(57)【要約】ＫＤＭ５拮抗剤を使用した、抗癌剤耐性の治療及び／または防止方法を本明細書で提供する。例えば個体における癌治療及び／または薬剤耐性の防止のための、ＫＤＭ５拮抗剤の使用方法を、本明細書で提供する。例えば、個体における癌の治療方法は、該個体にＫＤＭ５拮抗剤のみを、または他の癌治療薬と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）による治療を選択する。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における癌の治療方法であって、前記個体に、（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）癌治療薬を投与することを含む、個体における癌の前記治療方法。
【請求項２】
前記ＫＤＭ５拮抗剤及び前記癌治療薬のそれぞれの量は、癌感受性の期間の増大及び／または癌治療薬への細胞耐性の成長を遅らせるのに効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体に癌治療薬を投与することを含む癌治療の有効性を増大させる方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む、個体に癌治療薬を投与することを含む癌治療の有効性を増大させる前記方法。
【請求項４】
個体における癌の治療方法であって、癌治療が個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）癌治療を投与することを含み、前記癌治療は、前記ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して増大した有効性を有する、個体における癌の前記治療方法。
【請求項５】
個体における癌治療薬に対する癌耐性の成長を遅らせる、及び／または予防する方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む、個体における癌治療薬に対する癌耐性の成長を遅らせる、及び／または予防する前記方法。
【請求項６】
癌治療薬への耐性成長の可能性の増大を有する、癌を患う個体の治療方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌治療薬への耐性成長の可能性の増大を有する、癌を患う個体の前記治療方法。
【請求項７】
癌を患う個体における癌治療薬の感受性を増大させる方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬の感受性を増大させる前記方法。
【請求項８】
癌を患う個体における癌治療薬の感受性の期間を延ばす方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬の感受性の期間を延ばす前記方法。
【請求項９】
癌を患う個体における癌治療に対する応答期間を延ばす方法であって、前記個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療に対する応答期間を延ばす前記方法。
【請求項１０】
前記方法が更に、（ｂ）前記個体に有効量の癌治療薬を投与することを含む、請求項３、５、７、８または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＫＤＭ５拮抗剤は抗体、低分子阻害剤、結合ポリペプチド、及び／またはポリヌクレオチド拮抗剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５に結合し、ＫＤＭ５デメチラーゼ活性を阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄの１つ以上である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂの１つ以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌治療薬は化学療法である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌治療薬は化学療法であり、該化学療法がタキサンを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タキサンはパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌治療薬は化学療法であり、該化学療法は白金製剤を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌治療薬は標的療法である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌治療薬は標的療法であり、該標的療法はＥＧＦＲ拮抗剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＥＧＦＲ拮抗剤はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン、または薬剤として許容されるその塩（例えばエルロチニブ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌治療薬は標的療法であり、該標的療法はＲＡＦ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦ及び／またはＣＲＡＦ阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌治療薬は標的療法であり、該標的療法はＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＫＤＭ５拮抗剤は低分子ＫＤＭ５拮抗剤である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＫＤＭ５拮抗剤及び前記癌治療薬は同時に投与される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＫＤＭ５拮抗剤は前記癌治療薬の前に、及び／または同時に投与される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌は肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、及び／または乳癌）である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願シリアル番号第６１／８０１，４１４号、及び２０１３年３月２１日に出願された米国特許出願シリアル番号第６１／８０４，０８３号の利益を主張し、これらの出願は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本明細書に記載されるＫＤＭ５拮抗剤を使用した、癌治療及び／または抗癌剤耐性の防止方法を本明細書で提供する。
【背景技術】
【０００３】
抗癌剤に対する耐性を比較的早く獲得することは依然として、成功した癌治療への主な障害となっている。かかる薬剤耐性に対する分子的機序を明らかにする相当な努力により、薬剤排出、薬剤結合が不十分な標的突然変異体の獲得、代わりとなる生存経路の関与、及びエピジェネティックな変化を含む種々の機構が明らかとなっている。かかる機構は一般に、薬剤治療中に選択される腫瘍細胞集団内における希少で確率的な、耐性を付与する遺伝子変化を反映すると考えられている。Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １４１（ｌ）：６９−８０（２０１０）を参照のこと。癌治療でますます観察される現象は、いわゆる「再治療応答」である。例えば、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）での治療に良好に応答し、後で治療の失敗を経験した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者の中には、「休薬期間」の後でのＥＧＦＲ  ＴＫＩ再治療に対して、二次応答を示した者もいる。Ｋｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：１７３−１７４（２００４）；Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１５：１０７−１１１（２００５）を参照のこと。同様の再治療応答は他の幾つかの癌治療剤に対しては十分に証明されている。Ｃａｒａ  ａｎｄ  Ｔａｎｎｏｃｋ，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：２３−２７（２００１）を参照のこと。かかる発見は、抗癌剤への獲得耐性は、基本メカニズムが未だに証明されていないままの可逆的な「薬剤耐性」状態に関係があり得ることを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｍａら、Ｃｅｌｌ（２０１０）１４１（１）：６９〜８０
【非特許文献２】Ｋｕｒａｔａら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００４）１５：１７３〜１７４
【非特許文献３】Ｙａｎｏら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．（２００５）１５：１０７〜１１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特異的な耐性を付与する突然変異体の中には、獲得薬剤耐性を示す多くの癌患者で特定されたものもあるが、薬剤耐性に対する突然変異及び非突然変異的機構の相対的な関与、並びに腫瘍細胞亜集団の役割は未だに、多くが不明瞭なままである。新たな治療方法は、癌細胞集団内での異質性及び薬剤治療耐性を有する癌細胞の発生に対して、上手く対処することが求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要約）
例えば個体における癌治療及び／または薬剤耐性の防止のための、ＫＤＭ５拮抗剤の使用方法を、本明細書で提供する。例えば、個体における癌の治療方法は、該個体にＫＤＭ５拮抗剤のみを、または他の癌治療薬と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）による治療を選択する。いくつかの実施形態では、個体は、癌治療薬による治療の前にＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む治療を開始する。いくつかの実施形態では、個体はＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬を含む治療を同時に受ける。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は癌感受性の期間を増大させる、及び／または癌耐性の成長を遅らせる。
【０００７】
別の態様において、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を用いた治療の組み合わせを本明細書で提供する。
【０００８】
特に、個体に、（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、並びに（ｂ）癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を投与することを含む個体の癌の治療方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、癌感受性の期間を増大させる、及び／または癌治療薬に対する癌細胞の耐性の成長を遅らせるのに有効である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、癌治療薬を含む癌治療の有効性を増大させるのに有効である。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬の投与を含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、有効性を増大させるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、応答（例えば完全寛解）を増大させるのに有効である。
【０００９】
本明細書においては、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を含む、個体への癌治療薬を投与することを含む、癌治療の有効性を増大させる方法もまた提供される。ここで、癌治療は個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含み、癌治療は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、増大した有効性を有する。
【００１０】
更に、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、個体における癌治療薬への癌耐性を遅らせる、及び／または成長を防止する方法を本明細書で提供する。
【００１１】
個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌治療薬への耐性が成長する可能性が高い、癌を患う個体の治療方法を本明細書で提供する。
【００１２】
更に、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬への感受性を増大させる方法を、本明細書で提供する。
【００１３】
個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬の感受性の期間を延ばす方法もまた、本明細書で提供する。
【００１４】
個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬への応答時間を延ばす方法を本明細書で提供する。
【００１５】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法である。いくつかの実施形態では、標的療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、及び／またはＰＩ３Ｋ阻害剤の１種以上である。
【００１６】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、標的療法はＥＧＦＲ拮抗剤である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン及び／または薬学的に許容されるその塩である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミンである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はＮ−（４−（３−フルオロベンジルオキシ）−３−クロロフェニル）−６−（５−（（２−（メチルスルホニル）エチルアミノ）メチル）フラン−２−イル）キナゾリン−４−アミン、ジ４−メチルベンゼンスルホネート、または薬剤として許容されるその塩（例えばラパチニブ）である。
【００１７】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、標的療法はＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はＣＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブである。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤は３−（２−シアノプロパン−２−イル）−Ｎ−（４−メチル−３−（３−メチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−６−イルアミノ）フェニル）ベンズアミド、または薬剤として許容されるその塩（例えばＡＺ６２８（ＣＡＳ＃８７８７３９−０６−１））である。
【００１８】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、標的療法はＰＩ３Ｋ阻害剤である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は化学療法である。
【００１９】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、化学療法はタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【００２０】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、化学療法は白金製剤である。いくつかの実施形態では、白金製剤はカルボプラチンである。いくつかの実施形態では、白金製剤はシスプラチンである。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、化学療法はタキサン及び白金製剤である。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、タキサンはドセタキセルである。いくつかの実施形態では、白金製剤はカルボプラチンである。いくつかの実施形態では、白金製剤はシスプラチンである。
【００２１】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、化学療法はビンカアルカロイドである。いくつかの実施形態では、ビンカアルカロイドはビノレルビンである。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、化学療法はヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド類似体はゲムシタビンである。
【００２２】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は放射線治療である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５低分子拮抗剤である。
【００２３】
特定の実施形態の実施に際して有用であり得るＫＤＭ５低分子拮抗剤の例としては、式ＩまたはＩＩの化合物、その異性体もしくは異性体の混合物、または薬剤として許容されるその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが挙げられる。かかる化合物、並びにかかる化合物の調製に有用な工程及び中間体は、ＷＯ２０１２／００７００７及びＷＯ２０１２／００７００８に記載されている。
【化１】
2016520528.tif 000003
式中、Ｘ１は−Ａ−Ｂを示し、ここで
Ａは結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＨを表し、かつ
Ｂは以下を表す；
・Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基またはＣ２〜４アルキニル基、
ここでＣ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基またはＣ２〜４アルキニル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロ基、トリフルオロメチル基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、メチルスルフィニル基、メチルスルファニル基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、フェニル基、及び単環式または二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよく、
ここで、
Ｒ’はヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、フェニル基、または単環式もしくは二環式の複素環基を表し、
かつ、ここで
フェニル基は、メチル基、トリフルオロメチル基、ハロ基、シアノ基、アセトアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、及び単環式または二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
・−ＯＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ”、
式中、Ｒ’’は水素、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、シクロプロピル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルスルホニル基、もしくは単環式もしくは二環式の複素環基；または
式中Ｒ’’はＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、オキシ基、カルバモイル基、アミン基、もしくは単環式もしくは二環式の複素環基であり、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシメチル基、メトキシエチル基、アセチル基、シアノ基、エトキシカルボニル基、ジメチルアミノ基、Ｎ−［３（ジメチルアミノ）プロピル］Ｎ’エチルカルバミミドイル基、メチルスルフィニル基、メチルスルファニル基、メチルスルホニル基、メトキシエトキシエチル基、（ジメチルアミノ）エチル基、及びメチルスルファニルエチル基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、メトキシ基またはジメチルアミノ基により置換されてよい；
・−（Ｃ＝Ｓ）Ｒ’’’、
式中、Ｒ’’’は−ＮＨ２、メチルアミノ基またはジメチルアミノ基を表す；
・−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｎ−Ｒ””、
式中Ｒ””はヒドロキシ基またはメトキシ基を表す；
・スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、スルフィニル基、スルホニル基、
ここで、スルファモイル基、スルホニル基またはスルホニル基は所望により、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、メトキシ−Ｃ１〜４アルキル基、ジメチルアミノ基、（ジメチルアミノ）メチル基、（ジメチルアミノ）エチル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、及び単環式または二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
・フルオロ基、クロロ基、ブロモ基もしくはシアノ基；または
・単環式もしくは二環式の複素環基、
ここで、単環式もしくは二環式の複素環基は所望により、Ｃ１〜２アルキル基、ハロ基、ハロ−Ｃ１〜２アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基及びジメチルアミノ基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
かつ、
Ｘ２は以下を表す；
・Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、またはＣ２〜１８アルキニル基、
ここで、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基は所望により、Ｃ３〜６シクロアルキル基，ヒドロキシ基，ハロ基，トリフルオロメチル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルキル−Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル−Ｃ１〜６アルコキシ基、オキソ−Ｃ１〜６アルキル基、−ＮＨ２、ジメチルアミノ基、シアノ基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される、１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ１〜６アルキル基またはハロ基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；または
・−Ｏ−Ｘａ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｘｂ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘｃ、−ＮＸｄ１Ｘｄ２、−（ＣＯ）−ＮＸＥ１ＸＥ２、または−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＳＯ２−Ｘｆ、式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ、Ｘｄ１、Ｘｄ２、Ｘｅ１、Ｘｅ２、Ｘｆは、互いに独立して、水素、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、または６員環の単環式複素環基を表す；
ここで、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基または６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ヒドロキシ基、ハロ基、トリフルオロメチル基、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルキルカルボニル基、Ｃ１〜４アルキルアミノ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルキル−Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロ−Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基、オキソ−Ｃ１〜６アルキル基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、（メトキシエチル）（メチル）アミノ基、［（ジメチルアミノ）エチル］（メチル）アミノ基、シアノ基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ１〜６アルキル基、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基もしくはハロ基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；または
ここで、Ｘｅ１及びＸｅ２は互いに独立して水素、ヒドロキシ基、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基を表し、
ここで、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基は所望によりヒドロキシ基、メトキシ基、もしくはジメチルアミノ基により置換されてよい；ただし、ある種の実施形態においてＸｅ１及びＸｅ２は共に、水素を表すことはできない；かつある種の実施形態において、Ｘｂは水素を表すことはできない；または
・−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＸｊ１Ｘｊ２、−Ｓ−Ｘｋ、−（Ｃ＝Ｓ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｘｍもしくは−（Ｃ＝Ｓ）−Ｎ−Ｘｎ、
式中Ｘｊ１、Ｘｊ２、Ｘｋ、Ｘｍ、Ｘｎは互いに独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、アミノ基、メチルアミノ基もしくはジメチルアミノ基を表し、
ここでメチル基、エチル基もしくはプロピル基は所望により、メトキシカルボニル基、ジメチルアミノ基、カルバモイル基、フェニル基、シアノフェニル基、及び５もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；かつ
Ｘ３は水素、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基を表す；または
・−Ｏ−Ｘｇ−Ｓ−Ｘｈもしく−ＮＸｉ１Ｘｉ２、式中Ｘ９ｇ、Ｘｈ、Ｘｉ１及びＸｉ２は互いに独立して水素、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、もしくは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨを表し、式中ｎは０、１、２、３もしくは４である、
並びに
Ｘ４及びＸ５は互いに独立して以下を表す：
・水素、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ハロ基、ニトロ基、−ＮＨ２、もしくはシアノ基。
【化２】
2016520528.tif 000004
式中、
Ｘ１は−Ａ−Ｂを表し、ここで、
Ａは結合、Ｏ、Ｓ、もしくはＮＨを表し、かつ
Ｂは以下を表す；
・Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基、もしくはＣ３〜５シクロアルキル基、ここでＣ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基もしくはＣ３〜５シクロアルキル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
ここで、
Ｒ’はヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、シクロプロピル基、ジメチルアミノ基、フェニル基もしくは単環式もしくは二環式の複素環基を表す；
かつ、
フェニル基はメチル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン、シアノ基、アセトアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；または
・−ＯＨ、ただしある種の実施形態において、Ａが結合である場合に、Ｂは−ＯＨのみを表す；または
・−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ”、
ここで、Ｒ’’はヒドロキシ基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミノ基、メチルスルホニル基、単環式もしくは二環式の複素環基、Ｃ３〜４シクロアルキル基もしくはＣ１〜４アルキル基を表す；ここで、前記Ｃ３〜４シクロアルキル基もしくはＣ１〜４アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜３アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロ−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
・−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ’’’、
ここでＲ’’’はヒドロキシエチル基、メトキシエチル基、ジメチルアミノエチル基、メタンスルホニル基、もしくは所望によりジメチルアミノ基にて置換された−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基を表す；
・スルファモイル基、スルフィニル基、スルファニル基もしくはスルホニル基、
ここでスルファモイル基は所望により、１つまたは２つのＣ１〜３アルキル基により置換されてよく、かつ前記スルフィニル基、スルファニル基もしくはスルホニル基は所望により、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、カルボニル−Ｃ１〜３アルキル基、メチルスルファモイル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジメチルアミノエチル基、６員環の複素環、及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される１つの置換基で置換されてよい；
・フェニル基、単環式もしくは二環式の複素環基、
ここでフェニル基、単環式もしくは二環式の複素環基は所望により、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜３アルキル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、Ｃ１〜３アルコキシアルコキシ基、Ｃ１〜３アルコキシカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、シクロプロピル基及びＣ１〜３アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、前記シクロプロピル基もしくはＣ１〜３アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、シクロプロピル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜３アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロゲン−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
