(57)【要約】  本出願は、下記を含むパラレル有機合成のための多孔性支持体に関する：有機化合物を合成するための試薬を含む有機溶剤をスポッティングするための親媒性エリア、および有機溶剤に反発する疎媒性エリア。支持体およびその上で化合物を合成する方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物を合成するための試薬を含む有機溶剤をスポッティングするための親媒性エリア；ならびに
有機溶剤に反発する疎媒性エリア
を含む、パラレル有機合成のための多孔性支持体。
【請求項２】
紙に基づくアレイである、請求項１に記載の多孔性支持体。
【請求項３】
前記疎媒性エリアは少なくとも約１ｍｍの厚さである、請求項１または２に記載の多孔性支持体。
【請求項４】
多孔性支持体を提供すること；
親媒性エリアを取り囲む支持体の一部に疎媒性材料を適用して前記親媒性エリアを取り囲む疎媒性エリアを確立すること；
１つ以上の試薬を含む１つ以上の溶剤を前記親媒性エリア内に適用し、よって前記１つ以上の溶剤を前記親媒性エリア内に閉じ込めること；ならびに
前記１つ以上の溶剤から１つ以上の化合物を合成すること
を含む、平面に基づくアレイ上で１つ以上の化合物を合成する方法。
【請求項５】
前記１つ以上の溶剤を適用した後に前記多孔性支持体を修飾して前記親媒性エリア内に１つ以上の化合物を含む支持体を提供する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多孔性支持体は紙である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記疎媒性材料はテフロンなどの全フッ素置換ポリマである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
疎媒性部分は少なくとも約１ｍｍの厚さである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の試薬は互いに異なる、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の溶剤を親媒性エリア内に適用する工程において、過剰の溶剤が適用されそれにより前記溶剤が前記支持体を通って芯まで移動されて溶剤の流れを生成する、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶剤の流れは約０．１〜１０μＬ／分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
親媒性エリアを取り囲む支持体の一部に疎媒性材料を適用して前記親媒性エリアを取り囲む疎媒性エリアを確立すること；
１つ以上の試薬を親媒性エリア内に適用し、それにより前記試薬を前記親媒性エリア内部に閉じ込めること；ならびに
１つ以上の生化学アッセイを実施すること
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔性支持体上で１つ以上の生化学アッセイを実施する方法。
【請求項１３】
多孔性支持体を提供する工程；
親媒性エリアを取り囲む前記支持体の一部に疎媒性材料を適用して前記親媒性エリアを取り囲む第１の疎媒性エリアを確立する工程；
前記親媒性エリア内部の前記支持体の第２の部分に第２の疎媒性材料を適用して前記第１の疎媒性と第２の疎媒性エリアとの間に外側親媒性エリアを形成する工程；
第１の溶液を前記親媒性エリア内部に適用する工程；
第２の溶液を前記親媒性エリア内部に適用する工程
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の支持体を作製する方法。
【請求項１４】
前記第１の溶液は保護水溶液であり前記第２の溶液は修飾剤溶液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記保護水溶液はスクロースである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾剤溶液はテフロンＡＦなどの全フッ素置換ポリマである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎媒性材料を適用する工程はワックスプリンティングにより実施される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の疎媒性エリアは約０．５ｍｍの厚さを有する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔性支持体を使用して生理活性合成分子を同定する方法。
【請求項２０】
前記生理活性分子はペプチドまたは化学的に修飾されたペプチドまたは合成され得る他の分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生理活性分子は受容体生体分子に結合し、前記受容体はタンパク質、炭水化物、核酸または他の生物学的構造物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記生理活性分子は細胞の表面上の受容体に結合し前記細胞の生化学的または生理学的特性を変化させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
細胞は真核生物もしくは原核生物細胞、または細胞の凝集物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記特性は接着、伸展、遊走、細胞分裂、分化、遺伝子発現の変化、または細胞死を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は有機分子合成に関する。特に、本出願は紙の化学修飾および紙上での複雑な有機分子の合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンビナトリアルアレイ合成−例えば紙上でのＳＰＯＴ合成および平面支持体上での他のパラレル合成−の分野では、空間的に固定化した分子の大きなコレクションは、生体分子発見、薬物リードの発見および生体分子の機能的部分のマッピング（エピトープマッピング）などの適用に有用である。
【０００３】
セルロースの化学修飾は新しい付加価値のあるセルロース系製品の開発のための必須工程である。セルロース、および他の多孔性材料の修飾はセルロースに、新しい能力、例えば、限定はされないが、ある一定の化学物質を保持する能力（化学吸着、濾過）、病原体を非活性化するその能力、および紙の水分、塗料、他の修飾剤の接着剤に対する透過性の減少または増加を与える。
【０００４】
診断法の分野では、１つの紙のシート中の液体流の制御は、検出の多重化および試薬の処理に重要である。これらの診断適用のための、紙マイクロフルイディクスとして知られている水溶液の閉じ込めの利点は、当技術分野において特徴付けられている（例えば、ＵＳ  ２００９０２９８１９１  Ａ１号を参照されたい）。この分野における１つの欠点は非水溶液の、例えばエタノールの閉じ込めであり、これはいくつかの試料処理加工工程において要求され得；同様に、パターンを破壊し得る試薬を含む水溶液を保持することは問題である。例は、処理溶液中に存在する合成界面活性剤または生物流体中に存在する天然界面活性剤および両親媒性分子である。
【０００５】
水を保持し、水溶液の流れを支配する疎水性パターンによる紙のパターニングは当技術分野で知られている。例は、ＳＵ８、ＰＤＭＳおよびワックスプリンティング（ＵＳ特許公開２００９０２９８１９１  Ａ１号を参照されたい）および熱可塑性および熱反応性ポリマの「スィートパターニング」によるパターニング（欧州特許出願ＥＰ  ２２６５９５９  Ａ２号）である。これらの特許文書は一般的なパターニング方法を記載し、それらは、有機溶剤の長期閉じ込めを提供できる疎油性バリアを製造することは記載していない。その中で記載されるパターンは２つのクラスに分割でき、各々が特定の欠点を有し：クラスＩバリアは有機溶剤に対し化学的に安定ではなく；例は、ワックスバリアおよび熱可塑性有機ポリマ（ポリスチレン、など）で製造されたバリアであり；クラスＩＩバリアは、有機溶剤と反応しない材料である−これらは共有結合架橋ポリマ、例えばＰＤＭＳおよびＳＵ８により表される−が、ほとんどの有機溶剤と低い接触角を示す。そのような低い接触角は、有機合成の目的のために必要とされる有機溶剤の有効な閉じ込めを阻止し、非パターン（ｎｏｎ−ｐａｔｔｅｒｎｅｄ）紙を超える著しい利点を提供しないであろう。
【０００６】
