(57)【要約】本開示は、ADAM12のプロドメインに対するモノクローナル抗体と、その癌治療における使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープに特異的に結合することが可能な抗体であって、
vii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
viii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、
ix 7B8又は8F8と同じエピトープに結合可能な抗体と、
x 7B8又は8F8のADAM12との結合を阻害可能な抗体と、
xi 7B8又は8F8のVH及びVLを有する抗体と、
xii 7B8又は8F8のVH及びVLのCDRを有する抗体と、からなる群から選択される抗体。
【請求項２】
医薬として用いる請求項1記載の抗体。
【請求項３】
対象者における癌の治療方法において用いるための、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープを特異的に認識して結合することが可能な抗体又はその機能的等価物: ここで、当該抗体又はその機能等価物は、以下からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する:
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体、及び、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４】
マウスモノクローナル抗体である、請求項3記載の用途の抗体。
【請求項５】
ヒト化されている、請求項3乃至4の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項６】
前記機能的等価物は、前記抗体のADAM12プロドメイン結合断片を含むか、又は前記抗体のADAM12プロドメイン結合断片からなる、請求項3乃至5の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項７】
前記断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びScFv断片等のFv断片からなる群から選択される、請求項6記載の抗体。
【請求項８】
前記機能的等価物は、抗体を模倣する小分子模倣体である、請求項3乃至7の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項９】
前記抗体又はその機能的等価物は、配列番号2のアミノ酸残基1乃至10、又は配列番号2のアミノ酸残基11乃至20、又は配列番号2のアミノ酸残基21乃至30、又は配列番号2のアミノ酸残基31乃至40、又は配列番号2のアミノ酸残基41乃至50、又は配列番号2のアミノ酸残基51乃至60、又は配列番号2のアミノ酸残基61乃至70、又は配列番号2のアミノ酸残基71乃至80、又は配列番号2のアミノ酸残基81乃至90、又は配列番号2のアミノ酸残基91乃至100、又は配列番号2のアミノ酸残基101乃至110、又は配列番号2のアミノ酸残基111乃至120、又は配列番号2のアミノ酸残基121乃至130、又は配列番号2のアミノ酸残基131乃至140、又は配列番号2のアミノ酸残基141乃至150、又は配列番号2のアミノ酸残基151乃至160、又は配列番号2のアミノ酸残基161乃至170、又は配列番号2のアミノ酸残基171乃至178を含む又はこれらからなる、ADAM12のプロドメイン内のエピトープを特異的に認識して結合する、請求項3乃至8記載の用途の抗体。
【請求項１０】
前記エピトープは、前記プロドメインのグリコシル化ドメインを、0個、1個、又は2個含む、請求項8記載の抗体。
【請求項１１】
ドメインシャッフリングにより構築される、請求項3乃至10の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項１２】
抗体変異体である、請求項3乃至11の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項１３】
半減期、安定性、可溶性、及び/又はバイオアベイラビリティを増加させるために修飾されている、請求項12記載の抗体変異体。
【請求項１４】
遺伝子操作によるドメイン内スルフィド結合を含む、請求項13記載の抗体変異体。
【請求項１５】
1つ以上のFv断片は、VHドメイン及びVLドメインの間のペプチドリンカーを含む、請求項13記載の抗体変異体。
【請求項１６】
前記対象者は、哺乳動物である、請求項3乃至15の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項１７】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項16記載の抗体。
【請求項１８】
前記癌は、乳房、膀胱、卵巣、結腸、子宮、子宮頸部、腎臓、前立腺、食道、腎細胞、膵臓、直腸、胃、扁平細胞、肺、頭頚部、皮膚、精巣、肝臓、口腔、脳、骨、骨髄、及び血液細胞の癌からなる群から選択される、請求項3乃至17の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項１９】
前記癌は、乳房、膀胱、結腸、肝臓、肺、口腔、胃、脳、及び骨の癌からなる群から選択される、請求項3乃至18の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２０】
前記癌は、膀胱癌である、請求項3乃至19の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２１】
前記癌は、乳癌である、請求項3乃至17の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２２】
前記癌は、ADAM12レベルの上昇を特徴とする、請求項3乃至21の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２３】
前記ADAM12レベルは、インビボ又はインビトロで判定される、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
前記ADAM12レベルは、mRNAレベル又はタンパク質レベルを測定することにより判定される、請求項23記載の抗体。
【請求項２５】
前記mRNAレベルは、ノーザンブロット、RT-PCR、又はマイクロアレイ解析により判定される、請求項24記載の抗体。
【請求項２６】
前記タンパク質レベルは、ウェスタンブロット又は免疫染色により判定される、請求項24記載の抗体。
【請求項２７】
ゼラチン分解を阻害可能である、請求項3乃至26の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２８】
ADAM12の触媒活性を阻害しない、請求項3乃至27の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項２９】
MMP-14誘導性のBcl2相互作用キラータンパク質の増加を阻害することができる、請求項3乃至28の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項３０】
アポトーシスを誘導する、請求項3乃至29の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項３１】
細胞増殖に影響しない、請求項3乃至30の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項３２】
前記対象者の血清中で安定している、請求項3乃至31の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項３３】
投与後に前記対象者に対する毒性が無い、請求項3乃至32の何れかに記載の用途の抗体。
【請求項３４】
以下の工程を含む、必要とする個体における癌の治療方法:
a)個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程;
b)工程a)の試料におけるADAM12の発現レベルを判定する工程;
c)工程b)の発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程;
d)治療計画を評価する工程;
e)請求項1乃至30の何れかに記載の抗体の治療有効量を前記個体に投与する工程。
【請求項３５】
以下の工程を含む、必要とする個体における癌の治療方法:
a)個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程;
b)工程aの試料におけるゼラチンの分解レベルを判定する工程;
c)工程bの発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程;
d)治療計画を評価する工程;
e)請求項1乃至30の何れかに記載の抗体の治療有効量を前記個体に投与する工程。
【請求項３６】
必要とする個体における癌の治療方法であって、ゼラチン分解を阻害する抗体を投与することを含む方法。
【請求項３７】
必要とする個体における癌の治療方法であって、ADAM12のプロドメインに対する抗体を投与することを含む方法。
【請求項３８】
癌治療用の医薬を調製するための請求項1乃至30の何れかに記載の抗体の使用。
【請求項３９】
請求項1乃至30の何れかに記載の抗体を選択的に認識して結合することが可能な抗体。
【請求項４０】
ADAM12、MMP-14、及び/又はαVβ3の間の複合体の形成を阻害する方法であって、請求項1乃至30の何れかに記載の抗体を投与することを含む方法。
【請求項４１】
以下の工程を含む、請求項1乃至30記載の抗体を生産する方法:
i. ADAM12のプロドメイン又はその断片又はその機能的等価物を含むタンパク質を哺乳動物に投与する工程;
ii. 前記抗体のADAM12のプロドメインに結合する能力をスクリーニングする工程;
iii. 前記抗体のMMP-14及び/又はαVβ3間の複合体の形成を阻害する能力をスクリーニングする工程。
【請求項４２】
前記哺乳動物は、齧歯動物である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物から抗体産生細胞を単離すること、前記抗体産生細胞からハイブリドーマ細胞を調製すること、前記ハイブリドーマを培養すること、及び前記ハイブリドーマにより産生された抗体を単離することを含む、請求項41又は42の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体をコードする核酸構築物により宿主細胞をトランスフェクトする工程を備える、請求項1乃至30記載の抗体を生産する方法。
【請求項４５】
前記抗体は、組換え細胞により産生される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記組換え細胞は、細菌及び真核微生物を含む群から選択される微生物である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記微生物は、大腸菌、Lactobacillus zeae、枯草菌、Streptomyces lividans、Staphylococcus carnosus、巨大菌、及びCorynebacterium glutamicumを含む群から選択される細菌である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記微生物は、出芽酵母、Aspergillus niger、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、及びKluyveromyces lactisを含む群から選択される真核微生物である、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記組換え細胞は、植物細胞及び動物細胞を含む群から選択される、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
前記植物細胞は、シロイヌナズナ種、エンドウ豆、イネ、トウモロコシ、タバコ、オオムギ、又はその種子を含む群から選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣、マウス、及びヒトを含む群から選択される哺乳動物に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
前記動物細胞は、昆虫に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
前記動物細胞は、鳥類細胞株に由来する、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
更に、抗体を特定及び選択する工程を含む、請求項41乃至53の何れかに記載の方法。
【請求項５５】
請求項1乃至30の何れかに記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項５６】
更に、医薬的に許容可能な担体を含む、請求項55記載の医薬組成物。
【請求項５７】
pHがpH4乃至pH10である、請求項55及び56の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
経口摂取用に製剤化される、請求項55乃至57の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５９】
非経口投与用に製剤化される、請求項55乃至57の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記非経口投与は、注射によるものである、請求項59記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記非経口投与は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、大量投与、又は連続投与である、請求項59乃至60の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記投与は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で、例えば1日3回行われる、請求項55乃至61の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記治療の持続期間は、6乃至72時間である、請求項55乃至62の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記治療の持続期間は、24時間乃至7日間である、請求項55乃至63の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記治療の持続期間は、4日間乃至150日間である、請求項55乃至64の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記治療の持続期間は、生涯である、請求項55乃至65の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６７】
活性成分の投与量は、体重1kg当たり10μg乃至500mg、例として体重1kg当たり50μg乃至250mgである、請求項55乃至66の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６８】
請求項55乃至67の何れかに記載の医薬組成物と、取扱説明書とを備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドメイン特異的抗ADAM12抗体及びその癌治療における治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、西洋諸国において、疾患に関連する死因として2番目に多い。早期発見のためのスクリーニングの向上及び治療法の改善にも拘わらず、依然として新たな治療法が早急に必要とされている。個別化治療は、将来の癌治療として期待されており、その一部を成すのが、標的療法剤の開発である。酵素は、癌細胞の挙動を調節する鍵分子であり、幾つかの酵素は、現在、新たな癌治療を見つけるための探究における介入点とされている。
【０００３】
MMP (マトリックスメタロプロテアーゼ)、特にMMP-14は、腫瘍の成長、播種、及び血管形成を含む癌の病理における様々な側面において、重要な役割を果たす。MMP-14は、古典的な膜貫通型メタロプロテアーゼであり、ヒトの癌において上方制御され、癌のマウスモデルにおいて腫瘍の進行を加速する。MMP-14は、細胞外基質成分(即ち、線維性コラーゲン及びゼラチン)を分解し、MMP-2及びMMP-13といった酵素を活性化し、細胞表面タンパク質を放出させ、更に最近では、コラーゲン誘発アポトーシスを防止することが明らかとなっている。メタロプロテアーゼは幾つかの病理過程に強い影響を有することから、タンパク質分解活性を標的とした様々な小分子阻害剤が開発されている(Fingleton, The Cancer Degradome, 2008)。しかしながら、これらの阻害剤は、恐らくはメタロプロテアーゼの触媒部位における高度な構造的類似性により、有効性の欠如及び著しい毒性のため臨床試験には失敗している(Coussens, 2002)。
【０００４】
毒性を低減するために、対象のタンパク質を高い特異性で標的とすることが可能なモノクローナル抗体の使用等の他の戦略が、癌を含む幾つかの疾患の潜在的治療法として現れている(Fang, 2011)。実際に、企業及び研究所では、MMP-14に対する抗体を開発しており、これらは、癌の異種移植片モデルにおいて腫瘍の成長、浸潤、及び血管新生を阻害することが分かっている(Devy, 2009)。しかしながら、起こり得る問題の1つは、MMP-14が広範に発現され、生理学的に重要な、細胞外基質及び膜アンカータンパク質の幅広い分子の切断及び放出に関与しているため、「多面発現のような」、望ましくない副作用が発生するリスクが存在することである。したがって、毒性が低減され、望ましくない副作用が少ない、癌治療の新たな方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US2009/0029372
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease)は、MMPと共に、亜鉛依存性メタロプロテアーゼのメトジンシン亜族に属している(Stocker and Bode, 1995)。ADAM12遺伝子は、本発明者らによりクローン化された(Gilpin et al., 1998)。ADAM12は、正常な組織内では限定された組織内分布を示すが、胎盤内等における過度成長中、筋再生中、及び特に癌組織内において発現される。実際に、ADAM12は、乳癌、膀胱癌、喉頭癌、及び肺癌を含む様々なヒトの癌、更に膠芽腫において、強く上方制御される(Kveiborg et al., 2008)。ADAM12の過剰発現は、腫瘍細胞の増殖を加速し、腫瘍細胞のアポトーシスを阻害し、腫瘍細胞の移動及び侵入を増加させる。
【０００７】
2種類の自然発生ヒトADAM12スプライス変異型が存在し、ADAM12-L及びADAM12-Sと命名されている。ADAM12-Lドメイン組成は、原型の膜貫通型ADAMタンパク質に似ており、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ジスインテグリンドメイン、及びシステインリッチドメインを含み、更に膜貫通型ドメイン及び細胞質尾部ドメインが続く。ADAM12-Sは、可溶性のスプライス変異型であり、ADAM12-Lと同じドメインを含むが、膜貫通型ドメインが欠如しており、細胞質尾部は、C末端において33個のアミノ酸の並びで置き換えられている。ADAM12-Lは、乳癌のPyMTマウスモデルにおいて、その触媒活性とは独立して、腫瘍成長を刺激する(Frohlich et al., 2011)。
【０００８】
ジスインテグリンドメイン及びシステインリッチドメインにより、ADAM12分子は、インテグリン及びシンデカンとの結合を介して、細胞接着に関与する。特に、本発明者ら外は、ADAM12-Sのジスインテグリンドメインがインテグリンと相互作用することを証明している。プロドメインは、略26kDaであり、プロドメインと触媒ドメインとの間のフューリン部位における切断まで、主としてADAM12分子を不活性型に保つと考えられる。興味深いことに、フューリン切断後、プロドメインは、非共有結合を介して、成熟分子との会合を維持する(Wewer et al., 2006)。
【０００９】
本発明者らは、ADAM12を介して増進されたMMP-14のタンパク質分解活性を、ADAM12に対するモノクローナル抗体により、有意に低減可能であることを発見した。実際、本明細書に開示した抗体は、腫瘍細胞のアポトーシスの阻害を軽減することができる。したがって、本発明の目的は、癌の治療に用いることが可能なADAM12に対する抗体を提供することである。更に、このような抗体の投与により癌を治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、本発明は、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープに特異的に結合することが可能な抗体であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、
iii 7B8又は8F8と同じエピトープに結合可能な抗体と、
iv 7B8又は8F8のADAM12との結合を阻害可能な抗体と、
v 7B8又は8F8のVH及びVLを有する抗体と、
vi 7B8又は8F8のVH及びVLのCDRを有する抗体と、からなる群から選択される抗体に関する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、医薬として用いる抗体に関する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープを特異的に認識して結合することが可能な抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識し、
