(57)【要約】  本発明は、ＲＯＮアゴニストを含む特定のＲＯＮ組成物におけるＲＯＮ組成物、及び疾患の治療のための組成物の使用方法に関する。また、本発明は、ＲＯＮ関連又はＭＳＰ関連の疾患の診断に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＲＯＮアゴニスト抗体、又はその抗原結合断片、又は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）融合タンパク質、又はその機能的断片を含む、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ  Ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）アゴニスト。
【請求項２】
ＲＯＮアゴニストがＭＳＰ融合タンパク質又はその機能的断片を含む、請求項１に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項３】
ＭＳＰ融合タンパク質がＭＳＰβ及び融合部分を含む、請求項１又は２に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項４】
融合部分が二量体化ドメインを含む、請求項３に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項５】
融合部分がＦｃドメインを含む、請求項４に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項６】
ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、請求項５に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項７】
ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である、請求項６に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項８】
ＭＳＰ融合タンパク質がペプチドリンカーを更に含む、請求項１から７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項９】
ペプチドリンカーが２〜２０アミノ酸残基長、好ましくは、４〜１６アミノ酸残基長である、請求項８に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１０】
ペプチドリンカーが１６アミノ酸残基長である、請求項９に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１１】
ＲＯＮアゴニストがヒトＭＳＰ融合タンパク質である、請求項１から１０の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１２】
ＲＯＮアゴニストがヒトＭＳＰβ及びＦｃドメインを含む、請求項１１に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１３】
ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１２に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１４】
ＲＯＮアゴニストが配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１５】
ＲＯＮアゴニストが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１６】
ＲＯＮアゴニストが抗ＲＯＮアゴニスト抗体、又はその抗原結合断片を含む、請求項１に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１７】
抗ＲＯＮアゴニスト抗体が抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である、請求項１又は１６に記載のＲＯＮアゴニスト。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト、及び、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト、又は請求項１８に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体において、ＭＳＰ−関連又はＲｅｃｅｐｔｏｒ  ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ  Ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）関連疾患又は障害を治療する方法。
【請求項２０】
被験体における血清ＭＳＰレベルを検出する工程、正常対照における血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び、正常対照における血清ＭＳＰレベルと比較して被験体における血清ＭＳＰレベルが低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、且つ、血清ＭＳＰレベルが正常対照と比較して被験体において低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連疾患又は障害が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、又は創傷治癒の欠陥である、請求項１９から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＢＤがクローン病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連疾患又は障害が上皮創傷治癒の欠陥である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上皮創傷治癒の欠陥が糖尿病に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体が糖尿病の被験体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト又は請求項１８に記載の薬学的組成物と、上皮細胞とを接触させる工程を含む、上皮細胞の増殖、生存及び／又は遊走を増加させる方法。
【請求項３０】
被験体に、請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト又は請求項１８に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、必要とする被験体において、上皮創傷治癒を増強する、又は上皮細胞の増殖、生存及び／又は遊走を増加させる方法。
【請求項３１】
（１）被験体の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、
（２）正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び
（３）血清ＭＳＰレベルが正常対照と比較して被験体において低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程
を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型を検出し、且つ、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型を検出する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、且つ、血清ＭＳＰレベルが正常対照と比較して被験体において低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
被験体が糖尿病の被験体である、請求項３０から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
被験体がＩＢＤを有する、請求項３０から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＢＤがクローン病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
被験体に、請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト、又は請求項１８に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、必要とする被験体において、糖尿病を治療する方法。
【請求項３９】
被験体に、請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト、又は請求項１８に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、必要とする被験体において、血糖を低下させる方法。
【請求項４０】
被験体に請求項１から１７の何れか一項に記載のＲＯＮアゴニスト、又は請求項１８に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、必要とする糖尿病の被験体において、創傷治癒を治療する方法。
【請求項４１】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項３８から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
被験体において血清ＭＳＰレベルを検出する工程、正常対照における血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び、血清ＭＳＰレベルが正常対照に比べて被験体において低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程、を更に含む、請求項３８から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、且つ、血清ＭＳＰレベルが正常対照に比べて被験体において低い場合に、ＲＯＮアゴニストを被験体に投与する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＯＮアゴニストが抗ＲＯＮアゴニスト抗体、又はその抗原結合断片、又は、ＭＳＰ融合タンパク質、又はその機能的断片を含む、請求項１９から４３に記載の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＯＮアゴニストがＭＳＰ融合タンパク質又はその機能的断片を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＭＳＰ融合タンパク質がＭＳＰβ及び融合部分を含む、請求項４５に記載の方法
【請求項４７】
ＲＯＮアゴニストがＭＳＰβ−Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＳＰ融合タンパク質がペプチドリンカーを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ペプチドリンカーが２〜２０アミノ酸残基長、好ましくは、４〜１６アミノ酸残基長である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ペプチドリンカーが１６アミノ酸残基長である、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＲＯＮアゴニストがヒトＭＳＰ融合タンパク質である、請求項１９から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ＲＯＮアゴニストが、ヒトＭＳＰβ及びＦｃドメインを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＲＯＮアゴニストが配列番号２０、配列番号２２又は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１９から５３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＲＯＮアゴニストが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＭＳＰアゴニストが抗ＲＯＮアゴニスト抗体、又はその抗原結合断片である、請求項１９から４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＲＯＮアゴニスト抗体が抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＲＯＮアゴニスト抗体がモノクローナル、キメラ、ヒト、二重特異性又はヒト化抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
被験体が哺乳動物である、請求項１９から５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項６０】
被験体がヒトである、請求項５９の方法。
【請求項６１】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有すると疑われるか又は有する危険性がある被検者においてＩＢＤを診断する方法であって、
ａ．被験体の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、
ｂ．正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び
ｃ．被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルと比べて低い場合に、ＩＢＤを有するか又はＩＢＤを有する危険性がある被験体を診断する工程
を含む、方法。
【請求項６２】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を決定する工程、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、ＩＢＤを有するか又はＩＢＤを有する危険性がある被験体を診断する工程、を更に含む、請求項６１の方法。
【請求項６３】
ＩＢＤを有すると疑われるか又はＩＢＤを有する危険性がある被検者において、ＩＢＤを診断する方法であって、
ａ．被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、
ｂ．被験体の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、
ｃ．正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び
ｄ．被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルと比べて低い場合、且つ、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、ＩＢＤを有するか又はＩＢＤを有する危険性がある被験体を診断する工程
を含む、方法。
【請求項６４】
ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である、請求項６１から６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＩＢＤがクローン病である、請求項６１から６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
創傷治癒の欠陥を有することが疑われるか又は有する危険性がある被験体を診断する方法であって、
ａ．被験体の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、
ｂ．正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する工程、及び
ｃ．被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルと比べて低い場合、創傷治癒の欠陥を有するか又は有する危険性がある被験体を診断する工程
を含む、方法。
【請求項６７】
被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び、被験体においてｒｓ３１９７９９９多型が検出された場合、且つ、被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルよりも低い場合に、創傷治癒において症状又は障害を有するか又は有する危険性がある被験体を診断する工程、を更に含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
創傷治癒の欠陥を有することが疑われるか又は有する危険性がある被験体を診断する方法であって、
ａ．被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する工程、及び
ｂ．ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、創傷治癒の欠陥を有するか又は有する危険性がある被験体を診断する工程
を含む、方法。
【請求項６９】
創傷治癒が上皮創傷治癒である、請求項６６から６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
被験体が糖尿病の被験体である、請求項６６から６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
被験体が哺乳動物である、請求項６１から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
被験体がヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項１から１５の何れか一項に記載のＭＳＰ融合タンパク質。
【請求項７４】
ＭＳＰ融合タンパク質がヒトＭＳＰ融合タンパク質である、請求項７３に記載のＭＳＰ融合タンパク質。
【請求項７５】
請求項７３又は７４に記載のＭＳＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項７６】
配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７７】
配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項７６に記載の単離された核酸分子。
【請求項７８】
請求項７３又は７４に記載のＭＳＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７９】
配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項７８記載のベクター。
【請求項８０】
請求項７５から７７の何れか一項に記載の核酸分子、又は請求項７８又は７９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８１】
ａ．ＭＳＰ融合タンパク質を発現する条件下で、請求項８０に記載の宿主細胞を培養する工程、及び
ｂ．ＭＳＰ融合タンパク質を回収する工程
を含む、ＭＳＰ融合タンパク質を産生する方法。
【請求項８２】
請求項１６又は１７の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項８３】
抗体が抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である、請求項８２に記載の単離された抗体。
【請求項８４】
抗体がモノクローナル、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である、請求項８２又は８３の単離された抗体。
【請求項８５】
請求項８２から８４の何れか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項８６】
請求項８２から８４の何れか一項に記載の単離された抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項８７】
請求項８５に記載の核酸分子又は請求項８６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８８】
ａ．抗体を発現する条件下で、請求項８７に記載の宿主細胞を培養する工程、及び
ｂ．抗体を回収する工程
を含む、抗体を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年１１月３０日に出願された米国仮出願番号６１／７３２０４８号、及び２０１３年５月１５日に出願された６１／８２３７４４号の関連出願であり、その優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出される配列表が含まれており、本明細書にその全体が参照により援用される。２０１３年１１月２０日に作成された、前記ＡＳＣＩＩ形式のコピーは、Ｐ５５０５Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは３８２キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、腸管内での慢性炎症反応を特徴とする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の二つの形態である。ＣＤ及びＵＣ患者における一塩基多型（ＳＮＰ）の頻度を調べるゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、共有及び固有の感受性対立遺伝子を多数同定してきた。ＧＷＡＳ及び候補遺伝子アプローチの両方を使用して、ＣＤとＵＣの両方に対する感受性との関連があると考えられていたマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）における多型が同定されてきた。例えば、Barrettら, 2008, Nat Genet 40:955-62, 及び Consortium WTCC. 2007, Nature 447:661-78を参照。
【０００４】
この遺伝的リスクの増加の原因を恐らく担っている対立遺伝子は、アミノ酸６８９（６８９Ｒから６８９Ｃ）でのシステインのアルギニンへの変化をもたらすＭＳＰ（ｒｓ３１９７９９９）での非同義コーディングＳＮＰである。Goyetteら、2008, Mucosal Immunol 1:131-8を参照。
【０００５】
ＭＳＰは、肝臓によって発現する、プラスミノーゲン関連の可溶性増殖因子であり、その受容体である、Ｍｅｔファミリー受容体型チロシンキナーゼ、Ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ  Ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）に結合することができない不活性な一本鎖タンパク質（ｐｒｏ−ＭＳＰ）として血清中に分泌される。Ｒ４８３とＶ４８４の間のｐｒｏ−ＭＳＰのタンパク質分解切断は、それを、高い親和性でＲＯＮに結合し、受容体シグナル伝達を誘導することができる、活性な、二本鎖ジスルフィド結合／ヘテロダイマーに変換する。Gaudinoら、1994, EMBO J 13:3524-32、及びWangら、1994, Science 266:117-9を参照。α−鎖は、Ｎ末端ＰＡＮドメインに続き、４つのクリングルドメインを含み、β−鎖は、Ｃ末端のトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む。ｐｒｏ−ＭＳＰは、凝固カスケードと関与するもの、及び、炎症応答の間に誘導されたものを含む、多数の異なるセリンプロテアーゼによって、タンパク質分解的に活性化され得る。例えば、Wangら、1994, J Biol Chem 269:3436-40を参照。従って、ＭＳＰの組織損傷の部位での切断は、ＲＯＮの局所活性化をもたらす。
【０００６】
ＲＯＮの発現が、上皮細胞、マクロファージのサブセット、神経内分泌組織、及び発達中の骨で報告されており、上皮細胞増殖の誘導、生存、遊走及び細胞外マトリックスへの付着と関連している。例えば、Iwamaら、1995, Blood 86:3394-403、Gaudinoら、1995, Oncogene 11:2627-37、Danilkovitchら、1999, Exp Cell Res 248:575-82、及びDanilkovitchら、2000, Mol Cell Biol 20:2218-27を参照。より最近では、ＭＳＰ−ＲＯＮ経路が炎症応答の重要な負の調節因子として提案されている。主にリポ多糖及びインターフェロンγで刺激したマウス腹腔マクロファージの研究に基づいて、ＲＯＮシグナル伝達が炎症誘発性因子の発現を抑制し、組織修復に関与している可能性のある経路をアップレギュレートすることが見出された。例えば、Chenら、1998, J Immunol, 161:4950-9,及び、Wilsonら、2008, J Immunol, 181:2303-10を参照。先天性炎症応答におけるＲＯＮの抑制の役割は、ＲＯＮにおいて標的変異を持つマウスが、エンドトキシンチャレンジに対し増強された感度を示すことを実証する、インビボ研究によって支持されてきた。Waltzら、2001, J Clin Invest, 108:567-76を参照。これらのインビトロ及びインビボ試験は、ＭＳＰ６８９Ｃ多型に関連するＩＢＤの遺伝的リスクの増加が、改変されたＭＳＰとＲＯＮの間の結合、及びＲＯＮ媒介性阻害におけるマクロファージの活性化の異常の直接的な結果である、という推論を導いてきた。Khorら、2011, Nature 474:307-17、Gorlatovaら、2011, PLoS One 6:e27269を参照。逆説的に、より最近の研究では、６８９Ｃの多型が、より高いインビトロ遊走及び増殖を誘導する、ヒト単球細胞株において、ＭＳＰ刺激活性を増大させることを見出した。Hauserら、2012, Genes Immun 13:321-7。
【０００７】
従って、ＲＯＮシグナル伝達におけるＭＳＰ多型の役割、及びＩＢＤを含めたＲＯＮ関連疾患をより良く理解すること、及び治療のためのより良好な処置が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本出願は、試薬及びＲｅｃｅｐｔｏｒ  ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ  Ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）、特にＲＯＮアゴニストに関連する組成物、及び使用方法及びその製造方法を提供する。一態様において、本発明は、抗ＲＯＮアゴニスト抗体を含むＲＯＮアゴニスト又はその抗原結合断片、又はＲＯＮに特異的に結合するマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、融合タンパク質、又はその機能的断片を提供する。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストはＭＳＰ融合タンパク質又はその機能的断片を含む。ある実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、ＭＳＰβ及び融合部分を含む。ある好ましい実施態様において、融合部分は、二量体化ドメイン、限定するものではないが、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。ある実施態様において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインを含み；且つ更にある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃドメインである。ある他の実施態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ（ＤＡＮＡ）変異を更に含む。ある特定の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は二量体である。特定の他の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質がＲＯＮの結合に対して二価である。ある他の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、リンカー、好ましくは、ＭＳＰβ及び融合部分に結合するペプチドリンカーを更に含む。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、長さが２から２０アミノ酸残基であり、好ましくは、長さが４から１６個のアミノ酸残基であり、より好ましくは、長さが８から１６個のアミノ酸残基である。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、長さが１６アミノ酸残基である。ある他の実施態様において、ペプチドリンカーは、長さが４アミノ酸残基である。ある特定の実施態様において、ＭＳＰの融合タンパク質は、ヒトＭＳＰ融合タンパク質である。他の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、ヒトＭＳＰβを含む。ある他の実施態様において、ＭＳＰの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０、２２又は２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＭＳＰ融合タンパク質を含む。ある別の態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％の配列同一性を有するＭＳＰ融合タンパク質を含む。ある特定の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
更に他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、抗ＲＯＮアゴニスト抗体又はその抗原結合断片を含む。ある実施態様において、抗ＲＯＮアゴニスト抗体は、モノクローナル抗体ＹＷ６５１．１又は２Ｅ５．８．１の１つ又はそれ以上の高頻度可変領域を含む。ある他の実施態様において、抗体は、抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である。ある他の実施態様において、抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト、二重特異性抗体又はヒト化抗体である。
【００１０】
