(57)【要約】呼吸器ウイルス感染の阻害活性を有するペプチド、このペプチドの使用およびこのペプチドの製造方法を開示する。このペプチドは化学的方法または遺伝子工学的方法によって合成することができ、呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合可能な機能的領域を有し、呼吸器ウイルスの感染を阻害する活性を有する。該ペプチドは、標的細胞への呼吸器ウイルスの感染の防御、該感染の予防／治療、および、呼吸器ウイルスに対する新規の予防／治療薬の開発に有用である。また該ペプチドのいずれかをコードする単離ＤＮＡ、作動可能にプロモータと結合したＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターを含む宿主細胞、前記感染を阻害できるペプチドをスクリーニングするためのキットおよびそのスクリーニング方法を開示する。本発明は、前記感染の阻害におけるペプチドのメカニズムを開示し、広範囲な抗ウイルス活性を有する新しい予防／治療薬の開発のための理論的根拠を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的経路を介してまたは遺伝子工学プロセスによって合成されるペプチドであって、該ペプチドが呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合可能な機能的領域を有し、呼吸器ウイルスの感染を阻害する活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
さらに、細胞内の後期エンドソーム内の酸性化を妨げる機能を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
５つ以上の塩基性アミノ酸を有し、より好ましくは、そのＮ末端領域またはＣ末端領域に２つ以上の塩基性アミノ酸を有し、さらに好ましくは、そのＮ末端領域またはＣ末端領域に３つ以上の塩基性アミノ酸を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
４つ以上のシステインを有する請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
以下に記載するアミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を有する請求項３に記載のペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に記載されるアミノ酸配列；または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および／または付加によって得られたアミノ酸配列。
【請求項６】
アミノ酸配列（ｂ）が、アミノ酸配列（ａ）と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７に記載されているものである請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｎ末端領域がペプチドのＮ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個未満の配列を含み、Ｃ末端領域がペプチドのＣ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個未満の配列を含む請求項３に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｃ末端領域が２つのシステインおよび塩基性アミノ酸を有する請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｃ末端領域が、以下のアミノ酸組成の１０個のアミノ酸を有する請求項９に記載のペプチド：
塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−システイン−システイン−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸-遊離カルボキシル。
【請求項１１】
ヒトまたはマウスを起源とし、好ましくは、マウスβデフェンシン−４を起源とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、該インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスのサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７が含まれ、該コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
以下を含む組成物：
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド；および、
薬学的に許容される賦形剤。
【請求項１４】
下記プロセスを含む、標的細胞における呼吸器ウイルス感染を防御する方法：
標的細胞および呼吸器ウイルスを含む系において、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス；および、
該ペプチドにより標的細胞の後期エンドソームにウイルスＲＮＡの放出を阻害させて、それにより標的細胞における呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス；
ここで、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７が含まれ、コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる。
【請求項１５】
ペプチドとウイルスとの結合には、ウイルスの表面糖タンパクとペプチドとの結合が含まれ、該ペプチドは後期エンドソーム内のｐＨ低下を阻害することによってウイルスＲＮＡ放出を抑制することができる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
呼吸器ウイルスの感染の予防または治療用の医薬品の製造のための請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１７】
化学的経路を介するまたは遺伝子工学プロセスによるペプチドの合成を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離ＤＮＡ。
【請求項１９】
作動可能にプロモータと結合した請求項１８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
以下を含む、呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングするためのキット：
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドである陽性対照；および、
呼吸器ウイルスに感染できる標的細胞。
【請求項２２】
さらに細胞培養液を含む請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
さらに陰性対照またはブランク対照を含む請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、該インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７が含まれ、該コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
標的細胞が、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）、アカゲザル胎児腎細胞（ＦＲｈＫ−４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８８）およびアフリカミドリザル腎Ｅ６細胞（Ｖｅｒｏ−Ｅ６，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８６）から選択される請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
以下のステップを含む、呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングする方法：
ａ）単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ；
ｂ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドである陽性対照を準備するステップ；
ｃ）候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ；
ｄ）候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ；
ｅ）標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ；および、
ｆ）陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウィルス予防と治療の分野に関する。特に、本発明は呼吸器ウイルス感染の阻害活性を有するペプチド、このペプチドを用いた標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を防御する方法、呼吸器ウイルスの感染を予防または治療するための薬剤の製造のためのペプチドの使用、このペプチドの製造方法、このペプチドを含む組成物、このペプチドをコードする単離されたＤＮＡ、作動可能にプロモータと結合したＤＮＡを含む発現ベクター、その発現ベクターを含む宿主細胞、呼吸器ウイルスの感染を阻害できるペプチドをスクリーニングするためのキットおよびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は、おそらくすべての多細胞植物および動物によって生産される内在性の宿主防御分子である（非特許文献１参照）。これらは、感染初期のステージで侵入する病原菌を迅速に排除する自然免疫システムの最初の部分を含み、また全身性の獲得免疫反応を促進することができる（非特許文献２および非特許文献３参照）。ほとんどのＡＭＰは、通常陰電荷である微生物膜と結合する能力を供与する両親媒性およびカチオン分子である。何百ものＡＭＰが同定され、それらの構造の特徴および／またはアミノ酸組成に従って分類されている。脊椎動物のＡＭＰの２つのファミリーであるカテリシジンおよびデフェンシンは白血球および上皮細胞によって主に産生される小分子である（非特許文献４および非特許文献５参照）。カテリシジンの前駆体には保存されたアミノ末端である“カテリン”領域（約１００残基の長さ）が含まれている。加工されたカテリシジンペプチドは、αへリックス、βシートまたは他の三次構造を有するか、または有しない１２〜８０アミノ酸残基の長さの範囲にある（非特許文献６および非特許文献７参照）。デフェンシンは３個（稀に４個）の保存された分子内ジスルフィド架橋によって安定化された主にβシートを形成する、システインが多い小さな（２−６ｋＤ）ＡＭＰである。デフェンシンの３つのサブファミリーは、それらのジスルフィドパターンによって、脊椎動物においてはα−、β−、θ−デフェンシンにさらに分類される（非特許文献４参照）。一般的に、これらのペプチドは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌、真菌ならびにウイルスなどの微生物の感染に対してより広い範囲の非特異的な活性を有する。菌に対するＡＭＰの様々な作用には、膜の完全性の破壊（非特許文献８および非特許文献９参照）、核およびタンパク合成の阻害、シャペロン関連のタンパク質の折りたたみの抑制、細胞壁の生合成経路の遮断および膜の生合成を標的にすること（非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２参照）が含まれる。しかしながら、これまでのところ、ＡＭＰの抗ウイルスメカニズムは良くわかっていない。
【０００３】
デフェンシンは、抗菌（非特許文献１３および非特許文献１４参照）、抗ウイルス（非特許文献１５および非特許文献１６参照）および抗真菌（非特許文献１７および非特許文献１８）などの多くの性質を有していることが示されている。
【０００４】
自然界にあるデフェンシンはウイルス感染などの感染に反応する自然免疫および獲得免疫のシステムによって産生される（非特許文献１参照）。マウスではインフルエンザウイルス感染によってマウスのβデフェンシン−３およびβデフェンシン−４の遺伝子発現が上気道で誘導される（非特許文献１９参照）。ＨＩＶ−１  ＴａｔはヒトのＢ細胞でヒトのβデフェンシン−２の発現を誘導することができる（非特許文献２０参照）。
【０００５】
誘導されたデフェンシンは感染の初期ステージの微生物の侵入に対する防御において重要な役割を果たしている（非特許文献１参照）。ヒトのαデフェンシン−１はプロテインキナーゼＣの活性化の抑制を介してインフルエンザウイルス複製を阻害することが証明されている（非特許文献２１参照）。マウスβデフェンシン−２は標的細胞へのウイルスの侵入を阻止することによってウイルス感染を阻害することが証明されている（非特許文献１５参照）。θデフェンシンであるレトロサイクリン（ＲＣ２）は膜糖タンパクを架橋することによってウイルスと細胞の膜融合を阻害することが示されている（非特許文献１６参照）。抗体およびＴリンパ球などの獲得免疫システムのエフェクターは病原体に非常に特異的である。反対に、デフェンシンなどの自然免疫システムは、通常、微生物に対して広範囲な活性領域を有している。デフェンシンのユニークな性質は、薬剤耐性の機会を低下させて広範囲な領域を持つ抗ウイルス薬を開発するための魅力的な候補になる。抗ウイルス戦略のために、ウイルスの侵入、ウイルスＲＮＡの放出、ウイルス複製および放出の阻害は、抗ウイルス薬の開発のための標的として選択されるであろう。
【０００６】
新興感染を引き起こすオルソミクソウイルス、パラミクソウイルスおよびコロナウイルスなどの一般的な呼吸器ウイルスファミリーに対する特異的な抗ウイルス薬は入手ができないか、または、これらのウイルス遺伝子は迅速な変異のために薬剤耐性が出現する傾向にある（非特許文献２２、非特許文献２３および非特許文献２４参照）。マウスまたはヒトのデフェンシンの多くはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの抗ウイルス活性を有することが発見されているが（非特許文献２５、非特許文献２６および非特許文献２７参照）、治療薬としてのデフェンシンの開発は、不十分な有効性、副作用および商業規模生産のコスト効率が良い手段がないことなどのいくつかのファクターによって妨げられている。
【０００７】
そのため、安全で、有効で、広範な領域の抗ウイルス薬が、新興ウイルス呼吸器疾患に対抗するために緊急に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚａｓｌｏｆｆ，Ｍ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，３８９−３９５（２００２）
【非特許文献２】Ｒｏｈｒｌ，Ｊ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．，Ｋｏｅｈｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｅ．Ｋ．＆Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．Ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  １４（Ｄｅｆｂ１４）ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ＣＣＲ６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８８，４９３１−４９３９（２０１２）
【非特許文献３】Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ：ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ＣＣＲ６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，５２５−５２８（１９９９）
【非特許文献４】Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．Ｐｒｉｍａｔｅ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，７２７−７３８（２００４）
【非特許文献５】Ｓｅｌｓｔｅｄ，Ｍ．Ｅ．＆Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ，Ａ．Ｊ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，５５１−５５７（２００５）
