(57)【要約】  「インビトロ」の細胞およびヨーロピアンシーバス中の細胞の感染の間の、異なるベータノダウイルス間の相互作用を開示する。より具体的には、シマアジ神経壊死症ウイルス（ＳＪＮＮＶ）を投与し、次いでキジハタ神経壊死症ウイルス（ＲＧＮＮＶ）に曝露した魚類は、ＲＧＮＮＶへの曝露の前にＳＪＮＮＶを投与しない魚類と比較して、ＲＧＮＮＶに関連した疾患のより少ない症状および／または生存の増加を有する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対する魚類の保護における使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項２】
前記ＳＪＮＮＶが、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である、
請求項１に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項３】
前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである、請求項２に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項４】
前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、請求項２または３に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項５】
前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２のヌクレオチド６０４〜１０３０の配列に対するものである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項６】
前記ＳＪＮＮＶのアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２０４〜３３１の配列に対するものである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項７】
前記アミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２２３〜３３１に対するものである、請求項６に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項８】
前記アミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２３５〜３１５に対するものである、請求項７に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項９】
前記疾患に対する魚類の保護が、魚類の集団におけるＲＧＮＮＶ感染に起因する死亡の低減を伴う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項１０】
前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項１１】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項１２】
前記魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または減少した疾患の症状を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項１３】
ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項１４】
ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する魚類の保護における使用のためのワクチンであって、ＳＪＮＮＶを含むワクチン。
【請求項１５】
魚類におけるＲＧＮＮＶ感染の予防または治療における使用のためのＳＪＮＮＶを含むワクチン。
【請求項１６】
前記ＳＪＮＮＶが、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２が魚類へ投与される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２からなる、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２であり、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１を含まない、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ＳＪＮＮＶが、熱殺菌されたかまたは化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶの形態である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶが、アジリジン化合物、好ましくはバイナリーエチレンイミンを使用して不活性化されたものである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記ＳＪＮＮＶが、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチン、好ましくはＲＮＡワクチンの形態で投与される、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２７】
ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対して魚類を保護する方法であって、該魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、続いてＲＧＮＮＶに曝露された該魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または減少した疾患の症状を有する、方法。
【請求項２８】
前記ＲＧＮＮＶが魚類における死亡を引き起こし得る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＳＪＮＮＶを投与し、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より低い死亡率を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約６週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約３週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約７２時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約２４時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＳＪＮＮＶが単離体ＳＪ９３Ｎａｇを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳＪＮＮＶおよび前記ＲＧＮＮＶが同じ種の魚類に感染し得るものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＳＪＮＮＶの投与が、ウイルスを魚類に筋肉内注射もしくは腹膜注射すること、またはウイルスを含有する浴槽中に魚類を浸漬することによって行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量が少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量が約１×１０４〜約１．５×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＳＪＮＮＶの投与が、少なくとも１つのインターフェロン誘導遺伝子の転写発現の増加をもたらす、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記インターフェロン誘導遺伝子がＭｘを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
シーバスにおけるＲＧＮＮＶ感染に関連した死亡率を低減する方法であって、シーバスにＳＪＮＮＶを接種することを含み、続いて死亡を引き起こし得るＲＧＮＮＶに曝露されたシーバスが、ＳＪＮＮＶを接種せずにＲＧＮＮＶに曝露されたシーバスと比較して、低減された死亡率を有する、方法。
【請求項４３】
ＳＪＮＮＶを接種され、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記シーバスが、ＳＪＮＮＶの接種後約７２時間以内において、低減された死亡率を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
魚類をウイルスに感染させる方法であって、
ａ）前記魚類にＳＪＮＮＶを投与する工程と；
ｂ）ＲＧＮＮＶに前記魚類を曝露する工程と；
を含み、
前記魚類が、ＳＪＮＮＶを投与されずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類よりも、より少ないおよび／または低減したＲＧＮＮＶ感染に関連した症状を有する、方法。
【請求項４５】
細胞をＳＪＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＲＧＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＳＪＮＮＶの複製を阻害する方法。
【請求項４６】
細胞をＲＧＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＳＪＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＲＧＮＮＶの複製を刺激する方法。
【請求項４７】
ＲＧＮＮＶ感染に起因する魚類の死亡量を低減させるための組成物の製造におけるＳＪＮＮＶの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、キジハタ神経壊死症ウイルス（ＲＧＮＮＶ）感染に関連した疾患に対する魚類の保護における使用のためのシマアジ神経壊死症ウイルス（ＳＪＮＮＶ）に関する。別の態様において、本発明は、ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対して魚類を保護する方法であって、魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、その場合、続いてＲＧＮＮＶに曝露された魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または低減した疾患の症状を有する、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノダウイルス科、ベータノダウイルス属のウイルス（すなわちベータノダウイルス）は、世界中の様々な海生魚類および淡水魚類の種に感染し、魚類におけるウイルス性脳網膜症（ＶＥＲ）の病原体である。この疾患（ウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）とも呼ばれる）は、著しい魚類死亡を引き起こし得る。
【０００３】
疾患を引き起こすベータノダウイルスはエンベロープに包まれておらず、それらのゲノムは２つの一本鎖のプラス鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡ１およびＲＮＡ２と示される）を含有する。感染細胞は３つのｓｓＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、およびＲＮＡ１に由来したサブゲノムのＲＮＡ３）を含有する。ＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域を使用してベータノダウイルスを４つの異なる遺伝子型（シマアジ神経壊死症ウイルス（ＳＪＮＮＶ）、トラフグ神経壊死症ウイルス（ＴＰＮＮＶ）、マツカワ神経壊死症ウイルスおよびキジハタ神経壊死症ウイルス（ＲＧＮＮＶ））へと分類した（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。名称のうちのＮＮＶ部分は神経壊死症ウイルスを指し、名称のうちのイニシャル部分はそれが単離された魚類を指す。これらは、タイプ種として公知のシマアジ種によるＳＪＮａｇ９３単離体の特徴づけに基づき、認められた種となった（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。他のもの（それはベータノダウイルス属のメンバーであり得るが、分離した種としてまだ承認されておらず、上でリストされた４つの認められた種のいずれかの変種であるかまたはそうでないだろう）には、大西洋タラ神経壊死症ウイルス、大西洋オヒョウノダウイルス、ヨーロピアンシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）脳炎ウイルス、ドラゴングルーパー（Ｄｒａｇｏｎ  ｇｒｏｕｐｅｒ）神経壊死症ウイルス、ヒトミハタ神経壊死症ウイルス、ヒラメ神経壊死症ウイルス、バラマンディ（Ｌａｔｅｓ  ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）脳炎ウイルス、ヤイトハタ神経壊死症ウイルス、シーバス神経壊死症ウイルス、セネガルシタビラメ（Ｓｏｌｅａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）神経壊死症ウイルス、およびイシビラメノダウイルスが含まれる（Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，２０１２）。
