(57)【要約】  グリコシルヒドロラーゼ酵素変異体、具体的には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の特定のオキシドレダクターゼの変異体が開示される。グリコシルヒドロリアーゼ変異体をコードする核酸、グリコシルヒドロラーゼ変異体を含む組成物、該変異体を産生する方法、及び該変異体の使用方法についても記載される。
2016533739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ（ａ）発現、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイの性能、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイの性能から選択される少なくとも１つにおいて、前記親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質を有し、前記変異体は、配列番号３のアミノ酸１１１〜１１４及び１４４〜１６３に対応する１つ又は２つ以上の位置にて、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、変異体。
【請求項２】
前記変異体は、向上した熱安定性及び／又はＴｍを有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｆ、Ｌ１４８Ｐ、Ａ１４９Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｖ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｑ、Ｎ１５２Ｓ、Ｎ１５２Ｙ、Ｌ１５５Ｍ、Ｒ１５６Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ｅ１５８Ｗ、Ｅ１５８Ｙ、Ｉ１５９Ｑ、Ｉ１６０Ｄ、Ｉ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｅ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１６２Ｆ、Ｈ１６３Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体は、ｗｈＰＣＳ加水分解アッセイにて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｋ、Ｉ１４４Ｒ、Ｉ１４４Ｓ、Ｐ１４５Ｇ、Ｐ１４５Ｈ、Ｐ１４５Ｉ、Ｐ１４５Ｋ、Ｐ１４５Ｒ、Ｐ１４５Ｓ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ１４６Ａ、Ｄ１４６Ｃ、Ｄ１４６Ｅ、Ｄ１４６Ｆ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｍ、Ｄ１４６Ｑ、Ｄ１４６Ｔ、Ｄ１４６Ｙ、Ｎ１４７Ｆ、Ｎ１４７Ｍ、Ｌ１４８Ｋ、Ｌ１４８Ｖ、Ａ１４９Ｃ、Ａ１４９Ｄ、Ａ１４９Ｆ、Ａ１４９Ｇ、Ａ１４９Ｉ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｖ、Ｐ１５０Ａ、Ｐ１５０Ｃ、Ｐ１５０Ｄ、Ｐ１５０Ｅ、Ｐ１５０Ｆ、Ｐ１５０Ｇ、Ｐ１５０Ｈ、Ｐ１５０Ｉ、Ｐ１５０Ｋ、Ｐ１５０Ｌ、Ｐ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｆ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｉ、Ｇ１５１Ｋ、Ｇ１５１Ｍ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｖ、Ｇ１５１Ｗ、Ｇ１５１Ｙ、Ｎ１５２Ｅ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｈ、Ｎ１５２Ｋ、Ｎ１５２Ｐ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｐ、Ｙ１５３Ｑ、Ｙ１５３Ｒ、Ｙ１５３Ｓ、Ｙ１５３Ｖ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｃ、Ｖ１５４Ｄ、Ｖ１５４Ｅ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｈ、Ｖ１５４Ｋ、Ｖ１５４Ｎ、Ｖ１５４Ｐ、Ｖ１５４Ｑ、Ｖ１５４Ｒ、Ｖ１５４Ｔ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｎ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｆ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｌ、Ｒ１５６Ｍ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ｑ、Ｈ１５７Ｄ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｃ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｈ、Ｅ１５８Ｉ、Ｅ１５８Ｌ、Ｅ１５８Ｍ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｐ、Ｅ１５８Ｓ、Ｅ１５８Ｔ、Ｅ１５８Ｗ、Ａ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｎ、Ｈ１６３Ａ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｅ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｇ、Ｈ１６３Ｉ、Ｈ１６３Ｋ、Ｈ１６３Ｍ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｔ、Ｈ１６３Ｖ、Ｈ１６３Ｗ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体は、ｄａＣＳ加水分解アッセイにおいて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｆ１１２Ｖ、Ｋ１１３Ｌ、Ｋ１１３Ｍ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１１３Ｒ、Ｋ１１３Ｓ、Ｉ１１４Ｆ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１４４Ｆ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１４５Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｖ１５４Ｔ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１、２、又は３に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体は、Ｆ１１２Ｍ、Ｆ１１２Ｗ、Ｋ１１３Ｐ、Ｋ１１３Ｔ、Ｉ１１４Ｌ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１４４Ａ、Ｉ１４４Ｃ、Ｉ１４４Ｄ、Ｉ１４４Ｅ、Ｉ１４４Ｈ、Ｉ１４４Ｎ、Ｉ１４４Ｐ、Ｉ１４４Ｑ、Ｉ１４４Ｔ、Ｉ１４４Ｗ、Ｉ１４４Ｙ、Ｐ１４５Ｃ、Ｐ１４５Ｄ、Ｐ１４５Ｅ、Ｐ１４５Ｆ、Ｐ１４５Ｌ、Ｐ１４５Ｍ、Ｐ１４５Ｎ、Ｐ１４５Ｑ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４５Ｗ、Ｐ１４５Ｙ、Ｄ１４６Ｇ、Ｄ１４６Ｈ、Ｄ１４６Ｉ、Ｄ１４６Ｌ、Ｄ１４６Ｎ、Ｄ１４６Ｐ、Ｄ１４６Ｒ、Ｄ１４６Ｓ、Ｄ１４６Ｖ、Ｄ１４６Ｗ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｃ、Ｎ１４７Ｄ、Ｎ１４７Ｅ、Ｎ１４７Ｇ、Ｎ１４７Ｈ、Ｎ１４７Ｉ、Ｎ１４７Ｋ、Ｎ１４７Ｌ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｑ、Ｎ１４７Ｒ、Ｎ１４７Ｓ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｖ、Ｎ１４７Ｗ、Ｎ１４７Ｙ、Ｌ１４８Ａ、Ｌ１４８Ｃ、Ｌ１４８Ｄ、Ｌ１４８Ｅ、Ｌ１４８Ｆ、Ｌ１４８Ｇ、Ｌ１４８Ｈ、Ｌ１４８Ｉ、Ｌ１４８Ｍ、Ｌ１４８Ｎ、Ｌ１４８Ｑ、Ｌ１４８Ｒ、Ｌ１４８Ｓ、Ｌ１４８Ｔ、Ｌ１４８Ｗ、Ｌ１４８Ｙ、Ａ１４９Ｅ、Ａ１４９Ｈ、Ａ１４９Ｋ、Ａ１４９Ｌ、Ａ１４９Ｍ、Ａ１４９Ｑ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｓ、Ａ１４９Ｔ、Ａ１４９Ｗ、Ａ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｍ、Ｐ１５０Ｎ、Ｐ１５０Ｒ、Ｐ１５０Ｓ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５０Ｖ、Ｐ１５０Ｗ、Ｐ１５０Ｙ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５１Ｃ、Ｇ１５１Ｄ、Ｇ１５１Ｌ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｒ、Ｇ１５１Ｔ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｃ、Ｎ１５２Ｄ、Ｎ１５２Ｉ、Ｎ１５２Ｌ、Ｎ１５２Ｍ、Ｎ１５２Ｒ、Ｎ１５２Ｔ、Ｎ１５２Ｖ、Ｎ１５２Ｗ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｃ、Ｙ１５３Ｄ、Ｙ１５３Ｅ、Ｙ１５３Ｇ、Ｙ１５３Ｈ、Ｙ１５３Ｉ、Ｙ１５３Ｎ、Ｙ１５３Ｔ、Ｙ１５３Ｗ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｉ、Ｖ１５４Ｌ、Ｖ１５４Ｍ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ｗ、Ｖ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｎ、Ｒ１５６Ｔ、Ｒ１５６Ｖ、Ｒ１５６Ｗ、Ｒ１５６Ｙ、Ｈ１５７Ａ、Ｈ１５７Ｃ、Ｈ１５７Ｅ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｇ、Ｈ１５７Ｉ、Ｈ１５７Ｋ、Ｈ１５７Ｌ、Ｈ１５７Ｍ、Ｈ１５７Ｎ、Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１５７Ｑ、Ｈ１５７Ｒ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｖ、Ｈ１５７Ｙ、Ｅ１５８Ｇ、Ｅ１５８Ｋ、Ｅ１５８Ｒ、Ｅ１５８Ｖ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｃ、Ｉ１５９Ｄ、Ｉ１５９Ｅ、Ｉ１５９Ｆ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１５９Ｈ、Ｉ１５９Ｋ、Ｉ１５９Ｌ、Ｉ１５９Ｍ、Ｉ１５９Ｎ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ｓ、Ｉ１５９Ｔ、Ｉ１５９Ｖ、Ｉ１５９Ｗ、Ｉ１５９Ｙ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｃ、Ｉ１６０Ｅ、Ｉ１６０Ｇ、Ｉ１６０Ｈ、Ｉ１６０Ｋ、Ｉ１６０Ｌ、Ｉ１６０Ｍ、Ｉ１６０Ｎ、Ｉ１６０Ｐ、Ｉ１６０Ｑ、Ｉ１６０Ｒ、Ｉ１６０Ｓ、Ｉ１６０Ｔ、Ｉ１６０Ｖ、Ｉ１６０Ｗ、Ｉ１６０Ｙ、Ａ１６１Ｄ、Ａ１６１Ｆ、Ａ１６１Ｇ、Ａ１６１Ｈ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｋ、Ａ１６１Ｍ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｐ、Ａ１６１Ｑ、Ａ１６１Ｒ、Ａ１６１Ｓ、Ａ１６１Ｔ、Ａ１６１Ｖ、Ａ１６１Ｗ、Ｌ１６２Ｃ、Ｌ１６２Ｄ、Ｌ１６２Ｅ、Ｌ１６２Ｇ、Ｌ１６２Ｈ、Ｌ１６２Ｋ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６２Ｐ、Ｌ１６２Ｑ、Ｌ１６２Ｒ、Ｌ１６２Ｓ、Ｌ１６２Ｔ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６２Ｗ、Ｌ１６２Ｙ、Ｈ１６３Ｑ、Ｈ１６３Ｓ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の第２のアミノ酸置換を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体は、１〜１０個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体は、組み合わせ変異体である、請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
前記親ＧＨ６１ポリペプチドは、真菌グリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記真菌ＧＨ６１Ａは、ヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ  ｓｐ．）、及びシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）に由来する、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の親ＧＨ６１ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１４】
前記ベクターは、発現ベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、又は請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、真菌細胞又は細菌細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記真菌細胞は、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される糸状菌細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞は、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、又は前記発現ベクターによりコードされた親ＧＨ６１ポリペプチドの前記変異体を発現する、請求項１５、１６、又は１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ＧＨ６１ポリペプチドの変異体を産生する方法であって、前記変異体を産生するのに好適な条件下において、好適な培地にて、請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２０】
前記産生した変異体を単離することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＧＨ６１変異体を含む、組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、洗剤、飼料、飼料添加物、及び細胞培養上清からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物において、前記ＧＨ６１変異体が富化されている、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項２４】
セルロース基質を加水分解する方法であって、前記基質を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／８５９，６３０号、第６１／８５９，６６６号、第６１／８５９，６８０号、第６１／８５９，７０４号、第６１／８５９，７１２号、第６１／８５９，７２１号、及び第６１／８５９，７３５号（全て２０１３年７月２９日に出願）に基づく、優先権の利益を主張し、これら全ての開示内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、概して、グリコシルヒドロラーゼ酵素変異体、具体的には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の特定のオキシドレダクターゼの変異体に関する。グリコシルヒドロリアーゼ（hydrolyase）変異体をコードする核酸、グリコシルヒドロラーゼ変異体を含む組成物、該変異体を産生する方法、及び該変異体の使用方法についても記載される。
【０００３】
（政府の権利）
本発明は、エネルギー省により認められた条件付き契約番号Ｄｅ−Ｆｃ３６−０８ｇｏ１８０７８に基づき、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成により生産される、最も豊富な植物材料である。これらは、このような高分子基質を加水分解により単糖類にすることが可能な細胞外酵素を産生する、細菌、酵母菌及び真菌等の多数の微生物により分解され、エネルギー源として使用され得る（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。再生不可能な資源でのアプローチには限りがあるため、セルロースが主要な再生可能エネルギー源となる可能性は非常に大きい（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。生物学的プロセスを通してのセルロースの有効活用は、食料、飼料、及び燃料不足を克服するアプローチの１つである（Ｏｈｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０００５】
セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ  Ｄ−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成をもたらす酵素である。セルラーゼは従来、３つの主な種類に分けられてきた：エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｓｈｕｌｅｉｎ，１９８８）。エンドグルカナーゼは主に、セルロース繊維の非晶質部分に作用する一方で、セロビオヒドロラーゼは結晶性セルロースを分解することもできる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｔｔｉｌａ，１９９５）。β−グルコシダーゼは、セロビオース、セロオリゴ糖、及び他のグルコシドからＤ−グルコース単位を遊離するように作用する（Ｆｒｅｅｒ，１９９３）。
【０００６】
セルラーゼは多数の細菌、酵母菌及び真菌により産生されることが知られている。ある種の真菌は、結晶形態のセルロースが分解でき、発酵によりセルラーゼが速やかに多量に産生される、完全なセルラーゼ系を作り出す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の多くの酵母菌は、セルロースの加水分解能を欠いているため、糸状菌は特別な役割を果たす（例えばＡｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、及びＣｏｕｇｈｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【０００７】
ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧからなる真菌性セルラーゼの分類は更に、各分類内に複数の要素を含むように拡張することができる。例えば、２つのＣＢＨ、例えばＣＢＨ  Ｉ（Ｃｅｌ７Ａ又はグリコシルヒドロラーゼファミリー（ＧＨ）７Ａとしても知られている）及びＣＢＨ  ＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ又はＧＨ６Ａとしても知られている）、複数のＥＧ、例えばＥＧ  Ｉ（Ｃｅｌ７Ｂ又はＧＨ７Ｂとしても知られている）、ＥＧ  ＩＩ（Ｃｅｌ５Ａ又はＧＨ５Ａとしても知られている）、ＥＧ  ＩＩＩ（Ｃｅｌ１２Ａ又はＧＨ１２Ａとしても知られている）、ＥＧＶ（Ｃｅｌ４５Ａ又はＧＨ４５Ａとしても知られている）、ＥＧＶＩ（Ｃｅｌ７４Ａ又はＧＨ７４Ａとしても知られている）、ＥＧＶＩＩ（Ｃｅｌ６１Ｂ又はＧＨ６１ｂとしても知られている）及びＥＧＶＩＩＩ、並びに一連のＢＧ、例えばＢＧ１、ＢＧ３、及びＢＧ５に対する既知の遺伝子を含有するトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を含む種々の真菌源より、複数のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧが単離されている。
【０００８】
結晶性セルロースをグルコースに効率的に転換するためには、単独の成分としては結晶性セルロースの加水分解にさほど効果的でない、ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの各分類の成分又は酵素活性を含む、完全なセルラーゼ系が通常必要とされる（Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。異なる分類からのセルラーゼ成分間で相乗関係が観察されている。特に、ＥＧ型セルラーゼ及びＣＢＨ型セルラーゼは、相乗的に相互作用し、一層効率的にセルロースを分解する（例えばＷｏｏｄ，１９８５を参照）。
【０００９】
当技術分野においては、セルラーゼは洗剤組成物の洗浄能力を向上させる目的のため、柔軟剤としての使用のため、綿織物の感触及び外見の向上のため等、生地の処理に有用であることが知られている（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１０】
向上した洗浄性能を有するセルラーゼ含有洗剤組成物（米国特許第４，４３５，３０７号；英国出願第２，０９５，２７５号及び第２，０９４，８２６号）、並びに、生地の感触及び外見を向上させるための布地の処理における使用（米国特許第５，６４８，２６３号、第５，６９１，１７８号、及び第５，７７６，７５７号；英国出願第１，３５８，５９９号；Ｔｈｅ  Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ  Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．５４〜６１，１９８６）について文献がある。
【００１１】
当技術分野においては更に、セルラーゼはセルロース原材料をエタノールに転換するのに有用であることが知られている。本プロセスは、使われなければ廃棄される多量の原材料（例えば、原材料の燃焼又は埋立）を速やかに利用することができることを含む、多数の利点を有する。主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンからなる他の材料、例えば木材、草本作物及び農業又は都市廃棄物について、エタノール製造の原材料として使用することが検討されてきた。近年、酵素によるセルロース材料の加水分解を向上させるか又は増強する（augment）補助効果を更に付与する新たなグリコシルヒドロラーゼの種類が確認されているが、これら多くの新たな補助的酵素の作用機序は、完全に明らかにはなっていない。ＧＨ６１ファミリーとして早くからアノテーションされていた、かかるグリコシルヒドロラーゼファミリーの１つ（例えばＨａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ６１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ，Ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  Ｆａｍｉｌｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．３３０５〜３３１６を参照）、は繰り返しアノテーションされており、最も近年では、いくつかのファミリーメンバーが溶解性多糖類モノオキシゲナーゼであることが発見された後に、補助活性（ＡＡ）ファミリー９にアノテーションされている（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，「Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＺｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｒｅｄｏｘ  ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ２０１３，ｖｏｌ  ６，ｉｓｓｕｅ  １，ｐｐ．４１）。少なくとも２種類のＧＨ６１酵素がＴ．レーシに存在する（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  Ｍ．，「ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７  ｖｏｌ．２４９，ｉｓｓｕｅ  ２：ｐｐ．５８４〜９１、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌ６１Ａ（ＥＧ  ＩＶ）ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．６４９８〜６５０７、Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６１  ｍｅｍｂｅｒ，Ｃｅｌ６１Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ，ａｔ  １．６  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８，ｖｏｌ．３８３  ｉｓｓｕｅ  １：ｐｐ  １４４〜１５４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍａｓｓ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｓｙｎ．Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．５５３〜５６０）。直近では、最大更に４種類の、これらのグリコシルヒドロラーゼがトリコデルマ・レーシのゲノム内で同定されたことが報告された（Ｈａｋｋｉｎｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，「Ｒｅ−ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＺｙ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」２０１２，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．Ｖｏｌ  ４，ｉｓｓｕｅ  １１，ｐｐ．１３４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
１種類又は２種類以上のセルラーゼ、及び所望により１種類又は２種類以上のヘミセルラーゼとも組み合わせた場合に、リグノセルロース系バイオマス基質を加水分解して単糖類、二糖類、及び多糖類にする効力及び効率性を増強する、向上した能力を有するＧＨ６１酵素変異体群を提供することが当技術分野においては、有用であろう。変異ＧＨ６１ポリペプチドの向上した性質としては、温度依存性の活性プロファイルの変化、熱安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、基質特異性、産生物特異性、及び化学的安定性が挙げられるが、これらに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、グリコシルヒドロリアーゼファミリー６１（ＧＨ６１）活性を有する単離した変異ポリペプチド、かかる酵素をコードする核酸、ＧＨ６１をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞（例えばＧＨ６１ポリペプチドを発現する宿主細胞）、ＧＨ６１ポリペプチドを含有する組成物、並びにその産生方法及び使用方法について記載する。
【００１４】
したがって、本発明の態様は、親ＧＨ６１酵素の変異体を提供し、該変異体は、セルラーゼ増強活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ（ａ）発現（収率）、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ活性、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイ活性から選択される少なくとも１つにおいて、親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質又は性能を有する。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素は、ＧＨ６１Ａ酵素である。
【００１５】
