(57)【要約】  本発明は、ORAI1遺伝子の発現を阻害するための方法及び医薬組成物におけるsiRNA分子及びその使用に関する。本発明は、ORAI1遺伝子の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療及び/又は予防における前記siRNA分子の使用にも関し、好ましくは、前記眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、及び巨大乳頭結膜炎等の結膜炎及び/又は眼アレルギーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療及び/又は予防における使用のための、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とするsiRNA分子。
【請求項２】
前記眼状態が眼アレルギー及び/又は結膜炎である、請求項1に記載のsiRNA分子。
【請求項３】
前記眼状態が、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される、請求項1又は2に記載のsiRNA分子。
【請求項４】
19ヌクレオチド二本鎖領域を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
【請求項５】
平滑末端である、請求項4に記載のsiRNA分子。
【請求項６】
配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とし、細胞内に導入された場合にはORAI1遺伝子の発現を減少させるsiRNA分子であって、19ヌクレオチド平滑末端二本鎖構造体を含むsiRNA分子。
【請求項７】
配列番号112〜配列番号229からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる、請求項1から6のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
【請求項８】
少なくとも1つのヌクレオチドが化学修飾を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
【請求項９】
ヌクレオチドの前記化学修飾が、2'-O-メチル化及びウラシルリボースヌクレオチドのデオキシチミジンヌクレオチドによる置換及びこれらの組合せから選択される、請求項8に記載のsiRNA分子。
【請求項１０】
前記化学修飾がセンス鎖上、アンチセンス鎖上又は両鎖上にある、請求項8又は9に記載のsiRNA分子。
【請求項１１】
配列番号223〜配列番号229からなる群由来の少なくとも1つの配列から選択される、請求項8から10のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
【請求項１２】
ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療のための医薬の製造における請求項1から11のいずれか一項に記載のsiRNA分子の使用。
【請求項１３】
前記眼状態が眼アレルギー及び/又は結膜炎である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記眼状態が、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される、請求項12又は13に記載の使用。
【請求項１５】
請求項1から11に記載のsiRNA分子を少なくとも含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼状態の治療及び/又は予防のための、より詳細には、ORAI1の高レベルの発現及び/又は活性に関係する結膜炎及び/又は眼アレルギー等の眼状態の治療及び/又は予防のための方法及び組成物におけるsiRNA製品及びその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉(RNAi)は、大半の真核細胞に存在し、低分子二本鎖RNA(dsRNA)分子を使用して相同性依存型遺伝子サイレンシングを導く、天然に存在する転写後調節機構である。Fire及びMelloによる寄生虫の線虫(C. elegans)におけるその発見{Fire、1998}は2006年ノーベル賞を受賞した。その最初の報告の直後に、RNAiは、長いdsRNAを通じてではなく21ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)によって哺乳動物細胞においても起こることが示された{Elbashir、2001}。
【０００３】
RNA干渉のプロセスは、外来遺伝子の発現を妨げるために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられている。このプロセスは多様な門及び植物相に共通であり、転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれている。RNAi機構の発見以降、ヒト疾患を治療する新たな方法として遺伝子発現を選択的に変えることができる新たな化合物を発見する研究が、それ以外の、低分子又はタンパク質を伴う従来の製薬アプローチでは「新薬開発につながらない(undruggable)」標的に取り組むことにより、爆発的に増加してきた。
【０００４】
現行の知識によれば、RNAiの機構は、長い二本鎖RNAがダイサーとして知られているRNaseIII様タンパク質によりプロセシングされると開始される。タンパク質ダイサーは典型的には、N末端RNAヘリカーゼドメイン、RNA結合いわゆるPiwi/アルゴノート/Zwille(PAZ)ドメイン、2つのRNaseIIIドメイン及び二本鎖RNA結合ドメイン(dsRBD)を含有しており{Collins、2005}、その活性によって長い二本鎖RNAは2塩基3'オーバーハング及び5'リン酸及び3'ヒドロキシル基のある21〜24ヌクレオチド二本鎖siRNAにプロセシングされる。次に、こうして得られたsiRNA二重鎖はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られるエフェクター複合体に組み込まれ、そこで、RNAヘリカーゼ活性により二本鎖siRNA分子がアデノシン三リン酸(ATP)依存的にほどかれると{Nykanen、2001}、siRNAのアンチセンス又はガイド鎖は、RISCが標的mRNA配列を認識及び切断するように導く{Elbashir、2001}。mRNA分解をもたらすRISCの触媒活性は、エンドヌクレアーゼアルゴノート2(AGO2)により媒介される{Liu、2004; Song、2004}。AGO2はタンパク質の高度に保存されているアルゴノートファミリーに属する。アルゴノートタンパク質は、2つの共通ドメイン、すなわち、PIWI及びPAZドメインを含有する約100KDaの高度に塩基性のタンパク質である{Cerutti、2000}。PIWIドメインはダイサーとの相互作用に極めて重要であり、mRNAの切断の原因となるヌクレアーゼ活性を含有する{Song、2004}。AGO2はガイドとしてsiRNA二重鎖の1つの鎖を使用して相補的配列を含有するメッセンジャーRNAを見つけて、ガイド鎖の5'末端に対して塩基10と11の間でリン酸ジエステル骨格を切断する{Elbashir、2001}。RISCの活性化における重要なステップはAGO2によるセンス又はパッセンジャー鎖の切断であり、複合体からこの鎖を取り除く{Rand、2005}。siRNAガイド鎖とPIWIドメインの間の相互作用を分析する結晶学的研究から、RISCによる標的mRNA認識を導く「シード配列」を構成するのはヌクレオチド2〜8のみであること、及びこの配列において単一ヌクレオチドのミスマッチが起こればこの分子のサイレンシング能力に劇的な影響を与える可能性があることが明らかにされている{Ma、2005; Doench 2004; Lewis、2003}。mRNAは切断されると、その断片に保護されていないRNA末端が存在するせいで、細胞内ヌクレアーゼにより更に切断及び分解され、もはやタンパク質に翻訳されることはない{Orban、2005}。一方、RISCはその後のラウンドで再利用されることになる{Hutvagner、2002}。これが、特定のmRNA分子及びその対応するタンパク質の選択的減少をもたらす触媒過程を構成する。siRNAエフェクターを細胞又は組織中に直接送達し、そこでsiRNAエフェクターがRISCを活性化して標的mRNAの強力で特異的なサイレンシングを生ずることにより、所望の任意の遺伝子を調節する目的で、遺伝子サイレンシングというこの天然の機構を利用することが可能である。RNAiは、HIV、ウイルス肝炎、心血管及び脳血管疾患、代謝疾患、神経変性障害並びにがんの治療等の生物医学研究において適用されてきた{Angaji SAら、2010}。
【０００５】
長さ、構造、化学的組成及び配列に関して、siRNAが最大の有効性を達成するために持つべき理想的な特長を報告する多くの研究が発表されてきた。siRNA設計のための最初のパラメータはWO02/44321においてTuschlと同僚らにより提示されたが、それに続く多くの研究、アルゴリズム及び/又は改良点がそれ以降発表されている。siRNA選択アプローチは、機構的な詳細が明らかになるに従って一層精密になっており、その上既存の及び新たなデータを更に分析すれば、これらのアプローチを更に精巧にする追加の洞察が得られる{Walton SPら、2010}。代わりに、最近のいくつかの研究によれば、古典的な19+2 siRNA構造とははっきり異なり、オーバーハング、長さ、又は対称性の点で古典的なsiRNAの重要な特長と一致しない新規のRNAiトリガー構造の設計及び分析が報告され、哺乳動物細胞におけるRNAi機構の柔軟性が考察されている{Chang CIら、2011}。
【０００６】
その上、siRNA安定性の増強に多くの努力が注ぎ込まれてきた。なぜならば、生体液中でのRNaseの偏在性を考慮すると、この安定性はsiRNAに基づく療法にとって大きな障害の1つであると認識されているからである。siRNA分子に固有のもう1つの問題はその免疫原性であり、それによってsiRNAは自然免疫系の非特異的活性化を誘発することが分かってきた。意図しない遺伝子(mRNA)のノックダウンはsiRNA媒介遺伝子サイレンシングのよく知られた副作用である。このノックダウンは、siRNAと狙った標的以外のmRNAの間の部分的相補性の結果として引き起こされ、いずれかのsiRNA鎖に対する配列相補性を有する遺伝子からのオフターゲット効果(off-target effects:OTEs)を引き起こす。安定性増強及びOTE減少のために採る主要な戦略の1つは、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-アミノヌクレオチド、又は2'-O若しくは4'-Cメチレン架橋を含有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドの使用であった。その上、主にホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入による隣接するヌクレオチドを繋いでいるリボヌクレオチド骨格の修飾が報告されている。増強された安定性及び/又は免疫原性の減少は多くの場合効力とは反比例しているように思われ{Parrish、2000}、ある数、位置及び/又は組合せの修飾ヌクレオチドのみが安定で非免疫原性のサイレンシング化合物をもたらす可能性がある。これはsiRNAに基づく治療にとって重要なハードルであるため、良好な結果を示しているある種の修飾パターンを報告する様々な研究が発表されており、その例としてEP1527176、WO2008/050329、WO2008/104978又はWO2009/044392が含まれるが、更に多くの研究が文献中に見出すことができる{Sanghvi YS.2022; Deleaveyら、2012}。
【０００７】
アレルギー疾患は、食べる、肺内に呼吸する、注射する又は接触する外来タンパク質物質(「アレルゲン」)に対するヒト免疫系の過剰反応によって特徴付けられる。アレルギーは、遺伝成分を有する。片親のみがある種類のアレルギーを有する場合、それぞれの子供がアレルギーを有する見込みは3に1つである。両親ともアレルギーを有する場合は、その子供たちがアレルギーを有する可能性ははるかに高くなる(10中7)。アレルギーには治癒はないが、適切な予防及び治療で管理することができる。
【０００８】
世界中の人々の約30%がアレルギー症状を患っており、その40〜80%が目に症状を有する{Key B. 2001}。眼を冒すアレルギー疾患又は眼アレルギーは、非常に広範囲の臨床症状を有する異種遺伝子の疾患グループを構成する。眼アレルギーは通常、結膜(眼と眼瞼の裏層を覆っている膜)がアレルゲンに反応すると起こる。眼アレルギーは単独で又は他のアレルギー症状(例えば、鼻炎又は喘息)と併せて起こることがある。
【０００９】
基礎的な臨床研究により、眼アレルギーに存在する細胞、メディエータ、及び免疫学的事象について益々理解が進んでいる。眼、特に結膜は比較的多数のマスト細胞を有する。アレルゲンが存在すると、アレルゲンはこれらマスト細胞の表面上のFcεRI受容体で免疫グロブリンIgEに結合して、アレルギーのメディエータの活性化及び放出を始動させることができる(脱顆粒として知られるプロセス)。脱顆粒により、ヒスタミン、プロスタグランジン、トリプターゼ及びロイコトリエンを含むマスト細胞成分がマスト細胞外側の環境に放出される。種々の機構を通じて、これらの成分は眼アレルギーの徴候及び症状を生じる。アレルギー性炎症のマスト細胞の活性化は、多くの場合、眼アレルギーの急性相応答又は初期相と呼ばれる。急性相応答は、アレルギー性炎症の部位への炎症細胞の動員により、例えば、好酸球及び好中球の結膜への流入として特徴付けられる遅発相応答まで進むことがある。
【００１０】
眼アレルギーは、アレルギー専門医及び眼科医が遭遇するもっとも一般的な状態の1つを表す。眼アレルギーは通常、以下のような症状及び徴候、すなわち、結膜炎、眼瞼炎、眼瞼結膜炎又は角結膜炎に関連している。眼が赤く痒くなり、流涙及び僅かな眼脂が生じる。重症例では、眼の灼熱感、疼痛及び羞明も示すことがある。
【００１１】
眼を冒すアレルギー疾患には、季節性アレルギー性結膜炎(SAC)及び通年性アレルギー性結膜炎(PAC)等の軽症型、並びに春季角結膜炎(VKC)、アトピー性角結膜炎(AKC)及び巨大乳頭結膜炎(GPC)等の更に重症の症状が含まれる。後者の症状は角膜損傷等の合併症に関連することがあり、視力喪失を引き起こす可能性がある。SAC及びPACは一般的には、外部アレルゲンに対するIgE-マスト細胞媒介過敏症反応であり、AKC及びVKCはいくつかの免疫細胞型を伴う慢性炎症によって特徴付けられる。SAC及びPACアレルゲンは、抗原提示細胞(APC)の助けを借りて、Th2-優位型免疫応答を始動させ、この応答はB細胞からIgE放出を誘発する。アレルギー応答の活性化は通常、マスト細胞の浸潤及び脱顆粒を伴う。
【００１２】
SACは眼におけるもっとも一般的なアレルギー疾患であり、通常は空中花粉、粉塵、及び動物のフケのようなアレルゲンにより引き起こされる。その徴候及び症状は通常、春及び夏に生じ、一般的には冬場に減少する。結膜の掻痒、発赤及び腫脹がもっとも特徴的な症状であるが、流涙、灼熱感、及び羞明もある。ほとんどの場合、SACは重症ではない。しかし、SACは生活の質に影響を与えることがあり、著しい社会経済的影響を与えうるため、患者をひどく不安にさせうる{Kari O.及びSaari KM 2010}。
【００１３】
