(57)【要約】免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する操作された多価及び多重特異性結合タンパク質が、作製方法、ならびに疾患の予防、診断、予後、及び／または治療における使用とともに、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの標的に結合する二重特異性結合タンパク質であって、標的１が、ＴＬＲ−シグナル伝達自己抗原を含み、標的２が、免疫細胞受容体を含む、前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項２】
前記ＴＬＲ−シグナル伝達自己抗原が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）からなる群から選択される核酸を含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫細胞受容体が、表面結合免疫グロブリンまたはその断片を含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項４】
前記免疫細胞受容体が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項５】
前記免疫細胞がＢ細胞である、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項６】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９を含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項７】
標的２が、ＩｇＭ免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項８】
標的２が、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＧからなる群から選択される免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項９】
標的２が、アロタイプまたはイディオタイプの免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１０】
標的２が、免疫グロブリン軽鎖及び／または免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１１】
前記二重特異性結合タンパク質が、細胞増殖及び／または細胞死を引き起こす、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１２】
前記二重特異性結合タンパク質が、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子、ＢｉＴｅ（登録商標）分子、ＤＡＲＴ（登録商標）分子、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）分子、ｓｃＦｖ／ダイアボディ−ＩｇＧ分子、交差多重特異性分子、２つの要素が統合された二重特異性分子、ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）多重特異性分子、ＣｏｖＸＢｏｄｙ分子、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子、ｓｃＦＶ／ダイアボディ−ＣＨ２／ＣＨ３二重特異性分子、ＩｇＧ−非−Ｉｇタンパク質足場ベース多重特異性分子、ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）分子、及び正常ヒトタンパク質様ヒト血清アルブミン−二重特異性分子に連結されたｓｃＦＶ／ダイアボディからなる群から選択される形式を含む、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１３】
前記二重特異性結合タンパク質が、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、各々が、独立して、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメインであり、Ｃが定常ドメインであり、Ｘ１がリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であり、ｎが０または１であり、前記第１及び第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインが、第１の機能的標的結合部位を形成し、前記第１及び第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインが、第２の機能的標的結合部位を形成する、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１４】
前記二重特異性結合タンパク質が、４つの機能的標的結合部位を形成する２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む、請求項１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１５】
標的１についての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列からのＣＤＲ１〜３と対をなす配列番号３２のアミノ酸配列からのＣＤＲ１〜３を含み、標的２についての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列からのＣＤＲ１〜３と対をなす配列番号３４のアミノ酸配列からのＣＤＲ１〜３を含む、請求項１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１６】
標的１についての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列と対をなす配列番号３２のアミノ酸配列を含み、標的２についての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列と対をなす配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１７】
前記二重特異性結合タンパク質が、配列番号４０〜８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１８】
Ｘ１が、配列番号２１、２２、１３、１４、２９、及び３０のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項１９】
前記二重特異性結合タンパク質が、酸性環境で切断されるように酸感受性である、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項２０】
免疫接着分子、造影剤、治療剤、及び細胞傷害剤からなる群から選択される薬剤に連結された請求項１または１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質を含む、二重特異性結合タンパク質コンジュゲート。
【請求項２１】
前記二重特異性結合タンパク質コンジュゲートが、前記薬剤が酸性環境で放出されるように、酸感受性である、請求項２０に記載の前記二重特異性結合タンパク質コンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１または１３に記載の前記二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項２０に記載の前記二重特異性結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項２２または２３に記載の前記薬学的組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、Ｂ細胞活性化の阻害剤及び／またはＢ細胞増殖の阻害剤及び／またはＢ細胞死の誘発剤である、請求項２４に記載の前記薬学的組成物。
【請求項２６】
前記阻害剤が、Ｂリンパ球刺激剤（ＢＬｙｓ）の阻害剤である、請求項２５に記載の前記薬学的組成物。
【請求項２７】
前記阻害剤が、ベリムマブ、タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）、アタシセプト、及びブリシビモド（ｂｌｉｓｉｂｉｍｏｄ）からなる群から選択される、請求項２６に記載の前記薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の前記単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項３０】
請求項２６に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３１】
二重特異性結合タンパク質を産生する方法であって、前記二重特異性結合タンパク質を産生するのに十分な条件下の培養培地中で、請求項３０に記載の前記宿主細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項３２】
ＴＬＲの活性を調整することができる治療剤に対する患者の反応性を判定する方法であって、（ａ）患者から細胞試料を得るステップと、（ｂ）請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質の存在下で、前記細胞試料の第１の部分を治療剤で処理するステップと、（ｃ）請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質の非存在下で、前記細胞試料の第２の部分を治療剤で処理するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の前記試料中の細胞増殖及び／または細胞死を測定するステップであって、前記２つの細胞試料中の細胞増殖及び／または細胞死における差異が、前記治療剤に対する前記患者の反応性を示す、測定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項３３】
前記方法が、前記治療剤の有効性を評価するための臨床治験に対する前記患者の適格性を判定するために使用される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３４】
前記患者が、ＴＬＲの活性化を含む自己免疫疾患を有する疑いがある、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記細胞試料が、Ｂ細胞試料を含む、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ９である、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、円板状ループス、新生児ループス、シェーグレン病、皮膚筋炎、及び全身性硬化症からなる群から選択される、請求項３６に記載の前記方法。
【請求項３８】
ＴＬＲ９活性化またはＴＬＲ９阻害をそれぞれ必要とする患者においてＴＬＲ９応答性細胞を活性化または阻害するための方法であって、それを必要とする患者に、請求項２２または２３に記載の前記薬学的組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３９】
ＴＬＲ９活性化またはＴＬＲ９阻害を必要とする患者を治療するための方法であって、（ａ）前記患者からＴＬＲ９応答性細胞を含む細胞試料を得るステップと、（ｂ）前記患者のＴＬＲ９応答性細胞を請求項２２または２３に記載の前記薬学的組成物で処理するステップと、（ｃ）前記処理された細胞を前記患者に再導入するステップと、を含む、前記方法。
【請求項４０】
ＴＬＲシグナル伝達の阻害剤または刺激剤を識別する方法であって、ａ）試験薬と、Ｂ細胞と、請求項１に記載の前記二重特異性結合タンパク質とを、前記Ｂ細胞中の二重特異性結合タンパク質誘導応答を検出するのに好適な条件下で組み合わせるステップと、ｂ）前記Ｂ細胞中の前記二重特異性結合タンパク質誘導応答を阻害または刺激する前記試験薬の能力を判定するステップであって、前記二重特異性結合タンパク質誘導応答の阻害が、前記試験薬が阻害剤であることを示すか、または前記二重特異性結合タンパク質誘導応答の刺激が、前記試験薬がＴＬＲシグナル伝達の刺激剤であることを示す、判定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項４１】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９からなる群から選択される、請求項４０に記載の前記方法。
【請求項４２】
前記二重特異性結合タンパク質誘導応答が、細胞増殖及び／または細胞死からなる群から選択される応答を含む、請求項４０に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１３年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６１／８８７，４１２号及び２０１４年５月２日に出願された米国仮特許出願第６１／９８７，５８７号の優先権を主張し、それらの両方が、その全容において、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（分野）
Ｂ細胞受容体及び自己抗原と結合する多価及び多重特異性結合タンパク質、作製方法、自己免疫疾患の診断、予後、予防、及び治療を含むそれらの使用、ならびに治療薬及び臨床治験候補者の選別が提供される。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、一般的な健康障害であるが、これらの疾患の病因は依然としてよく理解されていない。自己免疫疾患は、２つの広範であるが重複するカテゴリーである、臓器特異性及び全身性に分類され得る。臓器特異性自己免疫疾患では、局所損傷、炎症、または機能障害が、特殊化した細胞、組織、または臓器に位置する特定の標的抗原に対する自己抗体または細胞媒介反応によってもたらされる。対照的に、全身性自己免疫疾患は、自己抗原の傷害に関係なく複数の部位の組織損傷及び炎症を伴い、通常、血管漏出及び循環自己免疫複合体（ＩＣ）の沈着によって開始される。これらのＩＣは、核の、またはあまり一般的ではないが、細胞質起源の遍在的可溶性細胞自己抗原への、自己抗体応答によって形成される。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、及び混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）は、かかる消耗性のＩＣ媒介全身性自己免疫疾患の例である。
【０００４】
ＳＬＥは、例えば、抗核抗体の産生及び循環免疫複合体の生成をもたらす免疫系の調節不全を特徴とする。これらの免疫複合体は組織及び関節に蓄積され、それらの炎症及び分解を引き起こす。この疾患は、全身でないとしても、ほとんどの臓器系に影響を及ぼし、多くの場合、関節、皮膚、腎臓、脳、体腔膜、肺、心臓、及び胃腸管の炎症及び結果として生じる損傷を伴う。この疾患の病理学的特質は、発疹または皮膚表面上の他の変化に似た再発性で広範かつ多様な血管病変である。
【０００５】
ＳＬＥの正確な原因は知られていない。しかしながら、一般的に、この疾患は、自己抗体産生及び病原性ＩＣの後発形成によって、直接的または間接的のいずれかで引き起こされることが認知されている。調節不全のＢリンパ球によって産生されるこれらの自己抗体は、ＤＮＡ、ヌクレオソーム、及びサブヌクレオソームを含む核自己抗原に対して明確に異なる特異性を有する。追加の自己抗原特異性は、Ｓｍ抗原及び核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）などのある特定のＲＮＡ／タンパク質複合体を含む。
【０００６】
自己免疫疾患との関連では、自己抗原は、Ｂ細胞を発現するＩｇＧ反応性またはリウマチ因子（ＲＦ）によって認識される自己抗体結合ＩＣとして循環する。多くの自己抗原は、ある特定のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのサイトゾル自然免疫受容体を刺激する高分子複合体と関連することによって全身性自己免疫疾患を誘発する。自己反応性Ｂ細胞の場合、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）は、自己抗原に結合し、それを適切な細胞区画内の自己抗原反応性ＴＬＲに送達する。例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡと関連する自己抗原、例えば、ヒストンまたはクロマチンは、リソソーム内区画中に見出される核酸検知ＴＬＲ７またはＴＬＲ９それぞれによって認識され得る。ＴＬＲによる関連した核酸の検出は、サイトカインまたは転写因子産生などの第２のシグナルを提供し、次いで、それはＢ細胞活性化を促進し、自己抗体の産生をもたらす。
【０００７】
ＴＬＲアゴニストのＢＣＲ送達が自己反応性Ｂ細胞活性化を促進することができるという考えは、最初にインビトロでの研究から現れ（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２（９）：１１７１−７、Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３−６０７）、その後、多数のインビボでの観察によって支持された。例えば、ＴＬＲ７欠損マウスは、ＲＮＡ関連自己抗原と反応する自己抗体を作ることができず、ＴＬＲ９欠損自己免疫傾向マウスは、ｄｓＤＮＡまたはクロマチンと反応する自己抗体を作ることができない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：３２１−３３１、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：４１７−４２８、Ｌａｒｔｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１３４９−１３５４、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１８４０−１８４８、Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．３４：３３９−３４８、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１８：１２１１−１２１９）。さらに、ＴＬＲ７のみを欠いている自己免疫傾向マウスは、明らかに軽減された疾患を有するが（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：４１７−４２８）、一方で、ＴＬＲ７の過剰発現は、悪化した臨床症状及び加速した死亡率をもたらす（Ｄｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：４１７−４２８、Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：１６６９−１６７２、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：９９７０−９９７５）。逆説的に言えば、ＴＬＲ９の機能的形態を発現することができない自己免疫傾向マウスは、より重度の臨床的疾患を常に患い、また短い寿命を有する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：３２１−３３１、Ｌａｒｔｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１３４９−１３５４、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１８４０−１８４８、Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．３４：３３９−３４８、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１２１１−１２１９）。
【０００８】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ９会合の差次的な結果、またはＴＬＲ７ではなくＴＬＲ９がどのように全身性自己免疫を軽減することができるのかについてはほとんど知られていない。自己免疫におけるＴＬＲ７及びＴＬＲ９会合の役割を判定するための限定要因のうちの１つは、ＩＣの細胞内送達及び免疫細胞中のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９）の活性化を可能にする薬剤の不足である。ＴＬＲ経路の標的誘発は、新規の治療法ならびに治療の利益を受けやすい可能性のある臨床治験候補者の選択を与えることができる予測を提供することができる。しかしながら、ＴＬＲ−９を刺激するため、ＢＣＲとＣｐＧ  ＤＮＡを架橋するためにＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ（抗ＩｇＭ）を使用してＢＣＲをＴＬＲ９と連結する効果を再現する最初の試みでは、自発的な免疫複合体での刺激の側面の全てを再現することができなかった（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８（６）：７９９−８０９）。
【０００９】
その結果、ＩＣを免疫細胞に送達することができ、ＴＬＲシグナル伝達を調整することができる新規の組成物及び方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫細胞受容体と自己抗原を結合することができる改善された多価結合タンパク質の必要性が当該技術分野において存在する。本開示は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達（例えば、活性化または阻害）自己抗原、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ含有自己抗原、及び免疫細胞受容体、例えば、Ｂ細胞受容体に結合して、エンドソーム区画内のＴＬＲレジデントに内在化され、運ばれる免疫複合体を形成する二重特異性結合タンパク質を提供する。二重特異性結合タンパク質は、エンドソームＴＬＲシグナル伝達の調整、結果として自己免疫疾患の調整のための媒介物として有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本発明は、少なくとも２つの標的に結合する二重特異性結合タンパク質を提供し、標的１は、ＴＬＲ活性化自己抗原を含み、標的２は、免疫細胞受容体を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、ＴＬＲ活性化自己抗原は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、免疫細胞受容体は、表面結合免疫グロブリンまたはその断片を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、免疫細胞標的はＢ細胞を含む。
【００１５】
ある特定の実施形態において、免疫細胞受容体はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を含む。
【００１６】
ある特定の実施形態において、免疫細胞受容体はＩｇＭ免疫グロブリンを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態において、免疫細胞受容体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＧ免疫グロブリン、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アロタイプ免疫グロブリン、またはイディオタイプ免疫グロブリンを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態において、ＴＬＲは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、二重特異性結合タンパク質は、細胞増殖及び／または細胞死を引き起こし得る。
【００２０】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、形式、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子、ＢｉＴｅ（登録商標）分子、ＤＡＲＴ（登録商標）分子、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）分子、ｓｃＦｖ／ダイアボディ−ＩｇＧ分子、交差多重特異性（例えば、二重特異性）分子、２つの要素が統合された二重特異性分子、ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）多重特異性（例えば、二重特異性）分子、ＣｏｖＸＢｏｄｙ分子、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子、ｓｃＦＶ／ダイアボディ−ＣＨ２／ＣＨ３二重特異性分子、ＩｇＧ−非−Ｉｇタンパク質足場ベース多重特異性（例えば、二重特異性）分子、ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、及び正常ヒトタンパク質様ヒト血清アルブミン−二重特異性分子に連結されたｓｃＦＶ／ダイアボディを含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は、各々が、機能的結合ドメイン標的、すなわち、免疫細胞受容体及び自己抗原についての結合部位を形成する第１及び第２の可変ドメイン配列（例えば、表１に列挙されるもの）を含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含有する、米国特許第７，６１２，１８１号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される結合タンパク質フレームワークを有する。
【００２２】
ある特定の実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、各々が、独立して、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメインであり、Ｃが定常ドメインであり、Ｘ１がリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であり、ｎが０または１であり、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインが、第１の機能的標的結合部位を形成し、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインが、第２の機能的標的結合部位を形成する、結合タンパク質が開示される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、ＣＨ１またはＣＬではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。
【００２４】
ある特定の実施形態において、二重特異性結合タンパク質は、４つの機能的標的結合部位を形成する２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原を結合することができる。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、高親和性で免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合することができる。
【００２６】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合するポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｘ１は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、Ｘ２はＦｃ領域を表し、ｎは０または１である。ある特定の実施形態において、結合タンパク質中のＶＤ１及び／またはＶＤ２は、重鎖可変ドメインである。ある特定の実施形態において、結合タンパク質中のＶＤ１及び／またはＶＤ２は、軽鎖可変ドメインである。ある特定の実施形態において、ＣＨ１ではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。ある特定の実施形態において、ＣＬではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。さらにある特定の実施形態において、Ｃは重鎖定常ドメインである。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示される結合タンパク質は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合するポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域である。ある特定の実施形態において、ＣＨ１ではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。ある特定の実施形態において、ＣＬではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示される結合タンパク質は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合するポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まない。ある特定の実施形態において、ＣＨ１ではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。ある特定の実施形態において、ＣＬではないという条件で、Ｘ１はリンカーである。
【００２９】
ある特定の実施形態において、２つのポリペプチド鎖を含む免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖が、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメインであり、Ｃが定常ドメインであり、Ｘ１が第１のリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であり、また第２のポリペプチド鎖が、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメインであり、Ｃが定常ドメインであり、Ｘ１が第２のリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域を含まない、結合タンパク質が提供される。様々な実施形態において、第１の可変ドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインである。様々な実施形態において、第２の可変ドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインである。
【００３０】
ある特定の実施形態において、２つのポリペプチド鎖を含む免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖が、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃが重鎖定常ドメインであり、Ｘ１が第１のリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であり、また第２のポリペプチド鎖が、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃが軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１が第２のリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域を含まない、結合タンパク質が提供される。
