(57)【要約】  本開示は、所定のゲノム遺伝子座内またはその近位に位置する外因性核酸配列を含む単離された細胞であって、前記外因性核酸配列が、組換えタンパク質の標的組込みのための一以上のポリヌクレオチド修飾酵素によって利用できる少なくとも１つの認識配列を含む、細胞を包含する。本開示はさらに、そのような細胞を調製するための方法、および組換えタンパク質の産生のためにそのような細胞を再標的化するための方法、ならびにそれらのためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に列挙される少なくとも１つのゲノム遺伝子座内またはその近位のゲノムＤＮＡに位置する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む、単離された細胞であって、各外因性核酸配列がポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、単離された細胞。
【請求項２】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項３】
少なくとも１つの認識配列が、細胞のゲノム中に内因性に存在しない核酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離された細胞。
【請求項４】
ポリヌクレオチド修飾酵素が、標的エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項５】
標的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された細胞。
【請求項６】
部位特異的リコンビナーゼが、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼからなる群から選択される、請求項４に記載の単離された細胞。
【請求項７】
第一の認識配列が第一のＺＦＮ対によって認識される、先行する請求項のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項８】
第二の認識配列が第一のＺＦＮ対とは異なる第二のＺＦＮ対によって認識される、請求項７に記載の単離された細胞。
【請求項９】
第一および第二のＺＦＮ対が、ｈＳＩＲＴ、ｈＲＳＫ４、およびｈＡＡＶＳ１からなる群から選択される、請求項７または８に記載の単離された細胞。
【請求項１０】
外因性核酸配列が、少なくとも１つの選択マーカー配列、少なくとも１つのレポーター配列、少なくとも１つの調節制御配列因子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む細胞を調製するための方法であって、
ａ）表２に列挙されるゲノム遺伝子座内またはその近位の配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼを細胞内に導入すること；
ｂ）（ｉ）標的ゲノム遺伝子座と実質的な配列同一性を有する配列または（ｉｉ）標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する外因性核酸を含む、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入すること；および
ｃ）外因性核酸が細胞のゲノム内に組み込まれるような条件下で細胞を維持すること
を含む、方法。
【請求項１２】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
外因性核酸が相同性指向プロセスによってゲノム内に組み込まれる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
外因性核酸が直接的ライゲーションプロセスによってゲノム内に組み込まれる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
標的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される、請求項１１−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの組換えタンパク質の産生のために細胞を再標的化するための方法であって、
ａ）表２に列挙される少なくとも１つのゲノム遺伝子座内またはその近位に位置する、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの外因性認識配列を含む細胞を提供すること；
ｂ）（ｉ）第一および第二の配列に隣接する組換えタンパク質をコードする配列を含む、少なくとも１つの発現構築物、および（ｉｉ）細胞における少なくとも１つの外因性認識配列を認識する、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素を、細胞内に導入すること；および
ｃ）組換えタンパク質をコードする配列が細胞のゲノム内に組み込まれるような条件下で細胞を維持すること
を含む、方法。
【請求項１７】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の少なくとも１つの外因性認識配列が標的エンドヌクレアーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列が、細胞における外因性認識配列付近の染色体配列と実質的な配列同一性を有する配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素が標的エンドヌクレアーゼである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞の少なくとも１つの外因性認識配列が標的エンドヌクレアーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列のそれぞれが、標的エンドヌクレアーゼの認識配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素が標的エンドヌクレアーゼである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞の少なくとも１つの外因性認識配列が部位特異的リコンビナーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列のそれぞれが、部位特異的リコンビナーゼ認識配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素が部位特異的リコンビナーゼである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
部位特異的リコンビナーゼが、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組換えタンパク質をコードする配列が、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結される、請求項１６−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
発現構築物が、少なくとも１つの選択マーカー配列、少なくとも１つのレポーター配列、少なくとも１つの調節制御配列因子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１６−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、少なくとも１つの組換えタンパク質の発現のための条件下で維持される、請求項１６−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
組換えタンパク質の産生のために細胞を再標的化するためのキットであって、認識配列に対応するポリヌクレオチド修飾酵素、および目的の組換えタンパク質をコードする配列の挿入のための構築物であって、認識配列および／または認識配列に隣接するゲノム配列に対応する一対の隣接配列をさらに含む構築物と共に、請求項１−１０のいずれか一項に記載の細胞を含む、キット。
【請求項２７】
組換えタンパク質をコードする配列の標的組込みを達成するための説明書をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド修飾酵素が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される、標的エンドヌクレアーゼである、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド修飾酵素が、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼからなる群から選択される、部位特異的リコンビナーゼである、請求項２６または２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、目的の細胞内への組換えタンパク質をコードする配列の標的組込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に関する。特に、目的の細胞は、所定のゲノム遺伝子座内またはその近位に位置する外因性核酸配列であって、組換えタンパク質をコードする配列の標的組込みのための一以上のポリヌクレオチド修飾酵素によって利用できる少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸配列を含む。
【背景技術】
【０００２】
近年、哺乳動物細胞のゲノム内の指定された位置での組換えタンパク質発現構築物の標的組込み（ＴＩ）が、生物医薬業界において多くの関心を巻き起こしている。ＴＩ技術は、細胞株開発の科学者が、既定のよく特徴付けられたゲノム遺伝子座内に目的の導入遺伝子を組み込むことを可能にし、それによって、細胞株安定性の増大、クローン対クローンおよび分子対分子の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の低減、ならびに細胞株開発タイムラインの全体的な低減につながるであろう、組換えタンパク質発現特性の予測を可能にする。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はバイオ治療タンパク質の産生のための最も一般的に使用される細胞株である。しかしながら、治療用タンパク質産生において認識されていたそれらの有用性にもかかわらず、これまで、ＣＨＯ細胞におけるＴＩは限られた成功しか収めていない。従って、生物生産業界に利益をもたらすであろう、ＣＨＯおよび他の細胞においてＴＩを達成する改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の様々な態様の中には、表２に列挙される少なくとも１つのゲノム遺伝子座内またはその近位のゲノムＤＮＡに位置する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む、単離された細胞であって、各外因性核酸配列はポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、細胞の提供がある。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つの認識配列は、細胞（またはＣＨＯ細胞）のゲノム中に内因性に存在しない核酸配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド修飾酵素は、標的エンドヌクレアーゼ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、または人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤）、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、またはＲ４インテグラーゼ）、またはそれらの組み合わせである。さらなる実施形態では、第一の認識配列は第一のＺＦＮ対によって認識される。さらに別の実施形態では、第一の認識配列は第一のＺＦＮ対によって認識され、第二の認識配列は第一のＺＦＮの対とは異なる第二のＺＦＮ対によって認識される。一つの反復では、第一および第二のＺＦＮ対は、ｈＳＩＲＴ、ｈＲＳＫ４、およびｈＡＡＶＳ１からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、外因性核酸配列は、少なくとも１つの選択マーカー配列、少なくとも１つのレポーター配列、少なくとも１つの調節制御配列因子、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【０００４】
本開示の別の態様は、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む細胞を調製するための方法を包含する。本方法は、（ａ）表２に列挙されるゲノム遺伝子座内またはその近位の配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼを細胞内に導入すること；（ｂ）（ｉ）標的ゲノム遺伝子座と実質的な配列同一性を有する配列または（ｉｉ）標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する外因性核酸を含む、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入すること；および（ｃ）外因性核酸が細胞のゲノム内に組み込まれるような条件下で細胞を維持することを含む。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、外因性核酸は相同性指向プロセスによってゲノム内に組み込まれる。さらなる実施形態では、外因性核酸は直接的ライゲーション（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）プロセスによってゲノム内に組み込まれる。さらに別の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される。
【０００５】
本開示のさらなる態様は、少なくとも１つの組換えタンパク質の産生のために細胞を再標的化するための方法を提供する。本方法は、（ａ）表２に列挙される少なくとも１つのゲノム遺伝子座内またはその近位に位置する、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの外因性認識配列を含む細胞を提供すること；（ｂ）（ｉ）第一および第二の配列に隣接する組換えタンパク質をコードする配列を含む、少なくとも１つの発現構築物、および（ｉｉ）細胞における少なくとも１つの外因性認識配列を認識する、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素を、細胞内に導入すること；および（ｃ）組換えタンパク質をコードする配列が細胞のゲノム内に組み込まれるような条件下で細胞を維持することを含む。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、細胞の少なくとも１つの認識配列は標的エンドヌクレアーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列は、細胞における外因性認識配列付近の染色体配列と実質的な配列同一性を有する配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素は標的エンドヌクレアーゼである。さらに別の実施形態では、細胞の少なくとも１つの外因性認識配列は標的エンドヌクレアーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列のそれぞれは、標的エンドヌクレアーゼの認識配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素は標的エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、または人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤である。さらなる実施形態では、細胞の少なくとも１つの外因性認識配列は部位特異的リコンビナーゼ認識部位であり；発現構築物の第一および第二の配列のそれぞれは、部位特異的リコンビナーゼ認識配列であり；かつ少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素は部位特異的リコンビナーゼであって、前記部位特異的リコンビナーゼはラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼからなる群から選択されるものである。さらなる実施形態では、組換えタンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結される。代替的な実施形態では、発現構築物は、少なくとも１つの選択マーカー配列、少なくとも１つのレポーター配列、少なくとも１つの調節制御配列因子、またはそれらの組み合わせをさらに含む。さらに別の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの組換えタンパク質の発現のための条件下で維持される。