対象者における癌の治療方法において用いられる抗体又はその機能等価物に関する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、必要とする個体における癌の治療方法であって、
a)個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程と、
b)工程a)の試料におけるADAM12の発現レベルを判定する工程と、
c)工程b)の発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程と、
d)治療計画を評価する工程と、
e)本明細書に開示した抗体の治療有効量を個体に投与する工程と、を備える方法に関する。
【００１４】
更に他の態様において、本発明は、必要とする個体における癌の治療方法であって、
a)個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程と、
b)工程a)の試料におけるゼラチンの分解レベルを判定する工程と、
c)工程b)の発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程と、
d)治療計画を評価する工程と、
e)本明細書に開示した抗体の治療有効量を個体に投与する工程と、を備える方法に関する。
【００１５】
更に他の態様において、本発明は、必要とする個体における癌の治療方法であって、ゼラチン分解を阻害する抗体を投与することを含む方法に関する。
【００１６】
更に他の態様において、本発明は、必要とする個体における癌の治療方法であって、ADAM12のプロドメインに対する抗体を投与することを含む方法に関する。
【００１７】
更に他の態様において、本発明は、癌治療用の医薬を調製するための本明細書に開示した抗体の使用に関する。
【００１８】
更に他の態様において、本発明は、本明細書に開示した抗体を選択的に認識して結合することが可能な抗体に関する。
【００１９】
更に他の態様において、本発明は、ADAM12、MMP-14、及び/又はαVβ3間の複合体の形成を阻害する方法であって、本明細書に開示した抗体を投与することを含む方法に関する。
【００２０】
更に他の態様において、本発明は、本明細書に開示した抗体を生産する方法であって、ADAM12のプロドメイン又はその断片又はその機能的等価物を含むタンパク質を哺乳動物に投与する工程と、前記抗体のADAM12のプロドメインに結合する能力をスクリーニングする工程と、前記抗体のMMP-14及び/又はαVβ3間の複合体の形成を阻害する能力をスクリーニングする工程と、を備える方法に関する。
【００２１】
更に他の態様において、本発明は、本発明の抗体を生産する方法であって、前記抗体をコードする核酸構築物により宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む方法に関する。
【００２２】
更に他の態様において、本発明は、本明細書に開示した抗体を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
更に他の態様において、本発明は、本明細書に開示した医薬組成物と取扱説明書とを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、ADAM12により細胞表面へのMMP-14の動員が促されることを示す図である。
【図２】図2は、ADAM12及びMMP-14の染色を示す図である。
【図３】図3は、細胞表面におけるADAM12及びMMP-14の共局在化がゼラチン分解を誘発することを示す図である。
【図４】図4は、細胞表面にADAM12を発現する細胞においてゼラチン分解が増加することを示す図である。
【図５】図5は、ADAM12誘導性ゼラチン分解がMMP-14により媒介されることを示す図である。
【図６】図6は、ADAM12誘導性ゼラチン分解がαVβ3インテグリンに依存することを示す図である。
【図７】図7は、293-Vnrにおけるβ3インテグリンの発現が内在性MMP-14を細胞表面に方向付けることを示す図である。
【図８】図8は、ADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)がADAM12誘導性ゼラチン分解を阻害することを示す図である。
【図９】図9は、ADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)がADAM12誘導性ゼラチン分解を阻害することを示す図である。
【図１０】図10は、7B8及び8F8がADAM12のプロドメインを認識することを示す図である。
【図１１】図11は、ADAM12が腫瘍細胞をインビトロでアポトーシスから保護することを示す図である。
【図１２】図12は、ADAM12が腫瘍細胞をインビトロでアポトーシスから保護することを示す図である。
【図１３】図13は、ADAM12がインビボで腫瘍成長を加速し、腫瘍アポトーシスを阻害することを示す図である。
【図１４】図14は、ADAM12の発現とMMP-14及びMMP-2の発現との間の正の相関を示す図である。
【図１５】図15は、8F8がインビトロで腫瘍細胞増殖に影響しないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図面の詳細な説明
【００２６】
図1. ADAM12により細胞表面へのMMP-14の動員が促される。(A-D) 293-VnR細胞を、ベクター対照又はADAM12Δcyt-GFPによりトランスフェクトした。(A)細胞を、MMP-14 (赤)、ADAM12 (緑)、及び核(青)について染色した。スケールバー=6μm。(B)細胞を(A)に記載したように染色し、1実験当たり500個超の細胞を、MMP-14の核近傍領域への局在化について計数した。平均データ(±標準偏差(s.d.))を、総細胞に対するパーセントで表している。(C)サイトスピンでの実験により、293-VnR細胞において表面のMMP-14が検出された。グラフは、MMP-14及びGFP細胞の分布を、総細胞に対する平均パーセント(±s.d.)で示している。各実験において、1000個超の細胞を計数した。(D)細胞表面ビオチン化アッセイ。ストレプトアビジン沈殿物を、MMP-14及びADAM12Δcyt-GFPについて、ウェスタンブロットにより分析した。全細胞溶解物中のMMP-14タンパク質も示している。(E)野生型MCF7細胞、MCF7-A12Δcyt、MCF7-A12Δcyt+dox由来の全細胞溶解物を、MMP-14及びADAM12タンパク質レベルについて、ウェスタンブロットにより分析した。(F) MCF7細胞のサイトスピンを、細胞表面MMP-14について免疫染色し、(C)に記載のように計数した。平均データ(±s.d.)を、総細胞に対するパーセントで表している。(G) MDA-MB-231細胞のサイトスピンを、細胞表面ADAM12 (緑)、MMP-14 (赤)、及びDAPI (青)について免疫染色した。スケールバー=12μm。(H) MDA-MD-231細胞を、ADAM12のsiRNA又は対照siRNAにより48時間に亘り処理し、mRNAを抽出した後、qPCRを行い、ADAM12及びMMP-14を検出した。(I) siRNA処理済みMDA-MB-231細胞のサイトスピンを免疫染色し、(C)に記載のように計数した。平均データ(±s.d.)を、総細胞に対するパーセントで表している。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００２７】
図2. ADAM12及びMMP-14の染色。(A) 0.1又は1μgのADAM12又は1μgの対照プラスミドによりトランスフェクトした293-VnR細胞の細胞表面上でのADAM12及びMMP-14の染色を、FACSにより分析した。データは、細胞表面染色を伴なう細胞の平均パーセントとして表している。(B、C)非透過処理MCF7細胞及びMDA-MB-231の細胞表面におけるMMP-14の染色を、FACSにより分析した。データは、細胞表面染色を伴なう細胞の平均パーセントとして表している。
【００２８】
図3. 細胞表面におけるADAM12及びMMP-14の共局在化は、ゼラチン分解を誘発する。(A) ADAM12Δcyt又は対照ベクター(左パネル)、MCF7-A12Δcyt及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞(中央パネル)、及びMDA-MB-231細胞のサイトスピン(右パネル)によりトランスフェクトした非透過処理293-VnR細胞に対して、Duolink(登録商標)試薬を、ADAM12 (6E6)及びMMP-14に対する抗体と共に用いた。明るい点は、共局在化を示す。左及び中央パネル、スケールバー=8μm、右パネル、スケールバー=12μm。(B)ベクター対照又はADAM12Δcytによりトランスフェクトした293-VnR細胞におけるin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。細胞培養物を、ADAM12及び核について染色し、ゼラチン分解について試験した。スケールバー:ベクター対照=100μm、ADAM12Δcyt=40μm。(C) 4及び20時間後のゼラチン分解のパーセント。緑色蛍光の無い面積を(B)の実験から測定し(μm2)、細胞当たりのゼラチン分解を計算した。平均パーセントデータ(±s.d.)を、20時間後の平均ADAM12Δcyt分解パーセント値(100％に設定)と相対的に表している。(D) MCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。スケールバー:中央画像=100μm、他の画像=20μm。(E)(D)に示したMCF7細胞のゼラチン分解(±s.d.)データの平均パーセントを、平均MCF7-A12Δcyt分解値(100％に設定)と相対的に示している。(F)対照siRNA又はADAM12のsiRNAにより処理したMDA-MB-231細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ(20時間)。スケールバー=10μm。(G)(F)に示したMDA-MB-231細胞のゼラチン分解(±s.d.)データの平均パーセントを、平均siRNA対照分解値(100％に設定)と相対的に示している。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００２９】
図4. 細胞表面にADAM12を発現する細胞においてゼラチン分解が増加する。(A) 293-VnR細胞を、ADAM12Δcytによりトランスフェクトし、Oregon Green(登録商標)488色素(10μg/ml)に結合させたゼラチンに塗布した。0.1、0.5、1、又は2μgのADAM12Δcyt cDNAプラスミドによりトランスフェクトした293-VnR細胞における、細胞当たりの平均ゼラチン分解(±s.d.)。(B) ADAM12-L又はADAM12Δcytによりトランスフェクトした293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。平均データ(±s.d.)を、平均ADAM12-L分解値(100％に設定)と相対的に表している。***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３０】
図5. ADAM12誘導性ゼラチン分解がMMP-14により媒介される。(A) ADAM12Δcyt又はその触媒不活性型ADAM12Δcyt-E351Qによりトランスフェクトした293-VnRを用いたin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。データは、平均ADAM12Δcyt分解値(100％に設定)に対する平均ゼラチン分解(±s.d.)として表している。(B) ADAM12Δcyt又は対照ベクターによりトランスフェクトし、GM6001 (10μM)、TAPI-2 (10μM)、又はビヒクルのみ(対照)により一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。細胞を、ADAM12及び核(DAPI)について染色した。ゼラチン分解ADAM12陽性細胞(±s.d.)の平均数を、ADAM12陽性細胞の総数に対するパーセントとして示している。(C) ADAM12Δcyt及び対照又はMMP-14のsiRNAによりコトランスフェクトした293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。平均データ(±s.d.)を、平均siRNA対照分解値(100％に設定)と相対的に表している。挿入図は、MMP-14について分析した全細胞溶解物のウェスタンブロットである。(D)非トランスフェクト293-VnR細胞、又はADAM12Δcyt、ベクター対照、若しくはMMP-14によりトランスフェクトした、又はMMP-14及びADAM12Δcyt若しくはMMP-14及びベクター対照によりコトランスフェクトした、293-VnR細胞についてのMMP-2ザイモグラフィ。下のパネル内の画像は、それぞれの培養物におけるゼラチン分解及び核染色(DAPI)を示す。ゼラチン分解は、分解面積をμm2単位で計測することで定量し、細胞数に相関させた。スケールバー=10μm。***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３１】
図6. ADAM12誘導性ゼラチン分解は、αVβ3インテグリンに依存する。(A) ADAM12Δcytによりトランスフェクトし、ADAM12ついての免疫染色したHEK293細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ、及びDAPI染色。スケールバー=8μm。(B) ADAM12Δcyt又は対照ベクターによりトランスフェクトし、正常マウスIgG又はαVβ3インテグリンに対する阻害抗体(10μg/ml LM609)により一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。細胞当たりの平均ゼラチン分解(μm2)(±s.d.)を画像の下に示している。スケール801バー=20μm。(C) 293-VnR細胞を、ADAM12Δcyt-GFP又はベクター対照によりトランスフェクトし、免疫沈降はマウスIgG、又はADAM12に対するmAb (7G3又は8F8)を用いた。沈殿物及び入力試料を、記載の抗体によるウェスタンブロットにより分析した。(D) 293-VnR細胞によりトランスフェクトしたADAM12Δcytに対して、Duolink(登録商標)試薬を、ADAM12 (6E6)/β3インテグリン、αVβ3インテグリン/MMP-14、及び陰性対照マウス及びウサギIgGに対する抗体と共に用いた。スケールバー=8μm。(E) FACSにより分析した、MCF7、MCF7-A12Δcyt、MCF7-A12Δcyt+dox、及びMDA-MB-231細胞株についてのαVβ3インテグリンの細胞表面染色平均パーセント(LM609抗体染色)。正常マウスIgGを、染色対照として用いた。(F) MCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+doxのin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。細胞をαVβ3インテグリン(LM609抗体)について免疫染色し、核をDAPI染色により視覚化した。スケールバー=15μm。(G)正常マウスIgG又は阻害性αVβ3インテグリン抗体(LM609)により一晩処理したMCF7-A12Δcyt細胞についてのゼラチン分解の平均パーセント(±s.d.)を、MCF7-A12Δcyt細胞+IgGの平均分解値(100％に設定)と相対的に表している。*P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３２】
図7. 293-Vnrにおけるβ3インテグリンの発現は、内在性MMP-14を細胞表面に方向付ける。(A) HEK.293及び293-Vnr細胞由来のβ3インテグリン及びMMP-14のウェスタンブロット分析。アクチンをローディングコントロールとして用いた。(B) 2HEK-293細胞を、ベクター対照又はADAM12Δcyt-GFPによりトランスフェクトした。細胞を透過化し、MMP-14、ADAM12、及び核について染色した。スケールバー=20μm。(C) HEK-293を、ADAM12Δcyt-GFP、免疫沈降マウスIgG又はADAM12 (6E6)若しくはMMP-14に対するmAbによりトランスフェクトした。沈殿物及び入力試料を、記載の抗体によるウェスタンブロットにより分析した。
【００３３】
図8. ADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)がADAM12誘導性ゼラチン分解を阻害する。(A) ADAM12Δcytによりトランスフェクトし、ADAM12に対する4μg/mlのmAb:6E6、7B8、及び8F8により一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。ADAM12モノクローナル抗体6E6及びDAPIを用いてディッシュを染色した。スケールバー=45μm。(B) ADAM12Δcyt (又は対照ベクター)によりトランスフェクトし、ADAM12に対するmAbの濃度を段階的に増加させて(0.04乃至4.0μg/ml)一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。データは、ゼラチン分解が生じたADAM12陽性細胞の平均パーセント(±s.d.)を表している。(C-F)対照マウスIgG又はmAb 7B8及び8F8 (10μg/ml)により一晩処理したMCF7-A12Δcyt (C、D)及びMDA-MB-231 (E、F)細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。スケールバー:(C)=20μm及び(E)=10μm。(D、F)平均対照IgG分解値(100％に設定)に対する。7B8、8F8、又は対照マウスIgG (10μg/ml)により処理したMCF7-A12Δcyt (D)及びMDA-MB-231 (F)細胞についてのゼラチン分解の平均パーセント(±s.d.)。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ANOVA (B)及びスチューデントのt検定(D、F)。
【００３４】
図9. ADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)がADAM12誘導性ゼラチン分解を阻害する。
上のパネル: ADAM12Δcytによりトランスフェクトし、4μg/mlのADAM12に対するmAb:7G3、6E6、7C4、及び8F8により一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。下のパネル: ADAM12Δcytによりトランスフェクトし、4μg/mlのADAM12に対するmAb:7G3、7C4、及び7B8により一晩処理した293-VnR細胞のin situ固相ゼラチナーゼアッセイ。データは、ゼラチン分解が生じたADAM12陽性細胞の平均パーセント(±s.d.)を表している。
【００３５】
図10. 7B8及び8F8は、ADAM12のプロドメインを認識する。(A) 293-VnR細胞を、ADAM12Δcyt、又はプロドメインが欠如したADAM12 (ADAM12pro)によりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、低温メタノール中で10分間固定し、PBS中で洗浄し、6E6、7B8、8F8、若しくは6C10 ADAM12抗体又は対照マウスIgG DAPにより免疫染色した。スケールバー=25μm。(B) MMP-14によりトランスフェクトした293-VnR細胞におけるゼラチン分解。ADAM12に対する抗体6E6、7B8、及び8F8、及びαVβ3インテグリンに対する抗体LM609を培養物に添加し(10μg/ml)、一晩置いた。 データは、平均MMP-14-6E6抗体分解値(100％に設定)に対するゼラチン分解の平均パーセント(±s.d.)として表している。n=3。*P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３６】
図11. ADAM12は、腫瘍細胞をインビトロでアポトーシスから保護する。(A) MCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞株を、3-Dコラーゲンに埋め込み、1実験当たり500個超の細胞からアポトーシス小体の平均パーセント(±s.d.)を決定した。(B) 3-Dコラーゲンから回収した細胞由来のADAM12、MMP-14、BIK、及びBIMのウェスタンブロット分析。棒グラフは、BIK及びBIMのレベルであり、バンド強度の定量(ImageJソフトウェアを使用)により決定され且つアクチンに対して正規化されている。MCF7レベルを1に設定した。(C、D) MCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+dox (C)並びにMDA-MB-231 (D)の3-Dコラーゲン培養物の500個超の細胞由来のアポトーシス小体の平均パーセント(±s.d.)。細胞は、対照マウスIgG、10μg/mlの8F8、又は10μMのGM6001により1日おきに処理した。(E) siRNA処理後にMMP-14について分析したMDA-MB-231細胞の3-D培養物から回収した細胞のウェスタンブロット。(F)コラーゲンゲル中での増殖前にMMP-14のsiRNA又は対照siRNAにより処理したMDA-MB-231細胞の4日間3-Dコラーゲン培養物の500個超の細胞由来のアポトーシス小体の平均パーセント(±s.d.)。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３７】