【００３１】
ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は同じである。ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は異なる。ある特定の実施形態において、第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＨ１ドメインではなく、かつ／または第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＬドメインではない。ある特定の実施形態において、第１のＸ１及び第２のＸ１は短い（例えば、約６個のアミノ酸）リンカーである。ある特定の実施形態において、第１のＸ１及び第２のＸ１は長い（例えば、約６個を超えるアミノ酸）リンカーである。ある特定の実施形態において、第１のＸ１は短いリンカーであり、第２のＸ１は長いリンカーである。ある特定の実施形態において、第１のＸ１は長いリンカーであり、第２のＸ１は短いリンカーである。
【００３２】
ある特定の実施形態において、本開示は、４つのポリペプチド鎖を含む二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子を提供し、第１の２つのポリペプチド鎖のうちの各々は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｘ１は第１のリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、第２の２つのポリペプチド鎖のうちの各々は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｘ１は第２のリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まない。かかるＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を有する。ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は同じである。ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は異なる。ある特定の実施形態において、第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＨ１ドメインではなく、かつ／または第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＬドメインではない。
【００３３】
ある特定の実施形態において、本開示は、４つのポリペプチド鎖を含むＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質を提供し、第１の２つのポリペプチド鎖のうちの各々は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は第１のリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、第２の２つのポリペプチド鎖の各々は、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は第２のリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まない。かかるＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を有する。ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は同じである。ある特定の実施形態において、第１及び第２のＸ１は異なる。ある特定の実施形態において、第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＨ１ドメインではなく、かつ／または第１のＸ１及び／もしくは第２のＸ１は、ＣＬドメインではない。
【００３４】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、任意の配向で免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合することができる少なくとも２つの可変ドメイン配列（例えば、ＶＤ１及びＶＤ２）を含む。ある特定の実施形態において、本開示は、第１及び第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、各々は、独立して、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、ＣＨ１ではないという条件でＸ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０または１であり、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的標的結合部位を形成し、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的標的結合部位を形成し、結合タンパク質は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合することができ、（ｉ）マウスＩｇＭについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３４及び３５からなる群から選択される配列を含み、かつ／または結合タンパク質は、ＩｇＭ結合ＥＬＩＳＡで測定したとき、約０．１９ｎＭ、または約０．２０ｎＭ、または約０．１２ｎＭ、または約０．１０ｎＭ、または約０．０３、または約０．０４のＥＣ５０でマウスＩｇＭと結合することができ、かつ／または（ｉｉ）ＤＮＡについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３２及び３３からなる群から選択される配列を含み、かつ／または結合タンパク質は、約２、または約３．５、または約４、または約４．５の抗核抗体（ＡＮＡ）スコアを有する。
【００３５】
ある特定の実施形態において、本開示は、第１及び第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、各々は、独立して、形式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、ＣＨ１またはＣＬではないという条件でＸ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０または１であり、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的標的結合部位を形成し、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的標的結合部位を形成し、（ａ）結合タンパク質は、ＩｇＭ及びＤＮＡと結合することができ、（ｉ）ＩｇＭについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列から３つのＣＤＲ（またはＣＤＲＳ１〜３）及び配列番号３５のアミノ酸配列から３つのＣＤＲ（またはＣＤＲＳ１〜３）を含み、かつ／または結合タンパク質は、ＩｇＭ結合ＥＬＩＳＡで測定したとき、約０．１９ｎＭ、または約０．２０ｎＭ、または約０．１２ｎＭ、または約０．１０ｎＭ、または約０．０３、または約０．０４のＩＣ５０でマウスＩｇＭと結合することができ、かつ／または（ｉｉ）ＤＮＡについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列から３つのＣＤＲ（またはＣＤＲＳ１〜３）及び配列番号３３のアミノ酸配列から３つのＣＤＲ（またはＣＤＲＳ１〜３）を含み、かつ／または結合タンパク質は、ＤＮＡと結合することができ、２、または約３．５、または約４、または約４．５のＡＮＡスコアを有する。
【００３６】
ある特定の実施形態において、本開示は、結合タンパク質を提供し、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１ではないという条件でＸ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、ＣＨ１またはＣＬではないという条件でＸ１はリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは０または１であり、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、マウスＩｇＭのために第１の機能的標的結合部位を形成し、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、ＤＮＡのために第２の機能的標的結合部位を形成するか、あるいは第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、ＤＮＡのために第１の機能的標的結合部位を形成し、第１及び第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、マウスＩｇＭのために第２の機能的標的結合部位を形成する。ある特定の実施形態において、（ａ）結合タンパク質は、マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合することができ、（ｉ）マウスＩｇＭについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３４及び配列番号３５を含み、かつ／または（ｉｉ）ＤＮＡについての機能的標的結合部位を形成する可変ドメインは、配列番号３２及び配列番号３３を含む。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含み、結合タンパク質は、４つの機能的標的結合部位を含む。ある特定の実施形態において、本開示は、マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合することができる結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、ＤＶＤ３７４６（重鎖では配列番号４０及び軽鎖では配列番号４１を含む）、ＤＶＤ３７４７（重鎖では配列番号４２及び軽鎖では配列番号４３を含む）、ＤＶＤ３７４９（重鎖では配列番号４４及び軽鎖では配列番号４５を含む）、ＤＶＤ３７５０（重鎖では配列番号４６及び軽鎖では配列番号４７を含む）、ＤＶＤ３７５１（重鎖では配列番号４８及び軽鎖では配列番号４９を含む）、ＤＶＤ３７５２（重鎖では配列番号５０及び軽鎖では配列番号５１を含む）、ＤＶＤ３７５３（重鎖では配列番号５２及び軽鎖では配列番号５３を含む）、ＤＶＤ３７５４（重鎖では配列番号５４及び軽鎖では配列番号５５を含む）、ＤＶＤ３７５５（重鎖では配列番号５６及び軽鎖では配列番号５７を含む）、ＤＶＤ３７５６（重鎖では配列番号５８及び軽鎖では配列番号５９を含む）、ＤＶＤ３７５７（重鎖では配列番号６０及び軽鎖では配列番号６１を含む）、ＤＶＤ３７５８（重鎖では配列番号６２及び軽鎖では配列番号６３を含む）、ＤＶＤ３７５９（重鎖では配列番号６４及び軽鎖では配列番号６５を含む）、ＤＶＤ３７６０（重鎖では配列番号６６及び軽鎖では配列番号６７を含む）、ＤＶＤ３７６１（重鎖では配列番号６８及び軽鎖では配列番号６９を含む）、ＤＶＤ３７６２（重鎖では配列番号７０及び軽鎖では配列番号７１を含む）、ＤＶＤ３７６４（重鎖では配列番号７２及び軽鎖では配列番号７３を含む）、ＤＶＤ３７６５（重鎖では配列番号７４及び軽鎖では配列番号７５を含む）、ＤＶＤ３７６６（重鎖では配列番号７６及び軽鎖では配列番号７７を含む）、ＤＶＤ３７６７（重鎖では配列番号７８及び軽鎖では配列番号７９を含む）、ＤＶＤ３７６９（重鎖では配列番号８０及び軽鎖では配列番号８１を含む）、及びＤＶＤ３７７０（重鎖では配列番号８２及び軽鎖では配列番号８３を含む）のうちのいずれか１つを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、本明細書の表２に示されるように、ＩｇＭ及びＤＮＡの各々についての重鎖及び軽鎖配列を含む。
【００３８】
重鎖、軽鎖、２つの鎖、または４つの鎖実施形態のうちのいずれかは、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号３）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号５）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号７）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１０）、ＡＤＡＡＰ（配列番号１１）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１５）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１６）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１７）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１８）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１９）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２０）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２４）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号２５）、またはＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号２６）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２７）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３０）、またはＧ／Ｓベース配列（例えば、Ｇ４Ｓ及びＧ４Ｓ繰り返し体、配列番号３１）を含む少なくとも１つのＸ１リンカーを含み得る。ある特定の実施形態において、Ｘ１は定常領域ではなく、ＣＨ領域ではなく、またはＣＬ領域でもない。ある特定の実施形態において、Ｘ２はＦｃ領域である。ある特定の実施形態において、Ｘ２は変異体Ｆｃ領域である。
【００３９】
ある特定の実施形態において、重鎖、軽鎖、２つの鎖、または４つの鎖実施形態のうちのいずれかは、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、及びＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）を含む少なくとも１つのＸ１リンカーを含み得る。ある特定の実施形態において、重鎖は配列番号２１を含み、軽鎖は配列番号１３を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は配列番号２２を含み、軽鎖は配列番号１４を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は配列番号２１を含み、軽鎖は配列番号１４を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は配列番号２２を含み、軽鎖は配列番号１３を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、第１のポリペプチド中に存在する場合、天然配列Ｆｃ領域または変異体配列Ｆｃ領域である。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１からのＦｃ領域、ＩｇＧ２からのＦｃ領域、ＩｇＧ３からのＦｃ領域、ＩｇＧ４からのＦｃ領域、ＩｇＡからのＦｃ領域、ＩｇＭからのＦｃ領域、ＩｇＥからのＦｃ領域、またはＩｇＤからのＦｃ領域である。
【００４１】
別の態様において、本開示は、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する結合タンパク質を作製する方法を提供する。ある特定の実施形態において、免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する結合タンパク質を作製する方法は、ａ）免疫細胞受容体と結合する第１の親抗体、またはその抗原結合部分を得るステップと、ｂ）自己抗原と結合する第２の親抗体、またはその抗原結合部分を得るステップと、ｃ）本明細書に記載される結合タンパク質のうちのいずれかをコードする構築物（複数可）を調製するステップと、ｄ）免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合する結合タンパク質が生成されるようにポリペプチド鎖を発現するステップと、を含む。
【００４２】
ある特定の実施形態において、第１の親抗体またはその抗原結合部分、及び第２の親抗体またはその抗原結合部分は、マウス抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、及び／または親和性成熟抗体である。
【００４３】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、第１の親抗体もしくはその抗原結合部分、または第２の親抗体もしくはその抗原結合部分によって示される少なくとも１つの所望の特性を所有する。あるいは、第１の親抗体またはその抗原結合部分、及び第２の親抗体またはその抗原結合部分は、結合タンパク質によって示される少なくとも１つの所望の特性を所有する。ある特定の実施形態において、所望の特性は１つ以上の抗体パラメータである。ある特定の実施形態において、抗体パラメータは、抗原特異性、抗原への親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、可溶性、産生効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、またはオルソロガス抗原結合である。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は多価である。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は多重特異性である。本明細書に記載される多価及びまたは多重特異性結合タンパク質は、特に治療的な見地から所望の特性を有する。例えば、多価及びまたは多重特異性結合タンパク質は、（１）抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体より早く内在化（及び／または異化）され得、（２）アゴニスト結合タンパク質であり得、かつ／または（３）細胞死及び／または多価結合タンパク質が結合することができる抗原を発現する細胞のアポトーシスを誘導し得る。多価及びまたは多重特異性結合タンパク質の少なくとも１つの抗原結合特異性を提供する「親抗体」は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、内在化（及び／もしくは異化）され得、かつ／またはアゴニスト、細胞死誘導及び／もしくはアポトーシス誘導抗体であり得、本明細書に記載される多価及びまたは多重特異性結合タンパク質は、これらの特性のうちの１つ以上における改善（複数可）を示し得る。さらに、親抗体は、これらの特性のうちの任意の１つ以上を欠いている場合があるが、本明細書に記載されるような多価結合タンパク質として構築される場合、それらの１つ以上を獲得し得る。例えば、異なるＦｃ突然変異体は、ＦｃＲ、Ｃ’結合を防止し得るか、または半減期を延ばし得る。
【００４４】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１の１つ以上の標的に対してオン速度定数（Ｋｏｎ）を有する。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０３Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０４Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０５Ｍ−１ｓ−１、または約１０５Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１の１つ以上の標的に対してオン速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００４５】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、多くても約１０−３ｓ−１、多くても約１０−４ｓ−１、多くても約１０−５ｓ−１、または多くても約１０−６ｓ−１の１つ以上の標的に対してオフ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、約１０−３ｓ−１〜約１０−４ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、または約１０−５ｓ−１〜約１０−６ｓ−１の１つ以上の標的に対してオフ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００４６】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、多くても約１０−７Ｍ、多くても約１０−８Ｍ、多くても約１０−９Ｍ、多くても約１０−１０Ｍ、多くても約１０−１１Ｍ、多くても約１０−１２Ｍ、または多くても１０−１３Ｍの１つ以上の標的に対して解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−１２Ｍ〜約１０−１３Ｍのその標的に対して解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００４７】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、薬剤をさらに含むコンジュゲートである。ある特定の実施形態において、薬剤は、免疫接着分子、造影剤、治療剤、または細胞傷害剤であり得る。
【００４８】
ある特定の実施形態において、二重特異性結合タンパク質または結合タンパク質コンジュゲートは、結合タンパク質が、酸性環境で切断されるように酸感受性である。ある特定の実施形態において、結合タンパク質コンジュゲートは、薬剤が酸性環境で放出されるように、酸感受性である。
【００４９】
ある特定の実施形態において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、金粒子、磁気標識、またはビオチンである。
【００５０】
ある特定の実施形態において、放射性標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍである。ある特定の実施形態において、治療剤または細胞傷害剤は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生剤、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、もしくはアポトーシス剤、または免疫抑制剤を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質は、ビオチン受容体ペプチド配列を含む。
【００５２】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質はグリコシル化される。例えば、結合タンパク質は、ヒトグリコシル化パターンを含み得る。
【００５３】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される結合タンパク質のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸を提供する。
【００５４】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される単離された核酸のうちのいずれか１つを含むベクターを提供し、ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）、ｐＴＴ３（追加の複数のクローニング部位を有するｐＴＴ、ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１７）、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ、ｐＢＯＳ、ｐＨｙｂＥ、またはｐＢＪである。ある特定の実施形態において、ベクターは、米国特許第８，１８７，８３６号に開示されるベクターである。ある特定の実施形態において、ベクターはｐＣＤＮＡ３．３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００５５】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、またはサッカロミセスセレビシアエなどの真菌細胞、またはＳｆ９などの昆虫細胞である。ある特定の実施形態において、例えば、異なる特異性を有する２つ以上の結合タンパク質は、単一組換え宿主細胞内で産生される。例えば、抗体の混合物の発現は、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（商標）（Ｍｅｒｕｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と呼ばれた米国特許第７，２６２，０２８号及び同第７，４２９，４８６号。
【００５６】
別の態様において、本開示は、二重特異性結合タンパク質を産生するのに十分な条件下の培養培地中で、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む本発明の二重特異性結合タンパク質を産生する方法を提供する。
【００５７】
別の態様において、本開示は、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下の培養培地中で、本明細書に開示される宿主細胞のうちのいずれか１つを培養するステップを含む本明細書に開示される結合タンパク質を産生する方法を提供する。ある特定の実施形態において、本方法によって産生される５０％〜７５％の結合タンパク質は、二重特異性四価結合タンパク質である。ある特定の実施形態において、本方法によって産生される７５％〜９０％の結合タンパク質は、二重特異性四価結合タンパク質である。ある特定の実施形態において、産生される９０％〜９５％の結合タンパク質は、二重特異性四価結合タンパク質である。
【００５８】
別の態様において、本開示は、結合タンパク質の放出のための組成物を提供し、組成物は、結晶化結合タンパク質、成分、及び少なくとも１つのポリマー担体を含む。ある特定の実施形態において、ポリマー担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）、もしくはＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブトリャート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース、セルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、硫酸化多糖、またはそれらの配合物及びコポリマーである。ある特定の実施形態において、成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコールである。
【００５９】
別の態様において、本開示は、有効な量の本明細書に開示される組成物を哺乳動物に投与するステップを含む哺乳動物を治療するための方法を提供する。
【００６０】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される結合タンパク質または結合タンパク質コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、障害を治療するための少なくとも１つの追加の治療剤を含む。例えば、追加の薬剤は、治療剤、造影剤、細胞傷害剤、血管新生阻害剤（抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ−トラップを含むが、これらに限定されない）、キナーゼ阻害剤（ＫＤＲ及びＴＩＥ−２阻害剤を含むが、これらに限定されない）、同時刺激分子遮断薬（抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０を含むが、これらに限定されない）、接着分子遮断薬（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌ選択抗体、小分子阻害剤を含むが、これらに限定されない）、抗サイトカイン抗体、もしくはそれらの機能的断片（抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦ、及び抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含むが、これらに限定されない）、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識もしくはリポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤、抗乾癬薬、コルティコステリオド、アナボリックステロイドエリスロポエチン、免疫処置、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗鬱剤、抗精神病薬、刺激薬、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン、または類似体、サイトカイン、もしくはサイトカインアンタゴニストであり得る。
【００６１】
ある特定の実施形態において、治療剤は、Ｂ細胞活性化の阻害剤及び／またはＢ細胞増殖の阻害剤及び／またはＢ細胞死の誘発剤である。
【００６２】
ある特定の実施形態において、治療剤は、阻害剤Ｂリンパ球刺激剤（ＢＬｙｓ）、例えば、ベリムマブ、タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）、ブリシビモド（ｂｌｉｓｉｂｉｍｏｄ）もしくはアタシセプト、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００６３】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される結合タンパク質によって結合されることができる標的（複数可）が有害である障害を患うヒト対象を治療するための方法であって、ヒト対象中の標的（複数可）の活性が、阻害され、かつ１つ以上の症状が緩和されるか、または治療が達成されるように、本明細書に開示される結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、方法を提供する。本明細書に提供される結合タンパク質を使用して、例えば、ＴＬＲシグナル伝達に関連するものなどの自己免疫疾患を患うヒトを治療し得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される結合タンパク質またはその抗原結合部分を使用して、炎症、喘息、アレルギー、アレルギー性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、線維化肺疾患、特発性肺線維症、肝線維症、ループス、Ｂ型肝炎関連の肝疾患及び線維症、敗血症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、乾癬、糖尿病、インスリン依存型糖尿病、ＨＩＶによって引き起こされる感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、骨関節炎（ＯＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性心疾患（ＩＨＤ）、セリアック病、接触過敏症、アルコール性肝疾患、ベーチェット病、アテローム硬化性血管疾患、眼球表面炎症性疾患、またはライム病を治療する。
