(57)【要約】遺伝子組み換えされたＨＢｃポリペプチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブＨＢｃポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸がシステイン残基によって置換されており、ＨＢｃがウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと集合化される場合に分子間ジスルフィド結合を形成することができるＨＢｃポリペプチド。、
【請求項２】
前記ネイティブＨＢｃポリペプチドが、配列番号：１または配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含む請求項１記載のシステイン置換されたＨＢｃポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸の置換が、［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］、［Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ］および［Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］から選択される請求項２記載のシステイン置換されたＨＢｃポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸の置換が、［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、または［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］である請求項３記載のシステイン置換されたＨＢｃポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：１の番号付けに対応して、７３〜８１位の残基におけるスパイク領域のアミノ酸が、負電荷を減少させるために置換されているＨＢｃポリペプチド。
【請求項６】
５７〜８１位の残基における疎水性ポケットのアミノ酸が置換されている請求項５記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項７】
記置換アミノ酸が天然に存在するウイルス遺伝子型由来である請求項５または６記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸置換が、［Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ９７Ｉ］または［Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ］のうちの１つである請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］、［Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ］および［Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換の対をさらに含む請求項５〜８のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１０】
［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］および［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］から選択されるアミノ酸置換をさらに含む請求項５〜８のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１１】
Ｍ６６Ｓのアミノ酸置換をさらに含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが単量体である請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが二量体である請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ＶＬＰへと集合化される請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、少なくとも１個の非天然型アミノ酸をさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１６】
前記非天然型アミノ酸が、クリックケミストリー反応のための反応基を提供する請求項１５記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１７】
前記非天然型アミノ酸が、アジドホモアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンまたはｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンである請求項１６記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１８】
非天然型アミノ酸に共役された一またはそれ以上の追加の部位をさらに含む請求項１６記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号：３〜３１、３４〜５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＢｃポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号：３９、配列番号：４２または配列番号：５２のアミノ酸配列を含む請求項１９記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載のベクターまたは請求項２１記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞タンパク質合成反応混合物。
【請求項２４】
プロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、細胞または無細胞タンパク質合成反応混合物に導入する工程、および
前記タンパク質を合成するために充分な期間、インキュベートする工程
を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、還元条件下でＶＬＰへと集合化される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＶＬＰへ追加のポリペプチドを共役させるさらなる反応の前に、前記ＶＬＰがジスルフィド結合を生成させるために酸化される請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は非感染性であり、高い表面密度で分子を提示することのできる反復性の表面性状を有し、および、天然のウイルスと比較して匹敵する細胞への取り込みおよび細胞内輸送性を有する。それらの機能特性の全ては、ワクチン、診断および治療のためのアセンブリコアとして、それらを魅力的なものとする。それらは、核酸、タンパク質および他の化学的部分の提示のための多価骨格として機能し得る。ＶＬＰは、それらがインビボでの安定性、リンパ節への輸送および提示されたエピトープによるＢおよびＴ細胞応答の刺激を提供するため、ワクチンとして特に魅力的である。それらはまた、デリバリー媒体として機能するように積み荷分子によって充填され得る。
【０００２】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）は、例えばＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質およびバクテリオファージＱβコートタンパク質等を含むＶＬＰｓを作製するための有効な方法と成り得る。ＣＦＰＳはまた、非天然型アミノ酸（ｎｎＡＡｓ）をタンパク質中に導入するための容易な手段を提供し、これは、Ｃｕ(Ｉ)触媒による［３＋２］環化付加クリックケミストリーを用いたＶＬＰへの抗原の直接的なタンパク質−タンパク質結合を可能にする。
【０００３】
ＶＬＰｓの種々の種類のうち、ＨＢｃ  ＶＬＰは、知識データベースに基づく外来ペプチド配列の提示のための柔軟かつ有望なモデルである。ＨＢｃ粒子は、１９８６年に有望なＶＬＰ担体として最初に報告された。最初のＶＬＰ候補でありかつ最初の正二十面体ＶＬＰ担体として、ＨＢｃ  ＶＬＰは、その特性が充分に明らかにされており、および、１００個を超える種々の外来配列のための担体として広く利用されてきた。ＨＢｃカプシドタンパク質は、１８３から１８５個のアミノ酸長である。ＨＢｃタンパク質のアルギニンリッチＣ末端は、ＶＬＰアセンブリにとって必要ではないため、１４９位のアミノ酸においてトランケートされたＨＢｃタンパク質が広く利用される。欠損型ＨＢｃ（１〜１４９）タンパク質は、２８〜３０ｎｍの平均直径およびＴ＝４の支配的正二十面体対称性を有する粒子へと自己集合化し得る。
【０００４】
しかしながら、ＨＢｃ  ＶＬＰの現在の応用においては、深刻な問題がある。ＶＬＰ
は、クリックケミストリー共役のあいだ安定ではなく、そして機能性分子との共役後に解離し得る。２つの欠損型ＨＢｃ単量体（１６．７ｋＤａ）が、二量体間のＣ６１−Ｃ６１ジスルフィド結合を介して二量体（３３．５ｋＤａ）を形成する。その後、１２０個の二量体が疎水性相互作用により１個のＶＬＰへと自己集合化する。二量体間のコンタクトが弱いため、機能性分子のＶＬＰ表面上への共役がＶＬＰ二量体間の相互作用を妨げる可能性があり、これは結果としてＶＬＰを不安定化する。第２の問題は、負電荷を有する分子はＶＬＰｓに不充分にしか共役しないことである。生理学的ｐＨにおいて、ＨＢｃ  ＶＬＰの表面は、負に帯電されている。同じ電荷は反発し合うため、負電荷を有する分子は、ＨＢｃ  ＶＬＰに近接することができず、このため、クリックケミストリー共役が、効果的に進み得ない。
【０００５】
本発明は、これら２つの問題に対処し、安定化されたＨＢｃ  ＶＬＰおよび改変されたＶＬＰ表面を提供する。
【０００６】
特許文献１には、ＣＦＰＳのあいだに非天然型アミノ酸を導入する方法が記載されている。特許文献２には、非天然型アミノ酸を介して抗原および他のポリペプチドをウイルス様粒子に直接的に連結する方法が記載されている。特許文献３には、ＣＦＰＳにより作製されたウイルス様粒子をキャプシド形成させる方法が記載されている。これらの文献の各々は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／００９３０２４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０１６８４０２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１６７９８１号明細書
【発明の概要】
【０００８】
遺伝子組み換えＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質であって、タンパク質の安定性および／または有用性を向上させる配列改変を含むタンパク質が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、ネイティブ配列の少なくとも２つのアミノ酸が、分子間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基と置換される。いくつかの実施形態において、４個のアミノ酸がシステインと置換される。したがってＨＢｃタンパク質は安定化され、および、そうでなければ四次構造の保持に不利であるような例えばクリックケミストリー反応のあいだなどの条件下、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として維持される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３４、配列番号：３５で示される配列などのＨＢｃ単量体または同等のＨＢｃポリペプチドに存在する少なくとも２個のアミノ酸、通常は２個のアミノ酸または４個のアミノ酸がシステインと置換され、この置換は、タンパク質のアセンブリーを安定化させる。例示的なアミノ酸置換の対としては、非限定的に、および、配列番号：１の番号付けに対応して、ＳＳ１：Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ；ＳＳ２：Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ；ＳＳ３：Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ４：Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ；ＳＳ５：Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ６：Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ；ＳＳ７：Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ；ＳＳ８：Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ９：Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ；およびＳＳ１０：Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃが挙げられる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換はＤ２９ＣおよびＲ１２７Ｃである。他の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃである。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃである。
【００１０】
他の実施形態において、ＨＢｃタンパク質は、代替的にまたは追加で、タンパク質の「スパイクチップ（spike tip）」上、すなわち配列番号：１または配列番号：２における７３〜８１位の残基領域上の負電荷を減少させるアミノ酸置換のセットを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換のセットは、減少した電荷を有する天然に存在するウイルス遺伝子型由来である。いくつかの実施形態において、アミノ酸変更のセットは、配列番号：１または配列番号：２の番号付けに対応して、Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３ＩおよびＦ９７Ｉである。いくつかの実施形態において、アミノ酸変更のセットは、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９ＱおよびＳ８１Ａである。いくつかの実施形態において、減少した負電荷を有するＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３４または配列番号：３５である。
