(57)【要約】  本発明は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体（例えば、抗体）の同定のための方法を提供する。一般に、これは、複数の抗原受容体発現細胞と対象となる抗原とを接触させることと、抗原受容体発現細胞の表面上の活性化接着分子のレベルを測定することと、複数の抗原受容体発現細胞から細胞表面上の活性化接着分子の量の増加を示す抗原受容体発現細胞を同定することとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を同定するための方法であって、
（ａ）複数の抗原受容体発現細胞を抗原と接触させることと、
（ｂ）前記抗原の存在下および非存在下で、前記抗原受容体発現細胞の表面上の活性化接着分子の量を測定することと、
（ｃ）前記複数の抗原受容体発現細胞から前記抗原に特異的に結合する抗原受容体発現細胞を同定することと、を含み、前記抗原の存在下における抗原受容体発現細胞の前記表面上の活性化接着分子の、適切な対照と比較した前記量の増加は、前記抗原受容体発現細胞への前記抗原の結合を示唆し、それによって対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を同定する、方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）で同定された前記抗原受容体発現細胞をクローン的に単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）で同定された前記抗原受容体の少なくとも一部の核酸またはアミノ酸配列を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接着分子はインテグリンである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記インテグリンは、白血球機能抗原１（ＬＦＡ−１）または最晩期抗原４（ＶＬＡ−４）分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
活性化接着分子の前記量は、活性化接着分子には結合するが、静止状態にある接着分子には結合しない細胞外基質タンパク質または抗体への抗原受容体発現細胞の結合を測定することによって測定される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞外基質タンパク質は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）またはフィブロネクチン分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外基質タンパク質または前記抗体への前記抗原受容体発現細胞の前記結合は、前記細胞外基質タンパク質または前記抗体でコーティングされたラベルフリーバイオセンサを使用して測定される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオセンサは、比色共鳴反射光バイオセンサである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原受容体は、Ｂ細胞受容体である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｂ細胞受容体は、ヒトＢ細胞受容体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原受容体発現細胞は、Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞は、１種以上のナイーブ動物から単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞は、対象となる抗原で免疫学的に負荷を与えていない１種以上の動物から単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物は、ヒトである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞は、不死化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞は、内在性抗体を発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞は、異種抗体のライブラリーを発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライブラリーは、特有の抗体の天然レパートリーを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライブラリーは、ナイーブ抗体ライブラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ライブラリーは、ヒト抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ライブラリーは、複数の特有の合成抗原受容体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｂ細胞は、特有のキメラ抗原受容体のライブラリーを発現し、各キメラ受容体は、異種結合分子に結合した抗原受容体の一部を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を生成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２３のいずれか一項の方法に従って抗原受容体を同定することと、