【００６４】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲの活性を調整、例えば、阻害または誘導することができる治療剤に対する患者の反応性を判定する方法であって、（ａ）患者から細胞試料を得るステップと、（ｂ）二重特異性結合タンパク質の存在下で、細胞試料の第１の部分を治療剤で処理するステップと、（ｃ）二重特異性結合タンパク質の非存在下で、細胞試料の第２の部分を治療剤で処理するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の細胞試料の細胞増殖及び／または細胞死を測定するステップであって、２つの細胞試料中の細胞増殖及び／または細胞死における差異が、治療剤に対する患者の反応性を示す、測定するステップと、を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、患者はＴＬＲ阻害剤を必要とする。ある特定の実施形態において、患者はＴＬＲ誘発剤を必要とする。本方法を使用して、例えば、治療剤の有効性を評価するために治療剤についての臨床治験に対する患者の組み入れまたは適格性を判定し得る。患者は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、円板状ループス、新生児ループス、シェーグレン病、皮膚筋炎、及び全身性硬化症などのＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９の活性化を含む自己免疫疾患を有することが疑われ得る。ある特定の実施形態において、細胞試料はＢ細胞を含む。
【００６５】
別の態様において、本開示は、ＢＣＲ阻害剤または活性剤を識別する方法であって、（ａ）ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する結合タンパク質の存在下または非存在下で、ＴＬＲ９応答性細胞を候補分子で処理するステップと、（ｂ）対照と比較して、ＴＬＲ９応答性細胞の増殖及び／または死を測定するステップであって、対照と比較して、ＴＬＲ９応答性細胞における増殖及び／または死の差異が、候補分子に対する患者の反応性を示す、測定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６６】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する二重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
【００６７】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲ９活性化またはＴＬＲ９阻害をそれぞれ必要とする患者においてＴＬＲ９応答性細胞を活性化または阻害するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６８】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲ９活性化またはＴＬＲ９阻害を必要とする患者を治療するための方法であって、（ａ）患者からＴＬＲ９応答性細胞を含む細胞試料を得るステップと、（ｂ）患者のＴＬＲ９応答性細胞を、ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する二重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物で処理するステップと、（ｃ）処理された細胞を患者に再導入するステップを含む、方法を提供する。
【００６９】
別の態様において、本開示は、ＢＣＲ阻害剤を識別する方法であって、（ａ）ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する結合タンパク質の存在下または非存在下で、ＴＬＲ７応答性細胞を候補分子で処理するステップと、（ｂ）対照と比較して、ＴＬＲ７応答性細胞の増殖及び／または死を測定するステップであって、対照と比較して、ＴＬＲ７応答性細胞における増殖及び／または死の差異が、候補分子がＢＣＲ阻害剤であることを示す、ステップと、を含む、方法を提供する。
【００７０】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲ７活性化を必要とする対象におけるＴＬＲ７応答性細胞を活性化する方法であって、ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する二重特異性結合タンパク質を含む薬学的調製物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００７１】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲ７活性化を必要とする対象におけるＴＬＲ７応答性細胞を活性化する方法であって、対象のＴＬＲ７応答性細胞を、ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する二重特異性結合タンパク質を含む薬学的調製物で処理することと、処理された細胞を対象に再導入することと、を含む、方法を提供する。
【００７２】
別の態様において、本開示は、ＴＬＲシグナル伝達の阻害剤または刺激剤を識別する方法であって、ａ）試験薬と、Ｂ細胞と、ＴＬＲ活性化自己抗原及び免疫細胞受容体と結合する二重特異性結合タンパク質とを、Ｂ細胞中の二重特異性結合タンパク質誘導応答を検出するのに好適な条件下で組み合わせるステップと、ｂ）Ｂ細胞中の二重特異性結合タンパク質誘導応答を、阻害または刺激する試験薬の能力をそれぞれ判定するステップであって、二重特異性結合タンパク質誘導応答の阻害が、試験薬が阻害剤であることを示すか、または二重特異性結合タンパク質誘導応答の刺激が、試験薬が、ＴＬＲシグナル伝達の刺激剤であることを示す、判定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７３】
ある特定の実施形態において、ＴＬＲはＴＬＲ７、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ３である。二重特異性結合タンパク質誘導応答は、細胞増殖及び／または細胞死をもたらし得る。
【００７４】
別の態様において、本開示は、免疫細胞受容体及び自己抗原、またはそれらの断片の試験試料をアッセイするためのキットを提供する。キットは、免疫細胞受容体及びＴＬＲ活性化自己抗原、またはそれらの断片の試験試料をアッセイするための少なくとも１つの構成成分、ならびに免疫細胞受容体及び自己抗原の試験試料をアッセイするための説明書を含み、少なくとも１つの構成成分が、結合タンパク質を含む少なくとも１つの組成物を含み、結合タンパク質が、任意選択で検出可能に標識される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】２つの配向でＩｇＭ及び核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の図である。
【図２】核酸、及びＢ細胞上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合したＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の図である。
【図３】（ａ）Ｂリンパ球刺激剤（ＢＬｙｓ）を伴うか、または伴うことなく、培養液で、（ｂ）ＢＬｙｓを伴うか、または伴うことなく、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）リガンド１８２６で、（ｃ）ＢＬｙｓを伴うか、または伴うことなく、ＰＬ２−３、抗クロマチンＩｇＧ２ａで、（ｄ）ＢＬｙｓを伴うか、または伴うことなく、二重特異性抗ＩｇＭ及び抗ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質ＤＶＤ３７５９で処理されたマウスＢ細胞からのデータを示す。細胞増殖は、カルボキシフルオセインジアセテート、サクシンイルニジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｒｎｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ）希釈及びＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ結合による細胞死によって定量化された。
【図４】（ａ）ＢＬｙｓを伴うか、または伴うことなく、二重特異性抗ＩｇＭ及び抗ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質ＤＶＤ３７５９で、または（ｂ）ＢＬｙｓを伴うか、または伴うことなく、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）リガンド１８２６で、複製して、６０〜７２時間処理された野生型（ＷＴ）、ＩＲＡＫ２ノックアウト（ＩＲＡＫ２  ＫＯ）、及びＩＲＡＫ４キナーゼ死ノックインマウス（ＩＲＡＫ４  ＫＩ）から単離されたＢ細胞からのデータを示す。細胞増殖は、ＣＦＳＥ希釈及びＴＯ−ＰＲＯ−３結合による細胞死によって定量化された。
【図５】示されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質によるＢＣＲ及びＴＬＲ−９を通じた刺激に応答する一次ヒトＢ細胞の増殖を検査する実験の結果を示す。
【図６】３７６４ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＣｐＧオリゴヌクレオチドＯＤＮ２００６（ＴＬＲ９阻害剤の存在下及び非存在下の両方で）に応答する一次ヒトＢ細胞の増殖を検査する実験の結果を示す。
【図７】（Ａ）ＨＥｐ−２でコーティングされたスライド上の２５週及び４０週齢のデオキシリボヌクレアーゼＨｅｔ、ＤＫＯ、及びＴＫＯマウスからのＤＫＯ  ＡＮＡ蛍光免疫染色パターン及び（Ｂ）疾患の過程の初期段階でのマウスからのＤＫＯ  ＡＮＡ染色パターンの概要を示す。「核小体」は、顕著な核小体パターンを示し、「斑紋核」は、非核小体斑紋パターンを指し、「細胞質」は、拡散細胞質染色を指し、「その他」は、増殖性細胞を対象とすると思われる抗体を含む。
【図８】（Ａ）二機能的ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質の模式図、（Ｂ）本来の抗ＩｇＭ抗体と比較した、Ｖ１（ＤＶＤ３７５６、ブルー）として抗ＩｇＭドメインを有するか、またはＶ２（ＤＶＤ３７５１、レッド；ＤＶＤ３７５４、グリーン）として抗ＩｇＭドメインを有する代表的なＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質のＩｇＭ結合ＥＬＩＳＡのグラフ、（Ｃ）（Ｂ）に描写されたＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質と比較した抗ＤＮＡ  ｍＡｂのＡＮＡ染色パターン、及び（Ｄ）丸のサイズ、増殖指標、大丸＞２０倍、中丸１０〜２０倍、小丸＜１０倍）によって示される３Ｈ−チミジン取込みによって判定される通りの各ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質のＢ細胞を活性化する能力を伴うＥＣ５０及びＡＮＡスコアの複合プロットを示す。丸の色は、Ｂ及びＣに描写されるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質、開いた黒丸として描写される追加のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質、及び塗りつぶされた黒丸で示された本来のｍＡｂに対応する。
【図９】（Ａ）Ｂ２２０−特異性磁気ビーズで単離され、ＣＦＳＥで標識され、かつ７２時間抗ＤＮＡ  ｍＡｂ、ＯＤＮ１８２６、またはＤＶＤ３７５４で刺激され、かつ培養液対照と比較されたＲＦ（ＡＭ１４  ＷＴ、ＡＭ１４  Ｔｌｒ９−／−）または非−Ｔｇ（ＢＡＬＢ／ｃ  ＷＴ、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｔｌｒ９−／−）マウスからのＢ２２０＋Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析、及び（Ｂ）２４時間ＤＶＤ３７５４または抗ＤＮＡ  ｍＡｂで刺激され、かつ培養液対照と比較された（Ａ）におけるマウスからのＢ細胞の３Ｈ−チミジン取込みを示す。データは、平均３つの別個の実験＋／−ＳＥＭを表す。
【図１０】（Ａ）各点が１匹のマウスを表す１０週齢のデオキシリボヌクレアーゼＨｅｔ、ＤＫＯ、及びＴＫＯマウスからの脾臓重量（全ての郡においてｎ＝１２）、（Ｂ）脾臓のＢ細胞の総数（Ｙ軸）、及び成熟Ｂ細胞％がバーの灰色部分及び挿入された数字によって示される成熟Ｂ細胞の％を列挙するためにＢ２２０及びＡＡ４．１に対して染色された脾臓細、（Ｃ）２４時間抗ＩｇＭ、ＯＤＮ１８２６、またはＤＶＤ３７５４で刺激されたデオキシリボヌクレアーゼＨｅｔ、ＤＫＯ、及びＴＫＯマウスからのＢ２２０−精製Ｂ細胞の３Ｈ−チミジン取込みのグラフを示す。（Ｂ）及び（Ｃ）の結果は、３つの別個の実験からであり、８匹のマウス／郡を含み、ＣＰＭ＋／−ＳＥＭとして要約される。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
免疫細胞受容体及び自己抗原と結合することができる多価及び／または多重特異性結合タンパク質が提供される。二重特異性結合タンパク質、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））結合タンパク質、及びその薬学的組成物、ならびにかかる二重特異性結合タンパク質を作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞も提供される。二重特異性結合タンパク質を使用して、インビトロまたはインビボいずれかで特定の抗原を検出する方法も提供される。
Ｉ．定義
【００７７】
別途、本明細書に定義されない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者に通常理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提供される定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先される。別途、文脈によって必要とされない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数も含むものとする。別途述べられない限り、「または」の使用は「及び／または」を意味する。「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は制限されない。
【００７８】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質及び核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知のものである。本明細書に提供される方法及び技法は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、別途示されない限り、本明細書を通じて引用され考察される参考文献に記載されるように、行われる。酵素反応及び精製技法は、当該技術分野で一般的に行われるように、または別途本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医学及び薬学的化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査法及び技法は、当該技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の治療に対して標準的技法が使用される。
【００７９】
選択用語は、本開示がより容易に理解され得るように以下に定義される。
【００８０】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、哺乳動物などの動物を指す。したがって、対象は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモットなどを指し得る。対象はヒトであることが好ましい。対象がヒトである場合、対象は、本明細書において「患者」と称され得る。対象の疾患の「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患の１つ以上の臨床症状の任意の改善を指す。
【００８１】
「Ｔｏｌｌ様受容体」及び「ＴＬＲ」という用語は、受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーを指す。現在、１０種の哺乳動物相同体が識別されており、ＴＬＲ〜ＴＬＲ１０と呼ばれる。ＴＬＲは、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８（Ｍｕｓｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１６１２、Ｗｅｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７（６）：８３７−４７）を含むシグナル伝達カスケードを通してダウンストリーム免疫応答遺伝子を活性化させることができる。微生物粒子に加えて、哺乳動物ＴＬＲはまた、ある特定の自己抗原、特に細胞死の結果として細胞から放出される細胞質構成成分を認識することができる（Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６７５−６８０）。「ＴＬＲ」という用語は、無傷のＴｏｌｌ様受容体、例えば、アクセスナンバー＊６０１１９４  ＴＯＬＬ様受容体１、ＴＬＲ１；＊６０３０２８ＴＯＬＬ様受容体２、ＴＬＲ２；＊６０３０２９  ＴＯＬＬ様受容体３、ＴＬＲ３；＊６０３０３０ＴＯＬＬ様受容体４、ＴＬＲ４；＊６０３０３１  ＴＯＬＬ様受容体５、ＴＬＲ５；＊６０５４０３ＴＯＬＬ様受容体６、ＴＬＲ６；＊３００３６５ＴＯＬＬ様受容体７、ＴＬＲ７；＊３００３６６ＴＯＬＬ様受容体８、ＴＬＲ８；＊６０５４７４ＴＯＬＬ様受容体９；ＴＬＲ９；及び＊６０６２７０ＴＯＬＬ様受容体１０；ＴＬＲ１０でＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎにおいて記載された受容体、または例えば、Ｔｏｌｌ様受容体の可溶性形態（すなわち、膜結合ドメインが削除されるか、または変更された）などのそれらの断片もしくは機能的断片を含む。ＴＬＲは、Ｔｏｌｌ様受容体のＭｙＤ８８結合または相互作用断片、またはＭｙＤ８８に結合するか、もしくは相互作用することができるＴｏｌｌ様受容体の相同体を含む。ある特定の実施形態において、ＴＬＲは、エンドソームＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ７もしくはＴＬＲ９、または断片もしくは機能的断片、またはそれらの相同体である。ある特定の実施形態において、ＴＬＲの細胞質ドメインは存在しない。
【００８２】
「免疫接着分子」という用語は、非抗体ポリペプチドの結合ドメインを抗体または抗体定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子を指す。
【００８３】
「Ｂリンパ球刺激剤」及び「ＢＬｙＳ」という用語は、「Ｂ細胞活性化因子」（ＢＡＦＦ）とも称される、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ遺伝子によってコードされるヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインを指す。例示的なＢＬｙＳタンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＬ５７３００９７及びＧＩ：２２４５４８９８３において示される。
【００８４】
「二重特異性結合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの標的に同時に結合することができ、かつ二重特異性結合タンパク質の抗原結合部位が、抗体Ｆｃ領域でないという条件で、２つの異なる標的、すなわち、２つの異なる抗原または同じ抗原上の２つの異なるエピトープのいずれかに対する特異性を有するように、少なくとも２つの明らかに異なる抗原結合部位を有するポリペプチドを指す。２つの標的は、同じ分子、例えば、同じ抗原上の異なるエピトープ上に位置し得、または別個の分子、例えば、２つの異なる細胞上、もしくは１つの細胞上及び可溶性抗原上に位置し得る。二重特異性結合タンパク質は、二重特異性抗体を含むが、既知の抗体構成成分ならびに形式ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子、ＢｉＴｅ（登録商標）分子、ＤＡＲＴ（登録商標）分子、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）分子、ｓｃＦｖ／ダイアボディ−ＩｇＧ分子、交差多重特異性（例えば、二重特異性）分子、２つの要素が統合された二重特異性分子、ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）多重特異性（例えば、二重特異性）分子、ＣｏｖＸＢｏｄｙ分子、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子、ｓｃＦＶ／ダイアボディ−ＣＨ２／ＣＨ３二重特異性分子、ＩｇＧ−非−Ｉｇタンパク質足場ベース多重特異性（例えば、二重特異性）分子、及び正常ヒトタンパク質様ヒト血清アルブミン−二重特異性分子に連結されたｓｃＦＶ／ダイアボディを含む、様々な他の形式を含む融合タンパク質も含む。二重特異性結合タンパク質の異なる形式の例は、米国特許第７，６１２，１８１号に見出すことができる。
【００８５】
「抗体」という用語は、一般的に、Ｉｇ分子のエピトープ結合特徴を保持する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖、または機能的断片、突然変異体、変異体、もしくはそれらの誘導体を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。かかる断片、突然変異体、変異体、または誘導体抗体形式は、当該技術分野において既知である。完全長抗体のある特定の実施形態において、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。ＣＨは、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＣＬは、単一のＣＬドメインからなる。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。一般に、各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で配列される。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスからなり得る。種属間の内因性抗体における多様性が存在する。
【００８６】
「二重特異性抗体」という用語は、その２つの結合アームのうちの１つ（ＨＣ／ＬＣの１対）上の１つの抗原（またはエピトープ）と結合し、かつその第２の結合アーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）上の異なる抗原（またはエピトープ）と結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、２つの明らかに異なる抗原結合アーム（特異性及びＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合する各抗原に対して一価である。二重特異性抗体は、二重特異性抗体の所望の特異性でマウスモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づいて、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）を使用して産生された。結果として生じるハイブリッド−ハイブリドーマ（またはクアドローマ）細胞株内の２つの異なるＩｇ重鎖及び軽鎖のランダム対形成のため、多くても１０種の異なる免疫グロブリン種が生成され、そのうちのたった１つが、機能的二重特異性抗体である。不対合形成された副産物の存在、及び著しく減少した産生収率、手段洗練された精製手順が必要とされる。
【００８７】
二重特異性抗体はまた、２つの異なるｍＡｂの化学的コンジュケーションによって産生され得るが（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１２）：６２８−３１）、この取組みは、均一な調製物を生み出さない。他の取組みは、２つの異なるモノクローナル抗体またはより小さな抗体断片の化学的コンジュケーションを使用した（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７０８）：８１−３）。二重特異性抗体を作製するための別の方法は、２つの親抗体をヘテロ−二機能的架橋剤でカップリングすることであるが、二重特異性抗体の結果として生じる調製物は、親抗体での架橋剤の反応が部位特異的でないので、著しい分子不均一性に悩まされる。二重特異性抗体のより均一な調製物を得るために、２つの異なるＦａｂ断片が、部位特異的方式で、それらのヒンジシステイン残基で化学的に架橋された（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９（７）：２３６７−７５）。しかしながら、本方法は、完全なＩｇＧ分子ではなく、Ｆａｂ’２断片をもたらす。
【００８８】
組換え二重特異性抗体の構築のために最も広く使用される形式である直列型単一鎖Ｆｖ分子及びダイアボディ、ならびにそれらの様々な誘導体を含む幅広い種類の他の組換え二重特異性抗体形式が開発された（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎ．１８（２）：３１４０）。常に、これらの分子の構築は、異なる抗原を認識する２つの単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片から始まる（Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９（１）：４７−５２）。直列型ｓｃＦｖ分子（ｔａＦｖ）は、追加のペプチドリンカーで２つのｓｃＦｖ分子を接続することによって作製される。これらの直列型ｓｃＦｖ分子中に存在する２つのｓｃＦｖ断片は、別個の折り畳まれた実在物を形成する。様々なリンカーを使用して、２つのｓｃＦｖ断片を接続し得、多くても６３個の残基の長さを有するリンカーが最も有効である（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：４２３−７４）。親ｓｃＦｖ断片は、通常、細菌中に可溶形態で発現され得るが、直列型ｓｃＦｖ分子は、細菌中の不溶性凝集物を形成する。故に、再折り畳みプロトコルまたは哺乳動物発現系は、常に適用されて、可溶性直列型ｓｃＦｖ分子を産生する。遺伝子導入ウサギならびにＣＤ２８及び黒色腫関連プロテオグリカンを対象とする直列型ｓｃＦｖのウシによるインビボでの発現が報告された（Ｇｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１０）：１３９３−４０１）。この構築物において、２つのｓｃＦｖ分子は、ＣＨ１リンカーによって接続され、多くても１００ｍｇ／Ｌの二重特異性抗体の血清構築が見られた。ドメイン順序の多様性を含むか、または異なる長さもしくは柔軟性を有する中間リンカーを使用する様々な戦略を用いて、細菌中の可溶性発現を可能にした。他でも、非常に短いＡｌａ３リンカーまたは長いグリシン／セリンの豊富なリンカーのいずれかを使用する細菌中の可溶性直列型ｓｃＦｖ分子の発現が報告された（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１２）：６４９５−５０２、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（９）：４８０２−９、Ｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１２５（１−２）：１３４−４０）。３または６個の残基の長さを有するランダム化された中間リンカーを含有する直列型ｓｃＦｖレパートリーのファージディスプレイ法を用いて、細菌中に可溶性及び活性形態で産生されるこれらの分子を富化し得る。この取組みは、６個のアミノ酸残基リンカーを有する好ましい直列型ｓｃＦｖ分子の単離をもたらす（Ａｒｎｄｔ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｓ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：３０５−２１）。このリンカー配列が、直列型ｓｃＦｖ分子の可溶性発現に対する一般的な解決法を表すかどうかは明らかではないが、この研究は、定方向突然変異誘発と併せた直列型ｓｃＦｖ分子のファージディスプレイ法が、活性形態で細菌中に発現され得るこれらの分子を富化し得ることを実証した。
【００８９】
二重特異性ダイアボディ（Ｄｂ）は、発現のためのダイアボディ形式を使用する。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインをおよそ５個の残基に接続するリンカーの長さを減少させることによって、ｓｃＦｖ断片から産生される（Ｐｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｒｉｕｓ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：５０７−ｌ  １）。リンカーサイズのこの減少は、ＶＨとＶＬドメインとの交差対形成による２つのポリペプチド鎖の判定を容易にする。二重特異性ダイアボディは、同じ細胞内の構造ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ構成）または構造ＶＬＡ−ＶＨＢ及びＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ構成）のいずれかで２つのポリペプチド鎖を発現することによって産生される。様々な異なる二重特異性ダイアボディが産生され、それらのほとんどは、細菌中に可溶性形態で発現され得る。しかしながら、可変ドメインの配向は、活性結合部位の発現及び形成に影響を及ぼし得る（Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（１５）：７０２１−５）。それにもかかわらず、細菌中の可溶性発現は、直列型ｓｃＦｖ分子に対する重要な利点を表す。しかしながら、２つの異なるポリペプチド鎖が単一細胞内で発現されるので、不活性ホモダイマーが、活性ヘテロダイマーと一緒に産生され、それは、均一の調製物を得るために追加の精製ステップを必要とする。二重特異性ダイアボディを生成させる別の取組みは、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）ダイアボディの産生である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１４）：６４４４−８．１８）。この取組みは、ＨＥＲ２及びＣＤ３を対象とする二重特異性ダイアボディのために実証された。大きなノブが、Ｖａｌ３７をＰｈｅと、かつＬｅｕ４５をＴｒｐと交換することによってＶＨドメイン中に導入され、相補的なホールが、抗ＨＥＲ２または抗ＣＤ３可変ドメインのいずれかにおけるＰｈｅ９８をＭｅｔに、かつＴｙｒ８７をＡｌａに突然変異することによってＶＬドメイン内に作られた。この取組みを使用して、二重特異性ダイアボディの産生が、親ダイアボディによって７２％からノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）ダイアボディによって９０％超えまで増加し得る。重要なことに、産生収率は、これらの突然変異の結果として少しだけ減少した。しかしながら、抗原結合活性の減少が、いくつかの構築物で観察された。したがって、このむしろ精巧な取組みは、変化しない結合活性を有するヘテロダイマー分子を産生するこれらの突然変異を識別するために、様々な構築物の分析を必要とする。さらに、かかる取組みは、定常領域での免疫グロブリン配列の突然変異の修正を必要とし、したがって、抗体配列の非天然及び非自然形態を作り出し、それは、増加した免疫原性、インビボの安定性不良、及び望ましくない薬物動態をもたらし得る。