【０００４】
ベータノダウイルスの異なる遺伝子型は恐らく魚類の異なる宿主範囲に感染する。しかしながら、野外における単一の魚類内のＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶの共存は、野生のオオニベ（Ａｒｇｙｒｏｓｏｍｕｓ  ｒｅｇｉｕｓ）中で示された。ＲＮＡ１およびＲＮＡ２の両方に基づいた遺伝子分析から、感染した魚類中での再集合体ウイルス（ＲＧＮＮＶ／ＳＪＮＮＶおよびＳＪＮＮＶ／ＲＧＮＮＶ）の存在も実証された。ＳＪＮＮＶからの１ゲノムＲＮＡ分子およびＲＧＮＮＶからの１ゲノムＲＮＡ分子を含有するかかる再集合体ウイルス株または単離体は、セネガルシタビラメおよびヨーロッパヘダイから単離された。再集合体株は、疾患の臨床的なアウトブレイクに関連した。再集合体は、ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶによる同じ細胞の共感染をもたらし得る。ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶ  ＲＮＡの両方が同じ感染細胞中で共存し得ることをこの証拠は指摘するが、これがどのように複製および／もしくは子孫ウイルス産生に影響するか、またはこれがどのように疾患の症状を引き起こす能力に影響するか、何も知られてない。
【０００５】
ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶは、イベリア半島に生息する魚類種（ヨーロピアンシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）、セネガルシタビラメ（Ｓｏｌｅａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、ヨーロッパヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ  ａｕｒａｔａ）、レッドバンディッドシーブリーム（Ｐａｇｒｕｓ  ａｕｒｉｇａ）、ヨーロッパマダイ（Ｐａｇｒｕｓ  ｐａｇｒｕｓ）、シャイドラム（Ｕｍｂｒｉｎａ  ｃｉｒｒｏｓａ）およびホワイトシーブリーム（Ｄｉｐｌｏｉｄｕｓ  ｓａｒｇｕｓ）等）中で分離して検出された。
【０００６】
ＲＧＮＮＶ遺伝子型は、地中海の領域において最も一般的なものであるように思われ、水産業（特にギリシャにおける）の破壊的な損失についての原因であった。ヨーロピアンシーバスの当分野における損失は最大６０％であると報告されている。したがって、ＲＧＮＮＶ感染の効果から魚類（特にタイ類（シーブリーム））を保護する手法についての緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、キジハタ神経壊死症ウイルス（ＲＧＮＮＶ）感染に関連した疾患に対する魚類の保護における使用のためのシマアジ神経壊死症ウイルス（ＳＪＮＮＶ）に関する。
【０００８】
好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶは、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である。
【０００９】
さらに好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。
【００１０】
より好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列のパーセンテージ同一性は、ＳＪＮａｇ９３  ＳＪＮＮＶのＲＮＡ２のヌクレオチド６０４〜１０３０の配列に対するものであるか、または、ＳＪＮＮＶのアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＳＪＮａｇ９３  ＳＪＮＮＶのＲＮＡ２によってコードされたタンパク質のアミノ酸２０４〜３３１、好ましくはＳＪＮａｇ９３  ＳＪＮＮＶのＲＮＡ２によってコードされたタンパク質のアミノ酸２２３〜３３１、より好ましくはＳＪＮａｇ９３  ＳＪＮＮＶのＲＮＡ２によってコードされたタンパク質のアミノ酸２３５〜３１５に対するものである。
【００１１】
好ましくは、ＳＪＮＮＶは、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３（好ましくはＳＪＮａｇ９３）からなる群から選択される。
【００１２】
好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶは、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される。
【００１３】
同様に好ましくは、疾患に対する魚類の保護は、魚類の集団におけるＲＧＮＮＶ感染に起因する死亡の低減を伴う。
【００１４】
さらに好ましくは、魚類は、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイおよびレッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ（好ましくはヨーロピアンシーバス）からなる群から選択される。
【００１５】
さらに好ましい実施形態において、ＲＧＮＮＶは、
ｉ）ＲＧＮＮＶ単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＲＧＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４に対する抗血清と血清学的に反応するＲＧＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＲＧＮＮＶ単離ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４に対する抗血清と血清学的に反応するＲＧＮＮＶ
である。
【００１６】
好ましい実施形態において、ＲＧＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＲＧＮＮＶ単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。
【００１７】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、その場合、続いてＲＧＮＮＶに曝露された魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または低減した疾患の症状を有する、使用のためのＳＪＮＮＶに関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する使用のためのＳＪＮＮＶに関する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対して魚類を保護する方法であって、魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、その場合、続いてＲＧＮＮＶに曝露された魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または低減した疾患の症状を有する、方法に関する。
【００２０】
好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶを使用して、後にＲＧＮＮＶに曝露された魚類（好ましくはシーバス）の死亡を、ＳＪＮＮＶ、またはＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一であるウイルスを投与されていない魚類（好ましくはシーバス）と比較して、減少させる。
【００２１】
本発明の別の好ましい態様において、魚類（好ましくはシーバス）におけるＲＧＮＮＶ感染に関連した死亡率を低減する方法であって、魚類（好ましくはシーバス）にＳＪＮＮＶを接種することを含み、その場合、続いて死亡を引き起こし得るＲＧＮＮＶの株（複数可）に曝露された魚類（好ましくはシーバス）が、ＳＪＮＮＶを接種されずにＲＧＮＮＶのその株（複数可）に曝露されたシーバスと比較して、低減した死亡率を有する、方法が提供される。
【００２２】
好ましくは、本発明に記載の方法において、ＲＧＮＮＶは魚類における死亡を引き起こし得る。好ましくは、ＳＪＮＮＶを投与し、続いてＲＧＮＮＶに曝露された魚類は、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より低い死亡も有する。
【００２３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、魚類はＳＪＮＮＶの投与後約６週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される。より好ましくは、魚類はＳＪＮＮＶの投与後約３週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される。特に好ましくは、魚類はＳＪＮＮＶの投与後約７２時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される。より特に好ましくは、魚類はＳＪＮＮＶの投与後約２４時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される。別の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶには単離体ＳＪ９３Ｎａｇが含まれる。さらに別の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶは同じ種の魚類に感染することができ、好ましくはヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベが含まれる。本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶの投与は、ウイルスを魚類に筋肉内注射もしくは腹膜注射すること、またはウイルスを含有する浴槽中に魚類を浸漬することによって行われる。本発明の方法のさらに別の好ましい実施形態において、魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量は少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である。より好ましくは、魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量は、約１×１０４〜約１．５×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である。本発明の方法の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶの投与は少なくとも１つのインターフェロン誘導遺伝子の転写発現の増加をもたらし、好ましくはインターフェロン誘導遺伝子にはＭｘが含まれる。好ましくは、本発明に記載の方法において、ＳＪＮＮＶを接種され、続いてＲＧＮＮＶに曝露されたシーバスは、ＳＪＮＮＶの接種後約７２時間以内において、低減された死亡率を有する。
【００２４】
本発明に記載の方法の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶは、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３  ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である。
【００２５】
本発明に記載の方法の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。
【００２６】
本発明に記載の方法のさらに好ましい実施形態において、ＲＧＮＮＶは、ＲＧＮＮＶ単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、
またはｉｉ）単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４に対する抗血清と血清学的に反応するＲＧＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＲＧＮＮＶ単離ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４に対する抗血清と血清学的に反応するＲＧＮＮＶ
を有する。
【００２７】
本発明に記載の方法の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＲＧＮＮＶ単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。
