(57)【要約】  本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に基づくＧＭ１ガングリオシドーシスのヒト細胞モデルおよびｉＰＳ細胞起源の神経前駆細胞を調製する方法、および、ＧＭ１ガングリオシドーシス治療剤の開発のための上のＧＭ１モデルの使用に関する。ＧＭ１患者フィブロブラスト起源のｉＰＳ細胞は、前記細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシスおよびリソソーム蓄積および遺伝子発現パターン変化等の細胞内ＧＭ１徴候の調査のために効率良く使用され得るように、ＧＭ１患者において示される特徴を模倣し得る神経前駆細胞（ＮＰＣ）およびニューロスフェア細胞へ分化し得る。つまり、本発明のＧＭ１細胞モデルは、ＧＭ１発症メカニズムの研究および該疾患の治療薬の開発のための研究のために効率良く使用され得る。本発明者らはまた、上のＧＭ１細胞モデルを使用することによって、インフラマソームインヒビターｒｈＩＬ１ＲＡまたはＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫをも確立し、さらに、それが、ＧＭ１ガングリオシドーシスの緩和／治療剤として効率良く使用され得ることをも確認した。加えて、ＧＭ１患者の分子徴候は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを引き起こすタンパク質変異として新たに同定されたＥ１８６Ａ変異を有する形質転換細胞において、再現され得る。したがって、誘導Ｅ１８６Ａ変異を含有する変異体細胞は、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして効率良く使用され得る。
2016533770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデル。
【請求項２】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をインビトロで誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）で誘導されたｉＰＳ細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項３】
ステップｉ）における誘導が、多能性マーカーの異所性発現によって達成される、請求項２に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項４】
以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデル。
【請求項５】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞をインビトロで調製すること；
ｉｉ）ステップｉ）で調製されたｉＰＳ細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）を誘導すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において誘導されたＮＰＣを収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項６】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の、胚様体（ＥＢ）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアへの分化を誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）において誘導された、胚様体（ＥＢ）の分化マーカー、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の特徴またはニューロスフェアの形態的特徴を分析すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項７】
胚様体分化マーカーが、外胚葉マーカーＮＥＳＴＩＮおよびＴＵＪ１、内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２、ならびに、中胚葉マーカーα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびＤＥＳＭＩＮからなる群から選択される１つまたは２つ以上のマーカーである、請求項６に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項８】
神経前駆細胞が、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
から選択される１つまたは２つ以上の特徴を有する、請求項６に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項９】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルからの分化した神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを、サンプル化合物または組成物で処置すること；
ｉｉ）ステップｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアの特徴を分析すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた結果と無処置コントロール群とを比較すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
ステップｉｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアが、以下のａ）〜ｃ）：
ａ）嚢胞性ニューロスフェアから正常ニューロスフェアへの回復；
ｂ）ニューロスフェア細胞のサイズの増大；および、
ｃ）炎症関連遺伝子の発現の低下
から選択される１つまたは２つ以上の特徴を有する、請求項９に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（メチル（３Ｓ）−３−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−３−メチルブタンアミド］プロパンアミド］−５−フルオロ−４−オキソペンタノアート）を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物。
【請求項１２】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物。
【請求項１３】
以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の減少；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルの使用。
【請求項１４】
以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルの使用。
【請求項１５】
Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法。
【請求項１６】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法。
【請求項１７】
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの使用。
【請求項１８】
ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の使用。
【請求項１９】
β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された、ＧＭ１ガングリオシドーシス変異体細胞モデル。
【請求項２０】
以下のステップ：
ｉ）β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターを構築すること；
ｉｉ）ステップｉ）において構築されたβ−ｇａｌ変異体発現ベクターで、分離した細胞を形質転換すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において形質転換された変異体細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項２１】
β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞を、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして使用する方法。
【請求項２２】
β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞の、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者起源の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いることにより、および、ｉＰＳ細胞由来の分化した組織特異的細胞を構築することにより、ＧＭ１ガングリオシドーシスヒト細胞モデルを調製する方法、ならびに、ＧＭ１ガングリオシドーシス治療剤のスクリーニングのための前記細胞モデルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）は、リソソームβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の欠乏によって引き起こされる極めてまれな遺伝性疾患であり、したがって、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に分類される。β−ｇａｌは、様々な生体分子の加水分解の役割を果たすリソソームに存在するＧＬＢ１遺伝子によってコードされる酵素である（Brunetti-Pierri N and Scaglia F, molecular genetics and metabolism 94, 391-396, 2008）。β−ｇａｌの最も代表的な基質は、ＧＭ１ガングリオシド、リソソーム・スフィンゴ脂質である。ＧＭ１ガングリオシドは、脳において豊富であり、かつ、神経細胞の発達および一般的な機能において重要な役割を果たす（Yu RK et. al, Neurochemical research 37, 1230-1244, 2012）。
【０００３】
β−ｇａｌ活性の欠乏は、小胞体（ＥＲ）を包含する他の細胞器官におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積を導き、それに応じて、発作、運動失調および肝脾腫大症を包含する様々な症状を引き起こす。かかる症状の重症度および疾患の発生ポイント(point of outbreak)は、残存するβ−ｇａｌ活性に関連していると推測される。ＧＭ１の最も特有な臨床的症状は、ＣＮＳにおける進行性の神経変性である。したがって、ＧＭ１は、基本的に、神経学的障害として理解され、他の神経変性疾患と非常に似た特徴を共有するように思われる（Vitner EB et. al, The Journal of biological chemistry 285, 20423-20427, 2010; Sandhoff K and Harzer K. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 33, 10195-10208, 2013）。
【０００４】
ＧＭ１の発達メカニズムの研究において、β−ｇａｌノックアウトマウスモデルが使われてきた。これから、折り畳まれていないタンパク質反応(unfolded protein response)（ＵＰＲ）、ミトコンドリア機能障害、増大した自食作用およびＴｒｋシグナリングの活性化などの神経細胞死に応答する様々なメカニズムが提案されてきた（Tessitore A, et al. molecular cell 15, 753-766, 2004; Sano R, et al. molecular cell 36, 500-511, 2009; Takamura A, et al. Biochemical and biophysical research communications 367, 616-622, 2008; Takamura A, et al. Journal of neurochemistry 118, 399-406, 2011）。炎症性因子の活性化が以前、β−ｇａｌ−／−マウスの脳で確認された。進行性のＣＮＳ炎症は、かかる活性化によって引き起こされる臨床的症状に密接に関連している（Jeyakumar M, et al. Brain : a journal of neurology 126, 974-987, 2003）。ＣＮＳの慢性炎症は、広義の神経変性疾患の基準に含まれており、脳構造の異常および脳機能の悪化を起こすことが知られている。それにも拘らず、慢性の神経炎症の分子メカニズムは十分には研究されていない。
【０００５】
インフラマソームの新しい役割が、近年、慢性炎症関連疾患において確認されてきている（Walsh JG et. al, Nature reviews Neuroscience 15, 84-97, 2014; Choi AM and Nakahira K, Nature immunology 12, 379-380, 2011; Franchi L et. al, Nature immunology 10, 241-247, 2009; Kufer TA and Sansonetti PJ, Nature immunology 12, 121-128, 2011）。近年の報告によれば、前記インフラマソームは、センサータンパク質、アダプタータンパク質およびカスパーゼ−１(caspase-1)などの３つの種類のタンパク質から構成されるタンパク質複合体である。感染、細胞損傷および細胞内ストレスによって引き起こされる様々な刺激によって、インフラマソームの形成およびカスパーゼ−１の活性化を促進する。活性化されたカスパーゼ−１は、ＩＬ１β、炎症誘発性(proinflammatory)サイトカインの成熟を誘導し、その後のＩＬ１βの分泌によってサイトカインを産生し、慢性炎症の誘導をもたらす。
【０００６】
したがって、インフラマソームは、マクロファージおよびミクログリアを包含する免疫細胞で研究されてきた。また、研究はＣＮＳニューロンにおけるインフラマソームの機能を証明しようとしていた（Walsh JG et. al, Nature reviews Neuroscience 15, 84-97, 2014）。さらに重要なことに、インフラマソームの活性化は、アルツハイマー病およびパーキンソン病を包含する神経変性疾患の発達の分子メカニズムとして説明されてきた（Heneka MT, et al.Nature493, 674-678, 2013）。アルツハイマー病を引き起こす分子としてよく知られるアミロイド−βは、リソソームの破壊によってインフラマソームの活性化を誘導する（Halle A, et al. Nature immunology 9, 857-865, 2008）。パーキンソン病を引き起こす重要な役割を果たす原線維性α−シヌクレインは、ＲＯＳの産生を増大することができ、リソソームを、インフラマソームを最終的に活性化するのには不安定にする（Codolo G, et al. PloS one8, e55375, 2013）。
【０００７】
ヒトＧＭ１発達に関する分子メカニズムは、十分には開示されておらず、ＧＭ１の処置は未だ不可能である。ＧＭ１マウスモデルを構築し、このモデルがヒトＧＭ１の多くの特徴をエミュレートすることができたとしても、それはヒトＧＭ１に決して置き換えることができず、したがって、ＧＭ１マウスモデルでの研究はすぐに限界に達するであろう。したがって、ＧＭ１発達メカニズムを再現することができるヒトに由来するＧＭ１細胞モデルの開発は、疾患のメカニズムおよび原因を理解し、より効果的な処置方法の確立のために非常に有用であろう。
【０００８】
幹細胞は、各組織を形成する細胞に分化する前の前分化の段階にある細胞であり、胚、胎児および成体の組織から得ることができる。幹細胞は、分化していない状態から無制限の増殖を行う自己増殖活性を有し、多能性を有するので、それらは、ある刺激が与えられると様々な組織の細胞に分化することができる。すなわち、幹細胞は、ある分化刺激（環境）によって分化するようになり、細胞分裂が完了した分化した細胞と異なり、細胞分裂によって自己と同じ細胞を産生するために自己再生する。幹細胞はまた、増殖／膨張能力および可塑性を有し、これにより、幹細胞は、環境が変化した場合、または、異なる刺激が与えられた場合、異なる細胞に分化することができる。
