(57)【要約】本発明は、脂質組成物を含む組成物であって、脂質組成物は、式（Ｉ）［式中、ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、Ｙ’は、アニオンであり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］で表示されるカチオン性脂質と；ステロール化合物であって、ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物と；ＰＥＧ化脂質であって、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ化脂質は、式（ＩＩ）［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、式（ＩＩＩ）［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び式（ＩＶ）［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールからなる群より選択されるＰＥＧ化脂質と；からなる、組成物に関する。
2016540769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質組成物を含む組成物であって、脂質組成物は、式（Ｉ）
【化５８】
2016540769.tif 000064
［式中、
ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、
ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、
Ｙ−は、アニオンであり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］
で表示されるカチオン性脂質と、
ステロール化合物であって、ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物と、
ＰＥＧ化脂質であって、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ化脂質は、式（ＩＩ）
【化５９】
2016540769.tif 000065
［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、
式（ＩＩＩ）
【化６０】
2016540769.tif 000066
［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び
式（ＩＶ）
【化６１】
2016540769.tif 000067
［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールからなる群より選択されるＰＥＧ化脂質とからなる、
組成物。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が互いに異なる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２が同じである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ個々に、かつ、独立して、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルがそれぞれ、１つ又は２つの二重結合を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
Ｃ１８アルケニルが、Ｃ９とＣ１０との間に１つの二重結合を有するＣ１８アルケニル、好ましくは、cis−９−オクタデシルである、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２が異なり、Ｒ１が、パルミチルであり、Ｒ２が、オレイルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２が異なり、ここで、Ｒ１が、ラウリルであり、Ｒ２が、ミリスチルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
カチオン性脂質が、式（Ｉａ）
【化６２】
2016540769.tif 000068
で表示される化合物である、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
Ｙ−が、ハロゲン化物、アセタート、及びトリフルオロアセタートを含む群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
Ｙ−が、Ｃｌ−である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
カチオン性脂質が、式（Ｉｂ）：
【化６３】
2016540769.tif 000069
で表示されるβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
カチオン性脂質が、式（Ｉｃ）：
【化６４】
2016540769.tif 000070
で表示されるβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
カチオン性脂質が、式（Ｉｄ）：
【化６５】
2016540769.tif 000071
で表示されるε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
ステロール化合物が、コレステロールである、請求項１〜１４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
ステロール化合物が、コレステロールである、請求項１２〜１４のいずれか一項、好ましくは、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ステロール化合物が、スチグマステリンである、請求項１〜１４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
ステロール化合物が、スチグマステリンである、請求項１２〜１４のいずれか一項、好ましくは、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分が、約８００〜約５０００Ｄａの分子量を有する、請求項１〜１８のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約８００Ｄａである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約２０００Ｄａである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約５０００Ｄａである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２３】
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンである、請求項１〜２２のいずれか一項、好ましくは、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
Ｒ３及びＲ４が同じである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
Ｒ３及びＲ４が異なる、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ個々に、かつ、独立して、Ｃ１３アルキル、Ｃ１５アルキル、及びＣ１７アルキルからなる群より選択される、請求項２３及び２５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
【化６６】
2016540769.tif 000072
である、請求項１〜２６のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１４及び１６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
【化６７】
2016540769.tif 000073
である、請求項１〜２６のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩＩ）［式中、Ｒ５が、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ｑが、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化セラミドである、請求項１〜２２のいずれか一項、好ましくは、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
Ｒ５が、直鎖状のＣ７アルキルである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
Ｒ５が、直鎖状のＣ１５アルキルである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドが、
【化６８】
2016540769.tif 000074
である、請求項１〜２２及び２９〜３１のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドが、
【化６９】
2016540769.tif 000075
である、請求項１〜２２及び２９〜３１のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３４】
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＶ）［式中、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ｒが、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールである、請求項１〜２２のいずれか一項、好ましくは、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３５】
Ｒ６及びＲ７が同じである、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
Ｒ６及びＲ７が異なる、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
Ｒ６及びＲ７がそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１７アルキル、直鎖状のＣ１５アルキル、及び直鎖状のＣ１３アルキルからなる群より選択される、請求項３４〜３６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３８】
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化７０】
2016540769.tif 000076
である、請求項１〜２２及び３４〜３７のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３９】
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化７１】
2016540769.tif 000077
である、請求項１〜２２及び３４〜３６のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４０】
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化７２】
2016540769.tif 000078
である、請求項１〜２２及び３４〜３６のいずれか一項、好ましくは、請求項１２〜１４のいずれか一項、より好ましくは、請求項１６及び１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４１】
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化７３】
2016540769.tif 000079
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化７４】
2016540769.tif 000080
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化７５】
2016540769.tif 000081
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンであり、ここで、ＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）
【化７６】
2016540769.tif 000082
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）
【化７７】
2016540769.tif 000083
からなる群より選択される、請求項１〜４０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化７８】
2016540769.tif 000084
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化７９】
2016540769.tif 000085
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化８０】
2016540769.tif 000086
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドであり、ここで、ＰＥＧ化セラミドが、
Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝
【化８１】
2016540769.tif 000087
及び
Ｎ−パルミトイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝
【化８２】
2016540769.tif 000088
からなる群より選択される、請求項１〜４０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化８３】
2016540769.tif 000089
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化８４】
2016540769.tif 000090
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化８５】
2016540769.tif 000091
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールであり、ここで、ＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］
【化８６】
2016540769.tif 000092
１，２−ジパルミトイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］
【化８７】
2016540769.tif 000093
からなる群より選択される、請求項１〜４０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
カチオン性脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化８８】
2016540769.tif 000094
であり、
ステロール化合物が、コレステロールであり、
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンであり、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化８９】
2016540769.tif 000095
である、請求項１〜４３のいずれか一項、好ましくは、請求項４１〜４３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
脂質組成物中において、カチオン性脂質組成物の含有量が、約６５モル％〜約７５モル％であり、ステロール化合物の含有量が、約２４モル％〜約３４モル％であり、ＰＥＧ化脂質の含有量が、約０．５モル％〜約１．５モル％であり、ここで、脂質組成物についてのカチオン性脂質、ステロール化合物、及びＰＥＧ化脂質の含有量の合計が、１００モル％である、請求項１〜４４のいずれか一項、好ましくは、請求項４１〜４４のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
脂質組成物中において、カチオン性脂質の含有量が、約７０モル％であり、ステロール化合物の含有量が、約２９モル％であり、ＰＥＧ化脂質の含有量が、約１モル％である、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化９０】
2016540769.tif 000096
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化９１】
2016540769.tif 000097
の通りである、請求項１〜４６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４８】
組成物が、担体を含み、好ましくは、担体が、薬学的に許容し得る担体である、請求項１〜４７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
担体が、水、水溶液、好ましくは、等張性水溶液、塩溶液、好ましくは、等張性塩溶液、バッファー、好ましくは、等張性バッファー、及び水混和性溶媒を含む群より選択される、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
担体が、水混和性溶媒であり、ここで、水混和性溶媒が、エタノール及び三級ブタノールからなる群より選択される、請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
担体が、ショ糖水溶液、好ましくは、２７０mM ショ糖水溶液である、請求項４８〜５０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５２】
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化９２】
2016540769.tif 000098
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ 式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン
の通りであり、ここで、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化９３】
2016540769.tif 000099
であり、
ここで、組成物が、２７０mM ショ糖水溶液を含む、請求項１〜５１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５３】
脂質組成物が、担体中で粒子を形成している、請求項４８〜５２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
粒子が、約３０nm〜約１５０nmのＤＬＳ測定に基づくＺ平均径を有する、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
粒子が、約５０nm〜約１００nmのＤＬＳ測定に基づくＺ平均径を有する、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
粒子のＤＬＳ測定に基づくＺ平均径が、動的光散乱により測定された場合、約６０〜８０nmである、請求項５３〜５５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
２７０mM ショ糖溶液中において、２０℃の温度で測定された場合、組成物が、約＋２５〜約＋８０mV、好ましくは、約＋３０mV〜約＋６０mV、より好ましくは、約＋４６mVのゼータ電位を有する、請求項１〜５６のいずれか一項、好ましくは、請求項４８〜５６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
組成物が、化合物を更に含み、ここで、化合物が、生物学的活性剤又は薬学的活性剤である、請求項１〜５７のいずれか一項、好ましくは、請求項４１〜５７のいずれか一項、並びにより好ましくは、請求項４７及び５２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
組成物が、化合物を更に含み、ここで、化合物を、脂質組成物により、細胞内及び／又は細胞に送達することができる、請求項１〜５７のいずれか一項、好ましくは、請求項４１〜５７のいずれか一項、並びにより好ましくは、請求項４７及び５２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
細胞が、哺乳類の細胞であり、好ましくは、哺乳類が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択される、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
細胞が、肺内皮細胞であり、好ましくは、細胞が、ヒト肺内皮細胞である、請求項５９〜６０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
化合物が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び小分子を含む群より選択される、請求項５８〜６１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
化合物が、核酸であり、ここで、核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、及びＬＮＡを含む群より選択される、請求項６２記載の組成物。
【請求項６４】
