(57)【要約】  本発明は、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートならびにＥＦＮＡ４関連障害の検出、予防、および療法におけるそれらの使用を提供する。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、式中、ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＥＦＮＡ４結合断片であり；そしてＬ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物、好ましくはカリケアマイシンである。開示された抗体−薬物コンジュゲートのＡｂは、あらゆるＥＦＮＡ４結合抗体であることができる。本発明の一部の側面において、Ａｂは、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、もしくは組み換えヒト抗体、またはそのＥＦＮＡ４結合断片である。本発明の一部の側面において、Ａｂは、内在化抗体および／または中和抗体である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）
の抗体−薬物コンジュゲートであって、式中：
（ａ）ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり；そして
（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤはカリケアマイシンである、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂがキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、または組み換えヒト抗体である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが内在化抗体および／または中和抗体である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、以下：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域；または
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域；
を含む抗体と、ヒトＥＦＮＡ４への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合する、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３として示されている３個のＣＤＲを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として示されている３個のＣＤＲを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、以下：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、カッパ軽鎖定常領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９として示されている３個のＣＤＲを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として示されている３個のＣＤＲを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
請求項５または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１８に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１９に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
請求項２０に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、カッパ軽鎖定常領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
請求項２２に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
請求項４〜２４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または３９として示されている重鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
請求項４〜２５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該Ａｂが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７または５３として示されている軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１〜２６に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該薬物が、カリケアマイシンのＮ−アセチル誘導体である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
請求項２７に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該薬物が、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンである、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
請求項２８に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該薬物が、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
請求項１〜２９に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、該リンカーが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、１〜１２のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
式：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）
の抗体−薬物コンジュゲートであって、式中：
（ａ）Ａｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片であり；そして
（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物であり、ここで該リンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここで該薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
式：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）
の抗体−薬物コンジュゲートであって、式中：
（ａ）Ａｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片であり；そして
（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物であり、ここで該リンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここで該薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
複数の請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物であって、該組成物が、１〜１２の範囲内の平均ＤＡＲを有する、組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物であって、該組成物が、３〜５の範囲内の平均ＤＡＲを有する、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物であって、該組成物が、３〜４の範囲内の平均ＤＡＲを有する、組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組成物であって、該組成物が、４〜５の範囲内の平均ＤＡＲを有する、組成物。
【請求項３８】
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物が、約４の平均ＤＡＲを有する、組成物。
【請求項３９】
複数の請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物であって、該組成物が、少なくとも５０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する、組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組成物であって、該組成物が、少なくとも６０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する、組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の組成物であって、該組成物が、少なくとも７０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する、組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物であって、該組成物が、少なくとも７５％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する、組成物。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の組成物であって、該組成物が、約７０％〜８０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する、組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを生成するためのプロセスであって、以下の工程：
（ａ）該リンカーを薬物部分に連結し；
（ｂ）該リンカー−薬物部分を該抗体にコンジュゲートさせ；そして
（ｃ）該抗体−薬物コンジュゲートを精製する；
を含む、プロセス。
【請求項４５】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む、医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む療法上有効量の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、ＥＦＮＡ関連障害を処置する方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、該ＥＦＮＡ関連障害が過剰増殖障害である方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、該過剰増殖障害が新生物性障害である方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、該新生物性障害が固形腫瘍を含む方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、該新生物性障害が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、または肺癌である方法。
【請求項５１】
請求項４８に記載の方法であって、該新生物性障害が血液悪性疾患を含む方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、該血液悪性疾患が白血病である方法。
【請求項５３】
対象におけるＥＦＮＡ関連障害の処置のための医薬品の製造における、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用。
【請求項５４】
請求項５３に記載の使用であって、該ＥＦＮＡ関連障害が過剰増殖障害である使用。
【請求項５５】
請求項５４に記載の使用であって、該過剰増殖障害が新生物性障害である使用。
【請求項５６】
請求項５５に記載の使用であって、該新生物性障害が固形腫瘍を含む使用。
【請求項５７】
請求項５６に記載の使用であって、該新生物性障害が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、または肺癌である使用。
【請求項５８】
請求項５５に記載の使用であって、該新生物性障害が血液悪性疾患を含む使用。
【請求項５９】
請求項５８に記載の使用であって、該血液悪性疾患が白血病である使用。
【請求項６０】
対象におけるＥＦＮＡ関連障害の処置における使用のための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６１】
請求項６０に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該ＥＦＮＡ関連障害が過剰増殖障害である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６２】
請求項６１に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該過剰増殖障害が新生物性障害である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６３】
請求項６２に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該新生物性障害が固形腫瘍を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６４】
請求項６３に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該新生物性障害が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、または肺癌である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６５】
請求項６２に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該新生物性障害が血液悪性疾患を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６６】
請求項６５に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲートであって、該血液悪性疾患が白血病である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６７】
腫瘍細胞集団において腫瘍開始細胞を低減する方法であって、該方法が、腫瘍細胞集団をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含み、ここで該集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含み；それにより、該腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞の頻度が低減する方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、該接触がインビボで実施される方法。
【請求項６９】
請求項６７に記載の方法であって、該接触がインビトロで実施される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２０１３年１１月４日に出願された仮米国出願第６１／８９９，８００号に対して優先権が主張され、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０００２】
配列リスト
この出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列リストを含む。．ｔｘｔファイルは、２０１３年１１月１日に作成された、５６ＫＢの大きさを有する“ＰＣ７２００５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ”と題された配列リストを含有する。この．ｔｘｔファイルに含有される配列リストは、本明細書の一部であり、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０００３】
本発明は、エフリン−Ａ４リガンド（ＥＦＮＡ４）抗体および抗体−薬物コンジュゲートに関する。本発明はさらに、癌の処置のためにそのような抗体および抗体−薬物コンジュゲートを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
受容体チロシンキナーゼの最大のファミリーであるエフリン受容体（ＥＰＨ）は、エフリンリガンド（ＥＦＮ）に結合するＩ型膜貫通タンパク質である。ＥＰＨサブファミリー中の受容体は、典型的には、単一のキナーゼドメインならびにＣｙｓリッチドメインおよび２個のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含有する細胞外領域を有する。配列分析に基づいて、エフリンリガンドは、２つの群中に分けられ得る：エフリン−Ａリガンド（ＥＦＮＡ）および３種類のエフリン−Ｂリガンド（ＥＦＮＢ）。ＥＦＮＡリガンド（すなわち、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ４、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６）は、典型的にはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を介して細胞表面にアンカーされているが、一部のＧＰＩアンカーされていないタンパク質が、エフリンｍＲＮＡ、例えばＥＦＮＡ４のオルタナティブスプライシングにより生成される。ＥＦＮＢリガンド（すなわちＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３）は、膜貫通ドメインならびに保存されたチロシン残基およびＰＤＺ結合モチーフを有する短い細胞質領域を含有する。ＥＦＮＡリガンドは、９種類の異なるエフリンＡ受容体（ＥＰＨＡ）（すなわちＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９）の全てと優先的に結合し、一方でＥＦＮＢリガンドは、６種類の異なるエフリンＢ受容体（ＥＰＨＢ）（すなわちＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）の全てと優先的に結合するが、一部の交差相互作用が報告されている。
【０００５】
ＥＦＮ−ＥＰＨシグナル伝達は、２方向性（リガンド発現細胞および受容体発現細胞の両方に影響を及ぼす）である可能性があり、神経発達、細胞パターン形成、血管新生、ならびに細胞の運動性および侵入を含む広い範囲の生物学的活動を制御している。癌の状況において、様々なＥＰＨおよびＥＦＮの発現が観察されており、様々な機能が報告されてきた(Hafner et al., Clinical Chemistry 50(3):490-499, 2004; Surawska et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 15(6):419-433, 2004; Pasquale, E.B, Nature Reviews Cancer 10(3):165-180, 2010)。リガンド−受容体結合の乱雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）ならびに機能的重複のため、それぞれのＥＦＮおよびＥＰＨの役割を正確に定めるのが困難であった。癌の処置のためのＥＰＨ受容体の療法的標的化が探求されてきたが、ＥＦＮリガンドの標的化が大きな程度まで追求されたことは一切ない(Pasquale, E.B., Nature Reviews Cancer 10(3):165-180, 2010)。
【０００６】
癌に関する追加の療法選択肢に関する重要な必要性が残っている。この目的のため、本発明は、ＥＦＮＡ４陽性癌を標的とする新規の抗体−薬物コンジュゲートを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hafner et al., Clinical Chemistry 50(3):490-499, 2004
【非特許文献２】Surawska et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 15(6):419-433, 2004
【非特許文献３】Pasquale, E.B, Nature Reviews Cancer 10(3):165-180, 2010
【非特許文献４】Pasquale, E.B., Nature Reviews Cancer 10(3):165-180, 2010
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートならびにＥＦＮＡ４関連障害の検出、予防、および療法におけるそれらの使用を提供する。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、式中、ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＥＦＮＡ４結合断片であり；Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。開示された抗体−薬物コンジュゲートのＡｂは、あらゆるＥＦＮＡ４結合抗体であることができる。本発明の一部の側面において、Ａｂは、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、もしくは組み換えヒト抗体、またはそのＥＦＮＡ４結合断片である。本発明の一部の側面において、Ａｂは、内在化抗体および／または中和抗体である。
【０００９】
本発明は、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートならびにＥＦＮＡ４関連障害の検出、予防、および療法におけるそれらの使用も提供する。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、式中、ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＥＦＮＡ４結合断片であり；Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤはカリケアマイシンである。
【００１０】
本発明の特定の側面において、Ａｂは、ｈｕＥ２２もしくはｈｕ４７抗体、またはヒトＥＦＮＡ４への結合に関してｈｕＥ２２もしくはｈｕＥ４７と競合する抗体、および／またはｈｕＥ２２もしくはｈｕＥ４７抗体と同じエピトープに結合する抗体である。例えば、Ａｂは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域；または（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域を含む抗体と、ヒトＥＦＮＡ４への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合することができる。
【００１１】
ヒトＥＦＮＡ４への結合に関してｈｕＥ２２と競合する、および／またはｈｕＥ２２と同じエピトープに結合するＡｂの中で、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用な代表的なＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３により定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む。
【００１２】
本発明の他のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートにおいて、Ａｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
ヒトＥＦＮＡ４への結合に関してｈｕＥ４７と競合する、および／またはｈｕＥ４７と同じエピトープに結合するＡｂの中で、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用な代表的なＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９により定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む。
【００１４】
本発明の他のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートにおいて、Ａｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域を含む。
【００１５】
本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＩｇＧ１重鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、またはＩｇＧ１重鎖定常領域およびカッパ軽鎖定常領域を含むＡｂを含む。例えば、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用なＡｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む抗体を含む。追加の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含む抗体を含む。
【００１６】
本発明の他の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または３９として示されている重鎖可変領域を有する抗体を含む。本発明の他の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７または５３として示されている軽鎖可変領域を有する抗体を含む。
【００１７】
本発明の特定の側面において、Ａｂは、ｈｕＥ５もしくはｈｕ１５抗体、またはヒトＥＦＮＡ４への結合に関してｈｕＥ５もしくはｈｕＥ１５と競合する抗体、および／またはｈｕＥ５もしくはｈｕＥ１５抗体と同じエピトープに結合する抗体である。例えば、Ａｂは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として示されている軽鎖可変領域；または（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として示されている軽鎖可変領域を含む抗体と、ヒトＥＦＮＡ４への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合することができる。
【００１８】
本発明の別の側面において、Ａｂは、ヒト化抗体、例えばｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２またはｈｕ４７抗体である。
【００１９】
本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの全てが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を含むリンカーを用いて調製されることができる。
【００２０】
本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの全てが、カリケアマイシンのＮ−アセチル誘導体、例えばＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンおよびＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）を含め、カリケアマイシン薬物を用いて調製されることができる。
【００２１】
本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの全てが、１〜１２の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有することができる。本発明の特定の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここで、薬物は、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。
【００２２】
本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここで、薬物は、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。
【００２３】
本発明は、複数の本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、１〜１２の範囲内の平均ＤＡＲを有する。本発明の特定の側面において、組成物は、３〜５の範囲内の平均ＤＡＲを有することができる。本発明の別の側面において、組成物は、３〜４の範囲内の平均ＤＡＲを有することができる。本発明の別の側面において、組成物は、４〜５の範囲内の平均ＤＡＲを有することができる。本発明の別の側面において、組成物は、約４の平均ＤＡＲを有することができる。
【００２４】
本発明は、さらに、複数の本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも５０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。本発明の別の側面において、組成物は、少なくとも６０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。本発明の別の側面において、組成物は、少なくとも７０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。本発明の別の側面において、組成物は、少なくとも７５％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。本発明の別の側面において、組成物は、約７０％〜８０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。
【００２５】
本発明は、さらに、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＥＦＮＡ４結合断片であり；Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはｖｃまたはｍｃであり、そしてＤは薬物である。
【００２６】
本発明は、さらに、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、ＡｂはＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＥＦＮＡ４結合断片であり；Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは０１０１または８２６１である。
【００２７】
本発明は、さらに、本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製するための方法を提供する。例えば、抗体−薬物コンジュゲートを生成するためのプロセスは、以下の工程を含むことができる：（ａ）リンカーを薬物部分に連結し；（ｂ）リンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートさせ；そして（ｃ）抗体−薬物コンジュゲートを精製する。
【００２８】
本発明の別の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートを作製する方法、それを調製する方法、その合成の方法、そのコンジュゲーションの方法、およびその精製の方法、ならびに本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートの調製、合成、およびコンジュゲーションのための中間体を含む。
【００２９】
本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物が、さらに提供される。
【００３０】
他の側面において、本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを含む療法上有効量の組成物を投与することによりＥＦＮＡ関連障害を処置する方法が、提供される。代表的なＥＦＮＡ関連障害は、過剰増殖障害、例えば新生物性障害、例えば固形腫瘍（例えば、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌等）および血液悪性疾患（例えば白血病等）を含む。対象におけるＥＦＮＡ関連障害を処置するための医薬品の製造のための開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの使用も、提供される。ＥＦＮＡ関連障害の処置における使用のためのＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートも、提供される。
【００３１】
他の側面において、本発明は、本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを含む療法上有効量の組成物および化学療法剤を投与することにより対象におけるＥＦＮＡ関連障害を処置する方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートにより患者におけるＥＦＮＡ４の過剰発現を特徴とする障害を処置する方法を含む。他の側面において、本発明は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートにより患者におけるＥＦＮＡ４の過剰発現を特徴とする癌を処置する方法を提供する。
【００３３】
さらに他の側面において、本発明は、腫瘍細胞集団において腫瘍開始細胞を低減する方法を提供する。例えば、その方法は、腫瘍細胞集団をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含むことができ、ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含み；それにより、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞の頻度が低減する。接触工程は、インビトロまたはインビボで実施されることができる。
【００３４】
本発明の別の側面は、本明細書で開示される化合物および組成物に関する診断的および療法的使用を含む。
【００３５】
本発明の他の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲート、容器、および処置を示す添付文書またはラベルを含む製品、すなわちキットを含む。
【００３６】
本発明のこれらの側面および他の側面は、本出願の全体としての概観により理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、アミノ酸の違いを示すヒトＥＦＮＡ４のａ、ｂおよびｃイソ型の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４）のアラインメントを提供する。
【図２】図２は、ＥＦＮＡ４抗体の（ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた）遺伝子配置ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を提供する。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７抗体に関する結合データを提供して、ＥＦＮＡ４に関する結合特異性を図説する。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＡｃＢｕｔ−ＣＭおよび抗体（Ｘ）にコンジュゲートしたＡｃＢｕｔ−ＣＭの構造を提供する。
【図５】図５は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析を提供する。
【図６】図６は、未コンジュゲート抗体の存在に関するＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ上での精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＵＰＬＣ−ＨＩＣ分析を提供する。
【図７】図７は、凝集体および２量体の存在に関するＢＥＨ２００  ＳＥＣ上での精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析を提供する。
【図８】図８は、遊離薬物の存在に関するＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−ＣＮ上での精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの逆相分析を提供する。
【図９】図９は、ＤＡＲ分布プロフィールに関するｉＣＥ２８０上での精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのｃＩＥＦ分析を提供する。
【図１０】図１０は、多数回の凍結融解のｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの安定性に対する作用を提供する。
【図１１】図１１は、Ｂｒｅａｓｔ−５（ＢＲ５）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１２】図１２は、Ｂｒｅａｓｔ−１３（ＢＲ１３）ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１３】図１３は、Ｂｒｅａｓｔ−２２（ＢＲ２２）ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１４】図１４は、Ｂｒｅａｓｔ−３１（ＢＲ３１）ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１５】図１５は、Ｏｖａｒｉａｎ−４５（ＯＶ４５）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１６】図１６は、Ｏｖａｒｉａｎ−５５（ＯＶ５５）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１７】図１７は、Ｏｖａｒｉａｎ−４４（ＯＶ４４）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１８】図１８は、Ｏｖａｒｉａｎ−６３（ＯＶ６３）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【図１９】図１９は、ＢＲ２２  ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおける、微小管阻害剤（ＭＴＩ）ｖｃ０１０１およびｍｃ８２６１にコンジュゲートしたｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の有効性を示す。
【図２０】図２０は、ＢＲ３１  ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおける、ＭＴＩ  ｖｃ０１０１にコンジュゲートしたｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の有効性を示す。
【図２１】図２１は、ＥＦＮＡ４を発現している２９３Ｔ細胞におけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのインビトロ細胞毒性（白い菱形）を、対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣ（斜線付きの丸）と対比して示す。
【図２２】図２２は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに曝露したＢＲ５  ＴＮＢＣ  ＰＤＸ腫瘍の抗ｈＩｇＧ１抗体（斜線付きの丸）および抗ｙ−−Ｈ２Ａ．Ｘ抗体（白い菱形）を用いた免疫組織化学を示す。
【図２３】図２３は、分離されたＢＲ２２  ＴＮＢＣ  ＰＤＸ腫瘍から単離されたＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋（斜線付きの丸）またはＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４−（白丸）細胞を移植されたマウスに関する腫瘍成長曲線を示す。
【図２４】図２４は、分離されたＢＲ３１  ＴＮＢＣ  ＰＤＸ腫瘍から単離されたＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋（斜線付きの丸）またはＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４−（白丸）細胞を移植されたマウスに関する腫瘍成長曲線を示す。
【図２５】図２５は、ＴＣＧＡデータを用いた、正常な隣接する乳房、ＴＮＢＣ、非ＴＮＢＣ乳房におけるＥＦＮＡ４  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図２６】図２６は、ＴＣＧＡおよびＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットからの乳癌腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示す。
【図２７】図２７は、ＴＣＧＡおよびＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットからの卵巣癌腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示す。
【図２８】図２８は、ＴＣＧＡおよびＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットからの肝細胞癌（ＨＣＣ）腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示す。
【図２９】図２９は、４ｍ／ｍおよび６ｍ／ｍのＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂの比率から生成された精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣに関する分析的ＨＩＣの比較を示す。
【図３０】図３０は、４ｍ／ｍおよび６ｍ／ｍのＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂの比率から生成された精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣに関する分析的ＨＩＣのさらなる比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、エフリン−Ａリガンド（またはＥＦＮＡ）、例えばＥＦＮＡ４に結合する抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本発明は、ＥＦＮＡ４抗体、リンカー、および薬物を用いてコンジュゲートを調製するためのプロセスも提供する。本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、ＥＦＮＡ４発現を特徴とする過剰増殖障害の診断、予防、および／または処置において用いられることができる組成物、例えば医薬品の調製および製造に関して有用である。本発明の一部の側面において、開示される抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の頻度を低減することができ、それは腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）および高増殖性腫瘍始原細胞（Ｔｐｒｏｇ）を包含する。
【００３９】
Ｉ．ＥＦＮＡの生理学
ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１８５４７号は、全ての細胞表面受容体−リガンド相互作用と同様に、エフリン受容体（ＥＰＨ）のエフリンリガンド（ＥＦＮ）による会合は、最終的に結果として細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらすことを記載している。受容体−リガンド相互作用は、同じ細胞の表面上の分子間（シス相互作用）で起こり得るが、一般に、シス相互作用はシグナル伝達カスケードの誘発につながらない、またはシス相互作用は実際には（例えば別々の細胞上の受容体およびリガンドの間の）トランス相互作用により開始されたシグナル伝達カスケードに拮抗し得ると考えられている。ＥＰＨ−ＥＦＮトランス相互作用の一側面は、受容体−リガンド会合における２種類のシグナル伝達カスケード−ＥＰＨを発現している細胞における順方向シグナル伝達カスケード、およびＥＦＮを発現している細胞における逆方向シグナル伝達カスケードの誘発に関する能力である。２つの別々のシグナル伝達カスケードの活性化は、ＥＰＨおよびＥＦＮが動物の胚発生において協調するように進化してきた細胞選別および細胞配置プロセスを反映している可能性がある。
【００４０】
ＥＰＨ−ＥＦＮシグナル伝達は、細胞骨格の動態を制御し、異なるタイプの細胞間の接着および反発相互作用の調節をもたらす細胞シグナル伝達経路を頻繁に活性化する。一般に、ＥＰＨおよびＥＦＮタンパク質は、胚形成の間に、成体の組織で観察されるレベルに対してはるかに高いレベルで存在するが、成体における継続した低レベル発現は、分化している細胞の陰窩中の組織幹細胞におけるそれらの源から腸管腔に面する絨毛の表面におけるそれらの最終的な位置への移動から生じる十分に定められた構造を有する成人の腸のような組織の正常な機能におけるこれらの分子に関する役割を反映している可能性がある。ＥＰＨは肝細胞癌において最初に同定され、そしてＥＰＨおよびＥＦＮ発現は典型的には成体では限られているため、ヒトの癌におけるＥＦＮおよび／またはＥＰＨの発現の再活性化は、癌細胞の脱分化および／またはこれらの癌細胞の周囲の正常な組織に浸潤して原発腫瘍の部位から遠い位置へと移動する能力につながっている可能性がある。他の研究は、ＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用は、血管新生における役割も有することを示唆してきた。
【００４１】
非リンパ系組織におけるＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用は、インテグリンおよび細胞骨格の再配置により細胞間の接着または反発力を生成することにより細胞相互作用を制御するという発見と一致して、リンパ細胞上にあるＥＰＨおよびＥＦＮ分子は、細胞外マトリックス構成要素への細胞接着、走化性および細胞移動を媒介することが示されている。例えば、ＥＦＮＡ１（ＥＰＨＡ２受容体に結合し、例えばＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００４４２８におけるようなアミノ酸配列を含む）の一次ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞上での会合は、細胞移動を刺激し、走化性を増進することが分かっている。ＥＦＮＡ１と同様に、ＥＦＮＡ４は、一次ＣＤ４  Ｔ細胞上で発現されているが、ＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用の乱雑性のため、ＥＦＮＡ４の会合がこれらの細胞において類似の作用を有するのかどうかは不明である。しかし、成熟したヒトＢリンパ球がＥＦＮＡ４を発現しており、活性化においてそれを分泌することが、実証されている。さらに、ＥＦＮＡ４は、あらゆる他のＥＦＮまたはＥＰＨ分子とは異なり、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者のＢ細胞上でも、またはそれによっても一貫して発現されている。興味深いことに、ＥＦＮＡ４イソ型の発現は、Ｑ−ＰＣＲにより測定された際に、障害の臨床徴候と相関している可能性がある。また、ＥＦＮＡ４の増大した発現を有することが既知であるＣＬＬ患者からのＢ細胞は、健康な人からのＢ細胞と比較して、経内皮移動能力における欠陥を示した。明らかに、ＥＦＮＡ４の会合は、ＣＬＬ細胞の細胞外マトリックス分子に接着する能力を低減し、それらのＣＣＬ１に対する走化性反応を低減した。一緒に、これらの報告は、ＢおよびＴ細胞の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）におけるＥＦＮＡ４に関する役割を示唆しており、上記で論じられた細胞内シグナル伝達データと組み合わせて見た場合、ＥＦＮＡ、特にＥＦＮＡ４を、抗癌療法の開発のための非常に興味深い標的にしている。
【００４２】
加えて、ＥＦＮＡ４の発現は、様々な癌幹細胞集団において高められている。バルク腫瘍（ｂｕｌｋ  ｔｕｍｏｒ）におけるいくつかのＥＰＨＡ受容体の同時上方制御と合わせて、これは、ＥＦＮＡ４に媒介されるリガンド−受容体相互作用が、腫瘍増殖、血管新生および／または腫瘍転移につながる細胞シグナル伝達カスケードを誘発し得るという可能性を高めている。特定の理論により束縛されることを望むわけでは一切ないが、本発明のＥＦＮＡ４抗体およびＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも部分的に、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の頻度を低減もしくは排除し、それにより伝統的な標準治療（ＳＯＣ）療法計画（例えばドキソルビシンおよびイリノテカン）とは異なる様式で腫瘍の伝播もしくは生存を妨げることによるか、または免疫療法的シグナル伝達もしくはＥＦＮＡ４発現細胞を殺すことができるペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の送達によるかのどちらかで作用すると信じられる。実施例８および９を参照。
【００４３】
代表的なＥＦＮＡ４タンパク質オルソログは、ヒト（ＮＰ＿００５２１８、ＮＰ＿８７２６３１またはＮＰ＿８７２６３２）、マウス（ＮＰ＿０３１９３６）、チンパンジー（ＸＰ＿００１１５３０９５、ＸＰ＿００１１５２９７１、ＸＰ＿５２４８９３、およびＸＰ＿００１１５２９１６）およびラット（ＮＰ＿００１１０１１６２）を含むが、それらに限定されない。転写されるヒトＥＦＮＡ４遺伝子は、染色体１からの最低でも５８１７ｂｐを含む。
【００４４】