本発明の特定の態様では、ＧＨ６１変異体は、ＧＨ６１Ａ成熟酵素（配列番号３）のアミノ酸位１１１〜１１４及び１４４〜１６３にかけてのアミノ酸残基の２つのストレッチの中に収まるアミノ酸置換を有する（即ち、２つのストレッチの少なくとも１つがアミノ酸置換を有し、アミノ酸のこれらの２つのストレッチの中での複数の置換もまた、開示される）。残基のこれらのストレッチは、ＧＨ６１Ａファミリーのある特定のメンバー間で保存されており、かつ／又は真菌性ＧＨ６１Ａの機能への鍵であると文献で報告されている。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ６１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ，Ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  Ｆａｍｉｌｙ」２０１０  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９：３３０５〜１６、Ｂｕｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆｓ．」Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３，７９（１１）：３３８０〜３３９１。トリコデルマ・レーシのＧＨ６１Ｂの既知の３Ｄ結晶構造に基づくと（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６１  ｍｅｍｂｅｒ，Ｃｅｌ６１Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ，ａｔ  １．６  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３８３，１４４〜１５４を参照）、配列番号３の１１１〜１１４位にかけての残基は、ＧＨ６１Ａの活性部位からかなり遠く（少なくとも２０オングストローム）に位置するショートループ及びβシートの一部であるが、部分的には酵素の表面に露出していると仮定することができる。配列番号３の１４４〜１６３位にかけての残基は一方で、ショートループ及び長いβシートの一部である。ループ内の残基はある程度、酵素活性部位の反対側の溶媒（solvent）に曝露されている。１６３位のヒスチジンは、酵素活性部位に、又はその近くに位置している。Ｔ．レーシのＧＨ６１Ｂの構造に基づくと、残基番号１５６のアルギニンと１５８のグルタミン酸との間に内部塩橋がある場合があり、かつ１１３位の残基であるリジンと特定の主鎖酸素原子との間にもまた、別の塩橋が存在する可能性があると、更に仮定することができる。これらの残基はＧＨ６１Ａの構造的完全性又は安定性、及びその機能に対して重要であると理解することができるため、これらの残基における特定の変異により、性質が全く低下しないか、又はある場合には、本明細書に記載されるように、親ＧＨ６１酵素と比較して少なくとも１つの向上した性質をもたらすことは驚きである。
【００１６】
ＧＨ６１成熟酵素（配列番号３）のアミノ酸位１１１〜１１４及び１４４〜１６３にかけての、保存アミノ酸残基の潜在的重要性を考慮すれば、これらの位置には、親ＧＨ６１と比較して性質の低下をもたらす多くのアミノ酸置換が存在する。したがって、本発明の特定の態様には、第１のアミノ酸置換、及び少なくとも１個の追加のアミノ酸置換を有するＧＨ６１変異体が含まれ、（１）第１のアミノ酸置換は、アミノ酸位１１１〜１１４及び１４４〜１６３にかけてのアミノ酸残基内にあり、かつ、少なくとも１個の追加のアミノ酸置換を有しないＧＨ６１内にある場合は、親ＧＨ６１と比較して低下した性質を有するＧＨ６１をもたらし、かつ、（２）少なくとも１個の追加のアミノ酸置換は、第１のアミノ酸置換を有するが、少なくとも１個の追加のアミノ酸置換を有しないＧＨ６１と比較して、低下した性質の改善を有するＧＨ６１をもたらす。例えば、アミノ酸位１１１〜１１４及び１４４〜１６３内の位置で置換を有するＧＨ６１変異体により表される（親ＧＨ６１と比較して）低下した産生性は、このＧＨ６１変異体において、ＧＨ６１酵素内の第２の位置に置換を導入することにより、改善される（なお、得られる補償的変異は必ずしも、低下した性質を野生型のレベルに戻すわけではなく、単に、第１のアミノ酸置換を有する変異体により示される低下した性質を改善することに留意されたい）。上述の第１のアミノ酸置換と少なくとも１個の追加のアミノ酸置換との関係は場合により、本明細書において補償的と称される。したがって、本発明の態様は、補償的アミノ酸置換を有するＧＨ６１変異体を含む。また、補償的アミノ酸置換は、互いを補い（rescue）合っている（例えばＧＨ６１変異体における第２のアミノ酸置換が、ＧＨ６１酵素の低下した性質をもたらす第１のアミノ酸置換を補っている）と言うこともできる。場合によっては、補償的アミノ酸置換により、親ＧＨ６１と比較してその性質が低下した変異ＧＨ６１の性質が補われた、と言える。かかる用語は当業者により十分に理解されるものである。特定の実施形態において、かかる補償的置換はＧＨ６１Ａ酵素の結晶構造に基づき、かつ／又は１つ又は２つ以上の密接に関係したＧＨ６１酵素の結晶構造に基づき、設計される。例えば、ＧＨ６１の発現を低下させる１１２位における置換（例えばＦ１１２Ａ及びＦ１１２Ｖ）は、９４位又は１４８位における置換により補われる（以下の実施例４を参照）。したがって、本発明の態様には、（１）１１２位及び９４位、並びに（２）１１２位及び１４８位にて補償的アミノ酸置換を有する、組み合わせＧＨ６１変異体が含まれる。これらの組み合わせ変異体、及び補償的変異体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｌ９４Ｉ−Ｆ１１２Ａ；Ｌ９４Ｖ−Ｆ１１２Ｉ；Ｆ１１２Ｉ−Ｌ１４８Ｉ；及びＬ９４Ｉ−Ｆ１１２Ｖ。
【００１７】
特定の実施形態において、ＧＨ６１変異体は少数の（a few）変異を有し、「少数の」とは、１〜１０個の変異（例えば、親ＧＨ６１酵素と比較して１〜１０個のアミノ酸置換）を意味する。
【００１８】
本発明の態様に従ったＧＨ６１変異体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１．親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ（ａ）発現、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイの性能、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイの性能から選択される少なくとも１つにおいて、前記親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質を有し、前記変異体は、配列番号３のアミノ酸１１１〜１１４及び１４４〜１６３に対応する１つ又は２つ以上の位置にて、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、変異体。
２．前記変異体は、向上した熱安定性及び／又はＴｍを有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｆ、Ｌ１４８Ｐ、Ａ１４９Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｖ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｑ、Ｎ１５２Ｓ、Ｎ１５２Ｙ、Ｌ１５５Ｍ、Ｒ１５６Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ｅ１５８Ｗ、Ｅ１５８Ｙ、Ｉ１５９Ｑ、Ｉ１６０Ｄ、Ｉ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｅ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１６２Ｆ、Ｈ１６３Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１に記載の変異体。
３．前記変異体は、ｗｈＰＣＳ加水分解アッセイにて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｋ、Ｉ１４４Ｒ、Ｉ１４４Ｓ、Ｐ１４５Ｇ、Ｐ１４５Ｈ、Ｐ１４５Ｉ、Ｐ１４５Ｋ、Ｐ１４５Ｒ、Ｐ１４５Ｓ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ１４６Ａ、Ｄ１４６Ｃ、Ｄ１４６Ｅ、Ｄ１４６Ｆ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｍ、Ｄ１４６Ｑ、Ｄ１４６Ｔ、Ｄ１４６Ｙ、Ｎ１４７Ｆ、Ｎ１４７Ｍ、Ｌ１４８Ｋ、Ｌ１４８Ｖ、Ａ１４９Ｃ、Ａ１４９Ｄ、Ａ１４９Ｆ、Ａ１４９Ｇ、Ａ１４９Ｉ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｖ、Ｐ１５０Ａ、Ｐ１５０Ｃ、Ｐ１５０Ｄ、Ｐ１５０Ｅ、Ｐ１５０Ｆ、Ｐ１５０Ｇ、Ｐ１５０Ｈ、Ｐ１５０Ｉ、Ｐ１５０Ｋ、Ｐ１５０Ｌ、Ｐ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｆ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｉ、Ｇ１５１Ｋ、Ｇ１５１Ｍ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｖ、Ｇ１５１Ｗ、Ｇ１５１Ｙ、Ｎ１５２Ｅ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｈ、Ｎ１５２Ｋ、Ｎ１５２Ｐ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｐ、Ｙ１５３Ｑ、Ｙ１５３Ｒ、Ｙ１５３Ｓ、Ｙ１５３Ｖ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｃ、Ｖ１５４Ｄ、Ｖ１５４Ｅ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｈ、Ｖ１５４Ｋ、Ｖ１５４Ｎ、Ｖ１５４Ｐ、Ｖ１５４Ｑ、Ｖ１５４Ｒ、Ｖ１５４Ｔ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｎ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｆ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｌ、Ｒ１５６Ｍ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ｑ、Ｈ１５７Ｄ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｃ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｈ、Ｅ１５８Ｉ、Ｅ１５８Ｌ、Ｅ１５８Ｍ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｐ、Ｅ１５８Ｓ、Ｅ１５８Ｔ、Ｅ１５８Ｗ、Ａ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｎ、Ｈ１６３Ａ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｅ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｇ、Ｈ１６３Ｉ、Ｈ１６３Ｋ、Ｈ１６３Ｍ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｔ、Ｈ１６３Ｖ、Ｈ１６３Ｗ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１又は２に記載の変異体。
４．前記変異体は、ｄａＣＳ加水分解アッセイにおいて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｆ１１２Ｖ、Ｋ１１３Ｌ、Ｋ１１３Ｍ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１１３Ｒ、Ｋ１１３Ｓ、Ｉ１１４Ｆ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１４４Ｆ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１４５Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｖ１５４Ｔ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１、２又は３に記載の変異体。
５．前記変異体は、Ｆ１１２Ｍ、Ｆ１１２Ｗ、Ｋ１１３Ｐ、Ｋ１１３Ｔ、Ｉ１１４Ｌ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１４４Ａ、Ｉ１４４Ｃ、Ｉ１４４Ｄ、Ｉ１４４Ｅ、Ｉ１４４Ｈ、Ｉ１４４Ｎ、Ｉ１４４Ｐ、Ｉ１４４Ｑ、Ｉ１４４Ｔ、Ｉ１４４Ｗ、Ｉ１４４Ｙ、Ｐ１４５Ｃ、Ｐ１４５Ｄ、Ｐ１４５Ｅ、Ｐ１４５Ｆ、Ｐ１４５Ｌ、Ｐ１４５Ｍ、Ｐ１４５Ｎ、Ｐ１４５Ｑ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４５Ｗ、Ｐ１４５Ｙ、Ｄ１４６Ｇ、Ｄ１４６Ｈ、Ｄ１４６Ｉ、Ｄ１４６Ｌ、Ｄ１４６Ｎ、Ｄ１４６Ｐ、Ｄ１４６Ｒ、Ｄ１４６Ｓ、Ｄ１４６Ｖ、Ｄ１４６Ｗ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｃ、Ｎ１４７Ｄ、Ｎ１４７Ｅ、Ｎ１４７Ｇ、Ｎ１４７Ｈ、Ｎ１４７Ｉ、Ｎ１４７Ｋ、Ｎ１４７Ｌ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｑ、Ｎ１４７Ｒ、Ｎ１４７Ｓ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｖ、Ｎ１４７Ｗ、Ｎ１４７Ｙ、Ｌ１４８Ａ、Ｌ１４８Ｃ、Ｌ１４８Ｄ、Ｌ１４８Ｅ、Ｌ１４８Ｆ、Ｌ１４８Ｇ、Ｌ１４８Ｈ、Ｌ１４８Ｉ、Ｌ１４８Ｍ、Ｌ１４８Ｎ、Ｌ１４８Ｑ、Ｌ１４８Ｒ、Ｌ１４８Ｓ、Ｌ１４８Ｔ、Ｌ１４８Ｗ、Ｌ１４８Ｙ、Ａ１４９Ｅ、Ａ１４９Ｈ、Ａ１４９Ｋ、Ａ１４９Ｌ、Ａ１４９Ｍ、Ａ１４９Ｑ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｓ、Ａ１４９Ｔ、Ａ１４９Ｗ、Ａ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｍ、Ｐ１５０Ｎ、Ｐ１５０Ｒ、Ｐ１５０Ｓ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５０Ｖ、Ｐ１５０Ｗ、Ｐ１５０Ｙ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５１Ｃ、Ｇ１５１Ｄ、Ｇ１５１Ｌ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｒ、Ｇ１５１Ｔ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｃ、Ｎ１５２Ｄ、Ｎ１５２Ｉ、Ｎ１５２Ｌ、Ｎ１５２Ｍ、Ｎ１５２Ｒ、Ｎ１５２Ｔ、Ｎ１５２Ｖ、Ｎ１５２Ｗ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｃ、Ｙ１５３Ｄ、Ｙ１５３Ｅ、Ｙ１５３Ｇ、Ｙ１５３Ｈ、Ｙ１５３Ｉ、Ｙ１５３Ｎ、Ｙ１５３Ｔ、Ｙ１５３Ｗ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｉ、Ｖ１５４Ｌ、Ｖ１５４Ｍ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ｗ、Ｖ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｎ、Ｒ１５６Ｔ、Ｒ１５６Ｖ、Ｒ１５６Ｗ、Ｒ１５６Ｙ、Ｈ１５７Ａ、Ｈ１５７Ｃ、Ｈ１５７Ｅ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｇ、Ｈ１５７Ｉ、Ｈ１５７Ｋ、Ｈ１５７Ｌ、Ｈ１５７Ｍ、Ｈ１５７Ｎ、Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１５７Ｑ、Ｈ１５７Ｒ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｖ、Ｈ１５７Ｙ、Ｅ１５８Ｇ、Ｅ１５８Ｋ、Ｅ１５８Ｒ、Ｅ１５８Ｖ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｃ、Ｉ１５９Ｄ、Ｉ１５９Ｅ、Ｉ１５９Ｆ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１５９Ｈ、Ｉ１５９Ｋ、Ｉ１５９Ｌ、Ｉ１５９Ｍ、Ｉ１５９Ｎ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ｓ、Ｉ１５９Ｔ、Ｉ１５９Ｖ、Ｉ１５９Ｗ、Ｉ１５９Ｙ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｃ、Ｉ１６０Ｅ、Ｉ１６０Ｇ、Ｉ１６０Ｈ、Ｉ１６０Ｋ、Ｉ１６０Ｌ、Ｉ１６０Ｍ、Ｉ１６０Ｎ、Ｉ１６０Ｐ、Ｉ１６０Ｑ、Ｉ１６０Ｒ、Ｉ１６０Ｓ、Ｉ１６０Ｔ、Ｉ１６０Ｖ、Ｉ１６０Ｗ、Ｉ１６０Ｙ、Ａ１６１Ｄ、Ａ１６１Ｆ、Ａ１６１Ｇ、Ａ１６１Ｈ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｋ、Ａ１６１Ｍ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｐ、Ａ１６１Ｑ、Ａ１６１Ｒ、Ａ１６１Ｓ、Ａ１６１Ｔ、Ａ１６１Ｖ、Ａ１６１Ｗ、Ｌ１６２Ｃ、Ｌ１６２Ｄ、Ｌ１６２Ｅ、Ｌ１６２Ｇ、Ｌ１６２Ｈ、Ｌ１６２Ｋ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６２Ｐ、Ｌ１６２Ｑ、Ｌ１６２Ｒ、Ｌ１６２Ｓ、Ｌ１６２Ｔ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６２Ｗ、Ｌ１６２Ｙ、Ｈ１６３Ｑ、Ｈ１６３Ｓ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の第２のアミノ酸置換を更に含む、１〜４に記載の変異体。
【００１９】
特定の実施形態において、親ＧＨ６１は真菌グリコシルヒドロラーゼ６１（ＧＨ６１）、例えばヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、又はシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）（又はこれらのそれぞれのアナモルフ、テレオモルフ若しくはホロモルフの対応する形態）由来のＧＨ６１Ａ、例えば配列番号３、７２、７３、７４、及び７７のいずれか１つから選択されるＧＨ６１Ａである。
【００２０】
本発明の態様は、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの触媒ドメイン（配列番号３４）及び／又はＨ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの糖質結合ドメイン（配列番号５１）に相同性を有する、酵素の触媒及び／又は糖質結合ドメインにおける変異体を含む。したがって、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの触媒ドメインに含まれる、上述の変異体の任意の１つ又は任意の組み合わせを、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素の触媒ドメインに相同である触媒ドメインに適合することができる。同様に、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの糖質結合ドメインに含まれる上述の変異体の任意の１つ又は任意の組み合わせを、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素の糖質結合ドメインに相同である糖質結合ドメインに適合することができる。上述の通り、これらの触媒ドメイン及び／又は糖質結合ドメインの変異体は、それぞれの親酵素よりも向上した性質を、少なくとも１つ有する。Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同な触媒ドメイン（配列番号３４）の例を、図２Ａ〜２Ｃに示す。Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同な糖質結合ドメイン（配列番号５１）の例を、図３に示す。更に、（１）ＧＨ６１変異体からの触媒ドメイン及び第２の酵素の糖質結合ドメイン、又は（２）ＧＨ６１変異体からの糖質結合ドメイン及び第２の酵素の触媒ドメインの一方を含むキメラ酵素が想定されており、ここで、このキメラ酵素のＧＨ６１ドメインは、本明細書に記載した１種類又は２種類以上の変異アミノ酸を含有する。
【００２１】
本発明の態様には、本明細書に記載した親ＧＨ６１の変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチドが含まれる。単離ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば発現ベクター又はポリヌクレオチドを増殖させるためのベクターの中に存在してよい。このベクターは、ベクターを増殖させ、かつ／又は本明細書に記載される、コードされたＧＨ６１変異体を発現する、宿主細胞中に存在してよい。宿主細胞は、ＧＨ６１変異体ポリヌクレオチドの増殖、及び／又はコードしたＧＨ６１変異体の発現において使用され得る任意の細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞等とすることができる。使用可能な好適な真菌細胞の種類の例としては、例えばトリコデルマ・レーシ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の細胞といった、糸状菌細胞が挙げられる。あるいは、真菌宿主細胞は、例えばサッカロマイセス・セルビシエ、スキッゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、クルベロマイセス・ラクタス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｕｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、アルキスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、デバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）又はデバリオマイセス・ポリモルフス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）といった酵母細胞とすることができる。
【００２２】
本発明の態様としては、例えば、ＧＨ６１変異体をコードするポリヌクレオチドが発現ベクター内に存在する（即ち、ＧＨ６１変異体をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞内でＧＨ６１変異体の発現を誘発するプロモーターに作用可能に結合している）場合に、ＧＨ６１変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を、好適な条件下にて、好適な培地で培養し、該ポリヌクレオチドからのＧＨ６１変異体を発現（又は産生）させることを含む、変異ＧＨ６１を産生する方法が含まれる。特定の実施形態において、この方法は更に、産生されたＧＨ６１変異体を単離することを更に含む。
【００２３】
本発明の態様はまた、本明細書に記載したＧＨ６１変異体を含有する組成物を含む。好適な組成物の例としては、洗剤組成物、飼料添加物、及びセルロース基質を処理（又は加水分解）するための組成物（例えば、デニム等の、セルロースを含有する生地；所望により前加水分解プロセスの前処理を受けている、リグノセルロース系バイオマス材料の混合物等の、セルロースを含有するバイオマス材料等）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載したＧＨ６１変異体及びセルロース基質を含む組成物は、本発明の更なる態様を表す。ＧＨ６１変異体を含有する洗剤組成物としては、洗濯洗剤及び食器洗剤が挙げられ、かかる洗剤は更に、界面活性剤等の追加の成分を含んでよい。好適なセルロース基質の例としては、草、スイッチグラス、スパルティナ（cordgrass）、ライグラス、クサヨシ、ススキ（miscanthus）、製糖残物（sugar-processing residues）、サトウキビバガス、農業廃棄物、稲わら、もみ殻、大麦わら、トウモロコシの穂軸、穀物のわら、麦わら、キャノーラのわら、オート麦わら、オート麦の殻、トウモロコシ繊維、まぐさ、大豆かん、トウモロコシ茎葉、林業廃棄物、木材パルプ、再利用した木材パルプ繊維、製紙スラッジ、おがくず、硬材、軟材、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の態様として、セルロース基質を加水分解する方法であって、基質を、本明細書に記載した変異ＧＨ６１と接触させることを含む、方法が含まれる。特定の実施形態において、ＧＨ６１変異体は細胞非含有組成物として提供されるが、別の実施形態では、ＧＨ６１変異体は、ＧＨ６１変異体を発現する宿主細胞内の宿主細胞組成物として提供される。したがって、ＧＨ６１変異体発現ベクターを含有する宿主細胞と基質を接触させる、セルロース基質を加水分解する方法の特定の実施形態。特定の実施形態において、本方法はリグノセルロース系バイオマスをグルコースに転換するためのものであり、これらの実施形態のいくつかにおいては、リグノセルロース系バイオマスは、限定ではないが、草、スイッチグラス、スパルティナ、ライグラス、クサヨシ、ススキ、製糖残物、サトウキビバガス、農業廃棄物、稲わら、もみ殻、大麦わら、トウモロコシの穂軸、穀物のわら、麦わら、キャノーラのわら、オート麦わら、オート麦の殻、トウモロコシ繊維、まぐさ、大豆かん、トウモロコシ茎葉、林業廃棄物、木材パルプ、再利用した木材パルプ繊維、製紙スラッジ、おがくず、硬材、軟材、及びこれらの組み合わせから選択される。他の特定の実施形態において、セルロース基質はセルロース含有生地、例えばデニムであり、これらの実施形態のいくつかにおいては、本方法はインディゴ染めしたデニムを（例えばストーンウォッシュプロセスで）処理するためのものである。
【００２５】
本発明の態様としては、本明細書に記載したＧＨ６１変異体を含有する、細胞培養上清組成物が含まれる。例えば、ＧＨ６１変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を、好適な条件下にて好適な培地で培養し、ポリヌクレオチドからＧＨ６１変異体を発現させ、ＧＨ６１変異体を細胞培養上清中に分泌させることにより得られる細胞培養上清。かかる細胞培養上清は、内因的及び／又は外因的に発現したタンパク質及び／又は酵素を含む、宿主細胞により産生された他のタンパク質及び／又は酵素を含むことができる。培地のかかる上清は最小限の産生後処理、又は産生後処理なしでそのまま使用することができ、この処理は典型的に、濾過により細胞片を取り除くこと、細胞を殺す手順、及び／若しくは限外濾過、又は上清中の酵素を富化若しくは濃縮する他の工程を含んでよい。かかる上清は本明細書において、「全培養液」又は「全セルラーゼ培養液」と称する。
【００２６】
ＧＨ６１変異体は、１種類又は２種類以上のセルラーゼ、及び／又は１種類又は２種類以上のヘミセルラーゼとの共発現により産生することができる。あるいは、ＧＨ６１変異体はセルラーゼ又はヘミセルラーゼ無しで産生することができる。後者の場合、ＧＨ６１変異体を、所望により、１種類又は２種類以上のセルラーゼ及び／又は１種類又は２種類以上のヘミセルラーゼと物理的に混合して、特定用途、例えばリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解に有用である酵素組成物を形成することができる。更なる実施形態において、ＧＨ６１変異体は更に、１種類又は２種類以上のアクセサリー酵素と共発現するか、又は物理的に混合することができる。既知のアクセサリー酵素としては、例えば、ある種のマンナナーゼ（これは場合によってはヘミセルラーゼとして特徴づけられるが、より多くの場合、アクセサリー酵素と考えられる）、ガラクタナーゼ、アラビナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えばフェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ）、リパーゼ、ある種の他のＧＨ６１ファミリー酵素、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ１様タンパク質、ＣＩＰ２、ＣＩＰ２様タンパク質、スオレニン（swollenin）、エクスパンション（expansion）、セロビオースヒドロゲナーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、及び、例えばセルロース結合モジュールであり得る、セルロース破壊タンパク質が挙げられる。
【００２７】
所望の変異ＧＨ６１酵素を含有する他の組成物、及びかかる組成物の使用方法もまた、想定されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｈ．ジェコリーナ由来の野生型ＧＨ６１Ａ（ＧＨ６１Ａ）の核酸配列（上の列）（配列番号１）及びアミノ酸配列（下の列）（配列番号２）を示す図である。配列番号２でのシグナル配列には下線を引いている。