かつ
Ｘ２は以下を表す；
・−ＣＯＯＨ、（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２もしくは−ＣＮ、
かつ
Ｘ３は以下を表す；
・水素もしくは−ＯＨ；または
・−Ｙ−Ｘａ−Ｘｂ、
式中、
ＹはＯ、Ｃ＝Ｏもしくは結合である；かつ
Ｘａは結合、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルＯ−、−Ｏ−、もしくは−ＮＸｂである、ただし、ある種の実施形態において、ＹがＯである場合、Ｘａは０ではない；かつ、各Ｘｂはそれぞれ−Ｈ、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、５員環の単環式複素環基、６員環の単環式複素環基もしくは二環式の複素環式芳香族基である；ここで、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、５員環の単環式複素環基、６員環の単環式複素環基もしくは二環式の複素環式芳香族基は所望により、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、ヒドロキシ直鎖または分枝鎖のＣ１〜４アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシアルコキシ基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル基、Ｃ１〜４アルキルカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ヒドロキシ基及び直鎖または分枝鎖のＣ１〜５アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、前記Ｃ１〜５アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロゲン−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
かつ
Ｘ４及びＸ５は互いに独立して以下を表す；
・水素、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ハロゲン、ニトロ基、−ＮＨ２、メトキシカルボニル基、アセチル基、メトキシカルバモイル基もしくはシアノ基。
【００２４】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の前に、及び／またはそれと同時に投与される。
【００２５】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌は肺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、及び／または黒色腫である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌である。いくつかの実施形態では、肺癌はＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は黒色腫である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（Ａ）翻訳後修飾をしたヒストン３（Ｈ３）尾部及びアミノ酸の位置の図面。ＫＤＭ５は、Ｈ３のリジン４からトリメチル及びジメチル標識を除去可能なデメチラーゼである。（Ｂ）ＫＤＭ５はＪＡＲＩＤ１としても知られている。ヒトにおけるデメチラーゼのＫＤＭ５／ＪＡＲＩＤ１ファミリーには、四つのメンバーであるＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄを含む。図面に示すように、ＫＤＭ５ファミリーメンバーは５つの保存ドメイン：ＪｍｊＮ、ＡＲＩＤ、ＪｍｊＣ、ＰＨＤ及びＣ５ＨＣ２ジンクフィンガーを含む。
【図２】（Ａ）ＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂの両方が、ヒト非小細胞肺癌細胞株中において、ＰＣ９親細胞と比較して、ＰＣ９の薬剤耐性がある存続生物（ＤＴＰ）を上方制御した。（Ｂ）未処置の肺腺癌患者と比較して、ネオアジュバント肺腺癌患者サンプルにおいてＫＤＭ５Ａ  ｍＲＮＡの相対的な発現レベルが高まった。（Ｃ）ウェスタンブロットに示すように、ＰＣ９親細胞と比較して、ＰＣ９  ＤＴＰにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ２が減少した。（Ｄ）ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡに示すように、ＰＣ９親細胞と比較してＰＣ９  ＤＴＰにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３が減少した。
【図３】（Ａ）ＫＤＭ５Ａデメチラーゼ触媒欠失突然変異体の図面（配列番号：１のナンバリングに基づくＨ４８３Ａ）。（Ｂ）３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５Ａショートヘアピンの発現により、ＰＣ９薬剤耐性細胞が除去される（データは図示せず）。３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５ＡショートヘアピンによるＰＣ９薬剤耐性細胞の除去は、野生型ＦＬＡＧをタグ付けしたＫＤＭ５Ａの同時発現により、救出することができる。（Ｃ）しかし、ＫＤＭ５Ａデメチラーゼ触媒不活性突然変異体は３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５ＡショートヘアピンによるＰＣ９薬剤耐性細胞の除去を救出することができない。このことは、ＫＤＭ５Ａデメチラーゼ活性には、薬剤耐性の確立が必要であることを示唆している。実験では、野生型ＫＤＭ５Ａが存在しない限り、薬物耐性細胞は内因性細胞のノックダウンを失った。
【００２７】
【図４】（Ａ）ＫＤＭ５ツール化合物及び関係するＫＤＭ５Ａ  ＩＣ５０、ＫＤＭ２／３  ＩＣ５０、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ＥＣ５０、ＭＤＣＫ細胞内で測定した化合物の細胞透過性（Ａ：Ｂ、頂端から基底外側）、及び化合物の測定したヒト血漿タンパク質結合の表。（Ｂ）ＣＰＩ−５５０またはＣＰＩ−７６６でインキュベートしたＰＣ９細胞のウェスタンブロット。ＣＰＩ−７６６はＨ３Ｋ４の脱メチル化を阻害し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の蓄積が観察された。（Ｃ）ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡにより測定した、様々な濃度のＣＰＩ−５５０及びＣＰＩ−７６６におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３／Ｈ３のグラフ表示。
【００２８】
【図５】質量分析による、ＫＤＭ５Ａ阻害剤であるＣＰＩ−７６６または不活性対照ＣＰＩ−５５０（不活性）で処理したＰＣ９細胞におけるＨ３Ｋ４標識の比較。（Ａ）ＣＰＩ−５５０及びＣＰＩ−７６６処理細内の未修飾、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、及びアセチル化したＨ３Ｋ４のモル分率（相対存在度）。（Ｂ）ＣＰＩ−７６６処理からＣＰＩ−５５０処理までにおける未修飾、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、及びアセチル化Ｈ３Ｋ４のピーク面積のＬｏｇ２の割合（０は変化なしを意味し、＋１は２倍増加、等）。
【００２９】
【図６】ＫＤＭ５、ＣＰＩ−４５５及びＰＣＩ−７６６拮抗剤は、複数の試験モデル（Ａ）ＰＣ９、（Ｂ）ＳＫＢＲ３、（Ｃ）Ｈ４４１、及び（Ｄ）Ｈ５９６）におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３を増大させた（ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによる）。
【００３０】
【図７】濃度５０μＭ以下のＰＣ９細胞（Ａ）及び濃度２５μＭ以下のＳＫＢＲ３（Ｂ）における薬剤中で９６時間後に測定したとおり、活性ＫＤＭ５ｉのみが実質的に細胞数に影響を与えない。しかし、３０日後でも、薬剤中でこれらの濃度にほぼ差異は見られなかった（データは図示せず）。
【図８−１】結合低分子ＫＤＭ５阻害剤が薬剤耐性を妨げる。（Ａ１〜２）１μＭのタルセバに細胞を配置する前に、２５ｕＭの活性ＫＤＭ５化合物または不活性対照でＰＣ９細胞を５日間インキュベートした。プレートを３０日間染色した後、タルセバ処理を行った。同様の実験を幾つかの他のモデルにも行った。例えば、ＳＫＢＲ３（Ｂ１〜３、及びＣ１〜２）、ＨＣＣ１９５４、Ｈ４４１や様々な薬剤である。全ての場合において、ＫＤＭ５阻害剤は親集団の増殖または生残に影響を与えなかった。
【図８−２】結合低分子ＫＤＭ５阻害剤が薬剤耐性を妨げる。（Ａ１〜２）１μＭのタルセバに細胞を配置する前に、２５ｕＭの活性ＫＤＭ５化合物または不活性対照でＰＣ９細胞を５日間インキュベートした。プレートを３０日間染色した後、タルセバ処理を行った。同様の実験を幾つかの他のモデルにも行った。例えば、ＳＫＢＲ３（Ｂ１〜３、及びＣ１〜２）、ＨＣＣ１９５４、Ｈ４４１や様々な薬剤である。全ての場合において、ＫＤＭ５阻害剤は親集団の増殖または生残に影響を与えなかった。
【図９】異なる特異的ｓｉＲＮＡを用いた、タキサン、パクリタキセルで処理したＨ１２９９内のＫＤＭ５ＡのｓｉＲＮＡノックダウン効果（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＧｅｎｏｍｅ（４倍））。培地及びパクリタキセル条件下でのＺ値をそれぞれ、Ｘ及びＹ軸に示している。同様の処理条件における他のクロマチン修飾因子遺伝子（Ｅｐｉ３００ライブラリーｓｉＲＮＡ）、非標的（ＮＴＣ）及びｓｉＴＯＸ対照のデータと共にＫＤＭ５Ａノックダウンデータを示している。
【図１０】Ｈ４４１  ＤＴＰにおけるＫＤＭ５及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の調節。（Ａ〜Ｂ）化学療法治療をしたＨ４４１細胞における、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の減少（Ａ）並びにＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂの増加（Ｂ）レベルを示すウェスタンブロット。（Ｃ〜Ｄ）５サイクルのカルボプラチン（５．３８μＭ）及びパクリタキセル（１．２５μＭ）処理の前に、２５μＭの活性または不活性ＫＤＭ５化合物と共に、Ｈ４４１細胞を３日間配置した。活性ＫＤＭ５化合物による処理はＤＴＰを妨げる。
【図１１】（Ａ〜Ｂ）５日間ＣＰＩ−７６６  ＫＤＭ５阻害剤で前処理することで、放射線耐性を持つＰＣ９細胞の数が減少した。（Ｃ）活性ＫＤＭ５阻害剤であるＣＰＩ−４４５及びＣＰＩ−７６６により５日間ＰＣ９細胞を前処理することで、不活性対照と比較して、γ線照射後の細胞の数が減少した。
【図１２】ＤＴＰを成長させる黒色腫癌細胞モデルの特定。（Ａ）選択したＣｏｌｏ−８２９細胞におけるベムラフェニブに対するＧＩ５０を測定するための薬物用量応答実験。８つの異なる用量のベムラフェニブを４日間インキュベーションした後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｒｅａｄｏｕｔを使用して、細胞生存アッセイを実施した。（Ｂ）１１日後におけるベムラフェニブでの治療の後のＤＴＰ（ｉｉ）と比較した、Ｃｏｌｏ−８２９対照細胞（ｉ）を示す顕微鏡写真。
【図１３】セミ・ハイスループットフォーマットにおける、Ｃｏｌｏ−８２９黒色腫細胞株のＤＴＰアッセイを実施するためのアッセイ開発。（Ａ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍで得られた、核で赤色蛍光標識（Ｎｕｃ−Ｒｅｄ）を恒常的に発現する細胞の顕微鏡写真。核マーカーの存在により、実験中にリアルタイムでデータを得た。６、１２、及び２４ウェルフォーマットにおける、陽性対照細胞（ｉ、ｉｉｉ及びｖ）並びにＤＴＰ（ｉｉ、ｉｖ及びｖｉ）をそれぞれ示す。（Ｂ）６、１２、及び２４ウェルフォーマットにおける、２０μＭのベムラフェニブ処理Ｃｏｌｏ−８２９細胞でのＤＴＰの確立をそれぞれ示す線グラフ。（Ｃ）実験終了時の、ＤＭＳＯ及び阻害剤処理ウェルにおけるＮｕｃ−Ｒｅｄ陽性細胞の数を示す棒グラフ。（Ｄ）６、１２及び２４ウェルアッセイプレートで得られたＤＴＰの数を比較する棒グラフ。６及び１２ウェルフォーマットは大変似ていると思われるため、１２ウェルプレートを選択した。
【図１４】ＫＤＭ５阻害剤はＤＴＰの形成を抑制する。（Ａ）Ｃｏｌｏ−８２９細胞を２５μＭのＫＤＭ５活性（ＣＰＩ−７６６）または不活性（ＣＰＩ−５５０）阻害剤で、ベムラフェニブの添加前に５日間前処理を行った際、ＤＴＰ形成の差異を見る実験の全期間にわたる生データを示すグラフ。実験中にリアルタイムでデータを得た。（Ｂ）ＣＰＩ−５５０またはＤＭＳＯ対照と比較して、細胞をＣＰＩ−７６６で前処理した場合の、形成したＤＴＰの数の大幅な減少を示す上述のデータのヒストグラムプロット。（Ｃ）ＣＰＩ−５５０及びＤＭＳＯ対照と比較して、ＣＰＩ−７６６処理をした際に形成したＤＴＰの数の減少を示すヒストグラム。
【図１５】用量に依存するＤＴＰの減少が存在するかを求めるための、異なる用量のＣＰＩ−７６６及びＣＰＩ−５５０の存在下におけるＤＴＰアッセイ。（Ａ）種々の用量のＣＰＩ−７６６及びＣＰＩ−５５０による前処理後に形成したＤＴＰの数の、用量依存による減少を示すヒストグラム。
【図１６】結合低分子ＫＤＭ５阻害剤が薬剤耐性を妨げる。１μＭのタルセバに細胞を配置する前に、ｎｕｃ−ＲＥＤＰＣ９細胞を、種々の濃度の活性ＫＤＭ５化合物ＣＰＩ−３８２（Ｂ）または不活性対照ＣＰＩ−３８３（Ａ）で５日間インキュベーションした。プレートを３０日間染色した後、タルセバ処理を行った。
【図１７】図１７（Ａ及びＢ）は、ＫＤＭ５阻害剤が結腸直腸癌細胞株の薬剤耐性をブロックすることを示す結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．定義
【００３２】
対象ポリペプチド「拮抗剤」（同じ意味で「阻害剤」とも称される）とは、対象ポリペプチドの活性または機能に干渉する、例えば、対象ポリペプチドが仲立ちする生物活性を部分的もしくは完全にブロック、阻害、または中和する作用物質である。例えば、ポリペプチドＸの拮抗剤とは、ポリペプチドＸが仲立ちする生物活性を部分的もしくは完全にブロック、阻害、または中和する任意の分子を意味し得る。阻害剤の例としては、抗体；リガンド抗体；低分子拮抗剤；アンチセンス及び阻害ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ）分子が挙げられる。好ましくは、阻害剤は対象ポリペプチドに結合する抗体または低分子である。特定の実施形態では、阻害剤は対象ポリペプチドに対して、約１，０００ｎＭ以下の結合親和性（解離定数）を有する。別の実施形態において、阻害剤は対象ポリペプチドに対して約１００ｎＭ以下の結合親和性を有する。別の実施形態において、阻害剤は対象ポリペプチドに対して約５０ｎＭ以下の結合親和性を有する。特定の実施形態では、阻害剤は対象ポリペプチドに共有結合している。特定の実施形態では、阻害剤は対象ポリペプチドのシグナル伝達を１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。別の実施形態において、阻害剤は対象ポリペプチドのシグナル伝達を５００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。別の実施形態において、阻害剤は対象ポリペプチドのシグナル伝達を５０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。ある種の実施形態において、拮抗剤は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上で対象ポリペプチドの発現レベルまたは生物活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、対象ポリペプチドはＫＤＭ５である。
【００３３】
用語「ポリペプチド」は本発明で使用する場合、特に指示がない限り、霊長類（例えばヒト）並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳類を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然の対象ポリペプチドを意味する。本用語は「完全長」の未処理ポリペプチドに加え、細胞中の処理で生じる任意の形態のポリペプチドを包含する。本用語はまた、ポリペプチドの自然発生変異体、例えばスプライス変異体またはアレリック変異体も包含する。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は本明細書で同じ意味で用いられ、任意の長さのポリマーまたはヌクレオチドを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、及び／もしくそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼ、もしくは合成反応によりポリマー中に導入可能な任意の基質とすることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾はポリマーの構築の前後において実施してよい。ヌクレオチド配列には、非ヌクレオチド成分が間に入ってもよい。ポリヌクレオチドは合成後更に、標識結合等の修飾を行ってよい。他のタイプの修飾には、例えば、１つ以上の自然発生ヌクレオチドを、類似体であるヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性連鎖を有するもの（例えばメチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）及び荷電性連鎖を有するもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）を含むもの、インターカレーターを有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの（例えばアルファアノマー核酸等）等と置換したもの、加えてポリヌクレオチドの未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホネート基、ホスフェート基で置換してよく、標準的な保護基で保護してよく、もしくは更なるヌクレオチドへの更なる連鎖を調製するために活性化してよく、または固体もしくは半固体の支持体に結合してよい。５’及び３’末端のＯＨは、アミン基または１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部位でリン酸化または置換することができる。他のヒドロキシル基もまた、標準的な保護基に誘導体化してよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖の類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類またはリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース類、非環式類似体、及びメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体が含まれる。１つ以上のホスホジエステル結合は代わりの連結基で置換されてよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ」）で置換されている実施形態が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は独立して水素、または所望によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アラルジル基を含有する、置換もしくは非置換のアルキル基（炭素数１〜２０）である。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及する全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３６】
用語「低分子」とは、約２０００ダルトン以下、好ましくは約５００ダルトン以下の分子量を有する任意の分子を意味する。
【００３７】
特定の実施形態の実施に際して有用であり得るＫＤＭ５低分子拮抗剤の例としては、式ＩまたはＩＩの化合物、その異性体もしくは異性体の混合物、または薬剤として許容されるその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが挙げられる。かかる化合物、並びにかかる化合物の調製に有用な工程及び中間体は、ＷＯ２０１２／００７００７及びＷＯ２０１２／００７００８に記載されている。
【化３】
2016520528.tif 000005
式中、Ｘ１は−Ａ−Ｂを示し、ここで
Ａは結合、Ｏ、ＳまたはＮＨを表し、かつ
Ｂは以下を表す；
・Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基またはＣ２〜４アルキニル基、
ここでＣ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基またはＣ２〜４アルキニル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロ基、トリフルオロメチル基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、メチルスルフィニル基、メチルスルファニル基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、フェニル基、及び単環式または二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよく、
ここで、
Ｒ’はヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルジメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、フェニル基、または単環式もしくは二環式の複素環基を表し、
かつ、ここで
フェニル基は、メチル基、トリフルオロメチル基、ハロ基、シアノ基、アセトアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、及び単環式または二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
・−ＯＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ”、
式中Ｒ’’は水素、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、シクロプロピル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルスルホニル基、もしくは単環式もしくは二環式の複素環基を表す；または
式中Ｒ’’はＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、オキシ基、カルバモイル基、アミン、もしくは単環式もしくは二環式の複素環基であり、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシメチル基、メトキシエチル基、アセチル基、シアノ基、エトキシカルボニル基、ジメチルアミノ基、Ｎ−［３（ジメチルアミノ）プロピル］Ｎ’エチルカルバミミドイル基、メチルスルフィニル基、メチルスルファニル基、メチルスルホニル基、メトキシエトキシエチル基、（ジメチルアミノ）エチル基、及びメチルスルファニルエチル基、からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、メトキシ基またはジメチルアミノ基により置換されてよい；
・−（Ｃ＝Ｓ）Ｒ’’’、
式中、Ｒ’’’は−ＮＨ２、メチルアミノ基またはジメチルアミノ基を表す
・−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｎ−Ｒ””、
式中Ｒ””はヒドロキシ基またはメトキシ基を表す；
・スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、スルフィニル基、スルホニル基、
ここで、スルファモイル基、スルホニル基またはスルホニル基は所望により、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、メトキシ−Ｃ１〜４アルキル基、ジメチルアミノ基、（ジメチルアミノ）メチル基、（ジメチルアミノ）エチル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
・フルオロ基、クロロ基、ブロモ基もしくはシアノ基；または
・単環式もしくは二環式の複素環基、
ここで、単環式もしくは二環式の複素環基は所望により、Ｃ１〜２アルキル基、ハロ基、ハロ−Ｃ１〜２アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基及びジメチルアミノ基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
かつ
Ｘ２は以下を表す；
・Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、またはＣ２〜１８アルキニル基、
ここで、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基は所望により、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ヒドロキシ基、ハロ基、トリフルオロメチル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルキル−Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル−Ｃ１〜６アルコキシ基、オキソ−Ｃ１〜６アルキル基、−ＮＨ２、ジメチルアミノ基、シアノ基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ１〜６アルキル基またはハロ基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；または
・−Ｏ−Ｘａ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｘｂ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘｃ、−ＮＸｄ１Ｘｄ２、−（ＣＯ）−ＮＸＥ１ＸＥ２、または−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＳＯ２−Ｘｆ；式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ、Ｘｄ１、Ｘｄ２、Ｘｅ１、Ｘｅ２、Ｘｆは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、または６員環の単環式複素環基を表す；
ここで、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基または６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ヒドロキシ基、ハロ基、トリフルオロメチル基、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、Ｃ１〜４アルキルアミノ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜６−アルコキシ基、Ｃ１〜６アルキル−Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロ−Ｃ１〜６−アルコキシ基、トリフルオロメチル−Ｏ−Ｃ１〜６−アルキル基、オキソ−Ｃ１〜６−アルキル基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、（メトキシエチル）（メチル）アミノ基、［（ジメチルアミノ）エチル］（メチル）アミノ基、シアノ基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルフェニル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここでフェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基は所望により、Ｃ１〜６アルキル基、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−６アルキル基もしくはハロ基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
もしくはＸｅ１及びＸｅ２は互いに独立して水素、ヒドロキシ基、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基、フェニル基、５員環の単環式複素環基、もしくは６員環の単環式複素環基を表す；
ここで、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基は所望によりヒドロキシ基、メトキシ基、もしくはジメチルアミノ基により置換されてよい；
ただし、ある種の実施形態においてＸｅ１及びＸｅ２は共に、水素を表すことはできない；かつある種の実施形態において、Ｘｂは水素を表すことはできない；または
・−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＸｊ１Ｘｊ２、−Ｓ−Ｘｋ、−（Ｃ＝Ｓ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｘｍもしくは−（Ｃ＝Ｓ）−Ｎ−Ｘｎ、
式中Ｘｊ１、Ｘｊ２、Ｘｋ、Ｘｍ、Ｘｎは互いに独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、アミノ基、メチルアミノ基もしくはジメチルアミノ基を表し、
ここでメチル基、エチル基もしくはプロピル基は所望により、メトキシカルボニル基、ジメチルアミノ基、カルバモイル基、フェニル基、シアノフェニル基、及び５もしくは６員環の単環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；かつ
Ｘ３は水素、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基を表す；または
・−Ｏ−Ｘｇ−Ｓ−Ｘｈまたは−ＮＸｉ１Ｘｉ２、式中Ｘ９ｇ、Ｘｈ、Ｘｉ１及びＸｉ２は互いに独立して水素、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、もしくは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨを表し、式中ｎは０、１、２、３もしくは４である
かつ、
Ｘ４及びＸ５は互いに独立して、以下を表す；
・水素、Ｃ１〜４アルキル基、ハロ−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ハロ基、ニトロ基、−ＮＨ２、もしくはシアノ基。
【化４】
2016520528.tif 000006
式中、
Ｘ１は−Ａ−Ｂを表し、ここで、
Ａは結合、Ｏ、Ｓ、もしくはＮＨを表し、かつ
Ｂは以下を表す；
・Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基もしくはＣ３〜５シクロアルキル基、ここでＣ１〜６アルキル基、Ｃ２〜４アルケニル基、Ｃ２〜４アルキニル基もしくはＣ３〜５シクロアルキル基は所望により、ヒドロ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４−アルコキシ、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、フェニル基、及び単環式もしくは二環式複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
ここで
Ｒ’はヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、シクロプロピル基、ジメチルアミノ基、フェニル基もしくは単環式もしくは二環式の複素環基を表す；
かつ、
フェニル基はメチル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン、シアノ基、アセトアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；または
・−ＯＨ、ただしある種の実施形態において、Ａが結合である場合、Ｂは−ＯＨのみを表す；または
・−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’’
