(57)【要約】  本発明は、医薬での使用のためのアルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法であって、a. アルミニウム塩調製物を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；b. エンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；およびc. エンドトキシンの量を測定するステップを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬での使用のための（特に、ワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法であって、以下のステップ：
a. アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
b. エンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；および
c. エンドトキシンの量を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
医薬での使用のための（特に、ワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法であって、以下のステップ：
a. アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
b. 該混合物を遠心分離し、それによりエンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；および
c. 上清のエンドトキシン含量を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３】
医薬での使用のための（特に、ワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法であって、以下のステップ：
a. アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
b. 該混合物を遠心分離し、それによりエンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；
c. パイロジェン不含容器に上清を移すステップ；および
d. 該上清のエンドトキシン含量を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
前記アルミニウム塩調製物と脱着バッファーとが、1：9〜9：1の比率で、例えば、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：2または8：2の比率で（特に、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3の間の比率で、特に4：6、5：5および6：4の比率で）混合される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
混合後かつ分離（特に、遠心分離）前に、混合物が（特に、撹拌を伴わずに）インキュベートされる（特に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24時間を超えて、特に、96時間または72時間未満、例えば、インキュベーション時間は1〜96時間、5〜72時間、10〜48時間、15〜36時間、または20〜28時間である）、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベーション（特に、リン酸アルミニウムのエンドトキシンを決定する方法での使用のための）が、室温（約22℃）で行なわれる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーション（特に、水酸化アルミニウムのエンドトキシンを決定する方法での使用のための）が、30℃超、35℃超、40℃超、45℃超、50℃超、55℃超、60℃超、65℃超で行なわれる、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、ステップ(a)に続いて、30秒間、40秒間、50秒間、1分間、1分30秒間または2分間を超えて、撹拌される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記脱着バッファーが、塩（特にNa2HPO4 [特に15〜20％]）および金属キレート剤（特にEDTA [特に、0.2〜0.3％]）を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱着バッファーがさらなる塩（特に、NaCl）を含む、（特に、水酸化アルミニウムのエンドトキシンを決定する方法での使用のための）請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脱着バッファー（特に、リン酸アルミニウムのエンドトキシンを決定する方法での使用のためのもの）がpH5.5以上のpH、例えば、約pH7〜pH9を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脱着バッファー（特に、水酸化アルミニウムのエンドトキシンを決定する方法での使用のためのもの）がpH9.5以上のpH、例えば、約pH9.5〜pH10.5を