(57)【要約】  患者がＴＮＦα阻害剤による治療に応答するかどうかを予測するインビトロ診断法を開示する。前記方法は、遺伝子発現プロファイルに基づく。開示する遺伝子の発現プロファイルを測定することによって、ＴＮＦα阻害剤による治療が有効であるか否かを予測することが可能である。
2016502400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者がＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性であるかどうかを予測するインビトロ方法であって、前記患者の生物学的サンプルにおいて、遺伝子ＡＢＣＣ４、ＡＩＤＡ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＢＭＰ６、ＢＴＮ３Ａ２、ＣＡ２、ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＮＤＯＤ１、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＭＮ１、ＧＣＬＣ、ＧＰＲ３４、ＨＯＲＡＭＤ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、ＭＭＤ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＭＳ４Ａ７、ＯＤＣ１、ＰＢＸ１、ＰＣＹＴ１Ｂ、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＲＤＭ１、ＰＳＭＥ４、ＲＡＤ２３Ａ、ＲＩＯＫ３、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＦ１１、ＳＬＣ７Ａ５、ＴＨＥＭ５、ＴＭＥＭ１７６Ａ、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、ＵＢＥ２Ｈ、ＷＡＲＳから、又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＱＰ９、ＣＣＬ４、ＣＮＴＮＡＰ３、ＣＹＰ４Ｆ３、ＤＨＲＳ９、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＥＬＯＶＬ７、ＥＰＳＴ１１、ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＰＡＭ、ＧＰＲ１５、ＧＺＭＢ、ＩＦＩ３５、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩ６、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＲＦ２、ＩＲＦ７、ＭＧＡＭ、ＭＩＣＡ、ＭＭＥ、ＭＸ１、ＯＲ２Ａ９Ｐ、ＰＦ４、ＰＴＧＳ２、ＲＡＶＥＲ２、ＲＦＣ１、ＲＧＳ１、ＲＳＡＤ２、Ｓ１００Ｐ、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ６から選ばれる少なくとも６個の遺伝子の発現レベルを測定することを含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２】
選択した遺伝子の相対発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子と比較して測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的サンプルにおいて、遺伝子ＥＬＯＶＬ７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＩＣＡ、ＯＲ２Ａ９Ｐ及びＲＡＶＥＲ２の発現レベル；又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴＭ１、ＭＩＣＡ及びＲＧＳ１の発現レベル；又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＤＨＲＳ９、ＩＦＩ３５、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＭＩＣＡ及びＲＦＣ１の発現レベルを測定する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
患者が関節リウマチ患者である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的サンプルにおいて、遺伝子ＢＭＰ６、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＯＤＣ１、ＲＮＦ１１及びＵＢＥ２Ｈの発現レベル；又は遺伝子ＡＲＨＧＥＦ１２、ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＧＣＬＣ、ＲＩＯＫ３及びＵＢＥ２Ｈの発現レベル；又は遺伝子ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＭＤ、ＯＤＣ１、ＲＮＦ１１及びＵＢＥ２Ｈの発現レベルを測定する請求項１又は２に記載方法。
【請求項６】
患者が炎症性腸疾患の患者である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＴＮＦα阻害剤が、抗−ＴＮＦα抗体、ＴＮＦ融合タンパク質又は組み換えＴＮＦ結合タンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＴＮＦα阻害剤が、アダリムマブ、セリトリズマブペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、又はペルスネルセプトである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
さらに、遺伝子の発現レベルを、患者の応答者群及び非応答者群から得られた基準値と比較する工程を含んでなる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
発現レベルを、生物学的サンプルにおける遺伝子のｍＲＮＡのレベルを定量することによって測定する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
さらに、バイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程を含んでなる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＴＮＦαに関連する疾患の治療に使用されるＴＮＦα阻害剤であって、治療される患者が、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって、ＴＮＦα阻害剤による治療に応答性であるとして分類されたものであるＴＮＦα阻害剤。
【請求項１３】
アダリムマブ、セリトリズマブペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、又はペルスネルセプトである請求項１２に記載のＴＮＦα阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断法の分野に属する。患者がＴＮＦα阻害剤による治療に応答するかどうかを予測する新規なインビトロ診断法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、炎症反応を促進するものであり、炎症反応は、それ自体、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、化膿性汗腺炎及び難治性喘息のような自己免疫疾患に伴う臨床的問題の多くの原因となる。これらの疾患は、しばしば、ＴＮＦ阻害剤を使用することによって治療される。
【０００３】
