(57)【要約】【構成】本発明では、バーコード技術における最近の進歩を携帯型無線通信デバイスに応用して、簡単な上にコストの低いチップ系多重無線検出システムを構築する。本システムを利用すると、対象となる複数のターゲットを同時にしかも数分で分析できる。本発明は、医薬品、農業や環境を始めとする広範な分野における病原体や汚染体の検出に適用可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる複数のターゲットを同時に同定する検出システムにおいて、
（ａ）異なる集団の一次ラベルおよび二次ラベルを有し、各集団の一次ラベルが対象となるターゲットの一つに特異的なリガンドに結合し、各集団の一次ラベルが、励起源に暴露されたときに、この結合されたターゲット特異性リガンドに対応する第１信号を発生でき、そして前記二次ラベルが別なターゲット特異性リガンドに結合し、かつ励起源に暴露されたときに、第２信号を発生でき、前記第１信号と前記第２信号が結合して、対象となるターゲットの存在下において総合信号を発生する多重検出素子、および
（ｂ）（ｉ）前記第１信号および第２信号を取り込む画像取り込み手段および（ｉｉ）前記の取り込まれた信号を分析する処理手段を有し、前記ターゲットに対応する前記総合信号が取り込まれたときに対象となるターゲットを同定する携帯型無線通信デバイスからなることを特徴とする検出システム。
【請求項２】
前記一次ラベルおよび二次ラベルがバーコード、金属、半導体または有機系ナノ構造体または分子、有機染料、またはこれらの組み合わせから構成される請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記リガンドがヌクレオチド系リガンド、アミノ酸系リガンド、多糖類系リガンド、蛋白質系リガンド、抗原、抗体、ホルモン、あるいはその他の有機分子または無機分子を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１信号および第２信号が光信号であり、このシステムがさらに前記一次ラベルおよび二次ラベルを励起する励起源、および励起された一次ラベルおよび二次ラベルからの発光光信号を収集する光学手段を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記第１信号および第２信号が光信号であり、前記携帯型無線通信デバイスがさらに一次ラベルおよび二次ラベルを励起する励起源、および励起された一次ラベルおよび二次ラベルからの発光光信号を収集する光学手段を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記一次ラベルがバーコードである請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記バーコードが動的な基体を介して溶液中の静的な基体または流れに結合する請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記基体がガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記基体が動的基体であり、この動的基体がマイクロチャネルまたは毛細管網を有する請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記基体が前記集団のバーコードおよび二次ラベルを受け取ることができる複数の凹み部を有する表面か、あるいはバーコードおよび二次ラベルが付着処理される実質的に平坦な表面を有する請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第１信号および第２信号が光信号であり、さらに第１光信号および第２光信号を収集する対物手段を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記無線通信デバイスが（ｉ）取り込まれた信号を遠隔地にネットワークシステムを介して送るか、（ｉｉ）取り込まれた信号の分析結果を遠隔地にネットワークシステムを介して送るか、あるいは（ｉｉｉ）取り込まれた信号および取り込まれた信号の分析結果の両者を遠隔地にネットワークシステムを介して送る通信手段を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記の取り込まれた信号の分析結果が、前記サンプル中の前記複数のターゲットの数量化結果を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記複数のターゲットが単細胞微生物および多細胞微生物、無機分子および有機分子を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記有機分子がペプチド、蛋白質、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸シーケンス、アミノ酸シーケンス、ＲＮＡシーケンスおよびＤＮＡシーケンスを有し、無機分子が金属原子を含有する請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記画像取り込み手段が、一次ラベルおよび二次ラベルからの信号を撮像（イメージング）できるカメラである請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記処理手段が命令を有し、命令が実行されたときに、サンプル内の対象となるターゲットを識別し、かつこれらターゲットを数量化するように第１信号および第２信号を識別する請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記バーコードが量子ドットを有する請求項６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記携帯型無線通信デバイスがスマートフォン、コンピュータ、タブレット、あるいは時計である請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
サンプル中の対象となる複数のターゲットの存在を同時に同定する方法において、（ａ）対象となる前記複数のターゲットとの相互作用時に前記複数のターゲットの一つにそれぞれ対応する異なる信号を発生する多重検出システムにサンプルを接触させ、（ｂ）携帯型無線通信デバイスによって信号を収集し、そして（ｃ）この携帯型無線通信デバイスを使用して、収集された信号を分析し、サンプル中に対象となる複数のターゲットが存在していることを同定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記多重検出システムが、異なる集団の一次ラベルおよび二次ラベルを含み、各集団の一次ラベルが対象となる複数のターゲットの一つに特異的なリガンドに結合し、各集団の一次ラベルが、励起源に暴露されたときに、この結合されたターゲット特異性リガンドに対応する第１信号を発生でき、そして前記二次ラベルが別なターゲット特異性リガンドに結合し、かつ励起源に暴露されたときに、第２信号を発生でき、前記第１信号と前記第２信号が結合して、対象となるターゲットの存在下において総合信号を発生し、そして前記工程（ｂ）に先立って、前記多重検出システムを前記サンプルとともに前記励起源に暴露して、対象となる前記ターゲットに対応する、異なる集団の第１信号および第２信号を発生し、一つのターゲットに対応する前記総合信号の収集時に前記サンプル中にこの一つのターゲットが存在することを同定する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記励起源への前記暴露に先立って、少なくとも一つの洗浄工程を実施して、未結合物質を除去する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（ｃ）の分析において、前記サンプル中の前記複数のターゲットを数量化する請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記一次ラベルおよび二次ラベルがバーコード、金属、半導体または有機系ナノ構造体および分子、有機染料、またはこれらの組み合わせから構成される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドがヌクレオチド系リガンド、アミノ酸系リガンド、多糖類系リガンド、蛋白質系リガンド、抗原、抗体、ホルモン、あるいはその他の有機分子または無機分子を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記一次ラベルがバーコードである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記バーコードが動的な基体を介して溶液中の静的な基体または流れに結合する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記基体が（ｉ）多重検出システムを受け取ることができる複数の凹み部を有する表面、あるいは（ｉｉ）多重検出システムを付着処理する実質的に平坦な表面を有する静的な基体である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記基体がガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記基体が動的基体であり、この動的基体がマイクロチャネルまたは毛細管網からなる請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記工程（ｂ）において（ｉ）第１端部で信号を収集し、そして（ｉｉ）信号を第２端部にネットワークシステムを介して送り、工程（ｃ）において第１端部または第２端部で信号を分析するか、あるいは第１端部および第２端部の両端部で信号を分析する請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２端部が前記第１端部から遠隔位置にある請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２端部が前記第１端部から複数の遠隔位置にある請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のターゲットが単細胞微生物、多細胞微生物、無機分子および有機分子を有する請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記有機分子がペプチド、蛋白質、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸シーケンス、アミノ酸シーケンス、ＲＮＡシーケンスおよびＤＮＡシーケンスを有し、無機分子が金属原子を含有する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象となる複数のターゲットを同時に検出するバーコードアセンブリーにおいて、（ａ）表面を有する基体、および（ｂ）この表面に結合した異なる集団のバーコードであって、各集団のバーコードが複数のターゲットの一つに対して特異的なリガンドを有するバーコードを有することを特徴とするアセンブリー。
【請求項３７】
前記バーコードアセンブリーが携帯型である請求項３６に記載のアセンブリー。
【請求項３８】
前記基体の表面が、前記異なる集団のバーコードを受け取ることができる複数の凹み部を有する請求項３６に記載のアセンブリー。
【請求項３９】
前記基体の表面が、前記の異なる集団のバーコードを付着処理する、実質的に平坦な表面を有する請求項３６に記載のアセンブリー。
【請求項４０】
前記基体がガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である請求項３６記載のアセンブリー。
【請求項４１】
複数のターゲットを同時に検出するバーコードのアセンブリーを製造する方法において、（ａ）バーコードを付着処理できる表面を有する基体を用意し、（ｂ）この基体の表面を異なる集団のバーコードに接触させ、そして（ｃ）これら異なる集団のバーコードを前記基体の表面に付着処理することを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４２】
前記基体の表面が、前記多重検出システムを受け取ることができる複数の凹み部を有する請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記基体の表面が、前記多重検出システムを付着処理する、実質的に平坦な表面を有する請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記基体がガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は情報管理、ターゲット検出および意志決定支援の分野に関し、具体的にはスマートフォン、タブレット、個人用携帯型情報端末機器（ＰＤＡ）などの無線通信デバイス、あるいはコンピュータ技術にバーコード技術を併用して、データを取得し、これを分析し、かつこれを送信するシステムおよび方法に関する。特に、本発明の場合、無線通信デバイス技術にバーコード技術を併用して、チップをベースとする多重検出システムを設計し、疾患マーカー、病原体、汚染体やその他の対象となる有機・無機のターゲットの存在を分析追跡し、取得されたデータを無線で指定位置または複数の位置に送信するものである。
【背景技術】
【０００２】
インターネット技術、ソーシャルメディアやスマートフォンの進歩によって現在地球規模で通信方法が大きく変化している。世界のどこかで発生した出来事に関する情報は直ちに地球規模で伝わる。にもかかわらず、これらの新しい通信方法はいまだ検出デバイスと十分に統合化されていないため、検出方法を単純化できる程度までに至っていない。また病原体、疾患マーカー、汚染源やその他の対象となる有機・無機のターゲットを地球規模で調査できる程度までに至っていない。疾患に関する例を挙げると、世界人口の多くは、資源に乏しい状態に、即ちコスト制約条件、安定な上に複雑なインフラの必要性、デバイスサイズ、および診断結果を分析できる専門家の必要性の理由から、現在普及している検出システムを利用できない状態に置かれている（文献１〜３）。この結果、疾患の未診断、誤診断が増え、薬剤耐性の原因になり、経済的な負担が増し、罹病率や死亡率が高くなっている。２０１１年現在において世界全体で加入者数が５９億以上になっているスマートフォンなどの無線通信デバイス（文献４）や最新の多重化検出デバイスを持つタブレットとの統合化が実現できれば、これら問題を緩和でき、また疾患や汚染拡散に関するリアルタイムな地球規模の調査が可能になると考えられる。
