(57)【要約】  本発明は、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングの阻害のための、及び関連する医学的状態、例えば肺動脈性高血圧症(PAH)の治療のための、マイクロRNA96及びその前駆体及び模倣体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺高血圧症の予防又は治療方法であって、
(a)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体、又は
(b)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸
を、標的細胞に送達すること、又は被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法であって、
(a)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体、又は
(b)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸
を、標的細胞に送達すること、又は被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３】
前記肺高血圧症が、肺動脈性高血圧症である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的細胞が、5-HT1B受容体を発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標的細胞が、血管細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
血管細胞が、血管平滑筋細胞(VSMC)又は血管内皮細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血管細胞が、肺動脈平滑筋細胞(PASMC)又は肺動脈内皮細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的細胞が、血管系に関連する細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的細胞が、外膜線維芽細胞又は免疫細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞が、Tリンパ球、単球、マクロファージ又はマスト細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
miR-96の前駆体が、pre-mir96である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
pre-mir96が、配列:
2016540049.tif 000012
を有し、ここで、成熟miR-96配列には下線が引かれている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
miR-96の前駆体が、pri-miR96である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
miR-96模倣体が、配列:
2016540049.tif 000013
(シード配列には下線が引かれている)
を有するか又はシード配列の外側の1つ以上の位置でその配列とは異なる、ガイド鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾糖残基を含む、請求項１〜１０又は１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１０、１４又は１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾塩基を含む、請求項１〜１０又は１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
miR-96、その模倣体又は前駆体が、担体と結合している、請求項１〜１０又は１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
担体が、薬学的に許容される脂質若しくはポリマー、又はそれらの組み合わせである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が、裸のDNAとして又は担体と結合して送達される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が、ウイルスベクターを介して送達される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスベクターが、アデノウイルス又はレトロウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法に使用するための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体。
【請求項２５】
肺高血圧症の予防又は治療方法に使用するための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体。
【請求項２６】
前記肺高血圧症が、肺動脈性高血圧症である、請求項２５に記載の使用のための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体。
【請求項２７】
miR-96の前駆体が、pre-mir96である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96の前駆体。
【請求項２８】
pre-mir96が、配列:
2016540049.tif 000014
を有し、ここで、成熟miR-96配列には下線が引かれている、請求項２７に記載の使用のためのmiR-96の前駆体。
【請求項２９】
miR-96の前駆体が、pri-miR96である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96の前駆体。
【請求項３０】
miR-96模倣体が、シード配列には下線が引かれている配列:
2016540049.tif 000015
を有するガイド鎖を含むか、又はシード配列の外側の1つ以上の位置でその配列とは異なる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96模倣体又はその前駆体。
【請求項３１】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾糖残基を含む、請求項２４〜２６又は請求項３０のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96模倣体又はその前駆体。
【請求項３２】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項２４〜２６、請求項３０又は請求項３１のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96模倣体又はその前駆体。
【請求項３３】
miR-96模倣体が、1つ以上の修飾塩基を含む、請求項２４〜２６又は３０〜３２のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-96模倣体又はその前駆体。
【請求項３４】
miR-96、その模倣体又は前駆体が、担体と結合している、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の使用のための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体。
【請求項３５】
担体が、薬学的に許容される脂質若しくはポリマー、又はそれらの組み合わせである、請求項３４に記載の使用のための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体。
【請求項３６】
血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法に使用するための、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸。
【請求項３７】
肺高血圧症の予防又は治療方法に使用するための、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸。
【請求項３８】
前記肺高血圧症が、肺動脈性高血圧症である、請求項３７に記載の使用のための核酸。
【請求項３９】
核酸が、裸のDNAとしての又は担体と結合した送達のために製剤化される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用のための核酸。
【請求項４０】
核酸が、ウイルスベクターの部分として提供される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用のための核酸。
【請求項４１】
ウイルスベクターが、アデノウイルス又はレトロウイルスベクターである、請求項４０に記載の使用のための核酸。
【請求項４２】
レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項４１に記載の使用のための核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングの阻害のための、及び関連する医学的状態、例えば肺動脈性高血圧症(PAH)の治療のための、マイクロRNA96及びその前駆体及び模倣体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺動脈性高血圧症(PAH)は、右心室不全につながる、重度の肺動脈リモデリング及び閉塞性肺血管病変を特徴とする壊滅的な疾患である。最近の疫学的研究は、疾患の発生率は、女性の方が大きいことを報告する: 疾患分類に応じて、男性に対する女性の比率は、4:11ほど大きくなり得る。
【０００３】
PAHは、年間2〜3人/100万人に影響を及ぼす予後不良を有する; PAHを有する患者は、それぞれ、68％、48％、及び34％の1、3、及び5年生存率を有する。生存は、現在の療法で顕著に増加しておらず、新たな治療アプローチが緊急に必要である。
【０００４】
遺伝性PAHは、smad1/ID経路2を介してシグナル伝達するBMPR2についての遺伝子の突然変異と関連する。セロトニンはまた、PASMC増殖及び収縮の促進によりPAHの発症に重要な役割を果たす。これは、トリプトファンヒドロキシラーゼ1(TPH1)3-5によりその合成を介して、セロトニントランスポーター(SERT)を介して細胞に入ることによって、及び/又は5HT1B受容体活性化3、6-13によって、行うことができる。
【０００５】
本発明者らは、雌のみがPHを発症する肺高血圧症(PH)の3つの動物モデル(SERT+マウス10、mts1過剰発現マウス14及びデクスフェンフルラミン処理マウス15)において、PHの発症がセロトニン依存的であり、内因性エストロゲン及び/又はエストロゲン代謝に依存し得る15-17ことを実証している。これは、性別、エストロゲン及びセロトニンが、PHにおける興味深い危険因子であることを示唆する。
【０００６】
マイクロRNA(miR)は、翻訳の抑制を介して(翻訳の阻害又はmRNA分解の誘導のいずれかを介して)細胞機能に大きな影響を有する小さな非コード化RNAである。マイクロRNAは、長さが数千ヌクレオチドであってもよい、RNA pol IIによって合成された一次RNA転写産物(pri-miRNA)から誘導される。単一のpri-miRNA転写産物は、2つ以上の活性なmiRNAを生じ得る。
【０００７】
核では、III型RNAse酵素ドローシャ(Drosha)は、pri-miRNA転写産物を、通常約70〜100ヌクレオチドの長さの、ステム-ループ又はヘアピン構造からなる前駆体miRNA(pre-miRNA)に処理する。次いで、pre-miRNAは、細胞質に輸送され、そこで、RNAseダイサー(Dicer)によってさらに処理され、ループを除去し、成熟二本鎖miRNA分子をもたらし、活性な「ガイド」鎖(典型的には15〜25ヌクレオチド長)を、全体的に又は部分的に相補的な「パッセンジャー」鎖にハイブリダイズさせる。
【０００８】
次いで、成熟二本鎖miRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体に組み込まれ、そこで、ガイド鎖は、標的mRNA中の結合部位にハイブリダイズする。
【０００９】
ガイド鎖は、標的結合部位に対して完全に相補的ではなくてもよい。しかし、「シード(seed)」配列と呼ばれるガイド鎖の領域は、通常、標的結合部位の対応する配列に完全に相補的である。シード配列は、典型的には、長さが2〜8ヌクレオチドであり、ガイド鎖の5'末端に又はその近く(1又は2ヌクレオチド以内)に位置する。
【００１０】
単一の不対ガイド鎖はまた、RISCに組み込まれることが可能であり得ると考えられている。また、RISCへのパッセンジャー鎖の組み込みを妨げるパッセンジャー鎖への(例えば、糖、塩基、又は骨格構造への)修飾も二重鎖miRNAによる標的阻害の効率を増加し得ると考えられている。
【００１１】
特定のmiRは、PAHに影響を与える遺伝子を調節することが以前に示されている18-20。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Shapiro S, Traiger GL, Turner M, Mcgoon MD, Wason P, Barst RJ. Sex differences in the diagnosis, treatment, and outcome of patients with pulmonary arterial hypertension enrolled in the registry to evaluate early and long-term pulmonary arterial hypertension disease management. Chest 2012 February;141(2):363-73.
【非特許文献２】Lane KB, Machado RD, Pauciulo MW et al. Heterozygous germline mutations in BMPR2, encoding a TGF-beta receptor, cause familial primary pulmonary hypertension. Nature Genetics 2000 September;26(1):81-4.
【非特許文献３】Dempsie Y, Morecroft I, Welsh DJ et al. Converging evidence in support of the serotonin hypothesis of dexfenfluramine-induced pulmonary hypertension with novel transgenic mice. Circulation 2008 June 3;117(22):2928-37.
【非特許文献４】Morecroft I, Dempsie Y, Bader M et al. Effect of Tryptophan Hydroxylase 1 Deficiency on the Development of Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension. Hypertension 2007 January 1;49(1):232-6.
【非特許文献５】Morecroft I, White K, Caruso P et al. Gene Therapy by Targeted Adenovirus-mediated Knockdown of Pulmonary Endothelial Tph1 Attenuates Hypoxia-induced Pulmonary Hypertension. Mol Ther 2012 August;20(8):1516-28.