核酸が、機能性核酸であり、好ましくは、機能性核酸が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、及びｍＲＮＡを含む群より選択される、請求項６２記載の組成物。
【請求項６５】
ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、及びｍＲＮＡを含む群より選択される、請求項６２記載の組成物。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、及びシュピーゲルマーを含む群より選択される、請求項６２記載の組成物。
【請求項６７】
オリゴヌクレオチドが、脂質組成物と複合体を形成している、請求項６２及び６６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６８】
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１〜６７のいずれか一項、好ましくは、請求項４１〜４７及び５３〜５６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６９】
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、請求項６８記載の組成物。
【請求項７０】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項６９記載の組成物。
【請求項７１】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項７０記載の組成物。
【請求項７２】
化合物が、タンパク質であり、ここで、タンパク質が、抗体、サイトカイン、及びアンチカリンを含む群より選択される、請求項６２記載の組成物。
【請求項７３】
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化９４】
2016540769.tif 000100
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化９５】
2016540769.tif 000101
の通りであり、
ここで、組成物が、好ましくは、担体として、２７０mM ショ糖水溶液を含み、
ここで、組成物が、化合物を含み、ここで、化合物が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、及びＲＮＡ干渉媒介性化合物を含む群より選択され、好ましくは、化合物が、（ａ）生物学的若しくは薬学的活性剤であり、並びに／又は、（ｂ）脂質組成物により、細胞内及び／若しくは細胞、より好ましくは、哺乳類肺内皮細胞に送達されることができる、請求項１〜７２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７４】
化合物が、機能性核酸であり、ここで、帯電した脂質窒素原子と核酸骨格リン酸との間の比（Ｎ／Ｐ比）が、約３〜１２、好ましくは、約５〜１０、及びより好ましくは、約８〜９、及び最も好ましくは、約８．４である、請求項１〜７３のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜７３のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項７３及び７４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７６】
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、請求項７５記載の組成物。
【請求項７７】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項７６記載の組成物。
【請求項７８】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項７７記載の組成物。
【請求項７９】
組成物が、０．２８mg/mL ｓｉＲＮＡ及び２．４mg/mL 総脂質を含む、請求項７３〜７８のいずれか一項、好ましくは、請求項７８記載の組成物。
【請求項８０】
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化９６】
2016540769.tif 000102
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化９７】
2016540769.tif 000103
の通りであり、
ここで、組成物が、好ましくは、担体として、２７０mM ショ糖水溶液を含み、
ここで、組成物が、化合物を含み、ここで、化合物が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びｓｉＮＡを含む群より選択され、好ましくは、化合物が、（ａ）生物学的若しくは薬学的活性剤であり、並びに／又は、（ｂ）脂質組成物により、細胞内及び／若しくは細胞、より好ましくは、哺乳類肺内皮細胞に送達されることができ、
ここで、帯電した脂質窒素原子と核酸骨格リン酸との間の比（Ｎ／Ｐ比）が、約８〜９、好ましくは、約８．４である、請求項１〜７９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項８０記載の組成物。
【請求項８２】
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、請求項８１記載の組成物。
【請求項８３】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項８２記載の組成物。
【請求項８４】
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、請求項８３記載の組成物。
【請求項８５】
組成物が、０．２８mg/mL ｓｉＲＮＡ及び２．４mg/mL 総脂質を含む、請求項８０〜８４のいずれか一項、好ましくは、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
対象の疾患を処置及び／又は予防する方法に使用するための、請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８７】
該方法が、有効量の組成物、好ましくは、治療的に有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項８８】
組成物が、化合物を対象の細胞内に送達する、請求項８６〜８７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８９】
細胞が、肺内皮細胞である、請求項８８記載の組成物。
【請求項９０】
化合物が、肺内皮細胞における治療効果を提供し、好ましくは、化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、請求項８９記載の組成物。
【請求項９１】
ターゲット分子が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係する、請求項９０記載の組成物。
【請求項９２】
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、請求項８６〜９１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９３】
対象が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択される、請求項８６〜９２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９４】
組成物が、静脈内投与により又は吸入により、対象に投与される、請求項８６〜９３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９５】
疾患を処置及び／又は予防するための医薬を製造するための、請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項９６】
疾患が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係するターゲット分子が肺内皮細胞に存在する疾患であり、ターゲット分子の阻害が、治療効果を提供する、請求項９５記載の使用。
【請求項９７】
組成物の化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、請求項９５〜９６のいずれか一項記載の使用。
【請求項９８】
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、請求項９５〜９７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９９】
医薬が、静脈内投与用である、請求項９５〜９８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１００】
請求項１〜８５のいずれか一項記載の組成物、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項記載の組成物、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１０１】
請求項１〜８５のいずれか一項記載の組成物、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項記載の組成物、及びより好ましくは、請求項７３及び８５に記載の組成物の化学組成が、薬学的活性剤である、請求項１００記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
請求項１〜８５のいずれか一項記載の組成物、好ましくは、請求項５７〜８５のいずれか一項記載の組成物、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物の担体が、薬学的に許容し得る担体である、請求項１００〜１０１のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
医薬組成物が、疾患を処置及び／又は予防するのに使用するためのものであり、ここで、疾患が、請求項９５〜９９のいずれかにおいて定義されている、請求項１００〜１０２のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
輸送剤としての、請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１０５】
輸送剤が、生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を、細胞、好ましくは、哺乳類細胞、及びより好ましくは、ヒト細胞内に輸送する、請求項１０４記載の使用。
【請求項１０６】
細胞が、肺内皮細胞、好ましくは、ヒト肺内皮細胞である、請求項１０５記載の使用。
【請求項１０７】
化学組成の化合物が、生物学的活性剤又は薬学的活性剤である、請求項１０４〜１０６のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０８】
請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【請求項１０９】
生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を、細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送する方法であって、
細胞又は細胞膜と、請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物及び生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１１０】
細胞中及び／又は細胞膜を通過した生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を検出する工程を含む、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物が、請求項５８〜８５のいずれか一項記載の組成物の化合物である、請求項１０９〜１１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
疾患を処置及び／又は予防する方法であって、
有効量の、請求項１〜８５のいずれか一項、好ましくは、請求項５８〜８５のいずれか一項、及びより好ましくは、請求項７３〜８５のいずれか一項記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１３】
組成物が、化合物を対象の細胞内に送達する、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
細胞が、肺内皮細胞である、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
化合物が、肺内皮細胞における治療効果を提供し、好ましくは、化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
ターゲット分子が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係する、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、請求項１１２〜１１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
対象が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択され、好ましくは、対象が、ヒトである、請求項１１２〜１１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１９】
医薬を製造する方法であって、
請求項１〜８５のいずれか一項記載の組成物を、薬学的活性剤と共に配合することを含む、方法。
【請求項１２０】
医薬が、請求項１〜１１９のいずれか一項記載の疾患を処置及び／又は予防するためのものである、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
薬学的活性剤が、肺疾患の処置に適した化合物である、請求項１１９〜１２０のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質組成物を含む組成物であって、疾患を処置する方法に使用するための脂質組成物を含む組成物、疾患を処置及び／又は予防するための医薬を製造するための脂質組成物を含む組成物の使用、脂質組成物を含む組成物を含む医薬組成物、輸送剤としての脂質組成物を含む組成物の使用、脂質組成物を含む組成物を含むキット、生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送する方法であって、細胞又は細胞膜と脂質組成物を含む組成物とを接触させることを含む方法、疾患を処置及び／又は予防する方法であって、有効量の脂質組成物を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学及び分子医学は両方とも、生物学的活性化合物の細胞内への導入に多いに頼っている。このような生物学的活性化合物は、典型的には、中でも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにペプチド及びタンパク質をそれぞれ含む。克服すべき障害は、典型的には、負に帯電した外表面を有する脂質二重層である。当技術分野において、数多くの技術が、細胞膜を通過させることにより、生物学的活性化合物を導入するのに開発されている。ただし、研究室用途を想定した一部の方法は、医療分野では使用できず、特に薬剤送達に適してない。例えば、当技術分野において公知のエレクトロポレーション及びバリスティック法でも、生物学的活性化合物の局所的な送達を可能にする程度であろう。前記脂質二重層とは別に、細胞膜は、トランスポーター系も含む。したがって、細胞膜を通過させて生物学的活性化合物を輸送するために、この種のトランスポーター系を使用する努力が行われた。しかしながら、このようなトランスポーター系の特異性又は交叉反応性のために、その使用は、一般に適用可能な方法ではない。
【０００３】
生物学的活性化合物を細胞内に輸送するための当技術分野において説明されているより一般に適用可能なアプローチは、ウイルスベクターの使用である。しかしながら、ウイルスベクターは、一部の細胞種内に効率的に遺伝子を輸送するためにしか使用できず、化学合成分子を細胞内に導入するのには使用することができない。
【０００４】
代替アプローチは、いわゆるリポソームの使用であった（Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252）（非特許文献１）。リポソームは、水中での両親媒性脂質の会合に基づいて生成される小胞である。リポソームは、典型的には、リン脂質の同心円状に配置した二重層を含む。層の数に応じて、リポソームは、小型の単層小胞、多層小胞、及び大型の多層小胞として分類することができる。リポソームは、水性中間層内に親水性化合物を包含することができるため、効果的な送達剤であることが証明されている。一方、疎水性化合物は、脂質層内に包含される。脂質配合の組成及びその調製方法は両方とも、得られた脂質凝集体の構造及びサイズにおける影響、このため、リポソームにおける影響を有することは、当技術分野において周知である。リポソームは、カチオン性脂質を包含することも公知である。
【０００５】
リポソームの成分とは別に、カチオン性脂質はそれ自体も、生体高分子の細胞送達に使用することができるため、かなりの注目を集めている。カチオン性脂質を使用して、任意のアニオン性化合物を、静電相互作用により、本質的に定量法で封入することができる。加えて、カチオン性脂質は、負に帯電した細胞膜と相互作用して、細胞膜輸送を開始すると考えられる。カチオン性脂質を含有するリポソーム配合の使用又はカチオン性脂質自体と生物学的活性化合物との使用は、各配合が限られた用途のものであるため、発見的なアプローチを必要とすることが見出されている。典型的には、一部の全てではない細胞種内にしかプラスミドを送達することができず、通常、血清に存在しないためである。
【０００６】
脂質と脂質により輸送される生物学的活性化合物との電荷及び／又は質量比は、種々の生物学的活性化合物の送達における重要な要因になってきている。例えば、サイズが５，０００〜１０，０００塩基を含むプラスミド送達に適した脂質配合は、一般的には、オリゴヌクレオチド、例えば、約１０〜約５０塩基を典型的に含む、ｓｉＲＮＡ分子、合成リボザイム、又はアンチセンス分子の送達に有効でないことが示されている。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムとについての最適な送達条件は、同じ細胞種であっても異なることが近年示されている。
【０００７】
米国特許第６，３９５，７１３号（特許文献１）には、カチオン性脂質が脂溶性基と、リンカーと、先端基とからなるカチオン性脂質系組成物及び生物学的活性化合物を細胞内に輸送するためのこのような組成物の使用が開示されている。
【０００８】
国際公開第２００５／１０５１５２号（特許文献２）には、機能性核酸分子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の送達に特に有効であることが証明されている、別のカチオン性脂質系組成物が開示されている。
【０００９】
処置される疾患及び送達される薬剤に応じて、特定の臓器又は特定の細胞種に薬剤を送達する必要性が存在する。１つのこのような特定の臓器は、肺であり、１つのこのような特定の細胞種は、肺内皮細胞である。肺及び肺内皮細胞のターゲッティングは、例えば、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧等の疾患を処置するための薬剤の送達に有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，３９５，７１３号
【特許文献２】国際公開第２００５／１０５１５２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の根底にある課題は、肺に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達可能な手段の提供である。本発明の根底にある更なる課題は、肺組織に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達可能な手段の提供である。本発明の根底にあるなお更なる課題は、肺内皮細胞に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達可能な手段の提供である。
【００１３】
本発明の根底にある別の課題は、肺疾患、好ましくは、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される肺疾患を処置する手段の提供である。
【００１４】
本発明の根底にある別の課題は、肺疾患、好ましくは、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される肺疾患を処置する手段の一部としての送達媒体の提供である。
【００１５】
本発明の根底にある別の課題は、医薬組成物の提供である。好ましくは、医薬組成物は、肺に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達するのに適している。本発明の根底にある更なる課題は、肺組織に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達するのに適した医薬組成物の提供である。本発明の根底にあるなお更なる課題は、肺内皮細胞に、作用剤、好ましくは、治療的活性剤、より好ましくは、薬剤を送達するのに適した医薬組成物の提供である。
【００１６】
本発明の根底にある別の課題は、肺疾患、好ましくは、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される肺疾患を処置するのに適した、又は、同処置に使用するための医薬を製造するのに使用することができる手段の提供である。