グリース、油、ワックスおよび溶剤反発性を付与するための、紙シートまたはセルロースパルプなどの基材のフルオロ化学物質によるコーティングは当技術分野で知られている。これらは「バルク修飾」と呼ばれる。バルク修飾の例はＳｃｈｗａｒｔｚ，  “Ｏｉｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，”  ＴＡＰＰＩ，  Ｓｅｍｉｎａｒ  Ｎｏｔｅｓ，  ７４，  ７１−７５，  （１９８７）において記載され、彼は、様々な基材を耐油性とするためのフルオロ化学物質の使用を開示する。油および水反発性を様々な基材に付与するためのフルオロケミカル組成物を記載する、当技術分野における改善は、米国特許５，６７４，９６１号、米国特許５，３３０，６２２号、米国特許第．４，４２６，４６６号、米国特許第．４，５２９，６５８号、および米国特許第．５，３７０，９１９号に記載される。これらの特許はフルオロ化学物質のミリメートルスケールのパターニングを記載していない。多孔性材料のバルク修飾の、これらの材料上でのフルオロ化学物質のパターニングされた堆積への拡張は、既存の技術に基づき自明ではない。
【０００７】
紙上でのパラレル合成は当技術分野で知られている。この概念は、紙のシート上の空間的に規定される位置で固定されたペプチドのアレイなどの、商品を得るために開発されたものである。例示的な製品が、下記などの会社から提供される：Ｉｎｔａｖｉｓ、Ｋｉｎｅｘｕｓ、Ｐｅｐｍｅｔｒｉｃ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＪＰＴ、ａｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｅｎｅｓｙｓ）。この合成は非パターン紙に基づく。アレイを作製するために、試薬の少量の溶液が、紙上の正確な位置に堆積される。制限された量の液体／単位面積を堆積させて紙上での異なる化学物質の空間配列を可能にし、それらが広がり、混合することを防止することが重要である。支持される合成に関する１つの基本的な問題は、十分な量の試薬の支持体への送達である。液体は紙上で毛管作用により広がるので、紙の単位面積は、Ｖ０＝Ｓ×ｈ×ｐとしておよそ規定される限られた量の溶剤しか保持できず、ここでｈは高さであり、ｓは面積であり、ｐは多孔度である。Ｖ０を超える溶液／単位面積を堆積させることは典型的には困難であり、というのも、液体が、比（体積）／（表面）を一定に維持するために、より大きな面積まで広がるからである。疎媒性境界による溶剤の閉じ込めは（体積）／（表面）比を３−５０倍で増加させ、新しい溶剤（例えば、低い蒸気圧を有するもの）および新しい化学変換（例えば、大過剰の試薬を必要とするもの）を用いた支持合成が可能になる。
【０００８】
増加した溶剤量／単位面積を維持するための１つの既存の解決策は、紙を金属ホルダに入れることである（１つの例がＩｎｔａｖｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供される）。金属フレームに基づく閉じ込めは多くの欠点を有し、不撓性、積層能力の欠如、および内側の芯の存在が挙げられる。
【０００９】
固体支持体上での合成では、固定化された反応部位への試薬の輸送が反応速度より速い、最適反応条件が要求される。そのような条件は、固体支持体を備えた撹拌反応器または固体に支持された反応物の床を通して試薬が連続して流れるフロースルー反応器中で最もよく達成される。平面アレイ上での合成については基本的な問題があり：個々のスポットに閉じ込められた溶液を撹拌できない。よって、試薬の輸送は、拡散律速である。パターン紙（ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｐａｐｅｒ）、例えば、紙上の撥水パターンを記載するＵＳ特許公開２００９０２９８１９１号および他の刊行物に記載されるものの上では、疎水性パターンにより閉じ込められた過剰の水が、時間と共に、重力のために紙を通って流れることが知られている。このプロセスでは、固体支持体は溶剤の連続流に曝露される。有機合成を促進するためには、パターンアレイでのこのフロースルーの使用は制限されており、なぜならそのような適用は、有機溶剤を保持するパターンの作製を必要とするであろうからである。
【００１０】
ＷＯ２０１１１０３６６８号は、癌特異ペプチドおよびこれをスクリーニングするためのアレイを記載する。合成は標準ＳＰＯＴを使用して実施される。しかしながら、合成後、膜は長期培養または細胞の表現型変化のスクリーニングに対してではなく、短期間細胞接着に対してのみ試験される。
【００１１】
セルロース上または内での細胞の長期培養または合成材料上または内でのスクリーニングは以前に記載されている。
【００１２】
ＵＳ２０１１０１０５３６０号“Ｐａｐｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｒａｙｓ”は、細胞が紙により支持された３Ｄ内部ゲル中で培養されたことを記載する。
【００１３】
ＣＡ２６６２４７７号は、内皮細胞接着を促進するためのコーティングを有する医療装置を記載し、米国特許第５，２５４，４７１号は、極細繊維でできた細胞を培養するための担体を開示する。
【００１４】
ＷＯ２００９／１２６９８０号は、セルロース系ヒドロゲルを開示し、これは、１５０−６２００の平均重合度を示すセルロースを含む。
【００１５】
ＷＯ２０１２０５６１１０号は、微生物セルロースに基づく細胞培養材料を記載する。
【００１６】
これらの参考文献に関する１つの問題は、それらが特異的細胞応答（接着、増殖、遊走、分化、再プログラミング）を促進するために多数（すなわち、＞１００）の化学的に修飾された３Ｄセルロースメッシュをスクリーニングするのに適合していないことである。これらの特徴は、細胞に基づく研究のための生理活性材料の開発、有機および細胞培養、毒性学研究および治療材料または診断アッセイの開発の領域で非常に魅力的であろう。
【００１７】
他の参考文献は、細胞増殖または分化を制御する材料の新しい化学組成物の発見の目的で、ペプチドまたは合成材料のアレイ上での細胞分化のためのスクリーニングを記載する。例えば、米国特許第８，０６２，８９０号は、自己組織化単層および幹細胞の表面を規定し；ＵＳ特許公開２０１０／０２７３２５９号は、幹細胞を培養するための基材および方法を記載し；ＵＳ特許公開２００５／００１９７４７号は、配列させた生体材料のナノリットルスケールの合成およびそのスクリーニングを開示し；米国特許第６，５４８，２６３号は、小型化細胞アレイ方法および細胞に基づくスクリーニングのための装置を記載し；米国特許第６，６５３，１２４号は、細胞培養、細胞モニタリングおよび薬物−標的確認のためのアレイに基づく微小環境を開示し；ならびにＷＯ２００７００８６０９号は、細胞培養アレイのための方法および装置を記載する。
【００１８】
これらのアレイの例は、２Ｄ表面上での細胞に基づくスクリーニングまたは２Ｄ表面上での合成およびスクリーニングに限定され；それらは、同じ支持体上での合成および細胞の３Ｄ培養を記載していない。
【００１９】
他の参考文献は、ペプチドにより修飾された３Ｄヒドロゲルに対するスクリーニングを記載し、この場合、細胞は長期間増殖できる。これらは、例えば、ＷＯ２０１２００９６８２号（細胞操作および培養における弾性基材および使用方法を記載する）；およびＵＳ特許公開２０１０／００５５７３３号（ソフトヒドロゲル上での生体分子の反応性マイクロコンタクトプリンティングの製造および使用を記載する）を含む。しかしながら、これらのプラットフォームは、有機合成を可能にしていない。試験される材料は全て別々に合成されて３Ｄ材料上に堆積されなければならない。
【００２０】
よって、改善された紙に基づくアレイを提供する必要がある。
【００２１】
この背景情報は、出願人により本発明と関連する可能性があると信じられている情報を知らせる目的で提供される。前記情報のいずれも本発明に対する先行技術を構成するという承認が必ずしも意図されず、解釈されるべきでもない。
【発明の概要】
【００２２】
以前の紙に基づくアレイおよびパラレル有機合成のための方法および生理活性材料に対するスクリーニングのための方法と関連する欠点のいくつかに対処し、または改善することが本出願の目的である。
【００２３】
本出願の１つの態様によれば、下記を含むパラレル有機合成のための多孔性支持体が提供される：有機化合物を合成するための試薬を含む有機溶剤をスポッティングするための親媒性エリア、および有機溶剤に反発する疎媒性エリア。多孔性支持体は典型的には、紙に基づいてよい。疎媒性エリアは少なくとも１ｍｍの厚さであってよい。
【００２４】
本出願の別の態様によれば、下記を含む平面に基づくアレイ上で１つ以上の化合物を合成する方法が提供される：多孔性支持体を提供すること、疎媒性材料を、親媒性エリアを取り囲む支持体の一部に適用して親媒性エリアを取り囲む疎媒性エリアを確立すること、１つ以上の試薬を含む１つ以上の溶剤を親媒性エリア内で適用し、よって１つ以上の溶剤を親媒性エリア内で閉じ込めること、および１つ以上の溶剤から１つ以上の化合物を合成すること。
【００２５】
方法は、１つ以上の溶剤を適用した後、多孔性支持体を修飾して親媒性エリア内に１つ以上の化合物を含む支持体を提供する工程をさらに含んでよい。
【００２６】
疎媒性材料はテフロンなどの全フッ素置換ポリマであってよい。
【００２７】
ある一定の実施形態では、１つ以上の試薬は互いに異なる。これにより、異なる反応が並行して起こる。
