(57)【要約】  本発明は、サンプル中の小分子を検出するための方法であって、a）検出されるべき小分子に特異的なアプタマーにナノ粒子（NP）又はマイクロ粒子（MP）をカップリングして、NP-アプタマーコンジュゲートを形成する工程、b）該NP-アプタマーコンジュゲートをサンプルと接触させる工程；及びc）該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位又は移動度の変化を検出する工程を含み、ここで、該変化が該小分子の存在を示す、方法を提供する。本発明はまた、ナノ粒子アプタマーコンジュゲート（NP-アプタマー）を提供するためにアプタマーとカップリングしたナノ粒子を含むバイオセンサーも提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の小分子を検出するための方法であって、
a）検出されるべき小分子に特異的なアプタマーにナノ粒子（NP）又はマイクロ粒子（MP）をカップリングして、NP-アプタマーコンジュゲートを形成する工程；
b）該NP-アプタマーコンジュゲートをサンプルと接触させる工程；及び
c）該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位又は移動度の変化を検出する工程
を含み、ここで、該変化が該小分子の存在を示す、方法。
【請求項２】
工程（a）が、任意選択で、アプタマーがNP又はMPとカップリングしているかを確認するために、NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度のいずれかの変化を検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化が、RPS、DLS及びその組み合わせから選択される技術により検出される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
変化が、NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の低下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
洗剤若しくは界面活性剤、又はその組み合わせが、任意選択で、工程（b）において使用される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
洗剤又は界面活性剤が、アニオン性界面活性剤又は洗剤、カチオン性界面活性剤又は洗剤、及び非イオン性界面活性剤又は洗剤から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
アプタマーが、配列：
5’-ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3’、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アプタマーが、任意選択で、蛍光タグを含んでよい、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ナノ粒子又はマイクロ粒子が、約5 nm〜約5ミクロンのサイズである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ナノ粒子又はマイクロ粒子が、金、パラジウム、ポリスチレン及びラテックスから選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
NP又はMP、及びアプタマーが、NP又はMPのアプタマーに対する数の比率が約1：1,000,000〜約1：1で存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが、環境サンプル又は生物学的サンプルである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的サンプルが、ex vivo生物学的サンプルである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
小分子が汚染物質である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
小分子がホルモンである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ホルモンが、17β-エストラジオール、テストステロン及びプロゲステロンから選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
（a）ナノ又はマイクロ粒子；及び
（b）アプタマー
を含むバイオセンサーであって、ここで、
該ナノ粒子又はマイクロ粒子は該アプタマーとカップリングして、NP-アプタマーコンジュゲートを提供し、且つ
該NP-アプタマーコンジュゲートがサンプル中の小分子と接触した場合に、該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度が変化する、
バイオセンサー。
【請求項１８】
NP-アプタマーコンジュゲートがサンプル中の小分子と接触した場合の該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化が低下である、請求項17に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化が、RPS、DLS及びその組み合わせから選択される技術により検出される、請求項17又は18に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
洗剤若しくは界面活性剤、又はその組み合わせを任意選択で含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
洗剤又は界面活性剤が、アニオン性界面活性剤又は洗剤、カチオン性界面活性剤又は洗剤、及び非イオン性界面活性剤又は洗剤から選択される、請求項20に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
アプタマーが、タグ化された蛍光を任意選択で含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
ナノ粒子又はマイクロ粒子が、約5 nm〜約5ミクロンのサイズである、請求項17〜22のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
ナノ粒子又はマイクロ粒子が、金、パラジウム、ポリスチレン及びラテックスから選択される、請求項17〜23のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
NP又はMPのアプタマーに対する数の比率が約1：1,000,000〜約1：1である、請求項17〜24のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
サンプルが、環境サンプル又は生物学的サンプルである、請求項17〜25のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
生物学的サンプルが、ex vivo生物学的サンプルである、請求項26に記載のバイオセンサー。
【請求項２８】
小分子が汚染物質である、請求項17〜27のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２９】
小分子がホルモンである、請求項17〜28のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項３０】
ホルモンが、17β-エストラジオール、テストステロン及びプロゲステロンから選択される、請求項29に記載のバイオセンサー。
【請求項３１】
アプタマーが、配列：
5’-ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3’、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
を含む、請求項17〜30のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項３２】
請求項17〜31のいずれか一項に記載のバイオセンサーの、サンプル中の小分子の検出における使用。
【請求項３３】
バイオセンサーが、RPS、DLS及びその組み合わせから選択される技術とともに使用される、請求項32に記載の使用。
【請求項３４】
バイオセンサーが、任意選択で、洗剤又は界面活性剤とともに使用される、請求項32又は33に記載の使用。
【請求項３５】
小分子が汚染物質である、請求項31〜34のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
小分子がホルモンである、請求項31〜35のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
ホルモンが、17β-エストラジオール、テストステロン及びプロゲステロンから選択される、請求項36に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小分子（small molecules）を検出するためのナノ粒子-アプタマーコンジュゲート（NP-アプタマー）を含む、新たに開発されたバイオセンサー、及び小分子の検出におけるその使用、及びサンプル中の小分子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常環境試験の一部として、標的分子の存在を迅速に検出し定量化する方法が現在必要とされている。例えば、内分泌攪乱化合物及びホルモンなどの小分子は、多くの場合、環境中のコンタミナントとして見られる。かかるコンタミナントは、水路、土壌、生物学的サンプル（植物及び動物の両方を含む）中で、住宅、農業、商用及び／又は産業上のアプリケーションからの環境汚染物質（pollutants）として見られ得る。いくつかの場合、これらの低分子量化合物、例えば以下に示すものなどは、その代謝産物及び／又は合成的に改変されたバリアントとともに、エストロゲンなどの内因性ホルモンの活性を模倣することにより、ヒト及び野生生物集団の健康に脅威を及ぼすことが知られている。これらの分子は、天然ホルモンの産生及び機能をブロックするか、模倣するか、刺激するか、又は抑制することにより作用する場合がある。これらの内因性ステロイドホルモン及び代謝産物を模倣する有機残留物は脂溶性であり、そのため、哺乳動物及び海洋生物種の生物系において生物濃縮する能力を有する。これは、ヒト血液血漿、母乳、胎児組織及び体液においてその証拠が確認されている［Allmyr et al., Anal. Chem., 78：6542-6546, 2006；Hileman, Chemical and Engineering News, 85：31-33, 2007；Van-Pelt et al. Endocrinology, 140：478-483, 2001；Skakkebaek et al., Human Reproduction 16：972-978, 2001；Vandenberg et al., Endocrine Reviews, 33（3）：2012］。従って、これらの小分子を容易に検出するための新規な方法が必要とされている。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
