(57)【要約】本発明は、末梢血液から分離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養することにより収得される心臓内膜由来の成体幹細胞、及びこれを有効成分として含有する血管疾患の治療のための細胞治療剤に関するものである。本発明による成体幹細胞はその起源が心臓の内膜であり、強い血管形成能を有するため、虚血や心筋梗塞などの心血管系疾患の治療に大きく有用である。【選択図】図１
2016523514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血液から分離された末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５日ないし８日の間、毎日、培地を交換しながらＴ細胞を除去して培養することにより収得される、心臓内膜由来の成体幹細胞。
【請求項２】
上記の成体幹細胞は次のような特性を示すことを特徴とする、請求項１に記載の心臓内膜由来の成体幹細胞：
（ａ）ＮＦＡＴｃ１、ＭｉｘＬ１およびＣＤ３１に対して陽性の免疫学的特性を示して、ＷＮＴ５ＡおよびＣＤ３に対して陰性の免疫学的特性を示すこと；および
（ｂ）付着されて成長して、線形態（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的特性を示すこと。
【請求項３】
末梢血液から末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を分離した後、ＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）する段階；および
上記のシーディングの後５日ないし８日の間、毎日、培地を交換しながらＴ細胞を除去する段階を含む、心臓内膜由来の成体幹細胞の製造方法。
【請求項４】
上記の成体幹細胞は次のような特性を有することを特徴とする、請求項３に記載の心臓内膜由来の成体幹細胞の製造方法：
（ａ）ＮＦＡＴｃ１、ＭｉｘＬ１およびＣＤ３１に対して陽性の免疫学的特性を示して、ＷＮＴ５ＡおよびＣＤ３に対して陰性の免疫学的特性を示すこと；および
（ｂ）付着されて成長して、線形態（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的特性を示すこと。
【請求項５】
請求項１または２に記載の成体幹細胞を有効成分として含有する、血管疾患の治療用の細胞治療剤。
【請求項６】
上記の血管疾患は心筋梗塞または下肢虚血であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞治療剤。
【請求項７】
成体幹細胞を個体に投与する段階を含む、請求項１または２に記載の血管疾患の予防または治療方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の成体幹細胞の血管疾患の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血液から分離された末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を培養することにより収得される心臓内膜由来の成体幹細胞、及びこれを有効成分として含有する血管疾患の治療のための細胞治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
患者へのオーダーメード型の細胞治療剤として用いられる細胞は種類および分化の程度に応じ体細胞治療剤と幹細胞治療剤に分けられ、その中で幹細胞治療剤は成体幹細胞治療剤と胚性幹細胞治療剤、最近に胚性幹細胞を代替できるもので脚光を浴びている逆分化幹細胞治療剤がある。
【０００３】
成体幹細胞は新生児や成人の発達された臓器と器官で発見される細胞として、自己再生能を有し、生物組織を構成する様々な細胞に分化することができる細胞として定義される。傷や事故などで組織や細胞に損傷を受けた際に、筋肉、骨、脂肪、神経などの細胞に分化されて、損傷された部位を回復させることができる細胞である。
【０００４】
成体幹細胞には造血幹細胞、間葉系幹細胞、他の組織の再生に関与する制限された分化能を有する組織特異的前駆細胞が属する。その中で最も非侵襲的な方法を用いて得られる細胞は骨髄採取を通じた造血幹細胞や間葉系幹細胞であり、他の細胞は生検を通じた侵襲的な組織を獲得する過程を通じて分離して用いられてきた。最も非侵襲的な方法とはいえでも、骨髄採取は麻酔が必要であり痛みを誘発するので、患者へのオーダーメード型の幹細胞を分離するためのより非侵襲的な方法として末梢血液を用いる細胞の獲得法が求められている。しかし、末梢血液だけでは成人から分離することができる造血幹細胞や間葉系幹細胞の数が非常に少なく分離方法が経済的ではなく、分離して出したとしても細胞治療に用いられるほどの量ぐらい増殖が円滑ではない場合が殆どなので、さらに実用性を高めることができる代替成体幹細胞や細胞獲得法が求められている。
