(57)【要約】本発明は、１）細切されたユリノキの樹皮に酢酸エチルを添加して、１次抽出し、抽出液にブタノールを加え、酢酸エチル層とブタノール層を層分離させた後、ブタノール層を除去し、減圧濃縮させ粗抽出物を得ている工程;と２）得られた粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３低級アルコール水溶液及びｎ−ヘキサンを加えた後、ｎ−ヘキサン層に溶解された維持成分と水不溶性物質を除去した後、低級アルコール水溶液層を得て、エピツリピノリドとコスツノリドを高純度に分離する工程;で構成された慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の突然変異であるＴ３１５Ｉの成長を効果的に抑制する慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供することである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）細切されたユリノキの樹皮１重量部に対して抽出溶媒として酢酸エチル２〜２０重量部を添加して、１次抽出し、抽出液にブタノール０．５〜１０重量部を加え、酢酸エチル層とブタノール層を層分離させた後、ブタノール層を除去し、減圧濃縮させ粗抽出物を得ている工程;と
２）得られた粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３低級アルコール水溶液及びｎ−ヘキサンを加えた後、ｎ−ヘキサン層に溶解された維持成分と水不溶性物質を除去した後、低級アルコール水溶液層を得て、エピツリピノリドとコスツノリドを高純度に分離する工程;からなるユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドを活性成分として含む慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法において、
上記慢性骨髄性白血病の治療薬は２０〜５０重量％の含有量のエピツリピノリドと５〜２０重量％の含有量のコスツノリドを含有して、上記抽出は冷浸、パーコレーション、超音波、温浸または還流の方法で抽出することを特徴とするユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドを活性成分として含む慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法。
【請求項２】
前記工程２）で得られた低級アルコール水溶液層に再び水を加えて低濃度低級アルコール水溶液を製造した後、ジクロロメタンを添加してジクロロメタン層を分離し、乾燥精製させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２の方法に基づいて得られたエピツリピノリドとコスツノリドを主成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療薬。
【請求項４】
有効成分として請求項３のエピツリピノリドとコスツノリドを含有して薬剤学的に許容される担体を含む慢性骨髄性白血病の治療または予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユリノキの樹皮から抽出されたエピツリピノリド（epi-Tulipinolide）とコスツノリド（costunolide）を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療に有用な成分を抽出分離する方法に関するものである。また、本発明は、抽出分離方法に応じて得られたエピツリピノリドとコスツノリドを主成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユリノキ（Liriodendron tulipifera L.、Yellow-poplar）は、モクレン科（Magnoliaceae）に属する落葉高木で、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物は、アルカロイド、セスキテルペンおよびリグナン化合物が含有されている。
【０００３】
ユリノキの抽出物には、コスツノリド、ツリピノリド（tulipinolide）、エピツリピノリド（epi-tulipinolide）、エピツリプジエノリド（Epitulipdienolide）とγ−リリオデノリド（gamma-liriodenolide）などセスキテルペンラクトン（sesquiterpene lactone）類が含まれている。
【０００４】
これらのセスキテルペンラクトンのうち、パルテノライド（parthenolide）は、核転写因子ＮＦ−κＢ、ｐ２１、およびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１等を介して抗炎症または抗癌効果を示す物質として知られている。特にパルテノライドとパルテノライドの合成誘導体であるLC-1（dimethylamino-parthenolide）は、核転写因子ＮＦ−κＢの活動の抑制を介してアポトーシスを誘導するため、急性骨髄性白血病（Acute myeloid leukemia（AML））に抗がん効果を示すことが報告された。
【０００５】
慢性骨髄性白血病は、骨髄内骨髄性白血球細胞がランダム増殖して血液中の蓄積された骨髄増殖性疾患である。白血病の種類は、大きく急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病に分けられる。