（ｂ）前記抗原受容体、またはその抗原結合部分を発現させることと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記抗原受容体は、抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の核酸またはアミノ酸配列を決定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＣＤＲを異種抗体のフレームワークに移植することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１３年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８８４，３４８号の優先権を主張し、参照により、その内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の概要
本発明は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体（例えば、抗体）の同定のための方法を提供する。本発明は、抗原受容体発現細胞（例えば、Ｂ細胞）の表面における抗原の同族抗原受容体への結合が、その細胞の表面上で接着分子（例えば、インテグリン）の活性化をもたらすという発見に少なくとも一部基づいている。これらの活性化接着分子は、（例えば、ラベルフリーアッセイシステムを用いて）容易に検出可能であり、それによって対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を含む抗原受容体発現細胞を同定する役割を果たす。本発明の方法は、対象となる抗原に特異的に結合する抗体発現細胞（およびそこで発現される抗体）の同定に特に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
したがって、一態様において、本発明は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を同定するための方法であって、複数の抗原受容体発現細胞を抗原と接触させることと、抗原の存在下および非存在下で、抗原受容体発現細胞の表面上の活性化接着分子の量を測定することと、複数の抗原受容体発現細胞から抗原に特異的に結合する抗原受容体発現細胞を同定することとを含み、抗原の存在下における抗原受容体発現細胞の表面上の活性化接着分子の量の、適切な対照と比較した増加は、抗原受容体発現細胞への抗原の結合を示唆し、それによって対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を同定する方法を提供する。
【０００４】
特定の実施形態において、本方法は、同定された抗原受容体発現細胞をクローン的に単離することをさらに含む。
他の実施形態において、本方法は、同定された抗原受容体の少なくとも一部の核酸またはアミノ酸配列を決定することをさらに含む。
特定の実施形態において、接着分子はインテグリンである。適切なインテグリンは、限定されないが、白血球機能抗原１（ＬＦＡ−１）または最晩期抗原４（ＶＬＡ−４）分子を含む。
特定の実施形態において、活性化接着分子の量は、活性化接着分子には結合するが、静止状態にある接着分子には結合しない細胞外基質タンパク質または抗体への抗原受容体発現細胞の結合を測定することによって測定される。適切な細胞外基質タンパク質は、限定されないが、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）またはフィブロネクチン分子を含む。
【０００５】
特定の実施形態において、細胞外基質タンパク質または抗体への抗原受容体発現細胞の結合は、細胞外基質タンパク質または抗体でコーティングされたラベルフリーバイオセンサを使用して測定される。具体的な実施形態において、バイオセンサは、比色共鳴反射光バイオセンサである。
特定の実施形態において、抗原受容体は、Ｂ細胞受容体（例えば、ヒトＢ細胞受容体）である。
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞は、Ｂ細胞（例えば、ヒトＢ細胞）またはハイブリドーマ細胞である。具体的な実施形態において、Ｂ細胞は、１種以上のナイーブ動物（例えば、ヒト）から単離される。別の具体的な実施形態において、Ｂ細胞は、対象となる抗原で免疫学的に負荷を与えていない１種以上の動物（例えば、ヒト）から単離される。
【０００６】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞（例えば、Ｂ細胞）は、不死化されている。
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞（例えば、Ｂ細胞）は、内在性抗体を発現する。
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞（例えば、Ｂ細胞）は、異種抗体のライブラリーを発現する。具体的な実施形態において、ライブラリーは、特有の抗体（例えば、ヒト抗体）の天然レパートリーを含む。別の具体的な実施形態において、ライブラリーは、ナイーブ抗体ライブラリーである。別の具体的な実施形態において、ライブラリーは、複数の特有の合成抗原受容体を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞（例えば、Ｂ細胞）は、特有のキメラ抗原受容体のライブラリーを発現し、各キメラ受容体は、異種結合分子に結合した抗原受容体（例えば、抗体）の一部を含む。
