(57)【要約】本明細書に、薬物に対する被検体のがん性腫瘍の感受性を解析し、薬物へのがん性腫瘍への応答を予測し、がん性腫瘍を有する被検体の予後を判定し、被検体のための個別化された治療法及び治療戦略を展開するためのアッセイ、方法及びキットが記載される。アッセイ、方法及びキットは、遺伝子やタンパク質の発現プロファイル又は被検体のがん性腫瘍のプロファイルを解析し、被検体のがん性腫瘍からのがん細胞において候補薬物を試験し、卵巣細胞やファローピウス管細胞の起源細胞の遺伝子発現プロファイルに基づいて被検体のがん性腫瘍を分類することを含む。これらの方法を使用して、適切な薬物（又は薬剤）が同定され、被検体をその薬剤で治療することができ、個別化された治療がその被検体のために展開可能である。
2016523527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体のがん性腫瘍の抗腫瘍薬に対する感受性を解析するため及び被検体のための個別化治療を展開するための方法であって、当該方法は、
（ａ）前記被検体のがん性腫瘍からがん細胞を得るステップと；
（ｂ）前記がん性細胞内のタンパク質又はｍＲＮＡのセットの発現を試験するステップであって、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する過剰発現又は低発現が前記抗腫瘍薬に対する抵抗性に関連することを特徴とし；
（ｃ）タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する過剰発現又は低発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の抵抗性と相関させ、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する正常な発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の感受性と相関させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記抗腫瘍薬は、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン及びＰＬＸ４７２０からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットは前記被検体のがん性腫瘍において前記コントロールに対して過剰発現又は低発現し、前記方法は前記被検体のがん性腫瘍に対して抵抗性の前記抗腫瘍薬とは異なる抗腫瘍薬を前記被検体に投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異なる抗腫瘍薬は、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン及びＰＬＸ４７２０からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットは前記コントロールに対して正常に発現し、前記方法は前記被検体に対して前記抗腫瘍薬を投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗腫瘍薬はタキソール又はビンクリスチンであり、タンパク質の前記セットは、チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、表皮型脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／Ｍｅｋ、Ｎ−カドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣα、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化ガンマ２、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、シグナル伝達性転写因子３及びシグナル伝達性転写因子５からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットの前記コントロールに対する過剰発現又は低発現を、タンパク質又はｍＲＮＡの第１のセットは前記コントロールに対して正常に発現するがん性腫瘍を有する第２の被検体と比較して前記被検体に対する不良な予後と相関させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記被検体は、卵巣がん腫瘍を有する女性のヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被検体のがん性腫瘍が感受性を有する抗腫瘍薬が同定されるまで、ステップｂ）及びｃ）を反復することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗腫瘍薬に対するがん患者のがん性腫瘍の応答を予測するため及び前記がん性腫瘍の治療のための患者の個別化治療を展開するための方法であって、当該方法は、
（ａ）前記患者のがん性腫瘍からがん細胞を得るステップと；
（ｂ）ＷＩＴ−ＯＣ、ＷＩＴ−Ｌ又はＷＩＴ−ＯＣｅ細胞培養培地内で前記がん細胞を培養するステップと；
（ｃ）前記培養がん細胞を前記抗腫瘍薬と接触させるステップと；
（ｄ）前記培養がん細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値を決定するステップと；
（ｅ）コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して増大したＩＣ５０又はＩＣ９０値を前記抗腫瘍薬に対する前記患者のがん性腫瘍の不良な応答と相関させるステップと、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して正常又は低いＩＣ５０又はＩＣ９０値を前記抗腫瘍薬に対する前記患者のがん性腫瘍の陽性応答とを相関させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記がん細胞は、前記患者からの腹水又は原発固形卵巣細胞から得られる卵巣がん細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗腫瘍薬は、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン及びＰＬＸ４７２０からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値はコントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して増大し、前記方法は第２の抗腫瘍薬を患者に投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の抗腫瘍薬は、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン及びＰＬＸ４７２０からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値は、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して正常又は低減されており、前記方法は前記抗腫瘍薬を患者に投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
がん性腫瘍を有する第２の患者からの培養がん細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値は、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して正常又は低減しており、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して増大したＩＣ５０又はＩＣ９０値を、前記患者に対して前記第２の患者と比較して不良な予後と相関させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者は、卵巣がん腫瘍を有する女性のヒトであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）１以上の内部コントロールとして１以上のＯＣＩ株と、
（ｂ）使用説明書と、
（ｃ）ＷＩＴ培地又はＷＩＴ培地の派生体と、任意に、
（ｄ）１以上のプローブを含むことを特徴とする被検体のがん性腫瘍の感受性を解析し、抗腫瘍薬に対する被検体のがん性腫瘍の応答を予測し、前記被検体のための個別化治療を展開するためのキット。
【請求項１９】
前記１又は２つ以上のプローブは、チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、表皮型脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／Ｍｅｋ、Ｎ−カドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣα、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化ガンマ２、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、シグナル伝達性転写因子３及びシグナル伝達性転写因子５からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質に対して特異的な少なくとも２つのプローブを含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
卵巣がん腫瘍を有する被検体の予後を判定するための方法であって、当該方法は、
ａ）前記被検体の腫瘍から試料を得るステップと；
ｂ）前記試料を遺伝子発現プロファイリングし、卵巣細胞に対してファローピウス管細胞でアップレギュレートされる遺伝子の第１のセット及びファローピウス管細胞に対して卵巣細胞でアップレギュレートされる遺伝子の第２のセットを含む発現プロファイルを得るステップと；
ｃ）前記遺伝子の第１及び第２のセットの発現レベルを決定するステップと；
ｄ）前記遺伝子の第２のセットのアップレギュレーションではなく、前記遺伝子の第１のセットのアップレギュレーションを、前記遺伝子の第１のセットはアップレギュレートされず、前記遺伝子の第２のセットはアップレギュレートされる卵巣がん腫瘍を有する第２の被検体と比較して疾患無憎悪生存予後と相関させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記遺伝子の第１のセットはＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６及びＯＳＢＰＬ３を含み、前記遺伝子の第２のセットはＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２及びＴＭＥＭ１６４を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現プロファイルの前記遺伝子の第１のセットはアップレギュレートされ、前記方法は前記被検体の卵巣がん腫瘍をファローピウス管様として分類するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現プロファイルの前記遺伝子の第２のセットはアップレギュレートされ、前記方法は前記被検体の卵巣がん腫瘍を卵巣様として分類するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体は、女性のヒトであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は、抗腫瘍薬を前記被検体に投与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、細胞生物学、分子生物学、腫瘍学及び医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行出願との関係
本出願は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる、２０１３年６月４日出願の仮出願第６１／８３０，７０９号を基礎とする優先権を主張する。
【０００３】
背景
がん細胞株を確立する方法の長年の改良方法の増加にもかかわらず、ヒトの原発腫瘍からの高品質で永続的な細胞株をルーチンで確立することは、未だに困難である。ヒト腫瘍の生物学的多様性を示すことはできない現在利用可能な腫瘍細胞株パネルにおいて、転移性、薬剤耐性がん表現型は示されていない。大多数のヒト腫瘍からの安定株の確立が不能なことは、ヒトのがんの研究のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用を制限してきた。種々の薬剤に対する患者の応答を予測する堅牢で有効なモデルシステムは、がん患者の個別化治療のための新薬の開発を大きく改善するであろう。したがって、処置に対する患者の応答を試験し、予測するための方法の開発の必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
薬剤に対する被検体の（例えば患者の）がん性腫瘍の感受性を解析するため、薬剤に対するがん性腫瘍の応答を予測するため、がん性腫瘍を有する被検体の予後を決定するため、前記被検体に対する個別化治療又は治療方法の展開のためのアッセイ、方法及びキットが、本明細書に記載される。特定の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）に耐性である患者の確認試験及び個々の患者に使用される特定の既存及び新たな薬剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、本明細書に記載のアッセイ及び方法を用いて達成することができ、がん治療のための個別化されたアプローチの展開を提供する。かかるアッセイは、ハイスループットスクリーニングアッセイ（例えば、一群、複数若しくは個体群の患者又は被検体及び薬剤のハイスループットスクリーニング）を含む。
【０００５】
よって、抗腫瘍薬（例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０等を含むが、これらに限定されない）に対する被検体のがん性腫瘍の感受性を解析するための方法及び被検体（例えば、卵巣がん腫瘍を有する女性のヒト）のための個別化治療を展開するための方法が、本明細書に記載される。前記方法は、（ａ）前記被検体のがん性腫瘍からがん細胞を得るステップと；（ｂ）前記がん性細胞におけるタンパク質又はｍＲＮＡのセットの発現を試験するステップと；（ｃ）タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する過剰発現又は低発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の耐性と相関させ、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する正常な発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の感受性と相関させるステップとを含み、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する過剰発現又は低発現が前記抗腫瘍薬に対する耐性に関連付けることを特徴とする。タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットが前記コントロールに比較して被検体のがん性腫瘍で過剰発現又は低発現する一実施態様では、前記方法は、前記被検体のがん性腫瘍が耐性である、前記抗腫瘍薬とは異なる抗腫瘍薬（例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン及びＰＬＸ４７２０など）を前記被検体に投与するステップをさらに含む場合がある。タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットが前記コントロールに対して正常に発現する一実施態様では、前記方法は、前記抗腫瘍薬を前記被検体に投与するステップをさらに含む場合がある。一実施態様では、前記抗腫瘍薬はタキソール又はビンクリスチンであり、タンパク質の前記セットは、チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、表皮型脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／Ｍｅｋ、Ｎ−カドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣα、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化ガンマ２、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、シグナル伝達性転写因子３及びシグナル伝達性転写因子５の少なくとも２つを含む。
【０００６】
前記方法は、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットの前記コントロールに比較して過剰発現又は低発現を、タンパク質又はｍＲＮＡの第１のセットは前記コントロールに比較して正常に発現するがん性腫瘍を有する第２の被検体と比較して前記被検体に対する不良な予後と相関させるステップをさらに含む場合がある。前記方法は、前記被検体のがん性腫瘍が反応する抗腫瘍薬が同定されるまで、ステップｂ）及びｃ）を反復することをさらに含む場合がある。
【０００７】
また、がん患者（例えば、卵巣がん腫瘍を有する女性のヒト）のがん性腫瘍の抗腫瘍薬（例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０など）に対する応答を予測するための方法及びがん性腫瘍の治療のための患者の個別化治療の展開方法が、本明細書に記載される。前記方法は、前記患者のがん性腫瘍からがん細胞を得るステップと；ＷＩＴ−ＯＣ、ＷＩＴ−Ｌ又はＷＩＴ−ＯＣｅ細胞培養培地において前記がん細胞を培養するステップと；前記培養がん細胞を前記抗腫瘍薬と接触させるステップと；前記培養がん細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値を決定するステップと；コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して増大したＩＣ５０又はＩＣ９０値を前記抗腫瘍薬に対する前記患者のがん性腫瘍の不良な応答と関連付けるステップと、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して正常又は低いＩＣ５０又はＩＣ９０値を前記抗腫瘍薬に対する前記患者のがん性腫瘍の陽性応答と関連付けるステップとを含む。前記がん細胞は、例えば、前記患者からの腹水又は原発固形卵巣細胞から得られる卵巣がん細胞である場合がある。一実施態様では、前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値は、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬の前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して増大し、前記方法は第２の抗腫瘍薬（例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０など）を患者に投与するステップをさらに含む。他の実施態様では、前記ＩＣ５０又はＩＣ９０値は、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値に対して、正常又は低減しており、前記方法は、前記患者に対して前記抗腫瘍薬を投与するステップをさらに含む。前記方法は、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値と比較して増大したＩＣ５０又はＩＣ９０値を、がん性腫瘍を有する第２の患者と比較して前記患者の不良な予後と関連付けるステップをさらに含む場合があり、ここで、前記第２の患者は、前記第２の患者からの培養がん細胞での抗腫瘍薬に対するＩＣ５０又はＩＣ９０値が、コントロール培養細胞における前記抗腫瘍薬のＩＣ５０又はＩＣ９０値と比較して正常又は低減しているがん性腫瘍を有する。
【０００８】
本明細書には、さらに、被検体のがん性腫瘍の感受性を解析し、抗腫瘍薬に対する被検体の（例えば、がん患者の）がん性腫瘍の応答を予測し、前記被検体のための個別化治療を展開させるためのキットを記載する。前記キットは、１以上の内部コントロールとして１以上のＯＣＩ株と；使用説明書と；ＷＩＴ培地又はＷＩＴ培地の派生体と；任意に、１以上のプローブとを含む。かかるキットでは、前記１以上のプローブは、以下のタンパク質：チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、表皮型脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／Ｍｅｋ、Ｎ−カドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣα、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化ガンマ２、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、シグナル伝達性転写因子３及びシグナル伝達性転写因子５のうち少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つなど）に対して特異的なプローブである場合がある。
【０００９】
また、卵巣がん腫瘍を有する被検体（例えば、女性のヒト）の予後を判定するための方法が、本明細書に記載される。前記方法は、前記被検体の腫瘍から試料を得るステップと；前記試料を遺伝子発現プロファイル化し、発現プロファイルは卵巣細胞と比較してファローピウス管細胞で上向き調節される遺伝子の第１のセット及びファローピウス管細胞と比較して卵巣細胞で上向き調節される遺伝子の第２のセットを含む；前記遺伝子の第１及び第２のセットの発現レベルを決定するステップと；前記遺伝子の第２のセットではなく、前記遺伝子の第１のセットの上向き調節を、前記遺伝子の第１のセットは上向き調節されず、前記遺伝子の第２のセットは上向き調節される卵巣がん腫瘍を有する第２の被検体と比較して不良な疾患無憎悪生存予後と相関させるステップとを含む。一実施態様では、前記遺伝子の第１のセットはＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６及びＯＳＢＰＬ３を含み、前記遺伝子の第２のセットはＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２及びＴＭＥＭ１６４を含む。前記発現プロファイルにおいて前記遺伝子の第１のセットが上向き調節されるある実施態様では、前記方法は、前記被検体の卵巣がん腫瘍をファローピウス管様として分類するステップをさらに含む場合がある。前記発現プロファイルにおいて前記遺伝子の第２のセットが上向き調節されるある実施態様では、前記方法は、前記被検体の卵巣がん腫瘍を卵巣様として分類するステップをさらに含む場合がある。前記方法は、前記被検体に、抗腫瘍薬を投与するステップをさらに含む場合がある。
【００１０】
特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、長さ又は翻訳後修飾、例えばグリコシル化又はリン酸化にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味するために同義的に使用される。
【００１２】
用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質又は特定の場合において、機能的な又は構造的なＲＮＡ分子をコードする核酸分子を意味する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの２つ又はそれ以上のヌクレオチド鎖を意味する。
【００１４】
用語「患者」、「被検体」及び「個体」は、本明細書において、互換的に使用され、治療される及び／又は生体試料を得る動物（例えば、ヒト、脊椎動物などの哺乳動物）を意味する。
【００１５】
核酸分子又はポリペプチドに言及する場合、「天然の」という用語は、天然由来の（例えば、野生型、ＷＴ）核酸又はポリペプチドを指す。
【００１６】