【００２８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、ＲＧＮＮＶは、ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＲＮＡ２と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列を有する。ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ１の代表的な実施例は、アクセッション番号ＮＣ＿００８０４０．１下でＧｅｎｂａｎｋ中で見出せる。ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ２の代表的な実施例は、アクセッション番号ＮＣ＿００８０４１．１下でＧｅｎｂａｎｋ中で見出せる。
【００２９】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセンテージ同一性は、ＲＧＮＮＶのＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ２の代表的な実施例は、アクセッション番号ＮＣ＿００８０４１．１下でＧｅｎｂａｎｋ中で見出せる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、魚類におけるＲＧＮＮＶ感染の予防または治療における使用のためのＳＪＮＮＶを含むワクチンに関する。さらに別の態様において、本発明は、ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する魚類の保護における使用のためのワクチンであって、ＳＪＮＮＶを含むワクチンに関する。
【００３１】
好ましくは、前記ワクチンにおいて、ＳＪＮＮＶは、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶである。より好ましくは、ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性は、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである。ワクチンの好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶは、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される。ワクチンの別の好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２は魚類へ投与される。好ましくは、さらに、ＳＪＮＮＶは、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２からなる。代替の実施形態において、ＳＪＮＮＶは、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２であり、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１を含まない。ワクチンの好ましい実施形態において、ＳＪＮＮＶは、熱殺菌されたかまたは化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶの形態である。典型的には、化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶは、アジリジン化合物（好ましくはバイナリーエチレンイミン）を使用して不活性化されたものである。好ましくは、ＳＪＮＮＶは、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチン（好ましくはＲＮＡワクチン）の形態で投与される。本発明に記載のワクチンの別の好ましい実施形態において、魚類は、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイおよびレッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ（好ましくはヨーロピアンシーバス）からなる群から選択される。好ましくは、さらに本発明に記載のワクチンにおいて、ＳＪＮＮＶは、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３（好ましくはＳＪＮａｇ９３）からなる群から選択される。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ＲＧＮＮＶ感染に起因する魚類の死亡量を低減させるための組成物の製造におけるＳＪＮＮＶの使用に関する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、細胞をＳＪＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＲＧＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＳＪＮＮＶの複製を阻害する方法に関する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、魚類をウイルスに感染させる方法であって、
ａ）魚類にＳＪＮＮＶを投与する工程と；
ｂ）ＲＧＮＮＶに魚類を曝露する工程と；
を含み、
前記魚類が、ＳＪＮＮＶを投与されずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類よりも、より少ないおよび／または低減したＲＧＮＮＶ感染に関連した症状を有する、方法に関する。
【００３５】
なおさらなる態様において、本発明は、細胞をＲＧＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＳＪＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＲＧＮＮＶの複製を刺激する方法に関する。
【００３６】
明細書中で援用され、明細書の一部を構成する添付の図面において、方法および組成物の実施形態またはそれらに関する実施形態が図示され、以下に与えられた詳細な記述と共に、実施例を記述する役目を果たす。図面中で図示された実施形態が限定のためではなく図示の目的のために示されることを認識されたい。以下に開示されるような図面中で図示された実施形態からの変化、修飾および偏向が本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに行なわれてもよいことを認識されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】異なるベータノダウイルス遺伝子型を５ｇの稚シーバスへ投与し、後続して魚類の死亡が起こる研究からの実施例データを図示する。
【図２】ＲＧＮＮＶの異なる株および接種物をシーバスへ投与し、後続して魚類の死亡が起こる研究からの実施例データを図示する。陽性対照はＲＧＮＮＶ単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４である。
【図３】ＲＧＮＮＶ株を異なる重量のシーバスへ投与し、後続して魚類の死亡が起こる研究からの実施例データを図示する。
【図４】ＳＪＮＮＶを既に投与されたシーバスへＲＧＮＮＶ株を投与した研究（例えばＳＪＮＮＶにより感染した魚類のＲＧＮＮＶ重複感染）からの実施例データを図示する。後続して魚類の死亡が起こった。
【図５】ＳＪＮＮＶにより感染した魚類がＲＧＮＮＶにより重複感染した後に、ＲＧＮＮＶゲノムＲＮＡを様々な時間で定量化する研究からの実施例データを図示する。各々のタイムポイントでの第１のカラムはＲＧ対照群（群３）であり、各々のタイムポイントでの第２のカラムはＳＪ／ＲＧ群（群４）である。
【図６】ＳＪＮＮＶにより感染した魚類がＲＧＮＮＶにより重複感染した後に、ＳＪＮＮＶゲノムＲＮＡを様々な時間で定量化する研究からの実施例データを図示する。各々のタイムポイントでの第１のカラムはＳＪ対照群（群２）であり、各々のタイムポイントでの第２のカラムはＳＪ／ＲＧ群（群４）である。
【図７】ＳＪＮＮＶゲノムＲＮＡを、（Ａ）細胞をＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶにより共感染した後、（Ｂ）ＳＪＮＮＶにより感染した細胞をＲＧＮＮＶにより重複感染した後、および（Ｃ）ＲＧＮＮＶにより感染した細胞をＳＪＮＮＶにより重複感染した後に、様々な時間で定量化する研究からの実施例データを図示する。
【図８】ＲＧＮＮＶゲノムＲＮＡを、（Ａ）細胞をＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶにより共感染した後、（Ｂ）ＳＪＮＮＶにより感染した細胞をＲＧＮＮＶにより重複感染した後、および（Ｃ）ＲＧＮＮＶにより感染した細胞をＳＪＮＮＶにより重複感染した後に、様々な時間で定量化する研究からの実施例データを図示する。
【図９−１】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１（配列番号：１）。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂについてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子、完全なｃｄｓ、ヌクレオチド配列。
【図９−２】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１（配列番号：１）。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂについてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子、完全なｃｄｓ、ヌクレオチド配列。
【図９−３】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１（配列番号：１）。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂについてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子、完全なｃｄｓ、ヌクレオチド配列。
【図１０ａ】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１（配列番号：２）。タンパク質Ａのアミノ酸配列
【図１０ｂ】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１（配列番号：３）タンパク質Ｂのアミノ酸配列。
【図１１】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２（配列番号：４）。外殻タンパク質についてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子、完全なｃｄｓ、ヌクレオチド配列。
【図１２】ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２（配列番号：５）。外殻タンパク質のアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書において、「ＳＪＮＮＶ」は、シマアジ神経壊死症ウイルス種または遺伝子型のベータノダウイルスを意味する。本明細書において開示されるＳＪＮＮＶウイルスは、一般的には、ＲＧＮＮＶ種または遺伝子型のいくつかのウイルスと同じ細胞の少なくともいくつかに、感染または少なくとも吸着することができる。ＳＪＮＮＶ単離体の実施例には、ＳＪ９３Ｎａｇ、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒが含まれるが、これらに限定されない。ＳＪＮＮＶの好ましい実施例は、単離体ＳＪ９３Ｎａｇである（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０５６５７１を参照、図９：配列番号：１（ＲＮＡ１：タンパク質Ａ、タンパク質Ｂについてのウイルス遺伝子）、図１０ａ：配列番号：２：タンパク質Ａのアミノ酸配列［シマアジ神経壊死症ウイルス］ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ６４３２９、図１０ｂ：配列番号：３：タンパク質Ｂのアミノ酸配列［シマアジ神経壊死症ウイルス］ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ６４３３０、図１１：配列番号：４：外殻タンパク質についてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子、完全なｃｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０５６５７２、図１２：配列番号：５：外殻タンパク質についてのシマアジ神経壊死症ウイルス遺伝子のアミノ酸配列、完全なｃｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ６４３３１）。
【００３９】
