(57)【要約】  本発明は、心臓疾患の予防又は治療用組成物に係り、具体的には（+）-シリンガレシノールを含む心臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式１で示される化合物、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【化１】
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［前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、又はＣ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表す。］
【請求項２】
前記化合物は（+）-シリンガレシノールである、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
前記心臓疾患は心血管疾患である、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
前記心血管疾患は、脳梗塞、脳出血、高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞、心不全、および動脈硬化からなる群より選ばれた一つ以上を含む、請求項３に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、該組成物の総重量を基準に０．００１重量％〜８０重量％の（+）-シリンガレシノールを含む、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項６】
前記有効成分はＳＩＲＴ（SIRTuin） １の発現を促進する、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項７】
前記有効成分は心筋細胞の死滅を抑制する、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は（-）-シリンガレシノールをさらに含み、
（+）-シリンガレシノールの重量が（-）-シリンガレシノールの重量の２倍以上である、請求項１に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物は食品組成物である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は薬学組成物である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の心臓疾患の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓疾患の予防又は治療用組成物に関し、具体的には（+）-シリンガレシノールを含む心臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は心筋損傷を起こす最も一般的な原因であって、虚血を起こす主な疾患である冠状動脈疾患は、今日、心不全の最も重要な病因である。心臓に血液を送り込む冠状動脈に激しい狭窄や閉塞が発生すると細胞の生存に必要な酸素および栄養素の供給が遮断され、この結果、細胞は死滅したり、深刻な機能障害を示したりするようになる。特に、心筋細胞は、再生、増殖する能力に乏しい細胞であって、虚血による心筋細胞の消失は心臓機能の悪化に大きな影響を及ぼす。
【０００３】
したがって、心筋細胞の死滅を抑制すれば、それによる心臓疾患としての心筋梗塞などの疾患を予防し、治療できると考えられる。現在、心筋梗塞症に対する薬物治療は、心筋梗塞症による心室の変化を防止させることに重点を置く。そのため、ステントを留置したり、血栓抑制剤であるアスピリンやプラビックスなどの心臓保護効果を付加的に持つ血圧薬を用いたりしている。しかしながら、これまでのところ、心筋梗塞症の治療中に死んだ心臓筋肉を画期的に回復させる方法はなかった。
【０００４】
本発明者らは、（+）-シリンガレシノールを心筋細胞に処理すれば心筋細胞の死滅を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６１６４９号
【特許文献２】韓国特許公開第１０−２００４−００３３９８３号公報
【特許文献３】特開２００９−２６３３５９号公報
【特許文献４】韓国特許公開第１０−２０１１−００２７６５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】WANG, T. et al., “Cardio-protective effects of total flavonoids from Dracocephalum moldavica L. on acute myocardial ischemia/reperfusion injury in rats”, In:2011, 5th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、心臓疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、一般式１で示される化合物、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む心臓疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、一般式１で示される化合物、具体的に（+）-シリンガレシノールを有効成分として含み、ＳＩＲＴ １発現を増大させて活性酸素によって誘導された心筋細胞の死滅を抑制でき、心臓疾患の予防又は改善に優れた効果を奏することができる。したがって、本発明は、心血管疾患を含む心臓疾患を予防又は改善し、これを治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]、（-）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（-）]、およびジンセンベリー（Ginseng Berry）から得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（ＧＢ）]をそれぞれ処理した心筋細胞でのＳＩＲＴ １遺伝子の発現変化を示すグラフである。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）は対照群に対して用いた。
【図２】過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を処理した心筋細胞に（+）-シリンガレシノール[Ｈ２Ｏ２+ｓｙｎ（+）]または（-）-シリンガレシノール[Ｈ２Ｏ2+ｓｙｎ（-）]を処理し、細胞の死滅が抑制された程度を示すグラフである。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）は対照群に対して用いた。
【図３】過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を処理した心筋細胞に（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]または（-）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（-）]を処理し、ＥＬＩＳＡリーダー（サーモマックス、モレキュラーデバイス社製）を利用して、５４０ｎｍの波長で形成されたホルマザンダイの光学的濃度（ＯＤ）を測定した結果である。
【図４】エゾウコギからシリンガレシノールを分離・精製する方法を図式化したものである。
【図５】エゾウコギメタノール抽出物（エゾウコギＭ）とエゾウコギエチルアセテート抽出物（エゾウコギＭ−Ｅ）に対するＨＰＬＣ結果である。
【図６】ジンセンベリーからシリンガレシノールを分離・精製する方法を図式化したものである。
【図７】ジンセンベリー（高麗人参の実）から抽出したシリンガレシノールの光学異性体間の比を示すものである。
【図８】ジンセンベリーから得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（ＧＢ）]、合成した（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]、合成した（+）-シリンガレシノールと合成した（-）-シリンガレシノールとが１：１[ｓｙｎ（+/-１：１）]、２：１[ｓｙｎ（+/-２:１）]、５：１[ｓｙｎ（ｓｙｎ（+/-５：１））]、または１０：１[ｓｙｎ（ｓｙｎ（+/-１０：１））]の比を有する場合、およびエゾウコギから得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（エゾウコギ）]を細胞に処理し、該当細胞でのＳＩＲＴ１遺伝子の発現程度を測定したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、一観点において、下記の一般式１で示される化合物、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む心臓疾患の予防又は治療用組成物に関するものであって、
【００１２】
【化１】
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【００１３】
前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、又はＣ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表す。