【０００９】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を包含するヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は優れた分化能を有しており、人体を形成するほとんど全ての組織の細胞に分化することができる。特に、患者起源のｉＰＳ細胞は、患者のものと免疫学的および遺伝学的に同一の特徴を示す組織特異的分化細胞をインビトロでの分化システムにおいて産生できる。したがって、ヒト多能性幹細胞は、免疫拒絶反応の心配のない、患者にカスタマイズされた細胞治療製品の開発だけでなく、器官形成の初期ステージにおける複雑な疾患のメカニズムを理解するためにも、効果的なエバリュエータ(evaluator)としてよく知られている（Muotri, A. R. (2009) Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85; Marchetto, M. C., B. Winner, et al. (2010) Hum Mol Genet 19(R1): R71-76）。
【００１０】
様々な遺伝性疾患を有する患者から得た患者起源のｉＰＳ細胞を疾患関連細胞に直接的に分化させた場合、疾患特異的表現型が観察されたことが以前に報告された（Park, I. H. et al. Cell 134, 877-886 (2008); Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)）。かかる疾患特異的ｉＰＳ細胞は、疾患または細胞損傷の原因に直接関与するこれたの組織に分化することができる。疾患特異的特徴を示す分化した組織−細胞は、疾患の原因を説明するためのメカニズムの研究のため、または、疾患の治療剤の開発のために用いることができる。
【００１１】
本発明者らは、患者起源のｉＰＳ細胞に基づくＧＭ１ガングリオシドーシスの研究のためのヒト細胞モデルの確立を試みた。結果として、本発明者らは、最初にＧＭ１起源の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をＧＭ１患者のフィブロブラストから構築し、次いでそれから胚様体（ＥＢ）および神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分化を誘導した。ＧＭ１患者由来のｉＰＳ細胞は、インビトロおよびインビボの両方で多能性を示し、同時に、ＧＭ１患者において検出されるＧＭ１原因遺伝子変異を有し、したがって、低減されたβ−ｇａｌ活性を示す。本発明者らはまた、ＧＭ１患者に起源するｉＰＳ細胞の神経前駆細胞への分化を誘導した。
【００１２】
結果として、β−ｇａｌの発現が増大し、その活性は分化した神経前駆細胞において減少し、細胞内のＧＭ１ガングリオシドーシスおよびリソソームの蓄積が増大したことを示唆する。ＧＭ１起源神経前駆細胞における遺伝子発現パターンは、正常細胞とのものと比較した。結果として、炎症関連経路、特にインフラマソーム代謝経路が促進されたことが確認された。ＧＭ１患者由来のｉＰＳ細胞から分化した神経前駆細胞をインフラマソームインヒビターで処置した場合、細胞形態およびサイズだけでなく、遺伝子発現パターンも、正常細胞のものと同様に回復した。上記の結果は、ＧＭ１の発生(outbreak)が、インフラマソームの活性化に関連し、したがって、インフラマソームの阻害がＧＭ１の処置に機能していることを示唆する。
【００１３】
本発明者らは、ＧＭ１患者起源の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）およびｉＰＳ細胞由来の神経前駆細胞を用いて、疾患特異的な表現型を検査した。結果として、インフラマソームがＧＭ１治療剤の開発の研究の鍵となる分子標的であり得、インフラマソームインヒビターがＧＭ１処置のポジティブな効果を示すことが示唆された。結論として、本発明者らは、ＧＭ１の原因の研究のため、および、疾患の治療剤の開発のために、効率良く用いることができる新規ＧＭ１ガングリオシドーシスのヒト細胞モデルを提案することによって、本発明を完成した。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いて、本発明者らによって開発された、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）患者の疾患の特徴を模倣できるヒト細胞モデルを用いて、ＧＭ１ガングリオシドーシスのさらなる研究のための改善された方法、および、ＧＭ１ガングリオシドーシス用治療剤の開発のための改善された方法を提供することである。
【００１５】
上記の目的を達成するため、本発明は、次のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスのｉＰＳ細胞モデルを提供する。
【００１６】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をインビトロで誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）で誘導されたｉＰＳ細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルを提供する。
【００１８】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞をインビトロで調製すること；
ｉｉ）ステップｉ）で調製されたｉＰＳ細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）を誘導すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において誘導されたＮＰＣを収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の、胚様体（ＥＢ）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアへの分化を誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）において誘導された、胚様体（ＥＢ）の分化マーカー、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の特徴またはニューロスフェアの形態的特徴を分析すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルからの分化した神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを、サンプル化合物または組成物で処置すること；
ｉｉ）ステップｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアの特徴を分析すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた結果と無処置コントロール群とを比較すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（メチル（３Ｓ）−３−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−３−メチルブタンアミド］プロパンアミド］−５−フルオロ−４−オキソペンタノアート）を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明はまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および治療のための医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の減少；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルの使用を提供する。
【００２４】
本発明はまた、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルの使用を提供する。
【００２５】
本発明はまた、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの使用を提供する。
【００２８】
本発明はまた、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の使用を提供する。
【００２９】
本発明はまた、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された、ＧＭ１ガングリオシドーシス変異体細胞モデルを提供する。
【００３０】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターを構築すること；
ｉｉ）ステップｉ）において構築されたβ−ｇａｌ変異体発現ベクターで、分離した細胞を形質転換すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において形質転換された変異体細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞を、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして使用する方法を提供する。
【００３２】
加えて、本発明は、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞の、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとしての使用を提供する。
【００３３】
有利な効果
ＧＭ１ガングリオシド患者のフィブロブラストを起源とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、ＧＭ１患者の疾患特異的特徴を模倣することができる神経前駆細胞（ＮＰＣ）およびニューロスフェア細胞に分化することができ、細胞内ＧＭ１ガングリオシド／リソソーム蓄積などのＧＭ１疾患症状および遺伝子変異もまた細胞内で確認することができる。したがって、前記細胞はＧＭ１モデル細胞として首尾よく確立されており、したがって、本発明のＧＭ１ヒト細胞モデルは、ＧＭ１の発達メカニズムの研究のため、および、疾患の治療剤の開発のための有用なモデルとして提案される。
【００３４】
加えて、ＧＭ１患者の分子症状は、新たに、タンパク質変異が引き起こすＧＭ１ガングリオシドーシスとして同定されたＥ１８６Ａ変異を有する形質転換された細胞において再現することができる。したがって、誘導されたＥ１８６Ａ変異を含有する変異体細胞は、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして効率よく用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面を参照することによって、最も良く理解される。図面において：
【図１】図１は、本発明の、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）由来のｉＰＳ細胞の調製プロセスおよびその使用を説明する模式図である。
【００３６】
【図２】図２は、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストにおける、ＧＭ１を引き起こす遺伝子変異を提示する：図２ａは、ＧＭ１患者由来のＧＭ００９１８細胞株における、ＧＭ１を引き起こすタンパク質変異であるＥ１８６Ａの遺伝子変異を説明する図表であり；および、図２ｂは、ＧＭ１患者由来のＧＭ０２４３９細胞株における、ＧＭ１を引き起こす遺伝子の変異を説明する図表である。
【００３７】
【図３】図３は、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストの特徴を提示する：図３ａは、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストにおけるリソソームの蓄積を説明する図表であり；図３ｂは、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストにおけるＧＭ１の蓄積を説明する図表であり；図３ｃは、Ｘ−ｇａｌ染色により確認された、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストにおけるβ−ｇａｌタンパク質の活性を説明する図表であり；図３ｄは、β−ｇａｌのＥ１８６Ａ変異体タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞におけるβ−ｇａｌ活性の低下を説明する図表であり；図３ｅは、Ｘ−ｇａｌ染色により確認された、β−ｇａｌのＥ１８６Ａ変異体タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞におけるβ−ｇａｌタンパク質の活性を説明する図表であり；および、図３ｆは、β−ｇａｌのＥ１８６Ａ変異体タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞におけるβ−ｇａｌタンパク質の発現レベルを説明する図表である。
【００３８】
【図４】図４は、β−ｇａｌのＥ１８６Ａ変異体タンパク質の構造分析を提示する：図４ａは、原核生物と真核生物との間のＧＬＢ１関連タンパク質の配列比較を説明する図表であり；図４ｂは、ヒトβ−ｇａｌタンパク質に基づくＥ１８６Ａ変異体タンパク質の３次元構造分析を説明する図表であり；および、図４ｃは、ヒトβ−ｇａｌタンパク質に基づくＥ１８６Ａ変異体タンパク質におけるＥ１８６残基部位を説明する図表である。
【００３９】
【図５】図５は、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストからの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の構築プロセスを説明する模式図である。
【００４０】
【図６】図６は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＮＰＣにおけるＧＭ１を引き起こす遺伝子の変異を説明する図表である。
【００４１】
【図７】図７は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の特徴を提示する：図７Ａは、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の形態的特徴を説明する図表であり；図７Ｂは、アルカリホスファターゼ染色（ＡＰ染色）によって確認された、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の非分化を説明する図表であり；および、図７Ｃは、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞における多能性マーカータンパク質の発現を説明する図表である。
【００４２】
【図８】図８は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）アッセイの結果を説明する図表である。
【図９】図９は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の核型分析の結果を説明する図表である。
【図１０】図１０は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞からインビボで分化した奇形腫の領域サイズを説明する図表である。
【００４３】
【図１１】図１１は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞からインビボで分化した奇形腫を説明する図表である。
【図１２】図１２は、フィブロブラストにおけるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の活性と比較された、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞における該活性を説明する図表である。
【００４４】