図12. ADAM12は、腫瘍細胞をインビトロでアポトーシスから保護する。(A) 3-D培養物から抽出し、DAPIにより染色したMCF7-A12Δcyt+dox細胞の代表顕微鏡写真。アポトーシスは、クロマチン凝縮及び核断片化を有する細胞数のパーセントを計数することにより評価した(矢印=アポトーシス小体)。スケールバー=8μm。(B)対照マウスIgG、10μg/mlの8F8、又は10μMのGM6001により1日おきに処理したMCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞の3-Dコラーゲン培養物の500個超の細胞由来のApopTag陽性細胞の平均パーセント(±s.d.)。(C) 2-D培養プレートにおいて増殖させた細胞由来のADAM12、MMP-14、BIK、及びBCL2L11のウェスタンブロット分析。(D)対照マウスIgG、10μg/mlの8F8、又は10μMのGM6001により1日おきに処理したMDA-MB-231細胞の3-Dコラーゲン培養物の500個超の細胞由来のApopTag陽性細胞の平均パーセント(±s.d.)。*P<0.05、***P<0.001。
【００３８】
図13. ADAM12は、インビボで腫瘍成長を加速し、腫瘍アポトーシスを阻害する。MCF7-A12Δcyt腫瘍細胞を、メスのマウスの乳腺に同所性移植した。一部のマウスには、飲料水中にドキシサイクリンを与え(MCF7-A12Δcyt+dox腫瘍、n=8)、他のマウスには、与えなかった(MCF7-A12Δcyt腫瘍、n=8)。(A)データは、平均腫瘍量(±s.d.)を表す。(B)腫瘍抽出物のADAM12に関するウェスタンブロット分析。(C) Metamorfソフトウェアプログラムを用いて、Ki67染色のために免疫染色したMCF7-A12Δcyt及びMCF7-A12Δcyt+dox腫瘍組織それぞれ5箇所からの画像で核を計数し、平均細胞増殖(±s.d.)を計算した。(D)(C)と同様の計数方法を用いて、腫瘍組織におけるApopTag陽性細胞の平均数(±s.d.)を推定した。(E) MCF7-A12Δcyt及びMCF7-A12Δcyt+dox腫瘍抽出物のMMP-14に関するウェスタンブロット分析。(F) MMP-14の43kDa断片(Eの矢印)のレベルのグラフ表示であり、ウェスタンブロットバンド強度の定量(ImageJソフトウェアを使用)により決定され且つアクチンに対して正規化されている。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、スチューデントのt検定。
【００３９】
図14. ADAM12の発現とMMP-14及びMMP-2の発現との間の正の相関。4種類のコホート:EMC286、Erasmus、TRANSBIG、及びMainzからの733のヒト乳腺腫瘍におけるADAM12-L、MMP-14、及びMMP-2遺伝子発現の相関分析。エストロゲン受容体陽性腫瘍(n=534)及び三種陰性乳癌(n=145)についても、遺伝子発現プロファイルにより評価した。(A) ADAM12とMMP-14との相関。(B) ADAM12とMMP-2との相関。単回帰分析及びピアソン相関を行った。
【００４０】
図15. 8F8は、インビトロで腫瘍細胞増殖に影響しない。MCF7-A12Δcyt細胞の増殖を、培養密度のパーセントとして、IncuCyteTM技術(Essen BioScience)により測定した。細胞を24ウェルプレートに播種し(105個/ウェル)、合計5日間に亘り、未処理のまま放置するか、或いは、24時間毎にADAM12に対する10μg/mlの8F8又は6E6若しくは対応する量の対照マウスIgGにより処理した。グラフは、細胞培養の培養密度パーセントを時間の関数として示している。データは、それぞれ3連で行った少なくとも3回の独立した実験(個別のn値をグラフに表示)の平均±SEMとして示している。ANOVAでは、群間に統計的に有意な差は無く、単回帰では、全ての培養条件で同様の成長率となった。
【００４１】
定義
【００４２】
抗体
【００４３】
「抗体」という用語は、血清の機能成分を表し、分子の集合(抗体又は免疫グロブリン)又は1個の分子(抗体分子又は免疫グロブリン分子)の何れかとされる場合が多い。抗体分子は、特異的な抗原決定基(抗原又は抗原エピトープ)との結合又は反応が可能であり、これは更に、免疫学的なエフェクタ機構の誘導に繋がり得る。個々の抗体分子は、通常、単一特異的であると見做され、抗体分子の組成は、モノクローナル(即ち、同一の抗体分子群からなる)又はポリクローナル(即ち、同一の抗原又は別個の異なる抗原の同じ又は異なるエピトープと反応する異なる抗体分子群からなる)となり得る。各抗体分子は、対応する抗原との特異的な結合を可能にする独自の構造を有し、全ての天然抗体分子は、2本の同一の軽鎖と2本の同一の重鎖という全体的に同じ基本構造を有する。抗体は、集合的に、免疫グロブリンとしても知られている。抗体又は抗体群という用語は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、無傷抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び一本鎖抗体を含み、更に、Fab、F(ab’)2、Fv断片又はscFv断片といった、抗体の結合断片、更に、二量体IgA分子s又は五価IgM等の多量体を含む。
【００４４】
自然発生抗体
【００４５】
「自然発生抗体」という用語は、抗原を認識して結合可能なヘテロ四量体の糖タンパク質であり、ジスルフィド結合により相互接続された2本の同一の重鎖(H鎖)及び2本の同一の軽鎖(L鎖)を含むものを示す。各重鎖は、重鎖可変領域(VHと略す)及び重鎖定常領域(CHと略す)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VLと略す)及び軽鎖定常領域(CLと略す)を含む。VH及びVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に細分可能であり、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存性の高い領域が散在している。抗体は、同一のヘテロ四量体を幾つか含む場合がある。
【００４６】
抗原
【００４７】
抗原は、少なくとも1個のエピトープを含む分子である。抗原は、例えば、ポリペプチド、多糖類、タンパク質、リポタンパク質、又は糖タンパク質となり得る。
【００４８】
エピトープ
【００４９】
エピトープは、抗体との特異的結合が可能な決定基である。エピトープは、例えば、ポリペプチド、多糖類、タンパク質、リポタンパク質、又は糖タンパク質に含まれる。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖といった分子の化学活性表面群からなり、通常、特異的な三次元構造性と、特異的な帯電特性とを有する。エピトープは、立体配座又は非立体配座となる場合があり、変性溶媒の存在下では、前者との結合は失われるが後者との結合は失われない。エピトープは、連続性又は不連続性となる場合があり、不連続エピトープは、タンパク質の一次配列内の少なくとも2つの離れた領域から形成されたタンパク質抗原上の立体配座エピトープである。
【００５０】
抗体
【００５１】
本発明は、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープに特異的に結合することが可能な抗体であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、
iii 7B8又は8F8と同じエピトープに結合可能な抗体と、
iv 7B8又は8F8のADAM12との結合を阻害可能な抗体と、
v 7B8又は8F8のVH及びVLを有する抗体と、
vi 7B8又は8F8のVH及びVLのCDRを有する抗体と、からなる群から選択される抗体に関する。
【００５２】
他の態様において、本発明は、医薬として用いる上述した抗体に関する。
【００５３】
他の態様において、本発明は、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープを特異的に認識して結合することが可能な抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識し、
対象者における癌の治療方法において用いられる抗体又はその機能等価物に関する。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、ADAM12のプロドメイン(配列番号2)内のエピトープを特異的に認識して結合することが可能な抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、
iii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082103で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F10により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識し、
対象者における癌の治療方法において用いられる抗体又はその機能等価物に関する。
【００５５】
本発明による抗体は、抗原を認識して結合することが可能な任意のポリペプチド又はタンパク質にしてよい。好ましくは、前記抗体は、前記抗原と特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、非特異的抗原(例えば、BSA)と比較して、少なくとも10倍の親和性で抗原と結合することを意味する。
【００５６】
好ましくは、前記抗体は、自然発生抗体又はその機能的等価物である。自然発生抗体は、抗原を認識して結合可能なヘテロ四量体の糖タンパク質であり、ジスルフィド結合により相互接続された2本の同一の重鎖(H鎖)及び2本の同一の軽鎖(L鎖)を含むものである。各重鎖は、重鎖可変領域(VHと略す)及び重鎖定常領域(CHと略す)を含むか、好ましくはこれらからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VLと略す)及び軽鎖定常領域(CLと略す)を含むか、好ましくはこれらからなる。VH及びVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に細分可能であり、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存性の高い領域が散在している。VH及びVLは、それぞれ、3つのCDRと4つのFRとを含むか、好ましくはこれらからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で並んでいる。
【００５７】
自然発生抗体は、ラクダ類(ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマ)が産生する重鎖抗体(HCAbs)にしてよい。HCAbsは、重鎖のみのホモ二量体であり、軽鎖及び第1の定常ドメインが欠如している(Hamers-Casterman et al., 1993)。他の自然発生抗体では、軽鎖を伴わない2本の重鎖の二量体として存在する新規又はテンジクザメ抗原受容体(New or Nurse Shark Antigen Receptor)(NAR)タンパク質の場合のように、軽鎖が欠如している場合がある。各鎖は、1つの可変領域(V)と5つの定常ドメインとにより構成される。NARタンパク質は、抗体分子よりも遙かに軽い単一免疫グロブリン可変様ドメインを構成する(Greenberg et al., 1995)。
【００５８】
本発明による自然発生抗体は、1個のヘテロ四量体からなるものであってよく、或いは数個の同一のヘテロ四量体を含んでもよい。したがって、本発明による自然発生抗体は、例えば、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEからなる群から選択され得る。こうした免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。本発明の好適な実施形態において、抗体は、IgG、例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4である。
【００５９】
本発明による自然発生抗体は、特定の種の抗体にしてよく、例えば、抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、羊、ニワトリ、ロバ、ラクダ類、又はヒト抗体にしてよい。抗体は、マウスモノクローナル抗体にしてよい。しかしながら、本発明による抗体は、幾つかの種の抗体のハイブリッドであってもよく、例えば、抗体は、ヒト化抗体等のキメラ抗体にしてもよい。ヒト及びヒト化抗体については、本明細書において更に詳細に説明する。
【００６０】
本発明による抗体は、自然発生モノクローナル抗体等のモノクローナル抗体であってよく、又は自然発生ポリクローナル抗体等のポリクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、モノクローナルである。モノクローナル及びポリクローナル抗体については、本明細書において更に詳細に説明する。
【００６１】
抗体の抗原結合断片
【００６２】
抗体の抗原結合断片は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片である。したがって、一部の実施形態において、抗体の機能的等価物は、抗体の結合断片である。好ましくは、前記断片は、自然発生抗体の抗原結合断片である。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実行可能であることが明らかとなっている。自然発生抗体の抗原結合断片の例には、例えば(i) Fab断片、即ち、VL、VH、CL、及びCH1ドメインからなる一価断片、(ii) F(ab’)2断片、即ち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合された2つのFab断片からなる二価断片、(iii) VH及びCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の1本のアームのVL及びVHドメインからなるFv断片、又は(v) VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., 1989)が含まれる。Fab断片は、パパイン分解により調製し得る。F(ab’)2断片は、ペプシン処理により調製し得る。
【００６３】
抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むことが好ましく、又は合成リンカーにより任意に接合し得る2つ以上の単離CDRの組み合わせを含むことが更に好ましい。
【００６４】
抗体の抗原結合断片の他の例は、(i)免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドに融合した抗原結合部位、(ii)ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、及び(iii) CH2定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。抗原結合部位は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域にすることができる。このような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、US2003/0118592及びUS2003/0133939において更に開示されている。これらの抗体断片は、当業者にとって既知である従来の手法を用いて取得され、断片は、無傷抗体と同じ方法で実用性についてスクリーニングされる。
【００６５】
抗体の抗原結合断片は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であるダイアボディ(diabody)であってもよい。ダイアボディは、好ましくは、同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。短すぎるため同一鎖上で2つのドメインの対形成をさせないリンカーを用いることにより、ドメインを別の鎖の相補的なドメインと対にして、2つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、及びHollinger et al., 1993において、更に詳しく説明されている。
【００６６】
異種特異的抗体
【００６７】
本発明による抗体は、二重特異性抗体等の「異種特異的抗体」にしてよい。二重特異性抗体は、特異性が相違する2つの異なる抗原結合部位を含むタンパク質又はポリペプチドである。例えば、二重特異性抗体は、(a)第1の抗原内の第1のエピトープと、(b)第2の抗原内の第2のエピトープとを認識して、これらに結合し得るか、或いは、同じ抗原内の2つの異なるエピトープを認識して、これらに結合し得る。「異種特異的抗体」という用語は、特異性が相違する2つ以上の異なる抗原結合部位を有する任意のタンパク質又はポリペプチドを含むものである。例えば、異種特異的抗体は、(a)第1の抗原上の第1のエピトープと、(b)第2の抗原上の第2のエピトープと、(c)第3の抗原上の第3のエピトープとを認識して、これらに結合し得るか、或いは、(a)第1の抗原上の第1のエピトープと(b)第2の抗原上の第2及び第3のエピトープとを認識して、これらに結合し得るか、或いは、同じ抗原上の異なるエピトープを認識して、これらに結合し得る。したがって、本発明は、限定では無く、同じ抗原又は異なる抗原上の異なるエピトープに対する二重特異性、三重特異性、四重特異性、及び他の多重特異性抗体を含む。
【００６８】
二重特異性抗体は、例えば、モノクローナル抗体から開始して、例えば、化学的架橋又は組換え技術を用いることにより、特異性を組み合わせるために2つのハイブリドーマを融合することで調製し得る。例えば、2つの異なる抗体(1及び2)のVH及びVLを組換え手段により結合して「クロスオーバ」鎖VH1-VL2及びVH2-VL1を形成し、その後、二量体化して両方の抗原結合部位を再構築し得る(WO94/09131参照)。二重特異性抗体は、例えば、WO94/13806に記載されるように、特異性の異なる2つの単鎖抗体を遺伝的に結合することにより調製してもよい。更に、抗体の2つの抗原結合断片を結合してもよい。
【００６９】
ヒト及びヒト化抗体
【００７０】
非ヒト抗体をヒト治療に用いることが望ましいとは限らないため、本発明による抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体にしてもよい。
【００７１】
ヒト抗体は、本明細書において、ヒト免疫グロブリン配列を用いた系から取得された抗体と理解される。ヒト抗体は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子又はヒト免疫グロブリン遺伝子から調製されたハイブリドーマにより、遺伝子導入又は染色体導入された動物(例えば、マウス)から単離された抗体にしてよい。ヒト抗体は、抗体を発現するように形質導入された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離してもよい。ヒト抗体は、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離してもよい。
【００７２】
ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態においては、こうした組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発又はインビボでの体細胞変異を受ける場合があるため、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VH及びVL配列に由来し、これらに関連する一方で、天然では生体内のヒト抗体生殖細胞系レパートリに存在しない可能性のある配列となる。
【００７３】
ヒト抗体は、野生型ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、更に好ましくは少なくとも96％、97％、98％、又は99％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７４】
前記遺伝子導入又は染色体導入動物は、再構成されていないヒト重鎖(μ及び/又はγ)及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位(minilocus)を含み得る。更に、動物は、内因性の重鎖及び軽鎖遺伝子座を不活性化する1つ以上の突然変異を含み得る。こうした動物の例は、Lonberg et al. (1994)及びWO02/43478に記載されている。
【００７５】
本発明による抗体は、キメラ抗体、即ち、異なる種に由来する領域を含む抗体にしてよい。キメラ抗体は、例えば、ある動物種由来の可変領域と、別の動物種由来の定常領域とを含み得る。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒトの定常領域とを有する抗体にすることができる。こうした抗体は、ヒト化抗体と呼ばれる場合がある。
【００７６】
したがって、本発明による抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から取得した配列により部分的にコードされ、且つ他の配列に部分的に由来するヒト化抗体にしてもよい。前記他の配列は、好ましくは、他の種由来の生殖細胞系免疫グロブリンであり、更に好ましくは他の哺乳動物種に由来する。特に、ヒト化抗体は、抗原結合部位が非ヒト種、好ましくは、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス又はラットからの免疫グロブリンに由来する一方、分子の残りの免疫グロブリン由来部分の一部又は全部がヒト免疫グロブリンに由来する抗体にしてよい。前記非ヒト種からの抗原結合部位は、例えば、完全なVL及びVHの一方若しくは両方、又はVL及びVHの一方若しくは両方の内の適切なヒトフレームワーク領域に接合された1つ以上のCDRからなるものとしてよい。したがって、ヒト化抗体において、CDRは、マウス又はラットのモノクローナル抗体由来にすることが可能であり、抗体の他の領域は、ヒト起源となる。
【００７７】
モノクローナル抗体
【００７８】