本発明は、他の観点において、対象に前記一般式１で示される化合物、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を有効量投与し、心臓疾患を予防又は治療する方法に関するものである。
【００１４】
本発明は、また他の観点において、前記一般式１で示される化合物、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む組成物の製造において、心臓疾患の予防又は治療用途に関するものである。
【００１５】
本明細書において「誘導体」とは、化合物の置換可能な位置で他の置換基に変更されるすべての化合物を意味する。このような置換基の種類には制限がなく、例えば、それぞれ独立してヒドロキシル、フェノキシ、チエニル、フリル、ピリジル、シクロヘキシル、アルキルアルコール、アルキルジアルコール、又は任意置換されたフェニルに置換されていてよいＣ１−１０の非環状炭化水素基；ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、メチル、又はアミノに置換されていてよいＣ５−６の環状炭化水素基；又は糖残基を含んでいてよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００１６】
本明細書において「糖残基」という用語は、多糖類の分子から１個の水素原子の除去時の基を意味し、したがって、例えば単糖類又はオリゴ糖に由来の残基を意味するものであってよい。
【００１７】
本明細書において「薬学的に許容し得る」とは、通常の医薬的服用量（medicinal dosage）にて用いるときに相当する毒性効果を避けることによって、動物、より具体的には、ヒトに用いていてよいという政府又はこれに準ずる規制機構の承認を受けることができるか若しくは承認を受けたか、又は薬局方に列挙されているか、その他一般的な処方として認知されたことを意味する。
【００１８】
本明細書において「薬学的に許容し得る塩」とは、薬学的に許容し得るものであり、且つ親化合物（parent compound）の好適な薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等といった無機酸により形成されるか；または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサノン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１,２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２,２,２］−ｏｃｔ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸により形成される酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）；または、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでいてよい。また、本明細書に係る化合物は、薬剤学的に許容し得る塩のみならず、通常の方法にて製造され得るあらゆる塩、水和物、溶媒和物をいずれも含むものであってよい。
【００１９】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記化合物は、（+）-シリンガレシノール（syringaresinol）、その誘導体又は薬学的に許容し得るその塩を含んでいてよい。
【００２０】
本明細書において「（+）-シリンガレシノール（syringaresinol）」とは、一般式２で示すような化学構造を有するリグナン系化合物であって、化学合成によって得るか、亜麻仁、黄柏、五加皮、胡麻、および高麗人参の実のうちの一種以上から抽出することができる。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
本発明の一側面は、（+）-シリンガレシノール（syringaresinol）を有効成分として含み、心筋細胞の死滅を抑制することができる。（+）-シリンガレシノールは、心筋細胞でＳＩＲＴ １の発現を促進し、活性酸素によって誘導された細胞死滅を抑制できるのに対し、その光学異性体である（-）-シリンガレシノールは、（+）-シリンガレシノールとは異なり、ＳＩＲＴ １発現を増大させることができず、心筋細胞を保護する効果がない。
【００２３】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記心臓疾患は心血管疾患を含む。
【００２４】
本明細書において「心血管疾患」とは、血管が詰まるかまたは破れることで組織への血液供給の障害を誘発する疾患であって、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、動脈硬化などを代表的な例に挙げられる。このような心血管疾患は、歳をとるにつれて血管を構成する内皮細胞が老化し、その過程で機能異常が蓄積されて発病するとされている。本発明に係る組成物は、一般式１で示される化合物、具体的に（+）-シリンガレシノールを有効成分として含み、心血管疾患を予防又は改善する効果に優れているため、心血管疾患、特に老化性心血管疾患を予防又は改善するうえで優れた効果を奏し得る。
【００２５】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記心臓疾患は、脳梗塞、脳出血、高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞、心不全、および動脈硬化からなる群より選ばれた一つ以上を含んでいてよい。
【００２６】
虚血性心臓疾患は、心筋細胞への血液を送り込む冠状循環系の異常により心筋が十分な量の酸素と栄養分を受けることができず死滅することで発病する疾患のことを言い、心筋梗塞、狭心症、心因性急死、および心不全などを代表的な例に挙げられる。このような虚血性心臓疾患は、歳をとるにつれて多様な代謝性疾患によって誘発され、我が国のヒトの死亡原因２位である。本発明に係る組成物は、（+）-シリンガレシノールを有効成分として含み、心筋細胞の死滅を抑制する効果に優れているため、心臓疾患、特に老化性心臓疾患を予防又は改善するうえで優れた効果を奏し得る。
【００２７】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記組成物は、該組成物の総重量を基準に０．００１重量％〜８０重量％の（+）-シリンガレシノールを含んでいてよい。
【００２８】
本発明の一側面に係る組成物は、該組成物の総重量を基準に１重量％〜８０重量％、好ましくは、５重量％〜６０重量％、より好ましくは、１０重量％〜３０重量％の（+）-シリンガレシノールを含んでいてよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すうえで好適であり、且つ、組成物の安定性および安全性をいずれも満足することができ、さらにはコスト対効果の面でも前記範囲で用いることが好適である。具体的に、（+）-シリンガレシノールが１重量％未満の場合は、心筋細胞の死滅抑制効果を得ることができず、８０重量％を超える場合は、安全性および剤形の安定性が劣化することがある。
【００２９】
ＳＩＲＴ １（Sirtuin 1）は、酵母のＳｉｒ２（silencing information regulator 2）の哺乳動物ホモログであって、ＮＡＤ＋依存的なヒストン脱アセチル化酵素である。カロリーを制限した場合、血管内皮細胞でＳＩＲＴ １の発現が増大すると知られている。ＳＩＲＴ １（Sirtuin 1）は、ＮＡＤ＋−依存的ヒストン蛋白質脱アセチル化酵素（NAD+-dependent histone deacetylase）であって、エネルギー代謝、ホルモン信号伝達、ストレスに対する反応などの多様な過程を調節する。したがって、血管細胞のＳＩＲＴ １発現を促進する物質を適用した場合、カロリーを制限する場合と同様、血管内皮細胞の老化を抑制することで動脈硬化をはじめとする心血管疾患を予防および治療することができると考えられる。
【００３０】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記有効成分は、ＳＩＲＴ（Sirtuin） １の発現を促進することができる。一般式１で示される化合物、具体的に（+）-シリンガレシノールは、ＳＩＲＴ（Sirtuin） １の遺伝子の活性を促進し又はＳＩＲＴ（Sirtuin） １蛋白質の発現を促進し、心臓疾患を予防し又は改善してこれを治療することができる。具体的に、（+）-リンガレシノルは、血管内皮細胞でのＳＩＲＴ １の発現およびテロメラーゼの活性を促進し、且つ老化標識子であるＳＡ−β−Ｇａｌの活性を減少させることによって、血管細胞の老化を抑制することができる。一方、老化した細胞ではｅＮＯＳの発現が減少してＮＯの生成が減少することによって血管の収縮・弛緩が円滑になされず、且つＰＡＩ−１の発現が増大して血栓の生成が促進する。（+）-シリンガレシノールは、老化した血管細胞でのｅＮＯＳの発現を増大させ、ＰＡＩ−１の発現は減少させることで血管細胞の老化を抑制し、且つ血管細胞の機能を正常化することができる。したがって、シリンガレシノールを有効成分として含む組成物は、血管老化を抑制して心血管疾患を予防し又は治療することができる。
【００３１】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記有効成分は、心筋細胞の死滅を抑制することができる。本明細書において「心筋細胞」とは、心臓壁をなす横紋筋であって心臓拍動に関与する。一般式１で示される化合物、具体的に（+）-シリンガレシノールは、心筋細胞の死滅を抑制することで心臓疾患を予防し又は改善してこれを治療することができる。
