(57)【要約】標的タンパク質を精製する方法は、少なくとも１つの標的タンパク質を含む細胞培養収集物またはタンパク質調製物を、８〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と接触させて混合物を形成する工程、その混合物を１つ以上の固体と接触させて混合物を形成する工程（その１つ以上の固体は、陽イオン性官能基、金属結合官能基またはその両方を備え、金属結合官能基は、（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）アリールアミンおよびそれらの組み合わせから選択される窒素含有部分を含む）、およびその混合物をその１つ以上の固体と接触させた後に固体材料を分離して、標的タンパク質を含む溶液を得る工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を精製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの抗体を含む細胞培養収集物またはタンパク質調製物を、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と接触させて、混合物を形成する工程；
（ｂ）固体基材、可溶性基材およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の官能化された基材と該混合物を接触させる工程であって、該１つ以上の官能化された基材は、陽イオン性官能基、金属結合官能基またはその両方を備え；
該金属結合官能基は、（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）アリールアミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される窒素含有部分を含む、工程；および
（ｃ）該１つ以上の官能化された基材と該混合物を接触させた後に固体材料を分離して、該抗体を含む溶液を得る工程
を含む、方法。
【請求項２】
（ｄ）前記細胞培養収集物をアラントインと接触させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アラントインが、（ａ）約０．６〜約３０％、（ｂ）約１〜約１０％および（ｃ）約１〜約２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
アラントインが、ゼロでない量から約０．６％までの範囲で存在する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の官能化された基材の総量が、前記調製物の総体積の約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％またはその間の中間値という体積比率である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの脂肪酸および前記１つ以上の官能化された基材が、単一容器内に配置される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の官能化された基材が、固体材料の通過を妨げつつ流体の通過を可能にするデバイス内に配置される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記デバイスが、膜、モノリス、織布、結晶性物質、ゼラチン様物質、粒子が充填されたカラムおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される多孔性材料を備える、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）が、デバイス内に配置された１つ以上の官能化された基材を用いて行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
固体材料が、沈降または遠心分離後の沈降によって除去される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
固体材料が、濾過によって除去される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
濾過が、膜濾過または深層濾過を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記膜濾過または深層濾過が、官能化された接触面を備える、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）の前に、前記抗体の部分精製が行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養収集物またはタンパク質調製物が、細胞を含み、必要に応じて、該細胞培養収集物が生成されたバイオリアクター内に存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養収集物またはタンパク質調製物が、細胞を含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質調製物が、天然に存在する生体液である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの脂肪酸が、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨという一般構造式を含み、式中、ｎは、５〜８の整数である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの脂肪酸が、エナント（ヘプタン）酸、カプリル（オクタン）酸、オクテン酸、ペラルゴン（ノナン）酸、ノネン酸またはカプリン（デカン）酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの脂肪酸が、ノナン酸である、請求項１〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの脂肪酸が、（ａ）約０．０５〜約５％、（ｂ）約０．１〜約１．０％、（ｃ）約０．２〜約０．４％および（ｄ）約０．１〜０．２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物が、界面活性剤を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が、非イオン性または双性イオン性または陽イオン性である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記陽イオン界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
臭化セチルトリメチルアンモニウムが、約０．００１％〜０．０５％または約０．００５％〜０．０２５％または約０．００７５％〜約０．０１％の範囲の濃度で存在する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の官能化された基材が、陰イオン、陽イオンまたは双性イオンからなる群より選択される少なくとも１つの電荷配置を備える、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記金属結合官能基および前記陽イオン性官能基が、別個の基材上に存在する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記金属結合官能基もまた、陽イオン性である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記金属結合官能基が、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾールおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記金属結合官能基が、式Ｉの化合物：
【化１】
2016520655.tif 000018
であって、式中、Ｒの各存在は、独立して、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであるが、ただし、少なくとも１つのＲは、必要に応じてリンカーを介した、固体支持体への付着部位であり；
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、独立して、（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎは、２〜６の整数であり、ＣＨ２基は、必要に応じて、ＯまたはＮＨによって置き換えられる、
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
陽イオン性キレート剤が、トリス（２−アミノエチル）アミンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記金属結合官能基および陰イオン性官能基が、別個の基材上に存在する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記金属結合官能基が、陰イオン性である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記金属結合官能基が、イミノ二酢酸、ニトリロ酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、アミノフェニルホスフェートおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
陰イオン性キレート剤が、イミノ二酢酸である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の官能化された基材が、陽イオン性である１つの基材および陰イオン性である別個の基材を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
抗体を精製するための方法であって、
細胞培養収集物またはタンパク質調製物を、８〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と接触させて、混合物を形成する工程；
該混合物をアラントインと接触させる工程；および
該混合物をアラントインと接触させた後に固体材料を分離して、該抗体を含む溶液を得る工程
を含む、方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの化学的に官能化された固体基材または可溶性基材と前記溶液を接触させる工程をさらに含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの化学的に官能化された固体が、トリス（２−アミノエチル）アミンを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
アラントインが、（ａ）約０．６〜約３０％、（ｂ）約１〜約１０％、（ｃ）約１〜約５％および（ｄ）約１〜約２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
アラントインが、ゼロでない量から約０．６％までの範囲で存在する、請求項３８〜４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法の実施を容易にするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に開示される実施形態は、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体などの抗体を含むタンパク質を精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の精製は、通常、細胞および残屑を除去する清澄化工程から始まり、その残留上清は、細胞および残屑の存在によって妨害され得る方法によって処理することができる。それらの除去は、一般に、遠心分離および濾過などの物理的な方法を必要とする。この工程は、時折、陰イオン交換能力を有する濾過材を使用すること、または抗体含有収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）に陰イオン交換粒子もしくは可溶性ポリマーを直接加えることを必要とする（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
物理的に清澄化された細胞培養収集物をアラントイン、可溶性の有機カチオンおよび混合粒子で二次的に処理することが、報告されている（非特許文献４）。このアプローチは、死細胞によって排出されるクロマチンの含有量およびクロマチンと会合した凝集物のレベルを特に減少させたが、所望の純度を達成するためには、その後に３つのクロマトグラフィー工程が必要だった。アラントインは、医師の処方箋不要のヘルスケア製品において幅広く使用されているＦＤＡ認可の抗炎症剤である。おそらく水素結合によって、ＩｇＧの溶液を含むタンパク質溶液からエンドトキシンが除去されることが知られている（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
カプリル酸（オクタン酸）との夾雑物共沈によるＩｇＧ抗体の部分精製が、開示された（非特許文献７；非特許文献８）。その脂肪酸は、すべてのタンパク質に結合するが、酸性の非ＩｇＧ夾雑物を特に沈殿させる傾向がある（非特許文献１；非特許文献９）。基本的な可変事項、例えば、カプリル酸濃度、ｐＨ、塩濃度、温度、および可溶性ＩｇＧ調製物から残留カプリル酸を除去するその後のクロマトグラフィー工程の必要性をはじめとした、細胞培養収集物に適用するためのメカニズムおよびプロセスの開発ガイドラインが示されている（非特許文献１）。他の手段によるその後の精製に向けた粗サンプルを調製する手法が、最も頻繁に報告されている（非特許文献１；非特許文献１０；特許文献１）が、その手法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を捕捉した後のポリッシング工程としても適用されてきた（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２０１０１２６２（Ａ１）号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，１９９６
【非特許文献２】Ｋｕｃｚｅｗｓｋｉ，Ｍ，．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔ．２３（３）（２０１０）２０−２５
【非特許文献３】Ｋｕｃｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，６（２０１１）５６−６５
【非特許文献４】Ｇａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１２９１（２０１３）３３−４０
【非特許文献５】Ｖａｇｅｎｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，ＡＣＳ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２２（２０１３）４４７２−４４７８
【非特許文献６】Ｖａｇｅｎｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １３１０（２０１３）１５−２０
【非特許文献７】Ｃｈａｎｔｕｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９（１９６０）２１８−２２０
【非特許文献８】ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．，９６（１９８７）２７１−２７８
【非特許文献９】Ｍｏｒａｉｓ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（２０１２）５０−５４
【非特許文献１０】Ｙ．Ｙｉｇｓａｗ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ  ｔｏ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ＸＩＩＩ，Ｑｕｅｂｅｃ
【非特許文献１１】Ｙ．Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）２５８９−２５９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書中に開示される実施形態は、標的タンパク質を精製する方法に関し、その方法は、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて混合物を形成する工程、１つ以上の固体材料または可溶性材料とその混合物を接触させて混合物を形成する工程（ここで、その１つ以上の固体材料または可溶性材料は、陽イオン性官能基および金属結合官能基を備え、その金属結合官能基は、（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）アリールアミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される窒素含有部分を含む）およびその１つ以上の静電気的に帯電した固体とその混合物を接触させた後に固体材料を分離して、標的タンパク質を含む溶液を得る工程を含む。処理された液体はさらに、正電荷を備える内部接触表面接触を有するデバイスに必要に応じて通され得、その後、所望であれば他の精製方法によって処理される。
【０００８】
いくつかの態様において、本明細書中に開示される実施形態は、標的タンパク質を精製するための方法に関し、その方法は、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて混合物を形成する工程、その混合物をアラントインと接触させる工程、およびアラントインとその混合物を接触させた後に固体材料を分離して、標的タンパク質を含む溶液を得る工程を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書中に開示される実施形態は、抗体を精製する方法に関し、その方法は、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて混合物を形成する工程、その混合物を１つ以上の固体材料または可溶性材料と接触させて混合物を形成する工程（ここで、その１つ以上の固体材料または可溶性材料は、陽イオン性官能基および金属結合官能基を備え、その金属結合官能基は、（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）アリールアミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される窒素含有部分を含む）およびその１つ以上の静電気的に帯電した固体とその混合物を接触させた後に固体材料を分離して、抗体を含む溶液を得る工程を含む。処理された液体はさらに、正電荷を備える内部接触表面接触を有するデバイスに必要に応じて通され得、その後、所望であれば他の精製方法によって処理される。
【００１０】
いくつかの態様において、本明細書中に開示される実施形態は、抗体を精製するための方法に関し、その方法は、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて混合物を形成する工程、その混合物をアラントインと接触させる工程、およびアラントインとその混合物を接触させた後に固体材料を分離して、抗体を含む溶液を得る工程を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