【００１１】
システインにより安定化されているかもしくは電荷が減少されている、またはその両方であるＨＢｃタンパク質はさらに、所定の位置に１つまたはそれ以上の非天然のアミノ酸を含んでいてもよい。対象となる非天然型アミノ酸としては、非限定的に、アジドホモアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−エチニルフェニルアラニン、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン等が挙げられる。非天然型アミノ酸（または複数の非天然型アミノ酸）は、ＨＢｃタンパク質のスパイク部位に配置されてもよい。対象となる部位としては、例えば、Ｎ７５、Ｔ７４、Ｌ７６、Ｑ７７、Ｄ７８、Ｑ７９およびＡ８０が挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸は、Ｄ７８を置換する。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸は、アジドホモアラニンである。
【００１２】
ＨＢｃポリペプチドまたはそれから生成されるＶＬＰは、ＨＢｃポリペプチド以外の共役部位を含んでいてもよく、このような部位は、例えばクリックケミストリーなどにより導入された非天然型アミノ酸においてＨＢｃと共役される。適切な部位としては、ポリペプチド、核酸、多糖類、治療薬、イメージング部位等を含む。関連する実施形態において、ＨＢｃ中の非天然のアミノ酸が、本発明のＨＢｃに、または本発明のＨＢｃを含むＶＬＰに追加の部位を結合させるためにクリックケミストリー反応において利用される方法が提供される。
【００１３】
本発明のＨＢｃポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を用いて宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養する工程、ポリペプチドを培養物から回収する工程によって、または、代替的には、ＨＢｃポリペプチドをコードする核酸構築物を作製する工程、および無細胞合成によりポリペプチドを産生する工程であって、合成が一対の転写および翻訳反応を含む工程によって、作製され得る。ベクターおよびＨＢｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを含むＶＬＰが提供される。
【００１４】
本発明の一実施形態において、本発明のタンパク質の無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＦＰＳ産物は合成され、および還元雰囲気下でＶＬＰへとさらに集合化され得る。ＣＦＰＳ産物は、約１Ｍ〜約２Ｍの塩、例えば、約１．５ＭのＮａＣｌなどの塩等の溶液中で透析されてもよい。集合化されたＶＬＰは、還元雰囲気下で単離されてもよい。合成およびＶＬＰへの集合化に続いて、ＶＬＰは、安定化のためのジスルフィド結合を生成するために酸化雰囲気へと切り替えられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＨＢｃ  ＶＬＰの図を示す。
【図２】図２は、五量体および六量体の構造を示す。
【図３】図３は、５倍ユニットおよび６倍ユニットの両方において可能なＳ−Ｓ結合位置の選択を示す。（ａ）は、二量体の側鎖間へのＳ−Ｓ結合の導入を示し、（ｂ）は、単量体のＣ末端領域間へのＣ−Ｃ結合の導入を示す。
【図４】図４は、正確なＳ−Ｓ結合の形成および評価のための手順を示す。ショ糖濃度勾配遠心後に、ＶＬＰサンプルがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元性）によっても評価された。
【図５】図５は、（ａ）元のＨＢｃタンパク質および突然変異体のＣＦＰＳ収率および（ｂ）非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラム分析を示す。Ｏ：元のＨＢｃ；ＳＳ１：Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ；ＳＳ２：Ｔ１０９Ｃ−Ｖ１２０Ｃ；ＳＳ３：Ｙ１３２Ｃ−Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ４：Ｙ１３２Ｃ−Ａ１３７Ｃ；ＳＳ５：Ｒ１３３Ｃ−Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ６：Ｒ１３３Ｃ−Ａ１３７Ｃ；ＳＳ７：Ｐ１３４Ｃ−Ｐ１３５Ｃ；ＳＳ８：Ｐ１３４Ｃ−Ｎ１３６Ｃ；ＳＳ９：Ｐ１３４Ｃ−Ａ１３７Ｃ；ＳＳ１０：Ｐ１３５Ｃ−Ｎ１３６Ｃ。
【図６】図６は、元のＨＢｃおよび突然変異体のＳＥＣ分析を示す。
【図７】図７は、精製ＶＬＰの酸化処理後の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラム分析を示す。ＳＥＣ分画９〜１１が、精製ＶＬＰｓとして集められた。過酸化水素およびジアミドが酸化剤として使用された。７９ｋＤａおよび９８ｋＤａの分子量のあいだに現れる３つのバンドは、ピルビン酸脱水素酵素複合体の３つのポリペプチドによる汚染を示している。
【図８】図８は、元のＨＢｃ ＶＬＰならびに酸化されたＳＳ１、ＳＳ７、ＳＳ８、ＳＳ９およびＳＳ１０  ＶＬＰｓのショ糖濃度勾配遠心分析を示す。
【図９】図９は、クリック反応生成物の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。対照として「銅無し（No Cu）」とラベルされている反応では、Ｃｕ（１）は添加されなかった。ＨＢｃ ＶＬＰは、放射活性を有していた。フラジェリンおよびＧＭ−ＣＳＦは、放射活性を有していなかった。
【図１０】図１０は、（ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ））の作製を示す。天然型突然変異体Ｑ８Ｂ６Ｎ７のスパイク領域がネイティブタンパク質へと移植された。
【図１１】図１１は、突然変異体ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）のＣＦＰＳ収率を示す。ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）は、新規ジスルフィド架橋（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）を導入することにより安定化された。
【図１２】図１２は、０．５Ｍ  Ｎａｃｌ（Ａ）または１．５Ｍ  Ｎａｃｌ（Ｂ）を含むバッファーに対する透析後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。
【図１３】図１３は、突然変異体ＨＢｃ（ＨＰ）のスパイクチップ上の６つの異なるｎｎＡＡ部位（Ｎ７５ＡＨＡ、Ｌ７６ＡＨＡ、Ｑ７７ＡＨＡ、Ｄ７８ＡＨＡ、Ｑ７９ＡＨＡおよびＡ８０ＡＨＡ）の選択を示す。
【図１４】図１４は、６つの異なる突然変異体（Ｎ７５ＡＨＡ、Ｌ７６ＡＨＡ、Ｑ７７ＡＨＡ、Ｄ７８ＡＨＡ、Ｑ７９ＡＨＡおよびＡ８０ＡＨＡ）のＣＦＰＳおよび透析後の溶解収率を示す。透析緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５Ｍ  ＮａＣｌであった。
【図１５】図１５は、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーに対する透析後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。
【図１６】図１６は、ＨＢｃ  ＶＬＰ突然変異体のクリック反応分析を示す。（Ａ）生理的ｐＨでの４つの異なる分子の表面電荷分布およびアルキン部位を有する非天然型アミノ酸（ｎｎＡＡ）の位置を示す。これらの４つの分子は、フラジェリンタンパク質、ＧＭＣＳＦタンパク質、ＩＭ９−ＳｃＦｖタンパク質およびＣｐＧ  ＤＮＡである。（Ｂ）クリック反応生成物の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラム分析を示す。
【図１７】図１７は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）ＶＬＰアセンブリを示す。
【図１８】図１８は、人工ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）ネットワークの導入を示す。
【図１９】図１９は、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＶＬＰｓの精製を示す。
【図２０】図２０は、精製したＶＬＰｓの酸化処理後の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラム分析を示す。ＳＥＣ分画８〜１３が精製ＶＬＰｓとして集められた。ジアミドが酸化剤として使用された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
遺伝子組み換えＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質であって、タンパク質の安定性および／または有用性を向上させる配列改変を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合によってその構造が安定化されているＨＢｃポリペプチドが提供される。置換されているＨＢｃタンパク質は、このため安定化され、および、そうでなければ四次構造の保持に不利である条件下、ＶＬＰとして維持される。他の実施形態において、ＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の「スパイクチップ（spike tip）」上、すなわち配列番号：１または配列番号：２における７３〜８１位の残基領域上の負電荷を減少させるアミノ酸置換のセットを含む。他の実施形態において、ＨＢｃタンパク質は、所定の位置、例えばＮ７５、Ｔ７４、Ｌ７６、Ｑ７７、Ｄ７８、Ｑ７９、およびＡ８０などに１つまたはそれ以上の非天然型アミノ酸を含む。ある実施形態において、本発明のＨＢｃタンパク質は、３つの種類の改変、すなわちジスルフィド結合安定化、負電荷減少、および所定の位値における非天然型アミノ酸、の全てを含む。
【００１７】
ＶＬＰの、および特には、例えばクリックケミストリーを介する１つまたはそれ以上の追加の部位への共役のために設計されたＶＬＰの構成成分としての本発明のＨＢｃポリペプチドの特定の使用が見出される。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸は、ＨＢｃタンパク質を追加の部位へと結合させるために使用される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書において、共役体、化合物または組成物の医薬の製造における使用を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書において、共役体、化合物または組成物の感染の予防または処置のための例えばワクチンなどの医薬の製造における使用を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書において、感染の予防または処置のための共役体、化合物または組成物の使用を提供する。
【００１９】
定義
本発明は、上述の特定の方法、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されず、それ自体変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することは意図していないこともまた理解されるべきである。
【００２０】
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（a）」、「および（and）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないと規定していない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」に対する言及は、複数個のそのような細胞を含み、および、「培養物（the culture）」に対する言及は、１つまたはそれ以上の培養物および当業者にとって公知であるそれらの等価物に対する言及を含む。本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、特に明示しない限り、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（a）」、「および（and）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないと規定していない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」に対する言及は、複数個のそのような細胞を含み、および、「培養物（the culture）」に対する言及は、１つまたはそれ以上の培養物および当業者にとって公知であるそれらの等価物に対する言及を含む。本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、特に明示しない限り、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２２】
用語「ＨＢｃ」は、Ｂ型肝炎コアタンパク質のアミノ酸ペプチド配列、または、配列番号：１もしくは配列番号：２で示されるその欠損型、または、例えば配列番号：３〜配列番号：５２のいずれか一つで示される同等なタンパク質を意味する。当業者であれば、アミノ酸の小さな変更、例えば１個、２個、３個，４個，５個、６個、７個、８個、９個または約１０個までなどの変更が、タンパク質の機能を変化させることなく配列内において行なわれ得ること、および、完全長のタンパク質が、本明細書において例示される欠損型と置換されてもよいことを理解するであろう。ＨＢｃは、正二十面体のウイルス状粒子を形成するように機能的に自己集合化することができる。本発明のＨＢｃポリペプチドは、上述のアミノ酸置換であって、（ａ）ＶＬＰへと集合化される際に分子間ジスルフィド結合を形成することのできる１またはそれ以上のシステイン残基の対を導入する；（ｂ）所定の位置における１つまたはそれ以上の非天然型アミノ酸、好ましくは、クリックケミストリー反応に関与することのできる非天然型アミノ酸；（ｃ）タンパク質の負電荷を減少させるための１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、のうちの１つまたはそれ以上を含むアミノ酸置換を含む。
【００２３】