【００２８】
ある一定の実施形態では、１つ以上の溶剤を親媒性エリア内で適用する工程において、過剰の溶剤を適用し、よって溶剤を支持体を通って芯まで移動させて溶剤の流れを生成することが提供される。溶剤の流れは約０．１〜１０μＬ／分である。
【００２９】
本出願の別の態様によれば、下記を含む、多孔性支持体上で１つ以上の生化学アッセイを実施する方法が提供される：疎媒性材料を、親媒性エリアを取り囲む支持体の一部に適用して親媒性エリアを取り囲む疎媒性エリアを確立すること；１つ以上の試薬を親媒性エリア内で適用し、よって試薬を親媒性エリア内に閉じ込めること、および１つ以上の生化学アッセイを実施すること。
【００３０】
本出願はまた、下記の工程を含む、支持体を作製する方法を提供する：多孔性支持体を提供する工程、疎媒性材料を、親媒性エリアを取り囲む支持体の一部に適用して第１の親媒性エリアを取り囲む疎媒性エリアを確立する工程；第２の疎媒性材料を、親媒性エリア内の支持体の第２の部分に適用して第１の疎媒性エリアと第２の疎媒性エリアの間の外側親媒性エリアを形成させる工程；第１の溶液を親媒性エリア内に適用する工程；および第２の溶液を親媒性エリア内に適用する工程。
【００３１】
ある一定の実施形態では、第１の溶液は保護水溶液であり、第２の溶液は修飾剤溶液である。保護水溶液はスクロースであってよく、一方、修飾剤溶液はテフロンＡＦなどの全フッ素置換ポリマであってよい。パターンはワックスプリンティングによりアウトラインを描くことができる。
【００３２】
第２の疎媒性エリアは約０．５ｍｍの厚さを有してよい。
【００３３】
特に、本出願は、２〜３の溶剤（例えば、高含量のフッ素を有する溶剤および全フッ素置換溶剤と無限に混和可能な溶剤）を除いて、公知の有機溶剤から選択したものを閉じ込めまたは反発する幾何的に規定されたエリアを含む多孔性支持体の、例えば紙の設計および製造を記載する。１つの特定の実施形態では、本出願は、有機溶剤に反発する境界（「疎媒性」、「疎油性」または「疎溶剤性（ｓｏｌｖａｎｏｐｈｏｂｉｃ）」）により取り囲まれた有機溶剤が透過できる（「親媒性」または「親水性」）エリア（「ゾーン」）の周期的アレイを含む紙のシートを提供する。過剰の有機溶剤を各ゾーンに添加でき；異なるゾーン内の溶剤は混合せず、よって、使用者は、１つの平面支持体上で並行して複数の化学反応を実施できる。本出願はまた、有機溶剤を閉じ込める、紙−パターニングされた全フッ素置換材料（「バリア」と呼ばれる）により取り囲まれた未修飾紙の複数の領域（「ゾーン」と呼ばれる）を含む基材の作製および使用のための方法を記載する。バリアは約１ミリメートルの最小厚さを有し、有機溶剤に反発し、この有機溶剤による長期処理に耐える能力を有する。バリアにより取り囲まれた「ゾーン」は、化学物質が連続工程でゾーンに適用される、紙上でのパラレルな、支持有機合成または分析手順のための支持体として機能できる。
【００３４】
ある一定の実施形態では、そのようなアレイの合成は、本出願で記載されるようにパターン支持体を使用して簡略化でき、かつ改善できる。例えば、本出願は、従来のアレイよりも速くてより効果的に合成を実施するために使用される、紙に支持された分子アレイを提供する。加えて、本出願は、局所フロースルー条件が試験される有機溶剤に対して達成されることを提供する。パターンエリアを通る有機溶剤の重力駆動流は、カラム内でのフロースルー合成に類似する条件の再現を可能にする。
【００３５】
ある一定の実施形態では、本出願は、液体を、１つの平面支持体上の９６ゾーンに閉じ込める基材を提供し；ゾーンの配列は、標準１２×８＝９６ウェルプレートのフットプリントと同一であり、ゾーンの形状は四角でありサイズは３×３ｍｍである。しかしながら、他のサイズ、形状および配列のエリアが作製され得ることが企図される。
【００３６】
ある一定の実施形態では、液体の最適長期保持を提供する支持体上のゾーンの配列およびゾーン間距離が提供される。四角形状ゾーンを有する実施形態では、ゾーン間のバリア厚さは少なくとも１ｍｍでなければならない。１つのバリア厚さが規定できない複合パターンの場合（例えば、例として、円の周期的アレイの使用の場合）、２つのゾーンを分離するバリア厚さは、最も小さな寸法で少なくとも１ｍｍの厚さである。１ｍｍ寸法は、有機溶剤を用いた処理に対する疎媒性パターンの長期安定性の研究に基づく。＜１ｍｍのバリアは、有機溶剤への長期曝露後に高い故障率を有することが示されている。
【００３７】
ある一定の実施形態では、本出願は特許権を付与されていない紙の、有機溶剤を閉じ込めることができるパターンへの変換のための方法を記載する。文献におけるそのようなパターンの大量生産および使用の報告は今日まで存在しなかった。本出願は、有機溶剤の長期保持のための明確に定義されたパターンを提供する。
【００３８】
本出願は、特定エリア中への液体の連続分注用に設計された液体取扱装置を使用する、パターン紙の自動製造のための工程を提供する。１つの実施形態によれば、耐久性のある材料、例えばアルミニウムまたは耐溶剤プラスチック（例えば、ポリプロピレン）でできた支持フレームが提供される。フレームにより、紙を９６−ウェルプレートを取り扱うように設計されたロボット装置と接続することが可能になる。代表的なマルチチャンネルディスペンサーのための大量生産手順の例が本明細書で記載される。
【００３９】
本出願は、試薬の局所保持、局所洗浄、局所フロースルー条件、および１つのアレイから別のアレイへの反応溶液の複製を含む、紙上での化学合成を促進して加速させるパターンアレイ内での液体取扱条件を記載する。
【００４０】
本出願は、パターン支持体上でのペプチドの多段階合成および、非パターン支持体上での従来の合成と比較した場合カップリングの改善された収率を提供する。さらに、本出願は、パターンアレイを用いて実施できるアッセイのフォーマットの例を提供する。アッセイのフォーマットは、非パターン紙上で実施されるアッセイとは基本的に異なる。試薬の溶液のスポットは、パターン紙の各エリアにおいて局所で堆積させて紙の所望のエリアに対する試薬の曝露を最大化でき、一方、全体の試薬の使用は最小化され得る。
【００４１】
本出願は、化学合成を改善して細胞接着エリアを規定する、溶剤反発技術を提供する。それはまた、化学的に修飾された３Ｄ多孔性材料の内側での、細胞の長期培養および表現型応答（増殖、遊走、分化）を記載する。
【００４２】
本出願は、その材料と接触した（上でまたは内側で）細胞培養における特定の応答を促進する、３Ｄ生体材料の迅速スクリーニングのための方法を提供する。
【００４３】
本出願は、細胞接着、伸展、細胞分裂、２Ｄおよび３Ｄでの遊走、細胞分化および脱分化、薬物および他の毒物に対する耐性の変化、細胞内での遺伝子発現およびタンパク質濃度の変化、組織様形態を有する３Ｄ細胞構造への凝集を含むが、それらに限定されない使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ワックス−パターン紙からのテフロンパターン紙の製造を示す。（Ａ）ワックス−プリンティング（Ｂ）スクロース溶液の堆積（Ｃ）テフロン溶液の堆積（Ｄ）乾燥、および保護溶液のリンス。
【図２】自動製造を示し、パターニングプロセスの異なる段階でのワークステーションの画像を含む：スクロース溶液の堆積（上）；テフロンＡＦ溶液の堆積（下）。
【図３】（Ａ）自動パターニングのために使用されるホルダーのスキーム；（Ｂ）ホルダー内にクランプさせた紙の画像；（Ｃ）乾燥ラック；（Ｄ）自動パターニングにより製造された４つの異なるパターンの例を示す。
【図４】（Ａ）溶剤の長期閉じ込めまたは広がりを示すスキーム；（Ｂ）蒸発まで水溶液を閉じ込めることにおける違いを示すためのワックス−パターン紙とテフロン−パターン紙の間の比較；ならびに（Ｃ−Ｄ）異なる形状のテフロン−パターン紙が様々な有機または水溶液を閉じ込めることを示す。
【図５】紙内での有機溶剤の閉じ込めおよびフロースルーを示す。（Ａ）２５μＬのＤＭＦを非パターン紙上へスポッティングすると４．９ｃｍ２のエリアが得られる；同じ体積を０．３９ｃｍ２のパターンエリアに閉じ込めることができる。（Ｂ）紙に閉じ込められた溶剤は、時間と共にパターンを通って流れる；（Ｃ）プロセスは、紙のいずれかの側の液滴の高さを測定することにより定量できる（ここでは、底側）；（Ｄ）異なる溶剤の紙を通る流れを説明するコマ撮りシリーズ；（Ｅ）７つの別々のパターンエリアからの、（Ｄ）からのデータのデジタル化により、フロースルー速度は１つの型の溶剤に対して再現性があることが明らかである。異なる粘度の溶剤（ここではＤＭＦおよびＮＭＰ）は異なるフロースルー速度を示す。
【図６】異なるパターニング幾何形態および有機溶剤への長期曝露に対するそれらの安定性を示す。＜１ｍｍの厚さのテフロン含有バリア（またはより厚いワックス含有バリア）を有するパターンは、有機溶剤への長期曝露に対してより安定性が低い。
