(57)【要約】本出願は、とりわけ、腫瘍細胞、腫瘍内皮細胞、および腫瘍始原がん細胞で発現する細胞表面ＧＲＰ７８を標的とする抗体またはその抗原結合性断片を提供する。これらの抗ＧＲＰ７８抗体またはその抗原結合性断片は、ＧＲＰ７８に対する親和性が高く、所与の種、例えばヒトにおけるそれらの改変されていない親抗体と比較して免疫原性が低く、また、ＧＲＰ７８を阻害するように機能する。重要なことに、これらの単離された新規の抗体およびその抗原結合性断片は、腫瘍細胞においてＰＩ３Ｋシグナル伝達を減弱し、アポトーシスを促進し、その一方で、残っている正常な細胞には影響を及ぼさない。当該抗体および抗原結合性断片は、ＵＰＲ標的化がん治療的処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞表面グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）（配列番号１）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号３１に示されているエピトープに結合する抗体または抗原結合性断片。
【請求項２】
それぞれ配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載されているアミノ酸配列、を有するＣＤＲ領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３またはそれらの２つまたは３つの組合せを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８に記載されているアミノ酸配列、を有するＣＤＲ領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３またはそれらの２つまたは３つの組合せを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
それぞれ配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１に記載されている配列からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７および配列番号２９に記載されている配列からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
配列番号２１に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号１５に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２７に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号１３に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
配列番号１７に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２５に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
配列番号１９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２５に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
配列番号１９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号２９に記載されている軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
配列番号３１に示されているエピトープとの結合について、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
配列番号３２に示されているエピトープとの結合について、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
前記重鎖可変領域が、ａ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸１〜３０からなる群より選択されるＦＲ１；ｂ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸３６〜４９からなる群より選択されるＦＲ２；ｃ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸６７〜９８からなる群より選択されるＦＲ３；ならびにｄ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸１０９〜１１９からなる群より選択されるＦＲ４を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
前記軽鎖可変領域が、ａ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸１〜２３からなる群より選択されるＦＲ１；ｂ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸３５〜４９からなる群より選択されるＦＲ２；ｃ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸５５〜８６からなる群より選択されるＦＲ３；ならびにｄ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸９６〜１０５からなる群より選択されるＦＲ４を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１８】
配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体よりもヒト被験体における免疫原性が低い、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
前記細胞表面ＧＲＰ７８に、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体と同様またはそれを超える結合親和性で結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、組換え抗体、ダイアボディ、キメラ化もしくはキメラ抗体もしくはその抗原結合性断片、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性断片、完全ヒト抗体もしくはその抗原結合性断片、ＣＤＲ移植抗体もしくはその抗原結合性断片、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２、または合成もしくは半合成抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
前記細胞表面ＧＲＰ７８に、少なくとも約１×１０−３Ｍ、少なくとも約１×１０−４Ｍ、少なくとも約１×１０−５Ｍ、少なくとも約１×１０−６Ｍ、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１１Ｍ、または少なくとも約１×１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２２】
被験体においてがんを検出するまたはがんの診断を確認する方法であって、前記被験体由来の試料を、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップ；および、前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合性断片の前記試料への結合を検出するステップを含み、前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合性断片の前記試料への結合が、前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合性断片の対照試料への結合と比較して増大することにより、前記被験体におけるがんが検出されるまたは前記被験体におけるがんの診断が確認される、方法。
【請求項２３】
前記がんが、前立腺がん、子宮がん、乳がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、または頭頸部がんである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対照試料ががんを有さない被験体由来の試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が血液、尿、生検材料、血清、痰、血漿、または脳脊髄液試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト被験体の細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害するための方法であって、前記細胞に、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原断片を、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する細胞に対する有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
ヒト被験体における腫瘍の成長速度を低下させるための方法であって、前記被験体に、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する腫瘍に対する治療有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
がんに罹患しているヒト被験体を処置する方法であって、（ａ）前記被験体において、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する複数のがん細胞を有する腫瘍を同定するステップ；および（ｂ）前記被験体に請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を治療有効量で投与し、それにより、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する前記がんを処置するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記がんが、前立腺がん、子宮がん、乳がん、卵巣がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、および頭頸部がんからなる群より選択される、Ｐ１３Ｋ活性が高いがんである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
薬学的に許容される担体または賦形剤中に請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
【請求項３１】
ヒト被験体におけるがんの処置に使用する医薬の製造における、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用であって、前記がんが、その表面にＧＲＰ７８を発現しているとして特定されている、使用。
【請求項３２】
前記抗体または前記抗原結合性断片が標識されており、前記標識は、蛍光標識、放射性標識、または示差的な核磁気共鳴シグネチャーを有する標識である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３３】
エフェクター分子と連結した請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片を含む、単離された免疫コンジュゲート。
【請求項３４】
前記エフェクター分子が免疫毒素、サイトカイン、ケモカイン、治療剤、または化学療法剤である、請求項３３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３５】
前記治療剤がアウリスタチンまたはアウリスタチン誘導体である、請求項３４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３６】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記抗体または前記抗原結合性断片の重鎖可変領域が、配列番号２２に記載されている核酸配列またはその縮重バリアントを含み、前記抗体または前記抗原結合性断片の軽鎖可変領域が、配列番号２４に記載されている核酸配列またはその縮重バリアントを含む、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
【請求項３８】
異種プロモーターに作動可能に連結した、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載のポリヌクレオチドで形質転換された、単離された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
この出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／７８１，３９５号（これは、参考としてその全体が援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本出願は、腫瘍細胞、腫瘍内皮細胞、および腫瘍始原がん細胞（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）で発現する細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片；ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
がん細胞は代謝的な変化を特徴とし、腫瘍微小環境では多くの場合、血流減少および低酸素症が顕著であり、これらは全て小胞体（ＥＲ）ストレスによって引き出される可能性がある。腫瘍細胞は、ＥＲの内腔内へのアンフォールディングまたはミスフォールディングされたタンパク質の蓄積に応答した細胞内ストレスシグナル伝達事象のカスケードである小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を活性化することによってこれらの有害な状態に適応する。ＵＰＲ経路は、多種多様の腫瘍型において活性化され、また、腫瘍細胞が不利な腫瘍微小環境で生存するために必須であることが実証されている（Ｌｉら、Ｊ  Ｈｅａｍｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ、４巻：８頁、２０１１年）。ＥＲストレスの持続時間および程度に応じて、ＵＰＲにより、適応性の抗アポトーシス経路の活性化による生存シグナル、または細胞死プログラムの誘導による死亡シグナルのいずれかがもたらされ得る。大多数の正常な細胞は活性な「ストレス」応答を受けていないので、これらの細胞ではＵＰＲ経路は休止した状態のままである。この腫瘍細胞と正常な細胞の間の食い違いにより、ＵＰＲを標的とする薬剤に対して、がん療法における特異性が実現される利点がもたらされ、ＵＰＲを薬理学的に誘導または抑制することができるＵＰＲ標的化がん治療薬が評価されている（同文献）。
【０００４】
ＥＲシャペロンＧＲＰ７８の誘導は、ＵＰＲシグナル伝達経路の主要な生存促進性アームである（ＭａおよびＨｅｎｄｒｓｈｏｔ、Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：９６６〜９７７頁、２００４年）。ＧＲＰ７８は、ＢｉＰ／ＨＳＰＡ５とも称される、７８キロダルトンのグルコースにより調節されるタンパク質であり、がん細胞の生存、腫瘍の進行、転移、および療法に対する耐性において重大な役割を果たす強力な抗アポトーシス性を有する（Ｌｅｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８巻：３４９６〜９９頁、２００７年；ＬｉおよびＬｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１巻：１３〜２２頁、２０１２年）（それぞれの全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。ヒト試験では、ＧＲＰ７８の上方制御は腫瘍ビルレンスおよび治療耐性に広範に関連付けられる（ＰｆａｆｆｅｎｂａｃｈおよびＬｅｅ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２巻：１５０〜１５６頁、２０１１年）（その全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。遺伝的に変更されたＧｒｐ７８マウスモデルの創製により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてがんにおけるＧＲＰ７８の決定的な役割がさらに実証された。例えば、固形腫瘍モデルでは、Ｇｒｐ７８ハプロ不全により、腫瘍潜伏の延期、腫瘍増殖の減少、アポトーシスの増加、腫瘍血管新生および転移性成長の減少が示された（Ｄｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２巻：４９８〜５０５頁、２００８年）（その全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。ＧＲＰ７８は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ発がん性シグナル伝達の新規の調節因子および抗がん療法の標的として確立されている（Ｆｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、４９巻：１９４４４〜１９４４４９頁、２００８年）（その全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。
【０００５】
伝統的に、ＧＲＰ７８は、そのカルボキシル末端に存在するＫＤＥＬ保持モチーフに起因してＥＲ内腔タンパク質とみなされるが、特定の細胞型の原形質膜の外側にＧＲＰ７８の細画分が存在する可能性があるという証拠が蓄積している（Ａｒａｐら、Ｃｅｌｌ、３巻：２７５〜２８４頁、２００４年；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ、９巻：２２９９〜２３０６頁、２００９年；Ｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ、２巻：１８１〜１８８頁、２０１１年）（それぞれの全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。生化学的試験により、ＥＲストレスによりＧＲＰ７８の細胞表面への局在化が積極的に促進され、ＥＲから細胞表面へのＧＲＰ７８の移行がＫＤＥＬ修正機構によって調節されることがさらに示されている（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０巻：１５０６５〜１５０７５頁、２０１０年）（その全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。これは、ＧＲＰ７８を標的とするペプチドは腫瘍組織内に向かうが、正常な器官にはそれほど向かわないという知見と併せて、細胞表面ＧＲＰ７８により、治療的な標的化の機会がもたらされることを示唆している（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．、３巻：４３５〜４４７頁、２００７年；Ｓａｔｏら、Ａｄｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、９７〜１１４頁、２０１０年）（それぞれの全体があらゆる目的について参照により組み込まれる）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｉら、Ｊ  Ｈｅａｍｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ（２０１１年）４巻：８頁
【非特許文献２】ＭａおよびＨｅｎｄｒｓｈｏｔ、Ｃａｎｃｅｒ（２００４年）１２巻：９６６〜９７７頁
【非特許文献３】Ｌｅｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００７年）８巻：３４９６〜９９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願は、とりわけ、腫瘍細胞、腫瘍内皮細胞、および腫瘍始原がん細胞で発現する細胞表面ＧＲＰ７８を標的とする新規の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。これらの抗ＧＲＰ７８抗体またはその抗原結合性断片は、細胞表面ＧＲＰ７８に対する親和性が高く、所与の種、例えばヒトにおけるそれらの改変されていない親抗体と比較して免疫原性が低く、また、ＧＲＰ７８を阻害するように機能する。重要なことに、これらの単離された新規の抗体およびその抗原結合性断片は、腫瘍細胞においてＰＩ３Ｋシグナル伝達を減弱し、アポトーシスを促進し、その一方で、正常な細胞には影響を及ぼさない。当該抗体および抗原結合性断片は、ＵＰＲ標的化がん治療的処置に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、配列番号１に示されているヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の単離された抗体または抗原結合性断片は、配列番号３１に示されているエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、本発明の単離された抗体または抗原結合性断片は、配列番号３２に示されているエピトープに結合する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、それぞれ配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、それぞれ配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９または配列番号２１に記載されている配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７または配列番号２９に記載されている配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号２１に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１５に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２７に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１３】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１３に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１７に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２５に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１９に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２５に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号１９に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号２９に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、ａ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸１〜３０からなる群より選択されるＦＲ１；ｂ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸３６〜４９からなる群より選択されるＦＲ２；ｃ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸６７〜９８からなる群より選択されるＦＲ３；ならびにｄ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のアミノ酸１０９〜１１９からなる群より選択されるＦＲ４を含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、ａ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸１〜２３からなる群より選択されるＦＲ１；ｂ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸３５〜４９からなる群より選択されるＦＲ２；ｃ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸５５〜８６からなる群より選択されるＦＲ３；ならびにｄ）配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のアミノ酸９６〜１０５からなる群より選択されるＦＲ４を含む。
【００１９】
別の態様では、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体よりもヒト被験体における免疫原性が低い、単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２０】
別の態様では、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体と同様またはそれを超える結合親和性で結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２１】
別の態様では、配列番号３１に示されているエピトープとの結合について、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体と競合する単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２２】
別の態様では、配列番号３２に示されているエピトープとの結合について、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体と競合する単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２３】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、組換え抗体、ダイアボディ、キメラ化もしくはキメラ抗体またはその抗原結合性断片、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片、完全ヒト抗体またはその抗原結合性断片、ＣＤＲ移植抗体またはその抗原結合性断片、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２、および合成または半合成抗体である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、細胞表面ＧＲＰ７８タンパク質に、少なくとも約１×１０−３Ｍ、少なくとも約１×１０−４Ｍ、少なくとも約１×１０−５Ｍ、少なくとも約１×１０−６Ｍ、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１１Ｍ、または少なくとも約１×１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。
【００２５】
別の態様では、抗体およびその抗原結合性断片は、ＧＦＰ７８を発現する腫瘍、例えば、前立腺がん、子宮がん、乳がん、卵巣がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、および頭頸部がんに関連する腫瘍などを検出するために使用される。
【００２６】
別の態様では、細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を介したシグナル伝達を阻害する方法が提供される。ある特定の実施形態では、前記方法は、細胞に、細胞表面ＧＲＰ７８タンパク質に結合し、ＧＲＰ７８の活性を阻害する抗体または抗原結合性断片を有効量で接触させるステップを含み得る。
【００２７】
別の態様では、被験体における腫瘍の成長速度を低下させる方法が提供される。ある特定の実施形態では、当該方法は、被験体にヒト細胞表面ＧＲＰ７８に結合する抗体または抗原結合性断片を治療有効量で投与するステップを含む。一実施形態では、被験体はヒト被験体である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、比較できる組織の非がん性細胞よりも高レベルのＧＲＰ７８を発現している細胞を含む。
【００２８】
別の態様では、本開示は、がんに罹患している被験体を処置するための方法であって、（ａ）被験体において、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する複数のがん細胞を有する腫瘍を同定するステップ；および（ｂ）被験体に、細胞表面ＧＲＰ７８に結合する抗体または抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは、ＰＩ３Ｋ活性が高いがん、例えば、前立腺がん、子宮がん、乳がん、卵巣がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、および頭頸部がんである。
【００２９】
別の態様では、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤も含み得る。
【００３０】
別の態様では、がんを処置するための医薬の製造における、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。
【００３１】
別の態様では、本明細書に開示されている抗体または抗原結合性断片は、標識または望ましい薬物動態特性を付与する部分などの追加的な機能性部分と共有結合により連結していてよい（または他のやり方でそれと安定に結びついていてよい）。例示的な標識としては、蛍光による検出方法、陽電子放出断層撮影による検出方法および核磁気共鳴による検出方法からなる群より選択される方法による検出に適した標識が挙げられる。標識は、例えば、蛍光標識、放射性標識、および示差的な核磁気共鳴シグネチャーを有する標識からなる群より選択することができる。
【００３２】
別の態様では、エフェクター分子と連結した（または他のやり方でそれと安定に結びついた）抗体または抗原結合性断片を含む単離された免疫コンジュゲートが提供される。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、免疫毒素、サイトカイン、ケモカイン、治療剤、または化学療法剤である。種々の実施形態では、治療剤は、アウリスタチンまたはアウリスタチン誘導体である。種々の実施形態では、アウリスタチン誘導体は、ドバリン（ｄｏｖａｌｉｎｅ）−バリン−ドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｎｉｎｅ）−ドラプロリン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）−フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）またはモノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ（ＭＭＡＥ）である。
【００３３】
別の態様では、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。別の態様では、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片をコードするヌクレオチド配列を１つまたは複数含むベクターが提供される。別の態様では、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片を発現させるベクターを含む単離された細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＧＲＰ７８−Ｈｉｓポリペプチドのクーマシー染色を示す図である。Ｍはタンパク質ラダーである。図１Ｂは、ＭＡｂ１５９のＧＲＰ７８に対する親和性を決定するためのスキャッチャードアッセイの結果を示す図である。図１Ｃは、ＭＡｂ１５９と一緒に４℃でインキュベートした種々の生細胞の画像である。正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＤ）細胞（左上）、Ｃ４−２Ｂ細胞（前立腺がん）（右上）、ＭＣＦ７細胞（左下）、およびグルコース欠乏ＭＣＦ７細胞（右下）を評価した。表面ＧＲＰ７８染色が緑色で示されている。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。
【図２】図２Ａは、グルコース欠乏ＨＴ２９細胞を５０μｇ／ｍＬのＭＡｂ１５９を用いて処理し、次いで全細胞溶解物をＭＡｂ１５９および対照ＩｇＧ抗体を使用したウエスタンブロッティングに供したウエスタンブロットを示す図である。相対的なｐＡＫＴレベルおよびｐＳ６レベルを数量化するためにＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を使用した。図２Ｂは、ビオチン化免疫沈降（ＩＰ）分析のウエスタンブロットを示す図である。表面ＧＲＰ７８と、ｐ８５との相互作用が検出されたが、ＥｐｈＢ２、Ｅｒｋ１／２、またはベータアクチンとの相互作用は検出されなかった。この分析では、Ｆｌａｇタグを付けたＧＲＰ７８（ＫＤＥＬを有さない）を２９３Ｔ細胞において過剰発現させ、その後、表面タンパク質のビオチン化およびＩＰを行った。ＧＲＰ７８のＩＰおよび対照のＩＰを、それぞれＦｌａｇ抗体とコンジュゲートしたアガロースビーズおよびマウスＩｇＧとコンジュゲートしたアガロースビーズを用いて実施した。「Ｓｕｍ」は始原細胞溶解物である。図２Ｃは、ビオチン化免疫沈降（ＩＰ）分析のウエスタンブロット（図２Ｂで使用したものと同じ）を示す図である。タプシガルジンを用いて処理した２９３Ｔ細胞において内在性表面ＧＲＰ７８とｐ８５の相互作用が検出された。ＩＰを、プロテインＧとコンジュゲートしたアガロースおよび３種のマウスモノクローナル抗体を用いて実施した。
【図３】図３Ａは、ビオチン化ＭＡｂ１５９（５０μｇ）をｉ．ｖ．注射した、ＨＴ２９腫瘍を有するマウス２匹から得た腫瘍および正常な器官組織の画像である。投与の６時間後にマウスを屠殺し、組織を採取し、ＭＡｂ１５９の局在化を評価した。蛍光色素とコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出されたＭＡｂ１５９の局在化が緑色で示されている。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。図３Ｂは、３ｍｇ／ｋｇの、Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたヒト化ＭＡｂ１５９または正常なヒトＩｇＧを静脈内注射したマウスの蛍光マウス全体画像を示す。注射の２８時間後に画像を取得した（左側のパネル）。その後、マウスにＰＢＳおよびホルマリンを灌流し、器官を腫瘍と一緒に採取し、主要器官のｅｘ  ｖｉｖｏ画像を取得した（右側のパネル）。図３Ｃは、ヒト化ＭＡｂ１５９の分布を決定するためにヒトＦｃ特異的抗体を用いて図３Ｂに示されている器官に対して実施した免疫組織化学的分析を示す図である。
