(57)【要約】  黄色ブドウ球菌感染の治療および予防のための免疫原性組成物およびワクチンが、本明細書中に提供される。これらの免疫原性組成物およびワクチンは、1種以上のキャリアタンパク質にN結合されているバイオコンジュゲート莢膜多糖の組み合わせを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）、および第2のN-グリコシル化タンパク質を含む組成物。
【請求項２】
第2のタンパク質が、CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla、またはCP8-Hlaである、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
第3のN-グリコシル化タンパク質をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
第3のN-グリコシル化タンパク質が、CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla、またはCP8-Hlaである、請求項4に記載の組成物。
【請求項５】
HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）、および第2のN-グリコシル化タンパク質を含む組成物。
【請求項６】
第2のタンパク質が、CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP8-ClfA、またはCP8-Hlaである、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
第3のN-グリコシル化タンパク質をさらに含む、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項８】
第3のN-グリコシル化タンパク質が、CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla、またはCP8-Hlaである、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）、(ii) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）、および(iii) 第3のN-グリコシル化タンパク質を含む組成物。
【請求項１０】
第3のN-グリコシル化タンパク質が、CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、またはCP8-Hlaである、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物を投与することにより、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）による感染を治療または予防する方法。
【請求項１２】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2013年12月4日出願の米国特許仮出願第61/911,919号（その開示は全体が参照により本明細書中に組み入れられる）の恩恵を主張する。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）感染の治療および予防のための免疫原性組成物およびワクチンが、本明細書中に提供される。これらの免疫学的組成物およびワクチンは、1種以上のキャリアタンパク質にN結合されているバイオコンジュゲート莢膜多糖の組み合わせを含む。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、菌血症、心内膜炎、肺炎、および創傷感染をはじめとする侵襲性ヒト感染症の主因である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は病院に固有のものであり、地域に関連したMRSA菌株が世界的に伝播して、重大な地球規模の課題をもたらしている［1〜3］。ブドウ球菌症を予防するためのワクチンに対する緊急の必要性がある。数種類のワクチンが臨床試験で調べられてきたが、莢膜多糖（CP）コンジュゲート、個別のタンパク質抗原、およびリポタイコ酸に対するモノクローナル抗体（mAb）は、様々な開発段階で失敗しており、そのことが、より広範な有効性を有する新規ワクチンに対する必要性を強調する［4〜6］。体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を惹起する黄色ブドウ球菌ワクチンが現在評価中であり［7］、α毒素（Hla）とCPの両方が、multi73成分ワクチン中に含めることに関して検討中の主要な抗原である。
【０００３】
血清型5（CP5）または血清型8（CP8）莢膜が黄色ブドウ球菌臨床単離株のうちの約75％により生成され、CP抗原は感染された動物の血中での生存のために重要である［8、9］。莢膜抗体はオプソニン性であり、ヒト好中球によるブドウ球菌の取り込みおよび殺菌を媒介する［8］。Hlaは分泌型孔形成毒素であり、リンパ球、マクロファージ、肺胞上皮細胞、肺内皮、および赤血球がそれに対して感受性である［10］。遺伝的に無毒化されたタンパク質（HlaH35L）は孔形成に障害があり、HlaH35Lに対する抗体は生来型Hlaの溶解活性を中和する［11］。HlaH35Lを用いた免疫化は、致死性ブドウ球菌性肺炎、致死性腹膜炎、および皮膚感染から、マウスを保護する［12〜14］。
【発明の概要】
【０００４】
CPを用いてグリコシル化された保存型ブドウ球菌タンパク質抗原を用いる免疫化は、黄色ブドウ球菌感染を予防するための洗練された効果的な戦略であり得、このことが、調製および個別に精製する必要がある個々のワクチン成分の数を限定する。そのようなアプローチは、新規な大腸菌N結合グリコシル化技術の開発を通して実現可能であり［15、16］、この際、O抗原がオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBによりタンパク質キャリア内の特異的部位に転移される［15〜17］。化学的にコンジュゲート化されたワクチンとは対照的に、バイオコンジュゲートワクチンは所定の分子構造を有して均質であり、タンパク質およびグリカン成分は生来型コンホメーションに保たれて、必須のB細胞エピトープの変性を回避する［18］。生成物は、ペプチドおよび同じ生物由来の共有結合された糖エピトープを含み、それにより、微生物疾患の多数の徴候に対するその有効性を拡大する。本発明者らは、CP5-緑膿菌エキソタンパク質A（exoprotein A）（Epa）、CP8-Epa、およびCP5-Hlaから構成される糖コンジュゲートワクチンを調製し、マウスでの菌血症および致死性肺炎に対するそれらの保護効率を評価した。CP5-EpaおよびCP8-Epaが菌血症を著明に減少させた一方で、CP5-Hlaバイオコンジュゲートワクチンは、菌血症と致死性肺炎の両方から保護した。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】大腸菌での黄色ブドウ球菌の5型莢膜多糖（CP5）および8型莢膜多糖（CP8）の合成を示す図である。A：大腸菌でのCP5またはCP8の発現を担う酵素をコードする人工遺伝子クラスターを構築した。それらは、黄色ブドウ球菌cap5またはcap8遺伝子座（黒色）および緑膿菌O11 LPS遺伝子座（灰色）からクローニングされた遺伝子を含む。B：黄色ブドウ球菌（黒色）、緑膿菌（赤色）および大腸菌（灰色）由来の酵素により媒介される、UDP活性化型糖前駆体の酵素的アッセンブリ、輸送、および多量体化を示す、CP5またはCP8多量体の生合成。太字の酵素は、大腸菌でのCP5およびCP8多量体を合成およびアッセンブルするために用いた。
【図２−１】大腸菌での黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖（CP5）および8型莢膜多糖（CP8）の生成を示す図である。A、B：黄色ブドウ球菌CP5およびCP8反復単位の構造が示される。
【図２−２】大腸菌での黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖（CP5）および8型莢膜多糖（CP8）の生成を示す図である。糖脂質は、組み換え大腸菌から抽出され、脂質キャリアからの酸放出後に2-アミノベンズアミド（2-AB）を用いて標識され；それにより、CP5およびCP8反復サブユニットの還元末端が2-ABを担持する。794.3の質量電荷比を有するHPLC溶出ピークのMALDI-TOF/TOF MS-MS分析を行なった。CP5（C）およびCP8（D）の断片化パターンが、対応する単糖を指し示す矢印により示される。
【図２−３】大腸菌での黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖（CP5）および8型莢膜多糖（CP8）の生成を示す図である。糖脂質は、組み換え大腸菌から抽出され、脂質キャリアからの酸放出後に2-アミノベンズアミド（2-AB）を用いて標識され；それにより、CP5およびCP8反復サブユニットの還元末端が2-ABを担持する。794.3の質量電荷比を有するHPLC溶出ピークのMALDI-TOF/TOF MS-MS分析を行なった。CP5（C）およびCP8（D）の断片化パターンが、対応する単糖を指し示す矢印により示される。
【図２−４】大腸菌での黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖（CP5）および8型莢膜多糖（CP8）の生成を示す図である。黄色ブドウ球菌CPを発現する大腸菌細胞由来のプロテイナーゼK処理全細胞溶解物を調製し、SDS-PAGEにより分離した。CP5（E）およびCP8（F）多量体を、銀染色およびCP5またはCP8に対する抗体を用いてプロービングしたウエスタンブロットにより可視化した。CP5-Epa（G）、CP8-Epa（H）、またはCP5-Hla（I）のいずれかを発現する大腸菌由来の精製されたバイオコンジュゲートをSDS-PAGEにより分離し、クーマシーブルー（CB）を用いて染色した。ニトロセルロースへのトランスファー後、バイオコンジュゲートを、緑膿菌エキソタンパク質A（Epa）、CP5、CP8、またはα毒素（Hla）に対する血清抗体を用いて、それらの反応性により検出した。
