(57)【要約】  吸着剤材料は、疎水性のモノビニルモノマーの親水性のモノビニルモノマーに対する体積の比率が約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマーを含み、該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲で緩衝可能であり、粒子の粒径は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間の粒径の粒子を含む。吸着剤は、クロマトグラフィーのカラムにおいて、血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結合を、その単離について促進するために使用され、その結果、単離されたＩｇＧは吸着剤からその後抽出される。吸着剤はまた、クロマトグラフィーのカラムにおいて、遺伝子組み換えのミルクからの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）モノクローナル抗体の結合を、その単離について促進ために使用され、その結果、単離されたＩｇＧモノクローナル抗体は吸着剤からその後抽出される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸着剤材料であって、
該吸着剤材料は、
疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率が、約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマーを含み、該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲で緩衝可能であり、粒子の粒径は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間である
ことを特徴とする吸着剤材料。
【請求項２】
粒径は、約１００マイクロメートルから約２００マイクロメートルまでの間である
ことを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項３】
粒子は、約５００オングストロームから約３マイクロメートルのサイズの孔を含む
ことを特徴とする、請求項２に記載の吸着剤材料。
【請求項４】
孔は互いに相互連結されている
ことを特徴とする、請求項３に記載の吸着剤材料。
【請求項５】
親水性モノビニルモノマーに対する疎水性モノビニルモノマーの体積は、約２０：８０である
ことを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項６】
マトリックスは、約７のｐＨに緩衝可能である
ことを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項７】
モノビニルモノマーは、約０．１ｍｅｑ／ｍｌから約１．５ｍｅｑ／ｍｌまでカルボキシル基を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項８】
カルボキシル基はおよそ０．７ｍｅｑ／ｍｌである
ことを特徴とする、請求項７に記載の吸着剤材料。
【請求項９】
モノビニルモノマーは：
ブチルアクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートを包含する、アクリル酸および疎水性のビニルを含有する化合物を含む、モノビニル酸
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項１０】
モノビニルモノマーは：
エチレン性に置換されたアミン、アリルアミン、Ｎ−アルキルエチレンアミンおよびジメチルアミノエチル・メタクリラートを包含する、置換されたアミンを含む、ビニルを含有する化合物
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項１１】
モノビニルモノマーは：
ブチルアクリラート  ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートを包含する、疎水性のビニルを含有する化合物
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項１２】
血漿から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を精製する方法であって、
該方法は、
吸着剤材料を得る工程を含み、
該吸着剤材料は、疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率が、約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマーを包含し、ここで該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲で緩衝可能であり、粒子の粒径は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間であり、
前記方法は、
クロマトグラフィーのカラムに吸着剤材料を置く工程、および
ＩｇＧを単離するためのクロマトグラフィーのカラムに血漿を通す工程
を含む、方法
【請求項１３】
血漿の単離されたＩｇＧを吸着剤材料から分離する工程
を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
血漿のＩｇＧの吸着剤材料の分離は、溶出により行われる
ことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血漿は、生の血漿である
ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生の血漿は哺乳類の血漿である
ことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生の血漿はヒト血漿である
ことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ミルクの乳漿から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）モノクローナル抗体を単離するための方法であって、該方法は、
吸着剤材料を得る工程を含み、