別の態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の本明細書に記載のＲＯＮアゴニスト及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。ある実施態様において、薬学的組成物は、ヒトＭＳＰ融合タンパク質、又はそれらの機能的断片を含む。ある実施態様において、薬学的組成物は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、ヒトＭＳＰ融合タンパク質を含む。ある他の実施態様において、薬学的組成物は、抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体、又はそれらの抗原結合断片を含む。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、本明細書に記載される、被験体へのＲＯＮアゴニスト、又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、それを必要とする被験体におけるＭＳＰ関連、又はＲＯＮ関連の疾患又は障害を治療する方法を提供する。ある実施態様において、ＲＯＮ関連疾患又は障害は、ＲＯＮの活性低下と関連している。ある特定の実施態様において、ＲＯＮの活性低下は、上皮細胞の増殖、生存又は遊走と関連している。ある実施態様において、ＲＯＮの活性低下は、創傷治癒の欠陥、症状又は障害に関連している。更にある実施形態において、ＲＯＮの活性低下は、腸又は皮膚における上皮創傷治癒の欠陥、症状又は障害に関連している。ある他の実施態様において、ＲＯＮ関連疾患又は障害には、限定されるものではないが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、原発性硬化性胆管炎、又は、創傷治癒における欠陥、症状又は障害を含む。ある他の実施態様において、ＩＢＤは潰瘍性大腸炎である。更に他の実施態様において、ＩＢＤはクローン病である。
【００１２】
ある実施態様において、創傷治癒の欠陥、状態又は障害は、線維性疾患である。ある他の実施態様において、創傷治癒の欠陥、症状又は障害は、慢性上皮損傷、限定するものではないが、特発性肺線維症、強皮症、及び原発性胆汁性肝硬変に関連している。ある他の実施態様において、創傷治癒は、上皮の創傷治癒である。ある特定の実施態様において、上皮創傷治癒の欠陥は、管腔、管又は導管の上皮層で起こる。ある実施態様において、上皮創傷治癒の欠陥は、腸の上皮層で起こる。ある実施態様において、上皮創傷治癒の欠陥は、結腸の上皮層で起こる。特定の機序（単数又は複数）に限定されないが、ある実施態様において、上皮の創傷治癒の改善は、上皮増殖、生存及び／又は遊走を増加させることによって反映又は達成される。ある他の実施態様において、創傷治癒は創傷閉鎖の程度によって測定される。ある他の実施態様において、上皮創傷治癒の欠陥は、皮膚で起こる。ある実施態様において、創傷は、慢性創傷、圧力創傷又は褥瘡である。ある他の実施態様において、上皮の創傷治癒の欠陥は、糖尿病に関連している。ある実施態様において、創傷は、糖尿病性創傷又は糖尿病性足部潰瘍を含む、糖尿病性潰瘍である。ある特定の実施態様において、被験体は糖尿病患者である。更にある実施形態において、被験体はヒト糖尿病患者である。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、ヒトＭＳＰ融合タンパク質、又はその機能的断片、又は抗ヒトＲＯＮ抗体、又はその抗原結合断片を含む。ある他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
ある実施態様において、方法は、被験体における血清ＭＳＰレベル、及び、必要に応じて、正常対照における血清ＭＳＰレベルを検出する、且つ、正常対照における血清ＭＳＰレベルと比較して、血清ＭＳＰレベルが被験体において低い場合、ＲＯＮアゴニスト、又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を被験体へ投与する工程を、更に含む。ある他の実施態様において、方法は、被験体における血清ＭＳＰレベルを検出する、且つ、正常対照の所定の血清ＭＳＰレベルと比較して、血清ＭＳＰレベルが被験体において低い場合、被験体へのＲＯＮアゴニスト、又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を、更に含む。ある実施態様において、方法は更に、正常対照における血清ＭＳＰレベルを検出する工程を含む。ある他の実施態様において、この方法は、被験体におけるｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、且つ、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、及び／又は、血清ＭＳＰレベルが正常対照に比べて、被験体において低い場合、被験体にＲＯＮアゴニストを投与する工程を更に含む。ある他の実施態様において、この方法は、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出され、且つ、血清ＭＳＰレベルが正常対照に比べて被験体において低い場合、被験体にＲＯＮアゴニストを投与する工程を更に含む。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、ヒトＭＳＰ融合タンパク質、又はその機能的断片、又は抗ヒトＲＯＮ抗体、又はその抗原結合断片を含む。ある他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。血清ＭＳＰレベルは、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイを含む、当技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。ｒｓ３１９７９９９多型は、当技術分野で既知の任意の方法によって検出され得る。例示的な方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社提供のＴａｑＭａｎプラットフォーム（ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ、カタログ＃４３５１３７９、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）などのシーケンシングベース又はＰＣＲベースのアッセイを使用した検出を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、被験体にＲＯＮアゴニスト又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、それを必要とする被験体における上皮の創傷治癒を増強する方法を提供する。更なる態様において、本発明は、ＲＯＮアゴニストと細胞を接触させることを含む、上皮細胞増殖、生存及び／又は遊走を増加させる方法を提供する。更なる態様において、本発明は、被験体にＲＯＮアゴニスト、又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与することを含む、それを必要とする被験体において上皮細胞の増殖、生存及び／又は遊走を増加させる方法を提供する。ある実施態様において、被験体はＩＢＤを有する。ある他の実施態様において、ＩＢＤは潰瘍性大腸炎である。更にある実施態様において、ＩＢＤはクローン病である。ある実施態様において、本発明のアゴニストを含むＲＯＮアゴニスト又は薬学的組成物は、手術を受けた被験体に、内部又は外部の外科的切開後の創傷治癒を増強するため、有利に適用される。ある他の実施態様において、被験体は糖尿病患者である。更に他の実施態様において、被験体はヒト糖尿病患者である。したがって、更なる態様において、本発明は、糖尿病患者における上皮創傷治癒を増強する方法を提供する。ある実施態様において、上皮創傷治癒は、糖尿病患者の皮膚で起こる。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、ヒトＭＳＰ融合タンパク質、又はその機能的断片、又は抗ヒトＲＯＮ抗体、又はその抗原結合断片を含む。ある他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
これらの態様のある実施態様において、本方法は、（１）ｒｓ３１９７９９９多型の存在、及び／又は、（２）被験体の血清ＭＳＰレベルを検出すること、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、又は、血清ＭＳＰレベルが正常対照と比べて被験体において低い場合、被験体へＲＯＮアゴニストを投与すること、を更に含む。ある実施態様において、本方法は、正常対照における血清ＭＳＰレベルを検出する工程を更に含む。ある実施態様において、本方法は、（ａ）被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出すること、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合に、被験体へのＲＯＮアゴニストを投与すること、又は、（ｂ）被験体における血清ＭＳＰレベルを検出し、血清ＭＳＰレベルが正常対照における血清ＭＳＰレベルと比べて、被験体において低い場合、被験体へのＲＯＮアゴニストを投与する、工程を更に含む。ある他の実施態様において、本方法は更に、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体で検出され、且つ、血清ＭＳＰレベルが正常対照と比べて被験体において低い場合、被験体にＲＯＮアゴニストを投与する、工程を含む。
【００１６】
更なる態様において、本発明は、被験体にＲＯＮアゴニスト又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を含み、それを必要とする被験体における糖尿病の治療方法を提供する。別の態様において、本発明は、被験体にＲＯＮアゴニスト、又はＲＯＮアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を含み、それを必要とする被験体における血糖を低下させる方法を提供する。更なる態様において、本発明は、糖尿病に関連する症状を治療する方法を提供する。ある実施態様において、症状は、限定するものではないが、糖尿病性ケトアシドーシス、代謝性アシドーシス、高血糖、高血糖高浸透圧症候群、又はメタボリックシンドロームである。これらの態様のある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、ヒトＭＳＰ融合タンパク質、又はその機能的断片、又は抗ヒトＲＯＮ抗体、又はその抗原結合断片を含む。ある他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
これらの態様のある他の実施態様において、糖尿病を治療する方法は、（ａ）被験体におけるｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出し、ｒｓ３１９７９９９多型を被験体において検出された場合に、対象へのＲＯＮアゴニストを投与する、及び／又は、（ｂ）被験体における血清ＭＳＰレベルを検出し、血清ＭＳＰレベルが正常対照における血清ＭＳＰレベルと比べて、被験体において低い場合は、被験体へＲＯＮアゴニストを投与する、工程を更に含む。
【００１８】
ある実施態様において、被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、被験体において血清ＭＳＰレベルを検出する、及びｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、及び／又は、血清ＭＳＰレベルは正常対照に比べて被験体において低い場合は、被験体へＲＯＮアゴニストを投与する、工程を更に含む。さらに他の実施態様において、方法は、被験体においてｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、被験体において血清ＭＳＰレベルを検出する、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、及び／又は、血清ＭＳＰレベルが正常対照に比べて被験体において低い場合は、被験体へＲＯＮアゴニストを投与する、工程を更に含む。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、（ａ）被験体の血清ＭＳＰレベルを検出又は決定する、（ｂ）必要に応じて、正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出又は決定する、及び、（ｃ）被験体の血清中のＭＳＰのレベルが、対照の血清ＭＳＰレベルよりも低い場合、ＩＢＤを有する被験体を診断する、工程を含む、ＩＢＤを有すると疑われる試験被験体において、ＩＢＤを診断する方法を提供する。更に別の態様において、本発明は、（ａ）被験体の血清ＭＳＰレベルを検出又は決定する、（ｂ）必要に応じて正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出又は決定する、及び、（ｃ）被験体の血清中のＭＳＰのレベルが対照の血清ＭＳＰレベルよりも低い場合、ＩＢＤを有する危険性がある被験体を診断する、工程を含む、ＩＢＤを有する危険性が疑われる試験被験体において、ＩＢＤを診断する方法を提供する。ある実施態様において、本方法は、試験被験体において、ｒｓ３１９７９９９多型の存在を決定する、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、ＩＢＤを有するか、又はＩＢＤを有する危険性がある被験体を診断する、工程を更に含む。
【００２０】
更に別の態様において、本発明は、（ａ）被験体の血清ＭＳＰレベルを検出する、又は被験体において、ｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、（ｂ）必要に応じて、正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する、及び、（ｃ）被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルに比べて低い場合、創傷治癒の欠陥を有するか、又は、有する危険性がある被験体を診断する、工程を含む、創傷治癒の欠陥、症状又は障害を有すると疑われるか、又は有する危険性がある被験体を診断する方法を提供する。ある実施態様において、本方法は、正常対照の血清ＭＳＰレベルを検出する工程を更に含む。ある実施態様において、本方法は、被験体の血清中のＭＳＰのレベルを検出する、及び、被験体において、ｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、又は、被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルに比べて低い場合は、創傷治癒の欠陥、症状又は障害を有するか、又は有する危険性がある被験体を診断する、工程を更に含む。ある他の実施態様において、本方法は、被験体の血清中のＭＳＰのレベルを検出する、及び、被験体において、ｒｓ３１９７９９９多型の存在を検出する、及び、ｒｓ３１９７９９９多型が被験体において検出された場合、及び、被験体の血清ＭＳＰレベルが正常対照の血清ＭＳＰレベルに比べて低い場合は、創傷治癒の欠陥、症状又は障害を有するか、又は有する危険性がある被験体を診断する、工程を更に含む。ある実施態様において、創傷治癒は上皮細胞の創傷治癒である。ある実施態様において、被験体はＩＢＤを有するか、又は有する危険性がある。ある他の実施態様において、被験体は糖尿病患者である。
【００２１】
別の態様において、本発明は、抗ＲＯＮ抗体又は本発明のＭＳＰ融合タンパク質を用いて、サンプル中のＲＯＮを検出する方法を提供する。更なる態様において、本発明は、被験体又は被験体由来のサンプルにおいて、抗ＲＯＮ抗体又はＭＳＰ融合タンパク質を使用して改変されたＲＯＮ発現レベルに関連する疾患又は症状を診断する方法を提供する。
【００２２】
全ての上述の態様のある実施態様において、被験体は哺乳動物である。全ての上述の態様のある他の実施態様において、被験体はヒトである。全ての上述の態様の更にある実施態様において、被験体は糖尿病を有するヒトである。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、ＲＯＮアゴニストをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。ある実施態様において、単離された核酸分子は、抗ＲＯＮ抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある他の実施態様において、単離された核酸分子は、ＭＳＰの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１９，２１又は２３のポリヌクレオチド配列と、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の核酸分子を含む。ある実施態様において、核酸分子は、配列番号１９、２１又は２３のポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施態様において、核酸分子は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ＲＯＮアゴニストをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。更に別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド配列がＲＯＮアゴニストをコードする、ポリヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子、又はポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターを含む宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ベクターは、抗ＲＯＮ抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。ある他の実施態様において、ベクターは、ＭＳＰの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。ある特定の実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。また、本発明は、（ａ）ＭＳＰ融合タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する、及び、（ｂ）ＭＳＰ融合タンパク質を回収する、工程を含む、ＭＳＰの融合タンパク質を産生する方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、単離されたＲＯＮアゴニスト抗体を提供する。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニスト抗体は、モノクローナル抗体ＹＷ６５１．１又は２Ｅ５．８．１の超可変ドメイン配列に少なくとも９５％の同一性である超可変領域配列を含む。ある実施態様において、抗体は抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である。
【００２６】
更なる態様において、本発明は、ＲＯＮアゴニスト抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。ある実施態様において、抗体は抗ヒトＲＯＮアゴニスト抗体である。別の態様において、本発明は、抗ヒトＲＯＮ抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含んでいる宿主細胞、又は、抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターは、単離された抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。本発明はまた、（ａ）単離された抗体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する、及び、（ｂ）単離された抗体を回収する、工程を含む、本明細書に記載される、単離された抗体を産生する方法を提供する。
【００２７】
更に別の態様において、本発明は、ＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連疾患又は障害を治療するため、医薬の調製のためのＲＯＮアゴニストの使用を提供する。ある実施態様において、ＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連疾患又は障害は、ＩＢＤ又は創傷治癒の欠陥、特に上皮の創傷治癒である。ある他の実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、抗ヒトＲＯＮ抗体又はヒトＭＳＰ融合タンパク質である。
【００２８】
本発明の特定の実施態様は、特定の好適な実施態様及び特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２９】
上記に記載された、任意の及び全ての実施態様は、文脈上明らかにそうでないことを示さない限り、本発明の任意の及び全ての態様に適用されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａ−Ｄは、マウスの骨髄性及び上皮細胞集団におけるＲＯＮの発現を調査した結果を示している。図１Ａは、(Chaudhuriら、出版のために提出された原稿)又はアイソタイプ対照抗体（斜線のヒストグラム）を使用して、ＲＯＮ発現をフローサイトメトリーにより分析した、示された細胞集団又は組織の単一細胞懸濁液のヒストグラムを示している。マクロファージ集団は、エキソビボ由来細胞についてはＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋、及び骨髄培養細胞についてはＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋でゲーティングした。結腸上皮細胞は、ＣＤ４５−ＥＣａｄｈｅｒｉｎ＋でゲーティングした。図１Ｂは、上皮細胞の基底側面にＲＯＮの発現を示す正常なマウスの結腸からの組織切片の免疫組織化学染色の顕微鏡写真を示している。図１Ｃは、ＲＯＮを染色し、且つ、核を対比染色した、正常マウスの結腸からの組織切片の免疫蛍光染色の顕微鏡写真を示している。白い矢印は、単一の上皮細胞の頂端膜側を示している。図１Ｄは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で６日間後処理し、ＲＯＮ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｆ４／８０を染色し、且つ、核（Ａ〜Ｄ）を対比染色した、マウスの結腸の組織切片の免疫蛍光染色の顕微鏡写真を示している。個々の染色及びマージされた画像は、（Ａ〜Ｄ）に示されている。図１Ｅは、ＲＯＮの免疫蛍光染色の顕微鏡写真を示している。スケールバー＝１００μｍ（Ｂ）、１０μｍ（Ｃ）、２０μｍ（Ｄ）及び４０μｍ（Ｅ）。図面は、実施例１に関連している。
【図２】図２Ａ−Ｄは、ＲＯＮがヒトにおける上皮細胞によって優先的に発現されることを示す、実施例１に記載された結果を示している。図２Ａは、ヒト細胞株及び初代細胞においてＲＯＮの発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲの調査の結果を示している。カラム１：  ＨＥＫ２９３対照、カラム２−４：上皮細胞株（ＨＣＴ１１５、ＨＴ２９、ＨＰＣ４）、カラム５−６：単球細胞株（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）、コラム７：ヒトＣＤ１４＋単球（ＭＯＮＯＳ）、及び、カラム８−１１：未処理のまま、又は、指定された刺激で処理した単球由来マクロファージ（ＭＤＭＳ）。カラム１〜７におけるデータは、３つの独立したサンプルの平均＋／−ＳＤであり、カラム８〜１１のデータは、ドナー２例の平均である。図２Ｂは、ＲＯＮの発現について単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析のヒストグラムを示している。細胞は、ヒトＲＯＮに特異的なモノクローナル抗体(clone 1A2.2, Chaudhuriら、2011, J Biol Chem. 286(37):32762-74)、又はアイソタイプ対照抗体（斜線のヒストグラム）で染色した。ＭＤＭＳは、ＣＤ１４＋ＣＤ３３＋でゲーティングした。図２Ｃは、免疫組織化学的にＲＯＮの発現について染色した健常者、潰瘍性大腸炎患者、及びクローン病患者の結腸の組織切片の顕微鏡写真を示している。スケールバー＝１００μｍ。図２Ｄは、正常な個体、及び潰瘍性大腸炎及びクローン病患者の非炎症及び炎症領域から採取したヒトの腸の生検サンプルにおけるＲＯＮの発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のデータを要約している。図２Ｅは、ヒトＲＯＮ（クローン１Ａ２．２）に特異的なモノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体（網掛けヒストグラム）を使用した、潰瘍性大腸炎患者から切除された腸組織の単一細胞懸濁液中でのＲＯＮ発現のフローサイトメトリー分析のヒストグラムを示している。マクロファージは、ＣＤ４５＋ＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋でゲーティングし、上皮細胞は、ＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋細胞としてゲーティングした。マクロファージデータは、６例のドナーの代表的なものであり、上皮細胞のデータは、３例のドナーを代表するものである。図２Ｆは、マクロファージ及び複数のドナーの切除腸組織からの上皮細胞におけるＲＯＮの発現の定量的な結果を示している。患者数が示されている。データは、アイソタイプ対照染色に対するＲＯＮ染色の平均蛍光強度比を表す。破線は、１：１の比、即ち、ＲＯＮの発現の欠如を示す。Ｎ、非−ＩＢＤ。図２Ｇは、図２Ｅと同じ消化条件で処理された細胞、又は未処理の細胞内で、ＲＯＮの発現レベルを示すヒストグラムを示している。
【図３】図３Ａ−Ｅは、実施例２の組換えヒトＭＳＰタンパク質の結合試験の結果を示している。図３Ａは、本試験で使用した組換えヒトＭＳＰタンパク質を示す図である。ジスルフィド結合によって接続されたα鎖及びβ鎖及びＰＡＮドメイン（Ｎ）、クリングルドメイン（Ｋ）、セリンプロテアーゼ様ドメイン（ＳＰＬ）を含む野生型ＭＳＰタンパク質が示されている（配列番号１２）。一本鎖ＭＳＰ（ｓｃＭＳＰ）（配列番号６）は、タンパク質分解切断部位（矢印）でのＲ４８３Ｅ変異により、恒常的に不活性である。完全長ＭＳＰタンパク質及びＭＳＰβタンパク質の６８９Ｒ及び６８９Ｃバージョン（それぞれ、配列番号４及び配列番号１０）を生成した。図３Ｂは、プレートに結合したＲＯＮ−Ｆｃ（配列番号４４）及び可溶性ＭＳＰを使用した、無細胞結合アッセイの結果を示している。群当たり３回の反復の平均が示されている。線は、ＭＳＰ６８９Ｒ、６８９Ｃ、ＭＳＰ６８９Ｒ（配列番号２、４、８）及びＭＳＰ６８９Ｃ（配列番号１０）、それぞれに対して０．１、０．２、０．０５及び０．１ｎＭのＥＣ５０値を得た、４パラメーター方程式に適合する用量反応曲線を表している。図３Ｃは、応答単位の相対的な応答を示す、固定化されたＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩに結合するＭＳＰタンパク質のＳＰＲ解析の結果を示している。データは、３回の独立した実験を代表するものである。図３Ｄは、ＲＯＮに結合するＭＳＰの放射性リガンド結合アッセイの結果を示している。親和性を生成するために使用された３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞への競合結合（大きいグラフ）及びスキャッチャードプロット（挿入グラフ）が示されている。３回の独立した実験の平均＋／−標準偏差（ＳＤ）が示されている。図３Ｅは、最下部に示したＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩの構造のホモロジーモデル（ＰＤＢコード４ＦＷＷ）であり、それは、上部に示したＭＳＰ（ＰＤＢコード２ＡＳＵ）に結合する。ＲＯＮ及びＭＳＰは、グローバルにＭｅｔ／ＨＧＦ複合体（ＰＤＢコード１ＳＨＹ）に整列させた。ＲＯＮの４Å以内に接触するＭＳＰβの残基の予測位置は、アスタリスクでマークされている。ＭＳＰβ残基６８９がシステインに変異し、矢印でマークされている。ＲＯＮの残基Ａ２２３は、ＭＳＰβの擬似Ｓ１ポケットの上に位置している。
【図４】図４Ａ−Ｂは、ｐｒｏ−ＭＳＰのタンパク質分解処理を示す、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅによって染色したゲル電気泳動の画像を提示している。ｐｒｏ−ＭＳＰ及びＭＳＰの両方からなる、精製された、ＭＳＰ６８９Ｒ（図４Ａ）及びＭＳＰの６８９Ｃ（図４Ｂ）は、増量したヘプシンと混合し、還元条件下でゲル電気泳動法により分析した。ｐｒｏ−ＭＳＰ、ＭＳＰα、及びＭＳＰβに対応する移動率が示されている。データは、３つの独立した実験を代表するものである。データは実施例３を参照。
【図５】図５Ａは、指定の処理をされたＡ２７８０−ｈＲＯＮ及びＢｘＰＣ３細胞における全Ａｋｔ及びｐＡｋｔのウェスタンブロット分析の写真を提示している。ブロットは３回行い、ｐＡｋｔ／全体比の平均を示している。図５Ｂは、ｓｃＭＳＰ又はＭＳＰの変異体で処理した、３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞のＭＳＤ分析の結果を示している。３つの処理の平均＋／−ＳＤを示している。データは、３つの独立した実験を代表するものである。図５Ｃは、ｓｃＭＳＰ又はＭＳＰの変異体で処理された３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞のスクラッチ創傷アッセイからの画像を提示している。画像は、指定した時間で、スクラッチ創傷後の同じ細胞培養物からのものである。破線は、初期スクラッチの位置を表している。図５Ｄは、培地のみ、ｓｃＭＳＰ、又はＭＳＰ変異体で処理した３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞からの、スクラッチ創傷アッセイの結果の定量化を示している。３つの処理の平均＋／−ＳＤを示している。データは、３つの独立した実験を代表するものである。図５Ｅは、ｓｃＭＳＰ又はＭＳＰ変異体で処理されたＲＯＮ受容体を発現しない、親３Ｔ３細胞からのスクラッチ創傷アッセイの結果の定量化を示す。３つの治療の平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。データは、３つの独立した実験を代表するものである。データは実施例４を参照。
