(57)【要約】本発明は、単核を阻害して、T細胞活性化を誘発することにおいて培養幹細胞と生物学的製剤の効力を定量化するための、迅速な、半自動化全血アッセイに関する。そのようなアッセイによって、個々の患者のための治療用幹細胞製品の抗炎症効力の定量化が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血免疫効力アッセイであって、
（１）ヘパリン化チューブに患者から血液サンプルを加えるステップと、
（２）培地で前記血液サンプルを１／５と１／２０の間で希釈し、次いで前記血液サンプルにＬＰＳ、ブレフェルディンＡを加えるステップと、
（３）前記ヘパリン化チューブ中の処理した前記血液サンプル中の細胞上の表面分子に対する抗体の混合物を加えるステップと、
（４）ホルムアルデヒドを加えて、室温でインキュベートするステップと、
（５）遠心分離によって前記細胞を濃縮するステップと、
（６）上清を捨てて、ペレットにサポニンを加えるステップと、
（７）ＰＥ標識抗体を、透過性を付与した前記細胞に加えるステップと、
（８）前記細胞を濃縮するステップと、
（９）フローサイトメトリーによって前記細胞を分析するステップを含む全血免疫効力アッセイ。
【請求項２】
ステップ（２）において前記血液サンプルが１／１０で希釈される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ＬＰＳが０．５と２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で加えられる、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ＬＰＳが２ｎｇ／ｍＬの濃度で、濃度を加えられる、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
ブレフェルディンＡが０．７５と３．１μｇ／ｍＬの間の濃度で加えられる、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ブレフェルディンＡが０．６μｇ／ｍＬの濃度で加えられる、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
ステップ（２）において前記血液サンプルが１／１０で希釈される、請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
ホルムアルデヒドの追加に続いて、前記血液サンプルが室温で暗所にて約１０分間インキュベートされる、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
ステップ（７）において前記ＰＥ標識抗体がおそらくＴＮＦ−αＰＥまたはＩＬ−１２−ＰＥから選択される、請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１０】
ステップ（７）でのインキュベーションに続いて、前記細胞が４００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えることによって洗浄され、次いで前記細胞が遠心分離によって濃縮される、請求項１〜９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１１】
単球またはＴ細胞上の表面分子に対する前記蛍光標識抗体がＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３およびＣＤ８から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
新規の免疫抑制化合物を特定する方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって、試験化合物を分析することを含む方法。
【請求項１３】
実施例または添付の図面を参照して、本明細書に実質的に記述される請求項１〜１２のいずれかに記載の全血免疫効力アッセイ。
【請求項１４】
実施例または添付の図面を参照して、本明細書に実質的に記述される新規の免疫抑制化合物を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単核を阻害して、T細胞活性化を誘発することにおいて培養幹細胞と生物学的製剤の効力を定量化するための、迅速な、半自動化全血アッセイに関する。そのようなアッセイによって、個々の患者のための治療用幹細胞製品の抗炎症効力の定量化が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞生物学は、胃腸疾患、免疫疾患および心臓疾患を含む広範囲にわたる疾患標的のための臨床と商業的な活動領域に進展してきた。培養幹細胞の直ちに適用できる治療特性は接触依存性および可溶性メディエーターを介して、その細胞のまわりの細胞挙動を調節する培養幹細胞の能力であることは、今や明白である。