(57)【要約】  本発明は、サンプルからの核酸の抽出、ＰＣＲの調製、およびＰＣＲ後の次世代シークエンシング方法が行われ得るｃＤＮＡライブラリの調製ステップを可能にする改良された半自動化された方法に関する。本方法および本方法に関連する追加の態様はより煩雑さを感じさせないものであり、コスト、試薬の量を抑え、そして、自動化されていない方法と比べて汚染が起こりにくい。
2016520330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルから核酸を抽出する工程、
ｂ）ＵＤＧ、ＤＮＡポリメラーゼ、および任意には逆転写酵素、およびｄＵＴＰを含む混合物に前記抽出した核酸を暴露する工程、
ｃ）先の増幅反応由来のキャリーオーバー増幅産物からの混合物を除染するために混合物をインキュベートする工程、
ｄ）ｄＵＴＰの存在下、増幅反応を行う工程
を含む、ＤＮＡライブラリを調製するための方法であって、
除染反応、任意には逆転写、およびＤＮＡポリメラーゼによって行われる増幅反応が、同じ反応混合物において行われる方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼがテルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的誘導体であって、Ｔａｑポリメラーゼの前記機能的誘導体が、Ｔａｑポリメラーゼの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも１００％のＤＮＡポリメリゼーション活性を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抽出された核酸が、工程ｂ）に先立って断片化される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡライブラリが、その後次世代シークエンシング反応において使用される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＵＤＧ、ＤＮＡポリメラーゼ、任意には逆転写酵素を含む酵素ミックスを含む試薬組成物。
【請求項６】
ｄＵＴＰをさらに含む請求項５記載の試薬組成物。
【請求項７】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的誘導体を含む試薬組成物。
【請求項８】
逆転写反応および／またはＰＣＲのための試薬を含む試薬組成物。
【請求項９】
核酸テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、ＵＤＧ酵素、および任意には逆転写酵素、およびｄＵＴＰ、ならびに、ＤＮＡポリメリゼーションおよび任意には逆転写のための試薬を含む核酸テンプレートの増幅のための反応混合物を除染するための方法。
【請求項１０】
前記ＵＤＧ酵素が、先の増幅反応由来のキャリーオーバー増幅産物からの混合物を除染するために充分な期間の後、不活性化される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼがテルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的誘導体である請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出された核酸が、工程ｂ）に先立って断片化される請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡライブラリが、その後次世代シークエンシング反応において使用される請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）サンプルから核酸を抽出する工程、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、および任意には逆転写酵素を含む混合物に前記抽出した核酸を暴露する工程、
ｃ）ｄＵＴＰの存在下、増幅反応を行う工程、
ｄ）得られた増幅産物を標準化する工程であって、
（ｉ）前記増幅産物を含む増幅混合物にアルカリ金属塩および溶媒を含むバッファ組成物を添加する工程、
（ii）前記増幅産物を含む増幅混合物にキャリア粒子を添加する工程、
（iii）ＤＮＡが前記キャリア粒子に結合するために充分な時間、前記混合物をインキュベートする工程、
（iv）前記混合物をエタノールで洗浄する工程、
（ｖ）前記キャリア粒子から標準化されたＰＣＲ産物を溶出される固定
を含む工程、
を含む、ＤＮＡライブラリを調製するための方法。
【請求項１５】
前記アルカリ金属塩がＮａＣｌである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒がポリエチレングリコールである請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記アルカリ金属塩が、約２．０〜約５．０Ｍの量のＮａＣｌとして、好ましくは約２．５Ｍ  ＮａＣｌとして添加される請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒がＰＥＧ８０００である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列分析の分野に関する。特には、本発明は、次世代シークエンシング（Next−Generation Sequencing、ＮＧＳ）に関連する方法およびツールに関する。ＤＮＡシークエンシングは、がんの進行に関与する種々の種類の遺伝子などを含む、多くのヒト疾患を読み解くための強力なアプローチである。
【背景技術】
【０００２】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術の出現は、シークエンシングにかかるコストを桁違いに低減し、および、スループットを顕著に増大させ、全ゲノムシークエンスを、臨床的行為を受け得る患者についての全体的なゲノム情報を獲得するための実行可能な方法とした。ＤＮＡシークエンシングは、個々の遺伝子、より大きな遺伝領域（すなわち遺伝子のクラスターまたはオペロン）、全長の染色体または完全長遺伝子の配列を決定するために使用され得る。使用される方法に依存して、シークエンシングはＤＮＡ中、または、動物、植物、微生物などの細胞、もしくは実質的に任意の他の遺伝情報源から単離されたヌクレオチドの順序を提供し得る。得られた配列は、分子生物学または遺伝学の研究者らによって、および、さらなる科学の発展のために使用され得、また、医療関係者によって処置法の決定を下すためまたは遺伝カウンセリングを助けるために使用され得る。後者の２つの使用は、しばしば個人別の医薬またはコンパニオン診断薬と関連して言及される。
【発明の概要】
【０００３】
ＮＧＳによってもたらされる利益とは別に、研究のツールから標準の臨床診療に変換され得る前に適切に取り組まねばならない多くの挑戦がある。診断を目的とするＮＧＳ技術は、できるだけ少ない手動の工程を必要とするべきであり、所定の時点で分析へと付される臨床サンプル以外の他の供給源由来の核酸材料によるコンタミネーションを防ぐために適切な機構を備えるべきであり、そして、方法は、迅速であり、かつ、臨床検査室で働いているスタッフによって容易に実施されるべきである。
【０００４】
それぞれの核酸配列の分析に使用される別個の方法をもたらす物理化学的機構を含む種々のＮＧＳ技術が開発されてきた。これらの技術は、当該技術分野において一般的に公知である。最も広範囲に適用されている技術は、イオン半導体（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標））シークエンシング、パイロシークエンシングおよび合成時解読（sequencing by synthesis）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＨＣＶアッセイのためのワークテーブルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
定義
本発明の方法を一般的に記載するにあたって、本発明方法のそれぞれの態様がより詳細に記載されるであろう。
【０００７】
本明細書中で使用されるように、シークエンシングされる核酸は、標的核酸（または標的）と称される。標的核酸としては、これらに限定される訳ではないが例えばゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、および、これらに限定される訳ではないが例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡなどが挙げられるがこれらに限定される訳ではない。標的核酸は、天然の供給源または人工の供給源を含む任意の供給源由来であり得る。核酸としては、ＰＣＲ産物、コスミド、プラスミド、天然または人工のライブラリのメンバーまたは種などであってもよい。本発明はこの意味において限定されることを意図していない。核酸は、これらに限定される訳ではないが、例えば、ヒトなどの哺乳類、ならびにバクテリア、ウイルス、菌類、寄生生物、およびマイコバクテリアなどの微生物などを含む動物または病原体源由来であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルス性核酸ではない。標的核酸は、これらに限定される訳ではないが、例えば、血液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、皮膚、髪、尿、便および粘液などの任意の体液または組織から得られ得る。標的核酸はまた、これらに限定される訳ではないが、環境サンプル（例えば水サンプルなど）、食物サンプル、または法医学的サンプル由来であってもよく、ここでサンプルは、新規のサンプル（例えば、核酸抽出に直接的に付された生検材料など）、または、保管が可能であるように処理されたサンプル、例えばホルマリン固定および／またはパラフィン包埋されたサンプル（ＦＦＰＥサンプル）などであり得る。
