(57)【要約】  Ca、F、および有機分子を含むフッ化カルシウム複合体を含む組成物が提供され、またそれらの使用のための方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ca、F、およびグルタチオンであるZを含むフッ化カルシウム複合体を含み、更に免疫学的に活性のあるサポニン画分を含む、アジュバント組成物。
【請求項２】
複合体が等パーセンテージ(w/w)のCaおよびFを含む、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
複合体がFのパーセンテージ(w/w)よりも高いパーセンテージ(w/w)のCaを含む、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
複合体が式(I)：
CaF(2-x)Z(x)/Z(y)  (I)
を有し、xが0〜2の非負数（包含的）であり、yが非負数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
複合体がy=0の式を有する、請求項４に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
複合体が式(II)：
CaF(2-x)Z(x)/HZ(y)  (II)
を有し、xとyの合計が2以下の非負数であり、xおよびyはいずれも0ではない、請求項１〜５のいずれか１項に記載のフッ化カルシウム組成物。
【請求項７】
前記複合体が式(III)：
CaF(2-x)Z(x)/AZ(y)  (III)
を有し、xとyの合計が2以下の非負数であり、xおよびyはいずれも0ではなく、Aは対イオンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のフッ化カルシウム組成物。
【請求項８】
Zがグルタチオンであり、複合体が51％のCa、48％のF、1％以下のグルタチオン(w/w)から28％のCa、20％のF、52％のグルタチオン(w/w)を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
組成物が製薬上許容される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
フッ化カルシウム複合体が粒子形態である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
複合体粒子がナノ粒子またはマイクロ粒子サイズ領域内にある、請求項１０に記載のアジュバント組成物。
【請求項１２】
Zがグルタチオンでない第2の複合体を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１３】
フッ化カルシウム複合体に吸着した抗原を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１４】
医薬において使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１５】
哺乳動物における免疫応答の生起において使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１６】
ヒトにおける免疫応答の生起において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１７】
ウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる疾患に対する哺乳動物の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１８】
ウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる疾患に対するヒトの予防および／または治療において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１９】
QS21の溶血活性の低下に使用するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のフッ化カルシウム複合体とQS21とを組合せるステップを含む、QS21の溶血活性の低減方法。
【請求項２１】
抗原と、請求項１〜２０のいずれか１項で規定したアジュバント組成物とを含有する、免疫原性組成物。
【請求項２２】
哺乳動物におけるウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる感染もしくは疾患の治療または予防のための方法であって、治療有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２３】
ヒトにおけるウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる感染もしくは疾患の治療または予防のための方法であって、治療有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物を該ヒトに投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
免疫原性応答を、それを必要とする哺乳動物において誘発するための方法であって、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２５】
免疫原性応答を、それを必要とするヒトにおいて誘発するための方法であって、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物を該ヒトに投与するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ワクチン抗原の安定化のための複合体、さらに複合体と共に使用される抗原に対する免疫応答を増強するための複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サブユニットワクチン、例えば組換えタンパク質/ポリペプチド抗原は弱い免疫原性しか示さず、このため安全且つ有効なアジュバントに対する需要がある。様々なアジュバントが知られており、例えば、ミョウバン、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウムなどの金属塩を含むアジュバントが挙げられる。例えば、Lindblad (2004年) Vaccine 22：3658-3668；Jiangら(2004年) Vaccine 23：693-698を参照されたい。
【０００３】
ワクチンの熱安定性は、それが世界中に流通する間の低温流通体系に対する必要性を低下させるかまたは回避するため、実用上および物流上の理由から望ましい。通常、抗原を安定化させるために凍結乾燥技術が適用される。しかしながら、凍結乾燥は、必ずしも可能または有効であるとは限らない。さらに、コストおよび時間がかかる凍結乾燥生産ステップを回避することで、世界中のより多くの人々がワクチンを入手できる可能性を高めることができるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Lindblad (2004年) Vaccine 22：3658-3668
【非特許文献２】Jiangら (2004年) Vaccine 23：693-698
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
一態様において、本開示は、Ca、FおよびZ(ここでZは有機分子である)を含むフッ化カルシウム複合体を提供する。それらの製造のための方法が提供される。アジュバントとしてのそれらの使用のための方法もまた提供され、同様に温度の影響に対して抗原を安定化させるためのそれらの使用のための方法も提供される。このような方法は、凍結乾燥を伴わない幾つかの複合体の使用を包含する。
【０００６】
さらなる態様において、フッ化カルシウム複合体を含むフッ化カルシウム組成物であって、前記複合体がCa、FおよびZ(ここでZは有機分子である)を含む、上記組成物が提供される。
【０００７】
さらなる態様において、沈殿条件下でCaCl2、NaF、およびNaZを組み合わせるステップと、不水溶性フッ化カルシウム複合体を回収するステップとを含む、ゾルゲル沈殿によるフッ化カルシウム複合体の製造方法が提供される。さらなる態様において、上記方法によって製造される製品が提供される。
【０００８】
さらなる態様において、先行する態様において開示されるフッ化カルシウム組成物を含むアジュバント組成物が提供される。
【０００９】
さらなる態様において、先行する態様において開示されるアジュバント組成物の製造方法が提供される。
【００１０】
さらなる態様において、抗原と、先行する態様において開示されるアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物が提供される。
【００１１】
さらなる態様において、先行する態様において開示される免疫原性組成物の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】HepBによって得られた動物結果：抗体測定(抗HBs 14pII)。抗原の応答は、抗原が、本明細書に記載されるCaF2ファミリーの様々な担体に吸着されている場合に維持される。
【図２】バッチ8833111と比較したバッチ8833107の赤外線スペクトル。赤外線分析は、バテライト型のCaCO3の存在を示す。
【図３】Ca/F/OH複合体の水溶性。前記複合体は、ハンドブックに報告されているCaF2の溶解性と比較して、より溶解性が高いことが示される。
【図４】t=0においてSDS-PAGEにより分析したF4T製剤。レーン：1、分子量標準；2、サンプルバッファー；3、CaF2/CO3+リポソーム；4、F4T+CaF2；5、F4T+CaF2+リポソーム；6、F4T+CaF2/システイン；7、F4T+CaF2/システイン+リポソーム；8、F4T+CaF2/CO3；9、F4T+CaF2/CO3+リポソーム；10、F4T。実施例3Bを参照。
【図５】4℃で1ヶ月後にSDS-PAGEにより分析したF4T製剤。レーン：1、分子量標準；2、F4Tバルク：バルクは-80℃で1ヶ月保存し、デポー(depot)の直前に解凍した；3、4℃で1ヶ月保存したF4Tバルク；4、無機物を含まずに製剤化し、4℃で1ヶ月保存したF4T；5、F4T+CaF2；6、F4T+CaF2+リポソーム；7、F4T+CaF2/システイン；8、F4T+CaF2/システイン+リポソーム；9、F4T+CaF2/CO3；10、F4T+CaF2/CO3+リポソーム。実施例3Bを参照。
【図６】30℃で1ヶ月後にSDS-PAGEにより分析したF4T製剤。レーン：1、分子量標準；2、F4Tバルク：バルクは-80℃で1ヶ月保存し、デポーの直前に解凍した；3、30℃で1ヶ月保存したF4Tバルク；4、無機物を含まずに製剤化し、30℃で1ヶ月保存したF4T；5、F4T+CaF2；6、F4T+CaF2+リポソーム；7、F4T+CaF2/システイン；8、F4T+CaF2/システイン+リポソーム；9、F4T+CaF2/CO3；10、F4T+CaF2/CO3+リポソーム。レーン3およびレーン4(複合体を含まないF4T)の実質的な分解に注目。実施例3Bを参照。
【図７】複合体+ClfAN123免疫原性(抗体)。抗原の免疫原性は、抗原が様々な担体に吸着されているときに維持されている。マウスに安定化ClfAN123複合体(無機担体上に吸着)を接種した。エマルション製剤中のこれらの吸着複合体の免疫原性を、ELISA-ClfAN123-複合体(濃度(μg/mL))によりPostIIIで実施した。左から右へ、未処理、CaF2/CaCO3に吸着、CaF2/N-アセチル-システインに吸着、CaF2に吸着、およびCaF2/システインに吸着。実施例4を参照。
【図８】バッチ8833152〜8833157の赤外線スペクトル。
【図９】HepB吸着抗原の免疫応答。実施例5を参照。
【図１０】本明細書に開示されるフッ化カルシウム複合体の電子顕微鏡写真。写っているのはバッチ#10616125に開示されるフッ化カルシウム複合体である(表１および表題「Ca/F/N-アセチル-システイン：バッチ#10616125」の実施例を参照)。
【図１１】異なる複合体に吸着させた2つの異なる用量のrF抗原による2回目の接種の14日後の血清中のRSV中和力価。実施例6を参照。
【図１２】異なる複合体に吸着させた2つの異なる用量のrF抗原による2回目の接種の14日後の血清中の抗-rF IgG濃度。実施例6を参照。
【図１３】2μgのrFとアジュバントで構成される様々なレジメンによるRSVチャレンジの4日後の肺中RSV力価。実施例7を参照。
【図１４】Balb/cマウス免疫原性モデルにおける複合体-19F-DT製剤の評価。実施例8を参照。
【図１５】Balb/cマウス免疫原性モデルにおける複合体-19F-DT製剤の評価(対照実験)。実施例8を参照。
【図１６】Balb/cマウス免疫原性モデルにおける複合体-19F-DT製剤の評価(対照実験)。実施例8を参照。
【図１７】Balb/cマウス免疫原性モデルにおける複合体-19F-DT製剤の評価(対照実験)。実施例8を参照。
【図１８】様々な複合体-PRNの動物結果。実施例9を参照。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本明細書には、抗原の不水溶性フッ化カルシウム複合体への吸着が、前記抗原を温度依存性分解に対して安定化させることが開示されている。さらに、フッ化カルシウム複合体が、それに吸着されている抗原に対する免疫応答を増加させることにより、アジュバントとして作用することが開示されている。
【００１４】
組成物
一部の態様において、Ca、FおよびZを含むフッ化カルシウム複合体を含むフッ化カルシウム組成物が提供される。「Z」は、有機(炭素含有)分子を意図する。「複合体」は、乾燥しているときに固体として存在し、且つ純水中では不溶性であるかまたは難溶性の物質を意図する。
【００１５】
一部の態様において、複合体は、等パーセント(w/w)のCaとFを含む。一部の態様において、複合体は、Fのパーセンテージ(w/w)より高いパーセンテージ(w/w)のCaを含む。「パーセントX(w/w)」(ここでXは組成物中に見られる分子または元素である)は、組成物の全重量のうちXに帰せられるパーセンテージを意図する。従って、本文脈における「w/w」は乾燥重量を意味する。相対比が既知の組成物については、パーセント(w/w)は数学的に決定することができる。例えば、CaF2の組成物は、約51％のCaと約49％のF(w.w)を含む：％(w/w)Ca=[(40g/モルCa*100)]/[40g/モルCa+(2*19g/モルF)]=51；％(w/w)F=[(2*19g/モルF)*100]/[40g/モルCa+(2*19g/モルF)]=49。それにも関わらず、％(w/w)は経験的方法によって決定することもできる。例えば、当該分子が酸または塩基である場合、その分子のパーセント(w/w)は、滴定によって決定することができる(Zが炭酸塩である場合、パーセント(w/w)炭酸塩は、HClを用いた滴定によって決定することができる)。あるいは、分子が部分的な重量パーセントの窒素を含有する場合、その分子のパーセント(w/w)は、元素分析法によって決定することが可能であり、この方法では窒素の量を決定した後、その窒素含有分子に帰せられる全重量を、窒素含有分子の分子量を用いて計算する。この方法のための装置は、例えば、Antek(商標)(300 Bammel Westfield Road、ヒューストン、テキサス 77090)から市販されている。あるいは、酸化可能な有機分子のパーセント(w/w)は、例えば硫酸存在下の過マンガン酸カリウムの存在下で、酸化還元滴定法によって決定することができる。
【００１６】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム複合体は、以下のとおりに表すことができる：
CaF(2-x)Z(x)/Z(y)  (式I)
ここでxは0〜2の非負数(包含的)であり、yは非負数である。一部の態様において、yは0〜2の非負数(包含的)である。一部の態様において、xとyの合計は2以下の非負数である。一部の態様において、xおよびyは両方とも0というわけではない。しかし、それらの構成を考慮すれば理解されるとおり、本明細書に記載されるフッ化カルシウム複合体は均一ではない可能性があり、むしろ、Zが主にイオン性相互作用または共有結合相互作用によって残りの構成成分と相互作用する領域と、Zが弱い力を介して残りの構成成分と相互作用する領域(「/Z」によって表される)とを含む可能性がある。この文脈において、Z(x)はイオン化形態のZを表し、Z(y)は非イオン化形態のZ(例えばHZもしくはAZまたはそれらの混合物、ここでAは対イオンである)を表す。このような不均一複合体は、以下のとおりに表すことができる：
CaF(2-x)Z(x)/HZ(y)  (式II)
または
CaF(2-x)Z(x)/AZ(y)  (式III)
［式中、xもyも0ではない］。
【００１７】
本明細書に開示されるフッ化カルシウム複合体は、乾燥すると固体を形成する特徴を有し、純水中で不溶性または難溶性であり、さらに5.0〜11.0(包含的)の範囲のE.C.P.を示す。
【００１８】