モノクローナル抗体(MAb)は、抗体分子が類似しているため同じエピトープを認識して結合する抗体群を示す。モノクローナル抗体は、一般に、宿主細胞株により産生され、多くの場合、ハイブリドーマ細胞株により産生される。モノクローナル抗体及び抗体合成ハイブリドーマ細胞を作成する方法は、当業者に周知である。抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗体を産生するBリンパ球を、不死化Bリンパ球細胞株に融合することにより調製し得る。本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)、又はAntibodies: A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載の、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション手法により調製し得る。前記モノクローナル抗体は、任意の適切な哺乳動物株由来としてよいが、しかしながら、多くの場合、モノクローナル抗体は、齧歯動物の抗体、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体となる。
【００７９】
ポリクローナル抗体
【００８０】
ポリクローナル抗体は、所定の特異的抗原を認識して結合する異なる抗体分子の混合物からなる抗体群を示し、したがって、ポリクローナル抗体は、前記抗原内の異なるエピトープを認識し得る。一般に、ポリクローナル抗体は、抗原により予め免疫された動物、好ましくは哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載の何れかの方法により調製し得る。
【００８１】
組換え抗体
【００８２】
本発明による抗体は、組換え抗体、即ち、組換え手段により調製、発現、作成、又は単離を行った抗体にしてもよい。本発明による組換え抗体は、例えば、合成ライブラリ又はファージディスプレイを用いて生産し得る。一部の実施形態において、抗体は、組換え細胞において生産される。組換え細胞は、細菌及び真核微生物を含む群から選択される微生物にしてよい。組換え抗体は、細菌、酵母等といった微生物の宿主生物、又は多細胞生物由来細胞の培養物において生産し得る。多くの場合、大腸菌(Escherichia coli)は、宿主生物として有用である。多くの場合、組換え抗体は、Fab断片、F(ab’)2、Fv断片等の少なくとも1つの抗原結合部位を含む自然発生抗体の断片であり、或いは、組換え抗体は、scFVである。したがって、一部の実施形態において、抗体は、Fab断片、F(ab’)2、Fv断片等の少なくとも1つの抗原結合部位を含む自然発生抗体の断片である。他の実施形態において、組換え抗体は、scFVである。
【００８３】
組換え抗体は、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ等の様々な系を用いて特定し得る。ファージディスプレイの出発点は、通常、ファージにより発現される自然発生抗体の単鎖抗体又は断片等の抗体のライブラリである。様々な種類のファージが、ファージディスプレイでの使用に適しており、例えば、M13、fd繊維状ファージ、T4、T7、又はλファージがある。ファージミドも使用し得るが、通常は、ヘルパーファージの使用が必要となる。一般に、ライブラリには、107乃至1015、例として109乃至1011種類のファージが含まれる。抗体は、ナイーブ抗体又は免疫由来抗体にし得る。ライブラリの抗体は、表面上でのディスプレイを確保するためにファージコートタンパク質(例えば、g3p又はg8p)に融合し得る。したがって、抗体(断片)は、適切なプロモーターに動作可能に結合させたファージコートタンパク質をコードする核酸の上流又は下流においてクローン化された核酸配列によりコードし得る。
【００８４】
抗体、例えば、抗体可変ドメインをコードするゲノム情報は、VH及びVL遺伝子セグメントを増幅する組換えDNA技術を用い、適切なファージへのクローニングを行うことで、非免疫又は免疫ドナーのB細胞から取得し得る。合成ライブラリは、VH及びVL遺伝子セグメントをインビトロで再構成すること、及び/又は、人工配列をVH及びVL遺伝子セグメントに導入することにより調製し得る。例えば、合成ライブラリは、VH及びVL遺伝子フレームワークを用いて調製し得るが、但し、ランダムオリゴヌクレオチドによりコードし得る、こうした人工相補性決定領域(CDR)への導入が行われる。また、ライブラリとして、様々なライブラリを、宿主細胞内で組み合わせてもよい。したがって、1つのライブラリは、重鎖Fv断片又はFab断片又はVH等の重鎖配列と、軽鎖Fv断片又はFab断片VL等の他の軽鎖配列とを含み得る。一般に、数回の選択、例えば2乃至5回、例として2乃至3回の選択が行われる。これは、抗原を固定化し、抗原をファージに接触させ、結合したファージを単離することにより行われる。抗原は、プラスチック面、ビーズ(磁気ビーズ等)、カラム内の樹脂等の任意の適切な固体面に固定化してよく、或いは、細胞の表面に発現させてもよい。
【００８５】
単鎖抗体
【００８６】
自然発生抗体は、ヘテロ四量体である。しかしながら、本発明による抗体は、1つ以上の抗原結合部位を備える単一のポリペプチドであってもよい。こうした抗体は、「単鎖抗体」とも呼ばれる。したがって、本発明による抗体は、単鎖抗体にしてもよい。
【００８７】
単鎖抗体は、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHを含み得る。こうした単鎖抗体を得るために、組換え方法を用いて、VL及びVHをコードする遺伝子を結合し得る。通常、単鎖抗体は、例えば、5乃至100個、例として5乃至50、例えば25個のアミノ酸のリンカーである合成リンカーにより分離される。前記リンカーは、VHのN末端をVLのC末端に接続するか、或いはその逆の接続を行う。これにより、VL及びVH領域が対を成して一価抗体様分子(単鎖抗体又は単鎖Fv (scFvとしても知られる)を形成する単一タンパク質鎖の生成が可能となる。Bird et al. (1988) Science 242:423-426及びHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい。
【００８８】
単鎖抗体は、二価抗体にしてよく、例えば、リンカーにより2つずつ結合された2つのVH領域及び2つのVL領域を含む単一ペプチド鎖にしてよい。単鎖抗体は、多価抗体にしてもよく、例えば、リンカーにより2つずつ結合された複数のVH領域及び複数のVL領域を含む単一ペプチド鎖にしてよい。VH及びVL領域は、同一のもの又は異なるものにしてよく、それぞれ単一特異性抗体又は異種特異的抗体が生じる。前記VH及び前記VLは、自然発生VH又はVLにしてよく、或いは、少なくとも1つの抗原結合部位を含む合成VH及びVLにしてよい。好ましくは、前記VH及びVLは、自然発生VH及びVLである。
【００８９】
ADAM12及びプロドメイン
【００９０】
2種類の自然発生ヒトADAM12スプライス変異型が存在し、それぞれADAM12-L (配列番号1は、アミノ酸配列を示し、配列番号3は、ヒトADAM12のmRNA配列を示す)及びADAM12-Sと命名されている。ADAM12-Lのドメイン組成は、原型の膜貫通型ADAMタンパク質に似ている。ADAM12Lは、909アミノ酸長のタンパク質であり、単一のペプチド(アミノ酸1-28)と、プロドメイン(配列番号1のアミノ酸29-206、配列番号2に表示)と、メタロプロテアーゼ(アミノ酸207-417)と、ジスインテグリンドメイン(アミノ酸418-512)と、システインリッチドメイン(アミノ酸513-588)と、融合様ドメイン(アミノ酸589-614)と、EGF様ドメイン(アミノ酸615-708)と、膜貫通型ドメイン(アミノ酸709-729)と、細胞質尾部(アミノ酸730-909)と、を含む。ADAM12Lは、更に、5つのNグリコシル化ドメインを含み、そのうち2つはプロドメイン内に見られる(NYT、アミノ酸111-113、及びNES、アミノ酸149-151)。ADAM12-Sは、可溶性スプライス変異型であり、ADAM12-Lと同じドメインを含むが、膜貫通型ドメインが欠如しており、細胞質尾部は、C末端において33個のアミノ酸の並びで置き換えられている。
【００９１】
ジスインテグリンドメイン及びシステインリッチドメインにより、ADAM12分子は、それぞれインテグリン及びシンデカンとの結合を介して、細胞接着に関与する((Iba et al., 1999、Thodeti et al., 2005a、Thodeti et al., 2005b)。特に、本発明者ら外は、ADAM12-Sのジスインテグリンドメインが、αVβ3インテグリンと相互作用することを証明しており、αVβ3インテグリンは、更にMMP-14と相互作用することが知られている。また、本発明者らは、MMP-14とADAM12とが、直接相互作用する可能性があることを発見した(図6C)。ADAM12のプロドメインは、略26kDaであり、プロドメインと触媒ドメインとの間のフューリン部位における切断まで、主として、ADAM12分子を不活性型に保つと考えられる。興味深いことに、フューリン切断後、プロドメインは、非共有結合を介して、成熟分子との会合を維持する。
【００９２】
ADAM12のプロドメインに結合する抗体
【００９３】
したがって、本発明の目的は、ADAM12のプロドメイン内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する抗体又はその機能的等価物を提供することである。
【００９４】
本発明の他の目的は、ADAM12のプロドメイン内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する抗体又はその機能的等価物を提供することである。
【００９５】
一部の実施形態においては、ADAM12のプロドメイン内のエピトープを特異的に認識して結合する抗体又はその機能的等価物であって、
i ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082101で寄託された、ハイブリドーマ細胞株7B8により産生されるモノクローナル抗体と、
ii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082102で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F8により産生されるモノクローナル抗体と、
iii ブダペスト条約に基づき、HPA Cultures collection (ECACC)にアクセッション番号13082103で寄託された、ハイブリドーマ細胞株8F10により産生されるモノクローナル抗体と、からなる群から選択される1つ以上の基準抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する抗体又はその機能的等価物を提供することである。
【００９６】
本発明の他の目的は、7B8、8F8、8F10、及び7C4からなる群から選択される、こうした抗体を提供することである。
【００９７】
抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体にしてよい。抗体は、抗体の産生に適していることが当該技術分野において知られている任意の生物、例えば、マウス、ヒツジ、ウサギ等の生きた生物、又は細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、若しくはCHO細胞等の哺乳類細胞といった細胞培養物を起源としてよい。抗体は、ヒト化してよい。好ましくは、抗体は、マウスモノクローナル抗体である。
【００９８】
更に、本発明の範囲には、抗体の結合断片を含む機能的等価物が含まれる。断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びScFv断片等のFv断片からなる群から選択され得る。機能的等価物は、単鎖抗体であってもよい。他の実施形態は、例えば、ADAM12のプロドメインに結合する抗体の結合断片を含むか、又はこうした結合断片からなる機能的等価物に関する。一部の実施形態において、機能的等価物は、例えば、抗体断片の半減期、安定性、バイオアベイラビリティ、可溶性、又は他の関連特性を増加させ得る、遺伝子操作したドメインを更に含んでもよい。例えば、当該技術分野においては、遺伝子操作によるドメイン内スルフィド結合により、抗体を安定化可能であることが知られている(Wozniak-Knopp et al. 2012)。他の安定化方法には、例えば、Fv断片の安定化をもたらすVH及びVLドメイン間でのペプチドリンカーの使用が含まれる(Reiter et al., 1994)。
【００９９】
機能的等価物は、抗体模倣物、又は抗体を模倣する小分子にしてもよい。抗体模倣物は、抗原との特異的結合が可能だが、構造的に抗体に関連しない、限定では無く核酸を含む有機化合物である。これらは通常、人工ペプチド又はタンパク質であり、一般に、モル質量は、約3乃至20kDaである。一部の種類は、抗体様βシート構造を有する。抗体模倣物は、抗体と比較して、良好な可溶性、組織への浸透、熱及び酵素に対する安定性を示すと共に、生産コストが比較的低くなる場合がある。
【０１００】
本発明の抗体は、ADAM12のプロドメインに結合することが可能である。更に、本発明の範囲には、ADAM12のプロドメイン内のエピトープに結合可能な抗体又はその機能的等価物が含まれ、前記エピトープは、配列番号2のアミノ酸残基1乃至10、又は配列番号2のアミノ酸残基11乃至20、又は配列番号2のアミノ酸残基21乃至30、又は配列番号2のアミノ酸残基31乃至40、又は配列番号2のアミノ酸残基41乃至50、又は配列番号2のアミノ酸残基51乃至60、又は配列番号2のアミノ酸残基61乃至70、又は配列番号2のアミノ酸残基71乃至80、又は配列番号2のアミノ酸残基81乃至90、又は配列番号2のアミノ酸残基91乃至100、又は配列番号2のアミノ酸残基101乃至110、又は配列番号2のアミノ酸残基111乃至120、又は配列番号2のアミノ酸残基121乃至130、又は配列番号2のアミノ酸残基131乃至140、又は配列番号2のアミノ酸残基141乃至150、又は配列番号2のアミノ酸残基151乃至160、又は配列番号2のアミノ酸残基161乃至170、又は配列番号2のアミノ酸残基171乃至178を含む。
【０１０１】
本発明の抗体は、ADAM12のプロドメインのグリコシル化ドメインを、0個、1個、又は2個含む。したがって、抗体は、配列番号1のアミノ酸残基111-113 (NYT)、及び/又は配列番号1のアミノ酸残基149-151 (NES)を含んでよく、或いはこれらのアミノ酸残基を含まなくてもよい。
【０１０２】
抗体は、単一のポリペプチド、タンパク質、又は糖タンパク質等、抗原結合部位を含む任意のタンパク質又はポリペプチドにしてよい。好ましくは、抗原結合部位は、少なくとも1つのCDRを含み、更に好ましくは可変領域を含む。
【０１０３】
したがって、抗原結合部位は、VH及び/又はVLを含み得る。抗体において、VH及びVLは、共に抗原結合部位を含み得るが、しかしながら、VH又はVLの何れかが、抗原結合部位を含んでもよい。特に、CDRは、抗体特異性を特定し得るため、好ましくは、抗原結合部位は、1つ以上のCDR、好ましくは少なくとも1つ、更に好ましくは少なくとも2つ、更に好ましくは少なくとも3つ、更に好ましくは少なくとも4つ、更に好ましくは少なくとも5つ、更に好ましくは6つのCDRを含む。好ましくは、抗原結合部位は、少なくとも1つのCDR3、更に好ましくは少なくとも重鎖のCDR3を含む。
【０１０４】
抗体は、例えば、抗体の抗原結合断片、好ましくは自然発生抗体、異種特異的抗体、単鎖抗体、又は組換え抗体の抗原結合断片にしてよい。
【０１０５】
本発明による抗体は、1つ以上の抗原結合部位を含み得る。自然発生ヘテロ四量体抗体は、2つの抗原結合部位を含む。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、抗体は、以下の特異的な重鎖CDRを1つ以上含む抗体である。好ましくは、抗体は、以下のCDRを少なくとも1つ、更に好ましくは少なくとも2つ、更に好ましくは3つ全て含む:上述したADAM12のプロドメインに結合する抗体の重鎖のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3。更に、抗体は、以下のCDRを好ましくは少なくとも1つ、好ましくは2つ、更に好ましくは3つ全て含む:上述したADAM12のプロドメインに結合する抗体の軽鎖のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3。
【０１０７】
一部の実施形態において、抗体は、ドメインシャッフリングにより構築される。本発明による一部の抗体は、軽鎖について、
i. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の軽鎖の何れかに由来するCDR1と、
ii. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の軽鎖の何れかに由来するCDR2と、
iii. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の軽鎖の何れかに由来するCDR3と、を含み、
重鎖について、
i. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の重鎖の何れかに由来するCDR1と、
ii. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の重鎖の何れかに由来するCDR2と、
iii. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の重鎖の何れかに由来するCDR3と、を含む。
【０１０８】
抗体は、更に、
i. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の重鎖のFR1、FR2、FR3、又はFR4と、
ii. ADAM12のプロドメインに結合する抗体の軽鎖のFR1、FR2、FR3、又はFR4と、からなる群から選択される1つ以上のFRを含み得る。
【０１０９】
したがって、特定の実施形態は、7B8、8F8、8F10、及び7C4の1つ以上の重鎖CDR、1つ以上の軽鎖CDR、及び1つ以上のFRを含む抗体に関する。
【０１１０】
本発明の抗体は、ドメインシャッフリングにより取得し得る。ドメインシャッフリングは、当該技術分野において既知の方法により実行可能であり、例として従来のクローニングにより、又はリガーゼ非依存法、例えばウラシル特異的切除試薬(USER)によるクローニング及び融合(Nour-Eldin et al., 2010; Villiers et al., 2010)又はギャップ修復(Eckert-Boulet et al., 2012)により行うことができる。
【０１１１】
或いは、抗体は、前記重鎖CDRの少なくとも1つ、更に好ましくは少なくとも2つ、更に好ましくは3つ全ての機能的等価物を含み得る。好ましくは、前記機能的等価物は、1乃至2個、更に好ましくは1個の置換又は欠失又は挿入を除き、前記重鎖CDRと同一である。
【０１１２】
或いは、抗体は、前記軽鎖CDRの少なくとも1つ、更に好ましくは少なくとも2つ、更に好ましくは3つ全ての機能的等価物を含み得る。好ましくは、前記機能的等価物は、1乃至2個、更に好ましくは1個の置換又は欠失又は挿入を除き、前記軽鎖CDRと同一である。
【０１１３】
好適な実施形態において、抗体又はその機能的等価物は、上述したCDRを少なくとも3つ、更に好ましくは少なくとも4つ、更に好ましくは少なくとも5つ、更に好ましくは6つ全て含む。
【０１１４】
一部の実施形態において、抗体は、抗体変異体である。こうした変異体は、限定では無いが、半減期、可溶性、及び/又はバイオアベイラビリティを増加させるために修飾された抗体を含む。
【０１１５】
ADAM12のプロドメインとの結合
【０１１６】
抗体又はその機能的等価物は、ADAM12のプロドメインに、又はADAM12のプロドメイン内のエピトープに結合することができる。抗体又はその機能的等価物がADAM12のプロドメイン又はADAM12のプロドメイン内のエピトープに結合可能であるかを判定するために、当該技術分野において既知の方法を用いることが可能であり、限定では無いが、免疫蛍光に基づく方法を、ADAM12のプロドメインによりトランスフェクトした細胞の細胞溶解物を用いたウェスタンブロットと任意に組み合わせて用いることができる。プロドメインのどのエピトープが抗体と結合するかについての情報を得ることが望ましい場合は、ADAM12のプロドメインをトランケートしたものを用いて、細胞をトランスフェクトしてもよい。
【０１１７】
ゼラチン分解の阻害
【０１１８】
一部の実施形態において、抗体又はその機能的等価物は、ゼラチン分解を阻害することができる。抗体又はその機能的等価物がゼラチン分解を阻害できるかを判定するために、当該技術分野において既知のアッセイを用いてよい。例えば、本発明の抗体により処理した細胞を、ゼラチンでコーティングしたディッシュに播種し、ゼラチン分解を経時的に評価することができる。ゼラチン分解の阻害を試験するのに適した他の方法は、当業者に認識されるであろう。
【０１１９】
ADAM12の触媒活性の阻害
【０１２０】
一部の実施形態において、抗体又はその機能的等価物は、ADAM12の触媒活性を阻害しない。抗体又はその機能的等価物がADAM12の触媒活性を阻害するかを判定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、インビトロ消光性蛍光ペプチド切断アッセイ又は細胞に基づくエクトドメイン放出アッセイを使用し得る。ADAM12の触媒活性の阻害を試験するのに適した他の方法は、当業者に認識されるであろう。
【０１２１】
MMP-14誘導性のBIKの増加の阻害
【０１２２】
一部の実施形態において、抗体又はその機能的等価物は、MMP-14誘導性のBIKの増加を阻害する。抗体又はその機能的等価物がMMP-14誘導性のBIKの増加を阻害するかを判定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、BIKのレベルは、細胞溶解物に対するウェスタンブロットにより判定し得る。MMP-14誘導性のBIKの増加の阻害を試験するのに適した他の方法は、当業者に認識されるであろう。
【０１２３】
アポトーシスの誘導
【０１２４】
一部の実施形態において、抗体又はその機能的等価物は、アポトーシスを誘導する。抗体又はその機能的等価物がアポトーシスを誘導するかを判定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、市販されているアポトーシス活性を判定するためのキットを用いてよく、又はアポトーシス小体を有する細胞の割合を視覚的に判定してもよい。MMP-14誘導性のBIKの増加の阻害を試験するのに適した他の方法は、当業者に認識されるであろう。