PACは眼における2番目に一般的なアレルギー疾患であり、通常は動物及びダニにより引き起こされる。その症状及び徴候はSACとほぼ同じであり、違いは患者がアレルギーを起こす特異的なアレルゲンであり、PACは通年性アレルゲンに曝されると年間を通じて起こることがある点である。PACはあらゆる年齢層を冒すが、大部分は若年及び中年の男女である。更に、PACはドライアイ症候群と関係があることが多い。
【００１４】
SAC及びPACはもっとも一般的な形態の眼アレルギーである。見積もりには変動があるが、これらの種類のアレルギーには一般住民の少なくとも15〜20%が冒されると言われている。SAC及びPACは過小診断され、したがって治療が不十分である場合が多い。SAC及びPACでは、アレルゲンにより誘発されるIgEの局所的放出のために、Ca2+依存性機構によってマスト細胞の脱顆粒が促される。IgE活性化マスト細胞は、アレルギー応答の最初のメディエータであるヒスタミン及びロイコトリエン4等の前もって形成された炎症性メディエータを遊離する。これらのメディエータは、アレルギー応答を増幅する領域を浸潤する好酸球を引き付ける。
【００１５】
VKCは主に子供や若年成人が冒される眼球表面の比較的希な慢性アレルギー性炎症である。主な症状は掻痒、発赤、腫脹、眼脂及び羞明である。もっとも特徴的な徴候は上部眼瞼結膜における巨大な乳頭である。
【００１６】
AKCは、眼球表面及び眼瞼の両側性慢性炎症疾患である。もっとも特徴的な徴候は眼瞼上の痒い湿疹病変である。AKC患者が幼年齢で白内障手術を受けることは希ではない{Kari O.及びSaari KM 2010 }。
【００１７】
GPCは上瞼板結膜の乳頭増殖によって特徴付けられる炎症性疾患である。GPCはアレルゲンではなくむしろ不活性物質により引き起こされる。これら刺激性の刺激が取り除かれると、結膜乳頭変化は消散する。コンタクトレンズ表面上のタンパク質の沈着は抗原性となりIgEの産生を刺激するおそれがある{La Rosa M.ら、2013}。
【００１８】
眼アレルギーの現行の治療には非薬理的及び薬理的戦略が含まれる。抗原の回避はあらゆる種類の眼アレルギーについての主要行動修正である。人工的涙代用物はバリア機能をもたらし、結膜粘膜のレベルにおける最前線での防御を改善するのに寄与する。非薬理的戦略が適切な症状緩和をもたらさない場合、薬理的治療を適用すればよい。
【００１９】
眼アレルギーの管理の頼みの綱は、抗ヒスタミン剤等の抗アレルギー治療薬、二重作用又は併用治療及びマスト細胞安定化剤の使用を含む。局所抗ヒスタミン剤(例えば、エメダスチン及びレボカバスチン)はヒスタミン受容体を競合的に及び可逆的にブロックし、掻痒及び発赤を緩和するが、それも短時間のみである。抗ヒスタミン剤は、阻害されたままである他の炎症誘発性メディエータに影響を与えない。作用持続期間が限られているため頻回投与が必要となり、局所抗ヒスタミン剤は、特に長期使用では眼に刺激性になることがある。
【００２０】
鬱血除去剤(例えば、オキシメタゾリン、テトラヒドロゾリン、及びナファゾリン)を抗ヒスタミン剤と組み合わせて使用する併用治療は血管収縮剤として作用するが、点眼するとチクチクする又はヒリヒリすることで知られている。他の有害事象には散瞳及び反動的充血が含まれるため、これらの併用治療はむしろ、短期間緩和させるのに適している。更に、これらの薬物は狭隅角緑内障を罹った患者での使用には推奨されない。マスト細胞安定化剤(例えば、クロモグリク酸、ロドキサミド、ネドクロミル)の作用機序は不明である。マスト細胞安定化剤は既存の症状を緩和することはなく、マスト細胞脱顆粒とその後のアレルゲンへの曝露を防ぐため予防的にのみ使用することができる。マスト細胞安定化剤は負荷期間が必要であり、その期間中の抗原曝露前に適用されなければならない{La Rosa M.ら、2013}。
【００２１】
上述の抗アレルギー薬ではアレルギー炎症過程を十分に制御できない場合、抗炎症剤を使用する。副腎皮質ステロイドは依然として、眼アレルギーの比較的重症な変種において使用されるもっとも強力な薬品の1つである{La Rosa M.ら、2013}。しかし、ステロイド薬は患者の健康全般を脅かす副作用をもたらすことがある。副腎皮質ステロイドの慢性投与は、腸カルシウム吸収を抑制し骨形成を阻害することにより薬物性骨粗鬆症をもたらすことがある。副腎皮質ステロイドの慢性投与の他の有害副作用には、身体代謝過程に対するこれらの薬物の効果による、高血圧、高血糖、高脂血症(トリグリセリドのレベルの増加)及び高コレステロール血症(コレステロールのレベルの増加)が含まれる。ある種の副腎皮質ステロイドは、このクラスの他の化合物よりも眼内圧(「IOP」)を上昇させる大きな潜在力を有することも知られている。例えば、プレドニゾロンは、極めて強力な眼抗炎症薬であるが、中等度の眼抗炎症活性を有するフルオロメトロンよりもIOPを上昇させる傾向が大きいことが知られている。副腎皮質ステロイドの局所的眼使用に関連するIOP上昇のリスクは時間とともに増加していくことも知られている。言い換えると、これらの薬剤の慢性(すなわち、長期)使用は著しいIOP上昇のリスクを増加させる。したがって、副腎皮質ステロイドは眼アレルギーの長期治療には適切ではない可能性がある。更に、副腎皮質ステロイドの慢性使用は、白内障及び緑内障の発症のリスクが増加するせいで禁忌となる{Ono SJ及びAbelson MB、2005}。
【００２２】
アレルギー免疫療法はアレルゲンに対する応答を減少させるのに有用であるが、アレルギー性結膜炎におけるその役割はまだ証明されていない。この治療の主目的は特定のアレルゲンに対して臨床寛容(clinical tolerance)を誘発することである。この療法は漸増用量で皮下に投与され、臨床反応の閾値より下にとどまる。舌下免疫療法(SLIT)は皮下アレルギー免疫療法の代替法と考えられており、舌下に経口投与されるが、SLITの長期結果はまだ入手可能ではない。この種の療法を用いた試験の大半がアレルギー性鼻炎を対象としてきた。一般に、アレルゲン投与に対する免疫応答は療法の有効性を予測せず、療法それ自体が全身反応を生じることがあり、その発生率及び重症度は投与されるアレルゲンの種類に応じて変動する{La Rosa M.ら、2013}。
【００２３】
更に、大多数のもっと新しい眼抗アレルギー剤は作用持続期間を制限し、1日2回投薬が必要である。作用持続期間がもっと長い局所調製物であれば、1日1回滴下すればよいので有利だと考えられる。したがって、従来の眼抗アレルギー剤と類似する安全性プロファイルを達成しつつ、効力及び作用持続期間等の面で利点を与えることができる新たな療法が必要とされている。
【００２４】
RNA干渉に基づく療法は、アレルギー治療において対処されていない必要性を満たす可能性があると指摘されてきた{Popescu FD. 2005}。アレルゲンで感作されたマウスにおいてCD40 siRNAを全身投与すると、樹状細胞及びB細胞機能の阻害並びに調節性T細胞の生成を通じて鼻アレルギー症状を減弱できることが実証されている{Suzuki M.ら、2009}。更に、アレルギー性鼻炎に対する、のsiRNAに基づくアレルゲン特異的療法も、CD40がサイレンシングされアレルゲンがパルスされた樹状細胞を使用することにより開発されている{Suzuki Mら、2010}。
【００２５】
細胞内の細胞内遊離カルシウム(Ca2+)濃度の変化は多くの生物学的細胞機能を調節する。Ca2+シグナルは細胞内の主要なカルシウム貯蔵場所である小胞体(ER)からのCa2+の制御された放出により発生する。ERからのカルシウム放出により細胞膜のストア感受性Ca2+(SOC)チャネルが活性化され、細胞質内への細胞外カルシウム流入のストア感受性Ca2+移行(SOCE)が始動される。最近の研究によって、アレルギーを含む種々の病態生理学的プロセスにおけるこのCa2+移行機構の重要性が強調された{Bergmeier Wら、2013}。
【００２６】
SOCEはER Ca2+プールの枯渇に応答して活性化される。SOCEの活性化により細胞外コンパートメントからCa2+移行が誘発され、これはストア感受性Ca2+放出活性化Ca2+(CRAC)チャネルにより媒介される{Hoth M.ら、1992}。
【００２７】
CRACチャネルは、STIM(間質相互作用分子)と呼ばれるカルシウム感知タンパク質とORAIと名付けられたポア形成サブユニットで構成されている。哺乳動物細胞は3つのORAIアイソフォーム、ORAI1、ORAI2及びORAI3を有し、ORAI2及びORAI3はORAI1と同じ役割を果たしているが、これらのタンパク質により発生するCa2+電流は、ORAI1により発生する電流の約3分の1〜2分の1である{Smyth J.T.ら、2006}。
【００２８】
ORAI1は、4つの膜貫通ドメインを有する偏在的に発現する33kDaの細胞膜タンパク質であり、このタンパク質はカルシウム貯蔵が枯渇するとカルシウムセンサー間質相互作用分子1(STIM1)により活性化され、CRACチャネルを通じて細胞質内への細胞外カルシウム流入を誘発する。ORAI1はCRACモジュレータ1、CRACM1、ORAT1、膜貫通タンパク質142A、TMEM142A、又はCRACチャネルタンパク質1とも呼ばれる。ORAI1はCRACチャネルの主要なサブユニットと定義されている{Wang Y.ら、2012}。
【００２９】
アレルギー応答における免疫細胞の短期及び長期活性化は細胞外コンパートメントから免疫細胞へのCa2+の流入により媒介されていることを示す証拠が増えている。短期応答にはマスト細胞の脱顆粒及びエフェクター細胞溶解T細胞の活性化が含まれる。実際、STIM1又はORAI1のいずれかを欠くマスト細胞は脱顆粒にかなりの欠損を示す{Vig M.ら、2008; Baba Y.ら、2008}。長期応答は、B及びT細胞増殖及び分化を制御する遺伝子発現のモジュレーションを含む{Parekh A.B.ら、2005}。
【００３０】
ORAI1はマウスマスト細胞エフェクター機能に極めて重要であることも示唆されている。ORAI1欠損マウス由来のマスト細胞は著しく欠損した脱顆粒を示し、IgE媒介インビボ受動アナフィラキシー応答の誘発もORAI1に依存している{Vig Mら、2008}。
【００３１】
RNAiによるORAI1ノックダウンがアレルギー性鼻炎において研究されてきた。ORAI1に対するshRNA(ショートヘアピンRNA)をコードする組換えレンチウイルスベクターがOVA感作マウスの鼻孔に投与されると、アレルギー性鼻炎症状(多くのくしゃみ及び多くの鼻擦り)が軽減された{Wangら、2012}。鼻炎は、閉塞又は鬱血に起因する鼻刺激又は炎症により生じる。アレルギー性鼻炎は、いくつかの種類の免疫細胞の応答性亢進と関連する上気道でのアレルギー性炎症である{Wangら、2012}。しかし、すべての鼻炎症例がアレルギー反応により引き起こされるわけではない。鼻炎は、煙草煙を含む化学物質曝露、温度変化、感染及び他の要因に対する応答としても生じる。
【００３２】
別の研究では、siRNAを用いてORAI1をノックダウンさせるとヒスタミン媒介COX-2発現及びNFkB活性化が減弱したがこれは、ORAI1媒介NFkB活性化がアレルギー応答における炎症反応を始動させるヒスタミンシグナルの伝達の原因となる重要なシグナル伝達経路であることが示している{Huang WCら、2011}。
【００３３】
したがって、眼アレルギーにおける炎症応答の重要な部分は、ORAI1活性化により媒介される可能性が高い。
【００３４】
アレルギー治療のためのORAI1のノックダウンを目的とするsiRNAに関する特許文献がある。WO2010/099401(The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University)は、ORAI1に結合してCRACチャネルを開くアミノ酸残基STIM1ドメインにCRACチャネルが接触している細胞中でCRACチャネルの活性をモジュレートする方法を記載している。治療可能な状態には、遅延型過敏症及び喘息を含む免疫系のアレルギー又は過敏症が収載されている。その記載において、siRNAを使用して内在性遺伝子の発現を乱し、前記内在性遺伝子がSTIMとORAIタンパク質の間の相互作用のモジュレートに効果があるかどうかを決定しうることが示されている。
【００３５】
WO2007/121186(The Queen's Medical Center)は、ヒト胚性腎臓細胞(HEK293)におけるヒトCRACM1(ORAI1)のsiRNA媒介サイレンシングを記載している。前記特許文献では、CRACM1(ORAI1)タンパク質との相互作用又はCRACMl(ORAI1)発現の破壊によってCRACチャネル活性をモジュレートする薬剤を使用すればアレルギー反応をモジュレートできることも示されている。
【００３６】
WO2009/095719(ISIS INNOVATION LIMITED社)は、アレルギー性障害、特にアレルギー性鼻炎の治療における使用のための、CRACMl(ORAI1)タンパク質を阻害する、siRNAでありうる薬剤と、マスト細胞のロイコトリエン活性化を阻害する薬剤との組合せを含む、マスト細胞活性化と関連する障害の治療における方法、使用及び使用のための製品について記載している。
【００３７】
US2011/0112058(Incozen Therapeutics Pvt. Ltd.社)は、肺がんを治療するための、好ましくはCRACMl/ORAI1を阻害する候補薬剤を同定するための方法を記載している。この文献はCRAC/STIM経路をモジュレートするためのsiRNAの使用についても記載している。前記文献は、CRACチャネルモジュレータが、アレルギー性鼻炎及びアレルギー性結膜炎を含むカルシウム放出活性化カルシウムチャネルに関連する疾患又は障害の治療、予防及び/又は寛解において有用であると言われてきたことも示している。
【００３８】
US2012/0264231(Hogan Patrickら)は、アレルギー性鼻炎又はアレルギー性結膜炎を含む、カルシウムシグナル伝達の調節不全に関連する状態及び疾患の治療のために、ORAIチャネルを通じてカルシウム流入をモジュレートする及び/又はORAIチャネルによって細胞内カルシウムを調節する、siRNAでありうる薬剤を同定するための方法及びシステムについて記載している。
【００３９】
眼アレルギーにおける炎症応答の重要な部分は、により媒介される。
【００４０】
ORAI1は炎症応答の重要な決定因子であるだけでなく、細胞増殖及び細胞遊走にも関係している。網膜色素上皮(RPE)細胞におけるsiRNAによるORAI1の阻害により、ORAI1が上皮増殖因子(EGF)媒介細胞増殖に関与していることが示された。この研究は、ORAI1が増殖性硝子体網膜症(PVR)等のEGF関連障害の処置に狙いを定めた薬物の潜在的な治療標的になる可能性があると仮定した{Yangら、2013}。PVRは、裂孔原性網膜剥離の合併症として発症する疾患であり、その発症中に、硝子体液由来の液体が網膜円孔に入る。網膜円孔又は涙が形成される機構は、まだ完全には理解されていない。網膜下腔における液体の蓄積及び網膜上の硝子体の牽引力により、裂孔原性網膜剥離が生じる。この過程において、網膜細胞層は、増殖し且つ上皮間葉転換(EMT)を受けながら遊走するRPEの能力を始動させる硝子体サイトカインと接触し、遊走して硝子体に入る能力を獲得する。この過程において、RPE細胞層-神経性網膜接着及びRPE-ECM(細胞外マトリクス)接着が失われる。RPE細胞は遊走する間に線維性膜を生じ、この膜は収縮して網膜を引っ張る。こうしたことすべてが最終的に、一次網膜剥離手術後の二次網膜剥離を生ずる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４１】
【特許文献１】WO02/44321
【特許文献２】EP1527176
【特許文献３】WO2008/050329
【特許文献４】WO2008/104978
【特許文献５】WO2009/044392
【特許文献６】WO2010/099401
