(57)【要約】  本出願は、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害するのに高い活性及び特異性を有するイミノ糖を提供する。【選択図】なし
2016517887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシン又はその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式Ｉ
【化１】
2016517887.tif 000034
（上式中、Rは、
【化２】
2016517887.tif 000035
であり、R1は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2, N3又はNH2から選ばれ、
Yは存在しないか、又は、カルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基であり、そして
Zは結合又はNHから選ばれ、
但し、Zが結合であるときには、Yは存在せず、
但し、ZがNHであるときには、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。）の化合物又はその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項３】
R１は置換もしくは非置換ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル又はオクチル基である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ZはＮＨである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
X1-5の少なくとも１つはNO2、N３又はNH2から選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項６】
式Ｉの化合物は式IA
【化３】
2016517887.tif 000036
の化合物の構造を有する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
R1 は-(CH2)5-であり、
W1-4はHであり、
X1はNO2であり、
X3 はN3であり、
X2, X4及びX5はHであり、
Yは-(CH2)-であり、そして
ZはNHである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
R1 は-(CH2)5-であり、
W1-4はHであり、
X1及びX3 はNO2であり、
X2, X4及びX5はHであり、
Yは-(CH2)-であり、そして
ZはNHである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式ＩＩ
【化４】
2016517887.tif 000037
（上式中、Rは、
【化５】
2016517887.tif 000038
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）の化合物又はその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
R’は１〜１２個の炭素原子を有する非置換もしくは置換アルキル基である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
R’は１〜３個の酸素原子により置換されているアルキル基である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
R’は(CH2)n-O-(CH2)m（式中、nは5〜8であり、mは0〜4である）である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
R’はアミノ置換アルキル基である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
R’は(CH2)p-NH-(CH2)q（式中、nは5〜8であり、そしてqは0〜2である）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
X1-5の少なくとも１つはハロゲン又はハロゲン化アルキルである、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
式IIの化合物は式IIa
【化６】
2016517887.tif 000039
を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
Rは
【化７】
2016517887.tif 000040
から選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式
【化８】
2016517887.tif 000041
の化合物又はその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記対象は、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させることが有益である疾患又は病態を有する対象であり、前記投与は前記疾患又は病態の治療をもたらす、請求項１〜２、９及び１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は病態は、ゴーシェ病、ファブリ病、サンドホフ病、テイ−サックス病、ＧＭ１ガングリオシド蓄積症、ニーマン−ピック病Ｃ型、II型糖尿病、糖尿病性腎症に関連した肥大又は過形成、血糖上昇、糖化ヘモグロビンレベル上昇、糸球体疾患又はループスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患又は病態はI型、II型又はIII型ゴーシェ病である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記投与はβ−グルコセレブロシダーゼ活性のシャペロンをもたらす、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患又は病態は全身性エリテマトーデスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記対象はヒトである、請求項１〜２、９及び１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
糖脂質の阻害に有効な量のＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシン又はその医薬上許容される塩に細胞を供することを含む、糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法。
【請求項２６】
糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法であって、糖脂質の阻害に有効な量の式Ｉ
【化９】
2016517887.tif 000042
（上式中、Rは、
【化１０】
2016517887.tif 000043
であり、R1は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2, N3又はNH2から選ばれ、
Yは存在しないか、又は、カルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基であり、そして、
Zは結合又はNHから選ばれ、
但し、Zが結合であるときには、Yは存在せず、
但し、ZがNHであるときには、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。）の化合物又はその医薬上許容される塩に前記細胞を供することを含む、方法。
【請求項２７】
糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法であって、糖脂質の阻害に有効な量の式ＩＩ
【化１１】
2016517887.tif 000044
（上式中、Rは、
【化１２】
2016517887.tif 000045
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）の化合物又はその医薬上許容される塩に前記細胞を供することを含む、方法。
【請求項２８】
前記化合物又はその医薬上許容される塩に細胞を供することをインビトロで行う、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記糖脂質はグルコセラミドベースのスフィンゴ糖脂質を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記糖脂質はＧＭ３を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞はヒト細胞である、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
式Ｉ
【化１３】
2016517887.tif 000046
（上式中、Rは
【化１４】
2016517887.tif 000047
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）の化合物。
【請求項３３】
R’は１〜１２個の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基である、請求項３２記載の化合物。
【請求項３４】
R’は１〜３個の酸素原子により置換されているアルキル基である、請求項３２記載の化合物。
【請求項３５】
R’は(CH2)n-O-(CH2)m（式中、nは5〜8であり、mは0〜4である）である、請求項３２記載の化合物。
【請求項３６】
R’はアミノ置換アルキル基である、請求項３２記載の化合物。
【請求項３７】
R’は(CH2)p-NH-(CH2)q（式中、nは5〜8であり、そしてqは0〜2である）である、請求項３２記載の化合物。
【請求項３８】
X1-5の少なくとも１つはハロゲン又はハロゲン化アルキルである、請求項３２記載の化合物。
【請求項３９】
X3及びX5の少なくとも１つはハロゲン、NO2又はハロゲン化アルキルであり、そしてX1, X2及びX4は水素である、請求項３２記載の化合物。
【請求項４０】
X3及びX5の少なくとも１つはF又はClである、請求項３２記載の化合物。
【請求項４１】
式IIa
【化１５】
2016517887.tif 000048
を有する、請求項３２記載の化合物。
【請求項４２】
Rは、
【化１６】
2016517887.tif 000049
