(57)【要約】  本発明は、細い注射針を介して周囲温度で液体ゾルとして注射され、ヒトまたは動物の体内の温かい組織に挿入されると高度に粘性のゲルに変化する、熱ゲル化性ペプチド送達システムに関する。好ましい実施形態では、前記システムは、疎水性ペプチド、キトサン、およびグルコースリン酸の使用に基づく。
2016540813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）薬学的に活性なペプチドまたは薬学的に許容されるその任意の塩、
（ｂ）キトサン、修飾キトサンまたはキトサン誘導体、
（ｃ）糖リン酸エステル、および
（ｄ）水
を含む、薬物送達システム。
【請求項２】
１つの前記ペプチドが疎水性である、請求項１に記載の薬物送達システム。
【請求項３】
１つの前記ペプチドが疎水性塩の形態で存在し、例えば、前記ペプチドがパモ酸塩として存在する、請求項１または２に記載の薬物送達システム。
【請求項４】
１つの前記ペプチドが、ソマトスタチンアナログ、例えば、オクトレオチド、パシレオチド、バプレオチドまたはランレオチド、好ましくはオクトレオチドまたはパシレオチド、より好ましくはパシレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項５】
前記キトサンが、７０〜９５％の脱アシル化度（ＤＤ）、好ましくは８５〜９５％のＤＤ、より好ましくは９０±２．５％のＤＤを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項６】
前記キトサンが、２０〜３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）、好ましくは８０〜２００ｋＤａのＭＷ、より好ましくは１００〜１５０ｋＤａのＭＷ、さらにより好ましくは１３５±２０ｋＤａのＭＷを有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項７】
前記キトサンが、５０〜１００％の脱アシル化度（ＤＤ）および３〜３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）、好ましくは８５〜９５％のＤＤおよび１００〜２００ｋＤａのＭＷ、より好ましくは８５〜９５％のＤＤおよび１００〜２００ｋＤａのＭＷを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項８】
前記糖リン酸エステルの糖が、単糖、二糖、またはオリゴ糖、好ましくはアルドース、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースの群、またはケトース、例えばフルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース、アラボケトース、キシロケトース、またはそれらの混合物の群から選択される単糖、好ましくはグルコースもしくはフルクトースまたはそれらの混合物である、請求項１から７のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項９】
前記糖リン酸エステルが、グルコースリン酸、好ましくはグルコース−１−リン酸、好ましくはα−Ｄ−グルコース−１−リン酸、より好ましくはα−Ｄ−グルコース−１−リン酸二ナトリウム水和物である、請求項１から８のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１０】
薬物送達システムの総重量を基準として、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、１〜３０重量％、２〜１０重量％、または２〜５重量％、好ましくは２〜５重量％の前記ペプチドをその遊離塩基形態で含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
薬物送達システムの総重量を基準として、０．１〜１０重量％、０．５〜５重量％、または１〜２重量％、好ましくは１〜２重量％の前記キトサンを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１２】
薬物送達システムの総重量を基準として、５〜５０重量％、好ましくは１０〜２５重量％の前記薬物送達システムの前記糖リン酸エステルを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１３】
薬物送達システムの総重量を基準として、以下を含む、実質的に以下を含む、本質的に以下からなる、または以下からなる、好ましくは以下からなる：
（ａ）遊離塩基形態、好ましくはパモ酸塩として存在する、好ましくはパシレオチドパモ酸塩である、２〜５重量％の疎水性ペプチド、
（ｂ）酸に供され、好ましくは塩酸に供される、９０±２．５％のＤＤおよび１３５±２０ｋＤａのＭＷを有する、１〜２重量％のキトサン、
（ｃ）１０〜２５重量％のグルコース−１−リン酸、および
（ｄ）水、
請求項１から１２のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の薬物送達システムの調製方法であって、
（１）酸性水溶液、好ましくは塩酸溶液にキトサンを溶解させるプロセスステップ、
（２）水性媒体、好ましくは水に糖リン酸エステルを溶解させるプロセスステップ、
（３）ペプチドを糖リン酸エステル溶液に溶解、部分的に溶解、または分散させる、好ましくはペプチドを分散させるプロセスステップ、および
（４）ペプチド／グルコースリン酸溶液および／または懸濁液を、キトサン溶液と合わせるプロセスステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（３）および（４）にさらに進む前に、ステップ（１）および（２）から得られる溶液が例えば１〜１２℃、好ましくは２〜８℃に冷却される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（３）が超音波の使用を含み、低温条件下で行われる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（４）において、前記ペプチド／グルコースリン酸溶液が低温条件下で前記キトサン溶液に加えられる、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法によって得られる薬物送達システム。
【請求項１９】
筋肉内または皮下使用、好ましくは皮下使用のための、請求項１から１３のいずれか一項、または請求項１８に記載の薬物送達システム。
【請求項２０】
アンプル、バイアル、またはプレフィルドシリンジ中の液体、好ましくは懸濁液の形態、好ましくは２１Ｇ以下の、好ましくは２５Ｇ以下の注射針を備えたプレフィルドシリンジ中の懸濁液の形態の、請求項１から１３、請求項１８、または請求項１９のいずれか一項に記載の薬物送達システムを含む剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細い注射針を介して周囲温度で液体ゾルとして注射され、ヒトまたは動物の体の温かい組織内に挿入されると高度に粘性のゲルに変化する、熱ゲル化性ペプチド送達システムに関する。次いで、該ペプチドは、熱的に誘導されたヒドロゲルから周囲の組織内に長期間にわたって制御された方式で放出される。