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脱着バッファーが、約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃の温度である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記脱着バッファーが、35℃超、40℃超、45℃超、50℃超、55℃超、60℃超または65℃超の温度である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脱着バッファーが、エンドトキシンを実質的に含まず、かつ/または無菌である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物が、100〜1500×gで遠心分離される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
エンドトキシン含量が、カブトガニ溶解物（Limulus Amebocyte Lysate）（LAL）アッセイにより（特に、速度論的発色法により）測定/定量される方法。
【請求項１８】
前記アルミニウム塩が、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはそれらの組み合わせである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法を含む、品質管理アッセイ。
【請求項２０】
アルミニウム塩のエンドトキシンを決定する方法での使用のための脱着バッファーを作製する方法であって、以下のステップ：
a. 塩基（特に、Na2HPO4）、金属キレート剤（特に、EDTA）および水を混合するステップ；任意により
b. 混合物を（特に、30秒間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15分間以上）撹拌するステップ；および、任意により
c. 該混合物を、5、10、15、20、25、または30分間以上インキュベートするステップ
を含む、上記方法。
【請求項２１】
アルミニウム塩のエンドトキシンを決定する方法での使用のための脱着バッファーを作製する方法であって、以下のステップ：
a. 塩、金属キレート剤および水を混合するステップ；任意により
b. 37℃±1℃でのインキュベーション時間と組み合わせて該混合物を撹拌するステップ（溶解させるため）；任意により
c. pHを固定するために酸または塩基を添加するステップ；任意により
d. 調製物の最終体積に達するために水を添加するステップ；および任意により
e. 37℃±1℃で保存するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２２】
ステップ(b)および/または(c)が1回、2回またはそれ以上繰り返される、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
水が実質的にエンドトキシンを含まない、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ(a)の水が、約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）まで予熱される、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
pHが7〜9、特に、約pH8または9.5〜10.5に調整される、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
前記バッファーが約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）であるときに、pHが調整される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
(d) 前記脱着バッファーを、約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）で保存するステップをさらに含む、請求項20〜26のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬での使用のための、特にワクチン中のアジュバントとしての使用のためのアルミニウム塩調製物中のエンドトキシン含量を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
パイロジェンまたはエンドトキシン（LAL）試験は、非経口薬に必要である。古典的エンドトキシンアッセイは、アルミニウム塩のエンドトキシン含量を試験するために用いることができない。製品に添加されたエンドトキシン対照は、アルミニウム塩と相互作用するその性質のために、回収されない。アッセイ有効性基準は、回収およびバルクアルミニウム濃縮物中の対照エンドトキシンを測定できる能力を必要とする。この相互作用を前提とすると、標準的なエンドトキシン試験はアルミニウム塩アジュバント中のエンドトキシン試験のために不適切であると一般的に考えられる。エンドトキシンを決定するために好適な唯一の試験は、ウサギにアルミニウム塩を注入することを含むウサギパイロジェン試験である。改良された方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、アルミニウム塩調製物中のエンドトキシンを正確に定量するための方法を提供する。本発明は、医薬での使用のための（特にワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
