(57)【要約】本開示は腫瘍成長の阻害方法に関する。より具体的には、本開示は、生存促進性細胞シグナル経路の活性を阻害して腫瘍成長を阻害するために糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンを標的化するためのモノクローナル抗体の使用に関する。例えば、ＭＵＣ１６糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンを標的化するためにモノクローナル抗体ＡＲ９.６が使用され得、それによりホスファチジイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）シグナル伝達経路を阻害する。
2016523961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍成長の阻害を必要とする対象に、Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するためのモノクローナル抗体を投与する工程を含む、腫瘍成長の阻害方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生存促進性細胞シグナル伝達経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質は切頭Ｏ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記切頭Ｏ−グリカンはＴｎ抗原、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ）、又は、その組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくは治療上有効なその断片の少なくとも１つを含む第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍は、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、及び、肝臓腫瘍から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌を治療するためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化するためのモノクローナル抗体を薬学的に許容可能な担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくは治療上有効なその断片の少なくとも１つを含む第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを更に含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
腫瘍成長の阻害を必要とする対象に請求項１２に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍成長の阻害方法。
【請求項２１】
癌を治療するためのものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍成長を阻害するために、Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するモノクローナル抗体の使用。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記生存促進性細胞シグナル伝達経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質は切頭Ｏ−グリカンを含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２７】
前記切頭Ｏ−グリカンはＴｎ抗原、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ）、又は、その組み合わせを含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくはその治療に有効な断片から選択される少なくとも１つの第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを使用することを含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記腫瘍は、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、及び、肝臓腫瘍から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項３３】
癌を治療するためのものである、請求項２２に記載の使用。
【請求項３４】
腫瘍成長を阻害するための、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
癌を治療するためのものである、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本願は、２０１３年７月９日に出願された米国仮特許出願第６１/８４４，２２６号の優先権を主張するものであり、その明細書の内容を参照により本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、癌の治療方法に関する。より具体的には、本開示は、糖タンパク質上の切頭（truncated）Ｏ−グリカンを標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するためのモノクローナル抗体の使用に関する。例えば、ＭＵＣ１６糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンを標的化するためにモノクローナル抗体ＡＲ９．６が使用され得る。
【０００３】
膵臓腺癌は、米国では癌関連死因の第４位であり、５年生存率は４％未満、生存期間中央値は６カ月未満である。アメリカ癌協会によれば、２０１３年の米国内での膵臓癌の推定発症者数及び推定死亡者数は、それぞれ、４５２２０人、３８４６０人である。膵臓癌患者の８０％超が、診断時において、局所的な又は進行が進んだ転移疾患に罹患している。
【０００４】
現在、Ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘが転移性疾患に罹患しているパフォーマンス・ステータスが良好な患者の第一線の治療法であり、ゲムシタビン単独又はアブラキサンとの併用療法がその他の膵臓腺癌患者の第一線の化学療法剤である。しかしながら、反応率は小さく、平均の全生存期間（overall survival）は惨憺たるものである。化学療法に対する患者の反応や予後が悪いことの原因の一つは、薬剤耐性の発生や、活発な腫瘍形成及び早期転移に関わる発癌シグナル伝達経路が恒常的に活性化することである。
【０００５】
このような弊害のため、膵臓癌等を一般的に含む致命的な癌に対抗する新規な分子標的治療が必要となっている。
【０００６】
膜ムチンＭＵＣ１６の異常発現が、卵巣癌、膵臓癌等の癌の腫瘍進行及び転移に関わっていることがよく知られている。腫瘍の進行及び転移におけるＭＵＣ１６の役割は、発癌調節因子（oncogenicmodulator）との相互作用による。例えば、卵巣癌細胞におけるＭＵＣ１６の異常発現は、メソテリン（腫瘍分化因子）との相互作用と、ナチュラルキラー細胞が仲介する細胞傷害性を阻害することによる免疫抑制機能とにより腹膜播種性転移を促進し、一方、ＭＵＣ１６の過剰発現は、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）の刺激により乳癌細胞の増殖を増加させるものと理解されている。また、ＭＵＣ１６の発現は膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）及び正常膵臓で検出されないものの、膵臓癌ではＭＵＣ１６はアップレギュレートされ、また、肝転移では発現が増加するものと理解されており、ＭＵＣ１６の発現は疾患進行の遅い段階で起こり得ることが示唆されている。
【０００７】
疾患進行におけるＭＵＣ１６の役割は知られているにもかかわらず、ムチン型糖タンパク質上のオリゴ糖（Ｏ結合型グリコシル化）修飾の潜在的な役割はほとんど知られていない。切頭Ｏ−グリカン（Ｔｎ、及び、シアリルＴｎ（ＳＴｎ））は、他の種類の腺腫と比較して膵臓腺癌において高い割合で発現することが研究により示されており、また、切頭Ｏ−グリカンの異常発現は、腫瘍進行及び治療成績の悪化と関連することがよく知られている。例えば、ＳＴｎ抗原はヒト癌腫の８０％超において発現しており、全てのケースで、ＳＴｎの検出は患者の予後不良及び全生存期間の短縮に相関している。さらに、腫瘍に関連する切頭炭化水素抗原であるＴｎ及びＳＴｎのムチン型糖タンパク質における発現は、腺癌で観察される最も一般的な腫瘍特異的なオリゴ糖改変である。癌細胞表面上のＴｎエピトープ及びＳＴｎエピトープの出現は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１の過剰発現、又は、コア３構造合成酵素／コア１構造合成酵素活性の欠如、及び／又は、コア１構造合成酵素特異的分子シャペロン（Ｃｏｓｍｃ）の欠陥によるものである。ＳＴｎ抗原の過剰発現は多くの上皮癌細胞に観察されるが、最も頻繁に観察されるのは膵臓癌である。例えば、ＳＴｎの過剰発現は、上皮癌細胞の腫瘍進行の早期段階（例えば、早期の上皮良性病変）、及び、膵臓癌の腫瘍進行の早期段階（例えば、膵臓腺癌の発生に先行すると考えられる前癌病変である、膵上皮内腫瘍性病変ステージＩＩＩ（ＰａｎＩＮ−３））において発生する。全般的に、これらの知見は、切頭Ｏ−グリカンの過剰発現は膵臓癌の発症に繋がる早期事象であることを示す。しかしながら、膵臓腫瘍化中のこれらの切頭Ｏ−グリカンの正確な生物学的機構はあまり理解されていないものと思われる。
【０００８】
それでもなお、２０年間の研究に亘って、癌治療を目的とした分子標的治療法の開発でムチン型Ｏ−グリカン等の既知の癌のバイオマーカーを利用する試みは失敗に終わっていた。
【０００９】
したがって、ムチン型糖タンパク質上のＯ−グリカンを標的化するモノクローナル抗体を使用して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害する新規な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
一実施形態によれば、腫瘍成長の阻害を必要とする対象に、Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するためのモノクローナル抗体を投与する工程を含む、腫瘍成長の阻害方法が提供される。
【００１１】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６であり得る。
【００１２】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６であり得る。
【００１３】
前記存促進性細胞シグナル伝達経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路であり得る。
【００１４】
前記Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質は切頭Ｏ−グリカンを含み得る。
【００１５】
前記切頭Ｏ−グリカンはＴｎ抗原、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ）、又は、その組み合わせを含み得る。
【００１６】
