(57)【要約】  無角対立遺伝子を有する家畜を作製するための組成物および方法が提供されており、他の遺伝子または染色体部分を変化させることなく無角対立遺伝子をウシ種に移入することが含まれる。動物は角を持たないように遺伝子改変され得る。１つのこのようなプロセスは、ウシ無角対立遺伝子の遺伝子移入を含む。従って、家畜品種は、家畜の他の形質を変化させることなく無角対立遺伝子を受け入れるように作製される。本発明の実施形態は、有角対立遺伝子から無角対立遺伝子へのゲノム改変を含む、遺伝子改変家畜動物である。
2016507228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有角対立遺伝子から無角対立遺伝子へのゲノム改変を含む、遺伝子改変家畜動物。
【請求項２】
前記動物が前記有角対立遺伝子を有する第１の動物品種であり、前記無角対立遺伝子が第２の動物品種において見出される、請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記無角対立遺伝子が、天然対立遺伝子および合成対立遺伝子からなる群から選択される、請求項１または２に記載の動物。
【請求項４】
前記天然対立遺伝子が前記品種に特有であるか、または前記品種の突然変異対立遺伝子である、請求項３に記載の動物。
【請求項５】
前記第１の品種が、ヘレフォード、アンガス、ショートホーン、シャロレー、リムザン、シンメンタール、ブラーマン、ブランガス、和牛、およびサンタ・ガートルーディス、エアシャー、ブラウン・スイス、カナディアンヌ、ダッチ・ベルテッド、ガーンジー、ホルスタイン（ホルスタイン−フリーシアン）、ジャージー、ケリー、ミルキング・デボン、ミルキング・ショートホーン、ノルウェージャン・レッド、ブサ、カナディアンヌ、エストニアン・レッド、フレックフィー、フリーイアン、ジロランド、イラワラ、アイリッシュ・モイルド、ラインバック、ムーズ・ライン・イッセル、モンベリアルド、ノルマンド、ランドール、サヒワール、オーストラリアン・ミルキング・ゼブ、シンメンタール、キアニーナ・マルキジャーナ、ロマニョーラからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の動物。
【請求項６】
前記第２の品種が、アンガス、レッド・アンガス、レッド・ポール、ギャロウェイ、ベルテッド・ギャロウェイ、アメリカン・ホワイト・パーク、ブリティッシュ・ホワイト、アメリファックス、ジャマイカ・ブラック、ジャマイカ・レッド、マレー・グレイ、ブランガス、レッド・ブランガス、セノポール、ボーア・ヤギからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の動物。
【請求項７】
前記無角対立遺伝子が、ＰＣケルト起源およびＰＦフリーシアン起源からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の動物。
【請求項８】
ファウンダー動物またはファウンダー動物の子孫である、請求項１〜７のいずれかに記載の動物。
【請求項９】
マーカーを含まない、および／またはレポーターを含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の動物。
【請求項１０】
前記ゲノム改変が前記無角対立遺伝子においてのみ成されている、請求項１〜９のいずれかに記載の動物。
【請求項１１】
前記遺伝子改変生物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄類からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の動物または前記動物の子孫の、家畜としての使用。
【請求項１３】
細胞の有角対立遺伝子に対するゲノム改変を含むインビトロ細胞。
【請求項１４】
前記有角遺伝子座における前記改変が、前記有角対立遺伝子から無角対立遺伝子への改変である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が家畜細胞である、請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞がウシ、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄類からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ヘレフォード、アンガス、ショートホーン、シャロレー、リムザン、シンメンタール、ブラーマン、ブランガス、和牛、およびサンタ・ガートルーディス、エアシャー、ブラウン・スイス、カナディアンヌ、ダッチ・ベルテッド、ガーンジー、ホルスタイン（ホルスタイン−フリーシアン）、ジャージー、ケリー、ミルキング・デボン、ミルキング・ショートホーン、ノルウェージャン・レッド、ブサ、カナディアンヌ、エストニアン・レッド、フレックフィー、フリーイアン、ジロランド、イラワラ、アイリッシュ・モイルド、ラインバック、ムーズ・ライン・イッセル、モンベリアルド、ノルマンド、ランドール、サヒワール、オーストラリアン・ミルキング・ゼブ、シンメンタール、キアニーナ・マルキジャーナ、およびロマニョーラからなる群から選択される家畜細胞である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、初代細胞、初代体細胞、または接合体である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の細胞。
【請求項１９】
家畜の幹細胞または始原生殖細胞である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞が前記改変を受ける場合、無角対立遺伝子をコードする相同性依存型組換え鋳型を含む、請求項１３〜１９のいずれかに記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞の前記有角対立遺伝子において染色体ＤＮＡを切断するために、部位特異的エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
動物をクローニングするための、請求項１２〜２１のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２３】
無角対立遺伝子をコードし、天然有角対立遺伝子と重複する配列を含む、単離核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の単離核酸を発現させるためのプラスミド。
【請求項２５】
遺伝子改変された家畜生物の作製方法であって、家畜初代細胞、家畜初代体細胞、家畜幹細胞、家畜始原生殖細胞、家畜接合体、家畜胚盤胞、または家畜胚の天然有角対立遺伝子を変更することを含み、前記有角対立遺伝子が無角対立遺伝子に変更される、方法。
【請求項２６】
前記家畜がウシ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記家畜初代細胞、家畜初代体細胞、家畜幹細胞、家畜始原生殖細胞、家畜接合体、家畜胚盤胞、または家畜胚の天然有角対立遺伝子に、
ａ．前記天然有角対立遺伝子内の部位を特異的に切断する部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸と、
ｂ．前記無角対立遺伝子を含む核酸相同性依存型組換え鋳型と
を導入することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）からなる群から選択される、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記初代体細胞が変更される、請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記胚が変更される、請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記接合体、胚盤胞、または胚を妊娠母動物に移植することをさらに含む、請求項２５〜２８または３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記初代細胞、初代体細胞、または接合体をクローニングして動物全体を作製することをさらに含む、請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
請求項２５〜３２のいずれかに記載の方法によって作製された家畜動物。
【請求項３４】
無角表現型を有する家畜ファウンダー動物を作製するための、請求項２５〜３２のいずれかに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７５２，２３２号明細書および２０１３年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８７０，５７０号明細書（これらはそれぞれ参照によって本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の陳述
本明細書に記載される研究の態様は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金１Ｒ４３ＲＲ０３３１４９−０１Ａ１およびＵＳＤＡ（米国国立食品・農業研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ））からのバイオテクノロジー・リスク・アセスメント・プログラム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）競争的助成金番号２０１２−３３５２２−１９７６６による支援を受けた。米国政府は、これらの発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
技術分野は、角を持たない細胞または動物などの遺伝子改変された生物に関連する。
【背景技術】
【０００４】
家畜の角は、動物の飼育をより容易にするために様々な種において除去される。これらの角を除去するためにいくつかのアプローチがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
動物は、角を有さないように遺伝子改変され得る。１つのこのようなプロセスは、ウシ無角（ｐｏｌｌｅｄ）対立遺伝子の遺伝子移入を含む。従って、家畜品種は、家畜の他の形質を変化させることなく無角対立遺伝子を受け入れるように作製される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、有角（ｈｏｒｎｅｄ）対立遺伝子から無角対立遺伝子へのゲノム改変を含む遺伝子改変家畜動物である。これらは有角対立遺伝子を有する第１の動物品種であることができ、無角対立遺伝子は第２の動物品種において見出される。無角対立遺伝子は天然でも合成でもよい。
【０００７】
本発明の実施形態は、細胞の有角対立遺伝子に対するゲノム改変を含むインビトロ細胞である。有角対立遺伝子（有角遺伝子座）における改変は、有角対立遺伝子から無角対立遺伝子への改変である。細胞は、家畜細胞であり得る。
【０００８】
本発明の実施形態は遺伝子改変された家畜生物の作製方法であって、家畜初代細胞、家畜初代体細胞、家畜幹細胞、家畜始原生殖細胞、家畜接合体、家畜胚盤胞、または家畜胚の天然有角対立遺伝子を変更することを含み、有角対立遺伝子は無角対立遺伝子に変更される。
【０００９】
実施形態には、レポーター遺伝子を用いずに細胞をホーミングエンドヌクレアーゼ（部位特異的エンドヌクレアーゼ）にさらすことと、クローン細胞のコロニーを形成することと、コロニーのメンバーのサブセットを試験して、標的染色体部位で改変を取り込んだコロニーを同定することとを含む、上記の方法のいずれかが含まれる。
【００１０】
さらなる実施形態は、これらの方法の１つまたは複数に従って作製された生物（遺伝子改変動物、遺伝子改変ファウンダー（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物、または遺伝子改変細胞）に関する。実施形態には、これらの技術に関与するプラスミド、ベクター、および単離核酸、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼおよびＨＤＲ鋳型ならびにこれらの発現のためのベクターが含まれる。
【００１１】
本発明の実施形態には、家畜動物を作製するための改変細胞の使用が含まれる。クローニングは、動物を作製するための１つの技術である。
【００１２】
実施形態には、改変動物またはその子孫の家畜としての使用が含まれる。細胞または動物を作製するための方法は、無角表現型を有する家畜ファウンダー動物を作製するためのものであり得る。
【００１３】
以下の特許出願は全ての目的のために参照によって本明細書に援用され、矛盾する場合には本明細書が支配する：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書、２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書、２０１１年２月２５日に出願された米国特許出願第６１／４４６，６５１号明細書、２０１２年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／６６２，７６７号明細書、および２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書。これらの特許出願のそれぞれは、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】パネルａ）は、ウシ有角／無角遺伝子座の概略図である。ＴＡＬＥＮは、矢じりで示される有角変異体を切断するように設計した。パネルｂ）は、４つのＴＡＬＥＮのセンス鎖配列である。パネルｃ）は、各ＴＡＬＥＮペアをコードするｍＲＮＡによるトランスフェクションの３日後の有角ホルスタイン線維芽細胞のサーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイである。ＴＡＬＥＮ  ＩＤおよびトランスフェクション後のインキュベーション温度は、ゲルの上側に示される。配列識別子は以下の通りである：ＨＰ１．１  ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（配列番号１および２）、ＨＰ１．２  ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（配列番号３および４）、ＨＰ１．３  ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（配列番号５および６）、ＨＰ１．４  ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（配列番号７および８）。
【図２】ＴＡＬＥＮ媒介によるＰＯＬＬＥＤの遺伝子移入。パネルａ）は、無角対立遺伝子をホルスタイン（ＨＯＲＮＥＤ）細胞へ遺伝子移入するための戦略の概略図である。ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（一番下）は、１０ｂｐ欠失を有する２１２ｂｐのタンデム反復（赤色矢印）である（図示せず）。ＰＯＬＬＥＤ  ＨＤＲプラスミドを用いた相同組換えによって修復され得るＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子（緑色の鉛直矢印）を特異的に標的にするようにＴＡＬＥＮを開発した。パネルｂ）は、ＰＯＬＬＥＤのホモ接合型またはヘテロ接合型遺伝子移入を有するコロニーの代表的な画像である。候補コロニーの陽性分類のために３つのプライマーセットを使用した：Ｆ１＋Ｒ１、Ｆ２＋Ｒ２およびＦ１＋Ｐ（ＰＯＬＬＥＤ特異的）。ＰＣＲ産物の同一性は、Ｆ１＋Ｒ１アンプリコンの配列決定によって確認した。
【図３】単離したコロニーの無角変換の例である。個々のコロニーは、図２に記載される細胞集団から増殖させた。図２に記載されるＰＣＲ法によって各コロニーを分析した。クローン３は、無角対立遺伝子へのヘテロ接合型変換を示す３８９および５９１ｂｐの両方の産物を有する（矢印）。使用した修復鋳型は長さ５９１の残基であった。
【図４】パネルａ）は、有角対立遺伝子を無角対立遺伝子へ変換するための概略図である。ＨＰ１．３ＴＡＬＥＮおよび短い修復鋳型が有角細胞に導入される。修復鋳型を無角アンガス（Ａｎｇｕｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより作製した；相同性の長さが示される。パネルｂ）は、２μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ＋Ｇａｌ４：ＲｅｃＡで被覆された５００ｎｇのｓｓＤＮＡによりトランスフェクトされた有角ホルスタイン線維芽細胞における無角変換のＰＣＲ評価である。各レーン／ＰＣＲ反応は、トランスフェクトされた集団から希釈された約３細胞当量からなる。有角細胞からのプライマーｂｔＨＰ−Ｆ１およびｂｔＨＰ−Ｒ１を用いるＰＣＲの結果、３８９ｂｐの産物が得られる。無角への変換は２０２塩基対の正味の挿入をもたらし、従って、同じプライマーのＰＣＲ産物は、５９１ｂｐ産物をもたらす（左側余白の矢印）。無角変換を示す産物を有する反応の数は右上の角に示される。パネルｃ）は、２ｕｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ＋１，５００ｎｇのｓｓＤＮＡによりトランスフェクトされた有角ホルスタイン線維芽細胞における無角変換のＰＣＲ評価である。無角変換を示す産物を有する反応の数は右上の角に示される。
【図５】ブタＡＰＣにおけるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介のＨＤＲの比較である。パネルａ）では、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮ（配列番号９および１０）およびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａ（配列番号１２）が野生型ＡＰＣ配列（配列番号１１）に対して示される。下側には、新規のＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐの挿入を送達するＨＤＲ  ｏｌｉｇｏ（配列番号１３）が示される。次に、２μＭのｏｌｉｇｏ  ＨＤＲ鋳型と、１μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ｈＣａｓ９をコードする１μｇの各プラスミドＤＮＡ、およびｇＲＮＡ発現プラスミドか、あるいはｈＣａｓ９をコードする１μｇのｍＲＮＡおよび０．５μｇのｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかとによってトランスフェクトされたブタ線維芽細胞を分割し、３０℃または３７℃のいずれかで３日間培養し、その後３７℃で１０日目まで増殖させた。パネルｂ）は、ＲＦＬＰおよびサーベイヤーアッセイ結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書において報告されるように、遺伝子操作を用いて無角家畜動物が作製された。通常は角を有するが、自然突然変異のために角を有さない動物は、無角動物と呼ばれる。酪農場経営者および牛の快適な生活を守るために、米国、ヨーロッパ、およびその他の地域において、日常的に手作業で乳牛の大部分から角が除去される。除角は痛みを伴い、動物のストレスの一時的な上昇を引き起こし、動物生産に追加費用がかかり、その後の傷害から動物を保護する意図にもかかわらずその実施を残酷であると見なす人もいる。いくつかの肉牛品種は天然に無角であり（例えば、アンガス）、ＰＯＬＬＥＤと呼ばれる優性の形質である。本明細書に記載される技術は、除角を受ける必要がない動物を提供することによって、動物の幸せ（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）を向上させる。無角性を付与する２つの対立遺伝子変異体が染色体１において最近同定された。これらの突然変異のいずれかを有する乳牛は稀であり、一般に、酪農遺伝子選択指数（ｄａｉｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃｅｓ）においてその有角対応物よりもはるかに低いランクである。ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子の有角品種への減数分裂遺伝子移入は従来の交雑によって達成することができるが、交雑動物の遺伝的メリットは、生産性を回復するために多数の長期にわたる世代の選択的繁殖を経験および必要とするであろう。
