(57)【要約】  活性化Ｂ細胞により産生された新規サイトカインであるＩＬ４０を含む組成物及び方法が提供される。本組成物としては、以下が挙げられる：ａ）抗−ＩＬ４０抗体、ＩＬ４０ペプチド及びＩＬ４０タンパク質；ｂ）ＩＬ４０遺伝子及びｃＤＮＡ配列をコードする核酸；及びｃ）これらの医薬組成物。本方法としては、治療法、診断法及び単離法が挙げられる。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ１７ｏｒｆ９９ポリペプチド遺伝子産物（ＩＬ４０）に対する抗体であって、
ａ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ；
ｂ）モノクローナル抗体；
ｃ）Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）；
ｄ）標識抗体；
ｅ）中和抗体；または
ｆ）ａ）〜ｅ）の任意の組み合わせである、
前記抗体。
【請求項２】
サンプル中のＩＬ４０の検出方法であって、
免疫検出方法において、検出剤として請求項１に記載の前記抗体を用いてＩＬ４０を免疫検出することを含む前記方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記免疫検出法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、組織学的方法、蛍光活性化細胞選別、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量分析法、免疫組織化学的方法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法、ウエスタンブロッティング法またはドットブロッティング法である、前記方法。
【請求項４】
ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１の抗体を投与して、ＩＬ４０を中和させることを含む前記方法。
【請求項５】
前記疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ４０が関与する疾患のための診断法またはセラノスティクス法（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）において検出剤として請求項１の前記抗体を用いて、ＩＬ４０を免疫検出することを含む、サンプル中のＩＬ４０検出方法。
【請求項７】
前記疾患は、リンパ腫、白血病、免疫不全または自己免疫疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬であり、前記免疫不全はＩｇＡ欠損症候群である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ４０の前記アミノ酸配列の一部若しくは全部、またはＩＬ４０の成熟形態を含むペプチド若しくは単離タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のペプチドであって、
ａ）ＩＬ４０の配列変異型、多形体または種対応物；
ｂ）ＩＬ４０の置換変異型、挿入変異型または欠失変異型；
ｃ）以下からなる群から選択されるＩＬ４０の非配列誘導体；
グリコシル化修飾ＩＬ４０、化学修飾ＩＬ４０及びＩＬ４０抱合体；
ｄ）ＩＬ４０の機能的変異型：
ｅ）ＩＬ４０の機能的セグメント、ＩＬ４０の保存領域、またはＩＬ４０の非保存領域；
ｆ）ＩＬ４０の融合タンパク質；または
ｇ）ａ）〜ｆ）の任意の組み合わせである、
前記ペプチドまたはタンパク質。
【請求項１１】
ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、
請求項９または請求項１０に記載の治療有効量の前記ペプチドまたはタンパク質を前記対象へ投与することを含み、前記ペプチドまたはタンパク質はＩＬ４０アンタゴニストである、前記方法。
【請求項１２】
前記疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、
治療有効量のＩＬ４０または請求項９または請求項１０に記載の前記ペプチドまたはタンパク質を前記対象へ投与することを含み、前記ペプチドまたはタンパク質はＩＬ４０アゴニストである、前記方法。
【請求項１４】
前記疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫,菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ４０の関与する疾患の診断法であって、診断／セラノスティクス法において標的またはサンプル対照として請求項９または請求項１０に記載の前記ペプチドまたはタンパク質を使用することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記疾患は、リンパ腫、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ４０を発現する細胞のサブセットの精製方法または単離方法であって、精製剤／単離剤として請求項１に記載の抗体を用いて、前記細胞のサブセットを精製または単離することを含む方法。