前記本発明の方法は、細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくは治療上有効なその断片のうちの少なくとも１つを含む第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを投与する工程を更に含み得る。
【００１７】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つであり得る。
【００１８】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３であり得る。
【００１９】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘであり得る。
【００２０】
前記腫瘍は、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、及び、肝臓腫瘍から選択され得る。
【００２１】
前記方法は癌の治療用であり得る。
【００２２】
他の一実施形態によれば、Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化するためのモノクローナル抗体を薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物が提供される。
【００２３】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６であり得る。
【００２４】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６である。
【００２５】
前記医薬組成物は、細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくは治療上有効なその断片のうちの少なくとも１つを含む第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを更に含み得る。
【００２６】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つであり得る。
【００２７】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３であり得る。
【００２８】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘであり得る。
【００２９】
他の一実施形態によれば、腫瘍成長の阻害を必要とする対象に本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍成長の阻害方法が提供される。
【００３０】
前記方法は癌の治療用であり得る。
【００３１】
他の一実施形態によれば、腫瘍成長を阻害するために、Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質を標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するモノクローナル抗体の使用が提供される。
【００３２】
前記モノクローナル抗体はＡＲ９．６であり得る。
【００３３】
前記ムチン型糖タンパク質はＭＵＣ１６であり得る。
【００３４】
前記存促進性細胞シグナル伝達経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路であり得る。
【００３５】
前記Ｏ−グリカンムチン型糖タンパク質は切頭Ｏ−グリカンを含み得る。
【００３６】
前記切頭Ｏ−グリカンはＴｎ抗原、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ）、又は、その組み合わせを含む、請求項２２に記載の使用。
【００３７】
前記使用は、細胞傷害性薬剤、追加の抗体若しくは治療上有効なその断片から選択される少なくとも１つの第２の治療薬、又は、化学療法レジメンを使用することを含み得る。
【００３８】
前記細胞傷害性薬剤はゲムシタビン及びアブラキサンの少なくとも１つであり得る。
【００３９】
前記追加の抗体又は治療上有効なその断片はオレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３であり得る。
【００４０】
前記化学療法レジメンはｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘであり得る。
【００４１】
前記癌は、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、及び、肝臓腫瘍から選択され得る。
【００４２】
前記使用は癌の治療用であり得る。
【００４３】
他の一実施形態によれば、腫瘍成長を阻害するための、本発明の組成物の使用が提供される。
【００４４】
前記使用は癌の治療用であり得る。
【００４５】
以下、用語を定義する。
【００４６】
用語「投与」は、治療を必要とする対象に、本発明にかかる抗体を単独で又は追加の１つ以上の化合物と共に提供することを意味するものである。
【００４７】
用語「組成物」は、特定量の特定成分を含む生成物のみならず、当該特定量の特定成分の組み合わせから直接的に又は間接的に生じる任意の生成物をも意味するものである。医薬組成物に関して上記用語は、１つ以上の有効成分と、薬学的に許容可能な担体を構成する１つ以上の不活性成分とを含む生成物のみならず、任意の２つ以上の当該成分の合一、複合化又は凝集により、１つ以上の当該成分の解離により、又は、１つ以上の当該成分同士の他の種類の反応又は相互作用により、直接的に又は間接的に生じる任意の生成物をも包含するものである。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明に係る抗体と薬学的に許容可能な担体とを混合することにより製造される任意の組成物を包含する。「薬学的に許容可能な」とは、担体、希釈剤又は賦刑剤が製剤中の他の全ての成分と適合しなければならず、投与患者に有害ではないことを意味するものである。
【００４８】
用語「化学療法レジメン」は、幾つかの化学療法剤を併用することを意味するものである。化学療法レジメンの理論的背景は、化学療法剤によって細胞傷害機序はそれぞれ異なり、複数の薬剤を使用することで、ある程度の相乗的な結果が得られるからである。化学療法剤は、それぞれ異なる用量依存的副作用を示すため、化学療法レジメンにおいて最大用量で一緒に投与することができる。化学療法レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。
【００４９】
用語「導入レジメン」は、疾患の初期治療に使用される化学療法レジメンを意味するものである。
【００５０】
用語「維持レジメン」は、癌の再発の可能性を低減するために、又は、現存する癌の継続した成長を防止するために化学療法を継続使用することを意味するものである。
【００５１】
本願明細書の主題の特徴及び利点は、添付の図面に示されるように、以下の特定の実施形態の詳細な説明に照らしてより明らかになる。本願明細書に開示の主題及び特許請求の範囲に記載の主題は全て、理解されるように、特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、様々な態様に変形することが可能である。したがって、図面及び発明の詳細な説明は、事実上、例示であって非限定的であるとみなされるべきであり、主題の全範囲は特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本開示の更なる特徴及び利点は、添付の図面と併せた下記発明の詳細な説明から明らかとなる。
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは膵臓癌細胞における切頭Ｏ−グリカンの発生を示す。膵臓癌細胞株のＣｏｓｍｃの遺伝子ノックアウト（図１Ａ）は、コア１構造合成酵素の酵素活性を不安的化することにより（図１Ａ、図１Ｂ）、Ｏ−グリカン（Ｔｎ及びＳＴｎ）の発現を示した（図１Ｂ）。Ｃｏｓｍｃの再発現（ＣＲ）は、コア１構造合成酵素の酵素活性を安的化することにより（図１Ａ、図１Ｂ）、切頭Ｏ−グリカンの形成を減少させた（図１Ｂ）。
【図２】図２Ａは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞遊走を増加させたことを示し（図２Ａ）、図２Ｂは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞が細胞浸潤を増加させたことを示す（図２Ｂ）。Ｃｏｓｍｃの再発現は、かかる効果を回復させる。
【図３】図３は、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏ同所性膵臓癌マウスモデルにおいて、腫瘍重量（図３Ａ）及び腫瘍体積（図３Ｂ）を増加させたことを示す。Ｃｏｓｍｃの再発現は、かかる効果を回復させる。
【図４】図４Ａは、Ｃａｐａｎ−１野生型細胞及びＣＫＯ（Ｃｏｓｍｉｃノックアウト）細胞におけるリンタンパク質の発現を示す。ＣＫＯ細胞ではＧＳＫ３、Ａｋｔ、Ｓ６Ｋｂ１、ＰＫＣａ、アデューシン、Ｊｕｎ、及び、Ｒａｆ１のリン酸化が増加した。ＣＫＯ細胞内のリンタンパク質の相対的fold change値（カウント毎分、ＣＰＭ）を野生型細胞のリンタンパク質量に対して正規化した。図４Ｂは、ｐ−Ａｋｔ及びＰＧＳＫ３ｂを確認するために親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞に対して行ったリン免疫ブロッティングを示す。
【図５】図５は、ＯＶＣＡＲ−３細胞（卵巣癌腫）及びＨｅｐＧ２細胞（肝癌腫）の親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞におけるＰＧＳＫ３ｂ及びＴ−合成酵素の確認を示す。
【図６】図６Ａは、Ｃａｐａｎ−１野生型細胞、ＣＫＯ細胞間でfold change値＞２で差次的に発現した遺伝子のＲＮＡシークエンス解析を示す。図６Ｂは、差次的に発現した遺伝子の大部分が癌と関連することを示す（ｎ＝７２、３７％）。
【図７】図７Ａは、差次的に発現した遺伝子に対する分子機能及び細胞機能によるＩＰＡ解析が、４９個の遺伝子が細胞の死及び生存に関連し、２８個の遺伝子が細胞運動に関連することを示したことを示す。図７Ｂは、特定の差次的に発現した遺伝子（ＲＮＡシークエンスの結果による）のｍＲＮＡ発現量のｑＲＴ−ＰＣＲによる確認を示す。ＩＧＦＢＰ５、ＦＧＦＧ１９、ＬＩＦ、ＳＰＰ１、ＳＰＤＥＦ、ＭＵＣ２、Ｃ１３ＯＲＦ１５、ＴＮＣ、ＤＡＰＫ１、及び、ＭＵＴＹＨの相対的発現値（n-fold change）は、ＣＫＯ細胞の野生型細胞に対して（ＧＡＰＤＨで）正規化した値によって算出される。各ポイントは、３回の独立した実験のトリプリケート値の平均±標準偏差を表す。[＊＊＊；ｐ＜０．０００５、＊＊；ｐ＜０．００５、＊；ｐ＜０．０５、ｎｓ；有意ではない]
【図８】図８は、ＲＮＡシークエンスデータに対するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓを示す。野生型Ｃａｐａｎ−１細胞と比較して、ＣＫＯ細胞で最もアップレギュレートされた遺伝子の１つであるＩＧＦＢＰ５に対するＩＰＡである。ＩＧＦＢＰ５はＥｒｂＢファミリーメンバーにより厳密に調節されている。
【図９】図９Ａは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞でＥｒｂＢ２／ＥＧＦＲ２／ＨＥＲ２（Ｙ１２４８）のリン酸化が増加したことを示す。  図９Ｂは、Ｃａｐａｎ−１  Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞のＨＥＲ２阻害剤（ＣＰ７２４７１４）による処理（２４ｈ時点）は、Ａｋｔ（Ｓ４７３）のリン酸化を用量依存的に阻害したことを示す。
