(57)【要約】  本発明は、可変対照線を具備した免疫クロマトグラフィー用ストリップ、前記免疫クロマトグラフィー用ストリップを具備した診断キット、及びこれを用いて検体中の標的物質を定性又は定量分析する方法に関するものである。本発明のラピッドテスト用ストリップは可変対照線を具備するため、フック効果による標的物質の定量測定における問題を克服でき、肉眼による定性分析だけでなく、信頼性の高い定量分析まで迅速かつ便利に行うことができる。さらに、検査線と可変対照線の補完効果によって標的物質のダイナミックレンジの改善効果がある。
2016520200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合体パッド及び検出パッドを具備したラピッドテスト用ストリップにおいて、前記接合体パッドは、標的物質と反応する第１所定量の第１リガンド及び第１リガンドに結合するシグナル検出標識物質を具備し、第１リガンドと標識物質は、検体展開前又は展開時に相互に連結されて接合体を形成し、検体の展開時に接合体は検出パッドに移動でき、
前記検出パッドには、相互に隔離された検査線及び可変対照線が具備されており、
前記検査線は、検体中の標的物質と反応する第２リガンドが固定されており、及び
前記可変対照線は、標的物質と同様であるか、又は第１リガンドと反応するその類似体である第３リガンドが第２所定量で固定されているため、検体中の標的物質と結合していないベア（bare）接合体と反応可能な、ラピッドテスト用ストリップ。
【請求項２】
第１所定量の第１リガンドの一部が、検体中の標的物質と反応することによって、前記第１リガンド及び標識物質を具備した接合体に標的物質が結合した複合体を形成し、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて前記形成された複合体の量が増加するのに対して、前記ベア接合体の量は減少する、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項３】
前記第１リガンド、標識物質及び標的物質を具備した複合体が、第２リガンドと反応して検査線で捕獲され、
前記検体中の標的物質と結合せずに、第１リガンド及び標識物質を具備したベア接合体が第３リガンドと反応して可変対照線で捕獲され、
前記検査線及び前記可変対照線の標識物質からのシグナルを測定することにより、検体中の標的物質の有無又はその量、或いはそれらをいずれも決定し得る、請求項２に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項４】
可変対照線のシグナル強度が、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて低下する、請求項３に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項５】
前記可変対照線からのシグナル強度が、検体中の標的物質の濃度がＭ値に達するまでは一定に維持されるが、その濃度がＭ値を超えると強度が徐々に低下し、最終的には０に収斂され、
前記Ｍ値が、前記第２所定量で固定された全ての第３リガンドがベア接合体に反応し飽和する場合における検体中の標的物質の最大濃度である、請求項４に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項６】
前記検出パッドには、検体の展開を確認するための不変対照線がさらに具備されており、
前記不変対照線にはレポーター分子が固定されている、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項７】
前記ラピッドテスト用ストリップは、
標的物質が含まれた検体が分析のために導入される検体パッド、
一末端が前記検体パッドと連結される接合体パッド、
一末端が前記接合体パッドの他の末端と連結される検出パッド、
一末端が前記検出パッドの他の末端と連結され、前記検体パッドから検体を展開するための駆動力を提供する吸収パッド、及び
前記ラピッドテスト用ストリップの下部に位置する固体支持体を含む、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項８】
前記支持体が、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、ガラス及びプラスチックからなる群より選択される材料から形成される、請求項７に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項９】
前記第１リガンド、第２リガンド及び第３リガンドが、タンパク質、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はアプタマーである、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項１０】
前記標識物質が、コロイド性金、ラテックス粒子、着色ポリスチレン微小粒子、酵素、蛍光性色素、伝導性高分子、発光物質又は磁性粒子である、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項１１】
前記ラピッドテスト用ストリップが免疫クロマトグラフィー用ストリップである、請求項１に記載のラピッドテスト用ストリップ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のラピッドテスト用ストリップがケース内にさらに装着されたキットであって、
前記キットには、下部のケースにはガイド及びストリップ支持部が具備されており、
上部のケースには検体投入口、及び
検査線及び可変対照線に相応する位置に結果確認窓が具備されている、診断キット。
【請求項１３】
前記診断キットには、様々な濃度の標的物質が含まれた検体に対する検査線と可変対照線の基準色票を含む標準シグナルデータがさらに提供される、請求項１２に記載の診断キット。
【請求項１４】
前記検査線と前記可変対照線からの標識物質のシグナルの有無及び強度を肉眼により定性又は半定量分析することのできる、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項のラピッドテスト用ストリップを用いて検体中の標的物質を定性又は定量分析する方法であって、
前記検体を前記接合体パッド又はそれ以前に位置するパッドに導入し、検体を展開させる段階（第１段階）、
検査線と可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を確認する段階（第２段階）、及び
検査線と可変対照線のシグナル強度と標準シグナルデータを比較し標的物質の量を測定する段階（第３段階）を含み、
前記標準シグナルデータは、様々な既知濃度の標的物質が含まれた各検体について、前記第１段階及び第２段階を行うことにより取得される、方法。
【請求項１６】