【０００３】
現状では、スマートフォンなどの“スマート”なモバイル装置は、ラテラル  フロー  イムノアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光体で標識化した細菌や組織染色における試験線の撮像に使用されているに過ぎない（文献５〜７）。ところが、これらの撮像技術では分析感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が低いため、感染や汚染の初期段階を検出できず、また複数のバイオマーカーを同時検出できないため、異なる株や病原体を高処理能力で検出できない。これら制限を取り払うために、携帯電話技術をラテラル  フロー  イムノアッセイや分子病理学などのポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）デバイスと併用する試みはあるにはある（文献４〜８）。しかし、いずれの技術も分析感度が低く、多重化能力に限界がある（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ）。スマートフォンを撮像技術と併用することを示す文献には記載があるが、スマートフォンやタブレットなどの無線通信デバイス技術をより複雑なターゲット検出スキームと結合することは依然として大きな課題であり、この課題を解決できれば、検出プロセスの処理能力をレベルアップできる上に、病原体や汚染株、あるいは突然変異などの複数のターゲットを同時に検出できると考えられる。
【０００４】
バーコード技術の一つの実例、即ち量子ドット（ＱＤ）バーコード技術の場合、分子検出に多様性を示し、ゲノムターゲットやプロテオミクスターゲットを始めとする多様なターゲットを検出できる（文献１２〜１４）。各バーコードには、例えばバーコードを構成するマイクロビーズ内に異なる発光ＱＤを設けているため重複しない光学記号を設けることができる。このバーコードが次に、対象となる分子、病原体マーカー、汚染体や全病原体（ｗｈｏｌｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ）などのターゲットに特異的に結合するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）と共役化する。このバーコード（一次ラベル）によって対象となるターゲットを同定できる一方で、このターゲットに二次ラベルが結合し、この結合が、ターゲットがバーコードリガンドによって確実に取得されたことを示す。一次ラベル/バーコード信号と二次ラベル信号からなる光学記号が、サンプルから対象となるターゲットを確実に検出したことを示す。これらバーコードをポイントオブケア検出に使用するという課題では、マイクロビーズ数、インキュベーション（培養）時間やマイクロビーズの安定性に微妙な差異が発生すると、これが分析特性に影響するため、専門家がアッセイ（評価）を行う必要がある。これらバーコードをチップに組み付けること（集積化）ができれば、これら問題を緩和できると考えられる。チップに集積化したマイクロビーズは現在分析をシーケンス化するさいに使用されているが、最終チップのコストはマイクロビーズが光ファイバーの端部に集積化されているため、高い（文献１５）。従って、現在の蛍光マイクロビーズの集積化技術は、遠隔地や資源に乏しい状態における通常の検出分野では費用対効果が薄い。
【０００５】
現在、無線通信デバイスを、対象となる複数のターゲットを有効に同時検出できるバーコード化技術と併用するシステムは存在しない。特に、複数の汚染体や病原体を有効に同時検出し、汚染体や病原体種間を識別できるバーコード化技術に無線通信デバイスを併用するシステムは現在見当たらない。従って、本発明の目的の一つは、バーコード化技術と、携帯型無線通信デバイスとを併用して、汚染体、疾患マーカー、病原体、突然変異体、ペプチド類、ゲノムターゲット、多糖類やその他の対象になり得る有機・無機のターゲットなどの複数のターゲットを同時検出するシステムを提供することにある。
【０００６】
本発明の別な目的は、携帯型無線通信デバイス技術と、バーコード技術とを併用したシステムおよび方法であって、サンプルから情報を収集し、この情報を分析し、この分析を使用して対象となる複数のターゲットを同時に同定する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）ために好適なシステムおよび方法を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに別な目的は、携帯型無線通信デバイス技術と、バーコード技術とを併用したシステムおよび方法であって、収集された情報を遠隔地に無線送信し、この情報を保存し、あるいはさらに分析できるシステムおよび方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の前記以外の目的に関しては、以下の発明の概要、発明の詳細な説明、発明の実施態様および実施例から理解できるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yager P et al.(2006) Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature 442:412-8. 335
【非特許文献２】Chin CD, Under V, Sia SK(2007) Lab-on-a-chip devices for global health: past studies and future opportunities. Lab on a chip 7:41-57.
【非特許文献３】Martinez AW, Phillips ST, Whitesides GM, Carrilho E (2010) Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices.
【非特許文献４】International Telecommunication Union Statistics Available at: 340 http://www.itu.int/ict/statistics.
【非特許文献５】Mudanyali O et al. (2012) Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab Chip. 2012 Aug 7; 12(15):2678-86.
【非特許文献６】Zhu H, Sikora U, Ozcan A (2012) Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. The Analyst 137:2541-4. 345
【非特許文献７】Breslauer DN, Maamari RN, Switz N a, Lam W a, Fletcher D a (2009) Mobile phone based clinical microscopy for global health applications. PloS One 4:e6320.
【非特許文献８】Korteweg C, Gu J (2010) Pandemic influenza A (H1N1) virus infection and avian influenza A (H5N1) virus infection: a comparative analysis.  Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire 88:575-87. 350
【非特許文献９】Smith GJD et al. (2009) Dating the emergence of pandemic influenza viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 1 1709-12.
【非特許文献１０】Yerly S et al.(2001) Nosocomial outbreak of multiple bloodborne viral infections. The Journal of Infectious Diseases 184:369-72.
【非特許文献１１】Chu C et al. (2001) Hepatitis C : Comparison with acute heptitis B -  Comparison of clinical, 355 virologic and pathologic features in patients with acute hepatitis B and C. Journal of Gastroenterology and Hepatology 16:209- 214.
【非特許文献１２】Giri S, Sykes EA, Jennings TL, Chan WCW (2011) Rapid screening of genetic biomarkers of infectious agents using quantum dot barcodes. ACS  Nano 5: 1580-7.
【非特許文献１３】Klostranec JM et al. (2007) Convergence of quantum dot barcodes with microfluidics and 360 signal processing for multiplexed high-throughput infectious disease diagnostics. Nano Letters 7:2812-8.
【非特許文献１４】Han M, Gao X, Su JZ, Nie S (2001) Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nature Biotechnology 19:631-5.
【非特許文献１５】Walt DR (2010) Fibre optic microarrays. Chemical Society Reviews 39:38-50. 365
【非特許文献１６】Zhu H, Mavandadi S, Coskun AF, Yaglidere O, Ozcan A (2011)  Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical chemistry 83:6641-7.
【非特許文献１７】Fournier-Bidoz S et al. (2008) Facile and rapid one-step mass preparation of quantum-dot barcodes. Angewandte Chemie (International ed in English) 47:5577-81.
【非特許文献１８】Peng X, Schlamp MC, Kadavanich AV, Alivisatos AP (1997) Epitaxial Growth of Highly 370 Luminescent CdSe / CdS Core / Shell Nanocrystals with Photostability and Electronic Accessibility. Journal of American Chemical Society 119:7019-7029.
【非特許文献１９】Hines MA, Guyot-Sionnest P (1996) Synthesis and  Characterization of Strongly Luminescing ZnS-Capped CdSe Nanocrystals. The Journal of Physical Chemistry 100:468-471. 375
【非特許文献２０】Dabbousi BO et al. (1997) (CdSe) ZnS Core-Shell Quantum Dots: Synthesis and Characterization of a Size Series of Highly Luminescent Nanocrystallites. Journal of Physical Chemistry B 101 :9463-9475.
【非特許文献２１】Guizar-Sicairos M, Thurman ST, Fienup JR (2008) Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters 33: 156-8. 380
【非特許文献２２】Guizar-Sicairos M Efficient subpixel image registration by cross- correlation. Available at: http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/18401 -efficient- subpixel-image-registration-by-cross-correlation.
【非特許文献２３】Ballard DH (1981) Generalizing the Hough Transform to detect arbitrary shapes. Pattern Recognition 13: 111-122. 385
【非特許文献２４】Peng T Detect circles with various radii in grayscale image via Hough Transform. Available at: http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9168-detect-circles- with-various-radii-in-grayscale-image-via-hough-transform.