から選ばれる、請求項３２記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１３年５月２日に出願された米国仮出願番号第６１／８１８，６２１号及び２０１４年１月２１日に出願された米国仮出願番号第６１／９２９，７０４号の利益を主張し、その全体の内容を参照により本開示に取り込む。
【０００２】
本出願はイミノ糖及び糖脂質阻害剤としてのその使用、ならびに、糖脂質阻害が利益を提供する病態及び疾患を治療する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
１つの実施形態は、有効量のＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシン又はその医薬上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し及び／又は糖脂質濃度を低下させる方法である。
【０００４】
別の実施形態は、有効量の式Ｉの化合物又はその医薬上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又は、糖脂質濃度を低下させる方法である。
【化１】
2016517887.tif 000003
（上式中、Ｒは、
【化２】
2016517887.tif 000004
であり、R1は置換もしくは非置換アルキル基であり、W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2, N3又はNH2から選ばれ、Yは存在しないか、又は、カルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基であり、そしてZは結合又はNHから選ばれ、
但し、Zが結合であるときには、Yは存在せず、
但し、ZがNHであるときには、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。）
【０００５】
さらに別の実施形態は、有効量の式ＩＩの化合物又はその医薬上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又は、糖脂質濃度を低下させる方法である。
【化３】
2016517887.tif 000005
（上式中、Rは、
【化４】
2016517887.tif 000006
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）
【０００６】
さらに別の実施形態は、有効量の下記式の化合物又はその医薬上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又は、糖脂質濃度を低下させる方法である。
【化５】
2016517887.tif 000007
【０００７】
さらに別の実施形態は、糖脂質の阻害に有効な量のＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシン又はその医薬上許容される塩に細胞を供することを含む、糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法である。
【０００８】
さらに別の実施形態は、糖脂質の阻害に有効な量の式Ｉの化合物又はその医薬上許容される塩に細胞を供することを含む、糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法である。
【化６】
2016517887.tif 000008
（上式中、Ｒは、
【化７】
2016517887.tif 000009
であり、R1は置換もしくは非置換アルキル基であり、W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2, N3又はNH2から選ばれ、Yは存在しないか、又は、カルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基であり、そしてZは結合又はNHから選ばれ、
但し、Zが結合であるときには、Yは存在せず、
但し、ZがNHであるときには、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。）
【０００９】
さらに別の実施形態は、糖脂質の阻害に有効な量の式ＩＩの化合物又はその医薬上許容される塩に細胞を供することを含む、糖脂質を産生することができる細胞中での糖脂質の生合成を阻害する方法である。
【化８】
2016517887.tif 000010
（上式中、Ｒは、
【化９】
2016517887.tif 000011
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）
【００１０】
別の実施形態は式Ｉの化合物である。
【化１０】
2016517887.tif 000012
（上式中、Ｒは
【化１１】
2016517887.tif 000013
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ〜１ＢはＮＢ−ＤＮＪ (図１Ａ)及びＵＶ−４(図１Ｂ)に関するＨＬ６０細胞におけるＧＭ３合成の投与応答阻害のＨｉｌｌプロットを表す。細胞の化合物投与の後に、ＧＳＬは抽出され、オリゴ糖は開裂されそして２−ＡＡによりラベル化され、そしてＮＰ−ＨＰＬＣにより分離された。ＧＭ３により誘導されたオリゴ糖のピーク面積を、未処理の細胞に対して定量化しそして表した。４パラメータロジスティックモデルを用いて、ＩＣ５０値を計算した。
【００１２】
【図２】図２は基質減少療法（ＳＲＴ）の細胞標的を示す。セラミドグルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の治療として、グルコ−及びガラクト立体化学のＮ−アルキル化イミノ糖によって阻害される。ウリジンジホスフェートグルコース（ＵＤＰ‐グルコース）セラミドグルコシルトランスフェラーゼは、スフィンゴ糖脂質生合成の最初のグリコシル化工程を触媒する。製品であるグルコシルセラミドは、３００を超えるＧＳＬのコア構造である。図２はＮ−アルキルイミノ糖に言及しているが、この図に示されているメカニズムは、Ｎ−アルキルイミノ糖だけでなく、他のＮ−置換イミノ糖、図３及び図１２に示されるイミノ糖などの他のＮ−置換イミノ糖に適用することができることが理解されるべきである。
【００１３】
【図３】図３は本研究に使用されるイミノ糖の化学式を提供する。
【００１４】
【図４】図４はＨＬ６０細胞のＧＳＬプロファイルを示す。ＨＬ６０細胞はイミノ糖の濃度を変化させながら、７２時間処理された。脂質をＨＬ６０細胞ペレットから抽出し、そして２ＡＡによるラベル化及びＮＰ‐ＨＰＬＣ分析によって特徴付けた。ＧＳＬ標準リリースは、酵素放出及び蛍光ラベル化の両方のためのポジティブコントロールである。ＧＭ３レベルはＩＣ５０の計算のために測定された。
【００１５】
【図５】図５はＧＭ３細胞還元アッセイからの代表的なＨｉｌｌプロットを示す。ＧＭ３ピーク面積を使用して、ＧＳＬ生合成の阻害を決定した。実験を３つの組で行い、そして誤差バーは標準偏差を示す。
【００１６】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｂはインビトロβ−グルコセレブロシダーゼアッセイの代表的なＨｉｌｌプロットを示す。ヒト胎盤β−グルコセレブロシダーゼの阻害の測定。実験を３つの組で行い、そして誤差バーは標準偏差を示す。
【図６Ｂ】同上。
【００１７】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｂはシャペロン処理時の酵素の増強を示すデータを提供する。収集及び酵素レベルのアッセイの３日前に１０μＭまでの非細胞傷害性レベルのイミノ糖で処理されたゴーシェＮ３７０Ｓ線維芽細胞であり、未処理の変異線維芽細胞と比較したものである。
【図７Ｂ】同上。
【００１８】
【図８】図８はＵＶ ６．２を製造するための合成スキームを提供する。
【００１９】
【図９】図９はＵＶ ６．４を製造するための合成スキームを提供する。
【００２０】
【図１０】図１０はＵＶ６．８を製造するための合成スキームを提供する。
【００２１】
【図１１】図１１はＴｏＰ‐ＤＮJに関するＨＬ６０細胞におけるＧＭ３合成の投与応答阻害のＨｉｌｌプロットを表す。図１１のデータを得るための方法は図１及び５と同一であった。
【００２２】
【図１２】図１２はＴｏＰ−ＤＮＪの化学式を提供する。
【００２３】
【図１３】図１３はＵＶ−４及びＴｏＰ―ＤＮＪに関する遊離オリゴ糖分析(ＥＲαグルコシダーゼ阻害の尺度)の結果を提供し、Ｔｏｐ−ＤＮＪはＥＲグルコシダーゼ阻害活性を実質的に欠いていることを示す。遊離グルコシルオリゴ糖はAlonziら、Biochem. J. (2008) 409, 571-580により測定した。
【００２４】
【図１４】図１４はヒト肝細胞がん細胞における細胞グルコシルセラミド及びその下流生成物であるラクトシルセラミド（ガングリオシド生合成の中間体）に対するＴｏｐ−ＤＮＪの効果を実証し、１０μＭ濃度のＴｏｐ−ＤＮＪでこの経路のほぼ完全な阻害を示している。スフィンゴ糖脂質(GlcCer及びLacCerを含む)はWolf, C. and Quinn, P.J. Progress in lipid research (2008) 47, 15-36により測定した。端的には、細胞脂質のクロロホルム−メタノール抽出物をHPLCに供し、他の細胞脂質からスフィンゴ糖脂質種を分離し、その後、内部標準とともに二次元質量分析法に供し、特定のスフィンゴ糖脂質種を定量化した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
特段の指示がないかぎり、「a」又は「an」は「１つ又はそれを超えること」を意味する。
用語「GCS」は、本明細書中に使用されるときに、セラミドグルコシルトランスフェラーゼEC 2.4.1.80又はUDP-グルコース−セラミドグルコシルトランスフェラーゼ又はグルコシルセラミドシンターゼとしても知られている、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを意味する。
用語「疾患」又は「病態」は一般に病的状態又は機能であると考えられる障害及び／又は異常を意味し、それは、特定の徴候、症状及び／又は機能不全の形で現れることができる。
【００２６】
本明細書中に使用されるときに、「処置」又は「治療」（"treat," "treating," "treatment"）などは疾患又は病態及び／又はそれに関連する徴候を無くし、低減し又は寛解することを意味する。
【００２７】