【図１３】図１３は、非ウイルス方法によって構築されたＥｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の特徴を説明する図表である：図１３Ａは、Ｅｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の細胞形態（ＡＰ染色）および同細胞における多能性マーカーの発現を説明する図表であり；図１３Ｂは、Ｅｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の核型分析の結果を説明する図表であり；および、図１３Ｃは、Ｅｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫を説明する図表である。
【００４５】
【図１４】図１４は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞からＧＭ１−ＮＰＣへの分化のプロセスを説明する模式図である。
【図１５】図１５は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から分化した胚様体（ＥＢ）の外胚葉、中胚葉および内胚葉マーカーの発現を説明する図表である。
【００４６】
【図１６】図１６は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から分化したＧＭ１−ＮＰＣにおける神経マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現を説明する図表である。
【図１７】図１７は、ＧＭ１−ＮＰＣにおける神経マーカータンパク質の発現を説明する図表である。
【００４７】
【図１８】図１８は、ＧＭ１−ＮＰＣ起源のニューロスフェアの形態およびサイズを説明する図表であり、図中、赤矢印は嚢胞性ニューロスフェアを示す。
【図１９】図１９は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から形成された神経ロゼットの分化を説明する図表である。
【００４８】
【図２０】図２０は、ＮＰＣ分化の経過、および、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストからのｉＰＳ細胞の構築プロセス、および、ＧＭ１患者の細胞において示された徴候を説明する模式図である。
【図２１】図２１は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびそれらから分化したＧＭ１−ＮＰＣにおけるＧＬＢ１遺伝子およびタンパク質の発現レベルを説明する図表である。
【００４９】
【図２２】図２２は、Ｘ−ｇａｌ染色によって確認された、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるβ−ｇａｌの活性を説明する図表である。
【図２３】図２３は、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるＧＭ１−ガングリオシドおよびリソソームの蓄積を説明する図表である。
【００５０】
【図２４】図２４は、マイクロアレイによって確認された、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンを説明する図表である。
【図２５】図２５は、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおいて変化したＧＭ１代謝関連遺伝子の発現レベルの比較を説明する図表である。
【００５１】
【図２６】図２６は、ＧＭ１マウスモデルにおいて、折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）を示するために既に報告された遺伝子発現パターンと比較された、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンを提示する；図２６Ａは、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるＵＰＲ遺伝子の確認を説明する図表であり；および、図２６Ｂは、ＵＰＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの比較を説明する図表である。
【００５２】
【図２７】図２７は、ＧＭ１−ＮＰＣ特異的発現経路を提示する：図２７Ａは、ＫＥＧＧ分析によって確認された、正常細胞における発現の２倍である発現増加の経過を説明する図表であり；および、図２７Ｂは、ＩＰＡ分析によって確認された、発現増加の経過を説明する図表である。
【００５３】
【図２８】図２８は、ＧＭ１患者由来の細胞における炎症反応エレメント(炎症 response element)を形成する遺伝子のマイクロアレイの結果を説明する図表である。
【図２９】図２９は、ＧＭ１患者由来の細胞における炎症反応エレメントを形成する遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量的比較を説明する図表である。
【００５４】
【図３０】図３０は、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアの形態的変化を提示する：図３０Ａは、インフラマソームインヒビターを処置することにより分化したＧＭ１−ニューロスフェアの形態を説明する図表であり；図３０Ｂは、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアの細胞直径の変化を説明する図表であり；および、図３０Ｃは、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアのうち、嚢胞性ニューロスフェア形成の低下を説明する図表である。
【００５５】
【図３１】図３１は、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアのマイクロアレイの結果を説明する図表である。
【図３２】図３２は、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアにおけるスフィンゴ脂質代謝関連酵素の発現を説明する図表である。
【００５６】
【図３３】図３３は、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアにおけるインフラマソーム関連経路の遺伝子発現パターンを説明する図表である。
【図３４】図３４は、インフラマソームインヒビターを処置することによって分化したＧＭ１−ニューロスフェアにおけるインフラマソーム関連経路の遺伝子発現パターンを調査するマイクロアレイの結果を説明する図表である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
好ましい態様の説明
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルを提供する。
【００５８】
本発明はまた、以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の減少；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルの使用を提供する。
【００５９】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者起源のフィブロブラストにおけるＧＭ１変異体遺伝子を確認し（図２参照）、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者のフィブロブラストからｉＰＳ細胞（ＧＭ１−ｉＰＳ細胞）を構築した（図５および６参照）。次いで、発明者らは、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の特徴を調査した。結果として、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞は、インビトロおよびインビボで多能性を有し、同時に、ＧＭ１患者において観察されたＧＭ１原因遺伝子変異に起因するβ−ｇａｌの低下を示した（図７〜１３参照）
【００６０】
本発明のＧＭ１起源ｉＰＳ細胞モデルが、ＧＭ１患者細胞のような特徴を示す多能性を有しているので、ｉＰＳ細胞モデルは、ＧＭ１メカニズムの研究および該疾患の治療剤の開発のためのヒト細胞モデルとして効率よく用いることができる。
【００６１】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をインビトロで誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）で誘導されたｉＰＳ細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００６２】
上記の方法において、ステップｉ）の誘導は、好ましくは、多能性マーカーの異所性発現によって実施される。とくに、異所性発現は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４などの再プログラミング因子を含有するレトロウイルスを用いることによって、または、前記再プログラミング因子を発現するエピソームベクターでの形質転換によって、または、ｉＰＳ細胞を構築する、当該分野の人によく知られた他の任意の方法によって達成することができる。
【００６３】
本発明のＧＭ１起源ｉＰＳ細胞モデルが、ＧＭ１患者細胞のような特徴を示す多能性を有しているので、ｉＰＳ細胞モデルは、ＧＭ１メカニズムの研究および該疾患の治療剤の開発のためのヒト細胞モデルとして効率よく用いることができる。
【００６４】
本発明は、さらに、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルを提供する。
【００６５】
本発明はまた、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルの使用を提供する。
【００６６】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の、胚様体（ＥＢ）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアへの分化を誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）において誘導された、胚様体（ＥＢ）の分化マーカー、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の特徴またはニューロスフェアの形態的特徴を分析すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法を提供する。
【００６７】
ステップｉｉ）において、胚様体分化マーカーは、好ましくは、外胚葉マーカーＮＥＳＴＩＮおよびＴＵＪ１、内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２、中胚葉マーカーα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびＤＥＳＭＩＮからなる群から選択されるが、常にそれらに限定されるものではない。
【００６８】
インフラマソーム関連遺伝子は、炎症性カスパーゼ関連遺伝子（Allan SM et. al, Nature reviews Immunology5, 629-640, 2005; McIlwain DR et. al, Cold Spring Harbor perspectives in biology 5, a008656, 2013）、インターロイキン１β（ＩＬ１β）およびその下流の分子を包含する炎症誘発性サイトカインをコードする遺伝子（Walsh JG et. al, Nature reviews Neuroscience 15, 84-97, 2014; John GR et. al, Glia 49, 161-176, 2005; Liu L et. al, Journal of neuroinflammation 8, 175, 2011; Manso Y et. al, Journal of biological inorganic chemistry 16, 1103-1113, 2011）およびインフラマソームの上方調節に関する遺伝子からなる群から選択される１または２つ以上であり得るが、常にそれらに限定されるものではない。
【００６９】
本発明の他の好ましい態様において、本発明者らは、ＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞（ＧＭ１−ｉＰＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）への分化を誘導した（図１４参照）。同時に、全ての分化マーカー（外胚葉、内胚葉および中胚葉マーカー）の発現をそこで確認し、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のＥＢが分化能を有することが示唆された（図１５参照）。ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の神経前駆細胞（ＧＭ１−ＮＰＣ）への分化もまた誘導し、結果として、ＧＭ１原因遺伝子の変異がいまだ観察され、神経マーカー遺伝子およびタンパク質の発現もまた確認された（図６、１６および１７参照）。ＧＭ１起源のニューロスフェアは、正常なものよりも小さく、嚢胞性ニューロスフェアのような表現型を示した。神経ロゼット形成の産出率はまた低下した（図１８および１９参照）。
【００７０】
本発明者らはまた、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおいて、ＧＭ１分子表現型が残り、変化しなかったか否かを調査した。結果として、ＧＬＢ１遺伝子およびタンパク質の発現は、有意に増大し（図２０および２１）、一方で、β−ｇａｌは、有意に低減し、および、したがって、ＧＭ１ガングリオシドーシスおよびリソソームの蓄積は増大した（図２２および２３）。
【００７１】
ＧＭ１の発達メカニズムを調査するため、本発明者らは、正常細胞におけるのと比較し、ＧＭ１−ＮＰＣにおける発現パターンにおいて、任意の変化を示す任意の遺伝子を探索した。結果として、正常と有意に異なった遺伝子発現を、ＧＭ１起源フィブロブラスト、ｉＰＳ細胞およびＮＰＣ、とくにＧＭ１−ＮＰＣにおいて確認した（図２４、２５および２６）。とくに、炎症経路に関連する遺伝子発現が増大し、炎症性カスパーゼ、インフラマソーム代謝経路の遺伝子ならびにＩＬ１βおよびＩＬ１βの下流分子をコードする遺伝子もまた上方調節された（図２７Ａ〜２９）
【００７２】
したがって、本発明のＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経前駆細胞はＧＭ１患者の細胞のような特徴を示した。そして、これらはまた、ＧＭ１特異的遺伝子の発現パターンの調査をも容易にし、そのため、本発明の前記ｉＰＳ細胞および神経前駆細胞は、ＧＭ１の発症メカニズムの研究のためのヒト細胞モデルとして効率よく用いることができる。
【００７３】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞をインビトロで調製すること；
ｉｉ）ステップｉ）で調製されたｉＰＳ細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）を誘導すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において誘導されたＮＰＣを収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００７４】
本発明のＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経前駆細胞はＧＭ１患者の細胞のような特徴を示した。そして、これらはまた、ＧＭ１特異的遺伝子の発現パターンの調査をも容易にし、そのため、本発明の前記ｉＰＳ細胞および神経前駆細胞は、ＧＭ１の発症メカニズムの研究のためのヒト細胞モデルとして効率よく用いることができる。
【００７５】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルからの分化した神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを、サンプル化合物または組成物で処置すること；