互いに化学的に相反する材料の組み合わせが、それらの材料のいずれか１つに個別に依存する精製方法よりも高い純度レベルおよび低い濁度レベルで、抗体を含む標的タンパク質を提供するという予想外の効果を有することが発見された。相反する材料の組み合わせは、通常、互いの個々の作用を打ち消し、粗悪なタンパク質精製、低いタンパク質回収率またはその両方をもたらすと予想されるだろう。それよりむしろ、本実施形態は、それらの材料が相乗的に働くことにより、個々の構成要素のいずれかが提供する能力を実質的に超えるタンパク質の純度レベルおよび回収率レベルを達成する明確な領域（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｗｉｎｄｏｗ）を提供する。これらの知見は、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体などの抗体に特に応用できる。さらに、実験結果から、組み合わせの中の各構成要素に対する反応性曲線が、個別に使用されたときの反応性曲線と異なることが示唆されている。これは、本明細書中に開示される実施形態の有用性を、個々の構成要素の公知の特性または応用性によって予測できなかったことを強調するものである。組み合わされる構成要素としては、７もしくは８もしくは９もしくは１０個の炭素原子を含む飽和脂肪酸、または１つの二重結合とともに６もしくは７もしくは８もしくは９個の炭素原子を含む不飽和脂肪酸、ならびに正電荷を有する可溶性材料および／または固体材料が挙げられ得る。それらには、金属結合官能基を備える１つ以上の固体材料または可溶性材料がさらに含められ得る。それらには、アラントインがさらに含められ得る。本明細書中に開示される方法において、それらの材料は、抗体種などの標的タンパク質を含む液体調製物中で混和され、次いで、好適なインキュベーション時間の後、固体を除去することにより、宿主細胞夾雑物が最大９９％またはそれ以上存在しない抗体含有溶液が得られ、ここで、平均回収率は、ＩｇＧ抗体の場合、約９０〜約９５％であり、濁度は、約５ＮＴＵ（比濁分析濁度単位（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  ｕｎｉｔｓ））未満である。
【００１２】
実験データは、本明細書中に開示される方法において使用される構成要素間の相互に相反する相互作用を実証する。例えば、陽イオン性（電気陽性）の構成要素と陰イオン性（電気陰性）の構成要素（例えば、脂肪酸）とは、互いに対して引力を有すると理解されており、それらの相互作用は、いずれか一方が細胞培養収集物などの抗体調製物の他の構成要素と相互作用する能力を減少させる傾向があるはずである。これは、抗体軽鎖などのある特定の夾雑物が、ある比の構成要素の組み合わせでは除去されるが、陽イオン性構成要素の比率が高まると抗体含有液体中に再出現することを示しているデータによって示唆される。１つの特定の例において、沈殿物内の夾雑物に結合した脂肪酸は、夾雑物よりも陽イオン性固体に対して強く引き寄せられるので、陽イオン性固体の量を増加させると、脂肪酸は、その固体に移動して、沈殿物から夾雑物が遊離され、その夾雑物が抗体調製物を再度汚染させるので、上記のことが生じると考えられている。相互相反作用の別の例では、結晶性アラントインは、細胞培養収集物中の９９％超の脂肪酸に結合すると実験的に示されたことから、添加された脂肪酸に対して同様の様式で作用する高い可能性が示唆される。これは、非抗体夾雑物を沈殿させる目的で抗体含有細胞培養収集物に加えられた脂肪酸の有効性を低下させると予想されるはずである。それとは反対に、本発明のこの態様は、科学文献において最適と報告されたレベルの半分未満の濃度で脂肪酸を効果的に使用できることに寄与する。理論に拘束されるものではないが、溶解されていないアラントインと水素結合を介して複合体化された脂肪酸は、その本来の電荷、疎水性および夾雑物結合能力を保っている一方で、溶解されていないアラントインの物理的な密度が、沈降によるそれらの脂肪酸の除去を促進する可能性がある。相互相反作用の別の例では、陰イオン性のキレート固体（それは脂肪酸に対して不活性であるはずである）を脂肪酸と陽イオン性のキレート固体との混合物に加えることにより、陽イオン性固体と脂肪酸との既出の相反する組み合わせによって首尾よく除去されていた夾雑物が抗体溶液に再度放出される。
【００１３】
相互相反作用の別の例では、非常に低い濃度の非イオン界面活性剤の添加は、疎水性相互作用を弱め、その結果、脂肪酸が効果を発揮する能力を干渉すると予想され得、その添加は、驚いたことに、遊離軽鎖夾雑物を除去する有効性を改善するが、量が多いと、酸性の非抗体タンパク質の除去が損なわれる。別の驚くべき例では、脂肪酸の電荷作用と疎水性作用の両方を干渉するはずの低レベルの陽イオン界面活性剤は、その組み合わせが酸性の非抗体タンパク質を除去する能力をおよそ２倍にし、凝集物の除去を２倍または３倍にするが、濃度が高くなると、逆の影響が出る。これらの例は、通常は相反する構成要素が、適切にバランスの取れた比率で組み合されるとき、それらは、アンタゴニストの非存在下では除去されない夾雑物を除去することができる領域を作り出し得ることを強調するものである。アンタゴニストによって提供される増強は、多くの場合、非常に実質的であるので、本開示の方法の全体的な精製性能は、利用可能な最も高性能の抗体精製方法として一般に見なされているプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの能力を超える。
【００１４】
金属イオンに結合する能力を有する官能化された固体材料を含めることは、処理された抗体のより高い純度およびより少ない凝集物含有量に寄与することも発見された。可溶性キレート剤は、驚いたことに、この利点をもたらさなかった。いかなる理論にも拘束されるものではないが、この効果は、金属イオンが抗体の表面から上記固体に結合した金属親和性リガンドに優先的に移動することによって媒介される可能性があり、抗体の疎水性の不均一さおよび静電気的な不均一さを低下させる効果は、金属イオンとの相互作用によって誘導されるか；または混入タンパク質に対して同じ効果を有することにより、それらの化学的挙動が変化して、本開示の方法に対してより応答性になることによって誘導される。あるいは、それは、金属によって媒介されない金属結合リガンドの二次的特徴の影響を反映しているかもしれない。
【００１５】
アラントインを含めることにより、脂肪酸沈殿によって微粒子が除去される能力が特に増強されることがさらに発見された。理論に拘束されるものではないが、アラントインの効果は、ウイルスをはじめとした極小粒子を含む大きな分子集合体をより大きなアラントイン結晶に結合させる水素結合によって媒介されると考えられている。アラントイン結晶は、１立方センチメートルあたり１．４５ｇという比較的高密度であることに起因して、会合した材料の迅速な重力沈降（ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を促進し、遠心分離によるそれらの沈降を高める。アラントイン結晶はまた、脂肪酸−夾雑物沈殿物の物理的構造を、典型的には粘りつくスラッジから、液体の通過を容易にし、濾過効率を改善するよりケーク様の粘稠性に、変化させる。水溶液に加えられるアラントインの一部は、最高約３６ｍＭまで溶解し、タンパク質と脂肪酸との疎水性相互作用を弱めると考えられている。溶解したアラントインは、固体を除去した後の抗体含有溶液中に残存すると理解される。これらの特徴は歓迎されるが、実験データから、アラントインが細胞培養収集物由来の脂肪酸の９９．７％に結合すると示唆されるので、それらの特徴は逆説的である。このことが暗示するように、アラントインの比率は、慎重に制御されなければならない。所与の用途に対する適切な比率は、通常１〜２％（ｗ／ｖ）から始まる、単純な実験法によって決定される。
【００１６】
本明細書中に開示される方法が、予想外にも、７または９または１０個の炭素原子を有する飽和脂肪酸をカプリル酸の代わりに用いることを可能にすることも発見された。エナント（ヘプタン）酸は、７つの炭素を含む。ペラルゴン（ノナン）酸は、９つの炭素を含む。カプリン（デカン）酸は、１０個の炭素を含む。なおもより驚いたことに、６または７または８または９個の炭素原子および１つの二重結合を有する不飽和脂肪酸が、有効である。オクタン酸以外の種は、抗体精製の分野において軽視されているにもかかわらず、実験データから、より疎水性の脂肪酸は、抗体回収率を低下させるリスクはより高いが、抗体凝集物およびフラグメントをカプリル酸よりも効率的に除去することが示唆されている。
【００１７】
実験データは、本明細書中に開示される方法が、Ａ）カプリル酸処理単独よりも１０倍効率的な微粒子除去を達成する可能性があり（カプリル酸単独で達成される２０比濁分析濁度単位（ＮＴＵ）以上に対して約２ＮＴＵの濁度を達成する）（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  前出）；Ｂ）ＩｇＧの純度を９９％超、通常、９９．９％超に高める可能性があり；Ｃ）凝集物含有量を１％以下に、典型的には０．５％未満に、しばしば０．０５％未満に減少させる可能性があり；Ｄ）抗体関連フラグメントの含有量を１％以下に減少させる可能性があり；Ｅ）ＤＮＡ、エンドトキシンおよびウイルスの除去を高める可能性があり；Ｆ）９０〜９５％のＩｇＧ回収率を助ける可能性があり；Ｆ）そのような精製を、細胞を生育したバイオリアクター内でさえ達成させ、それにより、プロセス効率を高める可能性があることを示唆している。これらの測定のいくつかに対する個々の結果は、ある特定の場合において、脂肪酸との従来の夾雑物共沈によって達成され得るが、本明細書中に開示される方法によって達成されるとき、それらのすべてが単一の操作において達成されるとは限らないことに注意されたい。
【００１８】
実験データは、本明細書中に開示される方法が、特に、抗体を別途またはさらに精製するために使用され得る従来の分画方法を干渉する夾雑物を除去するという驚くべき発見をさらに証明する。それらの方法は、低機能の分画方法（例えば、限外濾過または塩による沈殿または非イオン性有機ポリマーによる沈殿）が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーなどの高機能の分画方法によってのみ達成可能な精製レベルを達成するのを可能にし得る。例えば、本開示の方法による最初の精製に続く限外濾過または硫安塩析に続く陰イオン交換クロマトグラフィーによって、宿主タンパク質は１ｐｐｍ未満に、および凝集物は０．０５％未満に減少する。同様に驚くべきことに、本明細書中に開示される方法は、高機能の分画方法が通常達成できる純度よりも何百倍も高い純度を達成する能力をそれらの高機能の分画方法に付与し得る。例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、典型的には、宿主タンパク質の混入を約５００〜２０００百万分率（ｐｐｍ）の範囲に減少させるが、本開示の方法の後に実施されるプロテインＡクロマトグラフィーは、宿主タンパク質の混入を１ｐｐｍ未満に減少させる。
【００１９】
本明細書中に開示される方法の数多くの態様の統合を例証する１つの例示的な実施形態において、アラントインは、１％（ｗ／ｖ）という最終濃度をもたらす量で抗体含有細胞培養収集物に加えられた後、カプリン酸が０．２％（ｖ：ｖ）という最終濃度をもたらす量で加えられる。その混合物は、２時間インキュベートされ、その間に、カプリン酸と夾雑物との相互作用によって沈殿物が形成され、その沈殿物は、溶解されていないアラントイン結晶とともに散在する。この工程に続いて、ＴＲＥＮによって官能化された重合体粒子を５％（ｖ：ｖ）という最終濃度をもたらす量で加え、４時間にわたってインキュベートする。ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）は、ポリマー粒子上または他の官能化された固体上に固定化され得る電気陽性の金属結合化合物である。そのような材料は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを行う目的で販売されている。混合を終了し、カプリン酸−夾雑物沈殿物、残留カプリン酸、溶解されていないアラントインおよびＴＲＥＮ粒子からなる固体を、任意の都合のよい方法によって除去する。関連する実施形態において、ＴＲＥＮ粒子は、別の正に帯電した金属結合種によって官能化された粒子によって置き換えられる。関連する実施形態において、正に帯電した金属結合粒子は、粒子の組み合わせ、正に帯電したアミンベースのイオン交換体によって官能化されたいくつかのものおよび負に帯電した金属結合種によって官能化されたいくつかのものによって置き換えられる。関連する実施形態では、金属親和性を欠く正に帯電した粒子だけが存在し得る。関連する実施形態では、他の化学種によって官能化された粒子が存在し得る。関連する実施形態において、実質的に固体を含まない抗体含有液体は、電気陽性のデプスフィルターに通すこと、またはサンプルが電気陽性の表面もしくは他の官能化された表面と接触し、残留する脂肪酸もしくは他の可溶性の非抗体種をサンプルから取り除くという追加の利点を提供し得る他のデバイスに通すことによってさらに処理される。
【００２０】
本明細書中に開示される方法の様々な態様の統合を例証する別の例示的な実施形態において、アラントインは、２％（ｗ／ｖ）という最終濃度をもたらす量で細胞培養収集物に加えられた後、０．２％（ｖ：ｖ）という最終濃度をもたらす量でカプリン酸が加えられる。その混合物は、２時間インキュベートされ、その間に、カプリン酸と夾雑物との相互作用によって沈殿物が形成され、その沈殿物は、溶解されていないアラントイン結晶とともに散在する。次いで、その混合物は、溶解されていないアラントインとともに散在されるカプリン酸−夾雑物沈殿物を保持するが液体の通過を可能にする、少なくとも１つの官能化された固体を備えるデバイスと接触される。
【００２１】
本明細書中に開示される方法の様々な態様の統合を例証する別の例示的な実施形態において、アラントインは、１％（ｗ／ｖ）という最終濃度をもたらす量で細胞培養収集物に加えられた後、０．２％（ｖ：ｖ）という最終濃度をもたらす量でカプリン酸が加えられる。その混合物は、２時間インキュベートされ、その時間の間に、カプリン酸と夾雑物との相互作用によって沈殿物が形成され、その沈殿物は、溶解されていないアラントイン結晶とともに散在する。溶解されていないアラントインとともに散在するカプリン酸−夾雑物沈殿物は、任意の都合のよい方法によって除去され、液体は、少なくとも１つの官能化された表面を備えるデバイスと接触される。
【００２２】
本明細書中に開示される方法の様々な態様の統合を例証する別の例示的な実施形態において、アラントインは、１％（ｗ／ｖ）という最終濃度をもたらす量で細胞培養収集物に加えられた後、０．２％（ｖ：ｖ）という最終濃度をもたらす量でカプリン酸が加えられる。その混合物は、２時間インキュベートされ、その時間の間に、カプリン酸と夾雑物との相互作用によって沈殿物が形成され、その沈殿物は、溶解されていないアラントイン結晶とともに散在する。この工程に続いて、官能化された重合体粒子が加えられ、４時間インキュベートされる。それらの固体は、少なくとも１つの官能化された表面を備えるデバイスを使用して除去される。いくつかの実施形態において、処理された液体は、さらに処理する前に、正に帯電した接触表面を含むデプスフィルターに通される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、約０．２％カプリン酸は、約０．３％という濃度のペラルゴン酸または約０．４％という濃度のカプリル酸または約０．６％という濃度のエナント酸で置き換えられ得る。これは、夾雑物除去および抗体回収が脂肪酸の濃度および疎水性に依存することを明らかにする。実験データは、脂肪酸が疎水性であるほど、良好な結果を得るために必要な濃度は低く、ＩｇＧ抗体の回収を損ねる濃度は低いことを明らかにする。絶対濃度および相対濃度は抗体ごとに異なり得ること、およびゆえに、具体的な脂肪酸の上記濃度も変動し得ることが理解されるが、そのような値は、これまでに特徴付けられていない抗体の精製を評価するときの好都合な開始点に対する指針を当業者に提供するために提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、約０．２％カプリル酸は、それより高い濃度のときよりも効率的な凝集物除去を助け得る。しかしながら、約０．４％では、遊離抗体軽鎖、軽鎖二量体および他の断片的な形態ならびに他の夾雑物のより効率的な除去が達成され得る。したがって、当業者は、後に続く可能な分画方法における影響を考慮することによって、所与の脂肪酸の濃度を最適化する価値を認識するだろう。本明細書中に開示される方法の後に、凝集物の除去に特に適した方法が行われる場合、抗体フラグメントを除去する脂肪酸の濃度を最適化することが有益であり得る。本明細書中に開示される方法の後に、フラグメントの除去に特に適した方法が行われる場合、凝集物を除去する脂肪酸の濃度を最適化することが有益であり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アラントインは、脂肪酸の後に加えられ得る。別の関連する実施形態において、アラントインは、沈殿物が形成されるまで加えられない。別の実施形態において、アラントインは、沈殿物が除去されるまで加えられない。そのような実施形態の１つの具体例において、アラントインおよび官能化された固体は、沈殿物が除去された後に加えられ得、その後に、２回目の固体除去工程において共に除去される。いくつかの実施形態において、アラントインは省略される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤または双性イオン界面活性剤は、その臨界ミセル濃度よりも低い濃度で混合物に加えられ得る。実験データは、これが、抗体フラグメントの除去を改善する一方、臨界ミセル濃度より高い界面活性剤の濃度は、抗体フラグメントの除去を抑制し、抗体回収率を高めるという利点を相殺してしまうことを示唆する。いくつかの実施形態において、実質的により高い濃度の非イオン界面活性剤または双性イオン界面活性剤は、酸性の宿主細胞タンパク質の減少を実質的に損ね得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、低濃度の陽イオン界面活性剤は、宿主タンパク質およびＤＮＡの除去を実質的に増強し得る。いくつかのそのような実施形態において、陽イオン界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）としても知られる臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム；または臭化ドデシルトリメチルアンモニウム；または臭化デシルトリメチルアンモニウム；または臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム；または臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム、または正に帯電した異なる部分（例えば、第１級、第２級または第３級アミノ基）を有するバリエーション、またはより多いもしくはより少ない炭素原子を有するバリエーションである。いくつかのそのような実施形態において、０．０１％ＣＴＡＢは、除去される宿主タンパク質の量を２倍にし得るのに対し、０．０５％ＣＴＡＢは、除去効率を５倍低下させ得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、脂肪酸より先に低濃度の陽イオン界面活性剤を細胞培養収集物に加えることにより、凝集物の除去は、その順序が逆であるときに除去される凝集物の量よりも、場合によっては２または３倍、実質的に増強され得る。いくつかのそのような実施形態において、陽イオン界面活性剤は、約０．０１％という濃度の臭化セチルトリメチルアンモニウムである。いくつかの実施形態において、陽イオン界面活性剤は、他の陽イオン性有機化合物（例えば、エタクリジン、メチレンブルー、クロルヘキシジンおよび塩化ベンザルコニウム）で置換され得る。いくつかのそのような実施形態において、どの脂肪酸を用いるかおよびその脂肪酸の濃度も考慮に入れて、電気陽性の有機化合物の最適な量が、各抗体に対して個別に決定される必要があることが理解される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、化学的に官能化された固体は、少なくとも１つの窒素含有化合物を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つの窒素含有化合物は、金属イオンに結合する能力を有し得る。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つの窒素含有化合物は、負に帯電していることがあり、とりわけ、イミノ二酢酸、ニトリロ酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸およびアミノフェニルホスフェートを含む群からの１つ以上の化合物を含み得る。他のそのような実施形態において、少なくとも１つの窒素含有化合物は、正に帯電していることがあり、とりわけ、ＴＲＥＮ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミンおよびイミダゾールを含む群からの１つ以上の化合物を含み得る。