本明細書中で使用される、用語「ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地」、「ＷＩＴ−ｏｃ細胞培養培地」、「ＷＩＴ−ＯＣ培地」及び「ＷＩＴ−ｏｃ培地」は、互換的に使用され、腫瘍細胞（卵巣腫瘍細胞など）の培養に適した、１．０％ないし１０．０％ｖ／ｖの血清（好ましくは１．８％ｖ／ｖないし２％ｖ／ｖの血清、もっとも好ましくは約１．８％ｖ／ｖの血清）を含む細胞培養培地を指す。いくつかのかかる実施態様では、ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地は、０．１５μｇ／ｍＬないし０．３μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、好ましくは約０．１５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン及び／又は５．０μｇ／ｍＬないし５０．０μｇ／ｍＬのインスリン、好ましくは約１５．０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。類内膜腫瘍及び粘液性腫瘍由来の細胞などの特定の卵巣腫瘍細胞の培養に適したかかる実施態様では、ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地は、エストロゲン、例えば、３０ｎＭないし３００ｎＭの１７β−エストラジオール、好ましくは約１００ｎＭの１７β−エストラジオールの等価な力価の濃度で、エストロゲン（例えば、１７β−エストラジオール）をさらに含む。他の実施態様では、乳頭漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、がん肉腫及び未分化胚細胞腫、ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地由来の腫瘍細胞などの特定の卵巣腫瘍細胞の培養に適したこれらの培地等は、エストロゲンを実質的に含まない。培地で培養される細胞タイプに応じて、ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地はエストロゲンを含む場合も、エストロゲンを実質的に含まない場合もある。ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０４４６号及びＵＳ出願第
1452838614202_0
号に記載される。
【００１７】
語句「ＷＩＴ−ＦＯ細胞培養培地」、「ＷＩＴ−ｆｏ細胞培養培地」、「ＷＩＴ−ＦＯ培地」及び「ＷＩＴ−ｆｏ培地」は、本明細書で互換的に使用され、ファローピウス管及び卵巣上皮細胞に最適なＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地の改変型を意味する。ＷＩＴ−ｆｏ培地は、いくつかの補助剤で改変され、最終濃度０．５ないし１％の血清とし、ＥＧＦ（０．０１ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｅ９６４４）、インスリン（２０ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｉ０５１６）、ヒドロコルチゾン（０．５ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｈ０８８８）及び２５ｎｇ／ｍＬコレラ毒素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、２２７０３５）が補充された。
【００１８】
薬剤又は化合物に言及する場合、用語「適用外使用」は、薬剤又は化合物がＦＤＡ承認薬剤又は化合物のラベルに記載のものとは異なる方法で使用されることを意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「治療的な」及び「治療薬」は、互換的に使用され、疾患又は他の医学的状態を予防、改善又は治療できる任意の分子、化学物質、組成物、薬剤、治療薬、化学療法薬又は生物学的製剤を包含することを意味する。前記用語は、低分子化合物、アンチセンス試薬、ｓｉＲＮＡ試薬、抗体、酵素、ペプチド有機又は無機分子、細胞、天然化合物又は合成化合物、及びそれらに類するものを含む。
【００２０】
前記「試料」という用語は、そのもっとも広い意味で、本明細書において、使用される。ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体及びこれらに類するものを含む試料は、体液、細胞製剤の可溶性画分又は培地を含む場合があり、ここで、細胞は、成長したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ、細胞、組織、生検、皮膚、毛髪及びこれらに類するものであった。試料の例は、唾液、血清、組織、生検、皮膚、血液、尿及び血漿を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「治療」という用語は、疾病、疾病の徴候又は疾病素因を治癒、治癒、緩和、軽減、変更、治療、寛解、改善、防止する又は影響を与えるために、疾病、疾病の徴候又は疾病素因を有する患者又は被検体への治療薬の塗布又は投与、患者又は被検体からの単離組織又は細胞株への前記治療薬の塗布又は投与として定義される。
【００２２】
本明細書に記載のものと類似又は同等のアッセイ、キット及び方法が本発明の治療又は試験で用いることができるが、適したアッセイ、キット及び方法は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願及び特許は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書がコントロールする。以下に説明する特定の実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】卵巣がん細胞株及び卵巣腫瘍試料の遺伝子発現プロファイリングを２つの主要なクラスに識別する。Ａ）３７種類の細胞株及び２８５個のヒト組織の遺伝子発現データの教師なし階層的クラスタリング。少なくとも４個の細胞の組織全体の中央値に対して少なくとも２倍異なった発現レベルを有する遺伝子は、階層的クラスター解析で選択された（３，８３１遺伝子特徴）。データは行列形式で提示され、行は個々の遺伝子を表し、列は各組織を表す。前記行列中の各２乗は、個々の組織又は細胞株中の遺伝子特徴の発現レベルを表わす。細胞内の赤及び緑色は、スケールバー（ＬＯＧ２変換されたスケール）に示されるように、それぞれ比較的高い及び低い発現レベルを反映する。ヒートマップ上の赤、青及び黒のバーは、ヒト腫瘍試料；淡青、ＯＣＩ株；黄色バーＳＯＣ株である。ＳＯＣ細胞（黄色バー）は腫瘍クラスター１（赤色Ａバー）における排他的であったのに対し、ＯＣＩ細胞（淡青色バー）は腫瘍クラスター２（青色バー）において優勢である。腫瘍試料の小型サブセットは、細胞株（黒色バー）をまったく含まない小さな明確なクラスターを形成した。Ｂ）パネルＡでのクラスター１及び２における卵巣腫瘍を有する患者の無増悪生存期間及び全生存期間解析データ。ＯＣＩ株（青色バー、パネルＡにおけるクラスター２）と類似した遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍を有する患者は、ＳＯＣ株（赤色バー、パネルＡにクラスター１）と類似した遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍を有する患者と比較して、より悪い結果を有する。細胞株（黒色バー）を全く含まないクラスター３における腫瘍の小さなサブセットは、結果の解析から除外した。
【図２】卵巣がん細胞株の遺伝子発現プロファイリング及びタキソール応答は、２種類の主要なクラスに識別される。Ａ）ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡ（逆相タンパク質解析）クラスター１対クラスター２におけるＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株のタキソール応答。ＯＣＩ及びＳＯＣ株は、９６ウェルプレートのＷＩＴ−ＯＣ培地（５０００細胞／ウェル）において３連に播種された。翌日２０ｎＭタキソールを添加し、５日後に、代謝活性がアラマーブルーにより５９０／５３０蛍光として測定された。結果は、３、４以上の異なる実験の代表例である。Ｂ）ＯＣＩ  ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡ  クラスター１で過剰発現したタンパク質。ＯＣＩ及びＳＯＣ株のＲＰＰＡデータの階層的クラスタリングは、有意に、タキソール耐性と相関関係があるＯＣＩ株での過剰発現したタンパク質のサブセットを明らかにした（クラスター１、青色ラベル；クラスター２、赤色ラベル；ＯＣＩ−Ｃ４ｐ  紫色ラベル、ＩＣ−５０、ｐ＜０．０５、スピアマン）。データは行列形式で表され、ここで、行は細胞株を表し、列は各タンパク質に対する抗体プローブを表す。赤色及び緑色は、それぞれ比較的高い及び低い発現レベルを反映する。Ｃ）ＯＣＩ及びＳＯＣ株のｍＲＮＡデータの階層的クラスタリング。ＲＰＰＡ分析におけるタキソール応答に関連する遺伝子のサブセットのｍＲＮＡを試験した。細胞株のｍＲＮＡクラスタリングは、ＲＰＰＡグループと非常に類似していた。過剰発現した遺伝子は赤であり、低発現した遺伝子は緑色である。各グループ内で上向き調節される遺伝子の詳細なリストが、表２に示される（ＲＰＰＡ分析で、タキソール感受性クラス２細胞と比較して、タキソール耐性クラスター１ＯＣＩ細胞において過剰発現するタキソール耐性関連タンパク質のリスト）。クラスター１、青色ラベル；クラスター２、赤色ラベル；ＯＣＩ−Ｃ４ｐ紫色ラベル。
【図３】卵巣がん細胞株の遺伝子発現プロファイル化は、２つの主要なクラスに識別される。Ａ）ＯＣＩ（青色バー）及びＳＯＣ（赤色バー）卵巣がん細胞株のｍＲＮＡ発現レベルの教師なし階層的クラスタリング。データは行列形式で表され、行は個々の遺伝子を表し、列は各細胞株を表す。行列における各２乗は、個々の組織又は細胞株における遺伝子特徴の発現レベルを表わす。細胞における赤及び緑色は、スケールバー（ＬＯＧ２変換されたスケール）に示されるように、それぞれ比較的高い及び低い発現レベルを反映する。２種類の主要なクラスターが観察される；クラスターＩはＯＣＩ細胞株のみを含み（左クラスター、青色のみ）、クラスターＩＩはＳＯＣ及びＯＣＩ細胞株の混合を含む（右クラスター、赤色及び青色）。興味深いことに、乳頭状漿液性組織型はクラスターＩ（緑色バー）においてほぼ独占的に整列し、他のサブタイプは両方のクラスター（オレンジ色のバー）に存在した。Ｂ）パネルＡのヒートマップでの２つのクラスターを構成する細胞株のデンドログラム。細胞株名は以下のとおり着色される；第１列ＯＣＩ（青色）、ＳＯＣ（赤色）；第２列乳頭状漿液（濃緑色）、他の組織型（橙色）；第３列乳頭状漿液（濃緑色）、明細胞（淡青）、類内膜（ピンク）、粘液性（薄緑色）、他の組織型（橙色）。
【図４】卵巣がん細胞株のプロテオミクスプロファイルは、２つの主要なクラスに識別する。Ａ）ＯＣＩ細胞株（青色バー）及びＳＯＣ卵巣がん細胞株（赤色バー）における（ＲＰＰＡによって測定される）タンパク質発現の教師なしクラスタリングは、２つの別個のクラスターが明らかになった。行は細胞株を表し、列は各タンパク質の抗体プローブを表す。赤色及び緑色は、それぞれ比較的高い及び低い発現レベルを反映する。ｍＲＮＡクラスタリングのように、クラスター１はＯＣＩ細胞株のみを含み（ヒートマップの上半分、青色のみ）、クラスター２はＳＯＣ及びＯＣＩ細胞株の混合物を含む（ヒートマップの下半分、赤色及び青色）。乳頭状漿液性組織型はクラスターＩ（緑色バー）においてほぼ独占的に整列したのに対し、非乳頭状漿液性組織型（橙色バー）はクラスター１及びクラスター２に分割された。Ｂ）パネルＡの２つのクラスターを構成する細胞株のデンドログラム。細胞株名は、以下のとおり着色される；乳頭状漿液（緑色）、他の組織型（橙色）。また、図８を参照せよ。
【図５】ＯＣＩ異種移植片の病理組織が、原発ヒト腫瘍を再現する。Ａ−Ｃ）ＯＣＩ−Ｐ８ｐ（乳頭状漿液）、ＯＣＩ−Ｅ１ｐ（類内膜）及びＯＣＩ−Ｃ３ｘ（明細胞）を形成するために使用される原発ヒト腫瘍のＨ＆Ｅ染色切片。Ｄ−Ｆ）ＳＯＣ細胞（ＥＳ２、ＳＫＯＶ３及びＴＯＶ−１１２Ｄ）を免疫不全マウスに皮下注射することにより得られた異種移植片腫瘍のＨ＆Ｅ染色切片。腺、乳頭、間質性中核（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｏｒｅｓ）及び線維形成性間質などのヒト腺がんの典型的な特徴は存在しない。Ｇ−Ｏ）ＯＣＩ細胞株（Ｐ５ｘ、Ｐ７ａ、Ｐ９ａ、Ｃ５ｘ、Ｃ３ｘ、ＣＳｐ、Ｅ１ｐ）を免疫不全マウスに皮下注射することにより得られた異種移植片腫瘍のＨＥ染色切片。乳頭状漿液標本では、間質性中核及び乳頭構造（Ｇ、Ｈ及びＩ）の存在に留意されたい。類内膜標本では、類内膜表現型（Ｎ及びＯ）と一致し、それぞれ、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びムチン（茶色）に対して陽性であった腺（Ｍ）の存在に留意されたい。
【図６】クラスター１及びクラスター２のＯＣＩ細胞株のｍＲＮＡ発現プロファイルは、異なる経路に関連付けられる。経路解析では、我々は、クラスター１対クラスター２（ｐ，０．０５）の間で明らかに異なって発現した８２３個の遺伝子を整理するために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用した（図３）。Ａ）５５８個は、ＩＰＡ（ｐ＜０．０５）で、３７の中核経路（ｃｏｒｅ  ｐａｔｈｗａｙ）に分類されたクラスター１で上向き調節された。Ｂ）２６５個の遺伝子は、ＩＰＡ（ｐ＜０．０５）で、３７の中核経路に分類されたクラスター２で上向き調節された。
【図７】ユニークな遺伝子に関連し、２種類の独立した卵巣がんデータセットにおけるＯＣＥ又はＦＮＥのいずれかで過剰発現した１０種のプローブのセットの検証。（ａ）ＷｕデータセットのＯＶ様及びＦＴ様腫瘍細分類の臨床的特徴（ロジスティック回帰分析（順序変数として、グレード、ステージ）及びフィッシャー直接検定（組織型サブタイプ）のＰ値）との関連。（ｂ）ＴｏｔｈｉｌｌデータセットのＯＶ様及びＦＴ様サブグループの臨床的特徴（（ａ）のように算出されるＰ値）との関連。（ｃ）カプラン・マイヤープロットは、ＴｏｔｈｉｌｌデータでのＯＶ及びＦＴ様サブグループ間の無増悪生存期間及び全生存期間の有意な差異を示す（対数順位検定からの単変量Ｐ値が図示される）。多変量解析では、ＯＶ／ＦＴ様サブグループは、腫瘍グレード、ステージ、漿液性サブタイプ、患者年齢及び残存疾患を調節した後、全生存（Ｐ＝０．３４）ではなく、無増悪生存期間（コックス比例ハザードＰ＝０．０１）と非依存的に関連した。
【図８】ＯＣＩ株を示す一連のグラフ及び表は、標準的な細胞株と比較して、抗腫瘍薬の多様なパネルに対して有意により耐性である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
被検体のがん性腫瘍の薬剤に対する感受性を解析し、薬剤に対するがん性腫瘍の応答を予測し、がん性腫瘍を有する被検体の予後を判定し、被検体のための個別化治療又は治療方法を展開させるためのアッセイ、方法及びキットが本明細書に記載される。アッセイ、方法及びキットは、被検体のがん性腫瘍の遺伝子及びタンパク質発現特性又はプロファイルを解析することと、被検体のがん性腫瘍からのがん性細胞で候補薬剤を試験することと、卵巣細胞及びファローピウス管細胞の起始細胞の遺伝子発現特性に基づいて、被検体のがん性腫瘍を分類することとを含む。これらの方法を用いて、適当な１種類の薬剤（又は複数の薬物）が同定され、被検体はその薬剤で処置することができ、個別化治療が、このように被検者のために展開される。
【００２５】
生物学的方法及び化学的方法
従来の分子生物学技術を含む方法が、本明細書に記載される。かかる技術は、当該技術分野において一般に公知であり、例えば、分子クローニングなどの方法論の論文に詳細に記載されている：A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001;及びCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期更新）。従来の哺乳類細胞の培養方法は、当技術分野で一般に公知である。ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地の調製及び使用を含む、卵巣及びファローピウス管細胞（例えば、卵巣がん細胞及びファローピウス管がん細胞）を培養する方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０４４６号に詳述されている。いかなるＷＩＴ培地又はＷＩＴ培地の派生体（例えば、ＷＩＴ−Ｐ、ＷＩＴ−Ｉ、ＷＩＴ−Ｔ、ＷＩＴ−ＯＣ、ＷＩＴ−ＯＣｅ、ＷＩＴ−Ｌなど）を使用することができる。
【００２６】
薬剤への被検体のがん性腫瘍の感受性を分析及び個別化治療を展開するための方法及びアッセイ
本明細書に記載される方法を用いて、がん性腫瘍におけるタンパク質の特定のセットの発現プロファイル及び、コントロール又は特定の薬剤に対する反応性が公知である参照細胞株との比較に基づき、その特定の薬剤（例えば、抗腫瘍薬）の被検体のがん性腫瘍への効果の予測が可能である。一般に、被検体のがん性腫瘍がコントロール又は参照細胞株と、実質的に類似のタンパク質発現プロファイルを有し、前記コントロール又は参照細胞株が、特定の薬剤（例えば、タキソールなどの抗腫瘍薬）での処置に応答性である場合、その後、被検体のがん性腫瘍もその特定の薬剤（例えば、タキソール）での処置に応答性であると予測できる。反対に、被検体のがん性腫瘍が、コントロール又は参照細胞株と実質的に類似のタンパク質発現プロファイルを有し、コントロール又は参照細胞株が、特定の薬剤（例えば、タキソール）での処置に対して耐性である場合、その後、被検体のがん性腫瘍もその特定の薬剤（例えば、タキソール）での処置に対して耐性であると予測できる。
【００２７】
被検体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）のがん性腫瘍の薬剤（例えば、タキソール）に対する感受性を解析するため及び前記被検体のための個別化治療を展開するための典型的な方法は、前記被検体のがん性腫瘍からがん細胞を得るステップと；がん性細胞におけるタンパク質又はｍＲＮＡのセットの発現を試験するステップと；タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する過剰発現又は低発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の耐性と関連付け、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットのコントロールに対する正常な発現を前記抗腫瘍薬に対する前記被検体のがん性腫瘍の感受性と相関させるステップを含む。前記被検体は、任意の動物、例えば、ヒト、ウシ、イヌ、ヒツジ、ネコ、非ヒト霊長類、ブタなどの哺乳動物である場合がある。例えば、前記被検体は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３つなど）の卵巣がん腫瘍を有する女性のヒトである場合がある。前記がん性腫瘍は、いかなるタイプのがん性腫瘍であってもよい。がん性腫瘍の例としては、卵巣、ファローピウス管、肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、血液、免疫細胞、筋肉、骨、神経、内皮、線維芽細胞又は他の上皮及び間質性腫瘍からのがん性腫瘍を含む。
【００２８】
方法についてのこの例では、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットは、コントロールに対して過剰発現又は低発現が薬剤に対する耐性と関連するタンパク質を含む。タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットは、過剰発現が薬剤に対する耐性と関連するタンパク質又はｍＲＮＡのサブセットと、低発現が薬剤に対する耐性と関連するタンパク質又はｍＲＮＡのサブセットとを含む場合がある。典型的には、前記薬剤は、公知の抗腫瘍薬である。１つの実施態様では、前記抗腫瘍薬はタキソール又はビンクリスチンであり、タンパク質の前記セットは、チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、表皮型脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／Ｍｅｋ、Ｎ−カドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣα、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化ガンマ２、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、シグナル伝達性転写因子３及びシグナル伝達性転写因子５のうち少なくとも２つ（例えば、下記の表１に列挙されるタンパク質のうち２又はそれ以上（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０など））を含む。本明細書に記載の実施例では、表１に列挙されるタンパク質は、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株で過剰発現し、ＲＰＰＡ解析でタキソール耐性と関連することがわかった。この方法の使用は、タキソールに限定されるものではない。しかし、同一のアプローチが、いかなる他の抗腫瘍薬に適用することができる。図７に示すように、本明細書に記載される方法は、任意の抗腫瘍薬、例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０のために使用することができる。適用外使用と考えられる薬剤も本方法を用いて解析可能である。
【００２９】
被検体のがん性腫瘍からがん細胞を得るのに適したいかなる方法を使用することができる。典型的は方法では、がん細胞は、生検、針穿刺吸引、腹水又は手術中に除去される腫瘍細胞又は固形腫瘍断片を含むいかなる他の液体により得られる。また、がん細胞は、異種移植片から得てもよい。いくつかの実施態様では、前記方法は、がんを有する複数の患者（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、１０００、１０，０００人など）からのがん性腫瘍の感受性を同時に解析するために使用される。いくつかの実施態様では、複数の被検体からのがん細胞は、例えば、高処理で、同時に解析することができる。
【００３０】
本方法では、いかなる適切なコントロール試料を使用することができる。典型的には、前記コントロール試料は、同一の患者及び同一の組織から単離された標準的な細胞か、公知の薬剤応答−感受性又は抵抗性を有する他の患者から樹立された細胞株であり、被検体のがん性細胞におけるタンパク質のセットの発現が、このコントロール試料におけるタンパク質のセットの発現レベルに対して試験される。タンパク質の前記セットにおけるタンパク質の「過剰発現」に言及するとき、意味するものはコントロールと比較して少なくとも２倍の増加である。試料又はがん性細胞の集団の特定のタンパク質又はタンパク質のセットの発現が、当該特定のタンパク質又はタンパク質のセット（例えば、表１に列挙される１つ又は複数のタンパク質）の発現のベースラインレベル（コントロールレベルとしても知られる）と比較することができる。「ベースラインレベル」はコントロールレベルであり、いくつかの実施態様では、正常レベル、又はがん（例えば、卵巣がん）を有する被検体又は薬剤に対して感受性である細胞株で観察されないレベルである。また、「ベースラインレベル」又はコントロールレベルは、がん性細胞が抗腫瘍薬に対して感受性か耐性かを分析する前記被検体の前記がん（例えば、ファローピウス管様卵巣がん）と比較して、異なるタイプのがん（例えば、卵巣様卵巣がん）を有する被検体からの試料で観察されないレベルである。よって、特定の薬剤（例えば、タキソール）に対して感受性又は耐性を評価されるがん細胞の試料が、前記ベースラインレベルと比較して、前記特定のタンパク質（又はタンパク質のセット）の発現の測定可能な増大（すなわち、過剰発現、上向き調節）、低下又は実質的に変化しないかが、特定のタンパク質（又はタンパク質のセット）の発現のコントロール又はベースラインレベルに基づき、判定される場合がある。
【００３１】
前記がん性細胞におけるタンパク質のセットの発現は、いかなる適切な技術又はプロトコールを用いて解析される場合がある。例えば、逆相タンパク質解析（ＲＰＰＡ）アッセイ（Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，６５０−６５４，２００９）を使用することができる。タンパク質発現を解析する従来の方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの酵素結合検出システム、蛍光検出システム、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどを含む。いくつかの実施態様では、タンパク質発現は、対応するｍＲＮＡレベルを解析することにより、外挿することができる。ｍＲＮＡレベルを解析する従来の方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、次世代シーケンシング、ノーザンブロット法、マイクロアレイなどを含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、方法の前記ステップは、被検体のがん性腫瘍が感受性（応答性）である抗腫瘍薬が同定されるまで、異なる抗腫瘍薬で反復することができる。患者の腫瘍がタキソールに対して抵抗性であることがわかった場合、腫瘍が応答するであろう抗腫瘍薬が見つかるまで、前記方法はタンパク質の異なるセット及び１種又は複数の別の抗腫瘍薬で反復することができる。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍がタキソールに対して抵抗性であることが決定した後、第２の抗腫瘍薬を、第２の抗腫瘍薬に対して患者の腫瘍の耐性を最初に試験することなく、代わりに、患者に対して投与する場合がある。