【図７】ペプチド合成のための紙の活性化を示す。浸漬による標準アプローチおよびスポッティングによるアプローチの比較。ペプチド合成の収率は、アミノ酸の付着後の脱保護されたＦｍｏｃの量により定量すると、テフロン−パターンアレイ上では著しく高い。
【図８】テフロン−パターン紙および非パターン紙上でのデカペプチド（Ａｌａ）１０の合成を示し、合成の各工程でのカップリングの収率を記載する。
【図９】テフロン−パターン紙上での他の反応を示し、紙に付着されたペプチド中の隣接ジオールの酸化および得られたアルデヒドとのオキシム結合カップリングが含まれる。
【図１０】（Ａ）蛍光ゲルスキャナおよび（Ｂ）共焦点顕微鏡法を用いた、紙上で合成された公知の生理活性ペプチドへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の接着を示す。
【図１１】図１０で提供されたペプチドアレイ上のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の共焦点イメージングを示す。
【図１２】（Ａ）蛍光ゲルスキャナ、（Ｂ）ゲルスキャナ画像のデジタル化および（Ｃ）共焦点蛍光イメージングを用いた、ペプチドで修飾された紙上での長期細胞増殖を示す。
【図１３】アレイ上で合成されたペプチドの代表的な共焦点画像を示す。
【図１４】（Ａ）ペプチドアレイ、（Ｂ）共焦点イメージングおよび（Ｃ）蛍光ゲルスキャナ画像からの細胞数／ゾーンのデジタル化を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の接着を示す。
【図１５】（Ａ）蛍光ゲルスキャナによりイメージングされたアレイ、（Ｂ）アレイ上の配列のリストおよび（Ｃ）共焦点顕微鏡法画像を示す。
【図１６】ペプチドで修飾された紙上で増殖する細胞の代表的な共焦点画像を示す。
【図１７】ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＵＶ分析を示す（Ｆ）。（Ａ）ポジティブトータルイオンカウントトレース；（Ｂ）ネガティブトータルイオンカウントトレース；（Ｃ）ＵＶトレース；（Ｄ）−（Ｅ）ＭＳスペクトル。
【図１８】４８ペプチドのアレイの複製物（ｂ）の画像：蛍光ゲルスキャナ画像（ａ）の、対象となる抽出領域へのデジタル化（ｃ）を示し、これらは、較正曲線（ｄ）を使用して、細胞数／ペプチドゾーンのプロット（ｅ）に変換される。
【図１９】７日間、抗癌剤なし（ａ）およびあり（ｂ）で、ペプチドで修飾された紙上で培養された細胞の共焦点画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本明細書では、「有機溶剤」は、炭素および水素（例えば、ヘキサンなどの炭化水素が挙げられる）、酸素（例えば、アルコール、エーテル、エステルが挙げられる）、窒素（例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンが挙げられる）、塩素（例えば、ジクロロメタンが挙げられる）、臭素、ヨウ素またはそれらの組み合わせから構成される、任意の普通に使用される有機液体である。
【００４６】
本明細書では、非パターン紙により保持される液体の体積は厚さｈおよび多孔度ｐを有する紙のエリアＳ１を表し、Ｖ１＝Ｓ１×ｈ×ｐとして規定される体積（Ｖ１）を保持する。過剰体積Ｖ２＞Ｖ１を堆積させると、液体が広がり、エリアＳ１がエリアＳ２に増加して関係Ｖ２＝Ｓ２×ｈ×ｐが満たされ、体積／表面積の一定比が維持される（Ｖｉ／Ｓｉ＝ｃｏｎｓｔ）。
【００４７】
本明細書では、「溶剤の閉じ込め」は、疎媒性のパターン境界により取り囲まれたエリアＳの紙または他の多孔性材料の、このエリアＳが通常保持するであろうものよりも３〜１００の倍数ｆ大きな体積（Ｖｃｏｎｆ）の溶剤を保持する能力として規定される。エリアが半径ｒの円形であり、疎媒性バリア上の溶剤の接触角が９０度である場合、Ｖｃｏｎｆ＝（２／３）pｒ３であり、同じエリアの非パターン紙により保持される体積はＶ＝pｈｒであり、ここで、ｈは紙の厚さである。２つの体積の比は、ｆ＝２ｒ／３ｈとなり、これは、３ｍｍの典型的な半径および０．１ｍｍの厚さでは、閉じ込めることができる体積／表面積の２０倍の増加となる。
【００４８】
本明細書では、有機溶剤の閉じ込めを可能にする紙への修飾は「疎媒性修飾」または「疎媒性パターニング」と呼ばれる。「疎媒性」および「疎油性」という用語は、有機溶剤をはじく材料の能力を説明し；これは「疎水性」（水に反発する能力）という用語の一般的拡張である。
【００４９】
本明細書では、「溶剤による長期処理」は、この溶剤での完全な浸漬によるまたは選択されたエリアのスポッティングによる、パターニングされた材料の繰り返し曝露として規定される。曝露は少なくとも１分間続き、少なくとも５回繰り返される。この条件は、化学反応に必要なおよび反応後の未反応材料のリンスに必要な、典型的な曝露持続期間を構成する。
【００５０】
本明細書では、「大量生産」は、最小限にしか訓練を受けていない人により実施できる再現可能な自動、または半自動プロセスとして規定され、その人は、短いプロトコルに従い、多くの基材／日、例えば、１００またはそれより多くを作製する。プロセスは公知の液体取扱装置、例えばマルチチャンネル液体ディスペンサーまたはプログラム可能／ロボット液体ディスペンサーにより補助でき、さらに加速できる。
【００５１】
本明細書では、「支持された有機合成」は、少なくとも１つの試薬が共有または強い非共有結合により紙または他の多孔性の、平面不溶性支持体に固定されている、任意の化学変換を示す。
【００５２】
本明細書では、「紙」は、セルロースでできた任意の多孔性平坦材料を示す。密接に関連する特性を有する材料、例えば他の親水性、多孔性、不溶性ポリマ（合成または天然のいずれか）もまた、同様に使用できる。
【００５３】
典型的には、バルク紙修飾のために当技術分野で知られている任意のフルオロケミカルセルロース修飾剤は、本明細書で記載される「保護−脱保護」パターニング法（下記工程（ｉ）−（ｉｉｉ）を参照されたい）と組み合わせて親水性および疎油性／疎媒性領域を含むパターン基材を製造できる。
【００５４】
一般的なパターニング工程は下記を含む：
【００５５】
（ｉ）パターンのアウトラインはコンピュータ上で設計され、紙上に固体−ワックスプリンティングを使用して（例えば、Ｘｅｒｏｘ  Ｐｈａｓｅｒ  ＤＰ  ５６００固体インクプリンタを使用して）印刷される。パターンの寸法および配列は、以上で概説された要求を満たすようなものである。
【００５６】
（ｉｉ）未修飾のままであるエリアは、「詳細な説明」で概説されるスクロースまたは他の水溶性親水性材料の過剰の溶液をスポッティングすることにより保護される。溶液はワックス−パターンにより保持され；それは、そのエリアをフッ素化材料による浸出から保護する凸状水滴を生成する。
【００５７】
（ｉｉｉ）残りの、非保護エリアは、制御された流速で好適な全フッ素置換溶剤中のテフロンＡＦの溶液（例えば、ＨＦＥ７１００）を分注することにより、局所的に噴霧され、スポッティングされまたはコートされる。
【００５８】
（ｉｖ）全フッ素置換溶剤の蒸発およびスクロースを除去するための基材の水によるリンスにより、所望のエリアが親水性であり、および残りが疎媒性／疎油性である紙が得られる。
【００５９】
以上で記載される戦略のさらなる改変として、スクロースにより保護されていないエリアは、セルロースを修飾して、これを疎油性とする任意の当技術分野で公知の溶液、材料または処理に曝露させることができる。処理のために使用される溶液は、保護水溶液と、混和性であったり過度に反応してはならない。有機合成の分野で訓練されたものにより最適化され得る処理の一例は、セルロースの、共有結合により全フッ素置換基をセルロースに連結させる反応性化学物質を含む有機溶剤への曝露である。そのような共有結合の導入のための反応は、セルロースのヒドロキシル基のアルキル化またはエステル化、アクリレートラジカルまたはプラズマにより発生したラジカルなどのラジカル中間体とのそれらの反応、および多段階反応であってよい。紙を全フッ素置換材料で修飾し、以上で規定される戦略を妨害しない多くの反応により、２、３の明確に定義されたエリアにおいて全フッ素置換基で修飾された紙が得られる（パターン紙）。
【００６０】
パターニングにおける第１の工程は、ワックスパターニングまたは、紙を通してうまく分割された疎水性パターンを堆積させる任意の技術を用いて、所望のアレイの特徴のアウトラインを描くことである。簡単に言うと、ワックスパターニングは下記の通り実施できる：（ｉ）所望のパターンをコンピュータの助けにより描く、（ｉｉ）それを固体インクプリンタで印刷する（例えば、Ｘｅｒｏｘ  Ｐｈａｓｅｒ）、（ｉｉｉ）印刷された紙を２−７分間、１２０℃−１５０℃で維持されたオーブンに入れる。疎水性境界のアウトラインを描く際のそのようなパターニングの詳細および制限は、Ｃａｒｒｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｗａｘ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ”  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００９，  ８１  （１６），  ｐｐ  ７０９１-７０９５において見出すことができる。