このパラクリン、または「栄養」作用は、心筋梗塞、虚血肢、皮膚潰瘍、骨関節症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症および関節リウマチなどの一般的な炎症状態および自己免疫性状態を治療するために、培養幹細胞生成物の使用のための基礎を形成する、強力な抗炎症性特性および免疫抑制特性を含む。間葉系幹（または間質）細胞（ＭＳＣ）は、トランスレーショナル研究者および医療企業にとって主要な焦点であった。この優先傾向は、ＭＳＣが種々の利用可能な組織（骨髄、脂肪、胎盤、臍帯、歯肉）から培養でき、大量培養への拡張に適しており、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗炎症性効果を媒介することを確信して示してきたという事実から生じている。
【０００３】
幹細胞部門における商業的開発は、過去６年で劇的に増加し、治療用幹細胞、特に、在庫があってすぐに入手可能な培養拡張ＭＳＣは、いまや、有効性において著しい可変性の可能性がある商品を代表している。さらに、効力／有効性アッセイの必要性は、ほぼ間違いなく幹細胞治療用製品の承認の必要性になる。これは、単核およびＴ細胞抑制のための培養拡張したヒトＭＳＣの効力が組織原基、ドナーと継代数に依存し、および個々の被検体によって変化するからである。このように、医療供給者が幹細胞治療に関して最大のリスクベネフィットバランスを有する患者を選択する、ならびに各患者に対して最適製品を選択する明確な必要性が存在する。
【０００４】
単核は、骨髄中の骨髄単球性幹細胞から発達する。単球は血液に入り、数日間循環し、次いで組織内に移動する。組織において、単球はさらにマクロファージに成熟する。単核は、炎症性反応において重要な役割を果たしている。単球は、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１１（ｂとｃ）およびＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である。
【０００５】
Ｔ細胞は、免疫応答において大きな役割を果たす、リンパ球の一部であり、かつ適応免疫のコアにある。Ｔ細胞は、炎症が組織破壊と関連している疾患において有害になり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲ  ＣＤ４５ＲＡ（ナイーブ）およびＣＤ４５Ｒｏ（記憶）に対して陽性である。
【０００６】
炎症性疾患および免疫介在性疾患のためのＭＳＣの治療特性は、単核／マクロファージおよびＴ細胞活性化に対するそれらの調節効果と関連している。そのような疾患において、最もよく報告された抗炎症効果は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）などの抗炎症性サイトカインを産生する単球／マクロファージの「再プログラム化」と、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）およびインターロイキン１７（ＩＬ−１７）などの炎症誘発性サイトカインの産生に関与しているＴ細胞サブセットの活性化の抑制とがある。それらから利するところが最も高そうな患者に個々のＭＳＣ製品を合わせる良好な技法は、生み出されていない。個々の患者 への治療を最適化する（個別化医療」と呼ばれることが多い、医療へのアプローチの一つ）必要性が明らかに存在する。
【０００７】
Ｊｉａｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１１，６７７，２２１−３１は、ＩＬ−１０に基づくＭＳＣ−ＣＭおよびＭＳＣ−Ｌｙの効力に関するアッセイを記述している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、本発明の一目的は、自動化、フローサイトメトリーを用いた、ＭＳＣ抗炎症効力についてのヒト全血アッセイを開発することである。さらなる目的は、約２４時間以内に効力を発することができるＭＳＣ抗炎症効力についてのアッセイを開発することである。また、このアッセイは信頼性が高くなければならない。そのようなアッセイは、有望なレシピエントの血球を採取し、ポテンシャルドナー同種ＭＳＣのどのバッチが、患者の単核およびＴ細胞を阻害することにおいて最も強力かを判定する。
【０００９】
このように、本発明のさらなる目的は、刺激されたヒト単球のＭＳＣ再プログラム化を定量化するためのアッセイを開発することである。別の目的は、ヒトＴ細胞活性化のＭＳＣ抑制を定量化するためのアッセイを開発することである。特に、ヒト骨髄間葉系間質細胞（ｈＢＭ  ＭＳＣ）の効力を判定するためのアッセイを提供することが目的の一つである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、免疫調節化合物を特定するために用いることができるアッセイを提供することである。これは、化合物を９６ウェルプレートに滴定し、化合物の段階的な量での存在下で血液活性化を行い、次いでどの化合物が血球に対して免疫調節効果があるかを判定することによって行うことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、以下を含む全血免疫効力アッセイが提供される。