別の態様において、本発明は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体（例えば、抗体（例えば、ヒト抗体））を生成するための方法であって、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法に従って抗原受容体を同定することと、抗原受容体またはその抗原結合部分を発現させることとを含む方法を提供する。
特定の実施形態において、本方法は、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の核酸またはアミノ酸配列を決定することをさらに含む。具体的な実施形態において、本方法は、少なくとも１つのＣＤＲを異種抗体のフレームワークに移植することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｂ細胞受容体活性化をインテグリン活性化に関連付ける「インサイドアウト」シグナル伝達経路の略図を示す。
【図２】Ｂ細胞受容体活性化に応答した細胞外基質タンパク質へのＢ細胞の結合を測定するラベルフリーバイオセンサアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体の同定のための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、複数の抗原受容体発現細胞と対象となる抗原とを接触させることと、抗原受容体発現細胞の表面上の活性化接着分子の量を測定することと、複数の抗原受容体発現細胞から細胞表面上の活性化接着分子の増加量を示す抗原受容体発現細胞を同定することとを含む。
【００１０】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「抗原受容体」という用語は、Ｂ細胞受容体の膜結合型抗体成分（すなわち、膜結合型抗体）、またはＴ細胞受容体のαβ鎖もしくはγδ鎖成分を指す。この用語はまた、Ｂ細胞またはＴ細胞受容体の一部が異種結合分子で置換されたキメラ抗原受容体も包含する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するか、または組換えＤＮＡ技術によって作製される、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またその抗原結合断片（例えば、ＶＨおよび／もしくはＶＬ）を指す。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗原受容体によって認識される分子を指す。
本明細書で使用される場合、「接着分子」という用語は、細胞−細胞間または細胞−細胞外基質間の結合を媒介する細胞表面タンパク質を指す。「活性化」接着分子は、同族結合パートナーへの結合を可能にする三次構造コンフォメーションをとった接着分子である。「静止状態にある」接着分子は、同族結合パートナーへの結合を不可能にする三次構造コンフォメーションをとった接着分子である。
本明細書で使用される場合、「適切な対照」という用語は、細胞表面上の活性化接着分子の量の増加を特定するのに有用な任意の試料または基準値を指す。適切な対照は、限定されないが、対象となる抗原の非存在下における細胞を含む。適切な基準値は、限定されないが、対象となる抗原の非存在下において細胞の表面上に見られる活性化接着分子の平均量を含む。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「〜に特異的に結合する」または「特異的に結合する」は、少なくとも約１×１０〜６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、もしくはそれ以上の親和性で抗原に結合する、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で標的に結合する抗原受容体の能力を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫学的に負荷を与えた」という用語は、抗原に対する動物の曝露および免疫応答を指す。
本明細書で使用される場合、「ナイーブ動物」は、対象となる抗原で免疫学的に負荷を与えていない動物を指す。
本明細書で使用される場合、「抗原受容体の天然レパートリー」という用語は、動物の免疫細胞中で自然に発現される発現される抗原受容体のレパートリーを指す。
本明細書で使用される場合、「合成抗原受容体」という用語は、自然には存在しない抗原受容体を指す。
【００１３】
ＩＩ．抗原受容体
本発明の方法は、対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体を同定するのに有用である。抗原に結合したときに細胞表面接着分子の活性化を誘発することができるあらゆる細胞表面抗原受容体が、本発明の方法に用いられ得る。
特定の実施形態において、抗原受容体は、Ｂ細胞受容体の膜結合型抗体成分を含む。細胞の表面に提示されることが可能であり、かつ、抗原に結合したときに細胞表面接着分子の活性化を誘発することができるあらゆる抗体が、本発明の方法に用いられ得る。抗体は、げっ歯類、ウサギ類、トリ、ラクダ類、サメ、または霊長類（例えば、ヒト）を含むがこれらに限定されない、抗体を産生する任意の動物に由来してもよい。抗体は、限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＤを含む任意のアイソタイプであってもよい。抗体は、人工的、天然由来、またはそれらの組み合わせであってもよい。好ましい実施形態において、抗原受容体は、完全ヒト抗体である。