該吸着剤材料は、疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率が約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマーを包含し、ここで該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲で緩衝可能であり、粒子の粒径は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間であり、
前記方法は、
クロマトグラフィーのカラムに吸着剤材料を置く工程、および
ＩｇＧモノクローナル抗体を単離するためのクロマトグラフィーのカラムにミルクの乳漿タンパク質を通す工程
を含む、方法。
【請求項１９】
ミルクは遺伝子組み換えミルクを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子組み換えミルクは哺乳類のものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、以下の共同所有の米国仮特許出願に関する：２０１３年１１月１７日に出願され、Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：と題された、米国仮特許出願第６１／９０５，２３８号：および、Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅ  Ｒｅｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅ  Ｒｅｓｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙと題され、２０１３年１１月１７日に出願された、米国仮特許出願第６１／９０５，２３９号。前記開示はその全体が本明細書中に引用により組み込まれる。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は高度に選択的なクロマトグラフィーの適用のための新しいレジンの調製に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液ベースの製品に対する世界的な需要が増加し続けているので、生物工学的に精製された製品のための効果的かつ経済的な方法が求められている。こうした多くの方法には、様々な生理的な液体、天然のソース、および培養媒体からの、多数のタンパク質、酵素、ホルモンおよび他の生理活性化合物の単離が含まれている。クロマトグラフィーの分野に関連する、単離およびの精製の技術に相当な注意を払われてきた。
【０００４】
当技術分野で既知の従来のクロマトグラフィー材料は、多くの極めて重要な精製への応用に対し、十分かつ効果的には役立たない。精製された生成物は例えば、治療、化粧品および食糧において使用される。従来のクロマトグラフィー材料の適用の欠点としては、次のものがある：前処理作業を有する多段階の精製スキーム；精製中の材料の大規模な損失；および、結果として生じる低い収率および精製された産物の高コスト。
【０００５】
別の課題は、開始ソースとして生のヒトの血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の単離および精製を含んでいる。現在のＩｇＧ精製技術では、Ｃｏｈｎの工程のフラクションＩＩ＋ＩＩＩのペーストを使用する。しかしながら、前述の精製の段階の間、多数の製造工程の間にＩｇＧの少なくとも３０％を失う。故にその結果、商用での収率はもとのＩｇＧの５０％でしかない。
【０００６】
＜要約＞
本発明の実施形態は吸着剤材料に向けられ、それはマトリックスを規定する架橋した複数個のモノビニルモノマーを含む。モノビニルモノマーは、疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率が、約５：９から約４０：６０であり、マトリックスは、約５〜約９までｐＨ範囲に緩衝化され、また、約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルまでの間の粒子サイズである。吸着剤は、クロマトグラフィーィーのカラムにおいて、血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結合を、その単離について促進するために使用され、その後、単離されたＩｇＧは吸着剤から抽出される。吸着剤はまた、クロマトグラフィーのカラムにおいて、遺伝子組み換えのミルクからの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）モノクローナル抗体の結合を、その単離について促進するために使用され、その後、単離されたＩｇＧモノクローナル抗体は吸着剤から抽出される。
【０００７】
本発明の実施形態は新規の高度に選択的なクロマトグラフィーの材料に基づく。
【０００８】
本発明の実施形態はクロマトグラフィーの材料およびそれらの適用を含む。材料の中には、弱カチオン交換官能基（ｗｅａｋ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ）と疎水性官能基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ）、新しい単官能性アニオン交換樹脂剤、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの新素材を含む、二官能性のミックスモード（Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅｓ）・クロマトグラフィーの材料がある。クロマトグラフィーの材料は、タンパク質、酵素、糖タンパク質、多糖、とりわけ様々な生のソースからの、精製工程の改良に向けられる。
【０００９】
本発明の実施形態は、治療目的のための生のヒト血漿からのＩｇＧの単離および精製のための技術の効果を改良することに向けられている。
【００１０】
