(57)【要約】  薬剤の調製における活性成分の使用を開示する。当該薬剤は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現量を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現量を減少させるために使用され、特に血糖を調節するために使用することができ、活性成分は次の群から選択される。式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせ。式（Ｉ）では、ＸはＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、ＹおよびＺのいずれか１つは式（Ｉ’）であり、他方の１つはＨ、ＯＨまたは式（Ｉ’’）であり、かつ、Ｙが式（Ｉ’）の場合、Ｚは式（Ｉ’’）であり、Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない。2016520102.tif 000050【選択図】図１１
2016520102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分は、式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択され、
【化１】
2016520102.tif 000034
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化２】
2016520102.tif 000035
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化３】
2016520102.tif 000036
であり、かつ、Ｙが
【化４】
2016520102.tif 000037
の場合、Ｚは
【化５】
2016520102.tif 000038
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない、
血中グルコースレベルを調節するための薬剤の製造における活性成分の使用。
【請求項２】
活性成分は、式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択され、
【化６】
2016520102.tif 000039
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化７】
2016520102.tif 000040
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化８】
2016520102.tif 000041
であり、かつ、Ｙが
【化９】
2016520102.tif 000042
の場合、Ｚは
【化１０】
2016520102.tif 000043
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない、
ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるための薬剤の製造における活性成分の使用。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの２つがＯＨである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＸはＣ１−Ｃ３のアルキルである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物は、構造式（Ａ）であって、
【化１１】
2016520102.tif 000044
式中、Ｘａは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
Ｒ１ａからＲ１３ａは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ａからＲ３ａは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ａおよびＲ９ａは同時にＨとなることはない、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
ＸａはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ａ、Ｒ２ａおよびＲ３ａのうちの２つがＯＨである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）である、請求項５に記載の使用。
【化１２】
2016520102.tif 000045
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物は、構造式（Ｃ）であって、
【化１３】
2016520102.tif 000046
式中、Ｘｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
Ｙｃは、Ｈ、ＯＨまたは
【化１４】
2016520102.tif 000047
であり、および、
Ｒ１ｃからＲ１３ｃは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ｃからＲ３ｃは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ｃおよびＲ９ｃは同時にＨとなることはない、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項９】
ＸｃはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ｃからＲ３ｃのうちの２つがＯＨである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）の化合物は、化合物（２）である、請求項８に記載の使用。
【化１５】
2016520102.tif 000048
【請求項１１】
前記活性成分は、化合物（１）、前記化合物（１）の薬学的に許容される塩、化合物（２）、前記化合物（２）の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【化１６】
2016520102.tif 000049
【請求項１２】
前記活性成分は、前記化合物（１）、前記化合物（２）、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記活性成分は、抽出物で使用される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抽出物は、カンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記カンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物は、（ａ）抽出溶液を提供するために極性溶媒を用いてカンカニクジュヨウを抽出する工程、および、（ｂ）任意にて前記抽出溶液を乾燥させる工程、を含む方法によって調製され、
前記極性溶媒は、水、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記極性溶媒は、水、メタノール、エタノール、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤は、１型糖尿病の治療のために使用される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬剤は、２型糖尿病の治療のために使用される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬剤は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加させることにより、糖尿病、神経障害、心血管疾患および肥満の治療のために使用される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬剤は、ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させることにより、糖尿病の治療のために使用される、請求項２に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬剤は、１日毎に（前記式（Ｉ）の化合物で）約０．５ｍｇ／ｋｇ−体重から（前記式（Ｉ）の化合物で）約１００ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬剤は、１日毎に（前記式（Ｉ）の化合物で）約１ｍｇ／ｋｇ−体重から（前記式（Ｉ）の化合物で）約５５ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、請求項１または２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるため、ならびに特にそれを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するための薬剤に関し、特に、糖尿病治療においてカンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物から利用可能な活性成分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、生体組織中の不十分なインスリン分泌またはグルコースの非有効利用によって引き起こされる慢性代謝疾患であり、過剰な高血中グルコースレベルにつながる。インスリンは膵臓のβ細胞によって分泌されることが知られている。インスリンは血糖の調節において有効であり、脂肪細胞および筋肉細胞中のグルコース輸送を刺激し得る。肥満、老化および他の理由で、不十分なインスリン分泌またはインスリン感受性の欠乏を引き起こす可能性があり、血中グルコースレベルの増加および糖尿病をもたらす。糖尿病患者は、喉の渇き、過度の排尿、視力障害および体重減少等の症状に苦しむことがある。長期間にわたる高血糖値は、様々な臓器の機能障害および不調に繋がり得る。