【非特許文献６】Ｌｅｈｒｅｒ，  Ｒ．Ｉ．  ＆  Ｇａｎｚ，  Ｔ．  Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９，  １８−２２  （２００２）
【非特許文献７】Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｍ．Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎｓ，ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７５，３９−４８（２００４）
【非特許文献８】Ｓｈａｉ，Ｙ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｌｙｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４６２，５５−７０（１９９９）
【非特許文献９】Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｗ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｏｒｅｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ｍａｇａｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ７９，２００２−２００９（２０００）
【非特許文献１０】Ｂｒｏｇｄｅｎ，Ｋ．Ａ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍｅｒｓ  ｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ？  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３，２３８−２５０（２００５）
【非特許文献１１】Ｈａｌｅ，Ｊ．Ｄ．＆Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ  ５，９５１−９５９（２００７）
【非特許文献１２】Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｕｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７，１０１０−１０１３（２０１０）
【非特許文献１３】Ｎｉｚｅｔ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｆｒｏｍ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，４５４−４５７（２００１）
【非特許文献１４】Ｍｙｇｉｎｄ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｅｃｔａｓｉｎ  ｉｓ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，９７５−９８０（２００５）
【非特許文献１５】Ｇｏｎｇ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｔｓ  ｅｎｔｒｙ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５５，４９１−４９８（２０１０）
【非特許文献１６】Ｌｅｉｋｉｎａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｖｉｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｔｒｙ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，９９５−１００１（２００５）
【非特許文献１７】Ｋｒｉｓｈｎａｋｕｍａｒｉ，Ｖ．，Ｒａｎｇａｒａｊ，Ｎ．＆Ｎａｇａｒａｊ，Ｒ．  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ＨＢＤ−１  ｔｏ  ＨＢＤ−３  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎａｌｏｇｓ  Ｐｈｄ１  ｔｏ  Ｐｈｄ３．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５３，２５６−２６０（２００９）
【非特許文献１８】Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ３．Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５０，４６８−４７３（２０１０）
【非特許文献１９】Ｃｈｏｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｔｈａｎｇａｖｅｌ，Ｒ．Ｒ．＆Ｔａｎｇ，Ｘ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ（ＭＢＤ−１，−２，−３，ａｎｄ  −４）ｉｎ  ｕｐｐｅｒ  ａｎｄ  ｌｏｗｅｒ  ａｉｒｗａｙ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８０，１３６−１４３（２００８）
【非特許文献２０】Ｊｕ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ／ＡＰ−１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  ３３，３３５−３４１（２０１２）
【非特許文献２１】Ｓａｌｖａｔｏｒｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ａｌｐｈａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ（ｓ）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６，８３５−８４３（２００７）
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎｇ，Ｖ．Ｃ．，Ｓ．Ｋ．Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．Ｗｏｏ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ．２００７．Ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２０：６６０−６９４
【非特許文献２３】Ｃｈｅｎｇ，Ｖ．Ｃ．，Ｋ．Ｋ．Ｔｏ，Ｈ．Ｔｓｅ，Ｉ．Ｆ．Ｈｕｎｇ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ．２０１２．Ｔｗｏ  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／２００９／Ｈ１Ｎ１：ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ？  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２５：２２３−２６３
【非特許文献２４】Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ．２００８．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  １３：９５０−９７１
【非特許文献２５】Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｋｕａｎｇ，Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｌｉ，Ｔ．Ｇｏｎｇ，Ｚ．Ｊｉａｎｇ，Ｄ．Ｙａｎｇ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｌｉ．２００９．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３  ｉｎ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｖｉｒｕｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５４：６３９−６４７
【非特許文献２６】Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ，Ｍ．Ｅ．，Ｍ．Ｍ．Ｌｅｄｅｒｍａｎ，Ｚ．Ｆｅｎｇ，Ｂ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｊ．Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．Ｒ．Ｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｌ．Ｍａｒｏｔｔａ，Ｍ．Ｍｉｒｚａ，Ｂ．Ｊｉａｎｇ，Ｐ．Ｋｉｓｅｒ，Ｋ．Ｍｅｄｖｉｋ，Ｓ．Ｆ．Ｓｉｅｇ，  ａｎｄ  Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ．２００３．Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ２  ａｎｄ  ３  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｉｄｓ  １７：Ｆ３９−４８
【非特許文献２７】Ｓｕｎ，Ｌ．，Ｃ．Ｍ．Ｆｉｎｎｅｇａｎ，Ｔ．Ｋｉｓｈ−Ｃａｔａｌｏｎｅ，Ｒ．Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ，Ｐ．Ｇａｒｚｉｎｏ−Ｄｅｍｏ，Ｇ．Ｍ．Ｌａ  Ｔｅｒｒａ  Ｍａｇｇｉｏｒｅ，Ｓ．  Ｂｅｒｒｏｎｅ，Ｃ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｚ．Ｗｕ，Ｓ．Ａｂｄｅｌｗａｈａｂ，Ｗ．Ｌｕ，  ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｚｉｎｏ−Ｄｅｍｏ．２００５．Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１４３１８−１４３２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明のひとつの目的は、呼吸器ウイルスの感染を阻害する活性を有するペプチドを提供することである。本発明の別の目的はこのペプチドを合成する方法、このペプチドを含む組成物、このペプチドをコードする単離されたＤＮＡ、作動可能にプロモータと結合したＤＮＡを含む発現ベクターおよびその発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。本発明のまた別の目的は、標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を妨ぐ方法、および、呼吸器ウイルスの感染を予防または治療するための薬剤を提供することである。本発明のまた別の目的は、呼吸器ウイルスの感染を阻害できるペプチドをスクリーニングするためのキットとそのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は化学的経路を介してまたは遺伝子工学プロセスによって合成されるペプチドを提供する。そこでは、このペプチドは呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合可能な機能的領域を有し、呼吸器ウイルスの感染を阻害する活性を有する。
【００１１】
好ましくは、このペプチドは、さらに、細胞内の後期エンドソーム内の酸性化を妨げる機能を有する。
【００１２】
好ましくは、このペプチドは５つ以上の塩基性アミノ酸を有し、より好ましくは、このペプチドはそのＮ末端領域またはＣ末端領域に２つ以上の塩基性アミノ酸を有し、さらに好ましくは、ペプチドはそのＮ末端領域またはＣ末端領域に３つ以上の塩基性アミノ酸を有する。
【００１３】
好ましくは、ペプチドは４つ以上のシステインを有する。
【００１４】
好ましくは、ペプチドは以下に記載するアミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を有する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に記載されるアミノ酸配列；または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および／または付加によって得られたアミノ酸配列。
【００１５】
好ましくは、アミノ酸配列（ｂ）は、アミノ酸配列（ａ）と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。
【００１６】
好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７に記載されているものである。
【００１７】
好ましくは、Ｎ末端領域はこのペプチドのＮ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個未満の配列を含み、Ｃ末端領域はこのペプチドのＣ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個未満の配列を含む。
【００１８】
好ましくは、Ｃ末端領域は２つのシステインおよび塩基性アミノ酸を有する。
【００１９】
好ましくは、Ｃ末端領域には以下のアミノ酸組成を有する１０個のアミノ酸がある：
塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−システイン−システイン−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸-遊離カルボキシル。
【００２０】
好ましくは、このペプチドはヒトまたはマウスを起源とする。より好ましくは、このペプチドはマウスβデフェンシン−４を起源とする。
【００２１】
好ましくは、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択される。そのインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスのサブタイプであるＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７を含んでおり、コロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶとＭＥＲＳ−ＣｏＶを含んでいる。
【００２２】
本発明の別の態様は、以下を含む組成物を提供する：
本発明のペプチドのいずれかひとつ；および
薬学的に許容される賦形剤。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、下記プロセスを含む、標的細胞の呼吸器ウイルス感染を防御する方法を提供する：
標的細胞および呼吸器ウイルスを含む系において、本発明のペプチドのいずれかひとつを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス；
該ペプチドによって標的細胞の後期エンドソームにウイルスＲＮＡの放出を阻害させ、その結果、標的細胞において呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス；
ここで、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスとコロナウイルスから選択され、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７が含まれ、コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる。
【００２４】
好ましくは、ウイルスへのペプチドの結合にはウイルスの表面糖タンパクへのペプチドの結合が含まれる。このペプチドは後期エンドソーム内のｐＨ低下を阻害することによってウイルスＲＮＡ放出を抑制することができる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、呼吸器ウイルスの感染の予防または治療のための医薬品の製造のための本発明のペプチドのいずれかひとつの使用を提供する。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、化学的経路を介するまたは遺伝子工学プロセスによるペプチドの合成を含む、本発明のペプチドのいずれかひとつの製造方法を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、本発明のペプチドのいずれかひとつをコードする単離ＤＮＡを提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、作動可能にプロモータと結合した本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