式中、Ｒ’’はヒドロキシ基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミノ基、メチルスルホニル基、単環式もしくは二環式複素環基、Ｃ３〜４シクロアルキル基もしくはＣ１〜４アルキル基を表す；ここで、前記Ｃ３〜４シクロアルキル基もしくはＣ１〜４アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜３アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロ−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
・−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ’’’、
ここでＲ’’’はヒドロキシエチル基、メトキシエチル基、ジメチルアミノエチル基、メタンスルホニル基、もしくは所望によりジメチルアミノ基にて置換された−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基を表す；
・スルファモイル基、スルフィニル基、スルファニル基もしくはスルホニル基、
ここでスルファモイル基は所望により、１つまたは２つのＣ１〜３アルキル基により置換されてよく、かつ前記スルフィニル基、スルファニル基もしくはスルホニル基は所望により、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、カルボニル−Ｃ１〜３アルキル基、メチルスルファモイル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミノ基、ジメチルアミノエチル基、６員環の複素環、及び単環式もしくは二環式の複素環基からなる群から選択される置換基で置換されてよい；
・フェニル基、単環式もしくは二環式の複素環基、
ここでフェニル基、単環式もしくは二環式の複素環基は所望により、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜３アルキル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、Ｃ１〜３アルコキシアルコキシ基、Ｃ１〜３アルコキシカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、シクロプロピル基及びＣ１〜３アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、前記シクロプロピル基もしくはＣ１〜３アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、シクロプロピル基、Ｃ１〜３アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜３アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロゲン−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されてよい；
かつ
Ｘ２は以下を表す；
・−ＣＯＯＨ、（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２または−ＣＮ；
かつ、
Ｘ３は以下を表す；
・水素もしくは−ＯＨ；または
−Ｙ−Ｘａ−Ｘｂ、
式中、
ＹはＯ、Ｃ＝Ｏもしくは結合である；かつ
Ｘａは結合、Ｃ１〜１８アルキル基、Ｃ２〜１８アルケニル基、Ｃ２〜１８アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル−Ｏ、−Ｏ−、もしくは−ＮＸｂである、ただし、ある種の実施形態において、ＹがＯである場合、Ｘａは0ではない；かつ、各Ｘｂはそれぞれ−Ｈ、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、５員環の単環式複素環基、６員環の単環式複素環基もしくは二環式の複素環式芳香族基である；ここで、Ｃ３〜１０シクロアルキル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、５員環の単環式複素環基、６員環の単環式複素環基もしくは二環式複素環式芳香族基は所望により、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、ヒドロキシ直鎖または分枝鎖のＣ１〜４アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシアルコキシ基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル基、Ｃ１〜４アルキルカルボニル基、ＣＯＯＨ、シアノ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ヒドロキシ基及び直鎖または分枝鎖のＣ１〜５アルキル基からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；ここで、前記Ｃ１〜５アルキル基は所望により、ヒドロキシ基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１〜４アルコキシ基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、６員環の複素環、スルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、メチルスルホニル基、メチルスルホニルオキソ基、シアノ基、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ’、ハロゲン−フェニル基、及び単環式もしくは二環式の複素環基（ここでＲ’は上記で定義した通りである）からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されてよい；
かつ
Ｘ４及びＸ５は互いに独立して以下を表す
・水素、Ｃ１〜４アルキル基、ハロゲン−Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、ハロゲン、ニトロ基、−ＮＨ２、メトキシカルボニル基、アセチル基、メトキシカルバモイル基もしくはシアノ基。
【００３８】
「単離した」抗体は、その自然環境における成分から分離した抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により求められるように、純度９５〜９９％を超えて精製される。抗体精製の試験方法を参照するには、例えばＦｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【００３９】
用語「抗体」は本明細書において最も広範な意味で用いられ、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む種々の抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
【００４０】
用語「抗対象ポリペプチド抗体」及び対象ポリペプチド「に結合する抗体」とは、抗体が、対象ポリペプチドを標的にする診療及び／または治療薬として有用となるように、十分な親和性で対象ポリペプチドに結合可能な抗体を意味する。一実施形態において、抗対象ポリペプチド抗体の、無関係の非対象ポリペプチドタンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定するとおり、抗体の対象ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。ある種の実施形態において、対象ポリペプチドに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある種の実施形態において、抗対象ポリペプチド抗体は、対象ポリペプチド内で異なる種から保存された、対象ポリペプチドのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、対象ポリペプチドはＫＤＭ５である。
【００４１】
「遮断抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは低減させる抗体である。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は実質的に、または完全に抗原の生物活性を阻害する。
【００４２】
「親和性」とは、分子の単一の結合部位（例えば抗体）とその結合パートナー（例えば抗原）との非共有結合性相互作用の合計の強さを意味する。特に指示がない限り、本発明で使用する場合、「結合親和性」」とは、結合ペア（例えば抗体及び抗原）の要素間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）で表される。親和性は当該技術分野において既知の一般的な方法により測定可能であり、本明細書に開示されるものを含む。結合親和性を測定するために特定の説明及び代表的実施形態は、以下に記載されている。
【００４３】
「抗体断片」とは、抗原に結合する完全な抗体の一部を含む完全な抗体以外の分子を意味する。
【００４４】
抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
リファレンス抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上で、リファレンス抗体がその抗原に結合することをブロックする抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて５０％以上で、抗体がその抗原に結合することをブロックするリファレンス抗体を意味する。
【００４６】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残部が異なる源または種に由来する抗体を意味する。
【００４７】
用語「完全長抗体」、「完全な抗体」、及び「全抗体」は本明細書で同じ意味で用いられ、自然抗体の構造にほぼ等しい構造を有する、またはＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味する。
【００４８】
用語「モノクローナル抗体」は本発明で使用する場合、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体、すなわち、可能性のある変異型抗体（例えば、自然発生の突然変異体を含有する、またはモノクローナル抗体の調製中に生じ、かかる突然変異体が通常少量存在する）を除いて同一である、及び／または同一のエピトープに結合する母集団を含む個々の抗体を意味する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含む、ポリクローナル抗体の調製とは対照的に、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。したがって修飾語「モノクロナール」は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。
【００４９】
例えば、本発明において使用するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の代表的な方法を含む様々な技術により作製してよいが、これらに限定されない。「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により作製した、もしくはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列または他のヒト抗体コード化配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００５０】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。ある種の実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変領域に対応する全てまたはほぼ全てのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）、及びヒト抗体の可変領域に対応する全てまたはほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変領域を含む。ヒト化抗体は所望により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化した抗体を意味する。
【００５１】
本発明で使用する場合、用語「標的治療」とは、対象ポリペプチドに結合し、特定の対象ポリペプチドの活性及び／または活性化を阻害する治療薬を意味する。かかる薬剤の例としては、対象ポリペプチドに結合する抗体及び低分子が挙げられる。
【００５２】
「化学療法」とは、癌治療に有用な化合物を意味する。化学療法の例としては、以下が挙げられる：チオテパ及びシクロホスファミド（シトキサン（登録商標））等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン等のニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンω１Ｉ（例えばＮｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））；経口α−４インテグリン阻害剤のＣＤＰ３２３；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン、加えてネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドクソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン等のマイトマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジネン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、マイトテイン、トリロスタン等の抗副腎剤；フォリン酸等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサマイトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；マイトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン組換ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチン等の白金製剤；チューブリン重合を微小管形成から保護するビンカ（ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む）；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサ��ト；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド（ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）を含む）；クロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））等のビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；並びに製薬上許容できる上述のいずれかの塩、酸または誘導体；加えてＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語）等の、上記の２つ以上の組み合わせ；並びにＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボリンを混ぜ合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）による治療レジメンの略語）。
【００５３】
用語「細胞毒性剤」は本発明で使用する場合、細胞機能を阻害もしくは妨げる、及び／または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を意味する。本用語は、放射性同位元素（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤または薬剤（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤）、成長阻害剤、核酸分解酵素等の酵素及びその断片、抗生物質、並びに微生物、菌類、植物または動物由来の低分子毒素または酵素活性毒素等の毒素を含むことを目的とし、その断片及び／または変異体、並びに以下に開示する種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含む。他の細胞毒性剤を以下に記載する。腫瘍崩壊剤は、腫瘍細胞の破壊の原因となる。
【００５４】
「免疫複合体」とは、１つ以上の異種分子に結合した抗体であり、細胞毒性剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
「個体応答」または「応答」は、（１）減速及び完全停止を含む、病気の進行（例えば癌の進行）をある程度阻害すること；（２）腫瘍サイズの減少；（３）隣接した末梢臓器及び／もしくは組織中への癌細胞の侵入阻害（すなわち低減、減速または完全停止）；（４）転移阻害（すなわち低減、減速または完全停止）；（５）病気または疾患（例えば癌）に関連する１つ以上の症状のある程度の回復；（６）無進行生存の長さの増加；並びに／または（７）治療後のある時点での死亡率の低下を含む、個体への有効性を示す任意の終了位置を用いて評価することが可能であるが、これらに限定されない。
【００５６】
用語「実質的に同じ」は本発明で使用する場合、当業者が、前記値（例えばＫｄ値または発現）により測定した生物学的特性の背景の中で、２つの値の差に生物学的、及び／または統計的有意性がない、もしくはほとんどないと考えるように、２つの数値の類似性の程度が十分に大きいことを表す。前記２つの値の差は例えば、参照／コンパレータ値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／または約１０％未満である。
【００５７】
語句「実質的に異なる」とは、本発明で使用する場合、当業者が、前記値（例えばＫｄ値）により測定した生物学的特性の背景の中で、２つの値の差が統計的に有意であると考えるように、２つの数値の差の程度が十分に大きいことを意味する。前記２つの値の差は例えば、参照値／コンパレータ分子の関数として、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、及び／または約５０％以上である。
【００５８】
物質／分子、例えば医薬組成物の「有効量」とは、必要な用量及び期間で所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を意味する。
【００５９】
物質／分子の「治療的有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに物質／分子が個体内で所望の応答を誘発する能力等の要因によって変化し得る。「治療的有効量」とはまた、物質／分子の任意の毒性または有害作用より、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」とは、必要な用量及び期間で、所望の予防効果を達成する有効量を意味する。必ずしもではないが通常、予防的用量は疾患の初期段階時または前に被験体において使用されるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００６０】
用語「製剤処方」とは、中に含まれる有効成分の生物活性を可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する追加の化合物を含まない配合物を意味する。
【００６１】
「製薬上許容できる担体」とは、有効成分以外の、被験体に無毒の製剤処方中の成分を意味する。製薬上許容できる担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
語句「薬剤として許容される塩」は本発明で使用する場合、製薬上許容できる有機または無機化合物の塩を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「治療」（及び例えば「治療する」または「治療すること」等の文法的な変形）とは、治療される個体の自然経過を変えるための、予防または臨床病理の過程のいずれかで実施可能な臨床的介入を意味する。治療の所望の効果としては、病気の発症または再発防止、症状の緩和、病気の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移予防、疾患進行度の低下、病状の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、病気の進展を遅らせる、または病気の進行を遅くするために使用される。
【００６４】
「個体」または「被験体」は哺乳類である。哺乳類としては、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において個体または被験体はヒトである。
【００６５】
用語「同時に」とは本明細書において、２つ以上の治療薬の投与において、それらの個体への治療効果の時間が重複するように、時間の近接性が十分に高いことを意味するように用いられる。したがって、同時投与には１つ以上の他の作用物質の投与を中止した後で、１つ以上の作用物質の投与を継続する投与レジメンが含まれる。いくつかの実施形態では、同時投与は並行的、逐次的、及び／または同時的である。
【００６６】
「低減または阻害する」とは、全体的に２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の減少を引き起こす能力を意味する。低減または阻害する、とは治療される疾患の症状、転移の存在もしくはサイズ、または原発腫瘍のサイズを意味することができる。
【００６７】
用語「添付文書」は、指示、使用法、用量、投与、併用療法、かかる治療製品の使用に関する禁忌及び／または警告に関する情報を含む、治療製品販売用パッケージに通常含まれる説明書を指すために使用される。
【００６８】
「製品」とは、少なくとも１つの試薬、例えば病気もしくは疾患（例えば癌）の治療用薬剤、または本明細書で記載される生体指標を特異的に検出するプローブを含む任意の製造物（例えばパッケージもしくは容器）またはキットである。ある種の実施形態において、製造物またはキットは本明細書記載の方法を実施する一単位として促進、配布、または販売されてよい。
【００６９】
当業者により理解されるとおり、本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及には、その値またはパラメータ自体に向けられる実施形態が含まれる（かつそれについて記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す説明には、「Ｘ」の説明が含まれる。
【００７０】
本明細書に記載される発明の態様及び実施形態には、態様及び実施形態「からなる」及び／または「から本質的になる」が含まれると理解されている。本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には複数への言及が含まれる。
【００７１】
ＩＩ．方法及び使用
【００７２】
例えば、癌治療及び／または薬剤耐性の防止（例えば単剤及び／または併用療法）に対するＫＤＭ５拮抗剤の使用方法を本明細書で提供する。例えば、個体における癌の治療方法は、該個体にＫＤＭ５拮抗剤のみを、または他の癌治療薬と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、該個体は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）による治療を選択する。いくつかの実施形態では、個体は、癌治療薬による治療前にＫＤＭ５拮抗剤を投与することを含む治療を開始する。いくつかの実施形態では、個体はＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬を含む治療を同時に受ける。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は癌感受性の期間を増大させる、及び／または癌耐性の成長を遅らせる。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００７３】
ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の利用方法もまた、本明細書で提供する。
【００７４】
特に、個体に、（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、並びに（ｂ）癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を投与することを含む個体の癌の治療方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、癌感受性の期間の増大及び／または癌治療薬への細胞耐性の成長を遅らせるに効果的である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、癌治療薬を含む癌治療の有効性を増大させるのに有効である。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、有効性を増加させるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬のそれぞれの量は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、応答（例えば完全寛解）を増大させるのに有効である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００７５】
更に、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、個体への癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を含む癌治療の有効性を増大させる方法を、本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００７６】
個体での癌の処理方法を本明細書で提供する。ここで、癌治療は個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を投与することを含む。該癌治療は、ＫＤＭ５拮抗剤を含まない（不在下での）有効量の癌治療薬を投与することを含む治療（例えばケア治療の基準）と比較して、増大した有効性を有する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００７７】
更に、個体における癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）への癌耐性の成長を遅らせる、及び／または予防する方法を本明細書で提供し、これは個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することからなる。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００７８】
個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）への耐性成長の可能性の増大を有する、癌を患う個体の治療方法を、本明細書で提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００８０】
更に、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体において癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）に対する感受性を増大させる方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００８１】
更に、個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の感受性の期間を延ばす方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００８２】
個体に（ａ）有効量のＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）有効量の癌治療薬を投与することを含む、癌を患う個体における癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）に対する応答期間を延ばす方法もまた、本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００８３】
向上した癌治療の提供に加え、本明細書に記載されるある種の組み合わせの投与により、異なる治療を受ける同一の患者が経験する生活の質と比較して、患者の生活の質が向上し得る。例えば、本明細書に記載されるように、個体にＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の組み合わせを投与することにより、癌治療薬のみを治療として受けた場合に同一の患者が経験する生活の質と比較して、向上した生活の質が提供され得る。例えば、本明細書に記載される組み合わせによる併用療法は、必要な癌治療薬の投与量を減少させ、それにより、治療に関係する副作用（例えば悪心、嘔吐、脱毛、発疹、食欲減退、体重減少等）が減少する。組み合わせにより、腫瘍量、及び疼痛、臓器機能不全、体重減少等の関連する有害事象の低下もまた、引き起こされ得る。したがって、一態様は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）により癌治療をした患者の生活の質を向上するための、治療上の使用のためのＫＤＭ５拮抗剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬は同時に投与される。いくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法、化学療法、及び／または放射線治療である。いくつかの実施形態では、標的療法及び／または化学療法はＥＧＦＲ拮抗剤、ＲＡＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、タキサン、及び白金製剤の１つ以上である。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。
【００８５】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は自然または合成由来である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は抗体、結合ポリペプチド、結合低分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上に結合する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は１つ以上のＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄに結合する、並びに／またはそのデメチラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。
【００８７】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は標的療法である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は化学療法である。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌治療薬は放射線治療である。
【００８８】
本発明で使用する治療に対して耐性を有する癌としては、治療に対する応答性のない、及び／または著しい応答（例えば部分応答及び／もしくは完全応答）を生み出す能力が低下した癌が挙げられる。耐性は、治療法の過程において生じる獲得耐性であってよい。いくつかの実施形態では、獲得薬剤耐性は一過性、及び／または可逆的薬剤耐性である。治療に対する一過性及び／または可逆的薬剤耐性としては、治療法の休憩後に、治療に対する感受性を回復可能な薬剤耐性が挙げられる。いくつかの実施形態では、獲得耐性は持続耐性である。
【００８９】
治療に対する持続耐性としては、薬剤耐性を付与する遺伝子変化が挙げられる。
【００９０】
本発明で使用する治療に対する感受性を有する癌としては、応答性がある、並びに／または著しい応答（例えば部分応答及び／または完全応答）を生み出すことが可能な癌が挙げられる。
【００９１】