【図６】図６Ａは、ＥＭＢＡＲＫコホートからの正常、ＵＣ、及びＣＤ患者由来のＤＮＡ試料中のｒｓ３１９７９９９対立遺伝子を分析し、実施例５の結果をまとめたものである。Ｃ対立遺伝子は、ＭＳＰ６８９Ｒをコードし、Ｔ対立遺伝子は、ＭＳＰの６８９Ｃをコードする。対立遺伝子頻度及び数は、各群ごとに示されている。図６Ｂは、ｒｓ３１９７９９９遺伝子型によってグループ化された結果と併せ、ＥＬＩＳＡによって決定された、対応するＥＭＢＡＲＫ被験体血清サンプルにおける血清ＭＳＰ濃度を示す。＊，ｐ＝０．０００９；＊＊，ｐ＜０．００１．図６Ｃは、遺伝子型及び疾患の状態によってグループ化された血清ＭＳＰ濃度を示す。図６Ｄは、組換えヒトＭＳＰの変異体及びｓｃＭＳＰ上のＭＳＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの感度を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図７】図７Ａは、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴでＭＳＰ発現カセットに特異的なプライマーを使用して安定的にトランスフェクトされた細胞上の定量的ＰＣＲデータの棒グラフを示し、実施例５に関する。ＭＳＰカセットの値は、ΔＣＴ法を使用して、全ＤＮＡに対して標準化した。２つの６８９Ｒ−及び２つの６８９Ｃ−発現クローンの値が示されている。データは、３つの独立したサンプルの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。親、２９３  ＦｌｐＩｎ細胞。図７Ｂは、安定的にトランスフェクトされた細胞クローンによって細胞上清中にＭＳＰの分泌を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフを提示する。ＥＬＩＳＡ値は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により測定されたとおりに、細胞量の差が制御される。２つの６８９Ｒ−及び２つの６８９Ｃ−発現クローンの値が示されている。データは、３つの独立したサンプルの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。親、２９３  ＦｌｐＩｎ細胞。
【図８】図８は、ＭＳＰβ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質のデザインについて説明している。ヒト又はマウスＭＳＰβは、４、８、１２又１６のアミノ酸残基長のペプチドリンカーを含む、又は含まない、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインに融合した。融合タンパク質のクローニングは、実施例の項に記載されている。
【図９】図９は、ヒト完全長ＭＳＰ、ヒト及びマウスＭＳＰβ及びマウスＲＯＮ−Ｆｃについての様々なＭＳＰβ−Ｆｃ融合タンパク質の結合活性を検討する、結合アッセイの実験デザイン及び結果を示している。この図は、実施例６に関する。
【図１０】図１０は、ＭＳＰβ−Ｆｃ融合タンパク質のマウスＲＯＮ（ｍＲＯＮ）への結合、及び、ｍＲＯＮのインビトロでのシグナル伝達の活性化を実証した実施例７の結果を示している。図１０Ａ−Ｂは、細胞表面（Ａ）又は親３Ｔ３細胞（Ｂ）上でｍＲＯＮを発現している３Ｔ３細胞に結合する様々なｍＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａのタンパク質の結合データを示している。図１０Ｃは、ｍ１２ｍ（ｍＭＳＰβ−Ｌ１２−ｍＩｇＧ２ａ、配列番号３０）融合タンパク質によって誘発されるヒト初代結腸細胞におけるリン酸化Ａｋｔ（上のパネル）又は全Ａｋｔ（下のパネル）を検出したウェスタンブロット分析の画像を示している。図１０Ｄは、３Ｔ３−ｍＲＯＮ安定細胞でのｍＲＯＮの活性化に対するリンカーの長さの影響を要約したグラフを示している。図１０Ｅは、活性化が３Ｔ３細胞におけるｍＲＯＮ発現に依存していることを示す棒グラフを示している。
【図１１】図１１は、マウス結腸上皮細胞でインビボでのＭＳＰ融合タンパク質の結合を検討した、実施例８の実験デザイン及び結果を示している。ＰＢＳを注射したマウス、抗ブタクサアイソタイプ対照を注射したマウス、及びＭＳＰ−Ｌ１２−ｍＩｇＧ２ａを注射したマウスの結腸上皮切片は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスで染色し、シグナルは、Ｌｅｉｃａ  ＳＰＥ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して検出した。
【図１２】図１２Ａは、インビボでのＲＯＮのアゴニズムを検討した実施例９の実験デザインを示している。図１２Ｂは、野生型又はＲＯＮノックアウトマウスにおいて、ＭＳＰβ−Ｆｃ融合又は抗ブタクサアイソタイプ対照によって誘導されたマウスの結腸溶解物中のリン酸化Ａｋｔを検出する、ウェスタンブロット分析の画像を示している。図１２Ｃは、様々なｍＭＳＰβ−Ｆｃ融合タンパク質によるＡｋｔリン酸化を測定することにより、ＲＯＮの活性化のレベルを要約したものである。
【図１３】図１３Ａは、結腸上皮組織におけるＲＯＮシグナル伝達を検討する実験デザインを示している。ＭＳＰβ−Ｆｃ融合タンパク質を注射したマウス（図１３Ｃ）又は抗ブタクサアイソタイプ対照を注射したマウス（図１３Ｂ）からの結腸組織切片を、抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いた免疫組織化学により染色した。これらの図は、実施例９に関する。
【図１４】図１４Ａ及びＣは、ＭＲＯＮに結合した抗ＲＯＮモノクローナル抗体２Ｅ５．８．１及びＹＷ６５１．１が３Ｔ３−ＭＲＯＮ細胞の表面上に発現することを示すグラフを提示している。図１４Ｂ及びＤは、ｍＲＯＮを発現しなかった親３Ｔ３細胞において、結合が検出されなかったため、結合がＲＯＮに特異的であることを実証した結果を示している。これらの図は、実施例１０に関する。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、ＭＳＰ融合タンパク質及び抗ＭＲＯＮアゴニスト抗体によって誘導された３Ｔ３−ＭＲＯＮ細胞又は対照細胞におけるＡｋｔリン酸化を示す、実施例１１の結果を提示している。
【図１６】図１６は、実施例１２に記載したように、抗ＲＯＮ抗体によるＲＯＮブロッキングアッセイの結果を要約した棒グラフを示している。
【図１７】図１７は、ＲＯＮアゴニスト抗体によるＲＯＮのダウンレギュレーションを検討した、実施例１３の実験デザインを提示している。
【図１８】図１８は、アゴニスト抗体がＲＯＮをダウンレギュレートしなかったことを示す、実施例１３の結果をまとめた棒グラフを提示している。
【図１９】図１９Ａは、３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞における創傷治癒のＭＳＰ融合タンパク質及びＲｏｎアゴニスト抗体の効果を示す実施例１４の結果を示している。ＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞において効果は認められていない（図１９Ｂ）。
【図２０】図２０Ａは、ＲＯＮアゴニスト抗体を注射したマウスから単離された結腸細胞における実験例１５のデザイン及びインビボでのＲＯＮの活性アッセイの結果を示している。図２０Ｂ−Ｃは、ｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ）又はＷＴ及びＲＯＮ  ＴＫ−／−マウス（Ｃ）におけるアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１の治療の有無にかかわらず、非創傷の皮膚でのｐＡｋｔ誘導の結果を示している。＊，ｐ＜０．００３；＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図２１】図２１Ａは、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１を使用したｄｂ／ｄｂの糖尿病マウスに、実施例１６のインビボでの創傷治癒アッセイのデータをまとめたグラフを示している。図２１Ｂは、対照抗体又はアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａで処理したｄｂ／ｄｂマウスでの４日目又は２０日目の皮膚の創傷閉鎖の写真画像を示している。創傷組織におけるアゴニスト抗体によるｐＡｋｔ誘導の定量的なデータを図２１Ｃに示されている。
【図２２】図２２は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値の低下における、ＲＯＮアゴニスト抗体の効果を示す実施例１６の結果をまとめたものである。  発明の詳細な説明
【００３１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は全ての目的のために明確に参考として援用される。
【００３２】
この出願内で、特に明記しない限り、利用される技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innisら、1990. Academic Press, San Diego, CA).：などのいくつかの周知の参考文献の何れにも見出されていてよい。
【００３３】
本明細書で使用する、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「単離された抗体」への言及は、１つ又はそれ以上の単離された抗体を意味する。
【００３４】
以下に記載されるどのような実施態様も、文脈が明らかに他を示さない限り、本発明のどのような態様に適用される。全ての実施形態は、異なる態様の間及びそれ以内で、文脈が明確に指示しない限り、組み合わせてもよい。
【００３５】
Ｉ．定義
本明細書で使用される、用語ＭＳＰは、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の哺乳動物由来の任意の天然型ＭＳＰを含む。用語ＭＳＰは、「完全長ＭＳＰ」、「ｐｒｏ−ＭＳＰ」及びリーダー配列（例えば、シグナルペプチド又はシグナル配列）を欠く、分泌ＭＳＰを含む。本明細書で使用される場合、完全長ＭＳＰ及びｐｒｏ−ＭＳＰは、同じ長さであるが、ｐｒｏ−ＭＳＰがタンパク質分解的にα鎖及びβ鎖を生成するために処理されていない非活性ＭＳＰを表している点が異なっている。ｐｒｏ−ＭＳＰは、ジスルフィド結合（完全長ＭＳＰ）によって接続されたヘテロ二量体を形成する、α及びβ鎖を生成するために、セリンプロテアーゼヘプシンなどの転換酵素により、タンパク質分解的に切断される。リーダー配列は、成熟した、活性なＭＳＰタンパク質が細胞から分泌される前に切断される。ある実施態様において、ＭＳＰはまた、天然に存在するＭＳＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ある他の実施態様において、ＭＳＰは、機能を損なうことなく、タンパク質の組換え産生を容易にする変異を１つ又はそれ以上含む。そのような変異は、例えば、ヒスチジンタグ付きＭＳＰ（Ｈｉｓタグ）、ヒトＭＳＰにおけるＣ６７２Ａ及びマウスＭＳＰにおけるＣ６７７Ａを含む。ある特定の実施態様において、ＭＳＰは、ヒトＭＳＰである。典型的なヒトＭＳＰのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【００３６】
ＭＳＰβは、ＲＯＮ結合部位を含むＭＳＰのβ鎖を指す。ＭＳＰβは、単独でＲＯＮに結合するのに十分である。ある有利な実施態様において、二量体化ＭＳＰβはＲＯＮ結合及び動員を容易にする。ＭＳＰβコンストラクトは、ＭＳＰβが細胞外環境への細胞から分泌される前に除去される外因性のリーダー配列（例えば、配列番号１に示されるようにＨＧＦリーダー配列５５）を含む。他のある実施態様において、完全長ＭＳＰのコンテキストでのＭＳＰα鎖とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去するために、変異がＭＳＰβに導入される。ある実施態様において、変異は、ヒトＭＳＰβにおけるＣ５８８Ｓ又はＣ５８８Ａ変異であるか、又はマウスＭＳＰβにおけるＣ５９３Ｓ又はＣ５９３Ａ変異である。本開示を通して、ＭＳＰ又はＭＳＰβのアミノ酸残基の番号付けは、ｐｒｏ−ＭＳＰのアミノ酸残基の番号付けに基づいている。
【００３７】
ある実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、ＭＳＰβ及び融合部分を含む。ある他の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、ＭＳＰβの機能的断片及び融合部分を含む。ある他の実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は、ＭＳＰβ及び融合部分、又はその機能的断片を含む。
【００３８】
用語、タンパク質の「機能的断片」は、完全長タンパク質が短いが、それにもかかわらず、完全長タンパク質の所望の機能（例えば、ＲＯＮに結合するなど）を保持している、切断されたポリペプチドを意味する。ある実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質の機能的断片は、Ｖ４８４−Ｍ７０８、Ｖ４８４−Ｖ７００又はヒトＭＳＰのＶ４８４−Ｆ６９４からのアミノ酸配列を含む。Carafoliら、2005, FEBS J 272(22):5799-807を参照。それは、本発明での使用に適したＭＳＰ機能的断片を、配列及び当該技術分野において既知のＭＳＰの構造及び本明細書で提供されるガイダンスに基づき、デザインし、調製し、当該技術分野における当業者の能力の範囲内である。
【００３９】
用語「ｓｃＭＳＰ」の「一本鎖ＭＳＰ」は、ｐｒｏ−ＭＳＰ切断部位のＰ１位置に変異を含む非切断、不活性なｐｒｏ−ＭＳＰを指す。例えば、一本鎖ヒトＭＳＰは、ヘプシン切断をブロックするＲ４８３Ｅ変異を含む。ｓｃＭＳＰは、示されているように更に変異（Ｒ６８９Ｃなど）を含んでいてもよい。
【００４０】
ある態様において、本発明は、被験体の血清中のＭＳＰレベルが正常対照のものよりも低い場合、被験体における血清ＭＳＰレベルを検出し、且つ、被験体ＲＯＮアゴニストを投与するか、又はＲＯＮ関連又はＭＳＰ−関連疾患の診断決定をする工程を含む、治療又は診断方法を提供する。正常対照における血清ＭＳＰのレベルは、以前に測定された既知の平均正常レベルであるか、又は集団において知られているか、又は毎回測定されてもよい。ある実施態様において、この文脈において、「正常対照」又は「対照」は、野生型ＭＳＰ遺伝子を有する個体、好ましくはヒトを意味する。ある他の実施態様において、対照サンプルは、ｒｓ３１９７９９９多型を有していない個体、好ましくはヒト由来である。
【００４１】
用語「ＲＯＮアゴニスト」は、ＲＯＮ活性を刺激し、及び／又は、ＲＯＮを介してＲＯＮ下流シグナル伝達イベントを活性化する分子を意味する。ある実施態様において、ＲＯＮ活性は、Ａｋｔのリン酸化により測定される。ＲＯＮアゴニストの活性の指標として、他のＲＯＮ下流エフェクターを分析することは、当技術分野の技術の範囲内である。ある実施態様において、ＲＯＮのアゴニストはＭＳＰ融合タンパク質である。ある好適な実施態様において、ＭＳＰ融合タンパク質は二量体を形成することができる融合部分を含む。ある他の実施態様において、二量体のＭＳＰ融合タンパク質は細胞表面上のＲＯＮに結合し、細胞表面上のＲＯＮを動員し、ＲＯＮシグナル伝達を刺激する。ある実施態様において、融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。これは、融合部分が二量化することができる他の分子であり得ることが理解される。そのような融合部分は、限定するものではないが、ロイシンジッパーモチーフを含む。ある他の実施態様において、二量体ＲＯＮアゴニストが、リンカー、好ましくは可動性リンカー、最も好ましくは可動性ペプチドリンカーによって結合した、２つのＭＳＰβドメインを含む。
【００４２】
用語「ｒｓ３１９７９９９多型」とは、ヒトＭＳＰ遺伝子座におけるＲ６８９Ｃ変異を指す。ｒｓ３１９７９９９多型の存在は、限定するものではないが、シークエンシング、制限断片長多型解析、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのｑＰＣＲアッセイなどのＰＣＲ解析を含めて、当該分野において既知の任意の好適な方法によって、又はＳＮＰアレイなどのマイクロアレイアプローチによって検出されてよい。多型を検出するための適切なプライマー及びプローブをデザインすることは、当業者の技能範囲内である。
【００４３】
本明細書における目的のための「ヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００４４】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であって例示的な実施態様を本出願全体を通して、記載する。
【００４５】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００４６】
用語「抗ＲＯＮ抗体」及び「ＲＯＮに結合する抗体」は、抗体が、ＲＯＮを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＲＯＮに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＲＯＮ抗体の、無関係な、非ＲＯＮタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＲＯＮへの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＲＯＮへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗ＲＯＮ抗体は、異なる種由来のＲＯＮ間で保存されているＲＯＮのエピトープに結合する。ある好適な実施態様において、抗ＲＯＮ抗体は、アゴニスト抗ＲＯＮ抗体である。
【００４７】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４８】
「抗体断片」又は「抗体結合断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性（二重特異性を含む）抗体を含む。
【００４９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００５０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５１】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は次を含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５２】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効な量」、「有効量」又は「治療有効量」とは、例えば、ＲＯＮシグナル伝達の刺激、上皮の増殖の促進又は創傷治癒の増強などの、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。「有効量」又は「治療有効量」を構成する化合物の量は、疾患の重症度、治療すべき患者の状態又は年齢、又は投与経路に応じて変更してもよいが、当業者によって日常的に決定されてもよい。
【００５３】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいか、又は存在し得ない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００５４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５６】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００５７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD（1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００５８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００５９】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成するか、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。本明細書に記載の典型的なＨＶＲは、（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ(Chothia及びLesk, J. Mol.Biol.196:901-917（1987))；（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991))；（ｃ）アミノ酸残基２７Ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触(MacCallumら、J. Mol. Biol. 262: 732-745（1996))；及び（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含めた（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ、を含む。
【００６０】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００６１】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
【００６２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。純度の評価法の総説としては、例えばFlatmanら、J. Chromatogr. B 848:79-87（2007)を参照のこと。
【００６３】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００６４】
「抗ＲＯＮ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００６５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００６６】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在していてもよい。
【００６７】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てられてもよい。
【００６８】
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００６９】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
【００７０】
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
【００７１】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００７２】
「薬学的に許容される担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００７３】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００７４】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindtら、Kuby Immunology, 6th ed., W.H.Freeman and Co., page 91（2007).を参照）単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であってよい。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離されてもよい。例えば、Portolanoら、J. Immunol. 150:880-887（1993); Clarksonら、Nature 352:624-628（1991).を参照。
【００７５】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００７６】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、部分的には、ＲＯＮアゴニスト、及びＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連の疾患又は障害の治療のためのアゴニストを使用する方法に基づく。ある実施態様において、ヒトRONに特異的に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、MSP-関連又はRON関連疾患の診断又は治療に対して有用である。
【００７７】
Ａ．  典型的な抗ＲＯＮ抗体
一態様において、本発明は、ヒトＲＯＮに結合する、単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗ＲＯＮ抗体は、ＲＯＮ活性のアゴニストである。他の特定の実施態様において、ＲＯＮアゴニスト抗体は、Ａｋｔのリン酸化により例示されるＲＯＮ下流シグナル伝達を刺激する。他の特定の実施態様において、ＲＯＮアゴニスト抗体は、ＲＯＮに結合すると、表面のＲＯＮのダウンレギュレーションを引き起こすことはない。
【００７８】
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＲＯＮ抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＲＯＮ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【００７９】
更なる態様において、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＲＯＮ抗体は、単独又は組み合わせの何れかで、その特徴が組み込まれていもてよい：
【００８０】
１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）．
【００８１】
一実施形態において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される。例えば、非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen,ら、J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：  ４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかってもよい。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０  ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ  ＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【００８２】
他の実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００、又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたアッセイは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で行われる。一実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動態測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５°Ｃで、約２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chenら、1999, J. Mol. Biol. 293:865-881を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ  ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ  ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ
；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００８３】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudsonら、Nat Med 9, 129-134（2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,（Springer-Verlag, New York), pp. 269-315（1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【００８４】
ダイアボディは２価又は二重特異性であってよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134（2003); 及びHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448（1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた、Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134（2003)に記載されている。
【００８５】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ；  例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。
【００８６】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００８７】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855（1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【００８８】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復若しくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【００８９】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633（2008)に総説され、更に、Riechmannら、Nature 332:323-329（1988); Queenら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033（1989)；米国特許第５８２１３３７、７５２７７９１、６９８２３２１及び７０８７４０９；Kashmiriら、Methods 36:25-34（2005)（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498（1991)（「リサーフェシング」を記述）；Dall’Acquaら、Methods 36:43-60（2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbournら、Methods 36:61-68（2005) 及びKlimkaら、Br. J. Cancer, 83:252-260（2000)（ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【００９０】