【００１４】
特定の実施形態において、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体のαβまたはβγ鎖を含む。細胞の表面に提示されることが可能であり、かつ、抗原に結合したときに細胞表面接着分子の活性化を誘発することができるあらゆるＴ細胞受容体が、本発明の方法に用いられ得る。Ｔ細胞受容体は、げっ歯類、ウサギ類、トリ、ラクダ類、サメ、または霊長類（例えば、ヒト）を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞を有する任意の動物に由来してもよい。Ｔ細胞受容体は、人工的、天然由来、またはそれらの組み合わせであってもよい。好ましい実施形態において、抗原受容体は、完全ヒトＴ細胞受容体である。
他の実施形態において、抗原受容体は、異種結合分子に（化学的にまたは遺伝的に）結合した抗原受容体（Ｂ細胞および／またはＴ細胞受容体）の少なくとも一部を含むキメラ分子である。適切な異種結合分子は、限定されないが、抗体断片または誘導体、および代替の結合足場分子を含む。
【００１５】
好適な抗体断片または誘導体は、限定されないが、単一ドメイン抗体（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４（１９８９）を参照のこと）、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照のこと）、ユニボディ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７／０５９７８２号を参照のこと）、重鎖のみ抗体、およびナノボディ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５９，８０８号を参照のこと）を含む。
【００１６】
適切な代替の結合足場分子は、限定されないが、フィブロネクチンドメイン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５−１０９を参照のこと）、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３（１５−１６）：６９５−７０１を参照のこと）、プロテインＡのＺドメイン（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＮｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６６８−７６を参照のこと）、リポカリン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６７７−８３を参照のこと）、アフィリン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２−８５を参照のこと）、アフィチン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８−６８を参照のこと）、アビマー（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６−６１を参照のこと）、フィノマー（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（５）：３１９６−３２０４を参照のこと）、およびＫｕｎｉｔｚドメインペプチド（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＮｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ  ９（２）：２６１−８を参照のこと）を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、複数の特有の抗原受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）をコードする核酸ライブラリーを用いる。ライブラリーは、抗原受容体の天然レパートリー（例えば、通常、１種以上の脊椎動物に発現される抗原受容体の一部）および／または複数の合成抗原受容体（すなわち、通常、脊椎動物には発現されない抗原受容体）を含むことができる。好ましい実施形態において、ライブラリーは、１人以上のヒト対象のＢ細胞から単離された完全ヒト抗原受容体のレパートリーを含む。抗原受容体ライブラリーを作製するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２９１，１５９号に記載の方法を参照のこと）。
【００１８】
ＩＩＩ．抗原受容体発現細胞
細胞表面抗原受容体を発現するいずれの細胞も本発明の方法に使用するのに適しているが、但し、同族抗原への細胞表面抗原受容体の結合が、その細胞の表面で接着分子の活性化をもたらすものとする。本発明で使用するのに適した細胞は、限定されないが、正常な初代細胞（例えば、単離されたＢ細胞）、腫瘍細胞（例えば、リンパ腫細胞）、ハイブリドーマ、または不死化初代細胞を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞は、限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類、ウサギ類、ニワトリ、およびラクダ類の細胞を含む脊椎動物細胞である。脊椎動物細胞は、いずれの脊椎動物の器官に由来してもよいが、好ましくは白血球（例えば、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、単核球、マクロファージ、および樹状細胞）に由来する。具体的な実施形態において、脊椎動物細胞は、Ｂ細胞系列のリンパ球である。これらの細胞は、Ｂ細胞受容体の抗体成分の細胞表面発現を媒介する抗体特異的シャペロンタンパク質およびアクセサリー分子を発現するため、これらはＢ細胞受容体の発現に特に適している。Ｂ細胞は、ナイーブ動物（すなわち、対象となる抗原を負荷されていない動物）から、または以前に対象となる抗原を負荷された動物から単離されてもよい。好ましい実施形態において、Ｂ細胞は、以前に対象となる抗原を負荷されたヒトから単離される。この方法は、完全ヒト抗原特異的抗体の同定を可能にするため、特に有用である。