【図１０】図１０Ａは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞及び親（野生型）Ｃａｐａｎ−１細胞で観察されたＭＵＣ１６とＥｒｂＢ２との相互作用の増加を示す近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を示す。  図１０Ｂは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞及び親（野生型）Ｃａｐａｎ−１細胞で観察されたＭＵＣ１６とＥｒｂＢ２との相互作用の増加を示す近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を示す。
【図１１】図１１は、ＭＵＣ１６特異的抗体によるＣａｐａｎ−１細胞の処置（図１１Ａ）及びＯＶＣＡＲ−３細胞の処置（図１１Ｂ）を示す。２４ｈ時点後、野生型細胞及びＣＫＯ細胞におけるＡｋｔのリン酸化を調べるために、免疫ブロッティングにより細胞ライセートをプローブする。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＡＲ９．６  ｍＡｂエピトープのマッピングを示す。ＡＲ９．６  ｍＡｂは、ＭＵＣ１６  ＴＲのグリコシル化していない立体構造エピトープ（ＳＥＡドメイン５及びＳＥＡドメイン６）に結合する。ＭＵＣ１６  ＴＲ１．７は、ＴＲ４のリンカー領域の一部と、ＳＥＡドメイン５と、ＴＲ５リンカー領域全体と、ＴＲ６のＳＥＡドメインの半分とを含む（１２，６６０〜１２，９９３、２６４アミノ酸残基）。ＭＵＣ１６  ＴＲ１．２は、ＴＲ４のリンカー領域の一部と、ＳＥＡドメイン５と、ＴＲ５のリンカー領域とを含む（１２，６６５〜１２，８５８、１９４アミノ酸残基）。ＭＵＣ１６  ５／２  ＴＲコンストラクトは、ＳＥＡドメイン５の半分と、ＴＲ５のリンカー領域と、ＴＲ６のＳＥＡドメインとを含む（１２，７５７〜１２，９２３、１６７アミノ酸残基）。
【図１３】図１３は、本発明の方法の概要を示す。ＭＵＣ１６上の切頭Ｏ−グリカンの発現は、発癌細胞シグナル伝達を活性化して膵臓癌細胞の悪性特性を向上させる。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
実施形態において、癌の新規な治療方法が開示される。より具体的には、ムチン型糖タンパク質上の切頭Ｏ-グリカンを標的化して生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害するためのモノクローナル抗体の新規な使用方法が提供される。本発明の一実施形態によれば、切頭ムチン型糖タンパク質を標的化することにより、腫瘍形成及び腫瘍進行におけるその役割を阻害する。
【００５４】
一実施形態において、治療有効量のモノクローナル抗体ＡＲ９.６を使用してＭＵＣ１６糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンが標的化され得、それによりホスファチジイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）シグナル伝達経路を阻害する。
【００５５】
本方法は特に、ＭＵＣ１６糖タンパク質上のＯ−グリカン（ＣＡ１２５としても知られている）の癌特異的な切頭により、Ｈｅｒ２/Ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２としても知られている）受容体のリガンドが創製され、それにより、癌細胞の腫瘍形成能を増大させるＡｋｔを介して発癌シグナル伝達カスケードが生じることを教示する。本方法は、ＭＵＣ１６の異常なグリコ型は、癌腫のバイオマーカーとなるばかりではなく、発癌サイトカインの一形態として機能可能であることを規定する。
【００５６】
ＭＵＣ１６は、子宮内膜、気管、及び、角膜の正常な上皮に発現する、膜結合型の高度にグリコシル化された細胞表面糖タンパク質である。ＭＵＣ１６の発現はまた、ＭＵＣ１６の血液循環可溶体を産生する悪性腫瘍でアップレギュレートされていることが多い。膜ムチンＭＵＣ１６の異常発現は、膵臓癌等の癌の腫瘍形成能及び転移に関連することが知られている。さらに、ＭＵＣ１６は膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）では検出されず、原発性腫瘍及び転移巣で増加しており、そのため、かかるムチンの発現は疾患進行の後期に起こる事象であることが示唆される。卵巣癌細胞におけるＭＵＣ１６の異常発現は、メソテリン（腫瘍分化因子）との相互作用と、ナチュラルキラー細胞が仲介する細胞毒性を阻害することによる免疫抑制機能とを介して腹膜播種性転移を促進する。また近年の研究により、ＭＵＣ１６の過剰発現は、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）の刺激により乳癌細胞の増殖を増加させることが示されている。これらの報告は、ＭＵＣ１６が、発癌調節因子との相互作用により腫瘍進行及び転移に主要な役割を担っていることを強く示唆している。このように、ＭＵＣ１６が発癌調節因子との相互作用により癌において主要な役割を担っていることが研究により示されているが、ＭＵＣ１６等のムチン型糖タンパク質上のオリゴ糖（Ｏ結合型グリコシル化）修飾を、特に潜在的な癌治療法として研究することはほとんど行われていない。
【００５７】
患者の全生存期間を延ばすために、本発明に係る方法及び治療戦略を単独で又は細胞傷害性薬剤と併用して使用し得ることが考えられる。上記細胞傷害性薬剤としては、血管新生阻害剤、抗増殖剤、キナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ｐｏｌｏ様キナーゼ阻害剤、ｂｃｒ-ａｂｌキナーゼ阻害剤、成長因子阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターカレート抗生物質、白金含有剤、成長因子阻害剤、電離放射線、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物反応修飾剤（modifier）、免疫薬、抗体、ホルモン療法剤、レチノイド／デルトイド、植物アルカロイド、プロテアソーム阻害剤、ＨＳＰ−９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、ＭＥＫ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、ＥｒｂＢ２受容体阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び、これらの組み合わせ、並びに、他の抗腫瘍剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
血管新生阻害剤には、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＴＥ２阻害剤、ＩＧＦｌＲ阻害剤、マトリクスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）阻害剤、マトリクスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）阻害剤、トロンボスポンジン１等のトロンボスポンジン類似体、Ｎ−Ａｃ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｄ−ａｌｌｏｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ｎｖａ−Ｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＣＨ２ＣＨ３又はその塩、及び、Ｎ−Ａｃ−ＧｌｙＶａｌ−Ｄ−ａｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−ｌｌｅ−Ａｒｇ−ＰｒｏＮＨＣＨ２ＣＨ３及びその塩等のＮ−Ａｃ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｄ−ａｌｌｏｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ｎｖａ−ｌｌｅ−Ａｒｇ−ＰｒＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ３の類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
ＥＧＦＲ阻害剤の例には、イレッサ（ゲフィチニブ）、タルセバ（エルロチニブ又はＯＳＩ−７７４）、イコチニブ、アービタックス（セツキシマブ）、ＥＭＤ−７２００、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＴＰ−３８（ＩＶＡＸ）、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＥＧＦ−ワクチン、抗ＥＧＦｒイムノリポソーム、及び、タイケルブ（ラパチニブ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＰＤＧＦＲ阻害剤の例には、ＣＰ−６７３４５１、及び、ＣＰ−８６８５９６が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ＶＥＧＦＲ阻害剤の例には、アバスチン（ベバシズマブ）、スーテント（スニチニブ、ＳＵＩ  １２４８）、ネクサバール（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、ＣＰ−５４７６３２、アキシチニブ（ＡＧ１３７３６）、アパチニブ、カボザニチブ、ザクチマ（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）、ＡＥＥ７８８、ＡＺＤ−２１７１、ＶＥＧＦトラップ、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、マクゲン、Ｍ８６２、パゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）、ＡＢＴ−８６９、及び、アンジオザイムが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
トロンボスポンジン類似体の例には、ＴＳＰ−Ｉ及びＡＢＴ−５１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
オーロラキナーゼ阻害剤の例には、ＶＸ−６８０、ＡＺＤ−１１５２、及び、ＭＬＮ−８０５４が含まれるが、これらに限定されない。ｐｏｌｏ様キナーゼの例には、ＢＩ−２５３６が含まれるが、これに限定されない。
【００６４】
ｂｃｒ−ａｂｌキナーゼ阻害剤の例には、グリベック（イマチニブ）、及び、ダサチニム（ＢＭＳ３５４８２５）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
白金含有剤の例には、シスプラチン、パラプラチン（カルボプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、エロキサチン（オキサリプラチン）、又は、サトラプラチンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
ｍＴＯＲ阻害剤の例には、ＣＣＩ−７７９、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＲＡＤ００１、ＩＮＫ−１２８，及び、リダフォロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
