(57)【要約】  本発明はＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとする織物加工可能なエンドレスモノフィラメント及びマルチフィラメントの調製，並びに後続する低分子ジヒドラジドによるこのようなフィラメントの修飾に関する。繊維並びに該繊維から後続して調製される生地は，繊維の外部修飾に依存して生理食塩水中への時間変動的溶解性を示す。外部修飾された後，その繊維及び生地では，均等に分散されたゲル層へ移行する時間が延長される。外部修飾された繊維材料は完全な生体適合性を維持する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
初めに濃度４〜６重量％の酸化ヒアルロナンの水溶液を調製し，次にこの溶液を，５〜４５重量％の乳酸，少なくとも５０重量％の低級アルコール及び４〜１０重量％の水を含む凝固槽に押出して繊維を形成し，その後，低級アルコールで洗浄して乾燥させることを特徴とする，Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとする繊維の調製。
【請求項２】
前記繊維を洗浄する為に使用する前記低級アルコールは，エタノール，１‐プロパノール及びイソプロパノールから成る群より選択されることを特徴とする請求項１記載の調製。
【請求項３】
前記凝固槽で使用する前記低級アルコールはエタノール，１‐プロパノール及びイソプロパノールから成る群より選択されることを特徴とする請求項１又は２記載の調製。
【請求項４】
前記凝固槽中の乳酸の濃度が１０〜２０重量％であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の調製。
【請求項５】
前記繊維を乾燥させた後，有機酸の低分子ジヒドラジドを５×１０−６Ｍ〜０．０１Ｍの濃度で２０〜５０℃で１０分〜２４時間かけて溶解させている低級アルコールの７０〜８０％水溶液を含む安定化槽に浸漬する方法で外部修飾し，その後，前記繊維を低級アルコールで洗浄し，再度乾燥させることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の調製。
【請求項６】
前記安定化槽で使用する前記低級アルコールは，メタノール，エタノール，プロパン‐１‐オール及びプロパン‐２‐オールから成る群より選択されることを特徴とする請求項５記載の調製。
【請求項７】
前記有機酸の前記低分子ジヒドラジドは，コハク酸のジヒドラジド，アジピン酸のジヒドラジド又はピメリン酸のジヒドラジドから成る群より選択されることを特徴とする請求項５又は６記載の調製。
【請求項８】
前記有機酸の前記低分子ジヒドラジドが５×１０−３Ｍの濃度で前記安定化槽に存在することを特徴とする請求項５〜７いずれか１項記載の調製。
【請求項９】
前記繊維を７５〜８５℃の温度範囲で少なくとも１２時間熱負荷に供し，直後に実験室温度で乾燥させ，その後，有機ジアミノ化合物の作用に供し，加水分解に対して安定化させることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の調製。
【請求項１０】
Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンをベースとする繊維。
【請求項１１】
外部が架橋されたことを特徴とする請求項１０記載の繊維。
【請求項１２】
トウ，糸，織り糸，繊維ステープル及び織布，編地又は不織布を製造するための請求項１０又は１１で定義した繊維の使用。
【請求項１３】
請求項１０又は１１で定義した少なくとも２種の繊維で形成した糸。
【請求項１４】
少なくとも１種の繊維が請求項１０又は１１で定義した繊維であり，少なくとも１種の繊維が他の生分解性材料から形成された繊維から成る群より選択された繊維であることを特徴とする少なくとも２種の繊維により形成された糸。
【請求項１５】
請求項１０又は１１で定義した繊維から成る繊維ステープル。
【請求項１６】
請求項１５で定義した前記繊維ステープルから成る織り糸。
【請求項１７】
請求項１０，１１及び１３〜１６のいずれか１項で定義した繊維，トウ，糸，織り糸又は繊維ステープルから形成された織布，編地及び不織布。
【請求項１８】
他の生分解性繊維材料と組み合わせた請求項１０，１１及び１３〜１６のいずれか１項で定義した繊維，トウ，糸，織り糸又は繊維ステープルから成る織布，編地及び不織布。
【請求項１９】
平面状又は筒状の生地の形態又は３Ｄ骨格の形態で存在することを特徴とする請求項１７又は１８記載の織布，編地及び不織布。
【請求項２０】
請求項１０〜１９のいずれか１項で定義した繊維，糸，繊維ステープル，織り糸及び織布，編地又は不織布を修飾するための方法であって，これらを，有機酸の低分子ジヒドラジドを含む７０〜８０％濃度のアルコール水溶液の作用に２０〜５０℃で１０分〜２４時間供し，前記ジヒドラジドは前記溶液中に５×１０−６Ｍ〜０．０１Ｍの濃度で存在することを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記有機酸の前記低分子ジヒドラジドは，コハク酸のジヒドラジド，アジピン酸のジヒドラジド又はピメリン酸のジヒドラジドから成る群より選択されることを特徴とする請求項２０記載の修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとするエンドレスファイバーの調製及び後続する織物加工に関するものであり，前記エンドレスファイバーでは，生分解性ゲルへ変性する期間の延長に関して加工性が向上されている。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸又はヒアルロナンは，Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン及びＤ‐グルクロン酸により形成された連続的二糖単位から成る非硫酸化グリコサミノグリカンの群に属する。当該物質は通常，ヒト器官，主に組織の関節内補充又は潤滑を確実にする体液中において生じる（当該物質は例えば，関節液又は硝子体液に含まれている）。関連文献には，当該物質が治療過程の初期段階で再生する組織の肉芽形成を支持することから，創傷治療に対する当該物質の好ましい効果が記載されている。この為，当該物質は治療製剤の最も不可欠な構成成分に属していると言える。ヒアルロン酸の明確な特徴の１つには，例えばヒアルロナンに結合する特異的な薬物による標的細胞制御に利用し得るＣＤ４４タイプの細胞受容体への親和性が挙げられる。その他には，関連文献から分かることは，ＣＤ４４タイプの細胞受容体へのヒアルロナンの上記親和性はヒアルロナンの二糖単位に遊離カルボキシル基が存在していることが条件であるということである。