ｉｉ）ステップｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアの特徴を分析すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた結果と無処置コントロール群とを比較すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法を提供する。
【００７６】
ステップｉｉ）において、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアの特徴は、以下の、
ａ）嚢胞性ニューロスフェアから正常ニューロスフェアへの回復、
ｂ）ニューロスフェア細胞のサイズの増大、および
ｃ）炎症関連遺伝子の発現の低下
からなる群から好ましくは選択される１つまたは２つ以上であるが、常にそれらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明のＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経前駆細胞は、インフラマソームインヒビターで処理した場合、正常細胞のような細胞形態および正常な遺伝子発現パターンに回復することができ、前記ｉＰＳ細胞および神経前駆細胞が、ＧＭ１の治療剤の開発のためのヒト細胞モデルとして効率良く用いることができる。
【００７８】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ＧＭ１において発現の有意な増大を示すインフラマソーム代謝関連遺伝子の増大する発現を阻害するために、ＩＬ１βアンタゴニスト、インフラマソームインヒビターおよびカスパーゼ−１インヒビターで、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を処理した。結果として、分化したニューロスフェア細胞は、嚢胞性細胞形状から正常細胞形状に回復し、したがって、細胞の直径もまた増大した（図３０参照）。本発明者らはまた、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞がインフラマソームインヒビターで処置された場合、遺伝子発現パターンが変化し、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて有意に増大したインフラマソーム因子の発現が有意に低下した（図３１〜３４参照）。
【００７９】
本発明のＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経前駆細胞は、インフラマソームインヒビターで処置した場合、正常細胞のような細胞形態および正常な遺伝子発現パターンに回復することができ、前記ｉＰＳ細胞および神経前駆細胞が、ＧＭ１の治療剤の開発のためのヒト細胞モデルとして効率良く用いることができることが示唆された。
【００８０】
本発明はまた、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された、ＧＭ１ガングリオシドーシス変異体細胞モデルを提供する。
【００８１】
本発明はまた、以下のステップ：
ｉ）β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターを構築すること；
ｉｉ）ステップｉ）において構築されたβ−ｇａｌ変異体発現ベクターで、分離した細胞を形質転換すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において形質転換された変異体細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルをインビトロで構築する方法を提供する。
【００８２】
本発明はまた、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞を、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして使用する方法を提供する。
【００８３】
加えて、本発明は、β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞の、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとしての使用を提供する。
【００８４】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、ＧＭ１患者を起源とするフィブロブラストのゲノムにおけるＧＬＢ１遺伝子変異を調査した。結果として、Ｅ１８６Ａ（新規ＧＭ１原因遺伝子変異）をＧＬＢ１遺伝子において確認し（図２参照）、Ｅ１８６Ａ変異を示す細胞をまた、低減されたβ−ｇａｌ活性およびＧＭ１ガングリオシドの細胞内蓄積などがＧＭ１患者において観察されたものと類似の分子症状が示された（図３ａ〜３ｃ参照）。
【００８５】
Ｅ１８６Ａ変異がＧＭ１患者におけるβ−ｇａｌ活性の低下に直接的に関連するか否かを調査するため、本発明者らは、Ｅ１８６Ａ変異体をコードする遺伝子発現ベクターで形質転換した細胞におけるβ−ｇａｌ活性および発現を測定した。結果として、β−ｇａｌ発現および活性は、正常細胞のものに比較して、有意に低減した（図３ｄ〜３ｆ参照）
【００８６】
加えて、Ｅ１８６Ａ変異のβ−ｇａｌ活性への影響を調査するため、構造分析を実施した。結果として、ＧＭ１の変異に起因するＥ１８６Ａを含むタンパク質が、正常細胞における遺伝的に十分に保存されている領域において誘導されていることが確認され、β−ｇａｌ活性部位の周りの隣接する残基における変異がβ−ｇａｌ活性の低下の理由となり得ることが示唆された（図４参照）。
【００８７】
したがって、ＧＭ１患者の分子症状が、ＧＭ１ガングリオシドーシスの原因タンパク質の変異である、新しく見出されたＥ１８６Ａ変異を示す形質転換細胞において再現することができるので、Ｅ１８６Ａ変異を含有する変異体細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして有効に用いることができる。
【００８８】
本発明はまた、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（メチル（３Ｓ）−３−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−３−メチルブタンアミド］プロパンアミド］−５−フルオロ−４−オキソペンタノアート）を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物を提供する。
【００８９】
本発明はまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物を提供する。
【００９０】
本発明はまた、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の薬学的に有効な投与量を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象に投与するステップを含有する、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための方法を提供する。
【００９２】
本発明はまた、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの使用を提供する。
【００９３】
本発明はまた、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための本発明の医薬組成物のための、有効成分としてのインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の使用を提供する。
【００９４】
前記Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列で構成され、下記［式１］において構造が示されるが、常にそれらに限定されるものではない。
【００９５】
前記Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫは、市場で商業化されている任意のものであり得るカスパーゼ−１インヒビターＶＩ−カルビオケム（product #: cat # 218746; Merck Millipore）を包含するカスパーゼ−１インヒビターであり得る。
【化１】
2016533770.tif 000003
【００９６】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列から構成されるが、常にそれらに限定されるものではない。
【００９７】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質は、市場で商業化されている任意のものであり得るＩＬ１ＲＡ（product #: cat # 280-RA-050 (rhIL-1ra); R&D systems）などのインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質である。
【００９８】
本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡは、Ｍ１−ｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経前駆細胞において、ＧＭ１患者特異的細胞形態および遺伝子発現パターンが正常なものに回復する効果を示し、前記Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡが、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物の有効成分として、効率良く用いることができる。
【００９９】
本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡは、経口または非経口で投与することができ、医薬処方の一般的な形態で用いることができる。非経口投与は、直腸内、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、眼内もしくは皮下の注射、または吸入を包含する。
【０１００】
すなわち、本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡは、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤および界面活性剤などの一般的に用いられる希釈剤または賦形剤と混合することにより、非経口投与のために調製することができる。非経口投与用の処方は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤である。水不溶性賦形剤および懸濁剤は、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、エチルオレイン酸などの注射可能なエステルを含有することができる。坐剤は、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを含有することができる。
【０１０１】
本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡは、生理食塩水または有機溶媒などの多くの薬学的に許容される担体と混合することができ、グルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または安定性または吸収性を高める他の安定剤を付加的に包含することができる。
【０１０２】
本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡの有効な投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、投与回数は、１日あたり１〜３回である。
【０１０３】
本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡの有効な投与量は、比較的短い期間の点滴を有する単回投与によって、または、長期間の分割処置プロトコールの複数回投与によって、ボーラスの形態で投与することができる。有効な投与量の決定は、投与経路、所持時間、患者の年齢および他の条件などに依存する。したがって、この分野の知識を有するいかなる専門家は、本発明のＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫまたはＩＬ１ＲＡの有効な投与量を決定することができる。
【０１０４】
本発明の実施態様および現在好ましい態様を、実例として以下の例に示す。
しかしながら、当業者が本開示を考慮することにより、本発明の精神および範囲の中で修飾および改善してもよいことが解されるであろう。
【０１０５】
例１：ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）細胞の特徴の調査
＜１−１＞ＧＭ１細胞における新規遺伝子変異の確認
ＧＭ１を引き起こす遺伝子変異を調査するために、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者起源のフィブロブラストを培養し、続いてＧＭ１ガングリオシドーシスの原因遺伝子であるＧＬＢ１の配列決定を行った。
【０１０６】
具体的には、最初にＧＭ１ガングリオシドーシス患者起源のフィブロブラスト細胞株（ＧＭ００９１８、ＧＭ０２４３９、ＧＭ０３５８９、ＧＭ０５３３５、ＧＭ０５６５２、ＧＭ０５６５３、ＧＭ１０９１９およびＧＭ１２３６９）をCoriell Institute for Medical Research（USA）から購入した。ＧＭ００９１８、ＧＭ０３５８９、ＧＭ０５３３５、ＧＭ０５６５２、ＧＭ０５６５３、ＧＭ１０９１９およびＧＭ１２３６９細胞株は、小児期早期に診断されたそれらの患者に起源し、ＧＭ０２４３９細胞株は、青年期に診断された患者に起源した（http://ccr.coriell.org）。各細胞株を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Invitrogen, USA）、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Invitrogen, USA）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen, USA）および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma, USA）で補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）において培養した。
【０１０７】
培養が完了したら、ＲＮＡを、RNAiso Plus（Takara, Japan）またはRNeasy mini kit（Qiagen, USA）を使用し、製造元のプロトコールに従って、培養細胞から抽出した。次いで、ＰＣＲを、ＧＬＢ１のｃＤＮＡを合成するために、表１に列記されたプライマー（配列番号３および４）およびSuperscript III（Invitrogen, USA）を用いて、実施した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動した。完全長バンドをゲルから切り出し、続いてQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen, USA）を使用して精製した。ＧＬＢ１のｃＤＮＡの全配列を、表１に列記されたプライマー（配列番号５〜１０）を使用して、精製オリゴマーにより分析した。対照として、ヒト皮膚起源の野生型フィブロブラスト細胞株ＣＲＬ−２０９７（American Type Culture Collection, ATCC）を使用し、そこから、ＧＬＢ１のｃＤＮＡを上の記載と同じやり方で合成し、続いてその配列決定を行った。この野生型の対照を、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞株と比較した。
【０１０８】
【表１】
2016533770.tif 000004
【０１０９】
結果として、表２に示されるとおり、６種類のミスセンス変異、１つのナンセンス変異および２種の多型変異が、ＧＭ１患者起源のそれらの細胞株のうち８つにおいて、確認された（表２）。ＧＭ０３５８９を除く全てのＧＭ１患者起源の細胞株はホモ接合の変異を有し、ＧＭ０３５８９細胞株は２種類のヘテロ接合の変異を示した。このことは、β−ｇａｌ活性の壊滅の原因となったことから確認された。ｐ．Ｐ１０Ｌ変異が、これら８細胞株のうち７細胞株において確認された。このことは、これが最も一般的な変異であったことを示唆する。ｐ．Ｓ３５２Ｇ変異が、これら細胞株の３つにおいて確認された。このことは、この変異が、β−ｇａｌ活性の低下の原因であることを示す。加えて、Ｃ１２７Ｙ、ｐ．Ｒ１４８Ｓ、ｐ．Ｗ１６１Ｃ、ｐ．Ｒ２０１Ｃおよびｐ．Ｑ２５５Ｈミスセンス変異およびｐ．Ｒ３５１Ｘナンセンス変異等の、既に報告されたＧＭ１特異的遺伝子変異も、ＧＭ１細胞株において確認された。
