(57)【要約】  本発明は、抗ＩＬ−４抗体及び二重特異性抗体並びにそれらを使用する方法に関する。【選択図】図１Ａ−Ｂ【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−４に特異的に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニット及びＩＬ−１３に特異的に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、該抗体は、
ａ）ＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）へのＩＬ−４の結合を阻害する、
ｂ）インビトロで細胞のＩＬ−４誘発性増殖を阻害する、及び／又は
ｃ）インビトロで細胞のＩＬ−１３誘発性増殖を阻害する
抗体。
【請求項２】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１又は請求項２に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項６】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１及び３から９から選択されるＶＨ配列を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項７】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号２、１０及び１１から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項８】
第一のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項９】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；又は
ｂ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２
を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１０】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、
ａ）配列番号２１のアミノ酸配列又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、
ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１２】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、
ａ）配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；
ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列；
ｄ）配列番号４９のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｅ）配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；
ｆ）（ｄ）に記載のＶＨ配列及び（ｅ）に記載のＶＬ配列
を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１３】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１９、５６、又は４９のＶＨ配列を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１４】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号２０、５７、又は４８のＶＬ配列を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１５】
第二のＶＨ／ＶＬユニットが、配列番号１９又は５６のＶＨ配列及び配列番号２０又は５７のＶＬ配列；又は配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１６】
配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む抗体と、ＩＬ−４に対する結合を競合する、請求項１から１５の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１７】
配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む抗体と、又は配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列を含む抗体と、ＩＬ−１３に対する結合を競合する、請求項１から１６の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１８】
配列番号２９のアミノ酸７７から８９の範囲内で、又は配列番号２９のアミノ酸８２から８９の範囲内で、エピトープに結合する、請求項１から１７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１９】
ＩＬ−４に特異的に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニット及びＩＬ−１３に特異的に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む多重特異性抗体であって、第一のＶＨ／ＶＬユニットが配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含み、第二のＶＨ／ＶＬユニットが配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む、多重特異性抗体。
【請求項２０】
ＩｇＧ抗体である、請求項１から１９の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２１】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である、請求項２０に記載の多重特異性抗体。
【請求項２２】
ＩｇＧ４抗体である、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
【請求項２３】
抗体が、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域を含み、第一の重鎖定常領域がノブ（ｋｎｏｂ）変異を含み、第二の重鎖定常領域がホール（ｈｏｌｅ）変異を含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２４】
第一の重鎖定常領域が、ＩＬ−４に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
【請求項２５】
第二の重鎖定常領域が、ＩＬ−１３に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される、請求項２３又は請求項２４に記載の多重特異性抗体。
【請求項２６】
第一の重鎖定常領域が、ＩＬ−１３に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
【請求項２７】
第二の重鎖定常領域が、ＩＬ−４に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される、請求項２３又は請求項２６に記載の多重特異性抗体。
【請求項２８】
ＩｇＧ１抗体であり、ノブ変異がＴ３６６Ｗ変異を含む、請求項２３から２７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２９】
ＩｇＧ１抗体であり、ホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つの変異を含む、請求項２３から２８の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項３０】
ＩｇＧ４抗体であり、ノブ変異がＴ３６６Ｗ変異を含む、請求項２３から２７の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項３１】
ＩｇＧ４抗体であり、ホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つの変異を含む、請求項２３から２７及び３０の何れか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項３２】
配列番号３４の配列を含む第一の重鎖定常領域を含む、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
【請求項３３】
配列番号３５の配列を含む第二の重鎖定常領域を含む、請求項２３又は請求項３２に記載の多重特異性抗体。
【請求項３４】
配列番号３６の配列を含む第一の重鎖定常領域を含む、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
【請求項３５】
配列番号３７の配列を含む第二の重鎖定常領域を含む、請求項２３又は請求項３４に記載の多重特異性抗体。
【請求項３６】
配列番号３８の配列を含む第一の重鎖、配列番号３９の配列を含む第一の軽鎖、配列番号４０の配列を含む第二の重鎖、及び配列番号４１の配列を含む第二の軽鎖を含む、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に結合する多重特異性抗体。
【請求項３７】
ＩＬ−４に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；又は
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；又は
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列
を含む、抗体。
【請求項３８】
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項３７に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む、請求項３７又は請求項３８に記載の単離された抗体。
【請求項４０】
配列番号１及び３から９から選択されるＶＨ配列を含む、請求項３７から３９の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項４１】
配列番号２、１０及び１１から選択されるＶＬ配列を含む、請求項３７から４０の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項４２】
配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む、単離された抗体。
【請求項４３】
（ａ）請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体；
（ｂ）請求項１から３４の何れか一項に記載の多重特異性抗体の第一のＶＨ／ＶＬユニット；又は
（ｃ）請求項１から３４の何れか一項に記載の多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニット
をコードする単離された核酸。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４５】
宿主細胞が、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４４又は請求項４５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を生成する方法。
【請求項４７】
請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項４８】
請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体及び許容可能な担体を含む、薬学的製剤。
【請求項４９】
医薬として使用のための、請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５０】
好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、ＩＬ−４媒介性疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５１】
好酸球性疾患が、喘息、重度の喘息、慢性喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、乾癬、湿疹、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎プラスアトピー）、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、エピソード血管浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、蕁麻疹、オンコセルカ皮膚炎、好酸球関連胃腸疾患、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、好酸球性大腸炎、潰瘍性大腸炎、ウィップル病、鼻マイクロポリープ、鼻ポリープ、アスピリン不耐症、閉塞性睡眠時無呼吸、クローン病、強皮症、心内膜心筋線維症、線維症、炎症性腸疾患、特発性間質性肺炎、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、硬化症に続発する肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、ブドウ膜炎、がん、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
ＩＬ−１３媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５３】
ＩＬ−４媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５４】
呼吸器疾患が、喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、タバコ誘発性肺気腫、気道炎症、嚢胞性線維症、肺線維症、アレルギー性鼻炎、及び気管支拡張症から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５５】
好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、ＩＬ−４媒介性疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための医薬の製造における、請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項５６】
好酸球性疾患が、喘息、重度の喘息、重度の喘息、慢性喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、乾癬、湿疹、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎プラスアトピー）、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、エピソード血管浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、蕁麻疹、オンコセルカ皮膚炎、好酸球関連胃腸疾患、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、好酸球性大腸炎、潰瘍性大腸炎、ウィップル病、鼻マイクロポリープ、鼻ポリープ、アスピリン不耐症、閉塞性睡眠時無呼吸、クローン病、強皮症、心内膜心筋線維症、線維症、炎症性腸疾患、特発性間質性肺炎、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、硬化症に続発する肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、ブドウ膜炎、がん、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５５の使用。
【請求項５７】
ＩＬ−１３媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５５の使用。
【請求項５８】
ＩＬ−４媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項５５の使用。
【請求項５９】
呼吸器疾患が、喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、タバコ誘発性肺気腫、気道炎症、嚢胞性線維症、肺線維症、アレルギー性鼻炎、及び気管支拡張症から選択される、請求項５５の使用。
【請求項６０】
請求項１から４２の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、好酸球性疾患を有する個体を治療する方法。
【請求項６１】
好酸球性疾患が、喘息、重度の喘息、慢性喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、乾癬、湿疹、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎プラスアトピー）、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、エピソード血管浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、蕁麻疹、オンコセルカ皮膚炎、好酸球関連胃腸疾患、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、好酸球性大腸炎、潰瘍性大腸炎、ウィップル病、鼻マイクロポリープ、鼻ポリープ、アスピリン不耐症、閉塞性睡眠時無呼吸、クローン病、強皮症、心内膜心筋線維症、線維症、炎症性腸疾患、特発性間質性肺炎、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、硬化症に続発する肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、ブドウ膜炎、がん、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＩＬ−１３媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
ＩＬ−４媒介性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
呼吸器疾患が、喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、タバコ誘発性肺気腫、気道炎症、嚢胞性線維症、肺線維症、アレルギー性鼻炎、及び気管支拡張症から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
ＴＨ２経路阻害剤を個体に投与することを更に含む、請求項６０から６４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ＴＨ２経路阻害剤が、ＩＴＫ、ＢＴＫ、ＩＬ−９、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＯＸ４０Ｌ、ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＩｇＥ、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−４受容体アルファ、ＩＬ−１３受容体アルファ１、ＩＬ−１３受容体アルファ２、ＯＸ４０、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＬ１７ＲＢ、ＳＴ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＦｃイプシロンＲＩ、ＦｃイプシロンＲＩＩ／ＣＤ２３、Ｆｌａｐ、Ｓｙｋキナーゼ、ＣＣＲ４、ＴＬＲ９、ＣＣＲ３、ＩＬ５、ＩＬ３、及びＧＭ−ＣＳＦから選択される少なくとも一の標的を阻害する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
個体が、中等度から重度の喘息に罹患している、請求項６０から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
個体が、特発性肺線維症に罹患している、請求項６０から６６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年４月５日に出願された仮米国出願６１／８０８７４８号の優先権の利益を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された配列表を含み、その全体が参照することにより本明細書に援用される。２０１４年３月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１４．ＭＡＲ．１２ Ｐ５６０９Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬと命名され、大きさは７５４４２バイトである。
【０００３】
[発明の分野]
本発明は、抗ＩＬ−４抗体及び二重特異性抗体並びにそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
喘息は世界的に発生率が増加している複雑な病気である。他の発症のなかで、喘息患者の気道内における好酸球性炎症が報告されている。疾患の病態生理は、可変気道閉塞、気道炎症、粘液過分泌、及び上皮下線維症によって特徴付けられる。臨床的には、患者は咳、喘鳴、及び息切れを示し得る。多くの患者が現在利用可能な治療法で十分に治療されているが、幾人かの喘息患者は、今日の治療法の使用にもかかわらず、持続的な疾患を持っている。
【０００５】
多くの研究が、喘息及びアレルギーの病因におけるＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びそれらの受容体に関係している (例えば、Wills-Karp, 2004, Immunol. Rev. 202, 175ー190; Brightling et al., 2010, Clin. Exp. Allergy 40, 42ー49; Finkelman et al., 2010, J Immunol 184, 1663ー1674; Maes et al., 2012, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 47, 261ー270; Steinke and Borish, 2001, Respir. Res. 2, 66ー70)。ＩＬ−４は、２つの受容体に結合し、一つは、ＩＬ−４Ｒα及び共通γ鎖（γＣ）のヘテロダイマーであり、他方はＩＬ−４受容体α（ＩＬ−４Ｒα）及びＩＬ−１３受容体アルファ１（ＩＬ−１３Ｒα１）のヘテロダイマーである。後者の受容体、ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１は、ＩＬ−１３との共有受容体であり、これはまたＩＬ−１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３Ｒα２）からなる一本鎖受容体に一意的に結合する。ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びＩＬ−４Ｒα遺伝子の多型は、ＩｇＥレベル、アトピーの有病率、及び喘息の疾患の重症度などの特徴を含む、喘息及びアレルギーに関連している。更に、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びそれらの受容体の発現は、喘息及び他のアレルギー疾患において増加している。また、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びそれらの受容体の中和又は欠乏は、喘息の前臨床モデルにおいて疾患を改善する。
【０００６】
喘息を治療するため、多くの薬物が売りに出されているか又は開発中である。喘息治療のための数多くの標的の一つは、ＩＬ−１３である。ＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、好塩基球、好酸球、及び肥満細胞により産生される多面的ＴＨ２サイトカインであり、前臨床モデルにおいて喘息の病因に強く関係している。ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１３抗体を含むアンタゴニストは、以前に記載されている。例えば、国際特許出願番号２００５／０６２９６７を参照。かかる抗体は、ヒト治療薬として開発されてきた。最近、幾つかの研究は、喘息の治療におけるＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体の臨床活性を示している（例えば、Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098; Gauvreau et al., 2011, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, 1007-1014; Ingram and Kraft, 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 130, 829-42; Webb, 2011, Nat Biotechnol 29, 860-863を参照）。これらのうち、ＩＬ−１３活性を中和するヒト化ＩｇＧ４抗体であるレブリキズマブ（ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）は、大多数において吸入コルチコステロイド及び長時間作用型β２−アドレナリン受容体アゴニストによる治療にもかかわらず症候性であった喘息患者で肺機能を改善した（Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098）。加えて、ＩＬ−１３及びＩＬ−４に結合する二重特異性抗体が記載されている。例えば、米国特許出公開第２０１０／０２２６９２３号を参照。
【０００７】
しかし、中等度から重度の喘息患者は、代替治療の選択肢をなお必要としている。従って、喘息を治療するためのより良好な治療及び喘息患者を治療する方法を理解するための改良された方法を同定するための必要がある。
【０００８】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺実質の進行間質性線維症によって特徴づけられる拘束性肺疾患であり、米国では約１０万人の患者に影響を及ぼしている（Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 174:810-816 (2006)）。ＩＰＦに関連したこの間質性線維症は、肺機能の進行性の喪失につながり、ほとんどの患者で呼吸不全に起因する死に至る。診断時からの生存期間の中央値は２−３年である（Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824 (2011)）。ＩＰＦの病因並びに鍵となる分子及び病態生理学的なドライバーは不明である。ＩＰＦ患者における生存率を延長することが示された唯一の治療法は肺移植である（Thabut et al., Annals of internal medicine 151:767-774 (2009)）。しかし、肺移植はかなりの病的状態と関連しており、全てのＩＰＦ患者がそれに適した候補ではなく、かつ適切なドナー肺の相対的な不足がある。多数の試みにもかかわらず、現在までの薬物療法は、ＩＰＦ患者における無作為化プラセボ対照介入試験において、幾つかの介入は、一部の患者における肺機能低下の速度を遅くするように見えるものの、生存期間を延長することが示されていない（Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824 (2011); Richeldi et al., The New England J. of Med. 365:1079-1087 (2011)）。
【０００９】
ＩＬ−４及びＩＬ−１３シグナル伝達は、インビトロにおいて数多くの細胞タイプから線維形成反応を誘発することができる。ＩＬ−４又はＩＬ−１３による線維芽細胞の治療は、コラーゲン産生及び筋線維芽細胞表現型への分化を誘発することが示されている（Borowski et al., J. British Soc. Allergy Clin. Immunol., 38: 619-628 (2008); Hashimoto et al., J. Allergy Clin. Immunol., 107: 1001-1008 (2001); Murray, et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 40: 2174-2182 (2008); Saito et al., Intl. Archives Allergy Immunol., 132: 168-176 (2003)）。あるいは、活性化マクロファージはまた、線維芽細胞及び筋線維芽細胞を刺激するＴＧＦβ及びＰＤＧＦなどの増殖因子を生産する能力に一部が基づいた、線維形成プロセスの主な原因であることが提案されている。ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、代替的に活性化されたマクロファージ表現型の強力な誘発因子であり、これらの細胞におけるその活性を介して、少なくとも部分的に線維形成応答を駆動することができる（Doyle et al., Eur. J. Immunol., 24: 1441-1445 (1994); Song et al., Cell. Immunol., 204: 19-28 (2000); Wynn and Barron, Seminars Liver Dis., 30: 245-257 (2010）。
【００１０】