(b) エンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；および
(c) エンドトキシンの量を測定するステップ
を含む。
【０００４】
本発明はさらに、医薬での使用のための（特にワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法での使用のための脱着バッファーを作製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) 本明細書中で定義される通りの塩基、本明細書中で定義される通りの金属キレート剤および水を混合するステップ；任意により
(b) 該混合物を（特に30秒間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15分間以上）撹拌するステップ；および、任意により
(c) 該混合物を、5、10、15、20、25、または30分間以上インキュベートするステップ
を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、医薬での使用のための（特にワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
(b) エンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；および
(c) エンドトキシンの量を測定するステップ
を含む。
【０００６】
本発明は、医薬での使用のための（特にワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
(b) 該混合物を遠心分離し、それによりエンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；および
(c) 上清のエンドトキシン含量を測定するステップ
を含む。
【０００７】
本発明はさらに、医薬での使用のための（特にワクチン中のアジュバントとしての使用のための）アルミニウム塩調製物のエンドトキシン含量を決定する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) アルミニウム塩を脱着バッファーと混合し、それにより該アルミニウム塩からいかなるエンドトキシンも脱着させるステップ；
(b) 該混合物を遠心分離し、それによりエンドトキシンからアルミニウム塩を分離させるステップ；
(c) パイロジェン不含容器に上清を移すステップ；および
(d) 該上清のエンドトキシン含量を測定するステップ
を含む。
【０００８】
「エンドトキシン」との用語は、欧州薬局方5.1.10で定義されるもの、すなわち、エンドトキシンは、グラム陰性細菌由来のリポ多糖（LPS）および/またはリポオリゴ糖（LOS）であると考えられることを意味するために、本明細書中で用いられる。
【０００９】
混合ステップ後かつ分離/遠心分離ステップ前に、アルミニウム塩調製物および脱着バッファーを、アルミニウム塩に結合しているいかなるエンドトキシンも脱着されることを確実にするために、インキュベートすることができる。したがって、アルミニウム塩と脱着バッファーとの混合物が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24時間を超えて、インキュベートされる、本発明の方法が提供される。特定の実施形態では、インキュベーション時間は96時間または72時間未満であり、すなわち、インキュベーション時間は1〜96時間、5〜72時間、10〜48時間、15〜36時間、または20〜28時間である。特定の実施形態では、混合物は、インキュベーションステップ中に撹拌されない。
【００１０】
アルミニウム塩調製物と脱着バッファーとは、好適には、1：9〜9：1の比率で、例えば、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：2または8：2の比率で混合される。特定の実施形態では、アルミニウム塩調製物と脱着バッファーとは、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3の間の比率で、特に4：6、5：5および6：4の比率で混合される。
【００１１】
本発明の方法は、アルミニウム塩からのエンドトキシンの脱着を可能にするいずれかの温度で行なうことができる。好適には、前記インキュベーションが、10℃〜70℃、例えば、20℃〜65℃、20℃〜60℃、15℃〜30℃、17℃〜28℃、19℃〜26℃、21℃〜23℃、または約室温（約22℃）で行なわれる、本発明の方法が提供される。
【００１２】
本発明の方法は、脱着バッファーがアルミニウム組成物と混合されることを確実にするために、アルミニウム塩と脱着バッファーとの混合物を撹拌するステップを含むことができる。好適には、アルミニウム塩と脱着バッファーとの混合物が、ステップ(a)の後に30秒間、40秒間、50秒間、1分間、1分30秒間または2分間を超えて、撹拌される、本発明の方法が提供される。
【００１３】
エンドトキシンの脱着を促進するいずれかのバッファーを、本発明の方法で用いることができる。本方法での使用のために好適な脱着バッファーは、候補バッファーを、既知の量のエンドトキシン（例えば、20EU/mL）を含むアルミニウム塩に曝露し、室温で約24時間±4時間インキュベートし、10分間±1分間、10,000rpm±1000rpmで遠心分離し、続いて上清に対してLAL試験を行なうことにより決定することができる。エンドトキシンの50〜200％を脱着するバッファーが、好適な脱着バッファーであると見なされる。