３種類のヒトＥＦＮＡ４  ｍＲＮＡ転写産物バリアントおよびコードされるタンパク質が、表１において示されており、そのそれぞれは、転写されるＲＮＡのオルタナティブスプライシングから生じる：（１）２０１アミノ酸のプロタンパク質（ＮＰ＿００５２１８；ＥＦＮＡ４イソ型ａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードする１２７６塩基対のバリアント（ＮＭ＿００５２２７；ＥＦＮＡ４転写産物バリアント１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；（２）２０７アミノ酸のプロタンパク質（ＮＰ＿８７２６３１；ＥＦＮＡ４イソ型ｂ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）をコードする１１１０塩基対のバリアント（ＮＭ＿１８２６８９；ＥＦＮＡ４転写産物バリアント２）；および（３）１９３アミノ酸のプロタンパク質（ＮＰ＿８７２６３２；ＥＦＮＡ４イソ型ｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をコードする１１１１塩基対のバリアント（ＮＭ＿１８２６９０；ＥＦＮＡ４転写産物バリアント３）
【００４５】
【表１】
2016540826.tif 000002
【００４６】
ヒトＥＦＮＡ４タンパク質のそれぞれは、タンパク質の成熟形態（すなわち長さ１６８〜１８２ａａ）を提供するために切り落とされる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜２５を含む、予測されるシグナルまたはリーダー配列を含むことは、理解されるであろう。このシグナルペプチドは、そのポリペプチドを、細胞表面／分泌経路へと標的化する。シグナルペプチド、リーダーペプチドとも呼ばれる用語“シグナル配列”は、タンパク質が分泌される（細胞膜を通過する）ことを可能にするタンパク質のＮ末端にある約１５〜３０アミノ酸の区間を指す。シグナル配列は、タンパク質が分泌される際に除去される。結果としてタンパク質コード配列に作用するｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングにより、タンパク質のイソ型は、細胞により異なるように処理される。イソ型ａは、膜に局在し、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合により細胞表面にアンカーされているが、イソ型ｂおよびｃは、ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠いており、従って細胞により分泌されることが予想される。ヒトＥＦＮＡ４の３種類のタンパク質イソ型のアラインメントが、図１において示されている。前に示されたように、別途直接的な言及または文脈的な必要性により示されない限り、用語ＥＦＮＡ４は、ヒトＥＦＮＡ４のイソ型ａおよび免疫反応均等物に向けられているものとする。さらに、その用語は、それに抗体または免疫反応断片が特異的に結合することができるエピトープを含有するＥＦＮＡ４の天然またはバリアント形態の誘導体または断片も指し得ることは、理解されるであろう。
【００４７】
ＩＩ．ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート
本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、（ａ）Ａｂは、ＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、そして（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。Ｅｐｈ受容体シグナル伝達を阻害するために開発されたＴＫＩとは対照的に、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、例えば抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣは、特異的な表面分子およびそれらを発現している細胞を、それらのシグナル伝達機能にかかわらず、その分子が効率的に内在化する限り、標的とすることができる。そのような抗体−薬物コンジュゲートを調製および製造する方法、ならびにその同じ物の臨床適用における使用も、提供される。“抗体−薬物コンジュゲート”または“ＡＤＣ”は、ＥＦＮＡ４に結合する抗体誘導体を含む抗体またはその抗原結合断片を指し、本明細書において下記でさらに記載されるように、薬物、例えば細胞毒性、細胞増殖抑制、および／または療法剤にコンジュゲートされている。例えば、細胞毒性剤は、細胞毒性剤の腫瘍（例えばＥＦＮＡ４発現腫瘍）への標的化された局所送達のために、本明細書で記載されるように抗ＥＦＮＡ４抗体に連結またはコンジュゲートされることができる。
【００４８】
本明細書で用いられる際、用語“ＥＦＮＡ４”は、バリアント、イソ型、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。ＥＦＮＡ４は、当該技術において、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ４リガンド、ＥＰＨ−関連受容体チロシンキナーゼリガンド４、Ｅｐｈ関連キナーゼ４のリガンド、ＥＦＬ４、ＥＰＬＧ４およびＬＥＲＫ４としても知られている。本発明の一部の側面において、抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、ヒト以外の種からのＥＦＮＡ４、例えばマウス、ラット、または霊長類のＥＦＮＡ４、ならびにＥＦＮＡ４の異なる形態（例えばグリコシル化されたＥＦＮＡ４）と交差反応する。他の側面において、抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、ヒトＥＦＮＡ４に完全に特異的であることができ、種または他のタイプの交差反応性を示さない可能性がある。本明細書で用いられる際、用語ＥＦＮＡ４は、別途文脈的に指示されない限り、天然存在のヒトＥＦＮＡ４を指す。従って、“ＥＦＮＡ４抗体”、“抗ＥＦＮＡ４抗体”、“エフリン−Ａ４抗体”もしくは“エフリン−Ａ４リガンド抗体”または他の類似の名称は、ＥＦＮＡ４型リガンドもしくはイソ型、またはその断片もしくは誘導体と会合する、結合する、または反応する（本明細書で定義されるような）あらゆる抗体を意味する。さらに、“ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート”、“抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート”、“エフリン−Ａ４抗体−薬物コンジュゲート”または“エフリン−Ａ４リガンド抗体−薬物コンジュゲート”は、ＥＦＮＡ４型リガンドもしくはイソ型、またはその断片もしくは誘導体と会合する、結合する、または反応する（本明細書で定義されるような）あらゆる抗体−薬物コンジュゲートまたはＡＤＣを意味する。
【００４９】
“リンカー（Ｌ）”は、抗体の薬物への直接または間接的連結を記載する。リンカーの抗体への結合は、様々な方法で、例えば表面のリジン、酸化された炭水化物への還元カップリングにより、そして鎖間ジスルフィド結合を還元することにより遊離したシステイン残基により成し遂げられることができる。ヒドラゾン連結、ジスルフィド連結、およびペプチドベースの連結を含む様々なＡＤＣ連結系が、当該技術で既知である。
【００５０】
“薬物（Ｄ）”は、生物学的活性または検出可能な活性を有するあらゆる物質、例えば、療法剤、検出可能な標識、結合剤等、およびインビボで代謝されて有効薬剤になるプロドラッグである。薬物、ペイロードおよび化合物という用語は、互換的に用いられている。
【００５１】
“Ｌ−Ｄ”は、リンカー（Ｌ）に連結された薬物（Ｄ）の結果生じるリンカー−薬物部分である。
【００５２】
本発明と関連して用いられている追加の科学用語および技術用語は、本明細書で別途示されない限り、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、別途文脈により要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して用いられている命名法およびその技法は、当該技術で周知であり、一般的に用いられている命名法および技法である。
【００５３】
本発明の特定の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域を含む抗体（Ａｂ）、またはその抗原結合断片；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分（Ｌ−Ｄ）を含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここでその薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。本発明の他の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域を有する抗体（Ａｂ）、またはその抗原結合断片；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分（Ｌ−Ｄ）を含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここでその薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。
【００５４】
本発明の特定の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖を含む抗体（Ａｂ）、またはその抗原結合断片；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分（Ｌ−Ｄ）を含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここでその薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。本発明の他の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を有する抗体（Ａｂ）、またはその抗原結合断片；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分（Ｌ−Ｄ）を含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーは４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、かつここでその薬物はＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）である。
【００５５】
本発明はさらに、最適化された平均ＤＡＲおよび狭いＤＡＲ分布を有する抗体−薬物コンジュゲートを提供する。下記の節ＩＩＣ薬物におけるさらなる記載を参照。平均ＤＡＲおよびＤＡＲ分布は、ＡＤＣの臨床有効性への作用、特にＡＤＣの効力および潜在的な毒性の両方への作用を有する可能性があり、ＡＤＣの特性、例えば安定性および凝集への重要な作用を有する可能性がある。
【００５６】
抗体あたりのコンジュゲートした薬物分子の数を示すＤＡＲ（薬物対抗体比）または薬物装填（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ）は、１〜１２であることができる。複数の抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、様々な従来の手段、例えば紫外線分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣにより決定されることができる。
【００５７】
ＤＡＲ分布は、ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物中に存在し得る様々なＡＤＣ種のパーセントまたは割合（例えばＤＡＲ１〜１２）を提供する。ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、当該技術で既知の方法、例えばキャピラリー等電点分画法（ｃＩＥＦ）により決定されることができる。ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般にＤＡＲ１〜１２を有する広い範囲のＡＤＣ種を含有する広いＤＡＲ分布を有する高度に不均質な混合物として特性付けられることができる。ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般に特定のＤＡＲ、例えばＤＡＲ３〜５を有する狭い範囲のＡＤＣ種を含有する狭いＤＡＲ分布を有する高度に均質な混合物として特性付けられることができる。
【００５８】
本発明の特定の側面において、本明細書で開示される向上したコンジュゲーションおよび精製条件は、約３〜５の範囲、好ましくは約４の最適化された平均ＤＡＲ、および狭いＤＡＲ分布、例えば、（最も望ましい）３〜５のＤＡＲを有する種が総抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣの少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または約７０％〜８０％、または好ましくは約７５％〜８０％を構成する、より低い不均質性を有する抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣを提供する。図９参照。
【００５９】
本発明の特定の側面において、コンジュゲーションおよび精製の間に、疎水性がより大きくより早いクリアランスを示し、より高い毒性に寄与して療法指数（ＴＩ）を低下させる可能性のある、高いＤＡＲ（ＤＡＲ＞５）を有するＡＤＣを排除することが有益である。本発明の他の側面において、有効性にほとんど寄与しないが、標的抗原、例えばＥＦＮＡ４に関してＡＤＣと競合し得る未コンジュゲート抗体の量の増大を提供し、より低いＴＩをもたらす、低いＤＡＲ（ＤＡＲ＜２）を有するＡＤＣを排除することが有益である。本発明の別の側面において、高いＤＡＲ（ＤＡＲ＞５）を有するＡＤＣおよび低いＤＡＲ（ＤＡＲ＜２）を有するＡＤＣを排除することが有益である。
【００６０】
本発明の特定の側面において、コンジュゲーション反応混合物の調製において用いられるＣＭ対ｈｕＥ２２比は、最適化されたＤＡＲを有する抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣを生成し、より高いＤＡＲの種を排除するために、より高い比率と比較して、４〜５対１であることができる。
【００６１】
本発明の他の側面において、例えばリンカー−薬物部分の混合している渦の中央部分中への添加により部分的に達成されるような、高度な撹拌および激しい混合が、リンカー−薬物部分（ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）の添加の間に実施され、それは、低い量の未コンジュゲート抗体の達成において役に立ち、それは先行する方法を超える向上である。
【００６２】
本発明の他の側面において、反応のインキュベーション時間は、少ない凝集体を提供し、抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣの安定性を増大させるために、６０〜９０分間と比較して、２〜５分間に低減することができる。本発明の別の側面において、反応混合物中のエタノール（ＥｔＯＨ）の量は、少ない凝集体を提供し、抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣの安定性を増大させるために、９％と比較して、６〜８％まで低減することができる。
【００６３】
本発明の特定の側面において、精製の間に、溶離勾配は、抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣに関する狭いＤＡＲ分布を提供するように最適化されることができる。
【００６４】
本発明の特定の側面において、精製された抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣには未コンジュゲート抗体（遊離の抗体）が存在しないことができる（図６参照）。本発明の他の側面において、精製された抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣは、単量体性ＡＤＣであることができ、凝集体および２量体は存在しない（図７参照）。本発明の他の側面において、精製された抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣには、遊離の薬物が存在しないことができる（図８参照）。本発明のさらなる側面において、精製された抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣは、単量体性ＡＤＣであることができ、遊離の薬物が存在しないことができる。
【００６５】
ＩＩＡ．ＥＦＮＡ４抗体
本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの調製に関して、抗体、またはその抗原結合断片は、ＥＦＮＡ４に特異的に結合するあらゆる抗体、またはその抗原結合断片であることができる。本発明の抗体は、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１８５４７号においてさらに開示され、特性付けられており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。抗体、またはその抗原結合断片は、ＥＦＮＡ抗体−薬物コンジュゲートの調製における使用のために、単離、精製、または誘導体化されることができる。
【００６６】
“抗体”または“Ａｂ”は、特異的な標的または抗原、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１個の抗原認識部位を通して認識および結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる際、用語“抗体”は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、所与の抗原（例えばＥＦＮＡ４）に特異的に結合する能力を保持している完全な抗体の“抗原結合断片”（または部分）、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｃ等、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、二特異性抗体、ヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体、その変異体、抗体を有する融合タンパク質、またはその抗原結合断片（例えばドメイン抗体）、単鎖（ＳｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（例えばサメおよびラクダ抗体）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、細胞内抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ＳｃＦｖ（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136を参照）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含む要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の改変された形態を含むがそれらに限定されないあらゆるタイプの抗体を包含することができる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または（キメラまたはヒト化抗体を含む）あらゆる他の由来であることができる。本発明の一部の側面において、開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは組み換えヒト抗体、またはそのＥＦＮＡ４結合断片である。
【００６７】
標的または抗原（例えばＥＦＮＡ４タンパク質）に“特異的に結合する”または“優先的に結合する”（本明細書において互換的に用いられている）抗体、抗体−薬物コンジュゲート、またはポリペプチドは、当該技術で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定するための方法も、当該技術で周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、それが代わりの細胞または物質と反応または会合するよりも頻繁に、より急速に、より大きな持続時間で、および／またはより大きな親和性で反応または会合する場合、“特異的結合”または“優先的結合”を示すと言われる。抗体は、それが、それが他の物質に結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、および／またはより大きな持続時間で結合する場合、標的または抗原に“特異的に結合する”または“優先的に結合する”。例えば、ＥＦＮＡ４エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、このエピトープに、それが他のＥＦＮＡ４エピトープまたは非ＥＦＮＡ４エピトープに結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、および／またはより大きな持続時間で結合する抗体である。
【００６８】
用語“結合親和性”または“ＫＤ”は、本明細書で用いられる際、特定の抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を指すことが意図されている。ＫＤは、会合の速度（または“オン速度”もしくは“ｋａ”）に対する解離の速度（“オフ速度”または“ｋｄ”とも呼ばれる）の比率である。従って、ＫＤは、ｋｄ／ｋａと等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤがより小さいほど、結合親和性はより強いことになる。従って、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して弱い結合親和性を示す。抗体に関するＫＤ値は、当該技術で十分に確立された方法を用いて決定されることができる。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、典型的にはバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いることによる。
【００６９】
開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの特異的結合は、多数の異なる抗原を有する不均質な試料中のヒトＥＦＮＡ４抗原に対する抗体の優先的結合を指す。典型的には、特異的結合は、結合親和性が、少なくとも約１０−９Ｍ以上、少なくとも約１０−１１Ｍ以上、または少なくとも約１０−１２Ｍ以上を含め、少なくとも約１０−７Ｍ以上、例えば少なくとも約１０−８Ｍ以上である場合に起こる。例えば、本発明の抗体のヒトＥＦＮＡ４抗原に対する特異的結合は、少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲の、例えば約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲内、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍの範囲内、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲内、または約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲内の結合を含む。特異的結合は、ＥＦＮＡ４抗体、またはその抗原結合断片の、その抗体の対象への投与後のＥＦＮＡ４発現細胞への選択的標的化も指す。
【００７０】
本明細書で用いられる際、“エピトープ”は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、または他の方法で分子と相互作用することができるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、化学的に活性な表面の分子、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖の群化（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）からなり、一般に特異的な三次元構造の特徴ならびに特異的な電荷の特徴を有する。エピトープは、‘線状’または‘立体構造的’であることができる。線状エピトープでは、タンパク質および相互作用する分子（例えば抗体）の間の相互作用の点の全部が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体構造的エピトープでは、相互作用の点は、互いに隔てられているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって存在する。一度抗原上の望ましいエピトープが決定されたら、そのエピトープに対する抗体を、例えば本発明において記載される技法を用いて生成することが可能である。あるいは、発見プロセスの間に、抗体の生成および特性付けが、望ましいエピトープに関する情報を明らかにする可能性がある。次いで、この情報から、同じエピトープへの結合に関して抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体（すなわちその抗体は、その抗原への結合に関して競合する）を見付けるための交差競合試験を実施することである。抗体をそれらの交差競合に基づいて‘棚入れする（ｂｉｎｎｉｎｇ）’ための高スループットプロセスが、ＰＣＴ国際公開第０３／４８７３１号において記載されている。本明細書で用いられる際、用語‘棚入れする’は、抗体をそれらの抗原結合特徴および互いとの競合に基づいてグループ分けするための方法を指す。
【００７１】
しかし、ＥＦＮＡ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種からのＥＦＮＡ４分子（すなわちオルソログ）に対する、またはＥＦＮＡ４の１より多くのイソ型との交差反応性を有し得る。“単離された抗体”は、本明細書で用いられる際、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ＥＦＮＡ４に特異的に結合する単離された抗体は、ＥＦＮＡ４以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないことができる。この定義を読むことにより、例えば、第１標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２標的に特異的または優先的に結合する可能性もしない可能性もあることも、理解される。従って、“特異的結合”または“優先的結合”は、排他的結合を必ずしも必要としない（が、それは排他的結合を含むことができる）。一般に、結合への言及は、優先的結合を意味するが、必ず意味するわけではない。
【００７２】
本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されている軽鎖可変領域；または（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されている軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片と、ヒトＥＦＮＡ４への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合する抗体を含む。
【００７３】
用語“競合する”は、本明細書で抗体に関して用いられる際、第１抗体、またはその抗原結合断片が、エピトープに、第１抗体のその同族のエピトープとの結合の結果が、第２抗体の存在下で、第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して検出可能であるほどに低下するように、第２抗体、またはその抗原結合断片の結合に十分に類似した様式で結合することを意味する。しかし、第２抗体のそのエピトープへの結合への結合も、第１抗体の存在下で検出可能であるほどに低下するという代替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）は、必ずしも当てはまらない可能性がある。すなわち、第１抗体は、第２抗体のそのエピトープへの結合を、第２抗体が第１抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他方の抗体のその同族のエピトープまたはリガンドとの結合を、同程度、より大きい程度、またはより低い程度までのいずれであれ、検出可能であるほどに阻害する場合、その抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（単数または複数）の結合に関して互いと“交差競合する”と言われる。競合する、および交差競合する抗体は、両方とも本発明に包含される。そのような競合または交差競合が起こる機序（例えば立体障害、立体構造変化、または共通のエピトープもしくはその一部への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書で提供される教示に基づいて、そのような競合する、および／または交差競合する抗体は、本明細書で開示される方法に包含され、そのために有用であり得ることを理解するであろう。
【００７４】
天然または天然存在抗体、および天然免疫グロブリンは、典型的には、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのイソ型の重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖および軽鎖は、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の接触面を形成していると信じられている。用語“可変”は、可変ドメインの特定の位置が、抗体間で配列において大規模に異なっていることを指す。
【００７５】
抗体および上記で特筆した抗体ドメインは、“ポリペプチド”、“オリゴペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”、すなわち、あらゆる長さの、好ましくは比較的短い（例えば１０〜１００アミノ酸）アミノ酸の鎖として記載されることができる。その鎖は、線状または分枝状であることができ、それは、修飾されたアミノ酸を含むことができ、および／または非アミノ酸により遮られることができる。その用語は、天然に、または介入により修飾されているアミノ酸鎖も包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識構成要素とのコンジュゲーション。例えば、１個以上のアミノ酸の類似体（例えば非天然アミノ酸等が含まれる）、ならびに当該技術で既知の他の修飾を含有するポリペプチドも、その定義内に含まれる。そのポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在し得る。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌにより推奨される１文字記号により（どちらでもよい）言及されることができる。
【００７６】
抗体の“定常領域”は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指し、単独または組み合わせのどちらでもよい。キメラおよびヒト化ＥＦＮＡ４抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、それらのあらゆるイソ型（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型）、ならびにそれらの下位クラスおよび変異版のいずれか１つの定常領域に由来することができる。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられることができる。免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、下位クラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
【００７７】
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関わらないが、様々なエフェクター機能、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体の抗体依存性細胞傷害への参加、オプソニン化、補体依存性細胞傷害の開始、およびマスト細胞の脱顆粒を示す。当該技術で既知であるように、用語“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。“Ｆｃ領域”は、天然配列のＦｃ領域またはバリアントのＦｃ領域であることができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、位置Ｃｙｓ２２６におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶように定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、国立衛生研究所公衆衛生局、メリーランド州ベセスダ、1991）におけるような、ＥＵ指針の番号付けである。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を有する。
【００７８】
当該技術で用いられる際、“Ｆｃ受容体”および“ＦｃＲ”は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ下位クラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異型およびオルタナティブスプライシングされた形態を含めて含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（“活性化受容体”）およびＦｃγＲＩＩＢ（“阻害受容体”）を含み、それは、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994;およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995において総説されている。“ＦｃＲ”は、新生児型受容体ＦｃＲｎも含み、それは、母親のＩｇＧの胎児への移動の原因である(Guyer et al., J. Immunol., 117:587-593 (1976);およびKim et al., European J. Immunol., 24:2429-2434 (1994))。
【００７９】
本発明の一部の側面において、開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されているｈｕＥ２２重鎖またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されているｈｕＥ４７重鎖を含む。他の側面において、開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、カッパ軽鎖定常領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されているｈｕＥ２２軽鎖またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されているｈｕＥ４７軽鎖を含む。本発明の特定の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＩｇＧ１重鎖定常領域およびカッパ軽鎖定常領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７として示されている軽鎖、または別の例としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１として示されている重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３として示されている軽鎖を含むことができる。
【００８０】
抗体の“可変領域”は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指し、それは単独または組み合わせのどちらでもよい。当該技術で既知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ超可変領域としても知られている３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより近接して一緒に保持されており、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技法が存在する：（１）異種間の配列の変動性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (第5版, 1991, 国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ))；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-Lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997))。本明細書で用いられる際、ＣＤＲは、どちらかのアプローチにより、または両方のアプローチの組み合わせにより定められたＣＤＲを指すことができる。
【００８１】
可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方の蓄積、ＶＢＡＳＥ２、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造的定義または当該技術で周知のあらゆるＣＤＲ決定の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより最初に定義された超可変領域として同定されることができる。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、ＮＩＨ公衆衛生局、ワシントンＤ．Ｃを参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより最初に記載された構造的ループ構造として同定されることもできる。例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989)を参照。ＣＤＲの位置は、ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られることもできる。(例えばRetter et al., Nucleic Acids Res. 33(データベース特集号):D671-D674, 2005およびhttp://www.vbase2.org/を参照)。
【００８２】
ＣＤＲ同定への他のアプローチは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を用いて得られる“ＡｂＭ定義”、またはMacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996)において述べられている観察された抗原接触に基づくＣＤＲの“接触定義”を含む。本明細書においてＣＤＲの“立体構造的定義”と呼ばれる別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定されることができる。例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008を参照。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密には従わない可能性があるが、それでもなおＫａｂａｔＣＤＲの少なくとも一部と重複するであろうが、それらは、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しくは影響をおよぼさないという予測または実験的発見を考慮して、短く、または長くなっている可能性がある。本明細書で用いられる際、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含め、当該技術で既知のあらゆるアプローチにより定められたＣＤＲを指すことができる。本明細書で用いられる方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定められたＣＤＲを利用することができる。本明細書で記載されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートに関して、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＶＢＡＳＥ２、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造的定義のいずれに従って定められてもよい。
【００８３】
本発明の他の側面において、ＥＦＮＡ４抗体、またはその抗原結合断片は、抗体の１個以上のＣＤＲ（単数または複数）（例えば１個、２個、３個、４個、５個、または６個全部のＣＤＲ）を含む。
【００８４】
本発明に関して、下記の表２において示されているＣＤＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜６４）は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａアプローチを用いて得られ、図２において示されているＣＤＲは、ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた。従って、全てのそのような命名法により定められたＣＤＲを有する抗体は、本発明の範囲内に明確に含まれる。より広く言えば、用語“可変領域ＣＤＲアミノ酸残基”は、上記で述べられたようなあらゆる配列または構造ベースの方法を用いて同定されるようなＣＤＲ中のアミノ酸を含む。
【００８５】
本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕＥ２２抗体のＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３として示されている３個のＣＤＲを有する。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として示されている３個のＣＤＲを有する。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１９、および２３として示されている３個のＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３３、および３５として示されている３個のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片を含むこともできる。
【００８６】
本発明のさらに他の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた、またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた１個以上のｈｕＥ２２  ＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（表２参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（図２参照）を含む。別の例として、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（表２参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（図２参照）を含む。本発明の一部の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（表２参照）を有する重鎖可変領域；および（ｂ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（表２参照）を有する軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。本発明の一部の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（図２参照）を含む重鎖可変領域；および（ｂ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ２２  ＣＤＲ（図２参照）を含む軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。
【００８７】
本発明の他の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕＥ４７抗体のＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４５、および４９として示されている３個のＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、５９、および６１として示されている３個のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含むこともできる。
【００８８】
本発明のさらに他の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた、またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた１個以上のｈｕＥ４７  ＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（表２参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（図２参照）を含む。別の例として、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（表２参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（図２参照）を含む。本発明の別の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（表２参照）を含む重鎖可変領域；および（ｂ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（表２参照）を含む軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。本発明の一部の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（図２参照）を有する重鎖可変領域；および（ｂ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕＥ４７  ＣＤＲ（図２参照）を有する軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。
【００８９】
本発明の一部の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられる抗体は、モノクローナル抗体であろう。用語“モノクローナル抗体”または“ｍＡｂ”は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量存在し得る可能な自然発生変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられている。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。修飾語“モノクローナル”は、抗体の実質的に均質な集団から得られたものとしての抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法によるその抗体の生成を必要するものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されることができ、または例えば米国特許第４，８１６，５６７号において記載されている組み換えＤＮＡ法により作製されることもできる。モノクローナル抗体は、例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990において記載された技法を用いて生成されたファージライブラリーから単離されることもできる。
【００９０】
本発明の一部の側面において、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられる抗体は、一価、すなわち分子あたり１個の抗原結合部位を有するであろう（例えばＩｇＧまたはＦａｂ）。一部の場合において、一価抗体は、１個より多くの抗原結合部位を有し得るが、その結合部位は異なる抗原からのものである。本発明の一部の側面において、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、“二価抗体”、すなわち分子あたり２個の抗原結合部位を有する抗体（例えばＩｇＧ）を含み得る。一部の場合において、２個の結合部位は、同じ抗原特異性を有する。あるいは、二価抗体は、二特異性であることができる。“二特異性”、“二重特異性”または“二機能性”抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二特異性抗体の２個の抗原結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、それは同じタンパク質標的上にある可能性も異なるタンパク質標的上にある可能性もある。
【００９１】
用語“キメラ抗体”は、可変領域配列の一部または全部が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図されている。
【００９２】
本明細書で用いられる際、“ヒト化”または“ＣＤＲ移植”抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、受容抗体の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（供与抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギの１個以上のＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容抗体）である。
【００９３】
一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体中にも導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも存在しないが抗体の性能をさらに改良および最適化するために含められる残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むと考えられ、ここで、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。本発明の一部の側面において、抗体は、ＰＣＴ国際公開第９９／５８５７２号において記載されているように改変されたＦｃ領域を有する。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更されていることができる１個以上のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、またはＣＤＲ  Ｈ３）を有し、それは、元の抗体からの１個以上のＣＤＲ“に由来する”１個以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００９４】
ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法(Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988))に従って、齧歯類または変異体齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることにより実施されることができる。米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号も参照；それは参照により本明細書にそのまま援用される。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンの１個以上の可変領域のフレームワーク領域内の残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０号を参照）。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体中にも供与抗体中にもない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するため（例えば所望の親和性を得るため）に行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むと考えられ、ここで、超可変領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、フレームワーク領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細に関しては、Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327(1988);およびPresta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照；それは参照により本明細書にそのまま援用される。従って、そのような“ヒト化”抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列により置き換えられている抗体を含むことができる。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のフレームワーク残基が、齧歯類抗体中の類似の部位からの残基により置き換えられているヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号を参照。予め決定された抗原に関する向上した親和性を有するヒト化抗体およびヒト化抗体を生成するための技法が開示されている、米国特許第６，１８０，３７０号、およびＰＣＴ国際公開第０１／２７１６０号も参照。
【００９５】
“組み換えヒト抗体”または“完全ヒト抗体”は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、および／または当業者に既知の、もしくは本明細書で開示されるヒト抗体を作製するための技法のいずれかを用いて作製された抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１個のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１種類のヒト軽鎖ポリペプチドを有する抗体を含む。１つのそのような例は、マウスの軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを有する抗体である。ヒト抗体は、当該技術で既知の様々な技法を用いて生成されることができる。例えば、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、ここで、そのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現している(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388, (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, (1991))。ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン座位が内在性座位の代わりに遺伝子導入されている動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスの免疫処置により作製されることもできる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号において記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することにより調製されることができる（そのようなＢリンパ球は、個人から、もしくはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収されることができ、またはインビトロで免疫されていることもできる）。例えば、Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991);および米国特許第５，７５０，３７３号を参照。
【００９６】
本発明の抗体は、当該技術で周知の技法、例えば組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術もしくはそのような技術の組み合わせまたは当該技術で容易に知られている他の技術を用いて生成されることができる（例えば、Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999)およびFellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40 (2007)を参照）。追加の手引きが、Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)において見付けられることができる。代表的な方法は、本明細書における下記の実施例１〜３においても記載されている。
【００９７】
一般に、ハイブリドーマ細胞株の産生に関して、宿主動物の免疫処置の経路およびスケジュールは、一般に抗体刺激および産生に関する確立された従来の技法と一致する。ヒトを含むあらゆる哺乳類の対象またはそれからの抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳類およびハイブリドーマの細胞株の生成のための基礎の役目を果たすために操作されることができることが意図されている。典型的には、宿主動物は、本明細書で記載されるようなものを含むある量の免疫原を、腹腔内に、筋内に、経口で、皮下に、足底内に、および／または皮内に接種される。
【００９８】
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化された骨髄腫細胞から、Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975の一般的な体細胞ハイブリッド形成技法、またはBuck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982により修正されたような体細胞ハイブリッド形成技法を用いて調製されることができる。Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびソーク研究所細胞流通センター（米国カリフォルニア州サンディエゴ）からの骨髄腫株を含むがそれらに限定されない利用可能な骨髄腫株が、ハイブリッド形成において用いられることができる。一般に、その技法は、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を、融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、または当業者に周知の電気的手段により融合させることを含む。融合後、細胞を融合媒体から分離し、ハイブリッド形成しなかった親細胞を排除するために、選択増殖媒体、例えばヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）媒体中で増殖させる。血清を補われた、または補われていない本明細書で記載された媒体の全てが、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために用いられることができる。細胞融合技法に対する別の代替案として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞が、本発明のＥＦＮＡ４モノクローナル抗体を生成するために用いられることができる。ハイブリドーマは、所望であれば、拡張およびサブクローニングされ、上清が従来の免疫アッセイ手順（例えば放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）により抗免疫原活性に関してアッセイされる。抗体の源として用いられることができるハイブリドーマは、ＥＦＮＡ４に特異的なモノクローナル抗体、またはその一部を産生する親ハイブリドーマの全ての派生物、子孫細胞を包含する。
【００９９】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を用いてインビトロまたはインビボで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、所望であれば、培地または体液から、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過により単離されることができる。望まれない活性は、存在する場合、例えば、調製物を固相に結合した免疫原から作られた吸着剤上を流し、所望の抗体を免疫原から溶離する、または遊離させることにより除去されることができる。免疫される予定の種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、二官能性薬剤または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせたヒトＥＦＮＡ４または標的アミノ酸配列を含有する断片を用いた宿主動物の免疫処置は、抗体（例えばモノクローナル抗体）の集団をもたらし得る。
【０１００】
所望であれば、対象のＥＦＮＡ４抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は、配列決定されることができ、次いでそのポリヌクレオチド配列は、発現または増殖のためにベクター中にクローニングされることができる。対象の抗体をコードしている配列は、宿主細胞においてベクター中で維持されることができ、次いで宿主細胞は拡張され、将来の使用のために凍結されることができる。細胞培養における組み換えモノクローナル抗体の生成は、当該技術で既知の手段による抗体遺伝子のＢ細胞からのクローニングにより実施されることができる。例えば、Tiller et al., J. Immunol. Methods 329:112-124, 2008; U.S.Patent No. 7,314,622を参照。
【０１０１】
“宿主細胞”は、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのためのベクター（単数または複数）のための受容者であることができる、または受容者であった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、天然、偶発的、または故意の変異のため、必ずしも元の親細胞と（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）完全に同一ではない可能性がある。宿主細胞は、インビボで本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）をトランスフェクションされた細胞を含む。
【０１０２】
用語“ベクター”は、宿主細胞において対象の１以上の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を送達する、好ましくは発現することができるコンストラクトを意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞を含むが、それらに限定されない。
【０１０３】
用語“発現制御配列”は、核酸の転写を方向付ける核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的もしくは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであることができる。発現制御配列は、転写されるべき核酸配列に作動的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されている。
【０１０４】
あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を“ヒト化する”ための、または抗体の親和性もしくは他の特徴を向上させるための遺伝子操作のために用いられることができる。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置において用いられる場合、免疫応答を避けるために、ヒトの定常領域により近く似るように操作されることができる。ＥＦＮＡ４に対するより大きな親和性およびＥＦＮＡ４の阻害におけるより大きな有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい可能性がある。
【０１０５】
モノクローナル抗体をヒト化するために用いられることができる４つの一般的な工程が存在する：（１）出発する抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定する、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定する、（３）実際のヒト化方法論／技法、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；および第６，１８０，３７０号を参照。
【０１０６】
ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、移植、短縮されたＣＤＲの移植、特異性決定領域（ＳＤＲ）の移植、および下記で記載されるようなフランケンシュタイン組み立て（Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を含む様々な方法のいずれか１つを用いて調製されることができる。ヒト化抗体は、１以上の変化がＣＤＲ中に導入されている超ヒト化抗体（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）も含む。例えば、ヒトの残基が、ＣＤＲにおいて非ヒト残基の代わりに用いられることができる。これらの一般的なアプローチは、あらゆる所望の配列の抗ＥＦＮＡ４抗体を生成するために標準的な変異誘発および合成技法と組み合わせられることができる。
【０１０７】
ベニヤリングは、齧歯類または他の非ヒト抗体中の免疫原性である可能性のあるアミノ酸配列を、その抗体の溶媒が接近し得る外側をヒトのアミノ酸配列で再表面形成する（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）ことにより低減する概念に基づいている。従って、ベニヤリングされた抗体は、未改変の非ヒト抗体よりもヒト細胞に対して異質ではないように見える。Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98を参照。非ヒト抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域中の同じ位置の残基とは異なる非ヒト抗体中の露出した外側のフレームワーク領域残基を同定し、同定された残基をヒト抗体中のこれらの同じ位置を典型的に占めているアミノ酸で置き換えることによりベニヤリングされる。
【０１０８】
ＣＤＲの移植は、受容抗体（例えば所望のフレームワーク残基を有するヒト抗体または他の抗体）の１個以上のＣＤＲを供与抗体（例えば非ヒト抗体）のＣＤＲで置き換えることにより実施される。受容抗体は、候補受容抗体および供与抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択されることができる。例えば、フランケンシュタインアプローチに従って、ヒトのフレームワーク領域は、関連する非ヒト抗体のそれぞれのフレームワーク領域に対する実質的な配列相同性を有するものとして同定され、非ヒト抗体のＣＤＲが、異なるヒトフレームワーク領域の複合物上に移植される。やはり本発明の抗体の調製のために有用である関連する方法が、米国特許出願公開第２００３／００４０６０６号において記載されている。
【０１０９】
短縮されたＣＤＲの移植は、関連するアプローチである。短縮されたＣＤＲは、特異性決定残基および隣接するアミノ酸を含み、それは軽鎖中の２７ｄ〜３４位、５０〜５５位および８９〜９６位、ならびに重鎖中の３１〜３５ｂ位、５０〜５８位、および９５〜１０１位（(Kabat et al. (1987)の番号付けの慣習）の特異性決定残基および隣接するアミノ酸を含む。(Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9)を参照。特異性決定残基（ＳＤＲ）の移植は、抗体結合部位の結合特異性および親和性が、相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれの内部の最も高度に可変性の残基により決定されるという理解を前提としている。抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、入手可能なアミノ酸配列データの分析と合わせて、ＣＤＲ内のそれぞれの位置において生じるアミノ酸残基の構造的相違に基づいて配列の変動性をモデル化する（ｍｏｄｅｌ）ために用いられることができる。ＳＤＲは、接触残基からなる最小限の免疫原性ポリペプチド配列として同定される。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照。
【０１１０】
一般に、ヒトの受容フレームワークは、それらが供与抗体のフレームワーク領域に実質的に類似している、またはそれが可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に最も類似していることに基づいて選択される。移植後に、フレームワーク領域中への非ヒト残基の導入を含む追加の変更が、抗体の結合、機能性、コドン使用率、発現レベル等を最適化するために、供与および／または受容配列中になされることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号を参照。
【０１１１】
ＣＤＲの重鎖可変フレームワーク領域上への移植に関して、有用なフレームワーク配列は、ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）に由来することができる。ＣＤＲの軽鎖可変フレームワーク領域上への移植に関して、有用なフレームワーク配列は、ＤＰＫ２４下位群ＩＶ生殖細胞系列クローン、Ｗｉｌｌ下位群（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩ下位群生殖細胞系列クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）に由来することができる。
【０１１２】
抗原結合断片または抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解により、上記のような組み換え的方法（すなわち単一のポリペプチドまたは融合ポリペプチド）により、または化学合成により生成されることができる。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチドは、化学合成により好都合に作製される。化学合成の方法は、当該技術で既知であり、商業的に入手可能である。例えば、抗体または抗体断片は、固相法を用いる自動化されたポリペプチド合成装置により生成されることができるであろう。米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第６，３３１，４１５号も参照。
【０１１３】
本発明の他の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２、もしくはｈｕＥ４７重鎖および／または軽鎖可変領域、またはｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２、もしくはｈｕＥ４７重鎖もしくは軽鎖可変領域に実質的に類似した可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。
【０１１４】
ポリペプチドに適用される際、用語“実質的同一性”または“実質的類似性”は、２つのアミノ酸配列が、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、プログラムに供給されているような初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた場合に、少なくとも７０％、７５％または８０％の配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。一部の実質的に類似のアミノ酸配列において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている。
【０１１５】
実質的に類似のポリペプチドは、１個以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されている保存的に置換されたバリアントも含む。保存的置換の例は、ある非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの、別の非極性（疎水性）残基に関する置換；ある極性（親水性）残基の別の極性（親水性）残基に関する置換、例えばアルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、グリシンおよびセリン間での置換；ある塩基性残基、例えばリジン、アルギニンもしくはヒスチジンの別の塩基性残基に関する置換；またはある酸性残基、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の別の酸性残基に関する置換を含む。
【０１１６】
２つのタンパク質が実質的に同一であることのさらなる指標は、それらが全体の三次元構造を共有していること、または生物学的機能性均等物であることである。
【０１１７】
本発明の一部の側面において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のいずれか１つとして示されている重鎖可変領域および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のいずれか１つとして示されている軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含む、ＥＦＮＡ４に結合する抗体−薬物コンジュゲート。例えば、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片；またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７として示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片を含むことができる。別の例として、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片；またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３として示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片を含むことができる。
【０１１８】
本発明のＥＦＮＡ４抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片が、まず上記の方法のいずれかを用いて得られることができる。当該技術で既知であるように、“ポリヌクレオチド”、“核酸／ヌクレオチド”、および“オリゴヌクレオチド”は、本明細書において互換的に用いられており、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのどちらでもよい）、その類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖中に組み込まれることができるあらゆる基質を含む。ポリヌクレオチドは、あらゆる三次元構造を有することができ、既知または未知のあらゆる機能を実施することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、天然存在ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチド、またはそれらのあらゆる組み合わせであることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖の組み立ての前または後に与えられることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により遮られることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによりさらに改変されることができる。他のタイプの改変は、例えば、“キャップ”、天然存在ヌクレオチドの１個以上の類似体による置換、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホルアミデート類、カルバメート類等）による、および荷電した連結（例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類等）による改変、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジン等）のようなペンダント部分を含有する改変、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）による改変、キレーター（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有する改変、アルキル化剤を含有する改変、改変された連結（例えばアルファアノマー核酸等）による改変、ならびにポリヌクレオチド（単数または複数）の非改変形態を含む。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられる、標準的な保護基により保護される、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を用意するために活性化されることができ、または固体支持体にコンジュゲートされることもできる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化されていることができ、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機性キャッピング基部分により置換されていることもできる。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化されることができる。ポリヌクレオチドは、当該技術で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファまたはベータアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース類、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含有することもできる。１個以上のホスホジエステル結合が、代替の連結基により置き換えられることができる。これらの代替連結基は、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（“チオエート”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ジチオエート”）、（Ｏ）ＮＲ２（“アミデート”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（“ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）”）により置き換えられている特徴を含むが、それに限定されず、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は、独立してＨ、または場合によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルを含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全部の結合が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１１９】
抗ＥＦＮＡ４抗体重鎖および軽鎖可変領域をコードする代表的なＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ｈｕＥ５  ＶＨ  ＤＮＡ）、８（ｈｕＥ５  ＶＬ  ＤＮＡ）、１０（ｈｕＥ１５  ＶＨ  ＤＮＡ）、１２（ｈｕＥ１５  ＶＬ  ＤＮＡ）、１４（ｈｕＥ２２  ＶＨ  ＤＮＡ）、２８（ｈｕＥ２２  ＶＬ  ＤＮＡ）、４０（ｈｕＥ４７  ＶＨ  ＤＮＡ）、および５４（ｈｕＥ４７  ＶＬ  ＤＮＡ）として示されている。抗ＥＦＮＡ抗体重鎖および軽鎖をコードする代表的なＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ｈｕＥ２２  ＨＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８（ｈｕＥ２２  ＬＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２（ｈｕＥ４７  ＨＣ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４（ｈｕＥ４７  ＬＣ）として示されている。本明細書の下記の表２を参照。ｈｕＥ５およびｈｕＥ１５抗体のＣＤＲは、表２において下線により示されている。ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７抗体のＣＤＲは、表２において（ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定められた）、または図２において（ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた）、別々の配列および配列識別子として示されている。
【０１２０】
様々な改変、例えば変異、置換、欠失、および／または付加が、当業者に既知の標準的な方法を用いてｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２、およびｈｕＥ４７  ＤＮＡ配列中に導入されることもできる。例えば、変異誘発、例えば、変異したヌクレオチドが、ＰＣＲ産物が所望の変異を含有するようにＰＣＲプライマー中に組み込まれる、ＰＣＲに媒介される変異誘発、または部位特異的変異誘発が、標準的な方法を用いて実施されることができる。
【０１２１】
従って、本出願の開示に基づいて、当業者は、ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２、およびｈｕＥ４７  ＤＮＡに実質的に類似したＤＮＡの配列を容易に認識するであろう。用語“実質的類似性”または“実質的配列類似性”は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた際に、あらゆる周知の配列同一性のアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐにより測定した場合にヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを意味する。
【０１２２】
核酸配列の文脈における用語“パーセント配列同一性”は、最大一致に関して整列させた際に同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８またはより多くのヌクレオチドにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられることができる、当該技術で既知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較されることができ、それはＷｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン中のプログラムである。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列および検索配列の間の最高の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods MoI. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. MoI. Biol. 276:71-84 (1998);それは参照により本明細書にそのまま援用される)。別途明記されない限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムに関する初期設定のパラメーターが用いられる。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡをその初期設定のパラメーター（６のワードサイズおよびスコア行列に関してＮＯＰＡＭ因子（ＮＯＰＡＭ  ｆａｃｔｏｒ））と共に用いて、またはＧａｐをＧＣＧバージョン６．１において提供されているようなその初期設定のパラメーターと共に用いて決定されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０１２３】
２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらなる指標は、その核酸によりコードされるタンパク質が実質的に同一であること、全体的な三次元構造を共有していること、または生物学的機能的均等物であることである。これらの用語は、本明細書において下記でさらに定義される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が遺伝子コードにより許容されるような保存的に置換されたバリアントを含む場合に起こり得る。
【０１２４】
保存的に置換されたバリアントは、縮重コドン置換を有する核酸配列であり、ここで、１以上の選択された（または全部の）コドンが、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される。Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およびRossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98を参照。
【０１２５】
例えば、なされることができる１つのタイプの置換は、化学的に反応性であり得る抗体中の１個以上のシステインを、別の残基、例えば（限定ではなく）アラニンまたはセリンに変更することである。例えば、非カノニカル（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）システインの置換が存在することができる。その置換は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中で、または定常領域中でなされることができる。別の例として、そのシステインは、カノニカルであることができる。
【０１２６】
抗体は、例えば重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて、例えば抗体の結合特性を変化させるために改変されることもできる。例えば、ＣＤＲ領域の１個以上において、その抗体のＥＦＮＡ４に関するＫＤを増大もしくは低下させるために、ｋｏｆｆを増大もしくは低下させるために、またはその抗体の結合特異性を変化させるために、変異がなされることができる。部位特異的変異誘発における技法は、当該技術で周知である。例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.（上記）を参照。
【０１２７】
改変または変異は、ＥＦＮＡ４抗体の半減期を増大させるためにフレームワーク領域または定常領域においてなされることもできる。例えば、ＰＣＴ国際公開第００／０９５６０号を参照。フレームワーク領域または定常領域中の変異は、抗体の免疫原性を変化させるために、別の分子への共有結合的もしくは非共有結合的結合のための部位を提供するために、または補体結合、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のような特性を変化させるためになされることもできる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のあらゆる１個以上において、または定常領域において変異を有することができる。
【０１２８】
“生殖細胞系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）”として知られるプロセスにおいて、ＶＨおよびＶＬ配列中の特定のアミノ酸を、生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列中に天然に存在するアミノ酸と一致するように変異させることができる。特に、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を、その抗体が投与される際の免疫原性の危険性を低減するために、生殖細胞系列の配列と一致するように変異させることができる。本明細書で用いられる際、用語“生殖細胞系列”は、抗体遺伝子および遺伝子断片の、それらが親から子に生殖細胞を介して渡された際のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。この生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程の間に組み替えおよび超変異事象により変化している成熟Ｂ細胞中の抗体をコードしているヌクレオチド配列とは区別される。特定の生殖細胞系列を“利用する”抗体は、生殖細胞系列のヌクレオチド配列と、またはそれが指定するアミノ酸配列と最も近く整列するヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。そのような抗体は、しばしば、生殖細胞系列の配列と比較して変異している。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子に関する生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、当該技術で既知である（例えば、“Ｖｂａｓｅ”ヒト生殖細胞系列配列データベースを参照；Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992;およびCox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994も参照）。
【０１２９】
なされることができる別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去するためのものである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または定常領域中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物における不均質性の危険性を低下させ、従ってその均質性を増大させることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、その残基の一方または両方を変更することにより排除することである。別の例において、本発明のＥＦＮＡ４抗体の重鎖のＣ末端リジンは、切断されることができる。本発明の様々な側面において、ＥＦＮＡ４抗体の重鎖および軽鎖は、場合によりシグナル配列を含むことができる。
【０１３０】
一度本発明のＶＨおよびＶＬ区間をコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組み換えＤＮＡ技法により、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するためにさらに操作されることができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば抗体定常領域または柔軟なリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に、作動的に連結される。用語“作動的に連結される”は、この文脈において用いられる際、２個のＤＮＡ断片が、その２個のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるようにつながれることを意味することが意図されている。
【０１３１】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換されることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術で既知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であることができるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体間で生じることが知られている様々なアレルまたはアロタイプ、例えばＧｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）のいずれであることもできる。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の自然発生アミノ酸置換に相当する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結されることができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれに由来することもできる。
【０１３２】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術で既知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であることができる。カッパ定常領域は、異なる個体間で生じることが知られている様々なアレル、例えばＩｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）のいずれであることもできる。ラムダ定常領域は、３つのラムダ遺伝子のいずれに由来することもできる。
【０１３３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする別の断片に、ＶＨおよびＶＬ配列が連続した一本鎖のタンパク質として発現されることができ、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟なリンカーにより繋がれるように、作動的に連結される（例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554を参照）。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが用いられる場合は一価、２つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合は二価、または２つより多くのＶＨおよびＶＬが用いられる場合は多価であることができる。ＥＦＮＡ４に、および別の分子に特異的に結合する二特異性または多価抗体が生成されることができる。
【０１３４】
本発明の別の側面において、別のポリペプチドに連結された本発明のＥＦＮＡ４抗体の全部または一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンが、作製されることができる。別の側面において、ＥＦＮＡ４抗体の可変ドメインのみが、ポリペプチドに連結される。別の側面において、ＥＦＮＡ４抗体のＶＨドメインが、第１ポリペプチドに連結され、一方でＥＦＮＡ４抗体のＶＬドメインが、第１ポリペプチドと会合する第２ポリペプチドに、ＶＨおよびＶＬドメインが互いと相互作用して抗原結合部位を形成することができるような様式で、連結される。別の側面において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いと相互作用することができるように、リンカーによりＶＬドメインから分離されている。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象のポリペプチドに連結される。加えて、２個（またはより多く）の一本鎖抗体が互いに連結されている融合抗体が、作製されることができる。これは、単一のポリペプチド鎖上に二価または多価抗体を作製したい場合、または二特異性抗体を作製したい場合に有用である。
【０１３５】
他の改変された抗体が、ＥＦＮＡ４抗体をコードする核酸分子を用いて調製されることができる。例えば、“カッパボディ（Ｋａｐｐａ  ｂｏｄｉｅｓ）”(Ill et al., Protein Eng. 10:949-57, 1997)、“ミニボディ”(Martin et al., EMBO J., 13:5303-9, 1994)、“ダイアボディ”(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993)、または“ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）”(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991およびTraunecker et al., Int. J. Cancer (補遺) 7:51-52, 1992)は、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学の技法を用いて調製されることができる。
【０１３６】
二特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法により生成されることができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990, Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992を参照。加えて、二特異性抗体は、“ダイアボディ”または“ジャヌシン”として形成されることができる。本発明の一部の側面において、二特異性抗体は、ＥＦＮＡ４の２つの異なるエピトープに結合する。他の側面において、上記の改変された抗体は、本明細書で提供されるＥＦＮＡ４抗体からの可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１個以上を用いて調製される。
【０１３７】
抗体−薬物コンジュゲートの調製における使用に関して、本明細書で記載されるＥＦＮＡ４抗体は、実質的に純粋である、すなわち少なくとも５０％純粋である（すなわち汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋である、より好ましくは少なくとも９５％純粋である、さらにもっと好ましくは少なくとも９８％純粋である、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることができる。
【０１３８】
表２は、本発明のヒト化坑ＥＦＮＡ４抗体のアミノ酸（タンパク質）配列および関係する核酸（ＤＮＡ）配列を提供する。Ｋａｂａｔにより定められるようなｈｕＥ５  ＶＨ、ｈｕＥ５  ＶＬ、ｈｕＥ１５  ＶＨ、およびｈｕＥ１５  ＶＬのＣＤＲは、下線が付けられている。Ｋａｂａｔにより、およびＣｈｏｔｈｉａにより定められるようなｈｕＥ２２  ＶＨ、ｈｕＥ２２  ＶＬ、ｈｕＥ４７  ＶＨ、およびｈｕＥ４７  ＶＬのＣＤＲは、別々の配列として示されている。
【０１３９】
【表２−１】
2016540826.tif 000003
【０１４０】
【表２−２】
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【０１４１】
【表２−３】
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【０１４２】
【表２−４】
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【０１４３】
【表２−５】
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【０１４４】
【表２−６】
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【０１４５】
【表２−７】
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【０１４６】
ＩＩ．Ｂ．リンカー
本発明の抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、薬物を抗ＥＦＮＡ４抗体に連結またはコンジュゲートするためのリンカーを用いて調製されることができる。本発明の特定の側面において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートのリンカーは、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を含むが、それに限定されない。
【０１４７】
リンカー分子は、安定（切断不能）または加水分解可能（切断可能）であることができ、それによりそれは細胞侵入後に放出される。薬物が抗体から切断される主な機序は、リソソームの酸性ｐＨにおける加水分解（ヒドラゾン類、アセタール類、およびシス−アコニテート様アミド類）、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元を含む。切断に関するこれらの様々な機序の結果として、薬物を抗体に連結する機序も広く異なり、あらゆる適切なリンカーが用いられることができる。
【０１４８】
適切なコンジュゲーション手順の一例は、ヒドラジドおよび他の求核種の、抗体上に天然に存在する炭水化物の酸化により生成されるアルデヒドへのコンジュゲーションに頼っている。ヒドラゾンを含有するコンジュゲートは、所望の薬物放出特性を提供する導入されたカルボニル基を用いて作製されることができる。コンジュゲートは、一方の末端にジスルフィド、中央にアルキル鎖、そして他方の末端にヒドラジン誘導体を有するリンカーを用いて作製されることもできる。アントラサイクリン類は、この技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる細胞毒素の一例である。
【０１４９】
ヒドラゾン類以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境中で切断される可能性を有する。例えば、コンジュゲートは、細胞内で切断可能であるヒドラゾン以外の部位、例えばエステル、アミド、および／またはアセタール／ケタールを含有するチオール反応性リンカーから作られることができる。カンプトテシンは、これらのリンカーを用いてコンジュゲートさせることができる１つの細胞毒性剤である。５〜７員環ケトンから作製され、細胞毒性剤に結合した酸素の一方および抗体の結合のためのリンカーに結合した酸素の他方を有するケタールも、用いられることができる。アントラサイクリン類は、これらのリンカーと共に用いられるための適切な細胞毒素の一例でもある。