排除するわけではないが、疾患又は病態を治療することはその疾患、病態又は関連する徴候を完全に除去することを要求しない。本明細書中に使用されるときに、用語「治療又は処置（"treat," "treating," "treatment"）など」は予防的治療又は処置を包含することができ、予防的治療又は処置は疾患又は病態の再発(redeveloping)、又は、疾患又は病態の再発(recurrence)を起こしていないが、その危険性があり又は起こしやすい対象において、疾患又は病態が再発(redeveloping)すること、又は、以前に制御されていた疾患又は病態が再発(recurrence)することの可能性を低減することを指す。用語「治療」及びその同義語はこのような治療を必要とする対象に対して治療有効量の本発明の化合物を投与することが考えられる。かかる対象は哺乳動物などの温血動物であり得る。多くの実施形態において、対象はヒトであり得る。
【００２８】
用語「治療有効量」又は「有効用量」は、本明細書中に使用されるときに、本発明の方法により投与されるときに、必要とする個体に対して、注目の病態又は疾患の治療のために、イミノ糖などの活性剤を効果的にデリバリーするのに十分な量のイミノ糖などの活性剤の量を指す。リソソーム蓄積症の場合には、治療有効量の薬剤は所望なされない糖脂質蓄積を低減し（すなわち、ある程度遅延させそして好ましくは停止する）、及び／又は、ある程度、疾患に関連する１つ以上の徴候を緩和することができる。好ましくは、有効量は医学的に有益であるが、その使用に伴う利益に勝る毒性作用を示さない。
【００２９】
ＩＣ５０又はＩＣ９０ (阻害濃度５０又は９０)は特定のスフィンゴ糖脂質の５０％又は９０％の低減を達成するために使用される、イミノ糖などのスフィンゴ糖脂質生合成阻害剤の濃度であり得る。
【００３０】
本発明の発明者は特定のイミノ糖はセラミドグルコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であること、及び／又は、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、及び、ラクトシルセラミド由来ガングリオシドの細胞濃度を低下させるのに高い活性を有し得ることを発見した。特に、これらのイミノ糖は、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有し、及び／又は、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、及び、ラクトシルセラミド由来ガングリオシドの細胞濃度を低下させるのに、このような活性を有することが知られている化合物であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）よりも驚くほど高い活性を有し得る。例えば、米国特許第５，４７２，９６９号及び同第５，５２５，６１６号明細書を参照されたい。多くのＧＣＳ及びスフィンゴ糖脂質阻害剤は、例えば、米国特許第５，３０２，６０９号、同第５，４７２，９６９号、同第５，５２５,６１６号、同第５，９１６，９１１号、同第５，９４５,４４２号、同第５，９５２，３７０号、同第６，０３０，９９５号、同第６，０５１，５９８号、同第６，２５５，３３６号、同第６，５６９，８８９号、同第６，６１０，７０３号、同第６，６６０，７９４号、同第６，８５５，８３０号、同第６，９１６，８０２号、同第７，２５３，１８５号、同第７，１９６，２０５号及び同第７，６１５，５７３に開示されている。追加のＧＣＳ阻害剤及び治療法はＷＯ ２００８/１５０４８６、ＷＯ ２００９/１ １７１５０及びＷＯ ２０１０/０１４５５４に開示されている。
【００３１】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は、N-(9-メトキシノニル)デオキシノジリマイシン(UV-4)又はその医薬上許容される塩であり得る。N-(9-メトキシノニル)デオキシノジリマイシン及びその製造方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０/０２２２３８４号、同第２０１１/００６５７５４号、同第２０１１/００６５７５３号及び同第２０１１/０６５７５２号明細書のとおり、米国特許第８，４５０，３４５号及び同第８，４２６，４４５号に開示されている。
【００３２】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は米国特許出願公開第２００７/０２７５９９８号明細書に開示されている化合物であり得る。例えば、イミノ糖は式Ｉの化合物又はその医薬上許容される塩であり得る。
【００３３】
【化１２】
2016517887.tif 000014
（上式中、Ｒは
【化１３】
2016517887.tif 000015
であり、
R1は置換もしくは非置換アルキル基であり、
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、
X1-5は、独立して、H, NO2, N3又はNH2から選ばれ、
Yは存在しないか、又は、カルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基であり、そして
Zは結合又はNHから選ばれ、
但し、Zが結合であるときには、Yは存在せず、
但し、ZがNHであるときには、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。）。化学基の定義はＵＳ２００７/０２７５９９８と同一であり得る。
【００３４】
幾つかの実施形態において、R1は置換もしくは非置換C1〜C12アルキル基、すなわち、１〜１２個の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基であり得る。例えば、R1 は置換もしくは非置換C1〜C10アルキル基、又は、置換もしくは非置換C3〜C9アルキル基、又は、置換もしくは非置換C5〜C8アルキル基であり得る。幾つかの実施形態において、D1 は置換もしくは非置換ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル又はオクチル基である。
【００３５】
多くの実施形態において、ZがNHであることが好ましいことがある。このような場合には、Yはカルボニル以外の置換もしくは非置換C1-アルキル基である。
【００３６】
幾つかの実施形態において、X1-5の少なくとも１つの又は少なくとも２つはNO2, N3及びNH2から選ばれうる。幾つかの実施形態において、X1-5の少なくとも１つ又は少なくとも２つはNO2及びN3から選ばれうる。幾つかの実施形態において、X1-5の少なくとも１つ又は少なくとも２つはNO2及びNH2から選ばれうる。幾つかの実施形態において、X1-5の少なくとも１つ又は少なくとも２つはNH2及びN3から選ばれうる。
【００３７】
幾つかの実施形態において、式Ｉの化合物はデオキシノジリマイシン誘導体、すなわち、式Iaの化合物であり得る。
【化１４】
2016517887.tif 000016
【００３８】
ＤＮＪ誘導体の例としては、Ｎ−（Ｎ'−{４'−アジド−２'−ニトロフェニル）−６−アミノヘキシル）−デオキシノジリマイシン（ＮＡＰ−ＤＮＪ又はＵＶ−５）及びＮ−（Ｎ' −｛２，４−ジニトロフェニル）−６−アミノヘキシル）−デオキシノジリマイシン（ＮＤＰ−ＤＮＪ）が挙げられる。
【００３９】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は式ＩＩの化合物又はその医薬上許容される塩であり得る。
【化１５】
2016517887.tif 000017
（上式中、Ｒは
【化１６】
2016517887.tif 000018
であり、R’は置換もしくは非置換アルキル基であり、
【００４０】
W1-4は独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、又は、置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から選ばれ、X1-5は、独立して、H, NO2、ハロゲン、アルキル又はハロゲン化アルキルから選ばれる。）。用語「置換」はＵＳ２００７/０２７５９９８と同一の意味であり得る。式ＩＩの化合物は、例えば、図８〜１０に図示されたものと同様の合成スキームに従って調製されうる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、R’は置換もしくは非置換C1〜C12アルキル基、又は、置換もしくは非置換C2〜C10アルキル基、又は、置換もしくは非置換C3〜C9アルキル基、又は、置換もしくは非置換C5〜C8アルキル基であり得る。幾つかの実施形態において、R’は非置換C1〜C12アルキル基、又は、C2〜C10アルキル基、又は、C3〜C9アルキル基、又は、C5〜C8アルキル基であり得る。さらに、幾つかの実施形態において、R’は1〜3個の酸素原子により置換されているアルキル基、例えば、C1〜C12 又はC2〜C10又はC3-C9又はC5-C8 アルキル基であり得る。例えば、幾つかの実施形態において、R’は(CH2)n-O-(CH2)m（式中、nは3〜10又は5〜8であり、mは0〜4である）であり得る。幾つかの実施形態において、R’はアミノ置換アルキル基であることができ、すなわち、アミノ基により置換されているアルキル基、例えば、C1〜C12又はC2〜C10又はC3〜C9又はC5〜C8アルキル基であり得る。例えば、R’は(CH2)p-NH-(CH2)q（式中、nは3〜10又は5〜8であり、そしてqは0〜2又は0〜4である。）であり得る。
【００４２】
幾つかの実施形態において、式ＩＩの化合物中のX1-5の少なくとも１つ又は少なくとも２つはハロゲン、例えば、F, Cl又はBr、又は、ハロゲン化アルキルであり得る。ハロゲン化アルキルはC1ハロゲン化アルキル、例えば、CHCl2, CHF2, CH2Cl, CH2F, CF3又はCCl3であり得る。
【００４３】
幾つかの実施形態において、X3及びX5の少なくとも１つはハロゲン、NO2又はハロゲン化アルキルであり、X1, X2及びX4はHである。
幾つかの実施形態において、X3及びX5の少なくとも１つはF又はClである。
多くの実施形態において、W1, W2, W3及びW4は各々水素であり得る。
【００４４】
幾つかの実施形態において、式ＩＩの化合物は、デオキシノジリマイシン誘導体、すなわち、式ＩＩａの化合物であり得る。
【化１７】
2016517887.tif 000019
このような化合物の例としては図３に示すUV-6.2, UV 6.4, UV 6.5及びUV 6.8が挙げられる。
【００４５】
幾つかの実施形態において、式ＩＩ又はＩＩａの化合物は、Ｒが下記のいずれかであり得る。
【化１８】