【０００３】
糖尿病は、主に、１型糖尿病と２型糖尿病とに分類することができる。インスリン依存性糖尿病としても知られている１型糖尿病は、患者自身の免疫系の膵臓のβ細胞への攻撃を誘発する感染または環境毒素によって引き起こされる。その結果、膵臓のβ細胞は損傷を受けて、絶対的なインスリン欠乏をもたらし、血糖値の上昇を引き起こす。１型糖尿病は、全ての糖尿病患者の約５％から１０％に数えられる。１型糖尿病のほとんどの患者は３０歳前に診断され、そのため１型糖尿病は若年性糖尿病としても知られている。
【０００４】
２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病としても知られている。２型糖尿病のほとんどの患者は４０歳後に診断され、そのため成人発症型糖尿病としても知られている。２型糖尿病は、全ての糖尿病患者の約９０％から９５％に数えられる。２型糖尿病は、細胞内で生成するインスリン抵抗性によって引き起こされ、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌が徐々に減少して、糖尿病代謝性疾患を引き起こす。２型糖尿病の患者は、しばしば、高脂血症、肥満および他の症状に同時に罹患している。２型糖尿病の危険因子には、遺伝子異常、糖尿病家系、年齢、肥満（特に腹部肥満）、運動不足、妊娠糖尿病およびグルコース恒常性障害等が含まれる。
【０００５】
糖尿病の罹患率は年々増加している。２００８年の世界保健機関によると、２０３０年には、世界的に３億人より多くの人々が糖尿病となっているだろうと予測している。現在、運動、ダイエットおよび薬剤治療を含む糖尿病の臨床的治療方法が利用されている。薬剤治療は、インスリン注射、ならびに、スルホニル尿素薬（スルホニル尿素）、ビグアナイド薬（ビグアナイド）、α−グルコシダーゼ阻害剤およびインスリン増感剤等の経口血糖降下薬を含む。
【０００６】
本発明者らは、式（Ｉ）の化合物が、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現の増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現の減少において優れた効果を有し、血中グルコースの低下に効果的であり、従って、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するため、特にそれを必要とする対象の１型糖尿病および／または２型糖尿病を治療するために使用することができるということを見出した。
【化１】
2016520102.tif 000003
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化２】
2016520102.tif 000004
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化３】
2016520102.tif 000005
であり、かつ、Ｙが
【化４】
2016520102.tif 000006
の場合、Ｚは
【化５】
2016520102.tif 000007
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、次に示す化合物（１）および化合物（２）の少なくとも１つであり、カンカニクジュヨウ抽出物等の植物抽出物から得ることができる。
【化６】
2016520102.tif 000008
【０００７】
カンカニクジュヨウ抽出物は、オニク属（ｇｅｎｕｓ  Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ）に属する。カンカニクジュヨウの主たる活性成分は、エキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドを含む、フェニルエタノイド配糖体である。伝統中国医学の上海大学の研究チーム（中国）は、肝細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグルコース消費分析を行い、異なる薬剤により誘発させた１型糖尿病または２型糖尿病を持つマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤誘発性低血糖有効性試験を行った。その結果、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ）から得たアクテオシドは、グルコースの消費の促進に有効であり、血清インスリンレベルを向上させることにより空腹時血中グルコースレベルを低下させることができるということが示された（特許文献１参照、当該開示は参照により全体においてここに具体的に組み込まれる）。そこで、本発明では、カンカニクジュヨウ抽出物の活性成分を、糖尿病の動物モデルおよび肝グルコース消費試験を用いて判定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０２２８３８５４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、薬剤の製造における活性成分の使用を提供することであり、当該薬剤は、ＳＩＲＴ１（サーチュイン１）のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３（サイトカインシグナル伝達３のサプレッサー）のｍＲＮＡの発現を減少させるものであり、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するために使用することができる。活性成分は、式（Ｉ）の化合物、当該式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択され、
【化７】
2016520102.tif 000009
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化８】
2016520102.tif 000010
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化９】
2016520102.tif 000011
であり、かつ、Ｙが
【化１０】
2016520102.tif 000012
の場合、Ｚは
【化１１】
2016520102.tif 000013
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／もしくはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させる方法、または、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するための方法を提供することであり、式（Ｉ）の化合物、当該式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される有効成分の有効量を対象に投与することを含む。
【００１１】
本分野における当業者が特許請求の範囲の発明の特徴をよく理解できるように、本発明を実践するための詳細な技術および好ましい実施の形態を、添付する図面と共に以下の段落において記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】異なる条件で処置されたスプラーグ−ドーリー（ＳＤ）ラットの体重を示す曲線図である。
【図２】異なる条件で処置されたＳＤラットのカロリー摂取を示す曲線図である。
【図３】異なる条件で処置されたＳＤラットの血漿グルコース濃度を示す曲線図である。
【図４】異なる条件で処置されたＳＤラットの血漿グルコース濃度の曲線下面積を示す棒グラフの図である。
【図５】異なる条件で処置されたＳＤラットの血漿一酸化窒素（ＮＯ）濃度を示す曲線図である。
【図６】異なる条件で処置されたＳＤラットの血漿ＴＮＦ−α濃度を示す曲線図である。
