(57)【要約】  本発明は、クローン病の診断マーカーとしてのＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のクローン病を診断するインビボ方法に使用するためのＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質。
【請求項２】
対象のクローン病を診断するインビトロ方法であって、前記方法は、
（ａ）前記対象の体組織または体液のサンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量を測定することと、
（ｂ）前記測定量を前記タンパク質の１つまたは複数の所定の限界値と比較することと、
（ｃ）前記比較に基づいて前記対象がクローン病であるかどうかを判断することと、
を含み、それによって、（１つまたは複数の）前記所定の限界値未満のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の測定量は、前記対象がクローン病であることを示す、前記方法。
【請求項３】
前記体組織は、結腸組織及び回腸組織から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液は、全血、血漿及び血清から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量はＥＬＩＳＡによって測定される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
正常な対象からのサンプル中にあるＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量の少なくとも４０分の１未満である、試験対象からのサンプル中にあるＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量は、前記試験対象がクローン病であることを示す、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
クローン病は回腸型または回腸結腸型である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象はヒトである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｐｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量が測定される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロにおいて対象のクローン病を診断するための診断マーカーとしてのＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の使用。
【請求項１１】
前記対象の体組織または体液のサンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量が測定される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記体組織は、結腸組織及び回腸組織から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記体液は、全血、血漿及び血清から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量はＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
正常な対象からのサンプル中にあるＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量の少なくとも４０分の１未満である、試験対象からのサンプル中にあるＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量は、前記試験対象がクローン病であることを示す、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
クローン病は回腸型または回腸結腸型である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記対象はヒトである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
Ｐｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量が測定される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローン病の診断マーカーとしてのＰｅｌｌｉｎｏタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のＰｅｌｌｉｎｏファミリーは、以下の４メンバーからなる：Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２並びにＰｅｌｌｉｎｏ３  ｌｏｎｇ（Ｐｅｌｌｉｎｏ３ａとしても知られているＰｅｌｌｉｎｏ３Ｌ）及びＰｅｌｌｉｎｏ３  ｓｈｏｒｔ（Ｐｅｌｌｉｎｏ  ３ｂとしても知られているＰｅｌｌｉｎｏ３Ｓ）と称されるＰｅｌｌｉｎｏ３のスプライスバリアント。Ｐｅｌｌｉｎｏファミリーメンバーのそれぞれは、ホスホスレオニン残基を認識し、インターロイキン１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）との会合を仲介するＮ末端のフォークヘッド会合（ＦＨＡ）ドメイン並びにＥ３ユビキチンリガーゼ活性及びＩＲＡＫのリシン６３（Ｌｙｓ６３）結合型ポリユビキチン化を触媒する能力を与えるＣ末端のＲＩＮＧ様ドメインを含む。
