(57)【要約】本発明は、酵素反応を最適化することによって、発酵経路を通る流束を増加させることによって、発酵産物の産生を増加させる方法を提供する。具体的には、本発明は、発酵経路中の代謝ボトルネックに関与する酵素及び／または補因子を同定すること、ならびに親微生物と比較して、該酵素のうちの１つ以上の活性の増加、または該補因子のうちの１つ以上の可用性の増加を示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物でＣＯ含有基質を発酵させることに関する。【選択図】図１
2016520325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵産物を産生する方法であって、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定することと、
ｂ）前記律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、少なくとも１つの酵素、補因子、または両方を同定することと、
ｃ）発酵産物を産生するために、親微生物と比較して、ｉ）（ｂ）の前記少なくとも１つの酵素、もしくはその機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）（ｂ）の前記少なくとも１つの補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させることと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
発酵産物を産生する方法であって、前記方法は、発酵産物を産生するために、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させることを含み、前記組換え微生物は、
ａ）親微生物と比較して、発酵経路の律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、少なくとも１つの酵素、もしくはその機能的に同等な変異体の活性の増加、または
ｂ）親微生物と比較して、発酵経路の律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、少なくとも１つの補因子の可用性の増加、
のうちの少なくとも１つを示すように適合される、
前記方法。
【請求項３】
親微生物と比較して、発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を産生する方法であって、前記方法は、
ａ）前記発酵経路中の律速経路反応を決定することと、
ｂ）前記律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、少なくとも１つの酵素、補因子、または両方を同定することと、
ｃ）親微生物と比較して、ｉ）（ｂ）の前記少なくとも１つの酵素、もしくはその機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）（ｂ）の前記少なくとも１つの補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換え微生物を得るために、親微生物を形質転換することと、
を含み、前記発酵経路は、ＣＯを含む基質から少なくとも１つの発酵産物を産生することが可能である、
前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載の前記方法によって産生される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物。
【請求項５】
ａ）親微生物と比較して、少なくとも１つの酵素、もしくはその機能的に同等な変異体の活性の増加、
ｂ）親微生物と比較して、少なくとも１つの補因子の可用性の増加、または
ｃ）ａ）及びｂ）の両方、
のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物であって、前記少なくとも１つの酵素または補因子は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定されている、
前記組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物。
【請求項６】
前記律速経路反応は、前記発酵経路中の２つ以上の経路反応の前記酵素活性を比較し、最低の酵素活性を有するものを選択することによって同定される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物は、
ｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、前記少なくとも１つの酵素、またはその機能的に同等な変異体を過剰発現させること、
ｉｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、少なくとも１つの外因性酵素を発現させること、または
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方、
を行うように適合される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項８】
前記微生物は、前記少なくとも１つの酵素の前記活性を増加させる、または前記少なくとも１つの補因子の前記可用性を増加させるために、酵素エンジニアリングを受けている、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項９】
前記微生物は、前記親微生物と比較して、前記発酵経路の効率性の増加を示すように適合される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１０】
前記効率性の増加は、発酵産物の前記産生速度の増加を含む、請求項９に記載の前記組換え微生物。
【請求項１１】
前記発酵産物は、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、高級アルコール、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪酸、バイオポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の前記組換え微生物。
【請求項１２】
前記律速経路反応は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、エタノール、または２，３−ブタンジオール発酵経路中に存在する、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ  １．２．１．１０）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．７．５）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）、アセテートキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの酵素は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ピルビン酸シンターゼ）（ＥＣ  １．２．７．１）、ピルビン酸：ギ酸リアーゼ（ＥＣ  ２．３．１．５４）、アセト乳酸シンターゼ（ＥＣ  ２．２．１．６）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．５）、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４）、一級：二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１５】
前記微生物は、前記律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、前記少なくとも１つの酵素もしくは補因子の前記生合成に関与する、外因性核酸を発現させる、または内因性核酸を過剰発現させるように適合される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１６】
前記組換え微生物は、前記少なくとも１つの補因子の可用性の増加を示すように適合される、請求項５に記載の前記組換え微生物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの補因子は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）である、請求項１６に記載の前記組換え微生物。
【請求項１８】
前記微生物は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ  ３．５．４．１６）、アルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２５）、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（２．５．１．１５）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．１５）、ジヒドロ葉酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１２）、ホリルポリグルタミン酸シンターゼ（６．３．２．１７）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．３）、チミジル酸シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．４５）、またはジヒドロモナプテリンレダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．−）のうちの少なくとも１つの発現の増加を示す、請求項１７に記載の前記組換え微生物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの補因子は、コバラミン（Ｂ１２）である、請求項１６に記載の前記組換え微生物。
【請求項２０】
前記組換え微生物は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．３７）、５−アミノレブリン酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４３）、アデノシルコビンアミドキナーゼ／アデノシルコビンアミド−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１５６／２．７．７．６２）、アデノシルコビンアミド−ＧＤＰリバゾールトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．８．２６）、アデノシルコビンアミド−リン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．１．１０）、アデノシルコビリン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．１０）、α−リバゾールホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．７３）、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．５．１．１７）、コビリン酸（ＩＩ）−ａ，ｃ−ジアミドレダクターゼ（ＥＣ  １．１６．８．１）、コバルト−プレコリン５Ａヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．７．１．１２）、コバルト−プレコリン−５Ｂ（Ｃ１）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９５）、コバルト−プレコリン−７（Ｃ１５）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９６）、コバルトキレターゼＣｏｂＮ（ＥＣ  ６．６．１．２）、コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．９／６．３．５．１１）、フェリチン（ＥＣ  １．１６．３．１）、グルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）、グルタミル−ｔＲＮＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．７０）、グルタミル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＥＣ  ６．１．１．１７）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．６１）、ニコチン酸−ヌクレオチド−ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．２１）、酸素非依存型コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．９９．２２）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．１．２４）、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ／シロヒドロクロリンフェロキラターゼ（ＥＣ  １．３．１．７６／４．９９．１．４）、プレコリン−２／コバルト−因子−２  Ｃ２０−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３０／２．１．１．１５１）、プレコリン−３Ｂシンターゼ（ＥＣ  １．１４．１３．８３）、プレコリン−３Ｂ  Ｃ１７−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３１）、プレコリン−４  Ｃ１１−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３３）、プレコリン−６Ｘレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．５４）、プレコリン−６Ｙ  Ｃ５，１５−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３２）、プレコリン−８Ｗデカルボキシラーゼ（ＥＣ  １．−．−．−）、プレコリン−８Ｘメチルムターゼ（ＥＣ  ５．４．１．２）、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ＥＣ  ４．９９．１．３）、トレオニン−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．８１）、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３７）、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ／シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．１０７／  ４．２．１．７５）のうちの少なくとも１つの発現の増加を示す、請求項１９に記載の前記組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年６月５日出願の仮出願第６１／８３１，５９１号からの優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、酵素反応を最適化することによって、発酵経路を通る流束を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、発酵経路中の反応ボトルネックを同定し、対処することに関する。
【背景技術】
【０００３】
酢酸生成微生物は、例えば、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を含む基質の発酵によって、燃料及び他の化学物質（例えば、エタノール、ブタノール、またはブタンジオール）の産生に有用であることが既知である。
【０００４】
生成物濃度及び基質利用を改善するためのこれまでの努力は、菌株選択、発酵条件及びパラメータの最適化、ならびに培地処方またはプロセス条件の最適化に焦点を合わせきた（Ａｂｕｂａｃｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかしながら、天然生物の代謝は、高い収率、速度、及び力価の商業的目的を達成するように進化しなかった（Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０１１）。生物中のある特定の反応速度が、プロセス条件または菌株選択の最適化によって増加され得るが、典型的には、影響を受けず、律速である反応がいくつかある。
【０００５】
この１０年間、ゲノムスケールの代謝系の再構築を調査するために、多くのコンピュータ内での予測ツールが開発されてきた。これらの制約ベースのモデルは、代謝ネットワークを通る流束を研究するために、全ての考えられる正味流束分布（実行可能な流束空間）が、観察された細胞入力及び出力測定（外部流束）によって、かつ質量平衡等式及び熱力学方程式によって制約される、化学量論的アプローチを使用する。流束均衡解析（ＦＢＡ）は、ある特定の目的（通常、成長の最大化）を最適化する、代謝流束分布を同定するために、この解空間を調査する。流束均衡解析は、系中の酵素動態パラメータ及び代謝産物の濃度に関して、ほとんど情報を必要としない。しかしながら、そのようなアプローチの１つの制限は、律速反応（ボトルネック）を同定することができないことである。
【０００６】
発酵反応の効率性を増加させる方法を提供すること、または少なくとも、有用な選択を一般に提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、発酵産物を産生する方法を提供し、本方法は、少なくとも、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定するステップと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定するステップと、
ｃ）発酵産物を産生するために、親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させるステップと、
を含む。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、発酵経路を通る流束を増加させる方法を提供し、本方法は、少なくとも、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定するステップと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定するステップと、
ｃ）親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させるステップと、
を含む。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、親微生物と比較して、発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を産生する方法を提供し、本方法は、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定することと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定することと、
ｃ）親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換え微生物を得るために、親微生物を形質転換することと、
を含み、発酵経路は、ＣＯを含む基質から１つ以上の発酵産物を産生することが可能である。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、発酵産物を産生する方法を提供し、本方法は、発酵産物を産生するために、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させることを含み、本組換え微生物は、
ｉ）親微生物と比較して、発酵経路の律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、または
ｉｉ）親微生物と比較して、発酵経路の律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、１つ以上の補因子の可用性の増加、
のうちの少なくとも１つを示すように適合される。
【００１１】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、本組換え微生物は、
ｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体を過剰発現させること、または
ｉｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、１つ以上の外因性酵素を発現させること、または
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方、
を行うように適合される。
【００１２】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、本組換え微生物は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定される、酵素の活性を増加させる、または１つ以上の補因子の可用性を増加させるために、酵素エンジニアリングを受けている。特定の実施形態では、酵素エンジニアリングの方法は、指向進化、知識型設計、ランダム変異誘発法、遺伝子シャフリング、コドン最適化、部位特異的ライブラリの使用、及び部位評価ライブラリの使用からなる群から選択される。
【００１３】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、本組換え微生物は、親微生物と比較して、発酵経路の効率性の増加を示すように適合される。好ましくは、効率性の増加は、発酵産物の産生速度の増加を含む。
【００１４】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、律速経路反応は、発酵経路を構成する２つ以上の経路反応の酵素活性の解析によって決定される。
【００１５】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、律速経路反応は、最低の酵素活性を有する経路反応である。
【００１６】
第１、第３、または第４の態様の特定の実施形態において、１つ以上の発酵産物は、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、高級アルコール、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪酸、またはバイオポリマーのうちの少なくとも１つである。
【００１７】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、発酵経路は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、エタノール、または２，３−ブタンジオール発酵経路である。
【００１８】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、１つ以上の酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ  １．２．１．１０）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．７．５）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）、アセテートキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される。好ましくは、本実施形態の微生物は、エタノールの産生をもたらす、発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される。
【００１９】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、１つ以上の酵素は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ピルビン酸シンターゼ）（ＥＣ  １．２．７．１）、ピルビン酸：ギ酸リアーゼ（ＥＣ  ２．３．１．５４）、アセト乳酸シンターゼ（ＥＣ  ２．２．１．６）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．５）、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４）、一級：二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される。好ましくは、本実施形態の微生物は、２，３−ブタンジオールの産生をもたらす、発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される。
【００２０】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、本組換え微生物は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、酵素もしくは補因子の生合成に関与する、外因性核酸を発現させる、または内因性核酸を過剰発現させるように適合される。特定の実施形態では、内因性または外因性核酸は、上記の酵素から選択される酵素をコードする。
【００２１】
前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、本組換え微生物は、１つ以上の補因子の可用性の増加を示すように適合される。可用性の増加は、内因性核酸の変化した発現または外因性核酸の発現の結果として生じる可能性があり、内因性または外因性核酸は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、補因子の生合成に関与する。
【００２２】
特定の実施形態では、補因子は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）を含む。特定の実施形態では、本組換え微生物は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ  ３．５．４．１６）、アルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２５）、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（２．５．１．１５）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．１５）、ジヒドロ葉酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１２）、ホリルポリグルタミン酸シンターゼ（６．３．２．１７）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．３）、チミジル酸シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．４５）、またはジヒドロモナプテリンレダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．−）のうちの少なくとも１つの発現の増加を示す。
【００２３】
特定の実施形態では、補因子は、コバラミン（Ｂ１２）を含む。特定の実施形態では、本組換え微生物は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．３７）、５−アミノレブリン酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４３）、アデノシルコビンアミドキナーゼ／アデノシルコビンアミド−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１５６／２．７．７．６２）、アデノシルコビンアミド−ＧＤＰリバゾールトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．８．２６）、アデノシルコビンアミド−リン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．１．１０）、アデノシルコビリン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．１０）、α−リバゾールホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．７３）、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．５．１．１７）、コビリン酸（ＩＩ）−ａ，ｃ−ジアミドレダクターゼ（ＥＣ  １．１６．８．１）、コバルト−プレコリン５Ａヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．７．１．１２）、コバルト−プレコリン−５Ｂ（Ｃ１）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９５）、コバルト−プレコリン−７（Ｃ１５）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９６）、コバルトキレターゼＣｏｂＮ（ＥＣ  ６．６．１．２）、コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．９／６．３．５．１１）、フェリチン（ＥＣ  １．１６．３．１）、グルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）、グルタミル−ｔＲＮＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．７０）、グルタミル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＥＣ  ６．１．１．１７）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．６１）、ニコチン酸−ヌクレオチド−−ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．２１）、酸素非依存型コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．９９．２２）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．１．２４）、プレコリン−２  デヒドロゲナーゼ／シロヒドロクロリンフェロキラターゼ（ＥＣ  １．３．１．７６／４．９９．１．４）、プレコリン−２／コバルト−因子−２  Ｃ２０−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３０／２．１．１．１５１）、プレコリン−３Ｂシンターゼ（ＥＣ  １．１４．１３．８３）、プレコリン−３Ｂ  Ｃ１７−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３１）、プレコリン−４  Ｃ１１−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３３）、プレコリン−６Ｘレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．５４）、プレコリン−６Ｙ  Ｃ５，１５−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３２）、プレコリン−８Ｗデカルボキシラーゼ（ＥＣ  １．−．−．−）、プレコリン−８Ｘメチルムターゼ（ＥＣ  ５．４．１．２）、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ＥＣ  ４．９９．１．３）、トレオニン−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．８１）、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３７）、またはウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ／シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．１０７／４．２．１．７５）のうちの少なくとも��つの発現の増加を示す。
【００２４】
第５の態様において、本発明は、第３の態様の方法によって産生される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を提供する。
【００２５】
第６の態様において、本発明は、
ａ）親微生物と比較して、１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、
ｂ）親微生物と比較して、１つ以上の補因子の可用性の増加、または
ｃ）ａ）及びｂ）の両方、
のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を提供し、酵素または補因子は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与すると同定されている。
【００２６】
第７の態様において、本発明は、反応経路を通る流束を増加させるために、第５または第６の態様に従った微生物の使用を提供する。
【００２７】
第８の態様において、本発明は、発酵産物を産生する方法を提供し、本方法は、少なくとも、
ａ）Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、エタノール、または２，３−ブタンジオール発酵経路中の律速経路反応を決定するステップと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定するステップと、
ｃ）発酵産物を産生するために、親微生物と比較して、ｂ）の１つ以上の酵素または補因子をコードする、遺伝子またはその機能的に同等な変異体を発現または過剰発現させるように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させるステップと、
を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、第８の態様の酵素は、ＡＯＲ１であり、発酵産物は、エタノールである。
【００２９】
本発明はまた、部品、要素、または特徴のうちの２つ以上のいずれかまたは全ての組み合わせで、個々または集合的に、本出願の明細書において言及されるか、または示される、該部品、要素、または特徴に在すると概して言われてもよく、特定の整数が本明細書において言及され、それらが、本発明が関連する技術分野において既知の同等物を有する場合、そのような既知の同等物は、あたかも個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれると解釈される。
【００３０】
ここで、本発明の実施形態が、添付の図面を参照して、ほんの一例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】律速経路反応の同定を可能にするアセチル−ＣｏＡを介した、エタノール形成のための測定された酵素活性及びカルボキシドトロフ細胞を通る流束を詳述した、エタノール生合成経路の流束マップを示す。矢印の厚さは、特定の経路反応の活性に比例する。
【図２】律速経路反応の同定を可能にするピルビン酸を介した、２，３−ブタンジオール形成のための測定された酵素活性及びカルボキシドトロフ細胞を通る流束を詳述した、流束マップを示す。
【図３】発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１ＡＯＲ１の挿入及びプロモータの配列整合を示し、ＡＯＲ１の２つの内部ＮｄｅＩ部位がうまく変化され、それらが突然変異を含んでいなかったことを確実にする。
【図４】組換え微生物を産生するための成功した形質転換を示す、プラスミド対照及びＡＯＲ１過剰発現菌株の両方における予期された５７６ｂｐの産物の存在を示す。
【図５】ｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１形質転換体からのレスキュープラスミドのＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ消化後の、予期された断片の存在を示す。
【図６】プラスミド対照と比較して、ＡＯＲ１の過剰発現（×印、１０日目の上の線）が、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の独立栄養成長を改善することを示す。
【図７】図７Ａ：ＡＯＲ１過剰発現を有するＣ．オートエタノゲナム組換え菌株（正方形、１０日目の上の線）に対する、Ｃ．オートエタノゲナム野生型菌株中のエタノール産生（×印、１０日目の下の線）を示す。    図７Ｂ：ＡＯＲ１過剰発現を有するＣ．オートエタノゲナム組換え菌株（正方形、１０日目の上の線）に対する、Ｃ．オートエタノゲナム野生型菌株中のアセテート産生（×印、１０日目の下の線）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本明細書で言及されるように、「発酵経路」は、基質、好ましくはガス状基質が発酵産物に変換される、生化学反応（本明細書において「経路反応」と称される）のカスケードである。経路反応は、典型的には酵素を伴い、補因子を伴う場合があり、それにより、酵素または補因子は、経路反応速度を促進または増加させる。
【００３３】
本明細書で言及されるように、「律速経路反応」は、発酵経路の一部である反応であり、経路全体を通る流束が減速され、律速経路反応の反応速度によって決定される、経路中の「ボトルネック」である。全ての他の要因が一定である場合、律速経路反応の反応速度を増加させることは、発酵経路全体、及び潜在的には１つ以上の発酵産物の産生の速度に対して波及効果を有する。「ａ」または「ｔｈｅ」（単数）の律速経路反応が本明細書において言及される場合、複数（例えば、２つ以上）の律速経路反応もまた、本発明の範囲内に含まれ、そのような複数の反応もまた、本明細書に記載される方法に従って決定または変更され得ることを理解されたい。
【００３４】
本明細書で言及されるように、反応「流束」は、発酵経路中の１つ以上の反応を通した代謝産物の流量を指す。個々の経路反応を通る流束は、上限及び下限を有し、したがって、流束は、酵素活性に影響を及ぼす条件または要因の調節によって変更され得る。１つの経路反応を通る流束の調節は、発酵経路の全流束を変化させてもよい。流束は、当業者に既知の方法に従って測定されてもよい。一例として、流束は、流束均衡解析（ＦＢＡ）（Ｇｉａｎｃｈａｎｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を使用して測定されてもよい。特定の実施形態では、流束は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％増加する。経路を通る流束はまた、代謝産物及び生成物のレベル（メタボロミクス）（Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ならびに／またはＣ１３としての標識化実験（フラクソミクス）（Ｎｉｉｔｔｙｌａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって測定されてもよい。
【００３５】
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド」（ＮＡＤＨ）は、ＮＡＤ＋（酸化形）、ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋（還元形）、またはＮＡＤ＋及びＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋の両方のレドックス対のいずれかを指す。
【００３６】
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」（ＮＡＤＰＨ）は、ＮＡＤＰ＋（酸化形）、ＮＡＤＰＨ  ＋  Ｈ＋（還元形）、またはＮＡＤＰ＋及びＮＡＤＰＨ  ＋  Ｈ＋の両方のレドックス対のいずれかを指す。
【００３７】
本明細書で言及されるように、「酵素補因子」または単純に「補因子」は、酵素の生物学的機能、したがって反応の触媒を促進するために酵素に結合する、非タンパク化合物である。補因子の限定されない例としては、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、コバラミン、テトラヒドロ葉酸、及びフェレドキシンが挙げられる。補因子の全体的な可用性の増加は、経路反応速度を増加させることができる。補因子の産生に影響を及ぼす可能性がある要因は、補因子の可用性の増加を達成するように変化され得る、補因子生合成遺伝子の発現を含む。当業者に既知の他の要因もまた、補因子の可用性の増加を達成するために使用され得る。補因子の可用性の不足は、経路反応に対する律速効果を有する可能性がある。補因子の可用性の決定のための方法は、当業者に既知となるであろう。
【００３８】