【請求項１８】
前記サブセットは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により精製または単離され、前記細胞サブセットを選択する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、ハイブリドーマ、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である、請求項１の抗体を産生する細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の前記細胞を含む動物。
【請求項２１】
前記機能的変異型はＩＬ４０のアゴニスト若しくはアンタゴニストであり、前記融合タンパク質は、共有結合構造体若しくは非共有結合構造体または標識構造体である、請求項１０に記載のペプチドまたはタンパク質。
【請求項２２】
免疫細胞の誘導方法であって、ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ２及び／若しくはＢ細胞によって産生される他のＩＬ４０誘導タンパク質を産生するため、または前記免疫細胞の分化または成熟を誘発するために活性剤として請求項９または請求項１０に記載の前記ペプチドまたはタンパク質を使用することを含む、前記方法。
【請求項２３】
ＩＬ４０受容体を同定する方法であって、前記ＩＬ４０受容体に結合するためのリガンドとして請求項９または請求項１０に記載の前記ペプチドまたはタンパク質を使用することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記細胞は、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である、請求項９または請求項１０に記載のペプチドまたはタンパク質を産生する細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の細胞を含む動物。
【請求項２６】
ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部または全体を含む、核酸。
【請求項２７】
ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部または全体を含む核酸であって、請求項９に記載のペプチドまたはタンパク質をコードする、前記核酸。
【請求項２８】
請求項２６または請求項２７に記載の核酸であって、
ａ）別のヌクレオチド配列、標識または化学的誘導体に共役結合される；
ｂ）プライマー、プローブ、アンチセンス分子、またはＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡ配列をベースとしたオリゴヌクレオチドである；
ｃ）異種核酸配列に付着した組換え型構造体である；または
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の組み合わせである；
前記核酸。
【請求項２９】
前記異種核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、ベクターまたは発現ベクターである、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、前記対象に治療有効量の請求項２６または請求項２７に記載の核酸を投与することを含み、前記核酸によりＩＬ４０の発現が減少する、前記方法。
【請求項３１】
前記疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、前記対象に治療有効量の請求項２６または請求項２７に記載の核酸を投与することを含み、前記核酸によりＩＬ４０の発現が増加する、前記方法。
【請求項３３】
前記疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸はＲＮＡｉ分子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ＩＬ４０の関与する疾患の診断法であって、前記疾患の診断／セラノスティクス法においてプローブとして請求項２６または請求項２７に記載の核酸を使用することによってサンプルをプローブすることを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記疾患は、リンパ腫、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である、請求項２６または請求項２７に記載の核酸の組換え型形態を含む細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載の細胞を含む動物。