【背景技術】
【０００２】
多くの薬学的に活性なペプチドは、そのほとんどが胃腸管で分解する傾向にあるので、経口投与によって効果的に送達することができない。その結果、これらのペプチドは、非経口的に送達しなければならない。しかし、ペプトイド薬物の皮下組織または筋肉組織への非経口投与は、針注射による患者の不快感を伴う。多くのペプチドは数時間または１時間未満の短い半減期しか有していないので、これらの侵襲的な注射はかなり頻繁に繰り返す必要がある。そのため、その注射を行わなければならない頻度を減少させるために、インプラントまたは微粒子懸濁液の形態での非経口デポ製剤が開発されてきた。
【０００３】
慢性疾患に罹患している患者の快適さのために、非常に細い針によって注射できる徐放性薬物送達システムに向けて、今日の利用可能なデポ製剤技術をさらに開発する必要性がある。
【０００４】
液体ゾルとして注射することができ、非常に粘性のあるヒドロゲルとして凝固する、熱的に誘導されたヒドロゲルが提言された。しかしながら、これらのヒドロゲルの多くは、水性媒体に溶解させると、注射のために大きな針サイズがまた必要とされる高度に粘性の液体に変わる、高分子量ポリマーに基づく（例えば、X. Chen et al., J. Biomat. Applications 2011, 27(4), 391-402では、高ＭＷ（５００ｋＤａ）キトサンの使用のために、ゾルは針なしシリンジを用いて点眼しなければならなかった）。これまで提案されたシステムのさらなる問題は、流体がヒドロゲルに変化する直前に薬物のかなりの量が既に組織に放出されるための、注射直後の非常に強い薬物放出（いわゆる「バースト」）である。なおさらに、システムによっては、安定性の問題を有しており、保存時間中に既にヒドロゲルに変化してしまい、後の注射のための使用を不可能にさせる（例えば、従来、例えばＷＯ９９／０７４１６に記載されているようなキトサン／β−グリセロリン酸系について本発明の発明者によって観察されるように）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、患者の不快感を最小限にし、快適さ、安全性、および患者自身および臨床医療従事者によって行われる注射の操作性を最大限にするために、以下の要件をすべて満たす徐放性ペプチド薬物送達システムの必要性が依然として存在する：
すぐに使える（すぐに注射できる状態の薬物製品、特に準備の手間を必要としない、例えば、注射懸濁液を得るために乾燥粉末を水性ビヒクルで再構成する必要がない）、
非常に細い針（例えば、２１Ｇ以下）による注射可能性、
長期間（例えば、１ヶ月または数ヶ月）にわたる徐放性薬物放出、
生体適合性（例えば、どの成分も注射後に疼痛を全く引き起こさない）、
生分解性（例えば、すべての成分が妥当な時間後、体によって完全に再吸収されて、反復注射事象後のあらゆる成分の蓄積が回避される）、
妥当な貯蔵寿命にわたる物理的安定性（例えば、低温条件下または室温での保存中、経時的な、保存されたシステムのゾル品質の変化がない）、
賦形剤の良好な安全性プロファイル。
【０００６】
本発明は、驚くべきことにこれら要件のすべてを満たし、よって、商業的に実行可能なペプチド送達システムである。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、
（ａ）薬学的に活性なペプチドまたは薬学的に許容されるその任意の塩、例えばパシレオチドパモ酸塩、
（ｂ）キトサン（ＣＳ）、修飾キトサンまたはキトサン誘導体、
（ｃ）糖リン酸エステル、好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｇ１-Ｐ）、および
（ｄ）水
を含む、薬物送達システムを提供する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、第１の態様で定義された薬物送達システムの調製方法であって、
（１）酸性水溶液、好ましくは塩酸溶液にキトサンを溶解させるプロセスステップ、
（２）水性媒体、好ましくは水に糖リン酸エステルを溶解させるプロセスステップ、
（３）ペプチドを糖リン酸エステル溶液に溶解、部分的に溶解、または分散させる、好ましくはペプチドを分散させるプロセスステップ、および
（４）ペプチド／グルコースリン酸溶液、および／または懸濁液を、キトサン溶液と合わせるプロセスステップ
を含む、方法を提供する。
【０００９】
第３の態様では、第２の態様の方法によって得られる薬物送達システムが提供される。
【００１０】
第４の態様では、筋肉内または皮下使用、好ましくは皮下使用のための、第１〜第３の態様の薬物送達システムが提供される。
【００１１】
第５の態様では、アンプル、バイアル、またはプレフィルドシリンジ中の液体の形態の、第１、第３、または第４の態様の薬物送達システムを含む剤形が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＳ／Ｇ１-Ｐヒドロゲル対ＣＳ溶液からのパシレオチド放出プロファイル（平均±ＳＤ、ｎ=３）を示し、対照に対比する該ペプチドの制御された薬物放出を実証する図である。
【図２】初期添加の関数としてのＣＳ／Ｇ１−Ｐヒドロゲルからのパシレオチド放出プロファイルを示す図である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図３】２〜８℃および２０〜２５℃で保存されたＣＳ溶液およびＣＳ／ゲル化剤系についての２０．０±０．２℃での見かけの剪断粘度を示し（ｎ＝３）、参照実施形態に対比する本発明の実施形態の良好な物理的安定性を実証する図である。
【図４】２〜８℃および２０〜２５℃で保存されたＣＳ／ゲル化剤溶液の、３７℃でのレオロジーによって決定されたゲル化時間の進展を示し（ｎ＝３）、これは、参照実施形態に対比する本発明の実施形態の良好な物理的安定性を実証する図である。
【図５】２３Ｇ、２５Ｇおよび３０Ｇ針で２つの注射速度で大気中に注射された１ｍＬ  ＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液（１．５ｗｔ．％ＣＳおよび０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐ）の注射力を示し（ｎ＝１０）、本発明の実施形態の良好な注射可能性を実証する図である。
【図６】非濾過および０．２μｍ膜（ｎ＝３）による濾過によって殺菌された、１．５ｗｔ．％ＣＳ／０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐ溶液の３つの異なったバッチについてＣＳの相対Ｍｗを示し、非経口使用に好適とするために本発明の実施形態を殺菌する実現可能性を実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に記載し、例示する。
【００１４】