【図２Ａ】Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同なグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す図である。以下の酵素の触媒ドメインが位置合わせされている（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を示す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）ＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図２Ｂ】Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同なグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す図である。以下の酵素の触媒ドメインが位置合わせされている（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を示す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Hypocrea rufa）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）ＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図２Ｃ】Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同なグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す図である。以下の酵素の触媒ドメインが位置合わせされている（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を示す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）ＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図３】示したグリコシルヒドロラーゼ酵素の、以下の糖質結合ドメインのアミノ酸配列アラインメント（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す図である。ヒポクレア・ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａ（配列番号５１）、ヒポクレア・ビレンス由来のＧＨ６１酵素（配列番号５２）、シエラビア・テレストリス由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー２８酵素（配列番号５３）、ヒポクレア・アトロビリディス由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー４５酵素（配列番号５４）、ネオサルトリヤ・フミガタ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔａ）由来の推定エンドグルカナーゼ（配列番号５５）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来の推定酵素（配列番号５６）、ヒポクレア・ジェコリーナ由来のＣｉｐ１（配列番号５７）、ヒポクレア・ルーファ由来のエキソグルカナーゼ１（配列番号５８）、ヒポクレア・ビレンス由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー７酵素（配列番号５９）、ヒポクレア・アトロビリディス由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー５酵素（配列番号６０）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー４５酵素（配列番号６１）、トリコデルマ・コニンギ由来のエキソグルカナーゼ１（配列番号６２）、コレトトリカム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー６１（配列番号６３）、コレトトリカム・グラミニコラ由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー６１（配列番号６４）、アルトロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）由来の推定酵素（配列番号６５）、トリコデルマ・ハルジアウム由来のセロビオヒドロラーゼ（配列番号６６）、及びペニシリウム属由来のエンドグルカナーゼ（配列番号６７）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ここで、本発明は以下の定義及び実施例を用いて、専ら参考として、詳細に説明される。本明細書内で参照される全ての特許及び出版物（かかる特許及び出版物内で開示される全ての配列を含む）は明示的に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本明細書内で他に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００７）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明に用いられる多くの用語の全般的な辞書を、当業者に提供する。本明細書に記載されるものに類似又は等しい任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用可能であるが、好ましい方法及び材料が記載される。数字の範囲は、その範囲を規定する数字を含む。特に断りのない限り、核酸は５’から３’方向に、左から右に記述され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基の方向に、左から右に記述される。当該技術の定義及び用語に関して、実践者は特に、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３により指示される。本発明は変化させ得るものであり、記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されないものと理解されなければならない。
【００３１】
本明細書において提供する見出しは、明細書全体を参照することにより有することができる、本発明の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義される用語は、明細書全体を参照することにより、一層完全に定義される。
【００３２】
本明細書内で引用される全ての出版物は、本発明と関係して用いられ得る組成物及び方法論を記述及び開示する目的のために、明示的に参考として本明細書に組み込まれている。
【００３３】
Ｉ．定義
用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」「タンパク質」及び「ペプチド」と同義であり、互換的に用いられる。かかるアミノ酸配列が活性を示す場合、これらは「酵素」と称され得る。アミノ酸残基に対する、従来の１文字又は３文字のコードは、標準的なアミノ基からカルボキシ基末端方向（即ちＮ→Ｃ）にて表されるアミノ酸配列と共に用いられる。
【００３４】
用語「核酸」は、ポリペプチドをコード可能なＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及び合成分子を包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖であってよく、かつ化学修飾を有してよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられる。遺伝暗号は縮退するため、２種類以上のコドンが特定のアミノ酸をコードするために用いられてよく、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。したがって、本発明はＧＨ６１又はその変異体をコードする、全ての可能な変異ヌクレオチド配列を想定しており、これらは全て、遺伝暗号の縮退を付与することが可能である。特に断りのない限り、核酸配列は５’から３’方向で示される。
【００３５】
「セルラーゼ」又は「セルラーゼ酵素」とは、細菌若しくは真菌エキソグルカナーゼ若しくはエキソセルバイオヒドロラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）、及び／又はエンドグルカナーゼ、及び／又はβ−グルコシダーゼを意味する。セルラーゼ酵素のこれらの３つの異なる型は、相乗的にセルロース、及びその誘導体をグルコースに転換するように作用することが知られている。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「エンドグルカナーゼ」又は「ＥＧ」、又は「ＥＧ酵素」又は「ＥＧポリペプチド」は、セルロース、リケニン及び穀物のβ−Ｄ−グルカンでの、１，４β−Ｄ−グルコシド結合の内部加水分解（endohydrolysis）を触媒するエンド−１，４−β−グルカナーゼとして定義される。セルロースの加水分解では、この活性により、ＣＢＨ活性に対する基質である新たな鎖末端が生み出される。また、ＥＧは、１，３−結合もまた含有するβ−Ｄ−グルカンにて、１，４−結合を加水分解する。ある種のＥＧは、結晶性セルロースにて「進化するように（processively）」挙動することが示されている（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．Ｔｈｒｅｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８，１１２５，２８９〜２９７；及びＬｉ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ  ３ｃ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  Ｃｅｌ９Ａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０，７６，２５８２〜２５８８を参照）。
【００３７】
「ＧＨ６１」又は「ＧＨ６１酵素」等は、グリコシルヒドロラーゼ６１ファミリー、例えばグリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）ファミリーに属する酵素を意味する。ＧＨ６１酵素は、真菌類（Eumycota）又は卵菌類（Oomycota）の亜門である、糸状菌を含む真菌細胞に由来することができる。糸状菌は、偏性好気性の菌糸伸長及び炭素異化作用による栄養成長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類で構成される細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。糸状菌の親細胞は、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアウム；ペニシリウム属；フミコーラ・インソレンス及びフミコーラ・グリセアを含むフミコーラ属；Ｃ．ラックノウエンスを含むクリソスポリウム属；ミセリオフトラ属；グリオクラジウム属；アスペルギルス属；フサリウム属、ニューロスポラ属、例えばヒポクレア・ジェコリーナ等のヒポクレア属、及びエメリセラ属等の各種の細胞であってよいが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）」とは、以前はトリコデルマとして分類されていたか、又は現在トリコデルマとして分類されている、任意の真菌株を意味する。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素は非糸状菌細胞に由来することができる。ＧＨ６１Ａ酵素の例としては、ヒポクレア・ジェコリーナ（トリコデルマ・レーシ）、ヒポクレア・ルーファ、ヒポクレア・オリエンタリス、ヒポクレア・アトロビリディス、ヒポクレア・ビレンス、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス、トリコデルマ・サツリスポラム、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・クラッサ、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フィシェリ、シエラビア・テレストリス、及びシエラビア・ヘテロタリカで見出されるものが挙げられる。特定の態様において、ＧＨ６１酵素は、配列番号３、７２、７３、７４、７７に示す、成熟ＧＨ６１酵素配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、それらに少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、それらの対立遺伝子変異体、又はセルラーゼ増強活性を有するそれらの断片を含む。特定の実施形態において、ＧＨ６１Ａ酵素は、セルラーゼ増強活性を有し、かつ、配列番号３に対して少なくとも６０％、７０％、８���％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列、又は、セルラーゼ増強活性を有するその断片若しくは誘導体を含有する。
【００３８】
「ＧＨ６１活性」若しくは「ＧＨ６１Ａ活性」又は「活性」は、ＧＨ６１酵素に関する場合、ＧＨ６１ファミリーメンバーの特徴を示すセルラーゼ増強活性を意味する。特にＧＨ６１酵素は、ある種のセルラーゼと組み合わせた場合、リグノセルロース系バイオマス基質を加水分解して、例えば単糖類、二糖類、及び多糖類を生成する効力及び効率性を増強する能力が向上する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、酵素、タンパク質、ポリペプチド、核酸、又はポリヌクレオチドの「変異体」とは、変異体が、その親と比較して少なくとも１つの修飾又は変更を含み、かかる修飾又は変更が、人の介入により行われた、親ポリペプチド又は親核酸（例えば天然の、野生型の又は他に規定される親ポリペプチド又は核酸）に由来することを意味する。したがって、変異体は親と比較して少数の変異を有する場合があり、ここで「少数の」とは１〜１０個の変異を意味する。例えば、配列番号３と比較して１〜１０個のアミノ酸置換を有する変異体は、少数の置換を有するＧＨ６１変異体と称することができる。変更／修飾には、１つ又は２つ以上の部位における、異なるアミノ酸／核酸残基に対する、親におけるアミノ酸／核酸残基の置換、１つ又は２つ以上の部位における、親におけるアミノ酸／核酸残基（又はひと続きのアミノ酸／核酸残基）の欠失、１つ又は２つ以上の部位における、親におけるアミノ酸／核酸残基（又はひと続きのアミノ酸／核酸残基）の挿入、アミノ及び／若しくはカルボキシ末端アミノ酸配列、又は５’及び若しくは３’核酸配列のトランケーション、並びにこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本発明の態様に従った変異ＧＨ６１酵素（場合によっては「ＧＨ６１変異体」又は「ＧＨ６１Ａ変異体」とも称される）は、セルラーゼ増強活性を維持するが、いくつかの特定の態様おいては、例えば向上した性質といった、変化した性質を有してよい。例えば、変異ＧＨ６１酵素は、変化したｐＨ最適条件、向上した熱安定性若しくは酸化安定性、又はこれらの組み合わせを有してよいが、該変異ＧＨ６１酵素に特有のセルラーゼ増強活性を維持する。特定の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素は上で規定した、かつセルラーゼ増強活性を有するＧＨ６１Ａ酵素の変異体である。本発明のいくつかの態様では、変異ＧＨ６１酵素は、配列番号３に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列、又は酵素活性のあるその断片を含有する。
【００４０】
「組み合わせ変異体」とは、２つ以上の変異、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「親」又は「親の」ポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくは酵素配列（例えば「親ＧＨ６１酵素」）、又はそれらの等価物とは、変異ポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは酵素を設計するための開始点若しくはテンプレートとして用いられたポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は酵素配列を意味する。特定の実施形態において、親酵素は上述のＧＨ６１Ａ酵素（例えば配列番号３）である。語句「親」及び「親の」は、本文脈において互換的に用いられることに更に留意すべきである。
【００４２】
用語「野生型」とは、天然のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、即ち、人工的な変異体を含まないものを意味する。場合によっては、野生型配列は親配列として用いられる。
【００４３】
用語「異種の」とは核酸の一部に関して用いられる場合、その核酸が、自然では通常、互いに同一の関係が見出されない２つ以上の部分配列（subsequence）を含むことを指す。例えば、この核酸は典型的には組換えにより産生され、例えば、新たな機能的核酸を作製するために、関連性のない遺伝子を配列させることから、２つ以上の配列（例えば、あるソースからのプロモーターと、別のソースからのコード領域等）を有している。同様に、異種ポリペプチドは多くの場合、自然で互いに同一の関係が見出されない２つ以上の部分配列（例えば融合ポリペプチド）を意味する。
【００４４】
用語「組換え」とは、例えば細胞若しくは核酸、ポリペプチド、又はベクターに関して用いる場合、その細胞、核酸、ポリペプチド、又はベクターが、異種核酸若しくはポリペプチドの導入、若しくは天然の核酸若しくはポリペプチドの変更により改質されているか、又はその細胞が、そのように改質された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、又は、組換え細胞でない場合には、異常発現するか、低度に発現するか、若しくは全く発現しないような天然遺伝子を発現する。
【００４５】
用語「単離した」又は「精製した」とは、本明細書で使用する場合、天然に産生された環境から取り出された、ある成分を意味する。一般に、単離した、又は精製した核酸又はポリペプチドサンプルにおいては、対象の核酸又はポリペプチドは、それらが天然に産生される環境と比較して、高い絶対濃度又は相対濃度で存在する。
【００４６】
組成物中の成分又は物質（例えばポリペプチド又はポリヌクレオチド）の説明に際しては、用語「富化した」とは、富化組成物生成の原料である出発組成物と比較して、その成分又は物質が、その組成物中に相対的に高い濃度で存在することを意味する。例えば、富化ＧＨ６１組成物（又はサンプル）とは、宿主生物由来の最初の発酵産生物と比較して、ＧＨ６１の相対濃度又は絶対濃度が増加したものである。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を意味する。プロモーターは一般に、その中で標的遺伝子が発現する宿主細胞に対して適切なものとされる。プロモーターは、他の転写及び翻訳制御核酸配列（「調節配列」とも称される）と共に、所与の遺伝子を発現するのに必要である。一般に、転写及び翻訳制御配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、並びにエンハンサー又はアクティベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「構成的」プロモーターとは、最も環境的かつ成長する条件下にて活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境又は成長制御下にて活性であるプロモーターである。本発明において有用な誘導性プロモーターの例は、受託番号Ｄ８６２３５でＧｅｎＢａｎｋに格納されているＴ．レーシ（Ｈ．ジェコリーナ）ｃｂｈ１プロモーターがある。別の態様では、プロモーターはＨ．ジェコリーナのｃｂｈ  ＩＩ又はキシラナーゼプロモーターである。好適なプロモーターの例としては、Ａ．アワモリ又はＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，２３０６〜２３１５；Ｂｏｅｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，１５８１〜１５８５）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子、Ｈ．ジェコリーナ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）欧州特許出願第ＥＰ０１３７２８０Ａ１号）、Ａ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１４７０〜１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７〜４５）、Ａ．ニデュランスａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ３３，１３７〜１４９）、Ａ．ニデュランスｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，１４３〜１４７）、Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３，１４３０〜１４３９）、Ｈ．ジェコリーナｘｌｎ１遺伝子、Ｈ．ジェコリーナｃｂｈ２遺伝子、Ｈ．ジェコリーナｅｇ１遺伝子、Ｈ．ジェコリーナｅｇ２遺伝子、Ｈ．ジェコリーナｅｇ３遺伝子由来のプロモーター、及びＳＶ４０アーリープロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，２１１７〜２１３０）等の、より高次な真核プロモーターが挙げられる。
【００４８】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置されている場合、「作用可能に結合して」いる。例えば、分泌リーダー、即ちシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合、そのポリペプチドに対するＤＮＡに作用可能に結合しており、プロモーター若しくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に結合しており、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合した」とは、結合したＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーである場合は、連続的であり、かつ読み取りフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。結合は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、従来の慣習に従って用いる。したがって、用語「作用可能に結合した」とは、（プロモーター、又は転写因子結合部位の配列等の）核酸発現制御配列と、第２の核酸配列との間の機能的結合を意味し、この発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４９】
用語「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「分泌配列」、「分泌ペプチド」、「分泌シグナル配列」、「分泌シグナルペプチド」等は、より大きなポリペプチドの一部であって、そのペプチドの合成が行われる細胞の分泌経路を通して、そのより大きなポリペプチドを指示するペプチド配列、及びかかるペプチドをコードする核酸を意味する。一般に、このより大きなポリペプチド（又はタンパク質）は通常、分泌経路を経由した移行の最中に、切断されて分泌／シグナルペプチドが取り除かれるが、このポリペプチドの切断形態（即ち、シグナル／分泌ペプチドがない形態）は多くの場合、本明細書においてポリペプチドの「成熟形態」として称される。例えば、配列番号２には、シグナルペプチドを有する、Ｈ．ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａのアミノ酸配列が提供されている一方で、配列番号３には、Ｈ．ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａの成熟形態（即ち、シグナルペプチドを含まないアミノ酸配列）が提供されている。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、異なる宿主細胞間での導入のために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」とは、外来細胞内に異種ＤＮＡ断片を取りこみ、それを発現する能力を有するベクターを意味する。多くの原核細胞及び真核細胞発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００５１】
したがって、「発現カセット」又は「発現ベクター」とは、標的細胞内で特定の核酸の転写を可能にする、特定の一連の核酸成分を用いて、組換えにより、又は合成して生成した核酸構築物である。組換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことが可能である。通常、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列内に、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」とは、多くの細菌及び一部の真核生物内に存在する場合、染色体外自己複製遺伝因子を形成する、円形の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を意味する。プラスミドは、例えばクローニングベクター、増殖ベクター、発現ベクター等として、多数の異なる目的のいずれかのために用いてよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「選択マーカー」とは、コードされていることにより細胞内での発現が可能なヌクレオチド配列又はポリペプチドであって、細胞内でのその選択マーカーの発現により、その選択マーカーを発現しない細胞との区別が可能となるものを意味する。特定の実施形態において、選択マーカーは、対応する選択剤の存在下で、又は対応する選択的増殖条件下にて、それを発現する細胞を増殖させることができる。別の実施形態においては、選択マーカーにより、物理的特徴にから、例えば蛍光、免疫反応性等の違いから、その選択マーカーを発現しない細胞から、発現する細胞を同定及び／又は単離することを可能にする。
【００５４】
一般に、変異ＧＨ６１Ａをコードする核酸分子は、中〜高ストリンジェンシーな条件下にて、本明細書において配列番号１（天然型Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ）として提供されている野生型配列（又はその補体）にハイブリダイズする。しかし、場合によっては、実質的に異なるコドンの使用を有する、ＧＨ６１Ａをコードするヌクレオチド配列が用いられる一方で、ＧＨ６１Ａをコードするヌクレオチド配列によりコードされる酵素は、天然型酵素と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列を有する。例えば、特定の原核細胞又は真核細胞発現系において、ＧＨ６１Ａのより速い発現を促進するために、特定のコドンが、宿主により用いられる頻度に従って、コード配列を改変してよい（一般に「コドン最適化」と称される）。例えば、Ｔｅ’ｏ，ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９０：１３〜１９，２０００）は、糸状菌における、発現のための遺伝子最適化について記載している。かかる核酸配列は、「縮退」又は「縮退配列」と呼ばれることもある。
【００５５】
中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下にて、ある核酸配列と基準核酸配列が、互いに特異的にハイブリダイズする場合、これら２つの配列は、「選択的にハイブリダイズ可能」であると認識される。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５°低い）で生じ、「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５〜１０°低い温度で生じ、「中」又は「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０°低い温度で生じ、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０〜２５°低い温度で生じる。機能上、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブに厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用してよく、一方で、高ストリンジェンシー条件は、プローブに約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために使用する。
【００５６】
中及び高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である（例えば、明示的に本明細書に参考として組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９，９及び１１章、並びにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照）。高ストリンジェンシーな条件の例としては、５０％ホルムアミド、ＳＳＣ（５倍）、デンハート液（５倍）、０．５％  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬの変性キャリアＤＮＡ内での、約４２℃でのハイブリダイゼーションの後、室温にてＳＳＣ（２倍）及び０．５％  ＳＤＳで二度、及び更に二度、４２℃にてＳＳＣ（０．１倍）及び０．５％  ＳＤＳで洗浄することが挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、細胞に関する用語「形質転換した」、「安定的に形質転換した」、又は「トランスジェニック」とは、細胞が、そのゲノム内に組み込まれた非天然型（異種）核酸配列を有するか、又はその配列を、複数の世代にわたり維持されるエピソームプラスミドとして有することを意味する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「発現」とは、遺伝子の核酸配列に基づき、ポリペプチドが産生されるプロセスを意味する。このプロセスは一般に、転写と翻訳の両方を含む。