小化合物の検出に多くの場合使用される、より慣習的な方法論及び技術は、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography）（HPLC）、又は質量分析と結合させたガスクロマトグラフィー（Gas Chromatography coupled with Mass Spectrometry）（GCMS）を含む。これらの技術は、この目的のために非常に有用であるが、該分析は、実施が複雑化し得、完了までに長い期間がかかり得る。従って、これらの技術は、その場で実施することができず、特殊な装置及び訓練された操作者を必要とし、迅速な評価を提供しない。
【０００５】
従って、特に環境及びコンタミナント試験の領域において、小分子を検出及び定量化するための簡便で迅速且つ単純な方法が必要とされている。
【０００６】
アプタマーは一本鎖核酸（ssRNA、ssDNA）であり、従来の核酸とは異なって、抗体と類似する高い親和性及び特異性で、特異的標的に対する独特の結合特性を有する［Tuerk, C. Gold, L., Science, 1990, 249（4968）, 505-510；Ellington, A.D., Szostak, J.W., Nature, 1990, 346（6287）, 818-822］。アプタマーは、SELEXとして知られるプロセスにより、典型的には1012〜1015のオリゴヌクレオチドを含有するコンビナトリアルオリゴヌクレオチドライブラリーからin vitroで単離され、化学的に合成される。該オリゴヌクレオチドは、特異的標的と結合するその能力についてのセレクションプロセスと、何回にもわたるセレクションラウンド（典型的には8〜16ラウンド）に供される；最も特異的な核酸配列が単離される。SELEXで用いられる技術に応じて、このプロセスは数日から数ヶ月かかり得る［Cho, E. J., Lee, J.W., Ellington, A.D., Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2（1）, 241-264；Ellington, A. D., Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2（1）, 241-264］。アプタマーは、イオンから細胞全体にまで及ぶ広範な標的に対して生成されている。in vitroプロセスの使用は、毒性標的と結合できるアプタマーの生成及び選択を可能にし、これは、抗体などの免疫学的に開始される認識要素によっては不可能である。小さなサイズのアプタマー（通常、コイル状コンフォメーションで＜3 nm）はまた、抗体（およそ＞10 nmのサイズ）と比較して、表面系の水質センシング（surface-based aqueous sensing）目的に、より容易に適用可能なものにする［Song, S., et al., Trends in Analytical Chemistry, 2008, 27（2）, 108-117］。
【０００７】
Baker et al.,［Olowu, R. A.；Arotiba, O.；Maliu, S. N.；Waryo, T. T.；Baker, P.；Iwouoha, E., Sensors, 2010, 10, 9872］は、金ナノ粒子（AuNP）がドープされたポリ（3,4-エチレンジオキシチオフェン）（PEDOT）から開発された電気化学的DNAアプタセンサーが、17β-エストラジオールの検出に対して高親和性を有することを以前に示している。PEDOT-AuNPは、17β-エストラジオールを固定化するために合成される。このPEDOT-AuNPは、0.02 nMの検出限界で、0.1 nM〜100 nMの範囲で17β-エストラジオールを確実に検出することができる。
【０００８】
さらに、Baker et al.［Olowu, R. A., Ndangili, P.M., Baleg, A. A, Ikpo, C. O., Njomo, N., Baker, P, Iwuoha, E., Int. J. Electrochem. Sci., 2011, 6, 1686］はまた、内分泌攪乱化合物、特に17β-エストラジオールの決定において、ビオチン-アビジン相互作用を介する、デンドリマー第一世代（dendritic first generation）ポリ（プロピレンイミン）-ポリチオフェンコポリマー（以下に示す）官能化金電極から開発されたアプタマーバイオセンサーを調製し、示している。
【０００９】
【化２】
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【００１０】
センサープラットホーム及びアプタセンサーは、走査型電子顕微鏡法、フーリエ変換赤外分光法、電気化学的インピーダンス分光法、サイクリックボルタンメトリー及び矩形波ボルタンメトリーなどの技術を用いて研究された。著者らは、17β-エストラジオールの検出における反応が、0.1〜100 nMのセンサー線形範囲で矩形波ボルタンメトリーを用いて測定されたことを報告する。さらに、この特定のアプタマーは、17β-エストラジオールに対してのみ特異的である。
【００１１】
Lee and Gu et al.［Kim, Y. S., Jung, H. S., Matsuura, T., Lee, H. Y., Kawai, T., Gu, M. B. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22, 2525］は、17β-エストラジオールの検出において、金電極チップ上にssDNAアプタマーを固定化することによる、ssDNAアプタマーに基づく電気化学的バイオセンサーの合成及び使用を報告する。17β-エストラジオールの検出レベルは、1000〜0.1 nMの範囲であると報告されている。しかし、著者らは、0.01 nM〜0.001 nMの範囲にある、より低い濃度では、それらの測定は、アプタマーの基質との結合に関連しないかもしれないと報告しており、この特定の方法の信頼性を欠如させる。
【００１２】
US 2012/0088232は、ポイントオブケアラテラルフロー装置を用いて、ポイントオブケアロケーションで患者サンプル中の標的分子を検出するための方法を教示する。ポイントオブケアラテラルフロー装置は、癌マーカー及びタンパク質、特にp-グルコプロテイン（p-glucoprotein）（Pgp）を、フルオロフォアなどの適切なタグで標識されたアプタマーを利用することにより特異的に検出する。アプタマーは、ナノ粒子などの固体支持体にコンジュゲートされ、標的基質分子の存在は、動的光散乱を含む技術を用いて定量化される。この場合、動的光散乱は、アプタマー-基質複合体形成と関連する粒子サイズの増加を測定する。
【００１３】
本明細書内の従来技術の文献に対するいかなる言及も、いずれかの国において、かかる言及が当分野における共通の一般知識の一部を形成するとの承認を構成するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、サンプル中の小分子を迅速に検出するための方法を提供すること、又は少なくとも、有用な代替物を公衆に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、本明細書に開示するNP-アプタマーコンジュゲートが、低レベルでの小分子の検出に首尾よく適用でき、単離されたサンプル中において、これら小分子の存在の迅速な確認を提供することを発見した。
【００１６】
発明の記載
第一の側面において、本発明は、サンプル中の小分子を検出するための方法であって、
a）検出されるべき小分子に特異的なアプタマーにナノ粒子（NP）又はマイクロ粒子（MP）をカップリングして、NP-アプタマーコンジュゲートを形成する工程；
b）該NP-アプタマーコンジュゲートをサンプルと接触させる工程；
c）該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を検出する工程
を含み、ここで、該変化が該小分子の存在を示す、方法を提供する。
【００１７】
第一の側面の一実施態様において、該方法の工程（a）は、任意選択で、アプタマーがNP又はMPとカップリングしているかを確認するために、サイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を検出することを含んでよい。
【００１８】
第一の側面の別の実施態様において、工程（c）における変化は、NP-アプタマーコンジュゲートを小分子の存在下で接触させた場合に、NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度が低下することである。
【００１９】
第一の側面の別の実施態様において、NP-アプタマーのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化は、動的光散乱（DLS）又は抵抗パルスセンシング（Resistive Pulse Sensing）（RPS）を用いて検出される。粒子のサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を測定することができる他の技術を用いることもでき、これにはナノ粒子トラッキング解析が含まれる。
【００２０】
好ましくは、第一の側面の工程（b）において、NP-アプタマーコンジュゲートとサンプルとの接触は、1以上の界面活性剤を含む。界面活性剤（surfactant）は洗剤（detergent）であってよい。特に、洗剤は、アニオン性洗剤、カチオン性洗剤又は非イオン性洗剤であってよい。好ましくは、洗剤は、IGEPALTM（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）、Tween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミテート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）、Triton X-100（4-（1,1,3,3-テトラメチルブチル）フェニル-ポリエチレングリコール）、Nonidet p40（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）及びNonidet p40の代用品から選択される非イオン性洗剤であり得る。洗剤は、IGEPALTM（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）であることが好ましい。
【００２１】
NP-アプタマーコンジュゲートは、NP：アプタマーの数の比率が約1：1,000,000から約1：1まで含んでよい。より好ましくは、NP：アプタマーの比率は約1：50〜約1：10000、さらにより好ましくは、NP：アプタマーの比率は約1：500〜約1：2000である。
【００２２】
ナノ粒子は、サイズが約5 nm〜約5ミクロン、好ましくは約50 nm〜約500 nm、さらにより好ましくは約100 nm〜約250 nmのものである。
【００２３】
好ましくは、ナノ粒子は、金、パラジウム、ポリスチレン及びラテックスナノ粒子から選択される。より好ましくは、ナノ粒子は、ポリスチレンナノ粒子である。
【００２４】
ナノ粒子はまた、アミド／カルボン酸官能化ナノ粒子であってよい。好ましくは、ナノ粒子は、カルボン酸官能化ナノ粒子である。