治療に対する耐性の獲得及び／または感受性維持評価の測定方法は、当技術分野において既知であり、実施例に記載されている。薬剤耐性及び／または感受性は、（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤の存在下、及び／もしくは不存在化で、比較癌細胞または細胞集団を癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／もしくは放射線治療）に曝露すること、並びに／または（ｂ）例えば、癌細胞の増殖、細胞生存能、アポトーシスのレベル及び／もしくは割合、ヒストン３  リジン４（Ｈ３Ｋ４）メチル化状態（例えばモノメチル化、ジメチル化、及び／もしくはトリメチル化）、並びに／もしくは反応の１つ以上をアッセイすることにより測定してよい。
【００９２】
薬剤耐性及び／または感受性は、時間の経過とともに、及び／または種々の濃度の癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）、及び／または種々の量のＫＤＭ５拮抗剤で測定してよい。
【００９３】
薬剤耐性及び／または感受性を更に測定して、かつ／または親細胞、薬剤耐性のある生残細胞、及び／または薬剤耐性が拡大した細胞株の生残細胞を含む比較細胞株（例えばＰＣ９及び／またはＨ１２９９）と比較してよい。いくつかの実施形態では、細胞生存能をＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイによりアッセイしてよい。薬剤耐性等の耐性の獲得及び／または感受性の維持における変化を、実施例及びＳｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌにて記載されたようにして、薬剤耐性生残生物の成長をアッセイすることにより評価してよい。持続耐性及び／または拡大した生残生物等の耐性の獲得及び／または感受性の維持における変化は、実施例及びＳｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌにて記載されたようにして、薬剤耐性のある拡大した生残生物の成長をアッセイすることにより評価してよい。いくつかの実施形態では、耐性はＩＣ５０、ＥＣ５０の変化、または薬剤耐性のある生残生物及び／もしくは薬剤耐性のある拡大した生残生物における腫瘍成長の減少で示される。いくつかの実施形態では、変化は約５０％、約１００％、及び／または約２００％のいずれかより大きい。加えて、耐性の獲得及び／または感受性の維持における変化を、例えば、応答、応答所要時間、及び／または治療に対する進行時間（例えば部分応答及び完全応答）を評価することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価してよい。耐性の獲得及び／または感受性の維持における変化は、応答の変化、応答所要時間、及び／または多くの個体における治療に対する進行時間、例えば部分応答及び完全応答に基づいて良い。
【００９４】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌、乳癌、結腸直腸癌、大腸癌、黒色腫、及び／または膵臓癌である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））である。いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ１３３陽性である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、癌はＣＤ２４陽性である。いくつかの実施形態では、癌は低いＨ３Ｋ４  トリメチル化レベルを有する。いくつかの実施形態では、癌は低いＨ３Ｋ４  ジメチル化レベルを有する。いくつかの実施形態では、癌はＨ３Ｋ４  トリメチル化レベルの減少が進行する危険がある。いくつかの実施形態では、癌はＨ３Ｋ４  トリメチル化レベルの減少が進行する危険がある。
【００９６】
本明細書に記載される併用治療法のいずれかにおいて、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を含む治療方法を開始する際に、癌は、癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）のみを含む治療方法に対して感受性を有してよい（感受性の例としては、応答性があること、並びに／または著しい応答（例えば部分応答及び／または完全応答）を生み出すことが可能であることが挙げられるが、これらに限定されない）。本明細書に記載される併用治療法のいずれかにおいて、ＫＤＭ５拮抗剤及び癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を含む治療方法を開始する際に、癌は、癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）のみを含む治療方法に対して耐性を有していなくてもよい（耐性の例としては、応答性がないこと、並びに／または著しい応答を生み出す能力（例えば部分応答及び／もしくは完全応答）の低下、及び／もしくはそれが不可能なことが挙げられるが、これらに限定されない）。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、上記実施形態のいずれかに従う個体は、ヒトであってよい。
【００９７】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、併用療法は同時に投与されてよい。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、併用療法は併用投与（２つ以上の治療薬が同一または別々の配合物に含まれる）、及び個別投与を包含してよい。この場合、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の投与は、追加の治療薬及び／またはアジュバントの投与前に、同時に、逐次的に、及び／またはそれに続いて実施してよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の前に、及び／またはそれと同時に投与される。いくつかの実施形態では、併用療法は更に、放射線治療及び／または追加の治療薬を含む。
【００９９】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）は、経口、非経口、肺内、及び経鼻投与、並びに所望により、局所治療、病巣内投与を含む任意の好適な手段により投与することができる。非経口注入としては、筋肉内静脈内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、部分的には、投与が短期的なものか長期にわたるものかに応じて、例えば静脈内または皮下注射等の注射による、任意の好適な経路により行うことができる。種々の時点における単一または複数投与、ボーラス投与、及びパルス注入が挙げられるがこれらに限定されない種々の投与が、本明細書において考慮される。
【０１００】
前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＫＤＭ５拮抗剤（例えば抗体、結合ポリペプチド、及び／または結合低分子）並びに癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）は、良好な医事に合わせた方法で配合、投薬、及び投与してよい。本文脈で考慮すべき要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因が挙げられる。ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）は、必ずしもではないが、所望により、問題の疾患の予防または治療に現在使用されている１つ以上の作用物質と配合する。かかる他の作用物質の有効量は、配合物中に存在するＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の量、疾患または治療の種類、並びに上述の他の要因に依存する。これらは通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、もしくは本明細書で記載される１〜９９％の用量、または実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
【０１０１】
疾患の予防または治療に対し、本明細書に記載されるＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の適切な用量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）が予防または治療目的で投与されるかどうか、薬歴、治療歴患者の病歴並びにＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）に対する応答、並びに主治医の自由裁量に依存する。ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）は一度に、または一連の治療において患者に好適に投与される。数日間またはそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、病徴の所望の抑制が生じるまで続けられる。かかる用量は、断続的に、例えば毎週または三週間ごとに（例えば、患者がＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の投与を約２〜２０回、または例えば約６回受け取るように）投与してよい。最初の多めの投与量、それに続く一回以上の量の少ない用量を投与してよい。代表的な投与レジメンには投与が含まれる。しかし、他の投薬レジメンも有用である。この治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易に監視される。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＥＧＦＲ拮抗剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＲＡＦ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、及び（ｂ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。いくつかの実施形態では、併用療法は（ａ）ＫＤＭ５拮抗剤、（ｂ）タキサン（例えばパクリタキセル）、及び（ｃ）白金製剤（例えばカルボプラチンまたはシスプラチン）からなる。
【０１０２】
上記配合物または治療法のいずれかは、免疫複合体としてＫＤＭ５及び／または癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を使用して実施してよいと理解されている。
【０１０３】
ＩＩＩ．治療用組成物
【０１０４】
本明細書に記載される方法での使用のための、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を含む組み合わせを本明細書で提供する。ある種の実施形態において、組み合わせにより、単独で投与される癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の有効性が増大する。ある種の実施形態において、組み合わせは癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）に対する癌耐性の成長を遅らせる、及び／または防止する。ある種の実施形態において、組み合わせは癌を患う個体における癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の感受性の期間を延ばす。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び／または癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）（例えばＥＧＦＲ拮抗剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及び／またはＲＡＦ阻害剤）は抗体、結合ポリペプチド、結合低分子、及び／またはポリヌクレオチドである。
【０１０５】
ヒトにおけるデメチラーゼのＫＤＭ５／ＪＡＲＩＤ１ファミリーには、四つのメンバーであるＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄを含む。
【０１０６】
図１の図面に示すように、ＫＤＭ５ファミリーメンバーは５つの保存ドメイン：ＪｍｊＮ、ＡＲＩＤ、ＪｍｊＣ、ＰＨＤ及びＣ５ＨＣ２ジンクフィンガーを含む。ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄのアミノ酸配列は当技術分野において公知であり一般に入手可能となっており、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを参照のこと（例えば、ＫＤＭ５Ａ（例えばＰ２９３７５−１及び／もしくはＰ２９３７５−２）、ＫＤＭ５Ｂ（例えばＱ９ＵＧＬ１−１及び／もしくはＱ９ＵＧＬ１−２）、ＫＤＭ５Ｃ（例えばＰ４１２２９−１、Ｐ４１２２９−２、Ｐ４１２２９−３、及び／またはＰ４１２２９−４）、並びに／またはＫＤＭ５Ｄ（例えばＱ９ＢＹ６６−１、Ｑ９ＢＹ６６−２及び／もしくはＱ９ＢＹ６６−３）を参照のこと）。前記いずれかの方法におけるいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄの１つ以上の拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は汎ＫＤＭ５阻害剤である（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄを阻害する）。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ阻害剤（例えばＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上）並びに他のＫＤＭ（例えばＫＤＭ１、ＫＤＭ２、ＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ６、ＫＤＭ７及び／またはＫＤＭ８の１つ以上）を阻害する）である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂ拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂのデュアル拮抗剤である。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は特異的ＫＤＭ５拮抗剤、例えばＫＤＭ５Ａに特異的な拮抗剤、ＫＤＭ５Ｂに特異的な拮抗剤、並びに／またはＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂに特異的なデュアル拮抗剤である。
【０１０７】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、ＩＣ５０が約４μΜ、約２μΜ、約１μΜ、約５００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、及び／または３０ｎＭのいずれかより良い（例えば未満の）ＫＤＭ５Ａを有する。化合物に対するＫＤＭ５ＡのＩＣ５０の測定方法は、当技術分野において既知であり、その全体が参照として本明細書に組み込まれ、本明細書に記載されている。
【０１０８】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は約５μΜ、約７．５μΜ、約１０μΜ、約１５μΜ、及び／または約２０μΜのいずれかよりも大きいＩＣ５０のＫＤＭ２及び／またはＫＤＭ３を有する。化合物に対するＫＤＭ２及び／またはＫＤＭ３のＩＣ５０の測定方法は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ２はＫＤＭ２Ｂである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ３はＫＤＭ３Ｂである。
【０１０９】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、約２５μΜ、約１５μΜ、約１０μΜ、約７．５μΜ、約５μΜ、約４μΜ、約３．５μΜ、約３μΜ、約２．５μΜ、約２μΜ、及び／または約１μΜのいずれかより良い（例えば未満の）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ＥＣ５０を有する。化合物に対するＨ３Ｋ４ｍｅ３  ＥＣ５０の測定方法は、当技術分野において既知であり（ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂｊｂｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍｌ１２．４１９８６１で入手可能なＳａｙｅｇｈ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１１２．４１９８６１（２０１３）、及びＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７９：１９０５−１９１４（２０１２）を参照、その全体が参考として本明細書に組み込まれる）、かつ本明細書に記載される。
【０１１０】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はα−ケトグルタレートへのＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）の結合を阻害する。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）の結合に関して、α−ケトグルタレートと競合する。拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５は、α−ケトグルタレートへのＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）の結合を、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％もしくは約９０％のいずれか、及び／またはそのいずれかより高い値で阻害する。
【０１１１】
ＫＤＭ５拮抗剤及びα−ケトグルタレートの結合及び／または競合阻害の測定方法は、当技術分野において既知であり、例えばＫｒｕｉｄｅｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８：４０４−４０８（１６  Ａｕｇ．２０１２），Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７９：１９０５−１９１４（２０１２）、及びＳａｙｅｇｈ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１１２．４１９８６１（２０１３）（ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂｊｂｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ  １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４１９８６１から入手可能）に記載され、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
例えば、ケトグルタル酸−α−［１−１４Ｃ］−ナトリウム塩、α−ケトグルタル酸ナトリウム塩、及びＨＰＬＣ精製ペプチドを、例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ  ＭＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等の民間の供給元から入手してよい。アッセイで使用するペプチドはＫＤＭ５の断片でよい。例えば、アッセイで使用するＫＤＭ５ペプチドは例えば、昆虫細胞中で発現し、精製される。酵素活性は、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ及びＭｙｌｌｙｌａ（１９８２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８２：２４５−３０４）により記載されるアッセイを使用して、１４ＣＯ２を捕捉することにより求められる。
【０１１３】
アッセイ反応には５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００μＭのα−ケトグルタル酸ナトリウム塩、０．３０のケトグルタル酸−α−［１−１４Ｃ］−ナトリウム塩、４０μＭのＦｅＳＯ４、１ｍＭのアスコルベート、１５４１．８  ｕｎｉｔｓ／ｍＬのカタラーゼ、５０μＭのペプチド基質を含有または非含有で、及び種々の濃度のＫＤＭ５拮抗剤を含んでよい。反応はＫＤＭ５酵素を添加することにより開始する。
【０１１４】
ペプチド依存性の代謝回転率は、基質ペプチド存在下での代謝回転率から、ペプチド不在下での代謝回転率を減ずることにより計算される。阻害率及びＩＣ５０は、所定の阻害剤濃度におけるペプチド依存性の代謝回転率を用いて計算される。各阻害剤のＩＣ５０値の計算は、ソフトウェアＧｒａＦｉｔ（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｓｕｒｒｅｙ  ＵＫ）を使用して行われる。
【０１１５】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、ＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）のＨ３への結合を阻害する。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＨ３と、ＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）への結合を競合する。拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、Ｈ３へのＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）の結合を、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％もしくは約９０％のいずれか、及び／またはそのいずれかより高い値で阻害する。いくつかの実施形態では、Ｈ３は、Ｈ３Ｋ４を含むＨ３のポリペプチド断片からなる。いくつかの実施形態では、Ｈ３はＨ３Ｋ４ｍｅ３を含む。幾つかの実施形態では、Ｈ３はＨ３Ｋ４ｍｅ２を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ３は、Ｈ３Ｋ４（例えば、Ｈ２Ｎ−ＡＲＴ（ＫＭｅ３）ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ）を含むＨ３の２１アミノ酸ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｈ３はＨ３Ｋ４ｍｅ３［ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＧＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ−ＧＧＫ（Ｂｉｏｔｉｎ）］、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２［ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＧＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ−ＧＧＫ（Ｂｉｏｔｉｎ）］、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１［ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ−ＧＧＫ（Ｂｉｏｔｉｎ）］を含む。
【０１１６】
ＫＤＭ５拮抗剤、及びＨ３等のヒストンの結合阻害及び／または競合の測定方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７９：１９０５−１９１４（２０１２）、Ｋｒｕｉｄｅｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８：４０４−４０８（１６  Ａｕｇ．２０１２）、及びｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂｊｂｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４１９８６１から入手可能なＳａｙｅｇｈ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１１２．４１９８６１（２０１３）に記載され、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はヒストン３（Ｈ３）に対するＫＤＭ５の結合（例えば相互作用及び／または会合）を直接または間接的に阻害する。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＨ３  リジン４（Ｈ３Ｋ４）へのＫＤＭ５の結合（例えば相互作用及び／または会合）を直接または間接的に阻害する。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、トリメチル化及び／またはジメチル化Ｈ３Ｋ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び／またはＨ３Ｋ４ｍｅ２）へのＫＤＭ５の結合（例えば相互作用及び／または会合）を直接または間接的に阻害する。
【０１１８】
ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、ＫＤＭ５（例えばＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄ）のデメチラーゼ触媒ドメインと結合（例えば相互作用及び／または会合）する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、ＫＤＭ５のＪｍｊＣ及び／またはＪｍｊＮドメインと結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ａ拮抗剤であり、かつＫＤＭ５Ａ拮抗剤は、配列番号：１のアミノ酸残基４３７−６０３（ＪｍｊＣ）及び／またはアミノ酸残基１９−６０（ＪｍｊＮ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ａ拮抗剤は配列番号：１のアミノ酸残基４３７−６０３（ＪｍｊＣ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｂ拮抗剤は配列番号：１のアミノ酸残基４８３、４８６、及び／または５７１と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ｂ拮抗剤であり、かつＫＤＭ５Ｂ拮抗剤は配列番号：２のアミノ酸残基４５３−６１９（ＪｍｊＣ）及び／またはアミノ酸残基３２−７３（ＪｍｊＮ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｂ拮抗剤は配列番号：２のアミノ酸残基４５３−６１９（ＪｍｊＣ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｂ拮抗剤は配列番号：２のアミノ酸残基４９９、５０２、及び／または５８７と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ｃ拮抗剤であり、かつＫＤＭ５Ｃ拮抗剤は、配列番号：３のアミノ酸残基４６８−６３４（ＪｍｊＣ）及び／またはアミノ酸残基１４−５５（ＪｍｊＮ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｃ拮抗剤は配列番号：３のアミノ酸残基４６８−６３４（ＪｍｊＣ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｃ拮抗剤は配列番号：３のアミノ酸残基５１４、５１７、及び／または６０２と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５Ｄ拮抗剤であり、ＫＤＭ５Ｄ拮抗剤は配列番号：４のアミノ酸残基４５８−６２４（ＪｍｊＣ）及び／またはアミノ酸残基１４−５５（ＪｍｊＮ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｄ拮抗剤は配列番号：４のアミノ酸残基４５８−６２４（ＪｍｊＣ）と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５Ｃ拮抗剤は配列番号：４のアミノ酸残基５０４、５０７、及び／または５９２と結合（例えば相互作用及び／または会合）する。ＫＤＭ５拮抗剤のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はデメチラーゼ触媒活性を阻害する。
【０１２０】
ＫＤＭ５拮抗剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂ  ｊｂｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４１９８６１で入手可能なＳａｙｅｇｈ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１１２．４１９８６１（２０１３）、Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９（１２）：３６２５−３６（２０１２）、及びＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７９：１９０５−１９１４（２０１２）に記載されているものを含み当技術分野において公知であり、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤には、２，４−ピリジンジカルボン酸（２，４−ＰＤＣＡ）、２，４−ピリジンジカルボン酸、カテコール、Ｎ−フェニル−ベンゾイソチアゾール、及び／または２−（４−メチルフェニル）−１，２−ベンゾイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン（ＰＢＩＴ）を含むＪｍｊＣヒストンデメチラーゼ阻害剤があるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は、以下の式の分子または薬剤として許容されるその塩である。
【化５】
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【０１２１】
本明細書では、本明細書に記載される方法において有用なＥＧＦＲ拮抗剤もまた提供する。ＥＧＦＲは、Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：４１８４２５に記載される、受容体型チロシンキナーゼポリペプチドの上皮成長因子受容体を意味し、あるいは、Ｈｅｒ−１及びｃ−ｅｒｂＢ遺伝子産物、並びにＥＧＦＲｖＩＩＩ等の変異体と呼ばれる。ＥＧＦＲの変異体にはまた、欠失、置換及び挿入変異体、例えばＬｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＮＥＪＭ  ２００４，３５０：２１２９），Ｐａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０４：１４９７），Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ２００４，１０１：１３３０６）に記載されるものが挙げられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲは野生型ＥＧＦＲであり、通常は自然発生のＥＧＦＲタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤は抗体、結合ポリペプチド、結合低分子、及び／またはポリヌクレオチドである。
【０１２３】
