(57)【要約】  本発明は、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および該株の培養培地を有効成分として含有する、植物病原菌を防除する技術、方法および組成物に関するものである。特に、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および該株の培養培地は、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有し、そのため植物病原菌を防除する環境に優しい組成物として有用であり得る。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株。
【請求項２】
リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の植物病原菌に対する抗菌活性を有する、請求項１に記載の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株。
【請求項３】
請求項１に記載の株、該株の培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を有効成分として含む、植物病原菌を防除する組成物。
【請求項４】
前記感作物質が、下記の手順：
植物病原菌を、請求項１に記載の株または該株の培養培地を含有する培地で培養すること；および、
該株または該株の培養培地と該植物病原菌との相互作用により分泌される該感作物質を、メタノールを使用することにより回収すること
より回収される、請求項３に記載の植物病原菌を防除する組成物。
【請求項５】
植物病原菌を防除する方法であって、有効用量の請求項１に記載の株、該株の培養培地、または該植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を、植物または耕土と処理する工程を含有する、方法。
【請求項６】
植物病原菌を防除する組成物の製造における、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株、該株の培養培地、または前記植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＫＢＣ１００４株および該株の培養培地を有効成分として含む、植物病原菌を防除する技術、方法、および組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
環境および生態系の保全は大きな国際的関心事項である。植物病害を防除するのに有機合成農薬を過剰に使用することで、土壌汚染、環境／生態系の破壊、および動物に対する毒性などが引き起こされる。特に、このような有機合成農薬の誤用／過剰使用により引き起こされる農業生態系における汚染における消費者の懸念から、環境に配慮した安全な農作物に関心が持たれている。このような有機合成農薬の副作用を排除するために、植物病原菌に対して作用する生物学的防除システムが、生態系において防除の働きがある微生物およびその代謝産物を用いて研究されている。このような天然の植物保護剤の最も大きな利点は環境および農業生態系への影響が最低限であることである。しかしながら、天然の植物保護剤は生物であることから、室温での保存期間が短い。天然の植物保護剤として工業化されているほとんどの微生物はバチルス属の一種に属しており、これはバチルス属の一種の微生物が熱および乾燥などの環境ストレスに耐える内生胞子を形成することが可能であるためである。バチルス属の細菌は自然に広く分布しており、植物病原菌に対する抗生物質活性および植物の生育を促進する植物防御機構だけでなく、根圏の定着にも有利に働く複合機能を備えるペプチド様物質を産生する。
【０００３】
天然の植物保護剤に関する研究は１９７０年代初頭に始まり、主に政府研究施設、大学研究施設および企業が先導してきた。最も成功を収めた天然の植物保護剤は、Ｇａｌｌｔｒｏ−Ａ、Ｎｏｇａｌｌ／Ｄｉｅｇａｌｌ、およびＮｏｒｂａｃ８４Ｃであり、これらはアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）を用いて開発されたものであり、現在では登録済みの製品である。２００３年には、Agraquest Co．（米国）がＳｅｒｅｎａｄｅを開発し、この許諾製品は今では多国籍農業系企業であるBASFによって２５の国の世界市場で流通されている。韓国では、これまでに約３０種の天然の植物保護剤が登録および使用されている。特に、１７種の微生物が殺菌薬として使用されており、その中の１３種がバチルス属の一種に属する。
【０００４】
植物病害用の生物学的防除剤として使用されているバチルス属の一種の株は、内生胞子を有するとともに、培養し易いグラム陽性の非病原性微生物である。この株はプロテアーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼおよびセルラーゼなどの様々な酵素だけでなく、異なる構造を有する抗微生物性化合物を産生することも知られており、このことからこの微生物が生物学的産業において宿主微生物として広く使用されるような産業上重要なものであることが示唆される。
【０００５】
その一方で、バチルス・アミロリケファシエンスを用いて植物病原菌を防除する組成物として、ＫＢ３株（特許文献１）、ＣＳ６１株（特許文献２）、ＫＢ−ＭＪＫ  ６０１株（特許文献３）、ＩＮ９３７ａ株（特許文献４）、ＪＢＣ３６株（特許文献５）、ＥＭＬ−ＢＳ２株（特許文献６）、ＣＰ１株（特許文献７）、ＧＩＢ−０１株（特許文献８）、ＣＣ１７５株（特許文献９）、Ａ−７株（特許文献１０）、ＬＰ０３株（特許文献１１）、ＫＳ−４株（特許文献１２）、ＫＴＧＢ０２０２株（特許文献１３）、ＬＸ９株（特許文献１４）、およびＫＭ１１２株（特許文献１５）が抗真菌活性を示すことが報告されている。
【０００６】
上記バチルス・アミロリケファシエンス株を含む、植物病原菌に対する抗真菌活性を示す微生物防除剤が数多く報告されているにもかかわらず、様々な植物病害を防除する効果は依然満足のいくものではなく、そのため新規の生物学的な微生物防除剤が必要とされている。
【０００７】
従来技術では、病原菌に対して作用する微生物が生物学的防除に使用されている。しかしながら、抗菌活性を示す物質の有効濃度が非常に低いために、生物学的防除効果は低減する。
【０００８】
本発明者らは、様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有する新規の株および物質の開発を試みた。その結果として本発明者らによって、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および該株の培養培地が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニー（Rhizoctonia solani）ＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea）、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム（Colletotrichum acutatum）、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス（Rhizoctonia cerealis）、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）、およびキウイフルーツ疫病（kiwifruit phytophthora blight）を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリ（Phytophthora drechsleri）などの様々な病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していることが確認され、更に特定の感作物質を交換することにより病原菌を縮小または死滅する技術および方法が確立され、それにより本発明は完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１０−２０１１−００６５４３９号
