(57)【要約】次式2016522167.tif 000021を有するダイゼイン類似体が開示される。開示するダイゼイン類似体を含む組成物、有効量の開示するダイゼイン類似体を対象に投与することを含む、対象の骨疾患もしくは骨損傷を予防もしくは治療するための方法及び／または骨成長を刺激するための方法もまた開示される。間葉系幹細胞の骨形成能を向上させるために、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩによる処置によって改変させた単離間葉系幹細胞が開示される。
2016522167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式
【化１】
2016522167.tif 000018
（式中、
Ｒ１は、水素、
【化２】
2016522167.tif 000019
ＯＲ９であり、式中、Ｒ９は、水素または低級アルキルであり；
Ｒ２は、水素であるか、またはＲ３と一緒になって５員環または６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つまたは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得；
Ｒ３は、水素、アルキル、低級アルキル、アリル、シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、プロピン、２−（ピペリジン−１−イル）エチル、２−（ピロリジン−１−イル）エチル、または２−（ジメチルアミノ）エチルであり；
Ｒ４は、水素であるか、またはＲ３と一緒になって５員環または６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つまたは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得；
Ｒ５は、水素、酸素、またはＯＲ１０の１つまたは複数であり、式中、Ｒ１０は水素または低級アルキルであり；
Ｒ６は、水素、炭素または低級アルキルであり；
Ｒ７は、水素または結合であり、Ｒ５と一緒になってＲ７が結合である場合、Ｒ５及びＲ７は５員環を形成し、この場合Ｒ５は酸素であり；
Ｒ８は、水素またはＯＲ１１であり、式中、Ｒ１１は、水素または低級アルキルであり；
Ｘは、炭素または窒素であり、Ｘが炭素である場合、Ｒ６は炭素であり、Ｘ及びＲ６が炭素−炭素結合で結合し、この場合前記化合物は、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ、またはグリセオリンＩＩでない）
を有する化合物。
【請求項２】
次式
【化３】
2016522167.tif 000020
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、Ｒ３と一緒になって、５員芳香環を形成する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、Ｒ３と一緒になって、６員環を形成する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
６員環が、炭素−炭素二重結合を含む、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記炭素−炭素二重結合がＲ２を包含する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が、Ｒ３と一緒になって、５員芳香環を形成する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ４が、Ｒ３と一緒になって、６員環を形成する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項９】
６員環が、炭素−炭素二重結合を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記炭素−炭素二重結合がＲ４を包含する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記環が、Ｒ２で１つまたは複数のメチル基に置換されている、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４が水素である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２が水素である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ６がメチルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘが炭素であり、式中のＲ６が炭素であり、ＸとＲ６が炭素−炭素結合により結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記炭素−炭素結合が二重結合である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ５が酸素である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ５が２つの水素である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ９が、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチルまたはｉ−ブチルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ９が水素である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物が、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソプロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、
７−ブトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソブトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、
７−ヘキシルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
７−（アリルオキシ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
４−（８，８−ジメチル−２，３，４，８−テトラヒドロピラノ［３，２−ｇ］クロメン−３−イル）フェノール、
２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）ベンズアミド、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、
７−エトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
７−シクロペンチルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−８，８−ジメチル−２，３，９，１０−テトラヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−４（８Ｈ）−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−８−メチル−４Ｈ−フロ［２，３−ｈ］クロメン−４−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−プロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、及び
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミド
のうちの１つから選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項２３】
経口、静脈内、皮内、筋肉内及び皮下の投与用に製剤化される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
濃縮物、乾燥粉末、液剤、カプセル剤、ペレット剤及び丸剤を含む経口送達用の製品を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
間葉系幹細胞をさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記間葉系幹細胞が、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩまたはこれらの任意の組み合わせによって前処置されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
対象の骨欠損を予防または治療するための方法であって、
前記対象に有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、これによって骨疾患または骨損傷を予防または治療する、方法。
【請求項２８】
前記対象が、骨粗鬆症を有しているか、または有していると思われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、骨粗鬆症を有していると診断されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が骨折を有する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
対象の骨成長を刺激するための方法であって、
前記対象に有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、これによって骨成長を刺激する、方法。
【請求項３２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物を含む、任意の骨疾患または骨損傷の治療のための薬剤。
【請求項３３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩもしくはグリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩまたはこれらの任意の組み合わせによる処置によって改変されている単離間葉系幹細胞を含む、任意の骨疾患または骨損傷の治療のための組成物。
【請求項３４】
生体適合性基材を含む生体適合性骨回復システムであって、前記生体適合性基材は、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物がコートされている、かつ／あるいは
開示のダイゼイン類似体、及び／または請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩもしくはこれらの任意の組み合わせで処置した間葉系幹細胞が播種されている、
生体適合性骨回復システム。
【請求項３５】
骨欠損を治療するための方法であって、請求項３４に記載の生体適合性骨回復システムを前記骨欠損の部位に外科的に埋入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８０８，５３８号及び２０１３年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／８６５，０５０号の先の出願日の優先権を主張するものであり、両出願は、その全体を参照により本明細書に特に援用する。
【０００２】
政府助成の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号１Ｇ１２ＲＲ０２６２６０−０１及びアメリカ合衆国農務省助成金番号５８−６４３５−７−０１９に基づいた助成を受け、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、新規のダイゼイン類似体、ダイゼイン類似体、間葉系幹細胞を使用してヒトにおける骨形成を増加させるための方法、ならびに哺乳動物における種々の骨損傷及び／または骨疾患を治療及び／または予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨粗鬆症は、骨変性に関連した病的状態であり、低骨量及び骨構造の変性を特徴とする。骨密度が低くなり、構造が弱くなると、骨の強度が落ちて、骨折しやすくなり、罹患率及び死亡率が高くなる。多くの要因が骨粗鬆症の発症に関与するが、米国内の老人人口を鑑みれば、加齢が主要な危険因子であると考えられる。米国では２００万人以上の人々が骨粗鬆症に罹患しており、年間１７０億ドルの費用がかかっていると推定される。
【０００５】
現在の骨粗鬆症の治療レジメンは、骨の再生または骨の吸収を標的にする。なぜなら強く健康な骨を維持するために、通常はこの２つの過程がバランスを保っているためである。したがって、治療用化合物は骨吸収抑制剤と骨形成促進剤の２つの種類に分けられる。骨吸収抑制剤は、破骨細胞活性を制限することによって、正常なリモデリング中の骨の破壊を低減し、骨の損失を抑えるものである。これらの薬剤には、ビスホスホネート、カルシトニン及びデノスマブが挙げられる。研究では、これらの薬剤を単独でまたは組み合わせて送達すると、骨損失の抑制に効果的であることが示されている。これらの薬剤は骨粗鬆症の重症度を抑えるが、これに加えて、骨が再生して骨の構造を取り戻し、骨を強化する必要がある。骨形成促進剤は、骨密度（ＢＭＤ）を高くするだけでなく、骨の質及び強度も改善することが示されている。
【０００６】
エストロゲンは、骨形成促進剤であり、閉経後の女性における骨粗鬆症の治療に使用されている。エストロゲンは、骨粗鬆症の発症を抑え、ＢＭＤを増加させることから、骨代謝の強力な調節因子と考えられるが、ホルモン補充治療の形態でのエストロゲンの使用は、乳癌及び子宮体癌のリスク上昇との関連を理由に中止されている。したがって、エストロゲンの有効な代替物が必要である。選択的エストロゲン受容体調節剤であるラロキシフェンは、骨でエストロゲン様作用を、子宮、子宮内膜及び乳房組織でエストロゲン拮抗作用をもたらすことが示されている。しかしながら、ラロキシフェンも血栓塞栓症のリスク上昇に関連している。
【０００７】
骨粗鬆症を治療するための優れた薬物治療を明らかにする必要性は、依然として存在する。身体活動の増加が骨粗鬆症の発症率を下げ得る修正可能な生活様式の選択であるが、新しい治療的処置が開発されることで、個人の生涯にわたってより健康な骨が維持され、骨粗鬆症の発症がさらに少なくなるであろう。本開示は、これらの要求を満たすものである。
【発明の概要】
【０００８】
次式
【化１】
2016522167.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素、
【化２】
2016522167.tif 000004
ＯＲ９であり、式中、Ｒ９は、水素または低級アルキルであり；Ｒ２は、水素であるか、またはＲ３と一緒になって５員または６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つまたは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得；Ｒ３は、水素、アルキル、低級アルキル、アリル、シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、プロピン、２−（ピペリジン−１−イル）エチル、２−（ピロリジン−１−イル）エチル、または２−（ジメチルアミノ）エチルであり；Ｒ４は、水素であるか、またはＲ３と一緒になって５員または６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つまたは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得；Ｒ５は、水素、酸素、またはＯＲ１０の１つまたは複数であり、式中、Ｒ１０は水素または低級アルキルであり；Ｒ６は、水素、炭素または低級アルキルであり；Ｒ７は、水素または結合であり、Ｒ５と一緒になり、Ｒ７が結合である場合、Ｒ５及びＲ７は５員環を形成し、この場合Ｒ５は酸素であり；Ｒ８は、水素またはＯＲ１１であり、式中、Ｒ１１は、水素または低級アルキルであり；Ｘは、炭素または窒素であり、Ｘが炭素である場合、Ｒ６は炭素であり、Ｘ及びＲ６が炭素−炭素結合で結合し、この場合当該化合物は、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ、またはグリセオリンＩＩでない）を有するダイゼイン類似体が開示される。いくつかの実施形態において、ダイゼイン類似体は、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソプロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−ブトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソブトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−ヘキシルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−（アリルオキシ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、４−（８，８−ジメチル−２，３，４，８−テトラヒドロピラノ［３，２−ｇ］クロメン−３−イル）フェノール、２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）ベンズアミド、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−エトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−シクロペンチルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−８，８−ジメチル−２，３，９，１０−テトラヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−４（８Ｈ）−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−８−メチル−４Ｈ−フロ［２，３−ｈ］クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−プロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、及びＮ−（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミドのうちの１つである。
【０００９】
開示するダイゼイン類似体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物などの組成物もまた開示される。いくつかの実施形態において、本組成物は、間葉系幹細胞をさらに含み、いくつかの実施例において間葉系幹細胞は、たとえば、間葉系幹細胞の骨形成能を向上させるために、ダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩで前処置されている。
【００１０】
有効量の開示するダイゼイン類似体を対象に投与することを含む、対象の骨粗鬆症、骨減少症または骨折などの骨疾患または骨損傷を予防または治療するための方法もまた開示される。
【００１１】
有効量の開示するダイゼイン類似体を対象に投与することを含む、骨粗鬆症、骨減少症または骨折を有する対象などの対象の骨成長を刺激するための方法もまた開示される。
【００１２】
間葉系幹細胞の骨形成能を向上させるために、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩを用いた処置によって改変させた単離間葉系幹細胞もまた開示される。
【００１３】
開示するダイゼイン類似体及び／または開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩもしくはグリセオリンＩＩで処置した間葉系幹細胞のような間葉系幹細胞がコート及び／または播種された生体適合性基材を含む、生体適合性骨回復システムもまた開示される。骨欠損部位に生体適合性基材を外科的に埋入することを含む、開示する生体適合性骨回復システムを用いて骨欠損を治療するための方法もまた提供される。
【００１４】
前述の特徴及び他の特徴は、添付の図面を参照しながら進める、以下の複数の実施形態の詳細な説明により明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、フィトエストロゲンがＭＳＣの骨形成を高めることを示す一連のデジタル画像及び棒グラフである。３名のドナーから得たＭＳＣを分化誘導し、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）及びゲニステイン（１μＭ）に同時に曝露させた。１４日間骨形成するように誘導したＭＳＣを、カルシウム沈着を検出するためにアリザリンレッドＳで染色し、塩化セチルピリジニウムにより脱染色し、５９０ｎｍで測定して、骨形成分化量を定量化した。（図１Ａ）ビヒクル、エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインで処置してアリザリンレッド染色したＭＳＣの代表的画像。画像は４×倍率で取得した。（図１Ｂ）骨分化を１．０に標準化したビヒクル処置細胞を基準にして求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００１６】
【図２】図２は、ダイゼイン類似体のスクリーニングにより、ＭＳＣの骨形成をダイゼインと比較してさらに向上させた複数の分子が特定されたことを示す棒グラフである。ドナー１から得たＭＳＣを骨形成分化するように誘導し、各培地変更時にビヒクル（ＤＭＳＯ）、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）に同時に曝露させた。１４日後、骨形成分化培地中の細胞を、カルシウム沈着を求めるためにアリザリンレッドＳで染色した。アリザリンレッドＳで染色した細胞を塩化セチルピリジニウムで脱染色し、５９０ｎｍで測定してカルシウム沈着量を定量化した。骨分化能を１．０に標準化したビヒクル処置細胞を基準にして求めた。＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．０１。
【００１７】
【図３】図３は、ダイゼイン類似体が、ダイゼインと比較して、複数のドナー由来のＭＳＣの骨形成を高めることを示す一連の棒グラフである。ドナー３名から得たＭＳＣを骨形成分化するように誘導し、各培地変更時にビヒクル（ＤＭＳＯ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）に同時に曝露させた。１４日後、骨形成分化培地中の細胞を、カルシウム沈着を求めるためにアリザリンレッドＳで染色した。アリザリンレッドＳで染色した細胞を塩化セチルピリジニウムで脱染色し、５９０ｎｍで測定してカルシウム沈着量を定量化した。骨分化能をビヒクル処置細胞を基準にして求めた。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００１８】
【図４】図４は、ダイゼイン類似体による骨形成能の向上が用量依存性であることを示す一連のグラフである。ドナー３名から得たＭＳＣを骨形成分化するように誘導し、各培地変更時にダイゼイン類似体２ｃ、２ｆまたは２ｌに１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭの濃度で同時に曝露させた。１４日後、骨形成分化培地中の細胞を、カルシウム沈着を求めるためにアリザリンレッドＳで染色した。アリザリンレッドＳで染色した細胞を塩化セチルピリジニウムで脱染色し、５９０ｎｍで測定してカルシウム沈着量を定量化した。骨分化能をビヒクル処置細胞を基準にして求めた。
【００１９】
【図５】図５は、ダイゼイン類似体による骨形成能の向上が骨形成転写因子の発現の上昇と相関関係にあることを示す一連の棒グラフである。ドナー３名から得たＭＳＣを一緒にプールし、骨形成分化するように誘導し、各培地変更時にビヒクルまたはダイゼイン類似体２ｃ（１μＭ）に同時に曝露させた。１４日後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離し、各試料からｃＤＮＡを合成した。骨形成に関与する遺伝子（ＳＰ７、ＡＬＰ、ＯＰ、ＩＧＦ１）の転写レベルについてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００２０】
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、エストロゲン及びフィトエストロゲンが骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）及び脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）の骨形成及び脂肪細胞分化を促進することを示す一連のデジタル画像及び棒グラフである。ＢＭＳＣ（ｎ＝６）及びＡＳＣ（ｎ＝６）を骨形成分化培地または脂肪細胞分化培地中で培養し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはゲニステイン（１μＭ）を同時に加えた。（図６Ａ）１４日後、エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインで処置し、骨形成分化培地で誘導させた細胞を固定し、アリザリンレッドで染色し、明視野検鏡により４×倍率で可視化した。スケールバーは１００μｍを表す。（図６Ｂ）ビヒクル、エストロゲンまたはフィトエストロゲンで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣのアリザリンレッド染色量を定量化するために、細胞を１０％ＣＰＣで溶出し、５９０ｎｍで測定した。骨形成分化をビヒクル処置細胞（１．０に標準化）を基準にして求めた。（図６Ｃ）１４日後、脂肪細胞分化培地で誘導させた細胞を固定し、オイルレッドｏで染色し、明視野検鏡により１０×倍率で可視化した。スケールバーは１００μｍを表す。（図６Ｄ）ビヒクル、エストロゲンまたはフィトエストロゲンで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣのオイルレッドｏ染色量を定量化するために、細胞をイソプロパノールで溶出し、５４４ｎｍで測定した。脂肪細胞分化をビヒクル処置細胞（１．０に標準化）を基準にして求めた。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００２１】
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ダイゼイン類似体が、ＢＭＳＣ及びＡＳＣを分化させることにより、エストロゲン及びダイゼインと比較してより大きなカルシウム沈着を誘導することを示す一連のデジタル画像及び棒グラフである。ＢＭＳＣ（ｎ＝６）及びＡＳＣ（ｎ＝６）を骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）、ダイゼイン類似体２ｃ（１μＭ）、ダイゼイン類似体２ｇ（１μＭ）またはダイゼイン類似体２ｌ（１μＭ）を同時に加えた。（図７Ａ）１４日後、骨形成分化培地で誘導させた細胞を固定し、アリザリンレッドで染色し、明視野検鏡により４×倍率で可視化した。スケールバーは１００μｍを表す。（図７Ｂ）ビヒクル、エストロゲン、ダイゼインまたはダイゼイン類似体で処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣのアリザリンレッド染色量を定量化するために、細胞を１０％ＣＰＣで溶出し、５９０ｎｍで測定した。骨形成分化を１．０に標準化したビヒクル処置細胞を基準にして求めた。＊Ｐ＜０．０５。ビヒクル処置細胞と比較して＊＊Ｐ＜０．０１。エストロゲン処置細胞と比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１。ダイゼイン処置細胞と比較してＹＹＹＰ＜０．００１。
【００２２】
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成分化に対するダイゼイン類似体の効果が用量依存性であることを示す一連のグラフである。ＢＭＳＣ（ｎ＝６）（図８Ａ）及びＡＳＣ（ｎ＝６）（図８Ｂ）を骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル、エストロゲン、ダイゼインまたはダイゼイン類似体を１００ｐｍ〜１ｍＭの間の濃度で同時に加えた。１４日後、細胞を固定し、アリザリンレッドで染色し、１０％ＣＰＣで脱染色し、５９０ｎｍで測定した。骨形成分化を１．０に標準化したビヒクル処置細胞を基準にして求めた。