【０１１０】
図２に示されるとおり、新規ホモ接合ＧＭ１原因遺伝子変異であるｐＥ１８６Ａ変異がＧＭ００９１８細胞株において確認され（図２ａ）、ＧＬＢ１遺伝子におけるｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異がＧＭ０２４３９細胞株において確認された。このことは、上の遺伝子から合成されたβ−ｇａｌタンパク質がＲ２０１Ｃ変異を示したことを示唆する（図２ｂ）。
【０１１１】
【表２】
2016533770.tif 000005
【０１１２】
＜１−２＞ＧＭ１患者起源のフィブロブラストの特徴の調査
ＧＭ１患者の細胞の特徴を調査するために、ＧＭ１原因遺伝子変異として新たに同定された新規Ｅ１８６Ａ変異を示すＧＭ００９１８の特徴を調べた。
【０１１３】
具体的には、ＧＭ００９１８細胞株を、例＜１−１＞の記載と同じ条件で培養した。培養培地を、LysoTracker Red DND-99（１：２００００；Invitrogen, USA）で処置し、続いて３７℃で３０分間反応させた。次いで、細胞内リソソーム濃度を測定した。細胞を４％のホルムアルデヒドで処置し、続いて室温で１０分間固定した。細胞を、０．１％のtriton X-100を含有するＰＢＳで１５分間処置することによって、細胞膜に対して透過性が得られた。
【０１１４】
その後、処置細胞を、４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで洗浄し、それらを、一次抗体の抗ＧＭ１抗体（１：５０；ab23943, Abcam, USA）により４℃で終夜処置し、続いて洗浄した。細胞を、Alexa Fluor 488またはAlexa Fluor 594がコンジュゲートされた二次抗体で処置し、次いで室温で２時間放置した。次いで、細胞を、ＧＭ１ガングリオシドの蓄積を調査するために、蛍光顕微鏡下で観察した。発現レベルを比較するために、細胞を、核を染色するための４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で処置した。
【０１１５】
β−ｇａｌ活性を測定するために、Ｘ−ｇａｌ染色を実施した。それを行うために、低ｐＨ（ｐＨ４．５）の緩衝液を、上のＰＢＳ緩衝液と置き換えるため、５０ｍＭのクエン酸塩および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて調製した。Ｘ−ｇａｌ染色を、β−ｇａｌ染色キット（INtRon Biotechnology, 韓国）を使用し、製造元の使用説明書に従って実施した。青色を示したら、Ｘ−ｇａｌ染色を終了した。培養時間は、細胞種によるが、４時間〜終夜であった。ＣＲＬ２０９７細胞株を、リソソームの蓄積を比較するための対照として使用した。微細脳機能障害（ＭＢＤ）患者起源のフィブロブラストを、ＧＭ１ガングリオシドの細胞内蓄積を比較するための対照として使用した。
【０１１６】
結果として、図３ａおよび図３ｃに示されるとおり、リソソーム蓄積が、正常細胞株ＣＲＬ２０９７と比較して、ＧＭ００９１８細胞株において有意に増加した（図３ａ）。その一方で、ＧＭ１ガングリオシドの大量蓄積が、ＧＭ００９１８細胞株において確認された。これは、ＭＢＤ患者起源の細胞株と比較して、β−ｇａｌ活性の低下に起因した（図３ｂおよび３ｃ）。
【０１１７】
＜１−３＞ＧＭ１変異に従う細胞特徴の調査
ＧＭ１原因遺伝子変異として新たに確認されたＥ１８６Ａ変異が、β−ｇａｌ活性の低下の理由になり得るか否かを調査するため、本発明者らは、正常細胞におけるＥ１８６Ａ変異の有無によるＧＬＢ１タンパク質発現を観察した。
【０１１８】
具体的には、ＧＬＢ１遺伝子を、正常フィブロブラスト細胞株であるＣＲＬ２０９７細胞株から増幅し、それをｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（BD bioscience Clonetech）に挿入した。ＦＬＡＧタグを、ＧＬＢ１遺伝子の３’末端とＧＦＰタンパク質の５’末端との間に挿入することによって、野生型ＧＬＢ１遺伝子を含有するベクターを構築した。部位特異的突然変異誘発を、構築ベクターのＧＬＢ１遺伝子におけるＥ１８６Ａの部位に誘導することによって、変異ＧＬＢ１遺伝子を含有するベクターを構築した。変異体ＧＬＢ１遺伝子を含有する構築ベクターを、変異体遺伝子の発現を誘導するために、形質転換用２９３Ｔ細胞株に導入した。
【０１１９】
Ｅ１８６ＡのＧＬＢ１変異体遺伝子ベクターがトランスフェクトされた細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、続いて細胞デブリを取り除くために４℃で遠心分離を行った。２０〜３０μｇの細胞ライセートを、タンパク質を分離するため、４〜１５％ゲル（Bio-Rad, USA）上の電気泳動に進めた。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Bio-Rad, USA）上へ移し、続いて抗ＧＬＢ１抗体（１：５００；AF6464, R&D systems, USA）を使用してウェスタンブロッティングを行った。発色を補正するための対照として、ＧＡＰＤＨを、抗ＧＡＰＤＨ抗体を処置することによって、染色した。β−ｇａｌ活性を確認するために、Ｘ−ｇａｌ染色を、例＜１−２＞の記載と同じやり方で実施した。正常対照として、野生型ＧＬＢ１遺伝子を含有するベクターがトランスフェクトされた細胞を使用した。陰性対照として、細胞に、ＧＬＢ１遺伝子を含有しないベクターをトランスフェクトした。
【０１２０】
結果として、図３ｄ〜３ｆに示されるとおり、陰性対照のβ−ｇａｌ活性は、正常対照の１６％であった。これは、２９３ＴゲノムのＧＬＢ１から発現されたβ−ｇａｌ活性により確認された。変異体ＧＬＢ１遺伝子を含有するベクターがトランスフェクトされた細胞におけるβ−ｇａｌ活性は、正常対照の２２．９％であった。これは、陰性対照と同様のレベルであった（図３ｄ）。β−ｇａｌ活性の低減は、正常対照のと比較して、Ｘ−ｇａｌ染色により確認した（図３ｅ）。Ｅ１８６Ａのβ−ｇａｌ変異体タンパク質の発現レベルは、正常レベルの２５％まで低減した。これはウェスタンブロッティングにより確認した（図３ｆ）。形質転換を、種々の条件による種々のやり方で実施した。結果として、Ｅ１８６Ａのβ−ｇａｌ変異体タンパク質レベルは、これら試験のいずれによっても、正常対照のレベルまで回復しなかったことが確認された。このことは、この分子の特徴が、ＧＭ１患者の細胞において示されたものと同様であったことを示唆する。
【０１２１】
＜１−４＞ＧＭ１を引き起こすタンパク質であるＥ１８６Ａ変異体  タンパク質の構造分析
ＧＬＢ１タンパク質におけるＥ１８６Ａ変異の、活性低下に対する効果を調査するために、Ｅ１８６Ａ変異体タンパク質の構造を、モデリングにより分析した。
【０１２２】
具体的には、ＧＬＢ１タンパク質におけるＥ１８６Ａ変異を、ClustalW2およびBoxShade serverを使用することによって、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、シロイヌナズナ、トリコデルマおよびアルスロバクターのＧＬＢ１配列に配置した。ＧＬＢ１モデリングにおいて、変異体モデルを、PyMOLプログラムを介した鋳型としてヒトＧＬＢ１結晶構造（ＰＤＢコード：３ＴＨＣ）を使用することによって作製した。
【０１２３】
結果として、図４に示されるとおり、原核生物（アルスロバクター）のＧＬＢ１関連タンパク質配列は、真菌類またはヒト等の真核生物のＧＬＢ１関連タンパク質配列において保存されていたが、原核生物において保存された触媒残基および全ドメイン構造を含有するホモロジーにおいて、差異が観察された（図４ａ）。表２に示される６種類のミスセンス変異部位は、タンパク質機能を維持するのに重要である。特に、Ｒ１４８残基およびＥ１８６残基は、他の４残基と比較して、充分に保存されており、これら２残基の部位は、活性のあるＥ１８８残基に近い。ヒトβ−ｇａｌタンパク質結晶構造を３次元的に分析した。結果として、これら６つのミスセンス変異の部位上の残基は、活性残基を囲むＴＩＭバレルに位置付けられたことが確認された（図４ｂ）。Ｅ１８６残基はまた、Ｒ１４８、Ｑ１８４およびＹ１９９残基にも隣接した。このことは、Ｅ１８６が、これらの残基と密接に関連することを示唆する（図４ｃ）。Ｅ１８６残基に関連する全残基は、進化的に充分に保存されたが、これらの残基は、ＧＭ１患者の遺伝子において変異していた。したがって、これらの残基の変異は、β−ｇａｌの機能に対して効果を有ることが確認された（図４ａ）。
【０１２４】
例２：ＧＭ１起源の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の調製
本発明の例を実行するため、本発明者らは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４等の４つの再プログラミング因子を発現するレトロウイルスを使用する再プログラミング培養を通じて、ＧＭ１患者のフィブロブラストから多能性を有するｉＰＳ細胞(ＧＭ１−ｉＰＳ細胞)を構築した（Son MY et. al, Stem cells 31, 2375-2387; 2013）（図５）。
【０１２５】
具体的には、例＜１−１＞において変異体遺伝子により確認されたＧＭ１患者起源のフィブロブラスト細胞株であるＧＭ０２４３９に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４をコードするレトロウイルスをトランスフェクトし、続いて体細胞培地中５日間培養した。５日後、感染細胞を、ヒト胚性幹細胞培養培地（ｈＥＳＣ−ＣＭ）を含有する、マトリゲルで被覆されたプレート上へ移し、続いてさらなる培養を２〜３週間行った。次いで、ｉＰＳ細胞のコロニーを収集した。ＧＬＢ１遺伝子のｃＤＮＡを、例＜１−１＞の記載と同じやり方で得られたＧＭ１−ｉＰＳ細胞から合成し、続いて配列決定を行った。対照は、野生型ｉＰＳ細胞（ＷＴ−ｉＰＳ細胞）を、上の記載と同じやり方で、ＣＲＬ−２０９７から構築した。
【０１２６】
結果として、図６に示されるとおり、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、ＧＭ１患者起源のフィブロブラストから構築し、それらが、ＧＭ１起源のフィブロブラストにおいて示された変異と同等に、６０１Ｃ＞Ｔ変異を有することを確認した（図６）。
【０１２７】
例３：ＧＭ１起源のｉＰＳ細胞の特徴の調査
＜３−１＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の形態的特徴の調査
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の形態的特徴を調査するため、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞のコロニー種および核型を調査し、続いてショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析を行った。
【０１２８】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の再プログラミングを、例２の記載と同じやり方で誘導し、次いでＧＭ１−ｉＰＳ細胞コロニー形成の形態を位相差顕微鏡で観察した。本発明者らは、染色体Ｇバンド(chromosomal G-banding)分析による核型分析を実施するようGenDix Inc.（韓国）に依頼した。加えて、本発明者らはまた、ＧＭ１起源のフィブロブラスト細胞株（ＧＭ０２４３９）およびＧＭ１−ｉＰＳ細胞のＳＴＲ遺伝子型決定も実施するようヒトPass Inc.（韓国）に依頼し、結果を正常ヒト胚性幹細胞株Ｈ９  ｈＥＳＣと比較した。
【０１２９】
結果として、図７〜９に示されるとおり、多能性を有するＧＭ１−ｉＰＳ細胞は、ＧＭ１−フィブロブラスト細胞株から首尾よく誘導され（図８）、構築されたＧＭ１−ｉＰＳ細胞は、それらのコロニー種および核型がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のと同様であったことを実証した（図７Ａおよび９）。
【０１３０】
＜３−２＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色
ＧＭ１患者起源のＧＭ１−ｉＰＳ細胞の多能性を調査するために、アルカリホスファターゼ（多能性マーカー）染色（ＡＰ染色）を実施した。
【０１３１】
具体的には、固定溶液を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色キット（Sigma Aldrich, USA）を使用して、１ｍｌのクエン酸塩溶液、２．６ｍｌのアセトンおよび３２０μｌの３７％ホルムアルデヒド（Sigma Aldrich, USA）を混合することによって、調製した。調製された固定溶液を、例２で調製されたＧＭ１−ｉＰＳ細胞へ加え、それを室温で１５分間暗所に静置した。１００μｌの硝酸ナトリウム溶液を、１００μｌのＦＲＶ−アルカリ溶液と混合し、混合物を２分間静置した。４．５ｍｌの滅菌水および１００μｌのナフトールＡＳ−Ｂｌアルカリ溶液をそれに加え、混合物を、光を遮断するためアルミホイルで被覆し、保管した。固定された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、調製されたＡＰ染色混合物中にロードした。細胞を水またはＰＢＳで２回、各２分間洗浄し、ＡＰ染色細胞を位相差顕微鏡下で観察した。
【０１３２】
結果として、図７Ｂに示されるとおり、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、ＡＰ、多能性マーカーで陽染した（図７Ｂ）。
【０１３３】
＜３−３＞ＧＭ１起源のｉＰＳ細胞の多能性の確認
ＧＭ１患者起源の未分化ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞における多能性マーカータンパク質の発現を観察した。
【０１３４】
具体的には、例２において構築されたＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、４％ホルムアルデヒドで処置し、続いて室温で１０分間固定した。細胞を、０．１％のtriton X-100を含有するＰＢＳで１５分間処置することによって、細胞膜に対して透過性が得られた。その後、処置細胞を、４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで洗浄し、それらを、一次抗体である抗ＯＣＴ４抗体（１：１００；sc-9081, Cruz Biotechnology, USA）、抗ＮＡＮＯＧ抗体（１：１００；sc-33759, Cruz Biotechnology, USA）、抗ＴＲＡ−１−８１抗体（１：１００；MAB4381, Chemicon, USA）、抗ＳＳＥＡ３抗体（１：１００；MAB1435, R&D Systems, USA）、抗ＳＳＥＡ４抗体または抗ＴＲＡ−１−６０抗体（１：３００；Millipore, USA）により４℃で終夜処置し、続いて洗浄した。細胞を、Alexa Fluor 488またはAlexa Fluor 594がコンジュゲートされた二次抗体（Invitrogen, USA）で処置し、次いで室温で２時間放置した。次いで、細胞を、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−８０およびＴｒａ−１−６１タンパク質の発現を調査するために、蛍光顕微鏡下で観察した。発現レベルを比較するために、細胞を、核を染色するための４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で処置した。
【０１３５】
結果として、図７Ｃに示されるとおり、多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０タンパク質は、正常細胞と同様のレベルで、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞においても発現していた（図７Ｃ）。
【０１３６】