本明細書において使用されるように、「精製された（purified）」および「単離された（isolated）」との用語は、例えば、細胞物質であってこれらに限定される訳ではないが例えば細胞残渣、細胞壁成分、細胞膜、細胞器官、細胞中に存在する多量の核酸、炭水化物、タンパク質および／または脂質などの細胞物質などの、そこからポリペプチドが得られる材料からの実質的に汚染物質を含まないポリペプチドという意味において使用される。したがって、単離されているポリペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、２％または１％（乾燥重量）未満の細胞物質および／または汚染物質しか含まないポリペプチドの調製物を含む。本明細書において使用されるように、用語「精製された」および「単離された」は、化学的に合成されたポリペプチドに関して使用される場合、化学的前駆体またはポリペプチドの合成に関与する他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。
【００２４】
用語「ポリペプチド（polypeptide）」、「ペプチド（peptide）」、「オリゴペプチド（oligopeptide）」および「タンパク質（protein）」は、本明細書において交換可能に使用され、そして、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変されたまたは誘導体化されたアミノ酸を含んでいてもよい任意の長さのアミノ酸の高分子形態、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを意味する。
【００２５】
ポリペプチドは、組み換え合成または無細胞タンパク質合成の従来の方法に従って単離および精製されてもよい。例示的なコード配列が提供されるが、当業者であれば、提供されるアミノ酸配列に基づいて適切なコード配列を容易に設計し得る。当業者にとって公知である方法が、コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝的組み換えを含む。代替的に、対象ポリペプチドをコードすることのできるＲＮＡが、化学的に合成されてもよい。当業者であれば、本発明の任意のポリペプチドのための適切なコード配列を提供するために公知のコドン使用表および合成方法を容易に使用し得る。核酸は、実質的に純粋に単離および獲得され得る。通常、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかとしての核酸は、他の天然の核酸配列を実質的に含まずに、一般的に少なくとも約５０％、通常少なくとも約９０％純粋である状態で得られ、および、典型的には「組み換え体（recombinant）」であり、例えば、天然に存在する染色体上では通常関連しない１つまたはそれ以上のヌクレオチドによって隣接されている。本発明の核酸は、直鎖状分子として、または環状分子内で提供され得、および、自己複製分子（ベクター）内または複製配列なしの分子内で提供され得る。核酸の発現は、それら自身によって、または当該技術分野において公知の他の制御配列によって調節され得る。本発明の核酸は、当該技術分野において利用可能な様々な技術を用いて適切な宿主細胞中に導入され得る。
【００２６】
本明細書において使用されるように、用語「ウイルス様粒子（virus like particle）」は、１つまたはそれ以上のウイルスタンパク質、通常はウイルスコートタンパク質、の安定な巨大分子集合体を意味する。ＶＬＰ中の個々のタンパク鎖の数は、ウイルスの特定の幾何学的形状に依存して、少なくとも約６０個のタンパク質、約８０個のタンパク質、少なくとも約１２０個のタンパク質またはそれ以上であろう。本発明の方法において、ＨＢｃは、カプシド構造への自己集合化に許容的な条件下、具体的には還元条件下に維持される。本発明の方法は、ウイルスのポリヌクレオチドゲノムの非存在下でのコートタンパク質の合成を提供し、およびしたがって、カプシドは空であるか、または、非ウイルス性の成分、例えばｍＲＮＡ断片等を含むであろう。
【００２７】
安定なＶＬＰは、延長された期間、例えば、少なくとも約２４時間、少なくとも約１週間、少なくとも約１ヶ月またはそれ以上の期間、生理的条件下でカプシド構造内にタンパク質の結合体を維持する。一旦集合化されると、ＶＬＰは、例えばｐＨ変化、熱、凍結、イオン変化への暴露の際などに、ネイティブウイルス粒子と同程度の安定性を有し得る。当該技術分野において公知であるように、ＶＬＰｓの追加の成分が、ＶＬＰ内に含まれるか、またはＶＬＰ上に配置され得る。ＶＬＰｓは、完全なウイルス核酸を含まず、および、非感染性である。いくつかの実施形態において、ＶＬＰの表面上には十分なウイルス表面エンベロープ糖タンパク質および／またはアジュバント分子が存在するため、ＶＬＰ調製物が免疫原性組成物中に処方され、および動物または人間に投与される際、免疫応答（細胞性または体液性）が起こる。
【００２８】
物質の「有効量（effective amount）」または「十分量（sufficient amount）」とは、所望の生物学的効果、例えば、臨床結果を含む有益な結果などをもたらすために十分な量であり、このため、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。本発明の文脈において、ワクチンの有効量の一例は、個体における免疫応答（例えば、抗体産生）を誘発するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与され得る。
【００２９】
本明細書において使用されるように、フォールディングとは、ポリペプチドおよびタンパク質の三次元構造を形成するプロセスを意味し、ここで、アミノ酸残基間の相互作用が構造を安定化するように作用する。非共有結合的相互作用が、構造決定において重要であり、および、タンパク質との膜接触の効果が、正確な構造のために重要であり得る。天然に存在するタンパク質およびポリペプチドまたはそれらの誘導体および変異体において、適切なフォールディングの結果は、通常、最適な生物学的活性をもたらす配置であり、および、活性に関するアッセイ、例えば、リガンド結合、酵素活性等によって、簡便にモニタリング可能である。
【００３０】
例えば所望の生成物が合成物起源であるようないくつかの例において、生物学的活性に基づくアッセイは、あまり重要でないであろう。このような分子の適切なフォールディングは、物性、エネルギー的考察、モデリング研究等に基づいて測定され得る。
【００３１】
対象となる分離方法としては、アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーは、生体高分子中に通常存在する高度に特異的な結合部位を使用して、特定のリガンドを結合するそれらの能力に基づき分子を分離する。共有結合は、タンパク質試料にリガンドを過剰に提示する形式で、リガンドを不溶性の多孔質担体メディアへと結合させ、したがって１個の分子種の天然の生体分子特異的な結合を利用して、第２の種を混合物から精製する。アフィニティークロマトグラフィーでは、一般に抗体が使用される。好ましくは、マイクロスフェアまたはマトリックスがアフィニティークロマトグラフィーの担体として使用される。このような担体は、当該技術分野においては公知でありかつ市販されており、リンカー分子に結合され得る活性化された担体を含む。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドベースのアフィゲル（登録商標）（Affi-Gel）担体は、ぜん動ポンプまたは重力流出を用いる大部分の実験室規模での精製に適した低圧ゲルである。圧力耐性マクロ多孔質重合体ベースのアフィプレップ（登録商標）（Affi-Prep）担体は、分取用およびプロセス規模での適用に適する。
【００３２】
タンパク質はまた、イオン交換クロマトグラフィーによって分離され、および／または、当該技術分野において公知である方法を用いて、濃縮、濾過、透析等されてもよい。本発明の方法は、ネイティブタンパク質に匹敵する生物学的活性を有する非天然型アミノ酸を含むタンパク質を提供する。機能的アッセイで活性のレベルを測定し、例えば免疫染色、ＥＬＩＳＡ法、クマシーまたは銀染色されたゲルの定量化などの非機能的アッセイで存在するタンパク質の量を定量化し、および、生物学的に活性なタンパク質の総タンパク量に対する比を測定することにより、組成物中のタンパク質の比活性を決定してもよい。一般的に、このように規定された比活性は、ネイティブタンパク質の少なくとも約５％であり、通常、ネイティブタンパク質の少なくとも約１０％であり、および、約２５％、約５０％、約９０％またはそれ以上であってもよい。
【００３３】
本発明の改変されたＨＢｃタンパク質は、通常、所定の部位に少なくとも１個の非天然型アミノ酸を含み、および、１、２、３、４、５個またはそれ以上の非天然型アミノ酸から構成されるまたは含んでいてもよい。ポリペプチド中の２またはそれ以上の部位で存在する場合、非天然型のアミノ酸は、同一または異なっていてもよい。非天然型アミノ酸が異なっている場合、直交系ｔＲＮＡおよび同種のｔＲＮＡ合成酵素がそれぞれの非天然型アミノ酸に対して存在するであろう。
【００３４】
本発明の方法において使用可能な非天然型アミノ酸の例としては、以下を含む：チロシンアミノ酸の非天然型類似体；グルタミンアミノ酸の非天然型類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然型類似体；セリンアミノ酸の非天然型類似体；トレオニンアミノ酸の非天然型類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキン、エーテル、チオール、スルフォニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ；光活性化クロスリンカーを有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光性アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージドアミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化または炭水化物修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学開裂または光開裂可能なアミノ酸；延長された側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば糖置換セリン等；炭素結合された糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノ酸を含むアミノチオ酸；α,α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリン以外の環状アミノ酸等。
【００３５】
対象の非天然型アミノ酸としては、これらに制限されるわけではないが、例えばクリックケミストリー反応のための反応性基を提供するアミノ酸が挙げられる（Click Chemistry： Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions、Hartmuth C. Kolb、M. G. Finn、K. Barry、Sharpless Angewandte Chemie International Edition、第４０巻、２００１、Ｐ．２００４を参照のこと、参照により本明細書に明確に組み入れられる）。例えば、アミノ酸アジドホモアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが興味の対象である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸は、タンパク質上のメチオニンの包括的置換により導入され、例えば、メチオニンが無細胞反応混合物から除外され、そして０．２５〜２．５ｍＭのアジドホモアラニン（ＡＨＡ）から置換され得る。このような実施形態では、例えばＭ６６などの天然型メチオニンを異なるアミノ酸によって置換することが好ましい。
【００３７】
代替的に、非天然型アミノ酸が、直交系成分によって導入される。直交系成分としては，非天然型アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡなどが挙げられ、ここで、直交系ｔＲＮＡ塩基は、通常はアミノ酸と関連しないコドン、例えば終止コドン、４塩基コドン等とペアになる。反応混合物は、同種直交系ｔＲＮＡを（非天然型アミノ酸で）アミノアシル化することのできるｔＲＮＡ合成酵素をさらに含んでいてもよい。このような成分は公知であり、例えば、２００６年５月１６日に発行された米国特許第７，０４５，３３７号に記載されている。直交系ｔＲＮＡは、例えば終止コドン、例えばアンバー、オーカー、オパールコドンなど、のナンセンスコドン；４塩基コドンまたはそれ以上の塩基数のコドン；天然型または非天然型塩基対由来のコドン等であってもよいセレクターコドンを認識する。直交系ｔＲＮＡのアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そしてポリペプチド内のこの部位に非天然アミノ酸を導入する。
【００３８】
直交系ｔＲＮＡ合成酵素は、外因的に合成され、精製され、および、本発明の反応混合物中に、通常は少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、および約２００μｇ／ｍＬ以下である規定された量で添加され得る。タンパク質は、当該技術分野において公知であるように、細菌または真核細胞中で合成され、そして、例えばアフィニティークロマトグラフィー、ＰＡＧＥ、ゲル排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等により精製され得る。
【００３９】
用語「共役パートナー（conjugation partner）」または「選択された追加部位（selected additional moiety(s)）」は互換的に使用され、および、一般的に任意の部位、例えば、本発明のＨＢｃポリペプチドに共役するペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、標識等を意味する。共役パートナーは、本発明のＨＢｃポリペプチドへのクリックケミストリー共役のための相補的活性基を含んでいてもよい。例えば、ＨＢｃタンパク質上に存在する非天然型アミノ酸への共役を可能にする、１つまたはそれ以上の非天然型アミノ酸を用いて合成されてもよい。当業者であれば、共役の化学が公知であり、および、様々な基、例えばＣｐＧ、検出可能な標識、抗体、ポリペプチド等に容易に適用され得ることを理解するであろう。
【００４０】