【００２３】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ダイゼイン類似体がＢＭＳＣ及びＡＳＣにおけるアルカリホスファターゼ発現及びリン酸塩沈着を増加させることを示す一連のデジタル画像及び棒グラフである。ＢＭＳＣ（ｎ＝６）及びＡＳＣ（ｎ＝６）を骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）を同時に加えた。（図９Ａ）３日後、細胞を染色し、固定し、アルカリホスファターゼで染色した。（図９Ｂ）アルカリホスファターゼ染色を定量化するために、画像（合計で５枚の画像）ごとの陽性ピクセル数をＩｍａｇｅ  Ｊで計測した。（図９Ｃ）１４日後、細胞を染色し、固定し、硝酸銀で染色した。（図９Ｄ）硝酸銀染色後のリン酸塩沈着を定量化するために、画像（合計で５枚の画像）ごとのピクセル数をＩｍａｇｅ  Ｊで計測した。エストロゲン処置細胞と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１。画像は４×倍率で取得した。スケールバーは１００μｍを表す。ビヒクル処置細胞と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、エストロゲン処置細胞と比較して＃Ｐ＜０．０５、エストロゲン処置細胞と比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１、ダイゼイン処置細胞と比較してΨΨΨＰ＜０．００１。
【００２４】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＢＭＳＣにおける初期、中期及び後期の系列特異的骨形成遺伝子の発現がダイゼイン類似体によって有意に誘導されたことを示す一連のグラフである。ＢＭＳＣを骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）で同時に処置した。細胞を処置から３日、７日または１４日後に回収した。ＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡへと逆転写した。初期（図１０Ａ）、中期（図１０Ｂ）または後期（図１０Ｃ）の骨形成転写因子の分析をｑＰＣＲによって評価した。発現値は、１．０に標準化した非分化ビヒクル処置細胞で標準化した。ビヒクル処置ＢＭＳＣと比較して＊Ｐ＜０．０５、ビヒクル処置ＢＭＳＣと比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、エストロゲン処置ＢＭＳＣと比較して＃Ｐ＜０．０５、エストロゲン処置ＢＭＳＣと比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１、ダイゼイン処置ＢＭＳＣと比較してＹＰ＜０．０５、ダイゼイン処置ＢＭＳＣと比較してＹＹＹＰ＜０．００１。
【００２５】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＡＳＣにおける初期、中期及び後期の系列特異的骨形成遺伝子の発現がダイゼイン類似体によって有意に誘導されたことを示す一連の棒グラフである。ＡＳＣを骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）で同時に処置した。細胞を処置から３日、７日または１４日後に回収した。ＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡへと逆転写した。初期（図１１Ａ）、中期（図１１Ｂ）または後期（図１１Ｃ）の骨形成転写因子の分析をｑＰＣＲによって評価した。発現値は、１．０に標準化した非分化ビヒクル処置細胞で標準化した。ビヒクル処置ＡＳＣと比較して＊Ｐ＜０．０５、ビヒクル処置ＡＳＣと比較して＊＊Ｐ＜０．０１、ビヒクル処置ＡＳＣと比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、エストロゲン処置ＡＳＣと比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１、ダイゼイン処置ＡＳＣと比較してＹＹＹＰ＜０．００１。
【００２６】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、フルベストラント処置が、初期、中期及び／または後期の骨形成転写の阻害を介して、ダイゼイン類似体による骨形成誘導を低減させることを示す一連の棒グラフである。ＢＭＳＣまたはＡＳＣを骨形成分化培地中で培養し、ビヒクル、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）またはダイゼイン類似体（１μＭ）及びエストロゲン拮抗剤であるフルベストラントで同時に処置した。（図１２Ａ及び１２Ｃ）１４日後、細胞をアリザリンレッドで染色し、ＣＰＣで溶出した。染色の定量化を５９０ｎｍで測定し、分化ビヒクル処置細胞で標準化した。（図１２Ｂ及び１２Ｄ）細胞を処置から３日、７日または１４日後に回収した。ＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡへと逆転写した。骨形成転写因子の分析をｑＰＣＲによって評価した。発現値は、１．０に設定した非分化ビヒクル処置細胞で標準化した。処置ＭＳＣは非分化ＭＳＣで標準化し、処置ＡＳＣは非分化ＡＳＣで標準化した。ビヒクル処置細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、ビヒクル処置細胞と比較して＊＊Ｐ＜０．０１、ビヒクル処置細胞と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、エストロゲン処置細胞と比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１、ダイゼイン処置細胞と比較してＹＹＹＰ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
配列の簡単な説明
本明細書に示す核酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２の定義に従って、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略語を使用して記載される。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、表示された鎖への参照によって、相補鎖も包含されものと理解される。ＴＵＬ＿００１１ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で２０１４年４月３日に作成された４キロバイトのファイル形態であるＡＳＣＩＩテキストファイルとして、配列表を提出する。当該配列表は、参照により本明細書に援用する。
【００２８】
いくつかの実施形態についての詳細な説明
Ｉ．用語の要約
別途の説明がない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、開示する主題が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。化学用語における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ，１９８５及びＴｈｅ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，１９８１から得ることができる。本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形の用語は、特に明示しない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または」という語も、特に明示しない限り、「及び」を包含することが意図される。また、本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、Ｂ、またはＡ及びＢを包含することを意味する。
【００２９】
別途言及する場合を除いて、いかなる定量値も、「約」または「およそ」などの語の記載の有無にかかわらず、近似値である。本明細書に記載する材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図していない。いかなる分子重量値または分子質量値も近似値であり、説明のためにのみ提供される。別途言及する場合を除いて、本発明の方法及び技術は、概して、当該技術分野においてよく知られた従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用し論じる種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されている通りに実施される。たとえば、Ｌｏｕｄｏｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｐｐ．３６０−３６１，１０８４−１０８５；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；またはＶｏｇｅｌ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照されたい。
本明細書に開示する各種実施形態の検討を容易にするために、特定の用語に関する説明を以下に記載する。
【００３０】
投与：開示するダイゼイン類似体を含む医薬組成物などの組成物を有効的な経路を介して対象に提供または付与すること。例示的な投与経路は、注入（たとえば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内（ｉｐ）及び静脈内（ｉｖ））、経口、舌下、経皮及び吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
アルコキシ：Ｒが置換または非置換のアルキルである、−Ｏ−Ｒの構造を有する基（または置換基）。メトキシ（−ＯＣＨ３）は、代表的なアルコキシ基である。置換アルコキシの場合、Ｒは、非干渉置換基でアルキル置換されている。「チオアルコキシ」は、−Ｓ−Ｒを指し、Ｒは、置換または非置換のアルキルである。「ハロアルキルオキシ」とは、Ｒがハロアルキルである−ＯＲ基を意味する。
【００３２】
アルケニル：少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、母体であるアルケンの１つの炭素原子から１つの水素原子を除去することで得られる、１〜１０個の範囲の炭素原子数を有する不飽和一価炭化水素（たとえば、Ｃ２−１０アルケニル）。アルケニル基は、分枝鎖、直鎖、環式、シス型またはトランス型（たとえば、ＥまたはＺ）であってよい。
【００３３】
アルキニル：少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、母体であるアルキンの１つの炭素原子から１つの水素原子を除去することで得られる、１〜１０個の範囲の炭素原子数を有する不飽和一価炭化水素（たとえば、Ｃ２−１０アルキニル）。アルキニル基は、分枝鎖、直鎖または環式であってよい。
【００３４】
アルキル：特に明示しない限り、１〜１５個の炭素原子、たとえば、１〜１０個、１〜６個、または１〜４個の炭素原子を含む、非環式、飽和、分枝鎖または直鎖の炭化水素基。本用語は、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｔーブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルまたはドデシルなどの基を包含する。「低級アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基を指す。明確に「非置換アルキル」と称さない限り、アルキル基は、非置換でも置換でもよい。アルキル基は、１つまたは複数の置換基（たとえば、アルキル鎖中の各メチレン炭素については最大２つの置換基）で置換され得る。例示的なアルキル置換基には、たとえば、アミノ基、アミド、スルホンアミド、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ（メトキシなど）、アルキルチオ、チオアルコキシ、アリールアルキル、ヘテロアリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルファノ、ケトまたは他の官能基が挙げられる。
【００３５】
類似体または誘導体：元の化合物が有する所望の目的に合った機能的特性と類似の機能的特性を有する化合物に十分相応する化合物。類似体または誘導体は、ある物質、たとえばダイゼインなどの１つの形態であって、親化合物と比較して、少なくとも１つの官能基が変更、付加または除去されている物質の形態を指す。「官能基」は、物理的または化学的特性を物質に追加する炭化水素基以外の基を指す。
【００３６】
生体適合性：対象における望ましくないあらゆる局所または全身作用を誘発することなく、所望の機能（たとえば、医薬治療に関して）を果たすことができる生体適合材料またはデバイスの特性。生体適合性材料またはデバイスはまた、理想的には、有益な効果または細胞もしくは組織の応答をもたらす。いくつかの実施例では、生体適合性とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより簡素な化学種に酵素学的または化学的に分解される（「生物分解性」）材料またはデバイスを指す。生体適合性材料、デバイスまたはシステムは、生体の一部を置き換えるため、または生体組織に密着して機能を果たすために使用される合成または天然材料を包含する。「生体適合性」及び「生物学的に適合可能」という用語は、本明細書では区別なく用いられる。
【００３７】
骨欠損：損傷または手術、感染症、悪性腫瘍もしくは発育不良において生じた欠損に起因するものなどの骨の強度、機能及び／または完全性に影響を及ぼすあらゆる疾患、欠損または障害を包含する。骨欠損の例には、骨折（たとえば、致命的欠損または難治性骨折）、歯または顔面の欠損（たとえば、口蓋裂または顔面もしくは歯の損傷もしくは奇形）が挙げられるが、これらに限定されない。骨欠損の他の例には、骨減少症、骨粗鬆症などの骨脆弱性による疾患、ならびに肉腫（たとえば骨肉腫）などの骨の悪性腫瘍及び／または癌に起因する骨への損傷が挙げられる。
【００３８】
コート：本明細書で使用する場合、「コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ，  ｃｏａｔｉｎｇｓ）」、「コートされた（ｃｏａｔｅｄ）」及び「コート（ｃｏａｔ）」は、第１の物質または基材表面が第２の物質で少なくとも部分的に被覆または関係付けられている、材料及び材料の製造方法を定義する同一用語の複数形態である。第１の物質と第２の物質は、異なるものでなくてもよい。さらに、本明細書で使用する場合にデバイスまたは生体適合性基材が「コートされて」いるとき、コーティングは、結合剤を含めた任意の化学的または機械的な結合または力によって実施され得る。したがって、第１の物質からなるデバイスは、第３の物質である結合剤を介して、第２の物質で「コートされ」得る。本明細書で使用する場合、「コーティング」は、完全である必要はなく、「コートされる」第１の物質の表面全体を被覆する必要はない。また、「コーティング」は、完全であってもよい（たとえば、第１の物質のほぼ全体を被覆する）。複数のコーティングが存在してもよく、コーティングのそれぞれに複数の物質が存在してもよい。コーティングは、厚みが異なっていてもよいし、実質的に同一であってもよい。
【００３９】
細胞培養：設定した一連の条件（たとえば、培地、温度及び／または培養時間）における細胞集団の成長。いくつかの実施例では、細胞培養は、実質的な純粋培養（たとえば、単離間葉系幹細胞または脂肪由来幹細胞）を包含する。追加の実施例では、細胞培養は、２種類またはそれ以上の種類の細胞（たとえば、線維芽細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞及び造血細胞の１つまたは複数を含む骨髄細胞の培養）、異なる分化段階にある細胞（たとえば、多能性幹細胞と分化細胞の混合物）またはそれらの組み合わせの共培養などの混合培養を包含する。さらなる実施例において、細胞培養は、１つまたは複数の生体適合性基材、たとえば、スポンジ、ストリップ、スカフォールドまたはゲル（たとえば、コラーゲンスポンジまたはナイロンストリップ）と接触した細胞成長を包含する。
【００４０】
対照値または基準値：「対照」は、実験試料との比較に使用するための試料または標準を指す。
【００４１】
診断：疾患、たとえば、骨粗鬆症または骨折などの骨欠損を、その徴候、症状及び各種検査の結果から特定するためのプロセス。当該プロセスを通じて達した結論もまた「診断」と呼ばれる。一般的に実施される検査の形態には、血液検査及び医用画像診断が挙げられる。
【００４２】
分化：特殊化していない細胞がより特殊化した状態になる細胞の特徴の変化。分化は、大きさ、形状、極性、遺伝子発現、代謝活性及び細胞シグナルへの応答性の変化を引き起こし得る。特定の実施例において、間葉系幹細胞は、少なくとも１つの石灰化マーカーを呈するとき、たとえば、石灰化の遺伝子もしくはタンパク質の発現もしくは活性の上昇、またはカルシウムの分泌の上昇を示すとき、骨形成原細胞に分化する。
【００４３】
骨折：骨にひびが入るか、骨が折れた医学的状態、すなわち、骨の離断。骨折は、閉鎖性または開放性に分類され得る。閉鎖性骨折は、皮膚に損傷がない骨折であり、開放性（または複雑）骨折は、骨が外気と連絡している骨折である（たとえば、皮膚を貫くものまたは重度の組織損傷によるもの）。骨折はまた、単独骨折または多骨片骨折に分類される。単独骨折は、１つの線にのみ沿って生じ（たとえば、１つの骨が２つの断片に分断）、多骨片骨折は、１つの骨が複数の断片（たとえば、３つまたはそれ以上の断片）に分断する。骨折の他の種類には、完全骨折、不全骨折、縦骨折、横骨折、斜骨折、圧迫骨折、螺旋骨折、粉砕骨折及び圧迫骨折が挙げられる。別の骨折には、致命的欠損（たとえば、骨の一部の消失または一部が除去される場合）または難治性骨折（たとえば、骨折末端が互いに接触しない場合）が挙げられる。
【００４４】
疾患または状態の阻害：たとえば、疾患のリスクがあるか、または特定の疾患、たとえば、骨粗鬆症などの骨欠損などを有する対象における疾患または状態の発症を抑えることを指す語句。本開示の具体的な方法は、骨減少症及び／または骨粗鬆症を阻害するための方法を提供する。
【００４５】
間葉系幹細胞、またはＭＳＣ：骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞及び脂肪細胞を含む、種々の細胞型に分化することができる多能性間質細胞。ＭＳＣは、多能性を維持しつつ、大きな自己複製能を有する。
【００４６】
骨芽細胞：骨形成を担う単核細胞。骨芽細胞は、主にＩ型コラーゲンから構成される類骨を産生する。骨芽細胞はまた、類骨基質の石灰化を担う。骨は、骨を作る骨芽細胞と、骨を吸収する破骨細胞によって絶えず新しく形成される動的な組織である。骨芽細胞は、骨膜及び骨髄に位置する骨芽前駆細胞から生じる。骨芽前駆細胞は、主要な転写調節因子であるＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２を発現する未成熟の前駆細胞である。骨芽前駆細胞は、骨芽細胞に分化し始めると、オステリックス、１型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチン及びオステオネクチンを含む幅広いマーカーの発現を開始する。
【００４７】
破骨細胞：骨吸収プロセスを介して石灰化基質を除去することによって、骨組織を取り除く骨系細胞の一種。破骨細胞は、単球−マクロファージ細胞系の細胞融合によって形成される。破骨細胞は、酒石酸耐性酸ホスファターゼ及びカテプシンＫの高発現を特徴とする。
【００４８】
骨細胞：骨細胞自体の空隙（骨内の小腔）に埋まっている成熟した非分裂性骨細胞。骨細胞は、骨芽細胞に由来し、骨細胞系列の成熟の最終段階を示す。骨細胞は、骨芽細胞よりも低活性であり、骨基質の正味の上昇を担うわけではないが、骨基質の維持及び定期的な代謝回転に不可欠である。骨細胞の狭い細胞突起は、細管（骨内の細管）を通って、互いの結合、及び骨芽細胞との結合を維持する。
【００４９】
骨粗鬆症：低骨量及び骨組織の構造的劣化を特徴とし、骨折リスクが高くなる疾患または状態。世界保健機関（ＷＨＯ）は、骨粗鬆症を、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）で測定した場合で、脊椎または寛骨の骨塩量（ＢＭＤ）が健康な若年女性の平均値を２．５標準偏差以上下回る（Ｔスコア−２．５以下）ものと定義している。
【００５０】
関連障害である骨減少症は、脊椎または寛骨のＢＭＤが当該平均値の１〜２．５標準偏差で下回るものと定義されている。原発性骨粗鬆症は、加齢に伴う生殖腺機能の低下に関連した骨損失の結果であると考えられる。続発性骨粗鬆症は、骨代謝に悪影響を及ぼす慢性的な疾患、曝露または栄養不足に起因し得る。
【００５１】
通常、骨粗鬆症は、臨床的にまたはＸ線により診断される。骨粗鬆症は、低衝撃骨折（立った姿勢からの転倒により発生）または脆弱性骨折（自然に発生）を示す場合がある。
【００５２】
薬学的に許容可能な担体：本開示において有用である薬学的に許容可能な担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ，２２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）には、１つまたは複数の治療用化合物または分子の薬学的送達に適した組成物及び製剤、たとえば、１つまたは複数の核酸分子、タンパク質、またはこれらのタンパク質に結合する抗体、及び追加の医薬物質などが記載されている。
【００５３】
一般に、担体の性質は、採用される具体的な投与様式に依存する。たとえば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容可能な流体をビヒクルとして含む注入可能な流体を含む。固体組成物（たとえば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤形態）の場合、従来の非毒性固体担体には、たとえば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒性補助物質、たとえば、湿潤剤または乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤、たとえば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどを含有し得る。
【００５４】
プロドラッグ：たとえば、腸内の加水分解または血中の酵素変換によって、親化合物を生じるように生体内で変化する化合物。
【００５５】
精製された：「精製された」という用語は、完全な純度を求めるのではなく、むしろ相対的な用語とみなされる。したがって、たとえば、精製された調製物とは、所望の成分が先の環境よりも濃縮された状態、たとえば、試料の少なくとも約７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％、または９９重量％が所望の成分から構成されている場合である。化合物の純度は、たとえば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または他の従来法によって測定することができる。一実施例において、特定のダイゼイン類似体は精製され、９０％超、多くの場合は９５％超を示す。
【００５６】
本明細書に記載する化合物は、精製された形態で得ることができ、またはシリカゲル及び／またはアルミナクロマトグラフィーを含めた当該技術分野において知られた方法のいずれかによって精製され得る。たとえば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．ｂｙ  Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９７９；及びＴｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｓｔａｈｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９６９を参照されたい。一実施例において、化合物は、精製されたダイゼイン類似体を、他の不純物に対して、試料の少なくとも約７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％、または９９重量％の純度で包含する。
【００５７】
回復：骨欠損部位の空隙または構造的な不連続部分を少なくとも部分的に埋めるのに十分な新しい骨形成。回復という用語は、完全な治癒の過程または欠損を欠損前の状態に修復するのに１００％有効である治療である必要はない。
【００５８】
対象：「対象」という用語は、ヒト対象及び家畜対象の両方、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス及びウシを包含する。同様に、哺乳動物という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を包含する。
【００５９】
治療的有効量：本明細書に記載の化合物などの特定の薬剤を用いた治療を受ける対象に所望の効果をもたらすのに十分な当該薬剤の量。たとえば、骨粗鬆症を有する対象における骨損失を予防、阻害及び／もしくは治療すること、ならびに／または骨形成を促進することにおいて有用である、開示するダイゼイン誘導体の量であり得る。理想的には、薬剤の治療的有効量は、対象に実質的な細胞傷害作用を引き起こすことなく、対象の障害を予防、阻害及び／または治療するのに十分な量である。
【００６０】
対象の障害を予防、阻害及び／または治療するのに有用な組成物の有効量は、治療を受ける対象、障害の重症度、及び治療用組成物の投与方法に依存する。治療薬の有効量は、多くの異なる方法、たとえば、骨密度を調べることで決定することができる。有効量はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕの各種分析を介して決定することもできる。
【００６１】
幹細胞：２つ以上の特定の細胞型の完全に分化した機能性細胞を生み出すことができる細胞。生体内における幹細胞の役割は、動物の通常生活において破壊される細胞を置き換えることである。一般に、幹細胞（たとえば、胚幹細胞）は、制限なく分裂し、分化全能性である。分裂後の幹細胞は、幹細胞のまま留まるか、前駆細胞になるか、最終分化に進み得る。多能性幹細胞は、２つ以上の特定の細胞型の完全分化細胞を生み出すことができる幹細胞であるが、分化全能性ではない。一実施例では、多能性幹細胞は、自己複製でき、骨芽細胞などの骨形成細胞または石灰化細胞を生み出すことができる間葉細胞を包含する。多能性幹細胞は、出生後の対象の組織、たとえば、骨髄及び脂肪組織に由来し得る。骨形成原細胞は、少なくとも１つの特定の細胞型の完全に分化した機能性骨系細胞を動物（たとえば、ヒト）の体から生み出すことができる細胞である。骨形成原細胞は、限定するものではないが、骨細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、前破骨細胞及び／または破骨細胞などの完全に分化した骨系細胞を生み出すことができる。骨形成原細胞は、分裂後、前駆細胞（たとえば、少なくとも１つの特定の細胞型の完全に分化した機能性細胞を動物の体から生み出すことができる細胞）に留まることもできるし、最終分化に進むこともできる。骨形成原細胞は、骨細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、前破骨細胞及び／または破骨細胞などの骨系細胞の１つまたは複数の型を生じ得るが、その分化能は幹細胞よりも限定される。
【００６２】
基材：細胞が成長及び／または分化し得る、基材、枠組み、スカフォールドまたは支持体。細胞は、基材の外面に付着させてもよいし、基材中、たとえば、基材の孔に移してもよい。いくつかの実施例では、基材は、スポンジ、ストリップ、ゲル（たとえば、ヒドロゲル）、スカフォールドまたは他の三次元構造である。特定の実施例において、基材は、コラーゲンスポンジまたはナイロンストリップである。
【００６３】
十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を記述するために使用される語句。一実施例では、十分な条件下は、１つもしくは複数のダイゼイン類似体またはその組み合わせを所望の活性を与えるのに十分な濃度で対象に投与することを包含する。いくつかの実施例では、所望の活性は、骨粗鬆症などの骨損失に関連した徴候もしくは症状を予防もしくは阻害すること、一部もしくはすべての臨床症状の重症度の抑制、進行の遅延、対象の全体的健康もしくは幸福の改善、または当該技術分野にてよく知られた特定の疾患に固有の他のパラメータによるものである。治療は、有効であると思われる処置に対して完全に有効である必要はない。たとえば、骨損失の部分的な抑制または遅延は、少なくとも約５％の抑制、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％またはそれ以上である。
【００６４】
ＩＩ．いくつかの実施形態の概略
Ａ．概説
【００６５】