用語「〜ように適合される」は、本発明の組換え微生物の機能を説明するために、本明細書において使用されてもよく、例えば、微生物は、特定の酵素を発現させる「ように適合される」。酵素の発現と関連して使用されるとき、この用語は、酵素が連続的に発現されることを暗示せず、酵素が発現される可能性があり、そのような発現が構成的であっても、または誘導性であってもよい状況を含むことを目的とする。
【００３９】
本明細書で言及されるように、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養素及び微生物細胞を含む、培養培地である。
【００４０】
発酵経路または過程と関連して使用されるとき、用語「効率性を増加させること」、「効率性の増加」などは、発酵に影響を及ぼす微生物の成長速度の増加、上昇した生成物濃度における成長速度または生成物産生速度の増加、発酵ブロス中の発酵産物濃度の増加、消費される基質の体積当たりの、産生される発酵産物の体積の増加、発酵産物の産生速度または産生レベルの増加のうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない。効率性の増加は、親微生物を使用するときに測定される、対応する変数と比較して測定される。
【００４１】
「酵素活性」、「１つ以上の酵素の活性」、及び同様のフレーズは、個々の酵素の活性、酵素の量、または酵素の可用性が挙げられるがこれらに限定されない、酵素活性を指すと広く解釈されるべきである。したがって、酵素活性を「増加させること」が言及される場合、特定の反応に触媒作用を及ぼすための個々の酵素の活性の増加、酵素の量の増加、または酵素の可用性の増加を含むと解釈されるべきである。
【００４２】
フレーズ「触媒作用を及ぼすことに関与する」は、反応に直接触媒作用を及ぼす（すなわち、その速度を促進もしくは増加させる）酵素、ならびに反応に直接触媒作用を及ぼさないが、関連酵素の生物学的機能を促進する補因子を包含することを目的とする。
【００４３】
フレーズ「一酸化炭素を含む基質」及び同様の用語は、例えば、一酸化炭素が、成長及び／または発酵のための細菌の１つ以上の菌株に利用可能である、任意の基質を含むと理解されるべきである。
【００４４】
フレーズ「一酸化炭素を含むガス状基質」、ならびに同様のフレーズ及び用語は、あるレベルの一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。ある特定の実施形態では、基質は、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、及び４０体積％〜５５体積％のＣＯを含有する。特定の実施形態では、基質は、約２５体積％、または約３０体積％、または約３５体積％、または約４０体積％、または約４５体積％、または約５０体積％のＣＯ、または約５５体積％のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。
【００４５】
基質が水素を含有することは必要ではないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従った生成物形成に有害であってはならない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産生の全体的な効率性の改善をもたらす。例えば、特定の実施形態では、基質は、約２：１、または１：１、または１：２の比のＨ２：ＣＯを含んでもよい。一実施形態では、基質は、約３０体積％以下のＨ２、２０体積％以下のＨ２、約１５体積％以下のＨ２、または約１０体積％以下のＨ２を含む。他の実施形態では、基質流は、低濃度、例えば、５％未満、もしくは４％未満、もしくは３％未満、もしくは２％未満、もしくは１％未満のＨ２を含むか、または実質的に水素を含まない。基質はまた、例えば、約１体積％〜約８０体積％のＣＯ２、または１体積％〜約３０体積％のＣＯ２など、多少のＣＯ２を含有してもよい。一実施形態では、基質は、約２０体積％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態では、基質は、約１５体積％以下のＣＯ２、約１０体積％以下のＣＯ２、約５体積％以下のＣＯ２を含むか、または実質的にＣＯ２を含まない。
【００４６】
以下の記載において、本発明の実施形態が、「ＣＯを含有するガス状基質」を送達及び発酵させる観点から記載される。しかしながら、ガス状基質が代替の形態で提供されてもよいことが理解されるべきである。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体中に溶解されて提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素含有ガスで飽和され、その液体は、バイオリアクタに添加される。これは、標準的な方法を使用して達成され得る。一例として、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）が使用され得る。さらなる例として、ＣＯを含有するガス状基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。そのような代替方法は、「ＣＯを含有する基質」などの用語の使用によって包含される。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、ＣＯ含有ガス状基質は、工業オフガスまたは排ガスである。「工業排ガスまたはオフガス」は、工業的過程によって産生されるＣＯを含むガスを含み、鉄金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精製過程、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生産、及びコークス製造の結果として産生されるガスを含むと広く解釈される。さらなる例は、本明細書の別の個所に提供され得る。
【００４８】
文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、フレーズ「発酵させること」、「発酵過程」、または「発酵反応」などは、本明細書で使用される場合、過程の成長期及び生成物生合成期の両方を包含することを目的とする。本明細書においてさらに記載されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の成長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含んでもよい。したがって、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらのリアクタのうちの片方または両方への添加を含むと理解されるべきである。
【００４９】
用語「バイオリアクタ」は、１つ以上の容器及び／もしくは塔または配管からなる、発酵デバイスを含み、それは、連続撹拌槽リアクタ（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクタ（ＩＣＲ）、トリクルベッドリアクタ（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他のデバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の成長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含んでもよい。したがって、バイオリアクタまたは発酵反応への基質の添加を言及するとき、必要に応じて、これらのリアクタのうちの片方または両方への添加を含むと理解されるべきである。
【００５０】
本明細書で言及されるように、「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現され、目的微生物とは異なる微生物である。
【００５１】
本明細書で言及されるように、「目的微生物」は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現され、シャトル微生物とは異なる微生物である。
【００５２】
「外因性核酸」は、それらが導入される微生物の外に由来する核酸である。外因性核酸は、それらが導入されるべき微生物（例えば、本組換え微生物が由来する親微生物中）、それらが導入されるべき生物とは異なる菌株もしくは種を含むがこれらに限定されない、任意の適切な源に由来してもよく、またはそれらは、人工的にまたは組換え技術によって作られてもよい。一実施形態では、外因性核酸は、それらが導入されるべき微生物内に自然に存在する核酸配列を表し、それらは、特定の遺伝子の発現を増加させるか、または特定の遺伝子を過剰発現させるために導入される（例えば、発現を増加させるために、配列（例えば、遺伝子）のコピー数を増加させる、または強力もしくは構成的プロモータを導入することによって）。別の実施形態では、外因性核酸は、それらが導入され、微生物内に自然に存在しない生成物の発現、または微生物に固有の遺伝子の発現の増加を可能にするべき、微生物内に自然に存在しない核酸配列を表す（例えば、プロモータなどの調節要素の導入の場合）。外因性核酸は、それが導入されるか、または染色体外状態で維持されるべき微生物のゲノムと統合するように適合されてもよい。
【００５３】
「外因性」はまた、タンパク質を指すために使用されてもよい。これは、本組換え微生物が由来する親微生物中に存在しないタンパク質を指す。
【００５４】
組換え微生物及び核酸またはタンパク質と関連して本明細書で使用される場合、用語「内因性」は、本組換え微生物が由来する親微生物中に存在する任意の核酸またはタンパク質を指す。
【００５５】
オキシドレダクターゼ（またはデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ）は、１つの分子（還元体、電子供与体とも呼ばれる）から別の分子（酸化体、電子受容体とも呼ばれる）への電子の移動に触媒作用を及ぼす、酵素を含む。オキシドレダクターゼは、酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ１に分類される。
【００５６】
本発明が、配列が実質的に同じ機能を果たすという条件で、それらが本明細書において具体的に例示される配列とは異なる核酸を使用して、実施されてもよいことが理解されるべきである。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に対して、これは、コードされたタンパク質またはペプチドが、実質的に同じ機能を有することを意味する。プロモータ配列を表す核酸配列に対して、変異体配列は、１つ以上の遺伝子の発現を促進する能力を有する。そのような核酸は、本明細書において「機能的に同等な変異体」と称されてもよい。一例として、核酸の機能的に同等な変異体は、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、突然変異（欠失、挿入、ヌクレオチド置換など）及び／または多型を含む遺伝子などを含む。他の微生物からの相同遺伝子もまた、本明細書において具体的に例示される配列の機能的に同等な変異体の例と解釈され得る。これらは、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、Ｃ．リュングダリイなどの種における相同遺伝子を含み、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公表されている。フレーズ「機能的に同等な変異体」はまた、配列が特定の生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含むと解釈されるべきである。本明細書における核酸の「機能的に同等な変異体」は、好ましくは、同定される核酸と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有する。
【００５７】
また、本発明が、配列が本明細書において具体的に言及または例示されるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるポリペプチドを使用して、実施されてもよいことが理解されるべきである。これらの変異体は、本明細書において「機能的に同等な変異体」と称されてもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に同等な変異体は、同定されるタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、またはそれ以上のアミノ酸同一性を共有する、タンパク質またはペプチドを含み、対象となるペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。そのような変異体は、断片が、欠失が１〜５、〜１０、〜１５、〜２０、〜２５個のアミノ酸であってもよく、ポリペプチドのいずれかの末端において残基１から２５まで延在してもよく、かつ欠失が領域内の任意の長さであってもよく、または内部位置であってもよい、ポリペプチドの短縮型を含む、タンパク質またはペプチドの断片を、それらの範囲内に含む。本明細書における特定のポリペプチドの機能的に同等な変異体はまた、例えば、前段落において例示されるように、細菌の他の種における相同遺伝子によって発現されるポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「実質的に同じ機能」は、核酸またはポリペプチドが、それがその変異体である核酸またはポリペプチドの機能を実施することが可能であることを意味することを目的とする。例えば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同じ反応に触媒作用を及ぼすことが可能である。しかしながら、変異体が、それがその変異体であるポリペプチドまたは核酸と同じ活性レベルを有することを意味すると解釈されるべきではない。
【００５９】
機能的に同等な変異体が、それがその変異体である核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有するかどうかを、当業者に既知の方法を使用して評価することが可能である。しかしながら、一例として、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、またはメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼ活性を試験するためのアッセイが、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）に記載される。
【００６０】
本発明と関連して使用される場合、「過剰発現させる」、「過剰発現」、ならびに同様の用語及びフレーズは、同一条件下での親微生物のタンパク質（核酸を含む）の発現レベルと比較して、１つ以上のタンパク質の発現（それをコードする１つ以上の核酸の発現を含む）の任意の増加を含むと広く解釈されるべきである。タンパク質（または核酸）が任意の特定のレベルで発現されることを意味すると解釈されるべきではない。
【００６１】
「組換え微生物」は、親微生物と比較して、意図的な遺伝子修飾を受けている微生物である。「遺伝子修飾」は、広く解釈されるべきであり、例えば、核酸の挿入、欠失、または置換を含む。
【００６２】
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、自然に発生するもの（すなわち、野生型微生物）、またはすでに改変されているもの（すなわち、それは組換え微生物である）であってもよい。本発明の組換え微生物は、親微生物中の所望のレベルまで発現または過剰発現されなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾されてもよく、または１つ以上の補因子の可用性の増加を示すように改変されてもよい。
【００６３】
核酸「構築物」または「ベクター」という用語及び同様の用語は、細胞中に遺伝物質を導入するための媒体としての使用に好適な、任意の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を含むと広く解釈されるべきである。これらの用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド、及び人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターは、１つ以上の調節要素、複製起点、マルチクローニング部位、及び／または選択可能なマーカーを含んでもよい。１つの特定の実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによってコードされる１つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合される。核酸構築物またはベクターは、ネイキッド核酸、ならびに細胞への送達を促進するために１つ以上の薬剤と共に処方された核酸（例えば、リポソーム共役核酸、核酸が含有される生物）を含む。ベクターは、組換え微生物を産生するために、核酸のクローニングまたは発現及び微生物の形質転換のために使用されてもよい。
【００６４】
発酵経路の効率性は、経路を通る反応流束を増加させることによって増加され得る。流束の増加は、発酵に影響を及ぼす微生物の成長速度の増加、上昇した生成物濃度における成長速度または生成物産生速度の増加、発酵ブロス中の発酵産物濃度の増加、消費される基質の体積当たりの、産生される発酵産物の体積の増加、発酵産物の産生速度または産生レベルの増加のうちの１つ以上をもたらす。好ましくは、効率性の増加は、発酵産物産生速度の増加をもたらす。
【００６５】
本発明者らは、特定の経路反応が全経路を通る流束に影響を及ぼす、発酵経路中の律速経路反応を同定するための方法を実証している。場合によっては、これらの律速経路反応は、最大限に機能しておらず、それらの個々の速度を増加させることは望ましくない場合がある。本明細書に記載される本発明は、発酵経路中の律速経路反応（すなわち、ボトルネック）が同定されること、ならびに律速経路反応に関与する酵素の活性及び／または補因子の可用性を増加させるために採用される戦略を可能にする。したがって、本発明は、経路を通る反応流束に対する同時効果を有するために、ボトルネックを同定すること、及び律速経路反応速度を調節することに寄与する。組換えカルボキシドトロフ微生物を使用して、律速経路反応が同定及び対処されたのは、これが初めてである。
【００６６】
律速反応（ボトルネック）を同定するための一方法は、基質から生成物への発酵経路に関与する全反応に対する酵素活性を測定することである。これは、最低速度での反応を同定するために、プロセス条件下で成長する細胞中の反応の酵素活性を解析することによって行われ得る。次いで、これらは、律速にならないように調節され、したがって、系全体を通る流束を増加させ得る。この種類の経路解析及びボトルネック除去は、クロストリジウム種において一度も実施されていなかった。
【００６７】
本明細書に記載される本方法及び組換え微生物は、さらなる生化学的経路が調査され、所望の発酵産物が産生されることを可能にする。本方法は、親微生物中の生成物収率が、実行可能な目標になる生成物収率を欠いた可能性がある、または収率が低すぎて検出不可能であった経路に対して特定の有用性を有する。
【００６８】
本発明は、発酵産物を産生する方法を提供し、本方法は、少なくとも、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定するステップと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定するステップと、
ｃ）発酵産物を産生するために、親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させるステップと、
を含む。
【００６９】
本発明はまた、発酵経路を通る流束を増加させる方法を提供し、本方法は、少なくとも、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定するステップと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定するステップと、
ｃ）親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物で、ＣＯ含有基質を発酵させるステップと、
を含む。
【００７０】
本発明者らは、発酵経路に関与する酵素の活性を解析し、一部の経路反応が、同一経路中の他の反応よりも実質的に低い酵素活性を示すことがわかった。これは、経路反応が発酵経路を通る全流束を制限していることを示し、律速経路反応を同定するための方法を提供する。
【００７１】
酵素活性は、当業者に既知の方法によって測定されてもよい。特定の実施形態では、酵素活性は、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）に記載される方法によって測定され、実施例１で言及される。