いくつかの実施形態において、共役パートナーは、構造タンパク質、例えばコラーゲン、ケラチン、アクチン、ミオシン、エラスチン、フィブリリン、ラミン等である。いくつかの実施形態において、共役パートナーは、免疫原、例えば免疫化において有用である病原体タンパク質など、であって、例えば、これらに限定される訳ではないが、赤血球凝集素などのインフルエンザタンパク質などが挙げられる。対象のウイルスコートタンパク質としては、任意の公知のウイルス型、例えば、天然痘（痘瘡）等の二本鎖ＤＮＡウイルス；ワクシニア；水痘帯状疱疹を含むヘルペスウイルス；ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＫＳＶＨ、ＣＭＶ、ＥＢＶ；アデノウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；ＳＶ４０；Ｔ４ファージ、Ｔ２ファージ等のＴ偶数ファージ；ラムダファージ等が挙げられる。一本鎖ＤＮＡウイルスとしては、ｐｈｉＸ−１７４；アデノ随伴ウイルス等を含む。マイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、はしかウイルス；おたふく風邪ウイルス；呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）；パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）；メタニューモウイルス；狂犬病ウイルス；エボラウイルス；インフルエンザウイルス等が挙げられる。プラス鎖ＲＮＡウイルスとしては、ポリオウイルス；ライノウイルス；コロナウイルス；風疹；黄熱病ウイルス；西ナイルウイルス；デング熱ウイルス；ウマ脳炎ウイルス；Ａ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス：タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等が挙げられる。二本鎖ＲＮＡウイルスとしては、レオウイルス等を含む。レトロウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス；レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２等を含む。
【００４１】
共役パートナーとして適切なポリペプチドの例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば腫瘍抗原などの抗原タンパク質、ウイルスタンパク質、結核抗原を含む細菌タンパク質、マラリアタンパク質を含む原生動物タンパク質、レニン；ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリン；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；例えば第VIIIｃ因子、第IX因子、組織因子、およびフォンビルブランド因子などの止血因子；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカイン；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；例えばβ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のための受容体；インテグリン；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子、または、例えばＮＧＦ−βなどの神経成長因子、；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；例えばαＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；例えばＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子ＩおよびII（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）；ＤＥＳ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳内ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９など；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなど；例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１８などのインターロイキン（ＩＬｓ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；補体の崩壊促進因子；例えばエイズウイルスエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；特には単鎖可変領域フラグメント抗体などの抗体；ならびに、上記ポリペプチドの任意の断片、などが挙げられる。
【００４２】
本明細書において使用される無細胞タンパク質合成は、生物学的抽出物および／または特定試薬を含む反応混合物中でのポリペプチドの無細胞合成を意味する。反応混合物は、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの高分子の製造のためのテンプレート；合成される高分子のための単量体、例えばアミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびに、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などの合成のために必要である補因子、酵素および他の試薬を含むであろう。このような合成反応システムは当該技術分野において公知であり、文献に記載されている。無細胞合成反応は、当該技術分野において公知のバッチ、連続フローまたは半連続フローとして実施されてもよい。
【００４３】
ＣＦＰＳおよびそれに続く他の工程は、例えば１ｍＭ  ＤＴＴまたはその等価物の存在下などの還元条件下で実施されてもよい。ＶＬＰの集合化に続いて、条件は、酸化雰囲気へと、例えば、還元剤を除去するための、任意には約１Ｍまでの塩、約１．５Ｍまでの塩、約２Ｍまでの塩、例えばＮａＣｌなどの塩の存在下での透析によってなどにより、変えられてもよく、そして、５〜１０ｍＭのＨ２Ｏ２、５〜１０ｍＭのジアミドまたは等価物を添加することによってジスルフィド結合を形成するように酸化される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、無細胞合成は、酸化的リン酸化が活性化される反応、例えば、ＣＹＴＯＭＩＭ（登録商標）システムにおいて行われる。呼吸鎖および酸化的リン酸化の活性化は、Ｏ２の存在下におけるポリペプチド合成の増加によって証明される。酸化的リン酸化が活性化される反応において、Ｏ２の存在下での全体的なポリペプチド合成が、例えばＨＱＮＯなどの特異的な電子伝達系阻害剤の存在下、またはＯ２の不存在下、少なくとも約４０％減少される。反応の化学は、国際公開第２００４／０１６７７８号に記載されるものであってもよく、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
合成のためのＣＹＴＯＭＩＭ（登録商標）環境は、グルコースおよびリン酸塩を含む培地中で増殖された細菌細胞からの細胞抽出物を利用し、ここで、グルコースは、少なくとも約０．２５％（重量／体積）、より典型的には少なくとも約１％；および典型的には約４％以下、より典型的には約２％以下の初期濃度で存在する。このような培地の例としては、２ＹＴＰＧ培地が挙げられるが、特定および非特定両方の栄養源を用いた、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌の増殖に適切な、多くの公表されている培地が存在する（グルコース含有培地に関しては、Sambrook,J、E.F.Fritsch、およびT.Maniatis、１９８９  Molecular Cloning: A laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor University Press、Cold Spring Harbor,NY  を参照のこと）ため、当業者であれば、多くの培地がこの目的のために適合され得ることを認識するであろう。あるいは、培養物は、高い成長速度を維持するのに必要とされるように、特定または複合的培養培地のいずれかに連続的にグルコースが供給されるプロトコルを用いて増殖されてもよい。反応混合物は、ベシクル含有物、例えば内膜ベシクル溶液などで補充されてもよい。その場合、このようなベシクルは、約０〜約０．５容積、通常約０．１〜約０．４容積で含まれ得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、痕跡量以下、例えば０．１％未満で存在するかもしれず、および、０．０１％未満かもしれない。実質的にＰＥＧを含まない反応は、例えば酸化的リン酸化がＰＥＧにより阻害されない程度に十分に低いレベルのＰＥＧを含む。スペルミジンおよびプトレシン分子がＰＥＧの代わりに使用されてもよい。スペルミンまたはスペルミジンは、少なくとも約０．５ｍＭ、通常は少なくとも約１ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭ、および約２．５ｍＭ以下の濃度で存在する。プトレシンは、少なくとも約０．５ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭ、および約２．５ｍＭ以下の濃度で存在する。スペルミジンおよび／またはプトレシンは、初めの細胞抽出物中にに存在してもよく、または別個に添加されてもよい。
【００４７】
反応混合物中のマグネシウムの濃度は、合成全体に影響を及ぼす。細胞抽出物中にはマグネシウムが存在する場合が多いが、これはその後、濃度を最適化するための追加のマグネシウムで調整され得る。このような方法において有用なマグネシウム塩の供給源は、当該技術分野において公知である。本発明の一実施形態において、マグネシウムの供給源は、グルタミン酸マグネシウムである。マグネシウムの好ましい濃度は、少なくとも約５ｍＭ，通常は少なくとも約１０ｍＭ、および好ましくは少なくとも約１２ｍＭであり；そして約２５ｍＭ以下、通常は約２０ｍＭ以下の濃度である。合成を促進する、またはコストを削減するであろう他の変更は、反応混合物からのＨＥＰＥＳバッファーおよびホスホエノールピルビン酸の除外を含む。
【００４８】
系は好気および嫌気条件下で実施され得る。合成収率を増加させるために、特に１５μＬより多い反応において、酸素が供給されてもよい。例えば、反応チャンバーのヘッドスペースが、酸素で満たされてもよく、および、酸素が反応混合物中に注入されてもよい。より長い反応時間においては、タンパク質発現の過程のあいだ、酸素は連続的に供給されてもよく、または、反応チャンバーのヘッドスペースが再充填されてもよい。他の電子受容体、例えば硝酸塩、硫酸塩またはフマル酸塩などもまた、必要とされる酵素が細胞抽出物中で活性であるように、細胞抽出物の調製と共に供給され得る。
【００４９】
酸化的リン酸化の活性化のための外因性補因子を添加する必要はない。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ＮＡＤ＋、またはアセチルコエンザイムＡ等の化合物が、タンパク質合成収率を補完するために使用されてもよいが、必要ではない。ホスホエノールピルビン酸合成酵素（Ｐｐｓ）の代謝阻害剤であるシュウ酸の添加は、タンパク質収率の増大には有益であるが、必要ではない。
【００５０】
無細胞タンパク質合成のためのテンプレートは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、好ましくは、組み合わせられた系が、認識可能なプロモータをもつＤＮＡテンプレートから連続的にｍＲＮＡを産生する。内因性ＲＮＡポリメラーゼが用いられるか、または、外因性のファージＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＴ７もしくはＳＰ６が反応混合物に直接添加される。代替的には、ｍＲＮＡは、ＱＢレプリカーゼ、すなわちＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのためのメッセージをテンプレート中に挿入することにより連続して増幅され得る。精製されたｍＲＮＡは、一般的に、反応混合物に添加される前に、化学修飾により安定化される。ヌクレアーゼが、ｍＲＮＡレベルを安定化させるのを補助するために抽出物から除去されてもよい。テンプレートは、対象となるいかなる特定の遺伝子もコードし得る。
【００５１】
他の塩、特にはマンガンなどの生体関連性である塩がまた添加されてもよい。カリウムは、一般的に、少なくとも約５０ｍＭ、および約２５０ｍＭ以下の濃度で存在する。アンモニウムは、通常２００ｍＭ以下の濃度で、より一般的には約１００ｍＭ以下の濃度で存在していてもよい。反応は、通常、ｐＨ約５〜１０の範囲および約２５℃〜４０℃の温度の範囲、より一般的には、ｐＨ約６〜９の範囲および約２５℃〜４０℃の温度の範囲で維持される。
【００５２】
望ましくない酵素活性に対する代謝阻害剤が、反応混合物に添加されてもよい。代替的は、望ましくない活性の原因となる酵素もしくは因子が、抽出物から直接的に除去されてもよく、または、望ましくない酵素をエンコードする遺伝子が不活化されるか、もしくは染色体から除去されてもよい。
【００５３】
ポリペプチド
分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入によって四次構造が安定化されるＨＢｃポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、例えば配列番号：１または配列番号：２で参照されるＨＢｃ配列であって、少なくとも１対のアミノ酸がシステインと置換されている配列、２対、３対等の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］；［Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ］；［Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］；［Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ］；［Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］；［Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ］；［Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ］；［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］；［Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ］；および［Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ；Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃ；またはＤ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃである。対象となるアミノ酸配列としては、実施例に記載される配列、例えば配列番号：３〜配列番号：５２などが挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＨＢｃポリペプチドは、所定の部位に少なくとも１つの非天然型アミノ酸を、通常、上記のようなシステイン残基の導入と組み合わせて含む。非天然型アミノ酸（複数のアミノ酸）は、ＨＢｃタンパク質のスパイクに位置されてもよい。対象となる部位は、例えば、Ｎ７５、Ｔ７４、Ｌ７６、Ｑ７７、Ｄ７８、Ｑ７９およびＡ８０を含む。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸はＤ７８を置換する。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸は、アジドホモアラニンである。いくつかの実施形態において、残基６６位の天然に存在するメチオニンは、セリンで置換され（Ｍ６６Ｓ）、および非天然アミノ酸がメチオニン置換によって導入される。