【０００５】
従来、生検を通じて獲得できる組織特異的前駆細胞の中で心臓の再生に関連される成体幹細胞は心臓外膜と心筋で同定されてきた。心筋から獲得された幹細胞は心筋と冠状動脈を作ることができる能力を有していて、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｉｓｌｅｔ−１などのマーカーを有している。心臓外膜から獲得された幹細胞は間葉系幹細胞と同様の特徴を有していて、心筋と平滑筋細胞に分化することができる能力を有している。しかし、心臓内膜ではこれまでどのような成体幹細胞も同定されておらず、ただ血管内皮細胞と同一な細胞で構成されているだろうと見なされているのみであった。このような心臓内膜細胞は心臓の発生段階で心臓弁膜と心臓内の血管形成の役割を担当しており、ＮＦＡＴｃ１のマーカーを有しているが、成体になって行きながらＮＦＡＴｃ１マーカーの発現は徐々に減少すると知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これで、本発明者はヒト末梢血液から心臓内膜由来の多分化能の成体幹細胞を分離して、代替成体幹細胞と非侵襲的な細胞獲得法の提供という二つの要件を満たすために鋭意努力した結果、本発明を完成するようになった。
【０００７】
具体的には、本発明の目的は非侵襲的な方法である少量の末梢血液の採血を介して患者へのオーダーメード型の細胞治療に用いるための心臓内膜由来の成体幹細胞、これを用いる細胞治療剤及びその製造方法を提供するものである。
【０００８】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解されることができるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、末梢血液から分離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディングした後、５日ないし８日の間、毎日、培地を交換しながらＴ細胞を除去して培養することによって収得される、心臓内膜由来の成体幹細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、末梢血液から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した後、ＥＧＭ−２ＭＶ培地に懸濁してシーディングする段階；および上記のシーディングの後５日ないし８日の間、毎日、培地を交換しながらＴ細胞を除去して培養する段階を含む、心臓内膜由来の成体幹細胞の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の一具体例として、上記の成体幹細胞は（ａ）ＮＦＡＴｃ１、ＭｉｘＬ１およびＣＤ３１に対して陽性の免疫学的特性を示して、ＷＮＴ５ＡおよびＣＤ３に対して陰性の免疫学的特性を示し、（ｂ）付着されて成長して、線形態（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的特性を示すことを特徴とする。
【００１２】
本発明は、上記の成体幹細胞を有効成分として含有する、血管疾患の治療用の細胞治療剤を提供する。
【００１３】
本発明は、薬学的に有効量の上記の成体幹細胞を個体に投与する段階を含む、血管疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１４】
本発明は、上記の成体幹細胞を血管疾患の予防または治療に利用する方法を提供する。
【００１５】
本発明の一具体例として、上記の血管疾患は心筋梗塞または下肢虚血であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の幹細胞は従来に研究されてきた心臓外膜と心筋の起源ではなく、心臓内膜の起源で多分化能を有して少量の末梢血液だけでも分離培養が可能であり、培養段階で単に頻繁な培地の交換だけでも成体幹細胞を抑制している細胞及び環境を除去することで容易に製造することができる。
【００１７】
また、本発明の幹細胞は高い増殖力を有していて、培養の後、１ヶ月以内には遺伝的変異なしに保管および細胞治療に使われることができるほどの細胞数（１×１０７ｃｅｌｌｓ）を確保することができる。
【００１８】
また、本発明の幹細胞は細胞自体が有する増殖力と分化力で組織に注入する際に、血管形成を誘導することができるので、虚血が引き起こされる病症の治療に用いられることができるし、免疫細胞に比べて高い遺伝子の導入の効率を有するため遺伝子の導入後、他の種類の細胞に分化させたり、治療に用いることができる。
【００１９】
