(57)【要約】本開示は、BTN2A1を中和して、および／または、ガン細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、免疫反応を増強または誘導する方法および／またはガン細胞の溶解を誘導する方法および／または患者におけるガンを治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
BTN2A1を中和する化合物を患者に投与することを含む、患者における免疫反応を増強または誘導する方法。
【請求項２】
患者が、メラノーマなどのガンに苦しんでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
BTN2A1を中和する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマ細胞などのガン細胞の溶解を誘導する方法。
【請求項４】
BTN2A1を中和して、および／または、細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマ細胞などのガン細胞の死を誘導する方法。
【請求項５】
BTN2A1を中和して、および／または、細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるガンを治療する方法。
【請求項６】
ガンが、結腸ガン、前立腺ガン、肺ガンまたはメラノーマである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
BTN2A1を中和して、および／または、細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマを治療する方法。
【請求項８】
メラノーマが、原発性メラノーマまたは切除不能なメラノーマまたは転移性メラノーマである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、T細胞による細胞の細胞傷害性殺傷を誘導する、および／またはT細胞を活性化する量で投与される、請求項２〜８のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
化合物が、細胞上のBTN2A1に結合して、
(i)BTN2A1シグナル伝達を中和する；および／または
(ii)細胞死を誘導する；
請求項１〜９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１１】
化合物が、抗原結合ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が、抗体模倣体である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり、または抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の抗原結合フラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗原結合フラグメントが、
(i)ドメイン抗体(dAb)；
(ii)Fv；
(iii)scFvまたはその安定化形態(たとえば、ジスルフィド安定化scFv)；
(iv)ダイマーscFvまたはその安定化形態；
(v)二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体または高次マルチマー；
(vi)Fabフラグメント；
(vii)Fab’フラグメント；
(viii)F(ab’)フラグメント；
(ix)F(ab’)2フラグメント；
(x)抗体のFc領域に融合した(i)-(ix)の任意の1つ；
(xi)免疫エフェクター細胞に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに融合した(i)-(ix)の任意の1つ；
である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物が、毒性化合物に複合されることなくそれが結合する細胞の死を誘導する、請求項４〜１５のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１７】
化合物が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)および／または補体依存性細胞傷害性(CDC)を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が、作用剤に複合される、請求項１〜１７のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１９】
作用剤が、化合物が結合する細胞の死を誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が、全長抗体であるか、または全長抗体を含む、請求項１〜１９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、抗体定常領域に融合したBTN2A1の細胞外ドメインを含むタンパク質である、請求項１〜９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、BTN2A1の発現を阻害または防止する、請求項１〜９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２３】
化合物が、アンチセンス、siRNA、RNAi、shRNAおよび触媒核酸から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2013年11月29日出願の「ガンの治療方法」と題するオーストラリア特許出願第2013904620号に対する優先権を主張する。この出願の開示の全体を参照することにより本出願に含める。
技術分野
本開示は、ガンを治療するための試薬および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
医学研究における数多くの進歩にもかかわらず、依然として、ガンは、アメリカ合衆国における死亡の第二の主な原因である。外科的切除、放射線療法および化学療法などの臨床診療の従来法は、特に固形腫瘍にたいして重大な失敗率を有する。失敗は、初発腫瘍が完全に外科的に除去するには進行しすぎているか、無反応であるか、または元の部位における再成長による再発もしくは転移によって起こる。ガンは、依然として、医学研究および開発の中心的焦点である。
【０００３】
罹患率および死亡率の面での3つの主なガンは、結腸ガン、前立腺ガンおよび肺ガンである。新たな外科的手法は、結腸ガンに対して生存率を提供する。改善されたスクリーニング法は、前立腺ガンの検出を増加させ、早期の攻撃性の低い療法を可能にする。多くの研究が、早期発見が、生存および治療選択肢を増加させることを明らかにしている。肺ガンは、非常に難治性のままである。
【０００４】
アメリカ合衆国だけで、基底細胞ガン以外に、一年当り百万以上の新たな症例が発生し、この国の一年当り50万人以上の死亡の主な原因である。世界全体では、一年当りの新たな症例のガンの総数は、六百万を超える。
【０００５】
皮膚ガンは、すべてのガンのうち最も一般的であり、メラノーマは、最も重篤で攻撃型の皮膚ガンである。メラノーマは、皮膚ガンの症例の5%未満の割合を占めるが、皮膚ガンに関連する死亡の大きな原因である。2010年に、アメリカ合衆国では、ほぼ70,000人の人々が、メラノーマであると診断され、約9,000人の人々が、この疾患による死亡を予想された(American Cancer Society； www.cancer.org)。世界中でメラノーマの発生率は、増加しており、メラノーマ発症の生涯リスクは、オーストラリアでは男性で1/25であり、アメリカ合衆国では男性で1/58より大きい。転移性メラノーマは、依然として、最も治療が困難なガンのひとつであり、この疾患の進行型を有する個人の平均生存時間は、わずか9〜11ヶ月である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のことから、当業者には、メラノーマなどのガンの新たな治療が望ましいことが明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概略
本発明に到達することにおいて、本発明者らは、メラノーマ細胞などのガン細胞において高度に発現され、正常細胞において低レベルで発現される膜結合タンパク質であるブチロフィリン・サブファミリー2・メンバーA1(BTN2A1)を同定した。発明者らは、BTN2A1に対する抗体も作成し、BTN2A1に対する抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導することによって細胞(たとえば、メラノーマ細胞)を殺すことができることを明らかにした。さらに、本発明者らは、BTN2A1の中和が、メラノーマに対する免疫反応を増強することを明らかにした。たとえば、BTN2A1が、CD4+およびCD8+T細胞の増殖および活性化合物を抑制し、このタンパク質を中和することが、活性化T細胞およびメラノーマ細胞の細胞傷害のレベルを上昇させることが示された。本発明者らは、さらに、BTN2A1タンパク質が、たとえば、結腸ガン細胞、前立腺ガン細胞、肺ガン細胞などのさまざまなガン細胞上に発現され、線維芽細胞および単球などの血液細胞といったような正常細胞には有意に発現されないことを明らかにした。
本発明者らによるこれらの発見は、BTN2A1に結合および／またはBTN2A1を中和する試薬およびメラノーマ、結腸ガン、肺ガンまたは前立腺ガンなどのガンの治療におけるその使用のための基礎を提供する。たとえば、本開示は、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、メラノーマ細胞、結腸ガン細胞、肺ガン細胞または前立腺ガン細胞などのガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。たとえば、化合物は、たとえば、メラノーマなどのガンに苦しんでいる患者に投与される。
【０００８】
本開示は、また、BTN2A1を中和する化合物を患者に投与することを含む、患者における免疫反応を増強または誘導する方法を提供する。1つの例において、患者は、ガンに苦しんでいる。1つの例において、患者は、メラノーマに苦しんでいる。1つの例において、患者は、結腸ガンに苦しんでいる。1つの例において、患者は、肺ガンに苦しんでいる。1つの例において、患者は、前立腺ガンに苦しんでいる。必要に応じて、化合物は、細胞(メラノーマ細胞などのガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する。
【０００９】
本開示は、また、BTN2A1を中和する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマ細胞などのガン細胞の溶解を誘導する方法を提供する。必要に応じて、化合物は、細胞(メラノーマ細胞、結腸ガン細胞、肺ガン細胞または前立腺ガン細胞などのガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する。
【００１０】
本開示は、また、BTN2A1を中和して、および／または、細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマ細胞、結腸ガン細胞、肺ガン細胞または前立腺ガン細胞などのガン細胞の死を誘導する方法を提供する。1つの例において、ADCCによるか、または細胞に対する免疫反応(たとえば、T細胞媒介性免疫反応)を誘導することによって死を誘導する化合物は、抗体である。
【００１１】
本開示は、さらに、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるガンを治療する方法を提供する。
【００１２】
1つの例において、ガンは、結腸ガン、前立腺ガン、肺ガンまたはメラノーマである。
【００１３】
1つの例において、ガンは、メラノーマである。
【００１４】
1つの例において、ガンは、BTN2A1を発現または過剰発現する(たとえば、ガン細胞の表面上などのタンパク質レベルにおいてBTN2A1を過剰発現する)。
【００１５】
本開示は、さらに、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、メラノーマ細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者におけるメラノーマを治療する方法を提供する。
【００１６】
1つの例において、メラノーマは、原発性メラノーマまたは切除不能なメラノーマまたは転移性メラノーマである。
【００１７】
1つの例において、メラノーマは、BTN2A1を発現または過剰発現する(たとえば、メラノーマ細胞の表面上などのタンパク質レベルにおいてBTN2A1を過剰発現する)。
【００１８】
本開示は、さらに、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、結腸ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者における結腸ガンを治療する方法を提供する。
【００１９】
1つの例において、結腸ガンは、BTN2A1を発現または過剰発現する(たとえば、結腸ガン細胞の表面上などのタンパク質レベルにおいてBTN2A1を過剰発現する)。
【００２０】
本開示は、さらに、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、肺ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者における肺ガンを治療する方法を提供する。
【００２１】
1つの例において、肺ガンは、BTN2A1を発現または過剰発現する(たとえば、肺ガン細胞の表面上などのタンパク質レベルにおいてBTN2A1を過剰発現する)。
【００２２】
本開示は、さらに、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、前立腺ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を患者に投与することを含む、患者における前立腺ガンを治療する方法を提供する。
【００２３】
1つの例において、前立腺ガンは、BTN2A1を発現または過剰発現する(たとえば、前立腺ガン細胞の表面上などのタンパク質レベルにおいてBTN2A1を過剰発現する)。
【００２４】
1つの例において、化合物は、T細胞によるメラノーマ細胞の細胞傷害性殺傷を誘導するか、またはT細胞を活性化する量(たとえば、IFNγまたはTNFα産生のレベルによって決定される)で投与される。
【００２５】
1つの例において、化合物は、細胞上のBTN2A1に結合して、
(i)BTN2A1シグナル伝達を調節(たとえば、誘導または増強または低減化)する；および／または
(ii)細胞死を誘導する；
化合物である。
【００２６】
1つの例において、化合物は、細胞上のBTN2A1に結合して、
(i)BTN2A1シグナル伝達を中和する；および／または
(ii)細胞死を誘導する；
化合物である。
【００２７】
1つの例において、化合物は、たとえば、IgG Fc領域などの抗体定常領域(任意にヒンジ領域を含む)に融合したBTN2A1にお細胞外ドメインを含むタンパク質である。
【００２８】
1つの例において、化合物は、BTN2A1の発現を阻害する。たとえば、化合物は、アンチセンス、siRNA、RNAi、shRNAおよびリボザイムまたはDNAザイムなどの触媒核酸から選択される。
【００２９】
1つの例において、BTN2A1は、ヒトBTN2A1などの哺乳類BTN2A1である。
【００３０】
1つの例において、患者は、たとえば、ヒトなどの霊長類などの哺乳類である。
【００３１】
本明細書に記載の治療方法は、さらに、メラノーマ、前立腺ガン、結腸ガンまたは肺ガンなどのガンを治療するためのさらなる化合物を投与することを含むことができる。たとえば、さらなる化合物は、免疫療法または化学療法である。
【００３２】
本明細書に記載の治療方法は、さらに、外科手術および／または放射線療法などの、メラノーマなどのガンを治療するためのさらなる処置を行なうことを含むことができる。
【００３３】
1つの例において、本明細書に記載の方法は、さらに、患者からの細胞、たとえば、メラノーマ細胞、結腸ガン細胞、肺ガン細胞または前立腺ガン細胞などのガン細胞上のBTN2A1を検出することを含む。
【００３４】
本開示は、さらに、患者のガンを治療するための医薬の製造のための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物の使用を提供する。
【００３５】
本開示は、さらに、患者のメラノーマを治療するため、および／または、免疫反応を増強または誘導するための医薬の製造のための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、メラノーマ細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物の使用を提供する。
【００３６】
本開示は、さらに、患者のガンの治療における使用のための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を提供する。
【００３７】
本開示は、さらに、患者のメラノーマの治療における使用のため、および／または、免疫反応を誘導するための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、メラノーマ細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を提供する。
【００３８】
本開示は、さらに、患者の結腸ガンの治療における使用のため、および／または、免疫反応を誘導するための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、結腸ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を提供する。
【００３９】
本開示は、さらに、患者の前立腺ガンの治療における使用のため、および／または、免疫反応を誘導するための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、前立腺ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を提供する。
【００４０】
本開示は、さらに、患者の肺ガンの治療における使用のため、および／または、免疫反応を誘導するための、BTN2A1を中和して、および／または、細胞(たとえば、肺ガン細胞)上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物を提供する。
【００４１】
本開示は、さらに、細胞上のBTN2A1に結合して、
(i)BTN2A1シグナル伝達を調節する；および／または
(ii)細胞死を誘導する；
化合物を提供する。
【００４２】
1つの例において、本開示は、さらに、抗原結合ドメインを含むタンパク質であって、抗原結合ドメインが、細胞上のBTN2A1に結合して、
(i)BTN2A1シグナル伝達を中和する；および／または
(ii)細胞死を誘導する；
タンパク質を提供する。
【００４３】
1つの例において、細胞は、メラノーマ細胞である。
【００４４】
1つの例において、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン、たとえば、抗体の抗原結合ドメインである。
【００４５】
1つの例において、BTN2A1の中和は、化合物がBTN2A1に結合して細胞-化合物複合体を形成するようにメラノーマ細胞などのガン細胞を化合物と接触させ；該複合体をT細胞(たとえば、CD4+T細胞またはCD8+T細胞)と接触させ；次いで、メラノーマ細胞死(たとえば、T細胞によるガン細胞の細胞傷害性殺傷)のレベルを決定する；ことによって決定され、ここで、化合物の不在下と比較した化合物の存在下でのメラノーマ細胞死のレベルの増加は、化合物がBTN2A1を中和したことを示す。
【００４６】
1つの例において、BTN2A1の中和は、化合物がBTN2A1に結合して細胞-化合物複合体を形成するようにガン細胞(たとえば、メラノーマ細胞)を化合物と接触させ；該複合体をT細胞(たとえば、CD4+T細胞またはCD8+T細胞)と接触させ；次いで、T細胞の活性化のレベルを決定する(たとえば、細胞内インターフェロン(IFN)γまたは腫瘍壊死因子(TNF)αのレベルを決定することによって)；ことによって決定され、ここで、化合物の不在下と比較した化合物の存在下でのT細胞の活性化のレベルの増加は、化合物がBTN2A1を中和したことを示す。
【００４７】
本開示が企図する化合物は、天然化合物、化学的小分子化合物または生体化合物などのさまざまな形態のいずれかをとることができる。例示的な化合物として、核酸(たとえば、アプタマー)、ポリペプチド、ペプチド、小分子、抗体または抗体の抗原結合フラグメントが挙げられる。
【００４８】
1つの例において、化合物は、たとえば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などのタンパク質系化合物である。
【００４９】
1つの例において、化合物は、抗体模倣体である。たとえば、化合物は、IgNAR、ラクダ抗体またはT細胞受容体などの免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含むタンパク質である。
【００５０】
もう1つの例において、抗体模倣体は、アドネクチン、アフィボディ、アトリマー、エバシン、設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)またはアンチカリンなどの非抗体抗原結合ドメインを含むタンパク質である。
【００５１】
1つの例において、本開示の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。1つの例において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００５２】
1つの例において、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００５３】
本開示が企図する例示的な抗原結合フラグメントとして、
(i)ドメイン抗体(dAb)；
(ii)Fv；
(iii)scFvまたはその安定化形態(たとえば、ジスルフィド安定化scFv)；
(iv)ダイマーscFvまたはその安定化形態；
(v)二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体または高次マルチマー；
(vi)Fabフラグメント；
(vii)Fab’フラグメント；
(viii)F(ab’)フラグメント；
(ix)F(ab’)2フラグメント；
(x)抗体のFc領域に融合した(i)-(ix)の任意の1つ；
(xi)免疫エフェクター細胞(たとえば、二重特異性T細胞エフェクター/エンゲージャー；BiTe)に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに融合した(i)-(ix)の任意の1つ；
が挙げられる。
【００５４】
1つの例において、本開示の化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、それが結合するメラノーマ細胞などのガン細胞の死を誘導する。
【００５５】
ある例において、化合物(たとえば、抗体)は、毒性化合物に複合されることなくそれが結合する細胞の死を誘導する能力がある。
【００５６】
1つの例において、本開示の化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメントが結合する細胞の死をもたらすエフェクター機能などのエフェクター機能を誘導する能力がある。例示的なエフェクター機能として、ADCC、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)が挙げられる。
【００５７】
1つの例において、化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、ADCCを誘導する能力がある。
【００５８】
1つの例において、化合物は、エフェクター機能のレベルの増強を誘導する能力がある。たとえば、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)は、アフコシル化されたFc領域を含む。