本発明の実施形態は、生のヒト血漿からのＩｇＧの精製方法を含む。該方法は、本発明のクロマトグラフィーの構造の使用により、生のヒト血漿からのＩｇＧのクロマトグラフィーによる精製を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態における本発明は、クロマトグラフィーの構造およびそれらの調製方法を含む。クロマトグラフィーの構造は、イオン交換の原理、疎水性、および必要な孔径を含む材料の性質を組み合わせる。これらのクロマトグラフィーの材料は、抗体生産のための様々なクロマトグラフィー法に対する利点を備えた本発明を提供する。利点としては：前処理の回避；遠心分離ステップ（あるいは精密ろ過）の置き換え；生のソースからの高度に選択的な吸着の実証；吸着物の完全な回収；高い流体力学的特性；構造の体積の安定性；および、６００ｍｌ／時間までの流速があげられる。
【００１２】
本発明の材料の構造は、低圧液体クロマトグラフィー（ＬＰＬＣ）について適用可能であり、少なくとも３バールの圧力に耐える。本発明の二官能性のミックスモードの材料または媒体は、様々な生のソースからのＩｇＧ（および多数の他のタンパク質）を捕らえるための第１の一般的な工程として、統合され得る。
【００１３】
他の従来の樹脂剤とは対照的に、本発明のミックスモード（例えば吸着剤または媒体）は、ほぼ２倍の抗体結合能力を提供する。ＩｇＧが必要とするｐＨ範囲が６から７での吸着条件は、ミックスモードを使用して高いＩｇＧの精製度をもたらすのに貢献する。本発明では、必要とされる孔径を備えた新しい疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）（ＩｇＧの最後の精製）のために使用される。本発明の実施形態の構造を使用するＩｇＧ精製の方法は、２〜３工程から成る。
【００１４】
本発明の吸着剤材料中の、高いイオン交換容量および疎水性／親水性のバランスおよび孔径（例えば大きな孔径）はＩｇＧとＩｇＧモノクローナル抗体を単離するのに必要な活性要素（ａｃｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含んでいるため、本発明により遠心分離および脱塩の必要がなくなる。
【００１５】
本発明は、イオン交換を最適化し、疎水性と親水性の平衡を保ち、同様に相互結合した孔の顆粒の粒径および関連する多孔性を介して模倣の特性を利用するように調整可能なパラメータと共に、重合体のマトリックスを利用することにより、血漿からＩｇＧを単離することができる。本発明は、血漿または遺伝子組み換えミルクを精製するための多くの予備調製工程を避ける。なぜなら、本発明は前処理を回避し；遠心分離工程（あるいは精密ろ過）を取り替え；生のソースからの高度に選択的な吸着を実証し；完全な吸着の回収を提供し；高い流体力学的特性を示し；構造の体積の安定を示し；および６００ｍｌ／時間の流速を示すためである。構造は、低圧液体クロマトグラフィー（ＬＰＬＣ）に適用可能であり、少なくとも３バールの圧力に耐える。本発明のミクスト・モード（例えば吸着剤）は、様々な生のソースからのＩｇＧ（および多数の他のタンパク質）を捕らえるための第１の一般的な工程として、統合され得る。
【００１６】
本発明の実施例は、遺伝子組み換え動物ミルクからのヒトＩｇＧの精製方法を含む。該方法は、本発明のクロマトグラフィーの構造および吸着剤の使用により、遺伝子組み換えミルクからのヒトＩｇＧ（例えばＩｇＧモノクローナル抗体）のクロマトグラフィーによる精製を含む。
【００１７】
本発明の実施形態は、吸着剤材料（または媒体）に向けられる。該吸着剤は、疎水性モノビニルモノマー（例えばコモノマー）の親水性モノビニルモノマー（例えばコモノマー）に対する体積の比率が、約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマー（例えばコモノマー）を含み、該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲に緩衝可能であり、粒子の粒径は、約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間である。
【００１８】
随意に、粒径は、約１００マイクロメートルから約２００マイクロメートルまでの間である。
【００１９】
随意に、粒子は、約５００オングストロームから約３マイクロメートルのサイズの孔を含む。
【００２０】
随意に、孔は互いに相互連結されている。
【００２１】
随意に、親水性モノビニルモノマーに対する疎水性モノビニルモノマーの体積は、約２０：８０である。
【００２２】
随意に、マトリックスは、ｐＨ約７に緩衝可能である。
【００２３】
随意に、モノビニルモノマーは、約０．１ｍｅｑ／ｍｌから約１．５  ｍｅｑ／ｍｌまでカルボキシル基を含む。
【００２４】
随意に、カルボキシル基は約０．７  ｍｅｑ／ｍｌである。
【００２５】
随意に、モノビニルモノマーは、以下のうち１種以上を含む：ブチルアクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートを包含する、アクリル酸および疎水性のビニルを含有する化合物を含む、モノビニル酸。
【００２６】
随意に、モノビニルモノマーは、以下のうち１種以上を含む：エチレン性（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に置換されたアミン、アリルアミン、Ｎ−アルキルエチレンアミンおよびジメチルアミノエチル・メタクリラートを包含する、置換されたアミンを含む、ビニルを含有する化合物。
【００２７】
随意に、モノビニルモノマーは、以下のうち１種以上を含む：ブチルアクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートを包含する、ビニルを含有する化合物を含む、モノビニル酸。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、血漿から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を単離するための方法に向けられる。該方法は、以下を含有する収着材料を獲得する工程（または代替的に供給する工程）を含む：疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率が約５：９５から約４０：６０である、マトリックスを規定する複数の架橋されたモノビニルモノマーを含み、ここで該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲に緩衝可能であり、粒子の粒径は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間である。吸着剤材料は、クロマトグラフィーのカラムに置かれ、および、血漿はＩｇＧを単離するためにクロマトグラフィーのカラムに通される。