【図４−１】図４Ａは、ＳＣＬＣ細胞Ｈ２４９異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、腫瘍の進行が有意に阻害された（５８％）ことを示すグラフである。図４Ｂは、肺癌細胞Ａ５４９異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、腫瘍の進行が有意に阻害された（７８％）ことを示すグラフである。図４Ｃは、結腸がん細胞ＨＴ２９異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、腫瘍の進行が有意に阻害された（５０％）ことを示すグラフである。正常なマウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ抗体、週２回）を対照として使用した。各試験の終点のデータのみが示されている。図４Ｄは、結腸がん細胞ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９を使用した処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、イリノテカン（１８ｍｇ／ｋｇ、週２回）の有効性が改善されたことを示すグラフである。単独で投与した場合、ＭＡｂ１５９により、腫瘍の成長が対照群と比較して５４％阻害された。イリノテカン単独療法により、腫瘍の成長が８５％阻害された。併用療法はより有効であり、それにより腫瘍の成長が９５％阻害され、出発腫瘍体積の４７％までの腫瘍退縮が引き起こされた。この試験の終点のデータのみが示されている。図４Ａ〜４Ｄの全てのデータは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として示されている。Ｐ値はスチューデントＴ検定、両側（＊、Ｐ＜０．０５）；（＊＊、Ｐ＜０．０２）を用いて算出した。
【図４−２】図４Ｅは、ＭＡｂ１５９を使用した処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、Ｂ１６メラノーマ細胞の肺転移が阻害されることを示す一連の生のマウス画像を示す図である。Ｂ１６細胞注射およびＭＡｂ１５９処置の３週間後および４週間後に取得した生のマウス画像が左側に示されている。実験（４週間）の最後に採取した肺の写真が右側に示されている。
【図５−１】図５Ａは、ＰＴＥＮ欠損、ホルモン不応性マウス前立腺がん細胞ＣＥ１におけるＭＡｂ１５９の有効性を示すグラフである。図５Ｂは、ＳＣＬＣ細胞Ｈ２４９におけるＭＡｂ１５９の有効性を示すグラフである。図５Ｃは、肺癌細胞Ａ５４９におけるＭＡｂ１５９の有効性を示すグラフである。図５Ｄは、結腸がん細胞ＨＴ２９異種移植モデルにおけるＭＡｂ１５９の有効性を示すグラフである。腫瘍を、１０ｍｇ／ｋｇの抗体を用いて週２回処置した。図５Ｅは、結腸がん細胞ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）により、イリノテカン（１８ｍｇ／ｋｇ、週２回）の有効性が改善されたことを示すグラフである。この試験の終点のデータのみが示されている。
【図５−２】図５Ｆ〜５Ｈは、ＭＡｂ１５９で処置したＡ５４９腫瘍の代表的な免疫蛍光染色写真である。ＭＡｂ１５９処置により、細胞増殖の減少（Ｋｉ６７）、細胞アポトーシスの誘導（ＴＵＮＥＬ）、脈管構造障害（ＣＤ３１）およびＰＩ３Ｋシグナル伝達の低下（リン酸化Ｓ６）が導かれる。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。図５Ｉは、ＭＡｂ１５９で処置したＡ５４９腫瘍の代表的な免疫組織化学染色写真である。ＭＡｂ１５９により、リン酸化ＡＫＴレベルが低下したが、リン酸化ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）レベルは低下しなかった。数量化データは全て、平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスク、２重アスタリスク、および３重アスタリスクは、それぞれ、対応のない両側スチューデントＴ検定によって決定されたＰ＜０．０５およびＰ＜０．０２、およびｐ＜０．００１を示す。
【図６】図６Ａは、ＩｇＧで処置したＰｔｅｎｆ／ｆ；Ｍｘ１−Ｃｒｅマウスの背中を丸めた姿勢と、ＭＡｂ１５９（１０ｍｇ／ｋｇの正常なマウスＩｇＧまたはＭＡｂ１５９をｐＩｐＣと同時投与、７回用量）を用いて処置したマウスの正常な姿勢の比較を示す写真である。図６Ｂは、ＷＴ（ｎ＝４）、ＩｇＧを用いて処置したｃＰｆ／ｆ（ｎ＝５）、およびＭＡｂ１５９を用いて処置したｃＰｆ／ｆ（ｎ＝８）の脾臓の重量および白血病芽細胞の百分率の定量化を示すグラフである。データは全て平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として示されている。図６Ｃは、ＷＴ（ｎ＝４）、ＩｇＧを用いて処置したｃＰｆ／ｆ（ｎ＝５）、およびＭＡｂ１５９を用いて処置したｃＰｆ／ｆ（ｎ＝８）由来の尾部末梢血を用いた全血球計算を示すグラフである。尾部出血によって末梢血を採取し、自動血液分析器ＢＣ−２８００  ｖｅｔ（Ｍｉｎｄｒａｙ）を製造者の説明書に従って使用して分析した。データは全て平均±標準誤差として示されている。図６Ｄは、示されているタンパク質のレベルを検出するための、骨髄細胞溶解物を使用した代表的なウエスタンブロットの結果を示す図である。各群について、２匹のマウスからの試料を分析のために使用した。
【図７】図７Ａは、ＭＡｂ１５９により、Ｇｒｐ７８  ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄマウスから調製したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）溶解物におけるＧＲＰ７８タンパク質バンドが認識されることを示す免疫ブロットである。ＧＲＰ７８バンドは、ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するアデノウイルスを用いてＭＥＦを処理することによってＧｒｐ７８対立遺伝子を欠失させたｃ７８ｆ／ｆ  ＭＥＦには存在しなかった。抗ｂ−アクチン抗体を用いてブロットを再度探索して、両方のレーンにおける同等のタンパク質ローディングを確認した。図７Ｂは、フローサイトメトリー分析の結果を示す図である。表面ＧＲＰ７８が２種の乳がん幹細胞マーカーであるＤｌｌ１およびＤＮＥＲと同時発現することが示されている。この分析では、ＧＲＰ７８とＤｌｌ１の両方を発現している細胞をまず単離し、次いで、ＤＮＥＲ発現についてゲーティングした。図７Ｃは、ＭＡｂ１５９を用いて染色した原発性頭頸部腫瘍組織（緑色）および幹細胞マーカーであるＣＤ１３３（赤色）抗体の染色された画像である。矢印は、表面ＧＲＰ７８およびＣＤ１３３の共局在を示す。染色手順において透過処理剤は使用しなかった。核をＤＡＰＩで染色した（青色）。
【図８】図８Ａは、競合ＥＬＩＳＡにおけるＭＡｂ１５９とヒト化ＭＡｂ１５９の親和性の比較を示すグラフである。マウスＭＡｂ１５９およびヒト化ＭＡｂ１５９の一連の希釈物を、一定濃度のビオチン化マウスＭＡｂ１５９に対して、ＧＲＰ７８−Ｈｉｓへの結合について試験した。このグラフにより、マウスＭＡｂ１５９とヒト化ＭＡｂ１５９の両方について、その量が増加するとビオチン化ＭＡｂ１５９の結合が減少することが示される。ヒト化ＭＡｂ１５９はＧＲＰ７８に対してマウスＭＡｂ１５９よりもわずかに優れた親和性を示す。図８Ｂは、ＭＡｂ１５９とヒト化ＭＡｂ１５９の抗腫瘍活性の比較を示すグラフである。Ａ５４９異種移植腫瘍を、正常なマウスＩｇＧ、マウスＭＡｂ１５９、およびヒト化ＭＡｂ１５９で処置した（ｎ＝８）。抗体を週に２回、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。２重アスタリスクは、対応のない両側スチューデントＴ検定によって決定されたＰ＜０．００５を示す。
【図９】図９Ａは、処置の７日後の脂肪パッド＃４（上）および反対側の脂肪パッド＃９への転移（下）における原発性４Ｔ１腫瘍の写真である。黒い線によって腫瘍の境界が示されており、＃４パッドが黒い矢印によって示されている。図９Ｂは、４Ｔ１同所性乳がんモデルにおける肺転移の代表的な写真である。１４日目に、ＭＡｂ１５９処置により、対照ＩｇＧ群と比較して有意に少ない転移がもたらされた。白い破線によって腫瘍が区切られている。
【図１０】図１０は、４Ｔ１同所性乳がんモデルにおいて、ＭＡｂ１５９により肺および肝転移が阻害されたことを示す組織学的分析の図である。４Ｔ１細胞を注射していない正常なマウス由来の肺および肝臓のＨ＆Ｅ染色写真が上に示されている。中央のパネルは対照ＩｇＧを用いた処置によるものであり、下のパネルはＭＡｂ１５９を用いた処置によるものである。１３日目に、ＭＡｂ１５９で処置したマウスの肝臓では腫瘍は見られなかったが、対照群マウスの肝臓では大きな腫瘍が観察された（左側のパネル、黒い点線で区切られている）。１４日目に、対照群では肺の広い面積に腫瘍細胞が浸潤した（黒い点線で区切られている）が、ＭＡｂ１５９で処置した肺において観察することができた腫瘍細胞はほんのわずかであった（右側のパネル）。
【図１１】図１１Ａは、以下についての図である。Ａ５４９腫瘍の凍結切片（各群から４つの腫瘍）を溶解させて組み合わせ、その溶解物をウエスタンブロッティングに供した。相対的なリン酸化ＡＫＴ、Ｓ６、Ｅｒｋ１／２、Ｓｒｃ、およびＭＥＴの数量化を、Ｏｄｙｓｓｅｙを用いて実施した。図１１Ｂは、Ａ５４９異種移植試験における主要なマウス器官のＨ＆Ｅ染色写真である。この写真により、ＭＡｂ１５９処置後に明らかな毒性は示されない。スケールバー、１００μｍ。ＭＡｂ１５９により、異種移植腫瘍におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達が阻害され、正常な器官に対する毒性は示されない。
【図１２−１】図１２Ａは、対照ＩｇＧまたはＭＡｂ１５９を用いて処置した前立腺特異的ＰＴＥＮノックアウトマウスの生のイメージング写真である。ＭＡｂ１５９により、前立腺腫瘍の成長が有意に阻害された。この試験全体を通して同じイメージング設定を使用した。ＭＡｂ１５９で処置したマウスの１匹が４週目に麻酔により死亡した。
【図１２−２】図１２Ｂの左側は、図１２Ａから採取した前立腺背外側のヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す図である。対照ＩｇＧで処置した前立腺では広い面積の前立腺腺癌が示されるが、ＭＡｂ１５９で処置した前立腺では、軽度の前立腺上皮内腫瘍（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）のみが示される。図１２Ｂの右側は、ｐＳ６、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫの免疫組織化学的染色を示す図であり、対応するシグナル数量化が下に示されている。図１２Ｃは、対照ＩｇＧまたはＭＡｂ１５９を用いて処置した子宮特異的ＰＴＥＮノックアウトマウスから採取した子宮の代表的な写真である。ＭＡｂ１５９により、第３週から処置を開始した場合には子宮腫瘍の成長が有意に阻害されたが、第９週から処置を開始した場合には子宮腫瘍退縮および壊死が引き起こされた（黒い破線で区切られている）。図１２Ｄは、第９週から第１３週まで処置した子宮特異的ＰＴＥＮノックアウトマウスから採取した子宮腫瘍におけるｐＳ６のＨ＆Ｅ染色および免疫組織化学的染色を示す図である。対照ＩｇＧで処置した子宮では、腫瘍は大きく、広範囲にわたる腺扁平上皮がんが示される（黒い破線で区切られている）。対照的に、ＭＡｂ１５９で処置した子宮は、小さな腫瘍の島のみが伴う正常と思われる組織を有する（黒い矢印によって示される）。図１２Ｂおよび図１２Ｄの数量化データは平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示されている（ｎ＝４）。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いてシグナルを数量化した。２重アスタリスクは、対応のない両側スチューデントＴ検定によって決定されたＰ＜０．００２を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図１３】図１３Ａは、ＭＡｂ１５９により、グルコース欠乏ＨＴ２９およびＭＣＦ７の生存可能な細胞数が減少すること（ＭＴＴアッセイによって決定される）（上の棒グラフ＊＝ＭＡｂ１５９）、およびＭＡｂ１５９により、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定されるグルコース欠乏ＭＣＦ７細胞におけるアポトーシスが誘発されることを示す図である（下のブロット）。ＴＵＮＥＬシグナルが緑色で示されており、核は青色で示されている。データは平均±標準誤差として示されている。図１３Ｂは、比色定量アッセイキットを用いて決定される通り、ＭＡｂ１５９によりカスパーゼ８およびカスパーゼ９の活性が誘導されることを示すグラフである。データは平均±標準誤差として示されている。
【図１４】図１４Ａは、２９３Ｔ細胞において一過性に発現させたＧＦＰ７８バリアントの最初のアミノ酸および最後のアミノ酸、ならびに抗Ｆｌａｇ抗体およびＭＡｂ１５９を用いたウエスタンブロッティングのために使用した、変性させ還元した全細胞溶解物全体を示す図である。図１４Ｂの左側および右側のパネルは、ウエスタンブロッティングの結果を示す免疫ブロットである。内因的に発現したＧＲＰ７８が黒い矢印で示されている。図１４Ｃで示されている結果に基づいて、推定ＭＡｂ１５９エピトープを示す図である。下線が引かれている残基は、それぞれＫ６３３バリアントおよびＴ６４３バリアントの最後の残基である。Ａ６３８は太い黒字で示されている。
【図１５】図１５は、３つの異なる細胞株における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞傷害性を示すグラフである。３種の細胞株をＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥの存在下でインキュベートし、３日後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを使用して培養物の生存能力を評価した。試験した細胞株では、細胞表面で高いＧＲＰ７８発現が示され（Ｈ２４９）、細胞表面で中間のレベルのＧＲＰ７８発現が示され（Ｃ４２Ｂ）、または細胞表面でのＧＲＰ７８発現は示されなかった（ＨＥＫ−２９３）。曲線は、異なる細胞株におけるＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥの用量依存的な細胞傷害性を示す。結果は、少なくとも２回の実験を表す；エラーバー、ＳＥＭ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書において特に定義されていなければ、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、およびそれらに関する技法は、一般に使用され、当技術分野で周知のものである。別段の指定のない限り、本発明の方法および技法は、一般に、当技術分野で周知であり、本明細書全体を通して引用および考察されている種々の一般的な参考文献およびより詳細な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年）、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般に実現される通りまたは本明細書に記載の通り製造者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれに関する実験室における手順および技法は、一般に使用され、当技術分野で周知のものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置には、標準の技法が使用される。
【００３６】
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。ある特定の実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」とは、アルファ炭素がペプチド結合によって連結したアミノ酸の鎖である。したがって、鎖の一方の末端（アミノ末端）にある末端アミノ酸は遊離のアミノ基を有し、鎖の他方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離のカルボキシル基を有する。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」という用語（Ｎ末端と省略される）は、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸の遊離のα−アミノ基またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与している場合にはイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端にある遊離のカルボキシル基またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、これだけに限定されないが、アミド結合とは異なりエーテルによってつながったアミノ酸などのペプチド模倣薬を含めた、基本的に任意のポリアミノ酸も含む。
【００３７】
「ポリペプチド誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、化学修飾された、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学的部分とのコンジュゲート、リン酸化、およびグリコシル化がなされたポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドは、多少なりとも、任意の理由で、例えば、（１）タンパク質分解されやすさを低下させるため、（２）酸化されやすさを低下させるため、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するため、（４）結合親和性を変更するため、および（５）他の物理化学的性質または機能的性質を付与または修飾するために、修飾されたポリペプチドを含む。例えば、単一または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分）において行うことができる。「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド内でのアミノ酸の機能的に類似したアミノ酸による置換を指す。以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換になるアミノ酸を含有する：
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）
アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）  。
【００３８】
当技術分野で認められているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．  Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：１０５頁）に記載されている。
【００３９】
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書で使用される場合、対応する全長タンパク質と比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、断片は、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００または少なくとも１０００アミノ酸長であってよい。ある特定の実施形態では、断片は、例えば、最大で１０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１５０、最大で１００、最大で５０、最大で２５、最大で１０、または最大で５アミノ酸長であってもよい。断片は、その末端の一方または両方に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸、例えば、異なる天然に存在するタンパク質（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）に由来するアミノ酸の配列または人工的なアミノ酸配列（例えば、人工的なリンカー配列）をさらに含んでよい。
【００４０】
「ポリペプチド類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有するセグメントを含み、例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ発がん性シグナル伝達を調節する能力を保持するポリペプチドを指す。一般には、ポリペプチド類似体は、ネイティブな配列に対して保存的アミノ酸置換（または挿入または欠失）を含む。類似体は、一般には、少なくとも２０または２５アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸長またはそれ超の長さであり、多くの場合、全長ポリペプチドまでの長さであってよい。
【００４１】
「ポリペプチドバリアント」および「ポリペプチド変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、および／または置換がなされたアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、挿入、欠失、または置換されるアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００アミノ酸長であってよい。本発明のバリアントは、免疫コンジュゲートおよび融合タンパク質を含む。
【００４２】
「％配列同一性」という用語は、本明細書では、「％の同一性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした際の、２つまたはそれ超のペプチド配列の間のアミノ酸配列同一性のレベルまたは２つまたはそれ超のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の同一性とは、定義済みのアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じことを意味し、また、所与の配列が、別の長さの別の配列と少なくとも８０％同一であることを意味する。ある特定の実施形態では、％の同一性は、例えば、所与の配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはそれ超の配列同一性から選択される。ある特定の実施形態では、％の同一性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内である。
【００４３】
「％配列相同性」という用語は、本明細書では、「％相同性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした際の、２つまたはそれ超のペプチド配列の間のアミノ酸配列相同性のレベルまたは２つまたはそれ超のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性とは、定義済みのアルゴリズムによって決定される８０％配列相同性と同じこと意味し、したがって、所与の配列の相同体が、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列相同性を有することを意味する。ある特定の実施形態では、％相同性は、例えば、所与の配列に対する少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはそれ超の配列相同性から選択される。ある特定の実施形態では、％相同性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内である。
【００４４】
２つの配列間の同一性を決定するために使用することができる例示的なコンピュータプログラムとしては、これだけに限定されないが、インターネット上でＮＣＢＩウェブサイトにおいて公的に利用可能な一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁（公開された初期値設定、すなわち、パラメータｗ＝４、ｔ＝１７に特に関連する）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁も参照されたい。配列検索は、一般には、所与のアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共のデータベース内のアミノ酸配列と比較して評価する場合に、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して行われる。全ての読み枠が翻訳されている核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共のデータベース内のアミノ酸配列と対照して検索するためには、ＢＬＡＳＴＸプログラムが好ましい。ＢＬＡＳＴＰとＢＬＡＳＴＸはどちらも、オープンギャップペナルティ１１．０、および伸長ギャップペナルティ１．０の初期状態のパラメータを使用して実行され、ＢＬＯＳＵＭ−６２行列を利用する。
【００４５】
パーセント配列同一性の算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２つの配列間の類似性の統計解析も実施される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる１つの類似性の測定基準は最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これにより、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率が示される。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸の比較における最小和確率が、例えば約０．１未満、約０．０１未満、または約０．００１未満である場合に、参照配列と同様であるとみなされる。
【００４６】
「単離された分子」という用語（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）は、それが由来する起源または供給源に基づいて、（１）ネイティブな状態ではそれに付随する天然に関連する構成成分と関連していない、（２）同じ種に由来する他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞により発現される、または（４）天然に存在しない分子である。したがって、化学的に合成される分子、またはそれを天然に生じる細胞とは異なる細胞系において発現する分子は、その天然に関連する構成成分から「単離された」ものである。分子を、当技術分野で周知の精製技法を使用して単離することによって、天然に付随する構成成分を実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知のいくつもの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、当技術分野で周知の技法を使用してゲルを染色してポリペプチドを可視化してアッセイすることができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製のための当技術分野で周知の他の手段を使用することによって、より高い分解能をもたらすことができる。
【００４７】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一の種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋な」、「実質的に均一な」、または「実質的に精製された」ものである。ポリペプチドまたはタンパク質は単量体であっても多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、一般には、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％Ｗ／Ｗ、通常約９５％を構成し、９９％超純粋であることが好ましい。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、その後、当技術分野で周知の染色を用いてゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを視覚化することなどの、当技術分野で周知のいくつもの手段によって示すことができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製のための当技術分野で周知の他の手段を使用することによって、より高い分解能をもたらすことができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含み、腫瘍抗原に対する特異性または病理学的な状態で過剰発現する分子に対する特異性を有するタンパク質を指す。認められている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびにこれらの遺伝子の亜型および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖（ＬＣ）はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖（ＨＣ）は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それにより今度は、それぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが定義される。典型的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端により、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ超のアミノ酸の可変領域が定義される。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００４９】
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（および、一部の場合にはＣＨ４）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端までに以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は定義されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列はヒトなどの種内で比較的保存されている。構成物である軽鎖および重鎖の複合フレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを３次元空間おいて位置づけ、アラインメントするために役立つ。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ  ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。
【００５０】
Ｋａｂａｔ定義は抗体内の残基を番号付けるための標準であり、一般にはＣＤＲ領域を同定するために使用される。Ｋａｂａｔデータベースは現在オンラインで維持されており、ＣＤＲ配列を決定することができる。例えば、インターネット上で利用可能なＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ：３．２．１８．、２０１１年３月２９日、およびＢｒｏｃｈｅｔ，  Ｘ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６巻、Ｗ５０３〜５０８頁、２００８年）を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と同様であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、ある特定の構造的なループ領域の位置を考慮に入れたものである。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜１７頁（１９８６年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８３頁（１９８９年）を参照されたい。ＡｂＭ定義では、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって作成された、抗体構造をモデリングする組み込まれた一連のコンピュータプログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）；「ＡｂＭＴＭ，  Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｌｔｄ．を参照されたい。ＡｂＭ定義では、知見データベースと、Ｓａｍｕｄｒａｌａら、「Ａｂ  Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３巻：１９４〜１９８頁（１９９９年）に記載されているものなどの最初の方法との組合せを使用して抗体の三次構造を一次配列からモデリングする。その接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）は入手可能な複雑な結晶構造の解析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：７３２〜４５頁（１９９６年）を参照されたい。
【００５１】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号が付されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と称され、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対して異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体ごとに変動するが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位のみが抗原結合性に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。
【００５２】
「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体をパパイン消化することによって生成することができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、ネイティブな配列のＦｃ領域であってもバリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般には、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度（例えば、新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）は、エンドソームにおいてＩｇＧのＦｃ領域に酸性のｐＨで結合し、ＩｇＧを分解から保護し、それにより、ＩｇＧの長い血清半減期に寄与する）を媒介する。Ｆｃ部分のアミノ酸残基を置き換えることにより、抗体エフェクター機能が変更されることが当技術分野で公知である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号を参照されたい）。
【００５３】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、またはいくつものよく特徴付けられた断片として存在する。そのような断片としては、標的抗原に結合する、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィドにより安定化されたＦｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）が挙げられる。ｓｃＦｖタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合した融合タンパク質であるが、ｄｓＦｖは、鎖の結びつきを安定化するために鎖にジスルフィド結合が導入されるように変異させたものである。インタクトな抗体の消化に関して種々の抗体断片が定義されているが、そのような断片を化学的にまたは組換えＤＮＡの方法体系を利用することによって新規に合成することができることが当業者には理解されよう。したがって、本明細書で使用される場合、抗体という用語は、例えば、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成される多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド連結したＦｖ（ｄｓＦｖ）、細胞内抗体、およびエピトープ結合性断片または上記のいずれかの抗原結合性断片を包含する。