【０００８】
標的核酸は、当該技術分野において公知の任意の様式を用いて調製される。例として、ゲノムＤＮＡは、当該技術分野において公知の技術にしたがいサンプルから収集され得る（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」を参照のこと）。収集に続いて、ＤＮＡは、より短い長さの核酸を得るために断片化され得る。得られたフラグメントは、数百、数千または数万ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、フラグメントは、５０〜１０００ヌクレオチド長、１００〜１０００ヌクレオチド長、２００〜１０００塩基対長、または３００〜８００塩基対長、などであり得るがこれらに限定されるわけではない。核酸は、これらに限定される訳ではないが例えば機械的、酵素的または化学的手段を含む任意の手段によって断片化され得る。例えば、せん断、超音波処理、噴霧化、およびエンドヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅ  Ｉなど）消化、または、当該技術分野において核酸フラグメント、好ましくは所望の長さのフラグメントを産生するための公知の他の任意の技術などが挙げられる。断片化の後に、特定の長さをもつフラグメントを濃縮するまたは単離するために使用されるサイズ選択技術が続き得る。このような技術もまた当該技術分野において公知であり、そして、これらに限定される訳ではないが例えばゲル電気泳動またはＳＰＲＩなどを含む。
【０００９】
代替的には、既に所望の長さである標的核酸が使用され得る。このような標的核酸としては例えば、エクソン濃縮法（exon enrichment process）由来のものなどが挙げられる。シークエンシングに先立って、エクソンなどの配列を単離するおよび／または濃縮するための方法に関しては、Albertetら、Nat Meth 4(11):903-905 (2007)、Porrecaら、Nat Meth 4(11):931-936 (2007)、Okouら、Nat Meth 4(11):907-909 (2007)を参照のこと。したがって、より長い標的核酸を断片化する（ランダムにまたは非ランダムに）よりもむしろ、標的は、例えばｍＲＮＡｓ、ｃＤＮＡｓ、エクソン、（上述されるような）ＰＣＲ産物などのより短い、使用可能な長さで、天然に存在するまたは単離され得る核酸であり得る。
【００１０】
一般的に、標的核酸は、５’末端および３’末端のどちらかまたは両方で配列に連結される。これらのアダプター配列は、本発明のシークエンシング方法において使用され得る、シークエンシングプライマー位置（すなわち、シークエンシングプライマーがハイブリダイズするであろう位置）を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、後述されるように、増幅反応に付される標的は、同じまたは類似の長さ（例えば、標的間で５〜１０％の変動など）のものである。いくつかの実施形態において、このような変動は、全てのテンプレートが均一に増幅されることを確実にするために可能な限り小さく抑えられ得る。
【００１２】
増幅された産物は、様々な方法で担体の表面（例えばガラス表面など）に固定化され得る。例えば、増幅プロセスは、溶液中で行われて、そして、最終産物がその後、担体表面に付着されてもよい。増幅産物は、その５’末端またはその３’末端で固体担体へと付着され得る。付着は、担体表面に固定化されている核酸へのハイブリダイゼーションを介して行われてもよく、また、増幅産物の末端上の部位と担体表面上の部位との相互作用を介して行われてもよい。例として、ストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジンでコートされた担体表面とビオチンまたはデュアルビオチンでラベルされたＤＮＡ（Marguliesら、Nature 437:376 (2005)）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）と抗ジゴキシゲニン抗体または抗体フラグメント、フルオレセインと抗フルオレセイン抗体または抗体フラグメント（Goreら、Nature 442, 836-9 (2006)）の使用、または、例えばアミン官能化ガラスに結合され得、そしてビオチンラベル化されたＤＮＡをストレプトアビジンサンドイッチを介して固定化するために使用され得る例えばビオチン化スクシンイミジルプロピオネート−ＰＥＧなどのヘテロ官能性のクロスリンカーの使用（すなわち、核酸ビオチンストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジン−ビオチン固体担体相互作用）を介した使用などが挙げられる。
【００１３】
テンプレートは、表面上にランダムに固定化されているものとして参照されてもよい。これは、テンプレートが配列に基づいて固体担体表面上に配置されていないことを意味する。しかしながら、それらは、それぞれのテンプレートが、ポリメラーゼによって媒介される取り込み反応のあいだおよび／またはテンプレートの伸長のあいだに別のテンプレートによって使用されないであろう領域（つまり容量）によって、囲まれていることを確実にするような様式で固体担体上に配置され得る。すなわち、いくつかの実施形態において、テンプレートは、テンプレート同士のあいだのいかなる相互作用も防ぐために互いに十分な距離離れて表面上に配置される。
【００１４】
固体担体とは、それにテンプレートが結合または固定化されるエレメントであって、材料が、テンプレート、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および、シークエンシング反応および洗浄において使用される他の成分に比較的不活性である限り、これらに限定される訳ではないが例えばガラスまたは他のシリカベースの材料、プラスティック、または他のポリマーベースの材料などを包含する任意の材料を含み得る。固体担体は剛直性であっても剛直性でなくてもよい。多孔性であってもよい。連続的であっても連続的でなくてもよい。いくつかの実施形態において、固体担体は、ガラススライドである。いくつかの実施形態において、担体は、それ自身が固体担体上に固定化されている複数のビーズまたは粒子（例えばマイクロ粒子など）である。これらのビーズは多孔性であってもよい。担体は、メッシュであってもよい。いくつかの実施形態において、固体担体は、それ自身がこれらに限定される訳ではないが例えばコンタクト撮像素子などの検出器またはセンサーである。
【００１５】
複数のうちのそれぞれのメンバーが他のメンバーから十分に離間して配置されており、したがって、テンプレート間で重なりが発生していない限り、同一のまたは異なる複数のテンプレートが固体担体へと連結されてもよいことが理解されるべきである。
【００１６】
典型的には、テンプレートは、その自由端上で観察可能な（または検出可能な）部位へと結合されるべきである。この部位は、テンプレートの自由端を表すことを意図しており、したがって、力の方向におけるその位置および動きは、テンプレートの長さを示している。観察可能な部位は、任意の数の部位であり得、および、本発明はこの特性によって限定されるものではない。観察可能な部位の特性は、テンプレートの長さにおける変化を観察（または検出またはモニター）するために適したセンサーまたは検出器の種類を規定するであろう。いくつかの実施形態において、観察可能な部位は、例えばマイクロビーズなどのビーズであり、および、より特には、例えば磁性ビーズである。
【００１７】
部位は、様々な方法を介して、および、これらに限定される訳ではないが例えばビオチン／ストレプトアビジン、ＤＩＧ／抗ＤＩＧ、およびフルオレセイン／抗フルオレセイン結合対などの非共有結合性相互作用、ならびに、例えば本明細書においてテンプレート（またはプライマー）の担体表面への共有結合的固定化と関連して記載されるものなどの共有結合性相互作用などの様々な相互作用を用いることを介して、テンプレートへと付着され得る。
【００１８】
固体担体は、フローセルの一部またはフローセルに隣接する。本明細書で使用されるように、フローセルは、それを通して流体が行き来するインレットおよびアウトレットポートを少なくとも備えるチャンバである。テンプレートが連結される固体担体は、テンプレートを観察するために使用される検出システムの位置に依存して、フローセルの下方、上方、または隣に位置される。固体担体は、底壁、側壁、または上壁を備えるフローセルの壁部であってもよい。
【００１９】
理解されるであろうように、正確かつ迅速なテンプレートのシークエンシングは、非取り込み型ヌクレオチドがシステムから除去される程度および速さに依存する。したがって、迅速かつ完全な（またはほぼ完全な）非取り込み型ヌクレオチドの除去が重要である。微小流体システムはまた、洗浄能力を最大限のものとし、より少ない洗浄容量および洗浄間隔をもたらし得るようにデザインされるべきである。
【００２０】