【００５５】
他の実施形態において、ＨＢｃタンパク質は、代替的に、または追加で、タンパク質の「スパイクチップ」上の、すなわち、配列番号：１または配列番号：２における残基７３〜８１の領域の、負電荷を減少させるアミノ酸置換のセットを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換のセットは、減少された電荷を有する天然に存在するウイルス遺伝子型に由来する。この目的のための対象となるウイルス遺伝子型としては、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号  Ｑ８Ｂ６Ｎ７のものが挙げられ、本明細書において配列番号：３２として参照されている。
【００５６】
いくつかの実施形態において、配列番号：１または配列番号：２に関するアミノ酸置換のセットは、Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３ＩおよびＦ９７Ｉである。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換のセットは、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９ＱおよびＳ８１Ａである。いくつかの実施形態において、減少された負電荷を有するＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３４または配列番号：３５であり、これらの配列はまた、Ｍ６６ＳおよびＤ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃの任意の置換を含む。
【００５７】
対象のＨＢｃポリペプチドは、これらには限定されるわけではないが、配列番号：１、配列番号：２などに関して行われ得る以下のアミノ酸置換のセットを含む：
・｛Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ}；｛Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ｝；または｛Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃ｝；
・Ｍ６６Ｓ
・Ｎ７５ＡＨＡ、Ｔ７４ＡＨＡ、Ｌ７６ＡＨＡ、Ｑ７７ＡＨＡ、Ｄ７８ＡＨＡ、Ｑ７９ＡＨＡまたはＡ８０ＡＨＡ
・｛Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ, Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ９７Ｉ｝；または｛Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ｝。
【００５８】
ある実施形態において、ＨＢｃポリペプチドは、以下のアミノ酸置換のセットを含む：
・｛Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃ｝；
・Ｍ６６Ｓ
・Ｄ７８ＡＨＡ
・｛Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ９７Ｉ}。
【００５９】
ある実施形態において、ＨＢｃポリペプチドは、配列番号：３〜配列番号：３１、配列番号：３４〜配列番号：５２のうちの一つである。いくつかの実施形態において、ＨＢｃポリペプチドは、配列番号：３９、配列番号：４２および配列番号：５２のうちの一つである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＢｃポリペプチドの単量体形が提供される。他の実施形態において、本発明のＨＢｃポリペプチドの二量体形を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＢｃポリペプチドは、ＶＬＰへと集合化され、これは酸化による分子間ジスルフィド結合によって安定化され得る。
【００６１】
望ましい場合には、合成のあいだまたは発現のあいだに様々な基がペプチドに導入されてもよく、これは他の分子へのまたは表面への結合を可能にする。導入される基は、ＨＢｃドメイン自体に含まれる必要はなく、タグまたは融合Ｃ−末端またはＮ−末端としてＨＢｃドメインに導入されてもよい。このように、システインが、チオエーテルを形成させるために使用され得、そして、例えば、ヒスチジンが、金属イオン錯体を結合させるために、カルボキシル基が、アミドまたはエステルを形成するために、アミノ基が、アミドを形成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、非天然型アミノ酸が、タンパク質中の１つまたはそれ以上の規定の部位に、非制限的に含まれる。
【００６２】
本発明のＨＢｃポリペプチドは、共役パートナーへの直接的な結合を制御するための非天然型アミノ酸を含んでもよい。共役パートナーは、ＨＢｃポリペプチド上の非天然型アミノ酸への共役のための活性基を有していてもよい。いくつかの実施形態において、共役パートナーは、非天然型アミノ酸を含むように修飾され、ＨＢｃポリペプチドと反応されるが、ここで通常、ＨＢｃポリペプチドもまた非天然型アミノ酸を含み、およびジスルフィド安定化ＶＬＰへ集合化されている。共役パートナー上の非天然型アミノ酸は、ＨＢｃポリペプチド上に存在する非天然型アミノ酸とは異なっており、およびそれと反応する。
【００６３】
共役のための活性基が、反応性アジドおよびアルキン基である場合、ＨＢｃとパートナーとの反応は、当該技術分野で公知であるように、触媒作用に十分な濃度の、例えば、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約１ｍＭなどの銅（Ｉ）触媒で触媒されてもよい。反応が嫌気条件下で実施される限り、反応は、例えば臭化銅またはヨウ化銅またはテトラキス（アセトニトリル）第１銅ヘキサフルオロホスフェート等の銅（Ｉ）の商用的供給源を用いて実施され得る。反応は、様々な溶媒中で行われ得、ならびに、水と、アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｔＢｕＯＨおよびアセトンを含む様々な（一部）混和性の有機溶媒との混合物もまた良好に機能する。反応は室温で進行し、および、例えば少なくとも約１５分、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間またはそれ以上の時間で、望ましい終結レベルまで実施され得る。
【００６４】
本発明は、本発明のＨＢｃポリペプチドをエンコードする核酸をさらに提供する。当業者に認識されるように、遺伝暗号の縮重度のため、非常に多くの数の核酸が作製され得、その全てが本発明のＨＢｃポリペプチドをエンコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定することにより、当業者であれば、アミノ酸配列を変化させないような方法で１つまたはそれ以上のコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の異なる核酸を作製し得るであろう。
【００６５】
ＨＢｃポリペプチドをエンコードする本発明の核酸を用いて、様々な発現構築物が作製され得る。発現構築物は、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノム中に組み込まれるベクターであってもよい。代替的には、無細胞発現の目的のために、構築物は所望のペプチドの転写および翻訳に必要な要素を含み得るが、このような要素を複製開始点、選択マーカ等として含まなくてもよい。無細胞構築物は、例えばＰＣＲなどによって、インビトロで複製されてもよく、および、さらに増幅反応に最適化された末端配列を含んでいてもよい。
【００６６】
一般的に、発現構築物は、融合タンパク質をエンコードする核酸に作動可能に連結される転写および翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列（control sequences）」とは、特定の発現系、例えば哺乳類細胞、細菌細胞、無細胞合成等での、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物系に適する制御配列は、例えば、プロモータと、任意にはオペレータ配列と、およびリボソーム結合部位とを含む。真核生物細胞系は、プロモーターと、ポリアデニレーションシグナルと、エンハンサーとを利用し得る。
【００６７】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される（operably linked）」。例えば、プレ配列または分泌型リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、または、リボソーム結合部位は、それが翻訳の開始を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に「作動可能に連結される（operably linked）」とは、連結されているＤＮＡ配列が、隣接しており、および、分泌型リーダーである場合には、隣接しており、およびリーディングフレーム内にあることを意味する。連結は、ライゲーションによって、または増幅反応を介して達成される。従来の方法に従って配列を連結するために、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられてもよい。
【００６８】
一般的に、転写および翻訳制御配列としては、これらに限定されるわけではないが、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列などが挙げられる。好ましい実施形態において、制御配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。
【００６９】
プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターのいずれかをエンコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのどちらであってもよい。２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターもまた、当該技術分野において公知であり、および、本発明において有用である。好ましい実施形態において、プロモーターは強力なプロモーターであり、例えばＴ７プロモーターなど、インビトロ発現システムにおける高い発現性を可能にする。
【００７０】
さらに、発現構築物は、追加の要素を含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは１つまたは２つの複製システムを有していてもよく、これによってそれが生物中で、例えば、発現のため哺乳類または昆虫細胞中で、ならびに、クローニングおよび増幅のため原核宿主中で、維持されることが可能となる。追加で、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択遺伝子は、当該技術分野において公知であり、および使用される宿主細胞によって変わるであろう。
【００７１】
処方および使用
ＨＢｃから成るＶＬＰを含むＨＢｃポリペプチド、および、１つまたはそれ以上の共役部位を含む単量体、二量体またはＶＬＰｓは、薬学的に許容され得る賦形剤中で提供されてもよく、および様々な処方とされてもよい。当該技術分野において公知であるように、薬学的に許容され得る賦形剤は、薬理学的に効果のある物質の投与を容易にする相対的に不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状もしくは粘稠性を付与でき、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させるための塩、カプセル化剤、バッファーならびに皮膚浸透促進剤などが挙げられる。非経口薬および経口的薬デリバリーのための賦形剤および処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に記載されている。
【００７２】
他の処方としては、これらに限定されるわけではないが例えばリポソームなどの担体を含む、当該技術分野において公知の適切なデリバリー形状が挙げられる。Ｍａｈａｔｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９（１９９７）。リポソーム調製物としては、これらに限定されるわけではないが、サイトフェクチン、多重膜ベシクルおよび単膜ベシクルなどが挙げられる。
【００７３】
一般的に、これらの組成物は、注入または吸入により、例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等に投与するために処方される。従って、これらの組成物は、好ましくは、例えば、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液などの薬学的に許容され得るビヒクルと組み合わされる。特定の投与計画、すなわち投与量、タイミングおよび繰り返しなどは、特定の個体およびその個体の既往歴に依存するであろう。
【００７４】
本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、当然それ自体が変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定する意図はないこともまた理解されるべきである。
【００７５】