【００２９】
本発明のさらに別の態様は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、以下を含む呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングするためのキットを提供する：
本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照；および
呼吸器ウイルスに感染できる標的細胞。
【００３１】
好ましくは、そのキットにはさらに細胞培養液が含まれる。
【００３２】
好ましくは、そのキットにはさらに陰性対照またはブランク対照が含まれる。
【００３３】
好ましくは、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７が含まれ、コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる。
【００３４】
好ましくは、その標的細胞はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）、アカゲザル胎児腎細胞（ＦＲｈＫ−４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８８）およびアフリカミドリザル腎Ｅ６細胞（Ｖｅｒｏ−Ｅ６，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８６）から選択される。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、以下のステップを含む呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングする方法を提供する：
ａ）単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ；
ｂ）本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照を準備するステップ；
ｃ）候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ；
ｄ）候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ；
ｅ）標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ；
ｆ）陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
【発明の効果】
【００３６】
本発明は、様々な呼吸器ウイルス感染を抑制できるペプチドを提供し、呼吸器ウイルスの感染阻害におけるペプチドのメカニズムを開示する。呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合可能な機能的領域によって、このペプチドはウイルスの表面糖タンパクに結合し、次いでエンドサイトーシスを介して細胞のエンドソームに達することができる。このペプチドは塩基性アミノ酸が多いので後期エンドソーム内のｐＨの低下を抑制し、その結果、ウイルスとエンドソームの膜融合とそれに続くウイルスの分解およびウイルスＲＮＡの放出を妨げる。したがって本発明のペプチドは、インフルエンザウイルスおよびコロナウイルスの様々なサブタイプなどの呼吸器ウイルスの感染を妨ぐ強力な活性を示し、標的細胞の呼吸器ウイルス感染の阻止および呼吸器ウイルスの感染予防および治療に使用できる。本発明は呼吸器ウイルスの感染阻害におけるこうしたペプチドのメカニズムを開示し、広範囲な抗ウイルス活性領域を持つ新しい予防および治療薬の開発のための理論的根拠を提供し、予防および治療薬の開発のための道を開く。
【００３７】
添付の図面を参照しながら、実施例により本発明の好適態様について説明する：
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、組換えマウスβデフェンシン−４（ｒｍＢＤ４）の構造、発現および精製を示す。（Ａ）はマウスβデフェンシン−４（ｒｍＢＤ４）遺伝子の原コドンをＯＰＴＩＭＩＺＥＲによって大腸菌に適したコドンに最適化したことを示す。（Ｂ）は最適化した配列に基づき、６組のオリゴヌクレオチドがＰＣＲによるｒｍＢＤ４遺伝子の合成のためにデザインされていることを示す。下線を付したヌクレオチドはＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの認識部位を示す。（Ｃ）はβデフェンシン−４融合タンパクであるＴｒｘ−ｒｍＢＤ４（Ｔｒｘ−β−Ｄ−４）の発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を示す。この分析ではサンプルのタンパクを１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで最初に分解し、クーマシーブリリアントブルー溶液で染色することによって可視化し、ゲル上で平行して分解されたタンパクをＰＶＤＦ膜に転写し、一次抗体としてウサギ抗ｍＢＤ４抗体（１：２，０００，中国のＭａｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．より入手可能）、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合（ＨＲＰ−）ヤギ抗ウサギ抗体（１：３，０００，デンマークのＤａｋｏより入手可能）を用いてウエスタンブロットによって検出した。そして（Ｄ）は精製されたＴｒｘ−β−Ｄ−４、切断されたＴｒｘ−β−Ｄ−４および精製されたｒｍＢＤ４のトリシンゲル（１６％（ｗ／ｖ））電気泳動を示す（すなわち回復したβ−Ｄ−４を図１Ｄに示す。）。
【図２】図２はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのペプチドの抗ウイルス活性および細胞毒性の評価を示す。（Ａ）はＭＤＣＫ細胞培養のプラークアッセイによる３０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）およびＭＥＭ中のｍＢＤ４由来の１１の短鎖ペプチドの抗ウイルス活性のスクリーニングを示す。（Ｂ）はプラークアッセイによるＰＢ中で異なる濃度のＰ９の抗ウイルス効果の検出を示す。（Ｃ）はテトラゾリウムを基にした比色アッセイ（ＭＴＴ）を用いたＰ９，ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４の細胞毒性の検出を示す。
【図３】図３は致死的ウイルス感染マウスモデルでのＰ９の予防および治療効果の評価を示す。（Ａ）は致死的ウイルスの感染前にＰ９またはｒｍＢＤ４（５０μｇ／マウス）を鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与したマウスの生存率を示す。（Ｂ）は致死的ウイルスの感染４時間後にＰ９またはｒｍＢＤ４（５０μｇ／マウス）を鼻腔内投与したマウスの生存率を示す。（Ｃ）は致死的ウイルスの感染４時間後に示された用量（２００または４００μｇ／マウス）でＰ９を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与したマウスの生存率を示す。生存率の統計的有意差（９マウス／群）はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５によって解析し、Ｐ値をこれらの図に示した。
【図４】図４は、予防的および治療的にＰ９またはｒｍＢＤ４を投与したマウスの肺組織でのウイルス量と病理組織学的変化の検出を示す。（Ａ）は予防投与（予防）または鼻腔内投与による治療（鼻腔内投与治療）または腹腔内投与による治療（腹腔内投与治療）を受けたマウスの肺組織内のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定されたウイルスＲＮＡコピー数を示し、そのデータは５頭のマウスの結果を平均＋ＳＤとして示し、＊印は２標本のスチューデントｔ検定による解析としてＰ＜０．０５を示す。（Ｂ）はマウスの肺組織内の感染ウイルス力価のプラークアッセイによる検出を示し、その結果は５頭のマウスの結果を平均＋ＳＤとして示し、＊印は２標本のスチューデントｔ検定による解析としてＰ＜０．０５を示す。（Ｃ）はＨ＆Ｅ染色によって試験されたマウス肺組織内の病理組織学的変化を示す画像を提供する。Ｐ９を投与されたマウス（予防、鼻腔内投与治療または腹腔内投与治療）またはｒｍＢＤ４を投与されたマウス（予防または鼻腔内投与治療）、非投与マウス（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）および非感染マウス（Ｎｏｒｍａｌ）の典型的な肺組織の病理切片を図４Ｃに示す（元の倍率は１００×）。
【図５】図５は、Ｐ９がウイルスとの反応を介したＭＤＣＫ細胞のウイルス感染を阻害したことを示す。（Ａ）〜（Ｃ）はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで検出した感染後の表示された時点で収集した感染細胞内のウイルスＲＮＡコピー数を示す。（Ｄ）〜（Ｆ）はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで検出した感染後の表示された時点で収集した培養上清中のウイルスコピー数を示す。（Ｇ）〜（Ｉ）はプラークアッセイで検出した感染後の表示された時点で収集した培養上清中のウイルス力価を示す。非投与ウイルスコントロール（ＶＣ）が実験に含まれる。これらの図において、データは３つの個別の実験で平均＋ＳＤとして示され、＊印は２標本のスチューデントｔ検定による解析としてＰ＜０．０５を示す。
【図６】図６は、Ｐ９がウイルス粒子およびウイルス表面タンパクヘマグルチニン（ＨＡ）に結合することを示す。（Ａ）は共焦点顕微鏡で撮影された典型的な蛍光画像（元の倍率４００×）を示し、その結果は、Ｐ９が細胞ではなくウイルスに結合することを示す。（Ｃ）はＥＬＩＳＡで検出されたＰ９のＨＡおよびＮＡへの結合の親和性を示し、その結果は、Ｐ９がＮＡではなくＨＡに結合することを裏付ける。
【図７】図７は、Ｐ９がウイルス−受容体結合やエンドサイトーシスを阻害するのではなく、後期エンドソームにウイルスＲＮＡの放出を抑制させることを示す。（Ａ）および（Ｂ）は共焦点顕微鏡によって撮影された典型的な蛍光画像（元の倍率４００×）を示し、特に、（Ａ）の結果はＰ９がウイルス受容体結合およびエンドサイトーシスを抑制しないことを示し、（Ｂ）はウイルス（Ｂの左図に見られるように、カラー画像中では緑色スポット。白黒画像では灰色のスポットに対応する）とＰ９（Ｂの中図に見られるように、カラー画像中では赤スポット。白黒画像では灰色のスポットに対応する）の共局在（Ｂの右図に見られるように、カラー画像中ではオレンジのスポット。白黒画像では灰色のスポットに対応する）が感染の２時間後に示されることを示す。（Ｃ）は非投与ウイルス（「ＶＣ」と示す）またはＰ９を用いて前投与されたウイルス（「Ｐ９」と示す）を用いたＭＤＣＫ細胞の感染、表示された時点での感染細胞の採取およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡコピー数の検出によって得られた結果を示し、その結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。
【図８】図８は、Ｐ９が後期エンドソーム内のｐＨの低下を抑制し、感染細胞へのウイルスＲＮＡの放出を抑制することを示す。（Ａ）は表示された時点で収集され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出された細胞サンプル中のウイルスＲＮＡのコピー数を示し、その結果は、Ｐ９の阻害効果が後期エンドソーム阻害剤（ＮＨ４Ｃｌ）の阻害効果と同様であることを示す。（Ｂ）は共焦点顕微鏡によって撮影されたエンドソーム酸性化の検出を示す画像を提供し、白い矢印はウイルス局在（Ｂの左下図に見られるように、カラー画像中では緑スポット。白黒画像では灰色のスポットに対応する）およびそれに対応するエンドソーム酸性化（Ｂの左上図に見られるように、カラー画像中では赤スポット。白黒画像では灰色のスポットに対応する）を示し、一方、Ｐ９で事前に処理したウイルスで感染させた細胞では、エンドソーム酸性化は検出されなかった（Ｂの右上の図参照）が、エンドソーム中にウイルスは検出された（Ｂの右下図に見られるように、カラー画像中では緑スポット。白黒画像で灰色のスポットに対応する）。
【図９】図９は、Ｐ９中の塩基性アミノ酸がウイルス感染の阻害において重要な役割を果たしていることを示す。（Ａ）は、中性または酸性アミノ酸を有するＰ９のＣ末端に１〜３の塩基性アミノ酸を置換することにより（Ｐ９−Ｓ１、Ｐ９−Ｓ２およびＰ９−Ｓ３）、またはＰ９のＮ末端に３つの酸性アミノ酸を付加することにより（Ｐ９−ａｃｉ−１）、またはＰ９のＮ末端に３つの塩基性アミノ酸を付加することにより（Ｐ９−ＫＨＲ）得られたＰ９アナログペプチド（以下の表３を参照）などの示されたペプチドを示された濃度で、陰性コントロール（ＮＣ）として含まれるウシ血清アルブミンを用いたＥＬＩＳＡでテストしたウイルスタンパクＨＡに対する結合の親和性を示す。（Ｂ）はヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイによって測定されたウイルスＨＡタンパクのヘマグルチニンに対するペプチドの阻害活性を示す。（Ｃ）はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いたＭＤＣＫ細胞内でのＰ９アナログペプチドの抗ウイルス効果の検出結果を示す。
【図１０】図１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの広範囲な呼吸器ウイルスの感染に対するＰ９の抗ウイルス効果の検出を示す。５０％阻害効果（ＩＣ５０）をそれぞれ点線で示し、その結果を３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示した。図１０では、グラフ（ａ）はプラークアッセイによるインフルエンザＡウイルスの異なったサブタイプの感染に対するＰ９の抗ウイルス効果の検出を示し、グラフ（ｂ）はプラークアッセイによるＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染に対するＰ９の抗ウイルス効果の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、化学的経路を介して、または、遺伝子工学プロセスによって合成されたペプチドを提供する。このペプチドは、呼吸器ウイルスの表面糖タンパクと結合できる機能性領域を有し、呼吸器ウイルスの感染抑制の活性を有する。
【００４０】
例えば、呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５またはＨ７などのインフルエンザウイルスの場合、本発明のペプチドはウイルスの表面糖タンパクＨＡに結合することができる。呼吸器ウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶまたはＭＥＲＳ−ＣｏＶなどのコロナウイルスの場合、本発明のペプチドはウイルスの表面糖タンパクであるスパイクタンパク（Ｓタンパク）に結合することができる。
【００４１】
呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合できる機能性領域を有するため、このペプチドは呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合でき、さらには呼吸器ウイルスの感染阻害活性を発揮するためにエンドサイトーシスを通して細胞のエンドソーム内に輸送される。
【００４２】
好ましくは、本発明のペプチドは、さらに後期エンドソーム内の酸性化を妨げる機能を有する。特に、このペプチドはウイルス−エンドソーム膜融合を阻止するために後期エンドソーム内のｐＨ低下を抑制し、その結果、ウイルス分解およびウイルスＲＮＡ放出を抑制することができる。
【００４３】
好ましくは、本発明のペプチドは５つ以上（例えば、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６以下）の塩基性アミノ酸を有する。好ましくは、このペプチドは、そのＮ末端領域またはＣ末端領域に２つ以上（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３以下）の塩基性アミノ酸を有する。より好ましくは、このペプチドは、そのＮ末端領域またはＣ末端領域に３つ以上（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４以下）の塩基性アミノ酸を有する。
【００４４】
また、本発明の好適なペプチドは４つ以上（例えば、１０、９、８、７、６、５以下）、好ましくは４〜６個のシステインを有する。
【００４５】