【０００３】
ヒアルロン酸はグリコシド結合を選択的に切断し得る酵素により，人体において容易に分解可能であり，これにより，その後にヒト器官内で代謝される糖の単量体単位にまで分子質量が徐々に減少する。
【０００４】
潤滑性及び治癒力を有することから，ヒアルロン酸は医療用インプラントの生体受容を高める為に粘性ハイドロゲルの形態で利用することが多い。しかし，内部塗布用の潤滑ゲル製剤には，塗布部位においてゲルが不均等に分散するなど特定の短所がある。
【０００５】
徐々にゲル化する繊維から形成された平面状又は筒状の生地を貼付することで，より均等な分散が効果的に達成される。本出願の対象を構成する材料から形成されるこのような生地は，これまで関連文献に記載されることはなかった。ゲル形態と比較して最初の形態が乾燥した生地であれば，柔軟性の増加や機械的特性の向上に関して相当な利点がもたらされる。塗布可能なゲルとは異なり，貼付された生地は挿入時に個々の内部損傷の性質に合わせて正確に調整できる。また，塗布されたゲルの量は個々の生地結合材の内部で様々なメッシュサイズを利用して更に調整できる。
【０００６】
塗布方法に関する理由で，湿性組織に直接に付着して，その後，貼付部位の生地の外科的配置又は移動が制限され得ることを避ける為，繊維（又はそれ自体の生地）は初期段階で特定の抗接着性を示すことが不可欠である。従って，織物材料の特定の取り扱い安定性が十分に長時間持続することが望ましい。
【０００７】
天然形態の純粋ヒアルロン酸又はその塩由来の繊維又は生地の製作が，２件の特許出願，すなわち文献WO2009/050389及びPV2010‐1001に記載されている。
【０００８】
上記の特許出願（WO2009/050389）の最初の著者らは，２０％以下の許容水分量の濃縮酢酸中に（すなわち８０％以下の濃度の酢酸溶液に）押出することで２０％のヒアルロン酸又はその塩から繊維を調製し得る方法を報告している。上記の他方の特許出願（PV2010‐1001）の著者らは有機酸とアルコールとの混合液内でポリマー溶液を凝固させることにより繊維を調製し得る方法を報告している（添付の特許請求項では，両成分の比例量は１〜９９重量％の範囲で特定され，有機酸には，好適なものから順にギ酸，酢酸及びプロピオン酸が挙げられる）。
【０００９】
著者らの記述によれば，上記の沈殿槽に元の物質を押出することにより繊維を調製すれば繊維製品が形成されるが，少なくとも非常に強い刺激臭及びその酸の蒸気が個々の紡糸装置の操作者に対して現実的な安全性のリスクになっているという事実に関し，上記の酸を含むこのような槽の使用は技術的な観点から明らかに問題を抱えている。上記の問題は，製造工程の段階で比較的複雑かつ高コストの技術的手段を導入することで解決せざるを得ない。上記物質の人体に対する毒性についての情報は選択的文献の情報源（Wikipedia）以外の情報源では見られない。人体では，ギ酸は代謝されてメタノールになる。後者の物質の濃度が高いと視神経が永久的な損傷を受ける。更にギ酸により起こり得る腎損傷が記載されている。また，酢酸は強い臭気が特徴的である。その高い揮発性から，特に高濃度溶液の場合，その蒸気によっても粘性の膜は重度に腐食する。上記３種の酸の最後，すなわちプロピオン酸はプロピオン酸血症を発症させる肝毒素として一般的に認識されている（ソース：Wikipedia）。
【００１０】
上記特許に記載されている天然ヒアルロン酸をベースとする繊維は水に対する極めて高い親和性を特徴とする。この親和性により，湿潤環境への暴露から数秒〜数十秒間以内に繊維は溶解する。湿らせたグローブで外科医が繊維材料を把持し，貼付部位に挿入しなければならない状況では，このような持続時間は実践では不十分である。この理由から，上記に基づいてフィラメントから純粋に形成される織物材料は手術用途に実践的に適しているとは言えない。
【００１１】
従って一般的に，横切るように化学結合すること(transverse chemical bonds)によって，又は純粋に物理的な性質の結合（すなわち静電的又は疎水的相互作用）によって相互連結された鎖を有する架橋ヒアルロン酸をベースとする織物材料を提供することが望ましい。
【００１２】
上記に基づいて，関連文献は多様な化学修飾ヒアルロナンから繊維を調製する方法を記載している。それらの方法の目的はその溶解性に関して，調製された繊維を最大限まで安定化させることである。このように安定化させた繊維は膨潤した形態をとり，出来る限り長く身体の貼付部位に留まる必要がある。
【００１３】
特許文献US2006/0281912A1には，セチルトリメチルアンモニウムにより修飾されたヒアルロン酸から繊維を調製する方法が開示されており，ここでは修飾によりヒアルロナンのグルクロン部分にあるカルボキシル基がブロックされる。これにより，上記方法で修飾されたポリマーが水素結合や主要鎖間結合機能で安定化する能力を失うという状況になり，すなわち，長い（Ｃ１６‐セチルトリメチルアンモニウム）脂肪族側鎖の新たに生じた疎水性相互作用により個々の鎖間の結合が奪われる。しかし，このような相互作用は上記の水素結合よりかなり弱いものである。これにより，上記方法で修飾されたヒアルロナン誘導体が熱不安定性に対して影響を受けやすくなる。上記方法で修飾した後，ヒアルロナンを紡糸加工する。この為に，スパンメルト法を利用する。しかし重要な疑問に結論が出ていないままである。すなわち，ヒアルロナンのこの特定のタイプの官能基は一般的にその特性が限定的であると考えられる為，ヒアルロナンのカルボキシル基のブロックがその生物学的特性に影響を及ぼすことと関連性がある。