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、無線通信デバイスと、量子ドットバーコード化システムなどのバーコード化多重検出システムとを併用して、サンプル中の病原体、病原体マーカー、ペプチド類、プロテオミック、ゲノムターゲット、多糖類、有機・無機の分子など有機・無機の複数のターゲットの同時検出を可能にするシステムおよび方法を提供するものである。本発明のシステムの場合、多重検出システムからの光信号を撮像するカメラを備えた携帯型無線通信デバイスを使用して、対象となる複数のターゲットを定量的に分析できる。本発明のシステムおよび方法の場合無線能力をもつため、遠隔状態においても使用でき、収集されたデータおよび結果を無線送信して遠隔地において情報を保存および/またはさらに分析でき、ターゲットのマッピングおよび調査測定が可能になる。さらに、本発明のシステムおよび方法の場合、病原体や汚染体の分散移動について地球規模でリアルタイムに調査測定することができ、また潜在的に疫学的マッピングを簡単に実施できる。
【００１１】
一つの実施態様では、本発明は対象となる複数のターゲットを同時に同定する検出システムに関する。このシステムは、一つの実施態様では、（ａ）異なる集団の一次ラベルおよび二次ラベルからなり、各集団の一次ラベルが対象となるターゲットの一つに特異的なリガンドに結合し、各集団の一次ラベルが、励起源に暴露されたときに、この結合されたターゲット特異性リガンドに対応する第１信号を発生でき、そして二次ラベルが別なターゲット特異性リガンドに結合し、かつ励起源に暴露されたときに、第２信号を発生でき、ある集団の第１信号と第２信号が結合して、対象となるターゲットの存在下において総合信号を発生する多重検出素子、および（ｂ）（ｉ）前記第１信号および第２信号を取り込む画像取り込み手段および（ｉｉ）前記の取り込まれた信号を分析する処理手段からなり、前記ターゲットに対応する前記総合信号が取り込まれたときに対象となるターゲットを同定する携帯型無線通信デバイスから構成するものである。
【００１２】
本発明システムの一つの実施態様の場合、一次ラベルおよび二次ラベルはバーコード、金属、半導体または有機系ナノ構造体または分子、有機染料、またはこれらの組み合わせからなる。
【００１３】
本発明システムの別な実施態様の場合、リガンドはヌクレオチド系リガンド、アミノ酸系リガンド、多糖類系リガンド、蛋白質系リガンド、抗原、抗体、ホルモン、あるいはその他の有機分子または無機分子からなる。
【００１４】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、第１信号および第２信号は光信号であり、このシステムがさらに一次ラベルおよび二次ラベルを励起する励起源、および励起された一次ラベルおよび二次ラベルからの発光光信号を収集する光学手段を有する。
【００１５】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、第１信号および第２信号は光信号であり、前記携帯型無線通信デバイスがさらに一次ラベルおよび二次ラベルを励起する励起源、および励起された一次ラベルおよび二次ラベルからの発光光信号を収集する光学手段を有する。
【００１６】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、一次ラベルはバーコードである。
【００１７】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、バーコードは動的な基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を介して溶液中の静的な基体または流れに結合する。
【００１８】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、基体は（ｉ）多重検出システムを受け取ることができる複数の凹み部を有する表面、あるいは（ｉｉ）多重検出システムを付着処理する実質的に平坦な表面を有する静的な基体である。
【００１９】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、基体はガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である。
【００２０】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、基体はマイクロチャネルまたは毛細管網からなる動的な基体である。
【００２１】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、基体は集団のバーコードおよび二次ラベルを受け取ることができる複数の凹み部（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎｓ）を有する表面か、あるいはバーコードおよび二次ラベルが付着処理される実質的に平坦な表面からなる。
【００２２】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、第１信号および第２信号が光信号であり、さらに第１光信号および第２光信号を収集する対物手段を有する。
【００２３】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、無線通信デバイスが、（ｉ）取り込まれた信号を遠隔地にネットワークシステムを介して送るか、（ｉｉ）取り込まれた信号の分析結果を遠隔地にネットワークシステムを介して送るか、あるいは（ｉｉｉ）取り込まれた信号および取り込まれた信号の分析結果の両者を遠隔地にネットワークシステムを介して送る通信手段を有する。
【００２４】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、取り込まれた信号の分析結果がサンプル中の複数のターゲットの数量化結果を有する。
【００２５】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、複数のターゲットが単細胞微生物および多細胞微生物、無機分子および有機分子を有する。
【００２６】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、有機分子がペプチド、蛋白質、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸シーケンス、アミノ酸シーケンス、ＲＮＡシーケンスおよびＤＮＡシーケンスを有し、無機分子が金属原子を含有する。
【００２７】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、画像取り込み手段が、一次ラベルおよび二次ラベルからの信号を撮像（イメージング）できるカメラである。
【００２８】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、処理手段が命令を有し、命令が実行されたときに、サンプル内の対象となるターゲットを識別し、かつこのターゲットを数量化するように第１信号および第２信号を識別する。
【００２９】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、バーコードが量子ドットからなる。
【００３０】
本発明システムのさらに別な実施態様の場合、携帯型無線通信デバイスがスマートフォン、コンピュータ、タブレット、あるいは時計である。
【００３１】
一つの実施態様において、本発明はサンプル中の対象となる複数のターゲットの存在を同時に検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）方法に関する。この方法では、（ａ）対象となる複数のターゲットとの相互作用時に複数のターゲットの一つにそれぞれ対応する異なる信号を発生する多重検出システムにサンプルを接触させ、（ｂ）携帯型無線通信デバイスによって信号を収集し、そして（ｃ）携帯型無線通信デバイスを使用して、収集された信号を分析し、サンプル中に対象となる複数のターゲットの存在していることを同定する。
【００３２】
本発明方法の一つの実施態様の場合、多重検出システムが、対象となる複数のターゲットそれぞれにつき異なる集団の一次ラベルおよび二次ラベルからなり、各集団の一次ラベルが対象となる複数のターゲットの一つに特異的なリガンドに結合し、各集団の一次ラベルが、励起源に暴露されたときに、この結合されたターゲット特異性リガンドに対応する第１信号を発生でき、そして二次ラベルがターゲット特異性リガンドに結合し、かつ励起源に暴露されたときに、第２信号を発生でき、各集団の第１信号と第２信号が結合して、対象となるターゲットの存在下において総合信号を発生するものである。この方法の場合、工程（ｂ）に先立って、サンプルを含む多重検出システムを励起源に暴露して、対象となるターゲットに対応する異なる集団の第１信号および第２信号を発生し、前記一つのターゲットに対応する総合信号が収集されたときにサンプル中に一つのターゲットが存在していることを同定することからなる。
【００３３】
本発明方法の別な実施態様の場合、励起源に暴露する前に、少なくとも一つの洗浄工程を実施して、未結合物質を除去する。
【００３４】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、工程（ｃ）の分析に先立って、サンプル中の複数のターゲットを数量化する。
【００３５】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、一次ラベルおよび二次ラベルはバーコード、金属、半導体または有機系ナノ構造体または分子、有機染料、またはこれらの組み合わせたものからなる。
【００３６】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、リガンドはヌクレオチド系リガンド、アミノ酸系リガンド、多糖類系リガンド、蛋白質系リガンド、抗原、抗体、ホルモン、あるいはその他の有機分子または無機分子からなる。
【００３７】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、一次ラベルはバーコードである。
【００３８】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、前記バーコードが動的な基体を介して溶液中の静的な基体または流れに結合するバーコードである。
【００３９】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、基体は（ｉ）多重検出システムを受け取ることができる複数の凹み部を有する表面、あるいは（ｉｉ）多重検出システムを付着処理する実質的に平坦な表面を有する静的な基体である。
【００４０】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、基体はガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である。
【００４１】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、基体はマイクロチャネルまたは毛細管網からなる動的な基体である。
【００４２】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、工程（ｂ）において（ｉ）第１端部で信号を収集し、そして（ｉｉ）信号を第２端部にネットワークシステムを介して送り、工程（ｃ）において第１端部または第２端部で信号を分析するか、あるいは第１端部および第２端部の両端部で信号を分析する。
【００４３】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、第２端部は第１端部から遠隔位置にある。