【０００６】
本開示のさらに別の態様は、組換えタンパク質の産生のために細胞を再標的化するためのキットを包含する。本キットは、認識配列に対応するポリヌクレオチド修飾酵素、および目的の組換えタンパク質をコードする配列の挿入のための構築物であって、認識配列および／または認識配列に隣接するゲノム配列に対応する一対の隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む構築物と共に、表２に列挙される少なくとも１つのゲノム遺伝子座内またはその近位のゲノムＤＮＡに位置する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む細胞であって、各外因性核酸配列はポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、細胞を含む。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、キットは組換えタンパク質をコードする配列の標的組込みを達成するための説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド修飾酵素は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、および人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤からなる群から選択される、標的エンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、ポリヌクレオチド修飾酵素は、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼからなる群から選択される、部位特異的リコンビナーゼである。
【０００７】
本開示のさらなる態様および反復は以下に詳述される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＣＨＯゲノム位置Ｒｅｆｓｅｑ．ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１，ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ５３６６−２０６７９内へのヒトＡＡＶＳ１  ＺＦＮ認識配列の組込みのために用いられたドナープラスミドの概略図である。
【０００９】
【図２】図２は、組み込まれたＡＡＶＳランディングパッド（ｌａｎｄｉｎｇ  ｐａｄ）を含むＲｅｆｓｅｑ．ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１，ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ５３６６−２０６７９の概略図である。ジャンクションＰＣＲ（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ＰＣＲ）のために用いられたプライマー結合部位が示されている。
【００１０】
【図３】図３は、ＺＦＮ媒介標的組込みによりゲノム内に組換えタンパク質発現構築物を導入するために用いることができる、２つの異なる一般的なドナー設計の概略図である。（Ａ）例えば組換えタンパク質発現構築物を含む、組み込まれる所望の配列（本明細書において「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」配列と称する）は、ＺＦＮ認識配列を囲むゲノムＤＮＡ配列に相同である配列に隣接している。この設計は、古典的な相同組換えを介して標的組込みを可能にするであろう。（Ｂ）ペイロードは、宿主細胞ゲノムにおいて標的とされるものと同じＺＦＮ認識配列に隣接している。従って、ＺＦＮ対とのトランスフェクション時に、ＺＦＮは内因性ゲノムＤＮＡならびにドナーＤＮＡの両方を切断し、ＤＮＡ修復機構を介してペイロードの標的組込みを可能にするであろう、粘着性の付着末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄｓ）を残す。両方の設計において、ペイロードは選択マーカーのための発現カセットと共に、目的の組換えタンパク質のための発現カセットを含んでもよい。ペイロードにおける他の要素は、レポーター、プロモーター、または任意の他の外因性配列を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
組換えタンパク質、特にバイオ治療タンパク質産物をコードする配列の標的組込みは、所望の遺伝物質の組込み効率のため、かつ、組込み後のタンパク質発現の安定性、均一性、およびレベルの改善のため、ランダム組込みよりも強く好まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術ならびに本明細書で説明される他の技術などのエンドヌクレアーゼ技術は、今や、標的組込みの特定の従来の方法と比べて、カスタマイズのための効率と機会がより大きく、内因性ゲノム配列の部位特異的修飾の導入を可能にする。本開示は、組換えタンパク質をコードする配列の標的組込みに有用な細胞であって、それらのゲノムにおける「ランディングパッド」部位の取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のため特に適している、細胞を提供する。かかるランディングパッドを受け取るために、本明細書に記載されるように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）または他の哺乳動物細胞は改変されてもよい、すなわち、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的エンドヌクレアーゼなどのポリヌクレオチド修飾酵素のための一以上の認識配列を含む合成ヌクレオチド配列を含むように改変されてもよい。ランディングパッドは組換えタンパク質の発現のために好適な遺伝子座に挿入されてもよい。ゲノム内の特定の位置でのランディングパッド（ポリヌクレオチド修飾酵素のための一以上の認識配列を含む配列）の組込みの後、一以上のタンパク質をコードする配列は、対応するリコンビナーゼおよび／または標的エンドヌクレアーゼを用いて一以上の認識配列を含む位置に挿入されてもよく、かかる挿入はランダム組込みや他の既述の方法よりもより高いレベルの効率で発生する。複数のランディングパッドをゲノム中の異なる位置に配置することができ、組換えタンパク質発現構築物またはカセットならびに複数のユニークなタンパク質発現カセットのマルチコピーな組込みを可能にすることが理解されるであろう。
【００１２】
Ｉ．少なくとも１つの認識配列を含む外因性配列
一態様では、本開示は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的エンドヌクレアーゼなどの少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸配列（すなわち、ランディングパッド）を包含する。部位特異的リコンビナーゼは当技術分野においてよく知られており、一般にインベルターゼ、リゾルバーゼ、またはインテグラーゼと呼ばれ得る。部位特異的リコンビナーゼの非限定的な例は、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼを含み得る。部位特異的リコンビナーゼは特異的認識配列（もしくは認識部位）またはそれらのバリアントを認識し、それらの全ては当技術分野でよく知られている。例えば、ＣｒｅリコンビナーゼはＬｏｘＰ部位を認識し、ＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴ部位を認識する。
【００１３】
想定される標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ様エンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、または人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤を含む。これらの標的化酵素のそれぞれは以下にさらに説明される。例えば、典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼはＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）と切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、これらの両方が以下に説明される。また、ポリヌクレオチド修飾酵素の定義には、例えばＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼを含み得る、当業者に知られている任意の他の有用な融合タンパク質が含まれる。
【００１４】
ランディングパッド配列は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的エンドヌクレアーゼなどの特定のポリヌクレオチド修飾酵素に選択的に結合され、改変される、少なくとも１つの認識配列を含むヌクレオチド配列である。一般に、ランディングパッド配列における認識配列は、改変される細胞のゲノム中に内因性に存在しない。例えば、改変される細胞がＣＨＯ細胞である場合、ランディングパッド配列中の認識配列は内因性ＣＨＯゲノムには存在しない。標的組込みの割合は、標的細胞のゲノム内に内因性に存在しない、高効率ヌクレオチド修飾酵素のための認識配列を選択することによって改善されてもよい。内因性に存在しない認識配列の選択はまた、潜在的なオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）組込みを低減する。他の態様では、改変される細胞において天然である認識配列の使用が望ましいであろう。例えば、複数の認識配列がランディングパッド配列において採用される場合、一以上が外因性であってもよく、かつ一以上が天然であってもよい。
【００１５】
当業者は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的エンドヌクレアーゼによって結合され、切断される配列を、容易に決定することができる。３つの例示的なＺＦＮ認識配列が以下の表１に提供される。
【表１】
2016523084.tif 000002
【００１６】
複数の認識配列が単一のランディングパッドに存在してもよく、ランディングパッドが、二以上のユニークなペイロード配列（とりわけ、タンパク質発現カセットを含む）が挿入できるように、二以上のポリヌクレオチド修飾酵素によって連続して標的とされることを可能にする。あるいは、ランディングパッドにおける複数の認識配列の存在は、複数コピーの同一のペイロード配列がランディングパッドに挿入されることを可能にする。２つのペイロード配列が単一のランディングパッドを標的とする時、そのランディングパッドは、第一のポリヌクレオチド修飾酵素（第一のＺＦＮ対など）のための第一の認識配列、および第二のポリヌクレオチド酵素（第二のＺＦＮ対など）のための第二の認識配列を含む。代替的または追加的に、一以上の認識配列を含む個々のランディングパッドが、組換えタンパク質発現構築物を含むペイロード配列の複数コピーの組込みを可能にするために、細胞のゲノム内の複数の位置に組み込まれてもよい。増大したタンパク質発現が、発現構築物を含む複数コピーのペイロード配列で形質転換された細胞において観察され得る。あるいは、異なる発現カセットを含む複数のユニークなペイロード配列が、同一のランディングパッド中であろうと異なるランディングパッド中であろうと、挿入されるのと同時に、複数のタンパク質産物が発現され得る。ペイロード配列の数および種類に関係なく、標的エンドヌクレアーゼがＺＦＮである時、例示的なＺＦＮ対は、ｈＳＩＲＴ、ｈＲＳＫ４、およびｈＡＡＶＳ１を含み、上記表１で特定される認識配列を伴う。
【００１７】
一般的に言えば、ランディングパッドとして用いられる外因性核酸は少なくとも１つの認識配列を含み得る。例えば、外因性核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個またはそれより多くの認識配列を含んでもよい。１より多くの認識配列を含む実施形態では、認識配列は互いにユニークであってもよく（すなわち、異なるヌクレオチド修飾酵素によって認識されてもよく）、同一の繰り返し配列であってもよく、あるいは繰り返し配列とユニークな配列との組み合わせであってもよい。
【００１８】
ランディングパッドとして用いられる外因性核酸がまた、認識配列に加えて他の配列を含んでもよいことを当業者は容易に理解するであろう。例えば、抗生物質耐性遺伝子、代謝選択マーカー、または蛍光タンパク質などの選択マーカーをコードする一以上の配列を含めることは好都合であり得る。転写調節および制御因子（すなわち、プロモーター、部分的プロモーター、プロモータートラップ、開始コドン、エンハンサー、イントロン、インスレーター、および他の発現因子）などの他の補助的な配列の使用もまた存在できる。
【００１９】
適切な認識配列の選択に加えて、高い切断効率を有する標的エンドヌクレアーゼの選択もまた、ランディングパッドの標的組込みの割合を向上させる。標的エンドヌクレアーゼの切断効率は、例えば、ＣＥＬ−１アッセイもしくはＰＣＲアンプリコン中の挿入／欠失（インデル）のダイレクトシークエンシングを含む、当技術分野において周知の方法を用いて決定できる。
【００２０】
本方法において用いられる標的エンドヌクレアーゼおよび本明細書で開示される細胞の種類は、変わり得るし変わるだろう。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質であってもよく、あるいは操作されたタンパク質であってもよい。標的エンドヌクレアーゼの一例はジンクフィンガーヌクレアーゼであり、以下でさらに詳細に説明される。
【００２１】
使用できる標的エンドヌクレアーゼの別の例は、真核細胞の核へのエンドヌクレアーゼの進入を可能にする、少なくとも１つの核局在化シグナルを含むＲＮＡ誘導型（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ）エンドヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインおよびガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｉｎｇ  ＲＮＡ）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含む。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが特定の染色体配列を切断するように、ガイドＲＮＡによって特定の染色体配列に向けられる。ガイドＲＮＡが標的切断に対する特異性を提供するので、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは普遍的であり、異なるガイドＲＮＡと共に用いて異なる標的染色体配列を切断し得る。例示的なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、以下にさらに詳細に説明される。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様融合タンパク質、クラスター状規則配置短パリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系に由来するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとすることができる。
【００２２】
標的エンドヌクレアーゼはまたメガヌクレアーゼとすることができる。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位によって特徴づけられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識部位は一般に、約１２塩基対〜約４０塩基対の範囲である。この要件の結果として、認識部位は一般に任意の所定のゲノムにおいて一度だけ発生する。メガヌクレアーゼのうち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧという名前のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための価値あるツールとなっている。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を用いてそれらの認識配列を改変することにより、特定の染色体配列を標的としてもよい。例えば、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３１（１１）：２９５２−６２およびＳｔｏｄｄａｒｄ，２００５，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ｐｐ．１−４７を参照のこと。