他のそのような実施形態において、少なくとも１つの窒素含有化合物は、脂肪族炭化水素および芳香族炭化水素、カルボニル基、カルボキシル基、スルホ基、ホスホ基またはヒドロキシル基を含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、１つ以上の化学的に官能化された固体は、同じまたは類似の部分によって化学的に官能化された可溶性実体によって置き換えられ得るかまたはその可溶性実体と組み合わされ得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、化学的に官能化された固体または可溶性実体は、２つ以上のタイプの固体基材または可溶性実体を含み得、ここで、各々は、異なる窒素含有化合物を有する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、窒素含有化合物によって化学的に官能化された少なくとも１つの固体または可溶性実体は、窒素原子を欠く別の化学的に官能化された固体または可溶性実体と組み合わされ得、ここで、その窒素を欠く化合物は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、カルボニル基、カルボキシル基、スルホ基、ホスホ基またはヒドロキシル基を含む群からの１つ以上の官能基を含み得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、固体は、精密濾過、深層濾過および遠心分離を含む群からの１つ以上の処理を含む濾過または沈降を含む任意の都合のよい手段によって抗体含有溶液から分離され得、ここで、深層濾過は、実質的に不活性な濾過媒体または化学的に官能化された濾過媒体もしくは化学的に官能化された材料と組み合わされた濾過媒体を用いて行われ得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、１つ以上の不溶性材料種は、液体の通過を助けるが固体を通過させない少なくとも１つのデバイスに形成され得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、アラントインは、約０．６〜約３０％または約１〜約３０％または約１〜約１０％または約１〜約２％という重量体積濃度で加えられ得る。いくつかの実施形態において、アラントインは、省略され得る。いくつかの実施形態において、アラントインは、ゼロでない量から約０．６％までの範囲で存在し得る。アラントインの存在は、加えられたアラントインの一部が溶解しないのに十分な濃度（例えば、１％）であることが望ましい場合があるが、方法は、アラントインの非存在下またはアラントインの実質的にすべてが可溶性である濃度のアラントインの存在下でも適切な結果をもたらす場合がある。実験データは、より高い比率のアラントイン（例えば、２％、３％、４％、５％、１０％またはそれ以上）が、凝集物のより効率的な減少を助けるが、抗体回収率も少しであるが測定可能な程度に低下させてしまうことを示唆している。実験データは、アラントインが、独立して、ウイルスおよびエンドトキシンのレベルを３ｌｏｇ以上減少させることができ、通常、著しく清澄な（２．０ＮＴＵ）上清をもたらし得ることも明らかにしており、その実験データのすべてが、アラントインは、使用されると、本明細書中に開示される方法に対して好ましく寄与することを実証する。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、大きな生物学的化学種（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）および集合体とのアラントインの作用機序では、主に水素結合が関与するとみられ、このことは、なぜアラントインの有効性が、ｐＨまたは伝導率の実質的な変動にほとんど影響されないのかを部分的に説明し得る。これは、なぜアラントインに結合した脂肪酸が夾雑物との相互作用力を保持しているかも説明し得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記脂肪酸は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨという一般構造式（式中、ｎは、４以上１２以下の整数である）を有する１つ以上の種を含み得る。いくつかの実施形態において、ｎは、５〜８の整数である。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸は、エナント酸（ヘプタン酸）であり得る。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸は、カプリル酸（オクタン酸）であり得る。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸は、ペラルゴン（ノナン酸）であり得る。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸は、カプリン酸（デカン酸）であり得る。いくつかの実施形態において、２以上の脂肪酸種が、使用され得る。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、塩（例えば、ナトリウム塩、例えば、カプリル酸ナトリウム）の形態で加えられ得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、脂肪酸の脂肪部分は、炭素原子の線状の「直」鎖からなり得る。いくつかの実施形態において、脂肪酸の脂肪部分は、分枝鎖（例えば、６炭素の主鎖の２位に２炭素鎖を含み、合計８個の炭素原子をもたらす、２−エチルヘキサン酸）からなり得る。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、０．０５〜５％または０．１〜２％または０．２〜０．５％または中間値の濃度で存在し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、脂肪酸は、二重結合を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、二重結合は、炭素鎖の任意の位置に存在してよい。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸鎖は、６または７または８または９個の炭素原子を含み得る。１つのそのような実施形態において、脂肪酸は、末端の二重結合を有するノネン酸である。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、塩の形態で加えられ得る。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、０．０５〜５％または０．１〜２％または０．２〜０．５％または中間値の濃度で存在し得る。いくつかのそのような実施形態において、０．４％〜０．６％の８−ノネン酸は、０．４％のカプリル酸よりも良好な結果を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、２以上の脂肪酸種を使用するとき、その種は、ある範囲の疎水性、例えば、ヘプタン酸とデカン酸との組み合わせ、またはカプリル酸とノナン酸との組み合わせ、またはより高いもしくはより低い疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｃｉｔｙ）の脂肪酸を潜在的に含む他の組み合わせを包含するように選択され得る。いくつかのそのような実施形態において、それぞれの脂肪酸の比率は、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０もしくはそれらの間の任意の中間の範囲またはこれらの外側の他の比であり得る。いくつかのそのような組み合わせにおいて、使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に加えられる脂肪酸種の総量は、ゼロでない量から０．０１％までの範囲、０．０１〜０．１％、０．１〜１％、１〜５％、０．２〜０．４％または中間の範囲もしくは値であり得る。
【００４０】
２以上の脂肪酸種を使用するいくつかの実施形態において、種の総数としては、有用性をもたらす実験結果によって示される、任意の比率；および任意の総量で、３または４またはそれ以上が挙げられ得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、脂肪酸は、抗体調製物中で５〜３６０分または１５〜２４０分または６０〜１２０分または３０〜６０分または中間の時間にわたってインキュベートして放置された後、その混合物は、１つ以上の官能化された固体に曝露される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、炭素鎖長が、脂肪酸の溶解性に直接影響し、鎖長が短いほど、溶解性は高くなり、鎖長が長いほど、温度が低下するにつれて溶解性の低下は大きくなるので、脂肪酸がインキュベートされる温度は、存在する最も大きい脂肪酸種によって影響され得る。したがって、すべての場合において、約３７℃という開始温度が、それより低い温度よりも、高濃度の脂肪酸を溶媒和する。このことは、細胞培養の終了直後の回収物に脂肪酸を直接加えることに有利である。その後、なおもバイオリアクター内で３７℃においてインキュベーションを続けてよい。脂肪酸が疎水性であるほど、温度に対する溶解性の感度が高まり、ゆえに、温度に対する脂肪酸の機能性の感度が高くなることは明らかだろう。いくつかの実施形態において、より高い温度であると、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５までまたはそれ以上の脂肪酸を使用することが可能になり得る。より低い温度を使用するいくつかの実施形態において、例えば、処理を約２〜約８℃で行う場合、より短い脂肪酸鎖（例えば、Ｃ８、Ｃ７、Ｃ６またはそれ以下）の使用が好まれ得る。
【００４３】
ＴＲＥＮによって官能化された固体基材または可溶性基材を使用する１つの例示的な実施形態において、ＴＲＥＮは、一方の末端基によって基材に共有結合的に付着され、２つの第１級アミン窒素原子、１つの第二級アミン窒素原子、１つの第三級アミン窒素、５つの末端水素原子および３つの疎水性エチル基を有する種が形成される。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮは、２つの末端基によって基材に共有結合的に付着され、１つの第１級アミン窒素原子、２つの第二級アミン窒素原子、１つの第三級アミン窒素原子、４つの末端水素原子および３つのエチル基を有する種が形成される。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮは、３つの末端基によって基材に共有結合的に付着され、３つの第二級アミン窒素原子、１つの第三級アミン窒素原子、３つの末端水素原子および３つのエチル基を有する種が形成される。１つの実施形態において、共有結合的に固定化されたＴＲＥＮは、任意の組み合わせまたはこれらのサブセットまたは他の形態で存在し得る。
【００４４】
１つの実施形態において、電気陽性部分における強力な金属親和性官能基は、存在しないことがある。１つのそのような実施形態において、強力な金属親和性官能基は、電気陰性の化学反応基と会合され得る。１つのそのような実施形態において、電気陰性基は、水素結合および／または疎水性相互作用に関与する能力を与える機能的な小部分も含み得る。１つのそのような実施形態において、電気陰性基は、イミノ二酢酸またはニトリロ酢酸またはアスパラギン酸またはグルタミン酸または負に帯電した金属親和性リガンドの組み合わせであり得る。１つのそのような実施形態において、１つ以上の負に帯電した金属親和性リガンド種は、１つ以上の固体の１つの部分集団上に存在し得る一方で、金属親和性を実質的に欠く多価の電気陽性リガンドは、１つ以上の固体の別の部分集団上に存在し得る。
【００４５】
１つの実施形態において、双性イオン（ｚｗｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）種または非イオン種を介して強力な金属親和性官能基を媒介するように官能化された１つ以上の固体基材または可溶性基材が、存在し得る。そのような基材は、電気陽性の金属結合種を有する１つ以上の固体、または電気陰性の金属結合種を有する１つ以上の基材、または強力な金属結合官能基を欠く電気陽性の多価リガンド、または強力な金属結合官能基を欠く電気陰性の多価リガンド、または強力な金属結合官能基を欠く非イオン性もしくは双性イオン性のリガンド、または上記のものの任意の組み合わせとともに存在し得る。
【００４６】
１つ以上の基材上に金属結合官能基が存在することが、本明細書中に開示される方法において有益であり得ることは明らかだろう。実験データは、そのような官能基が、金属親和性官能基を欠く基材よりも良好な結果をもたらすことを示唆している。理論に拘束されるものではないが、この効果は、タンパク質表面に非特異的に結合した金属イオンを除去することによって達成される、タンパク質の電荷および／もしくは疎水性の不均一さの低減、または抗体が、他の種に結合している金属イオンを介してタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは他の混入生物学的化学種に結合している、金属架橋複合体の解離、または金属−リン脂質複合体もしくは金属−リン脂質−脂肪酸複合体からの金属イオンの除去、または脂肪酸とタンパク質との反応性の未知の態様、または上記のものの任意の組み合わせによって媒介され得る。しかしながら、実験データは、金属親和性官能基を有する１つ以上の基材の非存在下でも有用な結果が得られることがあることも示唆している。
【００４７】
１つ以上の基材が提供される１つの実施形態において、混合物は、５〜９６０分または１５〜７２０分または３０〜４８０分または６０〜２４０分または９０〜１２０分または中間の時間にわたってインキュベートされ得る。１つのそのような実施形態において、インキュベーションは、約３７℃もしくは約２２〜約２６℃もしくは約２〜約８℃において行われ得るか、または終了したばかりの細胞培養の収集物に加える結果として約３７℃から開始し、次いで、ある時間にわたるインキュベーションのために約２〜約８℃に移され得る。溶解性の程度はアルキル鎖長に依存するので、インキュベーション温度は、使用される脂肪酸の種によって部分的に決定されるか、または２以上の脂肪酸種の場合は最も大きい種によって部分的に決定される。例えば、１０炭素のカプリン酸は、３７℃において可溶性であるが、約２〜約８度では可溶性でない。それは、まず、ある時間にわたって収集物とともにインキュベートされ、次いで、帯電した化学的に反応性の多価の不溶性基材を加えた直後に約２〜約８度に置かれることがあり、ここで、カプリン酸が低温で不溶性であるおかげで、夾雑物の除去が増強され得る。
【００４８】
１つ以上の固体基材または可溶性基材が提供される１つの実施形態において、脂肪酸で処理された所与の体積の収集物に加えられる基材の比率は、単純な実験法によって決定され得る。現在の実験データは、約２％の体積比率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）の、ポリマーミクロスフェア上に共有結合的に固定化されたＴＲＥＮが、優れた結果を達成するのに適切であることを示唆している。場合によっては、１％以下が、適切であり得る。場合によっては、２％、３％、４％または５％より高い比率が、より良好な結果を支持し得る。しかしながら、述べたように、ＴＲＥＮの利用可能性が高いほど、脂肪酸沈殿が干渉される程度が高くなる。実験データは、過剰なＴＲＥＮ、例えば、場合によっては１０％が、脂肪酸沈殿によって事前に除去された夾雑物を抗体含有溶液中に再出現させることを示している。官能化された固体の最も有効な量が、単純な実験法によって決定され得ることは、当業者によって理解されるだろう。加えられる基材の量が多くなるほど材料の費用が高くなり、それによって、性能とコストとの最も望ましいバランスをもたらす解決策を選択する機会がもたらされることも等しく理解されるだろう。
【００４９】
１つ以上の固体が、流体の通過を許容するが固体の通過を許容しないデバイスに形成される１つの実施形態において、脂肪酸含有サンプルがそのデバイスを通過するときの接触時間は、そのデバイスのサイズ、効率および構造に応じて、数分または数秒に達し得る。
【００５０】
１つの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、ｐＨ調整の必要がない場合がある。脂肪酸の添加によって、収集物のｐＨが十分に低いレベルに低下することがあり、その後の１つ以上の固体による過剰な脂肪酸の除去によって、ｐＨは元の値に実質的に戻り得る。１つの実施形態において、収集物は、脂肪酸を加える前に、特定のｐＨ値に滴定され得、これは、その方法に頑強さを付加し得るが、潜在的には、その後の方法によってより高い純度に分画されるサンプルを調製する目的のために、その方法が行われた後に再度ｐＨの調整を必要とし得る。１つの実施形態において、開始時のｐＨは、４〜６または４．５〜５．５または４．７５〜５．２５または５．１〜５．３の範囲内の値または中間値（例えば、５．２）または別の中間値に調整され得る。最適なｐＨは、抗体種ごとに異なり得ることおよび抗体が存在する培地の組成に応じて異なり得ることが当業者によって理解されるだろう。最適な結果を達成するために使用されるｐＨが、本明細書中に開示される方法のさらなるエレメントの寄与に起因して、脂肪酸沈殿だけのときに必要とされるｐＨよりも穏やかであり得ることも等しく理解されるだろう。脂肪酸沈殿の従来の使用に伴う低いｐＨ値への曝露は、抗体に対して永続する有害作用を有し得る範囲内であるので、これは、顕著な考慮すべき事柄である。これは、本開示の方法の別の予想外の利点を強調するものである。
【００５１】
１つの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、水またはＮａＣｌもしくは他の塩などを用いる塩濃度の低下または上昇によって伝導率を調整する必要がない。しかしながら、塩濃度は、抗体の回収率および純度に影響することが知られており、本方法の必須の特徴から逸脱することなく、バリエーションが探索され得る。実験による証拠は、抗体の溶解性が、脂肪酸または他の添加物の存在とは無関係に、低伝導率および低ｐＨの条件において損なわれるようになることを示唆している。不良な抗体溶解性は、脂肪酸を沈殿させるに当たって、高い確率の有意な抗体損失に至る。これは、ｐＨの低下によって、伝導率が低下し得る程度が限定され得ることを意味し、抗体の過剰な損失を避けるために伝導率を上昇させることを示唆し得る。著しいことに、本明細書中に開示される方法の有効性は、伝導率を２０ｍＳ／ｃｍまで上昇させても実質的に低下しない。電荷相互作用が、この系の選択性の主要な比率を制御すると考えられており、２０ｍＳ／ｃｍは、多くのそのような相互作用を保留するのに十分であり、そのようなすべての相互作用を実質的に弱めるのに十分であるので、上記のことは、著しいことである。しかしながら、結果は、精製される厳密な抗体に応じて変動し得ること、およびより低い伝導率値で実験を行う際の値が存在し得ることが理解されるべきである。伝導率の低下は、脂肪酸および混入タンパク質の相互作用による陽イオン性固体の干渉を増加させるとみられ得るが、陽イオン性固体が可溶性夾雑物に結合する能力を高めることによって、改善された全体の結果を予想外にもたらし得る。
【００５２】
官能化された固体が粒子として提供される１つの実施形態において、それらの粒子は、脂肪酸含有収穫物に投入される前に、特定の緩衝液条件セットに平衡化され得る。一般的な事項として、それらの粒子を平衡化するために使用される緩衝液は、収集物とほぼ同じ伝導率を有し得るが、その伝導率を達成するのに十分な濃度の塩化ナトリウムを単純に含めることによって得られ得る。平衡ｐＨは、単純な実験の結果に応じて変動し得る。１つの方法工程は、適切なｐＫａの低濃度の緩衝物質で粒子を中性ｐＨに平衡化する工程であり得、ここで、その平衡緩衝液の緩衝能力は、収集物を実質的に変化させるのには不十分である。別の方法工程は、脂肪酸含有収集物のｐＨに近い平衡ｐＨを選択することであり得、ここで、その緩衝種の濃度は非常に低く、この場合、この方法を行った後の使用ｐＨの中和を干渉しない。別の方法工程は、処理後の収集物の所望のｐＨに近い平衡ｐＨを選択する工程であり得る。他のアプローチも考慮され得、実験的に最適に評価される。粒子を事前に平衡化することによって、より制御された再現性のあるプロセスが支持され得ること、およびそれらの条件が、その方法の全体の結果に影響し得ることを当業者は認識するだろう。同様に、流体接触面が、帯電した化学的に反応性の多価の不溶性部分を含む、デバイスの平衡化に対して、同じ考慮すべき事柄が適用される。