【００５４】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と称される、それぞれが単一の抗原結合性部位を有する２つの同一の抗原結合性断片が生じる。「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００５５】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖、ならびに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域も含有する１つの重鎖の一部を含み、したがって、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子が形成され得る。
【００５６】
抗体のペプシン処理により、２つの抗原結合性部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有し、なお抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片がもたらされる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有し、したがって、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって１つにまとまった２つのＦａｂ’断片で構成される。
【００５７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖由来の可変領域と軽鎖由来の可変領域の両方を含むが、定常領域を欠く。
【００５８】
「単鎖抗体」は、Ｆｖ分子が重鎖可変領域および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって接続して単一のポリペプチド鎖を形成したものであり、抗原結合性領域を形成するものである。単鎖抗体は、その開示が参照により組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号において詳細に考察されている。
【００５９】
「抗原結合性断片」および「抗原結合性タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、指定の標的抗原に結合する任意のタンパク質を意味する。本出願では、指定の標的抗原とは、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８タンパク質またはその断片である。「抗原結合性断片」は、これだけに限定されないが、抗体およびその結合性部分、例えば免疫学的機能性断片を含む。例示的な抗体の抗原結合性断片は重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ（複数可）、または重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域である。
【００６０】
抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）抗原結合性タンパク質の「免疫学的機能性断片」（または単に「断片」）という用語は、本明細書で使用される場合、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでも抗原に特異的に結合することができる抗体の部分（その部分の入手または合成の仕方にかかわらず）を含む抗原結合性タンパク質の種である。そのような断片は、標的抗原に結合し、所与のエピトープへの結合について、インタクトな抗体を含めた他の抗原結合性タンパク質と競合し得るという点で、生物活性がある。一部の実施形態では、断片は中和性断片である。一部の実施形態では、断片は、ＧＲＰ７８とＰＩ３Ｋの間の相互作用の可能性を遮断するまたは低下させることができるものである。一態様では、そのような断片は、全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖またはその一部を含む。これらの生物活性のある断片は、組換えＤＮＡ技法によって作製することもでき、インタクトな抗体を含めた抗原結合性タンパク質の酵素的切断または化学的切断によって作製することもできる。免疫学的機能性免疫グロブリン断片としては、これだけに限定されないが、Ｆａｂ、ダイアボディ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が挙げられ、これらは、これだけに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科の動物またはウサギを含めた任意の哺乳動物供給源に由来するものであってよい。さらに、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の機能性部分、例えば、１つまたは複数のＣＤＲを第２のタンパク質または小分子に共有結合させて、体内の特定の標的を対象とする、二機能性の治療的性質を有する、または長期の血清半減期を有する治療剤を創製することができることが意図されている。
【００６１】
ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つの領域間での対形成を可能にするためには短すぎるリンカーによってつながったＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、したがって、各領域が別のポリペプチド鎖上の相補的な領域と対形成することが可能になる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜４８頁（１９９３年）、およびＰｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２巻：１１２１〜２３頁（１９９４年）を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成によって生じるダイアボディは２つの同一の抗原結合性部位を有することになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合性部位を有するダイアボディを作出することができる。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ３つのポリペプチド鎖および４つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、それぞれ、同じであっても異なってもよい３つの抗原結合性部位および４つの抗原結合性部位を形成する。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本発明の構築物に使用する抗体および抗体断片は二特異性であってよい。二重特異性抗体または断片はいくつかの立体配置のものであってよい。例えば、二重特異性抗体は、単一の抗体（または抗体断片）と似ていてよいが、２つの異なる抗原結合性部位（可変領域）を有する。種々の実施形態では、二重特異性抗体は、化学的技法によって（Ｋｒａｎｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７８巻：５８０７頁、１９８１年）、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技法によって（例えば、米国特許第４，４７４，８９３号を参照されたい）、または組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有してよく、そのうちの少なくとも１つは腫瘍関連抗原である。種々の実施形態では、抗体および断片は、ヘテロ抗体（ｈｅｔｅｒｏａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。ヘテロ抗体は、互いと連結した２つまたはそれ超の抗体または抗体結合性断片（例えば、Ｆａｂ）であり、各抗体または断片の特異性が異なる。
【００６３】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、可能性のある自然に起こる変異以外は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原を対象とする。さらに、一般には異なる決定因子（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を対象とする。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であると解釈されるべきではない。
【００６４】
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの種、例えばヒトに由来するフレームワーク残基、および、標的とする抗原に特異的に結合する、別の種、例えばマウス抗体に由来するＣＤＲ（一般に抗原結合性を付与する）を有する抗体を指す。
【００６５】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入された変異）を含んでよい。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まないものとする。
【００６６】
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体を指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから取得したアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合性または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加的な保存的アミノ酸置換を有してよい。
【００６７】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、創製または単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞をトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、創製または単離された抗体などを含むものとする。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異誘発）に供し、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい配列である。そのような組換え手段は全て当業者に周知である。
【００６８】
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合すること、または他のやり方で分子と相互作用することができる任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、一般に、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループ化からなり、一般に、特異的な３次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。エピトープは、「直線状」であっても「立体構造」であってもよい。直線状エピトープでは、タンパク質と相互作用する分子（例えば、抗体など）の間の相互作用の点は全てタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体構造エピトープでは、相互作用の点は、タンパク質上の互いと離れたアミノ酸残基にまたがって生じる。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば本発明に記載の技法を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。次いで、この情報から、抗体を同じエピトープへの結合について競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現するための手法は、交差競合試験を行って、互いと競合的に結合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見つけ出すことである。
【００６９】
抗体を含めた抗原結合性タンパク質は、抗原に、少なくとも１×１０−６Ｍ、または少なくとも１×１０−７Ｍ、または少なくとも１×１０−８Ｍ、または少なくとも１×１０−９Ｍ、または少なくとも１×１０−１０Ｍ、または少なくとも１×１０−１１Ｍの解離定数（ＫＤ、または対応するＫｂ、下で定義される）値によって決定される高結合親和性で結合する場合に、抗原に「特異的に結合する」。目的のヒト抗原に特異的に結合する抗原結合性タンパク質は、他の種に由来する同じ目的の抗原にも、同じまたは異なる親和性で結合することができ得る。「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
【００７０】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質の濃度の変更を検出することによってリアルタイムでの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学的現象である。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１巻：１９〜２６頁（１９９３年）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１巻：６２０〜６２７頁（１９９１年）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８巻：１２５〜１３１頁（１９９５年）；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８巻：２６８〜２７７頁（１９９１年）を参照されたい。
【００７１】
「免疫コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用される場合、エフェクター分子と直接または間接的にコンジュゲートした抗体またはその抗原結合性断片を含む分子を指す。エフェクター分子は、検出可能な標識、免疫毒素、サイトカイン、ケモカイン、治療剤、または化学療法剤であってよい。免疫コンジュゲートは、抗体または抗原結合性断片の免疫反応性を保持し、例えば、抗体または抗原結合性断片の抗原に結合する能力は、コンジュゲーション後にはコンジュゲーション前とほぼ同じであるか、それよりもほんのわずかだけ低下する。本明細書で使用される場合、免疫コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）とも称される。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド単位で構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドとは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然に存在する核酸ならびに核酸類似体を含む。核酸類似体としては、天然に生じるリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連結に関与する天然に存在しない塩基、ヌクレオチドを含むもの、またはリン酸ジエステル結合以外の連結によって塩基が付着したものが挙げられる。したがって、ヌクレオチド類似体としては、例えば、これだけに限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホラミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。「核酸」という用語は、一般には、大きなポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般には、短いポリヌクレオチド、一般に約５０ヌクレオチド以下のものを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されている場合、これは、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されよう。
【００７３】
本明細書では、ポリヌクレオチド配列の記載には従来の表示法が使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。５’から３’への新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの付加方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と称され、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上のＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置する配列は「上流配列」と称される；ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の、コーディングＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にある配列は「下流の配列」と称される。
【００７４】
「相補的」という用語は、本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面の位相的な適合性または合わせて一致することを指す。したがって、２つの分子が相補的であると記載することができ、さらに、接触表面特性は互いと相補的である。第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、または、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる場合、第２のポリヌクレオチドと相補的である。
【００７５】
「と特異的にハイブリダイズする」または「特異的なハイブリダイゼーション」または「と選択的にハイブリダイズする」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子が特定のヌクレオチド配列と、その配列が複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡとして存在する場合に、ストリンジェントな条件下で優先的に結合、２重鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的部分配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とはより低い程度でハイブリダイズするまたはハイブリダイズしない条件を指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関しては、配列に左右され、異なる環境のパラメータの下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、ｐａｒｔ  Ｉ、ｃｈａｐｔｅｒ  ２、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第３版、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹに見出すことができる。
【００７６】
一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義済みのイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である（定義済みのイオン強度およびｐＨの下で）。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に相補的な残基を約１００超有する、相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃、ヘパリン１ｍｇを伴う５０％ホルマリン、ハイブリダイゼーションを一晩行うものである。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃で約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃で１５分である。ＳＳＣ緩衝液に関する記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を行ってバックグラウンドプローブシグナルを除去することができる。例えば約１００ヌクレオチド超の２重鎖に対する例示的な中間のストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、４５℃で１５分である。例えば約１００ヌクレオチド超の２重鎖に対する例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃で１５分である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおけるシグナルノイズ比が無関係のプローブに対して観察されるシグナルノイズ比の２倍（またはそれ超）であることにより、特異的なハイブリダイゼーションが検出されたことが示される。
【００７７】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、指定のポリヌクレオチド鋳型と特異的にハイブリダイズし、相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点をもたらすことができるポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーを、合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための薬剤の存在下に置くと起こる。プライマーは、一般には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、一般にはデオキシリボ核酸であるが、多種多様な合成プライマーおよび天然に存在するプライマーが多くの適用に有用である。プライマーは、合成が開始される部位として機能するように、それがハイブリダイズするように設計される対象の鋳型と相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合では、プライマーと鋳型の特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに左右される。プライマーを例えば発色性部分、放射性部分、または蛍光部分で標識し、検出可能な部分として使用することができる。
【００７８】
「プローブ」という用語は、ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、別のポリヌクレオチドの指定の配列と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを指す。プローブは、標的の相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするが、鋳型の正確な相補配列を反映する必要はない。そのような場合では、プローブと標的の特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに左右される。プローブを例えば発色性部分、放射性部分、または蛍光部分で標識し、検出可能な部分として使用することができる。プローブにより相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点がもたらされる例では、プローブはプライマーであってもよい。
【００７９】
「ベクター」は、それと連結した別の核酸を細胞に導入するために使用することができるポリヌクレオチドである。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加的な核酸セグメントをライゲーションすることができる直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、この場合、追加的なＤＮＡセグメントをウイルスのゲノムに導入することができる。ある特定のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製開始点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を直接導くことができるベクターの一種である。
【００８０】
「調節配列」とは、それが作動可能に連結した核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす核酸である。調節配列は、例えば、その効果を、調節される核酸に対して直接発揮するものであってもよく、１種または複数種の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて発揮するものであってもよい。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ、およびＢａｒｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：３６０５〜０６頁に記載されている。
【００８１】
本明細書で使用される「作動可能に連結した」という用語は、目的の遺伝子に隣接した発現制御配列と、トランスに作用するまたは目的の遺伝子を制御する距離にある発現制御配列の両方を含む配列を指す。「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用される場合、それがライゲーションしたコード配列の発現およびプロセシングをもたらすために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合には、タンパク質の分泌を増強する配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物体に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む；真核生物では、一般に、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、発現およびプロセシングのために存在することが必須である全ての構成成分を含むことが意図されており、また、存在することが有利である追加的な構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含んでよい。
【００８２】
「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉであってもよく、真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。一般には、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸で形質転換することまたはそれをトランスフェクトすることができる培養細胞であり、次いで、ポリペプチドコード核酸を宿主細胞において発現させることができる。「組換え宿主細胞」という句は、発現させる核酸で形質転換されたまたはそれがトランスフェクトされた宿主細胞を示すために使用することができる。宿主細胞は、核酸を含むが、調節配列が宿主細胞に導入され、調節配列と核酸が作動可能に連結しない限りその核酸を所望のレベルでは発現しない細胞であってもよい。宿主細胞という用語は、特定の対象の細胞だけではなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。次の世代では、例えば変異または環境の影響に起因してある特定の改変が起こり得るので、そのような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用されるこの用語の範囲に含まれる。
【００８３】
「標識」または「標識された」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体への別の分子の組み入れを指す。一実施形態では、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射標識されたアミノ酸の組み入れ、または、印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分へのポリペプチドの付着である。別の実施形態では、標識またはマーカーは、治療用の、例えば、薬物コンジュゲートまたは毒素であってよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質への標識付けの種々の方法は当技術分野で公知であり、それを使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁気薬剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびその類似体または相同体。一部の実施形態では、潜在的な立体障害を低下させるために、標識を種々の長さのスペーサーアームによって付着させる。
【００８４】
「免疫原性」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体または抗原結合性断片の、レシピエントに投与された際に免疫応答（体液性または細胞性）を引き出す能力を指し、例えば、ＨＡＭＡ応答を含む。ＨＡＭＡ応答は、被験体由来のＴ細胞により、投与された抗体に対する免疫応答がなされると開始される。次いで、Ｔ細胞によりＢ細胞が動員されて、特異的な「抗抗体」抗体が生じる。
【００８５】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、生物学的障害および／またはそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和または抑止する方法を指す。本明細書で使用される場合、疾患、障害または状態を「緩和する」とは、その疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または出現頻度を低下させることを意味する。さらに、本明細書では、「処置」への言及は、治癒的処置、待機的処置および予防的処置への言及を含む。
【００８６】
ＧＲＰ７８抗原
ヒト細胞表面ＧＲＰ７８は、本明細書で使用される場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜６５０を含む：
【００８７】
【化１】
2016520527.tif 000002
【００８８】
アミノ酸残基６５１〜６５４（下線が引かれている）はＣ末端ペプチドを示す。
【００８９】
ヒト細胞表面ＧＲＰ７８は、本明細書で使用される場合、配列番号２に記載されている核酸配列の核酸１〜１９５０によりコードされる：
【００９０】
【化２】
2016520527.tif 000003
【００９１】
種々の実施形態では、細胞表面ＧＲＰ７８ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸の配列を含む。種々の実施形態では、細胞表面ＧＲＰ７８ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。
【００９２】
配列番号１の６５０アミノ酸配列内の所与の位置に存在するアミノ酸残基の付加、欠失、または置換への言及により、ＧＲＰ７８のポリペプチドバリアントが本明細書に記載され得る。したがって、例えば、「Ｖ２７Ｗ」という用語は、配列番号１の２７位の「Ｖ」（バリン、標準の１文字コード）残基が「Ｗ」（トリプトファン、標準の１文字コード）で置換されていることを示す。
【００９３】
抗体
ヒト細胞表面ＧＲＰ７８ポリペプチドに結合する新規の抗体を生成する方法は当業者に公知である。例えば、ＧＲＰ７８ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、マウスに、ＧＲＰ７８ポリペプチドを含む免疫原性組成物を、検出可能な免疫応答を刺激するために有効な量で投与するステップ、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を得、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生ハイブリドーマを得るステップ、および抗体産生ハイブリドーマを試験してＧＲＰ７８ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するステップを含み得る。ハイブリドーマが得られたら、それを細胞培養物中で、任意選択で、ハイブリドーマ由来の細胞によりＧＲＰ７８ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が産生される培養条件で増殖させる。モノクローナル抗体を細胞培養物から精製することができる。次いで、抗体：抗原相互作用を試験して特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。
【００９４】
例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫に依拠する方法を含めた、必要な特異性の抗体を作製または単離する他の適切な方法を使用することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：２５５１〜２５５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【００９５】
抗体は、多数のやり方で工学的に作製することができる。抗体は、単鎖抗体（小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）またはＳＭＩＰ（商標））、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などとして作出することができる。抗体は、ヒト化抗体、キメラ化抗体、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、または完全ヒト抗体であってよい。多数の刊行物に多くの種類の抗体およびそのような抗体を工学的に作製する方法が記載されている。例えば、米国特許第６，３５５，２４５号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第６，４０７，２１３号；同第６，５４８，６４０号；同第５，５６５，３３２号；同第５，２２５，５３９号；同第６，１０３，８８９号；および同第５，２６０，２０３号を参照されたい。
【００９６】
キメラ抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。例えば、マウス（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃをコードする領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等の部分で置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際特許出願第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻：１０４１〜１０４３頁）；Ｌｉｕら（１９８７年）ＰＮＡＳ  ８４巻：３４３９〜３４４３頁；Ｌｉｕら、１９８７年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９巻：３５２１〜３５２６頁；Ｓｕｎら（１９８７年）ＰＮＡＳ  ８４巻：２１４〜２１８頁；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７年、Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４７巻：９９９〜１００５頁；Ｗｏｏｄら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：４４６〜４４９頁；およびＳｈａｗら、１９８８年、Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０巻：１５５３〜１５５９頁）。
【００９７】
抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において記載されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲに加えて、非ヒトである供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、基本的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））の方法に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に、インタクトなヒト可変領域未満が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、一般には、いくつかの超可変領域残基および任意選択でいくつかのフレームワーク領域残基がげっ歯類抗体の類似の部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【００９８】
Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許第５，６９３，７６１号には、抗体をヒト化するためのＷｉｎｔｅｒらへの改良が開示されており、それは、ＣＤＲの結合可能なコンフォメーションへのフォールディングに干渉する立体的なまたは他の化学的な不適合性がマウス抗体に見出されるので、結合活性の喪失をヒト化フレームワーク内の構造モチーフにおける問題に帰するという前提に基づくものである。この問題に取り組むために、Ｑｕｅｅｎは、ヒト化するマウス抗体のフレームワーク配列と直鎖ペプチド配列が密接に相同であるヒトフレームワーク配列の使用を教示している。したがって、Ｑｕｅｅｎの方法では、フレームワーク配列を種間で比較することに焦点が当てられている。一般には、入手可能なヒト可変領域配列を全て、特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基との百分率同一性を算出する。百分率が最も高いヒト可変領域を選択して、ヒト化プロジェクトのためのフレームワーク配列をもたらす。Ｑｕｅｅｎは、ヒト化フレームワーク内に、ＣＤＲを結合可能なコンフォメーションに支持するために重要なマウスフレームワーク由来のある特定のアミノ酸残基を保持することが重要であることも教示している。分子モデルから潜在的な重要性を評価する。保持する候補の残基は、一般には、ＣＤＲと直鎖配列で近接するまたは任意のＣＤＲ残基の物理的に６Å以内にある残基である。
【００９９】
他の手法では、結合活性が低いヒト化構築物が得られたら、単一の残基をマウス配列に復帰変異させ、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）に記載されている通り抗原結合性をアッセイすることによって特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性を実験的に決定する。フレームワーク配列内の重要なアミノ酸を同定するための別の例示的な手法は、Ｃａｒｔｅｒらに対する米国特許第５，８２１，３３７号、およびＡｄａｉｒらに対する米国特許第５，８５９，２０５号により開示されている。これらの参考文献には、ヒト化抗体では対応するマウスアミノ酸で置換して結合活性を保存することが必要な場合があるフレームワーク内の特異的なＫａｂａｔ残基の位置が開示されている。
【０１００】
「フレームワークシャッフリング」と称される、抗体をヒト化する別の方法は、個々のヒト生殖細胞系列フレームワークのプールとインフレームで融合した非ヒトＣＤＲ可変領域を用いてコンビナトリアルライブラリーを生成することに依拠する（Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３頁（２００５年））。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、良好な結合性を保持するヒト化抗体をコードするクローンを同定する。
【０１０１】
ヒト化抗体の作出に使用する軽鎖と重鎖両方のヒト可変領域の選択は抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法に従って、げっ歯類抗体の可変領域の配列を公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体と対照してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体用のヒトフレームワーク領域（フレームワーク領域）として認める（Ｓｉｍｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年））。別の方法では、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
【０１０２】
ヒト可変領域を置換するための非ヒト残基の選択は、種々の因子に影響され得る。これらの因子としては、例えば、特定の位置におけるアミノ酸が稀であること、ＣＤＲまたは抗原との相互作用の確率、および軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの界面間の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの界面に関与する確率が挙げられる（例えば、米国特許第５，６９３，７６１号、同第６，６３２，９２７号、および同第６，６３９，０５５号を参照されたい）。これらの因子を分析するための１つの方法は、非ヒト配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用することによるものである。３次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定３次元コンフォメーション構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における可能性のある残基の役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大などの所望の抗体特性を実現するために、非ヒト残基を選択し、ヒト可変領域残基を置換することができる。
【０１０３】
完全ヒト抗体を作出するための方法は、当技術分野において記載されている。例として、抗ＧＲＰ７８抗体またはその抗原結合性断片を作製するための方法は、ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成するステップ、当該ライブラリーを、ＧＲＰ７８またはその抗体結合性部分を用いてスクリーニングするステップ、ＧＲＰ７８に結合するファージを単離するステップ、およびファージから抗体を得るステップを含む。別の例として、ファージディスプレイ技法において使用するための抗体のライブラリーを調製するための１つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を、ＧＲＰ７８またはその抗原性部分を用いて免疫して免疫応答を生じさせるステップ、免疫した動物から抗体産生細胞を抽出するステップ、抽出された細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを単離するステップ、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップ、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ、およびｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入し、したがって、抗体を、ファージ上に発現させるステップを含む。このように本発明の組換え抗ＧＲＰ７８抗体を得ることができる。
【０１０４】
本発明の組換えヒト抗ＧＲＰ７８抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。ライブラリーは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡから調製したヒトＶＬ  ｃＤＮＡおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーであることが好ましい。そのようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法は当技術分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおいて使用することができる他の方法および試薬も存在する（例えば、それぞれがファージディスプレイライブラリーの調製およびスクリーニングに関する教示のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９１／１７２７１号、同第ＷＯ９２／２０７９１号、同第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９３／０１２８８号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１３７０〜１３７２頁（１９９１年）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３巻：８１〜８５頁（１９９２年）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１３７３〜１３７７頁（１９９１年）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）；およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照されたい）。
【０１０５】
ヒト抗体は、ゲノム内にヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の一部または全部を含む非ヒト、トランスジェニック動物、例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．／Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．−−  Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）を、ヒトＩｇＥ抗原を用いて免疫することによっても作製される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生が欠損した、工学的に操作されたマウス系統である。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７巻：１３〜２１頁（１９９４年）、ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１３０，３６４号、同第６，１６２，９６３号および同第６，１５０，５８４号を参照されたい。ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９９／４５０３１、ＷＯ９９／５３０４９、ＷＯ００／０９５６０、およびＷＯ００／０３７５０４も参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒト抗体を生成する。一部の実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、メガベースサイズのヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の生殖細胞系列立体配置断片を酵母人工染色体（ＹＡＣ）に導入することにより、ヒト抗体Ｖ遺伝子レパートリーのおよそ８０％を含有させたものである。他の実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒトラムダ軽鎖遺伝子座のほぼ全てをさらに含有する。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５巻：１４６〜１５６頁（１９９７年）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８巻：４８３〜４９５頁（１９９８年）、およびＷＯ９８／２４８９３を参照されたい（完全ヒト抗体の調製に関する教示のためにそれぞれの全体が参照により組み込まれる）。別の態様では、本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を、ＧＲＰ７８抗原を用いて免疫することによって、非ヒト、非マウス動物から抗ＧＲＰ７８抗体を作出するための方法を提供する。そのような動物は、上記の引用文書に記載の方法を使用して作製することができる。
【０１０６】
抗ＧＲＰ７８抗体の同定
本発明は、ＧＲＰ７８の作用を阻害および中和するモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、細胞表面ＧＲＰ７８に結合し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を通じたシグナル伝達を阻害する。本発明の抗体は、ＭＡｂ１５９と称されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗体を含む。
【０１０７】
候補抗ＧＲＰ７８抗体を、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタン免疫ブロッティング、または他の免疫化学的技法によって試験した。個々の抗体を特徴付けるために実施したアッセイは以下を含むものであった：１）腫瘍細胞アポトーシスを促進し、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を阻害する能力；２）ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍には局在化するが正常な器官には局在化しない能力；３）種々の異種移植腫瘍の成長および腫瘍転移を阻害する能力；４）腫瘍異種移植片において、増殖を減少させ、アポトーシスを誘導し、腫瘍脈管構造に障害を生じさせ、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を阻害する能力；５）Ｐｔｅｎ欠失により誘導される白血病誘発を抑制する能力；６）腫瘍転移を阻害する能力ならびに７）ＰＴＥＮ欠失により誘導される前立腺および子宮がん進行および白血病誘発を抑制する能力。実験の詳細は実施例に記載されている。
【０１０８】
本発明の抗体は、それらの交差反応性に関して記載または特定することもできる。ヒト細胞表面ＧＲＰ７８に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性を有する（当技術分野で公知の方法および本明細書に記載の方法を使用して算出される）、ＧＲＰ７８ポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。
【０１０９】
本発明の抗ＧＲＰ７８抗体と同じエピトープに結合する抗体も本発明に含まれる。抗体が、本発明の抗ＧＲＰ７８抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合について競合し得るかどうかを決定するために、交差遮断アッセイ、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。例示的な競合ＥＬＩＳＡアッセイでは、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングしたＧＲＰ７８を、候補競合抗体を伴ってまたは伴わずにプレインキュベートし、次いで、ビオチン標識した本発明の抗ＧＲＰ７８抗体を添加する。ウェル中のＧＲＰ７８抗原に結合した標識された抗ＧＲＰ７８抗体の量を、アビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を使用して測定する。抗体は、放射標識または蛍光標識、またはいくつかの他の検出可能であり測定可能である標識を用いて標識することができる。抗原に結合した標識された抗ＧＲＰ７８抗体の量は、候補競合抗体（試験抗体）の、同じエピトープへの結合について競合する能力と間接的に相関する、すなわち、同じエピトープに対する試験抗体の親和性が大きいほど、抗原をコーティングしたウェルに結合する標識された抗体が少なくなる。候補競合抗体は、候補抗体が、並行して候補競合抗体の不在下で実施された対照と比較して、ＧＲＰ７８抗体の結合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、なおより好ましくは少なくとも５０％遮断し得る場合に、同じエピトープに実質的に結合する抗体、または本発明の抗ＧＲＰ７８抗体と同じエピトープへの結合について競合する抗体であるとみなされる。このアッセイの変形を実施して、同じ定量値を得ることができることが理解されよう。
【０１１０】
種々の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２３、２５、２７または２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインの配列と、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個または０個の残基のみが異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、そのような配列の差異のそれぞれは、独立に、１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３、２５、２７または２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２４、２６、２８または３０の配列を有するポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２４、２６、２８または３０の配列を有する軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２４、２６、２８または３０の配列を有する軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。
【０１１１】
種々の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９および２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインの配列と、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個または０個の残基のみが異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、そのような配列の差異のそれぞれは、独立に、１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１３、１５、１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１４、１６、１８、２０または２２の配列を有するポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１４、１６、１８、２０または２２の配列を有する重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１４、１６、１８、２０または２２の配列を有する重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。
【０１１２】
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知の任意の定常領域を含んでよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域であってよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型、ＩｇＧ型およびＩｇＭ型重鎖定常領域であってよい。ある特定の実施形態では、軽鎖または重鎖定常領域は、天然に存在する定常領域の断片、誘導体、バリアント、または変異タンパク質である。
【０１１３】
本発明の種々の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号９：
【０１１４】
【化３】
2016520527.tif 000004
【０１１５】
に記載されている重鎖可変領域配列、および配列番号１１：
【０１１６】
【化４】
2016520527.tif 000005
【０１１７】
に記載されている軽鎖可変領域を含むマウス抗体である。
【０１１８】
種々の実施形態では、抗体は、配列番号２１：
【０１１９】
【化５】
2016520527.tif 000006
【０１２０】
に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２３：
【０１２１】
【化６】
2016520527.tif 000007
【０１２２】
に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１２３】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号２１に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２２：
【０１２４】
【化７】
2016520527.tif 000008
【０１２５】
に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、
軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２３に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２４：
【０１２６】
【化８】
2016520527.tif 000009
【０１２７】
に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１２８】
種々の実施形態では、抗体は、配列番号１５：
【０１２９】
【化９】
2016520527.tif 000010
【０１３０】
に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、配列番号２７：
【０１３１】
【化１０】
2016520527.tif 000011
【０１３２】
に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１３３】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１５に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号１６：
【０１３４】
【化１１】
2016520527.tif 000012
【０１３５】
に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、
軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２７に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２８：
【０１３６】
【化１２】
2016520527.tif 000013
【０１３７】
に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１３８】
種々の実施形態では、抗体は、配列番号１３：
【０１３９】
【化１３】
2016520527.tif 000014
【０１４０】
に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および上で定義されている配列番号２３に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１４１】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号１４：
【０１４２】
【化１４】
2016520527.tif 000015
【０１４３】
に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、
軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、上で定義されている配列番号２３に記載されているアミノ酸配列、または、上で定義されている、その対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１４４】
種々の実施形態では、抗体は、配列番号１７：
【０１４５】
【化１５】
2016520527.tif 000016
【０１４６】
に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、配列番号２５：
【０１４７】
【化１６】
2016520527.tif 000017
【０１４８】
に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１４９】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１７のいずれかに記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号１８：
【０１５０】
【化１７】
2016520527.tif 000018
【０１５１】
に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、
軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２５に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２６：
【０１５２】
【化１８】
2016520527.tif 000019
【０１５３】
に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１５４】
種々の実施形態では、抗体は、配列番号１９：
【０１５５】
【化１９】
2016520527.tif 000020
【０１５６】
に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、上で定義されている配列番号２５に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１５７】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１９のいずれかに記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２０：
【０１５８】
【化２０】
2016520527.tif 000021
【０１５９】
に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、
軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、上で定義されている配列番号２５に記載されているアミノ酸配列、または、上で定義されている、その対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１６０】
種々の実施形態では、抗体は、上で定義されている配列番号１９に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９：
【０１６１】
【化２１】
2016520527.tif 000022
【０１６２】
に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【０１６３】
ある特定の代替的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、上で定義されている配列番号１９のいずれかに記載されているアミノ酸配列、または、上で定義されている、その対応するポリヌクレオチド配列である配列番号２０に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２９に記載されているアミノ酸配列、またはその対応するポリヌクレオチド配列である配列番号３０：
【０１６４】
【化２２】
2016520527.tif 000023
【０１６５】
に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１６６】
【表１−１】
2016520527.tif 000024
【０１６７】
診断への使用
ＧＲＰ７８を発現する細胞、例えば、前立腺がん、子宮がん、乳がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、および頭頸部がんなどを検出するための方法を含めた、ＧＦＰ７８を検出するための方法が本発明で提供される。これらの方法は、被験体由来の試料を本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップを含み得る。当該方法は、原発腫瘍を検出するために使用することもでき、転移を検出するために使用することもできる。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、被験体におけるがんを検出するまたはがんの診断を確認するための方法が提供される。当該方法は、被験体由来の生体試料を本発明の単離された抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップおよび単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の試料への結合を検出するステップを含む。単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の試料への結合が、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の対照試料への結合と比較して増加することにより、被験体におけるがんが検出されるまたは被験体におけるがんの診断が確認される。対照は、がんを有さないことが分かっている被験体由来の試料であってもよく、標準値であってもよい。試料は、これだけに限定されないが、生検材料、剖検材料および病理検体由来の組織を含めた任意の試料であってよい。生体試料は、組織の切片、例えば、組織学的目的のために取得された凍結切片も含む。生体試料は、血液、血清、血漿、痰、および脊髄液などの体液をさらに含む。
【０１６９】
一実施形態では、血液試料などの生体試料中のＧＲＰ７８を検出するためのキットが提供される。ポリペプチドを検出するためのキットは、一般には、本明細書に開示されている抗体のいずれかなどの、ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト抗体を含む。一部の実施形態では、キットにはＦｖ断片などの抗体断片が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用するためには、抗体はｓｃＦｖ断片であってよい。さらなる実施形態では、抗体を標識する（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識を用いて）。
【０１７０】
一実施形態では、キットは、ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の使用手段を開示する説明用材料を含む。説明用材料は、電子形式で書かれたもの（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスクなど）であってもよく、視覚的なもの（例えば、ビデオファイルなど）であってもよい。キットは、キットを設計する目的の特定の適用を容易にするための追加的な構成成分も含んでよい。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含有し得る。キットは、さらに、特定の方法を実施するために常套的に使用される緩衝液および他の試薬を含み得る。そのようなキットおよび適切な含有量は当業者には周知である。
【０１７１】
一実施形態では、診断用キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、使用する特定の形式に伴って変動し得るが、生体試料中のＧＲＰ７８を検出する方法は、一般に、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下でＧＲＰ７８と特異的に反応する抗体と接触させるステップを含む。抗体を免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合させて免疫複合体を形成し、免疫複合体（結合した抗体）の存在を直接的または間接的に検出する。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は診断目的で標識されていても標識されていなくてもよい。一般には、診断アッセイは、抗体のＧＲＰ７８への結合によってもたらされる複合体の形成を検出することを伴う。抗体は直接標識されていてよい。これだけに限定されないが、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含めた、種々の標識を使用することができる。多数の適切なイムノアッセイは、当業者には公知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号；および同第４，０９８，８７６号を参照されたい）。標識されていない場合、抗体を凝集アッセイなどのアッセイに使用することができる。標識されていない抗体は、第１の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体または標識されていない免疫グロブリンに特異的な他の抗体）と反応性である標識された抗体（例えば、第２の抗体）または他の適切な試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）などの、抗体を検出するために使用することができる別の（１種または複数種の）適切な試薬と組み合わせて使用することもできる。
【０１７３】
本明細書において提供される抗体または抗原結合性断片は、ある特定の疾患に対する哺乳動物の易罹患性を検出する方法においても使用することができる。例示のために、当該方法を使用して、哺乳動物における、細胞上に存在するＧＲＰ７８の量および／またはＧＲＰ７８陽性細胞の数に基づいて進行する疾患に対する哺乳動物の易罹患性を検出することができる。一実施形態では、本出願は、腫瘍に対する哺乳動物の易罹患性を検出する方法を提供する。この実施形態では、試験される試料を、ＧＲＰ７８またはその一部に結合する抗体と、前記抗体の当該試料への結合に適した条件下で接触させ、ここで、試料は、正常な個体においてＧＲＰ７８を発現する細胞を含む。腫瘍に対する個体の易罹患性を示すものである抗体の結合および／または結合の量を検出し、ここで、受容体のレベルが高いことが、腫瘍に対する個体の易罹患性の増大と相関する。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片をｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断に使用することができる。例えば、ＭＡｂ１５９は表面ＧＲＰ７８を特異的に認識し、したがって、個人向けの薬のために腫瘍を画像化し、腫瘍における表面ＧＲＰ７８の量により疾患の進行および療法に対する応答が予測されるかどうかを決定するために使用することができる。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、検出することができる標識（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素の補因子であってよい）に付着している。活性部分は、鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃなどの放射性重金属などの放射性薬剤であってよい。そのような部分に付着させた結合性物質を、イメージング剤として使用し、ヒトなどの哺乳動物における診断に使用するめに有効な量で投与することができ、次いで、当該イメージング剤の局在化および蓄積を検出することができる。イメージング剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法または陽電子放出断層撮影法によって検出することができる。
【０１７６】