2016517887.tif 000020
【００４６】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は米国特許出願公開第２０１３/０３３１５７８号明細書中に開示されている化合物であることができ、その文献の全体を参照により取り込む。例えば、幾つかの実施形態において、イミノ糖は式I’の化合物であってもよい。
【化１９】
2016517887.tif 000021
（上式中、R1はC2〜C6アルキル又はオキシアルキル基であり、
YはO又はCH2であり、
Zは(CH2)3-O-CH2、(CH2)5、
【化２０】
2016517887.tif 000022
【化２１】
2016517887.tif 000023
であり、R2はa)Zが
【化２２】
2016517887.tif 000024
であるときには、直鎖もしくは枝分かれC10〜C16アルキル又はアルキレン基及びHであり、そしてb) Zが (CH2)3-O-CH2、(CH2)5又は
【化２３】
2016517887.tif 000025
であるときには、直鎖もしくは枝分かれC10〜C20 アルキル又はアルキレン基であり、
W1-4は各々独立して、H又はアルコール保護基から選ばれ、そしてX1-4 は互いに独立して、H又はC1-2 アルキルから選ばれる。
【００４７】
幾つかの実施形態において、式I’の化合物は式II’を有し得る。 
【化２４】
2016517887.tif 000026
幾つかの実施形態において、R1はC5 アルキルであり得る。
幾つかの実施形態において、-Z-Y-は
【化２５】
2016517887.tif 000027
であり、上式中、各X1-4 は、独立して、H又はメチルから選ばれる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、X4 はメチルであり、ここで、R2-Z-Y-は
【化２６】
2016517887.tif 000028
である。
【００４９】
幾つかの実施形態において、X1-4 は各々メチルであり、R1はC5 アルキルである。幾つかの実施形態において、W1-4 は各々Hである。
【００５０】
幾つかの実施形態において、R2 は 
【化２７】
2016517887.tif 000029
である。
【００５１】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は下記式の化合物
【化２８】
2016517887.tif 000030
（トコフェリルペンチルデオキシノジリマイシン、ＴＯＰ−ＤＮＪ）又はその医薬上許容される塩であり得る。
【００５２】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼ及び／又はＧＳＬ阻害剤として、上記のイミノ糖を多くの疾患又は病態を治療するために使用することができ、ここで、かかる疾患又は病態には、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又はスフィンゴ糖脂質濃度を低下することは有利であり得る。そのような疾患又は病態の例としては、ゴーシェ病（I型、II型及びIII型ゴーシェ病を含む）、ファブリー病、サンドホフ病、テイ-サックス病、パーキンソン病、II型糖尿病、糖尿病性腎症に関連した肥大又は過形成、血糖上昇、糖化ヘモグロビンレベル上昇、糸球体疾患及び全身性エリテマトーデスなどのループスが挙げられる。糸球体疾患の例としては、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、崩壊糸球体症、増殖性ループス腎炎、半月糸球体腎炎及び膜性腎症が挙げられる。
【００５３】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又は、スフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は、リソソームスフィンゴ糖脂質蓄積症（ＬＳＤ）、例えば、ゴーシェ病（I、II及びIII型）、ファブリ病、サンドホフ病、テイ−サックス病、ＧＭ１ガングリオシド蓄積症及びニーマン−ピックＣ型疾患であり得る。
【００５４】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又は、スフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は多発性骨髄腫であり得る。上記に開示したイミノ糖の多くはセラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤であることに加えて、グルコシダーゼ阻害剤である。セラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤及びグルコシダーゼ阻害剤であるイミノ糖などの薬剤による破骨細胞形成の阻害及び／又は多発性骨髄腫に関連する破骨細胞活性化の低減は、ＵＳ２０１１/０１３６８６８に開示されている。ＵＳ ２０１１/０１３６８６８は、また、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤及びグルコシダーゼ阻害剤であるイミノ糖などの薬剤により溶骨性活性及び／又は骨損失の低減又は防止を開示している。
【００５５】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又はスフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は、骨粗鬆症又は骨関節炎であり得る。これらの疾患に関連した破骨細胞形成の阻害及び／又は破骨細胞活性化の低減は骨吸収を防ぐことができる。
【００５６】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又はスフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は、多嚢胞腎疾患であることができ、それには多嚢胞腎疾患の常染色体優性又は劣性形が含まれる。
【００５７】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又はスフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は、糖尿病患者におけるアテローム性動脈硬化症又は腎肥大であり得る。
【００５８】
幾つかの実施形態において、セラミドグルコシルトランスフェラーゼを阻害し、及び／又はスフィンゴ糖脂質の濃度を低下させることが有益であり得る疾患又は病態は、II型糖尿病及び／又はその関連疾患又は病態であり得る。幾つかの実施形態では、そのような疾患又は病態は非アルコール性脂肪肝疾患であることができ、これは代謝症候群及びII型糖尿病の結果としてなる。幾つかの実施形態では、関連疾患又は病態は、II型糖尿病及び／又はアテローム性動脈硬化の前兆であり得る代謝症候群及び／又は関連脂質異常症であり得る。幾つかの実施形態では、上記のイミノ糖は、II型糖尿病及び／又はそれに関連する疾患又は病態を防止するために予防的に使用することができる。本発明はいかなる理論によっても限定されるものではないが、本発明の発明者らは、II型糖尿病及び／又はそれに関連する疾患又は病態の治療及び／又は予防のための理論的根拠は、グルコシルセラミドの濃度を低減するイミノ糖が、また、インスリン抵抗性をもたらす受容体不活性化及び内在化を引き起こす、脂質ラフトへのインスリン受容体の係合をもたらし得るガングリオシドの発現、特にＧＭ３を低減する。上記のイミノ糖は、したがって、表面ＧＭ３の細胞を減少させ、そして、インスリンに対する細胞の感受性を高めることができ、それにより、例えば、代謝症候群、II型糖尿病、非アルコール性肝臓疾患及びアテローム性動脈硬化症の発症の中心となることができる、インスリン抵抗性の治療に有用であり得る。
【００５９】
幾つかの実施形態において、上記のイミノ糖は、スフィンゴ糖脂質又はガングリオシドに又はそれを介して結合する毒素によって引き起こされる細菌性疾患の治療に使用することができる。例えば、コレラは、ガングリオシドＧＭ１へＢサブユニットを介して結合する毒素（コレラ毒素）によって引き起こされる。コレラ患者の経口イミノ糖治療により、又は、イミノ糖による結腸灌注によって、腸上皮における感受性細胞によるＧＭ１標的の発現を停止し又は実質的に低減し、毒素の効果を減少させることにより、対応する治療効果を有し得る。細菌毒素が関与する別の疾患は、下痢後（postdiarrhea）溶血性尿毒症症候群であり、それはガングリオシドグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）に結合する志賀毒素2型を生成する大腸菌細菌の特定の菌株に一般に関連している。 コレラの療法に関して上述したシナリオと類似して、毒素のガングリオシド標的（この場合のＧｂ３）の細胞発現を低減させることによって、大腸菌関連疾患を治療するために上記のイミノ糖を使用することができる。志賀毒素−２は、腸管出血性疾患を引き起こすことが知られている大腸菌の菌株である大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７により一般に発現される。それゆえ、上記のイミノ糖を使用して、Ｏ１５７に関連する腸管出血性疾患だけでなく、志賀毒素−２を発現する他の細菌によって引き起こされる腸管出血性疾患を治療することができる。
【００６０】
幾つかの実施形態において、腸の感染症又は炎症性疾患の治療のために、イミノ糖のヘッド基及び「テール基」の性質は両方とも重要であり得る。ここに記載された化合物は、スクラーゼ−イソマルターゼの阻害（意図しない/所望しない）と比較した、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ（目的の標的）に対する活性の好ましい比を有し得るが、一般に（特に腸疾患のために）セラミドグルコシルトランスフェラーゼを標的とする治療の目的では、スクラーゼ−イソマルターゼ阻害活性を欠いているイミノ糖化合物が好ましいであろう。したがって、トコフェリルペンチル−ＤＮＪなどの米国特許出願公開第２０１３/０３３１５７８号明細書に開示されているこれらの化合物は特に好ましいことがある。というのは（かかる化合物はグルコース型ヘッド基を有しても）、特定の他のＤＮＪ−系イミノ糖と異なり、セラミドグルコシルトランスフェラーゼに対する高い活性を維持しながら、スクラーゼ−イソマルターゼに対して非常に低い活性を有し得るからである。同様に、ガラクトース型又はイドース型イミノ糖ヘッド基を（ＤＮＪの代わりに）を有する化合物は特に好ましい。というのは、これらのヘッド基はスクラーゼ−イソマルターゼの阻害及び用量制限下痢の可能性を回避することができるからである。