【００１６】
遺伝学者は、数十年間、無角性の遺伝子座を探してきた。手短に言うと、無角性は２０年間、熱心な現代の研究の目的であった。Ａｌｌａｉｓ−Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「ウシ無角表現型および角の個体発生についての新規の洞察（Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｏｌｌｅｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ  Ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）」，Ｂｏｖｉｄａｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（５）：ｅ６３５１２を参照されたい。無角突然変異は多数の品種のウシ染色体１に迅速にマッピングされたが、無角性の遺伝的原因の実際の部位は、種々の理由からなかなか見つけられなかった。しかしながらごく最近、少なくとも２つの無角対立遺伝子（１つは「ケルト（Ｃｅｌｔｉｃ）」であり、１つは「フリーシアン（Ｆｒｉｅｓｉａｎ）」である）が存在することが示され、これらのそれぞれについて候補突然変異が提示された。Ｍｅｄｕｇｏｒａｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「ウシ無角性−対立遺伝子異質性を有する常染色体優性形質（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｏｌｌｅｄｎｅｓｓ−ａｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｔｒａｉｔ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）」，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３９４７７。これらの突然変異はどれも、既知のコーディングまたは調節領域に位置しなかった。本明細書において、本発明者らは、非無角（有角）動物の同等の部位において遺伝子変化を起こすことにより、無角表現型を生じさせることが可能であることを示す。
【００１７】
しかしながら、動物において無角性を作り出すこと、および動物のゲノムを妨害することなくそれを行うことが可能である。ケルトＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（ＰＣ対立遺伝子とも呼ばれる）の非減数分裂遺伝子移入（１０ｂｐを置換する２１２ｂｐの重複）は、有角乳用雄牛由来の線維芽細胞において達成した。ケルトＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を含む１５９４ｂｐ断片を含有するプラスミドＨＤＲ鋳型をアンガス品種から採取した（図１パネルａ）。ＴＡＬＥＮは、ＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子を切断するがＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子には影響を与えないでおくように設計した。驚くことに、この実験は、ｍＲＮＡとして送達された一対のＴＡＬＥＮが、プラスミド発現カセットと比べて同様の活性を有することを示した（データは示さず）。従って、ＴＡＬＥＮ発現プラスミドの可能性のあるゲノムの組込みを除外するためにｍＲＮＡとしてＴＡＬＥＮを送達する実験を実施した。２２６のうち５つのコロニー（２％）が、ＰＯＬＬＥＤの遺伝子移入を確認するための図１のパネルｂに示される各ＰＣＲ試験に合格した。５つのうち３つのクローンはＰＯＬＬＥＤ遺伝子移入に対してホモ接合型であり、対象とする対立遺伝子と１００％同一であることを配列決定により確認した（データは示さず）。
【００１８】
動物交配または人工生殖技術に基づく従来の繁殖プログラムは、望ましい形質を作り出すか、あるいは結合させる遺伝子の良好な組み合わせを最終的に生じることを願って、多数の遺伝子を混合することを含む。トランスジェニック技術は従来の繁殖プロセスを加速する見込みを与える。トランスジェニックプロセスのいくつかの欠点は、このプロセスが改善はあるものの、依然として遅く、コストがかかり、大きな労力を必要とすることである。低効率および結果の予測が不可能なことが通常である。さらに、対象とするゲノム部位にのみ変化を起こすプロセスはこれまで知られていない。
【００１９】
本発明者らは、農業、研究手段、または生物医学的な目的のために有用である種々の家畜細胞および／または動物において、様々な遺伝子の正確で高頻度の編集を開発した。これらの家畜遺伝子編集プロセスには、プラスミド、ｒＡＡＶおよびオリゴヌクレオチド鋳型を用いる、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により刺激される相同性指向修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）が含まれる。本発明者らは、本明細書において、ウシＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を有角ホルスタイン線維芽細胞に遺伝子移入したことを示す。この実施例は、角を有さない種々の品種の乳牛を作製できることを実証する。この変化はまた、動物のゲノムの他の遺伝子または他の部分を妨害することなく行うことができる。これらのプロセスは、レポーターを用いずに、および／または選択マーカーを用いずに遺伝子変化を起こすことができるように十分に高い効率を達成するために本発明者らによって開発された。さらに、本プロセスは、対象とする部位においてのみ対象とする変化を有する遺伝子改変動物を作製するためにファウンダー世代において使用することができる。これらの方法は、研究、農業および生物医学用途のために、家畜細胞、大型哺乳類、および家畜において、無角および有角対立遺伝子の非減数分裂の種内および種間遺伝子移入を実証する。
【００２０】
図１には、ウシＤＮＡ内の適切な部位に結合して切断する部位特異的ヌクレアーゼを作製できるかどうかを決定するための実験が記載される。問題の１つは、分子間組換えの可能性が高いために、所望の結合部位で繰り返される配列がターゲティングを混乱させ得ることを踏まえて、タンデム反復を結合できるかどうかを決定することであった。さらに、これらの結合は培養中の生きた細胞において効率的であり、相互に協同しなければならない。有角対立遺伝子は、特に、無角対立遺伝子と有角対立遺伝子との高類似性のために難題である。ＴＡＬＥＮ結合部位の選択位置は明らかでなかった；成功したＴＡＬＥＮの設計は、有角遺伝子座を切断および結合することができるが、ＴＡＬＥＮが無角対立遺伝子を切断することは許可しない。これらの設計の発見は、本発明の研究において重要な成果であった。このアプローチの成功は予測し得なかった。図１に示されるように、標的として選択される有角対立遺伝子は２１２残基を有し、無角対立遺伝子は、これらの２１２残基の反復を有した。無角対立遺伝子はさらに、反復の間に１０塩基対（ｂｐ）の欠失を有した。パネルａ）は２１２ｂｐ配列を示し、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮ（黒い逆三角形でマークされる）とｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（黒い三角形でマークされる）との間で、端部において欠失される１０ｂｐを有する。従って、ＴＡＬＥＮペアは１０ｂｐ欠失部位の縁部に配置された。ＴＡＬＥＮペアは、１０ｂｐ欠失領域において有角対立遺伝子を切断する。相同性依存型組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）鋳型を用いて、ＴＡＬＥＮが結合している場所の間に、２１２残基反復（１０ｂｐ欠失を有する反復なので、実際には２０２残基）の挿入を導いた。パネルａ）に示されるように、無角では、Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＲｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮは次に２０２残基によって分離される。また、無角対立遺伝子の再切断が低減される。結合および切断を適度に達成できるかどうかを決定するために、種々のＴＡＬＥＮを作製した。パネルｂ）の表は、試験したＴＡＬＥＮのいくつかを記載する。パネルｃ）は試験結果を示し、その有効性はＮＨＥＪ％によって測定される。３番目のレーンのＴＡＬＥＮ、ＨＰ１．３を続いて無角対立遺伝子の遺伝子移入のために使用した。
【００２１】
部位特異的（標的化とも呼ばれる）エンドヌクレアーゼの再結合を低減するための実施形態には、外因性無角対立遺伝子を細胞の染色体ＤＮＡに遺伝子移入するための相同性指向修復（ＨＤＲ）の方法が含まれ、この方法は、標的化ヌクレアーゼ系、および外因性対立遺伝子を含むＨＤＲ鋳型を細胞に導入することを含み、標的化ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡの内在性同族有角対立遺伝子配列と特異的に結合するためのＤＮＡ結合メンバーを含み、ここで、標的化ヌクレアーゼ系およびＨＤＲ鋳型は、ＨＤＲ鋳型配列に対する同一性を有するため、および内在性対立遺伝子の代わりに外因性対立遺伝子を染色体ＤＮＡに遺伝子移入するために、染色体ＤＮＡを変更するように動作し、ＨＤＲ鋳型配列は、ＤＮＡ結合メンバーのＨＤＲ鋳型配列に対する特異的結合を低減するように設計される。
【００２２】
図２は、有角対立遺伝子を有する細胞への無角対立遺伝子の遺伝子移入のための研究戦略および結果を示す。有角対立遺伝子はＰＣＲプライマーＦ１およびＲ１間に１５４６ｂｐを有する。この配列には、ＰＣＲプライマーＦ２およびＲ２間に３６５ｂｐが存在する。矢印によって示される２１２ｂｐ配列を有する有角対立遺伝子はこの領域にある。ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（一番下）は、１０ｂｐの欠失（図示せず）を有する２１２ｂｐのタンデム反復（２つの矢印で示される）を有する。ＰＣＲプライマーＦ２およびＲ２間の長さは５６７ｂｐである；５６７ｂｐは、有角対立遺伝子の３６５ｂｐに、２１２ｂｐの反復を加え、１０ｂｐの欠失を差し引いた値に等しい。ＨＤＲ鋳型の長さは１５９４ｂｐであった。鋳型配列が細胞の染色体に遺伝子移入されたら、プライマーＦ１およびＲ１間に１７４６ｂｐが存在する；１７４６は、有角対立遺伝子の１５４６ｂｐに反復の２１２ｂｐを加え、１０ｂｐの欠失を差し引いた値に等しい。さらに、無角対立遺伝子に特有のＰＣＲ産物は、タンデム反復領域においてＰで示される。ＴＡＬＥＮは、ＨＤＲ鋳型を用いて相同組換えにより修復され得るＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子（図１）を特異的に標的とするように開発された。ＴＡＬＥＮおよびＨＤＲ鋳型を受け入れた細胞を希釈し、単一の細胞としてプレーティングし、これを培養して、クローンコロニーにおいて複製させた。コロニーのメンバーを無角対立遺伝子について試験した。パネルｂは、ＰＯＬＬＥＤがホモ接合型またはヘテロ接合型遺伝子移入されたコロニーの代表的な画像を示す。候補コロニーの陽性分類のために３つのプライマーセットを使用した：Ｆ１＋Ｒ１、Ｆ２＋Ｒ２およびＦ１＋Ｐ（ＰＯＬＬＥＤ特異的）。ＰＣＲ産物の同一性は、Ｆ１＋Ｒ１アンプリコンの配列決定によって確認した。
【００２３】
図３は、無角変換の一例である。異なるＨＤＲ鋳型を使用したことを除いて図１および２について記載されたものと同様にして、無角対立遺伝子を細胞に遺伝子移入した。鋳型は５９１ｂｐの長さであった：５’ｇｔｃｔｇｇｇｇｔｇａｇａｔａｇｔｔｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｇｃｔｇｔｇａａａｔｇａａｇａｇｔａｃｇｔｇｇｔａｃｃａａｃｔａｃｔｔｔｃｔｇａｇｃｔｃａｃｇｃａｃａｇｃｔｇｇａｃｇｔｃｔｇｃｇｃｃｔｔｔｃｔｔｇｔｔａｔａｃｔｇｃａｇａｔｇａａａａｃａｔｔｔｔａｔｃａｇａｔｇｔｔｔｇｃｃｔａａｇｔａｔｇｇａｔｔａｃａｔｔｔａａｇａｔａｃａｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｇｔｃｔｇａａａｇｔｃｔｔｔｇｔａｇｔｇａｇａｇｃａｇｇｃｔｇｇａａｔｔａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｔｇａｇａｔａｇｔｔｔｔｃｔｔｔｇｃｔｃｔｔｔａｇａｔｃａａａａｃｔｃｔｃｔｔｔｔｃａｔｔｔｔｔａａｇｔｃｔａｔｃｃｃａａａａｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｔｇｔｃｃｔｔｇａｔｇｔｔｇａａｔｔａｔａｇｇｃａｇ（配列番号１４）。矢じりによって示されるように、１２のうちの１つのコロニーは、無角対立遺伝子の遺伝子移入を実証するＰＣＲ産物を有した。
【００２４】
図４は、無角対立遺伝子の細胞への遺伝子移入のための別のスキームを示す。３２５ｂｐのＨＤＲ鋳型を使用した。遺伝子移入された対立遺伝子は、レッド・アンガス（Ｒｅｄ  Ａｎｇｕｓ）無角であり、レシピエントは有角ホルスタイン線維芽細胞であった。鋳型は、２９ｂｐの上流重複部分および８４ｂｐの下流重複部分を有した。２１２ｂｐの反復が重複部分の間にあった。反復を天然の２１２ｂｐ配列の１０ｂｐの欠失の置換として使用した。このプロセスは、ＴＡＬＥＮの熱変性（一本鎖）オリゴマーを使用したことを除いて、図１〜３に記載されるものと同様であった。図４のパネルｂおよびｃに示されるように、２つの条件を試験した。パネルｂ）では、２μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ＋Ｇａｌ４：ＲｅｃＡでコートされた５００ｎｇのｓｓＤＮＡにより細胞をトランスフェクトした。各レーン／ＰＣＲ反応は、トランスフェクトされた集団から希釈された約３細胞当量からなる。有角細胞からのプライマーｂｔＨＰ−Ｆ１およびｂｔＨＰ−Ｒ１を用いるＰＣＲの結果、３８９ｂｐの産物が得られる。無角への変換は２０２の塩基対の正味の挿入をもたらし、従って、同じプライマーのＰＣＲ産物は、５９１ｂｐ産物をもたらす（左側余白の矢印）。無角変換を示す産物を有する反応の数は右上の角に示される。パネルｃ）は、２ｕｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ＋１，５００ｎｇのｓｓＤＮＡによりトランスフェクトされた有角ホルスタイン線維芽細胞における無角変換のＰＣＲ評価である。無角変換を示す産物を有する反応の数は右上の角に示される。
【００２５】
図５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による対立遺伝子の遺伝子移入を示す。この方法はＴＡＬＥＮ法と比較される。遺伝子移入された対立遺伝子は大腸腺腫症（ＡＰＣ）であった。パネルａ）において、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａは野生型ＡＰＣ配列に対して示される。下側には、新規のＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐ挿入（囲まれた部分を参照）を送達するＨＤＲ  ｏｌｉｇｏが示される。次に、２μＭのｏｌｉｇｏ  ＨＤＲ鋳型と、１μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ｈＣａｓ９をコードする１μｇの各プラスミドＤＮＡ、およびガイダンスＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現プラスミドか、あるいはｈＣａｓ９をコードする１μｇのｍＲＮＡおよび０．５μｇのｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかとによってトランスフェクトされたブタ線維芽細胞を分割し、３０℃または３７℃のいずれかで３日間培養し、その後３７℃で１０日目まで増殖させた。パネルｂ）において、チャートは、ＲＦＬＰおよびサーベイヤーアッセイ結果を示す。既に決定されたように、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲは３０℃で最も効率的であったが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介によるＨＤＲは３７℃において最も効果的であった。この遺伝子座について、サーベイヤーアッセイにより測定されるＤＮＡ切断頻度は同様であるにもかかわらず、ＴＡＬＥＮは、ＨＤＲの刺激のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系よりも効果的であった。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｈＣａｓ９を、プラスミドに対してｍＲＮＡとして送達する場合、ＨＤＲの差異はほとんどなかった。
【００２６】
本明細書の開示を鑑みて、ＴＡＬＥＮなどの部位特異的エンドヌクレアーゼによる無角動物の作製が教示される。遺伝子改変家畜を作製する際の障壁の１つは、動物細胞に改変を行う効率が従来の最良の実施でもわずか数パーセントであることである。低効率でも、遺伝子改変された下等動物（例えば、ミバエまたはマウスなど）の作製のためには有用であり得る、何故なら、これらの動物は短く多産な生殖サイクルを有し、改変が成功した少数の動物が存在するかどうかを決定するために数百の動物の作製、試験、および選別を提供するからである。しかしながら、従来通りに達成されるこれらの効率レベルは、遥かにより長い妊娠期間を有し、妊娠当たりの子孫の数が比較的少ない家畜偶蹄類には適さない。遺伝的手段を用いて家畜を改変する際の別の障壁は、初代細胞が不安定であるため、初代細胞におけるエンドヌクレアーゼ媒介のＤＮＡの改変が困難なことである。実際、ＴＡＬＥＮ改変細胞の頻度は、濃縮または選択方法が存在しなければ時間とともに著しく低下する。特定の理論に束縛されないが、対象とされない部位におけるＤＮＡ切断は、アポトーシスの誘発または非標的遺伝子の無効化によって細胞の安定性を損ない得ると理論化される。初代細胞という用語は生きている動物から単離された細胞を意味し、この細胞は、組織から単離された後に０〜２回の複製を経験している。結果として、遺伝子改変の成功のために形質転換細胞を作製および試験するために習慣的に使用される技術は、初代細胞においては、その老化傾向のために使用することができない。結果として、体細胞核移植または他の動物クローニング技術のために初代細胞を改変することを含む従来のアプローチを使用する場合、高い成功率を期待することは非現実的である。しかしながら、本明細書において報告されるように、ＴＡＬＥＮおよび他の部位特異的ヌクレアーゼ手段を使用して、遺伝子改変された家畜初代細胞が作製された。これらの改変は、クローニングまたは直接胚注入による遺伝子改変動物系統のファウンダーを作製するのに適する。