【００１４】
前記脱着バッファーが塩および金属キレート剤を含む、本発明の方法が提供される。好適な塩は当業者に周知であり、限定するものではないが、Na2HPO4が挙げられる。Na2HPO4は典型的には15％〜25％、例えば約18％、例えば17.8％、EDTA 0.224％、pH8.0の量で用いられる。
【００１５】
特に本発明の方法が水酸化アルミニウムのエンドトキシン含量を決定するために用いられる一部の実施形態では、脱着バッファーは、さらなる塩、例えばNaClを含むことができる。NaClが用いられる場合、典型的には脱着バッファーは、5〜250mM NaClを含む。
【００１６】
好適な金属キレート剤は当業者に周知であり、限定するものではないが、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）が挙げられる。EDTAは、典型的には0.2〜0.3％、例えば、約0.22％、例えば、0.224％の量で用いられる。
【００１７】
脱着バッファーは、アルミニウム塩からのエンドトキシンの脱着を促進するいずれかのpHであり得る。一実施形態では、本発明の脱着バッファーは、特に脱着バッファーがリン酸アルミニウムからエンドトキシンを脱着するために用いられる場合、pH5.5超のpHを有する。該脱着バッファーが約pH7〜pH9である、本発明の方法が提供される。特定の実施形態では、約pH8（例えば、pH7.5〜8.5）である脱着バッファーが提供される。
【００１８】
一実施形態では、本発明の脱着バッファーは、特に脱着バッファーが水酸化アルミニウムからエンドトキシンを脱着するために用いられる場合、pH9.5超のpHを有する。該脱着バッファーが約pH9.5〜pH10.5である、本発明の方法が提供される。特定の実施形態では、約pH10.0である脱着バッファーが提供される。特定の実施形態では、pHはpH10.5未満である。
【００１９】
脱着バッファーは、特に濃縮物として、例えば1.5〜2倍濃縮物として保存される場合、該バッファーの成分のうちの1種以上の沈殿を防止するいずれかの温度であり得る。好適には、該脱着バッファーが約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃の温度で保存される、本発明の方法が提供される。
【００２０】
脱着バッファーは、理想的にはエンドトキシンを含まず、好適には、脱着バッファーがエンドトキシンを実質的に含まない、すなわち、当業者に公知のいずれの技術を用いてもエンドトキシンを検出することができない、本発明の方法が提供される。
【００２１】
エンドトキシン含量の試験を可能にするために、エンドトキシンは、アルミニウム塩から脱着され、好適には分離される。分離は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて行なうことができる。好適には、アルミニウム塩をペレット化し、かつ上清中にエンドトキシンを維持するために必要な力で混合物が遠心分離される、本発明の方法が提供される。特に、脱着バッファーとアルミニウム塩との混合物が、1000〜1500×g、例えばおおよそ1118×gで遠心分離される、本発明の方法が提供される。
【００２２】
脱着されたエンドトキシンの含量は、エンドトキシンを測定するために当業者に利用可能ないずれかの試験に従って測定することができる。特に、エンドトキシン含量が測定される、本発明の方法が提供される。特に、エンドトキシン含量が定量される、本発明の方法が提供される。当業者に利用可能かつ公知である方法としては、限定するものではないが、カブトガニ溶解物（Limulus Amebocyte Lysate）（LAL）アッセイ、単球活性化試験またはEndoLISA法が挙げられる。特に、エンドトキシンは、LALにより（特に、速度論的発色法により）、本発明の方法で定量される。
【００２３】
本発明の方法は、ワクチン中のアジュバントとしての使用のためのいずれかのアルミニウム塩のエンドトキシン含量を決定するために用いることができる。好適なアルミニウム塩アジュバントは当業者に周知であり、限定するものではないが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアルミニウム塩アジュバントとしては、限定するものではないが、REHYDRAGELTM HS、ALHYDROGELTM85、REHYDRAGELTM PM、REHYDRAGELTMAB、REHYDRAGELTM HPA、REHYDRAGELTMLV、ALHYDROGELTMまたはそれらの組み合わせが挙げられる。特に、本発明の方法は、ADJUPHOS、REHYDRAGELTM HS（3％水酸化アルミニウム水溶液 [General Chemical社]）またはALHYDROGELTM 85（Brenntag BioSector社 [Denmark]）のエンドトキシン含量を決定するために用いられる。
【００２４】
特に、本発明の方法は、2.5〜3.5、2.6〜3.4、2.7〜3.3または2.9〜3.2、2.5〜3.7、2.6〜3.6、2.7〜3.5、または2.8〜3.4タンパク質（BSA）/mLアルミニウム塩のタンパク質吸着能を有するアルミニウム塩のエンドトキシン含量を決定するために用いることができる。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法は、2.9〜3.2mg BSA/mgアルミニウム塩のタンパク質吸着能を有するアルミニウム塩のエンドトキシン含量を決定するために用いられる。アルミニウム塩のタンパク質吸着能は、当業者に公知のいずれかの手段により測定することができる。本発明の特定の実施形態では、アルミニウム塩のタンパク質吸着能は、国際公開第2012/136823号の実施例1に記載される方法（BSAを利用する）またはその変法を用いて測定される。