【００２５】
ナノ粒子は、好ましくは、カルボン酸官能化ポリスチレンナノ粒子である。
【００２６】
ナノ粒子は、磁性元素（magnetic element）を含んでよい。例えば、磁性鉄コア（magnetic iron core）を含んでよい。
【００２７】
第一の側面の一実施態様において、検出されるべき標的小分子は、汚染物質（pollutant）であってよい。好ましくは、小分子は、ホルモンを模倣する化学物質、ホルモン、天然に存在するフィトエストロゲン、麻酔薬（narcotics）、及びその代謝産物から選択される。好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物、ステロイド性の性ホルモン、その代謝産物又は合成バリアントである。より好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物及びその代謝産物から選択される。さらにより好ましくは、小分子は、17β-エストラジオール（E2）；エストロン；エストリオール；アンドロステンジオン；テストステロン；ジヒドロテストステロン；プレグネノロン；プロゲステロン；17α-ヒドロキシプロゲステロン、17α-エチニルエストラジオール；イソフラボン；リグナン；クメスタン；有機ハロゲン化合物（有機塩素化合物、ポリ塩化有機化合物、ポリクロロビフェニル（PCB）を含む）；アルキルフェノール；アルキルフェノールエトキシレート；フタレート；ビスフェノールA（BPA）；ビス（4-ヒドロキシフェニル）メタン；コレステロール；アデノシン；トリクロサン；又は合成ステロイド、例えば、ジエチルスチルベステロール（diethylstilboestrol）（DES）；コカイン、ヘロイン、及び言及した化合物のその任意の代謝産物から選択される。より好ましくは、検出されるべき小分子は、17β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン及びアデノシンから選択される。
【００２８】
検出されるべき小分子はまた、ホルモン、又は体内疾患状態のマーカーであってもよい。例えば、該方法は、動物の生殖能力又はステータスを確立するためにホルモン及び／又は代謝産物の検出に使用され得る。或いは、該方法は、既知の疾患マーカーを検出するために使用され得、例えば、癌を検出するための癌遺伝子の過剰発現、感染と関連する分子の検出など、又は特定の状態と関連する特異的代謝産物のレベルを確立するために使用され得る。
【００２９】
検出されるべき小分子を含有するサンプルは、環境サンプル、例えば、水サンプル、土壌サンプル、又はさらには植物サンプルなどであってよい。該方法はまた、動物由来のサンプル、例えば、組織サンプル、毛髪若しくはウールサンプル、尿サンプル、血液サンプル、唾液サンプル又は糞便サンプルなどにおいて小分子を検出するために使用できる。一側面において、該方法は、家畜においてコンタミナントの存在を検出するために使用できるが、動物内の変化を検出するためにも使用でき、例えば、動物が発情期にあるかどうかを確立するために組織血液中におけるホルモンレベルの変化を検出するため、又は疾患若しくは状態と関連するマーカー化合物を検出するために使用できる。
【００３０】
第二の側面において、本発明は、
（a）ナノ又はマイクロ粒子；及び
（b）アプタマー
を含むバイオセンサーであって、ここで、
該ナノ粒子又はマイクロ粒子は該アプタマーとカップリングして、NP-アプタマーコンジュゲートを提供し、且つ
該NP-アプタマーコンジュゲートがサンプル中の小分子と接触した場合に、該NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度が変化する、
バイオセンサーを提供する。
【００３１】
第二の側面の一実施態様において、工程（b）におけるサイズの変化は、NP-アプタマーコンジュゲートが小分子と接触した場合に、NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度が低下することであってよい。
【００３２】
バイオセンサーは、NP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を検出するために、RPS、DLS及びその組み合わせから選択される技術と併せて使用されてよい。粒子のサイズ、表面電位及び／又は移動度トラッキングの変化を測定することができる他の技術を用いてよく、これにはナノ粒子トラッキング解析が含まれる。
【００３３】
好ましくは、洗剤若しくは界面活性剤、又はその組み合わせは、任意選択で、NP-アプタマーコンジュゲートが小分子と接触した場合に、そのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を検出することを助けるために使用される。界面活性剤は洗剤であってよい。特に、洗剤は、アニオン性洗剤、カチオン性洗剤又は非イオン性洗剤であってよい。好ましくは、洗剤は、IGEPALTM（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）、Tween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミテート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）、Triton X-100（4-（1,1,3,3-テトラメチルブチル）フェニル-ポリエチレングリコール）、Nonidet p40（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）及びNonidet p40の代用品から選択される非イオン性洗剤であり得る。洗剤は、IGEPALTM（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）であることが好ましい。
【００３４】
NP-アプタマーコンジュゲートは、NP：アプタマーの数の比率が約1：1,000,000から約1：1まで含んでよい。より好ましくは、NP：アプタマーの比率は約1：50〜約1：10000、さらにより好ましくは、NP：アプタマーの比率は約1：500〜約1：2000である。
【００３５】
ナノ粒子は、サイズが約5 nm〜約5ミクロン、好ましくは約50 nm〜約500 nm、さらにより好ましくは約100 nm〜約250 nmのものである。
【００３６】
第二の側面の一実施態様において、ナノ粒子は、金、パラジウム、ポリスチレン及びラテックスナノ粒子から選択されてよい。
【００３７】
好ましくは、ナノ粒子はポリスチレンナノ粒子である。或いは、ナノ粒子はまた、アミド／カルボン酸官能化ナノ粒子であってもよい。
【００３８】
或いは、好ましくは、ナノ粒子は、カルボン酸官能化ナノ粒子である。
【００３９】
ナノ粒子は、好ましくは、カルボン酸官能化ポリスチレンナノ粒子である。
【００４０】
ナノ粒子は、磁性元素を含んでよい。例えば、磁性鉄コアを含んでよい。
【００４１】
第二の側面のなお更なる実施態様において、検出されるべき標的小分子は、汚染物質であってよい。好ましくは、小分子は、ホルモンを模倣する化学物質、ホルモン、天然に存在するフィトエストロゲン、麻酔薬、及びその代謝産物から選択される。好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物、ステロイド性の性ホルモン、その代謝産物又は合成バリアントである。より好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物及びその代謝産物から選択される。さらにより好ましくは、小分子は、17β-エストラジオール（E2）；エストロン；エストリオール；アンドロステンジオン；テストステロン；ジヒドロテストステロン；プレグネノロン；プロゲステロン；17α-ヒドロキシプロゲステロン、17α-エチニルエストラジオール；イソフラボン；リグナン；クメスタン；有機ハロゲン化合物（有機塩素化合物、ポリ塩化有機化合物、ポリクロロビフェニル（PCB）を含む）；アルキルフェノール；アルキルフェノールエトキシレート；フタレート；ビスフェノールA（BPA）；ビス（4-ヒドロキシフェニル）メタン；コレステロール；アデノシン；トリクロサン；又は合成ステロイド、例えば、ジエチルスチルベステロール（DES）；コカイン、ヘロイン、及び言及した化合物のその任意の代謝産物から選択される。より好ましくは、検出されるべき小分子は、17β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン及びアデノシンから選択される。
【００４２】
検出されるべき小分子はまた、ホルモン、又は体内疾患状態のマーカーであってもよい。例えば、該方法は、動物の生殖能力又はステータスを確立するためにホルモン及び／又は代謝産物の検出に使用され得る。或いは、該方法は、既知の疾患マーカーを検出するために使用され得、例えば、癌を検出するための癌遺伝子の過剰発現、感染と関連する分子の検出など、又は特定の状態と関連する特異的代謝産物のレベルを確立するために使用され得る。
【００４３】
第二の側面の別の実施態様において、サンプルは、環境サンプル、例えば、水サンプル、土壌サンプル、又はさらには植物サンプルなどであってよい。該方法はまた、動物由来のサンプル、例えば、生物学的サンプル、組織サンプル、毛髪若しくはウールサンプル、尿サンプル、血液サンプル、唾液サンプル又は糞便サンプルなどにおいて小分子を検出するために使用できる。一側面において、該方法は、家畜においてコンタミナントの存在を検出するために使用できるが、動物内の変化を検出するためにも使用でき、例えば、動物が発情期にあるかどうかを確立するために組織血液中におけるホルモンレベルの変化を検出するため、又は疾患若しくは状態と関連するマーカー化合物を検出するために使用できる。
【００４４】
第三の側面において、本発明は、サンプル中の小分子の検出における、本明細書に記載のバイオセンサーの使用を提供する。
【００４５】
第三の側面の一実施態様において、本発明は、RPS、DLS及びその組み合わせから選択される技術と組み合わせたその使用を提供する。或いは、他の技術を用いて、サイズ、表面電位及び／又は移動度の変化を測定してよく、これにはナノ粒子解析が含まれる。
【００４６】
第三の側面の一実施態様において、バイオセンサーの使用は、任意選択で、洗剤又は界面活性を含む。界面活性剤は洗剤であってよい。特に、洗剤は、アニオン性洗剤、カチオン性洗剤又は非イオン性洗剤であってよい。好ましくは、洗剤は、IGEPALTM（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）、Tween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミテート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）、Triton X-100（4-（1,1,3,3-テトラメチルブチル）フェニル-ポリエチレングリコール）、Nonidet p40（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）及びNonidet p40の代用品から選択される非イオン性洗剤であり得る。洗剤は、IGEPAL（登録商標）（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）であることが好ましい。
【００４７】