【００２７】
本発明の実施形態は、部位特異的エンドヌクレアーゼを使用して、動物およびその子孫が角を有さないように、ウシ、水牛、偶蹄類、ヤギ、またはヒツジなどの家畜を遺伝子改変するための組成物および方法である。従来のプロセスを用いてこれらの動物を作製する際の問題の多くは上記で議論した。遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入またはそれに対する変化、反転、トランスロケーション、種間対立遺伝子移動、種内対立遺伝子移動、天然、合成、または新規の対立遺伝子への遺伝子変換からなるリストから選択され得る。例えば、染色体または染色体対における望まれない突然変異は正常な配列で置換され得る。一般に、標的ＤＮＡ部位が同定され、その部位へ特異的に結合し得るＴＡＬＥＮペアが作製される。ＴＡＬＥＮは、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターによって、細胞または胚へ送達される。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを切断して二重鎖切断を行い、これは次に修復され、その結果多くの場合、インデルが作製されるか、あるいは改変された配列による切断の修復のための鋳型として挿入されるか機能する、付随的な外因性核酸に含有される配列または多型が取り込まれる。外因性核酸という用語は、核酸が細胞中に天然に存在する核酸配列と同一であるかまたは異なるかにかかわらず、細胞または胚に付加される核酸を意味する。外因性配列は、配列が実際に染色体ＤＮＡに挿入される核酸であるかどうか、あるいは配列が細胞ＤＮＡを変化させるための鋳型として使用されるかどうかにかかわらず、標的細胞を変化させるために使用される配列を指す。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれらの一部を含む。ｓｓＤＮＡという用語は、ｓｓ−オリゴヌクレオチドを含む。細胞または胚は、例えば、家畜、偶蹄類、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギからなる群から選択され得る。家畜という用語は、食物または生物材料の商品として飼育される飼養化動物を意味する。偶蹄類という用語は、各足に偶数の指、通常２本、または時には４本の指を有するウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、およびヤギを含む、偶蹄（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）目の有蹄哺乳類を意味する。
【００２８】
一実施形態は、有角の代わりに無角である遺伝子改変家畜を作製する組成物または方法に関し、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮペア）によって特異的に結合される部位において細胞または胚のＤＮＡに遺伝子改変を行うＴＡＬＥＮペアまたは他の部位特異的ヌクレアーゼ系を細胞または胚に導入することと、細胞から家畜動物を生産することとを含む。細胞または胚に対して、例えば、接合体、胚盤胞、または胚への直接注入が使用され得る。あるいは、部位特異的ヌクレアーゼ、ＨＤＲ鋳型、および／または他の因子は、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターの導入のための多数の既知の技術のいずれかを用いて細胞に導入され得る。遺伝子改変動物は、既知のプロセス、例えば、妊娠宿主への胚の移植、または種々のクローニング方法に従って、胚または細胞から作製され得る。「ＴＡＬＥＮによって特異的に結合される部位における細胞のＤＮＡに対する遺伝子改変」、または「標的染色体部位における」などという語句は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合する際に、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼによって切断された部位で遺伝子改変が行われることを意味する。ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮペアが結合したところを正確に切断するのではなく、むしろ２つの結合部位の間の画定された部位で切断する。
【００２９】
別のこのような実施形態は、有角対立遺伝子の代わりに無角対立遺伝子を作製するための組成物または細胞または胚の処理を含む。細胞または動物胚は、研究のため、または動物のクローニングのために使用され得る。細胞は、家畜、偶蹄類、ウシ、ヤギ、ヒツジの細胞、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞であり得る。例えば、実施形態は、遺伝子改変を作製する組成物または方法であり、培養中の複数の初代細胞を、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮをコードするＴＡＬＥＮタンパク質または核酸にさらすことを含む。ＴＡＬＥＮは、タンパク質として、あるいは例えばベクター中のｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列によってコードされる核酸断片として導入され得る。
【００３０】
無角であるような動物の遺伝子改変は、レポーターを用いてまたは用いずに行うことができる。レポーターの回避は、後で除去する必要がないため、あるいは除去されない場合には許容的である必要がないために有用である。しかしながら、胚／細胞レベルの改変段階におけるレポーターの発現は、レポーターを発現しない細胞の排除を可能にする。あるいは、レポーターを発現する細胞を、クローニングまたは他のトランスジェニック動物技術により動物で使用するために培養物から移動することを可能にするか、あるいはさらなる培養および／もしくは数の拡大のため、ならびに／またはさらなるベクターおよび／もしくは核酸および／もしくはＴＡＬＥＮの付加のため、ならびに／または他の遺伝子改変のために第２の培養物へ移動することを可能にする。対象とする遺伝子に依存しないレポーターの発現に基づいた細胞の選択は、ある種の共選択プロセスである。レポーターという用語は、本明細書で使用される場合、レポーターおよび選択マーカーを含む。選択マーカーという用語は、本明細書で使用される場合、正または負のいずれかの生存選択基準による単離を可能にする形質を付与する、遺伝子発現生体分子を指す。レポーターは、例えば、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質であり得る。レポーターは、選択マーカー、例えば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、またはキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）であり得る。他の表現型マーカーは動物を選択するために使用することができ、このようなマーカーは、識別可能な物理的形質（例えば、エピトープまたは色）、成長速度、および／または生存率に基づいている。遺伝子改変細胞、胚、または動物の作製プロセスは、ヌクレアーゼを取り込んだ系、例えば、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮにさらした細胞または胚をレポーターの発現についてアッセイすることと、遺伝子改変家畜および／または偶蹄類または他の動物（魚、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、トリ、ニワトリ、ラットまたは実験動物）を作製するための方法または組成物においてその細胞または胚を使用することとを含む。例えば、初代細胞を細胞培養物から取り出し、クローニングのために使用することができる。あるいは、初代細胞を培養物から取り出し、クローン系統を作製するため、またはさらなるプロセスのために第２の培養物中に入れることができる。あるいは、レポーターを発現する胚または接合体は、代理雌親に移植するために使用されてもよいし、あるいはクローニングのために使用することもできるが、レポーターを発現しない他の胚または接合体はクローニングのために使用することができない。いくつかの実施形態では、レポーターは、マーカーを発現する細胞または胚を選択するために使用される選択マーカーである。
【００３１】
いくつかの家畜形質は、多型（大または小）、一塩基多型、欠失、挿入、または他の変異などの対立遺伝子に関連する。例えば、ベルジャン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）牛からのミオスタチン対立遺伝子（１１−ｂｐ欠失）は筋肉肥大（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｉｎｇ）表現型を引き起こすことがよく知られている。ベルジャン・ブルー対立遺伝子は正常な発達を妨害しない。
【００３２】
同様に、無角対立遺伝子のために、本明細書で教示される方法は、他の遺伝子を破壊することなく、および外因性遺伝子を取り込むことなく対立遺伝子を正確に配置する。無角対立遺伝子は角の非発生に関連するので、無角であるように改変された（直接注入またはクローニングによる）胚はうまく懐胎して、健康な動物の出生をもたらすことが期待される。細胞は有角対立遺伝子から無角対立遺伝子に改変されており、出願の時点で、これらの細胞から動物をクローニングして、生きて生まれる動物を生じさせるためのステップが行われている。
【００３３】
本発明の実施形態は、第１の家畜系統または品種から第２の家畜系統または品種への無角対立遺伝子の移植方法であり、第１の家畜系統／品種の無角対立遺伝子を含有する核酸の存在下、第２の家畜系統／品種の細胞または胚において一対のＴＡＬＥＮまたは部位特異的エンドヌクレアーゼによりＤＮＡを切断することを含む。胚または細胞を使用して、第１の系統／品種の無角対立遺伝子を有する第２の系統／品種の動物を作製することができる。対立遺伝子を含有するＤＮＡは、相同性依存型修復のための鋳型を提供する。鋳型として、このＤＮＡは切断の両側のＤＮＡの部分に対して相同性を有し、所望の対立遺伝子も含有する。
【００３４】
本発明の実施形態は、無角対立遺伝子を１つの品種から別の品種に移動させることを含む。例えば、対立遺伝子は、アンガス牛から他の牛に移動され得る。有角品種には、ヘレフォード（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ）、ショートホーン（Ｓｈｏｒｔｈｏｒｎ）、シャロレー（Ｃｈａｒｏｌａｉｓ）、リムザン（Ｌｉｍｏｕｓｉｎ）、シンメンタール（Ｓｉｍｍｅｎｔａｌ）、ブラーマン（Ｂｒａｈｍａｎ）、ブランガス（Ｂｒａｎｇｕｓ）、和牛（Ｗａｇｙｕ）、およびサンタ・ガートルーディス（Ｓａｎｔａ  Ｇｅｒｔｒｕｄｉｓ）、エアシャー（Ａｙｒｓｈｉｒｅ）、ブラウン・スイス（Ｂｒｏｗｎ  Ｓｗｉｓｓ）、カナディアンヌ（Ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ）、ダッチ・ベルテッド（Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄ）、ガーンジー（Ｇｕｅｒｎｓｅｙ）、ホルスタイン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）（ホルスタイン−フリーシアン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ−Ｆｒｉｅｓｉａｎ））、ジャージー（Ｊｅｒｓｅｙ）、ケリー（Ｋｅｒｒｙ）、ミルキング・デボン（Ｍｉｌｋｉｎｇ  Ｄｅｖｏｎ）、ミルキング・ショートホーン（Ｍｉｌｋｉｎｇ  Ｓｈｏｒｔｈｏｒｎ）、ノルウェージャン・レッド（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｒｅｄ）、ブサ（Ｂｕｓａ）、カナディアンヌ、エストニアン・レッド（Ｅｓｔｏｎｉａｎ  Ｒｅｄ）、フレックフィー（Ｆｌｅｃｋｖｅｉｈ）、フリーイアン（Ｆｒｉｅｉａｎ）、ジロランド（Ｇｉｒｏｌａｎｄｏ）、イラワラ（Ｉｌｌａｗａｒｒａ）、アイリッシュ・モイルド（Ｉｒｉｓｈ  Ｍｏｉｌｅｄ）、ラインバック（Ｌｉｎｅｂａｃｋ）、ムーズ・ライン・イッセル（Ｍｅｕｓｅ  Ｒｈｉｎｅ  Ｉｓｓｅｌ）、モンベリアルド（Ｍｏｎｔｂｅｌｉａｒｅｄｅ）、ノルマンド（Ｎｏｒｍａｎｄｅ）、ランドール（Ｒａｎｄａｌｌ）、サヒワール（Ｓａｈｈｉｗａｌ）、オーストラリアン・ミルキング・ゼブ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｍｉｌｋｉｎｇ  Ｚｅｂｕ）、シンメンタール、キアニーナ・マルキジャーナ（Ｃｈｉａｎｉｎａ  Ｍａｒｃｈｉｇｉａｎａ）、ロマニョーラ（Ｒｏｍａｇｎｏｌａ）が含まれる。上記リストの品種のいくつかは無角変異体も有するが、これらの系統は遺伝的性質が有角バージョンよりも劣っていることが多い。無角品種の例としては、アンガス、レッド・アンガス、レッド・ポール（Ｒｅｄ  Ｐｏｌｌ）、ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）、ベルテッド・ギャロウェイ（Ｂｅｌｔｅｄ  Ｇａｌｌｏｗａｙ）、アメリカン・ホワイト・パーク（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐａｒｋ）、ブリティッシュ・ホワイト（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｗｈｉｔｅ）、アメリファックス（Ａｍｅｒｉｆａｘ）、ジャマイカ・ブラック（Ｊａｍａｉｃａ  Ｂｌａｃｋ）、ジャマイカ・レッド（Ｊａｍａｉｃａ  Ｒｅｄ）、マレー・グレイ（Ｍｕｒｒａｙ  Ｇｒｅｙ）、ブランガス、レッド・ブランガス（Ｒｅｄ  Ｂｒａｎｇｕｓ）、セノポール（Ｓｅｎｏｐｏｌ）が挙げられる。本明細書において他で記載したように、部位特異的エンドヌクレアーゼ手段、例えばＴＡＬＥＮはタンパク質として送達されてもよいし、核酸、例えばｍＲＮＡまたはベクターによってコードされてもよい。品種という用語は、均質な外観、挙動、および同じ種の他の動物または植物と区別する他の特徴を有する家畜または植物の群を意味する。特定の���種に属する動物は、当業者に知られている。
【００３５】
対立遺伝子という用語は、遺伝子または遺伝子座の２つ以上の形態のうちの１つを意味する。生物の集団または種は、通常、種々の個体の間で各遺伝子座に多数の対立遺伝子を含む。遺伝子座における対立遺伝子の変異は、存在する対立遺伝子（多型）の数として、あるいは集団におけるヘテロ接合体の割合として測定可能である。天然対立遺伝子という用語は、本明細書で使用される場合、天然に見出される対立遺伝子を意味する。新規の対立遺伝子という用語は、非天然対立遺伝子を意味する。合成対立遺伝子という用語は、天然には見出されない対立遺伝子を意味する。外因性対立遺伝子は生物に導入されたものであり、内在性対立遺伝子は天然に細胞内にあるものであり、通常は、生物内でその野生型非改変状態で存在するものである。ヘテロ接合型である動物は２つの対立遺伝子を有する。場合によっては、外因性対立遺伝子を導入して、ヘテロ接合型動物内に既に存在する対立遺伝子にホモ接合型の動物を作製することが望ましい。対立遺伝子の種間移動は動物の１つの種から別の種への移動を意味し、種内移動は同種の動物間の移動を意味する。
【００３６】
無角のための２つのウシ対立遺伝子は、ウシの染色体１において同定されている（Ｍｅｄｕｇｏｒａｃ，２０１２）。ＰＣ、ケルト起源（２１２ｂｐ、１，７０５，８３４−１，７０６，０４５ｂｐ）は重複される（および、１０ｂｐ（１，７０６，０５１−１，７０６，０６０ｂｐ）の配列を置換する）。この対立遺伝子を有するいくつかの品種には、アンガス、ギャロウェイ、フレックフィー（Ｆｌｅｃｋｖｉｅｈ）、ゲルプフィー（Ｇｅｌｂｖｉｅｈ）およびムルナウ−ヴェルデンフェルザー（Ｍｕｒｎａｕ−Ｗｅｒｄｅｎｆｅｌｓｅｒ）が含まれる。第２の無角対立遺伝子ＰＦはフリーシアン起源を有し、以下のＰ５ＩＤ（７ｂｐの置換（ＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＡＧ（配列番号２６）によるＣＧＣＡＴＣＡの置換；１，６４９，１６３−１，６４９，１６９）、および８０，１２８ｂｐの重複（１，９０９，３５２−１，９８９，４８０ｂｐ  Ｐ８０ｋｂＩＤ、さらにその場所における５つの点突然変異（Ｇ１６５４４０５Ａ、Ｃ１６５５４６３Ｔ、Ｔ１６７１８４９Ｇ、Ｔ１６８０６４６Ｃ、Ｃ１７６８５８７Ａ）を特徴とする。これらの変化は、通常、固定ブロックとして遺伝性である。全ての染色体座標は、ＵＭＤ３．１ウシゲノムビルドからのものである。
【００３７】
レポーターを全く使用せずに遺伝子改変された動物；ＴＡＬＥＮ技術；対立遺伝子の移動
本発明の特定の実施形態は、レポーターおよび／または選択マーカーを使用することなく細胞または胚を改変するプロセスに関する。一般に、レポーター遺伝子の使用などの濃縮または選択方法が存在しないと、ＴＡＬＥＮ改変細胞の頻度は時間と共に著しく低下することが観察された。この観察は、レポーター遺伝子を含む、本明細書で報告されるコトランスフェクション、共選択技術などのアプローチなどを導く。
【００３８】
しかしながら、ＴＡＬＥＮ改変は、レポーターを必要としないほど高い効率で実施することができ、その使用はトランスジェニック動物系統の作製を遅延させるだけであることが発見された。特定の理論に束縛されないが、いくつかの因子が、独立して、レポーターを含まない実施形態の発明に寄与した。１つは、ＴＡＬＥＮが迅速かつ高効率で作用する傾向があるという認識である。しかしながら、ＴＡＬＥＮ改変は数日の期間の間に不安定になる傾向があるので、効率はサンプリングの時間に応じて低くなると考えることができる。さらに、一般通念では、安定して改変された生物のみを使用して、トランスジェニック動物を作製すべきであるため、短期間の改変を理解する誘因はほとんどない。他の系で従来通りに行われるように、安定な取込みを選択するために細胞生存遺伝子を使用する誘因が存在する。別の因子は、ＴＡＬＥＮを発現するベクターと比較して、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが予想外に効果的なことである。ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡの直接的な導入は一般に有用であり、実施例８および９で使用した。
【００３９】