（１）ヘパリン化チューブに患者から血液サンプルを採取するステップと、
（２）培地で血液サンプルを１／５と１／２０の間で希釈し、次いで該血液サンプルにＬＰＳ、ブレフェルディンＡを加えるステップと、
（３）ヘパリン化チューブ中の処理した血液サンプル中の細胞上の表面分子に対する抗体の混合物を加えるステップと、
（４）ホルムアルデヒドを加えて、室温でインキュベートするステップと、
（５）遠心分離によって細胞を濃縮するステップと、
（６）上清を捨てて、ペレットにサポニンを加えるステップと、
（７）ＰＥ標識抗体を、透過性を付与した細胞に加えるステップと、
（８）細胞を濃縮するステップと、
（９）フローサイトメトリーによって細胞を分析するステップ。
【００１２】
好ましくは、ステップ（２）において血液サンプルは、１／１０で希釈される。ステップ（２）において処理した血液は、４時間と３６時間の間でインキュベートされてもよい。
【００１３】
ＬＰＳは、０．５と２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で加えることができ、２ｎｇ／ｍＬの濃度が好ましい。ブレフェルディンＡは、０．７５と３．１μｇ／ｍＬの間の濃度で加えることができ、０．６μｇ／ｍＬの濃度が好ましい。ステップ（３）において、血液サンプルは、暗所にて約１０分間インキュベートしてもよい。
【００１４】
ステップ（４）で用いるホルムアルデヒドは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ参照番号Ａ０７８０３からのＩｎｔｒａｐｒｅｐキットの一部である試薬１であってもよい。ホルムアルデヒドまたは試薬１の追加に続いて、血液サンプルは、室温で暗所にて約１０分間インキュベートしてもよい。ステップ（６）で用いられるサポニンは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ参照番号Ａ０７８０３からのＩｎｔｒａｐｒｅｐキットの一部である試薬２であってもよい。これは、細胞の透過性付与をもたらす。
【００１５】
ステップ（７）においてＰＥ標識抗体は、ＴＮＦ−αＰＥまたはＩＬ−１２−ＰＥであってもよい。細胞は、抗体とともに暗所にて約１０分間インキュベートしてもよい。
【００１６】
ステップ（７）でのインキュベーションに続いて、細胞は、４００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えることによって洗浄し、次いで細胞は遠心分離によって濃縮してよい。次いで、洗浄ステップを繰り返し、次いで細胞をＰＢＳに再懸濁させてよい。血液サンプルは、ＴＮＦ−αの判定の場合は６時間、ＩＬ−１２の判定の場合は２４時間、インキュベートしてよい。インキュベーション温度は、５％ＣＯ２下で、３７℃であってよい。
【００１７】
単核上の表面分子に対する蛍光標識抗体は、ＣＤ４５およびＣＤ１４から選択されてよい。Ｔ細胞を調べるために、ＣＤ３およびＣＤ８への抗体の組み合わせを用いてよい。
【００１８】
血液サンプルは、抗体とともに室温で暗所にて１０分間、インキュベートしてよい。試薬１とのインキュベーションは、室温で暗所にて１０分間であってよい。
【００１９】
ステップ（６）において細胞は、２０℃で、１５００ｒｐｍで、５分間遠心分離させてよい。細胞は、ＴＮＦ−αＰＥとともに、室温で暗所にて１５分間インキュベートしてよい。ステップ（９）において細胞の濃縮は、２０℃で、１５００ｒｐｍで、５分間であってよい。
【００２０】
フローサイトメトリーは、光散乱と蛍光シグナルの組み合わせによって単球の同定またはゲーティングを可能にし、ゲーティングされた単球上で細胞内ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１２が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＬＰＳの異なる用量で６時間刺激された、ヒト末梢血のゲーティングされた単球のＴＮＦαの細胞内染色を示す。これは、ＬＰＳ用量を0.5〜２０ｎｇ／ｍＬに増加すると、単球の大部分が細胞質内ＴＮＦαを発現し、約５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで最大に達したことを示す。
【図２】２ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで６時間、刺激した単球によるＴＮＦαの発現に対する、同種ＭＳＣの数を増やして添加する効果を示す。図に示すように、ＭＳＣ細胞には、ＴＮＦα発現の用量依存的抑制がある。