代表的なＥＧＦＲ拮抗剤（抗ＥＧＦＲ抗体）としては、ニモツズマブ（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）として知られるヒト化モノクローナル抗体等の抗体、完全ヒトＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ、Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、並びにＥ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られ、ＵＳ６，２３５，８８３に記載されている完全ヒト抗体ＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ）が挙げられる。ペルツズマブ（２Ｃ４）は、ＨＥＲ２に直接結合するが、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲの二量体化を妨げることにより、ＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害するヒト化抗体である。ＥＧＦＲに結合する抗体の他の例としては、ＧＡ２０１（ＲＧ７１６０；Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ  ＡＧ）、ＭＡｂ  ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ  ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ  ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）、ＭＡｂ  ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９４３，５３３，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照）及びその変異体（キメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標）））並びに再構成ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０，Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．を参照）；完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体、ＩＭＣ−１１Ｆ８（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型変異型ＥＧＦＲに結合する抗体（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２１２，２９０）；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８９１，９９６に記載されている様な、ＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；並びにＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ（ＷＯ９８／５０４３３，Ａｂｇｅｎｉｘを参照）；ＥＭＤ  ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：６３６−６４０（１９９６））；ＥＧＦＲ結合に対する、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの両方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体、ＥＭＤ７２００（マツズマブ）；並びにｍＡｂ  ８０６またはヒト化ｍＡｂ  ８０６（Ｊｏｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５−３０３８４（２００４））が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞毒性剤と結合して、免疫複合体を産生する場合がある（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２，Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照）。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はパニツムマブである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はザルツムマブ、ニモツズマブ、及び／またはマツズマブである。本方法で有用な抗ＥＧＦＲ抗体としては、ＥＧＦＲに対して十分な親和性及び特異性を持って結合し、かつＥＧＦＲ活性を低減または阻害可能な抗体が挙げられる。選択された抗体は通常、ＥＧＦＲに対して十分強力な結合親和性を有し、例えば、該抗体はヒトｃ−ｍｅｔに、１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値で結合してよい。
【０１２５】
抗体親和性は例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ公開広報番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されているようなＢＩＡＣｏｒｅアッセイ等）；酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により測定してよい。好ましくは、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲリガンド活性が関係する疾患または状態を標的にし、かつ妨げる治療薬として使用することが可能である。また、例えば治療薬としての有効性を評価するために、該抗体に他の生物活性アッセイを行っても良い。かかるアッセイは、当技術分野において既知であり、標的抗原及び抗体の使用目的に依存する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞防御機構に焦点を当てて、ＥＧＦＲアームはＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２もしくはＣＤ３）等の白血球へのトリガー分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等の、ＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターと結合するアームと組み合わせてよい。更に、ＥＧＦＲを発現する細胞に対して細胞毒性剤を局在化するために、二重特異性抗体を使用してもよい。これらの抗体は、ＥＧＦＲ結合アーム、及び細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リジンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１２６】
代表的なＥＧＦＲ拮抗剤としてはまた、ＵＳ５６１６５８２、ＵＳ５４５７１０５、ＵＳ５４７５００１、ＵＳ５６５４３０７、ＵＳ５６７９６８３、ＵＳ６０８４０９５、ＵＳ６２６５４１０、ＵＳ６４５５５３４、ＵＳ６５２１６２０、ＵＳ６５９６７２６、ＵＳ６７１３４８４、ＵＳ５７７０５９９、ＵＳ６１４０３３２、ＵＳ５８６６５７２、ＵＳ６３９９６０２、ＵＳ６３４４４５９、ＵＳ６６０２８６３、ＵＳ６３９１８７４、Ｗ０９８１４４５１、ＷＯ９８５００３８、ＷＯ９９０９０１６、ＷＯ９９２４０３７、ＷＯ９９３５１４６、ＷＯ０１３２６５１、ＵＳ６３４４４５５、ＵＳ５７６００４１、ＵＳ６００２００８、及び／またはＵＳ５７４７４９８に記載される化合物等の結合低分子も挙げられる。特定の結合低分子ＥＧＦＲ拮抗剤としては、ＯＳＩ−７７４（ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ  １８３８０５（ＣＩ  １０３３、２−プロペンアミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−ジヒドロクロリド、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ  １０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１‐フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニルｌ）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチンアミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）；ラパチニブ（タイケルブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＺＤ６４７４（ザクティマ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＣＵＤＣ−１０１（Ｃｕｒｉｓ）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）；ＡＥＥ７８８（６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン、ＷＯ２００３０１３５４１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＰＫＩ１６６  ４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール、ＷＯ９７０２２６６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、及び／または薬学的に許容されるその塩（例えば、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン塩酸塩）である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はゲフィチニブ、及び／または薬学的に許容されるその塩である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はラパチニブ、及び／または薬学的に許容されるその塩である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はゲフィチニブ及び／またはエルロチニブである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲに対する特異的阻害剤であってよい。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＥＧＦＲ拮抗剤がＥＧＦＲ及び１つ以上の他の標的ポリペプチドを阻害する、二重阻害剤または汎阻害剤であってよい。
【０１２９】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、主要な生化学機能が、ホスホイノシチドの３−ヒドロキシル基をリン酸化することである脂質キナーゼのファミリーである。ＰＩ３Ｋ阻害剤の例は、当技術分野において既知であり、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＳＦ１１２６（低分子プロドラッグであって、インテグリン結合成分に連結した、ＬＹ２９４００２の複合体）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（イミダゾキノリン誘導体）、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６、ＸＬ７６５、ＧＤＣ−０９８０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＰＸ−８６６、ＧＤＣ−０９４１、ＧＳＫ６１５、及び／またはＣＡＬ−１０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＷＯ２００９／１１４８７４、ＷＯ２００９／０８８９９０、ＵＳ７５１１０４１、ＵＳ７６６６９０１、ＵＳ７６６２９７７、ＷＯ２０１０／０４６６３９、ＵＳ２０１００１０５７１１、ＷＯ２０１０／０３７７６５、ＵＳ２０１０００８７４４０、ＷＯ２０１００３４４１４、ＵＳ２０１０００７５９６５、ＵＳ２０１０００７５９５１、ＵＳ２０１０００７５９４７、ＷＯ２０１０／０３８１６５，ＷＯ２０１０／０３６３８０、ＷＯ２０１０／０５９７８８、ＷＯ２０１０／０４９４８１、ＷＯ２００９／１３４８２５、ＷＯ２００９／１２３９７１、ＷＯ２００９／０９９１６３，及び／またはＷＯ２００９／０４２６０７に記載されている化合物であり、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
本明細書では、本明細書に記載される方法において、癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）として有用なＲＡＦ阻害剤もまた提供する。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＲＡＦ阻害剤はＣＲＡＦ阻害剤である。代表的なＢＲＡＦ阻害剤は、当技術分野において既知であり、例えばソラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ−３６０３、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１  １８４３６）、ＧＤＣ−０８７９、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ２８１、ＡＺ６２８、ＡＲＱ７３６、ＢＡＹ７３−４５０６、ベムラフェニブ、並びにＷＯ２００７／００２３２５、ＷＯ２００７／００２４３３、ＷＯ２００９１１１２７８、ＷＯ２００９１１１２７９、ＷＯ２００９１１１２７７、ＷＯ２００９１１１２８０及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，４９１，８２９に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は選択的ＢＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦ  Ｖ６００の選択的阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、及び／またはＶ６００Ｄである。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒである。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブである。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブである。
【０１３２】
ベムラフェニブ（ＲＧ７２０４、ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ登録番号１０２９８７２−５５−５）は、種々の癌細胞株、例えば黒色腫細胞株でプログラム細胞死を引き起こすことが示されている。ＢＲＡＦが共通のＶ６００Ｅ変異体を有する場合、ベムラフェニブはＢＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路におけるＢＲＡＦ／ＭＥＫ工程を妨げる。ベムラフェニブは患者、例えば癌がＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異体を有する、ＦＤＡにより承認された黒色腫の患者内で作用する（すなわち、ＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸位置番号６００において、正常なバリンがグルタミン酸で置換される）。黒色腫の約６０％は、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異体を有する。Ｖ６００Ｅ変異体は、リンパ腫、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌及び肺癌を含む他の種々の癌に存在する。ベムラフェニブは以下の構造を有する。
【化６】
2016520528.tif 000008
【０１３３】
ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標）（ベムラフェニブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）はアメリカで承認された製剤であり、ＦＤＡが承認する試験により検出されたＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を有する切除不能な、または転移性の黒色腫を患う患者の治療に指定されている。ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標）（ベムラフェニブ）は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を欠失した黒色腫（野生型ＢＲＡＦ黒色腫）の患者での使用は推奨されない。
【０１３４】
本明細書では、本明細書に記載される方法において癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）として有用な白金製剤もまた提供する。
【０１３５】
白金製剤の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、及び／またはトリプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、白金製剤はシスプラチンである。いくつかの実施形態では、白金製剤はカルボプラチンである。本明細書では、本明細書に記載される方法において癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）として有用なタキサンもまた提供する。タキサンは、チューブリンに結合し、微小管集合及び安定を促進し、かつ／または微小管の解重合を防ぎ得るジテルペン類である。本明細書に含まれるタキサンとしては、タキソイド１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ及び／またはその誘導体がある。タキサンの例としては、パクリタキセル（すなわち、タキソール、ＣＡＳ番号３３０６９−６２−４）、ドセタキセル（すなわちタキソテール、ＣＡＳ番号＃１１４９７７−２８−５）、ラロタキセル、カバジタキセル、ミラタキセル、テセタキセル、及び／またはオルタタキセルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、タキサンはドセタキセルである。いくつかの実施形態では、タキサンはクレモフォア（例えばＴａｘｏｌ（登録商標））及びポリソルベート８０（例えばＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））等のＴｗｅｅｎ中に配合される。いくつかの実施形態では、タキサンはリポソーム封入タキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンはプロドラック形態である、かつ／またはタキサンの結合形態（例えばパクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス、及び／またはリノレイルカーボネート−パクリタキセルに共有結合したＤＨＡ）である。いくつかの実施形態では、パクリタキセルは実質的に界面活性剤を用いずに（例えばＴｏｃｏｓｏｌ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ等のクレモフォア及び／またはＴｗｅｅｎの不存在下で）配合される。いくつかの実施形態では、タキサンはアルブミンコートナノ粒子（例えばアブラキサン及び／またはＡＢＩ−００８）である。いくつかの実施形態では、タキサンはＴａｘｏｌ（登録商標）である。
【０１３６】
本明細書に記載される方法において癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）として有用なビンカアルカロイドを、本明細書で提供する。ビンカアルカロイドは、本来ニチニチソウ由来の抗有糸分裂剤及び微小管阻害剤のまとまりである。ビンカアルカロイドの例としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ビンカアルカロイドはビノレルビンである。
【０１３７】
本明細書に記載される方法において癌治療剤（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）として有用なヌクレオシド類似体を、本明細書で提供する。ヌクレオシド類似体としては、ゲムシタビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジネン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及び／またはフロクスウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド類似体はゲムシタビンである。
【０１３８】
Ａ．抗体
【０１３９】
本明細書に記載される方法における使用のための、ＫＤＭ５および／またはＥＧＦＲ等の対象ポリペプチドに結合する単離抗体を本明細書で提供する。上記実施形態のいずれかにおいて、抗体はヒト化している。更に、上記実施形態のいずれかによる抗体はモノクローナル抗体であり、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む。一実施形態において、抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、抗体は完全長抗体、例えば「完全ＩｇＧ１」抗体、または本明細書に定義する他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１４０】
更なる態様において、上記実施形態のいずれかによる抗体は、以下のセクションに記載する機能のいずれかを、単独でまたは組み合わせて、導入してよい。
【０１４１】
１．抗体親和性
【０１４２】
ある種の実施形態において、本明細書で提供する抗体は、≦１μΜ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）を有する。一実施形態において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施形態において、ＲＩＡは対象抗体のＦａｂ版、及びその抗原と共に実施する。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系の存在下で、最小濃度（１２５Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレート（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照）で捕捉することにより測定する。アッセイについての条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｎＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ  ９．６）中の捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５μｇ／ｍＬで一晩コーティングし、その後室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン２％（ｗ／ｖ）でブロックした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、対象Ｆａｂの連続希釈液と混合した（例えばＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）にある、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と一致する）。
【０１４３】
対象Ｆａｂを次いで一晩インキュベートする；しかし、確実に平衡状態に到達するように、インキュベーションを更に長い期間（例えば約６５時間）継続してよい。その後、インキュベーションのため、混合物を室温にて捕捉プレートに移す（約１時間）。溶液を次いで除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥すると、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０回カウントした。濃度が最大結合の２０％以下である各Ｆａｂを、競合結合アッセイでの使用のために選択した。
【０１４４】
別の実施形態によれば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。例えば、〜１０の応答単位（ＲＵ）にて不動化抗原ＣＭ５小片を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアッセイを２５℃にて実施する。一実施形態において、供給業者の取扱説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｉｎｃ．）をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）により、抗原を５μｇ／ｍＬ（〜０．２μＭ）まで希釈してから５μＬ／分の流速で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を得る。抗原注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。動力学測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）と共に、２５℃にて、約２５μＬ／分の流速で、２倍のＦａｂ連続希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）をＰＢＳ中に注入する。簡単な１：１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア版３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時に一致させることにより、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出する。例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記表面プラズモン共鳴アッセイにより会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、会合速度は、ストップトフロー分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）または撹拌キュベットを備えた８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定した際に抗原濃度が増加する中で、２５℃における、ＰＢＳ中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度における増減を測定する蛍光消光技術（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）を使用して求めることができる。
【０１４５】
２．抗体断片
【０１４６】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体は抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに以下に記載する他の断片が挙げられるがこれらに限定されない。ある種の抗体断片の参照には、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の参照には、例えばＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと；また、ＷＯ９３／１６１８５；並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５７１，８９４及び５，５８７，４５８も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論には、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８６９，０４６を参照のこと。
【０１４７】
二重特異性抗体とは、二価または二重特異的でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１  １６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。三重特異性抗体及び四重特異性抗体については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にもまた記載されている。
【０１４８】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変領域の全部もしく一部、または軽鎖可変領域の全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある種の実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２４８，５１６を参照）。
【０１４９】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、宿主細胞（例えば大腸菌またはファージ）の組み換えによる、完全な抗体のタンパク分解、及び産生を含む各種技術により製造可能であるが、これらに限定されない。
【０１５０】
３．キメラ及びヒト化抗体
【０１５１】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に開示されている。一実施例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）、及びヒト定常領域を含む。更なる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれらから変更している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体としては、その抗原結合断片が挙げられる。
【０１５２】
ある種の実施形態において、キメラ抗体はヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体をヒト化すると、ヒトに対する免疫原性は低下するが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は維持される。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変領域を含み、ＦＲ（またはその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は所望により、ヒト定常領域の少なくとも一部もまた含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のＦＲ残基の中には、例えば、抗体の特異性または親和性を維持または向上するために対応する非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）で置換されるものもある。
【０１５３】
ヒト化抗体及びその作成方法は例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）で確認され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８２１，３３７、７，５２７，７９１、６，９８２，３２１、及び７，０８７，４０９；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトに関する記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成」の記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲ構成」の記述）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲ構築のための「誘導選択」アプローチの記述）に詳しく記載されている。
【０１５４】
ヒト化に用いるヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６（１９９３）を参照）；重鎖または軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照）；並びにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）。
【０１５５】
４．ヒト抗体
【０１５６】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の種々の技術を使用して作製することができる。ヒト抗体は通常、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１５７】
抗原チャレンジに対して応答するヒト可変領域を有する完全なヒト抗体または完全な抗体を産生するために修飾したトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより、ヒト抗体を調製してよい。かかる動物は通常、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在する、もしくは動物の染色体中に無作為に導入したヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は通常不活性である。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の参照については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：  １１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術について記載のＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載のＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７７０，４２９；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載のＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，０４１，８７０；並びにＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について記載の米国特許公開公報ＵＳ２００７／００６１９００もまた参照のこと。