【００９０】
単一鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、二重特異性ダイアボディ様分子の形成を改善するための代替的な戦略を表す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５（３−４）：１２８−３０、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１）：２１−３６）。二重特異性単一鎖ダイアボディは、２つのダイアボディを形成するポリペプチド鎖を約１５個のアミノ酸残基の追加の中間リンカーで接続することによって産生される。その結果、モノマー単一鎖ダイアボディ（５０〜６０ｋＤａ）に対応する分子量を有する全ての分子は、二重特異性である。いくつかの研究は、二重特異性単一鎖ダイアボディが、精製された分子のほとんどがモノマーとして存在する可溶性及び活性形態で、細菌中に発現されることを実証した（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５（３４）：１２８−３０、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１）：２１−３６、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｋ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（２）：８３−１０５、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎ．９（７）：６１７−２１）。したがって、単一鎖ダイアボディは、直列型ｓｃＦｖ（全てのモノマーが二重特異性である）及びダイアボディ（細菌中で可溶性発現）の利点を兼ね備える。
【００９１】
ダイアボディはまた、Ｆｃと融合して、ジダイアボディ（ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）と名付けられたＩｇ様分子をより多く生成した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（４）：２８５６−６５）。さらに、ＩｇＧの重鎖中に２つのＦａｂ繰り返し体を含み、４つの抗原分子を結合することができる多価抗体構築物が、記載された（ＰＣＴ公開第ＷＯ０１７７３４２号、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（９）：４８５４−６１）。
【００９２】
「二重可変ドメイン結合タンパク質」及び「二重可変ドメイン免疫グロブリン」という用語は、その２つの結合アームの各々の中に２つの可変ドメインを有する結合タンパク質（例えば、一対のＨＣ／ＬＣ）を指し、その各々が抗原に結合することができる。ある特定の実施形態において、各可変ドメインは異なる抗原またはエピトープと結合する。ある特定の実施形態において、各可変ドメインは、同じ抗原またはエピトープと結合する。ある特定の実施形態において、二重可変ドメイン結合タンパク質は、同一の特異性及び同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して二価である。ある特定の実施形態において、二重可変ドメイン結合タンパク質は、単一特異性であり得、すなわち、１つの抗原と結合することができるか、または多重特異性であり得、すなわち、２つ以上の抗原と結合することができる。２つの重鎖二重可変ドメインポリペプチド及び２つの軽鎖二重可変ドメインポリペプチドを含む二重可変ドメイン結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質と称される。ある特定の実施形態において、各半分の４つの鎖の二重可変ドメイン結合タンパク質は、重鎖二重可変ドメインポリペプチド、及び軽鎖二重可変ドメインポリペプチド、及び２つの抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態において、各結合部位は、抗原結合部位当たり抗原結合に関わる合計６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。
【００９３】
「抗イディオタイプ抗体」という用語は、別の抗体抗原組み合わせ部位のアミノ酸配列に対する抗体を指す。抗イディオタイプ抗体は、抗原に対する免疫応答を向上させるために投与され得る。
【００９４】
「抗アロタイプ抗体」という用語は、別の抗体の定常領域のアミノ酸配列に対する抗体を指す。
【００９５】
「生物学的活性」という用語は、分子の１つ以上の生物学的特性（インビボで見出されるように天然に存在するか、または組換え手段によって可能になるかにかかわらず）を指す。生物学的特性は、受容体を結合すること、細胞増殖または他の細胞機能を誘導すること、細胞成長または他の細胞機能を阻害すること、サイトカイン産生または活性を誘導すること、シグナル伝達カスケードを活性化すること、アポトーシスを誘導すること、及び酵素の活性を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
「中和」という用語は、抗原の生物学的活性を相殺することを指し、例えば、結合タンパク質が、抗原に特異的に結合する場合、抗原を中和し得る。ある特定の実施形態において、中和結合タンパク質は、抗原（例えば、サイトカイン）に結合し、抗原の生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低下させる。
【００９７】
「特異性」という用語は、抗原と選択的に結合する結合タンパク質の能力を指す。
【００９８】
「親和性」という用語は、結合タンパク質と抗原との間の相互作用の強度であり、結合タンパク質のＣＤＲの配列、ならびに結合タンパク質及び抗原の性質、例えば、そのサイズ、形状、及び／または電荷により決定される。結合タンパク質は、負の副作用を最小限に抑えながら、所望の治療の評価項目を提供する親和性について選択することができる。親和性は、当業者に既知の方法を用いて測定され得る（米国第２００９０３１１２５３号）。
【００９９】
「効力」という用語は、所望の効果を達成するための結合タンパク質の能力を指し、治療有効性の測定である。効力は、当業者に既知の方法を使用して評価され得る（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１００】
「生物学的機能」という用語は、結合タンパク質の特異的なインビトロまたはインビボにおける作用を指す。結合タンパク質は、抗原のいくつかのクラスを標的とし、複数の作用機序を介して所望の治療結果を達成し得る。結合タンパク質は、可溶性タンパク質、細胞表面抗原、ならびに細胞外タンパク質沈着物を標的とし得る。結合タンパク質は、それらの標的の活性を作働させ、拮抗し、または中和させ得る。結合タンパク質は、それらが結合する標的のクリアランスを促進し得るか、または細胞に結合した時に細胞毒性をもたらし得る。２つ以上の抗体の部分は、単一の結合タンパク質分子において明らかに異なる機能を達成するために、多価形式に組み込まれ得る。生物学的機能を評価するために使用されるインビトロアッセイ及びインビボモデルは、当業者に既知である（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１０１】
「標的」及び「検出可能な標識」という用語は、特異性結合対のメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能なものにするために、抗体またはその分析物などの特異性結合対のメンバーに結合させた部分を意味する。特異性結合対の標識されたメンバーは、「検出可能に標識されている」と称される。したがって、「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の特定を与える標識が組み込まれたタンパク質を指す。ある特定の実施形態において、標識は、可視または計測手段により検出可能なシグナルを生成することができる検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識アミノ酸の取り込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色法により検出され得る、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）または免疫金により検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチドの標的の例には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）；色原体、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；及びガドリニウムキレートなどの磁気作用物質が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイに一般に用いられる標的の代表的な例には、光を生じる部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を生じる部分、例えば、フルオレセインが含まれる。この関連で、部分自体が検出可能に標識されない可能性があるが、さらに別の部分との反応の際に検出可能になり得る。
【０１０２】
「結合タンパク質コンジュゲート」という用語は、治療剤または細胞傷害剤などの化学的または生物学的部分に化学的に連結される抗体などの結合タンパク質を指す。「薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を含む。ある特定の実施形態において、治療剤または細胞傷害剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイとの関連において用いられる場合、例えば、コンジュゲート抗体は、検出抗体として使用される検出可能に標識された抗体であってよい。治療として用いられる場合、コンジュゲート結合タンパク質は、例えば、酸性環境における変化に応答して特定の身体または細胞区画中に薬剤を放出し得る。
【０１０３】
「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、「プラスミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。他のベクターは、ＲＮＡベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入される際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。ある特定のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター（または単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、互換的に使用され得る。しかしながら、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態もまた含まれる。本明細書に記載される結合タンパク質は、ベクターｐＣＤＮＡ３．３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して構築された。ｐＨｙｂＥベクターの一群（米国特許公開第２０１２０２３７９７６号）はまた、一般的に親抗体及び二重特異性結合タンパク質クローニングのために使用される。ｐＪＰ１８３；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇｌ，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ２に由来するＶ１は、野生型定常領域を有する抗体及び二重特異性結合タンパク質重鎖のクローニングのために使用される。ｐＪＰ１９１；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ３に由来するＶ２は、κ定常領域を有する抗体及び二重特異性結合タンパク質軽鎖のクローニングのために使用される。ｐＪＰ１９２；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ２に由来するＶ３は、λ定常領域を有する抗体及び二重特異性結合タンパク質軽鎖のクローニングのために使用される。λシグナルペプチド及びκ定常領域で構築されたＶ４は、λ−κハイブリッドＶドメインを有する二重特異性結合タンパク質軽鎖のクローニングのために使用される。κシグナルペプチド及びλ定常領域で構築されたＶ５は、κ−λハイブリッドＶドメインを有する二重特異性結合タンパク質軽鎖のクローニングのために使用される。ｐＪＰ１８３；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇｌ，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ２に由来するＶ７は、（２３４、２３５  ＡＡ）突然変異体定常領域を有する抗体及び二重特異性結合タンパク質重鎖のクローニングのために使用される。
【０１０４】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」という用語は、外来のＤＮＡが導入された細胞を指す。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指す。突然変異または環境的な影響のいずれかのために、後続の世代中にある特定の修飾が生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞を含む。ある特定の実施形態において、真核細胞は、原生生物、真菌、植物、及び動物細胞を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞株大腸菌；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、及びＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株Ｓｆ９；ならびに真菌細胞サッカロミセスセレビシアエを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
「トランスフェクション」という用語は、例えば、エレクトリポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの宿主細胞への外因性核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するために一般的に使用される様々な技法を包含する。
【０１０６】
「サイトカイン」という用語は、細胞間媒介物質として別の細胞集団に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質を指す。「サイトカイン」という用語には、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質ならびに天然サイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【０１０７】
「生物学的試料」または「試験試料」または「細胞試料」という用語は、生物または生物であったものからの物質の量を意味する。かかる物質は、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、リンパ球、単球、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節、及び脾臓を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
「構成成分」という用語は、組成物の要素を指す。診断キットに関連して、例えば、構成成分は、試験試料のアッセイ用のキットに含めることができる、捕捉抗体、検出もしくはコンジュゲート抗体、対照、較正物質、一連の較正物質、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止液などであり得る。したがって、「構成成分」は、例えば、抗分析物（例えば、抗ポリペプチド）抗体に結合することにより、固体支持体上に固定されている、上記のポリペプチドまたは他の分析物を含み得る。いくつかの構成成分は、溶液中にあり得るか、またはアッセイにおける使用として再構成するために凍結乾燥され得る。
【０１０９】
「対照」という用語は、分析物もしくは試験物質を含まないか（「陰性対照」）、または分析物もしくは試験物質を含む（「陽性対照」）ことで知られている組成物を指す。陽性対照は、既知の濃度の分析物または試験物質を含み得る。「陽性対照」は、アッセイの性能特性を確立するために使用され得、試薬（例えば、分析物または試験物質）の完全性の有用な指標である。「対照」、「陽性対照」、及び「較正物質」はまた、既知の濃度の分析物または試験物質を含む組成物を指すために本明細書において互換的に使用され得る。
【０１１０】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の免疫グロブリンのパパイン消化により、免疫グロブリンの可変領域から剥離され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号）。Ｆｃ領域は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び抗体と抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。いくつかの場合において、これらのエフェクター機能は、治療用の免疫グロブリンに対して望ましいが、他の場合において、治療目的に応じて、不要であるか、または有害でさえあり得る。
【０１１１】
結合タンパク質の「抗原結合部分」または「抗原結合部位」または「標的結合部位」という用語は、抗原または標的に特異的に結合する能力を保持する免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）などの結合タンパク質（例えば、抗体または受容体）の１つ以上の断片を意味する。結合タンパク質の抗原結合部分は、完全長抗体の断片、ならびに、２つ以上の抗原に特異的に結合する、二重特異性、二重特異性、または多重特異性形式により実行され得る。結合タンパク質の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、別個の遺伝子によってコードされるＦｖのＶＨ及びＶＬは、ＶＨ及びＶＬ領域が対合して一価分子を形成する（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知）単一タンパク質鎖として、これらを作製することを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して結合され得るが。かかるｓｃＦｖはまた、ダイアボディ、及び相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合部位を形成する一対の直列型Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」などの単一鎖抗体の他の形態であるような、「抗原結合部分」という用語内に包含される。抗原結合部分の全てのアミノ酸が抗原に結合するわけではない可能性がある。例えば、抗体の可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域（ＦＲ）の両方を含む。
【０１１２】
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を意味する。ある特定の実施形態において、多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、天然に存在する抗体ではない。「多重特異性結合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの標的が異なる２つ以上の標的と結合することができる２つの以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含み、四価または多価結合タンパク質である。
【０１１３】
「リンカー」という用語は、アミノ酸残基、または２つのポリペプチド（例えば、２つのＶＨまたは２つのＶＬドメイン）を連結するために使用されるペプチド結合により接続される２個以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを意味する。かかるリンカーポリペプチドは当該技術分野において周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３）。
【０１１４】
「ＣＤＲ」という用語は、免疫グロブリン可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々の中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、重鎖及び軽鎖可変領域の各々に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表記される。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載された系は（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｇｏｖｔ．Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆ．Ｎｏ．１６５−４９２、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基番号付け系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」、及び「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりもさらに可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基に番号付けする系を指すために、本明細書において、互換的に使用される。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３）は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある特定の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３またはＨ１、Ｈ２、及びＨ３（「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を表記する）と表記された。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５）により記載された。さらに他のＣＤＲ境界定義が、本明細書の系のうちの１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測または実験的発見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得る。
【０１１５】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によりリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を意味する。さらなる記載に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６を参照されたい。「Ｋｏｎ」という用語は、結合タンパク質／抗原複合体を形成するための抗原への結合タンパク質（例えば、抗体または二重特異性結合タンパク質）の、会合のためのオン速度定数、または「会合速度定数」を意味する。その標的抗原への結合タンパク質の結合速度または結合タンパク質、例えば抗体と抗原との間の複合体形成の速度を示すこの値はまた、以下の式により示される。
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）  →  Ａｂ−Ａｇ
【０１１６】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、結合タンパク質／抗原複合体からの結合タンパク質（例えば、抗体または二重特異性結合タンパク質）の、解離のためのオフ速度定数、または「解離速度定数」を意味する。この値は、以下の式により示されるように、結合タンパク質、例えば抗体の、その標的抗原からの解離速度または遊離抗体と抗原への経時的なＡｂ−Ａｇ複合体の分離を示す。
Ａｂ＋Ａｇ  ←  Ａｂ−Ａｇ
【０１１７】
「平衡解離定数」という用語は、平衡状態で滴定測定においてまたは解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を会合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることにより得られた値を意味する。会合速度定数、解離速度定数、及び平衡解離定数は、抗原への結合タンパク質（例えば、抗体または二重特異性結合タンパク質）の結合親和性を表すために使用される。会合及び解離速度定数を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。蛍光を基礎とする技法は、高い感度、及び平衡状態で生理学的緩衝液中の試料を検査する能力を提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的取組み及び機器を使用することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動態排除アッセイ）アッセイが使用され得る。
【０１１８】
「変異体」という用語は、アミノ酸の付加（例えば、挿入）、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列中の所与のポリペプチドとは異なるが、所与のポリペプチドの生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する（例えば、変異体抗ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭとの結合について抗ＩｇＭ抗体と競合することができる）。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様の特性（例えば、親水性ならびに荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸とのアミノ酸の置き換えは、微小変化が典型的に関与すると当該技術分野で認識されている。これらの微小変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することにより部分的に特定することができる（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）。アミノ酸のヒドロパシー指標は、その疎水性及び荷電の考慮を基礎とする。タンパク質中の同様のヒドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、タンパク質はタンパク質機能を依然として保持することが当該技術分野において既知である。一態様において、±２のヒドロパシー指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することもできる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性の考慮により、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能となる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。当該技術分野で理解されるように、同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。一態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて、置換が行われる。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。この観察に一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特に、疎水性、親水性、荷電、サイズ、及び他の特性により明らかにされるこれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解される。「変異体」という用語はまた、タンパク質分解、リン酸化、または他の翻訳後修飾などにより異なって処理されているが、その生物学的活性または抗原反応性、例えば、ＩｇＭまたはＤＮＡに結合する能力を保持するポリペプチドまたはその断片を含む。「変異体」という用語は、別途定義されない限り、変異体の断片を包含する。変異体は、野生型配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％，８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％同一であってもよい。
【０１１９】
「ＴＬＲシグナル伝達自己抗原」という用語は、個人の生理機能に対して内因性であり、ＴＬＲ応答をシグナル伝達する免疫原性抗原またはエピトープを指す。ある特定の実施形態において、ＴＬＲシグナル伝達自己抗原は、ＴＬＲ−７またはＴＬＲ−９を活性化する。ある特定の実施形態において、ＴＬＲシグナル伝達自己抗原は、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む自己タンパク質またはタンパク質複合体である。
【０１２０】
「ＴＬＲ活性化自己抗原」という用語は、個人の生理機能に対して内因性であり、ＴＬＲ応答を活性化する免疫原性抗原またはエピトープを指す。ある特定の実施形態において、ＴＬＲ活性化自己抗原は、ＴＬＲ−７またはＴＬＲ−９を活性化する。ある特定の実施形態において、ＴＬＲ活性化自己抗原は、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む自己タンパク質またはタンパク質複合体である。