【００３２】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記組成物は、（-）-シリンガレシノールをさらに含み、（+）-シリンガレシノールの重量比が、（-）-シリンガレシノールの重量比の２倍以上であってよい。前記のように、（+）-シリンガレシノールを（-）-シリンガレシノールの２倍以上含んではじめてＳＩＲＴ １の発現を活性化することができる。前記のような観点から、本発明に係る組成物において、（+）-シリンガレシノールの重量比は、（-）-シリンガレシノールの重量比の２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、又は６倍以上であってよい。（-）-シリンガレシノールよりも（+）-シリンガレシノールの含有量のほうが大きくなるほど、ＳＩＲＴ １の発現をさらに活性化することができる。
【００３３】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記組成物は、食品組成物であってよい。前記食品組成物は、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、又は動脈硬化のような心血管疾患を含む心臓疾患を予防又は改善することができる。本発明の他の一側面に係る食品組成物は、嗜好食品又は健康食品組成物を含む。
【００３４】
前記食品組成物の剤形は特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、ドリンク剤のような液剤、キャラメル、ゲル、バーなどに剤形化することができる。各剤形の食品組成物は、有効成分の他に当該分野において通常に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が生じることがある。
【００３５】
前記有効成分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与用量は、例えば、０.１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、５０ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ/日であってよいが、必ずしもこれに制限されるのではなく、投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症などといった様々な要因によって変わり得る。
【００３６】
本発明の一観点である心臓疾患の予防又は治療用組成物において、前記組成物は、薬学組成物であってよい。前記薬学組成物は、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、又は動脈硬化のような心血管疾患を含む心臓疾患を予防又は改善することができる。
【００３７】
本発明の一側面に係る薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されていてよい。
【００３８】
経口投与のための剤形としては、錠剤、丸剤、軟質および硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤、又はペレット剤であってよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。これらの剤形は、有効成分の他に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、又はグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸、又はポリエチレングリコール）、又は結合剤（例：マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、又はポリビニルピロリシン）を含有していてよい。場合に応じて、崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、又は甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化、又はコーティング方法によって製造されていてよい。
【００３９】
非経口投与のための製剤としては、点眼剤、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ、又は噴霧剤であってもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００４０】
本発明の一側面に係る薬学組成物の有効成分は、投与を受ける対象の年齢、性別、体重、病理状態およびその深刻度、投与経路、又は処方者の判断によって変わり得る。このような因子に基づいた適用量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であってよいが、必ずしもこれに制限されるものではない。
【００４１】
以下、実施例および実験例を挙げて、本発明の構成および効果について具体的に説明する。なお、これらの実施例および実験例は、本発明に対する理解を助けるために例示の目的で提供されたものであるに過ぎず、本発明の範疇および範囲がこれらによって制限されるものではない。
【００４２】
［比較例］（-）-シリンガレシノールの合成
（-）-シリンガレシノールを合成する段階を示すと、次の反応式のとおりである。
【００４３】
【化３】
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【００４４】
（１）４−（ベンジルオキシ）−３,５−ジメトキシベンズアルデヒド（化合物２）の製造
窒素雰囲気でシリンガアルデヒド（syringaldehyde）（化合物１）（３ｇ、１６．４７ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（６．８３ｇ、４９．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍＬ）に溶かした後、臭化ベンジル（２．９４ｍＬ、２４．７ｍｍｏｌ）を入れ、室温で一晩中攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液を水とエチルアセテートで抽出する。抽出した有機層を水で３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水してからフィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（５：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して白色固体の化合物２０（４．４５ｇ、９９．２％）を収得した。化合物２のＮＭＲデータは、下記のとおりである。
【００４５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ3.90 (s, 6H), 5.13 (s, 2H), 7.11 (s, 2H), 7.29-7.48 (m, 5H), 9.86 (s, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 56.2, 75.0, 106.7, 128.1, 128.2, 128.4, 128.6, 131.9, 137.2, 191.1.
【００４６】
（２）１−（４−（ベンジルオキシ）−３,５-ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オル（１−（４−（benzyloxy）−３,５−dimethoxyphenyl）prop−２−en−１−ol）（化合物３）の製造
窒素雰囲気で前記収得した化合物２（４．０４ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした後、−７８℃に温度を下げる。臭化ビニルマグネシウム（１７．８ｍＬの１Ｍ ＴＨＦ溶液）を入れ、−７８℃で１０分間攪拌した後、０℃に温度を上げて、再び２時間攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチングし（quenching）、エチルアセテートで抽出する。抽出した有機層を水で３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水してからフィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して薄い黄色固体の化合物２１（３．９７ｇ、８９．１％）を収得した。化合物３のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【００４７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ3.83 (s, 6H), 4.99 (s, 2H), 5.14 (m, 1H), 5.22 (ddd, J = 10.5, 1.2, 1.2 Hz, 1H), 5.37 (ddd, J = 16.8, 1.8, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (ddd, J = 16.5, 10.5, 6.0 Hz, 1H), 6.60 (s, 2H), 7.28-7.51 (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 56.1, 75.0, 75.4, 102.5, 103.4, 115.3, 127.8, 128.1, 128.4, 137.9, 138.3, 140.0, 153.6.