本発明においては、好ましくはペプチドのＮ末端領域にはこのペプチドのＮ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個以下の配列が含まれ、ペプチドのＣ末端領域にはこのペプチドのＣ末端アミノ酸から数えてアミノ酸１０個以下の配列が含まれる。
【００４６】
好ましくは、Ｃ末端領域は、２つのシステインを有し、塩基性アミノ酸が豊富である。本明細書で使用する「塩基性アミノ酸が豊富」という表現は、ペプチドのＣ末端に２個以上（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３以下）、好ましくは３〜６個の塩基性アミノ酸を有することを意味する。
【００４７】
より好ましくは、Ｃ末端領域は、以下のアミノ酸組成を持つ１０個のアミノ酸を有する：塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−システイン−システイン−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−遊離型カルボキシル。本明細書で使用されるＣ末端の「遊離型カルボキシル」とはＣ末端の塩基性アミノ酸のカルボキシルを示す。
【００４８】
本発明のペプチドは、好ましくは以下に示すアミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を有する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に記載されるアミノ酸配列；または
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および／または付加により得られたアミノ酸配列。
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に示されてるアミノ酸配列には、呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合できる機能性領域が含まれ、そのＣ末端領域は、２つのシステインを有し、塩基性アミノ酸が豊富である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、アミノ酸配列（ａ））は、呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合でき、呼吸器ウイルスの感染を防ぐために細胞の後期エンドソーム内の酸性化を抑制する機能を有する。
【００５０】
上述のアミノ酸配列（ｂ）を有するペプチドは、呼吸器ウイルスの感染抑制におけるペプチドの活性に対してそのアミノ酸の置換、除去および／または付加が実質的に影響を与えない限り、アミノ酸配列（ａ）において１個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および／または付加によって得られる。好ましくは、塩基性アミノ酸の数は、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および／または付加によって得られたアミノ酸配列において、変化しないかまたは増加する。アミノ酸配列（ｂ）はアミノ酸配列（ａ）と少なくとも７０％の相同性があることが好ましく、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９７％の相同性があることが好ましい。
【００５１】
また、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７に記載されているものが好ましい。上記のように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドは、呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合でき、呼吸器ウイルスの感染を妨げるために細胞の後期エンドソーム内の酸性化を妨げる機能を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に示されるアミノ酸配列のＣ末端のＮをひとつの塩基性アミノ酸Ｋに置換することによって得られる。この置換は呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに対するこのペプチドの結合親和性に影響を与えず、実質的に呼吸器ウイルスの感染に対するペプチドの効果に影響を与えないことが示された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７に記載されるペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０に示されるアミノ酸配列のＮ末端に３個の塩基性アミノ酸Ｋ，ＨおよびＲを付加することによって得られた。この付加は呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに対するこのペプチドの結合親和性に影響を与えず、また呼吸器ウイルスの感染に対するペプチドの効果に影響を与えないことが示された。
【００５２】
好ましくは、本発明のペプチドは、遺伝子工学（例えば、組換ペプチドとして得られる）または化学的合成方法により得られる。さらに本発明のペプチドは、マウスまたはヒト由来であることが好ましく、より好ましくは該ペプチドはマウスβデフェンシン−４（ｍＢＤ４）由来である。
【００５３】
開示された別の態様は、１つ以上の本発明のペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００５４】
組成物に使用されるペプチドの量は具体的な適用に応じて決定することができ、５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
【００５５】
本発明において、有用な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で通常使用されるものである。賦形剤は実用化の要件または具体的な用量に従って適切に選択でき、例えば「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｂａｏｑｉｕ  ＬＩ編著、Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ、２０１１年７月）の第４章「Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」（８２〜１００頁）などに開示されている場合もある。本発明の組成物において、薬学的に許容できる賦形剤は通常の範囲の量で使用することができ、実用化の要件に従って当業者はその適切な量を決定することができる。
【００５６】
開示された別の態様は、下記プロセスを含む、標的細胞の呼吸器ウイルス感染を防御する方法を提供する：
標的細胞およびウイルスを含む系において、本発明のペプチドを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス；および、
該ペプチドにより標的細胞の後期エンドソームにウイルスＲＮＡの放出を阻害させて、その結果、標的細胞において呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス。
【００５７】
好ましくは、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスとコロナウイルスから選択される。より好ましくは、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７が含まれ、コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる。
【００５８】
好ましくは、ウイルスとペプチドの結合にはウイルスの表面糖タンパクへのペプチドの結合が含まれる。さらにペプチドは、後期エンドソームにおけるｐＨの低下を抑制することによりウイルスＲＮＡの放出を抑制することができる。このように、ペプチドは標的細胞の呼吸器ウイルスの感染を妨げる効果を与える。
【００５９】
本発明の１つの特定の実施態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的細胞での呼吸器ウイルス感染の防御方法が実施される。
【００６０】
開示された別の態様は、呼吸器ウイルスの感染を予防または治療するための薬剤の製造のための本発明のペプチドのペプチドの使用を提供する。薬剤は、スプレーの形態、注射の形態（注射液または注射用凍結乾燥粉末など）、経口薬等の形態等で提供することができる。
【００６１】
開示された別の態様は、呼吸器ウイルスに感染しているか、呼吸器ウイルスの感染症を発症するリスクのある対象を治療又は予防する方法を提供する。該方法は、１種以上の本発明のペプチドを有効量、対象に投与するステップを含む。
【００６２】
ペプチドが呼吸器ウイルスに感染した対象の治療に使用される場合、投与量は治療に有効な量である。例えば、治療で使用される本発明のペプチドの合計投与量は、１〜４０ｍｇ／ｋｇ重／日の範囲とすることができ、好ましくは２〜２０ｍｇ／ｋｇ重／日であり、より好ましくは２．５〜１０／ｋｇ重／日である。
【００６３】
ペプチドが呼吸器ウイルスの感染症を発症するリスクのある対象の予防療法に使用される場合、投与量は予防に有効な量である。例えば、予防療法で使用される本発明のペプチドの合計投与量は、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ重／日の範囲とすることができ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ重／日であり、より好ましくは１〜１０／ｋｇ重／日である。
【００６４】
本発明のペプチドは、鼻腔内接種（例えばスプレー）または静脈注射（例えば腹腔内注射）で投与することができる。
【００６５】
本明細書に記載された呼吸器ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスとコロナウイルスを含む。より好ましくは、インフルエンザウイルスには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９等のインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７が含まれ、コロナウイルスにはＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶが含まれる。
【００６６】
開示された別の態様は、化学的経路を介するまたは生物学的方法（すなわち遺伝子工学）によるペプチドの合成を含む、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
【００６７】
当技術分野の一般的なプロセスを通して化学的方法または生物学的方法で所望のペプチドを合成することができる。例えば化学反応を経由して構成アミノ酸をひとつずつ結合することによって、化学的に所望のペプチドを合成できる。生物学方法による所望のペプチドの合成は、例えば以下のステップを含むことができる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を介して所望のペプチドをコードするＤＮＡを増幅するステップ；発現ベクターにＤＮＡをサブクローン化するステップ；真核性または原核性の宿主細胞に、ＤＮＡを含む発現ベクターを形質導入または形質転換し、所望のペプチドを発現するステップ。
【００６８】
開示された別の態様は、本発明のペプチドのいずれか１つをコードする単離ＤＮＡを提供する。
【００６９】
開示された別の態様は、作動可能にプロモータと結合した本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
【００７０】
本明細書に使用される用語「発現ベクター」は、作動可能に結合した遺伝子を発現させることができるベクターをいう。発現させる本発明のＤＮＡに作動可能にプロモータ配列が結合することによって、対応する本発明のペプチドの発現がプロモータ配列により促進される。一般的に遺伝子工学の技術で役に立つ発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。しかしながら、この開示は他の公知の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【００７１】
プロモーターがＤＮＡをＲＮＡに発現することを促進できる場合、プロモータと本発明のペプチドをコードするＤＮＡは「作動可能に結合している」。前記プロモーターは、遺伝子工学の分野で通常使用されるプロモータであってもよい。
【００７２】
また、本発明の発現ベクターは付加配列または翻訳レベルを増強することやコンストラクトから他の配列への読み過ごしを最小限にすることに役立つであろう終止配列等の配列を含むことができる。また発現ベクターは、例えばこれらのベクターを有する細胞をスクリーニングすることを可能とする抗生物質耐性遺伝子の形の選択マーカーをさらに有することができる。
【００７３】
開示された別の態様は、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００７４】
本明細書に使用される用語「宿主細胞」は、本発明の発現ベクターが導入された細胞をいう。その細胞は、例えば大量の本発明の発現ベクターを急速に産生するのに用いることができる原核細胞であってもよい。
【００７５】
宿主細胞は、一時的にまたは安定的に本発明の発現ベクターを用いて形質転換することができる。細胞への発現ベクターのこのような形質転換は、これには限定されないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿またはエレクトロポレーションなど当該分野で公知の任意の技術を介して達成することができる。
【００７６】
開示された別の態様は、対照が本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照；および呼吸器ウイルスに感染できる標的細胞を含む呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングするためのキットを提供する。
【００７７】
好ましくは、そのキットにはさらに細胞培養液が含まれる。より好ましくは、そのキットにはさらに陰性対照またはブランク対照が含まれる。陰性対照またはブランク対照は、標的細胞の呼吸器ウイルスの感染を抑制できないペプチドである。
【００７８】
前記標的細胞は呼吸器ウイルスに感染するものであり、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）、アカゲザル胎児腎細胞（ＦＲｈＫ−４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８８）およびアフリカミドリザル腎Ｅ６細胞から（Ｖｅｒｏ−Ｅ６，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８６）選択できる。呼吸器ウイルスは、インフルエンザウイルスとコロナウイルスから選択できる。好ましくは、インフルエンザウイルスはインフルエンザウイルスサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７を含む。またコロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶとＭＥＲＳ−ＣｏＶを含む。
【００７９】
開示された別の態様は、以下のステップを含む呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングする方法を提供する：
ａ）単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ；
ｂ）本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照を準備するステップ；
ｃ）候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ；
ｄ）候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ；
ｅ）標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ；
ｆ）陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
【００８０】
本発明の特定の実施態様では、呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００８１】
以下に図面を参照しながら実施例により本発明を詳細に説明する。本発明の対象、特徴、および態様は、以下の記載に開示され、または以下の記載により明白である。この記載は例示的な実施形態を説明する目的のためだけに提供されるものであり、例示的な構成で具体化される本発明のさらに広範な態様を限定することを意図するものではないことを当業者は理解する。
【実施例】
【００８２】
材料と方法
ウイルスと細胞培養