前記第２段階の検査線と可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）により確認する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検体を、固体支持体に吸収されたリガンドと反応させる段階を含む、検体中の一つ以上の標的物質の定性的又は定量的分析方法であって、一つの標的物質に対して二つの異なる反応メカニズムが適用されることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記２つの異なる反応メカニズムがサンドイッチ反応及び競争反応である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変対照線を具備したラピッドテスト用ストリップ、前記ラピッドテスト用ストリップを含む診断キット、及びこれを用いて検体中の標的物質を定性的又は定量的に分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラピッドテスト法として知られている免疫クロマトグラフィー分析法は、抗原-抗体反応によって微量の標的物質（analyte）を短期間で定性的又は定量的に分析する方法であり、様々な疾患の診断又は検査だけでなく、医学分野、農業、畜産業、食品、軍用、環境などの様々な分野において適用されている。一般的に、免疫クロマトグラフィー分析法は、標的物質と反応し変化を示す反応物質を含む分析ストリップ、又はプラスチックケース及びそのケースに装着された分析ストリップを含む分析装置により行われている。図１は、免疫クロマトグラフィー法で使用されている通常の分析ストリップの断面図である。図１に示されるように、通常の分析ストリップは、液状検体を受容するための検体パッド、肉眼又はセンサーによって検出できるシグナルを発生する表示（例えば、金粒子）を、抗原又は抗体などのリガンドに結合させることにより製造された接合体を含む接合体パッド、検体中の標的物質及び／又は前記接合体に特異的に結合するバインダー（binder、抗体又は抗原）を固定した検査線と、検体の展開を確認するための対照線が形成された検出パッド、及び前記液状検体を最終的に受容するための吸収パッドから構成されている。前述のように、これらの機能性パッドは相互に部分的に順序どおりに重畳されて連結されており、固体支持体上に連続的に配列される。プラスチックケース内部に装着された前記分析ストリップが使用される場合、ケースの上部には検体パッドに導入するための検体投入口が形成され、検出パッドのバインダーが固定された位置には検査結果を確認するための結果確認窓が形成される。分析ストリップを用いた免疫クロマトグラフィー法において、液状検体が検体パッドに注入されると、前記液状検体が毛細管現象によって接合体パッド及び検出パッドに流れ、最終的に吸収パッドに吸収される。例えば、標的抗原と結合可能な一方の抗体をメンブレンパッド上にライン型（検査線）に固定し、他方の抗体は一つの金粒子のような標識物質と結合させた後、前記検体を展開させる。展開される検体は接合体パッドを経ながら、その一部は、抗原-金粒子抗体の複合体を形成し、前記抗原-金粒子抗体は、固定された検査線に捕獲され、「検査線に固定された抗体-抗原-金粒子抗体」が形成される。この際、前記検査線は金粒子によって赤色を呈する。このように、前記接合体パッドに含有される接合体に含まれていた接合体も液状検体と共に移動する。検体中に標的物質が存在する場合、前記接合体は標的物質を介して検出パッド上に固定されたバインダーと結合し（通常「サンドイッチ反応」と言う）、又は前記接合体或いは標的物質がバインダーに競争的に結合する（通常「競争反応」と言う）。このような概念を基に、前記分析ストリップは検体中の標的物質の存在を肉眼又はセンサーを用いて感知することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述のラピッドテスト法、主に、前記ラピッドキットを用いた免疫クロマトグラフィー法は、一般的に長いメンブレンにそれぞれ特定物質を複数の水平ライン型に固定した後、縦に切って製造するストリップの形態である。従って、工程が単純で大量生産が可能であるという利点がある。さらに、ＥＬＩＳＡなどと比較して、追加の洗浄工程や二次反応を必要とせず、反応時間も１０分と短い。従って、前記免疫クロマトグラフィー分析法は、便宜性の観点から優れている。しかし、検出限界（detection limit）が比較的に低く、肉眼に基づいた検出であるため、正確な定量分析が困難であるという欠点がある。これらの理由から、従来の免疫クロマトグラフィー分析法は、通常、定性分析に用いられており、定量分析に用いるには多くの制限がある。
【０００４】
本発明者らは、定性分析だけでなく、定量分析においても免疫クロマトグラフィー用ストリップの信頼性を改善するために鋭意努力し、その結果、標的物質と同様の物質又はその類似体を含む可変対照線を追加した後に検査線と可変対照線の間のシグナル強度を比較することで、定量分析が可能であることを確認した。従って、本発明は、定性分析だけでなく、肉眼による信頼性の高い定量分析が可能な可変対照線を具備するラピッドテスト用ストリップを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様として、本発明は、接合体パッド（conjugate pad）及び検出パッド（detection pad）を具備したラピッドテスト用ストリップを提供し、前記接合体パッドは標的物質（analyte）と反応する第１所定量の第１リガンド及び第１リガンドと結合するシグナル検出標識物質を具備し、第１リガンド及び標識物質（label）は、検体の展開前又はその展開時に相互に連結され接合体を形成し、前記接合体は検体展開時に検出パッドに展開（migration）することができ、
前記検出パッドには、検査線及び可変対照線が相互に隔離されて具備されており、
前記検査線には、検体中の標的物質と反応する第２リガンドが固定されており、及び前記可変対照線は、第１リガンドと反応する同様の標的物質又はその類似体の第２所定量の第３リガンドが固定されているため、検体中の標的物質と結合していないベア接合体（bare conjugate）と反応可能な、ラピッドテスト用ストリップを提供する。
【０００６】
好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリプは、最初の第１所定量の第１リガンドが検体中の標的物質と反応することによって、前記標的物質が第１リガンドと標識物質を具備する接合体と複合体を形成し、形成された複合体の量が検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて増加するのに対して、ベア接合体の量は減少することを特徴とする。
【０００７】
さらに好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、前記第１リガンド、標識物質、標的物質を具備する複合体が第２リガンドと反応し検査線で捕獲され、前記検体中の標的物質と結合せずに、第１リガンドと標識物質を具備したベア接合体は、第３リガンドと反応して可変対照線で捕獲され、検査線及び可変対照線の標識物質からのシグナルを測定することにより、検体中の標的物質の有無又はその量、或いはそれらをいずれも決定することを特徴とする。
【０００８】
他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、可変対照線のシグナル強度が検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて 増加することを特徴とする。
他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、可変対照線からのシグナル強度が検体中の標的物質の濃度がM値に達するまでは一定のレベルに維持されるが、前記濃度がM値を超えると、シグナル強度が徐々に低下し、最終的に０に収斂されることを特徴とする。ここで、前記M値は、第２所定量で固定された全ての第３リガンドが前記ベア接合体と反応し飽和する場合における検体中の標的物質の最大濃度である。
【０００９】