本明細書において、「ＲＧＮＮＶ」は、キジハタ神経壊死症ウイルス種または遺伝子型のベータノダウイルスを意味する。本明細書において開示されるＲＧＮＮＶウイルスは、一般的には、ＳＪＮＮＶ遺伝子型のいくつかのウイルスと同じ細胞の少なくともいくつかに感染または少なくとも吸着することができる。ＲＧＮＮＶ単離体の実施例には、ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４、ＳｐＤＩ−ＩＡｕｓｃ１６８８．０８、Ｍｔ／０１／Ｓｂａ、Ｇｒ／０２／Ｓｂａ、Ｇｒ／１２／Ｓｂａ、Ｐｔ／０８／Ｓｂａ、Ｉｔ／２３／Ｓｂａ、Ｉｔ／２４／Ｓｄｒ、Ｉｔ／１９／Ｓｂａ、Ｊｐ／１５／Ｒｐ、Ｔｈ／０７／Ｂｇｒ、Ｓｇ／１４／Ｂａｒ、Ｓｐ／２０／Ｓｂａ、Ｇｒ／１６／Ｓｂａ、ＳＧＷａｋ９７、ＳＧＭｉｅ９５、ＲＧＯｋａ９４、ＪＳＯｉｔ９８、ＫＧＯｉｔ９７、ＨＧ０００１、ＢＧＴｈＡ９９、ＳＢＧｒｅ９６、ＷＳＢＵＳ９９Ａ、ＷＳＢＵＳ９９Ｂ、ＢＡｕｓ９４、ＪＦＨｉｒ９２、ＪＦＨｉｒ９６、ＪＦ９３Ｈｉｒ、ＭＲ９４Ｔｈａ、ＲＧ９４Ｏｋａ、ＪＦ９４Ｗａｋ、ＪＦ９５Ｏｉｔ、ＲＧ９１Ｔｏｋ、ＳＢ９５Ｉｔａ、ＳＧ９４Ｏｉｔ、ＪＦ９５Ｔｏｋ、ＪＳ９５Ｓｈｉ、ＪＦ９５Ｓａｇ、ＰＡ９４ＯｉｔおよびＫＧ９５ＯＩｔが含まれるが、これらに限定されない。ＲＧＮＮＶ単離体の好ましい実施例は、ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４またはＳｐＤＩ−ＩＡｕｓｃ１６８８．０８（特に好ましくはＥＲＶ３７８／１０２−５／０４）である。
【００４０】
本明細書において、「魚類」は、一般的には、ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶに感染し得る魚類の種を指す。これらの種には、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリーム、シャイドラムおよび野生のオオニベが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書において、「引き起こし得る」は、一般的にウイルスを指す時に、少なくとも特定の病態または状況下でウイルスが規定された効果（例えば症状および／または疾患および／または死亡）をもたらし得ることを意味する。
【００４２】
本明細書において、「症状」は、一般的には健全な動物にとっては正常でないと考えられる動物のまたは動物において観察可能なおよび／または測定可能な特徴を指す。症状は疾患を暗示し得る。本明細書において、動物は一般的には魚類であり、症状は、正常または健全な特徴であると考えられるものとは異なる魚類の特徴の変化（例えば物理的変化、行動変化など）であり得る。本明細書において、症状は、ウイルス感染に起因すると考えられるか、またはウイルス感染によって引き起こされると判断することができる。例えば、ベータノダウイルスは魚類におけるウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）の原因であり得る。ＶＮＮの症状には、中枢神経系（ＣＮＳ）における網膜の細胞中の空胞形成および中枢神経系ニューロン変性、食欲不振症、ならびに色素形成、視力、膀胱制御および遊泳挙動の異常が含まれ得る。ベータノダウイルスによって引き起こされたＶＮＮは、感染した魚類の死をもたらし得る。したがって死亡はＶＮＮの結果として参照することができるが、死亡をＶＮＮの症状であると判断することができる。症状は、他の用語（臨床的徴候、疾患の現われおよび同種のもの等）の使用を参照することができる。
【００４３】
本明細書において、「症状の低減」、「死亡の低減」、「死亡率の低減」、および同種のものは、一般的には、異なる魚類または異なる魚類の群における特性の比較を指し、魚類の１つの群中で観察された特性の程度は、別の群中で減少または低減される。一般的に、減少は作用または特徴に帰着することができる。本明細書において、例えば、ＲＧＮＮＶにより感染した魚類の集団は、一般的にはＲＧＮＮＶ感染に起因する症状を示すだろう。測定可能な数の感染した魚類が死亡するだろう。比較可能な集団において、症状を示すかまたは死亡する魚類の数は、魚類がＲＧＮＮＶ感染の前にＳＪＮＮＶを投与された場合、ＳＪＮＮＶを投与されなかった群よりも低いだろう。この状況において、ＳＪＮＮＶの事前投与は、ＲＧＮＮＶによって引き起こされる症状またはＲＧＮＮＶに関連した症状および／もしくは死亡を低減させたと言える。症状および死亡のような特性の低減は、ＳＪＮＮＶ投与に起因して、ＲＧＮＮＶに関連した疾患またはＲＧＮＮＶによって引き起こされる疾患からの保護を指摘することができる。
【００４４】
本明細書において、「投与すること」または「接種すること」は、一般的にはウイルスならびに魚類および／または細胞とのそれらの相互作用を指す時に、ウイルスが魚類中の細胞またはインビトロで培養された細胞に感染または少なくとも吸着できるように、ウイルスが魚類または細胞へ意図的に与えられるか、適用されるか、または導入されることを意味する。ウイルスを投与するまたは接種する１つの方法は、魚類の体の中へのウイルスの注射による。
【００４５】
本明細書において、「〜への曝露」または「〜へ曝露される」は、一般的には、ウイルスが動物の細胞を感染する可能性または機会があるように、動物（例えば魚類）が病原菌（例えばウイルス）へ近接している状況を指す。
【００４６】
本明細書において、「続いて投与すること」または「続いて接種すること」は、一般的にはウイルスが他のいくつかの事象が起こった後の時点で魚類へ投与される状況を指す。一実施例において、１つのウイルス（例えばＲＧＮＮＶ）は、異なるウイルス（例えばＳＪＮＮＶ）が魚類へ投与された後の時点で、魚類へ投与される。この状況において、ＲＧＮＮＶは、ＳＪＮＮＶのより早い投与に関連して「続いて投与される」と言える。
【００４７】
本明細書において、「感染」は、ウイルスが宿主細胞と相互作用し増倍するか、または追加のウイルスが産生されるように宿主細胞内で少なくとも増倍する機会を有するプロセスを指す。感染プロセスは、様々なステージで中断またはブロックすることが可能である。感染プロセスが中断またはブロックされる場合に、追加のウイルスの産生は阻害または低減され得る。
【００４８】
本明細書において、「共感染」は、一般的には、異なるウイルス（例えばＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶ）が、およそ同じ時間または同時に同じ宿主細胞と相互作用するプロセスを指す。一実施例において、２つの異なるウイルスによる細胞の共感染は、宿主細胞の内部で両方のウイルスからのゲノムの共存をもたらす。
【００４９】
本明細書において、「重複感染」は、２つのウイルスがおよそ異なる時間で同じ宿主細胞と相互作用する状況を指す。例えば、ＳＪＮＮＶによる細胞の感染が開始できるように細胞がＳＪＮＮＶに曝露され、ある程度の後の時間で、ＲＧＮＮＶ感染が開始できるように細胞はＲＧＮＮＶに曝露される例において、ＳＪＮＮＶは「感染」ウイルスであると言え、ＲＧＮＮＶは「重複感染」ウイルスであると言える。重複感染は一般的にはしたがって、ウイルスによる細胞の感染を指し、そこで細胞は以前にウイルスに感染している。感染ウイルスは重複感染ウイルスの前に細胞に感染したと言える。重複感染ウイルスは感染ウイルスに続いて細胞に感染したと言える。
【００５０】
本明細書において、「複製」は、一般的にはウイルスゲノムが宿主細胞の内部において再産生されるプロセスを指す。一般的に、複製は感染の間に起こる事象のサブセットを含む。
【００５１】
本明細書において、「再集合体」は、一般的には、少なくとも２つのゲノムセグメントの起源が同じでないウイルスに帰着することができる多分割ゲノム（例えば複数のセグメント中のゲノム）を備えたウイルスを指す。例えば、ＳＪＮＮＶを起源とした１つのゲノムＲＮＡ分子およびＲＧＮＮＶを起源とした第２のゲノムＲＮＡ分子を有すると思われるベータノダウイルスが公知である。
【００５２】
本明細書において、「転写発現」は、遺伝子のＤＮＡコピーからのＲＮＡの合成を指す。一実施例において、細胞内の特異的遺伝子によってコードされたＲＮＡの定常状態レベルを測定し、転写のレベルでの遺伝子の発現の調節の推測に使用することができる。一実施例において、遺伝子によってコードされたＲＮＡのレベルは細胞の異なる集団において測定され、ＲＮＡレベル中の差異はその遺伝子の転写率の変化に起因する。
【００５３】
本明細書において開示されるものは、魚類またはインビトロの細胞の感染におけるベータノダウイルス間の相互作用、およびその相互作用の効果である。記述されたベータノダウイルスは、一般的にはＳＪＮＮＶ種のウイルスおよびＲＧＮＮＶ種のウイルスである。一実施例において、ＳＪＮＮＶによる魚類の感染は、事前のＳＪＮＮＶ感染がない場合のＲＧＮＮＶの疾患／症状／効果と比較して、重複感染ＲＧＮＮＶの疾患、疾患の症状、疾患の効果、および同種のものを低減または減退させることができる。
【００５４】
ＲＧＮＮＶの重複感染に対するＳＪＮＮＶ感染の効果は、魚類の多様な種において観察され得る。一般的に、魚類は、ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶによって感染することができる任意の種を含む。いくつかの実施例には、ヨーロピアンシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）、セネガルシタビラメ（Ｓｏｌｅａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、ヨーロッパヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ  ａｕｒａｔａ）、レッドバンディッドシーブリーム（Ｐａｇｒｕｓ  ａｕｒｉｇａ）、ヨーロッパマダイ（Ｐａｇｒｕｓ  ｐａｇｒｕｓ）およびホワイトシーブリーム（Ｄｉｐｌｏｉｄｕｓ  ｓａｒｇｕｓ）が含まれる。
【００５５】
一般的に、ＳＪＮＮＶは、ＲＧＮＮＶも感染することができる魚類種に感染することができるＳＪＮＮＶであり得る。一実施例において、感染ＳＪＮＮＶは、重複感染ＲＧＮＮＶよりも少ないかまたは重度でない症状を引き起こし得る。一実施例において、ＳＪＮＮＶはＳＪ９３Ｎａｇ株または単離体であり得る（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。他のＳＪＮＮＶ単離体には、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒが含まれ得る。
【００５６】
「抗血清との血清学的な反応」は、当技術分野において周知の方法によって試験することができる。血清学的交差反応の検出のための試験の実施例は、ＥＬＩＳＡ、血球凝集抑制（ＨＩ）、血清中和（ＳＮ）アッセイ、交差中和試験およびウイルス中和試験である。好ましい実施例は交差中和試験である。ノダウイルス単離体についての抗血清との血清学的な交差反応の試験に使用される方法論については、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、ｐ２１を参照されたい。
【００５７】
ＳＪＮＮＶはシマアジ魚類の疾患のある仔魚から精製され、例えばＲＮＡは、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ  １９９５，ｐ１５６４によって記述されるような当該技術分野において周知の方法によって抽出することができる。
【００５８】
本発明に記載のＳＪＮＮＶ遺伝子型内に属するようなＲＮＡウイルスの同一性は、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、特に１６３５ページ、ならびにＮｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５およびＳｋｉｌｉｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、６４ページによって記述されるように、ＲＮＡ２のヌクレオチド６０４〜１０３０、またはアミノ酸レベルａａ２０４〜３３１、好ましくは２２３〜３３１、より好ましくは２３５〜３１５での外殻タンパク質遺伝子配列の可変領域との比較によって確立することができる。
【００５９】
ＳＪＮＮＶについての感染性ＲＮＡ転写は、ＳＪＮＮＶの公知の配列に基づいて、当技術分野において周知の方法によって代わりに行うことができる（配列番号：１〜５を参照）。これは、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１、ｐ２６５４〜２６５６中で詳細に記述される。
【００６０】
一般的に、ＲＧＮＮＶは、ＳＪＮＮＶにも感染し得る魚類種に感染し得る。一実施例において、ＲＧＮＮＶは、感染した魚類において症状および／または疾患を引き起こす。一実施例において、ＲＧＮＮＶは、感染した魚類において死亡を引き起こし得る。実施例ＲＧＮＮＶ株または単離体は、ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４（Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）である。
【００６１】
ベータノダウイルスは多様な方法によって繁殖させることができる。例えば、ウイルスは培養細胞中で増殖することができる。多様な培養細胞を使用することができる。いくつかの実施例細胞株には、Ｅ−１１細胞株（ＥＣＡＣＣ、ナンバー０１１１０９１６；Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ＳＡＦ−１細胞（ＥＣＡＣＣ、ナンバー００１２２３０１；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  １５０：１４３−１５３，１９９７）およびＳＳＮ−１細胞（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，２０６７−２０７１，１９９６）が含まれる。ウイルスを繁殖させるための技法は当分野において周知である。
【００６２】