非常に悪性のマウスのインフルエンザＡ型ウイルスの変異株であるＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４１５７４２Ｍｄ／２００９（Ｈ１Ｎ１）（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄ２２５Ｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｆ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ１Ｎ１  （２００９）ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）２３５，９８１−９８８（２０１０）”参照）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−５４４）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（“Ｃｈａｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｎｄ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ．Ｎｏｖ．１１，２００５；６：１３５”参照）、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３（Ｈ７Ｎ７）（“Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈ７Ｎ７）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａ  ｆａｔａｌ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３５６−１３６１．２００４”参照）およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（“Ｇａｏ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｖｉａｎ−ｏｒｉｇｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ７Ｎ９）ｖｉｒｕｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６８（２０）：１８８８−９７．Ｍａｙ  ２０１３”参照）は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）細胞で培養し、これらの力価はプラークおよびＴＣＩＤ５０アッセイによって検出した（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｉｌｌ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，８０９１−８０９６（２００８）”参照）。重篤な急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＲＡＳ−ＣｏＶ）株のＨＫＵ３９８４９は、アカゲザル胎児腎臓細胞（ＦＲｈＫ−４，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８８）で培養し（“Ｐｅｉｒｉｓ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｌａｎｃｅｔ．３６１（９３６６）：１３１９−２５．Ａｐｒ．２００３”参照）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）株のｈＣｏＶ−ＥＭＣ／２０１２（Ｄｒ．Ｒｏｎ  Ｆｏｕｃｈｉｅｒ，Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ���ら供与）は、アフリカミドリザル腎臓Ｅ６細胞（Ｖｅｒｏ−Ｅ６，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８６）で培養し、それらの力価はプラークおよびＴＣＩＤ５０アッセイによって検出した（“Ｚｈｏｎｇ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）  ｉｎ  Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ，ｉｎ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００３．Ｌａｎｃｅｔ  ３６２，１３５３−１３５８（２００３）”参照）。
【００８３】
組換えマウスデフェンシン−４のクローニング、発現および精製
マウスβデフェンシン−４（ｍＢＤ４）のコドンはＯＰＴＩＭＩＺＥＲに基づき大腸菌に適したコドンに最適化した（図１Ａ）（“Ｐｕｉｇｂｏ，Ｐ．，Ｇｕｚｍａｎ，Ｅ．，Ｒｏｍｅｕ，Ａ．  ＆  Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｌｖｅ，Ｓ．ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｗ１２６−１３１（２００７）”参照）。ｍＢＤ４の遺伝子断片を６塩基対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲに基づく遺伝子合成によって生産した（図１Ｂ）。コドンを最適化した遺伝子は、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）にクローニングし、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位でＰＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）にサブクローン化した。作製したプラスミドはチオレドキシンβデフェンシン−４融合蛋白質（Ｔｒｘ−β−Ｄ−４）を発現するためにＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。Ｔｒｘ−β−Ｄ−４は簡単な浸透圧ショック法によって大腸菌細胞質から放出され（“ＭｃＣｏｙ，Ｊ．＆Ｌａｖａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ｕｎｉｔ  １６  １８（２００１）”参照）、さらに取り扱い説明書に従い、ＨｉｓをトラップするＦＦカラムを用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イギリス）によって精製された（図１Ｃ）。組み換えマウスβデフェンシン−４を放出するために８０μｇのＴｒｘ−β−Ｄ−４を１Ｕ  ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）で分解した（短いｒｍＢＤ４またはβ−Ｄ−４）。β−Ｄ−４は、取扱説明書に従い、Ｓｐ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーによって回収した。精製したβ−Ｄ−４は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中にＰＤ−１０カラムを用いて脱塩した（図１Ｄ）。
【００８４】
抗ウイルス効果のペプチドデザインと評価
ｍＢＤ４由来の全長のｍＢＤ４（ｓｍＢＤ４）と短鎖ペプチドを表１に示すようにデザインし、それらをＭｏｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（上海，中国）によって化学的に合成し、確認した。最初に、短鎖ペプチドであるｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４の抗ウイルス効果を、低塩培地、すなわち２４．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および５．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含む３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（“Ｇｏｎｇ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｔｓ  ｅｎｔｒｙ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５５，４９１−４９８（２０１０）”参照）および高塩濃度培地ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で評価した。ペプチド（２５μｇ／ｍｌ）を、ＰＢまたはＭＥＭ中でＨ１Ｎ１ウイルス（５０ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）と事前に混合し、１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。ペプチドで事前に処理したウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、プラークアッセイを用いてこのペプチドの抗ウイルス活性を測定した（“Ｓｕｉ，Ｈ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍ２  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ５６７１（２００９）”参照）。
【００８５】
【表１】
2016520052.tif 000002
【００８６】
細胞毒性およびＩＣ５０アッセイ
ペプチドの細胞毒性をテトラゾリウムベースの比色（ＭＴＴ）アッセイを用いた５０％毒性濃度（ＴＣ５０）の検出によって測定した（“Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０，３０９−３２１（１９８８）”参照）。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞を９６穴プレートで一晩培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）（以下に記載したＰＢＳもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡから購入）、様々な濃度のペプチドを含んだ、またはペプチドを含まない１００μｌ／ｗｅｌｌのＭＥＭを３連で添加した。３７℃で２４時間インキュベートした後、１０μｌ／ｗｅｌｌのＭＴＴ溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，中国）をプレートに添加した。プレートを４時間インキュベートした後、１００μｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌ中の１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを各ウェルに添加した。さらに、３７℃で一晩インキュベートした後、そのプレートをＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｘ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を用いてＯＤ５７０およびＯＤ６４０の吸光度を測定した。
【００８７】
実験は、以下の参考文献に開示された方法により実施した。ただし、インフルエンザＡ型ウイルスの異なったサブタイプ、すなわちＨ１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，Ｈ５Ｎ１，Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９、コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびｈＣｏＶ−ＥＭＣの感染に対するペプチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をプラークアッセイによって直接測定すること、および／または、感染後１８時間に集められた培養上清中のウイルス力価をプラークアッセイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて間接的に検出することを除く（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｉｌｌ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，８０９１−８０９６（２００８）”参照）。
【００８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ウイルス効果の評価
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（１７−２１ｇ）を生物学的安全性レベル３の研究室で飼育し、標準の固形飼料および水を与えた。すべての実験のプロトコールは許可された生物学的安全性レベル３の動物施設の標準業務手順書に従い、動物倫理委員会によって承認された（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｉｌｌ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，８０９１−８０９６（２００８）”参照）。非常に悪性のマウスのインフルエンザＡ型ウイルスの変異株であるＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４１５７４２Ｍｄ／２００９（Ｈ１Ｎ１）はマウスの致死感染のために使用した。予防効果を評価するために、マウスに５０μｇ／マウスのＰ９またはｒｍＢＤ４を鼻腔内に接種（ｉ．ｎ．）し、その後、５ＬＤ５０のウイルスを感染させた。治療効果を評価するために、マウスに５ＬＤ５０のウイルスを感染させ、致死感染後４時間から開始し、１日おきにＰ９またはｒｍＢＤ４（５０μｇ／マウス／日）の３用量を鼻腔内に接種するか、１日おきに６日間、２００または４００μｇ／マウス／日のＰ９を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。生存および一般状態を２１日間または死亡まで観察した。ウイルス学的または病理学的検査のために、感染後５日目にマウスを屠殺した。血液および肺サンプルを収集した。
【００８９】
病理組織学的染色
感染マウスから収集した肺組織は、ＰＢＳ緩衝液中の１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで速やかに固定し、脱水を施し、パラフィンワックスで包埋した。４〜６μｍの厚さの切片をスライド上に載せた。ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡下で病理組織学的変化を観察した（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｉｌｌ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，８０９１−８０９６（２００８）”参照）。
【００９０】
ウイルスＲＮＡの抽出とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ウイルス量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出した（“Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄ２２５Ｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｆ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ１Ｎ１（２００９）ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）２３５，９８１−９８８（２０１０）”参照）。簡潔には、ウイルスＲＮＡはメーカーのプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて培養上清から抽出し、一方、細胞溶解液およびマウス肺組織中のウイルスＲＮＡはメーカーのプロトコールに従って、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。逆転写は、取り扱い説明書に従って、ＲＳＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて実施した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよび７５００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡ遺伝子のクローンは、陽性コントロールおよび標準物質として使用した。リアルタイムＰＣＲ実験は３連で実施した。
【００９１】
蛍光画像アッセイ