ヒト化に用いられてもよいヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Simsら、J. Immunol. 151:2296（1993))；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285（1992);及びPrestaら、J. Immunol., 151:2623（1993)を参照）；  ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633（2008)を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Bacaら、J. Biol. Chem. 272:10678-10684（1997)及び Rosokら、J. Biol. Chem. 271:22611-22618（1996)を参照）を含む。
【００９１】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijkら、Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74（2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459（2008)に記載されている。
【００９２】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製されてもよい。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体に組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125（2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変されてもよい。
【００９３】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001（1984); Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoernerら、J. Immunol., 147: 86（1991)を参照）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006:3557-3562（2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268（2006）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937（2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91（2005)に記載される。
【００９４】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成されてもよい。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【００９５】
５．  ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されてもよい。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37（O’Brienら、ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554; Clacksonら、Nature 352: 624-628（1991); Marksら、J. Mol. Biol. 222: 581-597（1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175（Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuら、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310（2004); Leeら、J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093（2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472（2004); 及びLeeら、J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【００９６】
あるファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winterら、Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455（1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffithsら、EMBO J, 12: 725-734（1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388（1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、２００５／０２６６０００号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、２００７／０２３７７６４号、２００７／０２９２９３６号及び２００９／０００２３６０を含む。
【００９７】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【００９８】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは、ＲＯＮ、好ましくはヒトＲＯＮに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＲＯＮ、好ましくはヒトＲＯＮの２つの異なるエピトープに結合されてよい。二重特異性抗体はまたＲＯＮを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために使用されてよい。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００９９】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537（1983))、国際公開第93/08829号、及びTrauneckerら、EMBO J. 1991: 10（3655)を参照）及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennanら、Science, 229:(81)を参照）、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelnyら、J. Immunol., 148(5):1547-1553（1992)を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448（1993)を参照）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruberら、J. Immunol., 152:5368（1994)を参照）、及び、例えばTuttら、J. Immunol. 147: 60（1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成されてもよい。
【０１００】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１０１】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＲＯＮ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１０２】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが所望されてよい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製されてよい。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１０３】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入されてよく、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０１０４】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１０５】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１０６】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、ある生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成されてもよい。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１０７】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行ってよい。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008)を参照）、及び／又は特異性決定残基で行われてもよく、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboomらのMethods in Molecular Biology 178:1-37（O’Brienら、ed., Human Press, Totowa, NJ,（2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定されてもよい。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１０８】
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生してもよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ中で行ってもよい。そのような改変は、例えば、ＨＶＲ中の残基と接触する抗原の外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の、ある実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１０９】
突然変異誘発のために標的としてよい抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells（1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除されてもよい。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされてもよい。
【０１１０】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１１１】
ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成されてもよい。
【０１１２】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えてもよい。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wrightら、TIBTECH 15:26-32（1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含んでもよい。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われてもよい。
【０１１３】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であってよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置されてもよい。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させてよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、OkazakiらのJ. Mol. Biol. 336:1239-1249（2004); Yamane-OhnukiらのBiotech. Bioeng. 87: 614（2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例
としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545（1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号， Presta, L;及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号，Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614（2004)；Kanda,Y.ら、Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688（2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１１４】
抗体変異体が、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善されてよい。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairettら)；米国特許第６，６０２，６８４号(Umanaら)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umanaら)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善されてよい。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju,S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
【０１１５】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つ又はそれ以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１１６】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ及びＦｃＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492（1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I.ら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063（1986)を参照) 及びHellstrom, Iら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502（1985); US5,821,337（Bruggemann, M.ら、J. Exp. Med. 166:1351-1361（1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）を用いてよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynesら、PNAS USA 95:652-656（1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価されてよい。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行ってよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってよい（例えば、Gazzano-Santoroら、J. Immunol. Methods 202:163（1996); Cragg, M.S.ら、Blood 101:1045-1052（2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743（2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B.ら、Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769（2006)を参照)。
【０１１７】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１１８】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShieldsら、J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604（2001)を参照）。
【０１１９】
ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１２０】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogieらのJ. Immunol. 164: 4178-4184（2000)に説明される。
【０１２１】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体(Guyerら、J. Immunol. 117:587（1976) 及びKimら、J. Immunol. 24:249（1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又はそれ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１２２】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40（1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１２３】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ又はそれ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれてよい。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用されてよい。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換されてよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成されてよい。
【０１２４】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変されてよい。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有ししてよい。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
【０１２５】
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kamら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605（2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないもの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１２６】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造されてよい。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＲＯＮアゴニストをコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしてよい。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ又はそれ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＲＯＮ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１２７】
抗ＲＯＮ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ又はそれ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定されてよい。
【０１２８】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生されてよい。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離されてよく、更に精製することができる。
【０１２９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, 2004, Nat. Biotech. 22:1409-1414、及びLiら,2006, Nat. Biotech. 24:210-215を参照。
【０１３０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用されてよい。
【０１３１】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１３２】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いてよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Ｇｒａｈａｍら、J. Gen Virol. 36:59（1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251（1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMatherら、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68（1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞(Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268（2003)を参照。
【０１３３】
Ｃ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ又はそれ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＲＯＮ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１３４】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinmanら、Cancer Res. 53:3336-3342（1993);及びLodeら、Cancer Res. 58:2925-2928（1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン(Kratzら、Current Med. Chem. 13:477-523（2006); Jeffreyら、Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362（2006); Torgovら、Bioconj. Chem. 16:717-721（2005); Nagyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834（2000); Dubowchikら、Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532（2002); Kingら、J. Med. Chem. 45:4336-4343（2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１３５】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
【０１３６】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性複合体を使用する場合、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１３７】
抗体と細胞傷害性薬物の二重特異性抗体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成されてよい。Vitettaら、Science 238:1098(1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら、Cancer Res. 52:127-131（1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用されてよい。
【０１３８】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ  ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを特に熟考する。
【０１３９】
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＲＯＮ抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＲＯＮの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、腸、結腸、皮膚、神経内分泌組織、発達中の骨、上皮細胞及び常駐腹腔ミクロファージなどの細胞又は組織を含む。
【０１４０】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＲＯＮ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＲＯＮの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＲＯＮ抗体のＲＯＮへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＲＯＮ抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＲＯＮ抗体とＲＯＮとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であってよい。一実施態様において、例えばＲＯＮが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＲＯＮ抗体が抗ＲＯＮ抗体による治療に好適な被験体を選択するために使用される。
【０１４１】
本発明の抗体を用いて診断されてよい例示的な疾患は、限定するものではないが、腫瘍、腫瘍進行及び腫瘍転移を含む。ある実施態様において、標識された抗ＲＯＮ抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０１４２】
Ｅ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＲＯＮ抗体及び／又はＭＳＰ融合タンパク質の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体又は組換えタンパク質と任意の薬学的に許容される担体(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA（1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されて
いる。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又はそれ以上の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１４３】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１４４】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、限定するものではないが、ＴＮＦ阻害薬、メサラジン、ステロイド、メトトレキサート、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、又は、インスリン、インスリンアナログ、メトホルミン、スルホニル尿素、又はグリタゾンなどの抗高血糖薬を含む、抗炎症治療又は抗高血糖治療を更に提供することが所望されてよい。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０１４５】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980)に開示される。
【０１４６】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。
【０１４７】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成されてよい。
【０１４８】
Ｆ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される任意のＲＯＮアドニストを治療方法に使用されてよい。
【０１４９】