ＳＪＮＮＶを含むウイルスの投与は、多様な技法を使用して魚類に対して行うことができる。例えば、ＳＪＮＮＶを魚類種の仔魚および／または稚魚へ投与することができる。ＳＪＮＮＶを成魚または成熟魚へ投与することができる。一実施例において、魚類は重さ約２．５ｇ〜１０ｇである。ＳＪＮＮＶの投与の経路は変動し得る。実施例には、筋肉内注射、腹腔内投与、飼料中で経口的に投与すること、ウイルスを含有する浴槽中での魚類の浸漬、および他が含まれる。
【００６３】
一般的に、魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量は、ＲＧＮＮＶによって引き起こされ得る症状（死亡が含まれる）を低減する量である。ウイルスの「量」は多様な技法によって決定することができる。一般的に、ウイルスの感染活性を測定するアッセイを使用することができる。一実施例において、感染性ウイルスはＴＣＩＤ５０の決定によって測定することができる。追加の方法を使用することができる。投与されたＳＪＮＮＶの量は、１０２、１０３、１０５、１０６、１０７またはそれ以上のＴＣＩＤ５０／魚類であり得る。一実施例において、魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量は少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である。一実施例において、魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量は、約１×１０４〜１．５×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である。魚類へ感染させた実施例体積は、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０または５００μｌであり得る。一実施例において、体積は約１０〜２００μｌである。別の実施例において、５０または１００μｌが注射される。
【００６４】
魚類への投与のためのウイルスの製剤化は、多様な方法を使用して行うことができる。一般的に、製剤は、ウイルスが魚類へ投与される時間までウイルスの感染性を持ち続けるだろう。一実施例において、ウイルスは生物学的緩衝液中で製剤化することができる。
【００６５】
ＲＧＮＮＶによって引き起こされる魚類における症状の低減に対するＳＪＮＮＶが有する効果は、一般的には持続的であり得る。例えば、ＳＪＮＮＶを投与された魚類は、ＳＪＮＮＶの投与後の様々な時間で続いて起こるＲＧＮＮＶ感染に起因する症状の低減を示し得る。様々な実施例において、ＳＪＮＮＶを投与された魚類は、ＳＪＮＮＶを投与されない魚類と比較して、ＳＪＮＮＶの投与後の６、５、４、３、２または１週間の間、続いて起こるＲＧＮＮＶ感染に起因する症状を低減し得る。低減された症状は、ＳＪＮＮＶ投与後に６、５、４、３、２または１日後の継続期間を有することができる。低減された症状は、ＳＪＮＮＶの投与後に９６、７２、４８、２４、１２または６時間の継続期間を有することができる。
【００６６】
ＲＧＮＮＶに関連した疾患および／または死亡に対するＳＪＮＮＶの効果についての作用メカニズムは信頼されないかまたは提供されていない。魚類および／または魚類の細胞もしくは魚類からの細胞の感染が、インターフェロンによって調節されることが公知である１つまたは複数の遺伝子の発現の変化をもたらし得るか、または変化に関連し得ることを、実施例の結果が指摘することが単に開示される。一実施例において、ＳＪＮＮＶによる魚類の感染は、１つまたは複数のインターフェロン誘導遺伝子からの定常状態ＲＮＡのレベルの増加に関連する。一実施例において、インターフェロン誘導遺伝子はＭｘであり得る。一実施例において、ＳＪＮＮＶは、インターフェロン誘導遺伝子からの転写の増加に関連する。
【００６７】
一実施例において、ＳＪＶＶＮ前のまたは同時のＲＧＮＮＶによる細胞の感染は、細胞中のＳＪＮＮＶの複製の阻害をもたらし得る。ＲＧＮＮＶにより感染した細胞のＳＪＮＮＶ重複感染は、ＳＪＮＮＶのゲノム複製の阻害を引き起こし得る。細胞のＲＧＮＮＶおよびＳＪＮＮＶ共感染は、ＳＪＮＮＶのゲノム複製の阻害を引き起こし得る。
【００６８】
一実施例において、ＲＧＮＮＶ前または同時のＳＪＮＮＶによる細胞の感染は、細胞中のＲＧＮＮＶの複製の刺激をもたらし得る。ＳＪＮＮＶにより感染した細胞のＲＧＮＮＶ重複感染は、ＲＧＮＮＶのゲノム複製の刺激を引き起こし得る。細胞のＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶ共感染は、ＲＧＮＮＶのゲノム複製の刺激を引き起こし得る。
【実施例】
【００６９】
実施例は実施例の例証の目的のためであり、限定の例証として解釈するべきできない。
【００７０】
実施例１−ベータノダウイルス、細胞株およびウイルス増殖
ウイルス単離体のＥＲＶ３７８／１０２−５／０４（ＲＧＮＮＶ遺伝子型；Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、ＳｐＤＩ−ＩＡｕｓｃ１６８８．０８（ＲＧＮＮＶ遺伝子型；Ｏｌｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，２００９）、ＳＪ９３Ｎａｇ（ＳＪＮＮＶ遺伝子型、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１）およびＳｐＳｓ−ＩＡｕｓｃ１６０．０３（ＲＧＮＮＶタイプＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶタイプＲＮＡ２による再集合体；Ｏｌｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，２００９）を、Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に従って、Ｅ−１１細胞株（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、イギリス、カタログ番号０１１１０９１６）（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）上で２５℃で増殖させた。細胞は、ウイルス接種の前にセミコンフルエントになるまで、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５％ウシ胎仔血清を補足したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ−１５）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５℃で増殖させた。ウイルス力価は、記述されるように（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編；５２７〜５３２ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７３年）、接種した培養の５０％において細胞変性効果を引き起こす最も高い希釈（ＴＣＩＤ５０）の使用によって決定された。
【００７１】
実施例２−シーバス
ヨーロピアンシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）を２１〜２５℃で維持した。示された重量のシーバスに、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によってウイルスを接種した（０．１ｍｌのＬ−１５培地を対照接種物として対照のために使用した）。他の研究において、シーバスをウイルスを含有する浴槽中での魚類の浸漬によって接種した（Ｌ−１５培地を接種物として対照のために使用した）。
【００７２】
実施例３−いくつかのＲＧＮＮＶ株によって引き起こされるシーバスの死亡
２．５ｇの平均重量のヨーロピアンシーバスを、１．０×１０６、２．５×１０５、１．０×１０５または１．０×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類のウイルス単離体ＳｐＤＩ−ＩＡｕｓｃ１６８８．０８（ＲＧＮＮＶ遺伝子型）によりｉ．ｍ．注射した。魚類を、２．５×１０５ＴＣＩＤ５０／魚類のウイルス単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４  ＲＧＮＮＶ遺伝子型により同様に注射した（図２中で陽性対照としてリストされた）。ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４単離体は、この研究において６９％の累積死亡率を引き起こした。
【００７３】
別の実験において（Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ｉ．ｍ．注射によって１０６ＴＣＩＤ５０のＥＲＶ３７８／１０２−５／０４  ＲＧＮＮＶ単離体により攻撃接種された稚ヨーロピアンシーバス（平均重量１０±０．３ｇ；ｎ＝１００）において、累積魚類死亡が３７％であったことが示された。細胞培養接種によって死んだ魚類からの組織ホモジネート（脳および眼）の分析から、分析されたすべてのサンプル中でＲＧＮＮＶの存在が実証された。ウイルスの同一性はＲＴ−ＰＣＲを使用して続いて確認された。
【００７４】
実施例４−異なるベータノダウイルス遺伝子型および魚類死亡
５ｇの重量のシーバスは、以下のＶＮＮ単離体、ＳＪ９３Ｎａｇ（ＳＪＮＮＶ遺伝子型）、単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４（ＲＧＮＮＶ）およびＳｐＳｓ−ＩＡｕｓｃ１６０．０３（ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２の再集合体）によりｉ．ｍ．攻撃接種された。０．１ｍｌの体積のＬ−１５培地を対照群中に注射したが、２．５×１０５ＴＣＩＤ５０／魚類の異なるウイルスの用量を使用した。温度は毎日測定し、およそ２２〜２５℃で維持した。ＶＮＮの典型的な症状および死亡は、ＲＧＮＮＶ（４７％の累積死亡）および再集合体（３３％の累積死亡）を接種された魚類においてのみ記録された。死亡はＳＪ９３Ｎａｇまたは対照群からは記録されなかった（図１）。
【００７５】
実施例５−生存魚類中の抗ＶＮＮＶ抗体の決定
実施例４からの５匹の生存魚類の血清をプールし、３プールを特異的抗ベータノダウイルス抗体を検出するためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＳＪ９３Ｎａｇ（ＳＪＮＮＶ遺伝子型）、ＳｐＳｓ−ＩＡｕｓｃ１６０．０３（ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ１／ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２の再集合体）またはＲＧＮＮＶ（Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）のいずれかによりコーティングし、プールした血清（１／３２希釈）を三重分析した。光学的密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで決定した。陰性対照ウェル（魚類血清の代わりにＰＢＳ）のＯＤ平均（３回の反復）を、カットオフ閾値として考慮した。
【００７６】
表１は３つの重複測定の平均ＯＤ値および標準偏差（ＳＤ）を示す。カットオフ閾値は０．３０５であった。
【表１】
2016520602.tif 000003
【００７７】
高レベルのウイルスゲノムおよび感染性ウイルス粒子は、ＳＪＮＮＶ単離体を接種された生存魚類の脳において記録されたが、死亡または臨床的徴候はなかった。間接的ＥＬＩＳＡによって測定された特異的抗体反応は、それぞれＲＧＮＮＶ、ＳＪＮＮＶおよび再集合体を接種した魚類について１／１０２４、１／４０９６および１／８１９２の力価で、ＶＮＮ接種群においてのみ観察された。
【００７８】
実施例６−死亡に対するシーバスサイズの効果
２．５ｇの平均重量のヨーロピアンシーバスを、２．５×１０５ＴＣＩＤ５０／魚類のウイルス単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４（ＲＧＮＮＶ遺伝子型）によりｉ．ｍ．注射した。魚類の死亡を毎日記録した。ＲＧＮＮＶのＥＲＶ３７８／１０２−５／０４単離体は、６９％の累積死亡率を引き起こした。実施例４において言及されるように、平均重量５ｇのシーバスへの同じ接種は、４７％の累積死亡をもたらした。２．５および５ｇの魚類についてのデータを図３中で示す。第３のトライアルにおいて、平均重量１０ｇのシーバスへの１０６ＴＣＩＤ５０の同じウイルスの接種は、３７％の死亡をもたらした。したがって、魚類サイズはＲＧＮＮＶ遺伝子型による感染についての死亡率と逆相関する。
【００７９】
実施例７−魚類における重複感染実験
シーバスが以前にＳＪＮＮＶにより感染されている場合にＲＧＮＮＶにより感染したシーバスにおける疾患の経過をモニターするために、研究が行われた。
【００８０】
稚ヨーロピアンシーバス（平均重量１０〜１５ｇ）を、以下の６００Ｌの４つの分離したタンクの中へ分配した。無感染の対照群（ｎ＝１５０）：時間０および再び２４時間後にＬ−１５培地（０．１ｍｌ）によりｉ．ｍ．注射した；
１）無感染の対照群（ｎ＝１５０）：時間０および２５時間後に０．１ｍｌのＬ−１５培地によりｉ．ｍ．注射した；
２）ＳＪＮＮＶ感染対照群（ｎ＝１５０）：時間０に１．５×１０６ＴＣＩＤ５０のＳＪＮＮＶ（単離体ＳＪ９３Ｎａｇ）および２４時間後にＬ−１５培地（０．１ｍｌ）によりｉ．ｍ．注射した；
３）ＲＧＮＮＶ感染対照群（ｎ＝１５０）：時間０にＬ−１５培地（０．１ｍｌ）および２４時間後に１．５×１０６ＴＣＩＤ５０のＲＧＮＮＶ（単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４）によりｉ．ｍ．注射した；