【００６１】
幾つかの実施形態において、上述のイミノ糖は、β−グルコセレブロシダーゼEC 3.2.1.45（また、Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ又は酸ベータ−グルコシダーゼとして知られる）を阻害することができる。β−グルコセレブロシダーゼは、その特徴的なリソソーム蓄積病態を生じさせるゴーシェ病で変異されるガングリオシドを含む、ＧＳＬのリソソーム異化に関与する酵素である。β−グルコセレブロシダーゼは、また、パーキンソン病の幾つかの例で（ヘテロ接合）変異され、ゴーシェ突然変異の「キャリア」に見出される素因変異である。β−グルコセレブロシダーゼの阻害は、それ自体が、治療目的でないが、この酵素の活性部位特異的阻害剤である化合物が、さもなければ自然にミスフォールディングする傾向がある酵素の特定の変異型の適切なフォールディングをシャペロンすることができることとなり、逆説的に、その触媒活性をゴーシェ表現型の低い基礎レベル特性から増加させる。
【００６２】
幾つかの実施形態において、上述のイミノ糖はβ−グルコセレブロシダーゼを向上させ、又は、その活性を増加させるためにシャペロンするであろう。この特性は、ゴーシェ病、特にＩ型を治療するために特に有用であるが、II型及びIII型ゴーシェ病（すなわち、神経細胞障害の形態）の治療にも有用である場合がある。同様に、β−グルコセレブロシダーゼの変異がパーキンソン病の危険性を高める正確なメカニズムは知られていないが、上記のイミノ糖のシャペロン効果は、β−グルコセレブロシダーゼの適切なフォールディングを可能にすること、及び、幾つかの場合において、その酵素活性の完全発現を可能にすることによって、パーキンソン病の前記変異の病理学的影響を打ち消すことができる。さらに、イミノ糖処理は、カベオラ媒介内在化によりＤ１ドーパミン受容体脱感作を防止し、それにより、パーキンソン病における病理学的に影響を受けたドーパミン作動性経路を増強する可能性がある。
【００６３】
幾つかの実施形態において、ＧＭ３合成を阻害し、及び／又は、ＧＭ３濃度を低下させることが有益であり得る、多くの疾患又は病態を、イミノ糖を使用して治療することができる。そのような疾患又は病態の例としては、I型ゴーシェ病が挙げられる。
【００６４】
幾つかの実施形態において、上記のイミノ糖は、糖脂質阻害有効量のイミノ糖又はその医薬上許容される塩に細胞を供することにより、糖脂質を産生することができるヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞において糖脂質生合成を阻害するために使用することができる（ガングリオシド蓄積症の基質減少療法）。用語「糖脂質」は、本明細書中に使用されるときに、ガングリオシドなどの糖脂質ベースの分子を含む。幾つかの実施形態では、糖脂質は、スフィンゴ糖脂質、例えば、グルコセラミドベースのスフィンゴ糖脂質であってよく、又は、それを含んでよい。幾つかの実施形態において、糖脂質は、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１などの、１種以上のガングリオシドを含むことができる。幾つかの実施形態では、処理はインビトロで行うことができる。なおも他の幾つかの実施形態では、細胞の処理はインビボで行ってもよい。例えば、幾つかの実施形態では、糖脂質阻害有効量又は濃度のイミノ糖又はその医薬上許容される塩は、糖脂質生合成を阻害することが有益であり得る疾患又は病態を有する対象に投与することができる。このような対象は、温血動物であってよく、例えば、ヒトなどの哺乳動物であってよい。そのような疾患又は病態の例としては、ゴーシェ病（I型、II型及びIII型ゴーシェ病を含む）、ファブリー病、サンドホフ病、テイ−サックス病、ＧＭＩガングリオシド蓄積症、ニーマン−ピックC型疾患、全身性エリテマトーデスなどのエリテマトーデス、多発性嚢胞腎疾患、多発性骨髄腫、ギランバレー症候群が挙げられる。用語「糖脂質阻害有効量」は、イミノ糖の使用の利点を上回ることがある毒性作用を引き起こすことなく、１種以上の糖脂質の産生を阻害するイミノ糖の量又は濃度を指す。
【００６５】
幾つかの実施形態において、イミノ糖は無機酸又は有機酸から得られる塩の形態であり得る、医薬上許容される塩及び塩形態の調製方法は、例えば、Bergeら(J. Pharm. Sci. 66:1-18, 1977)に開示されている。適切な塩の例としては、限定するわけではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（palmoate）、ペクチネート（pectinate）、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられる。
【００６６】
幾つかの実施形態において、イミノ糖又はその医薬上許容される塩は組成物の一部分として使用でき、該組成物は動物に該組成物をデリバリーするのに有用な医薬上許容されるキャリア及び／又は成分をさらに含む。組成物をヒトにデリバリーするのに有用な多くの医薬上許容されるキャリア及び組成物をウシなどの他の動物にデリバリーするのに有用な成分は当該技術分野で知られている。本発明の組成物に対する、このようなキャリア及び成分の添加は当該技術の通常の知識水準の範囲内に十分に入る。
【００６７】
幾つかの実施形態において、医薬組成物はイミノ糖又はその医薬上許容される塩から本質的になり、そのことはイミノ糖又はその医薬上許容される塩が組成物中における唯一の活性成分であることを意味することができる。
【００６８】
幾つかの実施形態において、イミノ糖又はその医薬上許容される塩はリポソーム組成物中で使用でき、例えば、米国出願公開第２００８/０１３８３５１号、同第２００９/０２５２７８５号及び同第２０１０/０２６６６７８号明細書に開示されているとおりである。医薬組成物中でのイミノ糖などの活性成分の実際の用量レベルは特定の患者にとって所望の治療応答を達成するのに有効な活性化合物の量を投与するために変動可能である。選択される用量レベルは投与経路、治療される病態の重篤度、及び、治療される患者の病態及び先行医療履歴に依存することができる。しかしながら、用量は、所望の治療効果を達成するために要求されるよりも低いレベルのイミノ糖の用量から開始して、そして所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることは当該技術水準の範囲内にある。所望ならば、有効な一日の用量は２〜４投与／日など、投与の目的で複数回投与に分割されうる。しかしながら、特定の患者のための特定の用量レベルは、体重、一般健康状態、食事、投与の時刻及び経路、及び、他の治療剤との組み合わせ、及び、治療される病態又は疾患の重篤度を含む種々の要因に依存するであろうことが理解されるべきである。成人の日量用量は１０キログラム体重当たり、約１マイクログラム〜約１グラム、又は、約１０ｍｇ〜１００ｍｇのイミノ糖の範囲であり得る。幾つかの実施形態において、合計日量用量は０．１ｍｇ/ｋｇ体重〜１００ｍｇ/ｋｇ体重、又は、１ｍｇ/ｋｇ体重〜６０ｍｇ/ｋｇ体重、又は、２ｍｇ/ｋｇ体重〜５０ｍｇ/ｋｇ体重、又は、３ｍｇ/ｋｇ体重〜３０ｍｇ/ｋｇ体重であり得る。日量用量は、１日で１回又は複数回の投与行為で投与されうる。例えば、幾つかの実施形態において、日量用量は１日当たりに２回投与(BID)、１日当たりに３回投与(TID)、又は、１日当たりに４回投与(QID)で分配されうる。特定の実施形態において、１ｍｇ/ｋｇ体重〜１０ｍｇ/ｋｇ体重の範囲の単一投与行為の用量をヒトに対してBID又はTIDで投与し、合計日量用量を２ｍｇ/ｋｇ体重〜２０ｍｇ/ｋｇ体重、又は、３ｍｇ/ｋｇ体重〜３０ｍｇ/ｋｇ体重とすることができる。もちろん、細胞又は動物に対して投与されるべきイミノ糖の量はイミノ糖の分子量及び投与経路などの、当業者によく理解されている多くの要因に依存することができる。
【００６９】
本発明の方法において有用な医薬組成物は全身投与を経口固体製剤、眼用、坐剤、エーロゾル、局所又は他の類似の製剤で行うことができる。例えば、それは、粉末、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、ゲル、溶液、懸濁液、シロップなどの物理的形態であってよい。イミノ糖に加えて、そのような医薬組成物は、薬物投与を強化及び促進することが知られている医薬上許容されるキャリア及び他の成分を含むことができる。ナノ粒子、リポソーム、再封入赤血球及び免疫学に基づく系などの他の可能な製剤はまた、イミノ糖を投与するために使用することができる。そのような医薬組成物は多数の経路によって投与することができる。本明細書で使用する用語「非経口」として、限定するわけではないが、皮下、静脈内、動脈内、髄腔内ならびに注射及び注入技術が挙げられる。一例として、医薬組成物は、経口的に、局所的に、非経口的に、全身的に、又は、肺経路により投与することができる。
【００７０】
本明細書に記載の実施形態は、限定するわけではないが、以下の実施例によりさらに例示される。
【実施例】
【００７１】
例１
材料及び方法
糖脂質生合成の阻害
細胞ベースのアッセイにおいてセラミドグルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害を決定するために、種々の濃度(０〜５００μＭ)の化合物Ｎ−（９−メトキシノニル)デオキシノジリマイシン（ＵＶ−４）及びＮ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）の存在下に、合流まで３日間、ＨＬ６０細胞を３つ培養した。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、その後、水中で再懸濁させ、そしてダウンス均質化した。このホモジネートのアリコートをタンパク質アッセイのために採取した。残部を４：８：３（ｖ／ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール：水で上記の糖脂質を抽出させた（Neville 2004, 正確な引用のために、本実施例の最後のセクション参考文献を参照されたい）。抽出した糖脂質を、ｐＨ５．０で１ｍｇ/ｍＬのタウロデオキシコール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液２０μＬ中でのセラミドグリカナーゼの調製剤（Hirudo medicinalisからの自家精製されたもの）を用いて３７℃で一晩加水分解した。糖脂質由来のオリゴ糖を水で３０μＬとし、下記のようにアントラニル酸（２−ＡＡ）でラベル化した。ラベル化されたオリゴ糖は下記のようにＮＰ−ＨＰＬＣによって分析された（Neville 2004, Neville 2009）。