本発明の態様では、ペプチドは、好ましくは疎水性である。一実施形態では、ペプチドは、そのアミノ酸の性質によって疎水性である。別の実施形態では、ペプチドは、塩、例えばジブニン酸塩、ナフトエ酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩／エンボン酸塩、ステアリン酸塩、キシナホ酸塩等の塩としてのペプチドを疎水性にするその対イオンによって疎水性である。好ましい実施形態では、ペプチドは、パモ酸塩として存在し、より好ましくは、モノパモ酸塩として存在する。
【００１５】
好ましい実施形態では、疎水性ペプチドまたはその塩は、アモルファス形態で存在し（結晶度＜２０％、好ましくは＜５％）、（例えば、ジェットミルによって）ｘ９０＜＝１０μｍ、例えば３μｍ、ｘ５０＜＝５μｍ、例えば１μｍ、ｘ１０＞＝０．３μｍ、例えば０．７μｍの粒径分布（レーザー光回折による）に微粉化され、＞＝８ｍ２／ｇ、例えば３２ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴによる）を有する。
【００１６】
さらに別の好ましい実施形態では、ペプチドは、ソマトスタチンアナログ、例えば、オクトレオチド、パシレオチド、バプレオチドまたはランレオチド、好ましくはオクトレオチドまたはパシレオチド、より好ましくはパシレオチドである。好ましい実施形態では、疎水性ペプチドは、オクトレオチドパモ酸塩またはパシレオチドパモ酸塩である。
【００１７】
本明細書における「疎水性」は、１０〜３３、１〜１０または０．１〜１ｇ／Ｌの溶解性の範囲での溶解性についての薬局方（ＵＳＰおよびＰｈＥｕｒ）記述用語に従って、それぞれ、周囲温度（例えば２０〜２５℃）の水にやや溶けにくい、溶けにくいまたは極めて溶けにくい原薬の性質を言う。好ましくは、疎水性ペプチドは、周囲温度で水に極めて溶けにくく、好ましくは、周囲温度での水への溶解度は約１ｇ／Ｌ以下である。例えば、疎水性ペプチドは、０．０２ｇ／Ｌの水への溶解度を有するパシレオチドパモ酸塩、もしくは０．２ｇ／Ｌ（２５℃）の水への溶解度を有するオクトレオチドパモ酸塩であり、または、約０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ  ｐＨ７．４）溶解度を有するバプレオチドパモ酸塩である。
【００１８】
本発明の態様では、キトサン、修飾キトサンまたはキトサン誘導体（例えば、キトサンＨＣｌ、カルボキシメチルキトサン、キトサン乳酸塩、キトサン酢酸塩）が使用される。好ましい実施形態では、７０〜９５％の脱アシル化度（ＤＤ）、好ましくは８５〜９５％のＤＤ、より好ましくは９０±２．５％のＤＤを有するキトサンが使用される。好ましい実施形態では、２０〜３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）、好ましくは８０〜２００ｋＤａのＭＷ、より好ましくは１００〜１５０ｋＤａのＭＷ、さらにより好ましくは１３５±２０ｋＤａのＭＷを有するキトサンが使用される。
【００１９】
好ましい実施形態では、キトサンは、５０〜１００％の脱アシル化度（ＤＤ）および３〜３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）、好ましくは８５〜９５％のＤＤおよび１００〜２００ｋＤａのＭＷ、より好ましくは８５〜９５％のＤＤおよび１００〜２００ｋＤａのＭＷを有する。キトサンは、例えばＨｅｐｐｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ（Ｓａａｌｅ）、Ｇｅｒｍａｎｙによって、例えば、キトサン９０／１０（ＤＤ  ８７．６〜９２．５％、粘度８〜１５ｍＰａｓは、約２０〜１００ｋＤａのＭＷ（ＧＰＣ）に相当する）、キトサン９０／２０（ＤＤ  ８７．６〜９２．５％、粘度１６〜３０ｍＰａｓは、約４０〜１５０ｋＤａのＭＷ（ＧＰＣ）に相当する）、キトサン９０／５０（ＤＤ  ８７．６〜９２．５％、粘度３１〜７０ｍＰａｓは、約８０〜２００ｋＤａのＭＷ（ＧＰＣ）に相当する）、キトサン９０／１００（ＤＤ  ８７．６〜９２．５％、粘度７１〜１５０ｍＰａｓは、約１００〜２５０ｋＤａのＭＷ（ＧＰＣ）に相当する）、またはキトサン９０／２００（ＤＤ  ８７．６〜９２．５％、粘度１５１〜３５０ｍＰａｓは、約１５０〜３００ｋＤａのＭＷ（ＧＰＣ）に相当する）の種類で得られる。粘度は、２０℃で１％酢酸中の１％キトサン溶液として測定される。本発明の好ましい実施形態では、キトサン９０／５０が使用される。
【００２０】
本発明の態様では、糖リン酸エステルが使用される。本発明の実施形態では、前記糖リン酸エステルの糖は、単糖、二糖、またはオリゴ糖、好ましくはアルドース、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースの群、またはケトース、例えばフルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース、アラボケトース（araboketose）、キシロケトース、またはそれらの混合物の群から選択される単糖であり、好ましくはグルコースもしくはフルクトースまたはそれらの混合物である。
【００２１】
好ましい実施形態では、前記糖リン酸エステルは、グルコースリン酸、好ましくはグルコース−１−リン酸、好ましくはα−Ｄ−グルコース−１−リン酸、より好ましくはα−Ｄ−グルコース−１−リン酸二ナトリウム水和物である。
【００２２】
本発明の態様では、薬物送達システムは、薬物送達システムの総重量を基準として、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、１〜３０重量％、２〜１０重量％、または２〜５重量％、好ましくは２〜５重量％のペプチドを遊離塩基形態で含む。
【００２３】
本発明の態様では、薬物送達システムは、薬物送達システムの総を基準として、０．１〜１０重量％、０．５〜５重量％、または１〜２重量％、好ましくは１〜２重量％のキトサンを含む。
【００２４】
本発明の態様では、薬物送達システムは、薬物送達システムの総重量を基準として、５〜５０重量％、好ましくは１０〜２５重量％の薬物送達システムの糖リン酸エステルを含む。好ましい実施形態は、薬物送達システムの総重量基準で、１０、１５、および２０重量％の糖リン酸エステル、グルコース−１−リン酸を含む。それらの好ましい実施形態では、パーセンテージ値は、それぞれ、０．２７、０．４０、および０．５３ｍｍｏｌ／ｇに相当する。
【００２５】
好ましい実施形態では、薬物送達システムは、薬物送達システムの総重量を基準として、以下を含む、実質的に以下を含む、本質的に以下からなる、または以下からなる、好ましくは以下からなる：
（ａ）遊離塩形態、好ましくはパモ酸塩として存在する、好ましくはパシレオチドパモ酸塩である、２〜５重量％の疎水性ペプチド、
（ｂ）酸に供され、好ましくは塩酸に供される、９０±２．５％のＤＤおよび１３５±２０ｋＤａのＭＷを有する、１〜２重量％のキトサン、
（ｃ）１０〜２５重量％のグルコース−１−リン酸、および
（ｄ）水。
【００２６】
本発明の第２の態様では、第１の態様によって定義された薬物送達システムの調製方法であって、
（１）酸性水溶液、好ましくは塩酸溶液にキトサンを溶解させるプロセスステップ、
（２）水性媒体、好ましくは水に糖リン酸エステルを溶解させるプロセスステップ、