別段の定めがない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者であれば一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似の、または等価の任意の方法、装置および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置および材料が以降に記載される。
【００７６】
本明細書において記載される全ての刊行物は、刊行物内で記載される、およびここで記載される本発明に関連して使用されてもよい、例えば試薬、細胞、構築物および方法論などを説明し、および開示することを目的として参照により本明細書に組み込まれる。上記でおよび本文を通して説明された刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示を提供するものにすぎない。本明細書における何物も、本発明者らが先願発明によるそのような開示に先立つ資格がないということの承認として解釈されるべきものではない。
【００７７】
以下の実施例は、当業者に対して本発明の主題をいかにして作製し、および使用するかについての完全な開示および記載を当業者へと提供するように述べられているものであり、発明として見なされるものの範囲を限定することは意図されていない。使用される数字（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確性を確実にするための努力が為されているが、実験的な誤りおよび逸脱は許容されるべきである。特に示されていない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、および、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【００７８】
実験
実施例１
Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の安定化および改変
材料および方法
プラスミド構築。１４９位のアミノ酸においてトランケートされたＣ末端を有する、サブタイプａｄｙｗ（Ｐａｓｅｋら、１９７９）のヒトＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）カプシド単量体をコードする配列が、大腸菌ｔＲＮＡ濃度に対して最適化され、そしてＤＮＡｗｏｒｋｓ（ｖ３．０）を用いて設計されたオリゴヌクレオチドから合成された。ベクターｐＥＴ２４ａ−ＨＢｃ１４９が、最適化されたＨＢｃタンパク質遺伝子をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位でｐＥＴ−２４ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に連結することにより（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）作製された。メチオニンアナログを組み入れるために、２つの突然変異（Ｍ６６ＳおよびＬ７６Ｍ）が導入された。ｐＥＴ２４ａ−ＨＢｃ１４９−Ｍ６６Ｓ−Ｌ７６ＭがＤＨ５ａ細胞中に形質転換され、そしてプラスミドが、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）中での使用のために、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製された。全ての突然変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて構築された。
【００７９】
ＨＢｃタンパク質変異体の配列。ＶＬＰｓを安定化させることを意図した、種々のシステイン突然変異を有する１０個の異なる変異体の配列：
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【００８０】
発現および集合化の収率に影響を及ぼすことなく、表面電荷を変化させ、および共役効率を改良することを意図された種々のＡＨＡ部位または種々の負の表面電荷をもつ突然変異を有する１７個の異なる変異体の配列。全ての配列は、ＳＳ１突然変異（赤色コドン）と、Ｍ６６Ｓ突然変異（青色コドン）とを含む。ＡＨＡは、試験された非天然型アミノ酸、アジドホモアラニンを意味する。
【００８１】
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【００８２】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）。ＣＦＰＳは、上述のＰＡＮＯｘ−ＳＰ（ＰＥＰ、アミノ酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、シュウ酸、スペルミジンおよびプトレシン）無細胞システム（ＪｅｗｅｔおよびＳｗａｒｔｓ、２００４）をいくつかの改変とともに用いて行われた。標準のＰＡＮＯｘ−ＳＰ  ＣＦＰＳ反応混合物は、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、それぞれ０．８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、３３ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１７０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１０ｍＭ  グルタミン酸アンモニウム、１６ｍＭ  グルタミン酸マグネシウム、１．５ｍＭ  スペルミジンを、１．０ｍＭ  プトレシン、０．１７ｍｇ／ｍＬ  フォリン酸、４５μｇ／ｍＬ  プラスミド、約１００〜３００μｇ／ｍＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、それぞれ２ｍＭの２０個の非標識アミノ酸、０．３３ｍＭ  ＮＡＤ、０．２６ｍＭ  補酵素Ａ（ＣｏＡ）、２．７ｍＭ  シュウ酸カリウム、および０．２８当量の大腸菌ＫＣ６  Ｓ３０抽出物（ＧｏｅｒｋｅおよびＳｗａｒｔｚ、２００８）を含む。ＨＢｃタンパク質におけるメチオニンの包括的置換のために、メチオニンが無細胞反応混合物から除外され、アジド部位を提示する非天然型アミノ酸、アジドホモアラニン（ＡＨＡ）（Ｍｅｄｃｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＬＬＰ、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｗａｙ、ＷＡ）１ｍＭから置換された。全ての試薬は、他に断りのない限り、シグマ−アルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手された。
【００８３】
ＨＢｃタンパク質を産生するためのＣＦＰＳ反応は、３０℃で６時間行われた。小量ＣＦＰＳ反応が、１．５ｍＬ  マイクロ遠心チューブ中２０μＬの容積で実施された。分取用スケールでの反応は、６ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０４６、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１ウェルにつき１ｍＬを用いた６ｍＬ量を使用した。８．４μＭ  Ｌ−［Ｕ−１４Ｃ］−ロイシン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）が、少量反応へ、および分取用スケール反応の２０μＬアリコットへ、上述のトリクロロ酢酸タンパク質沈澱プロトコルおよびベックマン  ＬＳ３８０１  液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いてタンパク質収率を測定するために添加された。
【００８４】
アルキン部位を有するＧＭ−ＣＳＦ、ＩＭ９−ＳｃＦｖおよびＣｐＧ  ＤＮＡの産生は、Ｐａｔｅｌらにより記載されている。アルキン部位を有するフラジェリンの産生は、Ｌｕらにより記載されている。
【００８５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。非取り込みＬ−「Ｕ−１４Ｃ」−ロイシンを除去するために、無細胞産生物は直ちに、６〜８０００  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｏｒｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｕｂｉｎｇ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）において１ｍＭ  ＤＴＴが添加された透析緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＭａＣｌ）に対して緩衝液を２回交換して透析された。透析された無細胞反応産生物は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が充填されたＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）カラム上にロードされた。ランニングバッファーは、５ｍＭ  ＤＴＴが添加された透析緩衝液である。溶出画分のタンパク質濃度が放射活性によって測定された。
【００８６】
ショ糖勾配沈降。ＳＥＣにより単離されたＶＬＰｓが、ＤＴＴを除去するためにまず透析緩衝液に対して透析され、そしてその後、１０ｍＭ  過酸化水素または１０ｍＭ  ジアミドを添加し、および室温で１時間インキュベートすることによって、ジスルフィド結合を形成するために酸化された。酸化剤は、透析緩衝液に対して緩衝液を２回交換して透析することにより除去した。酸化されたＶＬＰｓは速度沈降法により評価された。１０〜４０ｗ／ｖ％のショ糖連続密度勾配が、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｖｅｒ３．０５Ｌ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｋｅｒ（Ｂｉｏｃｏｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、ポリアロース（Ｐｏｌｙａｌｌｏｓｅ）１６×１０２ｍｍ遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）内の透析緩衝液中に調製された。ＶＬＰ産物（２００μＬ）が、ショ糖の上部に層状に載せられ、そして、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−Ｍ  超遠心機におけるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＷ−３２．１  スイングバケットローター（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）において緩加速および減速（プロファイル７）によって、４℃で７時間、３１，０００ｒｐｍで遠心分離された。０．５ミリリットル分画が採取され、そして、それぞれの分画における濃度が、放射活性測定により決定された。
【００８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラム。タンパク質のサイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析された。ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルおよび試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入された。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、試料はローディングバッファー（１×ＬＤＳランニングバッファーおよび５０ｍＭ  ジチオトレイトール）中、９５℃で１０分間変性された。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためには、試料はジチオトレイトールの添加および熱処理なしで、ＬＤＳランニングバッファーとの混合のみが行われた。試料は、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ２  タンパク質分子量スタンダードと共に１０％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル上にロードされ、そしてＭＥＳ／ＳＤＳランニングバッファー中で電気泳動された。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎが、ゲルを染色し、そして固定するために製造者の推奨に従って使用された。ゲルは、ストレージフォスファスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）への暴露の前に、ゲルドライヤモデル５８３（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて乾燥され、続いて、Ｔｙｐｏｏｎ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンされた。
【００８８】
アジド−アルキン共役および精製。［３＋２］環化付加クリック反応が、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェート触媒（［（ＣＨ３ＣＮ）４Ｃｕ］ＰＦ６または単に銅（Ｉ）触媒）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の還元状態を保持するために、嫌気性グローブボックス（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ、ＭＩ）内で行なわれた。銅（Ｉ）触媒が、クリック反応の速度を促進するために、０．５ｍＭ  エンハンサーリガンド、トリス（トリアゾリルメチル）アミン（ＴＴＭＡ）に加えて、１ｍＭで反応物に添加された。ＨＢｃ  ＶＬＰｓおよび機能的分子（フラジェリン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＭ９−ＳｃＦｖまたはＣｐＧ  ＤＮＡ）が、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて銅（Ｉ）触媒およびＴＴＭＡエンハンサーと混合された。銅（Ｉ）触媒の添加前に、クリック反応成分が嫌気性グローブボックス内で１時間、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ中で脱酸素化された。機能的分子をＨＢｃ  ＶＬＰへ連結するためのクリック反応は、終夜で行われた。
【００８９】
結果および考察