一部の態様において、Zは、イオン化するとアニオンを形成する官能基を含む。このような官能基としては、限定するものではないが、ヒドロキシル、ヒドロキシレート、ヒドロキソ、オキソ、N-ヒドロキシレート、ヒドロキサメート、N-オキシド、重炭酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩、脂肪酸、チオ乳酸塩、有機リン酸塩、二水素リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸のモノエステル、リン酸のジエステル、リン脂質のエステル、ホスホロチオエート、硫酸塩、硫酸水素塩、エノラート、アスコルビン酸塩、ホスホアスコルビン酸塩、フェノラート、およびイミン-オラート(imine-olate)からなる群から選択される1つ以上の官能基が挙げられる。一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はZを含み、ここでZは、カルシウムに対する親和性を有し、カルシウムおよびフッ化物と共に不水溶性複合体を形成するアニオン性有機分子である。
【００１９】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はZを含み、ここでZは、ヒドロキシル、ヒドロキシレート、ヒドロキソ、オキソ、N-ヒドロキシレート、ヒドロキサメート、N-オキシド、重炭酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩およびジカルボン酸塩、カルボン酸の塩、QS21の塩、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)樹皮抽出物、免疫学的に活性なサポニンの抽出物、飽和もしくは不飽和脂肪酸の塩、オレイン酸の塩、アミノ酸の塩、チオラート、チオ乳酸塩、チオール化合物の塩、システインの塩、N-アセチル-システインの塩、L-2-オキソ-4-チアゾリジンカルボン酸塩、リン酸塩、二水素リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸の塩、リン酸のモノエステルおよびそれらの塩、リン酸のジエステルおよびそれらの塩、3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピドAのエステル、3D-MLAのエステル、MPL、リン脂質のエステル、DOPC、ジオレオイルホスファチジン酸誘導体、CPGモチーフに由来するリン酸塩、CpGファミリーに由来するホスホロチオエート、硫酸塩、硫酸水素塩、硫酸の塩、エノラート、アスコルビン酸塩、ホスホアスコルビン酸塩、フェノラート、α-トコフェロール、イミン-オラート、シトシン、メチル-シトシン、ウラシル、チミン、バルビツール酸、ヒポキサンチン、イノシン、グアニン、グアノシン、8-オキソ-アデニン、キサンチン、尿酸、プテロイン酸、プテロイルグルタミン酸、葉酸、リボフラビン、ならびにルミフラビンからなる群から選択される化学分類のメンバーを含むものとして分類することができる。
【００２０】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はZを含み、ここでZは、N-アセチルシステイン、チオ乳酸塩、アジピン酸塩、炭酸塩、葉酸、グルタチオンおよび尿酸からなる群から選択される。一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はZを含み、ここでZは、N-アセチルシステイン、アジピン酸塩、炭酸塩および葉酸からなる群から選択される。
【００２１】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はN-アセチルシステインであるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下のN-アセチルシステイン(w/w)〜37％Ca、26％F、および37％N-アセチルシステイン(w/w)を含む。
【００２２】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はチオ乳酸塩であるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下のチオ乳酸塩(w/w)〜42％Ca、30％F、28％チオ乳酸塩(w/w)を含む。
【００２３】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はアジピン酸塩であるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下のアジピン酸塩(w/w)〜38％Ca、27％F、35％アジピン酸塩(w/w)を含む。
【００２４】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体は炭酸塩であるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下の炭酸塩(w/w)〜48％Ca、34％F、18％炭酸塩(w/w)を含む。
【００２５】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体は葉酸であるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下の葉酸(w/w)〜22％Ca、16％F、62％葉酸(w/w)を含む。
【００２６】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体はグルタチオンであるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、1％以下のグルタチオン(w/w)〜28％Ca、20％F、52％グルタチオン(w/w)を含む。
【００２７】
一部の態様において、本明細書中のフッ化カルシウム複合体は尿酸であるZを含み、複合体は、51％Ca、48％F、および1％以下の尿酸(w/w)〜36％Ca、26％F、および38％尿酸(w/w)を含む。
【００２８】
一部の態様において、Ca、FおよびZを含むフッ化カルシウム複合体は以下の組成を有する(チャート1)：
【００２９】
2016535736.tif 000002
2016535736.tif 000003
2016535736.tif 000004
2016535736.tif 000005
2016535736.tif 000006
【００３０】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は製薬上許容される。
【００３１】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム複合体は粒子形態である。一部の態様において、複合体粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子サイズの範囲内にある。
【００３２】
「ナノ粒子」は、1nm〜999nm(包含的)の範囲内の粒子を意図する。この定義内に包含されるのは、(A) 50nm〜100nm(包含的)；45nm〜110nm(包含的)；40nm〜120nm(包含的)；35nm〜130nm(包含的)；30nm〜140nm(包含的)；25nm〜150nm(包含的)；20nm〜160nm(包含的)；15nm〜170nm(包含的)；10nm〜180nm(包含的)；(B) 10nm以上、15nm以上、20nm以上、25nm以上；(C) 150nm以下、200nm以下、250nm以下、300nm以下、350nm以下、400nm以下、450nm以下、500nm以下、550nm以下、600nm以下、650nm以下、700nm以下、750nm以下、800nm以下、850nm以下；または(D) 約25nm、の範囲内の粒子である。
【００３３】
「マイクロ粒子」は、1μm〜999μm(包含的)の範囲内の粒子を意図する。この定義内に包含されるのは、50μm以下、100μm以下、150μm以下、200μm以下、250μm以下、300μm以下、350μm以下、400μm以下、450μm以下、500μm以下、550μm以下、600μm以下、650μm以下、700μm以下、750μm以下、800μm以下、850μm以下、900μm以下、950μm以下の範囲の粒子である。
【００３４】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は2種以上の複合体を含み、ここで各複合体は、先行する段落に開示されるCa、FおよびZを含み、さらに各複合体は、Ca、F、もしくはZのパーセント(w/w)により、またはZの化学構造により、他の複合体とは異なる。
【００３５】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は抗原を含み、ここで抗原は、フッ化カルシウム複合体に吸着されている。
【００３６】
「抗原」は、ヒトまたは動物において免疫応答を生起することができるタンパク質、多糖、ペプチド、核酸、タンパク質-多糖コンジュゲート、分子またはハプテンを意図する。抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、原生生物または真菌に由来するか、これら由来の分子に類似であるか、またはこれら由来の分子を模倣するように合成することができる。本発明の代替的実施形態において、抗原は、腫瘍細胞または新生物に由来するか、これら由来の分子に類似しているか、またはこれら由来の分子を模倣するように合成される。本発明のさらなる実施形態において、抗原は、アレルギー、アルツハイマー疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満およびニコチン依存症に関与する物質に由来するか、これら由来の分子に類似しているか、またはこれら由来の分子を模倣するように合成される。
【００３７】
フッ化カルシウム(CaF2)への、アルブミン、コンドロイチン硫酸および糖タンパク質の吸着は、Lindemann (1985年) Scandinavian Journal of Dental Research, 93：381-83に記載された。CaF2への微生物の付着は、Cheungら (2007年) Journal of applied Microbiology 102：701-710に報告された。さらに最近では、単分散CaF2中空ナノ球へのイブプロフェンの吸着が、Zhangら (2010年) Chem. Eur. J. 16：5672-5680に記載された。無機物への抗原の吸着は、抗原を、適切なバッファー中で、ナノ粒子またはマイクロ粒子形態の無機物の水懸濁液に混合することによって実施される。時間、温度、pH、塩および賦形剤の存在の最適化は、抗原について公知、または決定された条件に従って選択される。抗原の性質および化学組成に応じて、以下の吸着相互作用の少なくとも1つが起こり得る：リガンド交換による吸着、静電力による吸着、または疎水性力による吸着。抗原/無機物比はケースバイケースで最適化される。利用可能な無機物表面は、比較的小さなサイズの粒子を用いることによって増加させることができる。
【００３８】
一部の態様において、抗原は、穏やかな撹拌下で、室温で2時間にわたって吸着される。一部の態様において、フッ化カルシウム組成物の製造方法は、フッ化カルシウム複合体の形成中に、1つ以上の抗原をフッ化カルシウム複合体に吸着させるステップを含む。一部の態様において、フッ化カルシウム組成物の製造方法は、フッ化カルシウム複合体の形成後に1つ以上の抗原をフッ化カルシウム複合体に吸着させるステップを含む。
【００３９】
様々な有機化合物(Z)について、粒子の表面で測定される電荷は多様である(表2A参照)。この粒子特性は、静電相互作用による抗原吸着を最適化するために利用することができる。
【００４０】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、抗原の安定化に使用される。この使用の一部の態様において、抗原は熱安定化される。この使用の一部の態様において、抗原はフッ化カルシウム複合体に吸着される。
【００４１】
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、医薬に使用される。一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、哺乳動物における免疫応答の生起において使用される。一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、ヒトにおける免疫応答の生起において使用される。一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、ウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる疾患に対する哺乳動物の予防および/または治療において使用される。一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物は、ウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる疾患に対するヒトの予防および/または治療において使用される。このような使用のため、本明細書に開示される組成物は、それを必要とする対象への投与によって送達することができる。投与は、例えば、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、舌下送達、扁桃への送達、または鼻腔内送達による投与などの多数の経路による投与であり得る。
【００４２】
組成物の固体粒子からの製造方法
CaF2は市販されている(Riedel de Haen(商標))。本明細書に開示される組成物において使用するための純CaF2は、以下のスキームによって固体CaF2から調製することができる。
【００４３】
スキーム1：
1. CaF2固体粒子を容器に入れる。
2. 水を加える。
3. CaF2 + 水を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
6. ステップ3〜5を繰り返す。
7. CaF2固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００４４】
本明細書に開示される組成物において使用するための複合体は、以下のスキームによって調製することができる。出発成分は市販品を入手できる。
【００４５】
スキーム2：
1. 選択された化合物Zを含む溶液を調製する。
2. CaF2固体粒子を加える。
3. CaF2固体粒子+Zを含む溶液を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
8. ステップ3〜5を繰り返す。
6. 得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００４６】
水溶液からの組成物の製造方法
溶液中の出発成分からCaF2を合成するための方法は知られている。例えば、Sunら(2008年) Dental materials 24：111-116により、以下の噴霧乾燥によるナノサイズ化フッ化カルシウムの調製が報告されたが、この方法は、空気から容易にCO2を吸着し、望ましくない炭酸カルシウム混入を与える水酸化カルシウム溶液を使用するという不利な点を有する。Kalinkin (2005年) Inorganic Materials 41：1073-1079を参照されたい。ナノスケールのフッ化カルシウムはまた、Feldmannら (2006年) Small 2：1248-1250に従って調製することができるが、この方法は、微量レベルの濃度でもヒトに注射可能な調製物にとって問題となり得る硝酸塩を使用するという不利な点を有する。CaF2は、ゾルゲル沈殿法によって合成することができる。
【００４７】
ゾルゲル沈殿法は、Nandiyantoら (2011年) “Liquid-phase Synthesis of CaF2Particles and Their Low Refractive Index Characterization” KONA Powder and Particle Journal 29：141-155に記載されている。Nandiyantoは、特定のパラメータがゾルゲル工程下で粒子形成に影響を与えることを示している。例えば、粒子成長ステップに影響を与えるため、タイミングと温度を調整することができる。出願人らは、以下のステップに一般的に記載され、さらに実施例に詳細に記載されるように洗浄ステップを含めることによって、ゾルゲル工程を改変した。一部の態様において、洗浄ステップの包含は、粒子成長ステップを減少させるための別の方法である。希釈による洗浄中、出発物質の濃度が低下することが観察された。また、洗浄中、新たに形成される粒子の希釈が生じる可能性も予想される。本明細書に開示される組成物において使用するためのCaF2は、スキーム3により改変される反応Iに従って、ゾルゲル沈殿により調製することができる。
CaCl2 + NaF → CaF(2) + NaCl  (反応I)
【００４８】
スキーム3：
1. NaFを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。(NaFは市販品を入手できる)。
2. CaCl2を含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。(CaCl2は市販品を入手できる)。