【０００６】
成人白血病の約１５〜２０％を占めている慢性骨髄性白血病の場合、フィラデルフィア染色体（Philadelphia chromosome; Ph）によって発症さ骨髄内異常細胞が過剰に増殖して起こる疾患である。フィラデルフィア染色体は９番染色体のＡＢＬ遺伝子と２２番染色体のＢＣＲ遺伝子がそれぞれ切断された後、互いに転座がされて生成されるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子である。
【０００７】
この異常な融合遺伝子は、チロシンキナーゼ活性を有する融合タンパク質を発現させることにより、発癌タンパク質Ｐ２１０の合成に関与し、合成されたＰ２１０タンパク質は、骨髄球前駆細胞のアポトーシスを抑えて、最終的に、これらの細胞の異常な増殖に起因する骨髄増殖性疾患をもたらすものである。
【０００８】
イマチニブ（Imatinib）（商品名：グリベック）は第１世代の「BCR-ABL」のチロシンキナーゼ阻害剤として骨髄性白血病の１次治療薬として長期間使用されたが、イマチニブ（Imatinib）に耐性を持った患者が発生するなどの問題が発生した。
【０００９】
これに対してダサチニブ（Dasatinib）、ニロチニブ（Nilotinib）、ボスチニブ（Bosutinib）のイマチニブ耐性を克服した第2世代の治療薬が開発され、より効果的かつ多様な薬物治療が開発された。しかしながら、最近「BCR-ABL」の突然変異「T315I」変異遺伝子が発生することにより、これらの第２世代の薬剤も、それ以上の治療効果を示さない場合が発生した。第１世代の治療薬と第２世代の治療薬に抵抗または耐性の原因となる突然変異「T315I」変異遺伝子抑制に効果的な第３世代の治療薬の開発が要求される。
【００１０】
これに対してユリノキの抽出物の主成分であるエピツリピノリドが慢性骨髄性白血病（CML）、第１世代の治療薬であるイマチニブ（Imatinib）と第２世代の治療に抵抗性を持つ慢性骨髄性白血病に効果的な治療効果を示すこととして、これらの物質この慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の効果的優れた3世代の治療薬になることがあることを本発明者らの最近の研究で確認した。
【００１１】
また、本発明者らはこのためにユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドと同じ慢性骨髄性白血病に効果的な薬理活性成分の抽出分離精製を試みた。
【００１２】
一方、胃腸疾患の治療に有効な成分でユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドを抽出する方法は、本出願人によって大韓民国特許登録第１０−１３５３３０６号「ユリノキの樹皮で胃腸疾患の治療成分を抽出方法」で登録されている。
【００１３】
したがって、本発明者らは、様々な抽出溶媒を介して３〜５年生のユリノキの樹皮の抽出物またはユリノキの樹皮の抽出物の主成分であるエピツリピノリドを介して慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第１世代の治療薬であるイマチニブと第２世代の治療に抵抗性を示すＢＣＲ−ＡＢＬの変異Ｔ３１５Ｉバリアント遺伝子による慢性骨髄性白血病に効果的な治療薬の開発のためにユリノキの樹皮から活性成分としてエピツリピノリドとコスツノリドを含有する慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を開発して、本発明を完成するに至ったものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、様々な抽出溶媒を介して３〜５年生のユリノキの樹皮の抽出物またはのユリノキの樹皮の抽出物の主成分であるエピツリピノリドを介して慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第１世代の治療薬であるイマチニブと第２世代の治療に抵抗性を示すＢＣＲ−ＡＢＬの変異Ｔ３１５Ｉバリアント遺伝子による慢性骨髄性白血病に効果的な治療薬の開発のためにユリノキの樹皮から活性成分としてエピツリピノリドとコスツノリドを含有する慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を開発しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、１）細切されたユリノキの樹皮１重量部に対して抽出溶媒として酢酸エチル２〜２０重量部を添加して、１次抽出し、抽出液にブタノール０．５〜１０重量部を加え、酢酸エチル層とブタノール層を層分離させた後、ブタノール層を除去し、減圧濃縮させ粗抽出物を得る工程;と、２）得られた粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３低級アルコール水溶液及びｎ−ヘキサンを加えた後、ｎ−ヘキサン層に溶解された維持成分と水不溶性物質を除去した後、低級アルコール水溶液層を得て、エピツリピノリドとコスツノリドを高純度に分離する工程;からなるユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドを活性成分として含む慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法において、