非取り込み型ヌクレオチドの除去はまた、非取り込み型ｄＮＴＰｓを分解し、それらをさらなる取り込みに対して不適切なものとするアピラーゼの使用を介して部分的にまたは完全に行われ得る。アピラーゼは、自由流動性であり、洗浄バッファに添加され、そして、任意の種類のヌクレオチド三リン酸の取り込みが終了された（テンプレートの末端の検出可能な部位によるバックグラウンド以上の任意の動きの停止によって示される）後で、フローセル中へと導入され得る。代替的にまたは追加で、アピラーゼは、例えば固体担体表面（テンプレートもまたそこに固定または固定化される）などのフローセル内部に固定または固定化されてもよい。これは、酵素をより利用可能なものとするため、および表面への近接に関連するいかなる立体障害をも排除するため、リンカーの使用を介して行われ得る。アピラーゼは、長さの異なる様々なリンカーに結合され得る。この場合、アピラーゼは、フローセル内の様々なフローストリーム中、例えば壁部の近くの、および、フローストリームの近くまたはフローストリーム中央部などに存在し得る。上述のように、小さな速度で流れるフローストリームは壁部近くのスローストリームであり、そして、これらのフローストリーム中に存在している非取り込み型ｄＮＴＰｓは取り除かれにくい。アピラーゼをこのようなフローストリーム中に存在させることは、これらｄＮＴＰｓの除去を改善するはずである。このことは、テンプレート長における変化が、洗浄後にフローセル中に残存する残渣のおよび非取り込み型のｄＮＴＰによるものではなく、新たにフォローセル中へと導入されるｄＮＴＰｓの取り込みの結果である可能性を増加させるであろう。
【００２１】
本発明のいくつかの態様において、シークエンシング方法は、合成時解読（sequencing-by-synthesis）反応として参照される。これは、第１の核酸の配列を決定することが、第１番目をテンプレートとして用いる第２の核酸の合成を必要とすることを意味している。この方法によれば、第２の核酸の配列は、取り込まれたｄＮＴＰｓの順序および数から決定され、そして、第１の核酸の配列は、第１の核酸配列の相補として決定される。本発明の方法は、ｄＮＴＰ取り込みを、テンプレートの長さにおける変化によって検出するものであって、合成されている核酸へのｄＮＴＰの付加を直接的に観察することによるものではない。結果として、ｄＮＴＰは、天然のｄＮＴＰ（すなわち、例えば蛍光団などの任意の外因性の検出可能なラベルなどのいかなる修飾もなされていないｄＮＴＰ）であり得る。本開示から明らかであるように、本発明のシークエンシング方法もまた、テンプレートがそのまま保存されていることを必要とする。本発明のいくつかの態様は、蛍光なしでまたは非蛍光的様式で起こることが記載されているシークエンシング方法を含む。これらの特徴は、方法が蛍光の検出なしに、具体的には、取り込まれるそれぞれのｄＮＴＰからの蛍光の検出なしに、行われ得ることを意味している。これらの方法の実施形態は、したがって、外因性の蛍光団の付加によって修飾されていない天然のｄＮＴＰｓを使用し得る。しかしながら、これらの特徴は、テンプレートの自由端へ結合される観察可能な部位がそれ自身蛍光性であることの可能性を排除するものではない。この後者の場合、テンプレート長における変化は、個々に取り込まれるｄＮＴＰからの蛍光よりも、観察可能な部位の蛍光を介して可視化されるであろう。
【００２２】
同様に、本明細書において提供されるシークエンシング方法は観察可能な部位それ自身を検出する（例えば、ＣＭＯＳコンタクト撮像素子を用いることなどにより可能である）ことによってヌクレオチド取り込みを検出することが可能であることが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態において、観察可能な部位は、直接的に、および、酵素媒介性の事象を必要とすることなく、検出される。酵素的に検出されるヌクレオチド取り込みの例としては、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって媒介される遊離無機ピロリン酸塩の検出と組み合わせられるパイロシークエンシングが挙げられる（LeamonおよびRothberg、Chemical Reviews、"Cramming More Sequencing Reactions onto Microreactor Chips"、２００６を参照のこと）。したがって、本発明の態様は、ヌクレオチド取り込みが酵素により発生されるシグナルを使用することなく検出され得るため、非酵素的方法（またはヌクレオチド取り込みの非酵素的検出）と称される。
【００２３】
様々な実施形態において、特に興味の対象である分析物は、水素イオンであり、および、本開示に基づく大規模なＩＳＦＥＴアレイは、ｐＨを計測するように特に構成される。他の実施形態において、モニターされる化学反応は、ＤＮＡ合成プロセスまたは他の化学的および／または生物学的プロセスに関連していてもよく、および、ｃｈｅｍＦＥＴアレイが、ｐＨ、または、興味の対象である具体的な化学的プロセスに関する関連情報を提供する一または複数の他の分析物を計測するように特に構成されていてもよい。様々な態様において、ｃｈｅｍＦＥＴアレイは、従来のＣＭＯＳプロセッシング技術を使用して製造され、そして、全体のアレイからの迅速なデータ取得（対応するピクセルのアウトプットシグナルを取得するために全てのピクセルをスキャニングする）を可能にするように特に構成される。好ましいシークエンシングシステムは、イオンＰＧＭシステムであるが、プロトン検出に基づく他のシークエンシングシステムもまた考慮されている。例えば、パイロシークエンシングシステムおよびＩｌｌｕｍｉｎａ合成時解読は選択肢である。分析物検出および計測に関して、以下により詳細に記載される様々な実施態様において、本開示にしたがうｃｈｅｍＦＥＴアレイにより計測される一または複数の分析物は、興味の対象である化学的プロセスまたは複数の化学的プロセス（例えば、複数の核酸鎖の結合、抗体の抗原への結合など）に関する関連情報を提供する様々な化学物質を含んでいてもよい。いくつかの態様において、分析物の存在を単に検出することに加えて一または複数の分析物のレベルまたは濃度を計測する能力は、化学的プロセスまたは複数の化学的プロセスに関連する貴重な情報を提供する。他の態様において、興味の対象である分析物または複数の分析物の存在の単なる検出が記帳な情報を提供するかもしれない。本発明の最も好ましいシークエンシング方法は、イオン半導体（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標））のＰＧＭ（登録商標）システムを含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、テンプレートの核酸を複数個の断片化された核酸を作製するために断片化する工程、ビーズのそれぞれがそこに結合されている１本鎖からなる断片化された核酸を備える複数個のビーズを作製するために、複数の断片化された核酸のそれぞれからの１つのストランドを個々にビーズに結合させる工程、ビーズに結合されている１本鎖からなる断片化された核酸を備える複数個のビーズを、エリア内にそれぞれのセンサーのための離間した反応チャンバを備えるｃｈｅｍＦＥＴアレイへと運ぶ工程であって、ここで、ただ１つのビーズがそれぞれの反応チャンバ内に位置される工程、および、複数のチャンバ内で同時にシークエンシング反応を行う工程、を含む核酸をシークエンシングするための方法を提供する。
【００２５】
本発明は、同じフローセル内または同じ固体担体上で同時に複数の異なるシークエンシング反応を行うことを想定している。それぞれのシークエンシング反応は、固体担体上に固定化された１つのテンプレートに関する情報をもたらす。一度のランでシークエンシングされ得るテンプレートの数は、テンプレートの予測される長さおよび固体担体のエリアに依存するであろう。したがって、実施形態に依存して、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００個のテンプレートが固体担体上に固定化され得、そして同時にシークエンシングされ得る。さらなる他の実施形態において、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜１００００またはそれ以上のテンプレートが同時にシークエンシングされ得る。表１は、固体担体が２．８μｍビーズ毎に１．６ピクセル有するように構成され得ることを示している。
【００２６】
シークエンシング反応は、テンプレートにハイブリダイズされる新規に合成される核酸ストランド中にｄＮＴＰｓを取り込むことによって行われる。新規に合成されるストランドは、テンプレートへと結合されるプライマー由来、または、それからポリメラーゼ媒介性の伸長が進行し得る他の分子由来であり得る。
【００２７】
非限定的な例において、シークエンシング反応は、それらのハイブリダイゼーションを可能にする条件下、テンプレートをプライマーと接触させることによって、および、テンプレート／プライマーハイブリッドをポリメラーゼと接触させることによって、開始され得る。このような接触は、固体担体上への固定化の前、あいだ、および／または後に起こり得る。重要な実施態様において、これは、固体担体への固定化に続いて起こる。
【００２８】
ひとたびプライマーおよびポリメラーゼがテンプレートへと結合されると、繰り返される試薬サイクルがフローセルに流入し、そしてスローセルを通り抜ける。試薬フローが、プライマーの３’末端の直ぐ下流であるテンプレート上のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む場合、ポリメラーゼはｄＮＴＰを取り込むであろう。テンプレート上の隣接する下流位置が同一のヌクレオチドによって占められている場合（本明細書においてホモポリマーと称する）、ポリメラーゼは同一の数の相補的なｄＮＴＰｓを取り込むであろう。このような取り込みは、フロー中のｄＮＴＰがテンプレート上の次に利用可能なヌクレオチドに対して相補的でない場合に停止されるであろう。流れたｄＮＴＰの量およびそのようなフローの時間は、それぞれ、テンプレート上の相補的な塩基の数および全ての可能なｄＮＴＰｓを取り込むために必要とされる時間を超えるであろう。