3. ステップ1と2の溶液を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
6. 保持された液を混合し、混合物を静置する。
7. ステップ5〜6を繰り返す。
8. 得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００４９】
本開示において使用するため、Zを反応に含めることにより、ゾルゲル法をさらに改変した。一部の態様において、沈殿条件下でCaCl2、NaF、およびNaZを組み合わせるステップと、不水溶性フッ化カルシウム複合体を回収するステップとを含む、ゾルゲル沈殿によるフッ化カルシウム複合体の製造方法が提供される。一部の態様において、上記方法は、フッ化カルシウム複合体の洗浄ステップを含む。一部の態様において、沈殿条件下でCaCl2、NaF、およびNaZを組み合わせるステップと、不水溶性フッ化カルシウム複合体を回収するステップとを含む、ゾルゲル沈殿によるフッ化カルシウム複合体の製造方法が提供される。
【００５０】
本明細書に開示される組成物において使用するためのフッ化カルシウム複合体は、以下のスキーム4により、反応IIに従って調製することができる。
CaCl2 + NaF + AZ → CaF(2-x)Zx/Zy + NaCl  (反応II)
［式中、Aは金属であり、xおよびyは式Iにおいて記載されるとおりである。］
一部の態様において、AはCaまたはNaである。
【００５１】
スキーム4：
1. 選択されたNaZを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
2. NaFを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
3. CaCl2を含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
4. ステップ1とステップ2の溶液を組み合わせ、次いでステップ3の溶液と組み合わせた後、混合する。
5. 混合物を静置する。
6. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
7. 保持された液を混合し、混合物を静置する。
8. ステップ6〜7を繰り返す。
9. 得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００５２】
あるいは、本明細書に開示される組成物において使用するためのフッ化カルシウム複合体を、以下のスキーム5により、反応IIに従って調製することができる。
【００５３】
スキーム5：
1. NaFを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
2. CaCl2と選択された有機物Zを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
3. ステップ1とステップ2の溶液を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
6. 保持された液を混合し、混合物を静置する。
7. ステップ5〜6を繰り返す。
8. 得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００５４】
あるいは、本明細書に開示される組成物において使用するためのフッ化カルシウム複合体を、以下のスキーム6により、反応IIに従って調製することができる。
【００５５】
スキーム6：
1. NaFと選択された有機物Zを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
2. CaCl2を含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
3. ステップ1とステップ2の溶液を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
6. 保持された液を混合し、混合物を静置する。
7. ステップ5〜6を繰り返す。
8. 得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００５６】
あるいは、本明細書に開示される組成物において使用するためのフッ化カルシウム複合体を、スキーム7に従ってアスコルビン酸カルシウムを用いて調製することができる。
【００５７】
スキーム7：
1. CaC12H14O12を含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
2. NaFを含む溶液を調製(およびろ過滅菌)する。
3. ステップ1とステップ2の溶液を混合する。
4. 混合物を静置する。
5. 上清の1/2以下または1/2超を除去し、水で置換する。
6. 保持された液を混合し、混合物を静置する。
7. ステップ5〜6を繰り返す。
8. 結果として得られた固体を(例えば遠心分離により)濃縮する。
【００５８】
一部の態様において、フッ化カルシウム組成物の製造方法は、沈殿条件下で1種以上の抗原をCaCl2、NaF、およびNaZと組み合わせるステップを含む。一部の態様において、フッ化カルシウム組成物の製造方法は、フッ化カルシウム複合体の洗浄ステップを含み、ここで洗浄ステップは、1種以上の抗原をフッ化カルシウム複合体と組み合わせるステップをさらに含む。一部の態様において、フッ化カルシウム組成物の製造方法は、フッ化カルシウム複合体を1種以上の抗原と混合するステップを含む。
【００５９】
一部の態様において、本明細書に記載される方法により製造される製品が開示される。
【００６０】
アジュバント組成物
一部の態様において、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物を含むアジュバント組成物が提供される。「アジュバント組成物」は、抗原単独の投与と比較して当該抗原に対する免疫応答を増加させることができる、本明細書に開示されるフッ化カルシウム組成物を意図する。一部の態様において、本明細書に開示されるアジュバント組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。
【００６１】
一態様において、この免疫刺激剤はサポニンであってよい。本発明において使用するための特に好適なサポニンは、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)から単離されるサポニン調製物であり、Dalsgaardらにより、1974年(”Saponin adjuvants”、Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)において、アジュバント活性を有することが初めて記載された。Quil Aに伴う毒性を有することなくアジュバント活性を保持するQuil Aの精製フラグメント、例えばQS7およびQS21(QA7およびQA21としても知られている)が、HPLCによって単離されている(EP 0 362 278)。QS-21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から誘導される天然サポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および主要IgG2a抗体応答を誘導する。QS21は、本発明の文脈において好ましいサポニンである。
【００６２】
本発明の好適な形態において、アジュバント組成物中のサポニンアジュバントは、サポナリア・モリナquil Aの誘導体、好ましくはQuil Aの免疫学的に活性な画分、例えばQS-17またはQS-21、好適にはQS-21である。
【００６３】
特定の態様において、QS21は、それが外因性ステロール(例えばコレステロール)でクエンチされている低反応原性組成物中で提供される。幾つかの特定の形態の、QS21が外因性コレステロールでクエンチされている低反応原性組成物が存在する。特定の態様において、サポニン/ステロールはリポソーム構造の形態である(WO 96/33739)。この態様において、リポソームは、好適には室温で非晶質の中性脂肪、例えばホスファチジルコリン(例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)またはジラウリルホスファチジルコリン)を含有する。リポソームは、飽和脂質で構成されるリポソームのリポソーム-QS21構造の安定性を高める荷電脂質も含有し得る。これらの場合、荷電脂質の量は、好適には1〜20％(w/w)、好ましくは5〜10％である。リン脂質に対するステロールの割合は、1〜50％(mol/mol)、好適には20〜25％である。
【００６４】
好適なステロールとしては、β-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。1つの特定の態様において、アジュバント組成物は、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは当技術分野で周知であり、例えばコレステロールはMerck Index、第11版、341頁に、動物脂肪中に見られる天然ステロールとして開示されている。
【００６５】
活性サポニン画分がQS21である場合、QS21：ステロールの比は、典型的には約1：100〜1：1(w/w)、好適には1：10〜1：1(w/w)、また好ましくは1：5〜1：1(w/w)のオーダーであろう。好適には過剰なステロールが存在し、QS21：ステロールの比は、少なくとも1：2(w/w)である。一態様において、QS21：ステロールの比は1：5(w/w)である。ステロールは、好適にはコレステロールである。
【００６６】
別の態様において、アジュバント組成物は、Toll様受容体4(TLR4)アゴニストである免疫刺激剤を含む。「TLRアゴニスト」は、直接リガンドとして、または内因性もしくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、TLRシグナル伝達経路を介してシグナル応答を引き起こし得る成分を意味する(Sabroe ら, Jl 2003 p1630-5)。TLR4アゴニストは、TLR-4シグナル伝達経路を介して著しい(signally)応答を引き起こすことができる。TLR4アゴニストの好適な例はリポ多糖であり、好適にはリピドAの非毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドA、またはさらに特に3脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である。
【００６７】
3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によりMPLの名称で販売されており、文献全体を通してMPLまたは3D-MPLと呼ばれる(例えば、米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号および第4,912,094号を参照)。3D-MPLは、主としてIFN-g(Th1)表現型を有するCD4+T細胞応答を促進する。3D-MPLは、GB 2 220 211 Aに開示される方法に従って製造することができる。化学的には、3D-MPLは、3、4、5または6個のアシル化鎖を有する3脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。本発明の組成物においては、アジュバント組成物を調製するために小粒子3D-MPLを使用することができる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌ろ過することができるような粒子サイズを有する。このような調製物はWO 94/21292に記載されている。好ましくは、本発明のアジュバント組成物を調製するために粉末3D-MPLが使用される。
【００６８】
使用し得る他のTLR4アゴニストは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、例えば、WO98/50399または米国特許第6,303,347号 (AGPの製造方法も開示されている) に開示されるAGPであり、好適にはRC527もしくはRC529、または米国特許第6,764,840号に開示されるAGPの製薬上許容される塩である。一部のAGPはTLR4アゴニストであり、また一部のAGPはTLR4アンタゴニストである。いずれも免疫刺激剤として有用であると考えられる。
【００６９】
他の好適なTLR-4アゴニストはWO2003/01 1223およびWO 2003/099195に記載されているとおりであり、例えば、WO2003/011223の4〜5頁またはWO2003/099195の3〜4頁に開示される化合物I、化合物Ilおよび化合物III、また特に、WO2003/011223にER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680およびER804764として開示される化合物である。例えば、1つの好適なTLR-4アゴニストはER804057である。
【００７０】
特定の態様において、アジュバント組成物は、サポニンとTLR4アゴニストの両方を含む。具体例において、アジュバント組成物はQS21と3D-MPLを含む。
【００７１】
TLR-4アゴニスト(例えば3D-MPLなどのリポ多糖)は、アジュバント組成物のヒト用量当たり1〜100μgの量で使用することができる。3D-MPLは、約50μg、例えば40〜60μg、好適には45〜55μgもしくは49〜51μg、または50μgのレベルで使用することができる。さらなる態様において、アジュバント組成物のヒト用量は、3D-MPLを、約25μg、例えば20〜30μg、好適には21〜29μgもしくは22〜28μgもしくは28〜27μgもしくは24〜26μg、あるいは25μgのレベルで含む。
【００７２】
サポニン(例えばQS21)は、アジュバント組成物のヒト用量当たり1〜100μgの量で使用することができる。QS21は、約50μg、例えば40〜60μg、好適には45〜55μgもしくは49〜51μg、または50μgのレベルで使用することができる。さらなる態様において、アジュバント組成物のヒト用量は、QS21を、約25μg、例えば20〜30μg、好適には21〜29μgもしくは22〜28μgもしくは28〜27μgもしくは24〜26μg、あるいは25μgのレベルで含む。
【００７３】
アジュバント組成物中にTLR4アゴニストとサポニンの両方が存在する場合、TLR4アゴニストとサポニンの重量比は、適切には1：5〜5：1、好適には1：1である。例えば、3D-MPLがアジュバント組成物のヒト用量当たり50μgまたは25μgの量で存在する場合、好適には、QS21もそれぞれ50μgまたは25μgの量で存在し得る。
【００７４】
一態様において、免疫刺激剤は、例えばWO 2008/142133に示されるTLR9アゴニストである。具体例において、前記TLR9アゴニストは、免疫賦活オリゴヌクレオチド、特に非メチル化CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、WO 96/02555、WO 99/33488およびUS 5,865, 462に記載されている。本明細書に記載されるアジュバント組成物において使用するための好適なTLR9アゴニストはCpG含有オリゴヌクレオチドであり、場合により少なくとも3個、好適には少なくとも6個以上のヌクレオチドによって分離されている2つ以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有する。CpGモチーフは、シトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続く。
【００７５】
一態様において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合または場合によりホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合および他のヌクレオチド間結合(例えば、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドなど)も使用することができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの製造法は、US5,666,153、US5,278,302およびWO95/26204に記載されている。異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチド(例えば混合ホスホロチオエートホスホジエステル)が想定される。オリゴヌクレオチドを安定化させる他のヌクレオチド間結合を使用することができる。
【００７６】
本明細書に記載されるアジュバント組成物への配合に適したCpGオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。一態様において、これらの配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含む。
【００７７】
2016535736.tif 000007
【００７８】
