ＷＨｃＡｇにおける免疫優性のスパイクは、両方とも、へリックス−ループ−へリックス構造を有しているという点においてＦ２５４〜２７７エピトープに構造的に類似している。ＷＨｃＡｇプラットフォームに対し開発された組み合わせの技術によって、ＶＬＰにおけるＦ２５４〜２７７エピトープの２次構造を再生するための実験に基づいた手法が可能となる。また、ＷＨｃＡｇは、感受性の高いワクチン受容者において亢進性呼吸器疾患（ＥＲＤ）の誘導の可能性を低減することによって利点を提供する。非中和Ｆ特異的な抗体は、ＥＲＤに関与する（Graham, Immunological Reviews, 239:149-166, 2011）。単一の中和エピトープの標的化は、Ｆタンパク質の非サイトＡエピトープに対する非中和抗体の産生の機会を除去する。Ｔｈ１バイアスおよびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７の刺激もまた、ＥＲＤを阻止することを助け、防御抗体の産生に寄与する（Delgado et al., Nature Medicine, 15:34-41, 2008）。ＷＨｃＡｇＶＬＰは、ＴＬＲ７アゴニストとして作用するキャプシド形成したｓｓＲＮＡのアジュバント効果によって強化される、Ｔｈ１介在抗体のアイソタイプを誘発する（Lee et al., J Immunol, 182:6670-6681, 2009）; and Milich et al., J Virol, 71:2192-2201, 1997）。さらに、ＲＳＶ Ｆエピトープを有するＷＨｃＡｇＶＬＰは、亢進性呼吸器疾患（ＥＲＤ）に関与するＲＳＶ Ｆタンパク質特異的Ｔ細胞を準備（prime）させない（Graham, supra, 2011）。実用的な事項として、ＷＨｃＡｇＶＬＰは、安価で製造でき、細菌において、十分に組み換えられており、非常に熱安定性であり、第一世界の外部での使用に対し実用的な技術を形成するものである。したがって、ＷＨｃＡｇ／ＲＳＶ ＦハイブリッドＶＬＰの手法は、世界にＲＳＶワクチンの開発の可能性を提供する。
【０１４０】
【表１３】
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【０１４１】
【表１４】
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【０１４２】
【表１５】
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【０１４３】
【表１６】
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【０１４４】
【表１７】
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【０１４５】
【表１８】
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【０１４６】
【表１９】
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【０１４７】
【表２０】
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【０１４８】
【表２１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、エピトープ挿入に対する位置的な耐性を図示している、ウッドチャックヘパドナウイルスコア抗原（ＷＨｃＡｇ）の概略図を示す。丸は以下の位置を含む粒子会合に耐性である挿入位置を示す：１（Ｎ末端）、４４、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、８１、８２、８３、８４、８５、９２および１８７（Ｃ−末端）。１４９番目の残基（１５０〜１８８番目の残基を欠いている）においてトランケートされたＷＨｃＡｇのＣ末端もまた、粒子の会合に耐性である。対照的に、四角は以下の位置を含む粒子会合に非耐性である：２１、６６、７９、８０、８６および９１。位置の番号付けは、配列番号１として記載されている全長のＷＨｃＡｇアミノ酸配列に基づいている。１４９番目の位置においてトランケートされているＷＨｃＡｇは、配列番号２として記載されている。ＲＳＶ Ｆ２５４−２７７エピトープ（配列番号３）は、この図においてＷＨｃＡｇの７８番目の位置に挿入されている。
【図２】図２は、ハイブリッド（ＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）試験のフローチャートを示している。
【図３】図３Ａは、パリビズマブへの結合に対する固相の抗原としてのハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶの抗原性を示している。図３Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質へ結合するパリビズマブの阻害剤としての溶液中のハイブリッドＶＬＰの抗原性を示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、４つのＲＳＶ反応性モノクローナル抗体への結合に対する固相の抗原としてのハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの抗原性を示している。
【図５】図５は、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰがＲＳＶのパリビズマブ中和を阻害可能であることを示している。
【図６】図６Ａは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの免疫原性を示している。図６Ｂは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰに対する抗体が固相のＲＳＶ組み換えＦ（ｒＦ）タンパク質へのパリビズマブの結合を阻害可能であることを示している。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの免疫原性を示している。図７Ｃおよび図７ＤはハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ ＶＬＰの防御効果を示している。