【００７２】
酵素活性の解析に適している発酵経路の例としては、エタノール、２，３−ブタンジオール、またはアセチル−ＣｏＡ及びピルビン酸などのそれらの前駆体を産生するための発酵経路である、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、ならびに発酵経路中に必要とされ得る補因子、テトラヒドロ葉酸及びコバラミン（Ｂ１２）に対する生合成経路が挙げられる。
【００７３】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、図１及び２に記載されるように、酵素によって触媒作用が及ぼされる多くの反応からなる。所望の発酵産物の産生もたらす、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の後に続くステップもまた、発酵経路の一部として見なされる。
【００７４】
特定の実施形態では、発酵経路は、エタノール、ブタノール、アセトン、イソプロパノール、イソブタノール、２，３−ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪酸、及びバイオポリマーからなる群から選択される、発酵産物の産生をもたらす。
【００７５】
一実施形態では、経路反応のうちの１つ以上が発酵経路を通る流束速度を制限しているかどうかを決定するために、少なくとも２つ以上の個々の経路反応に触媒作用を及ぼす酵素の酵素活性が比較される。比較して、１つ以上の酵素が同一反応経路中の他の酵素よりも少ない活性を示すことがわかった場合、これは、反応が最大限に機能していないことを示す。特定の実施形態では、酵素活性は、経路中の他の酵素の活性よりも５％、１０％、または２０％少ない。特定の実施形態では、活性は、６９％少ない。別の実施形態では、活性は、８６％少ない。別の実施形態では、活性は、９０％少ないか、または活性の差は、９０％よりも大きい。
【００７６】
したがって、特定の実施形態では、律速経路反応は、発酵経路を構成する２つ以上の経路反応の酵素活性の解析、次いで、より低い／最低の活性を有する酵素を律速経路反応と指定することによって決定される。
【００７７】
酵素活性の不足は、反応に触媒作用を及ぼす遊離酵素の不足、競合基質による酵素の阻害もしくは不活性化、反応を促進するための補因子の不足、または酵素基質の不足を含む、多くの要因によって引き起こされる可能性がある。
【００７８】
本発明はまた、律速経路反応の問題に対処する方法を提供する。律速経路反応中の酵素活性の不足は、律速経路反応に関与する、ｉ）酵素もしくはその機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）補因子の可用性のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換えクロストリジウム微生物を提供することによって対処され得る。これは、経路を通る流束の全体的な増加をもたらす。
【００７９】
したがって、本発明は、親微生物と比較して、発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される、組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を産生する方法を提供し、本方法は、
ａ）発酵経路中の律速経路反応を決定することと、
ｂ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の酵素、補因子、または両方を同定することと、
ｃ）親微生物と比較して、ｉ）ｂ）の１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体の活性の増加、またはｉｉ）ｂ）の１つ以上の補因子の可用性の増加のうちの少なくとも１つを示すように適合される、組換え微生物を得るために、親微生物を形質転換することと、
を含み、発酵経路は、ＣＯを含む基質から１つ以上の発酵産物を産生することが可能である。
【００８０】
本発明の特定の実施形態では、本組換え微生物は、
ｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する１つ以上の酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体を過剰発現させること、
ｉｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の外因性酵素、もしくはそのうちのいずれか１つ以上の機能的に同等な変異体を発現させること、または
ｉｉｉ）律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する、１つ以上の補因子の可用性の増加を有すること、
のうちの少なくとも１つを行うように適合される。
【００８１】
このようにして、本発明者らは、発酵経路を通る流束を増加させ、最終的に発酵の効率性を増加させる方法で、ｉ）低い酵素活性もしくは酵素活性の不足、またはｉｉ）補因子の低い可用性もしくは可用性の不足のうちの少なくとも１つを克服するための方法を実証している。
【００８２】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上の酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ  １．２．１．１０）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．７．５）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）、アセテートキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される。好ましくは、本実施形態の微生物は、発酵経路を通る流束の増加を示し、エタノールの産生をもたらすように適合される。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上の酵素酵素は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ピルビン酸シンターゼ）（ＥＣ  １．２．７．１）、ピルビン酸：ギ酸リアーゼ（ＥＣ  ２．３．１．５４）、アセト乳酸シンターゼ（ＥＣ  ２．２．１．６）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．５）、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４）、一級：二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２）、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１７）、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ（ＥＣ：６．３．４．３）、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ（ＥＣ  １．１，１．５８）、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６９）、ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．９９．２）、及びヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１２．７．２）からなる群から選択される。好ましくは、本実施形態の微生物は、発酵経路を通る流束の増加を示し、２，３−ブタンジオールの産生をもたらすように適合される。
【００８４】
本発明の特定の実施形態では、本組換え微生物は、外因性核酸を発現させるか、または内因性核酸を過剰発現させるように適合され、該核酸は、酵素もしくはその機能的に同等な変異体をコードするか、補因子の生合成に関与し、該酵素または補因子は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことに関与する。
【００８５】
本発明に有用な組換え微生物を産生するための方法は、以下に記載される。
【００８６】
上記の酵素をコードする核酸は、当業者に既知であり、ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧ、ＵｎｉＰｒｏｔなどの遺伝子情報データベースを使用して容易に同定され得る。
【００８７】
本発明者らはまた、驚くべきことに、補因子可用性を増加することが、発酵経路を通る全流束に対して効果を有することがわかった。これらの場合、この発酵経路内の発酵経路または反応は、ある特定の補因子の可用性に依存するか、またはそれによって制限され得る。反応での使用が可能である補因子プールは、この補因子の生合成経路に関与するタンパク質及び遺伝子の発現を変化させることによって増加され得る。補因子可用性の増加の結果として、この補因子に依存した反応は、もはや制限されない。
【００８８】
特定の実施形態では、補因子は、テトラヒドロ葉酸を含む。上記の通り、そのような補因子の生合成に関与する酵素は、好ましくは、酵素をコードする対応遺伝子を発現または過剰発現させることによって、過剰発現されてもよい。テトラヒドロ葉酸の生合成に関与する酵素は、以下に詳述される。したがって、特定の実施形態では、本組換え微生物は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ  ３．５．４．１６）、アルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２５）、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンジホスホキナーゼ（ＥＣ  ２．７．６．３）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（２．５．１．１５）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．１５）、ジヒドロ葉酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．２．１２）、ホリルポリグルタミン酸シンターゼ（６．３．２．１７）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．３）、チミジル酸シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．４５）、ジヒドロモナプテリンレダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．−）の発現の増加を示す。全てがテトラヒドロ葉酸に関与する。
【００８９】
特定の実施形態では、補因子は、コバラミン（Ｂ１２）を含む。コバラミンの生合成に関与する酵素が以下に詳述される。したがって、特定の実施形態では、本組換え微生物は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．３７）、５−アミノレブリン酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４３）、アデノシルコビンアミドキナーゼ／アデノシルコビンアミド−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１５６／２．７．７．６２）、アデノシルコビンアミド−ＧＤＰリバゾールトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．８．２６）、アデノシルコビンアミド−リン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．１．１０）、アデノシルコビリン酸シンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．１０）、α−リバゾールホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．７３）、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．５．１．１７）、コビリン酸（ＩＩ）−ａ，ｃ−ジアミドレダクターゼ（ＥＣ  １．１６．８．１）、コバルト−プレコリン５Ａヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．７．１．１２）、コバルト−プレコリン−５Ｂ（Ｃ１）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９５）、コバルト−プレコリン−７（Ｃ１５）−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１９６）、コバルトキレターゼＣｏｂＮ（ＥＣ  ６．６．１．２）、コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ（ＥＣ  ６．３．５．９／６．３．５．１１）、フェリチン（ＥＣ  １．１６．３．１）、グルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）、グルタミル−ｔＲＮＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．７０）、グルタミル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＥＣ  ６．１．１．１７）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．６１）、ニコチン酸−ヌクレオチド−ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．２１）、酸素非依存型コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．９９．２２）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（ＥＣ  ４．２．１．２４）、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ／シロヒドロクロリンフェロキラターゼ（ＥＣ  １．３．１．７６／４．９９．１．４）、プレコリン−２／コバルト−因子−２Ｃ２０−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３０／２．１．１．１５１）、プレコリン−３Ｂシンターゼ（ＥＣ  １．１４．１３．８３）、プレコリン−３Ｂ  Ｃ１７−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３１）、プレコリン−４  Ｃ１１−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３３）、プレコリン−６Ｘレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．５４）、プレコリン−６Ｙ  Ｃ５，１５−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．１３２）、プレコリン−８Ｗデカルボキシラーゼ（ＥＣ  １．−．−．−）、プレコリン−８Ｘメチルムターゼ（ＥＣ  ５．４．１．２）、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ＥＣ  ４．９９．１．３）、トレオニン−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．８１）、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３７）、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ／シンターゼ（ＥＣ  ２．１．１．１０７／４．２．１．７５）の発現の増加を示す。
【００９０】
上記のタンパク質をコードする生合成遺伝子は、当業者に既知であり、遺伝子情報データベースを使用して容易に同定され得る。
【００９１】
理論によって束縛されることを望まないが、補因子の可用性の増加は、該補因子の生合成経路に関与する酵素または遺伝子の過剰発現を通して達成されると考えられる。結果として、この補因子に依存する反応は、もはや制限的ではない。
【００９２】
より高い活性を達成するための酵素の修飾
本発明の特定の実施形態では、本組換え微生物は、律速経路反応に触媒作用を及ぼすことが可能な酵素の酵素活性を増加させるために、酵素エンジニアリングを受けている。酵素エンジニアリングは、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、及び置換を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の任意の遺伝子修飾を含んでもよい。酵素活性の増加を達成するための好適な方法は、当業者に既知であるが、一例として、酵素エンジニアリング方法は、指向進化、知識型設計、ランダム変異誘発法、遺伝子シャフリング、コドン最適化、及び部位特異的ライブラリの使用、及び部位評価ライブラリの使用からなる群から選択される。
【００９３】
組換え微生物
本発明は、親微生物と比較して、本組換え微生物が発酵経路を通る流束の増加を示すように適合される、上記の方法によって産生される組換えカルボキシドトロフクロストリジウム微生物を、さらなる態様において提供する。
【００９４】
特定の実施形態では、酵素の発現の増加及び／または補因子の可用性の増加は、該酵素をコードする、または該補因子の生合成に関与する、核酸の発現及び／または過剰発現による影響を受ける。
【００９５】
さらなる態様では、本発明は、反応経路を通る流束を増加させるための、本発明の微生物の使用を提供する。
【００９６】
本発明の１つの特定の実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナムを含む、カルボキシドトロフクロストリジウムからなる群から選択される。
【００９７】
一実施形態では、微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、及び「Ｃ．ラグスダレイ」の種、ならびに関連した分離株を含む、カルボキシドトロフクロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際特許出願第２００９／０６４２００号）、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ  ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または「Ｃ．ラグスダレイＰ１１Ｔ「（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）（国際特許出願第２００８／０２８０５５号）、及び「Ｃ．コスカチイ」（米国特許第２０１１／０２２９９４７号）または「クロストリジウム種ＭＴ３５１」（Ｔｙｕｒｉｎ  ＆  Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ，２０１２）などの関連した分離株、及びＣ．リュングダリイＯＴＡ−１などのそれらの変異株（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）の菌株を含むがこれらに限定されない。
【００９８】
これらの菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子レベルで少なくとも９９％の同一性を有するが、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合及びＤＮＡ指紋実験によって決定される通り異なる種である、クロストリジウムｌ  ｒＲＮＡクラスターＩ（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）内のサブクラスターを形成する（国際特許出願第２００８／０２８０５５号、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）。
【００９９】
このクラスターの菌株は、同様の遺伝子型及び表現型の両方を有する、共通の特徴によって定義され、それらは全て、エネルギー保存及び発酵代謝の同じ形式を共有する。このクラスターの菌株は、シトクロムを欠き、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。
【０１００】