【非特許文献６】Lawrie A, Spiekerkoetter E, Martinez EC et al. Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulate S100A4/Mts1, a gene associated with pulmonary vascular disease. Circ Res 2005 August 5;97(3):227-35.
【非特許文献７】MacIntyre PD, Bhargava B, Hogg KJ, Gemmill JD, Hillis WS. Effect of Subcutaneous Sumatriptan, A Selective 5Ht1 Agonist, on the Systemic, Pulmonary, and Coronary Circulation. Circulation 1993 February;87(2):401-5.
【非特許文献８】MacLean MR, Clayton RA, Templeton AGB, Morecroft I. Evidence for 5-HT1-like receptor-mediated vasoconstriction in human pulmonary artery. British Journal of Pharmacology 1996 September;119(2):277-82.
【非特許文献９】MacLean MR, Morecroft I. Increased contractile response to 5-hydroxytryptamine(1)-receptor stimulation in pulmonary arteries from chronic hypoxic rats: role of pharmacological synergy. British Journal of Pharmacology 2001 October;134(3):614-20.
【非特許文献１０】MacLean MR, Deuchar GA, Hicks MN et al. Overexpression of the 5-hydroxytryptamine transporter gene - Effect on pulmonary hemodynamics and hypoxia-induced pulmonary hypertension. Circulation 2004 May 4;109(17):2150-5.
【非特許文献１１】Morecroft I, Heeley RP, Prentice HM, Kirk A, MacLean MR. 5-hydroxytryptamine receptors mediating contraction in human small muscular pulmonary arteries: importance of the 5-HT1B receptor. British Journal of Pharmacology 1999 October;128(3):730-4.
【非特許文献１２】Morecroft I, Loughlin L, Nilsen M et al. Functional interactions between 5-hydroxytryptamine receptors and the serotonin transporter in pulmonary arteries. J Pharmacol Exp Ther 2005 May;313(2):539-48.
【非特許文献１３】Morecroft I, Pang L, Baranowska M et al. In vivo effects of a combined 5-HT(1B) receptor/SERT antagonist in experimental pulmonary hypertension. Cardiovasc Res 2010 February 1;85(3):593-603.
【非特許文献１４】Dempsie Y, Nilsen M, White K et al. Development of pulmonary arterial hypertension in mice over-expressing S100A4/Mts1 is specific to females. Respiratory Research 2011;12(1):159.
【非特許文献１５】Dempsie Y, MacRitchie NA, White K et al. Dexfenfluramine and the oestrogen-metabolizing enzyme CYP1B1 in the development of pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res 2013 July 1;99(1):24-34.
【非特許文献１６】White K, Dempsie Y, Nilsen M, Wright AF, Loughlin L, MacLean MR. The serotonin transporter, gender, and 17 beta oestradiol in the development of pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res 2011 May;90(2):373-82.
【非特許文献１７】White K, Loughlin L, Maqbool Z et al. Serotonin transporter, sex, and hypoxia: microarray analysis in the pulmonary arteries of mice identifies genes with relevance to human PAH. Physiological Genomics 2011 April;43(8):417-37.
【非特許文献１８】Caruso P, MacLean MR, Khanin R et al. Dynamic Changes in Lung MicroRNA Profiles During the Development of Pulmonary Hypertension due to Chronic Hypoxia and Monocrotaline. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2010 April;30(4):716-U182.
【非特許文献１９】Caruso P, Dempsie Y, Stevens HC et al. A Role for miR-145 in Pulmonary Arterial Hypertension / Novelty and Significance. Circ Res 2012 July 20;111(3):290-300.
【非特許文献２０】Grant J, White K, MacLean M, Baker A. MicroRNAs in pulmonary arterial remodeling. Cell Mol Life Sci 2013;1-16.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
その最も広い形態において、本発明は、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングの阻害のための、及び関連する医学的状態、例えばPAHの治療のための、マイクロRNA96(miR-96)及びその前駆体、模倣体及びアゴニストの使用に関する。
【００１４】
理論に束縛されることを望むものではないが、5-HT1B受容体を発現する細胞においてmiR-96発現又は活性を増加させることが、特に有効であり得ると考えられている。標的細胞は、血管細胞、及び血管系に関連する細胞を含む。
【００１５】
本発明は、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法であって、
(a)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体、又は
(b)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸
を、標的細胞に送達すること、又は被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、肺高血圧症の予防又は治療方法であって、
(a)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体、又は
(b)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸
を、標的細胞に送達すること、又は被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法に使用するための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、肺高血圧症、特に肺動脈性高血圧の予防又は治療方法に使用するための、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体を提供する。
【００１９】
本発明はまた、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害するための医薬の製造における、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体の使用を提供する。
【００２０】
本発明はまた、肺高血圧症、特に肺動脈性高血圧症の予防又は治療のための医薬の製造における、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体の使用を提供する。
【００２１】
本発明はまた、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害する方法に使用するための、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸を提供する。
【００２２】
本発明はまた、肺高血圧症、特に肺動脈性高血圧症の予防又は治療方法に使用するための、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸を提供する。
【００２３】
本発明はまた、血管細胞増殖及び/又は血管リモデリングを阻害するための医薬の製造における、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸の使用を提供する。
【００２４】
本発明はまた、肺高血圧症、特に肺動脈性高血圧症の予防又は治療のための医薬の製造における、miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸の使用を提供する。
【００２５】
全ての態様において、本発明は、本質的に、標的細胞におけるmiR-96活性を増大させることを含む。
【００２６】
これは、標的細胞へのmiR-96の直接送達によって、miR-96模倣体の送達によって、又は活性なmiR-96若しくはmiR-96模倣体へ標的細胞内で処理される前駆体分子の送達によって、達成され得る。
【００２７】
あるいは、それは、活性なmiR-96若しくはmiR-96模倣体、又はいずれかの前駆体が標的細胞内で発現されるように、miR-96、その模倣体、又はいずれかの前駆体をコードする核酸を標的細胞へ送達することによって達成され得る。
【００２８】
標的細胞は、典型的には、5-HT1B受容体を発現する。標的細胞は、血管細胞、例えば、血管平滑筋細胞(VSMC)又は血管内皮細胞であってもよい。特に、それは、肺動脈平滑筋細胞(PASMC)又は肺動脈内皮細胞であってもよい。あるいは、それは、血管系に関連する細胞であってもよい。血管系に関連する細胞は、内皮、平滑筋又は外膜を含む、血管内又は血管壁中に位置する細胞である。血管系は、肺血管系であってもよい。血管系は、動脈、例えば、肺動脈であってもよい。したがって、血管系に関連する細胞は、外膜線維芽細胞及び免疫細胞、例えば、リンパ球(特にTリンパ球)、単球、マクロファージ及びマスト細胞を含む。
【００２９】