＜３−４＞ＧＭ１起源のｉＰＳ細胞の多能性のインビトロでの確認
ＧＭ１起源のｉＰＳ細胞が多能性をインビボで有するか否かを調査するために、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の奇形腫形成を、免疫不全ヌードマウスモデルに誘導した。
【０１３７】
具体的には、例２の記載と同じやり方で構築された１×１０６個のＧＭ１−ｉＰＳ細胞を計数し、それらを、３匹のＳＰＦ／ＶＡＦ免疫不全ヌードマウス（OrientBio, 韓国）に６週齢で移植した。動物を飼育した。１２週間後マウスを屠殺し、そこから奇形腫を収集し、それに４％ホルムアルデヒドを加え、続いてパラフィン包埋を行った。次いでＨ＆Ｅ染色を、内胚葉、外胚葉および中胚葉における奇形腫の形成を確認するために、ハリスヘマトキシリンおよびエオシンで処置することによって、実施した。奇形腫形成を定量するため、各奇形腫領域を撮影し、各々のサイズを、ImageJソフトウェアを使用することによって算出した。対照として、フィブロブラスト起源のｉＰＳ細胞（ＷＴ−ｉＰＳ細胞）を、奇形腫形成を誘導するため、上の記載と同じやり方で５匹のマウスに注入した。各マウスから得られた奇形腫を２〜５片に分割し、それらを統計分析のために使用した。
【０１３８】
結果として、図１０および１１に示されるとおり、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫は、ＷＴ−ｉＰＳ細胞と同様のサイズであった（図１０）。奇形腫形成を、外胚葉（神経組織および色素細胞）、中胚葉（脂肪細胞、軟骨および筋肉）および内胚葉（上皮）において確認したが、観察されたニューロスフェアへの分化は、ＷＴ−ｉＰＳ細胞より少なった（図１１）。
【０１３９】
＜３−５＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞におけるＧＭ１を引き起こすタンパク質変異の確認
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞における、ＧＭ１原因遺伝子の変異がもたらされた変異体タンパク質の特徴を調査するために、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞におけるβ−ｇａｌタンパク質の活性を調査した。
【０１４０】
具体的には、例２の記載と同じやり方で構築されたフィブロブラスト細胞株ＧＭ０２４３９およびＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、１０ｍＭのクエン酸塩、３０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＮｇＣｌ２を含有する分析用緩衝液（ｐＨ４．５）中に懸濁した。次いで、細胞を、凍結／解凍を１０回繰り返すことで溶解し、続いて、細胞デブリを取り除くため４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。２μｇのライセートを、２ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ；Sigma-Aldrich, USA）を含有する分析用緩衝液へ加え、続いて３７℃で３０分間培養した。３０分後、反応混合物の全体積の半分の体積で０．１Ｍのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）を加え、反応を終了させた。４−ＭＵの濃度を、β−ｇａｌ活性を確認するため、４４５ｎｍで蛍光強度を測定することによって算出した。対照のβ−ｇａｌ活性もまた、対照であるＣＲＬ２０９７およびＷＴ−ｉＰＳ細胞おいて、上の記載と同じやり方で確認した。次いで、ＧＭ１フィブロブラストおよびＧＭ１−ｉＰＳ細胞の相対的β−ｇａｌ活性を算出し、比較した。
【０１４１】
結果として、図１２に示されるとおり、ＧＭ１−フィブロブラスト細胞株およびＧＭ１−ｉＰＳ細胞のβ−ｇａｌ活性は、ＣＲＬ２０９７およびＷＴ−ｉＰＳ細胞のおおよそ７％であったことが確認された（図１２）。
【０１４２】
＜３−６＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞の非ウイルス方法による構築
ｉＰＳ細胞を分化させる他の方法が、細胞の特徴に影響を及ぼし得るか否かを調査するために、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載とは異なる方法により調製した。これは、非ウイルスの再プログラミング方法であった。
【０１４３】
具体的には、１×１０６個のＧＭ０２４３９フィブロブラストを計数し、調製し、それらに、Neon(登録商標) transfection system（Invitrogen, USA）を使用するエレクトロポレーションにより製造元のプロトコールに従って、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｌ−ＭＹＣおよびＳＶ４０ＬＴを発現する、ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰをベースとしたｐＣＥＴ４エピソームベクターを、トランスフェクトした。エレクトロポレーションの条件は、以下のとおりであった：１６５０Ｖのパルス電圧、１０ｍｓのパルス幅および３パルス。エレクトロポレーションによるトランスフェクション後、細胞を、マトリゲルで被覆された３５ｍｍウェル上に植え付け、続いてｉＰＳ細胞培養培地中で培養した。培養物から収集され、非ウイルス方法により誘導されたＧＭ１起源のｉＰＳ細胞（Ｅｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞）の特徴を、コロニー形態および核型を観察することによって、ＡＰ染色を実施することによって、多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を測定することによって、ならびに、例＜３−１＞、＜３−２＞、＜３−３＞および＜３−４＞の記載と同じやり方で奇形腫形成をインビボで観察することによって、調査した。
【０１４４】
結果として、図１３に示されるとおり、ｐＣＥＴ４エピソームベクターを細胞にトランスフェクトすることによって調製されたＥｐｉ−ＧＭ１−ｉＰＳ細胞は、レトロウイルスを細胞にトランスフェクトすることによって調製されたＧＭ１−ｉＰＳ細胞と同様の特徴を示した。したがって、ｉＰＳ細胞の特徴が、誘導方法によって変化することがなかったことを確認した（図１３）。
【０１４５】
例４：ＧＭ１起源の神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分化
＜４−１＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から胚様体（ＥＢ）および神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化の誘導
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞からＧＭ１起源の神経細胞への分化をインビトロで誘導するために、胚様体（ＥＢ）および神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分化を、図１４に示される模式図に従い、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から誘導した（図１４）。
【０１４６】
正確には、例２の記載と同じやり方で７日間の再プログラミングにより誘導されたＧＭ１−ｉＰＳ細胞コロニーを、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の胚様体（ＧＭ１−ＥＢ）への分化を誘導するため、胚様体分化培地（１０％の血清置き換え（ＳＲ）を含有するＤＭＥＤ／Ｆ１２）中、７日間培養した。分化したＧＭ１−ＥＢを、ＮＰＣ培地（１×Ｎ２／Ｂ２７（Invitrogen, USA）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Invitrogen, USA）および１０ｎｇ／ｍｌの白血病抑制因子（Sigma-Aldrich, USA）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２）中、もう２週間さらに培養した。次いで、分化したＧＭ１起源の神経前駆細胞（ＧＭ１−ＮＰＣ）を収集した。分化培養の期間の間、分化した細胞体を、McClain 組織 chopper（Mickle Engineering, Great Britain）を使用して毎週、継代培養し、培地を１日おきに置き換えた。神経細胞およびグリア細胞へのさらなる分化を誘導するために、収集されたＧＭ１−ＮＰＣを、成長因子を含有しないＮＰＣ培地中、マトリゲルで被覆されたカバースリップ上に付着させて、３〜４週間培養した。ＧＭ１の原因遺伝子であるＧＬＢ１におけるヌクレオチド配列変異を、例＜１−１＞の記載と同じやり方で分化したＧＭ１−ＮＰＣを使用して調査した。対照として、ＷＴ−ｉＰＳ細胞を、ＷＴ−ｉＰＳ細胞からＷＴ−ＥＢおよびＷＴ−ＮＰＣへの分化を誘導するため、上の記載と同じやり方で培養した。
【０１４７】
結果として、図４に示されるとおり、ＧＭ１起源のＮＰＣは、懸濁培養中、ニューロスフェアの球状形態を維持し、示されたＧＭ１フィブロブラスト細胞株およびＧＭ１−ｉＰＳ細胞と同じく、ＧＬＢ１遺伝子においてｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異を示した（図４）。
【０１４８】
＜４−２＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の胚様体（ＥＢ）の分化能
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の胚様体（ＧＭ１−ＥＢ）の分化能を調査するために、ＮＥＳＴＩＮおよびＴＵＪ１（外胚葉マーカー）、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２（内胚葉マーカー）、および、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびＤＥＳＭＩＮ（中胚葉マーカー）等の３つの胚様マーカーを調査した。
【０１４９】
具体的には、例＜４−１＞の記載と同じやり方で分化したＧＭ１−ＥＢを、ＮＥＳＴＩＮ、ＴＵＪ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、α−ＳＭＡまたはＤＥＳＭＩＮの発現を確認するために、免疫蛍光染色した。免疫蛍光染色用の一次抗体として、抗ＮＥＳＴＩＮ抗体（１：１００；MAB5326, Chemicon, USA）、抗ＴＵＪ１抗体（１：５００；PRB-435P, Covance, USA）、抗ＳＯＸ１７抗体（１：１００；MAB1924, R&D Systems, USA）、抗ＦＯＸＡ２抗体（１：１０００；ab40874, Abcam, USA）、抗α−ＳＭＡ抗体（１：４００；A5228, Sigma-Aldrich, USA）または抗ＤＥＳＭＩＮ抗体（１：５０；AB907, Chemicon, USA）を使用した。発現レベルを比較するために、細胞を、核を染色するための４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で処置した。
【０１５０】
結果として、図１５に示されるとおり、ＧＭ１起源の分化細胞は、ＥＳＴＩＮ、ＴＵＪ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、α−ＳＭＡおよびＤＥＳＭＩＮ等のそれら３つの胚葉マーカータンパク質の全てを発現した。このことは、細胞が多能性を有したことを示す（図１５）。
【０１５１】
例５：ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のＮＰＣの特徴
＜５−１＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のＮＰＣにおける神経マーカー遺伝子発現の確認
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のＮＰＣ（ＧＭ１−ＮＰＣ）の分化を調査するため、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施し、それによって、ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２等の神経マーカー遺伝子および多能性マーカー遺伝子ＲＥＸ１のｍＲＮＡ転写レベルを、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおいて観察した。
【０１５２】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で誘導した。次いで、ＲＮＡを、RNAiso Plus（Takara, Japan）またはRNeasy mini kit（Qiagen, USA）を使用し、製造元のプロトコールに従って、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞またはＧＭ１−ＮＰＣから抽出した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ  ＰＣＲ）を、細胞ゲノムのｃＤＮＡを合成するために、Superscript III（Invitrogen, USA）とともに、鋳型としての１〜２μｇの抽出ＲＮＡを使用して、実施した。ＲＴ−ＰＣＲが完了したら、１０μｌのｑＰＣＲ反応混合物を、０．２μｌの上の反応産物、１μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、０．５μｌのFAST SYBR green master mix（Applied Biosystems, USA）および蒸留水を混合することによって調製し、7500 Fast Real-time PCR system（Applied Biosystems, USA）を使用しｑＰＣＲに進めた。対照のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現もまた、発現レベルを補正するために、上の記載と同じやり方で確認した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現レベルに基づき、ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２またはＲＥＸ１のｍＲＮＡの倍変化(fold change)を算出した。
【０１５３】
結果として、図１６に示されるとおり、ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２等の神経マーカー遺伝子の発現を、ＷＴ−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ｉＰＳ細胞から分化したＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣにおいて確認した。その一方で、多能性マーカー遺伝子ＲＥＸ１の発現は有意に低下した（図１６）。ＧＭ１−ＮＰＣにおける神経マーカーの発現レベルもまた、ＷＴ−ＮＰＣより低かった。このことは、神経細胞へのＧＭ１−ｉＰＳ細胞の分化効率が低かったことを示唆する（図１６）。
【０１５４】
＜５−２＞ＧＭ１−ＮＰＣおよび同細胞から分化した細胞における神経マーカータンパク質の発現
ＮＰＣ、神経細胞およびグリア細胞が、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から首尾よく分化したか否かを確認するために、神経細胞特異的マーカータンパク質ＮＥＳＴＩＮ、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００の発現を、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から分化したＮＰＣ、神経細胞およびグリア細胞において確認した。
【０１５５】