このクラスターの全ての菌株は、約４．２ＭＢｐのゲノムサイズ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、及び約３２モル％ｍｏｌのＧＣ組成物（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）（国際特許出願第２００８／０２８０５５号、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、及びＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素をコードする保存された必須の鍵遺伝子オペロン（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，２０１１）を有する。ガス取り込みに関与する、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の機構および数は、核酸およびアミノ酸配列の違いにかかわらず、全種において同じであることがわかっている（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１０１】
菌株は全て、同様の形態及びサイズを有し（対数成長細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍの間である）、中温性（３０〜３７℃の間の最適成長温度）かつ厳密に嫌気性である（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）（国際特許出願第号２００８／０２８０５５）。さらに、それらは全て、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適な初期ｐＨは５．５〜６）、同様の成長速度を有するＣＯ含有ガスに対する強い独立栄養成長、ならびに主な発酵最終産物としてのエタノール及び酢酸を有する代謝プロファイル、ならびにある特定の条件下で形成される少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸など、同じ主要な系統発生形質を共有する（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（国際特許出願は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用が異なる）。一部の種が、ある特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して要求性であることがわかった一方で、要求性ではない種もあった。カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元は、これらの生物の範囲内で示されていない（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１０２】
したがって、記載される形質は、Ｃ．オートエタノゲナムまたはＣ．リュングダリイのような１つの生物に特異的ではなく、むしろカルボキシドトロフ由来のエタノール合成クロストリジウムに対する一般的な形質である。したがって、本発明は、これらの菌株にわたって機能することが予想され得るが、性能には差があり得る。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される。一実施形態では、その群はまた、クロストリジウムコスカチイも含む。１つの特定の実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【０１０４】
一実施形態では、本発明は、酵素を発現させるか、または補因子の可用性を増加させるように適合される、組換え微生物を提供し、酵素発現または補因子可用性は、核酸の発現に依存する。本組換え微生物はまた、酵素の発現及び／または補因子の可用性の増加もたらすように適合される、核酸構築物またはベクターを発現させてもよい。１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターであるが、クローニングに使用されるような他の構築物及びベクターが本発明によって包含される。１つの特定の実施形態では、発現構築物またはベクターは、プラスミドである。
【０１０５】
本発明の発現構築物／ベクターは、必要に応じて、プロモータに加えて任意の数の調節要素、ならびにさらなるタンパク質の発現に好適な追加の遺伝子を含有し得ることが理解されるであろう。一実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つのプロモータを含む。別の実施形態では、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモータを含む。１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターは、各遺伝子が発現されるための１つのプロモータを含む。一実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つ以上のリボソーム結合部位、好ましくは、各遺伝子が発現されるためのリボソーム結合部位を含む。
【０１０６】
本明細書に記載される核酸配列及び構築物／ベクター配列が、リボソーム結合部位及び／または制限部位に必要とされるような標準的なリンカーヌクレオチドを含有してもよいことが、当業者によって理解されるであろう。そのようなリンカー配列は、必要とされると解釈されるべきではなく、定義される配列に制限を与えない。
【０１０７】
本発明の発現構築物／ベクターを含む、核酸及び核酸構築物は、当該技術分野において標準的な多くの技術を使用して構築されてもよい。例えば、化学合成または組換え技術が使用されてもよい。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載される。本質的に、個々の遺伝子及び調節要素は、遺伝子が、所望のタンパク質を形成するために発現され得るように、互いに作動可能に結合される。本発明で使用するための好適なベクターは、当業者によって理解されるであろう。しかしながら、一例として、以下のベクターが好適であり得る：以下の実施例の節で例示されるｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、及びプラスミド。
【０１０８】
本明細書に記載される核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む、任意の適切な形態であってもよいことが理解されるべきである。
【０１０９】
組換え微生物を産生する方法
親微生物の遺伝子修飾の方法としては、本明細書に記載されるような異種遺伝子発現、ゲノム挿入もしくは欠失、遺伝子発現の変化もしくは遺伝子の不活性化、または酵素エンジニアリング方法などの分子法が挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）、Ｐｌｅｉｓｓ（２０１１）、Ｐａｒｋ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｒｏｃｈａｎ，Ｊ．Ｒ．（２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  １４２００７６５８２）に記載される。
【０１１０】
１つ以上の外因性核酸が、ネイキッド核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換過程を促進するために１つ以上の薬剤（例えば、リポソーム共役核酸、核酸が含有される生物）と共に処方されてもよい。１つ以上の核酸は、適切な場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態において、制限阻害剤が使用されてもよく、例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ＭｏｌｅＣ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４，４１２）を参照されたい。
【０１１１】
本発明の微生物は、組換え微生物を産生するための当該技術分野において既知の多くの技術を使用して、親微生物及び１つ以上の外因性核酸から調製されてもよい。ほんの一例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール介在形質転換、化学的もしくは自然な能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または共役によって達成され得る。好適な形質転換技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，１９８９に記載される。
【０１１２】
エレクトロポレーションは、Ｃ．リュングダリイ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｐｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１３０８７−９２；（Ｌｅａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；国際特許出願第２０１２／０５３９０５号）、Ｃ．オートエタノゲナム（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；国際特許出願第２０１２／０５３９０５号）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ｓｔｒａｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１０３３−３７）、またはムーレラ・サーモアセチカ（Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）など、いくつかのカルボキシドトロフアセトゲンに関して記載され、Ｃ．アセトブチリカム（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１９０−１９５）、Ｃ．セルロリティカム（Ｊｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６：３０７１−３０８０）、またはＣ．サーモセラム（Ｔｙｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：８８３−８９０）などの多くのクロストリジウムで使用される、標準的な方法である。プロファージ誘発は、カルボキシドトロフアセトゲンに対して、ならびにＣ．スカトロゲネスの場合で実証されている一方で（Ｐｒａｓａｎｎａ  Ｔａｍａｒａｐｕ  Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，２０１０，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ，Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、共役は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２９：１０３−１１０）、またはＣ．アセトブイリカム（ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９−８２６）を含む、多くのクロストリジウムの選択方法として記載されており、カルボキシドトロフアセトゲンに対するものと同様の方法で使用され得る。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、形質転換される微生物中で活性である制限系により、微生物中に導入される核酸をメチル化する必要がある。これは、以下に記載されるものを含む、種々の技術を使用して行われ得る。
【０１１４】
一例として、一実施形態では、本発明の組換え微生物は、以下のステップを含む方法によって産生される。
（ｉ）本明細書に記載される核酸を含む発現構築物／ベクター、及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターの、シャトル微生物への導入、
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの単離；ならびに１つ以上の構築物／ベクターの目的微生物への導入。
【０１１５】
一実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、構成的に発現される。別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、誘導される。
【０１１６】
シャトル微生物は、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を促進する、微生物、好ましくは、制限陰性微生物である。
【０１１７】
メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
【０１１８】
いったん発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に導入されると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、誘導される。誘導は、任意の好適なプロモータ系によるものであってもよいが、本発明の１つの特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、誘導性ｌａｃプロモータを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される。他の好適なプロモータとしては、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７系が挙げられる。本発明のさらなる実施形態では、メチル化構築物／ベクタープロモータは、構成的プロモータである。
【０１１９】
特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル微生物中で発現されるように、シャトル微生物の同一性に特有の複製起点を有する。好ましくは、発現構築物／ベクターは、発現構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が目的微生物中で発現されるように、目的微生物の同一性に特有の複製起点を有する。
【０１２０】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。次いで、発現構築物／ベクターは、多くの既知の方法のうちのいずれか１つに従って、シャトル微生物から単離されてもよい。ほんの一例として、以下の実施例の節に記載される方法が、発現構築物／ベクターを単離するために使用されてもよい。
【０１２１】
１つの特定の実施形態では、構築物／ベクターの両方が同時に単離される。
【０１２２】
発現構築物／ベクターは、多くの既知の方法を使用して、目的微生物に導入されてもよい。しかしながら、一例として、以下の実施例の節に記載される方法が使用されてもよい。発現構築物／ベクターはメチル化されるため、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は、目的微生物に組み込まれ、うまく発現されることが可能である。
【０１２３】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物に導入され、過剰発現されることが想定される。したがって、一実施形態では、得られたメチルトランスフェラーゼ酵素は、既知の方法を使用して収集され、発現プラスミドをメチル化するためにインビトロで使用されてもよい。次いで、発現構築物／ベクターは、発現のために目的微生物に導入されてもよい。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、発現構築物／ベクターのシャトル微生物への導入、シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの単離、次いで、発現構築物／ベクターの目的微生物への導入に続いて、シャトル微生物のゲノムに導入される。
【０１２４】
上記に定義された発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターは、組成物を提供するために組み合されもよいことが想定される。そのような組成物は、本発明の組換え微生物を産生するために、制限バリア機構を回避することにおいて特定の有用性を有する。
【０１２５】
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクター及び／またはメチル化構築物／ベクターは、プラスミドである。
【０１２６】
当業者は、本発明の微生物の産生に有用な多くの好適なメチルトランスフェラーゼを理解するであろう。しかしながら、一例として、以下の実施例に記載される枯草菌ファージΦＴ１メチルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼが使用されてもよい。一実施形態では、メチルトランスフェラーゼは、国際特許出願第２０１２／０５３９０５号に記載されている。
【０１２７】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合される、多くの構築物／ベクターが、メチル化構築物／ベクターを生成するために使用されてもよい。しかしながら、一例として、以下の実施例の節に記載されるプラスミドが使用されてもよい。
【０１２８】
産生方法
本明細書においてすでに言及されたように、本発明はまた、ＣＯを含む基質の発酵による、１つ以上の生成物の産生のための方法も提供する。
【０１２９】
特定の実施形態では、ＣＯを含む基質は、ガス状ＣＯを含む基質である。上記の態様のうちのいずれかの特定の実施形態では、基質は、典型的には、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、及び４０体積％〜５５体積％のＣＯなど、大きな割合のＣＯを含有する。特定の実施形態では、基質は、約２５体積％、または約３０体積％、または約３５体積％、または約４０体積％、または約４５体積％、または約５０体積％のＣＯ、または約５５体積％のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。
【０１３０】
ガス状基質は、工業的過程の副産物として得られるか、または自動車の排ガスからなど、他の源からのＣＯ含有排ガスであってもよい。ある特定の実施形態では、工業的過程は、製鋼所などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製過程、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア産生、メタノール産生、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、大気中に放出される前に、工業的過程から捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素及び水素を含むガス）の一成分であってもよい。工業的過程から産生されるＣＯは、通常、ＣＯ２を産生するために燃焼され、したがって、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス排出を低減し、バイオ燃料を産生することにおいて特定の有用性を有する。また、ガス状ＣＯ含有基質の組成物に応じて、それを発酵に導入する前に、塵埃粒子などの任意の望ましくない不純物を除去するために処理することが望ましくあり得る。例えば、ガス状基質は、既知の方法を使用して濾過または洗浄されてもよい。
【０１３１】
細菌の成長及び生成物の産生が生じるために、ＣＯ含有基質ガスに加えて、好適な液体栄養培地がバイオリアクタに供給される必要があることが理解されるであろう。
【０１３２】
本方法の態様の特定の実施形態では、発酵は、水性培養培地中で生じる。本方法の態様の特定の実施形態では、基質の発酵は、バイオリアクタ中で起こる。
【０１３３】
基質及び培地は、連続、バッチ、またはバッチフェド様式でバイオリアクタに供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物の成長を可能にするのに十分なビタミン及びミネラルを含有する。ＣＯを使用する発酵に好適な嫌気性培地は、当該技術分野において既知である。例えば、好適な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載される。本発明の一実施形態では、培地は、以下の実施例の節に記載される通りである。
【０１３４】
発酵は、望ましくは、発酵産物の産生が生じるための適切な発酵条件下で実施されるべきである。考慮されるべき反応条件としては、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクタを使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度が挙げられる。