【図３】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンがマウスで免疫原性であったことを示す図である。PBS、Hla、またはバイオコンジュゲートワクチン製剤を用いて免疫化されたマウス由来の血清中の抗原特異的抗体レベルを、1：100血清希釈にてELISAにより決定した。A：対照マウスまたはEpaにコンジュゲート化されたバイオコンジュゲートワクチン（biocojugate vaccine）の漸増用量を投与されたマウスでのCP5に対する抗体レベル。B：CP8-Epaまたは2a-Epaを用いて免疫化されたマウスでのCP8に対する抗体レベル。C：対照マウス、CP5-HlaまたはHlaのみを投与されたマウスでのCP5に対する抗体レベル。D：対照マウス、CP5-HlaまたはHlaのみを投与されたマウスでのHlaに対する抗体レベル。ELISAインデックスは、試験血清（1：100希釈）の405nmでのODを、希釈されてすべてのアッセイで含められる対照高力価血清の405nmでのODによって除算することにより算出される。
【図４Ａ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。A：CP5-EpaまたはCP5-HlaH135Lのいずれかに対するウサギIgG（10、1、または0.1μg/mL）は、HL-60オプソニン食作用殺菌（opsonophagocytic killing；OPK）アッセイ（n＝3）での血清型5黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株およびNewman株に対してオプソニン性であったが、一方で、Hlaおよびシゲラ属O1-Epaに対する抗体は非オプソニン性であった。
【図４Ｂ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。ヒト好中球を用いて行なわれたOPKアッセイは、CP5-Epaに対するウサギ抗体が、1μg/mLほどの低濃度にて、Reynolds（CP5）株（B）、Newman株（C）、USA100株（D）、およびUSA200株（E）に対してオプソニン性であったことを明らかにした。対照バイオコンジュゲートであるシゲラ属O1-Epaワクチンに対するウサギ抗体は、オプソニン活性を欠いていた。OPKアッセイは、CP5-Epa（示される濃度はμg/mLである）、ヒト多形核白血球（PMN）、および補体（C’）供給源としてのモルモット血清を用いて、記載された通りに（43）行なった。
【図４Ｃ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。ヒト好中球を用いて行なわれたOPKアッセイは、CP5-Epaに対するウサギ抗体が、1μg/mLほどの低濃度にて、Reynolds（CP5）株（B）、Newman株（C）、USA100株（D）、およびUSA200株（E）に対してオプソニン性であったことを明らかにした。対照バイオコンジュゲートであるシゲラ属O1-Epaワクチンに対するウサギ抗体は、オプソニン活性を欠いていた。OPKアッセイは、CP5-Epa（示される濃度はμg/mLである）、ヒト多形核白血球（PMN）、および補体（C’）供給源としてのモルモット血清を用いて、記載された通りに（43）行なった。
【図４Ｄ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。ヒト好中球を用いて行なわれたOPKアッセイは、CP5-Epaに対するウサギ抗体が、1μg/mLほどの低濃度にて、Reynolds（CP5）株（B）、Newman株（C）、USA100株（D）、およびUSA200株（E）に対してオプソニン性であったことを明らかにした。対照バイオコンジュゲートであるシゲラ属O1-Epaワクチンに対するウサギ抗体は、オプソニン活性を欠いていた。OPKアッセイは、CP5-Epa（示される濃度はμg/mLである）、ヒト多形核白血球（PMN）、および補体（C’）供給源としてのモルモット血清を用いて、記載された通りに（43）行なった。
【図４Ｅ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。ヒト好中球を用いて行なわれたOPKアッセイは、CP5-Epaに対するウサギ抗体が、1μg/mLほどの低濃度にて、Reynolds（CP5）株（B）、Newman株（C）、USA100株（D）、およびUSA200株（E）に対してオプソニン性であったことを明らかにした。対照バイオコンジュゲートであるシゲラ属O1-Epaワクチンに対するウサギ抗体は、オプソニン活性を欠いていた。OPKアッセイは、CP5-Epa（示される濃度はμg/mLである）、ヒト多形核白血球（PMN）、および補体（C’）供給源としてのモルモット血清を用いて、記載された通りに（43）行なった。
【図４Ｆ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。F：アッセイの特異性が、CP5-Epa IgGが食作用殺菌に関して血清型8の菌株（Reynolds［CP8］株）をオプソニン化できないことにより示された。莢膜陰性Reynolds（CP-）株は、PMN＋C’のみ（莢膜抗体を含むかまたは含まない）により死滅させられた。
【図４Ｇ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。G：CP8-Epaに対するウサギIgG（≧1μg/mL）は、血清型8黄色ブドウ球菌Reynolds（CP8）株およびMRSA株ST80に対してオプソニン性であった。抗体を含まないかまたはシゲラ属2a-Epa IgGを含むサンプルでは、殺菌は観察されなかった。
【図４Ｈ】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンが機能的抗体を惹起したことを示す図である。H：20μg HlaH135Lまたは2μg CP5-20μg HlaH135Lを用いて免疫化されたマウス（n＝7〜16）由来の血清は、ウサギ赤血球に対するHlaの溶解活性を中和した。溶血率（％）は、4U/mLの生来型Hlaを用いた赤血球の100％溶解と比較して算出された。HlaH135Lを用いて免疫化されたマウス由来の血清は、CP5-HlaH135Lを投与されたマウス由来の血清よりも大きなin vitro中和活性を示した。50％溶解力価の間の95％C.I.での重複の欠落は、P＜0.05で有意な差異を示す；バーはs.e.mを表わす。
【図５】黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートワクチンを用いる能動免疫化が、菌血症、体重減少、および腎膿瘍からマウスを保護することを示す図である。0日目、14日目、および28日目にCP5-Epaを用いて免疫化され、約107CFUの黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株を腹腔内経路によりチャレンジされたマウスは、シゲラ属O1-Epaを用いて免疫化されたマウスと比較して、血液から（P＝0.0029）（A）および腎臓から（P＜0.0001）（B）、より少ない細菌が回収され、少ない体重減少を示した（P＝0.005）（C）。D：0.2μg CP8-Epaを用いて免疫化され、3.9×107 CFU Reynolds（CP8）株でチャレンジされたマウスは、対照マウスと比較して減少した菌血症を示した（P＝0.0015）。0.2μg CP5-20μg HlaH135Lを用いて免疫化されたマウスは、菌血症から保護され（E）、かつ約107CFU Reynolds（CP5）株のチャレンジにより誘発される体重減少から保護された（F）。横線は群中央値を示す。統計解析は、マン・ホイットニーU検定を用いて行なった（* P＜0.05、** P＜0.01および*** P＜0.0001）。G：CP5-HlaH135L、2a-Epa、またはバッファーを用いて能動免疫化されたマウスでのマウスCP5抗体レベルと菌血症レベルとの逆相関（Spearmanノンパラメトリック分析によりP＜0.001）。細菌チャレンジの1日前に取得されたマウス血清を1：100に希釈し、CP5特異的ELISAにより試験した。1×107CFUの黄色ブドウ球菌Reynolds株をマウスに腹腔内チャレンジし、定量的血液培養をその後の2時間行なった。各点が1頭のマウス由来のサンプルを表わし、菌血症レベルに対する検出下限は5〜20CFU/mLの範囲であった。
【図６】CP5-HlaH135Lを用いた免疫化が多様な黄色ブドウ球菌単離株により誘発される致死性肺炎からマウスを保護したことを示す図である。2μg CP5-20μg HlaH135Lまたは20μg HlaH135Lを用いて免疫化されたマウスは、1.4×109CFU黄色ブドウ球菌Newman株（n＝15〜18）（A）、1.6×109CFU LAC株（n＝8）（B）、または6.0×108CFU ST80株（n＝9）（C）の鼻内チャレンジにより生じる致死性肺炎から保護された。D：マウスは、0日目、14日目、および28日目にバイオコンジュゲートワクチンを用いて免疫化された。マウスに、黄色ブドウ球菌Newman株のチャレンジの72時間前および24時間前に、CD4またはCD8aに対するモノクローナル抗体を注入した。対照動物にはPBSを投与した。CP5-HlaH135L免疫化マウス（T細胞枯渇ありまたはなし）は同様の生存曲線を示し、一方で、シゲラ属2a-EPAバイオコンジュゲートを用いて免疫化されたマウスは細菌チャレンジの24時間以内に死亡した。データは、ログランク検定を用いて解析した。
【図７】黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンに対して特異的なウサギIgGを用いる受動免疫化が菌血症および致死性肺炎からマウスを保護したことを示す図である。CP5-Epa IgGを投与され、6×106CFU黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株（A）または7×107CFU USA200株（B）でIPチャレンジされたマウスは、シゲラ属O1-Epa IgGを投与されたマウスと比較して、チャレンジ2時間後の血液から有意に少ない細菌が回収された。C：CP8-Epa IgGを投与されたマウスは、4×107CFUの黄色ブドウ球菌Reynolds（CP8）株により引き起こされる菌血症から保護された。CP5-Hla IgGを投与されたマウスは、黄色ブドウ球菌USA100株（8×107CFU/マウス）（D）またはNewman株（9×107CFU/マウス）（E）により誘発される菌血症の減少を示した。F：300μg CP5-EpaまたはCP5-HlaH135L IgGを用いて受動免疫化されたマウスは、Reynolds（CP5）株（4×106CFU）によるチャレンジ後に同様の菌血症の減少を示した。Hlaに対する抗体は、菌血症レベルに影響を有しなかった。横線は群中央値を表わし、P値（*＜0.05、**＜0.01および***＜0.0001）はマン・ホイットニーU検定を用いて決定した。G：CP5-HlaH135L IgGまたはHla IgGの単回1mg用量を用いて受動免疫化されたマウス（10頭/群）は、6.1×108CFU黄色ブドウ球菌Newman株による鼻内チャレンジの24時間前にCP5-Epa IgGまたはO1-Epa IgGを投与されたマウスよりも長く生存した（P＝0.0001）。H：9.7×108CFU Newman株を用いた細菌チャレンジの4時間前および24時間前に1mgのHla IgGまたはCP5-HlaH135LIgGを投与されたマウスは、致死性肺炎から保護された（P＜0.0001）。生存試験に関するP値は、ログランク検定を用いて決定した。