Ｈ１Ｎ１ウイルスは、取り扱い説明書に従って、緑色の蛍光疎水性色素Ｄｉｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて標識し、Ｐ９は、検出するために１：５０００に希釈したＲａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｓｍＢＤ４  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍａｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１：４００に希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ａｌｅｘａ５９４  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて赤色に標識した。細胞膜は、取り扱い説明書に従って、色素Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。標識したウイルスおよびＰ９は事前に１時間混合し、４℃または３７℃でＭＤＣＫ細胞とインキュベートした。感染細胞は、感染後の異なった時点でＰＢＳ緩衝液中１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン溶液にて固定し、画像を共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で撮影した。
【００９２】
エンドソームの酸性化の検出
ウイルス感染後のエンドソームの酸性化は、ｐＨ感受性色素、すなわちｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）の取り扱い説明書に従って、検出した。簡潔には、Ｈ１Ｎ１ウイルスは事前にＤｉｏで標識し、５０μｇ／ｍｌのＰ９（以下「Ｐ９処理」という）またはＰＢ（以下「非処理」という）と共に室温で４５分間インキュベートし、次いで４℃で１５分間インキュベートした。ＭＤＣＫ細胞に、５ＭＯＩのＰ９処理ウイルスまたは非処理ウイルスを接種し、４℃で１時間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌのｐＨ感受性色素（すなわち、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ）を細胞に添加し、４℃で１０分間インキュベーションを続け、その後、さらに３７℃で１０分間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、新しい培地をそれに添加し、直ぐに、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で画像を撮影した。
【００９３】
ウェスタンブロットアッセイ
ペプチドが結合したウイルスタンパクをウエスタンブロットアッセイによって同定した（“Ｇｕａｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｈｉｎａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，２７６−２７８（２００３）”参照）。簡潔には、ウイルスタンパクサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデンフロリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｈｉ−ｂｏｎｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）に転写した。一次抗体および二次抗体を希釈するためにＳｉｇｎａｌ  Ｂｏｏｓｔ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｋｉｔ（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＰＯＲＥ，ドイツ）を使用した。ウイルスタンパクと示された抗体またはペプチドの結合後、免疫反応したバンドを増幅化学発光によって可視化した。
【００９４】
エライザ（ＥＬＩＳＡ）
ウイルスタンパクへのペプチドの結合親和性は、ＥＬＩＳＡで検出した（“Ｄｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｎｇ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０，９４８−９５６（２００８）”参照）。簡潔には、異なった濃度のペプチドをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ブロッキング緩衝液（５％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン）と４℃で一晩インキュベートした。Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡまたはＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、ウイルスタンパクへのペプチドの結合親和性をウサギ抗Ｈｉｓ抗体（１：２，０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｖｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）またはウサギ抗ＨＡ抗体もしくはウサギ抗ＮＡ抗体（１：２，０００，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）によって測定し、二次抗体としてのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２，０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）によって認識し、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）で読んだ。
【００９５】
統計解析
マウスの生存と統計的有差を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｓｍ／）によって解析した。他の結果の統計的有意差は、Ｓｔａｔａ統計ソフトを用いて２標本のスチューデントｔ検定によって算出した。結果は、Ｐ＜０．０５で有意な差とみなした。
【００９６】
実施例
実施例１：抗ウィルスペプチドＰ９は培養細胞中で最も高い抗ウイルス活性を示した。
１１のｍＢＤ４由来ペプチドをデザインし、合成した（表１）。ｓｍＢＤ４，ｒｍＢＤ４および１１のｍＢＤ４由来ペプチド（表１）の抗ウイルス効果をインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ１Ｎ１）の感染に対して検出した。全長の合成ｍＢＤ４（ｓｍＢＤ４）および組み換えｍＢＤ４（ｒｍＢＤ４）と比べて、短鎖ペプチドＰ９（３０アミノ酸）は強力で、用量依存的な抗ウイルス活性を示し、一方、他の短鎖ペプチドは中間の抗ウイルス活性を示すか、または抗ウイルス活性はなかった（図２）。図２Ａでは、Ｈ１Ｎ１ウイルスを短鎖ペプチドおよび陽性コントロール（すなわち、ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４）のそれぞれと室温（Ｒ．Ｔ）で１時間、事前にインキュベートし、ＭＤＣＫ細胞に接種した。ウイルス感染に対する阻害効果はプラークアッセイにて検出した。感染率は、ペプチドで事前に処理したときのウイルスのプラーク数をＰＢで事前に処理したときのウイルスのプラーク数で割ることによって算出した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示した。図２Ａで示すように、Ｐ９は高い抗ウイルス活性を示し、それよりも短いＰ７およびＰ８は中間の抗ウイルス活性を示した。さらに、Ｐ９，ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４は、高塩濃度ＭＥＭ培地中に比べ、低塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢ）中でより有効であった。図２Ｂにおいて、Ｈ１Ｎ１ウイルス（５０ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を異なった濃度のＰ９、ｓｍＢＤ４またはｒｍＢＤ４で事前に処理した後、ＭＤＣＫ細胞に接種した。抗ウイルス活性はプラークアッセイにて検出した。ＩＣ５０は点線で示し、その結果は、ｓｍＢＤ４，ｒｍＢＤ４およびＰ９の平均ＩＣ５０が、それぞれ３．２μｇ／ｍｌ（０．７μＭ），１．５μｇ／ｍｌ（０．３３μＭ）および１．２μｇ／ｍｌ（０．３６μＭ）であった。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示した。Ｐ９のＩＣ５０は約１．２μｇ／ｍｌであり、ｓｍＢＤ４またはｒｍＢＤ４（それぞれ約３．２および１．５μｇ／ｍｌ）よりも低かった（図２Ｂ）。さらに、図２Ｃでは、Ｐ９，ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４の５０％毒性濃度（ＴＣ５０）をテトラゾリウムベースの比色（ＭＴＴ）アッセイを用いて検出した。その結果は、処理細胞の吸光度（ＯＤ）／未処理細胞の吸光度（ＯＤ）（すなわちＯＤ比）として示し、ＴＣ５０は点線で示した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示した。その結果、Ｐ９，ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４のＴＣ５０はそれぞれ８６０，９４および５８０μｇ／ｍｌであった（表２および図２Ｃ）。Ｐ９の細胞毒性が最も低く、ｓｍＢＤ４の９倍低かった。ｓｍＢＤ４の高い細胞毒性を考慮して、発明者らはそれを動物実験に含めなかった。Ｐ９の選択性指数（ＴＣ５０／ＩＣ５０）は７１７であり、ｍＢＤ４（選択指数：２９）およびｒｍＢＤ４（選択指数：３８７）に比べてそれぞれ約２５および２倍高かった。これらの結果は、Ｐ９がｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も高い抗ウイルス活性および選択指数を示すことを実証した。
【００９７】
【表２】
2016520052.tif 000003
【００９８】
実施例２：Ｐ９はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの致死感染に対して強力な防護効果を示した。
Ｐ９の予防および治療効果をＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの致死感染動物モデルで評価した（図３）。マウスの鼻腔内に致死用量のウイルスを接種する前に、Ｐ９またはｒｍＢＤ４を鼻腔内に接種したとき、Ｐ９投与したマウスの生存率は１００％（９／９）であり、ｒｍＢＤ４投与マウス（２２％（２／９））（Ｐ＜０．００８）および非投与マウス（０％）（Ｐ＜０．０００１）の生存率に比べて有意に高かった（図３Ａ）。Ｐ９の治療効果を評価するために、１日おきに致死感染４時間後に３用量（５０μｇ／１回／１日）のＰ９またはｒｍＢＤ４をマウスの鼻腔内に接種した（図３Ｂ）。その結果、Ｐ９およびｒｍＢＤ４を鼻腔内に投与したマウスの生存率はそれぞれ６７％（６／９）および３３％（３／９）であった。Ｐ９を鼻腔内投与したマウスの生存率は非投与マウスよりも有意に高く（Ｐ＜０．０１５）、ｒｍＢＤ４を投与したマウスに比べ、数値的に高かった（図３Ｂ）。さらに、投与量の影響を調べるために、感染４時間後に開始し、１日おきに６用量（２００または４００μｇ／１回／１日）のＰ９を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。その結果、マウスに４００μｇ／１回／１日のＰ９を腹腔内投与したときの生存率は５６％（５／９）であり、非投与マウスの生存率に比べて高かった（Ｐ＜０．０２６）が２００μｇ／１回／１日のＰ９を腹腔内投与したときの生存率は２２％（２／９）に低下した（図３Ｃ）。これらの結果から、用量依存効果が示された。本試験においてｒｍＢＤ４を鼻腔内に事前投与または事後投与したマウスではＰ９に比べて低い効果を示し、ｒｍＢＤ４を事前投与または事後投与したマウスでは生存率の統計的に有意な増加は示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００９９】
予防的投与、鼻腔内治療および腹腔内治療を受けたマウスの肺組織中のウィルスＲＮＡのコピー数およびウイルス力価をＲＴ−ＰＣＲ（図４Ａ）およびプラークアッセイ（図４Ｂ）にてそれぞれ検出した。その結果、Ｐ９の事前投与およびＰ９の鼻腔内投与または腹腔内投与したマウスの肺組織中のウイルス量は非投与マウスに比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。肺組織中の病理組織的変化をＨ＆Ｅ染色によって試験したところ、Ｐ９を事前投与または事後投与したマウスの肺胞損傷および間質炎症浸潤は、ｒｍＢＤ４を事前投与または事後投与したマウスおよび非投与マウスに比べ、重症度が低かった（図４Ｃ）。また、４００μｇ／１回／１日のＰ９を投与したマウスの肺胞損傷および間質炎症浸潤は２００μｇ／１回／１日のＰ９を投与したマウスに比べ重症度は低かった（図４Ｃ）。病理組織的結果は生存および肺組織のウイルス量の結果と一致した。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｐ９はｒｍＢＤ４に比べてＨ１Ｎ１ウイルスの致死感染に対する予防および治療効果がより高いことが示された。
【０１００】
実施例３：Ｐ９は、ウイルス表面の糖タンパクＨＡに結合することによってインフルエンザウイルス感染を阻害した。
Ｐ９がウイルス感染をどのように阻害するかを調べるために、ウイルス感染前にＰ９をＭＤＣＫ細胞もしくはＨ１Ｎ１ウイルスの事前処理に使用するか、またはウイルス感染後にＰ９を細胞培養液中に添加した。図５Ａ、５Ｄおよび５Ｇでは、ＭＤＣＫ細胞に０．３ＭＯＩのウイルスを感染させ、Ｐ９（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した（Ｐ９−ｍａｉｎｔで示す）。図５Ｂ、５Ｅおよび５Ｈでは、Ｐ９（２５μｇ／ｍｌ）で細胞を１時間事前処理し、０．３ＭＯＩのウイルスを感染させた（Ｐ９−ｃｅｌｌ−ｐｒｅで示す）。図５Ｃ、５Ｆおよび５Ｉでは、Ｐ９（２５μｇ／ｍｌ）で０．３ＭＯＩのウイルスを１時間事前処理し、細胞に接種した（Ｐ９−ｖｉｒｕｓ−ｐｒｅで示す）。感染細胞の内部（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）および細胞培養上清中（図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ）のウイルス量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定し、一方、上清中の感染ウイルスの力価は感染後の異なった時点でプラークアッセイにて検出した（図５Ｇ、５Ｈおよび５Ｉ）。その結果、培養液中で維持したときに、Ｐ９はウイルス複製および放出に対する有意な阻害効果は示さなかった（図５Ａ、５Ｄおよび５Ｇ）。また、細胞をＰ９で事前処理したときにウイルス感染は阻害されなかった（図５Ｂ、５Ｅおよび５Ｈ）。しかしながら、ウイルスをＰ９で事前処理したときに、細胞内および培養上清の両方のウイルス量は有意に減少した（Ｐ＜０．０５、図５Ｃ，５Ｆおよび５Ｉ）。これらの結果から（１）培養期間中、Ｐ９の存在下において感染細胞および培養上清中のウイルス量は、ウイルスを処理しなかったコントロールと同程度であったことから、Ｐ９は細胞内のウイルス複製および細胞からの放出を阻害できない（ＶＣで示す）、および（２）Ｐ９はウイルス感染を阻害するために標的細胞の表面ではなく、ウイルスに結合することよってウイルス感染を阻害できることが示された。
【０１０１】
Ｐ９がウイルス表面への結合によってウイルス感染を抑制することを確認するために、発明者らは、相互作用を観察するためにウイルスを緑色の蛍光で標識し、Ｐ９を赤色の蛍光で標識した。Ｄｉｏ色素で標識したウイルス（５ＭＯＩ）を５０μｇ／ｍｌのＰ９（図６ＡでＰ９−Ｖｉｒｕｓ−Ｐｒｅと示す）またはＰＢ（図６ＡでＶＣと示す）を用いて室温で１時間事前処理するか、またはＭＤＣＫ細胞を５０μｇ／ｍｌのＰ９を用いて室温で１時間事前処理した（図６ＡでＰ９−Ｃｅｌｌｓ−Ｐｒｅと示す）。ＭＤＣＫ細胞はウイルス（５ＭＯＩ）を感染させ、３７℃で１時間インキュベートした。次に、その細胞をＰＢＳ緩衝液中の１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定し、ウサギ抗ｓｍＢＤ４抗体およびＡｌｅｘ５９４標識したヤギ抗ウサギ抗体を用いて染色した。最後に、ＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で細胞核を染色した。典型的な画像を共焦点顕微鏡によって撮影した（元の倍率４００×）。図６Ａに示すように、ウイルスをＰ９で事前処理したときに、赤色で標識したＰ９（最初の列の真ん中の図の白黒画像においてグレーのスポットに対応）は緑色に標識されたウイルス粒子（最初の列の左図の白黒画像においてグレーのスポットに対応）に結合し、細胞内に運ばれた（カラー画像においてオレンジスポットであり、最初の列の右図に見られるように白黒画像においてグレーのスポットに対応）。一方、細胞を標識されたＰ９で事前処理したときに、Ｐ９は細胞膜または細胞の内側に検出されなかった。その結果から、Ｐ９がウイルス粒子に結合することによってウイルス感染を阻害することが確認された。