【００１４】
更に特許出願WO2010095049A1及びWO2010095056A2は湿式紡糸法を利用する繊維の調製を記載している。この場合，別々に修飾した１対のヒアルロナンから成る繊維を，その後，いわゆる「クリック」反応を利用して架橋する。上記の方法で架橋した後，その繊維では，天然ヒアルロナンから成る繊維と比較して加水分解抵抗も大幅に改善される。ヒアルロナン鎖の上記架橋は，異なる官能基（チオール，アジド，アルキン，アルケン及びカルボニル）を有する２種のポリマー鎖の間で起こる。その後，環状付加メカニズムに基づいて反応が起こる。このような反応中，五員環が主に形成される。この場合，温度が上昇して架橋プロセスが誘導される。また，上記のプロセスを利用して調製した繊維は大幅に向上された加水分解安定性を示し，従って相当する繊維材料を体内に挿入する位置で加水分解性液体潤滑ゲルの形成に寄与する要素になるとは考えられない。
【００１５】
特許出願WO2010061005に記載の光架橋反応により，更に繊維の加水分解安定化が可能となる。この場合，ヒアルロナンのメタクリル化誘導体を利用し，ＵＶ照射に曝露した後に空間的ポリマーネットワークを形成する。しかし，この特定の場合では，不十分な洗浄の影響を受けないメタクリレートのメタクリレートグラフトが器官に刺激反応を起こす可能性があることから，分解生成物の毒性に関して使用材料は問題を抱えている。この文脈で，確実に起こる酵素分解の過程で放出されるメタクリレート残基は発癌性物質として記載されている。引用した特許は，より強く安定的であるハイドロゲル材料の形成を好ましいとしているが，特殊な形態の繊維が個々の特許請求項の１つに記載されている。
【００１６】
修飾ヒアルロナンからの繊維の形成を記載している他の文献群の中には，特許出願WO93/11803，WO98/08876，US5658582及びUS2004/0192643がある。それら全てに，カルボキシル基のエステル化で修飾されたヒアルロナンからの繊維の形成が記載されている。また，それら繊維は湿式紡糸法により調製され，長時間の安定性が特徴的である。従ってそれらは，粘性ゲルが段階的に形成され，その後更に分散されることを可能にする生地の形態で体内に挿入することには使用不可である。
【００１７】
本特許出願に従って調製した繊維は，Ｎ‐アセチル‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンの水溶液から得られる。上記の特定の方法で修飾されたヒアルロナンの最終的な化学構造は，関連特許WO2011/069475，WO2011/069474，及びCZ PV 2012‐537の著者らによって以下のように記載されている：上記の方式で行うと，アルデヒド基の形成を導く選択的酸化はピラノース単糖環の分裂を起こさず，すなわち個々の多糖鎖の直鎖超分子構造に重大な影響が及ぶことはない。
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スキーム１：Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化された紡糸ヒアルロナンの構造（WO2011/069474，WO2011/069475，及びCZ PV 2012‐537）。
【００１８】
機械的強度の高いエンドレスファイバーの形成に関し，個々の巨大分子鎖が広範囲に平行な配列になり，それにより順に繊維が全体的に安定化することから，紡糸ポリマー中でポリマー鎖の直線度を最大に保つことが望ましいと一般的に考えられている（ソース：Hladik,Textile fibres）。これに関し，エンドレスモノフィラメントの機械特性は，後続するそれらの織物加工に不可欠である。
【００１９】
特許出願US2004/0101546A1にはＮａＩＯ４による多糖の生地の酸化反応によって得られる止血用織物材料の調製が記載されており，ここではその反応により外部アルデヒド基が生成される（スキーム２）。しかし，例示的な実施態様の記述では，セルロースをベースとする編地及び不織布での同様の修飾しか記載されていない。
【００２０】
著者らの意見では，上記の方法で修飾された生地と低分子アミン（ペプチドなど）との間に付加化学結合が形成され得る。その後，望ましくない非安定的イミン結合が水素化ホウ素ナトリウム，シアノ水素化ホウ素ナトリウム又はアミノボランにより還元され得る。しかし，引用した発明においては，繊維の体積全体へ（すなわちその表面だけでなく）アルデヒド結合（安定化アセタール結合）を得る為に繊維を別々に織物加工できるような方法によって，エンドレスモノフィラメント繊維の形成の問題を解決するようなことはしていない。
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スキーム２：ＮａＩＯ４によりヒアルロナンへと酸化した多糖であり，反応には個々の多糖骨格の分裂（部分的な亀裂）が伴う。
【００２１】
先行技術は，後に骨格又は担体系の生成に使用される架橋ハイドロゲルの形成にアルデヒド修飾ヒアルロナンを利用することも含む（EP1115433B1，WO2010138074A1，WO2009108100A1）。
【００２２】
関連文献では，下記で定義されているような本発明の物質に類似していると思われるＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと酸化されたヒアルロナンをベースとする織布のエンドレスファイバー，糸，編地を形成するために利用する技術の記載は見られない。