【図７】異なる条件で処置されたＳＤラットの血漿ＩＬ−６濃度を示す曲線図である。
【図８】異なる条件で処置されたＳＤラットの視床下部の脳組織におけるＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す曲線図である。
【図９】異なる条件で処置されたＳＤラットの視床下部の脳組織におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現レベルを示す曲線図である。
【図１０】異なる条件で処置された肝細胞を使用することにより行われた炭水化物消費分析を示す図である。
【図１１】異なる条件で処置された肝細胞を使用することにより行われた炭水化物消費分析を示す図である（用量依存性を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明のいくつかの実施の形態について詳細に記載する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施の形態において実施されてもよく、明細書中に記載する実施の形態に限定されるべきではない。加えて、別段の記載がない限り、本発明の明細書中（特に、特許請求の範囲中）に示される“１つの（ａ）”、“当該（ｔｈｅ）”またはそれに類似する表現は、単一および複数形の両方を含むべきである。さらに、本明細書で使用される“有効量”という用語は、投与された時に、被験対象において治療を受ける症状が少なくとも部分的に緩和し得る化合物の量を示す。本明細書で使用される“対象”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む、哺乳動物を示す。“治療”または“治療する”という用語は、特定の疾患および／もしくは障害の予防、特定の疾患および／もしくは障害の改善、ならびに／または、特定の疾患および／もしくは障害の予防または排除を含む。“対象の血中グルコースレベルを調節する”という用語は、対象の血中グルコースの濃度を通常の値に向けて変化させることを示す。本明細書で使用される“ｍｇ／ｋｇ−体重”という単位は、１ｋｇ体重毎に必要とする用量を意味する。
【００１４】
本発明は、薬剤の製造における活性成分の使用を提供し、当該薬剤は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／もしくはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるものであり、または、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するためのものである。当該活性成分は、式（Ｉ）の化合物、当該式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択され、
【化１２】
2016520102.tif 000014
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化１３】
2016520102.tif 000015
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化１４】
2016520102.tif 000016
であり、かつ、Ｙが
【化１５】
2016520102.tif 000017
の場合、Ｚは
【化１６】
2016520102.tif 000018
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない。
【００１５】
式（Ｉ）において、好ましくは、Ｘはメチル、エチル、直鎖状プロピルまたは分岐状プロピル等のＣ１−Ｃ３のアルキルであり、ＹおよびＺの両方はＨではなく、および／または、Ｒ１からＲ３のうちの２つはＯＨである。Ｘは、より好ましくはメチルである。
【００１６】
本発明の１つの好ましい実施の形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下に示す構造式（Ａ）であって、
【化１７】
2016520102.tif 000019
式中、Ｘａは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、および、
Ｒ１ａからＲ１３ａは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ａからＲ３ａは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ａおよびＲ９ａは同時にＨとなることはない。
【００１７】
式（Ａ）において、好ましくは、Ｘａはメチル、エチル、直鎖状プロピルまたは分岐状プロピル等のＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ａからＲ３ａのうちの２つはＯＨである。より好ましくは、Ｘａはメチルである。さらに好ましくは、Ｘａはメチルであり、Ｒ１ａからＲ３ａのうちの２つはＯＨであり、かつＲ８ａおよびＲ９ａの両方はＯＨである。式（Ａ）の当該化合物の実施の形態は、化合物（１）（すなわち、エキナコシド）である。
【化１８】
2016520102.tif 000020
【００１８】
本発明の別の好ましい実施の形態では、式（Ｉ）の化合物は、構造式（Ｃ）であって、
【化１９】
2016520102.tif 000021
式中、Ｘｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
Ｙｃは、Ｈ、ＯＨまたは
【化２０】
2016520102.tif 000022
であり、および、
Ｒ１ｃからＲ１３ｃは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ｃからＲ３ｃは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ｃおよびＲ９ｃは同時にＨとなることはない。
【００１９】
式（Ｃ）において、好ましくは、Ｘｃはメチル、エチル、直鎖状プロピルまたは分岐状プロピル等のＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ｃからＲ３ｃのうちの２つはＯＨである。より好ましくは、Ｘｃはメチルである。さらに好ましくは、Ｘｃはメチルであり、Ｒ１ｃからＲ３ｃのうちの２つはＯＨであり、かつＲ８ｃおよびＲ９ｃの両方はＯＨである。式（Ｃ）の当該化合物の実施の形態は、化合物（２）（すなわち、イソアクテオシド）である。
【化２１】
2016520102.tif 000023
【００２０】
従って、本発明のある実施の形態では、活性成分は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／もしくはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるため、または、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するための薬剤の製造において使用され、当該活性成分は、化合物（１）、化合物（１）の薬学的に許容される塩、化合物（２）、化合物（２）の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される。
【化２２】
2016520102.tif 000024
【００２１】
上記に示した活性化合物の薬学的に許容される塩の例には、ナトリウム塩またはカリウム塩等のアルカリ金属塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明によると、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／もしくはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるため、または、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するための薬剤は、化合物（１）、化合物（２）、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される活性成分を使用して製造することができる。これらの実施の形態では、活性成分はカンカニクジュヨウ等の植物を抽出することにより提供され得るので、当該活性成分は抽出物として使用され得る。
【００２３】
化合物（１）および／または化合物（２）を含むカンカニクジュヨウ抽出物は、次の工程を含む方法により調製することができる。（ａ）抽出溶液を提供するために極性溶媒を用いてカンカニクジュヨウを抽出する工程、および（ｂ）任意にて当該抽出溶液を乾燥させる工程。極性溶媒は、水、および／または、メタノール、エタノール、エチレングリコール、プロパノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ブチレングリコールもしくはこれらの組み合わせ等のＣ１−Ｃ４のアルコールである。