ＧＲＰ７８を対象とする抗体または抗原結合性断片を使用する免疫シンチグラフィーを使用して、がんおよび脈管構造を検出および／または診断することができる。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウム、または１２５ヨウ素で標識したＧＲＰ７８マーカーに対するモノクローナル抗体をそのようなイメージングに有効に使用することができる。当業者には明らかになる通り、投与される放射性同位元素の量は、放射性同位元素に左右される。当業者は、活性部分として使用される所与の放射性核種の特異的活性およびエネルギーに基づいて、投与するイメージング剤の量を容易に決めることができる。一般には、用量当たり０．１〜１００ミリキュリーのイメージング剤、または１〜１０ミリキュリー、または２〜５ミリキュリーを投与する。したがって、放射性部分とコンジュゲートした標的化部分を含むイメージング剤として有用な開示されている組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、一部の実施形態では１〜１０ミリキュリー、一部の実施形態では２〜５ミリキュリー、一部の実施形態では１〜５ミリキュリーを含む。
【０１７７】
治療的使用
ある特定の実施形態では、本出願は、腫瘍の成長を阻害するまたは低下させる方法およびがんに罹患している個体を処置する方法を提供する。これらの方法は、個体に上記の抗体または抗原結合性断片を治療有効量で投与するステップを伴う。これらの方法は、動物、より詳細にはヒトの治療的処置および予防的処置を特に目的としている。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本出願は、細胞を有効量の抗体または抗原結合性断片と接触させるステップを含む、アポトーシスを促進するための方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は内皮細胞である。
【０１７９】
本発明は、患者におけるがん細胞を処置する方法であって、前記患者に、薬学的に許容される担体中の本発明の抗体またはその抗原結合性断片を治療有効量で（単独療法として、または併用療法レジメンでのいずれかで）投与するステップを含み、そのような投与により、がん細胞の成長阻害および／または増殖が促進される方法を提供する。特に、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、がんと特徴付けられる障害の処置において有用である。そのような障害としては、これだけに限定されないが、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺のがんなどの固形腫瘍、およびそれらの遠隔転移、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫および白血病が挙げられる。乳がんの例としては、これだけに限定されないが、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、非浸潤性乳管癌、および非浸潤性小葉癌が挙げられる。気道のがんの例としては、これだけに限定されないが、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が挙げられる。脳がんの例としては、これだけに限定されないが、脳幹神経膠腫および視床下部神経膠腫、小脳星状細胞腫および大脳星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに神経外胚葉性および松果体腫瘍が挙げられる。男性生殖器の腫瘍としては、これだけに限定されないが、前立腺がんおよび精巣がんが挙げられる。女性生殖器の腫瘍としては、これだけに限定されないが、子宮内膜がん、子宮頸部がん、卵巣がん、膣がん、および外陰がん、ならびに子宮の肉腫が挙げられる。消化管の腫瘍としては、これだけに限定されないが、肛門がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、膵臓がん、直腸がん、小腸がん、および唾液腺がんが挙げられる。尿路の腫瘍としては、これだけに限定されないが、膀胱がん、陰茎がん、腎臓がん、腎盤がん、尿管がん、および尿道がんが挙げられる。眼がんとしては、これだけに限定されないが、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。肝臓がんの例としては、これだけに限定されないが、肝細胞癌（線維層板状の異型を伴うまたは伴わない肝細胞癌）、胆管細胞癌（肝内胆管癌）、および肝細胞・胆管細胞混合癌が挙げられる。皮膚がんとしては、これだけに限定されないが、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚がん、および非黒色腫皮膚がんが挙げられる。頭頸部がんとしては、これだけに限定されないが、鼻咽頭がん、および口唇・口腔がんが挙げられる。リンパ腫としては、これだけに限定されないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚のＴ細胞リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が挙げられる。肉腫としては、これだけに限定されないが、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が挙げられる。白血病としては、これだけに限定されないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、およびヘアリー細胞白血病が挙げられる。ある特定の実施形態では、がんは、ＰＩ３Ｋ活性が高いがん、例えば、前立腺がん、子宮がん、乳がん、骨髄性白血病、リンパ性白血病、小細胞肺がん、結腸がん、膵がん、神経膠腫、および頭頸部がんである。
【０１８０】
本出願は、被験体におけるがん細胞の成長を阻害する方法であって、有効量の抗体または抗原結合性断片を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。調節により、前記被験体のがん細胞の成長が、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％低下し得るまたは予防され得る。結果として、がんが固形腫瘍である場合、調節により、固形腫瘍のサイズが少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％縮小する。
【０１８１】
がん細胞増殖の阻害は、細胞に基づくアッセイ、例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の組み入れ（Ｈｏｓｈｉｎｏら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３８巻、３６９頁（１９８６年）；Ｃａｍｐａｎａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １０７巻：７９頁（１９８８年））；［．  ｓｕｐ．３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｈｅｎ，Ｊ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３巻：１３９５〜４０３頁（１９９６年）；Ｊｅｏｕｎｇ，Ｊ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０巻：１８３６７〜７３頁（１９９５年）；ｔｈｅ  ｄｙｅ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  ３４巻：２３９〜４６頁（１９９８年））などによって測定することができる。がん細胞の足場非依存性成長は、軟寒天におけるコロニー形成アッセイによって、例えば、軟寒天の上面に形成されるがん細胞コロニーの数を計数することによってなどで評価する（実施例およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年を参照されたい）。
【０１８２】
被験体におけるがん細胞成長の阻害は、被験体、例えば、動物モデルまたはヒト被験体におけるがんの成長をモニタリングすることによって評価することができる。１つの例示的なモニタリング方法は腫瘍形成能アッセイである。一実施例では、異種移植片は、既存の腫瘍または腫瘍細胞株に由来するヒト細胞を含む。腫瘍異種移植片アッセイは当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている（例えば、Ｏｇａｗａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９巻：６０４３〜６０５２頁（２０００年）を参照されたい）。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６９８，４１３号に記載されている中空繊維アッセイを使用して腫瘍形成能をモニタリングする。
【０１８３】
阻害の百分率は、モジュレーターによる処置下でのがん細胞増殖、足場非依存性成長、またはがん細胞成長を、陰性対照条件下（一般には、モジュレーター処置を伴わない）でのがん細胞増殖、足場非依存性成長、またはがん細胞成長と比較することによって算出される。例えば、がん細胞もしくはがん細胞コロニーの数（コロニー形成アッセイ）、またはＰＲＤＵもしくは［３Ｈ］−チミジンの組み入れがＡ（モジュレーターによる処置下）およびＣ（陰性対照条件下）である場合、阻害の百分率は（Ｃ−Ａ）／Ｃ×１００％になる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、開示されている本主題の方法を単独で使用することができる。あるいは、本主題の方法を、増殖性障害（例えば、腫瘍）の処置または予防を対象とする他の従来の抗がん治療的手法と組み合わせて使用することができる。例えば、そのような方法を、予防的がん予防において、外科手術後のがん再発および転移の予防において、ならびに他の従来のがん療法のアジュバントとして使用することができる。本出願では、抗体または抗原結合性断片を使用することにより、従来のがん療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および外科手術）の効果が増強され得ることが理解される。
【０１８５】
幅広い従来の化合物が抗悪性腫瘍活性を有することが示されている。これらの化合物は、化学療法において、固形腫瘍を縮小するため、転移およびさらなる成長を予防するため、または白血病性悪性腫瘍もしくは骨髄悪性腫瘍における悪性Ｔ細胞の数を減少させるために医薬品として使用されている。化学療法は種々の型の悪性腫瘍の処置において効果を示しているが、多くの抗悪性腫瘍化合物は、望ましくない副作用を誘導するものである。２種またはそれ超の異なる処置を組み合わせる場合、それらの処置は相乗的に機能し、処置のそれぞれの投薬量を減少させ、それにより、高投薬量で各化合物によりもたらされる有害な副作用を軽減することが可能になることが示されている。他の場合では、処置に対して不応性の悪性腫瘍が２種またはそれ超の異なる処置の併用療法には応答する可能性がある。
【０１８６】
本明細書に開示されている抗体または抗原結合性断片を、別の従来の抗悪性腫瘍剤と組み合わせて、同時にまたは逐次的に投与する場合、そのような抗体または抗原結合性断片により、抗悪性腫瘍剤の治療効果が増強され得る、またはそのような抗悪性腫瘍剤に対する細胞の耐性が克服され得る。これにより、抗悪性腫瘍剤の投薬量を減少させ、それにより、望ましくない副作用を軽減すること、または耐性Ｔ細胞における抗悪性腫瘍剤の効果を回復させることが可能になる。
【０１８７】
抗腫瘍併用療法のために使用することができる医薬化合物としては、ただ単に例示するためのものとして、以下が挙げられる：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。
【０１８８】
これらの化学療法用抗腫瘍化合物は、それらの作用機構により、例えば、以下の群にカテゴリー化することができる：代謝拮抗薬／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸アンタゴニストおよび関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））など；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然物、微小管撹乱物質、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））を含めた抗増殖／抗有糸分裂薬；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなど；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、それらの自体のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を取り除くＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば葉酸類似体（メトトレキセート）など；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解素（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌薬（ブレフェルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、およびプレドニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；増殖因子シグナルトランスダクションキナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；およびクロマチン撹乱物質。
【０１８９】
本抗体およびその抗原結合性断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてがん性細胞を直接死滅させるまたは除去するために利用することができる。直接死滅は、抗体（任意選択で細胞傷害性薬物と融合したもの）を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを伴う。一部の実施形態では、がんは、比較できる組織の非がん性細胞よりも高いレベルでＧＲＰ７８を発現しているがん細胞を含む。抗体はがん細胞上のＧＲＰ７８を認識するので、抗体が結合する細胞はいずれも破壊される。がん細胞を死滅させるまたは除去するために抗体を単独で使用する場合には、そのような死滅またはアブレーションは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣなどの内在性宿主免疫機能の開始によって成され得る。抗体がこのように細胞を死滅させるものであるかどうかを決定するためのアッセイは当業者の権限の範囲内である。
【０１９０】
医薬組成物
一態様では、本発明は、上記の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。したがって、本発明の医薬組成物、方法および使用は、以下に詳述されている通り、他の活性薬剤との組合せ（同時投与）の実施形態も包含する。
【０１９１】
一般に、本発明の抗体またはその一部は、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を伴う製剤として投与するために適している。「賦形剤」という用語は、本明細書では、本発明の化合物（複数可）以外の任意の成分を記載するために使用される。賦形剤（複数可）の選択は、特定の投与形式、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの因子に大きく左右される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」とは、生理的に適合性の任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せである。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれることが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、抗体の貯蔵寿命または効果を増強する湿潤剤または微量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝液である。本発明の医薬組成物およびそれらを調製するための方法は当業者には容易に明らかになるであろう。そのような組成物およびそれらを調製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）に見出すことができる。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、大量に、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として調製、包装、または販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、被験体に投与される活性成分の投薬量と同等、またはそのような投薬量の都合のよい一部分、例えば、そのような投薬量の２分の１または３分の１などである。
【０１９３】
当技術分野において許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与するための方法はいずれも、本発明の抗体および部分への使用に適し得る。
【０１９４】
本発明の医薬組成物は、一般には、非経口投与に適している。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、被験体の組織を物理的に突破し、その突破口を通じて医薬組成物を組織内に投与することを特徴とし、したがって、一般に血流内、筋肉内、または内臓内への直接投与をもたらす任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与は、これだけに限定されないが、組成物を注射することによって、外科的切開部を通じて組成物を適用することによって、組織浸透性非外科的創傷を通じて組成物を適用することによってなどで医薬組成物を投与することを含む。具体的には、非経口投与は、これだけに限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、滑液内への注射または注入；および腎臓透析による注入技法を含むことが意図されている。種々の実施形態は、静脈内経路および皮下経路を含む。
【０１９５】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、一般に活性成分を薬学的に許容される担体、例えば滅菌水または滅菌等張生理食塩水などと組み合わせて含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続的な投与に適した形態で調製、包装、または販売することができる。注射製剤は、単位剤形で、例えば、防腐剤を含有するアンプル中または複数回用量容器中に入った状態に調製、包装、または販売することができる。非経口投与用の製剤としては、これだけに限定されないが、懸濁剤、溶液、油性または水性のビヒクル中の乳剤、ペースト剤などが挙げられる。そのような製剤は、これだけに限定されないが、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤を含めた、１種または複数種の追加的な成分をさらに含んでよい。非経口投与用の製剤の一実施形態では、活性成分は、適切なビヒクル（例えば、滅菌発熱物質非含有水）を用いて再構成した後に、その再構成された組成物を非経口投与するための乾燥した（すなわち、粉末または顆粒状の）形態で提供される。非経口用製剤は、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくはｐＨを３〜９にするため）などの賦形剤を含有し得る水溶液も含むが、いくつかの適用については、滅菌非水溶液として、または、滅菌発熱物質非含有水などの適切なビヒクルと併せて使用する乾燥した形態としてより適切に製剤化される。例示的な非経口投与用形態は、滅菌水溶液、例えば、水性プロピレングリコールまたはブドウ糖溶液中溶液または懸濁剤を含む。所望であれば、そのような剤形を適切に緩衝することができる。他の有用な非経口的に投与可能な製剤は、活性成分を微結晶性の形態で、またはリポソーム調製物中に含む。非経口投与用の製剤は、即時放出および／または調整放出されるように製剤化することができる。調整放出製剤は、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出およびプログラミング放出を含む。
【０１９６】
例えば、一態様では、滅菌注射用溶液は、抗ＧＲＰ７８抗体を必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて上に列挙されている成分の１つまたは成分の組合せと一緒に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過したそれらの溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒径を維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１９７】
本発明の抗体は、鼻腔内にまたは吸入によって、一般には乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、または、例えば適切な薬学的に許容される賦形剤と混合した、構成部分が混合した粒子としてのいずれかで）、乾燥粉末吸入器から、加圧した容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは電気流体力学を使用して細かいミストを生じさせるアトマイザー）、またはネブライザーからのエアロゾル噴霧として、適切な噴射剤を使用してもしくは使用せずに、または点鼻剤として投与することもできる。
【０１９８】
加圧した容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、一般には、例えば、活性物質の分散、可溶化、または延長放出のために適した薬剤、噴射剤（複数可）を溶媒として含む、本発明の抗体の溶液または懸濁剤を含有する。
【０１９９】
乾燥粉末または懸濁剤の製剤に使用する前に、一般に、薬品を、吸入によって送達するために適したサイズまで微粒子化する（一般には、５ミクロン未満）。これは、例えば、スパイラルジェット破砕、流動床ジェット破砕、ナノ粒子を形成するための超臨界流体加工、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって実現することができる。
【０２００】
吸入器または吹き入れ器に使用するためのカプセル、ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、適切な粉末基剤および性能変更因子を含有するように製剤化することができる。
【０２０１】
メントールおよびレボメントールなどの適切な風味、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味剤を吸入／鼻腔内投与が意図された本発明の製剤に添加することができる。
【０２０２】
吸入／鼻腔内投与用の製剤は、即時放出および／または調整放出されるように製剤化することができる。調整放出製剤は、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出およびプログラミング放出を含む。
【０２０３】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合では、投薬量単位は、計量された量を送達する弁によって決定される。本発明による単位は、一般には、本発明の抗体の、計量された用量または「ひと吹き」が投与されるように準備される。全体的な１日用量は、一般には、単回用量で、または、通常は分割した用量として１日を通して投与される。
【０２０４】
本発明の抗体および抗体部分は、経口的な経路による投与のために製剤化することもできる。経口投与は、化合物が胃腸管に進入するように嚥下すること、および／または、化合物を口から直接血流に進入させる頬側投与、舌への投与、もしくは舌下投与を伴ってよい。
【０２０５】
経口投与に適した製剤としては、錠剤；多重微粒子またはナノ微粒子を含有する軟カプセル剤または硬カプセル剤、液剤、または散剤；ロゼンジ（液剤が充填されたものを含む）；チューズ；ゲル剤；速分散剤形；フィルム剤；膣坐薬（ｏｖｕｌｅ）；噴霧剤；および頬側／粘膜接着パッチなどの固体系、半固体系および液体系が挙げられる。
【０２０６】
液体製剤としては、懸濁剤、溶液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。そのような製剤は、軟カプセル剤または硬カプセル剤（例えば、ゼラチン製またはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）への充填剤として使用することができ、一般には、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、および１種または複数種の乳化剤および／または懸濁化剤を含む。液体製剤は、固体の再構成によって、例えば、サシェ剤から調製することもできる。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「同時投与される（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」および「と組み合わせて（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」という用語は、本発明の抗体および１種または複数種の他の治療剤に関しては、以下を意味し、指し、含むことが意図されている：本発明の抗体（複数可）と治療剤（複数可）のそのような組合せを、処置を必要とする患者に同時に投与することであって、そのような構成成分が、前記構成成分が実質的に同じ時間に前記患者に放出されるような単一の剤形に製剤化されている場合；本発明の抗体（複数可）と治療剤（複数可）のそのような組合せを、処置を必要とする患者に実質的に同時に投与することであって、そのような構成成分が、前記患者によって実質的に同じ時間に服用され、そこで、前記構成成分が実質的に同じ時間に前記患者に放出されるような、互いとは別に別個の剤形に製剤化されている場合；本発明の抗体（複数可）と治療剤（複数可）のそのような組合せを、処置を必要とする患者に逐次的に投与することであって、そのような構成成分が、連続した期間に前記患者によって各投与間に意味のある時間間隔を伴って服用され、そこで、前記構成成分が実質的に違う時間に前記患者に放出されるような、互いとは別に別個の剤形に製剤化されている場合；および、本発明の抗体（複数可）と治療剤（複数可）のそのような組合せを、処置を必要とする患者に逐次的に投与することであって、そのような構成成分が、前記構成成分が制御様式で放出され、そこで、それらが、同じ時間および／または違う時間に前記患者に同時に、継続的に、および／または重複して放出されるような、まとめて単一の剤形に製剤化されている場合であり、この場合、各部分は同じ経路によって投与することもでき、異なる経路によって投与することもできる。
【０２０８】
「治療有効量」とは、投与される治療剤の、処置される障害の症状の１つまたは複数をいくらかの程度まで軽減する量を指す。
【０２０９】
投薬レジメンは、最適な所望の応答がもたらされるように調整することができる。例えば、単回のボーラスを投与することもでき、いくつかの分割した用量を経時的に投与することもでき、治療状況によって示される通り用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与を容易にするため、および投薬量を均一にするために、非経口用組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、処置される患者／被験体に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の数量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の規格は、一般に、（ａ）化学療法剤の独特の特性および実現しようとする特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物の配合に関する技術分野における固有の限定によって規定され、直接左右される。
【０２１０】
したがって、本明細書において提供される本開示に基づいて、用量および投薬レジメンは治療的な技術分野において周知の方法に従って調整されることが当業者には理解されよ。すなわち、最大耐量を容易に確立することができ、また、検出可能な治療的利益を患者にもたらす有効量も決定することができ、同様に、検出可能な治療的利益を患者にもたらすための各作用剤の投与の時間的要件も決定することができる。したがって、ある特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されているが、これらの実施例は、決して、本発明の実施において患者にもたらすことができる用量および投与レジメンを限定するものではない。
【０２１１】
投薬量の値は、緩和しようとする状態の型および重症度に伴って変動してよく、単回用量または複数回用量を含んでよいことに留意すべきである。特定の被験体のいずれに対しても、具体的な投薬レジメンを、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に応じて経時的に調整するべきであること、ならびに、本明細書に記載されている投薬量範囲は単なる例示であり、特許請求された組成物の範囲または実施を制限するものではないことがさらに理解されるべきである。さらに、本発明の組成物を用いる投薬レジメンは、疾患の型、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体を含めた種々の因子に基づいてよい。したがって、投薬レジメンは広範に変動し得るが、標準の方法を使用して常套的に決定することができる。例えば、用量を、毒作用および／または検査値などの臨床効果を含み得る薬物動態パラメータまたは薬力学的パラメータに基づいて調整することができる。したがって、本発明は、当業者によって決定される患者内の用量漸増を包含する。適切な投薬量およびレジメンの決定は、関連する技術分野で周知であり、本明細書に開示されている教示が提供されれば、当業者により成されることが理解されよう。
【０２１２】
ヒト被験体への投与については、本発明の抗体または抗体部分の１ヶ月間の総用量は、一般には、当然、投与形式に応じて、患者当たり０．５〜１２００ｍｇの範囲内である。例えば、静脈内への１ヶ月間の用量は、患者当たり約１〜１０００ｍｇが必要になる場合がある。１ヶ月間の総用量は、単一用量または分割した用量で投与することができ、また、医師の自由裁量で、本明細書において示される典型的な範囲から外れ得る。
【０２１３】
本発明の抗体または抗体部分の治療的または予防的に有効な量の例示的な、非限定的な範囲は、１ヶ月当たり患者当たり１〜１０００ｍｇである。一実施形態では、本発明の抗体またはその一部は、１ヶ月当たり患者当たり約１〜２００ｍｇまたは１〜１５０ｍｇで投与することができる。
【０２１４】
免疫コンジュゲート
本出願は、さらに、エフェクター分子と直接または間接的にコンジュゲートした（または連結した）本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。この点について、「コンジュゲートした」または「連結した」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることを指す。連結は、化学的手段によるものであっても組換え手段によるものであってもよい。一実施形態では、連結は化学的なものであり、抗体部分とエフェクター分子の間の反応により、２つの分子間に共有結合が形成されて、１つの分子が形成される。任意選択で、ペプチドリンカー（短いペプチド配列）を抗体とエフェクター分子の間に含めることができる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子につなげる。他の実施形態では、体内半減期を増大させるために、エフェクター分子につなげた抗体または抗原結合性断片を脂質、タンパク質またはペプチドにさらにつなげる。したがって、種々の実施形態では、本開示の抗体を使用して、種々のエフェクター分子を送達することができる。
【０２１５】
エフェクター分子は、検出可能な標識、免疫毒素、サイトカイン、ケモカイン、治療剤、または化学療法剤であってよい。
【０２１６】
免疫毒素の特定の非限定的な例としては、これだけに限定されないが、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ、例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０など）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、コリックス（ｃｈｏｌｉｘ）毒素、またはそれらの改変毒素、または直接もしくは間接的に細胞の成長を阻害するもしくは細胞を死滅させる他の毒性薬剤が挙げられる。
【０２１７】
「サイトカイン」は、別の細胞に対して細胞間メディエーターとして作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質またはペプチドのクラスである。サイトカインは、免疫調節物質としての機能を果たし得る。サイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子および従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。したがって、複数の実施形態では、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ）；腫瘍壊死因子  スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバー；ヒト成長ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子、例えば、ＮＧＦ−βなど；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α；ＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）など；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−２１）、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、またはエンドスタチンを利用することができる。これらのサイトカインは、天然の供給源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質およびネイティブな配列のサイトカインの生物活性のある等価物を含む。
【０２１８】
ケモカインを本明細書に開示されている抗体とコンジュゲートすることもできる。ケモカインは、主に特定の白血球細胞亜型の化学誘引物質および活性化因子として作用する小さな（およそ約４〜約１４ｋＤａ）、誘導性の分泌される炎症促進サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカイン産生は、炎症性サイトカイン、増殖因子および病原体による刺激によって誘導される。ケモカインタンパク質は、保存されたアミノ酸配列モチーフに基づいてサブファミリー（アルファ、ベータ、およびデルタ）に分けられ、また、アミノ末端に近接する最初の２つのシステインの位置に基づいて４つの高度に保存された群−ＣＸＣ、ＣＣ、ＣおよびＣＸ３Ｃに分類される。現在まで、５０種を超えるケモカインが発見されており、少なくとも１８種のヒト７−膜貫通−ドメイン（７ＴＭ）ケモカイン受容体が存在する。使用されるケモカインとしては、これだけに限定されないが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１、およびフラクタルカインが挙げられる。
【０２１９】