好ましくは、バイオセンサーの使用は、小分子の検出におけるものである。好ましくは、小分子は汚染物質である。好ましくは、小分子は、ホルモンを模倣する化学物質、ホルモン、天然に存在するフィトエストロゲン、麻酔薬、及びその代謝産物から選択される。好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物、ステロイド性の性ホルモン、その代謝産物又は合成バリアントである。より好ましくは、小分子は、内分泌攪乱化合物及びその代謝産物から選択される。さらにより好ましくは、小分子は、17β-エストラジオール（E2）；エストロン；エストリオール；アンドロステンジオン；テストステロン；ジヒドロテストステロン；プレグネノロン；プロゲステロン；17α-ヒドロキシプロゲステロン、17α-エチニルエストラジオール；イソフラボン；リグナン；クメスタン；有機ハロゲン化合物（有機塩素化合物、ポリ塩化有機化合物、ポリクロロビフェニル（PCB）を含む）；アルキルフェノール；アルキルフェノールエトキシレート；フタレート；ビスフェノールA（BPA）；ビス（4-ヒドロキシフェニル）メタン；コレステロール；アデノシン；トリクロサン；又は合成ステロイド、例えば、ジエチルスチルベステロール（DES）；コカイン、ヘロイン、及び言及した化合物のその任意の代謝産物から選択される。より好ましくは、検出されるべき小分子は、17β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン及びアデノシンから選択される。
【００４８】
本発明の任意の一側面の一実施態様において、本発明は、下記配列：
5’-ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3’、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
を含むアプタマーを提供する。
【００４９】
本発明の任意の一側面の一実施態様において、配列を含むアプタマーは、
NH2（CH2）6ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
である。
【００５０】
本発明の任意の一側面のなお別の実施態様において、配列を含むアプタマーは、任意選択で、蛍光タグを含んでよい。タグは、Cy5.5であってよく、これは、IUPAC名により1H-ベンズ[e]インドリウム, 2-[5-[3-[6-[（2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル）オキシ]-6-オキソヘキシル]-1,3-ジヒドロ-1,1-ジメチル-6,8-ジスルホ-2H-ベンズ[e]インドール-2-イリデン]-1,3 ペンタジエン-1-イル]-3-エチル-1,1-ジメチル-6,8-ジスルホ-, 内塩, ナトリウム塩（1：3）（1H-Benz[e]indolium, 2-[5-[3-[6-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]-1,3-dihydro-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-2H-benz[e]indol-2-ylidene]-1,3 pentadien-1-yl]-3-ethyl-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-, inner salt, sodium salt (1:3)）としても知られる。当分野で既知の任意の蛍光タグを用いてよく、これはアプタマーの3’及び／又は5’の位置のいずれかに限定されないことが当業者に理解されるべきである。
【００５１】
なお別の側面において、本発明は、アデノシンアプタマー（27-merオリゴヌクレオチド）（Kim, J., Kim, I.Y., Choi, M.S., Wu, Q., Chem. Commun., 2009, 4747-4749）を用いて、且つ本明細書に記載の技術及び方法を用いて、低レベルでアデノシンを検出するための方法を提供する。好ましくは、アデノシンは、約500 nM以下のレベルで検出される。
【００５２】
詳細な説明
文脈がそうでないことを明らかに必要としない限り、本説明及び特許請求の範囲を通じて、単語「含む（comprise）」、「含むこと（comprising）」などは、排他的又は網羅的な意味とは対照的に包含的な意味、すなわち「含むが、限定されない（including, but not limited to）」を意味するものと解釈されるべきである。
【００５３】
本明細書に記載する場合、用語「アプタマー」は、特定の標的分子と特異的に結合する一本鎖のRNA又はDNAを意味することが意図される。用語「アプタマー」は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド配列と関連する。用語「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用されてよく、当分野内で一般に使用され理解される用語である。当業者ならば、アプタマーの配列コードのバリエーションが、基質とNP-アプタマーコンジュゲートとの結合に実質的な影響を及ぼすことなく、標準的な方法論によって変化されてよいことを容易に理解するだろう。
【００５４】
用語「コンフォメーション変化」は、アプタマーのコンフォメーション形態の変化、例えば、タイトなフォールディング構造から、結合部位の開放をもたらすルーズな線形型構造への変化、又はルーズな線形型構造からタイトなフォールディング構造への変化などを意味する。このタイプの変更は、当業者に容易に理解されるだろう。
【００５５】
用語「サンプル」は、環境源又は生物学的供給源から単離又は回収され、ex vivoに位置するサンプルを意味することが意図される。サンプルは、生物学的起源のものであってよく、動物から単離されてよく、又は環境から回収されてよい。サンプルの供給源は、例えば、土壌、水路、組織、血液、尿、唾液、糞便、毛髪及びウールなどを含んでよい。
【００５６】
用語「動物」は、ヒト及び非ヒト対象を意味することが意図される。例えば、ヒト；ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタを含む家畜（domesticated stock）；ネコ、イヌを含む飼いならされたペット；サル、トリ、両生類、爬虫類を含む野生動物；魚などの水性生活形態。
【００５７】
用語「小分子」は、Mwが約60〜約2000 g mol-1、好ましくはMwが約100〜500 g mol-1の範囲、より好ましくは約150〜350 g mol-1の範囲にある、シンプルな分子構造の化合物を意味することが意図される。かかる化合物の分子量及び分子量の計算は当業者に周知である。かかる化合物は、ホルモン模倣物、ホルモン、天然に存在するフィトエストロゲン、麻酔薬、及びその代謝産物、有機ハロゲン化合物並びに化合物、例えば、17β-エストラジオール（E2）；エストロン；エストリオール；アンドロステンジオン；テストステロン；ジヒドロテストステロン；プレグネノロン；プロゲステロン；17α-ヒドロキシプロゲステロン、17α-エチニルエストラジオール；イソフラボン；リグナン；クメスタン；有機ハロゲン化合物（有機塩素化合物、ポリ塩化有機化合物、ポリクロロビフェニル（PCB）を含む）；アルキルフェノール；アルキルフェノールエトキシレート；フタレート；ビスフェノールA（BPA）；ビス（4-ヒドロキシフェニル）メタン；コレステロール；アデノシン；トリクロサン；又は合成ステロイド、例えばジエチルスチルベステロール（DES）；コカイン、ヘロイン、及び言及した化合物のその任意の代謝産物などを含む。
【００５８】
用語「湿潤させる（wetting）」は、液体をナノポアへと浸透させ、その結果、ポアが液体で満たされ、ポアの液体での完全な充填がもたらされ、ポアを通る一定のイオン電流を観察することができることを意味することが意図される。
【００５９】
用語「NP-アプタマーコンジュゲート」はまた、マイクロ粒子-アプタマーコンジュゲートを含むことが意図される。すなわち、ナノ粒子又はマイクロ粒子のいずれかが使用されてよく、この用語は、マイクロ粒子を除外することを意図しない。
【００６０】
記載するように、本発明は、サンプル中の標的分子の存在を迅速に検出するためにアプタマーを使用する新規な方法、及び小分子を検出するための新規バイオセンサーを提供する。
【００６１】
理論に拘束されることを望むものではないが、該方法は、NP-アプタマーコンジュゲートを形成するために、標的化合物（ここで、標的化合物は小分子である）と選択的に結合することができるアプタマーをナノ粒子（NP）又はマイクロ粒子（MP）とカップリングすることにより働く。その際、NP-アプタマーコンジュゲートのNP成分のサイズ及び／又は表面電位は検出可能に増加し、それにより、NP-アプタマーコンジュゲートの形成が確認される。
【００６２】
次いで、NP-アプタマーコンジュゲートをサンプルと接触させる。標的分子がサンプル中に閾値濃度を超えて存在する場合に、NP-アプタマーコンジュゲートのアプタマー成分は様々な程度で標的分子と結合するだろう。この結合の結果、NP-アプタマーコンジュゲートの全体的なサイズにおける検出可能な低下、及び全体的な表面電位の変化がもたらされるだろう（この例は図3〜7で見られる）。サンプル中のNP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、又はNP-アプタマーコンジュゲートのサイズ、表面電位及び／若しくは移動度のこれらの変化の測定は、サンプル中の標的分子の存在について非常に迅速な測定を可能にする。基質との結合及びNP-アプタマー-基質コンジュゲートの形成における、NP-アプタマーのサイズ、表面電位及び／又は移動度の変化は、標的分子の濃度と比例する。従って、試験はまた、既知濃度の標準物質との比較により、標的分子の濃度を迅速に確立することができる。
【００６３】
試験はまた、非常に敏感であることが発見されており、1 nM程度低い、非常に低量の標的分子の存在を検出する。
【００６４】
ナノ粒子-アプタマーコンジュゲート
本発明のアプタマーは、標準的な方法論、例えば、SELEXを用いて短いオリゴヌクレオチドのライブラリーを調製することにより調製される。オリゴヌクレオチドは、特異的標的と結合する能力についてのセレクションプロセス、及び何回にもわたるセレクションラウンド（典型的には8〜18）に供され、最も特異的な核酸種が単離される［Cho, E. J., Lee, J.W., Ellington, A.D., Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2（1）, 241-264；Ellington, A. D., Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2（1）, 241-264］。
【００６５】
【化３】
2016507063.tif 000005
【００６６】