ＨＳＰ−９０阻害剤の例には、ゲルダナマイシン、ラディシコール、１７−ＡＡＧ、ＫＯＳ−９５３、１７−ＤＭＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、ＮＣＳ−６８３６６４、ミコグラブ、ＣＮＦ−２０２４、ＰＵ３、ＰＵ２４ＦＣ１、ＶＥＲ４９００９、ＩＰＩ−５０４、ＳＮＸ−２１１２、及び、ＳＴＡ−９０９０が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の例には、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＭＳ−２７５、バルプロ酸、ＴＳＡ、ＬＡＱ−８２４、トラポキシン、ツバシン、ツバスタチン、ＡＣＹ−１２１５、及び、デプシペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
ＭＥＫ阻害剤の例には、ＰＤ３２５９０１、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＡＲＲＹ−４３８１６２、及び、ＰＤ−９８０５９が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
ＣＤＫ阻害剤の例には、フラボピリドール、ＭＣＳ−５Ａ、ＣＶＴ−２５８４、セリシクリブ（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９、ＰＨＡ−６９０５０９、ＢＭＩ−１０４０、ＧＰＣ−２８６１９９、ＢＭＳ−３８７０３２、ＰＤ０３３２９９１、及び、ＡＺＤ−５４３８が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
ＣＯＸ−２阻害剤の例には、セレブレックスＴＭ（セレコクシブ）、パレコキシブ、デラコキシブ、ＡＢＴ−９６３、ＭＫ−６６３（エトリコキシブ）、ＣＯＸ−１８９（ルミラコキシブ）、ＢＭＳ３４７０７０、ＲＳ５７０６７、ＮＳ−３９８、ベクストラ（バルデコキシブ）、パラコシキブ、バイオックス（ロフェコキシブ）、ＳＤ−８３８１、４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイルフェニル）−１Ｈ−ピロール、Ｔ−６１４、ＪＴＥ−５２２、Ｓ−２４７４、ＳＶＴ−２０１６、ＣＴ−３、ＳＣ−５８１２５、及び、アルコキシア（エトリコキシブ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の例には、サルサラート（アミジェシック）、ジフルニサル（ドロビッド）、イブプロフェン（モトリン）、ケトプロフェン（オルヂス）、ナブメトン（レラフェン）、ピロキシカム（フェルデン）、ナプロキセン（アリーブ、ナプロシン）、ジクロフェナク（ボルタレン）、インドメタシン（インドシン）、スリンダク（クリノリル）、トルメチン（トレクチン）、エトドラク（ロジン）、ケトロラク（トラドール）、及び、オキサプロジン（デイプロ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
ＥｒｂＢ２受容体阻害剤の例には、ＣＰ−７２４−７１４、Ｃｌ−１０３３（カネルチニブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、オミタルグ（２Ｃ４、ペツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファミブ）、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ８０２４（ＨＥＲ２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、並びに、ＡＳ  ＨＥＲ２三官能性二重特異性抗体、ｍＡＢ  ＡＲ−２０９及びｍＡＢ  ２Ｂ−１が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、ＡＭＤ−４７３、アルトレタミン、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、ホテムスチン、グルホスファミド、ＫＷ−２１７０、マホスファミド、ミトラクトール、カルムスチン（ＢＣＮＵ），ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、トレオスルファン、ダカルバジン、及び、テモゾロマイドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
代謝拮抗物質の例には、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、単独で又はロイコボリンと併用した５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等のウラシル類似体、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、Ｓ−Ｉ、アリムタ（ペメトレキセドナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、ゲムザール（ゲムシタビン）、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エテニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、ＴＳ−Ｉ、メルファラン、ネララビン、ノラトレキシド、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキサート、ビダラビン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、ＥＩＣＡＲ、ヒドロキシ尿素、及び、デフェロキサミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
抗生物質の例には、インターカレート抗生物質が含まれるが、アクラルビシン、アクチノマイシンＤ等のアクチノマイシン、アムルビシン、アナマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシンａ、ブレオマイシンｂ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エルサミトルシン、エピルビシン、グラルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ネモルビシン、ネオカルチノスタチン、ペプロマイシン、ピラルビシン、レベッカマイシン、スチマラマー、ストレプトゾシン、バルルビシン、ジノスタチン、及び、これらの組合せに限定されない。
【００７７】
トポイソメラーゼ阻害剤の例には、アクラルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトセシン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシン、ジフロモテカン、塩酸イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、エドテカリン、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、エトポシド、エキサテカン、ギマテカン、ラルトテカン、オラテシン（Ｓｕｐｅｒｇｅｎ）、ＢＮ−８０９１５、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピクサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、及び、トポテカンからなる群から選択される１つ以上の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
抗体の例には、リツキシマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、特異的ＣＤ４０抗体、及び、特異的ＩＧＦＩＲ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
ホルモン療法剤の例には、エキセメスタン（アロマシン）、酢酸ロイプロリド、アナストロゾール（アリミデックス）、フォスレリン（ゾラデックス）、ゴセレリン、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、フォルメスタン、クエン酸タモキシフェン（タモキシフェン）、カソデックス、アバレリックス、トレルスター、フィナステライド、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、フルタミド、ビカルタミド、メゲストロール、ミフェプリストン、ニルタミド、デキサメタゾン、プレドニゾン、及び、他のグルココルチコイドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
レチノイド／デルトイドの例には、セオカルシトール（ＥＢ  １０８９、ＣＢ  １０９３）、レキサカルシトール（ＫＨ  １０６０）、フェンレチニド、アリレチノイン、ベキサロテン、及び、ＬＧＤ−１５５０が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
植物アルカロイドの例には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及び、ビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
プロテアソーム阻害剤の例には、ボルテゾミブ（ベルケード）、ＭＧＩ−３２、ＮＰＩ−００５２、及び、ＰＲ−１７１が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
免疫薬の例には、インターフェロンおよび他の多くの免疫増強剤が含まれるが、これらに限定されない。インターフェロンには、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、インターフェロンγ−１ｂ（アクティミューン）、インターフェロンγ−ｎ１、及び、これらの組合せが含まれる。他の薬剤には、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、テラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）、ウベニメクス、ＷＦ−１０、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、メラノーマワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、ＯｎｃｏＶＡＬ−ＣＬ、サルガラモスチム、タソネルミン、テクロイキン、チマラシン、トシツモマブ、ビルリジン、Ｚ−１００、エピラツズマブ、ミツモマブ、オレゴボマブ、ペムツモマブ（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧＩ）、プロベンジ（デンドレオン）、細胞傷害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体、及び、ＭＤＸ−０１０等の、ＣＴＬＡ４を遮断できる薬剤が含まれる。
【００８４】
生物反応修飾物質の例は、組織細胞の生存、成長又は分化等、生体の防御機構又は生物学的応答を修飾して、それらが抗腫瘍活性を有するようにする薬剤である。かかる薬剤には、クレスチン、レンチナン、シゾフラン、ピシバニール、及び、ウベニメクスが含まれる。
【００８５】