【００２４】
極性溶媒は、好ましくは、水、メタノール、エタノールおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される。極性溶媒は、より好ましくは、水、エタノールまたはこれらの組み合わせである。極性溶媒およびカンカニクジュヨウの量は、任意にて調整され得る。一般的に、極性溶媒とカンカニクジュヨウとの容量比率は、約１：１から約５０：１の範囲、好ましくは約５：１から約２０：１の範囲でよい。
【００２５】
カンカニクジュヨウ抽出物の提供に使用するためのカンカニクジュヨウの部分は、限定されない。例えば、カンカニクジュヨウ抽出物は、カンカニクジュヨウの茎、花または植物全体を抽出して、提供することができる。本発明の１つの実施の形態によると、カンカニクジュヨウの水気の多い茎が、抽出物を提供するために使用された。
【００２６】
工程（ａ）において、抽出は、所望の抽出効率を達成するための時間の間行われる。例えば、極性溶媒として水が使用された時、抽出時間は、通常、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、およびより好ましくは少なくとも６０分間である。任意にて、抽出効率を向上させるために、抽出は他の適切な抽出手法（例えば、煮熱、冷却、濾過、減圧下での濃縮および樹脂カラムクロマトグラフィー等）を伴ってもよい。任意にて、同様または異なる溶媒を用いて抽出工程（ａ）を１または複数回繰り返して、全ての液相を組み合わせてもよく、すると、当該植物に含有される活性成分を可能な限り抽出した、工程（ｂ）のための抽出溶液を提供し得ることができる。さらに、不活性成分を可能な限り除去するために、１または複数回、工程（ａ）および工程（ｂ）のサイクルを繰り返してもよい。
【００２７】
本発明による１つの実施の形態では、カンカニクジュヨウ抽出物は、次の方法によって調製された。カンカニクジュヨウを水中に浸し煮熱および濾過して、当該サイクルを３回繰り返した。異なるサイクルからの濾液を組み合わせ、１．１０の比重を有する濃縮物を提供するように真空下で濃縮した。その後、６０％の濃度になるように濃縮物中にエタノールを添加して、次いで１２時間冷蔵した。上清を回収し、１．１０の比重を有する粗抽出物を提供するように真空下で濃縮して、エタノールを回収した。その後、粗抽出物を、当該粗抽出物と同様の容量の熱水中に溶解させ、混合物を提供した。当該混合物を、精製のために、マクロ細孔吸収樹脂カラムに注入した。カラムは、水および４０％エタノールを用いて、順次溶出させた。エタノール溶出液を回収し、カンカニクジュヨウ抽出物を提供するように濃縮により乾燥させた。そのように提供されたカンカニクジュヨウ抽出物は、相対的に多い量の化合物（１）および相対的に少ない量の化合物（２）を含む。
【００２８】
本発明によると、式（Ｉ）の化合物、当該式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、またはこれらの組み合わせを使用して製造される薬剤は、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させるために使用することができ、特に、１型糖尿病および／または２型糖尿病等のそれを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するために使用することができる。ＳＩＲＴ１は、膵臓のβ細胞にインスリン分泌を促進させることができ、遊離基および炎症因子等のインスリン抵抗性を引き起こす関連因子を調節することができ、それによってインスリン抵抗性により引き起こされる症状を改善し得るということが知られている。さらに、ＳＯＣＳ３の発現レベルはレプチン抵抗性の指標として使用され得ることが知られている。従って、理論的に限定されることはないが、本発明により提供される薬剤は、対象のＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させることにより、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するために使用することができ、神経障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等）、心血管疾患（例えば、心疾患、低血圧、高血圧、高血糖、脳卒中、心筋梗塞、血栓症、動脈硬化等）、および肥満等の、ＳＩＲＴ１の発現レベルに関連する疾患を治療するために使用することができると考えられる。
【００２９】
対象の必要に応じて、本発明による薬剤は任意の適切な用量で投与され得る。例えば、血中グルコースレベルを調節するためにヒトにより投与される時、薬剤は、１日毎に（式（Ｉ）の化合物で）約０．５ｍｇから約１００ｍｇ／ｋｇ−体重、好ましくは１日毎に（式（Ｉ）の化合物で）約１ｍｇから約５５ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される。しかし、急性状態での患者では、投薬量は、実際での要求に応じて数倍または数十倍に増加し得る。
【００３０】
本発明によると、薬剤は、投与のために任意に適した形状であり得るし、任意に適した方法で適用され得る。例えば、薬剤は、経口投与、経鼻投与、静脈内注射、腹腔内注射および／または皮下注射に適した形状に製造され得る。経口投与形状での薬剤は自己投与での利便性のため、本発明の１つの好ましい実施の形態では、薬剤は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液体抽出物、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液またはチンキ剤等の、経口投与形状で提供される。形状および目的に応じて、薬剤は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。
【００３１】
一例としての経口投与に適した薬剤の製造の使用では、薬剤は、活性成分（すなわち、式（Ｉ）の化合物および／または式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩）の所望する活性に悪影響を及ぼさない、溶媒、油性溶媒、希釈剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、酸化防止剤、結合剤、潤滑剤および吸湿剤等の、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬剤は、任意の適した方法により、経口投与形状に調製することができる。
【００３２】
皮下注射または静脈内注射に適した薬剤では、薬剤は、等張液、生理食塩緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）、可溶化剤、乳化剤および他の担体等の１または複数の成分を含んでもよく、静脈内注射、乳液静脈内注射、粉末注射、懸濁液注射または粉末−懸濁液注射としての組成物を製造する。
【００３３】
上記アジュバントに加えて、薬剤は、得られる薬剤の味覚および視覚の魅力を向上させるために、香味剤、トナー、着色剤等の他の添加剤を任意にて含んでもよい。得られる製剤の保存性を改善するために、薬剤は、適量の防腐剤、保存剤、消毒剤、抗真菌剤等をも含んでもよい。さらに、本発明の薬剤は、他の活性成分が式（Ｉ）の化合物および／または式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩に悪影響を及ぼさない限り、当該薬剤の効果をさらに向上させるため、または当該薬剤の適用柔軟性および順応性を高めるために、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ）、インスリン増感剤等の、１または複数の他の活性成分を含んでもよい。
【００３４】
対象の要望に応じて、本発明による薬剤は、１日１回、１日数回または数日に１回等の様々な投与頻度で適用することができる。
【００３５】
本発明は、それを必要とする対象の血中グルコースレベルを調節するための方法も提供し、当該方法は、式（Ｉ）の化合物、当該式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される有効成分の有効量を対象に投与することを含む。活性成分およびその性質、ならびに当該活性成分の製剤および用量の選択は、上記の説明と同様である。
【００３６】
本発明は、以下の具体的な実施例でさらに詳細に説明される。しかし、以下の実施例は本発明を例示するためのみに提供されるものであり、本発明の範囲はこれにより限定されることはない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：カンカニクジュヨウ抽出物の調製
【００３８】