【００７２】
炭水化物蛍光ラベル化
糖脂質由来のオリゴ糖を、前述のようにアントラニル酸でラベル化した（Neville 2004）。簡単に述べると、アントラニル酸（３０ｍｇ／ｍＬ）を、メタノール中の酢酸ナトリウム三水和物（４％、ｗ/ｖ）及びホウ酸（２％ｗ/ｖ）の溶液中に溶解した。この溶液を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムに添加し（最終濃度４５ｍｇ/ｍｌ）、最終的なラベル化混合物を与えるように混合した。２−ＡＡラベル化混合物（８０μＬ）をＦＯＳサンプル（３０μＬ水）又は糖脂質由来のオリゴ糖に添加し、次いで、８０℃で１時間インキュベートした。反応物を室温に冷却し、１ｍＬのアセトニトリル/水（９７:３、ｖ/ｖ）を添加し、そして混合物をボルテックスした。ラベル化されたオリゴ糖を、Spe-edアミド2カラム（Applied Separations, Allentown, USA）を通してクロマトグラフィーによって精製した。カラムを、２×１ｍＬのアセトニトリル、２×１ｍＬの水、続いて２×１ｍＬのアセトニトリルで予め平衡化した。試料を重力流を使用して装填し、カラムを介して滴下した。カラムを２×１ｍＬのアセトニトリル/水（95：5、ｖ/ｖ）で洗浄し、２×０．７５ｍＬの水で、ラベル化されたオリゴ糖を溶出した。
【００７３】
順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ-ＨＰＬＣ）による炭水化物分析
蛍光ラベル化した糖脂質由来のオリゴ糖を、以前に公開されている方法(Alonzi 2008, Neville 2004, 2009)に従って、4.6 x 250 mM TSKgel（登録商標）アミド-80カラム(Sigma, UK)を用いてＮＰ-ＨＰＬＣにより分離した。クロマトグラフィー装置はWaters Alliance 2695分離モジュールならびにExλ360 nm及びEmλ425 nmにセットしたインラインWaters 474 蛍光ディテクターを含んだ。すべてのクロマトグラフィーを３０℃で行った。溶媒Ａはアセトニトリルであった。溶媒ＢはMilli-Q水であった。溶媒ＣはMilli-Q水中で、酢酸によりｐＨ３．８５に滴定された１００ｍＭ水酸化アンモニウムからなり、そして標準５．０Ｎ水酸化アンモニウム溶液(Sigma, UK)を用いて調製された。勾配条件は以下のとおりであった: 時刻= 0 min (t=0), 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=40, 52% A, 28% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=41, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 mL min-1); t=43, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 mL min-1); t=44, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 mL min-1); t=59, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 mL min-1); t=60, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1)。サンプル(< 50 μL)をMilli-Q 水／アセトニトリル(1:1, v/v)中に注入した。
【００７４】
ＧＳＬ阻害の分析に関して、モノシアリル−ガングリオシドＧＭ３に対応するピーク面積は阻害定数を生成するために阻害剤処理に応答して測定された（Liら、2008）。阻害定数（ＩＣ５０）は４パラメータロジスティックフィット（Hill Plot, Prismソフトウエア)を使用して計算した。
【００７５】
結果
セラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害
スフィンゴ糖脂質(Butters 2000)の生合成における重要な酵素であるセラミドグルコシルトランスフェラーゼの細胞阻害を評価するために、化合物をＨＬ６０細胞に３日間投与した。脂質抽出、オリゴ糖ヘッド基の酵素による解放及び蛍光ラベル化の後に、順相ＨＰＬＣを用いて、生合成に対する阻害の効果を分析した。ＨＬ６０細胞は糖脂質の単純レパトアを有し、そしてドミナント種はモノシアル化ガングリオシドGM3 (Mellor 2004) である。イミノ糖ＵＶ−４及びＮＢ−ＤＮＪによるセラミドグルコシルトランスフェラーゼの阻害により、ＧＭ３の減少をもたらす。それは以下のＨＰＬＣ分離により測定した。阻害の結果としてのＧＭ３減少の量をＩＣ５０値を得るために分析した(図１を参照されたい)。イミノ糖ＵＶ−４は、ゴーシェ病患者において、生合成を減少させることによって、ＧＳＬ蓄積を補正するために使用される公知のＧＳＬ阻害剤であるＮＢ−ＤＮＪ(Zavesca)よりも、細胞内で約１００倍強力であった。
【００７６】
参考文献
Neville, D. C. A.ら(2009) J Proteome Res 8, 681-687
Alonzi, D.S.ら (2008) Biochem J 409, 571-580
Mellor, H.R.ら (2004) Biochem J 381, 861-866
Neville, D.C.A.ら (2004) Anal Biochem 331, 275-282
Butters, T. D.ら (2000) Tetrahedron:Asymmetry 11, 113-124
Li, H.ら (2008) ChemBioChem 9, 253-260
【００７７】
例２
セラミドグルコシルトランスフェラーゼの阻害剤及びβ−グルコシダーゼのシャペロン
ＤＮＪヘッド基周囲をベースとする多くのイミノ糖は、セラミドグルコシルトランスフェラーゼの細胞標的に対する承認薬Zavesca（商標）（N-ブチルデオキシノジリマイシン、ＮＢ―ＤＮＪ）の驚くほど改善された有効性を示した。これは、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）枯渇の減少によってこれらのイミノ糖の治療用途を提供することができる。これは、例えば、抗ウィルス機構としてウイルス受容体結合を減少させることができ、ゴーシェ病などの糖脂質リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）のホストに対する基質減少療法（SRTは図２に示されている）を提供し、Zavescaはそのための認識された治療薬であり、また、細胞表面でのＧＳＬの枯渇による、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（Ｌｕｐｕｓ）の治療薬である。これらのイミノ糖は、多くの場合に、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼの、サブマイクロモルの範囲内の、阻害剤であることができ、小胞体関連分解経路によって通常に分解される、変異型酵素のシャペロンとして第二の治療のメカニズムを可能にする。
【００７８】
ＧＳＬのリソソーム分解はグリコシダーゼにより触媒され、多くの遺伝性疾患はヒトに見られ、ここで、リソソーム酵素を遺伝子エンコードする際の突然変異に起因するリソソーム酵素活性の欠如はリソソームでのＧＳＬの蓄積をもたらす(Buttersら、 2000a; Vellodi, 2005, これら及び他の引用文献に関しては、下記の参考文献セクションを参照されたい)。４０以上のリソソーム蓄積症のうちの１０を超える疾患はスフィンゴ糖脂質分解欠陥に起因し、例えば、ゴーシェ、ファブリ、テイ・サックス、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシド蓄積症である(Futerman & van Meer, 2004; Meikle ら、1999)。ＳＲＴは、ＬＳＤのため薬学的介入であり、酵素補充療法（ＥＲＴ）を代替する（Lachmann, 2010）。ＳＲＴの治療戦略は、部分的な生合成阻害によりＧＳＬ基質流入を減少させることである。これは、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ（CGT）の阻害の結果であり、リソソームでの変異分解酵素は、蓄積負荷をクリアにすることができ、最終的にクリアランスにつながることが可能である。
【００７９】
効果的に阻害するための化学的特性は、インビトロアッセイ及び細胞の研究により決定されうる(Buttersら、2000b; Plattら、1994a; Plattら、1994b)。細胞の研究は、保留以外の細胞毒性、及び、酵素が細胞内で作用している状況での細胞の利用可能性の両方を考慮することにより化合物で阻害可能性が解明されるときに、効力の最も大きな指標を提供することができる。そこで本研究は、以下に記載の多くのイミノ糖に関して、ＣＧＴに対する細胞アッセイ有効性の改善を示している。
【００８０】
シャペロン介在療法は、酵素活性がリソソームにおいて欠損しているときに、安定剤として作用する阻害剤に依存する方策であり得る。というのは、特定の新規に合成される突然変異含有タンパク質は不安定であり、そしてミスフォールディングする傾向があるからである。これらの構造的に欠陥のあるタンパク質は小胞体における品質管理システムにより検知され、次に、細胞の分解経路に向けられるものと認められる。これらのリソソーム酵素の幾つかの競争的阻害剤は阻害濃度未満で「シャペロン」として作用し、そして突然変異タンパク質を救済し、リソソーム内での加水分解活性の再構成をもたらすことができる（Fan, 2003）。
【００８１】
非阻害レベルでの突然変異酵素とのイミノ糖の相互作用は品質管理システムによる分解の前にＥＲにおいて起こり、リソソームに対する加水分解活性を保持する、突然変異酵素の輸送を可能にし、ここで、ＥＲルーメンとは異なり、多量蓄積量で存在しそして低ｐＨ環境に組み合わされた酵素基質は小分子阻害剤の解離をもたらし、そしてリソソーム酵素活性を増加させる。
【００８２】
酵素補充療法と比較して、小分子阻害剤／シャペロンを使用することの見かけの利点は、以下の１つ以上から得ることができる:経口投与の容易さ、免疫原生の欠如及び血液脳関門を横切るデリバリーの可能性、このため、神経変性臨床変異体を治療する可能性。
【００８３】