また、本発明の幹細胞はその起源が心臓の内膜であって、強い血管形成能を有するため心筋梗塞などの心血管系疾患の起電研究と治療に大きく寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＣｉＭＳ幹細胞の培養方法（図１ａ）、ＣｉＭＳの幹細胞の出現時期による細胞の形態（図１ｂ）、及びＣｉＭＳ幹細胞の表面マーカー（図１ｃ）を示すものである。
【００２１】
【図２】図２ａは、Ｔリンパ球によるＣｉＭＳ幹細胞の培養の抑制効果をコロニー染色で示すものであり、図２ｂは、初期ＣｉＭＳ培養で浮遊細胞の内のＣＤ３＋細胞の割合を示すものである。
【００２２】
【図３】図３ａは、骨髄移植、肝移植、腎臓移植を受けた患者でのＣｉＭＳ遺伝子型の分析結果であり、図３ｂは、心臓供与者と受容者の血液から獲得したＣｉＭＳ遺伝子型の分析結果である。
【００２３】
【図４】図４ａは、免疫染色を用いてＣｉＭＳでＮＦＡＴｃ１の位置を示すものであり、図４ｂは、ＣｉＭＳ特異的マーカーを確認したＲＴ−ＰＣＲの結果である。
【００２４】
【図５】図５は、心臓組織でのＮＦＡＴｃ１、ＣＤ３１マーカーの染色の結果である。
【００２５】
【図６】図６は、末梢血液単核細胞でＣｉＭＳ特異的マーカーであるＮＦＡＴｃ１／ＣＤ３１染色を用いてＣｉＭＳを培養した結果である。
【００２６】
【図７】図７ａは、健康な志願者と心臓移植患者でＣｉＭＳの出現時期に対する比較を示す結果であり、図７ｂは健康な志願者と心臓移植患者でＣｉＭＳマーカーである（ＮＦＡＴｃ１＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３−）発現細胞の数を示す結果である。
【００２７】
【図８】図８ａは、マウス心筋梗塞モデルでＣｉＭＳ注入の効果を示すものであって、図８ｂは、心筋梗塞の心臓組織でＧＦＰ−ＣｉＭＳの分布を示すものであり、図８ｃはマウス下肢虚血のモデルでＣｉＭＳ注入の効果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は末梢血液の中の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で分離された心臓内膜由来の多分化能の幹細胞に関するものである。
【００２９】
本発明において、「幹細胞」とは、個体を構成する細胞や組織の根幹になる細胞で、その特徴は反復分裂して自己再生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）することができて、環境に応じて、特定な機能を有する細胞に分化することができる多分化能力を有する細胞を意味する。胎児の発生過程の中で、すべての組織で生じていて、成人になっても骨髄、上皮組織など細胞が活発に交替されている一部の組織で発見される。幹細胞は分化できる細胞の種類に応じて受精卵が初分裂を開始する際に形成される万能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）と、この細胞が続けて分裂して作られた胞胚内膜にある全分化性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、そして成熟した組織と器官の中に入っている多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）で分類される。この際に、多能性幹細胞は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞のみに分化することができる細胞として、胎児期、新生児期および成体期のそれぞれの組織および臓器の成長と発達はもちろん成体組織の恒常性の維持と組織の損傷の際に再生を誘導する機能に関与している。このような組織特異的多能性細胞を総称して成体幹細胞ともいう。
【００３０】
本発明において、「末梢血液」とは、ヒトを含む哺乳動物で身体を流れている血液をいうことで、動脈、静脈、末梢血管などを用いて様々に抽出ができる。
【００３１】
本発明において、「末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ）」とは、末梢血液の内に存在する単核の細胞で、Ｂ  ｃｅｌｌ、Ｔ  ｃｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、ＮＫ  ｃｅｌｌ（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）などの免疫細胞、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、  好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、  好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）のような顆粒球細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）などを含めている。上記のＰＢＭＣの通常の製造方法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いる比重遠沈法で分離することができる（Ｂｌｏｏｄ、１９９８、９２：２９８９−９３など）。