（３）ペプチドを糖リン酸エステル溶液に溶解、部分的に溶解、または分散させる、好ましくはペプチドを分散させるプロセスステップ、および
（４）ペプチド／グルコースリン酸溶液および／または懸濁液をキトサン溶液と合わせるプロセスステップ
を含む、方法が提供される。
【００２７】
好ましい実施形態では、ステップ（３）および（４）にさらに進む前に、ステップ（１）および（２）から得られる溶液が例えば１〜１２℃、好ましくは２〜８℃に冷却される。
【００２８】
好ましい実施形態では、ステップ（３）は超音波の使用を含み、低温条件下で行われる。低温条件は、例えば、超音波処理中およびその後に、ステップ（３）に関与する成分が１〜１２℃の範囲、好ましくは２〜８℃の範囲で確実に維持される条件である。
【００２９】
ステップ（４）において好ましい実施形態では、低温条件下でペプチド／グルコース-リン酸溶液がキトサン溶液に添加される。低温条件は、例えば、添加中およびその後に、ステップ（４）に関与する成分が１〜１２℃の範囲、好ましくは２〜８℃の範囲で確実に維持される条件である。
【００３０】
第３の態様では、第２の態様の方法によって得られる薬物送達システムが提供される。
【００３１】
本発明の第４の態様では、第１または第３の態様の薬物送達システムは、筋肉内または皮下使用のためである。好ましい実施形態では、薬物送達システムは皮下使用のためである。好ましい実施形態では、薬物送達システムは、２１Ｇ、２３Ｇ、２５Ｇ、または３０Ｇ針によって、好ましくは２５針によって皮下組織に送達される。
【００３２】
本発明の第５の態様では、第１、第３または第４の態様の薬物送達システムを含む剤形は、アンプル、バイアル、またはプレフィルドシリンジ、好ましくはプレフィルドシリンジ中の液体の形態にある。好ましい実施形態では、プレフィルドシリンジは、２１Ｇ、２３Ｇ、２５Ｇ、または３０Ｇ針、好ましくは２５針を備えている。
【００３３】
好ましい実施形態として、第１、第３、第４または第５の態様の薬物送達システムは、９０％以上が３０μｍ未満の弦長の、ペプチドまたはペプチド塩粒子を含む微細かつ均一な懸濁液の形態にある（例えば、ラセンテックによるレーザー光走査プローブを有する、収束ビーム反射測定法、ＦＢＲＭ、によって測定）。
【００３４】
前記懸濁液は、アンプル、バイアルまたはプレフィルドシリンジに充填することができ、長い保存時間後にも、使用直前にゆっくりと振盪さえすればよい程十分安定である。
【実施例】
【００３５】
材料：
以下の実施例で使用されるキトサン（ＣＳ）は、技術等級、例えばＣｈｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）９０／５０、または医薬等級、例えばＣｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（バッチ１）およびＣｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（バッチ２）で、例えばＨｅｐｐｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ（ＨＭＣ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。これらのキトサンの粘度は、２０℃（１％酢酸中１％）で、粘度計（ブルックフィールドＤＶＩ＋ｐｒｏ）で測定され、粘度のデータは３１〜７０ｍＰａｓの範囲である。ＤＤは、測光または滴定のいずれかによって測定され、ＤＤデータは８７．６〜９２．５％の範囲にある。ＭＷは、屈折率（ＲＩ）検出と組み合わせて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定し、ＭＷデータは８０〜２００ｋＤａの範囲にある。α−Ｄ−グルコース−１−リン酸二ナトリウム塩水和物（Ｇ１−Ｐ、Ｍｗ：３７６．１６ｇ／ｍｏｌ）および塩酸（ＨＣｌ）は、様々なソースから市販されている。ペプチドパシレオチドの合成は、以前に、例えばＷＯ０２／１０１９２に記載されている。精製水、例えばＭｉｌｌｉＱ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）によって得られるＵｌｔｒａｐｕｒｅ（登録商標）水を使用した。
【００３６】
キトサンの物理的特性決定
本発明のために使用されたＣＳは、２つのＶｉｓｃｏＧｅｌ  Ａ６０００Ｍ（混床式）カラム（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙ  ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ、ＵＳＡ）上で、トリプル検出ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって特性決定した。装置は、光散乱セルに連結したサイズ排除クトマトグラフ；屈折率検出器、および粘度計からなり、絶対ポリマー分子量（Ｍｗ）、流体力学半径および固有粘度（η）の同時決定を可能にする。０．３Ｍ酢酸、０．３Ｍ酢酸ナトリウム、１％エチレングリコール移動相で、３０℃で、０．７ｍＬ／分の流速および０．１６３ｍＬ／ｇのｄｎ／ｄｃを用いて、分析を行った。ＣＳサンプルを１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、同一バッファ中に撹拌下２４ｈ溶解し、次いで、分析前に０．２μｍフィルターを用いて濾過した。注入体積は１００μＬであった。システムのキャリブレーションは、Ｖｉｓｃｏｔｅｋから入手したプルラン標準品（Ｍｗ＝１３３ｋＤａ、［η］＝０．５１５ｄＬ／ｇ、多分散性指数Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０８）を用いて行った。物理的データの評価のために、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ製のＯｍｎｉＳＥＣソフトウェアを使用した。ＣＳサンプルの各特性決定は二連で行った。
【００３７】
結果を表１に報告する。
【００３８】
【表１】
2016540813.tif 000003
【００３９】
製剤の調製
ＣＳ溶液：
ＣＳ溶液は、０．９：１に等しいキトサンアミン基：ＨＣｌのモル比に従って、塩酸（ＨＣｌ）中に３．７５ｗｔ．％ＣＳを溶解することによって得た。
Ｇ１−Ｐ溶液：
Ｇ１−Ｐ溶液は、ＭｉｌｌｉＱ水に３５０ｍｇ／ｍＬ−１で調製した。
【００４０】
ペプチド添加ＣＳ／Ｇ１−Ｐ懸濁液および粒径決定：
ペプチドパシレオチドパモ酸塩をＧ１−Ｐ溶液に加え、２ｈ磁気撹拌によって分散させ、氷浴中で磁気撹拌下、超音波プローブを用いて２分超音波処理した（振幅８０％、サイクル１、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＰ４００Ｓ超音波プロセッサ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。次いで、３．６０ｇ  Ｇ１−Ｐ／ペプチド懸濁液を、氷浴中で磁気撹拌下、２．４０ｇの冷ＣＳ溶液に滴下した。光学顕微鏡法および収束ビーム反射測定法（ＦＢＲＭ）によって検証されるように（表２）、均一懸濁液が得られるまで、得られたＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチド製剤をさらに撹拌した。１．５ｗｔ．％ＣＳ、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐおよび２．５または５．０ｗｔ．％ペプチドを含有する最終製剤を使用まで２〜８℃で保存した。