式（7）のNP-アプタマーコンジュゲートは、式（1）のナノ粒子カルボン酸を式（2）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとカップリングして、式（3）のO-アシルイソウレア中間体を形成することにより調製される。次いで、式（3）の化合物をNHSと反応させて、式（5）の中間体を形成する。アプタマー（8）（図2に示すようなもの）は、末端アミノ部分を有するH2N-アプタマー（6）を形成するために、第1級アミノ基で修飾する。このH2N-アプタマー（6）を化合物（5）と反応させて、スキーム1に示すように、一般式（7）のアプタマー-ナノ粒子コンジュゲートを形成する。必要に応じて、化合物（1）、（5）及び（7）は、反応混合物から、14,000 rpmのスピードで少なくとも20分間遠心分離することにより単離できる。
【００６７】
式（6）のH2N-アプタマーは、裸のNPサンプル（1）と比較した場合に、NP-アプタマーコンジュゲート（7）の最終的な物理的サイズの増加及び／又は表面電位の変化により、ナノ粒子（1）と首尾よく繋がれていると判断される。これは、1つ以上のアプタマーをNPとつなげて、単一のより大きなNP-アプタマーコンジュゲートを形成することにより達成される。次いで、これにより、粒子と結合されたアプタマーがもたらされ、これは、当分野で既知の技術を用いて正確に測定できる。例えば、サイズの変化は、動的光散乱（DLS）、抵抗パルスセンシング（RPS）、粒子トラッキング解析、又は標準的な文献の手順に従う任意の他の適した検出方法［Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U., Small, 2012, 8, 2436；Song, S., et al., Trends in Analytical Chemistry, 2008, 27（2）, 1087； Willmott, G. R, Parry, B.E.T., J. App. Physics, 2011, 109（9）；Kozak, D., et al., Nano Today, 2011, 6（5）, 531；Javier, D.J., et al., Bioconjugate Chemistry, 2008, 19（6）, 1309]により検出できる。これに加えて、DLS及び／又はRPS及び／又は粒子トラッキング解析を用いて、H2N-アプタマー（6）がカップリングして（7）を形成する場合に、NPsの表面電位の変化を評価できる。RPSの結果は、NPとH2N-アプタマー（6）が一緒にカップリングされる場合に、本明細書に開示のNP-アプタマーコンジュゲート（7）の直径が15 nm増加することを示す。
【００６８】
現在の慣用的な方法論を超えるRPSの利点は、粒子ごと（particle-per-particle）に基づくサンプル解析が可能となることである。RPSの分析時間は、数分から何時間又は何日間もの分析時間を有する慣用的な技術と比較して顕著に迅速であり、2〜6分間の範囲の分析時間である。
【００６９】
さらに、RPS位相解析光散乱（phase analysis light scattering）は、キャピラリーセルに（7）を入れ、金電極にわたって外部電圧を適用することにより、表面電位の変化を測定することが可能である。これをレーザー光で照らすことにより、光が散乱し、散乱光の周波数は電気泳動移動度と比例することから表面電位を測定できる。さらに、負に帯電した式（6）のアプタマーが（7）を形成する場合には、（7）のζ電位（表面電位の測定値）は、図14に示すように、（1）と比較してより負となる。RPSの場合には、集団（7）は、より低い粒子移動度及びより長いパルス持続時間（pulse durations）（図11に示すように）により（1）と比較される。
【００７０】
いずれのナノ粒子又はマイクロ粒子も、それが1つ以上のアプタマーと繋げることができ、アプタマーと標的分子とのいずれの結合に対しても不活性である限り、本発明での使用に適している。適したナノ粒子又はマイクロ粒子は、金、パラジウム、ポリスチレン又はラテックスを含むが、これらに限定されない。ナノ粒子又はマイクロ粒子はまた、アミド／カルボン酸官能化ナノ粒子又はマイクロ粒子、例えば、カルボン酸官能化ポリスチレン粒子などであってもよい。
【００７１】
標的分子の検出
本発明の方法、特に例示されるものは、NP-アプタマーコンジュゲートを使用し、NP-アプタマーコンジュゲートが標的基質分子と結合して、NP-アプタマー-基質コンジュゲートを形成する場合に（図5）、コンフォメーション及び表面電位の変化を測定することにより、サンプル中の小分子の検出に有用である。
【００７２】
アプタマーとNPとのカップリングにより、NP-アプタマーコンジュゲートの全体的なサイズ及び直径が増加し、且つその表面電位が変化する。しかし、NP-アプタマーコンジュゲートが基質と結合して、NP-アプタマー-基質コンジュゲートを形成する場合、それは全体的なサイズ及び直径の縮小を受け、異なる表面電位密度をさらす。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に開示のNP-アプタマーコンジュゲートが標的小分子と結合する場合、NP-アプタマーコンジュゲートのアプタマー成分は、コンフォメーション変化を受ける。例えば、アプタマーの全体的なサイズ、形状及び／又は表面電位は、その特異的標的のまわりにフォールディングすることにより縮小し、より小さくなる。これらのコンフォメーション変化は、図5に示すように、NP-アプタマーコンジュゲートのアプタマー鎖（tether）と標的分子の相互作用により誘発される。この変化の検出は、標的基質分子がNP-アプタマーと結合する場合を検出する方法を提供する。
【００７３】
基質と結合した際のNP-アプタマーコンジュゲートの直径の縮小が、基質の結合に起因することを確立するために、裸のNP（例えば、いずれのアプタマーも有さない化合物（1））を、図6に示すように、50 nM E2基質の存在下及び不在下にて評価した。結果は、いずれのサイズ変化も生じないことを示し；変化はいずれも、NPと繋がれたアプタマーの存在に起因することを結論づける。
【００７４】
これは、第二のコントロール実験にてさらに例証される。NP-アプタマーコンジュゲート（7）をブランクBWBに暴露した。サイズの縮小又は表面電位の変化はいずれも存在せず、サイズの変化が生じるために、NP-アプタマーコンジュゲート（7）は基質が存在することを必要とすることが確認された。従って、サイズ及び／又は表面電位のこれらの変化は、NP-アプタマーコンジュゲートが基質と結合し（図15）、NP-アプタマー-基質コンジュゲートを形成する直接的な結果である。
【００７５】
本発明は、任意の標的化合物の検出に使用するのに適していることが理解されるだろう。必要なのは、標的分子と特異的に結合するアプタマーを作製（上記のような既知の方法を用いて）することだけである。理想的には、標的分子は小分子であり、すなわち、NP-アプタマーコンジュゲートよりも十分に小さくて、アプタマーが標的化合物と結合した場合に、コンジュゲートサイズの低下をもたらすものである。
【００７６】
また、サンプルは、NP-アプタマーコンジュゲートと結合可能であり、サイズ変化の検出が可能であるように溶液中であることが好ましい。該方法は、特に、環境サンプル中のコンタミネート（contaminates）又は汚染物質の検出に適していることが理解されるだろう（例えば、水サンプル、土壌、生物学的サンプル（植物又は動物の組織、糞便、唾液、尿サンプルを含む）、又は水相中にあるか、若しくは水相へと変換可能若しくは抽出可能かのいずれかである標的分子を含むことが疑われる任意の適した環境サンプルなどであるが、これらに限定されない）。
【００７７】
しかし、該方法は、サンプル中の任意の化合物を検出するために使用できることが理解されるだろう。従って、本発明は、単一の適用に限定されず、溶液中の任意の標的化合物の検出を包含する。これは、例えば、動物のステータスを確立するために、生物学的サンプル中のホルモン又は代謝産物を検出することを含み得る。これは、ヒトを含む動物の生殖能力を確立するためにホルモンを検出することであり得る。
【００７８】
或いは、多くのマーカーが疾患と関連することが知られている。現在の方法は、診断目的でこれらのマーカーを検出するのに使用され得る。例えば、多くの遺伝子マーカーが癌と関連することが知られており、従って、該方法は、癌を診断するために患者由来のサンプル中の遺伝子発現を検出するために使用され得る。同様に、代謝産物を含む他のマーカーが様々な疾患又は状態と関連することが知られており、該方法は、当該疾患又は状態の診断、予後診断又はモニタリングの目的で、任意のかかるマーカーの検出又はモニタリングに使用するのに適している。
【００７９】
本発明者らは、驚くべきことに、また有利に、一般式（7）のNP-アプタマーコンジュゲートが、小分子、特に内分泌攪乱化合物及びエストロゲン化合物ファミリーのメンバーを認識することを発見した。
【００８０】
特に、検出されるべき小分子は、内分泌攪乱化合物、例えば、17β-エストラジオール（E2）、エストロン、エストリオール、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、プレグネノロン、プロゲステロン、17α-エチニルエストラジオール、17α-ヒドロキシプロゲステロン、合成ステロイド、例えば、ジエチルスチルベステロール（DES）、エチニルエストラジオール及びノルエチンドロン；天然に存在するフィトエストロゲン、例えば、イソフラボン、リグナン及びクメスタン；有機ハロゲン化合物、有機塩素化合物、ポリ塩化有機化合物、ポリクロロビフェニル（PCB）、アルキルフェノール、アルキルフェノールエトキシレート、フタレート、ビスフェノールA（BPA）、ビス（4-ヒドロキシフェニル）メタン、アデノシン、コレステロール、トリクロサン；並びに、麻酔薬（narcotics）、例えば、コカイン及びヘロインなどであり得る。
【００８１】
特に、小分子は、環境サンプル、例えば、家庭用水サンプル、農業用水サンプル、工業用水サンプル、土壌サンプル、単離された生物学的サンプル、及び動物から得られたサンプルなどで検出され得る。
【００８２】
本発明者らは、驚くべきことに、また有利に、図6、7及び8に示すように、NP上に繋がれた様々な数のアプタマー（すなわち、NP：アプタマーの数の比率）を用いて、1〜100 nMの範囲のE2濃度を検出することができ、図9a及び9bに示すように、500 nM程度低いレベルでアデノシンも検出することができた。この例におけるものよりも低いアプタマー密度を用いて、より低濃度のE2を検出することもできる。
【００８３】
E2濃度が増加するにつれて、NP上のアプタマーコーティングは、標的基質分子周囲でのフォールディングに起因して縮小する。さらに、RPSにより測定されるパルス持続時間（pulse duration time）（FWHM）は、NP-アプタマーがE2と結合する場合に増加する。RPSにおいて、FWHMは表面電位と関連し、ここで、より低いマグニチュードの表面電位は、より遅い動きをもたらし、従って、より長いFWHMとなる。本ケースでは、パルス持続時間の増加は、E2との結合がNP-アプタマーコンジュゲートの負の表面電位の低下と関連するという、位相解析光散乱を介した観察と一致する（図16を参照）。
【００８４】
洗剤の使用
本発明者らはまた、驚くべきことに、適切な濃度レベルの洗剤及び界面活性剤が、標的小分子に対する感受性の高まりを達成するために使用できることも発見した。理論に拘束されることを望むものではないが、洗剤及び／又は界面活性剤の存在は、アプタマーが標的分子と特異的に結合する能力を助ける。
【００８５】