【図３Ａ】異なる血液ドナーについての異なるＭＳＣ供給源の異なる効力を示す。
【図３Ｂ】異なる血液ドナーについての異なるＭＳＣ供給源の異なる効力を示す。
【図３Ｃ】異なる血液ドナーについての異なるＭＳＣ供給源の異なる効力を示す。
【図３Ｄ】異なる血液ドナーについての異なるＭＳＣ供給源の異なる効力を示す。
【図４Ａ】異なる血液ドナーが異なるＭＳＣに対して異なって反応することを示す。
【図４Ｂ】異なる血液ドナーが異なるＭＳＣに対して異なって反応することを示す。
【図５】ＭＳＣ対単球の固定比率による平均効力が固定されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の自動化アッセイは、単球およびＴ細胞の両活性化についてのＭＳＣの免疫調節特性の定量化を可能にする。モニターした細胞の集団は、用いた蛍光標識モノクローナル抗体の組み合わせに依存する。採用したプロトコルは、完全に自動化した方法で動作することができるように開発されたものである。このため、最初の全血細胞培養は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式の１ｍＬ培養容器を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓロボットワークステーションで開始する。４時間の培養に続いて、細胞は、自動化９６ウェルプレートＣ６サンプル収集モジュールを固定したＢ−Ｄ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター上での染色および分析のために、第２の９６ウェルプレートに移す。この自動化アッセイ形式は、ＭＳＣによる実行に成功した。細胞を加えることによる単球またはＴ細胞の活性化への効果を調べることに加えて、このアッセイを用いて、可溶性化合物の免疫調節特性のスクリーニングを行うこともできる。
【００２３】
このアッセイは、迅速なターンアラウンド、自動化アッセイを行うために開発された。アッセイは、ロボットで実施されることができる。結果は、６時間以内に得られることができる。ＴＮＦα産生は、単核が放出する最も急速なサイトカインであり、約２４時間要するＩＬ−１０よりも速い。
【００２４】
本発明の方法では、ブレフェルディンＡは、グリコシル化を遮断して、サイトカインの分泌を阻止するために細胞に加えられるので、サイトカインは上清中に見つからない。そのような戦略の利点は、定義された亜集団の間でサイトカイン分泌細胞の頻度が直接定量化できるということである。
【００２５】
また、このアッセイを用いて、Ｔ細胞活性化を判定することができる。同様に、このアッセイは、自動化することができ、６時間のターンアラウンドで、ゲーティングされたＣＤ８＋Ｔ細胞によるγＩＦＮ産生を検査する。このように、本発明のアッセイを用いて、追加した細胞と生物活性化合物の単球およびＴ細胞に対する効果を調べることができる。
【実施例】
【００２６】
アッセイプロトコル
１．細胞の活性：
ヘパリン化チューブに血液を採取する。
血液を５０μＬ、ＬＰＳを１ｎｇ／ｍＬ、ブレフェルディンＡを０．６μｇ／ｍＬおよびＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０８８３）を加え、最終量を５００μＬにする。他の血液希釈の場合、加える血液量を変える。これは、血液５０μＬを５００μＬで最終希釈する、すなわち１／１０になる。他の希釈（例えば１：２０）は、例えば、血液量を２５μＬに減らすが、最終量を５００μＬのままにしておくことによって、行うことができる。
【００２７】
ＬＰＳ供給源：（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ＃ｔｌｒｌ−３ｐｅｌｐｓ）他の濃度：０．５、２、５、１０および２０（ｎｇ／ｍＬ）を試験した。
【００２８】
ブレフェルディンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃００−４５０６−５１）最終濃度０．６μｇ／ｍＬ。０．７５、ｌ．１２、１．５、２．２５および３．１（μｇ／ｍＬ）も試験した。
【００２９】
次いで、処理した血液を、３７℃で、５％ＣＯ２下で、ＴＮＦ−αの場合は６時間、ＩＬ−１２の場合は２４時間インキュベートする。４時間と８時間のインキュベーションも試験した。
【００３０】
２．細胞内染色（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩｎｔｒａＰｒｅｐキット＃Ａ０７８０３）
１）９６ディープウェルプレート中の処理した血液サンプルに、単球によって発現した表面分子に対する蛍光標識抗体の混合物を加える（ＣＤ４５  ＰｅｒＣｐＣｙ５．５  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃４５−９４５９−４２およびＣＤ１４ＡＰＣ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−０１４９−４２）。  