【０１５０】
ｐＨ感受性リンカーのクラスの別の例は、シス−アコニテート類であり、それは、アミド結合に並列されたカルボン酸を有する。カルボン酸は、酸性リソソームにおけるアミド加水分解を加速する。いくつかの他のタイプの構造により類似のタイプの加水分解速度の加速を達成するリンカーも、用いられることができる。メイタンシノイド類は、Ｃ−９において結合したリンカーとコンジュゲートされることができる細胞毒素の一例である。
【０１５１】
薬物コンジュゲートに関する別の可能性のある放出法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素的加水分解である。一例において、ペプチドは、アミド結合を介してパラ−アミノベンジルアルコールに結合し、次いでカルバメートまたはカーボネートが、ベンジルアルコールおよび細胞毒性剤の間で作られる。ペプチドの切断は、アミノベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊、または自己破壊（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｏｎ）をもたらす。この戦略を用いて例示される細胞毒性剤は、アントラサイクリン類、タキサン類、マイトマイシンＣ、およびオーリスタチン類を含む。一例において、フェノールも、カルバメートの代わりにリンカーの崩壊により放出されることができる。別のバリエーションにおいて、ジスルフィド還元が、パラ−メルカプトベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊を開始するために用いられる。
【０１５２】
抗体にコンジュゲートした細胞毒性剤の多くは、水中での可溶性を、たとえあるとしてもほとんど有さず、それは、コンジュゲートの凝集のため、コンジュゲートへの薬物装填を制限し得る。これを克服するための１つのアプローチは、リンカーに可溶性の基を付加することである。抗体に結合したＰＥＧ二酸、チオール−酸、またはマレイミド−酸、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはデュオカルマイシン類似体のアミンに対するアミド結合を有するリンカーを含む、ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作製されたコンジュゲートが、用いられることができる。別の例は、細胞毒性剤に結合したＰＥＧ含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を組み込むアプローチは、薬物装填における凝集および制限の克服において有益である可能性がある。
【０１５３】
本発明の一部の側面において、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの調製のためのリンカーは、次の式を有するリンカーを含み：
（ＣＯ−Ａｌｋ１−Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）
式中、
Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は、独立して結合または分枝状もしくは分枝していない（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン鎖であり；
Ｓｐ１は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、ここでＸ、Ｙ、およびＺは、独立して結合、−ＮＲ’−、−Ｓ−、または−Ｏ−であり、ただし、ｎ＝０である場合、ＹおよびＺの少なくとも一方は結合でなければならず、Ａｒ’は、場合により（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、または３個の基で置換された１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであり、ただし、Ａｌｋ’が結合である場合、Ｓｐ１は結合であり；
ｎは、０〜５の整数であり；
Ｒ’は、場合により−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１〜Ｃ３）ジアルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−の１または２個の基により置換された分枝状または分枝していない（Ｃ１〜Ｃ５）鎖であり、ここでＡ−は、塩を完成する薬学的に許容可能な陰イオンであり；
Ａｒは、場合により（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、もしくは３個の基で置換された１，２−、１，３−、もしくは１，４−フェニレン（ここでｎおよびＲ’は、本明細書において前に定義された通りである）、または１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、もしくは２，７−ナフチリデンもしくは
【０１５４】
【化１】
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【０１５５】
であり、それぞれのナフチリデンもしくはフェノチアジンは、場合により（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、３、もしくは４個の基で置換されており、ここでｎおよびＲ’は、上記で定義された通りであり、ただし、Ａｒがフェノチアジンである場合、Ｓｐ１は窒素のみに連結された結合であり；
Ｓｐ２は、結合、−Ｓ−、または−Ｏ−であり、ただし、Ａｌｋ２が結合である場合、Ｓｐ２は結合であり、
Ｚ１は、Ｈ、場合により（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、または３個の基で置換された（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、またはフェニルであり、ここでｎおよびＲ’は、上記で定義された通りであり；
Ｓｐは、直鎖もしくは分枝鎖の二価もしくは三価（Ｃ１〜Ｃ１８）基、二価もしくは三価アリールもしくはヘテロアリール基、二価もしくは三価（Ｃ３〜Ｃ１８）シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル基、二価もしくは三価アリール−もしくはヘテロアリール−アリール（Ｃ１〜Ｃ１８）基、二価もしくは三価シクロアルキル−もしくはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）基、または二価もしくは三価（Ｃ２〜Ｃ１８）不飽和アルキル基であり、ここでヘテロアリールは、好ましくはフリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクルマリニル（ａｍｉｎｏｃｏｕｒｍａｒｉｎｙｌ）、またはフェナジニルであり、ここでＳｐが三価の基である場合、Ｓｐはさらに低級（Ｃ１〜Ｃ５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシ、または低級（Ｃ１〜Ｃ５）アルキルチオ基により置換されていることができ；そして
Ｑは、＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である。
【０１５６】
好ましくは、Ａｌｋ１は、分枝状または分枝していない（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン鎖であり；Ｓｐ’は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ’であり、ここで、Ｒ’は、本明細書において前に定義された通りであり、ただし、Ａｌｋ’が結合である場合、Ｓｐ１は結合であり；
Ａｒは、場合により（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、もしくは３個の基で置換された１，２−、１，３−、もしくは１，４−フェニレンであり、ここでｎおよびＲ’は、本明細書において前に定義された通りであり、またはＡｒは、１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、もしくは２，７−ナフチリデンであり、それぞれが場合により（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、もしくは−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、３、もしくは４個の基で置換されている。
【０１５７】
Ｚ１は、場合により（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、もしくは３個の基で置換された（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、またはフェニルであり；Ａｌｋ２およびＳｐ２は、一緒に結合であり；そしてＳｐおよびＱは、すぐ上で定義された通りである。
【０１５８】
参照により本明細書にそのまま援用される米国特許第５，７７３，００１号は、カリケアマイシン類から調製された求核性薬物、特にヒドラジド類および関連する求核種と共に用いられることができるリンカーを開示している。これらのリンカーは、薬物およびリンカーの間で形成される結合が加水分解可能である際によりよい活性が得られる場合に特に有用である。これらのリンカーは、（１）抗体との反応のための基（例えばカルボン酸）、および（２）薬物との反応のためのカルボニル基（例えばアルデヒドまたはケトン）を含む２個の官能基を含有する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成することができる。この結合は、切断可能、加水分解可能であり、標的細胞への結合後の療法剤のコンジュゲートからの遊離を可能にする。本発明の一部の側面において、用いられる加水分解可能なリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。本発明の他の側面において、抗体−薬物コンジュゲートは、（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）または４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）をリンカー分子として用いて調製されることができる。
【０１５９】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステル類または他の比較可能なほどに活性化されたエステル類は、活性化された加水分解可能なリンカー−薬物部分を生成するために用いられることができる。他の適切な活性化エステル類の例は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ−ＮＨＳ（スルホン化ＮＨＳ）、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）、ＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）、およびＤＮＰ（ジニトロフェニル）を含む。
【０１６０】
本発明の一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートは、カリケアマイシンまたはその誘導体、ＡｃＢｕｔリンカーおよび本発明の抗ＥＦＮＡ４抗体を反応させることにより調製される。例えば、米国特許第５，７７３，００１号を参照。ＡｃＢｕｔリンカーは、循環中で実質的に安定であるコンジュゲートを生成し、インビトロでヒト血漿中で３７℃においてアッセイされた際に１日あたりカリケアマイシンの推定２％を遊離する。そのコンジュゲートは、酸性リソソーム中でカリケアマイシンを遊離する。
【０１６１】
本発明の一部の側面において、ＡｃＢｕｔ−ＣＭ部分は、当該技術で、例えばＰＣＴ国際公開第０８／１４７７６５号および米国特許第８，２７３，８６２号において記載されている方法およびプロセスを用いて生成されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０１６２】
本発明の一部の側面において、ＡｃＢｕｔ−ＣＭ部分は、米国仮出願第６１／８９９，６８２号において記載されているような向上した合成プロセスを用いて生成されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。リンカー中間体（化合物１０）を合成するための方法は、次のように記載される：
【０１６３】
【化２】
2016540826.tif 000011
【０１６４】
スキーム１において、化合物１および化合物２を、２−メチルテトラヒドロフラン（２−ＭｅＴＨＦ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４ＮＦ）中で反応させる。塩化カルシウム二水和物の水中における溶液を添加し、下方の水相を撹拌後に除去する。上方の油相にメタノールおよび３等量の水中ＮａＯＨを添加する。反応混合物を、中間体エステル３の完全な消費が観察されるまで撹拌する。反応を１５℃まで冷却し、２−メチルテトラヒドロフランを添加した後、水を添加する。濃ＨＣｌをゆっくりと添加し、反応を１５〜３０℃の範囲で維持する。酸４が、有機層から得られる。
【０１６５】
【化３】
2016540826.tif 000012
【０１６６】
スキーム２において、化合物４に、適切な有機溶媒、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびアゾール活性化剤、例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を装填し、中間体５を形成する。他のアゾール活性化剤、例えばチオカルボニルジイミダゾール；カルボニルビス−ピラゾール、ここでそれぞれのピラゾールは場合により１〜３個の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基で置換されている；カルボニルビス−１，２，３−トリアゾール；カルボニルビス−ベンゾトリアゾール、およびカルボニルビス−１，２，４−トリアゾールが用いられることができ、それは、それにより化合物５に類似しているがイミダゾリル以外の異なるアゾール部分を含む中間体化合物を形成するであろう。中間体５を、ヒドラジン、好ましくはヒドラジンの水性の源、例えばヒドラジン一水和物と反応させ、中間体６が得られる。中間体６は、ＰＣＴ国際公開第０８／１４７７６５号において記載されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０１６７】
【化４】
2016540826.tif 000013
【０１６８】
スキーム３において、中間体６を、中間体７と、不活性（非反応性）溶媒（例えばメタノール（ＭｅＯＨ））中で、場合により酸性触媒（例えば酢酸（ＨＯＡｃ））を用いて反応させると、中間体８が得られる。
【０１６９】
【化５】
2016540826.tif 000014
【０１７０】
スキーム４において、中間体８を、強酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を場合により加熱下で用いることにより脱保護し、中間体９を形成する。他の強酸、例えば硫酸が、トリフルオロ酢酸の代わりに用いられることができる。
【０１７１】
【化６】
2016540826.tif 000015
【０１７２】
スキーム５において、中間体９を、リンカー中間体１０に変換する。中間体９は、当該技術で、例えば米国特許第８，２７３，８６２号において記載されているように、リンカー中間体１０に変換されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。しかし、好ましくは、スキーム５において示されているように、中間体９を、第３級アミン塩基、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）と、そしてトリメチルアセチルクロリド（ＰｉｖＣｌ）と、不活性溶媒、例えばテトラヒドロフランの存在下で反応させる。続いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）を導入してリンカー中間体１０を提供する。
【０１７３】
本明細書で上記で記載されたリンカー中間体１０を合成するためのプロセスは、本明細書で上記で記載されたプロセスは塩化メチレンの使用およびそれに伴って行われる安全対策を回避し、リンカー中間体１０のよりよい収量を提供するため、ＰＣＴ国際公開第０８／１４７７６５号において、および米国特許第８，２７３，８６２号において記載されているプロセスを上回る向上を提供する。
【０１７４】
リンカー中間体１０の合成に続いて、リンカー中間体１０を、先行技術において、例えば米国特許第８，２７３，８６２号において記載されているように、カリケアマイシン分子にコンジュゲートさせることができる。しかし、好ましくは、リンカー中間体１０は、カルボジイミドの存在下でカリケアマイシンと組み合わせられ、それは結果として得られるカリケアマイシン誘導体の収量を向上させる。用いられることができるカルボジイミド類の例は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）；Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド；Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−［２−（４−メチルモルホリン−４−イウム−４−イル）エチル］カルボジイミド  トシレート；Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−［４−（ジエチルメチルアンモニオ）シクロヘキシル］カルボジイミド  トシレート；Ｎ，Ｎ’−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル］カルボジイミド；およびＮ−ベンジル−Ｎ’−イソプロピルカルボジイミドを含むが、それらに限定されない。
【０１７５】
リンカー中間体１０のカリケアマイシンへのコンジュゲーションの結果得られるカリケアマイシン誘導体は、モノクローナル抗体（例えば抗ＥＦＮＡ４抗体）との反応の前に精製および単離されることができる。精製および単離は、以前に米国特許第８，２７３，８６２号において記載されているように行われることができる。または、精製は、逆相高性能液体クロマトグラフィー精製プロトコルを用いることにより行われることができる。１０の精製のための逆相高性能液体クロマトグラフィー精製プロトコルは、水性および有機性混合物を含む相による溶離を含むことができ、その相は、約４〜約６のｐＨの範囲である。例えば、５５％  ２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５および４５％アセトニトリルからなる移動相は、逆相高性能液体クロマトグラフィー精製のために用いられることができる水性／有機性移動相である。逆相高性能液体クロマトグラフィー精製プロトコルを用いた精製の後に、固相抽出プロトコルが行われることができる。
【０１７６】
本発明の他の側面において、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えばバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーであることができる。別の側面において、リンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル類（チオール類、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して起こり、一方でそのスルホ−ＮＨＳエステルは、（リジンおよびタンパク質またはペプチドのＮ末端にあるような）第１級アミンに対して反応性である。さらに、そのリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であることができる。
【０１７７】
放射性同位体のコンジュゲーションに有用な代表的なリンカーは、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）−イソチオシアネート、スクシンイミジル  ６−ヒドラジニウム  ニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）、およびヘキサメチルプロピレンアミンオキシム（ＨＭＰＡＯ）を含む(Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270;米国特許第６，０２４，９３８号)。あるいは、標的化分子は、放射性同位体が直接それに結合し得るように誘導体化されることができる(Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300)。ヨウ素化法も、当該技術で既知であり、代表的なプロトコルは、例えばKrenning et al. (1989) Lancet 1:242-244において、およびBakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-1509において見付けられることができる。
【０１７８】
ＩＩ．Ｃ．  薬物
開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの調製において有用な薬物は、生物学的または検出可能な活性を有するあらゆる物質、例えば療法剤、検出可能な標識、結合剤等、およびインビボで代謝されて有効薬剤になるプロドラッグを含む。薬物は、薬物誘導体であることもでき、ここで、薬物は、本発明の抗体とのコンジュゲーションを可能にするように官能化されている。開示される方法によれば、薬物は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられ、式中、（ａ）Ａｂは、ＥＦＮＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、そして（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。抗体あたりにコンジュゲートしている薬物（Ｄ）分子の数を示す薬物対抗体比（ＤＡＲ）または薬物装填は、ＤＡＲ１〜１２であることができる。従って、本発明の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、１のＤＡＲ、２のＤＡＲ、３のＤＡＲ、４のＤＡＲ、５のＤＡＲ、６のＤＡＲ、７のＤＡＲ、８のＤＡＲ、９のＤＡＲ、１０のＤＡＲ、１１のＤＡＲまたは１２のＤＡＲを有することができる。従って、本発明の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、１個の薬物分子、または２個の薬物分子、または３個の薬物分子、または４個の薬物分子、または５個の薬物分子、または６個の薬物分子、または７個の薬物分子、または８個の薬物分子、または９個の薬物分子、または１０個の薬物分子、または１１個の薬物分子、または１２個の薬物分子を含むことができる。ＤＡＲは、様々な従来の手段、例えばＵＶ分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣにより決定されることができる。
【０１７９】
式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の組成物、バッチおよび／または配合物は、ＤＡＲ１〜１２の、様々な数の薬物分子とコンジュゲートした複数の抗体を含むことができる。
【０１８０】
本発明の特定の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約１〜約１２の範囲の平均ＤＡＲ、例えば約２〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約６の範囲の平均ＤＡＲ、または約５〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約６〜約８の範囲の平均ＤＡＲ、または約７〜約９の範囲の平均ＤＡＲ、または約８〜約１０の範囲の平均ＤＡＲ、または約９〜約１１の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約１の平均ＤＡＲ、または約２の平均ＤＡＲ、約３の平均ＤＡＲ、または約４の平均ＤＡＲ、または約５の平均ＤＡＲ、または約６の平均ＤＡＲ、または約７の平均ＤＡＲ、または約８の平均ＤＡＲ、または約９の平均ＤＡＲ、または約１０の平均ＤＡＲ、または約１１の平均ＤＡＲを有することができる。前記の平均ＤＡＲの範囲において用いられる際、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。
【０１８１】
さらに、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、約３〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。さらに、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば３〜５の範囲の平均ＤＡＲ、３〜４の範囲の平均ＤＡＲ、または４〜５の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０１８２】
本発明の一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約３．０の平均ＤＡＲ、または３．０の平均ＤＡＲ、または３．１の平均ＤＡＲ、または３．２の平均ＤＡＲ、または３．３の平均ＤＡＲ、または３．４の平均ＤＡＲ、または３．５の平均ＤＡＲ、または３．６の平均ＤＡＲ、または３．７の平均ＤＡＲ、または３．８の平均ＤＡＲ、または３．９の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約４．０の平均ＤＡＲ、または４．０の平均ＤＡＲ、または４．１の平均ＤＡＲ、または４．２の平均ＤＡＲ、または４．３の平均ＤＡＲ、または４．４の平均ＤＡＲ、または４．５の平均ＤＡＲ、または４．６の平均ＤＡＲ、または４．７の平均ＤＡＲ、または４．８の平均ＤＡＲ、または４．９の平均ＤＡＲ、または５．０の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０１８３】
本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、１２以下の平均ＤＡＲ、１１以下の平均ＤＡＲ、１０以下の平均ＤＡＲ、９以下の平均ＤＡＲ、８以下の平均ＤＡＲ、７以下の平均ＤＡＲ、６以下の平均ＤＡＲ、５以下の平均ＤＡＲ、４以下の平均ＤＡＲ、３以下の平均ＤＡＲ、２以下の平均ＤＡＲ、または１以下の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０１８４】
本発明の他の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、１１．５以下の平均ＤＡＲ、１０．５以下の平均ＤＡＲ、９．５以下の平均ＤＡＲ、８．５以下の平均ＤＡＲ、７．５以下の平均ＤＡＲ、６．５以下の平均ＤＡＲ、５．５以下の平均ＤＡＲ、４．５以下の平均ＤＡＲ、３．５以下の平均ＤＡＲ、２．５以下の平均ＤＡＲ、１．５以下の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０１８５】
式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物は、ＤＡＲ分布により特性付けられることができる。ＤＡＲ分布は、ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物中に存在し得る様々なＡＤＣ種のパーセントまたは割合（例えばＤＡＲ１〜１２）を提供する。ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、当該技術で既知の方法、例えばキャピラリー等電点分画法（ｃＩＥＦ）により決定されることができる。
【０１８６】
本発明の一側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般にＤＡＲ１〜１２を有する広い範囲のＡＤＣ種を含有する広いＤＡＲ分布を有する高度に不均質なＡＤＣの混合物として特性付けられることができる。
【０１８７】
本発明の別の側面において、ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般に特定のＤＡＲ、例えばＤＡＲ３〜５を有する狭い範囲のＡＤＣ種を含有する狭いＤＡＲ分布を有する高度に均質な混合物として特性付けられることができる。
【０１８８】
本発明の特定の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、３〜５のＤＡＲを有する少なくとも５０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも５５％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも６０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも６５％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも７０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも７５％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも８０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも８５％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも９０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する少なくとも９５％の抗体−薬物コンジュゲートを有することにより特性付けられることができる。
【０１８９】
本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、３〜５のＤＡＲを有する５０％〜６０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する６０％〜７０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する７０％〜８０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する８０％〜９０％の抗体−薬物コンジュゲート、または３〜５のＤＡＲを有する９０％〜１００％の抗体−薬物コンジュゲートを有することにより特性付けられることができる。本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、３〜５のＤＡＲを有する約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％の抗体−薬物コンジュゲートを有することにより特性付けられることができる。
【０１９０】
例えば、療法剤は、癌細胞または活性化された免疫細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性、および／または免疫調節性作用を及ぼす薬剤である。療法剤の例は、細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、および免疫調節剤を含む。化学療法剤は、癌の処置において有用な化合物である。
【０１９１】
療法剤は、それを必要とする対象において障害を処置または予防するために用いられることができる組成物である。本発明において有用な療法剤は、抗癌剤、すなわちＥＦＮＡ４発現細胞、例えば乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）；卵巣癌；結腸直腸癌；白血病、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からの癌細胞において抗癌活性を有する薬剤を含む。
【０１９２】
代表的な療法剤は、細胞毒素、細胞毒性剤、および細胞増殖抑制剤を含む。細胞毒性作用は、標的細胞（単数または複数）の枯渇、排除および／または殺傷を指す。細胞毒性剤は、細胞に対して細胞毒性および／または細胞増殖抑制作用を有する薬剤を指す。細胞増殖抑制作用は、細胞増殖の阻害を指す。細胞増殖抑制剤は、細胞に対して細胞増殖抑制作用を有し、それにより細胞の特定の部分集合の増殖および／または拡張を阻害する薬剤を指す。
【０１９３】
追加の代表的な療法剤は、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、および細胞溶解性酵素（例えばＲＮアーゼ）を含む。薬剤は、療法的核酸、例えば免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤をコードする遺伝子を含むこともできる。これらの薬物の記述語は、互いに排他的ではなく、従って療法剤は、上記の用語の１以上を用いて記載されることができる。例えば、選択される放射性同位体は、細胞毒素でもある。療法剤は、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸、または誘導体として調製されることができる。一般に、放射性同位体を薬物として有するコンジュゲートは、放射性免疫コンジュゲートと呼ばれ、化学療法剤を薬物として有するコンジュゲートは、化学免疫コンジュゲートと呼ばれる。
【０１９４】
細胞毒性剤の例は、アントラサイクリン、オーリスタチン、ＣＣ−１０６５、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ヘミアステリン、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体を含むが、それらに限定されない。植物毒素、他の生理活性タンパク質、酵素（すなわちＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光増感剤（すなわち光力学療法のためのもの）が用いられることもできる。
【０１９５】
アントラサイクリン類は、細菌ストレプトマイセスに由来し、広い範囲の癌、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌を処置するために用いられてきた。典型的なアントラサイクリン類は、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわちアドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンを含むが、それらに限定されない。
【０１９６】
ドラスタチン類ならびにそれらのペプチド性類似体および誘導体であるオーリスタチン類は、抗癌および抗真菌活性を有することが示されている非常に強力な有糸分裂阻害剤である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号およびPettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, (1998)を参照。典型的なドラスタチン類およびオーリスタチン類は、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロリン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロリン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）および他の新規のものを含むが、それらに限定されない。
【０１９７】
本発明の一部の側面において、参照により本明細書にそのまま援用されるＰＣＴ国際公開第２０１３／０７２８１３号において記載されているオーリスタチン類およびそれらのオーリスタチン類を製造する方法が、本明細書において用いられる。
【０１９８】
例えば、次の構造を有するオーリスタチン０１０１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）：
【０１９９】
【化７】
2016540826.tif 000016
【０２００】
加えて、次の構造を有するオーリスタチン８２６１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）：
【０２０１】
【化８】
2016540826.tif 000017
【０２０２】
デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞毒性効力を有するＤＮＡアルキル化剤である。Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995を参照。典型的なドラスタチン類およびオーリスタチン類は、（＋）−デュオカルマイシンＡおよび（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、ならびに（＋）−ＣＣ−１０６５を含むが、それらに限定されない。
【０２０３】
エンジイン類は、９および１０員環またはコンジュゲートした三重−二重−三重結合の環系の存在のどちらかにより特性付けられる抗腫瘍細菌製品のクラスである。典型的なエンジイン類は、カリケアマイシン、エスペラミシン、およびダイネミシンを含むが、それらに限定されない。カリケアマイシンは、土壌生物ミクロモノスポラ・エキノスポラ亜種カリケンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ  ｓｓｐ．  ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からの天然生成物として最初に単離されたエンジイン系抗生物質であり(Zein et al. Science 27;240(4856):1198-1201, 1988)；それは標的細胞において二本鎖ＤＮＡの破断を生成し、続いてアポトーシスを誘導する(Zein et al. Science 27;240(4856):1198-1201, 1988; Nicolaou et al. Chem. Biol. Sep;1(1):57-66,  1994; Prokop et al. Oncogene 22:9107-9120, 2003)。
【０２０４】
本発明の一部の側面において、細胞毒性剤は、抗生物質、例えばカリケアマイシン（ＬＬ−Ｅ３３２８８錯体とも呼ばれる）、例えばβ−カリケアマイシン、γ−カリケアマイシンまたはＮ−アセチル−γ−カリケアマイシン（ガンマ−カリケアマイシン（γ１））である。本発明における使用に適したカリケアマイシン類の例は、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，９７０，１９８号、第５，０５３，３９４号、第５，０３７，６５１号、第５，０７９，２３３号および第５，１０８，９１２号において開示されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。これらの化合物は、適切なチオール類と反応してジスルフィドを形成し、同時に官能基、例えばヒドラジドまたはカリケアマイシンを抗ＥＦＮＡ４抗体にコンジュゲートさせるために有用である他の官能基を導入することができるメチルトリスルフィドを含有する。カリケアマイシンのジスルフィド類似体、例えば米国特許第５，６０６，０４０号および第５，７７０，７１０号において記載されている類似体が用いられることもでき、それは参照により本明細書にそのまま援用される。本発明の一部の側面において、ジスルフィド類似体は、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（以下“ＣＭ”）である。
【０２０５】
ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合するベンゾキノンアンサマイシン系抗生物質であり、抗腫瘍薬として用いられてきた。典型的なゲルダナマイシン類は、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）を含むが、それらに限定されない。
【０２０６】
メイタンシン類またはそれらの誘導体であるメイタンシノイド類は、有糸分裂の間に微小管の形成をチューブリンの重合の阻害により阻害することにより、細胞の増殖を阻害する。Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975を参照。典型的なメイタンシン類およびメイタンシノイド類は、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体ならびにアンサミトシンを含むが、それらに限定されない。
【０２０７】
タキサン類は、抗チューブリン剤または有糸分裂阻害剤として作用する。典型的なタキサン類は、パクリタキセル（例えばＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））を含むが、それらに限定されない。
【０２０８】
ビンカアルカロイド類も、抗チューブリン剤である。典型的なビンカアルカロイド類は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含むが、それらに限定されない。
【０２０９】
本発明の一部の側面において、薬剤は、免疫調節剤である。免疫調節剤の例は、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、グルココルチコイドおよびその類似体、サイトカイン類、キサンチン類、幹細胞増殖因子、リンホトキシン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、“Ｓ１因子”と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチン、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【０２１０】
本発明において有用な免疫調節剤は、腫瘍に対するホルモンの作用を遮断する抗ホルモン薬、およびサイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現を下方制御し、またはＭＨＣ抗原を覆い隠す免疫抑制剤も含む。代表的な抗ホルモン薬は、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェンを含む抗エストロゲン薬；ならびに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ）を含む。代表的な免疫抑制剤は、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に関する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド類、例えば糖質コルチコステロイド類、サイトカインまたはサイトカイン受容体拮抗薬（例えば、抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、およびＴ細胞受容体抗体を含む。
【０２１１】
本発明の一部の側面において、薬物は、毒素、ホルモン、酵素、および増殖因子を含むがそれらに限定されない療法的タンパク質である。
【０２１２】
毒素タンパク質（またはポリペプチド）の例は、ジフテリア（例えばジフテリアＡ鎖）、シュードモナス属の外毒素および内毒素、リシン（例えばリシンＡ鎖）、アブリン（例えばアブリンＡ鎖）、モデッシン（例えばモデッシンＡ鎖）、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、スタフィロコッカス属の腸毒素Ａ、ヨウシュヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）毒素、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、トリコテセン類、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えばセラトトキシン類（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎｓ））、ならびにコノトキシン（例えばＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）を含むが、それらに限定されない。
【０２１３】
ホルモンの例は、エストロゲン類、アンドロゲン類、プロゲスチン類およびコルチコステロイド類を含むが、それらに限定されない。
【０２１４】
本発明の一部の側面において、細胞毒性薬剤は、リポソームまたは生体適合性ポリマーを用いて作られることができる。本明細書で記載されるような抗ＥＦＮＡ４抗体は、血清半減期および生理活性を増大させるために、および／またはインビボでの半減期を延長するために、生体適合性ポリマーにコンジュゲートさせることができる。生体適合性ポリマーの例は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体および双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えばホスホリルコリン含有ポリマー）を含む。
【０２１５】
本発明の一部の側面において、薬物は、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２１６】
本発明において有用な追加の薬物は、血管形成を阻害する抗血管新生剤、例えばファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（例えば２−メトキシエストラジオールビス−スルファメート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスＩインターフェロン類、インターロイキン１２、プロタミン、アンジオスタチン、ラミニン、エンドスタチン、およびプロラクチン断片を含む。
【０２１７】
抗増殖剤およびアポトーシス促進剤は、ＰＰＡＲ−ガンマの活性化物質（例えばシクロペンテノンプロスタグランジン類（ｃｙＰＧ））、レチノイド類、トリテルペノイド類（例えばシクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリーデラン（ｆｒｉｅｄｅｌａｎｅ）、ダンマラン、ククルビタシン、およびリモノイドトリテルペノイド類）、ＥＧＦ受容体（例えばＨＥＲ４）の阻害剤、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（登録商標）（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾン（ｌｅｔｒｏｚｏｎｅ）））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレート剤（例えば３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（トリアピン））、アポプチン（ニワトリ貧血ウイルスからのウイルスタンパク質３−ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナル伝達の活性化物質、ならびにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル伝達の阻害剤（例えばＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）を含む。
【０２１８】
代表的な化学療法剤は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン類、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ；エチレンイミン類およびメチルアメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＥＵ；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン��ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ニュージャージー州プリンストンのＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、フランス、アントニーのＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類；ならびにカペシタビンを含む。
【０２１９】
本発明に従って用いられることができる追加の療法剤は、光力学療法のための光増感剤、例えば参照により本明細書にそのまま援用される米国公開第２００２０１９７２６２号および米国特許第５，９５２，３２９号；温熱療法のための磁性粒子、例えば参照により本明細書にそのまま援用される米国公開第２００３００３２９９５号；結合剤、例えばペプチド、リガンド、細胞接着リガンド等、ならびにより活性な細胞毒性遊離薬物に変換されることができるプロドラッグ、例えばホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。
【０２２０】
抗ＥＦＮＡ４抗体を用いる診断法に関して、薬物は、ＥＦＮＡ４発現細胞の存在をインビトロまたはインビボで検出するために用いられる検出可能な標識を含むことができる。インビボで検出可能である放射性同位体、例えばシンチグラフィー、磁気共鳴画像化、または超音波を用いて検出可能であるそれらの標識は、臨床診断適用において用いられることができる。有用なシンチグラフィー標識は、陽電子放出体およびγ放出体を含む。磁気共鳴画像化のための代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤である。超音波検出に関して、ガスまたは液体が、多孔性の無機粒子中に捕捉されることができ、それは微小な泡の造影剤として放出される。インビトロ検出に関して、有用な検出可能な標識は、蛍光体、検出可能なエピトープまたは結合剤、および放射性標識を含む。
【０２２１】
従って、本発明の一部の側面において、薬物は、画像化剤（例えば蛍光体またはＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）標識、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピューター断層撮影）標識）、またはＭＲＩ（磁気共鳴画像化）標識である。
【０２２２】
用語“標識”は、本明細書で用いられる際、“標識された”抗体を生成するように抗体に直接または間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であることができ（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学変化を触媒することができる。検出可能な標識の役目を果たすことができる放射性核種は、例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９を含む。標識は、検出不能な実体、例えば毒素であることもできるであろう。
【０２２３】
蛍光体の例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えばＡｌｅｘａ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば５−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えばＳＲ１０１）を含むが、それらに限定されない。
【０２２４】