【０１３５】
加えて、ＣＯが基質である場合、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質中のＣＯ分圧）を増加させ、したがって、発酵反応の効率性を増加させることが、多くの場合望ましい。増加した圧力における動作は、気相から液相へのＣＯ移動速度の有意な増加を可能にし、それは、発酵の産生のための炭素源として微生物によって取り込まれ得る。これが、バイオリアクタが大気圧より高い圧力に維持されるとき、滞留時間（流入ガス流速で割られたバイオリアクタ中の液体体積として定義される）が低減され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、概して、発酵が周囲圧力よりも高い圧力で実施されることが好ましい。また、所与のＣＯ変換速度が、部分的に基質滞留時間の関数であり、所望の滞留時間の達成が、バイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要とされるバイオリアクタの体積、及びその結果として発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号に示される実施例によると、リアクタ体積は、リアクタ動作圧力の増加に線形に比例して低減され得、すなわち、１０気圧の圧力で動作するバイオリアクタは、１気圧の圧力で動作するものの１０分の１の体積であれば十分である。
【０１３６】
一例として、上昇した圧力でガス−エタノール発酵を実施する利点が記載されている。例えば、国際特許出願第０２／０８４３８号は、それぞれ１５０ｇ／Ｌ／日及び３６９ｇ／Ｌ／日のエタノール生産性をもたらす、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されるガス−エタノール発酵を記載する。しかしながら、大気圧で、同様の培地及び流入ガス組成物を使用して実施される例示的な発酵は、１０〜２０倍少ないエタノール（Ｌ／日）を産生することがわかった。
【０１３７】
また、ＣＯ含有ガス状基質の導入速度が、液相中のＣＯ濃度が制限的にならないことを確実にするようなものであることが望ましい。これは、ＣＯ制限条件の結果が、１つ以上の生成物が培養によって消費されることであり得るためである。
【０１３８】
発酵反応を供給するために使用されるガス流の組成物は、その反応の効率性及び／またはコストに有意な影響を及ぼす可能性がある。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵過程の効率性を低減する可能性がある。発酵前または後の発酵過程段階における、望ましくないまたは不必要なガスの処理は、そのような段階に対する負担を増加させる可能性がある（例えば、ガス流がバイオリアクタに入る前に圧縮される場合、不必要なエネルギーが、発酵中に必要とされないガスを圧縮するために使用される可能性がある）。したがって、望ましくない成分を除去し、所望の成分の濃度を増加させるために、基質流、特に工業発生源由来の基質流を処理することが望ましくあり得る。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本発明の細菌の培養物は、水性培養培地中で維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気性微生物成長培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号及び同第５，５９３，８８６号、ならびに国際特許出願第０２／０８４３８号に記載され、かつ以下の実施例の節に記載される通りである。
【０１４０】
また、活性炭への酢酸の吸着を強化するために、ブロスのｐＨが上記の通り調節された場合、そのｐＨは、バイオリアクタに戻される前に、発酵バイオリアクタ中のブロスのものと同様のｐＨに再調節されるべきである。
【実施例】
【０１４１】
実施例１−ボトルネックの同定
エタノール及び２，３−ブタンジオールの産生のためのＣ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、またはＣ．ラグスダレイなどのカルボキシドトロフ細菌の発酵経路を、酵素アッセイを使用して、ボトルネックに関して解析した。このために、オキシドレダクターゼ反応は、それらが、還元または酸化が測定され得る１つ以上の補因子と結合されるため、特に好適である。メチルビオロゲンまたはベンジルビオロゲンなどの合成酸化還元色素もまた、この目的で使用され得る。
【０１４２】
エタノール及び２，３−ブタンジオールへのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び発酵経路のオキシドレダクターゼ酵素ステップを、それらの活性を決定するために分析した。これらの経路中の酵素は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２ガスの取り込み及び利用、ならびに生成物形成を含む、独立栄養成長に関与する。
【０１４３】
分析された酵素及びそれらの活性は、図１に詳述される。実施された全てのアッセイを、対照として、メチルビオロゲン（ＭＶ）またはベンジルビオロゲン（ＢＶ）のいずれかの合成酸化還元色素を使用して試験した。補因子フェレドキシン（Ｆｄ）、ＮＡＤＨ、及びＮＡＤＰＨ、またはこれらの組み合わせを以下に記載される通り試験した。ＣＯ及び水素上で独立栄養的に成長する、以下に記載される発酵からの粗抽出物を使用して、酵素アッセイを実施した。
【０１４４】
発酵
以下に記載される通り、３７℃の１．５Ｌバイオリアクタ中、ならびに唯一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガス中で、Ｃ．オートエタノゲナムを用いた発酵を実施した。１リットル当たり：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する発酵培地を、培養物成長のために使用した。培地をバイオリアクタ中に移し、４５分間１２１℃で加熱滅菌した。加熱滅菌後、培地にチアミン、パントテン酸（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を補充し、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元した。嫌気性を達成するために、リアクタ容器を、０．２μｍのフィルタを通して窒素でスパージした。接種の前に、ガスをＣＯ含有製鋼所ガスに切り替え、リアクタに連続的に供給した。供給ガス組成物は、２％のＨ２、４２％のＣＯ、２０％のＣＯ２、及び３６％のＮ２であった。培養物のｐＨを５〜５．２で維持した。
【０１４５】
細胞の採取
細胞の採取時（３．９ｇの細胞／Ｌの発酵ブロスのバイオマス）、ガス消費は、５モルのＣＯ／Ｌ−１／日−１及び１０ミリモルのＨ２／Ｌ−１／日−１であり、以下の代謝産物を産生した：１４ｇ／Ｌ−１／日−１のアセテート及び１９．５ｇ／Ｌ−１／日−１のエタノール。培養物のｐＨをＫ２ＣＯ３でｐＨ６に調節し、リアクタを氷水槽で冷却した。約１．２Ｌの培養物を氷上に収集した。培養物を２つの１Ｌ遠心ボトルに分け（このステップ及び全ての後続のステップを、酵素の不活性化を回避するための無酸素条件を確実にするために、嫌気性チャンバ中で実施した）、細胞を１０分間５０００ｒｐｍでペレット化した。上清を静かに移し、残液を除去した。各ペレットを１０ｍＭのＤＴＴを用いて約３０ｍＬの５０ｍＭ  Ｋ  ＰＯ４ｐＨ７．０中に再懸濁した。再懸濁液を予め計量された５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、細胞を１５分間最大速度（５０００ｇ）で再ペレット化した。チューブを嫌気性チャンバから取り出し、分析前に液体Ｎ２上ですぐに冷凍した。
【０１４６】
粗細胞抽出物の調製及び酵素アッセイ
無酸素条件下で、細胞を連続リアクタから採取した。それらを、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって記載されるように、フレンチプレスを通る３つのパスによって破壊した。無傷の細胞及び細胞残屑を、３０分間２０，０００×ｇ及び４℃の遠心分離によって除去した。上清を酵素アッセイのために使用した。指示される場合を除き、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって記載されるように、１．２×１０５Ｐａで、０．８ｍＬの反応混合物及び０．７ｍＬのＮ２またはＨ２またはＣＯで充填された、ゴム栓で閉じられた１．５ｍＬ嫌気性キュベット中で、３７℃で全てのアッセイを実施した。酵素を、以下またはＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって記載されるように分析した。酵素との反応の開始後、ＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ＋の還元を、３４０ｎｍ（ε＝６．２ｍＭ−１ｃｍ−１）または３８０ｎｍ（ε＝１．２ｍＭ−１ｃｍ−１）で、Ｃ．パストゥリアヌムのフェレドキシン還元を４３０ｎｍ（εΔｏｘ−ｒｅｄ?１３．１ｍＭ−１ｃｍ−１）で、メチルビオロゲン還元を５７８ｎｍ（ε＝９．８ｍＭ−１ｃｍ−１）で、及びベンジルビオロゲン還元を５７８ｎｍ（ε＝８．６ｍＭ−１ｃｍ−１）で、分光光度的に監視した。
【０１４７】
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、ならびに約３０μＭのフェレドキシン及び／または１ｍＭのＮＡＤ＋または１ｍＭのＮＡＤＰ＋を含有するアッセイ混合物を使用して、ＣＯデヒドロゲナーゼを測定した。気相は、１００％ＣＯであった。
【０１４８】
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、ならびに２５μＭのフェレドキシン及び／または１ｍＭのＮＡＤＰ＋及び／または１０ｍＭのメチルビオロゲンのアッセイ混合物を使用して、ヒドロゲナーゼ活性を測定した。気相は、１００％Ｈ２であった。
【０１４９】
１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、及び３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄｐｍ／μｍｏｌ）を含有するアッセイ混合物を用いて、Ｈ２を用いたＣＯ２のギ酸への還元に対するギ酸−水素リアーゼ活性を測定した。気相は、１００％Ｈ２であった。血清ボトルを２００ｒｐｍで連続的に撹拌し、液相と気相の平衡を確実にした。酵素との反応の開始後、１００μＬの液体試料を１．５分毎に引き出し、１５０ｍＭの酢酸を１００μＬ含有する１．５ｍＬセーフシールマイクロチューブに添加し、酸性化によって反応を停止した。次いで、２００μＬの混合物を、サーモミキサ中で１，４００ｒｐｍで撹拌しながら、１０分間４０℃でインキュベートし、形成された１４Ｃ−ギ酸の後に残った全ての１４ＣＯ２を除去した。続いて、１００μＬの混合物を５ｍＬのＱｕｉｃｋｓａｖｅ  Ａシンチレーション流体（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンタ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）中で、１４Ｃ放射能に関して解析した。
【０１５０】
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのギ酸、ならびに指示された場合、２５μＭのフェレドキシン、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭのＮＡＤ＋、及び／または１０ｍＭのメチルビオロゲンを含有するアッセイ混合物を用いて、ギ酸デヒドロゲナーゼ測定を実施した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０１５１】
１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．４ｍＭのテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭのホルムアルデヒド、０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋または０．５ｍＭのＮＡＤ＋を含有するアッセイ混合物を使用して、メチレン−Ｈ４Ｆデヒドロゲナーゼを測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０１５２】
メチレン−Ｈ４Ｆレダクターゼを以下の条件下で分析した。アッセイ混合物は、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのＦＡＤ、２０ｍＭのベンジルビオロゲン、及び１ｍＭのメチル−Ｈ４Ｆを含有した。酵素との反応の開始後、亜ジチオン酸ナトリウムを用いて、ベンジルビオロゲンを０．３のΔＡ５５５まで還元した。
【０１５３】
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、及び約２５μＭのフェレドキシンを含有する混合物を使用して、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼを分析した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０１５４】
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、１ｍＭの補酵素Ａ、及び１ｍＭのＮＡＤＰ＋または１ｍＭのＮＡＤ＋を含有する混合物を使用して、ＣｏＡアセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０１５５】
１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒドまたはアセトインのそれぞれ、及び１ｍＭのＮＡＤＰＨまたは１ｍＭのＮＡＤＨを用いたアッセイにおいて、アルコール及びブタンジオールデヒドロゲナーゼを測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０１５６】
Ｓｃｈoｎｈｅｉｔ，Ｗaｓｃｈｅｒ，＆Ｔｈａｕｅｒ（１９７８）によって記載されるように、フェレドキシンをＣ．パストゥリアヌムから精製した。
【０１５７】
結果
本発明者らが現時点では未知の結合部位を必要とすると信じているメチレン−ＴＨＦレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｐｏｅｈｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を除いて、カルボキシドトロフ細菌Ｃ．オートエタノゲナムのエタノール及び２，３−ブタンジオールへの経路中の全てのオキシドレダクターゼ反応を分析し、うまく検出し、この酵素の活性は、これまで他の生物では検出することができなかった。結果は、図１及び２に提供される。このデータを使用し、典型的には発酵過程中に生じ得るこれらの経路中のボトルネックを解析及び決定した。
【０１５８】
実施例２−エタノール産生に対するボトルネック
図１に示されるエタノール発酵経路に見られるように、エタノール産生に対するボトルネックは、アルコールデヒドロゲナーゼ反応である。全ての他の測定された反応が少なくとも１．１Ｕ／ｍｇの活性を示す一方で、アルコールデヒドロゲナーゼ反応ステップは、ＮＡＤＨでは０．３５Ｕ／ｍｇ（または３１％）、０．２Ｕ／ｍｇ（１８％）、及びＮＡＤＰＨでは０．１５Ｕ／ｍｇ（１３％）の総活性のみを有する。これは、経路中の全ての他の反応よりも６９％少ない。同様に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ反応は、ＮＡＤＨでは０．１６Ｕ／ｍｇ（１４％）、０．０８Ｕ／ｍｇ（７％）、及びＮＡＤＰＨでは０．０８Ｕ／ｍｇ（７％）のの総活性のみを有した。これは、経路中の全ての他の反応よりも８６％少ない。しかしながら、この反応は、アセテート及びアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）によって回避され得、それは、１．９Ｕ／ｍｇの活性を有し、かつアセテートキナーゼ反応中に基質レベルのリン酸化を通してＡＴＰを得、したがって、より多くのエネルギーを細胞に提供するという利点を有する。このボトルネックを克服し、発酵反応の効率性を増加させることにおいて少なくとも多少役立つために、内因性アルコール及び／またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素が、組換え微生物中で過剰発現されてもよく、または外因性アルコール及び／またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素が導入及び発現されてもよい。
【０１５９】
実施例３−ボトルネックを取り除くことによる、エタノール産生経路を通る流束の増加
アセチル−ｃｏＡのアセトアルデヒドへの、及びアセトアルデヒドからエタノールへの変換に触媒作用を及ぼす反応は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、またはＣ．ラグスダレイ中のエタノール形成における律速ステップであることが同定されている。これは、
ｉ．天然二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼを過剰発現させること、
ｉｉ．異種二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現させること、または
ｉｉｉ．異種アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを発現させること、
のいずれかによって克服され得る。これらの結果は、以下に記載される方法を使用することによって達成され得る。
【０１６０】
Ｃ．オートエタノゲナム中の天然二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現
Ｃ．オートエタノゲナム（配列番号１）の天然二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現させ、Ｃ．オートエタノゲナム中のＣ．アセトブチリカム（Ｇｅｎｂａｎｋ核酸番号ＣＰ００２６６１．１及びアミノ酸配列番号ＡＥＩ３４９０３．１）の異種二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることを選択した。
【０１６１】
Ｎｏｔ１及びＮｄｅ１制限酵素部位の間のＣ．オートエタノゲナムのＣ．オートエタノゲナムリン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の４８７ｂｐプロモータ配列を含有する、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５を使用して、遺伝子修飾を実施した（国際特許出願第２０１２０５３９０５号に記載されるように）。このプラスミドを新規のメチルトランスフェラーゼを使用してインビボでメチル化し、Ｃ．オートエタノゲナムに形質転換した。
【０１６２】
コドン改変Ｃ．オートエタノゲナム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の設計、合成、及びクローニング
Ｃ．オートエタノゲナム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列を他のクロストリジウム（配列番号２）に適合するようにコドン改変し、合成した。これは、遺伝子の染色体及びエピソームコピー間の相同的組換えの可能性を低減するために行われる。コドン改変Ｃ．オートエタノゲナム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、未改変のものと８１％の配列同一性を共有する。コドン改変遺伝子は、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素を使用して単離される。２６１３ｂｐ断片は、ＺＹＭＯ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲル抽出される。プラスミドｐＭＴＬ８３１５５はまた、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素で処理され、続いて、ＦＡＳＴＡＰアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理される。切断し、ホスファターゼ処理したプラスミドは、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ライゲーションは、１６℃で１時間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、切断挿入及びベクターを用いて設定され、それに続いて、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するためにライゲーション混合物が使用される。ＴＯＰ１０コロニーは、プラスミド単離（ＺＹＭＯ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐキット）、Ｎｄｅ１／Ｎｈｅ１酵素による制限消化、及び最終的に配列によって、正しい挿入を有するプラスミドに関してスクリーニングされる。