標的細胞への送達を含む方法は、in vitro、in vivo又はex vivoで行われ得る。
【００３０】
miR-96、模倣体又は前駆体は、適切な担体分子、例えば、薬学的に許容される脂質又はポリマーと結合して(例えば、それと複合体を形成して又はそれにカプセル化されて)送達され得る。
【００３１】
miR-96、模倣体又は前駆体をコードする核酸は、裸の核酸として送達され得る。あるいは、それは、適切な担体分子、例えば、薬学的に許容される脂質又はポリマーと結合して(例えば、それと複合体を形成して又はそれにカプセル化されて)送達され得る。いずれの場合においても、核酸は、典型的にはDNAである。
【００３２】
担体分子は、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤をさらに含み得る。
【００３３】
あるいは、miR-96、模倣体又は前駆体をコードする核酸は、ウイルスベクターを介して送達され得る。
【００３４】
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(特に、レンチウイルス)及びヘルペスウイルスベクターを含む、ウイルスベクターの任意の適切なタイプが使用され得る。アデノウイルス及びレンチウイルスが特に好まれ得る。それらは、活発に分裂していない細胞に送達される遺伝子(複数可)の発現を達成する能力を有するからである。
【００３５】
miR-96及びその前駆体
用語「miR-96」は、配列:
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU
からなるRNAオリゴヌクレオチドを指すために本明細書中で使用される。
【００３６】
これは、ヒト、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク、マーモセット、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ及びイヌを含む、ほとんどの哺乳動物における成熟miR-96の配列である。
【００３７】
成熟配列のヌクレオチド2〜7は、標的mRNAに結合する「シード」領域と呼ばれ、配列:
UUGGCA
を有する。
【００３８】
活性なmiR-96オリゴヌクレオチド(又は「ガイド鎖」)は、一本鎖であってもよく、又はそれは、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる第2のRNAオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされてもよい。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、「二本鎖miR-96」と呼ばれ得る、ハイブリダイズされた複合体において互いに反平行に走る。ガイド鎖は、単独で存在する場合、「一本鎖miR-96」と呼ばれ得る。
【００３９】
パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、いくつかのミスマッチを含有してよく、一方又は両方の鎖におけるすべてのヌクレオチドが他方の鎖における相補的ヌクレオチドにハイブリダイズするわけではないという結果をもたらす。したがって、二本鎖miR-96は、1つ以上のバルジ(バルジは、一方の鎖のみにおける不対ヌクレオチド、又は複数の連続した不対ヌクレオチドである)又は内部ループ(両方の鎖における向かい合った不対ヌクレオチド)を含有し得る。末端における1つ以上のヌクレオチドはまた、不対であってもよい。
【００４０】
パッセンジャー鎖は、ガイド鎖のシード配列と100％相補的であってもよい。
【００４１】
二本鎖miR-96の一方又は両方の鎖は、例えば1、2又は3ヌクレオチドの、3'オーバーハングを含んでもよい。すなわち、鎖の3'末端におけるヌクレオチドは、相補鎖(不対末端ヌクレオチドを含む)の最も5'側のヌクレオチドを超えて伸長し、したがって、相補鎖において対応するヌクレオチドを有さない。例えば、両方の鎖は、1、2又は3ヌクレオチドの3'オーバーハングを含んでもよい。あるいは、複合体は、一端又は両端において平滑末端であってもよい。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と同じ長さであるか、又は、2つの鎖の間のミスマッチの程度及びいずれかの3'オーバーハングの長さに応じて、例えば最大5ヌクレオチド又はそれ以上、長さが異なる。
【００４２】
成熟天然miR-96パッセンジャー鎖は、配列: 5'-AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG-3'を有し、以下のようにガイド鎖と対合すると考えられている:
2016540049.tif 000002
【００４３】
したがって、パッセンジャー鎖は、3'不対ヌクレオチド及び3ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。ガイド鎖は、3ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。ハイブリダイズされた複合体は、ガイド鎖における1つのバルジ及び内部ループによって隔てられた3つの相補性領域(その1つはシード配列のすべてを含む)を有する。
【００４４】
miR-96の前駆体は、pre-mir-96及びpri-mir-96、並びに成熟miR-96(一本鎖であれ又は二本鎖であれ)へ処理され得るその断片及び変異体を含む。
【００４５】
用語「pre-mir-96」は、いずれかの全長哺乳動物pre-mir-96配列からなるRNAオリゴヌクレオチド、又は、ガイド配列に完全に若しくは部分的に相補的である対応するパッセンジャー配列へとループ配列によって接続される成熟miR-96ガイド配列を含むその断片若しくは変異体を指すために使用され、ここで、オリゴヌクレオチドは、ガイド配列とパッセンジャー配列が互いにハイブリダイズする、ステム-ループ構造(又は「ヘアピン」)を形成することが可能である。
【００４６】
pre-mir-96は、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼ(RNAse III型酵素)ダイサー(Dicer)の基質として作用することが可能であり、それにより、それは成熟二本鎖miR-96へ処理される。
【００４７】
全長哺乳動物pre-mir-96配列は、ヒト配列(hsa-pre-mir-96):
2016540049.tif 000003
及びマウス配列(mmu-pre-mir-96):
2016540049.tif 000004
を含む。
【００４８】
両方の場合において、成熟配列(ガイド鎖の)には、下線が引かれている。
【００４９】
pre-mir-96は、示された配列と比較して、成熟配列の外側に1つ以上の改変を有し得る。
【００５０】
成熟配列の上流(5')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。例えば、上流の配列は、それと最適に整列された場合、5'ヒト配列とは1、2、3又は4ヌクレオチドが異なり得るか、又は、それと最適に整列された場合、5'マウス配列とは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11ヌクレオチドが異なり得る。
【００５１】
成熟配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。例えば、下流の配列は、それと最適に整列された場合、3'ヒト配列とは最大5、最大10、最大15、又は最大20ヌクレオチドが異なり得るか、又は、それと最適に整列された場合、3'マウス配列とは最大5、最大10、最大15、最大20、最大25又は最大30ヌクレオチドが異なり得る。
【００５２】
用語「pri-mir-96」は、いずれかの全長哺乳動物pri-mir-96配列からなるRNAオリゴヌクレオチド、又は、pre-mir-96配列を含み、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼ(RNAse III型酵素)ドローシャ(Drosha)によってpre-mir-96配列へ処理されることが可能であるその断片若しくは変異体を指すために使用される。
【００５３】
全長哺乳動物pri-mir-96配列は、ヒト配列(hsa-pri-mir-96):
2016540049.tif 000005
及びマウス配列(mmu-pri-mir-96):
2016540049.tif 000006
を含む。
【００５４】
ここでも、成熟配列には、下線が引かれている。
【００５５】
pri-mir-96は、示された配列と比較して、成熟配列の外側又は天然pre-mir-96配列の外側に1つ以上の改変を有し得る。
【００５６】
例えば、成熟配列の上流(5')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００５７】
pre-mir-96配列の上流(5')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００５８】
成熟配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００５９】
天然pre-mir-96配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００６０】
miR-96前駆体は、それが成熟miR-96(一本鎖であれ又は二本鎖であれ)へ処理され得る限り、任意の適切な長さであってよい。したがって、前駆体は、長さが少なくとも23ヌクレオチドであり、長さが少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも1500、又は少なくとも2000ヌクレオチドであってよい。
【００６１】
あるいは、前駆体は、長さが最大25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000又は2500ヌクレオチドであってよい。
【００６２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、いずれかの特定の長さを意味することを意図するものではなく、連結されたヌクレオチドの任意の単一の連続的な鎖を指すために単に使用されることに留意すべきである。
【００６３】
miR-96模倣体及びその前駆体
miR-96模倣体は、天然に存在するmiR-96と比較して構造又は配列において1つ以上の改変を有するが、miR-96によって調節されるmRNAにおけるmiR-96結合部位へハイブリダイズし、5-HT1B受容体の発現を阻害する能力を保持するオリゴヌクレオチドである。miR-96によって調節されるmRNAは、その翻訳が阻害されるか、又はその分解がmiR-96の結合によって促進されるもの(例えば、5-HT1B mRNA)を含む。
【００６４】
miR-96結合部位の例は、Htr1b mRNA(すなわち、5HT1B受容体をコードする遺伝子)中に見出される配列TGTGCTAGTGCCAAAである。
【００６５】
miR-96模倣体オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さが15〜25ヌクレオチドであり、例えば、長さが18〜25、20〜25、例えば20〜23、例えば20、21、22又は23ヌクレオチドである。
【００６６】
miR-96模倣体は、miR-96と比較して、塩基配列、ヌクレオチド構造、及び/又は骨格連結が異なっていてもよい。
【００６７】
miR-96模倣体は、典型的には、天然シード配列: 
UUGGCA
と同一であるシード配列を含む。
【００６８】
miR-96模倣体は、成熟天然配列:
2016540049.tif 000007
(シード配列には下線が引かれている)
を有するオリゴヌクレオチドを含んでよく、又はこれからなってよい。
【００６９】
miR-96模倣体は、シード配列の外側で成熟天然配列とは異なってよい。例えば、それは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10位で成熟天然配列とは異なっていてもよく、それらはすべてシード配列の外側に存在しなければならない。
【００７０】