関節リュウマチ（ＲＡ）は、多くの組織及び器官に影響を及ぼすが、主に柔軟関節を攻撃する慢性の、全身性炎症性自己免疫疾患と考えられる。ＲＡは、痛みを伴う、しばしば機能抑止の状態であり、運動機能の低下を生じさせる。一方、クローン病は、口から肛門までの消化管の各種の部位に影響を及ぼして、広範な症状を呈する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の１種である。クローン病は、主に、腹痛、下痢、嘔吐又は体重低下の原因となるが、消化管の外部では合併症の原因にもなる。
【０００４】
上記疾患について現在利用できる治療法は、患者集団全体に基づくものである。その結果、公知の治療は、一部の患者にとっては、有効な治療法が特定される前に、効果がない治療の繰り返しを生ずることになる。このように、ＴＮＦαに関連する疾患（例えば、ＲＡ又はＩＢＤ）をより良好に治療し、個々の患者について効果的な治療の選択肢を特定するために、特定の個人向けに作られた医薬品についての要求が存在する。
【０００５】
ヨーロッパ特許第１，８５７，５５９号は、患者が、ＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性であるか否かを予測するインビトロ法を開示しており、該方法は、患者の生物学的サンプルにおける８個の遺伝子の発現レベルを測定することを含んでなり、前記遺伝子は、ＥＰＳ１５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＡＫＡＰ９、ＲＡＳＧＰ３、ＭＴＣＢＰ−１、ＰＴＮＰ１２、ＭＲＰＬ２２、及びＲＰＳ２８である。
【０００６】
国際特許出願公開第２０１１／０９７３０１号は、関節リウマチ（ＲＡ）に罹った患者のＴＮＦα阻害剤による治療に対する応答性を予測する方法を開示しており、該方法は、患者からのサンプルにおけるＨＬＡ−ＤＲＢ１共有エピトープ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１ ＳＥ）対立因子の存在を測定することを含んでなり、ＨＬＡ−ＤＲ Ｂ１ ＳＥ対立遺伝子の少なくとも１個のコピーの存在は、患者がＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性であろうということを示す。
【０００７】
国際特許出願公開第２０１１／０９７３０１号及びヨーロッパ特許第１，８５７，５５９号が、ＴＮＦα阻害剤による治療に対する応答性の予測法を開示するとの事実にもかかわらず、ＴＮＦα関連性疾患の患者が各種の治療選択肢に対して応答性であるか否かをより効果的にかつより正確に決定する方法についての要求がなお存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
２０１０年末までに、世界では、２，０００，０００人以上の患者が、中でも、関節リウマチ（ＲＡ）又はクローン病（ＣＤ）において、インフリシキマブ、アダリムマブ、エタネルセプトのような抗−ＴＮＡ−α阻害剤による治療を受けているが、これらの効力は異なる（Ｍ．Ｐ．Ｋａｒａｍｐｅｔｓｏｕら，ＱＪＭ（２０１０）１０３（１２）：９１７−９２８）。
【０００９】
慢性炎症疾患におけるモノクロナール抗体（ｍＡＢ）治療法の基本的な課題は、２つの最近の文献の結論として要約される。１）ＲＡ患者の有意の割合、約３０％は、生物学的治療に対して応答できない（Ｖａｎ Ｂａａｒｅｓｅｎら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，６２２−６２９）。２）自己免疫疾患における生物学的治療の使用に焦点を当てたいくつかの大規模な研究からの結果は、効力が低下し、続いて、第２のＴＮＦ阻害剤へ移行することを示している（Ｒｕｂｂｅｒｔ Ｒｏｔｈら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９）。
【００１０】
従って、患者が、第１又は第２の治療選択肢以前に、治療に対して応答性であるか否かを予測することは、臨床背景における未だ対処されていない要求であり、治療法を、より費用効果があるものとし、患者に、個別化された治療が受けられる機会を提供することにより、これらの治療の使用につい大きな影響を及ぼすであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法は、遺伝子セット（その組み合わせ発現プロフィールが、ＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性の者（又は応答者）と非応答性の者（又は非応答者）との区別を可能にする）を特定するために、バイオインフォマティクス系アルゴリズムを使用することに基づくものである。
【００１２】
具体的には、上述の課題を解決するため、発明者らは、患者がＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性であるか否かを予測するインビトロ法を開発した。該方法は、前記患者の生物学的サンプルにおいて、遺伝子ＡＢＣＣ４、ＡＩＤＡ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＢＭＰ６、ＢＴＮ３Ａ２、ＣＡ２、ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＮＤＯＤ１、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＭＮ１、ＧＣＬＣ、ＧＰＲ３４、ＨＯＲＭＡＤ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、ＭＭＤ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＭＳ４Ａ７、ＯＤＣ１、ＰＢＸ１、ＰＣＹＴ１Ｂ、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＲＤＭ１、ＰＳＭＥ４、ＲＡＤ２３Ａ、ＲＩＯＫ３、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＦ１１、ＳＬＣ７Ａ５、ＴＨＥＭ５、ＴＭＥＭ１７６Ａ、ＴＭＥＭ１７６Ｂ、ＵＢＥ２Ｈ、ＷＡＲＳから、又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＱＰ９、ＣＣＬ４、ＣＮＴＮＡＰ３、ＣＹＰ４Ｆ３、ＤＨＲＳ９、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＥＬＯＶＬ７、ＥＰＳＴ１１、ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＰＡＭ、ＧＰＲ１５、ＧＺＭＢ、ＩＦＩ３５、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩ６、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＲＦ２、ＩＲＦ７、ＭＧＡＭ、ＭＩＣＡ、ＭＭＥ、ＭＸ１、ＯＲ２Ａ９Ｐ、ＰＦ４、ＰＴＧＳ２、ＲＡＶＥＲ２、ＲＦＣ１、ＲＧＳ１、ＲＳＡＤ２、Ｓ１００Ｐ、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ６から選ばれる少なくとも６個の遺伝子の発現レベルを測定することを含んでなる。好適な具体例によれば、ハウスキーピング遺伝子に対する選択した遺伝子の相対的な発現レベルを測定する。好ましくは、前記ハウスキーピング遺伝子は、シクロフィリンであり、さらに好ましくは、シクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）である。好ましくは、前記生物学的サンプルは末梢血であり、さらに好ましくは、発現レベルを末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において測定する。
【００１３】