ピリミジン類似体の例には、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラルチトレキセド、シタラビン（ａｒａ  Ｃ）、シトシンアラビノシド、フルダラビン、及び、ゲムシタビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
プリン類似体の例には、メルカプトプリン及びチオグアニンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
抗有糸分裂阻害剤の例には、ＡＢＴ−７５１、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、及び、ＺＫ−ＥＰＯが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明の化合物はまた、放射線治療の効果を向上させる放射線増感剤として使用されることが意図される。放射線治療の例には、外部照射治療（ＸＢＲＴ）（又は遠隔照射治療）、近接照射治療（又は密封線源放射治療）、及び、非密封線源放射治療が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の化合物はまた、ＡＢＴ２６３、ＡＢＴ７３７等の異なるクラスのＢｃｌ−２阻害剤と併用することができる。
【００９０】
本発明の方法を下記実施例により詳細に説明する。
【００９１】
本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を例示するために記載される下記実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解される。
[実施例］
実施例１
膵臓癌発症におけるＴＮ／ＳＴＮエピトープ含有糖タンパク質の役割
【００９２】
膵臓癌発症におけるＴｎ／ＳＴｎエピトープ含有糖タンパク質の役割を評価する第一の実験を行う。癌細胞表面上のＴｎエピトープ及びＳＴｎエピトープの出現は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１遺伝子の過剰発現、コア３構造合成酵素／コア１構造合成酵素活性の欠落、及び／又は、コア１構造合成酵素特異的分子シャペロンであるＣｏｓｍｃの欠陥による。本実験では、癌細胞表面に切頭Ｏ−グリカンを創製する万能かつ安定した遺伝子改変戦略であるＳｉｍｐｌｅＣｅｌｌｓを使用する。本方法は、ヒト膵臓癌細胞株であって、Ｏ−グリカンの伸長を制御する酵素であるコア１構造合成酵素の分子シャペロンであるＣｏｓｍｃの遺伝子座をジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）法で欠失させてＯ−グリカンのエピトープをＴｎ及びＳＴｎに制限したものを使用する。
【００９３】
図１に関して、Ｃａｐａｎ−１細胞でＣｏｓｍｃをノックアウト（ＫＯ）すると、コア構造１合成酵素の分解により癌細胞表面に切頭Ｏ−グリカンが形成される。かかる細胞株でＣｏｓｍｃを再発現するとコア１構造合成酵素の活性が回復してＴｎエピトープが伸長する。同様の結果が同質遺伝子型のＯＶＣＡＲ−３癌細胞、Ｃｏｌo２０５癌細胞、及び、ＨｅｐＧ２癌細胞で観察された（データ不図示）。これらの結果は、癌細胞のＣｏｓｍｃのノックアウトは、癌細胞表面に腫瘍に関連する切頭炭化水素抗原（Ｔｎ及びＳｔｎ）の恒常的な発現をもたらすことを示唆している。Ｃａｐａｎ−１  Ｃｏｓｍｃ再発現細胞（クローン番号１）を残りの全ての試験で使用した。
実施例２
膵臓細胞の腫瘍形成における切頭Ｏ−グリカンの役割
【００９４】
膵臓細胞の腫瘍形成における切頭Ｏ−グリカンの役割を調査する第二の実験を行う。同所性移植モデルで同細胞の発癌性及び転移性を評価する。
【００９５】
図２Ａ及び図２Ｂに関して、Ｃａｐａｎ−１膵臓癌細胞で切頭Ｏ−グリカンが発現すると、親細胞及びｃｏｓｍｃ再発現細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞遊走（ポリエチレンテレフタレート膜アッセイを使用、図２Ａ）及び細胞浸潤（Ｂｏｙｄｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイを使用、図２Ｂ）が増加した。図３Ａ及び図３Ｂに関して、ｉｎ  ｖｉｖｏ同所性膵臓腫瘍モデル内で成長させたｃｏｓｍｃ欠失細胞では、腫瘍の体積及び重量の有意な増加が観察される。
【００９６】
まとめると、Ｔｎ／ＳＴｎエピトープを発現するｃｏｓｍｃ欠失細胞は、親細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遊走、浸潤及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長、並びに、転移性が有意に増加した。
実施例３
ホスホキノーム解析
【００９７】
細胞のシグナル伝達機構が細胞表面受容体又はそのリガンドの異常グリコシル化の影響を受ける可能性をさらに調査するために、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ  ＫＰＳＳ−１．３  Ｓｃｒｅｅｎを使用して、リンタンパク質の発現の集中的な分析を同質遺伝子型のＣａｐａｎ−１細胞株で行った（ｎ＝３８）。ホスホキノームスクリーンは、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞において、親細胞と比較して少なくとも２４％の変化量（デュプリケートの平均からのメジアン範囲は±１２）で、ＰＫＢα／Ａｋｔ１（Ｓ４７３及びＴ３０８）、ＧＳＫ３β（Ｓ９及びＹ２１６）、Ｓ６Ｋｂ１、ＧＳＫ３α（Ｓ２１）、ＰＫＣα／β２、ＰＫＣα、アデューシンγ、ＰＫＣα、Ｊｕｎ（Ｓ７３）、及び、Ｒａｆ１の９個のリンタンパク質の選択的なアップレギュレーション（カウント毎分、ＣＰＭで測定）と、Ｍｓｋ１、ＰＫＣσ、ＭＥＫ１／２、Ｂ２３、Ｓｍａｄ１／５／８、Ｊｕｎ（Ｓ７３、２つの低分子量型）、及び、Ｅｒｋ１の７個のリンタンパク質のダウンレギュレーションとを示した（図４Ａ）。ＣＫＯ細胞でアップレギュレートされたリンタンパク質のＣＰＭ値を野生型細胞のＣＰＭ値で正規化し、リン酸化のfold change値として表した（図４Ａ）。特定のリンタンパク質（ｐＡｋｔ及びｐＧＳＫ）の量が同質遺伝子型のＣａｐａｎ−１細胞においてウェスタンブロッティングで確認される（図４Ｂ）。Ｃａｐａｎ−１  ＣＫＯ細胞ではＴ３０８におけるＡｋｔのリン酸化はベースラインを越えて増加するものの、正確な割合は算出できなかった。親細胞では当該部位におけるベースラインのリン酸化は検出できないからである。また、これらの結果は他の同質遺伝子型の癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−３及びＨｅｐＧ２）で確認される（図５）。これらの結果は、癌細胞内のＴｎ／ＳＴｎ抗原の発現は、膵臓癌（ＰＣ）細胞のホスファチジイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）発癌シグナル伝達経路を活性化させることを実証している。
実施例４
切頭Ｏ−グリカンが仲介する全般的遺伝子発現の変化
【００９８】
切頭Ｏ−グリカンの発現がＣＫＯ膵臓癌細胞において全般的遺伝子発現量に影響を与えるかどうかを評価するために、ＲＮＡシークエンス解析及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を行った。
【００９９】
ＲＮＡシークエンス解析は、ＣＫＯ細胞では、野生型細胞と比較して、fold change値＞２で、５９個の遺伝子がアップレギュレートされ、且つ、６７個の遺伝子がダウンレギュレートされ、また、８個の遺伝子がサイレンシングされたことを示した（図６Ａ）。さらに、疾患及び障害に基づいて分類すると、差次的発現した遺伝子の大部分が癌と関連する（ｎ＝７２、３７％）（図６Ｂ）。差次的発現した遺伝子の大部分は、細胞の死、生存及び移動機能と関連していた（図７Ａ）。ＣＫＯ細胞における特定の腫瘍増強遺伝子の（野生型細胞と比較した）ｍＲＮＡ量は、定量的リアルタイムＰＣＲ分析により確認される。ＣＯＳＭＣノックアウト（ＫＯ）細胞でアップレギュレートされた遺伝子であるＭＵＣ２、ＳＰＤＥＦ、ＬＩＦ、Ｃ１３ＯＲＦ１５、ＦＧＦ１９、及び、ＩＧＦＢＰ５は、野生型の細胞と比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲでは、fold change値で、それぞれ２．２０、２．８５、４．２１、５．５９、９．５６、及び、１７．３６の差を；ＲＮＡシークエンスでは、fold change値で、それぞれ３．４２、２．４８、２．７４、２．４８、３．００、及び、６．０４の差を、示した。ＣＯＳＭＣノックアウト細胞でダウンレギュレートされた遺伝子であるＤＡＰＫ１及びＭＵＴＹＨは、野生型細胞と比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲでは、fold change値で、それぞれ１．４、１．６の差を；ＲＮＡシークエンスでは、fold change値で、それぞれ２．０、２．１の差を示した。全体的に、これらの結果は、癌細胞表面上の切頭Ｏ−グリカンの発現は腫瘍の促進に関連する機能を有する遺伝子の発現を調節することを示唆している。
実施例５
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）
【０１００】
切頭Ｏ−グリカンを発現する膵臓癌細胞で観察された発癌細胞シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）を活性化する上流の受容体−リガンド相互作用を特定するために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して、（３８個中、２９個の）差次的にリン酸化されたタンパク質に対してネットワーク解析を行った。
【表１】
2016523961.tif 000003
【表２】
2016523961.tif 000004
【０１０１】
ＩＰＡは、有意数の癌経路（表１）が膵臓癌（ＰＣ）細胞内のＣｏｓｍｃのノックアウトの影響を受けることを明らかにした。これらのうち顕著なのは、ＣＫＯ細胞における上皮成長因子受容体（ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３）シグナル伝達経路の活性化である（表２）。これらのＥＧＲ受容体によるシグナル伝達は受容体の二量体化に依存する。幾つかの研究は、膵臓癌を含む癌では癌細胞表面のＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３二量体化がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ発癌細胞シグナル伝達経路を活性化することを報告している。これらの結果は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ発癌細胞シグナル伝達は、切頭Ｏ−グリカンを発現する膵臓癌細胞のＥＧＦ受容体の活性化を介して発生することを示唆する。
【０１０２】
同様に、ＣＫＯ細胞でアップレギュレートされた全ての遺伝子についてＩＰＡによりネットワーク解析を行った。ネットワーク解析は、ＩＧＦＢＰ５（インスリン様成長因子結合タンパク質５）の遺伝子発現（ＲＮＡシークエンスで６倍（fold change値）増加、ｑＲＴ−ＰＣＲで１７．６倍（fold change値）増加）は、ＥＧＦファミリーの受容体（ＥＧＦＲ１、２，３、４）により厳密に調節されることを明らかにした（図８）。同様に、他の遺伝子ＳＰＤＥＦ（転写因子）もまたＥＧＦＲ２により制御された（データ不図示）。ＲＮＡシークエンスとＩＰＡとを合わせた結果は、癌細胞上の切頭Ｏ−グリカンの発現はＥＧＦ受容体のファミリーメンバーを活性化して下流の発癌細胞シグナル伝達経路を誘発し、ＣＫＯ膵臓癌細胞で腫瘍形成を増加させることを実証している。