miR-96模倣体は、第2のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。天然miR-96と同様に、活性オリゴヌクレオチドは、「ガイド鎖」と称され、結合したオリゴヌクレオチドは、「パッセンジャー鎖」と称され得る。ハイブリダイズされた複合体は、二本鎖miR-96模倣体と称され得る。
【００７１】
模倣体パッセンジャー鎖の配列は、天然パッセンジャー鎖の配列と同一であってよく、又は1つ以上の位置において天然パッセンジャー鎖とは異なっていてもよい。例えば、模倣体パッセンジャー鎖の配列は、天然パッセンジャー鎖の配列とは、10個以下の位置、9個以下の位置、8個以下の位置、7個以下の位置、6個以下の位置、5個以下の位置、4個以下の位置、3個以下の位置、2個以下の位置、又は1個以下の位置において異なっていてもよい。好ましくは、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖のシード配列と100％相補的であり、模倣体配列と天然配列の間の配列の違いは、シード配列と相補的な領域の外側に生じる。
【００７２】
二本鎖miR-96模倣体の一方又は両方の鎖は、例えば1、2又は3ヌクレオチドの、3'オーバーハングを含み得る。例えば、両方の鎖は、3ヌクレオチドの3'オーバーハングを含み得る。あるいは、複合体は、一端又は両端で平滑末端であってもよい。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、1つ以上のミスマッチを含有してもよい。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と同じ長さであるか、又は最大5ヌクレオチド長さが異なる。
【００７３】
miR-96模倣体の前駆体は、典型的には酵素ダイサー(Dicer)の作用により又は酵素ドローシャ(Drosha)及びダイサー(Dicer)の連続作用により、miR-96模倣体へ標的細胞内で処理され得る任意の分子である。
【００７４】
したがって、前駆体は、模倣体配列の上流(5')及び/又は下流(3')の追加のオリゴヌクレオチド配列を有し得る。
【００７５】
前駆体は、ガイド配列に完全に若しくは部分的に相補的である対応するパッセンジャー配列へとループ配列によって接続されるmiR-96模倣体ガイド配列を含んでよく、ここで、オリゴヌクレオチドは、ガイド配列とパッセンジャー配列が互いにハイブリダイズする、ステム-ループ構造(又は「ヘアピン」)を形成することが可能である。そのようなオリゴヌクレオチドは、pre-mir-96模倣体とみなされてよく、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼ(RNAse III型酵素)ダイサー(Dicer)の基質として作用することが可能であり、それによって、それは別々のガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖miR-96模倣体へ処理される。
【００７６】
成熟配列の上流(5')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００７７】
成熟配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００７８】
あるいは、前駆体は、pri-mir-96模倣体であってよく(すなわち、それは、pre-mir-96模倣体配列の上流(5')及び/又は下流(3')の追加のオリゴヌクレオチド配列を有し)、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼ(RNAse III型酵素)ドローシャ(Drosha)によってpre-mir-96模倣体配列へ処理されることが可能であってよい。
【００７９】
例えば、成熟miR-96模倣体配列の上流(5')の配列は、対応する天然ヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００８０】
pre-mir-96模倣体配列の上流(5')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００８１】
成熟miR-96模倣体配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００８２】
pre-mir-96模倣体配列の下流(3')の配列は、対応するヒト又はマウス配列と、例えば、少なくとも50％の同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
【００８３】
miR-96模倣体前駆体は、それが成熟miR-96模倣体(一本鎖であれ又は二本鎖であれ)へ処理され得る限り、任意の適切な長さであってよい。したがって、前駆体は、長さが少なくとも23ヌクレオチドであり、長さが少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも1500、又は少なくとも2000ヌクレオチドであってよい。
【００８４】
あるいは、前駆体は、長さが最大25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000又は2500ヌクレオチドであってよい。
【００８５】
構造的修飾
上で論じた配列改変に加えて又は代替として、miR-96模倣体又はその前駆体は、RNAオリゴヌクレオチドと比較して1つ以上の構造的修飾を含み得る。
【００８６】
miR-96模倣体又は前駆体は、修飾糖残基、すなわち、リボース残基以外の糖残基、を含む1つ以上のヌクレオチドを含み得る。
【００８７】
修飾糖残基は、炭素環式又は非環式の糖、それらの2'、3'又は4'位の1つ以上に置換基を有する糖、及び糖の1つ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖を含む。
【００８８】
好適な修飾された糖は、OH; F; O-、S-、若しくはN-アルキル; O-、S-、若しくはN-アルケニル; O-、S-若しくはN-アルキニル;又はO-アルキル-O-アルキルから選択される糖置換基を有していてもよい。アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル、又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルであってよい。いくつかの実施形態では、これらの基は、O(CH2)xOCH3、O((CH2)xO)yCH3、O(CH2)xNH2、O(CH2)xCH3、O(CH2)xONH2、及びO(CH2)xON((CH2)xCH3)2から選択されてよく、ここで、x及びyは1〜10である。
【００８９】
糖置換基は、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、CI、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ及び置換シリルを含み得る。
【００９０】
他の置換基は、2'-メトキシエトキシ及び2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ、アリル(-CH2-CH=CH2)、-O-アリル(-O-CH2-CH=CH2)、メトキシ(-O-CH3)、アミノプロポキシ(-OCH2CH2CH2NH2)、及びフルオロ(F)を含む。
【００９１】
2'位(2'-)の糖置換基は、アラビノ(上)位置又はリボ(下)位置にあってもよい。1つの2'-アラビノ修飾は、2'-Fである。他の同様の修飾はまた、オリゴマー化合物の他の位置で、特に3'末端ヌクレオシド上の若しくは2'-5'結合オリゴヌクレオチドにおける糖の3'位、及び5'末端ヌクレオチドの5'位で行われてもよい。
【００９２】
修飾糖残基の例は、2'-O-メチルリボース、2'-O-メトキシエチルリボース、2'-フルオロ-リボース及び4-チオ-リボースを含む。
【００９３】
二環式糖はまた使用されてよく、典型的には、C3'エンドコンフィギュレーションに環を制約する2'、4'架橋(例えばメチレン架橋)を有するフラノシル環を含んでもよい。二環式糖を含有するヌクレオチドは、多くの場合、ロックド核酸(「LNA」)残基と称される。
【００９４】
miR-96模倣体又は前駆体は、独立して、修飾糖残基のこれらのタイプのいずれか又はすべての1つ以上を含有し得る。
【００９５】
追加的又は代替的に、miR-96模倣体又は前駆体は、1つ以上の骨格修飾、例えば、修飾されたヌクレオシド間結合を含み得る。
【００９６】
したがって、1つ以上の隣接するヌクレオチドは、リン酸部分の代わりに代替の結合部分を介して結合されてもよい。
【００９７】
修飾されたヌクレオシド間結合が、miR-96模倣体の一端又は両端に、すなわち、5'末端ヌクレオチドと、隣接するヌクレオチドとの間、及び/又は3'末端ヌクレオチドと、隣接するヌクレオチドとの間に存在することは特に望ましい。
【００９８】
ヌクレオシド間結合として使用するのに適した部分は、ホスホロチオエート、モルホリノ及びホスホノカルボキシレート部分、並びにシロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート及びスルホンアミド部分を含む。
【００９９】
ホスホロチオエート部分では、非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換される。ホスホロチオエート基は、血清タンパク質結合を促進し得、したがって、模倣体のin vivo分布及び生物学的利用能を改善し得る。模倣体がレシピエントに全身的に投与される場合、これは望ましいかもしれない。
【０１００】
追加的又は代替的に、miR-96模倣体又は前駆体は、天然に存在するアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの代替として1つ以上の修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ(5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシンを含む)、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンを含む。
【０１０１】
miR-96、模倣体及び前駆体の送達
miR-96、模倣体及び前駆体が、適切な担体と結合している(例えば、それと複合体を形成している、又はそれにカプセル化されている、又はそれと共有結合している)組成物が提供され得る。
【０１０２】
適切な担体は、薬学的に許容される脂質及びポリマー、並びにそれらの組み合わせを含む。例えば、組成物は、リポソーム、脂質小胞、脂質複合体又はポリマー複合体の形態を有していてもよい。
【０１０３】
例えば、脂質小胞及びリポソームは、オリゴヌクレオチドカーゴを含有する水性コアを有する脂質二重層粒子である。
【０１０４】
脂質複合体(又は「リポプレックス」)及びポリマー複合体(「ポリプレックス」)は、典型的には、複合体を形成するために、負に荷電したオリゴヌクレオチドと相互作用する正に荷電した脂質又はポリマーを含有する。
【０１０５】
カチオン性ポリマー又は脂質はまた、標的細胞の表面で負に荷電した分子と相互作用し得る。脂質及び頭部基の適切な選択によって、複合体は、適切な細胞内コンパートメントへのオリゴヌクレオチドカーゴの送達を促進するために、標的細胞の原形質膜との又は選択された内部の膜(例えば、エンドソーム膜又は核膜)との融合を促進するように調整され得る。リポプレックス及びポリプレックスによる遺伝子送達は、例えば、Tros de Ilarduya et al. in Eur. J. Pharm. Sci. 40 (2010) 159-170によって概説される。
【０１０６】
中性脂質エマルジョンはまた、ナノメートルのオーダーの直径を有する、miRNAを有する粒子状複合体を形成するために使用され得る。
【０１０７】
適切な脂質は、適用、カーゴ及び標的細胞に応じて、当業者によって選択され得る。単一の脂質、より一般的に、脂質の組み合わせを用いてもよい。
【０１０８】
適切な脂質は、例えば、WO2011/088309及びそこに引用されている参考文献に記載され、以下を含む:
-中性脂質及びリン脂質、例えば、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン(PC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン(SM)、カルジオリピン、ホスホスファチジン酸(phosphosphatidic acid)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、ジパルミトロエオイル-PE(dipalmitoloeoyl-PE)、ジフィタノイル-PE(diphytanoyl-PE)、DSPE、ジエライドイル-PE、ジリノレオイル-SM(dilinoleoyl-SM)、及びジリノレオイル-PE(dilinoleoyl-PE);
-ステロール、例えば、コレステロール
-ポリマー修飾脂質、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質、例えば、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、PEG-セラミドコンジュゲート、PEG修飾ジアルキルアミン及びPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン(diacyloxypropan)-3-アミン。特に好適なのは、PEG修飾ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロール、例えば、PEG-ジジミリストイル(didimyristoyl)グリセロール(PEG-DMG)、PEG-ジスチリルグリセロール(PEG-DSG)及びPEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(dimyristyloxypropylamine)(PEG-cDMA)である;
-カチオン性脂質、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」); N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N-N-トリエチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」); N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(dimethylammoniumbromide)(「DDAB」); N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTAP」); 1,2-ジオレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩(「DOTAP.Cl」); 3β-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N-2-(スペルミンカルボキサミド)エチル)-N,N-ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸(「DOSPA」)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine)(「DOGS」)、1,2-ジレオイル(dileoyl)-sn-3-ホスホエタノールアミン(「DOPE」)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(「DODAP」)、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン(「DODMA」)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ(dimyristyloxyprop)-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(「DMRIE」)、1,2-ジリノレイルオキシ(dilinoleyloxy)-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレオイル(Dilinoleoyl)-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1-リノレオイル-2-リノエイルオキシ(linoeyloxy)-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-2-DMAP)、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ(Dilinoleylcarbamoyloxy)-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-C-DAP)、1,2-ジリノレイルチオ(Dilinoleylthio)-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-S-DMA)、及び2,2-ジリノレイル-4-10 ジメチルアミノメチル(dimethylaminomethyl)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)。カチオン性脂質の市販調製物としては、リポフェクチン(Lipofectin)(商標)(Gibco/BRLから入手可能なDOTMA及びDOPEを含む)、及びリポフェクタミン(Lipofectamine)(商標)(Gibco/BRLから入手可能なDOSPA及びDOPEを含む)が挙げられる。
-アニオン性脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanoloamine)、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン及びリシルホスファチジルグリセロール。
【０１０９】
W0/0071096は、様々な製剤、例えばオリゴヌクレオチド送達のために効果的に使用することができるDOTAP:コレステロール又はコレステロール誘導体製剤を記載する。
【０１１０】
肺へのmiRNAの良好な送達を達成することが可能な市販の組成物は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、スクアレン油、ポリソルベート20及び抗酸化剤からなる中性脂質エマルジョンMaxSuppressor in vivo RNALancerII(BIOO Scientific, Austin, TX)である。合成miRNAとの複合体において、それは、ナノメートル直径範囲のナノ粒子を形成する。
【０１１１】
適切なポリマーとしては、ヒストン及びプロタミン(及び他のDNA結合タンパク質)、ポリ(エチレンイミン)(PEI)、カチオン性デンドリマー、例えばポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー、2-ジメチル(アミノエチル)メタクリレート(pDMAEM)、ポリ(L-リジン)(PLL)、炭水化物系ポリマー、例えばキトサン等が挙げられる。概説についてTros de Ilarduya et al. in Eur. J. Pharm. Sci. 40 (2010) 159-17を参照のこと。アテロコラーゲンなどのタンパク質及びペプチドを使用してよい。アテロコラーゲンは、子牛真皮からプロテアーゼ処理によって生成されたコラーゲン、特にペプシン処理したI型コラーゲンの水溶性形態である。
【０１１２】
シクロデキストリンはまた、送達のために有用であり得る。
【０１１３】
追加的又は代替的に、miR-96模倣体又は前駆体は、標的細胞の原形質膜を横断する輸送を促進するために、膜輸送部分を含み得る。この部分は、コレステロール及びステアロイル部分を含むがこれらに限定されない、適切な脂質又は他の脂肪性部分であってよい。他の膜輸送部分としては、細胞透過性ペプチド(「CPP」、例えば、HIV-1に由来するTAT及びMPG、ペネトラチン、ポリアルギニン)、及び融合性ペプチド(例えば、HIV-1エンベロープ(HGP)のエンドドメイン誘導体又はインフルエンザ融合性ペプチド(diINF-7))が挙げられる。膜輸送部分は、miR-96模倣体又はその前駆体自体と非共有結合的に結合している担体分子にコンジュゲートされてよい。あるいは、膜輸送部分は、miR-96模倣体又は前駆体自体にコンジュゲートされてよい。該部分は、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖のいずれかにコンジュゲートされてもよいが、ガイド鎖の機能を損なわないように、パッセンジャー鎖が好ましい。5'又は3'末端のいずれかでのコンジュゲーションが好ましいが、内部残基へのコンジュゲーションも可能である。
【０１１４】
誤解を避けるために、miR-96分子(すなわち、他の点では天然分子との構造又は配列の相違を有しない)は、膜輸送部分に結合した場合、miR-96模倣体又は前駆体と見なされ得る。
【０１１５】
標的細胞
miR-96活性が増加される標的細胞は、典型的には、血管細胞、又は血管系に関連する細胞である。
【０１１６】
血管系に関連する細胞は、内皮、平滑筋又は外膜を含む、血管内、又は血管壁中に位置する細胞である。
【０１１７】
典型的には、血管系は、肺血管系、特に肺動脈である。
【０１１８】
したがって、血管平滑筋細胞及び血管内皮細胞、特に肺血管平滑筋細胞及び肺血管内皮細胞、特に肺動脈平滑筋細胞及び肺動脈内皮細胞は、標的細胞である。
【０１１９】
発現は、高血圧条件下で、又は高血圧の発症につながる条件下で、モジュレートされ得る、例えば増加され得るが、標的細胞は、典型的には、5-HT1B受容体を構成的に発現する。
【０１２０】
5HT1B受容体は、Tリンパ球及び単核球、例えば、単球及びマクロファージ(22〜24)を含む、免疫応答及び炎症において役割を果たす多くの細胞で発現される。Tリンパ球及び炎症細胞を含む機能不全の免疫系は、PAHの病因に寄与する(25、26)。加えて、セロトニンは、5-HT1B受容体を介して線維芽細胞におけるDNA合成を刺激し、これはPAHのモデルにおける線維芽細胞の増殖に関連している(27、28)。
【０１２１】
したがって、5-HT1B受容体を発現する外膜線維芽細胞及び免疫細胞はまた、Tリンパ球、単球、マクロファージ及びマスト細胞を含む、標的細胞を表す。
【０１２２】
標的化剤
担体分子はまた、標的細胞の表面に結合することが可能な標的化剤を担持し得る。例えば、標的化剤は、標的細胞、例えば、血管平滑筋細胞(例えば、肺動脈平滑筋細胞)、血管内皮細胞(例えば、肺動脈内皮細胞)、外膜線維芽細胞、又は免疫細胞(例えば、Tリンパ球、単球、マクロファージ又はマスト細胞)、の表面で発現される分子に特異的に結合することが可能な、特異的結合パートナーであってもよい。好適な結合パートナーとしては、細胞表面分子に対する抗体等、又はこれらの細胞型のおけるこのような細胞表面分子に対するリガンド若しくは受容体が挙げられる。細胞表面分子は、関連する細胞型に特異的なマーカーであってよい。あるいは、標的化剤は、具体的には5-HT1B受容体自体に対する結合パートナーであってもよい。
【０１２３】
用語「特異的結合対」は、互いに特定の特異性を有する、及び通常の条件において他の分子への結合に優先して互いに結合する、特異的結合メンバー(sbm)及びその結合パートナー(bp)を含む分子の対を記載するために使用される。特異的結合対の例としては、抗体及びそれらの同種(cognate)エピトープ/抗原、リガンド(例えば、ホルモン等)及び受容体、アビジン/ストレプトアビジン及びビオチン、レクチン及び炭水化物、並びに相補的ヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１２４】
全抗体の断片が結合抗原の機能を果たし得ることは周知である。機能的結合断片の例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなるFab断片、(ii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片、(iii)単一抗体のVL及びVHドメインからなるFv断片、(iv)VHドメインからなるdAb断片(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989))、(v)単離されたCDR領域、(vi)F(ab')2断片、2つの連結されたFab断片を含む二価断片、(vii)VHドメイン及びVLドメインが、2つのドメインを抗原結合部位を形成するように結合させるペプチドリンカーによって連結されている、単鎖Fv分子(scFv)(Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)、(viii)二重特異性単鎖Fv二量体(PCT/US92/09965)、及び(ix)「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築された多価又は多特異性断片(WO94/13804; P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)である。