２）室温で暗所にて１０分間、インキュベートする。
３）試薬１を６０μＬ加える。室温で暗所にて１０分間、インキュベートする。
４）ＰＢＳ  １Ｘを３００μＬ加え、細胞を２０℃で、１５００ｒｐｍで、５分間、濃縮する。
５）上清を捨てる。
６）試薬２を５０μＬ加える。
７）希釈した（通常は、約１／１００最終濃度。正確な希釈は抗体のバッチによって決まる）ＴＮＦ−αＰＥ（カタログ１２−７３４９  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加える。ＩＬ−１２−ＰＥ抗体（カタログ１２−７２３５  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）との２４時間のインキュベーション後、ＩＬ−１２が検出される。室温で暗所にて１５分間、インキュベートする。
８）ＰＢＳ  １Ｘを６００μＬ加え、細胞を２０℃で、１５００ｒｐｍで、５分間、濃縮する。
９）上清を捨てる。
１０）９００μＬのＰＢＳ  １Ｘで洗浄を繰り返す。
１１）ＦＡＣＳ緩衝液６０μＬに再懸濁させる。
１２）ＡＣＣＵＲＩフローサイトメーターでサンプルを得る。この機械は、血液などの複合混合物中の細胞の定義された亜集団上の光散乱および蛍光シグナルを測定する。フローサイトメトリーを使用することにより、単球またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞のゲーティングされた亜集団によるサイトカイン産生を定量化することが可能になる。
【００３１】
血液を抗凝固剤に溶解させることは、重要である。ヘパリンは、抗凝固剤として好ましい。クエン酸塩およびＥＤＴＡはカルシウムをキレート化するので、使用することができない。最適には、血液は１／１０で希釈することが必要である。我々は、１／２、１／５、１／１０、１／２０および１／３０の希釈範囲にわたって試験した。希釈が不十分な場合、試験は上手くいかない。希釈が多すぎると、分析するのに十分な細胞がない。
【００３２】
上手くいくＬＰＳ濃度範囲は、広い（０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ）。用量／反応曲線の指数部上にある約１ｎｇ／ｍＬを用いることによって、試験は、添加した細胞または可溶性化合物による阻害に反応する。ＬＰＳが多くなると、活性化を阻害するのがより難しくなる。
【００３３】
図３は、異なるＭＳＣ供給源が種々の血液ドナーに対して異なる効力を有するように思われることを示す。例えば、ＭＳＣＡは、血液１および２を阻害するが、血液３および４をそれほど阻害しない。このように、本発明のアッセイによって、患者がＭＳＣ治療に対してどのように反応するかを予測することができる。図４は、異なる血液ドナーが異なるＭＳＣに対して異なって作用し、そのためドナー２からの血液は、Ａ由来のＭＳＣによって阻害されるが、Ｂ、ＣおよびＤ由来のＭＳＣによってそれほど阻害されないことを示す。このように、本アッセイによって、各患者のための異なるＭＳＣドナーの効率を比較することができる。図５は、ＭＳＣ対単球の比率がＯｒｂｓｅｎから購入したＭＳＣの「効力」に基づいて固定された、測定される平均効力を示す。このグラフは、ｈＢＭ  ＭＳＣの存在下で、単球ＴＮＦ−αの発現が減少することを示す。
【００３４】
本発明を参照して、本明細書で用いる場合、語句「含む／含んでいる」および語句「有する／含んでいる」を用いて、記述した特徴、整数、ステップまたは成分の存在を特定するが、１または複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはその群の存在または追加を妨げない。
【００３５】
明確にするために、別々の実施形態と関連して記述されている本発明のいくつかの特徴は、単一の実施形態の組み合わせでも提供されることができると認識される。反対に、短縮して、単一の実施形態と関連して記述されている本発明の種々の特徴は別々に、または任意の適切な副組み合わせでも提供されることができる。
【図１】
2016522899.tif 000002
【図２】
2016522899.tif 000003
【図３Ａ】
2016522899.tif 000004
【図３Ｂ】
2016522899.tif 000005
【図３Ｃ】
2016522899.tif 000006
【図３Ｄ】
2016522899.tif 000007
【図４Ａ】
2016522899.tif 000008
【図４Ｂ】
2016522899.tif 000009
【図５】
2016522899.tif 000010
【国際調査報告】
2016522899.tif 000011
2016522899.tif 000012