レポーターを含まない実施形態の発見に寄与する別の因子は、ｓｓＤＮＡ（ｓｓオリゴヌクレオチド）鋳型とＴＡＬＥＮ活性との間に予期せぬ相乗効果があることであった。この相乗効果の根拠は分かっていない。例えば、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）により５００，０００〜７５０，０００の細胞にＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡ０．５〜１０マイクログラムを送達した後、３０℃で３日間培養すると、一貫したレベルの改変が得られる。しかしながら、サーベイヤーアッセイによりアッセイされる場合にＮＨＥＪの増大で観察されるように、０．２〜１．６ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮによりこれらの同じ条件を補充すると、ＴＡＬＥＮ活性の増大が得られた。通常、トランスフェクションは、１〜４マイクログラムのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび０．２〜０．４ｎＭｏｌのｓｓＤＮＡからなる。実施形態は、５００，０００細胞あたり約０．０５μｇよりも多い、または５００，０００細胞あたり約０．０５μｇ〜約１００μｇの範囲の量のＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを細胞または胚に導入することを含み、当業者は、明確に示される範囲内の範囲および値の全てが考慮されることを直ちに認識するであろう。実施形態はさらに、約０．０２ｎＭｏｌよりも高い濃度のｓｓＤＮＡ、または約０．０１〜約１０ｎＭｏｌの範囲のｓｓＤＮＡを導入することを含む。
【００４０】
直接導入、例えば直接ｍＲＮＡ導入という用語は、ｍＲＮＡ材料の導入を指す。対照的に、ｍＲＮＡをコードするベクターによる導入は間接導入と呼ばれる。直接導入の多数のプロセス、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、遺伝子銃粒子、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気融合、および直接注入が知られている。
【００４１】
ファウンダー無角動物は、改変された細胞または胚から直ちに作製することができ、最初に改変された動物を作製し、その後これを繁殖させて新しいトランスジェニック系統の基礎を作製することを必要としない。ファウンダーまたはファウンダー動物という用語は、クローンニングされた細胞または処置／注入された胚（改変されている）から直接発生する第１世代（「Ｆ０」）のトランスジェニック動物を指すために使用される。本明細書で報告される方法は、繁殖および／または近親交配の中間ステップを伴わずに、染色体の標的部位においてのみ遺伝子改変されたファウンダーの作製を提供する。さらに、実施形態は、改変に対してホモ接合型であるファウンダーを含む。ファウンダーは、細胞および／または胚をレポーター遺伝子（および／または選択マーカー遺伝子）に全くさらすことなく調製され得る。
【００４２】
実施形態は、遺伝子改変された無角動物の作製方法を含み、前記方法は、ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに胚または細胞をさらす（ＴＡＬＥＮは胚または細胞の染色体の標的部位に特異的に結合する）ことと、代理母において細胞をクローニングするか、あるいは代理母に胚を移植することとを含み、代理母は、レポーター遺伝子を用いずに、およびＴＡＬＥＮが結合した染色体の標的部位においてのみ遺伝子改変された動物を懐胎する。動物は全てのレポーター遺伝子を含まなくてもよいし、あるいは選択マーカーを含まなくてもよく、例えば、選択マーカーを含まないが、蛍光タンパク質などのレポーターを有する。選択肢には、ｍＲＮＡとしてのＴＡＬＥＮおよび／または遺伝子改変のための鋳型、例えば対立遺伝子を提供するｓｓオリゴヌクレオチドの直接導入が含まれる。
【００４３】
遺伝子改変された無角動物の作製方法は、ＴＡＬＥＮおよび／またはベクターを培養細胞、例えば初代家畜細胞に導入することを含む。ＴＡＬＥＮは特定の染色体部位に向けられ、その部位で遺伝子変異を引き起こす。またＨＤＲ鋳型は、例えば二本鎖ベクターとして、一本鎖ＤＮＡとして、あるいは直接ｓｓヌクレオチドとして細胞に導入されてもよい。培養細胞は続いて培養され、クローン細胞のコロニーを形成する。好ましくはレポーター遺伝子を用いず、および／もしくは選択マーカーを用いずに、コロニーはＰＣＲによって試験され、および／もしくは配列決定されるか、または他の方法で遺伝子改変についてアッセイされる。対象とする部位で遺伝子改変されたコロニーから細胞が採取され、クローニングにおいて使用される。例えば、代理母に移植される１０〜５０，０００の胚（例えば、代理母あたり１〜５００の胚のセット）を作製するために１０〜５０，０００の細胞が使用され、当業者は、明確に示される範囲内の範囲および値の全てが考慮されることを直ちに認識するであろう。実施形態は、レポーター遺伝子を用いずに細胞をＴＡＬＥＮにさらすことと、クローン細胞のコロニーを作製することと、コロニーメンバーのサブセットを試験して染色体の標的部位に改変が取り込まれたコロニーを同定することとを含む。
【００４４】
培養細胞からクローン細胞のコロニーを作製するプロセスは既知である。このような方法の１つは、第１の培養物からの細胞を第２の培養物に分散させることを含み、例えば、その中に入れられる細胞の数に対して比較的大きい表面積を有するマルチウェルプレートまたはプレート内に細胞を希釈することによって、種々の細胞は互いに接触されない。細胞は、細胞が増殖可能になる期間培養される。増殖する細胞は、細胞がその最初の場所から遠く離れて移動する可能性が低い条件下で培養される。結果として、ユーザーは、その期間の後に細胞を観察して、全てが単一の細胞およびその子孫で作製された種々のコロニーを見ることができる。コロニー内の細胞のサブセットは、コロニー内の他の細胞を破壊することなくサンプリングすることができる。
【００４５】
部位特異的ヌクレアーゼ系
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集手段は、多数の生物においてバイオテクノロジー、遺伝子治療および機能性ゲノム研究の分野に影響を与えている。さらに最近、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によってその標的部位に向けられている。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系はＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のこのような手段である。これらは標的化ヌクレアーゼ系の例であり、これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次に、この部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合したヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡにおいて互いを見出す同族である。ＤＮＡ結合メンバーは染色体ＤＮＡにおいて同族配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、通常、対象となる同族配列を考慮して、対象となる部位あるいはその近くで核酸分解作用を得るように設計される。特定の実施形態は、このような系の全てに制限なしに適用可能であり、ヌクレアーゼの再切断を最小限にする実施形態、対象となる残基においてＳＮＰを正確に作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されている対立遺伝子の配置が含まれる。
【００４６】
ＴＡＬＥＮ
本明細書で使用される場合、ＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮの助けがなくても二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。またＴＡＬＥＮという用語は、同一の部位で協同してＤＮＡを切断するように操作された一対のＴＡＬＥＮの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。協同するＴＡＬＥＮは、ｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮ（ＤＮＡの左右方向（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）を参照する）、またはＴＡＬＥＮペアと呼ばれることもある。
【００４７】
ＴＡＬのコードが報告されており（ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、各ＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の認識に関与している。残基はＤＮＡ配列を標的とするように構築され得る。簡単に言うと、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位が決定され、ヌクレアーゼと、標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子が作製される。結合すると、ヌクレアーゼはＤＮＡを切断し、その結果、切断末端において遺伝子改変を行うように細胞修復機構が作動し得る。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体機能性である単量体ＴＡＬＥＮと、別の単量体ＴＡＬＥＮによる二量体化を必要とする他のＴＡＬＥＮとが含まれる。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合はホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらし、単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合はヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらすことができる。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核生物ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復によって、不死化ヒト細胞において遺伝子改変を誘導することが示されている。
【００４８】
細胞または胚へのＴＡＬＥＮ導入およびこれらに由来する動物の形成の種々の実施例が本明細書において提供される。ＴＡＬＥＮにより処理するための細胞には、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が含まれる。実施例１０には、精原幹細胞の改変についての実験結果が詳述される。これらの細胞は、動物、例えば家畜の遺伝子改変のための別の方法を提供する。遺伝子改変または遺伝子編集は、ドナー精巣から単離した精原幹細胞（オス生殖系幹細胞、本明細書ではＧＳＣと略される）においてインビトロで実行することができる。改変細胞は、レシピエントの生殖細胞減損精巣に移植される。移植された精原幹細胞は遺伝子改変を有する精子を生成し、これを人工授精（ＡＩ）またはインビトロ受精（ＩＶＦ）による繁殖のために使用して、ファウンダー動物を得ることができる。この方法は、遺伝子改変ファウンダーの産生を超えた利点を有する。このような利点の１つは、特定の疾患モデルのためのファウンダーが健康でなく、生殖年齢まで成長するのに適さない場合に明らかである。従って、ＧＳＣに導入された同じ改変は、健康な個体の精巣に移植することができ、健康な動物からの系統を繁殖させて新生子ブタにおいて疾患モデルを生じさせることが可能になる。
【００４９】
精原幹細胞においてＴＡＬＥＮ媒介のインデルを生じさせる可能性および効率は、最初に、ブタデュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子座（ＤＭＤ）のエクソン７に標的化されたＴＡＬＥＮをコードするプラスミドのトランスフェクションによって研究された。いくつかのヌクレオフェクション条件、プラスミド量およびインキュベーション温度の試験により、生殖細胞トランスフェクション率が２５％であるにもかかわらず最大効率１９％のＮＨＥＪが得られ、ＴＡＬＥＮ活性は３０℃で培養された複製物において最高であった。ＧＳＣは、３０℃で５日間を超えて培養した後でも生存したままであったが、全体的に見て、生殖細胞の生存率は３７℃の方が高かった。ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションでは、プラスミドＤＮＡに対して、より大きい活性と、家畜体細胞およびＧＳＣのより高い生存率とが得られた。特に、ｍＲＮＡトランスフェクションのピーク活性は、この実験ではプラスミドＤＮＡトランスフェクションを超えなかったが、同じレベルの改変を達成するために必要とされるｍＲＮＡの量は著しくより少なかった。実施例１１には、始原生殖細胞（トリ）において成功したＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲが詳述される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮを使用することができる。ＴＡＬＥＮは、通常、２つのＴＡＬエフェクタードメインがそれぞれＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合され、得られた各ＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位がスペーサー配列によって分離され、各ＴＡＬＥＮ単量体が認識部位へ結合することにより、ＦｏｋＩが二量体化し、スペーサー内で二重鎖切断を作製することが可能になるように、スペーサーを有する二分認識部位（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）にわたる二量体として機能する。しかしながら、単量体ＴＡＬＥＮは、機能するのに二量体化を必要としないヌクレアーゼに単一のＴＡＬエフェクターが融合されるように構築することもできる。このようなヌクレアーゼの１つは、例えば、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現されるＦｏｋＩの短鎖変異体である。その他の天然に存在するかあるいは操作された単量体ヌクレアーゼもこの役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮのために使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然に存在するＴＡＬエフェクターから得ることができる。あるいは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作することができる。操作された短鎖ＴＡＬＥＮは、ただ１つの操作されたＤＮＡ認識ドメインしか必要としないので、構築および配置がより容易であり得る。二量体ＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１つのＴＡＬエフェクター結合ドメインおよび他の種類の分子からの１つの結合ドメイン）を用いて作製することができる。ＴＡＬＥＮは、スペーサーを有する二分認識部位にわたる二量体として機能することができる。このヌクレアーゼ構造は、例えば、１つのＴＡＬＥＮ単量体および１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体から作製される標的特異的ヌクレアーゼのためにも使用することができる。このような場合、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーによって分離させることができる。２つの単量体を結合すると、ＦｏｋＩは二量体化し、スペーサー配列内で二重鎖切断を作製できるようになる。機能性ヌクレアーゼを作製するために、ホメオドメイン、ｍｙｂリピートまたはロイシンジッパーなどのジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩに融合させて、ＴＡＬＥＮ単量体とのパートナーとして機能させることもできる。
【００５１】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内で核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型または変異体酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、通常約１２〜４５塩基対（ｂｐ）、より好ましくは１４〜４５ｂｐの長さのポリヌクレオチド認識部位を有する場合、レアカッティング（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼも含む。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、画定された遺伝子座においてＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素触媒ドメインとの融合から得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または化学エンドヌクレアーゼであり得る。化学エンドヌクレアーゼにおいて、化学的またはペプチド性切断因子は、特定の標的配列を認識する核酸のポリマーまたは別のＤＮＡのいずれかに結合されることにより、切断活性を特定の配列に対して標的化する。また化学エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列に結合することが知られている、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の結合体のような合成ヌクレアーゼも包含する。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明に従う「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００５２】
相同性指向修復（ＨＤＲ）
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）損傷を修復するための細胞内のメカニズムである。この修復メカニズムは、損傷部位に対して著しい相同性を有する配列を有するＨＤＲ鋳型が存在する場合に細胞によって使用することができる。特異的結合（この用語は、生物学分野において一般的に使用される）は、非標的組織と比べて比較的高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの複数の非共有結合性の相互作用を含む。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の一種である。またタンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによって、ＤＮＡに特異的に結合することができる。対立遺伝子の遺伝子移入は、鋳型誘導性プロセスにより内在性対立遺伝子よりも外因性対立遺伝子を複写するプロセスを指す。場合により、内在性対立遺伝子は実際に切除されて外因性核酸対立遺伝子により置換され得るが、本理論では、プロセスは複写メカニズムである。対立遺伝子は遺伝子対であるため、これらの間には著しい相同性が存在する。対立遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子である可能性もあるし、あるいは、生物活性ＲＮＡ鎖のコード化、または制御タンパク質またはＲＮＡを受け入れる部位の提供などの他の機能を有することもある。