他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、前記検出パッドが、検体展開を確認するための不変対照線をさらに具備しており、前記不変対照線にはレポーター分子が固定されていることを特徴とする。
【００１０】
さらに好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、標的物質を含んだ検体が分析のために導入される検体パッド、
一末端が前記検体パッドと連結される接合体パッド、
一末端が前記接合体パッドの他の末端と連結される検出パッド、
一末端が前記検出パッドの他の末端と連結され、前記検体パッドから検体を展開するための駆動力を提供する吸収パッド、及び前記ラピッドテスト用ストリップの下部に位置する固体支持体から構成されることを特徴とする。
【００１１】
さらに他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、支持体がニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、ガラス及びプラスチックからなる群より選択される材料から形成されることを特徴とする。
【００１２】
さらに他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、第１リガンド、第２リガンド及び第３リガンドが、タンパク質、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はアプタマー（aptamer）であることを特徴とする。
【００１３】
さらに他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップは、前記標識物質が、コロイド性金、ラテックス粒子、着色ポリスチレン微小粒子、酵素、蛍光性色素、伝導性高分子、発光物質又は磁性粒子であることを特徴とする。
【００１４】
さらに他の好ましい実施態様として、前記ラピッドテスト用ストリップはクロマトグラフィー用ストリップである。
他の一態様として、本発明は、ケース内に装着された本発明のラピッドテスト用ストリップキットを含み、下部のケースにはガイド及びストリップ支持体が具備されており、上部のケースには検体投入口が形成され、及び検査線及び可変対照線が相応する位置に結果確認窓が具備されている診断キットを提供する。
【００１５】
好ましい実施態様として、前記診断キットは、様々な濃度の標的物質が含まれた検体に対する検査線と可変対照線の標準色票を含む標準シグナルデータを提供することを特徴とする。
【００１６】
他の好ましい実施態様として、前記診断キットは、肉眼により検査線と可変対照線からのシグナルの有無及び強度を測定することによって定量的又は半定量的分析を行うことができることを特徴とする。
【００１７】
さらに他の態様として、本発明は、前述のように、前記検体を前記接合体パッド又はそれ以前に位置したパッドに導入して展開させる段階（第１段階）、
検査線と可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を確認する段階（第２段階）、及び
検査線と可変対照線のシグナル強度と標準シグナルデータを比較して標的物質の量を決定し、
ここで、前記標準シグナルデータは、様々な既知濃度の標的物質を含む各検体を第１段階及び第２段階を行うことにより取得する段階（第３段階）から構成される、ラピッドテスト用ストリップを用いて検体中の標的物質の定性的又は定量的分析の方法を提供する。
【００１８】
さらに他の態様として、前記方法は、前記第２段階の検査線と可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）により確認することを特徴とする。
【００１９】
さらに他の態様として、本発明は、前記検体を固体支持体に吸収されたリガンドと反応させる段階を含む、検体中の一つ以上の標的物質の定性的又は定量的分析法を提供し、一つの標的物質に対して二つの異なる反応メカニズムが適用されることを特徴とする。
【００２０】
好ましい実施態様として、前記方法は、二つの異なる反応メカニズムがサンドイッチ反応及び競争的反応であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のラピッドテスト（rapid test）用ストリップは、可変対照線を具備するため、フック（hook）効果による標的物質の定量分析における問題を克服することができ、肉眼による検体中の定性分析だけでなく、信頼性の高い定量分析も迅速に行うことができる。さらに、検査線と可変対照線の補完効果により標的物質のダイナミックレンジの改善効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】通常の免疫クロマトグラフィー分析において使用される分析ストリップの断面を示す概要図である。
【図２】本発明の免疫クロマトグラフィー分析において使用される分析ストリップを示す概要図である。
【図３】本発明の免疫ラピッドテスト用ストリップにおける検体の導入前及び導入後の検査線、可変対照線及び不変対照線の様子を示す概要図である。
【図４】本発明の一実施態様によるラピッドテスト用ストリップの概要図である。
【図５】本発明の一実施態様による様々な検体の標的物質の濃度に対する分析結果を示す画像である。標的物質としてはヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が使用された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［発明を実施するための最良の形態］
前記目的を達成するための一態様として、本発明は、接合体パッド及び検出パッドを具備したラピッドテスト用ストリップを提供し、前記接合体パッドは標的物質と反応する第１所定量の第１リガンド及び第１リガンドと結合するシグナル検出標識物質を具備し、第１リガンド及び標識物質は、検体の展開前又は展開時に相互に連結され接合体を形成し、検体の展開時に接合体は検出パッドに展開することができ、前記検出パッドには、検査線及び可変対照線が相互に隔離されて具備されており、前記検査線には、検体中の標的物質と反応する第２リガンドが固定されており、及び前記可変対照線には、第１リガンドと反応する同様の標的物質又はその類似体の第２所定量の第３リガンドが固定されており、検体中の標的物質と結合していないベア接合体（Ｂａｒｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と反応可能な、ラピッドテスト用ストリップを提供する。
【００２４】
本発明は、検査線及び検体の展開を確認するための対照線だけが形成された検出パッドを具備した従来の分析ストリップにおいて、標的物質と同様の物質又は類似体が固定された可変対照線を追加することで、定性的分析だけでなく、信頼性の高い定量的分析も行うことができることを特徴とする。
【００２５】
さらに本発明は、特殊な分析器具を使用する必要がなく、肉眼により信頼性の高い半定量的分析を行うことができることを特徴とする。
好ましい実施態様において、本発明は、前記ラピッドテスト用ストリップが免疫クロマトグラフィー用ストリップであることを特徴とする。
【００２６】
本発明における用語「免疫クロマトグラフィー」とは、抗原-抗体反応に基づく免疫反応の原理と、検体及び試薬が移動相によって媒質に沿って展開する（migration）クロマトグラフィーの原理を結合させた分析方法である。つまり、多孔性膜に目的の抗体又は抗原を予め分注して固定し、その後、膜の一末端から前記固定した抗体又は抗原に向かって血液を展開させ、血液中の抗原又は抗体との反応を観察する。免疫反応は一般的な抗原-抗体の反応を意味する。しかし、本研究では抗原-抗体反応だけでなく、相互特異的に結合する受容体とリガンドの反応も広く含むが、これに制限されるものではない。さらに、免疫反応は酵素と基質間の反応など、相互特異的な認識により起こる反応も全て含む。
