(57)【要約】  本発明には、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体及びその調製方法と応用が記載されている。当該ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体には、下記通りの特徴がある。その粉末Ｘ線回折パターンにおいて、6.222±0.2°、7.379±0.2°、7.941±0.2°、23.631±0.2°、24.044±0.2°、25.497±0.2°、27.541±0.2°、30.736±0.2°、32.306±0.2°に特徴的吸収ピークを有する。示差走査熱量分析の結果として、吸熱最大値が９０℃〜９６℃にある。赤外線吸収パターンについては、3396.03、1652.70、1604.48、1500.35、1355.71、1243.86、1147.44、808.03、761.74 と 570.83cm-1にピークがある。当該ピロロキノリンキノンリチウム塩の多結晶体は、認知障害を治療する薬品の調製に応用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、6.222±0.2°、7.379±0.2°、7.941±0.2°、23.631±0.2°についての回析角（２θ値）に特徴的ピークを有し；示差走査熱量分析の結果として、吸熱最大値が90℃〜96℃にあり；赤外線吸収パターンについて、3396.03、1652.70、1604.48 と 1355.71 cm-1にピークがあることを特徴とする、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、24.044±0.2°、25.497±0.2°、27.541±0.2°、30.736±0.2°、32.306±0.2°にも特徴的吸収ピークを有し；赤外線吸収パターンについて、1500.35、1243.86、1147.44、808.03、761.74と570.83cm-1にもピークがあることを特徴とする、請求項1に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体。
【請求項３】
吸湿性分析により、九水和物として安定的に存在できて、相対湿度20〜50%の場合に一水和物になり、相対湿度70〜100%の場合に二水和物になることを特徴とする、請求項1に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体。
【請求項４】
示差走査熱量分析において、93.33℃の吸熱最大値であることを特徴とする、請求項1に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体。
【請求項５】
以下の方法を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の調製方法；
ピロロキノリンキノンを水酸化リチウムと混合させ（重量比4：1）、次いで０〜５℃で２時間攪拌しながら有機溶剤を添加し、次いでアセトニトリルをこの混合液に加え、（ピロロキノリンキノンに対するアセトニトリルの比は８ｍＬ：４ｇ）、続けて１時間攪拌し、沈殿したピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａをろ過により集める。得られたピロロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａを水に溶解し、次いでテトラヒドロフラン又はイソプロピルアルコールを完全に混合されるまで添加し（ピロロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａ、水及びテトラヒドロフラン又はイソプロピルアルコールの比は10〜1000mg：0.5〜20mL：4〜80mL）、室温で１晩置くことにより、ピロロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体を得る。
【請求項６】
有機溶剤が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アミルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ニトロメタン、アセトニトリル、クロロフォルム、ジクロロメタン、メチルtert-ブチルエーテル、及びそれらの２種以上の組合せから選択される、請求項５に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の調製方法。
【請求項７】
請求項１〜4のいずれか一項に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体及び薬学的に許容される賦形剤の少なくとも１種を含む医薬組成物。
【請求項８】
賦形剤が、充填剤、崩壊剤、結合剤、滑剤及びそれらの２種以上組合せから選択される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
充填剤がデンプン、乳糖、結晶セルロース、デキストリン、マンニトール、酸化酵素、硫酸カルシウム及びこれらの２種以上の組合せから選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
崩壊剤が、カルメロース及びその塩、クロスカルメロース及びその塩、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、並びに、これらの２種以上の組合せから選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