【０１５８】
かかる動物により産生された完全な抗体のヒト可変領域を、例えば異なるヒト定常領域を組み合わせることにより、更に修飾してよい。
【０１５９】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマ法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体産生のための、ヒト骨髄腫及びマウス・ヒトヘテロ骨髄腫細胞株について説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと。）
【０１６０】
ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製したヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。更なる方法としては、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，１８９，８２６（ハイブリドーマ細胞株からのモノクロナールヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるようなものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）についてもまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔ．＆Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ．，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１６１】
ヒト由来のファージディスプレイライブラリーからＦｖクローン可変領域配列を単離することにより、ヒト抗体を産生してもよい。かかる可変領域配列をその後、所望のヒト定常領域と組み合わせて良い。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術について以下で説明する。
【０１６２】
５．ライブラリー由来の抗体
【０１６３】
所望の単一の活性または複数の活性を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、抗体を単離してよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーの作製、及び所望の結合特性を有する抗体のためにかかるライブラリーのスクリーニングをする種々の方法が、当技術分野において既知である。かかる方法は例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）で確認され、更に、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
【０１６４】
ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリー内で無作為に再結合され、次いでＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Αｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているような、抗原結合ファージに対してスクリーニングすることが可能である。ファージは通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片をディスプレイする。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築の必要なしに、免疫原に対して高親和性の抗体を付与する。あるいは、未処理のレパートリーをクローニング（例えばヒトから）して、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載するような任意の免疫付与を行わずに、単一源の抗体を、広範囲の非自己抗原及び自己抗原にすることができる。最終的に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されているように、幹細胞から非再配列Ｖ遺伝子断片をクローニングし、無作為の配列を含むＰＣＲプライマーを用いて高可変ＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載している特許公報としては例えば、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７５０，３７３、並びにＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５／００７９５７４、２００５／０１１９４５５、２００５／０２６６０００、２００７／０１１７１２６、２００７／０１６０５９８、２００７／０２３７７６４、２００７／０２９２９３６、及び２００９／０００２３６０が挙げられる。
【０１６５】
ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体または抗体断片は、本明細書におけるヒト抗体またはヒト抗体断片と考えられている。
【０１６６】
６．多重特異性抗体
【０１６７】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施形態において、結合特異性の１つは、ＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ等の対象ポリペプチドであり、他の結合特異性は、任意の他の抗原に対するものである。ある種の実施形態において、二重特異性抗体は、ＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ等の、対象ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、ＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ等の対象ポリペプチドを発現する細胞に対する細胞毒性剤を局在化させるために使用してもよい。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１６８】
多重特異性抗体の作製技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖・軽鎖ペアを組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：  ５３７（１９８３）を参照）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）並びに「ノブ・イン・ホール」組み換え（例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７３１，１６８を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、Ｆｃヘテロ二量体分子の抗体作製のための組み換え静電的ステアリング効果（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６７６，９８０、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体産生のためのロイシンジッパー使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）；二重特異性抗体断片作製のための「二重特異性抗体」技術の使用（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）；並びに一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えばＧｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；並びに、例えばＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような、三重特異性抗体の調製により作製してもよい。
【０１６９】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する組み換え抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照）。
【０１７０】
本明細書における抗体または断片には、ＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ、並びに他の異なる抗原（例えばＵＳ２００８／００６９８２０参照）等の、対象ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる。
【０１７１】
７．抗体変異体
【０１７２】
ａ）グリコシル化変異体
【０１７３】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の増減は、１つ以上のグリコシル化部位を作製または除去するようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成され得る。
【０１７４】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合する炭水化物を変更してよい。哺乳類細胞により作製された自然抗体は通常、Ｎ結合により、Ｆｃ領域のＣＨ２領域にあるＡｓｎ２９７に通常結合した、通常分枝状の二分枝オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖は通常、種々の炭化水素、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分枝オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含んでよい。いくつかの実施形態では、特定の改善された性質を有する抗体変異体を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を行ってよい。
【０１７５】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定されるように、Ａｓｎ２９７に結合した全糖鎖構造（例えば複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造体）の合計に対するＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより、測定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のほぼ位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を意味するが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の軽度の配列変異により、アミノ酸の位置２９７の上流または下流約±３、すなわち、位置２９４〜３００に位置してよい。かかるフコシル化変異体は向上したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公報番号ＵＳ  ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，  Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。
【０１７６】
「脱フコシル化」または「フコース欠失」抗体変異体に関係する広報の例としては、以下が挙げられる：ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。脱フコシル化抗体を生成可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化で欠失したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願番号ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，特に実施例１１において）、並びにα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
【０１７７】
抗体変異体を更に、例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているバイセクトオリゴ糖と共に提供する。かかる抗体変異体はフコシル化を低下させ得る、及び／またはＡＤＣＣ機能を向上させ得る。
【０１７８】
かかる抗体変異体の例は、例えばＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，６０２，６８４（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）；及びＵＳ  ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体もまた提供する。かかる抗体変異体は向上したＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体は例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ  １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１７９】
ｂ）Ｆｃ領域変異体
【０１８０】
ある種の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾を、本明細書において提供する抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成してよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでよい。
【０１８１】
ある種の実施形態において本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）が不必要または有害である用途に対して所望の候補となる、全てではなく幾つかのエフェクター機能を有する抗体変異体を考慮する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣの低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠失している（そのためＡＤＣＣ活性も欠失している可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞の仲立ちをする主な細胞はＦｃ（ＲＩＩＩ）のみを発現するが、単球はＦｃ（ＲＩ）、Ｆｃ（ＲＩＩ）及びＦｃ（ＲＩＩＩ）を発現する。造血細胞内でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定例は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５００，３６２（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。
【０１８２】
あるいは、非放射性アッセイ法を用いても良い（例えば、フローサイトメトリー用ＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。
【０１８３】
あるいは、または更に、対象分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に記載されているような動物モデル内で評価してよい。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた実施し、抗体がＣ１ｑに結合できず、そのためＣＤＣ活性を欠失することを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２に記載されているＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。
【０１８４】
補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。当該技術分野において既知の方法を使用して（例えばＰｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。
【０１８５】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上が置換されたもの（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，７３７，０５６）が挙げられる。かかるＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上が置換されたＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７をアラニンに置換した、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，３３２，５８１）を含む。
【０１８６】
ＦｃＲへの結合が向上または低下した特定の抗体変異体について記載されている。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，７３７，０５６；ＷＯ２００４／０５６３１２，及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと。）ある種の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換基、例えばＦｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４の位置（ＥＵ残基ナンバリング）の置換基を有するＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、例えばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１９４，５５１，ＷＯ９９／５１６４２，及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち向上または低下のいずれか）をもたらすＦｃ領域内で変化が起こる。
【０１８７】
半減期が増大し、胎生Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）への結合が向上した、母体ＩｇＧを胎児に移行する役割を果たす抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。
【０１８８】
これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体としては、１つ以上のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の置換基、例えばＦｃ領域残基４３４の置換基を有するもの（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，３７１，８２６）が挙げられる。Ｆｃ領域変異体のその他の例に関係するＤｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６４８，２６０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６２４，８２１；及びＷＯ  ９４／２９３５１も参照のこと。
【０１８９】
ｃ）システイン改変抗体変異体
【０１９０】
ある種の実施形態において、システイン改変抗体、例えば抗体の１つ以上の残基がシステイン残基により置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製するのが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は抗体の接触可能部位にて発生する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、抗体を他の部位、例えば薬物部位、またはリンカー／薬物部位と結合させ、本明細書で更に記載する免疫複合体を作製するのに用いられる場合がある。ある種の実施形態において、任意の１つ以上の以下の残基をシステインで置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン改変抗体は、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，５２１，５４１に記載されているように作製してよい。
【０１９１】
Ｂ．免疫複合体
【０１９２】
更に、ＫＤＭ５またはＥＧＦＲ等の対象ポリペプチドに結合する抗体を含み、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物または動物由来の酵素活性毒素、もしくはこれらの断片）、または本明細書に記載される方法で使用する放射性同位元素等の１つ以上の細胞毒性剤に結合した免疫複合体を、本明細書で提供する。
【０１９３】
一実施形態において、免疫複合体は抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり、抗体が、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２０８，０２０、５，４１６，０６４及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  ＥＰ  ０４２５２３５を参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部位ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）等のオーリスタチン（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６３５，４８３、５，７８０，５８８、及び７，４９８，２９８）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１、及び５，８７７，２９６；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；並びにＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照）；ダウノマイシン及びドキソルビシン等のアントラサイクリン（例えばＫｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，６３０，５７９を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む１つ以上の薬剤に結合している。
【０１９４】
別の実施形態において、免疫複合体は、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素またはこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リジンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセンを含む。
【０１９５】
別の実施形態において、免疫複合体は、放射性原子に結合した、本明細書に記載される抗体を含み、放射性複合体を形成する。放射性複合体の作製のために、種々の放射性同位元素が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体を検出用に用いる場合、例えばＴｃ９９ｍもしくはＩ１２３等のシンチグラフィ検査用放射性原子、またはヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄等の核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴映像法、ＭＲＩとしても知られている）用のスピンラベルを含んでよい。
【０１９６】
Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジプイミデート塩酸塩等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアミド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、抗体及び細胞毒性剤の複合体を作製してよい。
【０１９７】
例えば、リジン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素１４でラベルした１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合用の代表的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２０８，０２０）を使用してよい。
【０１９８】
本明細書における免疫複合体またはＡＤＣは明確に、以下に限定されるわけではないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ、及びスルホＳＭＰＢ、並びに市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む架橋剤により調製したかかる複合体を考慮するが、これらに限定されない。
【０１９９】
Ｃ．結合ポリペプチド
【０２００】
結合ポリペプチドは、対象ポリペプチドを結合するポリペプチドであり、本明細書に記載される方法で使用するために提供されるＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＫＤＭ５拮抗剤及び／またはＥＧＦＲ拮抗剤である。
【０２０２】
結合ポリペプチドは、既知のポリペプチド合成法を用いて化学合成を行ってもよく、または組み換え技術を用いて調製及び精製を行っても良い。結合ポリペプチドは通常、少なくとも約５個の長さのアミノ酸である、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００個の長さのアミノ酸またはそれ以上であり、ここで、結合可能なかかる結合ポリペプチドは好ましくは、本明細書に記載されるように、例えばＫＤＭ５またはＥＧＦＲを特異的に標的にする。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＫＤＭ５デメチラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。
【０２０３】
結合ポリペプチドは、既知の技術を用いる過度な実験をすることなく同定されうる。これに関し、ポリペプチド標的に特異的に結合可能な結合ポリペプチドに対するポリペプチドライブラリーのスクリーニング技術は、当該技術分野において周知であることに留意すべきである（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５５６，７６２、５，７５０，３７３、４，７０８，８７１、４，８３３，０９２、５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，５７１，６８９、５，６６３，１４３；ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ８４／０３５０６及びＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３，並びにＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８を参照のこと）。
【０２０４】
ペプチドライブラリーの生成及びこれらのライブラリーのスクリーニング方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７２３，２８６、５，４３２，０１８、５，５８０，７１７、５，４２７，９０８、５，４９８，５３０、５，７７０，４３４、５，７３４，０１８、５，６９８，４２６、５，７６３，１９２、及び５，７２３，３２３にも開示されている。
【０２０５】
Ｄ．結合低分子
【０２０６】
上記の方法にて使用する、ＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ等の対象ポリペプチドの結合低分子拮抗剤として使用するための、結合低分子を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、結合低分子拮抗剤はＫＤＭ５デメチラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。
【０２０７】
結合低分子は、好ましくは本明細書に記載するＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲに特異的に結合する、本明細書に定義する結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子であることが好ましい。
【０２０８】
結合低分子は、周知の方法を用いて同定及び化学的に合成されてよい（例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合低分子はまた、ＫＤＭ５のＪｍｊＣドメイン及び／またはＪｍｊＮドメインに結合するものとして同定されてもよい。結合低分子は通常サイズが約２０００ダルトン未満、あるいはサイズが約１５００、約７５０、約５００、約２５０、または約２００ダルトン未満であり、ここで、好ましくは本明細書に記載されるポリペプチドに特異的に結合可能なかかる低分子は、既知の技術を使用して過度な実験をすることなく、同定してよい。
【０２０９】
これに関し、対象ポリペプチドに結合可能な分子に対する有機低分子ライブラリーのスクリーニング技術は当該技術分野において周知であることに留意すべきである（例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合有機低分子は例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、スルホン酸アリール、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等である。
【０２１０】
Ｅ．拮抗剤ポリヌクレオチド
【０２１１】
本明細書に記載される方法で使用するポリヌクレオチド拮抗剤もまた本明細書で提供する。ポリヌクレオチドはアンチセンス核酸及び／またはリボザイムであってよい。アンチセンス核酸は、本明細書に記載されたＫＤＭ５遺伝子及び／またはＥＧＦＲ遺伝子等の、対象遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。しかし、完全な相補性は、好ましいものの必要ではない。
【０２１３】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡをハイブリダイズさせて安定した二本鎖を形成可能な十分な相補性を有する配列を意味する；二本鎖のアンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をこのように試験してよい、または三本鎖形成をアッセイしてよい。ハイブリダイゼーション能力はアンチセンス核酸相補性の程度、及び長さの両方に依存する。通常、核酸のハイブリダイゼーションが大きくなればなるほど、より多くの塩基がＲＮＡとミスマッチし、安定した二本鎖（または場合により三本鎖）を含む場合があり、依然としてそれらを形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的な手順を使用して、許容範囲のミスマッチの程度を確認することができる。
【０２１４】
メッセージの５’末端、例えば５’未翻訳配列に相補的であり、ＡＵＧ開始コドンを含むポリヌクレオチドは、翻訳阻害で最も効率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳阻害に効果的であることが示されている。一般にはＷａｇｎｅｒ，Ｒ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照のこと。したがって、遺伝子の５’または３’未翻訳、未コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳阻害に対するアンチセンスアプローチに使用することができる。
【０２１５】