【請求項３９】
ＩＬ４０を発現する細胞のサブセットの選択方法であって、
ＩＬ４０を発現する細胞を含む細胞集団にＩＬ４０を結合させる分子を添加することと、
選択された細胞の集団を提供するために前記ＩＬ４０結合分子により標識された細胞を選択することとを含む、前記方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、
ａ）前記ＩＬ４０発現細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞である；
ｂ）前記ＩＬ４０結合分子は、抗−ＩＬ４０抗体またはＩＬ４０受容体である；
ｃ）前記選択細胞は、血液、体液、細胞懸濁液または患者サンプルから選択される；
ｄ）前記選択細胞は、ＩＬ４０発現細胞を調べるための調査ツールである；
ｅ）前記選択細胞は血球であり、また
ｉ）前記選択細胞により作製された免疫グロブリンのｍＲＮＡ供給源；
ｉｉ）完全ヒト化抗体の新規作製方法の供給源であり；
または
ｆ）ａ）〜ｅ）のいずれかの組み合わせ、である前記方法。
【請求項４１】
それを必要とする対象において、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法であって、
治療有効量の請求項３９に記載の選択細胞を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
対象中での活性化Ｂ細胞の検出方法であって、前記対象中での前記ＩＬ４０濃度を測定することを含み、ＩＬ４０濃度が対照よりも上昇する場合には、活性化Ｂ細胞が示唆される、前記方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
ａ）前記ＩＬ４０濃度は、免疫検出技術により測定される；
ｂ）前記方法は更に、別のバイオマーカーを測定することを含む；
ｃ）前記方法により、自己免疫疾患またはリンパ腫の診断を必要とする前記対象において、自己免疫疾患またはリンパ腫を診断し、前記濃度の上昇により、リンパ腫または自己免疫疾患が示唆される；
ｄ）前記ＩＬ４０濃度の上昇により、リンパ腫または自己免疫疾患のＩＬ４０産生サブタイプを決定する；または
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかを組み合わせたものである、前記方法。
【請求項４５】
前記免疫検出方法はＥＬＩＳＡ法、組織学的方法、蛍光活性化細胞選別、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量分析法、免疫組織化学的方法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法、ウエスタンブロッティング法またはドットブロッティング法である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
リンパ腫または自己免疫疾患の治療を必要とする対象において、リンパ腫または自己免疫疾患の治療方法であって、前記対象、または前記対象の腫瘍、組織若しくは細胞に治療有効量の請求項１に記載の抗体、または請求項２６若しくは請求項２７に記載の核酸を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記抗体は中和抗体であり、また前記核酸はアンチセンスＲＮＡである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンチセンスＲＮＡはＲＮＡｉ分子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象におけるＩＬ４０産生細胞の同定方法であって、請求項１に記載の抗体、または請求項２６若しくは請求項２７に記載の核酸をプローブとして使用し、前記細胞を同定することを含む、前記方法。
【請求項５０】
前記方法は、免疫組織化学的方法またはインサイチュハイブリダイゼーションを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＩＬ４０受容体の同定方法であって、
ａ）ＩＬ４０、標識ＩＬ４０、Ｈｉｓ−タグＩＬ４０、またはこれらの組み合わせによりＩＬ４０応答細胞の標識を行うこと、及び前記標識細胞の単離、精製及び／または分離を行うこと；
ｂ）ＩＬ４０、標識ＩＬ４０、Ｈｉｓ−タグＩＬ４０、またはこれらの組み合わせによりＩＬ４０応答細胞の標識を行うこと、及び前記標識細胞の単離、精製及び／または分離を行うことを含み、前記細胞は前記ＩＬ４０受容体を発現する真核またはバクテリア細胞である；
ｃ）酵母２ハイブリッド系においてＩＬ４０に結合するタンパク質を同定すること；または
ｄ）前記ＩＬ４０受容体発現細胞由来のメンブレン調製からのＩＬ４０結合タンパク質を免疫沈降させること、を含む前記方法。