【特許文献２】韓国特許出願公開第１０−２０１１−００２９３８７号
【特許文献３】韓国特許出願公開第１０−２０１１−００１４０３８号
【特許文献４】韓国特許出願公開第１０−２０１０−０１３３１１６号
【特許文献５】韓国特許第１１８９１０４号
【特許文献６】韓国特許出願公開第１０−２０１０−００６５５５７号
【特許文献７】韓国特許出願公開第１０−２０１０−００４０３０３号
【特許文献８】韓国特許出願公開第１０−２００９−００３７２１８号
【特許文献９】韓国特許第８３８１０３号
【特許文献１０】韓国特許第８６８９０１号
【特許文献１１】韓国特許第８０７４０３号
【特許文献１２】韓国特許第７８１４７２号
【特許文献１３】韓国特許第５３５９１２号
【特許文献１４】韓国特許第４７２３７６号
【特許文献１５】韓国特許第４２９５５８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、上記株または該株の培養培地を有効成分として含む、植物病原菌を防除する技術、方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明はＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を提供する。
【００１３】
本発明は、上記株、培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を有効成分として含む、植物病原菌を防除する技術、方法および組成物も提供する。
【００１４】
本発明は、上記株、培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を有効成分として含む、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）により引き起こされる芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）を防除する技術、方法および組成物を更に提供する。
【００１５】
加えて本発明は、下記の工程：
１）ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を液体培地において培養することにより培養産物を調製する工程と、
２）工程１）で調製された培養産物を乾燥するとともにそれを粉砕することにより原材料を調製する工程と、
を含む、植物病原菌を防除する組成物を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および培養培地は、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すため、植物病原菌を防除する環境に優しい技術、方法および組成物に有効に使用することができる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態の適用が、添付の図面を参照して最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を示す図である。
【図２】本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株のＡＮＩ分析による同定を示す図である。
【図３】バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の培養培地の酸沈殿物のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図４】バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された抗菌物質を確認するために行われたＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図５ａ】バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された抗菌物質を確認するために行われたＬＣ−ｍａｓｓの結果を示す図である。
【図５ｂ】図５ａのピーク＃１〜ピーク＃３の質量値を表す図である。
【図５ｃ】図５ａのピーク＃４〜ピーク＃６の質量値を表す図である。
【図５ｄ】図５ａのピーク＃７〜ピーク＃９の質量値を表す図である。
【図５ｅ】図５ａのピーク＃１０〜ピーク＃１２の質量値を表す図である。
【図６】リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）と、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株抽出液、阻止帯抽出液、培養濃縮液、および酸沈殿物との対峙培養を示す図である。
【図７】リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）とバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株との対峙培養による感作物質の産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を提供する。
【００２１】
上記株は、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の植物病原菌に対して抗菌活性を示すのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、土壌から分離された微生物の中から優れた抗菌活性を示した株を選択した後、その配列を同定した（配列番号１および図１を参照されたい）。次いで本発明者らは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて相同性の検索を行い、その系統発生的位置を確認した。分子系統解析により、選択された株はバチルス属の一種の系統群に属するバチルス・アミロリケファシエンスと特定された。
【００２３】
選択された株はゲノム解析によってもバチルス・アミロリケファシエンスと特定された（図２を参照されたい）。この株が、サーファクチン、バシロマイシンＤ様抗生物質、フェンギシン、推定ペプチド、バリシバクチン、バシリシン／アンチカプシン、マクロラクチン、バシラエン、およびジフィシジンの生合成に関与するゲノムを含有していたことがゲノムアノテーションにより確認された（表１を参照されたい）。
【００２４】
分離および特定された株はバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４と名付けられ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）のコリアンタイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ）に２０１３年１月１８日に寄託された（受託番号ＫＣＴＣ  １２研究院３５５ＢＰ）。
【００２５】
新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された酵素を調べた。結果として、本発明の新規の株がエステラーゼ（Ｃ４）およびナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼを産生したことが確認された（表２を参照されたい）。この株の糖質利用能（carbohydrate usability）を調べ、結果を表３に示す（表３を参照されたい）。
【００２６】
本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された抗生物質を調べるために、その株の培養培地の酸沈殿物を用いてＨＰＬＣを行った。結果として、複数のピークが３７分〜４５分の保持時間において検出された。ピークの保持時間の分析とともに、２２２ｎｍおよび２７５ｎｍで最大吸収を示すＵＶスペクトルによっても、この株により産生された抗生物質がリポペプチド抗生物質であるフェンギシンクラスターであったことが示唆された（図３および図４を参照されたい）。
【００２７】
その一方で、リポペプチド抗生物質フェンギシンと同様のＨＰＬＣ保持時間（３７分〜４５分）を示す領域をＬＣ−ｍａｓｓにより分析した。結果として、この株の培養培地は、バチルス属の一種の抗菌物質として知られるイツリンおよびフェンギシン群を含有していた（図５を参照されたい）。