【００３３】
適切な薬剤（又は薬物）が同定されると、被検体はその薬剤で処置することができ、被検体のために、個別化治療が展開される。より具体的には、特定の抗腫瘍薬がその特定の被検体に対して有効、又は１又は２以上の代替的な抗腫瘍薬と比較してより有効であるという予測又は示唆する結果に少なくとも部分的に基づいて、処置が被検体のために選択できる。例えば、もしタンパク質又はｍＲＮＡのセットが、コントロール試料に対して被検体のがん性腫瘍で過剰発現又は低発現する場合、被検体のがん性腫瘍が第１の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）に対して感受性でない（すなわち、抵抗性である）と判定され、これにより第１の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）とは異なる第２の抗腫瘍薬（例えば、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０など）を被検体に投与することができる。別の例では、タンパク質又はｍＲＮＡのセットがコントロール試料に対して被検体のがん性腫瘍で正常レベルに発現する場合、被検体のがん性腫瘍が第１の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）に対して感受性であると判定され、これにより、前記第１の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）を前記被検体に投与することができる。ヒト腫瘍、異なる遺伝子特性及び分子特性を有する異なる腫瘍の中で広い生物学的多様性があるように、本明細書に記載の方法は、特定の薬剤（例えば、抗腫瘍薬）に対する被検体の応答を予測することと、被検体のがん性腫瘍を分類することと、適当な処置戦略を選択することだけでなく、かかる特徴に基づいて被検体の予後／生存を予測することとを含む個別化されたがん処置に特に有用である。
【００３４】
前記方法によれば、被検体のがん性腫瘍に対して応答性であると判定された薬剤は、１又は２以上の他の抗腫瘍薬及び／又は処置（例えば、化学療法、放射線治療、手術など）と組み合わせて被検体に投与することができる。いくつかの実施態様では、前記方法は、被検体の予後、例えば、予後、生存期間、無増悪生存期間をさらに判定するステップを含むことができる。かかる実施態様では、前記方法は、タンパク質又はｍＲＮＡの前記セットの前記コントロール試料に対する過剰発現又は低発現を、タンパク質の第１のセットが前記コントロールに対して正常に発現するがん性腫瘍を有する第２の被検体と比較して前記被検体に対する不良な予後と相関させるステップをさらに含む。一般に、「不良な予後」又は「不良な予後／生存期間」が意味するものは、再発、転移又は腫瘍により死亡することのない、統計的に有意なより短い期間を意味する。
【００３５】
これらの方法では、被検体を薬剤で処置した後、１又は２以上（例えば、１、２、３、４など）の時点で、被検体又は被検体からの試料（例えば、生検、培養物）を薬剤に対する被検体の応答を決定するために分析することができる。言い換えると、薬剤が被検体に治療的な効果を有するか、例えば、腫瘍サイズ及び／又は腫瘍成長及び／又は腫瘍マーカーが減少するかを決定するために、被検体又は被検体からの試料（例えば、生検、培養物）を分析することができる。薬剤の治療効果のために、本明細書に記載されるタンパク質及びｍＲＮＡアッセイを含む、被検体からの試料を分析する任意の適当な方法を用いることができる。薬剤が治療効果を有するかを判定するための被検体を分析するいかなる適切な方法を用いることができる。かかる方法は、例えば、理学的検査、腫瘍バイオマーカー例えばＣＡ１２５及びイメージング法（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩ等）を含む。
【００３６】
がん性腫瘍の薬剤への応答を予測し、がん性腫瘍の処置のための個別化治療を展開するための方法及びアッセイ
本明細書に、薬剤（例えば、抗腫瘍薬）に対するがん患者のがん性腫瘍（例えば、卵巣がん腫瘍）の応答を予測し、がん性腫瘍の処置のための患者に対する個別化された治療法を展開するための方法（例えば、アッセイ）が記載される。一般的に、がん性腫瘍を有する患者から得た（例えば、生検又は手術から得た）がん性腫瘍細胞が、適切な培地（例えば、ＷＩＴ−ＯＣ又はＷＩＴ−ＦＯ培地）で培養され、特定の薬剤（又は薬剤の組合わせ）に曝露される。がん性腫瘍細胞の生存及び増殖への特定の薬剤（又は薬剤の組合せ）の効果は、患者のがん性腫瘍におそらく作用する特定の薬剤（又は薬剤の組み合わせ）の予測を行うために試験される。この方法を使用する処置は、特定の薬剤（例えば、抗腫瘍薬）が有効か、又は、特定の患者に対して１種以上の代替の薬剤よりも有効であろうことを示唆する予測又は結果に少なくとも部分的に基づいて患者のために選択することができる。適用外使用で利用されるおそれのある処置と同様に、かかる方法論は、患者（例えば、卵巣がん）で処置される病状に対して承認されている１以上の戦略に対する患者に特異的な応答の判定に使用することができる。本明細書に記載の予測方法の使用は、がん患者のための最適な個別化治療戦略を同定することができる。
【００３７】
１つの実施形態において、本方法は、薬剤（例えば、抗腫瘍薬）に対するがん患者の（例えば、卵巣がん腫瘍を持つ女性のヒト）がん性腫瘍の応答を予測し、がん性腫瘍の処置のために患者に対する個別化された治療法の展開を含む。典型的な本方法は、患者のがん性腫瘍からがん細胞を入手する工程; ＷＩＴ−ＯＣ細胞培養培地（又は他のＷＩＴ培地又はＷＩＴ培地の派生体）でがん細胞を培養する工程；薬剤に対して培養がん細胞を接触させる工程；培養がん細胞における患者のがん性腫瘍のＩＣ５０値（又はＩＣ９０値 - 腫瘍細胞の少なくとも90％を死滅させる薬剤の用量）を決定する工程；及び、対照培養細胞において薬剤に対する患者のがん性腫瘍の低い応答を有する薬剤に対するＩＣ５０（又はＩＣ９０）値と比較して、増加したＩＣ５０（又はＩＣ９０）値を相関させて、薬剤に対して陽性反応を有する対照培養細胞における薬剤に対するＩＣ５０（又はＩＣ９０）値と比較して、正常又は低いＩＣ５０（又はＩＣ９０）値と関連付ける工程を含む。「不良応答」とは、腫瘍の大きさ又は腫瘍マーカーが減少しないことを意味する。「陽性応答」は、腫瘍の大きさ又は腫瘍マーカーの減少を意味する。
【００３８】
患者のがん性腫瘍が試験される薬剤に応答しない１つの実施形態では、ＩＣ５０値は、対照培養細胞における薬剤のＩＣ５０値に比べ増加し、本方法は、さらに、第２の薬剤（すなわち、がん性腫瘍細胞が不良応答を示した試験薬剤とは異なる薬剤、例えば、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、及びＰＬＸ４７２０）を投与する工程を含む。他の実施態様では、患者のがん性腫瘍は、試験される薬剤に応答性であり、ＩＣ５０値が対照培養細胞中の薬剤に対するＩＣ５０値と比較して正常又は減少し、この方法はさらに、試験された薬剤（例えば、タキソール、ビンクリスチン、患者へのＵ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、及びＰＬＸ４７２０）を投与することを含む。この方法は、患者の予後を予想するために使用することができる。かかる実施態様において、本方法は、対照培養細胞での薬剤に対するＩＣ５０値と比較して第２の患者に由来する培養がん細胞における薬剤に対するＩＣ５０値が正常又は減少しているがん性腫瘍を有する患者と比較した場合に患者に対して悪い予後を有する対照培養細胞での薬剤に対するＩＣ５０値と比較して、増加したＩＣ５０値を相関させることを含む。
【００３９】
本明細書に記載の実験は、ＩＣ５０又はＩＣ９０値を測定することを含むが、薬剤に対するがん患者のがん性腫瘍の応答を予測するために他の測定を行うことができる。薬剤（例えば、タキソール）に応答して生存及び／又はがん細胞の増殖を測定するいかなるアッセイも使用できる。例えば、細胞数計測、ＭＴＴ、ＭＴＸ、アラマーブルー、アポトーシスアッセイ、細胞周期プロファイル等を使用することができる。
【００４０】
上記の他の方法と同様に、がん細胞は、被検体からの異種移植植片、腹水、生検又は原発性固体卵巣組織から取得できる。いくつかの態様において、この方法は、同時に複数（例えば、2人、3人、4人、5人、10人、15人、20人、25人、30人、35人、40人、50人、100人等）のがんを持つヒトの被検体からがん性腫瘍の薬剤（例えば、抗腫瘍薬）又は薬剤の組み合わせに対する応答を予測するために使用される。既に述べたように、抗腫瘍薬の非網羅的リストは、タキソール、ビンクリスチン、U0126、PJ34、アドリアマイシン、AS703026、5-フルオロウラシル、シスプラチン、PLX4720等を含む。
【００４１】
被検体が、薬剤で処置された後で、上記の他の方法と同様に１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ等）の時点、被検体又は被検体からの試料（例えば、生検、培養）が薬剤に対する被検体の応答を決定するために解析することができる。換言すれば、薬剤が、例えば腫瘍のサイズ及び／又は腫瘍の増殖及び／又は腫瘍マーカーを低減する等の被検体に治療効果を有しているかを判定するために、被検体又は被検体からの試料（例えば、生検、培養物）を分析することができる。薬剤の治療効果に対する解析のために、本明細書に記載されるタンパク質及びmRNAアッセイを含む、いかなる被検体からの試料を分析する適切な方法も使用できる。薬剤が治療効果を有するかどうかを判定するために被検体を解析するためのいかなる適切な方法も使用することができる。かかる方法は、例えば、物理的試験、ＣＡ１２５などの腫瘍バイオマーカー、及びイメージング（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩ等）を含む。
【００４２】
卵巣がん性腫瘍を有する被検体の予後を判定するための方法
卵巣がん腫瘍を有する被検体（例えば、ヒトの女性）の予後を判定するための方法の１つの実施態様は、被検体の卵巣がん腫瘍の遺伝子発現シグネチャー又はプロファイルの生成を含み、そして、卵巣がん性腫瘍をファローピウス管様又は卵巣様として分類する。以下の実施例３に記載の実験では、同じ被検体（例えば、患者）における正常なヒト卵巣（ＯＶ）とファローピウス管（ＦＴ）上皮細胞を区別する起源細胞の遺伝子発現プロファイルが同定され、原発性卵巣がんの遺伝子発現プロファイルへのＯＶ対ＦＴ細胞の起源細胞の遺伝子プロファイルの適用が、これらのがんの中で、区別されるＯＶ及びＦＴ様のサブグループの同定を可能にすることを示した。この実験はさらに有意に悪化無病生存率と相関する正常なＦＴ様腫瘍の分類を示し、したがって、被検体のがん性腫瘍の遺伝子発現シグネチャー又はプロファイルにこの分類を適用することは、被検体（例えば、ヒト女性）の予後を判定するために使用できる。
【００４３】
かかる方法の１つの例では、方法は、被検体の腫瘍から試料を取得するステップ；卵巣細胞と比較してファローピウス管細胞でアップレギュレートされる遺伝子の第１のセット、及び、ファローピウス管細胞と比較して卵巣細胞においてアップレギュレートされる遺伝子の第２のセットを含む発現プロファイルをもたらす遺伝子発現プロファイル化に試料を供するステップ；及び、遺伝子の第１及び第２のセットの発現レベルを判定するステップ；第１の遺伝子セットがアップレギュレートされておらず第２の遺伝子セットがアップレギュレートされている卵巣がん性腫瘍を有する第２の患者と比較して、遺伝子の第１セットのアップレギュレーションと遺伝子の第２セットの正常な発現を悪い無病性生存予後（例えば、腫瘍に起因する再発、転移又は死亡のない統計学的に有意に短い期間）に相関させるステップを含む。本方法において、ＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、及びＯＳＢＰＬ３の遺伝子が培養卵巣細胞と比較して培養ファローピウス管で過剰発現していることが認められるので、遺伝子の第１のセットは、典型的には、これらの遺伝子の全てを含む。他の遺伝子が培養卵巣がん細胞と比較して培養ファローピウス管細胞において過剰発現されることが認められるならば、遺伝子の第１のセットは、培養卵巣細胞と比較して培養ファローピウス管細胞で過剰発現される１つ又は複数の他の遺伝子と組み合わせて、１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、５種）のＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６及びＯＳＢＰＬ３を含むことができる。培養ファローピウス管細胞と比較して培養卵巣細胞においてＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、及びＴＭＥＭ１６４の過剰発現が認められるので、典型的には、遺伝子の第２セットはこれらが含まれる。他の遺伝子がまた、培養ファローピウス管細胞と比較して培養卵巣細胞において過剰発現されることが認められる場合、遺伝子の第2のセットは、培養ファローピウス管細胞と比較して培養卵巣細胞で過剰発現される1種又は複数の他の遺伝子との組み合わせで、ＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２及びＴＭＥＭ１６４の一種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種、５種）を含むことができる。しかし、いかなる適切な遺伝子もファローピウス管細胞及び卵巣細胞の間で相違して発現される限り、これらの遺伝子を解析することができる。ＰＣＲ及びＲＮＡ配列決定等の定量的な感度の高い方法は、例えば、ファローピウス管及び卵巣の間に相違して発現される他の適切な遺伝子を調べるために使用でき、遺伝子発現のプロファイル化は、本明細書に記載のもののいずれかを含むいかなる適切な方法を用いて行うことができる。
【００４４】
発現プロファイルの遺伝子の第１のセットがアップレギュレートされているが、遺伝子の第２のセットがアップレギュレートされていない実施態様では、本方法はさらに、ファローピウス管様として被検体の卵巣がん腫瘍を分類することを含むことができる。発現プロフィール中の遺伝子の第２のセットがアップレギュレートされているが、遺伝子の第１のセットがアップレギュレートされていない別の実施態様では、本方法はさらに、卵巣様として被検体の卵巣がん腫瘍を分類することを含むことができる。以下の実施例３に記載した実験で示されるように、ファローピウス管様腫瘍は、有意に高いステージのより高いグレードであり、主に、漿液腺がんで構成され、一方、対照的に、卵巣様腫瘍は、非漿液性サブタイプ及び低いグレードのがんを含んだ。したがって、被検体のファローピウス管様腫瘍である卵巣がん腫瘍及び被検体に対する予後不良との間で関連付けを行うことができる。被験者の卵巣がん腫瘍は卵巣様の場合は、被検体は予後良好（腫瘍の再発、転移又は死亡せずに長い期間）を有することが期待される。
【００４５】
本明細書に記載の他の方法と同様に、本方法はさらに、一種以上の抗腫瘍薬及び／又は処置（例えば、化学療法、放射線療法、外科手術など）で被検体を処置することを含むことができる。被験者は、１時点以上（例えば、１時点、２時点、３時点、４時点等）で、薬剤で処置した後の時点で、薬剤に対する被検体の応答を判定するために、被検体又は被検体由来の試料（例えば、生検、培養）を分析することができる。換言すれば、被検体又は被検体由来の試料（例えば、生検、培養）は、薬剤が被検体に対して治療効果を有するか、例えば、腫瘍のサイズ及び／又は腫瘍成長及び／又は腫瘍マーカーを減少させるか、を判定するために分析することができる。薬剤の治療効果を判定するための被検体からの試料を分析するための本明細書に記載されるタンパク質及びｍＲＮＡアッセイを含むいかなる適切な方法を使用することができる。薬剤が治療効果を有するかどうかを判定するために被検体を分析するためのいかなる適切な方法を使用することができる。かかる方法は、例えば、物理的試験、例えば、ＣＡ１２５等の腫瘍バイオマーカー及びイメージング（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩ等）を含む。
【００４６】
キット
（がん患者のがん性腫瘍の抗腫瘍薬に対する応答を予測する）抗腫瘍薬に対する被検体のがん性腫瘍の感受性を解析し、被検体のための個別化された治療法を展開するためのキットが、本明細書に記載される。被験者のがん性腫瘍が特定の抗腫瘍薬（例えば、タキソール）に対して感受性又は耐性であるかを判定するための典型的なキットは、内部対照として１種以上のＯＣＩ株などの少なくとも１つの対照；使用説明書；及び、ＷＩＴ培地又はＷＩＴ培地の派生体を含む。ＯＣＩ株は、典型的には対照として含まれているが、いかなる適切な対照を使用することができる。さらに、キットは、１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、１０種、２０種等）のプローブを含む場合がある。例えば、本キットは、いくつかのプローブが同時に使用される、例えば、多重化ＰＣＲアッセイで使用するための１種又は複数のプローブを含むことができる。特定のタンパク質に特異的なプローブを使用することができる。１種以上のプローブは、以下のタンパク質；チューブリン、ＡＫＴ、アンドロゲン受容体、Ｊｕｎ腫瘍遺伝子、クリスタリン、サイクリンＤ１、上皮細胞脂肪酸結合タンパク質、Ｅｔｓ関連遺伝子、ＦＡＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ３、Ｅｒｋ／ＭＥＫ、Ｎカドヘリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、ペアードボックス２、プロテインキナーゼＣ−α、タンパク質キナーゼＡＭＰ活性化γ２、ホスファターゼ及びテンシンホモログ、ＳＭＡＤ３、肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ、転写因子３に対するシグナル伝達因子及び活性化因子、並びに転写因子５に対するシグナル伝達因子及び活性化因子の少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、６種）に対して選択的な、たとえば、少なくとも２種のプローブとすることができる。任意に、キットはまた、陽性対照を含む容器、陰性対照、陽性結果の典型的な例の写真又は画像、及び陰性の結果の代表例の画像の典型的な例の写真又は画像を含む容器の１つ以上を含む場合がある。
【００４７】
データ及び解析
本明細書に記載のアッセイ、方法及びキットの使用は、従来の生物学方法、ソフトウェア及びシステムを採用することができる。有用なコンピュータソフトウェア製品は、典型的には、方法の論理ステップを実行するためのコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読媒体を含む。適切なコンピュータ可読媒体は、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ等を含む。コンピュータ実行可能命令は、適切なコンピュータ言語又はいくつかの言語の組み合わせで記述される場合がある。基本的な計算生物学の方法は、例えば、Ｓｅｔｕｂａｌ及びＭｅｉｄａｎｉｓら、計算生物学の方法の概要（ＰＷＳ版社、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７年）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ（編）、分子生物学の計算方法（エルゼビア、アムステルダム、１９９８年）；  Ｒａｓｈｉｄｉ及びＢｕｅｈｌｅｒ、バイオインフォマティクスの基礎：生物科学と医学における応用（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、２０００年）とＯｕｅｌｅｔｔｅとＢｚｅｖａｎｉｓバイオインフォマティクス：遺伝子とタンパク質の分析のための実用ガイド（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、第２版、２００１年）に記載されている。米国特許第６４２０１０８号を参照せよ。
【００４８】
本明細書中に記載のアッセイ、方法及びキットはまた、薬剤の設計、データの管理、分析、機器の操作等のさまざまな目的のために、様々なコンピュータプログラム製品及びソフトウェアを利用することができる。 米国特許公報5593839号、5795716号、5733729号、5974164号、6066454号、6090555号、6185561号、6188783号、6223127号、6229911号及び6308170号を参照せよ。さらに、本明細書に記載の実施態様は、データ（例えば、実験結果、分析）を提供するための方法、及びインターネット等のネットワークを介した他のタイプの情報を含む。
【００４９】
実施例
さらに本発明は、以下の具体例によって例示される。具体例は例示のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【００５０】
実施例１  原発腫瘍の表現型を維持する卵巣腫瘍細胞株でのタキソール感受性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ヒト腫瘍の大部分から安定な細胞株を確立できないことが、ヒトがん研究ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用を制限した。現在入手可能な腫瘍細胞株はヒト腫瘍の生物学的多様性を示すことができない。我々が９５％以上の事例で卵巣腫瘍のさまざまなサブタイプから細胞株を日常的に確立できるようにする細胞培養の培地及び方法を我々は以前に開発した。重要なことに、本明細書に記載した２５種類の卵巣腫瘍細胞株は、原発腫瘍の、ゲノム構造（genomic landscape）、組織病理及び分子特性を保持した。
【００５１】
本明細書で記載されたものは、薬剤への患者の反応（複数の反応を含む）を予測するためのこれらの細胞株の使用である。我々が確立した細胞株の薬剤反応は患者の転帰と相関することを我々は証明した。したがって、本方法を用いて得られた腫瘍細胞株は、試験し、処置への患者反応を潜在的に予測するための顕著に改善した新しいプラットフォームに相当する。様々な薬剤への患者反応を予測する堅固で効率的なモデル系は、がん患者の個別化処置用の新しい薬剤の開発を大いに向上させる。我々が確立した細胞株は、腫瘍細胞株パネルで以前に示されたものと比較して、より悪性で、薬剤耐性のがん表現型と一致する。したがって、この方法を用いて得られた腫瘍細胞株は、ヒト腫瘍の生物学及び処置を研究するのに顕著に改善した新しいプラットフォームに相当する。
【００５２】
改善したモデル系の明白な必要性と、我々が以前に記載した化学的に定義した培養培地（ＷＩＴ）（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）での有望な結果との両方によって、我々は普通のヒトのがん用の新しい培養系を開発した。本培地は、血清、下垂体抽出物、フィーダー層、馴化培地及び薬剤などの未定義の成分なしに基礎細胞代謝を維持するのに必須な栄養全てを提供する（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）。ＷＩＴ培地では、正常なヒト乳房上皮細胞は、７０回の集団倍化数を超え、おおよそ１０２１倍増の細胞数に到達する。これらの結果は、おそらく、ヒト腫瘍はかかる培地で常に増殖させることができると仮定することを我々に促した。
【００５３】
この報告の目的とは、標準培養の培地及び方法を用いて得た卵巣がん細胞株全ては、「標準卵巣カルシノーマ」細胞株、又は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  （ＥＣＡＣＣ）から入手可能な２６種類のＳＯＣ株を含むＳＯＣ細胞株として総称される。ＷＩＴ−ＯＣ培地を用いて得た卵巣がん細胞株のセットは「ＯＣＩ」細胞株として言及される。２つの事例では、腫瘤の大部分はファローピウス管に局在し、これらの細胞株は「ＦＣＩ」細胞株として言及される。
【００５４】
結果
ＯＣＩ腫瘍細胞株のｍＲＮＡの遺伝子発現プロファイルは、異なる臨床的特徴を有するヒト腫瘍と似ている。２８５種類のヒト卵巣腫瘍標本と同時のＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株パネルの試験は、３種類の異なる患者クラスターを示した。患者クラスター１はＯＣＩ株のみを含み、クラスター２は全てのＳＯＣ株を含んだ。細胞株のいずれもがクラスター３ではなかった（図１ａ）。ヒト腫瘍サンプルでの細胞株の分布が、１種類の細胞株（ＯＣＩ−Ｃ４ｐ）を例外としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株と同一であり、これらの細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型は、関連するｉｎ  ｖｉｖｏの臨床的な違いを反映することを強く示している。さらに、患者のこれらの２つのグループの臨床転帰の比較は、クラスター１のＯＣＩ様の腫瘍を患う患者が、多変量解析のＳＯＣ様のプロファイルを有するクラスター２の患者と比較して顕著により短期の進行がなく、全体的に長生きであることを明らかにした（図１ｂ）。