【００５９】
細胞内に核酸配列を挿入する文脈において、用語「導入された」とは「トランスフェクション」、又は「形質転換」若しくは「形質導入」を意味し、かつ、真核又は原核細胞内に核酸配列を組み込むことへの言及を含み、ここで、核酸配列は細胞のゲノム（例えば染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）内に組み込まれるか、自律性レプリコン内に転換されるか、又は一時的に発現（例えば、トランスフェクションしたｍＲＮＡ）してよい。
【００６０】
したがって、用語「所望のグリコシルヒドロラーゼ発現」又は同様の表現は、所望のグリコシルヒドロラーゼ遺伝子の転写及び翻訳を意味することになり、その産生物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後に処理したポリペプチドを含む。例として、ＧＨ６１Ａ発現のアッセイとしては、ＧＨ６１Ａ酵素のウェスタンブロット、ＧＨ６１Ａ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、及びセルラーゼ増強活性アッセイ、例えばＳｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３〜１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）に記載されるアッセイの増強が挙げられる。
【００６１】
用語「宿主細胞」とは、ベクターを含有し、かつ発現構築物の複製、並びに／又は転写、並びに／又は転写及び翻訳（発現）を支える細胞を意味する。本発明にて使用する宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、又は酵母菌、植物、昆虫、両生類、若しくは哺乳類細胞等の真核細胞とすることができる。特定の実施形態において、宿主細胞は糸状菌である。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「洗剤組成物」とは、汚れたセルロースを含有する布地を洗濯するための洗浄媒体で用いることを意図する混合物を意味する。本発明との関係においては、かかる組成物としては、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、更なる加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光染料、固化抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、酸化防止剤、並びに可溶化剤を挙げることができる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「界面活性剤」とは、当該技術分野において、表面を活性化する性質を有するとして一般に認識されている、任意の化合物を意味する。したがって、例えば、界面活性剤は洗剤に一般的に見られるものといった、アニオン性、カチオン性及び非イオン性界面活性剤を含む。アニオン性界面活性剤としては、直鎖又は分枝鎖のアルキルベンゼンスルホネート；直鎖若しくは分枝鎖のアルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；アルキル又はアルケニルスルフェート；オレフィンスルホネート；及びアルカンスルホネートが挙げられる。両性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩スルホネート、及びベタイン系両界面活性剤が挙げられる。かかる両性界面活性剤は、同じ分子内に正及び負に荷電した基を両方有する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンエーテル、及び高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加化合物、脂肪酸グリセリンモノエステル等を挙げることができる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「セルロース含有布地」とは、セルロース含有綿若しくは非綿、又は天然セルロース系誘導体並びに人工セルロース系誘導体（黄麻、亜麻、ラミー、レーヨン、及びリオセル）を含む、セルロースブレンド含有綿若しくは非綿から作製した、縫い合わせたか又は縫い合わせていない、任意の布地、糸又は繊維を意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「綿含有布地」とは、純粋な綿又は混綿から作製した、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿糸、原綿等を含む、縫い合わせたか又は縫い合わせていない布地、糸又は繊維を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「ストーンウォッシュ組成物」とは、セルロース含有布地のストーンウォッシュ加工において使用するための配合物を意味する。ストーンウォッシュ組成物は、販売前、即ち、製造プロセス中に、セルロース含有布地を改質するために用いられる。対照的に、洗剤組成物は汚れた衣類を洗浄することを意図しており、製造プロセス中に使用されない。
【００６７】
第１のポリペプチド内のアミノ酸位置（又は残基）が第２の、関係するポリペプチドのアミノ酸位置と「等価」であると表される場合、（ｉ）一次配列アラインメント（以下の配列アラインメント及び配列同一性の説明を参照）；（ｉｉ）構造的配列相同性；又は（ｉｉｉ）類似の機能的性質のうちの１つ又は２つ以上により、第１のポリペプチドのアミノ酸位置が、第２の関係するポリペプチドに示される位置に対応することを意味する。このように、第１のＧＨ６１酵素（又はその変異体）内のアミノ酸位置は、第２のＧＨ６１酵素（又は複数の異なるＧＨ６１酵素）の中のアミノ酸位置に「等価」（又は「相同」）として同定することができる。
【００６８】
一次配列アラインメント：等価なアミノ酸位置は、一次アミノ酸配列アラインメントの方法論を用いて決定することができ、その多くは当技術分野において既知である。例えば、２つ以上の異なるＧＨ６１酵素の一次アミノ酸配列の位置合わせをすることにより、一方のＧＨ６１酵素のアミノ酸位置番号を、位置合わせしたもう一方のＧＨ６１酵素の位置番号に対する等価物として示すことが可能である。このようにして、一方のＧＨ６１酵素（例えば配列番号３で示したＧＨ６１Ａ酵素）のアミノ酸配列を起点とするナンバリングシステムを使用して、別のＧＨ６１酵素での等価な（又は相同）アミノ酸残基を同定することができる。例えば、図２及び３に示すアラインメントを参照のこと。
【００６９】
構造的配列相同性：一次配列アラインメントの方法論を用いて「等価な」アミノ酸位置を決定することに加えて、二次及び／又は三次構造のレベルで相同性を決定することによってもまた、「等価な」アミノ酸位置を規定してよい。例えば、三次構造がＸ線結晶構造解析により決定されたグリコシルヒドロラーゼに対しては、等価な残基は、グリコシルヒドロラーゼの特定のアミノ酸残基の２つ以上の主鎖原子の原子座標が、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａとのアラインメント（ＮはＮ、ＣＡはＣＡ、ＣはＣ、及びＯはＯ）の後、０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内にあるものとして規定することができる。アラインメントは、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａに対する、問題のグリコシルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標のオーバーラップが最大となる、最良のモデルが配向及び配列されてから、行うことができる。一番良いモデルは、利用可能な最も高い分解能を与える結晶構造解析モデルである。２つ以上の異なるモデルが等しい分解能を有する場合、以下の式を用いて、実験の回折データに対して最も低いＲ因子を有するモデルを用いる。
【００７０】
【数１】
2016533739.tif 000003
【００７１】
類似の機能的性質：第２の関係するポリペプチドの特定の残基に機能的に類似した第１のポリペプチド（例えば第１のグリコシルヒドラーゼ及びＨ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ）における等価なアミノ酸残基とは、第２の関係するポリペプチド（例えばＨ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ）の特定の残基について決定され、かつ起因する様式で、ポリペプチドの構造、基質結合性、又は触媒作用を変更、改質、又はこれらに寄与するようにコンホメーションを取り入れる、第１のポリペプチドにおけるこれらのアミノ酸として定義される。第１のポリペプチドに対する三次構造がＸ線結晶構造解析で得られると、第２のポリペプチドに機能的に類似の、第１のポリペプチドのアミノ酸残基は、相同位置を占めることを基準にすると所与の残基の主鎖原子が等価の基準を満たさないかもしれないが、少なくとも２つの残基の側鎖原子の原子座標が、第２のポリペプチド（例えばＨ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ）の対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ内に収まるという程度には類似の位置を占める。
【００７２】
変異酵素（例えばＧＨ６１変異体）に関する用語「向上した」又は「向上した性質」又は「向上した性能」等は、本明細書において、それぞれの親酵素と比較して向上した変異酵素に関係する性能又は活性と定義される。向上した性質としては、宿主細胞からの向上した産生又はその中での発現（場合によっては収率と称される）、向上した熱安定性又は変化した温度依存活性プロファイル、所望のｐＨ又はｐＨ範囲における向上した活性又は安定性、向上した基質特異性、向上した産生物特異性、及び、セルロース加水分解工程において、化学又は他の成分の存在下での向上した安定性等が挙げられるが、これらに限定されない。向上した性能は、（ａ）発現（タンパク質含量の決定、又は収率）、（ｂ）熱安定性及び／又は融解温度（Ｔｍ）、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイを含むがこれらに限定されない特定のアッセイを使用して決定してよい。
【００７３】
変異ポリペプチド（例えばＧＨ６１変異体）に関する用語「向上した熱安定性」とは、本明細書では、親酵素に対して、高い温度で一定期間インキュベーションした後に、酵素活性の維持（又は、具体的に、ＧＨ６１酵素の場合には、セルラーゼ活性を増強する酵素の能力の維持）を示す変異酵素として定義される。かかる変異体は、親と比較して変化した熱活性プロファイルを示しても、又は示さなくてもよい。例えば、変異体は親と比較して、高温でのインキュベーションの後に向上したリフォールディング能力を有してよい。
【００７４】
「向上した産生物特異性」とは、親酵素と比較して変化した産生物プロファイルを示す変異酵素を意味し、ここで、変異体の変化した産生物プロファイルは、親と比較して所与の用途において向上している。「産生物プロファイル」とは、本明細書では、対象の酵素により産生される反応産生物の化学組成として定義される。
【００７５】
「向上した化学的安定性」とは、一定時間のインキュベーションの後、同一条件下では親酵素の酵素活性を低下させる化学物質（１つ又は複数）の存在下で、変異酵素が酵素活性の維持を示すことを意味する。向上した化学的安定性を有する変異体は、親酵素と比較して、かかる化学物質の存在下で反応をより良好に触媒することができる。
【００７６】
酵素に関する「ｐＨ範囲」とは、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を意味する。
【００７７】
酵素に関する用語「ｐＨ安定な」及び「ｐＨ安定性」とは、所定の期間（例えば１５分、３０分、１時間）、広範なｐＨ値にわたり、酵素が活性を維持する能力に関する。
【００７８】
「パーセント配列同一性」又は文法的に同様の表現は、アラインメントアルゴリズムを使用して、特定の配列が、特定の参照配列におけるアミノ酸残基に同一な、少なくとも一定の割合のアミノ酸残基を有することを意味する。配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立生物工学情報センター（＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）から一般に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列での同一の長さのワードと位置合わせした場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するか、又は満たすかのいずれかのクエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらの最初の隣のワードのヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための起点として機能する。ワードのヒットは、累積のアラインメントスコアをできる限り増加することができる限り、比較される２つの配列のそれぞれに沿って、両方の方向に拡大される。ワードのヒットの拡張は、最大の達成値からの累積アラインメントスコアの低下が数Ｘになるか、累積スコアがゼロ若しくはそれ未満になるか、又は配列のいずれかの終端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００７９】
次いで、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１指標は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、かつ最も好ましくは約０．００１未満であれば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似していると考えられる。
【００８０】
パーセント配列同一性に疑問が生じた際は、デフォルトパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用したアラインメントで決定する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照のこと。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターは、以下の通りである：
【００８１】
【表１】
2016533739.tif 000004
【００８２】
ＩＩ．分子生物学
本発明の実施形態は、対象の宿主細胞（例えば、糸状菌）において機能するプロモーターの制御下での、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸からの、所望のグリコシルヒドロラーゼ酵素（又はグリコシルヒドロラーゼ酵素の組み合わせ）の発現を提供する。したがって、本発明は、組換え遺伝学分野の、多くのルーチン技術に依存する。好適な組換え遺伝学の方法の例を開示する基本文献は、上記の通りである。
【００８３】
本発明では、親核酸／ポリペプチドに変異を導入することができる、当該技術分野において既知の任意の方法が想定されている。
【００８４】
本発明は、変異ＧＨ６１酵素、例えばＧＨ６１酵素の発現、精製、及び／又は単離、並びに使用に関する。これらの酵素は、配列番号２〜１１、１３、１４、及び１６のＧＨ６１Ａ／ＧＨ６１酵素、例えばＨ．ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａを含む、当該技術分野において既知のＧＨ６１酵素をコードする、多数のｇｈ６１遺伝子のいずれかを利用する組換え方法により調製されてよい。部分特異的突然変異誘発を含む、変異を導入するための任意の便利な方法を用いてよい。上で示した通り、突然変異（又は変異）としては、置換、付加、欠失又はトランケーションが挙げられ、これらは、発現したＧＨ６１変異体内での１つ又は２つ以上のアミノ酸の変化に対応する。また、ＤＮＡレベルで、発現タンパク質にアミノ酸の変化を組み込む部分特異的突然変異誘発及び他の方法は、多くの参照文献、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．２０１２、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌに見出すことができる。
【００８５】
親ＧＨ６１のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において既知の種々の方法により調製される。これらの方法としては、部分特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及び、先に調製した親ＧＨ６１Ａ酵素をコードするＤＮＡのカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
部位特異的突然変異誘発は、置換変異体の調製に用いることが可能な方法の１つである。本技術は、当該技術分野において周知である（例えばＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）、及びＫｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８（１９８７）を参照のこと）。手短に言えば、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発の実施においては、最初に、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、かかる開始ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズすることにより、開始ＤＮＡを変更する。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、かつ開始ＤＮＡの一本鎖を鋳型として使用することで、ＤＮＡポリメラーゼを、第２の鎖全体を合成するために使用する。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは、得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
【００８７】
ＰＣＲ突然変異誘発もまた、親ＧＨ６１のアミノ酸配列変異体を作製するのに好適である。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７〜１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、及びＶａｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３〜７３３（１９８９）を参照のこと。手短に言えば、少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲでの出発物質として使用する場合、鋳型ＤＮＡでの対応する領域と、僅かに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型とは異なる位置においてのみ、鋳型配列とは異なる特異的ＤＮＡ断片を比較的大量に作製することができる。
【００８８】
変異体を調製する別の方法である、カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５）により記載されている技術に基づく。出発物質は、変異される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異される出発ＤＮＡ内のコドンは同定される。同定された変異部位のそれぞれの側には、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。かかる制限部位が存在しない場合、開始ポリペプチドＤＮＡの適切な位置にかかる部位を導入するために、上述したオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を使用してかかる部位を作製してよい。プラスミドＤＮＡはこれらの位置で切断され、直鎖状にされる。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な手順を使用して合成され、オリゴヌクレオチドの二本鎖は、標準的な技術を使用して別々に合成された後、共にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドに直接結合することができるように、直鎖状プラスミドの末端と適合性のある５’及び３’末端部を有するように設計されている。ここで、このプラスミドは変異ＤＮＡ配列を含有する。
【００８９】
あるいは、又は更に、所望のＧＨ６１変異体の所望のアミノ酸配列を決定することができ、かつ、かかるＧＨ６１変異体をコードする核酸配列を合成により作製することができる。
【００９０】
このように調製した所望のＧＨ６１は多くの場合、使用目的に応じ、更なる改変を受けてよい。かかる修飾は更に、アミノ酸配列の変更、異種ポリペプチドとの融合、及び／又は共有結合修飾を含んでよい。
【００９１】
ＩＩＩ．変異ＧＨ６１ポリペプチド及びそれをコードする核酸
一態様では、変異ＧＨ６１酵素を提供する。特定の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素は親ＧＨ６１酵素に対して、本明細書で説明する通り、１つ又は２つ以上の変異を有し、かつ更に、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３）の成熟形態に少なくとも６０％（即ち、６０％又はそれ以上であるが、１００％未満）のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び最大９９．６％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、親ＧＨ６１は（上で定義した）真菌ＧＨ６１Ａである。更に、変異ＧＨ６１酵素はセルラーゼ増強活性を有し、ある種の実施形態においては、変異ＧＨ６１は（本明細書で詳細に記すように）親ＧＨ６１と比較して、向上した性質を有する。野生型のＨ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの完全長形態に対するアミノ酸配列を、図１に示す（配列番号２）。多くの他のグリコシルヒドロラーゼを有する、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの触媒ドメイン及び糖質結合ドメインの配列アラインメントをそれぞれ、図２及び３に示す。
【００９２】
特定の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素は、Ｈ．ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａの成熟形態（配列番号３）における１つ又は２つ以上のアミノ酸位置での、アミノ酸変異を含む。本発明の態様に従った一定の親ＧＨ６１酵素は、Ｈ．ジェコリーナの野生型ＧＨ６１Ａと同一のアミノ酸を有しない場合があるため、上記の残基（例えばアミノ酸位置Ｉ１４４）に対応するアミノ酸位置はまた、位置番号のみ（例えばアミノ酸位置１４４）で、又は接頭辞「Ｘ」を付けて（例えばアミノ酸位置Ｘ１４４）のいずれかで、指定され得る。ここで、Ｈ．ジェコリーナ由来のＧＨ６１Ａにおける特定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置を指定する、３つ全ての方法は、同じ意味であることを留意すべきである。場合によっては、語句「位置（位）」は除外される場合がある（例えばアミノ酸１４４、アミノ酸Ｋ１４４、又はアミノ酸Ｘ１４４）。
【００９３】
ＧＨ６１変異体のアミノ酸配列は、親アミノ酸配列のうちの１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により、親ＧＨ６１のアミノ酸配列とは異なる。Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの特定の残基若しくはその残基の一部に相同である（即ち、一次若しくは三次構造のいずれかで、位置が対応する）か、又は機能的に類似する（即ち、結合、反応、若しくは化学的若しくは構造的に相互作用する、機能的に同一若しくは類似の能力を有する）場合、ＧＨ６１変異体の残基（アミノ酸）は、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａの残基と等価である。本明細書で使用する場合、ナンバリングは、図１に示している成熟ＧＨ６１Ａアミノ酸配列のものに対応することを意図している。
【００９４】
相同性を決定するためのアミノ酸配列のアラインメントは、「配列比較アルゴリズム」を用いて決定することができる。比較のための配列の最適アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＡＬＤＨＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＡＬＤＨＡＳＴＡ）により、目視検査により、又はＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）によるＭＯＥにより実施することができる。上の「定義」セクションで提供した「パーセント配列同一性」の記載もまた、参照のこと。
【００９５】
特定の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素における変異は、コホート（１〜４）（実施例３を参照）に示すアミノ酸置換であり、置換部位は、Ｈ．ジェコリーナのＧＨ６１Ａの成熟形態（配列番号３）に対応する。いくつかの実施形態では、変異ＧＨ６１Ａ変異体は更に、野生型コホート（実施例３を参照）に示すアミノ酸置換を含む。コホート１〜４に示す置換の、可能なあらゆる組み合わせが、想定された本発明の実施形態であり、以下が含まれるが、これらに限定されない。
１．親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ（ａ）発現、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイの性能、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイの性能から選択される少なくとも１つにおいて、前記親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質を有し、前記変異体は、配列番号３のアミノ酸１１１〜１１４及び１４４〜１６３に対応する１つ又は２つ以上の位置にて、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、変異体。
２．前記変異体は、向上した熱安定性及び／又はＴｍを有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｆ、Ｌ１４８Ｐ、Ａ１４９Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｖ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｑ、Ｎ１５２Ｓ、Ｎ１５２Ｙ、Ｌ１５５Ｍ、Ｒ１５６Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ｅ１５８Ｗ、Ｅ１５８Ｙ、Ｉ１５９Ｑ、Ｉ１６０Ｄ、Ｉ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｅ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１６２Ｆ、Ｈ１６３Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１に記載の変異体。