【００４１】
ラセンテックＦＢＲＭ  ＰＩ−１４／２０６プローブ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、ＵＳＡ）を用いてＦＢＲＭデータを得、ラセンテックＦＢＲＭソフトウェア（バージョン６．７．０  ０９／２００５  Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＵＳＡ）で分析した。この光散乱技術は、懸濁液と接触するサファイアウィンドウの外側に焦点を合わせた回転レーザービームからの後方散乱光を測定する。レーザー光スキャン粒子がプローブウィンドウに近づいた時に、持続時間が弦長に翻訳される後方散乱光シグナルを生じる（粒子の１つのエッジから別のエッジまでの直線距離）。したがって、弦長が粒径に関連するとしても、粒径分布を直接測定するものではなく、むしろ弦長分布を測定するものである。
【００４２】
【表２】
2016540813.tif 000004
【００４３】
ペプチド添加ＣＳ懸濁液（グルコースリン酸を含まない対照）：
Ｇ１−Ｐ溶液の代わりに水にペプチドを分散させる以外は同じプロトコールに従って、対照としてのＣＳ／ペプチド懸濁液を調製した。
【００４４】
ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／パシレオチド２．５％（実施例１）およびＣＳ／Ｇ１−Ｐ／パシレオチド５％（実施例２）用の調製方法の詳細な説明（バッチサイズ６ｇ）：
【００４５】
材料：
ＨＭＣ製のＣｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ  ９０／５０ＤＤ：８８．７％Ｍｗ：１４９ｋＤａ；Ｆｌｕｋａ製のＨＣｌ  １Ｍ；Ｓｉｇｍａ製のＧ１−Ｐ二ナトリウム、Ｍｗ：３６１．５９ｇ／ｍｏｌ；パシレオチドパモ酸塩、アモルファス、微粉化（Ｍｗ遊離塩基：１０４７．２１、Ｍｗパモ酸塩：１４３５．５３、レーザー光回折による粒径分布：ｘ９０＜＝１０μｍ、本明細書では：３μｍ、ｘ５０＜＝５μｍ、本明細書では：１μｍ、ｘ１０＞＝０．３μｍ、本明細書では０．７μｍ、比表面積（ＢＥＴ）＞＝８ｍ２／ｇ、本明細書では３２ｍ２／ｇ）；水（ＭｉｌｌｉＱ）。
【００４６】
（１）キトサン溶液の調製
終夜の磁気撹拌によって、４０．００ｇの３．７５％ｗ／ｗキトサン溶液のＨＣｌ中溶液０．１８５Ｍを調製した。不溶性粒子状物質を取り除くために、１１μｍナイロンフィルタによってキトサン溶液を濾過する。溶液を２〜８℃で保存する。
【００４７】
【表３】
2016540813.tif 000005
【００４８】
（２）ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／パシレオチド２．５％熱ゲル化懸濁液の調製（実施例１）：
（２．１）Ｇ１−Ｐ／パシレオチドパモ酸塩５．７１２％懸濁液の調製：
３４２．７０ｍｇパシレオチドパモ酸塩および１５００．００ｍｇ  Ｇ１−Ｐをガラスビーカーに入れて秤量し、水で６．０００ｇに調整する。混合物は２ｈ磁気撹拌によって予備均質化する。次いで、混合物を、氷浴中で磁気撹拌下、超音波プローブ（振幅８０％、サイクル１）を用いて５分超音波処理によって均質化する。
【００４９】
【表４】
2016540813.tif 000006
【００５０】
（２．２）ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ＳＯＭ２３０  ２．５％熱ゲル化懸濁液の調製：
２．４００ｇキトサン溶液を、磁気撹拌機を有する風袋付きガラスフラスコに入れて秤量する。氷浴中で、キトサン溶液およびＧ１−Ｐ／パシレオチドパモ酸塩５．７１２％懸濁液を少なくとも１５分氷冷する。３．６００ｇ  Ｇ１−Ｐ／パシレオチドパモ酸塩５．７１２％懸濁液を磁気撹拌下キトサン溶液に滴下する。得られた懸濁液の撹拌は、少なくとも３０分または原薬が完全に分散するまで継続する。ｐＨおよび平均粒径を（ラセンテックプローブ、ＦＢＲＭを用いて）決定する。懸濁液を２〜８℃で保存する。
【００５１】
【表５】
2016540813.tif 000007
【００５２】
（３）ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／パシレオチド５％熱ゲル化懸濁液の調製（実施例２）：
（３．１）Ｇ１−Ｐ／パシレオチドパモ酸塩１１．４２３％懸濁液の調製：
６８５．４０ｍｇパシレオチドパモ酸塩および１５００．００ｍｇ  Ｇ１−Ｐをガラスビーカーに入れて秤量し、水で６．０００ｇに調整する。混合物を２ｈ磁気撹拌することによって予備均質化する。次いで、混合物を、氷浴中で磁気撹拌下、超音波プローブ（振幅８０％、サイクル１）を用いて５分超音波処理によって均質化する。
【００５３】
【表６】
2016540813.tif 000008
【００５４】
（３．２）ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／パシレオチド５％熱ゲル化懸濁液の調製：
２．４００ｇキトサン溶液を、磁気撹拌機を有する風袋付きガラスフラスコに入れて秤量する。氷浴中で、キトサン溶液およびＧ１−Ｐ／ＳＯＭ２３０パモ酸塩１１．４２３％懸濁液を少なくとも１５分氷冷する。３．６００ｇ  Ｇ１−Ｐ／パシレオチドパモ酸塩１１．４２３％懸濁液を磁気撹拌下キトサン溶液に滴下する。得られた懸濁液の撹拌は、少なくとも３０分または原薬が完全に分散するまで継続する。ｐＨおよび平均粒径を（ラセンテックプローブ、ＦＢＲＭを用いて）決定する。懸濁液を２〜８℃で保存する。
【００５５】
【表７】
2016540813.tif 000009
【００５６】
（４）結果：
【００５７】
【表８】
2016540813.tif 000010
【００５８】
ＨＰＬＣによるペプチド定量
Ｗａｔｅｒｓ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８  ３．５μｍ、５０  ｘ  ４．６ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてペプチドを定量した。６ステップグラディエントを用いて１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａは、水、アセトニトリル、リン酸（９００：１００：１Ｖ／Ｖ／Ｖ）からなり、移動相Ｂは（１００：９００：１Ｖ／Ｖ／Ｖ）からなる。１０μＬサンプルを４０℃のオーブン温度で注入した。分析は、２３０ｎｍのＵＶ検出器によって行った。すべてのサンプルを二連で注入した。得られたクロマトグラムをＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ６．８データシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。ペプチドの参照ストック溶液をメタノールで調製し、異なった濃度の標準溶液をｐＨ７．４の放出媒体で調製した（表２参照）。得られたキャリブレーション曲線は３〜２５０μｇ／ｍＬの範囲で、相関係数０．９９９超であった。