【特許文献７】WO2007/121186
【特許文献８】WO2009/095719
【特許文献９】US2011/0112058
【特許文献１０】US2012/0264231
【特許文献１１】WO2005/062937
【特許文献１２】EP2322617
【特許文献１３】EP2348133
【特許文献１４】US2013/0130377
【非特許文献】
【００４２】
【非特許文献１】Maniatis, T.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982、387〜389頁
【発明の概要】
【００４３】
本発明は、眼アレルギーにおけるORAI1発現及び結果としての眼炎症を減少させるための改良された製品を提供する。従来の抗アレルギー療法薬及びアレルギー免疫療法薬と比べた場合の、siRNA製品で眼アレルギーを治療することによる利点は、siRNAに基づく治療は、長期持続性効果をもつことである。この結果になるのは、エフェクター分子がもはや存在しなくなると、細胞は最初から新たな受容体を合成しなければならなくなるが、従来の治療では細胞膜上の受容体のレベルはそのままであるためである。
【００４４】
眼アレルギーは世界中で増加していると思われる。特に工業国では、環境汚染がアレルギーの個人の高まった感受性に対する主要な一因と広く考えられている。悪化する放出汚染に加えて、空中アレルゲンの世界的な増加も研究により指摘されてきた。更に別の考慮すべき事柄は、もっと貧しい国の住民は眼アレルギーの治療を求める可能性が少ないことであり、これが発展途上国で報告されている疾患の発生率を人為的に低くしている可能性のある要因である。
【００４５】
米国喘息アレルギー基金(Asthma and Allergy Foundation in America;AAFA)により、米国でのアレルギーにかかる年間コストは、ほぼ145億ドルと推定されることが示された。5000万の米国人が、屋内/屋外、食品及び薬物、ラテックス、昆虫、皮膚並びに眼アレルギーを含むあらゆる種類のアレルギーを患っている(5人に1人の米国人)と推定されていた。米国のアレルギー有病率は全体的に、あらゆる年齢層、性別及び人種集団にわたって1980年代初期以降ずっと増加してきた。
【００４６】
地理的特性にもかかわらず、世界各国の医師たちが適切な治療経過を選択するための判断基準に共通の根拠を見出している。いくつかの国出身の専門医によれば、これらの判断基準には、投薬の効力、安全性及び利便性並びに患者にとっての投与の快適さが含まれる。したがって、世界中で一定範囲の眼アレルギー症状を訴える患者の数が増加するにつれて、最適な治療を見つけることは、日ごとに一層複雑になり一層関心が持たれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１−１】本発明のsiRNAの標的配列として選択された標的遺伝子配列ORAI1の短い断片を示す図である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図２−１】本発明により包含されるORAI1を標的とする本発明のsiRNA分子のオリゴヌクレオチド配列を示す図である。図に与えられる配列番号はセンス(5'→3')鎖に関する。典型的にはsiRNAはdsRNAとして投与されることになり、したがってセンス鎖もその相補的なアンチセンス鎖も含むことになる。配列番号112〜配列番号222はそれぞれ配列番号1〜配列番号111を標的とするsiRNAである。一般に、siRNAはセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むことになり、3'ジヌクレオチドオーバーハング(例えば、dTdT)を含むこともある。しかし、これは不可欠ではない。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図２−４】図２−３の続きである。
【図３】ORAI1を標的とする修飾siRNAを示す図である。与えられた配列番号は修飾ORAI1 siRNAのセンス(5'→3')鎖に関する。
【図４】異なる細胞株(ヒトA204、マウスC2C12及びマウスJ744A,1)における配列番号112のトランスフェクション後のインビトロORAI1発現レベルを示す図である。
【図５】マウスC2C12細胞株におけるORAI1を標的とするsiRNAのトランスフェクション後のインビトロORAI1発現レベルを示す図である。
【図６】異なる細胞株(ヒトA204及びマウスC2C12)における配列番号112のトランスフェクション後の異なる細胞株のインビトロ毒性レベルを示す図である。
【図７】ヒトA204細胞における配列番号112並びにその修飾された対応物、配列番号223、配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227、配列番号228、及び配列番号229のトランスフェクション後のインビトロヒトORAI1発現レベルを示す図である。
【図８】マウスC2C12細胞における配列番号112並びにその修飾された対応物、配列番号223、配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227、配列番号228、及び配列番号229のトランスフェクション後のインビトロマウスORAI1発現レベルを示す図である。
【図９】ヒト細胞における配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)の用量応答を示す図である。配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)の漸増用量(0.001〜100Nm)でのヒトA204細胞のトランスフェクション並びにsiRNA作用機序の%ORAI1遺伝子発現結果の定量。
【図１０】マウス細胞における配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)の用量応答を示す図である。配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)の漸増用量(0.001〜100Nm)でのマウスC2C12細胞のトランスフェクション並びにsiRNA作用機序の%ORAI1遺伝子発現結果の定量。
【図１１】ヒト細胞における配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)のトランスフェクション後のORAI1並びにそのパラログORAI2及びORAI3の発現を示す図である。ヒトA204細胞における配列番号112及び配列番号227のトランスフェクション並びにsiRNA作用機序の%ORAI1、ORAI2及びORAI3遺伝子発現結果の定量。
【図１２】マウス細胞における配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)のトランスフェクション後のORAI1並びにそのパラログORAI2及びORAI3の発現を示す図である。C2C12マウス細胞における配列番号112及び配列番号227のトランスフェクション並びにsiRNA作用機序の%ORAI1、ORAI2及びORAI3遺伝子発現結果の定量。
【図１３】ヒト細胞における配列番号112(SYL116011)のトランスフェクション後の推定OTEの発現を示す図である。ヒトA204細胞における配列番号112のトランスフェクション並びにsiRNA作用機序の%ORAI1、MSLN及びOLFM12A遺伝子発現結果の定量。
【図１４】ラット細胞株における配列番号112(SYL116011)のトランスフェクション後のORAI1発現レベルを示す図である。ラットC6細胞における配列番号112のトランスフェクション及びsiRNA作用機序の%ORAI1遺伝子発現結果の定量。
【図１５】ラット細胞株における配列番号112(SYL116011)のトランスフェクション後のORAI1発現レベルを示す図である。ラットJTC-19細胞における配列番号112のトランスフェクション及びsiRNA作用機序の%ORAI1遺伝子発現結果の定量。
【図１６】ヒト、マウス及びラット細胞における配列番号112(SYL116011)、配列番号233(SYL116011v11)及び配列番号235(SYL116011v12)のトランスフェクション後のORAI1の遺伝子発現レベルを示す図である。
【図１７】インビボアッセイの予定を示す図である。
【図１８】眼アレルギーの誘発後の異なる時間におけるマウス全眼でのORAI1 mRNAのレベルを示す図である。NA:アレルギーなし。
【図１９】ブタクサ花粉誘発アレルギーのマウスモデルにおけるTLSP及びTnfrsf9のmRNAレベルを示す図である。mRNAレベルはアレルギーの誘発に先立って観察されるレベルの百分率として表される。
【図２０】眼アレルギーを示す眼臨床徴候を示す図である。マウスは眼アレルギーの誘発の1、3、6及び24時間後に観察された。臨床徴候は、以下のパラメータ、結膜浮腫及び充血(injection)、充血(hyperemia)、眼瞼浮腫、眼脂並びに流涙をスケール0〜3で段階分けすることにより吟味した。データはPBS処置群のアレルギーの誘発後1時間の臨床スコアリングの百分率として表し、PBSについては8動物及び配列番号112(SYL116011)処置群については15動物の平均±S.E.Mを表す。
【図２１】ブタクサ花粉誘発アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)の異なる用量を用いた治療に対する応答における結膜浮腫及び流涙を示す図である。マウスは眼アレルギーの誘発の1、3、6及び24時間後に観察された。A)結膜浮腫及びB)流涙はスケール0〜3でスコア化した。データはPBS処置群のアレルギーの誘発後1時間でのスコアリングの百分率として表し、PBSについては8動物及び配列番号112(SYL116011)処置群については15動物の平均を表す。
【図２２】ブタクサ花粉誘発アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)の異なる用量を用いた処置に対する応答における眼瞼結膜及び眼球結膜でのマスト細胞の浸潤を示す図である。A)処置の3時間後のPBS処置試料において観察されたマスト細胞の数の百分率として表された眼瞼結膜でのマスト細胞の浸潤。B)処置の3時間後のPBS処置試料において観察されたマスト細胞の数の百分率として表された眼球結膜でのマスト細胞の浸潤。
【図２３】ブタクサ花粉誘発アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)の異なる用量を用いた処置に対する応答における眼瞼結膜及び眼球結膜での好酸球の浸潤を示す図である。A)処置の24時間後のPBS処置試料において観察された好酸球の数の百分率として表された眼瞼結膜での好酸球の浸潤。B)処置の24時間後のPBS処置試料において観察された好酸球の数の百分率として表された眼球結膜での好酸球浸潤。
【図２４】ブタクサ花粉誘発アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)の異なる用量を用いた処置に対する応答におけるTLSP及びCD-137発現を示す図である。A)TLSPの発現; B)CD-137(Tnfrsf9)の発現。
【図２５】アレルギー負荷(allergy challenge)後の異なる時点で観察された臨床徴候を示す図である。アレルギーは、PBS、配列番号227(SYL116011v8)又はレボカバスチンで前処置したマウスに対し、ブタクサ花粉を眼に投与することにより誘発した。データは群ごとに10動物の平均を表す。
【図２６】投薬後充血からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクルを示す図である。
【図２７】投薬後斜視からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクルを示す図である。
【図２８】投薬後眼瞼腫張からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクルを示す図である。
【図２９】投薬後眼脂からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
第1の態様では、本発明は、ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療及び/又は予防における医薬として使用するためのsiRNA分子の提供に関するものであり、前記分子は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される配列を特異的に標的とし、細胞内に導入された場合にはORAI1遺伝子の発現を減少させる。好ましくは、標的配列は、配列番号1〜配列番号14からなる群、更に好ましくは、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択され、更により好ましくは、標的配列は配列番号1を含む又はからなる。
【００４９】
例えば、siRNA分子が遺伝子の発現を選択的に減少させる又は阻害する場合、前記遺伝子は本発明に従ったsiRNAにより「標的とされて」いることになる。本明細書で使用される語句「選択的に減少する又は阻害する」は、1つの遺伝子、この場合ORAI1、の発現に影響を与えるsiRNAを包含する。代わりに、siRNA(の1つの鎖)が厳密な条件下で遺伝子転写物、すなわち、そのmRNAにハイブリダイズする場合、siRNAは前記遺伝子を標的としていることになる。「厳密な条件下で」ハイブリダイズするとは、ハイブリダイゼーションを嫌う傾向がある標準条件下、例えば、高温及び/又は低塩含有量で標的mRNA領域にアニールすることを意味する。Maniatis, T.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982、387〜389頁には適切なプロトコル(0.1×SSC、68℃、2時間を含む)が記載されている。
【００５０】
本明細書で言及される核酸配列は、特に指示がない限り、5'から3'方向に書かれている。用語「核酸」とは、DNA若しくはRNAのどちらか又はDNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、チミン「T」)に若しくはRNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、ウラシル「U」)に存在するプリン若しくはピリミジン塩基を含むそれらの修飾型のことである。「T」塩基は、天然にはRNA中に存在しないが、本明細書に提供される干渉RNAは、例えば、3'末端に「T」塩基を含む場合がある。いくつかの場合、これらの塩基は、リボヌクレオチドの鎖中に存在するデオキシリボヌクレオチドを区別するために「dT」として現れる場合がある。
【００５１】
上に定義される標的配列はsiRNAを設計する目的で使用されるデータベースにおいて転写バリアントの定義のために使用される標的DNA配列として記載され、使用される特定の化合物はそのようなものとして定義されるRNA配列になる。
【００５２】
当分野の専門家は公開されているデータベースを通じていかなる標的遺伝子配列でも入手することができる。例えば、ヒトORAI1 mRNAに対応するGenBank受託番号はNM_032790(遺伝子ID:84876)である。マウスORAI1 mRNAに対応する相同GenBank受託番号はNM_175423(遺伝子ID:109305)である。更に、ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)は以下のORAI1ヒト及びマウス受託番号、それぞれENSG00000182500及びENSMUSGO0000049686を有する。ヒトORAI1 mRNAについて公開されている転写物はENST00000330079及びENST00000537188である。