ＩＬ−４及びＩＬ−１３はまた、インビボで複数の組織における線維形成応答を駆動することができる。マウスの肺におけるＩＬ−４又はＩＬ−１３のトランスジェニック過剰発現は、コラーゲン遺伝子の発現及び重度の上皮下線維症を誘発するのに十分である（Lee et al., J. Exper. Med., 194: 890-821 (2001); Ma et al. J. Clin. Invest., 116: 1274-1283 (2006); Zhu et al., J. Clin. Invest. 103: 779-788 (1999））。更に、多くの研究が、前臨床動物モデルにおける線維症のドライバーとしてＩＬ−４及びＩＬ−１３の役割を実証した。ＩＬ−１３の標的型破壊を有する又はＩＬ−１３に特異的な遮断抗体で処置されたマウスは、ブレオマイシン及びＦＩＴＣ誘発性肺線維症モデルにおける細胞外マトリックスの沈着の減少を示している（Belperio et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 27: 419-427 (2002); Kolodsick et al., J. Immunol., 172: 4068-4076 (2004); Liu et al., J. Immunol., 173: 3425-3431 (2004)）。同様に、ＩＬ−４は、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおける線維性応答の維持において重要であることが示されている（Huaux et al., J. Immunol., 170: 2083-2092 (2003)）。
【００１１】
複数の研究が、ＩＰＦ患者においてＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３の発現及び活性が上昇していると結論付けている。ＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体サブユニットの発現は、ＩＰＦ患者からの肺生検試料において、正常対照と比較して、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で増加していることが見出された（Jakubziak et al., J. Clin. Pathol., 57: 477-486 (2004)）。特に、本研究において、ＩＬ−４又はＩＬ−１３シグナル伝達によって高度に誘発される遺伝子、ＩＬ−１３Ｒα２が、免疫組織化学によりＩＰＦ生検における線維芽細胞の病巣で発現されることが見出され、これらの細胞における活性なＩＬ−４又はＩＬ−１３シグナル伝達を示唆している。ＩＬ−４及びＩＬ−１３はまた、正常対照と比較して、ＩＰＦ患者の気管支肺胞洗浄液において上昇することが見出された。注目すべきことに、これらの試料におけるＩＬ−１３のレベルは肺機能の鍵となる基準である、ＦＶＣ及びＤＬＣＯの予測されるパーセントと負に相関し（Park et al., J. Korean Med. Sci., 24: 614-620 (2009)）、ＩＰＦ患者におけるＩＬ−１３の病原性機能を示唆している。
【００１２】
ＩＰＦの患者は、代替治療の選択肢をなお必要としている。従って、ＩＰＦを治療するためのより良好な治療及びＩＰＦ患者を治療する方法を理解するための改良された方法を同定するための必要がある。
【００１３】
本明細書に引用される全ての参考文献は、特許出願及び刊行物を含み、任意の目的のためにその全体が本明細書において参照により援用される。
【発明の概要】
【００１４】
要旨
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体が提供され、ここで、多重特異性抗体は、ＩＬ−４に特異的に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニット、及びＩＬ−１３に特異的に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む、抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は：
ａ）ＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）へのＩＬ−４の結合を阻害する、
ｂ）インビトロで細胞のＩＬ−４誘発性増殖を阻害する、及び／又は
ｂ）インビトロで細胞のＩＬ−１３誘発性増殖を阻害する。
【００１５】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体の第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。一実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１及び３から９から選択されるＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号２、１０及び１１から選択されるＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む。
【００１６】
本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；又は（ｂ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列；（ｄ）配列番号４９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｅ）配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｆ）（ｄ）に記載のＶＨ配列及び（ｅ）に記載のＶＬ配列を含み得る。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１９、５６、又は４９のＶＨ配列を含む。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号２０、５７、又は４９のＶＬ配列を含む。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体の第二のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１９又は５６のＶＨ配列及び配列番号２０又は５７のＶＬ配列；又は配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列を含む。
【００１７】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む抗体と、ＩＬ−４に対する結合を競合する。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む抗体と、又は配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列を含む抗体と、ＩＬ−１３に対する結合を競合する。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号２９のアミノ酸７７から８９の範囲内で、又は配列番号２９のアミノ酸８２から８９の範囲内で、エピトープに結合する。
【００１８】
幾つかの実施態様において、ＩＬ−４に特異的に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニット及びＩＬ−１３に特異的に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む多重特異性抗体が提供され、ここで、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含み並びに第二のＶＨ／ＶＬユニットは、配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。
【００１９】
本発明に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体はＩｇＧ抗体であり得る。本発明に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体であり得る。本発明に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体はＩｇＧ４抗体であり得る。
【００２０】
本発明に記載される実施態様の何れかにおいて、多重特異性抗体は、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域を含むことができ、ここで、第一の重鎖定常領域はノブ（ｋｎｏｂ）変異を含み、かつ第二の重鎖定常領域はホール（ｈｏｌｅ）変異を含む。幾つかの実施態様において、第一の重鎖定常領域は、ＩＬ−４に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される。幾つかの実施態様において、第二の重鎖定常領域は、ＩＬ−１３に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される。幾つかの実施態様において、第一の重鎖定常領域は、ＩＬ−１３に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される。幾つかの実施態様において、第二の重鎖定常領域は、ＩＬ−４に結合するＶＨ／ＶＬユニットの重鎖可変領域部分に融合される。
【００２１】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むノブ変異を含むＩｇＧ１抗体である。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つの変異を含むホール変異を含むＩｇＧ１抗体である。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むノブ変異を含むＩｇＧ４抗体である。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つの変異を含むホール変異を含むＩｇＧ４抗体である。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号３４又は配列番号３６の配列を含む第一の重鎖定常領域を含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号３５又は配列番号３７の配列を含む第二の重鎖定常領域を含む。
【００２２】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体が提供され、ここで該多重特異性抗体は、配列番号３８の配列を含む第一の重鎖、配列番号３９の配列を含む第一の軽鎖、配列番号４０の配列を含む第二の重鎖、及び配列番号４１の配列を含む第二の軽鎖を含む。
【００２３】
幾つかの実施態様において、ＩＬ−４に結合する単離された抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；又は（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；又は（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１及び３から９から選択されるＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号２、１０及び１１から選択されるＶＬ配列を含む。
【００２４】
幾つかの実施態様において、ＩＬー４に結合する単離された抗体が提供され、ここで、該抗体は配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む。
【００２５】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載される二重特異性抗体又は単離された抗体の何れかをコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される多重特異性抗体の何れかの第一のＶＨ／ＶＬユニットをコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される多重特異性抗体の何れかの第二のＶＨ／ＶＬユニットをコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施態様において、単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞である。幾つかの実施態様において、宿主細胞を培養することを含む、抗体を生成する方法が提供される。
【００２６】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートが提供され、ここでイムノコンジュゲートは、本明細書に記載される多重特異性抗体又は単離された抗体の何れか及び細胞傷害性薬物を含む。
【００２７】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載される多重特異性抗体又は単離された抗体の何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤が提供される。
【００２８】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗体は、医薬として使用のために提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗体は、
好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、ＩＬ−４媒介性疾患又は呼吸器疾患の治療において使用のために提供される。幾つかの実施態様において、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、ＩＬ−４媒介性疾患又は呼吸器疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載される抗体の使用が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗体の有効量を個体に投与することを含む、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、ＩＬ−４媒介性疾患又は呼吸器疾患を治療する方法が提供される。幾つかの実施態様において、方法は、ＴＨ２経路阻害剤を個体に投与することを更に含む。幾つかの実施態様において、ＴＨ２経路阻害剤は、ＩＴＫ、ＢＴＫ、ＩＬ−９、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＯＸ４０Ｌ、ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＩｇＥ、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−４受容体アルファ、ＩＬ−１３受容体アルファ１、ＩＬ−１３受容体アルファ２、ＯＸ４０、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＬ１７ＲＢ、ＳＴ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＦｃイプシロンＲＩ、ＦｃイプシロンＲＩＩ／ＣＤ２３、Ｆｌａｐ、Ｓｙｋキナーゼ；ＣＣＲ４、ＴＬＲ９、ＣＣＲ３、ＩＬ５、ＩＬ３、及びＧＭ−ＣＳＦから選択される少なくとも一の標的を阻害する。幾つかの実施態様において、個体は中等度から重度の喘息に罹患している。幾つかの実施態様において、個体は特発性肺線維症に罹患している。
【００２９】
本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、好酸球性疾患は、喘息、重度の喘息、慢性喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、乾癬、湿疹、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎プラスアトピー）、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、エピソード血管浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、蕁麻疹、オンコセルカ皮膚炎、好酸球関連胃腸疾患、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、好酸球性大腸炎、潰瘍性大腸炎、ウィップル病、鼻マイクロポリープ、鼻ポリープ、アスピリン不耐症、閉塞性睡眠時無呼吸、クローン病、強皮症、心内膜心筋線維症、線維症、炎症性腸疾患、特発性間質性肺炎、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、硬化症に続発する肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、ブドウ膜炎、がん、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択され得る。幾つかの実施態様において、ＩＬ−１３媒介性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、ＩＬ−４媒介性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、がん、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫から選択される。本明細書に記載される実施態様の何れかにおいて、呼吸器疾患は、喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、タバコ誘発性肺気腫、気道炎症、嚢胞性線維症、肺線維症、アレルギー性鼻炎、及び気管支拡張症から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実施例２に記載されるように、抗体１９Ｃ１１は、ＩＬ−４受容体活性化の強力なアンタゴニストであることを示している。（Ａ）１９Ｃ１１は、固定化されたＩＬ−４ＲαへのＩＬ−４結合をブロックする。１９Ｃ１１（黒丸）、対照ＩｇＧ（白正方形）、ＩｇＧ無し（白三角形）。（Ｂ）１９Ｃ１１抗体は、ＴＦ−１細胞のＩＬ−４誘導性増殖を阻害する。１９Ｃ１１（黒丸）、対照ＩｇＧ（白正方形）、ＩｇＧ無し（白三角形）．ＩＬ−４の添加無し（黒三角形）
【図２】図２は、実施例４に記載されるように、大腸菌におけるＩｇＧ１アイソタイプとしての抗ＩＬ−１３ノブ及び抗ＩＬ−４ホールの（Ａ）非還元型試料及び（Ｂ）還元型試料のウェスタンブロットを示す。断片の命名は、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）であり、レーンのラベルはＭ（分子量標準）Ｃ（対照、抗体を発現しないプラスミド）である。図２はまた、実施例５に記載されるように、抗ＩＬ−１３．ノブ（Ｃ）及び抗ＩＬ−４．ホール（Ｄ）についての異なるアイソタイプ及び変異を比較するイムノブロットを示す。上のパネルは、非還元条件を示し、構築された半抗体（ＨＬ）を表し、一方下のパネルは、還元条件を示しており、重鎖及び軽鎖の同様の量が全ての変異体について合成されていることを実証している。
【図３】図３は、実施例６に記載されるように、二重特異性抗体の解析評価を示す。（Ａ）構築された二重特異性抗体のサイズ排除クロマトグラフィー。挿入は高分子量領域上の同じグラフの拡大図を示す。（Ｂ）構築された二重特異性抗体の非還元型ＣＥ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥのは、ヒンジジスルフィドの形成及び鎖間ジスルフィドの完全性を確認した。メインピークの面積は、形成された形成鎖間ジスルフィドを有するインタクトな抗体に相当する。幾つかのマイナーなピーク種は、ヘテロダイマーを安定化する完全な鎖間ジスルフィドを欠いているインタクトな抗体の反映している。（Ｃ）還元型ＣＥ−ＳＤＳは、軽鎖及び重鎖の予想される分布の存在を確認し、その材料の純度を示した。インタクトな軽鎖及び重鎖のメインピークは別として、トレースピークのみが検出された。
【図４】図４は、実施例６に記載されるように、インタクトな（Ａ）ＩｇＧ１−、（Ｂ）ＩｇＧ４−及び（Ｃ）ＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋアイソタイプに基づく二重特異性抗体のＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。
【図５】図５は、実施例８に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１アイソタイプ及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４アイソタイプ二重特異性抗体による、ヒトＩＬ−４ー（Ａ）、ヒトＩＬ−１３−（Ｂ）、又はヒトＩＬ−４／ＩＬ−１３−（Ｃ）誘導性増殖の用量依存性阻害を示す。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１アイソタイプ（黒丸）、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４アイソタイプ（白三角）、抗体の添加無し（白四角）、サイトカイン及び抗体の添加無し（黒四角）。
【図６】図６は、実施例８に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１アイソタイプ及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４アイソタイプ二重特異性抗体による、カニクイザルＩＬ−４ー（Ａ）及びカニクイザルＩＬ−１３−（Ｂ）誘導性増殖の用量依存性阻害を示す。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１アイソタイプ（黒丸）、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４アイソタイプ（（Ａ）の黒丸、（Ｂ）の白三角）、抗体の添加無し（白四角）、サイトカイン及び抗体の添加無し（黒四角）。
【図７】図７は、実施例８に記載されるように、カニクイザルにおける単回の静脈内又は皮下投与の投与後の、血清の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４（Ａ）及びＩｇＧ１（Ｂ）二重特異性抗体の濃度の平均値（±ＳＤ）を示す。ＥＬＩＳＡの定量の限界（ＬＯＱ）は０．０７８μｇ／ｍＬであった。ＬＯＱを超える全データが使用され、かつＬＯＱ以下の全データは除外された。ＳＤはｎ≦２の場合には計算されなかった。
【図８】図８は、実施例１０に記載されるように、アレルゲンに曝露された喘息の反応を模倣するアレルギー性炎症反応を誘発するＡ．ｓｕｕｍ抽出物で曝露されたカニクイザルへの静脈内投与後の、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１抗体の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液の濃度及び上皮被覆液（ＥＬＦ）の濃度を示す。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＥＬＩＳＡの定量の限界（ＬＯＱ）は０．０７８μｇ／ｍＬであった。ＬＯＱを超える全データが使用され、かつＬＯＱ以下の全データは除外された。ＳＤはｎ≦２の場合には計算されなかった。
【図９】図９は、実施例１１に記載されるように、（Ａ）アレルギー性気道炎症及び喘息のマウスモデルの治療のための研究デザインを示す。図９は、実施例１１に記載されるように、様々な処置後のアレルギー性気道炎症及び喘息のマウスモデル動物における、（Ｂ）肺好酸球数、（Ｃ）気管支肺胞洗浄液の好酸球数、（Ｄ）抗原特異的ＩｇＥのレベル、及び（Ｅ）血清ＴＡＲＣレベルを示す。各棒グラフにおいて、最初の４つの棒は、左から右に：対照処置、抗ＩＬ−４抗体処置、抗ＩＬ−１３抗体処置、及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体処置である。第五及び第六の棒は、存在する場合に、ナイーブマウスである。
【図１０】図１０は、実施例３に記載されるように、ヒトκ１軽鎖可変領域のコンセンサス配列（配列番号６１）、ｍｕ１９Ｃ１１抗体軽鎖可変領域（配列番号２）、及び１９Ｃ１１−κ１グラフト軽鎖可変領域（配列番号１０）のアミノ酸配列を示す。位置は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされ、及び可変軽鎖カッパＩコンセンサスフレームワークにｍｕ１９Ｃ１１からグラフトされた超可変領域は四角で囲まれている。
【図１１】図１１は、実施例３に記載されるように、ヒトκ３軽鎖可変領域のコンセンサス配列（配列番号６２）、ｍｕ１９Ｃ１１抗体軽鎖可変領域（配列番号２）、及び１９Ｃ１１−κ３グラフト軽鎖可変領域（配列番号１１）についてのアミノ酸配列を示す。位置は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされ、及び可変軽鎖カッパＩコンセンサスフレームワークにｍｕ１９Ｃ１１からグラフトされた超可変領域は四角で囲まれている。
【図１２】図１２は、実施例３に記載されるように、ヒトＶＨ１重鎖可変領域コンセンサス配列（配列番号６３）、ｍｕ１９Ｃ１１抗体重鎖可変領域（配列番号１）、並びに１９Ｃ１１−ＶＨ１グラフト（配列番号３）、１９Ｃ１１−ＶＨ１．Ｌ（配列番号４）、及び１９Ｃ１１−ＶＨ１．ＦＦＬ（配列番号５）重鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。位置は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされ、並びに超可変領域及び可変重鎖サブグループＩコンセンサスフレームワークに相当するｍｕ１９Ｃ１１から取られたバーニア位置は四角で囲まれている。
【図１３】図１３は、実施例３に記載されるように、ヒトＶＨ３重鎖可変領域コンセンサス配列（配列番号６４）、ｍｕ１９Ｃ１１抗体重鎖可変領域（配列番号１）、並びに１９Ｃ１１−ＶＨ３グラフト（配列番号６）、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＦＬＡ（配列番号７）、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ（配列番号８）及び１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ．ＳＶ（配列番号９）重鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。位置は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされ、並びに超可変領域及び可変重鎖サブグループＩコンセンサスフレームワークに相当するｍｕ１９Ｃ１１から取られたバーニア位置は四角で囲まれている。
【図１４】図１４は、実施例３に記載されるように、ＩＬ−４に対するヒト化抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）親和性測定の表を示す。
【図１５】図１５は、実施例７に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の濃度を増加させることによる、ヒトＩＬ−４Ｒに対するビオチン化ヒトＩＬ−４結合の阻害のプロットを示す。
【図１６】図１６は、実施例７に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の濃度を増加させることによる、ＩＬ−１３Ｒα１に対するビオチン化ヒトＩＬ−１３結合の阻害のプロットを示す。
【図１７】図１７は、実施例７に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の濃度を増加させることによる、ＩＬ−１３Ｒα２に対するビオチン化ヒトＩＬ−１３結合の阻害のプロットを示す。
【図１８】図１８は、実施例７に記載されるように、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の存在下における、ＩＬ−１３に対するＩＬ−１３Ｒα２の結合についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。示されるラインは、１２．５ｎＭから２００ｎＭの範囲の受容体の２倍の濃度系列を表す。
【００３１】
詳細な説明
別に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本願において使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００３２】
所定の定義
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数で使用される用語はまたその逆も複数形を含む。以下に記載される任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれた任意の文書と競合する場合では、以下に記載の定義が優先されるものとする。
【００３３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかでない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質」又は「抗体」は、複数のタンパク質又は抗体をそれぞれ包含し；「細胞」への参照は細胞の混合物などを含める。
【００３４】
本明細書で使用される用語「生物学的試料」は、限定されないが、血液、血清、血漿、唾液、気管支肺胞洗浄液、組織生検（例えば、肺試料）、及び鼻腔スワブ又は鼻ポリープを含む鼻試料を含む。
【００３５】
ＦＥＮＯアッセイは、ＦＥＮＯ（分別呼気一酸化窒素）を測定するアッセイを指す。そのレベルは、例えば、２００５年に米国胸部学会（ＡＴＳ）が発行したガイドラインに従っている、手持ち携帯装置のＮＩＯＸ ＭＩＮＯＴＭ（Ａｅｒｏｃｒｉｎｅ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して評価することができる。ＦＥＮＯは他の同様の方法、例えばＦｅＮＯ又はＦＥＮＯで留意され得、全てのその類似の異形が同じ意味を持つことが理解されるべきである。
【００３６】
喘息は、可変性と再発性の症状を特徴とする複雑な疾患で、根底にある炎症と関連し得るか又は関連し得ない、可逆性気道閉塞（例えば、気管支拡張による）及び気管支過感受性である。喘息の例としては、アスピリン感受性／悪化喘息、アトピー性喘息、重度の喘息、軽度の喘息、中等度から重度の喘息、コルチコステロイドナイーブ喘息、慢性喘息、コルチコステロイド抵抗性喘息、コルチコステロイド難治性喘息、新たに診断された未治療喘息、喫煙による喘息、コルチコステロイドで制御されない喘息、及び J Allergy Clin Immunol (2010) 126(5):926-938に述べられるような他の喘息を含む。