【００２３】
発明の要旨
本発明の対象は新規の織物加工可能なエンドレスモノフィラメント，複合的マルチフィラメント又はマルチフィラメント糸，及びそれに伴う前記の織物加工製品の製造であり，前記フィラメントはヒアルロナンをベースにしており，このヒアルロナンはＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化され，その後，低分子ジヒドラジドにより外部が修飾されたものである。先行技術を構成する技術的解決策と比較して，本発明に従って調製した繊維材料は人体に挿入した後，ゲル形成要素として働くという利点をもたらすが，その粘性ゲルへの自然な変性は時間的に推移する。個々の遅延時間は約３０分（非修飾繊維）〜約７５時間（外部修飾された繊維）の範囲である。次いで，膨張力の効果により繊維の架橋表面が分裂し，よって個々の芯部の非架橋芯部が露呈され，そのゲル形成分解が開始される。
【００２４】
本特許出願の構成の中で記載された酸化ヒアルロナンから成る繊維では，その全体積が個々のポリマー鎖のアルデヒド基とヒドロキシル基との間で形成されたアセタール結合により安定化されている。アセタール結合は加水分解に不安定な構造を構成し，この構造は後に，すなわち湿潤化の後に，繊維が全体的に変性されて所望の潤滑ゲル形態になるまで徐々に分解される。それにもかかわらず，このような繊維は天然ヒアルロナンから調製したものと比較して，かなり長時間にわたって非溶解性が持続する。水中に浸漬した後，繊維／生地は少なくとも３０分は固形の繊維状態のままである。このことにより繊維は，例えば上記時間内であれば切断されることなくピンセットで繰り返し把持できる。従って，化学的な観点から当該繊維が天然ヒアルロナンに非常に類似した材料を構成しているという事実は有用な可能性を示している。従って，その後に架橋によって外部が修飾されなくとも，本発明に従った繊維は，天然ヒアルロナンから調製した繊維と比較して，取り扱いの容易性からより好適で，完全に生物学的に許容可能である材料を提供している。施術中，外科医は前者又は後者から成るこのような繊維，糸又は生地を，湿ったグローブでも取り扱うことができる。約３０分持続した後，これらの繊維は潤滑ゲルへと徐々に変性する。上記エンドレスフィラメントが生体適合性の抗接着性ゲルに変性する過程では，その延長された持続時間は，例えば，複合糸又は外科用生地を開発する為に更に利用可能であり，ここでは，内部の生地インプラントの全体的な生物学的許容性を促進する均等分散ゲルがその後に形成されることが極めて望ましい。
【００２５】
従って，本発明は特にＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されるヒアルロナンをベースとする繊維の調製に関するものであり，ここでは最初に４〜６重量％の濃度の酸化ヒアルロナンの水溶液を調製し，その後，この溶液を５〜４５重量％，好ましくは１０〜２０重量％の乳酸，少なくとも５０重量％の低級アルコール，及び４〜１０重量％の水を含む凝固槽に押出して繊維を形成し，次にこれを低級アルコールで洗浄し，乾燥させる。押出された繊維を洗浄する為に使用する低級アルコールは，例えばエタノール，１‐プロパノール又はイソプロパノールでもよい。同様に，凝固槽で使用する低級アルコールは，例えばエタノール，１‐プロパノール又はイソプロパノールでもよい。
【００２６】
上記繊維がゲルに変性するその延長された時間は，このような繊維／糸又は生地の表面に架橋構造を形成することで更に延長することが可能であり，これは７０〜８０重量％のアルコール（メタノール，エタノール，プロパン‐１‐オール又はプロパン‐２‐オール），有機酸の低分子ジヒドラジド，及び２０〜３０重量％の水を含む架橋溶液に繊維を浸漬することで達成され，後者の存在は，有機酸のジヒドラジドを１０分〜２４時間で溶解するには必須である。上記の少量の水が存在するおかげで繊維が僅かに膨張し，それにより溶解したジヒドラジドが繊維の表面層に吸収されることが促進される。しかし，安定化槽を使用する前は，繊維は乾燥していなければならず，そうでなければジヒドラジドを含有する架橋槽を吸収できないからである。有機酸の低分子ジヒドラジドの有利な例の１つとして，コハク酸，アジピン酸又はピメリン酸のジヒドラジドが挙げられ，濃度は５×１０−６Ｍ〜０．０１Ｍの範囲であるが，５×１０−３Ｍが好ましく，適用温度は２０〜５０℃の範囲である。
【００２７】
上記架橋過程における主に外部の性質が原因で，どれくらいの量のアルデヒド基が反応に利用できるかが明らかでない為，使用する架橋剤の量を直接計算することができない。このことは架橋過程の効率にとって非常に重要であり，何故なら過剰量のジヒドラジドは架橋反応を停止させ，架橋構造を退行させるように破壊するからである。この為，架橋剤の最適な濃度は一見したところでは明確ではなく，実験的手法で決定するしかない。
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スキーム３：アルデヒド繊維の最適な架橋濃度の説明
【００２８】
外部架橋構造を形成する修飾を上記のように後に行わなくても，７２時間まで時間を延長させて３７℃の体温で，血漿の湿性生理環境下において当該繊維材料は完全な生体適合性，並びにゲルに変性する能力を保持する。
【００２９】
天然ヒアルロナンから調製した繊維を形成するゲル，すなわち特許出願WO2009/050389及びPV2010‐1001に従ったゲルと比較して，後者は湿った手術用グローブと接触した直後でさえ数十秒以内に即時に分解される為，当該繊維は，この持続時間の大幅な延長を含む上記態様により，安定性を維持し，実用的な利点を提供する。また，既知の繊維はこのようなグローブに付着しやすい。本特許出願で記載されたＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとして調製された繊維は，使用の初期段階では接着能が低いゲル形成材料であると考えられる。