カンカニクジュヨウの１０ｋｇの水気のある茎をスライスして８倍の容量の水中に１時間浸し、２時間煮熱して、その後濾過し、濾液を回収した。当該かす（ｄｒｅｇｓ）は６倍の容量の水と混合して、２回においてそれぞれ１時間煮熱して、その後濾過した。得られた３つの濾液を一緒に加え、次いで、１．１０の比重になるように５０℃において真空下で濃縮した。その後、６０％の濃度になるようにエタノールを濃縮物中へ添加して、１２時間冷蔵した。透明な上清溶液を回収し、１．１０の比重の粗抽出物が提供されるように５０℃において真空下で濃縮して、エタノールを回収した。６ｋｇの粗抽出物が得られた。そして、混合物を提供するために、当該粗抽出物を同じ容量の熱水中に溶解させた。当該混合物を、マクロ細孔吸収樹脂カラムに注入した。そして、４倍の容量の水および５倍の容量の４０％エタノールを用いて、カラムを順次溶出させた。まず、水の溶出液をマクロ細孔吸収樹脂カラムに注入して、その後３倍の容量の水を用いて溶出させた。得られた水の溶出液は、廃棄した。次いで、カラムを４倍の容量の４０％エタノールを用いて溶出させた。得られた２つの４０％エタノールの溶出液を回収して、濃縮により乾燥させて、１１０７ｇのカンカニクジュヨウ抽出物が提供された。
【００３９】
実施例２：カンカニクジュヨウ抽出物の活性分析
【００４０】
（１）実験動物の給餌
４週齢の雄ＳＤ（スプラーグドーリー）ラットを１週間給餌して、その後無作為に、５つの実験群およびコントロール群を含む６つの群（それぞれの群に１０ラット）に分けた。実験群のラットは、２３０ｍｇ／ｋｇ−体重でのニコチンアミドを腹腔内注射して、次いで６５ｍｇ／ｋｇ−体重でのストレプトゾシンを腹腔内注射して、糖尿病を誘発させた（ＤＭ群）。コントロール群には、同量のクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を、腹腔内注射した。１週間後、実験群の糖尿病誘発ラットの空腹時血中グルコースを測定すると、１２６ｍｇ／Ｌより大きな空腹時血中グルコースを確認した。その後、ラットに４５％の高脂肪食（ＨＦＤ）を６週間摂食させた。そして、表１に示す投与量を使用して、ラットに、０．５７１ｍｇ／ｋｇ−体重でのロシグリタゾン（インスリン増感剤である血中グルコースレベルを調節するための薬物）（ＤＭＲ群）、または、８０ｍｇ／ｋｇ−体重でのカンカニクジュヨウ抽出物（ＣＴＥ）（ＤＭＥ１群）、１６０ｍｇ／ｋｇ−体重でのＣＴＥ（ＤＭＥ２群）もしくは３２０ｍｇ／ｋｇ−体重でのＣＴＥ（ＤＭＥ４群）を、６週間にわたり１日１回経口投与した。コントロール群およびＤＭ群のラットには、６週間にわたり１日１回再蒸留水を投与した。ラットの体重を毎週測定して、カロリー摂取量を算出した。結果を、図１（体重）および図２（カロリー摂取量）に示す。当該結果は、それぞれの群のラットの体重およびカロリー摂取量において顕著な差異がないことを示している。
【００４１】
【表１】
2016520102.tif 000025
【００４２】
（２）グルコース（ブドウ糖）負荷試験
ラットを上記のように６週間処置した後、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。ラットに、２ｇ／ｋｇ−体重でのグルコースを投与して、次いで、血漿グルコース濃度を０分、３０分、９０分および１２０分後に測定し、グルコース摂取後のラットのグルコース負荷でのＣＴＥの効果を分析した。結果を図３に示す。図３の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出して、図４に示した。
【００４３】
図３および図４に示すように、ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）およびＤＭＲ群のラットにおける血漿グルコース濃度は、０分、３０分、９０分および１２０分で減少していた。これらの結果は、ＣＴＥがラットのグルコース吸収率を効果的に増加させ、そのため血糖値を下げ得るということを示している。
【００４４】
（３）血漿試料の分析
上記のグルコース負荷試験の後、ラットを屠殺して、腹腔動脈から血液試料を採取した。当該血液試料を、１５分間、３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。そして、血漿である上清を回収した。ラットの他の組織も取り出して秤量し、その後、次の生化学的データ分析のために、−８０℃で保存しておいた。
【００４５】
（３−１）グルコース濃度の測定
血漿２０μｌを採取し、グルコース酵素キット（極東  ＧＬ−Ｖ，極東製薬，日本）で分析して、空腹時血漿グルコース濃度を測定した。
【００４６】
空腹時血漿グルコース濃度は、次の式により算出される。
空腹時血漿グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）＝（Ｅｓ−ブランク）／（Ｅｓｔｄ−ブランク）×２００
ここで、Ｅｓ：血液試料の吸光度、ブランク：キットの溶媒（血液試料なし）の吸光度、Ｅｓｔｄ：基準試薬の吸光度、２００：基準試薬の濃度が２００ｍｇ／ｄｌ、である。結果を表２に示す。
【００４７】
（３−２）総トリグリセリド濃度の測定
血漿１０μｌを採取し、トリグリセリド酵素キット（Ａｕｄｉｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｏｒｋ，アイルランド）で分析して、血漿中の総トリグリセリド濃度を測定した。血漿中の総トリグリセリド濃度は、次の式により算出される。
血漿中の総トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｄｌ）＝（Ｅｓ−ブランク）／（Ｅｓｔｄ−ブランク）×２００
ここで、Ｅｓ：血液試料の吸光度、ブランク：キットの溶媒（血液試料なし）の吸光度、Ｅｓｔｄ：基準試薬の吸光度、２００：基準試薬の濃度が２００ｍｇ／ｄｌ、である。結果を表２に示す。
【００４８】
（３−３）総コレステロール濃度の測定
血漿１０μｌを採取し、コレステロール酵素キット（Ａｕｄｉｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｏｒｋ，アイルランド）で分析して、血漿中の総コレステロール濃度を測定した。血漿中の総コレステロール濃度は、次の式により算出される。
血漿中の総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）＝（Ｅｓ−ブランク）／（Ｅｓｔｄ−ブランク）×２００
ここで、Ｅｓ：血液試料の吸光度、ブランク：キットの溶媒（血液試料なし）の吸光度、Ｅｓｔｄ：基準試薬の吸光度、２００：基準試薬の濃度が２００ｍｇ／ｄｌ、である。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2016520102.tif 000026
【００５０】
表２に示すように、ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）の空腹時血中グルコースは低下していた。ＤＭＲ群およびＤＭＥ４群の総トリグリセリドは、有意に低下していた。糖尿病患者の不十分なインスリン濃度またはインスリン感受性の欠乏は、周囲の脂肪組織の異常な調節を引き起こし、脂肪細胞中のトリグリセリドの大量分解をもたらし得るということが知られている。その結果、血中の遊離脂肪酸の濃度が増加して、末梢組織におけるインスリン感受性の低下をもたらす。一方、インスリン抵抗性は、脂肪組織中のトリグリセリドの使用の低下に繋がり、血中のトリグリセリドの蓄積をもたらす。これらの結果は、ＣＴＥが糖尿病のラットの空腹時血中グルコース濃度および総トリグリセリド濃度の低下に有効であり、そのため血糖値を下げることができるということを示している。
【００５１】
（３−４）インスリン濃度の測定
血漿２５μｌを採取し、インスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ  Ｉｎｃ．，Ｓｙｌｖｅｎｉｕｓｇａｔａｎ  ８Ａ，スウェーデン）で分析した。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、基準曲線に基づき濃度を算出した。結果を表３に示す。
【００５２】
（３−５）レプチン濃度の測定
レプチンは、脂肪細胞により分泌されるタンパク質ホルモンである。体内のレプチン濃度の不均衡は、肥満およびインスリンの不均衡を引き起こし得ることが知られている。この実験では、血漿１００μｌを採取し、レプチン酵素イムノアッセイキット（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｓ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，米国）で分析した。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍの波長での吸光度を測定し、基準曲線に基づき濃度を算出した。結果を表３に示す。
【００５３】
（３−６）インスリン抵抗性の恒常性モデル評価式の算出
インスリン抵抗性の恒常性モデル評価式（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、次の式により算出される。