【０１６３】
正しいプラスミド、ｐＭＴＬ８３１５５−ｃｏｄ．ａｌｔ．ｎａＢｉＡＡＤＨが、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＳ２０ｍをすでに含有する、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株に導入される。
【０１６４】
Ｃ．アセトブチリカム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
Ｃ．アセトブチリカムからのゲノムＤＮＡは、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＰｕｒｅｌｉｎｋ  ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡミニキットを、製造業者の説明書に従って使用して単離される。Ｃ．アセトブチリカム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、プライマーｃａＢｉＡＡＤＨ−Ｆ（配列番号７）及びｃａＢｉＡＡＤＨ−Ｒ（配列番号８）、ならびにｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＰＣＲ増幅される。プライマーは、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素部位を含有する。２５８９ｂｐ  ＰＣＲ生成物は、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ＰＣＲ生成物及びプラスミドｐＭＴＬ８３１５５は、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理される。プラスミドは、ＦＡＳＴＡＰアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で更に処理される。切断され、ホスファターゼ処理されたプラスミド及び切断されたＰＣＲ生成物は、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ライゲーションは、１６℃で１時間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、切断挿入及びベクターで設定され、それに続いて、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するためにライゲーション混合物が使用される。ＴＯＰ１０コロニーは、プラスミド単離（ＺＹＭＯ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐキット）、Ｎｄｅ１／Ｎｈｅ１酵素による制限消化、及び最終的に配列によって、正しい挿入を有するプラスミドに関してスクリーニングされる。
【０１６５】
正しいプラスミド、ｐＭＴＬ８３１５５−ｃａＢｉＡＡＤＨが、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＳ２０ｍをすでに含有する、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株に導入される。
【０１６６】
Ｃ．オートエタノゲナムの形質転換：
ＤＮＡのメチル化：
米国特許出願第１３／０４９，２６３号に記載されるように、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、及びＣ．ラグスダレイからのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の配列によって、誘導性ｌａｃプロモータと融合したハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子（国際特許出願第２０１２０５３９０５号からの配列番号２７）を設計した。メチルトランスフェラーゼの発現は、国際特許出願第２０１２０５３９０５号からの配列番号２８の配列を有するタンパク質をもたらす。ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子を化学的に合成し、ベクターｐＧＳ２０中にクローン化した（ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ−ＥｃｏＲＩを使用した国際特許出願第２０１２０５３９０５号からの配列番号２９。得られたメチル化プラスミドｐＧＳ２０−メチルトランスフェラーゼを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入し、この形質転換体を再びプラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｃｏｄ．ａｌｔ．ｎａＢｉＡＡＤＨ及びｐＭＴＬ８３１５５−ｃａＢｉＡＡＤＨで形質転換した。インビボメチル化を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、メチル化プラスミドを単離し（Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎ  ｐｒｅｐキット）、Ｃ．オートエタノゲナムを電気穿孔するために使用した。
【０１６７】
エレクトロポレーション：
完全な形質転換の実験中、Ｈｕｎｇａｔｅ（１９６９）及びＷｏｌｆｅ（１９７１）によって記載される標準的な嫌気性技術を使用して、３７℃で、還元剤及び３０ｐｓｉ製鋼所排ガス（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ  ｓｉｔｅ（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺ）から収集；組成物：４４％のＣＯ、３２％のＮ２、２２％のＣＯ２、２％のＨ２）の存在下で、ＹＴＦ培地（表２）中でＣ．オートエタノゲナムを成長させた。
【表１】
2016520325.tif 000003
【０１６８】
コンピテント細胞を作るために、Ｃ．オートエタノゲナムの５０ｍＬの培養物を、連続５日間、新鮮なＹＴＦ培地に継代培養した。これらの細胞を使用し、０．０５のＯＤ６００ｎｍで、４０ｍＭのＤＬ−トレオニンを含有する５０ｍＬのＹＴＦ培地に接種した。培養物が０．０５のＯＤ６００ｎｍに達したとき、細胞を３０分間氷上でインキュベートし、次いで、嫌気性チャンバ中に移し、４，７００×ｇ及び４℃で採取した。培養物を、氷のように冷たいエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に、６００μＬの新鮮なエレクトロポレーション緩衝液の体積中に懸濁した。２μｇのメチル化プラスミド混合物及び１μＬの１型制限阻害剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、０．４ｃｍの電極間隙を有する、予め冷却されたエレクトロポレーションキュベット中に、この混合物を移し、以下の設定を有するＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、すぐにパルスした：２．５ｋＶ、６００Ω、及び２５μＦ。３．７〜４．０ｍｓの時定数を達成した。培養物を５ｍＬの新鮮なＹＴＦ培地中に移した。チューブホルダを備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、６００ｎｍの波長で、細胞の再生を監視した。バイオマスの初期の低下後、細胞は、再び成長し始めた。いったんバイオマスがその時点から倍増すると、ＹＴＦ寒天プレート及び５ｇ／Ｌのフルクトースを含有するＰＥＴＣ寒天プレート（表３）（両方とも１．２％Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（ＢＤ）及び１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含有する）上に、約２００μＬの培養物を広げた。コロニーは、３７℃での３０ｐｓｉ製鋼所ガスによる３〜４日間のインキュベーション後に見られる。
【表２】
2016520325.tif 000004
2016520325.tif 000005
【０１６９】
コロニーは、同様に５ｇ／Ｌのフルクトース及び１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含有する新鮮なＰＥＴＣ寒天プレート上にストリーキングされる。３７℃における３０ｐｓｉ製鋼所ガスでの２日間のインキュベーション後、単一コロニー単一コロニーは、５ｇ／Ｌのフルクトース及び１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含有する２ｍＬのＰＥＴＣ液体培地中に採取される。成長が生じるとき、培養物体積は、５ｇ／Ｌのフルクトース、１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコール、及び炭素源として３０ｐｓｉ製鋼所ガスを含有する、５ｍＬ、２５ｍＬ、及び次いで５０ｍＬのＰＥＴＣ培地まで連続的に拡大する。
【０１７０】
形質転換体中のプラスミドの同一性及び存在は、それぞれ、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｃｏｄ．ａｌｔ．ｎａＢｉＡＡＤＨに対してプライマーｆＤ１（配列番号３）及びｒＰ２（配列番号４）；ｎａＢｉ−ｆ（配列番号５）及びｎａＢｉ−ｒ（配列番号６）、ならびにｐＭＴＬ８３１５５−ｃａＢｉＡＡＤＨに対してプライマーｃａＢｉＡＡＤＨ−Ｆ（配列番号７）及びｃａＢｉＡＡＤＨ−Ｒ（配列番号８）を用いたＰＣＲによって確認される。
【０１７１】
ｐＭＴＬ８３１５５−ｃｏｄ．ａｌｔ．ｎａＢｉＡＡＤＨ及びｐＭＴＬ８３１５５−ｃａＢｉＡＡＤＨを含有するＣ．オートエタノゲナムを用いた発酵実験
発酵は、以下に記載される通り、３７℃の１．５Ｌバイオリアクタ中、ならびに唯一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガス中で実施される。１リットル当たり：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する、定義された培地が、培養物成長のために使用される。培地は、バイオリアクタ中に移され、４５分間１２１℃で加熱滅菌される。加熱滅菌後、培地は、チアミン、パントテン酸（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）が補充され、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元される。嫌気性を達成するために、リアクタ容器は、０．２μｍフィルタを通して窒素でスパージした。接種の前に、ガスは、ＣＯ含有製鋼所ガスに切り替えられ、リアクタに連続的に供給される。供給ガス組成物は、２％のＨ２、４２％のＣＯ、２０％のＣＯ２、３６％のＮ２である。培養物のｐＨは、５〜５．２で維持される。ガス流量が、初期に８０ｍＬ／分で設定され、中期指数増殖期中に２００ｍＬ／分まで増加すると同時に、撹拌は、２００ｒｐｍから３５０まで増加される。Ｎａ２Ｓは、０．２５ｍＬ／時間でバイオリアクタ中に与えられる。いったんＯＤ６００が０．５に達すると、バイオリアクタは、１．０ｍＬ／分の速度で連続モードに切り替えられる（希釈率０．９６ｄ−１）。成長が安定したとき、リアクタは、アセトインの１０ｇ／Ｌのラセミ混合物でスパイクされる。ＨＰＬＣによってバイオマス及び代謝産物を測定するために、培地試料が採取される。
【０１７２】
代謝産物の解析は、３５℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）及び３２℃で維持されるＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ）が備わった、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して、ＨＰＬＣによって実施される。わずかに酸性の水が、０．２５ｍＬ／分の流速の移動相として使用される（０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の細胞残基を除去するために、４００μＬの試料が、１００μＬの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合され、３分間１４，０００×ｇで遠心分離され、沈殿残渣を分離する。次いで、１０μＬの上清が、エタノール、アセテート、２，３−ブタンジオール、及び乳酸などの主要な代謝産物の解析のために、ＨＰＬＣ中に注入される。
【０１７３】
Ｃ．オートエタノゲナム中でアセチル−ｃｏＡをエタノールに転換する律速反応は、Ｃ．オートエタノゲナムのコドン改変天然二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現により、または異種Ｃ．アセトブチリカム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現により軽減される。したがって、エタノールへの産生流束の強化が期待され、より高いエタノール力価が、これらの遺伝子組換えＣ．オートエタノゲナム菌株中でもたらされる。
【０１７４】
Ｃ．オートエタノゲナム中の異種アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの発現
このために、我々は、Ｃ．オートエタノゲナム中で、ザイモモナス・モビリス（ＧｅｎＢａｎｋ核酸配列番号ＮＣ＿００６５２６．２及びアミノ酸配列番号ＹＰ＿１６３３３１．１）から異種ＮＡＤ／ＮＡＤＨ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（ＧｅｎＢａｎｋ核酸配列番号ＣＰ０００７２１．１及びアミノ酸配列番号ＡＢＲ３５９４７．１）からＮＡＤ／ＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現させることを選択した。
【０１７５】
コドン最適化ザイモモナス・モビリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の設計、合成、及びクローニング
ザイモモナス・モビリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列は、クロストリジウム中の最大発現のためにコドン最適化される。コドン改変Ｃ．オートエタノゲナム二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、未改変のものと８１％の配列同一性を共有する。コドン最適化遺伝子は、Ｎｄｅ１（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓによって供給）及びＮｈｅ１（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓによって供給）制限酵素を使用して単離される。１１５２ｂｐ断片は、ＺＹＭＯ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲル抽出される。プラスミドｐＭＴＬ８３１５５もまた、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素で処理され、続いて、ＦＡＳＴＡＰアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理される。切断され、ホスファターゼ処理されたプラスミドは、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ライゲーションは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、切断挿入及びベクターを用いて設定され、それに続いて、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するためにライゲーション混合物が使用される。ＴＯＰ１０コロニーは、プラスミド単離（ＺＹＭＯ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐキット）、Ｎｄｅ１／Ｎｈｅ１酵素による制限消化、及び最終的に配列によって、正しい挿入を有するプラスミドに関してスクリーニングされる。
【０１７６】
正しいプラスミド、ｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄが、上記に説明されたように、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＳ２０ｍをすでに含有する、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株に導入される。
【０１７７】
Ｃ．ベイジェリンキアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
Ｃ．ベイジェリンキからのゲノムＤＮＡが、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＰｕｒｅｌｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡミニキットを、製造業者の説明書に従って使用して単離される。Ｃ．ベイジェリンキアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、プライマーｃｂＡｄｈ−Ｆ（配列番号９）及びｃｂＡｄｈ−Ｒ（配列番号１０）、ならびにｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＰＣＲ増幅される。プライマーは、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素部位を含有する。２５８９ｂｐ  ＰＣＲ生成物は、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ＰＣＲ生成物及びプラスミドｐＭＴＬ８３１５５は、Ｎｄｅ１及びＮｈｅ１制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理される。プラスミドはさらに、ＦＡＳＴＡＰアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理される。切断され、ホスファターゼ処理されたプラスミド、及び切断されたＰＣＲ生成物は、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して洗浄される。ライゲーションは、１６℃で１時間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、切断挿入及びベクターを用いて設定され、それに続いて、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するためにライゲーション混合物が使用される。ＴＯＰ１０コロニーは、プラスミド単離（ＺＹＭＯ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐキット）、Ｎｄｅ１／Ｎｈｅ１酵素による制限消化、及び最終的に配列によって、正しい挿入を有するプラスミドに関してスクリーニングされる。
【０１７８】
正しいプラスミド、ｐＭＴＬ８３１５５−ｃｂＡｄｈが、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＳ２０ｍをすでに含有する、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株に導入される。
【０１７９】
コドン最適化ザイモモナス・モビリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びＣ．ベイジェリンキアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の１つのプラスミドへのクローニング