【００５３】
本明細書中に開示される方法が、そのような高い純度のＩｇＧ抗体を提供することを考えると、より高い精製レベルを達成するためのその後の抗体の処理が、当該分野において通常使用される任意のさらなる手法によって達成され得ることは明らかだろう。実験データは、その後の深層濾過工程が、宿主タンパク質の混入を５００ｐｐｍ未満に、および凝集物を０．０５％未満に減少させ得ることを示唆している。深層濾過の後、タンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過による濃縮が、宿主タンパク質の混入を５０ｐｐｍ未満に減少させ得る。その点から、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、宿主タンパク質の混入を１ｐｐｍ未満に減少させ得る。
【００５４】
したがって、いくつかの実施形態において、ＩｇＧ抗体を精製する方法が提供され、その方法は、７〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて混合物を形成する工程、およびその混合物を１つ以上の固体と接触させて混合物を形成する工程（ここで、その１つ以上の固体は、陽イオン性官能基および金属結合官能基を備え、その金属結合官能基は、（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）アリールアミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される窒素含有部分を含む）およびその１つ以上の固体とその混合物を接触させた後に固体材料を分離して、ＩｇＧ抗体を含む溶液を得る工程を含む。
【００５５】
いくつかのそのような実施形態において、本明細書中に開示される方法は、細胞培養収集物をアラントインと接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、アラントインは、（ａ）約０．６〜約３０％、（ｂ）約１〜約１０％および（ｃ）約１〜約２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、アラントインは、ゼロでない量から約０．６％までの範囲で存在する。
【００５６】
先の実施形態の１つ以上において、少なくとも陽イオン性官能基および／または金属結合官能基を有する１つ以上の固体（ｓｌｉｄ）基材の総量は、総体積の約０．２５％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％またはその間の中間値の体積比率である。この数値を決定する目的で、１つ以上の固体とは、官能化された固体のみを指し、それには、いかなる溶解されていないアラントインも含まれないが、それは、本方法に含められるべきである。先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の固体は、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、ファンデルワールス相互作用およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの機能性を備える。
【００５７】
官能化された可溶性基材が使用される先の実施形態の１つ以上において、少なくとも陽イオン性官能基および／または金属結合官能基を有する１つ以上のそのような基材の総量は、総体積の約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１．０％、２．０％またはその間の中間値の体積比率である。いくつかの実施形態において、固体基材に対する範囲は、約０．５〜約５％または約１％〜約２％であり得る。いくつかの実施形態において、可溶性基材に対する範囲は、約０．０１〜約１％または約０．１〜約０．５％であり得る。先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の可溶性基材は、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、ファンデルワールス相互作用およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの機能性を備える。
【００５８】
先の実施形態の１つ以上において、少なくとも１つの脂肪酸および１つ以上の官能化された（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）固体基材または可溶性基材は、単一の容器内に含められる。１つ以上のそのような実施形態において、少なくとも１つの脂肪酸および／または１つ以上の官能化された固体基材もしくは可溶性基材は、細胞培養物生成プロセスを行ったバイオリアクターに直接加えられる。
【００５９】
先の実施形態の１つ以上において、固体材料の通過を妨げつつ流体の通過を許容するデバイスにおいて抗体含有液体から固体が分離される。
【００６０】
先の実施形態の１つ以上において、固体の通過を妨げつつ流体の通過を許容するデバイスは、多孔性膜、モノリス、織布、無定形な繊維状材料、結晶性物質、大きな網状の（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）骨格上のハイドロゼラチン様（ｈｙｄｒｏｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ）物質、粒子が充填されたカラムおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される多孔性材料を含む。
【００６１】
先の実施形態の１つ以上において、本明細書中に開示される方法は、デバイス内に配置された化学的に官能化された固体と溶液を接触させる工程をさらに含む。
【００６２】
先の実施形態の１つ以上において、細胞培養収集物を少なくとも１つの脂肪酸と接触させた後に存在するかまたは分離工程において存在する固体材料は、沈降または遠心分離後の沈降によって除去される。
【００６３】
先の実施形態の１つ以上において、細胞培養収集物を少なくとも１つの脂肪酸と接触させた後に存在するかまたは分離工程において存在する固体材料は、濾過によって除去される。いくつかのそのような実施形態において、濾過は、膜濾過または深層濾過を含む。いくつかのそのような実施形態において、膜濾過または深層濾過は、官能化されたフィルター膜を備える。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つの官能基は、電気陽性である。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つの官能基は、金属イオンに結合する。
【００６４】
先の実施形態の１つ以上において、第１の接触工程の前に、ＩｇＧ抗体の部分精製が行われる。
【００６５】
先の実施形態の１つ以上において、細胞培養収集物は、細胞を含む。先の実施形態の１つ以上において、細胞培養収穫物は、細胞を含まない。
【００６６】
先の実施形態の１つ以上において、少なくとも１つの脂肪酸は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨという一般構造式を含む。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つの脂肪酸は、エナント（ヘプタン）酸またはカプリル（オクタン）酸またはペラルゴン酸またはカプリン（デカン）酸を含む。いくつかの関連する実施形態において、脂肪酸は、脂肪酸鎖の任意の位置に単一の二重結合を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、二重結合を含む脂肪酸は、ノネン酸である。いくつかのそのような実施形態において、脂肪酸は、８−ノネン酸である。いくつかの実施形態において、炭素主鎖は、非分枝状であり得；他の実施形態では、分枝状であり得る。
【００６７】
先の実施形態の１つ以上において、少なくとも１つの脂肪酸は、（ａ）約０．０５〜約５％、（ｂ）約０．１〜約１．０％、（ｃ）約０．２〜約０．４％および（ｄ）約０．１〜約０．２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ノナン酸は、約０．２５〜約０．５０％の範囲内で使用され得る。いくつかの実施形態において、ノネン酸は、約０．２〜０．４％の範囲内で使用され得る。
【００６８】
先の実施形態の１つ以上において、陽イオン界面活性剤は、（ａ）約０．００１〜０．１％、（ｂ）約０．００５〜０．０５％、（ｃ）約０．０１２５〜０．０２５％の濃度で存在し得る。先の実施形態の１つ以上において、陽イオン界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり得る。
【００６９】
先の実施形態の１つ以上において、疎水性の陽イオン性の構成要素は、本質的に芳香族（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはクロルヘキシジンまたはアレキシジン（ａｌｅｘｉｄｉｎｅ））であり得る。１つのそのような実施形態において、クロルヘキシジンの濃度は、（ａ）約０．００１％〜０．０１％、（ｂ）約０．００５〜０．０５％、（ｃ）約０．００７５〜約０．０１２５％の範囲内であり得る。
【００７０】
先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の官能化された固体基材または可溶性基材は、陰イオン、陽イオンまたは双性イオンからなる群より選択される少なくとも１つの電荷配置を含む。先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の官能化された固体基材または可溶性基材は、金属結合官能基を有する１つの種および陽イオン性である別個の種を含む。先の実施形態の１つ以上において、金属結合官能基は、陽イオン性である。
【００７１】
先の実施形態の１つ以上において、金属結合官能基は、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾールおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
先の実施形態の１つ以上において、金属結合官能基は、式Ｉの化合物：
【化１】
2016520655.tif 000002
であり、式中、Ｒの各存在は、独立して、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであるが、ただし、少なくとも１つのＲは、必要に応じてリンカーを介した、固体支持体への付着部位であり；Ｘ、ＹおよびＺの各々は、独立して、（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎは、２〜６の整数であり、ＣＨ２基は、必要に応じて、ＯまたはＮＨによって置き換えられる。１つのそのような実施形態において、金属結合官能基は、陽イオン性キレート剤であり、トリス（２−アミノエチル）アミン，ＴＲＥＮである。他の実施形態において、式Ｉに係る任意の類似したＴＲＥＮアナログが、本明細書中に開示される方法において使用され得る。数多くの商業的に入手可能な化合物が、式Ｉによって包含され、他のデザインされた合成化合物も、当業者によって日常的に使用される方法によって容易に調製され得る。例えば、式Ｉの第三級アミンは、連続的な還元的アミノ化反応によって第１級アミンから調製され得る。
【００７３】
先の実施形態の１つ以上において、既存の層を、例えば、還元的アミノ化によって、連続的に活性化し、次いで、多価のアミノ種を投入し、過剰な未結合のものを洗浄し、次いで、その表面を再度活性化することなどによって、正電荷のデンドリマー層が固体表面上に構築される。例えば、ＴＲＥＮの場合、ＴＲＥＮの最初の層を膜に共有結合的に付着し、過剰のものを洗浄する。次いで、結合したＴＲＥＮを活性化し、活性化剤を除去し、新しいＴＲＥＮを投入することにより、最初に固定化されていたＴＲＥＮの末端の反応性のアミノ基上にＴＲＥＮ分子を付加する効果、電荷領域の深さを本質的に２倍にする効果、および正に帯電した基の数を３倍にする効果がもたらされる。未結合のＴＲＥＮを洗浄した後、さらなる層が加えられ得る。多くの試薬および化学的方法が、概念的に等価な配置の電荷または他の相互作用基をもたらすために使用され得ることが当業者によって理解されるだろう。
【００７４】
先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の固体は、金属結合官能基を有する１つの固体および陰イオン性である別個の固体を含む。先の実施形態の１つ以上において、金属結合官能基は、陰イオン性である。先の実施形態の１つ以上において、金属結合官能基は、イミノ二酢酸、ニトリロ酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、アミノフェニルホスフェートおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。先の実施形態の１つ以上において、陰イオン性キレート剤は、イミノ二酢酸である。
【００７５】
先の実施形態の１つ以上において、１つ以上の官能化された固体基材または可溶性基材は、陽イオン性である１つの種および陰イオン性である別個の種を備える。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ抗体を精製するための方法が提供され、その方法は、８〜１０個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪酸と細胞培養収集物を接触させて、混合物を形成する工程、その混合物をアラントインと接触させる工程；およびその混合物をアラントインと接触させた後に固体材料を分離して、ＩｇＧ抗体を含む溶液を得る工程を含む。
【００７７】
いくつかのそのような実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの化学的に官能化された固体種または可溶性種と上記溶液を接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学的に官能化された固体種または可溶性種は、トリス（２−アミノエチル）アミンを含む。
【００７８】
先の実施形態の１つ以上において、アラントインは、（ａ）約０．６〜約３０％、（ｂ）約１〜約１０％および（ｃ）約１〜約２％からなる群より選択される範囲の濃度で存在する。先の実施形態の１つ以上において、アラントインは、ゼロでない量から約０．６％までの範囲で存在する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、天然起源（例えば、血清または血漿）のモノクローナルまたはポリクローナルＩｇＧ抗体に適用される。いくつかの実施形態において、上記方法は、酵素的な起源または組換え起源の断片的な免疫グロブリン構築物（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＳｃＦｖ）に適用される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法のいずれか１つの実施を容易にするキットが提供される。
【００８１】
以下の用語は、本発明がより容易に理解され得るように定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通じて示される。
【００８２】
「脂肪酸」とは、カルボキシル基によって終止される線状の脂肪族鎖からなる有機分子のことを指し、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨという一般構造式を有し、式中、ｎは、少なくとも１の整数である。本方法を実施するために適した脂肪酸の場合、「ｎ」は、少なくとも４から最大１２の整数であり得る。方法を実施するために適した飽和脂肪酸の具体例としては、特に、エナント（ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｐｉｃ），Ｃ７）酸、カプリル（オクタン，Ｃ８）酸、ペラルゴン（ノナン，Ｃ９）酸およびカプリン（デカン，Ｃ１０）酸が挙げられる。脂肪酸という用語は、炭素主鎖に沿った任意の位置に存在し得る１つの二重結合またはそれより多い数の二重結合（例えば、２、３、４、５つなど）を含む不飽和脂肪酸のことも指すことがある。
【００８３】
「アラントイン」とは、尿酸の酸化によって生成されるプリン代謝産物のことを指し、Ｃ４Ｈ６Ｎ４Ｏ３という構造式および２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素というＩＵＰＡＣ名を有する。
【００８４】
「ＴＲＥＮ」とは、トリス（２−アミノエチル）アミンのことを指す。この電気陽性化合物は、特に、金属イオンに対して強力な親和性を有すると知られている。ＴＲＥＮは、様々な可溶性材料および不溶性材料に化学的に加えられることにより、ＴＲＥＮによって媒介される化学的特性がそれらの材料に与えられ得る。
【００８５】
「細胞培養」とは、本文脈においては、ＩｇＧモノクローナル抗体を作製する目的のための液体培地中での細胞の培養のことを指す。この目的のために使用される細胞には、通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれるが、他の哺乳動物由来の細胞型、ならびに哺乳動物でない動物細胞、植物および微生物由来の細胞型も含まれ得る。すべての場合において、液体培地は、細胞増殖を助ける栄養分を含む。
【００８６】
「バイオリアクター」とは、制御された条件下で細胞を生育する容器のことを指す。その容器には、目標量の所望の抗体を産生するために必要な数の細胞を生育するのに適した寸法で；決定的なプロセスパラメータのモニタリングを可能にし、細胞増殖および抗体産生にとって理想的な条件を維持するための必要に応じた調整を可能にするセンサーおよび投入口（ｉｎｐｕｔｓ）を備えた、ステンレス鋼タンクまたは他の材料のタンクまたは裏打ちされたタンクまたはポリマーバッグが含まれ得る。
【００８７】
「収集物」または「細胞培養収集物」とは、一般に、細胞培養プロセスの終了時のバイオリアクターの内容物のことを指す。産生されたＩｇＧに加えて、収集物は最初に、細胞、細胞分泌物および死細胞が排出した内容物、ならびに最初に細胞を生育した栄養培地の内容物を含み得る。これらの非抗体構成要素は、抗体から除去されるべき夾雑物を構成する。それら（Ｔｈｅ）には特に、宿主のタンパク質およびＤＮＡが含まれるが、ウイルスおよびエンドトキシンも含まれ得る。細胞培養収集物は、しばしば、誤って構築された形態の抗体、または損傷された形態の断片的な形態の抗体も含む。
【００８８】
「清澄化された細胞培養収集物」とは、細胞が除去された収集物のことを指す。清澄化プロセスは、固体を除去するための、単なる遠心分離もしくは精密濾過またはそれら２つの組み合わせを意味し得るか、あるいは特定のクラスの可溶性夾雑物を収集物から抽出するために、化学添加物または化学的に相互作用する表面を有する固体材料を使用することを含み得る。
【００８９】
「官能化された固体」または「１つ以上の固体」とは、粒子；膜；モノリス；フィラメントもしくは繊維；無定形の、織り込まれた、もしくは結晶性のフリット；ゲル、またはそのような物理的形式の任意の化合物構築物もしくは組み合わせ（液体がデバイスを通過するのを許容しつつ固体の保持を助けるように構成された形式の１つ以上を有するデバイスを含む）といった物理的形態の、化学的に相互作用する固体のことを指す。官能化されたという用語自体は、基礎となる材料が、本開示の方法の実施を可能にする相互作用性の化学物質を有するという具体的な目的のために合成的に改変されることを示唆すると理解される。化学的に相互作用する表面を有する溶解されていないアラントイン結晶が、様々な実施形態において存在し得るが、天然の材料は、機能的になるために改変が必要ないので、アラントインは、「官能化された固体」が意味するものの範囲に含まれないことが理解されるべきである。同じ概念フレームワークが、官能化された可溶性基材にも適用され、官能化された可溶性基材は、官能化された固体基材と交換可能にまたは組み合わせて使用され得る。官能化される前の可溶性基材は、天然起源または合成起源であり得、数百ダルトン（Ｄ）から１００，０００Ｄ超の範囲のサイズであり得る。
【００９０】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素および通常、硫黄を含み、ペプチド結合によって連結された１つ以上のアミノ酸鎖からもっぱら構成される、複雑な有機高分子の任意の群のことを指す。タンパク質は、天然起源または組換え起源であり得る。タンパク質は、非アミノ酸部分によって（例えば、グリコシル化、ペグ化または他の化学部分との結合体化によって）修飾され得る。タンパク質の例としては、抗体、凝固因子、酵素およびペプチドホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９１】