【０１２１】
「ＴＬＲ阻害自己抗原」という用語は、個人の生理機能に対して内因性であり、ＴＬＲ応答を阻害する免疫原性抗原またはエピトープを指す。
【０１２２】
「自己免疫疾患」という用語は、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、無γグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（またルー・ゲーリック病、運動ニューロン疾患）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹自己免疫性ブドウ膜炎、バロー疾患（ｂａｌｏ  ｄｉｓｅａｓｅ）／バロー同心円性硬化症、バセドウ病、ビリーフス疾患（Ｂｅｌｉｅｆｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベルジェ病、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多巣性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、接触性皮膚炎、頭部動脈炎、クレスト症候群、クローン病（２つのタイプの突発性炎症性腸疾患のうちの１つ「ｉｂｄ」）、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、ドレスラー症候群、薬剤誘発性ループス、円板状ループス、エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維化肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ｇｂｓ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名妊娠性類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、化膿性汗腺炎、ヒューズストヴィン症候群（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｓｔｏｖｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、低γグロブリン血症、特発性炎症性脱髄性疾患、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、ｉｇａ腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、ループス腎炎、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織疾患、モルフェア、ムッハ・ハーベルマン病、別名急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（またデビック病）、神経性筋強直症、眼部瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（ｏｒｄ’ｓ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、ｐａｎｄａｓ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐｎｈ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、精神分裂病、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても既知）、血小板減少症、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎（２つの種類の特発性炎症性腸疾患「ｉｂｄ」のうちの１つ）、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、肉芽腫症、またはウェゲナー肉芽腫症を含み得るが、これらに限定されない。
【０１２３】
「酸感受性」という用語は、例えば、エンドソーム内で結合タンパク質及び／またはコンジュゲート薬剤の一部をエンドソーム内に放出するために、酸性環境下で反応する部分または複数の部分を含む結合タンパク質または結合タンパク質コンジュゲートを指す。低ｐＨ環境で活性薬剤を放出するために使用され得る酸感受性連結は、ジメチルマレイン酸無水物、シス−アコニチル（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ）、及びヒドラゾン連結を含むが、これらに限定されない。酸感受性組成物の追加の例は、米国公開第２０１１０１８９７７０号において見出すことができる。
ＩＩ．結合タンパク質の生成
【０１２４】
免疫細胞受容体及び／または自己抗原と結合することができる結合タンパク質ならびにその作製する方法が提供される。結合タンパク質は、様々な技術を使用して生成することができる。発現ベクター、宿主細胞、及び結合タンパク質を生成する方法が提供され、当該技術分野において周知である。
Ａ．親モノクローナル抗体を選択するための判断基準
【０１２５】
二重特異性結合タンパク質分子において所望される少なくとも１つ以上の特性を有する親抗体を選択することを含むある特定の実施形態が提供される。ある特定の実施形態において、所望の特性は、例えば、抗原特異性、抗原への親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、可溶性、産生効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、またはオルソロガス抗原結合などの１つ以上の抗体パラメータである（例えば、米国特許公開第２００９０３１１２５３号）。
Ｂ．結合タンパク質分子の構築
【０１２６】
結合タンパク質は、２つの異なる親モノクローナル抗体からの２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術により、直接的にまたはリンカーを介して直列に連結され、その後、軽鎖定常ドメインＣＬが続くように設計され得る。同様に、重鎖は、直接的にまたはリンカーを介して直列に連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、その後に、定常ドメインＣＨ１及びＦｃ領域が続く（図１）。
【０１２７】
可変ドメインは、本明細書に記載される方法のいずれか１つにより生成された親抗体から組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。ある特定の実施形態において、可変ドメインは、マウする重鎖または軽鎖可変ドメインである。ある特定の実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲ移植またはヒト化可変重鎖または軽鎖ドメインである。ある特定の実施形態において、可変ドメインは、ヒト重鎖または軽鎖可変ドメインである。
【０１２８】
リンカー配列は、単一アミノ酸またはポリペプチド配列であり得る。ある特定の実施形態において、リンカー配列の選択は、いくつかのＦａｂ分子の結晶構造分析に基づく。Ｆａｂまたは抗体分子構造中の可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインとの間には、天然の柔軟な連結が存在する。この天然の連結は、ＶドメインのＣ末端からの４〜６個の残基及びＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ末端からの４〜６個の残基により構成されるおよそ１０〜１２個のアミノ酸残基を含む。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に、最初の５から６個のアミノ酸残基は、強い二次構造なしにループ立体構造を採ることが可能であり、したがって、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーとして作用することが可能である。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部であるため、可変ドメインの天然の伸長であり、したがって、それらの使用は、免疫原性を最小化し得る。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、重鎖、軽鎖、２つの鎖、または４つの鎖実施形態は、アミノ酸配列
ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号３）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号５）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号７）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１０）、ＡＤＡＡＰ（配列番号１１）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１５）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１６）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１７）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１８）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１９）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２０）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２４）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号２５）、またはＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号２６）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２７）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３０）、またはＧ／Ｓベース配列（例えば、Ｇ４Ｓ及びＧ４Ｓ繰り返し体、配列番号３１）を含む少なくとも１つのリンカーを含む。ある特定の実施形態において、Ｘ２はＦｃ領域である。ある特定の実施形態において、Ｘ２は変異体Ｆｃ領域である。
【０１３０】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのあらゆる長さのあらゆる配列を含み得るが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基は含まず、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基；軽鎖リンカーは、ＣκまたはＣλからであり得、重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む、いずれかのアイソタイプのＣＨ１に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、及び他のタンパク質からの他の天然配列などの他のタンパク質に由来し得る。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、定常ドメインは、組換えＤＮＡ技術を使用して、２つの連結された可変ドメインに連結される。ある特定の実施形態において、連結された重鎖可変ドメインを含む配列は、重鎖定常ドメインに連結され、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列は、軽鎖定常ドメインに連結される。ある特定の実施形態において、定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインである。ある特定の実施形態において、二重特異性結合タンパク質重鎖は、Ｆｃ領域にさらに連結される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域を含む。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、２つの重鎖二重特異性ポリペプチド及び２つの軽鎖二重特異性ポリペプチドは、組み合わされて、本発明の二重特異性結合タンパク質を形成する。表１は、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を作製するのに有用である例示的な親抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を列挙する。ある特定の実施形態において、任意の配向における表１に列挙されるＶＨ及び／またはＶＬ領域のうちの少なくとも２つを含む二重特異性結合タンパク質が、提供される。ＶＨ及びＶＬドメイン配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（太字）及び当該技術分野において既知であるか、または当該技術分野において既知である方法を使用して容易に識別可能であるいずれかのフレームワーク配列を含む。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＲ及び／またはフレームワーク配列のうちの１つ以上が、機能を欠くことなく、当該技術分野において同じ抗原に結合することで既知の結合タンパク質からの他のＣＤＲ及び／またはフレームワーク配列に置き換えられる。
【０１３３】
表１：結合タンパク質を生成するための抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列のリスト
【表１−１】
2016535765.tif 000002
【０１３４】
【表１−２】
2016535765.tif 000003
【０１３５】
【表１−３】
2016535765.tif 000004
【０１３６】
特異性標的と結合することができる二重特異性結合タンパク質及びそれを作製する方法の詳細な記載が、以下の実施例の節に提供される。
Ｃ．結合タンパク質の産生
【０１３７】
二重特異性結合タンパク質は、当該技術分野において既知のいくつかの技法のうちのいずれかによって産生され得る。例えば、宿主細胞からの発現、二重特異性結合タンパク質重鎖及び二重特異性結合タンパク質軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技術により、宿主細胞にトランスフェクトされる。原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞中で、二重特異性結合タンパク質を発現することは可能であるが、かかる真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な二重特異性結合タンパク質を集合及び分泌する可能性が高いので、二重特異性結合タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物の宿主細胞中で発現される。
【０１３８】
二重特異性結合タンパク質の組換え発現のための例示的なシステムにおいて、リン酸カルシウムにより媒介されたトランスフェクションにより、二重特異性結合タンパク質重鎖及び二重特異性結合タンパク質軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、二重特異性結合タンパク質重鎖及び軽鎖配列は、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、それぞれ、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素に作動可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された形質転換体宿主細胞は、二重特異性結合タンパク質重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために培養され、無傷の二重特異性結合タンパク質が培養培地から収集される。標準的な分子生物学的技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から二重特異性結合タンパク質を収集する。二重特異性結合タンパク質が合成されるまで適切な培養培地中で、宿主細胞を培養することにより、二重特異性結合タンパク質を合成する方法も提供される。本方法は、培養培地から二重特異性結合タンパク質を単離することも含み得る。
【０１３９】
二重特異性結合タンパク質の重要な特徴は、それが、従来の抗体と同様の方法で産生及び精製され得ることである。二重特異性結合タンパク質の産生は、定常領域の配列修飾または化学的修飾を必要とせずに、所望の二重特異性活性を有する均一な単一の主産物をもたらす。「二重特異性」、「多重特異性」、及び「多重特異性多価」完全長結合タンパク質を生成するための他の前述の方法が、集合した不活性な単一特異性、多重特異性、多価の完全長結合タンパク質と、異なる結合部位の組み合わせを有する多価の完全長結合タンパク質との混合物の細胞内産生または分泌された産生をもたらし得る。
【０１４０】
驚くべきことに、本明細書に提供される「二重特異性多価完全長結合タンパク質」の設計は、主として、所望の「二重特異性多価完全長結合タンパク質」に集合する二重可変ドメイン軽鎖及び二重可変ドメイン重鎖をもたらす。
【０１４１】
組み立てられ、発現された二重可変ドメイン免疫グロブリン分子のうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、及び少なくとも９０％が、所望の二重特異性四価タンパク質であり、それ故に、向上した商業的有用性を有する。したがって、「二重特異性四価完全長結合タンパク質」の単一の主産物をもたらす単一細胞中の二重可変ドメイン軽鎖及び二重可変ドメイン重鎖を発現させるための方法が提供される。
【０１４２】
「二重特異性四価完全長結合タンパク質」の「主産物」をもたらす単一細胞中の二重可変ドメイン軽鎖及び二重可変ドメイン重鎖を発現させる方法であって、「主産物」は、二重可変ドメイン軽鎖及び二重可変ドメイン重鎖を含む全ての集合されたタンパク質の５０％超であり、例えば、７５％超及び９０％超である、方法が提供される。
ＩＩＩ．二重特異性結合タンパク質の使用
【０１４３】
２つ以上の抗原に結合するそれらの能力を考えると、本明細書に提供される結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または組織免疫組織化学などの慣用のイムノアッセイを使用して、（例えば、血清または血漿などの生物学的試料中の）抗原を検出するために使用することができる。二重特異性結合タンパク質は、結合したまたは結合していない抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接または間接的に標識される。好適な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、及び放射性物質を含む。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例は、ルミソールであり、好適な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、及び１５３Ｓｍが含まれる。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質は、インビトロ及びインビボの両方でそれらの抗原標的の活性を中和することができる。その結果、かかる二重特異性結合タンパク質は、例えば、抗原を含有する細胞培養物中、ヒト対象中、または本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象中の抗原活性を阻害するために使用することができる。ある特定の実施形態において、抗原活性が有害である疾患または障害を患う対象中の抗原活性を低下させる方法が提供される。本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質は、治療目的のために、ヒト対象に投与することができる。
【０１４５】
「抗原活性が有害である障害」という用語は、障害を患う対象における抗原の存在が、障害の病態生理または障害の悪化に寄与する因子のいずれかに関与していることを示すか、またはそれが疑われる疾患及び他の障害を含むことを意図する。その結果、抗原活性が有害である障害は、抗原活性の低下が障害の症状及び／または進行を緩和することが予測される障害である。かかる障害は、例えば、障害に罹患している対象の生物学的液体中の抗原濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液などの抗原濃度の増加）により明らかとされ得る。本明細書に提供される結合タンパク質で治療することができる障害の非限定的な例には、以下に、及び結合タンパク質を含む薬学的組成物に関連する節で考察されるこれらの障害が含まれる。ある特定の実施形態において、抗原はＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む。
【０１４６】
二重特異性結合タンパク質は、効力／安全性を向上させ、かつ／または患者の対象範囲を増加させるために、２つの異なる標的を同時に遮断するための治療剤として有用である。
【０１４７】
さらに、本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質は、細胞内送達（内部移行性受容体及び細胞内分子を標的化すること）、脳内への送達（血液脳関門を横断するためにトランスフェリン受容体及びＣＮＳ疾患媒介物質を標的化すること）を含む、組織特異性の送達（向上した局所ＰＫにより、より高い効力及び／またはより低い毒性に対する組織マーカー及び疾患媒介物質を標的化すること）のために使用することができる。二重特異性結合タンパク質はまた、その抗原の非中和エピトープへの結合を介して特異的な位置に抗原を送達するための担体タンパク質としての役目を果たすこともでき、さらに、抗原の半減期を増加させることもできる。さらに、二重特異性結合タンパク質は、患者に埋め込まれた医療デバイスに物理的に連結されるか、またはこれらの医療デバイスを標的とするように設計され得る（Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８（３）：４３７−４４６、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００（２２−２３）：６３１８−６３２４、Ｄｒｕｇ／ｄｅｖｉｃｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ，Ｗｕ（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２７（１１）：２４５０−２４６７、Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍａｒｑｕｅｓ（２００５）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．Ｓｙｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ：３７７−３９７）。簡潔に言えば、医療用インプラントの部位へ適切な細胞型を誘導することは、正常な組織機能の治癒及び回復を促進し得る。あるいは、デバイスに連結された、またはそれを標的とする二重特異性結合タンパク質により、デバイスの埋め込みの際に放出される媒介物質（サイトカインが含まれるが、これに限定されない）の阻害も提供される。ある特定の実施形態において、二重特異性結合タンパク質は、例えば、Ｂ細胞中で、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９などのＴＬＲを誘発する。
Ａ．様々な疾患における結合タンパク質の使用
【０１４８】
本明細書に提供される結合タンパク質は、例えば、結合タンパク質によって認識される標的が有害である様々な疾患を治療するための治療の分子として有用である。かかる結合タンパク質は、特異性疾患に関与する１つ以上の対象と結合し得る。免疫細胞受容体及び／または自己抗原の阻害はまた、動物モデルにおいて抗ウィルスワクチンを向上させることが示され、ＨＩＶ及び他の感染症、例えば、ヒトライノウイルス、他のエンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、またはアデノウイルスの治療において有用であり得る。
【０１４９】
本開示を制限することなく、ある特定の疾患病態のさらなる情報が提供される。
１．ヒト自己免疫及び炎症反応
【０１５０】
免疫細胞受容体及び／または自己抗原は、喘息、アレルギー、アレルギー性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、線維化肺疾患、特発性肺線維症、肝線維症、ループス、Ｂ型肝炎関連の肝疾患及び線維症、敗血症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、乾癬、糖尿病、インスリン依存型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、骨関節炎（ＯＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性心疾患（ＩＨＤ）、セリアック病、接触過敏症、アルコール性肝疾患、ベーチェット病、アテローム硬化性血管疾患、眼球表面炎症性疾患、またはライム病を含む一般自己免疫及び炎症反応に関係していた。
【０１５１】
本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質を使用して、神経障害を治療し得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される二重特異性結合タンパク質またはその抗原結合部分を使用して、神経変性疾患及び神経細胞の再生及び脊髄損傷を治療する。
２．関節リウマチ
【０１５２】
関節リウマチ（ＲＡ）、全身性疾患は、関節の滑膜における慢性炎症反応を特徴とし、軟骨の変性及び関節近傍骨のびらんを随伴する。多くの炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子は、疾患にかかった関節において発現される。結合タンパク質分子が関節リウマチの治療に有用であるかどうかが、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルなどの前臨床の動物ＲＡモデルを使用して、評価され得る。他の有用なモデルが当該技術分野において周知である（Ｂｒａｎｄ（２００５）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５５（２）：１１４−２２）。ヒト及びマウス相同分子種の親抗体の交差反応性（例えば、ヒト及びマウスＴＮＦ、ヒト及びマウスＩＬ−１５などに対する反応性）に基づいて、マウスＣＩＡモデルにおける確認試験が、「一致する代理抗体」由来結合タンパク質分子で実行され得、簡潔に言うと、２つ（以上）のマウス標的特異性抗体に基づく結合タンパク質は、ヒト結合タンパク質構築のために使用される親ヒトまたはヒト化抗体の特性（例えば、同様の親和性、同様の中和効力、同様の半減期など）に可能な限り一致し得る。
３．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
【０１５３】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、多岐にわたる臨床症状の可変のサブセットの提示で診断される複雑な自己免疫疾患である。しかしながら、全てのＳＬＥ患者に一般的である特徴は、核抗原に対する自己免疫反応の存在である。自己反応性Ｂ細胞は、疾患の診断に不可欠な自己抗体を産生するが、Ｂ細胞は、自己抗体産生に無関係の疾患の発症に積極的に関係することが証明された。疾患の発病をめぐる主な質問は、ＳＬＥ  Ｂ細胞における固有の欠損が、臨床的疾患の発症をもたらす免疫学的事象を誘発する役割を果たすかどうかである。他の免疫細胞は、ＳＬＥにおいて役割を果たすが、ＳＬＥ患者からのＢ細胞は、発病の根底にあると思われ、かつＢ細胞寛容の崩壊及びＳＬＥのその後の発病を最終的にもたらす活動性疾患における特徴的な活動亢進を説明するシグナル伝達欠損を示す。
【０１５４】
ＳＬＥの免疫病原性の特質は、ポリクローナルＢ細胞の活性化であり、それは、高グロブリン血症、自己抗体産生、及び免疫複合体形成をもたらす。感染症に対する先天性応答において重要な役割を果たすＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）はまた、内因性リガンドによって誘導される急性及び慢性炎症過程に関与する。
【０１５５】
特に、エンドソームに局在するＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、Ｂリンパ球及び樹状細胞それぞれ中に自己ＲＮＡ及びＤＮＡを含有する自己免疫複合体によって活性化される。これらの内因性ＴＬＲリガンドは、自己抗原と一緒に刺激性シグナルを提供する自己アジュバントとして働き、ひいては、例えばＳＬＥにおける自己抗原に対する末梢性寛容を破綻させる一因となる。ＳＬＥマウスモデルにおけるインビボ研究は、ＲＮＡ含有抗核抗体の生成及び腎臓内の病原性免疫複合体の沈着におけるＴＬＲ７の不可欠な役割を実証するしかしながら、ＤＮＡ反応性ＴＬＲ９は、ＳＬＥマウスモデルにおいて免疫刺激ならびに調節機能を有すると思われる。ＴＬＲ７及びＴＬＲ９によって認識されるＲＮＡ及びＤＮＡを含有する自己免疫複合体に対応して形質細胞様樹状細胞によって産生されるＩ型インターフェロンは、自己免疫応答の強力な増幅因子として作用する。サイトゾルＲＮＡ及びＤＮＡセンサーによる自己核酸のＴＬＲ非依存性認識がまた、自己免疫応答の生成において役割を果たし得る（Ｋｒｕｇ（２００８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１８３）：１２９−５１）。
【０１５６】
著しく増加したレベルのＩＬ−１７が、全身性エリテマトーデスを有する患者において検出された（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．３４（１）：１９−２５、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（３）：３８５−９３）。ＩＬ−１７は、ＳＬＥの発病における重要なサイトカインを表す。増加したＩＬ−１７産生が、ＳＬＥを有する患者ならびにループス様疾患を有する動物において示された。動物モデルは、ＩＬ−１７の遮断がループスの発現を減少させることを実証した（レビューにはＮａｌｂａｎｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）１５７（２）：２０９−２１５を参照）。ヒト及びマウス相同分子種の親抗体の交差反応性に基づいて（例えば、ヒト及びマウスＣＤ２０、ヒト及びマウスインターフェロンαなどの反応性）、マウスループスモデルにおける確認試験が、「一致する代理抗体」由来結合タンパク質分子で実行され得る。簡潔に言うと、２つ（以上）のマウス標的特異性抗体に基づく結合タンパク質は、ヒト結合タンパク質構築のために使用される親ヒトまたはヒト化抗体の特性（例えば、同様の親和性、同様の中和効力、同様の半減期など）に可能な限り一致し得る。
ＩＶ．薬学的組成物
【０１５７】