本発明の第１の好適な具体例によれば、遺伝子ＥＬＯＶＬ７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＩＣＡ、ＯＲ２Ａ９Ｐ及びＲＡＶＥＲ２の発現レベル；又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴＭ１、ＭＩＣＡ及びＲＧＳ１の発現レベル；又は遺伝子ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＤＨＲＳ９、ＩＦＩ３５、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＭＩＣＡ及びＲＦＣ１の発現レベルを、生物学的サンプルにおいて、好ましくは関節リウマチの患者において測定する。
【００１４】
本発明の第２の好適な具体例によれば、遺伝子ＢＭＰ６、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＯＤＣ１、ＲＮＦ１１及びＵＢＥ２Ｈの発現レベル；又は遺伝子ＡＲＨＧＥＦ１２、ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＧＣＬＣ、ＲＩＯＫ３及びＵＢＥ２Ｈの発現レベル；又は遺伝子ＣＡＤＭ２、ＣＤ３００Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＭＤ、ＯＤＣ１、ＲＮＦ１１及びＵＢＥ２Ｈの発現レベルを、生物学的サンプルにおいて、好ましくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病の患者において測定する。
【００１５】
本発明の第３の好適な具体例によれば、本発明の方法は、ＴＮＦα阻害剤による前記治療の効力を追及するために実施される。
【００１６】
本発明の好適な具体例によれば、前記ＴＮＦα阻害剤は、抗−ＴＮＦα抗体、ＴＮＦ融合タンパク質、又は組み換えＴＮＦ結合タンパク質であり、より好ましくは、前記ＴＮＦα阻害剤は、アダリムマブ、セリトリズマブペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ペルスネルセプト、又はその各種のバイオシミラーであり、さらに好ましくは、前記ＴＮＦα阻害剤は、インフリキシマブ又はその各種のバイオシミラーである。
【００１７】
他の態様では、本発明の方法は、さらに、上記遺伝子の発現レベルを、応答者群及び非応答者群から得られた基準値と比較する工程を含んでなる。
【００１８】
好ましくは、本発明の方法では、生物学的サンプルにおける前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを定量することによって、発現レベルを測定する。前記遺伝子の発現レベルを測定することに関して、ＤＮＡチップ技術及び逆転写酵素定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＱＰＣＲ）は特に有用である。
【００１９】
本発明の他の好適な具体例によれば、方法は、さらに、バイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程を含んでなる。好ましくは、前記バイオマーカータンパク質は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、又は抗−薬物抗体である。
【００２０】
さらに、本発明は、ＴＮＦα関連疾患の治療（治療を受ける患者は、本発明の方法によって、ＴＮＦα阻害剤による治療に対して応答性であると分類された者である）において使用されるＴＮＦα阻害剤に関するものであり、好ましくは、前記ＴＮＦα阻害剤は、アダリムマブ、セリトリズマブペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、又はペルスネルセプトである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の研究のタイムライン及びデザインを示す図である。
【図２】自動遺伝子パネル作製の概略経路を示す図である。
【図３】関節リウマチ（ＲＡ）患者群の治療前後における顕著に変化する遺伝子の正規化ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ＡＱＰ９に関するｐ値：：０．０２、ＴＮＦＡＩＰ６：０．０２８、ＩＧＪ：０．０１２）。データは、マイクロアレイ測定に基づいて算定したものである。
【図４】ＲＡにおける非応答者（ＮＲ）対応答者（Ｒ）について、統計学的に有意に変化すると認められる４個の遺伝子の正規化ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図５】クローン病（ＣＤ）患者群の治療前後における有意に変化する遺伝子の正規化ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ＭＭＰ８に関するｐ値：０．０１８、ＡＱＰ９：０．０１１、ＩＧＫＣ：０．００１、ＴＮＦＡＩＰ６：０．００５、ＭＧＡＭ：０．０１１）。データは、マイクロアレイ測定に基づいて算定したものである。
【図６】ＣＤにおけるＮＲ対Ｒについて、統計学的に有意に変化すると認められる４つの遺伝子の正規化ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図７】関節リウマチ（ＲＡ）において線形判別分析（ＬＤＡ）によってスコア化した３つの遺伝子リストを示す図である。左側のバーは非応答者を表し、右側のバーは応答者を表す。群間の差異が大きければ大きいほど及びサンプル間のオーバーラップが小さければ小さいほど、遺伝子リストの分離力は大きい。各遺伝子パネルについて、マイクロアレイ実験からの遺伝子パネル（テストコーホート）は左側であり、ＲＴ−ＱＰＣＲからの遺伝子パネル（検証コーホート）は右側であり、マイクロアレイデータに基づくネガティブコントロールとして役立つ最高のｐ値を持つ遺伝子リストは右側である。
【図８】クローン病（ＣＤ）において線形判別分析（ＬＤＡ）によってスコア化した３つの遺伝子リストを示す図である。左側のバーは非応答者を表し、右側のバーは応答者を表す。群間の差異が大きければ大きいほど及びサンプル間のオーバーラップが小さければ小さいほど、遺伝子リストの分離力は大きい。各遺伝子パネルについて、マイクロアレイ実験からの遺伝子パネル（テストコーホート）は左側であり、ＲＴ−ＱＰＣＲからの遺伝子パネル（検証コーホート）は右側であり、マイクロアレイデータに基づくネガティブコントロールとして役立つ最高のｐ値を持つ遺伝子リストは右側である。
【図９】ＲＡにおいて、各々の遺伝子パネルにおける遺伝子の数と、テスト又は検証コーホートのいずれかにおける前記遺伝子パネルについて算定した最小Ｆ値との間の相関を示す図である。
【図１０】ＣＤにおいて、各々の遺伝子パネルにおける遺伝子の数と、テスト又は検証コーホートのいずれかにおける前記遺伝子パネルについて算定した最小Ｆ値との間の相関を示す図である。
【図１１】ＣＤにおいてＥＬＩＳＡによって測定した（テストコーホート）ＩＦＮγのレベルを示す図である
【図１２】ＣＤにおいてＥＬＩＳＡによって測定した（テストコーホート）ＩＬ−６のレベルを示す図である
【図１３】ＲＡにおいて有意差を示す血清サイトカインの散布図である（テストコーホート）。
【図１４】テストコーホートからベースラインＲＡサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって測定したＴＮＦαのレベルを示す図である。
【図１５】テストコーホートから週２ＲＡサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって測定したＴＮＦαのレベルを示す図である。
【図１６】テストコーホートからのベースラインサンプル及び週２ＲＡサンプルにおいてＥＬＡＩＳＡによって測定したＴＮＦαのレベルを示す図である。
【図１７】ＲＡ患者における週２及び１４でＥＬＩＳＡによって測定したインフリキシマブのレベルを示す図である。