選択的なNP-アプタマーコンジュゲート標的結合は、アプタマーがSELEXを用いて作製されるのと同じ洗剤条件下で最適に活性化される。理論に拘束されることを望むものではないが、洗剤の存在は、弱く結合した非特異的標的をNP-アプタマー表面から除去することにより、アプタマーの電荷分布に影響を及ぼし、それにより、そのコンフォメーションエネルギー論を高める。
【００８６】
洗剤はまた、ナノポアメンブレンを湿潤させ、イオン電流がポアを通過することを可能にすることにより、RPSを用いた結果の分析を助ける。
【００８７】
【表１】
2016507063.tif 000006
【００８８】
検出の方法
本方法は、NP-アプタマーコンジュゲートの表面上でのコンフォメーション変化を検出することを伴う。当分野で知られるような、コンフォメーション変化を検出するための任意の適した方法を使用してよい。使用される方法は以下の技術を含んでよいが、これらに限定されない：
【００８９】
抵抗パルスセンシング（RPS）
抵抗パルスセンシング実験は、伝導性電解質の2つのセルを分離するチャネル又はポアを通ってトラバースする際の粒子の検出及び分析を伴う。外部電圧をシステムにわたって適用し、ベースライン電流がポアを通過し、ポアの抵抗性をモニタリングする。粒子がポア構造を通過する際に、イオン電流が妨げられ、事象（いわゆる、遮断（blockade））が引き起こされる。遮断持続時間（FWHM）及びマグニチュードは、それぞれ、粒子表面電位及びサイズと関連する。チューナブル（tuneable）ナノポアRPSは、円錐状のナノポア（タングステンニードルでの貫通により作製される）を含む伸縮性ポリウレタンメンブレンを利用したRPS分野の最新の進歩である。この技術は、例えば、Izon Nanoparticlesにより製造されるqNanoと称される装置で見られる。チューナブルナノポアRPSは、粒子ごと（particle-per-particle）の解析を生じることができ、固定的ナノポアと関連する目詰まりの問題を排除する多数の利点を有する［7〜9］（図1を参照）。
【００９０】
典型的なチューナブルナノポアRPS実験では、およそ500のNPsを解析する（500の遮断事象を生成する）。解析時間は、粒子濃度及びシステム条件に応じて2〜6分間の範囲である。次いで、同一実験条件下（ポアオープニング、適用電圧、圧力及び懸濁化媒体（suspending medium））で流した周知の粒子サイズに対する比較に基づきサイズを計算する。図4に示すように、データは、サイズ及びFWHM（それぞれX軸及びY軸）を表す散布図として表され、サイズ及びFWHMのヒストグラムが構築される。
【００９１】
動的光散乱（DLS）及び位相解析光散乱
動的光散乱（DLS）（光子相関分光法PCSとしても知られる）は、その散乱光の強度のランダムな変化に基づき、NPs懸濁液のサイズを測定する技術である。コロイド系における小粒子は、熱運動（ブラウン運動と称される）を受け、散乱光の強度ゆらぎ（fluctuation）を引き起こす。
【００９２】
サンプルをレーザーから供給される光で照らし、次いで、粒子による散乱光を集め（所与の角度90°で）、散乱光の強度ゆらぎを時間とともにモニタリングする（図3に示す）。データは、減衰時間を計算する相関計にリアルタイムで導入し、今度はこれを用いて、粒子の移動拡散係数（translation diffusion coefficient）（Dt）を算出する。Dtはストークス-アインシュタインの関係（以下に示す）に使用して、粒子の流体力学的サイズを見つける（懸濁液中のNPs+結合イオン）。最終的に、図1に示すように、NPsのサイズ分布が得られる（NPsは球状で単分散であるべきである）。参照：Malvern Instruments Ltd（2007）Technical information provided for the Zeta-sizer Nano。
Dh = KB T / 3πη Dt
Dh：流体力学的サイズ、KB：ボルツマン定数、T：温度、η：粘度、及び
Dt：移動拡散係数。
【００９３】
表面電位（具体的にはζ電位）は、サイズ測定と関連するがわずかに異なる様式で、光散乱方法（位相解析光散乱PALS）で得られる。NPsを含むサンプルをキャピラリーセルに入れ、金電極を用いて、セルにわたって外部電圧を適用する。粒子は、反対に帯電した電極へと移動する。サンプルが、粒子移動と反対に作用する力と平衡化した場合に、サンプルをレーザー光で照らし、散乱光を17°で集める。PALSにおいて、粒子移動に起因する位相シフトは、散乱光の強度ゆらぎを引き起こす。散乱光の周波数は、粒子の電気泳動移動度（UE）と比例する。データはリアルタイムで相関計に導入し、UEを計算する。最終的に、ヘンリーの式（以下に示す）を用いてζ電位を算出する。所与の実験条件下、電解質の粘度（η）、媒質の誘電率（ε）及びヘンリー関数（f（Κa）＝1.5（中程度の電解質濃度について））が知られ、ζ電位が、所与の集団に対するヒストグラムとして作製される。参照：Malvern Instruments Ltd（2007）Technical information provided for the Zeta-sizer Nano, chapter 16。
UE = 2 ε ζ電位 f（Κa）/3η
【００９４】
粒子トラッキング解析（PTA）
粒子トラッキング解析（ナノ粒子トラッキング解析を含む）はまた、ブラウン運動の解析を利用して、運動を受ける粒子のサイズを測定する。DLS測定と同様に、測定される粒子ブラウン運動のスピードは、ストークス-アインシュタインの関係（上記）を介して粒子サイズと関連する。
【００９５】
PTAは、粒子ブラウン運動を測定する手段においてDLSと異なる。PTAにおいて、粒子を含む溶液は限外顕微鏡で画像化され、粒子運動は、フレーム単位（frame-by-frame）で時間とともにトラッキングされる。従って、PTAは、アンサンブルな技術（DLSのような）というよりむしろ粒子単位（particle-by-particle）の技術（RPSのような）である。
【００９６】
基質の濃度レベルの定量化
NP-アプタマーコンジュゲートサイズの検出可能な変化は、サンプル中の標的分子の濃度に依存し、例えば、測定される変化が大きいほど、存在する標的分子のレベルが高くなる。従って、既知量の標的分子を含む一連のサンプルを利用して、試験サンプル中の標的分子の濃度を確立することができる標準曲線又は方程式を作製することが可能である。サンプル濃度を確立するための方法は当分野で周知である。
【００９７】
本発明は、サンプル中の標的分子の存在を、その濃度とともに非常に迅速に確立することができる方法を提供する。該方法は、NP-アプタマーコンジュゲートをサンプルと混合し、次いで、アプタマーサイズの変化を検出することを必要とする。この変化は、RPS、DLS、又は任意の他の適した方法若しくはシステムを用いて検出されてよい。
【００９８】
動的光散乱（DLS）及び抵抗パルスセンシング（RPS）などの技術の利用は、現場で又は都合のよい場所で潜在的に使用可能な、小さくて容易に利用可能な機械の使用を伴い、高レベルの専門的訓練を必要としない。
【００９９】
従って、本発明に従う方法は、標的分子、例えば、環境汚染物質などの迅速な検出及び定量化のための非常に簡便且つ容易な方法を提供する。
【０１００】
アプタマー
本発明に特異的な、配列：
5’-ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3’、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
を含むアプタマーを提供する。
【０１０１】
具体的には、アプタマーは、
NH2（CH2）6ATACGAGCTTGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC、又は
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有する配列
である。
【０１０２】
【化４】
2016507063.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図1は、光散乱及び抵抗パルスセンシングによる、NPs（1）、活性化NPs（2）、NPs-アプタマー（3）及びNPs-アプタマー+E2の検出の一般的な概略図を示す。
【図２】図2は、式（8）のE2アプタマーの予測二次構造を示す。
【図３】図3は、ナノ粒子懸濁液を含むサンプルによる散乱光の強度ゆらぎを示す。
【図４】図4は、（5）を形成するためのカルボキシル化ナノ粒子（1）の活性化を確認するNHSのUV吸収を示す。サンプルは異なる反応時間（○＝反応前、□＝20分後及び△＝1時間後）で連続的にクエンチした。反応は、6 nmoleのEDC、NHS及び200 μLのNPs（およそ4 nmoleのCOOH）間で生じた。反応は、サンプルを0.25 μmのフィルターを通して濾過することによりクエンチし、上清の吸収を測定した。
【図５】図5は、NP-E2アプタマーコンジュゲートによる基質E2の認識に関与するメカニズムの一般的な概略図を示す。
【図６】図6は、コントロール実験のサイズ及びFWHMの散布図を示す：（A）裸のNPs及び（B）裸のNPsを50 nM E2と反応させる。
【図７】図7は、NP-E2アプタマーコンジュゲートを用いた10 nM、40 nM及び70 nM E2の検出についてDLSを用いて得られた結果を示す。検出は、表2に記載するようにして実施し、その後、同じバッファー条件を用いて希釈して、トータルサンプル量1 mLとした。
【図８】図8は、（A）NPs、（B）NP-E2アプタマーコンジュゲート（7）、並びに（C）5 nM及び（D）20 nMのE2の検出（0.1アプタマー密度で）の散布図を示す。
【図９】図9（A）は、500 nM アデノシンの検出の間にTRPSにより得られた異なるサンプルのサイズのヒストグラムを示し；（B）は、500 nM アデノシンの検出についてTRPSにより得られた異なるサンプルのFWHMのヒストグラムを示す。破線の垂直線は、裸のNPs（一番上（最初）のヒストグラム）及びNP-アプタマー（三番目のヒストグラム）のモードバーにアライメントする。ビンサイズは、サイズ及び持続時間（FWHM）について、それぞれ、3.5 nm及び0.2 msである。括弧内の数は、3回の測定の平均の標準偏差を示す。
【図１０】図10（A）は、20 nM E2濃度でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのサイズのヒストグラムであり；（B）は、5 nM E2濃度でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのサイズのヒストグラムであり；（C）は、NP-E2アプタマーコンジュゲート（7）のサイズのヒストグラムであり；（D）は、NP（1）のサイズのヒストグラムである。
【図１１】図11（A）は、20 nM E2濃度でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのFWHMのヒストグラムであり；（B）は、5 nM E2濃度でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのFWHMのヒストグラムであり；（C）は、NP-E2アプタマーコンジュゲート（7）のFWHMのヒストグラムであり；（D）は、NP（1）のFWHMのヒストグラムである。
【図１２】図12（A）は、BWB, 0.01％ IGEPALTM中でのNP-E2アプタマーコンジュゲートを表し;（B）は、BWB, 0.1％ IGEPALTM中でのNP-E2アプタマーコンジュゲートを表す。