【００２８】
病原菌リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）に対する本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の拮抗作用を調べた。結果として、新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が単回の液体培養中に抗生物質を含有していたことが確認され、このことから抗生物質は細胞内では休止状態であったが、株が病原菌のような刺激因子を受けると、新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株における送達系および輸送系に関与する遺伝子が活性化することで、抗生物質が分泌されたことが示唆される（図６を参照されたい）。
【００２９】
植物病原菌に対する本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の増殖阻害効果を調べた。結果として、この株が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していたことが確認された。特に、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、および唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータムに対するこの株の抗真菌活性がより顕著であった（表５を参照されたい）。
【００３０】
リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）を含む植物病原菌に対する本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の作用機序を調べた。結果として、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）はバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株に対する反応として感作バンドを形成し、このことからバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株がリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）と相互作用することにより、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）が感作物質を分泌することで、病原菌自体の増殖が阻害されたことが示唆された（図７を参照されたい）。
【００３１】
したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すことが確認されたため、この株を、植物病原菌を防除する環境に優しい組成物として有効に使用することができた。
【００３２】
本発明は、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株、該株の培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を有効成分として含む、植物病原菌を防除する技術、方法および組成物も提供する。
【００３３】
上記植物病原菌は、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の病原菌であるのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【００３４】
上記感作物質は下記の手順：植物病原菌を、請求項１に記載の株または該株の培養培地を含有する培地で培養することと、該株または該株の培養培地と植物病原菌との相互作用により分泌される該感作物質を、メタノールを使用することにより回収することとにより得られるのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していたことが確認された。特に、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、および唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータムに対するこの株の抗真菌活性がより顕著であった（表４を参照されたい）。
【００３６】
したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株または該株の培養培地は、様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すことから、植物病原菌を防除する環境に優しい技術、方法、および組成物に有効に使用することができる。
【００３７】
本発明は、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および該株の培養培地を有効成分として含む、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）により引き起こされる芝生リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）を防除する技術、方法および組成物を更に提供する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を用いて液体または粉末の調製物を準備した後、それを１：２００〜１：１０００の比にて水で希釈した。希釈した調製物を用いて１Ｌ／ｍ２の割合（concentration）で土壌潅注を行った。土壌潅注の一ヶ月後、芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）による損傷を受けた区域を調べることで、この株の防除効果を観察した。結果として、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の粉末調製物は９０．１％の防除効果を示し、このことからこの株が天然の植物保護剤として非常に実用的なものであることが示唆される（表６を参照されたい）。
【００３９】
したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株または該株の培養培地は、芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）に対する優れた抗真菌活性を示すことから、リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）を防除する環境に優しい組成物として有効に使用することができる。
【００４０】
本発明は、下記の工程：
１）ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を液体培地において培養することにより培養産物を調製する工程と、
２）工程１）で調製された培養産物を乾燥するとともにそれを粉砕することにより原材料を調製する工程と、
を含む、植物病原菌を防除する組成物を製造する方法も提供する。
【００４１】
工程１）の培地は、０．１重量部〜１０．０重量部の濃度のデキストロースと０．１重量部〜１０．０重量部の濃度のペプトンとを含有するのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【００４２】
工程１）の培養はｐＨ５．５〜８．５において２５℃〜３５℃で行うのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【００４３】
本発明の組成物は、当業者に既知の従来方法により植物病原菌を防除するのに適した形態で、例えば乾燥粉末または液体配合物の形態で配合することができる。
【００４４】
特に組成物は液体のバイオ農薬の形態で配合することができる。バイオ農薬を粉末または細粒として調製するために、希釈剤をバイオ農薬に添加することができる。しかしながら、配合物はそれらに限定されるわけではない。
【００４５】