【００５９】
1つの例において、化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)によって誘導されたエフェクター機能を増強する1つ以上のアミノ酸配列置換を含むFc領域を含む。たとえば、1つ以上のアミノ酸配列置換は、置換を含まないFc領域と比較して、Fcγ受容体(FcγR)に対するFc領域の親和性を増加させる。たとえば、1つ以上のアミノ酸置換は、置換を含まないFc領域と比較して、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIcおよびFcγRIIIaから選択されるFcγRに対するFc領域の親和性を増強する。
【００６０】
1つの例において、化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、作用剤に複合される。例示的な作用剤として、検出可能な標識、またはポリエチレングリコールなどのタンパク質または抗体の半減期を延長する化合物、またはアルブミン結合タンパク質、または化合物が結合する細胞の死を誘導する作用剤が挙げられる。例示的な作用剤は、本明細書に記載される。
【００６１】
1つの例において、本開示の抗体は、全長抗体である。
【００６２】
本開示は、また、本開示の化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)および医薬的に許容しうる担体を含む組成物を提供する。
【００６３】
上述したように、本発明者らは、また、BTN2A1を中和することが、ガン細胞、たとえば、メラノーマ細胞を殺傷することにおいて有効な免疫反応(たとえば、T細胞免疫反応)を誘導することを明らかにしている。このようにして、本発明者らは、BTN2A1を中和して(たとえば、BTN2A1発現および／または活性のアンタゴニスト)、および／または細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物の治療効果を実証している。同様に、本開示は、医薬の製造におけるか、または医薬における、BTN2A1を中和して、および／または細胞上のBTN2A1に結合して、細胞死を誘導する化合物の使用を提供する。
【００６４】
配列表のための鍵
配列番号：1は、ヒトBTN2A1アイソフォーム1のアミノ酸配列である。
配列番号：2は、ヒトBTN2A1アイソフォーム2のアミノ酸配列である。
配列番号：3は、ヒトBTN2A1アイソフォーム3のアミノ酸配列である。
配列番号：4は、ヒトBTN2A1アイソフォーム4のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】メラノーマ腫瘍におけるBTN2A1、PD1L1およびPD1L2 の発現を示すグラフ表示である。データは絶対数で表され、実線は、分析のために通常用いられる50カウントのカットオフを表す。
【図２Ａ−Ｇ】図2A-Gは、メラノーマ細胞株(図2A)、結腸ガン細胞株(図2B)、肺ガン細胞株(図2C)、前立腺ガン細胞株(図2D)、単球(図2E)、正常組織(図2F)およびメラノーマ細胞(図2G)におけるBTN2A1発現のフローサイトメトリー分析(図2A-E)またはマイクロアレイ分析(図2FおよびG)の結果を示すグラフ表示である。図2A-Eについては、細胞株の名称を各グラフの右の表に記載し、抗BTN2A1抗体の結果を薄い灰色で示し、アイソタイプコントロール抗体の結果を濃い灰色で示す。
【図３】A-Cと名づけた一連のグラフ表示であり、BTN2A1がT細胞増殖を阻害し、FoxP3+制御性T細胞を誘導することを示す。図3Aおよび3Bでは、96ウェルプレートを組換えBTN2A1(10μg/ml)またはBSA(10μg/ml)でコーティングし、PBMC(CSFE-標識)を加えた。5時間後、CD4+(図3A)またはCD8+(図3B)細胞の増殖パーセンテージを、フローサイトメトリーによって分析した。図3Cでは、BTN2A1またはBSAコーティングプレートに、3PBMCまたはソートされたCD4+細胞を加え、3日間インキュベートした。CD4/CD25/FoxP3+細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。
【図４】A-Dと名づけた一連のグラフ表示であり、腫瘍細胞におけるBTN2A1ノックダウンが、T細胞活性化の増加および高い腫瘍細胞クリアランスをもたらすことを示す。図4において、BTN2A1またはスクランブルsiRNAコントロールに特異的なsiRNAでメラノーマ細胞をトランスフェクトし、48時間後にBTN2A1発現をフローサイトメトリーによって測定した。図4Bでは、NY-ESO-1陽性メラノーマ細胞におけるBTN2A1ノックダウンの2日後、HLA-マッチT細胞認識エピトープ96-104を培養物に加え、20時間後に、生存するメラノーマ細胞をMTSによって測定した。図4Cおよび4Dは、(B)で記載したものと同じ条件でのメラノーマ細胞との共インキュベーション後のCD8+T細胞における細胞内サイトカイン(IFNγ(図4D)またはTNFα(図4C))のレベルを示す。スクランブルコントロールについて観察されたレベルをY軸上で1に設定した。
【図５】AおよびBと名づけた2つのグラフ表示であり、インビトロアッセイの結果を示す。BTN2A1-陽性標的細胞[LM-MEL62(A)または293FS(B)のいずれか]を抗BTN2A1抗体(34C1)およびNK細胞とともに、10:1のエフェクター対標的細胞比(E:T)でインキュベートした。CytoTox-One試薬(Promega)を用いて乳酸脱水素酵素(LDH)放出を測定した。最大(界面活性剤)およびバックグラウンド(エフェクターおよび標的細胞単独)溶解に対してデータを標準化することによって特異的溶解を決定した。3人のドナーからのNK細胞を用いる3回繰り返し測定の平均およびSDを示す。
【図６】NK細胞活性化アッセイの結果を示すグラフ表示である。抗BTN2A1抗体(34C1)の存在および不在下で、健康なドナーからのPBMCをBTN2A1-陽性標的細胞(LM-MEL-62)とともにインキュベートした。フローサイトメトリーによって、CD107a+であるNK細胞(CD3-、CD56+)の割合を調べることによって活性化を決定した。4回の実験からの平均およびSDを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
詳細な記載
通則
本明細書を通して、他に特記しない限り、または文脈が要求しない限り、単一のステップ、組成物、ステップのグループまたは組成物のグループは、このようなステップ、組成物、ステップのグループまたは組成物のグループの1つおよび複数を包含する。
【００６７】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外のバリエーションおよび変更の影響を受けやすいことを理解するであろう。開示が、このようなバリエーションおよび変更を包含することを理解すべきである。本開示は、また、本明細書に言及または示されるすべてのステップ、特徴、組成物および化合物を、個別的または集合的に、そして、2つ以上の該ステップまたは特徴のすべてまたは任意の組合せを包含する。
【００６８】
本開示は、本明細書に記載された特定の例に限定されるものではなく、それらは例示の目的のみを意図する。機能的に等価な生成物、組成物および方法は、明らかに本開示の範囲内である。
【００６９】
本明細書における開示の任意の例は、他に特記しない限り、本開示の任意の他の例に準用されると解釈されるべきである。別の言い方をすれば、本開示の任意の特定の例を、本開示の任意の他の特定の例と組合せることもできる(相互に排他的である場合を除く)。
【００７０】
特定の特徴または特徴のグループまたは方法または方法ステップを開示する本開示の任意の例は、特定の特徴または特徴のグループまたは方法または方法ステップを放棄するための明示的な支持を提供すると理解されるものとする。
【００７１】
他に特に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は、一般に当業者(たとえば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学の技術分野の当業者)によって理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【００７２】
他に特記しない限り、本開示で利用した組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的技術は、当業者には周知の標準的手順である。このような技術は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons(1984)、J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、T.A. Brown(editor)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、Volumes 1 and 2、IRL Press(1991)、D.M. Glover and B.D. Hames(editors)、DNA Cloning: A Practical Approach、Volumes 1-4、IRL Press(1995 and 1996)、およびF.M. Ausubel et al. (editors)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、including all updates until present)、Ed Harlow and David Lane(editors) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、(1988)、およびJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons(現在までのすべてのアップデートを含む)などの文献に記載および説明されている。
【００７３】
本明細書における可変領域およびその部分、抗体およびそのフラグメントの記載および定義は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1987 and 1991、Bork et al.、J Mol. Biol. 242、309-320、1994、Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917、1987、Chothia et al. Nature 342、877-883、1989および／またはAl-Lazikani et al.、J Mol Biol 273、927-948、1997に記載の議論によってさらに明確になりうる。
【００７４】
用語「および／または」、たとえば、「Xおよび／またはY」は、「XおよびY」または「XまたはY」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味に対して明らかな支持を提供すると解釈されるものとする。
【００７５】
本明細書を通じて、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含んでいる(comprising)」などの変化形は、述べられた要素、整数またはステップ、あるいは要素、整数またはステップのグループを包含することを意味し、任意の他の要素、整数またはステップ、あるいは要素、整数またはステップのグループを排除することを意味するものではない。
【００７６】
本明細書で用いる用語「に由来する」は、特定された整数が、必ずしも直接的にその源から得られるとは限らないが、特定の源から得られてもよいことを示すと解釈されるものとする。
【００７７】
選択された定義
限定ではなく命名の目的のみのために、BTN2A1のアミノ酸配列は、NCBI RefSeq NP_001184162.1、NP_001184163.1、NP_008980.1またはNP_001184163.1 および／または配列番号：1-4において教示される。1つの例において、BTN2A1はヒトBTN2A1である。
【００７８】
用語「メラノーマ」は、正常な皮膚のメラニン細胞または黒子から始まり、急速かつ広範に転移する悪性度の高い腫瘍を意味する。用語「メラノーマ」は、用語「悪性メラノーマ」、「悪性黒色腫(melanocarcinoma)」、「黒色上皮腫」および「黒色肉腫」と互換的に用いられうる。
【００７９】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンドメインを含む任意の抗原結合タンパク質を包含すると理解されるであろう。例示的な免疫グロブリンは、抗体である。用語「免疫グロブリン」に包含されるさらなるタンパク質は、ドメイン抗体、ラクダ抗体および軟骨魚類由来の抗体(すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体(IgNARs))を包含する。しかしながら、一般に、ラクダ抗体およびIgNARは、VHを含み、VLをもたず、重鎖免疫グロブリンと称されることが多い。他の「免疫グロブリン」として、T細胞受容体が挙げられる。
【００８０】
当業者は、「抗体」が、一般に、複数のポリペプチド鎖、たとえば、VLを含むポリペプチドおよびVHを含むポリペプチドからなる可変領域を含むタンパク質であるとみなされることを承知するであろう。抗体は、また、一般に、定常領域または定常領域フラグメントまたは結晶化可能フラグメント(Fc)にアレンジされうることもある定常ドメインを含む。VHおよびVLは、相互作用して、1つまたは2、3の密接に関連する抗原に特異的に結合する抗原結合領域を含むFvを形成する。一般に、哺乳類由来の軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類由来の重鎖は、α、δ、ε、γまたはμである。抗体は、任意のタイプ(たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスでありうる。用語「抗体」は、また、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体およびキメラ抗体を包含する。
【００８１】
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」または「全抗体」は、抗体の抗原結合フラグメントに対して、その実質的に完全な形態での抗体を意味するために互換的に用いられる。特に、全抗体は、Fc領域を含む重鎖および軽鎖をもつ抗体を包含する。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン(たとえば、ヒト野生型配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列変異体であってもよい。いくつかの場合、インタクト抗体は、抗体は、1つまたはそれ以上のエフェクター機能を有することができる。
【００８２】
用語「裸の抗体」は、たとえば、毒性化合物または放射標識などのもう1つの化合物に複合しない抗体を意味する。
【００８３】
抗体の「抗原結合性フラグメント」は、インタクト抗体の1つ以上の可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体(linear antibody)；抗体フラグメントから形成された単鎖抗体分子および多特異性(multispecific)抗体が挙げられる。
【００８４】
本開示の文脈において、「エフェクター機能」は、細胞の殺傷をもたらす抗体のFc領域(天然配列Fc領域またはアミノ酸配列変種Fc領域)と結合する細胞またはタンパク質に媒介される生物活性を意味する。抗体またはその抗原結合フラグメントによって誘導されるエフェクター機能の例として、補体依存性細胞傷害；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)；抗体依存性細胞食作用(ADCP)；およびB細胞活性化が挙げられる。
【００８５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ADCC」は、特定の細胞傷害性細胞(たとえば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球およびマクロファージ)に存在するFc受容体(FcR)上に結合した分泌Igが、これら細胞傷害性エフェクター細胞と抗原産生標的細胞との特異的な結合を可能にし、その後、標的細胞の細胞毒による殺傷を可能にする細胞傷害性の一形態を意味する。対象分子のADCC活性を評価するため、インビトロADCCアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞(PBMC)およびNK細胞が挙げられる。
【００８６】
本明細書において、「可変領域」は、抗原と特異的に結合できる本明細書に規定されている抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を意味し、たとえば、CDRのアミノ酸配列、すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3並びにフレームワーク領域(FR)を含む。たとえば、可変領域は、3個のCDRと共に、3または4個のFR(たとえば、FR1、FR2、FR3および必要に応じてFR4)を含む。VHは、重鎖の可変領域を意味する。VLは、軽鎖の可変領域を意味する。
【００８７】
本明細書において、用語「相補性決定領域」(別称CDR、すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3)は、その配列が抗体間で変動する、FR間のループを形成する抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味し、その存在は、特異的抗原結合に対する主な寄与者である。各可変領域は通常、CDR1、CDR2およびCDR3として同定される3個のCDR領域を有する。1つの例において、CDRおよびFRに付与されたアミノ酸配置は、KabatのSequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1987 and 1991(本明細書において「Kabatの付番方式」とも称する)にしたがって定義される。Kabatの付番方式にしたがい、VH FRおよびCDRは、次の通りに配置される：残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)および103-113(FR4)。Kabatの付番方式にしたがい、VL FRおよびCDRは次の通りに置かれる：残基1-23(FRl)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)および98-107(FR4)。
【００８８】
「フレームワーク領域」(以下、FR)は、CDR残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８９】
用語「定常領域」は、可変領域以外の抗体の重鎖または軽鎖の一部を指す。重鎖において、定常領域は、一般に、複数の定常ドメインおよびヒンジ領域を含み、たとえば、IgG定常領域は、以下の結合された構成要素、定常重鎖(CH)1、リンカー、CH2およびCH3を含む。重鎖において、定常領域は、Fcを含む。軽鎖において、定常領域は、一般に、1つの定常ドメイン(CL1)を含む。
【００９０】
「結晶化可能フラグメント」または「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」(本明細書において互換的に用いることができる)は、本明細書において、一般に(必須ではないが)糖鎖付加され、補体カスケードの1つまたはそれ以上のＦｃ受容体および／または成分と結合できる少なくとも１個の定常ドメインを含む抗体の部分を意味する。重鎖定常領域は、5種のアイソタイプ、α、δ、ε、γまたはμのうちいずれかから選択することができる。さらに、さまざまなサブクラス(重鎖のIgGサブクラス等)の重鎖は、異なるエフェクター機能に関与し、よって、所望の重鎖定常領域を選ぶことにより、所望のエフェクター機能を有するタンパク質を産生することができる。例示的な重鎖定常領域は、ガンマ1(IgG1)、ガンマ2(IgG2)およびガンマ3(IgG3)またはそれらのハイブリッドである。
【００９１】
「定常ドメイン」とは、抗体におけるドメインであり、その配列は、抗体／同じ種類の抗体、たとえば、IgGまたはIgMまたはIgEで非常に類似している。抗体の定常領域は、一般に、複数の定常ドメインを含み、たとえば、γ、α、またはδ重鎖の定常領域は、2つの定常ドメインを含む。
【００９２】
「KabatのEU付番方式」という用語は、抗体重鎖の付番がKabat et al., 1991, Sequences of Proteinsof ImmunologicalInterest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesdaに教示される、EU指標にしたがうことを意味するように理解される。このEU指標はヒトIgG1 EU抗体の残基付番に基づく。
【００９３】
化合物と抗原との相互作用に関して、本明細書で用いる用語「結合する」は、同語作用が、抗原上の特定の構造(たとえば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味する。たとえば、抗体などの化合物は、一般に、タンパク質よりもむしろ特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。もし化合物が、エピトープ「A」に結合するならば、標識された「A」および化合物を含む反応において、エピトープ「A」(または遊離、非標識「A」)を含む分子の存在は、化合物に結合された標識された「A」の量を減少させるであろう。
【００９４】
本明細書で用いる用語「特異的に結合する」は、抗体またはその抗原結合フラグメントとBTN2A1鎖間の結合相互作用が、抗体またはその抗原結合フラグメントによって結合されるBTN2A1鎖の抗原決定基またはエピトープの存在に従属することを意味すると解釈されるべきである。したがって、抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の分子または有機体の混合物中に存在する場合でさえも、BTN2A1鎖の抗原決定基またはエピトープを選択的に結合し、認識する。1つの例において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、別の抗原または細胞の場合と比較して、より頻繁に、より迅速に、より長期間および／またはより高い親和性をもって、BTN2A1またはBTN2A1発現細胞と反応または結合する。この定義を読むことによって、たとえば、BTN2A1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、第二の抗原に特異的に結合してもよく、あるいはしなくてもよいことも理解される。このように、「特異的結合」は、必ずしも、排他的結合またはもう1つの抗原の非検出可能な結合を要求するものではない。用語「特異的に結合する」は、「選択的に結合する」と互換的に用いることができる。一般に、本明細書において結合は、特異的結合を意味し、各用語は、他の用語に対する明確な支持を提供すると理解されるべきである。特異的結合を決定する方法は、当業者には明らかであろう。たとえば、本開示の化合物を、BTN2A1またはBTN2A1発現細胞あるいはその変異体または別の抗原と接触させる。次いで、BTN2A1または変異体または別の抗原への化合物の結合を決定し、上記のように変異体または別の抗原よりもBTN2A1に結合する化合物をBTN2A1に特異的に結合するとみなす。
【００９５】
本明細書で用いる用語「中和する」は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、細胞におけるBTN2A1シグナル伝達を減少または予防する、および／またはそのリガンドへのBTN2A1の結合を減少または予防する能力があることを意味すると解釈されるべきである。化合物がBTN2A1シグナル伝達を中和するかどうかを決定する方法は、本明細書の記載に基づいて、当業者には明らかであろう。
【００９６】
本明細書で用いる用語「治療」は、臨床病理の過程中に治療される個体または細胞の自然な過程を変えるように設計された臨床的介入を意味する。望ましい治療効果として、疾患の進行速度の減少、病状の改善または緩和、および緩解または改善された予後が挙げられる。たとえば、疾患に関連する１つ以上の症状が鎮静または除去される場合、個体は成功裏に「治療される」。