【００４４】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、第２端部は第１端部から複数の遠隔位置にある。
【００４５】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、複数のターゲットが単細胞微生物、多細胞微生物、無機分子および有機分子を有する。
【００４６】
本発明方法のさらに別な実施態様の場合、有機分子がペプチド、蛋白質、オリゴ糖、脂質、遺伝子、ヌクレオチドシーケンス、アミノ酸シーケンス、ＲＮＡシーケンスおよびＤＮＡシーケンスを有し、無機分子が金属原子を含有する。
【００４７】
本発明は、一つの実施態様において、対象となる複数のターゲットを同時に検出するバーコードアセンブリーに関する。このアセンブリーは、（ａ）表面を有する基体、および（ｂ）この表面に結合した異なる集団のバーコードであって、各集団のバーコードが複数のターゲットの一つに対して特異的なリガンドを有するバーコードを有する。
【００４８】
本発明のバーコードアセンブリーの一つの実施態様の場合、アセンブリーが携帯型である。
【００４９】
本発明のバーコードアセンブリーの一つの実施態様の場合、基体の表面が、多重検出システムを受け取ることができる複数の凹み部からなる。
【００５０】
本発明のバーコードアセンブリーの別な実施態様の場合、基体の表面は、多重検出システムを付着処理する実質的に平坦な表面からなる。
【００５１】
本発明のバーコードアセンブリーのさらに別な実施態様の場合、基体はガラス、紙、セルロースまたはプラスチックからなる群から選択される静的な基体である。
【００５２】
本発明は、一つの実施態様において、複数のターゲットを同時に検出するバーコードアセンブリーの製造方法に関する。この製造方法では、（ａ）バーコードを付着処理できる表面を有する基体を用意し、（ｂ）基体の表面を異なる集団のバーコードに接触させ、そして（ｃ）異なる集団のバーコードが基体の表面に接着させる。
【００５３】
本発明の別な実施態様の場合、前記実施態様の基体は、バーコードを付着処理する実質的に平坦な表面からなる。
【００５４】
本発明のさらに別な実施態様の場合、前記実施態様の基体が、バーコードを受け取ることができる複数のマイクロウェルまたは凹みを有する。
【００５５】
本発明のさらに別な実施態様の場合、前記実施態様の基体はガラス、紙、セルロースまたはプラスチック基体からなる群から選択される静的な基体である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
例示のみを目的として、実施態様について図面を参照して説明する。
【図１】本発明の一つの実施態様におけるバーコード/携帯型無線通信デバイスシステムを示す概略図である。図１Ａに示す実施態様の場合、このシステムは（サンプルとのハイブリダイゼーション後の）異なる量子ドットバーコードを有するマイクロウェルチップ、異なる量子ドットバーコード（一次ラベル）および二次ラベルからの発光信号を可視化する光学手段、光学手段から信号を取り込み、信号を分析する携帯型無線通信デバイス、および携帯型無線通信デバイスから信号を無線受信し、これの保存および/または分析の続行を行う集中機構を有する。図１Ｂは、各ウェル内に異なるバーコードを有するマイクロウェルチップを示す写真である。図１Ｃは、携帯型無線通信デバイスカメラを使用して撮影した顕微鏡写真であり、チップの表面に組み付けた５種類の異なる量子ドットバーコード（実際の写真はカラー写真である）の画像を示す顕微鏡写真である。これらバーコードをＨｇランプ（λｅｘ＝３５０/５０）で励起し、光信号を倍率が２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．５０）で収集し、４３０ｎｍのロングパスフィルターでフィルター処理し、Ａｐｐｌｅ  ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォンを用いて０．０５秒の露光時間で撮像を行った。図１Ｄの写真は、（図１Ｄの左側にある）図１Ｃのスマートフォンによって撮像した光学像の他のデバイスへの無線送信を示すものである。
【図２】アッセイ画像および感度曲線を示す図である。図２Ａは、チップに付着処理した緑色、黄色および赤色（実際はカラー写真であり、矢印で強調して示す実施例、図８にＢ１、Ｂ４およびＢ６で示す）バーコードの顕微鏡写真であり、ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォンカメラ（蛍光顕微鏡法パラメータ：ＮＡ＝０．５０における倍率が２０倍の対物レンズ、λｅｘ＝３５０/５０、λｅｍ＝４３０ＬＰ、露光時間＝０．０５秒）を使用して撮像したものである。マイクロウェルについては、明視野顕微鏡法を使用して視覚化している。蛍光像および明視野像が重なっている。図２Ｂは、アッセイ後を示すもので、マイクロビーズバーコードの無線通信デバイスカメラで取得した蛍光像にターゲット被検体および二次ラベル化プローブが結合している（蛍光顕微鏡法パラメータ：ＮＡ＝０．５０における倍率が２０倍の対物レンズ、λｅｘ＝６４０/４０、λｅｍ＝６９２/４０、露光時間＝１秒）。緑色ビーズおよび赤色ビーズの両ビーズ（実際はカラー写真）は存在するが、黄色ビーズ（矢印で強調した実施例）は存在しない。これは、サンプル中にはＴ１、Ｔ６ゲノムターゲットは存在するが、Ｔ４は存在していないことを説明するものである。なお、バーコード上の白色スポットは、Ａｌｅｘａ６４７蛍光体と、Ｂ６内に含侵した６４０ｎｍ量子ドットとの合成強度が高いために発生した過剰露光が理由である。図２Ｃは、感染症への適用例としてだけここで使用するインフルエンザＡウィルスＨ１Ｎ１（Ｔ１）、Ｈ３Ｎ５（Ｔ２）、Ｈ５Ｎ１（Ｔ３）、およびＢ４２０型肝炎（Ｔ４）、Ｃ型肝炎（Ｔ５）の遺伝子バイオマーカー感度曲線である。エラーバーはいずれも三回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図３】感染症への適用例としてだけ使用する５種類の感染症ターゲット分子鎖Ｔ１〜Ｔ５ならびにネガティブコントロールＴ６およびポジティブコントロールＴ７の多重化検出を示す図である。図３の場合、ＡＴ７のみがハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｂの場合、ターゲットＴ１、Ｔ３、Ｔ５、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｃの場合、ターゲットＴ２、Ｔ４、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｄの場合、ターゲットＴ１、Ｔ２、Ｔ３、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｅの場合、ターゲットＴ４、Ｔ５、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｆの場合、Ｔ６を除くすべてのターゲットがハイブリダイゼーション時に存在していた。なお、Ｔ６を除いて、図３Ａ〜図３Ｆにおける他のいずれの値も図３Ｆにおけるそれぞれ正の値に対して標準化してある。
【図４】本発明の一つ実施態様における２．０μｍ（●）および２．９μｍ（■）についてのマイクロビーズの濃度およびサイズによって求めたマイクロウェルチップのマイクロビーズバーコード充填効率を示すグラフである。
【図５】量子ドットバーコードの強度を示すグラフである。７つのバーコードすべてについて既知のバーコード強度を示す。左から右にバーはフィルターλｅｍ＝５３０/１０（白色）、λｅｍ＝５８０/１０（斜線）、λｅｍ＝６４０/１０（格子縞）、およびλｅｍ＝６９２/４０（黒色）において観察した強度を示す。エラーバーはいずれも三回の複製からの標準偏差として算出したものである。
【図６】カスタム設計シーケンス（取り込みシーケンス：５´−ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ−３´；ターゲットシーケンス：５´−ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ａ  ＣＴＡ  ＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  Ｃ−３´；二次プローブシーケンス：５´−Ａｌｅｘａ６４７−ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  Ｇ−３´）について（Ａ）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｒｅｔｉｇａ  ＥＸｉ  Ｆａｓｔ１３９４、Ｑｉｍａｇｉｎｇ）および（Ｂ）ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラ（ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓ、Ａｐｐｌｅ  Ｉｎｃ．）を用いて撮像した画像から得た感度曲線の比較を示す。水平線が検出限界を示し、いずれも場合も〜１５ｆｍｏｌである。エラーバーについてはいずれも三回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図７】各バーコードについての取り込み鎖共役効率を示すグラフである。エラーバーについてはいずれも二回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図８】ＤＮＡシーケンス、これらの対応するバーコード画像および対応するバーコードスペクトルをリストアップした表である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書および特許請求の範囲において、多数の用語・術語に触れるが、いずれも定義すると、以下のような意味を有するものである。また、数値に関する表記、例えば範囲を含む寸法および重量は近似値であり、一般に適宜０．１、１．０または１０．０の増分で（＋）または（−）は変更することができる。すべての数値表記にはいずれも“約”が付くものと理解すべきである。
【００５８】
単数表現については、特に断らない限り、複数表現を含意するものである。
【００５９】
“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は、記載した要素が必ず含まれ、しかも他の要素が適宜含まれることを意味する。“Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”は、リストアップした要素を必ず含み、リストアップした要素の基本的な特性および新規な特性に重要な影響をもつ要素についてはこれらを排除し、かつ他の要素については適宜含むことを意味する。“Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”はリストアップした要素以外の要素はすべて排除されることを意味する。これら用語・術語によって定義され、記載される実施態様については、いずれも本発明の範囲内にある。
【００６０】