【００２９】
重要なことには、相補的ｄＮＴＰｓの取り込みは、二以上の結合されたプライマーで起こる。より好ましくは、取り込みは、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または全て、の結合プライマーにおいて起こる。プライマーの割合（％）は、テンプレート中の標的のコピーの数に依存し得る。いくつかの実施形態において、取り込みは、それぞれのテンプレート当たり、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、またはそれ以上のプライマーで起こる。本発明は、発生する長さ変化の大きさ（それが長さの増大であろうとも減少であろうとも）を増大させることによってシグナルノイズ比を向上させるため、任意のテンプレート上でハイブリダイズされているできるだけ多くのプライマーでｄＮＴＰｓを取り込むことを想定していることが理解されるであろう。
【００３０】
シークエンシング反応の一部として、テンプレートの核酸上の同じ場所にその相補的ヌクレオチドが存在していれば、ｄＮＴＰは、新規に合成されたストランドの３’末端（または第１に取り込まれるｄＮＴＰの場合、シークエンシングプライマーの３’末端）に連結される（または、本明細書において使用されるように「取り込まれる（incorporated into）」）であろう。導入されたｄＮＴＰの取り込みは、テンプレートの一本鎖領域を二本鎖領域へと変換し、そして、この変換がその後、伸長下のテンプレートの長さにおける変化に反映される。長さにおける変化は、テンプレートの自由端に位置している観察可能な部位（例えばビーズ）の位置を測定しおよびモニターすることによって検出される。したがって、ビーズ位置が任意の所定のフロースルーの後に変化しない場合、ｄＮＴＰは取り込まれなかったのであり、そして、フロースルーのｄＮＴＰはテンプレートにおける次に利用可能なヌクレオチドに対して相補的ではなかったということが結論付けられ得る。部位の位置における変化が検出された場合、その時には、フロースルーのｄＮＴＰは、相補的であり、そして、新規に合成されたストランドに取り込まれたのである。ｄＮＴＰは、その順番が既知であり、そして、シークエンシングが行われているあいだ中、好ましくは一定に保たれている限り、任意の順番で流され得る。
【００３１】
本発明のいくつかの態様における典型的なシークエンシングサイクルは、洗浄バッファを用いたフローチャンバ（およびウェル）の洗浄、テンプレートの核酸の末端に連結されている観察可能な部位の位置の測定、ポリメラーゼの存在下、フローチャンバ中への第１のｄＮＴＰ種（例えばｄＡＴＰ）の導入、観察可能な部位の位置の測定、洗浄バッファ中への任意にはアピラーゼのフロースルー、洗浄バッファのフロースルー、ポリメラーゼの存在下、第２のｄＮＴＰの導入などを含む。このプロセスは、全ての４つのｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）がチャンバを貫流し、そして新規に合成されたストランド中への取り込みが可能とされるまで継続される。この４つのヌクレオチドサイクルは、これらに限定される訳ではないが例えば１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上の回数を含む任意の回数繰り返され得る。サイクルの数は、シークエンシングされる標的の長さ、および、反応試薬、特にはｄＮＴＰストックおよび洗浄バッファ、を補充する必要性によって決定されるであろう。したがって、本発明の方法を用いて決定され得る配列の長さは、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド以内、１５００ヌクレオチド以内、２０００ヌクレオチド以内、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
【００３２】
適切なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらのサブユニット（そのようなサブユニットがテンプレートに基づき、およびハイブリダイズされたプライマーから出発して、新規な核酸ストランドを合成する能力を備えている限り）であり得る。適切なポリメラーゼのサブユニットの例は、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのｅｘｏ型クレノウ断片であって、かつ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたポリメラーゼである。他に適切なポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ４−ｅｘｏ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）、およびＢｓｔポリメラーゼなどが挙げられる。ポリメラーゼは、溶液中で遊離型であってもよく（および洗浄溶液および／またはｄＮＴＰ溶液中に存在していてもよく）、または、固体担体、フローセルの一または複数の壁部、テンプレートまたはプライマーの上に固定されていてもよい。
【００３３】
本明細書中で提供されるシークエンシング方法は、非限定的に、核酸（または、例えば哺乳類ゲノムおよびより特にはヒトゲノムなどを含むゲノム中に存在するような核酸の集合）の部分的または完全長のヌクレオチド配列を決定すること、サンプル中の核酸の存在または非存在を決定する（例えば診断的および法医学的方法において有益であり得るように）こと、核酸塩基が突然変異または変異（例えば一塩基多型を含む対立遺伝子変異など）を配列中に含むかどうかを決定すること、公知の核酸が新しい種の生成をもたらす突然変異を経ているかどうか（例えば抗生物質耐性微生物の原因であり得る）を決定すること、遺伝子改変された生物または遺伝子組換えの核酸の存在を決定すること、２つのサンプル（例えば通常の組織および病変組織）間で遺伝的な違いがあるかおよびどのような遺伝的な違いがあるかを決定すること、どのような治療レジメンが、被験者の体質および遺伝子型判定（例えばキャリア状態を決定するために一または複数の遺伝子座を分析することなど）によって決定され得る特定の症状をもつ被験者を処置するために最も有効であるかを決定すること、などを含む多数の適用例を有する。これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明の方法を用いて決定されるヌクレオチド配列は、得られた配列の向きを合わせるためおよび／または２つの配列間の違いを同定するために、公知のまたは参照の配列と比較されてもよい。これは、遺伝的変化および突然変異を同定するのに役立ち得る。公知のまたは参照の配列は、先に決定された配列（例えば、ある種の完全ゲノムシークエンシングから得られた）であり得る。
【００３４】
本明細書中で記載される方法はまた、症状の同定および処置を助けるように使用され得る。例えば、方法は、特定の症状と関連付けられる配列を同定するため、または、特定の症状がないことを診断するために使用される配列を同定するために使用され得る。分析されるサンプルは、ヒトを含む任意の対象由来のものであり得る。症状はがんまたは感染であり得る。
【００３５】
方法はまた、薬剤に対する肯定的な応答と関連付けられる配列を同定するために使用され得る。方法は、肯定的な応答を示した複数の対象からのＤＮＡ、および、薬剤に対して否定的な応答を示した複数の対象からのＤＮＡを、本明細書において提供される一または複数のシークエンシング方法を用いてシークエンシングすること、肯定的な応答を示した複数の対象における共通の配列、または、否定的な応答を示した対象からの共通の配列であってその配列が他の複数の対象の中には存在していない共通の配列を同定すること、を含んでいてもよい。好ましくは、対象は哺乳類であり、およびより好ましくはヒトである。
【００３６】
本明細書において記載される方法は、シークエンシング反応がロボティクスを介して実行されるように自動化されていてもよい。加えて、検出器またはセンサーから得られるシークエンシングデータは、個人用コンピュータ、個人用情報端末、携帯電話、ビデオゲームシステムまたはテレビへと入力されてもよく、これによりユーザーはシークエンシング反応の進行を離れてモニターすることができる。
【００３７】
本発明はさらに、増幅および／またはシークエンシング反応を行うために必要な様々な試薬および本明細書において示されている方法にしたがった使用のための説明を含むキットを想定している。
【００３８】
本明細書において提供される方法は、テンプレート中の標的のそれぞれのコピーにおける一つのヌクレオチドを検出することに依存している。分解能の限界は、使用される検出システムの分解能に依存する。
【００３９】