【０１２５】
抗体はいくつかの方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、したがって、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合物質に及ぶと解釈されるべきである。したがって、この用語は、上述の抗体断片、並びに抗体の誘導体、機能的等価物及びホモログに及び、天然であれ又は合成であれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、又は等価物は、含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023に記載される。
【０１２６】
抗体の代替が、ますます利用可能になっている。いわゆる「アフィニティータンパク質」又は「操作されたタンパク質足場」は、特定の標的に対するアフィニティーについて日常的に調整され得る。それらは、典型的には、標的に対するアフィニティーを有するように改変されている立体構造的に安定な又は固定されたコアを有する非免疫グロブリン足場タンパク質に基づく。改変は、足場タンパク質の表面における1つ以上の表面残基の置換及び/又は1つ以上の残基の挿入を含み得る。例えば、標的に対するアフィニティーを有するペプチドは、足場タンパク質の表面ループに挿入されてよく、又は足場タンパク質の表面ループの一部若しくは全てを置換してもよい。好適な足場及びそれらの操作された等価物としては以下が挙げられる:
-BPTI、LAC-DI、ITI-D2(クニッツ(Kunitz)ドメイン足場);
-ETI-II、AGRP(ノッティン(Knottin));
-チオレドキシン(ペプチドアプタマー);
-Fn3(アドネクチン(AdNectin));
-リポカリン(BBP)(アンチカリン(Anticalin));
-アンキリンリピート(DARPin);
-プロテインAのZドメイン(アフィボディ(Affibody));
-ガンマ-B-クリスタリン/ユビキチン(アフィリン(Affilin));
-LDLR-A-ドメイン(アビマー(Avimer))。
【０１２７】
例えば、Gebauer, M and Skerra, A, Current Op. Chem. Biol. 2009, 13: 245-255、及びFriedman, M and Stahl, S, Biotechnol. Appl. Biochem. (2009) 53: 1-29、並びにそれらにおける引用文献を参照のこと。
【０１２８】
miR-96、模倣体及び前駆体をコードする核酸
miR-96オリゴヌクレオチド、模倣体及び前駆体を標的細胞へ直接的に送達する代わりに、miR-96オリゴヌクレオチド、その模倣体、又はいずれかの前駆体をコードする核酸を、miR-96オリゴヌクレオチド、模倣体又は前駆体が標的細胞内で発現されるように、標的細胞に送達することが可能である。このようなアプローチは、「遺伝子治療」とみなされ得る。
【０１２９】
RNAからなる、すなわち、修飾された塩基、糖若しくはヌクレオシド間結合なしで、RNAの4つの天然に存在するヌクレオチドからなる、miR-96、その模倣体及び前駆体をコードするためにのみ、核酸を使用できることは、当業者には容易に明らかである。
【０１３０】
核酸は、典型的には、発現を促進するための適切な調節配列と作動可能に連結された、miR-96オリゴヌクレオチド、模倣体又は前駆体をコードする核酸配列を含む、発現構築物を含む。調節配列は、標的細胞に応じて選択され得るが、典型的には、適切なプロモーター、及び場合によりRNAポリメラーゼIIによる転写を指示するエンハンサー、並びに転写ターミネーター(通常はポリアデニル化シグナルを含む)を含む。
【０１３１】
プロモーターは、他の細胞又は組織型と比較して、標的細胞又は組織において優先的に又はそれらにおいてのみ転写を駆動する組織特異的プロモーターであってもよい。
【０１３２】
例えば、プロモーターは、血管細胞において、又は本明細書の他の箇所で定義されるように血管系に関連する細胞において優先的に又はそれらにおいてのみ転写を駆動するプロモーターであってもよい。したがって、プロモーターは、肺血管細胞において、例えば、血管平滑筋細胞において及び/又は血管上皮細胞(肺動脈平滑筋細胞及び上皮細胞を含む)、外膜線維芽細胞、又は免疫細胞、例えば、Tリンパ球、マスト細胞、単球及びマクロファージにおいて優先的に又はそれらにおいてのみ活性であってもよい。
【０１３３】
標的細胞への核酸の送達
miR-96、模倣体及び前駆体をコードする核酸は、任意の好都合な経路によって送達され得る。
【０１３４】
in vitroにおける細胞への核酸の送達方法としては、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、DNA負荷リポソーム、超音波処理、及び核酸でコーティングされたマイクロプロジェクタイル(microprojectile)(例えば、金又はタングステンマイクロビーズ)を用いたボンバードメントが挙げられる。これらの技術の様々なものが、in vivo又はex vivoにおける使用にうまく適合されている。
【０１３５】
したがって、核酸は、裸の形態で投与されてよく、ポリマー若しくは脂質などの適切な担体(本明細書の他の箇所に記載されるように)と結合して(例えば、それと複合体を形成して若しくはそれにカプセル化されて)いてもよく、又は粒子表面上にコーティングされてもよい。このような実施形態では、核酸は、典型的にはDNAである。これらの方法のいずれも、miR96、前駆体及び模倣体自身の送達に適切に適合され得る。
【０１３６】
核酸は、典型的には、発現ベクターの形態をとる。当業者は、治療的使用のために(同様に本明細書に記載の他の用途のために)適切な核酸発現ベクターを設計することが可能である。ベクターは、典型的には、適切な調節配列、例えばプロモーター配列及び転写終結配列と作動可能に結合して、場合により特定の適用に応じてエンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列と組み合わされて、miR-96、模倣体又は前駆体をコードする核酸配列を含む発現構築物を含有する。ベクターは、宿主細胞の染色体に統合することが意図されてよく、又はエピソーム、例えばプラスミドとして宿主染色体とは独立に存在し及び複製してもよい。
【０１３７】
あるいは、ウイルスベクターは、核酸を送達するために使用され得る。
【０１３８】
ウイルスベクターの任意の適切なタイプは、遺伝子送達ビヒクルとして使用され得る。これらとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(特に、レンチウイルス)及びヘルペスウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルス及びレンチウイルスが特に好ましいかもしれない。それらは、活発に分裂していない細胞に送達される遺伝子(複数可)の発現を達成する能力を有するからである。
【０１３９】
ウイルスベクターは、典型的には、ウイルス構造タンパク質と、標的細胞若しくは組織において遺伝子を発現するために機能的な形態で所望の発現構築物を含む核酸ペイロードとを含む。したがって、遺伝子は、典型的には、プロモーター及び他の適切な転写調節シグナルに作動可能に連結される。
【０１４０】
アデノウイルスベクターでは、核酸ペイロードは、典型的には、二本鎖DNA(dsDNA)分子である。レトロウイルスベクターでは、それは、典型的には、一本鎖RNAである。
【０１４１】
核酸ペイロードは、典型的には、それが、遺伝子送達ビヒクル中にパッケージされ、標的細胞若しくは組織において適切に処理されるのに必要なさらなる要素を含有する。
【０１４２】
アデノウイルスベクターの場合、これらは、アデノウイルス逆方向末端反復(ITR)配列及び適切なパッケージングシグナルを含み得る。
【０１４３】
レトロウイルスベクターの場合、これらは、特徴的末端配列(いわゆる「R-U5」及び「U3-R」配列)及びパッケージングシグナルを含む。末端配列は、逆転写から生じるプロウイルスのいずれかの末端において直接反復配列(「長い末端反復」又は「LTR」)の生成を可能にし、これは次いで、宿主細胞ゲノムへのプロウイルスの組み込みを促進し、続く発現を指令する。
【０１４４】
核酸ペイロードはまた、選択可能マーカー、すなわち、形質導入された細胞の容易な検出を可能にする産物をコードする遺伝子を含有し得る。例としては、蛍光タンパク質(例えば、GFP)、目に見える反応生成物を生成する酵素(例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ)に対する遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子がある。
【０１４５】
ウイルスベクターは、典型的には、複製コンピテント(replication-competent)ではない。つまり、核酸ペイロードは、ウイルス複製に必要なウイルス遺伝子(及び他の遺伝的要素)のすべてを含有しているわけではない。ウイルスベクターは、それにもかかわらず、構造タンパク質のすべて、並びにコードされたmiR-96、模倣体又は前駆体が発現され得るように、宿主細胞へのペイロードの導入に及びペイロードの適切な処理に必要な酵素活性を含有する。これらが核酸ペイロードによってコードされていない場合、それらは、典型的には、パッケージング細胞株によって供給される。当業者は、適切なウイルス送達ビヒクルを生成するために使用できる適切な細胞株をよく知っている。
【０１４６】
したがって、アデノウイルスベクターの場合、核酸ペイロードは、典型的には、E1、E2、E3又はE4領域からの1つ以上の機能的アデノウイルス遺伝子を欠く。これらの遺伝子は、例えば異種遺伝子又は選択マーカーを含む転写ユニットの挿入によって、欠失され又は他の方法で不活性化されてよい。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、核酸は、機能的ウイルス遺伝子を含有しない。したがって、アデノウイルスベクターの場合、存在する唯一のウイルス成分は、ITR及びパッケージングシグナルであってもよい。
【０１４８】
機能的ウイルス遺伝子を持たない核酸は、好ましいかもしれない。これらは、ウイルスタンパク質合成の結果として、形質導入された標的細胞又は組織に対して生じる宿主免疫応答の危険性を低減するからである。
【０１４９】
治療のための被験体
本発明の方法は、肺動脈性高血圧症(PAH)の治療又は予防のために使用され得る。予防的使用は、疾患の完全な予防を必ずしも意味するものではないが、疾患の発症を遅延させること、及び/又は発症時であれ若しくはその後であれ、症状の重症度を低減することを包含する。したがって、被験体は、PAHに罹患し得るか、又はPAHを発症するリスクがあり得る。
【０１５０】
肺動脈性高血圧症は、肺への及び肺内の血管の血管収縮を含む。それは、右心室不全につながる、重度の肺動脈リモデリング及び閉塞性肺血管病変によって特徴付けられる。それは、全身性エリテマトーデス(SLE)を有する患者における死亡率の重要な原因である。したがって、本発明は、SLE患者における、及びSLEによって影響を受けない患者における、PAHの予防又は治療の方法を包含する。
【０１５１】
PAHは、特発性PAH及び遺伝性PAH(家族性PAHとしても知られている)を含む。したがって、被験体は、PAHを発症しやすくさせる突然変異を有し得る。例えば、これは、BMPR2遺伝子(骨形成タンパク質経路のII型受容体)の突然変異であってもよい。このような突然変異は、早期終止コドンを導入するR899X及びN903Sを含む。他の素因となる突然変異は、KCNK3遺伝子(カリウムチャンネルサブファミリーK、メンバー3)における機能喪失突然変異を含む。
【０１５２】
被験体は、PAHに対する遺伝的素因について以前に試験されていてもよい。本発明はまた、被験体のゲノムにおいてPAHに対する遺伝的素因の存在又は非存在を決定し、そのような素因が同定された場合に、被験体に:
(a)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体、又は
(b)miR-96、その模倣体、若しくはいずれかの前駆体をコードする核酸
を処方又は投与することを含む、PAHの予防又は治療の方法を提供する。
【０１５３】
被験体は、特発性PAHを発症していてもよく、又は特発性PAHを発症するリスクがあってもよい。既知の危険因子は、女性の性別、及びフェンフルラミン/フェンテルミン(「フェンフェン」(fen-phen))などの食欲抑制薬の服用歴を含む。
【０１５４】
本発明は、女性被験体の治療に特に適用可能であり得るが、男性被験体の治療も有益であり得、本発明の範囲内に包含される。
【０１５５】
治療のための最も一般的な被験体はヒトであるが、本発明の方法は、任意の他の哺乳動物、例えば、他の霊長類(特に、例えば、ゴリラ、チンパンジー及びオランウータンなどの類人猿であるが、旧世界及び新世界サルも)、及びげっ歯類(マウス及びラットを含む)、並びに他の一般的実験室、家庭用及び農業用動物(例えば、限定されないが、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等)に広がり得る。
【０１５６】
医薬組成物及び治療方法
本明細書に記載された分子は、医薬組成物において製剤化され得る。これらの組成物は、上記の物質の1つに加えて、薬学的に許容される添加物、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効能を妨害すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内及び腹腔内経路に依存し得る。適切な組成物及び投与の方法の例は、Esseku and Adeyeye(2011)及びVan den Mooter G. (2006)に提供される。
【０１５７】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体、又はアジュバントを含み得る。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば、水、石油、動物若しくは植物油、鉱油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖溶液又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールが含まれ得る。
【０１５８】
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は苦痛の部位での注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まない且つ好適なpH、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を使用して、適切な溶液を調製することが十分可能である。必要に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤が含まれてもよい。
【０１５９】
個体に与えられる活性薬剤の性質がどうであれ(例えば、本発明に係る、細胞、ポリペプチド、核酸分子、他の薬学的に有用な薬剤)、投与は、「予防上有効量」又は「治療上有効量」であることが好ましく(場合により、予防は治療とみなされ得るが)、これは、個体に恩恵を示すのに十分である。実際の投与量、並びに投与の速度及びタイムコースは、治療されるものの性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量等の決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。上記の技術及びプロトコールの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsに見出すことができる。
【０１６０】
本発明は、添付の図面及び実施例を参照して、限定ではなく例として、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１−１】PASMCにおける性別にわたるマイクロRNAの異なった発現。雌性及び雄性WT及びBMPR2R899X+/-PASMCにおける定量的PCRによるマイクロRNA発現の解析は、性別が発現プロファイルに影響を与え得ることを示す。結果は、U6に対して正規化され、雌性WT値の倍数変化として表される。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.05*、p<0.01**(雌性対雄性)及びp<0.05+、p<0.01++、P<0.001+++(WT対BMPR2R899X+/-)。
【図１−２】PASMCにおける性別にわたるマイクロRNAの異なった発現。雌性及び雄性WT及びBMPR2R899X+/-PASMCにおける定量的PCRによるマイクロRNA発現の解析は、性別が発現プロファイルに影響を与え得ることを示す。結果は、U6に対して正規化され、雌性WT値の倍数変化として表される。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.05*、p<0.01**(雌性対雄性)及びp<0.05+、p<0.01++、P<0.001+++(WT対BMPR2R899X+/-)。
【図２】肺において最も高いmiR-96の発現。マウス組織における定量的PCRによるmiR-96発現のグローバル解析は、レベルが肺で有意に高いことを示す。(RV、右心室)。結果は、U6に対して正規化され、肺の値の倍数変化として表される。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.01**及びP<0.001***。
【図３】miR-96の標的としての5-HT1B受容体の検証。(A)及び(B)25nMの濃度におけるpre-miR-96は、ルシフェラーゼ活性を低下させるが、モックコントロールベクターに影響を与えない。(C)pre-miR-96トランスフェクションは、コントロール及びスクランブルmiRと比較して、成熟miR-96レベルを増加させる。結果は、U6に対して正規化され、コントロール値の倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.05*及びP<0.01**。
【図４】雌性BMPR2R899X+/-PASMCにおける標的5-HT1Bの増加した発現。WT及びBMPR2R899X+/-マウスからの雌性及び雄性PASMCにおける5-HT1B(A)タンパク質及び(B)mRNA発現の解析。雌性BMPR2R899X+/-PASMCは、雌性WTと比較して、増加した5-HT1Bタンパク質及びmRNA発現を示す。マウスPASMCにおける5-HT1Bタンパク質発現の代表的な免疫ブロット(C)。結果は、それぞれ、α-チューブリン及びGAPDHに対して正規化され、倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.05*、p<0.01**(雌性対雄性)、及びp<0.05+、p<0.01++、p<0.001+++(WT対+/-)。
【図５】BMP4刺激は、欠損雌性BMPR2R899X+/-PASMCにおけるmiR-96発現を救う(rescue)。雌性BMPR2R899X+/-マウスからのマウスPASMCは、1nM BMP4で刺激すると、miR-96レベルの一時的な増加を示す。結果は、U6に対して正規化され、倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。
【図６】SMAD1の欠損は、BMPR2R899X+/-と同様のmiR-96発現プロファイルを示す。損なわれたSMAD1発現(+/-)を有する雌性マウスに由来するマウスPASMCは、雌性WTマウスと比較して、miR-96発現における低減を示す(A)。肺組織全体では、雌性SMAD1+/-マウス対雌性WTにおいてmiR-96レベルにおける減少についての傾向があるが、雄性間では変化はない(B)。結果は、U6に対して正規化され、倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.01**。
【図７】miR-96及び5-HT1B発現に対するヒトPAHの影響。女性患者PASMCは、非PAHコントロールと比較して、mir-96発現の低減を有する(A)。5-HT1B受容体発現は、非PAHコントロールと比較して、女性患者PASMCにおいて増加し(B)、miR-96の低発現及び5-HT1Bの高発現が、BMPR2突然変異を有するHPAH患者内に見出される。結果は、RNU48に対して正規化され、女性コントロール値の倍数変化として表された。データは、平均値として表される。R899X、N903S: BMPR2突然変異。HPAH: 遺伝性PAH。IPAH: 特発性PAH。
【図８】エストロゲンの枯渇は、雌性マウスにおいてのみmiR-96発現を増加させ、標的5-HT1Bを減少させる。アロマターゼ阻害剤であるアナストロゾール(anastrazole)で処置された雌性マウスは、ビヒクルコントロールと比較して、miR-96(A)の増加した発現及び5-HT1B(B)の減少した発現を有し、一方、雄性マウスは、miR-96(C)又は5-HT1B(D)のいずれかの発現において変化を示さない。結果は、U6に対して正規化され、コントロール値の倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。P<0.05*及びP<0.01**。
【図９】miR-96の調節におけるエストロゲンの役割。1nMエストロゲン(E2)で72時間刺激されたヒトPASMCは、miR-96発現における低減(p=0.0512)(A)、及び5-HT1B受容体発現(B)における増加についての対応する傾向を示す。結果は、RNU48に対して正規化され、コントロール値の倍数変化として表された。データは、平均値±SEMとして表される。
【図１０】mir-96模倣体は、マウスにおける低酸素誘導性肺高血圧症(PH)を予防する。1.5mg/kgのmir-96模倣体を、2週間、週に一度、静脈内投与し、この期間の間、マウスを低酸素に曝した。miR-96模倣体は、右心室収縮期圧(A)、右心室肥大(B)及び肺血管リモデリング(C)における上昇を防止する。*P<0.05、**P<0.01、**P<0.001、****P<0.0001。一元配置分散分析(1-way ANOVA)に続く、Tukeyの事後検定。
【図１１】mir-96模倣体は、BMPR2突然変異(BMPR2R899X+/-)を有するマウスにおいて肺高血圧症(PH)を回復させる(reverse)。1.5mg/kgのmir-96模倣体を、2週間、週に一度、静脈内投与し、その後、マウスをPHの発症について評価した。miR-96模倣体は、右心室収縮期圧(A)、右心室肥大(B)及び肺血管リモデリング(C)における上昇を防止する。*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001。一元配置分散分析(1-way ANOVA)に続く、Tukeyの事後検定。
【発明を実施するための形態】
【０１６２】
研究は、マイクロRNA(miR)が、肺動脈性高血圧症(PAH)の病理生物学において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１６３】
遺伝性PAH(hPAH)は、骨形成タンパク質受容体2(BMPR2)についての遺伝子における突然変異と関連する。本発明者らは、PAH患者にも見られる突然変異を担持するPAHのBMPR2マウスモデル、BMPR2R899X+/-マウスを研究している。
【０１６４】
このモデルでは、性別は、肺動脈平滑筋細胞(PASMC)内のmiRの基礎発現の主要な根底にある調節因子として出現する。Mir-96は、雌性BMPR2R899X+/-マウスに由来するPASMCにおいて、雌性野生型(WT)と比較して下方調節された一方で、雄性トランスジェニックとそれらのWTコントロールの間で発現は変化しなかった。グローバル発現解析は、肺内で最高のmiR-96発現を示した。5-HT1B受容体についての標的遺伝子は、mRNA及びタンパク質レベルの両方で、雌性BMPR2R899X+/-PASMC内のmiR-96の発現と逆相関した。5HT1B遺伝子は、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってmiR-96の標的として確認された。