【００２９】
随意に、方法は付加的に、吸着剤から血漿の単離されたＩｇＧを分離する工程を含む。
【００３０】
随意に、吸着剤から血漿の単離されたＩｇＧを分離する工程は、溶出により行われる。
【００３１】
随意に、血漿は、生の血漿である。
【００３２】
随意に、生の血漿は哺乳類の血漿である。
【００３３】
随意に、生の血漿はヒト血漿である。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、ミルクの乳漿から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を単離するための方法に向けられる。該方法は、以下のものを包含する吸着剤を得る工程（または代替的に提供する提供する工程）を含む：疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する体積の比率において、約５：９５から約４０：６０でマトリックスを規定する、複数の架橋されたモノビニルモノマーを含み、ここで該マトリックスは約５から約９までのｐＨ範囲で緩衝可能であり、前記吸着剤材料は約１０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの間の粒径の粒子。吸着剤は、クロマトグラフィーのカラムにおかれ、ミルクの乳漿タンパク質は、ＩｇＧモノクローナル抗体を分離するためにクロマトグラフィーのカラムに通される。
【００３５】
随意に、ミルクは遺伝子組み換えミルクを含む。
【００３６】
随意に、遺伝子組み換えミルクは哺乳類のものである。
【００３７】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料が実施され得、あるいは本発明の実施例の試験に用いることができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載されている。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が統制する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に添付の図面を参照しながら、例としてのみ記載されている。特定の図面をここで詳細に参照して、詳細が一例として、本発明の実施形態の例示的説明の目的のために示される、ということが強調される。この点では、図面について行われる記述により、本発明の実施形態を実施する方法は当業者に明らかとなる。
【００３９】
【図１】図１は本発明に係るプロセスのフローチャートである；
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る二官能性のミックスモードでの、生のヒト血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る、陰イオン交換体による生の未希釈のヒト血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製である。
【図４】図４は、本発明の実施形態に係る、生のヒト血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製である。
【図５】図５は本発明に係る別のプロセスのフローチャートである。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係るクロマトグラフィーのカラムの吸着剤に対する、乳漿たんぱくの吸着テストのチャートである。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る乳漿たんぱくのクロマトグラフィーのチャートである。
【図８】図８は、本発明の実施例に係る、乳漿の最初のｐＨにおける、大きな孔径による乳漿たんぱくのクロマトグラフィーのチャートである。
【図９】図９は、本発明の実施例に係る、小さな孔径のクロマトグラフィーカラムでの、乳漿たんぱくのクロマトグラフィーのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
＜発明の詳細な説明＞
Ｉ．生の血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製
まず、ヒト血液からの血漿（例えば生のヒト血漿）から、ＩｇＧを精製するための典型的なプロセスを詳述するフローチャートである図１に、注意を向ける。フローチャートのブロックも、このセクションを通じて参照される。
【００４１】
最初に、ブロック１０２で吸着剤が調製される。その後、ブロック１０４でクロマトグラフィーのカラムに吸着剤がロードされる。工程はブロック１０６へと移り、ここで血漿（例えば生のヒト血漿）は、ブロック１０６でＩｇＧを単離するために吸着剤をロードしたクロマトカラムに通される。単離されたＩｇＧは吸着剤に結合する。
【００４２】
工程はブロック１０６からブロック１０８へと移り、ここで単離されたＩｇＧは、ブロック１１０で、単離したＩｇＧを得るために吸着剤から溶出される。この単離したＩｇＧは、今、多数の製品に適している。
【００４３】
ブロック１０６に戻り、クロマトグラフィーのカラムの吸着剤に結合しなかった非ＩｇＧ生成物を、随意に収集してもよい。これらの生成物は、再び同じ、吸着剤をロードしたクロマトグラフィーのカラムに通されてもよく、あるいは、プロセスが再開するブロック１０６に戻ると、例えば本発明の吸着剤を含む、異なるが類似した吸着剤をロードした、クロマトグラフィーのカラムに通されてもよい。
【００４４】
ブロック１０２、１０４、１０６、１０８、１１０および１１２の工程が、所望の間、繰り返され得る。
【００４５】
Ａ吸着剤を調製する（ミックスモード調製）（図１、ブロック１０２）。
疎水性モノマー（例えばコモノマー）および親水性モノマー（例えばコモノマー）の両方から架橋され形成された構造（例えば重合体モノマーのマトリックス）を製造する方法が本明細書の以下に記載されており、該方法は、前重合段階から成る遊離基の共重合の原理による懸濁重合を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態は、コモノマー（好ましくは任意のモノビニル弱酸から成る群から選択されたモノビニルモノマー）を含み、例えばブチルアクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートなどの、アクリル酸および疎水性のビニルを含有する化合物を含む。