【０１２５】
癌を治療する方法
【０１２６】
本発明の他の目的は、癌を治療する方法であって、本明細書に定めたADAM12のプロドメインに結合可能な抗体の治療有効投与量を必要とする対象者に投与する工程を備える方法を提供することである。好ましくは、抗体は、上述したように、7B8、8F8、8F10、及び7C4と、その機能的等価物又は変異体とからなる群から選択される。
【０１２７】
「必要とする対象者」は、初めて癌に罹患した対象者又は再発した癌に罹患した対象者等、癌に対する治療を必要とする対象者として理解される。対象者は、動物、好ましくは哺乳動物であり、例として、限定では無いが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマである。
【０１２８】
治療対象の癌は、乳房、膀胱、卵巣、結腸、子宮、子宮頸部、腎臓、前立腺、食道、腎細胞、膵臓、直腸、胃、扁平細胞、肺、頭頚部、皮膚、精巣、肝臓、口腔、脳、骨、骨髄、及び血液細胞の癌を含む群から選択し得る。したがって、治療対象の癌は、乳房、膀胱、結腸、肝臓、肺、口腔、胃、脳、及び骨の癌からなる群から選択され得る。好適な実施形態において、治療対象の癌は、膀胱癌である。他の好適な実施形態において、治療対象の癌は、乳癌である。他の好適な実施形態において、治療対象の癌は、ADAM12レベルの上昇を特徴とする。ADAM12レベルは、mRNA又はタンパク質のレベルを測定することにより、インビトロ又はインビボで判定し得る。例えば、ADAM12タンパク質のレベルは、ウェスタンブロット、免疫染色、又は当該技術分野において既知の他の方法により判定し得る(例えばUS2009/0029372参照)。mRNAのレベルは、ノーザンブロット、RT-PCR、マイクロアレイ解析、又は当該技術分野において既知の他の方法により判定し得る(US2009/0029372参照)。
【０１２９】
一部の実施形態において、癌の治療のために投与されるべき抗体は、ADAM12、MMP-14、及びαVβ3間の複合体の形成を阻害することができる。例えば、抗体は、ADAM12とMMP-14との間、又はADAM12とαVβ3との間、又はMMP-14とαVβ3との間の相互作用を阻害することにより、複合体形成を阻害し得る。特に、抗体は、ADAM12によるMMP-14の動員を阻害することができる。したがって、一部の実施形態において、抗体は、MMP-14の細胞表面への動員を阻害することができる。したがって、一部の実施形態において、抗体は、ゼラチン分解を阻害することができる。好ましくは、本発明において投与されるべき抗体は、ADAM12の触媒活性を阻害しない。一部の実施形態において、抗体は、更に、MMP-14誘導性のBcl2相互作用キラー(BIK)タンパク質の増加を阻害し得る。好適な実施形態において、抗体は、アポトーシスを誘導することができる。特に、腫瘍細胞のアポトーシスが、抗体により誘導される。好適な実施形態において、抗体は、細胞の増殖に影響しない。他の実施形態において、抗体は、血清中で安定している。好ましくは、抗体は、投与後に宿主生物に対する毒性が無い。特に、8F8は、インビトロで測定された細胞の増殖に影響しない(図15)。8F8及び7B8は、マウス血清中で安定していることが分かっている。8F8及び7B8は、免疫不全マウスにおいて、注射後に毒性の徴候を示さない。
【０１３０】
本発明の範囲には、上述した抗体を活性成分として含む医薬を提供することが含まれる。一部の実施形態において、本発明は、癌を治療するための前記医薬の使用に関する。
【０１３１】
更に本発明の範囲には、必要とする対象者における癌を治療する医薬を調製するための上述した抗体の使用が含まれる。一部の実施形態において、抗体は、7B8、8F8、8F10、及び7C4を含む群から選択される。抗体は、上述したように、抗体の機能的等価物又は変異体にしてよい。
【０１３２】
したがって、本発明は、必要とする個体における癌の治療方法であって、
a.個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程と、
b.工程aの試料におけるADAM12の発現レベルを判定する工程と、
c.工程bの発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程と、
d.治療計画を評価する工程と、
e.上述した抗体、その機能的等価物、又はその変異体の治療有効量を個体に投与する工程と、を備える方法に関する。
【０１３３】
更に、必要とする個体における癌の治療方法であって、
a.個体の腫瘍組織由来の試料を提供する工程と、
b.工程aの試料におけるゼラチンの分解レベルを判定する工程と、
c.工程bの発現レベルを、対照組織の発現レベルに相関させる工程と、
d.治療計画を評価する工程と、
e.上述した抗体、その機能的等価物、又はその変異体の治療有効量を個体に投与する工程と、を備える方法が開示される。
【０１３４】
本発明は、更に、必要とする個体における癌の治療方法であって、ゼラチン分解を阻害する抗体を投与することを含む方法に関する。
【０１３５】
本発明は、更に、必要とする個体における癌の治療方法であって、ADAM12のプロドメインに対する抗体を投与することを含む方法に関する。
【０１３６】
医薬組成物及び投与形態
【０１３７】
本発明は、本明細書に定めた抗体、その機能的等価物、又はその変異体を含む医薬組成物を包含する。本発明に関連して、「抗体」及び「化合物」という用語は、医薬組成物及び投与形態について述べる際には、同義語として用いられる。
【０１３８】
本発明に関連して、「医薬組成物」という用語は、本明細書において、一般には、本発明の抗体、その変異体又は機能的等価物と、任意に1つ以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤とを含有する組成物を意味し、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paに記載のもの等、従来の手法により調製し得る。組成物は、従来の形態、例えば、カプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁液、又は局所投与物にしてよい。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内又は皮下注射による非経口投与用に製剤化し得ると共に、アンプル、充填済みシリンジ、小容量点滴における単位用量の形態で、又は複数用量型容器において保存剤を添加して提供し得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳液のような形態、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液の形態をとり得る。組成物は、経口摂取に適したものにし得る。油性又は非水性担体、希釈液、溶媒、又はビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜油(例えば、オリーブ油)、及び注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が含まれ、保存剤、湿潤剤、乳化剤又は懸濁化剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の調合剤を含有し得る。或いは、活性成分は、滅菌固体の無菌分離により、或いは、溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態とし、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水と共に使用する前に構成してもよい。非経口製剤に有用な油には、石油、動物油、野菜油、又は合成油が含まれる。こうした製剤において有用な油の具体例には、落花生油、大豆油、胡麻油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤において用いられる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤は、一般に、約0.0001乃至約25重量％、例として約0.5乃至約25重量％の活性成分を溶液中に含む。保存剤及び緩衝剤を用いてもよい。注入部位の刺激を最小化又は除去するために、こうした組成物は、約12乃至約17の親水性-親油性バランス(HLB)を有する1種類以上の非イオン界面活性剤を含み得る。こうした製剤の界面活性剤の量は、一般に、約0.000001乃至約15重量％、例として約0.000001乃至約5重量％、又は約5乃至約15重量％の範囲となる。適切な界面活性剤には、ソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及び酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される、疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量の密封容器内で提供することが可能であり、使用直前に、例えば、水である注入用滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保管することができる。
【０１３９】
しかしながら、本発明による薬物送達の主要経路は、作用剤を血流に導入し、最終的に関連する組織を標的とするために、非経口的なものとなる。
【０１４０】
作用剤は、生物活性物質の投与対象となる動物の任意の粘膜、例えば、鼻、膣、眼、口、生殖管、肺、消化管、又は直腸、好ましくは鼻又は口の粘膜を介して投与してもよい。
【０１４１】
好適な実施形態において、本発明の作用剤は、非経口投与、即ち、静脈内、筋肉内、脊髄内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、又は腹腔内投与される。皮下及び筋肉内の形態での非経口投与が、一般に好適となる。こうした投与に適した剤形は、従来の手法により調製し得る。化合物は、吸入による投与、即ち、鼻腔内及び経口吸入投与してもよい。エアロゾル製剤又は定量吸入器等、このような投与に適した剤形は、従来の手法により調製し得る。
【０１４２】
一実施形態において、本発明による医薬組成物は、注入等の非経口投与用に製剤化される。
【０１４３】
他の実施形態において、本発明による医薬組成物は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、大量投与、又は連続投与用に製剤化される。
【０１４４】
投与の速度及び頻度は、症例毎に医師が決定し得る。一実施形態において、投与は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で、例えば1日3回行われる。
【０１４５】
治療の持続期間は、状態の重症度に応じて変化し得る。一実施形態において、治療の持続期間は、6乃至72時間である。慢性の場合、治療の持続期間は、生涯となり得る。
【０１４６】
投与量は、担当の医師が患者の特性と投与の手段及び様式とに基づいて決定することができる。本発明の一実施形態において、本明細書に定めた医薬組成物の活性成分の投与量は、体重1kg当たり10μg乃至500mg、例として20μg乃至400mg、例えば、30μg乃至300mg、例として体重1kg当たり50μg乃至250mg、例として40μg乃至200mg、例えば50μg乃至100mg、例として60μg乃至90μg、例えば70μg乃至80μgである。
【０１４７】
投与量は、大量投与又は連続投与として投与し得る。大量投与に関して、医薬組成物は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で投与し得る。投与が連続的な場合、通常は6時間乃至7日間の期間に亘り投与される。好ましくは、投与の持続期間は、24時間乃至7日間である。投与の持続期間は、4日間乃至150日間にしてよい。一部の実施形態において、投与の持続期間は、生涯となり得る。しかしながら、通常、投与量は、大量投与として1日に1乃至3回投与される。
【０１４８】
製剤
【０１４９】
本発明の化合物は、未加工の化学物質として投与することが可能だが、医薬製剤の形態で提供することが好ましい、したがって、本発明は、本明細書に定める本発明の化合物又はその機能的等価物と、その医薬的に許容可能な担体とを含む、医療用の医薬製剤を更に提供する。
【０１５０】
一実施形態において、上述した医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体を含む。
【０１５１】
本発明の作用剤は、上述した様々な投与形態に適した、広範な剤形で製剤化し得る。
【０１５２】
医薬組成物及び剤形は、本発明の抗体、又はその機能的等価物を活性成分として含み得る。
【０１５３】
更に医薬組成物は、固体又は液体にすることが可能な医薬的に許容可能な担体を含み得る。
【０１５４】
固体形態の調製物は、通常、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐薬、及び分散性顆粒等、経口又は腸内投与用に提供される。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤、又は封入材料として機能してもよい。
【０１５５】
好ましくは、組成物は、約0.5乃至75重量％が本発明の化合物又は化合物群であり、残りは、適切な医薬賦形剤からなる。経口投与用では、こうした賦形剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。
【０１５６】
粉末において、担体は、微粉化した活性成分との混合物である微粉化固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、1乃至約70パーセントの活性化合物を含む。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバター等である。「調製」という用語は、活性化合物を担体としての被包材料と共に製剤化することを含み、この被包材料は、担体類を伴う又は伴わない当該活性成分を囲みかつ結合した状態となるカプセルを提供する。同様に、カシェ剤及びトローチが含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カシェ剤、及びトローチは、経口投与に適した固体形態にすることができる。
【０１５７】
本発明による滴剤は、滅菌又は非滅菌の水性又は油性溶液又は懸濁液を含み得ると共に、活性成分を適切な水溶液に溶解し、任意に殺菌剤及び/又は防黴剤及び/又は他の任意の適切な保存剤を含め、任意に表面活性剤を含めることにより調製し得る。結果的に生じた溶液は、その後、濾過により浄化し、適切な容器に移した後、密封し、オートクレーブすること、或いは30分間98乃至100℃に維持することにより滅菌し得る。或いは、溶液は、濾過により滅菌し、無菌状態で容器に移してもよい。滴剤に含めるのに適した殺菌剤及び防黴剤の例は、硝酸フェニル水銀又は酢酸フェニル水銀(0.002％)、塩化ベンザルコニウム(0.01％)、及び酢酸クロルヘキシジン(0.01％)である。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセリン、希釈アルコール、及びプロピレングリコールが含まれる。
【０１５８】
更に、使用の少し前に、経口投与用の液体調製物に転換することを意図した固体調製物が含まれる。こうした液体形態には、溶液、懸濁液、及び乳液が含まれる。こうした調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含み得る。
【０１５９】
経口投与又は経口摂取に適した他の形態には、乳液、シロップ、エリキシル剤、水溶液、水性懸濁液、練り歯みがき、ゲル歯磨き剤、チューインガムを含む液体調製物、或いは、使用の少し前に液体調製物に転換することを意図した固体調製物が含まれる。乳液は、水性プロピレングリコール溶液中の溶液において調製してよく、或いはレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア等の乳化剤を含有し得る。水溶液は、活性成分を水に溶解させ、適切な着色剤、香味料、安定化剤、及び増粘剤を添加することにより調製することができる。水性懸濁液は、微粉化した活性成分を、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の粘性材料、及び他の周知の懸濁化剤と共に水中に分散させることにより調製可能である。固体調製物には、溶液、懸濁液、及び乳液が含まれ、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含み得る。
【０１６０】
本発明の化合物は、非経口投与(例えば、注射、例えば、大量投与注射又は連続注入)用に製剤化し得ると共に、アンプル、充填済みシリンジ、小容量点滴における単位用量の形態で、又は複数用量型容器において保存剤を添加して提供し得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳液のような形態、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液の形態をとり得る。油性又は非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜油(例えば、オリーブ油)、及び注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が含まれ、保存剤、湿潤剤、乳化剤又は懸濁化剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の調合剤を含有し得る。或いは、活性成分は、滅菌固体の無菌分離により、或いは、溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態とし、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水と共に使用する前に構成してもよい。
【０１６１】
非経口製剤に有用な油には、石油、動物油、野菜油、又は合成油が含まれる。こうした製剤において有用な油の具体例には、落花生油、大豆油、胡麻油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤において用いられる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０１６２】
非経口製剤での使用に適したセッケンには、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩、及びトリエタノールアミン塩が含まれ、適切な洗剤には、(a)例えばジメチルジアルキルハロゲン化アンモニウム及びアルキルピリジニウムハライド等の陽イオン洗剤、(b)例えばアルキル、アリール、及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリド硫酸塩、並びに、スルホコハク酸塩等の陰イオン洗浄剤、(c)例えば脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体等の非イオン洗剤、(d)例えばアルキルβ-アミノプロピオネート及び2-アルキルイミダゾリン第4級アンモニウム塩等の両性洗剤、及び(e)それらの混合物が含まれる。
【０１６３】
非経口製剤は、一般に、約0.5乃至約25重量％の活性成分を溶液中に含む。保存剤及び緩衝剤を用いてもよい。注入部位の刺激を最小化又は除去するために、こうした組成物は、約12乃至約17の親水性-親油性バランス(HLB)を有する1種類以上の非イオン界面活性剤を含み得る。こうした製剤の界面活性剤の量は、一般に、約5乃至約15重量％の範囲となる。適切な界面活性剤には、ソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及び酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される、疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量の密封容器内で提供することが可能であり、使用直前に、例えば、水である注入用滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保管することができる。即時注入溶液及び懸濁液は、上述した種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【０１６４】
本発明の化合物は、経皮投与又は経粘膜投与のために局所的に送達することができる。局所投与の領域には、皮膚表面、更に、膣、直腸、鼻、口、及び喉の粘膜組織が含まれる。皮膚及び粘膜を介した局所投与用の組成物は、腫れ又は発赤等の炎症の兆候を引き起こすべきではない。経皮投与には、一般に、皮膚を通過させて薬物を患者の体循環内へ到達させるために医薬品を送達することが伴う。皮膚部位には、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域が含まれ、前腕、腹部、胸部、背部、臀部、乳頭部等が含まれる。
【０１６５】
局所組成物は、局所投与に適した医薬的に許容可能な担体を含み得る。したがって、組成物は、例えば、懸濁液、溶液、軟膏、ローション、性交用潤滑剤、クリーム、フォーム、エアロゾル、スプレ、坐薬、移植物、吸入剤、舌下錠等の錠剤、カプセル、乾燥粉末、シロップ、バルム、又はトローチの形態をとり得る。こうした組成物を調製する方法は、製薬業において公知である。
【０１６６】
本発明の化合物は、表皮に対する局所投与用に、軟膏、クリーム、又はローションとして、或いは、経皮パッチとして、製剤化し得る。軟膏及びクリームは、水性又は油性基剤に、適切な増粘剤及び/又はゲル化剤を添加して製剤化し得る。ローションは、水性又は油性基剤により製剤化し得ると共に、一般に、一種類以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤を含む。口内での局所投与に適した製剤には、通常はスクロース及びアカシア又はトラガントである風味の付いた基剤中に活性剤を含むトローチと、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤中に活性成分を含むパステル剤と、適切な液体担体中に活性成分を含む洗口剤とが含まれる。