具体的には、ＧＭ１−ＮＰＣの分化、および、ＧＭ１−神経細胞およびＧＭ１−グリア細胞の分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で誘導した。次いで、免疫蛍光染色を、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００の発現を確認するために、例＜１−３＞の記載と同じやり方で実施した。免疫蛍光染色用の一次抗体として、抗ＮＥＳＴＩＮ抗体をＮＰＣに使用し、抗ＴＵＪ１抗体および抗ＭＡＰ２抗体（１：５００；AB5622, Chemicon, USA）を神経細胞に使用し、抗Ｓ１００抗体（１：１００；ab52642, Abcam, USA）をグリア細胞に使用した。発現レベルを比較するために、核を４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し比較した。対照として、ＷＴ−ＮＰＣ、および、ＷＴ−ＮＰＣ起源の神経細胞およびグリア細胞を、神経細胞特異的マーカータンパク質の発現を検査するために、上の記載と同じ条件下で免疫蛍光染色した。
【０１５６】
結果として、図１７に示されるとおり、ＭＡＰ２およびＴＵＪ１陽性神経細胞およびＳ１００陽性グリア細胞が、ＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣの両者から分化したことを確認した（図１７）。
【０１５７】
＜５−３＞ＧＭ１−ＮＰＣの形態的特徴
ＧＭ１−ＮＰＣの形態的特徴を確認するため、ＧＭ１−ＮＰＣ起源の分化したニューロスフェアの形態を調査した。
【０１５８】
具体的には、ＧＭ１−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣ起源のニューロスフェアの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で誘導した。次いで、ＧＭ１−ＮＰＣから分化したニューロスフェアの形状を、位相差顕微鏡で検査した。対照として、ＷＴ−ＮＰＣから分化したニューロスフェアのサイズおよび形状を検査し、上のと比較した。
【０１５９】
結果として、図１８に示されるとおり、ＷＴ−ＮＰＣ起源のニューロスフェアのほとんどが、縁が明確な円形状であるのに対し、ＧＭ１−ＮＰＣ起源のそれらのニューロスフェアは円形状ではなく、平均サイズが対照の約３６．２８％であった（図１８）。嚢胞性ニューロスフェアは、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のニューロスフェアに富んでいた。正確には、ＷＴ−ニューロスフェアからの嚢胞性ニューロスフェアの産出率が７．３１±１．４３％であったのに対し、ＧＭ１−ニューロスフェアからの嚢胞性ニューロスフェアの産出率は少なくとも４０％であった。
【０１６０】
＜５−４＞ＧＭ１から神経ロゼットへの分化
神経細胞がＧＭ１−ｉＰＳ細胞から効率良く分化したか否かを調査するため、円柱状の(columnar)神経上皮細胞を調製した。神経外胚葉の形成に重要な構造である神経ロゼットの形成を調査するために、奇形腫を、免疫不全マウスにおいてＧＭ１−ｉＰＳ細胞により誘導し、続いて奇形腫において神経ロゼット形成を調査した。
【０１６１】
具体的には、奇形腫の形成を、例＜１−４＞の記載と同じやり方で、免疫不全マウスにおいてＧＭ１−ｉＰＳ細胞から誘導した。次いで、神経組織および軟骨組織を得た。ＧＭ１−奇形腫における成熟神経細胞をＨ＆Ｅ染色によって観察した。発生した奇形腫を、抗ＴＵＪ１抗体および抗ＴＨ抗体を使用して、免疫細胞化学により確認した。
【０１６２】
結果として、図１９に示されるとおり、軟骨等の中胚葉および内胚葉に起源するそれらの組織において、ＷＴ−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫と、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫との間に差異はなかった。他方、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫が、全領域の１％を下回る神経ロゼットしか含有しなかったのに対して、ＷＴ−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫は、全領域のおおよそ９％の神経ロゼットを含有した。このことは、ＷＴ−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫と同程度に、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源の奇形腫においても首尾よく神経ロゼットが形成されなかったことが示唆される（図１９）。神経ロゼットをインビトロで誘導するケースにおいて、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞から分化した神経ロゼットの産出率は、ＷＴ−ｉＰＳ細胞において産生される産出率の約１３％であった。このことは、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞が、神経分化能に欠陥があることを示唆する。
【０１６３】
例６：ＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経細胞の分子表現型
＜６−１＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞および同細胞から分化したＧＭ１−ＮＰＣにおけるＧＬＢ１遺伝子およびタンパク質の発現
ＧＭ１患者起源のｉＰＳ細胞および同細胞から分化したＧＭ１−ＮＰＣが、ＧＭ１患者のものと同じ分子表現型を有するか否かを確認するために、図２０に示されるとおり、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるＧＬＢ１遺伝子およびタンパク質の発現を調査した。
【０１６４】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で調製し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で誘導した。次いで、ｑＰＣＲを、ＧＬＢ１のｍＲＮＡ発現レベルを確認するため、例＜４−２＞の記載と同じやり方で、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣを用いて、実施した。
【０１６５】
誘導されたＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞またはＧＭ１−ＮＰＣを得て、それらをＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、続いて細胞デブリを取り除くために４℃で遠心分離を行った。次いで、２０〜３０μｇの細胞ライセートを、タンパク質を分離するために、４〜１５％ゲル（Bio-Rad, USA）上で電気泳動を行った。得られたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Bio-Rad, USA）上へ移し、続いて抗ＧＬＢ１抗体（１：５００；AF6464, R&D systems, USA）を使用してウェスタンブロッティングを行った。発色を補正するための対照として、ＧＡＰＤＨを、抗ＧＡＰＤＨ抗体で処置することによって染色した。
【０１６６】
結果として、図２１に示されるとおり、ＧＬＢ１（β−ｇａｌ）ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、正常細胞と比較して、ＧＭ１起源の細胞において全て増大し、発現が最も増加したのはＧＭ１−ＮＰＣであった（図２１）。
【０１６７】
＜６−２＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞および同細胞から分化したＧＭ１−ＮＰＳにおけるβ−ｇａｌ活性
ＧＬＢ１のｍＲＮＡおよびタンパク質が、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおいて上方調節されたとしても、β−ｇａｌ活性はＧＭ１患者において低かった。したがって、Ｘ−ｇａｌ染色を、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるβ−ｇａｌ活性を確認するために実施した。
【０１６８】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。ＰＢＳを、５０ｍＭのクエン酸塩および１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ４．５の低ｐＨ緩衝液と置き換えた。Ｘ−ｇａｌ染色を、β−ｇａｌ染色キット（INtRon Biotechnology, 韓国）を使用し製造元のプロコールに従って、実施した。青色を示したら、Ｘ−ｇａｌ染色を終了した。培養時間は、細胞種によるが、４時間〜終夜であった。
【０１６９】
結果として、図２２に示されるとおり、少なくとも９０％の正常フィブロブラスト、ＷＴ−ｉＰＳ細胞およびＷＴ−ＮＰＣがＸ−ｇａｌによって染色されたのに対し、ＧＭ−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣはβ−ｇａｌ活性を失っていた。このことは、Ｘ−ｇａｌ染色によってもたらされる青色が散在していたことから確認した（図２２）。
【０１７０】
＜６−３＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積
ＧＭ１ガングリオシドの蓄積が、ＧＭ１患者におけるβ−ｇａｌ活性の低下によって引き起こされるか否かを確認するために、ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積を、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおいて調査した。
【０１７１】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。次いで、ＧＭ１−フィブロブラストおよびＧＭ１−ｉＰＳ細胞におけるＧＭ１ガングリオシドを、例＜３−３＞の記載と同じやり方で、免疫蛍光染色を行った。ここで使用された一次抗体は、抗ＧＭ１抗体（１：５０；ab23943, Abcam, USA）であった。ＧＭ１−フィブロブラストおよびＧＭ１−ＮＰＣにおけるリソソームの含有量を測定するために、培養培地を、LysoTracker Red DND-99（１：２００００；Invitrogen, USA）で処置し、続いて３７℃で３０分間反応した。ついで、細胞内リソソームを観察した。対照（ＷＴ−フィブロブラスト、ＷＴ−ｉＰＳ細胞およびＷＴ−ＮＰＣ）におけるＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積もまた、上の記載と同じやり方で測定した。
【０１７２】
結果として、図２３に示されるとおり、野生型細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの発現は極めて低かったが、ＧＭ１−フィブロブラストおよびＧＭ１−ｉＰＳ細胞におけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積は高かった（図２３）。ＧＭ１−ＮＰＣにおけるリソソーム含有量もまた、ＷＴ−ＮＰＣと比較して、高かった。このことは、リソソームの蓄積が、ＧＭ１ガングリオシドの蓄積によって誘導されたことを示唆する（図２３）。
【０１７３】
例７：ＧＭ１−ｉＰＳ細胞および同細胞から分化した神経細胞の転写産物の調査
＜７−１＞ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターン
ＧＭ１の遺伝的原因を理解するために、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンを調査した。
【０１７４】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。次いで、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣを得た。マイクロアレイを、Low RNA input linear amplification kit、cRNA cleanup moduleおよびWhole Human Genome Microarray 4X44K（Agilent Technology, USA）を使用し製造元のプロトコールに従って、実施した。得られたマイクロアレイ画像を、ＷＴ−フィブロブラスト、ＷＴ−ｉＰＳ細胞およびＷＴ−ＮＰＣに対応するシグナルとして修正した。修正値を、MeVプログラムを使用することによってヒートマップを作製するために使用し、発現パターンにおける変化（２倍未満の変化）を何ら示さなかった遺伝子を切り捨てた。
【０１７５】
結果として、図２４に示されるとおり、遺伝子発現パターンの変化は、正常細胞と比較して、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて最も有意であった。このことは、ＧＭ１−ＮＰＣが、ＧＭ１における遺伝的変化の分析において最も適正なモデルであったことを示唆する（図２４）。
【０１７６】
また、図２５にも示されるとおり、リソソーム・スフィンゴ脂質代謝経路におけるＧＭ２シンターゼとして、ＧＭ１ガングリオシド合成において重要な役割を果たすＢ４ＧＡＬＮＴ１の発現は、ＧＭ１細胞において低減していた。その一方で、ＧＭ１ガングリオシドを取り除くのに重要な役割を果たすＧＬＢ１酵素の発現は増加していた。したがって、ＧＭ１−ＮＰＣにおけるβ−ｇａｌ活性の低下を補うための、スフィンゴ脂質代謝を増大させるための、および、ＧＭ１ガングリオシド蓄積の増加を阻害するための、遺伝子発現が確認された（図２５）。
【０１７７】
＜７−２＞ＧＭ１マウスモデルおよびＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターン
ＧＭ１−ｉＰＳ細胞起源のＧＭ１−ＮＰＣがＧＭ１モデルに適切であるか否かを調査するために、ＧＭ１マウスモデル（β−ｇａｌ−／−）において示されたと既に報告されている折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）がＧＭ１−ＮＰＣにおいても観察されるか否かを調査した（Tessitore A, et al. Molecular cell 15, 753-766, 2004）。
【０１７８】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。次いで、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣを得て、続いて、正常細胞および得られた細胞における遺伝子発現パターンを検査するために、例＜７−１＞に記載のマイクロアレイを行った。発現レベルにおいていかなる変化でも示した遺伝子を選択した。ＧＭ１モデルにおいて上方調節されたと前に報告されているＵＰＲ遺伝子ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＸＢＰ１、ＰＤ１Ａ４およびＣＡＬＲのｍＲＮＡ発現レベルを、例＜５−１＞の記載と同じやり方に従うｑＰＣＲによって、ＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣにおけるｍＲＮＡ発現相対レベルと比較した。
【０１７９】
結果として、図２６に示されるとおり、既に報告されたレベルと同様の、ＵＰＲ遺伝子の上方調節が、ＧＭ１−ＮＰＣにおいても観察された。すなわち、発現パターンの変化は、ＧＭ１マウスモデルと同様であったが、ＧＭ１−フィブロブラストおよびＧＭ１−ｉＰＳ細胞におけるｍＲＮＡ発現は、有意には変化しなかった（図２６）。
【０１８０】
例８：ＧＭ１−ＮＰＣにおける免疫代謝経路の活性化の調査
＜８−１＞ＧＭ１−ＮＰＣにおいて特異的に発現される代謝経路
ＧＭ１患者の症状に影響を及ぼし得るあらゆる代謝経路を確認するために、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて特異的に上方調節される代謝経路を調査した。