【図１８】ＥＬＩＳＡによって測定した（テストコーホート）ＣＤ患者における週２でのインフリキシマブのレベルを示す図である。
【図１９】ＥＬＩＳＡによって測定した（テストコーホート）ＡＲ患者における週２でのインフリキシマブのレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
末梢血においてプロファイルする網羅的遺伝子発現は、自己免疫疾患の病因背景を説明すること及び疾患を層別化することにおける立証された技術である。末梢血は、細胞を含む生物学的物質の入手し易い源であり、スクリーニングプロセスのために使用することに関して明白な利点を有する。さらに、循環する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は炎症のキー細胞であるため、いくつかの研究グループが、マイクロアレイ実験においてＰＢＭＣｓを検討している。循環する単球、Ｔ細胞及びＢ細胞における遺伝子発現パターンは、疾患のメカニズムを反映するが、それは、必ずしも、薬理ゲノミクスマーカーを、治療法又は疾患の進行を対する応答性を予測する遺伝子パネルに基づく多重遺伝子診断テストにまで拡張するチャレンジであることを意味しない。ＰＢＭＣの遺伝子発現プロファイリングは、バイオプシー又は他の侵襲的な方法に代わる、より安価でかつより侵襲性の少ない代替法を提供する。しかし、現在まで、特殊な治療法に注目した各種の自己免疫疾患の遺伝子発現パターンの比較は行われていない。
【００２３】
治療に対する応答性を予測するバイオマーカー又は組み合わせバイオマーカーセットは、現在では、治療の特異性を改善するために一般的に使用されている。最も侵襲性の少ない末梢血サンプリングを使用することは、明白な利点も有する。制限として、サンプルの実験室的プロセスに関するサンプリングの困難性があるが、サンプルの異質性を最少にするためには、サンプルを集める臨床医及びサンプルを加工する研究者の両者が厳格なガイドラインに従う必要がある。
【００２４】
本発明者らは、テスト患者コーホートにおける網羅的末梢血遺伝子発現プロファイリングによって、最も分離力がある遺伝子パネルを決定し、独立した患者のコーホートについての結果を確認した。
【００２５】
要するに、本発明の方法は、１態様では、次のように要約される：すなわち、ＲＡ又はＣＤ患者から末梢血を採取し、任意に、ＰＢＭＣ’ｓを分離する。末梢血又は単離したＰＢＭＣのＲＮＡ（ＰＢＭＣ’ｓ ＲＮＡ）を単離し、ついで、ｃＤＮＡに逆転写する。本発明に従って選択した遺伝子の相対的発現レベルの測定のため、同時にＲＴ−ＱＰＣＲ法を使用する。
【００２６】
本発明者らによって追及されたアプローチは、より敏感なリアルタイム（ＲＴ）ｑＰＣＲ法による独立したコーホートにおいて確認された遺伝子のリストを同定するために、アフィメトリクスマイクロアレイ技術によるテストコーホートにおいて網羅的遺伝子発現分析を行うことであった。ＲＴ−ＱＰＣＲ技術は、遺伝子発現測定用の最も健全な手段（感受性、ダイナミックレンジ、標準化、処理能力及び費用の点で）であり、遺伝子発現測定を診断手段として理想のものとする。
【００２７】
しかし、発明者らは、ベースラインデータだけでなく、週２において得られたデータも検証のために使用できることを支持する。このように、応答者の状態を週２において統計学的に有意な様式で測定できる遺伝子も、関連する文献からのいくつかの遺伝子と同様に、有効な遺伝子セットに追加された。
【００２８】
両症状においてマイクロアレイによるベースラインサンプル及び週２サンプルの比較について、治療の効果自体は、ＣＤにおいて、５個の遺伝子によって表わされ、その内、ＡＱＰ９及びＴＮＦＡＩＰ６は、遺伝子発現レベルについてＩＢＤマーカーとして早期に同定されていた。ＭＧＡＭは、小児ＩＢＤにおけるＴＮＦαブロッキング治療に応答性の全ゲノム関連予測因子であることが判明し、一方、ＭＭＰ８の発現は、ＩＢＤにおける結腸サンプルの潰瘍ベースに活発に炎症を起こした領域において証明され、基質におけるその存在はＩＢＤの病因を示唆する。ＲＡでは、治療の最初の２週間で顕著な変動が認められる各遺伝子は、その発病に関連する：ＡＱＰ９及びＴＮＦＡＩＰ６は、ＰＢＭＣ遺伝子発現プロファイリングを介して、ＲＡ患者を健康なコントロールから識別した；及びＩＧＪ（免疫グロブリンＪ）は、健康な双子の一方と比較してＲＡに罹った双子の他方は、明らかに高いｍＲＮＡ発現を示した。
【００２９】
独立したコーホートにおけるＲＴ−ＱＰＣＲによる検証でも、結果として、応答者と非応答者との間で有意差を持つ遺伝子のリストが示された。ＣＤでは、これらの遺伝子は、ＴＭＥＭ１７６Ｂ及びＴＭＥＭ１７６Ａ（多重体を形成し、樹状細胞の成熟を抑制することによって、樹状細胞の機能のターゲットと考えられる）；ＵＢＥ２Ｈ（これについては、ＴＮＦ−ａが、ＵＢＥ２Ｈ依存性のユビキチン結合活性の公知のレギュレーターである）；及びＷＡＲＳ（トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ）を含む。ＲＡでは、骨関節炎の病理機序と関連するＣＹＰ４Ｆ３；ＤＨＲＳ９、ＭＧＡＭ；及びプロテオミクス研究で、ＲＡにおいてインフリキシマブについて非応答性の予測因子であるＰＦ４が重要であることが判明した。
【００３０】
単一遺伝子は、応答者と非応答者との間の有意差を示すかもしれないが、より大きい予測能力の要因となる根本的な差異は、単に、遺伝子パネルを分析することによって検出される。
【００３１】
最も大きい識別力を持つ遺伝子パネルを同定するために、正準変量分析（ＣＶＡ）又は線形判別分析（ＬＤＡ）を使用した。これは、遺伝子間の潜在的な相互作用を無視する単変量分析と比較すると、前記分析法が、多次元空間において完全な分離を提供する遺伝子パネルとして、遺伝子を同時に使用することによって、根本的な差異を表すことができるためである。
【００３２】
同様の遺伝子発現研究によって同定されたアウトカム変数に関連する遺伝子パネルセットは、患者の臨床的に均一なコーホートにおいてさえも、個々の変量及びマーカーに関連する不均一性とともに、サンプル調製、ｍＲＮＡ抽出又はデータの解析の各種の方法に寄与する共通のいくつかの遺伝子のみを有することが知られている。応答者と非応答者との間の統計学的に有意な差を持つ遺伝子のリストは、必ずしも、疾患又は治療の病原性における遺伝子の重要性を示すものではなく、従って、治療法の可能な対象を検出するためには、応答性に関連する遺伝子のリスト全体が解析されなければならない。
【００３３】
バイオインフォマティクス系アルゴリズムを構築することによって、両コーホート及び両疾患における応答者と非応答者との間の大きい識別力を持つ遺伝子パネルの選択を自動化することにより、結果として、各状態において応答者について１００％の分離を持つ約４７００個の遺伝子パネルが示された。これらの中でも、パネルのＦ値、相互検証データ、及び分離された群間のマージンを考慮して、最大の識別力を持つ３−３遺伝子パネルが同定された。
【００３４】
発明者らは、驚くべきことには、下記の事項を見出した：
１）慢性の炎症性疾患では、例えば、ＣＤ及びＲＡでは、末梢血遺伝子発現プロファイルが、予測性遺伝子パネル（インフリキシマブ治療以前に測定する場合、その発現レベルは、該治療に対して感受性である患者を特定する）を測定することに好適である。
２）ＣＤ及びＲＡにおいて応答性を予測するために、これらの疾患が同様の病因的背景を有するとの事実にもかかわらず、驚くべきことには、完全に異なった遺伝子パネルを必要とする。
３）相互検証分析における強い分離とともに、テストコーホート及び検証コーホートにおいて完全な分離を示すいくつかの遺伝子パネルが同定された。
【００３５】
サンプル収集は、本発明の方法では重要なポイントである。方法の主な基準の１つは、ＲＮＡを安定化させることであり、これによって、サンプルの保存及び移動を可能にする。このような方法としては、市販されているものを利用できるが、研究で使用されるもの（ＰＢＭＣ／Ｔｒｉｚｏｌ）よりも多少異なった細胞集団を生成する。サンプル収集は、適切な統計のために要求される最少１２０−１４０個のサンプルを提供することができなければならない。サンプル処理、ＱＣ測定及びＲＴ−ｑＰＣＲ測定は、公知の確立された技術である。