【図８】図８Ａ〜図８Ｆは、ＶＬＰ０１９血清によるＲＳＶ−Ａ、ＲＳＶ−Ｂおよびパリビズマブエスケープ変異体（ＭＡＲＭ Ｓ２７５Ｆ）の中和を示している。熱不活性化した血清またはパリビズマブの希釈液を１００〜２００ＰＦＵのＲＳＶと混合し、プラークアッセイによって力価を測定する前に１時間インキュベートした。抗ＶＬＰ１９血清は、野生型のＲＳＶ  Ａ２（図８Ａ）、いくつかの近年のＲＳＶ Ａの臨床的な単離物（図８Ｂ）２つのＲＳＶ Ｂの臨床的な単離物（図８Ｃおよび図８Ｄ）およびいくつかの抗体エスケープ変異体（図８Ｅおよび図８Ｆ）を中和した。
【図９】図９は、マウスにおけるアルミニウムおよび不完全フロインドアジュバント中のハイブリッドＷＨｃＡｇ−ＲＳＶ  ＶＬＰの防御効果の比較を示している。
【図１０】図１０は、ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示している。極低温電子顕微鏡解析を、ＰＢＳ中のパリビズマブＦａｂでインキュベートしたＷＨｃＡｇ、ＶＬＰ−１９およびＶＬＰ−１９において行った。サンプルを液体エタン中でガラス化し、NanoImaging Services, Inc において、FEI Tecnai T12電子顕微鏡でイメージングした。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＷＨｃＡｇおよびＷＨｃＡｇと比較した、ＶＬＰ１９のインビトロ解析の結果を図示している（レーン１、３および５）；およびＷＨｃＡｇ（２、４および６）。総タンパク質を、Sypro Ruby stainによって可視化した（レーン１および２）。ウェスタンブロットは、抗ＷＨｃＡｂ（レーン３および４）または抗ＲＳＶ Ｆパリビズマブ（レーン５および６）で検出した。図１１Ｂにおいて、ＥＬＩＳＡプレートをパリビズマブの希釈液でインキュベートする前にＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇでコーティングした。図１１Ｃにおいて、ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇ／ｍｌのパリビズマブと混合した競合剤（ＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇ）の希釈液でインキュベートする前に、ｓＦでコーティングした。図１１Ｄにおいて、ヒト血漿の希釈液でインキュベートする前にＶＬＰ−１９、ｓＦまたはＷＨｃＡｇでコーティングした。すべてのＥＬＩＳＡアッセイについて、結合したＩｇＧをＨＲＰコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧＡｂ、それに続くテトラメチルベンジジンを用いたインキュベーションによって検出した。反応を０．１ＮのＨＣｌで停止させ、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍにおいて読み取った。各ＥＬＩＳＡアッセイを３連で行い、示されたデータは単一のアッセイを示している。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＶＬＰ１９を用いた免疫化によって曝露からマウスが防御され、中和ＡｂおよびＦ特異的ＩｇＧが誘発されることを示している。BALB/cマウス（ｎ＝５）を０日目および１４日目に不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）または）ＰＢＳ単独の何れかにおいて調合した４０μｇのＶＬＰ１９の１００μＬを投与するか、または０日目に１０６ＰＦＵの野生型ＲＳＶ Ａ２で感染させた。２８日目に、血清をサンプリングし、マウスを１０６ＰＦＵの野生型ＲＳＶ Ａ２で曝露した。３２日目に肺を回収した。図１２Ｂは、熱不活性化血清のＲＳＶマイクロ中和力価を示す。図１２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって決定されたｓＦ特異的なＩｇＧの力価の血清を示す。各動物に対するデータポイントは平均を通った線で示されている。Ｔ−ｔｅｓｔは、ｐ値を決定するために行われ、“ｎs”は、“有意差なし”を示している。示したデータはＩＦＡによる免疫化からのものであった。独自のアジュバントを用いた免疫化により、類似の結果を得た。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、マウス抗ＶＬＰ１０血清が、ＲＳＶを中和し、ｓＦへの結合に対してパリビズマブと競合することを図示している。図１３Ａは、パリビズマブと比較した、ＶＬＰ１９免疫化マウスから得た熱不活性化血清を用いて行ったＲＳＶのＰＲＮＴ中和アッセイの結果を示している。図１３Ｂは、ＶＬＰ１９免疫化マウスから得た血清が、ｓＦへの結合に対してパリビズマブと競合することを示している。ＥＬＩＳＡプレートを、ｓＦでコーティングし、ネガティブコントロールの血清か抗ＶＬＰ１９血清の何れかの希釈液と混合した一定量のパリビズマブの混合物とインキュベートした。結合したパリビズマブをＨＲＰコンジュゲートした抗ヒトＡｂで検出した。洗浄の後、色を０．１Ｎ ＨＣｌを伴うテトラメチルベンジジンで発色させた。光学濃度を４５０ｎｍにおいて読み取り、％阻害をネガティブコントロールとの比較によって算出した。示したデータは３回の独立した実験の典型例である。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂハアジュバントの非存在下において投与されたＶＬＰ１９の免疫原性および有効性を示している。３つのB10xB10.S F1マウスの群は第０週および第６週目にｐＢＳ中のＶＬＰ１９の、示された投与によって腹腔内に免疫化した。マウスを出血させ、貯めた血清を試験した。図１４Ａは、抗ＶＬＰ１９血清の抗ＲＳＶタンパク質のＩｇＧ力価を示している。図１４Ｂは、抗ＶＬＰ１９血清のＲＳＶ中和力価を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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