【００５３】
本発明により同定された前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。
【００５４】
好ましい実施形態では、前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号14からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。これらの配列は以下の種、ヒト(Homo sapiens)、ハツカネズミ(Mus musculus)、イヌ(Canis lupus familiaris)、及びドブネズミ(Rattus norvegicus)の間で100%の相同性を示す。
【００５６】
RNAi分野では、インビトロ研究によりヒトsiRNAが動物モデル遺伝子のノックダウンを誘発することができないことが実証される場合、関連する動物モデルにおけるsiRNAの効力を分析するために代用化合物(surrogate compound)(動物活性類似体)が合成される。この代用物はヒトsiRNAと同じ領域に対して設計され、したがって前記2つのsiRNAは、ヒト標的遺伝子とウサギ標的遺伝子の間の相同性に応じて、少数のヌクレオチドを除いて同じ配列を有する。このアプローチは、他のオリゴヌクレオチドの開発のために、特に毒性学研究のために広く使用されてきた{Kornbrust D.ら、2013}。
【００５７】
更に好ましい実施形態では、前記好ましい標的領域は配列番号1(5'-TGATGAGCCTCAACGAGCA-3')を含む又はからなる。
【００５８】
したがって、本発明の態様に従ったsiRNAは、好ましくは、そのアンチセンス鎖が配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列に実質的に相補的であるRNA配列を含み、そのセンス鎖が前記アンチセンス鎖に相補的であるRNA配列を含み、両方の鎖がヌクレオチド間の標準塩基対形成によりハイブリダイズする二本鎖RNA分子を含むことになる。更に好ましくは、本発明の態様に従ったsiRNAは、そのアンチセンス鎖が配列番号1〜配列番号8からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列に実質的に相補的であるRNA配列を含む、二本鎖RNA分子を好ましくは含むことになる。
【００５９】
本発明の意味の範囲内で、標的mRNA配列に「実質的に相補的」は、前記標的配列に「実質的に同一」として理解してもよい。当業者が知っている「同一性」は、配列間のヌクレオチドの順番及び同一性をマッチさせることにより決定される場合のヌクレオチド配列間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的mRNA配列に85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%相補性を有するsiRNAのアンチセンス鎖は実質的に相補的であると見なされ、本発明において使用することができる。相補性の百分率は、第2の核酸分子中の1組の連続するヌクレオチドとワトソン-クリック型の塩基対を形成することができる第1の核酸分子中の連続するヌクレオチドの百分率を表している。好ましい実施形態では、アンチセンスsiRNA鎖は標的mRNA配列に100%相補的であり、センス鎖はsiRNAの二本鎖部分にわたってアンチセンス鎖に100%相補的である。siRNAは、不対オーバーハング、例えば、3'ジヌクレオチドオーバーハング、好ましくはdTdTを含んでいてもよい。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明により特定される前記眼状態は眼アレルギー及び/又は眼結膜炎である。更に好ましくは、前記眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される。
【００６１】
最先端技術から分かるように、多くの異なる構造がRNA干渉を達成すると提唱されてきた。一般に、これらの二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長であり平滑末端構造並びにオーバーハングを持つ構造を含む。オーバーハングは有利であると報告されてきたのであり、RNaseによる認識を減少させダイサーの天然基質を模倣するので、どちらかの鎖の、5'末端に存在していてもよいし3'末端に存在していてもよい。一部の筆者らは分子の両3'末端にオーバーハングを含むことを推奨し、他の筆者らは1つのオーバーハングで十分であると考えている。他の筆者らは特定の修飾パターンを有する平滑末端構造の使用を記載している(EP1527176、WO2005/062937、WO2008/104978、EP2322617、EP2348133、US2013/0130377及び他にも多数)。
【００６２】
オーバーハングは1〜5ヌクレオチドを含んでいてもよく、典型的にはオーバーハングはジヌクレオチドでできている。当分野で使用される古典的な分子は、19ヌクレオチド二本鎖分子を含み、この分子は、Tuschl(WO02/44321)による最初の研究が教唆するように、好ましくは、デオキシヌクレオチドを含む3'ジヌクレオチドオーバーハングを更に含む。これらのオーバーハングはヌクレアーゼ(RNase)分解に対する抵抗性を更に増強すると言われている。後に、Kimら、2005は、21マー産物(ジヌクレオチドオーバーハングを含有する)であることが、RISCに取り込まれるのに必要であると報告している。更に、Bramsenら、2009は、サイレンシング効率を更に増加させるためのオーバーハングへの不安定化修飾の導入の可能性について報告している。
【００６３】
したがって、本発明の種々の態様の好ましい実施形態は、少なくとも1つのオーバーハングを含む配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関する。更に好ましくは、前記siRNA分子は、配列番号1〜配列番号8からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする。本発明が配列番号1〜配列番号111から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関する場合、前記siRNAは、標的と同等の長さがあり相補的であるアンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖と同等の長さがありに相補的であるセンス鎖を含む。アンチセンス及びセンス鎖は、もう一方の鎖にも標的にも相補的ではない及び/又はsiRNAの二本鎖部分で対になっていない追加の塩基を更に含んでいてもよい。例えば、配列番号1は、19ヌクレオチド配列であり、siRNAは、配列同一性のこの部分にわたる19bp二本鎖領域及びジヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の種々の態様の好ましい実施形態は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関し、二本鎖siRNA分子のそれぞれの鎖は約18〜約28又はそれよりも多い(例えば、約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、若しくは28又はそれよりも多い)ヌクレオチド長である。
【００６５】
本発明の種々の態様の別の好ましい実施形態は、18〜28ヌクレオチド長又はそれよりも長い、配列番号112〜配列番号229からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むsiRNA分子に関する。更に好ましくは、二本鎖siRNA分子は少なくとも19ヌクレオチド長であり、配列番号112〜配列番号229からなる群から選択される。
【００６６】
本発明の種々の態様の別の代わりの実施形態は、平滑末端分子を提供する。
【００６７】
更に、本発明の好ましい実施形態は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなるsiRNAに関する。更に好ましくは、siRNAは、配列番号1〜配列番号8からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなる。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列に対して標的化される19ヌクレオチド二本鎖平滑末端siRNAに関する。更に好ましくは、siRNAは、配列番号1〜配列番号8からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列に対して標的化される。更に特定の実施形態では、この化合物は、配列番号112〜配列番号229からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。更に好ましい実施形態では、このsiRNAのアンチセンス鎖は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列に少なくとも80%、好ましくは、少なくとも90%相補的である。
【００６９】
好ましい実施形態では、この化合物は、配列番号112〜配列番号119からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。
【００７０】
更に好ましい実施形態では、この化合物はSYL1160011と名付けられた本発明者らの基準化合物のセンス鎖に対応する配列番号112(5'-UGAUGAGCCUCAACGAGCA-3')を含む又はからなる。
【００７１】
更に、背景技術と呼ばれるセクションに記載されるように、siRNA分子に関する重要問題は、RNaseの偏在性に起因する生体液中でのその分子の不安定性である。したがって、ヌクレオチドに対する多くの異なる化学修飾の使用が、化合物安定性を増強する目的で報告されてきた。
【００７２】
siRNA分子のもう1つの固有の問題はその免疫原性であり、それによりsiRNAは、ある種のサイトカイン、例えば、I型及び/又はII型インターフェロン並びにIL-12、IL-6及び/又はTNF-アルファ産生の上方調節を含む、自然免疫系の非特異的活性化を誘発することが分かってきた。これらの効果の原因は、siRNAによりTLR7、TLR8及び/又はTLR3等のトール様受容体が活性化されることであると考えられている。
【００７３】
これらの効果、RNaseによる認識及び免疫原性は、両方とも配列依存的であるとも報告されている。
【００７４】
RNaseに対する感受性を減少することにより化合物安定性を増強する化学修飾の一部は、それに続く応答の免疫認識の誘発も減少させることができる。しかし、以前のセクションに記載したように、siRNAに化学修飾されたヌクレオチドを挿入すると、サイレンシング効力も減少することがあり、したがって、挿入には注意して取り組まなければならない。
【００７５】
したがって、本発明の種々の態様の好ましい実施形態では、siRNAは化学修飾を有する少なくとも1つのヌクレオチドを更に含む。
【００７６】
安定性を増強し免疫原性効果を減少させる好ましい化学修飾には、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-フルオロヌクレオチド、2'-アミノヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、又は2'-O若しくは4'-Cメチレン架橋を含有するヌクレオチドが含まれる。エキソヌクレアーゼ保護のための他の好ましい化学修飾には、ExoEndoLight (EEL)、つまりセンス鎖中のすべてのピリミジンの2'-O-メチル残基への修飾、及びアンチセンス鎖における5'-UA-3'又は5'-CA-3'モチーフ中のすべてのピリミジンの修飾が含まれる。更に、センス鎖の1位も2'-O-メチルに変えることができ、センス鎖の5'-リン酸化を防ぎ、したがって、センス鎖を更に不活性化することによりsiRNAの特異性を増加する。更に、センス鎖は14位に2'-O-メチル修飾を含むこともできる。なぜならば、この位の2'-O-Meはセンス鎖を更に不活性化し、したがってsiRNAの特異性を増加させるからである。更に、エキソヌクレアーゼ保護のための他の好ましい化学修飾には、メチルフルオロ(MEF)、つまりセンス鎖上では2'-Fで開始し(5'-末端)、アンチセンス鎖上では2'-O-Meで開始し、2'-フルオロ及び2'-O-メチル修飾が交互に繰り返されるエキソ保護が含まれる。更に、センス鎖の1位は2'-O-Meに、アンチセンス鎖の1位は2'-Fに変えることもできる(これは効率的に5'-リン酸化することができるのと同じく)。その上、隣接するヌクレオチドを繋ぐリボヌクレオチド骨格の修飾は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入により行うことができる。本発明の意味の範囲内での更に好ましい化学修飾は、ウラシルリボヌクレオチドをデオキシチミジン(デオキシリボヌクレオチド)で置換することに関する。本発明の別の好ましい実施形態では、少なくとも1つの化学修飾されたヌクレオチドがsiRNAのセンス鎖上、アンチセンス鎖上又は両鎖上にある。
【００７７】
したがって、一実施形態では、siRNAは、配列番号223〜配列番号229からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。
【００７８】
上述のsiRNA分子は、当技術分野で既知の方法を使用して、細胞内部にその天然の構造のまま送達してもよい。例えば、インビトロ遺伝子サイレンシングを研究する場合、これらの化合物は標準トランスフェクション試薬を使用して投与される。効果をインビボで達成するためには、これらの化合物は裸で又は、例えば、リポソーム等の送達増強剤、特定の部分とのコンジュゲーション等を使用して投与してもよいが、多くの異なる代替案が当技術分野では知られており、身体内の所望の標的部位に応じて別様に使用される。
【００７９】
代わりに、本発明の種々の態様のsiRNA分子は真核生物プロモーターから細胞内で発現させることができる。siRNA分子を発現させることができる組換えベクターは、標的細胞に送達され、標的細胞内に留まることができる。代わりに、核酸分子の一過性発現をもたらすベクターを使用することもできる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。siRNA分子は発現すると、標的mRNAと相互作用しRNA干渉応答を生ずる。このようにして産生されるsiRNA分子は、そのセンス鎖とアンチセンス鎖がヌクレオチドの小さなループにより連結されているので、多くの場合shRNA(ショートヘアピンRNA)と呼ばれる。siRNA分子発現ベクターの送達は、静脈内若しくは筋肉内投与、対象から外植された標的細胞への投与とそれに続く前記対象への再導入等の全身的送達であっても、又は所望の標的細胞への導入を可能にすると考えられる他のいかなる手段による送達であってもよい。
【００８０】
本発明の更なる態様は、ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療方法において使用するための医薬の調製における、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAの使用に関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。前記方法は患者におけるORAI1の発現を阻害することを含む。用語、阻害は、発現又は活性の減少又は下方調節を示すために使用される。好ましくは、眼状態は眼アレルギー及び/又は結膜炎である。一実施形態では、眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せを含む群から選択される。