【００５３】
ＨＤ鋳型は、遺伝子移入されている対立遺伝子を含む核酸である。鋳型はｄｓＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）でもよい。ｓｓ鋳型ＤＮＡは、好ましくは、約２０〜約５０００の残基であるが、他の長さを使用することもできる。当業者は、例えば、５００〜１５００の残基、２０〜１００の残基など、明確に示される範囲内の範囲および値の全てが考慮されることを直ちに認識するであろう。鋳型は、さらに、置換すべき内在性対立遺伝子またはＤＮＡに隣接するＤＮＡに相同性を提供する隣接配列を含むことができる。また鋳型は、標的化ヌクレアーゼ系に結合され、従って、この系のＤＮＡ結合メンバーの同族結合部位である配列を含むこともできる。同族という用語は、通常は相互作用をする２つの生体分子を指し、例えば、受容体とそのリガンドなどである。ＨＤＲプロセスとの関連において、生体分子の１つは、対象とされる、すなわち同族のＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合するような配列で設計され得る。
【００５４】
標的化ヌクレアーゼ系に対する特異的結合を低減するための一実施形態は、その内在性ＤＮＡとのアライメントに対してＨＤＲ鋳型に変化を加えることを含む。１つのタイプの変化は、同族メンバー間のミスマッチを作成するように設計される。１つの変化は、１つまたは複数の残基の挿入または欠失である。別の変化は、結合を促進しない、１つの残基による別の残基の置換である。残基という用語は、分子鎖内の単位、例えば、タンパク質内のアミノ酸または核酸内の塩基を指す。変化を加える１つの場所は、系のＤＮＡ結合メンバーの同族結合部位である。
【００５５】
別のタイプの変化は、スペーサーと共に動作する系、例えばＴＡＬＥＮペアにおいて、スペーサーに変化を加えることによって、ヌクレアーゼの作用を妨害するように設計され、変化はスペーサー領域で行われる。これらの変化は、欠失、例えばヌクレアーゼが切断を行うのを妨害するような欠失を含み得る。これらの種々の変化は配列がアラインされる際にミスマッチを作るので、本明細書では通常ミスマッチと呼ばれ、この文脈では、欠失、挿入、または置換がミスマッチである。ヌクレアーゼのペアは協同性を提供するスペーシングを必要とし、これらの活性は、スペーサーへの付加または置換によって妨害することができる。
【００５６】
さらなる実施形態は、外因性対立遺伝子にミスマッチを配置する。系のＤＮＡ結合メンバーは、内在性対立遺伝子と少なくとも部分的に重複する部位で結合するように設計される。外因性対立遺伝子と同一性を有するように遺伝子移入されれば、ＤＮＡ結合メンバーは結合が低減されている。従って、ＤＮＡ結合メンバーの同族部位は、好ましい内在性対立遺伝子から好ましくない外因性対立遺伝子へ変化する。同族部位は、対立遺伝子の全て、またはその一部だけを包含し得る。外因性対立遺伝子の遺伝子移入を安定化するために外因性対立遺伝子へのミスマッチの導入が必要とされることは、驚くべきである。明らかに、再切断の問題は、遺伝子移入された対立遺伝子の安定性に対して非常に大きい影響を与える。この影響を示すデータは、従来法では同等の効率を有するプロセスが利用できないので、これまで他者によって得られることはなかった。
【００５７】
実施形態は、ＨＤＲ鋳型プロセスを用いて、残基の挿入、欠失、または置換によりこれらの種々の場所におけるミスマッチを作製することを含む。例えば、１〜１０００の残基が挿入、欠失、または置換され得る；当業者は、例えば、１〜３の残基、少なくとも１０の残基、４の残基、４〜２０の残基、１〜２０５の残基、１〜２２０の残基、１〜３００の残基、１〜５００の残基、１０〜１０００の残基など、明確に示される範囲内の範囲および値の全てが考慮されることを直ちに認識するであろう。これらのうちの１つまたは複数が結合されてもよく、例えば、１つの場所における挿入、別の場所における欠失、およびその他の場所による置換などである。
【００５８】
これらの種々の実施形態は、レポーターを含まない系において、ＳＮＰまたはＳＮＰに関連する実施形態を作製するために実施することができる。細胞または動物は、例えば、家畜、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、ラット、および実験動物であり得る。
【００５９】
組成物およびキット
本発明は、例えば、部位特異的なエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮをコードする核酸分子、これらのポリペプチド、このような核酸分子もしくはポリペプチドを含有する組成物、または操作された細胞株を含む組成物およびキットも提供する。また、無角対立遺伝子の遺伝子移入に有効なＨＤＲも提供され得る。このような品目は、例えば、研究手段として、あるいは治療的に使用することができる。
【００６０】
ベクターおよび核酸
ノックアウトのため、または他の目的で遺伝子の発現を得るために、様々な核酸を偶蹄類または他の細胞に導入することができる。トランスジェニック動物を作製するために使用することができる核酸構築物には、標的核酸配列が含まれる。本明細書で使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、ならびに二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。塩基部分における修飾は、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンを含む。糖部分の修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含む。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルホリノ環に連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格で置換され、４つの塩基が保持されたペプチド核酸を生成するために修飾することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７、およびＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオ酸もしくはホスホロジチオ酸骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置換することができる。
【００６１】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に動作可能に連結させることができる。調節領域はブタ調節領域であっても、または他の種に由来するものであってもよい。本明細書で使用される場合、動作可能に連結とは、標的核酸の転写を可能または容易にするような形で核酸配列に対して調節領域を配置することを指す。
【００６２】
任意のタイプのプロモーターを標的核酸配列に対して動作可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、および特定の刺激に応答性または非応答性のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切な組織特異的プロモーターはベータ細胞において核酸転写物を優先的に発現させることができ、例えばヒトインスリンプロモーターが含まれる。その他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝細胞または心臓組織において優先的に発現させることができ、それぞれ、アルブミンまたはアルファ−ミオシン重鎖プロモーターを含むことができる。他の実施形態では、組織特異性または時間特異性がほとんどなく、核酸分子の発現を容易にするプロモーター（すなわち、構成的プロモーター）を使用することができる。例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターなどのβアクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ｍｉｎｉＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用することができ、同様に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのウイルスプロモーターも使用することができる。いくつかの実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３、およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照されたい。
【００６３】
誘導性プロモーターの一例はテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系であり、これは、核酸の転写を調節するために使用することができる。この系では、突然変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）が単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ｔｒａｎｓ−活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合されて、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節されるテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）が作製される。抗生物質の非存在下で転写は最小であるが、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では、転写が誘導される。代替的な誘導系には、エクジソンまたはラパマイシン系が含まれる。エクジソンは昆虫の脱皮ホルモンであり、その産生は、エクジソンの受容体のヘテロ二量体およびウルトラスピラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）遺伝子（ＵＳＰ）の産物によって制御される。発現は、エクジソンまたはエクジソンの類似体（例えば、ムリステロンＡなど）による処理によって誘導される。誘導系を引き起こすために動物に投与される薬剤は、誘導剤と呼ばれる。
【００６４】
核酸構築物において有用であり得る付加的な調節領域には、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが含まれるが、これらに限定されない。このような調節領域は必須でないこともあるが、これらは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を与えることにより発現を増大させ得る。このような調節領域は、細胞内で核酸の最適な発現を得るために所望される場合に核酸構築物内に包含させることができる。しかしながら、このような付加的なエレメントがなくても十分な発現が得られることもある。
【００６５】
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸構築物が使用されてもよい。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置（例えば、細胞表面）に移動されるように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養物中の安定な形質転換体を選択するために有用である。他の選択可能なマーカーには、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列は、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列によって隣接され得る。例えば、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーが構築物から切除されるように、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位によって隣接され得る。Ｏｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１（Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説）、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照されたい。また、選択可能なマーカー遺伝子により中断されたＣｒｅまたはＦｌｐを活性化可能な導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件的発現によりトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは遍在性でも組織特異的でもよく、Ｆ０動物（例えば、ブタ）においてマーカーの遍在性または組織特異的な発現を引き起こし得る。導入遺伝子の組織特異的な活性化は、例えば、マーカーで中断された導入遺伝子を遍在的に発現するブタと、ＣｒｅまたはＦｌｐを組織特異的に発現するブタとを交雑させることによって、あるいは、マーカーで中断された導入遺伝子を組織特異的に発現するブタと、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼを遍在的に発現するブタとを交雑させることによって達成することができる。導入遺伝子の制御された発現またはマーカーの制御された切除により、導入遺伝子の発現が可能になる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、標的核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされるポリペプチドのその後の操作を容易にする（例えば、局在化または欠失を容易にする）ように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに配置されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００６８】
他の実施形態では、標的核酸配列は、標的核酸の発現が低減されるように標的核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導する。例えば、標的核酸配列は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御（ＣＦＴＲ）ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導することができる。例えば、ＣＦＴＲ  ＤＮＡと相同の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのＤＮＡの発現を低減するために使用することができる。ｓｉＲＮＡの構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６、Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３、Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３、Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６、Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１、およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７に記載されるように作製することができる。ｓｈＲＮＡの構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１によって記載されるように作製することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールして低分子ヘアピンを形成することができる相補領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【００６９】
核酸構築物は、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いてメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、緩衝液中３７℃において、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと共にインキュベートすることができる。過剰メチル化は、構築物を１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと共に３７℃で１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることによって確認することができる。
【００７０】
核酸構築物は、様々な技術を用いて、例えば生殖細胞、例えば卵母細胞もしくは卵など、前駆細胞、成体もしくは胚幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えばＰＫ−１５細胞など、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、または線維芽細胞、例えば皮膚線維芽細胞などを含む、あらゆる種類の胚細胞、胎児細胞、または成体偶蹄類細胞に導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系の使用、細胞を感染させることができる組換えウイルス、もしくはリポソーム、または核酸を細胞に送達することができる他の非ウイルス方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはリン酸カルシウム沈殿などが挙げられる。
【００７１】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち標的核酸配列に動作可能に連結された調節領域は、トランスポゾンの逆方向反復によって隣接される。マウス、ヒト、およびブタ細胞を含む細胞に核酸を導入するために、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）ゲノム  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔを含むいくつかのトランスポゾン系が開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙおよびＰａｓｓｐｏｒｔトランスポゾンは特に有用である。トランスポザーゼは、標的核酸と同じ核酸構築物上にコードされたタンパク質として送達することもできるし、別の核酸構築物上に導入することもできるし、あるいは、ｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供することもできる。
【００７２】