【０００３】
Ｐｅｌｌｉｎｏ３は、Ｐｅｌｌｉｎｏタンパク質のＥ３ユビキチンリガーゼファミリーのメンバーであり、これは、ＴＬＲ（トール様受容体）シグナル伝達に関与する。ＴＬＲは、病原体関連分子を感知し、サイトカイン及びＩ型インターフェロンを誘導することによって応答する。
【０００４】
２０１３年１２月１８日に出願され、２０１２年１２月２１日に出願された英国特許出願第１２２３１１４．８号の優先権を主張する出願人のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７７０５９号は、Ｐｅｌｌｉｎｏ３が炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）において保護的役割を果たす可能性があることを開示した。この出願の後半の主張は、遺伝子操作されてＰｅｌｌｉｎｏ３をコードする遺伝子が欠如したマウスの実験的大腸炎（ＤＳＳ誘導大腸炎）の増悪に基づくものであった。さらに、自然免疫受容体ＮＯＤ２の機能喪失型変異がクローン病の罹患率の増加に関連しており、この出願には、Ｐｅｌｌｉｎｏ３がＮＯＤ２シグナル伝達のメディエーターであることを示すデータが含まれていることから、これもまたＰｅｌｌｉｎｏ３がクローン病において保護的役割を果たす可能性があることと一致している。この仮定を前提として、出願人は、対照、クローン病及び潰瘍性大腸炎の患者から採取した大腸生検サンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の発現の量を評価した。このデータは、対照または潰瘍性大腸炎の対象と比較して、クローン病の対象の結腸組織ではＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量がひどく減少していることを示し、これは、Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３のいずれかのタンパク質発現量がクローン病である対象の有力な診断上の指標になる可能性があることを示唆する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明により、対象のクローン病のインビボもしくはインビトロ診断マーカーとしてのＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の使用が提供される。
【０００６】
本発明はまた、対象のクローン病を診断するためのインビボまたはインビトロ方法を提供し、本方法は、
（ａ）対象の体組織または体液のサンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量を測定することと、
（ｂ）測定量をタンパク質の１つまたは複数の所定の限界値と比較することと、
（ｃ）比較に基づいて対象がクローン病であるかどうかを判断することと、
を含み、それによって、（１つまたは複数の）所定の限界値未満のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の測定量は対象がクローン病であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書中で使用される場合、「Ｐｅｌｌｉｎｏ３」とは、別に明記されない限り、Ｐｅｌｌｉｎｏ３  ｌｏｎｇ（Ｐｅｌｌｉｎｏ３ａとしても知られているＰｅｌｌｉｎｏ３Ｌ）及びＰｅｌｌｉｎｏ３  ｓｈｏｒｔ（Ｐｅｌｌｉｎｏ３ｂとしても知られているＰｅｌｌｉｎｏ３Ｓ）を含むことが意図される。
【０００８】
体組織は、結腸組織及び回腸組織から選択することができ、体液は、全血、血漿及び血清から選択することができる。
【０００９】
Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む任意の適した方法によって測定することができる。
【００１０】
クローン病は、回腸型または回腸結腸型であってもよい。対象は、好ましくはヒトである。
【００１１】
Ｐｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の発現の量が上記タンパク質の所定の限界値よりも統計学的に有意に低い場合、この対象はクローン病であると診断される。例えば、正常な対象、すなわち、回腸結腸内視鏡検査が正常で、組織学的検査が陰性の対象の発現量の少なくとも４０分の１未満のＰｅｌｌｉｎｏ１、Ｐｅｌｌｉｎｏ２またはＰｅｌｌｉｎｏ３平均発現量を有する対象は、クローン病であると診断されるであろう。
【００１２】
任意に、本発明に使用される診断マーカーはＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質であり、Ｐｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量が測定される。
【００１３】
ヒトＰｅｌｌｉｎｏタンパク質は、以下のＮＣＢＩ受入登録番号を有する：
Ｐｅｌｌｉｎｏ１（ＮＰ＿０６５７０２．２  ＧＩ：１１０３７０６３）；Ｐｅｌｌｉｎｏ２（ＮＰ＿０６７０７８．１  ＧＩ：１０８６４０６３）；