【００３２】
本発明において、心臓内膜由来の幹細胞を製造する方法は、末梢血液から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した後、ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ−２）（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、Ｔ細胞で構成されるコロニーが形成されないように培地を初期５日間毎日交換することが望ましい。このように、毎日培地を交換すれば、約５日から８日の間にいくつかの細胞が観察されて、２週以内に継代して保管することができる量の細胞に増殖するので、この細胞を「ＣｉＭＳ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）」と命名した。ＣｉＭＳはＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ＡＢＣなどの間葉系幹細胞のマーカーとＣＤ３１の内皮細胞の表面マーカーを発現していたし、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲなどのマーカーを発現していないので、骨髄由来の血液細胞とは異なる性質を有していた。
【００３３】
本発明で、ＣｉＭＳは付着成長及び線形態（ｓｐｉｎｄｌｅ−ｓｈａｐｅ）の形態学的な特性を示し、この際に「付着」は培養フラスコ、プラスチックなどに付着して成長するという意味で付着対象に制限はない。
【００３４】
本発明は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）内の特定成体幹細胞の出現を抑制するＴ細胞（リンパ球）を除去する単純な培養方法により、心臓内膜由来の幹細胞を製造することができる。
【００３５】
本発明でＣｉＭＳの起源を明らかにするために、骨髄移植を受けた患者、肝移植を受けた患者、腎臓移植を受けた患者と心臓移植を受けた患者の血液を培養して供与者の遺伝子型と受容者の遺伝子型をＳＴＲ検査を通じて確認した結果、獲得されたＣｉＭＳは心臓移植を受けた患者のＣｉＭＳを除外して、すべての受容者と一致する遺伝子型を有していて、心臓移植を受けた患者で培養されたＣｉＭＳだけが供与者と一致する遺伝子を有していた。
【００３６】
本発明で、ＣｉＭＳは他の内皮細胞や間葉系幹細胞、皮膚繊維芽細胞、血液細胞に比べて、心筋内膜細胞マーカーであるＮＦＡＴｃ１を強く発現しており、原始線条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）と中胚葉のマーカーであるＭｉｘＬ１を発現しているが、内皮細胞の増殖や移住に関連されるマーカーであるＷｎｔ５ａは発現していなかった。これを用いて心臓移植を受ける患者を対象に心臓組織を得て組織染色をした結果、心臓の内膜にＮＦＡＴｃ１とＣＤ３１を同時に発現する細胞がところどころ存在することから、ＣｉＭＳの起源が心臓の内膜であることを明らかにした。
【００３７】
本発明で製造されたＣｉＭＳを用いて、免疫染色した結果、細胞質でＮＦＡＴｃ１が染色された。そこで、本発明者は血液で末梢血液単核細胞を分離してＳＬＯを用いて細胞膜内に抗ＮＦＡＴｃ１抗体が透過することができる条件を作って、ＣＤ３  ｎｅｇａｔｉｖｅ群でＮＦＡＴｃ１／ＣＤ３１  ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ群を培養してＣｉＭＳを直接的に選択培養することができる方法を確立した。このような方法を通じて確認した結果、血液から分離されたＣｉＭＳは正常人より免疫抑制剤の投与によりＣＤ３細胞の機能が顕著に低下されている心臓移植患者でより多く存在して、培養の際にその出現時期も短縮されていた。
【００３８】
本発明のＣｉＭＳは多分化能を有するが、ＧＦＰで染色したＣｉＭＳを心筋梗塞を誘導したマウスの心臓と虚血を誘導したマウスの下肢筋肉に注入した結果、１４日経過の後に、対照群に比べてＣｉＭＳを注入した群で左心室収縮能と血行が向上されたことを観察することができて、緑色蛍光を浴びている細胞がマウスの心臓で内皮細胞と血管平滑筋細胞に分化して血管を形成していることを観察することができた。これでＣｉＭＳの主な機能が損傷された血管の回復であることを間接的に知ることができた。
【００３９】