結合剤がポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デンプンスラリー及びこれらの２種以上の組合せから選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
滑剤がステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びこれらの２種の組合せから選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
認知障害を治療する薬物の調製にとりわけ有用である請求項１〜４のいずれか一項に記載のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体及び調製方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノンリチウム塩、
英語名：Trilithium derivatives of pyrroloquinoline-quinone、化学式C14H3N2O8Li3、分子量348で、化学式は下記通りである：
【０００３】
【化１】
2016522224.tif 000002
【０００４】
化学構成が同じではあるが、異なる物理的、化学的条件下で、２種類又は多種類の異なる構造の結晶体に生成する現象は、多結晶体又は同質異像と呼ばれている。薬物の多結晶性は薬品の研究開発上よく見られる現象で、薬品の品質に影響を与える重要な原因である。異なる多結晶体は外観、融点、硬度、溶解速度、化学的安定性、機械的安定性などで、異なる物理的特性を持つことができる。これらの物理的性質の相違は薬物の安定性、生物学的利用能及び薬物の有効性に影響を与える可能性がある。そのため、薬品の研究開発上、全面的に薬品の多結晶体を考慮すべきであり、結晶体の研究及び制御が薬物研究開発における重要な研究内容となった。
【０００５】
日本の科学者は２００３年に水溶性Ｂ群ビタミンＰＱＱを発見した。ＰＱＱ欠乏食を与えたマウスが、「成長が阻害され、皮膚がもろくて弱い、骨粗鬆症などの骨格異常、免疫応答が低下、繁殖力が減退、関節炎症になり易い」という種々の異常を呈したことで、ピロロキノリンキノンは体内の必要な栄養素であると分かった。その科学者の推測では、それはヒトに対して同じ影響もあるということである。現時点には、ＰＱＱの分子量が３３０であり、当初は微生物の中から発見され、高等な真核生物の体内にもＰＱＱが存在しており、その結晶体の構造と化学構成も明確になったと開示された。
【０００６】
ＰＱＱは多種の重要な酵素類の補助因子であり、呼吸鎖の機能と体内の遊離基のレベルに影響がある。研究ではＰＱＱ不足のマウスは、成長が阻害され、繁殖力が減退、関節の炎症になり易くなると発見されたので、ＰＱＱが体内に必要なビタミンと栄養素であると思われている。研究によれば、ＰＱＱは神経系統に関わる機能が下記通りの５種類があるということである。（1）酸化抵抗して、酸素の遊離基を勢いよく解消する。（2）呼吸鎖の機能に影響して、ミトコンドリアのエネルギー代謝を維持する。（3）信号の通路をアクティブにし、神経の増殖因子の分泌を刺激して、神経の修復又は神経の成長を促進する。（4）体細胞の生長を促進して、肝臓の損傷を有効に予防及び治療する。（5）α−シヌクレイン蛋白の沈殿を遅らせ、神経細胞の繊維化を予防及び治療する。それゆえ、ＰＱＱはパーキンソン病や老年痴呆など多種神経変異性病気に対して、潜在的な治療効果があると示唆されている。ピロロキノリンキノンリチウム塩はグリコーゲン合成酵素リン酸酵素3（Glycogen synthase kinase-3,GSK-3）の活性が抑制できる抑制剤として発見されたものである。研究によれば多種の神経・精神疾患に対して、潜在的な治療効果があると言われている。そこで研究者はＰＱＱリチウム塩の潜在的な幅広い応用価値に対して関心を持って、ＰＱＱリチウム塩の多重作用の仕組み及び神経・精神疾患を治療する可能性を探っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体及び調製方法と応用に対して、技術上解決することを目指している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、粉末Ｘ線回折パターンにおいて、6.222±0.2°、7.379±0.2°、7.941±0.2°、23.631±0.2°についての回析角（２θ値）に特徴的ピークを有し；示差走査熱量分析の結果として、吸熱最大値が90℃〜96℃にあり；赤外線吸収パターンについて、3396.03、1652.70、1604.48 と 1355.71 cm-1にピークがあることを特徴とする、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体、である。
さらに、その粉末Ｘ線回折パターンにおいて24.044±0.2°、25.497±0.2°、27.541±0.2°、30.736±0.2°、32.306±0.2°にも特徴的吸収ピークを有するもの、赤外線吸収パターンについて、1500.35、1243.86、1147.44、808.03、761.74 と 570.83cm-1にもピークがあるものもある。
【０００９】
さらに、吸湿性分析により、当該化合物は九水和物として安定的に存在できて、相対湿度20〜50%の場合に一水和物になり、相対湿度70〜100%の場合に二水和物になることが分かった。
そして、該化合物は示差走査熱量分析において、93.33℃の吸熱最大値を示す。