【００６１】
紙はその後、メカニカルカッター、例えばダイカッターまたはレーザーカッターにより切断されて成形され、紙が金属ホルダに適合される。典型的なホルダーは２つの部分から構成され：上部および底部、どちらも図３に記載され、紙を掴んでそれをテフロンパターニング工程を通して、ならびにその後の化学修飾工程および生化学アッセイ（必要に応じて）を通して支持する。ホルダーの２つの部分はぴったりとフィットするように設計され；理想的には、それらは軽く加圧することにより一緒に接合され、摩擦により一緒に保持され、可逆的に組立および解体が可能である。図３で記載されるホルダーは標準マルチウェルプレートのフットプリントを有し、マルチウェルプレートを取り扱うように製造された機器とのテフロン−パターン紙の適合性を最大化するように設計された。ホルダーの１つの目的は、紙の折込を防止し、紙を表面上方＞２ｍｍに吊し、紙と表面との接触を防止することである。なぜならそのような接触は液体のパターニングされた堆積を乱すからである。紙をクランプして吊す他の型のホルダー、例えば異なる機器に適合するように異なるフットプリントを有するものは、図３における設計の小さな改変により、設計できる。
【００６２】
必要に応じて、追加の締め付け要素（例えば、ねじ、ピン、スプリング、またはクランプなど）をホルダーに追加できる。そのような締め具はフレームの大量生産のために有益であり得る。上部と底部の間の「タイトな」フィットは、高精度製造を要求し、大量生産に関する製造原価を増加させる可能性がある。他方、インサートねじを有するシステムは上部と底部の製造において、必要なフィット／グリップを維持したまま、より大きな許容誤差を可能にする。フレーム寸法およびフィットは開閉の繰り返しにより損なわれ得るので、ねじまたは他の締め具はまた、ホルダーに対しより長い寿命を確保できる。
【００６３】
パターニングの第２の工程は、親水性ゾーン（または親媒性）での親水性保護溶液の、例えば水中に１ｇ／ｍＬのスクロースを含む溶液の堆積である。任意の好適な液体分注ツール、例えばマルチチャンネルピペット、マルチチャンネル液体取扱ロボットがこの工程で使用され得る。分注される保護溶液の体積／ゾーンは、パターンの設計およびゾーンのサイズに依存する。体積の大きな誤差は、液体堆積により半球状（凸状）滴が得られる限り、この工程で許容され得る。例として、直径７ｍｍを有する円形ゾーン（図３Ｄ、底部−左）の保護には３０−６０μＬの保護溶液／ゾーンを必要とし、５×５ｍｍの四角ゾーン（図３Ｄ、上部−左）では１５−４０μＬ／ゾーンを必要とし、１０．５ｍｍ直径の円形ゾーン（図３Ｄ、上部−右）では６０−１００μＬ／ゾーンを必要とした。
【００６４】
上記工程で記載されるスクロース溶液は、そのコストの低さ、低い蒸発速度および最適粘度のために選択される。これらの因子の組み合わせにより、液体またはアモルファス「カラメル化」材料の凸形状滴を紙上で保持でき、それをテフロンＡＦ溶液による浸透から保護する（以下で記載される）。テフロン溶液が液滴上に直接堆積したとしても、疎水性−親水性反発および重力駆動流により、テフロン溶液は保護エリアから「転がり落ちる」。凸形状を有さない水溶液による保護はそれほどうまくいかないようであり、なぜならそのようなパターンはテフロンフィルムによりコートでき、そのようなパターンは、位置およびテフロン溶液の堆積の流速の高度な正確さを必要とするからである。パターニングプロセスは、普通の水と共に働くように最適化できる。はなぜなら水滴は有機溶剤に反発する能力を有し；加えて、水は、パターニング後に簡単に蒸発するからである。しかしながら、水滴は、粘度が低く、時間と共にパターンを通って流れ、凸形状を失う。水はまた、テフロン溶液よりも速く蒸発する。テフロンＡＦの堆積は、水滴の堆積後、短期間内に起こらなければならない。理想的には、テフロンＡＦを溶解させるのに使用される溶剤の蒸発は、水の蒸発を防止する条件で実施されなければならない（低温、１００％湿度）。パターニングプロセスはまた、それらの形状を長期間保持する水性ゲル、例えばアガロースの液滴により保護された紙と共に働くように最適化でき；そのようなパターンは、スクロースまたは任意の水溶液パターンと異なり、機械的衝撃および回転に対して安定であろう。パターンはまた横向きにまたは逆さまに回転させ、コーティング溶液に浸漬させ、パターニング効率を最大化する幾何形態で乾燥させることができる。
【００６５】
パターニングにおける第３の工程は、ＨＦＥ−７１００中の２０％テフロンＡＦ溶液（６．４ｍｇ／ｍＬ）（Ｄｕｐｏｎｔ、グレード４００Ｓ２−１００−１；３２ｍｇ／ｍＬの市販溶液）の溶液の堆積である。テフロン溶液の濃度は紙アレイの使用目的に対して調整でき：紙が、有機溶剤への長期のおよび繰り返しの曝露を有する多段階化学合成での使用を意図される場合、より高い濃度のテフロンＡＦ（２０−４０％；６−１３ｍｇ／ｍＬ）が必要とされる可能性があり；有機溶液に短時間しか曝露されない紙では、より低い濃度（５−２０％；１．５−６ｍｇ／ｍＬ）が使用され得る。１５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有するテフロンＡＦの溶液は、低い粘度を有し、これにより、これらの溶液は、パターニングプロセス中に十分な速度で、その紙に浸透できる。２０ｍｇ／ｍＬより高い濃度のテフロンＡＦは粘性溶液を形成し、これは液体分注システムにより容易に扱うことができず；それらは十分紙に浸透せず、有機溶剤からの紙の所望の保護が得られない。
【００６６】
分注されるテフロン溶液の総体積は、特定のパターン内のテフロンに被覆される表面（「バックグラウンド」）の面積に依存する。図３で記載されるパターンに必要とされる例示的な体積：９６−円形ゾーンを有するパターンは５７ｃｍ２のバックグラウンド面積を有し、１．７ｍＬの、ＨＦＥ−７１００中６．４ｍｇ／ｍＬテフロンＡＦ（Ｄｕｐｏｎｔ、グレード４００Ｓ２−１００−１）溶液を必要とし；９６−四角ゾーンを有するパターンは７０ｃｍ２のバックグラウンド面積を有し、２．２ｍＬのこの溶液を必要とし；２４−円パターンを有するパターンは７３ｃｍ２のバックグラウンド面積を有し、３．６ｍＬのテフロン溶液が使用された（拡張多段階合成に対し）。
【００６７】
堆積後、テフロンＡＦの溶液は室温で蒸発させなければならない。乾燥は、アレイの上下少なくとも５ｃｍで、アレイを吊して維持することにより加速できる（例えばラック内、図３Ｃ）。乾燥はまた、アレイを、水滴の形状を乱さない熱気ストリーム（例えば、ヒートガン、モデルＭＨＴ  ７５０ＶＴ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｔｏｏｌ；＞３０ｃｍの距離）に曝露することにより、加速できる。紙はオーブン内で乾燥させることができる（例えば、６０℃で３０分）。他の条件を最適化させる場合、２つの因子を考慮しなければならない：（１）高い流速の空気は液滴の形状の乱れを引き起こすことがあり、パターニングの失敗および望まれないエリアでのテフロンの堆積に至る可能性があり；（２）乾燥プロセス中の高温はスクロースの溶液を沸騰させる可能性があり、これはアレイの望まれない領域での保護溶液の「跳ね飛び」を引き起こし得る。上記例および検討事項を使用して、乾燥条件は当業者により容易に最適化される。
【００６８】
乾燥工程は紙の光学特性における視認可能な変化を伴う。乾燥されたテフロン−パターン領域は不透明となり−それらは高い反射率を有する明るい白色であり；対照的に、同じアレイ上の、親水性の、スクロース保護領域は半透明に見える（図１Ｄ）。完全に乾燥されていない領域では不完全なパターニングが得られ、これは有機溶剤による処理中に不具合を起こす傾向があるので、テフロン溶液の完全乾燥は重要である。
【００６９】
最終工程として、アレイは水でリンスできる（例えば、水流下で２−５分、大きな容器内での少なくとも１０分の浸漬により、または保護溶液を除去する任意の他の好適なプロセス）。この工程中のアレイの水への曝露により、パターニングにおける全ての不完全さが明らかになり、それはテフロンパターンエリアでの透光性領域として現れる。この工程では、アレイは品質について検査されなければならない。不完全なアレイはパターニングプロセスに戻すことができる（例えば、スクロースおよびテフロンの繰り返し堆積が必要とされる）。複数の繰り返し堆積が可能であるが、望ましくはない。
【００７０】
水でリンスしたアレイは使用、パッケージングまたは貯蔵の前に乾燥される。
【００７１】
自動パターニング