【００９７】
本明細書で用いる用語「予防」は、個体における疾患の発生または再発に関する予防を提供することを含む。個体は、疾患または疾患再発の素因があるか、またはそれらの危険性がありうるが、その疾患または再発を未だに診断されていない。
【００９８】
「有効量」は、必要な投薬量での、および必要な期間の、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な少なくとも1つの量を意味する。有効量は、1回以上の投与において提供することができる。本開示のいくつかの例において、用語「有効量」は、増殖性障害、前述の疾患または病態の治療を達成するのに必要な量を意味する。有効量は治療される疾患または病態にしたがって、また、治療される哺乳類に関連する体重、年齢、民族的背景、性別、健康および／または身体的状態ならびに他の因子にもしたがって、変動しうる。典型的に、有効量は、開業医により日常的な試験および実験を通じて決定されうる、比較的広い範囲(たとえば、「用量」範囲)内に入るであろう。有効量は、単回用量で、または治療期間にわたり1回もしくは数回反復される用量で投与されうる。
【００９９】
「治療有効量」は、特定の障害(たとえば、メラノーマ)の測定可能な改善を達成するのに必要な少なくとも最小限の濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)の能力などの因子にしたがって、変動しうる。治療有効量は、また、治療的に有益な効果が、抗体またはその抗原結合フラグメントの任意の毒性作用または有害作用を上回る量でもある。メラノーマの場合、化合物の治療有効量は、ガン細胞の数を減少させることができ；原発性腫瘍の大きさを縮小することができ；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻止する(すなわち、ある程度まで遅延化させ、いくつかの例では、停止させる)ことができ；腫瘍転移を阻止する(すなわち、ある程度まで遅延化させ、いくつかの例では、停止させる)ことができ；腫瘍増殖または腫瘍進行をある程度まで阻止または遅延化することができ；および／または障害に伴う1つ以上の症状をある程度まで軽減することができる。化合物が存在するガン細胞の増殖および／または殺傷を予防することができる程度において、化合物は、細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性でありうる。ガン療法のために、たとえば、生存期間、疾患無増悪期間(TTP)、応答率(RR)、応答期間および／または生活の質を評価することによってインビボ有効性を測定することができる。
【０１００】
本開示にしたがって治療される「哺乳動物」は、非ヒト霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。1つの例において、哺乳動物は、ヒトである。
【０１０１】
治療される病態
本開示のいくつかの例において、本明細書に記載の方法は、ガンの治療用である。用語「ガン」は、典型的には、無制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を意味または記載する。ガンの例として、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなガンの、より特定の例として、扁平上皮細胞ガン(たとえば、上皮の扁平上皮細胞ガン)、小細胞肺ガン，非小細胞肺ガン，肺の腺癌および肺の扁平上皮癌などの肺ガン、腹膜のガン、肝細胞ガン、消化管ガンおよび消化管間質ガンなどの胃(gastricまたはstomach)ガン、膵臓ガン、神経膠芽腫は、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿管ガン、肝ガン、乳ガン、結腸ガン、直腸ガン、大腸ガン、子宮内膜ガンまたは子宮ガン、唾液腺ガン、腎(kidneyまたはrenal)ガン、前立腺ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝ガン、肛門ガン、陰茎ガン、メラノーマ、表在性拡大型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節型メラノーマ、多発性骨髄腫およびB-細胞リンパ腫(低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)；小リンパ球性(SL)NHL；中間グレード/濾胞性NHL；中間グレードびまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小型非開裂細胞NHL；巨大病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症など)；慢性リンパ性白血病(CLL)；急性リンパ芽球性白血病(ALL)；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および植後リンパ増殖性障害(PTLD)、ならびに母斑症を伴う異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍に関連するものなど)、メーグス症候群、脳ならびに頭頸部ガン、および関連転移が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある例において、本開示の化合物による治療に適しているガンとして、メラノーマ、前立腺ガン、結腸直腸ガンおよび肺ガン(たとえば、非小細胞肺ガン)が挙げられる。
【０１０２】
1つの例において、本開示の方法は、メラノーマを治療する。メラノーマは、主に、皮膚に起こるが、腸および眼、たとえばブドウ膜メラノーマなど、身体の他の部分でも見い出される。メラノーマは、メラニン細胞を含む身体の部分のいずれにおいても生じうる。メラノーマの例として、表在性拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマおよび末端黒子型メラノーマが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
メラノーマは、大きさ、潰瘍形成、リンパ節への拡散および／または他の組織または臓器への拡散などの多くの基準に従属して、病期分類されうる。
【０１０４】
1つの例において、メラノーマは、皮膚生検中に見られるメラノーマの厚さおよびその他の因子に基づくTカテゴリーにしたがって病期分類される。たとえば、本開示の方法は、以下のカテゴリーの1つに分類されるメラノーマを治療するために用いられる：
Tis：上皮内メラノーマ(腫瘍は、皮膚の最外層である表皮内にとどまる。)；
T1a：メラノーマは、1.0 mm以下の厚さであり、潰瘍なし、分裂速度1/mm2未満；
T1b：メラノーマは、1.0 mm以下の厚さである。潰瘍あり、および／または分裂速度1/mm2以上；
T2a：メラノーマは、1.01〜2.0 mmの厚さであり、潰瘍なし；
T2b：メラノーマは、1.01〜2.0 mmの厚さであり、潰瘍あり；
T3a：メラノーマは、2.01〜4.0 mmの厚さであり、潰瘍なし；
T3b：メラノーマは、2.01〜4.0 mmの厚さであり、潰瘍あり；
T4a：メラノーマは、4.0 mmを超える厚さであり、潰瘍なし；
T4b：メラノーマは、4.0 mmを超える厚さであり、潰瘍あり。
【０１０５】
上記カテゴリーにおいては、以下の特徴が考慮される：
腫瘍の厚さ：メラノーマの厚さは、ブレスロー値とも呼ばれる。
分裂速度：分裂速度を測定するために、病理学者は、メラノーマ組織のある領域における分割(有糸分裂)過程中の細胞の数を数える。
潰瘍形成：潰瘍形成は、メラノーマ上の皮膚の崩壊である。潰瘍化するメラノーマは、予後が悪い。
【０１０６】
1つの例において、メラノーマは、歩哨リンパ節生検が行なわれたかどうかに基づくNカテゴリーにしたがって病期分類される。歩哨リンパ節生検なしで行なわれるリンパ節の臨床病期分類は、以下のとおりである：
NX：所属リンパ節を評価することができない。
N0：所属リンパ節への転移なし。
N1：1個の所属リンパ節への転移がある。
N2：2または3個の所属リンパ節への転移、または所属皮膚へのメラノーマの転移、または所属リンパ節領域に向かうメラノーマの転移(リンパ節に到達せず)。
N3：4個以上の所属リンパ節への転移、または一緒に凝集するリンパ節への転移があるか、または所属皮膚へのメラノーマの転移、またはリンパ節領域に向かう、所属リンパ節内へのメラノーマの転移。
【０１０７】
リンパ節生検に続いて、病理学的病期を決定することができ、病期分類は、以下の通りである：
Na(N1aまたはN2a)は、メラノーマが、リンパ節内にあるが、顕微鏡下でのみ見られる程度に非常に小さいことを意味する(顕微鏡的転移としても知られる)。
Nb(N1bまたはN2b)は、メラノーマが、リンパ節内にあるが、画像化試験における可視化にとって十分に大きいか、または除去される前に医師によって感知されることを意味する(肉眼的転移としても知られる)。
N2cは、メラノーマが、所属皮膚または腫瘍の周囲の皮膚リンパ管の非常に小さい領域に転移していること(衛星腫瘍)を意味する(リンパ節に到達せず)。
【０１０８】
1つの例において、メラノーマは、転移が存在するかどうかに基づくMカテゴリーにしたがって病期分類される。Mカテゴリーは、以下の通りである：
M0：遠隔転移なし。
M1a：皮膚、皮下組織または身体の遠位部分におけるリンパ節への転移、正常な血中乳酸脱水素酵素(LDH)レベル。
M1b：肺への転移、正常な血液LDHレベル。
M1c：他の臓器への転移、または上昇した血液LDHレベルを伴う遠隔転移。
【０１０９】
1つの例において、メラノーマは、病期グループ分けにしたがって病期分類される。T、NおよびMグループが、決定されたら、それらを組合わせて、全体的な病期を得る。病期分類は、以下の通りである：
0期：Tis、N0、M0：メラノーマは、上皮にあり、このことは、表皮に存在するが、真皮(下層)に転移していないことを意味する。
IA期：T1a、N0、M0：メラノーマは、厚さ1.0 mm未満である。それは、潰瘍化しておらず、分裂速度1/mm2未満である。リンパ節または遠位臓器には見い出されていない。
IB期：T1bまたはT2a、N0、M0：メラノーマは、厚さ1.0 mm未満であり、潰瘍化しておらず、分裂速度が少なくとも1/mm2未満であるか、または厚さが、1.01〜2.0 mmであり、潰瘍化していない。リンパ節または遠位臓器には見い出されていない。
IIA期：T2bまたはT3a、N0、M0：メラノーマは、厚さが、1.01〜2.0 mmであり、潰瘍化しているか、または厚さが、2.01〜4.0 mmであり潰瘍化していない。リンパ節または遠位臓器には見い出されていない。
IIB期：T3bまたはT4a、N0、M0：メラノーマは、厚さが、2.01〜4.0 mmであり潰瘍化しているか、または厚さが、4.0 mmを超えており、潰瘍化していない。リンパ節または遠位臓器には見い出されていない。
IIC期：T4b、N0、M0：メラノーマは、4.0 mmより厚く、潰瘍化している。リンパ節または遠位臓器には見い出されていない。
IIIA期：T1a〜T4a、N1aまたはN2a、M0：メラノーマは、任意の厚さでありうるが、潰瘍化していない。メラノーマは、影響を及ぼされた領域近くの1〜3個のリンパ節に転移しているが、リンパ節は肥大しておらず、メラノーマは、顕微鏡下でのみ見い出される。遠位転移はない。
IIIB期：以下のいずれか1つを適用:
T1b〜T4b、N1aまたはN2a、M0：メラノーマは、任意の厚さでありえ、潰瘍化している。メラノーマは、影響を及ぼされた領域近くの1〜3個のリンパ節に転移しているが、リンパ節は肥大しておらず、メラノーマは、顕微鏡下でのみ見い出される。遠位転移はない。
T1a〜T4a、N1bまたはN2b、M0：メラノーマは、任意の厚さでありうるが、潰瘍化していない。メラノーマは、影響を及ぼされた領域近くの1〜3個のリンパ節に転移している。リンパ節はメラノーマゆえに肥大している。遠位転移はない。
T1a〜T4a、N2c、M0：メラノーマ任意の厚さでありうるが、潰瘍化していない。メラノーマは、所属皮膚または元の腫瘍の周囲のリンパ管の非常に小さい領域に転移しているが、リンパ節はメラノーマを含まない。遠位転移はない。
IIIC期：以下のいずれか1つを適用:
T1b〜T4b、N1bまたはN2b、M0：メラノーマは、任意の厚さでありえ、潰瘍化している。メラノーマは、影響を及ぼされた領域近くの1〜3個のリンパ節に転移している。リンパ節はメラノーマゆえに肥大している。遠位転移はない。
T1b〜T4b、N2c、M0：メラノーマは、任意の厚さでありえ、潰瘍化している。メラノーマは、所属皮膚または元の腫瘍の周囲のリンパ管の非常に小さい領域に転移しているが、リンパ節はメラノーマを含まない。遠位転移はない。
いずれかのT、N3、M0：メラノーマは、任意の厚さでありえ、潰瘍化しても、潰瘍化していなくてもよい。メラノーマは、4個以上の所属リンパ節へ転移しているか、または一緒に凝集するリンパ節へ転移しているか、または所属皮膚または元の腫瘍の周囲のリンパ管へ、および所属リンパ節へ転移している。リンパ節はメラノーマゆえに肥大している。遠位転移はない。
IV期：いずれかのT、いずれかのN、M1(a、bまたはc)：メラノーマは、皮膚の元の領域および所属リンパ節を超えて、肺、肝臓または能などの他の臓器へ、あるいは皮膚、皮下組織または遠位リンパ節の遠位領域へ転移している。所属リンパ節への転移も厚さもこの病期では考慮されないが、通常、メラノーマは厚く、所属リンパ節に転移もしている。
【０１１０】
1つの例において、本開示は、病期0のメラノーマの治療方法を提供する。
【０１１１】
1つの例において、本開示は、病期Iのメラノーマ(たとえば、病期IAまたは病期IB)のメラノーマの治療方法を提供する。
【０１１２】
1つの例において、本開示は、病期IIのメラノーマ(たとえば、病期IIA、病期IIBまたは病期IIC)のメラノーマの治療方法を提供する。
【０１１３】
1つの例において、本開示は、病期IIIのメラノーマ(たとえば、病期IIIA、病期IIIBまたは病期IIIC)のメラノーマの治療方法を提供する。
【０１１４】
1つの例において、本開示は、病期IVのメラノーマの治療方法を提供する。
【０１１５】
化合物
本明細書で検討するように、本開示の化合物は、たとえば、タンパク質系化合物または化学的化合物などのさまざまな形態をとることができる。典型的には、化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例示的な化合物を本明細書において検討する。
【０１１６】
抗体 
免疫化ベースの方法
抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知および／またはHarlow and Lane (編集者) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、(1988)に記載されている。一般に、このような方法において、必要に応じて任意の適切なまたは所望の担体、アジュバントまたは医薬的に許容しうる賦形剤と共に製剤された、BTN2A1タンパク質もしくは免疫原性フラグメントまたはそのエピトープ、あるいはそれ(すなわち、免疫原)を発現および提示する細胞は、非ヒト動物、たとえば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギまたはブタに投与される。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内または他の公知の経路により投与することができる。
【０１１７】
ポリクローナル抗体の産生は、免疫化動物の血液を免疫化後のさまざまな時点でサンプリングしてモニターすることができる。所望の抗体価を得る必要がある場合、1回以上のさらなる免疫化を行ってよい。適切な力価が得られるまで追加免疫および力価測定のプロセスは反復される。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫化動物の血を抜き、血清を単離して保存するおよび／またはこの動物を用いてモノクローナル抗体(Mab)を作製する。
【０１１８】
モノクローナル抗体は、本開示により企図される抗体の例示的な一形態である。用語「モノクローナル抗体」または「MAb」は、同一抗原(複数可)、たとえば、抗原内の同一エピトープと結合できる同種抗体集団を意味する。この用語は、抗体の供給源またはその作製様式に関する限定を目的としない。
【０１１９】
Mabの産生のため、たとえば、米国特許第4196265号明細書またはHarlow and Lane (1988)(上記を参照されたい)に例証されている手順等、数多くの公知の技法のうちいずれか一法を用いることができる。
【０１２０】
たとえば、適切な動物は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下において免疫原で免疫化される。ウサギ、マウスおよびラット等、齧歯類は、例示的な動物である。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう、また、たとえば、マウス免疫グロブリンタンパク質を発現しないよう遺伝子操作されたマウスは、本開示の抗体の作製に用いることもできる(たとえば、国際公開第2002/066630号に記載されている)。
【０１２１】
免疫化の後、抗体を産生する潜在能力を有する体細胞、特にBリンパ球(B細胞)は、MAb作製プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、脾臓、扁桃腺もしくはリンパ節生検または末梢血サンプルから得ることができる。次に、免疫化動物に由来するＢ細胞は、一般に、免疫原で免疫化された動物と同じ種に由来する不死骨髄腫細胞の細胞と融合される。
【０１２２】
ハイブリッド細胞は、組織培養培地中にヌクレオチドの新規合成を遮断する薬剤を含む選択培地における培養により増幅される。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサートおよびアザセリンである。
【０１２３】
増幅されたハイブリドーマは、たとえば、フローサイトメトリーおよび／または免疫組織化学および／または免疫アッセイ(たとえば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫測定法など)によるなどの抗体特異性および／または力価に対する機能的選択に付される。
【０１２４】
あるいは、ABL-MYC技術(NeoClone、米国53713ウィスコンシン州マディソン)が、MAbを分泌する細胞系の産生に用いられる(たとえば、Largaespadaら、J. Immunol. Methods. 197:85〜95、1996に記載されている)。
【０１２５】
ライブラリベースの方法
本開示は、抗体または(たとえば、その可変領域を含む)その抗原結合フラグメントのライブラリのスクリーニングも包含する。
【０１２６】
本開示により企図されるライブラリの例としては(免疫化を受けていない対象からの)、ナイーブライブラリ、(あるペプチドまたは抗原で免疫化された対象からの)免疫化ライブラリ、または合成ライブラリを含む。抗体またはその領域(たとえば、可変領域)をコードする核酸は、従来技術によりクローニングされ(たとえば、Sambrook and Russell、eds、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、3rd Ed、vols。1-3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001に開示されるように)、当技術分野で既知の方法を用いてタンパク質をコードし、提示するために使用される。タンパク質ライブラリを生成するための他の技術は、たとえば、米国特許第6300064号(たとえば、Morphosys AGのHuCALライブラリ)、同第5885793号、同第6204023号、同第6291158号または同第6248516号に示される。
【０１２７】
本開示にしたがう抗原結合フラグメントは、可溶性の分泌されたタンパク質であり得、または細胞もしくは粒子(たとえば、ファージもしくは他のウイルス、リボソームまたは胞子)の表面上の融合タンパク質として提示され得る。さまざまなディスプレイライブラリフォーマットは、当技術分野で既知である。たとえば、ライブラリはインビトロディスプレイライブラリ(たとえば、リボソームディスプレイライブラリ、共有ディスプレイライブラリ、またはmRNAディスプレイライブラリ、たとえば、米国特許第7270969号に示されるように)である。さらに別の例において、ディスプレイライブラリは、たとえば、米国特許第6300064号、同第5885793号、同第6204023号、同第6291158号、または同第6248516号に示されるように、抗体の抗原結合フラグメントを含むタンパク質がファージ上で発現される、ファージディスプレイライブラリである。他のファージディスプレイ方法は、当技術分野において既知であり、本開示により企図される。同様に、細胞ディスプレイの方法、たとえば、米国特許第5516637号に示される、たとえば、細菌ディスプレイライブラリ、たとえば、米国特許第6423538号に示される酵母ディスプレイライブラリ、または哺乳類ディスプレイライブラリが、本開示により企図される。
【０１２８】
ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法は、当技術分野で既知である。1つの例において、本開示のディスプレイライブラリは、たとえば、Scopes(In:Protein purification：principles and practice、Third Edition、Springer Verlag、1994)に示されるように、親和性精製を用いてスクリーニングされる。親和性精製の方法は、典型的に、ライブラリにより提示された抗原結合フラグメントを含むタンパク質を、標的ペプチドまたは抗原(たとえば、BTN2A1)と接触させることと、洗浄後、そのペプチドまたは抗原に結合したままのそれらのドメインを溶離することとを含む。
【０１２９】
スクリーニングにより特定された任意の可変領域またはscFvsは、所望される場合、容易に完全な抗体に変更される。可変領域またはscFvsを完全な抗体に変更するか、または再フォーマットする例示的な方法は、たとえば、 Jones et al.、J Immunol Methods。354:85-90、2010；またはJostock et al.、J Immunol Methods、289：65-80、2004；または国際公開第WO2012/040793号に示される。別法として、またはさらに、標準のクローニング方法が、たとえば、Ausubel et al(In：Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience、ISBN 047 150338、1987)、and/or(Sambrook et al(In：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、Third Edition 2001)に示されるように、使用される。
【０１３０】
脱免疫化、キメラ、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、およびヒト抗体、または抗原結合フラグメント
本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト化され得る。
用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からのFR上に移植された、またはそれに挿入された、非ヒト種(たとえば、マウスもしくはラットまたは非ヒト霊長類)からの抗体からのＣＤＲを含む、ヒト様可変領域を含むタンパク質を指すように理解されるものとする(この種類の抗体は、「CDR移植抗体」とも称される)。ヒト化抗体はまた、ヒトタンパク質のうちの1つ以上の残基が1つ以上のアミノ酸置換により修飾される、および／またはヒト抗体のうちの1つ以上のFR残基が対応する非ヒト残基により置換される、抗体も含む。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体においてもは非ヒト抗体においても見られない残基も含んでもよい。抗体の任意の追加の領域(たとえば、Fc領域)は一般に、ヒトである。ヒト化は、当技術分野で既知の方法、たとえば、米国特許第5225539号、同第6054297号、同第7566771号、または同第5585089号を用いて行われてもよい。用語「ヒト化抗体は、たとえば、米国特許第7732578号に示されるような、超ヒト化抗体も包含する。同様の意味が、「ヒト化抗原結合フラグメント」という用語に当てはまるように見なされる。