【図８】黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンを用いて免疫化されたマウス由来の血清がin vitro機能性アッセイにてブドウ球菌のオプソニン食作用殺菌を媒介したことを示す図である。（A）CP5-EpaまたはCP5-HlaH135Lを用いて免疫化されたマウスからプールされた血清（1：50から1：109,350まで、3倍希釈）は、血清型5黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株およびNewman株に対してオプソニン性であった。（B）CP8-Epaを用いて免疫化されたマウスからプールされた血清（1：50から1：109,350まで、3倍希釈）は、血清型8 Reynolds（CP8）株およびMRSA菌株であるST80株に対してオプソニン性であった。血清を含まないサンプルまたは免疫化前（免疫前（preimmune））のマウスもしくはシゲラ属2a-Epaバイオコンジュゲートワクチンを用いて免疫化されたマウスから収集されたプール血清を含有するサンプルは、オプソニン性が乏しかった。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
黄色ブドウ球菌感染の治療および予防のための免疫原性組成物およびワクチンが、本明細書中に提供される。これらの免疫原性組成物およびワクチンは、1種以上のキャリアタンパク質にN結合されているバイオコンジュゲート莢膜多糖の組み合わせを含む。
【０００７】
莢膜多糖は、以前に記載された通りに、原核生物宿主細胞で（例えば、大腸菌で）合成することができる。例えば、国際公開第2011/138361号として公開された、2011年5月4日に出願された国際特許出願第PCT/EP2011/057111号（全体が本明細書中に組み入れられる）を参照されたい。これらの莢膜多糖は、例えば、国際公開第2011/138361号として公開された、2011年5月4日に出願された国際特許出願第PCT/EP2011/057111号（全体が本明細書中に組み入れられる）に記載される通りに、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglBなど）を介してキャリアタンパク質にN結合させることができる。
【０００８】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、天然で1つ以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質である。他の実施形態では、1つ以上のN-グリコシル化コンセンサス配列が、キャリアタンパク質へと組み換え的に導入されている。コンジュゲートワクチンの製造での使用のために好適ないずれかのキャリアタンパク質を、本明細書中で用いることができる。例示的なキャリアタンパク質としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：緑膿菌の外毒素A（EPA）、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型ヘモリシンA（Hla、例えば、Hla H35L）、黄色ブドウ球菌のクランピング因子A（ClfA）、黄色ブドウ球菌のクランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然型糖タンパク質、肺炎連鎖球菌ニューモリシンおよび追加の肺炎連鎖球菌タンパク質抗原（例えば、肺炎連鎖球菌NOX、肺炎連鎖球菌PspA、肺炎連鎖球菌PcpA、肺炎連鎖球菌PhtD、肺炎連鎖球菌PhtE、肺炎連鎖球菌Ply、および肺炎連鎖球菌LytB）。特定の実施形態では、キャリアタンパク質がシグナルペプチドに融合されていることにより、該キャリアタンパク質はグラム陰性宿主細胞（例えば、大腸菌）のペリプラズムに配置される。具体的な実施形態では、シグナルペプチドはDsbAシグナルペプチドである。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、(i) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む。より具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。
【００１０】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む。より具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA、またはCP8-Hlaである。
【００１１】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）；(ii) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）；および(iii) キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖を含む。より具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。
【００１２】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、1種類のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含む。他の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、2種類以上のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、1種類のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含み、このとき、キャリアタンパク質は、黄色ブドウ球菌から取得される（HlaまたはClfaなど）。他の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、2種類以上のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含み、このとき、これらのキャリアタンパク質のうちの1種、2種またはすべては、黄色ブドウ球菌から取得される（HlaまたはClfaなど）。
【００１４】
別の態様では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体（例えば、ヒト被験体）を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、本明細書中に記載される1種以上の組成物を被験体に投与するステップを含む。
【００１５】
具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、(i) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）を含む第1のバイオコンジュゲート；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む第2のバイオコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与するステップを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ組成物の一部分として被験体に投与される。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ治療レジメンの一部分として、しかし異なる組成物として被験体に投与される。
【００１６】
別の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）を含む第1のバイオコンジュゲート；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む第2のバイオコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与するステップを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ組成物の一部分として被験体に投与される。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ治療レジメンの一部分として、しかし異なる組成物として被験体に投与される。
【００１７】
別の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）を含む第1のバイオコンジュゲート；(ii) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）を含む第2のバイオコンジュゲート；および(iii) キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖を含む第3のバイオコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与するステップを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1、第2および/または第3のバイオコンジュゲートは、同じ組成物の一部分として被験体に投与される。特定の実施形態では、第1、第2および/または第3のバイオコンジュゲートは、同じ治療レジメンの一部分として、しかし異なる組成物として被験体に投与される。
【００１８】