ＨＯＭＡ−ＩＲ＝空腹時血漿インスリン濃度（ｍＵ／ｍｌ）×空腹時血漿グルコース濃度（ｍｍｏｌｅ／Ｌ）÷２２．５
結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
2016520102.tif 000027
【００５５】
表３に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおける、血漿インスリン濃度、血漿レプチン濃度およびＨＯＭＡ−ＩＲは増加していた。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）における、血漿インスリン濃度、血漿レプチン濃度およびＨＯＭＡ−ＩＲは回復（低下）しており、ＤＭＥ４群に示す濃度はコントロール群の濃度に近かった。これらの結果は、ＣＴＥは、ラットにおいて、インスリン感受性を増加させることができ、レプチン抵抗性およびインスリン抵抗性を低下させることができるということを示している。
【００５６】
（３−７）尿素、クレアチニン、アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの濃度の測定
糖尿病は多くの合併症を引き起こし得ることが知られている。この実験では、尿素、クレアチニン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む、ラットの血漿中における肝臓および腎臓機能の指標の濃度を、それぞれ、尿素検出キット（ＵＲ２２１，Ｒａｎｄｏｘ，英国）、クレアチニン検出キット（ＣＲ５１０，Ｒａｎｄｏｘ，英国）、ＡＬＴ検出キット（ＡＬ１２６８，Ｒａｎｄｏｘ，英国）およびＡＳＴ検出キット（ＡＳ１２６７，Ｒａｎｄｏｘ，英国）によって分析した。結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
2016520102.tif 000028
【００５８】
表４に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおける、尿素およびクレアチニンの濃度、ならびにＡＬＴ／ＡＳＴ率は増加していた。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）における、尿素およびクレアチニンの濃度、ならびにＡＬＴ／ＡＳＴ率は、顕著に回復（低下）していた。
【００５９】
（３−８）血漿抗酸化酵素の濃度の測定
１型糖尿病および２型糖尿病の両方が、体内における抗酸化酵素の発現の減少を引き起こし、そのため酸化ストレスが増加し得るということが知られている。この実験では、ラットの血漿中における、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を、それぞれ、ＳＯＤ検出キット、カタラーゼ検出キットおよびＧＰｘ検出キット（Ｅｕｇｅｎｅ−Ｃｈｅｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ，台湾）により分析して、抗酸化酵素の発現レベルでのＣＴＥの効果を分析した。結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
2016520102.tif 000029
【００６１】
表５に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおける、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの活性は低下していた。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）およびＤＭＲ群のラットにおける、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの活性は有意に増加していた。これらの結果は、ＣＴＥは、抗酸化酵素の発現レベルを増加させることができ、そのため糖尿病により引き起こされる酸化ストレスを改善することができるということを示している。
【００６２】
（３−９）血漿脂質の過酸化の測定
糖尿病は、血漿脂質の過酸化の増加を引き起こし得ることが知られている。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、脂質の過酸化の指標として使用することができる。この実験では、脂質の過酸化でのＣＴＥの効果を分析するために、血漿マロンジアルデヒドの濃度を測定した。血漿０．５ｍｌを採取し、１ｍｌの反応試薬（０．２５Ｎ  ＨＣｌ中に溶解した１５％ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸、および、０．２５Ｎ  ＨＣｌ中に溶解した０．３７５％ｗ／ｖ％チオバルビツール酸）と均一に混合した。その後、混合物を、１５分間１００℃の水浴中に入れ、冷却した。次いで、その中に１ｍｌのｎ−ブタノールを添加して、強い衝撃を与えて混合し遠心分離した（１５００ｘｇ、１０分間）。上清を回収し、分光光度計を使用して５３２ｎｍでの当該吸光度を測定した。ここで、ＰＢＳ緩衝液をブランクとして使用して、５ｎＭの１，１，３，３，−テトラメトキシプロパンを基準として使用した。血漿マロンジアルデヒドの濃度は、次の式により算出された。
血漿マロンジアルデヒドの濃度（ｎＭ／ｍｌ）＝［（試料の吸光度−ブランク）／（基準の吸光度−ブランク）］×５
結果を表６に示す。
【００６３】
【表６】
2016520102.tif 000030
【００６４】
表６に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおける、血漿マロンジアルデヒドの濃度は増加していた。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）およびＤＭＲ群のラットにおける、血漿マロンジアルデヒドの濃度は低下していた。これらの結果は、ＣＴＥは、糖尿病によって引き起こされる脂質の過酸化の低下に有効であるということを示している。
【００６５】
（３−１０）血漿の炎症指標の測定
糖尿病患者の終末糖化産物（ＡＧＥ）の濃度は増加することが知られている。遊離したＡＧＥが終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）と結合すると、スーパーオキシドラジカルが生じて、下流のＮＦ−κＢ転写因子を活性化させ、そして一連の炎症反応をもたらし得る。この実験では、糖尿病によって引き起こされる炎症でのＣＴＥの効果を分析するために、一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含む、血漿中の炎症指標の濃度を測定した。１００ｍｌの異なる濃度の基準溶液または血漿を、捕捉抗体でコーティングしたマイクロプレートの異なるウェル内へ添加した。マイクロプレートを室温で２時間インキュベートして、試料を除去し、その後マイクロプレートを４００μｌの洗浄緩衝液（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄した。次いで、ＮＯ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の検出抗体１００μｌをマイクロプレートに添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、上清を廃棄して、マイクロプレートを洗浄緩衝液を用いて５回洗浄した。４８０μｌの酵素アビジン−ＨＲＰをマイクロプレートのそれぞれのウェル中に添加して、室温で３０分間インキュベートした。そして、上清を廃棄して、マイクロプレートを洗浄緩衝液を用いて５回洗浄した。次に、１００μｌの基質溶液をマイクロプレートのそれぞれのウェル中に添加して、室温で１５分間インキュベートした。その後、５０μｌの停止液をマイクロプレートのそれぞれのウェル中に添加して、濃度を算出するためにマイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの波長での吸光度を測定した。結果を図５から図７に示す。図５から図７において、試験後の事後比較（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）でダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）を使用しており、ここで、“ａ”、“ｂ”および“ｃ”は群の間の統計的有意差を表している。
【００６６】
図５から図７に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおける、ＮＯ（図５）、ＴＮＦ−α（図６）およびＩＬ−６（図７）の血漿濃度は増加しており、深刻な炎症を示していた。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを６週間与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）における、ＮＯ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の血漿濃度は低下していた。これらの結果は、ＣＴＥは、糖尿病によって引き起こされる炎症の低下に有効であるということを示している。