【００４８】
（３）（Ｓ）−（４-（ベンジルオキシ）−３,５-ジメトキシフェニル）（（Ｓ）−オキシラン−２−イル）メタノール（化合物５）の製造
窒素雰囲気でｄｒｉｅｄ ｐｏｗｄｅｒｅｄ ４Åモレキュラーシーブ（molecular sieve）（１０．５ｇ）に無水塩化メチレン（４５ｍＬ）を入れ、−２０℃に温度を下げる。これに（+）-ＤＩＰＴ（diisopropyltryptamine）（１．１８ｍＬ、５．９９ｍｍｏｌ）を入れた後、チタンイソプロポキシド（titanium isopropoxide）（１．４８ｍＬ、４．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり入れて３０分間攪拌する。３０分後、クメンヒドロキシド（cumene hydroxide）（１．８５ｍＬ、８０％、５．９９ｍｍｏｌ）を入れて３０分間攪拌する。次いで、無水塩化メチレン（１０ｍＬ）に溶かした化合物３（３ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり一滴ずつ添加（dropwise addition）する。−２０℃で５時間攪拌した後、０℃に温度を上げて一晩中攪拌する。ＴＬＣで反応を確認した後、１０％ＮａＯＨ溶液（３０ｍＬ、ｉｎ飽和ＮａＣｌ溶液）を入れて３時間攪拌した後、フィルターでろ過する。ろ過液を塩化メチレンで抽出し、ブライン（ｂｒｉｎｅ）溶液で洗浄する。無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、フィルターでろ過した後、該ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して化合物４（１．６５ｇ、５５．０％、赤色オイル）および化合物５（１．０６ｇ、３３．５％、赤色オイル）を収得した。化合物５のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【００４９】
[α]D +52.9o (c 1.0, CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.20 (s, 1H), 2.79 (dd, J = 5.1, 3.9 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 5.1, 2.7 Hz, 1H), 3.23 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 4.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 6.62 (s, 2H), 7.29-7.51 (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ43.7, 55.0, 56.2, 71.1, 75.0, 103.4, 127.8, 128.1, 128.4, 135.2, 137.8, 153.7.
【００５０】
（４）２−（４−（（Ｓ）−（（（Ｅ）−３−（４−（ベンジルオキシ）−３,５−ジメトキシフェニル）アリル）オキシ）（（Ｓ）−オキシラン−２−イル）メチル）−２,６−ジメトキシフェノキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（化合物７）の製造
【００５１】
窒素雰囲気でＮａＨ（０．６３３ｇ、６０％分散、１５．８２ｍｍｏｌ）にｄｒｉｅｄ ＴＨＦ／ＤＭＳＯ（１０：１）（２０ｍＬ）を入れ、０℃に温度を下げる。ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かした化合物５（０．５ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を付加して攪拌する。次いで、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かした臭化シンナミル（cinnamyl bromide）（化合物６）（１．１５ｇ、３．１６ｍｍｏｌ）を入れ、０℃で３０分間攪拌した後、室温に温度を上げて一晩中攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液を水でクエンチングし、エチルアセテートで抽出する。抽出した有機層を水で３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水してからフィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して薄い黄色オイルの化合物７（７６０ｍｇ、８０．２７％）を収得した。化合物７のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【００５２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ2.82 (m, 2H), 3.20 (dt, J = 3.3, 3.9 Hz, 1H), 3.83 (s, 6H), 3.85 (s, 6H), 4.08 (m, 2H), 4.33 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.02 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 6.19 (dt, J = 15.9, 6.0 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 6.59 (s, 2H), 6.61 (s, 2H), 7.27-7.53 (m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 45.2, 54.4, 56.1, 56.1, 69.6, 74.9, 75.0, 80.1, 103.7, 104.3, 125.1, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.4, 132.3, 132.7, 134.0, 136.9, 137.7, 137.8, 153.6, 153,7.
【００５３】
（５）化合物８の製造
窒素雰囲気で活性亜鉛粉（activated zinc dust）（０．１４６ｇ、４．４４ｍｍｏｌ）が入っているフラスコにＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かしたＣｐ２ＴｉＣｌ２（０．１８２ｇ、１．４６３ｍｍｏｌ）を入れ、化合物７（０．１９ｇ、０．６３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１６ｍＬ）に溶かしてから、６０℃に合わせた後、先に製造したＣｐ２ＴｉＣｌ溶液をカニューレ（cannula）にて２０分間加える。２０分間攪拌した後、ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶かしたＩ２（０．１０５ｇ、０．８２５ｍｍｏｌ）を付加し、反応溶液を１時間攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を入れて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出する。抽出した有機層を３回１０％  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液およびブライン溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水してから、フィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して薄い赤色オイルの化合物８（６２ｍｇ、３２．６％）を収得した。化合物８のNMRデータは下記のとおりである。
【００５４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ3.11 (m, 2H), 3.84 (s 12H), 3.94 (dd, J = 9.3, 3.6 Hz, 2H), 4.31 (dd, J= 8.7, 6.6 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 4.99 (s, 4H), 6.57 (s, 4H), 7.29-7.51(m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ54.3, 56.2, 72.0, 75.0, 86.0, 103.0, 127.8, 128.1, 128.4, 136.8, 137.8, 153.7.