【００３７】
好酸球性疾患とは、過剰の好酸球数に関連する疾患であり、その非定型症状は、体内の局所的又は全身的な好酸球のレベル又は活性に起因して現れる場合がある。過剰好酸球数又は活動に関連する疾患としては、限定されないが、喘息（アスピリン感受性喘息、慢性喘息、及び重度の喘息を含む）、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎（季節性アレルギー性鼻炎を含む）、非アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、乾癬、湿疹、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎プラスアトピー）、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、エピソード血管浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、蕁麻疹、オンコセルカ皮膚炎、好酸球関連胃腸疾患（ＥＧＩＤ）（限定されないが、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、及び好酸球性大腸炎を含む）、潰瘍性大腸炎、ウィップル病、鼻のマイクロポリープ及びポリープ、アスピリン不耐症、閉塞性睡眠時無呼吸、クローン病、強皮症、心内膜心筋線維症、がん（例えば、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫など）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫）、線維症、炎症性腸疾患、特発性間質性肺炎、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺線維症（特発性肺線維症（ＩＰＦ）及び硬化症に続発する肺線維症を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝線維症、及びブドウ膜炎を含む。好酸球由来の分泌産物はまた、血管新生及び腫瘍における結合組織形成の促進、及び慢性喘息、クローン病、強皮症及び心内膜心筋線維症などの状態で見られる線維化反応に関連している（Munitz A, Levi-Schaffer F. Allergy 2004; 59: 268-75, Adamko et al. Allergy 2005; 60: 13-22, Oldhoff, et al. Allergy 2005; 60: 693-6）。
【００３８】
ＩＬ−１３媒介性疾患とは、過剰のＩＬ−１３レベル又は活性に関連する疾患であり、その非定型症状は、体内の局所的及び／又は全身的なＩＬ−１３のレベル又は活性に起因して現れる場合がある。ＩＬ−１３媒介性疾患の例は、がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患（ＩＰＦなどの肺線維症を含む）、ＣＯＰＤ、及び肝線維症を含む。
【００３９】
ＩＬ−４媒介性疾患とは、過剰のＩＬ−４レベル又は活性に関連する疾患であり、その非定型症状は、体内の局所的及び／又は全身的なＩＬ−４のレベル又は活性に起因して現れる場合がある。ＩＬ−４媒介性疾患の例は、がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、線維症、炎症性腸疾患、クローン病、肺の炎症性疾患（ＩＰＦなどの肺線維症を含む）、ＣＯＰＤ、及び肝線維症を含む。
【００４０】
喘息様症状は、息切れ、咳（痰の産生及び／又は痰の質及び／又は咳周波数の変化）、喘鳴、胸部絞扼感、気管支収縮及び上記の症状の何れか又はこれらの症状の組み合わせに起因する夜間覚醒からなる群から選択される症状が含まれる（Juniper et al (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162(4), 1330ー1334）。
【００４１】
用語「呼吸器疾患」は、限定されないが、喘息（例えば、アレルギー性及び非アレルギー性喘息（例えば、年少の子供たちの中で、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染による））；気管支炎（例えば、慢性気管支炎）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（例えば、肺気腫（例えば、タバコ誘発性肺気腫）；気道炎症、好酸球増加症、線維症、過剰粘液産生、例えば、嚢胞性線維症、肺線維症、アレルギー性鼻炎を含む状態が含まれる。気道炎症、過度の気道分泌、及び気道閉塞によって特徴づけることができる疾患の例は、喘息、慢性気管支炎、気管支拡張症、及び嚢胞性線維症が挙げられる。
【００４２】
増悪（一般に喘息発作又は急性の喘息とも呼ばれる）は、息切れ、咳（痰の産生及び／又は痰の質及び／又は咳頻度の変化）、喘鳴、胸部絞扼感、上記の症状又はこれらの症状の組み合わせの何れかに起因する夜間覚醒の新規又は進行性の増加の症状の発現である。増悪はしばしば呼気の気流（ＰＥＦ又はＦＥＶ１）の低下によって特徴付けられる。しかし、ＰＥＦの変動性は、増悪からの回復に至るまで又は又はその最中には増加するかもしれないが、増悪の最中には通常は増加しない。増悪の重症度は、軽度から生命を脅かす範囲に及び、症状及び肺機能の両方に基づいて評価することができる。本明細書に記載されるように重度の喘息増悪は、喘息治療のために以下の入院加療、高コルチコステロイドの使用（例えば、一日のコルチコステロイドの総用量又は５００マイクログラム以上のＦＰ又は等価物の一日の総用量を３日間又はそれ以上連続して４倍する）、又は経口／非経口のコルチコステロイドの使用の任意の一又は組み合わせをもたらす増悪を含む。
【００４３】
「ＴＨ２経路阻害剤」又は「ＴＨ２阻害剤」はＴＨ２経路を阻害する薬剤である。ＴＨ２経路阻害剤の例は、ＩＴＫ，ＢＴＫ，ＩＬ−９（例えば、ＭＥＤＩ−５２８）、ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ、ＣＡＳ番号１９６０７８−２９−２；レシリズマブ（ｒｅｓｉｌｉｚｕｍａｂ））、ＩＬ−１３（例えば、ＩＭＡ−０２６、ＩＭＡ−６３８（アンルキンズマブとも言う、ＩＮＮ Ｎｏ．９１０６４９−３２−０；ＱＡＸ−５７６；ＩＬ−４／ＩＬ−１３トラップ）、トラロキヌマブ（ＣＡＴ−３５４，ＣＡＳ番号１０４４５１５−８８−９とも言う）；ＡＥＲ−００１、ＡＢＴ−３０８（ヒト化１３Ｃ５．５抗体とも言う）、ＩＬ−４（例えばＡＥＲ−００１、ＩＬ−４／ＩＬ−１３トラップ）、ＯＸ４０Ｌ、ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３及びＩｇＥ（例えば、ＸＯＬＡＩＲ、ＱＧＥ−０３１；ＭＥＤＩ−４２１２）；及び受容体、例えば：ＩＬ−９受容体、ＩＬ−５受容体（例えば、ＭＥＤＩ−５６３（ベンラリズマブ、ＣＡＳ番号１０４４５１１−０１−４）、ＩＬ−４受容体α（例えば、ＡＭＧ−３１７、ＡＩＲ−６４５）、ＩＬ−１３受容体α１（例えばＲ−１６７１）及びＩＬ−１３受容体α２、ＯＸ４０、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＩＬ−７Ｒアルファ（ＴＳＬＰの共受容体）、ＩＬ１７ＲＢ（ＩＬ−２５の受容体）、ＳＴ２（ＩＬ−３３の受容体）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２（例えばＡＭＧ−８５３、ＡＰ７６８、ＡＰ−７６１、ＭＬＮ６０９５、ＡＣＴ１２９９６８）、ＦｃｅｐｓｉｌｏｎＲＩ、ＦｃｅｐｓｉｌｏｎＲＩＩ／ＣＤ２３（ＩｇＥの受容体）、Ｆｌａｐ（例えば、ＧＳＫ２１９０９１５）、Ｓｙｋキナーゼ（Ｒ−３４３、ＰＦ３５２６２９９）；ＣＣＲ４（ＡＭＧ−７６１）、ＴＬＲ９（ＱＡＸ−９３５）及びＣＣＲ３、ＩＬ５、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦの多重サイトカイン阻害剤（例えば、ＴＰＩ ＡＳＭ８）からなる群から選択される標的の何れか一の活性の阻害剤を含む。上記標的の阻害剤の例は、例えば、国際公開第２００８／０８６３９５号；国際公開第２００６／０８５９３８号；米国特許第７６１５２１３号；米国特許第７，５０１，１２１号；国際公開第２００６／０８５９３８号；国際公開第２００７／０８０１７４号；米国特許第７８０７７８８号；国際公開第２００５００７６９９号；国際公開第２００７０３６７４５号；国際公開第２００９／００９７７５号；国際公開第２００７／０８２０６８号；国際公開第２０１０／０７３１１９号；国際公開第２００７／０４５４７７号；国際公開第２００８／１３４７２４号；米国特許出願公開第２００９／００４７２７７号；及び国際公開第２００８／１２７２７１号）に開示されている。
【００４４】
用語「小分子」は、５０ダルトンから２５００ダルトンの間の分子量を有する有機分子を指す。
【００４５】
用語「抗体」は最も広範な意味で使用され、具体的には例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体及び抗体の断片を網羅する。そのような抗体は、キメラ、ヒト化、ヒト及び合成である。このような抗体及びそれらの生成方法を以下でより詳細に説明する。
【００４６】
用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で用いられ、ポリエピトープ特異性を有する（すなわち、一の生物学的分子上の二以上の異なるエピトープに特異的に結合することが可能である又は二以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することが可能である）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体など）の抗原結合ドメインは、二つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、ここで、第一のＶＨ／ＶＬユニットは、第一のエピトープに特異的に結合し、第二のＶＨ／ＶＬユニットは、第二のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬユニットは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。かかる多重特異性抗体は、限定されないが、完全長抗体、二以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ダイアボディ、二重特異性抗体及びトリアボディ、共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体断片を含む。重鎖定常領域の少なくとも一部及び／又は軽鎖の定常領域の少なくとも一部を更に含むＶＨ／ＶＬユニットはまた、「ヘミマー」又は「半抗体」と称され得る。幾つかの実施態様によれば、多重特異性抗体は、各エピトープに、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で結合するＩｇＧ抗体である。幾つかの実施態様において、ヘミマーは、分子内ジスルフィド結合が第二ヘミマーとともに形成されるように重鎖可変領域の十分な部分を含む。幾つかの実施態様において、ヘミマーは、例えば、相補的なホール変異又はノブ変異を含む第２ヘミマー又は半抗体とのヘテロ二量体化を許容するノブ変異又はホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下で更に議論される。
【００４７】
「二重特異性抗体」は、一の生物学的分子上の二つの異なるエピトープに特異的に結合することが可能である又は二つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することが可能である抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体はまた、本明細書において「二重特異性」を有するとして又は「二重特異的」であるとして言及され得る。
【００４８】
本明細書において言及する「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」又は「ＫｎＨ」技術という用語は、インビトロ又はインビボで２つのポリペプチドの相互的な対合を導く技術であって、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに突起（ノブ）を及び他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによる技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面又はＶＨ／ＶＬ界面において導入されている（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、米国特許出願公開第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号及びZhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788を参照）。幾つかの実施態様において、ＫｎＨｓは、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合させることを駆動する。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含むことができ、又は類似したもしくは異なる軽鎖可変領域と対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含むことができる。ＫｎＨ技術を用いて、２つの異なるレセプター細胞外ドメインを互いに対合させること、又は（例えばアフィボディ、ペプチボディ及び他のＦｃ融合体を含む）異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列を対合させることもできる。
【００４９】
本明細書で使用する用語「ノブ変異」は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面でポリペプチドに突起（ノブ）を導入する変異を指す。幾つかの実施態様において、他のポリペプチドは、ホール変異を有する。
【００５０】
本明細書で使用する用語「ホール変異」は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面でポリペプチドに空洞（ホール）を導入する変異を指す。幾つかの実施態様において、他のポリペプチドは、ノブ変異を有する。
【００５１】
用語「治療薬」は疾患を治療することに用いられる任意の薬剤を指す。治療薬は、例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン又はペプチボディ）、標的をコードする核酸分子に結合し得るタンパク質又は核酸分子に結合し得るアプタマー又は小分子（すなわち、ｓｉＲＮＡを）などであり得る。
【００５２】
用語「コントローラー」又は「プリベンター（ｐｒｅｖｅｎｔｏｒ）」は、喘息の炎症を制御するために使用される任意の治療薬を指す。コントローラーの例は、コルチコステロイド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカスト、ジレウトン、プランルカスト、ザフィルルカストロイコトリエンの合成又は活性を阻害する）、ＬＡＢＡ、コルチコステロイド／ＬＡＢＡの組合せ組成物、テオフィリン（アミノフィリンを含む）、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、オマリズマブ、ＬＡＭＡ、ＭＡＢＡ（例えば、二官能性ムスカリンアンタゴニスト−ベータ２アゴニスト）、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）阻害剤、及び酵素ＰＤＥ−４阻害剤（例えば、ロフルミラスト）を含む。「第二コントローラー」は典型的には第一コントローラーとは同一でないコントローラーを指す。
【００５３】
用語「コルチコステロイド節約（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ｓｐａｒｉｎｇ）」又は「ＣＳ」は、他の治療薬の投与に起因する疾患の治療のためにコルチコステロイドを摂取している患者の疾患を治療するために使用されるコルチコステロイドの頻度及び／又は量の減少、又は消失を意味する。「ＣＳ節約剤」は、コルチコステロイドを摂取している患者においてＣＳを生じることが可能な治療薬を指す。
【００５４】
用語「コルチコステロイド」は、限定されないが、フルチカゾン（プロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）を含む）、ベクロメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、モメタゾン、フルニソリド、ベタメタゾン及びトリアムシノロンを含む。「吸入コルチコステロイド」は、吸入による送達に適しているコルチコステロイドを意味する。典型的は吸入コルチコステロイドは、フルチカゾン、プロピオン酸ベクロメタゾン、ブデノシド、フロ酸モメタゾン、シクレソニド、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、及び現在利用可能又は将来利用可能になる他のコルチコステロイドが挙げられる。吸入することができかつ長時間作用型β２−アゴニストと併用されるコルチコステロイドの例は、限定されないが、ブデソニド／ホルモテロール及びフルチカゾン／サルメテロールが含まれる。
【００５５】
コルチコステロイド／ＬＡＢＡ併用薬の例は、フロ酸フルチカゾン／ビランテロールトリフェナターテ（ｖｉｌａｎｔｅｒｏｌ ｔｒｉｆｅｎａｔａｔｅ）及びインダカテロール／モメタゾンを含む。
【００５６】
用語「ＬＡＢＡ」は、長時間作用型β−２アゴニストを意味し、そのアゴニストは、例えば、サルメテロール、ホルモテロール、バンブテロール、アルブテロール、インダカテロール、ａｒｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ及びクレンブテロールが含まれる。
【００５７】
用語「ＬＡＭＡ」は長時間作用型ムスカリンアンタゴニストを意味し、そのアゴニストはチオトロピウムを含む。
【００５８】
ＬＡＢＡ／ＬＡＭＡの組み合わせの例は、限定されないが、オロダテロールチオトロピウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ’ｓ）及びインダカテロールグリコピロニウム（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含む。
【００５９】
用語「ＳＡＢＡ」は、短時間作用型β−２アゴニストを意味し、限定されないが、サルブタモール、レボサルブタモール、フェノテロール、テルブタリン、ピルブテロール、プロカテロール、ビトルテロール、リミテロール、カルブテロール、ツロブテロール及びレプロテロールを含む。
【００６０】
ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（時にはｌｅｕｋａｓｔと称する）（ＬＴＲＡ）は、ロイコトリエンを阻害する薬物である。ロイコトリエン阻害剤の例には、モンテルカスト、ジロートン、プランルカスト、及びザフィルルカストが含まれる。
【００６１】
用語「ＦＥＶ１」は、強制呼気の最初の一秒間に吐き出された空気の体積を指す。それは気道閉塞の尺度である。ＦＥＶ１の２０％減少（ＰＣ２０）を誘導するために必要とされるメサコリンの刺激的濃度は気道過敏性の尺度である。ＦＥＶ１は他の同様の方法、例えばＦＥＶ１で留意され得、全てのその類似の異形が同じ意味を持つことが理解されるべきである。
【００６２】
用語「ＦＥＶ１の相対的変化」＝（治療の第１２週でのＦＥＶ１−治療開始前のＦＥＶ１）をＦＥＶ１で割ったもの。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ＦＶＣ」は、（ＦＥＶ１のように１秒間に排出された空気の量とは対照的に）残留体積に対して完全吸気と最大呼息の間の肺の空気の体積の変化を測定する標準試験を指す「努力肺活量」を指す。これは、機能的な肺気量の測定値である。ＩＰＦ、過敏性肺炎、サルコイドーシス、及び全身性硬化症を含む間質性肺疾患のような拘束性肺疾患の患者において、ＦＶＣは、肺実質の瘢痕に起因して典型的には低減される。
【００６４】
用語「軽度の喘息」は、一般的に１週間に２回未満の症状又は増悪、１ヶ月に２回未満の夜行性の症状を経験する患者を指し、増悪の間に無症候性である。軽度の、断続的な喘息は以下により必要に応じてしばしば治療される：吸入気管支拡張薬（短時間作用型吸入β２アゴニスト）；既知のトリガーの回避；毎年のインフルエンザワクチン接種；６〜１０年毎の肺炎球菌ワクチン接種；及び場合によっては同定されたトリガーへの暴露の前の吸入β２−アゴニスト、クロモリン、又はネドクロミル。患者が短時間作用型β２アゴニストの必要性が増加している（例えば、急性増悪のために１日に短時間作用型β２−アゴニストを３〜４回以上使用する又は症状のため１月に一以上のキャニスターを使用する）場合、患者は治療に漸増が必要であり得る。
【００６５】
用語「中等度喘息」は、一般に、患者は週２回以上増悪を経験しかつその増悪が睡眠や活動に影響を与える；患者は１ヶ月２回以上喘息のため夜間に覚醒する；患者は短時間作用型吸入β２−アゴニストを毎日又は一日おきにを必要とする慢性的な喘息症状を持っている；患者のＰＥＦ又はＦＥＶ１の治療前ベースラインが６０から８０％と予測され、及びＰＥＦ変動が２０から３０％である喘息を指す。
【００６６】
用語「重度の喘息」は、一般に、患者がほぼ継続した症状、頻繁な増悪、喘息に起因する頻繁な夜間覚醒を有し、活動が制限され、ＰＥＦ又はＦＥＶ１ベースラインが６０％未満と予測され、かつＰＥＦ変動が２０から３０％である喘息を指す。
【００６７】
救助薬の例としては、アルブテロール、ベントリンなどが含まれる。
【００６８】
「耐性」とは、治療薬による治療後にほとんど又は全く有意な改善を示さない疾患を指す。例えば、喘息が制御されないままであるか又はＦＥＶ１が改善しないかを確定するために、高用量のＩＣＳ（例えば、一日のコルチコステロイドの総用量又は５００マイクログラム以上のＦＰ（又は等価物）の一日の総用量を３日間又はそれ以上連続して４倍する）、又は全身のコルチコステロイドによる治療を要する喘息はしばしば重度の難治性喘息と考えられる。
【００６９】
本明細書に提供される治療薬は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。幾つかの実施態様では、治療薬は吸入される。幾つかの実施態様によれば、投与は注射、例えば、静脈内又は皮下注射によって与えられる。幾つかの実施態様によれば、治療薬は、注射器（例えば、充填済又は未充填）又はオートインジェクターを使用して投与される。
【００７０】
疾患の予防又は治療のために、治療薬の適量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、治療薬が予防を目的としてか治療を目的として投与されるのかどうか、以前の治療法、患者の病歴、及び薬剤への反応、及び主治医の判断により決定されるであろう。治療剤は、患者に対して、単回、又は一連の治療に渡って適切に投与される。治療薬組成物は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。これに関連した考慮因子としては、治療すべき具体的な疾患、治療すべき具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。
【００７１】
「患者の応答」又は「応答」（及びその文法的バリエーション）は、限定しないが、（１）減速及び完全な停止を含む疾患の進行のある程度の阻害；（２）疾患の発現及び／又は症状の数の減少；（３）病変サイズの縮小；（４）隣接末梢器官及び／又は組織への疾患細胞浸潤の阻害（即ち、減少、減速又は完全停止）；（５）疾患拡散の阻害（即ち減少、減速又は完全停止）；（６）疾病病変の退縮又はアブレーションを、必ずでは無いが、もたらし得る自己免疫応答の減少；（７）疾患に伴う１以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後の無病を提示する期間の増加；及び又は（９）治療後の任意の時点での死亡率の減少を含む、患者に対する利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価することができる。
【００７２】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び典型的な実施態様を本明細書に記載する。
【００７３】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００７４】
用語「抗ＩＬ−４抗体」及び「ＩＬ−４に結合する抗体」は、抗体が、ＩＬ−４を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＩＬ−４に結合することができる抗体を指す。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体の、無関係な、非ＩＬ−４タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＩＬ−４への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＩＬ−４へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。ある実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、異なる種由来のＩＬ−４間で保存されているＩＬ−４のエピトープに結合する。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。
【００７５】
用語「抗ＩＬ−１３抗体」及び「ＩＬ−１３に結合する抗体」は、抗体が、ＩＬ−１３を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＩＬ−１３に結合することができる抗体を指す。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体の、無関係な、非ＩＬ−１３タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＩＬ−１３への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１３へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。ある実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、異なる種由来のＩＬ−１３間で保存されているＩＬ−１３のエピトープに結合する。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。
【００７６】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００７７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００７８】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００７９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬのヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００８０】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００８１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）へと更に分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８２】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤を包含する。
【００８３】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体Ｆｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００８４】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、例えば、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。
【００８５】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。幾つかの実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
【００８６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００８７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００８８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００８９】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。幾つかの実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。幾つかの実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００９１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００９２】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成するか、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。本明細書における典型的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せを含む。
【００９３】