【００６７】
（４）ラットの肝臓、腎臓、心臓および腹部脂肪の重量の測定
この実験では、６週間異なる条件で処置されたラットの肝臓、腎臓、心臓および腹部脂肪の重量を測定した。表７に示すように、異なる群におけるラットの肝臓、腎臓、心臓および腹部脂肪の重量の間には有意差は存在しない。
【００６８】
【表７】
2016520102.tif 000031
【００６９】
（５）ＳＩＲＴ１およびＳＯＣＳ３の発現の測定
ＳＩＲＴ１はインスリン抵抗性を改善できることが知られている。さらに、ＳＯＣＳ３（サイトカインシグナル伝達３のサプレッサー）の発現レベルは、レプチン抵抗性の指標として使用することができる。この実験では、ラットのＳＩＲＴ１のｍＲＮＡおよび／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルでのＣＴＥの効果を調査した。まず、ラットの視床下部の脳組織のトータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出した。１μｇのトータルＲＮＡ、１μｌの０．５μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）、および、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（最終容量１２μｌ）を混合して、当該混合物を６５℃で５分間反応させて、その後、氷上で５分間静置した。そして、４μｌの５Ｘ第一鎖緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、および、１μｌのＨｉＳｃｒｉｐｔ  Ｉ逆転写酵素をその中へ添加して、その後、当該混合物を、３０℃で１０分間、４８℃で６０分間、７０℃で１５分間反応させた。そして、１μｌの当該得られたＤＮＡ、０．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液、０．５μｌの各遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ、および、再蒸留水（最終容量２５μｌ）を混合して、次の条件でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。３０秒間９４℃の変性反応４０サイクルの後に５分間９４℃の変性反応、３０秒間５５℃のアニーリング、３０秒間７２℃の伸長反応。結果を図８および図９に示す。
【００７０】
図８に示すように、コントロール群と比較すると、糖尿病のラット（ＤＭ群）のＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現レベルは顕著に低い。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）のＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現レベルは増加していた。これらの結果は、ＣＴＥはラットのＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現レベルを増加させることができ、それによりインスリン抵抗性を改善できるということを示している。さらに、図９に示すように、コントロール群と比較すると、ＤＭ群のラットにおけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルは顕著に増加しており、より深刻なレプチン抵抗性を示している。ＤＭ群と比較すると、ＣＴＥを与えたラット（ＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群）のＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルは有意に低下していた。これらの結果は、ＣＴＥはラットのＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルを低下させることができ、それによって糖尿病により引き起こされるレプチン抵抗性を改善できるということを示している。
【００７１】
実施例３：カンカニクジュヨウ抽出物中の成分の分析
【００７２】
カンカニクジュヨウ抽出物の成分を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。実験条件は、次の通りである。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、５μｍ）を使用、移動相は０．１％ギ酸含有アセトニトリル（ＡＣＮ）の溶媒Ａおよび０．１％ギ酸含有ＭＱ−Ｈ２Ｏの溶媒Ｂ、流速０．３ｍｌ／分、検出波長は３３３ｎｍ、である。エキナコシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，米国）、アクテオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，米国）およびイソアクテオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，米国）の基準液５μｌ、ならびに、カンカニクジュヨウ抽出物溶液（５０％メタノールに溶解）を、ＨＰＬＣシステムに別々に注入した。それぞれの試料のピーク領域を決定して、カンカニクジュヨウ抽出物中に含有されるエキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドの割合を、ピーク領域に基づいて算出した。結果を表８に示す。
【００７３】
【表８】
2016520102.tif 000032
【００７４】
表８に示すように、カンカニクジュヨウ抽出物は、約２６．２ｗｔ％のエキナコシド、約２．６ｗｔ％のアクテオシドおよび約４．４ｗｔ％のイソアクテオシドを含む。
【００７５】
表８に示されるデータに基づいて、実施例２に記載したＤＭＥ１群、ＤＭＥ２群およびＤＭＥ４群において投与されたＣＴＥ中に含有される各活性成分の含有量を算出して、結果を表９に示す。
【００７６】
【表９】
2016520102.tif 000033
【００７７】
実施例４：エキナコシドおよびイソアクテオシドの活性分析
【００７８】
上記の実験データは、カンカニクジュヨウ抽出物がエキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドを含むことを示す。この実験では、血中グルコースレベルの調節におけるエキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドの効果をさらに確認した。
【００７９】
（１）細胞アッセイ
ヒト肝細胞の肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）、ＢＣＲＣ番号：６００２５）を使用して、炭水化物消費分析を行った。当該細胞を１０００μｇ／ｍｌのグルコースで処置して、その後、１００ｎＭのインスリン、５０μｇ／ｍｌのカンカニクジュヨウ抽出物（ＣＴＥ）、１２．５μｇ／ｍｌのエキナコシド、１．２５μｇ／ｍｌのアクテオシド、または、２．２５μｇ／ｍｌのイソアクテオシド（すなわち、当該抽出物中に示される量による活性成分）で処置した。１時間後、炭水化物消費レベルを測定した。結果を図１０に示す。当該データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）；***Ｐ＜０．００１（コントロール群と比較）として示されている。
【００８０】
図１０に示すように、コントロール群と比較すると、５０μｇ／ｍｌのカンカニクジュヨウ抽出物、ならびに、１２．５μｇ／ｍｌのエキナコシドおよび２．２５μｇ／ｍｌのイソアクテオシドは、肝細胞の炭水化物消費レベルを効果的に増加することができていた一方で、１．２５μｇ／ｍｌのアクテオシドの効果は目立ったものではなく、これはその低い割合によるものかもしれない。
【００８１】
（２）濃度依存分析
カンカニクジュヨウ抽出物中に存在する活性成分が、肝細胞に血糖の取り込みを促進させる効果を有するかどうかをさらに確認するために、ＨｅｐＧ２細胞の処置について、カンカニクジュヨウ抽出物、エキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドの異なる濃度を使用して、上記の炭水化物消費分析を行った。結果を図１１に示す。当該データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１（コントロール群と比較）；＃Ｐ＜０．０５（インスリン群と比較）として示されている。
【００８２】