共有結合性ジスルフィド結合を導入することによるＨＢｃ  ＶＬＰの安定化。この研究において、Ｖ１４９においてトランケートされたＨＢｃカプシドタンパク質が使用された。トランケートされたＨＢｃタンパク質は、Ｔ＝４  正二十面体対称性で配置された２４０個のサブユニットから成るＶＬＰｓへと自己集合化する。Ｔ＝４  正二十面体カプシドは、図１に示されるように、１２個の正五角形の面と、３０個の正六角形の面とを有する。各々の五量体は、５個の六量体によって囲まれている。ＨＢｃ二量体の５倍ユニット（five-fold unit）およびＨＢｃ二量体の６倍ユニット（six-fold unit）は、図２に示されるように、１個の五量体と１個の六量体とをそれぞれ含む。５倍ユニットおよび６倍ユニットは、１個の二量体を共有し、および架橋結合されてＶＬＰを形成する。
【００９０】
「側鎖（side chains）」間の４種類の結合相互作用として、水素結合、塩橋、ジスルフィド結合および非極性疎水性相互作用が存在する。共有結合ジスルフィド結合が最も強力である。多くの共役反応の結果を分析した結果、本発明者らはＨＢｃ  ＶＬＰの骨格はクリック共役反応中安定でないことを発見した。これに対処するために、本発明者らは、隣り合う単量体同士がジスルフィド結合により連結されるために十分近接している部位を明らかにするためにカプシドの３Ｄ三次構造を評価した。５倍および６倍ユニットを架橋結合させるためにジスルフィド架橋を導入することができれば、ＶＬＰは安定化され得るであろう。
【００９１】
安定なＶＬＰを形成するために、５倍ユニットおよび６倍ユニットの両方でジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合可能な位置が探求された。２つのストラテジーが考案された。第一のストラテジーは、図３（ａ）に示されるように、二量体の側鎖間で最も短い距離にある２個のアミノ酸を探すことである。第二のストラテジーは、図３（ｂ）に示されるように、単量体のＣ末端領域間で可能なジスルフィド結合を調べた。正二十面体のカプシド構造によって示唆される距離が、括弧内に示されている。二量体にはもともと１個のジスルフィド結合が既に存在しているため、新規ジスルフィド結合の導入はＶＬＰを顕著に安定化し得る。全部で１０個の位置、ＳＳ１（Ｄ２９−Ｒ１２７）、ＳＳ２（Ｔ１０９−Ｖ１２０）、ＳＳ３（Ｙ１３２−Ｎ１３６）、ＳＳ４（Ｙ１３２−Ａ１３７）、ＳＳ５（Ｒ１３３−Ｎ１３６）、ＳＳ６（Ｒ１３３−Ａ１３７）、ＳＳ７（Ｐ１３４−Ｐ１３５）、ＳＳ８（Ｐ１３４−Ｎ１３６）、ＳＳ９（Ｐ１３４−Ａ１３７）およびＳＳ１０（Ｐ１３５−Ｎ１３６）が選択された。これらのアミノ酸のコドンは、その後、システインのコドンへと改変された。
【００９２】
正しいＳ−Ｓ結合を形成するために、ＨＢｓタンパク質は、まず最初に、還元雰囲気下のＣＦＰＳ系で合成された。ＨＢｃタンパク質は、ＣＦＰＳ系内でＶＬＰｓへと自己集合化し得る。集合化したＶＬＰｓは、その後、還元雰囲気下でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製された。還元雰囲気の維持は、ＶＬＰｓの集合化前の誤ったＳ−Ｓ結合の形成を防止するためである。精製されたＶＬＰｓは、その後、Ｓ−Ｓ結合を形成するために酸化剤（過酸化水素またはジアミド）を添加することにより酸化された。粒子径が、最終的に、ショ糖勾配遠心を用いて評価された。手順全体は、図４に示されている。
【００９３】
ＣＦＰＳの結果は、突然変異体の全てが、もとのＨＢｃタンパク質と同様の総収率を有していることを示した（図５（ａ））。１０個の候補の全てが、良好な溶解収率で発現された（≧３００μｇ／ｍＬ）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフ（図５（ｂ））は、少量の二量体のみが突然変異体のためのＣＦＰＳ系に形成されたことを示した。ＣＦＰＳ産物は、その後、ＳＥＣを使用して精製された（図６）。突然変異体ＳＳ３、ＳＳ４、ＳＳ５およびＳＳ６は、ＶＬＰへと集合化されなかった。ＳＥＣの分画９〜１１が集められ、そして１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２または１０ｍＭ  ジアミドの添加によって酸化された。酸化処理後、完全に架橋結合されたＶＬＰｓはＳＤＳによって分解されず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入り込めなかった（図７）。突然変異体ＳＳ２、ＳＳ７、ＳＳ８、ＳＳ９およびＳＳ１０においていくつかの単量体および二量体が観察され得たが、これは、いくつかのＳ−Ｓ結合が形成されなかったことを示していた。ＳＳ１粒子のみが、ジアミドによる酸化の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェル内に全て留まっており、および単量体または二量体を有さず、これはＳＳ１  ＶＬＰｓにおいてＳ−Ｓ結合の全てが形成されたことを示していた。これらの結果に基づいて、突然変異体ＳＳ１が最も優れたものであると思われた。突然変異体ＳＳ８もまた、Ｈ２Ｏ２で処理された場合には、完全に架橋結合された。酸化された粒子は、その後、適切な集合化を示すためにショ糖勾配遠心を用いて評価された（図８）。結果は、ＳＳ１、ＳＳ７、ＳＳ８、ＳＳ９およびＳＳ１０  ＶＬＰｓのサイズが全て正確であることを示していた。
【００９４】
酸化されたＶＬＰｓの機能をさらに検証するために、クリックケミストリー反応が試験された。フラジェリンタンパク質およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質が、付加体の例として使用された。ＣＦＰＳは、アルキン部位を有するｎｎＡＡｓをフラゲリンおよびＧＭ−ＣＳＦｓに、アジド部位を有するｎｎＡＡｓをＶＬＰｓに、導入するための容易な手段を提供する（Ｂｕｎｄｙら、２００８；ＧｏｅｒｋｅおよびＳｗａｒｔｚ、２００８；ＰａｔｅｌおよびＳｗａｒｔｚ、２０１１）。これは、銅（Ｉ）触媒による［３＋２］環化付加クリックケミストリー反応を用いた、フラジェリンまたはＧＭ−ＣＳＦのＶＬＰｓへの直接的なカップリングを可能にするにするであろう。この反応の結果（図９）は、フラジェリンおよびＧＭ−ＣＳＦがＳＳ１、ＳＳ７、ＳＳ８、ＳＳ９およびＳＳ１０  ＶＬＰｓに共役され得ることを示した。
【００９５】
上記結果に基づき、突然変異体ＳＳ１  ＶＬＰが最も効果的に安定化されたＶＬＰであり、ＳＳ８もほぼ同様に好適であった。
【００９６】
実施例２
生理的ｐＨにおいて、ＨＢｃ  ＶＬＰの表面は負に帯電されている。ＨＢｃ  ＶＬＰの表面は、その表面から突き出す１２０個の二量体スパイクで占められている。これらのスパイクは、立体化学的に利用可能性の高い明白な結合部位であるが、４個の負に帯電されたアミノ酸（Ｅ７７×２、Ｄ７８×２）で終止されている。ＶＬＰ表面上の負電荷は、スパイクチップ上のこれら４個の負に帯電したアミノ酸由来である。同じ電荷は反発し合うため、負電荷を有する分子は、ＨＢｃ  ＶＬＰに近接することができず、このため、クリックケミストリー共役が効果的に進み得ない。表面の負電荷の除去は、タンパク質の溶解性を顕著に低下させ、そしてＨＢｃタンパク質は、ＶＬＰｓへ良好に自己集合化出来なかった。以下の例は、この問題に対処する。
【００９７】
新規スパイクの移植。ＨＢｃ  ＶＬＰ表面の負電荷の除去は、その溶解性および自己集合化能力を低下させた。これをうけて本発明者らは、天然に存在するウイルス突然変異体におけるＨＢｃ二量体スパイクを再構築するための代替的な方法を探した。タンパク質単量体チップ上にたった１つの負に帯電されたアミノ酸を有するいくつかの天然型変異体が発見された。１個の天然型変異体（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ８Ｂ６Ｎ７）が選択され、そしてネイティブＨＢｃタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０３１４７）と比較された。遺伝子型Ｑ８Ｂ６Ｎ７では、１つの最終的な負電荷が依然として７８位に存在しているが、別の１つは、遺伝子型Ｐ０３１４７におけるもとの７７位から７０位へ移っている。
【００９８】
ＶＬＰの特性に対するＱ８Ｂ６Ｎ７におけるこれらの配列変更の効果を決定するために、Ｑ８Ｂ６Ｎ７におけるスパイク（スパイクチップ（ＳＴ）または疎水性ポケット全体（ＨＰ））が、ネイティブＨＢｃタンパク質に移植された（図１０）。２個の新規突然変異体ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）が作製され、そして突然変異体ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）と比較された。ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）は、チップ上の１個の負電荷（Ｄ７８）が除去されたネイティブＨＢｃタンパク質である。ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）が、新規ジスルフィド架橋（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）を導入することにより安定化された。ネイティブタンパク質のチップ上の１個の負電荷が除去された後、突然変異体ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）の溶解度は約５０％にすぎなかった（図１１）。２個の新規突然変異体ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）では溶解度が顕著に向上した（図１１）。ＨＢｃ（ＨＰ）は、ＨＢｃ（ＳＴ）よりも溶解性であった。ネイティブＨＢｃタンパク質は、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファー中ＶＬＰへと自己集合化し得るが、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）は、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーに対する透析後ＶＬＰへ自己集合化できず、これはウイルスカプシド表面上の負電荷が粒子集合にとって重要であることをさらに示唆した。より高濃度のＮａＣｌ（１．５Ｍ）を含むバッファーに対する透析後、改変されたＨＢｃタンパク質は、ＳＥＣ分析により、ＶＬＰへと集合化できていた。ＨＢｃ（ＨＰ）（配列番号：３５）はＨＢｃ（ＳＴ）よりも優れた溶解度を有していたため、その後の開発にはＨＢｃ（ＨＰ）が選択された。
【００９９】
スパイクチップ上における非天然型アミノ酸（ｎｎＡＡ）部位の選択。ＨＢｃ  ＶＬＰの表面は、その表面から突き出す１２０個の二量体スパイクで占められている。これらのスパイクのチップは、立体化学的に利用可能性の高い明白な結合部位である。最も良好な共役部位を同定するために、スパイクチップ上の６個の異なるｎｎＡＡ部位（Ｎ７５ＡＨＡ、Ｌ７６ＡＨＡ、Ｑ７７ＡＨＡ、Ｄ７８ＡＨＡ，Ｑ７９ＡＨＡおよびＡ８０ＡＨＡ）が、図１３に示されるように試験された。これらの突然変異体は、新規ジスルフィド架橋（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）を導入することにより、全て安定化された。ＡＨＡは、アジド部位を有するｎｎＡＡ、アジドホモアラニンを意味する。ｎｎＡＡ部位をＤ７８位に組み入れることにより、スパイクチップにおける負電荷が除去される。
【０１００】
ＣＦＰＳの結果は、突然変異体Ｄ７８ＡＨＡを除いて、これらの全ての突然変異体が非常に溶解性であることを示した（図１４）。しかしながら、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーに対する透析後、突然変異体Ｄ７８ＡＨＡの溶解収率は７０％に達し得た。ＳＥＣの結果は、これら全ての突然変異体がＶＬＰｓへと自己集合化できることを示した（図１５）。
【０１０１】
その後、これらの変異されたＶＬＰｓ上にリガンドを共役する能力がクリックケミストリー反応を用いて試験された。フラジェリンタンパク質、ＧＭＣＳＦタンパク質、ＩＭ９−ＳｃＦｖタンパク質およびＣｐＧ  ＤＮＡを含むアルキン官能基を有する４個の分子が使用された。ＩＭ９−ＳｃＦｖおよびＣｐＧ  ＤＮＡは、アルキン官能基付近の負電荷密度によって特徴付けられる。前述のように、ネイティブＨＢｃ  ＶＬＰの表面は負に帯電されていたので、負電荷を有する分子は、ネイティブＨＢｃ  ＶＬＰ表面に接近できず、およびそれゆえ、クリックケミストリー共役は、効果的に進行できない。突然変異体ＨＢｃ（ＨＰ）  Ｄ７８ＡＨＡは、スパイクチップ上に負電荷を有さなかった。共役反応の結果（図１６）は、ＨＢｃ  ＶＬＰ上の表面負電荷の除去が実際に、ＩＭ９−ＳｃＦｖおよびＣｐＧ  ＤＮＡの共役効率を、特にＣｐＧ  ＤＮＡに関して、顕著に向上させることを示した。上記結果に基づき、突然変異体ＨＢｃ（ＨＰ）  Ｄ７８ＡＨＡは、共役効率に関して最も良好なＶＬＰであった。
【０１０２】
ジスルフィド架橋の導入による安定化。１４９位のアミノ酸においてトランケートされたＨＢｃタンパク質は、主に（＞９５％）Ｔ＝４  ＶＬＰを形成することが示された。２個の単量体（１６．７ｋＤａ）は、密な二量体（３３．５ｋＤａ）を形成するように結合する。二量体の接合面において、２個の単量体のＣｙｓ−６１残基間のジスルフィド架橋が存在し、さらに二量体を安定化している、（図１７）。二量体（１２０個のコピー）は、その後、静電相互作用、水素結合および弱い疎水性相互作用によってＴ＝４  ＶＬＰへと自己集合化する。Ｔ＝４  正二十面体カプシドは、１２個の正五角形の面および３０個の正六角形の面を有する（図１７）。各々の五量体は、５個の六量体によって囲まれている。ＨＢｃ二量体の５倍ユニットおよびＨＢｃ二量体の６倍ユニットは、１個の五量体と１個の六量体とをそれぞれ含む。５倍ユニットおよび６倍ユニットは、１個の二量体を共有し、および架橋結合されてＶＬＰを形成する。５倍ユニットおよび６倍ユニットの接合面に、二量体間ジスルフィド結合が存在する。
【０１０３】
大きな分子または複数の分子との共役後のＨＢｃ  ＶＬＰの骨格を強化するために、５倍および６倍ユニットの両方を安定化させるであろう共有結合ジスルフィド架橋が導入された（図１８）。
【０１０４】