「宿主夾雑物」または「宿主細胞夾雑物」とは、目的の生成物を産出する細胞が生成する生体分子のことを指す。この用語は、様々なクラスの宿主夾雑物（例えば、宿主タンパク質および宿主ＤＮＡ）を含み得る。
【００９２】
「宿主タンパク質」または「宿主細胞タンパク質」または「ＨＣＰ」とは、目的の生成物を産生する細胞によって生成されるタンパク質のことを指す。そのようなタンパク質は、目的の生成物から除去されるべき夾雑物の１クラスに相当する。
【００９３】
「抗体」とは、天然の形態または遺伝的に改変された形態（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体およびインビトロで産生された抗体）を含む、ヒトまたは他の哺乳動物の細胞株に由来するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥクラスの免疫グロブリンのことを指す。それらの抗体は、単一のクローンによって産生され得る（その場合、モノクローナルと称される）か、または２つ以上のクローン由来であり得る（その場合、ポリクローナルと称される）。ＩｇＧ抗体は、特に、免疫グロブリンＧと称される抗体の１クラスのことを指し、それは、１つのサブクラスまたはサブクラスの混合物としても存在し得、例えば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４；またはマウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２ＢもしくはＩｇＧ３；またはラットではＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃとして存在し得る。真核生物宿主において天然にまたは組換え的に生成される抗体は、種々のグリコシル化された形態で存在し得るが、真核生物でない宿主において生成される抗体は、種々のグリコシル化された（ｇｌｙｃｏｓｙａｔｅｄ）形態およびグリコシル化されていない形態で存在し得る。抗体という用語は、酵素的な起源であるかまたはタンパク分解性の起源であるかに関係なく断片的な構築物を含むと理解されるように理解され、それには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨおよびＳｃＦｖが含まれるがこれらに限定されない。
【００９４】
「エンドトキシン」とは、溶解されると細胞から放出される、グラム陰性菌の外膜に存在する熱安定性の有毒なリポ多糖物質のことを指す。エンドトキシンは、リン酸残基およびカルボキシル残基の高含有量に起因して一般に酸性であり得、リピド−Ａ領域の脂肪酸含有量に起因して高度の疎水性であり得る。エンドトキシンは、水素結合に対する広範な機会を提供し得る。
【００９５】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖として共有結合的に結合された複数のヌクレオチドモノマーから構成される生体高分子のことを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合を形成する強い傾向を有し得る。
【００９６】
「タンパク質調製物」とは、目的のタンパク質を含む任意の水性または主に水性の溶液（例えば、細胞含有細胞培養収集物、（実質的に）無細胞の細胞培養上清、または精製の段階由来の目的のタンパク質を含む溶液）のことを指す。
【００９７】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、生存している宿主、主に細菌、植物および動物の細胞内でのみ複製し、ＲＮＡコアまたはＤＮＡコア、タンパク質コート、およびより複雑なタイプでは、取り囲んでいるエンベロープから構成される、超顕微鏡的で（直径およそ２０〜３００ｎｍ）代謝的に不活性な感染物質のことを指す。
【００９８】
本明細書中に開示される方法を特定の細胞培養収集物に対してカスタマイズする際の有用な開始点は、細胞を含むかまたは細胞がすでに取り除かれた細胞培養収集物に乾燥アラントインを加えることであり、ここで、加えられるアラントインは、１％，ｗ／ｖに至る。添加している間中、混合を維持する。アラントインの一部は溶解するが、別の一部は、溶解しないまま残る。水では、約０．６％が溶解し、残りは不溶性のままであるが、アラントインが様々な構成要素と相互作用する複雑な生体系では、その比率は、変化し得る。ノナン酸が、０．３％，ｖ／ｖの比率まで加えられ、撹拌が続けられる。あるいは、脂肪酸の添加が、アラントイン添加の前にまたはアラントイン添加と同時に行われ得るが、提案される順序は、その処理からのわずかに高い抗体回収率を助けると見られる。脂肪酸自体における負に帯電したカルボキシル基が、ｐＨを約５．４に低下させるので、場合によっては、ｐＨの調整は不要である。他の場合、または脂肪酸の塩が使用される場合、収集物のｐＨは、約ｐＨ５．２に調整されるべきである。伝導率は、調整される必要がない。混合は、最大２時間またはそれ以上にわたって維持され、その時点において、ＴＲＥＮを有するポリマー粒子が投入され、ここで、粒子の比率は、２％〜５％ｖ／ｖの範囲であり得る。２％より低い量および５％より高い量は、より効果的でない傾向がある。伝導率およびｐＨは、調整される必要がないが、ＴＲＥＮ粒子によるノナン酸イオンの除去に起因して、ｐＨは自然に上昇し得る。最大４時間またはそれ以上にわたって混合を続け、次いで、終了する。種々の混合方法、ミキサーおよび混合速度が、効率に関して実質的に変動し、本開示の方法を用いて得られる結果の質に直接影響する。ゆえに、それらは、最終的な方法を規定する前に体系的に検討されるべきである。混合の後、固体は、必要に応じて静置され、液体は、精密濾過または沈降などの任意の都合のよい方法によって清澄化される。清澄化された液体は、必要に応じて、正電荷によって集合された液体接触内部表面を有するデバイスへの通過によってさらに処理され得る。ｐＨまたは伝導率の条件の調整は、この工程では必要ない。処理された材料は、濁度、宿主細胞タンパク質、抗体凝集物、抗体フラグメント、ＤＮＡ、ヒストン、ヌクレオソーム、ウイルス、エンドトキシン、または特定の精製の目標にとって適切であり得る他の夾雑物の減少について評価され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、脂肪酸は、それらの酸性イオンの形態で収集物に投入され得る。酸性の形態で投入されるとき、脂肪酸自体が、使用ｐＨを好適な値に滴定し得るので、収集物のｐＨを調整する必要がない場合がある。ｐＨは、一般にｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整され得るが、より理想的には、４．５〜５．５もしくは４．８〜５．２の範囲または５．２に調整され得る。一般に、より酸性の条件が、より良好な夾雑物除去を助けるが、それほど酸性でない条件は、一般に、より高いＩｇＧ回収率に有利である。一般的な事項として、本開示の方法は、従来から行われてきた脂肪酸沈殿よりも高いｐＨ値において良好な結果をもたらす。極端なｐＨの回避は、抗体にかかる化学的ストレスを減少させ得、より高い回収率の機能的抗体および／または改善された抗体安定性の形態で二次的な利点を提供し得ると認識され得る。したがって、脂肪酸を用いた沈殿を行うために当該分野において通常実施されるものと反対の手順であるが、日常的なものとして、４．５〜５．５などの中程度のｐＨ値を評価することが、一般に有益である。事前のｐＨ滴定が、厳密には必要ない場合でも、それは、その方法の再現性を高め得るので、賢明であり得る。他の実施形態において、脂肪酸は、塩、例えば、カプリル酸ナトリウムもしくはペラルゴン酸ナトリウムもしくはカプリン酸ナトリウム；またはカプリル酸カリウムもしくはペラルゴン酸カリウムもしくはカプリン酸カリウム、あるいはカリウムカチオンなどとの他の塩として投入され得る。塩として投入されるとき、その塩の調製物によって、構成要素イオンの滴定能力が効果的に保留されるので、所望の使用ｐＨを達成するように適切な滴定剤を加えることによって使用溶液のｐＨを調整する必要があるだろう。好適な滴定剤は、酸、または目標の使用ｐＨにもしくは目標の使用ｐＨ付近に予め滴定された濃縮された緩衝剤からなり得る。予備的比較から、遊離酸の形態が、脂肪酸塩よりも効率的な夾雑物除去を助けることが示唆される。
【０１００】
実験データは、いくつかの実施形態において、カプリン酸が、特に凝集物の除去に対して、カプリル酸よりも有効であることを示唆しているが、しかしながら、その１０原子炭素鎖が原因であるより高い疎水性に明らかに起因して、それは、抗体損失のより高いリスクも伴い、時折、より低い回収率または外界温度の比較的小さな変動からの一貫性のない結果をもたらす。これまでの実験からの知見は、カプリン酸の有効濃度範囲が、同様の状況におけるカプリル酸の濃度の約半分であることを示唆している。このことは、実験を開始する際の１つの好適な濃度として０．２％のカプリン酸を示唆する。他の実験データは、ペラルゴン（ノナン酸，９−炭素）が、カプリル酸またはカプリン酸よりも好ましい疎水性と電荷とのバランスを提供し、より効率的な宿主タンパク質減少を助けることを示唆している。他の実験結果は、脂肪酸鎖の末端に単一の二重結合を有する９−炭素脂肪酸である８−ノネン酸もまた、カプリル酸またはカプリン酸よりも良好な結果をもたらすことを示唆している。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、官能化された固体は、収集物に加える前に、特定のｐＨ値に平衡化され得る。そのような調整は、約１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む標的ｐＨの緩衝液で固体を洗浄することによって達成され得る。次いで、平衡化された固体から、過剰な液体を除去するために吸引され得、それらは、湿ケークとして収集物に加えられ得る。所与の精製にとって最も適切な平衡ｐＨおよび伝導率を決定する実験は、有益であり得る。１つの実施形態において、固体は、最初の実験において、２０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、約５．１〜５．３または５．１５〜５．２５または５．２のｐＨに予め平衡化され得る。より高いおよびより低いｐＨおよび伝導率値が、その後の実験において評価され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、官能化された可溶性基材は、収集物に加える前に、特定のｐＨ値に平衡化され得る。そのような調整は、所望の基材の液体濃縮物に酸または塩基を加えることによって達成され得る。所与の精製にとって最も適切な平衡ｐＨおよび伝導率を決定する適度の実験法は、有益であり得る。１つの実施形態において、可溶性基材は、最初の実験において、２０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、約５．１〜５．３または５．１５〜５．２５または５．２のｐＨに予め平衡化され得る。より高いおよびより低いｐＨおよび伝導率値が、その後のランにおいて評価され得る。
【０１０３】
特定の精製にとって最も効果的な構成を決定するために、各変数について値の範囲を評価することは、一般に価値のあることだろう。アラントイン濃度は、より低い比率（例えば、１％）またはより高い比率（例えば、２、３、４、５％）または中間の増加量において評価され得る。実験データは、アラントインが１％未満でより効果的でなくなること、および５％超で抗体回収率が損なわれ得ることを示唆しているが、その低下が潜在的に上昇し得るという認識がある限り、より広い範囲が評価され得る。提案された１％より低い濃度は、凝集物の減少を特に損ない得る一方で、より高い濃度は、抗体回収率を損ない得る。より低い抗体回収率は、より価値があると見なされる他の効果に起因して、場合によっては許容され得る。アラントイン単独を加える場合のインキュベーション条件に関する実験法は、経験から、その効果が非常に速く生じると示唆されるので、一般に必要ない。脂肪酸濃度は、０．０５％〜５％で変更され得る。１５分もの短さのインキュベーション時間は、おそらく、凝集物および宿主タンパク質の除去を損ねるが、３０分または４５分または６０分または９０分または１２０分または他の最適な時間とともに評価され得る。２時間より長いインキュベーション時間も評価され得るが、これまでの実験データは、そのような時間における有意な利点を明らかにしていない。官能化された固体基材または可溶性基材の比率は、２％未満に低下され得るか、またはその値よりも高く上昇され得る。より低い比率は、本方法の全体的な有効性を損ねるとみられる一方で、より高い濃度は、相対的な利点なしに費用を増大させる傾向がある。より高い濃度は、前もって沈殿させておいた夾雑物が再可溶化されて、抗体含有溶液に再度混入する程度にまで、脂肪酸に結合するというますます高まるリスクも有する。細胞培養材料の間のバリエーションを考慮すると、１％〜５％の範囲を最初に探索することが賢明だろう。インキュベーション時間は、効率の主要な決定因子であるが、長いプロセス時間の経済的な不利益とバランスが取られるべきである。１６時間は、無人で行うことができる一晩のインキュベーションと一致するので、１６時間が、開始点として好都合であるが、より短い時間（例えば、１時間、２時間、４時間）およびユーザーの裁量でおそらくそれより短い、長いまたは中間の時間も評価されるべきである。脂肪酸との最初のインキュベーションに対する使用ｐＨは、４〜６または４．５〜５．５または４．８〜５．２の範囲であり得る。伝導率は、通常、調整を必要としないが、塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって通常の生理学的伝導率の約２倍に上昇され得るか、または水を加えることによって約半分に低下され得るか、または所望であれば、より広い範囲が評価され得る。
【０１０４】
実験結果は、カプリン酸が、いくつかの場合において抗体フラグメントの除去にとってより有効であり、一般に、他のすべての観点において少なくとも効果的であると見られると示唆しているので、カプリル酸に対する代替物としてカプリン酸を評価することが望ましい場合がある。カプリン酸は、可溶性である少なくとも約３０℃の温度において使用されることが有益であり得る。このことは、冷蔵して保存される細胞培養収集物に適用されるとき、不利益であると考えられ得るが、そのような懸念は、脂肪酸が新鮮な細胞培養収集物に直接加えられ得る場合、および特に細胞培養収集物がバイオリアクター内に存在したままである場合に、保留される。後者の場合、所望の任意のインキュベーション時間にわたって、高温が維持され得る。このアプローチは、脂肪酸のインキュベーションの後に温度を下げる場合、いくらかの比率のカプリン酸が不溶性になり、その系における固体と会合する可能性があるという二次的な利点を、その系からの除去の効率を高めるという効果とともに、有し得る。実験データは、カプリン酸が、カプリル酸と同じ濃度範囲にわたって評価され得るが、より低い濃度において有効であることが広く見出されることを示唆しており、ペラルゴン酸に対する最適濃度は、通常、それらの２つの中間である。８未満の炭素鎖長は、特に凝集物除去に関してそれほど効果的でなく、その結果として、より多い相対量を必要とするが、潜在的に有用なままである。同様に、１０を超える鎖長は、脂肪酸の固有の溶解性に起因して高濃度の可溶性試薬を達成することが困難であることによって損なわれ、それらは、場合によっては抗体回収率の低下という高いリスクをもたらす。一般的な事項として、実験データは、脂肪酸が疎水性であるほど、その有効濃度は低下し、ダイナミックレンジが狭くなることを示唆している。１つ以上の負電荷と１つ以上の脂肪族または芳香族の疎水性部分とを組み合わせている他の有機酸（飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸およびリン脂質を含むがこれらに限定されない）もまた、本明細書中に提示されるガイドラインに従って本明細書中に開示される方法を実施するために使用され得る。
【０１０５】
表面上にＴＲＥＮを有する粒子は、合成によって得てもよいし、商業的に購入してもよい（例えば、Ｂｉｏ  Ｗｏｒｋｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が製造するＷＯＲＫＢＥＡＤＳＴＭ４０  ＴＲＥＮ  Ｈｉｇｈ（Ｐ／Ｎ  ４０  ６０３  ０１０））。これらの粒子は、アガロースポリマーに基づくが、ＴＲＥＮは、広範囲の固体基材および可溶性基材を官能化するためにも使用され得ることが明らかであろう。固体は、球状、不揃い、または糸状であり得、場合によっては可溶性であり得る。上記方法は、ＴＲＥＮ粒子がカラムに充填された形式、またはＴＲＥＮが、流体の通過を許容するが固体の通過を許容しないデバイス内に収容された非微粒子表面（例えば、膜、モノリス、繊維、結晶性マトリックスまたは他の固体支持体）上に固定化された形式でも実施され得る。
【０１０６】
ＴＲＥＮを有する固体は、他の化学種を有する材料によって置換され得るか、または他の化学種を有する他の材料を伴い得るか、またはその両方であり得、ここで、他の化学種は、ＩｇＧから夾雑物を特に除去するという同じ機能および収集物に前もって加えられたいくらかの比率の脂肪酸を除去するという同じ機能をなおも果たす。１つのそのような実施形態において、ＴＲＥＮ粒子は、イミノ二酢酸を有する粒子と組み合わされる。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮ粒子は、負に帯電した骨格を有するポリマー粒子上にブチルまたは他の疎水性リガンドを有する粒子と組み合わされる。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮ粒子は、電気陰性部分（例えば、スルホ部分、ホスホ部分またはカルボキシ部分）を有する粒子と組み合わされる。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮ粒子は、疎水性スチレンジビニルベンゼン骨格上に第四級アミンを含むＤｏｗｅｘ  ＡＧ  １ｘ２などの疎水性の陰イオン交換材料と組み合わされる。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮ粒子は、疎水性陽イオン交換材料と組み合わされ得る。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮ粒子は、他の２以上のタイプの粒子と組み合わされ得る。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮは、金属親和性を伴う電気陽性ならびに水素結合およびファンデルワールス相互作用に関与する能力を有する、ＴＲＥＮのような電気陽性材料によって置換され得る。別のそのような実施形態では、ＴＲＥＮは、水素結合およびファンデルワールス相互作用に関与する能力も有する電気陽性種によって置換され得る。電気陽性種が金属親和性官能基を有しない１つのそのような実施形態において、電気陰性部分または双性イオン部分によって金属親和性官能基が提供される種が存在し得る。ＴＲＥＮ以外の電気陽性種は、１つ以上の第１級アミン、１つ以上の第二級アミンまたはより多くの第三級アミン、１つ以上の第四級アミンを含むことがあり、いくつかの具体例としては、１，３−ジアミノ−２−プロパノール；２−アミノ−１，３−プロパンジオール；エタノールアミン；１−アミノ−４−グアニドブタン；アンモニア；１，２−ジアミノエタン；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノ−２−プロパノール；ビス（ＴＲＩＳ）ペンタン；１，２−ジアミノエタン；トリメチルアミン；ビス（３−アミノプロピル）アミン；４−アミノ−４−（３−ヒドキシプロピル）−１，７−ヘプタンジオール；１，３−ジアミノプロパン；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；１，２−ジアミノエタン；ジエタノールアミン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｎ−（３−アミノプロピル）ジエタノールアミン；エタノールアミン；Ｎ−ブチルアミン；１，３−ジアミノペンタン；２−（２−アミノエトキシ）エタノール；ポリエチレンイミン（ＭＷ：２０００）；１−アミノ−１−デオキシ−ｄ−ソルビトール；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｎ，Ｖ−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン；ペンタエチレンヘキサミン；トリエタノールアミン；１，３−ジアミノ−２，２−ジメチルプロパン；３−メチルアミノ−１，２−プロパンジオール；２−アミノ−エタンチオール；ジアリルアミン；ポリアリ��アミン；ジエチレントリアミン；Ｎ−メチルジエタノールアミン；１，５−ジアミノペンタン；４−アミノ−４−（３−ヒドキシプロピル）−１，７−ヘプタンジオール；１，４−ジアミノブタン；トリメチルアミン；ジエチルトリアミン；６−アミノ−１−ヘキサノール；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；２−（メチルアミノ）エタノール；メチオニノール；４−アミノ−１−ブタノール；ヒドラジン、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびヒスタミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