【請求項５２】
ａ）インビトロまたはインビボにおいてＢ細胞の成長及び分化を促進する；
ｂ）ハイブリドーマ培養物の成長を増大させる；
ｃ）ハイブリドーマ培養物による抗体生成物を増加させる；または
ｄ）異なる哺乳類種由来のＩＬ４０を使用することにより、組織または細胞の種発生源を決定する；
ように免疫細胞をＩＬ４０またはその機能的変異型に曝露することを含むＩＬ４０の使用方法。
【請求項５３】
前記哺乳類種は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギまたはヒツジである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
自己免疫、自己免疫疾患またはリンパ腫に関与する請求項１〜５３のいずれか一項に記載の主題であって、
前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、乾癬、グレーブス病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、またはシェーグレン症候群であり、
前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉腫、または多発性骨髄腫である、主題。
【請求項５５】
前記抗体、ペプチド、タンパク質または核酸を局所的または全身に送達する、治療することまたは治療を含む請求項１〜５３のいずれか一項に記載の主題。
【請求項５６】
診断法、診断、診断するまたは診断法／セラノスティクス法を含み、
前記方法をサンプル上で実施する、
請求項１〜５３のいずれか一項に記載の主題。
【請求項５７】
前記サンプルは血清、血液、体液、腫瘍、組織、または細胞である請求項５６に記載の主題。
【請求項５８】
抗体、ペプチド、タンパク質または核酸分子を含み、前記分子は、
ａ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤またはそれらを組み合わせたものを含む；
ｂ）滅菌配合物として使用される；
ｃ）自己免疫疾患またはリンパ腫を治療するための別の治療薬を含む；
ｄ）緩効性または徐放性製剤である；
ｅ）標的投与形態である；
ｆ）ａ）〜ｅ）のいずれかの組み合わせである、
製剤処方である請求項１〜５３のいずれか一項に記載の主題。
【請求項５９】
前記緩効性製剤または徐放製剤は、エマルションまたはミセルを含み、前記標的投与形態は、リポソーム、包接錯体または担体である、請求項５８に記載の主題。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究開発に関する記載事項
本発明は、米国国立保健研究所の認可番号第ＡＩ０９６２７８号において、政府支援の下でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月２０日に出願された、米国特許仮出願第６１／９０６，８５５号の優先権を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は、ＩＬ４０と称される新規サイトカインが関与する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術
サイトカインは、免疫系を調節する低分子分泌タンパク質である。これらのタンパク質は、分類及び応答の大きさなど、免疫応答を調節する非常に重要な媒介物質である。例えば、インターロイキン、ケモカイン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー及びインターフェロンが挙げられる。これらの多くは、現在、免疫療法として調査されている。これらは、自己免疫疾患、癌及び他の疾患に関与している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、本明細書において、インターロイキン４０（ＩＬ４０またはＩＬ−４０）と称される新規サイトカインの同定に関与する。この分子は、活性化Ｂ細胞により作製された低分子分泌タンパク質である。このため、この分子は活性化Ｂ細胞のバイオマーカーである。また、全身性エリテマトーデスなどの特定の疾患では上方制御されている。Ｂ細胞はリンパ腫及び自己免疫疾患に結合することから、ＩＬ４０がこれらの疾患の病理学における役割を果たし、診断または予後のバイオマーカーとなることが期待される。また、この細胞は、これらの癌の発現に影響を及ぼすか、またはアポトーシスに対する耐性、これらの成長の促進若しくはこれらの分化の支持を付与することにより、リンパ腫の発現に影響を及ぼす。自己免疫では、病原体Ｂ細胞により作製されたＩＬ４０は、他の細胞に影響を及ぼすものとし、これらの状態と関連する炎症反応を支持している。その受容体を同定するために、ＩＬ４０の使用方法が意図される。その特定の受容体の同定は、リガンド及びその受容体の利用率を用いて上述の適応症において使用され得るこの相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストを同定することができるため、重要である。