いくつかの創意に富んだ実施形態が本明細書において記載されそして説明されているが、当該技術分野における当業者であるならば、本明細書で記載されている機能を実行するおよび／または結果および／または一または複数の有利点を獲得するための様々な他の手段および／または構造を容易に想到するものであり、そして、そのような変化および／または改変のそれぞれは、本明細書において記載されている発明の実施形態の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者であれば容易に、本明細書中に記載の全てのパラメータ、特質、材料および構成が例示を目的とするものであり、実際のパラメータ、特質、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の適用または複数の適用に依存するであろうことを理解するであろう。当業者であれば、慣例的な実験法を使用するのみで、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するであろうし、または確認することができるであろう。したがって、以下の実施例は、例示のみを目的として提示されていること、および、添付のクレームおよびその等価物の範囲内で、発明の実施態様が具体的に記載され権利が主張される方法とは別の方法でも実行され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の実施態様は、本明細書中に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関連している。加えて、二またはそれ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせも、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾を生じさせない限り、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
本明細書中で規定されるおよび使用される全ての定義は、辞書的な定義、参照によって組み入れられる文献中の定義、および／または規定される用語の一般的な意味を超えて規定されていることが理解されるべきである。
【００４１】
本明細書および添付のクレームにおいて使用されるように、単数形の「一つ（a）」、「一つ（an）」および「その（the）」は、文脈が明確にそうではないと規定していない限り、複数の参照物を含む。
【００４２】
本発明の実施形態
本発明は、サンプルからの核酸塩基の単離、（ＲＴ−）ＰＣＲ反応のセットアップ、（ＲＴ−）ＰＣＲベースの核酸塩基増幅、ＰＣＲ後の標準化および増幅産物の精製、ＰＣＲ増幅産物の断片化、以下の（Ａ）および（Ｂ）において規定される工程によって特徴付けられるアダプターとの連結のための半自動化された方法などに関する。
【００４３】
方法（Ａ）
（ａ）サンプルからの核酸の抽出；
（ｂ）任意には、（ＲＴ−）ＰＣＲ反応を実施する前の、先の増幅反応からのクロスおよびキャリーオーバーコンタミネーションを消化するための、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）の（ＲＴ−）ＰＣＲ混合物への添加；
（ｃ）単離された核酸の種類（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に依存して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇを、任意にはウラシルも含むヌクレオチド三リン酸構成単位（すなわち個々のヌクレオチド）を使用する（ＲＴ−）ＰＣＲ；
（ｄ）ＲＴ−ＰＣＲにおいて得られた核酸の標準化（標準化のための、例えば磁性マイクロビーズ（例えばＡｘｙＰｒｅｐ（登録商標）  ＭＡＧ  ＰＣＲ  ノーマライザー、Ａｘｙｇｅｎなど）などのキャリア構造物を使用することによる、ここで、このようなビーズは所望の配列長のヌクレオチド配列と結合する）工程であって、ＰＣＲに続くＲＴ−ＰＣＲ混合物をビーズへ結合させる工程、ＰＣＲ産物の結合に続くマイクロビーズを全面的に洗浄する工程、マイクロビーズからのＰＣＲ増幅産物の溶出を含む工程；
（ｅ）工程（ｄ）で得られた、溶出されたＰＣＲ増幅産物の断片化（せん断）；
（ｆ）結合した核酸の洗浄および溶出に続いて、工程（ｅ）の産物をキャリア構造物、例えばマイクロビーズなどに結合させる工程；
（ｇ）アダプター配列（特定のサンプルへの核酸の帰属を可能にする（例えば、臨床サンプルと患者など）バーコード配列を含む）の工程（ｆ）で得られた産物への連結；
（ｈ）工程（ｇ）で得られた産物を、キャリア構造物、例えば先の工程（ｄ）および／または（ｆ）で使用されたマイクロビーズなどを用いてクリーンアップする工程；
（ｉ）工程（ｈ）で得られた産物を、（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭシステムを用いた）シークエンシング反応に付す工程；ならびに
（ｊ）工程（ｉ）で得られたシークエンシング反応の結果を分析する工程。
【００４４】
方法（Ｂ）
（ａ）サンプルからの核酸の抽出；
（ｂ）任意には、（ＲＴ−）ＰＣＲ反応を実施する前の、先の増幅反応からのクロスおよびキャリーオーバーコンタミネーションを消化するための、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）の（ＲＴ−）ＰＣＲ混合物への添加；
（ｃ）単離された核酸の種類（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に依存して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇを、任意にはウラシルも含むヌクレオチド三リン酸構成単位（すなわち個々のヌクレオチド）を使用するＲＴ−ＰＣＲ；
（ｄ）プライマーの部分的消化（例えば、ＦｕＰａ試薬（Life Technologies）を使用することによる）；
（ｅ）アダプター配列（バーコード配列を含む）の工程（ｄ）で得られた産物への連結；
（ｆ）ＲＴ−ＰＣＲにおいて得られた核酸の標準化（標準化のための、例えば磁性マイクロビーズ（例えばＡｘｙＰｒｅｐ（登録商標）  ＭＡＧ  ＰＣＲ  ノーマライザー、Ａｘｙｇｅｎなど）などのキャリア構造物を使用することによる、ここで、このようなビーズは所望の配列長のヌクレオチド配列と結合する）工程であって、ＰＣＲに続くＲＴ−ＰＣＲ混合物をビーズへ結合させる工程、ＰＣＲ産物の結合に続くマイクロビーズを全面的に洗浄する工程、マイクロビーズからのＰＣＲ増幅産物の溶出を含む工程；
（ｇ）工程（ｇ）で得られた産物を、キャリア構造物、例えば先の工程（ｄ）および／または（ｆ）で使用されたマイクロビーズなどを用いてクリーンアップする工程；
（ｉ）工程（ｈ）で得られた産物を、（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭシステムを用いた）シークエンシング反応に付す工程；ならびに
（ｊ）工程（ｉ）で得られたシークエンシング反応の結果の分析する工程。
【００４５】
上記のワークフロー方法の独自性は、分析のための核酸の抽出からのプロセス、および、結果の分析へと続く最終的なＮＧＳ反応に必要とされる時間を減少させることを可能にする。ＵＤＧの使用は、核酸抽出、ＰＣＲセットアップ、ＰＣＲ後の精製ステップ、ライブラリ調製およびＮＧＳのために自動化されたシステムにおけるコンタミネーションのリスクを大幅に低減する。上記の方法を用いたこれらのステップの自動化は、特に診断応用のために必要とされる時間およびコストを減少させる。
【００４６】
驚くべきことに、本明細書において記載される革新的な代替法が次世代シークエンシングライブラリの調製において使用され得ることが判明した。本発明の方法は、種々のタイプのＮＧＳライブラリ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングまたはイオン半導体シークエンシングなどのため）の調製に使用され得る。本方法は、上記に提示されたＮＧＳワークフローへと組み入れられ得る。
【００４７】
通常、ＮＧＳライブラリは、そのような目的に適したバッファを含む市販のキットを使用して調製される。これらのバッファは、ＧＣ含量に関わらず、ＮＧＳライブラリのロバストな、高い適合度の増幅に特異的に最適化されている。ＮＧＳライブラリの調製のための自動化オープンシステムが、先の実行からのＰＣＲアンプリコンによる臨床サンプルのキャリーオーバーコンタミネーションに対する高いリスクを受けやすいため、このような危険を低減することが目的である。キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐために、ｄＵＴＰが（ＲＴ−）ＰＣＲマスターミックスに添加される。ＰＣＲマスターミックスのウラシルデハイドロゲナーゼ（ＵＤＧ）処理は、先の実行からのおよびその後の反応混合物中へと偶発的にキャリーオーバーされてしまった汚染物質アンプリコンを除去する。ウラシルデハイドロゲナーゼ（ＵＤＧ）は、デオキシリボースと塩基との間のＮ−グリコシド結合の加水分解によってＤＮＡからウラシルを除去し、脱プリンまたは脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）を生成する酵素である。
【００４８】
しかしながら、ＮＧＳライブラリ調製のためのバッファ（例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙなど）は一般的に、増幅反応のあいだのｄＵＴＰの取り込みには適していない。驚くべきことに、ＮＧＳライブラリ調製のために特異的に開発された特異的な高い適合度の酵素が、高い適合度を有する酵素ではない従来のＴａｑポリメラーゼによって置換され得ることが判明した。従来の（ＲＴ−）ＰＣＲバッファ（例えば１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含むバッファなど）が使用可能である。ＮＧＳライブラリの調製のためのプロトコールにおけるこの改変は、増幅のあいだのｄＵＴＰの取り込みを可能にする。
【００４９】
したがって、ある態様において、本発明は、特定の高い適合度のＰＣＲバッファを用いることなく、しかしながら、本質的に任意のＰＣＲに適しているＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼなど）が使用される、増幅のあいだのｄＵＴＰの取り込みを含む、ＮＧＳライブラリを調製するための方法に関する。このむしろ簡単なバッファおよび酵素の置換がｄＵＴＰの導入および汚染物質のキャリーオーバーを防ぐためのその後のＵＤＧを用いた処理を可能にする。