幾つかの実施態様において、ＨＶＲ残基は、図１０から１３において、又は本明細書の他の箇所で同定されるものを含む。
【００９４】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００９５】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む。
【００９６】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
【００９７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００９８】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００９９】
「抗ＩＬ−４抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【０１００】
「抗ＩＬ３抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、モノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。幾つかの実施態様において、モノクローナル抗体は、多重特異性（例えば二重特異性）抗体である。
【０１０２】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【０１０３】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。
【０１０４】
用語「添付文書」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。用語「添付文書」はまた、意図される用途、試験の原理、試薬の調製及び取り扱い、検体の収集及び調製、アッセイのキャリブレーション及びアッセイ手順、アッセイの感度と特異性などの性能と精度のデータに関する情報を含む、治療用製品のコマーシャルパッケージに慣習的に含まれている説明書を指すためにも使用される。
【０１０５】
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０１０６】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【０１０７】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【０１０８】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【０１０９】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＩＬ−４」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物起源由来の任意の天然型ＩＬ−４を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＩＬ−４、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＩＬ−４を含む。その用語はまた、天然に存在するＩＬ−４の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトＩＬ−４のアミノ酸配列は、配列番号２７及び２８、及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１１２．２に示される。典型的なカニクイザルＩＬ−４のアミノ酸配列は、配列番号３３に示される。
【０１１０】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＩＬ−１３」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物起源由来の任意の天然型ＩＬ−１３を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＩＬ−１３、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＩＬ−１３を含む。その用語はまた、天然に存在するＩＬ−１３の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列は、配列番号２９及び３０、及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５２２５．２に示される。典型的なカニクイザルＩＬ−１３のアミノ酸配列は、配列番号３２に示される。
【０１１１】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１１２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 第６版， W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原−結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【０１１３】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【０１１４】
組成物及び方法
ある実施態様において、ＩＬ−４に結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に結合する二重特異性抗体が提供される。抗体は、例えば、呼吸器疾患（例えば、喘息及びＩＰＦなど）、ＩＬ−４媒介性疾患、及びＩＬ−１３媒介性疾患を含む好酸球性疾患の診断又は治療のために有用である。
【０１１５】
典型的な抗ＩＬ−４抗体
幾つかの実施態様において、ＩＬ−４に結合する単離された抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１１６】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。幾つかの施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１７】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１８】
幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１９】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が提供される。
【０１２０】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＩＬ−４抗体はヒト化される。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号３から９の何れか一のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むＶＨを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号９のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むＶＨを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号１０か１１の何れか一のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３，及びＦＲ４を含むＶＬを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号１０のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３，及びＦＲ４を含むＶＬを含む。
【０１２１】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、配列番号１及び３から９の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−４抗体はＩＬ−４へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＩＬ−４抗体は、配列番号９のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１２２】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号２、１０及び１１の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−４抗体はＩＬ−４へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１０において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＩＬ−４抗体は、配列番号１０のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１２３】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９及び配列番号１０のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１２４】
幾つかの実施態様において、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−４抗体と、ＩＬ−４への結合を競合する抗体が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗ＩＬ−４抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。例えば、ある実施態様において、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−４抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。
【０１２５】
幾つかの実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−４抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。幾つかの実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書において定義されるインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体、又は他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１２６】
幾つかの実施態様において、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−４抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１２７】
典型的な抗ＩＬ−１３抗体
幾つかの実施態様において、ＩＬ−１３に結合する単離された抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１２８】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１２９】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３０】
幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１３１】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が提供される。
【０１３２】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＩＬ−１３抗体はヒト化される。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号１９のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＨを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号２０のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＬを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号５６のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＨを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号５７のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＬを含む。
【０１３３】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−１３抗体はＩＬ−１３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号１９のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号５６のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１３４】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体が提供され、該抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−１３抗体はＩＬ−１３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２０において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号２０のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号５７のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１３５】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号１９又は配列番号５８のＶＨ配列、及び配列番号２０又は配列番号５７のＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１３６】
幾つかの実施態様において、配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−１３抗体と、ＩＬ−１３への結合を競合する抗体が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。例えば、Ultsch, M. et al., Structural Basis of Signaling Blockade by Anti-IL-13 Antibody Lebrikizumab, J. Mol. Biol. (2013), dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.024を参照。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。例えば、ある実施態様において、配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ヒト前駆体ＩＬ−１３（配列番号２９）のアミノ酸６３から７４又はヒトＩＬ−１３（配列番号３０）の成熟形態のアミノ酸４５から５６の範囲内にあるエピトープ（それはＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳ（配列番号４３）である）に結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ヒト前駆体ＩＬ−１３（配列番号２９）のアミノ酸６８から７５又はヒトＩＬ−１３（配列番号３０）の成熟形態のアミノ酸５０から５７の範囲内にあるエピトープ（それはＥＳＬＩＮＶＳＧ（配列番号４２）である）に結合する抗体が提供される。
【０１３７】
別の典型的な抗ＩＬ−１３抗体は、１１Ｈ４及びｈｕ１１Ｈ４ｖ６を含むそのヒト化バージョンである。Ｍｕ１１Ｈ４は、配列番号４５及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、重鎖及び軽鎖可変領域を含む。ヒト化ｈｕ１１Ｈ４ｖ６は、配列番号４９及び４８のアミノ酸配列をそれぞれ含む、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ヒト化ｈｕ１１Ｈ４ｖ６は、配列番号４７及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、重鎖及び軽鎖を含む。
【０１３８】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１３９】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。  幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１４０】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１４１】
幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４２】
幾つかの実施態様において、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が提供される。
【０１４３】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＩＬ−１３抗体はヒト化される。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号４９のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＨを含む。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号４８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４を含むＶＬを含む。
【０１４４】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−１３抗体はＩＬ−１３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号４９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号４９のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１４５】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体が提供され、該抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＩＬ−１３抗体はＩＬ−１３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号４８において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＩＬ−１３抗体は、配列番号４８のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
【０１４６】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号４９及び配列番号４８のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１４７】
幾つかの実施態様において、配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４８のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−１３抗体と、ＩＬ−１３への結合を競合する抗体が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。例えば、Ultsch, M. et al., Structural Basis of Signaling Blockade by Anti-IL-13 Antibody Lebrikizumab, J. Mol. Biol. (2013), dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.053を参照。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。例えば、ある実施態様において、配列番号４９のＶＨ配列及び配列番号４９のＶＬ配列を含む抗ＩＬ−１３抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。
【０１４８】
幾つかの実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−１３抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−１３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。幾つかの実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書において定義されるインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体、又は他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１４９】
幾つかの実施態様において、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−１３抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１５０】
典型的な抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体
幾つかの実施態様において、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体のような）が提供される。幾つかの実施態様において、抗原結合ドメインは、他の標的に特異的には結合しない。ＩＬ−４及びＩＬ−１３に結合する多重特異性抗体は、抗ＩＬ−４抗体について本明細書に記載される実施態様の何れかに記載される可変領域の第一の組（ＶＨ及びＶＬ；ＶＨ／ＶＬユニットとも称する）、及び抗ＩＬ−１３抗体について本明細書に記載される実施態様の何れかに記載される可変領域の第二の組（ＶＨ及びＶＬ；ＶＨ／ＶＬユニットとも称する）。
【０１５１】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ（重鎖可変ドメイン）を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ（軽鎖可変ドメイン）を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ＩＬ−４に対する結合を競合する第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１５２】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号１９又は配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ（重鎖可変ドメイン）を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号２０又は配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ（軽鎖可変ドメイン）を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号１９又は配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２０又は配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ＩＬ−１３に対する結合を競合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号２９のアミノ酸８２から８９からなるＩＬ−１３のエピトープに結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号２９のアミノ酸７７から８９からなるＩＬ−１３のエピトープに結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１５３】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ（重鎖可変ドメイン）を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ（軽鎖可変ドメイン）を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ＩＬ−１３に対する結合を競合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１５４】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含み；かつ配列番号１９又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む第二のＶＨ及び配列番号２０又は配列番号５７のアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１５５】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含み；かつ配列番号４９のアミノ酸配列を含む第二のＶＨ及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１５６】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有するＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するＶＨ及び配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有するＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するＶＨ及び配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有するＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。ある実施態様において、上記配列において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。
【０１５７】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する第一のＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有する第一のＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する第二のＶＨ及び配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有する第二のＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。ある実施態様において、上記配列において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。
【０１５８】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する第一のＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有する第一のＶＬを含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び配列番号４９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する第二のＶＨ及び配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有する第二のＶＬを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。ある実施態様において、上記配列において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。
【０１５９】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６０】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６１】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六つのＨＶＲを含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６２】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６３】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６４】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６５】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６６】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６７】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６８】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１６９】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１７０】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１７１】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号２１又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１７２】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨ／ＶＬユニット；及び（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される三つのＶＨ ＨＶＲ配列；及び（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される三つのＶＬ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