【図１３】図13（A）は、BWB, 0.01％IGEPALTM中でのNPを表し;（B）は、BWB, 0.1％ IGEPALTM中でのNPを表す。
【図１４】図14は、NPs、NPs-NHSコンジュゲート（5）及びNP-E2アプタマーコンジュゲート（7）の表面電位（具体的にはζ電位）測定値を示す。
【図１５】図15は、コントロールサンプルNP-E2アプタマーコンジュゲート（7）、及びBWBとともにNP-E2アプタマーコンジュゲート（7）の散布図を示す。
【図１６】図16は、NPs、NP-アプタマーコンジュゲート、及び10 nM E2でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートの表面電位（具体的にはζ電位）測定値を示す。
【図１７】図17（A）は、E2検出プロセスの間にTRPSにより得られた異なる濃度でのNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのサイズのヒストグラムを示す。黒抜きのビン（solid bins）の位置は、DLSから得られた数によるサイズ分布の平均を示す；（B）は、E2検出プロセスの間にTRPSにより得られたNP-E2アプタマー-基質コンジュゲートのサイズのFWHMヒストグラムを示す。破線の垂直線は、裸のNPs及びNP-E2アプタマーのモードバーにアライメントする。ビンサイズは、サイズ及び持続時間（FWHM）について、それぞれ、3.5 nm及び0.2 msである。
【図１８】図18は、TRPSにおけるNP-アプタマー計数率に対するIGEPALの効果を示す。
【図１９】図19は、E2の検出及びビスフェノールA（BPA）の交差反応性試験の間にTRPSにより得られたサイズ及びFWHMのモード値（mode values）を示す。エラーバーは、3回の独立実験からの平均の標準偏差を示す。
【図２０】図20は、固定量（0.1 nmol）の蛍光タグアプタマー（F-アプタマー）と、複数の独立したNP数（1.04×1010、2.08×1010、3.12×1010及び4.16×1010）との反応から生じたサンプルの蛍光測定値を示す。破線の円形データポイントは、コントロールサンプルの結果を表す：活性化剤（EDC/NHS）の不在下、2.08×1010のNPsの0.1 nmol F-アプタマーへの暴露。差し込み図は、NPs（2.08×1010の粒子）と混合された連続濃度のF-アプタマーから構成された検量線（calibration curve）である。
【図２１】図21は、BWB中、並びに0.5、3.5及び6.5 μMのE2濃度の独立した検出における、400 nM E2アプタマーのCDスペクトルである。
【図２２】図22は、50 nMのE2、BPA+BPA、プロゲステロン、テストステロン、ビスフェノールA及びビス（4-ヒドロキシフェニル）メタンの特異性試験の間にTRPSにより得られたサイズ及びFWHMのモード値の変化を示す（エラーバーは、3回の独立測定値からの平均の標準偏差を示す）。サイズの相対的変化は、NPsに付加される20 nmのアプタマー伸長から計算し、FWHM持続時間の相対的変化は、NP-アプタマーの持続時間（1.5 ms）から計算した。
【図２３】図23（A）は、ニトロセルロース上に固定化した連続量のE2のドットブロット検出、及びNP-アプタマーコンジュゲートと結合したE2の化学発光可視化を示し；（B）は、NP-アプタマーコンジュゲートを用いた解離定数の測定、及びインキュベーション後の上清サンプルにおけるE2蛍光の測定を示す。NP-アプタマー濃度は100 nMである（エラーバーは、3回の独立実験の平均の標準偏差を示す）。
【実施例】
【０１０４】
本明細書に記載の実施例は、本発明の実施態様を説明する目的である。他の実施態様、方法及び分析タイプは、分子診断分野の当業者の範囲内であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当分野の範囲内の他の実施態様は、本発明の一部とみなされる。以下の手順は、NP-E2アプタマーを調製するために記載するが、他のアプタマーでの使用にも適しており、E2アプタマーのみに限定されるものではない。
【０１０５】
PAGE精製したH2N-E2アプタマーは、本発明者らが提供したオリゴヌクレオチド配列を用いてSIGMA-ALDRICHによりカスタム合成される。
【０１０６】
化合物（5）
カルボキシル化ナノ粒子（1）（400 μL、1.76E14粒子mL-1、8 nmoleの表面カルボン酸基に相当する；Bangs Labs）を2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸に懸濁する。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（2）（200 nmole、MES中0.01 M（20 μL））及びN-ヒドロキシスクシンイミド（4）（200 nmole、MES中0.01 M（20 μL））を添加し、反応混合物を室温で30分間インキュベートすることにより化合物（5）を形成する。キャラクタリゼーションの目的で、化合物（5）を14,000 rpmで20分間遠心分離することにより単離した。
【０１０７】
UV吸収によりNHSの消費をモニタリングできるように、（1）を1.5当量の（2）及び（4）と反応させることにより、様々な表面活性化密度を有する化合物（5）の形成を別個の反応シリーズでモニタリングする。カルボキシル化ナノ粒子（1）（200 μL、1.76E14粒子mL-1、4 nmoleの表面カルボン酸基に相当する；Bangs Labs）を、5つの別個の反応槽にて、2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸に懸濁する。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（6 nmole、MES中50 μM（100 μL））及びN-ヒドロキシスクシンイミド（6 nmole、MES中50 μM（100 μL））を、5つの反応槽それぞれに室温で添加する。5つの反応物は、それぞれ、5分後、10分後、20分後、30分後及び60分後に、0.2 μmのシリンジフィルターを通して濾過することによりクエンチし、上清液体のUV吸収を測定することによりNHSの消費をモニタリングする。
【０１０８】
NP-アプタマーコンジュゲート（7）を形成するためのH2N-アプタマー（6）の（5）とのカップリング
カルボキシル化ナノ粒子（1）（400 μL、1.76E14粒子mL-1、8 nmoleの表面カルボン酸基に相当する；Bangs Labs）を2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸に懸濁する。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（2）（200 nmole、MES中0.01 M（20 μL））及びN-ヒドロキシスクシンイミド（4）（200 nmole、MES中0.01 M（20 μL））を添加し、反応混合物を室温で30分間インキュベートすることにより化合物（5）を形成する。次いで、30分後に、0.2 nmoleのアミノ末端化（amino terminated）E2アプタマー（MES中650 nM（160 μL））を反応混合物に添加し、室温で一晩インキュベートする。次いで、NP-E2アプタマーコンジュゲート（7）を更なる実験のために14,000 rpmで少なくとも20分間遠心分離することにより単離する。化合物（7）生成のために本明細書に記載の実施例は、ナノ粒子あたり平均しておよそ1000のアプタマープローブを生じる。
【０１０９】
連結（tethering）の成功は、遠心分離を介した単離及びMESバッファーへの再分散後にNPsのゼータ電位を測定することにより確認できる。表2は、（中性）NHSエステルの形成は、ゼータ電位が、アニオン性カルボキシレート表面を有する裸のNPsに対する-36 mVと比較して-32 mVまで低下することを介して確認されることを示す。次いで、NPsのゼータ電位は、ポリアニオン性アプタマーとのカップリング時に-41 mVまで増加する。これらの観察は、裸のNPのゼータ電位がカップリング剤を含めない場合に得られることから、NP表面への非特異的付着というよりもむしろ共有結合官能化を反映する。アプタマー官能化の密度は、蛍光タグ化アプタマーを用いた場合のカップリング化アプタマー濃度を測定することにより、粒子あたりおよそ2.4×103のアプタマー（アプタマーあたりおよそ25 nm2の平均表面積に相当する）と見積もられる。カップリング反応においてNP:アプタマー濃度比の関数としてカップリングの程度を測定することにより、この官能化密度が、飽和値に相当することが分かる。
【０１１０】
【表２】
2016507063.tif 000008
【０１１１】
図17（A）は、TRPSが、アプタマーとのカップリングの結果として、NPsのモード径においておよそ20 nmの増加を解析（resolves）することを例示する。DLS及びTRPSの測定値は同様の傾向を明らかにするものの、絶対径は異なることが明らかである。DLSは、散乱光の強度分布に由来する数分布に基づく平均を与える一方、TRPS数分布は、粒子単位（particle-by-particle）の測定値に基づくことから、これは予想外というわけではない。
【０１１２】
E2の検出
下記表3に示すように、BWB中のNP-アプタマーコンジュゲート（7）（90 μLのストック溶液5.2E10 NPs mL-1）をBWB中のE2アリコートと組み合わせることにより100 μLの試験溶液を調製して、それぞれ、5 nM及び20 nMのE2濃度をもたらす試験溶液を得る。サンプルを室温で20分間インキュベートし、RPSを用いた分析前に3〜5分間超音波で分解する。
【０１１３】
【表３】
2016507063.tif 000009
【０１１４】
洗剤の作用に対する実験結果
NPs及びNP-アプタマーコンジュゲート（7）（5.2E10粒子mL-1）を異なる量のIGEPAL（登録商標）洗剤（0.1％v/v及び0.01％ v/v）を有するBWBに懸濁し、図12A及び図12Bに示すように、RPS、DLS ζ電位（PALSを介する）により分析する。洗剤濃度の変化を除いては、センシング測定において、コントロールについて上記に概略したのと同じ手順に従う。
【０１１５】
E2アプタマーを用いた他の小分子の検出
NP-E2アプタマーコンジュゲートの特異性を他の標的分子について調べる。実験は、E2の検出について上記したのと同じ条件を用いて実施する。図22は、この特定のNP-E2アプタマーコンジュゲートが、同じステロイド系ファミリーに分類されるE2、プロゲステロン及びテストステロンを区別しないことを示す。しかしながら、該ステロイド系ファミリーに属さない分子、例えば、ビスフェノールA及びビス（4-ヒドロキシフェニル）メタンなどに対しては優れた区別が達成される。これは、NP-E2アプタマーコンジュゲートが、ステロイド系ファミリーに属する分子クラスに対して特異的であるように開発できることを示す例であり、これは、関連する標的分子が同じ有害事象を誘発し得る場合に有利であり得、単一の標的として処理できる。しかしながら、この例は、NP-E2アプタマーコンジュゲートが、エストロゲンなどのステロイド系分子の特異的クラスを標的とするために生成され得ないことを意味するものではない。
【０１１６】
アデノシンの検出