別の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、1種類のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。別の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌感染を有するか、またはそれを発症するリスクを有する被験体を治療する方法が本明細書中に提供され、該方法は、2種類以上のキャリアタンパク質にN結合されているCP5およびCP8を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、黄色ブドウ球菌から取得されるキャリアタンパク質である（HlaまたはClfaなど）。
【００１９】
製造品
完成品の包装されかつラベル付けされた医薬製品もまた、本明細書中に包含される。この製造品は、密封されたガラスバイアルまたは他の容器などの適切な容器（vesselまたはcontainer）中に適切な単位投与剤形を含む。医薬製品は、例えば、1種以上の本明細書中に記載される組成物を単位投与剤形で含むことができる。
【００２０】
具体的な実施形態では、単位投与剤形は、非経口送達、静脈内送達、筋内送達、鼻内送達、または皮下送達のために好適である。つまり、それぞれの送達経路に好適な、好ましくは無菌の溶液が、本明細書中に包含される。
【００２１】
いずれかの医薬製品について、包装材料および容器は、保存および輸送中の製品の安定性を保護するために設計される。さらに、本明細書中に提供される製品は、使用説明書または感染（例えば、黄色ブドウ球菌感染）を適切に予防もしくは治療するやり方について医師、技術者、もしくは患者に助言する他の情報材料を含む。換言すると、製造品は、限定するものではないが、実際の用量、モニタリング手順、および他の情報をはじめとする投与レジメンを指示または示唆する指示手段を含む。
【００２２】
具体的には、包装材料（箱、瓶、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、IVバッグ、エンベロープ等など）；および該包装材料内に収容された本明細書中に記載されるワクチンまたは組成物（例えば、医薬組成物）の少なくとも1つの単位投与剤形を含む製造品が本明細書中に提供され、このとき、本明細書中に記載される該ワクチンまたは組成物（例えば、医薬組成物）は本明細書中に記載される黄色ブドウ球菌ワクチンを含み、該包装材料は、特定の用量を投与し、かつ本明細書中に記載される通りの特定の投与レジメンを用いることにより、黄色ブドウ球菌感染もしくはその1種以上の症状を予防、管理、および/または治療するために、本明細書中に記載される該組成物を用いることができることを示す指示手段を含む。
【００２３】
具体的な実施形態では、本明細書中に提供される製造品は、(i) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）を含む第1のバイオコンジュゲート；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む第2のバイオコンジュゲートを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ組成物中に提供される。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、異なる組成物中に（例えば、別個の容器中に）提供される。
【００２４】
別の具体的な実施形態では、本明細書中に提供される製造品は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）を含む第1のバイオコンジュゲート；および(ii) キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖を含む第2のバイオコンジュゲートを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第2の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、同じ組成物中に提供される。特定の実施形態では、第1および第2のバイオコンジュゲートは、異なる組成物中に（例えば、別個の容器中に）提供される。
【００２５】
別の具体的な実施形態では、本明細書中に提供される製造品は、(i) HlaにN結合されている5型莢膜多糖（CP5-Hla）を含む第1のバイオコンジュゲート；(ii) ClfAにN結合されている8型莢膜多糖（CP8-ClfA）を含む第2のバイオコンジュゲート；および(iii) キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖を含む第3のバイオコンジュゲートを含む。具体的な実施形態では、キャリアタンパク質にN結合されている第3の莢膜多糖は、CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、またはCP8-Hlaである。特定の実施形態では、第1、第2および/または第3のバイオコンジュゲートは、同じ組成物中に提供される。特定の実施形態では、第1、第2および/または第3のバイオコンジュゲートは、異なる組成物中に（例えば、別個の容器中に）提供される。
【実施例】
【００２６】
大腸菌でのCP5およびCP8の発現ならびにバイオコンジュゲートワクチン製造
細菌株、プラスミド構築物、プライマー、およびバイオコンジュゲートワクチン調製の詳細は、補足的方法にて提供されている。簡潔には、緑膿菌O11 O抗原遺伝子クラスター由来の遺伝子（wzzからwbpMまで）をPCRにより増幅し、黄色ブドウ球菌cap5HIJKまたはcap8HIJKを有するプラスミドにクローニングした。組み換えプラスミドを、リポ多糖および腸内細菌抗原発現に突然変異を含む大腸菌株に導入して、大腸菌でのCP5およびCP8の発現を生じさせた。Epaは無毒化のために改変され［19］、N末端シグナルペプチドは大腸菌DsbAシグナルペプチドに置換され、2つのグリコシル化コンセンサス配列が付加され［20］、C末端ヘキサヒスチジンタグが挿入された。1箇所のグリコシル化部位（glycosite）およびペリプラズム局在のためのシグナル配列を含むHlaH35Lの組み換え発現のための発現プラスミドは、黄色ブドウ球菌Hlaの、公表され［11、21］かつ無毒化された型に基づいて設計された。
【００２７】
PglBおよびEpaまたはHlaを含むプラスミドをCP5またはCP8を発現する大腸菌細胞に形質転換した。組み換えプラスミドを含む大腸菌を、対数増殖期まで増殖させ、PglBおよびEpaまたはHlaのうちのいずれかの発現を、1mM IPTGおよび0.2％アラビノースの添加により誘導した。37℃での一晩インキュベーション後、大腸菌を回収し、浸透圧ショックまたは高圧ホモジナイゼーションによりバイオコンジュゲートを抽出した［15、16］。バイオコンジュゲートワクチンを、サポート情報に詳細に記載される通りに、固定化金属アフィニティー、アニオン交換、ヒドロキシアパタイト、およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【００２８】
細菌培養
黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株、Reynolds（CP8）株、およびNewman株は、以前に記載された［9、22］。黄色ブドウ球菌LAC株およびST80株は、地域に関連したMRSA単離株である［23、24］。NRS 382（USA100）株およびNRS 383（USA200）株は、NIAID NIH契約番号第HHSN272200700055C号の下に支援された、黄色ブドウ球菌での抗生物質耐性に関するネットワーク（Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus）プログラムから取得した病院関連MRSA株である。菌血症研究およびオプソニン食作用殺菌（OPK）アッセイのために、黄色ブドウ球菌株を、2％NaClを添加したコロンビア寒天（Difco Laboratories社）上で37℃にて24時間培養した［9］。肺炎研究のために、ブドウ球菌を、記載された通りに対数増殖期まで増殖させたトリプシン大豆培養液（tryptic soy broth）（Difco社）培養から回収した［25］。
【００２９】
オプソニン食作用殺菌アッセイ
施設のガイドラインに則って承認された通りに、書面でのインフォームドコンセントを提供した健康なボランティアからヒト血液を収集した。慣用的なOPKアッセイ（0.5mL体積）を、記載された通りにヒト好中球を用いて行なった［26］。マイクロタイター系OPKアッセイは、Burton and Nahmにより記載されたものに基づいて行なった［27］。HL-60細胞（ATCC）を低継代（low passage）（＜3mo）で用い、10％加熱不活性化胎児ウシ血清（HyClone社）、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および0.25μg/mLアムホテリシン（Mediatech社）を添加した L-グルタミン含有RPMI 1640培地（Mediatech社）中で維持した。細胞を、記載された通りにN,N-ジメチルホルムアミドを用いて顆粒球へと分化させ［27］、それらの表現型をフローサイトメトリーにより確認した［27］。アッセイは96ウェルプレートで行ない、各ウェル（80μL）が、4×105個のHL60細胞、103CFU黄色ブドウ球菌、ウサギIgGまたはマウス血清、および補体（C’）供給源として1％モルモット血清（Cedarlane社）を含んだ。振盪しながら37℃にて2時間インキュベーションした後、HL60細胞を、20μLの1％Triton X-100の添加により溶解させた。サンプルは二重反復で播種し、CFU/mLでの変化（％）（すなわち、殺菌率）を、0時点でのものと比較した2時間後のCFU/mLでの減少として定義した。
【００３０】
Hla中和アッセイ
Hla（4HU/mL；Toxin Technology社）を、免疫化したマウス由来の血清の連続2倍希釈と共に1時間インキュベートした。等量の洗浄済み2％ウサギ赤血球を添加し、60分間インキュベートした。サンプルを200×gにて10分間遠心分離し、上清のOD545nmを測定した。各サンプルの溶血率（％）を4HUのHlaを用いて溶解された赤血球と比較した。50％の阻害力価を、勾配変化のあるS字曲線に対する非線形回帰を用いて算出した（PRISM 4ソフトウェア）。
【００３１】
動物感染試験