一態様では、医薬として使用するためのＲＯＮアゴニストが提供される。更なる態様において、ＭＳＰ関連又はＲＯＮ関連の疾患又は障害の治療に使用するためのＲＯＮアゴニストが提供される。ある実施態様において、疾患又は障害は、ＩＢＤ、糖尿病又は創傷治癒の欠陥である。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ＲＯＮアゴニスト抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、個体に有効量抗のＲＯＮ抗体を投与することを含む、ＩＢＤ、糖尿病又は創傷治癒の欠陥を有する個体を処置する方法において使用するための抗ＲＯＮ抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、上皮創傷治癒の増強に使用するための抗ＲＯＮ抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、上皮創傷治癒を増強するために、個体に抗ＲＯＮ抗体を効果的に投与することを含む、個体における創傷治癒を増強する方法において使用するための抗ＲＯＮ抗体を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１５０】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＲＯＮ抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は、ＩＢＤ、創傷治癒の欠陥、又は糖尿病の治療のためのものである。更なる実施態様において、医薬は、ＩＢＤ、創傷治癒の欠陥又は糖尿病を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む、ＩＢＤ、創傷治癒の欠陥又は糖尿病を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、この方法は少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。非限定的で例示的な更なる治療剤は、ＴＮＦ阻害薬、メサラジン、ステロイド、メトトレキサート、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、又はインスリン、インスリン類似体、メトホルミン、スルホニル尿素、又はグリタゾンなどの抗高血糖症の治療剤を含む。更なる実施態様において、医薬は、創傷治癒、上皮増殖又は遊走を増強する、又は血糖を低下させるためのものである。更なる実施態様において、医薬は、創傷治癒、上皮の増殖又は遊走又は血糖を低下させることを増強するため、有効量の医薬を個体に投与することを含む、創傷治癒、上皮の増殖又は遊走を増強又は個体における血糖を低下させる方法において使用するためのものである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであってよい。
【０１５１】
創傷治癒を測定する様々な方法がある。多くの場合、直線寸法、周囲及び面積を算出するため、画像が撮影されている。イメージＪプログラム（ＮＩＨ）は、画像からの創傷領域の測定を可能にする。最終的な治癒予後は、中心に向かう周辺部の遊走に基づいて、初期治癒率から推定することができる。これは、幾らかの数式を使用して行われ、最も一般的なものは修正されたギルマンの方程式である。治癒が不十分／遅い場合には、創傷縁の生検は、感染及び悪性腫瘍を除外するために行なわれてもよい。
【０１５２】
更なる態様において、本発明は、ＩＢＤ、創傷治癒の欠陥又は糖尿病を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、そうした疾患を有する個体に、抗ＲＯＮ抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであってよい。
【０１５３】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供されるＲＯＮアゴニストの何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されるＲＯＮアゴニストの何れか、及び薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＲＯＮ抗体又はＭＳＰ融合タンパク質の何れかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
【０１５４】
本発明のＲＯＮアゴニストは、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与されてよい。ある実施態様において、更なる治療剤は、ＴＮＦ阻害薬、メサラジン、ステロイド、メトトレキサート、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、又は、インスリン、インスリンアナログ、メトホルミン、スルホニル尿素、又はグリタゾンなどの抗高血糖薬である。
【０１５５】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明のアゴニストの投与が、追加の治療剤（複数も可）の投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。一実施態様において、抗ＲＯＮ抗体の投与、及び追加の治療剤の投与は、約１ヶ月、又は約１、２、３週間、又は約１、２、３、４、５、又は６日を置かずに行なわれる。
【０１５６】
本発明のＲｏｎアゴニスト（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、非経口、局所、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは系統的に又は局所的に投与される。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは局所的に投与される。
【０１５７】
本発明のＲＯＮアゴニストは良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０１５８】
局所投与用の薬学的組成物は、例えば、局所ゲルの形態で、処方されてよい。例えば、ＵＳ５１９２７３４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）を参照。ある実施態様において、組成物は、セルロース誘導体の存在下で製剤化してよい。ある他の実施態様において、局所製剤は、投与前に十分な緩衝液又は希釈剤と凍結乾燥製剤から再構成されてよい。ある実施態様において、ＲＯＮアゴニストは、上皮創傷治癒の欠陥を有する被験体への局所投与のために処方される。ある特定の実施態様において、上皮創傷治癒は、皮膚に起こる。ある他の特定の実施態様において、被験体は、糖尿病を有するヒトである。ある他の実施態様において、創傷治癒を改善するため、内部又は外部の外科的切開後に、本発明のＲＯＮアゴニストを含む局所製剤が使用されてよい。
【０１５９】
疾患の予防又は治療のためには、本発明のアゴニストの適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、アゴニストの種類、疾患の重症度及び経過、アゴニストを予防又は治療目的の何れにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及びアゴニストに対する応答性、及び担当医の判断に依存する。アゴニストは、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、アゴニスト約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されてもよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与されてもよい。初期の高負荷用量の後、１つ又はそれ以上の低用量を投与されてもよい。典型的な投薬レジメンは、投与することを含む。しかしながら、他の用量用法も使用されてもよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０１６０】
上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ＲＯＮ抗体の代わりか又は抗ＭＣＳＰ抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行ってもよいことが理解される。
【０１６１】
Ｇ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ  等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されてよい。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有してもよく（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明のアゴニストを包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含んでいてもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、又は更に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでいてもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでいてもよい。
【０１６２】
上記の製造品の何れかは、抗ＲＯＮ抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
【０１６３】
以下の実施例は、その発明の特定の実施態様、及び様々な用途を例示するものである。これらは、説明の目的のみのために記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６４】
組換えタンパク質のクローニング、発現及び精製
【０１６５】
組換えヒトプロＭＳＰ６８９Ｒ又は６８９Ｃ（Ｃ６７２Ａ）（配列番号２又は４、それぞれ）、ヒトＭＳＰβ６８９Ｒ又は６８９Ｃ（ＨＧＦリーダー、Ｖ４８４−Ｇ７１１；Ｃ５８８Ｓ、Ｃ６７２Ａあり及びなし）（配列番号８及び９）は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグ付きのｐＲＫ発現ベクターにクローニングした。適切に折り畳まれたタンパク質を得るために、Ｃ６７２Ａ変異が予め必要であることが示さた。(Wahlら、1997, J Biol Chem, 272:15053-6)。切断不可能な、一本鎖ｐｒｏ−ＭＳＰ（ｓｃＭＳＰ）の非活性バージョンとしての、ｓｃＭＳＰ（Ｒ４８３Ｅ、Ｃ６７２Ａ）（配列番号６）を作るために、Ｒ４８３Ｅ変異をヒトｐｒｏ−ＭＳＰ切断部位のＰ１位に導入した。全ての変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて作製した。ヒトＭＳＰの天然リーダー配列（又はシグナルペプチド）は、Ｍ１−Ｇ１８である。
【０１６６】
Ｃ６７２Ａ変異（配列番号２）、ヒトＭＳＰβ（ＨＧＦリーダー、Ｖ４８４、Ｇ７１１、Ｃ６７２Ａ、Ｃ５８８Ｓ）（配列番号９）及びマウスＭＳＰ（ＨＧＦリーダー、Ｖ４８９−Ｅ７１６、ＨＧＦリーダーＣ６７７Ａ、Ｃ５９３Ａ）（配列番号１６）、Ｈｉｓ−タグ付きのＣ末端を持つ全てを含むヒト完全長ＭＳＰは、ｐＲＫベクターにクローン化した。コンストラクトを、２週間、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で一時的にに発現させた。分泌タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ又はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５１０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【０１６７】
Ｓｅｍａ、ＰＳＩ及びＩＰＴ１ドメイン（天然リーダー配列＋Ｅ２５−Ｍ６８２）を含む組換えヒトＲＯＮは、ＣＨＯ細胞（配列番号４４）に発現させることにより、ヒトＩｇＧ１（ＲＯＮ−Ｆｃ）の有するＦｃ融合体として作られた。Ronsinら、1993, Oncogene 8(5):1195-202;Gherardiら、2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(21):12039-44;及びLuら、2007, Cancer Lett. 257(2):157-64. Epub 2007 Sep 21を参照。重鎖マウスＩｇＧ２ａ又はヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃ領域からの様々なリンカーの長さにより分離された組換えヒトＭＳＰ（ＨＧＦリーダー、Ｖ４８４−Ｇ７１１、Ｃ６７２Ａ、Ｃ５８８Ｓ）又はマウスＭＳＰ（ＨＧＦリーダー、Ｖ４８９−Ｅ７１６、Ｃ６７７Ａ、Ｃ５９３Ａ）は、ヒトＨＧＦシグナル配列（Ｍ１−Ｇ３１）（配列番号５５）を含有するｐＲＫベクターにクローン化した(Ashkenaziら、1997, Current Opinion in Immunology 9:195-200)。マウスＭＳＰがマウスＲＯＮだけを起動する一方で、ヒトＭＳＰは、ヒト及びマウスの両方のＲＯＮを活性化することができる。
【０１６８】
Ｆｃ受容体に結合する融合タンパク質を除去するために、変異体は、マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ重鎖において、２つの変異（ヒトＩｇＧ１におけるＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ、ｄｕｂｂｅｄ  ＤＡＮＡ）を用いて作った(Shields RLら、2001, J Biol Chem 276: 6591-6604;Gongら、2005, J Immunol. 174(2):817-26)。コンストラクトはｐＲＫベクターにクローン化し、上記のように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。ＭＳＰβ−Ｆｃ融合体はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社社、ピスカタウェイ、ＮＪ）で親和性クロマトグラフィーにより、その後、それらの溶出プロファイルに基づいて、単量体タンパク質を単離するため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で精製し、４℃で保存した。ＲＯＮ−Ｆｃは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で、親和性クロマトグラフィーにより、その後、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ）により精製した。
【０１６９】
Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む、組換えヒトＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩ（天然リーダー配列＋残基Ｅ２５−Ｐ５６８）を、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、組換えバキュロウイルスを生成するためのミツバチメリチン分泌シグナルを含む、Ｇａｔｅｗａｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中にクローニングした。イラクサギンウワバの昆虫細胞（１ｍｌあたり１×１０６細胞）をＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ）において多重感染度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）３で組換えバキュロウイルスを感染させた。７２時間のインキュベーション後、ＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩは、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、−２０℃でＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に保存した。
【０１７０】
ヒトＩｇＧ１の重鎖（ｍＲＯＮ−ｈＦｃ）（配列番号５０）のＣ末端Ｆｃ領域、又はＨｉｓタグ（ｍＲＯＮ−Ｈｉｓ）（配列番号５２）を含む、組換えマウスＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩ／ＩＰＴ１（天然リーダー配列＋Ｒ３３−Ｖ６８４）は、ＣＨＯ細胞中で発現させた。ｍＲＯＮ−Ｈｉｓは、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、−２０℃でＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に保存した。Ｆｃ融合タンパク質は、上述のように精製した。
【０１７１】
Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ｓＨｅｐｓｉｎ）（配列番号５４）を保有するヒト組換えヘプシンの細胞外ドメインを発現させ、Moranら、2006, J Biol Chem,(281: 30439-46)で説明したように精製した。抗体ファージディスプレイを使用して、ヘプシンの酵素活性を阻害する抗体２５（Ｆａｂ２５）を生成し、その後、大腸菌で発現させ、前述のように精製した(Ganesanら、2012, Protein Eng Des Sel 25:127-33)。
【０１７２】
本明細書に記載の全てのコンストラクトは、以下の表２に要約した。
【０１７３】
2016507480.tif 000003
2016507480.tif 000004
2016507480.tif 000005
2016507480.tif 000006
【０１７４】
細胞の単離、分化及び培養
【０１７５】
細胞株は、標準的なプロトコルに従って培養した。３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）で高グルコースＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で培養した。ヒト初代結腸細胞（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）は、結腸の細胞培養培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）で維持した。親３Ｔ３及びＡ２７８０細胞を、それぞれ３Ｔ３−mＲＯＮ及びＡ２７８０−mＲＯＮ細胞を生成するために(Chaudhuriら, 2011, J Biol Chem 286:32762-74)、安定的にマウスＲＯＮをトランスフェクトし、その培地に４００／ｍｌのＧ４１８を添加した。安定的にＭＳＰでトランスフェクトされた細胞株は、製造業者の説明書に従い、Ｆｌｐ−Ｉｎ系システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して作製した。位置６７２での野生型残基を有する組換えヒトプロＭＳＰ６８９Ｒ又は６８９Ｃ（Ｑ１９−Ｇ７１１）はｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）へクローン化し、２９３Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクトされた細胞を１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加した培地中に播種し、３週間後に、Ｚｅｏｃｉｎ耐性コロニーをクローニングディスク（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で採取した。ハイグロマイシン感受性及びゼオシン耐性を確認するために、クローンを再プレーティングした。
【０１７６】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて密度勾配遠心分離により血液から単離した。単球は、単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＰＢＭＣから精製した。ヒト単球由来マクロファージは、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ中で、１週間のＣＤ１４＋単球のインキュベーションによって得られた。マクロファージは、ＲＰＭＩ＋５％のＦＢＳにおいて、１８時間にわたり、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４で処理した。
【０１７７】
マウス骨髄由来マクロファージは、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び３０％のＬ９２９細胞からの馴化培地において、未分画の骨髄細胞をインキュベートすることによって得た。新鮮な増殖培地は、培養の３日目に追加し、付着マクロファージを７日目に採取した。細胞は、この時点で均一にＦ４／８０及びＣＤ１１ｂ陽性であった。
【０１７８】
腹腔滲出細胞は、定常状態の条件下で、又は、ＲＰＭＩ９ｍｌの腹腔洗浄による３％チオグリコレートの１ｍｌでの腹腔内注射４日後、マウスから採取した。細胞を、ＲＰＭＩで一度洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。肝臓単核細胞は、いくつかの変更を加えたが、(Egenら、2008, Immunity 28:271-84)の記載のように得られた。簡潔に述べると、ＲＰＭＩ＋０．２ｍｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）からなる３ｍｌの消化緩衝液で、門脈を介して肝臓を灌流した。肝臓を摘出し、さらに３７℃で、４０分間消化緩衝液中でインキュベートした。繰り返しピペッティングすることによる手作業での破壊（ｍａｎｕａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の後、肝細胞懸濁液を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で洗浄し、３５％パーコール中で再懸濁し、２０分間、８００×ｇで遠心分離して、細胞ペレットを収集した。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ社）で溶解し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。マウス結腸の単一細胞懸濁液については、結腸を動物から取り出し、ＨＢＳＳで洗浄し、２ｃｍの片に切断し、ＥＤＴＡ及びＤＴＴを含むＨＢＳＳ中で、一定に振とうしながら、３７℃で１５分間、インキュベートした。このインキュベーション時間は、上皮細胞の損失を避けるために短くした。組織は、ＲＰＭＩで２回洗浄し、ミンチし、ＲＰＭＩ＋０．２ｍｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉで、絶え間なく振盪しながら、３７℃で２０分間インキュベートした。単核細胞及び上皮細胞の両方を含む懸濁液は、１００μｍ及び７０μｍのフィルターを通して濾過し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０１７９】
ヒト腸切除サンプルは、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）との連携により、結腸癌患者１例、潰瘍性大腸炎患者２例、クローン病患者３例から得られた。一致した血清、ＤＮＡ、及び腸生検ＲＮＡサンプルはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社が主催するＩＢＤにおける多施設ＥＭＢＡＲＫ観察臨床試験の一部として収集した。インフォームドコンセントは、全てのヒト被験体から得られた。
【０１８０】
粘膜固有層及び上皮を含む組織の約３グラムを残して、漿膜、ラミナ筋、及び粘膜下組織を切開することにより、切除した腸組織の単一細胞懸濁液を調製した。これを、５ｍＭのＤＴＴで５０ｍｌのＨＢＳＳで、オービタルシェーカー上で、３０℃で１５分間、その後、１ｍＭのＥＤＴＡで５０ｍｌのＨＢＳＳ中でインキュベートした。組織を５０ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で２回洗浄し、０．５ｃｍ片にミンチし、５０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍｌのｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＶＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉにおいて、オービタルシェーカー上で３７℃にて、２０分消化した。消化された組織は、７０μｍポアフィルターを通して濾過し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）に再懸濁した。白血球の精製のため、細胞を７ｍｌ中に再懸濁し、ペレット化した等張性の３５％パーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を、６ｍｌの等張６０％パーコールでアンダーレイし、４℃で、２０００ＲＰＭで、２０分間遠心分離した。パーコール界面の細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。
【０１８１】
マウス
【０１８２】
Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｃ５７Ｂｌ／６リコンビナーゼ活性化遺伝子（ＲＡＧ）−２欠損、及びｄｂ／ｄｂマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から入手した。ＲＯＮ．ｋｏマウス（Ｗａｌｔｚら、２００１，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８（４）：５６７−７６に記載）は、遺伝子ターゲティングを介して除去されたＲＯＮのチロシンキナーゼドメインを欠いている。全ての動物実験は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社の施設内動物管理使用委員会によって承認された
【０１８３】
フローサイトメトリー
【０１８４】
マウス細胞は、Ｆ４／８０（クローンＢＭ８）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、ＭＨＣクラスＩＩ（クローンＭ５／１１４．１５．２）、及びマウスＲＯＮ（クローンＰＨ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）又はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）の何れか、に対する蛍光色素標識抗体で染色した。ヒト細胞は、ＣＤ１４（クローン６１Ｄ３）、ＣＤ１６（クローン３Ｇ８）、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０）ＥｐＣＡＭ（クローンＶＵ１Ｄ９）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＬＮ３）、及びヒトＲＯＮ（クローン１Ａ２．２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）又はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）の何れか、に対する蛍光色素標識抗体で染色した。指定されない限り、他の全ての抗体はＡｂｃａｍ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。エクスビボで分析したマウス及びヒト細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ａｑｕａ又はＶｉｏｌｅｔ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色した。細胞は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。生細胞は、大きさ及び生存率染色に基づいて同定され、ＲＯＮの発現は、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  を使用して、細胞の示された集団にゲーティングすることによって決定した（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）。
【０１８５】
ＭＳＰ結合アッセイ
【０１８６】
ａ．  プレートに固定化されたＲＯＮに結合するＭＳＰ
【０１８７】
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）は、２μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６で４℃にて一晩コーティングした。アッセイ緩衝液（ｐＨ７．２で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした後、アッセイ緩衝液中１μｇ／ｍｌのＲＯＮ−Ｆｃ融合タンパク質を添加し、プレートを穏やかに室温で振とうしながら１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、ＭＳＰ（１０００ｎＭ−０．２ｐＭ、２倍希釈系列）を１時間にわたって添加した。結合したＭＳＰは抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して検出し、その後、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した。反応を１ＭのＨ３ＰＯ４で停止し、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ）で測定した。ＭＳＰの５０％  効果濃度（ＥＣ５０）は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、４パラメーターフィットにより決定した。
【０１８８】
ｂ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ＲＯＮに結合するＭＳＰの動力学的測定
【０１８９】