【０１３１】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という用語は、ヒトにおいて、たとえば、ヒト生殖細胞株もしくは体細胞において見られる、または可変抗体領域、および任意に、定常抗体領域を用いて生成されたライブラリからの、可変抗体領域、および任意に、定常抗体領域を有する抗体を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、たとえば、ランダムまたはインビトロ部位特異的突然変異により導入された突然変異(具体的には、そのタンパク質の少数の残基における、たとえば、そのタンパク質の残基のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つにおける、保存的置換または突然変異を含む突然変異)を含み得る。これらの「ヒト抗体」は、ヒトの免疫応答の結果として生成される必要は必ずしもなく、むしろ、それらは組換え手段(たとえば、ファージディスプレイライブラリのスクリーニング)を用いて、ならびに／またはヒト抗体定常領域および／もしくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物(たとえば、マウス)により、ならびに／または(たとえば、米国特許第5565332号に示されるような)ガイド選択を用いて生成することができる。この用語はまた、このような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒト抗体は、ヒト抗体からのFR、またはヒトFRのコンセンサス配列からの配列を含むFRを含み、かつCDRのうちの１つ以上は、たとえば、米国特許第6300064号および／または同第6248516号に示されるように、ランダムまたは半ランダムである、タンパク質を含むとも考えられるであろう。同様の意味が、「ヒト抗原結合フラグメント」という用語に当てはまるように見なされる。
【０１３２】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、合成ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。「合成ヒト化抗体」という用語は、国際公開第WO2007/019620号に示される方法により調製される抗体を指す。合成ヒト化抗体は、抗体の可変領域を含み、ここで、その可変領域は、新世界の霊長類抗体可変領域からのＦＲと、非新世界霊長類抗体可変領域からのCDRとを含む。
【０１３３】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、霊長類化されてもよい。「霊長類化抗体」とは、非ヒト霊長類(たとえば、カニクイザル)の免疫化後に作製された抗体からの可変領域(単数または複数)を含む。任意に、その非ヒト霊長類抗体の可変領域は、霊長類化抗体を生成するためにヒト定常領域に連結される。霊長類化抗体を生成する例示的な方法は、米国特許第6113898号に示される。
【０１３４】
1つの例において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体またはフラグメントである。
「キメラ抗体」または、「キメラ抗原結合フラグメント」という用語は、可変ドメインのうちの１つ以上が特定の種(たとえば、マウスまたはラット等の、ネズミ科)からであり、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、一方、その抗体もしくはフラグメントの残りの部分は(たとえば、ヒトまたは非ヒト霊長類等の)別の種からであり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、抗体またはフラグメントを指す。1つの例においてキメラ抗体は、非ヒト抗体(たとえば、ネズミ科抗体)からのVHおよび／またはVLを含み、その抗体の残りの領域は、ヒト抗体からである。このようなキメラ抗体およびその抗原結合フラグメントの産生は当技術分野において既知であり、(たとえば、米国特許第6331415号、同第5807715号、同第4816567号、および同第4816397号に示されるような)標準の手段により達成することができる。
【０１３５】
本開示は、たとえば、国際公開第ＷＯ2000/34317号、および同第WO2004/108158号に示されるような、脱免疫化抗体またはその抗原結合フラグメントも企図する。脱免疫化抗体およびフラグメントは、1つ以上のエピトープ、たとえば、B細胞エピトープまたはT細胞エピトープが除去され(すなわち、変異され)、それによって対象がその抗体またはタンパク質に対して免疫応答を生じるであろう可能性を低減する。たとえば、本開示の抗体は、1つ以上のBまたはT細胞エピトープを特定するために分析され、そのエピトープ内の1つ以上のアミノ酸残基は変異され、それによって抗体の免疫原性を減少させる。
【０１３６】
抗体フラグメント
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本開示の抗体の抗原結合フラグメントは、(「ドメイン抗体」または、「dAb」という用語と交換可能に使用される)単一ドメイン抗体であり、またはそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む、単一ポリペプチド鎖である。
【０１３７】
二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体
いくつかの例において、本開示の抗原結合フラグメントは、国際公開第WO98/044001号および／または同第WO94/007921号に示されるもの等の、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、またはより高次のタンパク質複合体であり、またはそれらを含む。
【０１３８】
たとえば、二重特異性抗体は、2つの関連ポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は、構造VL-X-VHまたはVH-X-VLを含み、ここで、Xは単一のポリペプチド鎖中のVHおよびVLが関連すること(またはFvを形成すること)を許容するのに不十分な残基を含むリンカーであり、または不在であり、かつここで、１つのポリペプチド鎖のVHは他のポリペプチド鎖のVLに結合し、抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することができるFv分子を形成する。VLおよびVHは各ポリペプチド鎖において同じであり得る、あるいはVLおよびVHは各ポリペプチド鎖において異なり、二重特異的二重特異性抗体を形成し得る(すなわち、異なる特異性を有する２つのFvを含む)。
【０１３９】
エフェクター活性を誘導することができる、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体等は、BTN2A1に結合することができる抗原結合フラグメントと、免疫細胞、たとえば、T細胞上の細胞表面分子(たとえば、CD3)に結合することができる抗原結合フラグメントとを用いて作製されてもよい。
【０１４０】
単鎖Fv(scFv)フラグメント
当業者であれば、scFvが、単一のポリペプチド鎖中のVHおよびVL領域と、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする(すなわち、その単一のポリペプチド鎖のVHおよびVLが互いに関連し、Fvを形成するための)VHとVLとの間のポリペプチドリンカーとを含むことに気づくであろう。たとえば、そのリンカーは12以上のアミノ酸残基を含み、(Gly4Ser)3はcsFvmのためのより好ましいリンカーのうちの１つである。
【０１４１】
本開示は、単一のシステイン残基がVHのFRおよびVLのFRに導入され、そのシステイン残基がジスルフィド結合により連結され、安定なFvを産生する、ジスルフィド安定化Fv(またはdiFvまたはdsFv)も企図する。
【０１４２】
別法として、またはさらに、本開示は、二量体scFv、すなわち、非共有または共有結合により、たとえば、(たとえば、FosまたはJunに由来する)ロイシンジッパードメインにより連結された2つのscFv分子を含むタンパク質を包含する。別法として、2つのscFvは、たとえば、米国特許公報第20060263367号に示されるように、両方のscFvが形成することと、ペプチドまたは抗原に結合することとを許容するのに十分な長さのペプチドリンカーにより連結される。
【０１４３】
本開示は、エフェクター活性(たとえば、二重特異的T細胞エフェクターまたはBiTe)を誘導することができる二量体scFvも企図する。たとえば、1つのscFvはBTN2A1に結合し、本明細書に記載のCDRおよび／または可変領域を含み、もう1つのscFvは、免疫細胞、たとえば、T細胞上の細胞表面分子(たとえば、CD3)またはNK細胞上の細胞表面分子(たとえば、CD16またはCD16a)に結合する。1つの例において、その二量体タンパク質は、dAbおよびscFvの組み合わせである。エフェクター機能を誘導することができる二重特異的抗体フラグメントの例は、たとえば、米国特許第7235641号、国際公開第WO2004/106380号およびStein et al.、Antibodies、1：88-123、2012に示される。
【０１４４】
他の抗体および抗体フラグメント
本開示はまた、以下のような他の抗体および抗体フラグメントも企図する：
(i)米国特許第5,731,168号に示されるような、「鍵と鍵穴の」二重特異的タンパク質、
(ii)たとえば、米国特許第4,676,980号に示されるような、ヘテロ複合タンパク質、 
(iii)たとえば、米国特許第4,676,980号に示されるような、化学的クロスリンカーを用いて産生されるヘテロ複合タンパク質、および 
(iv)Fab3(たとえば、欧州特許第19930302894号に示されるような)。
【０１４５】
免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメント
本開示の化合物の1つの例は、T細胞受容体等の免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質(たとえば、抗体模倣体)、または重鎖免疫グロブリン(たとえば、IgNAR、ラクダ科抗体)である。
【０１４６】
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、それらが重鎖を含むが、軽鎖を含まない点において、免疫グロブリン(たとえば、抗体)の多くの他の形態と構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンは、「重鎖のみ抗体」とも称される。重鎖免疫グロブリンは、たとえば、ラクダ科および軟骨魚類(ＩｇＮＡＲとも称される)において見られる。
【０１４７】
天然の重鎖免疫グロブリン中に存在する可変領域は、一般に、それらを従来の4鎖抗体中に存在する(「VHドメイン」と称される)重鎖可変領域と、および従来の4鎖抗体中に存在する(「VLドメイン」と称される)軽鎖可変領域と区別するために、ラクダ科Ig中の「VHHドメイン」およびIgNAR中のV-NARと称される。
【０１４８】
重鎖免疫グロブリンは、関連する抗原に対して高い親和性で、かつ高い特異性で結合するために軽鎖の存在を必要としない。このことは、単一ドメイン結合フラグメントが、発現することが容易な、かつ概して安定で、可溶性である、重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。
【０１４９】
ラクダ科からの重鎖免疫グロブリン、およびその可変領域、ならびにそれらの産生および／または単離および／または使用の方法の概説説明は、以下の引用文献、国際公開第WO94/04678号、同第WO97/49805号、および同第WO97/49805号に特に見られる。
【０１５０】
軟骨魚類からの重鎖免疫グロブリン、およびその可変領域、ならびにそれらの産生および／または単離および／または使用の方法の概説説明は、国際公開第WO2005/118629号に特に見られる。
【０１５１】
V様タンパク質
本開示の化合物の一例は、T細胞受容体である。T細胞受容体は、結合して抗体のFvモジュールに同様の構造になる、2つのVドメインを有する。Novotny et al.、Proc Natl Acad Sci USA 88：8646-8650、1991は、どのようにT細胞受容体の2つのVドメイン(アルファおよびベータと称される)が融合され、単鎖ポリペプチドとして発現されるか、さらに、抗体scFvに類似の疎水性を直接的に低減するためにどのようにして表面残基を変えるかを示す。単鎖T細胞受容体、または2つのV-アルファおよびV-ベータドメインを含む多量体T細胞受容体の産生を示す、他の出版物は、国際公開第WO1999/045110号または同第WO2011/107595号を含む。
【０１５２】
抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質は、概して単量体である、V様ドメインを有するタンパク質を含む。このようなV様ドメインを含むタンパク質の例としては、CTLA-4、CD28およびICOSが挙げられる。このようなV様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示は、国際公開第WO1999/045110号に含まれる。
【０１５３】
アドネクチン
1つの例において、本開示の化合物は、アドネクチンである。アドネクチンは、ループ領域がペプチドまたは抗原結合を与えるよう変えられた、ヒトフィブロネクチンの第10フィブロネクチンIII(10Fn3)ドメインに基づく。たとえば、10Fn3ドメインのβサンドウィッチの1つの末端の3つのループは、アドネクチンがあるペプチドまたは抗原を特異的に認識することを可能にするよう作製され得る。さらなる詳細については、米国特許公報第20080139791号または国際公開第WO2005/056764号を参照されたい。
【０１５４】
アンチカリン
1つのさらなる例において、本開示の化合物は、アンチカリンである。アンチカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質等の小疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである、リポカリンに由来する。リポカリンは、あるペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る、円錐構造の開放末端に複数のループを有する堅いβシート二次構造を有する。このように作製されたリポカリンは、アンチカリンとして知られる。アンチカリンのさらなる説明については、米国特許第7250297Ｂ１号、または米国特許公報第20070224633号を参照されたい。
【０１５５】
アフィボディ
1つのさらなる例において、本開示の化合物は、アフィボディである。アフィボディは、あるペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る、黄色ブドウ球菌のタンパク質AのZドメイン(抗原結合ドメイン)に由来する足場である。そのＺドメインは、約58アミノ酸の3つのヘリックスの束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化により作製されている。さらなる詳細については、欧州特許第EP1641818号を参照されたい。
【０１５６】
アビマー
1つのさらなる例において、本開示の化合物は、アビマーである。アビマーは、Aドメイン足場ファミリーに由来する多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の天然ドメインは定義されたジスルフィド結合構造を取る。多様性は、Aドメインのファミリーにより示される天然変形のシャッフルにより作製される。さらなる詳細については、国際公開第WO2002088171号を参照されたい。
【０１５７】
DARPin
1つのさらなる例において、本開示の化合物は、設計アンキリン反復タンパク質(Designed Ankyrin Repeat Protein(DARPin))である。DARPinは、細胞骨格への完全な膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーである、アンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、2つのα-ヘリックスおよびβ-ターンからなる、33残基モチーフである。それらは、各反復の第1のα-ヘリックスおよびβ-ターン中の残基をランダム化することにより、異なる標的ペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る。それらの結合境界面は、モジュールの数を増加させることにより増加することができる(親和性成熟の方法)。さらなる詳細については、米国特許公報第20040132028号を参照されたい
【０１５８】
他の非抗体ポリペプチド
結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質は、ヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチン(アフィリン)、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、Ras結合タンパク質AF-6のPDZドメイン、サソリ毒素(カリブドトキシン)、C型レクチンドメイン(テトラネクチン)に基づくものを含む。
【０１５９】
可溶性BTN2A1
BTN2A1を中和することができる他のタンパク質として、BTN2A1の細胞外部分の少なくとも1つの部分を含む突然変異BTN2A1タンパク質および分泌されたタンパク質が挙げられる。たとえば、可溶性BTN2A1は、BTN2A1の1つまたはすべての細胞外ドメインを、抗体(たとえば、IgG1抗体)のFc領域と、または抗体(たとえば、IgG1抗体)。のヒンジ領域およびFc領域と融合させることによって製造されうる。
【０１６０】
定常領域
本開示は、抗体の定常領域および／または抗体のFc領域を含む化合物(たとえば、抗体およびその抗原結合フラグメント)を包含する。
【０１６１】
本開示の免疫グロブリン、抗体または抗原結合フラグメントの産生に有用な定常領域および／またはFc領域の配列は、多くの異なる源から得ることができる。いくつかの例において、化合物の定常領域、Fcまたはその一部は、ヒト抗体に由来する。定常領域、Fcまたはその一部は、さらに、Ｆｃまたはその一部は、IgA、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEなどの任意の抗体クラスならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4などの任意の抗体アイソタイプに由来してもよい。1つの例において、定常領域またはFcは、ヒトのアイソタイプIgG1またはヒトのアイソタイプIgG2またはヒトのアイソタイプIgG3または前述いずれかのハイブリッドである。
【０１６２】
1つの例において、定常領域またはFc領域は、エフェクター機能を誘導することができる。たとえば、定常領域またはFc領域は、ヒトIgG1またはIgG3 Fc領域である。もう1つの例において、定常領域またはFc領域は、IgG1およびIgG2 定常領域またはFc領域のハイブリッドまたはIgG1およびIgG3 定常領域またはFc領域のハイブリッドまたはIgG2およびIgG3 定常領域またはFc領域のハイブリッドである。例示的なヒトIgG1およびIgG2 定常領域またはFc領域のハイブリッドは、Chappelら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、88:9036〜9040、1991に記載されている。
【０１６３】
Fc領域が、エフェクター機能を誘導できるか否か決定するための方法は、当業者であれば理解できるであろうおよび／または本明細書に記載されている。
【０１６４】
エフェクター機能
1つの例において、本開示の化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、エフェクター機能を誘導することができる抗体のFc領域を含む。たとえば、エフェクター機能は、Fc媒介性エフェクター機能である。1つの例において、Fc領域は、IgG1 Fc領域またはIgG3 Fc領域またはIgG1/IgG2 Fc領域のハイブリッドである。
【０１６５】
好適には、本開示の化合物(たとえば、抗BTN2A1抗体またはその抗原結合フラグメント)は、BTN2A1発現細胞の少なくとも部分的な枯渇、実質的な枯渇、または除去を促進するか、または可能にするエフェクター機能を有するか、または示す。このようなエフェクター機能はFc受容体に対する結合親和性の強化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)、および／または補体依存性細胞傷害性(CDC)であり得る。
【０１６６】
1つの例において、本開示の化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)は、野生型ヒトIgG1および／またはヒトIgG3のFc領域と類似(たとえば、有意には異ならないか、または約10%以内)または同じレベルのエフェクター機能を誘導することができる。
【０１６７】
1つの例において、化合物は、増強されたレベルのエフェクター機能を誘導することができる。
【０１６８】
1つの例において、Fc領域を含む化合物によって誘導されたエフェクター機能のレベルは、化合物が野生型IgG1 Fc領域を含む場合と比較して増強される。
【０１６９】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントによって誘導されたエフェクター機能のレベルは、抗体またはその抗原結合フラグメントが野生型IgG1 Fc領域を含む場合と比較して増強される。
【０１７０】
IgGクラスの抗体について、いくつかのエフェクター機能(たとえば、ADCCおよびADCP)はFc領域と、さまざまな免疫細胞上で発現されるFcγ受容体(FcγR)と称される受容体のファミリーと、および／または補体、たとえば、C1q(たとえば、CDC)との契約により支配される。
【０１７１】
Fc/FcγR複合体の形成は免疫細胞を結合された抗原の部位に補充し、典型的にシグナル伝達および続く免疫応答をもたらす。エフェクター機能を強化するために、たとえば、「親」Fc領域と比較してADCC活性を変えるために、抗体Fc領域に対するFcγRの結合親和性を最適化する方法は、当業者に知られる。これらの方法は、抗体のFc領域と、関連するFc受容体との相互作用を強化し、ADCCおよびADCPを促進するその能力を増大させるための、抗体のFc領域の変更を含み得る。ADCC活性における強化も、Fc領域中の保存されたAsn297でのIgG1抗体に共有結合されたオリゴ糖の変さらにその後示されている。
【０１７２】
いくつかの非限定的な例において、ADCCなどのエフェクター機能を強化することは、通常グリコシル化野生型定常ドメインを有する化合物(たとえば、抗体)の、グリコシル化の変化または除去(たとえば、国際公開第WO00/61739号を参照されたい)および／またはアミノ酸配列突然変異(たとえば、国際公開第WO2008036688号を参照されたい)を含む変さらにより達成され得ることが、当業者により理解されるものとする。
【０１７３】
1つの例において、化合物は、それがADCCなどのエフェクター機能を誘導することができるような様式で、BTN2A1に結合する。
【０１７４】
1つの例において、化合物は、それがADCCなどのエフェクター機能を誘導することを許容する、BTN2A1内のエピトープに結合する。
【０１７５】
もう1つの例において、化合物は、哺乳類の細胞上のBTN2A1に結合することができ、それによってADCCなどのエフェクター機能を誘導する。
【０１７６】
たとえば、化合物は、ADCCなどのエフェクター機能を誘導するのに十分な時間、細胞表面上のBTN2A1に結合したままである。たとえば、その化合物は、ADCCが誘導されることを許容しないほど速く取り込まれることはない。
【０１７７】