【０１７３】
様々な実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む第一のヘミマーを含み、ここで第一のヘミマーは、重鎖定常領域内にノブ変異を含み、第二のヘミマーは、ＩＬ−１３に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含み、第二のヘミマーは、重鎖定常領域内にホール変異を含む。様々な実施態様において、多重特異性抗体は、ＩＬ−４に結合する第一のＶＨ／ＶＬユニットを含む第一のヘミマーを含み、ここで第一のヘミマーは、重鎖定常領域内にホール変異を含み、第二のヘミマーは、ＩＬ−１３に結合する第二のＶＨ／ＶＬユニットを含み、第二のヘミマーは、重鎖定常領域内にノブ変異を含む。幾つかの実施態様において、ホール変異を含む重鎖定常領域は、配列番号３５（ＩｇＧ１）又は配列番号３７（ＩｇＧ４）に示される配列を有する。幾つかの実施態様において、ノブ変異を含む重鎖定常領域は、配列番号３４（ＩｇＧ１）又は配列番号３６（ＩｇＧ４）に示される配列を有する。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号３８の配列を有する第一の重鎖及び配列番号３９の配列を有する第一の軽鎖を含む第一のヘミマー並びに配列番号４０又は５８の配列を有する第二の重鎖及び配列番号４１又は５９の配列を有する第二の軽鎖を含む第二のヘミマーを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号３８の配列を有する第一の重鎖及び配列番号３９の配列を有する第一の軽鎖を含む第一のヘミマー並びに配列番号４０の配列を有する第二の重鎖及び配列番号４１の配列を有する第二の軽鎖を含む第二のヘミマーを含む。
【０１７４】
幾つかの実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３多重特異性抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３多重特異性抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。幾つかの実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書において定義されるインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体、又は他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１７５】
幾つかの実施態様において、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３多重特異性抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１７６】
１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、抗原に対する解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０１７７】
幾つかの実施態様において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。幾つかの実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原により実施される。例えば、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例として、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したときに、１５０μｌ／ウエルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴのＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントする。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合的結合アッセイで使用するために選択される。
【０１７８】
幾つかの実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアッセイが、〜１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。幾つかの実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１７９】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１８０】
ダイアボディーは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003);及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１８１】
単一ドメイン抗体は、抗体の、重鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照）。
【０１８２】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
【０１８３】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１８４】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１８５】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１８６】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１８７】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。
【０１８８】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１８９】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006)に記載される。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１９０】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【０１９１】
５．ライブラリー由来抗体
本明細書に記載される抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１９２】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
【０１９３】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１９４】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＩＬ−４に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、結合特異性の一つはＩＬ−４に対してであり、他は、ＩＬ−１３に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＩＬ−４の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１９５】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；単一のＶＨ／ＶＬユニットにおいてＣＬドメイン及びＶＨドメイン間でフューリンが切断可能な結合（ｔｅｔｈｅｒ）を使用すること（例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５９８１０を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１９６】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号Ａ１を参照）。
【０１９７】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＩＬ−４並びにその他の異なる抗原、例えばＩＬ−１３（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１９８】
ノブ・イントゥー・ホール
多重特異性抗体を産生する方法としてのノブ・イントゥー・ホールの使用は、例えば、米国特許第５７３１１６８号、国際公開第２００９／０８９００４号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、Marvin and Zhu, Acta Pharmacol. Sin. (2005) 26(6):649-658、及びKontermann (2005) Acta Pharmacol. Sin., 26:1-9に記載される。簡潔な非限定的な議論が本明細書において提供される。
【０１９９】
「突起」とは、ヘテロ多量体を安定させ、それによって、例えばホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成を支持するように、第一のポリペプチドの界面から突き出し、従って隣接界面（即ち、第二のポリペプチドの界面）の代償空洞内に配置可能である少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。突起は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。幾つかの実施態様において、第一のポリペプチドの界面をコードする核酸は、突起をコードするために改変される。これを達成するために、第一のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸に置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。種々のアミノ酸残基の側鎖の体積が、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号の表１に示される。
【０２００】
幾つかの実施態様において、突起の形成のための移入残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される天然に生じるアミノ酸残基である。幾つかの実施態様において、移入残基はトリプトファン又はチロシンである。幾つかの実施態様において、突起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリンなど小さな側鎖の体積を有する。
【０２０１】
「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」は、第二のポリペプチドの界面から窪み、従って、第一のポリペプチドの隣接界面上の対応する突起を収容する少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。幾つかの実施態様において、第二のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするために改変される。これを達成するために、第二のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡに置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。幾つかの実施態様において、空洞の形成のための移入残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選択される天然に生じるアミノ酸残基である。幾つかの実施態様において、移入残基は、セリン、アラニン又はスレオニンである。幾つかの実施態様において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンなど大きな側鎖の体積を有する。
【０２０２】
突起は、空洞内に「配置することが可能」であり、このことは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれの界面上の突起と空洞の空間的位置、及びその突起と空洞の大きさが、界面での第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドの正常な会合を著しくを乱すことなく、その突起が空洞中に配置され得るようなものであることを意味している。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐなどの突起は通常、界面の軸から垂直に延びておらず、好適なコンフォメーションをとっていないので、対応する空洞と突起の位置合わせは、幾つかの例において、Ｘ線結晶構造解析又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られたものなど三次元構造に基づく突起／空洞の対のモデリングに依存し得る。このことは、当該技術分野において広く受け入れられている技術を用いて達成することができる。
【０２０３】
幾つかの実施態様において、ＩｇＧ１定常領域中のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ１定常領域中のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される一以上の変異を含む。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ１定常領域中のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。配列番号３４は、ノブ変異を有する典型的なＩｇＧ１定常領域を示し、配列番号３５は、ホール変異を有する典型的なＩｇＧ１定常領域を示す。
【０２０４】
幾つかの実施態様において、ＩｇＧ４定常領域中のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ４定常領域中のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される一以上の変異を含む。幾つかの実施態様において、ＩｇＧ４定常領域中のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。配列番号３６は、ノブ変異を有する典型的なＩｇＧ４定常領域を示し、配列番号３７は、ホール変異を有する典型的なＩｇＧ４定常領域を示す。
【０２０５】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構築物が、所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
【０２０６】
置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０２０７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０２０８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うこととなる。
【０２０９】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２１０】
改変（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーが、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するする別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０２１１】
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０２１２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２１３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２１４】
グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０２１５】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本明細書で提供される抗体のオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０２１６】
幾つかの実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０２１７】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２１８】
Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０２１９】
幾つかの実施態様において、重鎖定常領域などの抗体定常領域は、多重特異性抗体の形成を促進する、ノブ変異及び／又はホール変異を含む。非限定的で例示的なノブ変異及びホール変異、及びノブ・イントゥー・ホール技術は、一般に、例えば、米国特許第５７３１１６８号、国際公開第２００９／０８９００４号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、Marvin and Zhu, Acta Pharmacol. Sin. (2005) 26(6):649-658、及びKontermann (2005) Acta Pharmacol. Sin., 26:1-9に記載されている。特定の非限定的で例示的なノブ変異及びホール変異は本明細書において議論される。
【０２２０】
ある実施態様において、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である適応のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体が提供される。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０２２１】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２２２】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)）。
【０２２３】
ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する一以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０２２４】
幾つかの実施態様において、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記述されるように、改変された（即ち、改善され又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされる。
【０２２５】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
【０２２６】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２２７】
幾つかの実施態様において、抗体の定常領域は、本明細書において議論される一以上の変異（例えば、ノブ及び／又はホール変異及び／又は安定性を増大させる変異及び／又はＡＤＣＣを減少させる変異など）を含む。
【０２２８】
システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ（複数）」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０２２９】
抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０２３０】
幾つかの実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。幾つかの実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２３１】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＩＬ−４抗体をコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体をコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。幾つかの実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。幾つかの実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクターを含む（例えば、それらにより形質転換される）。
【０２３２】
幾つかの実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。幾つかの実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０２３３】
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体を作る方法が提供され、その方法は、抗体の発現に適した条件下で、多重特異性抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から多重特異性抗体を回収することを含む。幾つかの実施態様において、多重特異性抗体を作成する方法が提供され、ここで、方法は、第一のＶＨ／ＶＬユニットの発現に適した条件下で、多重特異性抗体（もしあれば、ときには「ヘミマー」又は「半抗体」と称される定常領域を含む）の第一のＶＨ／ＶＬユニットをコードする核酸を含む第一の宿主細胞を培養すること、及び任意で、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から第一のＶＨ／ＶＬユニットを回収すること、並びに第二のＶＨ／ＶＬユニットの発現に適した条件下で、多重特異性抗体（もしあれば、ときには「ヘミマー」又は「半抗体」と称される定常領域を含む）の第二のＶＨ／ＶＬユニットをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を培養すること、及び任意で、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から第二のＶＨ／ＶＬユニットを回収することを含む。幾つかの実施態様において、方法は、単離された第一のＶＨ／ＶＬユニット及び単離された第二のＶＨ／ＶＬユニットから多重特異性抗体を構築することを更に含む。かかるアセンブリーは、幾つかの実施態様において、２つのＶＨ／ＶＬユニット（又はヘミマー）間の分子内ジスルフィドを形成する還元工程を含み得る。多重特異性抗体を生成する非限定的で例示的な方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、米国特許出願公開第２００７／０１９６３６３号、米国特許出願公開第２００７／０１７８５５２、米国特許第５７３１１６８号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、及びZhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788に記述される。非限定的で例示的な方法はまた、以下の実施例に記述される。
【０２３４】
抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０２３５】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
【０２３６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０２３７】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０２３８】
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０２３９】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ− ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０２４０】
例示的なアッセイ
結合アッセイ及びその他のアッセイ
幾つかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０２４１】
幾つかの実施態様において、競合アッセイを、ＩＬ−４に対する結合について本明細書に記載されるＩＬ−４抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。幾つかの実施態様において、競合アッセイを、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３に対する結合について本明細書に記載されるＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合抗体は、ＩＬ−４結合のために、配列番号９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号１０を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。ある実施態様において、このような競合抗体は、ＩＬ−１３結合のために、配列番号１９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号２０を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。ある実施態様において、このような競合抗体は、ＩＬ−１３結合のために、配列番号４９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号４８を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。
【０２４２】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＩＬ−４は、ＩＬ−４に結合する第一の標識された抗体（例えば、配列番号９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号１０を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体）、及びＩＬ−４への結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＩＬ−４が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＩＬ−４への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化ＩＬ−４に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＩＬ−４に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＩＬ−４への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２４３】
更なる例示的な競合アッセイにおいて、固定化ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３に結合する第一の標識された抗体（配列番号１９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号２０を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体又は配列番号４９を含むＶＨアミノ酸配列及び配列番号４８を含むＶＬアミノ酸配列を含む抗体）、及びＩＬ−１３への結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＩＬ−１３が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＩＬ−１３への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化ＩＬ−１３に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＩＬ−１３に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＩＬ−１３への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。
【０２４４】
活性のアッセイ
幾つかの実施態様において、生物学的活性を有する抗ＩＬ−４抗体及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、ＩＬ−４受容体へのＩＬ−４結合の阻害、ＩＬ−４誘導性ＳＴＡＴ６リン酸化の阻害、ＩＬ−４誘導性細胞増殖の阻害、ＩｇＥへのＢ細胞のＩＬ−４誘導性スイッチングの阻害、喘息の活動、及びＩＰＦの活動を含み得る。幾つかの実施態様において、生物学的活性は、例えば、ＩＬ−１３受容体（例えば、ＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−１３Ｒα１を含むヘテロ二量体受容体）へのＩＬ−１３結合の阻害、ＩＬ−１３誘導性ＳＴＡＴ６リン酸化の阻害、ＩＬ−１３誘導性細胞増殖の阻害、ＩｇＥへのＢ細胞のＩＬ−１３誘導性スイッチングの阻害、ＩＬ−１３誘導性粘液産生の阻害、喘息の活動、及びＩＰＦの活動を含む。インビボ及び／又はインビトロにおいて、かかる生物学的活性を有する抗体もまた提供される。かかる生物学的活性の試験のための非限定的で例示的なアッセイが本明細書に記載され及び／又は当技術分野において周知である。