１つの実施形態において、高い程度の金属親和性を特に有する帯電した種としては、トリス（２−アミノエチル）アミン；ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、イミノ二酢酸（ｉｍｉｎｏｄｉａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ニトリロ酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾール、アミノエチルホスフェート、アミノフェニルホスフェートまたはそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの実施形態のすべてが特に、収集物中の凝集物のレベルを低下させる手段としての、クロマチンおよびクロマチンと会合した材料の除去に関することが認識されるだろう。これらの固相官能基は、可溶性の夾雑物を収集物から取り除く際にも重要な役割を果たし、それにより、上記方法によって達成される精製の要素全体に寄与することも等しく認識されるだろう。
【０１０８】
ＴＲＥＮおよび／または他の化学種が粒子以外の固体表面上で使用される実施形態では、収集物とともにそれらの粒子がインキュベートされる時間を評価する必要性は、劇的に減少し得る。例えば、化学種が、収集物が流れて通過し得る濾過膜の表面上に存在する場合、接触時間は、数時間ではなくおよそ数分であり得る。他の物理的形式は、種々の流動制限を課すことがあるかまたは流動させないことがあり、その材料を通過する流体の流速を評価することがすべての場合において賢明であり得る。種々の量の固相表面の接触面積を含む材料を評価すること、および流速に対する接触表面積の有効性を評価することも等しく賢明だろう。なぜなら、より広い面積は、有効性を損なわずにより速い流速を支持し得るが、経済性を損ない得るからである。カラムに充填されたＴＲＥＮ粒子を使用する実施形態において、条件を最適化するための実験にとって有用な開始点は、５ｃｍ以上の床高に充填することおよび約２００ｃｍ／時の線流速で収集物をカラムに貫流させることだろう。最大３０ｃｍなどのより高い高さを有するカラムが使用され得、そのようなカラムは、より高い効率を支持し得るが、より高い床高を横断する大きな圧力低下に起因して、低い流速とともに使用され得る。一般的な事項として、５〜１５ｃｍの床高のカラムが、好適な実際の範囲である。ほとんどのそのような実施形態において、一連の実験における最初の実験について、カラムに充填された粒子の体積は、収集物に直接加えられ得る粒子の体積と同じであり得る（例えば、２％）。その後の実験は、より小さいまたは大きい体積を評価することがあり、より小さい体積が、有効性を損ない得る一方で、より大きな体積は、経済性を損ない得ることに注意する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、沈殿物を除去した後、他のタンパク質分画法を続ける前に、処理された上清を他の官能化された固体に曝露して特定の夾雑物クラスを除去することが有益であり得る。１つのそのような実施形態において、上清は、イミノ二酢酸によって官能化された粒子と接触され得る。実験データは、イミノ二酢酸がより効率的に除去するカルシウム、マグネシウムおよびマンガンを除くほとんどの金属イオンを、ＴＲＥＮがイミノ二酢酸よりも効率的に除去することを示唆している。別のそのような実施形態では、上清は、残留脂肪酸の含有量を特に最小にすることを目的として、疎水性の陰イオン交換粒子と接触され得る。実験データは、スチレンジビニルベンゼン粒子上に第四級アミノ基を備えるＤｏｗｅｘ  ＡＧ  １Ｘ２がこの目的に特にふさわしいと示唆している。別のそのような実施形態では、負に帯電した金属結合官能基を有する粒子、または疎水性の陰イオン交換官能基を有する粒子、またはその両方を有する粒子、または両方を有しない粒子が、濾過デバイス（その表面は、類似もしくは代替の化学物質によって官能化されていることもあるし官能化されていないこともある）と接触され得る。１つのそのような実施形態において、固体を除去した後、処理された抗体調製物は、正電荷を有するデプスフィルターに通される。１つのそのような実施形態において、可溶性の酸性夾雑物の結合を高める電荷を有するデプスフィルターに通す前に、タンパク質調製物の伝導率を低下させる。１つのそのような実施形態において、そのデプスフィルターの少なくとも１つの（ｏｎ）サンプル接触表面は、電気陽性になるように化学的に改変されている。１つのそのような実施形態において、そのデプスフィルターは、電気陽性のモノリス、膜、または壁が多孔性の中空糸で置換され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、その系における個々のエレメントによって全体として示される影響の程度は、それらの独立した挙動によって予測できないので、本開示のエレメントのすべてが存在する本明細書中に開示される方法を行うことが有益であり得る。このことは、その系が、当該分野で行われる脂肪酸沈殿とは異なる物理的および化学的なメカニズムとの連携を通じて、従来の脂肪酸処理と異なる結果を全体として達成するという点を強調するものである。本明細書中に開示される方法を実施する際、その方法の単一のエレメントが、連続的に実行されることにより、任意の特定の標的ＩｇＧ抗体に対する合理化されたアプローチが提供され得る。いくつかの実施形態において、当該分野で公知であるような実験計画法（ＤｏＥ）などの統計的手法が、特定のＩｇＧ精製に対してデザインされた、本明細書中に開示される少ない数の方法実施形態の選択を特定する手段を提供する。
【０１１１】
１つの実施形態において、上記方法は、前もって他の手段によって処理されたＩｇＧ含有供給流に適用され得る。１つのそのような実施形態において、バイオリアクター収集物は、本発明と異なる様式で処理されている可能性がある。他の化学添加物の存在が、本方法の有効性を損ない得るかもしくは明白であり得ること、または本方法が、前処理の有益な効果を一層大きくし得ることは、当業者に明らかだろう。別のそのような実施形態において、ＩｇＧ含有供給流は、部分的に精製されていると言われることがある。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、精製されるＩｇＧは、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、生体液（例えば、血清または血漿または他の天然に由来する流体）中に存在し得る。そのような実施形態において、インビトロ細胞培養法によって作製されるモノクローナル抗体の処理について報告されているものと、同じ方法パラメータが、同じ範囲にわたって評価され得る。ポリクローナル抗体は、所与のモノクローナル抗体よりも広い分子挙動範囲を網羅すること、および異なる種に由来する抗体の挙動には差が観察され得ることが予想されるが、全体として本発明の必須の特徴から逸脱せずに、本明細書中に開示される方法のエレメントを調整することは当業者の権限の範囲内だろう。
【０１１３】
１つの実施形態において、収集物は、処理が適用され、固体がその系から除去された後に、１つ以上の方法によってさらに処理され得る。１つのそのような実施形態は、サンプルと同じ条件に平衡化された官能化されたフィルターまたは他のデバイスに、処理された収集物を通すことを含み得る。いくつかのそのような実施形態において、サンプルのｐＨおよび伝導率の条件は、官能化されたデバイスが夾雑物を抽出する能力を高めるように変更され得る。別の実施形態において、ＩｇＧは、膜分離法によって、濃縮および緩衝液交換され得、これにより、いくらかの夾雑物も除去される。別の実施形態において、処理された収集物は、高性能タンジェンシャルフロー濾過によって処理され得る。別の実施形態において、清澄化された上清は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって処理され得る。別の実施形態において、ＩｇＧは、ポリエチレングリコールによって、清澄化された収集物から沈殿され得る。別の実施形態において、ＩｇＧは、コスモトロピック塩（例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム）によって、清澄化された収集物から選択的に沈殿され得る。別の実施形態において、清澄化された収集物は、ＩｇＧがポリエチレングリコールの存在下において親水性粒子上で融合せざるを得ない立体排除クロマトグラフィーによって、またはＩｇＧが１つ以上のコスモトロピック塩の存在下において粒子上で融合せざるを得ない優先的な排除もしくはクロマトグラフィーによって、処理され得る。別の実施形態において、処理された収集物は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって処理され得る。別の実施形態において、処理された収集物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって処理され得る。別の実施形態において、処理された収集物は、所与のクロマトグラフィー媒体が、構成している官能基に連続的に適用されるときとは異なる分画結果をもたらすことができる複数の化学官能基を備える、いわゆる混合モードクロマトグラフィーの形式によって処理され得る。
【０１１４】
以下の実施例は、単なる例証のための一般的なものであると理解され、いかなる形式でも限定と見なされるべきでない。宿主タンパク質夾雑物の９９％、凝集物およびフラグメントの９０％、ＤＮＡ、エンドトキシンおよびウイルスの９９％を除去する最初の清澄化／精製工程の後、考えられる後に続くほぼ任意のポリッシング工程対が、インビボでのヒトの治療にとって十分なＩｇＧ純度を達成することができる可能性があり、いくつかの実施形態では、後に続く単一の処理工程だけでこの結果を達成することが可能であり得ることは、当業者に明らかであろう。
【実施例】
【０１１５】
実施例１．官能化された粒子による処理を伴うカプリル酸沈殿による夾雑物の除去。種々の量のカプリル酸を、遠心分離によって清澄化された細胞培養収集物に、それぞれ０．１、０．２、０．３、０．４および０．５％という最終濃度まで加えた。アラントインを、１％という最終濃度まで各サンプルに加えた。ｐＨも塩濃度も調整しなかった。０．４％カプリル酸における最終的なｐＨは、５．４だった。それらの混合物を２時間撹拌した。サンプルを０．２２μｍのマイクロフィルターに通すことによって、固体を除去した。次いで濾液を、ＴＲＥＮ、イミノ二酢酸およびブチルリガンドを有する多孔性粒子（それぞれ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ製のＷＯＲＫＢＥＡＤＳＴＭＴＲＥＮ  ４０  Ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製のＣｈｅｌｅｘ−１００およびＢｉｏ−Ｒａｄ製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｔ−ｂｕｔｙｌ）の等量混合物を含むカラムに通した（ここで、粒子の総体積は、適用されたサンプル体積の５％だった）。宿主細胞タンパク質は、収集物中の最初の２４２，８８８ｐｐｍというＩｇＧから、０．１％カプリル酸では２３３，３１８に；０．２％では１９３，４００ｐｐｍに；０．３％では５７，５１９ｐｐｍに；０．４％では３８，６０２ｐｐｍに；および０．５％では４２，６６６ｐｐｍに減少した。遊離軽鎖および軽鎖二量体を含むＩｇＧフラグメントは、収集物中の１２．２％から、０．３％カプリル酸では５．３％に；０．４％では３．４％に；および０．５％カプリル酸では３．６％に減少した。０．１および０．２％カプリル酸では、フラグメントは減少しなかった。凝集物は、収集物中の１．２８％から、０．１％カプリル酸では１．２２％に、０．２％カプリル酸では０．８７％に、０．３％カプリル酸では０．３１％に減少し、０．４および０．５％カプリル酸では検出不可能（０．０５％未満）だった。カプリル酸濃度にわたるＩｇＧ回収率は、０．１％カプリル酸では９９％、０．２％では９９％、０．３％では９５％、０．４％では９９％および０．５％では９５％だった。多孔性粒子の混合物で処理した後、宿主タンパク質は、０．４％カプリル酸で処理されたサンプルにおいて４２０５ｐｐｍに減少し、これは、９８％の減少に相当し、抗体は、９９％超純粋のままであり、１％フラグメントを含み、測定可能な凝集物はなく、全ＩｇＧ回収率は９９％だった。
【０１１６】
実施例２．宿主タンパク質の減少に対する使用ｐＨの影響。精密濾過によって清澄化されたＩｇＧ含有収集物を０．４％カプリル酸で処理する一連の実験を行い；実験コントロールではｐＨを調整せず；２つの別個の実験では、ｐＨをｐＨ６および７に調整した。宿主タンパク質の含有量は、調整されなかったコントロール（ｐＨ５．４）では３８，６０２ｐｐｍ、ｐＨ６．０では１７１，２３２およびｐＨ７．０では２４３，６７５ｐｐｍだった。
【０１１７】
実施例３．ポリエチレングリコールを用いたＩｇＧ沈殿によるその後の精製。０．４％および０．５％カプリル酸で処理した後に多孔性粒子で処理した実施例１からのサンプルを、２０．５％ＰＥＧ、８００ｍＭ  ＮａＣ１、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０で行われるポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）を用いた沈殿によってさらに精製した。０．４％カプリル酸で処理された収集物のＰＥＧ沈殿の後、宿主タンパク質は、１１ｐｐｍに減少し、凝集物は、０．０９％に減少し、軽鎖フラグメントは、検出不可能だった。０．５％カプリル酸で処理された収集物のＰＥＧ沈殿の後、宿主タンパク質は、１３ｐｐｍに減少し、凝集物は、０．１％に減少し、軽鎖フラグメントは、検出不可能だった。これらの結果は両方とも、宿主タンパク質の９９．９９９５％の減少に相当する。収集物を本方法によって処理しない平行コントロール実験では、ＰＥＧ沈殿によって、宿主タンパク質は６７，６８７ｐｐｍに減少した。本開示の方法によって提供される６，０００倍を超える改善は、２つの異なる利点を説明する。明らかな利点は、本方法による宿主タンパク質混入の減少によって、後に続く方法が宿主タンパク質混入をさらに大きく減少させることが可能になる点である。それは、本開示の方法は、精製方法自体が最良の結果をもたらす能力を干渉する夾雑物を特に除去するというほぼ間違いなくより大きな利点も強調する。
【０１１８】
実施例４．上記方法と陰イオン交換デプスフィルターとの統合。いかなる前処理も行わずに、０．４％カプリル酸を細胞培養収集物に加えた。アラントインを１％という最終濃度まで加えた。その混合物を２時間にわたって連続的に撹拌し、次いで、実施例１に記載された同じ多孔性粒子混合物処理に対する調製法において、実施例１〜３におけるような膜マイクロフィルターの代わりに、２段階の陰イオン交換デプスフィルターに通した。その深層濾過工程によって、宿主タンパク質は、１７６，２４４ｐｐｍから９１７３ｐｐｍに１９倍減少し、凝集物は、２．０３％から検出不可能（０．０５％未満）に減少し；軽鎖夾雑物は、１２％から１％に減少した。
【０１１９】
実施例５：プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる性能の向上。実施例４に記載されたようにアラントイン、カプリル酸および混合粒子で処理することによって調製されたサンプルを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ６５０Ｆ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による精製に供した。供給流が、遠心分離および／または精密濾過によって清澄化された細胞収集物からなるとき、プロテインＡは、通常、混入宿主タンパク質レベルを５００〜２，０００ｐｐｍの範囲のＩｇＧにまで減少させる。プロテインＡより先に、実施例１に記載されたカプリル酸−アラントインおよび多孔性粒子の方法を行うことにより、プロテインＡ工程は、１ｐｐｍ未満の宿主タンパク質レベルおよび検出可能なレベルより低い凝集物を達成することができた。このことは、本開示の方法が、プロテインＡがその潜在能力を発揮する能力を干渉する夾雑物を除去することを特に強調するものである。
【０１２０】
実施例６．陽イオン交換クロマトグラフィーに続く陰イオン交換クロマトグラフィーによる性能の向上。実施例４に記載されたようにアラントイン、カプリル酸および混合粒子で処理することによって調製されたサンプルを、陽イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製に供した。陽イオン交換は、遠心分離および／または精密濾過によって清澄化された細胞収集物の後に適用されるとき、通常、５，０００〜１５，００００ｐｐｍという宿主タンパク質レベルを達成する。１００ｐｐｍより低いレベルを達成するために、典型的には少なくとも２つのさらなるクロマトグラフィー工程が用いられる。陽イオン交換より先に、開示の方法を行うことにより、陽イオン交換工程によって、４．６ｐｐｍという宿主タンパク質レベルがもたらされ、凝集物は０．６８％に減少した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．２５におけるボイド排除（ｖｏｉｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）モードにおける陰イオン交換の、後に続く単一のポリッシング工程は、宿主タンパク質を１ｐｐｍ未満に、および凝集物を０．５３％に減少させた。あるいは、カラムが１．０Ｍ  ＮａＣＬ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０に平衡化され、充填され、同じ緩衝液で洗浄され、次いで、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０への直線勾配で溶出される、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの最終ポリッシング工程によって、宿主タンパク質の混入は、１ｐｐｍ未満に、凝集物は、０．０５％未満に減少した。
【０１２１】
実施例７．抗体沈殿に続く陰イオン交換クロマトグラフィーによる性能の向上。実施例４に記載されたようにアラントイン、カプリル酸および混合粒子で処理することによって調製されたサンプルを、実施例３に記載されたようにまずＰＥＧを用いた後、２．０硫酸アンモニウム，ｐＨ７．０に変化させる混合モードの沈殿工程によるさらなる精製に供した。ＩｇＧを再可溶化し、試験したところ、５．９ｐｐｍの宿主細胞タンパク質が明らかになった。凝集物は、検出レベルより低かった（０．０５％未満）。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．２５におけるボイド排除モードにおける陰イオン交換の、後に続く単一のポリッシング工程は、宿主タンパク質を１ｐｐｍ未満に減少させた。この結果は、安価な低機能の分画方法が、すべての分画方法のうち認められている最も高い性能の分画方法：プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに基づくプロセスよりも良い全体的な精製性能を達成させる基礎を本開示の方法が提供できることを強調するので、重要である。
【０１２２】