療法用または診断用放射性同位体または他の標識（例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ標識）が、本明細書で記載されるような抗ＥＦＮＡ４抗体へのコンジュゲーションのために薬剤中に組み込まれることができる。同位体は、抗体に直接、例えば抗体中に存在するシステイン残基において結合させることができ、または抗体および放射性同位体の結合を媒介するためにキレーターが用いられることができる。放射線療法に適した放射性同位体は、α−放出体、β−放出体、およびオージェ電子を含むが、それらに限定されない。診断適用に関して、有用な放射性同位体は、陽電子放出体およびγ−放出体を含む。本発明の抗ＥＦＮＡ４抗体は、さらに、抗体の検出または療法作用を促進するために、例えば抗体のチロシン残基上でヨウ素化されることができる。
【０２２５】
放射性同位体または他の標識の例は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１４Ｃ、１５Ｎ、１５Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｅ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４Ｔｃ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１２１Ｔｅ、１２２Ｔｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２５Ｔｅ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１３３Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１５３Ｐｂ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６５Ｔｍ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９７Ｐｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２４Ａｃ、および２２５Ａｃを含むが、それらに限定されない。
【０２２６】
ＩＩ．Ｄ．ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法
本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製するための方法も、提供される。例えば、本明細書で開示されるようなＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを生成するためのプロセスは、（ａ）リンカーを薬物部分に連結し；（ｂ）そのリンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートさせ；そして（ｃ）その抗体−薬物コンジュゲートを精製することを含むことができる。
【０２２７】
一例において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）リンカー−薬物部分（例えばＡｃＢｕｔ−ＣＭ）を抗ＥＦＮＡ４抗体またはその抗原結合断片に添加し、ここで抗体の濃度は、１〜２５ｍｇ／ｍｌの範囲であることができ、リンカー−薬物部分は、約１〜１５対１の抗ＥＦＮＡ４抗体の範囲のモル比であり；（ｂ）リンカー−薬物部分および抗ＥＦＮＡ４抗体を、非求核性、タンパク質適合性の約７〜９の範囲のｐＨを有する緩衝溶液中でインキュベートして単量体性抗体−薬物コンジュゲートを生成し、ここで、その溶液は、さらに（ｉ）適切な有機性共溶媒、および（ｉｉ）少なくとも１種類のＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を有する添加剤を含有し、ここで、そのインキュベーションは、約０℃〜約４５℃の範囲の温度で、約１分間〜約２４時間の範囲の期間の間実施され；そして（ｃ）工程（ｂ）において生成されたコンジュゲートに、ＤＡＲ１〜１２を有する抗体−薬物コンジュゲートを分離するためのクロマトグラフィー分離プロセスを施すことにより調製されることができ；未コンジュゲート抗ＥＦＮＡ４抗体、リンカー−薬物部分、および凝集したコンジュゲートからの１０％未満の低コンジュゲート率（ｌｏｗ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＦ）を提供する。
【０２２８】
本発明の一部の側面において、リンカー−薬物部分が、抗ＥＦＮＡ４抗体に添加され、ここで、抗体は約．０１〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２〜約３ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約３〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約４〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約５〜約６ｍｇ／の濃度を有し、またはここで抗体は約６〜約７ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約７〜約８ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約８〜約９ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約９〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１０〜約１１ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１１〜約１２ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１２〜約１３ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１３〜約１４ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１４〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１５〜約１６ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１６〜約１７ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１７〜約１８ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１８〜約１９ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１９〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２０〜約２１ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２１〜約２２ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２２〜約２３ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２３〜約２４ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約２４〜約２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、またはここで抗体は１０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度を有する。前記の抗体の範囲で用いられる場合、用語“約”は、＋／−０．５ｍｇ／ｍｌを意味する。
【０２２９】
本発明の一部の側面において、リンカー−薬物部分が、抗ＥＦＮＡ４抗体に添加され、ここで、リンカー−薬物部分対抗ＥＦＮＡ４抗体は、２〜３対１のモル比、または３〜４対１のモル比、または４〜５対１のモル比、または５〜６対１のモル比、または６〜７対１のモル比、または７〜８対１のモル比、または８〜９対１のモル比、または９〜１０対１のモル比、または１０〜１１対１のモル比、または１１〜１２対１のモル比、または１２〜１３対１のモル比、または１３〜１４対１のモル比、または１４〜１５対１のモル比である。本発明の一部の側面において、リンカー−薬物部分は、抗ＥＦＮＡ４抗体に、約４〜４．５対１のモル比で添加され、それにより望ましくないより高いＤＡＲの抗体−薬物コンジュゲートを減少させる。例えば、リンカー−薬物部分は、抗ＥＦＮＡ４抗体に、約４〜４．５対１のモル比で添加される。未コンジュゲート抗体、低いＤＡＲおよび高いＤＡＲの抗体−薬物コンジュゲートを低減するために、リンカー−薬物部分対抗体の他の範囲が用いられることもできる。
【０２３０】
本発明の一部の側面において、リンカー−薬物部分が、抗ＥＦＮＡ４抗体に添加され、ここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約２重量％〜約３重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約３重量％〜約４重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約４重量％〜約５重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約５重量％〜約６重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約６重量％〜約７重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約７重量％〜約８重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約重量８％〜約９重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約９重量％〜約１０重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の約１０重量％〜約１１重量％である。前記のリンカー−薬物部分対抗体（重量により５）の範囲で用いられる場合、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。
【０２３１】
本発明の一部の側面において、リンカー−薬物部分が、抗ＥＦＮＡ４抗体に添加され、ここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の２重量％〜３重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の３重量％〜４重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の４重量％〜５重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の５重量％〜６重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の６重量％〜７重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の７重量％〜８重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の８重量％〜９重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の９重量％〜１０重量％であり、またはここで薬物は抗ＥＦＮＡ４抗体の１０重量％〜１１％重量％である。
【０２３２】
本発明の一部の側面において、上記の工程（ｂ）（ｉｉ）において記載されているインキュベーションは、約０℃〜約５℃の範囲の温度で、または約０℃〜約４℃の範囲の温度で、または約５℃〜約１０℃の範囲の温度で、または約１０℃〜約１５℃の範囲の温度で、または約１５℃〜約２０℃の範囲の温度で、または約２０℃〜約２５℃の範囲の温度で、または約２５℃〜約３０℃の範囲の温度で、または約３０℃〜約３５℃の範囲の温度で、または約３５℃〜約４０℃の範囲の温度で、または約４０℃〜約４５℃の範囲の温度で実施される。前記の温度範囲で用いられる際、用語“約”は、＋／−１℃を意味する。
【０２３３】
本発明の一部の側面において、上記の工程（ｂ）（ｉｉ）において記載されているインキュベーションを、コンジュゲーション反応の少なくとも約５０％の完了、例えば少なくとも約６０％の完了、少なくとも約７０％の完了、少なくとも約８０％の完了、少なくとも約９０％の完了、少なくとも約９５％の完了、または少なくとも約９９％の完了のために十分な時間の間進行させる。従って、反応を、少なくとも約１分間〜約５分間進行させることができる。より長い時間も、コンジュゲートの凝集が受け入れられるレベルのままである限り、許容可能である。本発明の一部の側面において、反応は、約１分間でほぼ完了しており、その短い期間は、先行する方法を越える向上である。
【０２３４】
本発明の一部の側面において、上記の工程（ｃ）において、上記の工程（ｂ）の抗体−薬物コンジュゲートは、約１〜約１２の範囲の平均ＤＡＲ、例えば約２〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約６の範囲の平均ＤＡＲ、または約５〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約６〜約８の範囲の平均ＤＡＲ、または約７〜約９の範囲の平均ＤＡＲ、または約８〜約１０の範囲の平均ＤＡＲ、または約９〜約１１の範囲の平均ＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物を選択するためのクロマトグラフィー分離プロセスを施される。一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、約１の平均ＤＡＲ、または約２の平均ＤＡＲ、約３の平均ＤＡＲ、または約４の平均ＤＡＲ、または約５の平均ＤＡＲ、または約６の平均ＤＡＲ、または約７の平均ＤＡＲ、または約８の平均ＤＡＲ、または約９の平均ＤＡＲ、または約１０の平均ＤＡＲ、または約１１の平均ＤＡＲを有することができる。前記の平均ＤＡＲの範囲で用いられる際、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。
【０２３５】
一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、約３〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲを有することができる。
【０２３６】
一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、３〜５の範囲の平均ＤＡＲ、３〜４の範囲の平均ＤＡＲ、または４〜５の範囲の平均ＤＡＲを有することができる。
【０２３７】
一部の側面において、抗体−薬物コンジュゲートは、約３．０の平均ＤＡＲ、または３．０の平均ＤＡＲ、または３．１の平均ＤＡＲ、または３．２の平均ＤＡＲ、または３．３の平均ＤＡＲ、または３．４の平均ＤＡＲ、または３．５の平均ＤＡＲ、または３．６の平均ＤＡＲ、または３．７の平均ＤＡＲ、または３．８の平均ＤＡＲ、または３．９の平均ＤＡＲを有する。本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、約４．０の平均ＤＡＲ、または４．０の平均ＤＡＲ、または４の平均ＤＡＲ、または４．１の平均ＤＡＲ、または４．２の平均ＤＡＲ、または４．３の平均ＤＡＲ、または４．４の平均ＤＡＲ、または４．５の平均ＤＡＲ、または４．６の平均ＤＡＲ、または４．７の平均ＤＡＲ、または４．８の平均ＤＡＲ、または４．９の平均ＤＡＲ、または５．０の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０２３８】
本発明の別の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、１２以下の平均ＤＡＲ、１１以下の平均ＤＡＲ、１０以下の平均ＤＡＲ、９以下の平均ＤＡＲ、８以下の平均ＤＡＲ、７以下の平均ＤＡＲ、６以下の平均ＤＡＲ、５以下の平均ＤＡＲ、４以下の平均ＤＡＲ、３以下の平均ＤＡＲ、２以下の平均ＤＡＲ、または１以下の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０２３９】
本発明の他の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチおよび／または配合物は、１１．５以下の平均ＤＡＲ、１０．５以下の平均ＤＡＲ、９．５以下の平均ＤＡＲ、８．５以下の平均ＤＡＲ、７．５以下の平均ＤＡＲ、６．５以下の平均ＤＡＲ、５．５以下の平均ＤＡＲ、４．５以下の平均ＤＡＲ、３．５以下の平均ＤＡＲ、２．５以下の平均ＤＡＲ、１．５以下の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。
【０２４０】
本発明の一部の側面において、上記の工程（ｃ）において、上記の工程（ｂ）の抗体−薬物コンジュゲートは、薬物の重量により約２％〜約１０％の範囲の装填、例えば薬物の重量により約２％〜約４％の範囲の装填、または薬物の重量により約３％〜約５％の範囲の装填、または薬物の重量により約４％〜約６％の範囲の装填、または薬物の重量により約５％〜約７％の範囲の装填、または薬物の重量により約６％〜約８％の範囲の装填、または薬物の重量により約７％〜約９％の範囲の装填、または薬物の重量により約８％〜約１０％の範囲の装填を有する抗体−薬物コンジュゲートを選択するためのクロマトグラフィー選択プロセスを施される。前記の薬物装填の範囲で用いられる際、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。
【０２４１】
本発明の一部の側面において、上記の工程（ｃ）において、上記の工程（ｂ）の抗体−薬物コンジュゲートは、約１０％未満、例えば１０％未満、または約９％未満、または９％未満、または約８％未満、または８％未満、または約７％未満、または７％未満、または約６％未満、または６％未満、または約５％未満、または５％未満、または約４％未満、または４％未満、または約３％未満、または３％未満、または約２％未満、または２％未満、または約１％未満、または１％未満、または０％の低コンジュゲート率（ＬＣＦ）を有する抗体−薬物コンジュゲートを選択するために、クロマトグラフィー分離を施される。本発明の一部の側面において、０％より上のＬＣＦが意図されているが、１０％未満が望ましい。ＬＣＦの前記の記載において、用語“約”は、示された百分率の＋／−０．５％を意味する。本発明の一部の側面において、例えばリンカー−薬物部分の混合している渦の中央部分中への添加により部分的に達成されるような、高度な撹拌および激しい混合が、リンカー−薬物部分の添加の間に実施され、それは低未コンジュゲート率の達成において役に立ち、それは先行する方法を超える向上である。
【０２４２】
本発明の文脈において、モノマー性抗体−薬物コンジュゲートは、抗体の著しい凝集を伴わずにあらゆる数の薬物分子に連結またはコンジュゲートされた単一の抗体を指す。未コンジュゲート抗体または著しく低いコンジュゲートの（ｕｎｄｅｒ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体を有する所与の集団中の抗体の百分率は、低コンジュゲート率と呼ばれる。凝集した形態とは対照的なコンジュゲートの単量体形態は、重要な療法的価値を有し、ＬＣＦの最小化および凝集の実質的な低減は、ＬＣＦがより高度にコンジュゲートした比率（ｍｏｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＨＣＦ）と競合するのを防ぐことにより、結果として抗体出発物質の療法的に意味のある方式での利用をもたらす。
【０２４３】
カリケアマイシン類を含む多くの薬物の疎水性の性質は、結果として抗体−薬物コンジュゲートの凝集をもたらし得る。より高い薬物コンジュゲート（低減したＬＣＦ）および減少した凝集を有する単量体性抗体−薬物コンジュゲートを製造するために、コンジュゲーション反応は、（ｉ）共溶媒としてのエタノールおよび（ｉｉ）少なくとも１種類のＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を有する添加剤を含有する非求核性、タンパク質適合性の緩衝溶液中で実施されることができる。他のタンパク質適合性有機性共溶媒、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、ＤＭＦおよびＤＭＳＯが用いられることもできる。有機性共溶媒の一部または全部は、薬物をコンジュゲーション混合物中に移すために用いられる。有用なＣ６〜Ｃ１８カルボン酸は、デカン酸、オクタン酸もしくはカプリル酸、またはその塩類を含む。本発明の一側面において、カルボン酸は、デカン酸、または対応する塩類、例えばデカン酸ナトリウムである。少なくとも１種類のＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を有する添加剤の代表的な量は、２０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜９０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜８０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。Ｃ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩の濃度は、１５０〜３００ｍＭまで増大することができ、共溶媒の濃度は１〜１０％まで下げられることができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の比較可能なほどに活性化されたエステルを用いた抗体−薬物コンジュゲートの調製のための有用な緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝剤）を含む。コンジュゲーション反応において用いられる緩衝溶液は、遊離のアミンおよび求核種を実質的に欠いているべきである。別のアプローチとして、コンジュゲーション反応は、ｔ−ブタノールを含有し、追加の添加剤を含まない、非求核性、タンパク質適合性の緩衝溶液中で実施されることができる。例えば、米国特許第５，７１２，３７４号および第５，７１４，５８６号を参照、それは参照により本明細書にそのまま援用される。コンジュゲーションのための追加の方法およびカリケアマイシン含有コンジュゲートは、米国特許第５，７３９，１１６号および第５，８７７，２９６号において記載されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。
【０２４４】
コンジュゲートの形成に関する最適な反応条件は、温度、ｐＨ、リンカー−カリケアマイシン部分の入力、および添加剤の濃度のような反応変数の変動により経験的に決定されることができる。他の薬物のコンジュゲーションに適した条件は、当業者により、過度の実験操作なしで決定されることができる。
【０２４５】
抗体−薬物コンジュゲートを調製するための他の方法は、様々な刊行物において記載されてきた。例えば、化学修飾が、抗体において、リジン側鎖のアミンにより、またはコンジュゲーション反応が起こるために鎖間ジスルフィド結合を還元することにより活性化されたシステインのスルフヒドリル基により（どちらでもよい）なされることができる。例えば、Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005およびGentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004を参照。定められた化学量論を有する特定の薬物コンジュゲーションに関する抗体の特定の部位において操作された反応性システイン残基も、記載されてきた。例えば、Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008を参照。トランスグルタミナーゼおよびアミン（例えば反応性アミンを有する、またはそれに結合した細胞毒性剤）の存在下でのポリペプチド操作により反応性にされたアシル供与体グルタミン含有タグまたは内在性のグルタミン（すなわち、アシル供与体として共有結合を形成する能力）を用いたコンジュゲーションも、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０５９８８２号において記載されている。
【０２４６】
抗体−薬物コンジュゲートあたりの薬物分子の数をさらに増大させるために、薬物は、直鎖または分枝状ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされることができる。ＰＥＧ単量体は、式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−のものである。薬物および／またはペプチド類似体は、ＰＥＧに直接または間接的に、すなわち適切なスペーサー基、例えば糖類を通して結合していることができる。ＰＥＧ−抗体−薬物組成物は、インビボでの薬物安定性および標的部位への送達を促進するために、追加の親油性および／または親水性部分を含んでいることもできる。ＰＥＧ含有組成物を調製するための代表的な方法は、取り分け米国特許第６，４６１，６０３号；第６，３０９，６３３号；および第５，６４８，０９５号において見付けられることができる。
【０２４７】
例えば、抗体−カリケアマイシンコンジュゲート中のカリケアマイシンの量を増大させるために、抗体は、カリケアマイシンとのコンジュゲーションの前に、例えばＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＢＡ、またはＰＥＧ−ビス−マレイミドを用いてＰＥＧにコンジュゲートされる。ＰＥＧを用いて調製された抗体−薬物コンジュゲートは、標的抗原に関する低減した結合親和性を示す可能性があるが、なお増大した薬物装填の結果として有効である。
【０２４８】
コンジュゲーションの後、上記の工程（ｃ）のクロマトグラフィー分離において、コンジュゲートは、従来法により、未コンジュゲート反応物および／またはコンジュゲートの凝集形態から分離されることができる。これは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、クロマトフォーカシング（ＣＦ）ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００クロマトグラフィーのようなプロセスを含むことができる。クロマトグラフィー分離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって成し遂げられることもでき、それは、（１）ＬＣＦ含有率ならびに凝集体を効率的に低減する能力；（２）大きい反応量への適応；および（３）生成物の最小限の希釈を含む、ＳＥＣを越えるいくつかの利点を与える。適切なＨＩＣ媒体は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ  ＨＩＣ媒体を含む。
【０２４９】
本発明の一部の側面において、クロマトグラフィー分離は、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体を用いて実施される。実施例６において記載されるようなカスタマイズされた勾配を用いる場合、カラムに結合したままであるより高いＤＡＲの種が除去され、それは先行する方法を越える向上である。
【０２５０】
一部の側面において、精製プロセスは、濃縮および配合のための、遠心分離細胞除去工程、場合によりプロテインＡ親和性捕捉工程、続いて１つまたは２つの直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）クロマトグラフィー仕上げ工程、ウイルス濾過工程、および接線流濾過工程を含むことができる。
【０２５１】
典型的な抗ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ抗体−薬物コンジュゲートの調製は、１モルの抗体あたり３〜５モルのＣＭ、例えば抗体あたり３〜４モルのＣＭ、または抗体あたり４〜５モルのＣＭを含有する、優勢に（約９５％）コンジュゲートした抗体を含有する。インビボ研究において、薬物装填に関するこのモル範囲で調製されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、最小限の毒性を伴って非常に有効である。
【０２５２】
ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ抗体−薬物コンジュゲートは、実験室規模（１０〜２００ｍｇ）において再現性よく調製されてきた。ｐｇ  ＣＭ／ｍｇモノクローナル抗体として表されるＤＡＲまたは薬物装填は、ＣＭ濃度(μｇ／ｍＬ）を抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）で割ることにより決定される。これらの値は、２８０ｎｍ（抗体）および３１０ｎｍ（カリケアマイシン）におけるコンジュゲート溶液のＵＶ吸光度を測定することにより決定される。これは平均薬物装填であること、および実際の薬物装填はその平均薬物装填の値を中心とした準ガウス分布であること、すなわち抗体の一部は平均よりも高く装填されており、抗体の一部は平均よりも低く装填されていることを特筆することは、重要である。既知の抗体−カリケアマイシンコンジュゲート（例えばＣＭＣ−６７６およびＣＭＣ−５４４）と比較した場合、ＤＡＲ分布が非常に狭く、（最も望ましい）３〜５ＤＡＲの種が全体の約７５％を構成する。未コンジュゲート抗体（低コンジュゲート率またはＬＣＦ）は、分析的ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高性能液体クロマトグラフィー）を用いて測定されることができる。この値は、抗体上のＣＭ分布の尺度であり、一般に投与されるＣＭの量に影響を及ぼさない。ＥＬＩＳＡを用いて測定され得る未コンジュゲートＣＭは、抗体にコンジュゲートしていないＣＭの量を指し、総ＣＭのパーセントとして表される。薬物装填アッセイは、未コンジュゲートＣＭおよびコンジュゲートしたＣＭを識別しない。未コンジュゲートＣＭの量は、薬物装填アッセイを用いる場合は検出不能であるか無視できるほどであり、従ってこれらのアッセイはコンジュゲートしたＣＭの量を有効に測定する。
【０２５３】
ヒト化ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ抗体−薬物コンジュゲートの放出および安定性試験に関してアッセイするために、分析法が用いられることができる。コンジュゲートは、同一性（ＩＥＦ）、強度（総タンパク質および総ＣＭ装填）、純度（未コンジュゲートＣｍ、低コンジュゲート抗体、凝集体含有量および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および免疫親和性（抗原結合ＥＬＩＳＡ）に関して評価されることができる。当業者に既知の追加のアッセイが用いられることができる。これらのアッセイを用いて、バッチ間の一致性が商業的製造において維持されることができる。
【０２５４】
ＩＩＩ．ＥＦＮＡ抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ
本発明はさらに、ＥＦＮＡ結合活性、細胞表面上に存在するＥＦＮＡ４抗原への結合後の細胞内在化、および対象中のＥＦＮＡ４発現細胞に対する標的化を含む、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの活性を特性付けるためのインビトロおよびインビボのアッセイを開示する。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、抗体またはその抗原結合断片の側面を中和する、または枯渇させることにより特性付けられる。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、代替の薬物の有効性の欠如と比較した場合の特定の薬物の予想外の有効性により特性付けられる。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、その薬物と同じ作用様式を有する標準治療の療法剤より性能が優れていることとして特性付けられる。
【０２５５】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートのＥＦＮＡ４抗原または他のＥＦＮＡ抗原への結合を検出するための技法は、当該技術で既知であり、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを含む。追加の代表的な技法は、遠心分離、親和性クロマトグラフィーおよび他の免疫化学的方法を含む。例えば、Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, 米国ニュージャージー州トトワ; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, アムステルダム/ニューヨークを参照。抗原結合アッセイは、単離されたＥＦＮＡ４抗原またはＥＦＮＡ４発現細胞を用いて実施されることができる。
【０２５６】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの結合特異性は、結合エピトープの定義、すなわち、抗原結合に参加する非隣接残基を含む残基の同定、および／または抗原結合に影響を及ぼす残基の定義によりさらに記載されることができる。
【０２５７】
ＥＦＮＡ発現細胞によるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの内在化は、ＥＦＮＡ発現細胞の表面に結合した抗体またはコンジュゲートの量を時間の経過にわたって観察することによりアッセイされることができる。選択されたＥＦＮＡリガンドまたはそれらのイソ型は、可溶性形態で存在することができ、少なくとも一部のＥＦＮＡ４は、おそらく細胞表面と会合したままであり、それにより本明細書で開示される抗体の内在化を可能にする。従って、本発明の抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＥＦＮＡ４を発現する細胞により内在化されることができる。例えば、腫瘍開始細胞の表面上のＥＦＮＡ４に結合する抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞により内在化されることができる。
【０２５８】
ＥＦＮＡ４抗体の内在化は、細胞がＥＦＮＡ４抗体およびサポリン毒素にコンジュゲートしている二次抗体Ｆａｂ断片と共にインキュベートされる機能的アッセイを用いて評価されることができる。次いで、細胞の生存度が、あらゆる適切な方法により、抗体内在化を示す細胞性細胞毒性を用いて測定される。実施例５を参照。
【０２５９】
本発明の一部の側面において、開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、最も広い意味で用いられる際の“拮抗薬”、すなわち、本明細書で開示される天然の標的の生物学的活性またはその転写もしくは翻訳を部分的にまたは完全に遮断、阻害、または中和するあらゆる分子である。用語“阻害する”または“中和する”は、本明細書で本発明の抗体の生理活性に関して用いられる際、生物学的活性を含むがそれに限定されない阻害されているものの例えば進行または重症度に実質的に拮抗する、それを禁じる（ｐｒｏｈｉｂｉｔ）、予防する、抑制する、遅くする、混乱させる、排除する、停止する、低減する、または逆行させる抗体の能力を意味する。例えば、本発明の一部の側面において、抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの内在化の際に細胞の殺傷を促進する。
【０２６０】
より詳細には、中和抗体または中和性拮抗薬という用語は、ＥＦＮＡリガンドに結合し、またはそれと相互作用し、リガンドのその結合パートナー（例えばＥＰＨＡ受容体）への結合または会合を妨げ、それにより、そうでなければ分子の相互作用の結果もたらされていたであろう生物学的応答を阻止する抗体または拮抗薬を指す。ＥＦＮＡ４に関して、中和抗体または拮抗薬は、好ましくはＥＦＮＡ４のＥＰＨＡ４に結合する能力を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはより大きく減少させるであろう。この減少した活性は、当該技術で認められている技法を直接用いて測定されることができ、またはそのような低減がＥＰＨＡ４受容体活性に対して有するであろう影響により測定されることもできることは、理解されるであろう。
【０２６１】
本発明の他の側面において、本発明の抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、枯渇化抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）であることができる。枯渇化抗体という用語は、細胞表面上またはその付近のＥＦＮＡ４に結合して、またはそれと会合して、（例えば補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞性細胞傷害により）細胞の死または排除を誘導、促進する、または引き起こす抗体を指す。好ましくは、枯渇化抗体は、定められた細胞集団中の腫瘍永続化細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去する、排除する、または殺すことができるであろう。
【０２６２】
機能的アッセイは、抗体−薬物コンジュゲートの抗癌活性、例えば、既存の癌細胞を破壊する能力、または癌細胞の増殖を遅くする、もしくは妨げる能力を評価するための方法も含む。本発明の抗体−薬物コンジュゲートにより標的化される癌は、癌腫ならびに造血器悪性疾患、例えば白血病およびリンパ腫を含め、対象中のあらゆる組織の原発および転移腫瘍および癌腫の両方を含む。
【０２６３】
増殖阻害活性を有するＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＥＦＮＡ４発現細胞を排除する、またはＥＦＮＡ発現癌細胞の増殖を予防もしくは低減することができる。細胞増殖阻害の迅速なインビトロ評価のための代表的な方法は、Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98において記載されている。
【０２６４】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、核ＤＮＡ分解、核分解および凝縮、膜の完全性の喪失、および食作用により特性付けられる細胞死、例えばプログラム細胞死を誘導する能力を含むこともできる。細胞を評価するための代表的なアッセイは、Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885において記載されている。
【０２６５】
例えば、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの細胞毒性をインビトロで評価するため、ＥＦＮＡ４発現癌細胞および対照細胞をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの存在下で培養し、別に遊離薬物と共に培養する。それぞれの薬剤の細胞毒性は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として報告され、それは、未処理の対照と比較して細胞培養物の５０％低減を引き起こすコンジュゲートとしてまたは遊離薬物として与えられた薬物の量である。培養物中の細胞の数は、薬物暴露後に生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて決定される。
【０２６６】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの細胞毒性をインビボで評価するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて様々な癌細胞の皮下注射により腫瘍が用意される。ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートおよび対照化合物は、例えば週２回２週間（ｑ４ｄｘ４）の腹腔内注射により腫瘍を有するマウスに投与されることができる。測定可能な療法成績は、腫瘍細胞増殖の阻害を含む。実施例８参照。
【０２６７】
さらに、本発明は、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）を含む腫瘍細胞および／または関係する新生物の増殖、伝播または生存を、例えば抗ＥＦＮＡ４抗体または投与および送達の方法に応じて、選択された経路を作動させる、もしくはそれに拮抗する、または特定の細胞を排除することを含む様々な機序により、枯渇させる、静める、中和する、排除する、または阻害することができるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを提供する。実施例９参照。
【０２６８】
本明細書で用いられる際、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）という用語は、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；すなわち、癌幹細胞またはＣＳＣ）および高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）の両方を包含し、それは共に、一般にバルク腫瘍または塊の独特の亜集団（すなわち０．１〜４０％）を含む。本開示の目的に関して、腫瘍永続化細胞および癌幹細胞という用語は均等であり、本明細書において互換的に用いられることができる。逆に、ＴＰＣは、それらが腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現し、少数の分離された細胞の累代移植（マウスを通した２回以上の継代）により実証されるような無限の自己再生能力を有することができる点で、ＴＰｒｏｇとは異なる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によっては特性付けられない。
【０２６９】
本発明は、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）、および特に腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）を標的とし、それにより新生物性障害および過剰増殖性障害の処置、管理または予防を促進するＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを提供する。より具体的には、特定の腫瘍細胞亜集団は、ＥＦＮＡ４を発現し、おそらく癌幹細胞の自己再生および細胞生存に重要なモルフォゲンシグナル伝達の局所的な協調を修正する。従って、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、対象への投与の際にＴＩＣの頻度を低減するために用いられることができる。腫瘍開始細胞の頻度における低減は、ａ）腫瘍開始細胞の排除、枯渇、高感度化、沈静化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）もしくは阻害；ｂ）腫瘍開始細胞の増殖、拡張もしくは再発を制御すること；ｃ）腫瘍開始細胞の開始、伝播、維持、もしくは増殖を阻止すること；またはｄ）他の方法により、腫瘍形成細胞の生存、再生および／または転移を妨げることの結果として起こり得る。本発明の一部の側面において、腫瘍開始細胞の頻度における低減は、１以上の生理的経路における変化の結果として起こる。経路における変化は、腫瘍開始細胞の低減もしくは排除によるものであれ、またはそれらの可能性を改変すること（例えば誘導された分化、ニッチの混乱（ｎｉｃｈｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ））もしくは腫瘍環境もしくは他の細胞に作用を及ぼすそれらの能力に他の方法で干渉することによるものであれ、今度は、腫瘍形成、腫瘍維持および／または転移および再発を阻害することにより、ＥＦＮＡ４関連障害のより有効な処置を可能にする。
【０２７０】
腫瘍開始細胞の頻度におけるそのような低減を評価するために用いられることができる方法の中には、インビトロまたはインビボ（どちらでもよい）での限界希釈分析、好ましくは続いてポアソン分布統計を用いた数え上げまたはインビボもしくはインビボではなく腫瘍を生成する能力のような予め定められた決定的事象の頻度を評価することがある。周知のフローサイトメトリーまたは免疫組織化学的手段により頻度の値の低減を決定することも可能である。全ての前記の方法に関して、例えばDylla et al., PLoS ONE 3(6):e2428, 20082およびHoey et al, Cell Stem Cell 5:168-177, 2009を参照、そのそれぞれは、参照により本明細書にそのまま援用される。腫瘍開始細胞の頻度を計算するために用いられることができる、本発明と適合可能な他の方法は、定量化可能なフローサイトメトリーの技法および免疫組織化学染色手順を含む。代表的な方法は、実施例９において記載されている。
【０２７１】
上記で言及された方法のいずれかを用いて、次いで、本明細書の教示に従って、開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートにより提供されるＴＩＣ（またはその中のＴＰＣ）の頻度の低減を定量化することが可能である。一部の例において、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ＴＩＣの頻度を、（排除、誘導された分化、ニッチの混乱、沈静化等を含む上記で特筆された様々な機序により）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはさらには３５％低減することができる。本発明の他の側面において、ＴＩＣの頻度における低減は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％であることができる。本発明の特定の側面において、開示された化合物は、ＴＩＣの頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらに９５％低減することができる。ＴＩＣの頻度のあらゆる低減は、おそらく結果として新生物の腫瘍形成性、持続性、再発、侵攻性における対応する低減をもたらすことは、理解されるであろう。
【０２７２】
集まりつつある証拠が、腫瘍の成長、療法への抵抗性、および障害の再燃がＴＰＣにより制御されているという仮説を支持している。ＴＰＣの頻度は、腫瘍型において、または同じ腫瘍型を有する患者間で、障害の病期および／または腫瘍内の分化の程度の産物として異なり得る。ＴＰＣは、特定のタイプの癌を有する患者間でそれらの発現においてしばしば重複する細胞表面マーカーのパネル（ｐａｎｅｌｓ）を用いて同定および富化され得る。ＴＰＣは、累代移植の際に腫瘍を開始するそれらの機能的能力により最もよく定められ、一方で非腫瘍形成（ＮＴＧ）細胞は、これらの能力を欠いている。それらの独特の腫瘍開始能力に富む固形腫瘍細胞は、最初に乳癌において同定された；しかし、乳癌はある範囲の悪性病変を含む。現在までに、科学コミュニティは、特定のＥＰＣの同一性を特定の障害の亜型と関連付けることができておらず、それは群をまたいだ、および群内の両方での矛盾した結果の基礎となっている可能性があり、臨床に対する橋渡しの失敗の可能性を増大させている可能性もある。
【０２７３】
本発明は、ＴＰＣの富化を向上させる新規の細胞表面マーカーの組み合わせを提供する。特定の側面において、本発明は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＴＰＣの富化を促進する新規の細胞表面マーカーの組み合わせを提供する。本発明はさらに、ＴＮＢＣ中の新規のＴＰＣ関連療法標的としてのＥＦＮＡ４の同定を提供し；その発現レベルは、他の乳癌亜型および正常組織中よりも有意に高い。
【０２７４】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの薬物動態が、様々な動物において評価されることができ、未コンジュゲートカリケアマイシンの薬物動態と比較されることができる。例えば、これは、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、およびメスのカニクイザルにおける一回の静脈内大量瞬時投与後に行われることができる。ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの薬物動態は、一般に様々な種における低いクリアランス、低い分布の値、および長い見かけの終末相半減期により特性付けられる。未コンジュゲートカリケアマイシン誘導体の血清濃度は、定量化限界未満であることが予想される。１回量毒性範囲試験におけるこれらのコンジュゲートに関する毒性プロフィールは、比較可能な用量における他の抗体−カリケアマイシンコンジュゲートに関して得られる毒性プロフィールと類似していることが予想される。
【０２７５】
“アポトーシスを誘導する”抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成により決定されるようなプログラム細胞死を誘導する。細胞は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵巣、結腸直腸、肝臓、および肺腫瘍細胞である。様々な方法が、アポトーシスと関係する細胞事象を評価するために利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位置は、アネキシン結合により測定されることができ；ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡのラダリングにより評価されることができ；そしてＤＮＡの断片化に伴う核／クロマチンの凝縮は、低二倍体細胞におけるあらゆる増大により評価されることができる。
【０２７６】
本明細書で用いられる際、“抗体依存性細胞媒介性細胞傷害”または“ＡＤＣＣ”は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞に媒介される反応を指す。対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号において記載されているインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて評価されることができる。そのようなアッセイに関する有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞を含む。あるいは、または加えて、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば動物モデル、例えばClynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998)において開示されている動物モデルにおいて評価されることができる。
【０２７７】
“補体依存性細胞傷害”または“ＣＤＣ”は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の同族抗原と複合体形成した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163-171 (1997)において記載されているようなＣＤＣアッセイが実施されることができる。
【０２７８】