【００１７】
本発明の根底にある別の課題は、治療的又は薬学的活性剤、好ましくは、薬剤を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の処置方法及び／又は予防方法の提供である。本発明の根底にある更なる課題は、治療的又は薬学的活性剤、好ましくは、薬剤を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺疾患の処置方法及び／又は予防方法の提供である。本発明の根底にあるなお更なる課題は、疾患、好ましくは、肺疾患の処置方法及び／又は予防方法であって、処置が、治療的又は薬学的活性剤を、肺、好ましくは、肺内皮細胞に送達することを含む方法の提供である。
【００１８】
本発明の根底にある別の課題は、輸送剤の提供である。好ましくは、輸送剤は、生物学的活性剤、治療的活性剤、及び／又は薬学的活性剤を、細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送可能であり、ここで、好ましくは、このような細胞は、肺内皮細胞である。
【００１９】
本発明の根底にある別の課題は、生物学的活性剤、治療的活性剤、及び／又は薬学的活性剤を、細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送する方法の提供であり、ここで、好ましくは、このような細胞は、肺内皮細胞である。
【００２０】
本発明の根底にある別の課題は、キットの提供である。好ましくは、キットは、（ａ）疾患、好ましくは、肺疾患の処置方法及び／又は予防方法に使用するのに、（ｂ）生物学的活性剤、治療的活性剤、及び／又は薬学的活性剤を、細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送する方法に使用するのに（ここで、好ましくは、このような細胞は、肺内皮細胞である）、及び／又は、（ｃ）医薬、好ましくは、疾患、より好ましくは、肺疾患、及び最も好ましくは、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される肺疾患を処置及び／又は予防するための医薬の製造において使用するのに、適している。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
これら及び他の課題は、添付の従属する請求項の主題により解決される。好ましい実施態様は、添付の従属する請求項から得ることができる。これら及び他の課題は、下記実施態様によっても解決される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
実施態様１
脂質組成物を含む組成物であって、脂質組成物は、式（Ｉ）
【化１】
2016540769.tif 000003
［式中、
ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、
ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、
Ｙ−は、アニオンであり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］
で表示されるカチオン性脂質と、
ステロール化合物であって、ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物と、
ＰＥＧ化脂質であって、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ化脂質は、式（ＩＩ）
【化２】
2016540769.tif 000004
［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、
式（ＩＩＩ）
【化３】
2016540769.tif 000005
［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び
式（ＩＶ）
【化４】
2016540769.tif 000006
［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールからなる群より選択されるＰＥＧ化脂質とからなる、
組成物。
【００２３】
実施態様２
Ｒ１及びＲ２が互いに異なる、実施態様１記載の組成物。
【００２４】
実施態様３
Ｒ１及びＲ２が同じである、実施態様１記載の組成物。
【００２５】
実施態様４
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ個々に、かつ、独立して、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルからなる群より選択される、実施態様１〜３のいずれか一つに記載の組成物。
【００２６】
実施態様５
Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルがそれぞれ、１つ又は２つの二重結合を含む、実施態様４記載の組成物。
【００２７】
実施態様６
Ｃ１８アルケニルが、Ｃ９とＣ１０との間に１つの二重結合を有するＣ１８アルケニル、好ましくは、cis−９−オクタデシルである、実施態様５記載の組成物。
【００２８】
実施態様７
Ｒ１及びＲ２が異なり、Ｒ１が、パルミチルであり、Ｒ２が、オレイルである、実施態様１〜６のいずれか一つに記載の組成物。
【００２９】
実施態様８
Ｒ１及びＲ２が異なり、ここで、Ｒ１が、ラウリルであり、Ｒ２が、ミリスチルである、実施態様１〜６のいずれか一つに記載の組成物。
【００３０】
実施態様９
カチオン性脂質が、式（Ｉａ）
【化５】
2016540769.tif 000007
で表示される化合物である、実施態様１〜８のいずれか一つに記載の組成物。
【００３１】
実施態様１０
Ｙ−が、ハロゲン化物、アセタート、及びトリフルオロアセタートを含む群より選択される、実施態様１〜９のいずれか一つに記載の組成物。
【００３２】
実施態様１１
Ｙ−が、Ｃｌ−である、実施態様１０記載の組成物。
【００３３】
実施態様１２
カチオン性脂質が、式（Ｉｂ）：
【化６】
2016540769.tif 000008
で表示されるβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩である、実施態様１〜１１のいずれか一つに記載の組成物。
【００３４】
実施態様１３
カチオン性脂質が、式（Ｉｃ）：
【化７】
2016540769.tif 000009
で表示されるβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩である、実施態様１〜１１のいずれか一つに記載の組成物。
【００３５】
実施態様１４
カチオン性脂質が、式（Ｉｄ）：
【化８】
2016540769.tif 000010
で表示されるε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩である、実施態様１〜１１のいずれか一つに記載の組成物。
【００３６】
実施態様１５
ステロール化合物が、コレステロールである、実施態様１〜１４のいずれか一つに記載の組成物。
【００３７】
実施態様１６
ステロール化合物が、コレステロールである、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１４に記載の組成物。
【００３８】
実施態様１７
ステロール化合物が、スチグマステリンである、実施態様１〜１４のいずれか一つに記載の組成物。
【００３９】
実施態様１８
ステロール化合物が、スチグマステリンである、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１４に記載の組成物。
【００４０】
実施態様１９
ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分が、約８００〜約５０００Ｄａの分子量を有する、実施態様１〜１８のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００４１】
実施態様２０
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約８００Ｄａである、実施態様１９記載の組成物。
【００４２】
実施態様２１
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約２０００Ｄａである、実施態様１９記載の組成物。
【００４３】
実施態様２２
ＰＥＧ化脂質におけるＰＥＧ部分の分子量が、約５０００Ｄａである、実施態様１９記載の組成物。
【００４４】
実施態様２３
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンである、実施態様１〜２２のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１９〜２２のいずれか一つに記載の組成物。
【００４５】
実施態様２４
Ｒ３及びＲ４が同じである、実施態様２３記載の組成物。
【００４６】
実施態様２５
Ｒ３及びＲ４が異なる、実施態様２３記載の組成物。
【００４７】
実施態様２６
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ個々に、かつ、独立して、Ｃ１３アルキル、Ｃ１５アルキル、及びＣ１７アルキルからなる群より選択される、実施態様２３及び２５のいずれか一つに記載の組成物。
【００４８】
実施態様２７
式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
【化９】
2016540769.tif 000011
である、実施態様１〜２６のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１４及び１６のいずれか一つに記載の組成物。
【００４９】
実施態様２８
式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
【化１０】
2016540769.tif 000012
である、実施態様１〜２６のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００５０】
実施態様２９
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩＩ）［式中、Ｒ５が、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ｑが、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］で表示されるＰＥＧ化セラミドである、実施態様１〜２２のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１９〜２２のいずれか一つに記載の組成物。
【００５１】
実施態様３０
Ｒ５が、直鎖状のＣ７アルキルである、実施態様２９記載の組成物。
【００５２】
実施態様３１
Ｒ５が、直鎖状のＣ１５アルキルである、実施態様３０記載の組成物。
【００５３】
実施態様３２
式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドが、
【化１１】
2016540769.tif 000013
である、実施態様１〜２２及び２９〜３１のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００５４】
実施態様３３
式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドが、
【化１２】
2016540769.tif 000014
である、実施態様１〜２２及び２９〜３１のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００５５】
実施態様３４
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＶ）
【化１３】
2016540769.tif 000015
［式中、Ｒ６及びＲ７がそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ｒが、１８、１９若しくは２０、又は、４４、４５若しくは４６、又は、１１３、１１４若しくは１１５の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールである、実施態様１〜２２のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１９〜２２のいずれか一つに記載の組成物。
【００５６】
実施態様３５
Ｒ６及びＲ７が同じである、実施態様３４記載の組成物。
【００５７】
実施態様３６
Ｒ６及びＲ７が異なる、実施態様３４記載の組成物。
【００５８】
実施態様３７
Ｒ６及びＲ７がそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１７アルキル、直鎖状のＣ１５アルキル、及び直鎖状のＣ１３アルキルからなる群より選択される、実施態様３４〜３６のいずれか一つに記載の組成物。
【００５９】
実施態様３８
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化１４】
2016540769.tif 000016
である、実施態様１〜２２及び３４〜３７のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００６０】
実施態様３９
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化１５】
2016540769.tif 000017
である、実施態様１〜２２及び３４〜３６のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００６１】
実施態様４０
式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
【化１６】
2016540769.tif 000018
である、実施態様１〜２２及び３４〜３６のいずれか一つ、好ましくは、実施態様１２〜１４のいずれか一つ、より好ましくは、実施態様１６及び１８のいずれか一つに記載の組成物。
【００６２】
実施態様４１
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化１７】
2016540769.tif 000019
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化１８】
2016540769.tif 000020
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化１９】
2016540769.tif 000021
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンであり、ここで、ＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）
【化２０】
2016540769.tif 000022
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）
【化２１】
2016540769.tif 000023
からなる群より選択される、実施態様１〜４０のいずれか一つに記載の組成物。
【００６３】
実施態様４２
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化２２】
2016540769.tif 000024
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化２３】
2016540769.tif 000025
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化２４】
2016540769.tif 000026
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩＩ）で表示されるＰＥＧ化セラミドであり、ここで、ＰＥＧ化セラミドが、
Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝
【化２５】
2016540769.tif 000027
及び
Ｎ−パルミトイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝
【化２６】
2016540769.tif 000028
からなる群より選択される、実施態様１〜４０のいずれか一つに記載の組成物。
【００６４】
実施態様４３
式（Ｉ）で表示されるカチオン性脂質が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化２７】
2016540769.tif 000029
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化２８】
2016540769.tif 000030
及び
ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸塩
【化２９】
2016540769.tif 000031
からなる群より選択され、
ここで、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステリンからなる群より選択され、
ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＶ）で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールであり、ここで、ＰＥＧ化ジアシルグリセロールが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］
【化３０】
2016540769.tif 000032
１，２−ジパルミトイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］
【化３１】
2016540769.tif 000033
からなる群より選択される、実施態様１〜４０のいずれか一つに記載の組成物。
【００６５】
実施態様４４
カチオン性脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化３２】
2016540769.tif 000034
であり、
ステロール化合物が、コレステロールであり、
ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンであり、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、
１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化３３】
2016540769.tif 000035
である、実施態様１〜４３のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４１〜４３のいずれか一つに記載の組成物。
【００６６】
実施態様４５
脂質組成物中において、カチオン性脂質組成物の含有量が、約６５モル％〜約７５モル％であり、ステロール化合物の含有量が、約２４モル％〜約３４モル％であり、ＰＥＧ化脂質の含有量が、約０．５モル％〜約１．５モル％であり、ここで、脂質組成物についてのカチオン性脂質、ステロール化合物、及びＰＥＧ化脂質の含有量の合計が、１００モル％である、実施態様１〜４４のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４１〜４４のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様４４に記載の組成物。
【００６７】
実施態様４６
脂質組成物中において、カチオン性脂質の含有量が、約７０モル％であり、ステロール化合物の含有量が、約２９モル％であり、ＰＥＧ化脂質の含有量が、約１モル％である、実施態様４５記載の組成物。
【００６８】
実施態様４７
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化３４】
2016540769.tif 000036
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化３５】
2016540769.tif 000037
の通りである、実施態様１〜４６のいずれか一つに記載の組成物。
【００６９】
実施態様４８
組成物が、担体を含み、好ましくは、担体が、薬学的に許容し得る担体である、実施態様１〜４７のいずれか一つに記載の組成物。
【００７０】
実施態様４９
担体が、水、水溶液、好ましくは、等張性水溶液、塩溶液、好ましくは、等張性塩溶液、バッファー、好ましくは、等張性バッファー、及び水混和性溶媒を含む群より選択される、実施態様４８記載の組成物。
【００７１】
実施態様５０
担体が、水混和性溶媒であり、ここで、水混和性溶媒が、エタノール及び三級ブタノールからなる群より選択される、実施態様４９記載の組成物。
【００７２】
実施態様５１
担体が、ショ糖水溶液、好ましくは、２７０mM ショ糖水溶液である、実施態様４８〜５０のいずれか一つに記載の組成物。
【００７３】
実施態様５２
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化３６】
2016540769.tif 000038
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ 式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン
の通りであり、ここで、式（ＩＩ）で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミンが、１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化３７】
2016540769.tif 000039
であり、
ここで、組成物が、２７０mM ショ糖水溶液を含む、実施態様１〜５１のいずれか一つに記載の組成物。