Ｐｅｌｌｉｎｏ３ｌｏｎｇ（Ｐｅｌｌｉｎｏ３ａ）、アイソフォーム１（ＮＰ＿６５９５０２．２  ＧＩ：１４８６１２７９８）；及び
Ｐｅｌｌｉｎｏ３ｓｈｏｒｔ（Ｐｅｌｌｉｎｏ３ｂ）、アイソフォーム２（ＮＰ＿００１０９１９８０．１  ＧＩ：１４８６１２８３３）。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、対照（正常）、クローン病及び潰瘍性大腸炎の対象の結腸生検サンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の発現量を示す。
【図２】図２は、図１で使用されたサンプル中のＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の相対的な発現量を示すヒストグラムである。
【００１５】
本発明は、以下の実施例において説明される。
【実施例】
【００１６】
患者情報
進行中の治療の一環として定期的に結腸内視鏡検査を受けている１８〜８０歳の対象を、先を見越して募集した。インフォームドコンセントの後に、炎症性腸疾患の患者の異常な（炎症した）結腸または回腸部分及び対照の左結腸から２つの追加の生検を行った。匿名扱いの生検を瞬間凍結し、バッチ分析のために−８０℃で保存した。患者基本情報、病歴、内視鏡検査所見及び定期的な組織学的検査を記録した。
【００１７】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が１９名（６３％）及び対照が１１名（３７％）の合計３０名の対象が登録された。全体で１４名（４７％）が男性であり、平均年齢が４６．３８＋／−１６．４歳であった。ＩＢＤでは１９名のうち９名（４７％）であるのに対し、対照群では１１名のうち７名（６３％）と女性が多く、ＩＢＤの平均年齢が４３．９＋／−１６．２歳（範囲は２５〜７３歳）であるのに対して、対照は５４．１＋／−１６．２歳（範囲は１８〜７３歳）とわずかに高かったが、統計的有意性には達しなかった（ｐ＜０．２４）。
【００１８】
対照患者は、回腸結腸内視鏡検査が正常で、組織学的検査が陰性の対象と規定した。対照には、ＩＢＤを示唆する症状がなかった。８名はポリープ監視のために結腸内視鏡検査を受けており、残りの３名は貧血であった。
【００１９】
ＩＢＤ群中の、１４名がクローン病（回腸結腸の疾患が１０名及び回腸単独の疾患が４名（回腸の疾患及び回腸結腸の疾患は、クローンの２つの種類であり、活動性の部位を表わす））及び５名が潰瘍性大腸炎と確定された。アダリムマブの５名（２６％）、アミノサリチル酸の７名（３７％）、経口ステロイドの３名（１６％）を含む１５名（７９％）のＩＢＤ患者がＩＢＤに対する維持療法を受けていた。内視鏡検査において、６名（３２％）が中等症で、残りの１３名（６８％）が軽症と炎症を段階評価した。定期的な組織学的検査により、１２症例（６３％）で活動期の炎症が確認された。
【００２０】
組織の処理及び分析
冷凍した生検サンプルを解凍し、細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％（ｖ／ｖ）のＩｇｅｐａｌ、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル及びコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ７．４）に入れ、超音波処理した。細胞ライセートを１４，０００ｇで１０分間遠心分離して細胞片及び核を除去した。
【００２１】
上清をタンパク質濃度についてアッセイし、ライセートサンプル（５０μｇ）をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗Ｐｅｌｌｉｎｏ３抗体及び（ローディングコントロールとして）抗β−アクチン抗体を使用したイムノブロッティングによって分析した。ある症例では、抗体の非特異的結合を限定するために、抗Ｐｅｌｌｉｎｏ３抗体を形成するために使用した免疫源性ペプチドの存在下でイムノブロッティングを行った。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または増強された化学発光によって免疫反応性を視覚化した。コホート２のクローン病患者のうちの１名がサンプル採取の時点で非活動期の段階にあった。図１に示されるとおり、クローン病のすべての対象は、対照のサンプル（図１において「正常」と表示されている）及び潰瘍性大腸炎の対象と比較してＰｅｌｌｉｎｏ３タンパク質の量が大幅に減少していた。
【００２２】
対照（Ｃｏｎ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）の対象からの結腸生検サンプルの、前述の得られたウエスタンブロットをＩｍａｇｅ  Ｊ画像分析ソフトウェア（国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）により分析し、Ｐｅｌｌｉｎｏ３反応バンドの強度を、β−アクチンに対応するバンドの強度と比較して正規化した。図２に示されている結果は、対照及び潰瘍性大腸炎の対象のＰｅｌｌｉｎｏ３平均発現量がそれぞれ、クローン病の対象の平均発現量よりも４０倍及び２０倍高いことを示している。
【図１】
2016520605.tif 000002
【図２】
2016520605.tif 000003
【国際調査報告】
2016520605.tif 000004
2016520605.tif 000005
2016520605.tif 000006