実施例８．ＴＲＥＮ粒子による複数種の混合粒子の置き換え。いかなる前処理も行わずに、０．５％カプリル酸を細胞培養収集物に加えた。これにより、ｐＨが約５．３になった。その混合物を２時間にわたって連続的に撹拌した。次いで、アラントインを１％で加え、１５分間インキュベートした。ＴＲＥＮ粒子（Ｗｏｒｋｂｅａｄｓ  ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ）を５％ｖ／ｖの比率で加え、室温で一晩インキュベートした。その体積の半分を、上記のようにデプスフィルターに通すことにより、固体を除去した。他方の半分を０．２２μｍマイクロフィルターに通した。精密濾過バージョンは、収集物よりも１００倍少ない宿主タンパク質しか含まない材料をもたらし（１７６，２４４ｐｐｍに対して１，７５８）、凝集物を３．０３％から０．８３％に、抗体フラグメントを１１．８から１．２３％にし、抗体回収率は９０％だった。深層濾過バージョンは、宿主タンパク質を１３５ｐｐｍに減少させ、凝集物を０．０１％未満に減少させ、抗体回収率は８５％だった。
【０１２３】
実施例９．粒子インキュベーション時間。実施例８と平行して、一連の実験を行った。ＴＲＥＮ粒子とのインキュベーション時間を４または６時間に短縮すると、一晩（１６時間）のインキュベーションとほぼ同じ結果がもたらされた。インキュベーション時間を１または２時間に短縮すると、より劣った結果がもたらされた。
【０１２４】
実施例１０．処理された収集物の濃縮／膜分離法に続く陰イオン交換クロマトグラフィーによるＩｇＧ精製。タンジェンシャルフロー濾過は、プロセス溶液を濃縮するためおよび膜分離するために通常使用されるが、その能力があまりにも限定的であると考えられているので、精製工程であるとみなされない。実施例８からの深層濾過によって処理された材料を、タンジェンシャルフロー濾過によって濃縮した。宿主タンパク質の濃度は、２０ｐｐｍに減少した。凝集物は、０％のままだった。この材料を、実施例６に記載されたようなボイド排除モードにおける陰イオン交換によってポリッシングした。宿主タンパク質は、検出可能レベル未満（６０十億分率未満）に減少した。凝集物は、検出不可能だった。抗体軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントも検出不可能だった。このことは、別の認められている低機能の分画手法が、典型的に実施されるプロテインＡクロマトグラフィーに基づくプロセスよりも高い純度を達成することを本開示の方法が可能にできることを強調する。
【０１２５】
実施例１１．沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィーによるＩｇＧ精製。実施例８からの深層濾過で処理された材料を、実施例７における沈殿方法によって濃縮し、次いで、実施例６における陰イオン交換方法によって濃縮した。宿主タンパク質の濃度は、沈殿工程において１ｐｐｍ未満に、および陰イオン交換後に検出可能レベル未満（６０十億分率未満）に減少した。凝集物は、検出不可能だった。抗体軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントも、検出不可能だった。このことは、別の認められている低機能の分画手法が、典型的に実施されるプロテインＡに基づくプロセスよりも高い純度を達成することを本開示の方法が可能にできることを強調する。
【０１２６】
実施例１２．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによるＩｇＧ精製の向上。実施例８からの深層濾過で処理された材料を、実施例６におけるようなプロテインＡアフィニティー工程および陰イオン交換工程によって分画した。宿主タンパク質の濃度は、プロテインＡ工程において１ｐｐｍ未満に、および陰イオン交換後に検出可能レベル未満（６０十億分率未満）に減少した。凝集物は、検出不可能だった。抗体軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントも、検出不可能だった。この実施例は、本開示の方法が、高機能の精製方法の性能を１００倍超向上できることを強調する。
【０１２７】
実施例１３．中間の精製工程としての本開示の方法。遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物を実施例７に記載されたように沈殿によって分画する実験コントロールを行った。これにより、宿主タンパク質は、２８７，６５５ｐｐｍから６７，６８７ｐｐｍに、凝集物は、２．８３から１．５７％に、および抗体フラグメントは、１０．４から２．３％に減少した。後に続くボイド排除モードにおける陰イオン交換工程によって、宿主タンパク質は、９９．６％から２２１ｐｐｍに、および凝集物は１．４５％に減少した。この実験コントロールは、沈殿工程の後に０．４％カプリル酸、１％アラントインおよび５％ＴＲＥＮ官能化粒子による処理を行うプロセスと比較された。６時間にわたるインキュベーションの後、深層濾過によって固体を除去した。宿主タンパク質の混入は、２１ｐｐｍに減少し、凝集物は、検出可能レベル未満に減少した。この材料を、実施例６に記載されたように陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画した。宿主タンパク質の混入は、検出可能限界未満に減少した。したがって、中間工程として本開示の方法を使用すると、最終生成物の純度は、２００倍超上昇した。
【０１２８】
実施例１４．カプリン酸の適格性および硫安塩析、陰イオン交換クロマトグラフィー精製プロセスの使用可能性。細胞培養上清を、０．２％カプリン酸、１％アラントインおよび５％ＴＲＥＮ粒子で処理した。３７℃で一晩インキュベーションした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ−１フィルターにおける深層濾過によって固体を除去した。次いで、濾液を、５０ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．０中の２．０Ｍ硫酸アンモニウムを用いた沈殿によって精製し、次いで、実施例６に記載されたようにボイド排除モードにおける陰イオン交換クロマトグラフィーの最終ポリッシング工程によって精製した。宿主タンパク質は、カプリン酸−アラントイン−粒子処理によって、２８７，６５５ｐｐｍという開始レベルから９８７ｐｐｍに減少し、次いで、硫安塩析によって７６ｐｐｍに減少し、陰イオン交換によって１ｐｐｍ未満に減少した。凝集物は、カプリン酸−アラントイン−粒子工程において、検出レベル未満に減少した。抗体の軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントは、カプリン酸−粒子工程において１０．４から０．６％に減少し、硫安塩析後に検出可能レベル未満に減少した。このことは、認められている低機能の硫安塩析工程が、物理的手段によって清澄化された収集物で通常充填されるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの認められている高機能の代替法よりも良好な精製を達成することを本開示の方法が可能にできる別の例を提供する。
【０１２９】
実施例１５．カプリン酸濃度の評価。実施例１４と平行して、０．１、０．４および０．６％カプリン酸で実験を行った。０．１％は、匹敵する精製をもたらさなかった。０．４％および０．６％は、過剰な抗体損失を引き起こした。１％カプリン酸を用いた実験は、ほぼすべての抗体を夾雑物とともに沈殿させた。
【０１３０】
実施例１６．アラントイン有りおよび無しでの種々のカプリル酸濃度の評価。細胞含有収集物を、遠心分離および０．２２ミクロン膜による膜濾過によって清澄化し、次いで、上清のｐＨを６．０に低下させた。様々なサブサンプルを、０．０１％、０．０５％および０．１％の量のカプリル酸で処理した。すべてのサンプルが、処理の後に濁っていたことから、沈殿した材料を遠心分離によって除去した後でさえ、微粒子が残存するかまたは再形成することが示唆される。同じ一連の実験を、２％アラントインの存在下において繰り返した。抗体回収率および夾雑物減少は、本質的に等しかったが、処理された材料は、処理後にきれいに（ｓｐａｒｋｌｉｎｇ）透き通っていた。この実施例から、アラントインが本開示の方法の性能に全体的に寄与することが例証される。
【０１３１】
実施例１７．アラントインを加えることによる哺乳動物細胞収集物の清澄化の加速。通常の範囲の夾雑物の中でＩｇＭモノクローナル抗体を含む５Ｌの細胞含有細胞培養収集物に、アラントインを１％という最終濃度まで加えた。その容器を静かに回転させることにより、構成要素を混合した。アラントインと未知の細胞培養構成要素との相互作用によって、この量のアラントインが完全に溶解したので、さらに１％を加え、合計添加量は、２％（ｗ／ｖ）となった。その容器を再度、回転させることにより、構成要素を混合した。微粒子材料は、アラントインを加える前は非常にゆっくりと沈み、１％アラントインの存在下ではわずかに速くなるだけであることが観察されていたのに対して、沈降速度は、２％アラントインによって明らかに加速され、約２０分以内に細胞培養上清を光学的にきれいに透明にした。１％アラントインと２％アラントインとの差異は、サンプル中にいくらかの可溶化物質が存在することに起因して１％アラントインがほぼ完全に溶解されたことの示唆として解釈された。続いて、上清をデカントした。これにより、意図せずに沈殿物の一部が再懸濁され、続いてこれを遠心分離して、残存する固体を沈降させた。このことは、脂肪酸または他の添加物とは無関係にアラントインが細胞収集物の清澄化の質を改善できることを強調する。それは、少なくとも２％というアラントイン濃度で最初の試みを行うという潜在的な利点も強調する。それは、アラントインの過飽和濃度は実験的に決定され得るがその公知の水溶解性は有用な予備ガイドを提供し得るという効果とともに、アラントインの溶解性（ｓｏｌｕｂｌｉｌｉｔｙ）がサンプルの構成要素によって影響され得るという重要な点をさらに強調する。
【０１３２】
実施例１８．アラントインを加えることによるＥ．ｃｏｌｉ溶解産物の清澄化。２５０ｍＬの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０中の２０グラムのＥ．ｃｏｌｉペーストを、マイクロフルイダイザーを１６，０００×ｇで用いてホモジナイズした。次いで、そのホモジネートを１５，０００×ｇで１時間遠心分離して、最も大きい微粒子種を除去した。これにより、褐色の濁った上清がもたらされた。その上清に、乾燥アラントインを５％ｗ／ｖという最終濃度まで直接加えた。その混合物を約１分間回転させ、次いで、静置した。不溶性材料は、数分以内に沈み、元のホモジネートに存在したタンパク質生成物の９０％超を含むきれいに透き通った上清が得られた。その上清は、０．２２ミクロンのメンブランフィルターを容易に通過したが、アラントイン処理前の上清は、フィルターに接触した途端にそのフィルターを実質的に詰まらせた。この実施例は、アラントインが、処理されたサンプルの濾過性を劇的に改善できることを強調し、全体としてこの方法の性能に対するアラントインの独立した寄与を強調する。本開示の方法が、哺乳動物細胞培養によって産生される抗体に限定されないことも説明される。
【０１３３】
実施例１９．アラントインを使用した、ＩｇＧ−エンドトキシン混合物からの抗体の回収およびエンドトキシンの減少。エンドトキシンを、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０中の１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧに、２２，０００ＥＵ／ｍｌまで加えた。２％（ｗ／ｖ）アラントインを、この混合物のアリコートに加え、室温で１５分間混合した。その懸濁液を遠心分離によって清澄化した。タンパク質およびエンドトキシンの濃度を計測して、抗体回収率およびエンドトキシン除去を算出した。２％（ｗ／ｖ）アラントインは、エンドトキシンを２倍減少させた。抗体回収率は、アラントインの量に影響されなかった。その後の一連の実験において、アラントインの量を、１０％まで徐々に増加させた。抗体回収率は、１０％アラントインにおいて約９３％まで徐々に低下したが、エンドトキシン除去効率は、約９９％に上昇した。これらの実験から、より多い量のアラントインを使用すると、ＩｇＧの損失が生じ得ることが説明される。約１２ｋＤａ〜１ＭＤａの範囲のサイズのタンパク質を用いたさらなる実験から、タンパク質のサイズが大きくなるにつれてタンパク質の損失は増大するという明確な傾向が示唆される。この実施例は、アラントインが本開示の方法の性能を全体的に向上できることを説明する。
【０１３４】
実施例２０．アラントインを１０％の量で加えることによって、１ｍＬあたり１０１０個のマウス微小ウイルス粒子を含むウイルス培養物を生理学的条件下で共沈殿させた（ｃｏｐｒｅｃｉｐｔｉｔａｔｅｄ）。上清の感染性試験により、９９．９％のウイルスの除去が実証された。アラントインを１０％の量で加えることによって、１ｍＬあたり１０１０個のマウス白血病ウイルス粒子を含む別のウイルス培養物を生理学的条件下で共沈殿させた。上清の感染性試験により、９９．９％のウイルスの除去が実証された。この実施例は、全体として本開示の方法に対するアラントインの独立した寄与を説明する。
【０１３５】
実施例２１．２０ｍＳ／ｃｍの伝導率になるまでＮａＣｌを加えた清澄化されたＩｇＭ細胞培養収集物を、カラムに充填されたＴＲＥＮ粒子に通した。ＩｇＭ回収率は、９８％だった。ヒストンおよび通常の宿主タンパク質の除去は、約３５％だった。ＤＮＡの除去は、９９％だった。高分子量凝集物は、１９．４％から１．３％に減少した。この実施例は、全体として本開示の方法に対するＴＲＥＮ粒子の独立した寄与を説明する。
【０１３６】
実施例２２．遠心分離および精密濾過によって清澄化された抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ細胞培養収集物を、カラムに充填されたＴＲＥＮ粒子に通した（ここで、ＴＲＥＮ粒子の体積は、適用された細胞培養収集物の体積の２％だった）。流速は、２００ｃｍ／時だった。その処理によって、凝集物は、２０．４％から３．２％未満に減少した。宿主タンパク質の混入は、５８％減少した。この実施例は、全体として本開示の方法に対するＴＲＥＮ粒子の独立した寄与を説明する。
【０１３７】
実施例２３．遠心分離および精密濾過によって清澄化された抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ細胞培養収集物を、実施例１と同じ粒子混合物で充填されたカラムに通した（ここで、その粒子の体積は、適用された細胞培養収集物の体積の２％だった）。流速は、２００ｃｍ／時だった。この処理によって、凝集物は１７．４％から４％未満に減少した。宿主タンパク質の混入は、４２％減少した。この実施例は、全体として本開示の方法に対する官能化された混合粒子の独立した寄与を説明する。
【０１３８】
実施例２４．ＴＲＥＮおよびイミノ二酢酸の官能基の金属除去選択性の比較。遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物を、ＴＲＥＮによって官能化されたアガロースポリマーミクロスフェアのカラムまたはＣｈｅｌｅｘ−１００のカラムに通した。表１における結果は、Ｃｈｅｌｅｘが、カルシウムおよびマグネシウムに対して実質的により有効であることを示している。それらの２つのカラムは、銅、マンガン、ニッケル、鉛および亜鉛に対しても同様に有効である。ＴＲＥＮは、アルミニウムおよび鉄に対して実質的により有効である。
【０１３９】
【表１】
2016520655.tif 000003
【０１４０】
実施例２５．細胞培養収集物からのモノクローナルＩｇＧの統合された精製。細胞含有抗ＨＥＲ２細胞培養収集物を、２％という最終濃度のアラントインおよび０．２％という最終濃度のカプリル酸と混和し、次いで、２時間インキュベートした。ＴＲＥＮによって官能化された粒子を５％の最終比率まで加え、その混合物をさらに４時間インキュベートさせた。沈殿物を遠心分離によって除去し、上清をＣｈｅｌｅｘ−１００粒子とＤｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２粒子との等量混合物と混和し、ここで、その混和は、２％という最終比率だった。１時間のインキュベーションの後、混合物を陰イオン交換デプスフィルターに適用して、粒子を除去した。続いて、濾液を、約５０ｋＤａという球状タンパク質サイズと等しい多孔度を有する膜を使用するタンジェンシャルフロー限外濾過システムにおいて濃縮し、１Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍソルビトール、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．２の緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。１リットルあたり約２０ｇのＩｇＧまで濃縮した後、その濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、ボイド排除モードで操作されるＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑのカラムにおける陰イオン交換クロマトグラフィーによって処理した。この実施例は、本開示の清澄化方法が、認められている低機能の精製方法（限外濾過）および単一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程だけを使用するにもかかわらず、プロセスの性能を現行の方法より大きく上回らせられることを例証している。プロセスの結果を表２に要約する。
【０１４１】
【表２】
2016520655.tif 000004
【０１４２】
実施例２６．脂肪酸と逆帯電した固体との間の相反作用。遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞収集物を、１％アラントインおよび０．４％カプリル酸で処理し、次いで、４時間インキュベートした。その材料を３つのアリコートに分割した。第１のものを５％ＴＲＥＮ粒子で処理した。これは、一連のものに対する実験コントロールだった。第２のものを１０％ＴＲＥＮ粒子で処理した。第３のものを５％ＴＲＥＮ粒子および２％Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１Ｘ２粒子で処理した。これらの条件下の他の実験におけるように、５％ＴＲＥＮとの組み合わせは、特に、遊離軽鎖夾雑物を０．１％未満に減少させた。しかしながら、１０％ＴＲＥＮおよびＴＲＥＮ＋Ｄｏｗｅｘを用いた実験では、遊離軽鎖の量は、５％超まで戻った。これらの結果から、沈殿した軽鎖が溶解性を回復するのに十分な量のカプリル酸を、固体材料が、その沈殿した軽鎖から取り去り、それにより、沈殿していないＩｇＧに再混入したことが示唆される。特に、ＴＲＥＮと比べてより少ない量のＤｏｗｅｘが、この結果をもたらしたことは注目すべきことである。このことは、この特定の形態のＤｏｗｅｘの公知の強力な疎水性（ｈｄｙｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）と一致し、それは、カプリル酸夾雑物沈殿物からカプリル酸を競合的に解離させるための有効性を高めるはずである。
【０１４３】
実施例２７．脂肪酸と逆帯電した固体との間の相反作用。遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞収集物を、１％アラントインおよび０．４％カプリル酸で処理し、次いで、４時間インキュベートした。その材料を２つのアリコートに分割した。第１のものを５％ＴＲＥＮ粒子で処理した。これは、一連のものに対する実験コントロールだった。第２のものを５％ＴＲＥＮ粒子および５％ｃｈｅｌｅｘ２００粒子で処理した。これらの条件下の他の実験におけるように、５％ＴＲＥＮとの組み合わせは、特に、遊離軽鎖夾雑物を０．１％未満に減少させた。しかしながら、ＴＲＥＮ＋Ｃｈｅｌｅｘを用いた実験では、遊離軽鎖の量は、５％超まで戻った。ＴＲＥＮとｃｈｅｌｅｘの両方が、固相キレート剤であり、Ｃｈｅｌｅｘは、負電荷であるので、上記のことは説明しがたく、これは、Ｃｈｅｌｅｘが、カプリル酸イオンと直接相互作用しないはずであり、ゆえに、ＴＲＥＮが軽鎖を除去する能力に影響を及ぼさないはずであることを意味する。これらの結果は、その系における固相キレート剤の効果が、金属結合によって媒介されない可能性があるが、匹敵するが金属結合が異なるそのようなリガンドの化学的特徴によって媒介される可能性があることを示唆している。
【０１４４】