図１１に示すように、コントロール群と比較すると、５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの、カンカニクジュヨウ抽出物（ＣＴＥ）、エキナコシド、アクテオシドおよびイソアクテオシドは、肝細胞の炭水化物消費レベルを効果的に増加することができており、当該結果は用量依存性を示していた。ここで、アクテオシドの結果は前の調査と類似しており、アクテオシドでも肝細胞の炭水化物消費レベルを増加できることを示している。さらに、この実験の結果は、エキナコシドおよびイソアクテオシドは５μｇ／ｍｌのようなかなり低濃度において肝細胞の炭水化物消費レベルを増加できることを示している。この実験の結果は、肝細胞の炭水化物消費レベルの増加およびそれによる血糖値の低下でのカンカニクジュヨウ抽出物の効果は、主に、その中に含有されるエキナコシドおよびイソアクテオシドに起因しており、アクテオシドではないことも示している。
【００８３】
上記結果は、カンカニクジュヨウ抽出物ならびにその中に含有されるエキナコシドおよびイソアクテオシドは、血糖値の低下に有益であり、従って、血中グルコースレベルの調節のために、特に１型糖尿病および２型糖尿病の治療のために使用することができるということを示している。
【図１】
2016520102.tif 000051
【図２】
2016520102.tif 000052
【図３】
2016520102.tif 000053
【図４】
2016520102.tif 000054
【図５】
2016520102.tif 000055
【図６】
2016520102.tif 000056
【図７】
2016520102.tif 000057
【図８】
2016520102.tif 000058
【図９】
2016520102.tif 000059
【図１０】
2016520102.tif 000060
【図１１】
2016520102.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月11日(2015.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される活性成分の有効量を含み、
【化１】
2016520102.tif 000062
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化２】
2016520102.tif 000063
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化３】
2016520102.tif 000064
であり、かつ、Ｙが
【化４】
2016520102.tif 000065
の場合、Ｚは
【化５】
2016520102.tif 000066
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない、
血中グルコースレベルを調節するための医薬組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される活性成分の有効量を含み、
【化６】
2016520102.tif 000067
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
ＹおよびＺのいずれか１つは、
【化７】
2016520102.tif 000068
であり、他方の１つは、Ｈ、ＯＨまたは
【化８】
2016520102.tif 000069
であり、かつ、Ｙが
【化９】
2016520102.tif 000070
の場合、Ｚは
【化１０】
2016520102.tif 000071
であり、および、
Ｒ１からＲ１３は独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１からＲ３は同時にＨとなることはなく、Ｒ８およびＲ９は同時にＨとなることはない、
ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡの発現を増加および／またはＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現を減少させることにより糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの２つがＯＨである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＸはＣ１−Ｃ３のアルキルである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物は、構造式（Ａ）であって、
【化１１】
2016520102.tif 000072
式中、Ｘａは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
Ｒ１ａからＲ１３ａは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ａからＲ３ａは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ａおよびＲ９ａは同時にＨとなることはない、
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＸａはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ａ、Ｒ２ａおよびＲ３ａのうちの２つがＯＨである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【化１２】
2016520102.tif 000073
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物は、構造式（Ｃ）であって、
【化１３】
2016520102.tif 000074
式中、Ｘｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、
Ｙｃは、Ｈ、ＯＨまたは
【化１４】
2016520102.tif 000075
であり、および、
Ｒ１ｃからＲ１３ｃは独立してＨまたはＯＨであり、かつ、Ｒ１ｃからＲ３ｃは同時にＨとなることはなく、Ｒ８ｃおよびＲ９ｃは同時にＨとなることはない、
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＸｃはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｒ１ｃからＲ３ｃのうちの２つがＯＨである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）の化合物は、化合物（２）である、請求項８に記載の医薬組成物。
【化１５】
2016520102.tif 000076
【請求項１１】
前記活性成分は、化合物（１）、前記化合物（１）の薬学的に許容される塩、化合物（２）、前記化合物（２）の薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【化１６】
2016520102.tif 000077
【請求項１２】
前記活性成分は、前記化合物（１）、前記化合物（２）、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記活性成分は、抽出物で使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抽出物は、カンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記カンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物は、（ａ）抽出溶液を提供するために極性溶媒を用いてカンカニクジュヨウを抽出する工程、および、（ｂ）任意にて前記抽出溶液を乾燥させる工程、を含む方法によって調製され、
前記極性溶媒は、水、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記極性溶媒は、水、メタノール、エタノール、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、１型糖尿病を治療するためのものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記医薬組成物は、２型糖尿病を治療するためのものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物は、１日毎に（前記式（Ｉ）の化合物で）約０．５ｍｇ／ｋｇ−体重から（前記式（Ｉ）の化合物で）約１００ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬組成物は、１日毎に（前記式（Ｉ）の化合物で）約１ｍｇ／ｋｇ−体重から（前記式（Ｉ）の化合物で）約５５ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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