本明細書で使用する用語“リガンド（ｌｉｇａｎｄ）”または“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、有機または無機の取り込み分子（ｃａｐｔｕｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、あるいは一つかそれ以上の有機または無機のターゲットに対して選択的および／または特異的な結合を示す分子の群を指す用語である。ターゲットとしては、レセプター、プローブ、別な（有機または無機の）分子、あるいは病原体などのターゲット/ホール（単細胞または多細胞）微生物の特異部位を挙げることができる。所定のターゲットに対してリガンドは一つ以上存在することができる。リガンドは、ターゲットに対する結合親和性において相互に異なるものである。リガンドを例示すると、ヌクレオチド系リガンド（アプタマー、オリゴヌクレオチドなど）、アミノ酸系リガンド（抗体、ペプチド、蛋白質、酵素、レセプターなど）、多糖類系リガンド（ヒアルロナンなど）、抗原、ホルモン（ペプチドホルモン、脂質/リン脂質ホルモン、モノアミンホルモンなど）や有機または無機のターゲットに結合できるその他の分子を挙げることができる。
【００６１】
多重（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）は、２つ以上のターゲットの存在を同時に検出できる能力を指す用語である。多重検出システムとしては、バーコード、金属、半導体、あるいは有機系ナノ構造体または分子（例えば有機染料）を挙げることができる。
【００６２】
バーコードとしては、ターゲットを識別できる構造体またはシステムならば任意のタイプのものを使用することができる。本発明に使用可能なバーコードを例示すると、磁気バーコード、光バーコード（即ち量子ドットバーコード、有機染料バーコード）、電気バーコード、ＤＮＡバーコードやリトグラフ式バーコードを例示できる。
【００６３】
本明細書で使用するように、“量子ドット（ＱＤ）”は、従来知られているように、半導体性を示す光ルミネセンス材料である（例えば、Ａｌｉｖａｓａｔｏｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：９３３−９３７（１９９６）を参照）。ＱＤを非限定的に例示すると、ＣｄＳ量子ドット、ＣｄＳｅ量子ドット、ＣｄＳｅ/ＣｄＳコア/シェル量子ドット、ＣｄＳｅ/ＺｎＳコア/シェル量子ドット、ＣｄＴｅ量子ドット、ＰｂＳ量子ドット、および/またはＰｂＳｅ量子ドットを挙げることができる。当業者には公知なように、ＣｄＳｅ/ＺｎＳは、ＣｄＳｅコア面にＺｎＳシェルを被覆することを意味する（即ち“コア/シェル”量子ドット）。コア/シェルＱＤのシェル材料はバンドギャップが高く、コアＱＤ面を不動体化する結果、ＱＤよりも量子収量が高くなり、安定性が増し、用途が広くなる。
【００６４】
量子ドットバーコードは、異なる組み合わせの蛍光半導体ナノ結晶を含有するマイクロビーズを指す用語である。各マイクロビーズには、表面共役化分子（ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を同定する重複しない光記号を設けることができる。ほぼ１０，０００〜４０，０００の異なる光マイクロビーズについては、５〜６の異なるカラー量子ドットおよび６つの強度レベルを使用して設計することができる（文献９）。これによって、有意味な多重化が可能になり、そしてこれらバーコードによりフローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（文献１０〜１３）やマイクロフルーイド（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）チャネル（文献１４、１５）を使用して、あるいは他の手段を使用してターゲットを検出できる。
【００６５】
無線通信デバイスは、ワイヤ、ケーブル、あるいは光ファイバーの代わりに無線周波、赤外線、マイクロ波、あるいは他のタイプの電磁波または音波を使用して、信号またはデータを送信または受信する任意のデバイスを指す。また、このデバイスは画像、信号またはデータを取り込むカメラを備え、またこれら画像、信号またはデータの分析を持続する電子構成部分を有する。無線通信デバイスを例示すると、スマートフォン、タブレット、スマートウォッチ、携帯型情報端末や携帯型コンピュータを挙げることができる。
【００６６】
本発明によれば、バーコードなどの多重検出システムと、スマートフォンまたはタブレット技術といった携帯型無線通信デバイスとを統合化したものを対象となるターゲットの多重検出および同定、データの無線通信を行うシステムに使用することができる。検出デバイスの場合、携帯型無線通信デバイスと、多重検出システムとを統合化し、光学的機器、励起源および検出素子を現在のスマートフォンまたはタブレット程度のサイズに統合することを意図している。
【００６７】
図１Ａを参照して説明すると、一つの実施態様の場合、システム１００は多重検出システムを受け取る基体１２０、および無線通信デバイス１３０から構成することができる。図１Ａに示すように、多重検出システムは一次ラベル１１０、二次ラベル１１２、およびこれら一次および二次のラベル１１０および１１２に結合した対象ターゲットに対するリガンド１１１から構成することができる。この二次ラベルについては、一次ラベルに結合したものと同じターゲット特異性リガンドに結合してもよく、あるいは別なターゲット特異性リガンドに結合してもよい。図１では、一次ラベル１１０は量子ドットバーコードとして示す。なお、他の多重化システムも使用することが可能であり、またＱＤバーコード以外の一次ラベルを使用することも可能である。また、本システムには一次パネル１１０および二次パネル１１２を励起する励起源１４０、励起された一次ラベルおよび二次ラベルから光学的に発光した光を集光する対物レンズ１５０、および励起源からのビームおよび一次ラベルおよび二次ラベルから発光した光をフィルター処理する一つかそれ以上のフィルター１４２、１４４を設けることができる。システム１００はまた、無線通信デバイス１３０に収集されたデータを無線受信して、収集されたデータを保存するか、あるいはこれをさらに分析する集中装置（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｆａｃｉｌｉｔｙ、集中機構）１６０を有することができる。
【００６８】
本発明システムに使用することができる励起源を例示すると、発光ダイオード、レーザーダイオード、レーザーやランプバーナーを挙げることができる。非発光励起源を例示すると、電気的な潜在源を挙げることができる。本発明システムに使用することができる光フィルターを例示すると、吸着性ガラスフィルター、染料フィルター、色フィルター、ダイクロイックミラー、ビームスプリッターや薄膜偏光子を挙げることができる。
【００６９】
本発明の一つの実施態様の場合、無線通信デバイスそれ自体に、少なくとも一つの励起源、励起されたバーコードから発光した光を集光する対物レンズ、二次ラベルおよび一つかそれ以上のフィルターを設けることができる。
【００７０】
基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）については、多重検出システムを受け取ることができ、かつ携帯型であれば、任意の基体を使用することができる。基体としては、静的な基体、あるいは動的な基体を使用できる。好適な基体を例示すると、多重検出システムを受け取ることができるか、あるいはバーコードを付着処理できる実質的に平坦な表面を挙げることができる。具体的には、ガラススライド、セルロース膜、紙、プラスチック膜やプラスチックスライドなどを挙げることができる。動的基体としては、マイクロチャネルまたは毛細管網を例示することができる。利便性の点から、静的基体には一つかそれ以上のウェルを設けることも可能であり、多重検出システムを組織化するのに役立つ。静的基体の場合、この基体の表面に多重検出システムを結合することが可能である。また動的基体の場合、多重検出システムは基体を介して溶液中において流動することが可能である。
【００７１】
図１Ａを参照して説明すると、多重検出および/または同定（識別）および無線データ送信を行うこのようなシステム１００の開発に向けて、スライドなどの微細作成した基体１２０の表面にバーコード１１０などの一次ラベルを組み付けることによって携帯型として構成することが可能な多重チッププラットフォームを製作することができる。図１Ａに示す基体には、一次ラベルおよび二次ラベルを受け取る複数の凹み（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）即ちマイクロウェル１１５を設ける。基体１２０にサンプルを付加することができ、無線通信デバイス１３０を使用して、基体１２０から信号１２５を収集し、即ち取り込み、これら信号を畳み込み、病原体、疾患マーカーや汚染体（不純物）などの特異的なターゲットと信号を関連付けることができる。
【００７２】
対象となる異なるターゲットに対して特異的なリガンドまたはプローブについては、バーコードなどの一次ラベルに、そして二次ラベルに共役化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、即ち結合する。リガンドまたはプローブのバーコードまたは二次ラベルへの共役化即ち結合は、使用するリガンドまたはプローブのタイプ、およびバーコードおよび二次ラベルの表面の化学的特性に依存するものである。共役化方法を例示すると、媒介されたカルボジイミド、マレイミド、ｎ−ヒドロスクシンイミドまたはチオール−金属化学作用、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーション、抗原−抗体反応、蛋白質/小分子（ストレプトアビジン−ビオチン）などを使用する方法を挙げることができる。例えば、オリゴヌクレオチド系リガンドまたはプローブは、カルボジイミド化学作用を使用して、各バーコードの表面に共役化することができる。
【００７３】
図１Ａを参照する説明を続けると、次に、リガンド１１１を共役化したバーコード１１０を複数の凹み１１５を有する微細作成チップ即ち基体１２０に配列することができる。各凹みとしては直径が３μmのウェル（ＭｉｃｒｏＰｅｐ）を使用することができる。バーコードビーズは、任意の公知方法、例えばフローフォーカシング（ｆｌｏｗ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）方法を使用して（文献１６）用意することができる。バーコードビーズのサイズについては、任意の適当なサイズであればよい。例えば、マイクロウェルの直径と同様なサイズであればよい。バーコードのパネルを含有する、好ましくは緩衝液などの溶液をチップ上に直接添加すればよい。次に、バーコードを次に各ウェルに沈降させればよく、マイクロチップに結合後のアッセイ時にマイクロビーズがチップから簡単に脱着することはない。図４に示すように、チップ上への充填率については、ビーズの濃度およびサイズによって決まる。本発明におけるアッセイでは、一般的に、取り込まれた分子のビーズ面へのアクセスを最大化するために、２５〜５０％の充填率を採用する。図１Ｂは、各ウェルの異なるバーコードを含有する代表的なマイクロウェルチップを示す写真である。黒色矢印は、チップ上で分析すべきサンプルの滴を示す。サンプルについては、ほぼ室温かそれ以上の温度で培養することが可能である。次に、チップをリンス処理し、無線通信デバイスを用いて撮像すればよい。図１Ｃは、チップ面に組み付けた量子ドットバーコードの無線通信デバイスによって取り込んだ画像を示す顕微鏡写真である。
【００７４】
別な実施態様では、本発明システムはサンプル中の対象となる複数のターゲットを同時に検出する方法に使用することができる。一つの実施態様の場合、本発明方法は、（ａ）多重検出システム内部に分配配設した基体にサンプル接触させる工程であって、この多重検出システムが複数のターゲットとの相互作用時に異なる信号を発生でき、各信号が特定のターゲットに対応する工程、（ｂ）無線通信デバイスを使用して、基体からの信号を収集する工程、そして（ｃ）無線通信デバイスを使用して、収集された信号を分析することによって、サンプル中の複数のターゲットを同時に検出する工程からなる。本発明の一つの態様では、工程（ｃ）の分析では、サンプル中の複数のターゲットを数量化する。