実施例２８．プロセス順序の変更。抗ＨＥＲ２細胞培養収集物を、１％アラントインおよび０．４％カプリル酸で２時間処理し、次いで、５％ＴＲＥＮ粒子で４時間処理した。遠心分離によって固体を除去し、上清を陰イオン交換デプスフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＤＣ−１）に通した。宿主細胞タンパク質の混入は、５３１ｐｐｍに減少した。凝集物は、０．１％未満に減少した。過剰な遊離軽鎖は、１％未満に減少した。関連する実験において、デプスフィルターを陰イオン交換中空糸（Ｑｙｕ−ｓｐｅｅｄ，Ａｓａｈｉ）で置換した。宿主タンパク質の減少は、５２８ｐｐｍと等しかったが、凝集物は、たった３．７％にしか減少しなかった。
【０１４５】
実施例２９．ＤＮＡと脂肪酸との非相互作用性。カプリル酸沈殿は、ＤＮＡを沈殿させることができると報告されている（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ、前出）。それらの同一の負電荷は互いに反発するはずなので、これは筋が通らない。このことを、１、２、５、１０マイクログラム／ｍＬという濃度の精製されたＤＮＡを、ｐＨ５．２および生理学的伝導率において２時間、０．４％カプリル酸と混和する実験において確かめた。処理後のＤＮＡ濃度に有意差は観察されなかった。これは、その他の者が報告している明らかなＤＮＡの結合が、Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌによる研究（前出）によるとおそらくヌクレオソームのヒストン構成要素である中間種を介した間接的な結合に起因し得ることを示している。
【０１４６】
実施例３０．本開示の方法の特徴の非存在下でのカプリル酸沈殿による夾雑物の減少。カプリル酸単独と本開示の方法との差異を説明するために、実験を行って、カプリル酸による清澄化の性能についてのベースラインを実証した。２５９，７７７ｐｐｍの宿主タンパク質および凝集化されていないＩｇＧが約３０％に達する凝集物を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物において、すべての実験を行った。すべての実験を生理学的伝導率で行った。宿主タンパク質、ＩｇＧ回収率および凝集物含有量に対する効果を、３．５から７．０までの０．５間隔のｐＨ単位で評価した。ｐＨ３．５では、宿主タンパク質減少が最も大きかったが、ＩｇＧ回収率は５０％未満だった。ｐＨ４．５では、凝集物除去が最も大きかった。ｐＨ６．５および７．０では、ＩｇＧ回収率が最も高かったが、宿主タンパク質および凝集物の減少は不十分だった。すべての結果を下記の表に示す。
【０１４７】
【表３】
2016520655.tif 000005
【０１４８】
実施例３１．本開示の方法に対するｐＨの効果。１７２，０３８ｐｐｍの宿主タンパク質および２２％の凝集物も含むＩｇＧ含有収集物を、５．０、５．５、６．０、６．５および７．０のｐＨ値において評価し、ここで、１％アラントインおよび４％カプリル酸を収集物に加え、静かに混合し、次いで、５％（ｖ／ｖ）Ｂｉｏ  Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ粒子を加え、４時間混合した後、遠心分離および精密濾過によって固体を除去した。結果は、実施例３０よりも劇的に優れていたことから、本開示の方法の優れた性能が強調される。すべての結果を下記の表に示す。ＦＬＣとは、遊離軽鎖のことを指す。
【０１４９】
【表４】
2016520655.tif 000006
【０１５０】
先の実験を、より狭いｐＨ間隔で繰り返すことにより、最適なｐＨの推定を洗練させた。これらの実験を、同じ抗体を含む異なる細胞培養収集物において行った。すべての結果を以下の表に記載する。
【０１５１】
【表５】
2016520655.tif 000007
【０１５２】
実施例３２．官能化された粒子を加えない場合のｐＨおよび伝導率の組み合わされた影響。ｐＨ４．８、５．２および５．６の影響を、各々、１２ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍおよび２０ｍＳ／ｃｍの伝導率値で評価する、一連の実験を行った。出発物質は、同じ抗体＋２１３，８２１ｐｐｍの宿主タンパク質および２５．６％の凝集物を含む細胞培養収集物だった。データは、本開示の方法が、アラントインおよびカプリル酸構成要素に限定されるとしても、カプリル酸単独（実施例３０）よりも実質的に良い結果をもたらすことを示す。すべての結果を以下の表に記載する。
【０１５３】
【表６】
2016520655.tif 000008
【０１５４】
実施例３３．商業的に入手可能なＴＲＥＮ粒子と実験的に調製されたＴＲＥＮ粒子との比較。市販のＴＲＥＮ粒子は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーの手法を行うために製造されたものであり、本開示の方法を実施するために必要ない物理的特性（例えば、それらの粒子の、圧力抵抗性、規定の均一な粒子サイズ分布および規定のポアサイズ分布）を有する。これらの特徴は、不要であることに加えて、粒子を高価にさせる。本発明者らは、安価な生分解性セルロース粒子およびセルロース繊維からＴＲＥＮ粒子を調製した。それらの粒子または繊維を、１Ｍ  ＮａｏＨ、１ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム、１００ｍＭトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）および３２０ｍＭエピクロロヒドリンと平衡化し、次いで、５０℃で４時間反応させた。その緩衝液を１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで水に置き換えることにより、残留反応体および反応副産物を洗い流した。ＴＲＥＮの固定化を陰イオン性色素Ｍｅｔｈｙｌ  Ｂｌｕｅの結合によって確かめた。収集物をｐＨ５．２において１％アラントインおよび０．４％カプリル酸で処理した後に、それらの実験粒子を、５％ｖ：ｖにおける市販のＴＲＥＮ粒子と比較した。ＩｇＧ含有細胞培養物は、２８．３％の凝集物および２５８，９９９ｐｐｍの宿主タンパク質を含んだ。すべての結果を以下の表に示す。ｃＴＲＥＮとは、市販のＴＲＥＮ（ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ）のことを指す。ＣＰとは、セルロース粒子のことを指す。ＣＦとは、セルロース繊維のことを指す。１％の実験粒子は、１％の市販のＴＲＥＮよりも優れていたが、５％の市販のＴＲＥＮは、５％の実験粒子よりも良好な性能をもたらした。
【０１５５】
【表７】
2016520655.tif 000009
【０１５６】
実施例３４．本開示の方法と活性炭粒子の添加との比較。本方法を、２８２，７７３ｐｐｍの宿主タンパク質および３３．４％の凝集物を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に適用した。その収集物を、０．４％アクリル酸および１％アラントイン＋０、１、２または４％活性炭（４〜１２メッシュ，Ｄａｒｃｏ）で処理した。活性炭の添加によって、宿主タンパク質は減少したが、抗体回収率は、不釣り合いに減少した。活性炭は、４％において、ＩｇＧを含むすべてのタンパク質をサンプルから破滅的に警告なく排除した。結果を以下の表に示す。
【０１５７】
【表８】
2016520655.tif 000010
【０１５８】
実施例３５．種々の正に帯電した種によって官能化された粒子の影響。１、２、３、４および５％（ｖ：ｖ）の市販のＴＲＥＮの効果を、同じレベルにおけるＤｏｗｅｘ  ＡＧ  １Ｘ２と比較した。この実験は、１８８，５０３ｐｐｍの宿主タンパク質および２６．４％の凝集物も含むＩｇＧ含有収集物を用いて行われた。手短に言えば、Ｄｏｗｅｘは、わずかにより良い回収率および凝集物除去をもたらしたが、ＴＲＥＮは、宿主タンパク質および遊離軽鎖をより効率的に除去した。結果を以下の表に示す。
【０１５９】
【表９】
2016520655.tif 000011
【０１６０】
実施例３６．種々の表面化学によって官能化された粒子の影響。１）ジカルボキシ陽イオン交換体（ｃａｔｉｏｎ  ｅｃｈａｎｇｅｒ）（Ｃｈｅｌｅｘ−１００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２）スルホ陽イオン交換体（ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、負に帯電したアルキル疎水性固相（ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ｔｂｕｔｙｌ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、メタクリレートポリマー骨格上により低い濃度の負に帯電した基を有する正に帯電した粒子（ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ＨｉｇｈＱ）およびＤｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２とＴＲＥＮ（ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ）との組み合わせの効果を、２４１，２４１ｐｐｍの宿主タンパク質および２３．３％の凝集物も含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に対して評価した。アラントインを、１％の濃度まで加え、次いで、カプリル酸を０．４％で加えた。ｐＨを５．２に滴定し、さらに４時間にわたって粒子を加えるまで、サンプルを２時間撹拌した。データを以下の表に示す。Ｐ種とは、様々な固相化学のことを指す。
【０１６１】
【表１０】
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【０１６２】
実施例３７．本開示の方法に対する固体カルシウム化合物および溶解カルシウム化合物の影響。６５２，４５０ｐｐｍおよび３４．１％凝集物も含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、様々な濃度の塩化カルシウムまたはヒドロキシアパタイトで処理し、ｐＨ５．２に滴定し、２時間混合した。固体を除去し、サンプルを評価した。０．５〜８．０ｍＭの範囲のカルシウム濃度は、ＩｇＧ回収率に有意な影響を及ぼさなかった。ＨＣＰは、約７０，０００〜８０，０００ｐｐｍの範囲で存在し、軽鎖含有量は、ほとんど減少せず、凝集物レベルは、概して約２．５％まで減少した。０．５〜４％のｖ：ｖ濃度のヒドロキシアパタイトは、ＩｇＧ回収率を０．５％ＨＡにおける７９％から８％ＨＡにおける３８％に減少させた。宿主タンパク質は、減少したが、その減少は、ＩｇＧの損失よりも小さかった。軽鎖含有量は、効率的に減少しなかった。凝集物は、この研究における最低値まで減少したが、抗体の損失を相殺するには不十分だった。データを以下の表に示す。ＣＡ種は、それぞれ塩化カルシウム（ＣＣ）またはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）のことを指す。「ベース」と表示された行は、いかなるカルシウム添加物も用いずに得られた結果を示している。
【０１６３】
【表１１】
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【０１６４】
実施例３８．精製およびＩｇＭモノクローナル抗体。無細胞の細胞培養収集物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸を加えることによって処理し、約５．６という使用ｐＨをもたらした。その混合物を室温で２時間インキュベートし、次いで、ＴＲＥＮ粒子（Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ）を５％ｖ／ｖの量で加え、室温において４時間にわたって混合してインキュベートし、ここで、固体を遠心分離および精密濾過によって除去した。分析サイズ排除クロマトグラフィーは、凝集物が、約２３％という元の濃度から０．５％未満に減少したことを示した。宿主タンパク質のピークは、観察されなかったことから、低分子量の細胞培養液の構成要素を含まず、９８％超の純度が示唆された。処理されたＩｇＭを、実施例１４におけるＩｇＧと同じデプスフィルターに通す平行実験において、ＩｇＭが失われたことから、ＩｇＭがデプスフィルターの内側面に結合したことが示唆された。
【０１６５】
実施例３９．非イオン界面活性剤の効果。１％アラントインを、遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物の４つの５０ｍＬアリコートの各々に加えた。１つは、コントロールとして確保された。Ｔｗｅｅｎ−２０を他の３つにそれぞれ０．００５、０．０１および０．０２％の量で加えた。それらのサンプルを１０分間インキュベートした後、カプリル酸を０．４％まで加え、１Ｍ酢酸を加えることによってｐＨ５．３に調整し、次いで、２時間インキュベーションした。解析のためにサンプルを取り出し、濾過した。ＴＲＥＮ粒子を、そのサンプルの残りに５％の量で加え、４時間混合し、次いで、固体を精密濾過によって除去した。ＴＲＥＮ粒子を加える時点まで、凝集物の含有量は、コントロールから０．００５％Ｔｗｅｅｎまで減少し、次いで、０．０１％Ｔｗｅｅｎでも減少したが、０．０２％Ｔｗｅｅｎを用いたときはさらに改善しなかった。抗体回収率および過剰な遊離軽鎖の含有量は、ほぼ変化しなかった。ＴＲＥＮ粒子を加えた後、凝集物レベルは、すべてのサンプルにおいて同じであり、軽鎖含有量は、ほとんど影響されなかったが、ＩｇＧ回収率は、Ｔｗｅｅｎ含有量が０．０１％になるまで上昇したが、０．０２％ではさらに上昇しなかった。
【０１６６】
【表１２】
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【０１６７】
実施例４０．非イオン、双性イオンおよび陽イオン界面活性剤の効果。１％アラントインを、遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物の５０ｍＬアリコートの各々に加えた。１つは、コントロールとして確保された。以下の界面活性剤を、２つの各アリコートにそれぞれ０．０１％および０．０５％で加えた：グリコール酸（Ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）エトキシレート４−ノニルフェニル（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｌ）エーテル（Ｇｌｙｃｈ．，非イオン性）、エチレンジアミンプロポキシレート−ブロック−エトキシレートテトロール（ＴＥＴ，非イオン性）、Ｂｒｉｊ５８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７，非イオン性）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（非イオン性）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（非イオン性）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート水和物（ＣＨＡＰＳ，双性イオン性）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ，陽イオン性）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＤＴＡＢ，陽イオン性）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）陽イオン性）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（ＭＴＡＢ，陽イオン性）、臭化オクタデシルトリメチルアンモニウム（ＯＴＡＢ，陽イオン性）。それらのサンプルを１０分間インキュベートした後、カプリル酸を０．４％まで加え、１Ｍ酢酸を加えることによってｐＨ５．３に調整し、次いで、２時間インキュベーションした。
【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
実施例４１．種々の脂肪酸の効果。１％アラントインを、遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物の５０ｍＬアリコートの各々に加えた。１つは、コントロールとして確保された。別のコントロールとしてカプリル酸を０．４％まで加え、１Ｍ酢酸を加えることによってｐＨを５．３に調整し、次いで、２時間にわたって混合してインキュベートした。収集物の５つのアリコートを０．１％、０．２％、０．３％、０．４％および０．５％の２−エチルヘキサン酸（ＥＨＡ）で処理した。これらの実験を、３−ヘプテン酸（３ＨＡ）、次いで、３−オクテン酸（３ＯＡ）および８−ノネン酸（８ＮＡ）を用いて繰り返した。
【０１７０】
【表１４】
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【０１７１】
実施例４２．官能化された粒子有りおよび無しでのオクタン酸と８−ヘプテン酸との比較。１％アラントインを、遠心分離および精密濾過によって清澄化された細胞培養収集物の５０ｍＬアリコートの各々に加えた。１つは、コントロールとして確保された。別のコントロールとしてカプリル酸を０．４％まで加え、１Ｍ酢酸を加えることによってｐＨを５．３に調整した。その混合物を、２時間にわたって混合してインキュベートし、サンプルを試験のために取り出し、次いで、ＴＲＥＮ粒子を５％（ｖ：ｖ）の量で加え、さらに４時間にわたって混合してインキュベートした。精密濾過によって固体を除去し、次いで、解析した。この実験形式を、０．４％、０．５％および０．６％の８−ヘプテン酸を用いて繰り返した。
【０１７２】
【表１５】
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【０１７３】
実施例によって例証されたように、本開示の方法は、より高い精製レベルを達成するために、他の精製方法と併用され得る。そのような他の精製方法の例としては、ＩｇＧの精製のために通常使用される他の方法、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよび他の形態のアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーならびに混合モードクロマトグラフィー法；また、ポリエチレングリコールなどの非イオン性ポリマーを用いる抗体沈殿、または硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムもしくはクエン酸カリウムなどの塩を用いる抗体沈殿を含む沈殿の方法；また、結晶化および水性二相抽出の方法が挙げられるがこれらに限定されない。様々な方法にとって適切な条件を開発すること、およびそれらを本明細書中に開示される方法と統合して、特定の抗体の必要な精製を達成することは、当業者の権限の範囲内である。
【０１７４】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、各個別の刊行物または特許または特許出願が、すべての目的のためにその全体が参照により援用されると明確におよび個々に示されたかのように同程度に、それらの全体がすべての目的のために参照により援用される。参照により援用される刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような任意の矛盾する材料に取って代わるおよび／または優先すると意図されている。
【０１７５】
本明細書および請求項において使用される、成分、クロマトグラフィー条件などの数量を表現するすべての数は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それとは反対のことが示されない限り、本明細書および添付の請求項に示される数値パラメータは、本発明が得ようとしている所望の性能に依存して変動し得る近似値である。
【０１７６】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの改変およびバリエーションが、その精神および範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、単に例として提供され、決して限定していると意味されない。明細書および実施例は、単に例示的なものと見なされると意図されており、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求項によって示される。
【国際調査報告】
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