ＭＳＰ−β−Ｆｃ融合タンパク質へのＲＯＮ及びＲＯＮ−Ｆｃ融合体へのＭＳＰタンパク質の結合動態を、ｒｅｓｅａｒｃｈ−ｇｒａｄｅのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００光バイオセンサーを使用して決定した。アミンカップリング試薬、Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）及びナトリウムエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ８．５を、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社から得た。標準的なカップリングプロトコルは、バイオセンサー表面上へウサギ抗ヒトＩｇＧ１又はウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をつなぐために使用された。結合されないタンパク質でアミンカップリングの手順で行われるバイオセンサーチップが、非特異的結合を補正するために使用された。ＭＳＰ−Ｆｃ融合体へのＲＯＮ結合親和性を決定するため、５０から１００の間の応答単位（ＲＵ）のＭＳＰ−Ｆｃを、３つの固定化された抗Ｆｃ表面のそれぞれに捕捉した。様々な濃度（５００から３．９ｎＭ、２倍希釈系列）のＲＯＮ−Ｈｉｓを、３０μＬ／分の流量で２５℃にてＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０）中に注入し、解離は２４０秒間モニターした。測定の間、バイオセンサー表面は、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの１２０秒パルスで再生させ、続いて、１２０秒、ランニング緩衝液で洗浄した。
【０１９０】
ｈＲＯＮ−Ｆｃ又はｍＲＯＮ−Ｆｃ融合タンパク質へのＭＳＰタンパク質結合反応速度を決定するために、５０から１００の間の応答単位（ＲＵ）が、３つの固定化した抗ヒトＦｃ表面のそれぞれに捕捉された。様々な濃度（５０から０．７８ｎＭ、２倍希釈系列）のＭＳＰ、ＭＳＰ、ＭＳＰ又はｓｃＭＳＰを、３０μＬ／分の流量で２５℃にて、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０）中に注入し、解離は４分間モニターした。測定の間、バイオセンサーの表面は、１０ｍＭのｐＨ１．５のグリシン−ＨＣｌの２分のパルスで再生させた。
【０１９１】
各データセットは、動力学的パラメーターのｋｏｎ及びｋｏｆｆを決定するために、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に全体的に適合させた。平衡解離定数（ＫＤ）は、これらの速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出した。
【０１９２】
ｃ．表面プラズモン共鳴による、ＲＯＮに結合するＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａの動態計測
【０１９３】
ＢＩＡｃｏｒｅ−３０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用した。簡潔に述べると、ＣＭ５バイオセンサーチップは、サプライヤーの（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）試薬で活性化し、各フローセル上で約１００００応答単位（ＲＵ）を達成するために、ヒト抗体捕捉キットはヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧを結合するのに適用され、その後、１Ｍのエタノールアミンで未反応基をブロックした。
【０１９４】
動態測定のために、ｍＲＯＮ−Ｆｃ（カタログ番号＃４３１−ＭＳ、ヒトＩｇＧ１に融合したｍＲＯＮ細胞外ドメイン、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社）抗原は、約２５０ＲＵを達成するために捕捉され、その後、抗ｍＲＯＮ  Ｆａｂの２倍連続希釈（０．４９ｎＭから２５０ｎｍ）を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）中に、２５℃にて３０ｌ／分の流量で注入した。m会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は単純な一対一のラングミュア結合モデルを使用して計算した（ＢＩＡｃｏｒｅ評価用ソフトウェアのバージョン  ３．２）。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。
【０１９５】
ｄ．ＲＯＮに結合するＭＳＰのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による動態測定
【０１９６】
ＲＯＮに結合するＭＳＰのリアルタイム動態測定は、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用して行った。サンプル又は緩衝液は、ウェルあたり２００μｌの量で、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ社）に分注した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサーは実験に使用した。各実験は、以下の３つの工程からなる：平衡状態を確立するために、ＰＢＳアッセイ緩衝液中で１：１０に希釈したＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  緩衝液での１２０秒（ベースライン）のインキュベーション、結合標的でバイオセンサーをコートするための、アッセイ緩衝液中での１０μｇ／ｍｌのＲＯＮ−Ｆｃでの９００秒（負荷）のインキュベーション、種々の濃度（７５から４．７ｎＭで、２倍希釈系列）を含むアッセイ緩衝液中のＭＳＰ、ＭＳＰ又はｓｃＭＳＰでの４００秒（会合）のインキュベーション、及びＭＳＰの解離速度を測定するためのアッセイ緩衝液での４００秒（解離）のインキュベーション。動作温度は３０℃に維持した。データは、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ７．０ソフトウェアによって自動的に作成された。各データセットは、動態パラメーターのＫＡ及びＫＤを決定するため、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０を使用して、単純１対１結合モデルに全体的に適合させた。平衡解離定数（ＫＤ）は、これらの速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出した。
【０１９７】
ｅ．放射性リガンド結合アッセイによる、ＲＯＮに結合するＭＳＰの平衡測定
【０１９８】
ＭＳＰタンパク質は、ヨードゲン法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してヨウ素化し、ＮＡＰ−５カラムを使用したゲル濾過により遊離Ｎａ１２５Ｉから精製した。特異的活性の範囲は、１２．２６から１８．６５μＣｉ／ｇであった。競合反応混合物は、固定濃度のヨード化ＭＳＰ、及び５０μＬの用量中で５μＭから開始し、連続的に１０回、１〜２倍に希釈した非標識ＭＳＰで作られた。３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞は、１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ、３２５ｎＭのヒトＩｇＧ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）及び０．１％のアジ化ナトリウムからなる結合緩衝液で洗浄した。０．２ｍｌの結合緩衝液中の１５０，０００の細胞は、競合反応混合物に添加された。細胞との競合反応物を室温で２時間インキュベートし、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し、結合緩衝液で４回洗浄した。フィルターは、Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で計数した。結合親和性は、ＮｅｗＬｉｇａｎｄソフトウェアを使用して決定した（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）（マンソンら、１９８０，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０７：２２０−３９）。
【０１９９】
Ａｋｔリン酸化のウェスタンブロッティング
【０２００】
Ａ２７８０−ｈＲＯＮ及びＢｘＰＣ３細胞を、０．５％のＢＳＡを含む培地で一晩増殖させた。細胞を、３７℃で２０分間、１００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰ６８９Ｒ、ＭＳＰ６８９Ｃ又は何もなしで処理した。サンプルを氷冷ＰＢＳで２回細胞単層を洗浄することにより調製し、続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって定量化した。タンパク質（２０μｇ）、４％−２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でブロックし、室温で１時間インキュベートした。Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、及びホスホ−Ａｋｔモノクローナル抗体、Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で４℃で、膜を一晩プローブした。洗浄後、膜をＩＲＤｙｅ（商標）８００結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、リン酸化及び全体のキナーゼの発現量を検出した。
【０２０１】
ｍＲＯＮ発現３Ｔ３細胞におけるｍＲＯＮのＭＳＰβ−Ｆｃの活性化のため、タンパク質溶解物の上清１０−５０ｕｇは、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、製造業者の説明書に従って、テトラ細胞において、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移した。抗リン酸化Ａｋｔ抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｄ９Ｅ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）又はポリクローナル抗酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、続いて、製造業者の指示に従って、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体で、ブロットをプローブした。タンパク質バンドをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で膜をインキュベートすることによって可視化し、フィルムに露光した。
【０２０２】
固定組織切片の免疫蛍光及び免疫組織化学
【０２０３】
免疫蛍光染色のために、マウスの結腸を切除し、ＰＢＳで十分に洗浄し、及びＰＬＰ緩衝液（０．１ＭのＬ−リシン［ｐＨ７．４］、２ｍｇ／ｍｌのＮａＩＯ４、及び１０ｍｇ／ｍｌのパラホルムアルデヒドを含む０．０５Ｍのリン酸緩衝液）中で一晩固定し、続いて、３０％のスクロース中で脱水し、ＯＣＴ凍結包埋剤（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社）で包埋した。切片を１２μｍの厚さでＣＭ３０５０Ｓｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の上で切断し、ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓスライド（ＶＷＲ）に付着させた。切片を１０％のロバ血清中で（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ブロックし、以下の一次抗体を使用して染色した。Ｆ４／８０−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（ｃｌｏｎｅ  ＢＭ８，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ＦＩＴＣ（ｃｌｏｎｅ  Ｍ５／１１４．１５．２，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及びヤギ抗マウスＲＯＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）。ヤギ抗体を、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて可視化した。核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で対比染色し、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でマウントした。画像はライカＳＰＥ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して得た。
【０２０４】
マウスの皮膚を切除し、ＰＬＰ緩衝液（０．１ＭのＬ−リシン［ｐＨ７．４］、２ｍｇ／ｍｌのＮａＩＯ４、及び１０ｍｇ／ｍｌのパラホルムアルデヒドを含む０．０５Ｍのリン酸緩衝液）中で一晩固定し、続いて、３０％スクロース中で脱水し、ＯＣＴ凍結包埋剤（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社）で包埋した。厚さ１２μｍの切片をＣＭ３０５０Ｓクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ社）に付着させた。０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含む、１０％のロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で、切片をブロックし、以下の一次抗体を使用して染色した。Ｆ４／８０−ＦＩＴＣ（ｃｌｏｎｅ  ＢＭ８，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ｃｌｏｎｅ  ＤＥＣＭＡ−１，  ｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ヤギ抗マウスＲＯＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）。ヤギ抗体を、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて可視化した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で対比染色し、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でマウントした。画像は、ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ社）を使用して得た。
【０２０５】
ヒト組織における免疫組織化学のため、４μｍ切片をホルマリン固定し、パラフィン包埋した腸管組織から切断した。染色は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。調整済み試薬であるＶｅｎｔａｎａを使用して、脱パラフィン、内因性ペルオキシダーゼブロッキング及びＣＣ１  ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌを使用した前処理を行った。ヤギポリクローナル抗ヒトＲＯＮ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、切片を３７℃で３２分間インキュベートした。切片は、その後、非抱合型のウサギ抗ヤギ二次リンカー抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）で、続いて、抗ウサギＯＭＮＩＭＡＰ−ＨＲＰキット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ比色試薬（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）対比染色し、脱水、洗浄し、観察のためマウントした。
【０２０６】
マウス組織に対する免疫組織化学のために、４μｍ切片をホルマリン固定し、パラフィン包埋腸組織から切断した。切片を、キシレン中で脱パラフィンし、一連の等級のアルコールを通して再水和した。その後、切片をＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液（ＤＡＫＯ社）を使用して、抗原賦活のために前処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性については、ＫＰＬブロッキング溶液（ＫＰＬ社）を使用して、アビジン／ビオチンに対しては、アビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）を使用して、且つ、ＩｇＧ結合については、ＴＮＢブロッキング緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）で、切片をブロックした。切片を２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＲＯＮヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をビオチン化ロバ抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、続いて、ＡＢＣ−ＨＲＰエリート試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）とインキュベートした。金属増強ＤＡＢ比色ペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、発色現像を達成した。その後、切片をマイヤーのヘマトキシリン（Ｒｏｗｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で対比染色し、脱水し、キシレンで洗浄して、観察するためにマウントした。
【０２０７】
定量的ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ
【０２０８】
ＥＭＢＡＲＫコホートメンバーのｒｓ３１９７９９９の遺伝子型を決定するために、１０ｎｇのゲノムＤＮＡをＴａｑｍａｎＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に使用した。ＭＳＰの発現カセットの量を比較するために、安定的にトランスフェクトされた２９３Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞において、ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離し、５０ｎｇのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて分析した。ＭＳＰ発現カセットのＤＮＡに特異的なプライマー、５’−ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号５６）、５’−ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号５７）、及びＴａｑＭａｎプローブ５’−ＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴ−３’（配列番号５８）を用いた。ＭＳＰのＤＮＡ量をΔＣＴ法を用いたＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量化し、ＧＡＰＤＨ  ＤＮＡに対して正規化した。上皮細胞株及び骨髄細胞中のＲＯＮのｍＲＮＡ発現の分析のため、全ＲＮＡをｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ  ＤＮａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）を備えたＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて単離した。８０ｎｇのＲＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて分析し、ＲＯＮの発現はΔＣＴ法を使用して、ＲＰＬ１９発現に対して正規化した。ＲＯＮの増幅のために、プライマー５’−ＡＧＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号５９）、５’−ＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号６０）、及びＴａｑＭａｎプローブ５’ＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号６１）を用いた。ＲＰＬ１９の増幅のために、プライマー５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６２）、５’−ＧＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＧＣＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６３）、及びＴａｑＭａｎプローブは、５’−ＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号６４）を用いた。反応は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム上で実行され、７５００Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて分析した。
【０２０９】
腸の生検におけるｍＲＮＡ発現の分析のために、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）及びＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して単離したＲＮＡを使用して、組織サンプルを３ｍｍでホモジナイズした。ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。反応は、ヒトＲＯＮプライマーセットＨｓ００８９９９２５＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＧＡＰＤＨプライマーセットＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社）で実行された。ＲＯＮの発現は、ΔΔＣＴ法を使用して、ＧＡＰＤＨ及び基準ヒトＲＮＡサンプルに対して正規化した。
【０２１０】
ＭＳＰについてのＥＬＩＳＡアッセイ
【０２１１】
ヒト血清のアッセイのため、ｐＨ９．６の０．０５Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において、１μｇ／ｍｌの抗ｈＭＳＰα抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）でＭａｘｉＳｏｒｐプレートを４℃で一晩コーティングし、次に（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎｐＨ７．４）でブロッキング緩衝液中、室温で１時間インキュベートした。サンプルは、アッセイ希釈液（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ）で希釈し、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００ｎｇ／ｍｌまでアッセイ希釈液中で希釈し、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＡＭＤＥＸストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を、５０ｎｇ／ｍｌまでアッセイ希釈液中で希釈し、プレートに添加し、及び室温で３０分間インキュベートした。結合は、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質（ＫＰＬ社）での１５分間のインキュベーション、１ＭのＨ３ＰＯ４の添加、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度の測定により読み取った。ＭＳＰ濃度は、２から０．００８２ｎｇ／ｍｌまで、２〜５倍刻みで滴定した、ＭＳＰ６８９Ｒ、ＭＳＰ６８９Ｃ、ｓｃＭＳＰ６８９Ｒ、及びｓｃＭＳＰ６８９Ｃの標準曲線と比較することによって算出した。
【０２１２】
ｐｒｏ−ＭＳＰで安定的にトランスフェクトされた細胞からの上清をアッセイするために、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの抗ｈＭＳＰα抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で、Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＥＬＩＳＡプレート（ＢＤＦａｌｃｏｎ社）に４℃で一晩コーティングし、その後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中、室温で１時間インキュベートした。サンプルをＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で希釈し、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  緩衝液で  １μｇ／ｍｌまで希釈し、プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジンＨＲＰ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社）をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で、１：１０，０００に希釈し、プレートに添加し、室温で２０分間インキュベートした。結合は、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）での１５分間のインキュベーション、１ＭのＨ３ＰＯ４の添加、Ａ４５０の測定により読み取った。細胞量の差を照らし合わせるために、相対細胞密度をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏの添加、及びＧｌｏｍａｘ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）での発光の測定によって定量化した。ＥＬＩＳＡの結果は、細胞密度を照らし合わすため、発光により分けられた。
【０２１３】
３Ｔ３及び３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞における、ＭＳＰα−ＩｇＧ２ａのアゴニストによるＲＯＮアゴニズム及び抗ＲＯＮアゴニスト抗体
【０２１４】
３Ｔ３又は３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞を、０．５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭにおける播種し、一晩付着させた。次の日、培地を除去し、細胞を、培地のみ、抗ブタクサＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、ＭＳＰ、ｈ１６ｍ、ｍ１６ｍ、Ｍ４Ｍ、ｍ８ｍ、ｍ１２ｍ、又はｍ１６ｍ  ＭＳＰ−ＩｇＧ２ａのアゴニスト（１５ｎＭから１ｐＭまで、培地中に５倍希釈系列）、ＲＯＮアゴニスト抗体２Ｅ５．８．１又はＹＷ６５１．１（１５ｎＭから１ｐＭまで、培地中に５倍希釈系列）で、３７℃で３０分間処理した。細胞を、ＭＳＤ溶解緩衝液中で１５分間氷の上で溶解した。Ａｋｔリン酸化の検出のために、製造業者の説明書に従ってインキュベートし、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で読み取ったＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ９６−Ｗｅｌｌ  ４−Ｓｐｏｔ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｓｅｒ４７３）／全Ａｋｔプレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）に溶解物を添加した。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を使用して算出した。
【０２１５】
マウス結腸及び皮膚におけるＭＳＰ−ＩｇＧ２ａ及びＲＯＮ抗体アゴニスト活性のインビボ分析
【０２１６】
b結腸溶解物中のＡｋｔリン酸化を測定するため、群当たり５匹のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／ｋｇのｍ１２ｍ  ＭＳＰ−ＩｇＧ２ａアゴニスト、ＲＯＮアゴニスト抗体２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａ、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ  、又は１００μｌの容量のＰＢＳで希釈した同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を静脈内接種した。１時間後、結腸をマウスから採取し、冷たいＰＢＳで洗浄し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｍチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用して、５００μｌのＭＳＤ溶解緩衝液中でホモジナイズした。Ａｋｔリン酸化の検出のために、上清をウェスタンブロット分析によってアッセイするか、又は製造業者の説明書に従ってインキュベートし、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）に読み込ませた、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ９６−Ｗｅｌｌ  ４−Ｓｐｏｔ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｓｅｒ４７３）／Ｔｏｔａｌ  Ａｋｔプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）に添加した。皮膚の溶解物中のＡｋｔリン酸化を測定するために、０日目、メスのｄｂ／ｄｂマウスにイソフルランで麻酔し、背中の背側部分（肩甲骨から腰部の範囲）を剃毛し、体毛をＮａｉｒで除去し、滅菌水、アルコール、ベタジンで洗浄し、アルコール洗浄を繰り返した。正中線の左側１ｃｍと右側１ｃｍの２か所に直径６ｍｍの全層皮膚創傷を作るために、動物を腹側横臥状態に置いて、６ｍｍパンチ装置を使用した。厚さ０．５ｍｍ、内径１０〜１２ｍｍのシリコンフレームを、瞬間接着剤によって所定の位置に保持して、各創傷の周囲に配置した。２ｃｍ平方のＴｅｇａｄｅｒｍ又はＯＰ−ｓｉｔｅを創傷及びフレームの上に配置した。４日目、マウスに５ｍｇ／ｋｇのＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ、又は、１００μｌの体積のＰＢＳで希釈した同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を腹腔内接種した。１時間後、創傷の周りの２ｍｍの円形状の皮膚片及び非創傷領域からの６ｍｍ皮膚片ををＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｍチューブを使用して回収し、３００μｌのＭＳＤ溶解緩衝液中でホモジナイズした。