【００７４】
実施態様５３
脂質組成物が、担体中で粒子を形成している、実施態様４８〜５２のいずれか一つに記載の組成物。
【００７５】
実施態様５４
粒子が、約３０nm〜約１５０nmのＤＬＳ測定に基づくＺ平均径を有する、実施態様５３記載の組成物。
【００７６】
実施態様５５
粒子が、約５０nm〜約１００nmのＤＬＳ測定に基づくＺ平均径を有する、実施態様５４記載の組成物。
【００７７】
実施態様５６
粒子のＤＬＳ測定に基づくＺ平均径が、動的光散乱により測定された場合、約６０〜８０nmである、実施態様５３〜５５のいずれか一つに記載の組成物。
【００７８】
実施態様５７
２７０mM ショ糖溶液中において、２０℃の温度で測定された場合、組成物が、約＋２５〜約＋８０mV、好ましくは、約＋３０mV〜約＋６０mV、より好ましくは、約＋４６mVのゼータ電位を有する、実施態様１〜５６のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４８〜５６のいずれか一つに記載の組成物。
【００７９】
実施態様５８
組成物が、化合物を更に含み、ここで、化合物が、生物学的活性剤又は薬学的活性剤である、実施態様１〜５７のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４１〜５７のいずれか一つ、並びにより好ましくは、実施態様４７及び５２のいずれか一つに記載の組成物。
【００８０】
実施態様５９
組成物が、化合物を更に含み、ここで、化合物を、脂質組成物により、細胞内及び／又は細胞に送達することができる、実施態様１〜５７のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４１〜５７のいずれか一つ、並びにより好ましくは、実施態様４７及び５２のいずれか一つに記載の組成物。
【００８１】
実施態様６０
細胞が、哺乳類の細胞であり、好ましくは、哺乳類が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択される、実施態様５９記載の組成物。
【００８２】
実施態様６１
細胞が、肺内皮細胞であり、好ましくは、細胞が、ヒト肺内皮細胞である、実施態様５９〜６０のいずれか一つに記載の組成物。
【００８３】
実施態様６２
化合物が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び小分子を含む群より選択される、実施態様５８〜６１のいずれか一つに記載の組成物。
【００８４】
実施態様６３
化合物が、核酸であり、ここで、核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、及びＬＮＡを含む群より選択される、実施態様６２記載の組成物。
【００８５】
実施態様６４
核酸が、機能性核酸であり、好ましくは、機能性核酸が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、及びｍＲＮＡを含む群より選択される、実施態様６２記載の組成物。
【００８６】
実施態様６５
ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、及びｍＲＮＡを含む群より選択される、実施態様６２記載の組成物。
【００８７】
実施態様６６
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡ干渉媒介性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、及びシュピーゲルマーを含む群より選択される、実施態様６２記載の組成物。
【００８８】
実施態様６７
オリゴヌクレオチドが、脂質組成物と複合体を形成している、実施態様６２及び６６のいずれか一つに記載の組成物。
【００８９】
実施態様６８
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、実施態様１〜６７のいずれか一つ、好ましくは、実施態様４１〜４７及び５３〜５６のいずれか一つに記載の組成物。
【００９０】
実施態様６９
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、実施態様６８記載の組成物。
【００９１】
実施態様７０
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様６９記載の組成物。
【００９２】
実施態様７１
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様７０記載の組成物。
【００９３】
実施態様７２
化合物が、タンパク質であり、ここで、タンパク質が、抗体、サイトカイン、及びアンチカリンを含む群より選択される、実施態様６２記載の組成物。
【００９４】
実施態様７３
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化３８】
2016540769.tif 000040
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化３９】
2016540769.tif 000041
の通りであり、
ここで、組成物が、好ましくは、担体として、２７０mM ショ糖水溶液を含み、
ここで、組成物が、化合物を含み、ここで、化合物が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＮＡ、及びＲＮＡ干渉媒介性化合物を含む群より選択され、好ましくは、化合物が、（ａ）生物学的若しくは薬学的活性剤であり、並びに／又は、（ｂ）脂質組成物により、細胞内及び／若しくは細胞、より好ましくは、哺乳類肺内皮細胞に送達されることができる、実施態様１〜７２のいずれか一つに記載の組成物。
【００９５】
実施態様７４
化合物が、機能性核酸であり、ここで、帯電した脂質窒素原子と核酸骨格リン酸との間の比（Ｎ／Ｐ比）が、約３〜１２、好ましくは、約５〜１０、及びより好ましくは、約８〜９、及び最も好ましくは、約８．４である、実施態様１〜７３のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜７３のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３に記載の組成物。
【００９６】
実施態様７５
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、実施態様７３及び７４のいずれか一つに記載の組成物。
【００９７】
実施態様７６
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、実施態様７５記載の組成物。
【００９８】
実施態様７７
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様７６記載の組成物。
【００９９】
実施態様７８
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様７７記載の組成物。
【０１００】
実施態様７９
組成物が、０．２８mg/mL ｓｉＲＮＡ及び２．４mg/mL 総脂質を含む、実施態様７３〜７８のいずれか一つ、好ましくは、実施態様７８に記載の組成物。
【０１０１】
実施態様８０
脂質組成物が、下記：
７０モル％ β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【化４０】
2016540769.tif 000042
２９モル％ コレステロール、及び
１モル％ １，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（アンモニウム塩）
【化４１】
2016540769.tif 000043
の通りであり、
ここで、組成物が、好ましくは、担体として、２７０mM ショ糖水溶液を含み、
ここで、組成物が、化合物を含み、ここで、化合物が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びｓｉＮＡを含む群より選択され、好ましくは、化合物が、（ａ）生物学的若しくは薬学的活性剤であり、並びに／又は、（ｂ）脂質組成物により、細胞内及び／若しくは細胞、より好ましくは、哺乳類肺内皮細胞に送達されることができ、
ここで、帯電した脂質窒素原子と核酸骨格リン酸との間の比（Ｎ／Ｐ比）が、約８〜９、好ましくは、約８．４である、実施態様１〜７９のいずれか一つに記載の組成物。
【０１０２】
実施態様８１
組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、実施態様８０記載の組成物。
【０１０３】
実施態様８２
ｓｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧ２をターゲッティングする、実施態様８１記載の組成物。
【０１０４】
実施態様８３
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
の一方又は両方を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様８２記載の組成物。
【０１０５】
実施態様８４
ＡＮＧ２ターゲッティングｓｉＲＮＡ分子が、下記２つの配列：
5´aguuggaaggaccacaugc 3´（配列番号：１）及び
5´gcaugugguccuuccaacu 3´（配列番号：２）
を含み、好ましくは、大文字として示されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルである、実施態様８３記載の組成物。
【０１０６】
実施態様８５
組成物が、０．２８mg/mL ｓｉＲＮＡ及び２．４mg/mL 総脂質を含む、実施態様８０〜８４のいずれか一つ、好ましくは、実施態様８４に記載の組成物。
【０１０７】
実施態様８６
対象の疾患を処置及び／又は予防する方法に使用するための、実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物。
【０１０８】
実施態様８７
該方法が、有効量の組成物、好ましくは、治療的に有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、実施態様８６記載の組成物。
【０１０９】
実施態様８８
組成物が、化合物を対象の細胞内に送達する、実施態様８６〜８７のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１０】
実施態様８９
細胞が、肺内皮細胞である、実施態様８８記載の組成物。
【０１１１】
実施態様９０
化合物が、肺内皮細胞における治療効果を提供し、好ましくは、化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、実施態様８９記載の組成物。
【０１１２】
実施態様９１
ターゲット分子が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係する、実施態様９０記載の組成物。
【０１１３】
実施態様９２
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、実施態様８６〜９１のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１４】
実施態様９３
対象が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択される、実施態様８６〜９２のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１５】
実施態様９４
組成物が、静脈内投与により又は吸入により、対象に投与される、実施態様８６〜９３のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１６】
実施態様９５
疾患を処置及び／又は予防するための医薬を製造するための、実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【０１１７】
実施態様９６
疾患が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係するターゲット分子が肺内皮細胞に存在する疾患であり、ターゲット分子の阻害が、治療効果を提供する、実施態様９５記載の使用。
【０１１８】
実施態様９７
組成物の化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、実施態様９５〜９６のいずれか一つに記載の使用。
【０１１９】
実施態様９８
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、実施態様９５〜９７のいずれか一つに記載の使用。
【０１２０】
実施態様９９
医薬が、静脈内投与用である、実施態様９５〜９８のいずれか一つに記載の使用。
【０１２１】
実施態様１００
実施態様１〜８５のいずれか一つに記載の組成物、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つに記載の組成物、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【０１２２】
実施態様１０１
実施態様１〜８５のいずれか一つに記載の組成物、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つに記載の組成物、及びより好ましくは、実施態様７３及び８５に記載の組成物の化学組成が、薬学的活性剤である、実施態様１００記載の医薬組成物。
【０１２３】
実施態様１０２
実施態様１〜８５のいずれか一つに記載の組成物、好ましくは、実施態様５７〜８５のいずれか一つに記載の組成物、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物の担体が、薬学的に許容し得る担体である、実施態様１００〜１０１のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０１２４】
実施態様１０３
医薬組成物が、疾患を処置及び／又は予防するのに使用するためのものであり、ここで、疾患が、実施態様９５〜９９のいずれかにおいて定義されている、実施態様１００〜１０２のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０１２５】
実施態様１０４
輸送剤としての、実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【０１２６】
実施態様１０５
輸送剤が、生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を、細胞、好ましくは、哺乳類細胞、及びより好ましくは、ヒト細胞内に輸送する、実施態様１０４記載の使用。
【０１２７】
実施態様１０６
細胞が、肺内皮細胞、好ましくは、ヒト肺内皮細胞である、実施態様１０５記載の使用。
【０１２８】
実施態様１０７
化学組成の化合物が、生物学的活性剤又は薬学的活性剤である、実施態様１０４〜１０６のいずれか一つに記載の使用。
【０１２９】
実施態様１０８
実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【０１３０】
実施態様１０９
生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を、細胞内に又は細胞膜を通過させて輸送する方法であって、
細胞又は細胞膜と、実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物及び生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物とを接触させる工程を含む、方法。
【０１３１】
実施態様１１０
細胞中及び／又は細胞膜を通過した生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物を検出する工程を含む、実施態様１０９記載の方法。
【０１３２】
実施態様１１１
生物学的活性化合物又は薬学的活性化合物が、実施態様５８〜８５のいずれか一つに記載の組成物の化合物である、実施態様１０９〜１１０のいずれか一つに記載の方法。
【０１３３】
実施態様１１２
疾患を処置及び／又は予防する方法であって、
有効量の、実施態様１〜８５のいずれか一つ、好ましくは、実施態様５８〜８５のいずれか一つ、及びより好ましくは、実施態様７３〜８５のいずれか一つに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【０１３４】
実施態様１１３
組成物が、化合物を対象の細胞内に送達する、実施態様１１２記載の方法。
【０１３５】
実施態様１１４
細胞が、肺内皮細胞である、実施態様１１３記載の方法。
【０１３６】
実施態様１１５
化合物が、肺内皮細胞における治療効果を提供し、好ましくは、化合物が、細胞内のターゲット分子をターゲッティングし、より好ましくは、阻害し、これに基づいて、治療効果が達成される、実施態様１１４記載の方法。
【０１３７】
実施態様１１６
ターゲット分子が、疾患の根底にある病態メカニズムに関係する、実施態様１１５記載の方法。
【０１３８】
実施態様１１７
疾患が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、肺ガン、肺転移、肺高血圧、及び肺動脈高血圧を含む群より選択される、実施態様１１２〜１１６のいずれか一つに記載の方法。
【０１３９】
実施態様１１８
対象が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択され、好ましくは、対象が、ヒトである、実施態様１１２〜１１７のいずれか一つに記載の方法。
【０１４０】
実施態様１１９
医薬を製造する方法であって、
実施態様１〜８５のいずれか一つに記載の組成物を、薬学的活性剤と共に配合することを含む、方法。
【０１４１】
実施態様１２０
医薬が、実施態様１〜１１９のいずれか一つに記載の疾患を処置及び／又は予防するためのものである、実施態様１１９記載の方法。
【０１４２】
実施態様１２１
薬学的活性剤が、肺疾患の処置に適した化合物である、実施態様１１９〜１２０のいずれか一つに記載の方法。
【０１４３】
実施態様１２２
ｓｉＲＮＡが、表１に示されているターゲットをターゲッティングする、実施態様１〜６８のいずれか一つに記載の組成物。好ましい実施態様では、ターゲットは、
ＰＫＮ３（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：３のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：４のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）、
ＣＤ３１（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：１１のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：１２のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）、
Ｔｉｅ２（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：９のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）、
ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：１３のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：１４のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）、
ＣＤＨ５／ＶＥ−カドヘリン（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：１５のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：１６のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）、又は
ＢＭＰＲ２（ここでより好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号：１７のヌクレオチド配列を有する核酸鎖及び／又は配列番号：１８のヌクレオチド配列を有する核酸鎖を含み、ここで、核酸鎖のヌクレオチドは、表１に示されているように改変されている、又は、改変されていない、又は、異なって改変されている）である。
【０１４４】
カチオン性脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドである、本発明の各態様及び任意の態様の各実施態様及び任意の実施態様において、前記β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドが、好ましくは、β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドであることは、本発明の範囲内である。
【０１４５】
カチオン性脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドである、本発明の各態様及び任意の態様の各実施態様及び任意の実施態様において、前記β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドが、好ましくは、β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドであることは、本発明の範囲内である。
【０１４６】
カチオン性脂質が、ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドである、本発明の各態様及び任意の態様の各実施態様及び任意の実施態様において、前記ε−アルギニル−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドが、好ましくは、ε−Ｌ−アルギニル−Ｌ−リシン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドであることは、本発明の範囲内である。