【０１０２】
発明者らは、さらに、Ｐ９によるウイルス表面タンパクの結合を同定した（図６Ｂおよび６Ｃ）。図６Ｂでは、Ｈ１Ｎ１ウイルスのウイルスタンパクを１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＤＶＦ膜に転写した。レーン１はクーマシーブリリアントブルー溶液で染色したウイルスタンパクを示す。レーン２に関しては、Ｐ９の結合を調べるために、転写した膜をＰ９（５０μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートし、ウサギ抗ｓｍＢＤ４抗体（１：２０００、Ｍａｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でさらに１時間インキュベートした。レーン３に関しては、ＨＡおよびＨＡ１の検出のために膜をウサギ抗ＨＡ１抗体（１：２０００，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。レーン４に関しては、ＮＡの検出のために、膜をウサギ抗ＮＡ抗体でインキュベートした。レーン２〜４において結合を検出するために、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を二次抗体とした使用した。その結果、ウイルスタンパクＨＡおよびＨＡ１はＰ９（レーン２）およびウサギ抗ＨＡ１抗体（レーン３）の両方によって認識されたが、Ｐ９はウサギ抗ＮＡ抗体（レーン４）によって認識されるＮＡに結合しなかった（レーン２）。ウエスタンブロットアッセイ（図６Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（図６Ｃ）の両方の結果から、Ｐ９がＮＡではなく、ウイルス表面糖タンパクＨＡに結合することが示された。したがって、ウイルス感染を阻害するために、Ｐ９はウイルス表面タンパクＨＡに結合できると結論付けられた。
【０１０３】
実施例４：Ｐ９は、後期エンドソームからのＲＮＡ放出のためのウイルス分解を妨げる。
さらに、ウイルスと受容体の結合、エンドサイトーシスおよびウイルスＲＮＡを放出するためのウイルス−エンドソーム膜融合を含むウイルス感染のステップまたは複数のステップがＰ９を介する阻害に関係することを調べた。Ｄｉｏ色素で標識したＨ１Ｎ１ウイルスを２５μｇ／ｍｌのＰ９（図７ＡにおいてＰ９で示す）またはＰＢ（図７ＡにおいてＶＣで示す）で１時間事前処理した。ウイルス（２０ＭＯＩ）をＭＤＣＫ細胞に接種し、４℃で３時間インキュベートするか、５ＭＯＩのウイルスをＭＤＣＫ細胞に接種し、３７℃で１時間もしくは２時間インキュベートした。感染細胞を固定し、細胞膜をＡｌｅｘ−５９４色素で染色した。その結果、蛍光標識したウイルスをＰ９で事前処理し、４℃で細胞とインキュベートしたときに、Ｐ９はウイルスの細胞膜への結合を妨げなかった（図７Ａ）。また、図７Ａは、標識されたウイルスのＰ９との事前処理は、３７℃で１時間インキュベートした後のエンドサイトーシスによる細胞へのウイルスの侵入に影響を与えず、また、標識されたウイルスのＰ９との事前処理は、後期エンドソームが核の近くに移動する３７℃で２時間インキュベートした後のエンドソームの成熟に影響を与えなかったことを示した。図７Ｂでは、Ｄｉｏ色素で標識したＨ１Ｎ１ウイルスを５０μｇ／ｍｌのＰ９で１時間事前処理し、ＭＤＣＫ細胞をそのウイルスで感染させ、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ緩衝液中の１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定し、ウサギ抗ｓｍＢＤ４抗体およびＡｌｅｘａ５９４で標識したヤギ抗ウサギ抗体で染色した。図７Ｂは、Ｐ９がウイルスへの結合によって後期エンドソームに運ばれ、ウイルス感染の２時間後にウイルスと共に核周辺部に異動する可能性があることを示した。さらに、図７Ｃに示されるように、Ｐ９を事前処理したウイルスによって感染した細胞中のウイルスＲＮＡレベルは感染後に低下し、感染後３．５時間では未処理のウイルスコントロールに比べて、２倍以上低くなった。反対に、未処理のウイルス培養におけるウイルスＲＮＡは、感染後最初の２．５時間の間、同じレベルで維持され、感染３．５時間後に増殖を開始した。このことは、ウイルスＲＮＡが核膜孔を通して核に輸送され、新しいウイルス複製が始まることを示唆する。これらの結果は、Ｐ９がウイルス受容体結合およびエンドサイトーシスによるウイルスの細胞への侵入を防御できることを示した。もしくは、この結果から、Ｐ９が後期エンドソームからのＲＮＡ放出を阻害することが示唆された。
【０１０４】
実施例５：Ｐ９は、ウイルス−エンドソーム膜融合およびＲＮＡ放出のためのウイルス分解を妨げるために、エンドソームのｐＨ低下（酸性化）を抑制する可能性がある。
Ｐ９中の豊富な塩基性アミノ酸を考慮し、さらにＰ９が後期エンドソーム内のｐＨの低下を抑制することによってウイルス−エンドソーム膜融合を阻害する可能性があるかを調べた。Ｈ１Ｎ１ウイルスをＰＢ（図８ＡでＶＣと示す）またはＰ９（５０μｇ／ｍｌ）（図８ＡでＰ９と示す）で事前処理し、５ＭＯＩのウイルスをＭＤＣＫ細胞に接種し、３７℃でインキュベートした。接種後の表示された時点で集められた細胞サンプル中のウイルスＲＮＡコピー数は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出し、１０ｍＭおよび０．１ｍＭの明確に定義されたエンドソーム阻害剤であるＮＨ４Ｃｌの存在下での感染細胞のウイルスＲＮＡコピー数と比較した。図８Ａに示されているように、Ｐ９は、明確に定義された後期エンドソーム阻害剤である塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）の阻害に最適な濃度（１０ｍＭ）で処理したしたときと同等のウイルス感染阻害効果を示した（“Ｌａｋａｄａｍｙａｌｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｊ．Ｒｕｓｔ，Ｈ．Ｐ．Ｂａｂｃｏｃｋ，ａｎｄ  Ｘ．Ｚｈｕａｎｇ．２００３．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：９２８０−９２８５”および“Ｍａｔｌｉｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｒｅｇｇｉｏ，Ｈ．，Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．＆Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９１，６０１−６１３（１９８１）参照）。ウイルスＲＮＡに対するＰ９の阻害効果は、感染後３．５時間で最高値に達し、Ｐ９を事前処理したウイルスから得られたウイルスＲＮＡのコピー数は１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌで処理したときに比べ、少しだけ低かった。ウイルスＲＮＡに対するＰ９の阻害効果は、感染後６．５時間で１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌで処理したときと同等のレベルに達した。
【０１０５】
さらに、エンドソームの酸性化におけるＰ９の阻害活性を確認するために、発明者らはｐＨ感受性色素を用いてエンドソーム内のｐＨ低下を検出した（図８Ｂ）。ｐＨ感受性色素はｐＨ値が５〜７低下したときに赤い蛍光を示すｐＨ指示薬であり、細胞を未処理のウイルスで感染させたとき（ＶＣで示す）、感染細胞内の赤色スポット（カラー画像中で。左上図に見られるように、白黒画像では灰色のスポットに対応する）が後期エンドソームの酸性化過程を示した。図の白い矢印はウイルスの位置（図８Ｂの左下の図に見られるように、カラー画像では緑色のスポット、白黒画像ではグレーのスポットに対応する）およびそれに対応するエンドソーム酸性化（図８Ｂの左上の図に見られるように、カラー画像では赤色のスポット、白黒画像ではグレーのスポットに対応する）を示す。反対に、Ｐ９で事前処理したウイルスを細胞に感染させたとき（Ｐ９で示す）、カラーの画像では赤色の蛍光は観察されず（図８Ｂの右上図参照）、エンドソームにおいて酸性化過程は起こらなかったことを示した。この結果から、Ｐ９がウイルスと共にエンドソームに輸送されたときに、Ｐ９はエンドソーム内の酸性化を抑制することが明示された。
【０１０６】
実施例６：Ｐ９中の塩基性アミノ酸は抗ウイルス活性において重要な役割を果たす。
Ｐ９中の豊富な塩基性アミノ酸が後期エンドソーム内のｐＨ低下を抑制するのに重要な働きを担っているかどうかを確認するために、Ｐ９アナログペプチドをデザインし、Ｐ９のＣ末端側の１〜３の塩基性アミノ酸を中性または酸性アミノ酸に置き換えるか、または、Ｐ９のＮ末端側に３つの酸性アミノ酸もしくは３つの塩基性アミノ酸を付加することによって合成した（表３）。これらのアナログペプチドのウイルスタンパクＨＡに対する結合親和性はＥＬＩＳＡによって検出した（図９Ａ）。この結果は、１個および２個の塩基性アミノ酸（Ｐ９−Ｓ１およびＰ９−Ｓ２）の減少ならびに３個の酸性アミノ酸（Ｐ９−ａｃｉ−１）または３個の塩基性アミノ酸（Ｐ９−ＫＨＲ）の付加は、これらのＰ９アナログペプチドの結合親和性に影響を与えなかったことを示す。３個の塩基性アミノ酸の減少（Ｐ９−Ｓ３）は、ウイルスタンパクＨＡへの結合親和性を有意に低下させた。さらに、ウイルスＨＡタンパクの血球凝集に対するペプチドの阻害活性をＨＡＩアッセイによって測定した。示されたペプチド（５０μｇ／ｍｌ）は２倍ずつ順次希釈した。希釈されたペプチドおよびＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）（陰性コントロール）はＨ１Ｎ１ウイルスと室温で１時間事前にインキュベートし、５０μｌの５％（ｖ／ｖ）七面鳥赤血球細胞（ＴＲＢＣ）を各ウェルに添加した。その結果、ＰＢＳコントロールでは典型的な赤血球凝集が観察され、赤血球凝集を阻害するペプチドの最も高い希釈（ＨＡＩ活性）が記録された。この結果から、ＨＡＩ活性を示すＰ９−Ｓ１およびＰ９−ａｃｉ−１の両方がＰ９の活性と同等であることが示された（図９Ｂ）（希釈率を縦軸に示す）。さらに、ＭＤＣＫ細胞でのＰ９アナログペプチドの抗ウイルス効果はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて検出した。ウイルス（５０ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）は示されたペプチド（５０μｇ／ｍｌ）またはＰＢ（図９ＣにおいてＶＣと示す）と室温で１時間事前にインキュベートし、ＭＤＣＫ細胞に接種した。感染細胞は接種後の表示された時点で採取し、ウイルスＲＮＡコピー数をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで検出した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示した。この結果から、１個または２個の塩基性アミノ酸の減少（Ｐ９−Ｓ１およびＰ９−Ｓ２）ならびに３つの酸性アミノ酸の付加（Ｐ９−ａｃｉ−１）はこれらのＰ９アナログペプチドの抗ウイルス効果を低下させた（図９Ｃ）。しかし、Ｐ９のＮ末端の３つの塩基性アミノ酸の付加（Ｐ９−ＫＨＲ）は、抗ウイルス効果を低下させなかった。これらの結果から、実際にＰ９の豊富な塩基性アミノ酸はウイルス感染の阻害において重要な働きを担っていることが解明された。
【０１０７】
【表３】
2016520052.tif 000004
【０１０８】
注釈：変換したアミノ酸は太字で示した。Ｐ９−Ｓ１：一個の塩基性アミノ酸のＫをＮに置換した。Ｐ９−Ｓ２：二個の塩基性アミノ酸ＫとＲをＮとＤに置換した。Ｐ９−Ｓ３：三個の塩基性アミノ酸Ｒ、ＫおよびＲをＴ、ＮおよびＤに置換した。Ｐ９−ａｃｉ−１：三個の酸性アミノ酸Ｄ、ＥおよびＤをＰ９のＮ末端に付加した。Ｐ９−ＫＨＲ：三個の塩基性アミノ酸Ｋ、ＨおよびＲをＰ９のＮ末端に付加した。
【０１０９】
実施例７：Ｐ９を介する抗ウイルス効果は、ウイルス糖タンパクＨＡに対する高い結合親和性にも関連する。
別のペプチドＰ８はＰ９のＣ末端領域の２０アミノ酸を含むＰ９の短い形態であるが、すべての６塩基アミノ酸がＰ９と同じである（表１）。しかし、Ｐ９と比較すると抗ウイルス効果はかなり低かった（図２Ａおよび図９Ｃ）。Ｐ８のウイルスタンパクＨＡへの結合親和性はＥＬＩＳＡを用いて検出され（図９Ａ）、ＨＡＩを決定した（図９Ｂ）。その結果、Ｐ８はＰ９に比べて、ＨＡへの結合親和性が有意に低いことが示された。すなわち、この種類の抗ウイルスペプチドの抗ウイルスの有効性はペプチド内の塩基性アミノ酸の数だけではなく、ウイルスへの結合親和性によっても決定される。
【０１１０】
実施例８：Ｐ９は呼吸器ウイルスに対して広い領域の抗ウィルス効果を示した。
さらに発明者らは、Ｐ９がエンドソーム経路を介して標的細胞に侵入する他のエンベロープ呼吸器ウイルス、例えばインフルエンザＡ型ウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶの他のサブタイプの感染を細胞培養中で阻害するかどうかを検出した。インフルエンザウイルスのサブタイプであるＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９を段階希釈したＰ９と室温で１時間事前処理し、ＭＤＣＫ細胞に接種した。これらのウイルス感染に対するＰ９の阻害効果はプラークアッセイにて検出した。図１０（ａ）に示すように、Ｐ９はインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプであるＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９の感染に対して強い抗ウイルス有効性を示した。インフルエンザＡ型ウイルスのこれらのサブタイプの感染に対するＰ９のＩＣ５０は、１．５〜４．８μｇ／ｍｌの範囲であり、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対するＩＣ５０に比べて少し高かった（図２Ｂ）。
【０１１１】
さらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染に対するＰ９の阻害効果はＦＲｈＫ４およびＶｅｒｏ  Ｅ６細胞のプラークアッセイにて検出した。特に、Ｐ９のＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶに対する抗ウイルス有効性は、インフルエンザＡ型ウイルスに対する抗ウイルス有効性に比べて、その濃度が２５μｇ／ｍｌを超えるときには高かったが、２５μｇ／ｍｌよりも濃度が低いときには低かった（図１０（ｂ））。ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶに対するＰ９のＩＣ５０は、約１０μｇ／ｍｌであり、インフルエンザＡ型ウイルスに対するよりも約２〜７倍高かった。これらの結果から、Ｐ９は、エンドソーム経路を介して標的細胞に感染する複数の呼吸器ウイルスに対して広い領域の抗ウイルス活性を有することが示された。
【０１１２】
結論
マウスまたはヒトでの多くの防御は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ウイルス活性を有することが判っていたが（“Ｓｕｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，１４３１８−１４３２９（２００５）”，“Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ２  ａｎｄ  ３  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｉｄｓ  １７，Ｆ３９−４８（２００３）”および“Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３  ｉｎ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｖｉｒｕｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５４，６３９−６４７（２００９）”参照）、本発明は、本開示に従って構築された組み換えマウスβデフェンシン−４（図１）が広範囲の呼吸器ウイルスの感染に対して強い抗ウイルス効果を有することを、最初に報告した。しかし、全身治療のような防御の開発は、最適ではない有効性、副作用および商業規模生産のコスト効率が良い手段がないなどのいくつかの要因によって妨げられている（“Ｚａｓｌｏｆｆ，Ｍ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，３８９−３９５（２００２）”参照）。