【０２１７】
切片結腸組織におけるＡｋｔのリン酸化を測定するために、群ごとに４匹のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに５ｍｇ／ｋｇの  ｍ１２ｍ  ＭＳＰ−ＩｇＧ２ａのアゴニスト、又は１００μｌの容量のＰＢＳで希釈した同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を静脈内接種した。免疫組織化学は、切断したばかりの厚さ４μｍのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織切片をスライドガラス上にマウントして行った。スライドをキシレン中で脱パラフィンし、等級に分けられたアルコール（ｇｒａｄｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）を通して蒸留水に再水和化した。スライドを９９℃で２０分間、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液（Ｄａｋｏ社）で前処理し、２０分間冷却した。次いで、スライドをそれぞれ、（ＫＰＬブロッキング溶液Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＭＤ、ＵＳＡ）及びアビジン／ビオチンブロック（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で処理した。非特異的ＩｇＧ結合は、３％のＢＳＡ中、１０％正常ヤギ血清からなる血清をブロッキングしながら室温で３０分間ブロックした。一次抗体、抗ｐＡｋｔのクローンＤ９Ｅ（ウサギモノクローナル、＃４０６０Ｌ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、室温で６０分間、血清をブロッキングしながら、０．３７５ｕｇ／ｍｌで、スライド上でインキュベートした。スライドを洗浄し、室温で３０分間、７．５μｇの／ｍｌのヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）でインキュベートし、続いて、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中でインキュベートした。次いで、スライドをＰｉｅｒｃｅ金属増強ＤＡＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でインキュベートした。続いて、スライドを対比染色し、脱水し、カバースリップで覆った。
【０２１８】
インビトロ創傷治癒アッセイ
【０２１９】
０．５％のＢＣＳを含むＤＭＥＭ中で親３Ｔ３又は３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞を懸濁し、コラーゲンコートした９６ウェルプレートで播種した。翌日、ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ９６（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、各ウェル中でスクラッチ創傷が作られた。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、培地のみ、又は、１５ｎＭＭＳＰ６８９Ｒ、ＭＳＰ６８９Ｃ、ｓｃＭＳＰ、抗ブタクサＩｇＧ２ａ（０．６ｎＭ、０．１２ｎＭ、又は３ｎＭ）、ＭＳＰ（３ｎＭ）、ＲＯＮアゴニスト抗体２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａ（０．６ｎＭ又は０．１２ｎＭ）、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ（０．６ｎＭ又は０．１２ｎＭ）、又は対照として何も添加しないもの、を含む培地をウェルに添加した。細胞を、数時間ごとに画像化しながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、３２時間インキュベートした。ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアパッケージ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、創傷内の細胞密度を、創傷の外側の密度と比較して算出した。画像は、ＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所）を使用してガウスフィルタ、コントラスト強調、及びシャドーイングで分析後に均一に処理した。Abramoffら、2004, Biophotonics International 11:36-42も参照。
【０２２０】
インビボ創傷治癒アッセイ及び糖尿病マウスにおけるグルコース測定
【０２２１】
０日目、メスのｄｂ／ｄｂマウスにイソフルランで麻酔し、背中の背側部分（肩甲骨から腰部の範囲）を剃毛し、体毛をＮａｉｒで除去し、滅菌水、アルコール、ベタジンで洗浄し、アルコール洗浄を繰り返した。正中線の左側１ｃｍと右側１ｃｍの２か所に直径６ｍｍの全層皮膚創傷を作るために、動物を腹側横臥状態に置いて、６ｍｍパンチ装置を使用した。内径１０〜１２ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのシリコンフレームを、瞬間接着剤によって適所に保持されたフレームで各創傷の周囲に配置した。２ｃｍ四方のテガダーム又はＯｐ−ｓｉｔｅを創傷及びフレームの上に配置した。群あたり６匹の動物は、４日目から開始して４日ごとに、１００μｇの抗ブタクサＩｇＧ２ａ又はＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１を腹腔内に接種した。４日ごとに、各創傷の水平方向及び垂直方向の大きさはデジタルキャリパーを使用して測定し、平均値を測定した。創傷は、Ｎｉｋｏｎ  Ｄ２００デジタルカメラで撮影した。４日ごとに、２ｕｌの血液を、テールニック（ｔａｉｌ  ｎｉｃｋ）を介して採取し、血糖は、Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒで測定した。
【０２２２】
実施例１  ＲＯＮは、主に腸及び皮膚における上皮細胞によって発現される
ＭＳＰ６８９Ｃの多型は、マクロファージ活性のＲＯＮ媒介性阻害に干渉することによりＩＢＤのリスクを増加させることが仮定されている（例えば、Goyetteら、2008, Mucosal Immunol 1:131-8, Gorlatovaら、2011, PLoS One 6:e27269を参照）。しかしながら、マクロファージ上のＲＯＮの発現及び阻害活性が実証されているが（例えば、Chenら、1998、J Immunol161:4950-9を参照）、これらの報告は、主に、ＩＢＤに限定された関連性を有していてもよいマウス腹腔マクロファージ集団を利用した研究に依存してきた。このように、６８９Ｃ多型から生じるＭＳＰ活性の変化の影響を受けやすい細胞型を同定するために、定常状態及び炎症性の両方の条件下で、マウス及びヒトの様々な細胞型においてＲＯＮの発現を特徴づけた。
【０２２３】
マウスでのＲＯＮの発現パターンは、最初にフローサイトメトリーを使用して検討した。従来の報告（例えば、Iwamaら、Blood1995、86:3394-403）と一致して、常駐及びチオグリコレート刺激腹腔マクロファージは、ＲＯＮ受容体を高レベルで発現した。より低いレベルのＲＯＮが、肝クッパー細胞及びインビトロで培養された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭＳ）（図１Ａ）を含めた、他のマウスマクロファージ集団で発見された。解離結腸組織から単離された細胞上のＲＯＮの発現も検討した。粘膜固有層のマクロファージ集団でＲＯＮにのみ弱い染色が認められたが、比較的高い染色は、結腸上皮細胞で認められた（図１Ａ）。更に、腸管及び皮膚組織でのＲＯＮの発現パターンを定義するために、マウス結腸からの組織切片で免疫組織化学（ＩＨＣ）染色、及びマウス結腸及び皮膚からの組織切片で免疫蛍光（ＩＦ）染色を行った。腸管上皮の強いＲＯＮ染色は、個々の上皮細胞（図１Ｂ及びＣ）の側底面に局在することが検出された。皮膚上で強いＲＯＮ染色は、上皮細胞（図１Ｅ）に局在する。フローサイトメトリー分析と一致して、粘膜固有層におけるＲＯＮ染色は弱く、バックグラウンド上で区別することができなかった。注目すべきことに、結腸上皮及び粘膜固有層細胞上のＲＯＮの相対的発現は、炎症の条件下で変化しなかった。大腸炎を誘導するため、６日間の飲料水中に３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を提供されたマウスから採取した結腸は、上皮のＲＯＮ発現が顕著であることを示し、マクロファージマーカーとの共染色は、この細胞型（図１Ｄ）によって検出可能な発現を明らかにすることができなかった。
【０２２４】
腸管マクロファージではないが、腸上皮細胞によるマウスＲＯＮの強い発現を考えると、腸の炎症のコンテキスト内でマクロファージ活性の調節におけるＲＯＮの役割を再検討した。ヒト及びＩＢＤにこれらの知見を拡張するため、異なるヒト細胞型及び組織にわたるＲＯＮ発現が特徴づけられた。プライマリＣＤ１４＋単球、単球由来のマクロファージ（ＭＤＭＳ）、及び単球細胞株を含んだヒト骨髄性細胞集団と比較して、実質的に高いレベルのＲＯＮ転写物が、複数のヒト上皮細胞株で検出された（図２Ａ）。インターフェロンγ、ＬＰＳ、又はＩＬ４などの様々な刺激とＭＤＭ培養物の処理は、ＲＯＮの実質的なアップレギュレーションを誘導することはできなかった（図２Ａ）。これらのデータは、単球／マクロファージ集団ではないが、上皮細胞の表面上のＲＯＮタンパク質の発現を示す、フローサイトメトリー分析と一致している（図２Ｂ）。
【０２２５】
上記のデータは、ＲＯＮがヒト単球／マクロファージの集団における定常状態の条件下で発現しないことを示唆しているが、これらの発現パターンは、ＩＢＤの設定で変更し得る。健常者、潰瘍性大腸炎患者、及びクローン病の組織におけるＲＯＮ発現のＩＨＣ分析は、マウスで認められたものと同様に、上皮細胞に顕著な局在を実証した。（図２Ｃ、１１例の潰瘍性大腸炎患者からの組織切片からの代表的な画像、９例のクローン病患者及び８例の健常者）しかしながら、追加の細胞型でバックグラウンド染色又はＲＯＮ発現を表し得るこれらの切片で、いくつかの粘膜固有層染色も観察された。注目すべきことに、ＲＯＮの発現は、健常者、潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者から得られた腸生検でのＩＨＣ又はＲＯＮ転写物の定量分析の何れによらず、実質的に正常及び疾患組織との間で変化しなかった（図２Ｃ及びＤ）。これら以降のデータは、炎症を起こした生検サンプルに関連する炎症細胞の動員された集団ではないが、上皮細胞により発現しているＲＯＮと一致している。
【０２２６】
更にＩＢＤ組織においてＲＯＮの発現パターンを定義するために、ＩＢＤ患者（図２Ｅ）及び対照から腸のサンプルを切除し、ヒトの単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリーによって検討した。マクロファージ及び複数のドナーの腸切除組織からの上皮細胞でＲＯＮの発現を定量化し、その結果を図２Ｆに示す。
【０２２７】
以前の観察と一致して、ＲＯＮは、確実に上皮細胞に発現したが、全てがマクロファージ集団の場合、発現が不十分であった（図２Ｅ及びＦ）。組織処理及び酵素消化手順はＲＯＮ染色に影響を与えた可能性は、図２Ｇに示すように、フローサイトメトリー分析によって除外され、そのことは、腸切除からの単一細胞懸濁液を生成するために使用される酵素消化プロトコルが、ＲＯＮの発現のレベルに影響を及ぼさなかったことを示している。これらのデータは、ヒトにおいて、ＲＯＮが、骨髄性ではないが、上皮細胞集団により高度に発現することを意味している。マウスの免疫系とは対照的に、ヒトマクロファージ集団では、ＲＯＮ受容体の高いレベルでの発現は、定常状態下又は疾患条件下の何れでも検出されなかった。マウス及びヒトの両方において、ＲＯＮは、細胞の側底面に局在した腸上皮によって、構成的に高度に発現する。結果は、６８９Ｃ  ＭＳＰ多型が、恐らく上皮固有の影響によって、ＩＢＤを発症するリスクを与えることを示唆している。
【０２２８】
実施例２  ＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃ変異体は、同様の親和性を持つＲＯＮと結合する
上皮細胞がヒトの腸内ＭＳＰ活性の標的である可能性が高いと判断したため、ＲＯＮ活性化のための６８９Ｃ多型の影響を調査した。組換えＭＳＰのいくつかの形態を発現させ、以前に発表された研究と一致して、適切に折り畳まれたタンパク質を得るために、アミノ酸６７２（Ｃ６７２Ａ）においてアラニン置換にシステインを必要とした６８９Ｒ及び６８９Ｃ  ＭＳＰ変異体の完全長のバージョンを含む、哺乳類細胞から精製した（図３Ａ−Ｂ）。Gorlatovaら、2011, PLoS One, 6:e27269及びWahlら、1997, J Biol Chem 272:15053-6を参照。活性な２本鎖形態にタンパク質分解的切断を防止する、アミノ酸４８３（Ｒ４８３Ｅ）でのアルギニンからグルタミン酸への変異を有する、構造的に不活性な、一本鎖ＭＳＰ（ｓｃＭＳＰ）タンパク質もまた発現させ、対照として精製した。最終的に、ＭＳＰ  −  鎖（ＭＳＰ）の組換え６８９Ｒ及び６８９Ｃのバージョンでは、ＲＯＮとの高い親和性相互作用を担うドメインを作成した。Danilkovitchら、1999, J Biol Chem 274:29937-43及びWangら、1997, J Biol Chem 272:16999-7004を参照。重要なことは、ＭＳＰタンパク質が正常に発現し、位置６７２での変異がなく精製し、従って、このドメインの野生型配列を表す。
【０２２９】
ＭＳＰの無細胞アッセイにおいて、固定化されたＲＯＮに結合する、６８９Ｒ及び６８９Ｃタンパク質変異体は、重複する用量反応曲線を示した。予想通り、ｓｃＭＳＰ変異体は、ＲＯＮでコーティングしたプレート（図３Ｂ）に最小限の結合を示した。より正確にＲＯＮとのＭＳＰ相互作用を定量化するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が、固定化されたＲＯＮに可溶性ＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃの親和性を決定するために使用された。完全長ＭＳＰ又はＭＳＰの何れかのＲＯＮ結合反応速度に６８９Ｒと６８９Ｃのバージョンの間で有意差は認められなかった。直接的又は間接的の何れかのＲＯＮの固定化を使用したが、ｓｃＭＳＰについて、結合は認められなかった（図３Ｃ及び表３）。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、分子間相互作用のリアルタイム定量化のために使用される関連技術を用いて、同様の結果が得られた（表３）。ＲＯＮに結合する６８９Ｒ又は６８９Ｃ変異体の何れかの能力について、ＭＳＰβの変異部位６７２に影響は認められず、完全長のＭＳＰは、その発現に必要なＣ６７２Ａ変異によって影響を受けないことを示唆している（表３）。
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２５℃で、ＲＯＮ−Ｆｃを捕捉するＡＳＰＲ、２５℃で、固定化されたＲＯＮセマ／ＰＳＩを使用するｂＳＰＲ、３０℃で、ＲＯＮ−Ｆｃを使用するｃＢＬＩ、室温で２時間３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞に結合するｄＲａｄｉｏｌｉｇａｎｄ、氷の上で４時間３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞に結合するｅＲａｄｉｏｌｉｇａｎｄ。
【０２３０】
上記の結果を確認するために、標識されたＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃのタンパク質、及びヒトＲＯＮを発現する細胞株を使用して、放射性リガンド結合試験を実施した。無細胞アッセイと一致して、競合結合及びスキャッチャード分析では、ＭＳＰ変異体間での結合親和性ＲＯＮにおいて有意差は認められなかった（図３Ｄ及び表３）。まとめると、これらのデータは、６８９Ｃ多型がＭＳＰ及びＲＯＮの間の結合に影響を及ぼさないことを示している。この結論は、ＭＳＰに結合したＲＯＮのホモロジーモデルと一致している。簡潔に述べると、タンパク質データバンクからの座標を使用して、ＭＳＰ（２ＡＳＵ）、ＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩ（４ＦＷＷ）及びＨＧＦ（１ＳＨＹ）との複合体におけるＭｅｔ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩについて、ヒトＲＯＮ  Ｓｅｍａ／ＰＳＩに結合したＭＳＰのホモロジーモデルを作った。Carafoliら、2005, FEBS J 272:5799-807; Chaoら 2012, PLoS One 7:e41912;及びStamosら, 2004, EMBO J 23:2325-35を参照。ＲＯＮ及びＭＳＰβを、全ての構造を示すために使用されたＰｙｍｏｌ（ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４．１  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を用いて、ＭＥＴ／肝細胞成長因子（ＨＧＦ）複合体へグローバルに整列させた。ＭＳＰβ残基６８９は、ＰｙＭＯＬを使用して、システインに変異させた。ホモロジーモデルは、残基６８９が、推定上のＭＳＰ−ＲＯＮインタフェース（図３Ｅ）から遠位にあることを示している。
【０２３１】
実施例３  ｐｒｏ−ＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃ変異体は同様のタンパク質分解活性を受ける
ＭＳＰのタンパク質分解活性化が、インビボＲＯＮ活性を制御する重要な調節点を表すため、このプロセスがＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃとの間で異なるか否かを次に検討した。組換えＭＳＰは、トランスフェクトされた細胞の上澄みからの精製の後、不活性なｐｒｏ−ＭＳＰ（未切断）及びアクティブＭＳＰ（切断）形態の両方に存在し、恐らくは、発現の間に存在する内因性プロテアーゼ活性に起因する。６８９Ｒ又は６８９Ｃ一本鎖タンパク質を最後まで切断するため、ｐｒｏ−ＭＳＰを切断し、活性化するプロテアーゼ、ヘプシンの能力を検討した。Ganesanら、2011, Mol Cancer Res 9:1175-86を参照。
【０２３２】
ｐｒｏ−ＭＳＰは、活性ＭＳＰを生成するため、１００：１の比で室温での活性化緩衝液（５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％チャップス）中、ｓＨｅｐｓｉｎで一晩インキュベートした。ｓＨｅｐｓｉｎは、１０倍モル過剰の抗ヘプシン（Ｆａｂ２５）、その後、プロテインＡセファロースクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を添加することにより除去した。これは、ｐｒｏ−ＭＳＰの活性な二本鎖形態への完全な変換をもたらした。活性化の動態を決定するために、ｐｒｏ−ＭＳＰ（１００μｇ／ｍＬ、１．２５μＭ）を、ｓＨｅｐｓｉｎの様々な濃度（１００  ＮＭ−９７  ｐＭ、２倍希釈系列）で３７℃で１時間インキュベート、又は、活性化緩衝液中で室温にて０．５、１、２、４、６、８、１６又は２４時間、１．２５μＭのｐｒｏ−ＭＳＰを、１２．５ｎＭのｓＨｅｐｓｉｎでインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加により反応が停止し、その後、還元条件下で４％から２０％のトリス−グリシンゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の電気泳動分析を行った。
【０２３３】
明白な差は、１時間の間（図４）にわたって、これらの変異体を完全に切断するために必要なヘプシンの濃度では認められなかった。これらのデータは、６８９Ｃ多型がＲＯＮはｐｒｏ−ＭＳＰのタンパク質分解活性化に異なる効果を介したシグナル伝達に変化させないことを示唆している。
【０２３４】
実施例４  ＭＳＰ６８９Ｒ及び６８９Ｃ変異体は、同様の堅牢なＲＯＮシグナル伝達を誘導する
本明細書に提示される試験では、ＭＳＰ変異体の間で結合タンパク質分解活性化又はＲＯＮ結合に差は認められなかったが、６８９Ｃ多型は、依然としてＲＯＮ受容体を介したＭＳＰ依存性シグナル伝達に影響を与える可能性がある。この点に対処するために、いくつかのＲＯＮを発現する細胞株上のＭＳＰ変異体の下流の生物学的作用が決定された。Ａ２７８０−ｈＲＯＮ（Chaudhuriら, 2011, J Biol Chem 286:32762-74）のインビトロ刺激、及び完全長活性化ＭＳＰ６８９Ｒ又は６８９Ｃタンパク質の何れかとのＢｘＰＣ３は、ウェスタンブロット分析によって同様のレベルのリン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）を誘導した（図５Ａ）。
【０２３５】
更に、３Ｔ３−ｈＲＯＮ細胞におけるｐＡｋｔ誘導の定量的Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）の分析で、広範囲の用量にわたってＭＳＰ６８９Ｒと６８９Ｃとの活性の差を明らかにすることができなかった（図５Ｂ）。簡潔に述べると、３Ｔ３−ＲＯＮ細胞を、０．５％ウシ胎仔血清（ＢＣＳ）を含むＤＭＥＭ中に播種した。翌日、細胞を、ＭＳＰ６８９Ｒ、ＭＳＰ６８９Ｃ、ｓｃＭＳＰ（２５０ｎＭから４ｐＭ、培地中に１．５倍希釈系列）、又は培地だけ３０分間の滴定で処理し、ＭＳＤ溶解緩衝液（（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）に溶解した。Ａｋｔリン酸化の検出のため、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ９６−Ｗｅｌｌ  ４−Ｓｐｏｔ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｓｅｒ４７３）／Ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ  ｐｌａｔｅｓ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）に溶解物を添加し、製造業者の説明書に従ってインキュベートし、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で読み取った。ＲＯＮ結合のその欠如と一致して、ＭＳＤ分析によって示されるように、ｓｃＭＳＰは、堅牢なｐＡｋｔシグナルを誘導しなかった。
【０２３６】
ＲＯＮシグナル伝達は、創傷修復プロセスにおいて重要な役割を果たし、細胞増殖、生存、及び遊走を誘導することが報告されている。Nanneyら、1998, J Invest Dermatol 111:573-81及びSantoroら、2003, Dev Cell 2003;5:257-71を参照。６８９Ｃの多型がＭＳＰに対する、これらの下流細胞応答に影響を与えるかどうかを決定するために、ＭＳＰの変異体の存在下又は非存在下で創傷閉鎖を評価する、インビトロでの細胞単層スクラッチ創傷モデルを使用した。スクラッチ創傷は３Ｔ３−ＭＲＯＮ細胞のコンフルエントな単層で作られ、培養物はその後、ＭＳＰ６８９Ｒ、ＭＳＰ６８９Ｃ、培地のみ、又は不活性ｓｃＭＳＰで処理した。ＭＳＰ６８９Ｒ又は６８９Ｃでの処理で、未処理又はｓｃＭＳＰ処理培養物よりも小さい、同様の創傷の幅が得られた（図５Ｃ及びＤ）。これらのＭＳＰ−誘導された応答は、ＲＯＮ陰性３Ｔ３細胞において処理の影響が全く認められなかったため、ＲＯＮ発現に依存していた（図５Ｅ）。まとめると、これらのデータは、６８９Ｃ多型は、信号を介して結合するＭＳＰの能力を変化させないか、又はＲＯＮ受容体からの機能的応答を誘発しないことを示している。更に、それらは、ＭＳＰ依存性ＲＯＮシグナル伝達の、創傷修復に関連する細胞応答を駆動する能力を確認する。
【０２３７】
実施例５  ＭＳＰ６８９Ｃ多型の担体が血清ＭＳＰの量が減少させた
ＭＳＰは、主に肝臓で発現され、それは、血清中に分泌され、比較的高濃度で循環される。Yoshimuraら、1993, J Biol Chem 268:15461-8を参照。次に、ＭＳＰ６８９Ｒ及びＭＳＰ６８９Ｃについて、循環するＭＳＰの量を検討した。２０４例のドナーから一致したヒト血清及びＤＮＡサンプルは、ｒｓ３１９７９９９遺伝子型及びＭＳＰ血清濃度の両方について分析した。以前の遺伝学的研究と一致して、ＭＳＰのマイナー対立遺伝子は、疾患のない個体と比較して、潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者において多かった（図６Ａ）。例えば、Andersonら、2011, Nat Genet 43:246-52;Andersonら、2009, Gastroenterology 136:523-9 e3;Barrettら、2008, Nat Genet 40:955-62を参照。しかしながら、全体的なＩＢＤのリスクに対するこの対立遺伝子のささやかな貢献、及びＧＷＡＳコホートに比べて、我々の研究グループの比較的小さいサイズを考えると、これらの結果は統計的有意性を満たすことができなかった。
【０２３８】
ｒｓ３１９７９９９遺伝子型と血清ＭＳＰ濃度との関係を立証するため、ヒト血清中のＭＳＰを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発した。このアッセイは、６８９Ｃのタンパク質をＭＳＰ６８９Ｒ及びＭＳＰを検出するための同等の感度を有しており、タンパク質の活性化状態によって影響されなかった（図６Ｄ）。ｒｓ３１９７９９９遺伝子型コホートにおける血清ＭＳＰ濃度の分析は、ＭＳＰ６８９Ｒ変異体の２つのコピーを担持する個体と比較して、ＭＳＰ６８９Ｃ多型のヘテロ接合担体は２７％（Ｐ＜０．０００１）、ホモ接合担体は５０％（Ｐ＜０．０００１）、ＭＳＰより少量であることを明らかにした（図６Ｂ）。正常な個体、及びＣＤ又は潰瘍性大腸炎患者と診断された患者は、ＭＳＰ濃度において同様の遺伝子型依存性の減少を示したため、血清ＭＳＰのこれらの濃度の減少は、ＩＢＤの二次的影響ではなかった（図６Ｃ）。
【０２３９】
６８９Ｃ多型が、血清ＭＳＰのレベルの低下につながるメカニズムを調べるため、同じゲノム遺伝子座に位置する構成的プロモーターのＭＳＰ６８９Ｒ又は６８９Ｃ  ｃＤＮＡ下流の単一コピーを保有する、安定的にトランスフェクトされた細胞株が生成された。定量的ＰＣＲ分析は、個々のクローンをＥＬＩＳＡ（図６Ｄ）によって細胞培養上清において測定した統合ＭＳＰ  ＤＮＡ及びＭＳＰタンパク質量の同量を保有することを確認した。これらの試験は、タンパク質合成又は分泌での多型の影響について論じられる、６８９Ｃ多型が細胞によって産生されたＭＳＰの量に影響を与えないことを明らかにした。
【０２４０】
まとめると、これらのデータは、６８９Ｃ多型が循環するＭＳＰの減少したレベルと関連していることを示し、且つ、ＲＯＮ経路活性の結果として減少したことが、腸上皮細胞における創傷修復の効率性に影響を与え、ＩＢＤに対する感受性の増加につながることを示唆している。
【０２４１】
実施例６  高い親和性でＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質はＲＯＮと結合する
ＲＯＮアゴニストとして機能するために、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質は、ＲＯＮ受容体に結合する必要がある。結合アッセイには、完全長ヒトＭＳＰ、ヒト及びマウスＭＳＰβの親和性、及び固定化されたＲＯＮ受容体に対するヒト及びマウスＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合体の数を測定するために、表面プラズモン共鳴が使用された。結果は、ほとんどのＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質が、ＭＳＰ、天然ＲＯＮリガンドと同様の一桁のナノモル範囲の高い親和性でＲＯＮに結合したことを示した（図９）。エフェクター機能がない変異型ＩｇＧ２ａドメイン（Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ）を有する融合タンパク質は、野生型ＩｇＧ２ａを有するものとしてＲＯＮに対して同様の親和性を有していた（図９）。
【０２４２】
実施例７  インビトロでのＲＯＮアゴニストとしてのＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質機能
細胞においてＲＯＮシグナル伝達を誘導するために、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質は、細胞表面上に発現した完全長ＲＯＮと結合しなければならない。これが起きるか否かを決定するために、マウスＲＯＮで安定的にトランスフェクトした３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞）を、融合タンパク質の滴定又はアイソタイプコントロール抗ブタクサＩｇＧ２ａ抗体でインキュベートした。インキュベーション後の３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞のフローサイトメトリー分析は、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質が、２ｎｇ／ｍｌから５ＵＧ／ｍｌの広範囲の濃度で、細胞表面上のＲＯＮに結合することを示した。同じアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体の結合は最小限であり、高濃度でだけで認められた（図１０Ａ）。結合はＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞では発生なかったため、結合はＲＯＮ依存性である（図１０Ｂ）。