代替的CpGオリゴヌクレオチドは、重要でない欠失または付加を有する上記の配列を含んでいてもよい。
【００７９】
一態様において、免疫刺激剤はトコールである。トコールは当技術分野において周知であり、EP0382271に記載されている。特定の態様において、トコールは、α-トコフェロールまたはその誘導体であり、例えばα-トコフェロールスクシネート(ビタミンEスクシネートとしても公知)である。
【００８０】
一態様において、本明細書に開示されるアジュバント組成物は、フッ化カルシウム複合体に吸着されている免疫刺激剤を含む。一態様において、アジュバント組成物はフッ化カルシウム複合体に吸着されている免疫刺激剤を含み、ここでフッ化カルシウム複合体に吸着されている前記免疫刺激剤はMPLである。
【００８１】
一態様において、抗原をフッ化カルシウム組成物と共にまたは単独で投与する場合に、前記抗原に対して生起される免疫応答と比較した前記抗原に対する免疫応答の増加において使用するための、本明細書に開示されるアジュバント組成物が開示される。一態様において、抗原をリン酸カルシウムと共に投与する場合に、前記抗原に対して生起される免疫応答と比較した前記抗原に対する免疫応答の増加において使用するための、本明細書に開示されるアジュバント組成物が開示される。本明細書に開示される組成物は、それを必要とする対象への投与によって送達することができる。投与は、例えば筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、舌下送達、扁桃への送達、または鼻腔内送達による投与などの、多数の経路による投与であってよい。
【００８２】
アジュバント組成物の製造方法
一部の態様において、免疫刺激剤を本明細書に記載されるフッ化カルシウム複合体と組み合わせるステップを含む、本明細書に開示されるアジュバント組成物の製造方法が開示される。一部の態様において、抗原を本明細書に記載されるフッ化カルシウム複合体に吸着させるステップを含む、本明細書に開示されるアジュバント組成物の製造方法が開示される。
【００８３】
免疫原性組成物
一部の態様において、抗原と、本明細書に記載されるアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、舌下送達、扁桃へ送達、または鼻腔内送達される、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。
【００８４】
一部の態様において、pHが約pH5〜pH9である、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、ヒト投与に好適な、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、1種以上の製薬上許容される賦形剤、特にバッファー、Trisバッファー；またはヒスチジンバッファーを含む、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、組成物が無菌条件下で調製される、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、組成物が非発熱性である、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、組成物が等張性である、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、組成物が糖またはポリオールを含む、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。
【００８５】
一部の態様において、少なくとも1種の抗原と少なくとも1種の免疫刺激剤が、Ca、FおよびZのパーセント(w/w)ならびにZの化学構造によって定義される単一タイプの複合体に吸着されている、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、2種以上の抗原と2種以上の免疫刺激剤が、Ca、FおよびZのパーセント(w/w)ならびにZの化学構造によって定義される単一タイプの複合体に吸着されている、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、Ca、FおよびZのパーセント(w/w)ならびにZの化学構造によって定義される少なくとも第1のタイプおよび第2のタイプの複合体を含み、ここで少なくとも1種の抗原、少なくとも1種の免疫刺激剤、またはその両方が前記第1のタイプの複合体に吸着されており、且つ少なくとも1種の抗原、少なくとも1種の免疫刺激剤、またはその両方が前記第2のタイプの複合体に吸着されている、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、Ca、FおよびZのパーセント(w/w)ならびにZの化学構造によって定義される少なくとも1種の複合体を含み、ここで少なくとも1種の抗原、少なくとも1種の免疫刺激剤、またはその両方が前記少なくとも1種の複合体に吸着されており、且つ少なくとも1種の抗原、少なくとも1種の免疫刺激剤、またはその両方が異なる金属塩アジュバントに吸着されている、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一部の態様において、第2の金属塩アジュバントはリン酸カルシウムである。
【００８６】
一部の態様において、抗原をフッ化カルシウム組成物と共にまたは単独で投与する場合に、前記抗原に対して生起される免疫応答と比較した前記抗原に対する免疫応答の増加において使用するための、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。一態様において、抗原をリン酸カルシウムと共に投与する場合に、前記抗原に対して生起される免疫応答と比較した前記抗原に対する免疫応答の増加において使用するための、本明細書に開示される免疫原性組成物が提供される。本明細書に開示される組成物は、それを必要とする対象への投与によって送達することができる。投与は、例えば、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、舌下送達、扁桃への送達または鼻腔内送達などの多数の経路によるものであってよい。
【００８７】
免疫原性組成物の製造方法
一部の態様において、本明細書に記載されるフッ化カルシウム組成物を、本明細書に開示されるアジュバント組成物と組み合わせるステップを含む、本明細書に開示される免疫原性組成物の製造方法が提供される。
【００８８】
QS21の反応原性（Reactogenicity）を低下させるための組成物および方法
本明細書で先に記載したように、QS21は反応原性を有し、典型的には反応原性のより低い組成物（外来のステロール、例えばコレステロールでクエンチしたもの）で提供される。QS21が外来のコレステロールでクエンチされている反応原性のより低い組成物のいくつかの特定の形態が存在している。
本明細書では、Zがグルタチオンであるフッ化カルシウム組成物と組み合わせたQS21が、外来コレステロールでQS21がクエンチされた反応原性のより低い組成物に匹敵する溶血活性レベル（in vitroアッセイで測定して）を示すことが観察された。
従って、一部の態様において、Zがグルタチオンである、本明細書で規定するフッ化カルシウム組成物を含有し、免疫学的に活性のあるサポニン画分を更に含有するアジュバント組成物が提供される。一部の態様において、免疫学的に活性のあるサポニン画分がQS21であるアジュバント組成物が提供される。一部の態様において、Zがグルタチオンであるフッ化カルシウム複合体にQS21が吸着したアジュバント組成物が提供される。一部の態様において、QS21の溶血活性の低減において使用するための、Zがグルタチオンであるアジュバント組成物が提供される。一部の態様において、Zがグルタチオンであるフッ化カルシウム複合体とQS21とを組み合わせるステップを含む、QS21の溶血活性の低減方法が提供される。一部の態様において、先の段落で規定した抗原およびアジュバント組成物を含有する免疫原性組成物が提供される。QS21を含む免疫学的に活性のあるサポニン画分の溶血活性を決定するための好適な試験は、Ronnberg等、(1995) Vaccine 13:1375-1382に記載されている。
【００８９】
組成物を使用するための方法
哺乳動物におけるウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる感染症または疾患の治療または予防のための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量の本明細書に記載されるフッ化カルシウム組成物、アジュバント組成物、または免疫原性組成物を投与するステップを含む、上記方法が提供される。ヒトにおけるウイルス、細菌、または寄生生物によって引き起こされる感染症または疾患の治療または予防のための方法であって、前記ヒトに治療有効量の本明細書に記載されるフッ化カルシウム組成物、アジュバント組成物、または免疫原性組成物を投与するステップを含む、上記方法が提供される。
【００９０】
免疫原性応答を、それを必要とする哺乳動物において誘発するための方法であって、前記哺乳動物に、有効量の本明細書に記載されるフッ化カルシウム組成物、アジュバント組成物、または免疫原性組成物を投与するステップを含む、上記方法が提供される。免疫原性応答を、それを必要とするヒトにおいて誘発するための方法であって、前記ヒトに、有効量の本明細書に記載されるフッ化カルシウム組成物、アジュバント組成物、または免疫原性組成物を投与するステップを含む、上記方法が提供される。
【００９１】
別段の説明がない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野において通常の技能を有する者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。単数形用語「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、単語「or」は、文脈が明らかに別段の指示がない限り、「and」を包含することを意図する。用語「複数」は、2つまたはそれ以上を指す。さらに、ある物質の濃度またはレベル(例えば溶液成分濃度またはそれらの比)に関して示される数値限定、および反応条件(例えば温度、圧力およびサイクルの回数)は、おおよそであることが意図される。本明細書中で使用される用語「約」は、当該量±10％を意味することが意図される。
【００９２】
本発明を、以下の非限定的な図面および実施例を参照することによってさらに説明する。
【実施例】
【００９３】
分析方法：
等補償点(Equal Compensation Point)
等補償点測定(Equal Compensation Point measurements)：電位差測定滴定(J.R.Feldkampら, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1981年, 第70巻, n°6 p 638-640)によって等補償点(E.C.P.)の測定を実施した。結果を、4つの異なる滴定曲線(そのうち2つは水中で測定され、他の2つは様々なKCl(またはKNO3)濃度の存在下で測定された)の並列によって得られるグローバルグラフに示した。例えば、バッチCa/F/CO3 #8833172Aでは、2つの等補償点(E.C.P.)を得た：H2O/KCl系において6.4および8.7。この場合、pH6.4未満で粒子表面は負に荷電し、pH6.4〜pH8.7で粒子表面は正に荷電し、pH8.7超で表面粒子は負に荷電する(スキーム8)。得られたE.C.P. H2O/KNO3値の比較については表2A(本明細書中下記)を参照されたい。
【００９４】
乾燥重量
懸濁液の均質化後、アリコート(10ml)を80℃で5日間蒸発乾固させる。サンプルの重量(mg)は、10mlの懸濁液中に存在する乾燥物質量を表す。この重量の10分の1は、懸濁液1ml中の乾燥物質量を表す。
【００９５】
赤外線スペクトル
乾燥物質(本明細書に記載したとおりに得た)を手動粉砕し、そのまま赤外線分析に使用する。数mgのサンプルを、パーキンエルマー社製のFT赤外線装置の多重反射ホルダー上に置いた。スペクトルを4000cm-1〜600cm-1の透過率モードの％でスキャンした。赤外線分光法において、(極めてシャープなシグナルを与える純粋な有機物と比較して)無機物に吸着された有機物が常に極めて広いシグナルを与えることに留意すると興味深い。
【００９６】
この例は、CaF2中空球に吸着されたイブプロフェン(C.Zhangら, 2010年, Chem. Eur. J. 第16巻 p.5672-5680)、または蛍石(CaF2)に吸着されたオレイン酸塩(oleatate) (Handbook of Infrared Spectroscopy of Ultrathin Films. V.T. Tolstoy, I.V. ChernyshovaおよびV.A. Skryshevsky。2003年 John Wiley & Sons, Inc. (552頁)について記載されている。
【００９７】
Antekによる窒素含有量
懸濁液を、任意の他の処理を行うことなくAntex装置に注入した。その結果、N濃度はμgN/mlで表され、上清溶液と吸着物質の両方について見られる総N含有量を表す。分析は、最後の洗浄上清(W-10)についても行った。
【００９８】
CaおよびFの元素分析
500mgの乾燥物質を含む懸濁液をろ過して固体部分を回収し、これを焼成した。鉱化後、一部をCa％の決定(+/-0.5％)に使用し、他の部分をF％の決定(+/-1％)に使用した。
【００９９】
抗酸化能
過マンガン酸カリウム(KMnO4)は、硫酸溶液の存在下で、最強の酸化剤の1つである。青紫色の過マンガン酸アニオンは、還元されて酸化マンガン(MnO2、茶色)となる。この酸化マンガンを無色の(incolor)Mn++カチオンによりさらに還元し、5つの電子の交換を生じさせることができる。このような条件において、有機物の大部分は完全に酸化されたが、無機物(例えばCaF2)は無反応であった。
MnO4- (青紫色) + 4H+ + 3e- → MnO2 + 2H2O
MnO2 + 4H+ + 2e- → Mn++ (無色) + 2H2O
【０１００】
典型的には、5つのサンプル(0.1；0.2；0.3；0.4および0.5mlの懸濁液)を、透明なポリマー容器(フッ化物誘導体を酸性媒体に入れる場合、ガラス容器は避ける)に入れた。これらのそれぞれに、1mlのH2SO4(5M)を加える(酸を水に加え、決してその逆は行わない)。滴定は、KMnO4 1.0mM(青紫色)を、変色(discoloration)が3分間持続するまで一滴ずつ添加することによって実施する。このようにして、KMnO4 1.0mM/ml懸濁液のμlで表される抗酸化能が得られる。これらの値は、KMnO4 1.0mM/mg乾燥物質のμlに変換することができる。既知量のシステインまたはN-アセチル-システイン溶液(1.0 mM)による同様の滴定を実施した。このようにして、KMnO4の消費量とシステインまたはN-アセチル-システイン含有量との間の相関関係を確立することができる。さらに、懸濁液中に存在する乾燥物質の重量を考慮に入れて、乾燥物質当たりの有機物(システインまたはN-アセチル-システイン)の量を計算し、％(w/w)酸化可能な有機物/乾燥重量で表すことができる。
【０１０１】
市販の化学薬品
以下の市販製品を使用した：
・CaCO3固体：OMYA社(商標)製品 OMYAPURE35；
・CaCO3固体粒子：Sigma-Aldrich社製品 12010；
・フッ化ナトリウム：Merck社(商標)製品 1064490250；
・塩化カルシウム：Merck社(商標)製品 n° 1023780500；
・システイン：Aldrich社(商標)製品 168149；システイン：Merck社製品 1028380100；
・N-アセチル-システイン：Sigma社(商標)製品 A5099；
・チオグリセロール：Sigma社(商標)製品 88640；
・ホスホエタノールアミン：Sigma社(商標)製品 P0503-100；
・フッ化カルシウム：Riedel de Haen社(商標)製品 01123；
・重炭酸ナトリウム：Merck社(商標)製品 1063295000；
・炭酸ナトリウム：Merck社(商標)製品 1063981000；
・塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)：Merck社(商標)製品 2382；
・塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)：Sigma Aldrich社(商標)製品 12022；
・リン酸水素二ナトリウム二水和物：Merck社(商標)製品 1065805000；
・クエン酸三ナトリウム：Merck社(商標)製品 1110371000；
・水酸化ナトリウム：Merck社(商標)製品 1064981000；
・アスコルビン酸カルシウム：Fluka社(商標)製品 11138；
・グルタチオン：Merck社(商標)製品 104090.0050；
・グルタチオンオキシド：Sigma社(商標)製品 G46265G；
・チオ乳酸：Sigma Aldrich社(商標)製品 T3,100-3；
・アジピン酸：Carlo ERBA社(商標)製品 401785；