【０００６】
一態様では、Ｃ１７ｏｒｆ９９ポリペプチド遺伝子産物（ＩＬ４０）に対する抗体が提供される。抗−ＩＬ４０抗体は、以下であってもよい
；
ａ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ；
ｂ）モノクローナル抗体；
ｃ）Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）；
ｄ）標識抗体；
ｅ）中和抗体；または
ｆ）ａ）〜ｅ）の任意の組み合わせ。
【０００７】
別の態様では、抗−ＩＬ４０抗体の使用方法が提供される。本方法では、例えば次の方法において抗−ＩＬ４０抗体を使用することができる。
ａ）サンプル中でのＩＬ４０の検出方法。本方法としては、
免疫検出方法において、ＩＬ４０を検出するための検出剤として抗体を使用してＩＬ４０を免疫検出することが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫検出法は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、組織学的方法、蛍光活性化細胞選別、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量分析法、免疫組織化学的方法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法、ウエスタンブロッティング法またはドットブロッティング法である。ＥＬＩＳＡ法では、所定のタンパク質の２つの異なる工ピトーを認識する２つの異なる抗体を使用して、比色分析法において抗体の１つに結合される基質の検出を介してタンパク質を検出することができる。組織学的方法では、標識抗体を使用して、新鮮凍結組織、またはホルマリン固定パラフィン包埋サンプルのいずれかにおいて、組織サンプル中でタンパク質を検出することができる。蛍光活性化細胞選別では、蛍光色素標識抗体を使用して、特定のタンパク質を発現させる細胞を検出することができる。分泌タンパク質の場合、当業者に既知の手技により、該タンパク質の細胞内染色が可能である利用可能な技術が存在する。ラジオイムノアッセイでは、放射性標識タンパク質を使用して、競合法中に存在する放射活性量を測定することによって（例えば、特定の抗体を使用することにより）、所与のサンプル中に存在するタンパク質の量を測定することができる。これらの分析法の変異型としては、抗体／標識化合物を使用して、特定の抗体の親和性／結合活性に依存する競合法を介して所定のサンプル中における特定のタンパク質の量を測定することを伴う。ウエスタンブロッティング法では、ゲルの移動後に特定の抗体を使用することにより所与のタンパク質を検出することができ、この方法では、技術者は検出されるタンパク質の分子量を知ることもできる。
ｂ）ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法。この方法は、治療有効量の抗−ＩＬ４０抗体を対象へ投与し、ＩＬ４０を中和することを含む。いくつかの実施形態では、本疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である。
ｃ）サンプル中でのＩＬ４０の検出方法。本方法としは、ＩＬ４０が関与する疾患のための診断法またはセラノスティクス法（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）において検出剤として抗−ＩＬ４０抗体を使用してＩＬ４０を免疫検出することが挙げられる。抗体の使用をベースにして、生理液中での可溶性タンパク質の存在を検出するために利用可能な多くの方法がある。最も一般的なものとしては、ＩＬ４０の異なる工ピトープを認識する２つの異なる抗体を使用する酵素関連イムノアッセイである。そのうちの１つを生理液を配置するプレート中での捕捉抗体として使用する。この抗体をプレートに固着させて、液体内に存在するＩＬ４０を「捕捉」する。二次抗体は酵素に結合する。最終的に、基質を使用して、酵素により処理し、典型的には、ＥＬＩＳＡリーダーで検出され得る所与の色を発現させる。他の方法としては、酵素基質の代わりに放射能を使用して、所与の液体中に存在するＩＬ４０の量を測定するラジオイムノアッセイが挙げられる。本液体は、異なる疾患を有する患者から得ることができる。典型的には、活性化Ｂ細胞は、さまざまな癌（リンパ腫，白血病）または炎症若しくは自己免疫疾患（リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、乾癬、その他のもの）の病原体において任意の役割を担っていることが判明した。いくつかの実施形態では、本疾患は、リンパ腫、白血病、免疫不全または自己免疫疾患である。特定の実施形態では、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬であり、免疫不全はＩｇＡ欠損症候群である。