３．前記変異体は、ｗｈＰＣＳ加水分解アッセイにて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｋ、Ｉ１４４Ｒ、Ｉ１４４Ｓ、Ｐ１４５Ｇ、Ｐ１４５Ｈ、Ｐ１４５Ｉ、Ｐ１４５Ｋ、Ｐ１４５Ｒ、Ｐ１４５Ｓ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ１４６Ａ、Ｄ１４６Ｃ、Ｄ１４６Ｅ、Ｄ１４６Ｆ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｍ、Ｄ１４６Ｑ、Ｄ１４６Ｔ、Ｄ１４６Ｙ、Ｎ１４７Ｆ、Ｎ１４７Ｍ、Ｌ１４８Ｋ、Ｌ１４８Ｖ、Ａ１４９Ｃ、Ａ１４９Ｄ、Ａ１４９Ｆ、Ａ１４９Ｇ、Ａ１４９Ｉ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｖ、Ｐ１５０Ａ、Ｐ１５０Ｃ、Ｐ１５０Ｄ、Ｐ１５０Ｅ、Ｐ１５０Ｆ、Ｐ１５０Ｇ、Ｐ１５０Ｈ、Ｐ１５０Ｉ、Ｐ１５０Ｋ、Ｐ１５０Ｌ、Ｐ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｆ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｉ、Ｇ１５１Ｋ、Ｇ１５１Ｍ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｖ、Ｇ１５１Ｗ、Ｇ１５１Ｙ、Ｎ１５２Ｅ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｈ、Ｎ１５２Ｋ、Ｎ１５２Ｐ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｐ、Ｙ１５３Ｑ、Ｙ１５３Ｒ、Ｙ１５３Ｓ、Ｙ１５３Ｖ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｃ、Ｖ１５４Ｄ、Ｖ１５４Ｅ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｈ、Ｖ１５４Ｋ、Ｖ１５４Ｎ、Ｖ１５４Ｐ、Ｖ１５４Ｑ、Ｖ１５４Ｒ、Ｖ１５４Ｔ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｎ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｆ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｌ、Ｒ１５６Ｍ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ｑ、Ｈ１５７Ｄ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｃ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｈ、Ｅ１５８Ｉ、Ｅ１５８Ｌ、Ｅ１５８Ｍ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｐ、Ｅ１５８Ｓ、Ｅ１５８Ｔ、Ｅ１５８Ｗ、Ａ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｎ、Ｈ１６３Ａ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｅ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｇ、Ｈ１６３Ｉ、Ｈ１６３Ｋ、Ｈ１６３Ｍ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｔ、Ｈ１６３Ｖ、Ｈ１６３Ｗ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１又は２に記載の変異体。
４．前記変異体は、ｄａＣＳ加水分解アッセイにおいて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｆ１１２Ｖ、Ｋ１１３Ｌ、Ｋ１１３Ｍ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１１３Ｒ、Ｋ１１３Ｓ、Ｉ１１４Ｆ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１４４Ｆ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１４５Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｖ１５４Ｔ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１、２又は３に記載の変異体。
５．前記変異体は、Ｆ１１２Ｍ、Ｆ１１２Ｗ、Ｋ１１３Ｐ、Ｋ１１３Ｔ、Ｉ１１４Ｌ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１４４Ａ、Ｉ１４４Ｃ、Ｉ１４４Ｄ、Ｉ１４４Ｅ、Ｉ１４４Ｈ、Ｉ１４４Ｎ、Ｉ１４４Ｐ、Ｉ１４４Ｑ、Ｉ１４４Ｔ、Ｉ１４４Ｗ、Ｉ１４４Ｙ、Ｐ１４５Ｃ、Ｐ１４５Ｄ、Ｐ１４５Ｅ、Ｐ１４５Ｆ、Ｐ１４５Ｌ、Ｐ１４５Ｍ、Ｐ１４５Ｎ、Ｐ１４５Ｑ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４５Ｗ、Ｐ１４５Ｙ、Ｄ１４６Ｇ、Ｄ１４６Ｈ、Ｄ１４６Ｉ、Ｄ１４６Ｌ、Ｄ１４６Ｎ、Ｄ１４６Ｐ、Ｄ１４６Ｒ、Ｄ１４６Ｓ、Ｄ１４６Ｖ、Ｄ１４６Ｗ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｃ、Ｎ１４７Ｄ、Ｎ１４７Ｅ、Ｎ１４７Ｇ、Ｎ１４７Ｈ、Ｎ１４７Ｉ、Ｎ１４７Ｋ、Ｎ１４７Ｌ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｑ、Ｎ１４７Ｒ、Ｎ１４７Ｓ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｖ、Ｎ１４７Ｗ、Ｎ１４７Ｙ、Ｌ１４８Ａ、Ｌ１４８Ｃ、Ｌ１４８Ｄ、Ｌ１４８Ｅ、Ｌ１４８Ｆ、Ｌ１４８Ｇ、Ｌ１４８Ｈ、Ｌ１４８Ｉ、Ｌ１４８Ｍ、Ｌ１４８Ｎ、Ｌ１４８Ｑ、Ｌ１４８Ｒ、Ｌ１４８Ｓ、Ｌ１４８Ｔ、Ｌ１４８Ｗ、Ｌ１４８Ｙ、Ａ１４９Ｅ、Ａ１４９Ｈ、Ａ１４９Ｋ、Ａ１４９Ｌ、Ａ１４９Ｍ、Ａ１４９Ｑ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｓ、Ａ１４９Ｔ、Ａ１４９Ｗ、Ａ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｍ、Ｐ１５０Ｎ、Ｐ１５０Ｒ、Ｐ１５０Ｓ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５０Ｖ、Ｐ１５０Ｗ、Ｐ１５０Ｙ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５１Ｃ、Ｇ１５１Ｄ、Ｇ１５１Ｌ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｒ、Ｇ１５１Ｔ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｃ、Ｎ１５２Ｄ、Ｎ１５２Ｉ、Ｎ１５２Ｌ、Ｎ１５２Ｍ、Ｎ１５２Ｒ、Ｎ１５２Ｔ、Ｎ１５２Ｖ、Ｎ１５２Ｗ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｃ、Ｙ１５３Ｄ、Ｙ１５３Ｅ、Ｙ１５３Ｇ、Ｙ１５３Ｈ、Ｙ１５３Ｉ、Ｙ１５３Ｎ、Ｙ１５３Ｔ、Ｙ１５３Ｗ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｉ、Ｖ１５４Ｌ、Ｖ１５４Ｍ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ｗ、Ｖ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｎ、Ｒ１５６Ｔ、Ｒ１５６Ｖ、Ｒ１５６Ｗ、Ｒ１５６Ｙ、Ｈ１５７Ａ、Ｈ１５７Ｃ、Ｈ１５７Ｅ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｇ、Ｈ１５７Ｉ、Ｈ１５７Ｋ、Ｈ１５７Ｌ、Ｈ１５７Ｍ、Ｈ１５７Ｎ、Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１５７Ｑ、Ｈ１５７Ｒ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｖ、Ｈ１５７Ｙ、Ｅ１５８Ｇ、Ｅ１５８Ｋ、Ｅ１５８Ｒ、Ｅ１５８Ｖ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｃ、Ｉ１５９Ｄ、Ｉ１５９Ｅ、Ｉ１５９Ｆ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１５９Ｈ、Ｉ１５９Ｋ、Ｉ１５９Ｌ、Ｉ１５９Ｍ、Ｉ１５９Ｎ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ｓ、Ｉ１５９Ｔ、Ｉ１５９Ｖ、Ｉ１５９Ｗ、Ｉ１５９Ｙ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｃ、Ｉ１６０Ｅ、Ｉ１６０Ｇ、Ｉ１６０Ｈ、Ｉ１６０Ｋ、Ｉ１６０Ｌ、Ｉ１６０Ｍ、Ｉ１６０Ｎ、Ｉ１６０Ｐ、Ｉ１６０Ｑ、Ｉ１６０Ｒ、Ｉ１６０Ｓ、Ｉ１６０Ｔ、Ｉ１６０Ｖ、Ｉ１６０Ｗ、Ｉ１６０Ｙ、Ａ１６１Ｄ、Ａ１６１Ｆ、Ａ１６１Ｇ、Ａ１６１Ｈ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｋ、Ａ１６１Ｍ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｐ、Ａ１６１Ｑ、Ａ１６１Ｒ、Ａ１６１Ｓ、Ａ１６１Ｔ、Ａ１６１Ｖ、Ａ１６１Ｗ、Ｌ１６２Ｃ、Ｌ１６２Ｄ、Ｌ１６２Ｅ、Ｌ１６２Ｇ、Ｌ１６２Ｈ、Ｌ１６２Ｋ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６２Ｐ、Ｌ１６２Ｑ、Ｌ１６２Ｒ、Ｌ１６２Ｓ、Ｌ１６２Ｔ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６２Ｗ、Ｌ１６２Ｙ、Ｈ１６３Ｑ、Ｈ１６３Ｓ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の第２のアミノ酸置換を更に含む、１〜４に記載の変異体。
６．前記変異体は、Ｆ１１２Ｖ置換を含む、１に記載の変異体。
７．前記変異体は、Ｋ１１３Ｌ置換を含む、１又は６に記載の変異体。
８．前記変異体は、Ｋ１１３Ｍ置換を含む、１又は６に記載の変異体。
９．前記変異体は、Ｋ１１３Ｎ置換を含む、１又は６に記載の変異体。
１０．前記変異体は、Ｋ１１３Ｒ置換を含む、１又は６に記載の変異体。
１１．前記変異体は、Ｋ１１３Ｓ置換を含む、１又は６に記載の変異体。
１２．前記変異体は、Ｉ１１４Ｆ置換を含む、１又は６〜１１に記載の変異体。
１３．前記変異体は、Ｉ１１４Ｖ置換を含む、１又は６〜１１に記載の変異体。
１４．前記変異体は、Ｉ１４４Ｆ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
１５．前記変異体は、Ｉ１４４Ｇ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
１６．前記変異体は、Ｉ１４４Ｋ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
１７．前記変異体は、Ｉ１４４Ｒ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
１８．前記変異体は、Ｉ１４４Ｓ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
１９．前記変異体は、Ｉ１４４Ｖ置換を含む、１又は６〜１３に記載の変異体。
２０．前記変異体は、Ｐ１４５Ａ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２１．前記変異体は、Ｐ１４５Ｇ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２２．前記変異体は、Ｐ１４５Ｈ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２３．前記変異体は、Ｐ１４５Ｉ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２４．前記変異体は、Ｐ１４５Ｋ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２５．前記変異体は、Ｐ１４５Ｒ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２６．前記変異体は、Ｐ１４５Ｓ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２７．前記変異体は、Ｐ１４５Ｖ置換を含む、１又は６〜１９に記載の変異体。
２８．前記変異体は、Ｄ１４６Ａ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
２９．前記変異体は、Ｄ１４６Ｃ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３０．前記変異体は、Ｄ１４６Ｅ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３１．前記変異体は、Ｄ１４６Ｆ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３２．前記変異体は、Ｄ１４６Ｋ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３３．前記変異体は、Ｄ１４６Ｍ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３４．前記変異体は、Ｄ１４６Ｑ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３５．前記変異体は、Ｄ１４６Ｔ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３６．前記変異体は、Ｄ１４６Ｙ置換を含む、１又は６〜２７に記載の変異体。
３７．前記変異体は、Ｎ１４７Ｆ置換を含む、１又は６〜３６に記載の変異体。
３８．前記変異体は、Ｎ１４７Ｍ置換を含む、１又は６〜３６に記載の変異体。
３９．前記変異体は、Ｌ１４８Ｋ置換を含む、１又は６〜３８に記載の変異体。
４０．前記変異体は、Ｌ１４８Ｐ置換を含む、１又は６〜３８に記載の変異体。
４１．前記変異体は、Ｌ１４８Ｖ置換を含む、１又は６〜３８に記載の変異体。
４２．前記変異体は、Ａ１４９Ｃ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４３．前記変異体は、Ａ１４９Ｄ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４４．前記変異体は、Ａ１４９Ｆ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４５．前記変異体は、Ａ１４９Ｇ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４６．前記変異体は、Ａ１４９Ｉ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４７．前記変異体は、Ａ１４９Ｎ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４８．前記変異体は、Ａ１４９Ｐ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
４９．前記変異体は、Ａ１４９Ｖ置換を含む、１又は６〜４１に記載の変異体。
５０．前記変異体は、Ｐ１５０Ａ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５１．前記変異体は、Ｐ１５０Ｃ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５２．前記変異体は、Ｐ１５０Ｄ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５３．前記変異体は、Ｐ１５０Ｅ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５４．前記変異体は、Ｐ１５０Ｆ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５５．前記変異体は、Ｐ１５０Ｇ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５６．前記変異体は、Ｐ１５０Ｈ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５７．前記変異体は、Ｐ１５０Ｉ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５８．前記変異体は、Ｐ１５０Ｋ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
５９．前記変異体は、Ｐ１５０Ｌ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
６０．前記変異体は、Ｐ１５０Ｑ置換を含む、１又は６〜４９に記載の変異体。
６１．前記変異体は、Ｇ１５１Ｅ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６２．前記変異体は、Ｇ１５１Ｆ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６３．前記変異体は、Ｇ１５１Ｈ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６４．前記変異体は、Ｇ１５１Ｉ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６５．前記変異体は、Ｇ１５１Ｋ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６６．前記変異体は、Ｇ１５１Ｍ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６７．前記変異体は、Ｇ１５１Ｐ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６８．前記変異体は、Ｇ１５１Ｑ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
６９．前記変異体は、Ｇ１５１Ｓ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
７０．前記変異体は、Ｇ１５１Ｖ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
７１．前記変異体は、Ｇ１５１Ｗ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
７２．前記変異体は、Ｇ１５１Ｙ置換を含む、１又は６〜６０に記載の変異体。
７３．前記変異体は、Ｎ１５２Ｅ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７４．前記変異体は、Ｎ１５２Ｆ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７５．前記変異体は、Ｎ１５２Ｇ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７６．前記変異体は、Ｎ１５２Ｈ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７７．前記変異体は、Ｎ１５２Ｋ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７８．前記変異体は、Ｎ１５２Ｐ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
７９．前記変異体は、Ｎ１５２Ｑ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
８０．前記変異体は、Ｎ１５２Ｓ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
８１．前記変異体は、Ｎ１５２Ｙ置換を含む、１又は６〜７２に記載の変異体。
８２．前記変異体は、Ｙ１５３Ｆ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８３．前記変異体は、Ｙ１５３Ｋ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８４．前記変異体は、Ｙ１５３Ｌ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８５．前記変異体は、Ｙ１５３Ｍ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８６．前記変異体は、Ｙ１５３Ｐ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８７．前記変異体は、Ｙ１５３Ｑ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８８．前記変異体は、Ｙ１５３Ｒ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
８９．前記変異体は、Ｙ１５３Ｓ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
９０．前記変異体は、Ｙ１５３Ｖ置換を含む、１又は６〜８１に記載の変異体。
９１．前記変異体は、Ｖ１５４Ａ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９２．前記変異体は、Ｖ１５４Ｃ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９３．前記変異体は、Ｖ１５４Ｄ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９４．前記変異体は、Ｖ１５４Ｅ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９５．前記変異体は、Ｖ１５４Ｇ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９６．前記変異体は、Ｖ１５４Ｈ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９７．前記変異体は、Ｖ１５４Ｋ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９８．前記変異体は、Ｖ１５４Ｎ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
９９．前記変異体は、Ｖ１５４Ｐ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
１００．前記変異体は、Ｖ１５４Ｑ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
１０１．前記変異体は、Ｖ１５４Ｒ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
１０２．前記変異体は、Ｖ１５４Ｔ置換を含む、１又は６〜９０に記載の変異体。
１０３．前記変異体は、Ｌ１５５Ｃ置換を含む、１又は６〜１０２に記載の変異体。
１０４．前記変異体は、Ｌ１５５Ｆ置換を含む、１又は６〜１０２に記載の変異体。
１０５．前記変異体は、Ｌ１５５Ｋ置換を含む、１又は６〜１０２に記載の変異体。
１０６．前記変異体は、Ｌ１５５Ｍ置換を含む、１又は６〜１０２に記載の変異体。
１０７．前記変異体は、Ｌ１５５Ｎ置換を含む、１又は６〜１０２に記載の変異体。
１０８．前記変異体は、Ｒ１５６Ａ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１０９．前記変異体は、Ｒ１５６Ｃ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１０．前記変異体は、Ｒ１５６Ｄ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１１．前記変異体は、Ｒ１５６Ｄ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１２．前記変異体は、Ｒ１５６Ｆ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１３．前記変異体は、Ｒ１５６Ｈ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１４．前記変異体は、Ｒ１５６Ｉ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１５．前記変異体は、Ｒ１５６Ｋ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１６．前記変異体は、Ｒ１５６Ｌ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１７．前記変異体は、Ｒ１５６Ｍ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１８．前記変異体は、Ｒ１５６Ｐ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１１９．前記変異体は、Ｒ１５６Ｑ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１２０．前記変異体は、Ｒ１５６Ｓ置換を含む、１又は６〜１０７に記載の変異体。
１２１．前記変異体は、Ｈ１５７Ｄ置換を含む、１又は６〜１２０に記載の変異体。
１２２．前記変異体は、Ｈ１５７Ｗ置換を含む、１又は６〜１２０に記載の変異体。
１２３．前記変異体は、Ｅ１５８Ａ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２４．前記変異体は、Ｅ１５８Ｃ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２５．前記変異体は、Ｅ１５８Ｄ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２６．前記変異体は、Ｅ１５８Ｆ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２７．前記変異体は、Ｅ１５８Ｈ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２８．前記変異体は、Ｅ１５８Ｉ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１２９．前記変異体は、Ｅ１５８Ｌ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３０．前記変異体は、Ｅ１５８Ｍ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３１．前記変異体は、Ｅ１５８Ｎ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３２．前記変異体は、Ｅ１５８Ｐ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３３．前記変異体は、Ｅ１５８Ｓ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３４．前記変異体は、Ｅ１５８Ｔ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３５．前記変異体は、Ｅ１５８Ｗ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３６．前記変異体は、Ｅ１５８Ｙ置換を含む、１又は６〜１２２に記載の変異体。
１３７．前記変異体は、Ｉ１５９Ｑ置換を含む、１又は６〜１３６に記載の変異体。
１３８．前記変異体は、Ｉ１６０Ｄ置換を含む、１又は６〜１３７に記載の変異体。
１３９．前記変異体は、Ｉ１６０Ｆ置換を含む、１又は６〜１３７に記載の変異体。
１４０．前記変異体は、Ａ１６１Ｃ置換を含む、１又は６〜１３９に記載の変異体。
１４１．前記変異体は、Ａ１６１Ｅ置換を含む、１又は６〜１３９に記載の変異体。
１４２．前記変異体は、Ａ１６１Ｌ置換を含む、１又は６〜１３９に記載の変異体。
１４３．前記変異体は、Ａ１６１Ｙ置換を含む、１又は６〜１３９に記載の変異体。
１４４．前記変異体は、Ｌ１６２Ａ置換を含む、１又は６〜１４３に記載の変異体。
１４５．前記変異体は、Ｌ１６２Ｆ置換を含む、１又は６〜１４３に記載の変異体。
１４６．前記変異体は、Ｌ１６２Ｉ置換を含む、１又は６〜１４３に記載の変異体。
１４７．前記変異体は、Ｌ１６２Ｎ置換を含む、１又は６〜１４３に記載の変異体。
１４８．前記変異体は、Ｈ１６３Ａ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１４９．前記変異体は、Ｈ１６３Ｃ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５０．前記変異体は、Ｈ１６３Ｄ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５１．前記変異体は、Ｈ１６３Ｅ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５２．前記変異体は、Ｈ１６３Ｆ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５３．前記変異体は、Ｈ１６３Ｇ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５４．前記変異体は、Ｈ１６３Ｉ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５５．前記変異体は、Ｈ１６３Ｋ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５６．前記変異体は、Ｈ１６３Ｌ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５７．前記変異体は、Ｈ１６３Ｍ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５８．前記変異体は、Ｈ１６３Ｐ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１５９．前記変異体は、Ｈ１６３Ｒ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１６０．前記変異体は、Ｈ１６３Ｔ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１６１．前記変異体は、Ｈ１６３Ｖ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１６２．前記変異体は、Ｈ１６３Ｗ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１６３．前記変異体は、Ｈ１６３Ｙ置換を含む、１又は６〜１４７に記載の変異体。
１６４．前記親ＧＨ６１酵素は、真菌グリコシドヒドロラーゼファミリー６１ａ（ＧＨ６１Ａ）酵素である、１〜１６３のいずれか１つに記載の変異体。
【００９６】