下記は、市販のロボットスポッター（ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳ製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＸＳワークステーション）にインプットされる例示的な特定の工程および実験パラメータである。プログラムにより、使用者からの介在なしで、４つのパターン基材（約３．５分／アレイ）が得られる。プログラムレポートで詳述されるプログラムにより、４つの異なる形状のパターンが作製され、保護溶液の体積、その後、［００８１］および［００８３］で記載されるテフロン溶液の体積が、変更なしで分注される。
【００７２】
プログラムレポート
プログラム名：ＴＡＦｏｎ４ｄｉｆｆＰａｔｔ
ファイル名：Ｃ：＼ＰｒｏｇｒａｍＤａｔａ＼ＢｉｏＴｅｋ＼ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｏｗｅｒ＼ＰｒｏｇｒａｍＦｉｌｅｓ＼ＴＡＦｏｎ４ｄｉｆｆＰａｔｔｅｒｎ．ＰＧＭ
フォーマット：８−チャンネル（シングルチャンネルピペッターを使用）
コメント
Ａ＝９６円
Ｂ＝４８鍵穴形状
Ｄ＝９６四角
Ｅ＝２４円
供給リスト
タイプ９６円のステーションＡカラム１〜１２における容器、体積０μｌ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
タイプ９６円のステーションＢカラム１〜１２における容器、体積０μｌ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
タイプＬＡＢＣＯＮ２００ＲＯＢＯＴＩＣのステーションＣカラム１〜１２におけるチップ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
タイプ９６円のステーションＤカラム１〜１２における容器、体積０μｌ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
タイプ２４−円のステーションＥカラム１〜６における容器、体積０μｌ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
タイプＲＥＡＧ＿ＲＥＳ＿ＵＮＩＶのステーションＦカラム１〜１における容器、体積５０ｍｌ、１後リロード、１後リセット、ＩＤなし
ループ情報
最大ループ：１２
プロンプト：ループの数
プログラムコマンド
REMARK "96 円上での堆積を開始"
LOOP Max times [Level 1]
TIPS from Sta. C column 1 (+0) using Rack for tips, Waste for residual
ASPIRATE 40ul from Sta. F column 1 (+0) using PIPAspSugar
DISPENSE 40ul into Sta. A column 1 (auto-incr) using PIPDispensePaper
LOOP OFF
LOOP 88 times [Level 1]
DISPENSE 15μl into Sta. A location A1 (auto-incr) by col using SingleDispTAF
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 25μl into Sta. A location A1 (auto-incr) by col using SingleTAFLeft
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 25μl into Sta. A location A12 (auto-incr) by col using SingleTAFRight
LOOP OFF
REMARK "96 四角上での堆積を開始"
LOOP Max times [Level 1]
TIPS from Sta. C column 1 (+0) using Rack for tips, Waste for residual
ASPIRATE 25μl from Sta. F column 1 (+0) using PIPAspSugar
DISPENSE 25μl into Sta. D column 1 (auto-incr) using PIPDispensePaper
LOOP OFF
LOOP 88 times [Level 1]
DISPENSE 20μl into Sta. D location A1 (auto-incr) by col using SingleDispTAF
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 25μl into Sta. D location A1 (auto-incr) by col using SingleTAFLeft
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 25μl into Sta. D location A12 (auto-incr) by col using SingleTAFRight
LOOP OFF
REMARK "24円上での堆積を開始"
LOOP 6 times [Level 1]
TIPS from Sta. C column 2 (+0) using Rack for tips, Waste for residual
ASPIRATE 75ul from Sta. F column 1 (+0) using PIPAspSugar
DISPENSE 75ul into Sta. E column 1 (auto-incr) using PIPDispensePaper
LOOP OFF
LOOP 48 times [Level 1]
DISPENSE 70μl into Sta. E location A1 (auto-incr) by col using SingleDispFor24
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 50μl into Sta. E location A1 (auto-incr) by col using SingDisp24left
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 50μl into Sta. E location A6 (auto-incr) by col using SingDisp24Right
LOOP OFF
REMARK "48KH上での堆積を開始"
LOOP Max times [Level 1]
TIPS from Sta. C column 1 (+0) using Rack for tips, Waste for residual
ASPIRATE 32μl from Sta. F column 1 (+0) using PIPAspSugar
DISPENSE 32μl into Sta. B column 1 (auto-incr) using PIPDispensePaper
LOOP OFF
LOOP 88 times [Level 1]
DISPENSE 13μl into Sta. B location A1 (auto-incr) by col using SingleDispTAFslw
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 20μl into Sta. B location A1 (auto-incr) by col using SingleTAFLeft
LOOP OFF
LOOP 8 times [Level 1]
DISPENSE 20μl into Sta. B location A12 (auto-incr) by col using SingleTAFRight
LOOP OFF
<End>
【００７３】
ホルダーを使用する自動テフロン−パターニングは図２に記載される。別のカスタムホルダーを設計でき、この液体取扱機器または同様の液体取扱機器にインプットできる。ロボットのプログラミングユニットでは、ホルダーによりクランプされた紙は特定数のウェル（９６）、Ｘ、ＹおよびＺの寸法、および最大体積を有するマイクロプレート容器として記載される。分注が起こる正確な垂直限界変位および高さを規定し、液体取扱器の先端が紙に穴を開けることがないように確保することが重要である。
【００７４】
特定の実施形態では、液体−取扱システムは全フッ素置換溶剤と適合しなければならない（管類はＨＦＥ溶剤に反応してはならない）。全フッ素置換溶液の封じ込めは溶剤の蒸発を防止しなければならない。例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＸＳでは、全フッ素置換溶液は密封ビンから分注される。この例では、プログラム中のテフロン溶液の濃度は６．４ｍｇ／ｍｌであった。より高い濃度の溶液の取扱は、ロボットによる再現可能な分注を可能にするために、適切に調節される必要がある。
【００７５】