実施例６
ＨＥＲ２及びその下流のＡＫＴシグナル伝達経路の活性化
【０１０３】
ホスファチジイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）シグナル伝達経路は、細胞の増殖、成長、運動性及び生存を含む細胞プロセスを仲介する発癌性細胞シグナル伝達経路であり得ることが知られている。Ａｋｔ活性の増加は、アポトーシス促進性タンパク質の不活性化、抗アポトーシス遺伝子の活性化、細胞周期の促進などの多くの下流ターゲットへの影響を介して、細胞生存と主に関連付けられてきた。事実、Ａｋｔの活性化は膵臓癌の予後の悪化と関連している（例えば、膵臓腺癌の５９％がＡｋｔの過剰活性化を示したことが研究により示されている）。
【０１０４】
次に、Ｏ−グリカン発現細胞がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を活性化するかどうかを調査した。かかる活性化は、ＭＵＣ４、ＭＵＣ上のＴｎ抗原又はＭＵＣ１６とＥｒｂＢ−２受容体との相互作用によると思われる。ムチン−成長因子受容体間のこれらの相互作用は、発癌（すなわち、アップレギュレーション）機能及び腫瘍抑制（すなわち、ダウンレギュレーション）機能を有する遺伝子の発現を差示的に調節するものと思われる。
【０１０５】
図９に関して、ムチン型糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンの過剰発現は、ＥｒｂＢ２受容体の活性化を、当該受容体への結合又は当該受容体ファミリーメンバー同士のヘテロダイマー化の誘発により向上させた。野生型細胞及びＣｏｓｍｃ再発現細胞と比較して、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞においてＨＥＲ２（Ｙ１２４８）のリン酸化が増加していることが観察される（図９Ａ）。さらに、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞を小分子ＨＥＲ２阻害剤（ＣＰ７２４７１４）で処理すると、Ａｋｔのリン酸化が用量依存的に阻害される（図９Ｂ）。これらの結果は、切頭Ｏ−グリカンの発現は、Ｃｏｓｍｃノックアウト細胞のＨＥＲ２／Ａｋｔ発癌シグナル伝達経路を恒常的に活性化することを示唆している。
実施例７
ＨＥＲ２及び他のＥＧＦＲファミリーメンバーとムチンとの間のタンパク質間相互作用
【０１０６】
ＥＧＦ受容体の二量体化及び活性化状態を調査するために、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）により、タンパク質間相互作用試験をＣａｐａｎ−１野生型細胞及びＣＫＯ細胞に対して行う。ＰＬＡは、タンパク質に特異的な抗体を使用してタンパク質間相互作用を同定するために日常的に使用されている。かかる方法を使用して、成長因子受容体であるＥＧＦＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥＧＦＲ３（ＥｒｂＢ３）、及び、ＥＧＦＲ４（ＥｒｂＢ４）間の相互作用、及び、これらの成長因子受容体とムチン分子であるＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ４上のＴｎ、及び、ＭＵＣ１６との間の相互作用が同定される。重要なことに、ＣＫＯ細胞では、ＥＧＦＲ２と、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ４上のＴｎ、及び、ＭＵＣ１６との相互作用が親細胞と比較して有意に増加していることが観察された（図１０Ａ、１０Ｂ）。しかしながら、野生型細胞とＣＫＯ  Ｃａｐａｎ−１細胞との間では、ＥＧＦ受容体のホモ二量体化及びヘテロ二量体化のいずれにも有意な変化は観察されない。これらの結果は、切頭Ｏ−グリカンを発現する癌細胞では、ＭＵＣ４、Ｔｎ−ＭＵＣ４、及び、ＭＵＣ１６はＥＧＦＲ２／ＥｒｂＢ２と相互作用してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達カスケードを活性化することを実証している。
実施例８
ＭＵＣ１６に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＡＲ９．６はＡＫＴのリン酸化を阻害する
【０１０７】
ＣＫＯ膵臓細胞でムチン−ＥＧＦ受容体相互作用が下流のＡｋｔのリン酸化を活性化したかどうか直接確認するため、抗体ブロックアッセイを行った。ＭＵＣ１及びＭＵＣ１６に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で野生型細胞及びＣＫＯ細胞を処理した。ＭＵＣ１抗体は、検出可能なＡｋｔのリン酸化変化を誘発しなかった（データ不図示）。しかしながら、Ｃａｐａｎ−１野生型細胞を抗ＭＵＣ１６抗体（５Ｅ１１、Ｂ４３.１３、及び、ＡＲ９．６）で処理すると、基礎レベルのＡｋｔ活性化（自然な腫瘍進行の一部として、癌細胞表面に存在する最少量の切頭Ｏ−グリカンによる）を阻害し、ＡＲ９．６  ｍＡｂ（２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ）のみが、コントロール及びＩｇＧで処理したＣＫＯ細胞と比較して、２４ｈ時点で、（Ｏ−グリカンの恒常的な発現により）恒常的に過剰にリン酸化されたＡｋｔを有意に低減させた（図１１Ａ）。また、同様の効果が同質遺伝子型のＯＶＣＡＲ−３細胞で観察された（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＭＵＣ１６とＥＧＦ受容体との相互作用は、切頭Ｏ−グリカンを発現する膵臓癌細胞の発癌細胞生存シグナル伝達カスケードを活性化することを示唆する。
【０１０８】
図１１に関して、ＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ  ＡＲ９．６は、２．５μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌの濃度で、２４時間の時点で、コントロール及びＩｇＧ処理細胞と比較して有意にＡｋｔのリン酸化を低減させた。そのため、ＡＲ９．６は成長因子受容体よりもリガンド自体を標的にするものと考えられ、それにより、細胞表面結合糖タンパク質又は血液循環糖タンパク質に結合できるものと考えられる。したがって、本発明の方法は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ／ＥＧＦ等の既に実績のあるターゲットと異なる機構ではあるが、それらと同様の方法で癌の治療に使用され得る。
【０１０９】
元来、ＡＲ９．６は、オレゴボマブ抗体Ｂ４３．１３とは著しく異なるにもかかわらず、卵巣癌抗原ＣＡ１２５であるＭＵＣ１６タンパク質を認識するために作製された。抗体Ｂ４３．１３はＭＵＣ１６の切頭Ｏ−グリカン体を認識しない。
【０１１０】
まとめると、ＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ（ＡＲ９．６）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の有意な阻害を示した。これらの結果は、ＡＲ９．６がＭＵＣ１６とＥｒｂＢ２との相互作用をブロックして、その生存促進性細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害し得ることを示唆する。このように、ムチン型糖タンパク質（ＭＵＣ１６）上の切頭Ｏ−グリカンは、ＥｒｂＢ２受容体を介して発癌生存シグナル伝達を恒常的に活性化し、それにより、膵臓細胞の腫瘍形成能を向上させる。上記結果の概要を図１３に示す。
実施例９
ＡＲ９．６  ｍＡｂエピトープのマッピング
【０１１１】
次に、Ａｒ９．６  ｍＡｂのＭＵＣ１６上の結合部位を見出すためにＥＬＩＳＡ試験を行った。Ｓｅａドメインを含む、ＭＵＣ１６の様々なタンデムリピート（ＴＲ）を、Ａｒ９．６  ｍＡｂの濃度系列とインキュベートする。ＭＵＣ１６  ＴＲ１．７は、ＴＲ４のリンカー領域の一部と、ＳＥＡドメイン５と、ＴＲ５リンカー領域全体と、ＴＲ６のＳＥＡドメインの半分とを含む（１２，６６０〜１２，９９３、２６４アミノ酸残基）。ＭＵＣ１６  ＴＲ１．２は、ＴＲ４のリンカー領域の一部と、ＳＥＡドメイン５と、ＴＲ５リンカー領域とを含む（１２，６６５〜１２，８５８、１９４アミノ酸残基）。ＭＵＣ１６  ５／２  ＴＲコンストラクトは、ＳＥＡドメイン５の半分と、ＴＲ５のリンカー領域と、ＴＲ６のＳＥＡドメインとを含む（１２，７５７〜１２，９２３、１６７アミノ酸残基）。これらの全てのコンストラクトはＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞で発現させた。ＡＲ９．６  ｍＡｂは、ＭＵＣ１６  ５／２ＴＲを含む配列よりもＭＵＣ１６  １．７ＴＲ及びＭＵＣ１６  １．２ＴＲに対して反応性が増加したことが観察される（図１２Ａ、１２Ｂ）。これらの結果は、ＡＲ９．６  ｍＡｂは、グリコシル化していないＭＵＣ１６  ＴＲ上の立体構造エピトープに結合することを示唆する。しかしながら、グリコシル化がこれらの結合に影響するかどうかは不明である。
実施例１０
ＡＲ９．６とゲムシタビンとの併用療法
【０１１２】
疾患特異的なＭＵＣ１６をゲムシタビンと共にｍＡｂ  ＡＲ９．６で標的化することによる致命的な膵臓癌の併用療法を考察する。
【０１１３】
上記実施例及び予備観察では、非常に転移しやすい膵臓癌に対抗するために、ＭＵＣ１６の疾患特異的な形態を標的化するＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂをゲムシタビンと併用することが示唆された。また近年の研究でも、標的療法は単独で又は細胞傷害性薬剤との併用により、患者の全生存期間を有意に改善したことが示されている。例えば、卵巣癌患者に対するＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ（Ｂ４３.１３、すなわち、ＯＶＡｒｅｘ）の単独処置、及び、乳癌患者に対するＥｒｂＢ２に特異的なｍＡｂ（ハーセプチン）の細胞傷害性薬剤との併用処置は、患者の全生存期間の有意な改善を示した。
【０１１４】
一実施形態によれば、膵臓癌に対するＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂであるＡＲ９．６のゲムシタビン処置との併用は、非常に効果的な治療アプローチを提供し得、また、患者の薬剤反応及び全生存期間を改善し得る治療戦略を開発するという現在のニーズを満たし得る。
【０１１５】
本例は、ＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂとゲムシタビン処置との併用療法が膵臓癌の成長及び転移を低減し得ることを示唆する。かかる点に関して、ＡＲ９．６等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ、及び、ＡＲ９．６等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂとゲムシタビンとの組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト膵臓癌細胞株における悪性特性及び発癌シグナル伝達に対して影響を与え得る。親膵臓癌細胞株、及び、Ｃｏｓｍｃノックアウト（切頭Ｏ−グリカン発現）膵臓癌細胞株をＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ、ゲムシタビン、又は、ＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂとゲムシタビンとの組み合わせで処理し、抗体単独又は化学療法との併用処置が腫瘍細胞の悪性特性を阻害する潜在性が評価され得る。また、かかる治療法の発癌シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）への影響力が解析され得る。