【００５５】
タキソールへのｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１及び２の腫瘍細胞株の反応：患者の不完全な転帰と、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株との間での著しい相関が、最も一般的に使用される卵巣がんの治療用薬剤の２つであるタキソール及びシスプラチンへのこれらの細胞株の反応を試験することを我々に促した。我々は、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株と、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター２のＳＯＣ株とに対応する株のパネルを選択し、各パネルは、異なる腫瘍サブタイプ（ＰＳ、ＣＣ、ＣＳ、Ｅ、Ｍ）及び組織供給源（固形腫瘍、腹水及び異種移植片）の例を含んだ。これらの実験で、我々は、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株のタキソールのＩＣ５０は１０〜１００ｎＭの範囲であり、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター２のＳＯＣ株のＩＣ５０値よりも５〜１０倍高いことを観察した。これらの実験でのタキソールに対するＳＯＣのＩＣ５０は、以前の報告と一致した。また、クラスター２のＯＣＩ株のサブセットは、ＳＯＣ株と類似して、クラスター１のＯＣＩ株と比較してタキソールに、より感受性であった（図２ａ）。ＯＣＩ株及びＳＯＣ株は上記実験のＷＩＴ−ＯＣ培地に播種された。したがって、我々は、薬剤反応の違いが増殖培地の違いの結果ではないと推測する。重要なことに、我々は、別の微小管阻害剤のビンクリスチンへの反応は、ＯＣＩ株及びＳＯＣ株の間で同様に異なることが分かった。反対に、我々は、シスプラチンへの反応においてＯＣＩ株及びＳＯＣ株の間で有意差を見い出せなかった。
【００５６】
ＯＣＩ細胞の相対的なタキソール耐性の根拠を探索するために、我々は、タンパク質プロファイルがＩＣ５０の最大の違いであったクラスター１／ＯＣＩ株のタンパク質プロファイルを、クラスター２／ＳＯＣ株と比較した。４６種類のタンパク質のタンパク質発現レベル及びタキソール反応と、ＩＣ５０値との間で強い相関があった。これらのうち、我々は、クラスター１で過剰発現した２２種類のタンパク質に集中した（図２ｂ、表１）。頼もしいことに、タキソールの標的であるチューブリンは、これらのグループのタンパク質であった。さらに、このグループの１１種類の追加のタンパク質は別の研究でタキソール耐性と以前に関連付けられ、ＡＫＴ、ｐ３８、ＡＫＴ、ＰＴＥＮ、Ｓｒｃ、ＳＭＡＤ３、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５を含む。また、耐性関連タンパク質特性由来の遺伝子リストを含むｍＲＮＡマイクロアレイデータの教師なし階層的クラスタリングは、クラスター１及び２の同一細胞株グループを区別することができた（図２ｃ）。機能タンパク質ネットワーク関連ソフトウェアを用いて、我々は、これらの過剰発現タンパク質の大部分がお互いに直接的又は間接的のいずれかで相互作用することが分かった。これらのタンパク質のアミノ酸配列は当業者に周知である。
【００５７】
【表１−１】
2016523527.tif 000003
【００５８】
【表１−２】
2016523527.tif 000004
【００５９】
【表１−３】
2016523527.tif 000005
【００６０】
【表１−４】
2016523527.tif 000006
【００６１】
【表２−１】
2016523527.tif 000007
【００６２】
【表２−２】
2016523527.tif 000008
【００６３】
図１及び２で記載したように、我々は、患者が、卵巣がんの一次処置用薬剤である（また、乳房を含む多くのその他のがんに使用される）タキソールに応答するのを見分けるための試験を開発した。もう一つの実施態様では、この試験は、患者腫瘍の図１で列挙されるタンパク質の発現を解析する形態となる。別の実施態様では、我々がこれらの図で示すように、患者由来の細胞株を作製し、細胞株でＩＣ５０を決定するのにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を実施する形態となる。
【００６４】
実施例２  原発腫瘍の表現型を保持する新規卵巣腫瘍細胞株の特性評価
現在のところ入手可能なヒト腫瘍細胞株パネルは、通常、原発患者の腫瘍表現型を保持できない少数の株からなる。我々にヒト卵巣がんの多様なサブタイプから細胞株を９５％よりも高い効率で日常的に確立できるようにする細胞培養培地を我々は開発した。重要なことには、本明細書に記載した２５種類の卵巣腫瘍細胞株は、原発腫瘍の、ゲノム構造（genomic landscape）、組織病理及び分子特性を保持した。さらに、これらの細胞株の分子プロファイル及び薬剤反応は、異なる転帰を有する原発腫瘍の異なるグループと相関した。この新しい方法を用いて得られた腫瘍細胞株は、ヒト腫瘍の生物学及び処置を研究するのに顕著に改善した新しいプラットフォームに相当する。
【００６５】
体内で制御不能に増殖するヒトカルシノーマは、逆説的に、細胞培養で増殖することが困難である。様々な薬剤への患者反応を予測する、堅固で効率的な細胞株モデル系は、がん患者の個別化処置用の新しい薬剤の開発を大いに向上させる。我々が確立した細胞株はヒト卵巣腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ不均一性を獲得し、標準卵巣がん細胞株と比較してより悪性で、薬剤耐性のがん表現型と一致する。
【００６６】
改善したｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの明白な必要性と、我々が以前に記載したＷＩＴ培地での有望な結果（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）との両方によって突き動かされて、我々は普通のヒトのがん用の新しい培養系を開発することを目指した。これらの結果は、おそらく、ヒト腫瘍はかかる培地で常に増殖させることができると仮定することを我々に促した。本説明は、ヒト卵巣がんサブタイプに最適化した細胞培養培地（ＷＩＴ−ＯＣ）を用いて得た２５種類の新しい一連のＯＣＩの表現型特性を特徴付ける。
【００６７】
結果
腫瘍細胞は標準細胞培養培地で生育することができない。以前の説明と一致して、我々は、わずか１％未満の成功率の標準培養培地で腫瘍細胞株を確立することができた。１つの成功例では、卵巣腫瘍株ＯＣＩ−Ｕ１ａはＲＰＭＩ培地で得られ、ここでは、急増殖の短期間（０〜２０日）の後に、増殖停止（２０〜４０日）、大規模な細胞死（４０〜５０日）及び一連の細胞株を生じさせた急増殖率クローンの最終的な出現（６０〜９０日）があった。重要なことには、ＲＰＭＩで増殖した細胞株のゲノムで測定したコピー数多型（ＣＮＶ）は、優良な亜集団のクローン性増殖又は組織培養期間中での追加の遺伝子異常の獲得と一致して、開始腫瘍細胞集団で見られたものから顕著に変化した。ここ１０年長の研究期間にわたって、本分野での他の理解と一致して、これは標準培地を用いて一連の卵巣腫瘍細胞株を生じた唯一の患者腫瘍標本であった。
【００６８】
ＷＩＴ培地での卵巣腫瘍細胞の培養条件の最適化
また我々は、乳房細胞用に開発した最初のＷＩＴ培地（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）は、正常な卵巣細胞も卵巣の腫瘍のいずれの増殖も支持しないことを発見した。最も正常な上皮のように、正常なヒト乳房細胞は、生理的条件下では血液又は血清との直接の接触がない。したがって、我々が正常な乳房細胞用に開発した培地は、適切な生理環境により近づけるために血清を完全に欠いていた。反対に、正常な卵巣及びファローピウス管上皮細胞は、循環血液に存在するレベルの５０％と同じくらいの高さとなる生理血清タンパク質濃度を含む正常な腹水と直接的に接触することが知られている。実際には、多くの場合、卵巣腫瘍は、血清で存在するものよりも実質的に高いタンパク質及び増殖因子の濃度を有する悪性腹水で増殖する。したがって、我々は悪性卵巣細胞の生理的増殖条件を模倣するためにＷＩＴ培地に血清を添加した。しかし、ＷＩＴ培地への血清の補充は、追加の因子なしでは卵巣腫瘍細胞の増殖に十分ではなかった。長年にわたって多くの改変を試験した後、我々は、特定の濃度の血清、インスリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、コレラ毒、エストロゲンを含む因子の組み合せが、高効率で異なる卵巣腫瘍タイプを培養するのに必須であるが、十分ではないことが分かった。類内膜及び粘液組織型卵巣腫瘍は低０２条件（５〜１０％）で最も培養された一方、漿液性明細胞及び他のサブタイプは大気０２条件（１８〜２１％）で最も増殖したため、培地の最適化に加えて、０２レベル及び細胞接着表面を最適化することが必須であった。最後に、我々は、改変したプラスチック表面（Primaria, BD）が原発卵巣腫瘍の培養を最も良く実施した。
【００６９】
我々が、本研究の期間中に、一つずつ個別の培養培地変数を最適化することが継代培養で小さな改善をもたらすことを発見したことは注目に値する。それにもかかわらず、それらだけでは継代培養に効果がない多くの成分が大きな併用効果を有した。しかし、それらの相乗効果は予測することは困難であり、多様な成分の可能な組み合せ全てを実験的に試験することは、とても多くの変更のために禁止的であった。加えて、特定の変更が時々、いくつかの腫瘍サンプルに不必要であり、他の良好な培養に絶対的に必須であるために、１つの腫瘍サンプルでの条件の最適化は普遍的継代を保証しなかった。最後に、培養条件又は培養組成を変えることの効果が、時々、継代後に明らかになった。したがって、本過程の態様に費やしている多くの時間が、全ての卵巣がんサブタイプにわたって広い適用性を確かめるために、多くの継代にわたって多くの原発卵巣がんサンプルでの変化の組み合せを試験するのに必要であった。これらの４つの因子：（１）培地成分の相乗的併用効果の非自明な性質、（２）数か月にわたって各変更の長期間の効果を試験する必要性、（３）多くの腫瘍サンプルで各変更を試験する必然性、及び、（４）試験すべき非常に多くの変更が、ＷＩＴ−ＯＣ培地の開発への漸進的な系統的アプローチを妨げた。それにもかかわらず、培地及び細胞培養条件が一旦、最適化されると、２６サンプル中１つのサンプルのみが細胞株を作製できなかった。
【００７０】
ＯＣＩ細胞株は卵巣がんの主要な組織型サブタイプを含む。卵巣のアデノカルシノーマは、異なる特徴を有する多くの組織病理学的サブタイプを含む不均一な疾患である。多くの場合、「標準卵巣カルシノーマ」（ＳＯＣ）細胞株の多くを生じさせた腫瘍の原発サブタイプは知られていない。本研究では、我々は、組織型サブタイプとして知られるＳＯＣ細胞株の小サブセットを使用した。ＳＯＣ株からＷＩＴ−ＯＣ培地を用いて得た細胞株を区別するために、それらは「ＯＣＩ」細胞株として言及される。２つの事例では、腫瘍の大部分はファローピウス管に局在し、これらの細胞株は「ＦＣＩ」細胞株として言及される。卵巣カルシノーマの記号表示の後の大文字「ＯＣＩ」は、原発腫瘍の組織型サブタイプを指す。ＯＣＩパネルは乳頭状漿液性（Ｐ）、明細胞（Ｃ）、類内膜（Ｅ）、粘液性（Ｍ）がん、及び、カルシノサルコーマ（ＣＳ）及び未分化胚細胞腫（Ｄ）等のまれなタイプを含む。同時に、Ｐ、Ｃ、Ｅ及びＭサブタイプは卵巣アデノカルシノーマの９０％以上を占め、したがって、細胞株の本パネルは広く卵巣がんを代表する。各細胞株名の末尾の小文字は組織の供給源を指し、細胞株のうち１４種類は原発固形腫瘍（ｐ）から、腹水（ａ）から７種類、免疫不全マウスへのヒト腫瘍の直接移植から得た原発マウス異種移植片（ｘ）から４種類が確立された。２５種類のＯＣＩ株全てが、培養で形質転換した表現型の保持と一致して、軟寒天でコロニーを形成することができた。
【００７１】
ＷＩＴ−ＯＣ培地では、腫瘍細胞は即座に増殖することができ、多くの腫瘍細胞が、大幅なｉｎ  ｖｉｔｒｏクローン選択、又は、追加のゲノム又はエピジェネティックな異常を獲得する必要性なしに増殖したことを示唆している。さらに、増殖率の減少なしに３０〜１００回の集団倍化数でこれらの細胞を連続的に培養することができたが、我々は集団倍化数の上限を未だに同定できていない。
【００７２】
標準培地はＯＣＩ細胞株を支持することができない。我々が試験したＯＣＩ株のどれもが従来の標準培地で培養することができないことを我々は観察した。反対に、我々が試験したＳＯＣ株の全てがＷＩＴ−ＯＣ培地で培養することができた。現在まで、標準培地のどれもが従来のＳＯＣ株の全ての培養を支持せず、ＳＯＣ株の大型パネルが様々な異なる培地で培養する必要があるため、それらを互いに比較することを困難にしている。我々の結果は、ＷＩＴ−ＯＣ培地がＳＯＣ株用の万能培養培地として役立つ可能性を有し、細胞株同士の比較を容易にすることを示す。
【００７３】
ＯＣＩ細胞株は、原発腫瘍のゲノム構造（genomic landscape）と酷似する。主要な遺伝子変化が標準培地での細胞培養期間中に蓄積する。腫瘍ゲノムと細胞株ゲノムとを比較するため、我々は、それらのヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）プロファイルを調べて、各ＯＣＩ細胞株が未培養腫瘍サンプルに対応するプロファイルに顕著な類似性を示すことを発見した。多くの事例で、細胞株と腫瘍との間に特に顕著な類似性があった（ＯＣＩ−Ｍ１ｐ／ＴＭ１、ＯＣＩ−Ｐ２ａ／ＴＰ２、ＯＣＩ−Ｃ２ｐ／ＴＣ２、ＯＣＩ−ＥＰ１／ＴＥＰ１）。ＯＣＩ株の２つ（ＯＣＩ−Ｕ１ｐ及びＰ５ｘ）と、それらの対応腫瘍とは、全染色体腕にわたる大規模な変化を有した。反対に、残りの１０種類のＯＣＩ株と、それらの対応腫瘍とは、染色体の狭い領域にわたるＬＯＨのゲノム領域を含んだ。未培養腫瘍と対応細胞株とのＬＯＨパターン間で９０％以上の同一性があり、４つの事例を除いて、培養細胞と原発腫瘍との間のＬＯＨで有意差があった。全般的なＣＶＮの傾向は、ＯＣＩ細胞株と卵巣細胞との間で類似し、両方のデータセットにおいてＣＮＶの傾向は、染色体２、１９、２０でコピー数増加であり、染色体４、９、１３、１５及び１８でコピー数減少であった。残りの染色体はより複雑なパターンであった。興味深いことに、コピー数減少が染色体３及び８の短腕で顕著であり、コピー数増加は長腕で顕著であり、このパターンはＯＣＩ株で再現された。これらの結果は、ＯＣＩ株とそれらの対応腫瘍との間でのＬＯＨの比較と一致し、原発腫瘍のゲノム構造（genomic landscape）がＯＣＩ株で保持されることを示す。細胞株が確立される腫瘍の断片は必然的にＤＮＡが単離される腫瘍の断片と異なるため、腫瘍内の遺伝的不均一性はこれらの違いのいくつかが原因である可能性がある。また少数の事例では、それらの株及びその他のＯＣＩ株において増殖率の顕著な違いが全くないにもかかわらず、いくつかの変化は培養期間中の遺伝子変化の蓄積が原因である可能性がある。
【００７４】
これらの細胞が数十年前に確立され、原発腫瘍サンプルが入手できないため、我々は、ＳＯＣ株のＤＮＡと対応原発腫瘍ＤＮＡとを比較することができなかった。次に、我々は、ＴＣＧＡデータセットで解析した卵巣腫瘍とＯＣＩ細胞のコピー数多型（ＣＮＶ）パターンを比較した。ＬＯＨ解析と一致して、ＯＣＩ株の全般的なＣＶＮの傾向は、原発腫瘍サンプルに類似した。
【００７５】
細胞培養分野での持続的な問題は、株の交差汚染及び取り違えであり、公表された報告の１５〜２０％までに存在する。ＯＣＩ株と原発腫瘍組織との間の近似のゲノム一致は、ＯＣＩ株がユニークな患者からそれぞれ得られたことを保証する。さらに、我々は、これらの細胞株の認識用の固定のユニークな識別子を提供するのにＯＣＩ及びＳＯＣ株のミトコンドリアＤＮＡを配列決定した。全般的に、これらの結果は、大部分のＯＣＩ細胞株は、組織中に存在する遺伝子変化を正確に維持することを示す。
【００７６】
ＯＣＩ及びＳＯＣ株は、異なる遺伝子発現特性を有する。２５種類のＯＣＩ及び６種類のＳＯＣ株のｍＲＮＡ発現データの教師なし階層的クラスタリングを２つの主要なクラスターを示し、５５８個及び２６５個の遺伝子が、それぞれ、クラスター１及び２で上向き調節されたことが分かった（図３、表３）。
【００７７】
【表３−１】
2016523527.tif 000009
【００７８】
【表３−２】
2016523527.tif 000010
【００７９】
【表４−１】
2016523527.tif 000011
【００８０】
【表４−２】
2016523527.tif 000012
【００８１】
クラスター１はＯＣＩ株のみを含んだ（図３ａ−ｂ）。多くのＯＣＩ乳頭状漿液性株は、このクラスターであった（１０／１２）（図３ａ−ｂ、クラスター１）。反対に、クラスター２は主に非乳頭状漿液性腫瘍（１０／１３）からなり、細胞株サンプルの全ＳＯＣパネル（１２／１２）を含んだ（図３ａ−ｂ）。
【００８２】
上記の結果と一致して、他のものは、ヒト漿液性がんのｍＲＮＡプロファイルが異なるグループを構成する一方、類内膜及び明細胞腫瘍の小サブセットのプロファイルは乳頭状漿液性腫瘍のものと重複することを示した。このパターンを思い出すと、いくつかの類内膜及び明細胞ＯＣＩ株は乳頭状漿液性優勢クラスター１と相関し、組織学的に類内膜及び明細胞として分類された腫瘍のいくつかは乳頭状漿液性様の遺伝子発現特性を有することを示している（図３ｂ、クラスター１）。クラスター２のＯＣＩ株のｍＲＮＡ発現プロファイルはＳＯＣ株と似ていた（図３ａ−ｂ）。特に、異種移植片由来ＯＣＩ株４つのうち３つが、クラスター２であり（図３ａ−ｂ、Ｃ３ｘ、Ｃ５ｘ及びＰ５ｘ）、異種移植片由来の細胞株（クラスター２）が、原発腫瘍から確立した細胞株（クラスター１）と比較して異なる発現プロファイルを有することを示唆している。
【００８３】
重要なことに、標準培地及びＷＩＴ−ＯＣの両方で培養されたＳＯＣ株はお互いに隣接して培養され、ＯＣＩ及びＳＯＣ株の間で観察された違いは、培養培地に含まれた成分の違いが原因であったことを示している（図３ｂ）。クラスター１とクラスター２とで上向き調節されたｍＲＮＡプローブ及び下向き調節されたｍＲＮＡプローブは、それぞれ、３７経路及び４１経路を含み（ｐ＜０．０５）（図６ａ）、とりわけ、ＮＦ−ｋＢ、ＣＸＣＲ４、ＩＧＦ−１、Ｒｈｏ−ＧＤＩ、ＩＬＫ及びＩＬ−８シグナル（クラスター１）、Ｎｏｔｃｈ、ＢＲＣＡ、ＧＡＤＤ４５、グランザイム及びスタスミンシグナル伝達（クラスター２）を含んでいる（図６ｂ）。要約すれば、クラスター１は一般的に乳頭状漿液性の組織構造、ＯＣＩ細胞及び原発腫瘍由来株と関連し、クラスター２は非乳頭状漿液性の組織構造、ＳＯＣ細胞株及び異種移植片と関連した。
【００８４】
タンパク質及びｍＲＮＡ発現プロファイルは同一のＯＣＩ細胞株クラスターを同定する。次に我々は、逆相タンパク質解析（ＲＰＰＡ）を用いて主要なシグナル伝達経路を代表する２２６種類のタンパク質の発現レベルを調べた。タンパク質発現データの教師なし階層的クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）は２つの主要なクラスターを明らかにし、再度、クラスター１はＯＣＩ株のみと、多くの乳頭状漿液性株とを含んだ（１０／１２）（図４）。反対に、クラスター２は主に非乳頭状漿液性株であり（１０／１３）、全てのＳＯＣ株を含んだ（６／６）（図４）。クラスター１及び２の間で差動的に発現した遺伝子のリストについて表５及び６を参照せよ。これらの表現型の再現性を評価するために、タンパク質抽出物が２回の実験にわたって３回の異なる継代から３種類調製され、その都度、我々は、各細胞株由来の複製物が一緒にクラスター化されたことを観察した。また、細胞株のｍＲＮＡ及びＲＰＰＡプロファイルの比較が、分子表現型で驚くべき程度の一貫性を明らかにした。ｍＲＮＡ及びＲＰＰＡクラスターが、１つの例外と同一であった（ＯＣＩ−Ｃ４ｐ）。これらの結果は、ＯＣＩとＳＯＣ株との間での分子的違いが、継代及び解析プラットフォームにわたって安定で再現性があることを示す。
【００８５】
【表５−１】
2016523527.tif 000013
【００８６】
【表５−２】
2016523527.tif 000014
【００８７】
【表５−３】
2016523527.tif 000015
【００８８】
【表５−４】
2016523527.tif 000016
【００８９】
【表５−５】
2016523527.tif 000017
【００９０】
【表５−６】
2016523527.tif 000018
【００９１】
【表５−７】
2016523527.tif 000019
【００９２】
【表５−８】
2016523527.tif 000020
【００９３】
【表５−９】
2016523527.tif 000021
【００９４】
【表５−１０】
2016523527.tif 000022
【００９５】
【表６−１】
2016523527.tif 000023
【００９６】
【表６−２】
2016523527.tif 000024
【００９７】
【表６−３】
2016523527.tif 000025
【００９８】
【表６−４】
2016523527.tif 000026
【００９９】
【表６−５】
2016523527.tif 000027
【０１００】
ＯＣＩ細胞株は、マウス異種移植時にヒト腫瘍組織病理を再現する。ＯＣＩ株のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍表現型を調べるために、我々は免疫不全マウス宿主にそれぞれを注射した。腫瘍の顕微鏡的特徴は、卵巣腫瘍サブタイプを説明するのに長い間使用されている。最も一般的な悪性卵巣腫瘍サブタイプの、乳頭状漿液性カルシノーマは、最小細胞質と、非常に大きく、高グレードの、丸い核とを有する悪性上皮によって裏打ちされた小分枝を生じさせる間質性中核（central stromal cores）からなる指状構造（乳頭突起）を示す（図５ａ）。子宮内膜組織への類似性に因んで名づけられた類内膜アデノカルシノーマは、豊富な細胞質を有する伸長した悪性上皮細胞によって取り囲まれた中心管腔の周りの組織化された腺を特徴とする（図５ｂ）。典型的に明細胞カルシノーマは、過剰な細胞質グリコーゲンのためにＨＥ染色で明らかとなる豊富な細胞質を有する細胞で裏打ちされた微小嚢胞、腺及び／又は乳頭突起を次々に形成する（図５ｃ）。グリコーゲンの代わりに、粘液性がんはそれらの細胞質に高レベルのムチンを有する。腫瘍形態でのそれらの違いは、遺伝子発現及び臨床的特徴での妥当な違いを反映する。しかし、原発腫瘍の構造上の特徴を再現することは、多くの異種移植腫瘍モデルでの捉えどころのない目標であった。
【０１０１】
一般的に、ＳＯＣ株は、特異的な卵巣腫瘍サブタイプの典型的な組織病理学的特徴なしにマウスで不完全に分化した異種移植腫瘍をつくる（図５ｄ〜ｆ）。反対に、ＯＣＩ株は、原発ヒト腫瘍によく似ている組織病理を有する腫瘍異種移植片をつくった（図５ｇ〜ｏ）。ＯＣＩ−Ｐ５ｘ、Ｐ７ａ及びＰ９ａはヒト乳頭状漿液性カルシノーマから確立され、それらは免疫不全マウスで乳頭状漿液性様の特異的構造を再現した（図５ｇ〜ｉ）。ＯＣＩ−Ｃ３ｘ及びＣ５ｘ株はヒト明細胞から確立され、それらは明細胞によって裏打ちされた微小嚢胞及び乳頭突起をマウスで形成した（図ｊ及びｋ）。ＯＣＩ−ＣＳｐ株が不完全に分化したカルシノサルコーマから確立され、それは不完全に分化した腫瘍をマウスで形成した（図５ｌ）。ＯＣＩ−Ｅ１ｐ株は類内膜アデノカルシノーマから確立され、腺構造を有するエストロゲン受容体陽性腫瘍を形成し、原発腫瘍の表現型に似ている（図５ｍ〜ｏ）。
【０１０２】
要約すると、非常に顕著に、ＯＣＩ株が、一般的にこの特性を欠くＳＯＣ株と違って、組織病理学的レベルで対応するヒト卵巣カルシノーマの形態的表現型模倣物である腫瘍を形成した（図５ｄ〜ｆ）。
【０１０３】
ＯＣＩ株のｍＲＮＡプロファイルは、異なる転帰を有するヒト腫瘍を同定する。２８５種類のヒト卵巣腫瘍標本と同時のＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株パネルのクラスタリング解析は、２つの異なる患者クラスターを明らかにした。患者クラスターＰ１はＯＣＩ株のみを含み、クラスターＰ２はＳＯＣ株全てを含んだ（図１）。ヒト腫瘍サンプル中の細胞株の分布は１つの細胞株（ＯＣＩ−Ｃ４ｐ）を例外として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株クラスターと同一であり、これらの細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型はｉｎ  ｖｉｖｏ臨床腫瘍表現型と一致することを示している。さらに、患者のこれらの２つのグループの臨床転帰の比較は、クラスター１のＯＣＩ様の腫瘍を患う患者がＳＯＣ様のプロファイルを有するクラスター２の患者と比較して短期進行がなく、全体的に長生きであることを明らかにした（図１）。
【０１０４】