【００７５】
本出願人は、チップの表面にマイクロビーズバーコードなどの一次ラベルを組み付ける方法を開発した。一つの実施態様では、ガラススライドに直径が３．０μmの凹みを微細作成技術によって形成できる。直径が約３．０μmのマイクロビーズを使用することができる、異なる組み合わせの蛍光体を有するマイクロビーズバーコードの溶液を次にチップに付加すればよい。マイクロビーズバーコードは各マイクロウェルに沈降する。マイクロウェルに一旦結合した後は、これらマイクロビーズがマイクロウェルの表面から脱着することはない。マイクロビーズは非共有力によって所定位置に保持されることになる。バーコードの濃度およびサイズによって充填率が決まる（図４を参照）。
【００７６】
図１Ａを参照して説明すると、被験者体液などの対象サンプル、即ち環境サンプルを一次ラベル１１０、リガンド１１１および二次サンプル１１２を含有するチップ１２０に載置して適当な時間量、例えば約２０分間培養し、リンス処理または水洗処理し、分析システムに載置すればよい。次に、励起源１４０を使用して一次ラベルおよび二次ラベルを励起する。光信号の収集は対物レンズによって行えばよい。光信号を一つかそれ以上のフィルター１４２、１４４でフィルター処理してから、無線通信デバイスカメラ１３０を使用して信号を撮像し、無線通信デバイス１３０を使用して分析すればよく、あるいは集中装置１６０において遠隔分析を行ってもよく、あるいは他の無線通信デバイスによって分析を行ってもよく、あるいは両者を組み合わせて行ってもよい。本発明の一つの実施態様では、収集された信号データは、カスタム仕様アルゴリズムを使用して陽性（＋）か陰性（−）かを判定すればよい。なお、このアルゴリズムについては、無線通信デバイスに統合化/ダウンロード/アップロードすることができる。次に、データを集中装置に無線送信し、さらに評価を行ってもよく、保存を行ってもよく、あるいは病原体または汚染体のマッピングや追跡を行ってもよい。特異的なターゲットが検出されるのは、リガンドがターゲットに結合し、かつマイクロビーズの総合信号が一次ラベルおよび二次ラベルの両者から構成されている時である。
【００７７】
本発明方法の一つの実施態様では、一次ラベルは第１リガンドに結合し、そして二次ラベルは第２リガンドに結合すればよく、いずれのラベルも対象となる同じターゲットに対して親和性を示す。第１リガンドおよび第２リガンドについては、同じでもよく、あるいは異なっていてもよい。適当な時間が経過し、ラベルがリガンドに結合した後に、洗浄工程を実施して、未結合物質を洗い流すことができる。次に、ターゲット特異性リガンドに結合した一次ラベルおよびターゲット特異性リガンドに結合した二次ラベル両者とともに対象となるサンプルを培養すればよい。培養後に、少なくとも１回洗浄工程を行い、未結合の物質がある場合にはこれ除去すればよく、この後に励起/分析ステップが続く。
【００７８】
別な実施態様では、二次ラベルを、リガンドに結合した一次ラベルに付加することができる。次に、一次ラベルがリガンドに結合し、二次ラベルが一次ラベルに結合した状態で適当な時間サンプルの培養を行えばよい。サンプル培養後に、洗浄工程を実施して、未結合物質がある場合はこれを除去すればよい。洗浄工程後に励起工程を実施すればよい。
【００７９】
さらに別な実施態様では、リガンドに一次ラベルを結合した状態で適当な時間量対象となるサンプルを培養することができる。次に、二次ラベルを適当な時間付加すればよい。未結合物質がある場合にこれを除去する洗浄工程については、二次ラベルの付加前に、あるいは二次ラベルの付加後に、あるいは二次ラベルの付加前および付加後の両方において実施してもよい。励起工程については、洗浄工程後に行えばよい。
【００８０】
図１Ｂは、各ウェルに異なるバーコードを有する、本発明の一つの実施態様によるマイクロウェルチップを示す図である。バイオアッセイの場合、例えば約１０μＬのサンプルをチップ（黒色矢印を参照）に載置し、４０℃で培養し、リンス処理し、そして撮像を行えばよい。図１Ｃを参照して説明すると、無線通信デバイスカメラによってチップの表面に組み付けた異なるバーコードの画像を取り込むことができる（図１Ｃの場合、異なる５種類のＱＤバーコード）。これらバーコードについては、Ｈｇランプ（λｅｘ＝３５０/５０）などの好適な励起源によって励起すればよい。光信号については、対物レンズによって収集すればよい。光信号については、例えば波長が４３０ｎｍのパスフィルターを使用してフィルター処理すればよく、Ａｐｐｌｅ  ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォンなどの無線通信デバイスを使用して撮像すればよく、露光時間は０．０５秒に設定すればよい。図１Ｄに、光学画像の他の無線通信デバイスへの無線伝送を示す。
【００８１】
本発明の作用効果は次の通りである。（ａ）他の携帯電話系の方法と比較した場合、一つか複数（即ち２以上）のターゲットを検出できる（即ち多重化）；（ｂ）溶液中に保存するバーコードとは違ってバーコードをチップ上に付着処理できるため、バーコードの高い携帯性を確保でき、バーコードアッセイにおける工程数を減らすことが可能になり、（ｃ）デバイスそれ自体も携帯性を確保でき（デバイスが取り付けられるスマートフォンやタブレットのサイズよりも大きくなることはない）；（ｄ）量子ドットバーコードを同定（識別）する従来の検出プラットフォームの場合、高価な器具/検出器を必要とし、遠隔地で資源が制限されている状態やフィールドでは使用することができない（文献１２、１３）；（ｅ）本発明システムおよび方法の場合、手順が少なく、複雑でないため、使用が簡単かつ容易であるため、熟練技術者が必要ない；そして（ｆ）サンプルの付着処理からそれほど時を置かず３０分未満に検出を実施でき、分析結果を得ることができる。
【００８２】
本発明の理解および実施の一助として、以下に例示的な非限定的実施例を示す。
【実施例】
【００８３】
量子ドット合成
本実施態様では、発光ピーク波長が５４０ｎｍの（ＣｄＳｅＳ合金化−ＺｎＳでキャップした）量子ドット（ＱＤ５４０）をＣｙｔｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から購入し、取り扱い説明書に従って使用した。発光ピーク波長が５８９ｎｍおよび６４０ｎｍの量子ドット（ＱＤ５８９）および（ＱＤ６４０）については、文献の記載（１８〜２０）に従って合成し、キャラクタリゼーションを行い、使用するまでの間室温でクロロホルム中において保存した。他のタイプのＱＤナノ粒子も使用可能である。
【００８４】
量子ドットバーコード合成
本実施態様では、異なる比率の量子ドット（ＱＤ５４０、ＱＤ５８９、ＱＤ６４０）をポリマー系溶液と混合することによってＱＤバーコードを用意した。このポリマー溶液は、クロロホルムに溶解したＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のポリ（スチレン−コ−マレイン酸無水物）（３２％、クメン末端）からなるものである。ポリマー濃度は４重量％に設定した。次に、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ製のシリンジポンプを使用して流量０．９ｍＬ/時間で、かつフォーカシング流体として再蒸留（ＤＤ）水を１８０ｍＬ/時間の流量で使用してＩｎｇｅｎｉａｔｒｉｃｓ製のノズルシステムに前記の量子ドットポリマー溶液を導入してから、ＤＤ水を部分的に充填したビーカー内部にノズルシステムを沈めた。ポリマーバーコードビーズをその場で合成し、ビーズからなるＤＤ水白色コロイド状懸濁液を生成した。合成後、弁を閉め、一夜撹拌してビーズを安定化し、これを回収した。３５μmのＢＤ  Ｆａｌｃｏｎナイロンメッシュストレーナーキャップを使用してビーズをフィルター処理し、自動Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンターを使用してキャラクタリゼーションを行い、使用するまでの間４℃においてＤＤ水中に保存した。７種類の異なるバーコードを用意するために必要な量子ドット濃度を表２に示す。
【００８５】
マイクロウェルチップ上へのバーコードビーズ付着処理
直径が３μmのウェルを複数有するガラススライド（ＭｉｃｒｏＰｅｐ）上に５種類のバーコードビーズ（図８のＢ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６）を高いマイクロウェル充填率で高分散させるために、それぞれに対して濃度が３×１０７ビーズ/ｍＬのサンプルを用意した。次に、各サンプル２μＬをＤＤ水３５μＬおよび１％のＴｗｅｅｎを含有するＤＤ水５μＬと混合し、最終濃度を６×１０６ビーズ/ｍＬにした。次に、混合物を５分間音波処理し、ビーズ凝集を抑制してから、３０μＬをマイクロウェルチップに付着処理し、チップをＤＤ水でリンス処理し、乾燥し、この後に付着処理を行った。次に、ダスト粒子汚染を防止する防湿剤を有する密封乾燥室にチップを入れ、２時間乾燥してから撮像を行った。なお、混合物中のビーズ濃度を高くすると、マイクロウェル充填率が高くなるが（図４）、凝集のリスクが大きくなる可能性がある。
【００８６】
バーコード共役化および検証（Ｂａｒｃｏｄｅ  Ｂｅａｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）
ＤＮＡ取り込み鎖（即ちＣ１〜Ｃ７の５´端部に存在するアミン基）の対応するバーコードビーズ（即ちＢ１〜Ｂ７の重合体１７０からなる表面に存在するカルボン酸基）への共役化を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）との反応により行った。Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．製のＤＮＡ取り込み鎖について購入したものをＨＰＬＣ精製し、この状態で５´端部のアミン基および１２塩基スペーサーを用いて設計した。まず、ＴＥ緩衝液中１０ｐｍｏｌ/μＬの濃度で用意し、使用するまでの間４℃で保存した。共役化を行うために、ＥＤＣをまず１００ｍｇ/ｍＬの濃度でＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５、１００ｍＭ）に溶解した。ＥＤＣ溶液１００μＬとほぼ１０６個のビーズを混合し、ビーズのカルボキシル基を１０分間活性化した。次に、２８．８ｐｍｏｌのＤＮＡに対応するＤＮＡ取り込み鎖の２．８８μＬをビーズ溶液に加えた。反応を一夜行った。
【００８７】
共役化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を検証（ｖａｌｉｄａｔｅ）するために、５％Ｔｗｅｅｎを含有する１μＬのＤＤ水を１８０個のビーズ溶液に加え、３０００ｇにおいて５分間遠心分離した。次に、５０μＬの上澄み液を抽出した。ビーズの代わりにＤＤ水を加える以外は前記と同じ共役化操作を行い、各バーコードに対する対照例とした（即ち非共役化例）。９６個のウェルを形成した黒色プレートにおいて、７つのすべての共役化例からの１０μＬの上澄み液、７つすべての対照例からの１０μＬの上澄み液、およびＤＤ水のみを含有する１０μＬの４つのブランク例をそれぞれ個々のウェルに加えた。ＤＭＳＯに溶解したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉの１μＬをＴＥ緩衝液の１０ｍＬに加えることによってこれを１：１００００に希釈してから、希釈された溶液１９０μＬをサンプル含有ウェルそれぞれに加えた。すべての反応体を室温で１５分間培養してから、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ製プレートリーダーによって読み取りを行った。次に、共役化例の蛍光を、ビーズを含有しないそれぞれの対照と比較することによってバーコード毎の共役化量を求めた。即ち、信号が低いほど、共役化量が大きい。結果を効率（％）に変換した（図７を参照）。