組成物は希釈剤を更に含有することができ、この場合希釈剤は、微生物または他の有効成分を含む組成物全体におけるバイオ農薬組成物の量を調節する役割を果たす。本発明に使用可能な希釈剤には、アルギン酸ナトリウム、糊化デンプン、コーンスターチ、大豆粕、小麦ふすま、粒状繊維質、硫酸アンモニウム、珪藻土、ゼオライト、ベントナイト、タルク、カオリン、パイロフィライト、ホワイトカーボンおよびサッカライドが例示される。
【００４６】
本発明は、有効用量の上記株、該株の培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を植物または耕土と処理する工程を含有する、植物病原菌を防除する方法も提供する。
【００４７】
本発明の組成物を用いて植物病原菌を防除する方法は、噴霧（例えば、ネブライゼーション、ミスティング、アトマイジング、粉末散布、細粒散布、水面施与、段階施与（phase application）など）、土壌施与（例えば、混合、潅注など）、表面施与（例えば、塗布、塗抹、コーティングなど）、浸漬、燻煙などの従来方法により達成することができる。組成物の用量は損傷の状態、施与法および施与場所などを考慮して決定することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を用いて液体または粉末の調製物を準備した後、それを１：２００〜１：１０００の比にて水で希釈した。希釈した調製物を用いて１Ｌ／ｍ２の割合で土壌潅注を行った。土壌潅注の一ヶ月後、芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）による損傷を受けた区域を調べることで、この株の防除効果を観察した。結果として、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の粉末調製物は９０．１％の防除効果を示し、このことからこの株が天然の植物保護剤として非常に実用的なものであることが示唆される（表６を参照されたい）。
【００４９】
したがって、植物病原菌を防除する本発明の方法は植物病原菌を防除するのに有望な環境に優しい方法である。
【００５０】
本発明は、植物病原菌を防除する組成物の製造における、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株、該株の培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質の使用も提供する。
【００５１】
本発明の株または該株の培養培地は、様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すことから、植物病原菌を防除する環境に優しい組成物として有効に使用することができる。
【００５２】
本発明の実用的な実際の好ましい実施形態は、以下の実施例に示される通り説明される。
【００５３】
しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮し、本発明の趣旨および範囲の中で変更および改良を行い得ることを理解するであろう。
【実施例】
【００５４】
実施例１：バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の単離および特定
土壌から採取した微生物の中から優れた抗菌活性を示す株を選択した。
【００５５】
選択された株の特定のために、本発明者らは、韓国の昌原大学に依頼して、この株の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を解析した。結果として、図１のヌクレオチド配列（配列番号１）が確認された。次いで本発明者らは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて相同性の検索を行い、その系統発生的位置を確認した。分子系統解析により、選択された株はバチルス属の一種の系統群に属するバチルス・アミロリケファシエンスと特定された。
【００５６】
単離および特定された株はバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４と名付けられ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）のコリアンタイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ）に２０１３年１月１８日に寄託された（受託番号ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰ）。
【００５７】
実施例２：バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株のゲノムのシークエンシングおよび解析
バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株のゲノムのシークエンシングおよび解析を韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）にて行った。
【００５８】
特に、２×１００のペアエンドシークエンシングを、Ｈｉｓｅｑ２０００（Illumina）を用いてバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株にて行った。結果として、およそ５００ｂｐのフラグメント配列が得られ、そこから３０２５７４３０の配列（３．０６Ｇｂ）を読み取ることができた。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｖｅｒ．５．５を用いてこの配列をトリミングした後、平均長が９３．９ｂｐ（全体で２．４８Ｇｂ）の読み取り可能な配列を調製した。９９０９０５２ｂｐの配列がデノボアセンブリおよび参照マッピングにより同定された。参照配列として、バチルス・アミロリケファシエンスＦＺＢ４２（３９１８５８９ｂｐ）をマッピングに使用した。
【００５９】
ペアリードをデノボアセンブリから得られた足場構造に当てはめて、ギャップを埋めた。ギャップが一部埋められた配列をＲＡＳＴサーバー（http://rast.nmprd.org）に送り、その後自動ゲノムアノテーションを行った。２つの株に共通する遺伝子の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を２つの株間の遺伝的関係を測定するのに有用なツールとして使用することができる。この方法は、単純というだけでなく、あらゆる種類の種に適用し、種の下のレベルで株を特定することも可能である。９５％〜９６％のＡＮＩは、種の特定の基準として使用される従来の６０％〜７０％のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションである。ＡＮＩ解析はＪＳｐｅｃｉｅｓプログラムを用いて行った。結果として、本発明の株は、タイプ種であるバチルス・アミロリケファシエンス亜種アミロリケファシエンスＡＴＣＣ  ２３３５０Ｔ＝ＤＳＭ  ７Ｔと９３．８％のＡＮＩを示し、特にバチルス・アミロリケファシエンスＦＺＢ４２と９７．６％のＡＮＩを示した（図２）。したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株はバチルス・アミロリケファシエンスと特定された。
【００６０】
ＲＡＳＴ（Rapid Annotation Using Subsystem Technology）サーバーをゲノムアノテーションに使用した。このサーバーは細菌および古細菌のゲノムの標準的な全自動アノテーションを提供する。サブシステムは代謝経路またはタンパク質複合体またはタンパク質群を含む機能的役割の集合である。サブシステムは専門のアノテーターによって多重ゲノムから精選され、全自動アノテーションの重要な基礎となるタンパク質ファミリーＦＩＧｆａｍを構成している。現在、アノテーションが行われた遺伝情報はＳＥＥＤフレームワークに保存されている。ＳＥＥＤは１０００人ゲノムプロジェクト（the project to annotation 1000 genomes）を促進するアノテーション環境を示すものである。
【００６１】
バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４に最も近い種であるバチルス・アミロリケファシエンスＦＺＢ４２を参照配列に採用して、抗生物質生合成遺伝子群を調べた。
【００６２】
結果として、表１に示されるように、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４は、サーファクチン、バシロマイシンＤ様抗生物質、フェンギシン、推定ペプチド、バリシバクチン、バシリシン／アンチカプシン、マクロラクチン、バシラエンおよびジフィシジンの生合成に関与するゲノムを有することが確認された（表１）。
【００６３】
【表１】
2016507251.tif 000003
【００６４】
実施例３：バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の生化学的特徴
＜３−１＞バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された酵素の確認
実施例１において分離および特定されたバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された酵素を調べた。
【００６５】
特に１９の酵素を対象として株の酵素産生能を、ＡＰｉ  ＺＹＭキット（BioMeriux、フランス、リヨン）を用いて調べた。色の変化に従ってレベルを０から５に規定し、正確には陰性反応（−）を０と表し、得られた値が３以上である場合に陽性反応（＋）と判断する。
【００６６】
結果として、表２に示されるように、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株がエステラーゼ（Ｃ４）およびナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼを産生したことが確認された（表２）。
【００６７】
【表２】
2016507251.tif 000004
【００６８】
＜３−２＞バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の糖質利用能
バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の糖質利用能を調べるために、４９の糖質の酸化、発酵および同化を、ＡＰｌ  ５０  ＣＨＢキットを用いて調べた。酸が産生された場合に、培地中に含まれるフェノールレッド指示薬によって培地が黄色に変化し、これにより陽性反応であることが示された。一方で培地が赤色に変化した場合には陰性反応であることが示された。またエスクリン試験では、培地が赤色から黒色に変化した場合に陽性反応であることが示された。結果を表３に示す（表３）。
【００６９】
【表３】
2016507251.tif 000005
【００７０】
実施例４：植物病原菌に対して働くバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の抗菌物質の分析
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株により産生された抗生物質を分析するために、該株の培養培地の酸沈殿物を用いたＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳをNPChem（韓国）により行った。
【００７１】
特に、培養培地（２Ｌ）のｐＨを、ＨＣｌを添加することにより２に調節した後、サンプルを室温に５時間置いた。培養培地を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を捨てた。沈殿物をメタノールに溶解した。溶解しなかった沈殿物を遠心分離により取り除き、メタノールに溶解した沈殿物のみを減圧下で濃縮した。濃縮したサンプルを再度３００μｌのメタノールに溶解し、それをアッセイサンプルとして使用した。
【００７２】
ＨＰＬＣは表４に示される勾配溶媒を用いて行った。溶媒Ａは５％アセトニトリル／０．０４％ＴＦＡであり、溶媒Ｂはアセトニトリルであった。ここで使用されるカラムはＯＤＳカラムであり、流速は１ｍｌ／分に設定した。
【００７３】
【表４】
2016507251.tif 000006
【００７４】
ＨＰＬＣの結果として、図３および図４に示されるように、複数のピークが３７分〜４５分の保持時間において検出された。ピークの保持時間の分析とともに、２２２ｎｍおよび２７５ｎｍで最大吸収を示すＵＶスペクトルによっても、この株により産生された抗生物質がリポペプチド抗生物質であるフェンギシンクラスターであったことが示唆された（図３および図４）。
【００７５】
その一方で、リポペプチド抗生物質フェンギシンと同様のＨＰＬＣ保持時間（３７分〜４５分）を示す領域をＬＣ−ｍａｓｓにより分析した。
【００７６】
結果として、図５に示されるように、１２のＴＩＣピークが検出された。各化合物の分子量を測定した。結果として、化合物１の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５３８．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５６０．８で観察され、このことから化合物１の分子量が１５３８であることが示された。化合物２は２つの主要な化合物の混合物であった。第１の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５５２．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５７５．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５５２であることが示された。第２の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５６６．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５８８．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５６６であることが示された。化合物３の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５２３．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５４５．８で観察され、このことから化合物３の分子量は１５２３であることが示された。化合物４の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５３８．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５６０．８で観察され、このことから化合物４の分子量は１５３８であることが示された。化合物５は２つの主要な化合物の混合物であった。第１の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５０６．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５２８．７で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５０６であることが示された。第２の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５５２．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５７４．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５５２であることが示された。化合物６の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５６６．９で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５８８．８で観察され、このことから化合物６の分子量は１５６６であることが示された。化合物７は２つの主要な化合物の混合物であった。第１の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５２０．