【００８１】
ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療方法も提供される。前記方法は患者におけるORAI1の発現を阻害することを含む。前記方法は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAを投与することを含んでいてもよい。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。
【００８２】
一部の国では、慢性アレルギー性結膜炎とドライアイ症候群の組合せは極めて一般的である。増加しているドライアイ問題は、一般的な人工的気候(artificial climatization)、屋内及び屋外汚染物質並びに他の未知の理由に起因する。ドライアイ症候群を抱える患者のほうが眼アレルギーを患いやすい。なぜならば、涙膜はアレルゲンがマスト細胞と接触するのを防ぐ重要な障壁だからである。
【００８３】
ORAI1 mRNAに対するsiRNAを用いた治療的処置は、効果が観察される時間の長さを増加させ、それによって投薬回数を減らし患者のコンプライアンスを高めることにより、低分子の局所的点眼薬に有益であると予想されている。春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、及び巨大乳頭結膜炎を含むがこれらに限定されない眼アレルギー並びに/又は結膜炎等の症例では、これは特に重要である。なぜならば、これらの症例は慢性状態であることが多いからである。
【００８４】
そのような医薬の調製を考慮すると、本発明の種々の態様のsiRNAは医薬組成物として製剤化することができる。好ましくは、前記siRNAの組成物及び製剤は、対象の器官に局所的に投与してもよい。更により好ましい実施形態では、前記siRNAは、眼への、好ましくは、眼の角膜表面への局所投与のために製剤化してもよい。角膜表面への適用は、例えば、点眼薬、ゲル、ローション、クリーム又は眼球インサートの形態であってもよい。眼への他の投与形態は、眼球への注射を含んでいてもよい。
【００８５】
本発明の種々の態様の更なる好ましい実施形態は、ORAI1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療のための医薬として使用するための、先行する段落に記載される配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とするsiRNAに関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。上述のように、前記配列は、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなるsiRNAであってもよい。このsiRNAは平滑末端であってもよい。好ましくは、siRNAは、配列番号112〜配列番号229からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。本発明に従った使用のための他のsiRNAは、配列番号223〜配列番号229からなる群由来の少なくとも1つの配列を含む又はからなる。
【００８６】
本発明の文脈では、配列を「特異的に標的とする」ため、本発明のsiRNAは、好ましくは少なくとも同じシード配列を含む。したがって、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とする、本発明に従ったいかなる配列も、好ましくは、アンチセンス鎖の2〜8位で同一である。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。
【００８７】
上記にもかかわらず、本発明の種々の態様のsiRNAを使用して、眼以外の組織においてORAI1をサイレンシングすることができる。したがって、前記siRNAはそれに合うように製剤化すべきである。
【００８８】
例えば、siRNA分子は、対象への投与のための、リポソームを含む送達ビヒクルに含めることができる。担体及び希釈剤並びにその塩は薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。核酸分子は、リポソームへの封入、イオン泳動、若しくは生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリンポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)及びPLCAマイクロスフェア(microsphere)、生分解性ナノカプセル並びに生体付着性マイクロスフェア等の他のビヒクル内への取込み、又はタンパク質性ベクターを含むがこれらに制限されない当業者には既知の種々の方法により細胞に投与することができる。本発明の一実施形態では、siRNA分子は、B型肝炎ウイルスの成分とリポソームを組み合わせる細胞特異的siRNA担体を通じて送達される。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン及びポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-GAL)又はポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-triGAL)誘導体等のその誘導体と一緒に製剤化する又は複合体化することもできる。本発明の好ましい組成物は水溶液、特に、pH範囲が約7.0〜約7.4、好ましくは、pHが7.2±0.5のリン酸緩衝食塩水(PBS)等の生理食塩水である。
【００８９】
本発明のsiRNA分子は、膜破壊剤及び/又はカチオン脂質若しくはヘルパー脂質分子と複合体化してもよい。
【００９０】
本発明と共に使用してもよい送達システムは、例えば、水性及び非水系ゲル、クリーム、多層乳剤(multiple emulsions)、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素系並びに粉末を含み、可溶化剤、透過促進剤(例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸)、及び親水性ポリマー(例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン)等の賦形剤を含有することができる。一実施形態では、薬学的に許容される担体はリポソーム又は経皮浸透促進剤(transdermal enhancer)である。
【００９１】
本発明の医薬製剤は、細胞又は例えば、ヒトを含む対象への投与、例えば、全身若しくは局所投与に適した形態である。適切な形態は、部分的に、使用又は移行経路、例えば、経口、経皮、又は注射によるものに依拠している。他の要因は当技術分野で知られており、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮するのを妨げる形態等の考慮すべき点が含まれる。
【００９２】
本発明には、貯蔵又は投与のために調製され、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に薬学的有効量の所望の化合物を含む組成物も含まれる。治療的使用のための許容される担体又は希釈剤は製薬技術では周知である。例えば、保存剤、安定化剤、色素及び香味料を提供することができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。更に、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。
【００９３】
薬学的有効量とは、発生を予防する、阻害する又は疾患状態を治療する(症状をある程度、好ましくは、症状のすべてを軽減する)のに必要な用量である。薬学的有効量は一般的に、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、治療されている哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物及び当業者であれば認識する他の要因に依存する。
【００９４】
治療的有効量とは、眼アレルギーに関連する眼障害の開始を遅延させる又は最小限に抑えるのに十分なsiRNAの量のことでもありうる。治療的有効量とは、眼アレルギーに関連する眼障害の処置又は管理において治療効果をもたらす量の治療薬のことでもありうる。更に、本発明のsiRNAに関する治療的有効量とは、単独で又は他の療法と組み合わせて、眼アレルギーに関連する眼障害の処置又は管理において治療効果をもたらす量の治療薬を意味する。本発明のsiRNAの量との関係で使用した場合、前記用語は、全体的療法を改善し、望ましくない効果を減少する若しくは回避する、又はもう1つの治療薬の治療効力を増強する若しくはそれとの相乗効果をもたらす量を包含することができる。
【００９５】
眼アレルギー等の眼障害の処置又は管理における治療効果とは、アレルギー症状の持続的減少のことである。siRNAが細胞内のORAI1のレベルを減少すると仮定すると、処置を停止すれば前記細胞は新しいタンパク質を再合成しなければならない。したがって、siRNA治療に基づく療法は更に持続的な効果をもたらすことになる。これは治療効力の著しい増強と見なされる。
【００９６】
siRNAを使用するさらなる利益は、様々な点眼薬に基づく治療にしばしば付随する、体循環中における存在に由来する副作用又は急性毒性問題の可能性が最小であることである。これは、前記化合物が血流に入った場合、血液中に存在するRNAseに急速に分解されることに起因する。
【００９７】
一方、siRNA分子を単回用量バイアルで市場に出せることは、製剤への抗菌性保存剤の添加を回避できることを意味する。今日、市場に出ている大多数の製剤中には保存剤が存在する。これらの保存剤は一部の患者に不耐性をもたらし、処置を停止することが必要になることがある。いずれの問題も、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、及び巨大乳頭結膜炎を含むがこれらに限定されない眼アレルギー並びに/又は結膜炎等の状態が多くの場合慢性的であり、したがって、治療も慢性的になることを考慮すると、特に深刻である。
【００９８】
好ましい投与経路の1つは、好ましくは点眼液を使用して、眼に直接滴下することによる局所的投与経路である。上述のように、ORAI1 mRNAに対するsiRNAを用いた治療的処置は、効果が観察される時間の長さを増加させ、それによって投薬回数を減らし患者のコンプライアンスを高めることにより、低分子の局所的点眼薬に有益であると予想されている。
【００９９】
しかし、上で説明されるように、眼に対する直接投与経路以外の投与経路も使用することができる。製剤において用いられる正確な投与量及び投与計画も、投与経路に依存することになる。当業者であれば、用いる正確な投与量及び投与計画は障害の重症度にも依存しており、開業医の判断及びそれぞれの患者の状況に応じて決断すべきであることを理解していると考えられる。いかなる特定の対象にとっても特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与時間、投与経路及び排泄速度、薬物組合せ、並びに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することも理解されている。
【０１００】
本発明の及び本明細書に記載されている製剤又はsiRNAは、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント及び/又はビヒクルを含有する単位用量製剤で投与することができる。製剤は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ(lozenge)、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、乳濁液、硬若しくは軟カプセル、又はシロップ若しくはエリキシルとして経口使用に適した形態であってもよい。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造のために当技術分野で既知のいかなる方法に従って調製してもよく、そのような組成物は、薬剤的に優雅で味の良い調製物を提供するために1つ又は複数のそのような甘味料、香味料、着色料又は保存剤を含有しうる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として含有する。
【０１０１】
これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤;顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸;結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア;並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであってもよい。錠剤は被覆しないことも可能であり、又は既知の技法により被覆することも可能である。いくつかの場合、そのような被覆は、崩壊及び消化管への吸収を遅延させ、それによって更に長期間にわたって持続する作用をもたらすために既知の技法により調製することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の時間遅延物質(time delay material)を用いることが可能である。
【０１０２】
経口使用のための製剤は、活性成分を不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合させる硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分を水若しくは油媒体、例えば、ピーナツオイル、流動パラフィン若しくはオリーブオイルと混合させる軟ゼラチンカプセルとして提供することもできる。
【０１０３】
水性懸濁液は活性物質を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアラビアゴムであり、分散剤又は湿潤剤は天然に存在するホスファチド、例えば、レクチン、若しくはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸、又はエチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレイン酸であってもよい。水性懸濁液は、1つ又は複数の保存剤、例えば、エチル若しくはn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸、1つ又は複数の着色料、1つ又は複数の香味料、及びショ糖若しくはサッカリン等の1つ又は複数の甘味料を含有することもできる。
【０１０４】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油に、又は流動パラフィン等の鉱油に懸濁することにより製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有することができる。甘味料及び香味料を添加すれば味の良い経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することにより保持することが可能である。