ＯＣＩ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏタキソール反応は患者の転帰と相関する。不完全な患者の転帰と、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株との間での著しい相関が、最も一般的に使用される卵巣がんの処置用薬剤の２つであるタキソール及びシスプラチンへのこれらの細胞株の反応を試験することを我々に促した。我々は、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１及び２のＯＣＩ株と、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター２のＳＯＣ株とに対応する株のパネルを選択し、各パネルは、異なる腫瘍サブタイプ（Ｐ、Ｃ、ＣＳ、Ｅ、Ｍ）及び組織供給源（固形腫瘍、腹水及び異種移植片）の例を含んだ。ＯＣＩ株及びＳＯＣ株の両方が上記実験用のＷＩＴ−ＯＣ培地に播種された。これらの実験で、我々は、ｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター１のＯＣＩ株はｍＲＮＡ／ＲＰＰＡクラスター２のＳＯＣ株よりもタキソールへの感受性が低いことを観察した（図２）。また、同一クラスターのＳＯＣ株に類似するクラスター２のＯＣＩ株のサブセットは、クラスター１のＯＣＩ株と比較してタキソールにより感受性であった（図２）。これらの結果は完全な用量反応曲線と確認された。反対に、我々は、ＯＣＩ株及びＳＯＣ株の間でのシスプラチンへの反応において有意差を見い出せなかった。
【０１０５】
ＯＣＩ細胞の相対的なタキソール耐性について可能性のある根拠を探索するために、我々は、クラスター１／ＯＣＩ株のタンパク質プロファイルを、クラスター２／ＳＯＣ株と比較した（図２、表７）。クラスター１薬剤耐性株は、チューブリン（タキソールの標的）、ＰＡＸ２、Ｃｏｘ２、ＰＡＩ．１、ＡＫＴ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ３及び活性化型Ｅｒｋ（ＭＡＰＫｐＴ２０２）を含むタキソール耐性と以前に関連付けられたさまざまなタンパク質を過剰に発現した。クラスター２薬剤感受性細胞株は、多くの前アポトーシスタンパク質、例えば、Ｂｉｍ、ＳＭＡＣ−ＤＩＡＢＬＯ及び開裂カスパーゼ７のより高レベルと、不活性型リン酸化ＢＡＤ（ｐＳ１１２）、ＢＨ３単体の前アポトーシスタンパク質のより低レベルとを示し、これらのタンパク質はクラスター２細胞をタキソール誘導型アポトーシスにより感受性とした。高Ｂｉｍレベルは、Ｂｉｍをリン酸化し、それをユビキチン化及び分解のために標的にする活性型Ｅｒｋ（ＭＡＰＫｐＴ２０２）と逆相関した（表２）。これらの結果は、ＯＣＩ細胞株は卵巣がん薬剤反応の前臨床試験用の従来のＳＯＣ細胞株に有益な追加となることを示唆する。
【０１０６】
【表７−１】
2016523527.tif 000028
【０１０７】
【表７−２】
2016523527.tif 000029
【０１０８】
【表７−３】
2016523527.tif 000030
【０１０９】
ここで我々は、多種多様な卵巣カルシノーマ細胞タイプを増殖する方法を提供する。新規培地の形態での本方法の使用が、ＤＮＡ及びＲＮＡデータ及びタンパク質アレイの全ゲノムプロファイルを含む組織病理及び分子解析で広く特徴付けられる２５種類の新しい卵巣がん細胞株のパネルを今までに生み出した。
【０１１０】
我々が本明細書に記載するＯＣＩ細胞株の分子プロファイルは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質のプロファイルにわたって顕著な一貫性及び堅固性を示し、臨床的に関連のある患者集団をまとめる。例えば、ＯＣＩ細胞株のサブセットは、不良な転帰の患者由来の腫瘍に似ている遺伝子発現プロファイルを有し、卵巣がんの一次処置のタキソールにより耐性である。この結果は、これらのＯＣＩ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬剤反応が、薬剤処置へのｉｎ  ｖｉｖｏ患者反応と実際に密接に相関することを示す。かかる相関が、ヒト腫瘍と比較してより薬剤感受性となる傾向があり、細胞培養を利用した薬剤スクリーニングで偽陽性検出（false-positive hits）をもたらす標準腫瘍細胞株で稀と認識されているため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株データとｉｎ  ｖｉｖｏ患者データとの間でのかかる相関は特に助長している。我々はＯＣＩ株及びそれらの異種移植腫瘍の細胞学的、形態学的及び分子特性がヒト卵巣がんの特異的サブタイプに似ており、多くのＳＯＣ株の事例ではないことを観察したため、ＯＣＩ株とヒト卵巣腫瘍との間の密接な相関は、おそらく驚くべくことではない。
【０１１１】
さまざまな薬剤への患者反応を予測する、がん細胞集団を作製する堅固で効率的な培養系は、がん患者の個別処置用の新しい薬剤開発を大いに改善する。我々の結果は、本方法が、白血病、乳がん、膵臓がん、消化管サルコーマ等の他の腫瘍タイプを培養するのに適用できることを示唆する。本明細書で説明した方法は、個別化腫瘍治療に適用することができ、各患者の腫瘍の薬剤感受性プロファイルが培養腫瘍細胞でリアルタイムに評価でき、この情報が処置決定を導き出すために使用される。
【０１１２】
方法
原発腫瘍培養及び細胞株：新鮮な腫瘍組織断片が細分化され、１ｍｇ／ｍｌ  コラゲナーゼ（Roche）での分解前及び後にプライマリア（BD Biosciences）プレートに播種された。腫瘍細胞は、インスリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、コレラ毒及び血清を補充した以前に記載したＷＩＴ栄養培地（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）で培養された。我々はＷＩＴ−ＯＣとしてこのタイプの培地に言及する。この組成は、類内膜及び粘液性腫瘍用に１７β−エストラジオールを補充された。乳頭状漿液性、明細胞、未分化胚細胞腫及びカルシノサルコーマ腫瘍はプライマリア培養プレートに張り付いた単層として５％  ＣＯ２及び一定のＯ２にて３７℃で培養された。類内膜及び粘膜性腫瘍がプライマリア培養プレートに張り付いた単層として５％  ＣＯ２及び一定のＯ２にて３７℃で培養された。腫瘍細胞は一週間に１回、〜１：３の割合で継代され、約１ｘ１０４細胞／ｃｍ２で新しいフラスコに播種された。培養の最初の数週間に、（〜１−５）プレートは間質細胞を除去するために初めに希釈トリプシンで処理された。培養プレートにまだ張り付いている残りの細胞は継代培養用の０．２５％トリプシンで処理された。一般的に、腫瘍培養は４〜６回の継代において間質性及び正常な細胞タイプが存在しなかった（Supplemental Methods for further details of culture methodsを参照せよ）。ＳＯＣ細胞株が販売者の指示書どおりに増殖された。ＯＣＩ株が発行時のＩｎｃｅ研究室から入手可能である。研究手順の全てが、不要な組織を収集するのにブリガム・アンド・ウィメンズ・ホスピタル（ＢＷＨ）及びマサチューセッツ・ジェネラル・ホスピタル（ＭＧＨ）の施設内治験審査委員会によって承認された。
【０１１３】
タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ解析：タンパク質発現は以前に記載したようにＲＰＰＡによって解析された（Hu et al., Bioinformatics 23, 1986-1994, 2007）。複製データは平均化され、ｌｏｇ２変換され、中央値が求められ、クラスターの非中央値化ピアソン相関（ｖ．３．０）及びＪａｖａ  ＴｒｅｅＶｉｅｗ（ｖ．１．１．１）を用いて階層化クラスタリングに供された。細胞株のｍＲＮＡ発現はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォームを用いて測定された。２８５種類の卵巣腫瘍サンプルの遺伝子発現データはＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）（アクセッション番号ＧＳＥ９８９９）から得られ、ＲＭＡ法によって標準化された。腫瘍及び細胞株由来のゲノムＤＮＡがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙチップで解析された。コピー数解析がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＭＩＰ）３３０ｋマイクロアレイを用いて実施された。
【０１１４】
薬剤感受性実験：化学療法薬剤へのＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株の相対感受性が、９６ウェルの黒色壁付透明底コーニングプレートに３０００細胞／ウェルで６つ同数の細胞を播種し、１２時間ＷＩＴ−ＯＣで接着できるようにして測定された。ＯＣＩ細胞株及びＳＯＣ細胞株の両方がＷＩＴ−ＯＣ培地で薬剤に曝露された。細胞株は薬剤又は溶媒（vehicle）対照があるなかで９６時間培養された。薬剤処理後に代謝的に活性の細胞の画分が、培地中の２：１０（ｖ／ｖ）  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Promega Cat# G8081）とともに２時間インキュベーションすることによって測定され、反応が３％ＳＤＳの添加によって停止された。蛍光がＳｏｆｔＭａｘソフトウェア（５５５ＥＸ／５８５ＥＭ）を用いるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Molecular Devices, CA）で測定された。
【０１１５】
腫瘍形成能の解析：単一細胞懸濁物がマトリゲルで調製された：ＷＩＴ混合物（１：１）と、１００μｌ量あたり１〜５百万個の細胞とが、マウス１頭あたり腹腔内に１回及び皮下部位に２回注射された。腫瘍細胞注射は、６〜８週齢の雌の免疫不全ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA）で実施された。腫瘍は移植後５ないし９週間で摘出された。腫瘍組織病理が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の、ヘマトキシリン・エオジンで染色した切片を用いて評価された。全てのマウス研究は、ＢＷＨ又はＭＧＨの動物実験委員会のいずれかによって審査され、承認されたプロトコールを順守した。
【０１１６】
追加の方法
細胞培養培地：さまざまな異なる培地がヒトの乳房及び卵巣細胞を培養するのに以前に使用され、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＭＣＤＢ−１０５、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ及びＭＣＤＢ−１７０（ＭＥＧＭ）を含む。一般的に、原発卵巣又は乳がんサンプルのわずか数パーセントが、これらの標準細胞培養培地を用いて細胞株として確立された。これと一致して、我々は、１００種類以上の腫瘍由来の細胞を培養するための標準培地を用いて永久ヒト卵巣がん細胞株をまったく確立できなかった。したがって、我々が、Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007に記載するように、正常な組織由来のヒト乳房上皮細胞の増殖を支持するために以前に開発した化学的に定義された無血清細胞培養培地（ＷＩＴ）の使用を我々は探索した。
【０１１７】
ＷＩＴ培地は、血清、フィーダー層、組織抽出物又は薬理学的試薬などの未定義の成分なしに正常及び形質転換したヒト乳房細胞の長期間の増殖を支持することができる新規の化学的に定義された細胞培養培地の一群を含む（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）。正常細胞用に最適化したこの培地タイプ（ＷＩＴ−Ｐ）を用いて、我々は６カ月の連続培養期間に７０回以上の集団倍化数、ほぼ１０２１倍の細胞数の増加でヒト乳房上皮細胞（ＢＰＥＣ）を培養することができた（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）。反対に、標準培地では、これらの正常乳房上皮細胞は数回の継代後に増殖を停止した（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）。我々は初めに、ヒト卵巣腫瘍細胞株を確立するのに、形質転換したヒト乳房細胞（ＢＰＬＥＲ）（Ince et al., Cancer Cell 12, 160-170, 2007）用に最適化した培地タイプ（ＷＩＴ−Ｔ）を試験したが、この培地を用いて１２種類以上の腫瘍サンプルで不成功であった。
【０１１８】
次に、我々は、ＷＩ−Ｔ培地の明白な成分濃度の改変が原発卵巣腫瘍細胞の増殖を支持するかを試験した。最初に我々は、血清の低レベルが、腹腔での正常な卵巣、ファローピウス管及び卵巣がんの生理環境を模倣するのに必要とされることを説明した。多くの上皮のように、正常なヒト乳房細胞は、生理条件下で決して血液又は血清に直接的に接触しないので、我々が正常な乳房上皮細胞用に開発したＷＩＴ培地は完全に血清を除いた。反対に、卵巣及びファローピウス管は、循環血液の５０％と同じくらいの高さである生理血清タンパク質濃度を含む正常な腹水と直接的に接触する。重要なことには、卵巣がん患者に存在するヒト腹水中のタンパク質及び増殖因子の濃度は血清よりも高い。ＷＩＴ培地への血清の添加は、卵巣腫瘍細胞の増殖に必須であるが、十分ではないことが証明され、追加の因子が最適化されなければならない。
【０１１９】
培地を最適にすることに関する難しさの１つは、個別成分の自明ではない相乗的な組み合わせ効果である。多くの場合、個別の添加は卵巣がん培養の継代を徐々に増加しなかったが、全ての成分が最適濃度で添加されたとき、細胞増殖が急激に増加した。長年の最適化の後、ＷＩＴ−Ｔ培地へのウシ胎仔血清に加えて、インスリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ及びコレラ毒の含有が異なる卵巣腫瘍サブタイプの増殖を支持するうえで広い有効性を示すことが我々は分かった。
【０１２０】
類内膜及び粘液性がんなどのいくつかの卵巣腫瘍サブタイプは、エストロゲン受容体（ＥＲ）を発現し、β−エストラジオール（Ｅ２）の添加がこれらの腫瘍サブタイプの増殖を増大した。
【０１２１】
また、乳頭状漿液性及び明細胞腫瘍が大気Ｏ２（１８ないし２１％）で最も増殖した一方、ＥＲ＋類内膜及び粘液性腫瘍は低Ｏ２レベル（５ないし１０％）で最も増殖し、低Ｏ２レベル（１％）は有害であったため、我々はＯ２レベルを最適にしなければならなかった。さらに、低Ｏ２レベル（５％）での培養は、ＥＲ発現を維持するために必須であった。エストロゲンは細胞タイプに依存して酸化促進剤又は抗酸化剤の役割を果たすことが示された。これは、１００ｎＭ  β−エストラジオールでのＥＲ＋類内膜及び粘膜性ＯＣＩ株が低Ｏ２レベルで最も良い表現型を維持する１つの理由である。
【０１２２】
本工程の最も時間を要する態様は、最終的な組成が標本及びがんサブタイプの広範囲にわたる適用可能性を有することを確かめるために、多数の原発卵巣がんサンプルの誘導物を支持するのに各培地の能力を検証することの必要性であった。いくつかの成分は、いくつかのサンプルに培養効果でほとんど効果がない一方、それらはその他には絶対的に必須であった。重要なことには、これらの成分を除去することの効果は複数の継代後により明らかとなる。ここで、各成分の効果は、多くの継代にわたって試験されなければならなかった。
【０１２３】
また、細胞接着表面が重要であった。不均一に陰性に電荷した通常の組織培養プラスチックは変動的な結果を生じた一方、陽性及び陰性の混合電荷を有する改変した細胞培養プラスチック（Primaria, BD）は細胞の形態及び不均一性を保つことに役立った。
【０１２４】
自明ではない組み合わせの成果の性質、複数の継代及び複数の細胞株での条件を試験する必要性、及び、試験する条件が非常に大多数であること、これらの因子の全てが培地開発の漸進的アプローチを妨げた。さらに、ＷＩＴと標準培地との間での３０ないし５０個の違いはともかくとして、ＷＩＴ−ＴとＷＩＴ−ＯＣｅとの間での７個の違いに焦点を合わせても、３つの濃度で、２６２，１４４種類の組合せを試験する必要がある。したがって、振り返ってみても、これらのタイプぞれぞれを体系的に試験することは不可能である。
【０１２５】
これらの気力を失わせるような困難にもかかわらず、我々の実験努力は、原発卵巣がんの多くの長期間培養を支持したインスリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、コレラ毒、血清、β−エストラジオール、Ｏ２及び細胞培養フラスコの組み合わせの同定をもたらした。ＷＩＴ−ＯＣ（β−エストラジオールを添加したときは−ＯＣｅ）と名付けたヒト卵巣腫瘍用に最適化した培地は、熱で不活性化した２〜５％ウシ胎仔血清（HyClone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）とともにＥＧＦ（0.01 ug/mL, E9644, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、インスリン（20 ug/mL, I0516, Sigma-Aldrich）、ヒドロコルチゾン（0.5 ug/mL, H0888, Sigma-Aldrich）、２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒（227035, Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA）の終濃度を含む。ＷＩＴ−ＯＣの現在の組成を用いて、我々は相対的に高効率で卵巣腫瘍を培養することができた（２５／２６）。
【０１２６】
最後に、我々が試験したＯＣＩ株のいずれもが従来の標準培地で培養することができないことを我々は観察した。反対に、我々が試験した全てのＳＯＣ株はＷＩＴ−ＯＣ培地で培養することができた。我々が知る限り、標準培地のどれもが、従来のＳＯＣ株の全ての培養を支持しないので、ＳＯＣ株の大パネルをお互いに比較することが困難である。我々の結果は、ＳＯＣ株用の万能培養培地として役立つ可能性を有し、ＷＩＴ−ＯＣ培地が細胞株にわたる比較を容易にすることを示す。
【０１２７】
腫瘍組織収集及び臨床情報：研究手順の全てが、不要な組織を収集するのにブリガム・アンド・ウィメンズ・ホスピタルの治験審査委員会によって承認された。この最初の研究では、我々はヒト卵巣腫瘍の良好な培養方法を開発することに集中した。本目的のために、我々は、匿名の不要なヒト組織を用い、遡及的に臨床患者経過観察情報にアクセスしなかった。より多くの患者と臨床経過観察をともなう有望な研究は、個別の処置患者と、それらに対応する細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応との直接比較を調べる必要があり、現在進行中である。
【０１２８】
細胞株の確立:腫瘍は、線維芽細胞、内皮細胞、白血球、マクロファージなどの間質細胞と同様に、腫瘍細胞と混じりあっている正常な上皮細胞を含む多くの細胞タイプからなる複合組織である。これらのうち、線維芽細胞は、歴史的に標準培養培地で増殖することが最も容易な細胞である。一般的に、血清は線維芽細胞増殖を促進し、上皮細胞増殖を抑制する。腫瘍組織が高血清成分含有培地で培養されるとき、典型的に、線維芽細胞の急激な増殖があるため、数週間で線維芽細胞が培養プレートを完全に覆い尽くし、直ちに、腫瘍細胞を含む他の細胞タイプ全てが除去される。この理由のために、我々は、初期の継代（１〜５）期間に線維芽細胞増殖を抑制するための卵巣腫瘍細胞の培養のために低レベルの血清（２％）を用いた。上皮細胞と線維芽細胞との間のもう１つの違いは、組織培養プラスチックへの接着であり、一般的に、上皮細胞は培養フラスコにより強力に接着し、それらを遊離するのにより高濃度のトリプシンを必要とする。したがって、希釈したトリプシン（０．０５％）で最初に培地を処理することができ、選択的に間質細胞を除去する。その後、培養プレートに未だに接着している上皮細胞が継代培養用の０．２５％のトリプシンで処理される。ＷＩＴ−ＯＣは上皮腫瘍細胞増殖を支持し、線維芽細胞増殖を抑制するように設計された。しかし、一般的に、間質性及び正常な細胞タイプがない腫瘍培養を確立するために異なるトリプシン処理で４〜６回継代した。その後、ＦＢＳレベルは腫瘍細胞増殖を増加するために５％まで増加された。
【０１２９】
全てのＯＣＩ細胞について、我々は少なくとも２０〜２５回の集団倍化数で培養した。いくつかの事例では、我々は、組織的な集団倍化数解析を実行し、ＯＣＩ株が少なくとも１２０日間増殖できることを示した（〜６０回の集団倍化数）。ｍＲＮＡ抽出物（図３）及びタンパク質抽出物（図４）が、異なる研究者によって異なる時間（継代）で調製され、薬剤感受性実験（図１）は、異なる実施者によって独立に実施され、我々は、ｍＲＮＡ、タンパク質プロファイルと薬剤反応との間の顕著な程度の一致を観察した。これらの結果は、これらの細胞株が堅固で安定な表現型を有することを示す。
【０１３０】
クローン選択:クローン選択の可能性を意識しつつ、我々は、急増殖コロニーの出現についてＯＣＩ培養物の全てを注意深く観察し、開始細胞が少な過ぎるプレートを除外し、ＯＣＩ株の継代培養中、プレートの部分的なトリプシン処理を回避した。
【０１３１】
細胞増殖の測定：多くの以前の報告では、細胞継代の累積数が細胞株の良好な確立を示すために用いられた。しかし、継代数はそれだけで腫瘍細胞数の純増加を検証することに妥当ではないことに気付くことが重要である。細胞継代数とは、細胞が１つのプレートから首尾よく取り出され、新しい培養プレートに播種される回数をいう。これは、細胞の少なくともいくつかは転移に寛容であり、まだ生存していることを示す。しかし、継代数は必ずしも増加した細胞数と一致しない。例えば、我々は、ほぼ２０回の継代でＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９において腫瘍細胞株ＯＣＩ−Ｃ５ｘを継代することができた。しかし、これらの細胞の集団倍化数曲線は、７回の継代後に横ばいになった。したがって、継代７回から２０回までの間の純増加はなかった。ここで、ＭＣＤＢ−１０５／１９９を用いて増殖されたとき、これらの細胞は、多くの実験を実行するための実質的なプラットフォームを提供できなかった。プラットフォームとしての実用性が、集団倍化数を測定することによって良好に評価される。
【０１３２】
異なる研究からの結果の客観的比較が、「集団倍化数」に関する以前の研究を用いて行われ、すなわち、採取した細胞数のｌｏｇ２は、播種した細胞数のｌｏｇ２よりも少なく、ここで２個の細胞は１０回の集団倍化数（２１０＝１，０２４）で１０２４個の細胞まで増殖した。各１０回の集団倍化数は３桁（×１０３）の細胞数の純増加とほぼ等しく、そして、２０回の集団倍化数は１００万倍の増加に近く、３０回の集団倍化数は真の細胞数で１０億倍に近い。我々は、細胞増殖率の減少をともなうことなく、ＯＣＩ株を用いて３０〜１００回の集団倍化数を達成した。この時点で、我々は長期間細胞増殖実験を終了したので、達成することができる集団倍化数の上限はＯＣＩ株で非常に高くなりやすい。６０回の集団倍化数は、これらの細胞のいずれかの研究使用に十分に応えられる細胞数のほぼ１０２０倍（〜１０垓個の細胞）の増大に等しい。
【０１３３】
標準培地での腫瘍細胞の培養期間中に見られる増殖率の横ばいが、腫瘍組織の初期の播種と、細胞株の出現との間での長い時間差となりやすい。これは、培養系の効率及び実用性を評価するうえで顕著に変動し、細胞株の質に対して重要な意味合いを持っている。例えば、平均で、腫瘍細胞が最初に継代される前に５ヶ月（２１周間）以上要することが報告され、ＲＰＭＩ培地を用いる我々の経験と類似する（Verschraegen et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 9, 845-852, 2003）。
【０１３４】
標準細胞培養培地では、正常及び卵巣腫瘍細胞の両方が最初の数回の継代内で増殖停止される。テロメア短縮による増殖停止は典型的には５０〜７０回の継代後に生じるため、このタイプの初期増殖停止は不十分な培養条件が原因である。
【０１３５】
軟寒天コロニーアッセイ：我々が確立したＯＣＩ細胞株は培養で形質転換した表現型を維持することを確かめるために、我々は軟寒天で足場非依存性増殖アッセイを実施した。正常細胞は軟寒天コロニーを形成することができるため、これは、我々が実際に腫瘍細胞株を確立したことを確かめる優れた方法である。これらのアッセイのために、１２ウェルプルートのウェル底が、単層形成を妨げるためにＷＩＴ−ＯＣ培地で調製した０．６％寒天で密閉された。確立された培養物（継代６〜８回）由来の細胞が採取された。ＷＩＴ−ＯＣ培地の０．４％寒天に単一細胞懸濁物が添加され、室温に設定され、５％、ＣＯ２の３７℃インキュベーターに置かれた。細胞がＷＩＴ−ＯＣの０．４％寒天で２週間生育され、コロニー形成が播種後２〜４週評価された。
【０１３６】
代替的に、腫瘍細胞が懸濁培養で増殖された。腫瘍細胞塊（tumor spheres）は、２％のＢ２７サプリメント（Gibco）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（BD Biosciences）、４μｇ／ｍｌのへパリン及び０．５％メチルセルロースを含有するＷＩＴ−ＯＣ培地で増殖された。細胞塊形成実験のために、１５，０００〜２０，０００細胞／ウェルが６−ウェル超低接着プレート（Corning）に播種され、１、３、５日で生育され、細胞塊が７日目に計測された。