【００５５】
（６）（-）-シリンガレシノールの製造
化合物８（９０ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）をエタノール／ＴＨＦ（１：１）（９ｍＬ）に溶かした後、温度を６５℃に合わせる。これにラネーニッケル（Raney nickel）（０．１５ｇ）を入れ、６５℃で１時間攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液をアセトンとセライト（celite）を用いてろ過してから、ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して薄い黄色固体の化合物（５０ｍｇ、７８．７％）を収得した。収得した化合物が（８Ｓ、８'Ｓ）-（-）-シリンガレシノールであることは、下記のようなＮＭＲデータおよび［α］Ｄ値が−３８．５°（ｃ ０．１,ＣＨＣｌ３）であることから確認できる。
【００５６】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.09 (m, 2H), 3.90 (s 12H), 3.91 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.51 (s, 2H), 6.58 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 54.3, 56.4, 71.8, 86.1, 102.7, 132.1, 134.3, 147.1.
【００５７】
［実施例］（+）-シリンガレシノールの合成
（+）-シリンガレシノールを合成する段階を示すと、次の反応式のとおりである。
【００５８】
【化４】
2016502539.tif 000006
【００５９】
（１）（Ｒ）−（４−（ベンジルオキシ）−３,５−ジメトキシフェニル）（（Ｒ）−オキシラン−２−イル）メタノール（化合物１０）の製造
比較例の化合物５を製造する方法に比べて、（+）-ＤＩＰＴの代わりに（-）-ＤＩＰＴを用いることを除いては、実質的に同法によって化合物３〜化合物１０を製造した。化合物１０のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【００６０】
[α]D -47.5o (c 1.0, CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.32 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.79 (dd, J= 4.8, 3.9 Hz, 1H), 2.94 (dd, J = 4.8, 2.7 Hz, 1H), 3.22 (q, J = 3.3 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 4.82 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 6.61 (s, 2H), 7.29-7.51 (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ43.73, 54.98, 56.14, 71.11, 74.99, 76.57, 77.00, 77.42, 103.39, 127.78, 128.11, 128.41, 135.20, 136.84, 137.78, 153.69.
【００６１】
（２）２−（４−（（Ｒ）−（（（Ｅ）−３−（４−（ベンジルオキシ）−３,５−ジメトキシフェニル）アリル）オキシ）（（Ｒ）−オキシラン−２−イル）メチル）−２,６−ジメトキシフェノキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（化合物１１）の製造
比較例の化合物７を製造する方法と実質的に同法によって化合物６と化合物１０とを反応させて化合物１１を収得した。化合物１１のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【００６２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ2.82 (m, 2H), 3.19 (dt, J = 2.7, 3.9 Hz, 1H), 3.83 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 4.12 (m, 2H), 4.32 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 6.18 (dt, J = 15.9, 6.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 17.1 Hz, 1H) 6.59 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 7.28-7.52 (m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 45.3, 54.4, 56.1, 56.2, 69.7, 75.0, 75.1, 80.1, 103.7, 104.4, 125.1, 127.8, 128.1, 128.4, 128.5, 132.3, 132.8, 134.0, 137.9, 153.6, 156.7.
【００６３】
（３）化合物１２の製造
比較例の化合物８を製造する方法と実質的に同法によって化合物１１から化合物１２を収得した。化合物１２のＮＭＲデータは下記のとおりである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ3.11 (m, 2H), 3.84 (s, 12H), 3.93 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, 2H), 4.31 (dd, J= 9.3, 7.2 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.99 (s, 4H), 6.57 (s, 4H), 7.28-7.51 (m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ54.3, 56.2, 72.0, 75.0, 86.0, 103.0, 127.8, 128.1, 128.4, 136.8, 137.8, 153.7.
【００６４】
（４）（+）-シリンガレシノールの製造
比較例の（-）-シリンガレシノールを製造する方法と実質的に同法によって化合物１２から（+）-シリンガレシノールを製造した。製造した化合物が（８Ｒ、８'Ｒ）-（+）-シリンガレシノールであることは、下記のようなＮＭＲデータおよび［α]Ｄ値が+４０．９°（ｃ ０．１,ＣＨＣｌ３）であることから確認できる。
【００６５】
[α]D +40.9o (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.10 (m, 2H), 3.90 (s, 12H), 3.90 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.48 (s, 2H), 6.59 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ54.4, 56.4, 71.8, 86.1, 102.7, 132.1, 134.3, 147.1.
【００６６】
［製造例］化合物６の製造
一方、化合物６（臭化シンナミル）は、シリンガアルデヒド（１）の化合物２をＨｏｒｎｅｒ−Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ−Ｅｍｍｏｎｓオレフィン化させて不飽和エステル基を有する化合物（１３）にした後、ＤＩＢＡＬ−Ｈで還元させて不飽和アルコール基を有する化合物（１４）にし、再びＰＢｒ３にてＯＨをＢｒに置換させて製造することができる。具体的な化学反応式は下記を参考する。
【００６７】
【化５】
2016502539.tif 000007
【００６８】
［実験例１］心筋細胞でのＳＩＲＴ １発現促進効果の評価