骨の質量及び強度の損失と定義される骨粗鬆症は、骨の構造的及び力学的支持の低下をもたらし、骨折リスクを上昇させる。成人の骨格において、骨は、破骨細胞によって実施される連続的な吸収と骨芽細胞による形成とを受け、骨の存在量が調節される。骨粗鬆症では、破骨細胞活性の過剰刺激が観察され、骨細胞外基質の破壊がもたらされる。正常な構造がなければ、骨芽細胞は、表現型的に正常な骨を構築することができない。エストロゲンを用いるホルモン補充療法は、骨芽細胞活性の上昇に有効であったが、乳癌及び子宮癌の発生率を上げることにもなった。ダイゼインなどの他の植物由来エストロゲン、すなわちフィトエストロゲンの研究が最近行われており、骨形成活性を有することがわかった。
【００６６】
本明細書にて開示するように、本発明者らは、一連のダイゼイン類似体を設計及び合成し、これらの化合物の骨形成誘導について調査した。３名の異なるドナーから得たヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をダイゼイン類似体で処置すると、エストロゲンまたはダイゼインと比較して、骨形成の向上がみられた。これらのダイゼイン類似体による骨形成能の向上により、骨形成前駆細胞の成熟骨芽細胞への成熟を調節する骨形成の転写因子である、オステリックス（Ｓｐ７）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）が増加した。
【００６７】
ダイゼインは、骨の健康に有益な効果のある強力なエストロゲン化合物であることが知られているが、その臨床的可能性は、その生物学的利用可能性の低さ、好ましくない代謝及び子宮に対するエストロゲン性により、限られている。
【００６８】
本明細書にて開示する研究では、一連のダイゼイン類似体の実用性を骨形成の促進の点から調査した。適切な刺激下で骨芽細胞に分化するヒト骨髄由来ＭＳＣの骨形成誘導に対して、ダイゼインの構造的変化がもたらす影響について調べた。
【００６９】
７位のヒドロキシとダイゼイン中心部分とに構造的変化を施し、こうした置換及びダイゼイン骨格の変化の結果として、骨形成活性がどのように変動するか試験した。ダイゼインの代謝産物であるエクオールが、ゲニステイン及び他のイソフラボンと比較して、優れた骨治癒力を担う可能性が近年になって示されているので、いくつかのエクオール類似体も合成し、活性の取得能を試験した。
【００７０】
本明細書で開示するように、ダイゼイン類似体は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における骨形成の強力な用量依存的刺激因子である。エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインで処置した細胞は、カルシウム沈着が、ビヒクル処置ＢＭＳＣに対してそれぞれ１．６倍、１．５倍及び１．４倍、ビヒクル処置ＡＳＣに対してそれぞれ１．６倍、１．７倍及び１．４倍増加した。比較すると、ダイゼイン類似体で処置した細胞は、骨形成の向上を示した。たとえば、ダイゼイン類似体２ｃ、２ｇ及び２ｌで処置したＢＭＳＣは、ビヒクル処置ＢＭＳＣに対してそれぞれ１．６倍、１．６倍及び１．９倍の骨形成分化の増加を示し、ダイゼイン類似体２ｃ、２ｇまたは２ｌで処置したＡＳＣは、ビヒクル処置ＡＳＣに対してそれぞれ１．７倍、２．０倍及び２．２倍の骨形成分化の増加を示した。したがって、本明細書に示す結果は、開示するダイゼイン誘導体が、骨粗鬆症、骨減少症及び骨折などの骨疾患及び骨損傷の治療に使用でき、骨形成の誘導に優れることを実証するものである。
【００７１】
さらに、ＡＳＣなどの間葉系幹細胞は、簡単に単離することができるので、開示するダイゼイン誘導体とともに、組織工学及び再生目的のための理想的な候補となる。たとえば、ＡＳＣ及びＢＭＳＣなどの間葉系幹細胞を生体適合性のスカフォールド上に播種し、骨形成を増加させることができる。加えて、本明細書にて開示するダイゼイン類似体をこれらのスカフォールドにコートすることができる。
【００７２】
さらに、これらの化合物を閉経後の女性に使用する場合、ダイゼイン類似体化合物の重要な利点は、これらの化合物の癌細胞へのエストロゲン作用が限定的なことである。これまでの研究では、ダイゼイン及びダイゼイン誘導体の癌の増殖または進行への影響は軽微であることが判明している。したがって、これらの化合物を化学療法または他の形態の癌治療と組み合わせて使用し、リスクのある患者における骨粗鬆症の発生率を下げることができる。さらに、これらの化合物は、他の抗骨粗鬆症剤と組み合わせて使用することができる。
【００７３】
Ｂ．化合物
【００７４】
本明細書においてダイゼイン誘導体及び／または類似体と総称して呼ぶ化合物が開示される。これらの化合物は、骨減少症、骨粗鬆症及び骨折などの骨疾患及び骨損傷などの骨欠損、または骨損失の予防もしくは阻害もしくは骨成長の刺激が望ましい他の損傷及び状況の治療に使用することができる。本化合物の他の使用は、以下の実施例に記載する他の使用の通り、間葉系幹細胞、たとえば、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）または脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）の骨形成能を上昇させるなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける骨形成に関与する初期、中期及び後期の遺伝子の誘導を包含する。特定の開示実施形態において、本化合物は、骨減少症、骨粗鬆症及び骨折の治療に有効である。本化合物は、小分子治療用である。特定の開示実施形態において、本小分子治療物質は、以下に示す式
【化３】
2016522167.tif 000005
式Ｉ
（式中、Ｒ１は、独立して、水素、
【化４】
2016522167.tif 000006
ＯＲ９またはこれらの任意の組み合わせであり、式中、Ｒ９は、独立して、水素または低級アルキルであり；Ｒ２は、独立して、水素であるか、Ｒ３と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つもしくは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得、またはこれらの任意の組み合わせであり；Ｒ３は、独立して、水素、アルキル、低級アルキル、アリル、シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、プロピン、２−（ピペリジン−１−イル）エチル、２−（ピロリジン−１−イル）エチル、もしくは２−（ジメチルアミノ）エチル、またはこれらの任意の組み合わせであり；Ｒ４は、独立して、水素であるか、Ｒ３と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、この場合Ｒ３は１つもしくは複数の低級アルキルで任意に置換され得、環は芳香環であり得、またはこれらの任意の組み合わせであり；Ｒ５は、独立して、水素、酸素またはＯＲ１０の１つもしくは複数またはこれらの任意の組み合わせであり、式中、Ｒ１０は、独立して、水素または低級アルキルであり；Ｒ６は、独立して、水素、炭素もしくは低級アルキルまたはこれらの任意の組み合わせであり；Ｒ７は、独立して、水素または結合であるか、Ｒ５と一緒になり、Ｒ７が結合である場合、Ｒ５及びＲ７は、５員環を形成し、この場合Ｒ５は、酸素であり、またはこれらの任意の組み合わせであり；Ｒ８は、独立して、水素またはＯＲ１１であり、式中、Ｒ１１は、独立して、水素もしくは低級アルキルであり、またはこれらの任意の組み合わせであり；Ｘは、炭素または窒素であり、Ｘが炭素である場合、Ｒ６は炭素であり、Ｘ及びＲ６が炭素−炭素結合で結合し；または上述のＲ基の任意の組み合わせである）を有する多環式化合物である。したがって、上述したＲ基の任意の置換基は任意の組み合わせまたは副次的組み合わせで選択され得ることは、当業者には極めて明らかであろう。
【００７５】
特定の実施形態において、当該化合物は、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ、またはグリセオリンＩＩでない。
【００７６】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｒ３と一緒になって、５員芳香環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｒ３と一緒になって、炭素−炭素二重結合、たとえば、Ｒ２を含む炭素−炭素二重結合を含み得る、６員環を形成する。当業者であれば、Ｒ２がＲ３と一緒になって環を形成する場合、Ｒ３はＲ４とともに環を形成できないことを理解するであろう。
【００７７】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｒ３と一緒になって、５員芳香環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｒ３と一緒になって、炭素−炭素二重結合、たとえば、Ｒ２を含む炭素−炭素二重結合を含み得る、６員環を形成する。当業者であれば、Ｒ４がＲ３と一緒になって環を形成する場合、Ｒ３はＲ２とともに環を形成できないことを理解するであろう。
【００７８】
Ｒ２が環状構造の一部であるいくつかの実施形態において、その環は、Ｒ２が１つまたは複数のメチル基で置換される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は水素である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は水素である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、Ｒ６はメチルである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、Ｘは炭素である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、Ｘは炭素であり、Ｒ６は炭素であり、ＸとＲ６は、単結合または二重結合であり得る炭素−炭素結合で結合している（たとえば、式Ｖ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩを参照）。
【００８４】
いくつかの実施形態において、Ｒ５は酸素、たとえば、単結合または二重結合した酸素である。結合が単結合である場合、炭素に結合した他の置換基は水素であることが想定される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、Ｒ５は、２つの水素であり、それぞれが個別に炭素に結合している。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｒ９は、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチルまたはｉ−ブチルである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ９は水素である。
【００８８】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化５】
2016522167.tif 000007
式ＩＩ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００８９】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化６】
2016522167.tif 000008
式ＩＩＩ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９０】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化７】
2016522167.tif 000009
式ＩＶ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９１】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化８】
2016522167.tif 000010
式Ｖ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９２】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化９】
2016522167.tif 000011
式ＶＩ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９３】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化１０】
2016522167.tif 000012
式ＶＩＩ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９４】
特定の開示実施形態において、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、以下に示す式
【化１１】
2016522167.tif 000013
式ＶＩＩＩ
（式中、Ｒ基は、式Ｉに関して上記で定義した通りである）を有する。
【００９５】
具体例として、開示するダイゼイン誘導体及び／または類似体は、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソプロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−ブトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−イソブトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−ヘキシルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−（アリルオキシ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、４−（８，８−ジメチル−２，３，４，８−テトラヒドロピラノ［３，２−ｇ］クロメン−３−イル）フェノール、２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）ベンズアミド、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−エトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、７−シクロペンチルオキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−８，８−ジメチル−２，３，９，１０−テトラヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−４（８Ｈ）−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−８−メチル−４Ｈ−フロ［２，３−ｈ］クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−プロポキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン、またはＮ−（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミドのうちの１つから選択される。
【００９６】
「溶媒和物」とは、化合物と１つまたは複数の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、種々の度合いのイオン結合及び共有結合を包含し、たとえば、共有結合による付加物及び水素結合による溶媒和物が挙げられる。特定の場合には、溶媒和物は、たとえば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶固形物の結晶格子内に組み込まれている場合、単離することができる。「溶媒和物」は、液相の溶媒和物と単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物には、エタノール会合化合物、メタノール会合化合物などが挙げられる。「水和物」は、溶媒分子がＨ２Ｏである溶媒和物である。
【００９７】
開示する化合物はまた、複数の塩形成基が存在する場合、混合塩及び／または内部塩を含む、塩を包含する。塩は、一般に、無毒性である薬学的に許容される塩である。塩は、いかなる種類（有機と無機の両方）のもの、たとえば、フマル酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩及びリン酸塩であってよい。一実施例において、塩は、元素周期表の第ＶＩＩ族を形成する非金属（たとえば、ハロゲン）を包含する。たとえば、化合物は、臭化水素酸塩として提供され得る。
【００９８】
塩形成基のさらなる例には、適切な塩基と塩を形成することができる、カルボキシル基、ホスホン酸基またはボロン酸基が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩には、たとえば、元素周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ及びＩＩＢ族の金属由来である無毒性金属カチオンを挙げることができる。一実施形態において、リチウム、ナトリウムもしくはカリウムイオンなどのアルカリ金属カチオン、またはマグネシウムもしくはカルシウムイオンなどのアルカリ土類金属カチオンを使用することができる。塩はまた、亜鉛またはアンモニウムカチオンであり得る。塩はまた、適切な有機アミン、たとえば、非置換もしくはヒドロキシル置換のモノ−、ジ−もしくはトリ−アルキルアミン、特にモノ−、ジ−もしくはトリ−アルキルアミン、または第四級アンモニウム化合物、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−、ビス−もしくはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、たとえば、モノ−、ビス−もしくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミンもしくはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンもしくはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、もしくはＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、または第四級アンモニウム化合物、たとえば、テトラブチルアンモニウム塩により形成され得る。
【００９９】
薬学的に許容可能な塩を形成するためのさらなる対イオンは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１２にみられる。一態様において、薬学的に許容可能な塩を使用することは、組成物の浸透圧を調節するのにも役立ち得る。
【０１００】
ある種の実施形態において、本方法に使用される化合物は、多形で提供される。したがって、化合物は、２つまたはそれ以上の物理的形態、たとえば、異なる結晶形、すなわち結晶質、液晶質または非晶質（アモルファス）形態で提供され得る。
【０１０１】
Ｃ．医薬品の製造のための使用
【０１０２】
上記の化合物（たとえば、ダイゼイン類似体もしくは水和物もしくはこれらの薬学的に許容可能な塩）またはこれらの組み合わせのいずれかは、対象における骨粗鬆症及び／もしくは骨折などの骨欠損の治療、ならびに／または骨成長の刺激のための医薬品の製造における使用が意図される。こうした医薬品に適した製剤、当該医薬品から利益を受け得る対象及び他の特徴については、本明細書中に別途記載する。
【０１０３】
Ｄ．合成方法
【０１０４】
開示するダイゼイン類似体は、当該技術分野において知られている任意の方法によって合成することができる。開示化合物の合成に有用な一般的に知られている化学合成スキーム及び条件は、多くの一般的な参考文献に記載されており、入手可能である（たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１、またはＶｏｇｅｌ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照）。
【０１０５】
本明細書に記載の化合物は、ＨＰＬＣ、分取薄膜クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を含む、当該技術分野において知られている手段のいずれかによって精製され得る。順相及び逆相ならびにイオン性樹脂を含む、任意の適切な固定相を使用することができる。最も一般的には、開示化合物は、オープンカラムクロマトグラフィーまたは分取クロマトグラフィーによって精製される。
【０１０６】
以下の実施例にて、ダイゼイン類似体の好適な例示的合成を記載する（たとえば、実施例１を参照）。
【０１０７】
Ｅ．医薬組成物
【０１０８】
開示するダイゼイン類似体は、少なくとも、たとえば、骨減少症、骨粗鬆症及び／もしくは骨折を有するか、または有すると思われる対象における骨欠損、たとえば骨疾患もしくは骨損傷を予防もしくは治療するために、または／ならびに対象における骨成長を刺激するために有用であり得る。したがって、少なくとも１つの開示するダイゼイン類似体を含有する医薬組成物などの組成物もまた本明細書にて記載される。
【０１０９】
医薬組成物の製剤は、当該技術分野においてよく知られている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２には、ダイゼイン類似体の薬学的送達に適した例示的な製剤（及びそれらの成分）が記載されている。これらの化合物の少なくとも１つを含有する医薬組成物は、ヒトまたは獣医学の使用のために製剤化され得る。開示する医薬組成物の具体的な製剤は、たとえば、投与形態（たとえば、経口または非経口）及び／または治療すべき障害（たとえば、骨粗鬆症及び／または骨折）に依存し得る。いくつかの実施形態において、製剤は、少なくとも１つの有効成分、たとえば、開示するダイゼイン類似体に加えて、薬学的に許容可能な担体を含む。
【０１１０】
開示する方法及び組成物に有用な薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野における従来のものである。薬学的担体の性質は、採用される具体的な投与様式に依存する。たとえば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容可能な流体をビヒクルとして含む、注入可能な流体を含む。散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤形態などの固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体は、たとえば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒性補助物質または賦形剤、たとえば、湿潤剤または乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤、たとえば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどを任意で含有し得る。他の非限定的な賦形剤には、クレモフォールなどの非イオン性溶解剤、またはヒト血清アルブミンもしくは血漿調製物などのタンパク質が挙げられる。
【０１１１】
開示する医薬組成物は、薬学的に許容可能な塩として製剤され得る。他の好適な薬学的に許容可能な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ，２１１２にみられる。薬学的に許容可能な塩はまた、組成物の浸透圧を調節するのにも役立ち得る。
【０１１２】
開示する医薬組成物の剤形は、選択される投与様式によって決定される。たとえば、注入可能な流体に加えて、経口剤形も採用することができる。経口製剤は、シロップ剤、液剤もしくは懸濁剤などの液体、または散剤、錠剤もしくはカプセル剤などの固体であり得る。このような剤形を作製する方法は、当業者に知られているか、または、当業者には明らかであろう。
【０１１３】
ある種の実施形態では、開示する化合物を含有する医薬組成物は、個々の正確な用量の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。投与されるダイゼイン類似体などの有効成分の量は、治療を受ける対象、障害の重症度及び投与方法に依存し、当業者には知られている。これらの制限内で、投与される製剤は、ある量の本明細書に開示の抽出物または化合物を、治療を受ける対象に所望の効果を達成するのに有効な量で含む。
【０１１４】
特定の実施例において、経口投与の場合、本組成物は、約１．０〜約５０ｍｇの有効成分、特に、治療を受ける対象への用量を症状によって調整するために、約２．０ｍｇ、約２．５ｍｇ、５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。１つの例示的な経口投与計画では、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ（約２ｍｇ〜約１０ｍｇなど）の有効成分を含有する錠剤を１日２〜４回、たとえば２回、３回または４回投与する。
【０１１５】
他の実施例では、非経口投与での好適な用量は、１キロ当たり約１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量であり、非経口投与される約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇを含む。しかしながら、これよりも高い用量または低い用量、たとえば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇを含む、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇなどの用量も使用され得る。
【０１１６】
開示する組成物の１つまたは複数を含有する組成物の単回または複数の投与は、治療を行う医師が選択する用量レベル及びパターンで実施され得る。一般に、複数の用量が投与される。特定の実施例において、本組成物は、１日に１回、非経口投与される。しかしながら、本組成物は、１日に２回、１日に３回、１日に４回、１日に６回、隔日、１週間に２回、週に１回、月に１回投与することができる。治療は、通常、少なくとも１ヶ月間、通例では２または３ヶ月間、場合により６ヶ月間または１年間継続し、さらに、無期限、すなわち慢性的に継続し得る。治療の再開も可能である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物などの組成物は、間葉系幹細胞、たとえば、ＢＭＳＣまたはＡＳＣなどの本明細書に記載する間葉系幹細胞などを含む。間葉系幹細胞を取得するための方法は、当該技術分野において知られており、代表的な方法を以下の実施例にて記載する。いくつかの実施例では、投与の前に、間葉系幹細胞を化合物で前処置して、間葉系幹細胞の骨形成能を増大させる。いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩのうちの１つまたは複数で前処置する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する組成物及び方法は、間葉系幹細胞を利用する。間葉系幹細胞は、成体幹細胞などの幹細胞であり、２つ以上の特定の細胞型の完全分化細胞を生み出す能力を持つ。しかしながら、間葉系幹細胞は、動物の完全分化細胞のすべての型を生み出す能力を持たない。すなわち、間葉系幹細胞は、胚性幹細胞のように分化全能性ではない。間葉系幹細胞は、出生後の動物、たとえば、マウスまたはヒトなどの発育期、青年期または成体の動物中に少数存在する。これらの多能性幹細胞は、組織から精製し、間葉系幹細胞の供給源及び幹細胞の曝露条件に応じて、完全分化細胞の種々の型への分化を誘導することができる。
【０１１９】
間葉系幹細胞は、骨髄、たとえば、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨などの部位または他の骨髄腔から得ることができる。間葉系幹細胞の他の供給源には、胎盤、臍帯、骨膜、皮膚及び血液が挙げられる。間葉系幹細胞、たとえば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞などの複数の細胞型への分化能を有している（たとえば、Ｐｈｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２８９６−２９０２，２００７；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２７３９−２７４９，２００７を参照）。特定の実施例において、間葉系幹細胞は、骨髄から取得される。自己由来または同種間の間葉系幹細胞を本明細書に記載する方法に使用することができる。好ましい実施例において、間葉系幹細胞は、骨回復を必要とする対象の自己由来のものである。
【０１２０】