“ヒトエフェクター細胞”は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。その細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を実行することができる。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球、および好中球を含むが、それらに限定されず、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、典型的にはＩｇＧ１またはＩｇＧ３イソ型のものである。そのようなＡＤＣＣ媒介性抗体は、非ＡＤＣＣ抗体からの可変領域または可変領域断片をＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３イソ型の定常領域に対して操作することにより作製されることもできる。
【０２７９】
ＩＶ．ＥＦＮＡ抗体−薬物コンジュゲートの使用
本発明の抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、療法処置法および診断処置法を含むがそれらに限定されない様々な適用において有用である。
【０２８０】
ＩＶ．Ａ．インビトロ適用
本発明は、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを用いるインビトロの方法を提供する。例えば、開示される抗体は、単独または細胞毒性薬剤もしくは他の薬物との組み合わせのどちらにおいても、ＥＦＮＡ陽性癌細胞に特異的に結合してそのような細胞を細胞試料から枯渇させるために用いられることができる。ＥＦＮＡ発現細胞をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートと接触させることにより、アポトーシスおよび／または細胞増殖の阻害を誘導するための方法も、提供される。代表的なインビトロの方法は、本明細書において上記で“ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ”の見出しの下で記載されている。
【０２８１】
本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、それらのＥＦＮＡ４抗原に特異的に結合する能力に基づくインビトロでのＥＦＮＡ陽性細胞の検出においても有用性を有する。ＥＦＮＡ発現細胞を検出するための方法は、以下の工程を含むことができる：（ａ）細胞を有する生物学的試料を調製し；（ｂ）ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートをその生物学的試料とインビトロで接触させ、ここでその薬物は検出可能な標識であり；そして（ｃ）ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの結合を検出する。
【０２８２】
本明細書で開示されるＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍試料中の腫瘍開始細胞の頻度を低減するためにも有用である。例えば、その方法は、以下の工程：インビトロで腫瘍細胞集団（ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む）をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートと接触させ；それにより、その細胞集団中の腫瘍開始細胞の百分率が低減する；を含むことができる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によって特性付けられない。代表的な腫瘍試料は、腫瘍細胞を含有するあらゆる生物学的試料または臨床試料、例えば、組織試料、生検、血液試料、血漿、唾液、尿、精液等を含む。代表的な方法は、実施例９において記載される。
【０２８３】
ＩＶ．Ｂ．療法的適用
ＥＦＮＡ４関連障害は、乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）；卵巣癌；結腸直腸癌；白血病、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含むが、それらに限定されない。
【０２８４】
句“有効量”、“有効投与量”は、本明細書で用いられる際、あらゆる１以上の有益な、または所望の療法的結果を達成するために必要な薬物、化合物または医薬組成物の量を指す。予防的使用に関して、有益な結果または所望の結果は、障害の生化学的、組織学的および／または行動上の症状、障害の発現の間に存在するその合併症および中間的な病理学的表現型を含む、障害の危険性を排除もしくは低減すること、その重症度を低下させること、またはその開始を遅らせることを含む。療法的使用に関して、有益な結果または所望の結果は、患者の様々なＥＦＮＡ４関連障害の１以上の症状の発生率の低減もしくは改善、障害を処置するために必要とされる他の薬物療法の用量の減少、別の薬物療法の作用の増進、および／またはＥＦＮＡ４関連障害の進行の遅延のような臨床的結果を含む。
【０２８５】
一側面において、本発明は、対象におけるＥＦＮＡ４発現と関係する障害を処置するための方法を提供する。本発明は、対象におけるＥＦＮＡ４発現と関係する障害を処置するための方法における使用のための、本明細書で記載されるような抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物も提供する。本発明はさらに、対象におけるＥＦＮＡ４発現と関係する障害を処置するための医薬品の製造における、本明細書で記載されるような抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８６】
本発明の一部の側面において、対象におけるＥＦＮＡ４発現と関係する障害を処置する方法は、それを必要とする対象に、本明細書で記載されるようなＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む。ＥＦＮＡ４発現と関係する障害は、異常なＥＦＮＡ４発現、変化した、または異所性ＥＦＮＡ４発現、ＥＦＮＡ４過剰発現、および増殖性障害（例えば癌）を含むが、それらに限定されない。
【０２８７】
本発明の一側面において、障害は、以下の癌を含むがそれらに限定されない癌である：中皮腫、肝胆管（肝臓および胆管）、肝細胞癌、原発性または二次ＣＮＳ腫瘍、原発性または二次脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部の癌、黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸癌（胃癌、結腸直腸癌、および十二指腸癌）、乳癌、子宮癌、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキン性リンパ腫、脊椎軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または本明細書で開示された癌の１種類以上の組み合わせ。
【０２８８】
本発明の特定の側面において、抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを用いた標的化に適した癌は、ＥＦＮＡ４を発現している原発癌および転移癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；白血病、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４発現腫瘍を有する対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。本発明の他の側面において、対象においてＥＦＮＡ４発現癌細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。本発明の他の側面において、対象においてＥＦＮＡ４発現腫瘍の後退を誘導する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。他の側面において、本発明は、上記のような方法における使用のための、本明細書で記載されたような抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。他の側面において、本発明は、上記の方法における使用のための医薬品の製造における、本明細書で記載されたような抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８９】
従って、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを用いて処置されるべき患者は、バルク腫瘍試料のｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）およびＥＦＮＡ４抗原の高められた発現を含むがそれらに限定されないバイオマーカー発現に基づいて選択されることができ、それは結果として、腫瘍の由来または組織学ではなく富化された標的発現に関して選択された患者集団をもたらす。標的発現は、細胞染色の強度と組み合わせられた細胞染色の数の関数として測定されることができる。例えば、ＥＦＮＡ４の高発現の分類は、免疫組織化学染色により試験された細胞の３０％より多く（すなわち４０％、５０％または６０％）が（１〜４の尺度における）３＋のレベルでＥＦＮＡ４に関して陽性である患者を含み、一方でＥＦＮＡ４の中程度の発現は、細胞の２０％より多くが１＋〜２＋で染色される患者を含むことができる。標的発現は、本明細書で記載されたような腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）上のＥＦＮＡ発現を検出することにより測定されることもできる。
【０２９０】
ＴＮＢＣにおけるＥＦＮＡ４の発現は、それが他の乳癌亜型および正常組織におけるよりも高いため、特異的である。一般に、ＥＦＮＡ４のより低い発現レベルを有する腫瘍は、低クローディンＴＮＢＣの分子署名を示し、それは、患者選択戦略に関するその分類の可能性のある解釈の妥当性（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を示唆している。本発明は、ＥＦＮＡ４の増大した発現を有する患者の選択および本明細書で開示されたＥＦＮＡ４  ＡＤＣを用いた患者の処置を提供する。さらに、乳癌、卵巣癌および肝細胞癌におけるＥＦＮＡ４のコピー数の増加およびｍＲＮＡレベルの増加は、ＥＦＮＡ４の過剰発現に関する遺伝学的基礎を決定するために適切であり、患者選択戦略において用いられることができる。本発明はさらに、ＥＦＮＡ４のコピー数の増大を有する患者の選択および本明細書で開示されたＥＦＮＡ４  ＡＤＣを用いた患者の処置を提供する。本発明はさらに、ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡレベルの増大を有する患者の選択および本明細書で開示されたＥＦＮＡ４  ＡＤＣを用いた患者の処置を提供する。
【０２９１】
ＥＦＮＡ４の発現以外のバイオマーカーも、例えば多剤耐性（ＭＤＲ）に基づく腫瘍の特性付けを含め、患者の選択のために用いられることができる。ヒトの癌のほぼ５０％は、化学療法に完全に耐性であるか、または一過性にしか応答せず、その後それらはもはや一般的に用いられる抗癌薬による影響を受けないかのどちらかである。この現象はＭＤＲと呼ばれ、一部の腫瘍型により生得的に発現され、一方で他の腫瘍型は化学療法処置への暴露後にＭＤＲを獲得する。薬物排出ポンプであるＰ−糖タンパク質は、細胞毒性化学療法と関係するＭＤＲの大部分を媒介している。癌患者の腫瘍標本中に存在するＭＤＲ機序の表現型および機能分析が、特定のＭＤＲの機序（単数または複数）を特定の腫瘍型における化学療法への耐性と関連付けるために実施されることができる。
【０２９２】
本発明は、ＴＮＢＣ  ＴＰＣが、ＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋細胞間で著しく富化されているが、ＣＤ３２４−対応物においては富化されていないことを提供する。本発明はさらに、ＥＳＡおよび／またはＣＤ４６および／またはＣＤ３２４の、本明細書で開示されるＥＦＮＡ４  ＡＤＣを用いて患者を選択する、および患者を処置するためのマーカーとしての使用を提供する。本発明はさらに、ＥＳＡおよび／またはＣＤ４６および／またはＣＤ３２４の、本明細書で開示されるＥＦＮＡ４  ＡＤＣを用いてＴＮＢＣの患者を選択する、および患者を処置するためのマーカーとしての使用を提供する。
【０２９３】
癌の成長または異常増殖は、より発達した癌の形態または障害の状態への細胞内の変化を示唆するいくつかの指標のいずれか１つを指す。癌細胞または非新生物性増殖性障害の細胞の増殖の阻害は、当該技術で既知の方法、例えば遅延した腫瘍成長および転移の阻害によりアッセイされることができる。癌の成長の阻害を測定するための他の指標は、癌細胞生存における減少、（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像化法を用いて決定されるような）腫瘍体積または形態における減少、腫瘍脈管系の破壊、遅延型過敏性皮膚試験における向上した性能、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性における増大、および腫瘍特異的抗原のレベルにおける低下を含む。
【０２９４】
開示された療法的方法の所望の結果は、一般に対照またはベースライン測定と比較した場合の定量化可能な尺度である。本明細書で用いられる際、相対的な用語、例えば“向上させる”、“増大させる”または“低減する”は、対照、例えば本明細書で記載された処置の開始前の同じ個人における測定、または本明細書で開示された処置の非存在下での対照の個人（または多数の対照の個人）における測定と比較した値を示す。代表的な対照の個人は、処置されている個人と同じ形態の過剰増殖性障害に苦しんでいる個人であって、（処置される個人および対照の個人における障害の病期が比較可能であることを確実にするために）処置されている個人とおおよそ同じ年齢である個人である。
【０２９５】
療法に応答した変化または改善は、一般に統計的に有意である。本明細書で用いられる際、用語“有意性”または“有意な”は、２以上の実体間にランダムではない関係が存在する確率の統計分析に関する。関係が“有意”である、または“有意性”を有するか否かを決定するため、データの統計学的操作は“ｐ値”であることができる。使用者に定義されたカットオフ点より下に入るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされることができる。
【０２９６】
本明細書において上記で見出し“ＩＩＩ．ＥＦＮＡ抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ”の下で記載されたように、本発明は、腫瘍開始細胞を標的化するための方法も提供する。より詳細には、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞を含め、腫瘍細胞の増殖、伝播または生存を、枯渇させる、静める、中和する、排除する、または阻害することができる。
【０２９７】
従って、本明細書で開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍試料中の腫瘍開始細胞の頻度を低減するためにも有用である。例えば、その方法は、以下の工程：腫瘍細胞集団（ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む）をＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートと接触させ；それにより、その細胞集団中の腫瘍開始細胞の百分率が低減する；を含むことができる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によって特性付けられない。接触工程は、インビトロで実施されることもでき、ここで、本明細書において上記で記載されたように、腫瘍細胞集団が、生物学的試料中に含有される。あるいは、接触工程は、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの対象への投与後に起こるように、インビボで実施されることができる。
【０２９８】
ＩＶ．Ｃ．インビボ検出および診断
別の側面において、ＥＦＮＡ４発現と関係する障害を検出、診断、および／またはモニターする方法が提供される。例えば、本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体は、検出可能部分、例えば画像化剤および酵素−基質標識で標識されることができる。本明細書で記載されたような抗体は、インビボ診断アッセイ、例えばインビボ画像化（例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）または染色試薬のために用いられることもできる。
【０２９９】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの対象への投与後（ここで薬物は検出可能標識である）および結合のために十分な時間の後、抗体により結合されたＥＦＮＡ４発現細胞の生体内分布が可視化されることができる。開示された診断法は、処置法との組み合わせで用いられることができる。加えて、本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、検出および療法の二重の目的のために投与されることができる。
【０３００】
代表的な非侵襲性検出法は、シンチグラフィー（例えばＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピューター断層撮影）、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）、ガンマカメラ画像化、および直線形スキャン）、磁気共鳴画像化（例えば従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、光子磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ））、および超音波を含む。
【０３０１】
ＩＶ．Ｄ．形成
本発明はさらに、本明細書で開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートのいずれかおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物を提供する。さらに、組成物は、１種類より多くのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート（例えば、ＥＦＮＡ４の異なるエピトープを認識するＥＦＮＡ４抗体の混合物）を含むことができる。他の典型的な組成物は、ＥＦＮＡ４（例えばヒトＥＦＮＡ４）の同じエピトープ（単数または複数）を認識する１種類より多くのＥＦＮＡ４抗体もしくはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート、または異なるエピトープに結合するＥＦＮＡ４抗体もしくはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの異なる種を含む。
【０３０２】
本発明において用いられる組成物は、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で、さらに薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤を含むことができる(Remington: The Science and practice of Pharmacy 第21版, 2005, Lippincott Williams and Wilkins, 編者K. E. Hoover)。許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストラン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。“薬学的に許容可能な塩”は、本明細書で用いられる際、分子または高分子の薬学的に許容可能な有機または無機塩類を指す。薬学的に許容可能な賦形剤は、本明細書においてさらに記載される。
【０３０３】
ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの様々な配合物が、投与のために用いられることができる。本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、ニートで（ｎｅａｔ）投与されることができる。ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能な賦形剤は、様々な配合物中にあることができる。薬学的に許容可能な賦形剤は、当該技術で既知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは粘稠性を与える、または希釈剤の役目を果たすことができる。適切な賦形剤は、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩類、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透増進剤を含むが、それらに限定されない。非経口および非経口ではない薬物送達のための賦形剤ならびに配合物が、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版. Mack Publishing, 2000において述べられている。
【０３０４】
本発明の一部の側面において、これらの薬剤は、（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋内等での）注射による投与のために配合されている。従って、これらの薬剤は、薬学的に許容可能なビヒクル、例えば生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等と組み合わせられることができる。個々の投与計画、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の個人およびその個人の病歴に依存するであろう。
【０３０５】
本発明に従って用いられるＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの療法配合物は、所望の程度の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤または安定剤(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版 Mack Publishing, 2005)と、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される。許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度において受容者に非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸；塩類、例えば塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストラン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。
【０３０６】
ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを含有するリポソームは、当該技術において既知の方法、例えばEppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980;および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号において記載されている方法により調製される。増進された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成されることができる。リポソームは、定められた孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。
【０３０７】
有効成分は、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に捕捉されることもできる。そのような技法は、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版 Mack Publishing, 2005において開示されている。
【０３０８】
持続放出製剤が調製されることができる。持続放出製剤の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、形作られた物、例えば薄膜またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフェア）、スクロース酢酸イソブチル、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０３０９】
インビボ投与のために用いられる予定の配合物は、無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により容易に成し遂げられる。療法用ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０３１０】
本発明に従う組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与のための単位剤形、例えば錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐剤であることができる。
【０３１１】
固体組成物、例えば錠剤を調製するため、主要な有効成分が、医薬用キャリヤー、例えば従来の打錠用成分、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の医薬用希釈剤、例えば水と混合されて、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容可能な塩の均質な混合物を含有する固体前配合（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）組成物を形成する。これらの前配合組成物が均質であると言及する場合、その組成物が等しく有効な単位剤形、例えば錠剤、丸剤およびカプセルにすぐに細分されることができるように、有効成分が組成物全体にわたって均等に分散していることが意味されている。次いで、この固体前配合組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記のタイプの単位剤形に細分される。新規組成物の錠剤または丸剤は、延長された作用の利点を与える剤形を提供するために、コートされるか、または他の方法で調合されることができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬構成要素および外部投薬構成要素を含むことができ、後者は前者を覆う外膜の形態である。２つの構成要素は、胃における崩壊に耐える役目を果たし、内部の構成要素が完全な状態で十二指腸中へと通過することまたはその放出が遅延することを可能にする腸溶層により隔てられていることができる。様々な材料が、そのような腸溶層またはコーティングのために用いられることができ、そのような材料は、いくつかのポリマー性の酸ならびにポリマー性の酸のシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。
【０３１２】
適切な表面活性剤は、特に非イオン性薬剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン類（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン類（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）を含む。表面活性剤を含む組成物は、好都合には０．０５〜５％の表面活性剤を含むと考えられ、それは０．１〜２．５％であることができる。他の成分、例えばマンニトールもしくは他の薬学的に許容可能なビヒクルが、必要に応じて添加されることができることは、理解されるであろう。
【０３１３】
適切なエマルジョンは、商業的に入手可能な脂肪エマルジョン、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を用いて調製されることができる。有効成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中で溶解させることができ、あるいはそれは油（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）中で溶解させることもでき、リン脂質（例えば卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水との混合の際にエマルジョンが形成される。エマルジョンの張性を調節するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースが添加されることができることは、理解されるであろう。適切なエマルジョンは、典型的には２０％までの、例えば５〜２０％の油を含有するであろう。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含むことができ、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。
【０３１４】
エマルジョン組成物は、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートをＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されたエマルジョン組成物であることができる。
【０３１５】
吸入またはガス注入のための組成物は、薬学的に許容可能な水性もしくは有機性溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上記で述べられたような適切な薬学的に許容可能な賦形剤を含有することができる。本発明の一部の側面において、組成物は、局所または全身作用のために、経口または経鼻呼吸経路により投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容可能な溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧されることができる。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接呼吸されることができ、または噴霧装置は、フェイスマスク、テントもしくは断続的陽圧呼吸模擬装置に取り付けられることができる。溶液、懸濁液または粉末組成物は、好ましくは経口または経鼻で、配合物を適切な方法で送達する装置から投与されることができる。
【０３１６】
本発明は、本方法における使用のためのキットも提供する。本発明のキットは、本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートおよび本明細書で記載された本発明の方法のいずれかに従う使用のための説明書を含む１個以上の容器を含む。一般に、これらの説明書は、上記の療法処置のためのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの投与の記載を含む。
【０３１７】
本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの使用に関する説明書は、一般に意図される処置に関する投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば多数回用量包装）または小単位用量であることができる。本発明のキット中に供給される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えばキット中に含まれる紙シート）上に書かれた説明書であるが、機械で読み取り可能な説明書（例えば磁気または光学記憶ディスク上に保持された説明書）も許容可能である。
【０３１８】
本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装は、バイアル、ボトル、広口瓶、柔軟な包装（例えば密封されたマイラまたはプラスチックの袋）等を含むが、それらに限定されない。特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えばアトマイザー）またはミニポンプのような注入装置との組み合わせでの使用のための包装も、意図されている。キットは、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、その容器は、皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであることができる）。容器も、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、その容器は、皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも１種類の有効薬剤は、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートである。容器は、さらに第２の薬学的に有効な薬剤を含むことができる。
【０３１９】
キットは、場合により追加の構成要素、例えば緩衝剤および判断情報を提供することができる。通常は、キットは、容器およびその容器上のまたはその容器と関係するラベルまたは添付文書（単数または複数）を含む。
【０３２０】
ＩＶ．Ｅ．用量および投与
インビトロおよびインビボ適用に関して、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、有効投与量で提供または投与される。臨床の状況では、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的にのどちらかで予防的または療法的処置を成し遂げるために十分な量である。有効投与量は、１回以上の投与において投与されることができる。薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と合わせて達成される可能性があり、またはそうでない可能性もある。従って、“有効投与量”は、１種類以上の療法剤を投与する文脈において考えられることができ、単剤は、１種類以上の他の薬剤と合わせて望ましい結果が達成され得る、または達成される場合に、有効量で与えられていると考えられることができる。開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを用いたＥＦＮＡ４陽性細胞の検出に関して、本発明の組成物の検出可能な量、すなわちコンジュゲートの存在がインビトロまたはインビボで決定され得るようなコンジュゲートの用量が、対象に投与される。
【０３２１】
例えば、癌を有する対象に投与される場合、有効量は、癌細胞の細胞溶解、癌細胞の増殖の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、癌細胞抗原の低減、遅延された腫瘍成長、および／または転移の阻害を含む抗癌活性を引き出すために十分な量を含む。腫瘍の縮小は、有効性に関する臨床代用マーカーとして十分に受け入れられている。有効性に関する別の十分に受け入れられているマーカーは、無増悪生存である。ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、一般に重要な有効性パラメーターにおける少なくとも２５％の向上、例えば生存期間中央値、腫瘍進行までの時間、および全体的な奏効率における向上を示す。
【０３２２】
ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、あらゆる適切な経路により個人に投与されることができる。当業者には、本明細書で記載される実施例は、限定的であることが意図されているのではなく、利用可能な技法を説明することが意図されていることは、理解されるべきである。従って、本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体コンジュゲートは、個人に、既知の方法に従って、例えば静脈内投与、例えば大量瞬時投与としての静脈内投与またはある期間にわたる連続注入による静脈内投与で、筋内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液包内、ガス注入経由、髄腔内、経口、吸入または局所的経路により投与される。投与は、全身的、例えば静脈内投与、または局所的であることができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体配合物のための商業的に入手可能な噴霧器は、投与のために有用である。液体配合物は、直接噴霧されることができ、凍結乾燥された粉末は、再構成後に噴霧されることができる。あるいは、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、フルオロカーボン配合物および計量吸入器を用いてエアロゾル化されることができ、または凍結乾燥および製粉された粉末として吸入されることもできる。
【０３２３】
本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、部位特異的または標的化された局所送達技法により投与される。部位特異的または標的化された局所送達技法の例は、ＥＦＮＡ４抗体もしくはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの様々な埋め込み式のデポー源、または局所送達カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテル、人工移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み式の装置、部位特異的担体、直接注射、または直接適用を含む。例えば、ＰＣＴ国際公開第２０００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照。
【０３２４】
本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、注射（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋内等）による投与を含め、あらゆる適切な方法を用いて投与されることができる。ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、本明細書で記載されたように、吸入により投与されることもできる。一般に、ＥＦＮＡ４抗体およびＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの投与に関して、最初の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであることができる。本発明の目的に関して、典型的な一日投与量は、上記で言及された要因に応じて、約３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまたはより多い量までのいずれの範囲である可能性もある。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量が用いられることができる。数日またはより長い期間にわたる反復投与に関して、障害に応じて、処置は、症状の所望の抑制が起こるまで、または例えば腫瘍成長／進行もしくは癌細胞の転移を阻害するもしくは遅延させるための十分な療法レベルが達成されるまで持続する。典型的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの初期用量を投与し、続いて約１ｍｇ／ｋｇの毎週維持用量を投与すること、または続いて約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を隔週で投与することを含む。他の典型的な投与計画は、増大する容量（例えば１ｍｇ／ｋｇの初期用量および毎週またはより長い期間での１以上のより高い容量への徐々の増大）を投与することを含む。他の投与計画も、従事者が達成することを望む薬物動態的減衰のパターンに応じて有用である可能性がある。例えば、本発明の一部の側面において、週に１〜４回の投与が意図されている。他の側面において、月１回または２ヶ月ごとに１回または３ヶ月ごとに１回、ならびに毎週、２週間ごとおよび３週間ごとに１回の投与が意図されている。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされることができる。投与計画（用いられるＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを含む）は、時間の経過に伴い変動することができる。
【０３２５】
本発明の目的に関して、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの適切な投与量は、用いられるＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート（またはその組成物）、処置されるべき症状のタイプおよび重症度、薬剤が療法的目的のために投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴および薬剤への応答、投与される薬剤に関する患者のクリアランス速度、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。臨床医は、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートを、所望の結果を達成する投与量およびそれ以上に達するまで投与することができる。用量および／または頻度は、処置の過程にわたって変動することができるが、一定のままであることもできる。経験的な考慮すべき事柄、例えば半減期は、一般に投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト免疫系と適合可能である抗体、例えばヒト化抗体または完全なヒト抗体は、抗体の半減期を延長するためおよび抗体が受容者の免疫系により攻撃されるのを防ぐために用いられることができる。投与の頻度は、療法の過程にわたって決定および調節されることができ、一般に、症状の処置および／または抑制および／または改善および／または遅延、例えば腫瘍成長の阻害または遅延等に基づくが、必ずそうであるわけではない。あるいは、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの持続的連続放出配合物が、適切である可能性がある。持続放出を達成するための様々な配合物および装置が、当該技術で既知である。
【０３２６】
本発明の一部の側面において、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートに関する投与量は、そのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの１回以上の投与（単数または複数）を与えられてきた個人において経験的に決定されることができる。個人は、ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの増加する投与量を与えられる。有効性を評価するため、障害の指標が追跡されることができる。
【０３２７】
本発明の方法に従うＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの投与は、例えば受容者の生理的障害、投与の目的が療法的か予防的か、および当業者に既知の他の要因に応じて連続的または断続的であることができる。ＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であることができ、または一連の間隔の空いた用量におけることもできる。
【０３２８】
ＩＶ．Ｆ．併用療法
本発明の一部の側面において、本明細書で記載される方法は、さらに対象を療法の追加の形態により処置する工程を含む。一部の側面において、療法の追加の形態は、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、および／または追加の免疫療法を含むがそれらに限定されない追加の抗癌療法である。
【０３２９】
開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、最初の処置として、または従来の療法に非応答性である障害の処置のために投与されることができる。加えて、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、他の療法（例えば外科的切除、放射線、追加の抗癌薬等）との組み合わせで、それにより追加のもしくは増強された療法作用を引き出す、および／または一部の抗癌剤の肝細胞毒性を低減するために用いられることができる。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、追加の薬剤と同時投与もしくは同時配合されることができ、または追加の薬剤とのあらゆる順序での連続投与のために配合されることができる。
【０３３０】
併用療法に有用な代表的な薬剤は、本明細書において上記で副見出し“薬物”の下でＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの調製に有用であるものとして記載された薬物の全てを含む。本発明のＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、開示された抗ＥＦＮＡ抗体以外の抗ＥＦＮＡ抗体ならびに異なる抗原を標的とする抗体およびコンジュゲートを含め、他の療法用抗体および抗体−薬物コンジュゲートとの組み合わせで用いられることもできる。単独でまたは抗体−薬物コンジュゲートとして用いられることができる代表的な抗体は、抗５Ｔ４抗体（例えばＡ１、Ａ２、およびＡ３）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えばＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３３抗体（例えばＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、抗ＣＤ３３抗体−薬物コンジュゲート、抗ルイスＹ抗体（例えばＨｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗ＨＥＲ−２抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（ペルツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４））、抗ＣＤ５２抗体（例えばＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ））、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ））、抗ＤＮＡ／ヒストン複合体抗体（例えばｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗ＣＥＡ抗体（例えばＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗ＣＤ４７抗体（例えば６Ｈ９）、抗ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体、ＫＤＲ）抗体（例えばＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（例えばＩＮＧ−１）、抗ＦＡＰ抗体（例えばシブロツヅマブ）、抗ＤＲ４抗体（例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗プロゲステロン受容体抗体（例えば２Ｃ５）、抗ＣＡ１９．９抗体（例えばＧＩＶＡＲＥＸ（登録商標））および抗フィブリン抗体（例えばＭＨ−１）を含む。
【０３３１】
開示されたＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、処置計画の一部として細胞毒性薬剤の１以上の組み合わせと一緒に投与されることもできる。この目的のための有用な細胞毒性製剤は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシンおよびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）；ＡＢＶ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン）と交互のＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）と交互のＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニゾン）；ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキセート、エトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキセート、エトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、およびシスプラチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）；およびＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ＤＨＡＰ（シスプラチン、高用量シタラビンおよびデキサメタゾン）；ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）；ＰＶ（シスプラチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）；ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）；ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）；ＩＭ（イホスファミド、マイトマイシン）；ＩＥ（イホスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イホスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イホスファミド、シスプラチン）；ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イホスファミド、エトポシド）；ビノレルビンおよびシスプラチン；カルボプラチンおよびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）；ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ならびにＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキセート、ロムスチン、ビンクリスチン）を含む。
【０３３２】
ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、全身性抗癌薬、例えばエポチロン類（ＢＭＳ−２４７５５０、Ｅｐｏ−９０６）、タキサン類の再配合物（Ａｂｒａｘａｎｅ、Ｘｙｏｔａｘ）、微小管阻害剤（ＭＳＴ−９９７、ＴＴＩ−２３７）と、または標的化された細胞毒素、例えばＣＭＤ−１９３およびＳＧＮ−１５との組み合わせで用いられることができる。追加の有用な抗癌剤は、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、５−ＦＵ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、ＴＲＯＶＡＸ（登録商標）、アナツモマブマフェナトキス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、レトロゾール、ドセタキセル、およびアントラサイクリン類を含む。