二種のシリンガレシノールの光学異性体に対し、マウスの心筋細胞でのＳＩＲＴ １遺伝子発現促進効果を評価するために、下記のような実験を行なった。
【００６９】
生後１〜２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの心臓を切除してＨＢＳＳ溶液に浸漬し、はさみで細かくカットして、トリプシン（trypsin）／ＥＤＴＡ液に入れて４℃シェーカ（ｓｈａｋｅｒ）で一晩中放置した。翌日、トリプシン酵素液は捨て、１０％ ＦＣＳ／ＤＭＥＭ液を加えて消化を中断させた後、ＦＣＳ／ＤＭＥＭ液を捨て、コラゲナーゼ溶液を加えて３７℃シェイキングバス（shaking bath）に３分程度放置した後、上澄液だけをコニカルチューブ（conical tube）に集めた。このような過程を３回繰り返し行なって集めた溶液を７５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られたペレットは１０％ ＦＣＳ／ＤＭＥＭ溶液に再懸濁（resuspend）した後、これを培養フラスコ（culture flask）に移し、３７℃で７５分間培養した。
【００７０】
次いで、懸濁液を再び新しい培養フラスコに移し、再び７５分間培養後、懸濁液をコニカルチューブに移してから細胞数を計数した後、プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）を行なった。分注された細胞は１０％ ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地で３〜４日間培養してコンフルエンス（confluence）させた後、血清を除去した培地に実施例で得られた（+）-シリンガレシノール（５０ｍＭ）と比較例で得られた（-）-シリンガレシノール（５０ｍＭ）のそれぞれを２４時間処理した。対照群にはＤＭＳＯを処理した。
【００７１】
各試料を処理した細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、トリゾール試薬（TRIzol agent,Invitrogen）にてそれらからＲＮａを抽出した。前記抽出して定量した１μｇ／μｌのＲＮａと逆転写システム（Promega）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡおよびＳＩＲＴ１とＧＡＰＤＨの各遺伝子に対し、予めデザインされたプライマー（Primer）およびプローブ（probe）（Applied biosystems;SIRT1、Hs01009006_m1;GAPDH、Hs99999905_m1）を利用して各遺伝子の発現様相を測定した。ＰＣＲ反応と分析は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００システム（Corbett Research, Sydney, Australia）を利用した。その結果を図１に示した。
【００７２】
図１は、（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]、（-）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（-）]、およびジンセンベリーから得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（ＧＢ）]をそれぞれ処理した心筋細胞でのＳＩＲＴ １遺伝子の発現変化を示すグラフである。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）は対照群に対して用いた。図１に見られるように、（-）-シリンガレシノールは、ＳＩＲＴ １遺伝子の発現を増大できないと確認され、（+）-シリンガレシノールおよびジンセンベリーから得られたシリンガレシノールだけが心筋細胞でＳＩＲＴ １の発現を濃度依存的に増大させることを確認した。特に、（+）-シリンガレシノールのほうが、ジンセンベリーから得られたシリンガレシノールよりもＳＩＲＴ １の発現の増大に優れていることを確認することができた。
【００７３】
［実験例２］活性酸素による細胞死滅からの心筋細胞の保護効果の評価
実験例１と実質的に同法によって分離、培養した心筋細胞を、血清を除去した培地で２５０ｍＭ濃度の過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）にて２時間処理して活性酸素による細胞死滅を誘導した。２時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄してから５,２０,５０ｍＭ濃度の（+）-シリンガレシノールと（-）-シリンガレシノールを２４時間処理した。各細胞に３−［４,５−ジメチル−２−チアゾリル］−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT、Sigma）溶液を入れ、３７℃で４時間培養し、これにジメチルスルホキシドを入れて溶かした後、ＥＬＩＳＡリーダー（サーモマックス、モレキュラーデバイス社製）を利用して５４０ｎｍの波長で形成されたホルマザンダイの光学的濃度（ＯＤ）を測定した結果、図３を得た。図３は、過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を処理した心筋細胞に（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]または（-）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（-）]を処理し、ＥＬＩＳＡリーダー（サーモマックス、モレキュラーデバイス社製）を利用して５４０ｎｍの波長で形成されたホルマザンダイの光学的濃度（ＯＤ）を測定した結果である。
【００７４】
図２は、過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を処理した心筋細胞に（+）-シリンガレシノール[Ｈ２Ｏ２+ｓｙｎ（+）]または（-）-シリンガレシノール[Ｈ２Ｏ２+ｓｙｎ（-）]を処理して細胞の死滅が抑制された程度を示すグラフである。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）は対照群に対して用いた。
【００７５】
図２および３に見られるように、（+）-シリンガレシノールは濃度依存的に活性酸素によって誘導された心筋細胞の死滅を抑制したのに対し、（-）-シリンガレシノールはかえって細胞死滅を促進することが観察された。したがって、（+）-シリンガレシノールのほうが有効に心筋細胞を保護し、心臓疾患を予防又は改善できることが分かった。
【００７６】
［実験例３］エゾウコギから抽出したシリンガレシノールの光学異性体の比
１．エゾウコギの前処理
エゾウコギを収獲し、その皮をむいてエゾウコギ皮を製造した。
【００７７】
２．エゾウコギ皮からのシリンガレシノールの分離および分析
製造されたエゾウコギ皮５ｇにメタノール３ｍＬを加えてエゾウコギ抽出物１ｍｌ（エゾウコギＭ）を得た。これに対してエチルアセテートを処理して分離した後（エゾウコギＭ-ｅ）、ＨＰＬＣで分析した。前記分離・精製方法を図式化して図４に示し、ＨＰＬＣ結果を図５に示した。
【００７８】
３．エゾウコギから抽出した抽出物でのシリンガレシノールの光学異性体の比分析
試料をメタノールに溶かし、超臨界流体クロマトグラフィー（SFC:Supercritical fluid chromatography）法を用いてキラルカラム（chiral column, Chiralpak IB column）にて分離し、ＵＶ２１０ｎｍで検出した。
【００７９】
図５は、エゾウコギから抽出したシリンガレシノールの光学異性体の比を示す図である。エゾウコギから抽出した光学異性体の比は、（-）-シリンガレシノール：（+）-シリンガレシノール＝１：１であった。
【００８０】
［実験例４］エゾウコギから抽出したシリンガレシノールラセミ体、合成した（+）-シリンガレシノールおよびジンセンベリーから分離したシリンガレシノールラセミ体のＳＩＲＴ １発現促進効果の評価
１．ジンセンベリー（高麗人参の実）の前処理
生ジンセンベリーを収獲し、種子を分離して除去した後、ジンセンベリーの果皮を除去し果肉だけを日光乾燥または熱風乾燥して高麗人参実果肉乾燥物を製造した。