間葉系幹細胞はまた、脂肪組織（たとえば、皮下白色脂肪、たとえば、腹部、胸部、大腿部または腕部に由来する脂肪組織）から取得することができる。これらの細胞は、処理済み吸引脂肪細胞（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １３：４２７９−４２９５，２００２参照）または脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００：１２４９−１２６０，２００７参照）と呼ばれる。ＡＳＣは、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及び神経様細胞を含む、複数の細胞型への分化能を有する。ＡＳＣを単離するための方法は、当業者に知られており、たとえば、吸引脂肪から調製し、沈殿した間質血管細胞分画から単離される。たとえば、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００：１２４９−１２６０，２００７を参照されたい。自己由来または同種間のＡＳＣを本明細書に記載する方法に使用することができる。好ましい実施例において、ＡＳＣは、骨回復を必要とする対象の自己由来のものである。
【０１２１】
一実施形態において、医薬組成物は、骨粗鬆症及び／もしくは骨折の治療、ならびに／または骨成長の刺激のための第２の薬剤の同時投与なく、投与される。１つの特定の非限定的な実施例において、他の薬剤の同時投与なく、たとえば、同じく骨粗鬆症及び／もしくは骨折を標的にすることが知られている追加の薬剤、ならびに／または骨成長を刺激するための追加の薬剤の同時投与なく、本開示の組成物の１つまたは複数が投与される。他の特定の非限定的な実施例において、骨粗鬆症及び／もしくは骨折を標的にする追加の治療、ならびに／または骨成長を刺激するための追加の治療を含む、追加の作用物質と同時に、治療的有効量の開示医薬組成物が投与される。
【０１２２】
請求項１〜２１に記載のいずれかの化合物、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩを用いた処置によって改変させた、ＢＭＳＣまたはＡＳＣなどの単離間葉系幹細胞を含む、任意の骨疾患または骨損傷の治療のための組成物も開示される。
【０１２３】
Ｆ．使用方法
【０１２４】
本開示は、対象の骨疾患または骨損傷などの骨欠損に関連した１つまたは複数の徴候または症状の予防または阻害を含む、障害を治療するための方法を含む。いくつかの実施例では、対象の骨疾患または骨損傷は、骨減少症または骨粗鬆症である。いくつかの実施例では、対象の骨疾患または骨損傷は、骨折である。対象、たとえば、骨粗鬆症及び／または骨折を有する対象の骨成長を刺激するための方法も開示される。
【０１２５】
開示する方法は、１つまたは複数の開示するダイゼイン類似体（及び任意で１つまたは複数の他の医薬物質、たとえば、間葉系幹細胞）を、薬学的に許容可能な担体中で、対象の骨疾患または骨損傷などの骨欠損、たとえば、骨粗鬆症及び／もしくは骨折などを治療するのに有効な量、または対象の骨成長を刺激するのに有効な量で、対象に投与することを含む。治療は、たとえば、骨粗鬆症を有する対象の骨密度の低下を抑制もしくは遅延することによって、または骨折などの骨損傷部位における骨の再生もしくは内部成長によって、骨欠損に関連した徴候または症状を予防または低減することを含む。骨損失のかかる抑制は、いくつかの実施例において、たとえば、骨粗鬆症を有するか、骨粗鬆症の疑いがある対象で、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％の骨損失の抑制であり得る。骨折などの骨損傷部位における骨の再生または内部成長は、いくつかの実施例において、たとえば、対象と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％の骨成長の増加であり得る。いくつかの実施例では、間葉系幹細胞が、開示するダイゼイン類似体とともに、たとえばダイゼイン類似体の投与前、投与中または投与後に、投与される。いくつかの実施例では、投与の前に、間葉系幹細胞を化合物で前処置して、間葉系幹細胞の骨形成能を増大させる。いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩのうちの１つまたは複数で前処置する。いくつかの実施例では、間葉系幹細胞は、骨成長または骨損失の抑制が望まれる場所である損傷部位または体内に、たとえば注入または他の方法、たとえば、生体適合性骨回復システムに基づいて投与される。
【０１２６】
開示する方法に有用な投与経路には、経口及び非経口経路、たとえば、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、経直腸、局所、経眼、経鼻及び経皮が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
１つまたは複数のダイゼイン類似体の有効量は、少なくとも、具体的な使用方法、治療を受ける対象、腫瘍の重症度、治療用組成物の投与方法に依存する。組成物の「治療的有効量」とは、治療を受ける対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の化合物の量である。たとえば、当該量は、骨損失の予防もしくは阻害及び／または骨成長の刺激に必要である、開示するダイゼイン類似体の量であり得る。理想的には、開示するダイゼイン類似体の治療的有効量は、対象に実質的な副作用を引き起こすことなく、骨損失の予防もしくは阻害及び／または骨成長の刺激に十分な量である。
【０１２８】
開示するダイゼイン類似体または医薬組成物の治療的有効量は、当業者によって決定され得る。用量範囲の一例は、単回または分割用量で経口的に約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施例において、用量範囲は、単回または分割用量で経口的に約０．００５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である（平均体重約７０ｋｇを想定、平均を超えるまたは下回る個人については値を適宜調整）。経口投与の場合、本組成物は、たとえば、約１．０〜約５０ｍｇの有効成分、特に、治療を受ける対象への用量を症状によって調整するために、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。１つの例示的な経口投与計画では、約１ｍｇ〜約５０ｍｇの有効成分を含有する錠剤が１日２〜４回、たとえば２回、３回または４回投与される。
【０１２９】
他の実施例では、非経口投与での好適な用量は、１キロ当たり約１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量であり、非経口投与される約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇを含む。しかしながら、これよりも高い用量または低い用量、たとえば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇを含む、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇなどの用量も使用され得る。
【０１３０】
本開示の組成物の１つまたは複数を含有する組成物の単回または複数の投与は、治療を行う医師が選択する用量レベル及びパターンで実施され得る。一般に、複数の用量が投与される。特定の実施例において、本組成物は、１日に１回、非経口投与される。しかしながら、本組成物は、１日に２回、１日に３回、１日に４回、１日に６回、隔日、１週間に２回、週に１回、月に１回投与することができる。治療は、通常、少なくとも１ヶ月間、通例では２または３ヶ月間、場合により６ヶ月間または１年間継続し、さらに、無期限、すなわち慢性的に継続し得る。治療の再開も可能である。
【０１３１】
任意の特定の対象に関する用量の具体的な用量レベル及び頻度は、変動し得、特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、対象の年齢、体重、全般的な健康、性別及び食事、投与の様式及び時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、ならびに治療を受けている対象の状態の重症度などの種々の因子に依存する。
【０１３２】
本開示の治療を開始する前に、たとえば、骨損失の抑制及び／または骨成長の刺激を必要とする対象を選択するために、対象をスクリーニングすることができる。簡単に言えば、本方法は、対象が治療的処置を必要としているかどうかを判断するために、たとえば、対象が骨粗鬆症もしくは骨折などの骨疾患もしくは骨損傷を有するか、またはその疑いがあるかどうかを判断するために、対象をスクリーニングすることを含む。骨粗鬆症または骨折などの骨疾患または骨損傷を有する対象が選択される。一実施例では、対象は、臨床的徴候、臨床検査またはこの両方によって、骨粗鬆症または骨折などの骨疾患または骨損傷と診断される。たとえば、骨粗鬆症の場合、定量的コンピュータ断層撮影を使用して、骨髄密度を評価することができる。骨折の場合、簡単なＸ線技術で十分であり得る。
【０１３３】
本明細書に開示する治療用薬剤（開示するダイゼイン類似体を含むものなど）の投与の前の予備スクリーニングは必要ない。
【０１３４】
１回または複数の治療投与の後、骨損失の抑制または骨成長の刺激について、対象をモニタリングすることができる。特定の実施例において、対象は、１回または複数回分析される。画像解析を含む、本明細書に記載する方法などの当該技術分野において知られる任意の方法を使用して、対象をモニタリングすることができる。
【０１３５】
特定の実施例において、対象が治療に対して安定であるか、または軽微な応答、種々の応答もしくは部分的な応答を有する場合、再評価の後に、これまでに受けたものと同じ計画及び同じ薬剤の調製で、対象の寿命期間を含めた所望の時間量で、対象を再治療することができる。
【０１３６】
いくつかの実施例では、本方法は、治療的有効量の開示するダイゼイン類似体を追加の治療的処置とともに投与することを含み、特定の実施例では、骨損失を予防もしくは阻害するか、または骨成長を刺激する、治療量の薬剤の投与前、投与中または投与後に投与することをさらに含む。いくつかの実施例では、間葉系幹細胞が、開示するダイゼイン類似体とともに、たとえばダイゼイン類似体の投与前、投与中または投与後に、投与される。いくつかの実施例では、投与の前に、間葉系幹細胞を化合物で前処置して、間葉系幹細胞の骨形成能を増大させる。いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩのうちの１つまたは複数で前処置する。いくつかの実施例では、間葉系幹細胞は、骨成長または骨損失の抑制が望まれる場所である損傷部位または体内に、たとえば注入または他の方法、たとえば、生体適合性骨回復システムに基づいて投与される。
【０１３７】
Ｇ．生体適合性骨回復システム
【０１３８】
開示するダイゼイン類似体及び／または開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩもしくはグリセオリンＩＩで処置した間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞がコート及び／または播種された生体適合性基材を含む、生体適合性骨回復システムもまた本明細書にて開示される。骨損失部位に生体適合性基材を外科的に埋入することを含む、開示する生体適合性骨回復システムを用いて骨欠損を治療するための方法もまた提供される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、生体適合性基材は、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩ及び／またはグリセオリンＩＩのうちの１つまたは複数でコートされる。生体適合性基材は、部分的または完全にコートされ得る。さらなる実施例において、生体適合性基材は、実質的にコートされる。
【０１４０】
結合剤を含めた任意の化学的または機械的な結合または力を用いて、生体適合性基材をコートすることが考えられる。たとえば、第１の物質からなる生体適合性基材を、第３の物質である結合剤を介して、第２の物質（たとえば、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩ）で「コートする」ことができる。さらなる実施例において、生体適合性基材を、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩに含浸させる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞は、生体適合性基材上に播種される。基材への播種は、細胞が基材に接触するか、細胞が基材に付着するように細胞を基材に導入することを含む。好適な基材には、たとえば、スポンジ、ストリップ、スカフォールド、ゲルまたは三次元インプラントが挙げられ、コラーゲンまたはゼラチン、ヒアルロン酸、ポリマー（ナイロンまたはポリエステルなど）、ポリマー−ヒアルロン酸、ポリマー−生体活性ガラス、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイトの各表面、もしくは他の生物学的に適合可能な成分、または他のスカフォールドを含み得る。基材へ播種するための方法は、基材を細胞懸濁液とともにインキュベートすること、細胞懸濁液を基材に接触させて基材に細胞を含浸させること、または基材を細胞懸濁液に接触させて減圧にすることを含む。
【０１４２】
いくつかの実施例では、細胞が基材に浸透するか、基材に付着するのに十分な時間、基材を細胞懸濁液中（培地中に懸濁した細胞など）でインキュベートする。細胞懸濁液は、約１×１０３〜約１×１０９の細胞、たとえば、約１×１０５〜約１×１０７の細胞、たとえば、約２×１０６の細胞を含み得る。いくつかの実施例では、約１日〜約１０日、たとえば、約３日〜約７日、たとえば、約５日または約７日間、基材を細胞懸濁液中でインキュベートする。
【０１４３】
追加の実施例では、細胞懸濁液を基材表面に直接塗布し、懸濁液が基材（たとえば、スポンジ）に含浸するようにする。いくつかの実施例では、基材１ｍｍ当たり約１００，０００細胞〜基材１ｍｍ当たり約５００万細胞、たとえば、基材１ｍｍ当たり約５００，０００細胞〜基材１ｍｍ当たり約３００万細胞、または基材１ｍｍ当たり約１００万細胞〜基材１ｍｍ当たり約２００万細胞の細胞懸濁液が基材表面に塗布される。
【０１４４】
さらなる実施例において、基材を細胞（細胞懸濁液など）と接触させて、減圧にする。いくつかの実施例では、約４００ｍｍＨｇの減圧にして、細胞を基材に吸い込ませる。他の実施例では、重力によって細胞を基材に吸い込ませてもよい。
【０１４５】
基材が非多孔質材料（非多孔質ポリマー、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイトまたは金属など）である場合、細胞を基材の表面に直接播種し、細胞が基材表面に付着するようにしてもよい。
【０１４６】
細胞の基材への播種は、当該技術分野において知られている方法によって評価することができる。いくつかの実施例では、細胞の存在について、たとえば光学顕微鏡検査によって基材を目視検査する（透明基材の場合など）。他の実施例では、細胞を免疫蛍光法によって検出することができる（細胞タンパク質、たとえばアクチンの存在についての染色など）。細胞は、基材の外表面に付着させてもよいし、多孔質基材（スポンジまたはヒドロゲル）の場合は、基材の間隙などの基材の内部に細胞が存在してもよい。他の実施例では、細胞の基材への播種は、組織学染色（ヘマトキシリン及びエオシンなど）、核酸染色（核染色、たとえば４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）またはＨｏｅｃｈｓｔ染色を用いるものなど）、または免疫組織化学（たとえば、細胞によって発現されたアクチンなどのタンパク質の染色）を用いて細胞を染色することによって評価することができる。
【０１４７】
いくつかの実施例では、間葉系幹細胞の生体適合性基材上への播種後、基材上の細胞数が増加するように、たとえば、細胞がコンフルエントに達するまで、基材と細胞をさらなる一定時間培養する。他の実施例では、基材と細胞を、予め定めた時間、たとえば、約３日〜約１５日、約５日〜約１０日または約７日などの約１日〜約２０日間培養する。いくつかの実施例では、細胞を含有する基材を、開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩを含む培地中で培養する。
【０１４８】
いくつかの実施例では、生体適合性基材上への播種後の間葉系幹細胞の培養は、標準的な細胞培養技術、たとえば、細胞培養フラスコ、ディッシュまたはマルチウェルプレートなどを用いて実施される。培養条件は、培養物中の特定の細胞に適した条件であり、たとえば、約５％ＣＯ２の加湿環境下にて約３７℃での培養である。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、生体適合性埋植可能骨回復システムの構成要素である生体適合性基材の使用を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性埋植可能骨回復システムには、１つまたは複数の開示するダイゼイン類似体及び／または開示するダイゼイン類似体、ダイゼイン、グリシノール、グリセオリンＩもしくはグリセオリンＩＩで前処置した間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞がコート及び／または播種される。いくつかの実施例では、骨欠損を治療するために、生物学的に適合可能な基材を、対象内の骨欠損部位に外科的に埋入する。
【０１５０】
生体適合性基材は、１つまたは複数のタンパク質（たとえば、Ｉ型コラーゲンなどのコラーゲンまたはゼラチンなど）、ポリマー（たとえば、ナイロンまたはポリエステル）、ポリマー−ヒアルロン酸、ポリマー−生体活性ガラス、リン酸三カルシウム、ヒアルロン酸の各表面、ヒドロキシアパタイト、またはこれらの混合物を含み得る。いくつかの実施例では、基材は、ナイロン、絹、またはＤＡＣＲＯＮ（登録商標）ポリエステルなどの線維であり得る（たとえば、Ｂａｒｒｏｓ  Ｄ’Ｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９２：６４５−６５７，１９８０）。他の実施例では、基材は、チタンなどの金属を含み得る。
【０１５１】
生物学的に適合可能な基材は、スカフォールドまたは他の支持構造、たとえば、スポンジ、ストリップ、ゲル（ヒドロゲルなど）、スカフォールド、または他の三次元構造の形態であってよい。一実施例では、基材はスポンジである。特定の実施例において、生物学的に適合可能な基材は、コラーゲンまたはゼラチンスポンジである（ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）またはＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．）など）。他の特定の実施例では、生物学的に適合可能な基材は、ナイロンストリップである。
【０１５２】
基材は、一般に、三次元形状、たとえば、立方体、長方形ブロック、三角形、楔型または他の適切な形状である。特定の実施例において、基材は、回復させる特定の骨欠損に適合するように成形される。基材はまた、本質的に二次元形状、たとえばストリップであってもよい。生体適合性基材は、対象における特定の骨欠損の回復に適した大きさと形状を有する。たとえば、三次元基材は、約１ｍｍ３〜約５０ｍｍ３、たとえば、約５ｍｍ３〜約１０ｍｍ３などの約２ｍｍ３〜約２５ｍｍ３の体積を有し得る。いくつかの実施例では、本基材は、約０．５インチ×０．２５インチ〜約１インチ×１インチの寸法を有する。しかしながら、当業者であれば、基材の寸法は、回復させる骨欠損の大きさによって決定されることを認識するであろう。追加の実施例では、埋植可能骨回復システムは、骨欠損よりも大きい寸法で作製され、当該欠損に埋入する前に適切な大きさに切断され得る。
【０１５３】
生体適合性基材については、当該技術分野においてよく知られている（たとえば、米国特許第５，７００，２８９号及び同６，５４１，０２４号を参照）。生体適合性基材の例には、生分解性及び生体適合性のポリマースカフォールドが挙げられる（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  １：１２７−１３８，２００４参照）。これらのスカフォールドは、通常、１つまたは複数の生分解性ポリマーの混合物を含み、たとえば、限定するものではないが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）コポリマーなどの飽和脂肪族ポリエステル、ポリプロピレンフマレート（ＰＰＦ）などの不飽和線状ポリエステル、またはポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などの微生物生産脂肪族ポリエステル（Ｒｅｚｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７：３４１３−３４３１，２００６；Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．４４７：２２１−２３６参照）がある。種々の成分の比率を変化させることにより、異なる機械的特性を有するポリマースカフォールドが得られる。一般に使用されるスカフォールドは、ＰＬＡとＰＧＡの比率が約７５：２５であるが、この比率は具体的な用途に応じて変化し得る。他の一般に使用されるスカフォールドには、表面生侵食性ポリマー、たとえば、トリメリチルイミドグリシン（ＴＭＡ−ｇｌｙ）もしくはピロメリチルイミドアラニン（ＰＭＡ−ａｌａ）などのポリ（無水物）、または高分子量のポリ（オルガノホスファゼン）（Ｐ［ＰＨＯＳ］）などのポリ（ホスファゼン）、及び他の生体活性セラミックスが挙げられる。
【０１５４】
基材を製造するための材料の他の種類は、ヒドロキシアパタイト、またはリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）もしくはリン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）から形成されるセラミックである。カルシウムヒドロキシアパタイトは、地質堆積物として、また、通常の生体組織、主に、脊椎動物の骨、軟骨、エナメル質、象牙質及びセメント質、ならびに血管及び皮膚などの病的石灰化の多くの部位に自然発生する。合成カルシウムヒドロキシアパタイトは、純粋なＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、もしくはたとえば炭酸塩、フッ化物、塩化物などの他のイオンを含む純粋でないヒドロキシアパタイトとして、または、カルシウムを欠く結晶、もしくはカルシウムが部分的または完全にバリウム、ストロンチウム及び鉛などの他のイオンに置き換わっている結晶として実験室で形成される。
【０１５５】
リン酸カルシウムセラミックスは、非毒性、非免疫原性であり、骨の主成分であるカルシウムイオン及びリン酸イオンで構成されるので、これらの材料を骨欠損の回復におけるインプラントとして使用することができる。リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）［Ｃａ３（ＰＯ４）２］と、ヒドロキシアパタイト［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］の２つが広く使用されている。リン酸カルシウムインプラントは、骨伝導性であり、骨に直接結合できる明確な能力を有する。
【０１５６】
他の実施例では、延性のあるイオン性ヒドロゲルを形成することができるポリマーも生体適合性基材として用いることができる。ヒドロゲルは、他の基材を用いることなく、細胞を輸送し、新しい組織の形成を促進するために利用することができる。一実施例では、ヒドロゲルはポリマーのイオン性塩をイオンで架橋することによって作製され、その強度はイオンまたはポリマーの濃度が高くなるにつれて向上する。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋したときに、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元の開放格子構造を作り出す物質として定義される。ヒドロゲルの形成に使用することができる材料の例には、イオン結合により架橋されるアルギン酸塩などの多糖類、ポリホスファゼン及びヒドロキシエチルメタクリレートなどのポリアクリレート、またはそれぞれ温度もしくはｐＨで架橋されるＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）もしくはＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックコポリマーが挙げられる。他の材料には、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ヒアルロン酸及びコラーゲンが挙げられる。
【０１５７】
生物学的に適合可能な基材にはまた、ゼラチン、セルロースまたはコラーゲンを用いた材料が挙げられる。いくつかの実施例では、ゼラチンを用いた基材には、架橋ゼラチンの吸収性スポンジ、粉末またはフィルム、たとえば、変性コラーゲンから作られるＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）（Ｕｐｊｏｈｎ，Ｉｎｃ．，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈ．）が挙げられる。セルロースを用いた基材には、再生酸化セルロースシート材料などの適切な吸収性セルロース、たとえば、ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．）またはＯｘｙｃｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。生物学的に適合可能なコラーゲンベースの基材には、精製ウシ真皮コラーゲンなどの適切な吸収性コラーゲン、たとえば、ＡＶＩＴＥＮＥ（登録商標）（ＭｅｄＣｈｅｍ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、ＨＥＬＩＳＴＡＴ（登録商標）（Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，Ｍｏ．）、ＨＥＭＯＴＥＮＥ（登録商標）（Ａｓｔｒａ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓ．）またはＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１５８】
本明細書に記載する生体適合性埋植可能骨回復システムを用いる、骨欠損を治療するための方法が提供される。本方法は、上記の生体適合性埋植可能骨回復システムを準備することを含む。本骨回復システムは、骨欠損を治療するために、骨欠損部位に外科的に埋入される。いくつかの実施例では、骨回復システムは、回復させる欠損に適合する大きさに調整する。特定の実施例において、骨回復システムは、所定の位置に、たとえば頭蓋骨内の骨欠損に、たとえば開頭手術または他の頭蓋骨折において（ヒアルロン酸または瞬間接着剤などにより）接合させる。他の実施例では、骨回復システムは、所定の位置に、金属製またはプラスチック製ネジなどを用いて固定させる。いくつかの実施例では、本基材は、骨折箇所を覆うように伸ばすことができる線維、または欠損内部（たとえば、大きな破断または難治性骨折の場合）に多層膜として配置できる線維（ナイロン、絹またはＤＡＣＲＯＮ（登録商標）など）を含む。本方法は、ヒトまたは非ヒト対象に使用することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する生体適合性埋植可能骨回復デバイスは、骨の破断強度及び弾性率を減少させるなどの骨の強度、機能及び／または完全性に影響を及ぼす疾患、欠損または障害に起因する骨欠損を有する対象を治療するために用いられる。骨疾患の例には、骨脆弱性による疾患、たとえば、骨粗鬆症または骨減少症が挙げられるが、これらに限定されない。他の例には、肉腫（たとえば骨肉腫）などの骨の悪性腫瘍及び／または癌に罹患している対象の骨欠損が挙げられる。
【０１６０】