【００２３】
使用できる標的エンドヌクレアーゼのさらに別の例は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼである。ＴＡＬＥは、新しいＤＮＡ標的に結合するように容易に操作し得る植物病原体キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の転写因子である。ＴＡＬＥまたはそれらの切断型は、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを作製するために、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結され得る。例えば、Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７（１）：１７１−１９２；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ，Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ．，２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０５１）：１８４３−６；Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｐ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ，Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ＢＬ．，２０１３，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．，２３（１）：９３−９を参照のこと。
【００２４】
別の例示的な標的エンドヌクレアーゼは部位特異的ヌクレアーゼである。特に、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識配列がゲノム中に稀にしか発生しない「レアカッター」エンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列はゲノムにおいて一度だけ発生する。あるいは、標的ヌクレアーゼは、人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤であってもよい。
【００２５】
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
非限定的な例示的な標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼはＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、それらの両方は以下に説明される。
【００２６】
（ｉ）ジンクフィンガー結合ドメイン
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した任意の核酸配列を認識し、それに結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新たな結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計および様々な種類のセレクションを含むが、それらに限定されない。合理的設計は、例えば、二重（ｄｏｕｂｌｅｔ）、三重（ｔｒｉｐｌｅｔ）、および／または四重（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含み、各二重、三重または四重のヌクレオチド配列が特定の三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連しているデータベースを使用することを含む。例えば、出典明示により本明細書にその開示の全体が組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照のこと。一例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されたアルゴリズムが、予め選択された配列を標的とするようにジンクフィンガー結合ドメインを設計するために用いられてもよい。非縮重認識コード表を用いる合理的設計などの代替方法もまた、特定の配列を標的とするようにジンクフィンガー結合ドメインを設計するために用いることができる（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列における潜在的な標的部位を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公的に利用可能なｗｅｂベースのツールは、それぞれ、ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇおよびｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ／に見られる（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５）。
【００２７】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長、例えば、約９〜約１８ヌクレオチド長の範囲のＤＮＡ配列を認識し、結合するように、設計されてもよい。各ジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）は３つのヌクレオチドを認識し、結合する。一般に、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、４つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインは５つまたは６つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計され得る。例えば、出典明示により本明細書にその開示の全体が組み込まれる、米国特許第６，６０７，８８２号；第６，５３４，２６１号および第６，４５３，２４２号を参照のこと。
【００２８】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法はファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含み、それぞれ出典明示により本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；第および第６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第９８／３７１８６号；国際公開第９８／５３０５７号；国際公開第００／２７８７８号；国際公開第０１／８８１９７および英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。また、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性の増強は、例えば、出典明示により本明細書にその開示が組み込まれる、国際公開第０２／０７７２２７号において記載されている。
【００２９】
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのジンクフィンガー結合ドメインおよび方法は当業者に知られており、それぞれ出典明示により本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガー型（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５以上のアミノ酸長のリンカーを含む、好適なリンカー配列を用いて、一緒に結合してもよい。６以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的な例に関しては、出典明示により本明細書にその開示の全体が組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号を参照のこと。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガー（およびさらなるドメイン）の間に好適なリンカーの組み合わせを含んでもよい。
【００３０】
（ｉｉ）切断ドメイン
ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた切断ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得てもよい。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇ  （ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと。これらの酵素（またはその機能的断片）の一以上を切断ドメインの供給源として用いてもよい。
【００３１】
切断ドメインはまた、切断活性のために二量体化を必要とする、上述のような、酵素またはそれらの一部分に由来してもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含むように、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断のために必要とされてもよい。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体を作製するために、両方の単量体を含むことができる。本明細書で用いられる場合、「活性酵素二量体」は核酸分子を切断することができる酵素二量体である。２つの切断単量体が同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよく、あるいは各単量体が異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。
【００３２】
２つの切断単量体を用いて活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、好ましくは、それらのそれぞれの認識部位への２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば二量体化することによって切断単量体が活性酵素二量体を形成することを可能にする、互いに空間的な方向（ｓｐａｔｉａｌ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に切断単量体を配置（ｐｌａｃｅ）するように、配置（ｄｉｓｐｏｓｅ）される。結果として、認識部位の近端は約５〜約１８ヌクレオチドによって分離され得る。例えば、近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のヌクレオチドによって分離されてもよい。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの認識部位の間に介在できることが理解されるであろう（例えば、約２〜約５０ヌクレオチド対以上まで）。例えば本明細書に詳細に記載されているものなどの、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６つのヌクレオチドによって分離されてもよい。一般に、切断部位は認識部位の間にある。
【００３３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合すること、および結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号；および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照のこと。従って、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン、および、操作されてもよく、されなくてもよい、一以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができる。例示的なＩＩＳ型制限酵素は、出典明示により本明細書にその開示の全体が組み込まれる、国際公開第０７／０１４，２７５号に記載される。さらなる制限酵素もまた分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらもまた本開示によって企図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。
【００３４】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：  １０，５７０−１０，５７５）。従って、本開示の目的のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼで用いられるＦｏｋＩ酵素の部分は切断単量体と考えられる。それゆえ、ＦｏｋＩ切断ドメインを用いる標的二本鎖切断のため、それぞれＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、活性酵素二量体を再構成してもよい。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子もまた用いることができる。
【００３５】
切断ドメインは、例えば、それぞれ出典明示により本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、および第２００８０１３１９６２号に記載されるような、ホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ、一以上の操作された切断単量体を含んでもよい。非限定的な例として、ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。偏性ヘテロ二量体（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する、ＦｏｋＩの例示的な操作された切断単量体は、第一の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基位置４９０および５３８で突然変異を含み、第二の切断単量体がアミノ酸残基位置４８６および４９９で突然変異を含む対を含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５：７７８−７８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５：７８６−７９３）。例えば、一方のドメインにおいて、位置４９０のＧｌｕ（Ｅ）はＬｙｓ（Ｋ）に変更されてもよく、位置５３８のＩｌｅ（Ｉ）はＫに変更されてもよく（Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ）、別の切断ドメインにおいて、位置４８６のＧｌｎ（Ｑ）はＥに変更されてもよく、位置４９９のＩはＬｅｕ（Ｌ）に変更されてもよい（Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ）。他の態様では、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは３つのアミノ酸変更を含むことができる（Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７４−８１）。例えば、一方の改変されたＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤと呼ばれる）はＱ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、Ｎ４９６Ｄ突然変異を含むことができ、他方の改変されたＦｏｋＩドメイン（ＫＫＲと呼ばれる）はＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、Ｈ５３７Ｒ突然変異を含むことができる。
【００３６】
（ｉｉｉ）さらなるドメイン
いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは少なくとも１つの核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、染色体における標的配列で二本鎖切断を導入するために、核内にジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を標的化するのを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは当技術分野で知られている。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７を参照のこと。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼのＮ末端に、Ｃ末端に、あるいは内部の位置に配置してもよい。
【００３７】
他の態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含んでもよい。細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来の細胞透過性ペプチド配列、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞透過性ペプチドの配列、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列であってもよい。細胞透過性ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼのＮ末端に、Ｃ末端に、あるいは内部の位置に配置されてもよい。
【００３８】
（ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター状規則配置短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であってもよい。いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来してもよい。ＩＩ型系はＣｓｎ１サブファミリーまたはＣｓｘ１２サブファミリーであってもよい。例示的な態様では、エンドヌクレアーゼはＩＩ型系のＣａｓ９タンパク質に由来し得る。様々な態様において、エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属菌（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属菌（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属菌（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェックス・デゲンシイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジデイタス・デサルホルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属菌（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクター・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属菌（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属菌（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、リングビア属菌（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア属菌（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ）、等由来のＣａｓ９タンパク質（またはＣａｓ９ホモログ）に由来し得る。例示的な態様では、エンドヌクレアーゼはストレプトコッカス属由来のＣａｓ９タンパク質に由来する。
【００３９】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片に由来してもよい。他の態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは改変されたＣａｓ９タンパク質に由来してもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、そのタンパク質の一以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性、等）が改善されるように改変されてもよい。あるいは、改変されたＣａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるように、ＲＮＡ誘導型切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインがタンパク質から除去されてもよい。さらに他の態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質、改変されたＣａｓ９タンパク質、および／または他のタンパク質のドメインを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＧＦＰまたは別の蛍光タンパク質などのマーカーを含むことができる。
【００４０】
一般に、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９由来のエンドヌクレアーゼは、２つの機能的なヌクレアーゼドメイン、例えば、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。そのような態様では、エンドヌクレアーゼは二本鎖核酸を切断することができる。他の態様では、Ｃａｓ９由来のエンドヌクレアーゼは、１つの機能的なヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含むことができる。これらの態様では、エンドヌクレアーゼは一本鎖核酸を切断することができ、あるいは二本鎖核酸にニックを導入することができる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは同一のＣａｓ９タンパク質に由来してもよく、あるいは、それらは異なるＣａｓ９タンパク質に由来してもよい。
【００４１】
本明細書に開示されるＣａｓ９由来のエンドヌクレアーゼは、真核細胞の核への輸送のための少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。核局在化シグナルは当技術分野で知られている（例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１−５１０５を参照のこと）。例えば、一実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５）などのモノパータイト（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）な配列であってもよい。別の実施形態では、ＮＬＳはバイパータイト（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）な配列であってもよい。さらに別の実施形態では、ＮＬＳはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６）であってもよい。ＮＬＳは、エンドヌクレアーゼのＮ末端に、Ｃ末端に、あるいは内部の位置に配置されてもよい。非限定的な例では、ＮＬＳはエンドヌクレアーゼのＣ末端に配置される。
【００４２】
一般に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＤＮＡエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断できる。例示的な態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断できる。ＤＮＡは、例えば、直鎖状であっても環状であってもよい。例示的な反復では、ＤＮＡは染色体である（すなわち、ヒストンおよび他の染色体のタンパク質と会合している）。
【００４３】
（ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様融合タンパク質
本開示の一態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはその断片、およびエフェクタードメインを含む、融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに関して上述した態様のいずれかにおいて用いてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、クラスター状規則配置短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系タンパク質に由来する。エフェクタードメインは、切断ドメイン、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピジェネティック修飾ドメインであってもよい。
【００４４】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質ドメイン
融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはその断片を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系に由来し得る。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６を含む。
【００４５】
一実施形態では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。例示的な態様では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はＣａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、上記で特定されたものなどの任意の好適な種に由来してもよい。
【００４６】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、ならびに他のドメインを含むことができる。
【００４７】
融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／  ＣＡＳタンパク質、改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または野生型もしくは改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であってもよい。結合親和性および／または特異性を増大させ、核酸酵素活性を変化させ、かつ／またはタンパク質の他の特性を変更するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が改変されてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、改変または不活性化されてもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）して、融合タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除いてもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を切断または改変して、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化してもよい。
【００４８】
いくつかの態様では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片に由来してもよい。他の態様では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、改変されたＣａｓ９タンパク質に由来してもよい。例えば、タンパク質の一以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性、等）を変化させるように、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列が改変されてもよい。あるいは、ＲＮＡ誘導型切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインが、改変されたＣａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるように、タンパク質から除去されてもよい。
【００４９】
一般に、Ｃａｓ９タンパク質は少なくとも二つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、１つの機能的なヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含有するように、改変されてもよい。これらの態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、二本鎖核酸にニックを導入することができる。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインでのアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。他の態様では、Ｃａｓ９由来のタンパク質が二本鎖核酸を切断できないように、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの両方が改変または除去されてもよい。さらに他の態様では、Ｃａｓ９由来のタンパク質が全てのヌクレアーゼ活性を欠くように、Ｃａｓ９由来のタンパク質の全てヌクレアーゼドメインが改変または除去されてもよい。ヌクレアーゼドメインは、欠失突然変異、挿入突然変異、および／または置換突然変異により不活性化されてもよい。非限定的な例では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、全てのヌクレアーゼドメインが不活性化または欠失したＣａｓ９タンパク質に由来する。
【００５０】
融合タンパク質はまた、エフェクタードメインを含む。エフェクタードメインは、切断ドメインあるいは当業者によって決定される他の好適なドメインであってもよい。本開示の好ましい態様では、エフェクタードメインは切断ドメインである。エフェクタードメインは融合タンパク質のカルボキシまたはアミノ末端に配置されてもよい。
【００５１】
（ｉｉ）エフェクタードメイン
いくつかの態様では、エフェクタードメインは切断ドメインである。本明細書で用いられる場合、「切断ドメイン」はＤＮＡを切断するドメインを指す。切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得てもよい。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＣａｔａｌｏｇまたはＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと。これらの酵素（またはその機能的断片）の一以上を切断ドメインの供給源として用いてもよい。
【００５２】
いくつかの態様では、切断ドメインはＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼは、典型的には認識部位から数塩基対離れている部位でＤＮＡを切断し、かつ、それ自体、分離可能な認識ドメインおよび切断ドメインを有する。これらの酵素は一般に、食い違い状（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）の位置でＤＮＡの各鎖を切断するために二量体を形成するために、一過性に会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）単量体である。好適なＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。例示的な態様では、融合タンパク質の切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインまたはその誘導体である。
【００５３】