単独で、あるいは予防剤、治療剤、及び／または薬学的に許容される担体と組み合わせた、１つ以上の結合タンパク質を含む薬学的組成物が提供される。本明細書に提供される結合タンパク質を含む薬学的組成物は、障害の診断、検出、予後、またはモニタリングにおいて、障害または１つ以上のその症状の予防、治療、管理、または改善において、及び／または研究において使用されるが、これらに限定されない。単独で、あるいは予防剤、治療剤、及び／または薬学的に許容される担体と組み合わせた薬学的組成物の製剤化は、当業者に既知である（米国特許公開第２００９０３１１２５３号）。
【０１５８】
本明細書に提供される予防剤または治療剤の投与方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）、ならびに肺内投与（例えば、吸入器または噴霧器で投与されたエアロゾル化された化合物）が含まれるが、これらに限定されない。投与の特定経路のための薬学的組成物の製剤化、ならびに様々な投与方法に必要な材料及び技法が利用可能であり、当業者に既知である（米国特許公開第２００９０３１１２５３号）。
【０１５９】
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）が得られるように調節され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてよく、複数回分割用量が経時的に投与されてよく、あるいは、治療状況の緊急性により指示される通りに用量を比例的に減少または増加してもよい。投与の簡便さ及び投与量の均一性のために、単位投与形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。「単位投与形態」という用語は、治療される哺乳動物対象に単位投与量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に提供される単位投与形態のための仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成される具体的な治療または予防効果、ならびに（ｂ）個人における感受性の処置のためにかかる活性化合物を配合する際の当該技術分野に潜在的な限界により決定され、直接依存する。
【０１６０】
本明細書に提供される結合タンパク質の治療上または予防上有効な量の例示的な非限定範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は緩和しようとする病態のタイプ及び重症度により異なり得ることに留意されたい。任意の特定の対象に関して、具体的な投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに組成物の投与を施すかまたは指図するヒトの専門的な判断に従って経時的に調節される得、本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、特許請求されている組成物の範囲または実施を限定する意図はないことをさらに理解されたい。
Ｖ．併用療法
【０１６１】
本明細書に提供される結合タンパク質はまた、様々な疾患の治療に有用な１つ以上の追加の治療剤、その意図された目的のために専門医により選択される追加の薬剤とともに投与することもできる。例えば、追加の薬剤は、本明細書に提供される抗体により治療されるべき疾患または病態を治療するのに有用である、当該技術分野において認識されている治療剤であり得る。この組み合わせはまた、２つ以上の追加の薬剤、例えば、２つまたは３つの追加の薬剤を含み得る。
【０１６２】
併用療法の薬剤には、抗腫瘍剤、放射線治療、化学療法、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チューブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、キナーゼ阻害剤、及びｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
自己免疫及び炎症性疾患を治療するための組み合わせは、イブプロフェンなどの薬物を含むＮＳＡＩＤＳとも称される非ステロイド性抗炎症薬（複数可）である。他の組み合わせは、プレドニゾロンを含むコルチコステロイドであり、ステロイド使用の周知の副作用が、本明細書に提供される結合タンパク質と組み合わせて、患者を治療するときに必要とされるステロイド投与量を減らすことによって、低減されるか、または取り除かれさえもし得る。本明細書に提供される抗体またはその抗体結合部分が組み合わされ得る関節リウマチの治療剤の非限定例としては、以下、サイトカイン抑制抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）、他のヒトサイトカインまたは成長因子に対する抗体またはそれらのアンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦが含まれる。本明細書に提供される結合タンパク質またはその抗原結合部分は、抗体と組み合わされて、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡ、またはＣＤ１５４を含むそれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子となり得る。
【０１６４】
治療剤の組み合わせは、自己免疫及びその後の炎症性カスケードにおいて異なる時点で妨害し得る。例としては、本明細書に開示される結合タンパク質、及びＴＮＦアンタゴニスト様キメラ、ヒト化、またはヒトＴＮＦ抗体、アダリムマブ、（ＰＣＴ国際公開第９７／２９１３１号）、ＣＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、可溶性ｐ５５もしくはｐ７５ＴＮＦ受容体、またはそれらの誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（レネルセプト））、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、またはＩＬ−１阻害剤（インターロイキン−１−変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ＲＡなど）が含まれる。他の組み合わせは、本明細書に開示される結合タンパク質及びインターロイキン１１を含む。さらに別の組み合わせは、ＩＬ−１２機能に沿って、依存して、または呼応して作用し得る自己免疫応答の中心的存在を含み、特に関連性のあるものは、ＩＬ−１８抗体、可溶性ＩＬ−１８受容体、またはＩＬ−１８結合タンパク質を含むＩＬ−１８アンタゴニストである。ＩＬ−１２及びＩＬ−１８が、重複するが明らかに異なる機能及び両方が最も有効であり得るアンタゴニストの組み合わせを有することが示された。さらに別の組み合わせは、本明細書に開示される結合タンパク質及び非枯渇抗ＣＤ４阻害剤である。さらに他の組み合わせは、本明細書に開示される結合タンパク質及び抗体、可溶性受容体、またはアンタゴニストのリガンドを含む同時刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストを含む。
【０１６５】
本明細書に提供される結合タンパク質はまた、薬剤、例えばメトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニーネ／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオリンゴ酸塩（筋肉内及び経口）、アザチオプリン、コチチン、コルチコステロイド（経口、吸入、及び局所注射）、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリケート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウム、オキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン系薬物、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えばキナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、またはそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５もしくはｐ７５ＴＮＦ受容体、または誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））もしくはｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（レネルセプト）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、及びＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリアムシノロンアセトニド、プロポキシフェンナプシレート／アセトアミノフェン、葉酸塩、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、塩酸オキシコドン、酒石酸水素ヒドロコドン／アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え体、塩酸トラマドール、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／葉酸／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロン酸ナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、塩酸アミトリプチリン、スルファジアジン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸オロパタジン、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１  ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８  ＢＰ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ−７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１、またはメソプラムと組み合わされ得る。組み合わせは、���トトレキサートまたはレフルノミド、及び中度または重度の関節リウマチの場合は、シクロスポリンを含む。
【０１６６】
ある特定の実施形態において、結合タンパク質またはその抗原結合部分は、関節リウマチの治療のために以下のうちの１つ：ＫＤＲの小分子阻害剤、Ｔｉｅ−２の小分子阻害剤、メトトレキサート、プレドニゾン、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、レフルノミド、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、イブプロフェン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、アザチオプリン、トリアムシノロンアセトニド、プロプキシフェンナプシレート／アセトアミノフェン、葉酸塩、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、塩酸オキシコドン、酒石酸水素ヒドロコドン／アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え体、塩酸トラマドール、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／葉酸／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロン酸ナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、シクロスポリン、塩酸アミトリプチリン、スルファジアジン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸オロパタジン、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８  ＢＰ、ＩＬ−１２／２３、抗ＩＬ１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ−７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１、またはメソプラムと組み合わせて投与される。
【０１６７】
本明細書に開示される結合タンパク質が組み合わせられ得る多発性硬化症の治療剤の非限定例としては、以下、コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキサート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（ＡＶＯＮＥＸ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロン−β１ａ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；インターフェロンα−ｎ３）（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）、インターフェロン−α（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ／Ｊ＆Ｊ）、インターフェロンβ１Α−ＩＦ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ペグインターフェロンα２ｂ（Ｅｎｚｏｎ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１；ＣＯＰＡＸＯＮＥ；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静注用免疫グロブリン；クラブリビン；他のヒトサイトカインまたは成長因子に対する抗体またはそれらのアンタゴニスト、及びそれらの受容体、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、またはＰＤＧＦが含まれる。本明細書に提供される結合タンパク質は、抗体と組み合わされて、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、またはそれらのリガンドなどの細胞表面分子となり得る。本明細書に提供される結合タンパク質はまた、薬剤、例えばメトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン系薬物、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えばキナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、またはそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５もしくはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβ）、またはｂｃｌ−２阻害剤と組み合わされ得る。
【０１６８】
本明細書に提供される結合タンパク質が組み合わせられ得るＳＬＥ（ループス）の治療剤の例としては、以下、ＮＳＡＩＤＳ、例えば、ジクロフェナク、ナプロキセン、イブプロフェン、ピロキシカム、インドメタシン；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ；抗マラリア剤、例えば、ヒドロキシクロロキン；ステロイド、例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、ブデノシド、デキサメタゾン；細胞毒、例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート；ＰＤＥ４の阻害剤、またはプリン合成阻害剤、例えば、セルセプトが含まれる。本明細書に提供される結合タンパク質はまた、薬剤、例えばスルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、イムラン、及びＩＬ−１β変換酵素阻害剤及びＩＬ−１ｒａのようなＩＬ−１、例えば、カスパーゼ阻害剤などの炎症促進性サイトカインの合成、産生、または作用を妨害する薬剤と組み合わせられ得る。本明細書に提供される結合タンパク質はまた、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＴ細胞活性化分子を標的とする分子、例えば、ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧもしくは抗Ｂ７ファミリー抗体、抗ＰＤ−１ファミリー抗体と使用され得る。本明細書に提供される結合タンパク質は、ＩＬ−１１もしくは抗サイトカイン抗体、例えば、フォノトリズマブ（ｆｏｎｏｔｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＦＮｇ抗体）、または抗受容体受容体抗体、例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体及びＢ細胞表面分子に対する抗体と組み合わされ得る。遺伝子導入マウスにおけるｂｃｌ−２過剰発現が、ループス様表現型を引き起こすことが実証されたので、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合部分はまた、ＬＪＰ３９４（アベチムス（ａｂｅｔｉｍｕｓ））、Ｂ細胞を枯渇または不活性化する薬剤、例えば、リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、ｌｙｍｐｈｏｓｔａｔ−Ｂ（抗ＢｌｙＳ抗体）、ＴＮＦアンタゴニスト、例えば、抗ＴＮＦ抗体、アダリムマブ（ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号；ＨＵＭＩＲＡ）、ＣＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、ＣＤＰ  ５７１、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ）及びｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（レネルセプト））、ならびにｂｃｌ−２阻害剤と使用され得る（Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（５）：２７７８−８６）。本明細書に提供される薬学的組成物は、「治療上有効な量」または「予防上有効な量」の本明細書に提供される結合タンパク質を含み得る。「治療上有効な量」は、必要な投与量及び時間で、所望の治療結果に到達するために有効な量を指す。結合タンパク質の治療上有効な量は、当業者によって決定され得、個人の疾患の状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個人における所望の応答を引き出す結合タンパク質の能力などの要因に従って変化し得る。治療上有効な量はまた、抗体または抗体結合部分の任意の毒性のまたは有害な影響より治療上有益な影響が上回るものである。「予防上有効な量」は、必要な投与量及び時間で、所望の予防結果に到達するために有効な量を指す。典型的には、予防投与量は、疾患の初期段階より以前に、または疾患の���期段階で、対象において使用されるので、予防上有効な量は治療上有効な量より少ないであろう。
ＶＩ．診断及び予後
【０１６９】
本明細書中の開示はまた、診断アッセイ方法、１つ以上の結合タンパク質を含有する診断用キット、ならびに自動及び／または半自動システムで用いる方法及びキットの適合が含まれるが、これらに限定されない、診断／予後用適用も提供する。提供される方法、キット、及び適合は、個人における疾患または障害の検出、モニタリング、及び／または治療において用いられ得る。これは、以下にさらに解明される。
Ａ．アッセイの方法
【０１７０】
本開示はまた、本明細書に記載される少なくとも１つの結合タンパク質を使用して、試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度を決定するための方法も提供する。当該技術分野において既知の任意の好適なアッセイが、本方法において使用され得る。例には、イムノアッセイ及び／または質量分析を用いる方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本開示により提供されるイムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素免疫測定法の乗算（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、及び均一化学発光アッセイなどを含み得る。
【０１７２】
化学発光微小粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いるものは、イムノアッセイの一例である。
【０１７３】
質量分析を用いる方法は、本開示で提供され、これには、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）またはＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離／イオン化）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
イムノアッセイ及び質量分析を使用する生物学的試験試料の収集、取扱い、処理、及び分析のための方法は、当業者には周知であり、本開示の実施に際して提供される（米国特許公開第２００９０３１１２５３号）。
Ｂ．キット
【０１７５】
試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度について試験試料をアッセイするためのキットも提供される。このキットは、分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの構成成分、及び分析物またはその断片試験試料について試験試料をアッセイするための説明書を含む。分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの構成成分は、本明細書に開示される結合タンパク質及び／または抗分析物の結合タンパク質（またはその断片、変異体、またはその変異体の断片）を含むことができ、これは、任意選択で、固相上で固定化される。
【０１７６】
任意選択で、キットは、較正物質または対照を含み得、単離されたまたは精製された分析物を含み得る。キットは、イムノアッセイ及び／または質量分析による分析物の試験試料をアッセイするための少なくとも１つの構成成分を含み得る。分析物、結合タンパク質、及び／または抗分析物の結合タンパク質、またはその断片を含むキット構成成分は、当該技術分野で既知の任意の検出可能な標識を使用して任意選択で標識され得る。本開示の実施の際に提供される作製のための材料及び方法は、当業者に既知であろう（米国特許公開第２００９０３１１２５３号）。
Ｃ．キット及び方法の適合
【０１７７】
キット（またはその構成成分）、ならびに本明細書に記載されるイムノアッセイなどのアッセイによる試験試料中の分析物の存在、量、または濃度を決定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号において記載される通りの、かつ例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）などのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により商業的に販売されるような、様々な自動及び半自動システム（固相が微小粒子を含むものを含む）で使用するために適合され得る。
【０１７８】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットホームには、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）、及びＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、ならびに他のプラットホームが含まれるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット、及びキットの構成成分は、他の形式において、例えば、電気化学的または他の携帯もしくはポイントオブケアアッセイシステムで用いられ得る。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う商業的Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびに単回使用試験デバイスにおけるこれらの製造及び操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、同第７，４１９，８２１号、及び同第７，６８２，８３３号、ならびに米国公開第２００４００１８５７７号、同第２００６０１６０１６４号、及び同第２００９０３１１２５３号に記載されている。
【０１７９】
本明細書に記載される構成成分及び方法の他の好適な改変及び適合が明白であり、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を使用して行われ得ることは当業者には容易に明らかであろう。これまで詳細にある特定の実施形態を説明してきたが、例示のみを目的として含まれ、限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することにより、それがより明確に理解されるであろう。
実施例
実施例１：抗マウスＩｇＭ及び抗ＤＮＡ二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））タンパク質の生成及び特性評価
【０１８０】
免疫グロブリン可変重鎖及び可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド断片を合成し、かつｐＣＤＮＡ３．３ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にその断片をクローニングすることによって、４鎖二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））タンパク質を生成した。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物をヒト胎児腎臓２９３細胞内にクローニングし、かつそこで発現し、当該技術分野で既知の方法に従って精製した。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質のＶＨ及びＶＬ鎖アミノ酸配列を表１に提供する。表２の最も左の欄に列挙される配列番号は、表のその列中のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質の重鎖及び軽鎖の完全可変ドメインに対する配列を指す。表２の最も右の欄中の各列は、３つの配列番号を提供する。第１の数は、外側可変ドメイン配列の配列番号を指し、第２の数は、リンカーの配列番号を指し、第３の数は、内側可変ドメイン配列の配列番号を指し、それが一緒に、完全ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）可変ドメイン配列内に見出される（すなわち、ＶＤ１−Ｘ１−ＶＤ２を含む完全ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質の重鎖及び軽鎖可変ドメインの各々）。
【０１８１】
表２：マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質
【表２−１】
2016535765.tif 000005
【０１８２】
【表２−２】
2016535765.tif 000006
【０１８３】
上に列挙されたＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、ヒト軽鎖κ定常領域（配列番号８４）及び野生型ｈＩｇＧ１定常領域（配列番号８５）を含む。定常ドメイン配列及び代替を下の表３に示す。
表３：ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメイン
【表３】
2016535765.tif 000007
実施例２：親抗体及びＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質の機能的活性を決定するために使用されるアッセイ
実施例２．１：マウス
【０１８４】
ＡＭ１４  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子導入マウスは以前に記載された（Ｓｗｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．４３（８）：６０７−１８）。手短に言えば、ＡＭ１４は、「ａ」アロタイプのマウスＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａ）を認識するＡＭ１４重鎖及びＶｋ８軽鎖を含むＢＣＲである。ＡＭ１４重鎖及びＶｋ８軽鎖に対して陽性であるマウス中のＢ細胞の９５〜９８％が、ＡＭ１４  ＢＣＲを発現する。ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、またはＦｃγＲＩＩＢが欠損しているＡＭ１４  Ｂ細胞を生成するために、ＡＭ１４及びＶｋ８遺伝子を適切なノックアウトマウスにした。
実施例２．２：抗体及び試薬
【０１８５】
全ての抗体は、別途示されない限りｍＩｇＧ２ａである。α−ＤＮＡ反応性抗体ＰＡ４は、寛大にもＤｒ．Ｍ．Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ（Ｔｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）によって提供された。ラットα−マウスＩｇＭ（ｍＩｇＭ）ハイブリドーマＢ７−６は、寛大にもＤｒ．Ｍ．Ｊｕｌｉｕｓ（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）によって提供された。マウス抗クロマチンＩｇＧ２ａ抗体ＰＬ２−３を、Ｄｒ．Ｍ．Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ（Ｔｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から取得した。Ｂ細胞生存因子ＢＬｙＳを、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。ＴＬＲ９（１８２６）の実験的リガンドをＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｐｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＡｎｔｉｆａｄｅをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から取得した。抗マウスＩＲＦ−４抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）から取得した。抗ヤギＩｇＧＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７をＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から取得した。ＤＮＡ染色Ｓｙｔｏｘ  ＢｌｕｅをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から取得した。抗核抗体（ＡＮＡ）反応性を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）から取得したＡＮＡ試験キットを使用して試験した。ＡＮＡ試験キットは、固定のＨｅｐＧ２細胞、肝細胞癌腫細胞株でコーティングされたウェルを有するスライドを含有する。カルボキシフルオセインジアセテート、サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）、及びＴＯＰ−ＲＯ−３を、（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から取得した。ＩＲＡＫ２ノックアウトマウス（ＩＲＡＫ２ＫＯ）は、Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：１０３６７−１０３７５に記載される。ＩＲＡ４ノックインマウス（ＩＲＡＫ２ＫＯ）は、Ｋａｗａｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１０１３−２４に記載され、Ｄｒ．Ｘ．ＬＩ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ）によって提供された。別途示されない限り、全ての二次試薬を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。