上記慢性骨髄性白血病の治療薬は２０〜５０重量％の含有量のエピツリピノリドと５〜２０重量％の含有量のコスツノリドを含有して、上記抽出は冷浸、パーコレーション、超音波、温浸または還流の方法で抽出することを特徴とするユリノキの樹皮からエピツリピノリドとコスツノリドを活性成分として含む慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供することである。
【００１６】
ここで、前記工程２）で得られた低級アルコール水溶液層に再び水を加えて低濃度低級アルコール水溶液を製造した後、ジクロロメタンを添加してジクロロメタン層を分離し、乾燥精製させる工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記方法に応じて、得られたエピツリピノリドとコスツノリドを主成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療薬を提供することである。
【００１８】
本発明のまた他の目的は、有効成分として、上記エピツリピノリドとコスツノリドを含有して薬剤学的に許容される担体を含む慢性骨髄性白血病の治療または予防のための医薬組成物を提供することである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の効果は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第１世代の治療薬であるイマチニブと第２世代の治療に抵抗性を示すＢＣＲ−ＡＢＬの変異Ｔ３１５Ｉバリアント遺伝子による慢性骨髄性白血病に効果的な治療薬の提供のためにユリノキの樹皮から活性成分としてエピツリピノリドとコスツノリドを含有する慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、製造実施例１で得られたユリノキの抽出物の液体クロマトグラフを示したもので、エピツリピノリドとコスツノリドの存在を確認したものである。
【図２】図２は、製造比較例１で得られたユリノキの抽出物の液体クロマトグラフを示したものでエピツリピノリドとコスツノリドの存在を確認したものである。
【図３】図３は、製造実施例１で製造されたユリノキの抽出物から液体クロマトグラフを介して分離したエピツリピノリドの構造を１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを介して確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子である「BCR-ABL」の変異「T315I」変形遺伝子による慢性骨髄性白血病に効果的な抑制を示した慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供することである。
【００２２】
また、本発明は、３〜５年生のユリノキの樹皮を酢酸エチル溶媒を使用して抽出した後、分離精製したもので、抽出物には、代表的な指標成分であるエピツリピノリドとコスツノリドを含有するものである。したがって、本発明は、エピツリピノリドとコスツノリドを含有した慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、前記ユリノキの抽出物またはエピツリピノリドと同じ有効成分の慢性骨髄性白血病、第1世代の治療薬であるイマチニブ（商品名：グリベック）と第2世代の治療に抵抗性を示すＢＣＲ／ＡＢＬの変異Ｔ３１５Ｉバリアント遺伝子による慢性骨髄性白血病に効果的な抑制を示し、上記ユリノキの抽出物またはエピツリピノリド物質が慢性骨髄性白血病第3世代の薬物の効果的な使用の可能性を提示したものである。
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、酢酸エチルを抽出溶媒として使用して、慢性骨髄性白血病に効果的な薬理活性を持つエピツリピノリドとコスツノリドが含有された慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供することである。
【００２６】
上記慢性骨髄性白血病の治療薬には、有効成分としてエピツリピノリド、コスツノリドを含有する。本発明のユリノキの樹皮の抽出物には、様々な薬理成分があり、代表的な指標成分はエピツリピノリドとコスツノリドがある。
【００２７】
また、本発明は、前記ユリノキの樹皮の抽出物の成分の一つであるエピツリピノリドとコスツノリドを有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療のための、または予防のための医薬組成物を提供する。
【００２８】
また、本発明は、（１）ユリノキの樹皮を抽出溶媒である酢酸エチルを使用して、１次抽出し、ブタノールを加えブタノール溶解性成分を除去させて粗抽出物を製造する工程（工程（１））、（２）上記工程（１）で得られた粗抽出物を精製して指標成分の含有量を高めた高純度抽出物を製造する分離精製工程（工程（２））を含む慢性骨髄性白血病治療薬の分離製造方法を提供する。
【００２９】
上記の工程1は、ユリノキの樹皮を細切した後、酢酸エチル抽出溶媒として1次抽出し、抽出液にブタノールを加え、酢酸エチル層とブタノール層を層分離させた後、ブタノール層を除去し、減圧濃縮させて粗抽出物を収得する工程である。
【００３０】
上記の工程（２）は、上記の工程1で得られた粗抽出物、Ｃ１〜Ｃ３低級アルコール水溶液及びｎ−ヘキサンを加えた後、ｎ−ヘキサン層に溶解された維持成分と水不溶性物質を除去した後、低級アルコール水溶液層を得分離して本発明のエピツリピノリドとコスツノリドを高純度で分離精製する工程である。