【００８１】
２．ジンセンベリー果肉抽出物からのシリンガレシノールの分離および分析
前記製造したジンセンベリー果肉乾燥物１ｋｇに水又はアルコール３Ｌを加えて室温又は還流抽出し、ろ過した後、４０〜４５℃で減圧濃縮してジンセンベリー果肉抽出物３００ｇを得た。抽出物にエーテルを処理して脂溶性成分を除去した後、ブタノールで粗サポニンを抽出および濃縮した。これを分離・精製してシリンガレシノールを得、その具体的な方法は次のとおりである。
【００８２】
最初に、試料１９４ｇを逆相カラムクロマトグラフィー（reversed-phase（ODS） column chromatography）で精製し、このとき、溶出溶媒として最初は１００％の水を用い、メタノールを１０％ずつ徐々に増加させ、最終的には１００％のメタノール溶媒を用いた。その結果、ＧＢ−１ないしＧＢ−１０分画物を得、これらの分画物のうち、ＳＩＲＴ １発現活性を示した分画ＧＢ−３を選別して濃縮した後、５０％の水溶性メタノール（aqueous methanol）を用いてセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（Sephadex LH-20 column chromatography）を行なった。得た分画物のうち、ＳＩＲＴ １発現活性を示したＧＢ−３−６（3Ｆ）を選別して濃縮した後、クロロホルム：メタノール（１０：１）を展開溶媒にして分取シリカゲル（preparative silica gel）ＴＬＣを行い、その結果、Ｒｆ値０．６７の活性分画を精製した。前記分離・精製方法を図式化して図６に示した。
【００８３】
ＮＭＲ分光分析とデータベース検索を行なって分離・精製した活性化合物をシリンガレシノールと同定することができた。これを再確認するために質量（mass）分析を行い、ＥＳＩ−ｍａｓｓをｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅで測定した結果、［Ｍ+Ｎａ]+がｍ／ｚ ４４０．９で、[２Ｍ+Ｎａ]+がｍ／ｚ ８５８．９で観察され、分子量が４１８であることが分かった。またＮＭＲ分光分析を行なった結果、一般式３で示すような結果を得た。これにより、前記分離・精製した活性化合物はシリンガレシノールであると確認された。
【００８４】
【化６】
2016502539.tif 000008
【００８５】
このようにしてジンセンベリー実果肉からシリンガレシノールを分離した。
【００８６】
３．ジンセンベリー果肉から抽出した抽出物でのシリンガレシノールの光学異性体の比分析
試料をメタノールに溶かし、超臨界流体クロマトグラフィー（SFC:Supercritical fluid chromatography）法を用いてキラルカラム（Chiralpak IB column）にて分離し、ＵＶ２１０ｎｍで検出した。
【００８７】
その結果、図７を得た。図７は、高麗人参実果肉から抽出したシリンガレシノールの光学異性体の比を示す図である。高麗人参実果肉から抽出した光学異性体の比は、（-）-シリンガレシノール：（+）-シリンガレシノール＝１：５であった。
【００８８】
ヒト血管内皮細胞はＬＯＮＺＡ（Walersville, MD, USA）から購入し、血管内皮細胞専用培地（EGM-2, EGM-2 SingleQuots, LONZA）で７０％コンフルエント（confluent）になるまで５％ ＣＯ２培養器で培養した。血管内皮細胞の老化は、自然老化で育たないまで継代培養する方法にて誘導した。集団倍加レベル（Poplulation-doubling level, PDL）は、次式にて細胞成長が止まるまで各世代毎に計算した。ＰＤＬ値は、老化した細胞であればあるほど高くなる。
【００８９】
【数１】
2016502539.tif 000009
【００９０】
ジンセンベリーから得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（ＧＢ）]、合成した（+）-シリンガレシノール[ｓｙｎ（+）]、合成した（+）-シリンガレシノールと合成した（-）-シリンガレシノールが１：１[ｓｙｎ（+/-１：１）]、２：１[ｓｙｎ（+/-２：１）]、５：１[ｓｙｎ（ｓｙｎ（+/-５：１））]、又は１０：１[ｓｙｎ（ｓｙｎ（+/-１０：１））]の比を有する場合、およびエゾウコギから得られたシリンガレシノール[ｓｙｎ（エゾウコギ）]のそれぞれを５０ｍＭ濃度にて１４ ＰＤＬ細胞から二日に１回ずつ処理して４０ ＰＤＬ細胞まで老化を誘導しながら処理した。陰性対照群には培地体積１／１０００のＤＭＳＯを処理した。
【００９１】
各試料を処理した細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、トリゾール試薬（TRIzol agent, Invitrogen）でＲＮａを抽出した。前記抽出して定量した１μｇ／μｌのＲＮａと逆転写システム（Promega）を利用してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡおよびＳＩＲＴ１とＧＡＰＤＨの各遺伝子に対し、予めデザインされたプライマー（Primer）およびプローブ（probe）（Applied biosystems；SIRT1, Hs01009006_m1；GAPDH, Hs99999905_m1）を利用して各遺伝子の発現様相を測定した。ＰＣＲ反応と分析は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００システム（ Corbett Research, Sydney, Australia）を利用した。その結果を図８に示した。
【００９２】
図８に見られるように、（+）-シリンガレシノールを処理した細胞は、ＤＭＳＯだけを処理した細胞に比べて、約４倍以上もＳＩＲＴ１の発現を促進すると確認された。（+）-シリンガレシノールを処理した細胞は、ジンセンベリーから得られたシリンガレシノールを処理した細胞よりもＳＩＲＴ１の発現に優れていると観察された。さらには、（+）-シリンガレシノールを、（-）-シリンガレシノールの重量に比べて２倍以上処理した場合、ＳＩＲＴ１の発現が促進し、（+）-シリンガレシノールの相対的な含有量が多くなるほど、ＳＩＲＴ１の発現が顕著に促進することを確認した。
【００９３】
本発明の一側面に係る組成物の剤形例を以下で説明するか、他の種々の剤形としても応用可能であり、これらは、本発明を限定するためのものではなく、単に本発明を具体的に説明するためのものに過ぎない。
【００９４】
［剤形例１］健康食品
（+）-シリンガレシノール................... １０００ｍｇ
ビタミン混合物
ビタミンＡアセテート....................... ７０μｇ
ビタミンｅ................................. １．０ｍｇ
ビタミンＢ１............................... ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２............................... ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６............................... ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２............................. ０．２μｇ
ビタミンＣ................................. １０ｍｇ
ビオチン................................... １０μｇ
ニコチン酸アミド........................... １．７ｍｇ
葉酸....................................... ５０μｇ
パントテン酸カルシウム..................... ０．５ｍｇ
無機質混合物
硫酸第一鉄................................. １．７５ｍｇ