特定の態様では、ＩＩ−Ｓ型切断は、２つの異なる切断ドメイン（それぞれがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質またはその断片に結合している）の二量体化を促進するように改変されてもよい。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を突然変異させることによって改変されてもよい。非限定的な例として、ＦｏｋＩ切断ドメインの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８のアミノ酸残基が、改変のための標的である。例えば、偏性ヘテロ二量体を形成する、ＦｏｋＩの改変された切断ドメインは、第一の改変された切断ドメインがアミノ酸位置４９０および５３８で突然変異を含み、第二の改変された切断ドメインがアミノ酸位置４８６および４９９で突然変異を含む対を含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５：７７８−７８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５：７８６−７９３）。例えば、一方のドメインにおいて、位置４９０のＧｌｕ（Ｅ）はＬｙｓ（Ｋ）に変更されてもよく、位置５３８のＩｌｅ（Ｉ）はＫに変更されてもよく（Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ）、別の切断ドメインにおいて、位置４８６のＧｌｎ（Ｑ）はＥに変更されてもよく、位置４９９のＩはＬｅｕ（Ｌ）に変更されてもよい（Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ）。他の態様では、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは３つのアミノ酸変更を含むことができる（Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７４−８１）。例えば、一方の改変されたＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤと呼ばれる）はＱ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、Ｎ４９６Ｄ突然変異を含むことができ、他方の改変されたＦｏｋＩドメイン（ＫＫＲと呼ばれる）はＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、Ｈ５３７Ｒ突然変異を含むことができる。
【００５４】
例示的な態様では、融合タンパク質のエフェクタードメインはＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変されたＦｏｋＩ切断ドメインである。
【００５５】
（ｉｉｉ）さらなる任意のドメイン
いくつかの態様では、融合タンパク質は少なくとも１つのさらなるドメインを含む。好適なさらなるドメインの非限定的な例は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性または転位ドメイン、およびマーカードメインを含む。
【００５６】
特定の態様では、融合タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含むことができる。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸のストレッチを含む。核局在化シグナルは当技術分野で知られている（例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１−５１０５を参照のこと）。例えば、一実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５）などのモノパータイトな配列であってもよい。別の実施形態では、ＮＬＳはバイパータイトな配列であってもよい。さらに別の実施形態では、ＮＬＳはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６）であってもよい。ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端に、Ｃ末端に、あるいは内部の位置に配置されてもよい。
【００５７】
いくつかの態様では、融合タンパク質は少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞透過性ドメインはＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する細胞透過性ペプチド配列であってもよい。一例として、ＴＡＴ細胞透過性配列はＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）であってもよい。別の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号８）、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する細胞透過性ペプチド配列であってもよい。さらに別の実施形態では、細胞透過性ドメインはＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号９またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１０）であってもよい。さらなる態様では、細胞透過性ドメインはＰｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１１）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列であってもよい。細胞透過性ドメインは、融合タンパク質のＮ末端に、Ｃ末端に、あるいは内部の位置に配置されてもよい。
【００５８】
さらに他の態様では、融合タンパク質は少なくとも１つのマーカードメインを含むことができる。マーカードメインの非限定的な例は、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグを含む。いくつかの態様では、マーカードメインは蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ、）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または任意の他の好適な蛍光タンパク質を含む。他の態様では、マーカードメインは精製タグまたはエピトープタグであってもよい。例示的なタグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンを含むが、それらに限定されない。
【００５９】
（ｉｖ）融合タンパク質二量体
本開示はまた、上記のような、少なくとも１つの融合タンパク質を含む二量体の使用を企図する。二量体はホモ二量体であってもよく、ヘテロ二量体であってもよい。いくつかの態様では、ヘテロ二量体は２つの異なる融合タンパク質を含む。他の態様では、ヘテロ二量体は１つの融合タンパク質とさらなるタンパク質を含む。
【００６０】
いくつかの態様では、二量体は、２つの融合タンパク質単量体が一次アミノ酸配列に関して同一であるホモ二量体である。例えば、各融合タンパク質単量体は、同一のＣａｓ９様タンパク質および同一のＦｏｋＩ切断ドメインを含む。
【００６１】
他の態様では、二量体は２つの異なる融合タンパク質のヘテロ二量体である。例えば、各融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に由来してもよく、異なる細菌種由来のオルソロガスなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に由来してもよい。例えば、各融合タンパク質は、Ｃａｓ９様タンパク質が異なる細菌種に由来する、Ｃａｓ９様タンパク質を含むことができる。これらの態様では、各融合タンパク質は、異なる標的部位を認識するであろう（すなわち、プロトスペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）および／またはＰＡＭ配列によって特定される）。あるいは、２つの融合タンパク質は異なるエフェクタードメインを有することができる。エフェクタードメインが切断ドメインである態様では、各融合タンパク質は、上述のような、異なる改変されたＦｏｋＩ切断ドメインを含有できる。当業者によって理解されるように、ヘテロ二量体を形成する２つの融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質ドメインおよびエフェクタードメインの両方において異なることができる。
【００６２】
あるいは、ヘテロ二量体は１つの融合タンパク質とさらなるタンパク質を含んでもよい。例えば、さらなるタンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む。ジンクフィンガーは、３つ（３）のヌクレオチドを認識し、結合する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３つのジンクフィンガーから約７つのジンクフィンガーまで含むことができる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するタンパク質に由来してもよいし、あるいはそれは操作されてもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照のこと。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、上記セクション（Ｉ）（ｃ）（ｉｉ）に詳述される任意の切断ドメインであってもよい。例示的な態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変されたＦｏｋＩ切断ドメインである。かかるジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは改変されたＦｏｋＩ切断ドメインを含む融合タンパク質と二量体化するであろう。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性または転座ドメインから選択される少なくとも１つのさらなるドメインを含んでもよい。好適なさらなるドメインの例は、上記に詳述されている。
【００６３】
ＩＩ．細胞
本開示の別の態様は、特定のゲノム遺伝子座内またはその近位のゲノムＤＮＡに位置する、少なくとも１つの外因性配列を含む、細胞を提供する。外因性配列は、上記セクション（Ｉ）に記載されており、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素のための認識配列を含む。一般に、外因性核酸配列は、すなわち細胞子孫もまた外因性核酸配列の染色体コピーを含むように、安定にゲノム内に組み込まれている。安定な組込みをもたらすことを意図したトランスフェクションおよび培養プロトコルは当技術分野でよく知られており、かつ当業者は安定な組込みが起こったかどうかを容易に評価することができる。
【００６４】
少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素のための認識配列を含む外因性核酸配列は、表２に列挙される非限定的な例などのゲノム遺伝子座、または表２に列挙されるゲノム遺伝子座のホモログ、オルソログ、もしくはパラログ内またはその近位に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、ゲノム遺伝子座は高レベルの遺伝子発現と関連している。本開示の外因性核酸配列は、本明細書に記載される任意の好適な標的エンドヌクレアーゼによって任意のアクセス可能なゲノム遺伝子座内またはその近位に組み込まれてもよい。特定の実施形態では、選択されるゲノム遺伝子座は、組換え遺伝子発現のための既知または未知の「ホット」スポット（“ｈｏｔ”  ｓｐｏｔ）または「セーフ・ハーバー」スポット（“ｓａｆｅ−ｈａｒｂｏｒ”  ｓｐｏｔ）である。そのような部位は、転写的に活性であり、かつ安定した遺伝子発現を可能にするために遺伝子サイレンシングメカニズムに耐性であると知られているゲノム中の領域として認識されている。いくつかの実施形態では、本開示の外因性核酸配列は、表２で特定されるゲノム遺伝子座内に組み込まれてもよい。他の実施形態では、本開示の外因性核酸配列は、表２で特定されるゲノム遺伝子座の近位に組み込まれてもよい。
【００６５】
さらに、複数のランディングパッドが挿入される場合、各々が表２に列挙されるゲノム遺伝子座またはその近くに配置されてもよい。例えば、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素のための認識配列を含有する外因性核酸配列が、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個以上のゲノム位置に組み込まれてもよい。本明細書で述べたように、複数コピーの同一の外因性核酸配列が挿入されてもよいし、様々な異なる外因性核酸配列が挿入されてもよい。
【表２−１】
2016523084.tif 000003
【表２−２】
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【表２−３】
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【００６６】
細胞は任意の好適な真核細胞であってもよい。例示的な実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１株または任意の他の好適な細胞株に由来する細胞などの、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞が選択された細胞とされてもよいが、様々な他の細胞を用いてもよい。一般に、細胞は真核細胞または単細胞真核生物である。
【００６７】
哺乳動物細胞株が用いられる場合、細胞株は任意の樹立された細胞株、あるいはまだ説明されていない初代細胞株であってもよい。細胞株は接着性または非接着であってもよく、あるいは、細胞株は、当業者に知られている標準的な技術を用いて、接着性、非接着性または器官型（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ）増殖を促進する条件下で増殖させてもよい。ＣＨＯ細胞に加えて、好適な哺乳動物細胞株の非限定的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ７）、ヒト胚腎臓株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ）、ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）、ＨＩＨ／３Ｔ３細胞、人間Ｕ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＫ５６２細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＭＣＦ−７細胞、およびＴＲＩ細胞を含む。哺乳動物細胞株の広範なリストについて、当業者はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ（ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を参照してもよい。特に、組換えタンパク質産生および生物医薬製造に有用な細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｔが使用できる。
【００６８】
他の実施形態では、細胞は培養細胞、初代細胞、または不死化細胞であってもよい。好適な細胞は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌または酵母；ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９細胞もしくはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＳ２細胞などの昆虫細胞；およびマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、もしくはヒト細胞などの動物細胞を含む。例示的な細胞は哺乳動物のものである。哺乳動物細胞は初代細胞であってもよい。一般に、二本鎖切断に感受性である任意の初代細胞が用いられ得る。細胞は、種々な細胞種のもの、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴまたはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞等であってもよい。
【００６９】
さらに他の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。好適な幹細胞は、限定なしに、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、少能性幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、および単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む。