・尿酸：Fluka社(商標)製品 51449；
・塩化カルシウム六水和物：Merck社(商標)製品 102072.1000；
・葉酸：Fluka社(商標)製品 01769； 
・ヒポキサンチン：Fluka社製品 56700
・キサンチン：Sigma社(商標)製品 X7375-256
・グアニン：Aldrich社(商標)製品 G11950-100G
・シトシン：Fluka社(商標)製品 30430
・チミン：Sigma社(商標)製品 T0376-5G。
【０１０２】
実施例1. フッ化カルシウムのゾルゲル形成の特徴
フッ化カルシウム複合体を形成し、様々な方法によって特性決定した。この特性決定の結果を本実施例にまとめる。実施例1で言及される各バッチの形成の詳細は、実施例2に見られる。
【０１０３】
【表１】
2016535736.tif 000008
2016535736.tif 000009
2016535736.tif 000010
【０１０４】
ゾルゲル形成は、例えば、Nandiyantoに開示されるとおり、出発溶液の濃度を変化させることによって粒子サイズに影響を与えることを可能とする。溶液中で様々な選択された有機化合物を用いることにより、異なる表面電荷を有する複合体粒子(それらのE.C.P.値によって測定される、表2A)を得ることが可能となる。
【０１０５】
【表２Ａ】
2016535736.tif 000011
【０１０６】
CaF2沈殿中に炭酸塩を同時に用いた場合、Ca/F/CO3複合体粒子が得られた。重炭酸塩または炭酸塩の相対量を変化させることによって、異なる表面特性を示す複合体が得られた(表2B)。
【０１０７】
【表２Ｂ】
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【０１０８】
低い炭酸塩モル比では、形成された複合体はバテライト型の炭酸塩を示した。このことは、他の記載されたバテライト形成が、バテライト型の炭酸塩を得るために高い濃度(CaCl2 1M + K2CO3 1M)が必要とされたことを示唆しているため、驚きであった(Moriら(2009年) Materials Science and Engineering 29：1409-1414およびParkinら (2009年) Optics Express 17：21944-21955)。本明細書に開示される方法によって得られたこのバテライト型の炭酸塩は、免疫学的特性を有する有機物の吸着のために重要である(実験部分：MPLの吸着を参照)。
【０１０９】
沈殿中にシステインを用いた場合、Ca/F/システイン複合体粒子が得られた。添加の順序を変えることにより、異なる表面特性を示す複合体が得られた(表3)。
【０１１０】
【表３】
2016535736.tif 000013
【０１１１】
ここで得られるナノ粒子は、ハンドブックの標準値(一般的には単結晶に関する値)と比較してより高い溶解度を示す。例えば、図3はCa/F/OHナノ粒子バッチ11000123の水溶性を示す。この複合体は、ハンドブックに報告されているCaF2の溶解度(0.14mM)と比較してより溶解度が高い。このため、これらのタイプのナノ複合体粒子は、IM投与様式を用いるワクチン分野において極めて興味深い。
【０１１２】
「分析方法」に記載されるとおり、窒素含有量をAntekにより分析した。これらの結果から、製造中に使用した選択された出発有機物に由来する窒素の大部分が不溶性粒子上に位置していると考えられる(表4A参照)。
【０１１３】
【表４Ａ】
2016535736.tif 000014
【０１１４】
「分析方法」に記載されるとおり、抗酸化能を用いて酸化可能な有機物/乾燥重量の％(w/w)を決定した。結果を表4Bに示す。
【０１１５】
【表４Ｂ】
2016535736.tif 000015
【０１１６】
実施例2. 複合体の形成
詳細な説明に提供される一般的スキームに従って様々な複合体を形成した。他に示されない限り、本明細書において使用される全ての出発物質は、市販品を入手した。
【０１１７】
1. 市販の固体粒子の処理
{CaCO3}固体 水洗浄：バッチ#8833111
クエリー：OMYA(登録商標)の炭酸カルシウム264.8mgを、250mlの水で記載のとおりに処理した(スキーム1)。上清pHが示される(表5参照)。
【０１１８】
【表５】
2016535736.tif 000016
【０１１９】
最終体積は30mlであり、この懸濁液でE.C.P.を測定した。10mlのこの懸濁液を80℃で蒸発乾固させて秤量した。収率を、出発粉末の重量と比較して％で表した。乾燥物質のサンプルを赤外線分析に供したところ、カルサイト型のCaCO3を示した。
【０１２０】
{CaCO3}固体 水洗浄：バッチ#8833167
Mineral Technology(登録商標)社から販売されている、Ca(OH)2溶液中でCO2を泡立てることによって沈殿させた合成炭酸カルシウム(Multiplex MM バッチU203)247.9mgを、バッチ#8833111と同様に処理した(表5)。
【０１２１】
{CaCO3}固体 水洗浄：バッチ#11000077
NanoMaterials Technology(登録商標)社から販売されている、高重力制御沈殿(High Gravity Controlled Precipitation)NPCC111合成炭酸カルシウム0.828gを、バッチ#8833111と同様に処理した(表5)。
【０１２２】
NaF溶液で処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833107
フッ化ナトリウム(710.7mg)を水に溶解し、pHをpH7.43に調整し、総体積168mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、265.1mgのCaCO3固体粒子(OMYA(登録商標))を加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示され(表5参照)、最終体積は30mlである。10mlのこの懸濁液を80℃で蒸発乾固させて秤量した。収率は、出発粉末の重量と比較して％で表した。乾燥物質のサンプルを赤外線分析に供したところ、バテライト型のCaCO3の存在を示した(図2)。
【０１２３】
NaF溶液で処理した{CaCO3}固体：バッチ#9923127
2.6612gのCaCO3(OMYA(登録商標))を、1リットルの水に溶解した7.0843gのNaFで処理して9.52の出発pHを与え、バッチ#8833107と同様に処理した(表5)。収率は74.8％であった。CaおよびFの元素分析を示した(表5)。CaCO3の理論的元素組成はCa：40％およびCO3：60％であり；CaF2はCa：51.28％およびF：48.72％を与える。実験データはCa：48％およびF：41.9％を与え、フッ化物％は純CaF2であるとするには低すぎ、またCa％は純CaCO3であるとするには低すぎることを示している。乾燥物質のサンプルを赤外線分析に供すると、図2に示されるサンプル#8833107の赤外線分析と同様に、バテライト型の炭酸塩の存在を示す。HClによる滴定は、この粉末の炭酸塩が2.6％に過ぎなかったことを示している。このように、CaCO3部分がバテライト型であり、このため出発CaCO3物質とは異なるCa/F/CO3の複合体が得られた。
【０１２４】
CaCl2溶液で処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833164
塩化カルシウム(2.0223g)を水に溶解し、pHをpH7.48に調整し、総体積180mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、276.8mgのCaCO3固体粒子(OMYA(登録商標))を加えた。バッチ#8833107と同様に水洗浄および処理を実施した(表5)。
【０１２５】
システイン溶液で処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833110
システイン(2.0111g)を水に溶解し、pHをpH8.18に調整し、総体積168mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、277.4mgのCaCO3固体粒子(OMYA(登録商標))を加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表5参照)。
【０１２６】
N-アセチル-システイン溶液で処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833139
N-アセチル-システイン(3.1058g)を水に溶解し、pHをpH8.11に調整し、総体積180mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、266.3mgのCaCO3固体(Sigma-Aldrich社)を加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表5参照)。
【０１２７】
チオグリセロールで処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833114
チオグリセロール(1.5ml)を水に溶解し、pHをpH9.50に調整し、総体積168mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、263.5mg(2.63ミリモル)のCaCO3固体(OMYA(登録商標))を加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHは表6に示される。
【０１２８】
【表６】
2016535736.tif 000017
【０１２９】
ホスホエタノールアミンで処理した{CaCO3}固体：バッチ#8833109
ホスホエタノールアミン(2.3582g)を水に溶解し、pHをpH6.54に調整し、総体積168mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、270.6mgのCaCO3固体粒子(OMYA(登録商標))を加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３０】
{CaF2}固体 水洗浄：バッチ#8833141
フッ化カルシウム316.0mgを、250mlの水で記載のとおりに処理した(スキーム1)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３１】
システイン溶液で処理した{CaF2}固体：バッチ#8833142
システイン(2.0735g)(Merck社)を水に溶解し、pHをpH8.15に調整し、総体積182mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、353.1mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３２】
N-アセチル-システイン溶液で処理した{CaF2}固体：バッチ#8833148
N-アセチル-システイン(3.01924g)を水に溶解し、pHをpH8.20に調整し、総体積180mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、362.89mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３３】
炭酸塩(pH8.26)で処理した{CaF2}固体：バッチ#8833149
重炭酸ナトリウム(1.51058g)を180mlの水に溶解し、pH8.28を得た。この溶液をろ過滅菌した。この溶液に377.99mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３４】
炭酸塩(pH11.54)で処理した{CaF2}固体：バッチ#8833150
炭酸ナトリウム(1.88348g)を180mlの水に溶解し、pH11.54を得た。この溶液をろ過滅菌した。この溶液に383.85mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHが示される(表6参照)。
【０１３５】
ホスホエタノールアミンで処理した{CaF2}固体：バッチ#9923130
ホスホエタノールアミン(2.3517g)を水に溶解し、pHをpH6.55に調整し、総体積180mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に、351.41mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHおよび浸透圧が示される(表6参照)。
【０１３６】
チオグリセロールで処理した{CaF2}固体：バッチ#9923131
チオグリセロール(1.5ml)を水に溶解し、pHをpH9.44に調整し、総体積180mlとしてこれをろ過滅菌した。この溶液に350.6mgのフッ化カルシウムを加えた。水洗浄を記載のとおりに実施した(スキーム2)。上清pHおよび浸透圧が示される(表6参照)。
【０１３７】
2. ゾルゲル沈殿
Na2HPO4溶液をCaCl2溶液に添加：バッチ#391080
塩化カルシウム二水和物(1.8370g)を900mlの水に溶解し、pH6.37とした。ろ過滅菌後、この溶液を2リットルの滅菌Duran-Schottに入れた。リン酸水素二ナトリウム二水和物(2.2250g)を900mlの水に溶解し、pH9.32とした。ろ過滅菌後、無菌条件下で、この溶液をCaCl2溶液に加えた。一晩デカンテーションを行った後、1500mlの上清を捨て、1500mlの滅菌水と置換した。これらの洗浄を12回繰り返した。最後に懸濁液を遠心分離により総体積200mlまで濃縮した。これらの粒子は、E.C.P.(H2O/KCL)7.8を示す(表7参照)。
【０１３８】
CaCl2溶液をNa2HPO4溶液に添加：バッチ#391082
リン酸水素二ナトリウム二水和物(2.22382g)を900mlの水に溶解した。ろ過滅菌後、この溶液を2リットルの滅菌Duran-Schottに入れた。塩化カルシウム二水和物(1.83972g)を900mlに溶解した。ろ過滅菌後、無菌条件下で、この溶液をリン酸水素二ナトリウムに加えた。その後の処理は、バッチ#391080と同様であった(表7)。
【０１３９】
Na2HPO4およびクエン酸塩溶液をCaCl2溶液に添加：バッチ#391084
塩化カルシウム二水和物(1.8413g)を900mlに溶解した。ろ過滅菌後、この溶液を2リットルの滅菌Duran-Schottに入れた。リン酸水素二ナトリウム二水和物(2.2247g)を900mlの水に溶解してろ過滅菌した。クエン酸三ナトリウム(4.0259g)を180mlの水に溶解してpH8.49とし、ろ過滅菌した。無菌条件下で、クエン酸塩溶液をリン酸水素二ナトリウム溶液に加え、混合物をCaCl2溶液に加えた。その後の処理は、バッチ#391080と同様であった(表7)。
【０１４０】
Na2HPO4およびリシン溶液をCaCl2溶液に添加：バッチ#391086
塩化カルシウム二水和物(1.8350g)を900mlに溶解した。ろ過滅菌後、この溶液を2リットルの滅菌Duran-Schottに入れた。リン酸水素二ナトリウム二水和物を900mlの水に溶解してろ過滅菌した。100mlの水に15gのリシン塩基を加えた。塩酸(0.1N)を加え(40ml)、pH10.1を得た。この溶液をろ過滅菌してリン酸水素二ナトリウム溶液に加え、混合物をCaCl2溶液に加えた。その後の処理は、バッチ#391080と同様であった(表7)。
【０１４１】
【表７】
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【０１４２】
CaF2：バッチ#8833172D
フッ化ナトリウム(8.4158g)を500mlの水に溶解し、pH7.25に調整した。溶液をろ過滅菌し、100mlのこの溶液を、250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。
【０１４３】
塩化カルシウム(13.3555g)を600mlの水に溶解し、pH7.07に調整した。溶液をろ過滅菌し、100mlのこの溶液をNaF溶液に加えた。スキーム3に従って水洗浄を実施した。上清pHが示される(表8参照)。
【０１４４】
CaF2：バッチ#8833190
フッ化ナトリウム(8.4231g)を500mlの水に溶解した。溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1093g)を500mlの水に溶解した。溶液をろ過滅菌し、NaF溶液に加えた。スキーム3に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１４５】
【表８】
2016535736.tif 000019
【０１４６】
CaF2：バッチ#9440194
フッ化ナトリウム(8.4273g)を500mlの水に溶解した。溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1174g)を500mlの水に溶解した。溶液をろ過滅菌し、NaF溶液に加えた。スキーム3に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１４７】
Ca/F/OH：バッチ#11000123