【００８８】
共役化操作を終了するために、５０μＬの上澄み液を検証のために抽出した後、残っている上澄み液を除去した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＤＤ水の１００μＬを使用して共役化ビーズを（１９５）２回洗浄し、３０００ｇにおいて５分間遠心分離し、非共役化ＤＮＡ取り込み鎖がある場合にはこれを除去した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有する１００μＬのＤＤ水中において４℃で共役化ビーズを次に使用するまでの間保存した。
【００８９】
感度アッセイ
すべての感染疾患ＤＮＡターゲット鎖（図８のＴ１〜Ｔ５）およびそれぞれの共役化バーコードビーズ（図８のＢ１−Ｃ１〜Ｂ５−Ｃ５）のマイクロウェルチップ上において直接感度アッセイを行った。感度結果を図５に示す。Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．製のＤＮＡ取り込み鎖について購入したものをＨＰＬＣ精製し、その状態においてＴＥ緩衝液中０、５、１０、５０、１００、５００、１０００、２０００ｆｍｏｌ/μＬの増分濃度で用意した。５´端部にＡｌｅｘａ６４７蛍光体を有する、ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＤＮＡ検出鎖について購入したものをＨＰＬＣ精製し、その状態でＴＥ緩衝液中１００ｐｍｏｌ/μＬの濃度で用意した。ＤＮＡ取り込み/検出鎖サンプルを次に使用するまでの間４℃で保存した。アッセイを行うために、約１０４個の共役化ビーズに対応する共役化ビーズサンプルの１μＬをアッセイ条件毎にマイクロウェルチップに付着処理し、１時間乾燥処理を行った。次に、５μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（６０℃に加熱した１０×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、３μＬのＤＤ水、および１μＬのＤＮＡ検出鎖またはＤＤ水（ブランク条件）と各ＤＮＡ取り込み鎖サンプルの１μＬを混合した。この結果、各アッセイ条件につき１０μＬの合計ハイブリダイゼーション容量が得られ、濃度はブランク、０、５、１０、５０、１００、５００、１０００、２０００ｆｍｏｌであった。アッセイ条件毎に、マイクロウェルチップ上の共役化ビーズスポット全体にハイブリダイゼーション溶液を付着処理し，４０℃で２０分間培養した。次に、洗浄緩衝液（４０℃に加熱した０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１０ｍＬ中にマイクロウェルチップを沈め、撹拌によって２０秒間洗浄してから、５分間乾燥処理し、その後撮像した。なお、洗浄緩衝液が乾燥し、サンプルスポット全体において結晶化しないように留意すべきである。
【００９０】
多重化アッセイ
３−ｐｌｅｘ多重化アッセイ（図２Ａおよび図２Ｂ）のために、それぞれほぼ２×１０４のバーコードに相当する２μＬの各共役化バーコードサンプル（Ｂ１−Ｃ１（緑色）、Ｂ４−Ｃ４（黄色）およびＢ６−Ｃ６（赤色））を１８μＬのＤＤ水と混合し、希釈係数を元の４倍にした。希釈の目的は、チップへの付着後のビーズ凝集を抑制するためであり、ビーズ凝集が生じると、分析時にバーコードの解像に問題が生じることになる。アッセイを行うために、ほぼ１．２５×１０３の共役化ビーズに相当する５μＬの共役化バーコード混合物をアッセイ条件毎にマイクロウェルチップ上に付着処理し、３時間乾燥した。次に、２μＬのＴ１およびＴ６（各濃度：２ｐｍｏｌ/μＬ）を４０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（６０℃に加熱した１０×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、１４μＬのＤＤ水および１６μＬの検出鎖（濃度：１００ｐｍｏｌ/μＬ）と混合した。この結果、合計ハイブリダイゼーション容量が７０μＬになった。これから１０μＬのハイブリダイゼーション溶液を取り、マイクロウェルチップ上の共役化バーコードスポット全体に付着処理し、４０℃で２０分間培養した。次に、マイクロウェルチップを１０ｍＬの洗浄緩衝液（４０℃に加熱した０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に沈め、２０秒間撹拌によって洗浄し、さらに別な１０ｍＬの洗浄緩衝液を使用して再び洗浄して非特異的な結合をさらに抑制し、この後５分間乾燥を行ってから、撮像を行った。なお、洗浄緩衝液が乾燥し、サンプルスポット全体において結晶化しないように留意すべきである。
【００９１】
これら５種類のＤＮＡターゲット鎖（Ｔ１〜Ｔ５）すべてと、対応する共役化バーコード（Ｂ１−Ｃ１〜Ｂ５−Ｃ５）との間の交差反応性、ならびにネガティブ対照例・ポジティブ対照例（それぞれＢ６−Ｃ６およびＴ６、そしてＢ７−Ｃ７およびＴ７）との交差反応性について、検討を行った（図３Ａ〜図３Ｆ）。まず、それぞれほぼ６×１０４のバーコードに相当する６μＬの各共役化バーコードサンプルを１２６μＬのＤＤ水と混合し、希釈係数を元の４倍にした。希釈の目的は、チップへの付着後のビーズ凝集を抑制するためであり、ビーズ凝集が生じると、分析時にバーコードの解像に問題が生じることになる。アッセイを行うために、ほぼ２×１０４の共役化ビーズに相当する８μＬの希釈共役化バーコード混合物を多重化毎にマイクロウェルチップ上に付着処理し、４時間乾燥した。次に、２μＬの各標的例（ネガティブ条件のＤＤ水、およびポジティブ条件の２ｐｍｏｌ/μＬの対応するＤＮＡ標的鎖サンプル）を３５μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（６０℃に加熱した１０×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、１４μＬのＤＤ水および７μＬの検出鎖（濃度：１００ｐｍｏｌ/μＬ）と混合した。この結果、合計ハイブリダイゼーション容量が多重化例それぞれについて７０μＬになった。これから多重化２例それぞれについて２０μＬのハイブリダイゼーション溶液を取り、マイクロウェルチップ上の共役化バーコードスポット全体に付着処理し、４０℃で２０分間培養した。次に、マイクロウェルチップを１０ｍＬの洗浄緩衝液（４０℃に加熱した０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に沈め、２０秒間撹拌によって洗浄し、さらに別な１０ｍＬの洗浄緩衝液を使用して再び洗浄して非特異的な結合をさらに抑制し、この後５分間乾燥を行ってから、撮像を行った。なお、洗浄緩衝液が乾燥し、サンプルスポット全体において結晶化しないように留意すべきである。
【００９２】
サンプル撮像
オリンパスＩＸ７０倒立顕微鏡に装着した（特に断らない限りではあるが）Ａｐｐｌｅ製のｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓを使用して、すべてアッセイ（倍率１０倍でＮＡ＝０．３０の対物レンズ）については１０ｘの倍率で、あるいはすべての写真（倍率２０倍でＮＡ＝０．５０プラスさらに倍率１．６倍の対物レンズ）については３２倍の倍率で画像を取得した。励起−吸収フィルターセット[λｅｘ＝３５０/５０、λｅｍ＝４３０ＬＰ]（Ｔｈｏｒｌａｂ）、[λｅｘ＝４８０/４０、λｅｍ＝５３０/１０]（Ｔｈｏｒｌａｂ）、[λｅｘ＝４８０/４０、λｅｍ＝５８０/１０]（Ｔｈｏｒｌａｂ）、[λｅｘ＝４８０/４０、λｅｍ＝６４０/１０]（Ｔｈｏｒｌａｂ）、および[λｅｘ＝６２０/４０、λｅｍ＝６９２/４０]（Ｓｅｍｒｏｃｋ、Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ  Ｃｙ５−４０４０Ａ）を介して、顕微鏡に装着した水銀ランプを使用して量子ドットバーコードおよびＡｌｅｘａ６４７蛍光体を励起した。吸収フィルターλｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、およびλｅｍ＝６４０/１０はそれぞれ量子ドットＱＤ５４０、ＱＤ５８９、およびＱＤ６４０に対応し、これらを使用してバーコードを解像する蛍光を分離した。また、吸収フィルターλｅｍ＝６９２/４０を使用して、検出鎖Ａｌｅｘａ６４７蛍光体蛍光を分離し、対応する取り込み鎖でハイブリダイゼーションした検体の量を２７０回測定した。Ａｐｐｌｅ´ｓ  Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ製のＮｉｇｈｔＣａｐ  ａｐｐを使用して調整することができる画像露光時間は、それぞれ吸収フィルターλｅｍ＝４３０ＬＰ、λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、λｅｍ＝６４０/１０、およびλｅｍ＝６９２/４０について１/２０秒、１/５秒、１/５秒、１/５秒、および１秒に設定した。
【００９３】
画像分析
画像分析すべてについて、ＭａｔｈＷｏｒｋ´ｓ  ＭＡＴＬＡＢにカスタム設計アルゴリズムを書き込んだ。このアルゴリズムの場合、入力としてサンプルを有する５つの発光フィルター画像（λｅｍ＝４３０ＬＰ、λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、λｅｍ＝６４０/１０、およびλｅｍ＝６９２/４０）、およびバックグランド強度の調節ためのビーズなしマイクロウェルチップの同じフィルター画像を受け取るものである。画像については、ユーザーの選択に基づいて対象となるビーズを含むにようにクロップ処理した。クロップ処理されたフィルター画像については、Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍ  レジストレーション（２１、２２）を使用して、λｅｍ＝４３０ＬＰフィルター画像にアライメントした。次に、Ｈｏｕｇｈ変換（２３、２４）を使用して、λｅｍ＝４３０ＬＰフィルター画像に現れたものに基づいて各ビーズのサイズおよび位置をアルゴリズムを使用して確認した。次に、各ビーズについて、残りの４つのフィルター画像それぞれにおける面積全体の平均画素強度対してこれを関連付けた。ビーズ毎に、λｅｍ＝５３０/１０フィルター画像強度、λｅｍ＝５８０/１０フィルター画像強度、およびλｅｍ＝６４０/１０フィルター画像強度はその強度プロファイルを有する一方、λｅｍ＝６９２/４０フィルター画像強度は二次プローブ強度を示した。チップ上のバーコードを確認するために、最初に、既知のバーコード強度プロファイルを求めた（図６）。これらプロファイルについては、バーコードＢ１〜Ｂ７（図８を参照）のみを撮像し、フィルター毎にすべてのビーズにわたってメジアンフィルター強度を算出することによって得た。次に、ビーズの強度プロファイルについて、既知のバーコードの強度プロファイルそれぞれとこれを比較して、対象となるバーコードを確認した。具体的には、λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、およびλｅｍ＝６４０/１０のうちで最も高い強度に従ってバーコードをまず粗分類した。ビーズ強度プロファイルと既知バーコード強度プロファイルとの間のユークリッド距離を次式（１）により算出した。
2016507727.tif 000003
ＤＮ＝ビーズ強度プロファイルとバーコードＮ（Ｂ１〜Ｂ７）の強度プロファイルとの間のユークリッド距離