ｍＲＮＡの５’未翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの補体を含まなければならない。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、さほど効果のない翻訳阻害剤であるが、本発明で使用することができる。ｍＲＮＡの５’、または３’コード領域をハイブリダイズするように設計されたか否かに関わらず、アンチセンス核酸は少なくとも６個の長さのヌクレオチドを有さなければならず、好ましくは６〜５０個にわたる長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも５０個のヌクレオチドである。
【０２１６】
効果的なショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）としては、ＫＤＭ５Ａ（成熟アンチセンス）ＴＧＣＣＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号：５）、ＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＴ（配列番号：６）、及びＴＡＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号：７）並びにＫＤＭ５Ｂ（成熟アンチセンス）ＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＣ（配列番号：８）、ＴＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号：９）、及びＴＴＣＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号：１０）に基づくｓｈＲＮＡが挙げられる。
【０２１７】
Ｆ．抗体及び結合ポリペプチド変異体
【０２１８】
ある種の実施形態において、本明細書で提供する抗体及び／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を考慮する。例えば、結合親和性、並びに／または抗体及び／または結合ポリペプチドの他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。抗体及び／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を、抗体及び／もしくは結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を行うことで、またはペプチド合成により調製してもよい。かかる修飾には例えば、抗体及び／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列内での残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換が挙げられる。最終構造が所望の特性、例えば抗原結合を有する場合、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行い、最終構造に到達することができる。
【０２１９】
ある種の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換基を有する抗体変異体及び／または結合ポリペプチド変異体を提供する。置換の突然変異を誘発させる対象部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。表１において、見出し「好ましい置換」の下に保存的置換を示す。更に相当の変更を表１の見出し「代表的置換」の下に、かつアミノ酸側鎖クラスに関して以下に記載をする通りに示す。アミノ酸置換基を抗体及び／または対象ポリペプチド、並びに所望の活性、例えば抗原結合の維持／向上、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの向上のためにスクリーニングをした生成物に導入してよい。
【表１】
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【０２２０】
アミノ酸を一般的な側鎖の特性に従って分類してよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；
（５）鎖配向に影響を与える残基：グリジン、プロリン；
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０２２１】
非保存的置換には、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスと交換することを伴う。
【０２２２】
Ｇ．抗体及び結合ポリペプチド誘導体
【０２２３】
ある種の実施形態において、本明細書において提供する抗体及び／または結合ポリペプチドを更に修飾して、当技術分野において既知であり速やかに入手可能な、更なる非タンパク質性部位を含ませてよい。抗体及び／または結合ポリペプチドの誘導体化に好適な部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１、３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレンポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のため、製造において利点を有し得る。
【０２２５】
ポリマーは任意の分子量であってよく、かつ分枝または非分枝であってよい。抗体及び／または結合ポリペプチドに結合したポリマーの数は異なり、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは、同一であるかまたは異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、これらに限定されるわけではないが、改善される抗体及び／または結合ポリペプチドの特定の性質または機能、抗体誘導体及び／または結合ポリペプチド誘導体が規定される状態下の治療に使用されるかどうか、等を含む事項に基づき決定することができる。
【０２２６】
別の実施形態において、放射線照射により選択的に加熱され得る、非タンパク質性部位への抗体及び／または結合ポリペプチドの複合体を提供する。一実施形態において、非タンパク質性部位はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は任意の波長であってよく、かつ、通常の細胞を傷つけず、かつ抗体及び／または結合ポリペプチド−非タンパク質性部位近くの細胞を殺す温度まで非タンパク質性部位を加熱する波長を含むが、これに限定されるわけではない。
【０２２７】
ＩＶ．所望の機能を有するＫＤＭ５拮抗剤のスクリーニング及び／または同定方法
【０２２８】
抗体、結合ポリペプチド、及び／または低分子を含む、本明細書に記載される方法において使用するＫＤＭ５及び／またはＥＧＦＲ等の、対象ポリペプチドの更なる拮抗剤を上記で説明した。本明細書において提供する抗ＫＤＭ５抗体、結合ポリペプチド、及び／または結合低分子等の更なる拮抗剤は、当該技術分野において既知の種々のアッセイにより、その物理的／化学的性質及び／または生物活性を同定、スクリーニング、または特性決定してよい。
【０２２９】
ある種の実施形態においてＫＤＭ５ポリペプチドの原子座標からなるメモリを含むコンピュータシステムが、ＫＤＭ５のリガンド結合部位を有する化合物を合理的に同定するモデルとして有用である。かかる化合物は例えば、新規に設計するか、または既知の化合物の改質により設計するかのいずれかであってよい。他の場合、結合化合物を、既知の化合物がＫＤＭ５の分子モデルとドッキングするかどうかを試験することにより同定してよい。かかるドッキング法は一般に、当該技術分野において既知である。
【０２３０】
ＫＤＭ５の結晶構造データをコンピュータモデリング技術と共に使用し、結晶構造データの分析により、種々のＫＤＭ５結合化合物の結合モデルを開発することができる。部位モデルは、部位表面の三次元トポグラフィー、並びにファン・デル・ワールス接触、静電相互作用、及び水素結合機会等の要因を特徴づける。次に、コンピュータ・シミュレーション技術を使用して、これらに限定されるわけではないが、プロトン、ヒドロキシル基、アミン基、二価のカチオン、芳香族及び脂肪族官能基、アミド基、アルコール基等、モデル部位と相互作用するように設計されたものを含む官能基の相互作用位置をマッピングする。これらの基を、候補化合物が部位に特異的に結合するという予測を立てて、ファーマコフォアまたは候補化合物の中に設計してよい。したがって、ファーマコフォアの設計には、ファーマコフォアに含まれ、水素結合、ファン・デル・ワールス、静電、及び共有結合の相互作用を含む利用可能な種類の化学的相互作用のいずれかまたはその全てにより、部位と相互作用する候補化合物の能力を考慮することを伴うが、一般に、ファーマコフォアは非共有結合機構による部位と相互作用する。
【０２３１】
ファーマコフォアまたは候補化合物の、ＫＤＭ５ポリペプチドへの結合能力は、実際の合成に加え、コンピュータモデリング技術の使用により分析することができる。十分な結合エネルギー（一実施例において、約１０−２Ｍまたはそれ以上の標的の解離定数に対応する結合エネルギー）により標的（例えばＫＤＭ５ポリペプチド結合部位）に結合することがコンピュータモデリングにより示されたこれらの化合物のみを合成して、それらのＫＤＭ５ポリペプチドへの結合能力及びＫＤＭ５阻害能力、また該当する場合、当業者に既知の、及び／または本明細書に記載される酵素アッセイを使用した酵素機能を試験してよい。従って、コンピュータによる評価工程は、十分な親和性を有するＫＤＭ５ポリペプチドに想定外に結合する、不必要な化合物の合成を回避する。
【０２３２】
ＫＤＭ５ファーマコフォアまたは候補化合物を、化学成分または断片を、ＫＤＭ５ポリペプチドにおける個々の結合標的部位と会合する能力でスクリーニングして選択する一連の工程を用いてコンピュータにより評価し、設計してよい。当業者は、化学成分または断片の、ＫＤＭ５ポリペプチド、より詳細にはＫＤＭ５ポリペプチドの標的部位と会合する能力をスクリーニングする幾つかの方法の１つを使用してよい。該工程は例えば、ＫＤＭ５ポリペプチド座標に基づく、コンピュータスクリーン上の標的部位、または当該技術分野において既知のこれらの座標のサブセットの目視検査により開始してよい。
【０２３３】
癌細胞死を誘発する拮抗剤を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤの取り込みにより示される膜の結合性の喪失を、基準物質と比較して評価してよい。ＰＩ取り込みアッセイを、補体及び免疫エフェクター細胞の不存在化で実施してよい。腫瘍細胞を培地のみ、または適切な併用療法を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートした。各処理の後、細胞集塊除去のために、細胞を洗浄して、３５ｍｍのストレーナを取り付けた１２×７５チューブ（チューブ当たり１ｍＬ、処理群当たり３チューブ）中に分取した。チューブに次いでＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を入れる。試料はＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析してよい。
【０２３４】
培地のみ、及び／またはＰＩ取り込みにより測定した単剤療法と比較して、統計的に著しく細胞死を誘発するこれらの抗体を細胞死誘発抗体、結合ポリペプチドまたは結合低分子として選択してよい。
【０２３５】
スクリーニング及び／または同定法のいずれかにおけるいくつかの実施形態では、候補ＫＤＭ５拮抗剤は抗体、結合ポリペプチド、結合低分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は抗体である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤は結合低分子である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５デメチラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。
【０２３６】
Ｖ．製剤処方
【０２３７】
本明細書に記載するＫＤＭ５拮抗剤及び／または癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の製剤処方は、所望の程度の純度を有するかかる抗体を、１つ以上の任意の製薬上許容できる担体と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び／または標的療法は結合低分子、抗体、結合ポリペプチド、及び／またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、癌治療薬はＥＧＦＲ拮抗剤である。いくつかの実施形態では、癌治療薬はタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。いくつかの実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【０２３８】
製薬上許容できる担体は一般に、使用する用量及び濃度においてレシピエントに無毒であり、これらに限定されるわけではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；誘導体類（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の疎水性ポリマー；グリジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩生成対イオン；金属錯体（例えば亜鉛−タンパク質錯体）；並びに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０２３９】
本明細書における代表的な製薬上許容できる担体は更に、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の介在性薬剤分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある種の代表的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５／０２６０１８６及び２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチン分解酵素等の、１つ以上の更なるグルコサミノグリカナーゼと結合する。
【０２４０】
代表的な凍結乾燥製剤は、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２６７，９５８に記載されている。水性抗体製剤としてはＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１７１，５８６及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが挙げられ、後者の製剤としては、ヒスチジンアセテート緩衝液が挙げられる。
【０２４１】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の指示で必要な２つ以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでよい。かかる有効成分は、意図する目的に対して効果的な量の組み合わせで適切に存在する。有効成分は例えば、コアセルベーション技術または界面重合、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、それぞれコロイド状の薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルション中に調製したマイクロカプセル内に閉じ込めてよい。かかる技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２４２】
持続放出配合物を調製してよい。持続放出配合物の好適例としては、マトリックスが造形物、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である、ＫＤＭ５拮抗剤並びに／または癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／もしくは放射線治療）を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で使用する配合物は通常滅菌されている。滅菌は例えば、滅菌濾過膜を通す濾過により速やかに達成され得る。
【０２４４】
ＶＩ．製造物品
【０２４５】
本発明の別の態様では、上記疾患の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含む製造物品を提供する。該製造物品は、容器、及び容器上にあるまたは付属するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグ等が挙げられる。容器はガラスまたはプラスチック等の種々の材料から形成してよい。容器は組成物それ自体、または状態の治療、予防及び／もしくは診断に効果的な他の組成物と組み合わせた組成物を保持し、かつ、滅菌点検口を有してよい（例えば、容器は静注液バッグまたは皮下注射針で貫通可能なストッパを有するバイアルであってよい）。組成物内の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で記載されるＫＤＭ５拮抗剤である。ラベルまたは添付文書は、組成物が最適な状態の治療に使用されることを示す。更に、製造物品は（ａ）中に組成物を含有する第１の容器（ここで組成物はＫＤＭ５拮抗剤を含む）、並びに（ｂ）中に組成物を含有する第２の容器（ここで組成物は癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）を含む）を含んでよい。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、製造物品は容器、前記容器上のラベル、及び前記容器内に含まれる組成物を含み、ここで、組成物は、１つ以上の試薬（例えば、１つ以上の生体指標もしくはプローブに結合する一次抗体、及び／または本明細書に記載される１つ以上の生体指標に結合するプライマー）サンプル内に１つ以上の生体指標が存在することを評価するために組成物を使用可能であることを示す、容器上のラベル、並びにサンプル内に１つ以上の生体指標が存在することを評価するための試薬の使用説明書を含む。製造物品は更に、サンプルの調製及び試薬の利用のための取扱説明書及び材料のセットを含むことができる。いくつかの実施形態では、製造物品は更に一次及び二次抗体の両方といった試薬を含んでもよく、ここで二次抗体はラベル、例えば酵素標識に結合している。いくつかの実施形態では、製造物品は、本明細書に記載される１つ以上の生体指標に結合した、１つ以上のプローブ及び／またはプライマーを含む。
【０２４７】
製造物品のいずれかに関するいくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び／または癌治療薬は、抗体、結合ポリペプチド、結合低分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、癌治療薬はタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、癌治療薬はＥＧＦＲ拮抗剤である。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び／またはＥＧＦＲ拮抗剤は結合低分子である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合低分子拮抗剤はエルロチニブである。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤及び／またはＥＧＦＲ拮抗剤は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片であり、抗体断片はＫＤＭ５及び／または阻害剤に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５拮抗剤はＫＤＭ５デメチラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及び／またはＫＤＭ５Ｄの１つ以上である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、ＫＤＭ５はＫＤＭ５Ａ及び／またはＫＤＭ５Ｂである。
【０２５０】
本発明の本実施形態における製造物品は更に、組成物を特定の状態の治療に使用可能であることを示す添付文書を含んでよい。いくつかの実施形態では、添付文書は、ＫＤＭ５拮抗剤を、癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／もしくは放射線治療）の前に、並びに／またはそれと同時に投与するための取扱説明書を含む。あるいは、または更に、製造物品は更に、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩−緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液等の製薬上許容できる緩衝液を含む第２（または第３）の容器を含んでよい。更に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の視点から所望の他の物質を含んでもよい。
【０２５１】
製造物品内のその他の任意成分としては、１つ以上の緩衝液（例えばブロック緩衝液、洗浄緩衝液、基質緩衝剤等）、酵素標識により化学的に変化する基質等の他の試薬（例えば色素体）、エピトープ修復溶液、対照サンプル（陽性及び／または陰性対照）、対照スライド等が挙げられる。
【０２５２】
本明細書に記載される任意の上記製造物品は、ＫＤＭ５拮抗剤並びに癌治療薬（例えば標的療法、化学療法、及び／または放射線治療）の代わりに、またはそれに加えて、本明細書に記載される免疫複合体を含みうる、と理解されている。
【実施例】
【０２５３】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の概要を考慮して、種々の他の実施例を実施してよいと理解されている。結果もまた、図及び図の一覧に表示及び記載している。
【０２５４】
（実施例１）
材料及び方法
【０２５５】
細胞培養
【０２５６】
全ての細胞を、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ培地（高グルコース）中に、ＣＯ２  ５％、３７℃にて保持した。
【０２５７】
細胞生存アッセイ
【０２５８】
３×１０４個の細胞を、１２ウェルのクラスターディッシュの各ウェルに配置した。配置後２４時間で培地を取り除き、薬剤を含む培地と交換した。未処理細胞がコンフルエンスに達するまで、新鮮な培地を２日ごとに交換した。次いで培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ＰＢＳ中で４％  ホルムアルデヒドにより１５分間固定した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光性核酸染色法Ｓｙｔｏ６０（１ｎＭのＰＢＳ；分子プローブ）で１５分間染色した。染料を除去し、細胞単一膜をＰＢＳで洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により７００ｎｍで蛍光定量化を実施した。
【０２５９】
薬剤耐性生残生物（ＤＴＰ）の発生
【０２６０】
薬物感受性のある細胞を、本明細書に記載した関係する薬物により、確定したＩＣ５０値の１００倍を超える濃度で３ラウンド処理した。各処理は７２時間続けた。関係する薬物処理の第三ラウンドの終了時にディッシュに付着したままの生存細胞をＤＴＰとし、分析のために収集した。
【０２６１】
特にカルボプラチン及びパクリタキセルのＤＴＰについては、細胞を配置して６０〜７０％のコンフルエンシーにし、次いでカルボプラチン（５．３８μＭ）及びパクリタキセル（１．２５μＭ）で５サイクル、２４時間〜４８時間、薬物なしで処理した。化学療法の最終投与の１週間後にＤＴＰを収集し、分析した。
【０２６２】
γ線照射
【０２６３】
γ線照射のため、５０万個の細胞を阻害剤で置き換えた阻害剤で５日間処理した。細胞接着後（約８時間）、細胞を照射し、照射後５日間、細胞の数を数えた。
【０２６４】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡノックダウン
【０２６５】
ｓｉＲＮＡノックダウンのために、０．０６２５ｕＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  １トランスフェクション脂質（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｔ−２００１）、及び最終濃度が１２．５ｎＭの単一ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＧＥＮＯＭＥ）を使用して、黒色９６ウェルの底が透明なプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６０３）中で、ウェルあたり１０００個の細胞で、細胞をリバーストランスフェクションした。その後細胞を４８〜７２時間トランスフェクトした後、トランスフェクション培地を、培地中の関係する１μＭの薬物療法、または培地のみのいずれかと交換した。７２時間のインキュベーションの後、薬物を含む／含まない培地を新鮮な培地と交換し、関係する薬物療法後に生存した、薬剤耐性のある生残生物（ＤＴＰ）の回復（回復フェーズ）を可能にした。３日間の回復フェーズの後、ＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、メーカーのプロトコールに従って最終的な細胞生存度を測定した。
【０２６６】
ＣｙＱｕａｎｔ蛍光シグナルを、ＧＥ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（対物レンズ４倍）を使用して検出し、ＧＥ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｌｌｂｏｘ  １．９．１．を用いて開発した画像解析アルゴリズムを使用して、ウェルあたりの細胞数として定量化した。
【０２６７】
次いでデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで処理し、各細胞株を二度、完全に独立した条件にて実行した。
【０２６８】
ＫＤＭ５ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）実験に関しては、以下の配列を有するＫＤＭ５  ｓｈＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した：ＫＤＭ５Ａ  ｓｈＲＮＡ１−ＴＧＣＣＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号：５）（成熟アンチセンス）、ＫＤＭ５Ａ  ｓｈＲＮＡ２−ＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＴ（配列番号：６）（成熟アンチセンス）、ＫＤＭ５Ａ  ｓｈＲＮＡ３−ＴＡＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号：７）（成熟アンチセンス）、ＫＤＭ５Ｂ  ｓｈＲＮＡ１−ＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＣ（配列番号：８）（成熟アンチセンス）、ＫＤＭ５Ｂ  ｓｈＲＮＡ２−ＴＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号：９）（成熟アンチセンス）、及びＫＤＭ５Ｂ  ｓｈＲＮＡ３−ＴＴＣＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号：１０）（成熟アンチセンス）。ＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡの実験に関しては、以下の配列を有するＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した：ＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡ１−ＧＣＡＡＡＵＧＡＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＡ（配列番号：１１）、ＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡ２−ＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＧＡＣＣＧＣＡＵ（配列番号：１２）、ＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡ３−ＣＡＡＣＡＣＡＵＡＵＧＧＣＧＧＡＵＵＵ（配列番号：１３）、及びＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡ４−ＧＧＡＵＧＡＡＣＡＵＵＣＵＧＣＣＧＡＡ（配列番号：１４）。
【０２６９】
結合低分子阻害剤
【０２７０】
実験一般に、ＫＤＭ５阻害剤に関しては、化学療法の治療前に３〜５日間、活性または不活性化合物により細胞を処理し、調査期間中、薬物上に保持した。ＣＰＩ−３８２及びＣＰＩ−３８３の構造を以下に提供する。
【化７】
2016520528.tif 000010
【０２７１】
細胞収穫及びタンパク質分析
【０２７２】
細胞溶解物をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー中で調製し、前述の免疫ブロット法により分析した。Ｈ３の修飾に対する商業用抗体（Ａｂｃａｍ，Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞溶解物を分析した。
【０２７３】
質量分析用サンプル調製
【０２７４】
１０００万個の細胞を有するサンプルを溶解させ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／１７１．ｈｔｍｌ）を使用して細胞溶解物からヒストンを単離した。
【０２７５】
Ｑｕｂｉｔ蛍光プラットフォーム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、単離後のタンパク質定量化を行った。目標収率は、細胞５００万個当たり精製ヒストンが少なくとも２０μｇ、またはそれ以上であった。サンプルを次に誘導体化して、ｄ０／ｄ１０無水プロピオン酸及びトリプシン消化を用いた２進比較を実施した。特に、各サンプルのアリコート５μｇをｄ０無水プロピオン酸により誘導体化し、リジン及びモノメチル化リジン残基をブロックした。対照サンプル１５μｇを使用した。サンプルをトリプシンで消化した。ｄ０無水プロピオン酸で、対照サンプルを（ペプチドＮ末端上にさらして）再度誘導体化した。ｄ１０無水プロピオン酸で、試験サンプルを（Ｎ末端上にさらして）再度誘導体化した。各試験サンプルをそれぞれ、対照サンプルと１：１でプールした。次いでサンプルを多酵素消化した。サンプル当たり３つで１組の酵素を使用して、特性決定されるＰＴＭ部位周辺に大きなペプチド、及び全部位周辺において、付随する重複配列一致を作製した。
【０２７６】
質量分析
【０２７７】
ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓタンデム質量分析計上で、データ依存モードのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりペプチド消化を分析した。ＣＩＤ、ＨＣＤ及びＥＴＤフラグメンテーション方式を用いて、データを得た。データの取得に際し、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるデータベース検索を使用して、アセチル化、メチル化、ジメチル化、トリメチル化、リン酸化、及びユビキチン化を測定した。
【０２７８】
新規の配列決定を含む手動でのデータ分析を使用して、コンピュータによる推定アサインメントを確認し、Ｍａｓｃｏｔで一致しない修飾ペプチドに関する生データを調査した。正確な質量フルスキャンＬＣ／ＭＳデータを統合して、サンプル間での修飾ペプチドの相対的な存在量を求めた。トリプシン消化したプロピオニル化サンプルを、ｄ０／ｄ５ペアを比較して作動する各ＬＣ／ＭＳで定量化した（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＰＲ，８，５３６７−５３７４（２００９）の作業による）。代わりとなる酵素サンプルを、ＬＣ／ＭＳの操作中に標識なしで定量化した。
【０２７９】
ＫＤＭ２Ｂデメチラーゼアッセイ（質量分析アッセイ）
【０２８０】