埋植した骨回復デバイスが骨欠損を治療するかどうかを判断するアッセイは、当該技術分野において知られている。好適なアッセイの非限定的な例には、放射線透過法（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３５：１２４７−１２５５，２００４；Ｒｕｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３２：５９１−６０１，２００３；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１３：９４２−９４９，１９９８）；マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）法（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１３：９４２−９４９，１９９８；Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３５：１２４７−１２５５，２００４；Ｔａｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：１６０５−１６１１，２００３；Ｓｈｅｆｅｌｂｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３６：４８０−４８８，２００５）；末梢骨定量的コンピュータ断層撮影法（Ｒｕｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３２：５９１−６０１，２００３；Ｔａｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：１６０５−１６１１，２００３）；二重エネルギーＸ線吸収測定法（Ｈｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３６６：２５８−２６３，１９９９；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１３：４２−９４９，１９９８）；組織形態計測法（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３５：２４７−１２５５，２００４；Ｔａｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８：１６０５−１６１１，２００３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１７：７９１−７９９，２００２；Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０：８１６−８２２；２００２；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１３：９４２−９４９，１９９８；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０：４８６−４９１，２００２）；コラーゲンのマッソントリクローム染色（Ｒｕｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３２：５９１−６０１，２００３）；コラーゲンのゴールドナー染色（Ｈｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３６６：２５８−２６３；１９９９）；骨のフォンコッサ銀染色（Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０：８１６−８２２，２００２）；コラーゲンのサフラニンオレンジ染色（Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０：８１６−８２２，２００２）；及び免疫組織化学法（Ｒｕｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３２：５９１−６０１，２００３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１７：７９１−７９９，２００２；Ｓａｆａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９６：５１−６２，２００３；Ｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１２：９６−１０２，１９９７）が挙げられる。
【０１６１】
骨欠損を治療することには、骨欠損部位の空隙または構造的な不連続部分を少なくとも部分的に埋めるのに十分な新しい骨形成の刺激が含まれる。骨欠損の治療は、完全な治癒の過程、または欠損を欠損前の状態に修復するのに１００％有効である治療である必要はない。骨欠損の治療成功には、部分的な回復または治癒、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の骨欠損が新しい骨材料で埋まることが含まれる。
【０１６２】
Ｈ．代表的な骨欠損
【０１６３】
骨欠損は、致命的欠損または難治性骨折などの骨折であり得る。骨折は、骨にひびが入るか、骨が折れた状態、すなわち骨が離断した状態である。骨折は、閉鎖性（皮膚に損傷がない場合など）または開放性（外気にさらされている場合、たとえば、皮膚を貫くものまたは重度の組織損傷によるものなど）に分類することができる。骨折はまた、単独骨折または多骨片骨折に分類される。単独骨折は、１つの線にのみ沿って生じ（たとえば、１つの骨が２つの断片に分断）、多骨片（または粉砕）骨折は、１つの骨が複数の断片（たとえば、３つまたはそれ以上の断片）に分断する。他の種類の骨折には、完全骨折（骨片が完全に離断している場合など）、不全骨折（骨片が少なくとも部分的に接触している場合など）、縦骨折（骨の長軸に対して平行な骨折など）、横骨折（骨の長軸に対して直角な骨折など）、斜骨折（骨の長軸に対して斜めの骨折など）、圧迫骨折（たとえば骨粗鬆症の結果としての椎体の崩壊など）、螺旋骨折（骨折した骨の少なくとも一部分がねじれている場合など）、及び圧縮骨折（骨片が互いにぶつかることによって生じる骨折など）が挙げられる。小児の場合、骨折には若木骨折（骨は完全に破断していないが、骨皮質の完全な分断なく反りを呈する骨折など）も挙げられる。特定の実施例において、骨折は、致命的欠損（たとえば、骨の一部の消失または一部が除去される場合）及び難治性骨折（たとえば、骨折末端が互いに接触しない場合）を包含する。
【０１６４】
欠損または骨折は、いずれの骨におけるものでもよく、限定するものではないが、頭骨の骨、たとえば、前頭骨、頭頂骨、側頭骨、後頭骨、蝶形骨、篩骨などの頭蓋骨、頬骨、上下顎骨、鼻骨、下顎骨、口蓋骨、涙骨、鋤骨、下鼻甲介などの顔面骨、槌骨、砧骨、鐙骨などの耳の骨、舌骨、鎖骨または肩甲骨などの肩の骨、胸骨または肋骨などの胸郭の骨、頸椎、腰椎、胸椎を含めた脊柱の骨、上腕骨、尺骨及び橈骨を含めた腕の骨、舟状骨、月状骨、三角骨、豆状骨、大菱形骨、小菱形骨、有頭骨、有鉤骨を含めた手の骨、中手骨などの手のひらの骨、基節骨、中節骨及び末節骨などの指の骨、腸骨、仙骨及び尾骨などの骨盤の骨、大腿骨、脛骨、膝蓋骨及び腓骨などの脚の骨、踵骨、距骨、舟状骨、内側楔状骨、中間楔状骨、外側楔状骨、立方骨、中足骨、基節骨、中節骨及び末節骨などの足の骨ならびに骨盤骨が挙げられる。一実施例では、骨折は、骨外の骨形成なく、たとえば、軟組織における骨形成なく、回復される。
【０１６５】
脊椎固定を促進することによって骨欠損を治療するための方法もまた提供される。脊椎固定は、限定するものではないが、頸椎、腰椎、胸椎を含む、椎骨のいずれかにて誘導することができる。一実施例では、脊椎固定は、骨外の骨形成なく、たとえば、軟組織における骨形成なく、生じる。他の実施例では、口蓋裂、顎の損傷または欠損及び顔面骨折などの歯または顔面骨の欠損を治療するための方法が提供される。
【０１６６】
骨折治癒の自然過程は、損傷を受けた骨及び周囲組織が出血するときに開始する。血液が凝固し、断片間に配置される血餅を形成する。数日内に、血管が血餅のゼリー様マトリックスに成長する。新しい血管は、その領域に白血球を運び、非生存物質が徐々に除去される。血管はまた線維芽細胞を血管壁に運び、線維芽細胞が増殖し、コラーゲン線維を産生する。このようにして、血餅がコラーゲンのマトリックスに置き換えられる。
【０１６７】
Ｉ．臨床試験
【０１６８】
骨障害を治療するための本開示のダイゼイン類似体の１つまたは複数の使用に対する規制当局の認可を得るために、臨床試験が実施される。当該技術分野で知られているように、臨床試験は、第Ｉ相、第ＩＩ相、第ＩＩＩ相及び第ＩＶ相と称される検査段階を経て進められる。
【０１６９】
初めに、本開示のダイゼイン類似体を第Ｉ相試験において評価する。通常、第Ｉ相試験は、化合物の最良の投与様式（たとえば、丸剤または注入）、投与の頻度及び毒性について決定するために使用される。第Ｉ相試験は、治療候補物質の患者の体内における作用を評価するために、血液検査及び生体組織検査などの臨床検査を含むことが多い。第Ｉ相試験において、骨疾患または骨損傷を有する小患者群を特定用量の開示するダイゼイン類似体で処置する。この試験の間、当該化合物に関する最大耐性量（ＭＴＤ）及び用量制限毒性（ＤＬＴ）を決定するために、通常、群ごとに用量を増加させる。この過程は、次の第ＩＩ相試験に使用するのに適切な用量を決定するものである。
【０１７０】
第ＩＩ相試験は、本開示のダイゼイン類似体の有効性及び安全性をさらに評価するために実施され得る。第ＩＩ相試験では、第Ｉ相試験で有効であることが認められた用量を用いて、開示するダイゼイン類似体を骨疾患または骨損傷を有する患者群に投与する。
【０１７１】
第ＩＩＩ相試験は、開示するダイゼイン類似体が標準的治療または最も広く認められている治療にどの程度比肩するかを決定することに焦点が置かれる。第ＩＩＩ相試験では、患者を２つ以上の「群」の１つに無作為に割り当てる。２つの群を用いる試験では、たとえば、一群は標準的治療（対照群）を受け、他群は開示するダイゼイン類似体治療（治験群）を受ける。
【０１７２】
第ＩＶ相試験は、開示するダイゼイン類似体の長期的な安全性及び有効性をさらに評価するために使用される。第ＩＶ試験は、第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相試験ほど一般的でなく、開示するダイゼイン類似体の標準使用が承認された後に実施される。
【０１７３】
参加者の適性基準は、一般基準（たとえば、年齢、性別、疾患の種類）から、特定基準（たとえば、過去の治療の種類及び数、疾患の特徴、血球数、器官機能）に及び得る。一実施形態において、適性患者は、骨減少症または骨粗鬆症骨などの骨疾患または骨損傷の診断を受けている。適性基準は、試験相によっても変化し得る。また、骨疾患または骨損傷の客観的な測定結果、及び他の骨疾患または骨損傷の治療に反応しないことに基づいて、臨床試験に適した患者を選ぶこともできる。たとえば、第Ｉ相及び第ＩＩ相試験では、基準により、異常な器官機能または他の要因を理由に、試験治療によるリスクがあると考えられる患者を除外することが多い。第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相試験では、疾患の種類及び段階、ならびに過去の治療の数及び種類に関する追加の基準が含まれることが多い。
【０１７４】
第Ｉ相試験は、通常、他の治療オプションが有効でなかった１５〜３０名の参加者を含む。第ＩＩ相試験は、一般に、薬剤治療をすでに受けたが、その治療が有効でなかった最大１００名の参加者を含む。
【０１７５】
第ＩＩＩ相試験の参加者は、過去に受けた治療に基づいて限定されることが多い。第ＩＩＩ相試験は、通常、数百〜数千の参加者を含む。開示するダイゼイン類似体の有効性と標準的治療の有効性との間に事実上の差異があるかどうかを判断するためには、この多数の参加者が必要である。第ＩＩＩ相は、新たに骨疾患または骨損傷と診断された患者から、過去の治療に反応しなかった骨疾患または骨損傷に関連する再発徴候及び／または症状を有する患者までを含み得る。
【０１７６】
臨床試験はできる限り包括的であるように設計すべきではあるが、試験集団が多様化しすぎて、集団をより狭く限定した場合でも同様に治療が有効であるかどうかを判断できなくならないようにすべきことは、当業者であれば、理解するであろう。特に第ＩＩＩ相試験においては、試験に含まれる集団が多様になるほど、その結果を一般集団に適用することができる。臨床試験の各相における適切な参加者の選択は、当業者の通常の技術範囲と考えられる。
【０１７７】
開示するダイゼイン類似体は、通常、経口で試験参加者に投与される。本薬剤の用量範囲を試験することができる。専門知識を有する医師は、前臨床試験からの情報が提供されれば、臨床試験における使用のための薬剤の適切な投与量を容易に決めることができる。一実施形態において、用量範囲は、対象の体重に対して約１００μｇ／ｋｇ〜約５０００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、対象の体重に対して１ｍｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、対象の体重に対して約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇ、対象の体重に対して約１００μｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、対象の体重に対して約２００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、対象の体重に対して約２００ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、対象の体重に対して約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｍ〜約５００ｍＭである。
【０１７８】
第Ｉ相基準を満たすために、たとえば、一定の間隔で採取した血液などの試料の化学分析によって、本開示のダイゼイン類似体の分布をモニターする。たとえば、治療開始から約７２時間まで、一定の間隔で試料を採取することができる。
【０１７９】
即座に分析を実施しない場合は、採取後に試料をドライアイス上に置き、次に凍結容器に移し、分析できるようになるまで−７０℃で保存することができる。当該技術分野において知られている標準技法を使用して、試料を分析用に調製することができ、存在する本開示のダイゼイン類似体の量を、たとえば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。専門知識のある臨床薬理学者と協力して、薬物動態データを生成及び分析し、そのデータを使用して、たとえば、クリアランス、半減期及び最大血漿濃度を求めることができる。
【０１８０】
臨床試験の評価項目は、評価を受ける化合物の有効性を示す測定可能な結果である。評価項目は、試験の開始前に設定され、臨床試験の種類及び相に応じて変化する。
【０１８１】
本開示の主題について、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０１８２】
実施例１
ダイゼイン類似体の合成
スキーム１に示すように、ダイゼイン１の７−ヒドロキシル基における選択的Ｏ−アルキル化により、２ａ〜ｌ及び６の誘導体を得た。誘導体３は、塩基性化合物としてピコリンを含む還流キシレン中におけるマイクロ波照射下での１と１，１−ジエトキシ−３−メチルブタ−２−エンとの反応により得た。従来の加熱法に代えてマイクロ波法を導入することで、反応時間が大幅に短縮し、反応収率が改善した。さらに、１０％Ｐｄ／Ｃを用いた３の水素化により、溶媒の酢酸エチルまたはメタノールの使用に応じてそれぞれ主生成物として誘導体４または５が形成された。誘導体７は、連続的クライゼン転位及び触媒としてＣｓＦを含む還流Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン中におけるマイクロ波照射下での６の環化によって調製した。３をトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させて、そのトリフラートに変換し、それをＫＯＡｃ存在下でジボロン試薬を用いたＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）触媒ホウ素化反応を介した誘導体８の合成のための出発物質とした。エクオールの７−ヒドロキシル基におけるＯ−ブチル化により、誘導体９を得た。誘導体１０は、塩基としてピコリンを含む還流キシレン中におけるマイクロ波照射下でのエクオールと１，１−ジエトキシ−３−メチルブタ−２−エンとの反応により得た。
【化１２】
2016522167.tif 000014
【０１８３】
スキーム１  ダイゼイン誘導体及び類似体の合成。試薬及び条件：（ａ）Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＳＯ、ＲＢｒまたはＲＣｌ、室温、（ｂ）
【化１３】
2016522167.tif 000015
キシレン、１３０℃、マイクロ波、（ｃ）Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、酢酸エチル、室温、（ｄ）Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ、室温、（ｅ）ＣｓＦ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、１３０ｏＣ、（ｆ）ｉ）（ＣＦ３ＳＯ２）Ｏ、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃〜室温、ｉｉ）
【化１４】
2016522167.tif 000016
ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ＫＯＡｃ、ジオキサン、１２０℃。
【化１５】
2016522167.tif 000017
【０１８４】
スキーム２  １２ａ及び１２ｂの合成。試薬及び条件：（ａ）４−メトキシ−または４−ＴＨＰＯ−アニリン、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ、０℃〜室温、（ｂ）４−トルエンスルホン酸、ＭｅＯＨ、還流、（ｃ）Ｋ２ＣＯ３、ｉ−ブチルブロミド、ＤＭＳＯ、室温。
【０１８５】
スキーム２は、化合物１１及び１２ａ〜ｂの合成経路を示す。ＤＣＣ及びＤＭＡＰを活性化剤として用いた２，４−ジメトキシ安息香酸と４−アニシジンまたは４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）アニリンとの縮合により、それぞれ１２ａと２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）ベンズアミドを得た。化合物１１は、４−トルエンスルホン酸を含むメタノール中での２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）ベンズアミドの脱保護により得た。最後に、１１のＤＭＳＯ中でのＯ−ｉ−ブチル化により、Ｋ２ＣＯ３の存在下で化合物１２ｂを得た。
【０１８６】
合成の詳細
【０１８７】
ダイゼイン（１）は、Ｔｙｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（ＮＪ，ＵＳＡ）より取得した。エクオールは、Ｂｅｔａ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（ＣＴ，ＵＳＡ）より取得した。ビス（ピナコラト）ジボロン及びＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）は、ＣｏｍｂｉＰｈｏｓ  Ｃａｔａｌｙｓｔ，Ｉｎｃ（ＮＪ，ＵＳＡ）より取得した。４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）アニリンは、Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９９５，４３，２０８２−２０８７の方法に従って調製した。この文献はその全体を参照により本明細書に援用する。他の試薬及び溶媒はすべてＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＷＩ，ＵＳＡ）またはＡｃｒｏｓ  ｏｒｇａｎｉｃｓ（ＮＹ，ＵＳＡ）から取得し、受け取ったままの状態で使用した。使用したすべての有機溶媒は、試薬グレードの品質であり、さらに精製することなく使用した。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００スペクトロメータ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＢｒｕｋｅｒ  Ｆｏｕｒｉｅｒ−３００スペクトロメータ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）でｐｐｍ単位で記録した。ＧＣ−ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ５９７５Ｃ  ｉｎｅｒｔ  ＭＳＤ質量分析計で実施した。融点は、Ｍｅｌ−ｔｅｍｐ  ＩＩ融点測定装置で決定し、補正は行わない。合成粗生成物は、シリカゲル（６０〜１００メッシュ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）カラム上でのクロマトグラフィーの方法によって精製した。分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、２５０μの蛍光プレート（Ａｇｅｌａ  Ｔｅｃｈ．，ＤＥ，ＵＳＡ）上で実施し、ＵＶ光を使用して可視化した。すべての生成物に関して、純度は、Ｃ−１８逆相カラムを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）２０１０  ＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳシステムを用いるＨＰＬＣ法によって、９５％よりも高いことを確認した。マイクロ波加熱は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＭ  Ｃｏ．，ＮＣ，ＵＳＡ）の単一モードマイクロ波空洞で実施し、すべてのマイクロ波反応をテフロン（登録商標）製セプタムで密閉された厚肉のガラスバイアル中で行った。
【０１８８】
化合物２ｉ〜ｌ及び６の合成基本手順  ＤＭＳＯ  １０ｍＬ中のダイゼイン（１．２７ｇ、５ｍｍｏｌ）溶液に、無水Ｋ２ＣＯ３（０．９０ｇ、６．５ｍｍｏｌ）及び臭化物または塩化物（５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次に冷水中に注ぎ込んだ。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をヘキサン／酢酸エチル（４：１）を溶離液に使用するシリカゲルに通してクロマトグラフ処理した。生成物をアセトンで再結晶化させ、２ｉ〜ｌまたは６を固体として得た。
【０１８９】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン（２ｉ）。白色粉末、収率５４％。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３６６ （Ｍ＋Ｈ）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．３５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４２ （ｍ， ４Ｈ）， ２．６８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ 及び９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．００ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １Ｈ）， ９．５４ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ２４．２， ２５．７， ５４．７， ５７．３， ６６．７， １０１．５， １０２．４， １１５．５， １１５．７， １１７．９， １２２．８， １２４．１， １２７．４， １３０．６， １５３．７， １５７．５， １５７．９， １７５．５．
【０１９０】
３３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン（２ｊ）。白色粉末、収率４７％。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３５２ （Ｍ＋Ｈ）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ ＝１．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．５２ （ ｍ， ４Ｈ）， ２．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ ａｎｄ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３６ （ｓ， １Ｈ）， ９．５５ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）．
【０１９１】
７−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（２ｋ）。白色粉末、収率６１％。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３２６ （Ｍ＋Ｈ）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ２．２０ （ｓ， ６Ｈ）， ２．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ ａｎｄ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３７ （ｓ， １Ｈ）， ９．５４ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ４５．７， ５７．６， ６７．０， １０１．４， １１５．５， １１５．６， １１７．９， １２２．８， １２４．２， １２７．４， １３０．６， １５３．７， １５７．５， １５７．９， １６３．４， １７５．５．
【０１９２】
７−（アリルオキシ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（２ｌ）。無色結晶、収率４２％。ＧＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ２９４ （Ｍ＋）， ２５３， １３７， １１８． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ４．６６ （ｄｔ， Ｊ ＝ １．５ ａｎｄ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １．５ ａｎｄ １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４０ （ｄｍ， Ｊ ＝ １７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．０３ （ｍ， １Ｈ）， ６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ ａｎｄ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．００ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ９．７７ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ６９．４， １０１．７， １１５．５， １１５．６， １１８．０， １１８．８， １２２．８， １２４．１， １２７．４， １３０．５， １３３．０， １５３．６， １５７．５， １５７．８， １６２．９， １７５．４．
【０１９３】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン（６）。０℃の無水アセトン４０ｍＬ中の５００ｍｇ（１．９７ｍｍｏｌ）のダイゼイン溶液に、６０ｍｇ（２．３６ｍｏｌ、１．２０当量）の水素化ナトリウムを加えた。水素ガスの放出が止まってから、トルエン中の０．２５ｍＬ（２．３２ｍｍｏｌ、１．１８当量）の８０％プロパルギルブロミド溶液を反応混合物にゆっくりと添加した。次に、反応混合物を室温まで温めた。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル／ヘキサンを溶離液に使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、３２７ｍｇの３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン（６）を５７％の収率で得た。ｍ． ｐ．： ２２８−２３０℃． ＧＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ２９２ （Ｍ＋）， ２５４， ２０７， １７４， １４５， １１８． １Ｈ−ＮＭＲ （ＭｅＯＤ， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ３．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１２−７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２２ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＭｅＯＤ， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ５５．９， ７６．５， １０１．３， １１４．８， １１５．１， １２６．８， １３０．０， １３６．４， １５３．５．