本発明は、上記のピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の調製方法を提供した。その特徴としては、具体的な手順は下記通りである：ピロロキノリンキノンと水酸化リチウムとを4：1の重量比にて混合させ、その液を有機溶剤に入れて、均一に混合させる。0〜5℃にて溶解させ、保温しながら二時間攪拌し続ける。この液にアセトニトリルを加える。その際のアセトニトリルとピロロキノリンキノンとの割合は8mL：4gである。一時間攪拌した後に濾過して、ピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Aを得る。このピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａを水に溶解させ、テトラヒドロフラン或いはイソプロピルアルコールと混合させる（ピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａと水とテトラヒドロフラン或いはイソプロピルアルコールとを10〜1000mg：0.5〜20mL：4〜80mLの割合で混合する）。一晩常温で放置して、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体を得る。
上記有機溶剤は、原料をある程度に溶解し、且つ変質させたりすることが無ければ、ケトン類、エーテル類、アルカン類、芳香族類、エステル類、ニトリル類、アルコール類又はハロゲン化アルキルなどの有機溶剤の何れか又はその混合物でも良いという、あらゆる有機溶剤が含まれる。
最適な方法としては、前述の有機溶剤として、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アミルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ニトロメタン、アセトニトリル、クロロフォルム、２塩化メチルとメチルtert-ブチルエーテルの中の任意の1種又は2種以上の混合物を使用する。ピロロキノリンキノンと有機溶剤の比例は２０ｍｇ：１ｍＬとする。
【００１０】
本発明は医薬組成物の一種をも提供した。その特徴としては、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体及び薬学的に許容される賦形剤が含まれるということである。
最適化方法としては、前述の賦形剤は、充填剤、崩壊剤、結合剤及び滑剤の１種又は2種以上を組合せて添加することである。
更なる最適化としては、前述の充填剤としてデンプン、乳糖、結晶セルロース、デキストリン、マンニトール、酸化酵素と硫酸カルシウムの中の任意の１種又は２種以上を組合せて添加することである。
更なる最適化としては、前述の崩壊剤として、カルメロース及び塩、クロスカルメロース及び塩、クロスポビドン、ルスターチナトリウム及び低置換度ヒドロキシプロピルセルロースの中の任意の1種又は2種以上を組合せて添加することである。
更なる最適化としては、前述の接合剤として、ポリピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びデンプンの中の任意の１種又は２種以上を組合せて添加することである。
更なる最適化としては、前述の滑剤として、ステアリン酸Mg、ステアリン酸Caの中の任意の1種又は2種を組合せて添加することである。
本発明は認知障害を治療する薬物の調製における上記ピロロキノリンキノンのリチウム塩の結晶体の応用をも提供した。
【００１１】
本発明に記載された結晶体はＢ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩である。当該ピロロキノリンキノンリチウム塩の粉末Ｘ線回折パターンは図１と基本的に同じであり、DSCパターン、DVSパターン、赤外線吸収パターンは図２、３、４と基本的に同じである。
既存技術と比べて、本発明は下記通りの効果がある。
本発明は、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の調製方法及び応用を開示した。当該ピロロキノリンキノンリチウム塩の多結晶体は、認知障害を治療する薬物の調製に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。
【図２】ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体のＤＳＣパターンを示す図である。
【図３】ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体のDVSパターンを示す図である。
【図４】ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の赤外線吸収パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明を明らかに且つ分かり易くするために、最適化された実施例を以って、図を添付して下記通りに説明する。
【００１４】
実験条件：
粉末Ｘ線回折パターン：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ２  ｐｈａｓｅｒ  Ｘ線回折測定装置を使って、Cu-Ka（40KV、40mA）を用い、2θ回折角を3°〜40°にスキャンし、刻み幅0.2sに測定する。