以下で本発明を実施例を介してより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明の一例であるだけで、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．末梢血液から幹細胞の分離および培養法の確立
実施例１−１．末梢血液を用いたＣｉＭＳ培養方法
ヒト血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いて抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した後、ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に懸濁して１０ｕｇ／ｍｌ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎがコーティングされた６ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たりＰＢＭＣが４×１０６個／ｍｌになるようにシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、プレートを複数回強く振って、浮いている細胞を強いｓｕｃｔｉｏｎを介して除去した後、新しい培地に交換して培養することを７日間反復して７日後には２日に一回培地を交換した。その結果、図１ａおよび１ｂに示すように、５日から８日の間にＣｉＭＳ細胞の出現を確認することができて、ＣｉＭＳ細胞の出現の後、２週内にコロニーを形成しながら増殖した。このコロニーを０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いてｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅして１０％ＤＭＳＯが含まれているＦＢＳ  ｓｔｏｃｋ培地に懸濁してイソプロパノールフリージングコンテナ（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に入れて−７０℃で２４時間置いた後−１９０℃で保管した。
【００４１】
実施例１−２．分離されたＣｉＭＳのマーカーの確認
実施例１−１で得られたＣｉＭＳ細胞の表面マーカーを確認するためにフローサイトメトリー分析を実施した。その結果、図１ｃに示すように、ＣｉＭＳはＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ＡＢＣの間葉系幹細胞のマーカーとＣＤ３１の内皮細胞の表面マーカーを発現していて、骨髄由来血液細胞のマーカーであるＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲは発現していなかった。
【００４２】
実施例２．Ｔリンパ球による幹細胞培養の抑制効果の確認
末梢血液単核細胞でｐａｎ  Ｔ  ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分離キットを用いてＴリンパ球を除去した群とＴリンパ球が含まれている群に分けた後、反復的な培地の交換なしに浮遊細胞が存在する状態でＣｉＭＳ培養を行った。その次、ＣｉＭＳコロニーをクリスタルバイオレットで染色して、Ｔリンパ球の添加可否によるＣｉＭＳの出現を確認した。その結果、図２ａに示すように、Ｔリンパ球が存在する培養群でＣｉＭＳの出現が阻害される現象を観察したし、これは反復的に培地を交換することによって、ＣｉＭＳの出現を抑制しているＴリンパ球が除去されたことを示すものである。
【００４３】
また、毎日上澄液の浮遊細胞を獲得した後、ＣＤ３抗体でＴリンパ球を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。これを通じてＣｉＭＳ培養の際に初期に除去される浮遊細胞でＴリンパ球の割合を確認して、その結果を図２ｂに示した。
【００４４】
実施例３．ＣｉＭＳの起源の確認
ＣｉＭＳの起源を明らかにするために、骨髄移植を受けた患者、肝移植を受けた患者、腎臓移植を受けた患者の末梢血液単核細胞から実施例１−１の方法でＣｉＭＳを獲得した後、遺伝子型が受容者と同一であるか、供与者と同一であるかをＳＴＲ検査とＨＬＡ  ｔｙｐｉｎｇで確認した。その結果、図３ａに示すように、ＣｉＭＳは受容者と同一な遺伝子型を有することを確認したので、ＣｉＭＳは骨髄、肝、腎臓に起源するものではないことが分かった。
【００４５】
また、心臓移植を受けた患者の末梢血液単核細胞から獲得したＣｉＭＳの遺伝子型をＳＴＲ検査で分析した。その結果、図３ｂに示すように、ＣｉＭＳは供与者と同一な遺伝子型を有することを観察したし、心臓移植を受ける前後を比べたとき、心臓移植の前に受容者の遺伝子型と同一していたＣｉＭＳが心臓移植の後には供与者の遺伝子型を有するＣｉＭＳに変わる現象を１１人のケースで観察した。これはＣｉＭＳの起源が心臓である事実を証明するものである。