【０１４７】
本発明者らは、驚くべきことに、脂質組成物を含む組成物であって、脂質組成物が、式（Ｉ）
【化４２】
2016540769.tif 000044
［式中、
ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、
ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、
ここで、Ｙ−は、アニオンであり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］
で表示されるカチオン性脂質と、
ステロール化合物であって、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物と、
ＰＥＧ化脂質であって、ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）
【化４３】
2016540769.tif 000045
［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、
式（ＩＩＩ）
【化４４】
2016540769.tif 000046
［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ここで、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び
式（ＩＶ）
【化４５】
2016540769.tif 000047
［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールからなる群より選択されるＰＥＧ化脂質とからなる組成物が、ホスト生物、例えば、哺乳類の肺及び肺組織中に蓄積し、同肺及び肺組織に向うことにより、このような脂質組成物と会合した作用剤、例えば、核酸をこのような臓器及び組織、より具体的には、このようなホスト生物の肺内皮細胞に送達するのに適していることを見出した。好ましくは、このような核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡであるが、これらに限定されない。
【０１４８】
この発見は、カチオン性脂質のナノ複合体の典型的な全身挙動と比較した限りにおいて驚くべきことであり、同複合体は、一般的には、肺におけるｓｉＲＮＡの一過性蓄積のみを伴って、肝臓組織において一般的な遺伝子ノックダウンを示す（Polach, KJ et al. (2012), Mol Ther 20: 91-100；Schroeder, A et al. (2010), J Intern Med 267: 9-21；Tao, W et al. (2010), Mol Ther 18: 1657-1666）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分が、ナノ粒子周囲に親水性保護層を形成する脂質組成物により形成されたリポプレックスナノ粒子表面に存在しており、同ナノ粒子は、立体反発力によりオプソニンタンパク質の吸着を拒絶することにより、血清オプソニン、例えば、免疫グロブリン及びフィブロネクチンによるリポプレックスの結合及び急速な分解を避けることができると、本発明者らは推定している。さもなければ、リポプレックスの結合及び急速な分解は、カチオン性送達システムの静脈内投与に基づいて観察される全身毒性をもたらすであろう。更に、カチオン性脂質は、静電相互作用及びエントロピー効果それぞれによる、負に帯電したＲＮＡのリポプレックス内への能動的なローディングを可能にすることが示された。これにより、オリゴヌクレオチドを濃縮し、それらを分解から保護し、細胞による取り込み及びエンドソーム放出を促進する。本発明の脂質組成物におけるステロール化合物は、融合性を損なうことなく、リポプレックスの安定性を維持することにより、リポプレックスの層状構造、血漿薬物動態、及び生体内分布に影響を及ぼすと推定される。
【０１４９】
本明細書に提供されている実験的証拠を考慮して、本発明の脂質組成物を含む組成物が、肺疾患と、肺、肺組織、及び／又は肺内皮細胞に、薬学的活性剤及び／又は治療的活性剤をターゲッティングさせることにより処置することができる疾患とを処置するのに適していることは明らかである。このような疾患は、肺ガン及び肺転移を含み（例えば、Steeg, PS (2006), Nat Med 12: 895-904を参照のこと）、ここで、肺ガンの場合には、ターゲット分子は、ＣＤ３１、Ｒａｓ、ｍｙｃ、Ｈｉｆ−１ａ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、−Ｒ１、Ｒ−３、ＰＫＮ３、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ１４５である。本発明の脂質組成物を含む組成物により観察された低用量で１回の投与は、特に、静脈内の薬剤投与について入院を必要とする急性感染、例えば、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）／急性肺傷害（ＡＬＩ）、浮腫及び敗血症をもたらす炎症及び亢進した血管透過性により特徴付けられる生命を脅かす症候群の処置に有用な作用剤を送達するための媒体にもなる（van der Heijden, M et al. (2009), Expert Opin Ther Targets 13: 39-53；David, S et al. (2012), Crit Care Med 40: 3034-3041；及びHotchkiss, RS et al. (2003), N Engl J Med 348: 138-150）。ＡＲＤＳ／ＡＬＩそれぞれについて、薬学的活性剤又は治療的活性剤によりターゲッティングすることができる特定のターゲット分子は、ＡＮＧ２である。ＡＮＧ２は、「アンジオポイエチン−２」とも呼ばれ、内皮由来Ｔｉｅ２アンタゴニストであり、血管不安定化因子として、敗血症の罹患率及び死亡率に直接寄与する（Fiedler, U., and H.G. Augustin. 2006, Trends Immunol. 27:552-8）。したがって、合成核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、アンタゴミル（例えば、Piva et al. 2013, INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 43: 985-994、Ganguli et al., 2011, Bioinformation 7(1): 41-43 (2011)、及びCosta et al.2013, Pharmaceuticals, 6, 1195-1220に記載）、及び／又はマイクロＲＮＡ模倣物（例えば、Henry et al., 2011, Pharmaceutical research 12, 3030-3042；及びLing, H., et al. (2013), Nat Rev Drug Discov 12(11): 847-865に記載）を利用する脂質組成物による選択的ターゲット遺伝子阻害は、急性の生命を脅かす肺疾患を含む肺疾患の処置及び／又は予防のための戦略である。
【０１５０】
本発明の更なる態様は、脂質組成物であって、脂質組成物が、式（Ｉ）
【化４６】
2016540769.tif 000048
［式中、
ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、
ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、
ここで、Ｙ−は、アニオンであり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］
で表示されるカチオン性脂質と、
ステロール化合物であって、ステロール化合物が、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物と、
ＰＥＧ化脂質であって、ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ部分を含み、ここで、ＰＥＧ化脂質が、式（ＩＩ）
【化４７】
2016540769.tif 000049
［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、
式（ＩＩＩ）
【化４８】
2016540769.tif 000050
［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ここで、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び
式（ＩＶ）
【化４９】
2016540769.tif 000051
［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールからなる群より選択されるＰＥＧ化脂質とからなる脂質組成物である。
【０１５１】
本発明の更なる態様は、本発明の脂質組成物、本発明の医薬、又は本発明の送達媒体の製造における、式（Ｉ）
【化５０】
2016540769.tif 000052
［式中、
ｎは、１、２、３、及び４のいずれか１つであり、
ここで、ｍは、１、２、及び３のいずれか１つであり、
ここで、Ｙ−は、アニオンであり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルキル及び直鎖状のＣ１２〜Ｃ１８アルケニルからなる群より選択される］
で表示されるカチオン性脂質の使用に属する。
【０１５２】
本発明の更なる態様は、本発明の脂質組成物、本発明の医薬、又は本発明の送達媒体の製造における、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択されるステロール化合物の使用である。
【０１５３】
本発明のなお更なる態様は、本発明の脂質組成物、本発明の医薬、又は本発明の送達媒体の製造における、式（ＩＩ）
【化５１】
2016540769.tif 000053
［式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１３〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｐは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ホスホエタノールアミン、
式（ＩＩＩ）
【化５２】
2016540769.tif 000054
［式中、Ｒ５は、直鎖状のＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、ここで、ｑは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化セラミド、及び
式（ＩＶ）
【化５３】
2016540769.tif 000055
［式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ個々に、かつ、独立して、直鎖状のＣ１１〜Ｃ１７アルキルであり、ここで、ｒは、１５〜１３０の任意の整数である］
で表示されるＰＥＧ化ジアシルグリセロールの使用である。
【０１５４】
反対に示されない限り、本発明の組成物は、本発明の脂質組成物を含む組成物である。本発明の脂質組成物の任意の実施態様が本発明の脂質組成物の実施態様でもあることは、本発明の範囲内である。
【０１５５】
好ましくは、本明細書で使用する場合、送達剤又は送達媒体は、本発明の脂質組成物を含む組成物である。また好ましくは、本明細書で使用する場合、送達剤又は送達媒体は、本発明の組成物である。好ましくは、本明細書で使用する場合、送達剤又は送達媒体は、構造体に化合物を送達するのに適した組成物等の作用剤又は媒体であり、好ましくは、このような構造体は、臓器、組織、又は細胞であり、より好ましくは、このような構造体は、臓器、組織、又は細胞である。好ましい実施態様では、このような化合物は、治療的活性剤、生物学的活性剤、又は薬学的活性剤である。
【０１５６】
好ましくは、本明細書で使用する場合、治療的活性剤は、ホスト生物において、治療効果又は治療的に有益な効果を引き出すのに適した化合物である。
【０１５７】
好ましくは、本明細書で使用する場合、生物的活性剤は、ホスト生物において、生物学的効果を引き出すのに適した化合物である。
【０１５８】
好ましくは、本明細書で使用する場合、薬学的活性剤は、ホスト生物において、薬学的効果又は薬学的に有益な効果を引き出すのに適した化合物である。
【０１５９】
反対に示されない限り、治療的活性剤の任意の実施態様は、生物的活性剤及び薬学的活性剤の実施態様でもあり、並びにその逆もまた同様であることが認められるであろう。
【０１６０】
本発明に関して、治療は、予防も包含する。これに基づいて、治療的活性剤は、実施態様において、疾患の予防に活性な作用剤でもある。別の実施態様では、治療的活性剤は、疾患の予防に活性ではない。
【０１６１】
好ましくは、本明細書で使用する場合、アルキルは、１つの水素を失っているアルカン置換基であり、ここで、アルカンは、水素と炭素とからのみなり、全ての結合が単結合であり、炭素原子は、環状構造に結合しておらず、代わりに開いた鎖を形成している；アルカンの一般化学式は、ＣｎＨ２ｎ＋２である。
【０１６２】
好ましくは、本明細書で使用する場合、アルケニルは、１つの水素を失っているアルケン置換基であり、ここで、アルケンは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する不飽和化合物である。
【０１６３】
好ましくは、本明細書で使用する場合、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、ｎは、１〜４の任意の整数であり、これは、ｎが、１、２、３、及び４であり得ることを意味する。本明細書で使用する場合、ｍは、１〜３の任意の整数であり、これは、ｍが、１、２、及び３であり得ることを意味する。
【０１６５】
本発明の組成物におけるカチオン性脂質及びその調製方法は、例えば、国際公開第２００５／１０５１５２号に開示されている。
【０１６６】
本発明の組成物におけるカチオン性脂質は、カチオン性脂質であることを理解されたい。より好ましくは、前記脂質に存在するＮＨ又はＮＨ２基のいずれかが、プロトン化した形態で存在している。典型的には、前記脂質の任意の正電荷は、アニオンの存在により補償される。このようなアニオンは、一価又は多価のアニオンであることができる。好ましいアニオンは、ハロゲン化物、アセタート、及びトリフルオロアセタートである。本明細書で使用する場合、ハロゲン化物は、好ましくは、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、及び臭化物である。最も好ましくは、塩化物である。カチオン性脂質と、細胞内に輸送される治療的又は薬学的又は生物学的活性化合物との会合に基づいて、ハロゲン化物アニオンは、好ましくは１つ又は複数の負電荷を示す前記活性化合物により置き換えられるが、生物学的活性化合物の電荷全体が必ずしも負ではないことが認められなければならない。同じ考慮が、本発明の組成物における他の化合物に対して等しく適用できる。このような化合物がアニオン性化合物であるか、又は、１つ又は複数の負電荷を有する場合、このような負電荷は、カチオンの存在により補償することができる。このようなカチオンは、一価又は多価のカチオンであることができる。好ましいカチオンは、アンモニウム、ナトリウム、又はカリウムである。
【０１６７】
式（Ｉ）に基づく任意の化合物は、少なくとも２つの不斉Ｃ原子を含むことを認められたい。このような化合物の任意の可能性のあるジアステレオマー、すなわち、特にＲ−Ｒ、Ｓ−Ｓ、Ｒ−Ｓ、及びＳ−Ｒのジアステレオマーが本明細書に開示されていることは、本発明の範囲である。
【０１６８】
本発明の組成物におけるステロール化合物は、合成でもよく、又は、天然の供給源、例えば、羊毛又は植物から得てもよい。
【０１６９】
本発明の組成物におけるＰＥＧ化脂質は、商業的な供給源、例えば、NOF Corporation, Japan；Avanti Polar Lipids, US；又はCordon Pharma, Switzerlandから入手できる。
【０１７０】
本発明の脂質組成物及び本発明の組成物のＺ平均径を測定する方法は、当業者に公知であり、実施例部に記載されている動的光散乱ＤＬＳを含み、又は、例えば、the Zetasizer Nano Series User Manuel, Malvern Instruments Ltd., UKから採用することができる。
【０１７１】
本発明の脂質組成物及び本発明の組成物のゼータ電位を測定する方法は、当業者に公知であり、実施例部に記載されている電気泳動光散乱を含み、又は、例えば、the Zetasizer Nano Series User Manuel, Malvern Instruments Ltd., UKから採用することができる。
【０１７２】
本発明の組成物、及び特に、本発明の脂質組成物は、実施態様において、担体を含んでもよい。このような単体は、好ましくは、液体担体である。好ましい液体担体は、水性担体及び非水性担体である。好ましい水性担体は、水、塩水溶液、水性バッファー系であり、より好ましくは、バッファー系及び／又は塩水溶液は、生理的バッファー強度及び生理的塩濃度を有する。好ましい非水性担体は、溶媒、好ましくは、有機溶媒、例えば、エタノール、tert−ブタノールである。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、任意の水混和性有機溶媒を原理的に使用することができる。このため、組成物、特に脂質組成物は、全体として負に帯電した化合物、好ましくは、本発明の脂質組成物及び／又は本発明の組成物により送達される化合物と接触した際に、リポソームとして存在することができ、又は、リポソームを形成することができ、本発明の脂質組成物及び本発明の組成物は、ポリアニオン、例えば、核酸分子が、カチオン脂質、又は他の脂質成分を除いて少なくとも１つのカチオン性脂質成分を含有する脂質システムと相互作用する際に、リポプレックス、すなわち、カウンターイオン及び水の放出に基づく静電相互作用及びエントロピー効果により形成される複合体を形成することを認められたい。
【０１７３】
更なる実施態様では、本発明の脂質組成物及び／又は本発明の組成物は、凍結乾燥組成物として存在する。このため、凍結乾燥組成物は、室温において、組成物の有効な長期保存を可能にする。
【０１７４】
本発明の脂質組成物及び／又は本発明の組成物は、化合物を含むことは、本発明の範囲内であり、ここで、前記化合物は、生物学的活性剤、治療的活性剤、及び／又は薬学的活性剤である。この種の作用剤は、本明細書において、「活性剤」とも呼ぶものとする。
【０１７５】
好ましくは、任意のこのような活性剤は、負に帯電した分子である。負に帯電した分子という用語は、本発明のカチオン性脂質の正に帯電した基とイオン対合することができる、少なくとも１つ又は２つ以上の負に帯電した基を有する分子を含むことを意味するが、本発明者らは、いかなる理論にも拘束されることを望まない。原理的には、リンカー部分における正電荷は、脂質自体、又はカチオン性脂質と負に帯電した分子、すなわち、生物学的活性化合物との間で形成される任意の複合体のいずれかの構造全体にいくらかの作用も有することができる。それとは別に、本発明の脂質に導入された更なる正電荷は、米国特許第６，３９５，７１３号に開示されているカチオン性脂質と比較して、Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 May 07, 35 (18): 5616-23に教示されているように、この脂質の増大した毒性に寄与してしまうであろう。当業者が先行技術のこの文献から予測するものとは対照的に、本発明の化合物は、本明細書に開示されている種々の目的に特に適しており、特に、任意の増大した毒性がない。
【０１７６】
好ましくは、本明細書で使用する場合、ペプチドは、好ましくは、ペプチド結合を介して互いに共有結合している、少なくとも２つのアミノ酸からなる任意のポリマーである。より好ましくは、ペプチドは、２〜１０個のアミノ酸からなる。ペプチドの特に好ましい実施態様は、オリゴペプチドであり、オリゴペプチドは更により好ましくは、約１０〜約１００個のアミノ酸を含む。好ましくは、本明細書で使用する場合、タンパク質は、互いに共有結合している複数のアミノ酸からなるポリマーである。好ましくは、このようなタンパク質は、少なくとも約１００個のアミノ酸又はアミノ酸残基を含む。
【０１７７】
本発明のカチオン性脂質及び組成物に関して使用することができる好ましいタンパク質は、任意の抗体、好ましくは、任意のモノクローナル抗体である。
【０１７８】
本発明の組成物に関して使用する場合、特に好ましい生物学的活性化合物、すなわち、薬学的活性化合物及びこのような更なる成分は、核酸である。このような核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はこれらの任意の混合物のいずれかであることができる。より好ましくは、核酸は、機能性核酸である。好ましくは、本明細書で使用する場合、機能性核酸は、ペプチド及びタンパク質それぞれをコードする核酸ではない核酸である。好ましい機能性核酸は、当技術分野において公知の、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、及びシュピーゲルマーである。
【０１７９】
ｓｉＲＮＡは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６号に記載されている、小型の干渉性ＲＮＡである。これらの分子は、典型的には、互いに塩基対合している、すなわち、本質的に互いに相補であり、典型的には、ワトソン−クリック塩基対合により媒介される、１５〜２５個、好ましくは、１８〜２３個のヌクレオチド対を含む二本鎖ＲＮＡ構造からなる。この二本鎖ＲＮＡ分子における一方の鎖は、ターゲット核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して本質的に相補であり、一方、前記二本鎖ＲＮＡ分子の第２鎖は、前記ターゲット核酸のストレッチに対して本質的に同一である。ｓｉＲＮＡ分子は、両端及び両ストレッチそれぞれにおいて、数多くの更なるオリゴヌクレオチドによりフランキングされることができるが、同オリゴヌクレオチドは、必ずしも互いに塩基対合する必要はない。