【００３６】
記載したＰＢＭＣ／Ｔｒｉｚｏｌサンプル収集法以外にも、他のサンプル収集法をテストした。これらの中でも、ＰＡＸＧｅｎｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、米国）及びＬｅｕｋｏＬｏｃｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、米国）サンプリング法が、ＰＢＭＣ／Ｔｒｉｚｏｌ法と良好な相関性を示した。しかし、臨床では、最も好適なサンプリング法は、ＰＡＸＧｅｎｅサンプリング法であり、この方法は、実験室設備及びサンプル収集を行う者の熟練性をあまり必要としない。
【００３７】
発明者らによって同定及び確認された本発明による遺伝子セットは、クローン病（ＣＤ）又は関節リウマチ（ＲＡ）のいずれかにおいて、ＴＮＦα阻害剤に対する応答者と非応答者とを明確に識別するゲノム法に関する未だ対処されていない要求を満足するものである。本発明による診断法は、当分野において、初めて、個別化されたヘルスケアを導入する機会を提供するものであり、全ての患者に役立つものである。さらに、患者が効果のない治療を受けることを防止し、ついで、適切な治療に移行されるようにできるだけでなく、臨床医、監督及び診療報酬支払当局、及びプロバイダーも、治療の増大された効力及び安全性からの利益を受ける。
【００３８】
［実施例］
研究のデザイン
マイクロアレイ実験用のテストコーホートにおける研究（治療開始前及び開始後２週間の時点でサンプリングを行う）には、クローン病（ＣＤ）患者２０人及び関節リウマチ（ＲＡ）患者１９人が含まれる。
検証プロセスのために、ＲＴ−ＱＰＣＲ実験には、検証コーホートから０週の時点でのＲＡ患者１５人からのサンプル、テストコーホート（技術的検証用）からの患者５人からのサンプル、及び検証コーホートから０週の時点でのＣＤ患者２０人からのサンプルが含まれる。図１の概略ダイアグラムは、研究のタイムライン及びデザインを示す。
【００３９】
患者の募集
Ａ）関節リウマチ
試験対象患者基準：
・臨床診断された関節リウマチ患者（１９８７年からのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの基準）
・年齢２０〜６０歳
・メトトレキサートを含む少なくとも２つの疾患修飾性抗リウマチ薬に対して応答性でない者
・活動性疾患（２８個の関節において評価して（ＤＡＳ２８）疾患活動性スコア＞３．２を有するものとして定義される）
・抗−ＴＮＦ治療を経験していない患者
・エントリー前少なくとも２月間用量が安定していれば、１日当たり１０ｍｇのプレドニゾン治療は許される
・ベースライン前少なくとも１月間安定していれば、経口コルチコステロン（最大用量：１日当たり１０ｍｇ−プレドニゾン）及び非ステロイド抗炎症剤は許される
・患者は、最大耐性メトトレキサート治療（１週間当たり５〜３０ｍｇ）中である（ただし、ベースライン前少なくとも４週間は安定でなければならない）
・女性：男性の比は３：１である
【００４０】
除外基準：
喫煙者又は前喫煙者；妊婦又は授乳者；現在又は最近悪性腫瘍であった者；臨床的に顕著な併存症の者；活性な感染症患者；異なった原因による急性の炎症性関節疾患の病歴を持つ患者
【００４１】
収集したパラメーター：
年齢、ＲＡの診断（年）、ＤＡＳ２８、ＣＲＰ、Ｗｅ、ＲＦ、併存症、薬物（例えば、ＤＭＡＲＤＳ）  治療１４週間後、ＥＵＬＡＲ基準およびＤＡＳ２８における減少少なくとも１．２の両方を使用して、治療に対する臨床的応答性を評価する。
【００４２】
Ｂ）クローン病
試験対象患者基準：
・臨床診断されたクローン病患者
・年齢２０〜６０歳
・ＣＤＡＩ＞２５０
・抗−ＴＮＦ治療中でないこと
・メトトレキサート（ＭＴＸ）治療、ただし＜２０ｍｇ／週
・プレドニゾロン治療、だたし＜１０ｍｇ／週
・女性：男性の比は１：１である
【００４３】
除外基準：
喫煙者又は前喫煙者；妊婦又は授乳者；現在又は最近悪性腫瘍であった者；臨床的に顕著な併存症の者；活性な感染症患者；異なった原因による急性の炎症性腸疾患の病歴を持つ患者
【００４４】
収集したパラメーター：
年齢、ＣＤの診断（年）、ＣＤＡＩ（ＣＤＡＩが１５０以下に低下した場合には、患者は応答者と判断され、さもなければ、非応答者である）、ＣＲＰ、Ｗｅ、併存症、薬物、結腸のバイオプシーの概要（可能であれば）、１４週間後の応答性
【００４５】
患者サンプルの収集、加工及び保存（ＰＢＭＣ／Ｔｒｉｚｏｌ）
上記基準に基づき、臨床医によって、治療１４週間後に、治療に対する応答性を測定した。ＰＢＭＣ分離のため、ＥＤＴＡを収容するＶｅｎｏｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｎｉｅｒ  Ｋ２Ｅ）において、末梢血サンプル（１０ｍｌ）を集め、血清サンプルの抽出のために、天然チューブにおいて末梢血１０ｍｌを集めた。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によってＰＢＭＣｓを分離した。短時間に、末梢血を生理食塩水１０ｍｌで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ１０ｍｌ上に重ねた。２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、ついで、ＰＢＭＣｓの層を集めた。細胞を食塩水で２回洗浄し（１７００ｒｐｍ、７分間）、Ｔｒｉｚｏｌ試薬に溶解し、ＲＮＡの単離まで−７０℃において保存した。
【００４６】
臨床パラメーターの統計
患者のコーホートの臨床パラメーターを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して比較し、マン−ホイットニーのＵ検定を使用した（ｐ＜０．０５は、統計学的に有意とみなされる）。
【００４７】
ＲＮＡの単離
製造者のプロトコルに従い、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＲＮＡを単離した。ＲＮＡの量及び質を、ＵＶ光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でチェックした。
【００４８】
マイクロアレイ
注釈の豊富な遺伝子２８８６９個の網羅的遺伝子発現パターンを分析するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴアレイを使用した。ＲＮＡサンプル２５０ｎｇを増幅及びラベル付けするためにＡｍｂｉｏｎ ＷＴ ＥＸｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｓｏｓｙｔｅｍｓ）及びＧｅｎｅＣｈｉｐ ＷＴ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用した。サンプルを４５℃において１６時間ハイブリダイズし、ついで、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０を使用して標準洗浄プロトコルを実施し、アレイをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上でスキャンした。
【００４９】
マイクロアレイのデータの分析
マイクロアレイのデータをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ１０（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて分析した。ＲＭＡアルゴリズムを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータファイルをインポートし、メディアンノーマライゼーションを行った。ベースライン対週２サンプルの比較について、第１の工程において、最も低い発現レベルを持つプローブセットの２０％をフィルター除去し、ついで、残りのプローブセットのリストを倍数変更によってフィルター除去し（１．２倍カットオフ）、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定補正と対としたマン−ホイットニーのＵ検定を使用して、統計学的分析を行った。