図４に示されるように、簡単なワックス−パターニングにより閉じ込められないであろう、異なる溶剤（有機、または界面活性剤を有する水性）はテフロン−パターンアレイのウェルに長期間（蒸発まで）閉じ込めることができる。異なる幾何形態が、様々な適用のために設計可能である。
【実施例１】
【００７６】
図５は、パターンエリアを通る異なる溶剤の流速の定量化を説明する１つの例を示す。２０マイクロリットルのＤＭＦ、水またはＮＭＰを、テフロンパターンより取り囲まれた５×５ｍｍ親水性エリアにスポッティングした。１分毎の溶剤滴の形状を、カメラを使用してモニタし、液滴の高さを、紙の上下でカスタム画像解析スクリプト（ＭａｔＬａｂ）を用いて定量化した。紙を通る液体の流速の良好な再現性が観察された。異なる有機溶剤は異なるフロースルー速度を有する。フロースルー速度を、溶剤の５０％が紙を通って流れるのに必要とされる時間として概算した場合、この時間は、ＤＭＦではＮＭＰよりも２倍速かった。フロースルー速度は溶剤の粘度と関連する可能性があり、最適フロースルー条件は、図５で記載されるものと同様の方法を用いて設計し、定量できる。流れは、必要に応じて、マイクロウェルプレートのためのローターが取り付けられた遠心分離機内でアレイをスピンさせることにより加速できる、流れはまた、アレイ下で空気の吸引、例えば、アレイ下で真空に接続された管または管のアレイを適用することにより、加速できる。
【００７７】
図６は、有機溶剤に対する長期安定性およびパターンが故障する条件を検出するためのアッセイを説明する１つの例を示す。パターンの故障を検出するアッセイは下記の通りであった：「短期洗浄」：アレイをＤＭＦに３サイクル、それぞれ１分の間曝露させた；「長期洗浄」：アレイを２０サイクルの間ＤＭＦに曝露させた（各サイクル１分）および／または２４時間、ＤＭＦに浸漬させた。これらの条件は、アレイの多段階有機合成への典型的な曝露を模倣するために選択した。ワックス−パターニングプロセス中のパターンを設計するために使用されるストローク厚さは、テフロン−パターンアレイの安定性に影響し；このストロークはウェル間のテフロン含有バリアの厚さを規定した。テフロンの非常に小さなバリアを有するテフロン−パターンアレイは、「短期間洗浄」後でのみ溶剤を閉じ込めた。「長期洗浄」後、このパターンは故障した（図６Ａ）。このパターンの故障は、ウェルを分離するテフロンで保護されたエリアの＜１ｍｍ厚さのためであった。ワックスストロークを最小厚さ（例えば、１１５ミクロンの厚さの紙に対し０．５ｐｔ）まで低減させると、テフロン含有バリアの厚さが増加し、パターンは長期洗浄に耐えるようになる（図６Ｂ）。
【００７８】
図７は、パターン支持体は、標準ペプチド合成において使用されるカップリング反応中に、優れた性能を有することを証明した１つの例を示す。条件および試薬は、紙上での標準固相合成と同様である（ＳＰＯＴ）。アミノ酸のカップリングおよび合成の改善された収率が観察された（図７）。パターンおよび非パターン紙シートを、標準アミノ酸カップリング条件に曝露させ、合成されたペプチドの量／単位面積を比較した。この目的を達成するために、固相に付着した各ペプチドから除去されたＦｍｏｃの量を定量した。非パターンアレイと比較すると、パターンアレイ上で合成されたペプチドの量の著しい増加が観察された（図７）。
【００７９】
図８は、１０量体ペプチド（Ａｌａ）１０の２０工程合成における、パターン紙の優れた性能の別の例を示す。パターン支持体および非パターン支持体上での同じ合成の比較により、ほとんどの工程で収率はパターン支持体上で著しく高くなることが証明される。最終デカペプチド（Ａｌａ）１０の収率は、非パターン支持体上では約２０％およびパターン支持体上では約５０％である。各反応工程での不完全なペプチド配列収率が減少した。これらの不完全な配列は主生成物を汚染し、精製および下流アッセイにおいて問題を引き起こす。パターン支持体上で製造された最終生成物の予想される純度は、非パターン支持体上で生成された同じ生成物の純度よりも著しく高い。
【００８０】
図９は、隣接ジオールの酸化におけるパターンアレイの使用および固体支持体上に示される得られたアルデヒドとのオキシム結合形成を証明する一例を示す。酸化試薬（ＮａＩＯ４）は選択されたエリアのみにスポッティングされ、オキシムは酸化剤を含むエリアにおいてのみ形成された。他の化学合成が有機合成の当技術分野で知られているように実施され得る。
【実施例２】
【００８１】
紙を用いて、インビボおよびインビトロでの細胞の３Ｄ培養（Ｄｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ２００９，  １０６，  １８４５７−１８４６２）、それらの遊走（Ｄｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１１，  ６，  （５）：  ｅ１８９４０）、および薬物耐性（Ｄｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３，  ８５，  ８０８５−８０９４）を研究するための「折り畳み可能な」３Ｄ腫瘍モデルを作製できることが以前に示されている。テフロン−パターンアレイの使用により、細胞接着、増殖または分化を支持できる表面−固定化ペプチドを特徴付けることができる。生理活性ペプチドが合成され、以前に報告されており、これらは、幹細胞の自己再生を支持し（Ｍｅｌｋｏｕｍｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０，  ２８，  ６０６−６１０；  Ｋｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０，  ７，  ９８９−９９４；  Ｄｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１０，  １３２，  １２８９−１２９５）、上皮−間葉系移行を誘導する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ２０１１，  ４３７７−４３８２）ことが知られている。
【００８２】
図１０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の、紙上で合成された公知の生理活性ペプチドへの接着を示す。紙上に固定されると、合成した８つのペプチドのうち５つは、陽性対照ＧＲＧＤＳと同様の、またはそれより高いレベルでＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がんの接着を支持した。他の３つのペプチドは、スクランブルペプチド、ＧＧＲＤＳよりも大きな接着を支持した。未修飾セルロースおよびＧＧＲＤＳで装飾した紙は最小結合を示した。図１０（ａ）は、蛍光ゲルスキャナによるイメージングがＧＦＰ蛍光を位置づけることを示す（暗いエリア）。図１０（ｂ）は、ＧＲＧＤＳ（陽性対照）への結合およびＧＧＲＤＳ（陰性対照）への結合がないことを確認するための、共焦点顕微鏡法による確証的な結果を示す。
【００８３】
図１１は、図１０で提供されたペプチドアレイ上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。画像は、アレイ上で３時間のインキュベーション後の細胞の短期間接着を表す。
【００８４】
図１２は、ペプチドで修飾された紙上での長期細胞増殖を示す。図１２（ａ）では、ＧＲＧＤＳペプチドおよびＧＧＲＤＳペプチドで修飾された紙上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＧＦＰでトランスフェクトされている）の蛍光ゲルスキャナ画像が示される。紙上の細胞の蛍光強度を毎日６日にわたって追跡し、同じグレースケールレベルを用いて記録した。グレースケールの増加は、細胞数の増加を示す。
【００８５】
図１２（ｂ）は、ゲルスキャナ画像のグレースケール強度のデジタル化を示す。グレースケールは細胞数に比例し、細胞増殖を表す。図１２（ｃ）は、ペプチドで修飾された紙（青色）の繊維に付着する細胞の、代表的な共焦点蛍光画像（緑色）を示す。画像は、細胞による６日の増殖後にＧＲＧＤＳ修飾紙上で撮られている。これらの結果から、テフロン−パターンペプチドアレイの成分のいずれも、細胞に対し毒性を示さなかったことが示される。
【００８６】
図１３は、アレイ上で合成されたペプチドの代表的な共焦点画像を示す。画像は蛍光ゲルスキャナにより走査されたアレイ上のペプチドゾーンに対応する。画像は、アレイ上での３時間のインキュベーション後の細胞の短期間接着を表す。長期にわたり、ペプチドで修飾されたいくつかの表面上の細胞は、繊維に沿って広がり、細胞分裂を再開した。
【００８７】
テフロン−パターンアレイをその後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上でのファージディスプレイパニングにより新規に同定された３０個のペプチドの生物学的特性を評価するために使用した（表１）。
【００８８】
【表１−Ａ】
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【００８９】