別法として、またはさらに、化合物は、免疫エフェクター細胞がその化合物中の定常領域またはFc領域に結合し、ADCCなどのエフェクター機能を誘導することを許容するような様式で、細胞表面上のBTN2A1に結合される。たとえば、化合物のFc領域は、その化合物がBTN2A1に結合されたとき、免疫エフェクター細胞上のFc受容体(たとえば、FcγR)と相互作用することができるような様式で暴露される。本開示の文脈中で、「免疫エフェクター細胞」という用語は、Fc受容体を発現し、かつADCCまたはADCPによりそれが結合する細胞を殺滅することができる、任意の細胞を意味するように理解されるものとする。1つの例において、免疫エフェクター細胞は、NK細胞である。
【０１７８】
抗体または抗原結合フラグメントのエフェクター機能に関する上記段落のそれぞれはCDCの誘導に、必要な変更を加えて適用するように見なされるものとする。たとえば、化合物は、補体成分C1qがその化合物中の定常領域またはFc領域に結合し、CDCを誘導することを許容するような様式で細胞表面上のBTN2A1に結合される。
【０１７９】
さらに、抗体または抗原結合フラグメントのエフェクター機能に関する上記段落のそれぞれは、抗体のFc領域または定常領域以外の化合物の効力による、細胞媒介性エフェクター機能(たとえば、ADCCおよび／またはADCP)の誘導に、必要な変更を加えて適用するように見なされるものとする。たとえば、細胞媒介性エフェクター機能は本明細書に示されるようにBTN2A1に、および(たとえば、NK細胞上のCD16および／またはT細胞上のCD4への結合の効力により)免疫エフェクター細胞に結合する化合物を用いて誘導される。
【０１８０】
当業者であれば、より大きなエフェクター機能は、たとえば、より大きなレベルの効果、より維持された効果、またはより速い速度の効果として、多くの手段のいずれでも表され得ることを理解するであろう。
【０１８１】
1つの例において、定常領域またはFc領域は、エフェクター機能の強化を誘導するそれらの能力を増大させる、1つ以上のアミノ酸変更を含む。1つの例において、定常領域またはＦｃ領域は、1つ以上のFcγRに、より大きな親和性で結合する。1つの例において、定常領域またはFc領域は、野生型定常領域もしくはFc領域の親和性より1倍超大きい、または野生型定常領域もしくはFc領域の親和性より5倍超大きい、または野生型定常領域もしくはFc領域の親和性より5倍〜300倍大きい、FcγRについての親和性を有する。1つの例において、定常領域またはＦｃ領域は、KabatのEU指標にしたがう番号230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332および335から選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335RおよびT335Yから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326EおよびS239D/A330Y/I332E/K326Tから選択される、アミノ酸置換を含む。
【０１８２】
別の例において、定常領域またはＦｃ領域は、FcγRIIbに結合するより効率的にFcγRIIIaに結合する。たとえば、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号234、235、239、240、264、296、330およびI332から選択される位置での、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332DおよびI332Eから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。たとえば、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332EおよびS239D/V264I/A330L/I332Eから選択されるアミノ酸置換を含む。
【０１８３】
１つのさらなる例において、定常領域またはFc領域は、野生型定常領域またはFc領域により媒介されるADCCより大きなレベルでADCCを誘導する。たとえば、定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域またはFc領域により誘導されるADCCより5倍超大きい、または5倍〜1000倍大きいレベルでADCC誘導する。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332および335から選択される位置での、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335RおよびT335Yから選択される、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。1つの例において、定常領域またはFc領域は、KabatのEU指標にしたがう番号V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326EおよびS239D/A330Y/I332E/K326Tから選択される、アミノ酸置換を含む。
【０１８４】
1つの例において、定常領域またはFc領域は、以下のアミノ酸置換、KabatのEU指標にしたがう番号S239D/I332Eを含む。この定常領域またはFc領域は、野生型定常領域またはFc領域と比較してFcγRIIIaについての親和性における約14倍の増大、および野生型定常領域またはFc領域と比較して約3.3増大されたADCCを誘導する能力を有する。
【０１８５】
1つの例において、定常領域またはFc領域は、以下のアミノ酸置換、KabatのEU指標にしたがう番号S239D/A330L/I332Eを含む。この定常領域またはFc領域は、野生型定常領域またはＦｃ領域と比較してFcγRIIIaについての親和性における約138倍の増大、および野生型定常領域またはFｃ領域と比較して約323増大されたADCCを誘導する能力を有する。
【０１８６】
エフェクター機能を誘導するＦｃ領域の能力を増大させる、追加のアミノ酸置換は当技術分野において既知であり、および／または、たとえば、米国特許第6737056号、または同第7317091号に示される。
【０１８７】
1つの例において、定常領域またはFc領域のグリコシル化はエフェクター機能の強化を誘導するそれらの能力を増大させるよう変えられる。この点において、哺乳類細胞により産生された天然抗体は、典型的に、一般に、定常領域またはFc領域のCH2ドメインのAsn297へのN結合により取り付けられた、有枝の、二分岐のオリゴ糖を含む。オリゴ糖はさまざまな炭水化物、たとえば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに取り付けられたフコースを含み得る。いくつかの例において、本開示にしたがう定常領域またはFc領域は、Fc領域に(直接的にまたは間接的に)取り付けられたフコースを欠く炭水化物構造を含む、すなわち、そのFc領域は、「非フコシル化」される。このような変異体はADCCを誘導する改善された能力を有することができる。非フコシル化Fc領域または定常領域を作成する方法は、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)を発現することができない細胞株において免疫グロブリンまたは抗体を発現させること(たとえば、Yumane-Ohnuki et al.、Biotechnol. Bioengineer.、87：614-622、2004に示される)と、FUT8に対する低分子干渉ＲＮＡを発現する細胞において免疫グロブリンまたは抗体を発現させること(たとえば、Mori et al.、Biotechnol. Bioengineer.、88：901-908、2004に示される)と、グアノシン二リン酸(GDP)-マンノース4,6-脱水酵素(GMD)を発現することができない細胞において抗体または抗原結合フラグメントを発現させること(たとえば、Kanda et al.、J. Biotechnol.、130：300-310、2007に示される)とを含む。本開示は、たとえば、β-(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnT-III)を発現するよう変更された細胞株を用いて産生される、フコシル化レベルが減少した化合物の使用も企図する(たとえば、Umana et al.、Nat. Biotechnol.、17：176-180、1999に示される)。
【０１８８】
1つの例において、本開示にしたがう抗体または抗原結合フラグメントは、非フコシル化される。たとえば、免疫グロブリンまたは抗体は、FUT8を発現しない細胞(たとえば、CHO細胞等の、哺乳類細胞)において産生される。
【０１８９】
他の方法は、Fc媒介エフェクター機能の強化を誘導することができる、Fc領域もしくは定常領域または抗原結合フラグメントを先天的に産生する細胞株の使用を含む(たとえば、ウイルスワクチンの産生のためのアヒル胚由来幹細胞、国際公開第WO2008/129058号、鳥類EBX(登録商標)細胞における組換えタンパク質産生、国際公開第WO2008/142124号)。
【０１９０】
本開示の方法において有用な化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)は、たとえば、定常領域またはＦｃ領域に取り付けられた二分岐オリゴ糖がGlcNAcにより二分されている、二分オリゴ糖を有する化合物も含む。このような化合物は、フコシル化の減少および／またはADCC機能の改善を有し得る。このような化合物の例は、たとえば、米国特許第6602684号、および米国特許公報第20050123546号に示される。
【０１９１】
定常領域またはＦｃ領域に取り付けられたオリゴ糖における少なくとも1つのガラクトース残基を有する化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)も企図される。このような抗体または抗原結合フラグメントは、CDC機能の改善を有し得る。このような免疫グロブリンは、たとえば、国際公開第WO1997/30087号、および同第WO1999/22764号に示される。
【０１９２】
エフェクター機能を誘導する化合物の能力を決定する方法は、当技術分野において既知であり、および／または本明細書でより詳細に示される。
【０１９３】
安定化タンパク質
本開示の中和タンパク質は、IgG4定常領域または安定化IgG4定常領域を含むことができる。「安定化IgG4定常領域」という用語は、Fabアーム交換、半抗体のFabアーム交換もしくは形成を受ける傾向、または半抗体を形成する傾向を低減するように修飾された、IgG4定常領域を意味するものと理解されるであろう。「Fabアーム交換」とは、ヒトIgG4のための一種のタンパク質修飾を指し、そこではIgG4重鎖および取り付けられた軽鎖(半分子)が、別のIgG4分子からの重鎖-軽鎖の対と交換される。このようにして、IgG4分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるFabアームを獲得し得る(二重特異性分子をもたらす)。Fabアーム交換は、インビボで自然に起こり、精製された血液細胞または還元グルタチオン等の還元剤によってインビトロで誘発することができる。「半抗体」は、IgG4抗体が解離して、それぞれが単一の重鎖および単一の軽鎖を含む２つの分子を形成したときに形成される。
【０１９４】
1つの例において、安定化IgG4定常領域は、Kabatのシステム(Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、1987および／または1991)にしたがって、ヒンジ領域の241位にプロリンを含む。この位置は、EU付番方式(Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services、2001 and Edelman et al.、Proc. Natl. Acad. USA、63、78-85、1969)にしたがって、ヒンジ領域の228位に対応する。ヒトIgG4において、この残基は、一般にセリンである。プロリンに対するセリン置換に続いて、IgG4ヒンジ領域は、配列CPPCを含む。この点に関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の2つのＦａｂアームに運動性を与える、FcおよびFab領域を連結する、抗体重鎖定常領域のプロリンに富む部分であることに気付くであろう。ヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を伴う、システイン残基を含む。これは、一般に、Kabatの付番方式にしたがって、ヒトIgG1のGlu226からPro243まで伸びるものとして定義される。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド(S-S)結合を形成する、最初および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、IgG1配列と整列させてもよい(たとえば、国際特許出願第WO2010/080538号を参照されたい)。
【０１９５】
追加の変更
本開示は、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)の定常領域またはＦｃ領域への追加の変更も企図する。
たとえば、Fc領域の定常領域はその抗体またはフラグメントの半減期を増大させる、1つ以上のアミノ酸置換を含む。たとえば、定常領域またはFc領域は、新生児Fc領域(FcRn)についての定常領域またはFc領域の親和性を増大させる、1つ以上のアミノ酸置換を含む。たとえば、定常領域またはＦｃ領域は、エンドソームにおけるFc／FcRn結合を促進する、より低いpH、たとえば、約pH6.0でのFcRnについての親和性の増大を有する。1つの例において、定常領域またはＦｃ領域は、約pH7.4でのFcRnについてのその親和性と比較して、細胞再生利用後の定常領域またはFcの血中への再放出を促進する約pH6でのFcRnについての親和性の増大を有する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することにより、Fc含有または定常領域含有化合物の半減期を延長させるために有用である。
【０１９６】
例示的なアミノ酸置換は、KabatのEU付番方式にしたがう、T250Qおよび／またはM428Lを含む。追加のまたは代替のアミノ酸置換は、たとえば、米国特許公報第20070135620号に示される
【０１９７】
ペプチド
1つの例において、化合物は、たとえば、ランダムペプチドライブラリから単離されたペプチドである。適当なペプチドを同定するために、ランダムペプチドライブラリを作成し、米国特許公報第5733731号、米国特許公報第5591646号および米国特許公報第5834318号に記載のようにスクリーニングする。一般に、このようなライブラリは、インビトロまたはインビボのいずれかで発現され、ライブラリのスクリーニングを促進して、BTN2A1に特異的に結合する能力があるペプチドを同定するような方法で提示される短いランダムオリゴヌクレオチドから作成される。提示の方法として、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、細菌鞭毛ディスプレイ、細菌胞子ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、哺乳類表面ディスプレイ、およびmRNAディスプレイ、リボソームディスプレイおよび共有結合ディスプレイなどのインビトロディスプレイが挙げられる。
【０１９８】
BTN2A1に結合することができるペプチドは、たとえば、Scopes、1994に記載の標準的親和性精製方法、米国特許公報第645563号に記載のFACS分析を用いる精製などの当技術分野で周知の多くの方法のいずれかによって同定される。
【０１９９】
小分子
別の例において、結合分子は小分子である。このような小分子は、ライブラリから単離することができる。化学小分子ライブラリは、市販されたものを用いるか、または別法として、たとえば、米国特許第5463564号中のもの等の、当技術分野で既知の方法を用いて作成されてもよい。
小有機化合物を合成する技術は、その化合物により大幅に異なるであろう。しかしながら、このような方法は、当業者に周知であろう。
【０２００】
1つの例において、インフォーマティクスは、コンビナトリアルライブラリを作成するために、既知の化合物から好適な化学構築ブロックを選択するために使用される。たとえば、QSAR(定量的構造活性関係)モデリングアプローチは好適性を決定するために化合物構造の直線回帰または回帰ツリーを使用する。Chemical Computing Group, Inc. (Montreal、Canada)のソフトウェアは、確率的QSARモデルを作製するために、活性および不活性化合物についてのハイスループットスクリーニング実験データを使用し、そのモデルは、その後リード化合物を選択するために使用される。2成分QSAR方法は、ある特定の化合物が必要とされる機能、部分電荷、モル屈折率(結合相互作用)、およびlogP(分子の親油性)を行うであろう、または行わないであろう可能性の「記述子」を形成する、化合物の3つの特徴的特性に基づく。各原子は、その分子中に表面範囲を有し、その表面範囲は、それに関連するこれらの3つの特性を有する。ある範囲内の部分電荷を有する化合物の全ての原子が決定され、表面範囲(ファンデルワールス表面範囲記述子)が合計される。2成分QSARモデルは、その後活性モデルまたはADMETモデルを作製するために使用され、それらは、コンビナトリアルライブラリを構築するために使用される。したがって、最初のスクリーニングで特定されたリード化合物は、スクリーニングされる化合物のリストを拡張し、それによって高活性化合物を特定するために使用することができる。
【０２０１】
核酸アプタマー
別の例において、結合分子は、核酸アプタマー(適応可能オリゴマー)である。アプタマーは、本開示のペプチドまたはそのペプチドを含む抗原(たとえば、BTN2A1)等の、特定の標的に結合する能力を提供する、二次および／または三次構造を形成することができる、単鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログである。したがって、アプタマーは、抗体に類似のオリゴヌクレオチドである。一般に、アプタマーは、約15〜約40ヌクレオチド、たとえば、約20〜約40ヌクレオチド等の、約15〜約100ヌクレオチドを含み、この範囲内に入る長さのオリゴヌクレオチドは従来技術により調製することができる。
【０２０２】
アプタマーは、アプタマーのライブラリから単離され、またはそれから特定され得る。アプタマーライブラリは、たとえば、ランダムオリゴヌクレオチドをベクター(またはRNAアプタマーの場合、発現ベクター)にクローニングすることにより作成され、ここで、そのランダム配列は、PCRプライマーの結合部位を提供する既知の配列に隣接する。所望の生物学的活性(たとえば、BTN2A1に特異的に結合する)を提供するアプタマーが選択される。活性が増大したアプタマーは、たとえば、SELEX(指数関数的濃縮によるリガンドのシテマティック展開(Sytematic Evolution of Ligandsby EXponential enrichment))を用いて選択される。アプタマーライブラリを作成する、および／またはスクリーニングするための好適な方法は、たとえば、Elloington and Szostak, Nature 346:818-22, 1990、米国特許第5270163号、および／または同第5475096号に示される。
【０２０３】
核酸系BTN2A1シグナル伝達阻害剤
本開示の1つの例において、本開示の任意の例における本明細書に記載の治療方法は、BTN2A1の発現を減少させることを包含する。たとえば、このような方法は、核酸の転写および／または翻訳を減少させる化合物を投与することを包含する。1つの例において、化合物は、たとえば、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、PNA、干渉RNA、siRNA、マイクロRNAなどの核酸である。
【０２０４】
アンチセンス核酸
用語「アンチセンス核酸」は、本開示の任意の例における本明細書に記載のポリペプチドをコードする特定のmRNA分子の少なくとも一部に対して相補的であり、mRNA翻訳などの転写後イベントを干渉する能力があるDNAもしくはRNAまたはその誘導体(たとえば、LNAまたはPNA)、あるいはその組合せを意味するものとする。アンチセンス法の使用は、当技術分野で周知である(たとえば、Hartmann and Endres(編集者)、Manual of Antisense Methodology、Kluwer(1999)を参照されたい)。
【０２０５】
本開示のアンチセンス核酸は、生理的条件下で標的核酸にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、構造遺伝子もしくはコーティング領域に対応する配列または遺伝子発現もしくはスプライシングのコントロールに影響を及ぼす配列を包含する。たとえば、アンチセンス核酸は、BTN2A1をコードする核酸の標的コーティング領域、または5’-非翻訳領域(UTR)または3’-UTRまたはこれらの組合せに対応してもよい。アンチセンス核酸は、たとえば、標的遺伝子のエクソン配列のみへと転写中または転写後にスプライシングで切り出されうるイントロン配列に部分的に相補的であってもよい。アンチセンス配列の長さは、BTN2A1をコードする核酸の少なくとも19の連続したヌクレオチド、たとえば、少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチドなどの少なくとも50ヌクレオチドであるべきである。全遺伝子転写物に対して相補的である全長配列を用いてもよい。長さは、100-2000ヌクレオチドでありうる。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の度合いは、少なくとも90%、たとえば、95-100%であるべきである。
【０２０６】
触媒核酸
用語「触媒核酸」は、個別の基質を特異的に認識し、この基質の化学的変更を触媒するDNA分子もしくはDNA含有分子(当技術分野で「デオキシリボザイム」または「DNAザイム」としても知られる)またはRNA分子もしくはRNA含有分子(「リボザイム」または「RNAザイム」としても知られる)を意味する。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基A、C、G、T(およびRNAにはU)でありうる。
【０２０７】
典型的には、触媒核酸は、標的核酸の特異的認識のためのアンチセンス配列および核酸切断酵素活性(本明細書において「触媒ドメイン」とも称する)を含む。本開示において有用なリボザイムのタイプは、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムである。
【０２０８】
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するために有用である。特定の理論に縛られることを望むものではないが、この技術は、対象の遺伝子のmRNA、本願においてはBTN2A1をコードするmRNAと本質的に同一である配列またはその一部を含むdsRNA分子の存在に依存する。好都合なことに、組換えベクター宿主細胞内のシングルプロモーターからdsRNAを産生することができ、ここで、センスおよびアンチセンス配列は、センスおよびアンチセンス配列がハイブリダイズして、ループ構造を形成する非関連配列をもつdsRNA分子を形成するのを可能にする非関連配列によって隣接される。本開示のための適当なdsRNA分子の設計および作成は、特に、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029およびWO01/34815を考慮して、十分当業者の能力の範囲内にある。
【０２０９】
ハイブリダイズするセンスおよびアンチセンス配列の長さは、それぞれ、少なくとも19の連続したヌクレオチド、たとえば、少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチドなどの少なくとも30または50ヌクレオチドであるべきである。全遺伝子転写物に対して相補的である全長配列を用いてもよい。長さは、100-2000ヌクレオチドでありうる。標的転写物に対するセンスおよびアンチセンス配列の同一性の度合いは、少なくとも85%、たとえば、95-100%などの少なくとも90%であるべきである。