実施例２．３：抗体遺伝子のクローニング
【０１８６】
ＩｇＭ特異性抗体Ｂ７−６重鎖及び軽鎖のＶ領域を、標準方法に従って５’ＲＡＣＥによって増幅した。抗体遺伝子を、配列決定（Ｒｕｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７３（１）：３３−９）によって、未成熟終止コドンの不在で証明した。核酸特異性抗体ＰＡ４重鎖及び軽鎖のＶ領域を、標準方法に従って５’ＲＡＣＥによって増幅した。単離された抗体遺伝子の特異性を、ＰＡ４に対してはＡＮＡ試験によって、かつＢ７−６及びＨＢに対してはＥＬＩＳＡによって確認した。
実施例２．４：抗核抗体（ＡＮＡ）試験
【０１８７】
クローニングされたＢＷＲ４及びＰＡ４抗体ならびにＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、ＡＮＡ試験キットを使用して、ＡＮＡ反応性のために試験した。手短に言えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質及び抗体を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）において１μｇ／ｍｌに希釈した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質及び抗体を、５０μｌ／ウェルでＡＮＡスライドの別個のウェルに添加し、室温（ＲＴ）で２時間、湿室においてインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。結合抗体を検出するために、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートヤギα−ヒトＩｇＧ（α−ｈＩｇＧ）を１：１，０００の希釈で添加し、１時間湿室においてスライドをインキュベートした。非結合検出抗体を、ＰＢＳを含有するジャー中にスライドを浸漬し、かつ緩徐に揺動しながら１０分間室温でインキュベートすることによって、取り除いた。前のステップを２回繰り返し、１０μｌのＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅを各ウェルに添加し、２４ｍｍ×６０ｍｍの＃１カバーガラスを上部に据えた。カバーされたスライドを室温で一晩インキュベートし、次いで、縁に透明なマニキュアを塗布することによって封止した。スライドとＤＶＤ−Ｉｇタンパク質及び抗体の結合を蛍光顕微鏡法によって評価した。
実施例２．５：ＩｇＭ結合ＥＬＩＳＡ
【０１８８】
ｍＩｇＭとのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の反応性を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定した。手短に言えば、Ｕｌｔｒａ  Ｃｒｕｚ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）の各ウェルを、１００μｌのＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度でｍＩｇＭでコーティングした。プレートをプラスチックのラップでカバーし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートの各ウェルを３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。最終洗浄の後、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を各ウェルに添加し、プレートを２時間室温でインキュベートした。次いで、プレートを上記の通り洗浄した。列Ｂ〜Ｈのマイクロタイタープレートを１００μｌの希釈緩衝液（ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ）で満たした。次いで、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を希釈緩衝液において１μｇ／ｍｌに希釈し、１４７μｌのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、複製して列Ａの９６ウェルプレートに添加した。１／２ログ希釈に対して、４７μｌを列Ａから列Ｂに移動した。ピペットの先端を清潔な先端と取り換え、列Ｂから４７μｌを列Ｃに移動した。上記の通り、列Ｇまで連続移動を繰り返した。コーティングされたＩｇＭとの二次検出試薬の結合を評価するために、最終移動４７μｌをＧ１〜Ｇ１０からＨ１〜Ｈ１０にのみ移動し、ウェルＨ１１及びＨ１２を１００μｌの希釈緩衝液を含有したままにした。１００μｌアッセイ容量を維持するために、４７μｌをウェルＨ１〜Ｈ１０及びＧ１１〜Ｇ１２から取り除き、廃棄した。連続希釈が完了した後、プレートを１〜２時間室温でインキュベートした。プレートを上記の通り洗浄し、次いで、希釈緩衝液において１：３，０００で希釈された１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギα−ｈＩｇＧ  Ｆｃ特異性を各ウェルに添加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで、上記の通り４回洗浄した。１００μｌの３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を各ウェルに添加し、１０〜１５分間暗闇でプレートをインキュベートすることによって、プレートを発展した。１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加することによって、酵素反応を停止した。プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０２複数標識読み取り機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で、４５０ｎｍで読み取った。
実施例２．６：マウスＢ細胞の培養、ＢＣＲ／ＴＬＲ９刺激、及び［３Ｈ］チミジンアッセイ
【０１８９】
一次マウスＢ細胞を、ＢＤ  Ｉｍａｇ（商標）ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０磁気粒子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用する正の選択によって精製した。手短に言えば、Ｂ細胞を、４×１０５細胞／ウェルの密度で、９６ウェル平底プレートにおいてペンシリン−ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、及び５％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ中で培養した。ＢＣＲ及びＴＬＲ９を通した刺激では、別途留意されない限り、Ｂ細胞を０．３μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌのＰＡ４または５μｇ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ３７５１、ＤＶＤ３７５２、ＤＶＤ３７５４、ＤＶＤ３７５５、ＤＶＤ３７５９、及びＤＶＤ３７６０）の滴定で処理した。細胞をまた、対照として、ＴＬＲ９に対しては１μｇ／ｍｌの１８２６、実験的リガンドで処理した。２４時間後、細胞を、［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）で６時間パルスした。［３Ｈ］チミジンの取込みを、標識方法に従って液体シンチレーションβカウンタ（Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって定量化した。
実施例２．６：ＴＬＲ９活性化アッセイ及びフローサイトメトリ
【０１９０】
一次マウスＢ細胞を、上に記載した通り、正の選択によって精製した。＞４８時間の年齢の培養物では、増殖をカルボキシフルオセインジアセテート、サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈液によって、細胞死をＴＯ−ＰＲＯ−３結合によって定量化した。細胞をＣＦＳＥで標識するために、細胞を最初に２回ＰＢＳで洗浄した。次に、ＣＦＳＥのストックをＰＢＳにおいて１０μΜに希釈し、細胞を１×１０７細胞／ｍｌにした。細胞を１０μΜのＣＦＳＥで、１：１の比率で混合し、２分間緩徐に混合した。ＣＦＳＥ標識反応を、細胞懸濁液の出発容量と同等の容量で熱失活したウシ胎仔血清を添加することによって停止した。細胞を培養液で２回洗浄し、１−４×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、０．０５μｇ／ｍｌのＢｌｙｓを伴うか、または伴わずに０．５μｇ／ｍｌのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ３７５９及びＤＶＤ３７５４）または抗体とともにインキュベートした。増殖をフローサイトメトリによって、６０〜７２時間でフルオロフォア希釈液によって測定した。手短に言えば、細胞を小粒状にし、５００ｎＭのＴＯ−ＰＲＯ−３を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％のＦＣＳ）中に再懸濁した。あるいは、細胞をＳｙｔｏｘ  ｂｌｕｅ（１μΜ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ＴＯ−ＰＲＯ−３及びＳｙｔｏｘ  ｂｌｕｅの両方が、易感染性形質膜を有する細胞のＤＮＡを選択的に染色することによって死細胞を標識した。ＴＯ−ＰＲＯ−３とＳｙｔｏｘ  ｂｌｕｅとの唯一の機能的差異は、２つのフルオロフォアの励起及び発光スペクトルである。例えば、６０〜７２時間後、細胞を小粒状にし、５００ｎＭのＴＯ−ＰＲＯ−３を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％のＦＣＳ）中に再懸濁した。増殖及び細胞死の分析をＦＡＣＳによって実施した。フローサイトメトリ分析を、Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを有するＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）を使用して実行した。
実施例２．８：マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の特性評価
【０１９１】
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ３７５１−ＤＶＤ３７６０を、実施例２．５の方法に従って１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌで開始する半分のログ希釈で、ＩｇＭ結合アッセイによって特性評価した。ＤＶＤ３７５６、ＤＶＤ３７５７、ＤＶＤ３７５９、及びＤＶＤ３７６０は、そのアッセイにおいて最も高い効力を示した。その結果を表４に示す。
【０１９２】
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ３７５１−ＤＶＤ３７６０を、実施例２．４の方法に従って１０μｇ／ｍｌで染色する抗核抗体（ＡＮＡ）で特性評価した。ＤＶＤ３７５２、ＤＶＤ３７５４、及びＤＶＤ３７５５は、最も高い染色レベルを示した。その結果を表４に示す。
【０１９３】
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ３７５１−ＤＶＤ３７６０を、実施例２．６の方法に従って５ｍｇ／ｍｌでの３Ｈ取込みによって特性評価した。ＤＶＤ３７５１及びＤＶＤ３７５４は、最も高いレベルの３Ｈ取込みを示した。その結果を表４に示す。
表４：マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の特性評価
【表４】
2016535765.tif 000008
実施例２．９：ヒトＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の特性評価
【０１９４】
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ３７６１、ＤＶＤ３７６２、ＤＶＤ３７６５、ＤＶＤ３７６７、ＤＶＤ３７６９、及びＤＶＤ３７７０を、実施例２．５の方法に本質的に従って１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌで開始する半分のログ希釈で、ＩｇＭ結合アッセイによって特性評価した。ＤＶＤ３７６６、ＤＶＤ３７６７、及びＤＶＤ３７６９は、そのアッセイにおいて最も高い効力を示した。その結果を表５に示す。
表５：ヒトＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の特性評価
【表５】
2016535765.tif 000009
【０１９５】
ＤＮＡ及びヒトＩｇＭに対して特異的なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ならびにこれらのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対する親ＩｇＧ抗体を、本質的に実施例２．４に記載される通りにＡＮＡ反応性について試験した。これらの実験から、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、親ＩｇＧ抗体と同じＡＮＡ染色プロファイルを示すことが判定された。
実施例３：マウスＩｇＭ及びＤＮＡと結合するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質は一次マウスＢ細胞における細胞増殖及び細胞死を誘導する。
【０１９６】
一次マウスＢ細胞を、実施例２．７の通りに標識及び調製し、０．０５ｍｇ／ｍｌのＢ細胞生存因子ＢＬｙＳの存在下または非存在下で、培養液単独か、１ｍｇ／ｍｌのＴＬＲ９リガンドＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６、１ｍｇ／ｍｌのマウス抗クロマチン自己抗体ＰＬ２−３、または０．５ｍｇ／ｍｌのＤＶＤ３７５９のいずれかで刺激した。７２時間後、細胞を１μΜの細胞透過性ＤＮＡ染色Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅで染色し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析した。細胞分裂をＣＦＳＥの希釈によって判定し、死細胞をＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅで染色することによって識別した。
【０１９７】
図３は、Ｂ細胞のＤＶＤ３７５９ＩｇＭ／ＴＬＲ９共会合がいくつかのラウンドの分裂、続いて増殖後細胞死を誘導したことを示す。細胞はＢＬｙＳの添加によって救うことができる。この繁殖後細胞死は、ＴＬＲ９リガンド１８２６で刺激されたか、または抗クロマチン自己抗体ＰＬ２−３の存在下での細胞では観察されなかった。
実施例４：ＤＶＤ３７５９応答はＩＲＡＫ４キナーゼ活性に依存する
【０１９８】
ＩＲＡＫ４キナーゼ活性が、ＤＶＤ３７５９によってＴＬＲ９を誘導する活性化及び／または死に必要であるかを判定するために、野生型（ＷＴ）、ＩＲＡＫ２ノックアウト（ＩＲＡＫ２ＫＯ）、またはＩＲＡＫ４ノックイン（ＩＲＡＫ４  ＫＩ）一次Ｂ細胞のいずれかを、実施例２．７と同様の方法で精製及び試験した。手短に言えば、ＣＦＳＥ標識Ｂ細胞を、０．０５μｇ／ｍｌのＢ細胞生存因子ＢＬｙＳの存在下または非存在下で、１μｇ／ｍｌのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６または０．５μｇ／ｍｌのＤＶＤ３７５９のいずれかとともにインキュベートした９６ウェル平底プレートにおいて、４×１０６で蒔いた。７２時間後、細胞を５００ｎＭの細胞透過性ＤＮＡ染色ＴＯＰ−ＲＯ−３で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。細胞分裂をＣＦＳＥの希釈によって判定し、死細胞をＴＯＰ−ＲＯ−３で染色することによって識別した。
【０１９９】
図４は、Ｂ細胞のＤＶＤ３７５９ＩｇＭ／ＴＬＲ９共会合がいくつかのラウンドの分裂、続いて増殖後細胞死を誘導したことを示す。細胞はＢＬｙＳの添加によって救うことができる。しかしながら、ＤＶＤ３７５９増殖後細胞死は、ＩＲＡＫ４  ＫＩ  Ｂ細胞では観察されず、ＩＲＡＫ４キナーゼ活性がＤＶＤ３７５９によって誘導されたＴＬＲ９依存増殖後細胞死に必要であることを示した。
実施例５：ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質による一次ヒトＢ細胞のＢＣＲ／ＴＬＲ９刺激
【０２００】
一次ヒトＢ細胞を健康なドナーから取り出した１００ｍｌの血液から精製した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用して精製し、負の選択によりＣＤ３＋細胞を枯渇させた。ＣＤ３枯渇分画を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｎａｉｖｅ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用してＣＤ１９＋ＣＤ２７−ナイーブＢ細胞を精製するために使用した。手短に言えば、Ｂ細胞を、１×１０５細胞／ウェルの密度で、９６ウェル丸底プレートにおいてペンシリン−ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、及び１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ中で培養した。ＢＣＲ及びＴＬＲ９を通した刺激では、別途留意されない限り、Ｂ細胞を１μｇ／ｍｌもしくは５μｇ／ｍｌのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ３７４６、ＤＶＤ３７４７、ＤＶＤ３７４９、ＤＶＤ３７５０、ＤＶＤ３７６１、ＤＶＤ３７６２、ＤＶＤ３７６４、ＤＶＤ３７６５、ＤＶＤ３７６６、ＤＶＤ３７６７、ＤＶＤ３７６９、及びＤＶＤ３７７０）、または培養液で処理した。４８時間後、細胞を、［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）で１２時間パルスした。［３Ｈ］チミジンの取込みを、標識方法に従って液体シンチレーションβカウンタ（Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって定量化した。増殖アッセイの結果を図５に示す。
【０２０１】
さらなる一連の実験において、一次ヒトＢ細胞を上に記載された通りに精製した。１０８時間を超える年齢の培養物では、増殖をＶｉｏｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｅ４５０（ＶＰＤ４５０）希釈によって、細胞死をＴＯ−ＰＲＯ−３結合によって定量化した。細胞をＶＰＤ４５０で標識するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳにおいて１×１０７細胞／ｍｌ  ｉｎにした。次いで、ＶＰＤ４５０を３．５μΜの最終濃度に添加し、細胞を混合し、３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。標識反応を氷冷のＲＰＭＩ培養液を添加することによって停止した。細胞を培養液で２回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、５００ｎｇ／ｍｌのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を伴うか、または伴わずに、ＴＬＲ９阻害剤１８（Ｉｎｈ１８）、または２μΜのＯＤＮ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を伴うか、または伴わずに、１μｇ／ｍｌもしくは３μｇ／ｍｌのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ３７６４）とともにインキュベートした。増殖を、フローサイトメトリによって１０８時間でフルオロフォア希釈によって測定した。手短に言えば、細胞を小粒状にし、５００ｎＭのＴＯ−ＰＲＯ−３を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％のＦＣＳ）中に再懸濁した。ＴＯ−ＰＲＯ−３は、易感染性形質膜を有する細胞のＤＮＡを選択的に染色することによって死細胞を標識した。増殖及び細胞死の分析をＦＡＣＳによって実施した。フローサイトメトリ分析を、Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを有するＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）を使用して実行した。フローサイトメトリ分析の結果を図６に示す。
【０２０２】
これらのデータは、ヒトＩｇＭ及びＤＮＡに特異的に結合するＤＶＤ−Ｉｇ分子が一次ヒトＢ細胞を刺激して、ＴＬＲ９依存方式で増殖することができることを実証する。
実施例６：デオキシリボヌクレアーゼＩＩ−欠損マウスにおける自己反応性Ｂ細胞のＴＬＲ依存活性化
【０２０３】
ファゴリソソームエンドヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、及びＩ型ＩＦＮ、ＩＦＮａＲ１の受容体の両方の発現不能は、サイトゾルＤＮＡセンサー、ＳＴＩＮＧのアダプターに依存する機序を通して、炎症性関節炎の発症をもたらす。これらの二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスはまた、抗核自己抗体（ＡＮＡ）の産生及び脾腫を含む全身性自己免疫の他の兆候を発症する。過剰なレベルの未分解ＤＮＡの発生から予測され得るが、免疫蛍光染色パターンは、ＤＫＯマウスにおける自己抗体が、ＤＮＡ関連自己抗原ではなく、ＴＬＲ７優位ＳＬＥ傾向マウスにおいて一般に標的とされる、ＲＮＡ関連自己抗原を主に対象とすることを明らかにした。Ｕｎｃ９３ｂｒ−／−ＤＫＯマウスは、ＡＮＡを産生または脾腫を発症しないので、エンドソームＴＬＲは、ＤＫＯマウスの免疫活性化特性において重要な役割を果たしているに違いない。自己抗体産生におけるＴＬＲ９の役割をさらに調査するために、我々は、我々にＤＮＡ複合体を非ＴｇＢ細胞に誘導することを可能にするＩｇＭ及びＤＮＡに対して特異的な二機能的結合タンパク質を発展させた。これらのＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は、ＴＬＲ９依存機序を通して、Ｂ細胞を活性化する。ＤＫＯ  Ｂ細胞は、ＣｐＧ  ＯＤＮｓ及び抗ＩｇＭの両方への通常応答にもかかわらず、ＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子に応答することができなかった。したがって、デオキシリボヌクレアーゼＩＩの非存在で、Ｂ細胞は、ＤＮＡ関連自己抗原に応答することができない。
【０２０４】
（概要）
デオキシリボヌクレアーゼＩＩは、恒常性赤血球生成及びアポトーシスによって生成された細胞外ＤＮＡ破片の分解において重要な役割を果たすリソソームエンドヌクレアーゼである。マウスにおいて、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ欠損症は、Ｉ型ＩＦＮの過剰産生をもたらし、胎児期に致命的な貧血を引き起こす（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４９−５６）。機能的Ｉ型ＩＦＮ受容体を発現しないデオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスは、成人期まで生き残るが、抗核抗体（ＡＮＡ）の産生に関連する炎症性関節炎の形成を発症する（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：９９８−１００２）。ＳＴＩＮＧ欠損（Ｔｍｅｍ２３−／−）デオキシリボヌクレアーゼ２−／−マウスは関節炎の兆候を伴わずに成人期まで生き残るので、胚致死性及び関節炎の両方は、アダプター分子ＳＴＩＮＧに集中するサイトゾルＤＮＡセンサーに依存すると思われる（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：１９３８６−１９３９１）。
【０２０５】
自己抗体産生が自己抗原のアジュバント様活性に依存することが提唱された（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３−６０７、Ｂｕｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．１２：３７９−３８４、Ｐｌｏｔｚ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７３−７８）。ＳＬＥ及び関連する疾患との関連で、Ｂ細胞エンドソームＴｏｌｌ様受容体による内因性核酸関連自己抗原の検出は、ＡＮＡの産生に必要である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：４１７−４２８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４５２５−４５３２、Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１２０６１−１２０６６、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：１１７１−１１７７、Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３−６０７）。同じＴＬＲはまた、樹状細胞及び好中球の活性化において役割を果たす（Ｂｏｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１６３１−１６４０、Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：７３ｒａ２０、Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：８７５−８８５）。しかしながら、重要なＴＬＲダウンストリームシグナル伝達構成成分、ＭｙＤ８８及びＴＲＩＦを発現することができないマウスが、依然として関節炎を発症するので（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）、ＤＮＡセンサーＴＬＲ９またはＲＮＡセンサーＴＬＲ７のいずれも、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスにおける関節炎の発症に必要でない（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１９４３２−１９４３７）。興味深いことに、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスはまた、ＤＮＡに対する自己抗体を含む自己抗体を作製することが報告されたが（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、一方で、Ｔｍｅｍ２３−／−デオキシリボヌクレアーゼ２−／−マウスは、抗ＤＮＡ自己抗体（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）を作製することができないので、少なくとも１つの報告が、このモデルにおける抗ＤＮＡ抗体の産生がＳＴＩＮＧを必要とすることを提示した。それにもかかわらず、我々自身の予備自己抗原マイクロアレイデータは、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスが、核自己抗原の広大なパネルに対する抗体を作製し、このモデルにおける自己抗体産生がＵｎｃ９３Ｂ１、したがって、エンドソームＴＬＲの発現に依存することを示した（Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスによって産生された自己抗体の特異性をより良く理解するために、我々はここで、ＨＥｐ２細胞の蛍光免疫染色によるＡＮＡ反応性パターンのために血清を検査した。我々はまた、新規の二機能的自己抗体を開発して、ＤＮＡ  ＩＣに応答するデオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｂ細胞の能力を試験した。我々は、これらのマウスによって産生される抗核自己抗体のほとんどが、ｄｓＤＮＡではなくＲＮＡ関連自己抗原を対象とすることを見出した。さらに、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の欠乏は、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｂ細胞のＤＮＡへの応答不能と関連がある。
【０２０６】
マウス：ＲＦ及びＴｌｒ９−／−マウスは、以前に記載された（Ｕｃｃｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：５８７５−５８８４）。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのデオキシリボヌクレアーゼＩＩ欠損マウスは、親切にもＤｒ．Ｓ．Ｎａｇａｔａによって提供され、ＲＩＫＥＮ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得された。ＩＦＮγＲ１欠損及びＵｎｃ９３Ｂ１欠損マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから取得された。デオキシリボヌクレアーゼＩＩ−／−ＩｆｎａｒＩ＋／−（Ｈｅｔ）、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ−／−ＩｆｎａｒＩ−／−（ＤＫＯ）、及びデオキシリボヌクレアーゼＩＩ−／−ＩｆｎａｒＩ−／−Ｕｎｃ９３ｂＩ−／−（ＴＫＯ）はＵＭＭＳで飼育された。全てのマウスは、米国実験動物ケア認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）の規制に従ってマサチューセッツ医学部大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）の動物医学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で保持された。