【００２０】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞は、白血球（例えば、Ｂ細胞）とミエローマ細胞との縮合によって形成されるハイブリドーマ細胞である。ハイブリドーマ細胞を生成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ヒトＢ細胞をヘテロミエローマ細胞と縮合することによるヒトハイブリドーマ細胞の生成について記載する国際公開第ＷＯ９０／１３６６０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞は、不死化された初代細胞である。限定されないが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０４／７６６７７号を参照のこと）、またはｂｃｌ−６および／もしくはｂｃｌ−ｘｌ等のアポトーシスを阻害する遺伝子の異種発現（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれるＫｗａｋｋｅｎｂｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６（１）１２３−１２９を参照のこと）を含むあらゆる細胞不死化方法が本発明の方法に用いられ得る。そのような不死化は、ナイーブＢ細胞の場合のように、抗原結合に応答して細胞がアポトーシスを受ける状況において特に有用である。
【００２１】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞は、内在性抗原受容体（すなわち、通常、その細胞によって発現される抗原受容体）を発現する。他の実施形態において、細胞は、１種以上の異種抗原受容体（複数可）（すなわち、通常、その細胞によって発現されない抗原受容体）を発現する。そのような異種発現を達成するための方法は、当該技術分野において日常的である（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２４８，（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｅｄ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４（ＩＳＢＮ：１−５８８２９−０９２−１を参照のこと）。
【００２２】
細胞表面抗原受容体への抗原結合に応答して接着分子活性化を誘発するために必要な全ての細胞成分（例えば、細胞内シグナル伝達分子、抗原受容体の成分、および接着分子）を自然には発現しない抗原受容体発現細胞もまた、本発明の方法に使用することができる。そのような場合、抗原によって媒介される接着分子の活性化を促進するために、細胞内に不足しているタンパク質を異種的に発現させることが必要である。特定の一実施形態において、抗原受容体発現細胞は、抗原受容体の成分を異種的に発現する。例示的な抗原受容体成分として、限定されないが、Ｂ細胞受容体のＩｇαおよび／またはＩｇβ成分が挙げられる。
【００２３】
特定の実施形態において、抗原受容体発現細胞の集団が用いられ、その集団は、抗原受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の多様なライブラリーを発現する。抗原受容体発現細胞の集団は、脊椎動物から単離することができる。代替として、抗原受容体発現細胞の集団は、異種抗原受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の多様なライブラリーをコードする核酸を（例えば、発現ベクターの形態で）導入することによってインビトロで作製されてもよい。多様なライブラリーは、抗原受容体の天然レパートリー（例えば、通常、１種以上の脊椎動物に発現される抗原受容体の一部）および／または複数の特有の合成抗原受容体（すなわち、通常、脊椎動物には発現されない抗原受容体）を含むことができる。好ましい実施形態において、抗原受容体発現細胞の集団は、完全ヒト抗原受容体の多様なライブラリーを発現する。抗原受容体ライブラリーの作製方法は、当該技術分野で周知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２９１，１５９号に記載の方法を参照のこと）。
【００２４】
ＩＶ．抗原および抗原提示
限定されないが、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および小分子抗原を含むあらゆる抗原が、本発明の方法に使用するのに適している。しかしながら、当業者は、抗原を抗原受容体発現細胞に提示する方法は、発現される抗原受容体の種類に依存して異なることを認識するであろう。
Ｂ細胞受容体を発現する細胞の場合、抗原を抗原受容体発現細胞と直接接触させることができる。抗原は、抗原受容体発現細胞を含有する細胞培養培地または緩衝液に可溶型として加えることができる。付加的にまたは代替的に、抗原は、抗原受容体発現細胞が配置される基質（例えば、光バイオセンサ）に付着させてもよい。