特筆すべきことは、粉末サンプルのX線回折パターンの中に、特定の結晶体による回折パターンは殆ど特徴のある物である。その中にはバンド（特に低角度の場合）の相対強度は、結晶条件、粒径、混合物の相対含有量とその他の条件などによる支配志向性の効果に従って変化する。回折ピークの相対強度が、それと対応した結晶体にとって特徴のある物ではないため、既存の結晶形態と同じなのかを判断する時に、それらの相対強度でなく、ピークのポジションで判断すべきである。また、結晶形態の同一性を判断する際、全体形態を以って判断すべきである。その理由としては、1本の回折線が1つのフェイズを代表するのでなく、1セットの特定「d-1/11」のデータが1つのフェイズを代表するからである。また、混合物を確認する時に、含有量の低下などの要因により一部の回折線が欠けることがあるが、この時に高純度サンプルから得た安全なバンドに頼る必要がなく、1本のバンドでさえ、与えられた結晶体にとって特徴のあるものになる可能性もある。
【００１５】
DSCパターン：アメリカのPERKINELMER社のDSC8500示差走査熱量分析測定計を用いて測定した。分析は、窒素パージしながら10℃/分の速度で加熱を行った。
IRパターン：アメリカのNicolot社のNicolot-Magna FT-IR750の赤外分光法器を用いて、室温において、4000-350cm-1でスキャンする。
DVSパターン：型番SMS DVS Instrinsicの機器を用い、0-95%RH、温度25℃において、測定する。
【００１６】
実施例１：ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の調製
ピロロキノリンキノン４ｇと水酸化リチウム1gとを混合させ、脱イオン水１６ｍｌに入れて、均一に混合させる。次いで０〜５℃にて溶解させ、保温しながら二時間攪拌し続ける。この液にアセトニトリル８ｍｌを加え、一時間攪拌した後に濾過して、ピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａを得る。このピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａの１０ｍｇを水０．５ｍｌに溶解させ、テトラヒドロフラン４ｍｌと混合させる。一晩常温で放置して、Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体１ｍｇが得られる。得られたサンプルを測定したところ、その粉末Ｘ線回折パターンは図１に示す通りである。
具体的なピークのポジションは下記表の通りである。
【００１７】
【表１】
2016522224.tif 000003
【００１８】
【表２】
2016522224.tif 000004
【００１９】
得たサンプルに対して、その他特性について測定したところ、DSCパターン、DVSパターン、赤外線吸収パターンは図２、３、４の通りである。示差走査熱量分析の結果としては、吸熱最大値が９３．３３℃である。赤外線吸収パターンについては、3396.03、1652.70、1604.48、1500.35、1355.71、1243.86、1147.44、808.03、761.74 と570.83cm-1にピークがある。吸湿性分析により、当該化合物は九水和物として安定的に存在できて、相対湿度20〜50%の場合に一水和物になり、相対湿度70〜100%の場合に二水和物になり、湿度が更に上がれば多水和物になれることが分かった。
【００２０】
実施例２：Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩の調製
実施例１でできたピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａの１０ｍｇと０．５ｍｌの水とを均一に溶解させ、イソプロピルアルコール４ｍｌを入れて、一晩常温で放置して、ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体０．５ｍｇが得られる。粉末Ｘ線回折測定から得た結晶形態のピークポジションは実施例1と同じである。
【００２１】
実施例３：Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩の調製
Ａ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩の原料（上海日馨生物科技有限公司から購入）１０ｍｇに１ｍｌの有機溶剤（メタノールとメチルtert-ブチルエーテルとを1：1の割合で混合した溶剤）を入れ、均一に溶解させ、常温にて一晩放置した後に、Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩０．７ｍｇが得られる。粉末Ｘ線回折測定から得た結晶形態のピークポジションは実施例１と同じである。
【００２２】
実施例４：ピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物ＡとＢ結晶型との吸湿性比較
実施例１のピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物ＡとＢ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩に対して、５〜９５％の相対湿度範囲で、動的水蒸気吸脱着測定装置でピロロキノリンキノンリチウム塩の吸湿性を測定する。ＤＶＳ実験で下記の通りの結果が出た。ピロロキノリンキノンリチウム塩の中間物Ａは、６５％ＲＨの場合に吸水２５．３％；８０％ＲＨの場合に吸水３２．６％であり、極めて高い吸湿性を有し、通常の保管湿度範囲内で湿度変化が５〜２５％程度と激しく、固体状態があまり良くない。一方でＢ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩は、６５％ＲＨの場合に吸水８．４％；８０％ＲＨの場合に吸水１３．９％であり、吸湿性を有し、通常の保管湿度範囲内で湿度変化が５〜１０％程度と大きく、固体状態があまり良くない。