応答者対非応答者の比較について、第１の工程において、最も低い発現レベルを持つプローブセットの２０％をフィルター除去し、ついで、残りのプローブセットのリストを倍数変更によってフィルター除去し（１．２倍カットオフ）、多重検定補正用のＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇと対としていないＴ検定を使用して、統計学的分析を行った。遺伝子の機能的カテゴリー化を、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｐａｔｈｅｒｄｂ.ｏｒｇ/）にて行った。
【００５０】
ＲＴ−ＱＰＣＲ
３８４の同時リアルタイムＰＣＲ操作を行うことを可能にする３８４ウェル微少流体カードであり、いくつかの研究において遺伝子発現プロファイリングのために使用されているＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ （ＴＬＤＡ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、遺伝子発現データを得た。この低−から中−スループット微少流体カードは、２つのサンプルが、カードの各ウェルにプレ負荷した９６ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙターゲットに対して並行して達することを可能にする。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔにより、製造者のプロトコルに従って、ｃＤＮＡを発生させた。ＲＴ−ＰＣＲ操作において、１サンプル当たり、ＲＮＡ１μｇを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ操作において、１サンプル当たりＲＮＡ１μｇを使用した。各サンプルにおいて、ｃＲＮＡ４００ｎｇ（４μｌ）を使用した。ヌクレアーゼフリー水１９６μｌ及び２×ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２００μｌを、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ測定のために添加した。ついで、この混合物を、ＴＬＤＡの４個のサンプル負荷ポート（それぞれ、問題の遺伝子９６個のセットに接続している）に均等に分割した。アレイを一度遠心して（１′、１３００ｒｐｍ、室温）、サンプルをウェルに均等に分配した。続いて、カードを密封して、ウェル間の交換を防止した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システムを使用して、次の温度サイクル条件：５０℃で２分及び９４．５℃で１０分、続いて、９７℃で３０秒及び５９．７℃で１分のサイクル４０回で、ＲＴ−ＱＰＣＲ増幅行った。事前のマイクロアレイ実験に基づいて９１個の遺伝子を選択し、残る５個の遺伝子は、ノーマライゼーションのためのハウスキーピング遺伝子であった。
【００５１】
ＲＴ−ＱＰＣＲデータ分析
ＲＴ−ＱＰＣＲデータファイルを、ソフトウエアＤａｔａ Ａｓｓｉｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にインポートし、生データをΔＣｔ法によって正規化した。ノーマライザー遺伝子としてシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）を選択した。これは、その発現が、サンプル間で変動が少ないためである。応答者群と非応答者群との間で差次的に発現する遺伝子を見出すために、ノンパラメトリック統計テスト（マン−ホイットニーのＵ検定）及び正準変量分析（ＣＶＡ）を行った。
【００５２】
正準変量分析（ＣＶＡ）又は線形判別分析（ＬＤＡ）
対象の定義済み群間の分別は、正準変量分析（ＣＶＡ）によって最も良好に表される。ＣＶＡは線形判別分析（ＬＤＡ）の一般化であり、研究では、２つの用語が均等に使用される。応答者及び非応答者の群が遺伝子的変数によってスパン化された多次元空間で分別されるかどうかを測定し、もしそうであるならば、いずれの遺伝子サブセットが最良の識別力を有するかを測定するためにＣＶＡを使用した。ＣＶＡの結果は、ｅｉｇｅｎａｎａｌｙｓｉｓを介して誘導された正準関数（正準相関空間における観察の座標として機能する）から得られた、いわゆる、正準スコアである。
【００５３】
遺伝子パネルの自動生成
下記のアルゴリズム（ＣＤでは遺伝子４０個及びＲＡでは遺伝子４１個を使用した：テストコーホートによる実験の間にプレ−フィルター除去し、検証コーホートにおいて確認した）に従って両疾患及び両コーホートにおいて応答者と非応答者との間で１００％の分離を示す遺伝子パネルを自動的に生成するために、線形判別分析（ＬＤＡ）（Ｈａｍａｄｅｈ ＨＫら，高密度遺伝子発現プロファイリングを使用する混合シグネチャーの予測、Ｔｏｘｉｃｌｏ Ｓｃｉ． ２００２ ６月；６７（２）：２３２−４０）を使用した。
１）「インモデル遺伝子」のセットを創製する。初期には、このセットは全ての遺伝子を含む。いわゆる「保護遺伝子」を有する遺伝子セットも創製する。初期には、このセットは空である。
２）群間変異性と群内変異性の比であるＦ値を、各遺伝子について算定する。
３）テストコーホート及び検証コーホートの両方において、「インモデル遺伝子」のセットを使用して、分別アルゴリズム（ＬＤＡ）を実行する。いずれのケースにおいても、精度百分率値を「最良精度値」として記録する。
４）「選べる遺伝子」のセットは次のように定義される：
「選べる遺伝子」≒「インモデル遺伝子」−「保護遺伝子」
「選べる遺伝子」の群が空でない場合には、工程５）においてアルゴリズムを継続し、その他の場合には、アルゴリズムを工程７）にスキップする。
５）下記のモデル：
ａ）等しい確率でランダム（ｕｎｉｆｏｒｍモデル）；
ｂ）そのＦ値に逆比例する確率でランダム（Ｆ＿ｐｒｏｐモデル）；
ｃ）最低のＦ値を持つ遺伝子（ｍｉｎＦモデル）
に従って「選べる遺伝子」のセットから遺伝子を選択する。いずれのケースでも、選ばれた遺伝子は「インモデル遺伝子」のセットから一時的に除去される。ｍｉｎＦモデルの代わりに確率的モデルを使用する利点は、これらが、患者群のより良好な分離を提供できることにある。ｕｎｉｆｏｒｍモデル及びＦ＿ｐｒｏｐモデルは、確率的アルゴリズムを代表し、一方、ｍｉｎＦモデルは決定論的である。
６）「インモデル遺伝子」の（一時的に除去された）セットを使用して、分別を実行する。
ａ）２つの精度百分率値のいずれかがより低くなる場合には、選ばれた遺伝子は、「インモデル遺伝子」のセットに再挿入され、「保護遺伝子」のセットに加えられる。
ｂ）両精度百分率値が少なくとも「最良精度値」と同様に良好である場合には、選ばれた遺伝子は、「インモデル遺伝子」から恒久的に除去され、「保護遺伝子」のセットは空にされる。「最良精度値」は、算定された精度値によって上書きされる。
アルゴリズムは工程４）に戻る。