フッ化ナトリウム(4.2055g)を504.2mlの水に溶解した(pHは9.40であった)。この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1107g)を、508.2mlの水に溶解した。溶液をろ過滅菌し、NaF溶液に加えた。スキーム3に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１４８】
炭酸塩領域内のCa/F/CO3：バッチ#8833152〜8833157
Na2CO3溶液：10.6031gを500mlの水に溶解し(pH11.61を得た)、0.2μmろ過によって滅菌した。NaF溶液：8.41413gを500mlの水に溶解し(pH9.66を得た)、0.2μmろ過によって滅菌した。CaCl2溶液：13.3250gを600mlの水に溶解し(pH10.07を得た)、0.2μmろ過によって滅菌した。
【０１４９】
これらの溶液から出発して、Ca/F/CO3バッチ8833152〜8833157を、以下の表9によるステップ1〜3に従って実施した。
【０１５０】
【表９】
2016535736.tif 000020
【０１５１】
スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHは表10に示される。
【表１０】
2016535736.tif 000021
【０１５２】
このように、CO3-濃度の減少(またはF-濃度の増加)は、ますます少ない収量およびより低いW10 pH値を与える。
【０１５３】
最も高いF-濃度で得られたサンプル(#8833157)は、最も低いE.C.P.値.を与える。これは、これらの得られた沈殿物が、F-濃度が増加するにつれて、恐らくはCaF2含有量が増加したCaCO3粒子で構成されることを示唆している。
【０１５４】
従って、Ca/F/CO38833152→8833157のシリーズにおいて、本発明者らは以下の知見を有する：
-  CO3-が少なければ少ないほど、ますます多くのF-により補償される(出発モル比による)；
-  乾燥重量(mg/ml)に関しては類似の濃度(濃度がかなり低かった8833157を除く)；
-  CO3-含有量の減少(滴定およびIR(870cm-1、図8参照)により確認した)；
-  バテライト形態(IR 1490および1420cm-1、図8参照)に対するカルサイト形態の減少(IR 1430cm-1、図8を参照)；#8833155、#8833156および#8833157はバテライト型が多く；#8833152はバテライト型が少なく、カルサイト型が多かった。バテライト型は、750cm-1で弱いIRシグナルを与え、713〜715cm-1ではシグナルを与えなかった；他方、カルサイト型は、713〜715cm-1でIRシグナルを示し、750cm-1ではIRシグナルを示さない(M. SatoおよびS. Matsuda；Zeitschrift fur Kristallographie, 1969年 第129巻p. 405-410)；
-  類似のE.C.P.(H2O/KCl)値(比較的低い8833157を除く)；
-  比較的低い炭酸塩含有量におけるE.C.P.(H2O/KNO3)値の低下。
【０１５５】
重炭酸塩領域内のCa/F/CO3：
重炭酸ナトリウム溶液：重炭酸ナトリウム(8.4098g)を500mlの水に溶解し(この段階でpHは8.14であった)、ろ過滅菌した。フッ化ナトリウム溶液：フッ化ナトリウム(8.4158g)を500mlの水に溶解し、pHを7.25に調整した。溶液をろ過滅菌した。塩化カルシウム溶液：塩化カルシウム(13.3555g)を600mlの水に溶解し、pHを8.07に調整した。溶液をろ過滅菌した。
【０１５６】
重炭酸塩領域内のCa/F/CO3：バッチ#8833172A
10mlの重炭酸ナトリウム溶液を250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れ、90mlのフッ化ナトリウム溶液を加えた(この段階でpHは8.53であった)。
【０１５７】
塩化カルシウム溶液(100ml)をNaHCO3およびNaF溶液に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１５８】
重炭酸塩領域内のCa/F/CO3：バッチ#8833172B
5mlの重炭酸ナトリウム溶液を250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れ、95mlのフッ化ナトリウム溶液を加えた(この段階でpHは8.44であった)。
【０１５９】
塩化カルシウム溶液(100ml)をNaHCO3およびNaF溶液に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１６０】
重炭酸塩領域内のCa/F/CO3：バッチ#8833172C
1mlの重炭酸ナトリウム溶液を滅菌250ml Duranフラスコ(Schott社製)に入れ、99mlのフッ化ナトリウム溶液を加えた(この段階でpHは8.21であった)。
【０１６１】
塩化カルシウム溶液(100ml)をNaHCO3およびNaF溶液に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表8に示される。
【０１６２】
HCl滴定を、バッチ8833172A、8833172B、8833172Cおよび8833172Dで実施した。
【０１６３】
炭酸塩の存在は、HCl滴定によってモニターすることができる。比較は、類似量のナノ粒子、例えば：3.0mlの8833172A(8.28mg/ml)、2.7mlの8833172B(9.37mg/ml)、1.36mlの8833172C(18.52mg/ml)および1mlの8833172D(25.27mg/ml)を、必要な場合にはそれぞれ総体積が3mlとなるように水で希釈して用い、HCl0.3N溶液で滴定することにより行った(表8)。
【０１６４】
Ca/F/CO3：バッチ#9440195
重炭酸ナトリウム(8.4109g)を500mlの水に溶解し(この段階でpHは8.17であった)、ろ過滅菌した。フッ化ナトリウム(8.4203g)を500mlの水に溶解し、pHを7.29に調整した。溶液をろ過滅菌した。無菌条件下で、50mlの重炭酸塩溶液と450mlのフッ化ナトリウム溶液を滅菌1LのDuran-Schottに入れた。塩化カルシウム(11.1089g)を500mlの水に溶解し、pHを7.96に調整した。溶液をろ過滅菌し、Duran-Schott容器に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHおよびHCl滴定の結果が示される(表11)。
【０１６５】
【表１１】
2016535736.tif 000022
【０１６６】
Ca/F/CO3：バッチ#9923123
重炭酸ナトリウム(8.4122g)を500mlの水に溶解し(この段階でpHは8.12であった)、ろ過滅菌した。50mlのこの溶液を、1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。フッ化ナトリウム(8.42488g)を500mlの水に溶解し、pHを7.25に調整した。溶液をろ過滅菌し、450mlを、重炭酸塩溶液を既に含む1リットルのDuran-Schottフラスコに加えた。塩化カルシウム(11.1275g)を500mlの水に溶解し、pHを7.72に調整した。溶液をろ過滅菌し、NaHCO3およびNaF溶液に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHおよびHCl滴定の結果：表11を参照。
【０１６７】
Ca/F/CO3：#9923124
バッチ9923123用に調製した50mlの重炭酸ナトリウム溶液を、1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。フッ化ナトリウム(8.42253g)を500mlの水に溶解し、pHを7.27に調整した。溶液をろ過滅菌し、450mlを、重炭酸塩溶液を既に含む1リットルのDuran-Schottフラスコに加えた。
【０１６８】
塩化カルシウム(11.1111g)を500mlの水に溶解し、pHを7.70に調整した。溶液をろ過滅菌し、NaHCO3およびNaF溶液に加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHおよびHCl滴定の結果が示された(表11)。
【０１６９】
炭酸塩領域内のCa/F/CO3：11000080〜83
炭酸ナトリウム溶液：重炭酸ナトリウム(17.11g)を1000mlの水に溶解し、NaOHを加えてpH10.09とした。この溶液をろ過滅菌した。フッ化ナトリウム溶液：フッ化ナトリウム(20.16g)を1200mlの水に溶解した(pHは9.84であった)。溶液をろ過滅菌した。CaCl2溶液：44.4gを2000mlの水に溶解し(pH10.17を得た)、0.2μmろ過によって滅菌した。
【０１７０】
Ca/F/CO311000080：
1Lの滅菌Duran-Schottを使用：450mlの炭酸塩溶液を50mlのフッ化ナトリウム溶液に加え、pH10.09を得た。層流下、500mlの塩化カルシウム溶液を加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表11に示される。
【０１７１】
Ca/F/CO311000081：
1Lの滅菌Duran-Schottを使用：250mlの炭酸塩溶液を250mlのフッ化ナトリウム溶液に加え、pH10.07を得た。層流下、500mlの塩化カルシウム溶液を加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表11に示される。
【０１７２】
Ca/F/CO311000082：
1Lの滅菌Duran-Schottを使用：150mlの炭酸塩溶液を350mlのフッ化ナトリウム溶液に加え、pH10.06を得た。層流下、500mlの塩化カルシウム溶液を加えた。スキーム4に従って水洗浄を実施した。上清pHは表11に示される。
【０１７３】
Ca/F/CO311000083：
1Lの滅菌Duran-Schottを使用：50mlの炭酸塩溶液を450mlのフッ化ナトリウム溶液に加え、pH10.05を得た。層流下、500mlの塩化カルシウム溶液を加えた。スキーム8に従って水洗浄を実施した。上清pHは表19に示される。
【０１７４】
Ca/F/アスコルビン酸：バッチ#9440198
アスコルビン酸カルシウム(42.6001g)を400mlの水に溶解した(pH=7.35を得た)。水酸化ナトリウム17ml(0.5M)を加えてpH8.99とした。水(83ml)を加えてpH9.08を与え、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。フッ化ナトリウム(4.2063g)を500mlの水に溶解して(pH9.49を得た)ろ過滅菌した。この溶液をアスコルビン酸カルシウム溶液に加えた。翌日、混合物を2Lの滅菌Duran-Schottフラスコに移し、さらに1リットルの滅菌水を加えた。さらに15日間の静置期間を設けた。スキーム7に従って水洗浄を実施した。上清pHは表12に示される。
【０１７５】
【表１２】
2016535736.tif 000023
【０１７６】
Ca/F/システイン：バッチ#944055
フッ化ナトリウム0.84108gとシステイン2.42216g(Merck社)を84mlの水に溶解した。水酸化ナトリウム0.5N(16ml)を加えてpH8.18とした。溶液をろ過滅菌し、250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム2.22197gを100mlの水に溶解しpH10.03の溶液を得て、これをろ過滅菌した。無菌条件下、このCaCl2溶液を(NaF+システイン)溶液に加えた。水洗浄および上清pHは表3に示される。
【０１７７】
Ca/F/システイン：バッチ#944056
塩化カルシウム2およびシステイン2.42838g(Merck社)を80mlの水に溶解した。水酸化ナトリウム0.5N(21ml)を加えてpH8.18とした。溶液をろ過滅菌し、250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。フッ化ナトリウム0.84168gを100mlの水に溶解しpH8.78の溶液を得て、これをろ過滅菌した。無菌条件下、このNaF溶液を(CaF2+システイン)溶液に加えた。水洗浄および上清pHが示される(表3)。
【０１７８】
Ca/F/システイン：バッチ#944057
フッ化ナトリウム0.84196gを100mlの水に溶解しpH8.98の溶液を得て、これをろ過滅菌して250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム2.2265gとシステイン2.42194g(Merck社)を80mlの水に溶解した。水酸化ナトリウム0.5N(21ml)を加えてpH8.19とした。溶液をろ過滅菌した。無菌条件下、この(CaF2+システイン)溶液をNaF溶液に加えた。水洗浄および上清pHが示される(表3)。
【０１７９】
Ca/F/システイン：バッチ#944058
塩化カルシウム2.2242gを100mlの水に溶解しpH10.04の溶液を得て、これをろ過滅菌して250mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。フッ化ナトリウム0.84254gとシステイン2.42793g(Merck社)を83.5mlの水に溶解した。水酸化ナトリウム0.5N(16.5ml)を加えてpH8.19とした。溶液をろ過滅菌した。無菌条件下、この(NaF+システイン)溶液をCaF2溶液に加えた。水洗浄および上清pH：表3を参照。
【０１８０】
Ca/F/システイン：バッチ#9440099
フッ化ナトリウム(4.2287g)を500mlの水に溶解し(この段階でのpHは9.22であった)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1582g)とシステイン(12.1086g)(Merck社)を加えて400mlの水に溶解した(わずかに青紫色が得られ、pH=5.58であった)。水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(117ml)pH8.22とし、このわずかに青紫色の溶液をろ過滅菌した。CaCl2-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHおよび浸透圧が示される(表12参照)。
【０１８１】
Ca/F/システイン：バッチ#9440197
フッ化ナトリウム(4.215g)を400mlの水に溶解し(pH=9.62を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1037g)を400mlの水に溶解し(pH=10.06を得た)、システイン(12.1060g)(Merck社)を加えた(わずかに青紫色を得た。pH=5.6)。水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(107ml)、pH8.21とし、このわずかに青紫色の溶液をろ過滅菌した。CaCl2-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表12に示される。
【０１８２】
Ca/F/N-アセチル-システイン：バッチ#9440110
フッ化ナトリウム(4.2058g)を400mlの水に溶解し(pH=9.26を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.10976g)を400mlの水に溶解し、N-アセチル-システイン(16.37876g)を加えた(pH=1.67を得た)。水酸化ナトリウムを加え(0.550g)、さらに水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(196ml)、pH8.35とし、このわずかに青紫色の溶液(pH5超で発色が見られる)をろ過滅菌した。CaCl2-N-アセチル-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表12に示される。
【０１８３】
Ca/F/N-アセチル-システイン：バッチ#9440196
フッ化ナトリウム(4.2026g)を400mlの水に溶解し(pH=9.66を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1139g)を400mlの水に溶解し(pH=10.04を得た)、N-アセチル-システイン(16.3025g)を加えた(pH=1.4を得た)。水酸化ナトリウム(固体ペレット、Merck社製品1064981000、バッチB0467298)を加え(0.848g)、水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(172ml)、pH8.35とし、このわずかに青紫色の溶液(pH5超で発色が見られる)をろ過滅菌した。CaCl2-N-アセチル-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表12に示される。
【０１８４】
Ca/F/N-アセチル-システイン：バッチ#10616125