【０１０５】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、活性成分を分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び1つ又は複数の保存剤との混合物として提供する。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤はすでに上で言及した薬剤により例示されている。追加の賦形剤、例えば、甘味、香味及び着色剤が存在してもよい。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は植物油であっても鉱物油であってもこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アラビアゴム又はトラガントガム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ豆、レシチン、及び脂肪酸及びヘキシトール、無水物由来のエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレイン酸、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸であってもよい。乳剤は甘味料及び香味料を含有してもよい。
【０１０７】
シロップ及びエリキシルは甘味料、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はショ糖で製剤化することができる。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤並びに香味料及び着色剤を含有してもよい。本発明の及び本明細書に記載される医薬組成物又はsiRNAは、無菌で注射可能な水性又は油性懸濁液の形態であってもよい。
【０１０８】
この懸濁液は、上で言及している適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して既知の技術に従って製剤化することができる。
【０１０９】
無菌の注射可能な調製物は、非毒性で非経口的に許容できる希釈剤又は溶剤中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることが可能な許容されるビヒクル及び溶剤には、水、リンゲル液及び等張食塩水がある。更に、無菌の不揮発油は習慣的に溶剤又は懸濁媒として用いられている。この目的のため、合成モノ又はジグリセリドを含むいかなる無菌不揮発油でも用いることができる。更に、オレイン酸等の脂肪酸は注射液の調製に用途がある。
【０１１０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は溶液で、好ましくは、PBS等の緩衝生理食塩溶液で、又は例えば、点眼液の形態で等の眼への局所投与のためのゲルで製剤化される。そのような実施形態では、製剤はカチオン乳剤である及び/又は、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)、カーボポル(carbopol)、ヒアルロン酸及びポリアクリル酸を含むがこれらに限定されないバイオポリマーを含有してもよい。
【０１１１】
本発明の核酸分子は、例えば、薬物の直腸投与のために、坐薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体で、したがって、直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することにより調製することができる。そのような材料にはココアバター及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０１１２】
本発明の核酸分子は無菌媒体で非経口的に投与することができる。薬物は、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁させる又は溶解させることができる。有利なことに、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤等のアジュバントをビヒクル中に溶解させることができる。
【０１１３】
したがって、本発明の更なる好ましい実施形態は、先行する段落に記述されているように、配列番号1〜配列番号111からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAを少なくとも含む医薬組成物に関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号8からなる群から選択される、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。
【０１１４】
本発明の核酸分子は、全体的治療効果を増加するために他の治療化合物と組み合わせて対象に投与することもできる。適応症を処置するための複数の化合物を使用すれば、副作用の存在を減少させつつ有益な効果を増やすことができる。
【０１１５】
本明細書で使用されるように、用語「眼アレルギー」とは、ORAI1の増加した発現及び/又は活性により引き起こされる眼球表面のアレルギー性障害のことである。眼アレルギーはアレルギー性結膜炎と呼ばれることもある。眼アレルギーには、季節性アレルギー性結膜炎(SAC)、通年性アレルギー性結膜炎(PAC)、春季角結膜炎(VKC)、アトピー性角結膜炎(AKC)及び巨大乳頭結膜炎(GPC)が含まれるがこれらに限定されない多種多様な病態が含まれる。
【０１１６】
本明細書で使用されるように、用語「結膜炎」とは、結膜の炎症のことである。結膜炎はインドでは、はやり目又はマドラスアイ(madras eye)とも呼ばれる。結膜炎は一般には、感染(通常はウイルス性、しかし細菌性のこともある)又はアレルギー反応に起因する。
【０１１７】
眼アレルギーの「臨床症状」は、眼掻痒、眼発赤、眼瞼の腫脹、結膜浮腫、流涙、及び鼻炎、鼻づまり、鼻漏、鼻掻痒症(nasal pruritis)及び耳/口蓋掻痒症、並びにくしゃみを含むがこれらに限定されない。本発明は、少なくとも2つの臨床症状、更に好ましくは、少なくとも3つ、更により好ましくは、4つよりも多くを治療する又は予防することが好ましい。
【０１１８】
用語「患者」とは、本明細書で使用されるように、哺乳動物を含む動物、好ましくはヒトのことである。
【０１１９】
本明細書で使用されるように、用語「アレルゲン」とは、即時型過敏症(アレルギー)を生じることができる環境内にある任意の抗原物質のことである。既知のアレルゲンの一覧表には、植物花粉、カビの胞子、動物のフケ、ハウスダスト、食物、羽毛、色素、石ケン、洗剤、化粧品、プラスチック、及び薬物が含まれる。アレルゲンは、吸入、嚥下、接触、又は注射ことにより身体に入ることができる。空中アレルゲンは、例えば、花粉又は胞子に限定されないが、気流を通じて運ばれるほど軽いアレルゲンである。
【０１２０】
本発明における用語「アレルギー性結膜炎」とは、アレルギー反応により引き起こされる結膜の炎症として理解されている。結膜は眼を覆う薄い膜である。アレルゲンが結膜を刺激すると、眼で起きる一般的症状には、発赤(主に末梢小血管の血管拡張に起因する)、眼掻痒、眼瞼腫脹、増加した流涙、羞明、水様分泌物、及び異物感(疼痛を伴う)が含まれる。症状は通常、天候が温かく乾燥しているほうが患者には悪く、気温が下がり雨になると症状がやわらぐ傾向がある。
【０１２１】
本発明における用語「眼瞼炎」は眼瞼の慢性的炎症と理解されている。
【０１２２】
本発明における用語「眼瞼結膜炎」は、2つの別々の眼状態、眼瞼炎と結膜炎の同時発生と理解されている。眼瞼炎は外部眼瞼を冒し、結膜炎は結膜で生じる。
【０１２３】
本発明における用語「角結膜炎」は角膜と結膜の炎症と理解されている。
【０１２４】
本発明は以下の非限定的実施例により更に説明される。
【実施例】
【０１２５】
0.材料
・マウスORAI1プローブ: Taqman Gene Expression Assay Mm00774349_ml。
・マウスTLSPプローブ: Taqman Gene Expression Assay Mm01157588_ml。
・マウスTNFSR9プローブ:Taqman Gene Expression Assay Mm00441899_ml。
・18S内在性対照:Taqmqn Gene Expression Assay. Hs99999901_s1。
・Multiscribe逆転写酵素50U/ml(Applied Biosystems社P/N 4311235)。
・RNase阻害剤20U/μl(Applied Biosystems社P/N N8080119)。
・TaqMan 2X Universal Master Mix。
・非放射性細胞増殖アッセイキット(Promega社、Mannheim、ドイツ)。
・ヒトマスト細胞(HMC-1)。
・DMSO中イオノマイシンカルシウム塩1mM(Sigma Life Science社製Ref# I3909-1ml)。
・アネキシン-V検出キットLife Technologies社(Ref:V13241)。
【０１２６】
1.インビトロ分析
1.1異なる細胞株における本発明のsiRNAのトランスフェクション後のORAI1発現レベル
本発明のsiRNAのサイレンシング効果を実証するために、異なる細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、インビトロORAI1発現レベルを測定した。ヒトA204並びにマウスC2C12及びJ744A.1細胞に、トランスフェクション剤(transfection agent)としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて、100nMの配列番号112、19bp平滑末端dsRNA構造体をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは標準的な製造業者の説明書に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異性の対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及びSchmittgen、2001}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。すべてのリアルタイム定量PCR実験は3通り実施し、3回の独立した実験で繰り返した。平均及び標準偏差を計算した。図4に示すように、配列番号112は、ORAI1 mRNAレベルをA204及びC2C12細胞では、おおよそ70〜80%、J744A.1では、40%有意に減少させた。配列番号113、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118及び配列番号119、19bp平滑末端dsRNA構造体もORAI1 mRNA発現レベルをおおよそ40〜80%有意に減少させた(図5)。
【０１２７】
1.2本発明のsiRNAを用いたトランスフェクション後の異なる細胞株の細胞生存能
本発明のsiRNAの細胞生存能を実証するために、異なる細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、インビトロ毒性レベルを測定した。ヒトA204並びにマウスC2C12及びJ744A.1細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて100nMの配列番号112(19bp平滑末端dsRNA構造体)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは標準的な製造業者の説明書に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異性の対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNAトランスフェクションの結果生じうる細胞生存能レベルの変動を評価するために処理した。細胞生存能はCellTiter 96(登録商標)Aqueous Non-Radiactive Cell. Proliferation Assay from Promega社を使用して測定した。この方法は、490nm吸収の量により測定した場合の、MTSテトラゾリウム化合物をホルマザン生成物に減少させる生細胞の能力(デヒドロゲナーゼ酵素)に基づいている。平均及び標準偏差を計算した。図6に示すように、配列番号112では細胞生存能レベルに何の変化も見られなかった。したがって、配列番号112に毒性はなく安全である。
【０１２８】
1.3異なる細胞株における本発明の非修飾及び化学修飾siRNAのトランスフェクション後のORAI1発現レベル
本発明のsiRNAの安定性を改良し免疫原性活性化がないことを確認するために、異なるsiRNA最適化された化学修飾を基準配列番号112配列(19bp平滑末端dsRNA構造体)に導入し、このようにして新しい化学修飾siRNA(配列番号223、配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227、配列番号228及び配列番号229)が得られ、ORAI1 mRNAレベルを減少させるその能力を証明するためにヒト及びマウス細胞にトランスフェクトした。化学修飾は図3に詳述されている。ヒトA204並びにマウスC2C12及びJ744A.1細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて、100nMの配列番号112、配列番号223、配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227、配列番号228又は配列番号229(これらの構造はすべて、19bp平滑末端dsRNA構造体と一致している)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは標準的な製造業者の説明書に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異性の対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNA処置の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及び Schmittgen、2001年}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。すべてのリアルタイム定量PCR実験は3通り実施し、3回の独立した実験で繰り返した。平均及び標準偏差を計算した。図7及び図8が示すように、修飾siRNAは、ヒト細胞株においてもマウス細胞株においても、配列番号112に匹敵する優れた効力を示した。このように、化学修飾された製品、配列番号223、配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227、配列番号228及び配列番号229は、ORAI1 mRNAレベルを50〜80%減少させた。
【０１２９】
1.4ヒト及びマウス細胞における配列番号112及び配列番号227の用量応答