【００２７】
免疫クロマトグラフィー分析は、毛細管現象によって媒質（ｍｅｄｉａ）を通じて移動相と共に標的物質を含む検体が移動しながら行われる。従って、このような免疫クロマトグラフィーの展開のための媒質として、ストリップを製造して用いることができる。従って、このような免疫クロマトグラフィー分析として具体的な構成要素及びそれぞれの機能は後述する。
【００２８】
前記抗原-抗体反応を肉眼又はセンサーによって容易に確認できるようにするために、標識物質を用いることができる。標識物質が標的物質に結合できるように、標的物質に特異的に結合できるリガンドを標識物質に連結することができる。
【００２９】
本発明における用語「接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、前記標識物質と前記リガンドが相互連結して形成された結合体を意味するものであって、前記接合体は、シグナル検出のための標識物質と結合し、検体中の標的物質と反応する第１リガンドを含む。前記第１リガンドを後述する他のリガンドと区別するために、前記第１リガンドは、前記標識物質と結合し接合体を形成するリガンドを意味することにする。
【００３０】
本発明における前記第１リガンドは、標的物質と反応することのできる物質であって、標的物質と特異的に結合する物質を意味する。
前記標識物質と第１リガンドは、物理的又は化学的に連結させることができる。すなわち、標識物質と第１リガンドが手動吸着（passive adsorption）を介すか、又は反応性グループを持つように標識物質を改質させることによって第１リガンドとの共有結合を介して連結させることができるが、これに限定されるものではない。前記標識物質と第１リガンドとの連結は、当業者に公知の方法により行うことができる。
【００３１】
しかし、前記標識物質と第１リガンドは、ラピッドテスト用ストリップにおいて検体を展開させる前から接合体の形で接合体パッドに存在することができ、又は相互に連結されずに、個別に接合体パッドに存在した後、検体展開中にこれらが相互連結され接合体を形成する。いずれの場合においても、これらは接合体パッドに固定されていないため、検体展開時に前記標識物質と第１リガンドは、接合体の状態で検体パッドに移動することができる。
【００３２】
本発明における用語「標識物質」とは、肉眼又はセンサーによって感知することのできるシグナルを発生させる物質を意味する。前記標識物質は、コロイド性金（金粒子）、ラテックス粒子、着色ポリスチレン微小粒子、酵素、蛍光性色素、伝導性高分子、発光物質又は磁性粒子などであるが、これに限定されるものではない。さらに、前記シグナルは標識物質の内在的特性によって自律的に発生する発光であってもよく、外部の刺激によって発生する蛍光であってもよい。
【００３３】
本発明における用語「リガンド」とは、相互特異的に結合する物質を意味する。例えば、抗原に対して特異的に結合する抗体、特定の受容体に特異的に結合するリガンドなど相互にリガンドとして作用する物質を意味する。前記リガンドの非制限的な例としては、タンパク質、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はアプタマーであってもよい。さらに、本明細書のリガンドは、前述の特徴を示すものであれば限定されることなく如何なる物質であってもよい。本明細書全体において使用されるリガンドの意味は、特定の受容体に特異的に結合するリガンドを限定しない限り、前記で定義されたように相互特異的に結合する物質を意味する。
【００３４】
本発明の好ましい一実施態様において、前記標識物質と第１リガンドは予め相互連結され、接合体の形態で接合体パッドに存在することができる。この場合、前記標識物質と第１リガンドを個別に既知濃度の溶液により製造した後混合し、一定時間反応させ、接合体溶液を製造する。この接合体溶液を接合体パッドに分注し、接合体が具備された接合体パッドを製造する。この際、各溶液の濃度及び混合比率は、標識物質とリガンドの結合比を考慮して決定することができる。前記標識物質とリガンドの結合は、一つの標識物質に一つのリガンドが結合してもよく、一つの標識物質に複数個のリガンドが結合してもよく、又は複数個の標識物質が一つのリガンドに結合してもよい。具体的な結合比は重要ではないが、好ましい一態様として、一定の比率を維持してもよい。前記結合比は、標識物質とリガンドの種類によって変更することができ、これらの相対的な大きさ及び結合部位の量などを考慮して決定することができる。例えば、標識物質として数ミクロンサイズのラテックスビーズを使用する場合、また、リガンドとして抗体を使用する場合、複数個の抗体が一つのラテックスビーズに結合することができる。好ましくは、それぞれのラテックス表面に均等な量の抗体を結合させるために、抗体がラテックス表面で飽和され結合できるように抗体及びラテックス溶液の濃度及び混合比率を調節することができるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
前述のように、既知濃度の標識物質と第１リガンドを混合し反応させることで既知濃度の接合体溶液を取得することができる。前記接合体溶液は、一定濃度の接合体分子が溶液中に均等に分散している分散液の形態である。
【００３６】
前記ラピッドテスト用ストリップは、可変対照線を具備する免疫クロマトグラフィー用ストリップであって、標的物質と反応する第１所定量の第１リガンド及び第１リガンドに結合するシグナル検出標識物質を含む接合体パッド、及び検査線と可変対照線が隔離されて具備された検出パッドを含むことができる。
【００３７】
検体中の標的物質を定性分析だけでなく、定量的に分析するために、第３リガンドを検出パッドに固定し、「可変対照線（variable control line）」を形成した。本発明のラピッドテスト用ストリップの可変対照線には、検出パッドで流れる移動相（mobile phase）内のベア接合体（bare conjugate）と反応できるように、標的物質と同様の物質であるか、或いは第１リガンドと反応する標的物質の類似体を第３リガンドとして固定させることができる。検体中の標的物質と結合しないベア接合体は第１リガンドを含むので、前記第１リガンドは、標的物質と同様の物質又はその類似体、すなわち、第３リガンドと特異的に結合する。
【００３８】
さらに、前記第３リガンドの所定量を可変対照線に固定することができる。すなわち、前記第２所定量は、前記第３リガンドが可変対照線に固定された特定量を意味する。前記第２所定量の第３リガンドを固定することで、可変対照線のシグナル強度及び検体中の検出可能な標的物質の濃度範囲を調節でき、さらに信頼性の高い定量分析を可能にすることができる。
【００３９】
本発明における前記第３リガンドは、後述の他のリガンドから第３リガンドを区別するために、検出パッドに固定され可変対照線を形成するリガンドを意味する。