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５４２．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５２０であることが示された。第２の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５２２．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５４４．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５２２であることが示された。化合物８の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５３４．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５５６．８で観察され、このことから化合物８の分子量は１５３４であることが示された。化合物９は３つの主要な化合物の混合物であった。第１の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５０４．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５２６で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５０４であることが示された。第２の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５３４．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５５６．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５３４であることが示された。第３の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５５０．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５７２．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５５０であることが示された。化合物１０の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５１８．８で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５４０．８で観察され、このことから化合物１０の分子量は１５１８であることが示された。化合物１１は２つの主要な化合物の混合物であった。第１の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １０９６．７で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １１１８．４で観察され、このことからこの化合物の分子量は１０９６であることが示された。第２の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １５６２．９で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １５８４．８で観察され、このことからこの化合物の分子量は１５６２であることが示された。化合物１２の［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ  １０６８．６で観察され、［Ｍ＋Ｎａ］＋がｍ／ｚ  １０９０で観察され、このことから化合物１２の分子量は１０６８であることが示された。
【００７７】
得られた分子量データに基づき、データベースおよび文献の検索を行った。結果として、化合物はフェンギシンと同じようなＨＰＬＣ保持時間を示し、フェンギシンよりも分子量が僅かに大きかったことが確認された。化合物１１および化合物１２の分子量はイツリン化合物と類似していた。
【００７８】
したがって、この化合物はバチルス属の一種の抗菌物質として知られるイツリンおよびフェンギシン群であることが確認された（図５）。
【００７９】
実施例５：バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株による植物病原菌に対して働く抗菌物質の活性化
リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）に対するバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の拮抗作用を調べるために、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）を滅菌ジャガイモ寒天（１／５希釈）培地に置き、そこに２４時間培養した１０μｌのバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４培養液を接種し、その後３０℃で５日間対峙培養を行った。２つの株の間で形成された阻止帯を採取し、メタノールで抽出した。抽出液を濃縮して「ＣＺ」とした。
【００８０】
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株をＬＢ培地において３０℃にて１２０ｒｐｍで３日間振盪培養することで、第１の種菌を調製した。調製された第１の種菌を３０ＬのＬＢ培地において接種して、その後３０℃にて１２０ｒｐｍで３日間振盪培養を行った。細胞と培養培地とを超遠心分離により互いに分離した。得られた上清を１／１０に濃縮した後、これを「３０Ｌ」とした。
【００８１】
残存する細胞をエタノールで抽出し、抽出液を「細胞」とした。
【００８２】
酸の沈殿はＨＣｌを用いて３０Ｌの培養培地上清で行った。結果として得られた酸沈殿物を「酸沈殿物」とした。次いで、ジャガイモ寒天培地（１／５希釈）にリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ＣＺ、３０Ｌ、細胞、および酸沈殿物を添加し、その後３０℃で３日間培養を行った。
【００８３】
結果として、図６に示されるように、ＣＺおよび細胞抽出液は病原菌に対する拮抗作用を示したが、培養培地濃縮液（３０Ｌ）および酸沈殿物は病原菌に対する拮抗作用を示さなかった（図６）。したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が単回の液体培養中に抗生物質を含有していたことが確認され、このことから抗生物質は細胞内では休止状態であったが、株が病原菌のような刺激因子を受けると、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株における送達系および輸送系に関与する遺伝子が活性化することで、抗生物質が分泌されたことが示唆される。
【００８４】
実施例６：植物病原菌に対するバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の抗菌活性
実施例１において分離および特定され、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が植物病原菌に対する増殖阻害効果を有していたかについて調べるために、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を様々な植物病原菌とともに、滅菌ジャガイモ寒天培地において培養した。ここでは、植物病原菌として、ジャガイモ寒天培地において継代培養した各株をスライスし、直径５ｍｍの円形切片にした。ＬＢ培地において２８℃にて２４時間培養したバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４を５ｍｍのペーパーディスクへと分配させ（２０μｌ）、その後調製した切片との対峙培養を行った。サンプルを様々な病原菌が十分に増殖する温度である２８℃にて１０日間培養した後、阻止帯の直径を測定した。
【００８５】