【００３０】
本特許出願の枠組みの中で提案した別の重要な態様及び革新的なアプローチは，上記の関連特許WO2009/050389及びPV2010‐1001の考察の枠組みの中で述べられている紡糸技術に関し，効率の大幅な増加，コストの削減及び安全性リスクの軽減に対応している。
【００３１】
低度の揮発性が特徴的である低級アルコールと乳酸との混合液の凝固槽へのゲル押出（ゲル紡糸）の方法を利用した本特許出願に記載のエンドレスファイバーの形成は有効に利用できるものである。これにより，上記で引用された特許に記載の紡糸技術を用いたとしても，紡糸工程中の強い臭気は効率的に排除できる。同時に，個々の紡糸装置の操作者の健康状態に対する急性及び慢性的な影響のリスクが最小限になる。上記で引用した特許出願に記載された酸とは異なり，乳酸は全体的にヒトの健康に無害であると考えられている。乳酸は一般的に筋組織に存在する化学物質であり，また，上述の防腐効果により多様な化粧品の成分として用いられることも多い。更に，ポリマー形態をとる乳酸／乳酸塩は一般的に，ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はそのグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）をベースとして調製した医療用ポリマー分解性インプラントの成分として使用されている。上記の理由で，本特許出願に従って調製した繊維／糸又は生地に残留している可能性のある乳酸の残留物は完全に不要なものであるとは思われない。
【００３２】
上記で引用した２つの特許に記載されている他の酸に代わる乳酸の使用は，類似法により誘導可能であるとされるごくありきたりな解決法であるとは思われない。何故なら，上記で引用した特許で記載されている他の酸とは異なり，乳酸は固形結晶性物質であるからである。標準濃度８０％の水溶液の形態で存在する場合，液体物質のカテゴリーから独占的に選択される上記の他の全ての酸と比較して，乳酸は大幅に粘度の高い液体となる。上記の理由から（特に，純物質の異なる物質状態に起因して），乳酸の添加は非常に自明な技術的解決策であると看做すことはできない。更に，この文脈で上記の全ての酸の代わりに別の凝固剤として乳酸を使用できるということが，自明の仮説であるとは考えられない。
【００３３】
むしろ，アルコール，乳酸及び水から成る三成分混合液の特定の濃度範囲内で使用する場合，上記の誘導体（Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナン）をベースとする織物加工可能な繊維の形成に使用できる効率的な凝固剤になり得るのは乳酸だけであり，ここでは前記混合液のアルコール含有量は少なくとも５０重量％に達する。関連する最適化の調査の結論から，十分な機械的強度を有する繊維は特定の濃度範囲の凝固槽内でのみ形成されることが分かっている。このような槽は５〜４５重量％の範囲の量の乳酸，及び比例量で添加した低級アルコール（エタノール，プロパン‐１‐オール，プロパン‐２‐オール）を含有することが好ましい。また，槽には４〜１０重量％の量で水が含まれてもよい。十分な機械的強度を有する連続的に延伸可能な繊維が得られる凝固槽の濃度範囲は，これだけである。実験的方法において乳酸をベースとする凝固槽の機能的組成が見られることを考慮すると，上記で引用した２つの関連特許WO09/050389及びPV2010‐1001とは異なり，このような乳酸をベースとする槽の使用はありきたりな技術的解決策をもたらすものではないことは明らかであり，このことは，ヒアルロナンをベースとする繊維も粘度が大幅に低い純粋な酸（ギ酸，酢酸又はプロピオン酸）の形態で形成され得るという仮定に基づいている。すでに述べているように，このような酸の蒸気は健康に対してかなり危険性があり，そればかりか強い腐食作用もあり，結果として凝固容器の材質についての要望が高まりつつある。
【００３４】
凝固槽中の乳酸の含有量が低い場合，その全脱水に起因して繊維の脆性が高まる。反対に，凝固混合液中の乳酸濃度が高いと，過度の粘度が原因で槽の効果が失われる。
【００３５】
７５〜８５℃の温度範囲内で少なくとも１２時間，繊維に熱負荷を掛けることも可能であり，その際，実験室温度で乾燥させる。その後，加水分解に対して安定化させる為に，繊維を１，６‐ジアミノヘキサンなどのジアミノ化合物のアルコール溶液の作用に供する。熱改質の後，様々なタイプのアルデヒド基（上記スキーム２，スキーム１を参照）が生じる。新たに生じた二重結合はアルデヒド基と共役して存在し，これにより，熱改質を受けていない繊維と比較して多様なアミノリンカーの結合がより強固になる。結果として，得られた架橋構造の加水分解安定性は増加する。
【００３６】
更に，本発明はＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとする繊維に関するものであり，この繊維は，代替的には外部を架橋してもよい。固形の形態をとる繊維が数十分間水中で安定的であり，粘性の生体適合的な生分解性ハイドロゲルに徐々に変性することから，本発明に従った方法を利用して調製したエンドレスモノフィラメント（ファイバー）は，長時間の幾何学的安定性を特徴とする。更に，十分な機械的強度及び柔軟性を特徴とする。この為，それらを組み合わせて２つ以上の個々のフィラメントを含む繊維トウ（無撚モノフィラメント）の形態，又は２つ以上の個々の繊維を含む糸（撚りモノフィラメント）の形態にすることが可能である。更に，本発明に従った繊維は撚糸，ステープル及び織布，編地又は不織布を製造する為に使用可能である。
【００３７】