さらに、検体中の標的物質を検出するために、これと特異的に結合し選択的に捕獲することのできる第２リガンドを検出パッドに固定し、「検査線（test line）」を形成した。本発明のラピッドテスト用ストリップの検査線には、検出パッドで流れる移動相内の標的物質-接合体複合体、すなわち、標的物質と反応できるように、検体中の標的物質と反応する第２リガンドが固定されている。前記第２リガンドは、前記第１リガンドと同様の物質又はその類似体であるか、或いは標的物質と特異的に結合する第３の物質であってもよい。検体中の標的物質が移動相と共に展開される間に接合体パッド内の接合体と結合し複合体を形成する。このような複合体は標的物質を含み、前述のように第１リガンドは、標的物質と特異的に結合するため、前記第１リガンドと同様の物質或いはその類似体、又は標的物質と特異的に結合する第２リガンドは、標的物質との結合により前記複合体を検査線に捕獲させることができる。
【００４０】
本発明において、前記第２リガンドと後述する他のリガンドを区別するために、前記第２リガンドは、検出パッドに固定され検査線を形成するリガンドを意味する。
前述のように、免疫クロマトグラフィーは、媒質に沿って標的物質を含む移動相の展開に基づくクロマトグラフィーの原理を利用する。従って、本発明によるラピッドテスト用ストリップを用いた免疫分析には、標的物質を含む検体をストリップに沿って展開させるための移動相を必要とする。よって、本発明の免疫分析用キットは、緩衝液をさらに含むことができる。前記緩衝液は、ラピッドテスト用ストリップに沿って検体を移動させる移動相として機能し、また、接合体を溶解するための溶媒として機能することができる。必要に応じて、検体を希釈するための希釈液としての機能を果たす。例えば、全血分析をする場合、赤血球などの血球細胞を溶解させるための成分をさらに含むことができる。前記緩衝液とては、１０ｍＭ〜１Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液（PBS）、非イオン性或いは双イオン性界面活性剤、又はこれらの混合物など通常の緩衝液を制限なく使用することができ、抗原-抗体反応の目的とする反応の種類によって適宜選択することができる。
【００４１】
前記接合体パッドは、前述の標的物質と反応する第１所定量の第１リガンド及び第１リガンドに結合するシグナル検出標識物質を具備するパッドであって、前記第１リガンドと前記標識物質は、検体展開する以前から接合体の形態で連結されて接合体パッドに存在するか、又は相互に連結されることなく個別に接合体パッドに存在した後、検体が展開されるとともに、これらが相互に結合し接合体を形成することができる。
【００４２】
本発明において、前記第１所定量の第１リガンドのみが接合体パッド内に存在し得る。すなわち、前記第１所定量とは、接合体パッド内に存在する第１リガンドの特定量を意味する。接合体パッド内の第１リガンドが第１所定量で存在するため、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて、第１リガンドと標的物質が結合することによって形成される複合体の数が増加するのに対して、標的物質と結合しないベア接合体の数は減少し、反比例する。
【００４３】
好ましくは、前記接合体パッドは第１リガンドと標識物質が事前に相互に連結された接合体の形態で存在する。この際、前述のように、前記既知濃度の接合体溶液をパッドに適用して製造することができる。
【００４４】
さらに、前記接合体パッドは、内部対照群（internal control）として利用できるように、第４リガンドが標識物質と結合することによって形成された第２接合体をさらに含むことができる。前記第４リガンドとは、レポーター分子と特異的又は非特異的に反応することのできるリガンドを意味する。前記第２接合体は不変対照線のレポーター分子によって捕獲され、検体の展開を確認することができる。前記不変対照線及びレポーター分子に関するより具体的な説明は後述する。
【００４５】
前記検出パッドは、移動相と検体が展開されるための媒質であって、移動相と検体が検出パッドを構成する多孔性メンブレンの毛細管現象により移動することができる。さらに、前記検出パッドには、前記検査線と前記可変対照線が相互に隔離されて具備されており、検体の展開を確認するための不変対照線がさらに具備されている。前記検出パッドの一末端が前記接合体パッドに連結されてもよく、他の末端は検体の移動のための駆動力を提供する吸収パッドと連結されてもよい。前記接合体パッド及び前記吸収パッドは、検出パッド上に部分的に重畳されて位置することができる。前記検出パッドは、多孔性メンブレンから構成されてもよく、前記多孔性メンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン、ガラス繊維メンブレン、ポリエーテルスルホン（polyethersulfone、PES）メンブレン、セルロースメンブレン、ナイロンメンブレン又はこれらの組み合せであってもよいが、これに限定されるものではない。好ましくは、前記検出パッドは５〜１５μｍの気孔径を有するニトロセルロースメンブレンであってもよい。
【００４６】
本発明のラピッドテスト用ストリップを用いた定性的及び定量的分析の原理についてより具体的に説明する。
従来の分析ストリップにおいて、メンブレンパッド上に前記検査線が形成され、展開される標的物質-接合体複合体が検査線で捕獲されシグナルを発生する（サンドイッチ反応）。この際、シグナル強度は、標的物質の濃度が増加するにつれて増加する。しかし、前記標的物質の濃度が特定濃度を超えると、フック効果によりシグナル強度が低下する。このような現象は、従来の分析ストリップを用いた標的物質の定量分析をする上で大きな障害であった。
【００４７】
しかし、本発明のラピッドテスト用ストリップは、サンドイッチ反応だけでなく、接合体パッドにおいて第１所定量の第１リガンドが検体中の数量限定の標的物質に競争的に反応する特異的競争反応を一つのストリップに適用することを特徴とする。従って、従来の免疫クロマトグラフィー分析法に比べて、より迅速かつ便利な定量分析の実行を可能にする。
【００４８】
特に、液晶検体が本発明のラピッドテスト用ストリップの検体パッドに導入されると、移動相と検体の展開が始まる。接合体パッドにおいて、第１所定量の第１リガンドが検体中に数量限定の標的物質と競争的に反応する。第１所定量の第１リガンドの一部は、検体中の標的物質と反応し、前記第１リガンド及び標識物質を含む接合体に標的物質が結合した複合体を形成し、逆に標的物質と反応しなかった残りの第１リガンドはベア接合体として移動相と共に展開される。ここで、第１リガンドが第１所定量で維持されるため、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて前記形成された複合体の数が増加するのに対して、前記ベア接合体の量は減少する。
【００４９】
前記第１リガンド、標識物質及び標的物質を含む複合体は、展開中には第２リガンドと反応して検査線で捕獲されるのに対して、第１リガンドと標識物質を具備したベア接合体は、展開中には前記検体中の標的物質と結合せずに、第３リガンドと反応して可変対照線で捕獲される。前記複合体及びベア接合体は、第２リガンドが検査線に固定されており、第３リガンドが可変対照線に固定されているため、それぞれ検査線と可変検査線で捕獲される。
【００５０】
前記複合体とベア接合体はいずれも標識物質を含むことから、前記複合体とベア接合体が捕獲された検査線及び可変対照線上の標識物質からのシグナルを測定することで、検体中の標的物質の有無、量又は両方を測定することができる。
【００５１】
前述のように、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて前記複合体の数が増加し、逆に、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて前記ベア接合体の数は減少する。従って、ベア接合体が捕獲されている可変対照線からのシグナル強度は、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて低下する。