【０２４５】
イムノコンジュゲート
幾つかの実施態様において、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートが提供される。かかる非限定的で例示的な細胞傷害性薬物は、化学療法剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）及び放射性同位体を含む。
【０２４６】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（例えば、米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（例えば、米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（例えば、米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（例えば、Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０２４７】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
【０２４８】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が、放射性複合体の生産用に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２４９】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０２５０】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ  ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０２５１】
診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＩＬ−４抗体の何れかは、生物学的試料中のＩＬ−４の存在を検出するのに有用である。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れかは、生物学的試料中のＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、血清、血漿、鼻腔スワブ、気管支肺胞洗浄液及び痰などの細胞又は組織を含む。
【０２５２】
幾つかの実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＩＬ−４抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＩＬ−４の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＩＬ−４抗体のＩＬ−４への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＩＬ−４抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗ＩＬ−４抗体とＩＬ−４との間に形成されているかどうかを検出することを含む。かかる方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。幾つかの実施態様において、例えばＩＬ−４が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＩＬ−４抗体が、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体、又は任意の他のＴＨ２経路阻害剤による治療に好適な被験体を選択するために使用される。
【０２５３】
幾つかの実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体のＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３への結合を許容する条件下で、本明細書に記載される抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体とＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３との間に形成されているかどうかを検出することを含む。かかる方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。幾つかの実施態様において、例えばＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体、又は任意の他のＴＨ２経路阻害剤による治療に好適な被験体を選択するために使用される。
【０２５４】
抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を用いて診断することができる例示的な疾患が本明細書に提供される。
【０２５５】
ある実施態様において、標識された抗ＩＬ−４抗体が提供される。ある実施態様において、標識された抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０２５６】
薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。幾つかの実施態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２５７】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２５８】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を有するコントローラー及び／又はＴＨ２経路阻害剤を更に提供することが所望され得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２５９】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系に（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０２６０】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
【０２６１】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより達成することができる。
【０２６２】
治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＩＬ−４抗体の何れかを、治療方法で使用することができる。本明細書で提供される抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れかを、治療方法で使用することができる。
【０２６３】
ある実施態様において、医薬として使用のための抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、喘息、ＩＰＦ、呼吸器疾患、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、又はＩＬ−４媒介性疾患の治療において使用のための抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法において使用のための抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、喘息、呼吸器疾患、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、又はＩＬ−４媒介性疾患を有する個体を治療する方法において使用のための、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が提供される。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。
【０２６４】
上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２６５】
幾つかの実施態様において、医薬の製造又は調製における抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の使用が提供される。一実施態様において、医薬は、喘息、呼吸器疾患、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、又はＩＬ−４媒介性疾患の治療用である。更なる実施態様において、医薬は、喘息、呼吸器疾患、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、又はＩＬ−４媒介性疾患を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、喘息、ＩＰＦ、呼吸器疾患、好酸球性疾患、ＩＬ−１３媒介性疾患、又はＩＬ−４媒介性疾患を治療する方法において使用のためである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。
【０２６６】
幾つかの実施態様において、上記治療法の何れかにおいて使用のための、本明細書に記載される抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れかを含む、薬学的製剤が提供される。幾つかの実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れか、及び薬学的に許容可能な担体を含む。幾つかの実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れかと、少なくとも一の付加的治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２６７】
本明細書において提供される抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書において提供される抗体は少なくとも一の付加的な治療剤と同時投与され得る。ある実施態様において、付加的治療剤は、ＴＨ２阻害剤である。ある実施態様において、付加的治療剤は、コルチコステロイド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、ＬＡＢＡ、コルチコステロイド／ＬＡＢＡの組合せ組成物、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、オマリズマブ、ＬＡＭＡ、ＭＡＢＡ（例えば、二官能性ムスカリンアンタゴニスト−ベータ２アゴニスト）、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）阻害剤、又は酵素ＰＤＥ−４阻害剤である。
【０２６８】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の投与が、付加的治療剤又は薬剤の投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の投与、及び付加的治療剤の投与は、互いに、約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
【０２６９】
幾つかの実施態様において、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、神経膠芽腫又は非ホジキンリンパ腫などのがんを治療することにおいて使用される。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２７０】
抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体（及び任意の付加的な治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２７１】
抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。これに関連した考慮因子としては、治療すべき具体的な疾患、治療すべき具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる疾患の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２７２】
疾患の予防又は治療のためには、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は、治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は一時的又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。当業者は、疾患の種類及び重症度に応じて、抗体の適切な用量を決定することができる。抗ＩＬ−１３抗体についての非限定的で例示的な用量は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０８３１３２に記載される。抗体の投与のための一般的な指針は、例えば、Bai et al., Clinical Pharmacokinetics, 51: 119-135 (2012) 及びDeng et al., Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8(2):141-160 (2012)に見つけることができる。抗体療法の進行は、一般的な技術及びアッセイにより容易にモニターされ得る。
【０２７３】
上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の代わりか又はそれに加えて、イムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２７４】
製造品
幾つかの実施態様において、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベル又は添付文書を含んでなる。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性薬剤は、抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第ニの容器を含み得る。幾つかの実施態様において、製造品は、組成物が、特定の病状を治療するのに使用可能であることを示した添付文書を更に含んでいてよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。更に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２７５】
上記の製造品の何れかは、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２７６】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に与えられる一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２７７】
実施例１−特定の方法及び試薬
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のＢＩＡｃｏｒｅ親和性測定
抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−１３及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の結合反応速度は、ビアコア３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定された。抗ヒトＦｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、製造業者が提供したプロトコルを使用して、アミンベースカップリングを用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化された。抗体は、１２００共鳴単位（ＲＵ）のレベルで捕獲された。
【０２７８】
二重特異性結合が、ヒトＩＬ−４、ｃｙｎｏ ＩＬ−４，ヒトＩＬ−１３、ヒトＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（配列番号３１）、及びｃｙｎｏ ＩＬ−１３に対して、０、３．１３、６．２５、１２．５０、２５．０、及び５０．０ｎＭの濃度で測定された。サイトカインの結合に対するセンサーグラムが、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０のランニング緩衝液を用いて、２５℃の温度で、３０ｍｌ／分の流速で２分間の注入時間を用いて記録された。注入後、抗体からのサイトカインの解離は、ランニング緩衝液中で１０００秒間監視された。表面は、３Ｍ塩化マグネシウムの６０μｌの注入による結合サイクルの間で再生された。ランニング緩衝液のみを含んだブランクを差し引いた後、抗ＩＬ−１３／抗ＩＬ−４二重特異性抗体へのサイトカインの結合について観察されたセンサーグラムは、製造業者により供給された反応速度及び結合定数を計算するソフトウェアを用いて、１：１ラングミュア結合モデルを使用して分析された。
【０２７９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のＢＩＡｃｏｒｅ結合競合アッセイ
ビアコア３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を使用して、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体によるヒトＩＬ−１３へのヒトＩＬ−１３Ｒα２結合の阻害が試験された。ヒトＩＬ−１３が、アミンベースカップリングのための製造業者のプロトコルを使用して、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された。ＩＬ−１３は、フローセル４（ＦＣ４）に９８５共鳴単位（ＲＵ）のレベルで固定化され、未反応の部位はその後、１ＭのエタノールアミンＨＣｌを使用してブロックされた。ＦＣ３は、測定の基準細胞として使用され、それは活性化とその後のエタノールアミンによるブロッキングにより調製された。ＩＬ−１３Ｒα２（当該技術分野で標準的な方法に従って作製され精製されたヒスチジンタグ付き組換えヒトＩＬ−１３Ｒα２）の結合についてのセンサグラムが、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０のランニング緩衝液を用いて、２５℃の温度で、３０ｍｌ／分の流速で２分間の注入時間を用いて記録された。ＩＬ−１３へのＩＬ−１３Ｒα２の結合についての結合定数を決定するために、１２．５から２００ｎＭまで濃度を可変したＩＬ−１３Ｒα２の一連の溶液のセンサグラムが記録された。注入後、サイトカインからの受容体の解離は、ランニング緩衝液中で６００秒間監視された。表面は、１０ｍＭのグリシンＨＣｌの６０μｌの注入による結合サイクルの間で再生された。
【０２８０】
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の存在下におけるＩＬ−１３Ｒα２のＩＬ−１３への結合を評価するために、競合抗体の存在下におけるサイトカインに対する受容体の結合を評価するための追加のステップとして、２５０ｎＭの抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の６０μｌの注入が添加された。ランニング緩衝液のみを含んだブランクを差し引いた後、競合抗体の非存在下及び存在下における受容体のサイトカインへの結合について観察されたセンサーグラムは、製造業者により供給された反応速度及び結合定数を計算するソフトウェアを用いて、１：１ラングミュア結合モデルを使用して分析された。
【０２８１】
ＥＬＩＳＡ結合競合アッセイ
抗体が、ＩＬ−４がＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）への結合を阻害するかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。９６ウェルプレートにおいて、抗体の１５０μｇ／ｍＬ（１０００ｎＭ）溶液が、アッセイ緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含む、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］、ｐＨ７．５）中で３倍に連続希釈され、０．０００９、０．００３、０．００８、０．０２、０．０７、０．２１、０．６２、１．９、５．６、１６．７、５０．０、及び１５０μｇ／ｍＬ（それぞれ、０．００５６、０．０１７、０．０５、０．１５、０．４６、１．３７、４．１２、１２．３、３７、１１１、３３３、及び１０００ｎＭ）の範囲を提供した。各希釈液の量は、３５μＬであった。各ウェルに、ビオチン化ＩＬ４の１１．６ｎｇ／ｍＬ（７８０ｐＭ）溶液の３５μＬが添加された。その混合液を室温で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルの内容物は、ＰＢＳ中の可溶性ＩＬ−４Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３０−４Ｒ／ＣＦ）の２．０μｇ／ｍＬ溶液の５０μＬにより一晩コーティングされ、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックされた９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移された。４０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で５回洗浄した。次いで、各ウェルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン溶液（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μＬを受け取り、４０分間インキュベートされた。洗浄緩衝液で５回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）５０μＬが各ウェルに添加された。数分後、塩酸の１Ｎ溶液の５０μＬが添加され反応を停止させた。プレートを、スペクトラマックス３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎＭで読み取った。各試料について、４５０ｎＭでの光学密度（ＯＤ）読み取りが、濃度に対してプロットされた。曲線は、カレイダグラフ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）にプロットされ、４パラメーターフィットを使用してフィットされ又は点の間をプロットした。
【０２８２】
抗体が、ＩＬ−１３Ｒα１受容体へのＩＬ−１３結合を阻害するかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化ＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（配列番号３１）がビオチン化ＩＬ−４の代わりに使用され、かつ可溶性ＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４６−ＩＲ−１００）が可溶性ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃの代わりに使用される点を除いて、上述のように実質的に実施された。
【０２８３】
抗体が、ＩＬ−１３Ｒα２受容体へのＩＬ−１３結合を阻害するかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化ＩＬ−１３がビオチン化ＩＬ−４の代わりに使用され、かつ可溶性ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４６−ＩＲ−１００）が可溶性ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃの代わりに使用される点を除いて、上述のように実質的に実施された。
【０２８４】
プラスミドの構築及び抗体の発現
抗体は、以前に記述された発現ベクターにクローニングされた（Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263, 133-147）。重鎖及び軽鎖の一又は両方の翻訳開始強度を有するＳＴＩＩシグナル配列は、成熟した抗体をコードする配列の前に置かれた。タンパク質発現のため、適切なＷ３１１０誘導体中での一晩の培養物（Reilly and Yansura, 2010, Antibody Engineering (Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg)）は、ＬＢ（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）中で３０℃で増殖され、ＣＲＡＰ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）中に１：１００希釈され、３０℃で２４時間増殖された。より大規模な調製のために、例えば、以前に記述されるように（Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263, 133-147）、培養物は１０Ｌの発酵槽中で増殖された。
【０２８５】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために一晩の培養物２００μｌを回収し、ＮＲ−溶解緩衝液（８８μｌのＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１０μｌの１００ｍＭのヨードアセトアミド、２μｌのｌｙｓｏｎａｓｅ試薬（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））１００μｌに再懸濁させた。室温で１０分間インキュベートした後、試料は９３００ ＲＣＦで２分間回転せられ、５０μｌの上清を新しいチューブに移し、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同容量と混合された。ＮｕＰＡＧＥ４−１２％ビス−トリス／ＭＥＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に１０μｌの試料をロードする前に、試料は、９５℃で５分間加熱され、１６０００ｒｃｆで１分間回転された。ゲルはニトロセルロース膜上にｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって転送され、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷがコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ｃ）抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いてイムノブロットされ、ＬＩＣＯＲオデッセイイメージャーを用いて画像化された。
【０２８６】
還元細胞試料の全てについて、細胞ペレットは、Ｒ−溶解緩衝液（１０μｌの１Ｍ ＤＴＴ、８８μｌのＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）、２μｌのｌｙｓｏｎａｓｅ）に再懸濁され、試料が２×ＳＤＳ試料緩衝液と混合される前に、室温で１０分間インキュベートされた。ウェスタンブロットは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷがコンジュゲートした抗ヒト抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）が免疫検出のために使用されることを除いて、前述されるような画像である。
【０２８７】
精製及び二重特異性抗体の構築
大腸菌全細胞ブロスをＧＥＡ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＨ，Ｕ．Ｓ．Ａ）からのＮｉｒｏ−Ｓｏａｖｉホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られたホモジネートは、次いでポリエチレンイミン凝集剤を添加することによって０．４％の最終濃度に抽出され、精製水で希釈され、室温で１６時間混合された。抽出物は遠心分離によって除去され、０．２μｍの滅菌フィルターを用いた濾過後１５℃に冷却し、予め平衡化した（２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．１）プロテインＡカラムにロードされた。カラムを平衡緩衝液及び０．４Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）で洗浄し、最後に１００ｍＭの酢酸（ｐＨ２．９）で溶出した。プロテインＡプールを、その後、構築反応において混合した。
【０２８８】
別々の半抗体プロテインＡプールは、０．２Ｍのアルギニンで調整され、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いてｐＨ８．０にｐＨを調整し、混合され、Ｌ−還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が、二重特異性抗体に対して２００×モル過剰で追加され、４８時間２０℃でインキュベートされた。インキュベーションの後、構築された二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製された。陽イオン交換溶出液は濃縮され、緩衝液は、最終製剤緩衝液に交換された。
【０２８９】
インタクトな還元型質量分析による抗体の分析的特性評価