【０１９４】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−８−メチル−４Ｈ−フロ［２，３−ｈ］クロメン−４−オン（７）。反応フラスコ内で、２００ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）の３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）−４Ｈ−クロメン−４−オン及び１５０ｍｇ（０．９５ｍｍｏｌ）のＣｓＦを２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジエチルアニリン中に溶解させた。反応物を、出発物質がＴＬＣ上で完全に消失するまで、窒素雰囲気下にて還流させた。次に、反応溶液を室温まで冷却し、ヘキサン／酢酸エチル（９９／１）を溶離液に使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、６７ｍｇの３−（４−ヒドロキシフェニル）−８−メチル−４Ｈ−フロ［２，３−ｈ］クロメン−４−オン（７）を収率３４％で得た。ＧＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ２９２ （Ｍ＋）． １Ｈ−ＮＭＲ （ｄ−アセトン， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ２．５６ （ｓ， ３Ｈ）， ６．９０−６．９３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３３ （ｓ， １Ｈ）， ８．５４ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ｄ−アセトン， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ １３．０， ９９．９， １０９．３， １１５．０， １１８．４， １１９．８， １２０．８， １２３．４， １２４．９， １３０．３， １４９．８， １５２．１， １５７．３， １５７．４， １５７．６， １７５．９．
【０１９５】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−８，８−ジメチル−８Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］−クロメン−４−オン（３）。３−ピコリン２ｍＬ中のダイゼイン（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）及び１，１−ジエトキシ−３−メチル−２−ブテン（０．２０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に１３０℃で１時間マイクロ波を照射した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をヘキサンを溶離液に使用するシリカゲルを通してクロマトグラフ処理した。最終生成物をアセトンで再結晶化させ、０．１３ｇの３を無色針状結晶として収率４１％で得た。ｍ．ｐ．： ２６２〜２６４℃（Ｄｅｃ．）． ＧＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３２０ （Ｍ＋）， ３０５， ２５４， １８７， １５２， １１８． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ４００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．４５ （ｓ， ６Ｈ）， ５．９４ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７９ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ，１Ｈ）， ６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３６ （ｓ， １Ｈ）， ９．５７ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）．
【０１９６】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−８，８−ジメチル−２，３，９，１０−テトラヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−４（８Ｈ）−オン（４）。１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を含有する酢酸エチル１００ｍＬ中の化合物３（０．５０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を水素雰囲気下で室温にて一晩攪拌した。触媒を濾過し、濾液を濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにて精製し、０．３７ｇの４を収率７３％で得た。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３２５ （Ｍ＋Ｈ）． ｍ．ｐ．： １７６〜１８０℃（収率７３％）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．３７ ａｎｄ １．３８ （ｄｏｕｂｌｅ ｓ， ６Ｈ）， １．８５−１．８０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７０−２．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６７−４．５５ （ｍ， ２Ｈ，） ， ６．５１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ） ， ６．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ） ， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝１６．６， ２６．６， ２６．９， ３１．７， ５１．１， ７２．０５， ７５．７， １０８．９， １１２．２， １１３．７， １１６．１， １２６．７， １２７．２， １２９．８， １５５．７， １６０．９， １６１．２， １９１．０．
【０１９７】
４−（８，８−ジメチル−２，３，４，８，９，１０−ヘキサヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−３−イル）フェノール（５）。１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を含有するメタノール中の化合物３（０．５０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を水素雰囲気下で室温にて一晩攪拌した。触媒を濾過し、濾液を濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにて精製し、０．３２ｇの５を収率６７％で得た。ＧＣ／ＭＳ： ｍ／ｚ ３１０ （Ｍ＋， １００％）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．３２ ａｎｄ １．３３ （ｄｏｕｂｌｅ ｓ， ６Ｈ）， １．７８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６１−２．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９０−２．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１５ （ｍ， １Ｈ）， ３．９５ （ｔ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｍ， １Ｈ）， ４．６８ （ｓ， １Ｈ）， ６．３８ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８１−６．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．０ ａｎｄ ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）．
【０１９８】
４−（８，８−ジメチル−４−オキサ−４，８−ジヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−３−イル）フェニルトリフルオロメタンスルホナート（８）。ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．２８ｇ、０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）溶液を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のピリジン（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）及び３（０．２５ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の溶液に０ｏＣで滴加した。添加終了後、混合物を室温まで温め、１時間攪拌した。次に混合物をＥｔ２Ｏで希釈し、１０％ＨＣｌ水溶液でクエンチし、続けて飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、４−（８，８−ジメチル−４−オキサ−４，８−ジヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−３−イル）フェニルトリフルオロメタンスルホナートを得た。
【０１９９】
ビス（ピナコラト）ジボロン（０．０９ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（０．０１７ｇ、５％ｍｏｌ）及びＫＯＡｃ（０．０８ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、４−（８，８−ジメチル−４−オキサ−４，８−ジヒドロピラノ［２，３−ｆ］クロメン−３−イル）フェニルトリフルオロメタンスルホナート（０．１５ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液に添加し、混合物をＮ２下で８０℃にて一晩攪拌した。溶液を冷却した後、ジオキサンを減圧下で除去し、ＣＨ２Ｃｌ２及び水を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６６ｍｇの８，８−ジメチル−３−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ピラノ［２，３−ｆ］クロメン−４（８Ｈ）−オン（８）を収率４７％で得た。ＨＲＭＳ：計算値４３１．２０３０ （Ｍ＋Ｈ）；実測値４３１．２０２９． ｍ．ｐ．： ２２８〜２３０oC.１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．３７ （ｓ， １２Ｈ）， １．４０ （ｓ， ３Ｈ）， １．５２ （ｓ， ３Ｈ）， ５．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ０．６ ａｎｄ ９．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ０．６ ａｎｄ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５８−７．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８８−７．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ８．００ （ｓ， １Ｈ）， ８．０９ （ｍ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ２４．６， ２４．９， ２５．０， ２８．２， ８３．５， １１４．９， １１５．３， １２４．５， １２５．０， １２５．５， １２６．８， １２８．２， １２８．２， １３０．４， １３０．７， １３４．９， １３４．９， １３６．４， １５２．５， １７５．５．
【０２００】
４−（７−ブトキシクロマン−３−イル）フェノール（９）。２ｉを調製するために用いた手順に従って、エクオールと１−ブロモブタンとの反応により、９を白色粉末として収率６３％で得た。ＧＣ−ＭＳ ｍ／ｚ ２９８ （Ｍ＋）， １７９， １２０）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ４００ ＭＨｚ） δ ＝ ０．９０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３９ （六重項， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６４ （五重項， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８２ （ ｍ， ２Ｈ）， ３．０２ （ｍ， １Ｈ）， ３．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８９ （ ｍ， １Ｈ）， ４．１８ （ｍ， １Ｈ）， ６．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ 及び ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ９．２８ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）．
【０２０１】
４−（８，８−ジメチル−２，３，４，８−テトラヒドロピラノ［３，２−ｇ］クロメン−３−イル）フェノール（１０）。３を調製するために用いた手順に従って、エクオールと１，１−ジエトキシ−３−メチル−２−ブテンとの反応により、１０を無色液体として収率２７％で得た。ＧＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ ３０８ （Ｍ＋）， ２９３， １８７， １７３． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ４００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．３２ （ｓ， ６Ｈ）， ２．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８０ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１ （ｍ， １Ｈ）， ４．２１ （ｍ， １Ｈ）， ５．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１６ （ ｓ， １Ｈ）， ６．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ９．２７ （ｓ， １Ｈ， Ｄ２Ｏ交換可能）．
【０２０２】
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミド（１１）。ＤＭＦ３０ｍｌ中の５．５ｇの２，４−ジメトキシ安息香酸、５．８ｇの４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）アニリン及び３００ｍｇのＤＭＡＰの溶液を６．２ｇのＤＣＣで０℃にて処理した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、室温まで温め、一晩攪拌し、濾過し、濃縮して、２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）ベンズアミドを白色粉末として８７％の収率で得た。これを直接次の工程で使用した。
【０２０３】
１２．１ｇの２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）ベンズアミドを、ＭｅＯＨ  １００ｍｌ中の６４５ｍｇの４−トルエンスルホン酸一水和物で処理した。反応混合物を１時間加熱還流させ、その後、溶媒を減圧下で除去した。固体残留物を酢酸エチル中に溶解し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、カラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミド（１１）を白色粉末として収率５８％で得た。ＧＣ／ＭＳ： ｍ／ｚ ２７３ （Ｍ＋， １００％）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ３．８６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）， ６．６２−６．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ９．５６ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６， ７５ ＭＨｚ）： ５６．０， ５６．６， ９８．９， １０６．２， １１５．５， １１６．１， １２２．４， １３０．９， １３２．５， １５３．９， １５８．８， １６３．３， １６３．６．
【０２０４】
２，４−ジメトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）ベンズアミド（１２ａ）。ＤＭＦ１０ｍＬ中の１．８２ｇの２，４−ジメトキシ安息香酸、１．２３ｇの４−アニシジン及び０．１ｇのＤＭＡＰの溶液を、２．０６ｇのＤＣＣで０℃にて処理した。１時間０℃にて攪拌後、反応混合物を室温まで温め、一晩攪拌し、その後濾過し、濃縮し、カラムクロマトグラフィーにかけて、１２ａを白色粉末として収率８７％で得た。４３ ＧＣ／ＭＳ： ｍ／ｚ ２８７ （Ｍ＋， １００％）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ ３．８１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８８ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ３Ｈ）， ６．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．１ ａｎｄ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ９．５５ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ ５５．５， ５５．６， ５６．２， ９８．８， １０５．６， １１４．１， １１４．８， １２２．１， １３１．８， １３４．２， １５６．１， １５８．５， １６３．０， １６３．６．
【０２０５】
Ｎ−（４−イソブトキシフェニル）−２，４−ジメトキシベンズアミド（１２ｂ）。ＤＭＳＯ  ２ｍＬ中の２３０ｍｇの１１、１２７ｍｇの１−ブロモ−２−メチルプロパン及び１１６ｍｇのＫ２ＣＯ３を室温で２時間攪拌し、次にブラインでクエンチし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、カラムクロマトグラフィーで精製して、１２ｂを白色粉末として収率６３％で得た。ＧＣ／ＭＳ： ｍ／ｚ ３２９ （Ｍ＋， １００％）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ）： δ ＝ １．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ６Ｈ）， ２．０９ （ｍ， １Ｈ）， ３．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８９ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ６．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４ ａｎｄ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ９．５８ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ）： δ ＝ １９．３， ２８．３， ５５．６， ５６．２， ７４．８， ９８．８， １０５．６， １１４．８， １２２．０， １３１．６， １３４．２， １５５．９， １５８．５， １６２．９， １６３．６．
【０２０６】
実施例２
実施例３〜７に使用する材料及び方法
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。健常ドナー由来のＭＳＣは、インフォームドコンセントを得た後、テュレーン大学審査委員会の承認を受けたプロトコールに基づいて取得した。３名の個体から得た骨髄穿刺液から細胞を調製した。端的に言えば、健常成人ドナーの腸骨稜から骨髄穿刺液を得て、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）、ペニシリン１００単位／ｍｌ／ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｐ／Ｓ；ＧＩＢＣＯ（登録商標））、及びＬ−グルタミン２ｍＭ（ＧＩＢＣＯ（登録商標））からなる完全培地（ＣＣＭ）に再懸濁した。次に、１５０ｃｍ２の培養皿（Ｎｕｎｃ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）内のＣＣＭ中に細胞を置き、５％加湿ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。２４時間後、培地を取り除き、付着した生存細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））を用いて採取し、ＣＣＭ中に１００細胞／ｃｍ２で再播種した。３〜４日ごとに培地を交換した。培養物が７０％コンフルエントに達したら、トリプシンを用いて細胞を採取し、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で凍結し、液体窒素内に保存した。
【０２０７】
細胞培養。ＭＳＣを解凍し、１５０ｃｍ２の培養皿内のＣＣＭ中に播種し、５％加湿ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。２４時間後、生存細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンを用いて採取し、ＣＣＭ中に１００細胞／ｃｍ２で再播種した。３〜４日ごとに培地を交換した。全実験に関して、継代２〜６回の間のサブコンフルエント細胞（７０％コンフルエント以下）を使用した。記載のある場合、細胞をＤＭＳＯ（ビヒクル）、エストロゲン１０ｎＭ、ダイゼイン１μＭまたはダイゼイン類似体１μＭで処置し、２０％チャコールデキストロース処理済みＦＢＳ（ＣＤＳ−ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ及びＰ／ＳからなるＣＣＭ−ＣＤＳ中で培養した。
【０２０８】
ＭＳＣの骨形成分化。ダイゼイン類似体の骨形成能を決定するために、１名または３名のドナーから得たＭＳＣをＣＣＭ中で７０％コンフルエントで培養し、細胞をビヒクル、エストロゲン、ダイゼインまたはダイゼイン類似体１μＭで処置し、アスコルビン酸２−リン酸５０μＭ（Ｓｉｇｍａ）、β−グリセロールホスファート１０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）及びデキサメタゾン１０ｎＭを添加したＣＣＭ−ＣＤＳからなる骨形成分化用培地（ＯＤＭ）で培養した。新しい骨分化培地中にダイゼイン類似体（１μＭ）を２〜３日ごとに加えた。記載のある場合、用量反応関係を決定するために、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭのダイゼイン類似体をＯＤＭ中のＭＳＣに加えた。１４日後、細胞を１０％ホルマリンで１時間固定し、アリザリンレッド４０ｍＭ（ｐＨ４．１）で染色し、細胞外基質のカルシウム沈着を可視化した。デジタルカメラＤＸＭ１２００Ｆを備えるＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００で４×倍率にてＡＣＴ−１ソフトウェアを用いて画像を取得した。アリザリンレッド染色を定量化するために、細胞を１０％塩化セチルピリジニウム一水和物（Ｓｉｇｍａ）で３０分間脱染色し、溶液のＯＤを５９０ｎｍで測定することによってアリザリンレッドの量を求めた。結果を試料のタンパク質量で標準化し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）にのみ曝露させた細胞と比較した。
【０２０９】
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いる細胞のトータルＲＮＡ抽出のために、ビヒクル、エストロゲン（１０ｎＭ）、ダイゼイン（１μＭ）及び２ｃ（１μＭ）で１４日間処置したＭＳＣを回収した。次に、ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））で精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲをＥＸＰＲＥＳＳ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて製造業者の説明書に従って実施した。次の配列を示すプライマーを用いた。Ｓｐ７フォワード５’−ＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１）、リバース５’−ＡＴＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２）；ＩＧＦ−１フォワード５’−ＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号３）、リバース５’−ＴＴＣＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡ−３’（配列番号４）；ＡＬＰフォワード５’−ＣＴＡＡＣＴＣＣＴＴＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号５）、リバース５’−ＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６）；オステオポンチンフォワード５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号７）、リバース５’−ＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号８）。β−アクチンフォワード５’−ＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号９）、リバース３’−ＴＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡ−５’（配列番号１０）を内部標準点として用いた。反応終了時に、ΔΔＣｔを算出してｍＲＮＡ発現を定量化した。
【０２１０】
実施例３
エストロゲン及びダイゼインはＭＳＣ骨形成分化を促進する。
３名のドナーから得たＭＳＣをビヒクル、エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインで個別に処置し、アリザリンレッドで染色し、脱染色して、各処置群の染色量を定量化した。アリザリンレッドは、骨形成に関連する石灰化した細胞外基質を染色するので、骨形成分化の良好な指標である。エストロゲンは、ＭＳＣの骨形成分化を、ドナー１、ドナー２及びドナー３由来のビヒクル処置ＭＳＣに対して、それぞれ１．５±０．０９倍、１．５±０．１８倍及び１．６±０．０９倍増大させ（Ｐ＜０．０５；図１）、ダイゼインは、ＭＳＣの骨形成分化を、ドナー１、ドナー２及びドナー３由来のビヒクル処置ＭＳＣに対して、それぞれ１．７±０．１９倍、１．７±０．０１倍及び１．６±０．１５倍増大させた（Ｐ＜０．０５；図１）。これまでの研究と一致して、ＭＳＣは、骨形成分化するように誘導することができ、さらに、エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインの存在下において、全体的な分化能が向上する。エストロゲンとダイゼインのみが３名のドナー全員におけるＭＳＣの骨形成分化を一様に向上させた。ゲニステインは、ＭＳＣの骨形成分化を、ドナー１及びドナー２由来のビヒクル処置ＭＳＣに対して、それぞれ１．６±０．１９倍及び１．７±０．０２倍増大させたが（Ｐ＜０．０５；図１）、ドナー３由来のＭＳＣでは分化を誘導しなかった（１．０±０．１５；Ｐ＞０．０５；図１）。
【０２１１】