【００２５】
本発明の方法は、X線回折により測定した場合に2.8〜5.7nm、例えば、X線回折により測定した場合に2.9〜5.6nm、2.8〜3.5nm、2.9〜3.4nmまたは3.4〜5.6nmまたは3.3〜5.7nmの結晶サイズを有する、本明細書中に記載される（すなわち、本明細書中に記載されるタンパク質吸着能を有する）アルミニウム塩のエンドトキシン含量を決定するために用いられる。X線回折は当業者に周知である。本発明の特定の実施形態では、結晶サイズは、国際公開第2012/136823号の実施例1に記載される方法またはその変法を用いて測定される。
【００２６】
本発明の方法は、品質管理アッセイで特に有用である。「品質管理」アッセイとの用語は、品質管理（QC）が、製造される製品または実施される役務が、所定のセットの品質基準を順守するか、または製造業者の要件を満たすことを確実にすることが意図される手順または手順のセットであることを意味するために、本明細書中で用いられる。したがって、本発明の方法は、品質管理アッセイでの使用のために好適である。
【００２７】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される本発明の方法は、他のワクチン成分とのアルミニウム塩の製剤化前にアルミニウム塩調製物を試験するために用いられる。さらなる実施形態では、本明細書中に記載される本発明の方法は、他のワクチン成分（例えば、特定の抗原）とのアルミニウム塩の製剤化後にアルミニウム塩調製物を試験するために用いられる。さらなる実施形態では、本明細書中に記載される本発明の方法は、他のワクチン成分（例えば、抗原、特に本明細書中に記載されるもの）とのアルミニウム塩調製物の製剤化の前および後の両方に、エンドトキシン含量に関してアルミニウム塩調製物を試験するために用いられる。
【００２８】
本発明の方法は、以下のステップを含むことができる：アルミニウム塩のバルクからサンプルを抽出するステップ；本明細書中に定義される方法によりサンプルを試験するステップ；および続いて、サンプルが試験に合格する場合に、1種以上の抗原（特に、本明細書中に記載されるもの）を該アルミニウム塩に吸着させるステップ；および任意により1種以上のさらなる抗原（特に、本明細書中に記載されるもの）を該アルミニウム塩と組み合わせるステップ。
【００２９】
本発明のアルミニウム塩は、そのエンドトキシン含量を試験する前および/または後に、抗原と共に製剤化することができる。
【００３０】
本発明のアルミニウム塩と共に製剤化することができる抗原は、限定するものではないが、破傷風トキソイド（TT）、ジフテリアトキソイド（DT）、B型肝炎表面抗原、不活性化型ポリオウイルス（IPV）、パータクチン、線維状赤血球凝集素（FHA）、百日咳トキソイドおよび/またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）B型多糖（Hib） [特に、インフルエンザ菌B型由来のポリリボシルリビトールリン酸莢膜サッカリド（PRP））、ヒトパピローマウイルス（例えば、HPV 6、11.、16、18またはそれらの組み合わせ由来のウイルス様粒子）、キャリアタンパク質にコンジュゲート化された肺炎連鎖球菌由来の多糖、例えば、TT、DTおよび/またはCRM197が挙げられる。
【００３１】
破傷風トキソイド（TT）およびそれらの調製方法は、当技術分野で周知である。TTは、破傷風菌（Clostridium tetani）の培養物からの毒素の精製およびそれに続く化学的無毒化により生成することができるが、代替的には、毒素の組換え（または遺伝的無毒化型）アナログ（例えば、EP209281に記載される）の精製により作製される。無毒化の好適な方法は以下の通りである。発酵後、培養液を、ろ過助剤としてのDiatomiteの存在下で0.1〜0.3μmフィルターでろ過する。回収物を0.22μmフィルターを通して清浄化し、30kD平膜にて10倍体積のリン酸バッファー（20mM、pH7.3）に対して濃縮および透析ろ過する。透析ろ過した毒素を、続いて、以下の条件で37℃にて4週間、無毒化する：ホルムアルデヒド20mM、リジン3mM、リン酸カリウム100mM、当初pH7.3、500Lf/mL。得られたトキソイドを硫安分画により精製し、WFIに対して濃縮および透析ろ過（30kD）して硫酸アンモニウムを除去する。NaClを最終濃度0.9％まで添加し、pHを7.3に調整し、精製された破傷風トキソイドを滅菌ろ過する。
【００３２】
いずれかの好適な破傷風トキソイドを用いることができる。「破傷風トキソイド」は、全長タンパク質の免疫原性断片を包含する（例えば、C断片、EP478602を参照されたい）。
本発明の破傷風トキソイドは、典型的には、アルミニウム塩に吸着される。本発明の特定の実施形態では、アルミニウム塩は水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、本発明の破傷風トキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させることができる。さらなる実施形態では、破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着させることができる。
【００３３】