二重特異性の還元型及びインタクトな質量は、ナノチップＬＣシステムと連結したＡｇｉｌｅｎｔ６２１０ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いたＬＣ／ＭＳ分析によって得られた。二重特異性試料は、事前のＴＣＥＰ還元の有り無し両方で、注射あたり約５ｎｇの抗体で、直接オンラインＭＳ分析のためにＲＰＨＰＬＣにより脱塩された。還元型及び非還元型試料について得られたスペクトルは、多価タンパク質イオンの分布を示し、スペクトルは、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒワークステーションソフトウェア／定性分析Ｂ．０３．０１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．２００９）を使用して、ゼロ電荷状態にデコンボリューションされた。
【０２９０】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ変異体は、ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）を用いて分離され、０．２Ｍのリン酸カリウム及び０．２５Ｍの塩化カリウム液（ｐＨ６．２）からなる移動相を用いてアイソクラチックに溶出された。分離は、０．５ｍＬ／分の流速で室温で実施された。カラム溶出液は２８０ｎｍでモニターされた。高分子量種（ＨＭＷＳ）、メインピーク、及び低分子量種（ＬＭＷＳ）のピーク面積の相対的割合は、ダイオネックス社のＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアｖ６．８０のＳＲ１１をを用いて行った。
【０２９１】
キャピラリー電気泳動ードデシル硫酸ナトリウム分析（ＣＥ−ＳＤＳ）
二重特異性試料は、最初にクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６．６で希釈され、ＳＤＳ及びＮ−エチルマレイミドで３分間７０℃で処理された。冷却後、は、過剰のシアン化カリウムの存在下で、３ー（２ーフルオイル）キノリンー２ーカルボキシアルデヒド）（ＦＱ）により１０分間５０℃で標識された。標識化反応は、緩衝液交換によりクエンチされ、その後、１％ＳＤＳで処理された。非還元型試料は、７０℃で５分間加熱された。還元型試料は、７０℃で１０分間、５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理された。
【０２９２】
非還元型及び還元型試料は両方とも、直径５０μｍのコーティングされていない溶融シリカキャピラリーを用いるＢｅｃｋｍａｎ ＰＡ８００ ＣＥシステムを使用してＣＥＳＤＳにより分析された。試料は動電学的に注入され（５ｋＶで４０秒）、分離は、３５分間、極性を逆転させて１５ｋＶの定電圧で行われた。キャピラリー温度は４０℃に維持された。標識された成分の移動は、ＬＩＦ検出によりモニターされた励起は４８８ｎｍであり、発光は６００ｎｍでモニターされた。
【０２９３】
細胞培養（ＴＦ−１細胞）
ヒトＴＦ−１（赤白血病細胞、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が、５％ＣＯ２を含む３７℃での加湿インキュベーター中で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３，ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）；及び１Ｘペニシリン：ストレプトマイシン：グルタミン（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１０３７８−０１６，Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び２ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２１５−ＧＭ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含有する、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を含有する増殖培地中で培養された。アッセイ培地は、２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦを含まない増殖培地である。サイトカインが、以下の最終濃度で、指定される通りに、アッセイ培地に添加された：０．２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２０４−ＩＬ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、２ｎｇ／ｍｌのカニクイザルＩＬ−４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、及び２０ｎｇ／ｍｌのカニクイザルＩＬ−１３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【０２９４】
実施例２−ＩＬ−４に結合する抗体の生成
選択的に、ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）に結合する抗体のパネルが市販のヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して生成された。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの各後肢足蹠に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でモノホスホリル脂質Ａ及びトレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬＴＭ＋ＴＤＭ）ベースのアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）の全２５μｌに再懸濁された０．５μｇのＩＬ−４が、３から４日間隔で注射された。血清試料は、７回の追加免疫後に採取され、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって力価が測定され、ＩＬ−４に対する陽性免疫応答を有するマウスを同定した。動物は、ＰＢＳ中にアジュバントを使用して、足蹠（２５μｌ／足蹠で０．５μｇ）、腹腔内（１００μｌで２μｇ）、及び静脈内（５０μｌで１μｇ）の経路を介して、二回以上追加免疫された。最後の追加免疫後三日で、ＥＬＩＳＡで陽性の血清力価を示した動物は屠殺され、電気融合（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を使用して、脾細胞の単一細胞懸濁液をマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）と融合させた。融合したハイブリドーマ細胞は、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（登録商標）ハイブリドーマ選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）からのＭｅｄｉｕｍ Ｄ中でヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択を使用して、融合していない脾臓、膝窩リンパ節又は骨髄腫細胞から選択された。ハイブリドーマ細胞は、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（登録商標）ハイブリドーマ選択キットからのＭｅｄｉｕｍ Ｅ中で培養され、細胞培養上清を、さらなる特徴付け及びスクリーニングのために使用した。生成された１９２１のハイブリドーマ細胞株をスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が一般的に前述のように実施された（Baker,K.N.,et al., Trends Biotechnol. 20, 149-156 (2002)）。
【０２９５】
我々は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって決定される場合、≦１０ｐＭの親和性でヒトＩＬ−４に結合するクローン１９Ｃ１１を同定した。１９Ｃ１１がＩＬ−４ＲαへのヒトＩＬ−４の結合をブロックするかどうかを決定するために、ビオチン化ＩＬ−４（０．１７ｎＭ）が、クローン１９Ｃ１１又は対照抗体由来のＩｇＧ（１０００、２００、４０、８、１．６、及び０．３２ｎＭ、濃度）の段階希釈された上清５０μｌと前もって混合された。室温で３０分間のインキュベーションの後、混合物は、固定化可溶性ヒトＩＬ−４Ｒα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに移された。固定化のために、可溶性ヒトＩＬ−４Ｒαは、一晩４℃で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌのＩＬ−４Ｒαによりプレートをコーティングすることにより固定化された。プレートを、抗体／ＩＬ−４を添加する前にＰＢＳで希釈したウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の０．５％溶液の２００μＬでブロックした。抗体／ＩＬ−４混合物を添加した後、プレートを室温で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを０．０５％ポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）が、アッセイ緩衝液で１：５０００に希釈され、１００μＬが各ウェルに添加された。室温で３０分間のインキュベーション後、上述のようにプレートを洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬが添加され、プレートを５から１５分間インキュベートした。反応を１Ｎリン酸の添加によって停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、スペクトラマックス３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＯＤ４５０で読み取った。曲線は、カレイダグラフのグラフソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ）を使用してプロットされた。
【０２９６】
１９Ｃ１１は、ＴＦ−１細胞のＩＬ−４誘導性増殖をブロックするか否かを決定するために、精製された１９Ｃ１１又は無関係な対照抗体の連続希釈を、ＩＬ−４及びＴＦ−１細胞とともにインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、各試料は、３Ｈ−チミジンを投与され、４時間のインキュベーション後、３Ｈ−チミジンの取り込みが測定された。
【０２９７】
１９Ｃ１１は、ビオチン化ＩＬ−４のＩＬ−４Ｒαへの結合をブロックし（図１Ａ）、ＩＬ−４Ｒαとの結合に関与する領域と重複するＩＬ−４上のエピトープを示唆している。また、１９Ｃ１１は、ＴＦ−１細胞のＩＬ−４誘導性増殖を阻害した（図１Ｂ）。ＴＦ−１細胞のＩＬ−４誘導性増殖をブロックするためのＩＣ５０は０．０１４μｇ／ｍｌであると決定され、ＩＣ９０は０．０７μｇ／ｍｌであると決定された（データ非表示）。１９Ｃ１１は、その後、選択点変異を有するヒトＶκ−１／ＶＨＩＩＩアクセプターフレームワークに超可変領域を移植することによってヒト化された。１９Ｃ１１の結合親和性は、エピトープ、及び細胞活性は、ヒト化プロセス中において保存された（データ非表示）。
【０２９８】
実施例３−１９Ｃ１１のヒト化
ｍｕ１９Ｃ１１からの超可変領域（ＨＶＲ）は、ヒトＶＬカッパＩ（ｈｕＫＩ）、ＶＬカッパＩＩＩ（ｈｕＫＩＩＩ）、ＶＨサブグループＩ（ｈｕＶＨ１）及びＶＨサブグループＩＩＩ（ｈｕＶＨＩＩＩ）コンセンサスアクセプターフレームワークに移植され、ＣＤＲ移植片（１９Ｃ１１−κ１グラフト、１９Ｃ１１−κ３グラフト、１９Ｃ１１−ＶＨ１グラフト、１９Ｃ１１−ＶＨ３グラフト）を生成した（図１３から１０を参照）。ＶＬドメインでは、以下の領域が移植された：位置２４−３４（ＨＶＲＬ１、配列番号１５）、５０−５６（ＨＶＲＬ２、配列番号１６）及び８９−９７（ＨＶＲＬ３、配列番号１７）。ＶＬドメインでは、位置２６−３５ｂ（ＨＶＲＨ１、配列番号１２）、４９−６５（ＨＶＲＨ２、配列番号１３）及び９５−１０２（ＨＶＲＨ３、配列番号１４）が移植された。
【０２９９】
１９Ｃ１１−移植片は、各超可変領域に別々のオリゴヌクレオチドを用いたＩｇＧ発現構築物として、クンケル突然変異誘発によって生成された。正確なクローンはＤＮＡ配列決定により同定された。１９Ｃ１１−移植片の親和性と機能性を潜在的に高めるために、特定のマウスバーニアフレームワーク位置が、ＶＨドメインの移植片に復元された（図１２及び１３参照）。具体的には、１９Ｃ１１−ＶＨ１移植片の位置６７、６９及び７１、１９Ｃ１１−ＶＨ３移植片の位置６９、７１及び７８が多様化され、１９Ｃ１１−ＶＨ１．Ｌ、１９Ｃ１１−ＶＨ１．ＦＦＬ、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ、及び１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＦＬＡを生成した。更に、変異のＤ６２Ｓ及びＦ６３Ｖが１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡのＣＤＲ−Ｈ２に導入され、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ．ＳＶを生成した（図１３参照）。
【０３００】
スクリーニング目的のために、ＩｇＧ変異体は、最初に６ウェルプレートにおいて２９３細胞において産生された。ＶＬ及びＶＨをコードするベクター（各２μｇ）が、ＦｕＧｅｎｅシステムを用いて２９３細胞にトランスフェクトされた。ＦｕＧｅｎｅの６μｌが、ＦＢＳを含有しないＤＭＥＭ培地１００μｌと混合され、５分間室温でインキュベートされた。各鎖（２μｇ）がこの混合物に添加され、２０分間室温でインキュベートされ、次いで５％ＣＯ２中で３７℃で一晩のトランスフェクションのために６ウェルプレートに移された。翌日、トランスフェクション混合物を含有する培地は除去され、例えば、ＤＭＥＭをＦＢＳを含有する２ｍｌの細胞培養培地で置換された。細胞を更に５日間インキュベートした後、培地を５分間の１０００ｒｐｍで回収し、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルターを使用して滅菌濾過した。試料が４℃で保存される。
【０３０１】
親和性測定は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−Ａ１００を用いた表面プラズモン共鳴によって実施された。抗ヒトＦｃγ抗体（約〜７０００ＲＵ）が、ＣＭ５センサーチップ上で、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨを４．８中で固定された。２９３細胞で発現されるヒト化１９Ｃ１１ ＩｇＧ変異体は、抗ヒトＦｃγ抗体によって捕獲された。組換えＩＬ−４は３０μＬ／分の流速で注入された。各注入の後、チップは３ＭのＭｇＣＬ２を使用して再生された。結合応答は、ヒト化１９Ｃ１１変異体ＩｇＧのフローセルから対照フローセルを減算することにより補正した。ｋｏｎとｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルが動力学的解析に用いられた。
【０３０２】
ヒト化軽鎖（１９Ｃ１１−κ１移植片、１９Ｃ１１−κ３移植片）の各々をヒト化重鎖（１９Ｃ１１−ＶＨ１移植片、１９Ｃ１１−ＶＨ１．Ｌ、１９Ｃ１１−ＶＨ１．ＦＦＬ、１９Ｃ１１−ＶＨ３移植片、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ、及び１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＦＬＡ）の各々と組み合わせて、１２の異なるヒト化１９Ｃ１１変異体が作製された。マウス可変領域がヒトＩｇＧの定常領域と組み合わされたキメラ１９Ｃ１１と一緒に、１２のヒト化１９Ｃ１１変異体が、ＳＰＲによりＩＬ−４の親和性について試験された（図１４）。１９Ｃ１１−ＶＨ１移植片／κ１移植片、１９Ｃ１１−ＶＨ３移植片／κ１移植片、１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＦＬＡ／κ１移植片、及び１９Ｃ１１−ＶＨ３移植片／κ３移植片を除いて、変異体の大部分は、ＩＬー４対して１０ｐＭ未満の親和性を保持していた。１９Ｃ１１−ＶＨ１．ＦＦＬ／κ３移植片及び１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＦＬＡ／κ３移植片は、ＩＬ−４に対して１１ｐＭの親和性を有していた。
【０３０３】
１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ．ＳＶ／κ１移植片が、更なる試験のために選択された。ヒト化抗体１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ．ＳＶ／κ１移植片（以下の実施例では抗ＩＬ−４として参照される）についての重鎖及び軽鎖可変領域配列は、配列番号９及び１０にそれぞれ示される。抗体１９Ｃ１１−ＶＨ３．ＬＡ．ＳＶ／κ１移植片についての重鎖可変領域（ＨＶＲ）は、配列番号１２から１４に示され、軽鎖ＨＶＲは配列番号１５から１７に示される。
【０３０４】
実施例４−ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ１二重特異性抗体の生成
我々は以前、大腸菌内で、２つの異なる軽鎖を有するヒトＩｇＧ１の二重特異性抗体を生成する技術を確立した（Yu et al., 2011, Sci Transl Med 3, 84ra44）。この方法は、免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進するためにｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術（Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9, 617-621; Atwell et al., 1997, J Mol Biol 270, 26-35）を利用する。軽鎖誤対合の無い２つの異なる軽鎖の使用を可能にするために、我々は別々の大腸菌細胞内においてヘミマーとして各アームを培養した。我々は、ヒトＩｇＧ１のホールとして抗ＩＬ−４アームの及びヒトＩｇＧ１のノブとして抗ＩＬ−１３アームの発現を可能にするベクター中に抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１３親抗体をサブクローニングすることによって、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体を生成するこのアプローチを適用した。ＩｇＧ１のノブ定常領域の配列は配列番号３４に示され、及びＩｇＧ１のホール定常領域の配列は配列番号３５に示される。
【０３０５】
我々は、以前に作製され、特徴づけられているレブリキズマブ（ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）を抗二重特異性抗体の抗ＩＬ−１３のＦａｂのもとにした。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０６２９６７ Ａ２を参照。レブリキズマブは、１０ｐＭの検出限界未満であるビアコア由来のＫｄで可溶性ヒトＩＬ−１３に結合する。ＩＬ−１３へのレブリキズマブの結合は、ＩＬ−１３Ｒα１へのサイトカインの結合を阻害しないが、ヘテロ二量体シグナル伝達コンピテントＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１複合体のその後の形成をブロックする（Ultsch, M. et al., 2013, J. Mol. Biol., dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.024; Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098）。
【０３０６】
抗体発現のために、大腸菌株６４Ｂ４を用いた。一晩培養物はＬＢ（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）中で３０℃で増殖せられ、５ｍｌのＣＲＡＰ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）に１：１００に希釈され（Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147）、３０℃で２４時間増殖された。発現後、可溶性画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、その後半抗体種の形成を分析するために抗Ｆｃ免疫染色が行われた。ノブ及びホールの変異は両方とも主たる半抗体種をもたらす。１０Ｌの発酵槽へのスケールアップのために、初期スターター培養液（５００ｍｌ）を固定相に増殖させ、１０Ｌの発酵に植菌するために使用された（Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147）。
【０３０７】
大腸菌における抗ＩＬ−１３のＩｇＧ１ノブヘミマーの初期発現は、予想よりも少なかった。Ｆａｂ配列のランダム突然変異誘発及び／又は疎水性表面残基を置換すると、改善されたＦａｂの安定性及びフォールディングにつながる可能性があることが以前に示されている（Forsberg et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 12430-12436; Demarest et al., 2006, Protein Eng. Des. Sel., 19: 325-336; Kugler et al., 2009, Protein Eng. Des. Sel., 22: 135-147）。
【０３０８】
変異体は、大腸菌細胞中で発現され、非還元全細胞抽出物が非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、その後抗Ｆｃイムノブロットが行われた。ヘミマーバンドはオデッセイ（登録商標）（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量され、レブリキズマブに正規化された。
【０３０９】
重鎖及び軽鎖のいくつかの改変がヘミマー収率及び／又はフォールディングを改善することが見出された。改変の一つ、軽鎖のＭ４Ｌが選択された。更に、Ｑ１Ｅ改変が重鎖に導入された。二つの改変が、単一のヘミマーで組み合わされ、得られたヘミマーは、野生型ヘミマーに対して改善された収率及びフォールディングを有することが見出された。レブリキズマブのＱ１Ｅ重鎖可変領域の配列は配列番号１９に示され、及びレブリキズマブのＭ４Ｌ軽鎖可変領域の配列は配列番号２０に示される。これらの可変領域は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１二重特異性抗体を構築するために使用された。
【０３１０】
インタクトな二重特異性抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５９８１０に以前に記載された方法を用いる酸化還元化学によって単離された半抗体から構築された。
【０３１１】
実施例５−ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４二重特異性抗体の生成
ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の生成を確立した後、我々は、二重特異性プラットフォームをヒトＩｇＧ４アイソタイプに変えた。中等度から重度の制御されない喘息の治療において臨床的利益を示した抗ＩＬ−１３抗体であるレブリキズマブのアイソタイプを一致させるために、我々は、ヒトＩｇＧ４抗体として、抗ＩＬ−４／Ｉｌ−１３二重特異性抗体を作製することを望んだ（Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098）。
【０３１２】
ＩｇＧ１とは対照的に、ＩｇＧ４の重鎖−軽鎖間ジスルフィドは、非連続的なジスルフィドにより形成される。この非連続的なジスルフィド結合パターンは、大腸菌タンパク質について通常観察されない（Berkmen, 2005, J. Biol. Chem. 280, 11387-11394）。更に、ＩｇＧ４のヒンジ領域は、Ｓ２２８残基により不安定化され、ＩｇＧ４のＣＨ３二量体のインターフェイスは不安定なＲ４０９残基を含む（Dall'Acqua et al., 1998, Biochemistry 37, 9266-9273）（ＥＵ番号付けの慣習）。我々は、ＩｇＧ４のＦｃ領域の配列の影響、鎖間ジスルフィドパターン及び大腸菌における半抗体の機能発現におけるＣＨ３ Ｒ４０９並びにそれに続く二重特異性分子への構築を分析するためにいくつかの構築物を設計した。各ケースにおいて、構築後のＦａｂアーム交換を少なくするために、ヒンジ領域に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を導入した（Stubenrauch et al., 2010, Drug Metab. Dispos. 38, 84-91）。我々は、半抗体の機能発現におけるＩｇＧ４のＦｃ領域の影響を評価するために、対応するノブ／ホール変異（ノブ：Ｔ３６６Ｗ；ホール：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を有するＩｇＧ４のＦｃ領域をＩｇＧ１のＦａｂへ移植した。抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１３の両方の抗体について、これは、ＩｇＧ１アイソタイプとしてジスルフィド結合物質の同様な量を得ており（図２Ｃ及び２Ｄ）、Ｆｃ領域におけるアイソタイプの違いは、大腸菌で機能的な半抗体の発現に影響を与えないことを示している。我々は、次に、重鎖の定常領域全体をＩｇＧ４サブクラスに変換した。これは機能的に発現される半抗体の減少をもたらしたが、大腸菌は、原則的に、連続しないシステインから抗体の定常領域での分子内ジスルフィドを形成することができることを実証した。
【０３１３】
位置４０９は、ＣＨ３の安定性にとって重要であり得（Dall'Acqua et al., 1998, Biochemistry 37, 9266-9273）、及び下流の構築プロセスに対するＲ４０９の影響はこの段階では不明であったため、我々はまた、ＩｇＧ１アイソタイプで見いだされたＣＨ３インターフェイスを再作成するために、Ｒ４０９Ｋ変異を有するコンストラクトを設計した。両方の抗体において、これは、ＩｇＧ４アイソタイプの機能発現のわずかな低下を部分的にレスキューした（図２Ｃ及び２Ｄ）。
【０３１４】
実施例６−ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４二重特異性抗体の構築及び精製
異なる二重特異性抗体コンストラクトの構築を比較するために、我々は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋとして半抗体を発現する培養液を増殖させた。プロテインＡクロマトグラフィーによる半抗体の精製後、ヘミマー対は混合され、二重特異性抗体が、ヘテロ二量体化ノブ／ホール対の酸化還元化学工程により形成された。過剰な半抗体は、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー工程により除去された。最終クロマトグラフィー工程の後、材料は、アルギニンコハク酸、ｐＨ５．５、０．０２％のポリソルベート２０中に４５ｇ／ｌで調整された。構築された抗体は、半抗体種から安定なインタクトな抗体へ変化したことを確認するために、我々は、サイズ排除クロマトグラフィーによってそれらを特徴づけた。全ての３つのコンストラクトは、インタクトな１５０ｋＤａの抗体に対応する保持時間で溶出した（図３Ａ）。更に、凝集された種の有意な量は検出されず（ＩｇＧ１／ＩｇＧ４／ＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋにおいて０．６／０．４／０．４％）低分子量種の微量のみが検出され（ＩｇＧ１／ＩｇＧ４／ＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋにおいて０．２／０／４．４％）、両方のアイソタイプは、低凝集傾向の抗体を構築するために使用することができることを示唆している。
【０３１５】
二重特異性構築の間の工程の一つは、ヒンジジスルフィドの形成である。サイズ排除クロマトグラフィーは、鎖間ジスルフィドの酸化状態を分離できないため、我々は、抗体にキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム分析（ＣＥ−ＳＤＳ）を施し、３つ全てのフォーマットが同様の効率でヒンジジスルフィドを形成していることを見いだした。ＩｇＧ１、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋに対して、材料のうち８９．３％、９１．４％、及び８６．７％が、それぞれ完全酸化型コンフォーメーションで観察された（図３Ｂ）。我々は、次に、試料を還元し、重鎖に対する軽鎖のそれぞれの比率を決定するために、ＣＥ−ＳＤＳによってそれらを再分析した（図３Ｃ）。３つ全てのフォーマットは、軽鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ４／ＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋに対して３１．３／３１．４／３０．９％）及び重鎖（ｇＧ１／ＩｇＧ４／ＩｇＧ４Ｒ４０９Ｋに対して６５．８／６４．９／６５．４％）の類似し予想された分布を有しており、天然の抗体のコンフォーメーションの存在を更に確認した。
【０３１６】
ヘテロ二量体種が構築工程中に生成されたことを確認するために、我々は、質量分析によって、最終的な二重特異性分子を分析した。インタクトな還元型質量が、表２、図４及び表３に要約される。３つ全ての二重特異性抗体において、実験質量は理論質量に密接に一致しており、我々は、ホモ二量体種に対応するいかなる質量をも検出することができなかった。逆相ＨＰＬＣアッセイは、抗体は二重特異性であり、ホモ二量体抗体の証拠は無いことが確認された（データ非表示）。
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【０３１７】