別の態様では、（例えば上述の）親ＧＨ６１酵素に対して１つ又は２つ以上の変異を有する変異ＧＨ６１酵素をコードする核酸を提供する。特定の実施形態において、核酸によりコードされた親ＧＨ６１酵素は、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３）に対して、少なくとも約８０％（即ち、８０％又はそれ以上であるが、１００％未満）のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素をコードする核酸は、（シグナル配列をコードする核酸部分を除き）配列番号１に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは少なくとも９９．９％相同／同一である。遺伝暗号の縮退により、複数の核酸が同一の変異ＧＨ６１酵素をコードする場合があることが理解されよう。更に、本明細書に記載した変異ＧＨ６１酵素をコードする核酸は、組換えを行ってコドン最適化して、例えば対象の宿主細胞内での発現を向上させてよい。ある種のコドン最適化技術は、当技術分野において既知である。
【００９７】
ある種の実施形態において、変異ＧＨ６１酵素をコードする核酸は、ストリンジェントな条件下で、（シグナル配列をコードする核酸部分を除いて）配列番号：１に少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の相同性／同一性を有するＧＨ６１をコードする（又はそれをコードする核酸に相補的な）核酸にハイブリダイズする。
【００９８】
核酸は、シグナル配列を含む「完全長の」（「ｆｌ」又は「ＦＬ」）変異ＧＨ６１酵素をコードしていてもよいし、シグナル配列を欠いた変異ＧＨ６１酵素の成熟形態のみをコードしていてもよいし、又は、成熟形態のＮ末端部分及び／又はＣ末端部分を欠いた変異ＧＨ６１酵素のトランケーション形態をコードしていてもよい。
【００９９】
変異ＧＨ６１酵素をコードする核酸は、以下に記載するように、対象の宿主細胞内で変異ＧＨ６１酵素を発現させるのに好適なベクター内で、種々のプロモーター及びレギュレーターに作用可能に結合させることができる。
【０１００】
ＩＶ．組換えＧＨ６１変異体の発現
本発明の態様は、ＧＨ６１変異体をコードする核酸の生成に関係する方法及び組成物、かかる核酸を含有する宿主細胞、かかる宿主細胞によるＧＨ６１変異体の産生、並びにＧＨ６１変異体の単離、精製、及び／又は使用を含む。
【０１０１】
したがって、本発明の実施形態は、所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを形質導入、形質転換又はトランスフェクションした宿主細胞を提供する。例えば、所望のＧＨ６１変異体が細胞株の中で発現するように、糸状菌又は酵母細胞に、所望のＧＨ６１変異体をコードするＤＮＡセグメントに作用可能に結合した、プロモーター若しくは生物学的に活性なプロモーター断片、又は宿主細胞株内で機能する１つ又は２つ以上の（例えばひと続きの）エンハンサーを有する発現ベクターをトランスフェクションする。
【０１０２】
Ａ．核酸構築物／発現ベクター
所望のＧＨ６１変異体をコードする天然又は合成ポリヌクレオチドの断片は、対象の宿主細胞（例えば、糸状菌細胞又は酵母細胞）の中に導入、又はその中で複製可能な異種核酸構築物若しくはベクターの中に組み込まれてよい。本明細書にて開示したベクター及び方法は、所望のＧＨ６１変異体の発現に対する宿主細胞での使用に、好適である。ベクターが導入される宿主細胞内で、所望の複製／発現特性（かかる特性は一般に、使用者により規定される）を満たす限り、任意のベクターを使用してよい。多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、それらの一部は市販されている。クローニング及び発現ベクターもまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１に記載されており、これらはそれぞれ、明示的に本明細書に参照により組み込まれる。真菌用の適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６〜４２８に記載されている。適切なＤＮＡ配列を、種々の手順によりプラスミド又はベクター（本明細書では合わせて「ベクター」と称する）に挿入してよい。一般に、ＤＮＡ配列は標準的な手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位の中に挿入される。かかる手順及び関係するサブクローニングの手順は、当業者の知見の範囲内であると考えられる。
【０１０３】
所望のＧＨ６１変異体に対するコード配列を含む組換え宿主細胞は、所望の宿主細胞（例えば、以下で更に詳細に記載している）内に、所望のＧＨ６１変異体コード配列を含む異種核酸構築物を導入することにより作り出されてもよい。例えば、所望のＧＨ６１変異体コード配列を、周知の組換え技術に従って好適なベクターに挿入して使用し、ＧＨ６１の発現が可能な糸状菌の形質転換を行ってよい。上で既に述べた通り、本来有する遺伝暗号の縮退による、実質的に同一であるか、又は機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を使用して、所望のＧＨ６１変異体をクローニングし、発現させてよい。したがって、コード領域でのかかる置換は、本発明が対象とする配列変異体に含まれると理解される。
【０１０４】
本発明はまた、上述の、１つ又は２つ以上の所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸配列を含む、組換え核酸構築物も含む。この構築物は、本発明の配列が、順方向又は逆方向で挿入される、プラスミド又はウイルスベクター等のベクターを含む。
【０１０５】
異種核酸構築物は、所望のＧＨ６１変異体のコード配列を（ｉ）単独で；（ｉｉ）融合ポリペプチド又はシグナルペプチドコード配列等の、追加のコード配列と組み合わせて（ここで、所望のＧＨ６１変異体コード配列は優性コード配列である）；（ｉｉｉ）好適な宿主のコード配列の発現に効果的な、イントロン等の非コード配列、及びプロモーター因子及びターミネーター因子等の調節因子、又は５’及び／若しくは３’非翻訳領域と組み合わせて；並びに／又は（ｉｖ）所望のＧＨ６１変異体コード配列が異種遺伝子であるベクター若しくは宿主環境で、含んでよい。
【０１０６】
本発明の一態様では、異種核酸構築物を使用して、所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで宿主細胞、例えば樹立した糸状菌及び酵母菌株に導入する。所望のＧＨ６１変異体の長期間にわたる産生は、ＧＨ６１変異体の安定した発現を有する宿主細胞を生成することにより達成可能である。したがって当然、安定した形質転換細胞を生成するのに有効な任意の方法を、本発明の実施に使用してよいということになる。
【０１０７】
適切なベクターは通常、選択マーカーをコードする核酸配列、挿入部位、並びに、プロモーター及び終止配列等の好適な調節因子を備えている。ベクターは、宿主細胞内での（及び／又は、修飾した可溶性タンパク質の抗原コード配列が通常発現しないベクター若しくは宿主細胞環境での）コード配列の発現に効果的な、コード配列に作用可能に結合した、例えば、イントロン等の非コード配列、及び調節因子（即ち、プロモーター因子及びターミネーター因子）、又は、５’及び／若しくは３’非翻訳領域等の調節配列を含んでもよい。多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、それらの多くは市販されており、かつ／又はＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（前述）に記載されている。
【０１０８】
好適なプロモーターの例としては、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターの両方が挙げられ、これらの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されるようなｔｅｔ−ｏｎ又はｔｅｔ−ｏｆｆシステム（ＣｌｏｎＴｅｃｈ及びＢＡＳＦ）におけるｔｅｔ応答配列（ＴＲＥ）を含有するプロモーター、特定の金属塩を添加することにより上方制御することができるβアクチン及びメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は、発現用の特定の宿主細胞により認識されるＤＮＡ配列である。それは、変異ＧＨ６１ＡポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作用可能に結合している。かかる結合は、プロモーターがＧＨ６１変異体をコードする配列の転写／翻訳を実施することができるように、発現ベクター内で変異ＧＨ６１ＡポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の開始コドンに対して、プロモーターの位置決めをすることを含む。プロモーター配列は、変異ＧＨ６１Ａポリペプチドの発現の仲立ちをする転写及び翻訳調節配列を含有する。例としては、アスペルギルス・ニガー、Ａアワモリ又はＡ．オリザエ・グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、又はα−グルコシダーゼをコードする遺伝子；Ａ．ニデュランスｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポラ・クラッサｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガー又はリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼをコードする遺伝子；Ｈ．ジェコリーナｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、又は他のセルラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
【０１０９】
適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主に対する適切なマーカーが、当該技術分野において周知である。典型的な選択マーカー遺伝子としては、Ａ．ニデュランス又はＨ．ジェコリーナ由来のａｒｇＢ、Ａ．ニデュランス由来のａｍｄＳ、ニューロスポラ・クラッサ又はＨ．ジェコリーナ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガー又はＡ．ニデュランス由来のｐｙｒＧが挙げられる。好適な選択マーカーの更なる例としては、ｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等の変異株を形質転換するために用いられる異種核酸構築物に含まれる、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤ又はｌｅｕ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
かかる選択マーカーは形質転換細胞に、通常は糸状菌により代謝されない代謝産物を利用する能力を付与する。例えば、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミド上で増殖することを可能にする、酵素アセトアミダーゼをコードする、Ｈ．ジェコリーナ由来のａｍｄＳ遺伝子。選択マーカー（例えばｐｙｒＧ）は、栄養要求性突然変異体株が選択的な最少培地で増殖する能力を保持してよく、又は、選択マーカー（例えばｏｌｉｃ３１）は形質転換細胞に、阻害薬若しくは抗生物質の存在下での増殖能を付与してもよい。
【０１１１】
配列をコードする選択マーカーは、一般に当該技術分野において用いられる方法を使用して、任意の好適なプラスミドにクローニングされる。好適なプラスミドの例としては、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニデュランス由来のＡＭＡ１配列を含有し、Ａ．ニガー内で複製することが可能である。
【０１１２】
本発明の実施では、特に断りのない限り、分子生物学、微生物学、ＤＮＡ組換え、及び免疫学の従来技術を用い、これらは当該技術分野の通常の知識の範囲内である。かかる技術は、文献内で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１を参照のこと。
【０１１３】
Ｂ．ＧＨ６１及び変異ＧＨ６１酵素産生のための宿主細胞及び培養条件
ＧＨ６１Ａ変異体をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築物中にクローニングした後、そのＤＮＡを使用して微生物を形質転換する。本発明に従って、変異ＧＨ６１Ａを発現させる目的で形質転換される微生物は、多種多様の宿主細胞から選択することができる。以下のセクションは宿主細胞／微生物の例として提供され、本発明の態様の実施に用いることができる宿主細胞の範囲の限定を意味するものではない。
【０１１４】
（ｉ）糸状菌
本発明の態様は、対応する形質転換していない親糸状菌と比較して、所望のＧＨ６１変異体の産生又は発現を効果的にもたらす方法で改変、選択及び培養されている糸状菌を含む。
【０１１５】
所望のグリコシルヒドロラーゼの発現のために処理及び／又は改変されてよい親糸状菌の種の例としては、トリコデルマ、ペニシリウム属、フミコーラ・インソレンスを含むフミコーラ属、アスペルギルス・ニガーを含むアスペルギルス属、クリソスポリウム属、ミセリオフトラ属、フサリウム属、ヒポクレア属、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ  ｓｐ．）、及びエメリセラ属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
所望のＧＨ６１変異体を発現する細胞は、親真菌株を培養するのに一般に用いられる条件下で培養される。一般に、細胞は、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６，１９８８、及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７に記載されているような、生理的塩類及び栄養素を含有する標準的な培地の中で培養される。例えば、所望のＧＨ６１変異体の発現量が達成されるまで、振盪培地又は発酵槽内で、例えば、培地を２８℃でインキュベーションするといった標準的な培養条件が、当技術分野において既知である。
【０１１７】
所与の糸状菌の培養条件は例えば、科学文献及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の、真菌の供給元に見出すことができる。真菌の増殖が樹立された後、所望のＧＨ６１変異体の発現を引き起こす、又は可能にするのに効果的な条件に、細胞を曝露する。
【０１１８】
所望のＧＨ６１変異体をコードする配列が、誘導性プロモーターの調節下にある場合、誘導剤、例えば砂糖、金属塩又は抗生物質を、所望のＧＨ６１変異体の発現を誘発するのに効果的な濃度で、培地に添加する。
【０１１９】
一実施形態では、株はアスペルギルス・ニガー株であり、これは過剰発現したタンパク質を得るのに有用な株である。例えば、Ａ．ニガー変異体アワモリ（Ａ．  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ  ａｗａｍｏｒｉ）ｄｇｒ２４６は、多量の分泌セルラーゼを分泌することが知られている（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９〜９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４等の、アスペルギルス・ニガー変異体アワモリの他の株は、既知のＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．及びＫｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３）である。
【０１２０】
別の実施形態において、株はトリコデルマ・レーシ株であり、これは過剰発現したタンパク質を得るのに有用な株である。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３（１９８４）により記載されているＲＬ−Ｐ３７は、多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能的等価物としては、トリコデルマ・レーシ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）が挙げられる。これらの株はまた、変異ＧＨ６１を過剰発現するのにも有用であると、考えられる。
【０１２１】
有害となり得る天然型グリコシルヒドロラーゼ又はセルラーゼ活性を含まないＧＨ６１変異体を得るのが望ましい場合、所望のＧＨ６１変異体をコードするＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ構築物又はプラスミドを導入する前に、１つ又は２つ以上のグリコシルヒドロラーゼ遺伝子（例えばｇｈ６１ａ遺伝子）及び／又はセルラーゼ遺伝子が欠失した宿主細胞株を得ることが有用である。かかる株は、例えば米国特許第５，２４６，８５３号及び国際特許第９２／０６２０９号に開示されている方法等の、任意の便利な方法により調製されてよく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１つ又は２つ以上のグリコシルヒドロラーゼ遺伝子（例えば宿主細胞の内因性ｇｈ６１ａ遺伝子）を欠いている宿主微生物中で所望のＧＨ６１変異体を発現させることにより、同定、及び所望によりその後の精製手順が簡略化される。
【０１２２】
遺伝子の欠失は、所望の遺伝子を欠失又は破壊した形態を、当該技術分野において既知の方法によりプラスミドに挿入することにより、達成してもよい。次いで、この欠失プラスミドを、所望の遺伝子コード領域の内側にある適切な制限酵素部位で切断し、遺伝子コード配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠失又は破壊される遺伝子の遺伝子座からの、例えば約０．５〜約２．０ｋｂのフランキングＤＮＡ配列が、選択マーカー遺伝子の両側に残され得る。通常、適切な欠失プラスミドは、フランキングＤＮＡ配列を含む欠失遺伝子、及び選択マーカー遺伝子を含有する断片を１つの線状断片として取り除くことができるように、内部に特有の制限酵素部位を有する。
【０１２３】
特定の実施形態において、所望のＧＨ６１変異体をコードするＤＮＡの２つ以上のコピーが宿主株に存在し、ＧＨ６１変異体の過剰発現を促進してよい。例えば、宿主細胞は、ゲノムに組み込まれた所望のＧＨ６１変異体の複数のコピーを有してよく、又は代わりに、宿主生物内で自律複製可能なプラスミドベクターを含んでよい。
【０１２４】
（ｉｉ）酵母菌
本発明はまた、所望のＧＨ６１の産生のための、宿主細胞としての酵母菌の使用を想定している。加水分解酵素をコードする他のいくつかの遺伝子は、酵母菌Ｓ．セレビシエの種々の株に発現する。これらには、トリコデルマ・レーシ由来の２つのエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、２つのセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、及び１つのβ−グルコシダーゼ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｆｏｗｌｅｒ，１９９６）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidlium pullulans）由来のキシラナーゼ（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ，１９９６）、小麦由来のα−アミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）等をコードする配列を含む。更に、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）エンド−［β］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカス・フラヴェファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）セロデキストリナーゼ（ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎａｓｅ）（ＣＥＬ１）、及びエンドマイセス・フィブリリザー（Endomyces fibrilizer）セロビアーゼ（Ｂｇｌ１）が、Ｓ．セレビシエの実験室用株で上手く発現した（Ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１２５】
（ｉｉｉ）その他
いくつかの実施形態では、昆虫細胞又は細菌細胞発現系を含む、糸状菌細胞又は酵母細胞以外の宿主細胞での発現系を用いてもよいことが更に想定されている。ある種の細菌宿主細胞は、例えば、対象の酵素／変異体を発現できるだけでなく、ある種の単糖及び他の発酵可能な糖を代謝し、これらをエタノールに転換することが可能な、遺伝子組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）等の、エタノロゲンでもある細胞とすることができる。宿主細胞の選択は、本明細書に記載されたＧＨ６１変異体の使用者の要望により決定されてよいため、これに関してはいかなる限定も意図されない。
【０１２６】
Ｃ．所望のＧＨ６１をコードする核酸配列の宿主細胞内への導入
本発明は更に、外因的に提供された所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸配列を含むように遺伝子組換えされた細胞及び細胞組成物を提供する。親細胞又は細胞株は、クローニングベクター又は発現ベクターにより遺伝子組換えされて（例えば形質導入、形質転換又はトランスフェクションされて）よい。ベクターは例えば、上で更に記載したように、プラスミド、ウイルス性粒子、ファージ等の形態であってよい。
【０１２７】
本発明の形質転換の方法の結果、形質転換ベクターの全て又は一部を、宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込むことができる。しかし、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換もまた、想定されている。
【０１２８】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入する任意の周知の手順を用いてよい。これらには、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン、感染、原形質融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクター、及びクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来遺伝物質を宿主細胞内に導入する、任意の他の既知の方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（前述）を参照）の使用を含む。本質的に、用いる特定の遺伝子工学の手順は、ポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）を、所望のＧＨ６１変異体を発現可能な宿主細胞内に上手く導入することができなければならない。
【０１２９】
多くの標準的なトランスフェクション法を使用して、多量の異種ポリペプチドを発現するトリコデルマ・レーシ細胞株を産生することができる。ＤＮＡ構築物を、トリコデルマのセルラーゼ産生株の中に導入するいくつかの公表済みの方法としては、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ  ａｎｄ  Ｈａｒｍａｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９〜３５６、Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９〜１７４、Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９８７，Ｇｅｎｅ  ６：１５５〜１６４が挙げられ、アスペルギルスについては、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｈａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０〜１４７４、フサリウムについては、Ｂａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ  ａｎｄ  Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２〜８２１２、ストレプトマイセスについては、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ、及びバチルスについては、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，１９９０，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５〜１３８）、が挙げられる。アスペルギルス属の好適な形質転換プロセスの例は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６；１９８９に見出すことができる。
【０１３０】
本発明は更に、真菌セルラーゼ及びグリコシルヒドロラーゼ組成物を産生するのに用いるための、宿主細胞、例えばＨ．ジェコリーナ及びＡ．ニガー等の糸状菌の新規かつ有用な形質転換細胞を含む。したがって、本発明の態様には、所望のＧＨ６１変異体をコードする配列を含み、場合によっては１つ又は２つ以上の内因性グリコシルヒドロラーゼコード配列の欠失又は不活性変異（例えば、ｇｈ６１ａコード配列の欠失；グリコシルヒドロリアーゼ及び／又はセルラーゼ遺伝子を欠失した宿主細胞もまた、実施例に記載される）もまた含む、糸状菌の形質転換細胞が含まれる。
【０１３１】
また、所望のグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸配列を含む異種核酸構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することができ、かつ得られたＲＮＡは、例えば注入等の周知の方法により、宿主細胞内に導入できる。
【０１３２】
Ｄ．ＧＨ６１核酸コード配列及び／又はタンパク質発現の分析
所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸構築物で形質転換した細胞株による、所望のＧＨ６１変異体の発現を評価するために、タンパク質レベルで、ＲＮＡレベルで、又は特にＧＨ６１活性及び／若しくは産生性に対する機能的バイオアッセイにより、アッセイを実施することができる。
【０１３３】
一般に、所望のＧＨ６１変異体の発現を分析するために用いるアッセイとしては、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、又は（核酸コード配列を基準にして）適切に標識したプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、並びに従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
加えて、修飾ＧＨ６１の産生性及び／又は発現は、サンプル内で直接、例えばＧＨ６１活性（セルラーゼ増強活性）、発現、及び／又は産生性に対するアッセイにより、測定してよい。ＧＨ６１セルラーゼ増強活性を評価するアッセイは、例えばＳｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３  １４６）、Ｓｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）、並びに米国特許第５，２４６，８５３号及び第５，４７５，１０１号に記載されており、これらはそれぞれ、明示的に本明細書に参考として組み込まれる。修飾ＧＨ６１が単離した可溶性及び不溶性基質の加水分解を増強する能力は、Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）及びＯｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されているアッセイを使用して、測定することができる。ＧＨ６１によるセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼ活性の増強のアッセイに有用な基質としては、結晶性セルロース、濾紙、リン酸膨潤セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリルラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オルトニトロフェニルラクトシド、パラニトロフェニルラクトシド、オルトニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルセロビオシド、オルトニトロフェニルグルコシド、パラニトロフェニルグルコシド、メチルウンベリフェリルグリコシドが挙げられる。
【０１３５】
加えて、タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡ、競合免疫学的検定、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、間接免疫蛍光アッセイ等の免疫学的方法により評価してもよい。一定のこれらのアッセイは、ＧＨ６１酵素の検出のために設計された市販の試薬及び／又はキットを使用して、実施することができる。かかる免疫学的検定を用いて、所望のＧＨ６１変異体の発現を定性的及び／又は定量的に評価することができる。かかる方法の詳細は当業者に既知であり、かかる方法を実施するための多くの試薬は市販されている。特定の実施形態において、所望の変異ＧＨ６１酵素に特異的であるが、親ＧＨ６１に特異的でない免疫学的試薬、例えばＧＨ６１置換、又はＧＨ６１変異体の融合パートナーに特異的な抗体（例えばＮ又はＣ末端タグ配列、例えばヘキサ−ヒスチジンタグ又はＦＬＡＧタグ）を使用してよい。したがって、本発明の態様は、所望のＧＨ６１変異体の精製形態を使用して、様々な種免疫学的検定で使用するための、発現したポリペプチドに特異的なモノクロナール又はポリクロナール抗体のいずれかを産生すること含む。（例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１を参照のこと。）