動物試験は、施設のIACUCガイドラインに従って実行した。Swiss-Websterマウス（Taconic Farms社またはCharles River Laboratories社から購入）を、皮下（SC）経路により0日目、14日目、および28日目に免疫化した。対照動物は、無関係のシゲラ属O抗原バイオコンジュゲートワクチン（O1-Epaまたは2a-Epa）を投与された。EPAコンジュゲートはAlhydrogel(登録商標)を用いて製剤化し、CP5-HlaはAdju-Phos(登録商標)を用いて製剤化して、最終的なAl3+濃度を0.06％とした。
【００３２】
マウスは、それぞれの免疫化前および細菌チャレンジ前に採血した。1：100に希釈した血清を、ポリ-L-リジン［28］または生来型Hla（1μg/mL）とカップリングさせた精製CP（4μg/mL）を用いてコーティングされたマイクロタイタープレートでのELISAにより試験した。最後の免疫化の2週間後、マウスに黄色ブドウ球菌を腹腔内（IP）経路により接種し、定量的血液培養をチャレンジ後2時間行なった［9］。体重減少および腎臓感染を4日目に評価し、培養データはマン・ホイットニーU検定により解析した。致死性肺炎モデルに対しては、マウスに鼻内経路により接種し［25］、生存データを、ログランク検定を用いて解析した（Prism 4ソフトウェア）。菌血症に対する受動免疫化に関して、マウスにチャレンジ24時間前にウサギIgG（300μg〜1mg）を静脈内（IV）投与した。細菌チャレンジの1〜2時間後に、培養のためにマウスを採血した。
【００３３】
致死性肺炎に対する受動免疫化のために、マウスに細菌接種の24時間（または24時間および4時間）前に1mgウサギIgGをIP注入した。T細胞枯渇試験のために、能動免疫化されたマウスに、黄色ブドウ球菌Newman株を用いた鼻内チャレンジの72時間前および24時間前に、ラット抗マウスCD4（クローンGK 1.5）mAbまたはラット抗マウスCD8a（クローン8 53-6.7）mAbのいずれかを500μg、IP注入した。CD4+細胞およびCP8+細胞の枯渇は、脾臓リンパ球のフローサイトメトリー分析により確認した。
【００３４】
結果
大腸菌での黄色ブドウ球菌CPの合成。黄色ブドウ球菌CPは、グラム陰性細菌でのO多糖合成のポリメラーゼ依存的経路に対する相同性を共有する保存された経路により、細菌膜キャリア脂質であるウンデカプレニルピロリン酸上にアッセンブルされる［29］。O抗原アッセンブリは、UDPドナーからウンデカプレニルリン酸への糖リン酸の転移から開始される。脂質連結型O抗原は、異なるグリコシルトランスフェラーゼの連続的作用により、内膜の細胞質側でアッセンブルされる。次に、糖脂質はペリプラズムへとフリップして、多量体化される。O抗原リガーゼWaaLをオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBを用いて置換することにより、多量体化されたO抗原を、リピドAコアではなく、選択されたタンパク質キャリアに転移させることができる［16］［30］。O抗原産生が欠損した大腸菌株で黄色ブドウ球菌CP5またはCP8を合成するために、本発明者らは、黄色ブドウ球菌および緑膿菌由来の既知機能を有する遺伝子を含有する、プラスミドに基づくキメラ遺伝子クラスターを構築した（図1A）。遺伝子クラスターは、各々が三糖反復単位の一部分としてFucNAc二糖を含むので、黄色ブドウ球菌CPと緑膿菌O11抗原との類似した構造に基づいて設計された［31、32］。大腸菌単糖生合成遺伝子と組み合わせて、これらの遺伝子によりコードされる酵素は、反復三糖単位からなる、ウンデカプレニルピロリン酸連結型CP5またはCP8多量体を合成すると予測された（図1B）。組み換えプラスミドを、O抗原リガーゼWaaLを欠失した大腸菌株へと形質転換し、細菌糖脂質を抽出した。弱酸処理により多糖をキャリア脂質から放出させ、2-アミノベンズアミド（2-AB）により標識し、HPLCにより分離した。CP5（図2A）およびCP8（図2B）の単一反復サブユニットを回収し、MALDI-Q TOF/TOF分析を用いて特性決定した。794.3の質量電荷比で見られた主要イオンを、MS-MSに供した。一連の断片イオンは、還元末端に2-ABを含むCP5およびCP8単一反復単位のNa付加物の予測されるイオンと一致した（図2、CおよびD）。CP5およびCP8サブユニットが多量化され、かつリピドAに転移したことを示すために、WaaLを発現する大腸菌細胞由来の全細胞抽出物のプロテイナーゼK消化物を調製し、SDS-PAGEにより分離した。遺伝子操作された大腸菌細胞は、CP5またはCP8多量体を合成し、これは、銀染色により可視化され、かつ黄色ブドウ球菌CP5特異的抗血清またはCP8特異的抗血清によりそれぞれプロービングされてウエスタンブロット上で認識された（図2、EおよびF）。
【００３５】
大腸菌での黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンの酵素的合成
大腸菌で黄色ブドウ球菌ワクチンを産生させるために、脂質結合型CPを、タンパク質キャリア抗原およびPglBの存在下で発現させた。これにより、タンパク質抗原のコンセンサス配列D-X-N-X-S/T［20］内のAsn残基へのキャリア脂質からの多糖の転移が可能になった。CP5またはCP8遺伝子クラスター、2箇所のグリコシル化コンセンサス配列を含むEpa、およびPglBを発現する大腸菌細胞を培養した。EpaおよびPglBの発現を誘導し、グリコシル化されたEpaを抽出および精製した。SDS-PAGE分析により、EpaおよびCP5（図2G）またはEpaおよびCP8（図2H）に対する抗体と反応した90〜170kDaのバンドのラダーが明らかになり、これは、黄色ブドウ球菌CP抗原を用いるEpaの多様なグリコシル化を示した。
【００３６】
第二世代ワクチン系を、大腸菌でブドウ球菌タンパク質抗原（Hla）をグリコシル化するために設計した。アミノ酸130にグリコシル化コンセンサス配列を含むHlaH35Lを構築した。CP5生合成、HlaH35L、およびPglBをコードする遺伝子を保持する大腸菌細胞を培養した。HlaH35LおよびPglBの発現を誘導し、CP5-HlaH35Lを精製した。SDS-PAGEに供されたCP5-HlaH35L糖コンジュゲートにより、HlaおよびCP5（図2I）に対する抗体と反応した55〜70kDaのバンドのラダーが明らかになった。この知見は、CP5を用いてHlaH35Lをグリコシル化できることを確認する。
【００３７】
マウスでのバイオコンジュゲートワクチンの免疫原性
CP5-Epa、CP8-EpaまたはCP5-HlaH35Lを用いてマウスを免疫化した。CP5-Epaワクチンは 0.2〜1μg CP5/マウスにて最適な免疫原性を示し（図3A）、CP8-Epaは0.2μg CP8にて良好な免疫原性を示した（図3B）。CP5-HlaH35Lは、0.2および2μg/マウスのCP5濃度で免疫原性であった（図3C）。至適HlaH35L用量は20μg/マウスであったので（図3D）、2μg CP5-20μg HlaH35Lワクチンがさらなる評価のために選択された。
【００３８】
バイオコンジュゲートワクチンは機能的抗体を生じさせる
HL60食細胞および血清補体の存在下で、CP5-EpaまたはCP5-HlaH35Lに対して生起されたウサギIgGはCP5陽性黄色ブドウ球菌Reynolds株およびNewman株に対してオプソニン性であった（図4A）。≧1μg/mLのIgG濃度が、ブドウ球菌接種材料のうちの50％以上の殺菌をもたらした。同様に、CP5-EpaまたはCP5-HlaH35Lを用いて免疫化されたマウス由来の血清は、CP5産生性黄色ブドウ球菌に対してOPK活性を示した（補足図1A）。CP5-Epaに対するウサギ抗体はまた、食細胞供給源としてヒト好中球が含められた際にも、黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株およびNewman株に対してオプソニン性であった（図4、BおよびC）。MRSA菌株であるUSA100株およびUSA200株（両方ともCP5陽性）もまた、CP5-Epa抗体、ヒト好中球、および血清補体の存在下で殺菌された（図4、DおよびE）。CP5抗体は、Reynolds（CP8）株に対してはオプソニン性でなかった。Reynolds（CP-）株は、抗体の添加なしで、好中球および補体により殺菌された（図4F）。ウサギCP8-Epa IgGは、≧1μg/mLの濃度で、黄色ブドウ球菌Reynolds（CP8）株およびMRSA菌株であるST80株（図4G）に対してオプソニン性であった。同様に、マウスCP8-Epa抗血清は、CP8陽性黄色ブドウ球菌株に対して良好なオプソニン活性を示した（補足図1B）。
【００３９】
Hlaに対する機能的抗体はその溶解活性を中和する。図4Hに示される通り、HlaH35LまたはCP5-HlaH35Lのいずれかに対するマウス血清は、生来型Hlaのin vitro溶解活性を中和した。20μg HlaH35Lを用いて免疫化されたマウスは、2μg CP5-20μg HlaH35Lを投与されたマウスよりも高い中和力価を示した。
【００４０】
バイオコンジュゲートワクチンは黄色ブドウ球菌菌血症からマウスを保護する
CP5-Epaまたはシゲラ属O1-Epaワクチンを用いて免疫化されたマウスに、黄色ブドウ球菌Reynolds（CP5）株をIPチャレンジした。CP5-Epaを投与されたマウスは、無関係なシゲラ属ワクチンを投与されたマウスと比較して、菌血症（図5A）、腎膿瘍形成（図5B）、および体重減少（図5C）から保護された。同様に、CP8-Epaを用いて免疫化され、Reynolds（CP8）株でチャレンジされた動物は、有意な菌血症の減少を示した（図5D）。
【００４１】
第二世代バイオコンジュゲートワクチンは、CP5を用いてグリコシル化されたブドウ球菌トキソイド（HlaH35L）を含んだ。CP5-HlaH35Lは、Reynolds（CP5）株のチャレンジにより誘発される菌血症（図5E）および関連する体重減少（図5F）に対して保護性であった。個々のマウスでは、CP5抗体レベルと菌血症レベルとの間には逆相関があり（図5G）、このことは、保護が、ワクチンが誘導する抗体により媒介されたことを確認する。
【００４２】
CP5-HlaH35LはCP5陽性およびCP8陽性黄色ブドウ球菌により引き起こされる致死性肺炎から保護する