【００２５】
Ｔ細胞受容体（αβおよび／またはβγ）を発現する細胞の場合、ＭＨＣ分子と複合した短いペプチドの形態で抗原を細胞に提示することが必要であるかもしれない。単離されたＭＨＣ／ペプチド複合体は、抗原受容体発現細胞を含有する細胞培養培地に可溶型として加えることができる。付加的にまたは代替的に、単離されたＭＨＣ／ペプチド複合体は、抗原受容体発現細胞が配置される基質（例えば、光バイオセンサ）に付着させてもよい。付加的にまたは代替的に、抗原は、細胞（例えば、樹状細胞）の表面上のＭＨＣ／ペプチド複合体としてＴ細胞受容体発現細胞に提示することもできる。ペプチド抗原をＴ細胞受容体発現細胞に提示する方法は、当該技術分野で周知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ１９９２００７９５２号を参照のこと）。
【００２６】
Ｖ．接着分子
抗原が細胞表面抗原受容体に結合すると活性化されるあらゆる細胞表面発現接着分子が、本発明の方法における測定に適している。適切な接着分子は、限定されないが、インテグリン、カドへリン、およびセレクチンを含む。
インテグリンの活性化は、特に本発明の方法における測定に適している。刺激を与えていない免疫細胞の表面上のインテグリン分子は、不活性コンフォメーションで存在し、細胞外基質タンパク質に結合しない。免疫細胞上における抗原受容体への抗原の結合は、細胞表面インテグリンの活性化を引き起こし、それらが細胞外基質タンパク質に結合することができる（インテグリンの活性化に関する考察については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１２１（１４）；２２７９−２２８６を参照のこと）。例示的なインテグリンは、白血球機能抗原１（ＬＦＡ−１）および最晩期抗原４（ＶＬＡ−４）を含む。例示的なＬＦＡ−１分子は、ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１６７４６６２１７およびＧＩ：１８８５９５６７７に記載される２つのサブユニットを含むヒトＬＦＡ−１、ならびにｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１９８７８６およびＧＩ：１１１６０７４４７に記載される２つのサブユニットを含むマウスＬＦＡ−１を含む。例示的なＶＬＡ−４分子は、ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１１９６３１３９２およびＧＩ：１９７４３８１９に記載される２つのサブユニットを含むヒトＶＬＡ−４、ならびにｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１１４３２６５５４およびＧＩ：４５５０４３９４に記載される２つのサブユニットを含むマウスＶＬＡ−４を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、測定される接着分子は、内在性接着分子（すなわち、通常、アッセイされる抗原受容体発現細胞内で発現される分子）である。他の実施形態において、測定される接着分子またはその成分は、アッセイされる抗原受容体発現細胞内で異種的に発現される。
【００２８】
ＶＩ．接着分子活性化の測定
細胞表面抗原受容体に抗原が結合したときの細胞表面接着分子の活性化を測定するためのあらゆる方法が、本発明の方法に使用するのに適している。一般に、細胞表面接着分子の活性化は、１種以上の細胞外基質タンパク質への抗原受容体発現細胞の結合を測定することによって検出される。付加的にまたは代替的に、活性化された細胞表面接着分子は、活性化状態では接着分子に結合するが、不活性化状態では結合しない抗体を用いて検出することができる。
特定の実施形態において、細胞表面接着分子の活性化は、ラベルフリー結合アッセイを用いて検出される。そのようなアッセイは、一般に、細胞外基質タンパク質をバイオセンサ上に固定化することと、抗原の存在下および非存在下において、バイオセンサへの抗原受容体発現細胞の結合を測定することとを含む。抗原の存在下におけるバイオセンサへの抗原受容体発現細胞の結合の増加は、抗原受容体発現細胞が抗原に結合することを示唆する。
【００２９】
好ましい実施形態において、細胞表面接着分子の活性化は、比色共鳴反射光バイオセンサを使用して検出される。適切な比色共鳴反射光バイオセンサおよびその使用方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００４／００９１３９７号、同第２０１００１９６９２５号、同第２０１００２２１８４７号、同第２０１００２０２９２３号、同第２００７０１７２８９４号、同第２０１００２９１５７５号に開示されている。
抗原−活性化接着分子に結合するあらゆる細胞外基質タンパク質が、ラベルフリー結合アッセイに使用され得る。好適な細胞外基質タンパク質は、限定されないが、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）およびフィブロネクチンを含む。例示的なＩＣＡＭ−１分子は、ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：８２５６８２に記載されるヒトＩＣＡＭ−１およびｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１２４０９９に記載されるマウスＩＣＡＭ−１を含む。例示的なフィブロネクチン分子は、ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：３００６６９７１０に記載されるヒトフィブロネクチンおよびｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１１８１２４２に記載されるマウスフィブロネクチンを含む。