【００５９】
インビトロ放出試験：
２つの異なった方法を用いて三連でインビトロ放出試験を行った。方法Ｉでは、約０．５ｇ（０．００１ｇまで正確に秤量）の量の製剤を５０ｍＬチューブに２１Ｇ針で注入し、ゲル形成を可能にするために３７℃に維持された往復移動する水浴（ＧＦＬ、Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１ｈインキュベートした。次いで、３７℃に予熱したｐＨ７．４の２５ｍＬ放出媒体をデポにゆっくりと加え（ｔ＝０）、穏やかな撹拌（１０％）を開始した。方法ＩＩでは、３７℃に維持された往復移動する水浴（ＧＦＬ、Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、同量の製剤を、２５ｍＬ（ペプチド添加製剤について５０ｍＬ）の３７℃に予熱したｐＨ７．４の放出媒体を含有する５０ｍＬチューブに直接注入した（ｔ＝０）。ゲル形成を可能にするために１ｈ静置した後、穏やかな撹拌（１０％）を開始した。方法ＩおよびＩＩについて、規定の時点で、チューブをゆっくりと均質化し、遠心し、１０ｍＬサンプル（ペプチド添加製剤について２５ｍＬ）を媒体から取り出し、新鮮な放出媒体と交換して、体積を一定に維持し、シンク条件を維持した。すべての測定は二連で行った。放出されたペプチド量は上記のようにＨＰＬＣで測定した。各放出試験について使用した放出媒体ｐＨ７．４の組成を表３に挙げる。
【００６０】
【表９】
2016540813.tif 000011
【００６１】
ペプチド添加ＣＳ／Ｇ１−Ｐデポの徐放挙動：
ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチド製剤は、３７℃の放出媒体ｐＨ７．４に注入後に、固体デポに変化した。これに対して、ペプチド添加ＣＳ溶液（ゲル化剤なし）は、媒体のｐＨに応じて、多数の凝集物に徐々に凝固した。ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチドデポは、９０日間の放出試験にわたって、その形状および構造的に完全な状態を維持した。
【００６２】
ペプチド添加ＣＳ／Ｇ１−Ｐヒドロゲルの放出プロファイルを図１に示す。
【００６３】
Ｇ１−ＰのＣＳ溶液への添加は、ゲル化剤なしのペプチド懸濁液（６０．６±１６．８％）と比べて、初期バースト（６ｈ以内に２．５±２．１％放出）を顕著に減少させた。さらに、ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチド製剤は、３ヶ月超にわたってペプチドの徐放を示したが、放出された８０％は、純粋なＣＳ−基準の陽性対照については約３日間で達成した。実際に、２．５％ペプチドを含むデポは、二相放出パターンに従って、９０日以内に４７％放出を示した。第１週の間、約２０％の小さなバーストを示し、その後、より遅い徐放相を示した。放出されたペプチドの量の小標準偏差、ほとんどが±３％未満、は、完全な試験期間に三連のサンプル間で観察され、このことは、デポ製剤が長時間の放出の良好な再現性を達成することを示している。
【００６４】
薬物添加の影響
図２に示すように、ＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチド２．５製剤とＣＳ／Ｇ１−Ｐ／ペプチド５製剤との間で添加するペプチドを２倍にすることは、初期バーストに顕著な影響を与えず（６ｈで、それぞれ、２．５％および２．３％）、全体的な二相放出パターンが維持された。しかしながら、より遅い放出期では、５％添加ヒドロゲルは、２．５％添加ヒドロゲルよりもゆっくりとペプチドを放出し、このことは９０日間後に２つの製剤間に１８％の差をもたらした。
【００６５】
本発明の例示された実施形態の以下の分析試験は、対応するプラセボ製剤で実施し、その結果は、ペプチド含有製剤にほぼ同様に示すものである。
【００６６】
ＣＳ／Ｇ１−Ｐプラセボ溶液の調製：
０．９／１に等しいＣＳアミン基／ＨＣｌのモル比に従って、ＨＣｌに３．７５ｗｔ．％ＣＳを溶解することによってＣＳ溶液を得た。ＭｉｌｌｉＱ水中の様々な濃度でＧ１−Ｐ溶液を調製した。４℃で１５分間、ＣＳおよびＧ１−Ｐ溶液を別々に冷却した。次いで、磁気撹拌下氷浴に置いたＣＳ溶液にＧ１−Ｐ溶液を滴下した。得られたＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液を１５分間さらに撹拌した。得られた製剤を２〜８℃で保存した。参照として、ＣＳ／β−グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物（β−ＧＰ、Ｍｗ：２８８．１０ｇ／ｍｏｌ）溶液を同一の手順に従って調製した。
【００６７】
レオロジー測定：
レオロジー測定は、温度制御のための循環環境装置を備えたＨａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ１  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いて行った。コーンプレート幾何学的形状（２°コーン角度、３５ｍｍ径）間に導入されたサンプル体積は、約０．５ｍＬであった。すべての試験中に水蒸発を最小限に抑えるために溶媒トラップを使用した。２０．００±０．２０℃でその粘度を決定するために、１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）、および０．００〜０．５３ｍｍｏｌ／ｇの範囲のＧ１−Ｐ濃度で調製した、新たに調製した脱気したサンプルを、制御された剪断速度で回転試験に供した。剪断速度はその間に６０ｓで一定を維持し、その後、５〜１０３ｓ−１で徐々に増加させた。各剪断速度での３０ｓの平衡化後に決定した見かけの剪断粘度の平均として、見かけの剪断粘度値を計算した。以下の試験を行った：（ｉ）１Ｈｚの一定角周波数および３７．００±０．２０℃の一定温度で、ゲル化時間を決定するための時間掃引試験を行った。ゾル／ゲル転移温度（Ｔｇｅｌ）または時間（ｔｇｅｌ）は、Ｇ’曲線とＧ”曲線との交点に相当する；（ｉｉｉ）ヒドロゲルの強度は、空気と接触してまたはＰＢＳ中のいずれかで形成したヒドロゲルでの周波数掃引試験を行うことによって評価した。ゲルは以下のように作製した。１ｍＬ  ＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液を丸形の鋳型に注ぎ、水蒸発を避けるために水分で飽和した大気中で、または３７℃に予備加熱した１ｍＬ  ＰＢＳ中のいずれかで、３７℃で６時間、２４時間および４８時間インキュベートして、ヒドロゲルを形成させた。
【００６８】
安定性試験：