アルミニウム塩に対して破傷風トキソイドをはじめとするタンパク質を吸着させる方法は、当業者に周知である（例えば、ワクチン調製は、Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New Yorkに一般的に記載されている）。
【００３４】
ジフテリアトキソイド（DT）およびその調製方法は、十分に報告されている。いずれかの好適なジフテリアトキソイドを、エンドトキシン試験の後または前に、本明細書中に記載されるアルミニウム塩と共に製剤化することができる。例えば、DTは、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の培養物からの毒素の精製およびそれに続く化学的無毒化により生成することができるが、代替的には、毒素の組換え（または遺伝的無毒化型）アナログ（例えば、CRM197、または米国特許第4,709,017号、同第5,843,711号、同第5,601,827号、および同第5,917,017号に記載される通りの他の変異体）の精製により作製される。無毒化の好適な方法は以下の通りである。発酵後、ジフテリア毒素をTFF 0.45μmにより回収し、0.22μmフィルターを通して清浄化し、10kD平膜にて10倍体積のリン酸バッファー（20mM、pH7.2）に対して濃縮および透析ろ過する。透析ろ過した毒素を、続いて、以下の条件で37℃にて6週間、無毒化する：ホルムアルデヒド50mM、リジン25mM、リン酸カリウム50mM、当初pH7.2、300Lf/mL。得られたトキソイドを硫安分画により精製し、WFIに対して濃縮および透析ろ過（30kD）して硫酸アンモニウムを除去する。NaClを最終濃度0.9％まで添加し、pHを7.3に調整し、精製されたジフテリアトキソイドを滅菌ろ過する。
【００３５】
不活性化型ポリオワクチン（IPV）は、1型IPVもしくは2型IPVもしくは3型IPV、または1型および2型IPV、または1型および3型IPV、または2型および3型IPV、または1型、2型および3型IPVを含むことができる。
【００３６】
不活性化型ポリオウイルス（IPV）を調製する方法は、当技術分野で周知である。一実施形態では、IPVは、ワクチン分野で一般的な通りに1型、2型および3型を含むべきであり、かつホルムアルデヒドで不活性化されるソーク（Salk）ポリオワクチンであり得る（例えば、Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287；Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113；Salk et al., 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563；Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139；Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255を参照されたい）。あるいは、IPVは、Sabin株を用いて作製することができる（Sabin-IPV；Kersten at al. (1999), Vaccine 17:2059）。
【００３７】
一実施形態では、IPVは吸着されない（例えば、他の成分との混合前）。別の実施形態では、本発明のIPV成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させることができる（例えば、他の成分との混合前または後）。別の実施形態では、本発明のIPV成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着させることができる。さらなる実施形態では、IPV成分は水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着させることができる。吸着される場合、1種以上のIPV成分が別々に、または混合物として一緒に吸着されることができる。さらなる実施形態では、IPVは、本明細書中に記載される通りのアルミニウム塩/粒子に吸着される。
【００３８】
パータクチン（百日咳の69kDa抗原）は、熱安定性の外膜タンパク質であり、当技術分野で公知の方法により調製することができる（EP0162639参照）。任意により、パータクチンをアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態では、パータクチンを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態では、パータクチンを、本明細書中で記載される通りのアルミニウム塩に吸着させる。
【００３９】
線維状赤血球凝集素（FHA）は、当技術分野で周知の方法で調製することができる（国際公開第1990/013313号（米国特許第7479283号））に開示および言及される方法を参照されたい）。任意により、FHAをアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態では、FHAを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態では、FHAを、本明細書中で記載される通りのアルミニウム塩に吸着させる。
【００４０】