７）アルゴリズムは終了する。アウトプットは、「インモデル遺伝子」及び「最良精度値」のセットである。視覚化のため、Ｒソフトウエア（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ （２００８） Ｒ：統計学的演算用の言語及び環境  統計学的演算用のＲ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ウィーン オーストリア ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０ ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を、パッケージＭＡＳＳ（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｖ．＆Ｒｉｐｌｙ，Ｂ．Ｄ．（２００２） Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｓ．第４版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ニューヨーク）及びパッケージｗｏｒｄｃｌｏｕｄ（Ｉａｎ Ｆｅｌｌｏｗｓ （２０１２） ｗｏｒｄｃｌｏｕｄ：Ｗｏｒｄ Ｃｌｏｕｄｓ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ バージョン２．０ ｈｐｐｔ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｗｏｒｄｃｌｏｕｄ）と共に使用することによって線形判別分析を行った。
【００５４】
酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）
ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、インフリキシマブ及び抗−インフリキシマブ抗体の血清レベルを測定するため、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を行った。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造者のプロトコルに従って、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、及びＩＦＮｇの測定を行った。ＬＩＳＡ−ＴＲＡＣＫＥＲ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｉｎｆｌｅｘｉｍａｂ Ｋｉｔ（ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって、ＴＮＦａ、インフリキシマブ及び抗インフリキシマブ抗体のレベルを測定した。結果をｐｇ／ｍｌで示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用することによってデータを分析し、及びマン−ホイットニーのＵ検定を使用した（ｐ＜０．０５は、統計学的には有意と判断される）
【実施例１】
【００５５】
関節リウマチのテストコーホートサンプルの網羅的遺伝子発現分析
関節リウマチのテストコーホート患者群
マイクロアレイ実験には、ベースライン及び週２の時点での患者１９人から採取したサンプルが含まれる。各患者は同じ基本的治療を受けており、非喫煙者である。臨床医によって、応答者６人及び非応答者１３人が同定された。非応答者（ＮＲ）群と応答者（Ｒ）群との間には、年齢、ＤＡＳ２８、ＨＡＱ、ＣＲＰ、リウマチ因子、抗−ＣＣＰ又はＤＭＡＲＤｓについて有意差はなかった（表１）。
【表１】
2016502400.tif 000003
マイクロアレイ実験
網羅的遺伝子発現プロファイリングは、ベースラインにおいて、応答者と非応答者との間に統計学的に有意の差を持つ遺伝子を明らかにした。週２の時点で得られたサンプルを分析したところ、応答者と非応答者との間に統計学的に有意の差を持つ遺伝子を示した。いくつかの遺伝子の発現は、ベースラインにおいても、有意に異なり（ＥＰＳＴＩ１、ＩＦＩ４４、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＲＦＣ１、及びＲＳＡＤ２）、一方、他の遺伝子では、週２の時点で、異なった発現を示した（ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＰＡＭ、ＭＩＣＡ、ＥＬＯＶＬ７、ＰＦ４、ＲＧＳ１、及びＳＮＯＲＤ４１）。これらの遺伝子の多くは、文献によれば、ＲＡとの関連性を有する（ＦＣＧＲ３Ａ、ＭＩＣＡ、ＰＦ４、ＩＦＩＴ１、等）。
ベースラインサンプルと週２の時点のサンプルとを比較した結果、多重検定のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を行っても、統計学的に有意差を持つ３個の遺伝子（ＡＱＰ９、ＩＧＪ及びＴＮＦＡＩＰ６）のリストが示された。これらの遺伝子は、経時的に治療の効果を示す（図３）。
【実施例２】
【００５６】
関節リウマチの遺伝子パネルのＲＴ−ＱＰＣＲ検証
関節リウマチの検証コーホート患者群
臨床医によって、応答者４人及び非−又は中位−応答者１１人が同定された。各患者は同じ基本的治療を受けており、非喫煙者である。非応答者（ＮＲ）群と応答者（Ｒ）群との間には、年齢、ＤＡＳ２８、ＨＡＱ、ＣＲＰ、又はＤＭＡＲＤｓについて有意差はなかった（表２）。
【表２】
2016502400.tif 000004
ＲＴ−ＱＰＣＲ分析
ＲＴ−ＱＰＣＲ実験には、週０の時点で患者１５人から採取したサンプル及び技術的検証用のテストコーホートからの患者５人（応答者２人及び非応答者３人）からのサンプルが含まれる。検証ｑ−ＰＣＲ検査法の構成は次のとおりである：テストコーホートマイクロアレイに基づき、２９個のプローブセットは、ベースラインにおいて、非応答者対応答者の比について統計学的に有意であることが証明された。その内、２７個の遺伝子（特記及び核小体低分子ＲＮＡを持たない遺伝子は除外した）は、週２の時点でのＮＲ対Ｒの比較からの６個の遺伝子とともにＴＬＤＡカードに含まれ、１０個の遺伝子は文献から選択した。これ以外に、最終分析において、下記のようにして、４１個の遺伝子を使用した（差異を示さない遺伝子は除外した）。ＲＴ−ＱＰＣＲ実験の結果、４個の遺伝子が、ＮＲとＲとの間で統計学的に有意の差（１テイル  マン−ホイットニーのＵ検定）を示した（図４）。技術的検証も実施したところ、好結果であることが証明された。
【実施例３】
【００５７】
クローン病のテストコーホートサンプルの網羅的遺伝子発現分析
クローン病テストコーホート患者群
マイクロアレイ実験（テストコーホート）には、ベースライン及び週２の時点での患者２０人から採取したサンプルが含まれる。臨床医によって、応答者１４人及び非応答者６人が同定された。各患者は同じ基本的治療を受けており、非喫煙者である。非応答者（ＮＲ）群と応答者（Ｒ）群との間には、年齢、ＣＤＡＩ、ＣＲＰ、ヘモグロビン、白血球又は好中球について有意差はなかった（表３）。
【表３】
2016502400.tif 000005
網羅的遺伝子発現プロファイリングは、ベースラインにおいて、応答者と非応答者との間に統計学的に有意の差を持つ遺伝子を明らかにした。週２の時点で得られたサンプルを分析したところ、応答者と非応答者との間に統計学的に有意の差を持つ遺伝子を示した。これらの遺伝子のいくつかは、ベースラインにおいても有意に異なるものであり（ＤＤＸ１１Ｌ２、ＢＭＰ６、ＴＨＥＭ５、及びＡＢＣＣ４）、一方、他の遺伝子では、週２の時点での新たな所見であった（ＧＰＲ３４、ＰＲＤＭ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＣＡ２、ＭＭＤ、ＳＣＬ７Ａ５、ＣＡＤＭ２、及びＲＡＤ２３Ａ）。これらの遺伝子の多くは、文献によれば、ＣＤとの関連性を有する（ＢＭＰ６、ＡＢＣＣ４、ＣＡ２、ＩＬ１ＲＬ１、及びＰＲＤＭ１）。ベースラインサンプルと週２の時点のサンプルとを比較した結果、統計学的に有意な差異を持つ５個の遺伝子（ＡＱＰ９、ＩＧＫＣ、ＭＧＡＭ、ＭＭＰ８、及びＴＮＦＡＩＰ６）のリストが示された。これらの遺伝子は、経時的に治療の効果を示す（図５）。
【実施例４】
【００５８】
クローン病の遺伝子パネルのＲＴ−ＱＰＣＲ検証
クローン病の検証コーホート患者群