４）重複感染した群（ｎ＝１５０）：時間０に１．５×１０６ＴＣＩＤ５０のＳＪＮＮＶ（単離体ＳＪ９３Ｎａｇ）、次いで２４時間後に１．５×１０６ＴＣＩＤ５０のＲＧＮＮＶ（単離体ＥＲＶ３７８／１０２−５／０４）によりｉ．ｍ．注射した。
【００８１】
各々の実験群から、５０匹の魚類を、累積死亡を決定する使用のために分離して飼育した。残りの１００匹の魚類をサンプリングのために使用した（実施例８〜１０におけるデータを参照）。水温はトライアルの経過にわたって２２〜２４℃で維持した。死亡は毎日記録し、死んだ魚類は後のウイルス試験における使用のために−８０℃で凍結した。
【００８２】
無感染対照群（群１）に加えてＳＪＮＮＶ感染対照群（群２）については、死亡は観察されなかった（図４）。
【００８３】
ＲＧＮＮＶ接種対照群（群３）については、死亡は感染後約６日で最初に検出された。死亡は感染後１５日に約７６％で安定化した。
【００８４】
重複感染した群（群４）において、魚類は黒ずんだ色彩および異常な遊泳行動を示したが、２匹の動物のみが死亡した（４％の累積死亡）。この群において、ＳＪＮＮＶ感染は、ＲＧＮＮＶが事前のＳＮＪＪＶ感染のない魚類に感染した場合（群３）に観察された死亡を劇的に低減させた。
【００８５】
実施例８−重複感染実験において死んだＲＧＮＮＶ感染魚類からのウイルス
実施例７中で記述された実験からのＲＧＮＮＶ感染対照群（群３）の死んだ魚類を、ウイルスの存在についてアッセイした。感染後６日目および１２日目に死んでいることが見出された魚類からの脳および眼の組織をプールし、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび２％ウシ胎仔血清を補足した２０％（ｗ／ｖ）Ｌ−１５培地中でホモジナイズした。ホモジネートは、４℃で１０％ペニシリン−ストレプトマイシンにより一晩処理した。次いでホモジネートを７，５００×ｇで４℃で１５分間２回遠心分離し、１００μｌの上清をＥ−１１細胞に対するウイルス力価測定のために使用してＴＣＩＤ５０を決定した。データを表２中で示す。
【表２】
2016520602.tif 000004
【００８６】
これらのデータから、ウイルスが死んだ魚類から単離できたことが指摘される。
【００８７】
実施例９−重複感染実験におけるＳＪＮＮＶ感染ＲＧＮＮＶ重複感染魚類からのウイルスゲノムの定量化
実施例７中で記述された実験からの重複感染した群（群４）の魚類におけるウイルスゲノムの定量化を行った。９匹の生きている魚類を、ＲＧＮＮＶ重複感染の１２時間、３日、および７日後に群４からランダムに集めた。魚類を麻酔薬（ＭＳ−２２２、Ｓｉｇｍａ）の過剰用量によって屠殺し、各々のタイムポイントで３匹の魚類からの脳および眼を一緒にプールし、液体窒素中で直ちに凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００８８】
プールした器官は、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび２％ＦＢＳを補足したＬ−１５培地（２０％ｗ／ｖ）中でホモジナイズした。ホモジネートを７，５００×ｇで４℃で１５分間２回遠心分離した。体積２００μｌの３つの清澄にしたホモジネートを、すべてのサンプリング時間で、全ＲＮＡ抽出のために使用した。
【００８９】
ＲＮＡ抽出はトリゾール（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。得られたＲＮＡ濃度は、ＮＤ−１０００システム（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２６０ｎｍで決定した。ＲＮＡは使用するまで−８０℃で保存した。
【００９０】
ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。ｃＤＮＡ濃度はＮＤ−１０００システムを使用して２６０ｎｍで決定した。ｃＤＮＡは使用するまで−２０℃で保存した。
【００９１】
ウイルスゲノムは、ＲＧＮＮＶのＲＮＡ２セグメントおよびＳＪＮＮＶ遺伝子型を分離して検出する、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉベースの絶対リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プロトコルを使用して定量化した。具体的には、ＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ２は、既に記述された手順を使用して定量化した（Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２セグメントは、既に記述されたＰＣＲ条件（Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を使用してＴ４領域内の７５ｂｐ断片（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ３０８１４）を増幅するプライマー、ＳＪ−ＲＮＡ２−Ｆ（５’−ＧＡＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＡＣ−３’、ヌクレオチド６６５〜６８７）（配列番号：６）およびＳＪ−ＲＮＡ２−Ｒ（５’−ＡＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴ−３’、ヌクレオチド７３９〜７１７）（配列番号：７）を使用して定量化した。
【００９２】
接種後の異なる時間での各々のウイルスゲノムセグメントのコピー数の間の有意な差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、後続してＦｉｓｈｅｒの最小有意差（ＬＳＤ）検定によって計算した。統計的分析はＩＢＭ  ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを使用して行った。ｐ＜０．０５の値が有意であると判断された。
【００９３】
ＲＧＮＮＶゲノムの定量化については、データ（図５）から、ＲＧＮＮＶ接種対照群（群３）と比較して、ＲＧＮＮＶによる重複感染（ＳＪＮＮＶ感染の８日後）の７日後に、重複感染した群（群４）中でＲＧＮＮＶ複製が有意に減少することが示された（図５）。
【００９４】
これとは対照的に、重複感染した群（群４）中のＳＪＮＮＶ複製を、ＳＪＮＮＶ感染対照群（群２）に比較した場合には、有意な差は観察されなかった（図６）。
【００９５】
実施例１０−重複感染実験におけるインターフェロン（ＩＦＮ）誘導遺伝子の発現
実施例７中で記述された実験からの魚類を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用して、ＩＦＮ誘導遺伝子Ｍｘの転写発現について試験した。データから、感染後０〜４８時間のＲＧＮＮＶ感染対照群（群３）からの魚類においてＭｘの転写発現がないことが示された。これとは対照的に、Ｍｘ転写発現は、ＳＪＮＮＶ感染対照群（群２）および重複感染した群（群４）からの魚類において増加した。これらのデータから、ＳＪＮＮＶによる魚類の感染がＩＦＮ誘導遺伝子（Ｍｘ）を誘導するが、ＲＧＮＮＶは誘導しないことが指摘される。これらの結果から、ＳＪＮＮＶによる以前の感染によってＩＦＮ媒介性システムを誘導することが、ＲＧＮＮＶによる後の感染の効果からシーバスを保護して、重複感染した群において記録された死亡の減少についての原因であり得ることが示唆される。
【００９６】
実施例１１−培養細胞における重複感染実験
各々のウイルスの複製および増倍に対するＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶの共存の効果を調査する研究を行った。感染した細胞中のウイルスゲノムコピー数、および感染した細胞によって産生された感染性ウイルス粒子の産生を決定した。Ｅ−１１細胞を２４ウェルプレート中で増殖させた。２代目の継代の細胞単層は、二重で、２５℃（ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶの両方の増倍にとって至適温度）で０．１の感染多重度で感染させた。実験群は以下の表３中で示される通りであった。各々の実験群において、非接種Ｅ−１１細胞は対照として含まれた。
【表３】
2016520602.tif 000005
【００９７】
表３中で示された時間で、細胞および上清の両方を各々の実験群の２つのウェルから集めた。陰性対照は実験の終了時に収集した。全ＲＮＡは、実施例９中で記述されたように、トリゾール（登録商標）を使用して細胞から抽出した。ｃＤＮＡは、製造者の使用説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＲＴ−ＰＣＲのために使用し、各々の反応中にランダムヘキサマー（５０ｎｇ）および１μｇの全ＲＮＡを添加して合成された。ウイルスゲノムをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉベースの絶対リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して定量化し、実施例９中でも記述されたようにデータを分析した。
【００９８】
ウイルス力価を決定するために、複数の無細胞上清を力価測定してＴＣＩＤ５０を決定した（実施例１）。群３〜５において、中和アッセイは、以下のポリクローナル抗体（１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＬ−１５培地中で１／１００希釈）、（ｉ）ＲＧＮＮＶ遺伝子型を中和する抗ＮＮＶａｂ２６８１２（Ａｂｃａｍ）、および（ｉｉ）ＳＪＮＮＶを中和するウサギで作製した抗ＳＪＮＮＶ抗体（Ｔ．Ｎａｋａｉ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ、日本）を使用して、ウイルス力価測定の前に行った。
【００９９】
図７は、感染した細胞中のＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２のコピー数の測定を示す。図７Ａは、ＳＪＮＮＶ感染対照群（群１）中のＳＪＮＮＶコピー数と比較した、ＳＪＮＮＶ＋ＲＧＮＮＶ共感染群（群３）中のＳＪＮＮＶコピー数を示す。図７Ｂは、ＳＪＮＮＶ感染対照群（群１）中のコピー数と比較した、ＳＪＮＮＶを感染して２４時間後にＲＧＮＮＶを共感染した群（群４）中のＳＪＮＮＶコピー数を示す。図７Ｃは、ＳＪＮＮＶ感染対照群（群１）中のコピー数と比較した、ＲＧＮＮＶを感染して２４時間後にＳＪＮＮＶを共感染した群（群５）中のＳＪＮＮＶコピー数を示す。バーは２つの異なるサンプルの標準偏差を示す。統計的に有意な変化（ｐ＜０．０１）は星印によって表わされる。
【０１００】
図８は、感染した細胞中のＲＧＮＮＶ  ＲＮＡ２のコピー数の測定を示す。図８Ａは、ＲＧＮＮＶ感染対照群（群２）中のＲＧＮＮＶコピー数と比較した、ＳＪＮＮＶ＋ＲＧＮＮＶ共感染群（群３）中のＲＧＮＮＶコピー数を示す。図８Ｂは、ＲＧＮＮＶ感染対照群（群２）中のコピー数と比較した、ＳＪＮＮＶを感染して２４時間後にＲＧＮＮＶを共感染した群（群４）中のＲＧＮＮＶコピー数を示す。図８Ｃは、ＲＧＮＮＶ感染対照群（群２）中のコピー数と比較した、ＲＧＮＮＶを感染して２４時間後にＳＪＮＮＶを共感染した群（群５）中のＲＧＮＮＶコピー数を示す。バーは２つの異なるサンプルの標準偏差を示す。統計的に有意な変化（ｐ＜０．０１）は星印によって表わされる。
【０１０１】
これらの実験からのデータにより、ＳＪＮＮＶおよびＲＧＮＮＶにより感染した細胞において、ｉ）ＳＪＮＮＶゲノム複製はＲＧＮＮＶの存在下において部分的に阻害された；ｉｉ）ＲＧＮＮＶゲノム複製はＳＪＮＮＶの存在において刺激された、およびｉｉｉ）ゲノム複製に対するこれらの効果は感染性ウイルスの産生と相関しなかったことが示された。
【０１０２】
ＲＧＮＮＶによるＳＪＮＮＶ複製の阻害を示すデータは、以下の通り記述される。共感染群（群３）において、データ（図７Ａ）から、対照群（群１）と比較して、１２および４８時間のタイムポイントでＳＪＮＮＶゲノムコピー数が減少することが示された。このことは、ＲＧＮＮＶ感染細胞をＳＪＮＮＶにより２４時間後に重複感染させた（群５）実験においてより明らかであった。その実験において、データ（図７Ｃ）から、対照群（群１）と比較して、０、１２、４８、７２および９６時間のタイムポイントでＳＪＮＮＶゲノムコピー数が減少することが示された。ＳＪＮＮＶゲノムコピー数のこれらの減少は、細胞によって産生されたＳＪＮＮＶウイルスの力価と明確に相関していなかった。
【０１０３】
ＳＪＮＮＶによるＲＧＮＮＶ複製の刺激を示すデータは、以下の通り記述される。共感染群（群３）において、データ（図８Ａ）から、対照群（群２）と比較して、２４、４８および７２時間のタイムポイントでＲＧＮＮＶゲノムコピー数が増加することが示された。このことは、ＳＪＮＮＶ感染細胞をＲＧＮＮＶにより２４時間後に重複感染させた（群４）実験においてより明らかであった。その実験において、データ（図８Ｂ）から、対照群（群２）と比較して、０、１２、２４および４８時間のタイムポイントでＲＧＮＮＶゲノムコピー数が増加することが示された。しかしながら、９６時間で、対照群と比較して、ＲＧＮＮＶゲノムコピー数は減少した。ＲＧＮＮＶゲノムコピー数の増加は、細胞によって産生されたＲＧＮＮＶウイルスの力価と明確に相関していなかった。
【０１０４】