治療剤は化学療法剤であってよい。当業者は、使用する化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、ＳｌａｐａｋおよびＫｕｆｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、８６章、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版；Ｐｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１７章、Ａｂｅｌｏｆｆ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第２版、．ＣＯＰＹＲＩＧＨＴ．  ２０００年、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ．、Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ．（編）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第２版、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９５年；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ  Ｓ、Ｋｎｏｂｆ  Ｍ  Ｆ、Ｄｕｒｉｖａｇｅ  Ｈ  Ｊ（編）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第４版、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９３年を参照されたい）。免疫コンジュゲートを調製するために有用な化学療法剤としては、アウリスタチン、ドラスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＡＦＰ、ＡＥＢ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、メルファラン、クロラムブシル、ビンカアルカロイド、５−フルオロウリジン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、トポテカン、ナイトロジェンマスタード、シトキサン、エトポシド、ＢＣＮＵ、イリノテカン、カンプトテシン、ブレオマイシン、イダルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセル、ならびにそれらの塩、溶媒および誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、アウリスタチンＥ（当技術分野ではドラスタチン−１０としても公知である）またはその誘導体およびその薬学的に許容される塩または溶媒和化合物である。典型的なアウリスタチン誘導体としては、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが挙げられる。アウリスタチンＥおよびその誘導体、ならびにリンカーの合成および構造は、例えば、米国特許出願公開第２００３００８３２６３号；米国特許出願公開第２００５０２３８６２９号；および米国特許第６，８８４，８６９号（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２２０】
エフェクター分子は、当業者に公知の任意の数の手段を使用して本発明の抗体または抗原結合性断片と連結することができる。共有結合性の付着手段および非共有結合性の付着手段のどちらを使用することもできる。エフェクター分子を抗体に付着させるための手順は、エフェクター分子の化学構造に応じて変動する。ポリペプチドは、一般には、エフェクター分子の結合をもたらすための抗体の適切な官能基との反応に利用可能である種々の官能基、例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）基、遊離のアミン（−ＮＨ２）基またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基などを含有する。あるいは、抗体を誘導体化して追加的な反応性官能基に曝露または付着させる。誘導体化には、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから入手可能な分子などのいくつものリンカーのいずれかを付着させることが伴う。リンカーは、抗体とエフェクター分子をつなぐために使用される任意の分子であってよい。リンカーは、抗体およびエフェクター分子の両方と共有結合を形成することができるものである。適切なリンカーは、当業者には周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーを、それらの側鎖を通じて構成物であるアミノ酸に（例えば、ジスルフィド結合を通じてシステインに）または末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基につなげることができる。
【０２２１】
一部の場合では、免疫コンジュゲートがその標的部位に到達したらエフェクター分子が抗体から遊離することが望ましい。したがって、これらの状況では、免疫コンジュゲートは、標的部位の付近で切断可能な連結を含む。エフェクター分子を抗体から放出させるためのリンカーの切断は、酵素活性または免疫コンジュゲートを標的細胞の内部または標的部位の付近に導く条件によって促すことができる。
【０２２２】
抗体とエフェクター分子をコンジュゲートするための手順は以前に記載されており、当業者の権限の範囲内である。例えば、酵素的に活性な免疫毒素のポリペプチドを調製するための手順は、それらの特定の教示のためにこれによって参照により組み込まれるＷＯ８４／０３５０８およびＷＯ８５／０３５０８に記載されている。他の技法は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４１巻：８３２〜８３９頁（１９８８年）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４６巻：１１０１〜１１０６頁（１９９０年）；Ｓｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号；Ｓｈｉｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１巻：４１９２頁、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ０２／０８８１７２；米国特許第６，８８４，８６９号；国際特許公開ＷＯ２００５／０８１７１１；米国特許出願公開第２００３−０１３０１８９Ａ号；および米国特許出願第２００８０３０５０４４号に記載されている。
【０２２３】
本発明の免疫コンジュゲートは、抗体または抗原結合性断片の免疫反応性を保持し、例えば、抗体または抗原結合性断片の抗原に結合する能力は、コンジュゲーション後にはコンジュゲーション前とほぼ同じであるか、それよりもほんのわずかだけ低下する。本明細書で使用される場合、免疫コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）とも称される。
【０２２４】
ポリヌクレオチドおよび抗体の発現
本出願は、さらに、抗ＧＲＰ７８抗体またはその抗原結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝暗号の縮重が原因で、種々の核酸配列が各抗体アミノ酸配列をコードする。本出願は、さらに、例えば本明細書で定義されているストリンジェントなまたは低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、ｈＧＲＰ７８に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【０２２５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、これだけに限定されないが、約４５℃で６×ＳＳＣ中、フィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせ、その後、約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄すること、高度にストリンジェントな条件、例えば、約４５℃で６×ＳＳＣ中、フィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせ、その後、約６０℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１回または複数回洗浄することなど、または任意の他の当業者に公知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．  Ｍ．ら編  １９８９年  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、６．３．１〜６．３．６頁および２．１０．３頁を参照されたい）。
【０２２６】
当技術分野で公知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを化学的に合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７巻：２４２頁（１９９４年）に記載の通り）、これは、簡単に述べると、抗体をコードする配列の一部を含有する重複したオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションし、次いで、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅することを伴う。一実施形態では、使用するコドンは、ヒトまたはマウスに典型的なコドンを含む（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻：２９２頁（２０００年）を参照されたい）。
【０２２７】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から生成することもできる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手不可能であるが抗体分子の配列は既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、適切な供給源（例えば、抗体を発現している任意の組織もしくは細胞、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などから生成された抗体ｃＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端および５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、化学的に合成することまたは入手することができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２２８】
本発明は、本発明のＧＲＰ７８ポリペプチドおよび／または抗ＧＲＰ７８抗体を発現する宿主細胞も対象とする。原核生物（細菌）発現系および真核生物発現系（例えば、酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物および他の動物の細胞、トランスジェニック動物、およびハイブリドーマ細胞など）、ならびにファージディスプレイ発現系を含めた、当技術分野で公知の多種多様な宿主発現系を使用して、本発明の抗体を発現させることができる。
【０２２９】
本発明の抗体は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子を宿主細胞において組換え発現させることによって調製することができる。組換えによって抗体を発現させるために、抗体の免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する１つまたは複数の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞に対して形質転換、形質導入、感染などを行い、したがって、軽鎖および／または重鎖を宿主細胞において発現させる。重鎖および軽鎖は、１つのベクター内にあるそれらが作動可能に連結した異なるプロモーターからそれぞれ独立に発現させることができる、あるいは、重鎖および軽鎖は、１つが重鎖を発現し、１つが軽鎖を発現する２つのベクター内にあるそれらが作動可能に連結した異なるプロモーターからそれぞれ独立に発現させることができる。任意選択で、重鎖および軽鎖を異なる宿主細胞において発現させることができる。
【０２３０】
さらに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体軽鎖および／または重鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしてよい。抗体軽鎖および／または重鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで作動可能に連結するようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても異種シグナルペプチドであってもよい。組換え抗体が宿主細胞を培養する培地中に分泌され、そこから抗体を回収または精製することができることが好ましい。
【０２３１】
ＨＣＶＲをコードする単離されたＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒトならびに他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、例えば、標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、Ｋａｂａｔ（上記）に記載の通り、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）またはサブクラスの定常領域および任意のアロタイプのそのバリアントであってよい。
【０２３２】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はカッパ定常領域であってもラムダ定常領域であってもよい。
【０２３３】
抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子（複数可）に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子（複数可）の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、必要に応じて、抗体鎖遺伝子（複数可）の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選出、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に左右される。哺乳動物宿主細胞での発現に好ましい調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））および／またはポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質の発現を導くウイルス性エレメントが挙げられる。
【０２３４】
さらに、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列などの追加的な配列（例えば、複製開始点）および１種または複数種の選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる。例えば、一般には、選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性が付与される。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子（ｄｈｆｒマイナス宿主細胞においてメトトレキセート選択／増幅と共に使用するためのもの）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびＧＳ陰性細胞株（例えば、ＮＳＯなど）における選択／増幅のためのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）。
【０２３５】
軽鎖および／または重鎖を発現させるために、重鎖および／または軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）を宿主細胞に、標準の技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、感染症などによって導入する。理論的には原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞が好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。これは、そのような細胞の方が、適正にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を集合させ、分泌する可能性が高いからである。本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９巻：６０１〜２１頁、１９８２年に記載されている通り、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用する、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：４２１６〜２０頁、１９８０年に記載のｄｈｆｒマイナスＣＨＯ細胞を含む］、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２／０細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入した場合、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、より好ましくは、当技術分野で公知の適切な条件下で宿主細胞を成長させる培養培地への抗体の分泌が可能になるのに十分な期間にわたって培養することによって抗体を産生させる。抗体は、標準の精製方法を使用して宿主細胞および／または培養培地から回収することができる。
【０２３６】
宿主細胞は、インタクトな抗体の一部または断片、例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を従来の技法によって産生させるためにも使用することができる。例えば、宿主細胞を本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコードするＤＮＡでトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えＤＮＡ技術を使用して、ヒトＧＲＰ７８への結合には必要ない軽鎖および重鎖のいずれかまたはその両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去することもできる。そのような短縮されたＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。
【０２３７】
本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む１つまたは複数のベクターまたは構築物を含むことが好ましい。例えば、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入された細胞であり、前記ベクターは、本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドおよび／または本発明のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明は、本発明の２つのベクターであって、１つが本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、１つが本発明の抗体に存在するＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、それぞれが、高レベルの遺伝子の転写を駆動するためにエンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来するもの、例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント）に作動可能に連結したベクターが導入された宿主細胞も提供する。
【０２３８】
発現させたら、本発明のインタクトな抗体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性（例えば、プロテインＡ）、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めた当技術分野の標準の手順に従って精製することができる。治療用抗体を精製するための標準の手順は、例えば、Ｆｅｎｇ  Ｌ１、Ｊｏｅ  Ｘ．  Ｚｈｏｕ、Ｘｉａｏｍｉｎｇ  Ｙａｎｇ、Ｔｉｍ  Ｔｒｅｓｓｅｌ、およびＢｒｉａｎ  Ｌｅｅ、論文標題「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００５年９月／１０月）（治療用抗体の精製に関する教示のためにその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。さらに、組換えによって発現させた抗体調製物からウイルスを除去するための標準の技法も当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｒｄ  ＫｅｒｎおよびＭａｎｉ  Ｋｒｉｓｈｎａｎ、「Ｖｉｒａｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ」（Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００６年１０月）を参照されたい）。治療用抗体の調製物からウイルスを除去するための濾過の効果は、少なくとも一部において、濾過される溶液中のタンパク質および／または抗体の濃度に左右されることが公知である。本発明の抗体の精製プロセスは、１つまたは複数のクロマトグラフィー操作の主流からウイルスを除去するために濾過するステップを含み得る。医薬品グレードのナノフィルターを通して濾過してウイルスを除去する前に、本発明の抗体を含有するクロマトグラフィーの主流を希釈または濃縮して総タンパク質量および／または全抗体濃度を約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌにすることが好ましい。ナノフィルターは、ＤＶ２０ナノフィルター（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．）であることがなおより好ましい。医薬用途には、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％または約９６％均一である実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、約９８〜約９９％またはそれ超均一であることが最も好ましい。部分的にまたは所望の均一性まで精製されたら、次いで、滅菌抗体を本明細書に記載の通り治療的に使用することができる。
【０２３９】
上述の考察を考慮して、本発明は、さらに、これだけに限定されないが、本発明の抗体をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換し、したがって、核酸を発現する、哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞、トランスジェニック動物細胞、またはトランスジェニック植物細胞を含めた宿主細胞を培養するステップ、任意選択で、宿主細胞培養培地から抗体を回収するステップを含むプロセスによって得られる抗体を対象とする。
【０２４０】
ある特定の態様では、本出願は、ハイブリドーマ細胞株、およびこれらのハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体を提供する。開示されている細胞株は、モノクローナル抗体の産生以外にも使用される。例えば、細胞株を他の細胞（例えば、適切に薬物で印を付けたヒト骨髄腫、マウス骨髄腫、ヒト−マウス異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）またはヒトリンパ芽球様の細胞など）と融合して、追加的なハイブリドーマを作製し、したがって、モノクローナル抗体をコードする遺伝子の移入をもたらすことができる。さらに、当該細胞株は、単離し、発現させることができる抗ＧＲＰ７８免疫グロブリン鎖をコードする核酸の供給源として使用することができる（例えば、任意の適切な技法を使用して他の細胞に移入した際に（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい））。例えば、再構成された抗ＧＲＰ７８軽鎖または重鎖を含むクローンを単離することもでき（例えば、ＰＣＲによって）、細胞株から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、抗ＧＲＰ７８免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンを単離することもできる。したがって、抗体の重鎖および／または軽鎖またはその一部をコードする核酸は、種々の宿主Ｔ細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系において特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのバリアント（例えば、ヒト化免疫グロブリン）を産生させるための組換えＤＮＡ技法に従って得、使用することができる。例えば、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖などのバリアントをコードするｃＤＮＡまたはその誘導体を含む核酸を適切な原核生物ベクターまたは真核生物ベクター（例えば、発現ベクター）内に入れ、適切な宿主Ｔ細胞に適切な方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、感染症）によって導入し、したがって、核酸を１つまたは複数の発現制御エレメント（例えば、ベクター内、または宿主Ｔ細胞ゲノムに組み込まれる）に作動可能に連結することができる。産生のために、宿主Ｔ細胞を、発現に適した条件下（例えば、誘導因子の存在下、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補給剤などを補充した適切な培地の存在下）で維持することができ、それにより、コードされるポリペプチドが産生される。所望であれば、コードされるタンパク質を回収し、かつ／または単離することができる（例えば宿主Ｔ細胞または培地から）。産生方法は、トランスジェニック動物の宿主Ｔ細胞における発現を包含することが理解されよう（例えば、ＷＯ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９２年３月１９日公開を参照されたい）（その全体が参照により組み込まれる）。
【０２４１】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するために提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１）
表面ＧＲＰ７８を特異的に標的とするモノクローナル抗体の生成
ヒトＧＲＰ７８（アミノ酸１〜６５０；ＫＤＥＬを有さないモチーフ）およびＣ末端にヘキサヒスチジンタグを有するヒトＧＲＰ７８（ＧＲＰ７８−Ｈｉｓと称される）を構築し、２９３Ｔ細胞において一過性に発現させ、ニッケル−ＮＴＡカラム（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって精製し、免疫原として使用した。ＧＲＰ７８−Ｈｉｓの推定純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色に基づいて、９５％よりも高かった（図１Ａ）。
【０２４３】
雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、マウス当たり５０μｇのＧＲＰ７８−Ｈｉｓを用いて腹腔内に（ｉ．ｐ．）３回（２週間ごと）免疫した。抗原は、最初の免疫ではＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’  ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との１：１混合物として注射し、２回目と３回目の用量はＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との１：１混合物として注射した。マウスに、２０μｇのＧＲＰ７８−Ｈｉｓを用い、尾部静脈注射によって最終的な追加刺激を与え、４日後に、ＡＴＣＣ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）からの骨髄腫細胞株ＮＳ０と融合するために脾細胞を採取した。ハイブリドーマの上清を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と融合したＧＲＰ７８（ＫＤＥＬを有さない）を免疫沈降させる抗体についてスクリーニングした。選択されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をＢＤ  ＣＥＬＬｉｎｅ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で製造者のプロトコールに従って産生させた。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いてＭＡｂを精製した。ＭＡｂの推定純度は、ＨＰＬＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色に基づいて、９５％よりも高かった。
【０２４４】
ＭＡｂ１５９と称される、精製されたマウスモノクローナル抗体のうちの１つをさらなる分析のために選択した。ＭＡｂ１５９は、配列番号９に記載されている重鎖可変領域配列および配列番号１１に記載されている軽鎖可変領域配列を含む。ＭＡｂ１５９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１０および配列番号１２に記載されている核酸配列によりコードされる。
【０２４５】
（実施例２）
表面ＧＲＰ７８を標的とするモノクローナル抗体の特徴付け
Ａ．結合親和性
ＭＡｂ１５９の抗原に対する結合親和性を、以前に記載されている通り（Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、２０１０年）スキャッチャードアッセイによって決定した。ＭＡｂ１５９はヒトＧＲＰ７８に対して高親和性を有する（ＫＤ＝１．７ｎＭ）（図１Ｂ）。
【０２４６】
Ｂ．結合特異性
乳癌ＭＣＦ７細胞を、３００ｎＭのタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｉｎ）またはＤＭＳＯを用いて１６時間にわたって処理し、全細胞溶解物を、ＭＡｂ１５９（赤色のシグナル）およびＨＳＰ７０抗体（緑色のシグナル）を使用したウエスタンブロッティングに供した。全細胞溶解物２０μｇを４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に流し、ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に転写した。どちらの抗体にも同じ膜を使用した。ＴＢＳ中５％脱脂粉乳および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて４０分膜をブロッキングし、次いで、１μｇ／ｍｌの一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。膜を３回、それぞれ１０分洗浄し、二次ＨＲＰ標識またはＩＲＤｙｅ標識した二次抗体と一緒に４０分インキュベートした。ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＦｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用してＨＲＰシグナルを検出し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によってＩＲＤｙｅシグナルを検出した。ＭＡｂ１５９は、タプシガルギン処理後に有意に誘導されたＧＲＰ７８のみを認識し、ＭＡｂ１５９はＧＲＰ７８の最も近いパラログであるＨＳＰ７０に対する交差反応性は有さなかった（データは示していない）。
【０２４７】
Ｃ．結合特異性（がん細胞対正常な細胞）
正常な細胞および種々のがん細胞をＭＡｂ１５９と一緒に４℃でインキュベートした。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。表面ＧＲＰ７８染色（緑色）は、がん細胞Ｃ４−２Ｂ（前立腺がん細胞）およびＭＣＦ７（乳癌細胞）の表面には見ることができたが、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＤ）には見ることができなかった（図１Ｃ）。２日間のグルコース欠乏により、ＭＣＦ７細胞上の表面ＧＲＰ７８のレベルが有意に上昇した（図１Ｃ、左下）。これは、表面ＧＲＰ７８ががん細胞にのみに存在し、細胞がストレス下にあるとその量が有意に増加するという以前の所見と一致する（Ｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｊ．、２巻：１８１〜１８８頁、２０１１年；Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０巻：１５０６５〜１５０７５頁、２０１０年）。
【０２４８】
Ｄ．結合特異性（ヒトＧＲＰ７８対マウスＧＲＰ７８）
マウスＧＲＰ７８は、ヒトＧＲＰ７８に対してアミノ酸が９９％保存されている。図７Ａに示されている通り、免疫ブロットアッセイにおいて、ＭＡｂ１５９はＧｒｐ７８  ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄマウスから調製したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）溶解物におけるＧＲＰ７８タンパク質バンドを認識した。ＧＲＰ７８バンドは、ＭＥＦをｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するアデノウイルスで処理することによってＧｒｐ７８対立遺伝子を欠失させた場合にはｃ７８ｆ／ｆ  ＭＥＦに存在しなかった。抗β−アクチン抗体を用いてブロットを再度探索して、両方のレーンにおける同等のタンパク質ローディングを確認した。これらの結果により、ＭＡｂ１５９がマウスタンパク質溶解物中のＧＲＰ７８のみと免疫反応することも示され、これにより、その特異性が確認される（図７Ａ）。
【０２４９】
Ｅ．抗体エンドサイトーシス
ＭＡｂ１５９を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からのＥＺ連結ビオチンヒドラジドを製造者の手順に従って用いてビオチン化した。グルコースを欠乏させた（２日間）ＭＣＦ７細胞を、１０μｇ／ｍＬのビオチン化ＭＡｂ１５９を用い、３７℃または４℃で１時間処理した。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、０．１％トリトンＸ−１００を用いて透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で３０分染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを用いて画像を取得した。細胞を通常の成長温度（３７℃）でインキュベートした場合、４℃での、エンドサイトーシスが妨げられる細胞表面の細かい環様の外観と比較して、ＭＡｂ１５９はエンドサイトーシスを受け、細胞内エンドソームに局在した（緑色）、すなわち、エンドサイトーシスは３７℃でのみ観察された。
【０２５０】
（実施例３）
がん細胞およびがん幹細胞における表面ＧＲＰ７８発現