【表１−Ｂ】
2016533498.tif 000003
【００９０】
【表１−Ｃ】
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【００９１】
【表１−Ｄ】
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【００９２】
【表１−Ｅ】
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【００９３】
図１４（ａ）では、蛍光ゲルスキャナを使用して、ペプチド−アレイ上のファージ由来ペプチドへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞の接着を評価した。図１４（ｂ）は、高い、ない、および中程度の細胞接着を示すペプチドで修飾された紙の代表的な共焦点画像を表す（共焦点画像のより多くの例：図１３、１５、および１６）。図１４（ｃ）は、３２のペプチドの蛍光ゲルスキャナ画像からの細胞数／ゾーンのデジタル化を示す。（＋）線および（−）線は、陽性および陰性対照の強度レベルを表す。全体で、３０のペプチドのうちの１４がインテグリン結合ペプチドＧＲＧＤＳよりも高いレベルで細胞接着を支持し（図１４ｃ）；４つのペプチドが同様のレベルで接着を支持し、１０が接着を示さなかった。
【００９４】
図１５Ａでは、アレイを、蛍光ゲルスキャナによりイメージングし、４８時間後のアレイ上の細胞の存在（暗エリア）を同定した。図１５Ｂは、アレイの蛍光ゲルスキャナ画像に対応する配列を列挙する。細胞（緑）を紙繊維（青）上で共焦点顕微鏡法により観察し、紙中での細胞の生存性を評価した。我々は、細胞の付着およびそれらの紙支持体の繊維に沿った伸展を観察する。共焦点画像は、ＧＲＧＤＳ（陽性対照）（図１５Ｃ）、ＧＧＲＤＳ（図１５Ｄ）、ブランク紙（陰性対照）（図１５Ｅ）、ならびにＧＲＧＤＳよりも高い（図１５Ｆ）、同様の（図１５Ｇ）および低い（図１５Ｈ）細胞への結合を有するペプチドを表す。
【００９５】
図１６は、４８時間の培養後の、ペプチドで修飾された紙の内側で増殖する細胞の代表的な共焦点画像を示す。画像は、蛍光ゲルスキャナにより走査されたアレイ上のペプチドゾーンに対応する。
【００９６】
図１７は、＞９９％純度を有するペプチドに対するＬＣ−ＭＳ／ＵＶ分析の一例を示す。図１７Ａはポジティブトータルイオンカウント（ＴＩＣ）トレースを示し；図１７ＢはネガティブＴＩＣトレースを示し；図１７ＣはＵＶトレースを示し；ならびに図１７Ｄ−Ｅは示した溶出時間でのピークのＭＳスペクトルを示す。ＮＨ３ガスによる紙からのペプチドの切断では、Ｃ末端上に酸性官能基およびアミド官能基の混合物を生じることが認められた。これらの２つのペプチドはＬＣトレース上で＜１分だけ分離される二重線として現れる。
【００９７】
図１８は、半アレイでの典型的な細胞結合実験を示す（２つのパニング実験から同定された４０のペプチド、および８の対照）。図１８ａは、３時間のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞への曝露後の、４つの複製物の蛍光ゲルスキャナ画像を示す。アレイ上のペプチド配列のリストを図１８ｂに示す。図１８ｃは、図１８ａから抽出された各ペプチドについての対象となるゾーンから構成され、ペプチド別に編成される。各ペプチドゾーンに対する蛍光の平均強度がその後、これらの細胞に対して以前に確立された較正曲線により、細胞数／ゾーンに変換される（図１８ｄ）。図１８ｅは、４つの複製物にわたる標準偏差を有する得られたプロットである。
【００９８】
図１９は、ペプチド修飾アレイが、ＭＣＦ−７乳癌細胞の培養を７日間支持し、抗癌剤パクリタキセル（タキソール）に最後の４日間曝露された場合に観察される、薬物耐性および形態などの変化を示す。図１９ａは、４つのペプチド（２つの対照を含む）についてタキソールなし培地中で培養後のカルセイン染色細胞の共焦点画像を提供し、図１９ｂは、タキソールを有する培地中で培養された細胞に対応する。４番目のペプチドは薬物耐性細胞の集団を示す。各列の最後の顕微鏡写真は、形態学的な変化を誘導したペプチド上で培養された細胞に対する拡大図であり：薬物なしで培養された場合には凝集物を形成する伸展細胞の代わりに、タキソールに曝露された場合は分離した、丸い細胞がみられる。
【００９９】
これらの実験から、テフロン−パターン紙は多数のペプチドの合成および細胞に基づくスクリーニングのための有効なプラットフォームであることが確認された。紙は、分析装置または低コストの診断法などの適用に対する多用途支持体である（最近のレビューについては、Ｙｅｔｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２０１３，  １３，  ２２１０−２２５１；  Ｈｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００９，  ８１，  ９０５５−９０６４を参照されたい）。パラレル合成能力ならびに有機溶剤および界面活性剤に耐性のあるパターンの作製はまた、これらの領域で有益なはずである。低コストの紙のパターニングはこの技術を便宜的に利用可能にするが；しかしながら、材料製造のさらなる進歩（リソグラフィー、３Ｄ−プリンティング、製織、など；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．  ２０１３，  ４２，  ５１８４−５２０９）により、有機合成およびバイオアッセイに好適な、同様の低コストの、自立した、パターニングされた、多孔性シートが得られるであろう。
【０１００】
この明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、この発明が関連する分野の当業者の技術レベルを示し、それぞれ個々の、特許または特許出願が、参照により組み込まれることが特定的に、かつ個別に示されたのと同じ程度まで、本明細書で参照により組み込まれる。
【０１０１】
発明をこのように記載してきたが、これは多くの点で変更できることは明らかであろう。そのような変更は、発明の精神および範囲から逸脱しているものと考えられるべきではなく、当業者に明らかであろうそのような改変は全て、下記特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号２：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号３：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号４：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号５：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号６：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号７：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号８：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
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配列番号１０：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号１１：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号１２：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号１３：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
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配列番号９７：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号９８：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号９９：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号１００：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
配列番号１０１：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のファージディスプレイパニングによって同定されたペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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