【００３０】
ラベルフリー結合アッセイにおいて、１種以上の細胞外基質タンパク質（複数可）が、バイオセンサの表面に適用される。細胞外基質タンパク質は、バイオセンサの表面に均一に適用されてもよいか、または異なる場所に並べられてもよい。細胞外基質タンパク質は、単独で、または対象となる抗原と一緒に、バイオセンサに適用されてもよい。
特定の実施形態において、細胞表面接着分子の活性化は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して検出される。そのようなアッセイは、一般に、抗原受容体発現細胞を抗体に接触させること（抗体は、活性化状態では細胞表面接着分子に結合するが、不活性化状態では結合しない）と、ＦＡＣＳを用いて抗原の存在下および非存在下において抗原受容体発現細胞への抗体の結合を検出することとを含む。抗原の存在下における抗原受容体発現細胞への抗体の結合は、抗原受容体発現細胞が抗原に結合することを示唆する。
【００３１】
ＶＩＩ．抗原特異的抗原受容体の単離
対象となる抗原に結合する抗原受容体発現細胞（すなわち、抗原結合細胞）が同定されると、その細胞によって発現される抗原受容体のアミノ酸配列が同定される。当該技術分野において承認されている抗原受容体のアミノ酸配列を同定するためのあらゆる手段が、本発明の方法に用いられ得る。一般に、抗原結合細胞は、クローン的に単離され、発現される抗原受容体をコードする核酸が単離されて配列決定される。
特定の実施形態において、抗原結合細胞は、細胞採取デバイスを使用して細胞の集団からクローン的に単離される。適切な細胞採取デバイスは、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００３０１７９９１６号に記載されるものを含む。
【００３２】
他の実施形態において、抗原結合細胞は、マルチウェルプレートへの限界希釈によって細胞の集団から単離することができる。
他の実施形態において、抗原結合細胞は、ＦＡＣＳ機、および抗原結合細胞に特異的に結合する識別可能な標識を使用して細胞の集団から単離される。いくつかの実施形態において、識別可能な標識は、抗原結合細胞上で活性化された細胞表面接着分子に特異的に結合する蛍光標識された抗体である。他の実施形態において、識別可能な標識は、蛍光標識された対象となる抗原である。
【００３３】
付加的にまたは代替的に、抗原結合細胞は、細胞外基質タンパク質および／または対象となる抗原を含む基質に結合するそれらの能力に基づいて、非抗原結合細胞から単離することができる。
発現される抗原受容体をコードする核酸は、限定されないが、抗原受容体遺伝子の保存領域に特異的な核酸プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む当該技術分野で承認されている手段を用いて、抗原結合細胞から単離することができる。発現される抗原受容体をコードする単離された核酸は、次いで、当該技術分野で承認されている方法を用いて配列決定することができる（コードされたアミノ酸配列が推定される）。
対象となる抗原に特異的に結合する抗原受容体をコードする核酸が単離されると、インビトロで（例えば、細胞中で、または無細胞発現系で）またはインビボで（例えば、トランスジェニック動物において）それを異種的に発現させることができる。
【実施例】
【００３４】
ＶＩＩＩ．実施例
本発明は、さらなる制限であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。
【００３５】
実施例１
この実施例は、ＢＩＮＤ（商標）スキャナを用いて、比色共鳴反射光バイオセンサを使用してＢ細胞表面上のインテグリンＬＦＡ−１のＢ細胞受容体による活性化を検出できることを実証する。９６ウェルＢＩＮＤ（商標）ＴｉＯ２バイオセンサのプレートを、室温で１時間、１μｇ／ｍｌの濃度の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）タンパク質でコーティングした。バイオセンサはまた、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。次いで、ＩＣＡＭ−１でコーティングしたＢＩＮＤバイオセンサにＢ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣのＲＬ株）を４０，０００細胞／ウェルで播種し、完全増殖培地で増殖させた。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体Ｆ（ａｂ）２断片をニュートラアビジンとともに室温で３０分〜１時間インキュベートし、Ｆ（ａｂ）２断片を多量体化した。多量体化されたＩｇＭ抗体断片を、次いでＢ細胞リンパ腫細胞培養に加えて細胞表面Ｂ細胞受容体を架橋した。ＢＩＮＤ（商標）スキャナを用いて、室温で１５時間３．７５μｍの分解能でバイオセンサを走査することにより、バイオセンサへの細胞の結合を評価した（１０分毎に試料採取）。図２に記載されるデータは、Ｂ細胞受容体の架橋がバイオセンサへのＢ細胞の結合の増加をもたらし、ひいては、Ｂ細胞受容体の活性化が細胞表面上でＬＦＡ−１の検出可能活性化をもたらしたことを示している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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