植物病原菌として、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスプロデス（Colletotrichum gloeosprodes）、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリを使用した。
【００８６】
結果として、表５に示されるように、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が、本明細書で使用される全ての植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有しており、特に芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、および唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータムに対する抗真菌活性がより顕著であったことが確認された（表５）。
【００８７】
【表５】
2016507251.tif 000007
【００８８】
実施例７：リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）を含む植物病原菌に対するバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の作用機序および感作物質を回収する方法の確立
リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）を含む植物病原菌に対するバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の作用機序を調べるために、３ｍｌのバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４溶液を３００ｍｌの１．５％ジャガイモ寒天培地（１／５希釈）において接種して、細菌溶液培地を得た。調製した細菌溶液培地をペトリ皿へと分配した。培地を硬化させたら、コルクボール＃８を用いて培地に穴を開けた。１．５％寒天で穴を塞ぎ、これを硬化させた。直径５ｍｍの円形切片のリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）を培地に置いた。２４時間後、培地を肉眼で観察した。
【００８９】
結果として、図７に示されるように、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）は感作バンドを形成し、このことから病原菌がバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株と反応したことが示された。感作物質を分泌している領域を切り取り、メタノールで抽出した。抽出液を濃縮して、濃縮液をリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）と対峙培養させた。結果として、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）が感作物質に対する阻止帯を形成したことが確認された（図６および図７）。すなわち、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株はリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）と相互作用することで、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）が感作物質を分泌し、その結果病原菌自体の増殖の阻害が起こる。このようにして、この物質を回収する方法が確立された。
【００９０】
実施例８：バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の配合
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株を含む植物病原菌防除剤を液体および粉末の形態で調製した。
【００９１】
特にこの株をデキストロース（１％、ｗ／ｗ）およびペプトン（１％、ｗ／ｗ）を添加した液体培地において接種して、ｐＨ７．０において２８℃にて３日間振盪培養を行った。次いで培養液を、液体調製物および粉末調製物を配合する（formula）ための原材料として使用した。
【００９２】
液体調製物を調製するために、カリウム溶媒和物などの安定剤を０．１％〜０．５％の濃度で液体原材料に添加した。粉末調製物を調製するために、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の原材料（５．０％〜５０．０％、ｗ／ｗ）を希釈剤（５０．０％〜９５．５％、ｗ／ｗ）と混合して、その後噴霧乾燥を行った。
【００９３】
実施例９：植物病原菌に対するバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４の防除効果
韓国泗川市慶尚南道の区域における芝生（ノシバ）で発生した初期段階の芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）において、実施例５において調製された粉末調製物を、水で２００倍〜１０００倍に希釈して、１Ｌ／ｍ２の割合でその区域の土壌に一度潅注した（２０１１年５月２５日）。土壌潅注の一ヶ月後、芝草リゾクトニア葉腐病（ラージパッチ）による損傷を受けた区域を調べることで、この株の防除効果を観察した。
【００９４】
結果として、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の粉末調製物は９０．１％の防除効果を示し、このことからこの株が天然の植物保護剤として非常に実用的なものであることが示唆された（表６）。
【００９５】
【表６】
2016507251.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株または該株の培養培地を有効成分として含む、植物病原菌を防除する組成物は、様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すため、植物病原菌を防除する環境に優しい組成物の調製に有効に使用することができる。したがって、合成農薬により引き起こされる生態系の破壊およびヒト／動物に対する毒性などの懸念される問題は上記のものを使用することにより克服することができる。
【００９７】
当業者であれば、本明細書中で開示される任意の概念および具体的な実施形態を、本発明の同じ目的を遂行するために、他の配合物の変更または設計の基礎として容易に利用することができることを理解するであろう。かかる均等な配合物が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨および範囲を逸脱するものではないことも当業者には認識されるであろう。
【００９８】
【表７】
2016507251.tif 000009
【図１】
2016507251.tif 000010
【図２】
2016507251.tif 000011
【図３】
2016507251.tif 000012
【図４】
2016507251.tif 000013
【図５ａ】
2016507251.tif 000014
【図５ｂ】
2016507251.tif 000015
【図５ｃ】
2016507251.tif 000016
【図５ｄ】
2016507251.tif 000017
【図５ｅ】
2016507251.tif 000018
【図６】
2016507251.tif 000019
【図７】
2016507251.tif 000020
【配列表】