【００５０】
さらに、本発明は、ｄＵＴＰの取り込みのために野生型（組換えのまたは天然の）Ｔａｑポリメラーゼを使用する次世代シークエンシングライブラリの調製のための核酸増幅反応において、キャリーオーバーコンタミネーションを排除するための方法、すなわち、分析されるべき抽出された核酸と潜在的に先の（ＲＴ−）ＰＣＲ反応由来の汚染源ＤＮＡとを含む試薬混合物の汚染除去のための方法であって、以下の工程：
ａ）サンプルから得られた核酸を断片化する工程、
ｂ）増幅反応混合物中に存在する汚染源核酸の任意の増幅物を分解するのに適した分解酵素を添加する工程、
ｃ）ｄＵＴＰの存在下、第１の核酸増幅反応において第１の核酸増幅物を提供するために核酸テンプレートを増幅する工程、および
ｄ）前記分解酵素を不活性化する工程
を含む方法に関する。
【００５１】
ｄＵＴＰの取り込みのために野生型（組換えのまたは天然の）Ｔａｑポリメラーゼまたはその誘導体を使用する次世代シークエンシングライブラリの調製のための核酸増幅反応において、キャリーオーバーコンタミネーションを排除するための前述の方法の好ましい実施形態において、分解酵素はＵＤＧである。ＵＤＧ処理は通常、数分、例えば１０分まで、好ましくは５分までの時間を要する。続いて、酵素は、例えば約５分間約５０℃の温度に暴露されることなどによって、不活性化される。
【００５２】
ｄＵＴＰの取り込みのために野生型Ｔａｑポリメラーゼを使用する次世代シークエンシングライブラリの調製のための核酸増幅反応において、キャリーオーバーコンタミネーションを排除するための前述の方法の別の好ましい実施形態において、分解酵素はＵＤＧであり、Ｔａｑポリメラーゼは組換えのまたは天然のポリメラーゼである。
【００５３】
ｄＵＴＰの取り込みのために野生型（組換えのまたは天然の）Ｔａｑポリメラーゼを使用する次世代シークエンシングライブラリの調製のための核酸塩基増幅反応において、キャリーオーバーコンタミネーションを排除するための前述の方法の好ましい実施形態において、分解酵素はＵＤＧであり、および、ＵＤＧ処理されたライブラリは、次世代シークエンシング方法におけるさらなる工程であって、以下の工程：
ａ）サンプルから得られた核酸を断片化する工程、
ｂ）増幅反応混合物中に存在する汚染源核酸の任意の増幅物を分解するのに適した分解酵素を添加する工程、
ｃ）ｄＵＴＰの存在下、第１の核酸増幅反応において第１の核酸増幅物を提供するために核酸テンプレートを増幅する工程、および
ｄ）前記分解酵素を不活性化する工程
を含む工程に付される。
【００５４】
ＤＮＡライブラリの作製のため、または、上記ＤＮＡライブラリ調製のプロセスにおける反応混合物の汚染除去のための本発明の方法の好ましい実施形態はまた、クレームに記載されている。
【００５５】
上述の方法（Ａ）および（Ｂ）の好ましい実施形態は、例えば、臨床サンプル中に存在する標的核酸（例えば、癌遺伝子、または、ＨＣＶ、ＨＩＶなどの病原体由来の核酸など）の配列に関する知識が患者にとって最も有望な処置を医師が選択することを助けるコンパニオン診断などのインビトロ診断応用に関するが、これは、いくつかの癌遺伝子における修飾がある種の薬剤に対する抵抗性を付与するためである。
【００５６】
方法（Ａ）の好ましい実施形態において、サンプルは、例えば患者、好ましくはヒトの患者から得られる新規のサンプルである。サンプル材料としては例えば、血液、血漿、血液細胞の亜集団、例えばＴ細胞など、脳脊髄液、唾液、便などが挙げられる。
【００５７】
方法（Ａ）の好ましい実施形態において、サンプルは、その中に見いだされる核酸材料、例えばウイルスの、バクテリアの、菌類の、もしくは寄生生物由来の核酸など、または、そのような核酸を含む材料、例えばウイルス粒子、バクテリアなど、を単離するための血漿である。
【００５８】
方法（Ａ）の好ましい実施形態において、サンプル材料は血漿であり、そして、核酸材料は例えばＨＣＶ，ＨＩＶなどのウイルス由来である。ＨＣＶが標的である場合、興味の対象である領域は、好ましくはＮＳ５Ｂ遺伝子領域であり、これは６種類の主なＨＣＶ遺伝子型および多数のサブタイプを同定するためによく適している。ＨＣＶゲノム領域中の標的領域は、好ましくは、ヌクレオチド８６１６からヌクレオチド９２９８まで伸びているが、６種類のＨＣＶ遺伝子型の同定が可能である限り、領域はわずかにより長かったりまたより短かったりしてもよい。好ましいプライマーは、ＨＣＶゲノムのヌクレオチド８６１６〜８６３８、８６１４〜８６３５、９２７６〜９２９８および９１７１〜９１９１に結合する。プライマーは当該技術分野において公知である天然または修飾ヌクレオチド構成単位を含み得る。
【００５９】
方法（Ｂ）の好ましい実施形態において、サンプルは、例えば患者、好ましくはヒトの患者から得られる新規のサンプルである。サンプル材料としては例えば、血液、血漿、血液細胞の亜集団、例えばＴ細胞など、脳脊髄液、唾液、便などが挙げられる。方法（Ｂ）の別の好ましい実施形態において、サンプルは新規のサンプルではなく、それが得られた後に、例えばホルマリン固定および／またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥサンプルは様々な癌遺伝子の分析のために好ましいサンプルである）を用いることなどにより処理されているサンプルである。
【００６０】
方法（Ｂ）の好ましい実施形態において、サンプル材料は、例えばホルマリン固定および／またはパラフィン包埋されていてもよい任意の組織からのサンプルなどのヒト患者由来のＦＦＰＥサンプル、例えば皮膚、胸部組織、結腸、肺、肝臓、筋肉などからのサンプルなどである。非常に好ましい実施形態において、サンプルはメラノーマ形成に関与する遺伝子の分析のための皮膚サンプルである。この意味において標的とされる好ましい遺伝子は、以下の遺伝子の群のうちの一または複数の遺伝子を少なくとも含む：ＮＲＡＳ、ＡＫＴ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＧＮＡ１１、ＥＲＢＢ４、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＧＮＡＱ。これらの遺伝子は、メラノーマの進行に関与することが知られており、そして、それぞれの遺伝子の種々の部位に種々の点突然変異を含み得る。いくつかの突然変異が薬剤耐性を付与する一方、他のものは薬剤で処置可能（薬剤に感受性）であることが知られているため、特定の突然変異の分析は、治療する医師が適切な療法を選択することを可能にさせる。
【００６１】
本発明の別の態様は、ＦＦＰＥ組織からの核酸抽出のための対照材料として作用し得る新規ＦＦＰＥ細胞株の提供である。これらの細胞株は、標的配列に対応する遺伝情報、例えば形質転換を介してまたは他の方法を使用して先に導入された遺伝材料など、を保持しているかもしれない。代替的に、これらの遺伝子は、例えば細胞がすでに興味の対象である標的遺伝子（例えば癌遺伝子など）を保持している場合、または、標的遺伝子が実際のアッセイにおいて標的とされる遺伝子とは異なるべきである場合などには、遺伝子改変されていなくてもよい。例えば、アッセイが、臨床サンプルにおける一または複数の癌遺伝子の突然変異を標的としている場合、ＦＦＰＥ細胞株中の標的とされる遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、または、突然変異されていない野生型遺伝子であってもよい。ＦＦＰＥ細胞株材料の量は個々のアッセイの必要要件に合致するように選択され得るため、細胞株は、標的核酸の定量可能な量の供給源を提供する。本発明の細胞株は、任意のアッセイのためのキットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、さらに、核酸、例えばプライマー、バッファ、酵素などの抽出、精製、増幅または他の操作に適した追加の化学試薬を含んでいてもよい。
【００６２】
本明細書中で提供される別の態様は、ＤＮＡライブラリの標準化のための方法である。さらなる実施態様において、これらのＤＮＡライブラリは、例えば磁性マイクロビーズなどのキャリア粒子の使用を含む、その後のＮＧＳのために使用される。
【００６３】
以前の方法では、ＤＮＡライブラリの標準化は、アダプターの連結前の（ＲＴ−）ＰＣＲ反応において得られる断片化されたＤＮＡ増幅産物の定量および／またはサイズ選択を必要とした。驚くべきことに、マイクロビーズの使用を含むライブラリ調製はサイズ選択および／または事前の定量を必要としないことが発見され、ここで好ましいマイクロビーズは、Ａｘｙｇｅｎによって提供されるもの（ＡｘｙＰｒｅｐ（登録商標）  ＭＡＧ−ＰＣＲ−ＣＬ−５キット）またはこれに類似の製品である。これらマイクロビーズの使用はまた、核酸増幅および／または増幅産物へのアダプターの連結の後に依然として存在するより短いフラグメントを排除する。
【００６４】
さらに、驚くべきことに、連結の後にアダプターを含むライブラリが再び増幅されていた先行技術の方法とは異なり、生成されたＤＮＡライブラリのＰＣＲ増幅が必要ないことが発見された。
【００６５】
ビーズは経時的に核酸で飽和されるため、ビーズの量およびビーズのＤＮＡライブラリとのインキュベーション時間に依存して、結合ＤＮＡの量が規定され得る。
【００６６】
本発明の自動化された核酸抽出、増幅およびライブラリ調製方法（例えばＶｅｌａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製のＳｅｎｔｏｓａ  ＳＸ１０１プラットホームを用いての）は、時間、試薬量、およびコストを一般的に低減することを可能にし、そして、ＮＧＳのためのＤＮＡライブラリの手動での調製に関連するリスクを回避する。