【０１８１】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。次いで、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣを得て、続いて、正常細胞および得られた細胞における遺伝子発現パターンを検査するために、例＜７−１＞に記載のマイクロアレイを行った。発現レベルにおいていかなる変化でも示した遺伝子を選択した。選択された遺伝子を、DAVID Bioiformatics Resource（http://david.abcc.ncifcrf.gov）を使用しＫＥＧＧによって分析した。相互作用する経路の分析(interactive pathway analysis)（ＩＰＡ）を、Ingenuity Systems（EBIOGEN Inc.）を使用することによって、実施した。ＧＭ１モデルにおいて上方調節されると前に報告されたＵＰＲ遺伝子ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＸＢＰ１、ＰＤ１Ａ４およびＣＡＬＲのｍＲＮＡ発現レベルを、例＜５−１＞の記載と同じやり方に従うｑＰＣＲによって、ＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣにおけるｍＲＮＡ発現相対レベルと比較した。
【０１８２】
結果として、図２７に示されるとおり、様々な代謝経路が、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて上方調節された。特に、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用が増加したことを確認した（図２７Ａ）。加えて、免疫反応関連代謝経路が有意に上方調節された。このことは、免疫反応が、ＧＭ１の神経障害症状に密接に関連したことを示唆する（図２７Ｂ）。
【０１８３】
＜８−２＞ＧＭ１−ＮＰＣにおけるインフラマソーム関連代謝経路の発現
炎症反応が、ＧＭ１−ＮＰＣにおける炎症関連代謝経路の上方調節に従って増大するか否かを調査するために、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて、インフラマソームに関与する遺伝子の発現パターンを調査した。
【０１８４】
具体的には、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞を、例２の記載と同じやり方で構築し、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で、それらから誘導した。次いで、ＧＭ１−フィブロブラスト、ＧＭ１−ｉＰＳ細胞およびＧＭ１−ＮＰＣを得て、続いて、インフラマソームに関与する遺伝子の上方または下方調節を調査するために、例＜７−１＞に記載のマイクロアレイを行った。その発現パターンがＷＴ−ＮＰＣと比較して有意に変化した遺伝子を選択し、続いて、ＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣにおけるｍＲＮＡ発現相対レベルと比較するために、例＜５−１＞の記載と同じやり方に従ってｑＰＣＲを行った。
【０１８５】
結果として、図２８および図２９に示されるとおり、ほとんどのインフラマソーム因子の発現がＷＴ−ＮＰＣにおいて極めて低かった一方、インフラマソーム関連代謝経路は、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて高度に活性化された（図２８）。ｍＲＮＡ相対発現を定量すると、ＧＭ１−ＮＰＣにおけるアポトーシス性カスパーゼの発現が、ＷＴ−ＮＰＣと同様であったのに対し、炎症性カスパーゼ、炎症性インターロイキン、ＩＬ１β下流遺伝子および炎症関連代謝因子の発現は、ＷＴ−ＮＰＣにおけるそれらと比較して、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて有意に増加した（図２９）。
【０１８６】
例９：ＧＭ１−ＮＰＣにおけるインフラマソームの阻害による神経損傷の軽減
＜９−１＞インフラマソームの阻害によるＧＭ１−ＮＰＣ形態の回復
ＧＭ１におけるインフラマソーム関連代謝経路の増大した活性化によって引き起こされる神経損傷の回復を調査するために、ＧＭ１−ＮＰＣを、インフラマソームインヒビターＩＬ１βアンタゴニスト（ｒｈＩＬ１ＲＡ）およびカスパーゼ−１インヒビター（Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ）で処置し、次いで、ＧＭ１−ＮＰＣの形態を調査した。
【０１８７】
具体的には、ＧＭ１−ＮＰＣの分化を、例＜４−１＞の記載と同じやり方で誘導した。次いで、誘導されたＧＭ１−ＮＰＣを、１μｇ／ｍｌのｒｈＩＬ１ＲＡ（R&D Systems, USA）または１０μＭのＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（Merck Millipore, Germany）でそれぞれ処置した培養培地において、それらにおけるインフラマソームを阻害するために、培養した。２〜４週間後、培養されたＧＭ１−ＮＰＣ起源のニューロスフェアを得た。ニューロスフェアの形態を位相差顕微鏡で観察した。
【０１８８】
結果として、図３０に示されるとおり、インフラマソームインヒビターをそれらに処置すると、ＧＭ１−ニューロスフェアの異常な形態が正常な形状に戻った（図３０Ａ）。ニューロスフェア形態が回復するにつれ、ニューロスフェア直径が増加した（図３０Ｂ）。嚢胞性ニューロスフェアの形成が有意に低減し、したがって正常ニューロスフェアの数が増加した（図３０Ｃ）。
【０１８９】
＜９−２＞インフラマソームの阻害による、ＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンの変化
神経損傷が、ＧＭ１におけるインフラマソーム関連代謝経路の活性化の増大に従って軽減され得るか否かを調査するために、インフラマソームインヒビターで処置されたＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンを調査した。
【０１９０】
具体的には、ＧＭ１−ＮＰＣを、例＜４−１＞に記載の方法に従って分化させ、次いで例＜９−１＞の記載と同じやり方で、ｒｈＩＬ１ＲＡまたはＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫで処置した。マイクロアレイを、インフラマソームに関与する遺伝子の上方または下方調節を調査するために、例＜７−１＞の記載と同じやり方で、実施した。その発現パターンがＷＴ−ＮＰＣにおけるものと比較して有意に変化した遺伝子を選択し、次いで、ＷＴ−ＮＰＣおよびＧＭ１−ＮＰＣにおけるｍＲＮＡ相対発現レベルと比較するために、例＜５−１＞の記載と同じやり方に従ってｑＰＣＲを行った。ＷＴ−ＮＰＣを正常対照として使用した。陰性対照として、ＧＭ１−ＮＰＣを、ｒｈＩＬ１ＲＡまたはＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの代わりにＤＭＳＯで処置した。発現パターン（上方または下方調節のいずれか）およびｍＲＮＡ発現レベルを、上の記載と同じやり方で調査した。
【０１９１】
結果として、図３１〜図３４に示されるとおり、ＧＭ１−ＮＰＣにおける遺伝子発現パターンは、インフラマソームインヒビターの処置によって変化し、したがって、ＧＭ１−ＮＰＣにおいて増加したインフラマソーム関連因子の発現は有意に低減した（図３４）。Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−１インヒビター）で処置したＧＭ１−ＮＰＣにおいて、計２７，３７５のオリゴプローブ対のうち９．３％が、変化した発現パターンを示した（図３１）。それらの発現パターンの変化を実証するこれら遺伝子のほとんどは、ＧＭ１を媒介する神経損傷によって変化されたそれらの遺伝子発現パターンを正常パターンに戻す傾向にあった（図３１）。例えば、ＧＭ１を引き起こすタンパク質ＧＬＢ１の発現は、ＧＭ１−ＮＰＣにおけるそれと比較して、４７％低減し、低減されたＢ４ＧＡＬＮＴ発現は２．６倍増加した（図３２）。インフラマソームがｒｈＩＬ１ＲＡの処置によって阻害されると、３．６％の遺伝子が、変化した発現パターンを示すが、それらもまた、ＧＭ１細胞における異常な遺伝子発現を正常発現パターンへ回復する傾向にあった（図３３）。
【０１９２】
当業者は、前述の説明において開示された概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を遂行するために他の態様に修飾または設計するための土台として容易に利用され得ることを解するであろう。当業者はまた、かかる均等の態様が、添付のクレームに記載の発明の精神および範囲から逸脱しないことも解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月28日(2015.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ）〜ｖｉｉ）：
ｉ）ＧＬＢ１遺伝子のｃ．６０１Ｃ＞Ｔ変異；
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）タンパク質のＲ２０１Ｃ変異；
ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞の正常細胞形態；
ｉｖ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０などの多能性マーカーの発現；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；および、
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデル。
【請求項２】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をインビトロで誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）で誘導されたｉＰＳ細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項３】
ステップｉ）における誘導が、多能性マーカーの異所性発現によって達成される、請求項２に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項４】
以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
の１つまたは２つ以上によって特徴付けられる、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデル。
【請求項５】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス患者から分離したフィブロブラストから、誘導多能性幹細胞をインビトロで調製すること；
ｉｉ）ステップｉ）で調製されたｉＰＳ細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）を誘導すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において誘導されたＮＰＣを収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス神経前駆細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項６】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の、胚様体（ＥＢ）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアへの分化を誘導すること；および、
ｉｉ）ステップｉ）において誘導された、胚様体（ＥＢ）の分化マーカー、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の特徴またはニューロスフェアの形態的特徴を分析すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項７】
胚様体分化マーカーが、外胚葉マーカーＮＥＳＴＩＮおよびＴＵＪ１、内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２、ならびに、中胚葉マーカーα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびＤＥＳＭＩＮからなる群から選択される１つまたは２つ以上のマーカーである、請求項６に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項８】
神経前駆細胞が、以下のｉ）〜ｖｉｉｉ）：
ｉ）ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を包含する神経マーカー遺伝子の発現；
ｉｉ）ＭＡＰ２、ＴＵＪ１およびＳ１００を包含する神経マーカータンパク質の発現；
ｉｉｉ）開裂した嚢胞性ニューロスフェア；
ｉｖ）神経ロゼット形成の低下；
ｖ）ＧＬＢ１遺伝子およびβ−ｇａｌタンパク質の上方調節；
ｖｉ）β−ｇａｌ活性の低下；
ｖｉｉ）ＧＭ１ガングリオシドおよびリソソームの蓄積；および、
ｖｉｉｉ）炎症関連遺伝子の上方調節
から選択される１つまたは２つ以上の特徴を有する、請求項６に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスモデルとして誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを使用する方法。
【請求項９】
以下のステップ：
ｉ）ＧＭ１ガングリオシドーシスｉＰＳ細胞モデルからの分化した神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアを、サンプル化合物または組成物で処置すること；
ｉｉ）ステップｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアの特徴を分析すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた結果と無処置コントロール群とを比較すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
ステップｉｉ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）またはニューロスフェアが、以下のａ）〜ｃ）：
ａ）嚢胞性ニューロスフェアから正常ニューロスフェアへの回復；
ｂ）ニューロスフェア細胞のサイズの増大；および、
ｃ）炎症関連遺伝子の発現の低下
から選択される１つまたは２つ以上の特徴を有する、請求項９に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスのための治療剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（メチル（３Ｓ）−３−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−３−メチルブタンアミド］プロパンアミド］−５−フルオロ−４−オキソペンタノアート）を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物。
【請求項１２】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質を有効成分として含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの予防および処置のための医薬組成物。
【請求項１３】
β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された、ＧＭ１ガングリオシドーシス変異体細胞モデル。
【請求項１４】
以下のステップ：
ｉ）β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターを構築すること；
ｉｉ）ステップｉ）において構築されたβ−ｇａｌ変異体発現ベクターで、分離した細胞を形質転換すること；および、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において形質転換された変異体細胞を収集すること
を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルをインビトロで構築する方法。
【請求項１５】
β−ｇａｌタンパク質のアミノ酸配列においてＥ１８６Ａ変異を含むβ−ｇａｌ変異体ベクターで形質転換された変異体細胞を、ＧＭ１ガングリオシドーシス細胞モデルとして使用する方法。
【国際調査報告】
2016533770.tif 000040
2016533770.tif 000041
2016533770.tif 000042
2016533770.tif 000043
2016533770.tif 000044
2016533770.tif 000045