【０２１０】
例示的な小干渉RNA(siRNA)分子は、標的mRNAの約19-21の連続したヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。たとえば、siRNA配列は、ジヌクレオチドAAで開始し、約30-70%(たとえば、30-60%、40-60%、約45%-55%など)のGC含量を含み、たとえば、標準的BLASTサーチによって決定されるように、それが導入された哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列に対して高いパーセンテージの同一性を有さない。BTN2A1の発現を減少させるsiRNAは、LifeTechnologiesまたはSanta Cruz Biotechnologyから市販されている。
【０２１１】
BTN2A1の発現を減少させるショートヘアピンRNA(shRNA)は、たとえば、Origene Technologies, Incから市販されている。
【０２１２】
タンパク質産生
組換え発現
1つの例において、本明細書に記載の化合物は、ペプチドまたはポリペプチド(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)である。1つの例において、化合物は、組換え体である。
【０２１３】
組換えペプチドまたはポリペプチドの場合、それをコードする核酸を発現ベクター内にクローニングし、次いで、そうでなければ免疫グロブリンまたは抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、あるいはサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞または骨髄腫細胞などの哺乳類細胞などの宿主細胞にトランスフェクトさせる。
【０２１４】
ペプチドまたはポリペプチドを発現させるのに用いる例示的細胞は、CHO細胞、骨髄腫細胞またはHEK細胞である。細胞は、さらに、ペプチドまたはポリペプチド(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)の発現を促進する1つ以上の突然変異および／または欠失を含む。1つの非限定的例は、発現したペプチドまたはポリペプチド(たとえば、抗体のFc領域を含む)のフコシル化に必要な酵素をコードする遺伝子の欠失である。たとえば、欠失した遺伝子は、FUT8をコードする。市販のFUT8欠失CHO細胞の供給源は、Biowa(ポテリジェントTM細胞)である。たとえば、非フコシル化ペプチドまたはポリペプチドの発現のために用いる細胞は、BiowaのポテリジェントTM細胞などのFUT8欠失CHO細胞である。
【０２１５】
これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当技術分野において既知であり、たとえば、Ausubel et al.、(編者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までのすべてのアップデートを含む)またはSambrook et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に示される。広くさまざまなクローニングおよびインビトロ増幅方法は、組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体を生成する方法も当技術分野で既知である。米国特許第4816567号または同第5530101号を参照されたい。
【０２１６】
単離後、その核酸をさらなるクローニングのために(DNAの増幅)または細胞以外の系におけるもしくは細胞における発現のために、発現構築物または発現ベクター中のプロモーターに機能的に連結して挿入する。したがって、本開示の別の実施例は、本開示の単離された核酸と、1つ以上の追加のヌクレオチド配列とを含む、発現構築物を提供する。好適には、その発現構築物は、当技術分野において理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母、または細菌性人工染色体の形態である。発現構築物は、細菌もしくは他の宿主細胞における単離された核酸の維持増殖のために、組換えＤＮＡ技術による操作のために、および／または本開示の核酸または化合物の発現のために、好適であり得る。
【０２１７】
本明細書で用いる用語「プロモーター」は、その最も広い文脈において取られるべきであり、正確な転写開始のために必要とされる、TATAボックスまたは開始エレメントを含む、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、その転写調節配列は、たとえば、発達刺激および／または外部刺激に応答して、または組織特異的様式で、核酸の発現を変える追加の調節エレメント(たとえば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサー)を伴う、または伴わない。本文脈において、用語「プロモーター」は、それが機能的に連結される、核酸の発現を与える、活性化する、または強化する、組換え、合成、もしくは融合核酸、または誘導体を示すためにも使用される。例示的なプロモーターは、その核酸の発現をさらに強化する、ならびに／または空間的な発現および／もしくは一時的な発現を変えるための、１つ以上の特異的調節エレメントの追加のコピーを含有し得る。
【０２１８】
本明細書で用いる用語「に機能的に連結される」は、核酸の発現がプロモーターにより制御されるように、その核酸に関連してそのプロモーターを配置することを意味する。
【０２１９】
細胞における発現のための多くのベクターが入手可能である。ベクター構成要素は一般に、非限定的に、以下のもの、シグナル配列、(たとえば、本明細書に提供される情報に由来する)化合物をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列のうちの１つ以上を含む。例示的なシグナル配列は、原核生物分泌シグナル(たとえば、pelB、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンII)、酵母分泌シグナル(たとえば、インベルターゼリーダー、αファクターリーダー、または酸性ホスファターゼリーダー)、または哺乳類分泌シグナル(たとえば、単純ヘルペスgDシグナル)を含む。
【０２２０】
哺乳類細胞において活性な例示的なプロモーターはサイトメガロウイルス媒介初期プロモーター(CMV-ＩＥ)、ヒト伸長因子１-αプロモーター(EF1)、核内低分子ＲＮＡプロモーター(U1aおよびU1b)、α-ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター(SV40)、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、アデノウイルス主要遅延プロモーター、β-アクチンプロモーター；CMVエンハンサー／β-アクチンプロモーター、または免疫グロブリンもしくは抗体プロモーターもしくはそれらの活性フラグメントを含むハイブリッド調節エレメントを含む。有用な哺乳類ホスト細胞株の例は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1系(COS-7、ATCCCRL 1651)、ヒト胚腎臓系(懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞)、ハムスター仔腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である。
【０２２１】
たとえば、ピキア・パストリス、出芽酵母、および分裂酵母を含む群から選択される酵母細胞等の、酵母細胞における発現のために好適な典型的なプロモーターは、非限定的に、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター、またはTEF1プロモーターである。
【０２２２】
単離された核酸またはこれを含む発現構築物を発現のために細胞に導入するための手段は、当業者にとって公知のものである。所定の細胞に用いられる技法は、公知の成功した技法に依存する。組換えDNAを細胞に導入するための手段は、とりわけマイクロインジェクション、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクタミン(Gibco、米国メリーランド)および／またはセルフェクチン(Gibco、米国メリーランド)を用いることによる等、リポソームを介したトランスフェクション、PEG介在性DNA取り込み、エレクトロポレーションおよびDNAコーティングしたタングステンまたは金粒子(Agracetus Inc．、米国ウィスコンシン)使用による等の微粒子銃(microparticle bombardment)を含む。
【０２２３】
化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)を生成するために使用される宿主細胞は、使用される細胞のタイプにより、さまざまな培地中で培養され得る。Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)、Sigma)、RPMl-1640(Sigma)、およびDulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)、Sigma)等の、市販の入手可能な培地は哺乳類細胞を培養するために好適である。本明細書で議論される他の細胞種を培養するための培地は当技術分野で既知である。
【０２２４】
当業者は、前述の記載から、本開示が、また、本開示の化合物(たとえば、ペプチドまたはポリペプチド化合物あるいは抗体またはその抗原結合フラグメント)をコードする単離核酸を提供することを理解するであろう。
【０２２５】
本開示は、また、プロモーターに機能的に連結された本開示の単離核酸を含む発現構築物を提供する。1つの例において、発現構築物は、発現ベクターである。
【０２２６】
1つの例において、本開示の発現構築体は、プロモーターに機能的に連結されたポリペプチド(たとえば、VHを含む)の1つをコードする核酸、およびプロモーターに機能的に連結された別のポリペプチド(たとえば、VLを含む)をコードする核酸を含む。
【０２２７】
別の例において、発現構築体は、二シストロン性発現構築物であり、たとえば、5’から3’の順に以下の機能的に連結された構成要素を含む：
(i)プロモーター、 
(ii)第1のポリペプチドをコードする核酸；
(iii)内部リボソーム進入部位；および 
(iv)第2のポリペプチドをコードする核酸。
【０２２８】
たとえば、第1のポリペプチドがVHを含み、第2のポリペプチドがVLを含むか、または第1のポリペプチドがVLを含み、第2のポリペプチドがVHを含む。
【０２２９】
本開示は、その1つが第1のポリペプチド(たとえば、VHを含む)をコードし、別の1つが第2のポリペプチド(たとえば、VLを含む)をコードする、別々の発現構築物も企図している。たとえば、本開示は、また、
(i)プロモーターに機能的に連結されたポリペプチド(たとえば、VHを含む)をコードする核酸を含む、第1の発現構築物と、
(ii)プロモーターに機能的に連結されたポリペプチド(たとえば、VLを含む)をコードする核酸を含む、第2の発現構築物と、を含む組成物を提供する。
【０２３０】
本開示は、また、本開示による発現構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０２３１】
本開示は、また、本開示の化合物(たとえば、ペプチドまたはポリペプチド化合物あるいは抗体またはその抗原結合フラグメント)を発現する単離された細胞、または本開示の化合物を発現するように遺伝子的に変更された組換え細胞を提供する。
【０２３２】
1つの例において、細胞は、本開示の発現構築物、すなわち、：
(i)プロモーターに機能的に連結されたポリペプチド(たとえば、VHを含む)をコードする核酸を含む、第1の遺伝子構築物と、
(ii)プロモーターに機能的に連結されたポリペプチド(たとえば、VLを含む)をコードする核酸を含む、第2の遺伝子構築物と、を含み、
第1および第2ポリペプチドが、本開示の抗体または抗原結合フラグメントを形成する遺伝子構築物を含む。
【０２３３】
遺伝子構築物は、細胞に組み込まれるか、またはエピソーム性のままでありうる。
【０２３４】
本開示の細胞の例として、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞が挙げられる。
【０２３５】
本開示は、さらに、本開示の遺伝子構築物を、化合物が製造されるのに十分な条件下に維持することを含む、本開示の化合物(たとえば、ペプチドまたはポリペプチド化合物または抗体またはその抗原結合フラグメント)の製造方法を提供する。
【０２３６】
1つの例において、本開示の化合物の製造方法は、化合物が製造されるのに十分な条件下で、および任意に分泌されるのに十分な条件の下で、本開示の細胞を培養することを含む。
【０２３７】
1つの例において、本開示の化合物の製造方法は、さらに、化合物を単離することを含む。
【０２３８】
1つの例において、本開示の化合物の製造方法は、さらに、化合物を医薬的に許容しうる担体とともに製剤することを含む。
【０２３９】
タンパク質の単離
ペプチドまたはポリペプチド(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)を精製する方法は、当技術分野において既知であり、および／または本明細書に示される。
【０２４０】
ペプチドまたはポリペプチドが培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清を、はじめに、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、AmiconまたはMillipore Pellicon ultrafiltration unitを用いて濃縮することができる。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記ステップのいずれにも含めることができ、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を予防するために含めることができる。
【０２４１】
細胞から調製されたペプチドまたはポリペプチドは、たとえば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー(たとえば、タンパク質A親和性クロマトグラフィーまたはタンパク質Gクロマトグラフィー)、または上記の任意の組み合わせを用いて精製することができる。これらの方法は、当技術分野において既知であり、たとえば、国際公開第WO99/57134号、またはEd Harlow and David Lane(編集者) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)に記載される。
【０２４２】
ペプチド合成
ペプチドは当業者に知られる化学的方法を用いて合成される。たとえば、合成ペプチドは固相、液相、もしくはペプチド濃縮、またはそれらの任意の組み合わせの既知の技術を用いて調製され、天然および／または非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、85:2149-2154、1963の元の固相手順の脱保護、中和、カップリング、および洗浄プロトコルでの、標準のBoc(Nα-アミノ保護Ｎα-t-ブチルオキシカルボニル)アミノ酸樹脂、またはCarpino and Han、J. Org. Chem.、37:3403-3409、1972により示される、塩基性不安定性Nα-アミノ保護9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸であり得る。FmocおよびBoc両方のNα-アミノ保護アミノ酸は、たとえば、Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、BachemまたはPeninsula Labs等の、さまざまな商業的源から得ることができる。
【０２４３】
一般に、化学合成方法は、伸長中のペプチド鎖への１つ以上のアミノ酸の連続的追加を含む。通常、はじめのアミノ酸のアミノまたはカルボキシル基のいずれかは好適な保護基により保護される。保護された、または誘導されたアミノ酸はその後、アミド結合の形成を許容する条件下で、不活性固体支持に取り付けられ、または好適に保護された相補(アミノまたはカルボキシル)基を有する配列中に次のアミノ酸を添加することにより溶液中で利用され得る。その保護基をその後、新規に添加されたアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸(好適に保護された)をその後添加し、このように続ける。所望のアミノ酸を適切な配列に連結させた後、任意の残りの保護基(および、固相合成技術を使用した場合、任意の固体支持)を連続してまたは同時に除去し、最終的なポリペプチドにする。この一般的な手順の単純な変さらにより、たとえば、保護されたトリペプチドと適切に保護されたジペプチドとを(キラル中心をラセミ化しない条件下で)カップリングさせ、脱保護後にペンタペプチドを形成させることにより、１つ超のアミノ酸を一度に伸長中の鎖に添加することが可能である。たとえば、固相ペプチド合成技術については、J. M. Stewart and J. D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co.、Rockford、IL 1984)およびG. Barany and R. B.Merrifield、The Peptides ：Analysis、Synthesis、Biology、editors E. Gross and J. Meienhofer、Vol. 2、(Academic Press、New York、1980)、pp. 3-254、ならびに古典的な溶液合成については、M. Bodansky、Principles of Peptide Synthesis、(Springer-Verlag、Berlin 1984)and E. Gross and J. Meienhofer、Eds.、The Peptides ：Analysis. Synthesis. Biology、Vol.1を参照されたい。これらの方法は、本開示のペプチドの合成のために好適である。
【０２４４】
本明細書に示されるペプチドは同時多ペプチド合成の方法によるなどの、他の方法によっても化学的に調製することができる。たとえば、Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA  82：5131-5135、1985、または米国特許第4,631, 211号を参照されたい。
【０２４５】
核酸合成
本開示の核酸ベースの化合物を生成する／合成する方法は、当技術分野で既知である。たとえば、オリゴヌクレオチド合成はGait(編集者) Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach、IRL Press、Oxford(1984)に示される。たとえば、プローブまたはプライマーは生物学的合成により(たとえば、制限エンドヌクレアーゼでの核酸消化により)、または化学合成により得ることができる。短い配列(最大約100ヌクレオチド)については、化学合成が望ましい。
【０２４６】
より長い配列については、たとえば、Messing Methods Enzymol、101：20-78、1983に記載の一本鎖DNAのためのM13の使用等の、分子生物学において使用される標準の複製方法が有用である。
【０２４７】
オリゴヌクレオチド合成についての他の方法は、たとえば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル方法(Narang、編集者、「Synthesis and Applications of DNA and RNA」Academic Press、New York(1987))、および支持体上合成(Beaucage、et al.、Tetrahedron Letters、22：1859-1862、1981)、およびホスホルアミデート技術(Caruthers、M. H.、et al.、「Methods in Enzymology,」Vol. 154、pp. 287-314(1988)、ならびにNarang(1987)およびそれらの中に包含される引用文献に示される他のものを含む。
【０２４８】
複合体
1つの例において、本開示の化合物は、作用剤に複合する。たとえば、作用剤は、放射性同位体、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、被験者内での化合物の半減期を増加させる作用剤およびその混合物から選択される。
【０２４９】
他の化合物は、化合物に直接または間接的に結合されうる(たとえば、間接的結合の場合、リンカーを含みうる)。化合物の例として、放射性同位体(たとえば、ヨウ素-131、イットリウム-90またはインジウム-111)、検出可能な標識(たとえば、フルオロフォアまたは蛍光ナノ結晶または量子ドット)、治療用化合物(たとえば、化学療法剤または抗炎症剤)、コロイド(たとえば、金)、毒素(たとえば、リシンまたは破傷風トキソイド)、核酸、ペプチド(たとえば、血清アルブミン結合ペプチド)、タンパク質(たとえば、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質または血清アルブミン)、被験者内での化合物の半減期を増加させる作用剤(たとえば、ポリエチレングリコールまたはこの活性を有する他の水溶性ポリマー)およびその混合物が挙げられる。本開示の化合物に複合されうる例示的な化合物およびこのおうな複合のための方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、国際公開第2010/059821号に記載されている。
【０２５０】
化合物は、ナノ粒子に複合してもよい(たとえば、Kogan et al.、Nanomedicine (Lond)。2：287-306、2007に概説されるように)。ナノ粒子は、金属性ナノ粒子であってもよい。
【０２５１】
本開示の化合物に複合されうるいくつかの例示的な化合物を第1表に挙げる。
第1表：複合において有用な化合物
【表１】
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【０２５２】
1つの例において、本開示の化合物は、化学療法剤に複合する。
【０２５３】
1つの例において、本開示の化合物は、メイタンシノイド、たとえば、DM1またはDM4に複合する。
【０２５４】
1つの例において、本開示の化合物は、アウリスタチン、たとえば、MMAEまたはMMADに複合する。
【０２５５】
BTN2A1に特異的に結合する化合物の選択
BTN2A1またはそのエピトープに特異的に結合する化合物の適当な選択方法は、当業者には利用可能である。
【０２５６】
たとえば、BTN2A1に結合する能力がある化合物を同定するために、スクリーニングを行ってもよい。次いで、BTN2A1に結合する任意の化合物をスクリーニングして、関連タンパク質、たとえば、BTN2A2に実質的に結合しない化合物を同定する。
【０２５７】
たとえば、抗体フラグメントを提示するファージディスプレイライブラリを、BTN2A1またはその可溶性形態でスクリーニングして、それに結合するタンパク質を同定する。次いで、抗体フラグメントが検出可能に結合することができないBTN2A1に関連する1つ以上のタンパク質を用いて、交差反応性タンパク質を除去する。前述の本明細書に記載の他の化合物を同定するためのスクリーニング法に基づいて、非ヒト動物の免疫付与のためのスクリーニング方法を考案することもできる。
【０２５８】
化合物の活性検定
本開示の化合物は、たとえば、以下のように、生物活性について、容易にスクリーニングされる。
【０２５９】
結合アッセイ
このようなアッセイの1つの形態は、たとえば、Scopes(In:タンパク質purification：principles and practice、Third Edition、Springer Verlag、1994)に記載されるような、抗原結合アッセイである。このような方法は、一般に、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)を標識化すること、およびそれを固定された抗原に接触させることを含む。非特異的に結合したタンパク質を除去するための洗浄後、標識の量および、その結果、結合した化合物が検出される。もちろん、化合物を固定し、かつ抗原を標識化することができる。たとえば、本明細書に記載したような、パニング型アッセイも使用することができる。 