【０２４３】
ＲＯＮへのＭＳＰの結合は、ＲＯＮシグナル伝達を誘導しており、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質がＲＯＮアゴニストとして機能している場合は、それらのＲＯＮへの結合もシグナル伝達を誘導する必要がある。ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質が生物学的に関連する細胞型におけるシグナル伝達を誘導することを確実にするために、内因的にＲＯＮを発現するヒト初代結腸細胞をｍ１２ｍアゴニストで刺激した。
【０２４４】
ヒト初代結腸細胞株ＨＰＣ１（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ社）は、０．５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中のプレートに播種し、一晩接着させた。翌日、培地を除去し、細胞を０．５ｍｌの培地で３７℃にて３０分間処理した。又はｍ１２ｍ  ＭＳＰ−ＩｇＧ２ａアゴニストは培地中で０．４又は０．７５ｎＭの濃度に希釈した。細胞を、ＭＳＤ溶解緩衝液中で１５分間（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）氷の上で溶解した。Ａｋｔリン酸化の検出のために、上清をウェスタンブロット分析によってアッセイした。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、セリン４７３（図１０Ｃ）でのＡｋｔリン酸化の誘導、ＲＯＮシグナル伝達の下流である改変を示した。
【０２４５】
より詳細にＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａの融合タンパク質のＲＯＮアゴニスト活性を評価するため、３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞を、融合タンパク質、ＭＳＰ、又は同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体で、ある範囲の濃度にわたって刺激した。これらの細胞中のセリン４７３におけるＡｋｔリン酸化の定量的Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）分析は、ＭＳＰのように、融合タンパク質が用量依存的にＡｋｔのリン酸化を誘導することを示した。更に、ＭＳＰβとＩｇＧ２ａとの間のより長いスペーサーはＲＯＮアゴニストとしての、より大きな効力と関連している（図１０Ｄ）。抗ブタクサ対照抗体は、このアッセイで活性がなかった（図１０Ｄ）。Ａｋｔリン酸化がＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞に誘導されなかったため、観察されたシグナル伝達は、ＲＯＮ依存性である（図１０Ｅ）。
【０２４６】
実施例８  ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａのタンパク質は、インビボで腸上皮と結合する
腸上皮に修復経路を誘導するために、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質は、この組織に到達し、この組織内の細胞に結合する必要がある。全身投与されたＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質が結合した細胞を同定するために、ＲＡＧ２−／−マウスは、ＰＢＳ、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合体、又は同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を静脈内注射された。具体的には、ＲＡＧ−２欠損マウスは、ＰＢＳ又は５ｍｇ／ｋｇのｍ１２ｍ  ＭＳＰ−ＩｇＧ２ａアゴニスト又は抗ブタクサＩｇＧ２ａを対照として投与された。１時間後、動物を屠殺した（図１１）。結腸は、全てのマウスから採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＬＰ緩衝液（０．１ＭのＬ−リシン［ｐＨ７．４］、２ｍｇ／ｍｌのＮａＩＯ４、及び１０ｍｇ／ｍｌのパラホルムアルデヒドを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液）中で一晩固定し、続いて、３０％スクロース中で脱水し、ＯＣＴ凍結包埋剤（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社）に包埋した。１２μｍの切片を、ＣＭ３０５０Ｓクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ社）に付着させた。切片を、１０％ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）でブロックし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスで染色した。画像は、ライカＳＰＥ共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社）を用いて得た。
【０２４７】
抗マウスＩｇＧでの凍結切片腸組織の染色は、結腸上皮にＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ（図１１、下のパネル）の特異的結合を示すと同時に、アイソタイプ対照は、血管及び組織実質に局在し（図１１、中央のパネル）、非特異的染色パターンを有していた。最小限の染色がＰＢＳを注射したマウスの結腸において観察された（図１１、上のパネル）。これらのデータは、全身投与されたＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａが腸実質に到達することができ、上皮に結合したことを示している。更に、これは、腸内でのＲＯＮの発現の主な部位であるため、融合タンパク質は、その活性に応答する細胞型へのアクセスを有していた。
【０２４８】
実施例９  ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質は、インビボでのＲＯＮのアゴニストとして機能する
免疫組織化学データは、全身投与されたＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質は、腸上皮へのアクセスを有し、ＲＯＮを発現する細胞に結合できることを実証している。ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａタンパク質が、生体内でのシグナル伝達ＲＯＮを誘導するか否かを決定するため、マウスに融合タンパク質を静脈内注射した（図１２Ａ）。ウェスタンブロット分析は、同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体と比較して、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａを投与されたマウスからの結腸の全組織溶解物におけるＡｋｔのリン酸化の増加を示した（図１２Ｂ）。Ａｋｔリン酸化の増加ＲＯＮのチロシンキナーゼドメインを欠くＲＯＮ．ｋｏマウスの結腸において認められなかったために、このシグナル伝達は、ＲＯＮ依存性であった（図１２Ｂ）。ＭＳＰβとＩｇＧ２ａとの間に４、８、１２、又は１６のアミノ酸のスペーサーを有する融合タンパク質を注射したマウスの結腸において、Ａｋｔリン酸化の定量的ＭＳＤ分析により、結腸内のＲＯＮシグナル伝達が確認された。この分析は、Ａｋｔリン酸化において、それぞれ、約２．６−、２−、２．３−、及び２．５倍の増加を検出した（図１２Ｃ）。３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞とは異なり、結腸におけるＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａのタンパク質のアゴニスト活性はＭＳＰβとＩｇＧ２ａとの間のスペーサーの大きさに関連していない。これらのデータは、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａのタンパク質が機能状態で結腸に到達し、この組織にＲＯＮ依存性のシグナル伝達を誘導することを示している。
【０２４９】
マウス結腸のウェスタン及びＭＳＤ分析は、この組織においてＲＯＮアゴニストがＲＯＮシグナル伝達を誘導することを実証した。結腸上皮は、関連する組織となり得るもので、ＲＯＮシグナル伝達を誘導し、修復経路を刺激する。シグナル伝達がこれらの細胞において誘導されるか否かを確認するため、マウスにＲＯＮアゴニストタンパク質又は同一のアイソタイプ（図１３Ａ）の抗ブタクサ対照抗体の何れかを静脈内注射した。これらのマウスからの結腸組織は、その後、切片にし、リン酸化Ａｋｔを染色した。対照抗体で処理した動物において、結腸は、陰窩細胞において、弱い、散乱した核リン酸化Ａｋｔ染色を示した（図１３Ｂ）。対照的に、ＲＯＮアゴニストを投与されたマウスの結腸はより強く核及び細胞質染色を示し、それは、より多くの主に表面及び上部陰窩の上皮細胞に局在していた（図１３Ｃ）。これらの結果は、ＲＯＮアゴニストが修復経路の誘導に関連する細胞型においてシグナル伝達を誘導することを示している。
【０２５０】
実施例１０  ＲＯＮアゴニスト抗体は細胞表面に発現するＲＯＮに結合する
抗ｍＲＯＮアゴニスト抗体は、抗原としてｍＲＯＮを使用して生成された。スクリーニングの後、２つのクローンを同定し、更に分析した。ＲＯＮアゴニストとして機能するためには、インビボで、ＲＯＮアゴニスト抗体が、細胞表面上に発現する完全長ＲＯＮに結合する必要がある。これが発生するか否かを決定するために、３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞を、ハムスター抗ＲＯＮ抗体２Ｅ５．８．１−ハムスターＩｇＧ１又はヒト抗ＲＯＮ抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ１の滴定でインキュベートした。このインキュベーション後の３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞のフローサイトメトリー分析は、両方のアゴニスト抗体が、約２ｎｇ／ｍｌから４０ｕｇ／ｍｌの広範囲の濃度で細胞表面上のＲＯＮに結合することを示した（図１４Ａ及びＣ）。アゴニストと同じアイソタイプの対照ハムスター及びヒト抗体は、３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞に結合しなかった（データには示されていない）。それらはＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞に結合しなかったので、アゴニスト結合する抗体は、ＲＯＮに特異的である（図１４Ｂ及びＤ）。
【０２５１】
実施例１１  ＲＯＮアゴニスト抗体はインビトロでＲＯＮアゴニストとして機能する
抗ＲＯＮ抗体のアゴニスト活性を評価するため、２Ｅ５．８．１及びＹＷ６５１．１抗体クローンを、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を含むように再フォーマットした。２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａ、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ、ＭＳＰ、又は同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体の濃度の範囲で３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞を刺激した。これらの細胞中のセリン４７３におけるＡｋｔリン酸化の定量的Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）分析は、ＭＳＰのように、アゴニスト抗体が、用量依存的にＡｋｔのリン酸化を誘導することを示した（図１５Ａ）。抗ブタクサ対照抗体は、このアッセイにおいて活性を有さなかった（図１５Ａ）。Ａｋｔリン酸化が観察されたシグナル伝達は、ＲＯＮ依存性であることを示し、ＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞において誘導されなかった（図１５Ｂ）。
【０２５２】
実施例１２  あるＲＯＮアゴニスト抗体は、ＲＯＮへのＭＳＰ結合をブロックしない
ＲＯＮアゴニスト抗体は、ＭＳＰのように、ＲＯＮに結合する。そのためそれらは、ＲＯＮに結合するＭＳＰに干渉し、いくつかの状況では、ＭＳＰによるＲＯＮシグナル伝達の減少をもたらす可能性がある。このような干渉が発生するか否かを決定するため、プレートベースの結合アッセイを使用して、ＲＯＮに結合するＭＳＰ（図１６）を測定した。このアッセイにおいて、ＰＢＳ中で２ｕｇ／ｍｌのｍＲＯＮ−ｈＦｃ融合（配列番号５０）でＭｉｃｒｏｔｅｓ  ＥＬＩＳＡプレート（ＢＤＦａｌｃｏｎ社）を４℃にて一晩コーティングし、ＰＢＳでプレインキュベートしたウェルに結合するＭＳＰが最大であると考えられた。プレートを洗浄し（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）、１×試薬希釈液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で１時間ブロックした。プレートを洗浄し、３０ｕｇ／ｍｌのＰＢＳ、抗ブタクサＩｇＧ２ａ、ＰＨ４抗ＲＯＮ  ＩｇＧ２ａ抗体、又はアゴニスト抗体２Ｅ５．８．１、又は１Ｘ試薬希釈液で希釈したＹＷ６５１．１で３０分間インキュベートした。ヘキサヒスチジンでタグ付けされたマウスＭＳＰβは、０．１ｕｇ／ｍｌでの最終濃度まで添加し、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）でインキュベートし、１：２０００の希釈で、１Ｘ試薬希釈液において希釈した。プレートを洗浄し、結合を、１５分間ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）でのインキュベーションによって読み取り、１ＭのＨ３ＰＯ４を添加し、Ａ４５０を測定した。
【０２５３】
予想されるように、ＲＯＮを結合しない抗ブタクサ抗体とのプレインキュベーションは、ＭＳＰ結合を減少させることに失敗した。また予想されるように、ＲＯＮ結合のために、ＭＳＰと競合する、ＰＨ４抗ＲＯＮ抗体とのプレインキュベーションは、ＭＳＰ結合を減少させた（図１６）。ＲＯＮアゴニスト抗体２Ｅ５．８．１は、ＭＳＰ結合を減少させなかったが、アゴニスト抗体ＹＷ６５１．１は程よくＭＳＰ結合を減少させた。これらの結果は、ＲＯＮへのこれら２つのアゴニスト抗体の結合は恐らく異なり、一方はＭＳＰとの競合であるが、もう一方はそうではないことを示している。
【０２５４】
再フォーマットされたモノクローナル抗体２Ｅ５．８．１及びＹＷ６５１．１の特性を表４に要約する。
2016507480.tif 000008
【０２５５】
実施例１３  ＲＯＮアゴニスト抗体は、細胞表面からＲＯＮのダウンレギュレーションを誘導しない
次に、ＲＯＮの活性化が、ＭＳＰ又はアゴニスト抗体に対する反応性の減少をもたらす、細胞表面からの受容体の除去を誘導するか否かを検討した。アゴニスト抗体がダウンレギュレーションＲＯＮの誘導か否かに対処するために、細胞ベースのアッセイを使用した（図１７及び１８）。３７℃でのアゴニスト抗体とのインキュベーションが、インキュベーションを氷上で行った対照と比較して、細胞表面上のＲＯＮの量を減少させるか否かを決定するために、フローサイトメトリーが使用された（図１７）。
【０２５６】
２０００００の３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞をペレット化し、３７℃、又は氷上の何れかで、ＦＡＣＳ緩衝液中、２０ｕｇ／ｍｌに希釈した、ハムスターＩｇＧ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＭＳＰ、ｍ１２ｍＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ、Ｐｈ４−ＩｇＧ２ａ、ＹＷ６５１．１−ヒトＩｇＧ１、又は２Ｅ５．８．１−ハムスターＩｇＧ１で、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）で２回洗浄した。
【０２５７】
アゴニスト試薬を介したＲＯＮの検出のために、３７℃で、又は氷上の何れかで、以下のとおり、ハムスターＩｇＧ及び２Ｅ５．８．１について、細胞を３０分間インキュベートした：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＹＷ６５１．１について；ＦＡＣＳ緩衝液中で、１：５００に希釈したＲ−フィコエリトリン結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）：ＰＨ４及びＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａについて；ＦＡＣＳ緩衝液中で、１：２５０に希釈したフィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）ＦＡＣＳ緩衝液中でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧを１：５００に希釈した。ＲＯＮダウンレギュレーションは、ダウンレギュレーションを示す、１未満の比で、氷上でのインキュベート後のＲＯＮシグナルに対する３７℃でのインキュベーション後のＲＯＮシグナルの比率を算出することによって決定した。
【０２５８】
代替抗体とＲＯＮを検出するため、３７℃で、又は、氷上での何れかで、以下のとおり、細胞を３０分間インキュベートした：ハムスターＩｇＧを、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、及び２Ｅ５．８．１で処理した細胞について、ＲＯＮは、ＦＡＣＳ緩衝液中で、１：１０００に希釈した、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でコンジュゲートされたＰＨ４抗体で検出した；ＭＳＰ、ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ、ＰＨ４、及びＹＷ６５１．１で処理した細胞について、２Ｅ５．８．１抗体は、ＦＡＣＳ緩衝液中１ｕｇ／ｍｌの濃度で使用した。２Ｅ５．８．１は、その後、ＦＡＣＳ緩衝液中、１：５００に希釈したＲ−フィコエリトリン結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧで検出した。ＲＯＮダウンレギュレーションは、ダウンレギュレーションを示す、１未満の比で、氷上でのインキュベート後のＲＯＮシグナルに対する３７℃でのインキュベーション後のＲＯＮシグナルの比率を算出することによって決定した。
【０２５９】
細胞表面ＲＯＮを測定するための異なる方法を使用して、２つの実験を並行して行った。一つは、アゴニストに特異的な二次抗体を使用して、ＲＯＮを検出した。その他では、異なる抗体を使用して、ＲＯＮを検出した。重要なこととして、ブロックデータは、ＲＯＮ結合についてアゴニストと競合しない検出抗体を選択するために使用した。予想されたように、ＲＯＮに結合しないハムスターＩｇＧ及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、ＲＯＮダウンレギュレーションを誘導しなかった。ＲＯＮ検出法の両方を使用したアッセイは、細胞表面ＲＯＮのレベルが、ｍ１２ｍ  ＭＳＰβ−ＩｇＧ２ａ融合体、抗ＲＯＮ抗体Ｐｈ４、又はＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１、及び２Ｅ５．８．１との３７℃でのインキュベーション後、比較的変化がなかったことを示した。細胞表面に結合するＭＳＰを検出するために、試薬は使用できなかったが、２Ｅ５．８．１抗体がＭＳＰとのインキュベーション後のＲＯＮを検出したとき、ＲＯＮレベルは変化していなかった。これらのデータは、ＲＯＮ抗体が、ＲＯＮ表面受容体の発現の調節の観点から、ＭＳＰと同様に作用し、細胞表面からＲＯＮのダウンレギュレーションを誘導しなかったことを示唆する。
【０２６０】
実施例１４  ＲＯＮアゴニスト抗体は、インビトロのスクラッチ創傷アッセイで修復を誘導する
上述で示したように、細胞単層を利用しているスクラッチ創傷実験において、ＭＳＰは、創傷治癒をモデルする修復応答を誘導することができる。ＲＯＮアゴニスト抗体がＭＳＰによって誘発されるものと類似している細胞において下流効果を誘導するかどうかを決定するために、スクラッチ創傷アッセイにおいて修復を誘導する抗体の能力について評価した。上に示したように、１２時間のヒトＭＳＰの処理（ＭＳＰ６８９Ｒ又はＭＳＰ６８９Ｃの何れか）はｈＲＯＮを発現する３Ｔ３細胞において創傷治癒を誘導し、抗ブタクサ抗体の対照（図５Ｃ）と比較して、創傷の領域内のより大きな細胞密度として可視化した。同様に、ＭＭＳＰ−Ｆｃ融合タンパク質とＲＯＮアゴニスト抗体は、ＭＲＯＮ（図１９Ａ）を発現する３Ｔ３細胞を用いたインビトロ系において、同様の修復応答を誘導した。３２時間にわたるスクラッチ創傷３Ｔ３−ｍＲＯＮ細胞における細胞密度の定量分析は、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１及び２Ｅ５．８．１がＭＳＰによって誘導されるのと同様の、対照ＩｇＧ抗体で処理した細胞で認められたものより大きい、スクラッチ創傷修復を誘導したことを示している。ＭＳＰもアゴニスト抗体の何れもが、ＲＯＮ陰性親３Ｔ３細胞内の修復（図１９Ｂ）を誘発しないので、創傷修復のこの刺激は、ＲＯＮ依存性である。
【０２６１】
実施例１５  ＲＯＮアゴニスト抗体は、マウスの結腸及び皮膚にＲＯＮシグナル伝達を誘導する
ＲＯＮアゴニスト抗体が、インビボでＲＯＮシグナル伝達を誘導するか否かを決定するために、マウスは、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ、２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａ、又は同一のアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を静脈内又は腹腔内に注射された。結腸におけるＡｋｔリン酸化の定量的ＭＳＤ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）分析は、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａ及び２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａが、結腸において、ＲＯＮアゴニストとして作用し、対照抗体を介して、それぞれ、Ａｋｔのリン酸化の約７及び５倍の増加を誘導することを示した（図２０Ａ）。これらのデータはまた、ＲＯＮのアゴニスト抗体が機能状態において結腸に到達し、組織中のＲＯＮシグナル伝達を誘導することを実証している。
【０２６２】
皮膚におけるＡｋｔリン酸化の定量的ＭＳＤ分析は、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａが糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（図２０Ｂ）及び野生型対照（「ＷＴ」、即ち、ＲＯＮ  ＴＫ−／−系統同腹子、ＲＯＮ  ＴＫ＋／＋又はＲＯＮ陽性マウス）（図２０Ｃ）から非創傷皮膚におけるＲＯＮアゴニストとして作用し、それぞれ、コントロール抗体を介してＡｋｔのリン酸化において約２−及び３倍の増加を誘導することを示している。ＲＯＮ  ＴＫ−／−マウス（ＲＯＮのチロシンキナーゼドメインに欠損があるＲＯＮ欠損マウス）において、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａは、ＲＯＮがシグナル伝達を誘導せず、シグナル伝達がＲＯＮ依存性であることを示している（図２０Ｃ）。
【０２６３】
実施例１６  ＲＯＮアゴニスト抗体は、糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスにおいて、創傷治癒を誘導し、血糖を低下させる
ＲＯＮアゴニスト抗体は、インビトロでＲＯＮに結合し、マウスの結腸でのシグナル伝達を誘導することを示したが、次に、このシグナル伝達がインビボで損傷した上皮組織の修復を誘導することができるかどうかを決定した。ＭＳＰが上皮損傷の皮膚創傷モデルにおける治癒を誘導することが示されてきており(Santoroら、2003, Dev Cell.5(2):257-71)、修複（図２１Ａ−Ｂ）の誘導について、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａをアッセイするために、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における本実験で同様のモデルを使用した。
【０２６４】
試験期間中、創傷の大きさは、ＲＯＮアゴニスト抗体を投与したマウスについては、ゼロ近くまで減少し、創傷が閉鎖の点に治癒したことを意味している（図２１Ａ）。際立って対照的に、創傷は、同じアイソタイプの対照抗体を投与したマウスについては、閉鎖していなかった。実際には、創傷の大きさは５０％だけ減少した。この結果は、全身投与されたＲＯＮアゴニスト抗体は、損傷を受けた上皮の修復を誘導したことを示している。更に、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａは、ｄｂ／ｄｂマウス（図２１Ｃ）から負傷した皮膚にコントロール抗体を介してＡｋｔリン酸化を誘導した。したがって、上述のスクラッチアッセイの結果と一致して、皮膚におけるＡｋｔリン酸化の定量的ＭＳＤ分析は、ｄｂ／ｄｂマウス（図２１Ｃ）からの創傷皮膚と同様に、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（図２０Ｂ）、野生型ＲＯＮ陽性マウス（図２０Ｃ）の非創傷皮膚において、ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａがＲＯＮアゴニストとして作用したことを示している。
【０２６５】
創傷治癒障害に加えて、ｄｂ／ｄｂマウスは、上昇した非空腹時血糖値などのヒトの糖尿病に似た他の表現型を有する。ＲＯＮアゴニスト抗体が、他のｄｂ／ｄｂマウスの表現型を変更するかどうかを立証するため、非空腹時血糖値に対するＹＷ６５１．１−のＩｇＧ２ａ又は２Ｅ５．８．１−ＩｇＧ２ａの効果を測定した。複数の時点で、ＲＯＮアゴニスト抗体ＹＷ６５１．１−ＩｇＧ２ａを投与されたマウスは、同じアイソタイプの抗ブタクサ対照抗体を受けたマウス（図２２）と比較して、有意に低い血糖値を示した。これらの結果は、ＲＯＮ抗体がメタボリックシンドロームのモデルにおいて複数の表現型を変更するのに有効であることを示している。
【０２６６】
詳細にかつその特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、その変更及び変形は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの態様は特に有利であると本明細書で同定されているが、本発明は、必ずしも本発明のこれらの特定の態様に限定されないことが企図される。
【図１Ａ】
2016507480.tif 000009
【図１Ｂ】
2016507480.tif 000010
【図１Ｃ】
2016507480.tif 000011
【図１Ｄ】
2016507480.tif 000012
【図１Ｅ】
2016507480.tif 000013
【図２Ａ】
2016507480.tif 000014
【図２Ｂ】
2016507480.tif 000015
【図２Ｃ】
2016507480.tif 000016
【図２Ｄ】
2016507480.tif 000017
【図２Ｅ】
2016507480.tif 000018
【図２Ｆ】
2016507480.tif 000019
【図２Ｇ】
2016507480.tif 000020
【図３Ａ】
2016507480.tif 000021
【図３Ｂ】
2016507480.tif 000022
【図３Ｃ】
2016507480.tif 000023
【図３Ｄ】
2016507480.tif 000024
【図３Ｅ】
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【図４】
2016507480.tif 000026
【図５Ａ】
2016507480.tif 000027
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
2016507480.tif 000032
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2016507480.tif 000036
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2016507480.tif 000040
【図１０Ｂ】
2016507480.tif 000041
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
2016507480.tif 000046
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2016507480.tif 000050
【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2016507480.tif 000054
【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
2016507480.tif 000056
【図１５Ｂ】
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【図１６】
2016507480.tif 000058
【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
2016507480.tif 000061
【図１９Ｂ】
2016507480.tif 000062
【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
2016507480000001.app
【国際調査報告】
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2016507480.tif 000072
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