【０１８０】
ＲＮＡｉは、本質的にｓｉＲＮＡと同じ設計を有するが、この分子は、ｓｉＲＮＡと比較してかなり長い。ＲＮＡｉ分子は、典型的には、５０個以上のヌクレオチド及び塩基対それぞれを含む。
【０１８１】
ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉと同じ方式の作用に基づいて活性な更なる分類の機能性核酸は、ｓｉＮＡである。ｓｉＮＡは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７４６５４号に記載されている。とりわけ、ｓｉＮＡは、ｓｉＲＮＡに対応し、ここで、ｓｉＮＡ分子は、いずれのリボヌクレオチドも含まない。
【０１８２】
好ましくは、本明細書で使用する場合、アンチセンス核酸は、ターゲットＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡとの塩基相補性に基づいてハイブリダイズすることにより、ＲＮａｓｅＨを活性化するオリゴヌクレオチドである。ＲＮａｓｅＨは、ホスホジエステル及びホスホチオアート結合ＤＮＡの両方により活性化される。ただし、ホスホジエステル結合ＤＮＡは、ホスホチオアート結合ＤＮＡを除いて、細胞ヌクレアーゼにより急速に分解される。このため、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６〜２３個のヌクレオチドの範囲である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例は、中でも、米国特許第５，８４９，９０２号及び同第５，９８９，９１２号に記載されている。
【０１８３】
更なるグループの機能性核酸は、好ましくは、基本的に２つの部分を含むＲＮＡからなり、触媒活性を有する核酸であるリボザイムである。第１部分は、触媒活性を示し、一方、第２部分は、ターゲット核酸との特異的な相互作用を担う。ターゲット核酸とリボザイムの前記部分との間の相互作用に基づいて、典型的には、ハイブリダイゼーション及び２つのハイブリダイズ鎖における本質的に相補なストレッチの塩基におけるワトソン−クリック塩基対合により、触媒活性部分は、活性になることができ、このことは、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合において、リボザイムは、ターゲット核酸を、分子内又は分子間のいずれかで開裂することを意味する。リボザイム、その使用、及び設計原理は、当業者に公知であり、例えば、Doherty and Doudna（Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457-75）に記載されている。
【０１８４】
なお更なるグループの機能性核酸は、マイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、小型の非コードＲＮＡ分子である。完全に処理された成熟ｍｉＲＮＡは、典型的には、約２２個のヌクレオチドの長さを有する。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写及び転写後制御において機能する。真核生物の核ＤＮＡによりコードされたｍｉＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡ模倣物は、ｍＲＮＡ分子内の相補配列との塩基対合を介して機能し、通常、翻訳抑制又はターゲット分解による遺伝子サイレンシングをもたらす（例えば、Anand, S. (2013), Vasc Cell 5(1): 2；Kasinski, A. L. and F. J. Slack (2011), Nat Rev Cancer 11(12): 849-864；Liu, D., et al. (2011), Int J Dev Biol 55(4-5): 419-429；Staszel, T., et al. (2011), Pol Arch Med Wewn 121(10): 361-366；Urbich, C., et al. (2008), Cardiovasc Res 79(4): 581-588；Costa, P. M. and M. C. Pedroso de Lima (2013), Pharmaceuticals (Basel) 6(10): 1195-1220；及びHenry, J. C., et al. (2011), Pharm Res 28(12): 3030-3042を参照のこと）。
【０１８５】
別のグループの機能性核酸は、アンタゴミルであり、例えば、Costa, P. M. and M. C. Pedroso de Lima (2013), Pharmaceuticals (Basel) 6(10): 1195-1220；Piva, R., et al. (2013), Int J Oncol 43(4): 985-994；Ganguli, S., et al. (2011), Bioinformation 7(1): 41-43；及びLing, H., et al. (2013), Nat Rev Drug Discov 12(11): 847-865に記載されている。
【０１８６】
なお更なるグループの機能性核酸は、アプタマーである。アプタマーは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり、ターゲット分子と特異的に相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造又は選択は、例えば、欧州特許第０５３３８３８号に記載されている。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、及びリボザイムとは対照的に、アプタマーは、任意のターゲットｍＲＮＡを分解しないが、ターゲット化合物、例えば、タンパク質の二次及び三次構造と特異的に相互作用する。ターゲットとの相互作用に基づいて、ターゲットは、典型的には、その生物学的活性に変化を示す。アプタマーの長さは、典型的には、短くて１５個〜長くて８０個のヌクレオチドの範囲であり、好ましくは、約２０〜約５０個のヌクレオチドの範囲である。
【０１８７】
別のグループの機能性核酸は、シュピーゲルマーであり、例えば、国際公開第９８／０８８５６号に記載されている。シュピーゲルマーは、アプタマーに類似する分子である。ただし、シュピーゲルマーは、アプタマーとは対照的に、Ｄ−ヌクレオチドよりむしろ、完全又は大部分のいずれかでＬ−ヌクレオチドからなる。その他に、特に、シュピーゲルマーの可能性のある長さに関して、アプタマーに関して概説したのと同じものをシュピーゲルマーに適用する。
【０１８８】
本発明の更なる態様は、本発明の脂質組成物又は本発明の組成物を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、薬学的活性化合物と、場合により、薬学的に許容し得る担体とを含む。このような薬学的に許容し得る担体は、好ましくは、本発明の組成物に関して本明細書に定義されている担体の群より選択することができる。本明細書に記載されている任意の組成物が、その成分及びこれらの任意の組み合わせが薬学的に許容し得るという条件のもとで、医薬組成物としても原理的に使用することができることは、当業者に理解されるであろう。医薬組成物は、薬学的活性化合物を含む。このような薬学的活性化合物は、本発明の組成物の更なる化合物又は活性剤と同じであることができ、それらは、好ましくは任意の生物学的活性化合物、より好ましくは本明細書に開示されている任意の生物学的活性化合物である。更なる成分、薬学的活性化合物、及び／又は生物学的活性化合物は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び核酸を含む群より選択される。
【０１８９】
本発明の組成物、特に、医薬組成物は、種々の投与形態に使用することができ、局所投与及び全身投与が特に好ましい。更により好ましいものは、筋肉内、経皮、皮下、静脈内、及び肺投与を含む群より選択される投与経路である。好ましくは、本明細書で使用する場合、局所投与は、各組成物が、組成物及び生物学的活性剤がそれぞれ投与されるべき細胞、組織、及び臓器それぞれに対して近い空間的関係で投与されることを意味する。本明細書で使用する場合、全身投与は、局所投与と異なる投与を意味し、より好ましくは、体液、例えば、血液及び髄液それぞれへの投与である。この場合、体液は、組成物及び生物学的活性化合物がそれぞれ送達されるべき細胞、組織、及び臓器それぞれに、組成物を輸送する。
【０１９０】
好ましくは、本明細書で使用する場合、ホスト生物又は対象は、哺乳類であり、好ましくは、哺乳類は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択され、より好ましくは、ホスト生物又は対象は、ヒトである。
【０１９１】
本発明の組成物を使用して製造することができる任意の医薬はそれぞれ、対象の処置及び予防のためのものである。好ましくは、このような対象は、哺乳類であり、更により好ましくは、このような哺乳類は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマを含む群より選択される。更なる態様では、本発明の組成物及び／又は本発明の脂質組成物は、輸送剤として、より好ましくは、トランスフェクション剤として使用することができる。
【０１９２】
好ましくは、本明細書で使用する場合、輸送剤は、化合物、より好ましくは、薬学的活性化合物等の生物学的活性化合物を、膜、好ましくは、細胞膜を通過させて輸送する、及びより好ましくは、このような化合物を、本明細書に先に記載されているように、細胞内に輸送するのに適した任意の作用剤である。好ましくは、細胞は、肺内皮細胞、より好ましくは、本明細書に定義されているホスト生物の内皮細胞である。
【０１９３】
なお更なる態様では、本発明は、生物学的活性化合物を細胞に輸送する方法、とりわけ、生物学的活性化合物により細胞をトランスフェクションする方法に関する。工程の順序は必ずしも限定されないが、第１工程では、細胞及び細胞膜をそれぞれ提供する。第２工程では、本発明の化合物及び生物学的活性化合物、例えば、薬学的活性化合物を提供する。この反応を、細胞及び膜それぞれと接触させることができ、本発明の化合物及び組成物の生物物理学的特徴により、生物学的活性化合物は、膜の一方側から他方側に輸送され、又は、膜が細胞を形成している場合、細胞の外側から細胞内に輸送されるであろう。細胞及び膜それぞれを接触させる前に、生物学的活性化合物と、本発明の組成物及び／又は本発明の脂質組成物とを接触させ、これに基づいて、好ましくは、複合体が形成され、このような複合体を、細胞及び膜それぞれと接触させることは、本発明の範囲内である。
【０１９４】
本発明の更なる態様では、生物学的活性化合物及び薬学的活性化合物それぞれを輸送する方法は、細胞及び膜それぞれを提供する工程と、本発明の組成物及び／又は本発明の脂質組成物を提供する工程と、組成物と細胞及び膜それぞれとを両方接触させる工程とを含む。組成物を、細胞及び膜それぞれと接触させる前又は同接触中に形成することができることは、本発明の範囲内である。
【０１９５】
本明細書に開示されている生物学的活性化合物を輸送する任意の方法の実施態様において、本方法は、更なる工程、好ましくは、生物学的活性化合物が輸送されているかどうかを検出する工程を含むことができる。このような検出反応は、本方法に基づいて輸送される生物学的活性化合物の種類に強く依存し、当業者に容易に明らかであろう。このような方法が、本明細書に記載されている任意の細胞、組織、臓器、及び生物において行われることは、本発明の範囲内である。
【０１９６】
更なる態様では、本発明は、医薬を製造する方法に関する。本方法は、治療的活性剤又は薬学的活性剤を、本発明の組成物及び／又は本発明の脂質組成物と共に配合することを含む。このような配合をどのように実施するかについての詳細は、当業者に公知であり、本説明の実施例部から採用することもできる。
【０１９７】
本発明は、下記図及び実施例により更に例示される。同図及び実施例から、本発明の更なる特徴、実施態様、及び利点を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、種々のリポプレックス配合を使用した全身適用１時間後の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡ分布を示す図である。ｓｉＲＮＡ濃度を、組織１ｇ当たりの％初期用量［％ID/g］で示す。
【図２】図２ａは、ＤＡＣＣを形成する化合物、その化学構造、及び％で表現したそのモル比、並びに、ＤＡＣＣにより形成されたリポプレックスのｓｉＲＮＡ分子の基本設計及び前記ｓｉＲＮＡ分子を示す。ｓｉＲＮＡ分子は平滑末端であり、両鎖上の円は、２−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを示す。図２ｂは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡリポプレックスの粒径分布を、Ｚ平均径として示す図である。図２ｃは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡリポプレックスのゼータ電位を示す図である。図２ｄは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡリポプレックスの電子顕微鏡写真である。
【図３−１】図３ａは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡリポプレックスの投与後１、６、及び２４時間での種々の臓器中における、％ID/g 組織で表現したｓｉＲＮＡ濃度を示す図である。図３ｂは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣｙ３の全身ｉ．ｖ．投与１時間後の肺における、Ｃｙ３ラベルｓｉＲＮＡの細胞分布を例示するホルマリン固定パラフィン包埋肺組織切片の一連の共焦点顕微鏡画像である。左上の画像は、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色を白色で示し、右上の画像及び下側の画像は、ｓｉＲＮＡＣｙ３染色を赤色で、及び核染色緑色で表す拡大図を示す。スケールバーを示す。
【図３−２】図３ｃは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣｙ３の全身ｉ．ｖ．投与後１時間での以下の臓器における、Ｃｙ３ラベルｓｉＲＮＡの細胞分布を例示する心臓、肝臓、脾臓、及び腎臓のホルマリン固定パラフィン包埋切片の一連の共焦点顕微鏡画像である。上側のパネルは、低倍率において白色で示し、下側のパネルは、拡大図において赤色で示す。スケールバーを示す。
【図４】図４ａは、Ｔｉｅ−２の阻害用のＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックスによるトランスフェクション後の、マウス内皮細胞株であるＭＳ−１のウェスタンブロット分析結果を示す。図４ｂ〜４ｅは、定量的逆転写酵素−ＰＣＲ分析により決定された場合における、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックスによる処置後の、マウスの肺（図４ｂ）、心臓（図４ｃ）、肝臓（図４ｄ）、及び腎臓（図４ｅ）の細胞における、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ阻害に対するＴｉｅ−２  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。
【図５】図５ａは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックス、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣＤ３１リポプレックス、及び２７０mM ショ糖溶液によるボーラス注射により処置したマウスの肺細胞における、アクチン  ｍＲＮＡ阻害に対するＴｉｅ−２  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。この場合、リポプレックスの投与量はそれぞれ、３．０mg/kg、１．５mg/kg、及び０．７５mg/kgとした。図５ｂは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックス及び５％ グルコース溶液の注入により処置したマウスの肺細胞における、アクチン  ｍＲＮＡ阻害に対するＴｉｅ−２  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。この場合、リポプレックスの投与量はそれぞれ、０．３mg/kg、１．０mg/kg、３．０mg/kg、６．０mg/kg、及び１２mg/kgとした。
【図６】図６ａは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックス、対照リポプレックス、又はショ糖により処置したマウスの肺細胞における、３日ｐ．ｔ．、７日ｐ．ｔ．、１４日ｐ．ｔ．、及び２１日ｐ．ｔ．での、アクチン  ｍＲＮＡ阻害に対するＴｉｅ−２  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。図６ｂは、単一用量のＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２リポプレックス又はショ糖溶液の投与後３日目及び２１日目に収集したマウス肺組織のウェスタンブロット分析結果を示し、ここで、ＰＴＥＮを、ローディング対照として使用した。
【図７】図７ａ〜７ｄは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＶＥＧＦＲ２リポプレックス（図７ａ）、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＶＥ−カドヘリンリポプレックス（図７ｂ）、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＢＭＰＲ２リポプレックス（図７ｃ）、及びＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣＤ３１リポプレックス（図７ｄ）により処置したマウスの肺内皮における、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ阻害に対する種々のターゲット遺伝子（図７ａ：ＶＥＧＦＲ２、図７ｂ：ＶＥ−カドヘリン、図７ｃ：ＢＭＰＲ２、及び図７ｄ：ＣＤ３１）阻害を示す図であり、ここで、各場合において、２７０mM ショ糖及びＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡ対照を、対照群の動物に投与した。
【図８】図８ａは、肺転移マウスモデルについての実験設定及びＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣＤ３１を使用する処置スキームの代表例である。図８ｂは、図８ａに示した処置スキーム中の１５日目までの、相対的な体重を例示する図である。図８ｃは、図８ａのスキームに示した実験肺転移マウスモデルにおける、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣＤ３１、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ、又は対照としての２７０mM ショ糖により処置した細胞負荷後７０日の期間についての、定義されたエンドポイント評価基準によるマウスの生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ図である。図８ｄは、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＣＤ３１リポプレックス、対照リポプレックス、又はショ糖により処置したマウスの肺組織における、ＣＤ３４  ｍＲＮＡ阻害に対するＣＤ３１  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。
【図９】図９ａは、ＬＰＳ処置による炎症応答を誘導するための実験設定及びＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＡＮＧＰＴ２を使用する処置スキームの代表例である。図９ｂは、ＬＰＳ（０．５mg/kg）又は生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）のいずれかによる負荷後６時間でのマウス肺における、アクチン  ｍＲＮＡ発現に対するＡＮＧＰＴ２  ｍＲＮＡ阻害を示す図である。マウスを、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＡＮＧＰＴ２リポプレックスにより、２．８mg/kg、２．０mg/kg、及び１０mg/kgの用量で処置した。２７０mM ショ糖を、媒体対照として使用した。
【図１０】図１０ａは、S.pneumoniae感染肺マウスモデルについての実験設定及びＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＡＮＧＰＴ２を使用する処置スキームの代表例である。図１０ｂは、図１０ａのスキームに示したように、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＡＮＧＰＴ２及びアンピシリン、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ及びアンピシリン、ショ糖及びアンピシリン、又はショ糖及び媒体（生理食塩水）のいずれかにより処置した、S.pneumoniaによる負荷後１０日の期間についてのマウスの生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ図である。