百日咳トキソイドを生成する方法は、当業者に周知である。百日咳毒素は、ホルムアルデヒド処理の周知の方法により、または突然変異（PT誘導体）により、無毒化することができる。該タンパク質のS1サブユニット内の残基の置換は、百日咳毒素の免疫学的特性および保護特性を保持するが、低下した毒性を有するかまたは毒性がないタンパク質を生じさせることが見出されている（EP322533）。EP322533の請求の範囲で論じられている無毒化突然変異は、本発明のPT無毒化型変異体の例である。任意により、百日咳トキソイドをアルミニウム塩粒子に吸着させる。本発明の一実施形態では、百日咳トキソイドを水酸化アルミニウムに吸着させる。本発明の特定の実施形態では、百日咳トキソイドを、本明細書中に記載される通りのアルミニウム塩に吸着させる。
【００４１】
インフルエンザ菌b型由来のポリリボシルリビトールリン酸莢膜サッカリド（PRP）は、キャリアタンパク質にコンジュゲート化することができる。サッカリドは、リボース、リビトールおよびホスフェートのポリマーである。Hib抗原を、任意により、国際公開第97/00697号に記載される通りにリン酸アルミニウムに吸着させることができ、または国際公開第02/00249号に記載される通りに吸着されていなくてもよく、または特別な吸着のプロセスを受けなくてもよい。
【００４２】
本明細書中で「アルミニウムアジュバント塩に吸着されていない」（「未吸着型」または「非吸着型」）抗原とは、例えば、新たなアルミニウムアジュバント塩への抗原の特別なまたは専用の吸着ステップが、組成物を製剤化するプロセスに含まれないことを意味する。
【００４３】
Hibは、いずれかのキャリアにコンジュゲート化することができ、該キャリアは、少なくとも1つのTヘルパーエピトープを提供することができ、かつ破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM-197（ジフテリア毒素変異体）または分類不可能なインフルエンザ菌由来のプロテインD（EP0594610）であり得る。
【００４４】
さらなる実施形態では、B型肝炎表面抗原を含む免疫原性組成物を製剤化するステップをさらに含む、本発明のプロセスが提供される。
【００４５】
B型肝炎表面抗原（HBsAg）の調製は、十分に報告されている。例えば、Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54:125；Gregg et al., 1987, Biotechnology 5:479；EP0226846；EP0299108を参照されたい。これは、以下の通りに調製することがきる。1つの方法は、多量のHBsAgがHBV感染中に肝臓で合成され、血流中に放出されるため、慢性B型肝炎キャリアの血漿から微粒子形状の抗原を精製することを含む。別の方法は、組換えDNA法によりタンパク質を発現させることを含む。HBsAgは、サッカロミセス・セレビジエ酵母、ピチア、昆虫細胞（例えば、Hi5）または哺乳動物細胞での発現により調製することができる。HBsAgをプラスミドに挿入することができ、かつプラスミドからのその発現を「GAPDH」プロモーター（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来）などのプロモーターにより制御することができる。酵母は、合成培地中で培養することができる。続いて、HBsAgを、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および限外ろ過などのステップを含むプロセスにより精製することができる。精製後、HBsAgを透析（例えば、システインを用いる）に供すことができる。HBsAgは、微粒子形状で用いることができる。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「B型肝炎表面抗原」または「HBsAg」との表現は、HBV表面抗原の抗原性を提示するいずれかのHBsAg抗原またはその断片を含む。HBsAg S抗原の226アミノ酸の配列（Tiollais et al., 1985, Nature 317:489およびその中の引用文献を参照されたい）に加えて、本明細書中で記載される場合のHBsAgは、所望であれば、上記の引用文献およびEP0278940に記載されるpre-S配列の全部または一部分を含むことができることが理解されるであろう。特に、HBsAgは、ad血清型のB型肝炎ウイルス上のオープンリーディングフレームに対してHBsAgのLタンパク質の残基133〜145およびそれに続く残基175〜400を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる（このポリペプチドは、L*と称される；EP0414374を参照されたい）。本発明の範囲内に入るHBsAgにはまた、EP0198474（Endotronics）に記載されるpreS1-preS2-SポリペプチドまたはEP0304578（McCormick and Jones）に記載されるものなどのそのアナログが含まれる。本明細書中で用いる場合、HBsAgはまた、変異体、例えば、国際公開第91/14703号または欧州特許出願公開第0511855号A1に記載される「エスケープ変異体」、特に145位でのアミノ酸置換がグリシンからアルギニンであるHBsAgも意味することができる。
【００４７】
HBsAgは粒子形状であり得る。粒子は、例えばSタンパク質のみを含むことができ、または複合粒子、例えばL*、S)であることができ、ここで、L*は上記で定義した通りであり、SはHBsAgのSタンパク質を示す。該粒子は、有利には酵母で発現される形態である。
【００４８】
一実施形態では、HBsAgは、ENGERIX BTM（GlaxoSmithKline Biologicals S.A.）で用いられる抗原であり、これは、国際公開第93/24148号でさらに説明されている。
【００４９】