本発明は上記繊維から形成された糸，並びに本発明に従った少なくとも１種の繊維及び手術用途での使用に適した様々な生分解性材料，例えば（ポリ（２‐ヒドロキシエチルメタクリレート，ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン），ポリ（メチルメタクリレート），ポリ（ビニルアルコール），ポリアクリル酸，ポリ（エチレン‐ビニルアセテート共重合体），ポリ（エチレングリコール），ポリ（メタクリル酸），ポリ乳酸，ポリグリコリド，ポリ（ラクチド‐グリコリド共重合体），ポリ無水物，ポリオルトエステル，ポリカプロラクトン，ポリヒドロキシアルカノエート，キトサン，コラーゲン又はこれらの任意の組み合わせ）から形成された少なくとも１種の繊維により形成された織り糸にも関連する。最後に付け加えるが，本発明の対象は本発明に従った繊維をベースとする繊維ステープルとこのようなステープルから形成される織り糸である。
【００３８】
代替的に，他の生分解性繊維材料と組み合わせた上記繊維，糸（撚りモノフィラメント），トウ（無撚モノフィラメント），ステープル又は織り糸は，平面状又は筒状の生地の形態又は３Ｄ骨格の形態をとり得る織布，編地及び不織布の製造に使用可能である。
【００３９】
更に，本発明は本発明に従った繊維，糸，繊維ステープル，織り糸及び織布，編地又は不織布を修飾する方法に関するものであり，ここでは，それらは，５×１０−６Ｍ〜０．０１Ｍの濃度で溶液として存在する有機酸の低分子ジヒドラジドを含む７０〜８０％濃度のアルコール水溶液の作用に，２０〜５０℃で１０分〜２４時間供される。有機酸の低分子ジヒドラジドはコハク酸のジヒドラジド，アジピン酸のジヒドラジド，ピメリン酸のジヒドラジドから成る群より選択可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】繊維の調製を繰り返し行った際に測定した引裂き強さを示す。
【図２】繊維の調製を繰り返し行った際に測定した引裂き歪みを示す。
【図３】繊維の調製を繰り返し行った際の粒度分布を示す。
【図４】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンから形成された繊維材料での生存率試験を示す。
【図５】ジヒドラジド（ＡＤＨ‐アジピン酸のジヒドラジド，ＰＭＡＤＨ‐ピメリン酸のジヒドラジド，及びＳＡＤ‐コハク酸のジヒドラジド）により外部が修飾された繊維の分解生成物の非毒性についての検証を表しており，「酵素１００，５００及び１０００」は，それぞれ１００，５００及び１０００μg/mlの濃度のヒアルロニダーゼ酵素を含み，繊維を含有しないブランク溶液を意味する。
【図６】外部が修飾された繊維の溶解度についての情報を含む表を示し，ジヒドラジドアジピン酸塩による修飾は様々な媒体で起こる。所与の媒体における溶解性（膨張による分解）は０〜４の等級で示し，ここでは４は繊維が完全に溶解したことを意味する（目視不能であることに相当する）。
【図７】エンドレスモノフィラメント，並びにＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンから調製した５種のエンドレスモノフィラメントから成る撚糸を示す。
【図８】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンから調製した５種のエンドレスモノフィラメントから成る撚糸の機械的特性を示す。
【図９】ジヒドラジドアジピン酸塩の溶液を使用して外部を架橋したアルデヒドヒアルロナンのＮＭＲの記録を示す。反応した後，材料は難水溶性になった。
【図１０】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が選択的に酸化されたヒアルロナンから調製した熱改質繊維のＮＭＲの記録を示し，繊維の熱負荷によりアルデヒド基が不飽和α，β‐アルデヒドに変換され，それらとアミノ基を有する化合物との間の結合の安定性が大幅に高まっている。
【図１１】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとするマルチフィラメント糸から成る横編み生地を示す。
【図１２】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとするマルチフィラメント糸により横糸が形成され，ＰＥＳフィラメントにより縦糸が形成された複合的縦編み生地を示す。
【図１３】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとするマルチフィラメント糸から成る筒状の横編み生地を示す。
【図１４】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとする繊維及びＰＬＬＡ繊維を含む複合的マルチフィラメント糸から成る縦編み生地を示す。
【図１５】Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位がアルデヒドへと選択的に酸化されたヒアルロナンをベースとするマルチフィラメント糸から成る平織生地を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
特に明記しない限り，本特許出願に記述された分子量（ＭＷ）は平均分子質量値を意味する。
【００４２】
実施例１：８０％のプロパン‐２‐オール，１６％の乳酸及び４％の水を含む混合物への初期溶液の押出によるモノフィラメントの調製
Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化された４７６kDaのＭＷのヒアルロナン２．５gを実験室温度で１６時間かけて脱塩水中に溶解し，５％濃度の透明で均質な粘性溶液を得た。この溶液をシリンダー押出機に移し，消泡した。
【００４３】