核酸は、ベクターに取り込まれてもよい。ベクターは、キャリアから標的ＤＮＡへ移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、またはベクター系と呼ばれることもあり、エピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどの、ゲノムまたは他の標的化ＤＮＡ配列にＤＮＡの挿入をもたらすために必要とされる一連の構成要素である。動物において遺伝子を送達するために使用される、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび組込みファージウイルス）および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）などのベクター系は、２つの基本構成要素：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）で構成されるベクターと、２）ベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識して、標的ＤＮＡ配列にベクターを挿入する、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、または他のインテグラーゼ酵素とを有する。ベクターは、ほとんどの場合、１つまたは複数の発現制御配列を含む１つまたは複数の発現カセットを含有しており、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳をそれぞれ制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００７３】
多数の異なるタイプのベクターが知られている。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳類発現プラスミドは、通常、複製開始点、適切なプロモーターおよび任意選択のエンハンサー、またさらに、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指し、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然に存在する核酸および化学修飾された核酸、例えば、合成塩基または代替骨格が含まれる。核酸分子は二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は本明細書では広義に使用され、遺伝子操作技術を用いてその遺伝子材料が変更された遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。従って、ノックアウト偶蹄類は、外因性遺伝子または核酸が動物またはその子孫において発現されるか否かに関係なくトランスジェニックである。
【００７５】
本明細書に記載される核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの場合により、略語「Ｔ」が「Ｔ」または「Ｕ」を表すことを可能にする従来の慣例に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の配列を表すことが意図される。ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドサブユニットの核酸分子である。ポリヌクレオチド類似体またはポリ核酸は、化学的に修飾されたポリヌクレオチドまたはポリ核酸である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格の一部を代替官能基で置換することによって作製することができる。本明細書において「モルホリノ」と呼ばれるモルホリノ修飾ポリヌクレオチドは、塩基がモルホリノ−ホスホロジアミデート骨格により連結されたポリヌクレオチド類似体である（例えば、米国特許第５，１４２，０４７号明細書および米国特許第５，１８５，４４４号明細書を参照）。モルホリノに加えて、ポリヌクレオチド類似体の他の例としては、塩基がポリビニル骨格によって連結された類似体、偽ペプチド２−アミノエチル−グリシン基で形成されたアミド結合によって塩基が連結されたペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオシドサブユニットがメチルホスホナート基によって連結された類似体、ヌクレオシドサブユニットに連結するリン酸残基がホスホロアミダート基によって置換された類似体、およびホスホロチオ酸化ＤＮＡ、２’Ｏ−メチル基を有する糖部分を含有する類似体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、周知の日常的に使用される固相合成技術によって作製することができる。あるいは、このような合成のための他の適切な方法を使用することができる（例えば、一般的な分子クローニングおよび化学的な核酸合成技術）。また同様の技術を使用して、モルホリノまたはホスホロチオ酸誘導体などのポリヌクレオチド類似体を作製することもできる。さらに、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド類似体は、商業的に入手することもできる。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容可能な組成物の例は、例えば、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどのカチオンにより形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸などにより形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸などにより形成される塩；および（ｄ）元素アニオン、例えば、塩素、臭素、およびヨウ素から形成される塩を含む塩である。
【００７６】
配列アライメントは、類似性の領域を同定するためにＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の配列を配置する手段である。ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のアラインされた配列は、通常、マトリックス内の列として表わされ、連続カラムにおいて同一または類似の特徴がアラインされるように、残基間にギャップが挿入される。
【００７７】
ポリペプチド
活性を変化させることなく一般にアミノ酸配列に成され得る様々な保存的変化が存在する。これらの変化は保存的置換または突然変異と呼ばれる；すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸分類に属するアミノ酸が別のアミノ酸で置換され得る。アミノ酸配列の置換は、そのアミノ酸が属する種類の他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正帯電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負帯電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような変化はポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される見かけの分子量または等電点に実質的に影響を与えないと思われる。例示的な保存的置換には、正電荷を保持するためにＬｙｓによるＡｒｇの置換およびその逆；負電荷を保持するためのＧｌｕによるＡｓｐの置換およびその逆；遊離−ＯＨが保持されるようにＳｅｒによるＴｈｒの置換；ならびに遊離ＮＨ２を保持するためのＧｌｎによるＡｓｎの置換が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失、および挿入は、場合により、ポリペプチドまたは核酸断片の機能を損失することなく行うことができる。置換は、例えば、１個、２個、３個、またはそれ以上の残基を含むことができる。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、１文字アミノ酸指示語または３文字略語のいずれかを使用する。本明細書において使用される略語は、標準ポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６９），２４３，３５５２−３５５９に従っている。全てのアミノ酸残基配列は、本明細書において、左右の方向性を有する式によって、アミノ末端からカルボキシ末端への慣習的な方向で表される。
【００７８】
場合により、本明細書に記載される配列に対するペプチドの同一性パーセントの決定が必要とされることもある。このような場合、同一性パーセントは、ペプチド、またはペプチドの一部の残基の数に関して測定される。例えば、９０％同一性のポリペプチドは、より大きいペプチドの一部でもあり得る。実施形態は、本明細書に記載される配列について指示される同一性および／または保存的置換を有するこのようなポリペプチドを含む。
【００７９】
精製という用語は、ポリペプチドに関連して本明細書で使用される場合、天然に存在する対応物を有さないポリペプチド（例えば、ペプチド模倣物）、または化学的に合成され、従って他のポリペプチドにより実質的に汚染されていないポリペプチド、または天然で付随される他の大部分の細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞成分）から分離また精製されたポリペプチドのいずれかを指す。精製ポリペプチドの一例は、乾燥重量で少なくとも７０％が、天然で関連しているタンパク質および天然起源有機分子を含まないものである。従って、精製ポリペプチドの調製物は、例えば、乾燥重量で少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％がポリペプチドであり得る。またポリペプチドは、ポリペプチドの精製または標識を容易にする（例えば、親和性マトリックス上への捕獲、顕微鏡下での可視化）タグ配列（例えば、ポリヒスチジンタブグ、ｍｙｃタグ、またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含有するように操作することもできる。従って、ポリペプチドを含む精製組成物は、他に記載されない限り、精製ポリペプチドを指す。
【００８０】
ポリペプチドは、化学修飾を含むことができ、化学修飾という用語は、この文脈では、天然に存在するアミノ酸の化学構造の変化を指す。このような修飾は側鎖または末端に対して行うことができ、例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端を変化させる。いくつかの実施形態では、修飾は、ポリペプチドを他の材料に連結させるか、または治療薬に結合するために便利に使用され得る化学基を作製するために有用である。
【００８１】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、リコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質と共に、標的化ヌクレアーゼ系の投与を含む。リコンビナーゼは核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索して、その配列に対して実質的に相同であるＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲの鋳型としての役割を果たす核酸配列と結合され得る。リコンビナーゼは次にＨＤＲ鋳型と結合されてフィラメントを形成し、細胞に挿入される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと結合するＨＤＲ鋳型は、タンパク質、ｍＲＮＡとして、リコンビナーゼをコードするベクターにより、細胞または胚内に挿入され得る。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示は、あらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用されており、矛盾する場合には、本明細書が支配する。リコンビナーゼという用語は、細胞内で、２本の比較的長いＤＮＡ鎖の間における比較的短いＤＮＡ片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼには、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージからのＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細菌において見出される１９８のアミノ酸で構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、活性部位セリンに依存してＤＮＡ切断および組換えを開始するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位が隣接する特定の配列を欠失させるために実験で使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ）組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【００８２】
本明細書では、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に、（ｉ）その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをその相同標的に適切に配置する能力と、（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸を形態的に調製する能力と、（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補的配列を見出して結合する能力とを本質的に全て、またはその大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最もよく特徴付けられたＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するものである。タンパク質の元の対立遺伝子型に加えて、いくつかの突然変異体ＲｅｃＡ様タンパク質、例えばＲｅｃＡ８０３が同定されている；さらに、例えば、酵母、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳類（ヒトを含む）、および植物を含む多数の生物は、ＲｅｃＡ様ストランド転移タンパク質を有する。これらのタンパク質は、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２およびＤＭＣ１を含む。組換えタンパク質の実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質、または別の生物由来の相同組換えタンパク質で得あり得る。
【００８３】
遺伝子改変動物
核酸構築物を非ヒト動物に導入して、核酸構築物がゲノムに組み込まれたファウンダー動物を作製するために、当該技術分野において既知の種々の技術を使用することができる。このような技術には、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、レトロウイルス媒介による胚への遺伝子導入、胚幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介による遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５、Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、および卵丘もしくは乳腺細胞、または成体、胎児、もしくは胚幹細胞などの体細胞のインビトロ形質転換とその後の核移植が含まれるが、これらに限定されない。前核マイクロインジェクション、精子媒介による遺伝子導入、および体細胞核移植は、細胞質インジェクション、始原生殖細胞移植、および生殖細胞が胚で増殖される胚盤胞キメラ産生と共に、特に有用な技術である。
【００８４】
通常、前核マイクロインジェクションでは、核酸構築物は受精卵に導入される；精子頭部および卵からの遺伝子材料を含有する前核は原形質内で目に見えるので、１または２細胞受精卵が使用される。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボで（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）得ることができ、インビトロ受精卵を作製することができる。例えば、ブタでは、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精ディッシュにおいて５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  ＭＥＤＩＵＭ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中で受精させることができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）の調製において、新たに採取するかまたは凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中に４×１０５精子になるように再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によって分析することができる。最終インビトロ授精は、雄ブタに応じて約４０の運動精子／卵母細胞の最終濃度において１０μｌ容積で実施することができる。全ての受精卵母細胞を３８．７℃、５．０％ＣＯ２雰囲気中で６時間インキュベートする。授精の６時間後、推定の接合体をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄して、０．５ｍＬの同じ培地に移すことができる。この系は、ほとんどの雄ブタに対して常に２０〜３０％の胚盤胞を生じることができ、多精授精率（ｐｏｌｙｓｐｅｒｍｉｃ  ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）は１０〜３０％である。
【００８５】
体細胞核移植では、遺伝子改変細胞または割球、例えば、胚割球、胎児線維芽細胞、成体の耳の線維芽細胞、または顆粒膜細胞を除核卵母細胞に導入して、結合細胞を確立することができる。慣習では、第２減数分裂で停止された卵母細胞は「卵」と呼ばれる。胚の作製後（例えば、卵母細胞の融合および活性化によって）、活性化の約２０〜２４時間後に胚はレシピエントの雌成体の卵管に移植される。標準的な繁殖技術を用いて、最初のヘテロ接合型ファウンダー動物から標的核酸にホモ接合型である動物を作製することができる。
【実施例】
【００８６】
実施例１  ＴＡＬＥＮの設計および作製