完全長組み換えＫＤＭ２Ｂタンパク質をＳｆ９昆虫細胞から精製して、同質性の近いものにした。脱メチル化反応緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＸ−１００、０．００１％ＢＳＡ、１ｍＭのアスコルベート（Ｃａｔ番号Ａ４０３４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのＴＣＥＰ、及び５０μＭのＦｅ２（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（Ｃａｔ番号Ｆ１５４３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだ。２５μＬの脱メチル化反応系中において、１００ｎＭの組み換えＫＤＭ２Ｂ及び２μＭのビオチン化Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２ペプチド（２６−４６  ａａ）を、化合物と１０分間インキュベートし、次いで２．０μＭのα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して反応を開始した。（全ての試薬濃度は最終試薬濃度である。）
【０２８１】
反応を４０分間、室温にてインキュベートし、次いで１％ギ酸  ２５μＬを添加して反応をクエンチした。停止後、分析のためプレートを密閉し−８０℃にて凍結させた。
【０２８２】
ＫＤＭ３Ｂデメチラーゼアッセイ（質量分析アッセイ）
【０２８３】
完全長組み換えの、Ｆｌａｇをタグ付したＫＤＭ３Ｂタンパク質をＳｆ９昆虫細胞から精製した。
【０２８４】
脱メチル化反応緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．４ｍＭのアスコルベート（Ｃａｔ番号Ａ４０３４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのＴＣＥＰ（Ｃａｔ番号Ｄ９７７９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．４μＭのα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４０μＭのＦｅ２（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（Ｃａｔ番号Ｆ１５４３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだ。２５μＬの脱メチル化反応系中において、１５ｎＭの組み換えＫＤＭ３Ｂ及びを化合物と、上記緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１．４μＭのα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２．５μＭのビオチン化Ｈ３Ｋ９ｍｅ１ペプチド（１−２１  ａａ）を添加し、反応を開始した。（全ての試薬濃度は最終試薬濃度である。）
【０２８５】
反応を１５分間、室温にてインキュベートし、次いで等体積の１％ギ酸を添加することによりクエンチした。停止後、分析のためプレートを密閉し−８０°Ｃにて凍結させた。
【０２８６】
ＫＤＭ３Ｂデメチラーゼアッセイ（ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ）
【０２８７】
完全長組み換えの、Ｆｌａｇをタグ付したＫＤＭ３Ｂタンパク質をＳｆ９昆虫細胞から精製した。脱メチル化反応緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．３）、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．４ｍＭのアスコルベート（Ｃａｔ番号Ａ４０３４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのＴＣＥＰ（Ｃａｔ番号Ｄ９７７９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び４０μＭのＦｅ２（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（Ｃａｔ番号Ｆ１５４３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだ。
【０２８８】
１０μＬの脱メチル化反応系中において、０．５ｎＭの組み換えＫＤＭ３Ｂ及び０．１μＭのビオチン化Ｈ３Ｋ９ｍｅ１ペプチド（１−２１  ａａ）を化合物と１０分間、上記緩衝液中でインキュベートし、次いでα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）  １．４μＭを添加して反応を開始した。（全ての試薬濃度は最終試薬濃度である）。反応を１５分間、室温にてインキュベートし、次いで等体積の５０ｍＭの検出溶液（ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．３）、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＮＯＧ、０．０５μＭのＵｌｉｇｈｔ−ＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．）、及び０．２ｎＭのＰＥ  Ｅｕ−抗−Ｈ３Ｋ９ｍｅ０抗体（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．））の添加によりクエンチした。プレートを３０分間インキュベーションし、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器で読み取った。
【０２８９】
ＫＤＭ５Ａデメチラーゼアッセイ（質量分析アッセイ）
【０２９０】
完全長組み換えの、Ｆｌａｇをタグ付したＫＤＭ５Ａタンパク質をＳｆ９昆虫細胞から精製した。脱メチル化反応緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのアスコルベート（Ｃａｔ番号Ａ４０３４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＴＣＥＰ（Ｃａｔ番号Ｄ９７７９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．０μＭのα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５０μＭのＦｅ２（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（Ｃａｔ番号Ｆ１５４３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだ。２５μＬの脱メチル化反応系中において、２０ｎＭの組み換えＫＤＭ５Ａを化合物と１０分間上記緩衝液中でインキュベートし、次いで２．０μＭのα−ケトグルタレート（番号Ｋ２０１０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、４．０μＭのビオチン化Ｈ３Ｋ９ｍｅ１ペプチド（１−２１  ａａ）、及びＦｅ２（ＮＦ４）２（ＳＯ４）２を添加して反応を開始した。（全ての試薬濃度は最終試薬濃度である）。反応を３０分間、室温にてインキュベートし、次いで等体積の１％ギ酸を添加することによりクエンチした。停止後、分析のためプレートを密閉し−８０°Ｃにて凍結させた。
【０２９１】
デメチラーゼアッセイのためのハイスループット質量分析（ＨＴ−ＭＳ）分析
【０２９２】
全ての反応を、Ａｇｉｌｅｎｔ（以前はＢｉｏＣｉｕｓ  Ｉｎｃ）により開発されたＲａｐｉｄＦｉｒｅＴＭ  ＨＴ−ＭＳプラットフォームにより読み取り、詳細に記述した（Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００４；２（４）：３７３−３８１）。
【０２９３】
手短に言えば、プレートを解凍し、トリプル四重極質量分析計Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００に繋げたＲａｐｉｄＦｉｒｅＴＭシステムを使用して、直ちに分析した。サンプルをプレートからクリーンアップカートリッジ（ＡｇｉｌｅｎｔカラムＡ）に直接送達し、０．１％ギ酸を用いて、３秒の洗浄サイクルで不揮発性アッセイ成分を除去した。ペプチド基質及び脱メチル化生成物を、８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸で質量分析計に共溶出した。
【０２９４】
基質及び生成物のシグナルの両方を＋５の電荷種で読み取り、基質から生成物への転換率を評価した。
【０２９５】
ＪＡＲＩＤ細胞アッセイ（全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３電荷の測定）
【０２９６】
細胞を、９６ウェルイメージングプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  番号３５３２１９）中の１０％ＤＭＥＭに配置した。約２４時間後、培地を０％  ＤＭＥＭに変更し、化合物を０％  ＤＭＥＭに適切に添加した。化合物添加の２４時間後に、細胞を１０分間室温にて４％  ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳにて１回洗浄して−２０℃にて１０分間、氷冷したメタノールを添加した。次いで細胞を洗浄し、ＰＢＳを添加した。染色するまでプレートを４℃にて保持した。
【０２９７】
細胞を、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ溶液、５％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中の０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、滅菌フィルター）で３０分間室温にてブロックし、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３染色のために染色した。次いで一次抗体混合物（ウサギ抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（細胞シグナル伝達番号９７５１）１：２００、及び／またはマウス抗全ヒストン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＭＡＢ３４２２）１：３００とのブロッキング溶液）を室温にて４５分間添加した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、続いて暗部にて室温で４５分間、二次抗体混合物（ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号Ａ１１０３４）１：５００、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号Ａ１１０３２）１：５００、及び／またはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号Ｈ３５７０）１：４０００のブロッキング溶液）を添加した。その後細胞をＰＢＳで洗浄し、イメージングするまでＰＢＳ（Ｄ１００）中に４℃で保存した。細胞のイメージをＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで入手した。
【０２９８】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ＭＳＤ
【０２９９】
細胞をＰＢＳで洗い流し、ＭＳＤ緩衝液ＡＴ（ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｐＨ７．９、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、スクロース  ０．２５Ｍ、ベンゾナーゼ（１：１００００）、新鮮な１倍の蛋白質分解酵素抑制剤カクテル及び１ｍＭのＰＭＳＦ／ＡＥＢＳＦを補充した１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加した。
【０３００】
細胞を３０分間溶解させ、次いで５ＭのＮａＣｌ  １０μＬを添加し、更に１５分間氷上で溶解させた。溶解物を、氷冷した、塩及び２０ｍＭの洗剤非含有緩衝液（トリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、新鮮な１倍の蛋白質分解酵素抑制剤カクテル及び１ｍＭのＰＭＳＦを補充）１５０μＬで洗浄した。
【０３０１】
ＭＳＤプレート（カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３）を次いで、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３：２μｇ／ｍＬの最終濃度に対して、及び／またはＨ３のプレート試験用にＨ３：１μｇ／ｍＬの最終濃度に対して、捕捉抗体抗ヒストン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＡＢ３４２２）でコーティングした。ＭＳＤプレートを次いで５％ブロッカーＡ（ＭＳＤカタログ番号Ｒ９３  ＡＡ−２）でブロックした。ＭＳＤプレートの溶解物を次いで移して密閉し、２：３０時間室温にて振盪しながらインキュベーションし、その後、ＴＢＳＴの１％ブロッカーＡ中の検出抗体（抗ヒストンＨ３（番号４４９９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）０．１２５μｇ／ｍＬ、及び／または抗Ｋ４Ｍｅ３（番号９７５１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）１μｇ／ｍＬ）により３０分間インキュベーションした。ＴＢＳＴの１％ブロッカーＡ中のスルホタグウサギ抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｒ３２ＡＢ−１）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。抗Ｋ４Ｍｅ３（＃９７５１）を１μｇ／ｍＬで、かつ抗ヒストンＨ３（＃４４９９）を０．５μｇ／ｍＬで使用した。１倍のＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤカタログ番号Ｒ９２ＴＤ−３）を添加し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００で読み取った。０％または最小限のＤＭＳＯで処理したサンプルを用いる、提供されたマクロテンプレートを使用して、データを分析した。対応するヒストンＨ３レベルに対応する各ウェル中のメチル標識レベルの割合を計算すること、並びにそれを換算及び平均することにより、全ヒストンＨ３に対してデータの換算もした。
【０３０２】
結果
【０３０３】
ＫＤＭ５は、Ｈ３のリジン４からトリメチル及びジメチル標識を除去可能なデメチラーゼである。ＫＤＭ５はＪＡＲＩＤ１としても知られ、かつヒトにおけるデメチラーゼのＫＤＭ５／ＪＡＲＩＤ１ファミリーは４つのメンバー、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、及びＫＤＭ５Ｄを含む。図１に示すように、ＫＤＭ５ファミリーメンバーは５つの保存ドメインを含む：ＪｍｊＮ、ＡＲＩＤ、ＪｍｊＣ、ＰＨＤ、及びＣ５ＨＣ２ジンクフィンガー。
【０３０４】
図２Ａに示すように、ＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂは共に、親ＰＣ９細胞と比較してヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９薬剤耐性生残生物（ＤＴＰ）中で上方制御された。更に、図２Ｂに示すように、ＫＤＭ５Ａ  ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、未処置の肺腺癌患者と比較して、ネオアジュバント肺腺癌患者のサンプル内で高まっている。図２Ｃ〜Ｄに示すように、ＫＤＭ５Ａ及びＫＤＭ５Ｂの発現レベルの変化に一致して、ウェスタンブロッティング及びＭＳＤ  ＥＬＩＳＡの両方により、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ２はＰＣ９親細胞と比較してＰＣ９  ＤＴＰ内で減少している。
【０３０５】
薬剤耐性確立のためにＫＤＭ５Ａデメチラーゼ活性が必要であることを確認するために、３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５Ａショートヘアピンの発現は、ＰＣ９薬剤耐性細胞を除去することが示された。３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５ＡショートヘアピンによるＰＣ９薬剤耐性細胞の除去は、Ｆｌａｇをタグ付したＫＤＭ５Ａ野生型の共発現により救出されたが、ＫＤＭ５Ａデメチラーゼ触媒不活性変異体は、３’−ＵＴＲ−ＧＦＰノックダウンのＫＤＭ５ＡショートヘアピンによるＰＣ９薬剤耐性細胞の除去を救出することができなかった。図３Ｂ〜Ｃを見ると、これらの実験は、野生型ＫＤＭ５Ａが存在しない限り、薬剤耐性細胞は内因性遺伝子のノックダウンを欠失することを示した。
【０３０６】
図４に示す、かつ上述の低分子ＫＤＭ５拮抗剤はＨ３Ｋ４の脱メチル化を阻害することが可能であり、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の蓄積が、ウェスタンブロッティング、ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ、及び質量分析により観察された。図４Ｂ〜Ｃ、図５Ａ〜Ｂ、図１０、及び図示さないデータを参照のこと。ＣＰＩ−４５５及びＰＣＩ−７６６を含むこれらの低分子ＫＤＭ５拮抗剤は、図６Ａ〜Ｄに示すように、ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡにより、複数の試験モデルであるＰＣ９（ＮＳＣＬＣ）、ＳＫＢＲ３（乳癌）、Ｈ４４１（ＮＳＣＬＣ）、及びＨ５９６（肺上皮腺扁平上皮癌）中においてＨ３Ｋ４ｍｅ３を増大させた。図７Ａ〜Ｂに示すように、活性低分子ＫＤＭ５拮抗剤のＣＰＩ−４５５及びＣＰＩ−７６６は、９６時間後に測定した際、ＰＣ９細胞中の５０μＭ以下の濃度、及びＳＫＢＲ３中の２５μＭ以下の濃度の薬物中で単独では細胞数に実質的に影響を及ぼさなかった。
【０３０７】
しかし、これらの濃度での低分子ＫＤＭ５拮抗剤は癌治療薬と組み合わせた際、薬剤耐性を阻害することが可能であった。図８及び図示しないデータに示すように、引用した癌治療薬と組み合わせた、ＣＰＩ−４５５及びＣＰＩ−７６６を含む活性低分子ＫＤＭ５拮抗剤は、ＰＣ９、ＳＫＢＲ３、ＨＣＣ１９５４（乳癌）、及びＨ４４１細胞株中の薬剤耐性生残生物の成長を阻害することができた。全ての場合において、ＫＤＭ５阻害剤は親集団の増殖または生残に影響を与えなかった。
【０３０８】
同様に、活性低分子ＫＤＭ５拮抗剤を使用することで、エルロチニブと組み合わせたＣＰＩ−３８２はＰＣ９細胞内の薬剤耐性生残生物の成長を低減させることが可能であったが、一方で不活性対照分子ＣＰＩ−３８３は有意な効果をもたらさなかった（図１６を参照）。
【０３０９】
加えて、図１１及び図示しないデータに示す放射線治療との関係において、放射線治療と組み合わせた、ＣＰＩ−４５５及びＣＰＩ−７６６を含む活性低分子ＫＤＭ５拮抗剤は薬剤耐性生残生物の成長を阻害することができた。
【０３１０】
これらの実験は、ウェスタンブロッティング、ＭＳＤアッセイ、及び質量分析により測定したように、活性ＫＤＭ５阻害剤はＨ３Ｋ４ｍｅ３中での薬物依存性増大を示したことを表している。
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【０３１１】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡスクリーニング法
【０３１２】
０．０６２５ｕＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  １トランスフェクション脂質（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｔ−２００１）、及び最終濃度が１２．５ｎＭの単一ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＧＥＮＯＭＥ）を使用して、黒色９６ウェルの底が透明なプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６０３）中で、ウェルあたり１０００個の細胞で、細胞をリバーストランスフェクションした。その後細胞を４８〜７２時間トランスフェクトした後、トランスフェクション培地を、培地中の関係する１μＭの薬物療法、または培地のみのいずれかと交換した。７２時間のインキュベーションの後、薬物を含む／含まない培地を新鮮な培地と交換し、関係する薬物療法後に生存した、薬剤耐性のある生残生物（ＤＴＰ）の回復（回復フェーズ）を可能にした。３日間の回復フェーズの後、ＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、メーカーのプロトコールに従って最終的な細胞生存度を測定した。ＣｙＱｕａｎｔ蛍光シグナルを、ＧＥ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（対物レンズ４倍）を使用して検出し、ＧＥ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｌｌｂｏｘ  １．９．１．を用いて開発した画像解析アルゴリズムを使用して、ウェルあたりの細胞数として定量化した。その後に、スクリーニングデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで処理した。Ｅｐｉ３００  ｓｉＲＮＡスクリーン全体を各細胞株上で二度、完全に独立した条件で実行した。以下のｓｉＲＮＡ配列を使用した。
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【０３１３】
結果：
【０３１４】
Ｈ１２９９  ＤＴＰ細胞を調製し、タキサン、パクリタキセルを薬物として使用し上述の通りスクリーニングした。図６に示すＫＤＭ５Ａ  ｓｉＲＮＡは実質的に、培地のみと比較してパクリタキセルの存在下においてＨ１２９９  ＤＴＰの生存能を低下させた。
【０３１５】
（実施例３）
ＤＴＰ形成におけるＫＤＭ５阻害剤の役割研究のための、黒色腫ＤＴＰモデルの使用
【０３１６】
黒色腫はそれほど一般的ではないが、死に関係する皮膚癌の大部分の原因となる、最も危険な皮膚癌の形態である。米国では、約１６万件の新たな黒色腫の事例が毎年診断され、そのうち半分以上が侵襲的黒色腫である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１４．Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；２０１４）。黒色腫治療における最近の進展の１つは、標的化学療法ベムラフェニブの使用によるものである（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６４：２５０７−２５１６）。
【０３１７】
この薬物は、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異体を有する癌の黒色腫患者においてのみ作用する。この変異体は黒色腫患者の約半分で発生し、薬物に対する初期応答は良好であるが、他の多くの作用物質と同様に、時間の経過とともに細胞が本療法への耐性を高め、治療に対して応答しなくなる。
【０３１８】
薬剤耐性のメカニズムを理解するために、黒色腫細胞株を使用した。
【０３１９】
野生型及びＶ６００Ｅ変異体の両方の、１８個の黒色腫細胞株をスクリーニングして、ベムラフェニブ感受性細胞株を同定した。変異体細胞株がベムラフェニブに対して感受性があることを、結果は示した。３個の異なる変異体細胞株（Ａ３７５、ＨＴ１４４及びＣｏｌｏ−８２９）を選択し、薬剤耐性生残生物（ＤＴＰ）を作製した。試験をした３つの細胞株のうち、Ｃｏｌｏ−８２９は一貫したＤＴＰ相を示し、細胞株を容易に処理することができた。したがって、この細胞株をＤＴＰ形成のモデルとして選択した。次に、セミ・ハイスループットでＤＴＰアッセイを実施するために、大規模なアッセイ開発を行った。本工程には、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏ）を用いて、各細胞からイメージ取得を補助する核（Ｎｕｃ−Ｒｅｄ）細胞中で構造的に赤色蛍光標識を発現するＣｏｌｏ−８２９細胞を作製すること、及び種々のプレートフォーマットを試験して、データ整合性を損なうことなく、最大数のウェルを有するプレートを選択することを含んだ。アッセイを開発して、ＫＤＭ５阻害剤を使用して実験を行い、これらのセル内でのＤＴＰ形成に対するＫＤＭ５阻害の任意の効果があるかどうかを測定した。結果ははっきりと、活性ＫＤＭ５阻害剤での前処理は、ベムラフェニブ治療にて形成したＤＴＰの数を著しく低下させたことを示した。
【０３２０】
結論として、Ｃｏｌｏ−８２９は、他のＤＴＰモデルに類似した発見を伴う、黒色腫細胞株中で形成したＤＴＰ形成を研究するための代表的なモデルシステムであり、ＫＤＭ５阻害剤は、この黒色腫モデルのＤＴＰ集団を無効にする重要な役割を果たす。
【０３２１】
材料及び方法
【０３２２】
１．ＤＴＰ確立のための黒色腫細胞株の選択
【０３２３】
目標の１つは、ベムラフェニブに対して感受性が高く、ＤＴＰ形成の影響を受けやすい細胞株を同定することであった。このために、インキュベーションの４日後に、８つの異なる用量のベムラフェニブによるＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ｒｅａｄｏｕｔを用いて、１８個で１組の黒色腫細胞株を標準細胞生存アッセイにより試験した。
【０３２４】
結果は、６００ｎＭ以下のＧＩ５０を有する、３つの細胞株（Ａ３７５、Ｃｏｌｏ８２９及びＨＴ１４４）を同定した。これらの３つの細胞株は全て、ＢＲＡＦ変異体であった。これらの細胞株全ての実験後、ＤＴＰ確立のための好ましい細胞株として、Ｃｏｌｏ−８２９を選択した。
【０３２５】
方法
【０３２６】
化合物：ベムラフェニブを使用した（Ｐｌｘ−４０３２、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
【０３２７】
１．１  ベムラフェニブに対して感受性のある黒色腫細胞株の同定
【０３２８】
０日目：９６ウェル平底プレート内に、１０００細胞／ウェルを総体積１００μＬで配置した。
【０３２９】
１日目：細胞をベムラフェニブで処理した。アッセイ中の最高濃度は２０μＭであり、３倍に希釈し、最低濃度を９ｎＭとした。
【０３３０】
５日目：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  １００μＬを各ウェルに添加し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎ上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、データをプロットした。
【０３３１】
１．２  黒色腫細胞株内でのＤＴＰの確立
【０３３２】
０日目：４プレート／細胞株で、細胞（４．５×１０６細胞／Ｐ１５０ディッシュ）を配置した。
【０３３３】
２日目：全ての細胞株は、６０〜８０％コンフルエンスであった。２つのプレートでは、各細胞株を２０μＭのベムラフェニブで処理し、残りの２つのプレートをＤＭＳＯで処理した（対照）。
【０３３４】
５日目：培地を変更した。処理したＤＭＳＯ中の細胞はコンフルエントであった。これらのプレート中の細胞を数え、８分の１の数を新たな２つのＰ１５０ディッシュに再配置した。
【０３３５】
他のプレート全てをベムラフェニブで処理した。
【０３３６】
８日目：培地を変更した：プレートをそれぞれ、ベムラフェニブまたはＤＭＳＯで処理した。
【０３３７】
１１日目：細胞をＰＢＳ、及びトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎｉｓｅ）で洗浄した。細胞を数え、ベムラフェニブ処理したディッシュに対して、対照ディッシュに残っている細胞の割合を同定した。ベムラフェニブ処理したディッシュに残る細胞を、薬剤耐性生残生物（ＤＴＰ）と呼んだ。
【０３３８】
２．セミ・ハイスループットフォーマットでのＤＴＰアッセイを実施するためのアッセイ開発
【０３３９】
２．１  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ陽性Ｃｏｌｏ−８２９細胞の調製
【０３４０】
材料：Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏ製のＣｅｌｌＰｌａｙｅｒＴＭ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（Ｌｅｎｔｉ、ＥＦ−１  ａｌｐｈａ、ｂｌｅｏ）。
【０３４１】
１０万個の細胞を６ウェルプレートに配置し、翌日、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄウイルスを、ＭＯＩ  １で添加した。その後、細胞を選択してゼオシン内に入れ、Ｎｕｃ−Ｒｅｄ細胞をゼオシン内で定期的に保持した。
【０３４２】
２．２  ６、１２、及び２４ウェルフォーマットでのＤＴＰ形成試験
【０３４３】
１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＮｕｃ−Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏ−８２９細胞をそれぞれ、６（３ｍＬ）、１２（２ｍＬ）、及び２４（１ｍＬ）ウェルプレートに配置した。２日後、ベムラフェニブ（２０μＭ）またはＤＭＳＯ（対照）を添加してウェルを複製し、前述の通りＤＴＰ形成アッセイを実施した。
【０３４４】
３．ＤＴＰアッセイでのＫＤＭ５阻害剤試験
【０３４５】
使用した化合物：ＣＰＩ−７６６（活性）及びＣＰＩ−５５０（不活性）
【０３４６】
０日目：２×１０６個のＣｏｌｏ−８２９細胞を１０ｃｍディッシュに配置した。
【０３４７】
１日目：細胞を２５μＭのＣＰＩ−７６６もしくはＣＰＩ−５５０、またはＤＭＳＯで処理した。
【０３４８】
３日目：これらのＫＤＭ５阻害剤前処理細胞を１２ウェルプレート上に４通り配置し（ウェル当たり２×１０５個の細胞、２ｍＬ体積）、それぞれＫＤＭ５阻害剤を添加した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅに配置し、データ収集を開始した。
【０３４９】
５日目：これらの細胞を新鮮なＫＤＭ５阻害剤で処理した。ウェルの半数を２０μＭのベムラフェニブで処理し、残りのウェルにＤＭＳＯを添加した。
【０３５０】
８日目及び１１日目：５日目の化合物を用いて、処理を繰り返した。
【０３５１】
１４日目：実験を完了した。
【０３５２】
（実施例４）
ＫＤＭ５阻害剤は結腸直腸癌細胞株の薬剤耐性をブロックする
【０３５３】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）への化学療法の標準的治療に対する耐性モデルを、相対的なＩＣ５０値（３３μＭの５−ＦＵ、及び６ηＭのＳＮ−３８）の比率で、ＣＲＣ細胞株ＳＷ４８０を５−フルオロウラシル及びイリノテカン活性代謝産物ＳＮ−３８を組み合わせて１６日間続けて処理することにより開発し、その後薬物を取り出した。細胞はこの処理期間中に漸次的に死亡する。残存するＤＴＰ細胞は、最初の細胞集団の約８％を構成し、大きく非分裂性のようである。薬物を取り出した後、細胞は更に数日間続けて死亡したが、その後増殖を再開し増加して、薬物の不存在下にて約２週間以内にＤＴＥＰコロニーを形成した。
【０３５４】
図１７に示すように、ＳＷ４８０細胞を２０μＭのＫＤＭ５阻害剤  ＣＰＩ−７６６で７日間前処理した後、化学療法治療では、１６日目にてアッセイしたＤＴＰ細胞生残において２．９倍の減少となった。さらに、１６日目での生残細胞は結局、この日に薬物を取り出した後全て死亡し、決してコロニーを形成しなかったため、ＫＤＭ５阻害剤は完全にＤＴＰ細胞の増加を阻害する。この濃度のＣＰＩ−７６６は化学療法の不存在下で、少なくとも治療後の２７日は、親ＳＷ４８０細胞株の細胞生残または増殖に検出可能な影響を及ぼさない。２０μＭの不活性類似体ＣＰＩ−５５０はＤＴＰ生残に影響を与えず、また、試験を行った他のクロマチン制御因子（例えば０．２μＭの５−アザシチジン及び２０ｎＭのトリコスタチンＡ）の阻害剤もまた、影響を与えない。
【０３５５】
これらの結果は、ＫＤＭ５活性は特に、化学療法での治療中、及び薬物取り出し後のこれらの細胞の増加に対して、ＳＷ４８０細胞のＤＴＰ集団の生残に必要であることを示唆する。
【０３５６】
前述の発明が実例として、かつ理解を明瞭にする目的のための実施例として、幾つか詳細に記載されてはいるが、これらの説明及び実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用した全ての特許及び科学文献の開示は、それら全体を参照として明示的に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2016520528.tif 000028
【図１３】
2016520528.tif 000029
【図１４】
2016520528.tif 000030
【図１５】
2016520528.tif 000031
【図１６】
2016520528.tif 000032
【図１７】
2016520528.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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