【０１６７】
本発明によるクリーム、軟膏、又はペーストは、外用の活性成分の半固形製剤である。微粉化又は粉末化形態の活性成分を、単独で、或いは水性又は非水性の流体中の溶液又は懸濁液中で、適切な機械を用いて、油脂性又は非油脂性基剤と混合することで作成し得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィン、又は流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属セッケン等の炭化水素と、粘液と、アーモンド油、コーン油、ラッカセイ油、ヒマシ油、又はオリーブ油等の天然由来の油と、羊毛脂又はその誘導体と、又はステアリン酸又はオレイン酸等の脂肪酸とを、プロピレングリコール又はマクロゴール等のアルコールと共に含み得る。製剤には、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体といった陰イオン、陽イオン、又は非イオン界面活性剤等の任意の適切な表面活性剤を含めてもよい。天然ゴム、セルロース誘導体、又はケイ素質シリカ等の無機材料、及びラノリン等の他の成分といった懸濁化剤を含めてもよい。
【０１６８】
本発明によるローションには、皮膚又は眼への付与に適したものが含まれる。点眼薬は、殺菌剤を任意で含有する滅菌水溶液を含み得ると共に、滴剤調製用のものと同様の方法で調製し得る。皮膚に付与するローション又は塗布剤には、アルコール又はアセトン等、乾燥を早め皮膚を冷却する作用剤、及び/又は、例えば、グリセロール又はヒマシ油若しくはラッカセイ油等の油といった保湿剤を含めてもよい。
【０１６９】
経皮送達は、複合体の供給源を長期間に亘り患者の皮膚に触れさせることで達成し得る。経皮パッチは、医薬品-化学修飾剤複合体を制御された状態で身体に送達するという追加の利点を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)、Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)、及びTransdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)を参照されたい。こうした剤形は、医薬品-化学修飾剤複合体を、エラストマーマトリックス材料等の適切な媒体に溶解、分散、又は他の形で組み入れることにより作成することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通る化合物の流動を増やすこともできる。こうした流動の速度は、速度制御膜を設けること、又はポリマーマトリックス又はゲル中に化合物を分散させることにより制御することができる。
【０１７０】
例えば、単純な接着パッチは、バッキング材とアクリル酸系接着剤とにより作成することができる。医薬品-化学修飾剤複合体及び任意の促進剤を接着剤流延溶液に配合し、完全に混合させる。溶液は、バッキング材に直接流延し、流延溶媒をオーブンで蒸発させ、接着フィルムを残す。剥離ライナを付着させて、システムを完成させることができる。
【０１７１】
フォームマトリックスパッチは、一般にポリウレタンである薄いフォーム層にゲル状の医薬品-化学修飾剤溶液を閉じ込めることを除き、液体貯留システムと同様の設計及び構成要素を有する。このフォーム層は、バッキングと膜との間に位置し、パッチの辺縁で熱融着させる。
【０１７２】
受動的送達システムでは、放出速度は、一般に、貯留部と皮膚との間に配置された膜、モノリシックデバイスからの拡散、又は送達システムにおいて速度制御障壁の役割を果たす皮膚自体により制御される。米国特許第4,816,258号、第4,927,408号、第4,904,475号、第4,588,580号、第4,788,062号等を参照されたい。薬物送達速度は、部分的には、膜の性質に応じて決まる。例えば、体内の膜を通る薬物送達速度は、一般に、皮膚障壁を通るものよりも速い。複合体がデバイスから膜へ送達される速度は、貯留部と皮膚との間に配置された速度制限膜を用いて制御することが最も有利となる。皮膚が複合体に対して充分な透過性を有する(即ち、皮膚を介した吸収が、膜を通過する速度よりも大きい)と仮定すると、膜は、患者が受ける投薬速度を制御する役割を果たす。
【０１７３】
適切な透過膜材料は、所望の透過性の度合い、複合体の性質、及びデバイスの構築に関する機械的考慮事項に基づいて選択し得る。透過膜材料の例には、広範な天然及び合成ポリマーが含まれ、例として、ポリジメチルシロキサン(シリコーンゴム)、エチレン酢酸ビニル共重合体(EVA)、ポリウレタン、ポリウレタン-ポリエーテル共重合体、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース材料、例えば三酢酸セルロース及び硝酸/酢酸セルロース、及びヒドロゲル、例えばメタクリル酸-2-ヒドロキシエチル(HEMA)が含まれる。
【０１７４】
本発明の化合物は、坐薬としての投与用にも製剤化し得る。脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを最初に溶融させ、活性成分を、例えば撹拌により、均質に分散させる。次に、溶融均質混合物を都合の良いサイズの鋳型に注ぎ、冷却させて凝固させる。
【０１７５】
活性化合物は、例えば、約0.5％乃至約50％の本発明の化合物が、ポリエチレングリコール(PEG)担体(例えば、PEG1000[96％]及びPEG4000[4％])中に含まれた坐薬として製剤化し得る。
【０１７６】
本発明の化合物は、膣内投与用に製剤化し得る。活性成分に加え担体を含むペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレは、当該技術分野において適切なものとして知られている。
【０１７７】
本発明の化合物は、経鼻投与用に製剤化し得る。溶液又は懸濁液は、従来の手段、例えば、点滴器、ピペット、又はスプレにより、鼻腔に直接付与される。製剤は、単一又は複数用量の形態で提供し得る。後者で点滴器又はピペットを用いる場合、これは、患者が適切な所定量の溶液又は懸濁液を投与することにより達成し得る。スプレの場合、これは、例えば、定量式噴霧スプレポンプにより達成し得る。
【０１７８】
本発明の化合物は、特に鼻腔内投与を含む気道へのエアロゾル投与用に製剤化し得る。化合物は、一般に、例えば5ミクロン未満程度の小さな粒子サイズを有する。こうした粒子サイズは、当該技術分野において公知の手段、例えば、微粒子化により達成し得る。活性成分は、クロロフルオロカーボン(CFC)、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガス等、適切な噴射剤と共に加圧パック内に提供される。エアロゾルは、更にレシチン等の界面活性剤を含むことが都合の良い場合もある。薬物の用量は、計量弁により制御し得る。或いは、活性材料は、乾燥粉末の形態、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリジン(PVP)等のデンプン誘導体といった適切な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供し得る。粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えば、ゼラチン等のカプセル又はカートリッジ、或いは吸入器を用いて粉末が投与され得るブリスタパックにおいて、単位用量の形態で提供し得る。
【０１７９】
望ましい場合、製剤は、活性成分の持続又は制御放出投与に適した腸溶コーティングと共に調製することができる。
【０１８０】
医薬調製物は、単位剤形であることが好ましい。こうした形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量に再分割される。単位剤形は、パケット錠剤、カプセル、バイアル又はアンプル入り粉末等、個別量の調製物がパッケージに含まれたパッケージ調製物にすることができる。更に、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ自体にすることが可能であり、或いは、これらの何れかが適切な数量でパッケージ化された形態にすることもできる。
【０１８１】
医薬組成物のpHは、生理学的な目的に適した任意のpHにしてよく、例としてpH4乃至pH10、好ましくは5乃至8、更に好ましくはpH7程度にしてよい。
【０１８２】
ADAM12のプロドメインに対する抗体を生産する方法
【０１８３】
本発明の他の目的は、上述したADAM12のプロドメインに対する抗体又はその変異体若しくは機能的等価物を生産する方法であって、
i. ADAM12のプロドメイン又はその断片又はその機能的等価物を含むタンパク質を哺乳動物に投与する工程と、
ii. 前記抗体のADAM12のプロドメインに結合する能力をスクリーニングする工程と、
iii. 前記抗体のMMP-14及び/又はαVβ3間の複合体の形成を阻害する能力をスクリーニングする工程と、を備える方法を提供することである。
【０１８４】
こうした方法は、ADAM12のプロドメイン又はその断片又はその機能的等価物を含むタンパク質を哺乳動物に投与する工程を含み得る。一部の実施形態において、哺乳動物は、齧歯動物である。方法は、更に、前記哺乳動物から抗体を産生する細胞を単離する工程と、前記細胞からハイブリドーマを調製する工程と、ハイブリドーマを培養する工程と、前記ハイブリドーマにより産生された抗体を単離する工程と、を含み得る。
【０１８５】
或いは、方法は、細胞による抗体産生に依存してもよい。したがって、他の態様において、本発明は、本発明の抗体を生産する方法であって、前記抗体をコードする核酸構築物により宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む方法に関する。一部の実施形態において、抗体は、組換え細胞により産生される。一部の実施形態において、組換え細胞は、限定では無いが、酵母及び糸状菌等の細菌及び真核微生物を含む群から選択される微生物である。例えば、抗体の発現に適した細菌は、大腸菌、Lactobacillus zeae、枯草菌(Bacillus subtilis)、Streptomyces lividans、Staphylococcus carnosus、巨大菌(Bacillus megaterium)、及びCorynebacterium glutamicumを含む群から選択し得る。微生物は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Aspergillus niger、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、及びKluyveromyces lactisを含む群から選択される真核微生物にしてよい。組換え細胞は、植物細胞でも動物細胞でもよい。植物細胞は、シロイヌナズナ種、エンドウ豆、イネ、トウモロコシ、タバコ、オオムギ、又はその種子を含む群から選択し得る。適切な動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣、マウス、及びヒトを含む群から選択される哺乳動物に由来する動物細胞株となり得る。或いは、動物細胞は、昆虫又は鳥に由来してもよい。例えば、細胞は、DT40細胞等、ニワトリに由来する細胞株である。
【０１８６】
方法は、更に、抗体を特定及び選択する工程を含み得る。
【０１８７】
本発明の抗体を認識する抗体
【０１８８】
本発明の他の目的は、本発明の抗体を認識することが可能な抗体を提供することである。こうした抗体は、免疫染色等の方法に使用し得る。
【実施例】
【０１８９】
実施例1:抗体及び化学物質
【０１９０】
ADAM12に対する抗体(ADAM12のプロドメインに結合する)、6E6 (ジスインテグリン/システインリッチドメインに結合する)、及びポリクローナルウサギrb122 (システインリッチドメインに対して生成)は、既に記載されている(Sundberg et al., 2004, Gilpin et al., 1998)。更に、ADAM12に対するマウスモノクローナル抗体(7B8、7C4、7G3、及び8F10)を、本研究において記載の通りに生成した(Sundberg et al., 2004)。簡単に言えば、完全長ADAM12-SをHEK293により生産し、精製した後、マウスの免疫に用いた。ハイブリドーマは、マウス脾臓細胞及びマウス骨髄腫細胞株(NS-1)を融合することにより精製した。単細胞ハイブリドーマを拡張及び選択し、免疫蛍光を用いてADAM12 mAbを生産した。簡単に言えば、COS-7又はHEK293又は293-Vnr細胞を、ADAM12-Lをコードする構築物によりトランスフェクトし、ハイブリドーマ由来の条件培地を添加し、蛍光タグを付けた二次Abにより視覚化した。その後、最も産生の高いハイブリドーマをサブクローン化し、以前の記載(Sundberg et al., 2004)に従い免疫蛍光を用い、更にADAM12-Lをコードする構築物によりトランスフェクトした細胞由来の細胞溶解物を使用したウェスタンブロットを用いて、最も産生の高いハイブリドーマとして選択した。抗体のそれぞれがADAM12のどのドメインを認識するかを判断するために、ADAM12を様々な形でトランケートしたものにより、cos-7細胞をトランスフェクトした。
【０１９１】
研究に用いた他の抗体には、GFP (Clontech Laboratories、米国カリフォルニア州マウンテンビュー)、αVβ3インテグリン(LM609)(Chemicon/Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ)、及びアクチン(Calbiochem、米国マサチューセッツ州ビレリカ)に対するマウスモノクローナル抗体、BIKに対するヤギポリクローナル抗体、及びBCL2L11 (Santa Cruz Biotechnology Inc.、米国カリフォルニア州サンタクルーズ、及びNordic Biosite、スウェーデン、タビー)、MMP-14 (Abcam、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ及びLifeSpan Bioscience、米国ワシントン州シアトル)、及びβ3インテグリン(Santa Cruz Biotechnology Inc)に対するウサギポリクローナル抗体が含まれる。Ki67、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス、ヤギ抗ウサギ、及びウサギ抗ヤギ免疫グロブリンは、Dako (デンマーク、グロストルプ)から入手した。Alexa Fluor(登録商標)488-ウサギ抗ヤギIgG、Alexa Fluor(登録商標)488-ヤギ抗マウスIgG、Alexa Fluor(登録商標)546のヤギ抗マウスIgGのF(ab)2断片、及びAlexa Fluor(登録商標)546のヤギ抗ウサギIgGのF(ab)2断片は、Invitrogen (デンマーク、ネールム)から入手した。GM6001及びTAPI-2は、Calbiochemから入手した。
【０１９２】
プラスミド
【０１９３】
トランスフェクションに用いた完全長ヒトADAM12-L、GFPに融合したヒトADAM12-L、又は細胞質尾部(ADAM12Δcyt)の無いヒトADAM12-Lをコードする哺乳動物発現構築物は、以前に記載されている(Hougaard et al., 2000; Kawaguchi et al., 2003)。ADAM12の触媒部位(E351Q)における点突然変異を、Mutagenex (Hillsborough、米国ニュージャージー州)により誘導し、ADAM12Δcyt-E351Qをコードする発現構築物を生成した。レトロウイルス形質導入のために、ADAM12-ΔcytをコードするcDNAを、pRevTRE (Clontech BD Sciences、デンマーク、ブレンビー)に導入した。
【０１９４】
細胞培養、トランスフェクション、FACS、及び細胞表面タンパク質のビオチン化
【０１９５】
αVβ3インテグリンを安定して発現するHEK293細胞株は、293-VnRと呼ばれ、以前に記載されている(Sanjay et al., 2001)。HEK293、MCF7、及びMDA-MB-231は、ATCC (LGC Standards AB、スウェーデン、ボロース)から入手し、記載の通りに培養し(Albrechtsen et al., 2011、Frohlich et al., 2011)、FuGENE(登録商標)6 Transfection Reagent (Roche Applied Science、デンマーク、ビズオウア)を用いて一過性にトランスフェクトした。ゼラチナーゼ除去FBSを一部の培養に用いて、記載の通りに実施した(Kang et al., 2000)。pRevTREベクター内のADAM12Δcytを、以前の記載の通りに、MCF7 Tet-Off (Clontech BD Sciences)へ安定的に形質導入した(Ronnov-Jessen et al., 2002)。安定したMCF7-A12Δcyt細胞株を、50μg/mlのハイグロマイシンB (Roche Applied Science)と100μg/mlのジェネテシン(Sigma)を加えた成長培地において維持した。MCF7-A12Δcyt細胞株におけるADAM12の発現を停止させるため、100ng/mlのドキシサイクリン(Sigma-Aldrich)を成長培地に添加した。MMP-14及びADAM12に対する低分子干渉RNA (siRNA)は、siGENOME(登録商標) SMARTpool試薬として、Thermo Scientific Dharmacon(登録商標)(Lafayette、米国コロラド州)から入手し、siRNAユニバーサルネガティブコントロールは、Sigma-Aldrichから入手した。siRNAのトランスフェクションは、OPTI-MEM(登録商標)I及びLipofectamineTM 2000 (Invitrogen)を用いて行った。FACS解析及び細胞表面タンパク質のビオチン化は、以前の記載通りに行った(Lydolph et al., 2009、Stautz et al., 2012))。
【０１９６】
免疫蛍光染色
【０１９７】
ADAM12の視覚化は、以前に記載されている(Albrechtsen et al., 2011)。MMP-14及びαVβ3インテグリンの視覚化のために、細胞をパラホルムアルデヒド中に固定してブロックし(1％ウシ血清アルブミン及び1％正常ヤギ血清)、透過処理を行った後、又は行わずに(0.5％ Triton-X 100)、一次及び二次抗体並びに4’、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI[Invitrogen]、1:5000)を添加した。サイトスピン実験では、ADAM12及びMMP-14の細胞表面染色を、(Kawaguchi et al., 2003)に記載のものと同様の方法で行った。簡単に言えば、細胞のトリプシン処理及び染色を透過処理せずに行い、4％パラホルムアルデヒド中に固定し、サイトスピン遠心分離機(Sandon、Thermo Fisher Scientific Inc、米国イリノイ州60133)において回転させた。ADAM12及びMMP-14染色細胞は、MetaMorphソフトウェアを用いて、多重波長細胞スコアリングプログラムにより計数した。
【０１９８】
細胞表面での共局在化のために、Olink (Uppsala、スウェーデン)のDuolink(登録商標)試薬を非透過処理細胞に対して用いた。簡単に言えば、Duolinkアッセイは、異なる種で生じた2つの一次抗体をそれぞれの標的抗原(即ち、ADAM12、MMP-14、又はαVβ3インテグリン)に結合させるin situプロキシミティライゲーションアッセイ(PLA)手法である。種特異的な二次抗体は、それぞれ独自の短いDNA鎖が付着した状態にあり、一次抗体と結合し、極めて近接する際には、DNA鎖が相互作用して増幅され、蛍光顕微鏡において個別の点として視認される相補的蛍光プローブにより標識される。蛍光画像化は、63x/1.4 Plan-Apochromat水浸対物レンズを装着した共焦点レーザー走査型顕微鏡(LSM510 Meta、Carl Zeiss、ドイツ、オーバーコッヘン)、又は同じタイプの対物レンズを備えた倒立型Zeiss Axiovert 220 Apotomeシステムを用いて行った。画像は、Axiovisionプログラム(Carl Zeiss)及びMetaMorphソフトウェアを用いて処理した。
【０１９９】
in situゼラチナーゼ、3-Dコラーゲンアッセイ、及びゼラチンザイモグラフィ
【０２００】
細胞を、Molecular Probes (Life Technologies、デンマーク、ネールム)のOregon Green(登録商標)488色素(G-13186)に結合させたゼラチン(10μg/ml)でコーティングしたディッシュに播種した。(特に記載が無い場合)細胞播種の20時間後に、MetaMorphソフトウェアを用いて(ゼラチン蛍光内の黒い穴として観察される)分解面積をμm2単位で計測することにより、ゼラチン分解を定量し、細胞の数、及びADAM12について染色した細胞の数に相関させた。各実験では、1000個超の細胞を計数し、同じ種類の実験を、独立して少なくとも3回、繰り返した。PureCol (Advanced BioMatrix、米国カリフォルニア州サンディエゴ)溶液を用いて、製造業者の手順に従って3-Dコラーゲンゲルを作成し、記載の通りに細胞を埋め込み、増殖させた(Maquoi et al., 2012)。ゼラチンザイモグラフィは、以前の記載の通りに行った(Tatti et al., 2008)。
【０２０１】
アポトーシス及び増殖性細胞の検出
【０２０２】
MetaMorph(登録商標) Microscopy Automation & Image Analysisソフトウェアを用いて、自動で核の計数を行い、アポトーシス細胞体及び細胞増殖を検出した(Universal Imaging Corporation、米国ペンシルベニア州ダウニングタウン)。ApopTag(登録商標) Peroxidase ISOL Apoptosis Detection Kit (Millipore)を、培養細胞、又はマウス腫瘍組織からのパラフィン切片に対して用いた。アポトーシスは、更に、DAPIにより染色されたクロマチン凝縮及び核断片化を有する細胞(アポトーシス小体)の数のパーセントを計数することにより評価した。試料毎に少なくとも500個の細胞を調べ、アポトーシスを定量した。マウス腫瘍の平行パラフィン切片をKi67について染色し(Dako)、細胞増殖を推定した。