オンラインツール「ＴＡＬ  ＥＦＦＥＣＴＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＴＡＲＧＥＴＥＲ」を用いて、ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列およびＲＶＤ配列の候補を同定した。次に、最終目的ベクターとしてｐＣＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）およびＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）を用いて、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙプロトコルに従って、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ  トランスフェクションまたはインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写のためのプラスミドを構築した（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＨＩＰＵＲＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＩＤＩＰＲＥＰキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて最終ｐＣ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮベクターを作製し、使用の前に配列決定した。以前に示されたように（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１０）、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ３Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ＱＩＡＰＲＥＰ  ＳＰＩＮ  ＭＩＮＩＰＲＥＰキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて作製した構築ＲＣＩｓｃｒｉｐｔベクターをＳａｃＩによって直線化し、インビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写のための鋳型として使用した。以前に示されたように（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）、３’−０−Ｍｅｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５−メチルシチジン三リン酸プソイドウリジン三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびアデノシン三リン酸グアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチド混合物を代わりに用いて、ＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮベクターから改変ｍＲＮＡを合成した。最終ヌクレオチド反応濃度は、キャップアナログについては６ｍＭ、グアノシン三リン酸については１．５ｍＭ、および他のヌクレオチドについては７．５ｍＭである。得られたｍＲＮＡは、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＣＬＥＡＮＵＰキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製前に処理されたデオキシリボヌクレアーゼであった。
【００８７】
実施例２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計および作製
方法（Ｍａｌｉ，２０１３）に従って、遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列をＣｈｕｒｃｈ  ｌａｂ  ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８２４）にクローニングした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８１５）のコトランスフェクション、またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されるｍＲＮＡのいずれかによって提供した。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９  ｃＤＮＡを包含する）からＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドへのＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片のサブクローニングによって構築した。ｍＲＮＡの合成は、ＫｐｎＩを用いて直線化を実施したことを除いて上記のように行った。
【００８８】
実施例３  ドナー修復鋳型の調製
Ａ）ＢＢ−ＨＤＲ（１，６２３ｂｐ）プラスミド。ベルジャン・ブルーゲノムＤＮＡからのベルジャン・ブルー対立遺伝子を包含する１，６９５ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し（ｂｔＧＤＦ８ＢＢ５−１：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣ（配列番号１５）；ｂｔＧＤＦ８ＢＢ３−１：５’−ＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡ（配列番号１６））、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＴＯＰＯクローニングした。このプラスミドは、分析プライマーセットの陽性対照の鋳型として、および以下のプライマー（ＢＢ  ｄｅｌ  ＨＲ  １６２３  ５−１：５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＴＴＣＣ（配列番号１７）；ＢＢ  ｄｅｌ  ＨＲ  １６２３  ３−１：５’−ＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡ（配列番号１８））を用いたＰＣＲよる１，６２３ｂｐのＢＢ−ＨＤＲ鋳型の誘導のために使用し、上記と同様にＴＯＰＯクローニングした。各プラスミドは、使用の前に配列を確認した。Ｆａｓｔ−Ｉｏｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＥＮＤＯ−ＦＲＥＥキット（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを調製した。ｒＡＡＶ  パッケージング。ＡＤＥＮＯーＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＶＩＲＵＳ  ＨＥＬＰＥＲ−ＦＲＥＥシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＢＢ−ＨＤＲをｐＡＡＶ−ＭＣＳにクローニングし、パッケージングした。簡単に言うと、１０ｃｍディッシュのＡＡＶ−２９３細胞をそれぞれ５μｇのｐＡＡＶ−Ｈｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶーＲＣおよびＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲプラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、スクレ−ピングにより細胞をプレートから１ｍｌの成長培地に取り出した。３回の凍結融解サイクルによりウイルス粒子を遊離させた後、微量遠心機において最大速度で５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、標的細胞の感染のために直接使用した。
【００８９】
Ｂ）無角１５９４鋳型。アンガスゲノムＤＮＡからの３８３のＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を包含する１，７８４ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し（Ｆ１：５’−ＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号１９）；Ｒ１−５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号２０））、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＴＯＰＯクローニングした。このプラスミドは、分析プライマーセットのための陽性対照の鋳型として、および以下のプライマー（１５９４  Ｆ：５’−ＡＴＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧ（配列番号２１）；Ｒ１：５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号２２））を用いたＰＣＲよる１，５９２ｂｐのＨＤＲ鋳型の誘導のために使用し、上記と同様にＴＯＰＯクローニングした。各プラスミドは、使用の前に配列を確認した。Ｆａｓｔ−Ｉｏｎ  ＭＩＤＩ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅキット（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを調製し、５μｇまたは１０μｇを、２μｇのＨＰ１．３  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした。全てのオリゴヌクレオチド鋳型を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、１００ｎｍｏｌｅの合成を標準的な脱塩により精製し、ＴＥ中４００μＭで再懸濁した。
【００９０】
実施例４  組織培養およびトランスフェクション
ブタまたはウシ線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭ中５％のＣＯ２で、３７℃または３０℃（指示通り）において保持した。トランスフェクションについては、他に記載されない限り、全てのＴＡＬＥＮおよびＨＤＲ鋳型を、ＮＥＯＮトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるトランスフェクションによって送達した。簡単に言うと、１００％コンフルエンスに達している低継代数のオッサバウ（Ｏｓｓａｂａｗ）、ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）、和牛、またはホルスタイン線維芽細胞を１：２に分割し、７０〜８０％のコンフルエンスで次の日に回収した。各トランスフェクションは、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡおよびオリゴ（ｏｌｉｇｏ）と混合した緩衝液「Ｒ」中に５００，０００〜６００，０００細胞を再懸濁し、以下のパラメータ：入力電圧１８００Ｖ、パルス幅２０ｍｓ、およびパルス数１により１００μｌチップを用いて電気穿孔することで構成された。通常、各トランスフェクションには、２〜４μｇのＴＡＬＥＮ発現プラスミドまたは１〜２μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび２〜３μＭの対象とする遺伝子に特異的なオリゴが含まれた。これらの量からの偏差は図面の説明文に示される。トランスフェクションの後、細胞を６０：４０に分割して６ウェルディッシュの２つの別々のウェルに入れ、それぞれ３０℃または３７℃のいずれかで３日間培養した。３日後に細胞集団は増殖され、３７℃で少なくとも１０日目まで、編集の安定性を評価した。
【００９１】
実施例５  希釈クローニング
トランスフェクションの３日後、５０〜２５０の細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、個々のコロニーが直径約５ｍｍに達するまで培養した。この時点で、ＰＢＳ中に１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で希釈した６ｍｌのＴＲＹＰＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、コロニーを吸引し、２４ウェルディッシュウェルのウェルに移植し、同じ４２０条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを捕集し、凍結保存および遺伝子型同定のために分割した。サンプルの調製：３日目および１０日目にトランスフェクトされた細胞集団を６ウェルディッシュのウェルから採取し、１０〜３０％を、５０μｌの１ＸＰＣＲ適合性溶解緩衝液：２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫが新たに補充された、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４５％のＴｒｙｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．４５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に再懸濁させた。以下のプログラム：５５℃で６０分間、９５℃で１５分間を用いて、ライセートを熱サイクルで処理した。希釈クローニングからのコロニーサンプルは、２０〜３０μｌの溶解緩衝液を用いて上記のように処理した。
【００９２】
実施例６
ＰＯＬＬＥＤ遺伝子移入の検出は、１Ｘ  ＭｙＴａｑ  Ｒｅｄミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて３８サイクル（９５℃で２５ｓ、６２℃で２５ｓ、７２℃で６０ｓ）、Ｆ１プライマー（上記の実施例３を参照）および「Ｐ」プライマー（５’−ＡＣＧＴＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣ）（配列番号２３）を用いるＰＣＲによって実施した。第２のＰＣＲアッセイは、（Ｆ２：５’−ＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号２４）；Ｒ２−５’−ＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴ）（配列番号：２５）を用いて実施した。両方の試験に合格した候補を、隣接するＦ１およびＲ１プライマーを用いるＰＣＲと、その後のＴＯＰＯクローニング、ならびに配列決定により分析した。
【００９３】
実施例７  アンプリコンの配列決定および分析
トランスフェクトした集団からＤＮＡを単離し、１００〜２５０ｎｇを、製造業者の推奨に従って構築された５０μｌのＰＬＡＴＩＮＵＭ  ＴＡＱ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＨＩＧＨ  ＦＩＤＥＬＩＴＹ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。各サンプルは、多重配列決定を可能にするために独自のバーコードを有するプライマーセットに割り当てた。ＰＣＲ産物の一部を２．５％アガロースゲルで分解して大きさを確認し、その後ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるＰＣＲクリーンアップを行った。サンプルを定量し、配列決定のための単一サンプルにプールした。混ぜ合わせた単一のサンプルに２５％ＰｈｉＸを入れ（配列多様性のため）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭＩＳＥＱ配列決定装置において配列決定し、１５０塩基対のペアードエンド読取り（ｐａｉｒｅｄーｅｎｄ  ｒｅａｄ）が生じた。ＦＡＳＴＱＣ  Ｒｅａｄ−ｐａｉｒｓを用いて読取り品質を評価し、重複端部は、ＥＡ−ＵＴＩＬＳパッケージからのＦＡＳＴＱ−ＪＯＩＮを用いて連結した。カスタムＰＥＲＬスクリプトを用いて、連結された読取りを逆多重化し、インサートタイプをカウントした。逆多重化（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）ステップでは順方向および逆方向プライマーの正確な一致が必要とされた。ＲＦＬＰアッセイおよび配列決定によりクローン化動物の遺伝子型を同定した。
【００９４】
実施例８  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡによる家畜細胞のトランスフェクションは効率的な標的切断をもたらす。
ＴＡＬＥＮ  ｃＤＮＡ（ＴＡＬＥＮペアＰ６５１１．１およびＤＭＤ７．１）を、以前に記載された（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１０）ように転写されるｐＴ３ＴＳクローニングベクター内のＴ３プロモーターの下流にクローニングし、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、製造業者のプロトコルに従ってＭＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ３キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ｍＲＮＡ合成を行った。Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１３も参照されたい。３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５−メチルシチジン三リン酸プソイドウリジン三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および２つの標準リボヌクレオチド、アデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチド混合物を代わりに用いてＭＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ３キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、同じベクターから改変ｍＲＮＡを合成した。ｍＲＮＡ合成反応をデオキシリボヌクレアーゼ処理した後、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＣＬＥＡＮＵＰキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。ａ）以下の設定：１パルス、１８００ｖ；２０ｍｓ幅および１００ｕｌチップでＮＥＯＮヌクレオフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、指示される量のｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮをブタ線維芽細胞にトランスフェクトした（複製物あたり５００，０００〜７５０，０００細胞）。トランスフェクト細胞を３０℃または３７℃で３日間培養した後、サーベイヤーアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によりインデル分析を行った。Ｇｕｉｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０において記載されるようにＮＨＥＪパーセントを計算し、グラフにプロットした。ＮＨＥＪ％の比較のために、ｐ６５１１．１ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）も同じ条件下でトランスフェクトした。ｂ）ｍＲＮＡの構造、組成またはインビトロ合成反応スキームは、ＴＡＬＥＮ活性に対してあまり影響を与えない。ＤＭＤ７．１ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡは、標準または改変リボヌクレオチドを用いて、個々に（「Ｉ」、別々の反応におけるｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ）、または同じ反応（Ｄｕａｌ  「Ｄ」）のいずれかによって合成した。次に、反応を２つの複製物に分割し、その一方に、製造業者のプロトコルに従ってＰｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて付加的なｐｏｌｙＡテイルを付加した。