【０２０７】
ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質：ＤＶＤ３７５４は、重鎖では配列番号５０及び軽鎖では配列番号５１を含む。ＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築する方法は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１２，１８１号及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９ｍＡｂｓ１：３３９−３４７の実施例に示される。可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）領域は、Ｉｇ−プライマーセットに基づいて少し修飾されたプライマーセットである（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ＃６９８３１−３）、ＶＨに対してはＮＬＨ５／ＮＬＨ３のオリゴ混合物、ＶＬに対してはＮＬＫ５／ＮＬＫ３のオリゴ混合物を使用して、その全容が参照により本明細書に組み込まれるマウス−抗ＤＮＡｍＡｂ（ＰＡ４）（Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  Ｍａｒ；２４（３）：７２３−３０）、及びその全容が参照により本明細書に組み込まれるラット抗マウスＩｇＭ  ｍＡｂ（Ｂ７−６）（Ｊｕｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８４  Ａｕｇ；１４（８）：７５３−７）を産生するハイブリドーマからＰＣＲクローニングさた。次いで、ＶＨ／ＶＬ  ＰＣＲ断片は、配列され、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中に発現され、標準タンパク質Ａを使用して精製され、かつハイブリドーマ誘導ｍＡｂと一緒に物理的（ＳＥＣ、ＭＳ）及び機能的に特性評価されたヒトＩｇＧ１定常領域を含有する哺乳動物発現プラスミド内にサブクローニングされた。次いで、各ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ配列を使用して、以前に記載した通り（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，２００９）ＤＶＤ−Ｉｇ分子を設計した。ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、合成され、発現され、さらなる特性評価のための均一性のために精製されたＩｇＧ１定常領域を含有する哺乳動物発現プラスミド内にサブクローニングされた。
【０２０８】
ＡＮＡ：ＨＥｐ−２ヒト組織培養基質スライドを、２時間室温で、５μｇ／ｍｌの抗ＤＮＡ−ＩｇＧ２ａまたはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質とともにインキュベートした。スライドを洗浄し、結合抗体を、Ａｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ヒト抗体またはＤｙＬｉｇｈｔ４８８ヤギ抗マウス抗体で検出した。
【０２０９】
ＩｇＭ結合ＥＬＩＳＡ：ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）タンパク質の滴定（１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ）を、マウスＩｇＭでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。結合抗体をビオチン化抗ヒトＩｇＧ及びストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。ＥＣ５０はＰｒｉｓｍ６を使用して滴定曲線から計算した。
【０２１０】
Ｂ２２０＋Ｂ細胞の増殖：Ｂ細胞を、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０コンジュゲート磁気粒子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して磁気ビーズ分離によって精製し、以前に記載した（Ｎｕｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．９４：８６５−８７５）通り、１５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＯＤＮ１８２６（ＣｐＧ；Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、抗ＤＮＡ−ｍＡｂ（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１６：６０３−６０７）、またはＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（１μｇ／ｍｌ）で、刺激した。Ｂ細胞増殖を、刺激後２４時間で３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）取込みによって評価した。長期間の増殖アッセイでは、Ｂ２２０精製Ｂ細胞を、２分間、ＰＢＳにおいて最終濃度２．５μΜのＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した。次いで、細胞を洗浄し、ＢＬｙＳ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で７２時間培養した。
【０２１１】
Ｂ細胞のＦＡＣＳ：多色フローサイトメトリ分析を、ＤＩＶＡ  ｓｏｆｔｗａｒｅを有するＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行した。分析をＦｌｏｗ  Ｊｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で実行した。未成熟及び成熟Ｂ細胞比率を、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ｂ２２０及びＡＰＣ−ＡＡ４．１（ｅＢｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して判定した。死細胞及び破片を前方散乱及び側方散乱によって排除した。増殖をＣＦＳＥ希釈によって評価した。細胞死を、２０ｎＭの最終濃度でＤＮＡ染色ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して確定した。
結果及び考察
デオキシリボヌクレアーゼＩＩ−／−ｘＩｆｎａｒ２−／−二重ノックアウトマウスにおける自己抗体産生は、エンドソームである。
【０２１２】
デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスは、固相ＥＬＩＳＡによって判断される通り、抗ＤＮＡ抗体を作製することが以前に報告された（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：９９８−１００２）。しかしながら、ＤＮＡは高荷電分子であり、直接結合アッセイは、多くの場合、相対的に非特異性相互作用を検出することができる。ＤＫＯマウスによって産生された自己抗体の自己抗原特異性をより良く理解するために、血清を、初期（２０〜２５週）及び後期（＞４０週）段階の疾患過程で収集し、ＨＥｐ−２細胞の蛍光免疫染色によって評価した。ｄｓＤＮＡまたは他のクロマチン構成成分と反応する自己抗体を示す有糸分裂プレートの描写に関連する均一核染色パターンが予測される。ほとんど全てのＤＫＯ血清がＡＮＡを作製するが、全く予想外に、初期出血からのほとんど８０％（２３中１８）の血清が顕著な核小体染色パターンを示した。初期の血清の残部は、追加の斑紋核、または細胞質染色（図７Ａ、７Ｂ）を示したが、どの血清も有糸分裂プレートを染色しなかった。それに反して、デオキシリボヌクレアーゼ＋／−ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）Ｉｆｎａｒ１−／−マウスからの全ての血清は、初期の時点で完全にＡＮＡ陰性であり、限られた数のみが、後期の時点で非常に弱い陽性となった。ＤＫＯマウスが歳をとるにつれ、染色パターンはより複雑になり、エピトープ拡散を示すが、依然として均一核（図７Ａ）ではなく斑紋核に分類される可能性が高く、さらに、我々は、ｄｓＤＮＡと反応する自己抗体だけあって、有糸分裂プレートを染色するいかなる血清も見出せなかった。抗核小体及び／または抗ＳｍＲＮＰ抗体は、ＴＬＲ７、ＲＮＡ特異性受容体が著しい役割を果たすＳＬＥ傾向マウスに一般に見出される（Ｂｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２００２．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｉｎ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ（−／−）ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９５：１１６７−１１７４）。全体的に見て、これらの結果は、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−ＤＫＯマウスによって産生される自己抗体がＲＮＡ関連自己抗原を主に認識することを示す。
【０２１３】
エンドリソソーム区画中に位置するＴＬＲ７及びＴＬＲ８の両方が、ＲＮＡ関連自己抗原と反応する自己抗体の検出に関与したが（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：１１７１−１１７７、Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：１６６９−１６７２、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：９９７０−９９７５）、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５などのＲＮＡセンサーは、サイトゾル中に存在し、潜在的に自己抗体産生にも貢献し得る。Ｕｎｃ９３Ｂ１は、リソソーム区画への核酸検知ＴＬＲの輸送に必要であるシャペロンタンパク質であり、機能的Ｕｎｃ９３Ｂ１の非存在下で、マウスは、全てのＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９リガンドに応答することができない（Ｔａｂｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１５６−１６４）。注目すべきことには、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｕｎｃ９３ｂ１−／−三重ノックアウト（ＴＫＯ）マウスは、蛍光免疫染色（図７Ａ）及び自己抗原マイクロアレイの両方によって判定されるが、ＡＮＡを作製することができない。したがって、ＳＴＩＮＧ依存関節炎モデルにおいてでさえ、エンドソームＴＬＲは、絶対的にＲＮＡ関連自己抗原を対象とするＡＮＡの精製に必要である。
【０２１４】
過剰なレベルのＤＮＡによって誘発される全身性自己免疫のモデルにおいて観察されるＲＮＡ−自己抗原バイアスが存在することが興味深かった。突出したＲＢＣ核及びアポトーシス断片の食作用が、ＴＬＲ９を含むエンドソームＴＬＲと関連する食区画中の核酸の初期の集積をもたらす可能性が高いので（Ｈｅｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３７：９８６−９９７）、エンドソームＴＬＲ活性化の兆候を見出したことは驚くべきことではなかった。それにもかかわらず、ＤＮＡの過剰な蓄積を考えると、より多くのＤＮＡ中心応答、及び核小体または斑紋核ではなく、均一核を有するＡＮＡの産生、染色パターンが存在することが予測された。ｄｓＤＮＡ反応性抗体の明らかな不在は、ＴＬＲ９シグナル伝達カスケードにおける機能的欠陥を指摘した。
ＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は、非遺伝子導入Ｂ細胞に対してＤＮＡ  ＩＣを標的とする
【０２１５】
初期の研究において、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−ＤＫＯ  Ｂ細胞は、通常、小分子ＣｐＧ  ＯＤＮベースＴＬＲ９リガンドに応答することが見出された。しかしながら、より多くの疾患関係ＤＮＡ関連自己抗原複合体を有するこれらの細胞を試験することが重要であった。自己ＩｇＧ２ａに対して特異的な導入遺伝子がコードされた低親和性ＢＣＲを発現するＢ細胞は、ＴＬＲ９に完全に依存する機序を通して、ハプテン特異性モノクローナル抗体ではなく、ＩｇＧ２ａ  ＤＮＡ反応性モノクローナル自己抗体によって活性化され得る（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１６：６０３−６０７）。これらのリウマチ因子（ＲＦ）Ｂ細胞は、自然形成免疫複合体（ＩＣ）に対する原型自己反応性Ｂ細胞応答者個体群の応答を検査するための実験的読み出しを提供する。しかしながら、これらの取組みは、正確なＢＣＲ導入遺伝子を発現する細胞に限定され、したがって、多重遺伝子を遺伝的に標的にしたマウスの評価は、適切なＲＦ重鎖及び軽鎖も発現する最適な突然変異を有するマウスを作り出すために関係する系統の広範な交雑を必要とした（Ｎｕｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．９４：８６５−８７５）。
【０２１６】
自己抗原ＩＣに対する遺伝子標的Ｂ細胞応答の分析を促進するために、ＤＮＡ及びＩｇＭ結合ドメインの両方を組み込み、したがって、ＤＮＡ関連ＩＣを、全てのＩｇＭを発現するＢ細胞に誘導する二機能的免疫グロブリンが開発された。これらの抗体の構築のために使用されたＤＮＡ結合ドメインは、ＴＬＲ９依存機序を通してＲＦ  Ｂ細胞を活性化するその能力のために選択されたＩｇＧ２ａ  ＤＮＡ反応性モノクローナル抗体に由来した。。我々が選択したプラットホーム、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質は、各Ｆａｂ中に２つの明らかに異なる可変ドメインを本質的に作り出すために、ヒト定常領域ドメインに接続された短いリンカーによって直列に融合された２つの抗体のＶＬ及びＶＨドメインを組み込む従来の抗体重鎖及び軽鎖を含む（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１２９０−１２９７）（図８Ａ）。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質は、Ｎ末端の結合ドメインのうちの１つのいずれか、及び２つのドメインの間の明らかに異なる長さのリンカーとともに構築され得る。両方のＶドメインの最適な結合活性を可能にする配向及びリンカー組み合わせは、Ｖドメイン組み合わせに応じて、変化し得る。ＩｇＭ及びＤＮＡ反応性の両方を発現したＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質を識別するために、５つの異なるリンカーと接続されたＮ末端のＩｇＭまたはＤＮＡ  Ｖドメインのいずれかを有する８つの異なるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質が、直接結合ＥＬＩＳＡによって判定されるようなＩｇＭと結合する能力及び免疫蛍光ＨＥｐ−２染色アッセイによって判定されるようなＤＮＡと結合する能力のために評価された。一般的に、Ｎ末端抗ＩｇＭドメインを有するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質は、より高い親和性を有すＩｇＭと結合するが、内部抗ＩｇＭドメインはまた機能的である（図８Ｂ）。それに反して、Ｎ末端抗ＤＮＡドメインを有するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質のみが、ＡＮＡによって陽性であり、染色の強度は、Ｖ１及びＶ２ドメインの間のリンカーに基づいて、この郡内で変化した（図８Ｃ）。ＩｇＭ及び／またはＤＮＡと反応するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質は、Ｂ細胞を活性化するその能力のためにアッセイされ、代表的なＤＶＤの応答の相対的レベルが３Ｈ−チミジン取込みによって評価された（図８Ｄ）。高いＡＮＡスコア及び中度のＩｇＭ結合親和性を有する１つの特定のＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質、ＤＶＤ３７５４は、残りのものより強くＢＡＬＢ／ｃ  Ｂ細胞を刺激した。
Ｂ細胞（Ｂ  Ｃｃｅｌｌｓ）のＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質活性化はＴＬＲ９依存である
【０２１７】
ＲＦ  Ｂ細胞を活性化するＩｇＧ２ａ  ｄｓＤＮＡ反応性自己抗体の能力は、おそらく破損したか、または死にかけている細胞から放出された内因性ＤＮＡに依存するこのアッセイシステムにおける実際のリガンドは特定されていないが、ＲＦ  Ｂ細胞応答は、外因性デオキシリボヌクレアーゼＩの存在下で、顕著に減少することが示され、Ｔｌｒ９−／−ＲＦ  Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａ  ＤＮＡ特異性ｍＡｂに応答できない（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１６：６０３−６０７）。ＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質をさらに特性評価するために、それらは、Ｔｌｒ９＋／＋及びＴｌｒ９−／−  ＲＦ  Ｔｇと非Ｔｇ  Ｂ細胞の両方を活性化するそれらの能力のために本来のＩｇＧ２ａ抗ＤＮＡ  ｍＡｂと直接比較された。以前に見出された通り、抗ＤＮＡ  ｍＡｂは、Ｔｌｒ９＋／＋  ＲＦ  Ｂ細胞のみを活性化した。それに反して、ＤＶＤ３７５４は、増殖するために、ＲＦ及び非Ｔｇ  ＢＡＬＢ／ｃ  Ｂ細胞の両方を誘導したが、ＲＦ  Ｔｌｒ９−／−またはＢＡＬＢ／ｃ  Ｔｌｒ９−／−Ｂ細胞は誘導せず、活性化のレベルは抗ＤＮＡ  ｍＡｂと同等であった（図９Ａ、Ｂ）。したがって、ポリクローナルＢ細胞のＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ３７５４活性化は、ＴＬＲ９依存であり、どの抗ＤＮＡ  ｍＡｂがＲＦ  Ｂ細胞を活性化するかによって機序を再現する。したがって、ＩｇＭ／ＤＮＡ  ＤＶＤ３７５４は、追加のＢＣＲ非Ｔｇ遺伝子標的系統のＤＮＡ応答を調べるために使用され得る。
Ｂ細胞のＤＶＤ３７５４  ＩＣ活性化はデオキシリボヌクレアーゼＩＩを必要とする
【０２１８】
関節炎を除いて、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−マウスは、非常に若い年齢でさえ広範な脾腫を発症する。この脾腫は、骨髄中の成熟ＲＢＣの次善の生成に起因する髄外造血に原因があった。骨髄マクロファージの、ＲＢＣ分化の最終段階の間に生成されたＲＢＣ核を分解する能力がないことに関係する間（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４３：９９８−１００２）。関節炎とは対照的に、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｔｍｅｍ２３−／−マウスが依然として脾腫を発症するので、脾腫は、ＳＴＦ  Ｇ依存経路によって誘発されない。しかしながら、これらのマウスは、細胞破片のクリアランスにおいて同等の問題、したがって、髄外造血の必要条件を有するべきであったにもかかわらず、脾腫は、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｕｎｃ９３ｂ１−／−ＴＫＯマウスにおいて著しく減少した（図１０Ａ）。それらの異なるサイズ、含有された同等の成熟濾胞性Ｂ細胞区画にもかかわらずＤＫＯ及びＴＫＯ脾臓の両方を保証するために、ＤＫＯ及びＴＫＯ脾臓Ｂ細胞を、Ｂ２２０及びＡＡ４．１の発現のために、フローサイトメトリによってデオキシリボヌクレアーゼ２＋／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｂ細胞と比較した。全ての３つの系統は、成熟と未成熟Ｂ細胞の相対的に同等の比率を含み（図１０Ｂ）、これらのＢ細胞は、ＣＤ６９またはＣＤ８６などのＢ細胞活性化マーカーを発現することができなかった（データ表示なし）。したがって、それらはＢＣＲ対象リガンドに同等に応答することが予測された。
【０２１９】
次いで、ＤＫＯ血清中のｄｓＤＮＡ特異性自己抗体の欠乏に取り組むために、ヘテロ接合性デオキシリボヌクレアーゼ２＋／−Ｉｆｎａｒ１−／−、ホモ接合性デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−ＤＫＯ、及びデオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｕｎｃ９３ｂ１−／−ＴＫＯＢ細胞を、抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２、小分子ＴＬＲ９リガンドＯＤＮ１８２６、及びＤＶＤ３７５４で刺激した。予測した通り、全ての３つの系統からの成熟Ｂ細胞は、抗ＩｇＭに同等に応答し、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−Ｕｎｃ９３ｂ１−／−ＴＫＯマウスは、小分子ＴＬＲリガンドならびにＤＶＤ３７５４の両方に応答することができなかった。予想外に、ＤＫＯ  Ｂ細胞はまた、ＯＤＮ１８２６への通常応答にもかかわらず、ＤＶＤ３７５４に応答することができなかった（図１０Ｃ）。デオキシリボヌクレアーゼＩＩは、貪食媒介ＤＮＡ分解において重要な役割を果たすことが以前に示されたが（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：１５４６−１５４９）、一方で、線虫において、死亡死骸の有効な分解は、本来のアポトーシス細胞、及び細胞死骸を貧食する食細胞の両方においてデオキシリボヌクレアーゼＩＩ相同体の発現を必要とする（Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｕｉｌｅｒａ（２００３）Ｇｅｎｅ  ３２２：１−１５）。ＤＶＤ３７５４に対するＤＫＯ  Ｂ細胞の応答不能は、分解においてデオキシリボヌクレアーゼＩＩが果たすＢ細胞の本来の役割を指摘し、したがって、内因性ＤＮＡ断片の検出は、ＢＣＲを通って伝達され、それによって、ｄｓＤＮＡと反応する抗体の不在を説明する。おそらく、ＴＬＲ９は、分解を必要としないＯＤＮ  １８２６に依然として応答するので、ＤＫＯ  Ｂ細胞において依然として機能的である。次いで、過剰な量の非分解ＤＮＡは、おそらく、ＲＮＡ−ならびにＲＮＡ関連自己抗原の両方を含有する細胞破片を適切に片付けるマクロファージまたは他の食細胞の能力を妨害し、それによって、ＲＮＡ反応性ＴＬＲに依存する機序を通して自己抗体の産生を誘発する。
【０２２０】
ＴＬＲ９は、自己免疫傾向マウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生に必要であるが、ＳＬＥ傾向Ｔｌｒ９−／−マウスは、常に、ＴＬＲ９が十分な同腹子よりも重度の臨床的疾患を発症する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２５：４１７−４２８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４５２５−４５３２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１２１１−１２１９）。ＴＬＲ９は、全身性自己免疫のトリガとして作用するアポトーシスまたは他の形態の細胞破片のクリアランスにおいて重要である防御抗体の産生に必要であることが提示された（Ｓｔｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７：２９５３−２９６５）。ＴＬＲ９の負の調節役割の別の考えられる説明は、ＴＬＲ７駆動Ｂ細胞応答が、ＲＮＡ関連自己抗原を対象とするＴＬＲ９依存自己抗体の同時発現によって本質的に制限され、明らかに異なる活性化経路またはＲＮＡ関連自己抗原を対象とする抗体の他の固有の特性のために単位病原性であることである。内因性ＴＬＲ９リガンドに対するデオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−ＤＫＯマウスの応答不能は、主にＲＮＡ駆動のＴＬＲ依存全身性自己免疫疾患のリストにこのモデルを加える。
【０２２１】
ＤＫＯマウスにおける関節炎の発症は、ＴＬＲ非依存であるが（Ｋａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０７：１９４３２−１９４３７）、我々のデータは、自己抗体産生におけるＴＬＲ７のＢ細胞発現を含意する。興味深いことに、脾腫は、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−  Ｕｎｃ９３ｂｒ１−／−ＴＫＯマウスにおいて著しく減少した。追加の交雑が、ＴＬＲ７または他のＵｎｃ９３Ｂ１依存ＴＬＲが、ＤＫＯマウスによって示される非関節炎造血性障害の要因であるかどうかを判定するために必要である。いずれの場合も、現在の研究は、デオキシリボヌクレアーゼ２−／−Ｉｆｎａｒ１−／−ＤＫＯの自己免疫及び炎症性特徴がＴＬＲ９ではなくＴＬＲを必要とすることを実証した。
参照による組み込み
【０２２２】
本出願全体にわたって引用され得る全ての引用された参照文献（文献参照、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、その中に引用された参照と同じように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。本開示は、別途指定されない限り、当該技術において周知の免疫学、分子生物学、及び細胞生物学の従来の技法を採用する。
【０２２３】
本開示はまた、分子生物学及び薬物送達の分野で周知の技法を参照によりそれらの全体を組み込んでいる。これらの技法は、以下の出版物に記載される技法を含むが、これらに限定されない。
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（４ｔｈ  Ｅｄ．１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．（ＩＳＢＮ  ０−４７１−３２９３８−Ｘ）、
ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＤＲＵＧ  ＢＩＯＡＶＡＩＬＡＢＩＬＩＴＹ，ＤＲＵＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ  ＤＥＳＩＧＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、
Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＣＲＹＳＴＡＬＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）、
Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）、
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ，ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１、
Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１）、
Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）．
【０２２４】
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、Ｌｕ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｄｓ．，ＣＬＯＮＩＮＧ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ．２９８ｐｐ．（ＩＳＢＮ  １−８８１２９９−２１−Ｘ）．
ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、
Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ：ＡＮ  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（３ｄ  Ｅｄ．１９８５）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｖ．２：４０９ｐｐ．（ＩＳＢＮ０−６３２−０１３１８−４）．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１−３．（ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）．
ＳＵＳＴＡＩＮＥＤ  ＡＮＤ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８
Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ：ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＧＥＮＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９８７）ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｏｒｓｔ  Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓ）．６３４ｐｐ．（ＩＳＢＮ０−８９５７３−６１４−４）。
【０２２５】
均等物
本開示は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本開示を限定するというよりはむしろ、全ての点において例示であると考えられるべきである。本開示の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲により示され、したがって、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内にある全ての変更は本明細書に包含されることが意図される。
【図１】
2016535765.tif 000010
【図２】
2016535765.tif 000011
【図３】
2016535765.tif 000012
【図４】
2016535765.tif 000013
【図５】
2016535765.tif 000014
【図６】
2016535765.tif 000015
【図７】
2016535765.tif 000016
【図８】
2016535765.tif 000017
【図９】
2016535765.tif 000018
【図１０】
2016535765.tif 000019
【配列表】
2016535765000001.app
【国際調査報告】
2016535765.tif 000020
2016535765.tif 000021
2016535765.tif 000022
2016535765.tif 000023