【００４６】
実施例４．ＣｉＭＳの心臓内膜の特異的遺伝子発現の究明
心臓内でＣｉＭＳの地理的な位置を明らかにするためにＣｉＭＳ特異的なマーカーを発掘する必要がある。このためにＣｉＭＳを免疫染色した結果、図４ａに示すように、ＮＦＡＴｃ１がＣｉＭＳの細胞質に存在することを確認することができた。すなわち、複数の遺伝子のスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を通じてＣｉＭＳが他の内皮細胞や間葉系幹細胞、皮膚繊維芽細胞、血液細胞、胚性幹細胞に比べて心筋内膜細胞に特異的に発現する心筋内膜細胞のマーカーであるＮＦＡＴｃ１を強く発現していることを観察することができた。したがって、ＮＦＡＴｃ１をＣｉＭＳの細胞特異的マーカーで定めた。
【００４７】
また、図４ｂに示すように、ＣｉＭＳは原始線条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）と中胚葉のマーカーであるＭｉｘＬ１を発現していて、前駆細胞の性質を有することが分かり、内皮細胞の増殖および移住に関連されるマーカーであるＷＮＴ５Ａは発現していないので、これをｎｅｇａｔｉｖｅマーカーとして用いることができることを明らかにした。
【００４８】
実施例５．心臓内膜でＮＦＡＴｃ１とＣＤ３１染色を通じたＣｉＭＳの存在の検証
心臓移植を受けた患者を対象に心臓組織を得た後、ＣｉＭＳ特異的なマーカーを用いて次のような方法で免疫組織染色を行った。心臓組織をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定してパラフィンブロックを作って、  脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）過程を経た後、ＤＡＫＯ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに浸して、電子レンジでｒｅｔｒｉｅｖａｌ過程を経てから染色に用いた。ＮＦＡＴｃ１に対する抗体はシグナルの増幅と特異性のためにＳｏｌｕｌｉｎｋ  Ｃｈｒｏｍａｌｉｎｋ  Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  ｏｎｅ−ｓｈｏｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔを用いてジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）をコンジュゲーションして１：１００に用いて、ＣＤ３１に対する抗体もやはりビオチンがコンジュゲーションされたものを１：１００に用いた。免疫染色結果、図５に示すように、心臓外膜や心筋より心臓の内膜にＮＦＡＴｃ１とＣＤ３１を同時に発現する細胞が存在することを確認することができた（矢印の表示を参考）。したがって、ＣｉＭＳの心臓内の地理的位置が心臓の内膜であることを知ることができた。
【００４９】
実施例６．ＣｉＭＳ特異的マーカー（ＮＦＡＴｃ１／ＣＤ３１）を用いたＣｉＭＳの培養
ＮＦＡＴｃ１がＣｉＭＳの細胞質に存在する結果をもとに、ＮＦＡＴｃ１マーカーを用いて、ＣｉＭＳを末梢血液単核細胞から直接に分離する方法を開発した。まず、血液から末梢血液単核細胞を分離したあとＳＬＯ（Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ）を処理して細胞膜内にＮＦＡＴｃ１抗体が透過することができる条件を作った。その後、ＣＤ３１とＣＤ３抗体を付けた後にＣＤ３  ｎｅｇａｔｉｖｅ群でＮＦＡＴｃ１とＣＤ３１に同時に最も強く染色される細胞群をフローサイトメトリー分析を通じたｓｏｒｔｉｎｇで分離し出して培養した。その結果、図６に示すように、ＮＦＡＴｃ１−／ＣＤ３１−／ＣＤ３−、ＮＦＡＴｃ１−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３−、ＮＦＡＴｃ１＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３−培養群の中で、ＮＦＡＴｃ１＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３−群でのみ、ＣｉＭＳコロニーが確認されたので、ＣｉＭＳを末梢血液単核細胞で直接的に選択培養することができる方法を確立した。
【００５０】
実施例７．末梢血液内でＣｉＭＳの出現時期と量の分析
対照群として健康な志願者（ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ）と心臓移植患者（ＨＴＰＬ  ｐａｔｉｅｎｔ）からＣｉＭＳを培養して、これの出現時期を比較分析した。その結果、図７ａに示すように、ＣｉＭＳは健康な志願者（５８人）より免疫抑制剤の投与により、Ｔリンパ球の機能が顕著に低下されている心臓移植患者（４２人）で、平均２日ほど、より速く出現することを分かることができた。