【００９５】
プラスミドＤＮＡからのＴＡＬＥＮの発現は、家畜細胞におけるＴＡＬＥＮ媒介によるインデルの誘導のために有効な方法であった；しかしながら、ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを細胞のゲノムへ組込むことが可能である。対照的に、ｍＲＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込むことはできない。ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドの組込みを回避するために、ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションによって同様のレベルのＴＡＬＥＮ活性が達成され得るかどうかを決定するための実験を実施した。標準または改変リボヌクレオチドのいずれかを用いて、ｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮペアをコードするＴＡＬＥＮのためのｍＲＮＡを作製した。２つの量の各ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ調製物をヌクレオフェクションによりブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃で３日間培養した後、インデルの分析を行った。３０℃でインキュベートした全てのｍＲＮＡトランスフェクションについてＮＨＥＪパーセントは同様であったが、３７℃でインキュベートしたトランスフェクト細胞については用量応答が観察された。改変リボヌクレオチドと標準リボヌクレオチドとの間のＮＨＥＪパーセントの著しい違いはこの複製物では検出できなかったが、同等の量を使用しなかった。特に、３０℃でインキュベートした全ての群におけるｍＲＮＡトランスフェクションは、同じ条件下でプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトされたｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮよりも著しく優れていた。
【００９６】
第２の遺伝子座、ブタＤＭＤにおいて改変ヌクレオチド対標準ヌクレオチドで合成されたｍＲＮＡの影響を調査するために別の実験を実施した。この実験は、ｐｏｌｙＡテイルの付加がＴＡＬＥＮ活性に影響を与えるかどうか、および各ＴＡＬＥＮ単量体（ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ単量体）が同じ転写反応（Ｄｕａｌ）で合成できるかどうか、あるいはこれらを個々に合成して、トランスフェクションの前に混合しなければならないかどうかも評価した。１または４マイクログラムのＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃で３日間培養した。ｐ６５１１．１  ＴＡＬＥＮと同様に、３０℃で培養した細胞において、ＴＡＬＥＮ活性の違いはほとんど観察されず、改変ヌクレオチド、ｍＲＮＡのインビトロポリアデニル化またはｍＲＮＡの二重転写はいずれも活性に影響を与えないことが示唆された。４μｇのｍＲＮＡが１μｇのトランスフェクションよりも優れていたので、この場合も用量応答性が３７℃培養の複製物において観察できた。また、ポリアデニル化ｍＲＮＡは、３７℃の複製物において非アデニル化ｍＲＮＡよりも優れているようであった。
【００９７】
特に、ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドＤＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトする場合、１４日目まで培養された細胞に対して３日目に測定されたＮＨＥＪ％レベルの著しい低下（４０〜６０％）が認められた。このようなＮＨＥＪ％の低下は、本明細書に示されるｍＲＮＡトランスフェクト複製物のいずれについても観察されなかった、１４日目の改変レベルについてのデータは示されない。従って、ｍＲＮＡトランスフェクションは、ＴＡＬＥＮ活性についてだけでなく、長期間の培養後に高比率の改変細胞を維持することについても、ＤＮＡトランスフェクションよりも優れているようである。特定の理論に束縛されないが、この結果は、プラスミドＤＮＡに対して、ｍＲＮＡでトランスフェクトされた場合に、細胞生存率が改善されるためであると考えられる。
【００９８】
実施例９  選択せずにｍＲＮＡトランスフェクションにより作製されたコロニーの分析
実施例８と同様に、ＴＡＬＥＮをコードする１〜４マイクログラムのｍＲＮＡをウシまたはブタ初代線維芽細胞に添加した。ＴＡＬＥＮに暴露した後３日間、細胞を３０℃で成長させ、細胞の数を数え、１０ｃｍのディッシュに１〜２０細胞／ｃｍ２の密度範囲でプレーティングした。直径３〜４ｍｍの個々のコロニーが観察されるまで、細胞を１０〜１５日間培養した。ｐ−２００ピペッタを用いて穏やかな吸引の下でコロニーを吸引し、５００μｌの成長培地（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１１）を有する２４ウェルプレートのウェルに排出した。明確に画定されるコロニー（約１０〜３０／プレート）を有するプレートをコロニー吸引のために選択し、複数のコロニーから細胞を吸引する可能性を制限した。２４ウェルディッシュにおいてコロニーが７０〜９０パーセントコンフルエントに到達したら、インデル分析のために一部を回収し、残りを凍結保存した。インデルの結果は線維芽細胞クローンにおける遺伝子型分布の表の最後の５行に示される。これらの結果は、選択マーカーを使用することなく、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡがトランスフェクトされた線維芽細胞からコロニーを容易に単離できることを実証する。分析されたクローンの突然変異頻度は、３日目のソース集団の改変レベルによって正確に予測された。２対立遺伝子の改変を有するクローンも容易に同定することができた。
【００９９】
【表１】
2016507228.tif 000003
【０１００】
実施例１０  ＤＮＡおよびｍＲＮＡコード化ＴＡＬＥＮは精原幹細胞において活性である。
ブタ生殖細胞を１０週齢の雄ブタから単離し、分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）により濃縮した。プログラムＸ−００１およびＸ−００５を使用し、ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ系Ａｍａｘａ溶液「Ｖ」−および「Ｌ」および「Ｂ」を用いて、ｅＧＦＰおよびＤＭＤ特異的ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを生殖細胞にトランスフェクトした。Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１３も参照されたい。各トランスフェクション反応は、１０６の濃縮生殖細胞、および指示されるマイクログラムのＴＡＬＥＮコードプラスミドＤＮＡにより実施した。同じ方法を用いて、ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを送達した。ヌクレオフェクションの後、これらを５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃または３０℃で５日間培養した。ＧＦＰおよびＵＣＨ−Ｌ１の発現の共局在化について免疫蛍光分析によりトランスフェクション効率を評価した。細胞生存率は、トリパンブルー排除によって評価した。
【０１０１】
実施例１１  始原生殖細胞におけるＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲ
またＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲは、ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）において、ニワトリＤｄｘ４遺伝子座で試験した。２つのＴＡＬＥＮペアをイントロン１（Ｔａｌ１．１）およびエクソン７（Ｔａｌ７．１）上に構築し、これらの機能をＤＦ１ニワトリ細胞において確認した。実施例８およびＣａｒｌｓｏｎ  ２０１３も参照されたい。続いて、ＧＦＰをＤｄｘ４遺伝子のエクソン２と融合させるように設計したドナーターゲティングベクターにより、各ＴＡＬＥＮペアをコトランスフェクトした。予想されるように、Ｔａｌ１．１による切断は相同組換えを刺激したが、ドナーターゲティングベクター内の相同配列の外側にあるＴａｌ７はＨＤＲを刺激しなかった。
【０１０２】
実施例１２  ＴＡＬＥＮ刺激ＨＲによる有角細胞へのウシ無角対立遺伝子の遺伝子移入
無角対立遺伝子は最近同定された（Ｍｅｄｕｇｏｒａｃ，Ｓｅｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）（図１の略図）。無角において重複される領域の３’を切断するために４つのＴＡＬＥＮペアを設計した（図１）。ＴＡＬＥＮペアをコードするｍＲＮＡを用いて有角ホルスタイン線維芽細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの３日後の活性について分析した。サーベイヤーアッセイにより、各ＴＡＬＥＮペアの活性が明らかになった（図１）。ピーク活性はＨＰ１．３により観察され、従って次の実験のためにこれを選択した。有角ホルスタイン初代線維芽細胞を、指示される量および処理で、ｓｓＤＮＡ修復鋳型と共に２マイクログラムＨＰ１．３ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡによりトランスフェクトした（図４）。トランスフェクションの３日後に、ＰＣＲによる無角への変換について細胞の集団を分析した。ＮＬＳ−ＲｅｃＡ−Ｇａｌ４による修復鋳型のコーティング（Ｌｉａｏ  ａｎｄ  Ｅｓｓｎｅｒ  ２０１１）は、無角変換の頻度に対して著しい効果を有した（図４パネルｂおよびｃ）。無角変換は個々のコロニーにおいて明白であった（図３）。
【０１０３】
方法：ＮＥＯＮトランスフェクション系を用いて、以下のパラメータ（１パルス；１８００ｖ；２０ｍｓ幅）下で約６００，０００の細胞をトランスフェクトした。各トランスフェクションは、指示される修復鋳型と共に、２マイクログラムのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡで構成した。以下の方法により修復鋳型をＧａｌ４：ＲｅｃＡでコートした。５００ナノグラム（全部で３ｕｌ）の修復鋳型ＰＣＲ産物を９５℃で１０分間インキュベートし、氷上に２分間置いた後、０．８ｕｌの緩衝液［１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＯＡｃ、ｐＨ７．５；５００ｍＭのＮａＯＡｃ；１０ｍＭのＤＴＴ；１０ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２］、０．６ｕｌの１６．２ｍＭのＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ）および１，２５０ｎｇのＮＬＳ−ＲｅｃＡ−Ｇａｌ４を８ｕｌの全反応容積で添加した。次に、この反応を３７℃で３０分間インキュベートし、氷上に置いた。全容積を単一のトランスフェクションで使用した。以前に記載された方法（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）を用いて細胞を培養し、分析した。５９１ｂｐのＨＤＲ鋳型を使用した。
【０１０４】
実施例１３
無角対立遺伝子を遺伝子移入するために本明細書に記載される方法によって作製した細胞、またはそれにより改変した胚をクローニングし、および／または代理雌に移植し、懐胎させ、無角対立遺伝子を含む生きた動物として誕生させる。
【０１０５】
さらなる開示
１．有角対立遺伝子から無角対立遺伝子へのゲノム改変を含む、遺伝子改変家畜動物。２．動物が有角対立遺伝子を有する第１の動物品種であり、無角対立遺伝子が第２の動物品種において見出される、１の動物。３．無角対立遺伝子が天然対立遺伝子および合成対立遺伝子からなる群から選択される、１または２の動物。４．天然対立遺伝子がその品種に特有であるか、あるいはその品種の突然変異対立遺伝子である、３の動物。５．第１の品種が、ヘレフォード、アンガス、ショートホーン、シャロレー、リムザン、シンメンタール、ブラーマン、ブランガス、和牛、およびサンタ・ガートルーディス、エアシャー、ブラウン・スイス、カナディアンヌ、ダッチ・ベルテッド、ガーンジー、ホルスタイン（ホルスタイン−フリーシアン）、ジャージー、ケリー、ミルキング・デボン、ミルキング・ショートホーン、ノルウェージャン・レッド、ブサ、カナディアンヌ、エストニアン・レッド、フレックフィー、フリーイアン、ジロランド、イラワラ、アイリッシュ・モイルド、ラインバック、ムーズ・ライン・イッセル、モンベリアルド、ノルマンド、ランドール、サヒワール、オーストラリアン・ミルキング・ゼブ、シンメンタール、キアニーナ・マルキジャーナ、ロマニョーラからなる群から選択される、１〜４のいずれかの動物。６．第２の品種が、アンガス、レッド・アンガス、レッド・ポール、ギャロウェイ、ベルテッド・ギャロウェイ、アメリカン・ホワイト・パーク、ブリティッシュ・ホワイト、アメリファックス、ジャマイカ・ブラック、ジャマイカ・レッド、マレー・グレイ、ブランガス、レッド・ブランガス、セノポール、ボーア（Ｂｏｅｒ）ヤギからなる群から選択される、１〜５のいずれかの動物。７．無角対立遺伝子が、ＰＣケルト起源およびＰＦフリーシアン起源からなる群から選択される、１〜６のいずれかの動物。８．ファウンダー動物またはファウンダー動物の子孫である、１〜７のいずれかの動物。９．マーカーを含まない、および／またはレポーターを含まない、１〜８のいずれかの動物。１０．ゲノム改変が無角対立遺伝子においてのみ成されている、１〜９のいずれかの動物。１１．遺伝子改変生物がウシ、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄類からなる群から選択される、１０の方法。１２．１〜１１のいずれかの動物または前記動物の子孫の家畜としての使用。１３．細胞の有角対立遺伝子に対するゲノム改変を含むインビトロ細胞。１４．有角遺伝子座における改変が、有角対立遺伝子から無角対立遺伝子への修飾である、１３の細胞。１５．細胞が家畜細胞である、１３または１４の細胞。１６．細胞が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄類からなる群から選択される１３〜１５のいずれかの細胞。１７．細胞が、ヘレフォード、アンガス、ショートホーン、シャロレー、リムザン、シンメンタール、ブラーマン、ブランガス、和牛、およびサンタ・ガートルーディス、エアシャー、ブラウン・スイス、カナディアンヌ、ダッチ・ベルテッド、ガーンジー、ホルスタイン（ホルスタイン−フリーシアン）、ジャージー、ケリー、ミルキング・デボン、ミルキング・ショートホーン、ノルウェージャン・レッド、ブサ、カナディアンヌ、エストニアン・レッド、フレックフィー、フリーイアン、ジロランド、イラワラ、アイリッシュ・モイルド、ラインバック、ムーズ・ライン・イッセル、モンベリアルド、ノルマンド、ランドール、サヒワール、オーストラリアン・ミルキング・ゼブ、シンメンタール、キアニーナ・マルキジャーナ、およびロマニョーラからなる群から選択される家畜細胞である、１３〜１５のいずれかの細胞。１８．細胞が、初代細胞、初代体細胞、または接合体である、１３〜１７のいずれかの細胞。１９．家畜の幹細胞または始原生殖細胞である、１３〜１７のいずれかの細胞。２０．細胞が改変を受ける場合、無角対立遺伝子をコードする相同性依存型組換え鋳型を含む、１３〜１９のいずれかの細胞。２１．細胞の有角対立遺伝子において染色体ＤＮＡを切断するために、部位特異的なエンドヌクレアーゼをさらに含む、２０の細胞。２２．動物をクローニングするための、１２〜２１のいずれかの細胞の使用。２３．例えば、ｍＲＮＡおよび／またはＨＤＲ鋳型のように、無角対立遺伝子をコードし、天然有角対立遺伝子と重複する配列を含む単離（または合成、または天然から分離された）核酸。２４．２３の単離核酸を発現させるためのプラスミドまたは他のベクター。核酸は、例えばキットとして、他の成分と混合することができる。２５．遺伝子改変された家畜生物の作製方法であって、家畜初代細胞、家畜初代体細胞、家畜幹細胞、家畜始原生殖細胞、家畜接合体、家畜胚盤胞、または家畜胚の天然有角対立遺伝子を変更することを含み、有角対立遺伝子が無角対立遺伝子に変更される、方法。２６．家畜がウシ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、２５の方法。２７．家畜初代細胞、家畜初代体細胞、家畜幹細胞、家畜始原生殖細胞、家畜接合体、家畜胚盤胞、または家畜胚の天然有角対立遺伝子に、天然有角対立遺伝子内の部位を特異的に切断する部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸と、無角対立遺伝子を含む核酸相同性依存型組換え鋳型とを導入することを含む、２５または２６の方法。２８．部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）からなる群から選択される、２５〜２７の方法。２９．初代体細胞が変更される、２５〜２８のいずれかの方法。３０．胚が変更される、２５〜２８のいずれかの方法。３１．接合体、胚盤胞、または胚を妊娠母動物に移植することをさらに含む、２５〜２８、または３０のいずれかの方法。３３．初代細胞、初代体細胞、または接合体をクローニングして動物全体を作製することをさらに含む、２５〜２９のいずれかの方法。３４．２５〜３２のいずれかの方法で作製された家畜動物。３４．無角表現型を有する家畜ファウンダー動物を作製するための、２５〜３２のいずれかの方法の使用。
【０１０６】
参考文献
本明細書内のいずれかに記載される特許出願、特許、刊行物、および雑誌論文は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用され、矛盾する場合には本明細書が支配する。
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【図１】
2016507228.tif 000004
【図２】
2016507228.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2016507228.tif 000008
【配列表】
2016507228000001.app
【国際調査報告】
2016507228.tif 000009
2016507228.tif 000010