ＲＧＮＮＶ感染の前またはそれとおよそ同時のＳＪＮＮＶによる細胞の感染は、ＳＪＮＮＶを含有しない細胞中のＲＧＮＮＶの複製と比較して、細胞中のＲＧＮＮＶ  ＲＮＡの複製を少なくとも最初は刺激することも見出された。複製に対するこの効果は感染した細胞によって産生された感染性ウイルスと相関しないだろう。
【０１０５】
ＳＪＮＮＶ感染の前またはそれとおよそ同時のＲＧＮＮＶによる細胞の感染は、ＲＧＮＮＶを含有しない細胞中のＳＪＮＮＶの複製と比較して、細胞中のＳＪＮＮＶ  ＲＮＡの複製を部分的に阻害することも見出された。複製に対するこの効果は感染した細胞によって産生された感染性ウイルスと相関しないだろう。
【０１０６】
実施例の組成物および方法などが記述によって例証されているが、そして記述はかなりに詳細であるが、出願の範囲を制限または多少なりとも限定することは本出願人の意図ではない。本明細書において記述された組成物および方法などを記述する目的のための構成要素または方法論のすべての考えられる組み合わせを記述することは、もちろん可能ではない。追加の利点および修飾は、当業者に容易に思いつくだろう。したがって、本開示は、示され、記述された具体的な詳細、代表的な機器および例示的な実施例へ限定されない。したがって、本出願は、出願の範囲内にある変更、修飾および変動を包含することが意図される。さらに、先行する記述は、本発明の範囲を限定することを意味しない。むしろ、本発明の範囲は添付の請求項およびそれらの均等物によって決定されるべきである。
【０１０７】
参照文献
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Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ  “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｉｐｅｄ  Ｊａｃｋ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａｎｏｄａｖｉｒｕｓｅｓ”  Ｊｏｕｒｎａｌ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２００１），  ８２，  ２６５３−２６６２  
Ｌｏｐｅｚ−Ｊｉｍｅｎａ  Ｂ，  Ａｌｏｎｓｏ  Ｍｄｅｌ  Ｃ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＫＤ，  Ａｄａｍｓ  Ａ，  Ｉｎｆａｎｔｅ  Ｃ，  Ｃａｓｔｒｏ  Ｄ，  Ｂｏｒｒｅｇｏ  ＪＪ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ？ｔｅｒｍ＝Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｓａｄｏ％２０Ｅ％５ＢＡｕｔｈｏｒ％５Ｄ＆ｃａｕｔｈｏｒ＝ｔｒｕｅ＆ｃａｕｔｈｏｒ＿ｕｉｄ＝２１７８３３３１  “Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｄ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｇｒｏｕｐｅｒ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  （ＲＧＮＮＶ）  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｅａｂａｓｓ  （Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）．”  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｄｅｃ  ２９；１５４（１−２）：８６−９５
Ｍｏｒｉ，  Ｋ，  Ｍａｎｇｙｏｋｕ，  Ｔ，  Ｉｗａｍｏｔｏ，  Ｔ，  Ａｒｉｍｏｔｏ，  Ｍ，  Ｔａｎａｋａ，  Ｓｉ，  Ｎａｋａｉ，  Ｔ    “Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｂｅｔａｎｏｄａｖｉｒｕｓ”  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｖｏｌ．５７  ｎｏ．１−２  ｐａｇｅ．１９−２６  （２００３１２０３）
Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  Ｔ，  Ｍｏｒｉ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｈａｓｈｉ  Ｍ，  Ｎａｋａｉ  Ｔ，  Ｆｕｒｕｓａｗａ  Ｉ，  Ｍｕｒｏｇａ  Ｋ．“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｆｉｓｈ  ｎｏｄａｖｉｒｕｓｅｓ，  ｔｈｅ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｒｉｎｅ  ｆｉｓｈ”  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９５  Ｊｕｌ；７６  （  Ｐｔ  ７）：１５６３−９．
ＮＩＳＨＩＺＡＷＡ，  Ｍ．  ＦＵＲＵＨＡＳＨＩ，  Ｔ．  ＮＡＧＡＩ，  Ｔ．  ＮＡＫＡＩ，  ＡＮＤ  Ｋ．  ＭＵＲＯＧＡ  “Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｎｏｄａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｎｅ”  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，  Ａｐｒ．  １９９７，  ｐ．  １６３３-１６３６
Ｏｌｖｅｉｒａ  ＪＧ，  Ｓｏｕｔｏ  Ｓ，  Ｄｏｐａｚｏ  ＣＰ，  Ｔｈｉｅｒｙ  Ｒ，  Ｂａｒｊａ  ＪＬ，  Ｂａｎｄｉｎ  Ｉ．  ”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｅｔａｎｏｄａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ  ｏｕｔｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｆａｒｍｅｄ  ｆｉｓｈ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ．”  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００９  Ｄｅｃ；９０（Ｐｔ  １２）：２９４０−５１
Ｓｋｌｉｒｉｓ  ＧＰ，  Ｋｒｏｎｄｉｒｉｓ  ＪＶ，  Ｓｉｄｅｒｉｓ  ＤＣ，  Ｓｈｉｎｎ  ＡＰ，  Ｓｔａｒｋｅｙ  ＷＧ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＲＨ．
“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｉｓｈ  ｎｏｄａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｒｏｐｅ  ａｎｄ  Ａｓｉａ．”  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ｍａｙ；７５（１）：５９−６７
Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：  Ｎｉｎｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２０１２，  Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ  （Ｂｅｔａｎｏｖｉｒｕｓ），  ｐ  １０６１−１０６７
【図１】
2016520602.tif 000006
【図２】
2016520602.tif 000007
【図３】
2016520602.tif 000008
【図４】
2016520602.tif 000009
【図５】
2016520602.tif 000010
【図６】
2016520602.tif 000011
【図７】
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【図８】
2016520602.tif 000013
【図９−１】
2016520602.tif 000014
【図９−２】
2016520602.tif 000015
【図９−３】
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【図１０ａ】
2016520602.tif 000017
【図１０ｂ】
2016520602.tif 000018
【図１１】
2016520602.tif 000019
【図１２】
2016520602.tif 000020
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月9日(2015.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類におけるＲＧＮＮＶ感染の治療における使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項２】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶである、請求項１に記載のＳＪＮＮＶ。
【請求項３】
前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、以下のうちの１つ以上に対するものである、請求項２に記載のＳＪＮＮＶ：
（ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域；
（ｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２のヌクレオチド６０４〜１０３０の配列；
（ｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２０４〜３３１の配列；
（ｉｖ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２２３〜３３１の配列；および
（ｖ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２３５〜３１５の配列。
【請求項４】
前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、請求項２または３に記載のＳＪＮＮＶ。
【請求項５】
前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＳＪＮＮＶ。
【請求項６】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＳＪＮＮＶ。
【請求項７】
前記魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または減少した疾患の症状を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳＪＮＮＶ。
【請求項８】
ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症の治療における使用のためのＳＪＮＮＶ。
【請求項９】
ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する魚類の保護における使用のためのワクチンであって、ＳＪＮＮＶを含むワクチン。
【請求項１０】
魚類におけるＲＧＮＮＶ感染の治療における使用のためのＳＪＮＮＶを含むワクチン。
【請求項１１】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶである、請求項９および１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２からなる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２であり、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１を含まない、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ＳＪＮＮＶが、熱殺菌されたかまたは化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶの形態である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶが、アジリジン化合物、好ましくはバイナリーエチレンイミンを使用して不活性化されたものである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記ＳＪＮＮＶが、ウイルスを魚類に筋肉内注射もしくは腹膜注射すること、またはウイルスを含有する浴槽中に魚類を浸漬することによって投与される、請求項２もしくは請求項３に記載のＳＪＮＮＶ、または請求項９〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量が、約１×１０４〜約１．５×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である、請求項２もしくは請求項３に記載のＳＪＮＮＶ、または請求項９〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ＳＪＮＮＶの魚類への投与が、該魚類において少なくとも１つのインターフェロン誘導遺伝子の転写発現の増加をもたらす、請求項２もしくは請求項３に記載のＳＪＮＮＶ、または請求項９〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記インターフェロン誘導遺伝子がＭｘを含む、請求項２２に記載のＳＪＮＮＶまたはワクチン。