【００６７】
本発明はまた、遺伝子ライブラリの調製のためのキットを想定している。
【００６８】
さらに、本発明は、簡略化されたおよび改良されたライブラリ調製プロトコールを提供する。上述されているように、続くＮＧＳプロトコールにおいて使用されるＤＮＡライブラリの調製のための磁性ビーズを標準化することが、さらなる分析のための核酸の正確な量を得るために非常に重要である。そのため、（ＲＴ−）ＰＣＲが増幅された核酸の標準化のために使用され得る後に、限定された結合表面を備えるＤＮＡ結合ビーズが使用され得る。
【００６９】
さらに、先行技術の方法は、その後の次世代シークエンシング工程のために事前に規定された量のＤＮＡを得るために、本質的に以下の工程を必要とする：
１）（ＲＴ−）ＰＣＲ
２）磁性ビーズを用いたＰＣＲ産物のクリーンアップおよびバッファのクリーンアップ
３）ビーズの（例えばエタノールを用いた）洗浄
４）磁性ビーズに結合したＰＣＲ産物の溶出
５）標準化のための磁性ビーズおよび標準化のためのバッファを用いたＰＣＲ産物の標準化
６）ビーズの（例えばエタノールを用いた）洗浄
７）標準化されたＰＣＲ産物の溶出。
【００７０】
標準化のための磁性ビーズ（定義）は、おそらく一段階ＲＴ−ＰＣＲバッファ中のｄＴＴが標準化のためのビーズへの増幅されたＤＮＡ産物の結合を阻害するため、非常にＲＴ−ＰＣＲバッファに感受性である。これまで先行技術の方法においては、上記の工程２）〜４）を行うことが必要であり、これにより、増幅が行われた後ＲＴ−ＰＣＲ混合物中に存在している試薬を除去することが行われていた。
【００７１】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、（ＲＴ−）ＰＣＲ産物が、例えばポリエチレングリコールなどの溶媒と例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌなどのアルカリ金属塩とを含むＮＧＳライブラリ調製のためのビーズを標準化のために含む新規の本発明の組成物に暴露される場合に、面倒で、時間のかかるおよびコストの高い工程２）〜４）が、省略され得ることを発見した。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば約２．０〜約５．０Ｍ  ＮａＣｌ、例えば約２．０〜約４．０Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは２．５Ｍ〜約３．５Ｍ  ＮａＣｌ、非常に好ましくは約２．５〜約３．０Ｍ  ＮａＣｌを含み、および最も好ましくは、本発明のバッファ中のアルカリ金属の濃度は、２．５Ｍ  ＮａＣｌである。ＮＧＳライブラリ調製のための標準化のためのビーズのための本発明のバッファはさらに、約１０％〜約３０％の溶媒、例えば、約１２．５％〜約２５％、または１５．０％〜約２５％、または１７．５％〜約２２．５％、好ましくは約２０％の溶媒を含む。溶媒は好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば高分子量ＰＥＧ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００などである。ＮａＣｌを他のアルカリ金属塩、例えばＭｇ，Ｋなどによって置換することもまた可能である。非常に好ましい実施形態において、ＮＧＳライブラリ調製のための標準化のためのビーズのための本発明のバッファは、約２．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０％  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００を含む。
【００７２】
ＮＧＳライブラリの調製および改良されたＮＧＳワークフローのための本発明の方法において、上述されるバッファは、増幅された核酸を含む得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅混合物に直接添加される。本発明のバッファは、好ましくは、増幅混合物に対して２：１〜１：２の比で添加され、および最も好ましくは、本発明のバッファは、ＰＣＲ増幅混合物に対してほぼ等量（例えば１：１）で添加される。最も好ましい実施態様において、ＮＧＳライブラリ調製のための標準化のためのビーズのための本発明のバッファは、約２．５Ｍ  ＮａＣｌを含み、および、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００がＰＣＲ増幅混合物に対して１：１の比で添加される。
【００７３】
ＮＧＳのためのライブラリ調製のための時間および行程はしたがって、非常に減少され得る。さらに、（ＲＴ−）ＰＣＲ産物へと添加されるバッファは非常に安価であり、特に、それはクリーンアップビーズおよびクリーンアップバッファよりもはるかに安価である。
【００７４】
以下に記載される実施例は単なる例に過ぎず、および、決して、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１：Ｖｅｌａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製の自動化プラットホームＳｅｎｔｏｓａ  ＳＸ１０１を用いたＮＧＳのためのＨＣＶライブラリの調製
【００７６】
１．ＲＴ−ＰＣＲ
ＨＣＶウイルス性ＲＮＡがヒト血漿から単離され、そしてｃＤＮＡが合成される。
ここで、本工程は、自動化プラットホームＳｅｎｔｏｓａ  ＳＸ１０１を用いて行われる。
ＲＴ−ＰＣＲが実行される前に、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）が、先のアッセイ由来の潜在的な汚染物質を排除するために、ＲＴ−ＰＣＲ混合物へ添加される。増幅前に、２５℃で４分間、ＵＤＧを使用して、アンプリコン−キャリーオーバー汚染物の消化を行う。
【００７７】
２．ＲＴ−ＰＣＲ後の標準化
図１に記載される作業プラットホームが参照される。
試薬９６ウェルプレート（図１、位置Ｃ１）のウェルの調製：
試薬９６ウェルプレートへのアリコット
Ｂ４：７５μＬ  シアラーゼバッファ（Life technologies）
Ｃ４：５０μＬ  シアラーゼ酵素
Ｄ４：５０μＬ  シアラーゼ酵素
Ｂ６：３０μＬ  ｄＮＴＰミックス
Ｃ６：１００μＬ  １０×  リガーゼバッファ
Ｄ６：５０μＬ  ＤＮＡリガーゼ
Ｅ６：３０μＬ  ニック修復ポリメラーゼ（Enzymatics）
Ｃ８：Ｐｌ＋バーコード１２ミックス
ライブラリ調製試薬（Library Prep Reagent）ホルダへのアリコット
１Ａ：２２０μＬ  標準化ビーズ（Axygen）
１Ｂ：５００μＬ  ミネラルオイル（Sigma）
１Ｄ：空のチューブ
２Ａ：１５００μＬ  ＰＣＲクリーンアップバッファ（Vela Diagnositics, Inc）
２Ｂ：１５０００μＬ  クリーンアップビーズ（Axygen）
２Ｃおよび２Ｄ：標準化結合バッファ（Axygen）
３Ａ：１５００μＬ  標準化溶出バッファ（Axygen）
３Ｂおよび３Ｃ：１６００μＬヌクレアーゼ非含有水（ＢＳＴ）
【００７８】
試薬９６ウェルプレートの温度（図１におけるＴＥＭＰ２）を１５℃にセットする。
それぞれのサンプルの全てのＰＣＲ産物（全部で４つ）の２５μＬを規定の位置へとプールする。
５回混合し、１９５μＬの標準化のためのビーズを１５００μＬのＰＣＲ精製バッファに移す（Lib Prep Reagent）。
１０回混合し、８６μＬのＰＣＲ精製バッファ（Vela Diagnostics）および標準化ビーズ（Axygen）を移す。プールされたＰＣＲ産物の規定の位置へと混合（Lib Prep Reagent）し、１０回混合する。
室温で３分間インキュベートする。
ＰＣＲプレートを図１のプラットホーム内の位置Ｂ５の磁気ホルダに移動する。
２分間インキュベートする。
ピペッティングにより４０μＬの上澄みを３回、および５０μＬを一回廃棄する。
ＰＣＲプレート上の選択されたウェルに８０％エタノール１００μＬを加える。
ＰＣＲプレートをサーモミキサー（ＴＭＸ）へと移動し、そして、２分間１０００ｒｐｍで振とうする。
ＰＣＲプレートを図１の位置Ｂ５の磁性ホルダへともどす。
ＴＭＸの温度制御を作動させ５６℃に設定する。
２分間インキュベートする。
ピペッティングにより７０μＬの上澄みを３回、および４０μＬを一回廃棄する。
ＰＣＲプレートを事前に５６℃にセットされたサーモミキサー（ＴＭＸ）へと移動する。
プレートを２分間乾燥する。
ＰＣＲプレートを位置Ｃ１へと移す。
溶出バッファ３５μＬを加える（Lib Prep Reagent  １ＡからＰＣＲプレートへ）。
ピペッティングにより５回混合する。
ＰＣＲプレートをサーモミキサーへと移動する。
サーモミキサー上で、５６℃で１４００ｒｐｍで５分間振とうする。
磁性プレート（Ｂ５）へとプレートを戻し、そして２分待つ。
【００７９】
３．せん断
せん断バッファ（Life technologies）６３μＬおよび３０μＬを規定の位置へと移し、５回混合する。混合物８０μＬをせん断酵素（Life technologies）（Ｃ４およびＤ４）にそれぞれ移し２０回混合する。
１５μＬを規定の位置へと移す。溶出されたサンプル（工程２より）１５μＬを同じ規定の位置へ移し、混合する。
ＰＣＲプレートをサーモミキサーへ移動し、そして、１２分、３８℃で１３分、インキュベートする。
【００８０】
４．ＰＣＲビーズクリーンアップ