我々は、Ｒ４０９及びＲ４０９Ｋ ＩｇＧ４の二重特異性ノブ−イントゥーホール抗体の構築内の任意の有意差を検出することができなかったので、全ての更なる研究は、野生型（Ｒ４０９）ＩｇＧ４二重特異性抗体フォーマットを利用した。
【０３１８】
実施例７−ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の生化学的特徴付け
我々は、次に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４二重特異性抗体を、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に対するそれらの結合親和性並びにＩＬ−４及びＩＬ−１３のそれらの受容体への結合をブロックするそれらの能力が同等であるかどうかを評価するために、特徴付けた。ＩＬ−４及びＩＬ−１３に対するＩｇＧ１及びＩｇＧ４二重特異性抗体の親和性が、実施例１に記載されるようにビアコアによって測定され、親抗体のものに匹敵し（表４）かつ同様であることが見出され、リガンドを結合する能力は、二重特異性フォーマット又はアイソタイプによって影響されないことを示している。
【０３１９】
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、ヒトＩＬ−１３、ヒトＩＬ−１３ Ｒ１３０Ｑ（配列番号３１）、及びカニクイザルＩＬ−１３に高親和性で結合する。解離定数０．０５６、０．１４２、及び０．０４８（ｎＭ）が、それらのサイトカインについて、それぞれ計算された。速度定数が表４に提供される。更なるＳＰＲ実験は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、ヒトＩＬ−４及びカニクイザルＩＬ−４に高親和性で結合することを示した。解離定数０．０４６及び０．０７６が、それらのサイトカインについて、それぞれ計算された。速度定数が表４に提供される。
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【０３２０】
二重特異性分子が、その受容体へのサイトカインの結合をブロックすることができることを確実にするために、実施例１に記載されるＥＬＩＳＡ競合結合アッセイが実質的に使用された。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、ビオチン化ヒトＩＬ−４（５．８ｎｇ／ｍＬ）のヒトＩＬ４Ｒへの直接結合を阻害した（図１５参照）。ＩＬ４Ｒに対する結合するビオチン化ＩＬ４の減少は、二重特異性抗体の０．０３５から２５μｇ／ｍＬ（０．２３から１６７ｎＭ）で観察された。
【０３２１】
対照的に、抗ＩＬ−４／Ｉｌ−１３二重特異性抗体は、ビオチン化ヒトＩＬ−１３（０．６２５ｎｇ／ｍＬ）のヒトＩＬ−１３Ｒα１への直接結合を阻害しなかった（図１６参照）。試験した濃度での二重特異性抗体の添加によって、ＩＬ−１３Ｒα１へのビオチン化ヒトＩＬ−１３の結合の低下は観察されなかった。
【０３２２】
抗ＩＬ−４／Ｉｌ−１３二重特異性抗体は、ビオチン化ヒトＩＬ−１３（０．０５６ｎｇ／ｍＬ）のヒトＩＬ−１３Ｒα１への直接結合を実質的に阻害しなかった（図１７参照）。ＩＬ−１３Ｒα２へのビオチン化ＩＬ−１３の結合の部分的な減少が観察された。
【０３２３】
ＳＰＲは、実施例１に記載のように、ＩＬ−１３へのＩＬ−１３Ｒα２の結合を観察するために使用された。センサグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）は、固定化されたＩＬ−１３に対するＩＬ−１３Ｒα２の一連の濃度の注入に対して集められた。センサグラムに基づいて、０．３６５ｎＭ（ｋｏｎ＝２４．２７×１０４±０．４９Ｍｓ−１、ｋｏｆｆ＝０．８９１ｘ１０−４±０．０２６ｓ−１）の結合定数（Ｋｄ）が観察された。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、別のＳＰＲ実験で高親和性（Ｋｄ＝５６ｐＭ）でＩＬ−１３に結合することが以前に示された（表４参照）。ＩＬ−１３へのＩＬ−１３Ｒα２の結合の阻害を試験するために、ＩＬ−１３Ｒα２の注入前に、２５０ｎＭの抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体が、固定化されたＩＬ−１３に対して注入された。二重特異性抗体の結合は固定化されたＩＬ−１３とのＩＬ−１３Ｒα２の結合を阻止しなかった（図１８を参照）。二重特異性抗体：ＩＬ−１３複合体へのＩＬ−１３Ｒα２の結合のＫｄは、１．０９ｎＭであった（ｋｏｎ＝１０．０６ｘ１０４±０．５６Ｍｓ−１、ｋｏｆｆ＝１．１０ｘ１０−４±０．１２ｓ−１）。固定化ＩＬ−１３の二重特異性抗体による前飽和は、ＩＬ−１３へのＩＬ−１３Ｒαの結合を控えめに破壊するだけであり、二重特異性抗体は、ＩＬ−１３Ｒα２へのＩＬ−１３の結合を有意には阻害しないことを示している。
【０３２４】
従って、親抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１３抗体と同様に、二重特異性抗体は、ＩＬ−４ＲαへのＩＬ−４の結合を完全に阻害し、ＩＬ−１３Ｒα１又はＩＬ−１３Ｒα２に対するＩＬ−１３の結合を実質的には阻害しなかった。これらの知見は、各ＩＬ−１３及びＩＬ−４アームについての結合エピトープ及び一価親和性が二重特異性抗体に保存されていることを示唆している。
【０３２５】
実施例８−細胞アッセイにおけるＩＬ−４及びＩＬ−１３活性の中和
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ４二重特異性抗体の両方の活性が、ヒトＩＬ−４及びＩＬ−１３がＴＦ−１細胞の増殖を誘導するインビトロ細胞アッセイで評価された。ヒトＩＬ−４及びヒトＩＬ−１３単独及び組み合わせによって誘導されるＴＦ−１細胞の増殖をブロックする各二重特異性抗体の能力が、以下に記載するように評価された。
【０３２６】
抗体は、９６ウェル組織培養プレート（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．３５３０７２，Ｆａｌｃｏｎ ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｊ）において、サイトカインを含有するアッセイ培地５０μｌ中で３．３倍に連続希釈された。プレートは３７℃で３０分間インキュベートされた。ＴＦ−１細胞はアッセイ培地で２回洗浄され、２．５×１０５細胞／ｍｌの最終容量で再懸濁された。５０μｌの細胞が、１００μｌの総容積の各ウェルに添加された。プレートを、ウェルあたり１μＣｉの３Ｈチミジンを添加する前に、３７℃で、５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で４日間インキュベートした。更なる４時間のインキュベーションの後、増殖を、液体シンチレーションカウンターを用いて、細胞に関連する３Ｈチミジン取り込みによって測定した。重複試料からの結果が平均値として表される。グラフは、カレイダグラフを使用して作り出された（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）。
【０３２７】
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４二重特異性抗体の両方とも、ＴＦ−１細胞のヒトＩＬ−４及びＩＬ−１３誘導性増殖を用量依存的に阻害し、二つの異なる二重特異性抗体の間で、インビトロ中和のためのＩＣ５０に有意な差は見られなかった（図５及び表５）。
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【０３２８】
同様の分析が、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ４二重特異性抗体が、ＴＦ−１細胞において用量依存的にカニクイザルＩＬ−４及びＩＬ−１３誘導性増殖を阻害するかを決定するために行われた（図６）。
【０３２９】
実施例９−カニクイザルにおける薬物動態学的研究
我々は、ＩｇＧ４及びＩｇＧ１抗ＩＬ−４／Ｉｌ−１３二重特異性抗体のインビボ薬物動態を、カニクイザルに単一の静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）投与後に評価した。カニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ）の研究は、施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４によるＰＫ研究は、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（ＣＲＬ）前臨床サービス（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）で行われた。ＣＲＬストックからの合計１５匹のメスのカニクイザル（２．２−２．６ｋｇ）は、無作為に５群（ｎ＝３／群）に割り付けられた。グループ１の動物は、対照ビヒクルの静脈内（ＩＶ）及び皮下（ＳＣ）用量を与えられた。群２、３、及び４の動物は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４の単一ＩＶボーラス用量を、それぞれ１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇで与えられた。群５の動物は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４のＳＣ用量を１０ｍｇ／ｋｇで与えられた。
【０３３０】
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１によるＰＫ試験は、Ｓｈｉｎ Ｎｉｐｐｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＳＮＢＬ）ＵＳＡ（Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｗａ）で行われた。ＳＮＢＬストックからの合計１２匹のメスのカニクイザル（２．４−３．１ｋｇ）は、無作為に４群（ｎ＝３／群）に割り付けられた。グループ１の動物は、対照ビヒクルのＩＶ用量を与えられた。群２、３、及び４の動物は、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１の単一ＩＶボーラス用量を、それぞれ１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇで与えられた。
【０３３１】
両方の研究に対して、血清試料は、投与後４−５週間までの様々な時点で採取され、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１の濃度は、０．０７８μｇ／ｍＬの定量限界を用いたＥＬＩＳＡにより評価され、抗治療抗体（ＡＴＡ）はブリッジングＥＬＩＳＡにより評価された。ＰＫデータの計算のために、研究１日目を、用量投与の開始を示すために、ＰＫ０日目に変換した。生存中の投薬日後の全ての時点は、研究日マイナス１として計算された。各動物の血清濃度データはＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）、バージョン５．２．１を用いて２コンパートメント分析を用いて分析した（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））。
【０３３２】
抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１二重特異性抗体の血清濃度−時間プロファイルは、試験された用量範囲にわたって線形薬物動態により二相性の配置を示した（図７Ａ及び７Ｂ）。両方の抗体の中心コンパートメントの初期体積は、制限された分布を示す血清量に類似していた。カニクイザルにおけるヒトＩｇＧ４及びＩｇＧ１抗体について予想されるように、両方の抗体は、比較的遅いクリアランス（ＣＬ）と長い末端半減期を有していた（抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ４に対して平均ＣＬ＝５．７９から６．７０ｍＬ／日／ｋｇ、及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ１に対して３．５９から４．０９ｍＬ／日／ｋｇ）。１０ｍｇ／ｋｇの用量群について計算されるエリアアンダーカーブ（ＡＵＣ）に基づいて、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４抗体のＳＣの生物学的利用能は９５．１％であった。抗治療抗体（ＡＴＡ）の存在は、１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量群内の全３匹の動物を含み、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４を投与した動物の５０％で検出され、１４日目後の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ＩｇＧ４の消失の増加と関連するように見えた。ＰＫに影響を及ぼさないように見えた抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ１処置動物において、ＡＴＡの低い発生率が検出された。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１二重特異性抗体の両方の全体的な薬物動態は、カニクイザルにおける他のヒト化ＩｇＧ１及びＩｇＧ４モノクローナル抗体のものと類似で同等であった。
【０３３３】
実施例１０−カニクイザル喘息モデルにおける肺分配
我々は、喘息のカニクイザルモデルにおけるＩｇＧ４対ＩｇＧ１抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の肺分配の潜在的な違いを評価した。この喘息モデルでは、ブタ回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）に自然に感作したカニクイザルは、アレルゲンに暴露された喘息患者のそれを模倣するアレルギー性炎症反応を誘発するＡ．ｓｕｕｍ抽出物のエアロゾル曝露を受けた。
【０３３４】
カニクイザルにおける肺分配の研究は、ＩＡＣＵＣによって承認された。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１を比較する本研究は、ＣＲＬ、前臨床サービス（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）で行われた。本研究は、二つの異なるセッションからなった。最初のセッションでは、ＣＲＬストックからカニクイザル（３−１０ｋｇ）は、各動物における適切な気道応答を誘発するＡ．ｓｕｕｍ曝露の適合性を判断するために、ブタ回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）によるベースラインエアロゾル曝露を受けた。動物は、曝露期間を通じて苦痛の徴候をモニターされ、このセッション中に抗体を与えられなかった。４週間後、２番目のセッションが開始され、合計７匹のオスカニクイザルは、無作為に２つの群に割り当てられた（ＩｇＧ４の群でｎ＝３；ＩｇＧ１の群でｎ＝４）。これらのサルは、その後、研究１日目と研究８日目に、ＩＶ急速投与量を介して、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１の何れかの１０ｍｇ／ｋｇを受けた。その後、動物は、研究９日目にＡ．ｓｕｕｍによるエアゾール吸入を介して曝露された。投与後最大２３日間までの様々な時点で、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液及び血清試料が採取され、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１濃度について、０．０７８／ｍｌの定量限界を用いたＥＬＩＳＡにより分析された。データの計算のために、研究１日目を、用量投与の開始を示すために、ＰＫ０日目に変換した。生存中の投薬日後の全ての時点は、研究日マイナス１として計算された。尿素及びアルブミンは、上皮被覆液（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）（ＥＬＦ）の濃度を推定し、炎症誘発性血管漏出を補正するために、それぞれ、ＢＡＬ及び血清中で測定された。回虫特異的ＩｇＥはまた、ＥＬＩＳＡにより血清中で測定された。Rennard et al., 1986, J. Appl. Physiol., 60(2): 532-538によって記載されるように、希釈因子はＢＡＬ及び血清尿素濃度データを用いて推定された。
【０３３５】
我々は、研究日１及び８における１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後及び研究日９日目のＡ．ｓｕｕｍ抽出物による肺曝露の後に、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／３ ＩｇＧ１抗体の上皮被覆液（ＥＬＦ）濃度に対して血清濃度を比較した。ＥＬＦ中のＩｇＧ濃度値は、例えば、Rennard et al., 1986, J. Appl. Physiol., 60(2): 532-538に記載されるように、ＢＡＬ液採取手順に固有の希釈に関してＢＡＬ液のＩｇＧ濃度のデータを補正することにより導き出した。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３のＩｇＧ４及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ１二重特異性抗体の血清から肺への分配は、研究の全期間にわたって同等であった（図８）。アレルゲン曝露の前に、両方の抗体のＥＬＦ濃度は、ＩｇＧの血清濃度の約１％−４％であり、全身の抗体のごく一部がＥＬＦに達したことを示している。研究９日目におけるＡ．ｓｕｕｍによる吸入曝露は、両抗体の肺分配の増加を生じるように見えた。しかし、ＥＬＦ中のアルブミン濃度に対してＩｇＧ濃度を正規化し、血清ＩｇＧ濃度に対してこれらの値を比較すると、そのデータは、呼吸器曝露後のＥＬＦのＩｇＧ濃度の増加は、曝露により誘導された非特異的な高分子血管漏出に起因することを示唆した。
【０３３６】
実施例１１−マウスアレルギー性気道炎症及び喘息モデルにおける抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−１３、及び抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３抗体の有効性
８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がこの研究で使用された。０日目に、全てのマウスは、１００μｌの無菌ＰＢＳ中の２ｍｇのミョウバン中５０μｇトリニトロフェニル−オボアルブミン（ＴＮＰ−ＯＶＡ）により腹腔内（ＩＰ）で免疫化された。免疫後３５日目に開始して、全てのマウスは、７日間連続で毎日、ネブライザーを介して３０分間、ＰＢＳ中の１％ＴＮＰ−ＯＶＡにより、エアロゾル曝露された。３７日目に開始し、図９Ａに示すように、マウスは７日間の各エアロゾル曝露の４時間前に腹腔内に（ＩＰ）投与されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により毎日処置された。
【０３３７】
４２日目には、全てのマウスは、（研究の間に達成されたＴＮＰ−ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、及び抗体血清濃度を測定するため）、最終的に２００μｌの血清のために、麻酔下で後眼窩から血液を採取された。マウスは、ＥＬＩＳＡによるＴＮＰ−ＯＶＡ特異的免疫グロブリン及び血清ＴＡＲＣ（胸腺及び活性化制御ケモカイン）測定のための血清試料を得るために、イソフルラン麻酔下で後眼窩採血された。気管支肺胞洗浄液の試料は、白血球百分率数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔｓ）のために収集された。肺を冷ＰＢＳで灌流し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。肺は粉々に切り刻まれ、その後、金属マッシュによりすりつぶされ、単一細胞懸濁液を得て、次にバイアル０．７μｍのナイロンフィルターを通して濾過された。肺試料は５ｍｌ中に再懸濁される。細胞懸濁液の一定容量が、ＦＩＴＣ標識された蛍光ビーズの一定濃度まで添加され、細胞数を得るために試料あたり５０００ビーズイベントを収集する、フローサイトメーターで分析された。肺の定量的及び表現型分析のために、試料あたり３００万肺細胞は、表面白血球マーカーに対する蛍光色素標識モノクローナル抗体で染色された（ＣＤ４４−ＦＴＣ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＣＲ３−Ｐｅ及びＣＤ４−ＡＰＣ，又はＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ及びＧｒ−１−ＡＰＣ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。試料は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に流され、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析された。
【０３３８】
その実験の結果は図９Ｂから９Ｅに示される。抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、抗ＩＬ−４抗体よりも大きな程度に肺の好酸球を抑制し（ｐ＝０．０３８１）、かつ抗ＩＬ−１３抗体よりも大きな程度に肺の好酸球を抑制するように見えたが、その差は統計的な有意性には達しなかった（ｐ＝０．１８０３）（図９Ｂ）。同様に、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の投与は、抗ＩＬ−４抗体（ｐ＝０．００３１）又は抗ＩＬ−１３抗体（ｐ＝０．０１３５）の何れかよりも大きい程度に気管支肺胞洗浄液中の好酸球を抑制した（図９Ｃ）。抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の何れかの投与は、対照処置と比較して、ＴＮＰ−ＯＶＡ特異的ＩｇＥを減少させるように見えたが、その結果は統計的有意性には達しなかった（図９Ｄ）。最後に、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体の投与は、抗ＩＬ−４抗体又は抗ＩＬ−１３抗体の何れかよりも大きい程度に血清ＴＡＲＣレベルを抑制した（それぞれ、ｐ＜０．０００１及びｐ＝０．０３２３）（図９Ｃ）。
【０３３９】
議論
本明細書において、我々は、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３に対するヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ４二重特異性抗体を作製するために、以前に開発されたノブ・イントゥー・ホール二重特異性抗体のプラットフォームを適用した。ＩＬ−４及びＩＬ−１３の重複かつユニークな生物学並びに中等度から重度の喘息患者の治療における抗ＩＬ−１３抗体の活性を前提として、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を標的とする二重特異性抗体は、喘息の治療のために抗ＩＬ−１３よりも改善された治療法であり得る。上記実施例１１に提示されたデータは、この仮説を支持している。我々の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体は、中等度から重度の制御されない喘息における第ＩＩ相試験で臨床的有効性を示した抗ＩＬ−１３抗体レブリキズマブの拡張である。レブリキズマブは、ヒトＩｇＧ４抗体であるので、我々は、我々の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体のアイソタイプをレブリキズマブのそれに一致させるために、ヒトＩｇＧ４によるノブイントゥーホール二重特異性抗体プラットフォームを使用した。
【０３４０】
ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４アイソタイプの主な違いの一つは、二量体の安定性に影響を与えるＣＨ３ダイマーインターフェイスである。違いは、位置４０９によって駆動される。我々の結果は、半抗体としての発現並びに二重特異性抗体への構築の両方の観点から、ノブ・イントゥー・ホール変異は、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン内のＡｒｇ４０９と適合することを示している。我々は、２つの異なるアイソタイプ間の構築効率又は最終抗体物質の品質における有意差を検出することはできなかった。
【０３４１】
様々なアイソタイプのヒト抗体の発現は、哺乳動物細胞において十分に確立されているが、大腸菌内で異なるヒト抗体アイソタイプを発現する試みは少なく、従って、大腸菌内でのヒトＩｇＧ４アイソタイプの完全長又は半抗体の発現は、十分には文書化されていない。ここでは、我々は、これらの抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体について、ヒトＩｇＧ４ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）を大腸菌細胞において大量に首尾良く発現させることができ、かつヒトＩｇＧ１二重特異性抗体と同じくらい容易に二重特異性抗体へと構築されることができることを実証する。
【０３４２】
ノブ・イントゥー・ホール技術の特徴の一つは、最終的な二重特異的分子内における一価親抗体の生物物理学的特性の保持である。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の二重特異性抗体の両方は、親Ｆａｂの標的エピトープ及びインビトロ細胞アッセイにおいて高い効力につながる、ＩＬ−４又はＩＬ−１３標的サイトカインに対する高親和性を含む結合特性を保持していた。
【０３４３】
カニクイザルにおける薬物動態学的研究は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方の二重特異性抗体において遅いクリアランス及び終末相半減期を示した。また、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４二重特異性抗体の両方が、肺中の病原性ＩＬ−４及びＩＬ−１３の完全な中和を可能にすることができるレベルで血清から肺に同程度に分配され、これは喘息の治療のために重要である。カニクイザルにおいて、ＩｇＧ４の二重特異性は、ＩｇＧ１の二重特異性に比べて、ＡＴＡの高い割合を有するように見えるが、我々の研究で使用された動物の数の少なさ、並びにカニクイザル対ヒトでのヒト化抗体の免疫原性との間の明確な関係の欠如を考慮すると、我々は、ヒトにおける我々の抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３ＩｇＧ４及びＩｇＧ１二重特異性抗体の相対的な免疫原性についての結論を出すことはできない。しかしながら、抗体ＦａｂのＣＤＲ領域は別として、我々の二重特異性抗体は、ヒトにおいて最小限の免疫原性を示すべきである完全ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４の配列からなることは留意されるべきである。したがって、我々が作製した二重特異性抗体は、喘息並びにＩＰＦ及び他の呼吸器疾患のための臨床開発に対する良好な候補である。更に、本明細書に提示されるインビボデータに基づいて、例えば、喘息、ＩＰＦ及び他の呼吸器疾患のようなヒトの疾患を治療する方法が当然従う。
【０３４４】
異なるヒトアイソタイプの抗体は、血清補体タンパク質及び免疫エフェクター細胞上のＦｃγ受容体への結合の違いに起因する、非常に異なるインビボ及びインビトロの特性を有することができる（Nirula, A. et al., 2011, Curr Opin Rheumatol 23, 119-124）。具体的には、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体は、効果的に補体系を活性化し、Ｆｃγ受容体に係合して抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）をトリガーするが、一方、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの抗体は、補体系を活性化せず、減少したＡＤＣＣを有する。重要なことには、抗体のエフェクター機能のこれらの特性は、哺乳動物細胞における発現の間に生成される抗体のグリコシル化を必要とする。大腸菌などの細菌細胞中で産生された抗体は、アイソタイプに関係なく、抗体のグリコシル化の欠如に起因し、抗体のエフェクター機能を欠いている（Jung, S.T. et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22, 858-867; Simmons, L.C., et al., 2002, J Immunol Methods 263, 133-147）。この研究で産生される二重特異性抗体は、大腸菌で産生され、したがって、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能を欠いたが、本明細書に記載される二重特異性抗体はまた、哺乳動物細胞において産生され得る。このアプローチは、完全にグリコシル化された二重特異性抗ＩＬ−４／ヒトＩｇＧ１ＩＬ−１３及びＩｇＧ４抗体アイソタイプを含むように、これらの抗体のためのノブ・イントゥー・ホール二重特異性抗体のプラットフォームを有効に拡張し得、ひいては異なるエフェクター機能を有する治療用二重特異性抗体の広範囲を提供し得る。
【０３４５】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示と実施例によりある程度詳細に記載してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に援用される。
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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