【０２６０】
中和の決定
本開示のいくつかの例において、本開示の化合物は、BTN2A1活性を中和する。
タンパク質のシグナル伝達を中和する化合物の能力を評価するためのさまざまなアッセイが当技術分野で周知である。
【０２６１】
1つの例において、BTN2A1の中和は、化合物がBTN2A1に結合して、細胞-化合物複合体を形成するように、メラノーマ細胞を化合物に接触させること；該複合体をT細胞(たとえば、CD4+T細胞またはCD8+T細胞)に接触させること：およびメラノーマ細胞の死(たとえば、T細胞によるメラノーマ細胞の細胞傷害性殺傷)のレベルを決定することによって決定される。ここで、化合物の不在下と比較した場合の化合物の存在下でのメラノーマ細胞の死のレベルの増加は、化合物がBTN2A1を中和したことを示す。たとえば、メラノーマ細胞およびT細胞は、HLAマッチし、T細胞は、メラノーマ細胞(たとえば、NY-ESO-1またはMelan A)によって認識された抗原を認識する。1つの例において、複数のメラノーマ細胞(たとえば、約2.5x104細胞)を、複数のT細胞(たとえば、約12.5x104T細胞)に接触させる。次いで、たとえば、ホルマザン塩(Promega Corporation)に対するMTS還元を評価するアッセイを用いて、たとえば、生存能力の喪失を決定することによって、メラノーマ細胞の生存能力の喪失を評価する。
【０２６２】
1つの例において、BTN2A1の中和は、化合物がBTN2A1に結合して、細胞-化合物複合体を形成するように、メラノーマ細胞を化合物に接触させること；該複合体をT細胞(たとえば、CD4+T細胞またはCD8+T細胞)に接触させること：およびT細胞産生の活性化のレベルを決定すること(たとえば、インターフェロン(IFN)γまたは腫瘍壊死因子(TNF)αのレベルを決定することによって)によって決定される。ここで、化合物の不在下と比較した場合の化合物の存在下でのT細胞の活性化のレベルの増加は、化合物がBTN2A1を中和したことを示す。たとえば、メラノーマ細胞およびT細胞は、HLAマッチし、T細胞は、メラノーマ細胞(たとえば、NY-ESO-1またはMelan A)によって認識された抗原を認識する。1つの例において、複数のメラノーマ細胞(たとえば、約105細胞)を、複数のT細胞(たとえば、約2.5x104T細胞)に接触させる。1つの例において、活性化は、細胞が細胞表面CD3およびCD8ならびにIFNγおよび／またはTNFα産生に対して染色される蛍光活性化細胞ソーティングによって決定される。次いで、CD8+IFNγ+および／またはCD8+TNFα+細胞の数を決定する。
【０２６３】
別法として、ELISAまたはELISPOTアッセイを用いて、T細胞によって分泌されたサイトカインの量を評価することができる。
【０２６４】
本開示は、BTN2A1シグナル伝達の中和を評価するための他の方法を企図する。
【０２６５】
エフェクター機能の決定
ADCC活性を評価する方法は、当技術分野で既知である。
1つの例において、ADCC活性のレベルは51Cr放出アッセイ、ユーロピウム放出アッセイまたは35S放出アッセイを用いて評価される。これらのアッセイのそれぞれにおいて、BTN2A1を発現する細胞を、列挙される化合物のうちの1つ以上と共に、その化合物がその細胞により取り込まれるのに十分な時間および条件下で培養する。35S放出アッセイの場合、BTN2A1を発現する細胞を35S-標識化メチオニンおよび／またはシステインと共に、標識化されたアミノ酸が新規に合成されたタンパク質に取り込まれるのに十分な時間、培養し得る。次いで、細胞を、本開示の化合物の存在下または不在下、および免疫エフェクター細胞、たとえば末梢血単核細胞(PBMC)および／またはNK細胞の存在下で培養する。次いで、細胞培養培地中の51Cr、ユーロピウムおよび／または35Sの量を検出し、その化合物の不在下と比較した場合の、その化合物の存在下での増加は、その抗体または抗原結合フラグメントがエフェクター機能を有することを示す。化合物により誘導されるADCCのレベルを評価するためのアッセイを開示する例示的な出版物は、Hellstrom、et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063、1986およびBruggemann、et al.、J. Exp. Med. 166:1351-1361、1987を含む。
【０２６６】
化合物によって誘導されたADCCのレベルを評価するための他のアッセイとして、フローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology、Inc. CA、USA)またはCytoTox 96(登録商標)(Promega、WI、USA)
が挙げられる。
【０２６７】
別法として、またはさらに、米国特許第7317091号に記載のように、化合物のエフェクター機能を、1つ以上のFcγRに対するその親和性を決定することによって評価する。
【０２６８】
C1q結合アッセイを行って、化合物がC1qに結合して、CDCを誘導することができることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行ってもよい(たとえば、Gazzano-Santoro et al、J. Immunol. Methods 202：163、1996を参照されたい)。
【０２６９】
親和性決定
任意に、BTN2A1またはそのエピトープに対する化合物の解離定数(Kd)または会合定数(Ka)または平衡定数(KD)を決定する。1つの例において、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメント)に対するこれらの定数は、放射標識または蛍光標識BTN2A1結合アッセイによって測定される。このアッセイは、非標識BTN2A1の滴定系列の存在下での、化合物と標識BTN2A1(またはその可溶性形態、たとえば、Fc領域に融合したBTN2A1の細胞外領域を含む)の最小濃度の平衡を保たせる。非結合のBTN2A1を除去するための洗浄後、標識の量を決定する。
【０２７０】
たとえば、免疫測定法、表面プラズモン共鳴(SPR)(Rich and Myszka Curr. Opin. Biotechnol 11:54、2000；Englebienne Analyst. 123：1599、1998)、等温滴定熱量測定法(ITC)または当技術分野で周知のその他の動力学的相互作用アッセイなどの抗体反応のための標準的方法によって、親和性測定値を決定することができる。
【０２７１】
1つの例において、定数は、表面プラズモン共鳴アッセイ、たとえば、固定されたBTN2A1または領域を用いるBIAcore表面プラズモン共鳴(BIAcore、Inc.、Piscataway、NJ)を用いて測定される。例示的なSPR法は、米国特許第7229619号に記載されている。
【０２７２】
治療効果の評価
本開示の化合物の、本明細書に記載の疾患または身体的状態を治療する能力を評価するために、さまざまなインビトロアッセイを利用することができる。T細胞の活性化またはT細胞の細胞傷害性を決定するための例示的なアッセイは、上述のとおりであり、ADCCおよびCDCを決定するための方法である。これらのアッセイは、メラノーマ細胞を殺傷する細胞の能力を決定するように、容易に適合される(たとえば、化合物の存在下での細胞増殖レベルを決定することによって)。
【０２７３】
1つの例において、化合物の、疾患または身体的状態を治療する効果は、インビボアッセイを用いて評価される。
【０２７４】
1つの例において、ガン、たとえば、メラノーマの異種移植モデルを用いて、治療効果を評価する。たとえば、マウス(NOD/SCIDマウス)に、ガン細胞、たとえば、メラノーマ細胞を投与し、マウスに本開示の化合物を投与し、任意の腫瘍の大きさのレベルまたは任意の腫瘍の存在またはその転移を評価する。化合物の不在下と比較した場合の化合物の存在下での腫瘍の大きさまたは数あるいは転移の減少は、治療効果を示す。
【０２７５】
組成物
適当に、本開示の化合物の哺乳動物への投与のための組成物または方法において、化合物は、当技術分野において理解される通り、医薬的に許容しうる担体と組み合わされる。したがって、本開示の1つの例は、医薬的に許容しうる担体と組み合わせた本開示の化合物を含む組成物(たとえば、医薬組成物)を提供する。別の1つの例において、本開示は、哺乳動物への投与前に化合物と組み合わせるまたは混合するのに適切な、医薬的に許容しうる担体を含むキットを提供する。この例において、キットは、使用のための説明書をさらに含むことができる。
【０２７６】
一般用語において、「担体」は、任意の哺乳動物、たとえば、ヒトに安全に投与することのできる固体もしくは液体の充填剤、結合剤、希釈剤、カプセル封入物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁化剤、コーティング剤または滑沢剤を意味する。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA、1991)に記載されている通り、特定の投与経路に応じて、当技術分野で公知の様々な許容しうる担体を用いることができる。
【０２７７】
たんなる一例として、担体は、糖(たとえば、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース)、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油および合成モノまたはジグリセリドを含む油、低級アルコール、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、ステアリン酸ナトリウムまたはマグネシウム等の滑沢剤、等張性生理食塩水並びに発熱物質不含水を含む群から選択することができる。たとえば、担体は、非経口投与に適合性があるか、または適切である。非経口投与は、消化管を通らない任意の投与経路を含む。非経口投与の非限定的な例として、注射、注入等が挙げられる。具体例として、注射による投与として、静脈内、動脈内、筋肉内および皮下注射が挙げられる。たとえば、皮内、筋肉内および皮下送達され得るデポー剤または徐放性製剤による送達もまた企図される。
【０２７８】
併用療法
本開示の化合物および／または本開示の方法は、ガン、たとえば、メラノーマの治療のための療法において、単独または他の作用剤との併用で用いることができる。
【０２７９】
たとえば、本開示の化合物または本開示の方法において使用される化合物は、少なくとも1つの治療剤と共投与される。たとえば、さらなる治療剤は、化学療法剤である。
【０２８０】
1つの例において、化学療法剤は、たとえば、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、イリノテカン、メトトレキサート、パクリタキセル、トポテカン、ビンクリスチンまたはビンブラスチンである。1つの例において、化学療法剤は、メトトレキサート、l-アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シタラビン、イダルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、フルダラビン、クロラムブシルおよびその組合せから選択される
【０２８１】
いくつかの例において、さらなる治療剤は、アルデスロイキン、ダカルバジン、DTIC-ドーム(ダカルバジン)、イピリムマブ、プロロイキン(アルデスロイキン)、ベムラフェニブ、ヤーボイ(イピリムマブ)および／またはゼルボラフ(ベムラフェニブ)であってもよい。
【０２８２】
いくつかの例において、さらなる治療剤は、たとえば、ヤーボイ(イピリムマブ)、ニボルマブ、ランブロリズマブまたはMPDL-3280Aなどの、免疫反応のレギュレーター(たとえば、CTLA-4またはPD-1またはPD-L1)を中和する免疫療法剤である。
【０２８３】
いくつかの例において、本開示の化合物は、個人において、放射線療法との併用で、ガン、たとえば、メラノーマの治療のために用いられる。いくつかの例において、本開示の化合物は、個人において、個人からのガン、たとえば、メラノーマの全部または一部の外科的除去との併用で、ガン、たとえば、メラノーマの治療のために用いられる。
【０２８４】
本開示のいくつかの例において、被験者は、抗ガン療法を用いて、ガン、たとえば、メラノーマに対して、予め治療されている。1つの例において、抗ガン療法は外科手術である。もう1つの例において、被験者は、本開示の化合物の投与の前、中(たとえば、同時)または後に、さらなる抗ガン療法でさらに治療される。抗ガン療法として、外科手術、放射線療法(radiation therapy)(放射線療法(radiotherapy))、生物療法、免疫療法、化学療法またはこれらの療法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２８５】
投薬量および投与のタイミング
疾患もしくは病気(condition)の治療のため、活性化合物(たとえば、本開示の抗体または抗原結合フラグメント)の適切な投薬量は、治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、化合物が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療法、患者の臨床歴および化合物に対する応答性ならびに主治医の判断に応じて変わるであろう。特定の投薬処方、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体および医師に評価される該個体の病歴に依存するであろう。通常、臨床医は、投薬量が所望の結果を得られる量に達するまで免疫グロブリンを投与するであろう。
【０２８６】
本開示の方法は、哺乳動物における疾患または病気の症状の治療、寛解または予防に、あるいは哺乳動物の予後の改善に有用である。本開示の方法は、疾患または病気の発症またはその再発リスクのある個体における疾患または病気の発症遅延または予防にも有用である。
【０２８７】
本明細書に記載の化合物の投与のため、通常の投薬量は、1日間当り約10ng/kg〜約100mg/kg(個体体重)またはそれ以上で変動し得る。数日間以上にわたる反復投与のため、治療される疾患または障害の重症度に応じて、治療は、所望の症状抑制が達成されるまで持続することができる。
【０２８８】
いくつかの例において、化合物(たとえば、抗体または抗原結合フラグメントなどのポリペプチド系化合物)は、約1mg/kg〜約30mg/kgの初期(または負荷(loading))量で投与される。次いで、化合物を約0.0001mg/kg〜約10mg/kgの維持量で投与することができる。維持量を、10〜15日毎、たとえば、10日または11日または12日または13日または14日または15日毎等、7〜30日毎に投与することができる。
【０２８９】
治療に対し適切に応答しない哺乳動物の場合、1週間に複数回の用量を投与することができる。あるいは、またはさらに、増加した用量を投与することができる。
【０２９０】
もう1つの例において、有害反応を経験している哺乳動物のため、初期(または負荷)量を1週間の多数の日に、あるいは多数の連続日に分割することができる。
【０２９１】
特定の化合物の投薬量は、抗体または抗原結合フラグメントの1回以上の投与を受けた哺乳動物において経験的に決定することができる。化合物の有効性を評価するために、疾患または病気の臨床症状をモニターすることができる。
【０２９２】
本開示の方法における化合物の投与は、たとえば、レシピエントの生理学的状態、投与目的が治療であるか予防であるかということ、および当業者にとって周知の他の要因に応じて、継続的であっても間欠的であってもよい。化合物の投与は、前選択された期間にわたって基本的に継続的であっても、たとえば、病気の発症中または発症後におけるいずれかの一連の間隔を置いた(spaced)用量であってもよい。
【０２９３】
本開示は、以下の非限定的実施例を包含する。
【実施例１】
【０２９４】
材料および方法
FabであるHu34C1を作成し、メラノーマ細胞に特異的に結合し、末梢血単核細胞には実質的に結合しないことを示した。この抗体をインタクトIgGフォーマットに再フォーマットし、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。
【０２９５】
細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン試薬を補足したFreeStyle発現培地中で、FreeStyle293細胞を培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、8% CO2の加湿インキュベーター中、37℃で維持した。
【０２９６】
一過性トランスフェクション
使用説明書にしたがって、293fectinトランスフェクション試薬を用いて、哺乳動物発現ベクターによるFreeStyle293細胞の一過性トランスフェクションを行なった。1x106 生存細胞/mlの採集濃度にて、細胞(30 ml)をトランスフェクトし、8% CO2下、37℃にて5日間、非バッフル125 mLフラスコ(Corning)中で振とうしながらインキュベートした。4時間のトランスフェクション中、細胞培養物にルピン(Lupin)を補足して、最終濃度に0.5 % v/vした。2500 rpmでの遠心分離によって、細胞培養物の上清を採取し、次いで、精製前に、0.22μMフィルターを通した。
【０２９７】
抗体精製
タンデムプロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよび脱塩カラムクロマトグラフィーを用いて、モノクローナル抗体を精製した。使用説明書にしたがって、AKTA express(GE Healthcare、UK)を用いて、Hitrap MabSelect SuReおよびHiPrep 26/10脱塩樹脂を用いるクロマトグラフィーを行なった。簡単に述べると、1X MT-PBS緩衝液中でプロテインAアフィニティーカラムの平衡化を行なった。ろ過された馴化細胞培養培地(25 ml)を、1 ml/分でカラムに適用し、1 X MT-PBS(10ml)および10mM Tris、0.5M アルギニン、150mM NaCl 150mM NaCl pH 7.2(6ml)で連続的に洗浄した。次いで、結合した抗体を0.1M 酢酸ナトリウム pH 3.0(8ml)で溶離させ、次いで、脱塩カラムに適用した。280 nmにおける吸光度を用いて、抗体濃度を決定した。タンパク質画分をプールし、Amicon UltraCel 50K遠心分離デバイスを用いて濃縮した後、0.22μMフィルターを用いてろ液を滅菌した。
【０２９８】
SDS-PAGEによって、抗体の純度を分析した。
還元サンプル緩衝液中の2μgのタンパク質をNovex NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelにロードし、NuPAGE MES SDSランニング緩衝液により、X細胞 SureLock Mini-Cell(Invitrogen、CA)において200Vの一定電圧を適用した後、使用説明書にしたがって、Coomassie Stainを用いて視覚化した。
【０２９９】
抗体Hu34C1によって認識されるメラノーマ抗原としてのBTN2A1の同定
共有結合した抗体樹脂の生成
抗体Hu34C1-G4Fabk-mG2aFC-RF11-82を、NHS活性化アガロース(Pierce NHS活性化アガローススラリー 26200)に、1.8 mg/mlにて共有的に結合させた。90 %以上の結合効率が観察された。非関連アイソタイプマッチしたコントロールmAb(BM4)を有するコントロール樹脂も生成された。
【０３００】
細胞溶解液の生成
接着メラノーマ細胞株LM-Mel-62を、5 % CO2下、37℃にて、10%FCS(Sigma #12003)、50U/ml ペニシリンおよ50μg/ml ストレプトマイシン(Pen-Strep、Gibco #15070-063)、2 mM グルタマックス(Gibco #35050)を補足したRPMI 1640 media(Sigma #R0883)中で培養した。全細胞溶解液を生成するために、培養培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄し、15cmプレート当り10mlの新鮮な氷冷PBSを、4℃にて30分間加えた。次いで、ピペット操作により細胞を除去し、必要に応じて細胞を掻き出し、4℃、250 gにて、5分間の遠心分離によってペレット化し、NP40系溶解緩衝液(0.025 M Tris、pH 7.5、0.15 M NaCl、0.001M EDTA、1 % NP40、5 % グリセロール、新たに補足されたプロテアーゼインヒビターカクテル-ロシュ・コンプリート・プロテアーゼ・インヒビター)に溶解した。回転ホイール上にて4℃にて1時間後、遠心分離(13,000 g、10分、4℃、エッペンドルフ遠心分離機)によって核および細胞デブリを除去し、溶解液を使用時まで凍結させた。使用直前に、溶解液を融解させ、再遠心分離(4000g、10分)し、0.2ミクロンフィルターを通してろ過して、沈殿した物質を除去した。
【０３０１】
Hu34C1抗原免疫沈降
Hu34C1抗原の同定のために、LM-Mel-62細胞の80 x 15cmのコンフルエントプレートからの細胞溶解液(およそ50 mlの溶解液)を用いた。6 mlのコントロール抗体結合樹脂を複数回通すことによって、溶解液を、まず徹底的に予備清澄化した。次いで、予備清澄化した材料を、4℃にて回転ホイール上で、0.5 mlの抗体34C1が共結合したビーズとともにインキュベートした。3時間後、BioRadカラムへ混合物を徐々に移し、集めた溶解液を、捕捉された抗体樹脂に2回通した。次いで、抗体樹脂を、氷冷NP40溶解緩衝液(30 ml)および氷冷PBS(20 ml)で徹底的に洗浄した後、酸性溶離緩衝液(IgG Immunopure溶離緩衝液-Pierce)で溶離した。溶出液を、Amicon 遠心分離デバイス(10 kDaカットオフ)を用いて濃縮した。少量の濃縮液を、質量分析によって直接分析に付し、残りに、還元SDS PAGEサンプル緩衝液を補足し、75℃にて5分間インキュベートし、タンパク質を、4-12 % Tris-Bis Novex gelで分離した。タンパク質を、最初にシプロ・ルビー(Molecular Probes)で、次いで、Phastブルー・クマシー(Pharmacia)による染色によって視覚化した後、質量分析同定のためにタンパク質バンドを切断した。
【０３０２】
質量分析
ゲルフラグメントを、100 mM 重炭酸アンモニウム(AmBiC)で洗浄した後、還元した。バンドを、室温にて1時間、10 mM DTTで還元し、次いで、暗室中、室温にて1時間、55 mMヨードアセトアミドで迅速にアルカリ化した。過剰のDTTおよびヨードアセトアミドを、100 mM AmBiCおよびアセトニトリル(MeCN)で洗浄して除去した。ゲルバンドを、真空遠心分離機(EZ-2 plus、GeneVac、New York、USA)において20分間脱水した。無水ゲルピースを、12.5 ng/μL-1のトリプシンを含有する100 mM AmBiCの溶液を用いて再度水和させた。ゲルバンドを、4℃にて45分間インキュベートした。過剰の上清を除去し、100 mM AmBiCと交換した。サンプルを室温にて一夜消化した。逐次脱水(50%(v/v) MeCN、1%(v/v) ギ酸)および再水和(50 mM AmBiC)を介して、ゲルバンドからペプチドを抽出した。各病期から採取した溶液をプールし、真空遠心分離機(EZ-2 plus、GeneVac、New York、USA)にて1-2 μLに濃縮した。サンプルを、0.1 M 酢酸で戻して、最終体積20 μLにした。続いて、各ゲルバンドを、Eksigent NanoUltra cHiPLC system(AB Sciex、Mulgrave、Australia)を備えたAB Sciex 5600 Triple TOF(AB Sciex、Mulgrave、Australia)で分析した。ペプチドを、33分間にわたる0〜30 % MeCNの直線勾配(300 nL/分)で分離した。トップ20の前駆体イオンを標的とするIDAモードで装置を駆動させた。MASCOTサーチエンジンを用いるMSPF MSILEを用いて、データを調査した。簡単に述べると、サーチパラメーターを次のようにセットした：酵素＝トリプシン、固定修飾＝カルバミドメチル(Cys)、可変修飾＝酸化(Met)、ペプチド質量耐性 50 ppm、フラグメント質量耐性 0.3 Da、許容切断ミス 2、装置タイプ＝ESI-Q-TOF、ヒト配列に限定されたスイスプロットデータベースを選択した。すべてのサーチ結果を手作業で検証した。