【００５２】
より具体的には、前記可変対照線からのシグナル強度は、検体中の標的物質の濃度がＭ値に達するまでは一定に維持されるが、前記シグナル強度は前記濃度がＭ値を超えると徐々に低下する。最終的にシグナル強度が０に収斂される。ここで、前記Ｍ値は、前記第２所定量で固定された全ての第３リガンドが前記ベア接合体に反応し飽和する場合における検体中の標的物質の最大濃度である。本発明の一実施例において、前記検体中の標的物質の濃度が０〜９０ｎｇ／ｍＬの範囲に達するまでは可変対照線からのシグナル強度が最も強いレベルで維持されるため、全ての第３リガンドが前記ベア接合体と反応していることが確認できる。従って、本実施例におけるＭ値は約９０ｎｇ／ｍＬであることが確認できる（実施例２）。しかし、前記Ｍ値は、第２所定量、第３リガンド及び標的物質の種類に応じて異なるため、分析目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００５３】
前述のように、検体の濃度が増加するにつれて検査線からのシグナル強度が増加する。しかし、前記検体の濃度が特定レベルを超えると、フック効果によりシグナル強度が低下する。本発明の標的物質の濃度増加による検査線及び可変対照線のシグナル強度パターンを図３に示す。
【００５４】
結果的に、前記検査線及び前記可変対照線上の標識物質からのシグナルを測定することにより標的物質の定性的及び定量的分析を行うことが可能である。より具体的に、前記検査線と可変対照線からのシグナルは、既知濃度の標的物質に対して予め完成しておいた標準シグナルデータと比較し、標的物質の濃度を分析することができる。前記濃度はシグナルの強度を肉眼で確認し、半定量的に分析することができ、また、濃度計（densitometer）のようなリーダー（reader）を使用してより厳密に定量的に分析することができる。
【００５５】
本発明における前記検出パッドには、検体の展開を確認することのできる不変対照線がさらに具備されており、レポーター分子は不変対照線に固定されてもよい。
本発明における用語「不変対照線（constant control line）」とは、検体又は検体中の標的物質の濃度に関係なく、一定のシグナルを発生する部分を意味する。前記不変対照線は、前記検査線及び前記可変対照線の形成と類似した方法を用いて形成することができる。しかし、前記可変対照線は、標的とする物質（analyte）とは結合せず、検体と共に移動相によって検出パッドに沿って移動する第２接合体の第４リガンドと特異的又は非特異的に結合し捕獲され得るリガンドを固定することで形成することができる。又は、前記不変対照線は、検体と共に移動相によって検出パッドに沿って移動する標識物質、又は標識物質が結合した別途の物質と特異的又は非特異的に結合して捕獲され得るリガンドを固定させて形成することができる。結果的に、検体中の標的物質の濃度及び存在の有無とは関係なく、一定のシグナルを発生させることのできる物質をリガンドとして固定させ、不変対照線を形成する。前記不変対照線で使用され得るリガンドは「リポーター分子」という用語を使用して表現しており、例えば、前記レポーター分子の例としては、抗ウサギＩｇＧ、抗トリＩｇＹ、ストレプトアビジン（Streptavidin）、ウシ血清アルブミンなどを含むことができる。
【００５６】
固定されるレポーター分子の濃度を変えることで、不変対照線を二つ以上形成することができる。前記不変対照線に固定されたレポーター分子の濃度が増加するほど、不変対照線が強いシグナルを一定に発生することができる。
【００５７】
前記不変対照線に特定濃度のレポーター分子を固定させる場合、そこから発生されるシグナル強度は一定レベルを維持するため、レポーター分子のシグナル強度に対応する検査線又は可変対照線におけるシグナル強度が決定される。複数の不変対照線は、レポーター分子の濃度を変えることで形成されることから、異なるシグナル強度を有する複数の不変対照線が形成される。これらのシグナル強度は定量分析のために検査線又は可変対照線と比較される。すなわち、前記不変対照線は内部標準シグナルデータとして活用することができる。
【００５８】
例えば、二つの不変対照線が形成され、シグナル強度１と３を発生すると仮定した場合、既知濃度の標的物質に基づいて、検査線がシグナル強度１の場合、標的物質の濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、検査線がシグナル強度３の場合、標的物質の濃度が３０ｎｇ／ｍＬであるということを予めて決めることができる。未知濃度の標的物質の結果、検査線がシグナル強度２を示す場合、シグナル強度が、不変対照線のシグナル強度に比べて二つの不変対照線間の中間値に相当するシグナル強度であることを容易に確認することができる。
【００５９】
前記検査線、前記可変対照線及び前記不変対照線の大きさ及び位置は、使用される抗原-抗体反応によって適宜選択することができるが、これに限定されるものではない。前記不変対照線のシグナルの有無から成功的な検体の展開を確認することができ、検査線と可変対照線のシグナル強度を予め決定された標準シグナルデータと比較することで標的物質の定量分析を行うことができる。前記標準シグナルデータについては後述する。
【００６０】
本発明において、検査線及び可変対照線のシグナル強度による定量分析の場合、検体中の標的物質のダイナミックレンジ（dynamic range）は１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであってもよい。本発明の一実施例において、検体中の標的物質を分析した結果、検体中の標的物質のダイナミックレンジが５〜１００,０００ｎｇ／ｍＬと広いことを確認した（実施例２）。すなわち、従来の分析ストリップは、検体中の標的物質の濃度が特定の濃度を超えると、フック効果により、検査線のシグナル強度が低下する現象を示すことは前述した通りである。しかし、本発明のラピッドテスト用ストリップは、検体中の標的物質の濃度が増加するにつれて徐々に低下する可変対照線をさらに含んでおり、前記可変対照線はフック効果による影響を受けないため、検査線のみ有する従来のストリップの限界を示すダイナミックレンジを、検査線と可変対照線の組み合わせによりフック効果が発生する範囲まで広げたことを特徴とする。しかし、前記ダイナミックレンジは、標的物質の種類、検出パッド上に固定されるリガンドの量及びシグナル検出装置などによって異なってもよく、本発明のダイナミックレンジが前記範囲で限定されるものではない。
【００６１】
本発明におけるラピッドテスト用ストリップについてより具体的に説明する。本発明の前記ラピッドテスト用ストリップは、目的の標的物質を含む検体が導入された検体パッド、一末端が前記検体パッドと連結される前記接合体パッド、一末端が前記接合体パッドの他の末端と連結される前記検出パッド、一末端が前記検出パッドの他の末端と連結され、前記検体パッドから検体移送のための駆動力を提供する吸収パッド、及び前記ラピッドテスト用ストリップの下部に位置する固体支持体を含んでもよい。本発明のラピッドテスト用ストリップにおける構成図を図２に示す。
【００６２】
前記固体支持体はニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（PolyVinylidene DiFluoride、PVDF）、ガラス及びプラスチックからなる群より選択される材料により形成されてもよい。前記固体支持体上にストリップを付着し、ストリップの耐久性を高めることで、取り扱い及び保管を容易にすることができる。