【０１１６】
さらに、ＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ同所性膵臓腫瘍モデルにおけるゲムシタビン処置に対して効果的に影響し得る。膵臓癌の同所性腫瘍モデルが重傷複合免疫不全マウスに使用され得る。ＡＲ９．６  ｍＡｂ等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ、ゲムシタビン、又は、その組み合わせで、マウスを１回又は２回の治療サイクルで処置し得る。ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  ２デオキシグルコースを使用して近赤外線ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｅｒ（ＰＥＡＲＬ）により撮像することにより、腫瘍成長がモニターされ得る。腫瘍の進行及び全生存期間は様々な時点でモニターされ得る。Ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖指数及びアポトーシスは、それぞれ、免疫組織化学染色法及びＴＵＮＥＬアッセイで解析され得る。
【０１１７】
本発明の一実施形態によれば、ムチン型糖タンパク質上の切頭Ｏ−グリカンの異常発現及びＭＵＣ１６の過剰発現は膵臓癌の腫瘍進行及び転移と関連付けられ、そのため、これらの切頭Ｏ−グリカン含有ＭＵＣ１６の疾患特異的な形態をＡＲ９．６  ｍＡｂ及びゲムシタビンで標的化することにより腫瘍細胞成長が阻害されるはずであることが開示される。一実施形態によれば、切頭Ｏ−グリカンを発現する膵臓癌細胞は、ゲムシタビンと共に、ＡＲ９．６等のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂで処理され得る。ＡＲ９．６  ｍＡｂ、ゲムシタビン、及び、ＡＲ９．６  ｍＡｂとゲムシタビンとの併用処理のためのＭＵＣ１６及びＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２陽性の膵臓癌細胞が調査され得る。細胞の生存性及びアポトーシスは、それぞれ、蛍光アラマーブルーアッセイ及び、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞アッセイにより解析され得る。細胞シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ軸）の変化を評価することができる。ＡＲ９．６  ｍＡｂ及びゲムシタビンの併用による癌細胞の遊走及び浸潤の阻害は、それぞれ、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）膜アッセイ及びＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイを使用して行うことができる。
【０１１８】
膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ−１及びＣｏｌｏ３５７（親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞）を様々な濃度のＡＲ９．６  ｍＡｂ単独、ゲムシタビン単独及びこれらの組み合わせと様々な時点で処理し、Radhakrishnan P., et al. Clin Cancer Res 2013 Apr 15;19(8):2025-35に記載の蛍光アラマーブルーアッセイを使用して、細胞生存性を測定することができる。リン酸緩衝生理食塩水及びアイソタイプの抗体ＩｇＧで細胞を処理したものを上記処理のコントロールとすることができる。下記米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のアルゴリズムを使用して用量反応カーブが評価され得る：時間ｔ０におけるコントロール細胞のＴｚ１／４数；時間ｔにおけるコントロール細胞のＣ１／４数；時間ｔにおける処理細胞のＴ１／４数；１００×[（Ｔ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）]。これらの実験は３回繰り返して行うことができ、次いで、ｕｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ検定により統計解析が行われ得る。
【０１１９】
ＡＲ９．６  ｍＡｂ、ゲムシタビン及びこれらの組み合わせにより誘発されるアポトーシスは、Radhakrishnan P., et al. Clin Cancer Res 2013 Apr 15;19(8):2025-35に記載されているとおりＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞アッセイを使用して、Ｃａｐａｎ−１細胞及びＣｏｌｏ３５７細胞の親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞で行うことができる。リン酸緩衝生理食塩水及びアイソタイプの抗体ＩｇＧで細胞を処理したものを上記処理のコントロールとすることができる。細胞生存性（生存／死）は、蛍光顕微鏡法により生存（緑）細胞数及び死滅（赤）細胞数をカウントすることに決定することができる。実験は少なくとも３回繰り返され、次いで、ｔ検定を行って有意差が決定され得る。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞アッセイに加えて、カスパーゼ活性アッセイ又はカスパーゼ前駆体に特異的な抗体を使用する免疫ブロッティングにより、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９等のアポトーシス経路の開始因子及び執行因子の活性化（intactなカスパーゼと切断型カスパーゼを示す）が調査され得る。
【０１２０】
ＥｒｂＢ２−ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化は癌細胞の細胞遊走及び浸潤に影響するため、Radhakrishnan P., et al. Clin Cancer Res 2013 Apr 15;19(8):2025-35に既に記載されているとおり、ポリエチレンテレフタレート膜及びＭａｔｒｉｇｅｌ（５００μｇ／フィルター）でコートしたポリカーボネート製フィルター（孔サイズ：１２ｍｍ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して、ＡＲ９．６  ｍＡｂ単独、ゲムシタビン単独又はこれらの組み合わせで処理した膵臓癌細胞の遊走・浸潤が分析され得る。膜及びｍａｔｒｉｇｅｌを横断する細胞は、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ細胞染色キット（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）で染色され得る。細胞（６フィールド／ウェル）を倍率×１００で観察し、平均細胞数／視野として表すことでできる。各ケースで独立した実験を３回行うことができる。データは３つの独立し測定値の平均±標準偏差で表され得る。
【０１２１】
ＣｏｓｍｃノックアウトＣａｐａｎ−１細胞では、ＧＳＫ３ｂ、Ａｋｔ、Ｓ６Ｋ、及び、ＰＫＣａの活性化が親細胞よりも起こり、そのため、ＡＲ９．６  ｍＡｂ単独、ゲムシタビン単独及びこれらの組み合わせで処理した膵臓癌細胞に対する、ＭＵＣ１６とＥｒｂＢ２との相互作用が仲介するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化、及び、その下流のシグナル伝達エフェクターが調査できる。ホスホＰＩ３キナーゼｐ８５（Ｔｙ４５８）／ｐ５５（Ｔｙｒ１９９）抗体及びホスホＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８及びＳｅｒ４７３）抗体を使用する免疫ブロッティングによって未処理及び処理済みのＣａｐａｎ−１及びＣｏｌｏ３５７の親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞のライセートを分析して、ＰＩ３Ｋタンパク質及びＡｋｔタンパク質の不活性化／非リン酸化を確認することができる。活性型Ａｋｔは、リン酸化等の翻訳後修飾による下流タンパク質の活性化又は不活性化による細胞生存、細胞サイクルの進行及び増殖シグナル伝達カスケードの主要な調節因子である。したがって、細胞増殖及び細胞周期進行機能に関連するタンパク質（ＧＳＫ３ｂ、ｐ２１Ｃｌｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ1、及び、サイクリンＤ１）のリン酸化を、ホスホＧＳＫ３ｂ（Ｓｅr９）、ホスホｐ２１（Ｔｈｒ１４５及びＳｅｒ１４６），ホスホｐ２７（Ｔｈｒ１５７）、及び、サイクリンＤ１に特異的な抗体を使用する免疫ブロッティングによって分析してもよい。細胞生存に関連するタンパク質（Ｂａｄ及びＸＩＰＡ）も、ホスホＢａｄ（Ｓｅｒ１３６）及びホスホＸＩＡＰ（Ｓｅｒ８７）に特異的な抗体を使用する免疫ブロッティングによって評価することができる。
【０１２２】
ＭＵＣ１６とＥｒｂＢ２との相互作用の阻害により、ＡＲ９．６  ｍＡｂ単独で又はゲムシタビンとの併用で処理した細胞でＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化及びその下流のシグナル伝達エフェクターを低減することが可能であるとの仮説が立てられる。ＡＲ９．６  ｍＡｂによる処理は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達軸、或いは、ＭＵＣ１６がＪＡＫ２シグナル伝達経路を活性化する可能性など、他の経路を有意に阻害し得る。Ａｋｔはまた、転写因子、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化を介する抗アポトーシス遺伝子発現の転写制御により、癌細胞の生存を向上させる。抗アポトーシス遺伝子（Ｂｃｌ−２を含む）の発現（ｍＲＮＡ発現）は、ＡＲ９．６  ｍＡｂ単独で又はゲムシタビンとの併用で処理した親細胞及びＣｏｓｍｃノックアウト細胞のリアルタイムＰＣＲ分析により定量化することができる。当業者は、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏは研究室で使用される日常のアッセイを含むことを理解する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びｕｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ検定を使用して、コントロール群と処置群との間に有意差があるかどうか決定することができる。ｐ＜０．０５のときにのみ有意差があると考えることができる。
【０１２３】