【０２０３】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析
【０２０４】
細胞溶解物及び腫瘍組織の免疫沈降及びウェスタンブロットは、以前に記載の通りに行った(Frohlich et al., 2011、Stautz et al., 2012)。
【０２０５】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)
【０２０６】
全RNAを、細胞株から抽出及び単離し、qPCRを、以前の記載の通りにプライマーにより行った(Frohlich et al., 2011; Pennington and Edwards, 2010)。
【０２０７】
インビボ腫瘍原性アッセイ
【０２０８】
等量のMCF7-A12Δcyt細胞を、6乃至8週齢NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wjl/SzJマウス(The Jackson Laboratory、米国メイン州バーハーバー)の乳腺に同所性に注入した。2つの実験を、2種類の腫瘍細胞濃度、即ち、1マウス当たり1×106及び3×106個の細胞を用いて行った。腫瘍細胞注入の1週間前、及び実験の残りの期間中、マウスには、飲料水中に0.667μg/mlのエストラジオール-17β(Sigma-Aldrich)を与えた。MCF7-A12Δcyt細胞を注入した一部のマウスには、飲料水中に2mg/mlのドキシサイクリン(Sigma-Aldrich)を与えた。腫瘍サイズ(長さ及び幅)を経時的に測定した。1匹のマウスの腫瘍が1.2cm2になった直後に、マウスの殺処分を行い、記載通りに組織を分析した(Frohlich et al., 2011、Kveriborg et al., 2005)。全ての実験は、デンマークの動物実験検査局(Animal Experiment Inspectorate)の指針に従って行われた。
【０２０９】
患者群及びデータ解析
【０２１０】
以下のデータの未加工データ(CELファイル)は、Array Express (GSE2034、GSE5327、GSE7390、GSE11121)からダウンロードしており、遺伝子発現オムニバス(GEO、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)で入手可能である。4種類のコホート(EMC286、Erasmus、TRANSBIG、及びMainz、Desmedt et al., 2007; Minn et al., 2007; Schmidt et al., 2008; Wang et al., 2005)からの4つのデータセットを、以前の記載の通りに選択した(Li et al., 2012)。全てのデータは、RMA (Robust Multichip Average)アプローチを用いて共に正規化しており、計算は、Partek Genomics Suite 6.6 (米国ミズーリ州セントルイス)を用いて行った。全ての計算及びデータの提示は、log2変換値で行っている。ERステータス及び三種陰性乳癌は、遺伝子発現プロファイルにより評価した。単回帰分析を、Qlucore Omics Explorer 2.2 (スウェーデン、ルンド)において行い、ADAM12 (213790_at)の発現レベルをMMP-14 (202828_s_at)及びMMP-2 (201069_at)の発現と相関させた。GraphPad Prismを用いて、ピアソン相関を行った。
【０２１１】
統計分析
【０２１２】
全てのアッセイは、独立して少なくとも3回、行った。統計分析は、Excel又はGraphPadソフトウェアを用いて、独立した2群を比較するスチューデントのt検定又はフィッシャーの正確確率検定により行った。ゼラチン分解と抗体阻害との関連性は、分散分析(ANOVA)を用いて分析した。P値0.05未満を統計的に有意と見做した。
【０２１３】
実施例2:ADAM12により腫瘍細胞表面へのMMP-14の動員が促される。
【０２１４】
ADAM12が細胞表面へのMMP-14の動員に影響するかを調べるため、293-VnRと呼ばれる、αVβ3インテグリンを安定的に発現するHEK293細胞株を利用した(Sanjay et al., 2001)。293-VnR細胞内の内因性MMP-14の免疫染色により、細胞の90％近くにおいて、核近傍での点状の局在化が実証された一方、細胞表面でのMMP-14の染色を示す細胞は殆ど無かった(図1A、上のパネル及び図1B)。しかしながら、細胞質尾部が無いため容易に細胞表面へ方向付けられる(Hougaard et al., 2000) ADAM12Δcytによりトランスフェクした際に、細胞は、細胞表面でのMMP-14の免疫染色を示し(図1A、下のパネル)、点状のMMP-14免疫染色を伴なう細胞数は有意に減少した(図1B)。その後、特異的に細胞表面局在化を解析するサイトスピン実験により、MMP-14の免疫局在性に対するADAM12の影響を評価した。ADAM12Δcyt蛍光タンパク質(GFP)によりトランスフェクトした細胞は、対照ベクター-GFPと比較して、MMP-14細胞表面染色を伴なう細胞数が略10倍の増加を示した(図1C)。最後に、ビオチン化アッセイ及び蛍光活性化細胞選別(FACS)解析において、細胞表面MMP-14は、ADAM12Δcytによりトランスフェクトした293-VnR細胞において検出可能だが、対照によりトランスフェクトした細胞では検出できないことを実証した(図1D、図2A)。ADAM12Δcytを過剰発現させた際に、対照細胞と比較して、全細胞溶解物中の内因性MMP-14の発現レベルに変化は観察されなかった(図1D)。総合すれば、これらのデータは、ADAM12が293-VnR細胞の細胞表面へのMMP-14の動員を促すという発見を裏付けている。
【０２１５】
癌の状況におけるADAM12及びMMP-14の複合発現の機能的関連性を探究するため、まず、ADAM12が更に癌細胞株において細胞表面へのMMP-14の移動を促すかを、低侵襲性且つ非転移性の乳癌細胞株MCF7を用いて判定することにした。野生型MCF7細胞は、ADAM12を殆ど又は全く発現しないため(図1E)、Tet-Offシステムを用いて、ADAM12 (MCF7-A12Δcyt)の発現を誘導した。ドキシサイクリン無しで増殖させたMCF7-A12Δcyt細胞は、ADAM12を発現し(図1E)、成長培地にドキシサイクリンを添加することによりADAM12は発現しなくなった(MCF7-A12Δcyt+dox)。以前の公表文献(Deryugina et al., 2000; Figueira et al., 2009; Maquoi et al., 2012)とは対照的に、3種類全ての実験条件下で、等しいレベルのMMP-14を検出することができた(図1E)。細胞表面でのMMP-14の免疫局在化は、膜の透過処理を行わずに分析しており、MMP-14の細胞表面染色を示した細胞数は、MCF7-A12Δcyt細胞において、MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞と比較して、10倍超の増加を示した(図1F)。これらのデータは、FACS解析により確認された(図2B)。
【０２１６】
次に、内因的に発現されたADAM12がMMP-14の細胞分布に影響するかを調べた。この目的のため、ADAM12を発現することが明らかとなっている侵襲性乳癌細胞株MDA-MB-231を用いた(Solomon et al., 2010)。ADAM12の細胞表面発現をサイトスピン実験により確認し、更に、細胞表面においてADAM12に並置されたMMP-14の存在を明らかにした(図1G)。MDA-MB-231細胞におけるADAM12siRNAノックダウンにより、ADAM12のmRNAレベルの有意な減少が生じた(図1H)。細胞表面でのMMP-14の免疫局在化は、膜の透過処理を行わずに分析しており、MMP-14の細胞表面染色を示した細胞数は、ADAM12 siRNAにより処理したMDA-MB-231細胞において、対照処理細胞と比較して有意に低かった(図1I)。これらのデータは、FACS解析により確認された(図2C)。特に、MMP-14 mRNAのレベルは、ADAM12のノックダウンにより影響を受けなかった(図1H)。これらのデータにより、ADAM12が腫瘍細胞表面へのMMP-14の動員を調節し得ることが更に確認された。
【０２１７】
実施例3:腫瘍細胞表面におけるADAM12及びMMP-14の共局在化は、ゼラチン分解を誘発する。
【０２１８】
細胞表面におけるADAM12とMMP-14との空間関係を、図1において調べた3種類の細胞株で、Duolink手法(材料及び方法において簡単に説明している)を用いて分析した。Duolink実験は、非透過処理細胞に対して行い、ADAM12及びMMP-14の共局在化を、細胞表面における明白色の点として視覚化した(図3A)。ADAM12及びMMP-14は、ADAM12が外因的に発現されたか、或いはMDA-MB-231細胞のように、内因的に発現されたかに関係無く、細胞表面に共局在化した(図3A)。
【０２１９】
次に、ADAM12が媒介するMMP-14の細胞内局在における変化が、MMP-14の特徴を示す生物活性を変化させるかを調べた。ゼラチン分解アッセイを用いて、様々な実験条件下での293-VnR細胞の基質分解活性を試験した。ゼラチン分解は、細胞表面下に黒色の領域を残すゼラチン蛍光の消失として定義した。ADAM12Δcyt-トランスフェクト細胞は、ゼラチンを分解可能だったが、ADAM12を発現しない細胞(即ち、非トランスフェクト細胞又はベクター対照によりトランスフェクトした細胞)では、ゼラチン分解が低いか、又は生じなかった(図3B)。ゼラチン分解は、トランスフェクションに用いたADAM12プラスミドの量の増加と共に増加した(図4A)。ADAM12を発現する培養物において、ゼラチン分解は、培養4時間後に検出できたが、20時間後には約5倍に増加した(図3C)。ADAM12及びMMP-14の細胞表面への移動がゼラチン分解の発生に必要かを、完全長ADAM12-Lで293-VnR細胞を一過性にトランスフェクトすることにより、更に試験した。完全長ADAM12-Lは、殆どが細胞内に保持されており(Hougaard et al., 2000)、細胞表面に容易に位置するADAM12Δcytの異所性発現を有する細胞と比較して、低いゼラチン分解効率を示した(図4B)。
【０２２０】
次に、図1に示したような、乳癌細胞株でのMMP-14の細胞内局在におけるADAM12依存性の変化が、ゼラチンを分解する能力に影響するかを分析した。MCF7-A12Δcyt細胞は、48時間後に有意なゼラチン分解を示したが、野生型MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞は、この時間枠では、ゼラチンを分解する傾向を殆ど示さなかった(図3D、E)。MDA-MB-231細胞は、それ自体がゼラチンを分解することが知られている(Yamaguchi et al., 2009)。ここでは、MDA-MB-231細胞内の内因性ADAM12のsiRNAノックダウンが、ゼラチン分解を有意に減少させることが実証された(図3F、G)。
【０２２１】
総合すれば、これらのデータは、ADAM12及びMMP-14が腫瘍細胞表面に共局在化すること、及びADAM12が乳癌細胞株におけるゼラチン分解の重要な調節因子であることを示している。
【０２２２】
実施例4:ADAM12誘導性ゼラチン分解がMMP-14により引き起こされる。
【０２２３】
次に、どのプロテアーゼがADAM12誘導性ゼラチン分解の要因であるかを調べた。ADAM12の触媒活性自体が、観察されたゼラチン分解に必要であるかを試験するために、触媒部位突然変異(E351Q)を含むADAM12Δcytにより、293-VnR細胞をトランスフェクトした。ゼラチン分解は、野生型ADAM12ΔcytとADAM12ΔcytE351Qとによるトランスフェクト後と同様であり、ADAM12自体がゼラチン分解の要因ではないことを示した(図5A)。ゼラチン分解がメタロプロテアーゼ活性から生じることを確認するために、何れもメタロプロテアーゼの広範な阻害剤であるGM6001又はTAPI-2により、ゼラチン上で増殖させる細胞を処理した(Black et al., 1997、Gijbels et al.,1994、Moss and Rasmussen, 2007)。GM6001及びTAPI-2は、共に有意なゼラチン分解の減少を引き起こした(図5B)。その後、MMP-14が関与するかを判断するために、ADAM12Δcyt-トランスフェクト293-VnR細胞において、MMP-14のsiRNAノックダウンを行った(図5C)。ゼラチン分解は、MMP-14ノックダウンの際に、対照siRNAと比較して有意に減少し(図5C)、MMP-14自体又はMMP-14活性化メタロプロテアーゼ(例えば、MMP-2)が、これらの実験条件下でのゼラチン分解に大きく寄与することを示唆した。
【０２２４】
細胞表面へのMMP-14の動員時に、MMP-2が活性化し、ゼラチン及びコラーゲンを分解することはよく知られている(Itoh et al., 2008)。そのため、MMP-2が観察されたゼラチン分解の候補であるかを試験することにした。最初に、ゼラチン分解を試験したトランスフェクト293-VnR細胞からの無血清細胞培養上清を、MMP-2の存在及び活性について、ザイモグラフィにより調べた(図5D、上のパネル)。非トランスフェクト293-VnR細胞由来の培地では、MMP-2の不活性プロ形態の存在のみが検出され、細胞をADAM12Δcyt又は空ベクターの対照によりトランスフェクトした際には、MMP-2の成熟形態は観察されなかった。一方、細胞をMMP-14により直接トランスフェクトした場合、MMP-2の活性(成熟)形態を、ザイモグラムにおけるサイズの移行から検出することができた(図5D、上のパネル)。対応するゼラチン分解実験(下のパネル)から分かるように、ゼラチン分解は、MMP-2が活性化していないADAM12Δcytトランスフェクト培養物において発生しているが、MMP-14によりトランスフェクトした細胞では、MMP-2の活性化及びゼラチン分解が共に観察されている。MCF7-A12Δcyt及びMCF7-A12Δcyt+dox由来の無血清細胞培養上清に対して行ったザイモグラフィも、MMP-2の活性化を示さなかった(図5E)。したがって、これらのデータは、共に、MMP-2がADAM12誘導性ゼラチン分解の候補プロテアーゼでは無いことを示している。
【０２２５】
実施例5:αVβ3インテグリンは、ADAM12とMMP-14媒介ゼラチン分解との間を繋ぐ。
【０２２６】
我々は、以前に、ADAM12の分泌型が腫瘍細胞上のαVβ3インテグリンに結合することを明らかにしている(Thodeti et al., 2005b)。更に、MMP-14が細胞表面においてαVβ3インテグリンに関連すること、及び細胞表面のMMP-14活性がαVβ3インテグリンにより調節されることがよく知られている(Borrirukwanit et al., 2007、Deryugina et al., 2004、Galvez et al., 2002)。これらのデータに基づき、293-VnR細胞と異なりαVβ3インテグリン発現を示さないが、293-VnR細胞と同程度にMMP-14を発現する、親のHEK293細胞を試験した(図7A)。ADAM12Δcytを発現する非透過処理HEK293においてMMP-14の表面局在化は検出されず(図7B)、ゼラチン分解は見られなかった(図6A)。ADAM12Δcyt-トランスフェクト293-VnR細胞におけるゼラチン分解に対するαVβ3インテグリンの役割を試験するため、αVβ3インテグリンに対する阻害性LM609抗体を細胞に添加した。ゼラチン分解は、LM609の存在下で有意に減少した(図6B)。これらの結果は、ADAM12-MMP-14軸におけるαVβ3インテグリンの役割を示唆している。したがって、膜アンカーADAM12が、より大きな複合体においてαVβ3インテグリン及びMMP-14に関連するかを分析するために、ADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)を用いて免疫沈降による研究を行った。ADAM12を、MMP-14とαVβ3インテグリンとの両方と免疫共沈降させた(図6C)。興味深いことに、ADAM12を発現するHEK293において細胞表面MMP-14は検出できなかったが、ADAM12及びMMP-14タンパク質間の免疫共沈降は、依然として観察された(図7C)。これは、ADAM12及びMMP-14間の相互作用が溶解物中に存在するが、しかしながら、αVβ3インテグリンが、細胞表面へのタンパク質の三重複合体の正確な輸送において重要な役割を果たすことを実証している。加えて、細胞表面におけるADAM12、MMP-14、及びαVβ3インテグリン間の共局在化を視覚化するために、ADAM12Δcytによりトランスフェクトした非透過処理細胞である293-VnR細胞に対してDuolink手法を利用した。図6Dに示すように、細胞表面での共局在化が、ADAM12及びαVβ3インテグリン間と、αVβ3インテグリン及びMMP-14間とにおいて観察された(図6D)。ADAM12Δcytを用いて、試験細胞をトランスフェクトしたため、これらのデータから、ADAM12、MMP-14、及びαVβ3インテグリン間の相互作用が3つの分子の細胞外部分に関係することが明らかとなる。
【０２２７】
幾つかの報告では、αVβ3インテグリンのレベルがMCF7細胞の細胞表面において低いこと又は存在しないことが実証されているが(Deryugina et al., 2000; Figueira et al., 2009; Taherian et al., 2011)、しかしながら、FACS解析及び免疫染色は、共にMCF7細胞におけるADAM12の過剰発現がαVβ3インテグリンの細胞表面レベルを増加させることを示している(図6E、6F)。加えて、我々は、MDA-MB-231細胞が中程度のレベルのαVβ3インテグリンを発現することを示す以前の報告(Borrirukwanit et al., 2007; Taherian et al., 2011)を確認した(図6E)。そのため、ADAM12依存性のMMP-14の活性化がαVβ3インテグリン機能に関連するかを分析するために、MCF7-A12Δcyt細胞培養物を、αVβ3インテグリン阻害性LM609抗体により処理した。LM609処理MCF7-A12Δcyt細胞培養物において、IgG処理培養物と比較して、ゼラチン分解の80％の減少が観察された(図6G)。総合すれば、これらのデータは、αVβ3インテグリンがADAM12誘導性のMMP-14の活性化に関与することを示している。
【０２２８】
実施例6:ADAM12プロドメインに対するモノクローナル抗体がゼラチン分解を阻害する
【０２２９】
ヒトADAM12に対するモノクローナル抗体(mAb)を作成し、ゼラチン分解アッセイにおいて機能阻害活性について試験した。mAb 6E6は、細胞表面でADAM12を塊状化することが既に明らかとなっており(Albrechtsen et al., 2011)、ADAM12Δcytによりトランスフェクトした293-VnR細胞におけるゼラチン分解に影響しなかった。作成したADAM12に対する3種類のmAb (7B8 8F8、及び7C4)は、ゼラチン分解を明らかに阻害した(図8A、8B及び図9A、9B)。MAb 8F8及び7B8は、ADAM12のプロドメインのエピトープを認識する(図9)。インビトロ消光性蛍光ペプチド切断アッセイ及び細胞に基づくエクトドメイン放出アッセイにより、8F8及び7B8がADAM12の触媒活性に対する阻害効果を引き出さないことが実証されている(データ図示せず)。これらの抗体は、ADAM12の代わりにMMP-14によりトランスフェクトした293-VnR細胞におけるゼラチン分解に対する阻害効果も全く示さなかった(図9B)。
【０２３０】
加えて、MCF7-A12Δcyt及びMDA-MB-231細胞がゼラチンを分解する能力について、ヒトADAM12に対するmAbの影響を試験した。MCF7-A12Δcyt細胞を用いた場合、mAb 7B8及び8F8は、マウス対照IgGと比較して、ゼラチン分解に対する有意な阻害効果を示した(図8C、8D)。同様に、MDA-MB-231細胞において、ゼラチン分解は、7B8及び8F8 mAbを用いた際に有意に阻害された(図8E、8F)。
【０２３１】
実施例7:ADAM12は、乳房腫瘍細胞株をコラーゲン誘導性アポトーシスから保護する。
【０２３２】
最近の研究では、MMP-14がI型コラーゲン誘導性アポトーシスから乳癌細胞を保護することが実証されている(Maquoi et al., 2012)。我々は以前に、ADAM12の過剰発現が、インビボ及びインビトロの両方で、腫瘍細胞のアポトーシスを減少させることを明らかにしている(Kveiborg et al., 2005)。これらの結果を踏まえ、ADAM12媒介性のMMP-14の活性化がMCF7細胞をI型コラーゲン誘導性アポトーシスから保護するかを試験することにした。この目的のため、MCF7、MCF7-A12Δcyt、及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞を、I型コラーゲンに6乃至7日間に亘り浸し、アポトーシス細胞の形態学的性質(例えば、膜の小疱形成)を調べた。ADAM12を発現するMCF7細胞(MCF7-A12Δcyt)は、明確な細胞境界を有する丸形を維持したが、ADAM12を発現しないMCF7細胞(MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox)は、膜の小疱形成が見られ、アポトーシスの発生を示した(データ図示せず)。3種類のMCF7細胞株におけるアポトーシス細胞の頻度を分析するために、3-Dコラーゲンゲルから回収した細胞において、アポトーシス小体を計数した。MCF7細胞におけるアポトーシス小体の代表画像を図12Aに示す。アポトーシス小体のパーセントは、MCF7-A12Δcytにおいて、MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞と比較して有意に減少した(図11A)。ADAM12の過剰発現がMCF7細胞をアポトーシスから保護するという観察は、ApopTag染色を用いて確認された(図12B)。