マウスを、HlaH35L、CP5-HlaH35L、CP5-Epa、またはシゲラ属2a-Epaを用いて免疫化し、CP5陽性Newman株を鼻内チャレンジした。HlaH35LまたはCP5-HlaH35Lを用いて免疫化されたマウスは、致死性肺炎から保護された。CP5-Epaを用いて免疫化されたマウスが、シゲラ属2a-Epaを投与されたマウスと同様に感染によって死亡したので、CP5抗体は保護を媒介しなかった（図6A）。HlaH35LおよびCP5-HlaH35Lワクチンはまた、CP陰性菌株であるUSA300 LAC株（図6B）およびCP8陽性MRSA菌株であるST80株（図6C）により引き起こされる致死性肺炎からも保護した。HlaH35LがCP5-HlaH35LよりもHlaに対して高い中和抗体応答を惹起した（図4H）という事実にも関わらず、2種類のワクチンにより惹起される肺炎に対する保護は同程度であった。つまり、黄色ブドウ球菌HlaのCP5グリコシル化は、バイオコンジュゲートワクチンの保護効果を拡大して、菌血症（図5E）および致死性肺炎（図6、A〜C）の両方からマウスを保護するようにした。
【００４３】
T細胞は致死性肺炎に対するCP5-HlaH35L媒介保護に関して重要でない
本発明者らの受動免疫化実験（下記）および以前の報告［13、33］は、Hla抗体単独で黄色ブドウ球菌致死性肺炎に対して保護性であることを示唆する。ブドウ球菌性肺炎に対する免疫での12種類のT細胞の考えられる役割を調べるために、本発明者らは、CP5-HlaH35Lまたはシゲラ属2a-Epaを用いてマウスを免疫化した。動物には、500μgラット抗マウスCD4（クローンGK 1.5）mAbまたはラット抗マウスCD8a（クローン53-6.7）mAbを、黄色ブドウ球菌Newman株チャレンジの72時間前および24時間前に投与した、対照マウスにはPBSを投与した。CD4+細胞またはCP8+細胞の枯渇は、処置した動物由来の脾細胞のフローサイトメトリー分析により確認した。対照CP5-HlaH35L免疫化マウスおよびT細胞枯渇に供されたマウスは致死性肺炎モデルにて同様の生存を示し、一方で、シゲラ属2a-Epaを用いて免疫化したマウスは感染により死亡した（図6D）。これらの結果は、致死性黄色ブドウ球菌肺炎に対するCP5-HlaH35L媒介保護に関して、T細胞は重要でないことを示す。
【００４４】
バイオコンジュゲートワクチンに対する抗体は菌血症および致死性肺炎から保護した
黄色ブドウ球菌のIPチャレンジの1日前に、マウスを、CP5-Epa、CP8-Epa、またはCP5-HlaH35Lに対するウサギIgGを用いてIV投与にて受動免疫化した。シゲラ属O1-Epa抗体と比較して、CP5-Epa抗体は、Reynolds（CP5）株（図7A）およびMRSA菌株であるUSA200株（図7B）により引き起こされる菌血症に対して保護性であった。同様に、Reynolds（CP8）株菌血症は、CP8-Epaに対する抗体により有意に減少した（図7C）。CP5-HlaH35Lに対する抗体は、MRSA菌株USA100株（図7D）、Newman株（図7E）、およびReynolds（CP5）株（図7F）により引き起こされる菌血症を減少させた。CP5-EpaまたはCP5-HlaH35Lのいずれかに対する抗体が菌血症を減少させた一方で、黄色ブドウ球菌HlaH35Lまたはシゲラ属2a-Epaに対する抗体が保護をもたらさなかったので、保護はCP特異的であった（図7F）。
【００４５】
鼻内細菌チャレンジの24時間前にIP投与されたCP5-HlaH35LIgGを用いた受動免疫化は、Newman株により引き起こされる致死性肺炎に対して限定的な保護をもたらした（図7G）。しかしながら、2回目のIgG用量が細菌接種の4時間前に投与された場合は、CP5-HlaH35Lを投与されたマウスのうちの90％が致死性の接種材料から生き残った（図7H）。
【００４６】
考察
病院および地域社会での黄色ブドウ球菌の有病率の増加および抗生物質に対するその拡大する抵抗性は、この微生物に対する予防的ワクチンの必要性を際立たせてきた。しかしながら、有効なブドウ球菌ワクチンの開発は、捉えどころのないままであった。CPまたは黄色ブドウ球菌鉄表面決定因子Bに基づく13種類の単一成分ワクチンを用いた能動免疫は、第三相臨床試験にて侵襲性疾患から患者を保護することができなかった。［6、7、34、35］。同様に、クランピング因子Aまたはリポタイコ酸を標的とする受動免疫化戦略は、未熟児でのブドウ球菌敗血症を予防しなかった［7］。現在の試みは、複数のブドウ球菌毒性因子を標的とするワクチンの調製に向けられている。好中球による毒素中和およびオプソニン食作用殺菌を媒介する抗体の重要性に加えて、T細胞に基づく免疫が、特定のタンパク質抗原により引き起こされるワクチン媒介保護に対して重要であることが、動物感染モデルで、最近示された［7、36〜38］。
【００４７】
好中球によるオプソニン食作用殺菌は黄色ブドウ球菌の宿主クリアランスに対して重要な成分であるので、本発明者らは、オプソニン抗体を惹起するブドウ球菌CPを標的としてきた。バイオコンジュゲートワクチンの製造は複雑かつ高価であり、組み換えタンパク質の調製ならびに複合多糖の抽出および精製を必要とする。化学的コンジュゲート化の非特異的な性質により、化学的にコンジュゲート化されたワクチンは不均質であり、バッチ間で変動し、かつ多くの場合に低収率で生成される。さらに、タンパク質抗原への多糖の慣用のコンジュゲート化は変性性化学物質を必要とし、これはタンパク質キャリアまたは一部の不安定な多糖に影響を及ぼして、重要なエピトープの変化をもたらす可能性がある。
【００４８】
本発明者らは、タンパク質変性のリスクを伴わずに、関連する黄色ブドウ球菌タンパク質への黄色ブドウ球菌CPのコンジュゲート化を可能にする新規技術を開発した。カンピロバクター属オリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBは、オリゴ糖を特異的タンパク質コンセンサス配列に転移させることができ［20］、これにより細菌細胞での糖タンパク質の産生を可能にする。このタンパク質グリコシル化系は、大腸菌へと機能的に移転されている［15］。このグリコシル化機構を用いて、様々な多糖を組み換えタンパク質へと転移させることができ、これにより、新規ワクチンとして活用できるバイオコンジュゲートの製造を可能にする。バイオコンジュゲートワクチンのロットは均質であり、T細胞免疫応答を阻害するために、製造の途中で遊離の多糖が存在しない。バイオコンジュゲートは大腸菌で産生されるので、多糖抽出のために毒性生物の増殖は必要とされない。
【００４９】
本研究では、本発明者らは、CP5-EpaおよびCP8-Epaバイオコンジュゲートワクチンの産生、精製、および有効性を実証した。また、本発明者らは、緑膿菌O11抗原の二糖中間体が黄色ブドウ球菌グリコシルトランスフェラーゼに対する基質として機能し得ることを示し、これにより、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のグリコシルトランスフェラーゼを組み合わせることができることを初めて示した。バイオコンジュゲートワクチンはマウスおよびウサギでオプソニン性抗体を惹起し、能動免疫化および受動免疫化戦略は実験的菌血症からマウスを保護した。第二世代バイオコンジュゲートワクチン（CP5-HlaH35L）は、同じ微生物に由来する、共有結合されたタンパク質および多糖抗原の潜在能力を示すための重要な概念実証製品（proof-of-concept product）であった。CP5-Epaを投与された動物と同様に、CP5-HlaH35Lを用いて免疫化されたマウスは、数種類のCP5陽性黄色ブドウ球菌単離株により引き起こされる菌血症から保護された。重要なことに、CP5-HlaH35Lワクチンは、血清型5、血清型8、または莢膜陰性黄色ブドウ球菌株により引き起こされる致死性肺炎からもマウスを保護した。つまり、CP5-HlaH35Lバイオコンジュゲートワクチンは、菌血症（CP5抗体により媒介される）および致死性肺炎（HlaH35L抗体により媒介される）に対する保護有効性を示した。
【００５０】
コンジュゲートワクチン開発のためのこの新規な糖エンジニアリングアプローチ（glyco-engineering approach）は、産業界に大改革をもたらし得るであろう。CP5、CP8、およびHlaH35Lを含む三価黄色ブドウ球菌ワクチン候補（本明細書中に記載される）は、機能的抗体を惹起し、様々な動物モデルで広範囲に保護をもたらす。CP8を用いる黄色ブドウ球菌表面タンパク質のグリコシル化が達成されており、現在、製造および試験が行われている。糖エンジニアリング技術（glycoengineering technology）は、それに対してタンパク質または多糖抗原のみでは広範な保護をもたらすのに十分ではない黄色ブドウ球菌などの微生物病原体に対する、明確に定義された、新規かつ有効なワクチンの開発を可能にする。さらに、タンパク質抗原への莢膜抗原のコンジュゲート化は、別個の莢膜コンジュゲートおよびタンパク質成分を含有するワクチンと比較して、注入される成分の減少を可能にする。
【００５１】
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【００５２】
補足的方法
Epa、HlaH35L、CP5、およびPglBを発現するプラスミド
バイオコンジュゲートワクチンの調製のために用いられる細菌株およびプラスミド構築物は、表S1に記載される。緑膿菌Epaは、バイオコンジュゲートワクチン製造のために最初に用いられたキャリアタンパク質であった。以下の通りに、Epaを無毒化のために改変し［1］、N末端シグナルペプチドを大腸菌DsbAシグナルペプチドで置換し、2箇所のグリコシル化コンセンサス配列を付加し［2］、かつC末端ヘキサヒスチジンタグを挿入した。
【００５３】
大腸菌シグナル配列、HAタグ、および成体ウシリボヌクレアーゼBを、オリゴヌクレオチドP1-F/R（表S2にすべてのプライマーが列挙されている）および鋳型DNAとしてpSVSPORT/RNAseを用いるPCRにより調製した［3］。アンプリコンを、VspIおよびEcoRIを用いて処理し、pEC415へとクローニングし、pMIK11を得た。C末端に融合されたヘキサヒスチジンタグを有する緑膿菌DSM1117株由来の成熟エキソタンパク質A配列（toxA）をコードするインサートによる置換のために、HA RNaseセグメントを、NdeIおよびEcoRI消化によりプラスミドから除去した。toxAを、オリゴヌクレオチドP2-F/Rを用いたPCRにより増幅し、NheIおよびEcoRIを用いて消化し、pMIK11へとライゲーションした。N末端に生じたアミノ酸配列は、MKKIWLALAGLVLAFSASAAEEA（配列番号1）であった。QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit（Stratagene社）を使用し、オリゴヌクレオチドP3-F/Rを用いて、toxAへと無毒化突然変異L552V、ΔE553を導入した。さらなるQuikChange突然変異導入を、得られたプラスミド（p70）に対して行なって、オリゴヌクレオチドP4-F/Rを用いてtoxAのアミノ酸A376付近にSmaI部位を導入し、p88を得た。グリコシル化部位を導入するために、SmaIを用いてp88を消化し、2つのアニーリングされた相補的リン酸化オリゴヌクレオチド（P5-F/R）から構成されるカセットを、切断されたベクターにライゲーションし、p137を得た。オリゴヌクレオチドP6-F/Rを用いるQuikChange突然変異導入により、p150を生成させるためにp137へと追加のグリコシル化部位を挿入した。