2016507251000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月15日(2015.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明者らは、様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有する新規の株および物質の開発を試みた。その結果として本発明者らによって、バチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および該株の培養培地が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニー（Rhizoctonia solani）ＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea）、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム（Colletotrichum acutatum）、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Colletotrichum gloeosporioides）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス（Rhizoctonia cerealis）、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）、およびキウイフルーツ疫病（kiwifruit phytophthora blight）を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリ（Phytophthora drechsleri）などの様々な病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していたことが確認され、更に特定の感作物質を交換することにより病原菌を縮小または死滅する技術および方法が確立され、それにより本発明は完成に至った。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株および培養培地は、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスポリオイデス、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すため、植物病原菌を防除する環境に優しい技術、方法、および組成物に有効に使用することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記株は、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の植物病原菌に対して抗菌活性を示すのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
植物病原菌に対する本発明の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株の増殖阻害効果を調べた。結果として、この株が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスポリオイデス、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していたことが確認された。特に、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、および唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータムに対するこの株の抗真菌活性がより顕著であった（表５を参照されたい）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
したがって、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、灰色かび病を引き起こすボトリティス・シネレア、唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータム、甘柿炭疽病を引き起こすコレトトリカム・グロエオスポリオイデス、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、ブラウンパッチを引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、白絹病を引き起こすスクレロチウム・ロルフシイ、およびキウイフルーツ疫病を引き起こすフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を示すことが確認されたため、この株を、植物病原菌を防除する環境に優しい組成物として有効に使用することができた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
上記植物病原菌は、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の病原菌であるのが好ましいが、常にそれらに限定されるわけではない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株が、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリなどの様々な植物病原菌に対する優れた抗真菌活性を有していたことが確認された。特に、芝草病害を引き起こすリゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、イエローパッチを引き起こすリゾクトニア・ケレアリス、および唐辛子炭疽病を引き起こすコレトトリカム・アキュタータムに対するこの株の抗真菌活性がより顕著であった（表４を参照されたい）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
【表３】
2016507251.tif 000021
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
植物病原菌として、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリを使用した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
【表５】
2016507251.tif 000022
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株。
【請求項２】
リゾクトニア・ソラニーＡＧ−２−２（ＩＶ）、ボトリティス・シネレア、コレトトリカム・アキュタータム、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス、リゾクトニア・ケレアリス、リゾクトニア・ソラニーＡＧ−１（１Ａ）、スクレロチウム・ロルフシイ、およびフィトフトラ・ドレクスレリからなる群から選択される１つまたは複数の植物病原菌に対する抗菌活性を有する、請求項１に記載の新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株。
【請求項３】
請求項１に記載の株、該株の培養培地、または植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を有効成分として含む、植物病原菌を防除する組成物。
【請求項４】
前記感作物質が、下記の手順：
植物病原菌を、請求項１に記載の株または該株の培養培地を含有する培地で培養すること；および、
該株または該株の培養培地と該植物病原菌との相互作用により分泌される該感作物質を、メタノールを使用することにより回収すること、
より回収される、請求項３に記載の植物病原菌を防除する組成物。
【請求項５】
植物病原菌を防除する方法であって、有効用量の請求項１に記載の株、該株の培養培地、または該植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質を、植物または耕土と処理する工程を含有する、方法。
【請求項６】
植物病原菌を防除する組成物の製造における、ＫＣＴＣ  １２３５５ＢＰの受託番号で寄託された新規のバチルス・アミロリケファシエンスＫＢＣ１００４株、該株の培養培地、または前記植物病原菌との相互作用により分泌される感作物質の使用。
【国際調査報告】
2016507251.tif 000023
2016507251.tif 000024
2016507251.tif 000025
2016507251.tif 000026
2016507251.tif 000027