【０３３３】
併用療法に関して、ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートおよび／または１種類以上の追加の療法剤もしくは診断剤は、意図される療法または診断の性能に適したあらゆる時間フレーム内で投与される。従って、単剤は、実質的に同時に（すなわち、単一の配合物として、または数分もしくは数時間以内に）、またはあらゆる順序で連続的に投与されることができる。例えば、単剤処置は、互いに約１年以内、例えば約１０、８、６、４、もしくは２ヶ月以内、または４、３、２もしくは１週間（単数または複数）以内、または約５、４、３、２もしくは１日（単数または複数）以内に施されることができる。第２の療法剤との組み合わせでのＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートの投与は、好ましくはどちらか単独での投与よりも大きい作用を引き出す。
【０３３４】
本発明の一部の側面において、療法の追加の形態は、１種類以上の療法剤を、本明細書で記載されたようなＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートに加えて投与することを含む。その療法剤は、第２抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２５抗体、および／または抗ＣＤ２０抗体）、血管新性阻害剤、細胞毒性剤、抗炎症剤（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、プレドニゾン、マイトマイシン、プロゲステロン、タモキシフェン、またはフルオロウラシル）を含むが、それらに限定されない。
【０３３５】
本発明の一部の側面において、１種類より多くのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートが存在していることができる。少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類の異なる、またはより多くのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートが存在していることができる。一般に、これらのＥＦＮＡ４抗体またはＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有することができる。例えば、以下のＥＦＮＡ４抗体の１種類以上が用いられることができる：ＥＦＮＡ４上のあるエピトープに向けられた第１ＥＦＮＡ４抗体およびＥＦＮＡ４上の異なるエピトープに向けられた第２ＥＦＮＡ４抗体。
【０３３６】
開示された併用療法は、相乗的療法作用、すなわち、それらの個々の作用または療法成績の合計よりも大きい作用を引き出すことができる。測定可能な療法成績は、本明細書において記載されている。例えば、相乗的療法作用は、単剤により引き出される療法作用または所与の組み合わせの単剤により引き出される療法作用の合計よりも少なくとも約２倍大きい、または少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい、または少なくとも約２０倍大きい、または少なくとも約５０倍大きい、または少なくとも約１００倍大きい作用であることができる。相乗的療法作用は、単剤により引き出される療法作用または所与の組み合わせの単剤により引き出される療法作用の合計と比較した少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％の、またはより大きい療法作用における増大として観察されることもできる。相乗作用は、それらが組み合わせで用いられた際に療法剤の低減した投与を可能にする作用でもある。
【０３３７】
別途示されない限り、詳細な記載全体を通して用いられた際に、用語“約”は、用語“約”の後の値の＋／−１％の値を意味する。
【実施例】
【０３３８】
以下の実施例は、説明目的でのみ提供されており、本発明の範囲を限定することは一切意図されていない。実際、本明細書で示された、および記載された本発明に加えた本発明の様々な修正が、当業者には前記の記載から明らかになると考えられ、それは添付された特許請求の範囲内に入る。
【０３３９】
実施例１
抗ＥＦＮＡ４抗体の生成
国際公開第２０１２／１１８５４７号において記載されているように、ＥＦＮＡ４マウス抗体は、ｈＥＦＮＡ４−ＥＣＤ−Ｆｃ、ｈＥＦＮＡ４−ＥＣＤ−Ｈｉｓ、ＥＦＮＡ４を過剰発現しているＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞の全細胞または本明細書で述べられたように調製された血漿調製物を用いた接種により産生された（ＥＣＤ−細胞外ドメイン）。免疫原は、全て商業的に入手可能な出発物質（例えば、組み換えヒトエフリン−Ａ４  Ｆｃキメラ、ＣＦ  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃３６９−ＥＡ−２００）および／または当業者に周知の技法を用いて調製された。
【０３４０】
ＥＦＮＡ４マウス抗体は、メスのマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−Ｉ、ＦＶＢ）をＥＦＮＡ４抗原の様々な製剤を用いて免疫することにより生成された。免疫原は、ＦｃコンストラクトもしくはＨｉｓタグ化ヒトＥＦＮＡ４、１０７個のＥＦＮＡ４を過剰発現している２９３細胞から抽出された膜画分、または表面上にヒトＥＦＮＡ４を過剰発現している３Ｔ３細胞全体を含んでいた。マウスは、全ての注射に関して足蹠経路により免疫された。等量のＴＩＴＥＲＭＡＸまたはミョウバンアジュバントと共に乳化された１０μｇのＥＦＮＡ４免疫原または１×１０６個の細胞もしくは細胞均等物が、免疫処置のために用いられた。免疫処置後にマウスは安楽死させられ、流入領域リンパ節（膝窩および鼠径部、肥大していた場合）が解剖され、抗体産生細胞のための源として用いられた。リンパ球は、組織粉砕機を用いたリンパ節の機械的破壊により放出された。
【０３４１】
２つの融合プロトコルの一方を用いた。第１のプロトコルにおいて、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ装置を用いた電気融合を実施し、続いてポリクローナルハイブリドーマを蒔いてスクリーニングし、続いてサブクローニングしてモノクローナルハイブリドーマを生成した。第２のプロトコルにおいて、ＢＴＸ機器を用いた電気融合を実施し、続いてハイブリドーマライブラリーをバルクで増殖させ、ハイブリドーマの単一細胞沈着を行い、続いてクローンをスクリーニングした。
【０３４２】
Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ装置融合プロトコル：融合を、Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０;Kearney et al、J. Immunol. 123: 1548-1550 (1979))から購入した非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比率で混合することにより実施した。細胞混合物を、８００ｇにおける遠心分離により穏やかにペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞を２〜４ｍＬのＰｒｏｎａｓｅ溶液で２分間より長くない時間処理した。電気融合を、融合生成装置、モデルＥＣＭ２００１（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）を用いて実施した。細胞を、平底マイクロタイタープレート中に２×１０４／ウェルで蒔き、続いて選択ＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）中で２週間インキュベートした。次いで、個々のウェルを抗ヒトＥＦＮＡ４モノクローナルＩｇＧ抗体に関してＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによりスクリーニングした。
【０３４３】
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、トランスフェクションされた２９３細胞からの精製された組み換えＥＦＮＡ４  Ｈｉｓ融合タンパク質を用いて、炭酸緩衝液中で１００ｎｇ／ウェルでコートした。プレートを４℃で一夜インキュベートし、次いで２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中３％ＢＳＡでブロッキングした。ハイブリドーマプレートからの上清をそれぞれのウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）を用いて現像し、分光光度計によりＯＤ  ４５０において分析した。
【０３４４】
陽性ウェルからのＥＦＮＡ４分泌ハイブリドーマを、限界希釈法または単一細胞ＦＡＣＳ選別により再スクリーニングおよびサブクローニングした。サブクローニングは、選択された抗原陽性ウェルに対して限界希釈プレーティングを用いて実施された。プレートを、単一コロニー増殖の存在に関して目視で調べ、次いで単一コロニーのウェルからの上清を上記の抗原特異的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、下記のようにＦＡＣＳで確認した。結果として得られたクローン集団を拡張し、凍結媒体（９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）中で凍結保存し、液体窒素中で保管した。ＥＦＮＡ４で免疫したマウスからのこの融合は、上記のＥＬＩＳＡプロトコルを用いてＥＦＮＡ４に反応性のマウスモノクローナル抗体を生成した。
【０３４５】
ＢＴＸ機器融合プロトコル：Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比率で電気融合により融合させた。電気融合は、Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、モデル４７−０３００（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて実施された。融合した細胞を、アザセリン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ９６６６）を補ったハイブリドーマ選択培地（１５％  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％  ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン、５０μΜ  ２−メルカプトエタノール、および１００μΜヒポキサンチンを含有するＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１５−０１７−ＣＭ）培地）中で再懸濁し、次いで４枚のＴ２２５フラスコに、フラスコあたり９０ｍｌの選択培地で蒔いた。次いでそのフラスコを、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベーター中に６〜７日間置く。
【０３４６】
６〜７日間増殖させたら、そのライブラリーを４８枚のＦａｌｃｏｎ  ９６ウェルＵ底プレート中に、Ａｒｉａ  Ｉ細胞選別機を用いて、ウェルあたり１細胞で蒔く。簡潔には、１５％  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００  ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン、５０μΜ  ２−メルカプトエタノール、および１００μΜヒポキサンチンを含有する培地を、４８枚のＦａｌｃｏｎ  ９６ウェルＵ底プレート中に、ウェルあたり２００ｕｌで入れる。生存可能なハイブリドーマを、Ａｒｉａ  Ｉ細胞選別機を用いて、ウェルあたり１細胞で配置し、１０〜１１日間培養し、上清をＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによりＥＦＮＡ４に関して反応性の抗体に関してアッセイする。
【０３４７】
マウス免疫グロブリンを分泌している増殖陽性ハイブリドーマのウェルを、マウスＥＦＮＡ４特異性に関して、上記のＥＬＩＳＡアッセイと類似のＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。簡潔には、９６ウェルプレート（ＶＷＲ、６１０７４４）を、炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬのマウスＥＦＮＡ４−Ｈｉｓで４℃において一夜コートした。プレートを洗浄し、２％  ＦＣＳ−ＰＢＳで３７℃において１時間ブロッキングし、すぐに使用したか、または４℃で保った。未希釈のハイブリドーマ上清を、プレート上で室温において１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：１０，０００希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて室温で１時間プローブ処理する（ｐｒｏｂｅｄ）。次いでプレートを上記のように基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ４５０において読み取る。ヒトＥＦＮＡ４に高い親和性で結合した典型的なマウス抗体Ｅ２、Ｅ５、Ｅ８、Ｅ１５、Ｅ２２、Ｅ３１、Ｅ４７、Ｅ６０、Ｅ７３、Ｅ７６、Ｅ９１およびＥ１０５のアミノ酸配列および関係する核酸配列（ＣＤＲに下線を引いた）が、国際公開第２０１２／１１８５４７号において提供されている。
【０３４８】
本発明の様々なマウス抗ＥＦＮＡ４抗体の結合特徴を、表３において示す。その抗体は、ナノモル濃度範囲の比較的高い親和性を示し、ＥＦＮＡ４タンパク質上の少なくとも３つの異なるビン（ｂｉｎｓ）またはエピトープに結合する。ほとんどの抗ＥＦＮＡ４抗体は、ジスルフィド結合が完全である抗原とのみ反応し（ＮＲ）、一方でＥ２２およびＥ９１は、還元されていない抗原および還元された抗原の両方と反応した（ＮＲ／Ｒ）。Ｅ２２およびＥ９１は、それぞれ配列ＱＲＦＴＰＦＳＬＧＦＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）およびＲＬＬＲＧＤＡＶＶＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）を認識した。さらに、Ｅ５、Ｅ１５、Ｅ９１およびＥ１０５は、マウスのＥＦＮＡ４と交差反応性であり、全ての抗体は、高度に類似したカニクイザルのＥＦＮＡ４と交差反応した。抗体の中和する（すなわち受容体リガンド相互作用、特にＥＦＮＡ４−ＥｐｈＡ２相互作用を遮断する）、および／または内在化する能力も、細胞を殺す能力と共に提供される。
【０３４９】
【表３】
2016540826.tif 000018
【０３５０】
実施例２
抗ＥＦＮＡ４抗体のヒト化
国際公開第２０１２／１１８５４７号においてさらに記載されているように、実施例１からのマウス抗体の４種類を、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を用いてヒト化した。重鎖および軽鎖に関するヒトのフレームワークを、機能性ヒト生殖細胞系列遺伝子に関する配列および構造類似性に基づいて選択した。構造類似性は、Chothia et al.（上記）において記載されているように、マウスのカノニカルＣＤＲ構造を同じカノニカル構造を有するヒトの候補に対して比較することにより評価された。
【０３５１】
より詳細には、マウス抗体Ｅ５、Ｅ１５、Ｅ２２およびＥ４７を、コンピューターに支援されたＣＤＲ移植法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｉｃ．）および標準的な分子工学技法を用いてヒト化し、ヒト化抗体Ｅ５、Ｅ１５、Ｅ２２およびＥ４７（以下ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７）をそれぞれ生成した。可変領域のヒトのフレームワーク領域は、マウスのフレームワーク配列に対する最高の配列相同性およびそのカノニカル構造に基づいて選択された。分析の目的のため、ＣＤＲドメインのそれぞれに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔらの番号付けに従う。いくつかのヒト化抗体バリアントを、最適なヒト化抗体を生成するために作製し、そのヒト化抗体は一般に、ヒトのフレームワーク領域を伴うマウスのハイブリドーマからの抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を保持している。Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いて測定した際に、ＨｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７  ｍＡｂは、ＥＦＮＡ４抗原に、それらのマウスの対応物に対する親和性と類似の親和性で結合し、ｈｕＥ５は、わずかに低い親和性で結合した。
【０３５２】
分子工学手順を、当該技術で認められている技法を用いて実施した。総ｍＲＮＡを、ハイブリドーマから、製造業者のプロトコル（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って抽出した。完全なマウスのレパートリーを標的とするように設計された３２マウス特異的５’リーダー配列プライマーを含むプライマー混合物を、３’マウスＣγ１プライマーとの組み合わせで用いて、抗体重鎖の可変領域を増幅および配列決定した。同様に、マウスカッパ定常領域に特異的な単一の逆方向プライマーと組み合わせられた、Ｖｋマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計された３２  ５’Ｖｋリーダー配列プライマー混合物を用いて、カッパ軽鎖を増幅および配列決定した。ＶＨおよびＶＬ転写産物を、１００ｎｇの総ＲＮＡから、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅した。
【０３５３】
それぞれのハイブリドーマに関して、合計８つのＲＴ−ＰＣＲ反応：Ｖカッパ軽鎖に関して４つおよびＶガンマ重鎖（γ１）に関して４つを運転した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを、増幅のために用いた（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）。抽出されたＰＣＲ産物を、特異的Ｖ領域プライマーを用いて直接配列決定した。ヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴを用いて分析し、最高の配列相同性を有する生殖細胞系列のＶ、ＤおよびＪ遺伝子のメンバーを同定した。得られた配列を、ＶＢＡＳＥ２データベース(Retter et al.、上記）の分析から、ならびにＶＨおよびＶＬ遺伝子のマウス生殖細胞系列データベースに対するアラインメントにより得られたＩｇのＶおよびＪ領域の既知の生殖細胞系列ＤＮＡ配列に対して比較した。
【０３５４】
ヌクレオチド配列情報から、Ｅ５、Ｅ１５、Ｅ２２およびＥ４７の重鎖および軽鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子区画に関するデータが得られた。その配列データに基づいて、抗体のＩｇ  ＶＨおよびＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新規のプライマーセットを、組み換えモノクローナル抗体のクローニングのために設計した。続いて、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列を、マウスＩｇの生殖細胞系列配列とアラインメントした。
【０３５５】
Ｅ５、Ｅ１５、Ｅ２２およびＥ４７の重鎖および軽鎖遺伝子を同定し、その結果を下記の表４において要約する。
【０３５６】
【表４】
2016540826.tif 000019
【０３５７】
全ての４つのクローンからの得られた重鎖および軽鎖配列を、機能性ヒト可変領域配列に対してアラインメントし、相同性およびカノニカル構造に関して再調査した。重鎖および軽鎖の分析の結果を、下記で表５および６においてそれぞれ示す。
【０３５８】
【表５】
2016540826.tif 000020
【０３５９】
【表６】
2016540826.tif 000021
【０３６０】
生殖細胞系列選択およびＣＤＲ移植プロセスは、一般にそれらの結合特性を保持している抗体を提供するようであり、コンストラクトのほとんどではマウスの残基を挿入する必要性はほとんどなかった。しかし、ｈｕＥ１５において、抗体の特性を向上させるために重鎖の残基６８を変異させてＴｈｒ（Ｔ）からＬｙｓ（Ｋ）に戻した。
【０３６１】
ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７のアミノ酸配列および関係する核酸配列は、上記の表２において示されている。ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７に関するＶＨ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９において示されており、対応する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０において示されている。ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７のカッパＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３において示されており、対応する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４において示されている。
【０３６２】
実施例３
ヒト化坑ＥＦＮＡ４抗体の発現
抗ＥＦＮＡ４抗体ｈｕＥ５、ｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７を、当該技術で認められている技法および国際公開第２０１２／１１８５４７号において記載されている技法を用いて発現させ、単離した。その目的のため、両方の重鎖の合成ヒト化可変ＤＮＡ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ヒトＩｇＧＩ発現ベクター中にクローニングした。可変軽鎖断片を、ヒトＣ−カッパ発現ベクター中にクローニングした。抗体を、重鎖および軽鎖のＣＨＯ細胞中への同時トランスフェクションにより発現させた。
【０３６３】
より詳細には、抗体産生のために、マウスおよびヒト化可変遺伝子のＰＣＲ産物のヒト免疫グロブリン発現ベクター中への方向性クローニングを行った。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲにおいて用いられた全てのプライマーは、ヒトＩｇＧＩおよびＩＧＫ定常領域をそれぞれ含有する発現ベクター中への直接的なクローニングを可能にする制限部位（ＩｇＨに関してＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ＩｇＫに関してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ）を含んでいた。簡潔には、ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、続いてそれぞれＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を精製した後、発現ベクター中にライゲーションした。ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物および２５ｎｇの線状ベクターＤＮＡを含む１０μＬの総体積で実施された。コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬのライゲーション産物を用いた４２℃での熱ショックにより形質転換し、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）上に蒔いた。次いで、ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧＩ発現ベクターの同じ部位中に挿入し、一方で合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩＶＫ挿入断片を、それぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位中にクローニングした。
【０３６４】
ヒト化抗体を産生する細胞を、適切なプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の２９３ｆｅｃｔｉｎを用いたトランスフェクションにより生成した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１  １２６８）細胞を、１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、標準的な条件下で、１０％熱非働化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬペニシリンＧを補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのもの）中で培養した。
【０３６５】
一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。等量のＩｇＨおよび対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（１２．５μｇのそれぞれのベクターＤＮＡ）を、１．５ｍＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに添加した。その混合物を、室温で３０分間インキュベートし、培養プレートに均等に分布させた。上清をトランスフェクションの３日後に回収し、１０％ＦＢＳを補った２０ｍＬの新しいＤＭＥＭで置き換え、トランスフェクションの６日後に再び回収した。培養上清から細胞破砕片を、８００×ｇで１０分間の遠心分離により取り除き、４℃で保管した。組み換えキメラおよびヒト化抗体を、プロテインＧビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
【０３６６】
実施例４
抗ＥＦＮＡ４抗体の結合特性
国際公開第２０１２／１１８５４７号において記載されているように、本発明のＥ１５、Ｅ２２およびＥ４７抗体の結合特性を表７において示す。
【０３６７】
【表７】
2016540826.tif 000022
【０３６８】
さらなる特性を、ＥＬＩＳＡを用いて決定し、抗ＥＦＮＡ４抗体ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７のエフリン−Ａ４（ＥＦＮＡ４）に対する結合特異性を、相同性のファミリーメンバーであるエフリン−Ａ１（ＥＦＮＡ１）およびエフリン−Ａ３（ＥＦＮＡ３）と共に分析した。抗体結合を、エフリン−Ａ１−Ｈｉｓ、エフリン−Ａ３−ｈｕＦｃ、エフリン−Ａ４−ｈｕＦｃおよびエフリン−Ａ５−ｈｕＦｃ（全てＲ＆Ｄからのもの）をＢｉｏＯｎｅ  Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）プレート上にＰＢＳ中で４℃において一夜コートしたものを用いた直接ＥＬＩＳＡにより決定した。ビオチン標識されたｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７を、そのプレート上で室温において２．５時間インキュベートし、ストレプトアビジンＨＲＰを用いて、緩衝するヒトＩｇＧシグナルの非存在下でビオチン標識抗体からのシグナルを現像した。図３Ａにおいて示されているデータは、ｈｕＥ２２はＥＦＮＡ４に結合するがＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３またはＥＦＮＡ５には結合しないことを示している。図３Ｂにおいて示されているデータは、ｈｕＥ４７はＥＦＮＡ４に結合するがＥＦＮＡ１またはＥＦＮＡ３には結合しないことを示している。
【０３６９】
ヒト化抗ＥＦＮＡ４抗体ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の結合を、ＥＦＮＡ４発現細胞に対してフローサイトメトリーにより評価した。接着細胞を、ＴｒｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１２６０４−０２１）を用いて解離させ、細胞培養培地で中和し、計数した。細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５３０７７）中に、５×１０ｅ５細胞／１００μＬ培地／ウェルで蒔いた。プレートを３００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。全ての試薬を後の工程のために氷上で維持した。それぞれのペレットを、１００μＬの、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で１０μｇ／ｍＬの一次ヒト化抗ＥＦＮＡ４抗体（ｈｕＥ２２またはｈｕＥ４７）または陰性対照抗体中で再懸濁した。プレートを氷上で３０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞のペレットを２００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で洗浄した。それぞれの細胞のペレットを、１００μＬの、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で１：５０希釈されていたＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−１１５−０９８）中で再懸濁した。プレートを氷上で３０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞のペレットを２００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で洗浄した。それぞれのペレットを、１００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で再懸濁し、２５０μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡを含有する５ｍＬポリカーボネートチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５２０５４）に移した。試料を、試料あたり５μＬの７ＡＡＤ（Ｂ−Ｄ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５１−６８９８１Ｅ）を生存度染色剤として用いて、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３７０】
抗体結合を、非常に低レベルのＥＦＮＡ４を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ親細胞およびヒトＥＦＮＡ４の高発現を可能にするベクターによるＨＥＫ２９３Ｔの安定形質移入体であるＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞に関して、上記の方法で測定した。表８は、ＥＦＮＡ４発現細胞株への抗体結合の平均チャンネル蛍光（ＭＣＦ）を示す。ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞（過剰発現細胞）に強く結合するが親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には結合しないことにより、ＥＦＮＡ４標的に関する特異性を実証している。
【０３７１】
【表８】
2016540826.tif 000023
【０３７２】
内因性ＥＦＮＡ４発現癌細胞株：乳房細胞株ＢＴ−４８３、ＨＣＣ２０２およびＭＸ−１、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞株ＭＥＣ１およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株Ｚ１３８を分析した。表９において示されているＭＣＦ値は、抗ＥＦＮＡ４抗体ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の、その抗原の内因性発現を有する様々な癌細胞株に結合する能力を示している。
【０３７３】
【表９】
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【０３７４】
実施例５
抗ＥＦＮＡ４抗体の内在化およびインビトロ細胞毒性
ｈｕＥ２２の内在化を、細胞を一次抗体およびサポリン毒素にコンジュゲートしている二次抗体（抗原結合断片、Ｆａｂ）と共にインキュベートする機能的アッセイで評価した。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、一夜インキュベートし、次いで、それぞれサポリンコンジュゲート抗ヒトＦａｂ断片（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＩＴ−５１）を１．５：１の二次：一次抗体のモル比で伴うｈｕＥ２２またはヒトＩｇＧ１対照抗体の用量応答に４日間曝露した。次いで、細胞生存度を、ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ５４３０）を用いて測定し、細胞生存度を未処理の細胞と比較して５０％阻害する一次抗体濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア上でのロジスティック非線形回帰により計算した。
【０３７５】
細胞毒性は、一次抗体、例えばｈｕＥ２２が標的細胞中に内在化し、サポリンコンジュゲートＦａｂ断片を細胞中に運び込む場合に達成される。表１０において示されているように、ｈｕＥ２２は、ＨＥＫ２９３Ｔ親細胞と比べて約６０倍の特異性でＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞にサポリンに媒介される細胞毒性を与え、一方で対照一次抗体は、どちらの細胞株にも有意な細胞毒性を与えなかった。ＨＥＫ２９３Ｔ親細胞において発現されているＥＦＮＡ４の低いレベルは、ｈｕＥ２２が対照抗体よりも低いＩＣ５０をもたらすことにつながった可能性がある。これらの結果は、ｈｕＥ２２抗体が標的依存性の様式で細胞中に内在化したことを実証している。
【０３７６】
【表１０】
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【０３７７】
実施例６
抗ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ抗体−薬物コンジュゲートのコンジュゲーションおよび精製
Ａ．コンジュゲーション
本発明において、抗ＥＦＮＡ４抗体ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７を、図４Ａにおいて示されているようなＡｃＢｕｔ−Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＡｃＢｕｔ−ＣＭ）ＯＳｕエステルにコンジュゲートさせ、図４Ｂにおいて示されているようなｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣを生成し、ここで、Ｘはあらゆる抗体、例えばｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７であることができる。ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、抗ＥＦＮＡ４抗体に、リジン残基を介してコンジュゲートして、薬物対抗体比（ＤＡＲ）の狭い分布を有する抗ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを生成し、ここで、ＡＤＣの約７０％〜８０％は、３〜５のＤＡＲを有し、約３〜５の範囲の平均ＤＡＲを有する。
【０３７８】
ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの生成のためのコンジュゲーション反応混合物は、１０ｍｇ／ｍｌ以下の精製されたｈｕＥ２２抗体およびＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＯＳｕエステルを、４〜４．５対１のモル比で含んでいた。高い撹拌が、ＡｃＢｕｔ−ＣＭの混合している渦への添加の間に実施された。反応ｐＨは８．３であり、他の反応構成要素の濃度は以下の通りであった：１８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、４１ｍＭデカン酸ナトリウム、および８％（ｖ／ｖ）エタノール。反応は３３℃で５分間実施された。コンジュゲーション反応が完了した後、反応混合物を、１．３体積のｐＨ８．５に調節された１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を用いて、混合しながらゆっくりと希釈した。類似の反応混合物を、ｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの生成のために用いた。
【０３７９】
Ｂ．精製
精製するため、上記の希釈された反応混合物を、図５（上の線は２８０ｎｍ、下の線は３１０ｎｍ）において示されているように、２つのバッチで、５カラム体積（ｃｖ）の０．５２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＨＩＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。カラム上に装填されたタンパク質は、３．５ｍｇ／ｍｌベッド体積であった。流速は、試料装填を通して１５ｍｌ／分であり、クロマトグラフィーの洗浄および溶離相の全体を通して２２ｍｌ／分であった。この向上した勾配は、カラムに結合したより高いＤＡＲのＡＤＣを除去する。
【０３８０】
装填の間の未結合の画分は、主に反応試薬および未コンジュゲート抗体のほとんどであり、それは廃棄された。次いで、カラムを０．３ｃｖの０．５２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄して全ての残っている試薬を除去した。次いで、１ｃｖの０．５２Ｍから０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）への段階勾配を用いて、あらゆる緩く結合した未コンジュゲート抗体を、存在する場合は低装填抗ＥＦＮＡ４−ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭと共に溶離した。次いで、主な画分を、１ｃｖの０．４Ｍから５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）への段階勾配を用いて溶離して、勾配の終了付近で３〜５のＤＡＲを有するｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを提供した。より高いＤＡＲを有するｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭコンジュゲートが存在する場合、その画分は、２ｃｖの５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）の勾配、次いで純粋な脱イオン水の溶離を用いて溶離された。脱イオン水での溶離後に結合したままであったより高いＤＡＲを有するあらゆるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭコンジュゲートは、２ｃｖの２０％エタノールを含有する１０ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて溶離された。
【０３８１】
キャピラリー等電点分画法（ｃＩＥＦ；ｉＣＥ２８０，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて、ｈｕＥ２２−ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの精製されたバッチは、狭いＤＡＲ分布を有しており、ここでＡＤＣの約７０％〜８０％、好ましくは約７５％〜８０％は、３〜５のＤＡＲを有していた。例えば、図９は、ｈｕＥ２２−ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの精製されたバッチが狭いＤＡＲ分布を有しており、ここでＡＤＣの約７８％が３〜５のＤＡＲを有していることを示している。ＤＡＲは、ＵＶ分光法により、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍにおける吸光度を測定して決定される。
【０３８２】
さらに、ｈｕＥ２２−ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの精製されたバッチは、約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲを有していた。例えば、ｈｕＥ２２−ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの精製されたバッチは、約４の平均ＤＡＲを有し、より詳細には平均ＤＡＲは約４．６であった。
【０３８３】
この向上したコンジュゲーションおよび精製プロセスは、６未満である、一部の側面において３〜５の範囲のＤＡＲを有するＡＤＣを生成した。さらに、そのプロセスは、より狭い装填の分布、例えば製品内でのより低い不均質性を生成した。コンジュゲーションおよび精製プロセスに対する向上は、さらに以下のものを含んでいた：１）ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭ対ｈｕＥ２２比を４〜４．５対１まで低下させて、より低いＤＡＲを有するＡＤＣを生成し、２）ＡｃｔＢｕｔ−ＣＭのｈｕＥ２２への添加の間に高い撹拌を実施して、低い量の未コンジュゲート抗体（遊離抗体）を有するＡＤＣを生成し、３）インキュベーション時間を６０〜９０分間と比較して２〜５分間に低減して、少ない凝集体を提供し、そして４）エタノール量を６〜８％に低減して、少ない凝集体を提供する。
【０３８４】
両方のバッチからの精製されたプールされたピークを、凍結状態での保管を促進するため、配合された緩衝液に対して２回透析した。配合された緩衝液の組成は、２０ｍＭトリス、７．５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣを、以下を用いて特性付けた：
−未コンジュゲート抗体の存在に関する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ；ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ）、図６において示されているように、遊離の抗体は精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭにおいて検出されなかった；
−凝集体および２量体の存在に関するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ，Ｗａｔｅｒｓ）、図７において示されているように、１００％単量体が存在し、凝集体または２量体は検出されなかった；
−遊離薬物の存在に関する逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＲＰ；Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−ＣＮ，Ａｇｉｌｅｎｔ）、図８において示されているように、遊離薬物は精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭにおいて検出されなかった；および
−薬物分布プロフィールのためのキャピラリー等電点分画法（ｃＩＥＦ；ｉＣＥ２８０，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）、図９において示されているように、３〜５の所望の狭いＤＡＲ分布は約７８％であり、ごく微量のＤＡＲ７以上の種が存在し、ＤＡＲ１および未コンジュゲート（ＤＡＲ０）の種は検出されなかった。
【０３８５】
類似の精製プロセスを、ｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの生成に関して用いた。下記の図１０および表１１は、凍結融解サイクルの精製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ抗体−薬物コンジュゲートの安定性への作用を示す。多数回の凍結融解において有意な変化は観察されなかった。
【０３８６】
【表１１】
2016540826.tif 000026
【０３８７】
図２９は、４ｍ／ｍおよび６ｍ／ｍのＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂの比から生成された精製されたＡＤＣ（２ｍｇ）に関する分析的ＨＩＣの比較を示す（上の線は２８０ｎｍ、下の線は３１０ｎｍ）。４ｍ／ｍのＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂ比は、４．３の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを生成し（上のパネル）、６ｍ／ｍのＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂ比は、５．２の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを生成した（下のパネル）。４ｍ／ｍを用いて生成されたＡＤＣは、低疎水性単量体として特性付けられる所望のＡＤＣのより高い収率および高疎水性凝集体として特性付けられる望ましくないＡＤＣのより低い収率を有していた。図３０は、４ｍ／ｍ（上の線）および６ｍ／ｍ（下の線）のＣＭ対ｈｕＥ２２  Ａｂの比率から生成された精製されたＡＤＣに関するさらなる分析的ＨＩＣを示す。特に、６ｍ／ｍを用いて生成されたＡＤＣ（５．２ＤＡＲの調製物）は、高疎水性種および凝集の増大した存在を有し、それは４ｍ／ｍ（４．３ＤＡＲの調製物）で生成されたＡＤＣにおいてより低かった。
【０３８８】
実施例７
抗ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣのインビトロ結合および細胞毒性
Ａ．結合アッセイ
ヒトおよびカニクイザルのＥＦＮＡ４タンパク質に関するｈｕＥ２２の結合定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、精製を容易にするためにヒスチジンタグに融合させた組み換えＥＦＮＡ４細胞外ドメインを用いて決定した。その結果は、ヒトおよびカニクイザルのＥＦＮＡ４両方に関するｈｕＥ２２の高い親和性を示した（表１２参照）。カニクイザルのＥＦＮＡ４タンパク質配列は、ヒトのＥＦＮＡ４タンパク質配列に高度に相同性であり、全体で９８％の同一性および細胞外ドメインにおいて９８％の同一性を有する。対照的に、ラットの抗原へのｈｕＥ２２の結合は検出されず、別個の研究において、マウスの抗原への結合は検出されなかった。ラットまたはマウスのＥＦＮＡ４にｈｕＥ２２が結合しないことは、おそらく定められたｈｕＥ２２エピトープ内のラットおよびマウスのＥＦＮＡ４配列中の保存されていない残基により説明される。
【０３８９】
ヒトおよびカニクイザルのＥＦＮＡ４に関するｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの結合定数を、ｈｕＥ２２と同じ結合アッセイで決定した。表１２において示されているように、ＡＤＣおよび未コンジュゲートｍＡｂ（ｈｕＥ２２）は、ヒトおよびカニクイザルの抗原両方に対して比較可能な結合定数を有していた。
【０３９０】
【表１２】
2016540826.tif 000027
【０３９１】
ｈｕＥ２２およびｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣの細胞結合および内在化を分析した。親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＥＦＮＡ４陰性）および（高レベルのヒトＥＦＮＡ４を発現するように操作された）ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４を用いた。ｈｕＥ２２およびｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣは、ＥＦＮＡ４抗原を発現する細胞に対する特異的な結合を示した。さらに、未コンジュゲートｈｕＥ２２およびｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣは、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞に対して比較可能な結合を示し、どちらの抗体も親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には結合しなかった（表１３参照）。表１２（上記）におけるＳＰＲの結果と合わせて、これらのデータは、生体コンジュゲーションプロセスはｈｕＥ２２の結合特性を変化させなかったことを示している。
【０３９２】
【表１３】
2016540826.tif 000028
【０３９３】
Ｂ．細胞毒性アッセイ
一度ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣが細胞中に内在化したら、カリケアマイシンの遊離が細胞毒性を誘発する。内在化している抗体は、典型的には分解のためにリソソーム区画に移動する。直接的な細胞毒性アッセイを用いて、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの細胞毒性応答を分析した。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４過剰発現細胞およびＨＥＫ１９３Ｔ親（ＥＦＮＡ４陰性）細胞を、透明な平底組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５３０７２）中に、ウェルあたり１８０μＬの細胞培養培地あたり５００細胞で蒔いた。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において一夜培養した。次の日に、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよび陰性非結合性対照であるｈＩｇＧ１−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣを、細胞に、１μｇ／ｍＬから出発して細胞培養培地中での半対数（ｈａｌｆ−ｌｏｇ）希釈を用いる１０点濃度曲線として、３通りで（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で９６時間インキュベートした。次いで、細胞生存度を、ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６水性非放射性細胞増殖アッセイ、カタログ番号Ｇ５４３０）を製造業者の説明書に従って用いて測定した。４０μＬの組み合わせたＭＴＳ試薬を、それぞれのウェルに添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１．５時間インキュベートした。表１４において示されているように、細胞の生存度を未処理の細胞と比較して５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア上でのロジスティック非線形回帰により計算した。図２１は、様々な濃度のｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ（白いひし形）またはｈＩｇＧ−ＡｃＢｕｔ対照ＡＤＣ（斜線付きの丸）に曝露されたＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞を示し、細胞生存度を測定し、未処理の細胞の細胞生存度に対して標準化した。