【０１３７】
ＬＯＨ解析：腫瘍組織のゲノムＤＮＡがパラフィン切片から、又は、入手可能なときには、新鮮な組織から抽出された。新鮮な腫瘍組織がＲＬＴ＋細胞溶解液（Qiagen）で直接的に均質化された。ＤＮＡがＱｉａｇｅｎ  Ａｌｌ−Ｐｒｅｐミニキットを用いて溶解物から抽出された。簡潔には、ＤＮＡがＳｔｙ１で開裂され、断片がＰＣＲ増幅された。さらに、精製した生成物はＤＮａｓｅＩで断片化され、ビオチン化され、チップにハイブリダイゼーションされ、シグナル増幅をともなうフィコエリスリンコンジュゲート化ストレプトアビジンで蛍光的に標識された。推定ＬＯＨ解析は、ｄＣＨＩＰソフトフェアを用いて実施され、０．２の標準ヘテロ接合性率を用いて隠れマルコフモデルに供された。
【０１３８】
ＬＯＨセグメント解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（４．１．４．８４０版）を用いて実施された。ＢＲＬＭＭアルゴリズムが遺伝子型決定に用いられた（スコア閾値＝０．５、前サイズ＝１０，０００、ＤＭ閾値＝０．１７）。対応のないサンプル解析がアフィメトリックスがプラットフォームを提供したＨａｐＭａｐサンプルからもたらされた２０人の女性サンプルを用いてＣＮ及びＬＯＨについて実施された（初期設定、例えば、正規化、０．１Ｍｂゲノム平滑化）。したがって、ソフトフェア内のセグメント報告ツールは、フィルター処理した結果を得るのに実行された（セグメント＝５あたりのマーカーの最小数、セグメント１００ｋｂｐの最小ゲノムサイズ）。最終的に、全てのサンプル用のプローブセットを同期化した後、さらに我々は、染色体にわたって６０ｋｂｐ領域毎のＬＯＨコールを集約した。全てのサンプルのかかる領域でＬＯＨコールが全くないとき、その領域は最終表から除外された。
【０１３９】
コピー数解析：コピー数解析がアフィメトリックスからのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＭＩＰ）３３０ｋマイクロアレイを用いて実施された。ＭＩＰプローブは、２つの末端配列が２つの隣接ゲノム配列に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、これらの２つの末端がそれらの間で単一塩基で反転した様式でゲノムＤＮＡにアニーリングする。コピー数解析では、ゲノムＤＮＡがＭＩＰプローブにハイブリダイゼーションされ、反応物がヌクレオチド混合物を含有する２つの別々のチューブに分けられる（アデノシン＋チミジン又はシトシン＋グアニンのいずれかの三リン酸）。ポリメラーゼ及びリガーゼの添加で、ＭＩＰプローブはゲノムのアレルに相補的なヌクレオチドが存在する中で循環する。循環したプローブ数は比例的に鋳型ＤＮＡの絶対量を反映するため、ゲノムＤＮＡが反応を制限してる。循環後、未使用のプローブ及びゲノムＤＮＡは、循環したプローブのみを残すエンドヌクレアーゼによって反応物から除去される。その後、それらのプローブは、増幅され、標識され、検出され、タグマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって定量化され、タグは低交差ハイブリダイゼーションをするように設計される。データはＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙからのＮｅｘｕｓ  ５．１ソフトウェエアを用いて分析された。
【０１４０】
ＯＣＩ細胞のＣＮＶパターンと、ＴＣＧＡデータセットの卵巣腫瘍とを比較するために、我々は、ＴＣＧＡデータポータルからＭＳＫＣＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １Ｍ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎデータをダウンロードした。このセットは、ＣＢＳアルゴリズムを用いて４８７種類のＴＣＧＡ卵巣サンプルから作製した４９７個のコピー数のセグメントファイルを含んだ。我々は、無作為に１００個のファイルを選択し、重複間隔の平均ｌｏｇ２強度値を一緒に合計する間隔結合アルゴリズムを用いて個々のコピー数ファイルを単一のコンセンサスに結合した。
【０１４１】
同様に、我々は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＩＰアレイ及びＲバイオコンダクターのＤＮＡコピーパッケージのＣＢＳアルゴリズムを用いて２５種類の卵巣細胞株サンプル用の個々のコピー数プロファイルを作製した。コンセンサスコピー数プロファイリングは、同一の間隔結合アルゴリズムを用いてこれらの２５種類のサンプルから作製された。コピー数／ＬＯＨの方法。
【０１４２】
ＲＮＡ発現解析：全ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて製造者の指示書に従って、３つの各細胞株（同一の細胞株由来の異なる継代数）から抽出された。ＲＮＡは、高品質を確かめるのにキャピラリー電気泳動装置（Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いるサイズ画分手法で検査され、ＲＮＡ濃度がＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Nanodrop Technologies Inc, Wilmington, DE）を用いて推量された。細胞株の遺伝子発現はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォームを用いて測定された。組込み制御全ての未加工のシグナルがアレイのパフォーマンスの品質管理として検査された。サンプル独立性対照がハイブリダイゼーション及びシグナル発生を検査するのに用いられ、ハウスキーピング遺伝子はサンプル依存性対照として用いられた。バックグラウンドサブトラクション後、データは分位標準化を用いてアレイにわたって標準化された（Bolstad et al., 2003）。平均シグナル強度は遺伝子発現プロファイリングに用いられた。
【０１４３】
また、２８５種類の卵巣腫瘍サンプルの遺伝子発現データがＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）から得られた（アクセッション番号ＧＳＥ９８９９）。サンプルはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０プラットフォームを用いて評価された。データはＲＮＡ法によって標準化された（Irizarry et al., Nucleic acids research 31, e15, 2003）。２つのデータセットは、遺伝子シンボルを適合することによって組み合された。データは各サンプルについて中央値を求められた。組織にわたって中央値と比較して、少なくとも４種類の細胞株で少なくとも２倍の違いを有する発現レベルの遺伝子が選択された。これは、さらなる解析用の３８３１個の遺伝子を生じた。
【０１４４】
図３では、組み合わせたサンプルは、細胞株が異なる臨床転帰の患者サンプルを用いてグループ化されたかを見るために階層的クラスタリングを用いてクラスター化された。これは、距離行列を利用したスピアマンの相関係数と、凝集アルゴリズムを利用したウォードの最小分散とを用いて行われた。サンプルツリーは３つの主要なブランチに切分けられた（図１）。クラスターＰ２は、全てのＳＯＣ細胞株（及び数種類のＯＣＩ細胞株）に存在し、全てのＯＣＩ細胞株はクラスターＰ１にグループ化された。ブランチ３が小さく、細胞株サンプルが全くないために、ブランチ３は生存解析に含まれなかった。無増悪生存及び全生存についてのカプラン−マイヤー曲線が図１でプロットされた。未加工のデータがプラットフォーム販売者のソフトウェアから作製された後に、全ての統計解析がＲで実施された（Team, 2011）。
【０１４５】
原発腫瘍が、正常な細胞、間質細胞、炎症細胞、アポトーシス細胞、血管、壊死マトリクス等の不均一性混合物であるため、細胞株と原発腫瘍組織とのｍＲＮＡ発現の比較が取り組まれている。さらに、培養中の細胞株は腫瘍と比較して対数分裂期の周期で非常に高い細胞数を有する。ここで、組織と細胞株との比較は、一般的に、細胞周期、間質、マトリクスの遺伝子、炎症性遺伝子が優勢なプロファイルを生じる。我々は、培養条件を最適化するために多くで用いられる新鮮な腫瘍材料を制限されたため、我々は、いくつかのこれらの問題に取り組む顕微解剖を実施するために十分な組織材料を有していなかった。これらの理由のために、我々は、原発腫瘍組織と細胞株とを比較することができなかった。
【０１４６】
経路集積解析（pathway enrichment analysis）を利用したマイクロアレイデータの使用方法：図６の経路解析について、我々は、共通の遺伝子発現を示すのに異なるプローブによって検出した各サンプルの各遺伝子のｌｏｇ２変換マイクロアレイデータでの発現平均値を使用した。ＭＡＴＬＡＢ  ２０１０ｂで、スチューデントのｔ検定のｐ値及び倍数変化値がクラスター１及び２の比較を用いて各遺伝子について計算された。遺伝子名及びそれらの関連ｐ値、倍数変化値がＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）に取り込まれた。ｐ値及び倍数変化値について、０．０５及び１として切り捨てを設定することによって（ｌｏｇ２利用、上向き又は下向き調節のいずれか）、８２３個の遺伝子が、顕著に異なって発現するとみなされた。５５８個及び２６５個の遺伝子が、それぞれ、クラスター１及びクラスター２で上向き調節されることを見い出した。ＩＰＡの「コア解析」モジュールを用いて、３７経路及び４１経路が、上向き調節された際にクラスター１及び２に対応して、（ＩＰＡによるｐ値＜０．０５で）有意に高められることが見い出された。
【０１４７】
タンパク質発現解析：図４では、細胞溶解物がニトロセルロースでコーティングされたスライドに不動化され、各スライドは、関心のあるタンパク質に特異的な抗体とともにインキュベーションされた。タンパク質溶解物は、ＳＤＳ及びタンパク質分解酵素阻害剤を含む溶解液で調製された。６ウェルプレートでの半コンフルエントウェルが、３重（同一の細胞株由来の少なくとも２つの異なる継代物）に、１２５μＬの溶解液で氷上で溶解された。サンプル濃度はＢＣＡ測定後に調整された。各サンプルは希釈系列（５倍希釈）でスライドに滴下され、スライドは、１５６種類（第１実験）及び１９１種類（第２実験）の第１抗体で調べられ、シグナル強度がビオチンコンジュゲート化二次抗体によって獲得され、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ触媒系によって増幅された。スライドは、スポットのシグナル強度をもたらすために走査され、分析され、ＭｉｃｒｏＶｉｇｅｎｅソフトウェア（Vigene Tech inc. Carlise, MA）を用いて定量化され、ＲパッケージのＳｕｐｅｒＣｕｒｖｅによって処理された。タンパク質濃度が、曲線の当てはめによって各溶解物についてスーパーカーブ（supercurve）から得られ、中央値分散分析によって標準化された。本研究で利用した抗体は、主にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に含まれるタンパク質を標的にしているか、又はその他のがん関連シグナル伝達経路であった。特にＲＰＰＡ解析用に開発されたソフトウェアを用いて、シグナル強度データが収集され、標準化された。繰り返されたデータは平均化され、ｌｏｇ２中央値が求められ、階層的にクラスター化され（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ３．０）、ヒートマップで可視化された（Ｊａｖａ  ＴｒｅｅＶｉｅｗ  １．１．１）。ｌｏｇ変換ＲＰＰＡ値の両側スチューデント試験がバイオコンダクター／Ｒのｔ検定機能を用いて実施された。
【０１４８】
細胞株ユニーク識別子ｍｔＤＮＡ：細胞培養での一般的な問題は細胞の交差汚染又は取り違えである。１９７０年代から繰り返された研究では、細胞株の１５〜２５％が第２番目株で汚染されているか、又は完全に取り違えられていることが示された。１９７０年代及び１９８０年代における１００種類を超えるがん細胞株が実はＨｅＬａ細胞であることが示された。有効な細胞培養の品質及び同一性管理が、細胞株の種間及び種内汚染、それらのさらなる拡大及び伝播を避けるために必要とされる。しかし、取り違え及び交差汚染に対して用心深く観察することは、存立している研究室による細胞の実用的な「ユニークな識別子」を開発することによって可能である。
【０１４９】
我々は、この原稿で試験した１６種類の細胞株が関連しない個別のもの由来であるというｍｔＤＮＡ配列の証拠を得た。したがって、ＯＣＩ細胞株は受け入れ研究室によって確かめられ、純度及び完全性が観測される。これは、細胞株の汚染及び取り違えの発生を顕著に減らす。ヒトｍｔＤＮＡの制御領域は急速な進化速度のために非常に多型である。ｍｔＤＮＡは組換えを起こさず、細胞あたり高いコピー数で存在する。この理由のために、その解析は細胞株の同定にとても有用である。
【０１５０】
ＤＮＡは標準的な方法を用いるＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出された。ＨＶＩ及びＨＶＩＩセグメントは、特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅された。２つのセグメントは両鎖のキャピラリー電気泳動によって直接的に配列決定された。ヌクレオチドの置換及び挿入／欠失がＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（NCBI Reference Sequence NC_012920.1）との比較によって見い出された。ＰＣＲ増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラー（Applied Biosystems Inc., USA）を用いて５０μｌ中で実施された。ＤループｍｔＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物は、１２０Ｖ及び６０ｍＡで６０分間の１×ＴＢＥ緩衝液を用いる１％アガロースゲルの電気泳動、及び、臭化エチジウム染色後のＵＶ照射下で検出され、写真撮影された。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（QIAGEN, USA）での精製後、ＰＣＲ産物の全てがＰＣＲとして同一のプライマーを用いて両方向で配列決定された（Operon, Petaluma, CA）。ヌクレオチドの配列決定後、配列変化はＣＬＵＳＴＡＬＷ２を用いるケンブリッジ参照配列との比較によって決定された。
【０１５１】
薬剤感受性実験：タキソールに対するＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株の相対感受性が９６ウェルの黒色壁付透明底コーニングプレートに３０００細胞／ウェルで６つ播種し、１２時間ＷＩＴ−ＯＣで接着させて測定した。ＯＣＩ及びＳＯＣ細胞株の両方が、ＷＩＴ−ＯＣ培地で１ないし８００ｎＭ（又は溶媒対照）の範囲のタキソール投与量の存在中で１２０時間培養された。薬剤処理後に代謝的に活性な細胞の画分が培地中で２時間２：１０（ｖ／ｖ）  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Promega Cat# G8081）とのインキュベーションによって測定され、反応が３％ＳＤＳの添加によって停止された。蛍光がＳｏｆｔＭａｘソフトウェア（５５５ＥＸ／５８５ＥＭ）を用いるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Molecular Devices, CA）で測定された。４つの独立アッセイに対して計算された値において、高変動の事例では、４つの追加の独立アッセイが異常値を規定し、除外するために実施された。
【０１５２】
致死用量解析：データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを用いて解析され、値は（４つのパラメーターを有するＳ字状の）可変勾配をともなう用量反応抑制曲線にフィッティングされた。最低値（Ｂ）と最高値（Ｔ）との間の反応ｒ（Ｂ＜ｒ＜Ｔ）としての細胞の生存性は、式（１）として、抑制についての一般的なヒルの方程式を介して濃度（Ｃ）に依存して評価された。
【数１】
2016523527.tif 000031
式（１）中、ＩＣ５０は最低値と最高値（Prismで用いられたような表記）との間の中間である反応を生じる濃度であり、ｎはヒル係数である。Ｔは一定で１００と等しくなるように制約され、Ｂはゼロ以上となるように制約された。したがって、データを合わせてからＢ、Ｔ、ＩＣ５０及びｎを得た後、特定の反応ｒ（可変）を生じる濃度が式（２）から算出され、これは９０％の致死をもたらす濃度に対応するＬＤ９０値を評価するために用いられた（ｒ＝１０％の生存可能細胞）。
【数２】
2016523527.tif 000032
実施例３  正常起源細胞の遺伝子発現プロファイルは、卵巣腫瘍の結果腫瘍を予測する
【０１５３】
大部分の上皮性卵巣がんは、卵巣やファローピウス管上皮内の異なる細胞から発生すると考えられている。我々は、これらの異なる起源細胞は、卵巣腫瘍の表現型を判定する役割を果たす可能性があり、また、卵巣がんの分子分類の情報を与えることができると仮定した。この仮説を検証するために、がんに罹患していない複数のドナーからの対の正常なヒト卵巣（ＯＶ）及びファローピウス管（ＦＴ）の上皮細胞を単離し培養するための新たな方法を開発し、細胞型が同一患者内で区別される起源細胞遺伝子発現プロファイルを同定した。原発性卵巣がんのＯＶ対ＦＴの起源細胞遺伝子プロファイルの適用は、これらのがんの中での異なるＯＶ及びＦＴ様サブグループの同定を可能にした。重要なことは、正常なＦＴ様腫瘍の分類は有意に無憎悪性生存と相関した。この結果は、同一患者からの正常なヒトのＯＶ及びＦＴ上皮細胞の培養のための新しい実験方法を報告する。これらの知見は、起源細胞が、卵巣腫瘍の不均一性及び腫瘍転帰に関連する差異の重要な起源であるとの新たな証拠を提供する。
【０１５４】
卵巣腫瘍の不均一性の分子基盤を検討する研究は、それらの遺伝子発現プロファイルに基づく卵巣がんの異なる転写サブタイプを同定した。この分子不均一性の原因を理解することは、サブタイプで階層化されたケアによって治療成績を向上させるために標的化され得る異常な遺伝子又は経路に脚光を当てるために重要である。我々の目的は、関連した腫瘍動態を判定する際に、卵巣とファローピウス管の起源細胞の役割を検討し、卵巣がんで観察される分子不均一性への寄与を明確にすることであった。この目標に向けて、我々は同じ個体からの対の正常な卵巣上皮とファローピウス管上皮細胞とを培養し、増殖させるための新しい細胞培養培地及び方法を開発した。そして、我々は、同じ患者からの正常な卵巣上皮とファローピウス管上皮とを区別し、そして、ファローピウス管（ＦＴ）様及び卵巣上皮（ＯＶ）様などの原発性卵巣腫瘍を分類するために、この情報を適用する遺伝子プロファイルを同定した。この分類は、患者の転帰を予測するものであった。これらの知見は、起源細胞が卵巣腫瘍の不均一性及び腫瘍表現型が関連する差異の重要な源であるとの新たな証拠を提供する。
【０１５５】
材料及び方法
正常ヒトファローピウス管と卵巣上皮の組織収集と培養
組織を収集するために、ＩＲＢが承認したプロトコールにしたがって、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院で治療されていた良性婦人科疾患の２名の閉経後のドナーから、正常な卵巣とファローピウス管からの剥離物がキットナー（例えば、Aspen Surgical）を用いて収集された（下記の補足方法を参照せよ）。本研究において使用された細胞は、この研究の過程の間に組織試料から研究者によって直接確立された初代培養細胞である。回収した細胞は直ちにＷＩＴ−ｆｏ細胞培養培地中に播種され、表面修飾された組織培養フラスコ（Primaria, BD, Bedford, MA）に移し、５％ＣＯ２大気下３７℃でインキュベートした。ＷＩＴ培地は以前に報告され（Stemgent, Cambridge, MA）、ＷＩＴ−ｆｏは、ファローピウス管と卵巣上皮細胞用に最適化された修正バージョンである（下記の補足方法を参照せよ）。培地は２〜３日毎に交換され、１０〜１５日後に、室温で０．０５％トリプシン（〜１５秒間曝露）を使用して浮き上げさせ、その後、トリプシンを１０％血清含有培地中で不活性化し、ポリプロピレンチューブ中で過剰のトリプシン及び血清を除去するために細胞を遠心分離した（５００ｘｇ、４分）。継代培養は、１×１０４／ｃｍ２の最小濃度で細胞を播種することによって確立された（一般的に１：２での分割比で適用、すなわち、１個のフラスコ中の細胞を、２個の同サイズのフラスコに播種した）。しかし、我々は分割比に依拠するよりも、むしろ必要な最小限の密度で播種するために細胞を計数することを非常に推奨する。培地は、細胞の再播種２４時間後、及びその後４８〜７２時間毎に交換した。
【０１５６】
卵巣上皮細胞を培養するために、５〜１０％ウシ胎児血清の範囲で、２ｍＭの１−グルタミンを含み、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子を含まないＭＣＤＢ１０５／１９９培地の１：１混合物を含む以前に報告された細胞培養培地（１４−１６）、及び１０〜１５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２（１：１混合物）とを我々は試験した。いずれの場合も、数回の集団倍化数を超えて卵巣上皮細胞を増殖することはできなかった。ファローピウス管上皮細胞の培養のために、０．１％ＢＳＡ、５％血清（２．５％ウシ胎児血清と２．５％Ｎｕ血清の1：1混合物）及び１７βエストラジオールを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２の１：１混合物、又は２％の血清置換を補充してこの培地を少し改変したバージョンの、いくつかの以前に報告された培地（１７−１９）を我々は試験した。我々が試験した上記の従来の細胞培養培地は、ヒト卵巣又はファローピウス管由来の正常な上皮細胞の長期増殖を支持しなかった。上記のように、細胞不死化及び特徴付けられた遺伝的要素を有する正常な細胞の形質転換及び腫瘍形成の解析が行われた（以下の補足方法を参照せよ）。
【０１５７】
ウエスタンブロット法、ライブ映像の細胞画像及びＦＡＣＳ
タンパク質発現は、総細胞タンパク質の免疫ブロッティングによって、ＰＶＤＦ膜上に転写し、サイトケラチン７（ＭＡＢ３５５４）（Millepore, Billerica, MA）、ＰＡＸ８（１０３３６−１−ＡＰ）（ProteinTech Group, Inc, Chicago, IL）、ＦＯＸＪ１（ＨＰＡ００５７１４）、ＨＯＸＡ５（ａｂ８２６４５）（Abcam, Cambridge, MA）、及びＨＯＸＣ６（ａｂ４１５８７）（Abcam）並びにβアクチン（クローンＡＣ−１５）  （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）に対する抗体をプローブとしてＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で判定された（以下の補足方法を参照せよ）。細胞は、２日間フルオロディッシュ（World Precision Instruments, Sarasota, FL）上で増殖され、ライブ映像の細胞画像が、ニコン製ＴＥ２０００−Ｕ型倒立顕微鏡を用いて４０倍の倍率で撮影された。ＦＡＣＳアリア・マルチカラー高速度ソーター（ＢＤ）を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析は、ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴで感染させたＧＦＰ陽性の卵巣及びファローピウス管細胞の定量に使用された。
【０１５８】
発現プロファイリング及びマイクロアレイ解析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出され、品質がバイオアナライザー（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて確認された。５〜１５μｇの間のＲＮＡが、ダナ・ファーバー癌研究所マイクロアレイ中核施設で、アフィメトリクスＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０マイクロアレイ（Affymetrix Inc., Santa Clara, CA）にハイブリダイズされるビオチン化されたｃＤＮＡターゲットを生成するために使用された。マイクロアレイＣＥＬファイルは、ＧＥＯ（ＧＳＥ３７６４８）で利用できる。
【０１５９】