ＰＣＴクリーンアップビーズを混合し、そして、５０μＬのビーズをLib Prep Reagentから規定のＰＣＲプレートウェルへと移す。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、２６℃で３分間、１２００ｒｐｍで振とうする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性ホルダへと移動し、２分待つ。
ピペッティングにより上澄みを７０μＬおよび３０μＬそれぞれ廃棄する。
８０％エタノール１００μＬを加える（Lib Prep ReagentからＰＣＲプレートへ）。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ戻し、２６℃で３分間、１２００ｒｐｍで振とうする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性ホルダへと移動する。３分待つ。
ピペッティングにより上澄み７０μＬを１回、および５０μＬを一回廃棄する。
５分間待つことによりビーズを乾燥させる。
ＰＣＲプレートを位置Ｃ１へと戻す。
２８μＬの溶出バッファを加える（溶出バッファをLib Prep Reagentから選択されたＰＣＲプレートウェルへと移す）。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、２６℃で２分間、１２００ｒｐｍで振とうする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５上の磁性ホルダへと移動し、そして２分待つ。
【００８１】
５．ライゲーション
９０μＬのリガーセバッファ（Enzymatics）、１８μＬのｄＮＴＰ、３６μＬのＴ４リガーゼ（Enzymatics）、１８μＬのマンタポリメラーゼ（Enzymatics）、および１０８μＬの水を規定の試薬プレートウェルから別の規定のチューブへと移し、そして１０回混合する。
試薬プレートの規定のウェルから別の規定のウェルへと別の１５μＬのミックスを移す。
続いて、１０μＬのバーコードアダプターを同じ規定のウェルへ移す。
工程４からの抽出されたサンプル２５μＬを同じ規定のウェルへと移し、そして、１０回混合する。混合物を２５μＬのミネラルオイルで覆う。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、そして２６℃で１０分間インキュベートする。
温度を６５℃まで昇温させ、そしてさらに５分インキュベートする。
【００８２】
実施例２：ＡｍｐｌｉＳｅｑ（登録商標）ライブラリオートメーション
【００８３】
ＡｍｐｌｉＳｅｑ（登録商標）試薬（Life technologies, Inc）を用いた試薬９６ウェルプレート（図１、位置Ｃ１）のウェルの調製：
以下のものを試薬９６ウェルプレートへアリコットする
Ａ１：プライマープール１：１０μＬ
Ｃ１：プライマープール２：１０μＬ
Ａ３：ＰＣＲマスターミックス：１５μＬ
Ａ５：ＦｕＰａ：７μＬ
Ａ７：リガーゼ酵素：７μＬ
Ｃ７：スイッチ溶液：１５μＬ
Ａ９：バーコードアダプターミックス：８μＬ
以下のものをライブラリ調製試薬（Library Prep Reagent）ホルダ（位置Ｂ１）へアリコットする
１Ａ：溶出バッファ：１００μＬ
２Ａ：ミネラルオイル：３００μＬ
２Ｂ：結合バッファ２００μＬ
２Ｃ：標準化ビーズ：４０μＬ
２Ｄ：ヌクレアーゼ非含有水：１００μＬ
６Ａ：８０％エタノール：２ｍＬ
【００８４】
自動化プラットホームＳｅｎｔｏｓａ  ＳＸ１０１（Vela Diagnostics）を用いたＡｍｐｌｉＳｅｑ（登録商標）ライブラリオートメーション
【００８５】
１．ＰＣＲ
位置ＴＥＭＰ２における温度を４℃にセットする。
４μＬのＰＣＲマスターミックスを試薬プレートの規定のウェルから、他の選択されたウェル中のプライマープールへと移す。
ピペッティングにより１０回混合する。
選択された試薬９６ウェルプレートからそれぞれ７μＬのＰＣＲミックスを選択されたＰＣＲ９６ウェルプレートウェルへと移す。
規定の溶出プレートウェルからそれぞれ３μＬのｇＤＮＡサンプルを選択されたＰＣＲ９６ウェルプレートウェルへと移す（総計のＰＣＲ容量＝１０μＬ）。
ＰＣＲプレートを手動で密封し、以下のプログラムを用いた増幅のためのＰＣＲへと移す
ステップ１：９９℃、２分間
ステップ２：９９℃、１５秒間
ステップ３：６０℃、４分間
ステップ２を繰り返す（２１回）
１０度で保持
ＰＣＲの後、ＰＣＲプレートをＳｅｎｔｏｓａ  ＳＸ１０１プラットホーム上の位置Ｃ１（図１）まで戻す。
サーモミキサーの温度を５２℃にセットする。
【００８６】
２．ＦｕＰａ反応
選択された試薬９６ウェルプレートから所定のＰＣＲ９６ウェルプレートウェルへと２μＬのＦｕＰａ（Life technologies）を移す。
規定のウェルから１０μＬのＰＣＲ産物をＦｕＰａ試薬を含むＰＣＲプレート上のウェルへと移し、ピペッティングにより５回混合する。
先の工程のＰＣＲプレートウェルの上を覆うように４０μＬのオイルを加える（Lib Prep ReagentからＰＣＲプレートへと）。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、そして３００ｒｐｍで、５２℃で１０分間、５７℃で１０分間、および６２℃で２０分間振とうする。
ＰＣＲプレートをＳＸ１０１上の位置Ｃ１へと戻す。
【００８７】
３．ライゲーション反応
スイッチ溶液（Life technologies）４μＬを規定の試薬プレートウェルから別の規定のＰＣＲプレートウェルへと加える。
規定の試薬プレートウェルから別の規定のＰＣＲプレートウェルへとリガーゼ２μＬを移す。
規定の試薬プレートウェルから所定のＰＣＲプレートウェルへと２μＬのバーコードアダプターを移す。
ライブラリ調製試薬を含む所定のウェルから５μＬの水を別の所定のＰＣＲプレートウェルへ加える。
１７μＬのサンプルを加え、そして、ピペッティングにより５回混合する。
全てのサンプルを選択されたＰＣＲプレートウェルからリガーゼを既に含んでいるウェルへと移し、そして、ピペッティングにより５回混合する。
選択されたＰＣＲプレートウェルＢ５の上に重なるように４０μＬのオイルを加える（Lib Prep Reagentから規定のＰＣＲプレートウェルへ）。
２０分間待つ。
サーモミキサーを７２℃にセットし、そして、さらに１０分間待つ。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、７２℃で１０分間、３００ｒｐｍで振とうする。
【００８８】
４．ビーズ標準化
標準化するためのビーズをピペッティングにより１０回混合する。
Lib Prep Reagent中の標準化するためのビーズ１０μＬをLib Prep Reagent中の結合バッファ２００μＬに加える。
ＰＣＲプレートをＴＭＸから位置Ｃ１へと移動する。
サーモミキサーの温度を２５℃にセットする
１００μＬのビーズ溶液を所望のＰＣＲプレートウェルへと移す前に、規定のウェル中でビーズ溶液を１０回混合する。
５分待つ。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動する。
２５℃で１分間、１２００ｒｐｍで振とうする。
４分間インキュベートする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性プレートホルダへと移動し、そして２分インキュベートする。
ピペッティングにより上澄み５０μＬを２回、および２０μＬを一回廃棄する。
選択されたＰＣＲプレートウェルに８０％エタノール１００μＬを移す。
プレートをＴＭＸへ戻し、そして、２５℃で１分間、１０００ｒｐｍで振とうする。
１分間インキュベートする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性プレートホルダへ戻し、そして２分インキュベートする。
ピペッティングにより上澄み５０μＬを２回、および２０μＬを一回廃棄する。
プレートをＴＭＸへ戻し、そして、２５℃で１分間、１０００ｒｐｍで振とうする。
１分間インキュベートする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性プレートホルダへ戻し、そして２分インキュベートする。
ピペッティングにより上澄み５０μＬを２回、および２０μＬを一回廃棄する。
ＴＭＸを５８℃にセットする。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、エタノールを２分間乾燥させる。
ＰＣＲプレートを位置Ｃ１へ戻す。
ＰＣＲプレートの選択されたウェルに２５μＬの溶出バッファを加える。
ＰＣＲプレートをＴＭＸへ移動し、そして、２分間、１２００ｒｐｍで振とうする。
ＰＣＲプレートを、位置Ｂ５の磁性プレートホルダへと移動し、そして２分インキュベートする。
１つの規定されたＰＣＲプレートウェルから別の規定されたウェルへと溶出されたサンプル２５μＬをピペットで移す。
【００８９】
方法およびこのような方法に関する追加の態様はより煩雑さを感じさせないものであり、コスト、試薬の量を抑え、そして、自動化されていないまたはより多くの手動の工程を必要とする類似の方法と比べて汚染が起こりにくい。
【図１】
2016520330.tif 000003
【国際調査報告】
2016520330.tif 000004
2016520330.tif 000005
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2016520330.tif 000007
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