セラミドグルコシルトランスフェラーゼの阻害を通した細胞表面でのＧＳＬレベルの減少は、また、ＳＬＥの治療において治療的役割を有する。ＳＬＥは広範な炎症、自己抗体産生機序及び免疫複合体堆積を特徴とする自己免疫性疾患である。ＳＬＥは身体のほぼすべての器官系に影響を及ぼす。ＳＬＥの基礎的原因は知られていないが、Ｂ及びＴ細胞の異常は自己免疫の損失、自己抗体の産生、及び、腎臓及び他の標的組織における免疫複合体の堆積に寄与するものと考えられる。これらの異常は、Ｇｂ３の増加（おそらくループスＴ細胞活性化を制御する転写因子ＦＬＩ１の発現及びスフィンゴ糖脂質代謝の調節を通した、特に、初期疾患の間のノイラミニダーゼ(Neu1)発現及び／又はＮＥＵ活性の制御を通した分解経路を介することによるＩＬ−４産生の結果として)を含む細胞膜脂質の性質を変化させることを特徴とし、活性化を高めることができる (Richardら, 2013)。さらに、リンパ球の細胞膜におけるＧＳＬの蓄積が増加すると、酸化ストレスが増加し、そしてＳＬＥ患者において応答に影響を及ぼしかつ心血管の危険性に寄与する要因である反応性酸化種の生成が増加する(Nandagudiら, 2013)。
【００８４】
以下の化合物（図３及び１２を参照されたい）はスフィンゴ糖脂質生合成経路酵素（セラミドグルコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴ）に対して改良された効力を有し、及び／又は、β−グルコセレブロシダーゼの阻害剤（及び続くシャペロン）として改良された効力を有することを示す。認可薬Zavesca (NB-DNJ/UV-1)はポジティブコントロールとして示している。
【００８５】
方法:
細胞培養
ＨＬ６０細胞及びゴーシェリンパ芽球細胞（Ｎ３７０Ｓ）を、それぞれ１０％又は１５％（ｖ/ｖ）のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ/ｍＬのストレプトマイシンで補充された、ＲＰＭＩ１６４０媒体中で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
【００８６】
糖脂質生合成の阻害
細胞アッセイ中のセラミドグルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害を決定するために、ＨＬ６０細胞を、合流まで３日間、種々の濃度（０〜１００ｍＭ）の化合物の存在下に培養した。細胞を回収し、そしてリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、水中で再懸濁させ、そしてダウンス均質化した。このホモジネートのアリコートをタンパク質アッセイのために採取した。残部を４：８：３（ｖ／ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール：水で上記の糖脂質を抽出させた（Nevilleら、2004）。抽出した糖脂質を、ｐＨ５．０で１ｍｇ  ｍＬ−１のタウロデオキシコール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液２０ｍＬ中でのセラミドグリカナーゼの調製（Hirudo medicinalisからの自家精製されたもの）を用いて３７℃で一晩加水分解した。糖脂質由来のオリゴ糖を水で３０ｍＬとし、下記のようにアントラニル酸（２−ＡＡ）でラベル化した。ラベル化されたオリゴ糖は下記のようにＮＰ−ＨＰＬＣによって分析された。
【００８７】
炭水化物蛍光ラベル化
遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）及び糖脂質由来のオリゴ糖を、前述のようにアントラニル酸でラベル化した（Neville 2004）。簡単に述べると、アントラニル酸（３０ｍｇ  ｍＬ−１）を、メタノール中の酢酸ナトリウム三水和物（４％、ｗ/ｖ）及びホウ酸（２％ｗ/ｖ）の溶液中に溶解した。この溶液を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムに添加し（最終濃度４５ｍｇ  ｍＬ−１）、最終的なラベル化混合物を与えるように混合した。２−ＡＡラベル化混合物（８０ｍＬ）をＦＯＳサンプル（３０ｍＬ水）又は糖脂質由来のオリゴ糖に添加し、８０℃で１時間インキュベートした。反応物を室温に冷却し、１ｍＬのアセトニトリル/水（９７:３、ｖ/ｖ）を添加し、そして混合物をボルテックスした。ラベル化されたオリゴ糖を、Speedアミド2カラム（Applied Separations, Allentown, USA）を通してクロマトグラフィーによって精製した。カラムを、２×１ｍＬのアセトニトリル、２×１ｍＬの水、続いて２×１ｍＬのアセトニトリルで予め平衡化した。試料を重力流を使用して装填し、カラムを介して滴下した。カラムを２×１ｍＬのアセトニトリル/水（95：5、ｖ/ｖ）で洗浄し、２×０．７５ｍＬの水で、ラベル化されたオリゴ糖を溶出した。
【００８８】
順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）による炭水化物分析
糖脂質由来のオリゴ糖を、以前に公開されている方法に従って、4.6 x 250 mM TSKgel アミド-80カラム(Sigma, UK)を用いてＮＰ-ＨＰＬＣにより分離した。クロマトグラフィー装置はWaters Alliance 2695分離モジュールならびにExλ360 nm及びEmλ425 nmにセットしたインラインWaters 474 蛍光ディテクターからなった。すべてのクロマトグラフィーを３０℃で行った。溶媒Ａはアセトニトリルであった。溶媒ＢはMilli-Q（登録商標）水であった。溶媒ＣはMilli-Q水中で、酢酸によりｐＨ３．８５に滴定された１００ｍＭ水酸化アンモニウムからなり、そして標準５．０Ｎ水酸化アンモニウム溶液(Sigma, UK)を用いて調製された。勾配条件は以下のとおりであった: 時刻= 0 min (t=0), 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=40, 52% A, 28% B, 20% C (0.8 mL min-1); t=41, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 mL min-1); t=43, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 mL min-1); t=44, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 mL min-1); t=59, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 mL min-1); t=60, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 mL min-1)。サンプル(< 50 mL)をMilli-Q（登録商標） 水／アセトニトリル(1:1, v/v)中に注入した。
【００８９】
ＧＳＬ分析に関して、モノシアリル−ガングリオシドＧＭ３に対応するピーク面積は阻害定数を生成するために阻害剤処理に応答して測定された。
【００９０】
β−グルコセレブロシダーゼ阻害アッセイ
ヒト胎盤β−グルコセレブロシダーゼをFurbish ら、Proc. Nat. Acad. Sci. (1977) 74 (8) 3560-3の変更手順により分離し、精製した。ｐＨ ５．２で０．２５％のタウロコール酸ナトリウム、０．１％ ＴＸ１００を含む０．１ Ｍクエン酸リン酸緩衝液中の５ ｍＭ４−メチルウムベリフェリル−β−グルコシド(4-MU-b-グルコシド) ５０ｍｌ中で、３７℃で１５〜６０分間、酵素活性を測定した。２００ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウムの添加により反応を停止し、そしてex 350 nm, em 460 nmで蛍光測定した。０．５ ｍＭ の基質濃度を用いて、胎盤β−グルコセレブロシダーゼについて阻害定数（ＩＣ５０）を生成した(4-MU-β-グルコシドのKm, 1.9 ± 0.3 mM)。３回の繰り返しで決定した。Hill 傾斜プロット(Prizmソフトウエア)を用いてデータをフィッティングし、そして対称標準誤差を各ＩＣ５０値に対して決定した。
【００９１】
β−グルコセレブロシダーゼ活性アッセイ
ゴーシェリンパ芽球（Ｎ３７０Ｓ）を種々の濃度の阻害剤(０〜５０ μＭ)中で３日間培養し、その後、β-グルコセレブロシダーゼ活性を測定した。８００ｇで５分間遠心分離操作されている小さいダウンス均質化器及びタンパク質及びβ−グルコセレブロシダーゼ活性に関して取った上層液を用いて、水中に均質化されたリン酸緩衝食塩水中で細胞を２回洗浄した。タンパク質濃度を、製造者の指示に従ってBCAアッセイ(Pierce, UK)を用いて決定した。すべての酵素活性化測定を、上記のとおりのホモジネートのアリコート及びｐＨ ５．２で０．２５％のタウロコール酸ナトリウム、０．１％ ＴＸ１００を含む０．１ Ｍクエン酸リン酸緩衝液中の５ ｍＭの４−メチルウムベリフェリル−β−グルコシドを用いて行った。β−グルコセレブロシダーゼによる基質の特異的な加水分解を確認するために、ブロモコンジュリトール(５００μＭ〜２．５ｍＭ)を幾つかの酵素に添加し、活性決定を行った。酵素活性化は未処理の細胞と比較した、処理済み細胞の酵素活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）の倍数増加として定義される。
【００９２】
結果
セラミドグルコシルトランスフェラーゼ阻害
スフィンゴ糖脂質の生合成における重要な酵素であるセラミドグルコシルトランスフェラーゼの細胞阻害を評価するために、化合物を無毒性濃度でＨＬ６０細胞に３日間投与した。脂質抽出、オリゴ糖ヘッド基の酵素による解放及び蛍光ラベル化の後に、順相ＨＰＬＣ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、生合成に対する阻害の効果を分析した。ＨＬ６０細胞は糖脂質の単純レパトアを有し、そしてドミナント種はモノシアル化ガングリオシドGM3 である。イミノ糖によるセラミドグルコシルトランスフェラーゼの阻害により、ＧＭ３の減少をもたらす。それは以下のＨＰＬＣ分離により測定した（図４）。表１はセラミドグルコシルトランスフェラーゼ細胞アッセイデータを表す。ＩＣ５０値は図５中などのHill プロットを用いて計算した。
【００９３】
【表１】
2016517887.tif 000031
【００９４】
表１のデータは、幾つかの場合に１００倍を超える活性の向上を明らかに示す。インビトロデータが活性の良好な指標を提供するように見えるが、このアッセイは化合物のアクセス及び保持性の細胞差異を考慮に入れることができる点でデータは重要である。アクセスに起因する変動はＣＧＴがイミノ糖に自由にアクセス可能であるという細胞位置によって制限されうる。イミノ糖は、細胞質ゾル中の化合物の濃度が細胞外濃度と平衡状態にあるように迅速かつ効率的に形質膜を横切ることができる。シスゴルジの細胞質側のセラミドグルコシルトランスフェラーゼと直接的に相互作用することができる細胞内にＮ−アルキル化ＤＮＪ類似体は入ることができる。