B型肝炎表面抗原は、任意によりアルミニウム塩に、特にリン酸アルミニウムに吸着させることができ、これは、他の成分との混合の前に行なうことができる（国際公開第93/24148号に記載されている）。B型肝炎成分は、実質的にチオサーマル不含であるべきである（チオサーマルを含まないHBsAgの調製方法は、EP1307473にて以前に公開されている）。
【００５０】
本発明はさらに、アルミニウム塩のエンドトキシンを決定する方法での使用のための脱着バッファーを作製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) 本明細書中で定義される通りの1種以上の塩、本明細書中で定義される通りの金属キレート剤および水を混合するステップ；任意により
(b) 該混合物を（特に30秒間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15分間以上）撹拌するステップ；および、任意により
(c) 該混合物を、5、10、15、20、25、または30分間以上インキュベートするステップ
を含む。
【００５１】
本発明はさらに、アルミニウム塩のエンドトキシンを決定する方法での使用のための脱着バッファーを作製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) 塩、金属キレート剤および水を混合するステップ；任意により
(b) 37℃±1℃でのインキュベーション時間と組み合わせて該混合物を撹拌するステップ（溶解させるため）；および任意により
(c) pHを固定するために酸または塩基を添加するステップ；
(d) 調製物の最終体積に達するために水を添加するステップ；任意により
(e) 37℃±1℃で保存するステップ
を含む。
【００５２】
ステップ(a)および(b)は2回以上行なうことができ、ステップ(b)および/または(c)が1回、2回またはそれ以上繰り返される、本明細書中で定義される通りの脱着バッファーを作製する方法が提供される。
【００５３】
水が実質的にエンドトキシン不含である、定義される通りの脱着バッファーを作製する方法が提供される。
【００５４】
ステップ(a)の水が約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）まで予熱される、定義される通りの脱着バッファーを作製する方法が提供される。
【００５５】
pHが7〜9、特に約pH8に調整される、定義される通りの脱着バッファーを作製する方法が提供される。アルミニウム塩からエンドトキシンを脱着させる脱着バッファーの能力に影響を与えずに、そのpHに調整するために任意の酸を用いることができる。特に、本明細書中に記載される脱着バッファーの製造にてpHを調整するために、HClを用いることができる。特に、バッファーが約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）であるときに、pHが調整される。アルミニウム塩からエンドトキシンを脱着させる脱着バッファーの能力に影響を与えずに、そのpHに調整するために任意の好適な塩基または酸を用いることができる。
【００５６】
(d)約30℃〜45℃、35℃〜40℃、36℃〜38℃、または約37℃（±1℃）で脱着バッファーを保存するステップをさらに含む、本明細書中に定義される通りの脱着バッファーを作製する方法が提供される。
【００５７】
「含むこと」（comprising）、「含む」（comprise）および「含む」（comprises）との用語は、いずれの場合でも、それぞれ、「からなること」（consisting of）、「からなる」（consist of）および「からなる」（consists of）との用語と任意により置換可能であることが、本発明者らにより意図される。
【００５８】
本明細書中で用いられる「約」との用語は、±10％の量を意味するものと意図される。
【実施例】
【００５９】
1. 脱着バッファーの調製：
100mLの脱着バッファーを作製するために、17.8gのNa2HPO4、0.224gのEDTAおよび90mLのパイロジェン不含水（可能であれば、37℃のインキュベーターで予熱される）を、250mLのNuncパイロジェン不含容器に入れた。
【００６０】
撹拌テーブル上で15分間撹拌し、37℃±1℃にてインキュベーター中で30分間加熱し、かつ完全に溶解するまで撹拌および加熱を繰り返すことにより、塩およびEDTAを溶解させた。
【００６１】
pHを調整するために、3mLのHCl 1Nを添加し、pHを測定し、必要であればHCl 1Nを用いてpH8.0まで調整する。体積を、パイロジェン不含水を用いて最大100mLにする。エンドトキシンの非存在を、1/100希釈にてLAL分析により決定した。脱着バッファーは、37℃±1℃にて保存した。
【００６２】
2. エンドトキシンの決定：
アルミニウムサンプル（4mL）のエンドトキシン含量を決定するために、脱着バッファー（6mL）をアルミニウム塩サンプルに添加した。混合物を1分間撹拌し、続いて24時間、室温でインキュベートした。
【００６３】
インキュベーション後、チューブを5回上下に転倒させることにより、混合物をゆっくりと振盪する。サンプル（1.5mL）を取り出し、2mLエッペンドルフチューブに移す。混合物を10,000rpmにて10分間遠心分離した。次に、上清をパイロジェン不含チューブに移した。続いて、1/50希釈にて速度論的発色法によりLALを用いて、エンドトキシン含量を定量した。
【国際調査報告】
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