フッ化ナトリウム(4.2026g)を500mlの水に溶解し(pH=9.01を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1362g)を500mlの水に溶解し(pH=10.04を得た)、N-アセチル-システイン(16.3313g)を加えた(pH=1.63を得た)。水酸化ナトリウム(固体ペレット、Merck社製品1064981000、バッチB0467298008)をpH8.02まで加え、さらに水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(5ml)、pH8.30とし、このわずかに青紫色の溶液(pH5超で発色が見られる)をろ過滅菌した。CaCl2-N-アセチル-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pH：表12を参照。
【０１８５】
Ca/F/N-アセチル-システイン：バッチ#11000101
フッ化ナトリウム(4.2101g)を500mlの水に溶解し(pH=9.35を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1715g)を500mlの水に溶解し(pH=9.97を得た)、N-アセチル-システイン(16.3469g)を加えた(pH=1.79を得た)。水酸化ナトリウムをpH7.69まで加え、さらに水酸化ナトリウム0.5Nを加えて(5ml)、pH8.36とし、このわずかに青紫色の溶液(pH5超で発色が見られる)をろ過滅菌した。CaCl2-N-アセチル-システイン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表12に示される。
【０１８６】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#10616185
フッ化ナトリウム(4.2098g)を500mlの水に溶解し(pH=8.9を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1025g)を500mlの水に溶解し(pH=10.00を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオンを加えた(pH=2.67を得た)。水酸化ナトリウムを加えてpH8.57とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示される。
【０１８７】
【表１３】
2016535736.tif 000024
【０１８８】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#11000030
フッ化ナトリウム(4.2260g)を500mlの水に溶解し(pH=9.47を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.120g)を500mlの水に溶解し(pH=9.92を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオン(3.0726g)を加えた(pH=2.72を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.59とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示した。
【０１８９】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#11000033
フッ化ナトリウム(4.2097g)を500mlの水に溶解し(pH=9.35を得た)、HCl 0.3Mを加えてpH6.94とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。
塩化カルシウム(11.117g)を500mlの水に溶解し(pH=9.91を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオン(30.7g)を加えた(pH=2.64を得た)。水酸化ナトリウムとHCl 0.3Mを加えてpH7.04とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示される。
【０１９０】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#11000086
フッ化ナトリウム(4.2235g)を500mlの水に溶解し(pH=9.34を得た)、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1431g)を500mlの水に溶解し(pH=9.92を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオン(3.0782g)を加えた(pH=2.84を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.59とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示される。
【０１９１】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#11000099
フッ化ナトリウム(4.1101g)を500mlの水に溶解し(pH=9.58を得た)、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(1101228g)を500mlの水に溶解し、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた(pH=10.05を得た)。グルタチオン(3.0716g)を加えた(pH=2.79を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.57とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示される。
【０１９２】
Ca/F/グルタチオン：バッチ#11000194
フッ化ナトリウム(4.2059g)を500mlの水に溶解し(pH=9.24を得た)、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1371g)を500mlの水に溶解し(pH=9.99を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオン(3.0912g)を加えた(pH=3.07を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.58とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオン溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表13に示される。
【０１９３】
Ca/F/グルタチオンオキシド：バッチ#10616198
フッ化ナトリウム(0.4220g)を50mlの水に溶解し(pH=8.64を得た)、ろ過滅菌して100mlの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(1.1112g)を30mlの水に溶解し(pH=9.97を得た)、グルタチオンオキシド(6.5611g)を加えた(pH=6.27を得た)。水酸化ナトリウム0.5Nおよび0.05Mを加えてpH7.55とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオンオキシド溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表14に示される。
【０１９４】
【表１４】
2016535736.tif 000025
【０１９５】
Ca/F/グルタチオンオキシド：バッチ#11000139
フッ化ナトリウム(4.20838g)を50mlの水に溶解し(pH=9.82を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(1.1528g)を500mlの水に溶解し(pH=9.97を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオンオキシド(3.2255g)を加えた(pH=6.84を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.21とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオンオキシド溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表14に示される。
【０１９６】
Ca/F/グルタチオンオキシド：バッチ#11000140
フッ化ナトリウム(4.20027g)を50mlの水に溶解し(pH=9.82を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(1.1068g)を500mlの水に溶解し(pH=9.94を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。グルタチオンオキシド(6.56150g)を加えた(pH=6.55を得た)。水酸化ナトリウムと水酸化ナトリウム0.5Mを加えてpH8.12とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-グルタチオンオキシド溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表14に示される。
【０１９７】
Ca/F/チオ乳酸塩：バッチ#11000031
フッ化ナトリウム(4.2078g)を500mlの水に溶解し(pH=9.56を得た)、ろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1187g)を500mlの水に溶解し(pH=9.89を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。チオ乳酸(8.5ml)を加えた(pH=1.96を得た)。水酸化ナトリウムを加えてpH9.54とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-チオ乳酸塩溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示される。
【０１９８】
【表１５】
2016535736.tif 000026
【０１９９】
Ca/F/チオ乳酸塩：バッチ#11000059
フッ化ナトリウム(4.2146g)を500mlの水に溶解し(pH=9.47を得た)、HCl 0.03Nを加えてpH7.16とした。この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1780g)を500mlの水に溶解し(pH=9.98を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。チオ乳酸(8.5ml)を加えた(pH=2.05を得た)。水酸化ナトリウムとNaOH 0.03Mを加えてpH7.16とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-チオ乳酸塩溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示される。
【０２００】
Ca/F/チオ乳酸塩：バッチ#11000060
フッ化ナトリウム(4.2161g)を500mlの水に溶解し(pH=9.45を得た)、HCl 0.03Nを加えてpH7.93とした。この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1786g)を500mlの水に溶解し(pH=9.96を得た)、この溶液を0.22μmフィルター上でろ過して清浄な800ml Beckerに移し入れた。チオ乳酸(8.5ml)を加えた(pH=1.96を得た)。ナトリウムとNaOH 0.03Mを加えてpH8.07とし、この溶液をろ過滅菌した。CaCl2-チオ乳酸塩溶液をNaF溶液に加えた。スキーム5に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示した。
【０２０１】
Ca/F/アジピン酸：バッチ#11000129
アジピン酸(7.3070g)を500mlの水に溶解した(pH=2.81を得た)。水酸化ナトリウムを加えてpH5.39とした。フッ化ナトリウム(4.1967g)を加えた；この段階でのpHは5.59であった。さらにNaOHを加えてpH8.02とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。
塩化カルシウム(11.1481g)を500mlの水に溶解した(pH=10.81を得た)。この溶液をろ過滅菌し、NaF/アジピン酸塩滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示される。
【０２０２】
Ca/F/アジピン酸：バッチ#11481026
アジピン酸(7.3174g)を500mlの水に溶解した(pH=2.99を得た)。水酸化ナトリウムを加えてpH5.11とした。フッ化ナトリウム(4.1979g)を加えた；この段階でのpHは5.48であった。さらにNaOHを加えてpH5.94とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。
塩化カルシウム(11.1163g)を500mlの水に溶解した(pH=9.82を得た)。この溶液をろ過滅菌し、NaF/アジピン酸塩滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示される。
【０２０３】
Ca/F/アジピン酸：バッチ#11481027
アジピン酸(7.3151g)を500mlの水に溶解した(pH=2.98を得た)。ナトリウムを加えてpH5.36とした。フッ化ナトリウム(4.1995g)を加えた；この段階でのpHは5.48であった。さらにNaOHを加えてpH7.18とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。
塩化カルシウム(11.1209g)を500mlの水に溶解した(pH=9.82を得た)。この溶液をろ過滅菌し、NaF/アジピン酸塩滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHは表15に示される。
【０２０４】
Ca/F/尿酸：バッチ#11000182
フッ化ナトリウム(4.1650g)を500mlの水に溶解した(pH=9.52を得た)。尿酸(0.13223g)を少しずつ数回に分けて加えて溶解に時間(一晩)をかけ、必要な場合にはNaOH(0.5M)添加によりpH降下を補償した；この段階でのpHは8.60であった。この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム六水和物(21.9929g)を500mlの水に溶解した(pH=6.24を得た)。この溶液をろ過滅菌し、NaF/尿酸塩無菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pH：表14を参照。
【０２０５】
Ca/F/葉酸(ビタミンM)：バッチ#11481018
フッ化ナトリウム(4.2026g)を500mlの水に溶解した(pH=9.33を得た)。葉酸(0.4481g)を加え、pHは5.74まで降下した。NaOH 0.5Mを加えてpH6.98とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム(11.1183g)を500mlの水に溶解した(pH=9.73を得た)。この溶液をろ過滅菌し、NaF/葉酸塩無菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pH：表14を参照。
【０２０６】
Ca/F/ヒポキサンチン：バッチ11481198
フッ化ナトリウム(4.21g)を500mlの水に溶解し、1.36gのヒポキサンチンを加え、NaOH 0.5Mを加えてpH9.83とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム二水和物(14.73g)を500mlの水に溶解し、1mlのNaOH(0.05M)を加えてpH9.31とし、この溶液をろ過滅菌してNaF/ヒポキサンチン滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHについては表15Aを参照。
【０２０７】
Ca/F/キサンチン：バッチ11481199
フッ化ナトリウム(4.22g)を500mlの水に溶解し、1.52gのキサンチンを加え、NaOH 0.5Mを加えてpH10.75とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム二水和物(14.71g)を500mlの水に溶解し、1mlのNaOH(0.05M)を加えてpH9.39とし、この溶液をろ過滅菌してNaF/キサンチン滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHについては表15Aを参照。