シリンダーとピストンから構成されるその押出機を正確な直線測定装置に入れ，押出速度を２００μl/分の値に設定した。外径５００μmの紡糸用単ノズルによって，１６％の乳酸，８０％のプロパン‐２‐オール及び４％の水を含む凝固溶液に当該溶液を押出した。その後，形成されたフィラメントを純粋イソプロパノール中，室温で４時間かけて連続的に巻き上げた。上記時間が経過した後，フィラメントは十分に固化していた。その後，フィラメントを加圧下で乾燥させ，６０℃で８時間かけて２５mbar（２．５kPa）まで減圧した。
【００４４】
上記の方法で調製した後，エンドレスモノフィラメントは０．８８Nの引裂き強さ（図１）及び９．０１％の引裂き歪み（図２）を示した。測定したフィラメントの最終繊度は６．２Tex（図３）であった。水に浸漬した後，フィラメントは約４０分以内に完全に溶解した（目視で完全に見えなくなった）。
【００４５】
実施例２：８０％のエタノール，１６％の乳酸及び４％の水を含む混合物への初期溶液の押出によるモノフィラメントの調製
Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化された６６２kDaのＭＷのヒアルロナン１．５gを実験室温度で１２時間かけて脱塩水中に溶解し，４％濃度の透明で均質な粘性溶液を得た。ゲル状の溶液を遠心分離により消泡した。シリンダーとピストンから構成される押出機を正確な直線測定装置に挿入し，押出速度を２００μl/分の値に設定した。外径５００μmの紡糸用単ノズルによって，１６％の乳酸，８０％の変性エタノール及び４％の水を含む凝固溶液に当該溶液を押出した。その後，形成されたフィラメントを変性エタノール（１０％のプロパン‐２‐オールで変性）の中で，４時間かけて連続的に巻き上げ，その後，加圧下で乾燥させ，６０℃で８時間かけて２５mbar（２．５kPa）まで減圧した。
【００４６】
上記の方法で調製した後，エンドレスモノフィラメントは０．８２Nの引裂き強さ，及び１３．７５％の高い引裂き歪みを示した。測定したフィラメントの最終繊度は６．３１Texであった。加工剤の残留量は以下のとおりであった：乳酸０．２％，エタノール０．０１５％，プロパン２‐オール０．０８％。水に浸漬した後，フィラメントは４３分以内に完全に溶解した（目視で完全に見えなくなった）。
【００４７】
実施例３：６０％のプロパン‐２‐オール，３２％の乳酸及び８％の水を含む混合液への初期溶液の押出によるモノフィラメントの調製
Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化された６３１kDaのＭＷのヒアルロナン０．８gを実験室温度で１２時間かけて脱塩水中に溶解し，５％濃度の透明で均質な粘性溶液を得た。ゲル状の溶液を遠心分離により消泡した。シリンダーとピストンから構成される押出機を正確な直線測定装置に挿入し，押出し速度を２００μl/分の値に設定した。外径５００μmの紡糸用単ノズルによって，３２％の乳酸，６０％のプロパン‐２‐オール及び８％の水を含む凝固溶液に当該溶液を押出した。その後，形成されたフィラメントをプロパン‐２‐オール中，４時間かけて連続的に巻き上げ，その後，加圧下で乾燥させ，６０℃で８時間かけて２５mbar（２．５kPa）まで減圧した。
【００４８】
上記の方法で調製した後，エンドレスモノフィラメントは０．７９Nの引裂き強さ及び１０．２１％の引裂き歪みを示した。
【００４９】
実施例４：外部構造が修飾されていないフィラメントの生存率試験
アルデヒド基を有するヒアルロナンから調製した後，フィラメントを培地（１０％のウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン（１００U/ml/１００μg/ml）を含むダルベッコ変法イーグル培地）に溶解し，得られた溶液を，９６個のウェルを有するパネルに播種した３Ｔ３細胞に添加し，最終密度は３０００c/wであった。ＭＴＴ試験により２４〜７２時間かけて生存率を測定した。試験では，物質ブルーテトラゾリウム臭化チアゾリル（ＭＴＴ）を培地に溶解した後，濃度５mg/mlの最終ＭＴＴ溶液２０μlを各ウェルに添加した。インキュベーションを２．５時間行った。その後，培地を取り除き，２２０μlの可溶化液をピペットにより各ウェルに添加した。次のインキュベーション（３０分間継続）では，代謝したホルマザンを完全に溶解させた。その後，VERSAmaxマイクロプレートリーダーを用いて５７０nm及び６９０nmで吸光度を測定した。
【００５０】
測定を個別に５回実施した。その後のデータ処理では，１対の試料でのスチューデントｔ‐検定を利用し，ｐ値≦０．０５は有意であると考えられた。
【００５１】
全てのケースで，試験に供した繊維材料は細胞生存率を低下させないということが明らかになった（図４）。
【００５２】
実施例５：アジピン酸，コハク酸及びピメリン酸のジヒドラジドによるフィラメントの外部修飾
酸化ヒアルロナンをベースとするフィラメント３０mg（約５m）を，７０％エタノール溶液及び濃度５．１０−３Ｍのアジピン酸の溶解ジヒドラジドから成る反応槽を含む大型のペトリ皿に入れた。その後，フィラメントを含む反応混合液を実験室温度で２時間静置した。次に，フィラメントを８０％エタノールで洗浄し，４０℃で２０分間乾燥させた。
【００５３】
修飾したフィラメントを脱塩水中で溶解度試験に供した。試験では，フィラメントは僅かに膨張したが，その後，少なくとも１週間，十分な安定性が見られた。反対に，ＰＢＳでの試験では２４時間以内にフィラメントが完全に溶解したことから，フィラメントの不安定性が明らかになった。この事実から，外部架橋層だけが形成され，緩衝液の高いイオン力の作用に起因してフィラメントの芯での膨張過程に対する抵抗性が不十分であることが示された。
【００５４】
コハク酸及びピメリン酸のジヒドラジドを使用したケースでフィラメントは類似の挙動を示した。ＮＭＲにより，ヒドラゾンをベースとする構造的結合を形成する外部反応の存在が証明されている（図９）。更に，修飾した材料を水に曝露する不溶解性試験により架橋構造が形成されたことが分かった。
【００５５】