【００３１】
また、必要に応じて、前記低級アルコール水溶液層に水を加えて低濃度の低級アルコール水溶液で製造した後、これを酢酸エチルを加えた後、酢酸エチル層に溶解されたエピツリピノリドとコスツノリドをさらに高純度で分離精製することができる。
【００３２】
本発明に使用されたユリノキの樹皮は、大韓民国全羅南道康津郡で採取した。採取した樹皮を乾燥して、細切後、乾燥した試料の重量の２〜２０倍、好ましくは４〜１０倍の量の抽出溶媒を加えて室温１５℃〜５０℃で２４〜９６時間抽出して得られた抽出液を減圧濃縮し、乾燥して本発明の抽出物を得た。
【００３３】
本発明は、ユリノキの樹皮のエキス中の指標成分であるエピツリピノリドとコスツノリドの含有量を効率的に抽出または精製することができる製造方法である。
【００３４】
【化１】
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【００３５】
前記製造されたユリノキの樹皮の抽出物は、Agilent HPLC1200 series（USA）の機器を使用して、高性能液体クロマトグラフィー法によりエピツリピノリド（滞留時間〜３１分）とコスツノリド（滞留時間〜３６分）の存在を確認し、含有量を測定した。分析条件は、逆相カラムKromasil C18カラムを使用して試料濃度５ｍｇ／ｍＬ、紫外線波長215nmで測定し（流速：１．０ｍＬ／分）、移動相の水とメタノールについて、時間に応じたグラジエントの条件を使用した（表１） 。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
上記表１の条件で分析した結果、主成分であるエピツリピノリドとコスツノリドは、それぞれ約３１分と約３６分で検出された。いくつかの成分の中でエピツリピノリドとコスツノリドの存在は、エピツリピノリドとコスツノリドの標準品試料を高速液体クロマトグラフィーに注入した後、流出されるまで、必要とされる滞留時間（retention time）が一致してすることで確認した。
【００３８】
エピツリピノリドの立体化学を通じた分析では、比旋光度（specific rotation）を測定した結果、文献で報告されたエピツリピノリドの値（[α]Ｄ＝＋７６）とユリノキから抽出分離して測定されたエピツリピノリドの実際の値（[α]Ｄ＝＋７４）が一致して立体化学的にエピツリピノリドに決定した。
【００３９】
ユリノキの抽出物をLC-MSを使用して、エピツリピノリドとコスツノリドをはじめとする各含有成分の分子量を測定した。エピツリピノリド分子量は２９０、コスツノリドの分子量は２３２で確認され、他の成分、リデンチン（Ridentin）（ＭＷ＝２６４）、そして、デアセチルリピフェロリド（Deacetyllipiferolide）（ＭＷ＝２６４）と推定される成分も確認された。
【００４０】
また、ＮＭＲ分光学的分析法によってエピツリピノリドの構造も確認した。コスツノリドの存在もコスツノリド標準品を購入してＨＰＬＣにより比較分析して、存在を確認した。
【００４１】
ＬＣ−ＭＳ分析に使用した機器は、Waters社のＬＣ−ＭＳ分析機器を使用し、分析条件は、逆相カラムを使用した。試料体積は２μL、流速は０．３ｍＬ／分で分析し、PDA紫外線の波長は２００〜５００ｎｍで測定した。詳細なHPLC移動相のグラジエントの条件は表2のとおりである。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
この時、本発明の製造方法によるユリノキの樹皮の抽出物はエピツリピノリド４０〜５０重量％とコスツノリド１０〜２０重量％を含有しており、上記抽出方法は、冷浸、パーコレーション、超音波、温浸または還流の方法で抽出することも可能である。
【実施例】
【００４４】
（製造実施例１）酢酸エチル溶媒を用いた抽出物の製造
１.溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇを酢酸エチル２０００ｍＬに、室温で24時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル１次抽出液を得て、得られた１次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物１２．５４ｇを得た。
【００４５】
２．精製工程
得られた粗抽出物１２．５４ｇを７０％エタノール２００mＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００mＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、２．７５ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量は４４．１重量％、コスツノリド含量は１５．６重量％であることを確認した。
【００４６】
（製造実施例２）酢酸エチル溶媒を用いた抽出物の製造
１．溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇを酢酸エチル２０００ｍＬに、室温で７２時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル１次抽出液を得て、得られた１次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物１３．７２ｇを得た。
【００４７】
２．精製工程