【００４７】
代替的に、コモノマーは、アリルアミン、Ｎ−アルキルエチレンアミン、ジメチルアミノエチル・メタクリラートのような、置換されたアミン（好ましくはエチレン性に置換されたアミン）などの、任意の弱塩基性ビニルを含有する化合物を含む群からのものである。
【００４８】
代替的に、モノビニル・コモノマーは、ブチルアクリラート  ｔｅｒｔ−ブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、オクチルおよびフェニルアクリラート、およびメタクリラートなどの、疎水性のビニルを含有する化合物を含む群からのものである。これらの材料は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の新規の樹脂剤である。
【００４９】
例えば、体積ベースで、疎水性モノビニルモノマーの親水性モノビニルモノマーに対する比率は、約５：９５から約４０：６０であり、例えば約２０：８０である。吸着剤材料は例えば、モノビニルモノマーが約０．１ｍｅｑ／ｍｌから約１．５ｍｅｑ／ｍｌ（ミリ当量／ミリリッター）までカルボキシル基を含むような状態であり、例えばカルボキシル基は約０．７ｍｅｑ／ｍｌである。
【００５０】
前述のモノマー（例えばコモノマー）のための架橋剤は、例えば、鎖に少なくとも２つの反復された炭素基、好ましくは２から１０まで反復された炭素基を有する長鎖の架橋剤である。架橋剤は、ヘキサヒドロ−１、３、５−トリアシロイルトリアジン（ｔｒｉａｃｒｙｌｏｙｌｔｒｉａｚｉｎｅ）（ＨＴＡ）、トリアリルイソシアヌラート（ｔｒｉａｌｌｙｌｉｓｏｃｙａｎｕｒａｔｅ）（ＴＡＩＣ）、ｐ−フェニレンジメタクリルアミド（ｐ−ＰＨＤＭＡ）、Ν、Ν´−メチレンジアクリルアミド（ＭＤＡＡ）、Ν、Ν’−エチレンジメタクリルアミド（ＥＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンジメタクリルアミド（ＨＭＤＭＡ）、ペンタエリトリトール  トリアクリラート（ｔｒｉａｃｒｙｌａｔｅ）（ＰＥＴＡ）およびペンタエリトリトール  テトラアクリラート（ｔｅｔｒａａｃｒｙｌａｔｅ）（ＰＥＴＥＴＡ）から成る群から選択される  ポリビニルモノマー（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｍｏｎｏｍｅｒ）である。
【００５１】
本発明のクロマトグラフィーの材料は、フリーラジカル重合法（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に基いている。方法の開始剤は、加硫酸アンモニウム、１、ｌ’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）から成る群から選択されるフリーラジカル開始剤である。コモノマーおよび開始剤は、有機溶剤（例えば有機溶剤の混合物）から成る群から好適に選択される溶液中でインキュベートされる。
【００５２】
付加的に、または随意に、コモノマーおよび開始剤は、好ましくはポリエチレングリコールとブチルアルコールの混合物、シクロヘキサノールとデシルアルコール、ラウリルアルコールである溶液中でインキュベートされる。随意に、コポリマー溶液は、酢酸とポリエチレングリコールの混合物、フォルムアミド、ブチルアルコール、シクロヘキサノールおよびデシルアルコールを含む。前重合の段階は、選択された溶剤中のコモノマーおよび開始剤を溶かす工程を含む。
【００５３】
選択された溶剤に対するコモノマー混合物の典型的な比率は、１から４の範囲にわたる。前重合の混合物をインキュベートするための典型的な媒体は、いくつかの溶剤成分の混合物から成る。ポリマー構造は、すべて前重合工程を備えた懸濁重合法によって調製される。分散媒（Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）は、無機塩類の水溶液を含んでいる。前重合の位相に対する分散媒の比率は、容積／容積で好ましくは約１乃至４から約１乃至５まである。
【００５４】
すべてのポリマー構造は前重合の工程を備えた懸濁重合によって調製される。モノビニルモノマー、架橋剤および開始剤が選択された溶液中に溶かされる。前重合の工程の間、所望の粘性を達成するために、５０−８０℃の温度にて、フリーラジカル重合が製造される。粘着性の前重合分散相は、７０−８０℃の温度にて分散媒に組み入れられ、その結果生じる生成物は、８０−９５℃にて生成される。分散媒は、硫酸ナトリウムの２０％溶液であり、および／または随意に塩化ナトリウムの水溶液である。
【００５５】
結果として生じる生成物は、（平均粒径、例えば直径において）１０μｍ−３００μｍ、例えば約１００μｍから２００μｍの範囲の、球状の顆粒（粒子）から調製されている。果粒剤（例えば粒子）は、互いに相互連結された、約５００オングストロームから約３マイクロメートルまでのサイズの孔を含む。顆粒は、氷酢酸、水、１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、１Ｍ塩酸塩（ＨＣｌ）および水で洗浄することにより、調製される。洗浄後、顆粒は湿式分留（ｗｅｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）される。
【００５６】
調製された吸着剤は、クロマトカラムにおいてチャージされる。吸着剤は、カラム中で、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液によって、約５から約９のｐＨ、例えば約ｐＨ７で衡化される。初期のｐＨが７．４までの、ヒト血液からの血漿（例えば生のヒト血漿）は、カラムに入れられる。平衡化された緩衝液によるカラムの洗浄後、結合したＩｇＧの脱離が行われる。脱離は、最後の１ＭのＮａＯＨ中で、ｐＨ５；５．５；６．０で異なる０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液の溶液による、段階的な勾配（ｓｔｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）によってもたらされる。
【００５７】