安定性試験は、以下の異なったＣＳ溶液で行った：（ｉ）純粋なＣＳ溶液、１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（２）；２つのＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液（ｉｉ）１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）／０．２７ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐ、および（ｉｉｉ）１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）／０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐ、および（ｉｖ）ＣＳ／β−ＧＰ溶液、および参照として１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）／０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  β-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物（β−ＧＰ、Ｍｗ：２８８．１０ｇ／ｍｏｌ）。これらの溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、２Ｒガラスバイアルに満たし、気密密閉前に窒素でパージした。  Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ＦＭＳ−７６０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＬＬＣ）を用いて周波数変調分光によって決定された平均ヘッド・スペース酸素量は、０．７０±０．０７％であった。サンプルは、冷蔵条件（すなわち、２〜８℃）および室温（すなわち、２０〜２５℃）で保存し、２〜８℃で保存されたサンプルについてはｔ＝１、７、１４、３０、６０、９０、１３５、１８０および２７０日後に、２０〜２５℃で保存されたサンプルについてはｔ＝１、７、１４、３０、６０および１８０日後にそれぞれ分析した。各時点で、一群の異なった性質が各サンプルについて得られた：（ｉ）製剤を物理的外観、すなわち、色、濁度、コンシステンシー（液体またはゲル状態）の任意の変化を目視した；（ｉｉ）ｐＨ値は、６９１ｐＨメータ（Ｍｅｔｒｏｈｍ、Ｈｅｒｉｓａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した；（ｉｉｉ）２０．００±０．２０℃での粘度は、「レオロジー測定」の項で述べたステップ試験を行うことによって測定した；（ｉｖ）ゲル化時間は、「レオロジー測定」で定義した時間掃引試験によって決定した。
【００６９】
ＣＳ／ゲル化剤溶液の保存安定性：
保存安定性は、インサイチュでのヒドロゲル系形成の医薬開発中に評価しなければならない重要なパラメータである。この種類の製剤は、許容される貯蔵寿命を有しているべきであり、すなわち、その物理的熱ゲル化性は、投与まで一定の保存条件において維持されるべきである。本項は、参照であるＣＳ／β−ＧＰ熱ゲル化溶液（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  β−ＧＰを含む）および純粋なＣＳ溶液（同一のポリマー濃度：１．５ｗｔ．％での）と比べた、本発明の２つのＣＳ／Ｇ１−Ｐ熱ゲル化溶液（０．２７および４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐを含む）の安定性研究を提供する。研究は、２つの異なった保存温度（２〜８℃および２０〜２５℃）、外観、ｐＨ、粘度、および溶液のゲル化時間、ならびにＣＳ分子量についての、６〜９ヶ月間の追試を含んだ。
【００７０】
外観およびｐＨ：
全体として見れば、（２つの温度についての）６〜９ヶ月間の保存中に、外観（液体状態）でも、ＣＳおよびＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液のｐＨ値でも変化は観察されなかった。純粋なＣＳ溶液のｐＨは５．２±０．１を維持したが、ＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液のｐＨは、０．２７および０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐについて、それぞれ、７．１±０．１および７．２±０．１であった。これに対して、ＣＳ／β−ＧＰ溶液は、２〜８℃では３０日未満で濁ったゲルに変わり、２０〜２５℃ではわずか１日後には、７．４〜７．０のｐＨ値に降下した。
【００７１】
粘度：
ＣＳ溶液およびＣＳ／ゲル化剤系の見かけの剪断粘度は、図３に報告する。結果は、６〜９ヶ月までの長い、冷蔵条件での保存期間中、純粋なＣＳおよびＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液の見かけの剪断粘度が変化しなかったことを示す。反対に、ＣＳ／β−ＧＰの粘度は、３０日以内に、５ｓ−１の剪断速度で約１８０ｍＰａｓから７５００ｍＰａｓまで顕著に増加した。同様に、ＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液の粘度は、２ヶ月にわたって室温で安定であり、６ヶ月後に低い剪断速度でわずかに増加したのみであった。一方、純粋なＣＳ溶液の粘度は経時的に非常にわずかに減少し、ＣＳ／β−ＧＰ溶液の粘度はたった７日後に劇的に上昇した。これらの結果は、前者の観察を十分に整合する、すなわち、純粋なＣＳ溶液およびＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液は、両方の保存条件について長時間、液体状態を維持したが、ＣＳ／β−ＧＰ溶液は時間と共にゲルに変化した。冷蔵条件下での保存は、室温では７日未満なのに対し、１４日あまり液体状態でのＣＳ／β−ＧＰ製剤の維持を可能にした。ゾル/ゲル転移が一旦起こると、ＣＳ／β−ＧＰゲルの粘度は、安定するまで増加し続ける（図３（ｇ）の２〜８℃では、より感知できる）。
【００７２】
ゲル化時間：
３７℃に設定された異なったＣＳ／ゲル化剤製剤のゾル／ゲル転移時間は、同一の保存期間を追跡し、図４に報告する。０．２７ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐからなる溶液のゲル化時間は、長時間安定ではなく、２０〜２５℃および２〜８℃で、それぞれ、最初は約４０分から６ヶ月保存後には３５分および２７分に減少し、２０〜２５℃条件下で長時間観察された有意差を有すると思われる。これらの差は、Ｇ１−Ｐ濃度が０．４０ｍｍｏｌ／ｇまで増加すると、消失する。実際に、２０〜２５℃で保存された、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐを含有するＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液で観察されたゲル化時間は、２ヶ月間にわたって安定であったが、その後わずかに減少した。しかしながら、冷蔵条件下で保存すると、この溶液は９ヶ月間にわたって１２．２±１．０分の一定のゲル化時間を示した。ＣＳ／β−ＧＰ溶液に関して、サンプルは、２〜８℃で３０日未満、および２０〜２５℃で１日未満に自発的ゲル化を経た。ＣＳ／β−ＧＰ系は時間掃引試験の初めからゲル様挙動（Ｇ’＞Ｇ”）を示したので、これらの観察は、ゲル化時間のレオロジー測定によって確認した。しかしながら、それでもなお、これらの時点の前に既に、ゲル化時間は非常に速く１〜２分の範囲であった。そのため、室温または冷蔵条件下のいずれかで保存すると、ＣＳ／β−ＧＰ溶液は安定でなかった。逆に、ＣＳ溶液への、代わりのゲル化剤としての０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐの添加は、特に２〜８℃で保存すると、該系の安定性を顕著に改善した。