【図１１】図１１は、ＥＤＮ１又は可溶性ＶＥＧＦレセプター１（ｓＦｌｔ１）のいずれかをターゲッティングする種々のｓｉＲＮＡ分子と種々の送達システムを使用して、マウス中でのＥＤＮ１発現の低下を決定するための実験設定を概説する概要である。
【図１２】図１２は、図５に例示した実験設定に基づいて処置したマウスからの肺組織の総ライゼート中でのＥＤＮ１  ｍＲＮＡ発現を示すバー図である。ＥＤＮ１  ｍＲＮＡ発現を、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡに対して正規化する。
【実施例】
【０１９９】
実施例１：材料及び方法
以下に記載した材料及び方法を、反対に示されない限り、実施例全体を通して使用した。
【０２００】
小型干渉性ＲＮＡ
実施例２〜９に付された実験に使用したｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）を、表１に列記する。前記実施例２〜９で使用したｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）は、平滑末端であり、１９mer 二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、両鎖における交互の２’−Ｏ−メチル改変により安定化している。実施例１０〜１１に付された実験に使用したｓｉＲＮＡ分子を、表２に列記する。前記実施例１０〜１１で使用したｓｉＲＮＡ分子は、平滑末端であり、１９mer 二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、両鎖における交互の２’−Ｏ−メチル改変により安定化している。ただし、ルシフェラーゼをターゲッティングする対照ｓｉＲＮＡ分子は、２３mer 二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、両鎖における交互の２’−Ｏ−メチル改変により安定化している。このような改変は、Santel A et al.（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）及びCzauderna, F. et al.（Czauderna, F. et al. (2003), Nucleic Acids Res 31: 2705-2716）において以前に記載されており、BioSpring（Frankfurt a.M., Germany）により合成された。ヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル改変は、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、このように、対応する大文字により表現されている改変ヌクレオチドにより示されており、一方、非改変ヌクレオチドは、対応する小文字により表現されている。
【表１】
2016540769.tif 000056
【表２】
2016540769.tif 000057
【０２０１】
ｓｉＲＮＡリポプレックスの調製及び特徴決定
Ａｔｕｐｌｅｘは、
ａ）５０モル％ β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩、
ｂ）４９モル％ １，２−ジフィタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、及び
ｃ）１モル％ Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン  ナトリウム塩
を含有する脂質組成物である。
【０２０２】
ＤＡＣＣ９は、
ａ）７０モル％ 下記式：
【化５４】
2016540769.tif 000058
で表示されるβ−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩、
ｂ）２９モル％ コレステロール、及び
ｃ）１モル％ 下記式：
【化５５】
2016540769.tif 000059
で表示されるｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ
を含有する脂質組成物であり、ここで、電荷比［脂質／リン酸オリゴ］は、８．４である。
【０２０３】
ＤＡＣＣ１０は、
ａ）７０モル％ 下記式：
【化５６】
2016540769.tif 000060
で表示されるβ−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩、
ｂ）２９モル％ コレステロール、及び
ｃ）１モル％ 下記式：
【化５７】
2016540769.tif 000061
で表示されるｍＰＥＧ−２０００−セラミド−Ｃ８
を含有する脂質組成物であり、ここで、電荷比［脂質／リン酸オリゴ］は、８．４である。
【０２０４】
ＤＡＣＣ９とも呼ばれるカチオン性リポソームは、カチオン性脂質であるＡｔｕＦＥＣＴ０１（β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩；Silence Therapeutics AG, Berlin, Germany）と、コレステロール（Sigma Aldrich）と、ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］；Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA）とから、モル比  ７０：２９：１で構成され、２７０mM 無菌ショ糖溶液による脂質薄膜再水和により調製された（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）。上記ＤＡＣＣ１０脂質組成物から構成されるカチオン性リポソームを、同様の方法で調製した。得られたリポソームのストック溶液はそれぞれ、５mg/mL又は９mg/mL以下（例えば、注入試験用）の総脂質濃度を有した。ｓｉＲＮＡリポプレックスの形成は、等量のリポソーム分散液とｓｉＲＮＡ溶液とを、２７０mM ショ糖中で混合することにより生じた。この目的のために、両濃度を、最終的なリポプレックス配合が、約６．８の最終的な脂質／ｓｉＲＮＡ比［ｍ／ｍ］により特徴付けられる方法で調節した。同比は、約８．４の核酸骨格リン酸と帯電した脂質窒素原子との間の電荷比（Ｎ／Ｐ比）に対応した。リポソーム及びリポプレックスの粒径（Ｚ平均径、強度分布）及びゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を使用する動的光散乱により測定した。ここで、対応する分散剤特性を、２７０mM ショ糖に調節した。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ｎｓＴＥＭ）を、Vironova AB（Stockholm, Sweden）により行った。
【０２０５】
ＤＡＣＣに言及する場合、これは、このような言及が、ＤＡＣＣ９及びＤＡＣＣ１０の両方を指すことを意味する。
【０２０６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡ分布及びＲＮＡｉ
８週齢のＣ５７Ｂｌ／６ｊ（Harlan）のオス及びメスを、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用した。本試験における全ての動物実験を、承認されたプロトールに基づき、Landesamt fur Arbeits-, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin, Germany (No. G0264/99)のガイドラインを遵守して行った。等張性のｓｉＲＮＡリポプレックス配合を、示した用量において、尾静脈のボーラス注射により静脈内に投与した。ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３生体内分布試験のために、マウスに、単一用量のＤＡＣＣ９ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重）を受けさせた。注射後１時間で、マウスを、頸椎脱臼により殺処分し、組織を、以前に記載されているように（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）、パラフィン包埋で処理した。４μm 切片を切出し、Roticlear（Roth, A538.5）により脱パラフィンし、段階的なエタノール洗浄により再水和し、Sytox Green染料（Molecular probes）により対比染色した。蛍光取込みを、Zeiss LSM510 Meta共焦点顕微鏡により分析した。画像を記録し、Zeiss LSM5ソフトウェアにより処理した。種々の臓器におけるｓｉＲＮＡ分布の定量分析のために、マウスに、ＰＫＮ３  ｓｉＲＮＡと共に配合したリポプレックスを、単一用量で受けさせた。種々の組織中のＰＫＮ３  ｓｉＲＮＡ濃度を、改良捕捉プローブサンドイッチバイブリダイゼーションアッセイ法（Aleku, M, et al. (2008). Cancer Res 68: 9788-9798）により測定した。ターゲットｍＲＮＡノックダウン分析のために、組織を、マウスの殺処分後直ちに解剖し、液体窒素中で即座に瞬間凍結した。約２０mg 組織を、Mixer Mill MM 301（Retsch GmbH, Haan, Germany）中で、タングステンカーバイドビーズ（Qiagen）を使用してホモジナイズした。トータルＲＮＡを、Invisorb Spin Tissue RNA MiniKit（Invitek, Berlin, Germany）により、ライゼートから単離した。組織に応じて、２５〜１００ng トータルＲＮＡを、BioTez GmBH, Berlin, Germanyから得たアンプリコンセット（表３に列記）による定量TaqMan RT-PCRに使用した。TaqMan RT-PCR反応を、ABI PRISM 7700配列検出器（ソフトウェア：Sequence Detection System v1.6.3 (ABI)）又はStepOnePlus（商標）リアルタイムＰＣＲシステム(ABI)により、以前に記載されているように（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）、３００及び１００nMそれぞれの濃度でのプライマー及びプローブを使用するＲＴ−ＰＣＲ用の標準的なプロトコールを使用して行った。TaqManデータを、相対ＣＴ法を使用することにより算出した。ターゲットタンパク質発現を、以前に記載されているように（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）、組織のホールライゼートのウェスタンブロットにより評価した。瞬間凍結組織を、Mixer Mill MM 301（Retsch GmbH, Haan, Germany）中でホモジナイズし、タンパク質を、Riper-lysisバッファー中で抽出した。等量のタンパク質を、下記抗体：ウサギ抗ＰＴＥＮ（Ab-2, Neomarkers, Fremont, CA, USA）及びマウス抗Ｔｉｅ２（clone Ab33, Upstate 05-584）を使用する免疫ブロット分析にローディングした。
【表３】
2016540769.tif 000062
【０２０７】
注入試験
注入試験のために、頸静脈カテーテル処置マウス（Harlan）に、最高用量（１２mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重；４０mL/kg 体重）のＤＡＣＣ９／リポプレックスを、単一の１時間注入で受けさせた。用量設定のために、ＤＡＣＣ９リポプレックスストック溶液を、投与容量を一定に維持するために、５％ グルコース溶液中で希釈した。
【０２０８】
マウス内皮細胞株ＭＳ１のトランスフェクション
マウス内皮細胞株ＭＳ１（ATCC CRL-2279）を、American type cell culture collection（ATCC）から取得し、供給元の推奨に従って培養した。細胞を、６ウェルプレートに播種し、以前に記載されているように（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡ  Ｔｉｅ−２によりトランスフェクションした。簡潔に、細胞播種後約１２時間で、１０％ 血清含有培地で希釈した種々の量のＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡ配合を、細胞に加えて、１０〜１６０nM ｓｉＲＮＡのトランスフェクション濃度範囲を達成した。トランスフェクション後３日で、細胞を溶解させた。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、以前に記載されているように（Santel, A et al. (2006). Gene Ther 13: 1222-1234）、免疫ブロットに付した。
【０２０９】
実験肺転移マウスモデル
Ｌｅｗｉｓ肺ガン腫（ＬＬＣ）細胞を、１０％ ＦＣＳ及び４mM グルタミンを加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を、トリプシンにより引き剥がし、その後、細胞培養培地及びＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ ２００μL中の２５万個の細胞を、８週齢のオスのＢＤＦ１マウス（Harlan）の尾静脈内に注射した。マウスを、腫瘍細胞負荷の５日前から開始して、１日置きに１１回、等張性ショ糖又はＤＡＣＣ９リポプレックスにより処置した。マウスを、体重の推移及び苦痛のサインについて毎日モニターした。定義したエンドポイント評価基準（スコア４以上）に達した時点で、動物を、頸椎脱臼により殺処分した。エンドポイント評価基準は、苦痛のサイン（悪液質、衰弱、移動又は摂食困難、化合物毒性（ハンチング痙攣）、３日連続の１５％ 体重減少又は１日での２β％ 体重減少、及びスコア４以上）とした。
【０２１０】
Streptococcus pneumonia感染肺モデル
本試験を、Eurofin/Panlabs（Ricerca, study B09784, adapted from model 608100）により行った。体重２０〜２２ｇのオス特定病原体フリーＩＣＲマウスを、尾静脈注射により、ＤＡＣＣ９リポプレックス（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重）又は媒体対照としてのショ糖で処置した。２４時間後、全てのマウスに、Streptococcus pneumoniae（ATCC 6301）を、ＬＤ９０〜１００用量（０．０２mL、７〜９×１０６ＣＦＵ）で、気管内に感染させて、急性肺炎を誘発させた。感染２時間後、準最適単一用量のアンピシリン（３mg/kg）を、静脈内経路で与えた。マウスの生存を、感染後１０日までモニターする。アンピシリンにより処置しない場合、マウスは、S.pneumoniaによる感染後３日以内に死亡した。生存について中程度の向上のみが、単一用量のアンピシリンにより観察された。アンピシリン処置に加えて、ＤＡＣＣ９／Ａｎｇｐｔ２  ｓｉＲＮＡ前処置により、マウスの生存が顕著に向上した。５０％超の動物の生存は、試験物質の顕著な活性を示している。
【０２１１】
統計学的分析
データを、平均±ＳＥＭとして表現する。
【０２１２】
実施例２：ＤＡＣＣの肺特異性
ｓｉＲＮＡカーゴを選択臓器に送達するその各能力を調査するために、種々のリポプレックス配合を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価した。ｓｉＲＮＡの生体内分布パターンを試験するのに使用した全てのリポプレックスを、カチオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１及びｓｉＲＮＡＰＫＮ−３と共に配合したが、種々の共脂質及び／又はＰＥＧ脂質を種々の比で含有させた。リポプレックスを、尾静脈注射により、静脈内に投与し、ｓｉＲＮＡ濃度を、全身適用１時間後の肝臓、腎臓、肺、心臓、及び脾臓の組織サンプル中で、ｓｉＲＮＡ特異的定量ＥＬＩＳＡ系捕捉プローブアッセイ法を使用して測定した。結果を、図１に示す。
【０２１３】
種々のリポプレックスの組成を、表４にまとめる。
【表４】
2016540769.tif 000063
【０２１４】
各組織に送達されたｓｉＲＮＡ濃度は、使用したリポプレックス系に応じて変動し、一方、ＤＡＣＣ９リポプレックス系は、肺への最も効率的なｓｉＲＮＡ送達を示した（図１、黒色バー）。更に、リポプレックス配合安定性と機能的な臓器取り込みとの間の逆相関、すなわち、その凝集傾向に関しても最も安定した配合は、その後の分解のために肝臓及び脾臓に直接蓄積するよりもむしろ、肺内皮の血管床に少なくとも捕捉されることも見出された。しかしながら、ターゲット組織へのｓｉＲＮＡ送達及び細胞取込みは、種々のカチオン性脂質系システムについて、Heyes et al.（Heyes, J, Palmer, L, Bremner, K, and MacLachlan, I (2005). J Control Release 107: 276-287）により以前に説明されたように、活性を担う唯一の要因ではなかった。このことは、エンドサイトーシスが律速である代わりに、むしろ、ｓｉＲＮＡが、遺伝子サイレンシング、例えば、エンドソーム放出及びＲＩＳＣローディングの効率における最も大きな影響を有する細胞により内部移行されると生じるそれらの事象であることを示唆している。
【０２１５】
実施例３：ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡリポプレックスの脂質組成及び物理化学的特徴決定
本明細書においてＤＡＣＣ９リポプレックスと呼ぶ場合もあるＤＡＣＣ９リポプレックスは、正に帯電した脂質システムＡｔｕＦＥＣＴ０１（β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩）、コレステロール、及びｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］）（モル比  ７０：２９：１）と、両鎖における交互の２’−Ｏ−メチル改変により化学的に安定化している平滑末端ｓｉＲＮＡ二本鎖（Santel, A, et al. (2006), Gene Ther 13: 1222-1234；Aleku, M, et al. (2008), Cancer Res 68: 9788-9798）とから、２７０mM ショ糖溶液中で構成されている。ＤＡＣＣ９の化合物、その化学構造、及び％で表現したそのモル比、並びに、リポプレックスにおけるｓｉＲＮＡ分子の基本設計を、図２ａに示す。ｓｉＲＮＡ分子については、それらは平滑末端であり、円は、２−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを示すことに留意されたい。
【０２１６】
得られたＤＡＣＣ９リポプレックス粒子を、サイズ及びゼータ電位に関して特徴付けた。Ｚ平均径は、２７０mM ショ糖溶液中において動的光散乱により測定した場合、〜７０nmとなり、結果を図２ｂに示す。２７０mM ショ糖中において測定したゼータ電位は、図２ｃから得ることができるように、４０〜５０mVであった。
【０２１７】
ＤＡＣＣ９リポプレックス粒子の電子顕微鏡法により、図２ｄに示したように、主にほぼ球状配置の層状構造であることが明らかになった。ショ糖の添加により、凍結、乾燥、及び再水和工程中における配合安定性が可能となり、これにより、凍結乾燥生成物として効果的な長期保存を確保した（データを示さず）。同様の結果を、ＤＡＣＣ１０脂質組成物、両鎖における交互の２’−Ｏ−メチル改変により化学的に安定化している平滑末端ｓｉＲＮＡ二本鎖（Santel, A, et al. (2006), Gene Ther 13: 1222-1234；Aleku, M, et al. (2008), Cancer Res 68: 9788-9798）から、２７０mM ショ糖溶液中で構成されているＤＡＣＣ１０リポプレックスについて得た。
【０２１８】
実施例４：ＤＡＣＣによる肺内皮へのｓｉＲＮＡの主な送達
ＤＡＣＣ９リポプレックスの全身適用によるｓｉＲＮＡ送達の組織分布及び動態をより詳細に特徴付けるために、マウスを、単一用量のＤＡＣＣ９（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重）により処置し、種々の臓器から数多くの組織サンプルを、ＤＡＣＣ９リポプレックス配合の投与後１、６、及び２４時間で収集して、各ｓｉＲＮＡ濃度を測定した。結果を図３ａに示す。
【０２１９】
図３ａから得ることができるように、最も高いｓｉＲＮＡ濃度［約４０％ ID/g 組織］を１時間の時点での肺組織において見出し、脾臓、肝臓が続き、腎臓及び心臓ではより少なかった。調査した全ての組織中のｓｉＲＮＡ濃度は、経時的に減少し、初期用量の１％を下回るｓｉＲＮＡレベルは、血液、脳、前立腺、又は骨格筋において測定された。
【０２２０】
主にターゲッティングした組織内のｓｉＲＮＡ分布を試験するために、マウスを、シアニン染料（Ｃｙ３）ラベルｓｉＲＮＡと配合したＤＡＣＣ９リポプレックスにより処置した。ついで、組織中のＣｙ３ラベルｓｉＲＮＡを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の共焦点顕微鏡により可視化した。肺、肝臓、腎臓、及び心臓におけるｓｉＲＮＡ分布パターンは、図３ｂ〜ｃから得ることができるように、血管染色パターンを示唆した。
【０２２１】
調査した全ての臓器から、肺が、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３により最も強く染色され、ここで、ｓｉＲＮＡ染色は、肺血管にむらなく分布している。
【０２２２】