安定なＶＬＰｓを形成するために、５倍ユニットおよび６倍ユニットの両方において一致した可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合位置が探索された。合計で、１０個の位置、ＳＳ１（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）、ＳＳ２（Ｔ１０９Ｃ−Ｖ１２０Ｃ）、ＳＳ３（Ｙ１３２Ｃ−Ｎ１３６Ｃ）、ＳＳ４（Ｙ１３２Ｃ−Ａ１３７Ｃ）、ＳＳ５（Ｒ１３３Ｃ−Ｎ１３６Ｃ）、ＳＳ６（Ｒ１３３Ｃ−Ａ１３７Ｃ）、ＳＳ７（Ｐ１３４Ｃ−Ｐ１３５Ｃ）、ＳＳ８（Ｐ１３４Ｃ−Ｎ１３６Ｃ）、ＳＳ９（Ｐ１３４Ｃ−Ａ１３７Ｃ）、ＳＳ１０（Ｐ１３５Ｃ−Ｎ１３６Ｃ）、が選択された。選択されたアミノ酸のコドンが、システインのコドンに変更された。ＣＦＰＳ後、ＶＬＰｓが、図１９に示されるように、ＳＥＣによって精製された。ＶＬＰ分画が集められ、そして２０ｍＭ  ジアミドの添加によって酸化された。酸化処理の後、完全に架橋結合されたＶＬＰｓはＳＤＳによって分解されず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入り込めなかった（図２０）。ＳＳ１粒子のみが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料添加ウェル中に完全に留まっており、これは、Ｓ−Ｓ結合の全てがＳＳ１  ＶＬＰにおいて形成されたことを示していた。しかしながら、ＳＳ８もほぼ変化がなかった。これらの結果に基づき、突然変異体ＳＳ１およびＳＳ８が望ましい特性を有していた。ＶＬＰ内のジスルフィドネットワークをより強力にするために、ＳＳ１およびＳＳ８がＶＬＰ中に、同時に導入された。ＳＥＣ分析は、突然変異体ＳＳ１＋ＳＳ８がＶＬＰ集合を妨げないことを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析もまた、ＳＳ１＋ＳＳ８  ＶＬＰにおいてＳ−Ｓ結合の全てが形成されたことを示した。
【０１０５】
上記結果に基づき、突然変異体ＨＢｃ（ＨＰ）Ｄ７８ＡＨＡ  ＳＳ１＋ＳＳ８（配列番号：５２）が、最も安定化したＶＬＰであり、およびさらに高い共役効率も提供した。
【０１０６】
材料および方法
プラスミド構築。１４９位のアミノ酸においてトランケートされたＣ末端を有する、サブタイプａｄｙｗ（Ｐａｓｅｋら、１９７９）のヒトＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）カプシド単量体をエンコードする配列が、大腸菌ｔＲＮＡ濃度に対して最適化され、そしてＤＮＡｗｏｒｋｓ（ｖ３．０）を用いて設計されたオリゴヌクレオチドから合成された。ベクターｐＥＴ２４ａ−ＨＢｃ１４９が、最適化されたＨＢｃタンパク質遺伝子をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位でｐＥＴ−２４ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に連結することにより（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）作製された。メチオニンアナログを組み入れるために、２つの突然変異（Ｍ６６ＳおよびＬ７６Ｍ）が導入された。ｐＥＴ２４ａ−ＨＢｃ１４９−Ｍ６６Ｓ−Ｌ７６ＭがＤＨ５ａ細胞中に形質転換され、そしてプラスミドが、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）中での使用のために、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））を用いて精製された。全ての突然変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて構築された。
【０１０７】
ＨＢｃタンパク質変異体の配列。野生型、ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）の配列が、以下の表に示された。ＨＢｃ（Ｄ７８Ｍ）、ＨＢｃ（ＳＴ）およびＨＢｃ（ＨＰ）は、新規ジスルフィド架橋ＳＳ１（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）を導入することにより安定化された。全ての配列は、ＳＳ１突然変異体およびＭ６６Ｓ突然変異を含んでいる（下線部）。
【０１０８】
2016507520.tif 000013
【０１０９】
異なるＡＨＡ部位を有するＨＢｃ（ＨＰ）の配列が、以下の表に示される。これらは全て、新規ジスルフィド架橋ＳＳ１（Ｄ２９Ｃ−Ｒ１２７Ｃ）を導入することにより安定化された。ＡＨＡは、アジドホモアラニン、試験された非天然型アミノ酸を意味する。
【０１１０】
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2016507520.tif 000015
【０１１１】
異なるジスルフィド結合部位を有するＨＢｃ（ＨＰ）Ｄ７８ＡＨＡの配列が、以下の表に示される。ＡＨＡは、アジドホモアラニン、試験された非天然型アミノ酸を意味する。
【０１１２】
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2016507520.tif 000017
2016507520.tif 000018
【０１１３】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）。ＣＦＰＳは、上述のＰＡＮＯｘ−ＳＰ（ＰＥＰ、アミノ酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、シュウ酸、スペルミジンおよびプトレシン）無細胞システム（ＪｅｗｅｔおよびＳｗａｒｔｓ、２００４）をいくつかの改変とともに用いて行われた。標準のＰＡＮＯｘ−ＳＰ  ＣＦＰＳ反応混合物は、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、それぞれ０．８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、３３ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１７０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１０ｍＭ  グルタミン酸アンモニウム、１６ｍＭ  グルタミン酸マグネシウム、１．５ｍＭ  スペルミジンを、１．０ｍＭ  プトレシン、０．１７ｍｇ／ｍＬ  フォリン酸、４５μｇ／ｍＬ  プラスミド、約１００〜３００μｇ／ｍＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、それぞれ２ｍＭの２０個の非標識アミノ酸、０．３３ｍＭ  ＮＡＤ、０．２６ｍＭ  補酵素Ａ（ＣｏＡ）、２．７ｍＭ  シュウ酸カリウム、および０．２８当量の大腸菌ＫＣ６  Ｓ３０抽出物（ＧｏｅｒｋｅおよびＳｗａｒｔｚ、２００８）を含む。ＨＢｃタンパク質におけるメチオニンの包括的置換のために、メチオニンが無細胞反応混合物から除外され、アジド部位を提示する非天然型アミノ酸、アジドホモアラニン（ＡＨＡ）（Ｍｅｄｃｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＬＬＰ、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｗａｙ、ＷＡ）１ｍＭから置換された。全ての試薬は、他に断りのない限り、シグマ−アルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手された。
【０１１４】
ＨＢｃタンパク質を産生するためのＣＦＰＳ反応は、３０℃で６時間行われた。小量ＣＦＰＳ反応が、１．５ｍＬ  マイクロ遠心チューブ中２０μＬの容積で実施された。分取用スケールでの反応は、６ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０４６、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１ウェルにつき１ｍＬを用いた６ｍＬ量を使用した。８．４μＭ  Ｌ−［Ｕ−１４Ｃ］−ロイシン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）が、少量反応へ、および分取用スケール反応の２０μＬアリコットへ、上述のトリクロロ酢酸タンパク質沈澱プロトコルおよびベックマン  ＬＳ３８０１  液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いてタンパク質収率を測定するために添加された。
【０１１５】
アルキン部位を有するＧＭ−ＣＳＦ、ＩＭ９−ＳｃＦｖおよびＣｐＧ  ＤＮＡの産生は、Ｐａｔｅｌらにより記載されている。アルキン部位を有するフラジェリンの産生は、ルＬｕらにより記載されている。
【０１１６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。非取り込みＬ−「Ｕ−１４Ｃ」−ロイシンを除去するために、無細胞産生物は直ちに、６〜８０００  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｏｒｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｕｂｉｎｇ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）において１ｍＭ  ＤＴＴが添加された透析緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＭａＣｌ）に対して緩衝液を２回交換して透析された。透析された無細胞反応産生物は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が充填されたＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）カラム上にロードされた。ランニングバッファーは、５ｍＭ  ＤＴＴが添加された透析緩衝液である。溶出画分のタンパク質濃度が放射活性によって測定された
【０１１７】
ショ糖勾配沈降。ＳＥＣから単離されたＶＬＰｓが、ＤＴＴを除去するためにまず透析緩衝液に対して透析され、そしてその後、１０ｍＭ  過酸化水素または１０ｍＭ  ジアミドを添加し、および室温で１時間インキュベートすることによって、ジスルフィド結合を形成するために酸化された。酸化剤は、透析緩衝液に対して緩衝液を２回交換して透析することにより除去した。酸化されたＶＬＰｓは速度沈降法により評価された。１０〜４０ｗ／ｖ％のショ糖連続密度勾配が、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｖｅｒ３．０５Ｌ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｋｅｒ（Ｂｉｏｃｏｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、ポリアロース（Polyallose）１６×１０２ｍｍ遠心チューブ（Beckman）中の透析緩衝液に調製された。ＶＬＰ産物（２００μＬ）が、ショ糖の上部に層状に載せられ、そして、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−Ｍ  超遠心機におけるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＷ−３２．１  スイングバケットローター（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）において緩加速および減速（プロファイル７）によって、４℃で７時間、３１，０００ｒｐｍで遠心分離された。０．５ミリリットル分画が採取され、そして、それぞれの分画における濃度が、放射活性測定により決定された。
【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラム。タンパク質のサイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィによって分析された。ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルおよび試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入された。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、試料はローディングバッファー（１×ＬＤＳランニングバッファーおよび５０ｍＭ  ジチオトレイトール）中、９５℃で１０分間変性された。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためには、試料はジチオトレイトールの添加および熱処理なしで、ＬＤＳランニングバッファーとの混合のみが行われた。試料は、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ２  タンパク質分子量スタンダードと共に１０％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル上にロードされ、そしてＭＥＳ／ＳＤＳランニングバッファー中で電気泳動された。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎが、ゲルを染色し、そして固定するために製造者の推奨に従って使用された。ゲルは、ストレージフォスファスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）への暴露の前に、ゲルドライヤモデル５８３（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて乾燥され、続いて、Ｔｙｐｏｏｎ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンされた。
【０１１９】
アジド−アルキン共役および精製。［３＋２］環化付加クリック反応が、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェート触媒（［（ＣＨ３ＣＮ）４Ｃｕ］ＰＦ６または単に銅（Ｉ）触媒）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の還元状態を保持するために、嫌気性グローブボックス（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ、ＭＩ）内で行なわれた。銅（Ｉ）触媒が、クリック反応の速度を促進するために、０．５ｍＭ  エンハンサーリガンド、トリス（トリアゾリルメチル）アミン（ＴＴＭＡ）に加えて、１ｍＭで反応物に添加された。ＨＢｃ  ＶＬＰｓおよび機能的分子（フラジェリン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＭ９−ＳｃＦｖまたはＣｐＧ  ＤＮＡ）が、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて銅（Ｉ）触媒およびＴＴＭＡエンハンサーと混合された。銅（Ｉ）触媒の添加前に、クリック反応成分が嫌気性グローブボックス内で１時間、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ中で脱酸素化された。機能的分子をＨＢｃ  ＶＬＰへ連結するためのクリック反応は、終夜で行われた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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