【００７０】
特定の他の実施形態では、細胞は胚であってもよい。いくつかの実施形態では、胚は一細胞胚であってもよい。胚は、脊椎動物であってもよく、無脊椎動物であってもよい。好適な脊椎動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含む。好適な哺乳類の例は、限定なしに、げっ歯類、コンパニオンアニマル、家畜、および非霊長類を含む。げっ歯類の非限定的な例は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットを含む。好適なコンパニオンアニマルは、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットを含むが、それらに限定されない。家畜の非限定的な例は、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、およびアルパカを含む。好適な非霊長類は、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、とベルベットモンキーを含むが、それらに限定されない。鳥類の非限定的な例は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウを含む。あるいは、動物は、昆虫、線虫等の無脊椎動物であってもよい。昆虫の非限定的な例は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、蚊、およびカイコを含む。
【００７１】
ＩＩＩ．外因性配列を含む細胞を調製する方法
上述の細胞は、当業者に公知の任意の好適な方法を用いて調製され得る。しかしながら、いくつかの態様において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含むランディングパッドを含む細胞を調製する方法は、（ａ）表２に列挙されるゲノム遺伝子座内またはその近位の配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼ（またはその標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸）を細胞内に導入する段階；（ｂ）ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸、第一の上流の隣接配列、および第一の下流の隣接配列を含む、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドであって、上流配列および下流配列が段階（ａ）の標的ゲノム遺伝子座のいずれかの側と実質的な配列同一性を有する、ドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入する段階；および（ｃ）標的エンドヌクレアーゼが標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断を導入し、かつ外因性核酸がゲノム遺伝子座内またはその近位の標的部位内に組み込まれるように、二本鎖切断が相同性指向プロセスによって修復されるような条件下で細胞を維持する段階、を含む。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる；すなわち、標的エンドヌクレアーゼおよびポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸を含むドナーポリヌクレオチドは、同時に細胞に投与できる、あるいは別個の段階で投与できる。
【００７２】
別の実施形態では、上述の細胞は、（ａ）表２に列挙されるゲノム遺伝子座内またはその近位の配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼ（またはその標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸）を細胞内に導入し；（ｂ）ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸配列、第一の上流の隣接配列、および第一の下流の隣接配列を含む、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドであって、上流配列および下流配列が段階（ａ）の標的エンドヌクレアーゼの認識配列を含む、ドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入し；かつ（ｃ）標的エンドヌクレアーゼが標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断を導入し、かつドナーポリヌクレオチドが線状化されるようにドナーポリヌクレオチドにおいて二本鎖切断を導入するような条件下であって、外因性配列を含む線状化されたドナーポリヌクレオチドは、外因性核酸が細胞のゲノム内に組み込まれるように、切断された染色体配列に直接ライゲートされる、条件下で細胞を維持することにより、調製されてもよい。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる。
【００７３】
従って、本開示は、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、少なくとも１つの外因性核酸配列を含む細胞を調製するための方法であって、（ａ）表２に列挙されるゲノム遺伝子座内またはその近位の配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼ（またはその標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸）を細胞内に導入すること；（ｂ）（ｉ）標的ゲノム遺伝子座と実質的な配列同一性を有する配列または（ｉｉ）標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する外因性核酸を含む、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入すること；および（ｃ）外因性核酸が細胞のゲノム内に組み込まれるような条件下で細胞を維持することを含む、方法を提供する。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる。
【００７４】
ポリヌクレオチド修飾酵素のための認識配列を含む外因性配列を含有するドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の直鎖状または環状であってもよい。一般に、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。ドナーポリヌクレオチドはベクターとすることができる。好適なベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを含む。ドナーポリヌクレオチドは、さらなる転写制御配列因子、選択マーカー配列、および／またはレポーター配列を含むことができる。
【００７５】
本明細書で説明するように、外因性核酸において提供されるポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも一つの認識配列は、好ましくは、細胞のゲノム中に内因性に存在しない核酸配列を含み得る。外因性核酸配列に対する他の追加および変形もまた、上記セクションＩに提供されている。例えば、外因性核酸配列は、任意に、少なくとも１つの選択マーカー、レポーター遺伝子のための少なくとも一つの配列、および／または少なくとも１つの調節制御因子配列を含んでもよい。さらに、外因性核酸配列は、認識配列が同一でも異なっていてもよい、ポリヌクレオチド修飾酵素のための複数コピーの認識配列を含んでもよい。
【００７６】
本開示の細胞を調製するための本明細書に記載される方法はまた、同時に複数の認識部位を含む細胞を調製するために用いてもよい。一態様では、細胞内に導入される外因性核酸は、第二のポリヌクレオチド修飾酵素のための第二の認識配列であって、第一の認識配列および第二の認識配列は異なるポリヌクレオチド修飾酵素によってそれぞれ認識されるものをさらに含む。代替的または追加的に、上述の方法の段階（ａ）から（ｃ）は、第二の認識配列を含む第二の外因性核酸、第二の上流の隣接配列、および第二の下流の隣接配列、ならびに第一の標的エンドヌクレアーゼによって標的とされるものとは異なるゲノム遺伝子座を標的とする第二の標的エンドヌクレアーゼを用いて、繰り返されてもよい。この工程はさらなる外因性核酸配列で繰り返すことができる。外因性核酸はさらなるプラスミドにおいて、あるいは別の好適な形式で提供されてもよい。標的遺伝子座は、上記の表２に示される遺伝子座であってもよく、あるいは当業者に知られた別の好適な遺伝子座であってもよい。当業者によって最も好都合とみなされるように、かかる段階は、段階（ａ）−（ｃ）に連続してまたは同時に行われ得る。いずれにしても、さらなる認識配列は、本明細書に開示されるような任意の認識配列とすることができる。
【００７７】
本開示のポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含有する外因性核酸を含む、例示的なプラスミドの模式図が図１に提供される。
【００７８】
一態様では、本方法は少なくとも1つの外因性核酸を含むプラスミドを細胞内に導入することを含む。外因性核酸は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位を含む。プラスミド中の外来配列は上流配列および下流配列に隣接し、上流配列および下流配列は、標的遺伝子座のいずれかの側と実質的な配列同一性を有するか、用いられる標的エンドヌクレアーゼのための認識部位を含むものである。
【００７９】
述べたように、一実施形態では、外因性核酸中のポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位は、染色体配列における標的切断部位のいずれかの側と実質的な配列同一性を共有する、上流配列および下流配列に隣接している。別の実施形態では、外因性核酸中のポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位は上流配列および下流配列に隣接し、これらの各々は、ゲノム内に外因性核酸を組み込むために用いられる標的エンドヌクレアーゼの認識配列を含む。当業者は、それらの公的に入手可能な配列に基づいて、表２で特定される遺伝子座のいずれかのための好適な隣接配列を容易に調製することができる。同様に、当業者は、本方法で用いられる標的エンドヌクレアーゼの既知の認識配列に基づいて、好適な隣接配列を容易に調製することができる。
【００８０】
外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド中の上流配列および下流配列は、標的染色体配列と（外因性配列を含む）ドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。本明細書で用いられる場合、上流配列は、標的切断部位のすぐ上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する、あるいは標的エンドヌクレアーゼの認識配列を含む、核酸配列を指す。同様に、この実施形態における下流配列は、標的切断部位のすぐ下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する、あるいは標的エンドヌクレアーゼの認識配列を含む、核酸配列を指す。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、語句「実質的な配列同一性」は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。従って、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド中の上流配列および下流配列は、標的切断部位または標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する（すなわち、上流または下流）染色体配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施形態では、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド中の上流配列および下流配列は、標的切断部位または標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する染色体配列と、約９５％または１００％の配列同一性を有してもよい。
【００８２】
上流または下流の隣接配列は、約１０ヌクレオチドから約２５００ヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、上流または下流の配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００ヌクレオチドを含んでもよい。例示的な上流または下流の隣接配列は、約２０から約２００ヌクレオチド、約２５から約１００ヌクレオチド、あるいは約４０から約６０ヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態では、上流または下流の隣接配列は、約２００から約５００ヌクレオチドを含んでもよい。
【００８３】
上流配列および下流配列に隣接する認識部位を含む外因性核酸の長さの合計は変わり得るし変わるだろう。外因性核酸は約２５ヌクレオチドから約５５００ヌクレオチドの長さの範囲であってもよい。様々な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、または５０００ヌクレオチド長であってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法で用いられるポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位を含む外因性核酸は、二本鎖、一本鎖、直鎖状または環状配列として提供されてもよい。例えば、外因性核酸は、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、消化により線状化されたポリヌクレオチド、ＰＣＲ断片、ネイキッド（ｎａｋｅｄ）核酸、またはリポソームもしくはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸であってもよい。典型的には、ポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位を含む外因性核酸はＤＮＡであるだろう。いくつかの実施形態では、外因性核酸はリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基を有するヌクレオチド、または修飾されたリボース部分を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノを含む。ヌクレオチドは、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせによって連結されてもよい。
【００８５】
標的エンドヌクレアーゼ（またはコードする核酸）、および本明細書に記載のポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位を含む外因性核酸は、様々な手段によって細胞内に導入され得る。好適な送達手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光トランスフェクション（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、専売薬剤で増強した核酸の取り込み、およびリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介する送達を含む。一実施形態では、標的エンドヌクレアーゼ配列と外因性核酸がヌクレオフェクションによって細胞内に導入されてもよい。別の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼ配列と外因性核酸がマイクロインジェクションによって細胞内に導入されてもよい。例えば、標的エンドヌクレアーゼ配列と外因性核酸は、細胞の核または細胞質内にマイクロインジェクションされてもよい。あるいは、標的エンドヌクレアーゼ配列と外因性核酸が一細胞胚の前核内にマイクロインジェクションされてもよい。
【００８６】