ｄ）ＩＬ４０が発現する細胞のサブセットの精製方法または単離方法。本方法には、細胞のサブセットを精製するまたは単離するために、精製剤／単離剤として抗−ＩＬ４０抗体を使用することを含む。抗体は、ハイブリドーマ培養から精製することができる。典型的には、最初に０．４５ｍｍフィルターを介して上清を濾過し、細胞片を除去する。好ましい方法としては、タンパク質Ａ／Ｇクロマトグラフィーを含む。濾過したハイブリドーマ培養をＡ／Ｇタンパク質カラムに入れ、ｐＨが変化することによって破断され、カラムから精製抗体が溶出する可能性がある結合基において、抗体分子がＡ／Ｇタンパク質に結合することになる。次に精製抗体をさまざまな蛍光色素により標識し、その後、蛍光活性化セルソーターにおいて分析することができる細胞懸濁液の染色に使用することができる。この手技により、抗体によって認識される抗原を発現する細胞サブセットを同定することとなり得る。いくつかの実施形態では、サブセットは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により精製または単離され、細胞サブセットを選択する。
【０００８】
更なる態様では、抗−ＩＬ４０抗体を産生する細胞が提供され、本細胞は、ハイブリドーマ、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である。本細胞は、本明細書に記載のいずれかの抗−ＩＬ４０抗体を産生し得る。また、細胞を含む臓器、組織、または動物が提供される。
【０００９】
別の態様では、ＩＬ４０のアミノ酸配列の一部またはすべてを含むペプチドまたは単離タンパク質、若しくはＩＬ４０の成熟形態を含むペプチドまたは単離タンパク質が提供される。ＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質は、以下であり得る。
ａ）ＩＬ４０の配列変異型、多形体または種対応物；
ｂ）ＩＬ４０の置換変異型、挿入変異型または欠失変異型；
ｃ）グリコシル化修飾ＩＬ４０、化学修飾ＩＬ４０及びＩＬ４０抱合体からなる群から選択されるＩＬ４０の非配列誘導体；
ｄ）ＩＬ４０の機能的変異体；
ｅ）ＩＬ４０の機能的活性セグメント、ＩＬ４０の保存領域、またはＩＬ４０の非保存領域；
ｆ）ＩＬ４０の融合タンパク質；または
ｇ）ａ）〜ｆ）の任意の組み合わせ。
【００１０】
いくつかの実施形態では、機能的変異型はＩＬ４０のアゴニスト若しくはアンタゴニストであり、融合タンパク質は、共有結合生成物若しくは非共有結合構造体または標識構造体である。
【００１１】
ＩＬ４０は、一般に、リンパ球及び白血球の特定の集団中に存在し得る特定の受容体に結合されるものとする。受容体を同定するために、本明細書に記載のとおりＩＬ４０が標識（ＦＬＡＧ若しくはＨＩＳ−タグ）または放射能のいずれかで標識される方法を使用することができる。アミノ酸基を用いた標識（ＦＬＡＧまたはＨＩＳ−タグ）で標識した場合、第２の抗ＦＬＡＧまたは蛍光色素で標識した抗−ＨＩＳ抗体を用いることによって、ＩＬ４０がその受容体と上手く結合しているところを検出することができ、また、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で検出することができる。放射能で標識した場合、結合は、受容体を発現させる細胞に結合させている放射活性計数を測定することによって監視することができる。ＩＬ４０の生物活性は、さまざまな白血球集団中において（例えば、表５に列挙した集団を参照のこと）発現がＩＬ４０によって調節される遺伝子の発現を測定することによって監視し得る。白血球（例えば脾細胞）は、ｍＲＮＡを細胞から調製する前にインビトロにおいてＩＬ４０の存在下で６時間培養することができ、かつ、リアルタイムＰＣＲでこれらの遺伝子の発現を測定するために使用することができる。インビボでは、ＩｇＡの最適な生成にＩＬ４０が必須である。このため、インビボでは、ＩＬ４０アンタゴニストをマウスに投与し、さまざまな時間間隔でその後の血清または血漿中のＩｇＡ濃度を測定することによって、ＩＬ４０アンタゴニストの活性を監視することができる。逆に、インビボでは、ＩＬ４０−／−マウスに投与し、さまざまな時間間隔で血清または血漿中のＩｇＡ濃度を測定することによって、ＩＬ４０アンタゴニストの活性を測定することができる。奏功するＩＬ４０アゴニストにより、ＩＬ４０−／−の突然変異によって誘発されたＩｇＡの欠損を補正することができるものとし、このため、ＩｇＡ濃度は、正常なマウスのＩｇＡ濃度まで上昇するものとする。
【００１２】