【０１３６】
Ｖ．ＧＨ６１変異体ポリペプチドの富化、単離及び／又は精製方法
一般に、宿主細胞培養物内で産生された所望のＧＨ６１変異体ポリペプチドを培地内で分泌させ（ＧＨ６１変異体を含有する培養物上清を産生する）、例えば細胞培養培地から不必要な成分を除去することにより、富化、精製又は単離してよい。しかし、場合によっては、所望のＧＨ６１変異体ポリペプチドは細胞可溶化物からの回収が必要な細胞形態から産生してもよい。所望のＧＨ６１変異体ポリペプチドは、当業者により日常的に用いられる技術を用いて、産生された細胞又は細胞上清から採取される。例としては、濾過（例えば限外濾過又は精密濾過）、遠心分離、密度勾配分画（例えば密度勾配超遠心分離）、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、高分離能を有する物質を使用したイオン交換（Ｍｅｄｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）等のイオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｆｌｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｅｌｌｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ  ａｎｄ  Ｑｕｅｉｒｏｚ，１９９９）及び二相分画（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
富化、単離、又は精製したＧＨ６１変異体ポリペプチドが場合によっては望ましいが、他の実施形態では、ＧＨ６１変異体ポリペプチドを発現する宿主細胞を、ＧＨ６１媒介性セルラーゼ増強活性を必要とするアッセイで直接用いる。したがって、セルロースバイオマス加水分解アッセイ又はプロセスでの使用が見出されるＧＨ６１変異体ポリペプチド組成物を得るために、所望のＧＨ６１変異体ポリペプチドの富化、単離又は精製が、必ずしも必要というわけではない。例えば、本明細書に記載した変異ＧＨ６１Ａを発現する宿主細胞を、セルロース加水分解プロセスにおいて直接（即ち、対象のアッセイでの使用の前に、宿主細胞からＧＨ６１Ａを単離することなく）使用できるように、本発明の態様に従ったセルラーゼ及びグリコシルヒドロラーゼ含有系を設計してもよい。
【０１３８】
ＶＩ．ＧＨ６１変異体の有用性
所望のＧＨ６１変異体をコードする核酸、所望のＧＨ６１変異体ポリペプチド及びそれを含む組成物には、広範な用途で有用性が見出されることを理解することができ、それらのいくつかを以下に記載する。本明細書に記載されるＧＨ６１変異体の向上した１つ又は複数の性質を、多くの方法で活用することができる。例えば、熱ストレス条件下で向上した性能を有するＧＨ６１変異体を使用して、高温（例えば親ＧＨ６１が僅かしか作用しない温度）にて行うアッセイでのセルラーゼ増強活性を増加することができ、これによって、使用者は（親ＧＨ６１の使用と比較して）使用するＧＨ６１の総量を低減させることができる。変化したｐＨ最適条件、界面活性剤の存在下での増加した安定性若しくは活性、基質に対する増加した特異的活性、変化した基質切断パターン、及び／又は対象の宿主細胞内での高い発現量を有するＧＨ６１変異体を含む、ＧＨ６１変異体ポリペプチドの他の向上した性質を、セルラーゼ組成物のセルロース加水分解活性を決定するのに好適なアッセイで利用することができる。
【０１３９】
本明細書に記載したＧＨ６１変異体は、実質的にあらゆるセルロール系物質の処理を増強するのに、例えば繊維工業での処理（例えば、バイオフィニッシング若しくはバイオストーン加工）、洗剤、飼料、パルプ及び製紙産業、並びに／若しくはバイオエタノール製造での処理を増強するのに使用することができる。
【０１４０】
したがって、本明細書で記載したＧＨ６１変異体ポリペプチドには、向上した洗浄能力を示し、柔軟剤として機能し、かつ／若しくは綿織物の感触を改善する（例えば「ストーンウォッシュ」又は「バイオポリッシュ」）洗剤組成物において、木材パルプを（例えばバイオエタノール製品用に）糖に分解するための組成物において、及び／又は飼料組成物において、用途が見出される。ＧＨ６１変異体の単離及び性質決定は、かかる組成物の特性及び活性を調整する能力を付与する。
【０１４１】
本明細書に記載した所望のＧＨ６１変異体を含有する酵素混合組成物には、エタノール製造での用途が見出される。本プロセスからのエタノールは更に、オクタン価向上剤として、又はガソリンの代わりの燃料として直接に使用することができ、このことは、燃料源としてのエタノールが、石油由来製品よりもより環境適合性であるため、有利となる。エタノールの使用は、大気の質を改善し、かつ地域のオゾンレベル及びスモッグを場合により低下させることが知られている。更に、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは、非再生可能エネルギー及び石油化学供給品の急激な移行の影響を和らげる点において、戦略的に重要となる可能性がある。
【０１４２】
糖化発酵分離方式とは、バイオマス（例えばトウモロコシ茎葉）中に存在するセルロースをグルコースに転換した後に、酵母菌株でグルコースをエタノールに転換するプロセスである。同時糖化発酵とは、バイオマス中に存在するセルロースをグルコースに転換するのと同時に、かつ同じ反応器内で、酵母菌株でグルコースをエタノールに転換するプロセスである。したがって、本発明のＧＨ６１変異体には、バイオマスをエタノールに分解するこれらのプロセスの両方において、用途が見出される。容易に利用可能なセルロース源からのエタノールの製造により、安定的で再生可能な燃料源がもたらされる。いくつかのプロセスでは、バイオマスは完全に（例えば二糖類を含有する）グルコースに分解されず、かかる産生物はエタノール製造以外での用途を見出されることに更に留意すべきである。
【０１４３】
セルロース系原材料は多様な形態をとることが可能であり、農業廃棄物、草及び木材、並びに都市廃棄物（例えば再生紙、庭で刈り取った草等）といった他の、価値の低いバイオマスを含むことができる。エタノールは、これらのセルロース系原材料のいずれかの発酵により産生することができる。したがって、多様な原材料を本発明の所望のグリコシルヒドロラーゼについて使用してよく、かつ、使用のために選択される原材料は、転換が実施される地域に依存し得る。例えば、アメリカ中西部では麦わら、トウモロコシ茎葉及びバガス等の農業廃棄物が優位を占めるが、カリフォルニアでは稲わらが優位であり得る。しかし、任意の利用可能なセルロース系バイオマスが任意の地域で使用されてよいことが、理解されなければならない。
【０１４４】
別の実施形態では、セルロース系原材料は前処理されてよい。前処理は、高温で、かつ希酸、濃酸又は希釈アルカリ溶液の添加によるものであってよい。前処理溶液を、少なくとも部分的にヘミセルロース成分を加水分解するのに十分な時間添加した後、中和する。
【０１４５】
バイオマスの転換に加え、本明細書に記載したＧＨ６１変異体ポリペプチドは、洗剤組成物中に存在させることもでき、この洗剤組成物は、例えば界面活性剤（アニオン性、非イオン性及び両性界面活性剤を含む）、加水分解酵素、ビルダー剤、漂白剤、青味剤及び蛍光染料、固化抑制剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤等といった任意の１種類又は２種類以上の洗剤成分を含むことができる。これらの成分は全て、洗剤技術分野で既知である。ＧＨ６１変異体ポリペプチドを含有する洗剤組成物は、液体、顆粒、エマルション、ゲル、ペースト等を含む、任意の便利な形態とすることができる。ある種の形態（例えば顆粒）において、洗剤組成物は、セルラーゼ保護剤を含有するように配合することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許第１９９７０２００２５号（発明の名称「酵素洗剤組成物」）を参照のこと）特定の実施形態において、ＧＨ６１変異体ポリペプチドは洗剤組成物中に、全洗剤組成物に対して０．００００５重量％〜約５重量％で、例えば全洗剤組成物に対して約０．０００２重量％〜約２重量％で存在する。
【０１４６】
上で見た通り、親ＧＨ６１酵素と比較して向上した性質を有するＧＨ６１変異体ポリペプチド（及びそれらをコードする核酸）には、通常は少なくとも１種類のセルラーゼの存在下でグリコシルヒドロラーゼを用いる、多数のアッセイ及びプロセスのいずれかを改善する用途が見出される。
【実施例】
【０１４７】
本発明は以下の実施例で、更に詳細に記載されており、これらは、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。添付の図面は、明細書及び本開示の記載の構成部分として考えられるべきであることを意図している。本明細書で引用した全ての参照文献は、それらの中に記載されているあらゆるものが明確に、参考として組み込まれている。
【０１４８】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）、ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ及びｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（ユニット）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈ及びｈｒ（時間）；℃（セ氏温度）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（未完了）；ＮＡ（該当なし）；ｒｐｍ（毎分回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロベース対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量／体積）；ｖ／ｖ（体積／体積）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ｗｈＰＣＳ（全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉）；ｄａＣＳ（希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉）；Ｐｉ又はＰＩ（性能指数）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＦＡＢ（国際特許公報第２０１２／１２５９５１号に記載されている、特定のハイブリッドβ−グルコシダーゼ）；ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）；並びにＲＰＣ（逆相クロマトグラフィー）
【０１４９】
（実施例１）
アッセイ
以下のアッセイを、以下に記載する実施例で使用した。以下に提供するプロトコールと異なる部分は、いずれも実施例に示される。これらの実験では、反応の完了後に、分光光度計を使用して、形成した産生物の吸光度を測定した。
【０１５０】
Ｉ．可溶性糖質の測定
Ａ．残留グルコースの測定のためのヘキソキナーゼアッセイ
ヘキソキナーゼアッセイを使用して、ｗｈＰＣＳから産生されたグルコースを測定した。１０倍希釈した上清１０μＬを、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）内の、１９０μＬのグルコースヘキソキナーゼアッセイ混合物（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｒｅｄａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に加えた。プレートを１５分間、室温でインキュベーションした。インキュベーション後、上清の吸光度を３４０ｎｍで測定した。残留グルコースを含有する培養物の上清を、更なる研究のためにプールから除外した。
【０１５１】
Ｂ．グルコースの測定のためのＡＢＴＳアッセイ
ＧＨ６１Ａ  Ａｖｉｃｅｌ活性アッセイで生成された単量体グルコースを、ＡＢＴＳアッセイを使用して検出した。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１８８８）５．４８ｇ／Ｌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼＶＩ−Ａ型（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８３７５）０．２Ｕ／ｍＬ、及び食品等級グルコースオキシダーゼ（ＧＥＮＥＮＣＯＲ（登録商標）５９８９Ｕ／ｍＬ）２Ｕ／ｍＬを含有した。（以下のＶＩＩＩで記載したＡｖｉｃｅｌアッセイからの）ＧＨ６１Ａ活性アッセイ混合物５０μＬを、５０μＬのＡＢＴＳアッセイ溶液に加えた。活性アッセイ混合物を添加した後、ＯＤ４２０、２２℃の周囲温度にて、５分間にわたって反応を動力学的に続けた。各アッセイ条件に対するグルコースの適切な検量線は常に含まれた。
【０１５２】
Ｃ．可溶性糖質の濃度決定のためのＨＰＬＣアッセイ
ＲＥＺＥＸ  ＲＦＱ−Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  Ｈ＋（８％）１００×７．８ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを使用して、グルコース濃度を決定した。カラムは８０℃で、かつ０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を溶出液として用い、０．９ｍＬ／分の流速で操作した。サンプル３０μＬをｍｉｌｌｉＱ  ９０μＬと混合し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ  ９６ウェル濾過システムで、真空下にて濾過した。４倍希釈したサンプル１０μＬを注入した。適切なキャリブレーション設定を使用して、所望の可溶性糖質（例えばグルコース、セロビオース、キシロース、及び／又はアラビノース等）の正確な濃度を決定した。
【０１５３】
ＩＩ．タンパク質精製並びに透析
野生型又は変異ＧＨ６１Ａを発現するＨ．ジェコリーナ（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｍａｎ１）由来の上清を、１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）内で４倍希釈し、５００μＬの最終体積を得た。この混合物を、中間体混合物（５回）と、２００μＬのＢｉｏｋａｌ  Ｗｏｒｋｂｅａｄ  ４０  ＩＤＡ  Ｈｉｇｈと共に、１００ｍＭのＣｕＳＯ４を充填して３０分間インキュベーションした。１，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、フロースルーに存在するタンパク質サンプルを精製した。精製したサンプルを「Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ９６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｐｏ  ｄｉａｌｙｚｅｒ」１０ｋＤ  ＭＷＣＯ（＃７４−０９０３）プレートを使用して、４℃で一晩、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に透析した（４０回）。
【０１５４】
ＩＩＩ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質の決定、正規化及びエンドＨ処理
ＢＳＡを標準として用いるＢｉｏＲａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、タンパク質濃度を決定した。選択したサンプルに対し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法より得られたタンパク質濃度を、精製ＧＨ６１Ａを参照として用いたＳＥＣ  ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ  ＨＰＬＣにより得られたタンパク質データと比較した。およそ５０ｍＭのＮａＡＣ（ｐＨ  ５．０）で適宜希釈することにより、ＧＨ６１Ａサンプルを１００ｐｐｍに正規化することを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法とＨＰＬＣ測定との間の補正係数を（必要であれば）考慮に入れて行い、ＨＰＬＣ値が指示値であった。タンパク質サンプルを、１０ｐｐｍのＳ．プリカタス（Ｓ．ｐｌｉｃａｔｕｓ）由来のエンドＨグリコシダーゼ（例えばＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）で処理し、３７℃、８００ｒｐｍで４〜２０時間インキュベーションした。
【０１５５】
ＩＶ．正規化後のタンパク質含量決定のためのＨＰＬＣアッセイ
Ａ．タンパク質決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
エンドＨ処理し、正規化したＧＨ６１Ａ変異体の濃度を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ１２５  ＳＥＣ  １．７μｍ（４．６×１５０ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣにより決定した。サンプル２５μＬを、ｍｉｌｌｉＱ  ７５μＬと混合した。サンプル１０μＬをカラムに注入した。４．５分間、０．３５ｍＬ／分で定組成で運転しながら、ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ６．７５）を使用して化合物を溶出した。２２０ｎｍの波長でタンパク質を検出した。精製した野生型ＧＨ６１Ａ（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬ）を使用して作成した検量線より、ＧＨ６１Ａ変異体のタンパク質濃度を決定した。性能指数（ＰＩ）を計算するために、ＧＨ６１Ａ変異体の濃度を、同じプレートの平均野生型ＧＨ６１Ａ（例えば参照酵素）の濃度で割った。
【０１５６】
Ｂ．タンパク質決定のための逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）
精製した培養上清からのＧＨ６１Ａ変異体タンパク質の濃度を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ  ３．６ｕ  ＸＢ−Ｃ８（５０×２．１ｍｍ）カラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣにより、概ね以下に記載した通りに（いくつかのサンプルに対しては僅かに変化させて）、決定した。サンプル９０μＬを、５０％アセトニトリル１０μＬと混合した。サンプル１０μＬをカラムに注入した。以下の勾配を使用して、化合物を溶出した：溶出液Ａ（０分、９０％）、（１．５分７０％）、（３．５分５５％）、（３．６分５％）、（４．１分５％）、（４．２分９０％）、（４．５分９０％）。溶出液ＡはＭｉｌｌｉＱ＋０．１％  ＴＦＡであり、溶出液Ｂはアセトニトリル＋０．０７％  ＴＦＡであった。２２０ｎｍの波長でタンパク質を検出した。精製した野生型ＧＨ６１Ａ（１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬ）を使用して作成した検量線より、ＧＨ６１Ａ変異体のタンパク質濃度を決定した。場合によっては、（上述したように、）分析の前に、サンプルをエンドＨで処理した。以下に記載するアッセイのために、このタンパク質の決定に基づき、サンプルを正規化した。性能指数（ＰＩ）を計算するために、ＧＨ６１Ａ変異体の濃度を、同じプレートの平均野生型ＧＨ６１Ａ（例えば参照酵素）の濃度で割った。
【０１５７】
Ｖ．熱安定性アッセイ
Ａ．熱安定性を測定するためのＡｖｉｃｅｌアッセイ（「Ａｖｉｃｅｌ  Ａｆｔｅｒ」とも呼ぶ）
加熱インキュベーション後の（野生型と及び変異体を含む）ＧＨ６１Ａポリペプチドの残基活性を、Ａｖｉｃｅｌアッセイを使用して決定した。２５μＬのアリコートを、ＰＣＲ機器の９６ウェルＰＣＲプレート内で４通りに、６６℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＧＨ６１Ａポリペプチド残基の特異的活性を以下（セクションＶＩＩＩ）に記載の通り決定した。野生型酵素の活性に対する変異体の相対的な残基活性を、インキュベーション後の平均特異的活性と、インキュベーション前の平均特異的活性とを比較することにより決定した。
【０１５８】
Ｂ．ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ及びＲＴ−ＰＣＲ機器を使用した、タンパク質の熱シフトアッセイ（「Ｔｍ」とも呼ぶ）
（野生型及び変異体を含む）ＧＨ６１Ａポリペプチドのアンフォールディングを以下の通りに測定した。２５μＬのＧＨ６１Ａ野生型及び変異体タンパク質サンプル（エンドＨ未処理）、並びに８μＬ（５０ｍＭのＮａＡＣ（ｐＨ  ５．０）で千倍希釈）のＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを、９６ウェルのＨａｒｄ  Ｓｈｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（ＨＳＰ９６４５  ＢｉｏＲａｄ）内で混合した。このサンプルを、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸを接続したＲＴ−ＰＣＲ機器でインキュベーションした。サンプルを１分間で３０℃にて、その後、５秒ごとに０．２℃ずつ増加する、３０℃から９０℃の勾配でインキュベーションした。５秒ごとの蛍光データを集め、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸマネージャソフトウエアを使用して、データを分析した。上述の方法により、各ＧＨ６１Ａ変異体の融解温度Ｔｍを決定し、野生型ＧＨ６１Ａ（複数測定）の平均（中央）Ｔｍと比較した。Ｔｍで見られる向上の程度を記録した。
【０１５９】
ＶＩ．全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ
記載されている通りに（Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０５：６９〜８６，２００３を参照）、２％ｗ／ｗのＨ２ＳＯ４でトウモロコシ茎葉を前処理し、３Ｍの水酸化アンモニウムで５．０のｐＨに滴定し、終濃度が０．０１％のアジ化ナトリウムを保存のために添加した。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を添加し、終濃度が固形分１０％となった。反応混合物中のセルロース濃度は約３％であった。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底、非結合ＰＳ）の各ウェルに、このセルロース懸濁液を７０μＬ加えた。２つの異なる方法を用いて、ｗｈＰＣＳの性能を測定した：Ａ）２ｇ／Ｌの酵素バックグランド混合物４７μＬを、ｗｈＰＣＳに添加した。この酵素混合物は、それぞれ約８：１：１の比率で、ＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧの各酵素を提供した。次いで、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａ変異体のいずれかを発現する、Ｈ．ジェコリーナ由来の精製した上清（１００μｇ／ｍＬ）を２２、１１、５及び３μＬ、ｗｈＰＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に添加した。補償体積の酢酸ナトリウム緩衝液を加え、総体積の差の埋め合わせをした。Ｂ）０．２２５ｇ／Ｌの酵素バックグランド混合物２５μＬを、ｗｈＰＣＳに添加した。酵素バックグラウンド混合物は、それぞれ約４：１．５：１の比率でＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧの各酵素を、並びに（混合物中の酵素の約５％及び２０％を表す）アクセサリーキシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を提供した。次いで、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａ変異体のいずれかを発現する、Ｈ．ジェコリーナ細胞からの５０μｇ／ｍＬの精製上清２５μＬを、ｗｈＰＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に添加した。補償体積の酢酸ナトリウム緩衝液を加え、総体積の差の埋め合わせをした。
【０１６０】
密封後、プレートを５０℃に温度調節したインキュベータ内に配置し、９００ｒｐｍで連続的に振盪した。７２時間後、プレートを５分間氷上に配置し、各ウェルに１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）を添加することで、加水分解反応を停止させた。プレートを密閉し、２分間室温で、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清中における、グルコースを放出した加水分解の反応産生物を、ヘキソキナーゼ及び／又はＨＰＬＣグルコース濃度決定法により、分析した。用量反応曲線を、野生型ＧＨ６１Ａ酵素に対して作成した。性能指数（ＰＩ）を計算するために、変異ＧＨ６１Ａにより産生された（平均の）全ての糖を、同量の野生型ＧＨ６１Ａ（例えば参照酵素）により産生された、（平均の）全ての糖により割った。
【０１６１】
ＶＩＩ．希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイ
ｄａＣＳ基質：トウモロコシ茎葉は粉砕して０．９ｍｍのスクリーンを通した後、国際公開特許第０６１１０９０１号、又は米国特許出願第２００７００３１９１８号、第２００７００３１９１９号、第２００７−００３１９５３号、若しくは第２００７００３７２５９号での記載に従い、希アンモニアで前処理し、１ＭのＨ２ＳＯ４で５．０のｐＨに滴定し、終濃度で０．０１％のアジ化ナトリウムを保存のために添加した。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を添加し、終濃度が固形分１０％となった。反応混合物中のセルロース濃度は、約３％であった。
【０１６２】
Ａ．マイクロタイターアッセイ１：０．２２５ｇ／Ｌの酵素バックグラウンド混合物２５μＬを、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底、非結合）のウェル内にある、上述のｄａＣＳ基質７０μＬに加えた。酵素バックグラウンド混合物は、（それぞれ約４：１．５：１の比率で）ＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧの各酵素を、並びに（混合物中の酵素の約５％及び２０％を表す）アクセサリーキシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を提供した。次いで、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａ変異体のいずれかを発現する、Ｈ．ジェコリーナ細胞からの２５μｇ／ｍＬの精製上清２５μＬを、ｄａＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に添加した。補償体積の酢酸ナトリウム緩衝液を加え、総体積の差の埋め合わせをした。密封後、プレートを５０℃に温度調節したインキュベータ内に配置し、９００ｒｐｍで連続的に振盪した。７２時間後、プレートを５分間氷上に配置し、各ウェルに１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）を添加することで、加水分解反応を停止させた。プレートを密閉し、２分間室温で、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清中の可溶性糖質を（上記Ｉ．Ｃにおける）ＨＰＬＣで分析した。用量反応曲線を、野生型ＧＨ６１Ａ酵素に対して作成した。性能指数（ＰＩ）を計算するために、変異ＧＨ６１Ａにより産生された（平均の）全グルコースを、同量の野生型ＧＨ６１Ａ（例えば参照酵素）により産生された、（平均の）全グルコースにより割った。
【０１６３】
Ｂ．マイクロタイターアッセイ２：各ＧＨ６１Ａ酵素を含有する上清を、１５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ  ５．０）で５００ｐｐｍに正規化した。正規化したＧＨ６１Ａの上清を、１５：８５（それぞれ重量／重量）の比率でバックグラウンド混合物と混ぜ合わせ（バックグラウンド混合物はＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧ酵素（それぞれ約６：１：４．４の比率）、並びにアクセサリーキシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素（混合物中の酵素の約５％及び２３％を表す）を提供する）、固形分９．７％、最終合計濃度１０ｍｇ酵素／（ｇＧ＋Ｘ）で、ｄａＣＳに投与される。反応（reaction）（最終体積１２０μＬ）を２４時間、５０℃でインキュベーションしてから、１００ｍＭのＮａ−グリシン（ｐＨ  １０．０）を使用してクエンチした。産生された可溶性糖類の濃度を、（上記Ｉ．Ｃのような）ＨＰＬＣで決定し、（ＷＴを参照として用い、）グルコース産生性及びキシロース産生性に対してＰＩを計算した。各反応は、３通りで実施した。