【００５１】
また、健康な志願者と心臓移植患者からＣｉＭＳを培養して、ＣｉＭＡ特異的マーカーである（ＮＦＡＴｃ１＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３−）を用いてフローサイトメトリー分析をした結果、図７ｂに示すように、心臓移植患者のＣｉＭＳの数が健康な志願者に比べて約４倍程度増加されていることを分かることができた。
【００５２】
実施例８．マウス心筋梗塞モデルと下肢虚血モデルでＣｉＭＳの役割の究明
マウス心筋梗塞モデルでＣｉＭＳの役割を究明するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で表示されるＣｉＭＳを心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｃｔｉｏｎ）を誘導したマウスの心臓に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ）。その結果、図８ａに示すように、１４日経過後にＣｉＭＳを注入していない対照群は心筋梗塞のサイズが１９．５２％であり、ＣｉＭＳを注入した群では心筋梗塞のサイズが８．２３％で、ＣｉＭＳの注入が心筋梗塞を大きく減らす効果があることを観察した。また、左心室の内径分画率（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、左心室の収縮期（ＬＶＥＳＤ）、および弛緩期末左心室の内径（ＬＶＥＤＤ）の測定を通じた左心室の収縮能も対照群に比べてＣｉＭＳを注入した群で増加されることを観察することができた。また、心筋梗塞が誘導されたマウスの心臓組織を分析した結果、図８ｂに示すように、ＣｉＭＳは主に内皮細胞（ＥＣ）と平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に分化されて血管を成していることを確認することができた。
【００５３】
また、マウスの下肢虚血モデルでＣｉＭＳの役割を究明するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で表示されたＣｉＭＳを下肢虚血を誘導したマウスの下肢筋肉に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ）。その結果、図８ｃに示すように、１４日経過後にＣｉＭＳを注入していない対照群に比べてＣｉＭＳを注入した群で下肢再生が抜群に行われて、レーザードップラーで血流量を測定した際に、ＣｉＭＳ注入群が対照群に比べて血流量の割合が増加する様相が観察された。
【００５４】
このような結果からＣｉＭＳの組織内の主な機能は損傷された血管の復旧を通じて組織の再生に関与することを確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の幹細胞は従来に研究されてきた心臓外膜と心筋起源ではなく、心臓内膜起源で、多分化能を有して少量の末梢血液だけでも分離培養ができて、培養段階で単に頻繁な培地の交換だけでも成体幹細胞を抑制している細胞および環境を除去することで容易に製造することができる。また、本発明の幹細胞は心筋梗塞などの心血管系疾患の起電研究と治療に大きく寄与することができる。
【図１Ａ】
2016523514.tif 000003
【図１Ｃ】
2016523514.tif 000004
【図２Ｂ】
2016523514.tif 000005
【図３Ａ】
2016523514.tif 000006
【図３Ｂ】
2016523514.tif 000007
【図７Ａ】
2016523514.tif 000008
【図７Ｂ】
2016523514.tif 000009
【図１Ｂ】
2016523514.tif 000010
【図２Ａ】
2016523514.tif 000011
【図４Ａ】
2016523514.tif 000012
【図４Ｂ】
2016523514.tif 000013
【図５】
2016523514.tif 000014
【図６】
2016523514.tif 000015
【図８Ａ】
2016523514.tif 000016
【図８Ｂ】
2016523514.tif 000017
【図８Ｃ】
2016523514.tif 000018
【国際調査報告】
2016523514.tif 000019
2016523514.tif 000020
2016523514.tif 000021
2016523514.tif 000022
2016523514.tif 000023
2016523514.tif 000024