また、ＩＬ４０融合タンパク質を使用して、インビボまたはインビトロでのＩＬ４０活性を監視するか、またはインビボでの未変性ＩＬ４０の薬物速度を変動させることができる。融合タンパク質の例としては、これらに限定されないが、融合によりＩＬ４０−Ｆｃ融合タンパク質となるような免疫グロブリン重鎖に結合するものが挙げられる。この融合タンパク質は、多くの白血球集団中に存在するＦｃ受容体に結合することができることによって、インビボにおいて更に安定し得るか、または所望の結合特性を示し得る。このため、リンパ系組織に対して融合タンパク質の選択的局在がもたらされ得る。別の方法としては、ＩＬ４０を使用して、Ｂ細胞に優先的に結合する他のサイトカインまたはケモカインとの融合タンパク質を産生し得る。例えば、ＩＬ４０は、Ｂ細胞及びＴ細胞の双方のサブセット中に存在するＩＬ４受容体と結合するＩＬ４サイトカインのこれらの一部をコードするインターロイキン４（ＩＬ４）遺伝子の一部に融合し得る。別の方法としては、ＩＬ４０は、ＣＸＣＲ５に結合するケモカインであるＣＸＣＬ１３に融合させることができ、受容体もＢ細胞中に優先的に発現する。これらの融合タンパク質が、Ｂリンパ球の生物学的応答またはヒトの体内でのそれらのホーミングパターンを向上させるか、または変化させ得る所望の生物学的性質を示す場合もある。
【００１３】
ＩＬ４０は、放射能（アミノ酸または原子）により、または少量のアミノ酸をその配列に添加することによって標識させ得る。これまでに使用された二つ共通の標識としては、ＨＩＳ−タグ及びＦＬＡＧが挙げられる。後者は、速やかに利用可能であり、それらのエピトープを認識し、このため、標識を付着させたときに標識ＩＬ４０の検出に使用することができる商業用モノクローナル抗体であるという利点を有する。
【００１４】
更なる態様では、ＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質の使用方法が提供される。本方法では、ペプチドまたはタンパク質を使用することができる。例えば：
ａ）免疫細胞の誘導方法。本方法は、免疫細胞を誘導して、ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ２及び／若しくはＢ細胞によって産生される他のＩＬ４０誘導タンパク質を産生するため、または免疫細胞の分化または成熟を誘発するために活性剤としてペプチドまたはタンパク質を使用することを含む。細胞は、２４時間インビトロで、組織培養培地、典型的には、ＲＰＭＩ１６４０若しくはＤＭＥＭ若しくはウシ胎児血清、グルタミン及びメルカプトエタノールを補足した類似の培地を用いて、ＩＬ４０と共にインキュベートすることができる（さまざまな濃度にて）。
ｂ）ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法。本方法は、治療有効量のペプチドまたはタンパク質を対象へ投与することを含み、このペプチドまたはタンパク質はＩＬ４０アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、本疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である。
ｃ）ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法。本方法は、治療有効量のＩＬ４０またはペプチド若しくはタンパク質を対象へ投与することを含み、このペプチドまたはタンパク質はＩＬ４０アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である。
ｄ）ＩＬ４０が関与する疾患の診断方法。本方法としては、診断法／セラノスティクス法において、標的またはサンプル対照としてペプチドまたはタンパク質を使用することを含む。抗体の使用をベースにして、唾液、血清、血漿精液、気管支肺胞洗浄液体、尿、涙、リンパ液、汗、胆汁、脳脊髄液などの生理液中での可溶性タンパク質の存在を検出するために利用可能な多くの方法がある。最も一般的な方法としては、ＩＬ４０の異なる工ピトープを認識する２つの異なる抗体を使用する酵素結合（ＥＬＩＳＡ）免疫吸着法である。そのうちの１つを生理液を配置するプレート中での捕捉抗体として使用する。この抗体をプレートに固着させて、液体内に存在するＩＬ４０を「捕捉」する。二次抗体は酵素に結合する。最終的に、基質を使用して、酵素により処理し、典型的には、専用ＥＬＩＳＡリーダーで検出され得る所与の色を発現させる。他の方法としては、酵素基質の代わりに放射能を使用して、所与の液体中に存在するＩＬ４０の量を測定するラジオイムノアッセイが挙げられる。本液体は、異なる疾患を有する患者から得ることができる。典型的には、活性化Ｂ細胞は、さまざまな癌または炎症若しくは自己免疫疾患の病原体において任意の役割を担っていることが判明した。いくつかの実施形態では、本疾患は、リンパ腫、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬である。