細胞傷害性薬剤との併用によるモノクローナル抗体の標的化治療は、過去１０年間重要な研究分野であった。かかる治療アプローチは、膵臓癌患者の治療結果の改善に有望である。膵臓癌細胞のＡＲ９．６  ｍＡｂによる処置は、ムチンと成長因子受容体との相互作用を変化させることによりＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存シグナル伝達経路の阻害を示すため、癌細胞のＡＲ９．６  ｍＡｂにより前処理は、恒常的に活性な生存経路の阻害によりゲムシタビンの抗腫瘍効果を増強できることが示唆される。そこで、同所性膵臓癌モデルでゲムシタビン処置に対するＡＲ９.６  ｍＡｂの増強効果を実証することが考えられる。重傷複合免疫不全マウスの膵臓癌のｉｎ  ｖｉｖｏ同所性腫瘍モデル（コントロール群、並びに、ＡＲ９.６  ｍＡｂ単独、ゲムシタビン単独及びその組み合わせによる処置群）を調査することができる。腫瘍成長（体積）は、Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｅｒを使用してモニターすることができる。免疫組織化学染色法及びＴＵＮＥＬアッセイによるｉｎ  ｖｉｖｏ増殖及びアポトーシスと共に、腫瘍進行までの時間及び全生存期間を評価することができる。
【０１２４】
切頭Ｏ−グリカンを発現する膵臓癌細胞は、Derosier LC, et al. Mol Cancer Ther 2007 Dec;6(12 Pt 1):3198-207に記載されているように、マウス膵臓内に同所的に移植することができる。簡潔に説明すると、まず、キシラジン−ケタミン塩酸溶液を静脈内投与してマウスを麻酔する。左上腹部を小さく切開し、次いで脾臓を引き出して膵臓を露出させることができる。２７ゲージの針を使用して、膵臓癌細胞（３０〜４０μｌ中に０．１〜０．５×１０６個）が膵臓に注入され得る。腹部をクロム腸線縫合糸及びエチロン縫合糸の二層縫合で閉じることができる。移植２〜３週後、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷをコンジュゲートした２−デオキシグルコースを使用して、Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｅｒにより腫瘍成長を測定することができ、その後、マウスは様々な治療群にランダマイズされ得る。
【０１２５】
腫瘍細胞の移植から２〜３週間後、マウスを下記群（各群ｎ＝１５）に振り分けることができる：未処置（ベヒクルコントロールであるＰＢＳ、群１）；ＡＲ９．６単独（移植後２２日、２６日、２９日及び３３日目に１００μｇを静脈内投与、群２）；ゲムシタビン単独（移植後２３日及び３０日目に６０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与、群３）；ＡＲ９．６（移植後２２日、２６日、２９日及び３３日目に１００μｇを静脈内投与）とゲムシタビン（移植後２３日及び３０日目に６０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与）との組み合わせ（群４）；及び、ＡＲ９．６（移植後２５日、２８日、３２日、３５日、５３日、５６日、６０日及び６３日目に１００μｇを静脈内投与）とゲムシタビン（移植後２６日、３３日、５４日及び６２日目に６０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与）との組み合わせ（群５）。マウスを更にｉｎ  ｖｉｖｏイメージングして移植後４１日、７２日及び８３日目に腫瘍面積を算出することができる。
【０１２６】
各治療試験の処置群のマウスについて各腫瘍面積を算出し、これを初期（治療前）ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング試験から得られたものと比較することができる。Ｋｒｉｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して、群間の処置後の腫瘍体積変化を決定することができる。ｐ値０．０５未満を統計的有意差とすることみなすことができる。ウィルコクソンの符号順位検定（正規近似）を使用して、ペアワイズ比較することができる。さらに、マウスの死亡時、又は、ネブラスカ大学医療センターの動物管理使用委員会が承認したプロトコルに従った屠殺時に腫瘍を記録しながら、マウスの生存期間の追跡調査が行われ得る。ログランク検定を使用して群間の生存期間が比較され得る。カプラン・マイラー手法を使用して生存期間カーブが生成され得る。他の臓器への腫瘍の転移は、巨視的及び微視的に調べられ得る。
【０１２７】
上記試験から得られた腫瘍組織（群１〜４）について、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介性ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）と免疫組織化学染色法によるカスパーゼ３活性化とを用いてアポトーシスの解析をすることができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖指数は、Radhakrishnan P., et al Clin Cancer Res 2013 Apr 15;19(8):2025-35に既に記載されているように、抗Ｋｉ  ６７（増殖マーカー）の免疫化学的染色により分析することができる。組織染色強度は、組織染色の強度及び程度に基づく複合スコアが付与され得る。上記強度は、−、＋、＋＋、及び、＋＋＋の４段階でランク付けされ得る。これらの値は、−[０]、＋[１]、＋＋[２]、＋＋＋[３]と、数値スコア化され得る。染色の程度は、下記４段階でランク付けされ得る：１（０〜２４％）、２（２５〜４９％）、３（５０〜７４％）、４（７５〜１００％）。複合スコアは、上記二つの値の乗算により算出され得、その値は０〜１２の範囲となり得る。群間の値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びｕｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ検定で比較される。
【０１２８】
モノクローナル抗体と細胞傷害性薬剤とを組み合わせた標的化治療は、癌患者の全体生存期間を長期化することができるものと考えられる。したがって、ＡＲ９.６  ｍＡｂとゲムシタビンの併用療法で処置したマウスにおいて、各剤単独の場合よりも腫瘍進行までの時間と生存期間とが有意に延長され得る。同様に、併用療法に由来する腫瘍組織では、アポトーシスが有意に増加し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖指数が減少し得る。さらに、ＡＲ９.６  ｍＡｂ単独で又はゲムシタビンとの併用で処置した動物では、転移が有意に低減し得る。また、観察された反応に基づいて、コントロール動物−処置動物間の転移プロファイルの有意変化を調査することができる。例えば、腹膜内の播種及び転移が減少した場合、ＭＵＣ１６とメソテリンとの相互作用が腹膜転移の発生に影響した可能性は、（ＭＵＣ１６特異的な抗体を使用するＥＬＩＳＡにより）腹膜体液内のＭＵＣ１６レベルと、（ＭＵＣ１６及びメソテリンに特異的な抗体を使用する）免疫蛍光により腹膜腫瘍組織のＭＵＣ１６とメソテリンとの相互作用のレベルと、を分析することにより評価することができる。もしも提案されたＡＲ９.６  ｍＡｂ処置が全体生存期間又は転移活性を有意に改善しない場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ同所性腫瘍モデルシステムにおいてＡＲ９.６  ｍＡｂ単独又はゲムシタビン併用について用量増加試験を実施し、また、抗体投与スケジュールを変えて、抗腫瘍形成能及び細胞傷害効果を十分調査することができる。ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷをコンジュゲートした２−デオキシグルコースを用いるイメージングに問題が発生した場合、ＳＴｎ抗原に特異的なｍＡｂであるＴＫＨ−２をコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷも使用することができる。同所性膵臓モデルは既知であり、かかるモデルシステムにおいて膵臓癌に対する多数の抗腫瘍剤のスクリーニングが行われている。
【０１２９】
切頭Ｏ−グリカン含有ＭＵＣ１６は膵臓癌における疾患特異的な標的であり、これをゲムシタビンと共にｍＡｂ  ＡＲ９.６で標的化することにより、全生存期間が改善され得る。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ等の追加の化学療法的アプローチをＡＲ９．６と併用することや、ＭＵＣ１６に対する他の抗体（Ｂ４３．１３等）をゲムシタビンと併用して致命的な膵臓癌に対抗する代替的な治療処置を見出すことが考えられ得る。また、ヒト膵臓癌腫瘍組織におけるＭＵＣ１６、ＭＵＣ１６−ＥｒｂＢ２間相互作用、及び、発癌シグナル伝達経路の相関的活性化のレベルを評価することもできる。
【０１３０】
切頭Ｏ−グリカンの異常発現は、腫瘍進行及び治療成績の悪化と関連することが幾つかの研究により示されている。さらに、ＳＴｎ抗原は膵臓癌前駆病変ＰａｎＩＮ−３で過剰発現しているため、これらの切頭Ｏ−グリカンは膵臓癌の進行及び早期転移に重要であることが強く示唆される。我々の予備データは、切頭Ｏ−グリカンの過剰発現は、ＥｒｂＢ２受容体を介して発癌シグナル伝達経路を活性化することにより膵臓癌細胞の腫瘍形成能を向上させることを示す。切頭Ｏ−グリカン発現細胞のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ  ＡＲ９．６による処置は、発癌シグナル伝達経路の活性化を有意に低下させる。したがって、非常に活発な膵臓癌細胞に対して（ＡＲ９．６及びゲムシタビン）の併用療法が調査され得る。提供される上記研究は、膵臓癌細胞に対するＡＲ９．６及びゲムシタビンの併用療法はかつて研究されていないため、高度に革新的であり、かつ、新規なものである。
【０１３１】
全ての種類の癌の中でも膵臓癌でＳＴｎ抗原の発現が最も頻繁に観察されていることが多くの研究により報告されている。コア３構造合成酵素を異所発現させてこれらの切頭Ｏ−グリカンを伸長させると膵臓癌細胞の腫瘍成長及び転移が抑制されたため、オリゴ糖の修飾は、発癌、腫瘍抑制及び転移に係る細胞活性を仲介するタンパク質の活性に影響し、そのため、腫瘍の進行特性及び生物学的特性に顕著に影響を及ぼすことが示唆される。さらに、発癌生存シグナル伝達経路の活性化による切頭Ｏ−グリカン発現膵臓癌細胞の腫瘍形成能の向上が観察された。切頭Ｏ−グリカン発現膵臓癌細胞のＭＵＣ１６に特異的なｍＡｂ  ＡＲ９．６による処置は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路のリン酸化の阻害を示した（上記参照）。これらのデータは、ＭＵＣ１６上の切頭Ｏ−グリカンは膵臓癌細胞の腫瘍形成能を向上させることを実証する。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ同所性膵臓腫瘍モデルにおけるＡＲ９．６  ｍＡｂ及びゲムシタビンの併用療法を評価して、これらの併用療法の抗腫瘍能を決定することができる。本研究により得られる前臨床データは、膵臓癌に対する新規な治療アプローチに繋がるものであって、より重要なことには、長年の目的であった新規な標的治療戦略を開発へ向けて前進するための重要な情報を提供でき、また、膵臓癌患者の全生存期間の改善への一助となるものと考えられる。
【０１３２】
以上、好適な実施形態を説明し、また、添付の図面で図示したが、これらは本開示を逸脱せずに改変され得ることが当業者に明らかであろう。かかる改変は、本開示の範囲に含まれる可能な変形例として考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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