酸化亜鉛................................... ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム........................... ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム......................... １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム....................... ５５ｍｇ
クエン酸カリウム........................... ９０ｍｇ
炭酸カルシウム............................. １００ｍｇ
塩化マグネシウム........................... ２４．８ｍｇ
【００９５】
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的に健康食品に適合した成分を好適な実施例に従い混合組成したが、その配合比を任意に変形実施してもよい。
【００９６】
［剤形例２］健康飲み物
（+）-シリンガレシノール................... １０００ｍｇ
クエン酸................................... １０００ｍｇ
オリゴ糖................................... １００ｇ
タウリン................................... １ｇ
精製水..................................... 残量
【００９７】
通常の健康飲料の製造方法にて前記成分を混合した後、約１時間にわたって約８５℃で撹拌加熱して得た溶液をろ過し、滅菌して得る。
【００９８】
［剤形例３］錠剤
（+）-シリンガレシノール１００ｍｇ、大豆抽出物５０ｍｇ、葡萄糖１００ｍｇ、紅参抽出物５０ｍｇ、澱粉９６ｍｇ、およびマグネシウムステアレート４ｍｇを混合し、３０％エタノールを４０ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥し、打錠機を利用して打錠して得る。
【００９９】
［剤形例４］顆粒剤
（+）-シリンガレシノール１００ｍｇ、大豆抽出物５０ｍｇ、葡萄糖１００ｍｇ、および澱粉６００ｍｇを混合し、３０％エタノールを１００ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥して顆粒を形成し、それを包みに充填して得る。
【０１００】
［剤形例５］軟膏
下記の表１に表した組成により通常の方法にて軟膏を製造した。
【０１０１】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、心臓疾患の予防又は治療用組成物に係り、具体的には、（+）-シリンガレシノールを含む心臓疾患の予防又は治療用組成物に関する。本発明は、一般式１で示される化合物、具体的に（+）-シリンガレシノールを有効成分として含み、ＳＩＲＴ １発現を増大させて活性酸素によって誘導された心筋細胞の死滅を抑制でき、心臓疾患を予防又は改善するうえで優れた効果を奏することができる。したがって、本発明は、心血管疾患を含む心臓疾患を予防又は改善し、これを治療することができる。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月1日(2015.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
（１）４−（ベンジルオキシ）−３,５−ジメトキシベンズアルデヒド（化合物２）の製造
窒素雰囲気でシリンガアルデヒド（syringaldehyde）（化合物１）（３ｇ、１６．４７ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（６．８３ｇ、４９．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍＬ）に溶かした後、臭化ベンジル（２．９４ｍＬ、２４．７ｍｍｏｌ）を入れ、室温で一晩中攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液を水とエチルアセテートで抽出する。抽出した有機層を水で３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水してからフィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（５：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して白色固体の化合物２（４．４５ｇ、９９．２％）を収得した。化合物２のＮＭＲデータは、下記のとおりである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（２）１−（４−（ベンジルオキシ）−３,５-ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オル（１−（４−（benzyloxy）−３,５−dimethoxyphenyl）prop−２−en−１−ol）（化合物３）の製造
窒素雰囲気で前記収得した化合物２（４．０４ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした後、−７８℃に温度を下げる。臭化ビニルマグネシウム（１７．８ｍＬの１Ｍ ＴＨＦ溶液）を入れ、−７８℃で１０分間攪拌した後、０℃に温度を上げて、再び２時間攪拌する。ＴＬＣで反応終結を確認した後、反応溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチングし（quenching）、エチルアセテートで抽出する。抽出した有機層を水で３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で脱水してからフィルターでろ過する。ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して薄い黄色固体の化合物３（３．９７ｇ、８９．１％）を収得した。化合物３のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
（３）（Ｓ）−（４-（ベンジルオキシ）−３,５-ジメトキシフェニル）（（Ｓ）−オキシラン−２−イル）メタノール（化合物５）の製造
窒素雰囲気でｄｒｉｅｄ ｐｏｗｄｅｒｅｄ ４Åモレキュラーシーブ（molecular sieve）（１０．５ｇ）に無水塩化メチレン（４５ｍＬ）を入れ、−２０℃に温度を下げる。これに（+）-ＤＩＰＴ（diisopropyltryptamine）（１．１８ｍＬ、５．９９ｍｍｏｌ）を入れた後、チタンイソプロポキシド（titanium isopropoxide）（１．４８ｍＬ、４．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり入れて３０分間攪拌する。３０分後、クメンヒドロペルオキシド（cumene hydroperoxide）（１．８５ｍＬ、８０％、５．９９ｍｍｏｌ）を入れて３０分間攪拌する。次いで、無水塩化メチレン（１０ｍＬ）に溶かした化合物３（３ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり一滴ずつ添加（dropwise addition）する。−２０℃で５時間攪拌した後、０℃に温度を上げて一晩中攪拌する。ＴＬＣで反応を確認した後、１０％ＮａＯＨ溶液（３０ｍＬ、ｉｎ飽和ＮａＣｌ溶液）を入れて３時間攪拌した後、フィルターでろ過する。ろ過液を塩化メチレンで抽出し、ブライン（ｂｒｉｎｅ）溶液で洗浄する。無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、フィルターでろ過した後、該ろ過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して化合物４（１．６５ｇ、５５．０％、赤色オイル）および化合物５（１．０６ｇ、３３．５％、赤色オイル）を収得した。化合物５のＮＭＲデータは下記のとおりである。
【国際調査報告】
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