E2アプタマーをNPとカップリングするのと同じプロトコル（上記）に従って、アデノシンアプタマー（Kim, J., Kim, I.Y., Choi, M.S., Wu, Q., Chem. Commun., 2009, 4747-9）を217NPとカップリングする。裸のNPは、-36.0から-40 mVへとゼータ電位の増加を示し、カップリングが成功していることが確認される。図9aに示すように、およそ10 nmの直径の増加がTRPSを用いて観察される。直径の増加は、図9bに示すように、粒子持続時間FWHMにおける変化と関連しない。理論に拘束されることを望むものではないが、後者は、立体障害作用（steric drag effect）と電気泳動移動度との間のバランスであり得ると仮定される。アデノシンは、アデノシンアプタマーを用いて、E2の検出に適用されたのと同じバッファー及びナノポア条件下、図9a及び9bに示すように、500 nM程度低いレベルにて検出することができる。アデノシンは、NP-アデノシンアプタマーコンジュゲートの減少（227から221 nmへ）、及び粒子パルス持続時間FWHMの増加（0.43から1 msへ）により検出される。
【０１１７】
サンプルのRPS分析のための一般的手順
表2に記載のサンプル溶液40 μLを、RPSの上部セルに入れ、一定の電圧及びナノポアサイズ下、500の遮断事象（blockade events）を記録する。BWB（本実施例において表3のサンプル溶液を作製するために使用される）は、10 mM NaCl、0.5 mM KCl、0.2 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2、5％ v/v EtOHを含む2 mM TRIS-HCl（pH 7.5）；1％ v/v IGEPALTM非イオン性界面活性剤からなる。
【０１１８】
サンプルのDLS分析のための一般的手順
DLSを介したサイズ測定のためのサンプルは、表3に詳述する100 μLのサンプル溶液を、同じバッファー（BWB）を用いて、全体積1 mLまでその後希釈することを除いて、RPSに関するものと同じ方法で調製する。
【０１１９】
PALSを介したζ電位測定のためのサンプルは、表3に詳述する100 μLのサンプル溶液を、脱イオン水を用いて、全体積1 mLまでその後希釈することを除いて、RPSに関するものと同じ方法で調製する。
【０１２０】
チューナブル抵抗パルスセンシング（TRPS）のための一般的手順
チューナブルポアメンブレン（サイズ表示NP200）をqNano装置にマウントする（ともにIzon Scienceから得られる）。メンブレンを、所望のポアサイズに達するまで伸ばし、このケースでは、装置の歯を46.11 mm離す。洗剤を有さない0.75 μLのBWBを下部フルイドセル（fluid cell）に入れ、0.1％ IGEPAL洗剤を有する40 μLのBWBを上部セルに入れる。BWB中のIGEPALの存在は、TRPSにおいてスムーズなNP-アプタマーの通過を促進する（図18を参照）。上部及び下部フルイドセルの電極間に0.26 Vの外部電圧を適用して、70±10 nAのバックグラウンド電流（I）を生じさせる。40 μLの試験サンプルを上部フルイドセルに入れ、いずれの気泡も存在しないことを確保する。少なくとも500の遮断事象を集め（通常、4〜7分間かかった）、Izon Scienceの専用の事象解析ソフトウェア（v. 2.2）を用いて分析する。適切な標準サンプル、典型的には直径217 nmのカルボキシル化ポリスチレンNPsを用いてキャリブレーション後、サイズを計算する。
【０１２１】
図19は、E2検出のTRPS方法が、非常にロバストで再現性があることを示しており、カルボキシル化NPsの官能化から開始して実施した3回の独立実験について、NP-アプタマーのサイズ及びパルス持続時間の測定値（FWHM）は、それぞれ5％未満及び20％未満の変動しか伴わない。図19はまた、NP-アプタマーのサイズとパルス持続時間測定値との間に存在する強い相関関係も説明し、ともに共通の原因（origin）を有することが確認される。5 nM程度低い濃度でE2を確実に検出することが可能である。図19はまた、交差反応性実験において、内分泌攪乱物質ビスフェノールA（BPA）に対して優れた識別も示す。NP-アプタマーのサイズ及びパルス持続時間はともに、50 nM BPAの存在によっては統計的に影響を受けない。
【０１２２】
蛍光のための一般的手順
CY5.5［（IUPAC名−1H-ベンズ[e]インドリウム, 2-[5-[3-[6-[（2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル）オキシ]-6-オキソヘキシル]-1,3-ジヒドロ-1,1-ジメチル-6,8-ジスルホ-2H-ベンズ[e]インドール-2-イリデン]-1,3 ペンタジエン-1-イル]-3-エチル-1,1-ジメチル-6,8-ジスルホ-, 内塩, ナトリウム塩（1：3））であって、アプタマーの3’末端の蛍光タグとして（参照：http://www.fluorophores.tugraz.at）］を用いた蛍光実験を、ストック溶液中異なる量のNPs（1.04×1010、2.08×1010、3.12×1010及び4.16×1010）を用いて実施し、蛍光タグ化アプタマー（F-アプタマー）を用いて、先に記載するカップリング反応を適用する。インキュベーション及び精製後、NP-アプタマーサンプルを500 μLのMESバッファーに懸濁し、上清溶液を1 mLまで補充する。検量線は、NPsからの散乱により生じる任意の干渉を説明するために、2.08×1010の粒子mL-1のカルボキシル化NPsを含む500 μLのMESバッファーサンプルで生成された異なるF-アプタマー濃度の蛍光強度を測定することにより確立される。スタンダードな1 cm経路長クオーツ蛍光セルを用いて、645 nmでの励起で、650〜800 nmの波長範囲にわたる発光スペクトルを測定する。665 nmのロングパスフィルターを用いて、散乱した励起光をブロックする。濃度を定量化するために700 nmでのピーク強度を使用する。蛍光実験は、Shimadzu RF-5301PC分光蛍光光度計を用いて実施する。励起及び発光スリット幅は、かかる希釈サンプル中の測定蛍光強度を高めるために、それぞれ、10 nm及び15 nmの分解能に設定する。
【０１２３】
図20は、複数の独立したNP数（1.04×1010、2.08×1010、3.12×1010及び4.16×1010）と、固定量（0.1 nmol）の蛍光タグ化アプタマー（F-アプタマー）との反応から生じるサンプルの蛍光測定値を示す。破線の円形データポイントは、コントロールサンプルの結果を表す：活性化剤（EDC/NHS）の不在下、2.08×1010のNPsの0.1 nmol F-アプタマーへの暴露。
【０１２４】
使用するNPsは、その表面にカルボキシル基を有し、製造者により決定されるように、1.04×1010の粒子数に対して5 nmolのカルボキシレートである。複数の量のNP（1.04×1010、2.08×1010、3.12×1010及び4.16×1010）を固定量のF-アプタマー（0.1 nmol）に暴露し、次いで、本明細書に記載するようにカップリングが終了した場合にNP-F-アプタマーコンジュゲートを混合物から分離し、NP-F-アプタマー及び上清サンプルの両方において、蛍光を測定する。
【０１２５】
図20に示すように、活性化剤（EDC/NHS）を伴わないNPs（2.08×1010）のF-アプタマーへの暴露はいずれの相互作用も生じなかったことから、蛍光測定値は、共有結合官能化に由来し、NP表面への非特異的付着ではない。図20に示すように、0.1 nmolのF-アプタマーは、2番目の量のNPs（2.08×1010）により完全に消費され、残りの量のNPsは、ほぼ同じ蛍光シグナルを生じた。これは、より低いNP濃度でも、NP表面を飽和するのに十分に高い数のF-アプタマー：NP比率を有する一方、アプタマーは、NP濃度が増加するにつれて、より低い密度でカップリングすることを示す。
【０１２６】
1.04×1010及び2.08×1010のサンプルの蛍光強度は、2.08×1010のNPsと混合した複数濃度のF-アプタマーから構築した標準検量線を用いて、nmolの濃度及び最終的には数に変換される。粒子あたりのF-アプタマー数は、1.04×1010及び2.08×1010の粒子並びにそれらの上清を含むサンプル中での測定値に対応して、それぞれ、2.66×103、2.6×103、1.7×103及び2.66×103であると分かる。全体的な平均F-アプタマー密度は、粒子あたり2.4×103であり（標準偏差0.4×103、n＝4）、各アプタマーについて25 nm2の自由空間を生じる。遠心分離プロセスの間に消失するNPsからおよそ11％の更なる不確実性が存在する。
【０１２７】
円二色性（Circular Dichromism）（CD）
Chirascan CDスペクトロメータ装置を用いて、CD技術によるコンフォメーション遷移研究を実施する。400 nMのE2アプタマー溶液（1 mL）をBWBで作製し、異なる濃度のE2（0、0.5、3.5及び6.5 μM）を独立して含める。スタンダードな1 cm経路長クオーツセルを用いて、200〜400 nmの波長範囲にわたってCDスペクトルを測定し、スキャニング速度は1分間あたり200 nmである。
【０１２８】
ドットブロッティング実験のための手順
ニトロセルロースメンブレンを乾燥前に10分間BWBに浸漬する。E2をエタノールに溶解し（例えば、エタノール1ミリリットルあたり50 mgのE2のストック溶液など）、メンブレン上にスポットし、次いで、ブロット（blotto）ブロッキング溶液中に室温で2時間浸漬する。ビオチン標識E2アプタマー（BWB中3.16 μM）を、異なる量のE2を含有するメンブレンとともに、ロッキングインキュベーター（15オシレーション／分）上、一晩、4℃で個別にインキュベートする。非特異的に結合したアプタマーは、メンブレンをBWBで3回すすぐ（ロッキングインキュベーター（40オシレーション／分）上で10分間）ことにより除去する。結合した基質-アプタマーコンジュゲートは、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート（BWB中167 ng/mL）とともにインキュベートすることにより、化学発光を用いて可視化する。インキュベーションは、室温で2時間放置する。BWBを用いてアプタマーの洗浄を繰り返して、メンブレン表面から非特異的に結合したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを除去する。可視化のための化学発光反応溶液（0.1 M Tris-HCl pH 8.5、25 μM ルミナール（luminal）、396 μM p-クマル酸、及び0.01％の過酸化水素（脱イオン化H2O中））を使用直前に準備する。メンブレンを化学発光溶液中、室温、暗所にて1分間インキュベートし、次いで、透明のプラスチックバッキングにすぐに入れ、透明のプラスチックラップを用いてラップし、X線カセットに入れる。X線フィルムをメンブレン上部に慎重に置き、15分間暴露する。フィルムは、GBX現像溶液中で3分間、2回浸し、浸漬（soaking）の間に脱イオン化H2Oですすぐことにより現像する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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