本明細書に記載の「基本的に純粋」という専門用語には、XRPD、Raman分光法或いはIR法での90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、更に好ましくは97%以上、更に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の純度の結晶形態が含まれる。
【００２３】
実施例５：ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の医薬組成物
Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩、ステアリン酸Ｍｇ、結晶セルロースを下記割合で混合する。
【００２４】
Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩      １．４ｍｇ
結晶セルロース                          １１６．２ｍｇ
ステアリン酸Ｍｇ                            ２．４ｍｇ
合計：                                  １２０    ｍｇ
【００２５】
それから、当該製品をプレス機にセットして、７ｍｍの金型でプレスして、１２０ｍｇの錠剤、即ちピロロキノリンキノンリチウム塩の経口薬の錠剤を得る。
【００２６】
実施例６：ピロロキノリンキノンリチウム塩の結晶体の生物学機能を確認する動物テスト
（１）実験材料：
１．野生のマウス（上海SLAC実験動物責任有限公司、体重１６〜１８ｇのオス１０匹）を第１組とする。
２．ＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックマウス（南京大学モデル動物研究所、体重３０〜４０ｇのオス６０匹）６０匹をランダムで１０匹／組×６組（第２〜７組）に分ける。
【００２７】
第１組：野生マウス組
第２組：モデル組
第３組：陽性薬対照  アリセプト組
第４組：ピロロキノリンキノンリチウム塩の高分量組
第５組：ピロロキノリンキノンリチウム塩の中高分量組
第６組：ピロロキノリンキノンリチウム塩の中低分量組
第７組：ピロロキノリンキノンリチウム塩の低分量組
【００２８】
（２）薬液の調製
ピロロキノリンキノンリチウム塩の高分量組：３．６ｍｇのＢ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩をｄｄＨ２Ｏに入れて溶解させ、１２ｍｌのＡ溶液を得て、ピロロキノリンキノンリチウム塩の高分量組に用いる。
ピロロキノリンキノンリチウム塩の中高分量組：６ｍｌのＡ溶液をｄｄＨ２Ｏに入れて、１２ｍｌのＢ溶液を得て、ピロロキノリンキノンリチウム塩の中高分量組に用いる。
ピロロキノリンキノンリチウム塩の中低分量組：6ｍｌのＢ溶液をｄｄＨ２Ｏに入れて、1２ｍｌのＣ溶液を得て、ピロロキノリンキノンのトリリチウム塩の中低分量組に用いる。
ピロロキノリンキノンリチウム塩の低分量組：６ｍｌのＣ溶液をｄｄＨ２Ｏに入れて、１２ｍｌのＤ溶液を得て、ピロロキノリンキノンリチウム塩の低分量組に用いる。
アリセプト組：１錠（５ｍｇ）を押し砕いて、０．５％ＣＭＣで溶解させて、０．１５ｍｇ／ｍｌのアリセプト溶液を得る。
【００２９】
（３）実験装置
モリス水迷路（モリス水迷路実験動画分析システム、JLBehv-MWMG、上海Jiliangソフトウェア科技有限公司）
（４）実験手順
第１組及び第２組には、通常生理食塩溶液が、第３組〜第７組には、上記（２）で調製された薬液が、１ｍｌ／１００ｇ／１日の処方で１ヶ月毎日投与される。５週目から、実験動物に対して、毎回与薬の３０分後にモリス水迷路によるトレーニングを行わせる。該トレーニングを４日間続ける。５日目にプローブテストを実施した。モリス水迷路の集計ソフトでそれぞれのマウスが４つの象限での活動線路及びプラットフォームの中心区域と周辺区域での活動時間と道のりを記録し、集計処理をする。
データは平均値±標準差
【００３０】
【数１】
2016522224.tif 000005
【００３１】
で表示し、データ差異に対して一元配置分散分析法で分析を実施し、組別の差異はＰ＜０．０５で判断すると、下記通りの結果（表１、２、３）が出た。
【００３２】
【表３】
2016522224.tif 000006
【００３３】
【表４】
2016522224.tif 000007
【００３４】
【表５】
2016522224.tif 000008
【００３５】
結論
Ｂ結晶型ピロロキノリンキノンリチウム塩は、モリス水迷路の試験でＡＰＰ/ＰＳ１ダブルトランスジェニックマウスに対する用量-反応関係が明確であり、APP/PS1ダブルトランスジェニックマウスの空間記憶力を好適に改善し、認知障害を修復する能力を持っている。 
【図１】
2016522224.tif 000009
【図２】
2016522224.tif 000010
【図３】
2016522224.tif 000011
【図４】
2016522224.tif 000012
【国際調査報告】
2016522224.tif 000013
2016522224.tif 000014
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