【００９５】
β−グルコセレブロシダーゼ阻害
すべて検討した化合物は、４−メチルウムベリフェリル−β−グルコシド（表２）を使用して蛍光発生アッセイによって決定されるように、ＮＢ―ＤＮＪと比較したヒト胎盤β−グルコセレブロシダーゼの阻害効力は改良されたことを示した。表２のＩＣ５０値は、例えば、図６のようなHill プロットを用いて計算した。
【００９６】
【表２】
2016517887.tif 000032
【００９７】
表２中のインビトロデータは、検討した化合物はUV1（Zavesca）に比べて驚くほど高いβ−グルコセレブロシダーゼ阻害活性を有することを示す。これらのデータは、検討した化合物が競合的阻害剤として作用し、分解からそれを保護することができるような程度にERにおいて変異型酵素に結合し、タンパク質を安定化することができることを示唆している。
【００９８】
β−グルコセレブロシダーゼをシャペロンする能力
最も一般的なＮ３７０Ｓ変異を有する変異型ゴーシェリンパ芽球中の化合物群のシャペロン活性を表３に報告する。これらのデータは、未処理の細胞と比較して、β−グルコセレブロシダーゼ活性の倍数増加を示している。完全な用量−応答関係を図７に記載している。
【００９９】
【表３】
2016517887.tif 000033
【０１００】
ここでも、検討したイミノ糖はＵＶ１と比較して驚くほど高い効力の向上を示す。２倍の増加はまた、SRTを提供する化合物と同様に、潜在的な治療の面で重要であり、リソソームにおける活性増大は疾患に関連した任意のＧＳＬ蓄積の問題を高め／クリアすることができる。
【０１０１】
要約
検討したイミノ糖はZavesca(UV1)と比較して、細胞標的に対して驚くほど高い効力を示した。セラミドグルコシルトランスフェラーゼは上記の多くの疾患、例えば、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における治療標的であるが、特に、ＬＳＤ（ゴーシェ病を含む）の治療における治療標的である。（上記の基質減少療法の次の）ゴーシュ病の治療のための作用の第二のメカニズムは突然変異β−グルコセレブロシダーゼの適切なフォールディングを促進する小分子を用いたゴーシュ病のシャペロン介在療法である。この第二のメカニズムはミスフォールディングされた突然変異Ｎ３７０Ｓによるゴーシュ病の患者にのみ有効であり得る。というのは、イミノ糖はβ−グルコセレブロシダーゼのこの特定の突然変異体の適切なフォールディングを促進することを示したからである。ＧＢＡ遺伝子中３００を超える突然変異体が報告されており、Ashkenzai Jewsの５つの最も一般的な突然変異体のうちの少なくとも３つはＮ３７０Ｓ、８４ＧＧ及びＶ３９４である（Faresら、2008）。２０毎に約１つのAshkenzai JewsはＮ３７０Ｓ突然変異体のコピーを保有する。３３４毎に約１つは８４ＧＧ変異体のコピーを保有する。Ｖ３９４Ｌ突然変異体は１，１１２毎に約１つのAshkenzai Jewsで見られる。Ｎ３７０Ｓ突然変異体は、通常に、神経学的症状を欠くＩ型ゴーシェ病とのみ関連がある(Elstein ら、2001)。Ｎ３７０Ｓ突然変異体はシャペロン療法を受けることができるので、本発明の化合物は、Ｉ型ゴーシュ病のＮ３７０Ｓバリアントの場合に、基質減少（セラミドグルコシルトランスフェラーゼの阻害）により部分的に介在されそしてシャペロン効果（β−グルコセレブロシダーゼのフォールディングの促進）により部分的に介在される作用の二重メカニズムを有するものと理解されうる。この突然変異により、突然変異体酵素のシャペロン介在フォールディングが可能になり、ＥＲにおけるＥＲＡＤトランスポータにより根絶から保護し、適切にフォールディングされた酵素の、適切な行き先細胞小器官である適切なリソソームへの正確な輸送をさらに可能にする。これらの２つの標的酵素（β−グルコセレブロシダーゼ及びＣＧＴ）の細胞位置も重要であり得る。というのは、ＣＧＴはイミノ糖に明らかにアクセス可能であるゴルジ装置の細胞質表面上に見られ、一方、ＥＲ（シャペロン効果が発生している）はイミノ糖に対するアクセス可能性がずっと低いことがあるからである。しかしながら、阻害レベル未満の化合物はシャペロンの効果を発揮するために必要とされ得るので、この特性は、本発明の化合物の有利な特徴であり得る。
【０１０２】
参考文献
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【０１０３】
例３
Ｈｕｈ７．５細胞培養(図１４): Ｈｕｈ７．５細胞を、１００Ｕ/ｍｌのペニシリン、１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシン、２ ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で生育した。すべてのインキュベーションは３７℃／５％ ＣＯ２であった。細胞脂質プロファイルに対するイミノ糖の効果はイミノ糖の存在下又は非存在下に４日間インキュベートした後の細胞で決定し、その時点で、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、低温ＰＢＳで３回洗浄し、トリパンブルー染色を用いて計数し、そして最終的な細胞ペレットをメタノール：アセトン(vol１：１)中に再懸濁させ、その後、脂質プロファイリングした。ブラッドフォードタンパク質アッセイ(Bio-Rad)を用いて小体積の各サンプルを使用して総タンパク質評価した。
【０１０４】
GlcCer及びLacCerの測定 (図１４):
グルコシルセラミド(測定及びＭＳ法がガラクトシル部分からグルコシルを区別しないので「グルコシルセラミド」の測定から推測)及びラクトシルセラミド(LacCer)の明確な測定を細胞脂質の総括的なリピドーム分析の一部として行った。その方法は以前に詳細に記載されている(Wolf, C., Quinn, P. J., Lipidomics: Practical aspects and applications. Progress in Lipid Research 2008, 47, 15-36: Quinn, P. J., Rainteau, D., Wolf, C., Lipidomics of the red cell in diagnosis of human disorders. Methods Mol Biol 2009, 579, 127-159)。培養された肝細胞がんＨｕｈ７．５細胞のペレットをBligh & Dyerの方法を用いてクロロホルムにより抽出した (Bligh, E. G., Dyer, W. J., A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 1959, 37, 911-917)。クロロホルム抽出物を、ポリビニルアルコール官能化シリカカラム(PVASil, YMC, ID 4mm, 長さ250mm, Interchim, Montlucon 03100, France)上でHPLC (Agilent 1200 Series)に供し、種々の脂質クラスに分離した。より極性の低い脂質(トリグリセリド、ジグリセリド、コレステロールエステル、セラミド、グルコシル−及びラクトシルセラミド)を溶媒系ヘキサン／イソプロパノール／水酢酸アンモニウム10mM (40/58/2 vol/vol)により５〜１５分間溶出した。次いで、極性の増加の関数として、以下の順序：ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリンで、溶媒系ヘキサン／イソプロパノール／水酢酸アンモニウム10mM (40/50/10 vol/vol)により１５〜６０分間リン脂質を溶出した。溶出された脂質をスぺクトロメータ(TurboIon, Framingham, MA 01701, USA)のエレクトロスプレイ界面に流した。脂質イオン化をポジティブモードで、M+NH4+ 及びM+H+検知に関して運転した。源は三連四重極型質量分析計(API3000, ABSciex, Toronto, Canada)に結合されており、それは次々に溶出された脂質クラスの特徴的な断片イオンをモニタリングするために「衝突誘起解離」モード（又は「前駆体」モード）で運転された。特徴的な断片イオンの前駆体分子種は、ソフトウエアLIMSA により、培養された肝がん細胞用に調製されたライブラリーで同定された (Haimi, P., Chaithanya, K., Kainu, V., Hermansson, M., Somerharju, P., Instrument-independent software tools for the analysis of MS-MS and LC-MS lipidomics data. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2009, 580)。イオン対（前駆体／製品イオン）のリストの、同定される脂質の分子種は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により定量化用に調製された。対応するＭＲＭピークを時間積分する。クラス内のすべての分子種の均一な応答係数を仮定して、適切な脂質クラス標準に対して脂質量を計算した。
【０１０５】
プロファイルを比較する統計的な手順はソフトウエアXLStat（登録商標） (バージョン2011. 2; Addinsoft, France)を用いて行った。パラメータ試験、多変量解析、相関試験及び回帰手法を(Golmard, J. L., 2012, Analyse Statistique des Donnees, Edition Ellipses, Paris 75740 Cedex 15, France)に記載されるとおりに用いた。
【０１０６】
上記は特に好ましい実施形態を参照しているが、本発明はそれに限定されないことが理解されるであろう。様々な変更は開示の実施形態なされてよく、そのような変更は本発明の範囲内にあることが意図されることは当業者に考えられるであろう。
【０１０７】
本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許出願及び特許の全体を参照により本明細書中に取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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