ヒトA204並びにマウスC2C12細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて、増加する用量の配列番号112(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011)及び配列番号227(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011v8)(0.001〜100nM)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは製造業者の標準的な条件に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異的対照として使用した。細胞ペレットは回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及び Schmittgen、2001}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。すべてのリアルタイム定量PCR実験は3通り実施し、3回の独立した実験で繰り返した。平均及びS.E.Mを計算した。図9が示すように、ヒト細胞では用量0.5nMでORAI1レベルの有意な減少が観察された。最大効果は、配列番号112と配列番号227の両方で用量100nMへの応答に見られた。濃度10〜50nMの間では配列番号112と配列番号227に僅かな差が観察された。配列番号227は、ORAI1 mRNAレベルを60〜80%減少させ、配列番号112は、ORAI1 mRNAレベルを40〜60%減少させた。濃度0.05〜0.001nMの間では差は観察されなかった。これらのデータを使用すれば、阻害濃度50(IC50)値は、配列番号227で1.98nM、配列番号112で5.3nMと計算された。
【０１３０】
図10に示すように、ORAI1レベルの有意な減少がマウスC2C12細胞においても用量2.5nMで観察された。最大効果は、配列番号112と配列番号227の両方で用量50nMへの応答に見られた。濃度5〜100nMの間では配列番号112と配列番号227に僅かな差が観察された。配列番号112も配列番号227もORAI1 mRNAレベルを70〜80%減少させた。濃度0.1〜0.001nMの間では差は観察されなかった。これらのデータを使用すれば、阻害濃度50(IC50)値は、配列番号227で1.98nM、配列番号112で1.25nMと計算された。
【０１３１】
1.5配列番号112及び配列番号227のトランスフェクション後のORAI1並びにそのパラログORAI2及びORAI3の発現
本発明のsiRNAの特異的なサイレンシング効果を実証するために、異なる細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、インビトロORAI1、ORAI2及びORAI3発現レベルを測定した。本発明者らは、ORAI1チャネルファミリーの受容体に対する配列番号112及び配列番号227の効果を分析し、構造的に及び機能的にORAI1チャネルに関係のあるタンパク質に対するその効果を分析した。ORAI1、ORAI2及びORAI3のmRNAレベルは、配列番号112及び配列番号227での処置後ヒトA204及びC2C12マウス細胞において吟味した。ヒトA204及びマウスC2C12細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて、100nMの配列番号112及び配列番号227をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは製造業者の標準的な条件に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異的対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。図11及び図12は、配列番号112及び配列番号227がORAI1 mRNAのレベルを、ヒト細胞においてORAI2又はORAI3のmRNAレベルに著しい影響を与えることなく、おおよそ70〜80%(図11)、マウス細胞で60〜70%(図12)選択的に減少させることができたことを示している。
【０１３２】
1.6ヒト細胞における配列番号112(SYL116011)のトランスフェクション後の推定OTEの発現
意図されない標的に関する本発明のsiRNAの特異的なサイレンシング効果を実証するために、配列番号112について推定インシリコオフターゲット効果をヒト細胞株において決定した。ヒト細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、MSLN及びOLFM12A発現レベルを測定した。本発明者らは、MSLN及びOLFM12A遺伝子発現に対する配列番号112の効果を分析した。MSLN及びOLFM12AのmRNAレベルは、トランスフェクション剤としてTransit TKOを用いて、100nMの配列番号112で処置後ヒトA204細胞において吟味した。すべてのトランスフェクションは製造業者の標準的な条件に従って、正の対照及び負の対照を用いて実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異的対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、配列番号112作用機序の結果生じうる推定OTE mRNAレベルの変動を評価するために処理した。図13は、配列番号112が推定OTEのレベルを減少させなかったことを示している。
【０１３３】
1.7ラット細胞株における配列番号112のトランスフェクション後のORAI1発現レベル
配列番号112のサイレンシング効果を実証するために、異なる細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、インビトロORAI1発現レベルを測定した。ラットJTC-19及びC6細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit IT2020及びリポフェクタミン2000を用いて、100nMの配列番号112をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは負の対照を用いて製造業者の標準的な条件に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異的対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及びSchmittgen、2001}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。すべてのリアルタイム定量PCR実験は3通り実施し、3回の独立した実験で繰り返した。平均及びS.E.Mを計算した。図14及び図15が示すように、配列番号112は、ORAI1 mRNAレベルをJTC-19細胞でおおよそ70%、C6細胞で40〜70%有意に減少させた。配列番号112では、ORAI1 mRNAレベルはJTC-19細胞では72時間で完全には回復せず、C6細胞では回復しない(図14及び図15)。
【０１３４】
1.8配列番号112(SYL116011)、配列番号233(SYL116011v11)及び配列番号235(SYL116011v12)のトランスフェクション後のORAI1の遺伝子発現レベル
ヒトA204、マウスC2C12及びJTC-19ラット細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO、リポフェクタミン2000及びMirus IT2020を用いて、100nMの配列番号112(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011)及び配列番号233(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011v11)及び配列番号235(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011v12)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは製造業者の標準的な条件に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異的対照として使用した。細胞ペレットは回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak and Schmittgen、2001}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。図16に示すように、ORAI1レベルの実質的な減少がヒト、マウス及びラット細胞において観察された。ORAI1 mRNAレベルはヒト細胞では配列番号112(SYL116011)、配列番号233(SYL116011v11)及び配列番号235(SYL116011v12)について70〜80%減少した。マウス細胞では、ORAI1 mRNAレベルは配列番号112(SYL116011)、配列番号233(SYL116011v11)及び配列番号235(SYL116011v12)で50%減少し、ラット細胞では配列番号112(SYL116011)で50%、配列番号233(SYL116011v11)及び配列番号235(SYL116011v12)でそれぞれ95%及び99%減少していた。
【０１３５】
2.インビボ分析
2.1ブタクサ花粉により誘発される眼アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)のインビボ効力の分析
本試験の目的は、ブタクサ花粉により誘発される眼アレルギーのマウスモデルにおける眼アレルギーに関連する症状を減少させるため、ORAI1の発現をサイレンシングするように設計された本発明のsiRNA、特に配列番号112(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011)及び配列番号227(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011v8)の効力を分析することであった。
【０１３６】
ブタクサは、ヒマワリ科キク科(Asteraceae)のブタクサ属(Ambrosia)の顕花植物である。ブタクサ花粉は高度にアレルゲン性であり、一般にはあらゆる空中花粉の中で最大のエアロアレルゲンであり、世界中の花粉症(hay fever)の第一原因と見なされている。米国環境健康科学研究所(NIEHS)は、ブタクサ、並びに長葉羊蹄、藜、シロザ、オオバコ、ヒメスイバ及びヤマヨモギ等の他の草が世界中で花粉アレルゲンの最も多産な生産者の一部であることを示している。この花粉は、アレルギー性結膜炎を試験するための動物モデルにおいて一般的に使用されている{Bacsi Aら、2005}。
【０１３７】
この分析の目的は、本発明の化合物[配列番号112(SYL116011)及び配列番号227(SYL116011v8)]の点眼によるORAI1の下方調節が、マウスにおいてブタクサ花粉誘発眼アレルギーにより引き起こされる症状を軽減するかどうかを決定することであった。
【０１３８】
本発明者らは、ORAI1がマウスの眼において発現しているのかどうか、その発現がブタクサ花粉誘発眼アレルギーへの応答で上方調節されるのかどうかを解析した。本発明者らは、配列番号112(SYL116011)又は配列番号227(SYL116011v8)を局所的に適用して、上述のマウスモデルにおけるアレルギー応答に対する、ORAI1の発現をサイレンシングする効果も吟味した。この目的のために以下のパラメータを分析した。
・アレルギー誘発への応答における臨床徴候:アレルギー性結膜炎の典型的眼徴候には、掻痒、眼瞼腫脹、結膜腫脹(結膜浮腫)、及び粘液堆積(mucus deposition)が含まれる。眼アレルギーに関連する粘液は大量であり、粘質であり、粘着性でもある。結膜の代替物は通常、眼球結膜が「ガラス状」外見を呈する原因となり、眼瞼結膜の色は赤というよりもむしろピンクになり、度々乳白色の外見を見せる。
・局所マスト細胞の数:アレルギー刺激結膜マスト細胞が脱顆粒して数分後、炎症メディエータの放出が結膜のより深い層から遊走してくる更に多くのマスト細胞を引き付ける。
・好酸球の局所浸潤:結膜への炎症細胞の浸潤はアレルゲン曝露の数時間後に生じ、アレルゲンに対する後期応答の一部である。いくつかの異なる種類の細胞が結膜へ遊走するが、主な種類は好酸球である。
・アレルギーに関係する分子バイオマーカーの発現変化:
-  胸腺間質性リンパ球新生因子(TLSP)は、その特異的受容体TLSPRに結合することにより樹状細胞を活性化する上皮由来サイトカインである。TLSPRへのTLSPの結合により炎症性Th2型の応答が誘発される。TLSPは主に上皮細胞により産生されるがマスト細胞で産生されることもあり、アレルギー性炎症の部位では上方調節されていることが分かっている{Zheng X.ら、2010}。
-  腫瘍懐紙因子受容体スーパーファミリー、メンバー9(Tnfrsf9)又はCD-137は記憶T細胞の共刺激分子である。この共刺激分子は活性化されたT細胞、NK細胞及び樹状細胞(DC)で発現し、そのリガンドCD137Lは成熟DC、活性化されたマクロファージ及び活性化されたB細胞上で検出されている。CD-137はT細胞活性化及び増殖を同時刺激し、活性化されたT細胞の生存を増強し、CD4+ Tヘルプを抑制する。アレルギー性炎症では、CD-137はIL-4依存性Th2応答を媒介することが示されており、IgE媒介アレルギー応答を抱えた患者の好酸球で上方調節されている。
【０１３９】
A.方法
a.1試験システム特徴付け
【０１４０】
【表１】
2016535592.tif 000002
【０１４１】
本発明のsiRNAの更なる利点は、配列番号1〜配列番号8が、異なる動物配列に渡って、ORAI1遺伝子の高度に保存された領域に一致していることである。実際、これらの配列はヒトとマウスの間で同一であり、この動物モデルは眼アレルギーの試験に特に適している。
【０１４２】
a.2アレルギーの誘発
アレルギー性結膜炎は、1日目に腹腔内注射により0.25mlのミョウバン中50μgのブタクサ(Rw)花粉の混合物で動物を免疫化することにより誘発した。免疫化溶液は投与直前に調製し、常時光から保護した。免疫化10日後、1.25mgのRw花粉をそれぞれの眼に局所的に滴下した。投与は投与量5μL/眼で実施した。この手順は当業者に既知の標準的な既存の発表されているプロトコルから適応させたもので、siRNAの効力を吟味する前に検証した{Magone M.T.ら、1998}。
【０１４３】
a.3試験項目管理
試験項目は、6日目に開始して5日間にわたり1日1回動物の両眼に局所的眼経路により適用した(図4)。動物の別個の群はビヒクル(PBS)を投与され、対照として働いた。投与は投与量5μL/眼で実施した。
【０１４４】
a.4臨床所見及び試料の収集
動物の全体的健康状態は最初の投与から屠殺まで毎日モニターした。マウスは局所的眼花粉の滴下に先立って及び花粉滴下後の24時間までの異なる時点で過敏症の臨床徴候について検査した。結膜浮腫及び充血、眼瞼浮腫、眼脂及び流涙はスケール0〜3で段階分けした。臨床スコアリングは実験条件ついて知らされていない、経験豊かな観察者により実施された。動物はアレルギー負荷の3時間又は24時間後に屠殺された。屠殺に先立って、血漿中のIgE、IL-13、IL-10及びMCP-1の存在を吟味するために血液試料を収集した。屠殺眼(sacrifice eyes)に続いて、脾臓及び頸部リンパ節は単離され、組織学的検査のために処理され、後にRNAで保持される、又は結膜中の上述のサイトカインのレベルを分析するために処理された。
【０１４５】
a.5病理組織学
摘出された眼は10%ホルマリン(1/20体積)に24時間浸し、次に0.1Mのリン酸バッファーで数回洗浄してホルマリンを取り除き、このバッファー中にほぼ24時間維持した。試料はエタノール中でインキュベートし、エタノール濃度を増加させることにより脱水し、その後組織処理装置(Leica TP 1020、Cat.no- 0704 37101、Leica Microsystems社、Nussloch、ドイツ)において低融点パラフィンに包埋した。試料はミクロトームで切断して2μmの薄片を得て、その後薄片はマスト細胞の数を計数するためにトルイジンブルー(toludine blue)で染色する又は好酸球浸潤を吟味するためにヘマトキシリンエオジンで染色した。