拡大図に基づいて、肺におけるｓｉＲＮＡに由来する染色は、微細に点在し、細胞核周囲に集中していた。この観察から、ｓｉＲＮＡの細胞内への取込みが示されている（図３ｂ）。心臓では、明確なＣｙ３染色が毛細血管に沿って並ぶのが見出され、一方、筋肉繊維には、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３シグナルは存在しなかった（図３ｃ）。肝臓の類洞内皮細胞層は、弱いｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色パターンを示し（図３ｃ）、一方、肝臓類洞内の個々の細胞は、強くＣｙ３染色した。卵型の核（図３ｃ、矢印を参照のこと）は、外来性の粒子状物質の除去を担うＫｕｐｆｆｅｒ細胞を示し、したがって、ここで見出されたリポプレックスは、食作用により取り込まれている可能性もある（Whitehead, KA et al. (2009), Nat Rev Drug Discov 8: 129-138）。その大きく、規則正しく、及び丸い核により認識できる肝細胞は、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色されていなかった。脾臓におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色は、白色髄の辺縁帯ではっきりしており、一方、白色髄の中心は、Ｃｙ３染色されていないままであった（図３ｃ）。血液からのリポプレックスクリアランスを担うことが公知である単球及びマクロファージが、この帯内に隔絶されているため、各マクロファージによるリポプレックスクリアランスは、この領域中で観察された向上したｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色パターンを説明することができた。明確なＣｙ３シグナルを、腎臓の尿細管周囲毛細血管においても検出した（図３ｃ、矢印）。尿細管細胞の染色は、細管のルーメンに対するＣｙ３−ｓｉＲＮＡ蓄積の傾向を伴って拡散性であった。このことは、腎臓による遊離したｓｉＲＮＡの分泌を示している。要するに、ＤＡＣＣ９送達システムによるｓｉＲＮＡ分布の定量的及び定性的分析から、ｓｉＲＮＡの取込みが主に肺において生じることが明らかになったが、明確なｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３に由来するシグナルを、心臓、肝臓、及び腎臓の微小血管並びに肝臓及び脾臓の食細胞においても検出した。
【０２２３】
実施例５：肺血管におけるＤＡＣＣ９によるターゲット遺伝子発現の阻害
ＤＡＣＣ９により送達されたｓｉＲＮＡが機能的に活性であり、血管床におけるターゲット遺伝子発現の阻害に使用することができるかどうかを試験するために、ターゲット遺伝子であるＴｉｅ−２に特異的なｓｉＲＮＡを含むＤＡＣＣ配合を調製した。Ｔｉｅ−２発現は、内皮細胞に非常に特異的であり、多くの臓器におけるこの細胞種についての一般的なマーカーである（van der Heijden, M et al., Expert Opin Ther Targets 13: 39-53）。まず、ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２のＲＮＡｉ活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２によりトランスフェクションし、Ｔｉｅ−２タンパク質発現を、細胞ライゼートにおいて、免疫ブロットにより７２時間後に評価した。結果を図４ａに示す。
【０２２４】
Ｔｉｅ−２発現は、１６０及び８０nM ｓｉＲＮＡの用量におけるＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２により顕著に低下し、４０nM ｓｉＲＮＡでは低下が少なかった（図４ａ）。これにより、ＤＡＣＣ９は、ｓｉＲＮＡを細胞内に機能的に送達し、ＲＮＡｉを媒介することができることが確認された。これらの濃度は、ｓｉＲＮＡ  ＩＣ５０を反映していないことに留意されたい。ＤＡＣＣ９は、細胞培養トランスフェクション実験に最適化されておらず、より低い濃度を後者において使用することができるためである。
【０２２５】
ＤＡＣＣ９が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管内皮において、遺伝子サイレンシング可能であるかどうかを調査するために、マウスに、３つの用量のＤＡＣＣ９リポプレックスを、連続した日数で尾静脈注射（３×２．８mg/kg）により与えた。肺、心臓、肝臓、及び腎臓の組織を、最後の処置２４時間後に収集した。トータルｍＲＮＡを、組織ホールライゼートから調製し、ターゲットｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。結果を図４ｂ〜ｅに示す。Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルは、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡ対照又はショ糖溶液のいずれかによる対照処置と比較して、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２により全身に処置したマウスの肺組織において、８０％超低下していた（図４ｂ）。顕著なＴｉｅ−２ノックダウンは、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２配合の繰返し投与後でも、肝臓、腎臓、及び心臓の組織において観察されなかった（図４ｃ〜ｅ）。このことは、肺が、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２により機能的にターゲッティングされる主な臓器であることを示している。
【０２２６】
実施例６：ターゲット遺伝子発現のＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡ用量応答性
マウスにおけるＤＡＣＣ９リポプレックスによるターゲット遺伝子阻害についての用量要求を更に調査するために、単一用量の３．０、１．５、及び０．７５mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重 ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２又はＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１を、静脈内尾静脈ボーラス注射により投与した。肺組織を、ＲＮＡ分析用に注射２４時間後に収集した。Ｔｉｅ−２ターゲット遺伝子発現の阻害についての結果を図５ａに示す。
【０２２７】
驚くべきことに、ボーラス処置により注射した単一用量のＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２（３．０mg ｓｉＲＮＡ/kg）は、図４ｂについて記載されている繰返し投与（３×２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg）後に得られたのと同様に、Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルを低下させるのに既に十分であった（図５ａ及び４ｂを比較）。１．５mg ｓｉＲＮＡ/kgも、Ｔｉｅ−２発現を低下させるのに有効であったが、程度はより低かった。０．７５mg ｓｉＲＮＡ/kgは、Ｔｉｅ−２レベルに顕著に影響を及ぼさなかった。ここまでに記載されている全てのＤＡＣＣ９適用を、ボーラス注射により行ったが、注入による適用がヒトにおけるリポプレックス送達の好ましい方式であるため、種々の用量のＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−2を、マウスの頸静脈内に１時間の注入により投与した。注入方式によるこのような投与（注入は、約１時間の期間にわたって投与される）は、臨床環境において必要条件である。結果を図５ｂに示す。
【０２２８】
ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２注入後のターゲット遺伝子サイレンシングは、３mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重でのボーラス注射によるターゲット遺伝子サイレンシングに匹敵した。肺組織におけるＴｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルは、約８０％低下した。この適用方式はボーラス注射と比較してより大量のＤＡＣＣ９リポプレックスの使用を可能にするため、投与量は、６mg ｓｉＲＮＡ/kg及び／又は１２mg ｓｉＲＮＡ/kgにそれぞれ増大した。リポプレックス濃度のこの増大は、Ｔｉｅ−２発現レベルを更に９５％超に低下させることを示した（図５ｂ）。それにも関わらず、全ての動物は、最も高い用量（１２mg/kg）においても、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２の注入処置に耐えた（図５ｂ）。
【０２２９】
上記データに基づいて、肺におけるＴｉｅ−２発現阻害のための約１．５mg ｓｉＲＮＡ/kgのマウスにおけるＥＣ５０は単一用量を使用するが、より高い用量である３mg/kg（ボーラス）及び６mg/kg（注入）にも耐えた。ただし、より高い単一用量のｓｉＲＮＡリポプレックスは、１２mg ｓｉＲＮＡ/kgの用量レベルにおいて（用量３及び１mg ｓｉＲＮＡ/kgにおいて体重減少が無視できるのと比較して）１０％超の低下を示す、体重推移に望ましくない効果を有した（データを示さず）。臨床的観点から、観察された低用量で、１回の投与が、その後の毒性プロファイルに望ましい。
【０２３０】
実施例７：ＤＡＣＣにより媒介されるターゲット阻害の持続性及びＲＮＡｉ媒介性ノックダウンの検証
ＤＡＣＣ９リポプレックスによるターゲット遺伝子阻害の持続性を評価するために、マウスを、単一用量（２．８mg/kg）のＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２又はＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＡＮＧＰＴ２により処置し、コホートを、処置後（ｐ．ｔ．）３、７、１４、及び２１日目に殺処分した。各肺組織におけるＴｉｅ−２ターゲットｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。結果を図６ａに示す。
【０２３１】
ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＴｉｅ−２処置群におけるＴｉｅ−２発現の最も優れた低下は、リポプレックスによるｐ．ｔ．３日目に観察された（ＤＡＣＣ９対照群と比較して、８０％超のＴｉｅ−２低下）。それにも関わらず、Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルは、ショ糖又は対照ＤＡＣＣ９リポプレックスのいずれかにより処置した対照群と比較して、２１日後でも５０％超低下した（図６ａ）。注目すべきことに、単一用量のＤＡＣＣ９リポプレックス（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg）は、ターゲット遺伝子Ｔｉｅ−２のｍＲＮＡレベルを、６０〜９０％低下させることを示し（図６ａ）、このサイレンシング効果は３週間まで持続した。
【０２３２】
Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡの低下が、Ｔｉｅ−２タンパク質の対応する低下をもたらすことを確認するために、肺組織ホモジネートを、それぞれ、ＤＡＣＣ９リポプレックス又は媒体対照としてのショ糖による処置後３及び２１日目のマウスから調製した。Ｔｉｅ−２タンパク質を、図６ｂに示されているように、ウェスタンブロットにより検出した。Ｔｉｅ−２タンパク質レベルの最も優れた低下は、Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルの各低下に対応して、処置後３日目に見られ、経時的に徐々に弱まることが示された。ただし、Ｔｉｅ−２タンパク質発現の顕著な低下が、処置後２１日目においても観察された。更に、Ｔｉｅ−２  ｍＲＮＡレベルは、２１日後において、７０％超低下したままである。
【０２３３】
実施例８：ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡによる肺内皮中の更なるターゲット遺伝子の阻害
ＤＡＣＣ９送達システムが、Ｔｉｅ−２とは別の肺内皮に発現している他の遺伝子も阻害可能であることを確認するために、ＤＡＣＣ９リポプレックスを、その発現が内皮細胞に非常に限定されている、他の遺伝子ターゲット：ＶＥＧＦＲ２レセプター、ＶＥ−カドヘリン、ＢＭＰＲ２、及びＣＤ３１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡにより調製した。ここで、各ｓｉＲＮＡの配列は、実施例１に示した通りである。単回注射（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg）のＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＶＥＧＦＲ２、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＶＥ−カドヘリン、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＢＭＰＲ−２、又はＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１によるマウスの処置により、各ターゲット遺伝子のｍＲＮＡレベルは、図７に示されているように、６０〜９０％低下した。このため、ｍＲＮＡレベルの観察された低下は、ＤＡＣＣ９リポプレックスが、ｓｉＲＮＡを血管内皮に機能的に送達可能であることにより、ターゲット特異的遺伝子サイレンシングをこの組織種において可能にすることを証明している。更に、ＤＡＣＣ９リポプレックスの単回適用のみで、肺血管における各ターゲット遺伝子の発現をダウンレギュレーションするのに十分であった。
【０２３４】
実施例９：ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１処置による実験肺転移マウスモデルの生存向上
ＣＤ３１／Ｐｅｃａｍ１は、ホモタイプ細胞及びヘテロタイプ細胞の相互作用に必要とされる細胞表面タンパク質である。ＣＤ３１／Ｐｅｃａｍ１は、腫瘍形成、例えば、血管新生、血管透過性、及び転移の複数のプロセスに関与している（Cao, G et al. (2009), Am J Pathol 175: 903-915；DeLisser, H et al. (2010), Proc Natl Acad Sci USA 107: 18616-18621）。ＲＮＡ干渉によりＣＤ３１をターゲッティングすることが、皮下異種移植腫瘍モデル及び同所性前立腺ガンモデルにおいて、腫瘍成長の低下をもたらすことが、以前の研究においても証明されている（Santel, A, et al. (2006), Gene Ther 13: 1360-1370）。
【０２３５】
本研究において、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１が、肺ガンの処置に治療的に使用できるかどうかを調査した。この最後に、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１による処置が、実験肺転移マウスモデル（Santel, A et al. (2010), Clin Cancer Res 16: 5469-5480）において、治療効果を有するかどうかを試験した。このモデルにおいて、Ｌｅｗｉｓ肺ガン腫細胞（ＬＬ）を、同系ＢＤＦ１マウスに静脈内適用することにより、肺における腫瘍細胞のコロニー形成及びその後の肺転移の進行をもたらす。ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１、対照リポプレックスであるＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ、及び媒体対照としてのショ糖を調製し、ＬＬ腫瘍細胞ｉ．ｖ．注射の５日前に、マウスに注射した。ボーラス注射（２．８mg/kg）による処置を、１日置きに１５日目まで繰り返した（図８ａ）。
【０２３６】
体重を、連続的にモニターした。図８ｂから得ることができるように、処置期間中のＤＡＣＣ９リポプレックス適用による体重減少は観察されなかった。
【０２３７】
動物の生存を、腫瘍細胞負荷後７０日までの間、定義されたエンドポイント評価基準によりモニターした。結果を図８ｃに示す。ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１を受けた動物の生存は、ショ糖（ｐ＜０．００６、対数順位検定）又はＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ（ｐ＜０．００１）を受けた対照処置群と比較して、顕著に向上した。等張性ショ糖溶液又はルシフェラーゼ対照リポプレックスにより処置した動物は、乏しい生存を示し、ショ糖対照群において、３０日後に生存していた動物はおらず、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ対照群において、７０日まで生存していた動物は、２匹のみであった。対照的に、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１を受けた８匹の動物の内７匹が、７０日まで生存した。ＣＤ３１発現を、腫瘍細胞負荷後１６日における処置期間の完了後に、個々のコホートにおいて評価した（図８ａ）。ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡルシフェラーゼ又は媒体対照としてのショ糖により処置した動物と比較して、ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＣＤ３１により処置した動物の肺におけるＣＤ３１発現は、約８０％低下し（図８ｄ）、このことにより、ＣＤ３１発現を、治療環境において、ＤＡＣＣ９リポプレックスによりターゲッティングすることができることが確認された。
【０２３８】
実施例１０：マウス中におけるＬＰＳによるＡＮＧ２誘導のＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡＡＮＧ２による防止
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、示した用量のＤＡＣＣ９リポプレックス又はショ糖溶液により静脈内処置した。４８時間後、マウスを、ＬＰＳ（０．５mg/kg、ｉ．ｖ．）又は生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）により負荷した。肺組織を、ＬＰＳ処置６時間後に収集し、ＲＮＡ単離用に処理した（図９ａを参照のこと）。肺組織サンプル中のＡＮＧＰＴ２  ｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。アクチン  ｍＲＮＡレベルを、正規化群として使用した。使用した材料及び方法に関する実験の他の態様を、実施例１に従って行った。
【０２３９】
結果を図９ｂに示す。図９ｂから得ることができるように、ショ糖処置群では、ＬＰＳは、肺組織中のＡＮＧＰＴ２  ｍＲＮＡレベルの上昇を誘導した。ＤＡＣＣ９／ＡＮＧＰＴ２  ｓｉＲＮＡ処置は、用量依存的な様式でＡＮＧＰＴ２誘導を低下させた。
【０２４０】
実施例１１：ＤＡＣＣ／ｓｉＲＮＡ処置によるS.pneumoniae感染肺モデル（マウス）の生存向上
体重２０〜２２ｇ オス特定病原体フリーＩＣＲマウスを、ＤＡＣＣ９リポプレックス（２．８mg ｓｉＲＮＡ/kg 体重）又はリポプレックスに対する媒体対照としてのショ糖により、尾静脈注射で処置した。２４時間後、全てのマウスに、Streptococcus pneumoniae（ATCC 6301）を、ＬＤ９０〜１００用量（０．０２mL、７〜９×１０６CFU）で気管内に感染させて、急性肺炎を誘発させた。感染２時間後、準最適単一用量のアンピシリン「ＡＭＰ」（３mg/kg）又は０．９％ NaClを、静脈内経路で与えた。マウスの生存を感染後１０日までモニターする（図１０ａを参照のこと）。使用した材料及び方法に関する実験の他の態様を、実施例１に従って行った。結果を図１０ｂに示す。
【０２４１】
図１０ｂから得ることができるように、アンピシリンによる処置を行わない場合、マウスは、S.pneumoniaによる感染後３日以内に死亡した。中程度の生存の向上のみが、単一用量のアンピシリンにより観察された。アンピシリン処置に加えて、ＤＡＣＣ９／Ａｎｇｐｔ２  ｓｉＲＮＡ（ＤＡＣＣ９／ｓｉＲＮＡＡｎｇｐｔ２）の予備処置は、マウスの生存を顕著に向上させる。動物の５０％超の生存は、試験物質の顕著な活性を示している。
【０２４２】
実施例１２：マウスにおけるＥＤＮ−１発現の低下
本動物試験の目的は、エンドセリン１コード遺伝子であるＥＤＮ１をターゲッティングするための種々の送達システムを評価することであった。実験設定及びマウスに対する処置スキームを、図１１に概説する。
【０２４３】
マウスを、ＤＡＣＣ９、ＤＡＣＣ１０と配合した（互いに１００％相補であることにより、各鎖が１９個のヌクレオチドからなる２本の別々の鎖からなる）ＥＤＮ１−ｈｍｒ２と呼ばれるＥＤＮ１ターゲッティングｓｉＲＮＡを単一用量で、又は、Ａｔｕｐｌｅｘと配合したＥＤＮ１−ｈｍｒ２  ｓｉＲＮＡを３つの用量で、ボーラス適用により処置した。対照リポプレックスは、ｓＦＬＴ１−ｈｍ４と呼ばれる、可溶性ＶＥＧＦレセプター１（ｓＦｌｔ１）をコードする遺伝子をターゲッティングするｓｉＲＮＡを含有した。ターゲット遺伝子発現を、肺組織において、処置４８時間後に分析した。
【０２４４】
結果を図１２に示す。前記図１２から、ｓｉＲＮＡを肺組織に送達する目的で、ＤＡＣＣ９又はＤＡＣＣ１０のいずれかと配合したｓｉＲＮＡは、Ａｔｕｐｌｅｘと配合したｓｉＲＮＡより強力であることは明らかである。
【０２４５】
本明細書に列挙した全ての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４６】
明細書、特許請求の範囲、及び／又は図面に開示されている本発明の特徴は、個々に、及び、それらの任意の組み合わせの両方で、それらの種々の形態において、本発明を実現するための材料であることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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