得られた粗抽出物１３．７２ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、２．９８ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量は４６．２重量％、コスツノリド含量は１２．０重量％であることを確認した。
【００４８】
（製造実施例３）酢酸エチル溶媒を用いた抽出物の製造
１．溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇをハンマーで粉砕した後、酢酸エチル２０００ｍＬに、室温で96時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル１次抽出液を得て、得られた１次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物２５．７１ｇを得た。
【００４９】
２.精製工程
得られた粗抽出物２５．７１ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、３．８４ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量は４７．０重量％、コスツノリド含量は１５．４重量％であることを確認した。
【００５０】
（製造比較例1）クロロホルム溶媒を用いた抽出物の製造
1.溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇをハンマーで粉砕した後、クロロホルム2000mＬに、室温で24時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル1次抽出液を得て、得られた1次抽出液にブタノール500mＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物１０．４３ｇを得た。
【００５１】
２.精製工程
得られた粗抽出物１０．４３ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、１．９２ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量２２．１重量％、コスツノリド含量は５．２重量％であることを確認した。
【００５２】
（製造比較例２）エタノール溶媒を使用した抽出物の製造
１.溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇをエタノール２０００ｍＬに、室温で２４時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル1次抽出液を得て、得られた1次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物１９．５ｇを得た。
【００５３】
２.精製工程
得られた粗抽出物１９．５ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、２．６５ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量１５．４重量％、コスツノリド含量は３．７重量％であることを確認した。
【００５４】
（製造比較例  ３）  エタノール/水（１：１）混合溶媒を用いた抽出物の製造
1.  溶媒抽出工程
細切した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇをエタノール/水（１：１）混合溶媒２０００ｍＬに、室温で２４時間振とう・インキュベーションして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル１次抽出液を得て、得られた1次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物２５．１７ｇを得た。
【００５５】
２.精製工程
得られた粗抽出物２５．１７ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、１．７５ｇの抽出物を得した。抽出物中にエピツリピノリドとコスツノリドの含有量をＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳを介して定量分析してエピツリピノリド含量８．８重量％、コスツノリド含量は２．７重量％であることを確認した。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
前記製造実施例１−３、製造比較例１−３に示すように、製造実施例の方法に基づいて製造されたユリノキの樹皮の抽出物は、エピツリピノリドの含有量が４４〜４７重量％を示し、コスツノリド含有量の場合、１２〜１６重量％を示した。一方、製造比較例の方法に基づいて製造されたユリノキの樹皮の抽出物は、エピツリピノリドの含有量が8〜23重量％を示し、コスツノリドの含有量の場合、2〜6重量％を示した。
【００５８】
これは、抽出溶媒の違いに基づくもので、酢酸エチルがユリノキからエピツリピノリドとコスツノリドを最も高い含有量で抽出することができていることを確認したものである。
【図１】
2016517863.tif 000007
【図２】
2016517863.tif 000008
【図３】
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【国際調査報告】
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