【０３０３】
ELISAによるBTN2A1抗原検証
ELISAのために、Nunc Maxisorpイムノプレートを、1 μg/mLのPBS中の適当な抗原100 μL/ウェルで、4℃にて一夜コーティングした。PBSのみでコーティングしたネガティブコントロールウェルもまた、インキュベートした。次いで、ウェルを、200 μLの5%スキムミルク/PBSで、37℃にて2時間ブロックし、PBSTで3回洗浄した。適当な抗体を加えて、2 %スキムミルク粉末を含有するTBS-T中の最終濃度10 μg/mLにし、プレートを室温にて60分間インキュベートした。ウェルを、TBS-Tで5回洗浄し、HRP複合抗ヒトIgG抗体とともにインキュベートした。室温にて60分間のインキュベーション後、前述のとおりウェルを洗浄し、100 μL/ウェルのTMB/E基質を用いて、結合した抗体を検出した。ウェルを、室温にて10分間インキュベートした後、0.5体積の2 M H3PO4を添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーでの450 nmにおける吸光度によって、得られるシグナルを測定した。
【０３０４】
細胞培養
組織を機械的に分離し、コラゲナーゼIVを含む培地中で37℃にて一夜消化することによって、新鮮な患者の腫瘍からメラノーマ細胞株を確立した。使用したすべてのガン細胞株、10% FCSを補足したRPMI1640(LifeTechnologies、Carlsbad、CA 92010、USA)中で増殖させた。線維芽細胞およびメラニン細胞を購入し、それぞれの特殊な増殖培地(すべてLonza、Lonza Inc.、NJ 07401、USA)中で増殖させた。
【０３０５】
免疫蛍光
ウェル当り40,000細胞にて12ウェルプレートで、LM-Mel-62を平板培養した。翌日、細胞を洗浄し、4%PFAで10分間固体し、PBS500ml中の20μg/mlのBTN2A1抗体を用いて、4℃にて10時間染色した。翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、二次坑マウスPE抗体を1:100希釈で室温にて1時間加え、次いで、PBSで2回洗浄した。使用説明書にしたがって、最終濃度300nMにてDAPI(LifeTechnologies)を加えた。オリンパス顕微鏡および適当な20xフィルターで、写真を撮った。
【０３０６】
フローサイトメトリー
細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄した。細胞を暗室中、BTN2A1抗体の10μg/mlPBS溶液で、4℃にて30分間染色した。細胞をPBSで2回洗浄し、暗室中で、PBSで1:100希釈した抗マウスIgG-PE標識二次抗体(Jackson-Immuno Research Laboratories、PA、USA 19390)とともに4℃にて20分間インキュベートした。PBSを用いる2回の洗浄ステップに続いて、製造者のプロトコルにしたがって、LIVE/DEAD固定可能死細胞染色(LifeTechnologies)で細胞を染色した。細胞ストレーナーを通して細胞をろ過し、適当なレーザー設定でFacsCantoII(Becton、Dickinson and Company)を駆動させた。ゲートを生細胞のみに設定し、結合をアイソタイプと比較した。すべてのデータ分析を、FlowJo(TreeStar、Ashland、OR 97520 USA)を用いて行い、必要に応じて、統計分析をPRISM(GraphPad Software、Inc、La Jolla、CA 92037 USA)ソフトウェアを用いて行なった。
【０３０７】
メラノーマ細胞株およびメラノーマ組織における免疫組織化学
メラノーマ細胞株を80%集密まで増殖させることによって、細胞ブロックを製造し、細胞ペレットを採取した。150μlの正常ヒト血清を加え、木製アプリケータースティックで細胞ペレットをチューブの底から剥がした。トロンビン(Warner Lambert Company、New Jersey 07950、USA)150μlを加え、混合した。形成クロットをTally Hoペーパーに移し、標準的パラフィン包埋のために10%ホルマリン中、組織カセットに置いた。ヒト組織標本を患者から採取し、標準的パラフィン包埋のために10%中性緩衝ホルマリン中で固定した。
【０３０８】
細胞/組織ブロックをミクロトームで厚さ4μMに切断した。切片を帯電したスライドガラスに置き、37℃にて一夜乾燥させた。切片/スライドを100%キシレン中で脱ロウし、100%エタノール、次いで、70%エタノールで5分間、次いで、1×5分間水道水中で再水和させた。次いで、スライドをPBST(3×5分間)で洗浄した後、3%過酸化水素(dH2O中で希釈)中で室温にて15分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。次いで、スライドをPBST(3×5分間)で洗浄した後、HIGH上マイクロウェーブ圧力調理器中で20分間、クエン酸緩衝液[pH 6](Thermo Scientific)中に抗原を回収し、次いでPBSで3回洗浄した後、非特異的染色をSuperBlock(登録商標)(Thermo Fisher Scientific、MA 02454、USA)で室温にて45分間ブロックした。一次抗体をDako抗体希釈液(Dako Denmark A/S、DK-2600、デンマーク)で希釈して、 3μg/mLにした。切片を、一次抗体(マウス抗BTN2A1モノクローナル抗体：CSL 34C1-G4FabK-mG2aFc-aMICまたはIgG2aアイソタイプコントロール：CSL BM4-95F-1B7)とともに、4℃にて一夜インキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、抗マウスEnVision+ System HRP二次抗体とともに、室温にて45分間インキュベートした。二次抗体を希釈せず(Dako)に用い、スライドを再度PBSで洗浄した後、DABクロモゲン(Dako)で〜90分間染色を進行させた。ヘマトキシリンおよびスコット水でスライドを対比染色した後、70%エタノール(10分間)；次いで100%エタノール中で5分間脱水した。次いで、スライドを100%キシレン中でインキュベートした後、カバースリップを載せた。
【０３０９】
BTN2A1発現のためのqPCR
Primer3を用いてBTN2A1プライマーを設計した。製造者のプロトコルにしたがって、RNEasyキット(Qiagen)を用いて、細胞株または腫瘍からRNAを抽出し、製造者のプロトコルにしたがって、高性能逆転写キット(LifeTechnologies)を用いて逆転写した。VII7 qPCRマシン(LifeTechnologies)およびSensiFastマスターミックス(Bioline、London NW2 6EW、UK)を用いて、qPCRを行なった。10,000ベータアクチン(ハウスキーピング遺伝子)コピー当りのコピー数を計算した。
【０３１０】
メラノーマサンプルのナノストリング分析
Rocheのハイ・ピュアFFPE RNAマイクロ・キットを用いるRNA抽出のために12個の転移性メラノーマサンプル(パラフィン包埋)からのコアを用いた。簡単に述べると、100%キシレンでパラフィンを除去し、細胞ペレットを70%エタノールで洗浄し、55℃にて乾燥した。ペレットを組織溶解緩衝液およびプロテイナーゼKとともに55℃にて4時間インキュベートし、次いで供給されたフィルターチューブを用いてRNA抽出を行なった。NanoDropを用いてRNAの濃度を定量し、Bioanalyserを用いて質を制御した。
【０３１１】
製造者の勧告書(NanoString Technologies、Inc. Seattle、WA 98109、USA)にしたがう次のナノストリングアッセイのために、250μgのRNAを用いた。オーストラリア、メルボルン、ピーター・マッカラム・キャンサー・センターのnCounter Analysis Systemにおいて、分析を行なった。データは、絶対カウントで表す。
【０３１２】
BTN2A1のsiRNA媒介性ノックダウン
2つのBTN2A1標的siRNAまたはネガティブコントロールsiRNA(LifeTechnologies)を、製造者のプロトコルにしたがって、RNAiMaxx(LifeTechnologies)を用いて、10nMの濃度でメラノーマ細胞にトランスフェクトした。24時間後、培地を完全成長培地に変更し、トランスフェクションの48時間後に、qPCRおよび／またはフローサイトメトリーによってノックダウン効率を決定した。
【０３１３】
増殖アッセイ
Ficoll-Hypaqueでの密度勾配遠心分離によって、健康なドナー軟膜(Red Cross、Melbourne)から、PBMCを精製した。細胞を、PBS/0.1% BSA中、106/mlにて再懸濁させ、CFSE(Invitrogen)を加えて、最終濃度1μMにした。細胞を、37℃、5% CO2にて10分間インキュベートし、次いで、5倍容の氷冷TCRPMI培地(RPMI、10% ヒト血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン酸塩、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムを含む)を加え、細胞を氷上で5分間インキュベートした。細胞を、TCRPMIで2回洗浄した。NUNC MaxiSorb96ウェルプレート(eBioscience、Inc. San Diego、CA 92121、USA)のウェルを、PBS中の10μg/mlまたは1μg/ml組換えBTN2A1タンパク質(Origene、Rockville、MD 20850、USA)、またはコントロールとしてBSAで、4℃にて一夜コーティングした。プレートを、PBSで1回濯いだ。2x105個のPBMCを各ウェルに置いた。各条件(すなわち、BTN2A1またはBSAコーティングされたウェル)に、拮抗的抗CD3抗体 OKT3(ebioscience)(最終濃度10μg/ml)または抗CD3/CD28 ダイナビーズ(LifeTechnologies)のいずれかを、1:1の細胞対ビーズ比にて加えた。等体積の培地をコントロールウェルに加えた。細胞を、37℃にて72時間インキュベートした。細胞を、CD3、CD4およびCD8について蛍光抗体で染色し、サンプルをFACS Cantoにて処理した。FlowJoソフトウェアを用いて、CFSEの希釈に基づいて、CD4+またはCD8+細胞増殖のパーセンテージの決定などの分析を行なった。
【０３１４】
制御性T細胞の誘導
Ficoll-Hypaqueでの密度勾配遠心分離によって、健康なドナー軟膜(Red Cross、Melbourne)から、PBMCを精製した。細胞の一部を、PBS/0.5%BSA/2mM EDTA中、80μl/107細胞にて再懸濁させた。磁性抗CD4ビーズ(Miltenyi biotech)を、20μl/107細胞にて加えた。細胞を、4℃にて15分間インキュベートし、次いで、洗浄した。CD4+細胞を、AutoMACS(Miltenyi biotech)およびプログラム「Possel」を用いる分離によって単離した。96ウェルプレートのウェルを、PBS中の10μg/mlまたは1μg/ml組換えBTN2A1タンパク質、またはコントロールとしてBSAで、4℃にて一夜コーティングした。プレートを、PBSで1回濯いだ。PBMCまたはソートされたCD4+細胞のいずれかを、2x105/ウェルにて置き、37℃、5% CO2にて72時間インキュベートした。細胞を、CD3、CD4およびCD8について蛍光抗体で表面染色し、次いで、FoxP3についてFoxP3細胞内染色キット(ebioscience)を用いて細胞内染色した。サンプルをFACS Cantoにて処理し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。各条件について、CD4+CD25+FoxP3+ 制御性T細胞のパーセンテージを評価した。
【０３１５】
遺伝子発現分析
オーストラリアゲノムリサーチ機関(Australia Genome Research Facility) (AGRF、オーストラリア)にて、イルミナHT-12 v3アレイ上でRNAを分析した。生のデータを、limma packageを用いて統計学的計算のためのR環境(http://www.rproject.org/)に読み込み、normexp functionを用いてバックグラウンドを補正し、log2変形し、分位点正規化した。
【０３１６】
T細胞活性化アッセイ
HLAマッチし、NY-ESO-1の発現に対して陽性であるメラノーマ細胞株またはメランAを、我々の細胞株データベースから選択した。細胞を12ウェルプレートに置き、上述の、スクランブルするか、または2つの異なるBTN2A1特異的siRNAのいずれかでトランスフェクトし、37℃、5% CO2にて48時間インキュベートした。RT-PCRによって、この時点での特異的BTN2A1ノックダウンを確認した。メラノーマ細胞を、105細胞/ウェルにて96ウェルプレートに置いた。NY-ESO-1 HLA-Cw*0304/*0303制限エピトープ96-104および124-133、またはメランA HLA-A*0201エピトープ25-36のいずれかを認識するT細胞クローンを、TCRPMIおよびブレフェルジンA中、2.5x104/ウェルにて加えた。細胞を、37℃、5% CO2にて4時間インキュベートした。細胞を、CD3およびCD8について蛍光抗体で表面染色し、次いで、IFNγおよびTNFαについてBD biosciencesからの固定および透過化試薬を用いて細胞内染色した。サンプルをFACS Cantoにて処理し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。各条件について、CD8+ IFNγ+またはCD8+ TNFα+活性化T細胞のパーセンテージを決定した。
【０３１７】
細胞傷害性アッセイ
HLAマッチし、NY-ESO-1の発現に対して陽性であるメラノーマ細胞株またはメランAを、我々の細胞株データベースから選択した。細胞を1、上述の、スクランブルするか、または2つの異なるBTN2A1特異的siRNAのいずれかでトランスフェクトし、37℃、5% CO2にて48時間インキュベートした。RT-PCRによっ2.5x104105細胞/ウェルにて96ウェルプレートに置いた。NY-ESO-1 HLA-Cw*0304/*0303制限エピトープ96-104および124-133、またはメランA HLA-A*0201エピトープ25-36のいずれかを認識するT細胞クローンを、12.5x104/ウェル(エフェクター：標的比、5：1)にて2回加えた。細胞を、37℃、5% CO2にて16-20時間インキュベートした。メラノーマ細胞に対するT細胞の細胞傷害性を、MTSアッセイ(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega、WI 53711-5399、USA)を用いて決定した。
【０３１８】
Hu34C1によるADCCアッセイ
BTN2A1陽性標的細胞(LM-Mel-62または293FSのいずれか)(約1×104細胞)を、10:1のエフェクター：標的細胞(E:T)に比率にて、抗BTN2A1抗体(34C1)およびNK細胞とともに、RPMI/5% FCS中、37℃にて18時間インキュベートした。CytoTox-One試薬(Promega)を用いて、乳酸脱水素酵素(LDH)放出を測定した。最大(界面活性剤)およびバックグラウンド(エフェクターおよび標的細胞単独)溶解に対してデータを正規化することによって、特異的溶解を決定した。
【０３１９】
健康なドナーからのPBMCを、RPMI/10% FCS中、抗BTN2A1抗体(34C1)の存在および不在下で、37℃にて4時間、BTN2A1陽性標的細胞(LM-Mel-62)(Behren et al.、Pigment Cell and Melanoma Research、DOI：10.1111/pcmr.12097、2013)とともにインキュベートした。前述のフローサイトメトリー(Penack et al. Leukemia. 19：835-840、2005)によって、CD107a+であるNK細胞(CD3-、CD56+)の比率を審査することによって、NK細胞活性化を決定した。4つの実験からの平均および標準偏差を示す。
【実施例２】
【０３２０】
結果
モノクローナル抗体Hu34C1によって認識された抗原としてのBTN2A1の同定
モノクローナル抗体Hu34C1によって認識されたメラノーマ抗原を同定するために、上述の方法セクションで記載した、共有結合した抗体ビーズおよびメラノーマ細胞株LM-Mel-62からの総細胞抽出物を用いて大規模免疫沈降を行なった。突出したタンパク質バンドは、溶出したタンパク質免疫沈降物では検出されたが、異なるメラノーマ特異的抗体によるコントロール免疫沈降物では明らかではなかった。質量分析同定のために、タンパク質バンドを切り出した。さらに、いくつかの直接溶出液も分析した。
【０３２１】
MS/MS分析は、同定されたペプチドにおいて、広い範囲もつ、BTN2A1である主要バンドを示した。モノクローナル抗体Hu34C1のための抗原としてのBTN2A1の同定を、市販のヒトsBTN2A1によって行なわれたELISAによってさらに確実なものにした。
【０３２２】
異なるメラノーマ細胞株におけるBTN2A1発現
次いで、BTN2A1およびブチロフィリン・スーパーファミリーの他のファミリーメンバーの発現を、初期継代のメラノーマ細胞株において評価した。細胞において、BTN2A1の発現を検出した。イルミナHT12 v3遺伝子発現アレイによって検出されたように、BTN3A2以外、他のファミリーメンバーは高度には発現されなかった。
【０３２３】
LM-Mel-62細胞上でBTN2A1抗体を試験し、それが高度に特異的な様式で生きているメラノーマ細胞の表面に結合することを明らかにした。これは、試験したすべてのメラノーマ細胞株に対して当てはまった。
【０３２４】
メラノーマサンプルのナノストリング分析もまた、BTN2A1の高い発現を示した。このレベルは、現在のメラノーマ療法の標的であるPD1L1およびPD1L2よりも一貫して高かった(図1)；そして、試験したすべてのメラノーマサンプルは、BTN2A1転写物について陽性であった。
【０３２５】
他のガン細胞株および正常細胞におけるBTN2A1発現
さらなるガン細胞株もまた、BTN2A1の発現について試験した。第2表および図2から明らかなように、これらの細胞株はすべて、強い抗体結合を示した。図2Eもまた、BTN2A1が単球によって有意な程度には発現されないことを示す。図2FおよびGもまた、BTN2A1が、正常組織においては高度には発現されないが、複数のメラノーマ細胞においては高レベルで発現されることを実証するBioGPSからのデータを示す。同じアレイおよびプローブセットからのデータに基づいて、正常細胞についての平均値は、25.3であり、メラノーマサンプルについては990.9である。
第2表：抗BTN2A1抗体による染色を示すガン細胞株
【表２】
2016540046.tif 000003
【０３２６】
正常組織におけるBTN2A1発現
メラニン細胞および線維芽細胞などの正常ヒト組織細胞株において、タンパク質レベルにおけるBTN2A1の発現を評価した。これらの組織内に結合が存在しないか、または弱い結合のみが存在することを検出することができ、このことは、BTN2A1が、毒性ペイロードをデリバリーするための良好な免疫複合体標的でありうることを意味する。
【０３２７】
ヒトメラノーマ組織におけるBTN2A1発現
BTN2A1発現が、培養においてメラノーマ細胞に特有ではないことを確認するために、qPCRを用いて、原発性メラノーマ組織内でのBTN2A1 mRNAの発現を評価した。24個の転移性腫瘍サンプルからRNAを抽出し、すべてのサンプルにわたって高レベルのBTN2A1発現を検出した。また、パラフィン包埋メラノーマサンプルにおいて免疫組織化学を用い、一次転移性メラノーマ細胞の単細胞懸濁液においてフローサイトメトリーを用いて、BTN2A1表面発現を検出した。培養したメラノーマ細胞におけるBTN2A1抗体(Hu34C1)を用いる免疫蛍光は、細胞表面膜染色を確認した。
【０３２８】
T細胞における組換えBTN2A1タンパク質の効果
次いで、BTN2A1自体の機能を評価して、その発現/活性による干渉が、免疫学的細胞サブセットに影響を及ぼしうるかどうかを決定した。ヒト組換えBTN2A1でコーティングされた96ウェルプレートを用いて、一般的活性化シグナル(CD3およびCD28コーティングされたビーズ)の存在下、タンパク質自体が、制御性T細胞発達および／またはCD4+/CD8+T細胞増殖阻害または刺激効果を有するかどうかを試験した。図3に示されるように、BTN2A1組換えタンパク質の存在は、刺激された条件において、CD4+およびCD8+T細胞の増殖の低下をもたらした。比較すると、CD4/CD25/FoxP3+細胞(制御性T細胞表現型)のパーセンテージが増加したことが示された。
【０３２９】
T細胞機能におけるBTN2A1遮断効果
BTN2A1レベルを干渉する効果を審査するために、siRNAを用いて、既知の抗原発現プロフィールおよびHLA型をもついくつかのメラノーマ細胞株を用い、BTN2A1をノックダウンした。ノックダウンの48時間後、NY-ESO-1またはメランAエピトープのいずれかに特異的なHLAマッチT細胞クローンを、18-20時間、メラノーマ細胞に加えた。腫瘍細胞上のその標的抗原を認識したT細胞は活性化され、IFNγおよびTNFα産生の発現を特徴とした。機能的に、この活性化は、CD8+T細胞による腫瘍細胞の細胞傷害性殺傷をもたらす(図4)。BTN2A1の不完全なノックダウンにもかかわらず(図4A)、メラノーマ細胞は、T細胞によって、1:1のエフェクター(E)(T細胞)：標的(メラノーマ)(T)細胞の比率で、より効率的に殺傷され(図4B)、これは、また、IFNγおよびTNFαに対する細胞内サイトカイン染色(ICS)によって測定されるように、BTN2A1ノックダウン後の活性化T細胞のより高いパーセンテージによって反映された(図4Cおよび4D)。
【０３３０】
BTN2A1に対する抗体はADCCを誘導する
図5に示すように、抗BTN2A1抗体34C1は、BTN2A1を発現しているメラノーマ細胞および293細胞においてNK細胞媒介性ADCCを誘導した。この効果は、用量依存性であることが明らかにされ、抗体によって媒介されることを示す。単一の異なるドナーからのNK細胞を用いて行なわれた実験において、類似の結果が得られ(示さず)。
【０３３１】
図6もまた、抗BTN2A1抗体34C1が、NK細胞を活性化することを明らかにする。特に、これらのデータは、BTN2A1を発現しているメラノーマ細胞の存在下、34C1が、PBMCサンプル中の活性化されたNK細胞の比率を増加させることを明らかにする。
【０３３２】
前述のデータは、BTN2A1が、たとえば、メラノーマを治療するための細胞死を誘導する化合物(たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント)にとっての標的であることを実証する。
【図１】
2016540046.tif 000004
【図２Ａ】
2016540046.tif 000005
【図２Ｂ】
2016540046.tif 000006
【図２Ｃ】
2016540046.tif 000007
【図２Ｄ】
2016540046.tif 000008
【図２Ｅ】
2016540046.tif 000009
【図２Ｆ】
2016540046.tif 000010
【図２Ｇ】
2016540046.tif 000011
【図３】
2016540046.tif 000012
【図４】
2016540046.tif 000013
【図５】
2016540046.tif 000014
【図６】
2016540046.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月2日(2016.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016540046000001.app
【国際調査報告】
2016540046.tif 000016
2016540046.tif 000017
2016540046.tif 000018
2016540046.tif 000019