下の材料および方法の節に記載されている特異性が高いＭＡｂ１５９およびフローサイトメトリー技法を利用して、原発腫瘍および腫瘍細胞株における表面ＧＲＰ７８の発現を検査した。１５症例の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）から新鮮に採取した全血細胞における細胞表面ＧＲＰ７８レベルは著しく高かった（１２〜９８％、中央値５２％）。新鮮に採取した乳がん組織から調製した単一細胞浮遊液およびヒト小細胞肺癌細胞のコホートでも、細胞表面ＧＲＰ７８を伴う細胞が実質的なパーセントで示された（それぞれ８〜３４％および３４〜６７％）（表１）。前立腺細胞株の採取物では、ＢＰＨ（良性過形成性前立腺上皮細胞株）における表面ＧＲＰ７８レベルはほとんど検出できなかったが、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰおよびＣ４−２Ｂ、ならびにＰＴＥＮ欠損マウスＣＥ１およびＥ２から確立された２つの初代細胞株では高かった。ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５、Ａ５４９、およびＭＣＦ７などのがん細胞株でも表面ＧＲＰ７８発現が示された（データは示していない）。
【０２５１】
【表１−２】
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【０２５２】
頭頸部扁平上皮癌などの腫瘍幹細胞も細胞表面ＧＲＰ７８を有することが示されているので（Ｍｉｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．、４巻：３３０〜３４４頁、２０１１年）、Ｄｌｌ１／ＤＮＥＲを同時発現することが示されている３重陰性（エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性、およびＨｅｒ２陰性）乳がん幹様細胞における細胞表面ＧＲＰ７８の発現を検査した（Ｐｅｃｅら、Ｃｅｌｌ、１巻：６２〜７３頁、２０１０年）。原発性３重陰性乳房腫瘍組織をフローサイトメトリーのために処理した。ＧＲＰ７８とＤｌｌ１の両方を発現している細胞をまず単離し、次いで、ＤＮＥＲ発現についてゲーティングした。本発明者らの分析では、Ｄｌｌ１および表面ＧＲＰ７８が同時発現し、これらの２重陽性細胞の８０％がＤＮＥＲ陽性でもあり（図７Ｂ）、これにより、３重陰性乳がんにおけるがん幹様細胞の表面ＧＲＰ７８の濃度が示される。
【０２５３】
ＭＡｂ１５９を用いて染色した原発性頭頸部腫瘍組織（緑色）および幹細胞マーカーＣＤ１３３（赤色）抗体。矢印は、表面ＧＲＰ７８およびＣＤ１３３の共局在を示す。染色手順において透過処理剤は使用しなかった。核をＤＡＰＩで染色した（青色）。同様に、頭頸部原発腫瘍細胞では、表面ＧＲＰ７８は、幹様細胞マーカー  ＣＤ１３３と共局在化した（図７Ｃ）。
【０２５４】
（実施例４）
ＭＡｂ１５９により、腫瘍細胞アポトーシスが促進されＰＩ３Ｋシグナル伝達が阻害される
最初に、ＭＡｂ１５９の腫瘍細胞に対する効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験した。上記の通り細胞を単離し、９６ウェルプレートにウェル当たり、総体積１００μＬ中細胞１×１０４個の密度で播種した。４連ウェルを、ＭＡｂ１５９（２０μｇ／ｍＬもしくは１００μｇ／ｍＬ）または１００μｇ／ｍＬの正常なマウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて３日間処理した。その後、１０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートし、蛍光強度を製造者の説明書に従って測定した。ＣＬＬの患者（表１において識別されている患者と同じ）由来の全血細胞をＭＡｂ１５９または対照ＩｇＧと一緒に３日間インキュベートした場合、ＭＡｂ１５９処理により、細胞の生存能力の有意な低下が引き起こされたが、対照ＩｇＧには毒性はなかった（データは示していない）。
【０２５５】
グルコース欠乏ＨＴ２９細胞株およびＭＣＦ７細胞株における抗体の毒性も抗体の有効性が増大すると予想して試験した。この分析のために、がん細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり総体積５００μＬ中細胞２×１０４個の密度で播種した。１日後に、培地をグルコースを含まない成長培地に変えた。３連のウェルを５０μｇ／ｍＬのＭＡｂ１５９または対照マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を用いて処理した。処理の５日後に、細胞の生存能力を、以前に記載されている通り（Ｋｕｍａｒ，Ｓｉｎｇｈら、２００６年）３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用して評価した。ＭＡｂ１５９により、これらの培養条件下で結腸および乳癌細胞株ＨＴ２９およびＭＣＦ７の細胞生存能力が低下した（５０％超）（図１３Ａ、上の棒グラフ）。細胞表面でアポトーシスが誘発されるかどうかも決定しようとした。この分析のために、細胞をアポトーシス分析のためにカスパーゼ−８／９比色定量アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰニックエンド標識付け（ＴＵＮＥＬ）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造者の説明書に従って用いて処理した。次いで、それぞれ外因性アポトーシス経路および内因性アポトーシス経路の活性化を表す、活性化されたカスパーゼ８およびカスパーゼ９のレベルを測定した。さらに、ＭＡｂ１５９により、それぞれ外因性アポトーシス経路および内因性アポトーシス経路を示すカスパーゼ８およびカスパーゼ９が活性化されることを観察した（図１３Ｂ）。これは、少なくとも一部において、細胞の生存能力の低下が細胞表面で開始されたことを示唆している。生存能力の低下は、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定されるグルコース欠乏ＭＣＦ７細胞におけるアポトーシスの増加によって引き起こされ得る（図１３Ａ、下のブロット）。
【０２５６】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路により、細胞生存を含めた細胞における多くの生物学的事象が調節され、ＧＲＰ７８によりＰＩ３Ｋ活性が調節されることが以前に示されている。したがって、ＭＡｂ１５９を用いて処理した、細胞表面ＧＲＰ７８を発現する腫瘍細胞が、リン酸化ＡＫＴおよびＳ６レベルの変化によって測定されるＰＩ３Ｋ活性の変更を有するかどうかを検査した。この分析のために、グルコース欠乏ＨＴ２９細胞を５０μｇ／ｍＬのＭＡｂ１５９と一緒にインキュベートし、全細胞溶解物を、本明細書に以前に記載されている通りＭＡｂ１５９および対照ＩｇＧを使用したウエスタンブロット分析に供した。相対的なｐＫＡＴレベルおよびｐＳ６レベルを数量化するためにＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を使用した。実際に、ＭＡｂ１５９処理した細胞では、対照と比較してリン酸化ＡＫＴおよびＳ６レベルの両方が低下することが見出された（図２Ａ）。上記の結果により、ＭＡｂ１５９によりＰＩ３Ｋ経路が阻害されることが示される。
【０２５７】
（実施例５）
表面ＧＲＰ７８はＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットと相互作用する
細胞表面ＧＲＰ７８を標的化することによりＰＩ３Ｋシグナルが調節されるという実施例４における本発明者らの発見を考慮して、細胞表面ＧＲＰ７８とＰＩ３Ｋ構成成分の間に直接の相互作用があるかどうかを決定しようとした。この分析のために、細胞表面への転位を増加させた、ＦＬＡＧタグを付けたＧＲＰ７８（ＫＤＥＬを有さない）を過剰発現させ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０巻：１５０６５〜１５０７５頁、２０１０年）、細胞表面タンパク質をビオチンで標識し、ビオチン標識したタンパク質を単量体アビジン（ａｖｉｄ）ビーズで精製した。ＧＲＰ７８をこの表面タンパク質のプールから免疫沈降させ、その相互作用パートナーをウエスタンブロッティングによって検出した。具体的には、１０ｃｍのディッシュで成長している２９３Ｔ細胞に、Ｆｌａｇタグを付けたＧＲＰ７８（ＫＤＥＬを有さない）を単独でトランスフェクトした、またはヒトＥｐｈＢ２全長発現ベクターと同時トランスフェクトした。トランスフェクトした３日後、細胞を、氷冷のＰＢＳを用いて２回すすぎ、０．５ｍｇ／ｍＬのＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に、４℃で３０分、穏やかに振とうしながらインキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を、１００ｎＭの最終濃度まで加えてビオチン化反応を停止させた。細胞を、氷冷のＰＢＳを用いて２回すすぎ、次いで、溶解緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１×プロテアーゼ阻害剤反応混液、および１％トリトンＸ−１００）を用いて溶解させた。ビオチン化表面タンパク質を、単量体アビジン−アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造者の説明書に従って用いて精製した。溶出したビオチン化タンパク質を、抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とコンジュゲートしたビーズを用いて４℃で一晩さらにインキュベートして、Ｆｌａｇタグを付けたＧＲＰ７８をプルダウンした。次いで、ビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、結合したタンパク質を、５０ｍＭのジチオスレイトールを補充したＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて溶出し、その後、９５℃で５分インキュベートした。ＩＰに対する陰性対照は、Ｒｏｃｋｌａｎｄからの正常なマウスＩｇＧとコンジュゲートしたビーズであった。ｐ８５と表面ＧＲＰ７８の内在性相互作用を見るための試験では、ビオチン標識する前に、代わりに２９３Ｔ細胞を３００ｎＭのタプシガルジンを用いて１６時間処理した。プロテインＧビーズ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ならびにｐ８５抗体、ＧＲＰ７８抗体、およびベータアクチン抗体（全てマウスＩｇＧ１、反応当たり５μｇ）を用いて免疫沈降を実施した。図２Ｂに見られるように、ＧＲＰ７８は、ＰＩ３Ｋの調節性サブユニットであるｐ８５とは複合体を形成したが、ＥＲＫ１／２または細胞表面特異的タンパク質であるＥｐｈＢ２とは複合体を形成しなかった。この相互作用を内在性発現条件下でさらに確認した。最初にタプシガルジンを用いて表面ＧＲＰ７８レベルを誘導し、その後、以前の通りビオチン−アビジン系を使用して細胞表面タンパク質を精製した。表面ＧＲＰ７８およびｐ８５の免疫共沈降を、ＧＲＰ７８抗体またはｐ８５抗体のいずれかを用いて実現した（図２Ｃ）。これらの結果により、表面ＧＲＰ７８がＰＩ３Ｋ構成成分に結合するという第１の証拠がもたらされ、また、表面ＧＲＰ７８が、ＰＩ３Ｋサブユニットと直接複合体を形成することによってＰＩ３Ｋシグナル伝達を調節し得ることが示唆される。
【０２５８】
（実施例６）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＡｂ１５９は腫瘍に局在化するが正常な器官には局在化しない
これらの種々の試験のために、以下の材料および方法の節に記載の通り異種移植腫瘍を確立した。ＭＡｂ１５９が腫瘍に好んで局在化し正常な器官には局在化しないかどうかを、ＨＴ２９異種移植腫瘍を有するマウスにおいてビオチン標識したＭＡｂ１５９を追跡することによって決定することを試みた。具体的には、ＨＴ２９腫瘍を有するマウス２匹にビオチン化ＭＡｂ１５９（５０μｇ）をｉ．ｖ．注射によって投与した。６時間後、マウスを屠殺し、組織を採取し、ＭＡｂ１５９の局在化について画像化した。免疫蛍光法のために、ＯＣＴに包埋した新鮮な凍結組織を５μｍの切片にし、リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、切片を、ヤギ血清を用いてブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、抗体結合を、蛍光色素とコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて局在化した。核を６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド水和物（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ蛍光顕微鏡およびＭｅｔａ  Ｍｏｒｐｈイメージングシリーズシステムを用いて画像を得た。蛍光色素とコンジュゲートしたストレプトアビジン（緑色で示されている）を用いたＭＡｂ１５９の局在化は腫瘍においてのみ検出され、正常な器官（心臓、肝臓、腎臓、および肺を含む）では検出されなかった（図３Ａ）。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。
【０２５９】
（実施例７）
ヒト化ＭＡｂ１５９の親和性、活性、および特異性
次に、ヒトにおける潜在的な免疫原性を回避するためにヒト化ＭＡｂ１５９を作出した。この分析のために使用したヒト化ＭＡｂ１５９は、配列番号２１に記載されている重鎖可変領域および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域を含むものであった。この抗体は、親マウス抗体に匹敵する、ＧＲＰ７８に対する親和性（図８Ａ）および腫瘍の成長阻害における有効性（図８Ｂ）を有する。
【０２６０】
ヒト化ＭＡｂ１５９の腫瘍特異的局在化を決定するために、Ｃｙ５．５で標識したヒト化Ｍａｂ１５９を注射した、腫瘍を有する生体マウスを画像化した。この分析のために、本明細書に記載の通り異種移植腫瘍を確立した。腫瘍が約４００ｍｍ３の体積に達したら、マウス（群当たり２匹）をＴｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔに３日間供し、次いで、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５．５標識した抗体（第一級アミンを通じた標識）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを実施し、ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗体の蛍光を取得するためにＣｙ５．５フィルターセットを使用した。全ての画像の取得に同一の照明設定（ランプ電圧、フィルター、ｆ／ｓｔｏｐ、視野、ビニング）を使用した。蛍光発光画像を正規化し、ステラジアン当たり平方センチメートル当たり１秒当たりの光子（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として報告した。全ての近赤外蛍光画像を、１秒の曝露時間（ｆ／ｓｔｏｐ＝４）を使用して取得した。注射の２８時間後、以前に記載されている通り、マウスにＰＢＳを灌流し、その後、ホルマリンを灌流した（Ｍｉｔｒａ，Ｍｉｋｏｌｏｎら、２００６年）。この試験において使用した対照ＩｇＧは正常な血清から精製したヒトＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）である。注射の２８時間後、ＭＡｂ１５９が皮下Ｈ２４９腫瘍に優先的に局在するが、マウス器官には局在しないことが見出された（図３Ｂ、左側のパネル）。
【０２６１】
試験終了時に、動物にＰＢＳを灌流し、その後ホルマリンを灌流し、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングと同じ設定を用いたｅｘ  ｖｉｖｏイメージングのために器官を腫瘍と一緒に採取した。対照ＩｇＧとヒト化ＭＡｂ１５９の間で腫瘍のシグナル強度に劇的な差異があった（図３Ｂ、右側のパネル）。さらに、ＭＡｂ１５９は腫瘍に特異的に局在化することが示されたが、対照ＩｇＧについてはそれが示されなかった。組織を、ヒトＦｃ特異的抗体を使用した免疫組織化学的分析にさらに供した。免疫組織化学的検査のために、凍結切片を、３％ホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。切片を、３％Ｈ２Ｏ２を用いて１０分間処理し、ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片を、ＰＢＳを用いて洗浄し、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて処理した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡およびＩｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ６．０  ｓｙｓｔｅｍを用いて画像を得た。免疫組織化学的分析により、ヒト化ＭＡｂ１５９の腫瘍への特異的な局在化が確認されたが、対照ＩｇＧでは確認されなかった（図３Ｃ）。したがって、ヒト化ＭＡｂ１５９が肝臓ではなく腫瘍に特異的に局在化することが示される。
【０２６２】
（実施例８）
ＭＡｂ１５９は種々の異種移植腫瘍の成長および腫瘍転移を阻害する
ＭＡｂ１５９の有効性を種々の腫瘍モデルにおいてさらに検査した。ヒト小肺がん細胞Ｈ２４９、非小細胞肺がん細胞Ａ５４９および結腸がん細胞ＨＴ２９を用いて異種移植腫瘍を確立した。次いで、腫瘍を、１０ｍｇ／ｋｇのＭＡｂ１５９または正常なマウスＩｇＧを用いて週２回処置した。図４Ａ〜４Ｃに示されている通り、ＭＡｂ１５９により、どちらのモデルにおいても対照と比較して腫瘍の進行が有意に阻害された（それぞれ５８％、７８％および５０％阻害）。
【０２６３】
ＧＲＰ７８標的化療法と従来の化学療法の併用により有効性が高まるかどうかをさらに試験するために、結腸がん異種移植モデルにおいてＭＡｂ１５９（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）とイリノテカン（１８ｍｇ／ｋｇ、週２回）を併用した。ＧＲＰ７８過剰発現が結腸直腸がん発生に関連することが報告されているので、結腸がんモデルを選択した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｗａｎｇら、２０１１年）。図４Ｄに示されている通り、単独で投与した場合、ＭＡｂ１５９により、腫瘍の成長が対照群と比較して５４％阻害された。イリノテカン単独療法により、腫瘍の成長が８５％阻害された。併用療法はより有効であり、腫瘍の成長が９５％阻害され、出発腫瘍体積の４７％までの腫瘍退縮が引き起こされた。
【０２６４】
ＧＲＰ７８により、腫瘍の成長および転移を伴う腫瘍における血管の成長も促進される（Ｄｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８巻：２８４８〜２８５７頁、２０１１年）。したがって、同系黒色腫がん細胞株の転移性成長に対するＭＡｂ１５９の効果を検査した。Ｂ１６肺転移モデルは以前に記載されている（同文献）。簡単に述べると、Ｂ１６−Ｆｌｕｃ−Ａ１メラノーマ細胞（５×１０５）を、外側尾静脈を通して注射した。メラノーマ細胞を注射した直後にＭＡｂ１５９を用いた処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）を開始した。肺転移を第３週から始めて毎週、発光イメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によってモニタリングした。第４週に屠殺した後、肺を取り出して腫瘍を可視化した。図４Ｅの左側のパネルに示されている通り、ＭＡｂ１５９処置により、肺腫瘍形成が有意に減少した。対照群と比較して、ＭＡｂ１５９で処置したマウス由来の肺の腫瘍は有意に少なかった（図４Ｅ、右側のパネル）。
【０２６５】
（実施例９）
ＭＡｂ１５９により、腫瘍異種移植片における増殖が減少し、アポトーシスが誘導され、腫瘍脈管構造が損なわれ、ＰＩ３Ｋシグナル伝達が阻害される
異種移植実験の最後に、分析のために腫瘍を採取した。ＭＡｂ１５９処置群では、増殖の指標（Ｋｉ６７染色）が著しく低下し（図５Ｆ）、アポトーシス（ＴＵＮＥＬアッセイ）が有意に増加し（図５Ｆ）、血管密度（ＣＤ３１染色）はそれほど大きくなく低下した（図５Ｇ）。ＭＡｂ１５９処置により、リン酸化Ｓ６およびＡＫＴの顕著な減少ももたらされ、これにより、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害が示される（図５Ｈ、図５Ｉおよび図１１Ａ）。しかし、リン酸化ＥＲＫ１／２、ｃ−Ｍｅｔ、およびＳｒｃのレベルに有意な変化は観察されず（図５Ｇおよび図１１Ａ）、これにより、多くの場合にＰＩ３Ｋ小分子阻害剤により誘導され、耐性の発生に関与するこれらの代償的な経路が変更されなかったことが示される。さらに、抗体の全身投与が、動物の食物摂取、体重（データは示していない）および生命維持に必要な器官の顕微鏡レベルの検査によって測定して、耐容性が良好であったことに注目すべきである（図１１Ｂ）。
【０２６６】
（実施例１０）
ＭＡｂ１５９はＰｔｅｎ欠失により誘導される白血病誘発の抑制に有効である
上記の試験により、細胞表面ＧＲＰ７８の標的化によりＰＩ３Ｋシグナル伝達が調節されることが確立される。したがって、Ｐｔｅｎノックアウト自然発生白血病モデルにおいて構成的なＰＩ３Ｋの環境でＭＡｂ１５９を試験した。Ｐｔｅｎ（ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄ）；Ｍｘ−１は白血病モデルであり、また、白血病芽球および末梢血球数を分析するためのフローサイトメトリーについてのプロトコールは記載されている（Ｗｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、２０１１年）。６〜８週齢のＰｔｅｎｆ／ｆ；Ｍｘｌ−Ｃｒｅマウスにポリイノシンポリシチジン酸（ｐＩｐＣ、２０μｇ／ｇＷ）の合計７回用量を１日おきに腹腔内投与してＣｒｅ発現を誘導した。１０ｍｇ／ｋｇの正常なマウスＩｇＧまたはＭＡｂ１５９をこれらの７回用量についてｐＩｐＣと同時投与した。最後のｐＩｐＣ注射の３日後に、ＭＡｂ１５９またはＩｇＧを最終的に投与し、さらに３日後にマウスを分析した。以前に報告されている通り、造血系におけるＰｔｅｎの誘導性ノックアウトにより、骨髄増殖性疾患および最終的には白血病の発生が導かれる。図６Ａに示されている通り、これらのＰｔｅｎノックアウトマウスは、対照ＩｇＧを用いて処置した場合には病的に背中を丸めた姿勢を有したが、ＭＡｂ１５９を用いて処置したマウスは正常に見えた。ＰＴＥＮ欠乏により、骨髄（ＢＭ）における白血病芽細胞の有意な増加および脾臓の重量の増加が導かれる。図６Ｂに示されている通り、ＭＡｂ１５９で処置したマウスでは脾臓サイズが有意に縮小した。図６Ｃに示されている通り、ＭＡｂ１５９で処置したマウスでは、白血球、リンパ球、単球、および顆粒球がＰＴＥＮ欠損マウスにおける野生型レベルと同様に回復した。ＰＩ３Ｋシグナル伝達に対する効果を、ウエスタンブロッティングを用いてリン酸化ＡＫＴのレベルによって測定した（図６Ｄ）。同じＰｔｅｎヌルモデルにおけるＧｒｐ７８の誘導性ヘテロ接合性アブレーション後のＡＫＴ活性化の抑制（同文献）と一致して、ＭＡｂ１５９により、リン酸化ＡＫＴがＰＴＥＮ欠損マウスにおける正常レベルまで低下した。
【０２６７】
（実施例１１）
ＭＡｂ１５９により腫瘍転移が阻害される
ＧＲＰ７８により、腫瘍の成長および転移を伴う腫瘍における血管の成長が促進される。細胞表面ＧＲＰ７８は３重陰性乳がん幹様細胞において誘導されることが示されたので、マウス３重陰性乳腺癌細胞４Ｔ１を使用した同所性腫瘍モデルにおいてＭＡｂ１５９を試験した。４Ｔ１細胞を同質遺伝子型ＢＡＬＢ／ｃマウスの＃４脂肪パッドに埋め込み、それは主要な部位において急速に成長し、２週間にわたって反対側の脂肪パッド、肺、および肝臓への転移を形成した。これらのマウスの半数に、１０ｍｇ／ｋｇのＭＡｂ１５９、または生理食塩水（対照）を埋め込み時から開始して隔週用量で注射した。７日後に、ＭＡｂ１５９により、原発腫瘍の成長および＃９脂肪パッドへの二次転移が阻害された（図９Ａ、ｎ＝２）。１３日後に、いくつかの２〜３ｍｍサイズの転移性腫瘍が対照動物（ｎ＝３）の肝臓には存在していたが、ＭＡｂ１５９で処置したマウス（ｎ＝３）には存在しなかった。対照動物における局所肝転移の存在により、いくつかの肝葉の限局性壊死が生じたが、ＭＡｂ１５９で処置した動物では、肝臓は正常に見えた（図１０の左側のパネル、データは示していない）。１４日目に実験を終了した。この段階で、対照マウス３匹全てにおいて、原発腫瘍と＃９脂肪パッド二次腫瘍はどちらも大きくなり、体壁を通って基底の腹膜腔に浸潤していた。比較すると、ＭＡｂ１５９で処置したマウスでは、マウス３匹のうち２匹で完全な原発腫瘍退縮が示され、第３のマウスでは腫瘍サイズの縮小が示された。ＭＡｂ１５９で処置した動物のいずれにおいても目に見える反対側の転移はなかった。肺転移の組織学的評価により、対照動物の肺体積の大部分が転移性乳がんに占められており、それにより対照肺の５０％において内出血が生じていたことが示された（図１０、右側のパネル）。ＭＡｂ１５９処置により肺転移は有意に阻害され（図９Ｂ）、Ｍ１５９で処置した動物のいずれにおいても内出血の証拠はなかった（図１０）。乳房腫瘍組織の分析により、ＭＡｂ１５９によりｐＳ６レベルが有意に低下したことが示され、これにより、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害が示唆される。
【０２６８】
同系黒色腫がん細胞株の転移性成長に対するＭＡｂ１５９の効果も検査した。ルシフェラーゼを安定に発現するＢ１６−Ｆｌｕｃ−Ａ１メラノーマ細胞を静脈内に注射した。肺における腫瘍転移および進行を、動物全体発光イメージングシステムを用いて生でモニタリングした。ＭＡｂ１５９処置により、肺腫瘍形成が有意に減少した。実験の最後に、肺を採取し、肺表面上の着色した腫瘍を観察した。対照群と比較して、ＭＡｂ１５９で処置したマウス由来の肺の腫瘍は有意に少なかった。
【０２６９】
（実施例１２）
ＭＡｂ１５９により、ＰＴＥＮ欠失により誘導される前立腺および子宮がんの進行および白血病誘発が抑制される
細胞表面ＧＲＰ７８の標的化によりＰＩ３Ｋシグナル伝達が調節されることが確立されたので、前立腺、子宮、および造血系に誘導性ＰＴＥＮノックアウトを含むＰＴＥＮノックアウト自然発生腫瘍モデルにおける構成的なＰＩ３Ｋの環境でＭＡｂ１５９を試験した。ＰＴＥＮノックアウト自然発生前立腺がんモデルでは、ＰＴＥＮ欠失はプロバシンプロモーターの下でのＣｒｅ誘導を用いて実現される。ルシフェラーゼ発現も同じＣｒｅによって誘導され、したがって、発光イメージングシステムを用いてＰＴＥＮ欠損前立腺細胞を画像化することができる。２〜３ヶ月で前立腺において腫瘍が発生する。２ヶ月齢のＰＴＥＮヌルマウスに、対照ＩｇＧまたはＭＡｂ１５９を１０ｍｇ／ｋｇ用量で１週間に３回与えた。生の動物発光イメージングを用いて腫瘍の進行をモニタリングした。ＭＡｂ１５９処置群では、顕著な腫瘍退縮があった（図１２Ａ）。対照的に、対照ＩｇＧ処置群のマウスは均一に進行した。これにより、ＭＡｂ１５９により、ＰＴＥＮ欠損前立腺がんの退縮が引き起こされ得ることが示される。前立腺背外側の組織学的分析により、対照ＩｇＧで処置した前立腺には広範囲にわたる腺癌があったことが示される（図１２Ｂ）。対照的に、ＭＡｂ１５９で処置した前立腺には軽度の前立腺上皮内腫瘍（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）のみがあった（図１２Ｂ）。さらなる免疫組織化学的な分析により、ＭＡｂ１５９によりｐＡＫＴレベルおよびｐＳ６レベルが有意に低下したことが示され、したがって、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害が示唆される（図１２Ｂ）。リン酸化ＥＲＫの些細な減少もＭＡｂ１５９処置によってもたらされた（図１２Ｂ）。
【０２７０】
プロゲステロン受容体プロモーターの下でのＣｒｅの誘導を用いてＰＴＥＮ欠失が実現されるＰＴＥＮノックアウト自然発生子宮がんモデルにおけるＭＡｂ１５９の有効性も試験した。マウスは、早ければ３週齢から１ヶ月齢までにｉｎ  ｓｉｔｕにおいて癌腫を発生する。３週齢および９週齢のＰＴＥＮヌルマウスに、対照ＩｇＧまたはＭＡｂ１５９を２０ｍｇ／ｋｇ用量で１週間に３回、１ヶ月間与えた。対照ＩｇＧで処置した３週齢マウスでは、１ヶ月後に子宮がんが急速に発生した。対照的に、ＭＡｂ１５９で処置した３週齢マウスは、正常な子宮を有した（図１２Ｃ）。９週齢マウスに関しては、ＭＡｂ１５９処置により、９週齢マウスにおける子宮がんの進行が有意に抑制され、子宮腫瘍の壊死が誘発された（図１２Ｃ）。さらなる組織学的分析により、ＭＡｂ１５９で処置した子宮には小さな腫瘍領域を伴う正常と思われる組織があったが、対照ＩｇＧで処置した子宮には大きな腺扁平上皮腫瘍があったことが明らかになった（図１２Ｄ、左側のパネル）。このＭＡｂ１５９の抗腫瘍活性は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害によるものであり得る：ＭＡｂ１５９で処置した子宮では対照のＩｇＧ処置した子宮と比較してｐＳ６レベルが有意に低下した（図１２Ｄ）。
【０２７１】
（実施例１３）
ヒト化ＭＡｂ１５９の薬物動態学および毒性学的試験
この分析のために使用したヒト化ＭＡｂ１５９は、配列番号２１に記載されている重鎖可変領域および配列番号２３に記載されている軽鎖可変領域を含むものであった。
【０２７２】
Ａ．薬物動態学
単一の１０ｍｇ／ｋｇ用量のヒト化ＭＡｂ１５９を、Ｃ５７ＢＬ／７マウス３匹にｉ．ｖ．投与し、注射の３０分後、４時間後、１日後、２日後および５日後に血清試料を採取した。抗体の血清中レベルを、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べると、プロテインＡ（ウェル当たり１μｇ）をＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡを用いてブロッキングし、その後、血清、およびＡＰと融合したＧＲＰ７８  １００ｎｇを適用した。ＡＰ基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を適用した後、４０５ｎｍにおける光学読み取りを用いて、結合した抗体−抗原複合体を検出した。非コンパーメント解析を使用して薬物動態学パラメータを算出し、そこでは、台形公式を使用してＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、血清半減期およびＡＵＣを決定した。この抗体は、親マウス抗体に匹敵する、ＧＲＰ７８に対する親和性および腫瘍の成長阻害における有効性を有する（データは示していない）。以下の表２に示されている通り、６１．５μｇ／ｍＬの平均最大血清中濃度（Ｃｍａｘ）が実現され、平均血清半減期は３日を超え、４０４５±１０２６μｇ＊ｈｒ／ｍＬの曲線下面積（ＡＵＣ）が実現された。
【０２７３】
【表２】
2016520527.tif 000026
【０２７４】
Ｂ．毒性学的試験
Ｃ５７ＢＬ／７マウスを用いて毒性学的試験を行った。Ｃ５７ＢＬ／７マウスに、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのヒト化ＭＡｂ１５９、または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（ｎ＝３）を週２回、５週間にわたってｉ．ｖ．注射した。血液を化学パネルおよび全血球計算（ＣＢＣ）分析のために採取した。主要器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、および胸腺）を組織分析のために採取した。実験の最後に、動物を、イソフルランを使用して麻酔し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＩＡＣＵＣによって認められたプロトコールに従って全採血によって安楽死させた。剖検の間に、全ての動物を完全な肉眼的検査に供し、知見を書き留めた。血液学的分析および血清生化学的分析のための血液を心臓穿刺により大静脈から採取した。血液を単回の抜き取りにより採取し、次いで、血液学的検査のために０．２〜０．５ｍＬをＥＤＴＡチューブに分注し、血清生化学検査のために血液０．２〜０．５ｍＬを血清分離チューブに入れた。血液学的試験には、白血球数（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）、赤血球数、血小板数、白血球数（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔ）（好塩基球、好酸球、リンパ球、好中球および単球）、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、多染性、および住血性寄生虫が含まれた。分析した血清生化学パラメータには、アルブミン、グロブリン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、クレアチニン、リン、カルシウム、ナトリウム、塩化物、コレステロール、およびクレアチニンホスホキナーゼが含まれた。動物の脾臓、精巣、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、心臓、肝臓、食道、肺、腎臓、および大腿骨からの骨髄スメアを病理組織検査のために採取した。これらを、１０％中性緩衝ホルマリンを使用してすぐに固定し、ヘマトキシリン−エオシン染色および顕微鏡レベルの検査に供した。血液学的実験、血清生化学実験および病理組織実験はＡｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）において商業的に実施された。全ての結果を収集し、解析し、スチューデントＴ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して統計解析を実施した。全体的に、ヒト化ＭＡｂ１５９で処置したマウスの血液または生命維持に必要な器官のいずれにおいても有意な毒性は見出されなかった（下記表３参照）。所見は、ヒト化ＭＡｂ１５９で処置したマウスの１匹の膵臓において軽度の炎症が見出されたことのみであり、これは対照抗体で処置したマウスにおいても観察された。これらの結果により、ヒト臨床試験に進めるための良好な安全性および薬物動態学的データがもたらされる。
【０２７５】
【表３】
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【０２７６】
（実施例１４）
エピトープのマッピング
ＧＲＰ７８バリアントを２９３Ｔ細胞において一過性に発現させ、変性させ還元した全細胞溶解物全体を、抗Ｆｌａｇ抗体およびＭＡｂ１５９を用いたウエスタンブロッティングのために使用した。各バリアントについて最初のアミノ酸および最後のアミノ酸が示されている（図１４Ａ）。ウエスタンブロッティングの結果が図１４Ｂの左側のパネルおよび右側のパネルに示されている。内因的に発現したＧＲＰ７８が黒い矢印で示されている。図１３Ｂに示されている結果に基づいて、推定ＭＡｂ１５９エピトープが枠内に強調表示されている（図１４Ｃ）。下線が引かれている残基は、それぞれＫ６３３バリアントおよびＴ６４３バリアントの最後の残基である。Ａ６３８は太い黒字で示されている。
【０２７７】
（実施例１５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥ免疫コンジュゲートにより、細胞表面ＧＲＰ７８を発現している細胞に対する細胞毒性が引き起こされる。
【０２７８】
ＭＡｂ１５９およびアウリスタチン誘導体ＭＭＡＥを含む免疫コンジュゲートを当技術分野に記載の通り調製し、評価した；例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００３年、２１巻（７号）：７７８〜７８４頁（コンジュゲーションおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験方法を教示する目的で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、プロテアーゼにより切断可能なジペプチドリンカー（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）を、自己犠牲型（ｓｅｌｆｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）ｐ−アミノベンジルカルバメートスペーサーを通じてＭＭＡＥのＮ末端位に付着させた。Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥは、生理的条件下では安定であるが、リソソーム抽出物および腫腫瘍関連リソソーム酵素であるヒトカテプシンＢの存在下では急速な加水分解を受け、それによりＭＭＡＥの放出が導かれることが報告されている。ＭＡｂ１５９を還元し、次いで、マレイミドを含有するＭＭＡＥ薬物誘導体を用いてアルキル化し、それにより、ＭＡｂ１５９当たり約２〜４個の薬物が付着した非凝集型コンジュゲートを形成する。