ＯＶ／ＦＴプロファイルは、プラットフォームに関連する方法論的なバイアスを最小限にするために、同様の方法で生成された公衆に利用可能なデータセットと比較された。したがって、新鮮凍結卵巣がんから単離され増幅されていない全ＲＮＡを解析して、同じ（ＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０）又は類似（ＨＧ  Ｕ１３３Ａ）のアフィメトリクスマイクロアレイプラットフォームを使用してプロファイル化して生成したデータセットが、これらの比較に使用された。我々は、また、最大のサンプル数（ＴＣＧＡ）及び非漿液性腫瘍（Wuら、Cancer Cell 2007; 11: 321-33、Tothillら、Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208)）を含むデータセットを優先させた。Ｗｕらにより公衆に公開されている卵巣がんデータセット（Cancer Cell 2007; 11: 321-33）（ＧＥＯシリーズのアクセッション番号ＧＳＥ６００８）及びＴｏｔｈｉｌｌら（Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208）（ＧＳＥ９８９１）と同様に、２名の患者からの４種のｈＴＥＲＴ不死化細胞株（ＯＣＥ、ＦＮＥ）のアフィメトリクスマイクロアレイが、ｖｓｎｒｍａ（Huberら、Bioinformatics 2002; 18 Suppl 1: S96-104）を使用して独立に正規化された。ＴＣＧＡのｍＲＮＡ発現データはＴＣＧＡコンソーシアムによって正規化された。
【０１６０】
我々は、ＯＣＥ／ＦＮＥ細胞へのグローバル発現プロファイルに基づいて、階層的なクラスタリングを適用し、患者（１又は２）によって、そして細胞型（卵巣又はファローピウス管）によって最強の分離が観察された。同じ患者の不死化された卵巣上皮対ファローピウス管の対のｈＴＥＲＴの間に特異的に発現される遺伝子を同定するために、我々は患者の相違をブロックするＬｉｍｍａで重複相関関数を使用した改変ｔ検定（偽発見率（ＦＤＲ）、ｐ＜０．０５に調整）を適用した。
【０１６１】
３種の公衆に利用可能な遺伝子発現データセットからファローピウス管（ＦＴ）様及び卵巣（ＯＶ）様としてヒト卵巣腫瘍を分類するために、我々はＦＮＥ又はＯＣＥのいずれかで過剰発現したユニークな遺伝子象徴を伴う最も高度に有意な１０種のプローブセットを選択した。そして、各腫瘍に対する全体的なプロファイル発現スコアを計算するために、ＦＮＥ遺伝子は（＋１）、ＯＣＥ遺伝子は（−１）と重み付けして、２種の卵巣がんデータセットにおけるこれら１０種のプローブセットの正規化された発現値の合計を算出した（より高スコアの腫瘍はよりＦＴ様）。そして、ＯＶ様又はＦＴ様などの卵巣腫瘍を分類する混合モデリングを使用して、このスコアにガウス曲線の２つのモードを持つ分布を一致させる。
【０１６２】
我々は、ＦＴ様又はＯＶ様の順序ロジスティック回帰（グレード、ステージ）、又はフィッシャーの正確確率検定（組織学的サブタイプ）を使用して、患者の分類された腫瘍の臨床的特徴を比較した。カプラン・マイヤープロット及び対数順位検定を使用する単変量Ｐ値、並びに多変量Ｃｏｘ比例ハザード試験が、生存に対するＦＴ／ＯＶ様の分類の関連性を評価するために計算された。すべての解析は、Ｒのバージョン２．１０．１を使用して行った。
【０１６３】
結果
正常な卵巣とファローピウス管上皮の培養の確立
正常なヒト卵巣上皮とファローピウス管上皮細胞は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院で廃棄された組織を収集するためのＩＲＢに承認されたプロトコールにしたがって、良性の婦人科の条件のための手術を受けている２名の閉経後の患者より、内視鏡キットナーを使用して卵巣の表面とファローピウス管の線毛終末の別々の剥離物から収集した。
【０１６４】
正常なヒト原発性卵巣とファローピウス管上皮細胞を培養するために、我々は、前記の化学的に定義されたＷＩＴ培地を変更した。次に、我々は、ＷＩＴ−ｆｏ又はコントロール培地条件のいずれかの複製プレートの同じドナーからの細胞を播種することによって、従来より培養卵巣上皮とファローピウス管上皮に使用されている他の培地（Auerspergら、Lab Invest 1994; 71: 510-8、及びComerら、Hum Reprod 1998; 13: 3114-20）と、ファローピウス管と卵巣細胞（ＷＩＴ−ＦＯ）用に最適化され変更された培地中におけるこれらの細胞の長期的な増殖を比較した。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、正常な卵巣上皮とファローピウス管上皮の両方を１０回の集団倍化を越えて増殖させることが可能であり、これは、細胞数＞１０００倍の純増加に相当する。これとは対照的に、卵巣上皮又はファローピウス管上皮のいずれも、従来の培地で数回の集団倍化を超えて増殖させることはできなかった。我々は、培養正常ヒト乳腺細胞に元来最適化された未修正のＷＩＴの培地（Inceら、Cancer Cell 2007; 12:160-170）を含む従来より報告されている培地のいずれにおいても、正常卵巣上皮又はファローピウス管上皮の長期培養を確立することができなかった（以下の補足方法を参照）。
【０１６５】
培養された卵巣とファローピウス管上皮細胞集団の起源を判定するために、我々は６名の患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織における正常なヒト卵巣とファローピウス管の細胞サブタイプ特異的マーカーを検討した。３種の抗体（ＰＡＸ８、ＦＯＸＪ１及びＣＫ７）は、卵巣の封入嚢胞の上皮から卵巣表面、及び非繊毛ファローピウス管上皮からの繊毛上皮を区別した（以下の補足方法を参照せよ）。卵巣表面及び封入嚢胞上皮の両方はＣＫ７＋であった。卵巣表面上皮は、稀なＰＡＸ８＋細胞を除いてＰＡＸ８−であった（中皮表現型）。対照的に、卵巣封入嚢胞の＞７５％の上皮が完全にＰＡＸ８＋細胞（ミュラー表現型）から構成された（下記の補足方法を参照せよ）。ファローピウス管では、非繊毛上皮は、ＣＫ７＋／ＰＡＸ８＋／Ｆ０ＸＪ１−であり、繊毛細胞はＯＣ（卵巣上皮）とＦＮと呼ばれている卵巣の封入嚢胞上皮及び非繊毛ファローピウス管上皮及びこれらの培養細胞の染色プロフィールと最も一致するＣＫ７−／ＰＡＸ８−／Ｆ０ＸＪ１＋であった。以下、ＯＣ（卵巣上皮）及びＦＮ（非線毛ファローピウス管）と記載する。
【０１６６】
卵巣とファローピウス管上皮培養の不死化
次に、我々は、不死化された派生体（各ＯＣＥ及びＦＮＥ細胞）を作製するために、ＯＣ及びＦＮ細胞へｈＴＥＲＴを導入した。免疫ブロッティングは、培養された卵巣とファローピウス管上皮は予想されたＣＫ７＋／ＰＡＸ８＋／ＦＯＸＪｌ−を示し、ＯＣＥとＦＮＥ細胞の全てが均一のＰＡＸ８＋／ＦＯＸＪｌ−表現型を有することを確認する免疫蛍光を示した。ＯＣＥとＦＮＥ細胞はＨＯＸＡ５及びＨＯＸＣ６の発現に基づいて識別できた。ウェスタンブロッティングは、ＯＣＥ細胞がＨＯＸＡ５＋／ＨＯＸＣ６＋であることを、一方対照的に、これらのタンパク質がＦＮＥ細胞において検出されないことが確認された。
【０１６７】
不死化されたＯＣＥ及びＦＮＥ細胞は、４０回の集団倍化を超えて継続的に培養され、これは細胞数の〜１０１２倍の純増加に相当する。これとは対照的に、標準培地で同じ細胞を培養した複製プレート（以下の補足方法を参照）、又は変更されていないＷＩＴ培地に移した場合は、数回の継代後に増殖が停止した。
【０１６８】
正常なヒト上皮性卵巣培養の不死化は、以前、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７及びＳＶ４０Ｔ／ｔ（Maines-Bandieraら、Am J Obstet Gynecol 1992; 167: 729-35 及びTsaoら、Exp Cell Res 1995; 218: 499-507）などのウイルス腫瘍遺伝子を使用して試みられてきたが、しかし、この方法はまた遺伝的不安定性を増大させ、これらの有限な寿命の対応するものと比較して不死化細胞における遺伝子発現プロファイルを有意に変化させることが可能なＤＮＡの変異の蓄積を惹起できる。さらに、遺伝的不安定性は、最終的に数週間〜数ヶ月内の連続培養で破たん及び細胞死をもたらすため、これらのＳＶ４０Ｔ／ｔとＥ６／Ｅ７形質転換細胞は不死ではない。したがって、ＷＩＴ−ｆｏ培地を使用して、我々は、ｈＴＥＲＴで不死化されたＯＣＥとＦＮＥ細胞の長期培養可能な最初の実用的かつ堅固なシステムを開発した。
【０１６９】
患者の卵巣がんを分類するための起源細胞（ファローピウス管対卵巣）の遺伝子プロファイルの応用
「卵巣」がんがファローピウス管又は卵巣上皮内で発生する可能性を示唆する研究等に基づいて、我々はそれがＦＮＥとＯＣＥ細胞が異なる遺伝子プロファイルを発現するかを判定する価値があるか、そして、この起源細胞のプロファイルがヒト卵巣がんのこれらの異なるサブグループを区別するためにその潜在的な有用性を試験可能か否かを判断するために我々は推論した。ＦＮＥとＯＣＥ細胞の遺伝子発現プロファイルは、ＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０アレイを用いて試験した。修正されたｔ検定の適用はＬＩＭＭＡを使用して患者の違いをブロックしながら（ＦＤＲは、Ｐ＜０．０５に調整）、それぞれＦＮＥ又はＯＣＥ細胞で有意にアップレギュレートされた６３２と５２５のプローブセットが識別された。
【０１７０】
このリストから、我々はユニークな遺伝子シンボルを伴う最も高く顕著に区別されて発現するトップ１０のプローブセットを選択した。これらの遺伝子の５種は、培養ファローピウス管細胞で過剰発現され（ＦＮＥ遺伝子：ＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＰＬ３）、他の５種の遺伝子は、培養卵巣細胞において過剰発現された（ＯＣＥ遺伝子：ＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３：ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４）。予備的な解析において、差別的発現がより顕著ではない追加プローブを含むことは逆効果と判断され、２０又は１００種の非常に顕著なプローブセットを含めることは、分類にノイズを生じるだけのように思われた。したがって、すべての更なる分析は１０種のプローブセットを用いて実施した。
【０１７１】
これらの遺伝子についての核酸配列は、当技術分野で周知であり、それらの名称及び／又はアクセッション番号により国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースで見い出すことができる。以下のとおりこれらの遺伝子についてのアクセッション番号（ＮＣＢＩ参照配列番号）の例は、ホモサピエンスドッキングタンパク質５（ＤＯＫ５）：ＮＭ＿０１８４３１；ホモサピエンスＣＤ４７分子（ＣＤ４７）：ＮＭ＿００１７７７、ＮＭ＿１９８７９３、ＢＣ０３７３０６；ホモサピエンスヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ３（ＨＳ６ＳＴ３）：ＮＭ＿１５３４５６、ＮＭ＿２０５５５１、ＸＭ＿９２６２７５、ＸＭ＿９３１１５９、ＸＭ＿９４１５９３、ＸＭ＿９４５２９３；ホモサピエンスジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）：ＮＭ＿１３０７９７、ＮＭ＿００１９３６．４、ＮＭ＿００１０３９３５０．２、ＮＭ＿００１２９０２５３．１、ＮＭ＿００１２９０２５２．１；ホモサピエンスオキシステロール結合タンパク質様タンパク質ＯＳＢＰＬ３（ＯＳＢＰＬ３）：ＡＦ３９２４４４、ＸＭ＿００５２４９６９８．１、ＮＭ＿０１５５５０．３、ＮＭ＿１４５３２０．２、ＮＭ＿１４５３２１．２、ＮＭ＿１４５３２２．２；ホモサピエンススタニオカルシン２（ＳＴＣ２）：ＮＭ＿００３７１４；ホモサピエンスｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＳＦＲＰ１）：ＮＭ＿００３０１２．４、ＢＣ０３６５０３．１；ホモサピエンス溶質キャリアファミリー３５、メンバーＦ３（ＳＬＣ３５Ｆ３）：ＮＭ＿１７３５０８、ＸＭ＿９３９３５８；ホモサピエンスセリンヒドロキシメチル２（ミトコンドリア）（ＳＨＭＴ２）：ＮＭ＿００５４１２、ＮＲ＿０２９４１６．１、ＮＲ＿０２９４１５．１、ＮＲ＿０２９４１７．１、ＮＭ＿００１１６６３５６．１、ＮＭ＿００１１６６３５７．１、ＮＭ＿００１１６６３５９．１、ＮＭ＿００１１６６３５８．１、ＮＲ＿０４８５６２．１；及びホモサピエンス膜貫通タンパク質１６４（ＴＭＥＭ１６４）：ＮＭ＿０１７６９８、ＸＭ＿００１７１４４７７、ＸＭ＿００２３４３８３８、ＮＭ＿０３２２２７である。これらの配列及びアクセッション番号は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０１７２】
ヒト卵巣がんの細胞起源を調べるために、我々は、以前に公表されたデータセットにおけるこれら１０のプローブセットの発現プロファイルを調べた。ＦＮＥにおいてアップレギュレートされる遺伝子を（＋１）に、ＯＣＥにアップレギュレートされる遺伝子を（−１）に重み付けして各試料に対して全体的なプロファイル発現スコアが計算され、ガウス曲線の二峰性分布が、２つのサブ集団を予測するための混合モデリングと共にこれらのスコアに適用された。
【０１７３】
我々は、まず、正常なヒトのファローピウス管上皮及び正常な卵巣表面上皮がプロファイルされ以前に公表されたデータセットにおいて、ＦＮＥ対ＯＣＥの起源細胞プロファイルの１０種のプローブセットを検証した。これは、以前に公表された研究において、単一の細胞型の分析であることに注目する価値がある。正常な卵巣細胞又はファローピウス管細胞は、別個の研究で紹介された。このように、異なる収集方法と解析プラットフォームが使用され、卵巣とファローピウス管細胞は患者が一致しなかった。これらの違いにもかかわらず、ＦＮＥ対ＯＣＥの起源細胞プロファイルの１０種のプローブセットが、正しく顕微解剖された全てのＦＴＥサンプルをファローピウス管（ＦＴ）様として分類し（Ｎ＝１２）、全ての培養ＯＳＥ細胞は、卵巣（ＯＶ）様として（Ｎ＝６）２つの異なるデータセットにおいて分類された。さらに、Ｗｕらの未培養の正常な４種のＯＳＥの剥離物のデータセット（Cancer Cell 2007; 11: 321-33）の全てが、正しくＯＶ様に分類された。
【０１７４】
１０種のプローブセットの遺伝子プロファイルは、次にＷｕらのデータセット（Cancer Cell 2007; 11: 321-33）において手作業で顕微解剖された９９個の漿液性、類内膜、明細胞及び粘液性卵巣がんを分類するために使用された。プラットフォームの相違に起因して８／１０プローブセットが解析に利用可能であった。密度プロットで可視化されたＦＮＥ対ＯＣＥのプロファイル発現スコアは、ＦＴ様及びＯＶ様サブグループに分類される卵巣腫瘍に関する我々の２相性の分類を支持する明確な二峰性の分布を示した。ＦＴ様及びＯＶ様腫瘍などの臨床的特徴の比較は、ＦＴ様腫瘍が、有意により高いステージかつより高いグレードにあり、漿液性腺がんで構成されることを示した（すべての比較についてＰ＜０．００１）（図７ａ）。これとは対照的に、ＯＶ様腫瘍は、非漿液性サブタイプ及びより低いグレードのがんを含んだ。
【０１７５】
さらに、これらの結果を検証するために、我々は次にＯＣＥ対ＦＮＥの起源細胞プロファイルを子宮内膜腫瘍の小サブグループ（Ｎ＝２０）を伴う主に漿液性がん（ｎ＝２４６）を含む第２の卵巣腫瘍データセット（Tothillら、Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208）において評価した。Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットでは、プロファイル発現スコアの左側の傾斜(skewing)を観察し、その傾斜はＯＶ様腫瘍の小サブグループと一致している。Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおける腫瘍は、顕微解剖されておらず、潜在的に間質性遺伝子発現に低い信号対雑音（S/N)比であり、まさに漿液性及び類内膜腫瘍サブタイプを含んだ。このように、Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおける、スコアの明確な二峰性の欠如は、これらの要因に起因する可能性が高い。これとは対照的に、Ｗｕデータセットにおける腫瘍サンプルは、組織学的サブタイプの多様な分布を表し、顕微解剖で精製され、間質信号の妨害なしに培養上皮細胞由来のプロファイルを持つ患者の腫瘍プロファイルのより直接的な比較を可能にする。
【０１７６】
それにもかかわらず、Ｔｏｔｈｉｌｌのデータセットにおいて、ＦＴ様のサブグループは漿液性腫瘍と比較して大きく濃縮されて含まれており（Ｐ＜０．０１）、より進行したステージの腫瘍を含んだ（Ｐ＝０．０７）（図７ｂ）。しかし、Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおいて、低グレードの病変をほとんど含まない可能性があるため、腫瘍の悪性度との関連性は認められなかった（Ｐ＝０．８７）。我々はまた、起源細胞プロファイルから連続的なスコアを使用してＷｕ及びＴｏｔｈｉｌｌデータセットにおける腫瘍の組織学的サブタイプ、グレード及びステージとの関連を評価し、ＦＴ／ＯＶ様の二分裂に基づく結果と同様の結果を観察した。
【０１７７】
Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおける患者生存の解析は、ＦＴ様腫瘍が有意な無増悪性生存期間（単変量対数順位Ｐ＜０．００１）、及び全生存（単変量Ｐ＝０．０４９５）を有することを明らかにした（図７ｃ）。多変量解析では、腫瘍のグレード、ステージ、漿液サブタイプ、患者の年齢及び残存疾患を調整した後、ＯＶ／ＦＴ様サブグループは、無増悪生存期間と関連し（コックス比例ハザードＰ＝０．０１）、全体的な生存期間と関連しなかった（Ｐ＝０．３４）。
【０１７８】
ほとんどの卵巣がん遺伝子発現データセットは、ファローピウス管で発生すると考えられている高いグレードの漿液性腫瘍から構成される。これらのデータセットは、境界と低グレードの腫瘍を実際より低く評価し、同様に、子宮内膜、明細胞、粘液性及び移行卵巣がんなどの様々な組織学的サブタイプを実際より低く評価する。例えば、ＴＣＧＡデータセット（Nature 2011; 474: 609-15）は漿液性の高グレードの腫瘍のみが含まれる（Ｎ＝４９１）。このデータセットでは６／１０のプローブセットがプラットフォームの相違による解析のために利用可能であった。これらの６種のプローブセットで、我々は、ＦＮＥ対ＯＣＥプロファイルが４３のＴＣＧＡ腫瘍をＯＶ様として、４４８腫瘍をＦＴ様として分類することを認めた。したがって、おそらく驚くことではないが、プロファイルスコアはほとんど変動がなく、ＴＣＧＡデータセットにおいて、患者の生存率とこれらのサブグループの関連はなかった。Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットでは、２０種の高いグレードの漿液性腫瘍がＯＶ様として並びに２１７種の腫瘍がＦＴ様として分類された。これらの結果は、最も高いグレードの漿液性のがん腫が実際にファローピウス管で発生する可能性だけでなく、ＦＮＥ対ＯＣＥの起源細胞プロファイルを評価するために、これらのデータセットの限界を強調表示することと一致する。
【０１７９】
関連する腫瘍表現型の正常な起源細胞の影響を直接試験するために、我々は以前に報告したように（Inceら、Cancer Cell 2007; 12: 160-170 及びHahnら、Nature 1999; 400: 464-8）、我々はまたＳＶ４０ラージＴ／スモールｔ（ＳＶ４０Ｔ／ｔ）及びＨ−ｒａｓの抗原の連続導入によりｈＴＥＲＴ不死化のＦＮＥ及びＯＣＥ細胞の形質転換派生体を作製した。これらの腫瘍形成性細胞は、以下にそれぞれ、ＦＮＬＥＲとＯＣＬＥＲと記載される。形質転換されたＦＮＬＥＲとＯＣＬＥＲの同数の細胞は、２４匹の免疫不全ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの腹腔内と皮下部位（細胞型当たり１２匹のマウス）に注射した。注入５〜９週間後の剖検解析は、両方の細胞型において同様の速度の異種移植形成、総腫瘍量及び腫瘍組織病理学（病巣の微小乳頭様構築物の貧分化）を明らかにした。ＦＮＬＥＲとＯＣＬＥＲの両方の派生された腫瘍は、腹腔周囲組織に浸潤性が高かった（ＦＮＬＥＲ浸潤）。腫瘍（＞０．５グラム）を有するマウスからの肺の検査では肺転移の発症傾向の著しい違いを明らかにした。ＦＮＬＥＲはマウスの６７％の肺における転移を形成し（Ｎ＝６）、一方、同質遺伝子のＯＣＬＥＲは、マウスの１３％のみで転移を形成した（Ｎ＝８）（Ｐ＝０．０４、マン・ホイットニー検定）。肺の各セットにおける転移性細胞の数もまたＦＮＬＥＲ腫瘍を有するマウスでより高かった。ｐ５３及びＳＶ４０に対するＨＥ及び免疫組織化学染色で転移性細胞の存在がＦＦＰＥマウス肺で確認された。試験したマウスにおいて、肺転移について試験された合計腫瘍量又は腫瘍のインキュベーション時間の相違は観察されなかった。これらのｉｎ  ｖｉｖｏのデータは、ＦＴ様の患者の腫瘍が悪い転帰と関連するとの我々の以前の観察と組み合わせて、正常な起源細胞が腫瘍表現型の判定に実際に役割を果たし得ることを示唆している。
【０１８０】
補足的方法
組織収集
すべての研究操作は、廃棄された組織を収集するために、内部審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。研究プロトコールは、増加した遺伝的リスクを持っている女性、又は、卵巣若しくはファローピウス管を変化可能な医療を受けている女性を除外するために、臨床情報へのアクセスが制限されて許可された。最適化の期間中、我々は、数年間にわたって、手術後の病理スイートで収集した１８の組織片と、手術室で収集した１９の組織剥離を含めた合計３７試料で様々な培地製剤及び細胞収集方法を試験した。
【０１８１】
手術後に採取された組織片が機械的又は酵素的に分離され、様々な処方のＷＩＴ−ｆｏ培地中に播種された。このアプローチでは、我々は、任意の培養の中で短期の卵巣細胞を確立できず、３種のファローピウス管培養物のみを確立することができた。これとは対照的に、手術中に表面剥離物を収集することは、より成功的であった。このアプローチでは、正常卵巣とファローピウス管（線毛末端）からの剥離物は、良性婦人科の条件に対して手術を受けた患者から内視鏡キットナー（例えば、Aspen Surgery）を使用して手術中に採取した。これらの患者の中で、我々は、約７５％の症例のファローピウス管采から、約３０％の卵巣表面上皮で培養細胞を確立することができた。しかし、どちらか一方のみの組織をサンプリングでき、又はそれらの両方は無病ではなく若しくはどちらか一方が前の手術で除去されており、多くの症例で、同じ患者から対の正常な卵巣表面及びファローピウス管上皮細胞を利用できなかった。また、我々は、両方の組織を採取した場合においても、これらの試料をＷＩＴ−ｆｏ培地処方を最適化するために使用しており、細胞対の一つが、時には最適化期間中での増殖停止又は細胞死により失われた。しかし、一旦すべての条件が最適化されると、我々は５６歳と６５歳の婦人科がんのいずれのタイプを保有しない２人の患者から、対になった卵巣表面とファローピウス管上皮細胞株を樹立することができた。卵巣とファローピウス管は無病であった。
【０１８２】
卵巣表面上皮：手術中に易しく扱われるとしても、ほとんどの正常な卵巣上皮を直ちにはぎ取られるほど、正常な卵巣表面上皮は非常に繊細である。正常な卵巣の表面被膜を収集するために、ルーチンの外科的手順において、外科医又は病理学者によって器官が広範囲に取り扱われる前に、細胞が収集される必要がある。卵巣の封入嚢胞上皮は、無細胞層によって卵巣表面に直接隣接して配置され、又はわずかなストローマ細胞によって分離される場合があり、及び時には嚢胞が局所的に表面に広がっている。したがって、卵巣の表面を強く擦過すると、封入嚢胞上皮を剥離することができる。
【０１８３】
ファローピウス管采上皮：対の卵巣表面上皮及びファローピウス管上皮の培養を確立するために、我々は、患者からのそれらの除去前に手術室で標本を収集した。ファローピウス管上皮細胞をキットナーの終端辺りの采を丸めることにより、内視鏡キットナーを用いて収集した。細胞は直ちに小さな組織培養皿の細胞培養ＷＩＴ−ｆｏ培地に播種され、その後、組織培養フラスコに移され（例えば、細胞密度を最大化するために、６ウェルプレートの１又は２つのウェル）、そして、可及的速やかに組織培養インキュベーターに入れられた。おそらく、卵巣表面上皮に比べてファローピウス管采において上皮細胞が豊富なため、患者から取り除かれた標本からファローピウス管上皮培養を確立することはより容易であった。
【０１８４】
初代の正常なヒトファローピウス管及び卵巣上皮の培養