＝フィルターＭ（λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、λｅｍ＝６４０/１０）におけるビーズの強度
ＩＢＮＦＭ＝フィルターＭ（λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、λｅｍ＝６４０/１０）におけるバーコードＮ（Ｂ１〜Ｂ７）の強度
【００９４】
対象となるバーコードについては、既知強度が最も小さいユークリッド距離になるバーコードとして同定する。最後に、メジアンアッセイ強度（即ちλｅｍ＝６９２/４０フィルター強度）は、同じバーコードについてすべてのビーズに関して算出し、そのバーコードのハイブリダイゼーション信号として定義した。なお、対応する背景強度については、３０５の記録された強度から差し引き、チップまたは励起源に固有な、発生する可能性のある強度バラツキを調節した。また、二次プローブ強度については、これら強度における対応するバーコードのブランク信号によってλｅｍ＝６９２/４０フィルター（図５の黒色バー）から減算した。
【００９５】
結果および検討
無線通信デバイス、この場合スマートフォンのカメラが異なる蛍光発光バーコードを撮像できるかどうかについて、またカスタムアルゴリズムを使用して光信号を二次蛍光ラベルから識別できるかどうかについて評価を行った。まず、スマートフォンカメラが、チップ上のバーコード化ビーズそれぞれを識別できる撮像解像度および感度を有していることを確認した。５種類の重複しない蛍光量子ドットバーコードを設計し、チップの表面に組み付けた。これらバーコードの量子ドットは、各種の比率で混波された５４０ｎｍ、５８９ｎｍ、６４０ｎｍの波長で発光した（図８）。このチップを顕微鏡ステージの表面に載置し、Ｈｇランプ（λｅｘ＝３５０/５０）で励起し、対物レンズ（倍率２０、ＮＡ＝０．５０）で光信号を集め、フィルター処理（λｅｍ＝４３０ＬＰ）を行い、顕微鏡の接眼レンズに装着したＡｐｐｌｅ  ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォン（露光時間＝１/２０秒）を用いて撮像を行った。図１Ｃから明らかなように、異なるバーコードの蛍光発光について視覚的に識別できる能力がある。
【００９６】
次に、バーコードおよび二次プローブの信号を識別できるＭａｔｈＷｏｒｋｓ´ＭＡＴＬＡＢを使用してアルゴリズムを構築した。このアルゴリズムには入力として、サンプルを有する５つの発光フィルター画像、および背景強度を調節するためにビーズを設けなかったマイクロウェルチップの同じフィルター画像（λｅｍ＝４３０ＬＰ、λｅｍ＝５３０/１０、λｅｍ＝５８０/１０、λｅｍ＝６４０/１０、λｅｍ＝６９２/４０）を入力した。
【００９７】
例示のみを目的として、本システムは顕微鏡の前部ポートに装着したＡｐｐｌｅ  ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓ、およびチップ上のバーコードを励起する水銀ランプから構成する。アルゴリズムについては、マイクロウェル内の各マイクロビーズの光信号をバーコードの既知パネルの光信号と比較することによってバーコードを識別できるように設計する（図５を参照）。図２Ａを参照して説明すると、緑色バーコード２１０、黄色バーコード２１２、赤色バーコード２１４（図８にはそれぞれＢ１、Ｂ４、Ｂ６として示す）をチップに付着処理し、ｉＰｈｏｎｅＴＭを使用して、撮像した。図２ａに示すように、このｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの場合、マイクロウェル内の各バーコードの特異な発光を取り込むことができる。アッセイを行った後、マイクロビーズのスマートフォンカメラ取得蛍光画像をターゲット被検体および二次プローブ（蛍光顕微鏡法パラメータ：ＮＡ＝０．５０における倍率２０倍の対物レンズ、λｅｘ＝６４０/４０、λｅｍ＝６９２/４０、露光時間＝１秒）に結合した。緑色ビーズおよび赤色ビーズの信号はいずれもポジティブであった。これは、Ｔ１ゲノムターゲットおよびＴ６ゲノムターゲットがサンプルには存在するが、Ｔ４には存在していないことを説明するものである。なお、バーコード上の白色スポットは、Ａｌｅｘａ６４７蛍光体と、Ｂ６内に含侵した６４０ｎｍ量子ドットとの合成強度が高いために発生した過剰露光が理由である。図２ｂに示すように、バーコードの光信号は、適当なフィルター処理を使用すると、二次プローブから識別できる。次に、チップ上のターゲット被検体を検出するさいの、ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの分析性能をコストの高いＣＣＤカメラのそれと比較した。
【００９８】
例えば、モデルゲノムシーケンスを使用して、ポジティブな検出を対象とする最終マイクロビーズコンプレックスのサンドウィッチ構造を説明する。シーケンス５´−ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ−３´と共役化した独立した一つの蛍光発光バーコードを有するチップを用意した。次に、ターゲットシーケンス５´−ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ａ  ＣＴＡ  ＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  Ｃ−３´およびＡｌｅｘａ６４７染料ラベル化二次シーケンス５´−Ａｌｅｘａ６４７−ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  Ｇ−３´を含有する溶液を加えた。ポジティブな検出の場合、マイクロビーズからの光信号は、バーコードおよびＡｌｅｘａ染料内の量子ドットから構成する。ターゲットシーケンスが、二次プローブおよびバーコードの両方にハイブリダイゼーションし、Ａｌｅｘａ染料の蛍光強度からターゲット被検体の濃度から確認できるものと考えられる。本明細書の説明から理解できるように、ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの場合、コストの高いＣＣＤカメラと比較して同程度の検出限界およびダイナミックレンジを実現できる（図６を参照）。以上の結果から、ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの場合、チップ面状のバーコードを撮像でき、生物学的アッセイの検出器として使用でき、また量子ドットバーコード検出システムのコストおよびサイズを抑制できることが確認できた。
【００９９】
感染疾患の分子レベル検出を目的とする、フォーンカメラを使用する他の唯一の検討については、分析的な曲線が得られず、従ってラテラルフローアッセイの性能を評価できなかった（文献５）。また、ラテラルフローアッセイの場合多重化も行えず、従って、このアッセイは高濃度で存在する分子の検出に限定されるものである。
【０１００】
発展途上国では疾患マーカーを簡単に検出できるため、ラテラルフローシステムが優先的に使用されているが、これらシステムの場合、最小検出限界が一般的にｍＭ〜μＭの範囲にあるため、複数のバイオマーカーを同時に分析する能力に制限がある。量子ドットバーコードの重要な作用効果は、マイクロビーズ内部に異なる色/強度の組み合わせがあるため、これが大きなバーコードライブラリーを与えるため、かなりの多重化能力を実現できることである。Ｎｉｅなどの評価によれば、５〜６の異なる発光量子ドットを使用して１０，０００〜４０，０００の異なるバーコードを構築できる（文献１４）。
【０１０１】
例えば、インフルエンザＡウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、および２０種のＢ型肝炎、Ｃ型肝炎を対象とする遺伝子ターゲットを選択し、本発明の統合化無線通信デバイス量子ドットバーコードチップシステムを多重検出に使用できることを説明してきた。インフルエンザＡウィルスは空気感染であり、伝染性が強く、症状が似ているため、臨床的に診断がかなり難しく、パンデミックリスクがある（文献８、９）。血液感染するＢ型肝炎（ＨＢＶ）やＣ型肝炎（ＨＣＶ）の場合、資源が制限されている状態で感染するものである（文献１０）。これらの感染症は、全体的な不快感、黄疸、ムカつきおよび/または嘔吐などの共通の症状を表すため臨床的な診断が難しい（文献１１）。
【０１０２】
５種類の感染症バイオマーカーそれぞれに対して７種類のバーコードを設計し、かつネガティブ対照およびポジティブ対照を設計した（図８を参照）。バーコード毎の分析感度およびリニア・ダイナミックレンジは、それぞれ平均して５０ｆｍｏｌおよび１００倍以下である（図２参照）。ここで本発明が証明したことは、本発明チップが複数のバイオマーカーターゲットを同時に検出できることである。対象となる５種類の病原体毎に遺伝子ターゲットシーケンスの異なる組み合わせ、加えてポジティブ対照、および二次蛍光プローブシーケンスを混合することによって６種類の異なる疑似ターゲットシーケンスを用意した。また、例えばターゲットシーケンスＴ１、Ｔ３、Ｔ５およびＴ７でスパイクした溶液、あるいはＴ２、Ｔ４およびＴ７でスパイクした溶液を用意した。チップに１０μＬのサンプルを加え、４０℃で２０分間培養し、洗浄緩衝液でリンス処理し、乾燥し、撮像を行い、アルゴリズムを使用して分析を行った。図３に、６種類のサンプルすべての溶液中においてすべてのターゲットバイオマーカーを確認できたことを示す。例えば、図３Ｂにおいて、本発明溶液はシーケンスＴ１、Ｔ３、Ｔ５およびＴ７を含有し、棒グラフは本発明方法が二次プローブウィルスを含有するバーコードを、二次プローブを含有しない（Ｔ２、Ｔ４およびＴ６）バーコードに対して識別できることを示す。
【０１０３】
以上本発明によれば、無線通信デバイス技術に量子ドットバーコードを併用すると、異なるタイプのターゲット、本実施例の場合では感染症マーカーを検出できる装置を構築できることが証明できた。即ち、本発明には２つの主要な態様がある。（ａ）バーコードをチップ上に簡単に移すことができる態様と、（ｂ）バーコードと携帯型無線通信デバイス技術とを統合化することによって、世界中のどこにおいても多重検出が可能になり、データを分析するために熟練した技術者が必要ない態様の２つである。この検出装置があれば、病院、環境管理局、疾病管理センターや軍などが汚染体、病原体や他の対象となるターゲットの発生および拡散をモニターでき、またポイントオブケアやケア状態において使用すると、癌、糖尿病、心血管疾病や他の疾病に関連するターゲット、あるいは疾患マーカーだけでなく、他の農業上の、あるいは環境上の対象となる病原体や汚染体を確認することができる。
【０１０４】
表１：シーケンスＩＤ  Ｎｏ．
2016507727.tif 000004
【０１０５】
表２：合成したマイクロビーズのリスト
2016507727.tif 000005
【０１０６】
以上、添付図面に示し、かつ説明してきた実施態様によって、本発明を実施し、かつ使用する最良の形態を明らかにした。
【０１０７】
これ以上説明しなくても、当業者ならば、本明細書の記載に基づいて、本発明を十分に利用できるはずである。引用したすべての文献、並びに優先権証明書については本明細書に援用するものとする。
【符号の説明】
【０１０８】
１００：システム
１１０：一次ラベル、バーコード
１１１：リガンド
１１２：二次ラベル
１１５：マイクロウェル
１２０：基体、チップ
１２５：信号
１３０：無線通信デバイス
１４０：励起源
１４２、１４４：フィルター
１５０対物レンズ
１６０：集中装置
２１０：緑色バーコード
２１２：黄色バーコード
２１４：赤色バーコード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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