【０２７９】
３種の細胞株をＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥの存在下でインキュベートし、３日後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを使用して培養物の生存能力を評価した。試験した細胞株では、細胞表面で高いＧＲＰ７８発現が示された（Ｈ２４９）、細胞表面で中間のレベルのＧＲＰ７８発現が示された（Ｃ４２Ｂ）、または細胞表面でのＧＲＰ７８発現は示されなかった（ＨＥＫ−２９３）。図１５に示されている通り、ＭＡｂ１５９−ＭＭＡＥの結合は保持され、細胞表面ＧＲＰ７８を発現している細胞に対する細胞毒性が引き起こされる。
【０２８０】
したがって、本明細書には、治療的潜在性を有するヒトＧＲＰ７８に対するモノクローナル抗体（例えば、ＭＡｂ１５９）の生成および選択が記載されている。例えば、ＭＡｂ１５９がＧＲＰ７８に特異的に結合し、ＧＲＰ７８エンドサイトーシスを誘導し、アポトーシスを促進することが実証される。さらに、細胞表面ＧＲＰ７８はＰＩ３Ｋと複合体を形成し、ＭＡｂ１５９により、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達が阻害され得ることが実証される。ヒトがん異種移植モデルにおいて、ＭＡｂ１５９は腫瘍細胞に特異的に局在していた。ＭＡｂ１５９を用いて処置した腫瘍では、腫瘍細胞の増殖の顕著な低下、腫瘍細胞死滅の増強、腫瘍血管密度の低下、リン酸化ＡＫＴ／Ｓ６レベルの低下が示され、また、ＭＡＰＫシグナル伝達のいかなる代償的な上方制御も伴わなかった。さらに、Ｐｔｅｎ欠失によって誘導されるＡＫＴ活性化および白血病誘発がＭＡｂ１５９により遮断された。マウス毒性学的試験では、ＭＡｂ１５９によりマウスの生命維持に必要な器官に対する毒性の証拠は示されなかった。この抗体により、細胞表面ＧＲＰ７８の生物学およびその治療的潜在性の両方を試験する独特の機会が開けた。
【０２８１】
ＭＡｂ１５９の別の潜在的な適用は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのために使用できることにある。ＭＡｂ１５９は表面ＧＲＰ７８を特異的に認識し、したがって、個人向けの薬のために腫瘍を画像化するため、ならびに腫瘍における表面ＧＲＰ７８の量により疾患の進行および療法に対する応答が予測されるかどうかを決定するために使用することができる。臨床試験では、試験被験体の組み入れのためのスクリーニングプロセスとして患者イメージングが取り入れられる。これは、保存用の腫瘍試料の免疫染色を用いた分析は細胞内ＧＲＰ７８がそのような分析に干渉することに起因して難しいので、細胞表面ＧＲＰ７８標的化療法において特に重要である。
【０２８２】
追加的な材料および方法
抗体および他の試薬：ｐ８５に対する抗体（ＰＩ３Ｋ調節単位、ウサギモノクローナル）、Ａｋｔに対する抗体、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）に対する抗体、Ｓ６に対する抗体、リン酸化Ｓ６に対する抗体、ＥＲＫ１／２に対する抗体、リン酸化ＥＲＫ１／２に対する抗体、Ｓｒｃに対する抗体、リン酸化Ｓｒｃ（Ｔｙｒ４１６）に対する抗体、ＧＲＰ７８に対する抗体、およびリン酸化ＧＲＰ７８（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）に対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）からのものであった。ベータアクチンおよびＦＬＡＧ抗体はＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのものであり、ＧＡＰＤＨおよびｐ８５（マウスモノクローナル）抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）からのものであった。ウサギポリクローナルＨＳＰ７０抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）からのものであった。ＣＤ３１抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からのものであった。Ｋｉ６７抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からのものであった。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびＩＲＤｙｅとコンジュゲートした二次抗体はＲｏｃｋｌａｎｄ（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）からのものであった。
【０２８３】
細胞培養物：Ａ５４９細胞株、ＨＴ２９細胞株、ｃｏｌｏ２０５細胞株、ＬＮＣａｐ細胞株、ＭＣＦ７細胞株、および２９３Ｔ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｃ４２Ｂ細胞はＭｉｃｈａｅｌ  Ｓｔａｌｌｃｕｐ（ＵＳＣ）から善意で提供され、小細胞肺癌細胞Ｈ６９、Ｈ８２、Ｈ２４９、およびＨ３４５はＤｒ．Ｒａｖｉ、Ｓａｌｇｉａ  ｉｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏから善意で提供された。Ｂ１６−Ｆｌｕｃ−Ａ１メラノーマ細胞株の生成が記載されている（Ｄｏｎｇ，  Ｓｔａｐｌｅｔｏｎら、２０１１年）。これらの細胞は全て、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、およびＣｅｌｌｇｒｏ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からの１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。
【０２８４】
フローサイトメトリー：接着性細胞については、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＰＢＳ／０．２％ＥＤＴＡを用いて３７℃で約５分にわたって解離させた。培養培地を用いてＥＤＴＡを中和した後、細胞を１０００ｒｐｍで５分遠心分離した。次いで、細胞を、冷たいＰＢＳ／０．５％ＢＳＡを用いて洗浄し、その後、１０％の正常なヤギ血清と一緒に氷上で３０分インキュベートし、正常なヤギ血清中に希釈した一次抗体と一緒に氷上で１時間インキュベートした。その後、細胞を、冷たいＰＢＳを用いて洗浄し、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体と一緒に氷上で３０分インキュベートした。冷たいＰＢＳを用いた最終的な洗浄の後、細胞核をＤＡＰＩで染色し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）を用いて分析した。
【０２８５】
ヒト血液試料については、試料を３体積のＰＢＳで希釈し、次いで、円錐管中２体積のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上にかぶせた。混合物を、ブレーキを有さないスイングバケットローターにおいて４００ｇで３０分遠心分離した。中間期に単核細胞層を新しいチューブに慎重に移し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。ペレット化した細胞を、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁した。残りの手順は上記と同じである。
【０２８６】
ヒト固形腫瘍試料については、腫瘍の生検材料を、剥離はさみを使用して機械的にさいの目に切って最大寸法が３ｍｍ未満の小さな小片にし、その後、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（０．９ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＰＢＳ中）を用いて３７℃で一晩消化した。次いで、試料を、７０ｉＭのナイロン細胞濾過器を通して濾過した。濾液を２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、ペレット化した細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中に再懸濁した。残りの手順は上記と同じである。
【０２８７】
マウス腫瘍異種移植モデル：ＨＴ２９細胞、Ａ５４９細胞、ｃｏｌｏ２０５細胞、およびＣＥ１細胞を増殖させ、トリプシン消化後に採取し、無血清培地に再懸濁した。細胞（２×１０６）を、８週齢のＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に両側に皮下注射した。腫瘍の成長を週に３回測定し、体積を０．５２×ａ×ｂ２として推定した（ここで、ａおよびｂは腫瘍の最大長および最小長である）。腫瘍が約１００ｍｍ３になったら（０日目）、動物を処置群および対照群（群当たりｎ＝１０腫瘍）に、各群の平均腫瘍体積が同等になり、群間の標準誤差が最小になるように分配した。各群を、抗体を週２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注射することによって処置した。実験の最後に、組織分析のためにマウスを屠殺した。全ての手順はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認められたものであり、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓに従って実施された。
【０２８８】
表面タンパク質のビオチン化、免疫沈降およびウエスタンブロッティング
１０ｃｍのディッシュで成長している２９３Ｔ細胞に、Ｆｌａｇタグを付けたＧＲＰ７８（ＫＤＥＬを有さない）を単独でトランスフェクトした、またはヒトＥｐｈＢ２全長発現ベクターを同時トランスフェクトした。トランスフェクトした３日後、細胞を、氷冷のＰＢＳを用いて２回すすぎ、０．５ｍｇ／ｍＬのＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に、４℃で３０分、穏やかに振とうしながらインキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を、１００ｎＭの最終濃度まで加えてビオチン化反応を停止させた。細胞を、氷冷のＰＢＳを用いて２回すすぎ、次いで、溶解緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１×プロテアーゼ阻害剤反応混液、および１％トリトンＸ−１００）を用いて溶解させた。ビオチン化表面タンパク質を、単量体アビジン−アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造者の説明書に従って用いて精製した。溶出したビオチン化タンパク質を、抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とコンジュゲートしたビーズを用いて４℃で一晩さらにインキュベートして、Ｆｌａｇタグを付けたＧＲＰ７８をプルダウンした。次いで、ビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、結合したタンパク質を、５０ｍＭのジチオスレイトールを補充したＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて溶出し、その後、９５℃で５分インキュベートした。ＩＰに対する陰性対照は、Ｒｏｃｋｌａｎｄからの正常なマウスＩｇＧとコンジュゲートしたビーズであった。ｐ８５と表面ＧＲＰ７８の内在性相互作用を見るための試験では、ビオチン標識する前に、代わりに２９３Ｔ細胞を３００ｎＭのタプシガルジンを用いて１６時間処理した。プロテインＧビーズ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ならびにｐ８５抗体、ＧＲＰ７８抗体、およびベータアクチン抗体（全てマウスＩｇＧ１、反応当たり５μｇ）を用いて免疫沈降を実施した。
【０２８９】
ウエスタンブロットに関しては、一般には、全細胞溶解物２０μｇを４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に流し、ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に転写した。ＴＢＳ中５％脱脂粉乳および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて４０分膜をブロッキングし、次いで、１μｇ／ｍｌの一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。膜を３回、それぞれ１０分洗浄し、二次ＨＲＰ標識またはＩＲＤｙｅ標識した二次抗体と一緒に４０分インキュベートした。ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＦｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用してＨＲＰシグナルを検出し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によってＩＲＤｙｅシグナルを検出した。
【０２９０】
抗体エンドサイトーシス
ＭＡｂ１５９を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からのＥＺ連結ビオチンヒドラジドを製造者の手順に従って用いてビオチン化した。Ａ５４９細胞を、１０μｇ／ｍＬのビオチン化ＭＡｂ１５９を用い、３７℃または４℃で１時間処理した。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、０．１％トリトンＸ−１００を用いて透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で３０分染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを用いて画像を取得した。
【０２９１】
細胞の生存能力アッセイ
がん細胞を、２４ウェルプレートに総体積５００μＬ中ウェル当たり細胞２×１０４個の密度で播種した。１日後に、培地をグルコースを含まない成長培地に変えた。３連のウェルを５０μｇ／ｍＬのＭＡｂ１５９または対照マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を用いて処理した。処理の５日後に、細胞の生存能力を以前に記載されている通り３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用して評価した［３５］。細胞を、アポトーシス分析のためにもカスパーゼ−８／９比色定量アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰニックエンド標識付け（ＴＵＮＥＬ）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造者の説明書に従って用いて処理した。
【０２９２】
原発性ＣＬＬ細胞に対するＭＡｂ１５９の効果を検査するために、上記の通り細胞を単離し、９６ウェルプレートに総体積１００μＬ中ウェル当たり細胞１×１０４個の密度で播種した。４連ウェルをＭＡｂ１５９（２０μｇ／ｍＬもしくは１００μｇ／ｍＬ）または１００μｇ／ｍＬの正常なマウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて３日間処理した。その後、１０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートし、蛍光強度を製造者の説明書に従って測定した。
【０２９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ近赤外蛍光イメージングおよびｅｘ  ｖｉｖｏ近赤外蛍光イメージング
確立された異種移植腫瘍（Ｈ２４９）の体積が約４００ｍｍ３に達したら、マウス（群当たり２匹）をＴｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔに３日間供し、次いで、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５．５標識した抗体（第一級アミンを通じた標識）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを実施し、ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗体の蛍光を取得するためにＣｙ５．５フィルターセットを使用した。全ての画像の取得に同一の照明設定（ランプ電圧、フィルター、ｆ／ｓｔｏｐ、視野、ビニング）を使用した。蛍光発光画像を正規化し、ステラジアン当たり平方センチメートル当たり１秒当たりの光子（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として報告した。全ての近赤外蛍光画像を、１秒の曝露時間（ｆ／ｓｔｏｐ＝４）を使用して取得した。注射の２８時間後、以前に記載されている通り、マウスにＰＢＳを灌流し、その後、ホルマリンを灌流した［３４］。次いで、腫瘍および器官を切開し、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングと同じ設定を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングに供した。この試験において使用した対照ＩｇＧは正常な血清から精製したヒトＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）である。
【０２９４】
Ｂ１６肺転移モデル
Ｂ１６肺転移モデルは以前に記載されている  ［１１］。簡単に述べると、Ｂ１６−Ｆｌｕｃ−Ａ１メラノーマ細胞（５×１０５）を、外側尾静脈を通して注射した。肺転移を第３週から始めて毎週、発光イメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によってモニタリングした。メラノーマ細胞を注射した直後にＭＡｂ１５９を用いた処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）を開始した。第４週に屠殺した後、肺を取り出して腫瘍を可視化した。正常なマウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を対照として使用した。各群のマウスは４匹であった。
【０２９５】
同所性４Ｔ１乳がんモデル
１０μＬ中合計６．３×１０５個の４Ｔ１細胞を＃４乳房脂肪パッドにＨａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジおよび特別注文の２９ゲージの除去可能な針（Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７６５３−０１および７８０３−０６  ＲＮ／２９ＧＡ／０．５’’／１２度）を使用して注射した。マウス乳頭が脂肪パッドの位置の位置的な手掛かりとしての機能を果たした。抗体ＭＡｂ１５９または対照の正常なマウスＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇで週２回、腹腔内注射によって投与し、転移負荷および安楽死終点を評価するためにマウスの体重および体調をモニタリングした。第１の用量を４Ｔ１細胞注射の３０分後に与えた。同所に注射の７日後、１３日後および１４日後に、末端剖検の際に反対側の＃９脂肪パッド、肺、および肝臓への転移を決定した。外科的切開の際に、真皮を体壁から分離し、ピンで留めて戻して乳房脂肪パッドを露出させた。原発腫瘍および目に見える転移を有する転移性の乳房脂肪パッドおよび他の器官を１０％中性緩衝ホルマリンに２４時間にわたって固定し、その後、４℃で３０％スクロース中に再構成した。これらの器官をパラフィンに包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５ウルトラミクロトームを使用して７．５ミクロンの切片を得た。
【０２９６】
マウス脂肪パッドにおける最大の腫瘍サイズを決定するため、および異なる深さの器官組織における転移を評価するために、検体全体を通してステップカットを生成した。検体に１５０μｍの間隔で７．５μｍの切片を生成し、多数の深さの３〜４枚のスライドをヘマトキシリン−エオシン染色によって分析した。スライドを、キシレン（３分）、キシレン（３分）、１００％エタノール（１分）、９０％エタノール（１分）、８０％エタノール（１分）および７５％エタノール（１分）中で逐次的にインキュベートし、その後、イオン除去水ですすぐことによって脱パラフィン処理した。スライドをＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中で４分染色して乳房脂肪パッドなどの脂肪組織に透過させ、０．３％酸アルコールを使用して１分間脱染した。Ｅｏｓｉｎ  Ｙ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）染色を３時間実施して、脂肪組織に染色透過させた。Ｈ＆Ｅ染色したスライドを顕微鏡によって評価し、正確な比較を可能にするために、腫瘍の直径が最大である深さにおける４×像を取得した。同様に、肺および肝臓を評価するために、多数の深さにおける転移負荷を評価し、代表的な４×像を示した。
【０２９７】
免疫蛍光法および免疫組織化学的検査
免疫蛍光法のために、ＯＣＴに包埋した新鮮な凍結組織を５μｍの切片にし、リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、切片を、ヤギ血清を用いてブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲートした適切な二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて抗体結合を局在化した。核を６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド水和物（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ蛍光顕微鏡およびＭｅｔａ  Ｍｏｒｐｈ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｅｒｉｅｓ  ｓｙｓｔｅｍを使用して画像を得た。
【０２９８】
免疫組織化学的検査のために、凍結切片を、３％ホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。切片を、３％Ｈ２Ｏ２を用いて１０分間処理し、ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片を、ＰＢＳを用いて洗浄し、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて処理した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡およびＩｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ６．０  ｓｙｓｔｅｍを用いて画像を得た。
【０２９９】
各試料について代表的な写真を４枚取得し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を用いて数量化を実施した。Ｐ値を対応のない両側スチューデントＴ検定によって決定した。
【０３００】
薬物動態学
単一の１０ｍｇ／ｋｇ用量のヒト化ＭＡｂ１５９を、Ｃ５７ＢＬ／７マウス３匹にｉ．ｖ．投与し、注射の３０分後、４時間後、１日後、２日後および５日後に血清試料を採取した。抗体の血清中レベルを、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べると、プロテインＡ（ウェル当たり１μｇ）をＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡを用いてブロッキングし、その後、血清、およびＡＰと融合したＧＲＰ７８  １００ｎｇを適用した。ＡＰ基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を適用した後、４０５ｎｍにおける光学読み取りを用いて、結合した抗体−抗原複合体を検出した。非コンパーメント解析を使用して薬物動態学パラメータを算出し、そこでは、台形公式を使用してＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、血清半減期およびＡＵＣを決定した。
【０３０１】
毒性学的試験
Ｃ５７ＢＬ／７マウスを用いて毒性学的試験を行った。Ｃ５７ＢＬ／７マウスに、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのヒト化ＭＡｂ１５９、または１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（ｎ＝３）を週２回、５週間にわたってｉ．ｖ．注射した。血液を化学パネルおよび全血球計算分析のために採取した。主要器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、および胸腺）を組織分析のために採取した。実験の最後に、動物を、イソフルランを使用して麻酔し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＩＡＣＵＣによって認められたプロトコールに従って全採血によって安楽死させた。剖検の間に、全ての動物を完全な肉眼的検査に供し、知見を書き留めた。血液学的分析および血清生化学的分析のための血液を心臓穿刺により大静脈から採取した。血液を単回の抜き取りにより採取し、次いで、血液学的検査のために０．２〜０．５ｍＬをＥＤＴＡチューブに分注し、血清生化学検査のために血液０．２〜０．５ｍＬを血清分離チューブに入れた。血液学的試験には、白血球数（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）、赤血球数、血小板数、白血球数（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔ）（好塩基球、好酸球、リンパ球、好中球および単球）、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、多染性、および住血性寄生虫が含まれた。分析した血清生化学パラメータには、アルブミン、グロブリン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、クレアチニン、リン、カルシウム、ナトリウム、塩化物、コレステロール、およびクレアチニンホスホキナーゼが含まれた。動物の脾臓、精巣、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、心臓、肝臓、食道、肺、腎臓、および大腿骨からの骨髄スメアを病理組織検査のために採取した。これらを、１０％中性緩衝ホルマリンを使用してすぐに固定し、ヘマトキシリン−エオシン染色および顕微鏡レベルの検査に供した。血液学的実験、血清生化学実験および病理組織実験はＡｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）において商業的に実施された。全ての結果を収集し、解析し、スチューデントＴ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して統計解析を実施した。
【０３０２】
本明細書において開示され、特許請求されている項目および方法は全て、本開示に照らして過度な実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の項目および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく項目および方法に変形を適用することができる当業者には明らかである。当業者に対して明らかであるそのような変形および等価物は全て、現在存在するものであれ以後開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨および範囲の範囲内であるとみなされる。本明細書において言及される特許、特許出願、および刊行物は全て、本発明が関する分野の当業者のレベルを示す。特許、特許出願、および刊行物は全て、あらゆる目的について、それぞれの刊行物が具体的にかつ個別に、その全体が任意のかつ全ての目的について参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されているいかなる要素（複数可）の非存在下でも実施することができることが適切である。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変および変形を用いることができること、および、そのような改変および変形は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０３０３】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基に関しては標準の文字の略語を使用して、およびアミノ酸に関しては３文字コードを使用して示されている。
【０３０４】
配列番号１は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８ポリペプチドのアミノ酸配列である。コード配列はアミノ酸残基１〜６５０である。アミノ酸残基６５１〜６５４はＣ末端ペプチドを示す。
【０３０５】
配列番号２は、ヒト細胞表面ＧＲＰ７８ポリペプチドをコードする核酸配列である。コード配列は核酸１〜１９５０である。
【０３０６】
配列番号３は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【０３０７】
配列番号４は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【０３０８】
配列番号５は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【０３０９】
配列番号６は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【０３１０】
配列番号７は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【０３１１】
配列番号８は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【０３１２】
配列番号９は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するマウス抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３１３】
配列番号１０は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するマウス抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３１４】
配列番号１１は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するマウス抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３１５】
配列番号１２は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するマウス抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３１６】
配列番号１３は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３１７】
配列番号１４は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３１８】
配列番号１５は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３１９】
配列番号１６は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３２０】
配列番号１７は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３２１】
配列番号１８は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３２２】
配列番号１９は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３２３】
配列番号２０は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３２４】
配列番号２１は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３２５】
配列番号２２は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３２６】
配列番号２３は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３２７】
配列番号２４は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３２８】
配列番号２５は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３２９】
配列番号２６は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３３０】
配列番号２７は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３３１】
配列番号２８は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３３２】
配列番号２９は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０３３３】
配列番号３０は、細胞表面ＧＲＰ７８に特異的に結合するヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０３３４】
配列番号３１は、本発明の抗体および抗原結合性断片が結合する、配列番号１のアミノ酸残基６０８〜６３７を含むエピトープのアミノ酸配列である。
【０３３５】
配列番号３２は、本発明の抗体および抗原結合性断片が結合する、配列番号１のアミノ酸残基６２３〜６３７を含むエピトープのアミノ酸配列である。
【０３３６】
【化２３】
2016520527.tif 000028
【０３３７】
【化２４】
2016520527.tif 000029
【０３３８】
【化２５】
2016520527.tif 000030
【０３３９】
【化２６】
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【０３４０】
【化２７】
2016520527.tif 000032
【図１】
2016520527.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
2016520527.tif 000037
【図５−１】
2016520527.tif 000038
【図５−２】
2016520527.tif 000039
【図６】
2016520527.tif 000040
【図７】
2016520527.tif 000041
【図８】
2016520527.tif 000042
【図９】
2016520527.tif 000043
【図１０】
2016520527.tif 000044
【図１１】
2016520527.tif 000045
【図１２−１】
2016520527.tif 000046
【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2016520527000001.app
【国際調査報告】
2016520527.tif 000051
2016520527.tif 000052
2016520527.tif 000053
2016520527.tif 000054