ファローピウス管及び卵巣から収集された細胞は、直ちにＷＩＴ−ｆｏ細胞培養培地中に播種され、表面修飾処理された組織培養フラスコ（Primaria, BD Biosciences, Bedford, MA）に移され、５％Ｃ０２大気及び３７℃でインキュベートした。我々の経験では、通常の組織培養プラスチックウェアでこれらの細胞を増殖することはほぼ不可能なので、我々は強く、これらの培養プレートを使用することを推奨することに留意せよ。より低い０２濃度下における細胞のインキュベートは、結果を改善せず、また、我々は、通常の組織培養プラスチックを使用して長期培養を確立することができなかった。ＷＩＴ−ｆｏは、我々が以前に報告（Bastら、Nat Rev Cancer 2009; 9: 415-28）したＷＩＴ培地の修正バージョンである（Stemgent, Cambridge, MA）。卵巣とファローピウス管上皮細胞に対してＷＩＴ培地を適合させるために、いくつかの補助剤に対して最終濃度０．５〜１％の血清へ改変した。正常なヒト上皮細胞は、生理的条件下で、通常、血液又は血清と直接接触しない。したがって、我々は、ほとんどの正常な細胞に使用する培地は、生理学的条件を模倣するために、完全に無血清であった。しかし、正常な卵巣表面とファローピウス管の線毛終端の細胞は、生理的血清タンパク質が含まれる正常な腹水と直接接触させる。実際に、これらの血清タンパク質の濃度は、循環血液の５０％ほど高くなり得る。したがって、我々は、正常な卵巣細胞の生理学的成長の条件を模倣するために、ＷＩＴ培地に血清を添加した。ＷＩＴ−ｆｏ培地を調製するために、低濃度の血清（０．５〜１％）に加えて、ＥＧＦ（０．０１ｕｇ／ｍＬ、Sigma, E9644）、インスリン（２０μｇ／ｍＬ、Sigma, I0516）、ヒドロコルチゾン（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma H0888）及び２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（Calbiochem, 227035）がＷＩＴに補充された。培地が２〜３日毎に交換され、１０〜１５日後に、トリプシンへの曝露を最小限にするために（〜１５−３０秒間のトリプシンへの曝露又は必要であればより長い時間）、細胞を連続的にチェックし、組織培養フラスコを軽く叩きながら、室温で０．０５％のトリプシンを用いて組織培養プラスチックウェアから浮き上げさせた。トリプシンは１０％血清を含む培地を用いて不活性化し、過剰のトリプシン及び血清を除去するためにポリプロピレンチューブ中で細胞を遠心分離した（５００ｘｇ、４分間）。継代培養は、１×１０４／ｃｍ２の最小濃度で細胞を播種することによって確立された（１：２の分割比が通常適用された。つまり、１個フラスコの細胞を２個の同容量のフラスコに分割した）。しかし、我々は分割比に依存するよりも、必要最小限の密度で播種するために細胞を計数することをむしろ推奨する。培地は、細胞を再播種後２４時間に、その後４８−７２時間毎に交換した。初代細胞培養物は、一般的に１〜２週間毎に、又は細胞が〜９０−９５％の密度に達したときに分割された。
【０１８５】
通常の卵巣表面とファローピウス管上皮細胞は、１０回の集団倍化を超えてＷＩＴ−ｆｏ培地で培養し、一方、標準的な培地の条件下において同じ細胞の複製プレートの培養は、数継代後、増殖を停止した。多くの以前の報告では正常な卵巣とファローピウス管上皮を培養することの成功は、達成された細胞の継代数として記載されている。細胞継代数が、細胞が正常に一つのプレートから浮き上げさせられて新しい培養プレートに播種される回数を意味することは価値がない。これは、細胞の少なくとも一部が移動を許容し、まだ生きていることを示す。しかし、継代数は、必ずしも増殖及び細胞数が関連する正味の増加と相関しない。例えば、我々は、コントロール培地中で４継代で、約６０日間、ファローピウス管上皮を「継代」できた。しかし、曲線は１４日後にはほぼ横ばいであり、細胞数の正味の増加はなかった。
【０１８６】
我々の結果の公平な比較は、「集団倍化」を単位とする又は回収した細胞の数のＬｏｇ２が播種した細胞の数ではない点である。したがって、２個の細胞は、１０回の集団倍化で１０２４細胞（２１０＝１０２４）に拡大される。各１０回の集団倍化は約３桁（×１０３）の正味の細胞数の増加に等しく、２０回の集団倍化は正味の細胞数の１００万倍の増加に近く、３０回の集団倍化は正味の細胞数が１０億倍の増加に近い。対照的に、細胞継代は、細胞数の正味の増加はほとんどないに等しい。例えば、ＷＩＴ−ｆｏ培地中で増殖した卵巣上皮細胞は７継代（４２日）で１４回の集団倍化に、正味の細胞数は８１９２倍の増加に達する。標準的なコントロール培地では、同じ細胞が同様に７回（４２日）継代することができ、しかし、これらは細胞数の５．３倍の正味の増加に等しい２．４回の集団倍化に過ぎない。このように同じ細胞数は標準培地に比べＷＩＴ−ｆｏで１５４６倍の数に増加した（８１９２÷５．３＝１５２６）。
【０１８７】
我々は、卵巣上皮細胞を培養するために、５〜１０％の範囲のウシ胎児血清を含むＭＣＤＢ１０５／１９９培地の１：１の混合物と２ｍＭの１−グルタミンを含み、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子なしの、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムのＦ−１２（１：１混合物）を含む、数種の以前に報告された細胞培養培地を試験した（Inceら、Cancer Cell 2007; 12: 160-170; Visvaderら、Nature 2011; 469: 314-22; Dubeau, Lancet, Oncol 2008; 9: 1191-7）。我々は、いずれの場合も、数回の集団倍化を超えて卵巣上皮細胞を増殖することはできなかった。ＭＣＤＢ１０５／１９９培地／１０％ウシ胎児血清コントロール培地を使用するときに我々が観察した卵巣上皮細胞成長速度（〜２回の集団倍化）は、Auerspergらによる以前の報告（J Cell Physiol 1997; 173: 261-5 and  Lab Invest 1994; 71: 510-8）のより低い範囲内（ＭＣＤＢ１０５／１９９培地／１５％ウシ胎児血清を使用して２−１２集団倍化）であった。
【０１８８】
ファローピウス管上皮の培養に対して、我々は、０．１％ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２の１：１混合物、５％血清（２．５％ウシ胎児血清と２．５％Ｎｕ血清の１：１混合物）及び１７βエストラジオール、又は２％の血清置換をこの培地に補充してわずかに変更したバージョンの、いくつかの以前に報告された培地（Piekら、J Pathol 2001; 195: 451-6; Leeら、J Pathol 2007; 211: 26-35; Kindelburgerら、Am J Surg Pathol 2007; 31: 161-9;及びThe Cancer Genome Atlas Research Network Nature 2011; 474: 609-15）を試験した。上述の我々が試験した従来の培地は、ヒトの卵巣及びファローピウス管由来の正常な上皮細胞の長期的な増殖を支持しなかった。ヒトの正常なファローピウス管と卵巣の上皮細胞を培養することに関する追加の注意事項は次のとおりである：
・大容量の培地中での細胞の維持、典型的なボリュームよりも大きい；
例えば
Ｔ２５フラスコ＝１０ｍｌ。Ｔ７５フラスコ＝２８ｍｌ。
６ｃｍプレート＝４ｍｌ。１０ｃｍプレート＝１５ｍｌ。
・２〜３日毎又は培地が黄色系又は茶色に変わる場合は早く培地を交換する。
・トリプシン処理：細胞を急速にトリプシン処理する（室温、トリプシンを追加するとき＜１分）；細胞がフラスコから外れて直ちにトリプシンを不活性化する。そうでなければ細胞は生存しない。解凍したばかりの０．０５％トリプシンを使用するトリプシン処理する、その後の１０〜２０％血清を含む培地でのトリプシンの不活性化（この目的のためにトリプシンの分割及び凍結を行う）。代替的に、トリプシン処理に対して「ＴｒｙｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓ」（BD)（無血清細胞培養用に設計）が、（製造者の指示に従って）プレートから細胞を剥離するために使用できる。
・細胞播種密度：最小播種密度＞１０，０００細胞／ｃｍ２増殖領域（組織培養プレート）、例えば、１個のＴ２５フラスコに４０万細胞を播種する。
・細胞を凍結：「バンバーカー」フリーズダウン培地は、良好に機能する（Lymphotec Incによって生産され、和光研究所ケミカルによって頒布されるＢａｍｂａｎｋｅｒ）（使用については、製造元の指示に従う）。細胞は、２０％血清を含む１０％ＤＭＳＯの培地で凍結することができるが、この方法はＢａｍｂａｎｋｅｒほど最適ではない。（製造業者の指示に従って）「ミスターフリーズ」コンテナ（Nalgene）中で細胞を凍結する。
【０１８９】
レトロウイルス感染症
図６（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いて、（ＰＭＩＧ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴのための）両種性レトロウイルスが、レトロウイルスベクター１μｇ並びに８：１の比率の（ｐＵＭＶＣ３）及びエンベロープ（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）プラスミドの全パッケージング１μｇでの２９３Ｔプロデューサー細胞株のトランスフェクションによって作製された。ウイルス上清を２４及び４８時間に採取し、初代卵巣表面とファローピウス管上皮細胞に８μｇ／ｍｌのポリブレンで感染させた。レトロウイルスは次の順序の個々のステップで順次にレシピエント細胞に導入された：ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴ、ｐＢａｂｅ−ｚｅｏ−ＳＶ４０−ＥＲ及びｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−Ｈ−ｒａｓ  Ｖ１２。感染した細胞の選択が連続的に実施され、薬剤選択（５００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏ）と１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐｕｒｏ））を各感染後ポリクローナル感染集団を精製するために使用された。初代卵巣表面上皮細胞は、２〜６継代の間に不死化され、２６〜３０継代の間に形質転換された。初代ファローピウス管上皮細胞は１〜４継代の間にｈＴＥＲＴが形質導入され、１６継代で形質転換された。ｈＴＥＲＴで不死化された細胞、並びにＳＶ４０及び／又はＨ−ｒａｓを用いて形質導入された細胞は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、プライマリア組織培養ウエア（BD Biosciences）で培養した。レトロウイルスの使用を含むすべてのプロトコールは、微生物学的安全性に関する委員会によって承認された。
【０１９０】
不死化された卵巣表面とファローピウス管の上皮細胞株は、ｈＴＥＲＴの（Ｅ）、ＳＶ４０初期領域（Ｌ）及びＨｒａｓ（Ｒ）をエンコードするベクターを導入後の完全に形質転換された派生体が、ＯＣＬＥＲとＦＮＬＥＲと記載される。
【０１９１】
腫瘍形成性及び転移の解析
免疫不全マウスにおける腫瘍形成実験のためのプロトコールは、ハーバード大学常任動物委員会によって承認された。全ての実験は、関連する制度や国のガイドライン及び規制に準拠して行った。マトリゲル及びＷＩＴ−ｆｏの混合物（１：１）で１００μL容量当たり１００万個の細胞に調製された単一細胞の懸濁液が調製され、マウス１匹当たり腹腔内（ＩＰ）１か所と皮下（ＳＣ）２か所に注射された。腫瘍細胞の注射は６〜８週齢の雌性免疫不全ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA）で実施された。腫瘍は、ヌードマウスのＩＰ及びＳＣ部位への組織培養由来の腫瘍形成性細胞の移植後５〜９週に採取された。腫瘍の組織病理学は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織からヘマトキシリン・エオジンで染色した切片で評価した。免疫組織化学は、正常なヒト卵巣とファローピウス管（ＩＲＢ承認されたプロトコール下で収集された廃棄された組織）と同様に、マウスＯＣＬＥＲとＦＴＬＥＲ異種移植片における免疫染色のパターンを判定するために細胞型特異的マーカー（ＣＫ７、ＦＯＸＪ１、ＰＡＸ８）を使用してＦＦＰＥ組織で実施された。最初に、新鮮な組織における肺へのＧＦＰ発現腫瘍細胞の転移をオリンパス製ＳＺＸ１６型ステレオ蛍光顕微鏡を用いて解析し、その後、ＦＦＰＥ組織のヘマトキシリン・エオシン染色切片の顕微鏡検査で解析した。マウス肺における腫瘍細胞の存在が、ＳＶ４０  ＬＴ（Ｖ−３００）及びｐ５３（ＦＬ−３９３）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）の免疫染色により確認された。免疫染色は、従来のＡＢＣ法を用いて行った。
【０１９２】
ライブセルイメージング及び蛍光活性化細胞選別
細胞は、未処理のフルオロディッシュ（World Precision Instruments, Sarasota, FL）で２日間増殖され、生細胞の画像がニコン製ＴＥ２０００−Ｕ型倒立顕微鏡及び画像取得のためのＥＺ−Ｃ１ソフトウェア（ニコン）を使用して油浸で４０倍の倍率で撮影された。ＦＡＣＳアリア多色高速ソーター（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析が、ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴで感染後のＧＦＰ陽性の卵巣及びファローピウス管細胞の割合を定量化するために適用された。
【０１９３】
マイクロアレイデータの正規化と解析
ｈＴＥＲＴによる不死化された細胞株（ＯＣＥ、ＦＮＥ）のアフィメトリクスマイクロアレイ、Ｗｕらによる公衆に公開された卵巣癌データセット（Cancer Cell 2007; 11: 321-33）（ＧＥＯシリーズのアクセッション番号ＧＳＥ６００８）、及びＴｏｔｈｉｌｌらの（(Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208）（ＧＥＯシリーズアクセッション番号ＧＳＥ９８９１）が独立してＲでの分散安定化法（ｖｓｎｒｍａ）を使用して正規化された。我々はまた、ＴＣＧＡコンソーシアムによって規格化されたＴＣＧＡのｍＲＮＡ発現データ（Nature 2011; 474: 609-15）を使用した。細胞株の間の遺伝子発現の比較は５４６７５のプローブを測定する１２ヒトゲノムＵ１３３プラス２マイクロアレイ（HG U133Plus2.0, Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いて行った。アレイされた試料は、２つの生物学的複製（２名の患者由来のｈＴＥＲＴで不死化された対のＯＣＥとＦＮＥ細胞）、及び各細胞株由来の３つの実験的複製（異なる継代）を含んだ。マイクロアレイＣＥＬファイルは、ＧＥＯ（ＧＳＥ３７６４８）で利用できる。
【０１９４】
我々は、まず、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて、完全連結階層的クラスタリング（ユークリッド距離）を適用し、患者（１又は２）によって最も強い分離を観察し、サンプルの次の細分化は細胞型（卵巣又はファローピウス管）であった。卵巣対ファローピウス管由来の上皮細胞間で区別的に発現される遺伝子を同定するために、我々は、マイクロアレイデータのための線形モデル（Smythら、Stat Appl Genet Mol Biol 2004; 3: Article3）（LIMMA）を使用する改変ｔ検定（Ｐ＜０．０５）を適用し、偽発見率（ＦＤＲ）に対して修正した。ＦＤＲで調整されたＰ値カットオフ＜０．０５、１，１５７プローブセットの設定は、不死化された（ＯＣＥ対ＦＮＥ）細胞の間で有意に変動した。我々は教師なし階層的クラスタリング解析において患者間の相違を観察したので、我々はＦＮＥとＯＣＥ間で差次的に発現する遺伝子を同定するために患者の相違に対してブロックしながらＬｉｍｍａの重複相関関数を適用（Auersperg et al., Lab Invest 1994; 71: 510-8）させた。
【０１９５】
我々は、最初に、公衆に公開されている３つの卵巣癌データセット（上記で詳述）におけるファローピウス管（ＦＴ）様と卵巣（ＯＶ）様としてヒト卵巣腫瘍を分類するために、我々はＦＤＲ調整Ｐ値に基づくＦＮＥ対ＯＣＥの遺伝子リストをソートし、特徴的な遺伝子シンボルを有する１０種のプローブセットを選択し、ＦＮＥのプローブセットを＋１、ＯＣＥのプローブセットを−１と重み付けすることにより２種の卵巣がんデータセットにおける１０種のプローブセットの正規化された発現値の合計を計算した。具体的には、各腫瘍に対するスコアを計算するために、ＯＣＥ遺伝子の正規化された発現値の合計がＦＮＥ遺伝子の発現値の合計から減算された（例えば、より高いスコアの腫瘍は、よりＦＴ様である）。次に、各データセットにおいて、よりＯＶ様又はＦＴ様である２つの腫瘍グループを識別するために、このスコアに混合モデリングを用いて、ガウス曲線の二峰性分布をフィットさせる。
【０１９６】
まず、新鮮凍結され顕微解剖された９９個の上皮性卵巣がん（多くの非漿液性組織学的サブタイプを含む）の発現プロファイルを含み、同様のプラットフォーム（アフィメトリクスＨＧ  Ｕ１３３Ａ）上に配列されたＷｕらのデータセット（Cancer Cell 2007; 11: 321-33）にこのクラスタリングを行った。１０種の選択されたプローブセットのうち８種がアレイプラットフォームの相違によって解析のために利用可能であった。我々は、（上述のように）ＷｕデータにおけるＦＴ様及びＯＶ様の部分母集団を規定するために、この起源細胞プロファイルを使用し、この分類の正当性を判定するために、密度プロットを使用して、これらのスコアの分布を可視化した。我々はＦＴ様／ＯＶ様として分類され、順序ロジスティック回帰（グレード、ステージ）、又はフィッシャーの正確確率検定（組織学的サブタイプ）を使用して、これらに関連するＰ値を算出し、患者の腫瘍の臨床的特徴を評価した。
【０１９７】
起源細胞プロファイルは、さらに２４６の漿液と２０の子宮内膜の新鮮凍結された悪性腫瘍（顕微解剖ではない）を含み、ＨＧ  Ｕ１３３プラス２．０（Affymetrix）上に配列され、重要なことには、遺伝子発現パターンが患者の生存データとリンクすることが可能なＴｏｔｈｉｌｌらのデータセット（Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208）で検証された。ガウス混合モデル化し、上記のように、腫瘍の分類のための同様の方法がＴｏｔｈｉｌｌデータセットに適用された。ＦＴ様／ＯＶ様分類が患者の無病生存率及び全生存率の違いに関連しているか否かを評価するために、我々は、カプラン・マイヤープロットを構築し、単変量Ｐ値が対数順位検定を用いて計算された。その後、多変量での統計的な有意性を判定するために、グレード、ステージ、漿液性組織学的サブタイプ、患者の年齢及び残留疾患を調整しながら、コックス比例ハザードテストを適用した。
【０１９８】
最後に、上述したのと同じ方法を使用して、４９１の漿液性で高グレードの腫瘍（ステージ及びグレードが欠落しているものを除外）が含まれるＴＣＧＡデータセット（Nature 2011; 474: 609-15）におけるＯＣＥ対ＦＮＥの起源細胞プロファイルを試験した。ＴＣＧＡのデータセットでは６／１０のプローブセットがプラットフォームの相違によって利用可能であった。すべてのマイクロアレイと生存解析は、Ｒバージョン２．１０．１を使用して行った。
【０１９９】
卵巣上皮の中皮対ミュラー表現型
卵巣表面上皮は、一般に、腹膜中皮の表面の内側を覆い主に中皮様の形態を有する平坦又は立方細胞と非常に類似している。ミュラー管表現型と一致する、柱状及び／又は繊毛の上皮を有する卵巣上皮細胞の第二のサブ集団は、時々卵巣表面に確認できる。卵巣の封入嚢胞上皮は、従来より、下層の間質に卵巣表面上皮の陥入から生じると考えられており、中皮とミュラーの両方の表現型は、卵巣の封入嚢胞上皮で観察される。我々が培養する卵巣上皮（ＯＣＥ）細胞は、これらの細胞型の中でミュラー表現型を示した。正常な成人の卵巣におけるミュラー表現型を有する卵巣の上皮細胞は、卵巣皮質において微小環境及びホルモン環境への卵巣上皮の曝露から生じる、又は子宮及びファローピウス管に由来し、子宮内膜細胞の逆流、剥離及び管の癒着による直接接触によって卵巣表面に自分自身を埋め込む。我々は、主に卵巣封入嚢胞にミュラー管表現型卵巣上皮を観察し、したがって、ＯＣＥ細胞がミュラー表現型の卵巣の封入嚢胞上皮を起源とする可能性があることを支持する。しかし、Ｌｉらによる最近の研究（Mod Pathol 2011）は、封入嚢胞に加えて、卵巣の表面に稀なミュラー表現型細胞を報告する。従って、培養されたＯＣＥ細胞はまた、嚢胞上皮に加えて、卵巣の表面のミュラー表現型上皮細胞を起源としている可能性がある。
【０２００】
要約すると、我々は、起源細胞が、卵巣腫瘍の表現型の重要な差異を媒介し得ることを示した。同じ腫瘍遺伝子が起源細胞に依存して非常に異なる表現型の結果を有することができることを示唆する他の知見に照らして、各腫瘍の起源細胞及び分化状態に関する脈絡情報に対して、腫瘍の様々なタイプの遺伝的変異性のスペクトルを調査するための継続的な努力を組み合わせたアプローチが、異なる遺伝子異常の効果を評価するために必要とされる。卵巣がんにおいて、この情報は、起源細胞の分類に基づく個別化医療へのアプローチ、及び、がん予防モデルにおける起源サイトの役割に対処することを助けることができる。ここでは、卵巣がんの病因における異なる起源細胞の役割を研究する能力を大きく向上させる新しい培養システムを我々は報告する。
【０２０１】
実施例４−抗腫瘍薬のパネル
図８を参照すると、我々の結果は、ＯＣＩ株は、標準細胞株と比較して有意に抗腫瘍薬の多様なパネルに対してより耐性があることを示している。これらの実験では、ＡＴＣＣ卵巣腫瘍株（ＳＫＯＶ３、ＯＶ９０、ＴＯＶ−１１２０及びＡ２７８０）及びＯＣＩ卵巣腫瘍株（ＦＣＩ−Ｐ２ｐ、ＯＣＩ−Ｐ５ｘ、ＯＣＩ−Ｐ２ａ、ＯＣＩ−Ｃ４ｐ、ＯＣＩ−Ｐ７ａ、ＯＣＩ−Ｃ５ｘ、ＯＣＩ−ＣＳｐ、ＦＣＩ−Ｐｌｐ、ＯＣＩ−Ｐ９ａｌ、ＯＣＩ−Ｐ８ｐ、ＯＣＩ−Ｐ３ａ、ＯＣＩ−Ｐｌａ）が９６ウェルプレートにおいてＷＩＴ−ＯＣ培地に播種された（５０００細胞／ウェル）。次の日、タキソール、ビンクリスチン、Ｕ０１２６、ＰＪ３４、アドリアマイシン、ＡＳ７０３０２６、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ＰＬＸ４７２０とＰＪ３４の連続希釈液を添加した。生存細胞数が、薬物に応じて、７２〜１４４時間のインキュベーション後にアラマーブルーによる５９０／５３０蛍光として測定された。我々は、ＯＣＩ株は、一般的に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤ＰＪ３４による細胞増殖阻害に対してより耐性であることを認め、現在までに臨床におけるこの薬剤に対して認められる応答の低レベルと一致する可能性がある。ＯＣＩ株はまた、ＭＡＰＫ阻害剤Ｕ０１２６及びＤＮＡインターカレーション薬剤であるアドリアマイシン並びに５−フルオロウラシルに対してより耐性であった。したがって、抗腫瘍薬剤に対する被検体のがん性腫瘍の感受性を解析し、被検体のための個別化された治療法を展開する本明細書に記載の方法は、いかなる薬物のために使用できる。
【０２０２】
その他の実施態様
いかなる改善が、アッセイ、キット、及び方法ステップの一部又は全てでなすことができる。本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される、いかなるかつ全ての実施例又は例示的な言葉（例えば「など」）は、本発明の理解を容易にするものであり、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の性質又は利点又は好ましい実施態様に関する本明細書のいかなる記載は、限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲は、かかる記載に限定されるものではない。より一般的には、明細書の用語は、本発明の実施に不可欠であるとして、いかなる請求されていない要素を示すものと解釈されるべきものではない。本明細書に記載された実験は、卵巣がんに関連しているが、本明細書に記載のアッセイ、方法及びキットは、いかなるがんにも適用することができる。本発明は、適用可能な法律によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載の主題のすべての修正及び均等物を含む。さらに、本明細書に示されない又は文脈によって明らかに禁忌でない限り、全ての改変可能な上記要素の組み合わせが本発明によって包含される。
【図１Ｂ】
2016523527.tif 000033
【図２Ａ】
2016523527.tif 000034
【図６Ａ】
2016523527.tif 000035
【図６Ｂ】
2016523527.tif 000036
【図７Ａ】
2016523527.tif 000037
【図７Ｂ】
2016523527.tif 000038
【図７Ｃ】
2016523527.tif 000039
【図７Ｄ】
2016523527.tif 000040
【図８】
2016523527.tif 000041
【図１Ａ】
2016523527.tif 000042
【図２Ｂ】
2016523527.tif 000043
【図２Ｃ】
2016523527.tif 000044
【図３Ａ】
2016523527.tif 000045
【図３Ｂ】
2016523527.tif 000046
【図４Ａ】
2016523527.tif 000047
【図４Ｂ】
2016523527.tif 000048
【図５】
2016523527.tif 000049
【国際調査報告】
2016523527.tif 000050