いくつかの実施例は、本発明の実施形態の構造の可能性を実証するために記載されている。結果として生じるデータは、本発明の吸着剤材料または媒体上の生ヒト血漿からのＩｇＧの分離及び精製に関する。高い選択的な収着は、第１の工程および第２の工程中における、生の始めの血漿に起因する。ＩｇＧの完全な精製（仕上げ）は、第３の工程で行われる。吸着溶出の条件は、高純度かつ完全に回収されるＩｇＧの単離の見通しを提供している。これは、例えば、吸着−溶出のｐＨ、構造の親水性−疎水性のバランス、および孔の大きさなどの要因とパラメータに起因している。以下の実施例は、非限定的であり、それゆえ、本発明の実施形態のポリマークロマトグラフィー材料の広い適用可能性を限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
Ａ１．ミックスモード（吸着剤）調製
実施例２５０ｍｌのフラスコに、撹拌機、アルゴンのためのインレットパイプおよび滴下漏斗が提供される。このフラスコへ、２０％硫酸ナトリウムが１２０ｍｌ注がれ、アルゴンは２０分間泡立たせられる。同時に、２ｍｌのフェニル・メタクリル酸塩、３ｍｌのメタクリル酸、０．９２１ｇのＨＴＡ、２ｍｌのラウリルアルコール、１１ｍｌのブタノール、１１ｍｌのシクロヘキサノール（ｃｙｌｏｈｅｘａｎｏｌ）が加えられる。コモノマーの溶解の後、０．０６ｇの１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）を加える。粘性プレポリマーを得るために１０分間６０℃の温度にて共重合を行う。プレポリマーを１２０ｍｌの２０％硫酸ナトリウムへ分散する。温度を６０−７０℃にて３０分間維持する。その後、温度を１００℃に上げ、１時間その温度で反応を継続する。次に、２５℃の温度まで冷やした後、結果として生じた球状の顆粒を分散相から分離する。顆粒を氷酢酸で洗浄し、その後水で、次に１ＭのＮＡＯＨ水溶液で、その後塩酸の１Ｍ水溶液で、最終的に水で洗浄する。収量は５．６ｇであった。調製したコポリマーを、２００μｍの、１００μｍの、および１００μｍ以下のフラクションにおいて、湿った状態で分留する：
【００５９】
これらの顆粒は、相互に連結した孔と共に、約１０００オングストロームの平均サイズの孔を有する。コモノマーの、疎水性のものの親水性のものに対する体積比は、約２０：８０であり、およびイオン交換のためのイオン濃度は、（メタクリル酸からの）カルボキシル基の約０．７ｍｅｑ／ｍｌ（ミリ当量／ミリリットル）であった。
【００６０】
Ｂ．生のヒト血漿からのＩｇＧのクロマトグラフィー
ミックスモードのフラクション１００μｍ−２００μｍの顆粒（粒子状物質）４ｍｌを、１．６ｃｍの内径、２ｃｍの高さを有するカラムへ導入し（ロードし）（図１、ブロック１０４）、１ＭＮａＯＨおよび１ＭＨＣｌおよび蒸留水（ＤＷ）で調節する。最後に、０．１Ｍの緩衝酢酸溶液によりｐＨ７で吸着剤を平衡化した。
カラム内の吸着：生のヒト血漿、０．６ｍｌ／ｍｉｎ（図１、ブロック１０６）の流速。
洗浄：０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ７
溶出：最後の１ＭのＮａＯＨ中で、ｐＨ５；５．５；６．０で異なる０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液（図１、ブロック１０８）。
【００６１】
図２−４にクロマトグラフィー分離の結果を示す。カラム（グラフ）から溶出したタンパク質、および、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色した溶出ピークの還元１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析の、プロフィールが示される。
【００６２】
図２は、弱酸および疎水性のコモノマーに基づく二官能性の構造の生の未希釈のヒト血漿からの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の１工程の精製を示し、分離グラフおよび還元された電気泳動（ＰＡＧＥ）によって提示される。分離グラフの溶出画分５は、電気泳動像のライン２に係り、溶出画分６は、電気泳動像のライン３に係り、溶出画分７は、電気泳動のライン４に係り、溶出画分８は、電気泳動のライン５に係る。溶出画分の電気泳動分析は、ヒト血清アルブミンを混合することなく単離されたＩｇＧの純度を示す。１Ｍ水酸化ナトリウムによる最終溶出は２８０ｎｍでの吸収がないことを示し、故に任意のタンパク質がないことを示す。
【００６３】
図３に示されるように、生のヒト血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の１工程での精製は、陰イオン交換樹脂を使用して行われ、分離グラフおよび還元された電気泳動（ＰＡＧＥ）によって提示される。グラフの、フロースルーおよび洗浄の画分１−４は、電気泳動像のライン１およびライン２に係る。全ての血清アルブミンが、ＩｇＧなしのフロースルーにおいて単離される。グラフの溶出画分７−１８は、電気泳動像のライン３，４，５，６に係る。人血清アルブミンの混合なしの、ＩｇＧの実際的な完全な収着が示されている。グラフの溶出画分２１−２７は、図３の電気泳動像のライン７に係る。ここで、任意のタンパク質は存在しないことが示される。溶出画分２１−２７の高い吸収Ａ２８０ｎｍは、１Ｍ水酸化ナトリウム中の溶解された低分子の混合物によるものである。
【００６４】
図４において、ヒト血漿からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の１工程での精製は、ＨＩＣ材料により行われ、分離グラフおよび還元された電気泳動（ＰＡＧＥ）が用いられる。グラフのフロースルーの画分１−３は、電気泳動像のライン１に係る。分離グラフの溶出画分６−８は、電気泳動像のライン２に係る。これは、マーカーライン３によれば、ヒト血清アルブミンおよび他の血漿タンパク質の混合なしに単離された、ＩｇＧの高い純度を示しています。分離グラフの溶出画分１０−１２は、電気泳動像のライン４に係る。ここで、任意のタンパク質は存在しないことが示される。溶出画分１０−１２の高い吸収Ａ２８０ｎｍは、１Ｍ水酸化ナトリウム中の溶解された低分子の混合物によるものである。収着−溶出サイクルの終了後のクロマトグラフィーカラムの１ＭＮａＯＨでの処理は、タンパク質を示さなかったため、すべての３つの図のＰＡＧＥの結果は、完全な吸着回収を示している。
【００６５】