【０１６５】
本発明者らはまた、BMPR2突然変異を有する女性PAH患者に由来するPASMCが、低いmiR-96及び高い5HT1B発現を示すことを確認した。
【０１６６】
これらの結果は、エストロゲンなどの性ホルモンが、miR-96を調節する役割を果たし得ることを示唆する。これと一致し、本発明者らは、in vivoで内因性エストロゲンの合成を阻害することが、雌性マウスのみにおいて肺のmiR-96を増加させ、5-HT1B発現を減少させることを示している。ヒトPASMCにおけるエストロゲンでの直接の刺激は、miR-96の低減及び5-HT1B発現の増加を引き起こした。
【０１６７】
要約すれば、miR-96の減少は、増加した5HT1B発現と関連した。これは、miR-96模倣体/pre-miR-96の戦略が、PAHに対する新規治療アプローチであり得ることを示唆する。この仮説を支持して、前臨床試験は、mir-96模倣体が肺高血圧症のマウスモデルにおける肺高血圧症を予防する又は回復させるのに有効であることを確認する。
【実施例】
【０１６８】
材料及び方法
細胞培養
マウス肺動脈平滑筋細胞
BMPR2+/- R899Xマウス及び対応する野生型コントロールマウス由来の雌性及び雄性の肺動脈平滑筋細胞(PASMC)は、N. W. Morrell教授(University of Cambridge, Cambridge, UK)によって提供された。BMPR2+/- R899Xマウスは、BMPR2遺伝子のヘテロ接合ノックイン変異を有する。マウスは、Westら(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L744-L755, 2008)によって記載されたものと同様であった。手短に述べると、PAMSCは、増殖因子(上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子及びインスリン)及び抗生物質(ペニシリン ストレプトマイシン)の存在下で、20％FBS(ウシ胎児血清)DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)中で増殖させた。PASMCは、継代4と8の間で使用し、細胞生存率は、区別できる平滑筋細胞の形態に基づいた。
【０１６９】
ヒト肺動脈平滑筋細胞
女性のヒトPASMCは、N. W. Morrell教授(University of Cambridge, Cambridge, UK)によって提供された。手短に述べると、ヒトPASMCは、3人のPAH患者、HPAHを有する2人及びIPAHを有する1人からの肺血管系の小さな遠位肺動脈から外植された。非PAH被験体由来のPASMCをコントロールとして使用した。ヒトPASMCは、抗生抗真菌溶液(ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシンを含有する)の存在下で10％FBS DMEM中で増殖させ、継代4と8の間で使用した。PASMC表現型を、平滑筋細胞の形態を介して確認した。
【０１７０】
RNA及びタンパク質解析
miRNA及びmRNAのTaqman定量的PCR解析
全RNAを、製造業者の説明書に従ってmiRNeasyキット(Qiagen)を用いて抽出し、RNAの純度を、NanoDrop-1000分光光度計を用いて定量した。miR及びmRNAの発現を、以前[17]記載されているように、Taqman定量的PCRによって評価した。倍数変化を得るために、miR発現データを、マウスの場合はU6に対して、ヒトの場合はRNU48に対して正規化した。mRNA発現データを、GAPDHに対して正規化した。すべてのPASMC miRNA及びmRNA発現データは、三連におけるn=6である。
【０１７１】
タンパク質のウエスタンブロット解析
タンパク質をRIPA溶解法を用いて抽出した。RIPA緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤PMSF、大豆トリプシンインヒビター、及びベンズアミジンを補充した。手短に述べると、補充されたRIPA緩衝液を、PASMCに添加し、次いで、10分間氷上で撹拌した。細胞溶解物をスクレーピングによって収集した。タンパク質発現データを、α-チューブリンに対して正規化し、デンシトメトリーを用いて定量した。すべてのタンパク質発現データは、二連におけるn=4である。
【０１７２】
マイクロRNA-96模倣体のin vivoでの有効性
miR-96が肺高血圧症の病理に関与したかどうかを評価するために、マイクロRNA-96模倣体(Applied Biosystems、#MC10422、成熟マウス及びヒトmiR-96と同一である塩基配列UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUを有する)を、MaxSuppressor(商標) In Vivo RNA-LANCEr II送達法を使用して、2週間週、週に一度、尾静脈を介して静脈内投与した。模倣体は、注射あたり1.5mg/kgの用量で、すなわち、注射あたりマウスあたり約30μgで、製造説明書に従って、送達試薬中で調製した。ネガティブマイクロRNA模倣体(Applied Biosystems)及びPBSを投与した動物を、コントロールとして使用した。
【０１７３】
慢性低酸素症
2ヶ月齢の雌性野生型(WT)C57/Bl(Charles River)マウスを、以前(18)に記載されているように、14日の低圧低酸素(10％ O2、550mbar)に曝露した。正常酸素条件(21％ O2、1000mbar)で維持したマウスを、コントロールとして研究した。
【０１７４】
PHのin vivo評価
右心室収縮期圧(RVSP)、右心室肥大(RVH)及び肺血管リモデリングの測定を、以前(3、4、10)に記載されているように、行った。
【０１７５】
標的の検証
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
psi-CHECK-2デュアルルシフェラーゼレポーターベクター(Promega)を、レポーターアッセイに使用した。手短に述べると、5-HT1B受容体遺伝子の3'UTR(非翻訳領域)の断片を、ゲノムマウスDNAからポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成し、XhoI及びNotI制限部位でpsi-CHECK-2ベクターの多重クローニング部位にインフュージョン(in-fusion)クローニング法によりクローニングした。次いで、psi-CHECK-2 5-HT1Bベクターを、配列決定し、5-HT1Bの3'UTR領域内の不要な突然変異が存在しないことを確認した。1μgのpsi-CHECK-2コントロールベクター又はpsi-CHECK-2 5HT1Bベクターを、pre-miR-96(Ambion)又はスクランブルmiR(Ambion)と一緒に、合計6時間、リポフェクタミン(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)及びオプティメム(optimem)(Invitrogen)を使用して、HeLa細胞に共トランスフェクトし、その後、10％FBS DMEMで置き換えた。HeLa細胞を48時間置き、ルシフェラーゼ活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて測定し、照度計により検出した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、内部ホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化し、データを、内部コントロールの割合として表した。
【０１７６】
データの解析
値を、平均値±平均値の標準誤差として表す。t検定又は二元配置分散分析(2-way ANOVA)に続くボンフェローニの事後検定を、適切な場合、すべてのグループ間の統計的有意性を評価するために行った。p<0.05の確率レベルを、統計的に有意であると定義した。
【０１７７】
結果
図1は、多くのmiRが性別によって異なって影響を受けたことを実証し、miR-96は、雌性BMPR2R899X+/-マウスにおいて、野生型コントロールに対して、大幅に下方調節されたが、雄性ではそうではなかった; miR-96レベルは、雄性BMPR2R899X+/-マウスに対して雌性BMPR2R899X+/-マウスにおいてより低かった。
【０１７８】
miR-96の肺発現は、他の組織レベルと比較して非常に高く、これは、肺の選択的標的化を容易にする(図2)。本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、5HT1B受容体が、miR96の標的であることを確認した(図3)。
【０１７９】
miR96の減少した発現は、雌性BMPR2R899X+/-マウスにおける5HT1B受容体についての標的遺伝子における上昇と関連した(図4)。減少したmiR96発現は、BMP4刺激によって救われた(図5)。同じ表現型は、Smad1+/-マウスに由来するPASMCで観察される(図6)。
【０１８０】
結果は、ヒトPASMCで確認されている(図7)。特別に関心があるのは、R899X突然変異を有する女性患者において、5HT1Bレベルが高く、miR96発現が極めて低かったことである(図7)。
【０１８１】
本発明者らはまた、アロマターゼ阻害剤アナストロゾールによるエストロゲン枯渇の、miR96及び5HT1B受容体の両方の発現に対する効果を調べた。以前に本発明者らは、アナストロゾールが、雌性マウス及びラットにおいてPAHを回復させるが、雄性ではそうではないことを示している(未発表)。ここでは、本発明者らは、アナストロゾールによるin vivoでのエストロゲンの枯渇が、雌性マウスの肺においてmiR96発現を増加させ、5HT1B発現を減少させたが、雄性ではそうではないことを示す(図8)。
【０１８２】
これに沿って、miR-96遺伝子は、エストロゲン応答性領域を有し、エストロゲン自体は、miR-96の発現を減少させ、5HT1B受容体の発現を増加させた(図9)。
【０１８３】
図10及び11は、miR-96模倣体が、in vivoのマウスモデルにおいて、実験的PHを予防すること及び回復させることの両方が可能であることを確認する。
【０１８４】
考察
本発明者らの結果は、増加したエストロゲン及びBMPR2のハプロ不全が、減少したmiR-96発現と関連することを示唆する。
【０１８５】
miR-96は、通常は、5HT1Bについての遺伝子の翻訳を抑制し、そのため、miR-96の減少は、5HT1B発現の増加を誘導する。これは、セロトニン及び肺血管リモデリングによるPASMC増殖を促進し、PAHの発症に寄与する。
【０１８６】
本発明は、上述の例示的な実施形態に関連して説明されてきたが、この開示を与えられたとき、多くの等価な変更及び変形が当業者には明らかである。したがって、記載された本発明の例示的な実施形態は、例示であって限定的なものでないと考えられる。記載された実施形態に対する様々な変更は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書で引用したすべての文献は、参照により明示的に組み込まれる。
【０１８７】
参考文献
2016540049.tif 000008
2016540049.tif 000009
2016540049.tif 000010
2016540049.tif 000011
【図１−１】
2016540049.tif 000016
【図１−２】
2016540049.tif 000017
【図２】
2016540049.tif 000018
【図３】
2016540049.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016540049.tif 000024
【図９】
2016540049.tif 000025
【図１０】
2016540049.tif 000026
【図１１】
2016540049.tif 000027
【配列表】
2016540049000001.app
【国際調査報告】
2016540049.tif 000028
2016540049.tif 000029
2016540049.tif 000030
2016540049.tif 000031