【００５４】
1箇所のグリコシル化部位（glycosite）を有するHlaH35Lの組み換え発現のための発現プラスミドを、黄色ブドウ球菌Hlaの、公表され［4、5］かつ無毒化された型に基づいて設計した。具体的には、大腸菌 DsbAのシグナル配列に対するコード配列を、成熟HlaH35Lタンパク質のコード配列に、その上流かつインフレームで融合させ、次に下流のヘキサヒスチジンタグを融合させた、Hlaの公表された構造に基づき［6］、融合された配列のアミノ酸130に、合理的設計によりグリコシル化部位を導入した。グリコシル化部位およびヘキサヒスチジンタグを含む、成熟型の、シグナルペプチドが切断されたHlaH35LをコードするDNAを、商業的供給者により合成し、p150のNheIおよびSalI部位へとサブクローニングして、プラスミドp570を得た。
【００５５】
大腸菌で黄色ブドウ球菌CP5の生合成経路遺伝子の組み換え発現のためのプラスミドを生成させるために、マルチクローニング部位（MCS）を、オリゴカセットP7-F/Rを用いてpLAFR1［7］のEcoRI部位に挿入し、プラスミドp336を得た。緑膿菌O11 O抗原遺伝子クラスター（wzzからwbpMまで）を、オリゴヌクレオチド（oligos）P8-F/Rを用いてPCRにより緑膿菌PA103株のゲノムDNAから増幅し、Bsu36IおよびPciIを介してpLAFR1 MCSへとクローニングし、プラスミドp341を得た。pACT3（cap5H-HA）およびpEXT22（cap5I-myc/cap5J-FLAG）へと、黄色ブドウ球菌cap5HはHAタグを含んでサブクローニングし、cap5Iはmycタグを含んでサブクローニングし、cap5JはFLAGタグを含んでサブクローニングした［8］。本発明者らは、以下のプライマーを用いて、黄色ブドウ球菌Mu50株のゲノムDNAからPCRによりcap5遺伝子を増幅した：(i) cap5H-HA：P9-F/R、(ii) cap5I-myc：P10-F/R、(iii) cap5J-FLAG：P11-F/R。p341内で、O11-wbjA-wzy遺伝子を、Datsenko & Wanner［9］の方法を用いて、黄色ブドウ球菌cap5HIJ遺伝子と置き換えた。cap5H-HA-cap5I-myc-cap5J-FLAG断片を、鋳型としてpACT3-cap5-HAおよびpEXT22-cap5I-myc-cap5J-FLAGならびに以下のプライマーを用いる重複PCRにより第1ステップで一緒に増幅した：(i) PCR1（cap5H-HA増幅）：P12-F/R、(ii) PCR2（cap5I-myc-cap5J-FLAG増幅）：P13-F/R、(iii) 重複PCR3（cap5H-HAをcap5I-myc-cap5J-FLAGとつなぎ合わせる）：P14-F/R。第2の重複PCRでは、PCR鋳型としてそれぞれ重複PCR3からのPCR産物およびpKD3［9］、ならびに以下のプライマーを用いて、つなぎ合わせられたcap5H-HA-capI-myc-capJ-FLAG遺伝子を選択マーカー（cat）に融合し、これはFLP認識標的（FRT）部位に隣接された：(i) PCR4（FRT隣接cat遺伝子の増幅）：P15-F/R、(ii) 重複PCR5（cap5H-HA-capI-myc-capJ-FLAGをcat遺伝子につなぎ合わせる）：P16-F/R。得られたPCR産物をpKD46［9］およびp341を含むDH5α細菌へと形質転換し、クロラムフェニコール耐性コロニーを記載された通りに選択し［9］、p345を生成した。CP5特異的フリッパーゼをコードする遺伝子cap5Kを、プライマーP17-F/Rを用いて黄色ブドウ球菌Mu50株のゲノムDNAからPCRにより増幅し、それにより、HAタグを導入した。アンプリコンを、MssIおよびAlw44Iを介してcap5J-FLAGの下流にてp345へとサブクローニングし、プラスミドp393を得た。
【００５６】
1つのプラスミド中でCP5およびPglBの発現をコードする遺伝子を組み合わせるために、HAタグ付けpglBに対する遺伝子を、重複PCRを用いて大腸菌O121株由来のO抗原遺伝子クラスターに由来する構成的プロモーターと組み合わせ、p393へとクローニングした。O121 rfbプロモーター領域を、鋳型として大腸菌O121株由来のO121 O抗原クラスターを含むp331を用いて、オリゴヌクレオチド対P18-F/Rを用いる第1のPCRで増幅した［10］。HAタグ付けpglBに対する遺伝子を、鋳型としてPglB発現プラスミドp114［11］を用いて、オリゴヌクレオチド対P19-F/Rを用いる第2のPCRで増幅した。第3の重複PCRを用いて、オリゴヌクレオチドP20-F/Rならびに鋳型として第1および第2のPCRからのPCR産物を用いることにより、O121プロモーター領域を増幅し、pglB遺伝子と組み合わせて、1つのPCR産物とした。重複PCR産物（O121-pglB）を、PscI制限部位を介してp393へとクローニングし、プラスミドp484を得た。
【００５７】
大腸菌での黄色ブドウ球菌CP8の生合成経路遺伝子の組み換え発現のためのプラスミドを生成させるために、上記のプラスミドp345中に存在するcap5HIJクラスターを、制限エンドヌクレアーゼBspTIおよびAlw44Iを用いてcap8HIJクラスター（p327に由来する、下記を参照されたい）により置き換え、プラスミドp405を得た。このcap8HIJ遺伝子クラスターは、Mycタグ（cap8H）、FLAGタグ（cap8I）およびHAタグ（cap8J）もまたコードするコドン使用頻度が最適化されたORFとして、GenScript Inc.により合成され、pUC57へとクローニングされ、プラスミドp327を生じた。さらに、cap8HIJK遺伝子を、黄色ブドウ球菌MW2株由来のゲノムDNAを用いて増幅し、BspTIおよびAlw44Iを用いてp345へとサブクローニングして、それにより、cap5HIJをcap8HIJKにより置き換えて、プラスミドp404を得た。このプラスミドは、2つのAlw44I部位（5’および3’）およびHAタグに対するORF（3’）を導入するオリゴヌクレオチド対P21-F/Rを用いてcap8Kを増幅するためのPCRで、鋳型として機能した。PCR産物を、Alw44Iを介してp405へと自発的に（unforced）クローニングし、p413をもたらした。このプラスミド内で、O11 wzz-wzxに対する遺伝子をMCSにより置き換えた。この目的のために、オリゴヌクレオチド対P22-F/Rをアニーリングさせ、Eco81IおよびBspTIを介してp413プラスミドへとライゲーションして、プラスミドp555を生じさせた。オリゴヌクレオチドP23-F/Rをアニーリングさせることにより得られた構成的活性プロモーターを、SanDIおよびBspTIを介してプラスミドp555へとクローニングして、プラスミドp564を得た。
【００５８】
大腸菌株の構築
菌株StGVXN1690を、CP5-EpaおよびCP8-Epaの産生のためにDatsenko and Wanner［9］の方法により構築した。最初に、大腸菌W3110のwaaL遺伝子を、LPS合成を無効にするために、cat耐性カセットにより置換した。オリゴヌクレオチドP24-F/Rを、鋳型としてpKD3を用いるcatカセットのPCRのために用いた。PCR産物は、FRT部位に隣接されるcat発現カセットをコードした。waaLの欠失およびcatカセットの挿入後、waaLの不在をコロニーPCRにより評価した。加えて、LPSが産生できないことを、ノックアウトを確認するための銀染色により分析した。catカセットを部位特異的FLP駆動性組み換えにより記載された通りに除去し［9］、追加の染色体突然変異を導入した。腸内細菌共通抗原（ECA）の合成を防ぐために、遺伝子クラスター中のrmlBからwecGまでの遺伝子の範囲を、pKD3から生成されたPCR産物およびオリゴヌクレオチドP25-F/Rを用いて欠失させた。突然変異導入を、(i) 突然変異体および突然変異型DNA領域に隣接するプライマーから生成されるPCR産物の配列決定、(ii) 銀染色を用いるLPS形成の不在の確認、ならびに(iii) プロテイナーゼK処理細胞抽出物およびECA検出のためのモノクローナル抗体からの免疫ブロットでのECAの不在を示すことにより確認した［12］。
【００５９】
大腸菌StGVXN1717株を、StGVXN1690株を作製するために用いたものと同様の方法により調製した。waaL遺伝子を欠失させ、catカセットを除去し、続いて、ECAクラスター由来のwecAおよびwzzE遺伝子を、pKD3からPCR生成されたcatカセットおよびオリゴヌクレオチドP26-F/Rを用いて欠失させた。部位特異的FRT組み換えによるcatの除去後、rmlB-wecG DNA断片を、上記の通りに別のcatカセットにより染色体上で置き換えた。
【００６０】
ウンデカプレニルピロリン酸（Und-PP)結合CP5およびCP8グリカンの分析
O抗原グリカンを、大腸菌StGVXN1690株で分析した。p393を用いて細胞を形質転換することによりCP5を発現させ、p564を用いて細胞を形質転換することによりCP8を発現させた。菌株を、振盪フラスコ中で一晩増殖させた。A600nmが400に相当する細胞を回収し、0.9％NaClを用いて1回洗浄し、凍結乾燥した。CP5およびCP8を抽出し、記載された通りに分析した［10］。
【００６１】
バイオコンジュゲートワクチンの製造