ＩＩ．遺伝子組み換えのミルクからのＩｇＧの精製
まず、遺伝子組み換えミルク（例えば遺伝子組み換え哺乳類からのミルク）からのＩｇＧモノクローナル抗体の精製のための典型的なプロセスを詳述するフローチャートである、図５に注意が向けられる。フローチャートのブロックも、このセクションを通じて参照される。最初に、ブロック５０２で吸着剤が調製される。その後、ブロック５０４でクロマトグラフィーのカラムに吸着剤がロードされる。プロセスはブロック５０６へと移り、ここで液体の乳漿蛋白（以下乳漿という）は、ブロック５０６でＩｇＧモノクローナル抗体を単離するために吸着剤をロードしたクロマトカラムに通される。単離されたＩｇＧモノクローナル抗体は吸着剤に結合する。
【００６６】
ブロック５０６に先立ち、ブロック５０５にて、ミルクから乳漿を得る従来の過程により、遺伝子組み換えのミルクから乳漿を得る。例えば、乳漿を製造するために、遺伝子組み換えのミルクを加熱し、レンネットまたは食用の酸を加える。これは、遺伝子組み換えのミルクを凝結させるか凝固させて、液体の乳漿からミルク固体（カード）を分離する。
【００６７】
プロセスはブロック５０６からブロック５０８へと移り、ここで単離されたＩｇＧモノクローナル抗体は、ブロック５１０にて、単離したＩｇＧモノクローナル抗体を得るために吸着剤から溶出される。この単離したＩｇＧは、今、多数の製品に適している。ブロック５０６に戻り、クロマトグラフィーのカラムの吸着剤に結合しなかった非ＩｇＧモノクローナル抗体の生成物を、ブロック５１２にて随意に収集してもよい。ブロック５０２、５０４、５０６、５０８、５１０および５１２のプロセスが、所望される限り、繰り返され得る。
【００６８】
Ａ  吸着剤（ミックスモード調製）を調製する（図１、ブロック５０２）
ミックスモード（吸着剤）、すなわちその調製のための新規の樹脂の組み合わせおよび方法は、イオン交換、疎水性および多孔性の原理を含むいくつかの重要な材質特性を組み合わせる役割を果たす。ミックスモード吸着剤はクロマトカラムでチャージされる。
【００６９】
吸着剤は、カラムにおいて、ｐＨ６の０．１Ｍ酢酸ナトリウムの緩衝溶液によって平衡化される。ｐＨ４．５の乳漿は（ミルクがカゼインから脱する）ｐＨ７（ＮａＯＨを数滴）で処理され、カラムにロードされる。平衡化された緩衝液によるカラムの洗浄後、結合したＩｇＧの吸着が行われる。脱離は、最後の１ＭのＮａＯＨ中で、ｐＨ５，ｐＨ６、ｐＨ７、およびｐＨ８で異なる０．３６Ｍの酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）緩衝液の溶液による、段階的な勾配によってもたらされる。
【００７０】
いくつかの実施例は、本発明の実施形態の構造の可能性を実証するために記載されている。得られたデータは、本発明の構造または媒体上での生ヒト血漿からの乳漿蛋白の分離及び精製に関する。多数のＩｇＧにおける全乳漿タンパク質は、新規の構造によって吸収されることが示されている。高純度かつ完全な回収を有するタンパク質の単離の見通しを提供する吸着条件は、例えば、吸着のｐＨ、構造の疎水性の寄与、および孔の大きさなどの要因およびパラメータに起因している。以下の実施例は、非限定的であり、それゆえ、本発明の実施形態のポリマークロマトグラフィー材料の広い適用可能性を限定するものではない。吸着剤材料は上に詳述された吸着剤材料または媒体に従って調製されている。
【００７１】
Ａ１．ミックスモード（吸着剤）調製
この吸着剤の製造は、”ミックスモード調製”について上の詳述された実施例に従っている。
【００７２】
Ｂ．乳漿蛋白のクロマトグラフィー
ミックスモードのフラクション１００μｍ−２００μｍの４ｍｌを、１．６ｃｍの内径、２ｃｍの高さを有するカラムへ導入し、１ＭＮａＯＨおよび１ＭＨＣｌで調節する。最後に、吸着剤はカラムのｐＨ４．７収着で０．１Ｍの緩衝酢酸溶液で平衡化される：５０ｍｌのミルク乳漿は０．６ｍｌ／分の流速で適用される。
洗浄：０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．７。
溶出：１ＭのＮａＯＨ中で、ｐＨ：４．５；５；５．２；５．５；６．０；７．０；８．０で異なる０．３６Ｍのクエン酸塩緩衝液ポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００７３】
クロマトグラフィーの分離の結果が図７、８および９に示される。カラム（グラフ）から溶出した乳漿蛋白、および、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色した溶出ピークの還元１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析の、プロフィールが示される。
【００７４】
図６は、ミックスモード樹脂の乳漿蛋白の吸着試験を示す。ライン１は、生の最初の乳漿のタンパク質を表す。
【００７５】
ライン２、３は、大きな孔のミックスモードでのクロマトグラフィーからの０．３６Ｍ  ＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ５〜５．５）で溶出された画分である。この得られたデータは、生の最初の乳漿（ライン３）の内容物によれば、大きな孔のミックスモード（レーン５および６）でのすべての乳漿蛋白の収着を示す。ＩｇＧの吸着が示される。低分子量の乳漿蛋白は、小さな孔の新規の構造にて分離される（レーン１および２）。孔径、疎水性の寄与、およびｐＨが異なっている、新規の構造による吸着と溶出の条件の最適化は、ＩｇＧ（ＩｇＧモノクローナル抗体）の精製の実現を可能にする。
【００７６】
図７は、大きな孔のミックスモード樹脂（吸着剤）の乳漿蛋白のクロマトグラフィーを示す。ＩｇＧ（例えばＩｇＧモノクローナル抗体）が他のタンパク質と共に分離されることが示される（レーン３および４）。ＩｇＧの精製のために、ｐＨの吸着脱着条件の最適化が必要である。
【００７７】
図８は、乳漿の当初のｐＨにて、大きな孔のミックスモード樹脂剤（例えば吸着剤）による、乳漿蛋白のクロマトグラフィーを示す。実証されたデータからは、乳漿たんぱくの当初のｐＨ値における吸着により、低分子量（ＭＭ）タンパク質からの２番目の工程の分離が可能になることが示される。
【００７８】