【０１１３】
本発明では、上記の課題を解決するためにｍＢＤ４に由来する１１個の短いペプチドをデザインし、合成した。これらの短鎖ペプチドの抗ウィルス有効性をスクリーニングした後、ＩＣ５０がｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４に比べて低く、約１．２μｇ／ｍｌに達する（図２Ｂ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインフルエンザＡ型ウイルスＨ１Ｎ１に対する最も高いウイルス活性を示すｍＢＤ４のＣ末端側の３０アミノ酸（表１）を含むｍＢＤ４の短い形態であるひとつのペプチドＰ９を発見した。さらに驚くべきことに、Ｐ９はマウスモデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、Ｈ１Ｎ１ウイルスの致死感染に対する予防効果および治療効果が、ｒｍＢＤ４に比べてはるかに高いことが見つけられた（図３および４）。さらに、ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４と比べてＰ９は最も低い細胞毒性を示し（図２Ｃおよび表２）、ｓｍＢＤ４およびｒｍＢＤ４よりもそれぞれ２５倍および２倍高いという、より素晴らしい選択性指数を有する。ヒトβデフェンシン−３由来のいくつかの短鎖ペプチドがより強力な抗菌効果を示し、βデフェンシン−３自体に比べて宿主細胞に対して低い毒性を示すことは報告されている（“Ｂａｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈａｒｇｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８，７２２９−７２３９（２００９）”参照）が、βデフェンシン由来の短鎖ペプチドがより素晴らしい選択的指数およびｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な抗ウイルス効果を提供できるということは、初めての開示である。ｓｍＢＤ４はそれ自体の高い細胞毒性のために抗ウイルス薬の候補にならない。組み換えβデフェンシンの生産（発現、酵素処理および精製など）は時間が掛かり、高価であり、抗ウイルス薬としてβデフェンシンを開発することも制限する。それに対して、本発明のペプチドは高い抗ウイルス活性および低い細胞毒性を示すだけでなく、化学的手法を用いて直接合成することができ、水に対する高い溶解性を示す。したがって、本発明のペプチドは新規の抗ウイルス薬の開発のための理想的な候補である。
【０１１４】
本発明のペプチドの抗ウイルスメカニズムを理解するために、最初に発明者らは、Ｐ９がウイルスの複製または放出ではなく、ウイルス感染を阻害することを示した（図５Ａ，５Ｄおよび５Ｇ）。βデフェンシンの抗ウイルス活性が、ウイルスが感染する標的細胞との間接的な相互作用、または、ウイルスの糖タンパクおよび／もしくはエンベロープとの直接的な相互作用のいずれかを介していることが報告されていることから（“Ｋｌｏｔｍａｎ，Ｍ．Ｅ．＆Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｌ．Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，４４７−４５６（２００６）”および“Ｄｉｎｇ，Ｊ．，Ｃｈｏｕ，Ｙ．Ｙ．＆Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｌ．Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎ  １，４１３−４２０（２００９）”参照）、発明者らは、Ｐ９がウイルスまたは標的細胞と結合するかどうかを調べた。その結果、Ｐ９はウイルス感染を阻害するために、細胞膜ではなく（図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈおよび６Ａ）ウイルスに結合する（図５Ｃ、５Ｆ，５Ｉおよび６Ａ）ことが示された。さらに本発明は、Ｐ９が、ウイルス表面の他のウイルスタンパクＮＡではなく、糖タンパクＨＡに結合することを明確にした（図６Ｂおよび６Ｃ）。インフルエンザウイルスの感染が複数の段階、すなわち、ウイルス−受容体結合、エンドサイトーシス、エンドソーム酸性化によりウイルス−エンドソーム膜融合が結果として生じる前期エンドソームから後期エンドソームへの移行、および、その後のウイルス複製を促すウイルスＲＮＡの放出のためのウイルス分解（脱殻）を経ることは周知である（“Ｌａｋａｄａｍｙａｌｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｊ．Ｒｕｓｔ，Ｈ．Ｐ．Ｂａｂｃｏｃｋ，ａｎｄ  Ｘ．Ｚｈｕａｎｇ．２００３．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：９２８０−９２８５”および“Ｌｅｉｋｉｎａ，Ｅ．，Ｈ．Ｄｅｌａｎｏｅ−Ａｙａｒｉ，Ｋ．Ｍｅｌｉｋｏｖ，Ｍ．Ｓ  Ｃｈｏ，Ａ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｊ．Ｗａｒｉｎｇ，Ｗ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｘｉｅ，Ｊ．Ａ．Ｌｏｏ，Ｒ．Ｉ．Ｌｅｈｒｅｒ，ａｎｄ  Ｌ．Ｖ．Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋ．２００５．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｖｉｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｔｒｙ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：９９５−１００１”参照）。そこで本発明では、どのステップがＰ９を介した阻害効果に関係しているかをさらに調べた。その結果、Ｐ９はウイルス−受容体結合およびエンドサイトーシスを阻害するのではなく、ウイルス分解および後期エンドソームからのウイルスＲＮＡ放出を阻害することが示された（図７）。
【０１１５】
対処すべき次の疑問は、本発明のペプチドが、なぜ、どのようにしてウイルスの分解と後期エンドソームからのウイルスＲＮＡの放出を阻害できるかである。後期エンドソーム内の低ｐＨ（５．０）が、インフルエンザウイルス−エンドソーム膜融合には重要である。以前の研究では、後期エンドソーム阻害剤のＮＨ４Ｃｌは後期エンドソーム内のｐＨ低下を阻害することによってウイルス−エンドソーム膜融合を阻害できることが示されている（Ｍａｔｌｉｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｒｅｇｇｉｏ，Ｈ．，Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．＆  Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９１，６０１−６１３（１９８１）”および“Ｌａｋａｄａｍｙａｌｉ，Ｍ．，Ｒｕｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｈ．Ｐ．＆  Ｚｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，９２８０−９２８５（２００３）”参照）。Ｐ９は塩基性アミノ酸が豊富であることを考慮し、発明者らはＰ９が後期エンドソーム内のｐＨ低下を阻害し、次にウイルス−エンドソーム膜融合を妨げ、結果としてウイルス複製を引き起こすためのウイルスＲＮＡの核への放出を阻害することによって抗ウイルス機能を発揮するがどうかを調べた。その結果、Ｐ９はＮＨ４Ｃｌと同様の阻害効果を発揮してウイルスＲＮＡの放出を阻害し、その阻害効果は感染後３．５時間で最高レベルに達した（図８Ａ）。また実際に、Ｐ９は後期エンドソーム内のｐＨ低下を阻害できることが示された（図８Ｂ）。さらに、Ｐ９の塩基性アミノ酸は後期エンドソーム内の酸性化の進行の抑制のために不可欠であった。３つの付加的酸性アミノ酸をＰ９に付加（Ｐ９−ａｃｉ−１）するか、または１〜２個の塩基性アミノ酸を置換（Ｐ９−Ｓ１およびＰ９−Ｓ２）したときに、これらのＰ９アナログペプチドの抗ウイルス効果は低下したが（図９Ｃ）、これらの結合親和性はＰ９と同程度か、または高かった（図９Ａ）。したがって、そのような種類の抗ウイルスペプチドに含まれる塩基性アミノ酸は後期エンドソーム内のｐＨ低下の抑制に重要な役割を担っている可能性があることがこの結果により示された。
【０１１６】
特に、そのようなペプチドの抗ウイルス活性に影響を与える別の重要因子はウイルスに対するペプチドの結合親和性である。Ｐ８は、Ｐ９と同じ数の塩基性アミノ酸を含む（表１）が、Ｐ９に比べて低い結合親和性（図９Ａおよび９Ｂ）と抗ウイルス効果（図２Ａおよび９Ｃ）と示すという事実によってこのことは解明された。主なＡＭＰの共通の特徴は、ＡＭＰと負電荷を有する微生物膜タンパクまたはリン脂質との初期の相互作用の引き金となるそれらのネット正電荷である（“Ｊｕｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ３  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｐａｒｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５，９５４−９６０（２０１１）”および“Ｊｅｎｓｓｅｎ，Ｈ．，Ｈａｍｉｌｌ，Ｐ．＆  Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９，４９１−５１１（２００６）”参照）。さらに、カチオン性ペプチドの抗菌作用はそれらの疎水性（“Ｋｕｓｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｉ．，Ｓｈａｌｅｖ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｉｋｈｌｉｎ，Ｍ．，Ｇａｉｄｕｋｏｖ，Ｌ．＆  Ｍｏｒ，Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ  Ｓ４  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１６９４１−１６９５１（２００２）”および“Ｚｅｌｅｚｅｔｓｋｙ，Ｉ．，Ｐａｇ，Ｕ．，Ｓａｈｌ，Ｈ．Ｇ．  ＆Ｔｏｓｓｉ，Ａ．Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｒａｔｉｏｎａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｉｎｉｍａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２６，２３６８−２３７６（２００５）”参照）および、それらの２次構造（“Ｊｅｎｓｓｅｎ，Ｈ．，Ｈａｍｉｌｌ，Ｐ．＆  Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９，４９１−５１１（２００６）”参照）と関係する。Ｐ８の低い結合親和性はＮ末端の１０個のアミノ酸の欠失に関係している可能性があり、おそらくＰ８の疎水性または２次構造に影響を与え、その結果、Ｐ８の結合親和性を低下させる。
【０１１７】
インフルエンザウイルスおよびコロナウイルスを含む無数の病原菌ウイルスでは、生産的なウイルス複製を開始するためのウイルス分解や、宿主細胞へのウイルスＲＮＡ放出のために、ウイルスとエンドソーム膜の融合が必要となる（“Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．＆  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．Ｈｏｗ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｎｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４，２３７−２４２（２００４）”および“Ｄｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７，２２６−２３６（２００９）”参照）。膜融合はウイルスエンベロープ糖タンパクを介し（例えば、インフルエンザウイルスのＨＡまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク）、後期エンドソーム内の酸性環境を必要とする（“Ｄｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７，２２６−２３６（２００９）”および“Ｄａｓ，Ｋ．，Ａｒａｍｉｎｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａ，Ｌ．Ｃ．，Ｋｒｕｇ，Ｒ．Ｍ．＆  Ａｍｏｌｄ，Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７，５３０−５３８（２０１０）”参照）。本発明では、発明者らは、本発明のペプチドによって介される抗ウイルス効果のメカニズムは２つの主要な因子に関係していることを示した。１番目は、このペプチドがウイルスの表面の糖タンパクに結合でき、２番目には、このペプチドがウイルス−エンドソーム膜融合を妨げるために後期エンドソーム内のｐＨ低下（酸性化）と、その後のウイルスＲＮＡ放出を阻害できることである。また、このメカニズムに基づくと、本発明のペプチドは他の無数の病原菌ウイルスの感染を阻害できるはずである。その結果、実際にＰ９はＨ３Ｎ２，Ｈ５Ｎ１，Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９を含むインフルエンザＡ型ウイルスの他のサブタイプ（図１０（ａ））および２つのコロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶ（図１０（ｂ））の感染を阻害できることが示された。これらのウイルスの表面糖タンパクに本発明のペプチドが効率的に結合する場合、本発明のペプチドは他の無数の病原性ウイルスの感染を阻害できると予想することは妥当である。したがって、本発明のペプチドは、他の無数の病原菌ウイルス、特にこれらの呼吸器ウイルスの感染に対する広い領域の抗ウイルス薬として開発される理想的な候補である。
【０１１８】
要約すると、ｍＢＤ４から得られた短鎖ペプチドは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９を含むインフルエンザＡ型ウイルスの異なったサブタイプと、２つのコロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染に対して広い領域の抗ウイルス活性を提供できることが示された。本発明のペプチドの広い領域の抗ウイルス効果のメカニズムは、以下に起因していることが解明される：（１）このペプチドはウイルス粒子の表面のウイルス糖タンパクに効率的に結合できる；そして（２）このペプチドは後期エンドソーム内のｐＨ低下（酸性化）を阻害することができる豊富な塩基性アミノ酸を含み、ウイルス−エンドソーム膜融合とそれに続くウイルス分解およびウイルスＲＮＡ放出を阻害する。インフルエンザＡ型ウイルスとコロナウイルスは、最近、いくつかの致死的なパンデミックおよび大流行を引き起こした。いくつかの抗インフルエンザ薬が開発されたが、これらの抗ウイルス薬を臨床治療に応用した後、直ぐに薬剤耐性ウイルス株が出現した。特に、今までのところ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染に対する予防および治療のために使用することができる効果的な抗ウイルス薬は未だない。この点でＰ９のような抗ウィルス性のペプチドは、広い領域の抗ウイルス活性を有し、薬剤耐性の可能性が低い、新しい有望な予防薬および治療薬の可能性がある。さらに、本発明で開示されるメカニズムに基づいて、広い領域の抗ウイルス活性を有する、さらに新しい抗ウイルスペプチドが、無数の病原菌ウイルスの予防および治療のための新しい抗ウイルス薬の商品としてデザインされ、開発されるであろう。
【０１１９】
本発明の精神と本質から逸脱することなく、説明した例示的な態様に様々な変更と修正が可能であることは当業者にとって明らかである。この変更と修正は添付されたクレームの範囲に含まれる。
【図１】
2016520052.tif 000005
【図２】
2016520052.tif 000006
【図３】
2016520052.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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