ポリヌクレオチド修飾酵素のための認識部位を含む１より多くの外因性核酸が細胞内に導入される実施形態では、分子は同時にまたは連続して導入されてもよい。例えば、認識部位を含む外因性核酸、各認識部位は特定のポリヌクレオチド修飾酵素に対して特異的である、は同時に導入されてもよい。あるいは、認識部位を含む各外因性核酸を連続して導入してもよい。
【００８７】
本方法は、少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸が標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるように、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断が相同組換えまたは直接的ライゲーションによって修復されるよう、適切な条件下で細胞を維持することを含む。
【００８８】
一般に、細胞は特定の細胞のための適切な条件下で維持される。好適な細胞培養条件は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１；およびＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載されている。当業者は、細胞を培養するための方法が当技術分野で知られており、かつ細胞の種類に応じて変わり得るし変わるだろうということを理解している。特定の細胞の種類のための最良の技術を決定するために、あらゆる場合において、ルーチンな最適化が用いられ得る。
【００８９】
細胞が一細胞胚である実施形態では、胚はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、細胞培養で）培養されてもよい。典型的には、胚は、二本鎖切断の修復を可能にし、胚の発生を可能にするように、適切な温度で必要なＯ２／ＣＯ２比を備える適切な培地中で培養される。培地の好適な非限定的な例は、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣ、およびＨＴＦ培地を含む。当業者は、培養条件が胚の種類に応じて変わり得るし変わるだろうということを理解するであろう。胚の特定の種類のための最良の培養条件を決定するために、あらゆる場合において、ルーチンな最適化が用いられ得る。
【００９０】
いくつかの例では、胚は、雌の宿主の子宮に胚を移植することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養されてもよい。一般的に言えば、雌の宿主は胚と同一または類似の種由来のものである。好ましくは、雌の宿主は偽妊娠である。偽妊娠の雌の宿主を調製する方法は当技術分野で知られている。さらに、雌の宿主に胚を移植する方法が知られている。ｉｎ  ｖｉｖｏで胚を培養することは胚が発生するのを可能にし、かつ胚由来の動物の出生をもたらし得る。
【００９１】
改変された染色体配列を含む動物を繁殖させて、改変された染色体配列についてホモ接合性である子孫を作製してもよい。同様に、ヘテロ接合性および／またはホモ接合性の動物が目的の遺伝子型を持つ他の動物と交配されてもよい。
【００９２】
ＩＶ．外因性配列を含む細胞の使用方法
一以上のランディングパッド配列、すなわち、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む一以上の外因性配列を含有する、本明細書に記載される細胞は、組換えタンパク質、例えば、生物医薬タンパク質の産生のために用いることができる。具体的には、ランディングパッドにおける認識配列は、目的のタンパク質をコードする配列の組込みのためのポリヌクレオチド修飾酵素（すなわち、標的エンドヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼ）によって、標的化できる。組換えタンパク質の産生のために再標的化できる一以上のランディングパッド含有する、本明細書に記載される方法および細胞を用いることには、いくつかの利点がある。第一に、（後続の再標的化のため）ランディングパッド配列を挿入するために安定したゲノム遺伝子座（単数）または遺伝子座（複数）を選択することにより、標的組込み（所望の遺伝物質の取り込み）の効率を増加させることによって、組換えタンパク質の産生を増加できる。ゲノムにおける既知の安定した位置内に目的の遺伝子配列（すなわち、組換えタンパク質配列）を組み込むための、高効率の標的エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼの使用は、組換えタンパク質配列の効率的な組込みだけではなく（標的エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼの組込み効率を増大させるようにゲノム遺伝子座（単数）または遺伝子座（複数）が選択され得る）、組込み後のタンパク質配列の継続的で安定的な発現をもたらす。その結果、これは細胞株の安定性の増大およびクローン対クローンおよび分子対分子（組換えタンパク質）の不均一性の低減につながり、細胞株開発時間の全体的な低減およびタンパク質産生の増大をもたらす。さらに、本明細書に記載される方法を用いて、複数コピーの同一の組換えタンパク質の標的組込みまたは１より多くの異なる組換えタンパク質の組込みのための複数のランディングパッド部位を含む細胞を生成することができ、それによって、達成できるタンパク質の産生に関して最大の柔軟性を提供できる。また、選択マーカー、レポーター配列、および／または調節制御因子配列などの任意の配列を含めることは、生物生産能力をさらにカスタマイズすることを可能にする。
【００９３】
従って、さらなる態様では、ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む、一以上のランディングパッドまたは外因性配列を含有する、本明細書に記載される細胞は、組換えタンパク質または目的のタンパク質の産生のために再標的化されてもよく、本方法は、（ａ）上流の隣接配列および下流の隣接配列により隣接される組換えタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの発現構築物を、本開示の細胞（ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含有する組み込まれた外因性配列を含む細胞）内に導入すること、ここで上流の隣接配列および下流の隣接配列は、段階（ｂ）の標的エンドヌクレアーゼの認識配列に隣接する染色体配列と実質的に同一である；（ｂ）細胞の染色体配列に組み込まれた外因性配列に存在する特定の認識配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼを細胞内に導入すること、ここで標的エンドヌクレアーゼは認識配列で二本鎖切断を導入する：および（ｃ）組換えタンパク質をコードする配列が染色体内に組み込まれるように、二本鎖切断が相同性指向プロセスによって修復されるような条件下で細胞を維持すること、を含む。組換えタンパク質は、標準的なタンパク質発現手順およびプロトコルを用いて再標的化された細胞から発現させることができる。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる；すなわち、組換えタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの発現構築物を含むドナーポリヌクレオチドおよび標的エンドヌクレアーゼは、同時に細胞に投与できる、あるいは別個の段階で投与できる。
【００９４】
さらに別の態様では、一以上のランディングパッド配列を含有する、本明細書に記載される細胞は、（ａ）ポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む組み込まれた外因性配列を含む細胞内に、細胞の染色体配列に組み込まれた外因性配列に存在する特定の認識配列を標的とする、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼを導入すること；（ｂ）標的エンドヌクレアーゼの認識配列により隣接される組換えタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの発現構築物を細胞内に導入すること；および（ｃ）標的エンドヌクレアーゼがランディングパッドにおける標的認識配列において二本鎖切断を導入し、かつ発現構築物が線状化されるように発現構築物において二本鎖切断を導入するような条件下で細胞を維持すること、ここで線状化された発現構築物は、組換えタンパク質をコードする配列が染色体内に組み込まれるように、切断された認識配列に直接的に連結される、によって、組換えタンパク質の産生のために再標的化されてもよい。組換えタンパク質は、標準的なタンパク質発現手順およびプロトコルを用いて再標的化された細胞から発現させることができる。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる。
【００９５】
さらに別の態様では、一以上のランディングパッド配列を含む、本明細書に記載される細胞は、（ａ）少なくとも１つの組み込まれた外因性リコンビナーゼ認識配列を含む細胞を提供すること；（ｂ）細胞の染色体配列に組み込まれたリコンビナーゼ認識配列を認識する少なくとも１つのリコンビナーゼを細胞内へ導入すること；（ｃ）リコンビナーゼのための認識部位により隣接される組換えタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの発現構築物を細胞内へ導入すること；（ｄ）組換えタンパク質をコードする配列が染色体内に組み込まれるように、発現構築物と染色体配列との間でリコンビナーゼが配列を交換するような条件下で細胞を維持することによって、組換えタンパク質の産生のために再標的化されてもよい。組換えタンパク質は、標準的なタンパク質発現手順およびプロトコルを用いて再標的化された細胞から発現させることができる。段階（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができる。
【００９６】
本発明の方法では、本明細書に記載されるように、発現構築物は当業者の知識および能力の範囲内で変化してもよい。例えば、発現構築物は複数コピーの単一の組換えタンパク質を含んでもよい。発現構築物は、代替的または追加的に、少なくとも２つの異なる組換えタンパク質をコードする配列を含んでもよい。発現構築物は、少なくとも１つの選択マーカー（後述する）、少なくとも１つのレポーター遺伝子配列、および／または少なくとも一つの調節配列因子を含んでもよい。例えば、組換えタンパク質をコードする配列は、真核細胞における発現のために好適なプロモーター制御配列に作動可能に連結できる。プロモーター制御配列は、構成的または調節されたもの（すなわち、誘導性または組織特異的）とすることができる。好適な構成的プロモーター制御配列は、サイトメガロウイルス初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの断片、または前述のいずれかの組み合わせを含むが、それらに限定されない。好適な誘導性プロモーター制御配列の非限定的な例は、抗生物質（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）によって調節されるもの、および金属イオン（例えば、メタロチオネイン１プロモーター）、ステロイドホルモン、小分子（例えば、アルコール調節プロモーター）、熱ショック等によって調節されるものを含む。組織特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、  Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型とすることができ、あるいは、それはより効率的または効果的な発現のために改変されてもよい。存在してもよい他の制御因子は、さらなる転写調節および制御因子（すなわち、部分的プロモーター、プロモータートラップ、開始コドン、エンハンサー、イントロン、インスレーター、ポリＡシグナル、終結シグナル配列、および他の発現因子）を含み、また存在できる。
【００９７】
組換えタンパク質は、生物治療および／または診断用途において有用なものを含む任意の組換えタンパク質、ならびに工業用途において有用な任意の組換えタンパク質とすることができる。例えば、組換えタンパク質は、限定なしに、抗体、抗体の断片、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、Ｆｃ領域、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、Ｆｃ融合タンパク質、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）（または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ））因子、血液成分、酵素、機能性食品タンパク質、糖タンパク質、前述のいずれかの機能的断片もしくは機能的バリアント、あるいは前述のタンパク質および／またはそれらの機能的断片もしくはバリアントのいずれかを含む融合タンパク質とすることができる。例示的な実施形態では、組換えタンパク質はヒトまたはヒト化タンパク質である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、および／またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）などの増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列に連結されてもよい。
【００９９】
他の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、蛍光タンパク質（好適な蛍光タンパク質は上記セクションＩに列挙されている）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、またはカルモジュリンなどのレポータータンパク質をコードする核酸配列に連結されてもよい。
【０１００】
Ｖ．キット
本開示のさらなる態様は、目的の組換えタンパク質の発現のためのキットを包含する。キットは、上記のヌクレオチド修飾酵素の認識部位を含む少なくとも１つの外因性配列、認識部位に対応する好適なポリヌクレオチド修飾酵素、および目的の組換えタンパク質をコードする配列の挿入のための構築物であって、認識部位配列または認識部位配列に隣接するゲノムＤＮＡに対応する一対の隣接配列をさらに含む構築物、を含む細胞株を含む。キットはまた、目的の組換えタンパク質をコードする配列の標的組込みを達成するための説明書を含む。一実施形態では、目的の組換えタンパク質をコードする配列の挿入のための構築物は、選択マーカーのための配列、レポーター遺伝子配列および／または調節制御因子配列をさらに含む。従って、キットは、上述した組換えタンパク質の発現および産生のために細胞を再標的化するのに有用な材料および試薬を提供する。
【０１０１】
いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載される認識部位を含む１より多くの外因性配列（すなわち、部位が同一でも異なっていてもよい１より多くの認識部位を生じる）、および認識部位に対応する適切なポリヌクレオチド修飾酵素を含む、細胞株を含む。
【０１０２】
いくつかの態様では、キットは、目的の組換えタンパク質をコードする配列の挿入のための１より多くの構築物であって、認識部位配列および／または認識部位配列に隣接するゲノムＤＮＡに対応する一対の隣接配列をさらに含む構築物を含む。
【０１０３】
細胞株は、所定量の生存細胞を含む試料中に提供される、ＣＨＯ細胞株細胞であってもよい。いくつかの態様では細胞は凍結されてもよい。
【０１０４】
キットはさらに、標的組込みを用いるタンパク質の組換え発現のための開示された方法を実施するために有用な、一以上のさらなる試薬を含んでもよい。キットは、一般に、一以上の別個の組成物として、または、任意に、試薬の共用性（ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）が可能である混合物として、試薬を保持する一以上の容器を備えるパッケージを含む。キットはまた、上記に詳述した方法のいずれかの段階を処理または実施するのに有用な、バッファー、希釈剤、培養培地／培地、標準、および／または任意の他の材料などの、ユーザーの観点から望ましいとされ得る他の材料を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書で提供されるキットは、好ましくは、上記セクション（Ｉ）において詳述した組換えタンパク質を発現させるための説明書を含む。キットに含まれる説明書は包装材料に固定されてもよく、あるいはパッケージ挿入物として含まれていてもよい。説明書は典型的には書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。かかる説明書を格納し、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体が本開示によって企図される。このような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等を含むが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１０６】