これまでの研究では、卵巣切除した骨粗鬆症動物モデルに対するゲニステイン及びダイゼインの送達に焦点が当てられ、当該イソフラボン類の使用による骨損失の抑制が示されている。ダイゼイン添加食餌による卵巣切除ラットは、腰椎、大腿骨ならびにその骨端線領域及び骨幹端領域（海綿骨及び皮質骨に富む領域）の骨塩量（ＢＭＤ）が偽処置ラットに匹敵した。さらに、ダイゼインは、ＡＬＰ活性及び結節形成を介してマウス骨髄細胞及びマウス骨芽前駆細胞の骨形成を高めることがわかっている（Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｗｉｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２００５，１６，２０７−２１３）。Ｒａｓｓｉらは、破骨細胞の成熟がｉｎ  ｖｉｖｏで阻害され、その結果、骨吸収が制限され、ＢＭＤが上昇することを実証した（Ｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，１７，６３０−６３８）。
【０２１２】
実施例４
ダイゼイン類似体は、ＭＳＣ骨形成分化を促進し、エストロゲンまたはダイゼインよりも有効性が高い。
骨形成分化を高める能力を決定するために、２３のダイゼイン類似体をスクリーニングした。まず、１名のドナー（年齢：２１歳、ＢＭＩ：２２．７、人種：白人、性別：女性）から得たＭＳＣを、骨形成分化培地（ＯＤＭ）中でエストロゲン、ダイゼインまたはダイゼイン類似体により処置した。１４日後、細胞をアリザリンレッドで染色し、脱染色して、各処置群の染色量を定量化した。エストロゲン及びダイゼインは、ＭＳＣの骨形成分化を、ＯＤＭ中のビヒクル処置ＭＳＣに対して、それぞれ１．７±０．２（Ｐ＜０．０５；図２）及び１．７±０．３（Ｐ＜０．０５；図２）増大させた。骨形成分化に対するダイゼイン類似体の効果は、誘導なし、低誘導及び高誘導の３群に分けることができる。２３のダイゼイン類似体のうち１６が骨形成分化を向上させた（Ｐ＜０．０５；図２）。２３のダイゼイン類似体のうち９つ（昇順で、２ｄ、２ｂ、２ａ、４、７、６、１０、２ｇ及び１２ｂ）が低誘導の分類に該当し、ビヒクルに対して、１．６倍〜２．０倍の骨形成分化を誘導する。ダイゼイン類似体のうち７つ（昇順で、２ｌ、２ｆ、１２ａ、２ｉ、２ｃ、２ｈ、２ｅ）が高誘導の骨形成分化であった（ビヒクルに対して２．４倍を超えるほどの増加）。エストロゲン及びダイゼインは、ダイゼイン類似体とともに試験を行う場合、骨形成分化の低い誘導物質に留まった。
【０２１３】
最も強力な骨形成性ダイゼイン類似体特定し、そのダイゼイン類似体の骨形成誘導の強さを決定するために、ドナー１において最も高い分化レベルを示した１０の骨形成性ダイゼイン類似体を、合計で３名のドナー（平均年齢：２２．４歳、平均ＢＭＩ：２１．５、人種：白人、性別：女性）における１４日後の分化について、さらに試験した。調査した１０の化合物のうち、２ｉ及び２ｄは、ドナー２及びドナー３由来のＭＳＣに対して細胞傷害性であった（図３）。他の８つの化合物（２ｃ、２ｆ、２ｇ、２ｅ、２ｈ、２ｌ、１０、１３ａ及び１２）は、３名のドナー全員の骨形成を、ビヒクル処置ＭＳＣに対して、それぞれ平均で２．０±０．４１、１．８±０．４８、２．０±０．６４、２．３±０．３３、２．０±０．４８、２．０±０．１８、２．２±０．１９、２．１±０．１４、及び２．２±０．４２（Ｐ＜０．０５）増大させた。
【０２１４】
実施例５
選択したダイゼイン類似体は、骨分化の刺激において低ＩＣ５０濃度を呈する。
骨形成活性におけるダイゼイン類似体の用量依存性をさらに決定するために、選択した３つのダイゼイン類似体（２ｃ、２ｆ及び２ｌ）を異なる濃度で処置した後、ＭＳＣの骨分化の程度を求めた。これらの選択した３つのダイゼイン類似体は、７日で分化の増大を示した。これは、より早く、かつより強い骨形成刺激を示唆するものである。ＭＳＣ（ドナーｎ＝３）を３つのダイゼイン類似体それぞれに対数倍（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭ）で曝露し、１４日後に細胞をアリザリンレッドで染色し、定量化のために脱染色した。図４に示すように、ＩＣ５０値を１．５倍の相対骨分化を達成するのに必要な類似体濃度として定義すると、３つの類似体は、ドナーに依存して、１ｎＭ超〜１μＭ未満の範囲にあるＩＣ５０値を有すると思われる。ドナー１に対する２ｃ、２ｆ及び２ｌのＩＣ５０は、それぞれ２．２ｎＭ、６５．８ｎＭ及び１３６．０ｎＭであり、ドナー２に対する２ｃ、２ｆ及び２ｌのＩＣ５０は、それぞれ１７０．４ｎＭ、６５．７ｎＭ及び２２３．７ｎＭであり、ドナー３に対する２ｃ、２ｆ及び２ｌのＩＣ５０は、それぞれ２．１ｎＭ、１．３８μＭ及び５５．１ｎＭである。ドナー３名で平均した２ｃ、２ｆ及び２ｌのＩＣ５０は、それぞれ５８．２ｎＭ、５０３．８ｎＭ及び１３８．２ｎＭである。したがって、ドナーの変動性によりＩＣ５０値に不確かさが加わっているが、異なるドナーにおける３つの類似体の骨形成能の程度は、一貫しているように見受けられる。たとえば、ドナー１、ドナー２及びドナー３に対する類似体２ｆのＩＣ５０は、それぞれ６５．８ｎＭ、６５．７ｎＭ及び１．３８μＭであり、効力の最も小さい類似体であることを示す。対照的に、類似体２ｃのＩＣ５０は、ドナー１及びドナー３由来のＭＳＣでは２．２ｎＭ及び２．１ｎＭ、ドナー２の細胞では１７０ｎＭであり、３つの類似体の中で効力の最も大きい類似体であることを示す（Ｐ＜０．０５；図４）。
【０２１５】
実施例６
ダイゼイン類似体は、ＭＳＣにおける骨形成転写因子の発現を促進する。
ダイゼイン類似体がＭＳＣの骨形成分化を向上させる機構を調査するために、２ｃをＯＤＭへの添加剤として用いて１４日間処置した細胞を、ＯＤＭ中のビヒクル処置細胞と比較した。細胞をＲＮＡ抽出のために回収して、ｃＤＮＡ合成をし、骨形成転写因子の発現についてｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。２ｃを含有するＯＤＭで処置した細胞は、ＯＤＭ（Ｐ＜０．０５；図５）中のビヒクル処置細胞に比べてより高い濃度のＳｐ７（２０．０８±４．８１）、ＡＬＰ（２．４５±０．８０）、ＯＰ（２．６８±０．１１）及びＩＧＦ１（２６．９６±９．１９）を示した。Ｓｐ７は、前駆幹細胞またはＭＳＣを骨芽細胞系列に向かわせるのに必要な初期遺伝子の１つである。分化系列決定に続いて、骨芽前駆細胞は、増殖段階に進み、続いて、骨形成細胞外基質を形成しながら、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲンなどの遺伝子を発現する。成熟の最終段階では、これらの骨芽前駆細胞は、細胞外基質を石灰化し、オステオポンチン（ＯＰ）及びオステオカルシンを産生する。成熟骨が形成されると、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）が強度と耐性を与えるように骨密度を調節する。この高度に調節された遺伝子発現及び細胞分化のプログラムは、無数の転写因子の発現と活性により制御されている。これらの因子は、骨生成が正常になされるように統合的かつ特異的に他の転写因子とともに作用する。
【０２１６】
ダイゼイン類似体２ｃで処置したヒトＭＳＣにおけるＳｐ７、ＡＬＰ、ＯＰ及びＩＧＦ−１の発現上昇は、表現型的に観察される骨形成の増加を支援する。最近の研究では、エストロゲン曝露を受けたマウス骨芽細胞でのＡＬＰ及びＩＧＦ−１発現の類似の増加が記載されている。フィトエストロゲンとしてのダイゼインに関する別の研究では、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）及びエストロゲン受容体ベータ（ＥＲβ）などの下流受容体の上方制御の可能性が調査された。これらの研究により、ダイゼインがＥＲα及びＥＲβの発現だけでなく、ビタミンＤ受容体合成も増加させることが示された。これは、ダイゼインがこれらのエストロゲン依存経路を介して骨の形成及び成熟を促進することを示唆するものである４０，４１。正確な作用様式及び関与する経路を明確にするには、さらなる機構研究が必要であるが、これまでに得られた結果によれば、これらのダイゼイン類似体がエストロゲン経路のより効果的な活性物質であると考えられ、骨の合成及び成熟を増加させることが示唆される。
【０２１７】
実施例７
構造−活性関係
１２の２系統のダイゼイン類似体のうち、２ａ、２ｂ及び２ｇが、エストロゲン及びダイゼインの骨形成活性と比較して、ドナー３名全員の細胞において中程度の骨形成活性を示したが、２ｄは、ドナー２名の細胞に対して毒性を示し、３人目においては中程度の骨形成を示した。したがって、ヒドロキシル水素のメチル、エチル、ｎ−プロピル及びシクロペンチルの置換基は、骨形成能に有意な改善をもたらさなかった。しかしながら、置換基がイソプロピル（２ｃ）、ｎ−ブチル（２ｅ）、２−ブチル（２ｆ）、アリル（２ｌ）またはｎ−ヘキシル（２ｈ）であった場合、骨形成能の顕著な向上が観察された。実際、これらの類似体は、３名のドナー全員の幹細胞において骨形成を促進させる最も強力な化合物の代表である。興味深いことに、置換基がプロピル−１−インである類似体６は、中程度の骨形成能しか示さなかった。６、２ｄ及び２ｌの活性と比較すると、３つの炭素置換基に関する最適の構造は、三重結合でも飽和シグマ結合でもなく、二重結合を１つ含有するものである。また、２系統では、窒素を含有する極性置換基を有する３つのダイゼイン類似体（２ｉ、２ｊ及び２ｋ）のうち、２つ（２ｊ及び２ｋ）は骨形成作用がなかった一方、３つ目は、ドナー２名に対して強力な毒性を示すことが認められた。これは、７−Ｏ位の極性の増加が骨形成活性を維持するには望ましくない可能性があることを示している。
【０２１８】
７，８位の環化を伴う他の構造変更は、有意な骨形成能をもたらさなかった。たとえば、３つの環状類似体（３、４及び７）のうち、類似体３はいかなる骨形成活性も示さなかったが、４及び７は骨再生を促進する中程度の能力を示した。ダイゼインの中心構造部分をダイゼイン代謝産物であるエクオールの構造に変更した場合、有意な失活がみられた。たとえば、類似体２ｅは、１４日で２倍を超える骨形成の増加を促進する最も強力な化合物の１つである。この分子の中央部分をエクオールの構造に変更（すなわち、カルボニル及び中央の６員環にある二重結合の還元的除去）すると、類似体９になるが、ドナー３名の幹細胞のいずれにおいても骨形成活性を有さない。別の比較可能なペアでは、ダイゼイン類似体４が中程度の骨形成能を示したのに対し、そのエクオール類似体５は識別可能な骨形成活性を有さなかった。
【０２１９】
中央の環系を開裂させる試みは、種々の結果をもたらした。類似体１１、１２ａ及び１２ｂでは、環状構造の代わりにアミド結合を導入して、両方のフェニル環が自由に回転できるようにした。３つのうち１２ａは、強い骨形成活性を呈したため、剛直なキノン環状構造は必要でない可能性が示唆される。しかしながら、他の２つの類似体１１及び１２ｂは、活性がまったくなかったため、４’位における最適な置換は、本来のヒドロキシル基でもｉ−ブトキシ基でもなく、メトキシである可能性が示唆された。
【０２２０】
実施例８
実施例９−ＸＸに使用する材料及び方法
抗ＣＤ４５−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ１１ｂ−ＰｅＣｙ５、抗ＣＤ１６６−フィコエリトリン（ＰＥ）、抗ＣＤ１０５−ＰＥ、抗ＣＤ９０−ＰｅＣｙ５、抗ＣＤ３４−ＰＥ、アイソタイプコントロールのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ヒトＩｇＧ１、及びアイソタイプコントロールのＰＥヒトＩｇＧ２ａは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から取得した。抗ＣＤ４４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。Ｉ型コラゲナーゼ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、分画５）、塩化カルシウム、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、アスコルビン酸２−リン酸、β−グリセロールホスファート、アリザリンレッドＳ、オイルレッドＯ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、硝酸銀、１７β−エストラジオール及びダイゼインは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から取得した。
【０２２１】
初代細胞
【０２２２】
６名の同意した健常白人女性ドナーから初代ヒトＢＭＳＣを取得した。これらの６名の個体の腸骨稜から採取した骨髄穿刺液から細胞を調製した。Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を用いて有核細胞を分離し、α−最小必須培地（αＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）、ペニシリン１００単位／ｍｌ／ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（Ｐ／Ｓ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、及びＬ−グルタミン２ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））からなる完全培地（ＣＣＭ）中に再懸濁した。次に、細胞を１５０ｃｍ２の培養皿（Ｎｕｎｃ（登録商標）；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に播種し、加湿５％ＣＯ２インキュベータで３７℃に維持した。３〜４日ごとに培地を交換した。培養物が７０％コンフルエントに達したら、細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ  １ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を用いて採取し、実験で使用するまで凍結保存した。
【０２２３】
選択的脂肪吸引手順を受ける６名の同意した健常白人女性ドナーから初代ヒトＡＳＣを取得した。対象の皮下脂肪組織から得た処理済み吸引脂肪細胞からＡＳＣを単離した。塩化カルシウム２ｍＭを添加した、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させた０．１％Ｉ型コラゲナーゼ及び１％ＢＳＡ中で脂肪吸引物をインキュベートした。７５ｒｐｍで振盪する３７℃の水浴内に混合物を６０分間置き、次に、油、脂質、初代脂肪細胞及びコラゲナーゼ溶液を除去するために遠心分離にかけ、細胞ペレットを残した。細胞をＣＣＭ中に再懸濁し、１５０ｃｍ２培養皿に播種した。細胞を同じく加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で維持した。細胞が８０〜９０％コンフルエントに達するまで新しいＣＣＭを２〜３日ごとに加え、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ１ｍＭを用いて採取し、使用まで凍結保存した。
【０２２４】
細胞培養
【０２２５】
約１０６のＢＭＳＣまたはＡＳＣの凍結バイアルを解凍し、ＣＣＭ  ２０ｍｌを含む１５０ｃｍ２培養皿（Ｎｕｎｃ（登録商標），Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上に播種し、５％加湿ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。２４時間後、培地を取り除き、付着した生存細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ  １ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を用いて採取し、ＣＣＭ中に１００細胞／ｃｍ２で再播種した。３〜４日ごとに培地を交換した。全実験に関して、継代２〜６回の間のサブコンフルエント細胞（７０％コンフルエント未満）を使用した。
【０２２６】
フローサイトメトリー
【０２２７】
０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ  １ｍＭを用いて３７℃で３〜４分間処理してＡＳＣを採取した。合計で３×１０５細胞をＰＢＳ  ５０μｌ中に懸濁し、一次抗体で標識した。試料を室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。次に、試料をＧａｌｉｏｓ（登録商標）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）により、Ｋａｌｕｚａ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を実行させて分析した。前方及び側方散乱光によって細胞を分析するために、ＦＡＣＳｃａｎＧａｌｉｏｓ（登録商標）フローサイトメータをマイクロビース（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅ均一ミクロスフェア；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で標準化した。少なくとも１０，０００のイベント数で分析し、アイソタイプコントロールと比較した。
【０２２８】
コロニー形成単位アッセイ
【０２２９】
ＣＣＭを含む１０ｃｍ２プレート上にＢＭＳＣ及びＡＳＣを１００細胞の密度で播種し、１４日間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳですすぎ、３％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）により室温で３０分間染色した。プレートをＰＢＳで洗浄し、水道水で１回洗浄した。直径２ｍｍよりも大きいコロニーを計測した。各実験は、３試験で実施した。
【０２３０】
分化プロトコール
【０２３１】
骨形成分化。ＣＣＭを含む６ウェルプレート中でＢＭＳＣ及びＡＳＣを７０％コンフルエントになるまで培養した。培地は、アスコルビン酸２−リン酸５０μＭ、β−グリセロールホスファート１０ｍＭ及びデキサメタゾン１０ｎＭをＣＣＭに添加して作製した新しい骨形成分化培地と交換した。記載のある場合、チャコールデキストラン処理済みウシ胎児血清（ＣＤＳ−ＦＢＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）からなる培地を通常のＦＢＳに代え、分化の期間中、エストロゲン１０ｎＭ、ダイゼイン１μＭまたはダイゼイン類似体１μＭを骨形成分化培地に添加した。フルベストラント１００ｎＭ（ＩＣＩ１８７，２８０；Ｓｉｇｍａ）と、エストロゲン１０ｎＭ、ダイゼイン１μＭまたはダイゼイン類似体１μＭとの併用処置によって、エストロゲン阻害試験を実施した。
【０２３２】
脂肪細胞分化。ＣＣＭを含む６ウェルプレート中でＢＭＳＣ及びＡＳＣを７０％コンフルエントになるまで培養した。培地は、デキサメタゾン０．５μＭ、イソブチルメチルキサンチン０．５ｍＭ及びインドメタシン５０μＭをＣＣＭに添加して作製した新しい脂肪細胞誘導培地と交換した。記載のある場合、ＣＤＳ−ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）からなる培地を通常のＦＢＳに代え、分化の期間中、エストロゲン１０ｎＭ、ダイゼイン１μＭまたはダイゼイン類似体１μＭを脂肪細胞分化培地に添加した。
【０２３３】
染色プロトコール
【０２３４】
アリザリンレッド染色。１４日後、骨形成分化培地中の骨形成分化の過程にある細胞を１０％ホルマリンで１時間固定し、蒸留水で洗浄し、１％アリザリンレッドＳ（ｐＨ４．１）で染色し、細胞外基質のカルシウム沈着を可視化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＸＭ１２００Ｆを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）で４×倍率にてＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアバージョン２．７を用いて画像を取得した。スケールバーは１００μｍを表す。
【０２３５】
オイルレッドＯ染色。１４日後、脂肪細胞分化培地中の脂肪細胞分化の過程にある細胞を１０％ホルマリンで１時間固定し、ＰＢＳ  ２部及び０．５％オイルレッドＯ原液３部からなるオイルレッドＯで染色し、中性脂肪を可視化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＸＭ１２００Ｆを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００で１０×倍率にてＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアバージョン２．７を用いて画像を取得した。スケールバーは１００μｍを表す。
【０２３６】
アルカリホスファターゼ染色。３日後、骨形成分化培地中の骨形成分化の過程にある細胞を１０％ホルマリンで１時間固定し、蒸留水で洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ中でインキュベートし、アルカリホスファターゼ活性を可視化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＸＭ１２００Ｆを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００で４×倍率にてＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアバージョン２．７を用いて画像を取得した。スケールバーは１００μｍを表す。
【０２３７】
硝酸銀染色。１４日後、骨形成分化培地中の骨形成分化の過程にある細胞を１０％ホルマリンで１時間固定し、蒸留水で洗浄し、３％硝酸銀中でインキュベートし、細胞外基質中のリン酸石灰化を可視化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＸＭ１２００Ｆを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００で４×倍率にてＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアバージョン２．７を用いて画像を取得した。スケールバーは１００μｍを表す。
【０２３８】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。骨形成分化培地中のビヒクル、エストロゲン１０ｎＭ、ダイゼイン１μＭまたはダイゼイン類似体１μＭで処置した細胞を、３日、７日及び１４日に回収した。記載のある場合、ビヒクル、エストロゲン、ダイゼイン及びダイゼイン類似体で処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣを同時にフルベストラント１００ｎＭで処置し、３日、７日及び１４日に回収した。細胞のトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＢＭＳＣ及びＡＳＣから抽出し、製造業者の説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））で精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲをＥＸＰＲＥＳＳ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて製造業者の説明書に従って実施した。遺伝子発現の変化を検出するために、以下のフォワード及びリバースプライマー配列を用いた。ｒｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）、５’−ＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）及び５’−ＴＣＡＡＴＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１２）；ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス性癌遺伝子ホモログ（ｃ−Ｆｏｓ）、５’−ＣＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧＣ−５’（配列番号１４）；オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ）、５’−ＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）；ディスタルレスホメオボックス５（ＤＬＸ５）、５’−ＴＧＧＣＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣ’（配列番号１７）及び５’−ＴＧＧＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１８）；分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）、５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１９）及び５’−ＴＧＴＣＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴＧ−３’（配列番号２０）；Ｉ型コラーゲンアルファ（ＣＯＬ１Ａ１）、５’−ＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣ−３’（配列番号２１）及び５’−ＡＧＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＴ−３’（配列番号２２）；インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、５’−ＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＴＴＣＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡ−３’（配列番号２４）；ならびにベータアクチン（β−アクチン）、５’−ＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号９）及び３’−ＴＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡ−３’（配列番号１０）。ＲＴ−ＰＣＲプライマーはすべてＰｒｉｍｅｒ３（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ヒトβ−アクチンの発現は、ｍＲＮＡ含有量を標準化するために用いた。試料は３試験で試験した。各ＰＣＲ���実施には、テンプレートなしコントロール及び非逆転写コントロールを含めた。
【０２３９】
実施例９
ＢＭＳＣ及びＡＳＣは、類似の幹細胞特性を示す。
ＢＭＳＣ及びＡＳＣを細胞表面抗原について染色し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を得るために播種し、骨形成系統及び脂肪細胞系統に分化するように誘導した。重複する細胞表面マーカープロファイル（ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０６＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ３４−、及びＣＤ４５−）を示したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ＣＦＵを形成することができ、骨形成分化及び脂肪細胞分化に進んだ。
【０２４０】
実施例１０
エストロゲン及びフィトエストロゲンは、骨形成分化を促進するが、エストロゲンのみがＢＭＳＣ及びＡＳＣの脂肪細胞分化を促進する。
ＦＢＳ中の内因性エストロゲンを除去し、エストロゲンまたはフィトエストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインを添加したチャコールデキストラン処理済みウシ胎児血清（ＣＤＳ−ＦＢＳ）からなる骨形成分化培地中でＢＭＳＣ及びＡＳＣを培養した。１４日後、細胞をアリザリンレッドで染色し、明視野検鏡により画像化した（図６Ａ）。アリザリンレッド染色を溶出し、光学密度測定値を得ることによってアリザリンレッド染色を定量化した。骨形成分化培地中で培養した、エストロゲン、ダイゼイン及びゲニステインで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ビヒクル処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣと比較して、より大きな骨形成分化を示した。エストロゲン、ダイゼイン及びゲニステインで処置したＢＭＳＣは、ビヒクル処置ＢＭＳＣと比較して、それぞれ１．６倍、１．５倍及び１．４倍のより高い骨形成分化を示した（Ｐ＜０．０１；図６Ｂ）。エストロゲン、ダイゼイン及びゲニステインで処置したＡＳＣは、ビヒクル処置ＡＳＣ（１．０に標準化）に対して、それぞれ１．６倍、１．７倍及び１．４倍の骨形成分化の増加を示した（Ｐ＜０．０１；図６Ｂ）。エストロゲン、ダイゼイン及びゲニステインのすべてが骨形成分化を促進したが、６つのＢＭＳＣドナーのうち２つと、６つのＡＳＣドナーのうち３つは、ゲニステイン処置に反応せず、ビヒクル処置のＢＭＳＣまたはＡＳＣと同等の骨形成分化を呈した。さらに、明視野検鏡による可視化では、ビヒクル処置細胞と比較して、エストロゲン、ダイゼインまたはゲニステインで処置したＢＭＳＣまたはＡＳＣの細胞毒性の増大は示されなかった。