図９は、小さな孔径および相当な疎水性でミックスモード樹脂剤（例えば吸着剤材料）での乳漿蛋白のクロマトグラフィーを示す。調製されたデータは、小型の孔および必須の疎水性の寄与（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を備えた新規の構造により、低いＭＭタンパク質の分離が可能となることを示す。ｐＨ４の吸着条件は、乳漿蛋白の当初のｐＨ値である。
【００７９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの複合は、「含むがこれに限定されない」を意味する。この用語は、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００８０】
語句「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、追加の成分および／または工程が特許請求されている組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変更しない場合にのみ、組成物または方法は、追加の成分および／またはステップを含んでもよい、ということを意味する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の引用を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、それらの混合物を包含する複数の化合物を含んでもよい。
【００８２】
「典型的に（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という単語は、本明細書中で、「実施例、例または例示として役立つ」ことを意味する。「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」と記載される任意の実施形態は、他の実施形態よりも好ましいか又は有利であるものとしては必ずしも解釈されず、および／または、他の実施形態からの特徴の組み込みを必ずしも除外しない。
【００８３】
単語「随意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、本明細書中で、「いくつかの実施形態で提供され、他の実施形態で提供されない」ことを意味するように用いられる。本発明の任意の特定の実施形態は、このような機能が競合しない限り、「随意の」複数の特徴を包含し得る。
【００８４】
本出願を通して、本発明の様々な態様が範囲形式（ｒａｎｇｅ  ｆｏｒｍａｔ）で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜と簡潔さのためであり、本発明の範囲において柔軟でない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、あり得る全てのサブ範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅｓ）を、その範囲内の個々の数値と同様に、具体的に開示したものと考えられるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどのように、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６と同様に、サブ範囲を具体的に開示したものと考えられるべきである。これは範囲の幅にかかわらず適用される。
【００８５】
数値範囲が本明細書に示されているときはいつでも、指示された範囲内の任意の支持された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第一の指示数および第二の指示数の「間の範囲／範囲の（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ）」という語句および、第一の指示数および第二の指示数の「からの範囲／範囲の（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ  ｆｒｏｍ）」という語句は、本明細書において交換可能に使用され、第一および第二の指示された数値、およびすべての分数および整数の数値を、その間に含むという意味である。
【００８６】
量、範囲および大きさ、寸法および他の測定可能な量を表す場合、単語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」および「約（ａｂｏｕｔ）」は交換可能に使用される。
【００８７】
明確性のために別々の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態中に組み合わされて提供され得る、ということが認識される。逆に、簡略化のために単一の実施形態の文脈において記載されている本発明の様々な特徴は、別々に、または任意の適切なサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）にて、又は本発明の他の実施形態において適切に提供され得る。実施形態は、それらの要素なしで効力がない限り、様々な実施形態の文脈で記載された特定の特徴は、こそれらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【００８８】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されるが、多くの代替、変更および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲の内に入る、そのような全ての代替、修飾および変形を包含することが意図されている。
【００８９】
あたかも個々の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ引用によって本明細書中に組込まれることが示されるのと同程度に、本明細書で言及される刊行物、特許および特許出願はすべて、全体が引用によって本明細書中へ組み入れられる。さらに、本出願における引用または任意の参考文献の特定は、こうした参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されないものとする。セクションの見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2016540235.tif 000013
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