【０２０８】
Ca/F/グアニン：バッチ11481195
50mlの水中1.52gのグアニンに、NaOH(固体ペレット)(1.4g)を加えた。溶解後、4.21gのフッ化ナトリウムと450mlの水を加えた。溶液のpHは12.52であった。この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム二水和物(14.71g)を500mlの水に溶解し、0.5mlのNaOH(0.05M)を加えてpH8.48とし、この溶液をろ過滅菌してNaF/グアニン滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHについては表15Aを参照。
【０２０９】
Ca/F/シトシン：バッチ11954009
フッ化ナトリウム(4.22g)を500mlの水に溶解し、1.10gのシトシンを加え(pH9.03を得た)、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム二水和物(14.73g)を500mlの水に溶解し、1mlのNaOH(0.05M)を加えてpH9.18とし、この溶液をろ過滅菌してNaF/シトシン滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHについては表15Aを参照。
【０２１０】
Ca/F/チミン：バッチ11954064
フッ化ナトリウム(4.22g)を500mlの水に溶解し、1.26gのヒポキサンチンを加え、NaOH 0.5Mを加えてpH9.11とし、この溶液をろ過滅菌して1リットルの滅菌Duran-Schottフラスコに入れた。塩化カルシウム二水和物(14.75g)を500mlの水に溶解し、0.5mlのNaOH(0.05M)を加えてpH8.31とし、この溶液をろ過滅菌してNaF/チミン滅菌溶液に注ぎ入れた。スキーム6に従って水洗浄を実施した。上清pHについては表15Aを参照。
【０２１１】
【表１５Ａ】
2016535736.tif 000027
【０２１２】
Caアジピン酸塩：バッチ11954096
炭酸カルシウム(5g)を500mlの水に懸濁した。アジピン酸(7.3g)を加えた。さらなる水量を体積が750mlとなるまで加え、混合物を60℃で1時間加熱した。この溶液をろ過滅菌した(0.22μmフィルター)。得られた溶液を加熱し、約280mlの総体積になるまで蒸発により濃縮した。結晶を上清から分離し、80℃で5日間乾燥させた。この製品は、熱重量分析測定中にアジピン酸カルシウム標準として使用される。
【０２１３】
熱重量分析による複合体の有機物含有量の分析
乾燥物質サンプルを熱重量分析に供した。N2下の室温(RT)〜600℃、およびO2下の600℃〜800℃の重量損失を記録し、燃焼した有機物の量の差を表した。
【０２１４】
【表１５Ｂ】
2016535736.tif 000028
【０２１５】
実施例3A. MPLの吸着
様々な無機粒子へのMPL(水中ナノ粒子)の吸着を無菌条件下で実施し、LumiSizer(登録商標)装置を用いたSTEP(登録商標)技術(空間時間分解消光プロファイル)によってMPL吸着％を測定した。表16は、これらの吸着データをまとめ、カルシウム-フッ化物-炭酸塩複合体中のバテライト型の炭酸塩の存在が、1ml水中で500μg無機複合体への100μg MPLの100％吸着を可能とすることを示す。Ca/F/N-アセチル-システイン(バッチ10616125)は、同様の結果を与える。
【０２１６】
【表１６】
2016535736.tif 000029
【０２１７】
実施例3B. 吸着抗原の安定性および熱安定性
F4T(かなり不安定な抗原)を用いて、吸着抗原の安定性および熱安定性の向上を実証した。表17は、抗原吸着条件および最終組成についてまとめる。
【０２１８】
【表１７】
2016535736.tif 000030
【０２１９】
遠心分離(抗原/無機部分を捨てるため)後に上清で実施したHPLC定量により、抗原吸着を決定した。上清中に抗原がないことは、吸着抗原100％に等しいと解釈した。吸着の安定性はt=0およびt=1ヶ月(4℃)で測定したが、熱安定性は1ヶ月後(30℃)に決定した(表18)。
【０２２０】
【表１８】
2016535736.tif 000031
【０２２１】
F4T抗原の安定性プロファイル評価は、SDS-PAGE分析によりt=0で実施し(図4)、t=1ヶ月(4℃)で比較したが(図5)、熱安定性は、30℃で1ヶ月後に決定した(図6)。静電力により吸着されている抗原は、SDS-PAGEゲル環境および適用された実験的泳動条件によって放出された。この安定性および熱安定性測定の全てのケースにおいて、非吸着対照サンプルと比較すると、吸着物質の抗原プロファイルは見事に保持されていた。
【０２２２】
実施例4. ClfAN123抗原およびHepB抗原に対する免疫応答
複合体-ClfAN123吸着抗原の免疫応答
複合体-ClfAN123の吸着を表19に示し、製剤組成を表20に示した。
【０２２３】
【表１９】
2016535736.tif 000032
【０２２４】
【表２０】
2016535736.tif 000033
【０２２５】
図7に示されるとおり、抗原を様々な担体に吸着させた場合に、抗原の免疫原性が維持された。
【０２２６】
HepB吸着抗原の免疫応答
製剤組成を示す(表21)。
【表２１】
2016535736.tif 000034
【０２２７】
抗体測定(抗HBs 14pII)(図1)に示されるとおり、抗原の応答は、抗原が本明細書に記載されるCaF2ファミリーの様々な担体上に吸着された場合に維持された。
【０２２８】
実施例5：免疫応答
HepB吸着抗原の免疫応答
このin vivoでのフッ化カルシウム複合体の研究について、実施例4で使用したのと同じフッ化カルシウム複合体バッチを用いる反復実験のため、5種のフッ化カルシウム複合体とAlOOHを実施例4から選択し；さらに、研究のため、1/2量の初期フッ化カルシウム複合体に吸着させたHepBを選択した(1240mg対600mgのフッ化カルシウム複合体)。さらに、この研究のため、これまでに試されていないフッ化カルシウム複合体(これまでに試験したバッチのZとは異なるZを含む)を選択した。試験した複合体は以下のとおりであった：
・1. AlOOH 1240μg
・2. AlOOH 600μg
・3. CaF2/CO31240μg
・4. CaF2/CO3600μg
・5. CaF2N-アセチルシステイン 1240μg
・6. CaF2N-アセチルシステイン 600μg
・7. CaF2/グルタチオン 1240μg
・8. CaF2/グルタチオンオキシド 1240μg
・9. CaF2/アジピン酸塩 1240μg
・10. CaF2/尿酸 1240μg(新たなフッ化カルシウム複合体)
・11. CaF2/尿酸 600μg(新たなフッ化カルシウム複合体)
・12. CaF2/葉酸 1240μg(新たなフッ化カルシウム複合体)
・13. CaF2/葉酸 600μg(新たなフッ化カルシウム複合体)
・14. HepB単独(担体なし)
【０２２９】
予備的な結果(統計処理なし)を、一番上(#1=「エンゲリックス(Engerix)様」処方)から(#14 hepB単独)まで同じ順番で、図9にまとめる。
【０２３０】
実施例6：様々な複合体に吸着させた組換えFタンパク質のBalb/cマウスへの接種は、水酸化ミョウバンと類似レベルのRSV中和抗体およびrF結合抗体を誘導する
【０２３１】
組換えRSV Fタンパク質(rF)を用いて、複合体による吸着測定を行った：Balb/Cマウスにおける免疫原性試験のため、5つのrF-複合体製剤を選択し、水酸化ミョウバン吸着またはリン酸カルシウム吸着させたrFと比較した(表22参照)。
【表２２】
2016535736.tif 000035
【０２３２】
Balb/cマウスの群(n=9/群)に、表22の製剤を3週間の間隔で2回筋肉内接種した。選択したアジュバントのそれぞれと共に、2つの異なる用量でrF抗原を使用した。
【０２３３】
35日目に、全てのマウスから血清を個別に採取し(2回目の接種の14日後)、プラーク減少アッセイを用いてRSV中和抗体の存在について試験し、またELISAにより抗rF IgG濃度について試験した。
【０２３４】
中和アッセイのため、各血清の連続希釈物を、RSV A(ロング株)と共に33℃で20分間プレインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス-血清混合物を、Vero細胞を予め播種したプレートに移した。各プレート上で、1つのカラム中の細胞はウイルスのみ(100％感染性)と共にインキュベートし、2つのウェルには、ウイルスまたは血清を入れなかった(細胞対照)。プレートを33℃で2時間インキュベートし、培地を除去して、0.5％CMC(低粘度カルボキシメチルセルロース)を含むRSV培地を全ウェルに添加した。免疫蛍光染色の前に、プレートを33℃で3日間インキュベートした。
【０２３５】
ELISAについて、様々な群を比較するために用いた統計的方法は、log10値の分散分析(Analysis of Variances)(ANOVA 1またはANOVA 2)であった。
【０２３６】
図11に示される結果は、試験した2つの抗原用量において、本複合体のいずれかによって誘導された中和抗体応答と、水酸化ミョウバンによって誘導された中和抗体応答との間に有意差が観察されなかったことを示した。さらに、2μg抗原用量において、アジピン酸塩複合体は、N-アセチル-システイン複合体および尿酸複合体よりも有意に高い中和抗体力価を誘導した。リン酸カルシウムは、水酸化ミョウバン(0.1μg rF)、アジピン酸塩複合体(2μg rF)、システイン複合体(2μg rF)および尿酸複合体(0.1μg rF)より有意に低い中和抗体力価を誘導したことから、免疫原性の低いアジュバントであった。
【０２３７】
抗rF IgGの濃度について血清サンプルを試験した場合に、極めて類似する結果が得られた(図12)。
【０２３８】
実施例7：様々な複合体に吸着させた組換えFタンパク質のBalb/cマウスへの接種は、RSVチャレンジ後の肺中RSVウイルス負荷を有意に低下させることができる。
マウス効力研究のため、実施例6に記載される実験に基づいて、アジピン酸塩複合体、システイン複合体および尿酸複合体を選択し、水酸化ミョウバン（Alum hydroxide）と比較した。実験計画は表23に記載される。
【表２３】
2016535736.tif 000036
【０２３９】
Balb/cマウスの群(n=8/群)に、表23の製剤を3週間の間隔で2回筋肉内接種した。2回目の接種の14日後、動物に1.54x106 pfuのRSVを鼻腔内チャレンジした。これらの例示的ワクチンの効力を測定するため、RSVチャレンジの4日後に肺を回収し、個々に秤量してホモジナイズした。各肺ホモジネートの連続希釈物(それぞれ8つの複製)をVero細胞と共にインキュベートし、播種の6日後に、プラークを含むウェルを免疫蛍光法によって同定した。TCID50計算のためのスピアマン-カルバー(Spearman-Karber)法を用いてウイルス力価を決定し、肺1グラム当たりで表した。様々な群を比較するために用いた統計的方法は、log10値のANOVA 1であった。
【０２４０】
図13に示される結果は、2μg rF+アジピン酸塩複合体によるワクチン接種が、2μg rF+ミョウバン-OHによるワクチン接種と同様に、マウス肺中のRSV複製を完全に消失させることができる唯一の複合体製剤であったことを示した。試験した2つの他の複合体(複合体/システインおよび複合体/尿酸)は、ウイルス複製を完全には妨げなかったが、肺中のウイルス複製を有意に(P<0.001)低下させた。これらの結果は、RSVチャレンジされたBalb/cマウスにおけるウイルス複製の異なる阻害の程度によって示されるとおり、同様の抗体応答にも関わらず、異なる複合体が定性的に異なるワクチン応答を誘導し得ることを示す。
【０２４１】
実施例8：Balb/cマウス免疫原性モデルにおける複合体19F-DT製剤の評価
10種の異なる19F-DT製剤を、Balb/cマウス免疫原性モデルにおいて、2つの実験を通して試験した。複合体製剤を、0.1μg 19F-DTの用量で、0、14および28日目に筋肉内投与した。28日目(ELISAおよびOPA(プール血清で行った実験20140179を除く))および42日目(ELISAおよびOPA)に採取した個々の血清中でIgGレベルおよびOPA力価を決定した。Ca/F/尿酸製剤およびCa3(PO4)2製剤(対照として使用した)を除く全ての候補製剤が、AlPO4に対する非劣性基準に達した。図14〜17を参照。
【０２４２】
実施例9：複合体PRNの動物結果
手短に言えば、BALB/cマウスの群(n=16/群)に、2週間の間隔で2回筋肉内接種し；全てのマウスから、1回目の接種の14日後と2回目の接種の7日後に血清を個別に採取し、以下のプロトコルに従って抗PRN IgG抗体の存在について試験した。
【０２４３】
96ウェルプレートを、炭酸塩-重炭酸塩バッファー(50mM)中のPRN(6μg/ml)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。PBS-BSA 1％バッファーによる飽和ステップ後、マウス血清をPBS-BSA 0.2％-Tween 0.05％中で1/100希釈し、プレートのウェル中で連続希釈した(12回の希釈、ステップ1/2)。ペルオキシダーゼに結合した抗マウスIgGを加えた(1/5000倍希釈)。ペルオキシダーゼ基質(OPDA)の添加後に比色反応を観察し、分光光度法(波長：490〜620nm)により読み取る前にHCL 1Mで停止させた。各プレートに加えた試験した各血清および標準について、ODと希釈の関係に4パラメータロジスティック曲線を適合させた(Softmaxpro)。これは、STD力価で表される各サンプル力価の導出を可能とした。
【０２４４】
【表２４】
2016535736.tif 000037
【０２４５】
実施例10：デング(Denge)/複合体
TRISバッファー(pH8.0)中の4.7％ソルビトール中で製剤化したデング4を様々な複合体に吸着させ、1ml当たり4μg抗原の最終濃度とした。遠心分離後、ELISAにより上清中の抗原を測定した。遠心分離後に測定した類似のデング4製剤に100％ELISA値を与える。従って、低いELISA値は、複合体への抗原の高い吸着を示す。表25は、各製剤に含まれる複合体量を示す。
【表２５】
2016535736.tif 000038
【０２４６】
実施例11：QS21の吸着
免疫刺激剤QS21は、単独でヒトワクチンに使用するには溶血性が高すぎる。コレステロールを含有するいくつかの製剤がこの問題を回避する。キリア（quilliac）抽出物および誘導体を含む新規製剤では溶血試験が必須である（C. Kensil等、1991, J. Immunology, vol 146(2) p.431-437）（S. Soltysik等、Vaccine 1995 vol 13(15) p.1403-1410）（B. Ronnberg等、1995, Vaccine, vol 13(14) p.1375-1382）（B.P. da Silva等、2005, Vaccine vol 23 p.1061-1070およびOliveira-Freitas等、2006, Vaccine, vol 24 p.3909-3920およびC. Rodrigues等、2012, Chemistry and Biodiversity, vol 9 p.58-67）。
無機複合体上へのQS21の吸着は、製剤へのコレステロールの添加なしにニワトリ赤血球の溶血を防止することが見出された。このことは、6.7mgの無機複合体上に50、25および12.5μgのQS21が吸着したCa/F/グルタチオン（バッチ11000099）を用いて得られた結果によって支持された（表26）。
【表２６】
2016535736.tif 000039
【図１】
2016535736.tif 000040
【図２】
2016535736.tif 000041
【図３】
2016535736.tif 000042
【図４】
2016535736.tif 000043
【図５】
2016535736.tif 000044
【図６】
2016535736.tif 000045
【図７】
2016535736.tif 000046
【図８】
2016535736.tif 000047
【図９】
2016535736.tif 000048
【図１０】
2016535736.tif 000049
【図１１】
2016535736.tif 000050
【図１２】
2016535736.tif 000051
【図１３】
2016535736.tif 000052
【図１４】
2016535736.tif 000053
【図１５】
2016535736.tif 000054
【図１６】
2016535736.tif 000055
【図１７】
2016535736.tif 000056
【図１８】
2016535736.tif 000057
【配列表】
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【国際調査報告】
2016535736.tif 000058
2016535736.tif 000059
2016535736.tif 000060