実施例６：Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンをベースとするフィラメントの熱改質  ―  不飽和α，β‐アルデヒドへの変換
乾燥状態で直径１２０μmの調製済フィラメント０．５gをペトリ皿に入れた後，熱風ドライヤーの中に置き，フィラメントを８０℃の温度に１８時間曝露した。その後，フィラメントを静置し，室温で冷却した。フィラメントをＮＭＲ構造解析に供し，熱曝露により除去反応が起こり，骨格炭素単位Ｃ４とＣ５間の共役二重結合が形成されたことが確認された（スキーム１ｂ参照）。個々のＮＭＲ分析の記録を図１０に示す。次にフィラメントを１，６‐ジアミノヘキサンの溶液中８時間かけて修飾した。乾燥させた後，それを脱塩水中に浸漬した。非修飾の対照試料と比較して，加水分解耐性の増加が少なくとも１２時間持続したことが確認された。
【００５６】
実施例７：分解生成物の毒性試験
コハク酸，アジピン酸及びピメリン酸のジヒドラジドにより架橋され，２０mg/mlの濃度の溶液の形態で存在するフィラメントの試料に，５００単位のウシ精巣ヒアルロニダーゼを含むアセテート緩衝液（５００μl）を追加した。３７℃でのインキュベーションを９６時間行った。５００μlの分解生成物を２０mlの培地（１０％のウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００U/ml/１００μg/ml）を含むダルベッコ変法イーグル培地）に希釈し，次いで当該混合物を使用して３Ｔ３株の細胞に影響を与えた。上清を調製した濃度に基づいて，試験に用いた濃度は１０００μg/ml，５００μg/ml及び１００μg/mlであった。ジヒドラジドで外部を修飾した繊維の分解生成物は試験細胞に対して毒性は無いことが実験から明らかになった（図５）。
【００５７】
実施例８：エンドレスモノフィラメントからのマルチフィラメント糸の形成
Ｎ‐アセチル‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンから調製し，繊度が６〜７Texの範囲である５本のモノフィラメントを撚糸フレームに設置した。撚糸に先立ち，乾燥器内でＮａＢｒの飽和水溶液上で，目的最終含水量が約６０％になるようにフィラメントを調整した。フィラメントの含水量が増加すると，当該フィラメントはより柔軟になり，ひいてはその後の撚糸工程で引裂き抵抗が高まる。以下の撚糸パラメータを設定した：送り速度４m/分，スピンドル速度１，４００m/分，トラベラ重量６０mg。フィラメントを撚糸し，直径３５０μmの撚糸を形成した。その後，糸の機械的特性を測定した（図８）。
【００５８】
実施例９：酸化ヒアルロナン（６７％）をベースとするフィラメント及びＰＬＬＡフィラメント（３３％）からの複合モノフィラメント糸の形成
Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンから調製して繊度が８Texである２本のモノフィラメント，並びに繊度が６．５Texである１本のＰＬＬＡフィラメントを撚糸フレームに設置した。撚糸に先立ち，含水量が４５〜５０％になるようにフィラメントを２４時間調整した。フィラメントの含水量がこのように増加すると，当該フィラメントはより柔軟になり，ひいてはその後の撚糸工程で引裂き抵抗が高まる。以下の撚糸パラメータを設定した：送り速度５m/分，スピンドル速度１，５００m/分，トラベラ重量５０mg。フィラメントを撚糸し，直径１３０〜１７０μmの糸を形成した。糸は以下の機械的特性を示した：引張り強度２．３±０．２N，伸長１６．５±１．７％，及び結節強度１．２±０．３N。
【００５９】
実施例１０：Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンをベースとするフィラメントから成る横編地
実施例８に記載の糸と同様に調製した糸をリング型撚糸フレームで撚糸し，三本撚糸を形成した。その後，作業直径が１１／２’で針ゲージ５ＧのHarry Lucas丸編み機で糸を加工し，筒状の編地を形成した（図１３）。仕上がった平面状の横編地の坪量は１１０g/m2，コース密度は５ループ/cm，ウェール密度は３．５ループ/cmであった（図１０）。
【００６０】
実施例１１：酸化ヒアルロナンをベースとするフィラメント及びＰＬＬＡフィラメントから調製した複合糸から成る縦編地
実施例９に記載の糸と同様に調製した糸をリングタイプの撚糸フレームで撚糸し，二本撚糸を形成した。その後，必要な縦糸をドラム型整経台で形成した。縦糸をワープビームで巻き戻した。針ゲージ１１Ｇのスプリングフック針を備えた縦編み機（クロッシェ編み機，Rius）にワープビームを設置した。縦糸をラッピングガイド及び編み針に引き入れ，編んで鎖編みを形成した。このように，編地が製造され，その鎖編みは前面横糸により織編みになっていた（図１１）。
【００６１】
実施例１２：Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン基の６位が酸化されたヒアルロナンから調製したフィラメントから成る生地
必要な縦糸をドラム型整経台で形成し，個々の縦糸は実施例８に記載の糸と同様に調製した。その後，縦糸をワープビームで巻き戻した。ワープビームをシャトル型リボン織機に取り付け，縦糸を綜絖及び筬に引き入れた。同じ組成の横糸を，シャトルに挿入されたボビンに巻き上げた。縦糸及び横糸のピッチの値が望ましい平織を得る為に，開口及び検出のメカニズムに必要なパラメータを調整した。仕上がった平織生地の坪量は７５g/m2，縦糸のピッチは１０糸/cm，横糸のピッチは２０糸/cmであった（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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2016502612.tif 000022
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