7Lのバッチ培地（酵母抽出物［BD社］10g/L、大豆ペプトン［Organotechnie社］20g/L、グリセロール53g/L、56mMリン酸塩、5mMクエン酸塩、2mM MgCl2、および微量元素）を含む15Lバイオリアクター（New MBR AG）を、CP5-EPAを産生させるためには大腸菌StGVXN1690 p150、p114およびp393株を用い、またはCP5-HlaH35Lを産生させるためには大腸菌StGVXN1717 p570およびp484株を用いて、0.05のOD600nmまで接種した。培養物を好気条件下で37℃にて増殖させた。40のOD600nmにて、1mM IPTG（CP5-EPAのみの産生に対して）および0.2％アラアビノースを用いて細菌細胞を誘導した。誘導に続いて、流速186g/hでの一定供給（180g/Lグリセロール、100g/L大豆ペプトン、33mM MgSO4、1mM IPTGおよび微量元素）を開始した。誘導の15時間後、遠心分離により細菌細胞を回収し、0.9％NaClを用いて洗浄し、200のOD600nmまで、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）結合バッファー（30mM Tris、500mM NaCl、pH8）中に懸濁した。細菌を、APV1000（APV Manufacturing社）中で800barにてホモジナイズし、続いて、遠心分離して、上清として清浄化ホモジネートを得た。
【００６２】
CP8-Epaの産生のために、10mM MgCl2を添加したTerrific培地（Terrific broth）に、大腸菌（StGVXN1690 p150、p114およびp564）の一晩培養物を接種し、37℃にて振盪しながらインキュベートした。1mM IPTGおよび0.1％アラビノースを用いて0.9のOD600nmにて培養物を誘導し、次の日に、バイオマスを回収した。細菌細胞を、0.9％NaClを用いて洗浄し、溶解バッファー（30mM Tris HCl pH8.5、1mM EDTA、20％スクロース）中にOD600nm 20まで懸濁した。1mg/mLリゾチーム（Sigma-Aldrich社）中で30分間、4℃にて撹拌しながらインキュベートした後、サンプルを遠心分離し、可溶性ペリプラズム抽出物を得た。
【００６３】
バイオコンジュゲートワクチンの精製
CP5-EPAを、以下の通りに、IMACに始まり、次にアニオン交換を行ない、最後にサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行なう3種類のクロマトグラフィーステップを用いて精製した：60mL Ni-セファロースビーズ（GE-Healthcare社）を清浄化ホモジネートに添加した。糖タンパク質が結合したビーズをIMAC結合バッファーを用いて洗浄し、クロマトグラフィーカラムに充填した。充填されたカラムを6倍カラム容量（CV）のIMACバッファーA（30mM Tris、200mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8）を用いて洗浄し、続いて、15CVの0％〜100％IMACバッファーB（30mM Tris、200mM NaCl、500mMイミダゾール、pH8）の線形勾配を用いて溶出した。画分をSDS-PAGEにより分析し、糖タンパク質を含有する画分をプールして、QバッファーA（10mM Tris、pH7）を用いて6.5mS/cmの伝導度まで希釈した。希釈されたサンプルを、60mL Q Ceramic HyperD F（Pall AG）クロマトグラフィーカラムにロードし、4CVのQバッファーAを用いて洗浄し、15CVの0〜100％QバッファーB（10mM Bis-Tris、500mM NaCl、pH7）の線形勾配を用いて溶出した。画分をSDS-PAGEにより分析し、糖タンパク質を含有する画分をプールした。サンプルを、10kDaカットオフ115cm2 mPES中空線維（Spectrum Europe B.V.）を用いる接線流ろ過により25mLまで濃縮した。濃縮サンプルの12.5mLのアリコートを、320mL Superdex 200（GE Healthcare社）を充填したXK26/60カラム（GE Healthcare社）にロードした。1×PBS（Amresco社）を用いる定組成溶離（isocratic elution）から得られた画分をSDS-PAGEにより分析し、糖タンパク質を含有する画分をプールして、−80℃で保存した。
【００６４】
CP5-HlaH35Lを、CP5-EPAについて記載した通りに、IMACから始まり、SECで終了する4種類の連続的精製ステップにより精製した。中間の精製ステップでは、アニオン交換およびそれに続くヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、以下の通りに行なった。IMACから得られたプールした画分を、ANXバッファーA（10mM Tris pH7.5）を用いて3mS/cmの伝導度まで希釈し、16mLベッド体積ANX Sepharose 4 Fast Flow (High Sub)（GE Healthcare社）カラムにロードした。5CV ANXバッファーAを用いてカラムを洗浄し、生成物を、0〜100％ANXバッファーB（10mM Tris、1M NaCl、pH 7.5）の線形勾配を用いて溶出した。糖タンパク質を含有する画分をプールし、リン酸塩濃度を、500mM NaH2PO4を用いて5mMに調整し、5mMリン酸バッファー（pH7.2）を用いて伝導度を10mS/cmに調整した。サンプルを、14mLセラミックヒドロキシアパタイトタイプI（Bio-Rad Laboratories社）カラムにロードし、6CV HAバッファーA（10mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH6.8）を用いて洗浄し、0〜100％HAバッファーB（10mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、pH6.8）の線形勾配を12CVにわたって用いて溶出した。糖タンパク質を含有する画分をプールし、5kDa PES Pellicon接線流ろ過メンブレン（Millipore社）に対して12mLまで濃縮した。SECを、CP5-EPAに関して記載した通りに行なった。
【００６５】
CP8-EPAを、IMACに始まり、続いて2種類のアニオン交換クロマトグラフィーステップを行ない、最後にサイズ排除クロマトグラフィーを行なう4種類のクロマトグラフィーステップを用いて精製した。30mM Tris pH8、500mM NaCl、および10mMイミダゾールpH8を添加したペリプラズム抽出物を、5mL HisTrapカラム（GE Healthcare社）にロードした。カラムを、5CV HisTrap洗浄バッファー（30mM Tris pH8、200mM NaCl、10mMイミダゾール）を用いて洗浄し、続いて、100％HisTra溶出バッファー（30mM Tris pH8、200mM NaCl、500mMイミダゾール）を用いて溶出した。画分をSDS-PAGEにより分析し、糖タンパク質を含有する画分をプールして、PallQバッファーA（20mM L-His pH6.0）中に5mS/cmまで希釈した。希釈したサンプルを、10mL Q Ceramic HyperD F（Pall AG）クロマトグラフィーカラムにロードし、5CVのPallQバッファーAを用いて洗浄し、20CVの0％〜100％PallQバッファーB（20mM L-His pH6.0、1M NaCl）の線形勾配を用いて溶出した。画分をSDS-PAGEにより分析し、糖コンジュゲートを含有する画分をプールして、SourceQバッファーA（20mM BisTris pH6.0）中に5mS/cmまで希釈した。希釈されたサンプルを10mL Source 15Q（GE Healthcare社）クロマトグラフィーカラムにロードし、5CVのSourceQバッファーAを用いて洗浄し、20CVの0％〜100％SourceQバッファーB（20mM Bis Tris pH6.0、1M NaCl）の線形勾配を用いて溶出した。画分をSDS-PAGEにより分析し、糖コンジュゲートを含有する画分をプールして、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitをUltracel-30メンブレン（Millipore社）と共に用いて、0.5mLまで濃縮した。Superdex 200 10/300 GLを予備充填したゲルろ過カラム（GE Heathcare社）にサンプルをロードした。1×PBSを用いた定組成溶離（isocratic elution）から得られた画分をSDS-PAGEにより分析し、糖タンパク質を含有する画分をプールして、4℃にて保存した。
【００６６】
フレキシネル赤痢菌（Shigella flexneri）2a-EPAを含有するホモジネートを、500kDa mPES中空線維（Spectrum社）に対する接線流ろ過により清浄化し、Q Ceramic HyperD F（Pall社）クロマトグラフィーマトリックスに対して精製し、続いて、Source 15Qビーズ（GE Healthcare社）を用いる第2のアニオン交換精製ステップを行なった。CP5-EPAに関して記載された通りのSECを、最終精製ステップとして行なった。志賀赤痢菌（S. dysenteriae）O1-EPAを、Source 15Qビーズをマトリックスとして用いる2種類のアニオン交換クロマトグラフィーステップと、それに続く、CP5-EPAに関して記載された通りのSECステップにより精製した。
【００６７】
黄色ブドウ球菌ワクチンおよび対照のシゲラ属ワクチンのエンドトキシン濃度は同等であり、39〜557EU/mgタンパク質の範囲であり、平均して155EU/mgタンパク質であった。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
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【００７０】
等価物及び参照による援用：
本明細書に記載した実施形態は、単なる例示を意図するものであり、当業者であれば、本明細書に記載の具体的な手順に対する数多くの等価物を認識し、又は単に慣用的な実験を用いて実施することができるだろう。そのような等価物は全て本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の実施形態に包含される。本明細書で引用するすべての参考文献（特許出願、特許及び刊行物など）は、個々の刊行物又は特許又は特許出願がすべての目的のために参照により組み込まれていると具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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