ＲＴ−ＱＰＣＲ実験（検証コーホート）には、ベースラインでの患者２０人から採取したサンプルが含まれる。臨床医によって、応答者１３人及び非応答者７人が同定された。各患者は同じ基本的治療を受けており、非喫煙者である。非応答者（ＮＲ）群と応答者（Ｒ）群との間には、年齢、ＣＤＡＩ、ＣＲＰ、ヘモグロビン、白血球、又は好中球について有意の差はなかった（表４）。
【表４】
2016502400.tif 000006
ＲＴ−ＱＰＣＲ分析
検証ｑ−ＰＣＲ検査法の構成は次のとおりである：テストコーホートにおける４０個のマイクロアレイに基づき、４９個のプローブセットは、ベースラインにおいて、非応答者対応答者の比について統計学的に有意であることが証明された。その内、３６個の遺伝子（特記及び小さい仁ＲＮＡを持たない遺伝子は除外した）は、週２の時点でのＮＲ対Ｒの比較からの遺伝子８個とともにＴＬＤＡカードに含まれ、７個の遺伝子は文献から選択した。これ以外に、最終分析において、下記のようにして、４０個の遺伝子を使用した（差異を示さない遺伝子は除外した）。ＲＴ−ＱＰＣＲ実験の結果、４個の遺伝子がＮＲとＲとの間で統計学的（１テイル マン−ホイットニーのＵ検定）に有意の差を示した（図６）。
【実施例５】
【００５９】
発現データの生物統計学的分析
上述した自動遺伝子パネル生成を使用する両コーホートにおけるプレ−フィルター除外した４０／４１（ＲＡ／ＣＤ）個の遺伝子の遺伝子発現データを使用して、統計学的分析を行い、応答者と非応答者との間を分別する最良の遺伝子パネルを発見するためのアルゴリズムをデザインした。
両確率モデルにより、決定論的ｍｉｎ＿Ｆ及び５０００倍でアルゴリズムを実行した。ＲＡでは、Ｆ＿ｐｒｏｐが、テストコーホート及び検証コーホートの両方において（それぞれ、マイクロアレイ及びＲＴ−ＱＰＣＲデータを使用する）、応答者と非応答者との間で１００％の分別を示す遺伝子パネルの４７４７個の組み合わせを生成し、一方、ｕｎｉｆｏｒｍは、さらに、４９０９個の遺伝子パネルを生成した。ＣＤでは、これらの数は、Ｆ＿ｐｒｏｐについて４６５７及びｕｎｉｆｏｒｍについて４８７８であった。ｍｉｎ＿Ｆモデルは１００％の分離も生成する（ただし、確率モデルは、両疾患において、精度指標の点では、多少重度の分離を生成することに注意しなければならない）。５００回の実行によって生成された１００％の分離を提供する多数の遺伝子パネルは、他にも、１００％の分離を持つパネルが存在し、これらのパネルの総数は５００００個を越えることを示唆する。
交差検証は、明示的な検証セットが利用できない場合に、仮想の検証セットに対するモデルの適合を予測する１つの方法である。発明者らは、検証データとしてオリジナルのサンプルからのただ１個の観察を使用し、他の観察をトレーニングデータとして使用することを含む一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）を使用した。サンプル中の各観察が検証データとして１回使用されるように、これを繰り返した。可視化のため、Ｆ値、交差検証及び分離された群間のマージンを考慮して、最良の識別力を持つ３−３遺伝子パネルを選択した。マイクロアレイ実験において最高のｐ値を持つ遺伝子のリストは、分離を示さない負のコントロールとして機能する（表５）。
最良の識別力を持つＲＡ用の遺伝子パネルは、ＣＮＴＮＡＰ３、ＣＹＰ４Ｆ３、ＧＺＭＢ、ＭＭＥ、ＭＸ１、ＲＡＶＥＲ２、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、及びＴＮＦＡＩＰ６のような遺伝子を含み（ＲＡ１）、一方、第２の遺伝子パネルは、ＣＮＴＮＡＰ３、ＣＹＰ４Ｆ３、ＥＰＳＴＩ１、ＭＭＥ、ＲＧＳ１、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、及びＴＮＦＡＩＰ６を含み（ＲＡ２）、第３の遺伝子パネルは、ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＰＡＭ、ＧＺＭＢ、ＩＦＩ３５、ＭＭＥ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＶＥＲ２、ＲＦＣ１、及びＲＳＡＤ２からなる（ＲＡ３）（図７）。
最良の識別力を持つＣＤ用の遺伝子パネルは、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＥＮＤＯＤ１、ＦＣＧ１Ａ、ＧＣＬＣ、ＧＰＲ３４、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、及びＯＤＣ１のような遺伝子を含み（ＣＤ１）、一方、第２の遺伝子パネルは、ＡＢＣＣ４、ＡＩＤＡ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＣＡＤＭ２、ＦＭＮ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＯＤＣ１、ＰＣＹＴ１Ｂ、及びＲＮＡＳＥ２を含み（ＣＤ２）、第３の遺伝子パネルは、ＡＩＤＡ、ＣＡＤＭ２、ＧＣＬＣ、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＭＤ、ＰＣＹＴ１Ｂ、ＰＲＰ５Ｋ１Ｂ、ＲＩＯＫ３、及びＲＮＦ１１からなる（ＣＤ３）（図８）。
【表５】
2016502400.tif 000007
図９及び１０において、応答者と非応答者との間で１００％の分離及び各患者群について算定した最小のＦ値を示す（Ｆ値がより高いこと、分離がより良好であることは、最小のＦ値を選択することがモデルの最弱ポイントであることを意味する）各パネル内の遺伝子の数は、最高の識別力を持つ遺伝子パネルの推定数を明らかにするために、Ｆ値によって分類して示されている。最小Ｆ値の曲線の屈曲点は、プロット上の遺伝子パネルが応答者と非応答者との間の１００％の分離につながるとの記述から、ＲＡでは約３５０個の遺伝子パネル、一方、ＣＤでは２００個の遺伝子パネルが強力な分離を生ずること示している。
【実施例６】
【００６０】
ＥＬＩＳＡ分析
５個の炎症性サイトカイン（ＴＮＦａ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮｇ、及びＩＬ１２）、治療用モノクロナール抗体インフリキシマブ、及び抗−薬剤（抗−インフリキシマブ）抗体の血清タンパク質レベルを決定するためにＥＬＩＳＡ測定を実施した。表６は、統計学的分析に基づき、ＲＡにおいて、ベースラインで、応答者との非応答者との間にＩＬ−１２のレベルについて有意な差異が認められ、一方、ＣＤにおいて、ＩＦＮγのレベルが統計学的に異なることに一致したことを示している。ＲＡコーホートにおいて、ＴＲＡＣＫＥＲ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｋｉｔによって、ＴＮＦαを測定した。有意な比較の詳細な散布図を図１１〜１３に示す。
【表６】
2016502400.tif 000008
ＬＩＳＡ−ＴＲＡＣＫＥＲ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｋｉｔをテストするため、ＴＮＦα、インフリキシマブ及び抗−インフリキシマブ抗体のＥＬＩＳＡトライアル実験も実施した。キットの限界量に関しては、テストコーホートからのサンプルのみが含まれる。下記のサンプルが含まれる：
2016502400.tif 000009
従って、テストコーホートのＲＡ患者からのサンプルにおいて、ＴＮＦαのみを測定したが、ベースライン又は週２において、又はベースライン対週２の比較において、応答者と非応答者との間に差異は検出されなかった（図１４〜１６）。
インフリキシマブ及び抗−インフリキシマブ抗体を、ＲＡ及びＣＤの週２及び週１４のサンプルにおいて測定した（図１７〜１９）。抗−インフリキシマブ抗体レベルは、週１４においてインフリキシマブレベル０を示した患者を代表する３個のサンプルにおいてのみ検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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