【請求項２４】
ＲＧＮＮＶ感染に起因する魚類の死亡量を低減させるための組成物の製造におけるＳＪＮＮＶの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例の組成物および方法などが記述によって例証されているが、そして記述はかなりに詳細であるが、出願の範囲を制限または多少なりとも限定することは本出願人の意図ではない。本明細書において記述された組成物および方法などを記述する目的のための構成要素または方法論のすべての考えられる組み合わせを記述することは、もちろん可能ではない。追加の利点および修飾は、当業者に容易に思いつくだろう。したがって、本開示は、示され、記述された具体的な詳細、代表的な機器および例示的な実施例へ限定されない。したがって、本出願は、出願の範囲内にある変更、修飾および変動を包含することが意図される。さらに、先行する記述は、本発明の範囲を限定することを意味しない。むしろ、本発明の範囲は添付の請求項およびそれらの均等物によって決定されるべきである。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対する魚類の保護における使用のためのＳＪＮＮＶ。
［２］  前記ＳＪＮＮＶが、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である、
［１］に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［３］  前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである、［２］に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［４］  前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、［２］または［３］に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［５］  前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２のヌクレオチド６０４〜１０３０の配列に対するものである、［２］〜［４］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［６］  前記ＳＪＮＮＶのアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２０４〜３３１の配列に対するものである、［２］〜［５］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［７］  前記アミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２２３〜３３１に対するものである、［６］に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［８］  前記アミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２によってコードされるタンパク質配列のアミノ酸２３５〜３１５に対するものである、［７］に記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［９］  前記疾患に対する魚類の保護が、魚類の集団におけるＲＧＮＮＶ感染に起因する死亡の低減を伴う、［１］〜［８］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［１０］  前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、［１］〜［９］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［１１］  前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、［１］〜［１０］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［１２］  前記魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または減少した疾患の症状を有する、［１］〜［１１］のいずれかに記載の使用のためのＳＪＮＮＶ。
［１３］  ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する使用のためのＳＪＮＮＶ。
［１４］  ＲＧＮＮＶ感染によって引き起こされる魚類におけるウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症に対する魚類の保護における使用のためのワクチンであって、ＳＪＮＮＶを含むワクチン。
［１５］  魚類におけるＲＧＮＮＶ感染の予防または治療における使用のためのＳＪＮＮＶを含むワクチン。
［１６］  前記ＳＪＮＮＶが、
ｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備えたＳＪＮＮＶ、
またはｉｉ）単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ、
またはｉｉｉ）ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは少なくとも９７％同一、より特に好ましくは少なくとも９９％同一である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を備え、単離体ＳＪＮａｇ９３に対する抗血清と血清学的に反応するＳＪＮＮＶ
である、［１５］に記載のワクチン。
［１７］  前記ＳＪＮＮＶのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセンテージ同一性が、ＳＪＮＮＶ単離体ＳＪＮａｇ９３のＲＮＡ２セグメント内のＴ４可変領域に対するものである、［１６］に記載のワクチン。
［１８］  前記ＳＪＮＮＶが、少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類の量で魚類へ投与される、［１４］〜［１７］のいずれかに記載のワクチン。
［１９］  ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２が魚類へ投与される、［１４］〜［１８］のいずれかに記載のワクチン。
［２０］  前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１およびＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２からなる、［１９］に記載のワクチン。
［２１］  前記ＳＪＮＮＶがＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ２であり、ＳＪＮＮＶ  ＲＮＡ１を含まない、［１９］に記載のワクチン。
［２２］  前記ＳＪＮＮＶが、熱殺菌されたかまたは化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶの形態である、［１４］〜［２１］のいずれかに記載のワクチン。
［２３］  前記化学的に不活性化されたＳＪＮＮＶが、アジリジン化合物、好ましくはバイナリーエチレンイミンを使用して不活性化されたものである、［２２］に記載のワクチン。
［２４］  前記ＳＪＮＮＶが、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチン、好ましくはＲＮＡワクチンの形態で投与される、［１４］〜［２２］のいずれかに記載のワクチン。
［２５］  前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベ、好ましくはヨーロピアンシーバスからなる群から選択される、［１４］〜［２４］のいずれかに記載のワクチン。
［２６］  前記ＳＪＮＮＶが、ＳＪＮａｇ９３、Ｊｐ／０６／ＳＪ、ＳＪＯｒｉ、ＳＪ９１Ｎａｇ、ＳＪ９２Ｎａｇ、ＳＪ９４ＮａｇおよびＲＳ９５Ｈｉｒ  ３、好ましくはＳＪＮａｇ９３からなる群から選択される、［１４］〜［２５］のいずれかに記載のワクチン。
［２７］  ＲＧＮＮＶ感染に関連した疾患に対して魚類を保護する方法であって、該魚類へＳＪＮＮＶを投与することを含み、続いてＲＧＮＮＶに曝露された該魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より少ないおよび／または減少した疾患の症状を有する、方法。
［２８］  前記ＲＧＮＮＶが魚類における死亡を引き起こし得る、［２７］に記載の方法。
［２９］  ＳＪＮＮＶを投与し、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記魚類が、ＳＪＮＮＶの事前投与をせずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類と比較して、より低い死亡率を有する、［２８］に記載の方法。
［３０］  前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約６週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、［２７］に記載の方法。
［３１］  前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約３週間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、［２７］に記載の方法。
［３２］  前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約７２時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、［２７］に記載の方法。
［３３］  前記魚類がＳＪＮＮＶの投与後約２４時間以内にＲＧＮＮＶに曝露される、［２７］に記載の方法。
［３４］  前記ＳＪＮＮＶが単離体ＳＪ９３Ｎａｇを含む、［２７］に記載の方法。
［３５］  前記ＳＪＮＮＶおよび前記ＲＧＮＮＶが同じ種の魚類に感染し得るものである、［２７］に記載の方法。
［３６］  前記魚類が、ヨーロピアンシーバス、セネガルシタビラメ、ヨーロッパヘダイ、レッドバンディッドシーブリーム、ヨーロッパマダイ、ホワイトシーブリームおよび野生のオオニベを含む、［３５］に記載の方法。
［３７］  前記ＳＪＮＮＶの投与が、ウイルスを魚類に筋肉内注射もしくは腹膜注射すること、またはウイルスを含有する浴槽中に魚類を浸漬することによって行われる、［２７］に記載の方法。
［３８］  前記魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量が少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である、［２７］に記載の方法。
［３９］  前記魚類へ投与されるＳＪＮＮＶの量が約１×１０４〜約１．５×１０４ＴＣＩＤ５０／魚類である、［２７］に記載の方法。
［４０］  前記ＳＪＮＮＶの投与が、少なくとも１つのインターフェロン誘導遺伝子の転写発現の増加をもたらす、［２７］に記載の方法。
［４１］  前記インターフェロン誘導遺伝子がＭｘを含む、［４０］に記載の方法。
［４２］  シーバスにおけるＲＧＮＮＶ感染に関連した死亡率を低減する方法であって、シーバスにＳＪＮＮＶを接種することを含み、続いて死亡を引き起こし得るＲＧＮＮＶに曝露されたシーバスが、ＳＪＮＮＶを接種せずにＲＧＮＮＶに曝露されたシーバスと比較して、低減された死亡率を有する、方法。
［４３］  ＳＪＮＮＶを接種され、続いてＲＧＮＮＶに曝露された前記シーバスが、ＳＪＮＮＶの接種後約７２時間以内において、低減された死亡率を有する、［４２］に記載の方法。
［４４］  魚類をウイルスに感染させる方法であって、
ａ）前記魚類にＳＪＮＮＶを投与する工程と；
ｂ）ＲＧＮＮＶに前記魚類を曝露する工程と；
を含み、
前記魚類が、ＳＪＮＮＶを投与されずにＲＧＮＮＶに曝露された魚類よりも、より少ないおよび／または低減したＲＧＮＮＶ感染に関連した症状を有する、方法。
［４５］  細胞をＳＪＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＲＧＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＳＪＮＮＶの複製を阻害する方法。
［４６］  細胞をＲＧＮＮＶに感染させる前またはそれと同時に、細胞をＳＪＮＮＶに感染させることを含む、細胞中のＲＧＮＮＶの複製を刺激する方法。
［４７］  ＲＧＮＮＶ感染に起因する魚類の死亡量を低減させるための組成物の製造におけるＳＪＮＮＶの使用。
【国際調査報告】
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