【０１４６】
a.6 RNA単離及び逆転写
全RNAは、RNeasy RNA抽出キット(Invitrogen社、CA、米国)を使用して全眼、脾臓又はリンパ節から単離した。4μgの全RNAは、High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems, Inc.社、Foster City、CA、米国)を使用して製造業者の説明書及びIT-B-0003-01に従って逆転写した。
【０１４７】
a.7 qPCR
qPCRはStepone plus検出システム(Applied Biosystems社)を使用して実施した。500ナノグラムのそれぞれの試料をTaqMan 2X Universal Master Mixにおいて、95℃で10分間、続いて95℃で15秒間及び60℃で1分間を40サイクルの条件で増幅させた。すべてのqPCR増幅は3通り実施し、常に逆転写対照及びテンプレート対照なしを含む少なくとも2つの独立した実験で繰り返した。ORAI1、TLSP及びTnfrsf9 mRNAレベルは、内部標準として18S遺伝子を使用し、ΔΔCT法により相対的に定量するqPCRによって分析した{Livak K. J.及びSchmittgen T. D.、2001}。
【０１４８】
a.8血漿及び結膜中のIgE、IL-13、IL-10及びMCP-1の分析
以下のサイトカイン、IgE、IL-13、IL-10及びMCP-1の量を以下のキットを使用し、製造業者の説明書に従ってマウスの血漿及び結膜中で吟味した。
【０１４９】
B.結果
b.1マウス眼中のORAI1の発現及び眼アレルギーに対する応答における誘発
ORAI1の発現は、方法のセクションで述べたとおりにアレルギー誘発後の異なる時点でマウスの眼において吟味した。図17は、ORAI1が眼に存在していること、その発現がアレルギー負荷に対する応答で急速に上方調節されていることを示している。ORAI1 mRNAレベルの2倍の増加がブタクサ花粉の投与の3〜6時間後に観察された。ORAI1の負荷24時間後レベルは基底レベルのおおよそ350%であった。
【０１５０】
b.2  眼アレルギーに対する応答でのアレルギーバイオマーカーの発現の吟味
TLSP及びTnfrsf9のmRNAレベルは、予め感作されたマウスにおいてブタクサ花粉の滴下による眼アレルギー誘発後の異なる時点で試験した。TLSPとTnfrsf9の両方で有意な減少が負荷3時間後に観察された。誘発24時間後Tnfrsf9 mRNAレベルはベースライン近くであったが、TLSPのmRNAレベルはそれでも基底レベルのおおよそ1.5倍であった(図18)。
【０１５１】
b.3  眼アレルギーのマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)の効力
方法のセクションで述べたとおりに、動物の3つの群にミョウバンに吸着させたブタクサ花粉の用量を腹腔内に(IP)注射した。IP注射の5日後、1つの群(A、n=8)は5日の期間にわたりPBSの点眼/日を受け、第2の群(B、n=15)は同一期間中配列番号112(SYL116011)を150μg/眼/日の用量(低用量)で受け、第3の群は5日間にわたり配列番号112(SYL116011)を375μg/眼/日の用量(高用量)で受けた。動物たちは花粉の点眼の1、3、6及び24時間後に眼アレルギーに関係する症状について検査を受けた。図20に示すように、配列番号112(SYL116011)のどちらの用量を用いた処置も、アレルギーの即時臨床徴候を有意に減少させた。臨床徴候の更なる分析により、配列番号112(SYL116011)のいずれの用量も、試験したパラメータのうちの2つ、つまり結膜浮腫(結膜の浮腫)及び流涙に対して特に効果があることが示された(図21)。
【０１５２】
マスト細胞の浸潤は眼アレルギーの誘発の3時間後に眼瞼結膜及び眼球結膜において吟味した。375μg/眼/日の用量で投与された配列番号112(SYL116011)は眼瞼結膜と眼球結膜の両方で浸潤しているマスト細胞の数を有意に減少させた(図22)。
【０１５３】
好酸球浸潤は負荷後24時間で結膜において吟味した。再び、結膜の両方の領域における高用量の配列番号112(SYL116011)に対する及び眼球結膜における低用量に対する応答で浸潤している好酸球の有意な減少が観察された(図23)。
【０１５４】
全眼におけるアレルギーバイオマーカーTLSPの分析により、配列番号112(SYL116011)に対する応答でこのマーカーの発現の用量依存的な減少が示された。CD-137(Tnfrsf9)の発現もアレルギー負荷の3時間後、配列番号112(SYL116011)に対する応答で有意に減少した。図11に見えるように、このアレルギーマーカーはアレルギー誘発の3時間後、有意に誘発されている(図24)。
【０１５５】
b.4  眼アレルギーのマウスモデルにおける配列番号227(SYL116011v8)の効力
更に、方法のセクションで述べたとおりに、動物の3つの群にミョウバンに吸着させたブタクサ花粉の用量を腹腔内に(IP)注射する別のインビボ実験を実施した。IP注射の5日後、1つの群(A、n=10)は5日の期間にわたりPBSの点眼/日を受け、第2の群(B、n=10)は同一期間中本発明の別の化合物[配列番号227(SYL116011v8)]を450μg/眼/日の用量で受け、第3の群は5日間にわたり0.5mg/mlのレボカバスチンを2μL受けた。レボカバスチンは眼アレルギーの治療用に現在市場に出ている第2世代のH1受容体アンタゴニストである。動物たちは花粉の点眼の0.5、1、3、6及び24時間後に眼アレルギーに関係する症状について検査を受けた。図25に示すように、配列番号227(SYL116011v8)を用いた処置はアレルギーの臨床徴候を有意に減少させ、臨床徴候の減少はレボカバスチンに対する応答で観察された減少よりも大きかった。臨床徴候の更なる分析により、配列番号227(SYL116011v8)はPBS処置動物と比べた場合試験されたすべてのパラメータを改善することが示された。したがって、この化合物は眼アレルギーに効果的な治療的処置であることが証明された。
【０１５６】
2.2実験的アレルギー性結膜炎のマウスモデルにおける配列番号112(SYL116011)のインビボ効果の評価
本試験の目的は、マウスモデルにおけるアレルギー性結膜炎に関連する充血、斜視、眼脂、及び眼瞼腫脹のようなアレルギー症状を減少させるため、ORAI1の発現をサイレンシングするように設計された本発明のsiRNAの効果を評価することであった。
【０１５７】
本試験の目標は、配列番号112(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116011)の点眼によるORAI1の下方調節が、アレルギー性結膜炎のマウスモデルにおけるアレルギー症状(充血、斜視、眼脂、及び眼瞼腫脹)を軽減するかどうかを評価することであった。正の対照として、一般に使用されている薬物、抗アレルギーPatanol(登録商標)を使用した。Patanol(登録商標)(0.1%オロパタジン)は、点眼薬として投与される抗ヒスタミン/マスト細胞安定化剤二重作用である。Patanol(登録商標)はヒスタミンの効果をブロックし、マスト細胞がアレルギー症状の原因となる化学物質を放出するのを妨げる。負の対照としてPBS(ビヒクル)の局所投与を使用した。
【０１５８】
A.方法
本試験では、0日目、雌Balb/Cマウスを水酸化アルミニウムと混合した短いブタクサ(short ragweed)で感作した。18日目、負荷に対して非レスポンダーと見なされるマウスを排除するため、局所処置に先立って平衡塩類溶液(BSS)中の短いブタクサでマウスを局所的に感作した。非レスポンダーは、充血においてベースラインから最低2ユニットの変化すらなかったマウスであった。レスポンダーの数が少なかったせいで、マウスは21日目に再び感作された。24日目、レスポンダーを識別するために18日目の手順を繰り返した。48匹のマウスが試験のために選ばれ、無作為に6群に分け、1群あたり8匹のマウスにした。予防的処置群は25〜27日目にそれぞれの局所用薬物を受けた(2、3及び5群は1日1回、6群は1日4回)。28〜31日目、マウスは、それぞれの薬物を受けながら1日2回ブタクサで局所的に負荷された[1日3用量を受けるPatanol(登録商標)群を除いてすべての群で1日1回]。動物は第1、第4、第6及び第8回目の負荷後の評価で充血、斜視、眼脂、及び眼瞼腫脹について評価された。
【０１５９】
a.1動物
マウスは直接接触寝床付のポリカーボネートケージ[ALPHA-dri(登録商標)]に収容した。ケージは動物保護法及び実験動物の世話と使用に関する手引書(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に記載される基準に従っていた。動物のための空間推奨(space recommendation)はPHSポリシー及びAWAに合致していた。動物ケージ中の寝ワラ又は寝床は、動物を乾燥して清潔に保つのに必要な頻度で交換した。
【０１６０】
動物は、新鮮で味の良い栄養的に十分な食物を適宜与えた。清潔で、飲用に適した汚染されていない水を適宜供給した。環境管理は温度22±4℃(68±5oF)、相対湿度50±20%を維持するように設定した。12時間明/暗サイクルを維持した。動物はベースライン評価に先立って施設への到着後少なくとも5日間順応させた。試験全体を通じて獣医のスタッフは必要ではなかった。
【０１６１】
a.2アレルゲン感作
・経路:皮下、両方の後ろ膝
・頻度:すべての群で0日目及び21日目
・手順:感作ごとに、SRWを受けている動物は0.65mgの水酸化アルミニウム中100μgのブタクサを50μL受けた。
【０１６２】
a.3投薬
配列番号112(SYL116011)、正の対照としてPatanol(登録商標)又はビヒクル対照を用いた局所処置を、概要を述べたすべての群に施した。マウスは目盛を付けたマイクロピペットを使用して角膜に局所的に、それぞれの眼に3μLの液滴で処置して投薬した。予防処置日(25〜27日)中、Patanol(登録商標)動物は1日4回、おおよそ午前9時、午後12時、午後2時及び午後5時に投薬した。すべての時刻は±60分であり、投薬の正確なタイミングは研究記録に書き留めた。群2、3、5及び6の動物はその局所投薬をおおよそ午後1時±60分に受けた。負荷日(28〜31日目)、Patanol(登録商標)マウスは負荷日には1日3回投薬をおおよそ午前9時、午後1時、及び午後4時に与えられたが、投薬の時刻は±90分であった。他のすべての群はおおよそ午後1時に投薬された。再び、投薬の正確なタイミングは研究記録に記録した。
【０１６３】
a.4アレルゲン負荷
・経路:眼適用、両目
・頻度:18日目、スクリーニングSRW負荷を実施してレスポンダーを同定した。マウスはSRW負荷に先立ってベースラインで評価した。次に負荷18±1分後、動物を再び評価した。レスポンダーがいなかったために、試験は遅れた。21日目に第2の感作が発生し、24日目にスクリーニングSRW負荷を繰り返した。25〜27日目、群2、3、5及び6はそのそれぞれの予防的処置を開始した。28〜31日目、第1回毎日Patanol(登録商標)投薬のおおよそ30分後及び第3回毎日Patanol(登録商標)投薬後にBID負荷が発生した。28〜31日目、28日目の局所投薬1後及び29〜31日目の第3回局所投薬後、動物はPatanol(登録商標)局所投薬30分後に評価し、その後評価の約3分後負荷させ、負荷の18分後に再び評価した(後局所負荷1、4、6、及び8)。
・手順:マウスはそれぞれの眼に3μl平衡塩類溶液(BSS)中150μgのSRW(3μlの50mg/mL)懸濁液の局所投薬で負荷した。動物は24日目のベースライン充血からのその変化に基づいて無作為化した。
【０１６４】
a.5組織収集
動物を安楽死させ、死亡の確認後右目と付属器を摘出してデビッドソン固定液に24時間保存した。固定の24時間後、組織は長期保存のため70%エタノールに移した。眼はパラフィン包埋し、眼ごとに1ヘマトキシリン-エオジン染色(H&E)、1TBlue、及び1非染色スライドを作成した。
【０１６５】
a.6統計法
データは、二元配置ANOVAをボンフェローニポストテストと共に使用して解析し、群間の臨床徴候の差を比較した。
【０１６６】
B.結果
充血、斜視、眼瞼腫脹、及び眼脂についてのデータは、N=8の眼についての平均±S.E.Mである。同じマスク観察者が負荷1、4、6、及び8でマウスを評価し、これはそれぞれ試験日第28、29、30、及び31日に起きた。充血、斜視、及び眼脂では、動物は0〜4スケールの重症度で評価した(0は正常で、4が最悪)。眼瞼腫脹では、マウスはスケール0〜2で段階分けした。エンドポイントごとに、動物は投薬30分後[Patanol(登録商標)のみで]又はその日の負荷に先立ってベースラインのみで(他のすべての群で)評価した。すべての群は、二元配置ANOVAをボンフェローニポストテストと共に用いて解析し、ビヒクルに対し少しでも統計的有意であれば星印を付けて書き留めた。
【０１６７】
b.1投薬後充血からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクル
データは群あたりn=8の眼についての平均±S.E.Mである。Patanol(登録商標)は28日目最初の負荷後有意に低い応答を示した(p<0.01)。配列番号112(SYL116011)の予防用量は、Patanol(登録商標)に類似する傾向を示したが、統計的有意性は認められなかった(図26参照)。
【０１６８】
b.2投薬後斜視からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクル
データは群あたりn=8の眼についての平均±S.E.Mである(図27参照)。統計的有意性は認められなかった。
【０１６９】
b.3投薬後眼瞼腫脹からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクル
データは群あたりn=8の眼についての平均±S.E.Mである(図28参照)。統計的有意性は認められなかった。
【０１７０】
b.4投薬後眼脂からの変化-予防用の配列番号112(SYL116011)対予防用のPatanol(登録商標)及びビヒクル
データは群あたりn=8の眼についての平均±S.E.Mである(図29参照)。統計的有意性は認められなかった。
【０１７１】
C.結論
試験結果では、予防用の配列番号112(SYL116011)は充血、眼瞼腫脹、及び眼脂が減少するという同じ傾向をたどったように思われる(図26〜29参照)が、試験で使用したNが少なかったせいで、二元配置ANOVAをボンフェローニポストテストと共に用いてこれらのデータを解析した場合、統計的有意性はない。
【０１７２】
注目すべきなのは、ORAI1の発現をサイレンシングするように設計された本発明の配列番号112(SYL116011)の効果を評価すると、結果が、配列番号112(SYL116011)群における用量応答では、現在市場に出ている既知の抗アレルギー薬のPatanol(登録商標)で処置した群と類似する傾向を示し、両方の場合で、マウスモデルにおけるアレルギー性結膜炎に関連するアレルギー症状を減少させたことである。Nをより大きくすればデータの解析は統計的に有意になると予想される。
(参考文献)
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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