【００６３】
さらに、追加的な外部ケース装着を容易にすることができる。前記固体支持体として使用されるプラスチックの材質はポリプロピレンフィルム、ポリエステルフィルム、ポリカーボネートフィルム、アクリルフィルムなどであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明の他の一態様として、ケース内に装着された本発明のラピッドテスト用ストリップキットを含み、下部のケースにはガイド及びストリップ支持体が含まれ、上部のケースには検体投入口が形成され、及び検査線及び可変対照線に相応する位置に結果確認窓が具備されるものである診断キットを提供する。
【００６５】
本発明の前記ラピッドテスト用ストリップがケース内にさらに装着されてもよい。下部のケース内部にはラピッドテスト用ストリップを適切な位置に配置させるための複数のガイド及び／又はストリップ支持体を含むことができる。選択的に、下部のケースのガイド及びストリップ支持体の位置に対応する位置の上部のケースに前記ガイドとストリップ支持体をさらに含むことができる。すなわち、前記ガイド及び／又はストリップ支持体は必要に応じて下部のケースに形成されるか、或いは上部のケースと下部のケースの両方に形成されてもよい。さらに、上部のケースには検体投入口及び検査線、可変対照線及び不変対照線に対応する位置に標識物質からのシグナルを検出するための結果確認窓を含むることができる。前記検体投入口は、検出パッドの一末端に、すなわち、検査線に対する吸収パッドの反対側の末端であると共に、検体がメンブレンに沿って展開できるように検査線と十分に離隔された地点にホール又はスリットなどの形で形成される。前記結果確認窓は、検出パッド上に検査線及び可変対照線が位置した位置、及び／又は必要に応じて、不変対照線がさらに形成される場合、不変対照線を含み、肉眼又はセンサーにより十分に確認することのできる大きさで形成される。前記検査線、可変対照線及び不変対照線を確認できるものであれば、その大きさ及び形に限定されることなく形成される。
【００６６】
前記上部のケース及び下部のケースは一般的なプラスチック素材を用いて製造することができ、例えば、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン（acrylonitrile butadiene styrene、ABS）などであってもよいが、これに限定されるものではない。前記上部のケース及び下部のケースは別に製作することができ、結合溝及び結合突起など通常の手段で結合する。或いは、一体型（integrated form）として製造されてもよい。
【００６７】
さらに、前記診断キットは、様々な濃度の標的物質が含まれた検体に対して検査線と可変対照線の標準色票を含む標準シグナルデータと共にさらに提供されてもよい。
本発明に使用される、前記標準シグナルデータとは、様々な既知濃度の標的物質が含まれた検体に対して、本発明のラピッドテスト用ストリップを用いて、検査線と可変対照線におけるシグナル強度を要約したデータを意味する。これらの標準シグナルデータは異なる方法で要約することができ、代表的に各標的物質の濃度に対応する検査線と可変対照線の色で要約することができる。同様に、ｐＨを測定するためのリトマス試験紙により検討することができ、それぞれのｐＨに対応する試験紙の色を整理した標準色票を共に提供する。特に、前記標準色票を含む標準シグナルデータを使用する場合、肉眼のみでも標的物質のシグナル強度と標準シグナルデータを容易に比較することができるため、簡単かつ迅速に半定量的分析が可能である。これと関連して、前記診断キットは、前記検査線と前記可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を肉眼で確認することで、定性的又は半定量的な分析を行うために使用することができる。言い換えると、前記キットに検体を適用した後、検査線と可変対照線からのシグナルの有無と強度を、提供された標準色票を含む標準シグナルデータと肉眼により比較することで、検体中の標的物質の有無及びその濃度を分析することができる。
【００６８】
さらに他の態様として、本発明は前記ラピッドテスト用ストリップを用いて検体中の標的物質を定性又は定量分析する方法として検体を前記接合体パッド又はそれ以前に位置したパッドに導入して展開させる第１段階、検査線と可変対照線の標識物質からのシグナルの有無及び強度を確認する第２段階、及び検査線と可変対照線のシグナル強度と標準シグナルデータを比較して標的物質の量を決定する第３段階を含み、前記標準シグナルデータは、様々な既知濃度の標的物質が含まれた各検体について第１段階及び第２段階を行うことにより取得する分析方法を提供する。
【００６９】
さらに他の態様として、本発明は、固体支持体に吸収された検体とリガンドの反応を含む検体中の一つ以上の標的物質の定性又は定量分析法を提供し、一つの標的物質に対して二つの異なる反応メカニズムが適用されることを特徴とする。前記本発明の方法に適した二つの異なる反応メカニズムはサンドイッチ反応及び競争的反応であってもよい。
【００７０】
本発明のラピッドテスト用ストリップを用いて検体中の標的物質を定性及び／又は定量分析する方法に関する詳細な原理は、前述のとおりである。また、標準シグナルデータも前述のとおりである。
【００７１】
具体的な分析方法は下記の順に行うことができる。まず、目的の標的物質を含む液状検体を前記接合体パッド又はそれ以前に位置したパッドに導入することができる。すなわち、前記液状検体は、検体を接合体パッドに導入することによってストリップに導入することができるが、好ましくは接合体パッド以前、例えば、検体パッドに投入して導入することができる。さらに、前記検体にＰＢＳのような緩衝液を加え均等に混合した後、これを同様の方法でストリップに導入することができる。
【００７２】
前記検体がラピッドテスト用ストリップにローディング（導入）されると、前記検体の展開（migration）が始まり、その後、不変対照線によって検体の成功的な展開を確認することができる。検体の成功的な展開が確認されると、検査線と可変対照線からの標識物質のシグナルの有無及び強度が確認される。検査線から観察されたシグナルは検体中に標的物質が含まれていることを示す（定性分析）。さらに、検査線及び可変対照線のシグナル強度と、標準シグナルデータを比較することで、検体中の標的物質の濃度を決定することができる（定量分析）。
【００７３】
本発明の具体的な一実施態様では、可変対照線をさらに含むラピッドテスト用ストリップを用いたヒト免疫グロブリンＧ（ｈｕｍａｎＩｇＧ；標的物質）の分析を行った。その結果、検体中の標的物質の濃度が５〜１００,００ｎｇ／ｍＬの範囲でフック効果が発生したにも関わらず、肉眼により信頼性の高い定量分析が可能であることを確認した（表１及び図５）。
【００７４】
本発明の免疫分析のための検体は、哺乳類、好ましくはヒトから分離した全血、血球、血清、血漿、骨髄液、汗、尿、涙、唾液、皮膚、粘膜、毛髪など全ての生体試料を含んでもよい。好ましくは、前記検体は血液である。前記血液は、血球を除去した血清又は血漿であってもよい。全血を用いる場合、血球を溶解するための成分を緩衝液に添加してもよい。これは、例示的なものであって、本発明の免疫分析のための検体は特に限定されるものではない。
【００７５】
本発明の免疫分析方法は、マラリア抗原（Ag）、エイズ（HIV）、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、梅毒、胃潰瘍原因菌、腫瘍マーカー（AFP、PSA、CEA）、結核、ＳＡＲＳ、デング熱、ハンセン病など主に全血を検体として使用する疾病の診断に有効である。