【０２４１】
ＢＭＳＣ及びＡＳＣの脂肪細胞分化に対するエストロゲンまたはフィトエストロゲンの効果を決定するために、細胞をエストロゲン、ダイゼイン及びゲニステインを添加したＣＤＳ−ＦＢＳからなる脂肪細胞分化培地中で培養した。１４日後、細胞をオイルレッドｏで染色し、明視野検鏡により画像化した（図６Ｃ）。オイルレッドｏ染色をイソプロパノールで溶出し、光学密度測定値を得ることによってオイルレッド染色を定量化した。エストロゲン処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ビヒクル処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣと比較して、それぞれ１．６倍の脂肪細胞分化の向上を示した（Ｐ＜０．０１；図６Ｄ）。ダイゼイン処置ＢＭＳＣは、ビヒクル処置ＢＭＳＣと比較して、１．２倍の脂肪細胞分化の向上を示したが（Ｐ＜０．０１；図６Ｄ）、ＡＳＣの脂肪細胞分化はダイゼイン処置で向上しなかった。
【０２４２】
ダイゼイン類似体は、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの脂肪細胞分化を低減させつつ骨形成分化を促進する。
【０２４３】
ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおけるダイゼイン類似体の骨形成能を決定するために、ダイゼイン類似体を合成し、ＣＤＳ−ＦＢＳを用いて作製した骨形成分化培地に添加した。各培地交換時にＢＭＳＣ及びＡＳＣを２ｃ、２ｇ及び２ｌで処置した。次に、細胞をアリザリンレッドで染色し、明視野検鏡により画像化し（図７Ａ）、染色量をＣＰＣで溶出することによって定量化した。２ｃ、２ｇ及び２ｌで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ビヒクル処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣと比較して、骨形成の向上を示した。２ｃ、２ｇ及び２ｌで処置したＢＭＳＣは、ビヒクル処置ＢＭＳＣに対して、それぞれ１．６倍、１．６倍及び１．９倍の骨形成の増加を示した（Ｐ＜０．０５；図７Ｂ）。２ｃ、２ｇ及び２ｌで処置したＡＳＣは類似の傾向を示し、ビヒクル処置ＡＳＣに対して、骨形成はそれぞれ１．７倍、２．０倍及び２．２倍の増加により向上した（Ｐ＜０．０５；図７Ｂ）。さらに、２ｌ処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣは、エストロゲン及びダイゼインで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣと比較して、骨形成の向上を示し（Ｐ＜０．００１；図７Ｂ）、エストロゲンまたはダイゼインよりも２ｌがより強力な骨形成性化合物であることが示唆された。
【０２４４】
２ｃ、２ｇ及び２ｌ処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣが骨形成分化の向上を示した一方で、これらの化合物は脂肪細胞分化を刺激しなかった。２ｃで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ビヒクル処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣと同等の脂肪細胞分化を示したが、２ｇ及び２ｌ処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ビヒクル、エストロゲンまたはダイゼイン処置のＢＭＳＣまたはＡＳＣと比較して、脂肪細胞分化の有意な減少を示した（Ｐ＜０．００１）。
【０２４５】
ダイゼイン類似体２ｃ、２ｇ及び２ｌは、類似のＥＣ５０を有するが、有効性が異なる。
【０２４６】
最も強力な化合物である２ｇ及び２ｌにおけるＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成の最大効果の５０％（ＥＣ５０値）を誘導するのに必要なダイゼイン類似体の濃度を決定するために、追加の試験を行った。このため、２ｇ及び２ｌを対数倍の１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲に及ぶ濃度でＢＭＳＣ及びＡＳＣに投与した。この結果を、同じく１００ｐＭ〜１ｍＭの濃度で添加したエストロゲン及びダイゼインと比較した。エストロゲンに関するＢＭＳＣ及びＡＳＣでのＥＣ５０値は、それぞれ１０−８．３５及び１０−９．２０であった。ダイゼイン２ｇ及び２ｌに関するＢＭＳＣでのＥＣ５０値は、それぞれ１０−６．６２、１０−６．９９及び１０−６．９９であった。ダイゼイン２ｇ及び２ｌに関するＡＳＣでのＥＣ５０値は、ＢＭＳＣに類似し、それぞれ１０−７．７６、１０−７．５３及び１０−７．３２であった。エストロゲンは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおける骨形成の最も強力な刺激を呈し、１ｎＭ〜１０ｎＭ濃度で骨形成の向上をもたらすが、２ｌは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣに対する骨形成分化の影響が最も大きく、２．０〜２．４倍の骨形成増加をもたらした（図８）。エストロゲンの用量が増えても、２ｌの骨形成と同等の骨形成またはこれを超えるさらなる骨形成は誘導されなかった。
【０２４７】
２ｇ及び２ｌ処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣにおいて、アルカリホスファターゼ活性の向上及びリン酸塩沈着の増加が観察された。
【０２４８】
２ｇ及び２ｌの有効性が高いことから、２ｇまたは２ｌで処置した細胞が初期の骨形成を促進するかどうかを決定するために、さらなる技術を使用した。ＢＭＳＣ及びＡＳＣを骨形成分化培地中でビヒクル、エストロゲン、ダイゼイン、２ｇまたは２ｌで３日間処置し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性検出用基質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ中でインキュベートした。３日後、エストロゲン、２ｇ及び２ｌで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、ＡＰ活性の増大を示した（図９Ａ〜Ｂ）。より具体的には、エストロゲンはＢＭＳＣ及びＡＳＣの分化をそれぞれ２．０倍及び１．６倍増大させ、２ｇは分化を２．１倍及び２．４倍増大させ、２ｌは分化を１．９倍及び２．６倍増大させた（Ｐ＜０．０５；図９Ａ〜Ｂ）。ダイゼイン処置ＢＭＳＣは、ビヒクルに対して、ＡＬＰ活性の増大を示したが（１．６倍の増加；Ｐ＜０．０５）、ダイゼイン処置ＡＳＣは、ビヒクル処置ＡＳＣと類似のＡＬＰ活性を呈した。
【０２４９】
後期骨形成の間に分泌され、骨の成熟細胞外基質の必須要素であるリン酸塩沈着を評価するために、細胞を骨形成分化培地中でビヒクル、エストロゲン、ダイゼイン、２ｇまたは２ｌで１４日間処置し、硝酸銀中でインキュベートした。エストロゲン及びダイゼイン処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣは、リン酸塩沈着の増大が示されたが、エストロゲン処置では、ダイゼイン処置よりも大きなリン酸塩沈着がもたらされた（Ｐ＜０．００１；図９Ｃ〜Ｄ）。２ｇ及び２ｌへのダイゼインの構造変更は、エストロゲン処置と比較して同等のリン酸塩沈着またはそれよりも大きい沈着をもたらした（Ｐ＜０．００１；図９Ｃ〜Ｄ）。２ｌを用いたＢＭＳＣ及びＡＳＣの処置は、他のすべての処置群と比較して、リン酸塩沈着の最も有意な増加をもたらした（Ｐ＜０．００１；図９Ｃ〜Ｄ）。
【０２５０】
総合すると、これらの結果は、エストロゲンで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣが、ＡＬＰ活性とリン酸塩沈着の増加によって骨形成の向上を示すことを示唆している。ダイゼインによる処置は、エストロゲンまたはダイゼイン類似体よりも効果が弱かった。ダイゼイン類似体２ｇ及び２ｌも同様に、ＡＬＰ活性とリン酸塩沈着の向上をもたらした。
【０２５１】
エストロゲン、ダイゼイン、２ｇ及び２ｌ処置は、異なる遺伝子誘導プロファイルをもたらした。
【０２５２】
骨形成分化の向上をもたらすエストロゲン、ダイゼイン、２ｇまたは２ｌによって誘導される遺伝子を特定するために、ＢＭＳＣ及びＡＳＣを骨形成分化培地中で化合物の添加ありまたは添加なしで３日、７日または１４日間処置した。細胞を回収して、主要な骨形成遺伝子の発現をｑＰＣＲで評価した。発現の開始、発現レベル及び遺伝子発現の長さにおける差異は、エストロゲン、ダイゼイン、２ｇ及び２ｌ処置の間で変動し、ＢＭＳＣとＡＳＣの間で異なった（図１０、図１１）。これらの化合物によって誘導されたＢＭＳＣ及びＡＳＣの遺伝子発現プロファイルには類似点も存在するが、有意な差異も観察された。
【０２５３】
エストロゲンで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、骨形成に関与する初期、中期及び後期の遺伝子の誘導を示す。
【０２５４】
エストロゲンで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、初期及び後期の骨形成遺伝子の同様の一時的誘導を呈したが、中期骨形成遺伝子の誘導では有意な差異が観察された（図１０、図１１）。より具体的には、エストロゲンは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの両方において、初期転写因子であるｃ−Ｆｏｓ及びＣＯＬ１Ａ１の発現をエストロゲン処置から３日以内に誘導した（Ｐ＜０．０５；図１０、図１１）。これらの遺伝子は、エストロゲン処置の３日後及び１４日後に同様に誘導されるが、遺伝子誘導レベルは、ＢＭＳＣとＡＳＣで変動した。処置の３日後、エストロゲンは、非分化細胞に対して、ＢＭＳＣにおけるｃ−ＦＯＳ発現を２．４倍増加させた一方、ＡＳＣでは、ｃ−ＦＯＳ発現が１４１．１倍増大した。ＣＯＬ１Ａ１発現の誘導は、非分化細胞に対して、ＢＭＳＣでは３．４倍、ＡＳＣでは１８．３倍であり、ＢＭＳＣとＡＳＣの間で異なった（図１０、図１１）。これらの結果は、エストロゲン刺激に対する応答の違いを際立たせるものである。
【０２５５】
さらに、一時的ではあるが誘導レベルに関連する中期骨形成遺伝子に対するエストロゲンの効果における差異が観察された。ＢＭＳＣでは、ＳＰＡＲＣ及びＤＬＸ５がエストロゲン処置の７日後に上方制御され、一方、ＡＳＣでは、ＳＰＡＲＣ、ＤＬＸ５及びＳＰＰ１が処置の１４日後に上方制御された（図１０、図１１）。ＢＭＳＣとＡＳＣの間で中期遺伝子の誘導レベルは、エストロゲンによる処置後、有意に変動した。エストロゲン処置ＢＭＳＣは、７日目により高い中期遺伝子の誘導レベルを呈した（ＳＰＡＲＣ：ＢＭＳＣ６．９倍対ＡＳＣ１．３倍、ＤＬＸ５：ＢＭＳＣ１７．８倍対ＡＳＣ５．８倍；図１０、図１１）。
【０２５６】
エストロゲン刺激に関連するＢＭＳＣとＡＳＣとの間の別の差異は、ＲＵＮＸ２及びＩＧＦ１の発現であった。ＢＭＳＣにおけるＲＵＮＸ２発現は、エストロゲン処置の７日後に増加したが（９．１倍）、ＡＳＣにおけるＲＵＮＸ２発現の増大（２２．０倍）は１４日まで生じなかった（図１０、図１１）。ＩＧＦ１誘導は、ＢＭＳＣのエストロゲン処置の３日後にＢＭＳＣにおいて有意に増大したが、この効果はＡＳＣでは認められなかった（図１０、図１１）。総合すると、これらの結果は、エストロゲンがＢＭＳＣとＡＳＣの両方で骨形成遺伝子の発現を刺激することを示唆している。
【０２５７】
ダイゼイン処置ＢＭＳＣ及びＡＳＣは、異なる遺伝子発現プロファイルを呈する。
【０２５８】
ＢＭＳＣ及びＡＳＣをダイゼインで処置し、骨形成分化に向かうように刺激した。細胞を３日、７日及び１４日に回収し、主要な骨形成因子の発現をｑＰＣＲによって調べた。ダイゼイン処置ＢＭＳＣは、非分化ＢＭＳＣに対して、骨形成分化７日後にＲＵＮＸ２及びＳＰＡＲＣ発現をそれぞれ９．１倍及び３．６倍に増加させた（Ｐ＜０．０５；図１０）。ダイゼイン処置ＡＳＣは、ｃ−ＦＯＳ発現を３日後に１３４．９倍、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１発現を１４日後にそれぞれ３８９９．６倍及び１０．２倍増加させた（Ｐ＜０．００１；図１１）。これらの結果は、ダイゼインがＢＭＳＣ及びＡＳＣにて骨形成分化の増加をもたらす異なるシグナル伝達カスケードを誘導することを示唆している。
【０２５９】
さらに、ダイゼインのエストロゲン活性を決定するために、ＢＭＳＣ及びＡＳＣに関して、細胞をダイゼイン及び抗エストロゲンフルベストラントで処置することによって、エストロゲン阻害物質試験を実施した。フルベストラントは、ダイゼイン処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成能をそれぞれ１．７倍〜１．０倍及び１．５倍〜１．０倍減少させた（図１２）。さらに、ダイゼインと同時にフルベストラント処置をすることによって改変した遺伝子の分子分析を行った。フルベストラントは、ＢＭＳＣにおけるＲＵＮＸ２発現、ならびにＡＳＣにおけるｃ−ＦＯＳ、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１発現を減少させた（図１２）。ダイゼインは７日目にＲＵＮＸ２の発現を増加させたが、フルベストラントによる同時処置はＲＵＮＸ２発現を２．７倍減少させた（Ｐ＜０．０５；図１０、図１２）。ＡＳＣに関しては、フルベストラントは、ｃ−ＦＯＳを３日目に５．２倍（５．４倍〜１．２倍；Ｐ＜０．００１）、ＩＧＦ１を７日目に２．４倍（２．８倍〜０．４倍；Ｐ＜０．０１）、ＣＯＬ１Ａ１を１４日目に１．１倍（２．６倍〜１．５倍；Ｐ＜０．０５；図１１、図１２）減少させた。これらの阻害物質試験は、フルベストラント処置がダイゼインによって活性化された遺伝子発現を減少させたことから、ダイゼインがエストロゲン依存性機構を介して作用することを示唆している。
【０２６０】
ダイゼイン類似体２ｇは、エストロゲン依存性機構における骨形成分化を向上させた。
【０２６１】
２ｇは、エストロゲンと同様に、エストロゲンによって誘導される遺伝子の小群（ＲＵＮＸ２、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１）を増大させた。２ｇで処置したＢＭＳＣは、７日におけるＲＵＮＸ２発現が７．９倍増加した（Ｐ＜０．００１；図１０）。さらに、２ｇで処置したＢＭＳＣは、３日、７日及び１４日におけるＣＯＬ１Ａ１の発現がそれぞれ１０．８倍、４．１倍及び２１，６００．４倍増加した（Ｐ＜０．０５；図１０）。ＣＯＬ１Ａ１の発現は、１４日におけるエストロゲン処置またはダイゼイン処置のＢＭＳＣと比較して、有意に強かった（Ｐ＜０．００１；図１０Ｃ）。２ｇで処置したＡＳＣは、１４日におけるビヒクル、エストロゲンまたはダイゼイン処置のＡＳＣと比較して、ＣＯＬ１Ａ１の同様の発現増加を示した（Ｐ＜０．００１；図１１Ｃ）。
【０２６２】
２ｇのエストロゲン活性を確認するために、ＢＭＳＣ及びＡＳＣを用いて、骨形成分化培地中で各細胞を２ｇとフルベストラントとで同時に３日、７日または１４日間処置することによって、阻害物質試験を実施した。フルベストラント処置は、ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおける２ｇの骨形成活性を、それぞれ１．９倍から０．８倍及び２．０倍から０．９倍へとビヒクル処置細胞と同等のレベルにまで減少させた（Ｐ＜０．００１；図１２）。さらに、フルベストラントは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおけるＲＵＮＸ２、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１の発現を減少させた。具体的には、２ｇとフルベストラントとで処置したＢＭＳＣは、３日目のＲＵＮＸ２発現が３．４倍の減少、３日目のＣＯＬ１Ａ１発現が９．９倍の減少、１４日目のＩＧＦ１の発現が４０．０倍の減少となった（Ｐ＜０．０５）。ＡＳＣに関しては、フルベストラントは、７日目のＲＵＮＸ２発現を４．１倍、１４日目のＣＯＬ１Ａ１の発現を３．３倍減少させることによって、２ｇの活性を阻害した（Ｐ＜０．０１）。総合すると、これらの結果は、２ｇがエストロゲン媒介機構を通して作用し、フルベストラントの存在下で活性が表現型的及び分子的に減少することを示すものである。
【０２６３】
骨形成に対するダイゼイン類似体２ｌの効果は、エストロゲン依存機構とエストロゲン非依存機構の両方を介する。
【０２６４】
エストロゲン、ダイゼイン及び２ｇとは異なり、２ｌで処置したＢＭＳＣは、本試験で調べた初期、中期及び後期の骨形成遺伝子のすべてにおいて発現増加を示した。非分化ＢＭＳＣに対して、２ｌで処置したＢＭＳＣは、３日目のＲＵＮＸ２、ｃ−ＦＯＳ、ＳＰＡＲＣ、ＤＬＸ５、ＳＰＰ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦ１の発現について、それぞれ１５２．８倍、５１．６倍、３４．４倍、４１．２倍、３８．８倍、３１．８倍及び１２４．４倍の増大を示した（Ｐ＜０．０５；図１０）。ダイゼイン類似体２ｌは、７日目のｃ−ＦＯＳ、ＳＰＡＲＣ、ＤＬＸ５及びＳＰＰ１の発現をそれぞれ１．８倍、８．９倍、１８２．８倍及び１２．３倍で継続的に誘導した（Ｐ＜０．０５；図１０）。さらに、２ｌ処置ＢＭＳＣは、１４日目においてさえ、後期骨形成遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１の増加を呈した（Ｐ＜０．０５；図１０）。これらの結果は、２ｌが骨形成を開始し維持するための主要な骨形成調節遺伝子を誘導することによって骨形成を有意に誘導することを示唆するものである。
【０２６５】
ＢＭＳＣへの効果は顕著であったが、ＡＳＣへの効果は弱かった。２ｌで処置したＡＳＣは、同様の遺伝子誘導の増加を呈したが、ｃ−ＦＯＳ、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１に限られた。２ｌで処置したＡＳＣは、３日後のｃ−ＦＯＳ発現について２０４．５倍の向上を呈した（Ｐ＜０．０５；図１１）。分化の１４日後、２ｌ処置ＡＳＣは、ＣＯＬ１Ａ１の発現が、ビヒクル処置ＡＳＣ（１４７１．７倍）またはエストロゲン処置（２０６１．２倍）ＡＳＣと比較して、より高かった（４１３９．８倍）（Ｐ＜０．０５；図１１）。同様に、２ｌで処置した分化１４日のＡＳＣにおけるＩＧＦ−１発現は、ビヒクル処置ＡＳＣ（６．８倍）またはエストロゲン処置ＡＳＣ（４．４倍）と比較して、ＩＧＦ発現の増大（２２．６倍）を示した（Ｐ＜０．０５；図１１）。
【０２６６】
２ｌのエストロゲン活性をさらに特定すると、２ｌとフルベストラントの併用処置は、ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおける骨形成を減少させた。しかしながら、骨形成分化は、フルベストラントによって完全に阻害されたわけではなく、２ｌ誘導骨形成がエストロゲンと非エストロゲン活性の両方を介していることを示唆している。より具体的には、２ｌで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、それぞれ２．０倍及び２．４倍の骨形成の増加を示した（図１２）。２ｌとフルベストラントの同時送達は、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成をそれぞれ１．５倍及び１．７倍減少させた（Ｐ＜０．００１；図１２）。さらに、フルベストラントは、ＢＭＳＣとＡＳＣの両方において初期及び中期の転写因子発現を減少させたことから、フルベストラントの骨形成に関するエストロゲン機構が初期から中期の骨形成遺伝子の誘導を介するものであることが示唆される。ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１の発現は、フルベストラントの存在下であってもＢＭＳＣでは誘導が継続した（図１２）ことから、２ｌが別の非エストロゲン誘導経路を利用して、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１の下流上方制御をもたらす骨形成を誘導していることが示唆される。
【０２６７】
考察
【０２６８】
骨粗鬆症は、ＢＭＤの減少及び骨構造の損失を特徴とし、脆弱性及び骨折罹患率を増加させる疾患である。疾患の進行を抑制し、骨強度を高めるためには、骨形成を増加させるための新しい化合物の開発が必要である。本明細書中に呈示した研究では、ＢＭＳＣとＡＳＣの両方におけるｉｎ  ｖｉｔｒｎｏでの骨形成能について、合成ダイゼイン類似体の試験を行った。ダイゼイン類似体２ｇ及び２ｌは、アリザリンレッド染色、アルカリホスファート染色及び硝酸銀染色によって特徴付けられる骨形成分化を増加させることがわかった。加えて、これらのダイゼイン類似体は、エストロゲンまたはダイゼイン処置の細胞と比較して、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成分化を向上させた。さらに、フルベストラントでの同時処置により、２ｇの骨形成活性が消失し、２ｌの骨形成活性が弱まったことから、２ｇが主にエストロゲン受容体経路を介して作用する一方、２ｌがエストロゲン受容体依存経路と非依存経路の両方を用いる可能性が示唆される。主要な骨形成遺伝子の転写レベルに関する分析では、２ｇ及び２ｌがＢＭＳＣ及びＡＳＣにおいて骨形成遺伝子を特異的に誘導したことが示され、これらの２つの化合物が別々に骨形成を誘導することを示唆している。
【０２６９】
これまでに発表された研究と一致して、ゲニステインは、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成能を増加させた。Ｂｉｔｔｏらによる過去の研究では、卵巣切除により誘発させたラットの骨粗鬆症性骨に対して、ゲニステインがＢＭＤを向上させるだけでなく、構造も回復させたことが示された（たとえば、Ｂｉｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００８，１５５：８９６−９０５；及びＢｉｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１０，１７：３００７−３０１８を参照）。さらに、ラットにおけるゲニステイン処置の効果が、骨粗鬆症を治療するために一般的に使用される選択的エストロゲン受容体調節剤であるラロキシフェンよりも良好に骨の全体的構造及び強度を改善したことが観察された。追加研究では、ゲニステインが破骨細胞の骨吸収活性を阻害し、ＢＭＳＣと骨芽細胞の骨形成分化及び成熟を刺激することが示された。Ｍｉｎｇと共同研究者らは、ゲニステインがＥＲ、ｐ３８ＭＡＰＫ−Ｒｕｎｘ２、ＮＯ／ｃＧＭＰの経路を強化し、破骨細胞形成阻害因子であるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の誘導を介して骨吸収を阻害したと結論付けた。これらの研究は、ゲニステインにより、閉経後または早発閉経後の骨減少性女性において、ホルモン補充療法による治療を受けた女性に匹敵するほど骨損失が抑制され、ＢＭＤが増加したという結果に対する裏付けを提供するものである。
【０２７０】
比較研究では、ラットの卵巣切除誘発性骨損失を防止するには、ダイゼインがゲニステインよりも効果的であることが示された。卵巣切除誘発性骨損失ラットモデルを教示するという点で、Ｐｉｃｈｅｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ  ２０００，１３０：１６７５−１６８１を本明細書に特に援用する。ダイゼインは、腰椎、大腿骨ならびにその骨端線領域及び骨幹端領域（海綿骨及び皮質骨に富むことがわかっている領域）のＢＭＤをそれぞれ高めることがわかった。ダイゼイン処置によって観察された効果はエストロゲン処置に匹敵するものであったが、ゲニステイン処置のみが骨幹端領域の骨密度の増加をもたらした。ダイゼイン処置はまた、破骨細胞活性を下げて細胞外基質の分解量を抑制しつつ、コラーゲン形成を増加させることによって、生体力学的強度を上げることがわかった。総合すれば、ダイゼイン処置は、骨吸収活性の抑制及び骨形成促進活性の向上をもたらす。この研究の結果は、ＢＭＳＣ及びＡＳＣにおけるダイゼインの骨形成促進活性に関する別の裏付けを提供するものである。追加研究では、卵巣切除マウスモデルの複数部位において、高カルシウムと合わせたダイゼインにより、骨質量及び生体力学的強度が維持され、現行の骨粗鬆症治療レジメンにダイゼインを追加できることが示されている。
【０２７１】
これらのフィトエストロゲンは、げっ歯類モデルの骨密度の増加に効果的であることが証明されたが、本明細書にて開示する新しく開発されたダイゼイン誘導体については、骨分化及び再生に関し、ヒトＢＭＳＣ及びＡＳＣにおける骨形成活性を向上させる能力を決定するために試験を行った。本明細書にて開示した特定の実施例において、４−ヒドロキシ部分を維持したまま７−ＯＨの水素をイソプロピル（２ｃ）、シクロペンチル（２ｇ）またはアリル（２ｌ）で置換して変更した場合、エストロゲン活性はダイゼインよりも低く、骨形成活性は有意に増加した。本明細書にて開示した研究では、２ｇと２ｌの化合物の用量を増やしても、細胞の骨形成活性に悪影響はなく、細胞毒性ももたらされなかった。
【０２７２】
類似体２ｇは、エストロゲンよりもはるかに弱いエストロゲン活性を有したが、２ｇ処置では、ＢＭＳＣのＲＵＮＸ２、ＳＰＡＲＣ及びＩＧＦ１、ならびにＡＳＣのＲＵＮＸ２及びＣＯＬ１Ａ１が向上した。ＲＵＮＸ２は、間葉系幹細胞から骨芽細胞への成長及び成熟を制御する多数の遺伝子の転写を調節することから、骨芽細胞の成長及び適切な骨形成に必須であると考えられている。ＳＰＡＲＣ、ＩＧＦ１及びＣＯＬ１Ａ１はすべて、ＢＭＤの増加、生体力学的強度の向上及び細胞外基質の維持に関与していた。２ｇ処置のＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成活性に対するフルベストラントの阻害効果は、２ｇのエストロゲン活性を示したことから、より弱い類似体２ｇがエストロゲン受容体に関係するシグナル伝達経路を介して骨形成活性を向上させると考えられる。
【０２７３】
同様に、２ｌへのダイゼインの構造変更でも、エストロゲン様機構におそらく起因して、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成分化が向上した。興味深いことに、２ｇとは異なり、フルベストラント処置では、２ｌの骨形成活性が失われなかったことから、２ｌがエストロゲン非依存機構を介して作用する可能性が示唆された。２ｌで処置したＢＭＳＣ及びＡＳＣは、細胞の分化及び細胞外基質の石灰化に関与する初期、中期及び後期の骨形成遺伝子の転写レベルの変化を示した。２ｌで処置したＢＭＳＣでは、すべての骨形成遺伝子が上方制御され、ＢＭＳＣにおける２ｌの強力な効果が示された。対照的に、２ｌで処置したＡＳＣでは、ｃ−ＦＯＳ、ＣＯＬ１Ａ１及びＩＧＦ１が変化したが、顕著な効果は少なかった。
【０２７４】
これらの研究ではさらに、これらの化合物がＡＳＣでもＢＭＳＣでも同様の効果を有することが示された。ダイゼイン類似体の研究ではさらに、ダイゼインの軽微な構造変更により、ＡＳＣでの効果がより顕著であるものの、ＢＭＳＣ及びＡＳＣの骨形成分化がさらに増加することが示されている。ＢＭＳＣ及びＡＳＣは両細胞とも、同じ胚葉から誘導されるため、類似の生物学的特徴を有する。しかしながら、これらの２つの細胞種に関する綿密な分析により、近年、免疫表現型及び遺伝子発現プロファイルにおける差異が明らかになった。たとえば、Ｍｏｎａｃｏと共同研究者らは、初期骨形成分化の間、ＡＳＣは、脂肪代謝、遊走及び免疫調節性能がＢＭＳＣに比べてより大きく、一方、ＢＭＳＣは、炎症、細胞成長及び増殖の誘導がより大きいと結論付けた（Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２，７：１−１９）。過去に発表されたこのデータは、ＢＭＳＣとＡＳＣの間における分析の転写レベルの違いを示しており、本明細書に示した結果と一致し、これらの２つの細胞種が異なる作用機構を介して骨形成分化に向かうことを示唆している。
【０２７５】
本開示の発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すれば、例示した実施形態が本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことが認識されるはずである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定められる。したがって、これらの請求項の範囲及び趣旨に該当するすべてを我々の発明として特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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