【０１６４】
Ｃ．バイアルアッセイ：４ｇのｄａＣＳ基質を、バイアルごとに加えた後、ＣＢＨ：ＥＧ：ＢＧ（それぞれ約２．９：１：１．６の重量比）と、アクセサリーキシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素（混合物中の酵素の約１５％及び１２．６％を表す）との、１ｍＬの酵素バックグラウンド混合物を加えた。上記混合物を、５．７８ｍｇ／（ｇ  Ｇ＋Ｘ）の用量で、各バイアルに加えた。各ＧＨ６１Ａ変異体には、１．２及び０．６ｍｇ／（ｇ  Ｇ＋Ｘ）でアッセイを行い、ＷＴのＧＨ６１Ａには、１．４４及び０．３６ｍｇ／（ｇＧ＋Ｘ）でアッセイを行った。ＣｕＳＯ４（１０ｍＭ）を５０μＬ加え、終濃度を１００μＭに到達させた。サンプルは３通りで試験した。サンプルは４日間、５０℃でインキュベーションした。５０μＬの糖化液体培地をサンプリングし、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）４５０μＬを添加して濾過した。産生されたグルコース及びキシロースの濃度を、（上記Ｉ．Ｃのような）ＨＰＬＣにより決定した。ＰＩは、グルコース産生性及びキシロース産生性に対して（参照としてＷＴを使用して）計算した。
【０１６５】
ＶＩＩＩ．Ａｖｉｃｅｌ活性アッセイ
Ａｖｉｃｅｌを酢酸ナトリウム５０ｍＭ（ｐＨ  ５．０）で希釈し、３．３３％  ｗ／ｖの混合物を得た。この懸濁液７５μＬを、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底、非結合ＰＳ）内に分注した。次いで、１５μＬの１０ｍＭアスコルビン酸、１５μＬの１ｍＭ  ＣｕＣｌ２、及び３５μＬの、ＦＡＢ（国際公開特許第２０１２／１２５９５１号を参照）を発現する（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、ΔＭａｎ１）株由来の、７１４μｇ／ｍＬの培養上清２５μＬをＡｖｉｃｅｌ溶液に加えた。次いで、１００μｇ／ｍＬの精製したＧＨ６１Ａ野生型又はＧＨ６１Ａ変異体１０μＬを、Ａｖｉｃｅｌ／ＦＡＢ混合物に加えた。各野生型及び変異体は４通りでアッセイした。マイクロタイタープレートを密閉し、５０℃に温度調節したインキュベータ内で、９００ｒｐｍで連続して振盪しながらインキュベーションした。２０時間後、１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）１００μＬを各ウェルに加えることにより、加水分解反応を停止させた。プレートを密閉し、２分間室温で、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清（上記Ｉ．Ｂでは、ＧＨ６１Ａ活性アッセイ混合物とも呼ばれる）中の加水分解反応産生物を、ＡＢＴＳアッセイ（上記Ｉ．Ｂを参照）により、分析した。用量反応曲線を野生型ＧＨ６１Ａに対して作成した。性能指数（ＰＩ）を計算するために、変異ＧＨ６１Ａにより産生された（平均の）全ての糖を、同量の野生型ＧＨ６１Ａ（例えば参照酵素）により産生された、（平均の）全ての糖により割った。
【０１６６】
（実施例２）
Ｉ．ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ変異体の生成
Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素をコードする配列（配列番号１）をｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターにクローニングして、ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａプラスミドを産生した（ｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開特許第２０１１／０６３３０８号に記載されているｐＴＴＴｐｙｒＧに、ｐｙｒＧ遺伝子がｐｙｒ２遺伝子で置き換えられていることを除いて類似している）。完全長ＧＨ６１Ａ酵素のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａプラスミド又はｐＴＴＴｐｙｒＧを使用して、ＧＨ６１Ａ成熟酵素（配列番号３）のアミノ酸１１１〜１１４及び１４４〜１６３にかけての、アミノ酸残基の２つのストレッチに収まるアミノ酸置換を生成し、実施例１に記載したアッセイの１つ又は２つ以上で試験した。
【０１６７】
以下の配列番号１は、参照Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１ＡをコードするＤＮＡ配列を示す。
ＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＴＴＣＣＡＴＡＣＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＣＧＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＣＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＡＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＡＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＡＡＣ
【０１６８】
以下の配列番号２は、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ完全長酵素の配列を示す。
ＭＩＱＫＬＳＮＬＬＶＴＡＬＡＶＡＴＧＶＶＧＨＧＨＩＮＤＩＶＩＮＧＶＷＹＱＡＹＤＰＴＴＦＰＹＥＳＮＰＰＩＶＶＧＷＴＡＡＤＬＤＮＧＦＶＳＰＤＡＹＱＮＰＤＩＩＣＨＫＮＡＴＮＡＫＧＨＡＳＶＫＡＧＤＴＩＬＦＱＷＶＰＶＰＷＰＨＰＧＰＩＶＤＹＬＡＮＣＮＧＤＣＥＴＶＤＫＴＴＬＥＦＦＫＩＤＧＶＧＬＬＳＧＧＤＰＧＴＷＡＳＤＶＬＩＳＮＮＮＴＷＶＶＫＩＰＤＮＬＡＰＧＮＹＶＬＲＨＥＩＩＡＬＨＳＡＧＱＡＮＧＡＱＮＹＰＱＣＦＮＩＡＶＳＧＳＧＳＬＱＰＳＧＶＬＧＴＤＬＹＨＡＴＤＰＧＶＬＩＮＩＹＴＳＰＬＮＹＩＩＰＧＰＴＶＶＳＧＬＰＴＳＶＡＱＧＳＳＡＡＴＡＴＡＳＡＴＶＰＧＧＧＳＧＰＴＳＲＴＴＴＴＡＲＴＴＱＡＳＳＲＰＳＳＴＰＰＡＴＴＳＡＰＡＧＧＰＴＱＴＬＹＧＱＣＧＧＳＧＹＳＧＰＴＲＣＡＰＰＡＴＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＬＮ
【０１６９】
以下の配列番号３は、Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ成熟酵素の配列を示す。
ＨＧＨＩＮＤＩＶＩＮＧＶＷＹＱＡＹＤＰＴＴＦＰＹＥＳＮＰＰＩＶＶＧＷＴＡＡＤＬＤＮＧＦＶＳＰＤＡＹＱＮＰＤＩＩＣＨＫＮＡＴＮＡＫＧＨＡＳＶＫＡＧＤＴＩＬＦＱＷＶＰＶＰＷＰＨＰＧＰＩＶＤＹＬＡＮＣＮＧＤＣＥＴＶＤＫＴＴＬＥＦＦＫＩＤＧＶＧＬＬＳＧＧＤＰＧＴＷＡＳＤＶＬＩＳＮＮＮＴＷＶＶＫＩＰＤＮＬＡＰＧＮＹＶＬＲＨＥＩＩＡＬＨＳＡＧＱＡＮＧＡＱＮＹＰＱＣＦＮＩＡＶＳＧＳＧＳＬＱＰＳＧＶＬＧＴＤＬＹＨＡＴＤＰＧＶＬＩＮＩＹＴＳＰＬＮＹＩＩＰＧＰＴＶＶＳＧＬＰＴＳＶＡＱＧＳＳＡＡＴＡＴＡＳＡＴＶＰＧＧＧＳＧＰＴＳＲＴＴＴＴＡＲＴＴＱＡＳＳＲＰＳＳＴＰＰＡＴＴＳＡＰＡＧＧＰＴＱＴＬＹＧＱＣＧＧＳＧＹＳＧＰＴＲＣＡＰＰＡＴＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＬＮ
【０１７０】
変異産生のために選択したそれぞれの部位（即ち、配列番号３の１１１位〜１１４位及び１４４位〜１６３位にかけてのアミノ酸残基のストレッチ内のアミノ酸）に対して、典型的には１４〜１６個の置換変異体が得られた。変異体は、示した位置で置換されたＧＨ６１Ａ変異体配列をそれぞれコードする、個々に精製したプラスミドとして得た。
【０１７１】
ＩＩ．ＧＨ６１Ａ変異体の産生
Ｈ．ジェコリーナ株（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｍａｎ１）のプロトプラストを、個々のｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａ又はｐＴＴＴｐｙｒＧ−ＧＨ６１Ａ構築物で形質転換し（形質転換あたり、単一のＧＨ６１Ａ変異体）、アセトアミドを含有する選択寒天上で、例えば国際特許出願公開第２００９／０４８４８８号（参照により本明細書に組み込まれる）で先に記載されているように２８℃で７日間増殖させた。Ｈ．ジェコリーナのプロトプラストを生成して採取し、アセトアミド寒天に再度配置して、２８℃で７日間インキュベーションした。胞子を１５％グリセロールで採取し、−２０℃で保存した。
【０１７２】
マイクロタイタープレートでのＧＨ６１Ａ変異体の産生については、体積１０μＬの、所望のＨ．ジェコリーナ胞子懸濁液を、ＰＶＤＦフィルタプレート内の２％グルコース／ソホロース混合物を添加した、２００μＬのグリシン最少培地に加えた。各ＧＨ６１Ａ変異体は４通りで増殖させた。酸素透過膜でプレートを密閉した後、プレートを２２０ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で６日間インキュベーションした。培地を低圧下でマイクロタイタープレートに移して、上清を採取した。
【０１７３】
振盪フラスコ内でのＧＨ６１Ａの産生に関しては、事前培養物（ＹＥＧ培地）を、所望のＨ．ジェコリーナ胞子懸濁液１０μＬで植え付け、２８℃で２日間、２００ｒｐｍで増殖させた。事前培養物１ｍＬを使用して、２５ｍＬの最小培地を植え付けた。振盪フラスコの発酵は、２８℃、２００ｒｐｍにて５日間行った。発酵の最後に、培養物を濾過して、濃縮及び定量化を行った。
【０１７４】
（実施例３）
ＧＨ６１Ａ変異体の性質決定
Ｈ．ジェコリーナＧＨ６１Ａ変異体酵素の、対象の種々の性質を試験した。具体的には、配列番号３の１１１位〜１１４位及び１４４位〜１６３位にかけてのアミノ酸残基のストレッチにおいてアミノ酸置換を有するＧＨ６１Ａ変異体について、実施例１、セクションＩＶ．Ａで説明したタンパク質の発現、実施例１、セクションＶ．Ｂで説明した熱安定性（Ｔｍ）、残留グルコースの測定のためのヘキソキナーゼアッセイを使用しての、実施例１、セクションＶＩ．Ａで説明したｗｈＰＣＳの加水分解（ｗｈＰＣＳ  ＨＫ）、及び、グルコース濃度決定のためのＨＰＬＣアッセイを使用しての、実施例１、セクションＶＩ．Ｂで説明したｗｈＰＣＳの加水分解（ｗｈＰＣＳ  ＨＰＬＣ）の試験を行った。
【０１７５】
試験したＧＨ６１Ａ変異体のそれぞれに対する性能指数（ＰＩ）は、上述のｗｈＰＣＳアッセイの両方に対して、かつ一定レベル超でのタンパク質産生において、決定した。ＰＩは、参照ＧＨ６１Ａ（即ち、その部位に野生型アミノ酸を有するＧＨ６１Ａ）に対する、試験したＧＨ６１Ａ変異体の性能の割合である。０．０５以下のＰＩは一般に、０．０５に修正した。しかし、ＨＰＬＣタンパク質発現値が０．０であれば、０．０４に修正した。野生型残基を有するＧＨ６１Ａ酵素のＰＩ値は、１．００に設定した。Ｔｍの向上は、変異体のＴｍ測定値と、野生型の親ＧＨ６１Ａの平均Ｔｍ測定値との比較により示された。
【０１７６】
以下は、上記アッセイの少なくとも１つにおいて、野生型ＧＨ６１Ａよりも向上した性質（例えば向上した熱安定性、タンパク質産生、又はＰＩ＞１．０で表される性能）を有するＧＨ６１Ａ置換変異体の一覧である。ＧＨ６１Ａ変異体は、以下のコホートに分類される。
【０１７７】
コホート１−ｗｈＰＣＳ（ＨＰＬＣ）で向上したＰＩを有するＧＨ６１Ａ変異体：Ｐ１４５Ｇ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｑ、Ｄ１４６Ｙ、Ｎ１４７Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｃ、Ｖ１５４Ｄ、Ｖ１５４Ｅ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｈ、Ｖ１５４Ｐ、Ｖ１５４Ｑ、Ｖ１５４Ｔ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｆ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｌ、Ｒ１５６Ｍ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ｑ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｃ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｈ、Ｅ１５８Ｉ、Ｅ１５８Ｍ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｐ、Ｅ１５８Ｔ、Ｈ１６３Ａ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｅ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｇ、Ｈ１６３Ｉ、Ｈ１６３Ｋ、Ｈ１６３Ｍ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｔ、及びＨ１６３Ｗ。
【０１７８】
コホート２−ｗｈＰＣＳ（ＨＫ）で向上したＰＩを有するＧＨ６１Ａ変異体：Ｉ１４４Ｋ、Ｉ１４４Ｒ、Ｉ１４４Ｓ、Ｐ１４５Ｇ、Ｐ１４５Ｈ、Ｐ１４５Ｉ、Ｐ１４５Ｋ、Ｐ１４５Ｒ、Ｐ１４５Ｓ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ１４６Ａ、Ｄ１４６Ｃ、Ｄ１４６Ｅ、Ｄ１４６Ｆ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｍ、Ｄ１４６Ｔ、Ｎ１４７Ｆ、Ｎ１４７Ｍ、Ｌ１４８Ｋ、Ｌ１４８Ｖ、Ａ１４９Ｃ、Ａ１４９Ｄ、Ａ１４９Ｆ、Ａ１４９Ｇ、Ａ１４９Ｉ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｖ、Ｐ１５０Ａ、Ｐ１５０Ｃ、Ｐ１５０Ｄ、Ｐ１５０Ｅ、Ｐ１５０Ｆ、Ｐ１５０Ｇ、Ｐ１５０Ｈ、Ｐ１５０Ｉ、Ｐ１５０Ｋ、Ｐ１５０Ｌ、Ｐ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｆ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｉ、Ｇ１５１Ｋ、Ｇ１５１Ｍ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｖ、Ｇ１５１Ｗ、Ｇ１５１Ｙ、Ｎ１５２Ｅ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｈ、Ｎ１５２Ｋ、Ｎ１５２Ｐ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｐ、Ｙ１５３Ｑ、Ｙ１５３Ｒ、Ｙ１５３Ｓ、Ｙ１５３Ｖ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｋ、Ｖ１５４Ｎ、Ｖ１５４Ｒ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｎ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｑ、Ｈ１５７Ｄ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｌ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｓ、Ｅ１５８Ｗ、Ａ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｎ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｔ、Ｈ１６３Ｖ、Ｈ１６３Ｗ、及びＨ１６３Ｙ。
【０１７９】
コホート３−向上した熱安定性及び／又はＴｍを有するＧＨ６１Ａ変異体：Ｉ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｆ、Ｌ１４８Ｐ、Ａ１４９Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｖ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｑ、Ｎ１５２Ｓ、Ｎ１５２Ｙ、Ｌ１５５Ｍ、Ｒ１５６Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ｅ１５８Ｗ、Ｅ１５８Ｙ、Ｉ１５９Ｑ、Ｉ１６０Ｄ、Ｉ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｅ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１６２Ｆ、Ｈ１６３Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、及びＨ１６３Ｙ。
【０１８０】
コホート４−（上のＶＩＩで記載したアッセイのいずれかにおいて）ｄａＣＳで向上した活性を有するＧＨ６１Ａ変異体：Ｆ１１２Ｖ、Ｋ１１３Ｌ、Ｋ１１３Ｍ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１１３Ｒ、Ｋ１１３Ｓ、Ｉ１１４Ｆ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１４４Ｆ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１４５Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｖ１５４Ｔ、Ｈ１６３Ｄ、及びＨ１６３Ｙ。コホート１、２、３、又は４のＧＨ６１Ａ変異体のいずれか１つは、本発明において用途を見出す。特定のＧＨ６１Ａ変異体は２つ以上のコホートに存在し、本発明の態様に従ったＧＨ６１Ａ変異体として、特に興味深いものであり、例えば、コホート１及び２、コホート１及び３、コホート１及び４、コホート２及び３、コホート２及び４、コホート３及び４に存在するＧＨ６１Ａ変異体等がある。３つのコホートに存在する変異体、例えば変異体Ｈ１６３Ｄ（コホート１、２及び４に存在）、並びにＨ１６３Ｙ（コホート２、３及び４に存在）もまた、特に興味深い。更に、組み合わせＧＨ６１Ａ変異体（即ち、２つ以上の置換を有するＧＨ６１Ａ変異体）を生成するために、コホート１、２、３及び／又は４のＧＨ６１Ａ変異体から任意の置換の組み合わせを使用できる。組み合わせＧＨ６１Ａ変異体は、以下で更に詳細を記載する。
【０１８１】
上記コホート１、２、３及び４のＧＨ６１Ａ変異体に加え、野生型ＧＨ６１Ａと比較して向上した性質を有しないが、ｗｈＰＣＳ（ＨＰＬＣ）アッセイ、ｗｈＰＣＳ（ＨＫ）アッセイ、又はｄａＣＳアッセイのいずれかの１つ又は２つ以上で、野生型レベルの活性を示したＧＨ６１Ａ置換変異体を同定した。配列番号３のアミノ酸位１１１〜１１４及び１４４〜１６３は、ＧＨ６１Ａの構造的完全性又は安定性、及びその機能にとって重要であると理解することができるため、これらの残基における特定の変異が、野生型ＧＨ６１酵素に類似の性質を有する変異体をもたらしたことは、驚きである。これらのＧＨ６１Ａ変異体は以下の通りであり、本明細書において野生型コホートと称されるものを形成する。Ｆ１１２Ｍ、Ｆ１１２Ｗ、Ｋ１１３Ｐ、Ｋ１１３Ｔ、Ｉ１１４Ｌ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１４４Ａ、Ｉ１４４Ｃ、Ｉ１４４Ｄ、Ｉ１４４Ｅ、Ｉ１４４Ｈ、Ｉ１４４Ｎ、Ｉ１４４Ｐ、Ｉ１４４Ｑ、Ｉ１４４Ｔ、Ｉ１４４Ｗ、Ｉ１４４Ｙ、Ｐ１４５Ｃ、Ｐ１４５Ｄ、Ｐ１４５Ｅ、Ｐ１４５Ｆ、Ｐ１４５Ｌ、Ｐ１４５Ｍ、Ｐ１４５Ｎ、Ｐ１４５Ｑ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４５Ｗ、Ｐ１４５Ｙ、Ｄ１４６Ｇ、Ｄ１４６Ｈ、Ｄ１４６Ｉ、Ｄ１４６Ｌ、Ｄ１４６Ｎ、Ｄ１４６Ｐ、Ｄ１４６Ｒ、Ｄ１４６Ｓ、Ｄ１４６Ｖ、Ｄ１４６Ｗ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｃ、Ｎ１４７Ｄ、Ｎ１４７Ｅ、Ｎ１４７Ｇ、Ｎ１４７Ｈ、Ｎ１４７Ｉ、Ｎ１４７Ｋ、Ｎ１４７Ｌ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｑ、Ｎ１４７Ｒ、Ｎ１４７Ｓ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｖ、Ｎ１４７Ｗ、Ｎ１４７Ｙ、Ｌ１４８Ａ、Ｌ１４８Ｃ、Ｌ１４８Ｄ、Ｌ１４８Ｅ、Ｌ１４８Ｆ、Ｌ１４８Ｇ、Ｌ１４８Ｈ、Ｌ１４８Ｉ、Ｌ１４８Ｍ、Ｌ１４８Ｎ、Ｌ１４８Ｑ、Ｌ１４８Ｒ、Ｌ１４８Ｓ、Ｌ１４８Ｔ、Ｌ１４８Ｗ、Ｌ１４８Ｙ、Ａ１４９Ｅ、Ａ１４９Ｈ、Ａ１４９Ｋ、Ａ１４９Ｌ、Ａ１４９Ｍ、Ａ１４９Ｑ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｓ、Ａ１４９Ｔ、Ａ１４９Ｗ、Ａ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｍ、Ｐ１５０Ｎ、Ｐ１５０Ｒ、Ｐ１５０Ｓ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５０Ｖ、Ｐ１５０Ｗ、Ｐ１５０Ｙ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５１Ｃ、Ｇ１５１Ｄ、Ｇ１５１Ｌ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｒ、Ｇ１５１Ｔ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｃ、Ｎ１５２Ｄ、Ｎ１５２Ｉ、Ｎ１５２Ｌ、Ｎ１５２Ｍ、Ｎ１５２Ｒ、Ｎ１５２Ｔ、Ｎ１５２Ｖ、Ｎ１５２Ｗ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｃ、Ｙ１５３Ｄ、Ｙ１５３Ｅ、Ｙ１５３Ｇ、Ｙ１５３Ｈ、Ｙ１５３Ｉ、Ｙ１５３Ｎ、Ｙ１５３Ｔ、Ｙ１５３Ｗ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｉ、Ｖ１５４Ｌ、Ｖ１５４Ｍ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ｗ、Ｖ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｎ、Ｒ１５６Ｔ、Ｒ１５６Ｖ、Ｒ１５６Ｗ、Ｒ１５６Ｙ、Ｈ１５７Ａ、Ｈ１５７Ｃ、Ｈ１５７Ｅ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｇ、Ｈ１５７Ｉ、Ｈ１５７Ｋ、Ｈ１５７Ｌ、Ｈ１５７Ｍ、Ｈ１５７Ｎ、Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１５７Ｑ、Ｈ１５７Ｒ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｖ、Ｈ１５７Ｙ、Ｅ１５８Ｇ、Ｅ１５８Ｋ、Ｅ１５８Ｒ、Ｅ１５８Ｖ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｃ、Ｉ１５９Ｄ、Ｉ１５９Ｅ、Ｉ１５９Ｆ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１５９Ｈ、Ｉ１５９Ｋ、Ｉ１５９Ｌ、Ｉ１５９Ｍ、Ｉ１５９Ｎ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ｓ、Ｉ１５９Ｔ、Ｉ１５９Ｖ、Ｉ１５９Ｗ、Ｉ１５９Ｙ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｃ、Ｉ１６０Ｅ、Ｉ１６０Ｇ、Ｉ１６０Ｈ、Ｉ１６０Ｋ、Ｉ１６０Ｌ、Ｉ１６０Ｍ、Ｉ１６０Ｎ、Ｉ１６０Ｐ、Ｉ１６０Ｑ、Ｉ１６０Ｒ、Ｉ１６０Ｓ、Ｉ１６０Ｔ、Ｉ１６０Ｖ、Ｉ１６０Ｗ、Ｉ１６０Ｙ、Ａ１６１Ｄ、Ａ１６１Ｆ、Ａ１６１Ｇ、Ａ１６１Ｈ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｋ、Ａ１６１Ｍ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｐ、Ａ１６１Ｑ、Ａ１６１Ｒ、Ａ１６１Ｓ、Ａ１６１Ｔ、Ａ１６１Ｖ、Ａ１６１Ｗ、Ｌ１６２Ｃ、Ｌ１６２Ｄ、Ｌ１６２Ｅ、Ｌ１６２Ｇ、Ｌ１６２Ｈ、Ｌ１６２Ｋ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６２Ｐ、Ｌ１６２Ｑ、Ｌ１６２Ｒ、Ｌ１６２Ｓ、Ｌ１６２Ｔ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６２Ｗ、Ｌ１６２Ｙ、Ｈ１６３Ｑ、及びＨ１６３Ｓ。
【０１８２】
本発明の特定の実施形態において、この野生型コホートにおける置換の１つ又はそれらの組み合わせは、ＧＨ６１の変異体の作製に用いられる。更に、この野生型コホートにおける置換の１つ又はそれらの組み合わせは、上記コホート１、２、３及び／又は４で同定した置換の１つ又は２つ以上を有する、組み合わせＧＨ６１Ａ変異体を作製するのに用いられる。野生型コホート置換はまた、ＧＨ６１Ａの１１１位〜１１４位及び１４４位〜１６３位にかけてのアミノ酸残基のストレッチの外側の位置における置換（又は他の変異）、例えば１つ又は２つ以上の向上した性質をもたらす置換と組み合わせても用いられる。
【０１８３】
（実施例４）
ＧＨ６１Ａにおける補償置換
ＧＨ６１ＡのＦ１１２位における置換は、Ｆ１１２Ａ及びＦ１１２Ｖを含む、野生型親酵素と比較して低下した発現量を示す。これらの変異体は共に、（上の実施例１、セクションＩＶ．Ｂで決定して）５００ｐｐｍ（百万分率）未満で発現したのに対し、同一条件下で産生された野生型酵素は約２７００ｐｐｍであった。トリコデルマ・レーシのＧＨ６１Ｂの既知の３Ｄ結晶構造（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６１  ｍｅｍｂｅｒ，Ｃｅｌ６１Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ，ａｔ  １．６  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３８３，１４４〜１５４を参照）に基づき、（一般に入手可能な解析ソフトウエアを使用して）ＧＨ６１Ａのアミノ酸側鎖のコンピュータによる分析を行い、可能性のある補償置換、即ち、Ｆ１１２位におけるアミノ酸置換を有するＧＨ６１変異体の安定性を向上させることによって、これらの変異体の低下した発現量を潜在的に補い得る可能性のある置換を同定した。このコンピュータ分析に基づく、一連の組み合わせＧＨ６１Ａ変異体を（上述の通り）生成して発現させ、（上の実施例１、セクションＩＶ．Ｂの通り）発現量を決定した。
【０１８４】
以下の４つの、ＧＨ６１Ａの組み合わせ変異体は、Ｆ１１２Ａ又はＦ１１２Ｖの単一アミノ酸置換変異体のいずれかの発現量よりも向上した発現量を示した。
１．Ｌ９４Ｉ−Ｆ１１２Ａ
２．Ｌ９４Ｖ−Ｆ１１２Ｉ
３．Ｆ１１２Ｉ−Ｌ１４８Ｉ
４．Ｌ９４Ｉ−Ｆ１１２Ｖ
【０１８５】
Ｆ１１２Ａ及びＦ１１２Ｖ単一アミノ酸変異体は、野生型ＧＨ６１Ａ酵素の約１２〜１５％の量で発現したが、上記４つの組み合わせ変異体は、野生型ＧＨ６１Ａ酵素の約２５〜６０％の量で発現した。
【０１８６】
加えて、これらの組み合わせ変異体を、上の実施例１、セクションＶＩ．Ｂで記載したｗｈＰＣＳアッセイで試験した。タンパク質量を正規化した場合、これらの組み合わせ変異体のそれぞれは、ｗｈＰＣＳアッセイにおいて野生型ＧＨ６１Ａ酵素と同等に実施した。
【０１８７】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、単に例証の目的のためであり、それらの観点から、種々の改変又は変更が当業者には提案され、本出願及び添付の請求項の趣旨及び範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用された全ての出版物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれら全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
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【０１８９】
【表２−１】
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【０１９０】
【表２−２】
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【０１９１】
【表２−３】
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【０１９２】
【表２−４】
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【０１９３】
【表２−５】
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【０１９４】
【表２−６】
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【０１９５】
【表２−７】
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【０１９６】
【表２−８】
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【０１９７】
【表２−９】
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【０１９８】
【表２−１０】
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【０１９９】
【表２−１１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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