【００７３】
注射可能性の評価：
１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）、および０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐを含有するＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液の注射力を、電気伸長テスター（Ｚｗｉｃｋ  Ｚ  ２．５、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、ｔｅｓｔＸｐｅｒｔ  ＩＩソフトウェア（バージョン３．０、Ｚｗｉｃｋ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。１ｍＬシリンジ（１ｍＬ  Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ  Ｔｉｐ  ｓｙｒｉｎｇｅ、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて、１ｍＬの熱ゲル化溶液を空のガラス容器に注入した。数個の針を試験した：（ｉ）２３Ｇ（ＨＳＷ  ＦＩＮＥ−ＪＥＣＴ（登録商標）２３Ｇ  ｘ  １”、Ｈｅｎｋｅ−Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、（ｉｉ）２５Ｇ（Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）皮下針、２５Ｇ  ｘ  １”  Ｔｈｉｎ  Ｗａｌｌ  Ｎｅｅｄｌｅ、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、ＵＳＡ）、および（ｉｉｉ）３０Ｇ（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（商標）３、３０Ｇ  ｘ  １／２”、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）。測定前に、すべてのシリンジを室温で１０分間平衡化し、少量の溶液が現れるまで気泡を追い出すように処理した。各々の針サイズについて、２つの異なった注射速度：８０および１００ｍｍ／分で注射力を測定した。すべての測定は１０回反復した。
【００７４】
２０Ｎの上限は、Schoenhammer et al in Pharmaceutical Research, 26 (2009) 2568-2577に従って、皮下注射の許容される基準として設定された。結果は図５に示し、針サイズのみが注射力に顕著に影響を与えることを示している。ＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液を注射するために必要な力は、２３Ｇおよび２５Ｇ針を用いる場合には、非常に滑らかな注射を可能にすると考えられる５Ｎ未満であった。３０Ｇより細い針の使用は、約１７．５Ｎの増加した注射力を必要としたが、２０Ｎの上限を依然として超えなかった。したがって、本発明のＣＳ型製剤は３０Ｇまたはそれより細い針による注射を容易にすると考えられる。
【００７５】
殺菌濾過：
１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（１）、および０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐを含有するＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液は、０．２２μｍシリンジフィルター（親水性、３３ｍｍ径、４．５ｃｍ２濾過領域、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濾過した。溶液の性質に対する殺菌濾過の影響は、殺菌濾過の前後で測定した、ＧＰＣによって決定したＣＳの分子量を研究することによって３バッチについて評価した。濾過溶液中のＣＳの分子量は、非濾過溶液のＭｗに対して計算した。すべての測定は三連で行った。
【００７６】
殺菌濾過はＣＳ／Ｇ１−Ｐ溶液で簡単に行った。図６に示すように、溶液の粘度を濾過後に変えずに維持した。ＧＰＣ分析は、非濾過製剤と濾過製剤との間で約１％のポリマー分子量のわずかな減少を示したに過ぎなかった。この値は、本方法の厳密な範囲内である（±５％）。したがって、ポリマー材料は、殺菌濾過中にフィルター上に失われたポリマー材料はなかったと考えられる。
【００７７】
ＣＳ／Ｇ１−Ｐヒドロゲルのインビボ投与／局所忍容性：
３週間にわたるＣＳ／Ｇ１−Ｐヒドロゲルの局所忍容性は、健康な１０週令のハンスウェスター雄性ラットで検査した。室温で平衡化した、０．５ｍＬ殺菌ＣＳ／Ｇ１−Ｐ熱ゲル化溶液（１．５ｗｔ．％Ｃｈｉｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）９０／５０（２）、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｇ１−Ｐ）は、一般的な麻酔下で９匹のラットの肩甲骨間領域に２３Ｇ針を用いて皮下注射した。陰性対照としてその尾、背側領域に、同量の滅菌生理食塩水を皮下注射した。動物の健康状態および体重をモニターした。血液サンプルは、血液分析用に３日目に（プレドーズ）に舌下穿刺によって、ならびに血液および生化学的分析用に検死の日に大静脈穿刺によって、イソフルラン下で集めた。１、７および２１日後に、イソフルランへの曝露後に大静脈穿刺からの失血によって、３匹のラットを屠殺し、組織学的試験のために注射部位の組織を切除した。
【００７８】
【表１０】
2016540813.tif 000012
【００７９】
ラットに皮下的に注射されたＣＳ／Ｇ１−Ｐ製剤の周囲で観察された炎症性応答は、ＰＬＧＡ微粒子または標準的なＣＳ／β−ＧＰヒドロゲルのような他のデポシステムについて報告された組織応答と同様に、典型的な異物反応であった。製剤の注射後に、急性または慢性の炎症が順番に起こり、炎症は時間と共に消える傾向にあった。線維症は炎症性応答を伴い、移植部位を囲んだ；十分に血管新生した未熟顆粒組織では注射７日後に始まり、２１日目に向かって、線維芽細胞およびコラーゲン線維からなるわずかに血管新生した厚い被膜を形成した。したがって、ヒドロゲルは許容される組織生体適合性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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