コドン最適化ザイモモナス・モビリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びＣ．ベイジェリンキアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、Ｃ．オートエタノゲナムのリン酸アセチルトランスフェラーゼプロモータ下でオペロンを形成するために、ｐＭＴＬ８５１５５プラスミド上ですでに説明された好適な制限部位間に集められる。得られたプラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄ−ｃｂＡｄｈは、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＳ２０ｍをすでに含有する、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ菌株に導入される。
【０１８０】
Ｃ．オートエタノゲナムの形質転換
プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｃｂＡｄｈ、及びｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄ−ｃｂＡｄｈは全て、エレクトロポレーションによってＣ．オートエタノゲナムに導入され、得られたコロニーは、上記に説明されたようにスクリーニングされる。
【０１８１】
ｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｃｂＡｄｈ、及びｐＭＴＬ８３１５５−ｚｍＡｌｄ−ｃｂＡｄｈを含有するＣ．オートエタノゲナム形質転換体を用いた発酵実験
発酵は、実施例１に説明されるように実施される。異なる発酵段階における代謝産物が、エタノール、アセテート、２，３−ブタンジオール、及び乳酸に対して解析される。
【０１８２】
二官能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現と同様に、Ｃ．オートエタノゲナム中でアセチル−ｃｏＡをエタノールに転換する律速ステップは、個々の、あるいはオペロン中で一緒のコドン最適化ザイモモナス・モビリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びＣ．ベイジェリンキアルコールデヒドロゲナーゼの発現によって軽減される。したがって、エタノールへの産生流束の強化が期待され、より高いエタノール力価が、これらの遺伝子組換えＣ．オートエタノゲナム菌株中でもたらされる。
【０１８３】
実施例４−２，３−ブタンジオール産生に対するボトルネック
図２に見られるように、２，３−ブタンジオール産生に対するボトルネックは、ピルビン酸：フェレドキシンレダクターゼ（ＰＦＯＲ）酵素によって触媒作用が及ぼされる、アセチルＣｏＡからピルビン酸への反応である。全ての他の測定された反応が少なくとも１．１Ｕ／ｍｇの活性を示す一方で、この律速反応は、フェレドキシンの存在下で０．１１Ｕ／ｍｇ（１０％）のみの酵素活性を有する。これは、経路中の全ての他の経路よりも９０％少ない。このボトルネックを克服し、発酵からの生成物収率を増加させることにおいて少なくとも多少役立つために、内因性ＰＦＯＲ酵素が過剰発現されてもよく、または外因性ＰＦＯＲ酵素が導入及び発現されてもよい。
【０１８４】
実施例５−ボトルネックを取り除くことによる、２，３−ブタンジオール産生経路を通る流束の増加
アセチル−ｃｏＡのピルビン酸への変換に触媒作用を及ぼす反応は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、またはＣ．ラグスダレイ中の２，３−ブタンジオール形成における律速ステップであることが図２中で同定されている。これは、Ｃ．オートエタノゲナム中でピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）をコードする遺伝子を過剰発現させることによって克服され得る。遺伝子はコドンで合成され、タンパク質を発現させ、そのアミノ酸配列は、Ｃ．オートエタノゲナム中に自然に見られる（配列番号１１）。
【０１８５】
遺伝子は、天然遺伝子に対する相同性を低減し、望ましくない組み込み事象を回避し、発現に関する問題を最小限に抑えるために、コドン最適化及び合成される（配列番号１２）。遺伝子は、ｐＭＴＬ８３１５５にサブクローニングするための制限酵素切断部位、ＸｂａＩ（３’末端）及びＮｈｅＩ（５’末端）が隣接する。合成構築物及びｐＭＴＬ８３１５５は、ＸｂａＩ及びＮｈｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化され、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）でｐＭＴＬ８３１５５中にライゲーションされる。大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するために、ライゲーション混合物が使用され、所望のプラスミドを含有するコロニーが、プラスミドミニプレップ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び制限消化（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって同定される。所望のプラスミドは、実施例３に記載されるように、メチル化され、Ｃ．オートエタノゲナム中で形質転換される。良好な形質転換体は、チアンフェニコール耐性、ならびにプライマーｒｅｐＨＦ（配列番号１３）及びＣａｔＲ（配列番号１４）を用いたＰＣＲ解析によって同定され、それは、プラスミドが存在するとき、１５８４塩基対生成物を得る。
【０１８６】
所望のプラスミドを含有すると同定された形質転換体は、工場ガスの存在下で、ＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地を含有する血清ボトル中で成長し、ＨＰＬＣ解析によって測定されるそれらの代謝産物産生は、プラスミドを含まない親生物のものと比較される。形質転換された菌株中のＰＦＯＲ活性もまた、粗抽出物中で測定され（実施例１に記載されるように）、親菌株中で観察されたボトルネックが軽減されていることを確認する。ＰＦＯＲの過剰発現は、細胞内の全体的な活性を増加させ、経路中のボトルネックを軽減し、ピルビン酸を通る流束の増加及び２，３−ブタンジオール産生の増加をもたらす。
【０１８７】
実施例６−全体的な生成物収率の増加のために、アセチル−ＣｏＡ前駆体を増加させるためのボトルネック
図１及び２に見られるように、ガスＣＯ及びＨ２は、それぞれ２．７及び２．４Ｕ／ｍｇの活性を有する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸：水素リアーゼを介して、カルボキシドトロフ細菌によって容易に利用される。しかしながら、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝の測定された酵素（ギ酸デヒドロゲナーゼ、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ）は、約１．１Ｕ／ｍｇの活性のみを示す。アセチル−ＣｏＡレベルを増加させるために、全ての下流生成物、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝の内因性酵素（ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼ、メチレン−ＴＨＦ，デヒドロゲナーゼ／ホルミル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ、メチレン−ＴＨＦレダクターゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ）が過剰発現されてもよく、または実質的に同じ機能を有する外因性酵素が、導入及び発現されてもよい。別の戦略は、必要とされる補因子テトラヒドロ葉酸及びコバラミンの生合成遺伝子の発現を増加させることによって、それらの可用性を増加させることである。
【０１８８】
実施例７−より良好な産生及び成長速度を達成するための、最適化された系に対する最後のボトルネックの軽減
上記の実施例は、それぞれ２．７及び２．４Ｕ／ｍｇの活性を有する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ，及び／またはギ酸：水素リアーゼの活性と一致するために、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路ならびにエタノール及び２，３−ブタンジオール発酵経路を含む系を通る流束を最適化する方法を記載する。
【０１８９】
これらの上記のボトルネックに対処し、本発明者らはここで、さらなる律速経路反応、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃａｔｓｅ）（ＡＯＲ）反応に目を向ける（図１を参照されたい）。この反応は、１．９Ｕ／ｍｇの活性を有し、それは、一酸化炭素デヒドロゲナーゼの活性よりも約３０％低い。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼの両方が、フェレドキシンを補因子として使用する少ない酵素のうちの１つであるため、両方の活性に一致することが特に重要である。これは、フェレドキシンの有限のプールがあるためであり、したがって、それを循環させる酸化及び還元反応は、サイクルの最大効率性を確実にするために均衡を保つべきである。本発明者らは、これが、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子（ＡＯＲ１−配列番号１６）を過剰発現させることによって達成され得ることがわかった。過剰発現は、エタノール産生を３１％改善した。このボトルネックの軽減は、発酵によるエタノール産生を改善させただけではなく、フェレドキシンプールがより良好に均衡を保つため、生物の成長速度も改善した。結果は、以下に詳述される。
【０１９０】
ＡＯＲ１発現プラスミドの構築
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌプロモータ（ＰＷＬ）（配列番号１５）及びアルデヒド：：フェレドキシンオキシドレダクターゼ１遺伝子（ＡＯＲ１）（配列番号１６）のＤＮＡ配列を、クロストリダム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ）オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノムＤＮＡからのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、表４のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅した。ゲノムＤＮＡをＢｅｒｔｒａｍ  ａｎｄ  Ｄuｒｒｅ（１９８９）による改良された方法を使用して単離した。１００ｍＬの一晩培養物を採取し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍＬのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース；ｐＨ８．０）中に懸濁した。３００μＬのリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を添加し、混合物を３０分間３７℃でインキュベートし、続いて、２８０μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を添加し、さらに１０分間インキュベートした。２４０μＬのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μＬのトリス−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、及び１０μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の添加によって、ＲＮＡを室温で消化した。次いで、１００μＬのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、タンパク質分解を３７℃で１〜３時間行った。最後に、６００μＬの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加し、続いて、フェノール−クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの量及び質を分光光度的に調査した。ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位及び大腸菌株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、増幅した５７３ｂｐプロモータＰＷＬを大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３１５１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ７９７６４７；Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）にクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７を得た。ＡＯＲ１のコード配列は、２つの内部ＮｄｅＩ部位を含有するため、スプライス重複（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｗａｒｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を使用し、コドンの変化なく、これらのＮｄｅＩ部位を除去した。ＡＯＲ１の１８４９ｂｐ  ＰＣＲ生成物及びプラスミドｐＭＴＬ８３１５７の両方を、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲ１で消化し、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１（配列番号１７）を産生するためにライゲーションした。発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１の挿入及びプロモータを、表４に示されるオリゴヌクレオチドを使用して完全に配列決定し、結果は、ＡＯＲ１の２つの内部ＮｄｅＩ部位がうまく改変され、それらが突然変異を含まなかったことを確認した（図３）。
【表３】
2016520325.tif 000006
【表４】
2016520325.tif 000007
【０１９１】
クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＡＯＲ１の過剰発現：
プラスミドｐＭＴＬ８３１５７及びｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１を、上記のように、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１に導入した。７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを使用して、Ｃ．オートエタノゲナム形質転換体を選択した。コロニーを３日間のインキュベーション後に観察し、それらを精製のために同じ選択的寒天培地上に再ストリーキングした。接合完了体の同一性を確認するために、プライマーａｄｈＥ１−Ｆ（配列番号２８；ＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＡＣ）及びａｄｈＥ１−Ｒ（配列番号２９；ＧＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣ）を使用して、ＰＣＲを行い、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のａｄｈＥ１（ＣＡＥＴＨＧ＿３７４７）を確認した。図４は、プラスミド対照及びＡＯＲ１過剰発現菌株の両方における、予期された５７６ｂｐの産物の存在を示す。さらに、プラスミド制限消化解析を実施するために、プラスミドＤＮＡをＣ．オートエタノゲナム形質転換体から抽出し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に再び形質転換した。これは、クロストリジウムから単離されるプラスミドが制限消化解析に十分な質を有していないため、「プラスミドレスキュー」と一般的に称される。図５は、ｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１形質転換体からのレスキュープラスミドのＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ消化後の、予期された断片の存在を示す。
【０１９２】
ＡＯＲ１の過剰発現は、成長速度を改善する：
Ｃ．オートエタノゲナムプラスミド対照（ｐＭＴＬ８３１５７）及びＡＯＲ１過剰発現菌株（ｐＭＴＬ８３１５７−ＡＯＲ１）の１００％ＣＯ中で独立栄養的に成長する能力を、５０ｍＬのＰＥＴＣ培地（表３）を含有する、３連の２５０ｍＬの血清ボトルで試験し、３０ｐｓｉのＣＯで加圧した。チアンフェニコールを、２つのプラスミド含有菌株に対して最終濃度７．５μｇ／ｍＬまで補充した。４００μＬの活性培養物を各血清ボトル中に接種し、液相試料を、６００ｎｍの波長のＯＤ測定及びＨＰＬＣによる代謝産物解析のために採取した。
【０１９３】
図６は、律速経路反応に触媒作用を及ぼす酵素ＡＯＲ１の過剰発現が、１００％ＣＯ条件下で、プラスミド対照と比較して、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の独立栄養成長を改善することを示す。例えば、ＡＯＲ１過剰発現菌株は、１３日目に１．７３のピークＯＤ６００に達した一方で、プラスミド対照は、２２日目に０．７８のピークＯＤ６００に達しただけであった。
【０１９４】
ＡＯＲ１の過剰発現は、クロストリジウム・オートエタノゲナムのエタノール産生を増加させる
加えて、１００％のＣＯ中、Ｃ．オートエタノゲナムのＡＯＲ１過剰発現菌株は、Ｃ．オートエタノゲナム野生型菌株と非常に似た１．７〜１．８のＯＤ６００に達したが、Ｃ．オートエタノゲナムのＡＯＲ１過剰発現菌株は、野生型（×印、１０日目の下の線）よりも３１％多くのエタノール（図７Ａ、正方形、１０日目の上の線）を生成した。アセテート産生は、本組換え微生物（図７Ｂ、正方形、１０日目の下の線）と野生型微生物（図７Ｂ、×印、１０日目の上の線）との間で同様であり、したがって、ＡＯＲ過剰発現菌株は、約３０％高い全体的な生成物力価をもたらした。
【０１９５】
要約すると、上記の実施例は、本発明者らが最初に、律速経路反応及びその反応に関与するに関連酵素／補因子を同定する方法をうまく実証したことを示す。第２に、本発明者らは、酵素が活性の増加を示し、したがって、発酵経路を通る流束速度（及びしたがって全体的な効率性）を大幅に増加させる、組換え微生物を産生した。
【０１９６】
本発明は、読み手が過度の実験なしに本発明を実施することを可能にするために、ある特定の好ましい実施形態を参照して本明細書に記載されてきた。しかしながら、当業者は、成分及びパラメータの多くが、本発明の範囲から逸脱することなく、ある特定の程度まで変更もしくは修正され得るか、または既知の同等物の代わりに使用され得ることを、容易に認識するであろう。そのような修正及び同等物は、あたかも個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれることが理解されるべきである。本文書の読み手の理解を強化するために、題名、見出しなどが提供され、本発明の範囲を制限するものと見なされるべきではない。
【０１９７】
もしある場合、上記および下記に列挙される、全ての出願、特許、及び出版物の開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書中の任意の出願、特許、及び出版物への言及は、それらが有効な従来技術を構成するか、または世界のいかなる国においても共通の一般知識の一部を形成するという認識または任意の形態の示唆ではなく、かつそうであると見なされるべきではない。
【０１９８】
本明細書及び以下の任意の請求項全体を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、用語「含む」、「含むこと」などは、排他的な意味とは対照的に包含的な意味、すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」の意味で解釈されるものとする。
【図１】
2016520325.tif 000008
【図２】
2016520325.tif 000009
【図３】
2016520325.tif 000010
【図４】
2016520325.tif 000011
【図５】
2016520325.tif 000012
【図６】
2016520325.tif 000013
【図７】
2016520325.tif 000014
【配列表】
2016520325000001.app
【国際調査報告】
2016520325.tif 000015
2016520325.tif 000016