【００７６】
［発明を実施するための形態］
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１： ラピッドテスト用ストリップの製造
Ａ．検査線、可変対照線及び不変対照線が形成された検出パッドの作製
３つの分析線をニトロセルロース膜に設けた。ラミネーター（laminator）を用いてニトロセルロース膜をプラスチックカードに積層（lamination）した。その後、検査線の第２リガンドとしてはヤギ抗-ヒト免疫免疫グロブリン（anti-human IgG from goat、Arista、USA）を、可変対照線の第３リガンドとしてはヒト免疫グロブリン（human IgG）を、不変対照線のレポーター分子としてはウシ血清アルブミン（BSA）を用い、これをそれぞれ自動分注機を利用して分注した後、２５〜３０℃で２日間（４８時間）乾燥させた。
【００７８】
Ｂ．接合体パッドの製作
０．５％ポリビニルアルコール（polyvinylalcohol、PVA）が含まれたトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）でパッドを十分に濡らし、乾燥機で完全に乾燥し接合体パッドを前処理した。
【００７９】
直径が約４０ｍｍのコロイド性金粒子（colloidal gold particle）とヤギ抗-ヒト免疫グロブリン（anti-human IgG from goat）が結合した第１接合体溶液を準備し、さらに、直径が約４０ｍｍのコロイド性金粒子ストレプトアビジン（streptavidin）が結合した第２接合体溶液を準備した。前記第１接合体溶液及び第２接合体溶液を前処理パッドに適用し完全に乾燥させた。引き続き、前記パッドを適切な大きさに切断し準備した。
【００８０】
Ｃ．検体パッドの製作
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡが含まれた０．０８Ｍのホウ酸塩緩衝液に検体パッドを十分に濡らし乾燥機で完全に乾燥させた。引き続き、前記パッドを適切な大きさに切断した。
【００８１】
Ｄ．吸収パッドの製作
吸収パッドは乾燥機で水分を完全に乾燥させ、如何なる処理もせずにそのまま使用した。引き続き、前記パッドを適切な大きさに切断した。
【００８２】
Ｅ．ラピッドテスト用ストリップの製作
前記の手順によって準備された検出パッド、接合体パッド、検体パッド及び吸収パッドを図４に示す構造台に組み立てる。
【００８３】
すなわち、シールが付着した検体パッドを接合体パッドの一末端と重畳するように付着し、検出パッドの他の一末端を前記接合体パッドの他の一末端と重畳するように付着し、検出パッドの他の一末端は上段表示用シールを付着した吸収パッドの一末端と相互重畳するようにして付着した。この集合体を切断機を利用して約２±１．０ｍｍのサイズに切断し、最終的に図４のようなストリップを製造した。
【００８４】
図４において、それぞれの符号の説明が意味するところは以下のとおりである。
１：検体パッド；１６±４×４±２ｍｍ
２：抗-ヒト免疫グロブリンと金粒子の接合体パッド；６±１．０×４±２ｍｍ
３：ニトロセルロース検出パッド；２５±５×４±２ｍｍ
４：プラスチック固体支持体
５：吸収パッド；１８±４×４±２ｍｍ
６：抗-ヒト免疫グロブリンが固定された検査線
７：ヒト免疫グロブリンが固定された可変対照線
８：ウシ血清アルブミンが固定された不変対照線
実施例２： ラピッドテスト用ストリップを利用した免疫分析
９５ウェルプレートに、標的物質であるヒト免疫グロブリン（human IgG）とリン酸塩緩衝液（PBS）を含む検体溶液を１００μＬずつ分注した。前記検体溶液は、０ｎｇ／ｍＬ、５．６ｎｇ／ｍＬ、１１．２ｎｇ／ｍＬ、２２．５ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１８７ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１．５μg／ｍＬ、３．１２μg／ｍＬ、６．２５μg／ｍＬ、１２．５μg／ｍＬ、２５μg／ｍＬ、５０μg／ｍＬ、又は１００μg／ｍＬの濃度のヒト免疫グロブリンを用いて準備した。
【００８５】
前記実施例１によって作製されたラピッドテスト用ストリップを、前記検体溶液が入っている９６ウェルプレートに入れて１０分間展開させた。
図５は、標的物質としてのヒト免疫グロブリンの濃度によるクロマトグラフィー用ストリップの展開結果を示した画像である。
【００８６】
さらに、検査線、可変対照線及び不変対照線からのシグナル強度を肉眼で確認し、下記表１に示した。これと関連して、それぞれのシグナル強度は色彩強度で判断し、最も高い色彩強度を任意で５とし、最も低い色彩強度を０にした。
【００８７】
【表１】
2016520200.tif 000003
【００８８】
表１に示すように、検体中の標的物質（IgG）の濃度が増加するにつれて検査線のシグナル強度が徐々に増加し、約３７５ｎｇ／ｍＬ〜７５０ｎｇ／ｍＬで最も強く観察された。その後、シグナル強度は徐々に低下し、これは、前述のフック効果によるものである。従って、検査線のシグナル強度だけを用いて前記標的物質を定量的に分析することはできない。
【００８９】
例えば、検査線のシグナル強度が２の場合、検体中の標的物質（IgG）の濃度が４０ｎｇ／ｍｌ及び約１０μｇ／ｍｌの付近で観察された。検査線が同様のシグナル強度を示したとしても、標的物質の濃度は異なることがある。
【００９０】
しかし、可変対照線のシグナル強度は、検体中の標的物質（IgG）の濃度が増加するにつれて徐々に低下する。詳細には、０〜９０ｎｇ／ｍＬまでの標的物質の濃度でシグナル強度が最も高いレベルの５にほとんど維持されることが確認された。このように標的物質の濃度が低い場合は、前記検査線でフック効果が発生しないため、検査線のシグナル強度によって標的物質の濃度を決定することができる。標的物質の濃度が増加する場合、検査線はフック効果の発生によりシグナル強度が不規則となる。しかし、可変対照線はシグナル強度が持続的に低下するので、可変対照線によって前記標的物質の濃度を分析することができる。
【００９１】
例えば、検査線のシグナル強度が２の場合、前述のように、前記標的物質が約４０ｎｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬの２つの濃度を有する。しかし、前記可変対照線は２つの濃度に対してシグナル強度が５又は２で現れるため、検査線のみを用いた従来の方法と違って、前記濃度を定量的に測定することができることを示す。
【００９２】
さらに、前記ラピッドテスト用ストリップは、標的物質が５ｎｇ／ｍＬ〜１００,０００ｎｇ／ｍＬまでの広いダイナミックレンジを有することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のラピッドテスト用ストリップは、可変対照線を有するため、フック効果により検体の定量分析の際に発生する問題を克服できると共に、検体中の肉眼による定性分析だけでなく、信頼性の高い定量分析を迅速に行うことができる。さらに、標的物質のダイナミックレンジを検査線と可変対照線の補完的効果により改善できる効果がある。
【図４】
2016520200.tif 000004
【図１】
2016520200.tif 000005
【図２】
2016520200.tif 000006
【図３】
2016520200.tif 000007
【図５】
2016520200.tif 000008
【国際調査報告】
2016520200.tif 000009
2016520200.tif 000010