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参照は、当業者に、本発明において使用する用語のうちの多くの一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するとき、以下の用語は、別段に定めのない限りそれらに与えられた意味を有する。
【０１０７】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記（該）（ｓａｉｄ）」は、１つ以上の要素があることを意味することを意図する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙される要素以外の追加的な要素が存在する可能性があることを意味する。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指し、かかる調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにはかかわらない。従って、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素（ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、複製起点、マトリックス結合部位（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）、および遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定される必要はない。
【０１０９】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状または環状構造の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに対して限定的であるとして解釈されない。本用語は、天然のヌクレオチドの既知のアナログ、および塩基、糖、および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは同一の塩基対合特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対合する。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド修飾酵素」は、標的エンドヌクレアーゼまたは部位特異的リコンビナーゼを指す。標的エンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ様エンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼもしくは関連する単量体ハイブリッド、または人工的な標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤を挙げることができる。部位特異的リコンビナーゼとしては、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ−デルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼを挙げることができる。
【０１１１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合、用語「近位」はゲノム遺伝子座の近くの位置を意味する。近位の位置は、所定数のヌクレオチド、すなわち、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００ヌクレオチド、または５ｋｂ、５０ｋｂ、もしくは５００ｋｂおよびその間の値を含むより長い距離のヌクレオチド内の位置を指し得る。あるいは、一つの同定された遺伝子座に別の同定された遺伝子座よりも比較的近い場合、すなわち、遺伝子間配列、挿入は特定のゲノム遺伝子座に近接してもよい。
【０１１３】
本明細書で用いられる場合、用語「認識部位」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、ポリヌクレオチド修飾酵素によって認識され、結合される核酸配列を指す。ポリヌクレオチド修飾酵素は、認識部位に結合し、切断する標的エンドヌクレアーゼであってもよい。あるいは、ポリヌクレオチド修飾酵素は、認識部位を含有する配列間の交換を媒介するリコンビナーゼであってもよい。
【０１１４】
「上流」および「下流」という用語は、固定された位置に対する核酸配列内の位置を指す。上流は、位置に対して５’である領域（すなわち、鎖の５’端付近）を指し、また下流は、位置に対して３’である領域（すなわち、鎖の３’端付近）を指す。
【０１１５】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において既知である。典型的には、かかる技術は、遺伝子に関してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も同様に、この様式で決定および比較されることが可能である。一般に、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸との一致を指す。二以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列された配列間の正確な整合の数を、より短い方の配列の長さで除して、１００を乗じたものである。核酸配列に関するおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）によって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコア付けマトリックスを用いて、アミノ酸配列に適用し、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化することができる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーション内のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、当技術分野において一般に既知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルタ＝無、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予期＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０配列、ソート順＝ハイスコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトに見出すことが可能である。本明細書に説明する配列に関して、配列同一性の所望の度合いの範囲は、約８０％〜１００％、およびこれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、および��も好ましくは９８％配列同一性である。
【０１１６】
本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、変更および変形が可能であることは明らかであろう。また、上に挙げた実施形態または反復のいずれかを任意の組合せで組み合わせることができる。
【実施例１】
【０１１７】
実施例１：ＺＦＮ認識ランディングパッドの挿入
塩基対１２９３１−１２９７０でのＲｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６およびＮｅｕ３を標的とするようにＺＦＮ対を設計した。Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１  塩基対１２９３１−１２９７０、Ｒｏｓａ２６、またはＮｅｕ３を標的とするＺＦＮを、懸濁適応ＣＨＯ  Ｋ１細胞株に個別にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、トランスフェクトされたプールにおけるＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６およびＮｅｕ３部位でのＺＦＮの切断効率を、ＣＥＬ−Ｉ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより、またはインデル（挿入／欠失）の直接配列決定により評価した。ＺＦＮ活性がインデルの直接配列決定により算出された場合、各個々の部位から少なくとも４０個のＰＣＲアンプリコンを分析に用いた。ＺＦＮ活性は、内因性ＣＨＯ部位ＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６およびＮｅｕ３部位で、それぞれ、約１６％、３１％および４１％であると推定された。
【０１１８】
ＺＦＮ検証に続いて、ｈＡＡＶＳ１  ＺＦＮ対のための認識配列を含むランディングパッドを、ＣＨＯゲノムにおけるこれらの三つの異なる部位：Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６、およびＮｅｕ３に導入した。図１に示されるように、Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１，  Ｒｏｓａ２６およびＮｅｕ３配列に対する５’および３’ホモロジーアームにより隣接されるＡＡＶＳ１  ＺＦＮ認識配列を含有するドナープラスミドが構築された。
【０１１９】
図１に示されるプラスミドドナーを、懸濁適応ＣＨＯ  Ｋ１細胞株内へ、Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１  塩基対１２９３１−１２９７０、Ｒｏｓａ２６、またはＮｅｕ３を標的とするＺＦＮとコトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、トランスフェクトされたプールにおけるＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６およびＮｅｕ３部位の各々でのＺＦＮの切断効率を、ＣＥＬ−Ｉ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより確認した。
【０１２０】
陽性のＣＥＬ−Ｉの結果に続いて、指定された３つの遺伝子座内へのＡＡＶＳ１ランディングパッドの標的組込みがトランスフェクトされたプールにおいて起こったかどうかを決定するために、ジャンクションＰＣＲが行われた。ジャンクションＰＣＲは、図２に示されるように、左（５’）ホモロジーアーム（「ＬＨＡ」）または右（３’）ホモロジーアーム（「ＲＨＡ」）のすぐ外側のＣＨＯゲノムＤＮＡに相同なプライマーならびにＡＡＶＳ１ランディングパッドに相同な相補的プライマーを用いて行われた。陽性ＰＣＲ産物は、遺伝子座の各々について、ＺＦＮ媒介標的組込み（ＴＩ）事象がトランスフェクトされたプールに存在したことを示した。
【実施例２】
【０１２１】
実施例２：ＺＦＮ認識ランディングパッドの活性
実施例１で調製されたジャンクションＰＣＲ陽性のトランスフェクトされたプールが、限界希釈クローニングによって単一細胞クローニングされた。単一細胞クローンが、実施例１で説明されるように、ジャンクションＰＣＲによってＮＷ＿００３６１８２０７．１、Ｒｏｓａ２６、およびＮｅｕ３でのランディングパッドの組込みに関してスクリーニングされた。陽性クローンがスケールアップされ、解析された。
【０１２２】
Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座で両方の対立遺伝子上に組み込まれたヒトＡＡＶＳ１ランディングパッドを示すクローンが単離され、スケールアップされた。Ｎｅｕ３遺伝子座で単一の対立遺伝子上にＡＡＶＳ１ランディングパッドを示すクローンが単離され、スケールアップされた。ＡＡＶＳ１  ＴＩクローンは、次いで、ヒトＡＡＶＳ１  ＺＦＮ対で個別にトランスフェクトされた。トランスフェクションの３日後、ＣＥＬ−ＩアッセイあるいはＰＣＲおよびインデルの直接配列決定を、上記のＴＩクローンにおけるｈＡＡＶＳランディングパッドで行い、外因性ランディングパッドにおけるＡＡＶＳ１  ＺＦＮ切断効率を評価した。３つの遺伝子座に組み込まれたＡＡＶＳ１  ＺＦＮ認識配列に隣接するフォワードおよびリバースプライマー（図２に示される、ｊＰＣＲ  Ｆ３およびＲ）。ＰＣＲ産物が、直接配列決定され、あるいはＣＥＬ−Ｉヌクレアーゼで処理され、ゲル電気泳動によって解析された。
【０１２３】
ＰＣＲ産物を直接、配列決定した場合、Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１遺伝子座での結果は、５２％の平均ｈＡＡＶＳ１ＺＦＮ切断効率を示した。ＣＥＬ１アッセイを用いた場合、Ｒｏｓａ２６遺伝子座でランディングパッドを示す調製されたクローンは、１８％の平均ｈＡＡＶＳ１  ＺＦＮ切断効率を示した。Ｎｅｕ３遺伝子座でランディングパッドを示す調製されたクローンは、ＰＣＲ産物を直接配列決定することにより、１６％の平均ｈＡＡＶＳ１  ＺＦＮ切断効率を示した。細胞増殖および生存率における不利な表現型の変化が、Ｎｅｕ３遺伝子座に組み込まれたランディングパッドを含有するクローンで観察された、これはＲｏｓａ２６およびＲｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１と比較した場合の、低い効率の主な原因であるだろう。
【０１２４】
これらの結果は、外因性ＺＦＮ認識配列を正確な位置でＣＨＯゲノム内に組み込み、操作されたランディングパッドを生成できることを示す。
【実施例３】
【０１２５】
実施例３：ＺＦＮ認識ランディングパッドでの組換えタンパク質の組込み
Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＮＷ＿００３６１８２０７．１などの、挿入のためのＣＨＯゲノム遺伝子座は、所望の発現特性および／または組込みの容易さに基づいて決定することができる。ＺＦＮなどの標的エンドヌクレアーゼは、選択されたゲノム遺伝子座に基づいて選択または設計することができる。実施例１および２に記載されるように、プラスミドは、一以上の認識配列、レポーターおよび／または選択マーカー、ならびに一以上の調節因子を含有する好適なランディングパッドを含むよう調製することができる。プラスミドは標的エンドヌクレアーゼとともにＣＨＯ細胞内に挿入することができ、かつランディングパッドの組込みは、ＰＣＲ、配列決定、またはサザンブロットなどの方法を用いて確認できる。
【０１２６】
組換えタンパク質発現構築物は、次いで、ランディングパッド部位での標的組込みのために調製することができる。標的組込みにとって所望の配列（「ペイロード」）は、ＩｇＧ重鎖および／またはＩｇＧ軽鎖、ならびに選択可能なマーカーのための別のものなどの、目的の組換えタンパク質のための１つまたは２つ、二以上の独立した発現カセットを含むことができる。ペイロードは、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、一対のＺＦＮ）を用いる相同性指向プロセスによる組込みを可能にするために、５’および３’ホモロジーアームに隣接され得る。あるいは、ペイロードは、それぞれ付着性の粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄｓ）の直接的ライゲーションまたはリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介したペイロードの標的組込みを可能にするように、標的エンドヌクレアーゼ認識配列（すなわち、ＺＦＮ認識配列）、あるいは部位特異的リコンビナーゼ認識配列に隣接され得る。概略が図３に提供される。次いで、細胞をスクリーニングして、組込みがランダムではなく標的部位で発生したことを確認できる。次いで、細胞を、組換えタンパク質（単数）またはタンパク質（複数）の産生のために用いることができる。
【０１２７】
これらの解析の結果は、利用可能な選択方法を用いる場合、標的組込みがランダム組込みよりも大きな割合で発生すること、および組換えタンパク質の発現が、安定、均質であり、組換えタンパク質がランダムに組み込まれた細胞と比較して好適なレベルで提供されることを実証すると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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