【０３９４】
表１４および図２１において示されるように、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、インビトロでＥＦＮＡ４標的発現細胞に対して用量依存性の細胞毒性応答を誘発し、細胞増殖を標的および濃度依存性の様式で阻害した。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞がｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに曝露された際、１ｎｇ/ｍＬ  ＡＤＣの濃度は細胞増殖を５０％阻害し（ＩＣ５０）、対照的に、対照ＡＤＣは１５０倍より大きく活性が低かった。データは、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの強力かつ特異的な細胞毒性活性を実証している。対照ＡＤＣおよびｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣは、ＥＦＮＡ４発現を欠いているＨＥＫ２９３Ｔ親細胞に対しては細胞毒性を誘発せず、それは特異性および抗原依存性を実証した。
【０３９５】
【表１４】
2016540826.tif 000029
【０３９６】
実施例８
抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートのインビボ有効性
実施例６において記載されたコンジュゲーションおよび精製プロセスに従って調製された抗ＥＦＮＡ４  ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの作用を、ヒト腫瘍患者由来異種移植片（ＰＤＸ）のインビボ成長においてさらに評価した。原発腫瘍切除試料を、臨床現場から、ヒト対象の保護に関する施設内審査委員会の承認に従って、そしてＨＩＰＡＡの規制に従って入手した。
【０３９７】
それぞれのモデルにおける標的ＥＦＮＡ４の発現を、２つの方法：ｍＲＮＡ抽出物を用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびタンパク質抽出物を用いたＥＬＩＳＡで測定した。表１５は、腫瘍モデルのパネルにおけるＥＦＮＡ４の標準化されたｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示す。ＥＦＮＡ４は、試験した全てのモデルで検出され、換言すれば、両方の測定結果は、腫瘍モデルＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの測定結果を超えていた。
【０３９８】
【表１５】
2016540826.tif 000030
【０３９９】
腫瘍断片は、氷上でＨｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で保管および輸送され、成長因子の専売の混合物を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）中に埋め込まれ、切除の２４時間以内にメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体中に皮下移植された。マウスを、毎日健康状態に関して、そして腫瘍増殖に関して最初に目視検査により週２回モニターした。一度腫瘍が触知可能になったら、腫瘍体積の測定を始めて腫瘍成長を追跡し、細胞の倍加時間を概算した。腫瘍体積は、方程式Ｖ＝（Ａ＊Ｂ２）／２を用いて概算され、ここでＡは長軸であり、Ｂは短軸である。腫瘍が５００ｍｍ３〜１，５００ｍｍ３の体積に達した際に、それらを研究のためおよび再移植のために回収した。系統に応じて、機械的および／または化学的解離を用いて個々の細胞を継代のために分離することができる。生きた細胞を、実験を受けていない（ｎａｉｖｅ）動物中に、動物あたり１０，０００〜５０，０００細胞で接種した。
【０４００】
有効性試験のため、腫瘍を継代試験から回収し、細胞を解離させて単一細胞懸濁液にした。調製物を、トリパンブルー排除試験を用いて生きた細胞に関して計数し、マウスあたり１０，０００〜５０，０００細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ中で接種した。ＰＤＸの差次的成長速度を説明するため、ランダム化における最小限の腫瘍体積の分散を許容するために少なくとも２５％多い動物で開始した。腫瘍成長は、最初は触知可能性により追跡され、一度腫瘍体積が約３０ｍｍ３に達したら測定を開始した。研究は、一度腫瘍を有するマウスのコホートが１４０〜１８０ｍｍ３に達したら腫瘍サイズに基づいてランダム化され；群は６〜１０匹のマウスの範囲であった。動物に、腹腔内注射により、様々な用量レベルのＡＤＣを週２回２週間（Ｑ４ｄｘ４）、１．５ｍｇ／ｋｇ（最大耐用量）のドキソルビシンを週１回２週間（Ｑ７ｄｘ２）、または５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを週１回２週間投与した。試験群を、ＩＡＣＵＣプロトコルに従って屠殺の必要が示された際に個々のマウスまたは群全体の腫瘍の測定結果が１２００ｍｍ３に達するまで追跡した。選択された投与試験に関して、薬物動態学的顎下採血を、２または６時間、３６時間および７２時間の時点で実施した。１０μＬの量の血液を、すぐにピペットで９０μＬのＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に入れた。試料を分析の前に−８０℃で保管した。それぞれの腫瘍の測定に関して、腫瘍体積±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が提供された。ＧＴ＝大きい腫瘍サイズにより終了した群。ＮＤ＝ＳＥＭを用いた有意な測定を行うために十分な動物が残っていない。全ての試験は、ＰＢＳビヒクルおよび分析されているものと同じリンカー−ペイロードにコンジュゲートした非結合性ｈＩｇＧ１抗体を有し、比較可能な薬物対抗体比（ＤＡＲ）およびＤＡＲ分布を有する対照抗体−薬物コンジュゲートを含んでいた。
【０４０１】
Ａ．乳癌
表１６〜２０および図１１〜１４は、様々なトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸ腫瘍モデルにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を実証するデータを提供する。得られた結果は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭが、全てのＴＮＢＣ  ＰＤＸモデルにおいて、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）と類似の作用機序を有するドキソルビシン標準治療（ＳＯＣ）による処置と比較して優秀な有効性を示したため、意外であった。
【０４０２】
表１６および図１１は、Ｂｒｅａｓｔ−５（ＢＲ５）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。８０日より長い間の持続的な退縮が、０．２７ｍｇ／ｋｇのｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭにより達成され、０．０３６ｍｇ／ｋｇほどの低い容量レベルでも抗腫瘍活性を誘発した。対照的に、対照のＡＤＣもドキソルビシン標準治療（ＳＯＣ）も、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４０３】
【表１６】
2016540826.tif 000031
【０４０４】
表１７および図１２は、Ｂｒｅａｓｔ−１３（ＢＲ１３）ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに関して、０．２７ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、９０日間の退縮をもたらし、その後腫瘍は再度成長した。さらに、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、腫瘍成長を約４０日間遅らせた。対照的に、対照のＡＤＣもドキソルビシンＳＯＣも、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４０５】
【表１７】
2016540826.tif 000032
【０４０６】
表１８および図１３は、ＴＮＢＣのより感受性の低い腫瘍モデルであるＢｒｅａｓｔ−２２（ＢＲ２２）ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭに関して、０．２７ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、腫瘍成長を約４０日間遅らせたが、完全な退縮は一切もたらさなかった。さらに、０．２７ｍｇ／ｋｇより下の用量レベルは、最小限の作用を有していた。対照のＡＤＣもドキソルビシンＳＯＣも、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４０７】
【表１８】
2016540826.tif 000033
【０４０８】
図１９は、様々な微小管阻害剤（ＭＴＩ）、例えばｖｃ０１０１およびｍｃ８２６１にコンジュゲートしたｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の、ＢＲ２２  ＰＤＸにおける有効性を示す。そのデータは、ＭＴＩ  ＡＤＣは腫瘍成長に有意に影響を及ぼさなかったことを実証している。従って、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭが同じＢＲ２２  ＰＤＸモデルにおいて増大した有効性を示したのは意外であった。
【０４０９】
表１９および図１４は、Ｂｒｅａｓｔ−３１（ＢＲ３１）ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。０．２７ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、約１２０日間の退縮をもたらし、その後その腫瘍は一部の動物において再度成長した。０．０９ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、約５０日間腫瘍を退縮させ、その後その腫瘍は再度成長した。対照的に、対照のＡＤＣもドキソルビシンＳＯＣも、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４１０】
【表１９】
2016540826.tif 000034
【０４１１】
図２０は、ＭＴＩ  ｖｃ０１０１にコンジュゲートしたｈｕＥ１５、ｈｕＥ２２およびｈｕＥ４７の、ＢＲ３１  ＰＤＸにおける有効性を示す。そのデータは、ＭＴＩ  ＡＤＣは腫瘍成長に有意に影響を及ぼさなかったことを実証している。従って、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭおよびｈｕＥ４７−ＡｃＢｕｔ−ＣＭが同じＢＲ２２  ＰＤＸモデルにおいて増大した有効性を示したのは意外であった。
【０４１２】
表２０は、Ｂｒｅａｓｔ−５６（ＢＲ５６）ＴＮＢＣ  ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。対照的に、対照のＡＤＣもドキソルビシンＳＯＣも、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４１３】
【表２０】
2016540826.tif 000035
【０４１４】
Ｂ．卵巣癌
表２１および図１５は、Ｏｖａｒｉａｎ−４５（ＯＶ４５）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。０．２７ｍｇ／ｋｇにより、７５日より長い間の持続的な退縮が達成された。退縮は、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量レベルでも達成され、一部の動物において５０日後に腫瘍が再成長した。０．０３６の用量レベルは、腫瘍成長を約２５日間遅らせた。対照的に、対照のＡＤＣは、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４１５】
【表２１】
2016540826.tif 000036
【０４１６】
表２２および図１６は、Ｏｖａｒｉａｎ−５５（ＯＶ５５）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。腫瘍の退縮は、０．２７および０．０９ｍｇ／ｋｇの用量レベルで達成され、０．０３６の用量レベルは、腫瘍成長におけるいくらかの遅延をもたらした。対照のＡＤＣは、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４１７】
【表２２】
2016540826.tif 000037
【０４１８】
表２３および図１７は、卵巣癌のより感受性の低い腫瘍モデルであるＯｖａｒｉａｎ−４４（ＯＶ４４）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。０．２７ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、腫瘍成長を約５０日間遅らせたが、腫瘍を退縮させなかった。０．２７ｍｇ／ｋｇより下の用量レベルは、最小限の作用を有していた。対照のＡＤＣは、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０４１９】
【表２３】
2016540826.tif 000038
【０４２０】
表２４および図１８は、卵巣癌のより感受性の低いモデルであるＯｖａｒｉａｎ−６３（ＯＶ６３）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。一過性の腫瘍退縮が、０．２７ｍｇ／ｋｇにおいて達成され、腫瘍成長における遅延が、０．０３６および０．０９ｍｇ／ｋｇにおいて達成された。
【０４２１】
【表２４】
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【０４２２】
表２５は、Ｏｖａｒｉａｎ−３９（ＯＶ３９）卵巣癌ＰＤＸにおけるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの有効性を示す。
【０４２３】
【表２５】
2016540826.tif 000040
【０４２４】
Ｃ．小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および結腸直腸癌
いくつかの追加の有効性試験を、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）のモデルであるＬＵ８０およびＬＵ８６  ＰＤＸ、ならびに結腸直腸癌（ＣＲＣ）のモデルであるＣＲ５  ＰＤＸにおいて実施し、データを表２６〜２８において示す。得られた結果は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭが、ＳＣＬＣおよびＣＲＣ  ＰＤＸモデルにおいて、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）と類似の作用機序を有するドキソルビシン標準治療（ＳＯＣ）による処置と比較して優秀な有効性を示したため、意外であった。
【０４２５】
【表２６】
2016540826.tif 000041
【０４２６】
【表２７】
2016540826.tif 000042
【０４２７】
【表２８】
2016540826.tif 000043
【０４２８】
ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを用いた全てのインビボ有効性試験の結果を、表２９および３０において要約する。要約すると、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、ＴＮＢＣ（非低クローディン（ｎｏｎ−Ｃｌａｕｄｉｎ  ｌｏｗ））、卵巣癌、ＳＣＬＣおよび結腸直腸癌のモデルにおいて腫瘍成長を強く阻害した。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、試験した全ての場合（ＴＮＢＣおよびＳＣＬＣ）において、標準治療化学療法（ＳＯＣ）より性能が優れていた。腫瘍の退縮は、初回投与時の大きさと比較した平均腫瘍体積の低減として定義された。
【０４２９】
乳房および卵巣モデルにおいて、腫瘍の退縮は、投与後の平均腫瘍体積の低減として定義された。ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害。％ＴＧＩ＝［１−（処置されたものの平均腫瘍体積）／（ビヒクルの平均腫瘍体積）］。腫瘍が退縮した場合、増殖停止時間（ＴＴＰ）が、初回投与および平均腫瘍体積が退縮後に有意に増大した（再成長した）時点の間の日数であるように決定された。腫瘍が実験の過程の間に再成長しなかった場合、ＴＴＰは、初回投与および実験の終了の間の日数である。上記のように、全ての動物は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣを週２回４サイクル、ドキソルビシンを１．５ｍｇ／ｋｇで週１回２サイクル、またはシスプラチンを５ｍｇ／ｋｇで週１回２サイクル投与された。ＡＤＣ用量レベルは、抗体含有量に従ってｍｇ／ｋｇで列挙されている。動物は、それらが静脈内投与された１４４５８０を除く全ての試験において腹腔内投与された。
【０４３０】
【表２９】
2016540826.tif 000044
【０４３１】
【表３０】
2016540826.tif 000045
【０４３２】
実施例９
腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の低減
抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲート処置が腫瘍中の腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）頻度を低減したかどうかを決定するため、腫瘍を抗ＥＦＮＡ４抗体−薬物コンジュゲートであるｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、または対照ｈＩｇＧ抗体−薬物コンジュゲートである対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで前処理し、次いで前処理された分離された腫瘍からの生きたヒト腫瘍細胞を、限界希釈分析において、実験を受けていない動物中に移植した。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭまたは対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍を有するマウスからの腫瘍を、最初の処置後（ＢＲ２２に関して）１２日目および（ＢＲ１３に関して）２１日目の時点で回収した。回収累代移植の日は、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ曝露後にいつ腫瘍が退縮し始めたかに基づいて選択された。腫瘍を分離し、抗ヒトＥＳＡ、抗マウスＣＤ４５、および抗マウスＨ２Ｋｄ抗体で染色した。処置群あたり３個の腫瘍をプールし、生きたヒト腫瘍細胞（ＥＳＡ＋）を、フローサイトメトリーにより選別した。
【０４３３】
ＢＲ２２に関して、８匹のマウスの群に、対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処置された腫瘍から選別された４００、１００、５０、または２０個の腫瘍細胞を注射し、そして８匹のマウスの群に、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処置された腫瘍から選別された３９０、９０、４０、または１８個の腫瘍細胞を注射した。ＢＲ１３に関して、１０匹のマウスの群に、対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処置された腫瘍から選別された４００、１００、６０、または２０個の腫瘍細胞を注射し、そして１０匹のマウスの群に、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処置された腫瘍から選別された３８０、１６０、５０、または２５個の腫瘍細胞を注射した。
【０４３４】
受容マウス中の腫瘍を、毎週測定し、注射後２１週の時点で、受容マウス中で２００ｍｍ３を超えていた腫瘍を陽性として採点した。ポアソン分布統計を用いて、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）により、移植後２１週の時点で腫瘍を有する、および有しない受容マウスの注射された細胞の用量を用いて、それぞれの集団におけるＴＩＣの頻度を計算した。ＢＲ２２およびＢＲ１３  ＰＤＸの両方に関して、そのデータは、標準的な腫瘍体積測定とは独立しているＴＩＣ頻度の第２エンドポイントを用いて、抗腫瘍有効性を実証している。そのデータはさらに、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭはより侵攻性の／腫瘍形成性のＴＩＣ（またはＣＳＣ）を標的とすることを実証している。
【０４３５】
ＢＲ２２で処理された腫瘍中のＴＩＣの数は、表３１において示されるように、対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍の５５個の細胞中の１個のＴＩＣから、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍の１４７個の細胞中の１個のＴＩＣへと、約３倍低減した（両側検定においてｐ＝０．０１９）。
【０４３６】
【表３１】
2016540826.tif 000046
【０４３７】
同様に、ＢＲ１３の処理された腫瘍中のＴＩＣの数は、表３２において示されるように、対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍の７５個の細胞中の１個のＴＩＣから、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍の２７０個の細胞中の１個のＴＩＣへと、約２．６倍低減した（ｐ＝０．０００７）。要約すると、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍細胞を注射されたマウスは、類似の数の対照−ＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理された腫瘍細胞を注射されたマウスよりも一貫して少ない腫瘍を生成し、これは、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ処置が腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）を低減したことを示している。
【０４３８】
【表３２】
2016540826.tif 000047
【０４３９】
実施例１０
血漿中の総ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのインビトロ安定性
ＡＤＣを投与されたマウスにおける薬物動態試験からの血漿試料中の総ＡＤＣおよび総抗体の定量化を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて決定した。ＥＬＩＳＡおよび液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法を用いて、ラットおよびサルにおける探索的毒性学試験からの、ならびにＡＤＣを用いたインビトロ血漿安定性試験における、総ＡＤＣ、総抗体および未コンジュゲートペイロードも定量化した。
【０４４０】
実施例６において記載されたコンジュゲーションおよび精製プロセスに従って調製されたｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのインビトロ安定性を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットおよびカニクイザルの血漿において総ＡＤＣおよび総抗体をＥＬＩＳＡにより測定することにより決定した。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを、マウス、ラット、サル、およびヒト血漿中で１〜５０μｇ／ｍＬの濃度で３７℃において１６８時間までインキュベートし、総ＡＤＣおよび総抗体（ヒト血漿を除く）をＥＬＩＳＡを用いて決定した（表３３および３４を参照）。
【０４４１】
ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのラット、マウス、およびサル血漿中での３７℃で１６８時間のインキュベーション後に残っている総抗体の平均（ｎ＝３）量は、緩衝液対照と類似しており、両方のインキュベーション濃度において種にわたって類似していた。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｗ／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中での３７℃で１６８時間のインキュベーション後に残っている平均（ｎ＝３）総ＡＤＣおよび総抗体量は、１μｇ／ｍＬインキュベーションに関してそれぞれ９４．５％および９０．５％ならびに５０μｇ／ｍＬインキュベーションに関してそれぞれ８８．３および９８．６％であり、これは、総ＡＤＣの血漿中での生物学的温度における最小限の熱分解の存在を示している。
【０４４２】
総抗体濃度は、ヒト血漿中での総ＡＤＣのインキュベーションに関しては、ヒトＩｇＧを含有するヒト血漿中でのヒトＩｇＧに関するＥＬＩＳＡの検出の限界により、決定されることができなかった。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭのラット、マウス、サル、およびヒト血漿中での３７℃で１６８時間のインキュベーション後に残っている総ＡＤＣの平均量は、緩衝液対照と類似しており、両方のインキュベーション濃度において種にわたって類似していた。ＮＣ＝計算されなかった；ＳＤ＝標準偏差。
【０４４３】
【表３３】
2016540826.tif 000048
【０４４４】
【表３４】
2016540826.tif 000049
【０４４５】
実施例１１
作用機序
ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭの作用機序を、それがカリケアマイシンの作用機序と一致していることを実証するために分析した。リン酸化されたヒストンバリアントＨ２Ａ．Ｘ（ｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘ）は、ＤＮＡ損傷の確立されたバイオマーカーである。そのアッセイを検証するため、癌細胞株を、未コンジュゲートＡｃＢｕｔ−ＣＭで処理し、ｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘマーカーは分離した焦点（ｆｏｃｉ）において細胞核中で明らかであり、それは典型的な染色パターンである。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭによる処置は、結果としてインビトロおよびインビボの両方で標的細胞中のＤＮＡ二本鎖破断をもたらし、これは、カリケアマイシンＡＤＣの予想される作用機序と一致している。
【０４４６】
ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４または親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、０．３μｇ／ｍＬのｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、対照ＡＤＣまたは未コンジュゲートｈｕＥ２２に４時間曝露した。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理し、抗ヒストンｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃０５−６３６）と共に１時間インキュベートし、洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート二次抗体と共に、およびＤＡＰＩ核酸染色剤と共に３０分間インキュベートし、次いで洗浄し、マウント媒体およびカバーガラスで保護した。細胞をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて可視化し、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ含有量のｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘバイオマーカーに関して分析した。
【０４４７】
ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭへの曝露後、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞は、ＤＮＡ損傷を示す分離したｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘの焦点を示し；対照的に、対照ＡＤＣまたは未コンジュゲートｈｕＥ２２による処理後は焦点は観察されなかった（画像は示していない）。さらに、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、標的陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において焦点を誘導しなかった。従って、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、標的依存性およびカリケアマイシン依存性の様式でＤＮＡ損傷を生成し、これはＡＤＣの予想される作用機序と一致している。
【０４４８】
類似の結果が、インビボでの薬力学研究において得られた。ＥＦＮＡ４発現性ＢＲ５  ＴＮＢＣ  ＰＤＸ腫瘍を有するマウスに、１用量の１ｍｇ／ｋｇ  ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを投与し、腫瘍を２４、４８および９６時間後に回収した。腫瘍をホルマリン中で固定し、パラフィン（ＦＦＰＥ）中に包理した。切片を、２．４μｇ／ｍＬ抗ｈｕＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃３４４３−１）および１．８ｍｇ／ｍＬ  抗γ−Ｈ２Ａ．Ｘ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２５７７Ｓ）で染色し、スライドをＡｐｅｒｉｏ  ＡＴ２上で走査した。デジタル画像分析のため、健康な生存可能な組織の領域を分類し、一方で壊死領域および無関係な組織を排除した。生存可能な領域内の個々の細胞を、使用者に定義されたパラメーター（例えば膜ｈＩｇＧ染色または細胞内ｙ−  Ｈ２Ａ．Ｘ染色）に基づいて採点し、生存可能な領域中のマーカー陽性細胞の百分率を報告した。
【０４４９】
図２２において示されているように、抗ｈＩｇＧ１抗体による免疫組織化学（斜線付きの丸）は、投与後２４時間の時点でのほぼ全ての腫瘍細胞および９６時間の時点で腫瘍細胞の約半分の細胞膜の染色を示した。図２２においてさらに示されているように、抗ｙ−−Ｈ２Ａ．Ｘ抗体による免疫組織化学（白いひし形）は、腫瘍細胞における核の染色を明らかにし；予想されたように、ピーク抗ｙ−−Ｈ２Ａ．Ｘ染色の時間は、ＡＤＣの内在化およびペイロードの遊離がカリケアマイシンがＤＮＡ損傷をもたらす前に起こるため、ピーク細胞結合の時間から遅れた。ダッシュ記号は、群あたりの中央値を示す。インビトロおよびインビボの研究を合わせて、抗ＥＦＮＡ４−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ  ＡＤＣに関する予想される作用機序を実証した。
【０４５０】
カリケアマイシンにより生成されるＤＮＡ損傷は、アポトーシスを誘導し、それは最終的に細胞死をもたらす(Zein et al, 1988; Nicolaou et al, 1994; Prokop et al, 2003)。ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭを用いた処置後のアポトーシスは、アネキシンＶを用いた染色により評価され、それは細胞表面上のホスファチジルセリンへの結合によりアポトーシス細胞に印を付ける(Koopman et al, 1994)。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４または親ＨＥＫ２９３Ｔを、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭ、対照ＡＤＣまたはｈｕＥ２２  ｍＡｂで処理し、次いでアネキシンＶおよび生存度染色剤７ＡＡＤを用いて染色した。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＥＦＮＡ４細胞のｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭによる処理は、結果として実質的に高いレベルのアポトーシス細胞をもたらし、一方で親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の処理は、実質的に高いレベルのアポトーシス細胞をもたらさなかった（表３５参照）。対照ＡＤＣもｈｕＥ２２  ｍＡｂも、有意な程度までのアポトーシスを誘導しなかった。従って、ｈｕＥ２２−ＡｃＢｕｔ−ＣＭは、標的細胞において、標的およびカリケアマイシン依存性の様式でアポトーシスを誘導した。
【０４５１】
【表３５】
2016540826.tif 000050
【０４５２】
実施例１２
ＴＮＢＣ  ＴＰＣの富化
１９種類の乳房ＰＤＸ腫瘍を収容するＰＤＸ腫瘍バンクが設立された。患者の病理報告、腫瘍の組織病理、およびＰＡＭ−５０（＋）パネルを用いたマイクロアレイサブクラスタリングに基づいて、これらのＰＤＸ腫瘍モデルの１３種類は、ＴＮＢＣを有する患者に由来することが確証され；その３種類は、低クローディン（ＣＬ）亜型であることが特性付けられた。乳房ＰＤＸ腫瘍は、回収され、分離されて単一細胞懸濁液になり、フローサイトメトリーにより厳密なダブレット識別ゲート処理を用いて分析された。さらに、ヒトＥＳＡ＋腫瘍細胞が、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、ＣＤ２４およびＣＤ３４発現に関してそれぞれ分析された。
【０４５３】
乳癌における腫瘍永続化細胞（すなわち癌幹細胞）の境界を定めている（ｄｅｍａｒｃａｔｅ）と考えられている重要な細胞表面マーカーに関する注意深い表現型プロファイリングの際に、ＴＮＢＣを有する患者由来のＰＤＸ腫瘍中の全ての細胞は、一様にその抗原を発現しており、従ってそれは乳癌のこの亜型においてＴＰＣを同定するための有用性をほとんど保持していないことが明らかになった。フローサイトメトリーによる数百の細胞表面抗原の表現型プロファイリングは、ＢＲ２２およびＢＲ３１  ＰＤＸ腫瘍において、ＣＤ４６およびＣＤ３２４を含むいくつかの不均質に発現されている抗原を同定した。
【０４５４】
予想されるＴＰＣ（すなわちＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋細胞）を、ＢＲ２２  ＰＤＸ腫瘍からＦＡＣＳにより単離し、移植の前にフローサイトメトリーにより再分析した。娘腫瘍（単数または複数）を同様に分離し、分析して親腫瘍を反映する細胞不均質性を確証した。分離されたＢＲ２２およびＢＲ３１乳房ＰＤＸ腫瘍から単離された５０個のＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋（斜線付きの丸）またはＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４−（白いひし形）細胞を移植された個々のマウスに関する腫瘍成長曲線が、それぞれ図２３および２４において示されている。ＣＤ４６および／またはＣＤ３２４の発現を有しないまたは有する単一細胞の単離および免疫無防備マウス中への移植を促進するためのこれらのマーカーの利用は、ＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋細胞は腫瘍を効率的に永続化してそれらの親腫瘍の表現型の不均質性を複製することができるが、それらのＣＤ３２４−対応物はそれができないことを実証した。
【０４５５】
完全に不均質な腫瘍が、５０個ほどの少ない移植された細胞でも効率的に開始され、一方でＣＤ３２４−亜集団内のＴＰＣの頻度は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ上で単離される細胞の１％細胞不純物プロフィールの結果もたらされる予想される偽陽性期待値の誤差の範囲内であった（表３６参照）。
【０４５６】
【表３６】
2016540826.tif 000051
【０４５７】
ＣＤ３２４＋細胞亜集団内の１：７１の実証されたＴＰＣ頻度は、１００個のＣＤ３２４＋細胞を移植されたマウスあたり平均１．４個の機能するＴＰＣをもたらし、一方で１％の選別誤差率は、単離されたＣＤ３２４−細胞内の平均０．０１４％のＣＤ３２４＋細胞の混入頻度をもたらすと考えられ、それは１．４％（０．２〜２．７％の範囲）の偽陽性頻度に換算される。
【０４５８】
さらに、トランスクリプトーム全体の配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォーム（１００×１００ｂｐペアエンド配列決定）を用いて、それぞれ低クローディンおよび非低クローディンＴＮＢＣならびに乳癌のルミナルＢ亜型を含む様々な亜型のいくつかの乳房ＰＤＸ腫瘍モデルからの単離されたＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋ＴＰＣおよびＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４−ＮＴＧ細胞を用いて行った。トランスクリプトーム全体の配列決定を、正常な組織、例えば心臓、肝臓、腎臓、肺、結腸、皮膚、膵臓、および卵巣から得られたｍＲＮＡも用いて実施した。全ての試料に関する得られたｆｐｋｍ（１００万あたりのキロ塩基あたりの断片）値を、標準的な技法を用いて標準化し、次いで細胞表面にあるという注釈が付けられているタンパク質をコードする遺伝子に焦点を合わせるように選別した。この選別されたデータセットを入力として用いて、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ内のＤＥＳｅｑ２パッケージを用いて、ＮＴＧ細胞および正常組織の両方に対してＴＰＣにおいて差次的に発現されている遺伝子を、それらの調整されたｐ値と共に同定した。特に、ＥＦＮＡ４は、ｐ値を偽発見率に関して調整した後でさえも、ＮＴＧ細胞および正常組織に対してＴＰＣにおいて有意に高められていた。
【０４５９】
実施例１３
ＥＦＮＡ４発現はＴＮＢＣ  ＴＰＣにおいて高められている
実証されたＴＮＢＣ  ＴＰＣの富化をさらに進めるため、トランスクリプトーム全体の配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォーム（１００×１００ｂｐペアエンド配列決定）を用いて、低クローディンおよび非低クローディンＴＮＢＣならびに乳癌のルミナルＢ亜型を含む様々な亜型のいくつかの乳房ＰＤＸ腫瘍モデルからの単離されたＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋ＴＰＣおよびＥＳＡ＋ＣＤ４６＋ＣＤ３２４−ＮＴＧ細胞を用いて実施した。
【０４６０】
トランスクリプトーム全体の配列決定を、正常な組織のパネル、例えば心臓、肝臓、腎臓、肺、結腸、皮膚、膵臓、および卵巣から得られたｍＲＮＡも用いて実施した。全ての試料に関する得られたＦＰＫＭ（１００万あたりのキロ塩基あたりの断片）値を、標準的な技法を用いて標準化し、次いで細胞表面にあるという注釈が付けられているタンパク質をコードする遺伝子に焦点を合わせるように選別した。この選別されたデータセットを入力として用いて、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ内のＤＥＳｅｑ２パッケージを用いて、ＮＴＧ細胞および正常細胞の両方に対してＴＰＣにおいて差次的に発現されている遺伝子を、それらの調整されたｐ値と共に同定した。特に、ＥＦＮＡ４は、ｐ値を偽発見率に関して調整した後でさえも、ＮＴＧ細胞および正常組織に対してＴＰＣにおいて有意に高められていた。
【０４６１】
加えて、様々な亜型（実施例１２において記載された）を包含する１９の乳房ＰＤＸ腫瘍の間で、ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡ発現を、バルク乳房ＰＤＸ腫瘍または正常な生命の維持に重要な器官においてマイクロアレイにより評価した。ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡ発現は、正常な乳房または評価されたあらゆる他の正常な組織よりも平均で２．６倍より大きく高く高められていた。
【０４６２】
さらに、正常な隣接する乳房、ＴＮＢＣ、および非ＴＮＢＣ乳房腫瘍におけるＥＦＮＡ４  ｍＲＮＡの発現を、入手可能な癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）研究ネットワーク(Weinstein JN et al. Nature Genetics 45:1113-1120, 2013)のデータを用いて評価した。ＥＦＮＡ４発現は、一般にＴＮＢＣの非低クローディン亜型において他の乳癌亜型に対してより高かった。ＰＡＭ（５０）＋遺伝子サインを２９２人の患者からの原発腫瘍標本から生成されたＴＣＧＡデータに適用した際、図２５において示されているように、ＴＮＢＣ腫瘍（ｎ＝９５）におけるＥＦＮＡ４の高められた発現は、正常な隣接する乳房（ｎ＝１０８）および非ＴＮＢＣ亜型の乳房腫瘍（ｎ＝１９７）と比較して明らかなままであった。横線は中央値を示す。
【０４６３】
乳癌および卵巣癌におけるＥＦＮＡ４の過剰発現の遺伝学的基礎を分析した。図２６は、ＴＣＧＡおよびＭＥＴＡＢＲＩＣ(Curtis, C et al. Nature Apr. 18; 486(7403):346-352, 2012)データセットからの乳房腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示しており、図２７は、卵巣腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示している。白い四角は、２５番目〜７５番目の百分位数を表し、エラーバーは、１０番目〜９０番目の百分位数の境界を定めており、個々の点は、１０番目の百分位数の下または９０番目の百分位数の上に入る。正常なコピー数（ｎ＝２）は、破線により示されている。
【０４６４】
一部の乳房腫瘍において、ＥＦＮＡ４の過剰発現は、コピー数の増大の結果である可能性がある（図２６参照）。ＴＣＧＡ乳癌データセットにおいて、腫瘍試料の２５．５％は、ＥＦＮＡ４の顕著なコピー数の増大（ｎ≧２．５）を有し、一方で実質的なコピー数の喪失を有する試料はなかった。ＴＮＢＣ試料の部分集合は、ＥＦＮＡ４のコピー数の増大の比例した発生率を有していた。同じ傾向が、ＭＥＴＡＢＲＩＣ乳癌データセットにおいて観察され、腫瘍試料の１４．３％においてｎ≧２．５であった。さらに、ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡレベルおよびＤＮＡコピー数の間に強い相関があった（ｒ＝０．４８；ｐ＜０．０００１）。そのデータは、乳癌、特にＴＮＢＣにおけるＥＦＮＡ４の過剰発現に関する可能性のある遺伝学的基礎を示唆している。
【０４６５】
高められたＥＦＮＡ４遺伝子発現がタンパク質における増大に変換されるか否かを決定するため、モノクローナル抗体のパネルを、伝統的な免疫処置およびハイブリドーマアプローチにより生成し、サンドイッチＥＬＩＳＡ対を同定した。１７の正常器官、４９の原発乳房腫瘍標本、および９のＴＮＢＣ  ＰＤＸ腫瘍モデルからの組織タンパク質溶解物の分析は、結果として、ＥＦＮＡ４タンパク質レベルがＴＮＢＣにおいて正常な組織および乳癌の他の亜型に対して高められているだけでなく、発現はＴＮＢＣの非低クローディンサブクラスにおいて低クローディン部分集合に対してより高いという観察をもたらした。これらの結果は、バルク腫瘍レベルにおいてさえも、高められたＥＦＮＡ４遺伝子発現はＥＦＮＡ４タンパク質における意味のある増大に変換されることを確証している。
【０４６６】
卵巣癌では、ＥＦＮＡ４のコピー数の増大（ｎ≧２．５）が、ＴＣＧＡ試料の実質的な割合（２２．２％）において観察され、一方で有意なコピー数の喪失の事例はなかった（図２７参照）。ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡレベルおよびＤＮＡコピー数の間には強い相関があり（ｒ＝０．３２；ｐ＜０．０００１）、それは乳癌における観察に類似していた。乳癌におけるデータと合わせて、この観察は、腫瘍におけるＥＦＮＡ４過剰発現に関する可能性のある遺伝学的基礎を示唆している。
【０４６７】
乳癌および卵巣癌に加えて、肝臓癌は、高頻度のＥＦＮＡ４のコピー数の増大を示した。図２８は、３つのデータセット：Ｐｆｉｚｅｒ−ＡＣＲＧ（ｎ＝３１０）、Ｐｆｉｚｅｒ−Ｓａｍｓｕｎｇ（ｎ＝２７２）およびＴＣＧＡ（ｎ＝２１２）からの肝細胞癌（ＨＣＣ）腫瘍試料におけるＥＦＮＡ４のコピー数を示す。全ての試料は三角形で表されており、横線は中央値を示す。正常なコピー数（ｎ＝２）は、破線により示されている。３つのデータセットにわたって一貫して、高頻度なＥＦＮＡ４のコピー数の増大があるが、有意なコピー数の喪失はなく；ＡＣＲＧ、ＳａｍｓｕｎｇおよびＴＣＧＡのデータセットにおいて、それぞれ試料の６８．４％、３７．５％および２９．７％が、ｎ≧２．５を有していた。肝臓癌では、３つの独立したデータセットにおいて、ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡレベルおよびＤＮＡコピー数の間に強い相関があった：ＴＣＧＡの相関係数＝０．５０（ｐは約０）；ＡＣＲＧの相関係数＝０．５６（ｐは約０）およびＳａｍｓｕｎｇの相関係数＝０．３８（ｐ＝３Ｅ−０９）。ＨＣＣにおけるＥＦＮＡ４の増大は、限局性ではなく、むしろ染色体領域Ｃｈｒ１ｑ２１〜１ｑ２２の増幅の上で起こっており、それはＥＬＫ４、ＭＤＭ４およびＰＡＲＰ１も含んでいる。特に、ＥＦＮＡ４のｍＲＮＡの発現レベルは、ＨＣＣデータセットにおけるコピー数と強く相関しており、それは、ＥＦＮＡ４の増大を有する腫瘍が抗ＥＦＮＡ４  ＡＤＣによる処置により応答性である可能性があることを示唆した。
【０４６８】
実施例１４
エフリン−Ａ４の結合特性
エフリン−Ａ４のＥｐｈ受容体に結合する特性を、さらに分析した。抗ＥＦＮＡ４抗体はエフリン−Ａ４に結合し、一方でそのリガンドはそのＥｐｈ受容体と会合しているため、これらの２つの高分子間の親和性を決定した。商業的に入手可能なＥｐｈ受容体およびエフリン−Ａ４の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により直接比較し、最も関連する受容体を決定した。抗ヒト抗体捕捉キットを用いて、組み換えＥｐｈ受容体をＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。それぞれの抗原注入サイクルの前に、２μｇ／ｍＬの濃度のＥｐｈ受容体を表面上に、２分間の接触時間および５μＬ／分の流速で捕捉させた。捕捉された抗体のベースラインからの負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）は、１５０〜２６０応答単位で一定であった。受容体の捕捉および１分間のベースラインの後、単量体性ヒトエフリン−Ａ４を、２分間の会合相の間に表面上を４００、２４１、１４５、８７、５３、３２、１９および１２ｎＭの濃度で流し、続いて１０μＬ／分の流速で２分間の解離相を行った。それぞれのサイクルの後、抗ヒト捕捉表面を、１０μＬ／分で３０秒間の接触時間の３Ｍ  ＭｇＣｌ２で再生させた。
【０４６９】
Ｂｉａｃｏｒｅのデータを、まず平衡における応答（Ｒｅｑ）の平均値を計算することにより処理した。次いで、Ｒｅｑを濃度（Ｍ）に対してプロットし、定常状態親和性当てはめを用いて親和性および理論上のＲｍａｘを計算した。全ての場合において、少なくとも５つの異なる分析物濃度を用いてこの計算を行った。全てのデータ分析工程は、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において完了された。
【０４７０】
エフリン−Ａ４のＥｐｈ受容体への結合からの生データおよびＲｅｑ対濃度曲線（示されていない）は、最高の親和性を有する受容体はＥｐｈＡ２であり、最低の親和性を有する受容体はＥｐｈＡ１０であることを決定した。表３７は、エフリン−Ａ４への結合に関して試験した９種類のＥｐｈ受容体を、親和性が低下する順に示す。そのデータは、Ｅｐｈ受容体に関するエフリン−Ａ４に対する親和性は全て本明細書で開示された抗ＥＦＮＡ４抗体よりも低いことを実証している。
【０４７１】
【表３７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
【化２】
2016540826.tif 000083
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
【化３】
2016540826.tif 000084
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
【化４】
2016540826.tif 000085
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
【化５】
2016540826.tif 000086
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
【化６】
2016540826.tif 000087
【国際調査報告】
2016540826.tif 000088
2016540826.tif 000089
2016540826.tif 000090
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2016540826.tif 000092
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