【０２３３】
MMP-14は、アポトーシス促進性Bcl-2相互作用キラータンパク質(BIK)の上方制御を妨げることが以前に明らかになっている(Maquoi et al., 2012)。我々は、最初に、BIK及び他のアポトーシス促進性Bcl-2相互作用タンパク質(BCL2L11、BIM)のタンパク質レベルを、2-D培養において増殖させた3種類のMCF7細胞株において分析した。BCL2L11のレベルは、3種類のMCF細胞株で変化が観測されなかったが、MCF7-A12ΔcytにおいてBIKの僅かな下方制御が見られた(図12C)。しかしながら、(Maquoi et al., 2012)と一致して、3-Dコラーゲンゲルにおいて増殖させたMCF7-A12Δcyt細胞では、MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox対照細胞と比較して、BIK、更にBCL2L11の有意な下方制御が観察された。これは、2-D培養物中のADAM12が、細胞を刺激して抗アポトーシス表現型を取得させ、3-Dコラーゲンゲルにおいて増殖させた場合のように細胞がチャレンジを受けた場合に、これが更に顕著になることを示唆している(図11B)。総合すれば、これは、ADAM12が、MMP-14、BIK、及びBCL2L11活性の調節を介して、MCF7細胞をプログラム細胞死から保護することを示している(図11B)。MCF7-A12Δcyt細胞においてADAM12が誘導するアポトーシス保護効果は、これらの細胞をADAM12に対するmAb 8F8と共にインキュベートすることにより低減させることができた(図11C及び図12B)。同様に、ADAM12には影響しないがMMP-14活性を阻害するメタロプロテアーゼ阻害剤GM6001を用いることで、MCF7-A12Δcyt細胞内のアポトーシス小体の割合が有意に増加する一方、mAb 8F8又はGM6001の影響は、野生型MCF7及びMCF7-A12Δcyt+dox細胞において観察されなかった(図11C及び図12B)。
【０２３４】
Maquoiらは、MDA-MB-231細胞が非常に低いレベルのアポトーシス細胞を3-Dコラーゲン培養物中に示すことを以前に明らかにしている(Maquoi et al., 2012)。そのため、我々は、ADAM12活性の阻害が3-Dコラーゲンゲルにおいて増殖させたMDA-MB-231細胞のアポトーシスに影響するかを調べた。実際に、ADAM12 (8F8)に対するmAbと共にインキュベートしたMDA-MB-231細胞では、対照細胞と比較して、アポトーシス小体のレベルが有意に増加した(図11D)。ApopTag染色でも、対照細胞と比較して、MCF7-A12Δcytにおけるアポトーシス細胞数の減少が明らかとなった(図12C)。GM6001も同様に、MDA-MB-231細胞におけるアポトーシス小体の割合を有意に増加させた(図11D、図12D)。アポトーシスに対するADAM12媒介性の保護におけるMMP-14の役割を更に精査するため、MDA-MB-231細胞をMMP-14に対するsiRNAにより一過性にトランスフェクトした。MDA-MB-231細胞の3-Dコラーゲン培養物は、MMP-14の効率的なノックダウンを示しており(図11E)、アポトーシス小体のパーセントの有意な増加が見られた(図11F)。まとめると、これらのデータは、ADAM12誘導性のMMP-14活性が癌細胞をプログラム細胞死から保護することを示している。これらの発見と一致して、抗体8F8は、インビトロで細胞の増殖に対する影響を示さなかった。したがって、ADAM12のプロドメインに対する抗体は、ADAM12とMMP-14との間の相互作用を抑制し、そのため、阻害を軽減する。
【０２３５】
実施例8:ADAM12は、乳房腫瘍細胞アポトーシス能をインビボで減少させる。
【０２３６】
ADAM12及びMMP-14が共に腫瘍細胞のアポトーシスにインビボで影響することを実証した以前の研究に基づいて(Kveiborg et al., 2005、Maquoi et al., 2012、Roy et al., 2011)、ADAM12が、MMP-14活性の調節を介して、乳癌のマウスモデルにおけるアポトーシス能を調節可能であるという仮説を立てた。そこで、MCF7-A12Δcyt細胞を、6乃至8週齢NOD.Cg-Prkdcマウスの乳腺に同所性に注入した。MCF7細胞におけるADAM12の過剰発現は、対照MCF7-A12Δcyt+doxマウス(MCF7-A12Δcyt細胞を注入したが飲料水中にドキシサイクリンを投与したもの)と比較して、有意に高い腫瘍量をもたらした(図13A)。ウェスタンブロットにより、ADAM12の発現がMCF7-A12Δcyt腫瘍において確認されたが、MCF7-A12Δcyt+dox腫瘍では確認されなかった(図13B) ADAM12-S及びADAM12-Lにより以前の研究を検証した際に(Roy et al., 2011)、MCF7腫瘍におけるADAM12Δcytの発現増加は、Ki67染色による判定では、腫瘍細胞の増殖に影響しなかった(図13C)。対照的に、ApopTag染色では、MCF7-A12Δcyt接種マウスにおいて、MCF7-A12Δcyt+doxマウスと比較して、アポトーシス腫瘍細胞数の有意な減少が明らかとなった(図13D)。MMP-14活性に対するADAM12の影響を評価するために、活性MMP-14を示す、部分的に自己消化されたMMP-14の43kDa断片(Cho et al., 2008; Ellerbroek et al., 2001; Itoh, 2006)のレベルを、ウェスタンブロットにより分析した(図13E)。バンド強度の定量による判定において、対照MCF7-A12Δcyt+dox腫瘍と比較して、MCF7-A12Δcyt腫瘍において、MMP-14の43kDa断片のレベルの有意な増加を観察した(図13F)。これらのインビボデータは、腫瘍の進行に対するADAM12の影響が、アポトーシスの減少を介して、恐らくはMMP-14の活性の増加を介して、媒介されることを示唆している。
【０２３７】
実施例9:ADAM12の発現は、ヒト乳癌におけるMMP-14及びMMP-2の発現と相関する。
【０２３８】
我々の細胞培養物及びマウスの研究から得られた結果は、乳房腫瘍におけるADAM12及びMMP-14の両方のレベル増加が腫瘍の進行にとって有利となることを示唆している。そのため、ヒト乳房腫瘍におけるADAM12及びMMP-14の発現の相関関係の調査を目指した。材料及び方法において記載した4種類のコホートから、合計733個のヒト乳房腫瘍試料について、遺伝子発現プロファイルデータセットを組み合わせた。全ての腫瘍は、補助化学療法を受けていないリンパ節陰性患者から取得しており、共に分析することで、ADAM12及びMMP-14発現の間に正の相関を発見した(図14A)。この正の相関は、エストロゲン受容体(ER)陽性腫瘍において、更にER、プロゲステロン受容体、及び上皮増殖因子受容体(ERBB2)の発現が欠如した乳癌のサブタイプである三重陰性乳房腫瘍(TNBC)において維持された(図14A)。興味深いことに、ADAM12とMMP-2との間には、更に強い相関が発見された。この正の相関は、全ての腫瘍、ER陽性腫瘍、及びTNBCで見られた(図14B)。これらのデータは、ADAM12が、MMP-14活性のモジュレータとして、ヒト乳房腫瘍に生物学的に関連し得ることを示唆している。
【０２３９】
実施例10:臨床状況における抗ADAM12抗体
【０２４０】
41歳の女性は、左乳房に腫瘤を見つけた。自己検診中、患者は、最初に小さな結節に気付き、受診までの2ヶ月に大きさが2倍になった。マンモグラフィにより、直径2.5cmの腫瘤の存在が確認された。胸部及び腹部CTスキャンでは、肺、肝臓、副腎、腎臓、脾臓、又は卵巣に腫瘤は見られなかった。骨スキャンも同じく陰性となった。
【０２４１】
患者は、非定型的根治的乳房切除術を受け、腋窩リンパ節の切除を含め、腫瘍を除去した。14のリンパ節を取り除き、うち1つは、完全に腫瘍細胞に置き換わっており、他の3つは、顕微鏡的転移を示した。腫瘍の免疫染色により、三重陰性腫瘍であることが分かり、癌腫細胞の染色は、HER2/neu (ERBB2)、エストロゲン、及びプロゲステロン受容体について陰性となった。しかしながら、免疫染色を用いることで、腫瘍細胞の染色は、MMP-14及びADAM12発現の両方で陽性となった。
【０２４２】
臨床病期に基づいて、患者には、左乳房及び腋窩に対する補助放射線療法を施す。加えて、患者には、化学療法とADAM12に対するモノクローナル抗体を用いた標的療法との組み合わせを含む補助療法を施す。
【０２４３】
補助療法は、合計52週間のADAM12 mAb療法について、以下の用量及びスケジュールの一方に従って施している。
【０２４４】
パクリタキセル、ドセタキセル、又はドセタキセル/カルボプラチン投与中及び投与後:
初期量5mg/kgの静脈内注入を90分間、その後3mg/kgの静脈内注入を30分間、化学療法中毎週、最初の12週間(パクリタキセル又はドセタキセル)又は18週間(ドセタキセル/カルボプラチン)に行う。
【０２４５】
ADAM12 mAbの最終週の投与の1週間後、ADAM12 mAbの静脈内注入を6mg/kgで30乃至60分間、3週間毎に投与する。
【０２４６】
実施例11:配列
【０２４７】
配列番号1:ヒトADAM12-Lのアミノ酸配列
【化１】
2016536326.tif 000002
シグナルペプチド: 1-28
プロドメイン: 29-206
メタロプロテアーゼ: 207-417
ジスインテグリン: 418-512
システインリッチ: 513-588
融合様: 589-614
EGF様: 615-708
膜貫通: 709-729
細胞質尾部: 730-909
プロドメイン内のNグリコシル化部位: 111-113 (NYT)
149-151 (NES)
【０２４８】
配列番号2:
ADAM12-Lのプロドメインのアミノ酸配列(配列番号1のアミノ酸29乃至206に対応)。
【化２】
2016536326.tif 000003
【０２４９】
配列番号3:
ヒトADAM12-L mRNA
GenBank: AF023476.2
太字斜体はコザックコンセンサス
太字下線はプロドメイン配列
【化３−１】
2016536326.tif 000004
【化３−２】
2016536326.tif 000005
【０２５０】
配列番号4
ヒトMMP-14
Uniprot: P50281
【化４】
2016536326.tif 000006
【０２５１】
配列番号5
ヒトMMP-14、mRNA
NCBI基準配列: NM_004995.2
【化５】
2016536326.tif 000007
【０２５２】
参考文献
【０２５３】
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【符号の説明】
【０２５４】
[図1]
A
Vector control: ベクター対照
Merged + DAPI: 併合 + DAPI
B
％ of cells with juxta nuclear MMP-14 staining: 核近傍MMP-14染色を伴なう細胞の％
ADAM12 negative cells: ADAM12陰性細胞
ADAM12 positive cells: ADAM12陽性細胞
C
％ MMP-14 and GFP-positive cells: MMP-14及びGFP陽性細胞の％
Vector-GFP: ベクター-GFP
D
Streptavidin precipitates: ストレプトアビジン沈殿物
Total cell lysate: 全細胞溶解物
Vector-GFP: ベクター-GFP
ADAM12 mature: ADAM12成熟
Actin: アクチン
E
Actin: アクチン
F
％ of cells with cell surface MMP-14 staining: 細胞表面MMP-14染色を伴なう細胞の％
G
merged: 併合
H
Fold changes of mRNA levels compared to siRNA control: siRNA対照と比較したmRNAレベルの倍数変化
siRNA対照
[図2]
A
FACS ％ cell surface staining: FACS, 細胞表面染色の％
Vector: ベクター
Anti-MMP-14: 抗MMP-14
Anti-ADAM12: 抗ADAM12
対照IgG
B
FACS, ％ MMP-14 cell surface staining: FACS, MMP-14細胞表面染色の％
C
FACS, ％ MMP-14 cell surface staining: FACS, MMP-14細胞表面染色の％
MDA-MB-231 siRNA control: MDA-MB-231 siRNA対照
[図3]
A
293-VnR vector control: 293-VnRベクター対照
B
293-VnR vector control: 293-VnRベクター対照
Oregon gelatin: Oregonゼラチン
Merged + DAPI: 併合 + DAPI
Oregon gelatin + DAPI: Oregonゼラチン + DAPI
C
Gelatin degradation (％ of ADAM12Δcyt, 20 hrs): ゼラチン分解(ADAM12Δcytの％、20時間)
Control: 対照
4 hours: 4時間
12 hours: 12時間
E
Gelatin degradation (％ of MCF-A12Δcyt): ゼラチン分解(MCF-A12Δcytの％)
F
MDA-MB-231 siRNA control: MDA-MB-231 siRNA対照
G
Gelatin degradation (％ of siRNA control): ゼラチン分解(siRNA対照の％)
[図4]
A
Gelatin degradation per cell (μm2): 細胞当たりのゼラチン分解(μm2)
μg cDNA used for transfection: トランスフェクションに用いたcDNAのμg
B
Gelatin degradation (％ of ADAM12-L): ゼラチン分解(ADAM12-Lの％)
[図5]
A
Gelatin degradation (％ of ADAM12Δcyt): ゼラチン分解(ADAM12Δcytの％)
B
Gelatin degradation (％ of ADAM12-positive cells): ゼラチン分解(ADAM12陽性細胞の％)
Vector control: ベクター対照
Vehicle control: ビヒクル対象
C
Gelatin degradation (％ of siRNA control): ゼラチン分解(siRNA対照の％)
siRNA control: siRNA対照
D及びE
無し
Vector control: ベクター対照
プロ(72kDa)
中間
活性
Gelatin degradation per cell (μm2)
[図6]
A
Gelatin (488): ゼラチン(488)
Merged: 併合
B
Control vector: 対照ベクター
ADAM12Δcyt+マウスIgG
Geratin degradation per cell (μm2): 細胞当たりのゼラチン分解(μm2)
C
β3 Integrin: β3インテグリン
Input: 入力
Actin: アクチン
Control IgG: 対照IgG
D
ADAM12-β3 integrin: ADAM12-β3インテグリン
αVβ3 integrin-MMP-14: αVβ3インテグリン-MMP-14
Control mouse and control rabbit: 対照マウス及び対照ウサギ
E
FACS ％ cell surface staining: FACS, 細胞表面染色の％
F
Oregon gelatin: オレゴンゼラチン
αVβ3 integrin: αVβ3インテグリン
Merged: 併合
G
Gelatin degradation (％ of MCF7-A12Δcyt IgG): ゼラチン分解(MCF7-A12Δcyt IgGの％)
[図7]
β3 integrin: β3インテグリン
Actin: アクチン
B
Combined + DAPI: 合体 + DAPI
C
Input: 入力
Actin: アクチン
[図8]
Gelatin: ゼラチン
Merged + DAPI: 併合 + DAPI
B
％ADAM12-positive cells with gelatin degradation: ゼラチン分解を有するADAM12陽性細胞の％
control: 対照
C
Mouse IgG: マウスIgG
D
Gelatin degradation by MCF7-A12Δcyt (％ of control IgG): MCF7-A12Δcytによるゼラチン分解(対照IgGの％)
E
Mouse IgG: マウスIgG
F
Gelatin degradation by MDA-MB-231 (％ of control IgG): MDA-MB-231によるゼラチン分解(対照IgGの％)
[図9]
％ ADAM12 positive cells with degradation: 分解を有するADAM12陽性細胞の％
vector control: ベクター対照
[図10]
A
6E6 (disintegrin- and cystein-rich domains): 6E6 (ジスインテグリンドメイン及びシステインリッチドメイン)
prodomain: プロドメイン
catatalytic domain: 触媒ドメイン
Control mouse: 対照マウス
B
Gelatin degradation (％ of MMP-14 6E6): ゼラチン分解(MMP-14 6E6の％)
[図11]
A、C、及びD
％ Apoptotic bodies in 3-D collagen cultures: 3-Dコラーゲン培養物におけるアポトーシス小体の％
B
Actin: アクチン
Fold change compared to MCF7: MCF7と比較した倍数変化
E
siRNA control: siRNA対照
プロ形態
成熟形態
断片
Actin: アクチン
MDA-MB-231 in 3-D collagen culture: 3-Dコラーゲン培養物におけるMDA-MB-231
F
％ Apoptotic bodies in MDA-MB-231 3-D collagen cultures: MDA-MB-231の3-Dコラーゲン培養物におけるアポトーシス小体の％
siRNA control: siRNA対照
[図12]
B及びD
％ ApoTag positive cells in 3-D collagen: 3-DコラーゲンにおけるApoTag陽性細胞の％
C
Actin: アクチン
[図13]
A
Tumor weight (g): 腫瘍重量(g)
B
Actin: アクチン
C
Number of Ki67-positive cells per mm2 tumor tissue: 腫瘍組織1mm2当たりのKi67陽性細胞数
D
Nuber of Apoptag-positive cells per mm2 tumor tissue: 腫瘍組織1mm2当たりのApoTag陽性細胞数
E
Actin: アクチン
F
43 kDa fragment of MMP-14/Actin: MMP-14/アクチンの43kDa断片
[図14]
All samples: 全試料
Linear regression: 線形回帰
Pearson Correlation: ピアソン相関
Estrogen receptor positive: エストロゲン受容体陽性
Tripel-negative breast cancer: 三重陰性乳癌
[図15]
％ Confluency: 培養密度(％)
Time (hours): 時間(時)
No treatment, n=10: 処理無し、n=10
【図１−１】
2016536326.tif 000008
【図１−２】
2016536326.tif 000009
【図１−３】
2016536326.tif 000010
【図１−４】
2016536326.tif 000011
【図１−５】
2016536326.tif 000012
【図２】
2016536326.tif 000013
【図３−１】
2016536326.tif 000014
【図３−２】
2016536326.tif 000015
【図３−３】
2016536326.tif 000016
【図３−４】
2016536326.tif 000017
【図４】
2016536326.tif 000018
【図５−１】
2016536326.tif 000019
【図５−２】
2016536326.tif 000020
【図５−３】
2016536326.tif 000021
【図６−１】
2016536326.tif 000022
【図６−２】
2016536326.tif 000023
【図６−３】
2016536326.tif 000024
【図６−４】
2016536326.tif 000025
【図７】
2016536326.tif 000026
【図８−１】
2016536326.tif 000027
【図８−２】
2016536326.tif 000028
【図８−３】
2016536326.tif 000029
【図９】
2016536326.tif 000030
【図１０】
2016536326.tif 000031
【図１１−１】
2016536326.tif 000032
【図１１−２】
2016536326.tif 000033
【図１１−３】
2016536326.tif 000034
【図１２−１】
2016536326.tif 000035
【図１２−２】
2016536326.tif 000036
【図１３−１】
2016536326.tif 000037
【図１３−２】
2016536326.tif 000038
【図１３−３】
2016536326.tif 000039
【図１４−１】
2016536326.tif 000040
【図１４−２】
2016536326.tif 000041
【図１５】
2016536326.tif 000042
【配列表】
2016536326000001.app
【国際調査報告】
2016536326.tif 000043
2016536326.tif 000044
2016536326.tif 000045
2016536326.tif 000046