ｅ）ＩＬ４０の受容体の同定方法。本方法は、ＩＬ４０受容体に結合するためのリガンドとしてペプチドまたはタンパク質を使用することを含む。ＩＬ４０受容体は、その受容体に結合するために使用することができる標識ＩＬ４０を用いて同定され得る。次に、抗−ＩＬ４０または抗−標識抗体を使用してリガンド／受容体複合体を免疫沈降させることができる。こうした標識の例としては、Ｈｉｓ−タグ、フラグ−タグなどが挙げられる。また、受容体を発現するラジオイムノアッセイ細胞を介して最初に検出されるように、ＩＬ４０を放射線標識することもできる。異なる細胞を放射線標識と共にインキュベートし、インキユベート後、細胞を洗浄するか、または粘度及び遊離対結合放射線標識ＩＬ４０の遠心分離によって分離される勾配を介して通過させる。放射能を保持する細胞は、特定のＩＬ４０受容体を発現するものとする。
【００１５】
更なる態様では、ＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質を産生する細胞が提供され、本細胞は、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である。本細胞は、本明細書に記載のいずれかのＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質を産生し得る。また、細胞を含む臓器、組織、または動物が提供される。
【００１６】
別の態様では、未変性遺伝子において発見される１つ以上のイントロンを欠失している配列か、または非天然ヌクレオチドが導入されている配列など、ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部または全体を含む核酸が提供される。核酸は、以下のものであり得る。
ａ）ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部または全体を含み、この核酸が本明細書に記載のＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質をコードする；
ｂ）別のヌクレオチド配列、標識（例えば、ＨＩＳ−タグ若しくはＦＬＡＧ）、またはビニルスルホン誘導体科染料、蛍光色素分子などの化学誘導体、またはプロテオミクスなど他の技術で一般的に使用される他のタグ（例えばビオチン）に共役結合されている。
ｃ）プライマー、プローブ、アンチセンス分子、またはＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０  ｃＤＮＡ配列をベースとしたオリゴヌクレオチド、
ｄ）異種核酸配列に付着した組換え型構造体、または
ｅ）混合ａ）〜ｄ）のいずれかを組み合わせたもの。
【００１７】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、ベクターまたは発現ベクターであってもよい。
【００１８】
更なる態様では、ＩＬ４０配列含有核酸の使用方法が提供される。本方法では、核酸を使用することができる。例えば：
ａ）ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法。この方法は、治療有効量の核酸を対象へ投与することを含み、本核酸により、ＩＬ４０の発現が減少する。いくつかの実施形態では、本疾患は、自己免疫疾患またはリンパ腫である。
ｂ）ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法。この方法としては、治療有効量の核酸を対象へ投与することを含み、本核酸によりＩＬ４０の発現が減少する。いくつかの実施形態では、疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫,菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である。また、いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡｉ分子であってもよい。
ｃ）ＩＬ４０が関与する疾患の診断方法。本方法は、疾患の診断法／セラノスティクス法においてプローブとして核酸を使用することを含む。いくつかの実施形態では、本疾患は、リンパ腫、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎または乾癬である。
【００１９】
更なる態様では、ＩＬ４０配列含有核酸の組換え型形態を含む細胞が提供され、本細胞は、組換え型細菌細胞、組換え型酵母菌細胞または組換え型哺乳類細胞である。本細胞は、本明細書に記載のいずれかのＩＬ４０配列含有核酸を含み得る。また、細胞を含む臓器、組織、または動物が提供される。
【００２０】
別の態様では、ＩＬ４０を発現する細胞のサブセットの選択方法が提供される。本方法は、ＩＬ４０を発現する細胞を含む細胞集団にＩＬ４０結合分子を添加すること及び選択された細胞の集団を提供するためにＩＬ４０結合分子により標識された細胞を選択することを含む。ＩＬ４０発現細胞としては、Ｂ細胞、場合により他の白血球及び骨髄細胞及び胎児肝細胞が挙げられる。ＩＬ４０を発現し得る細胞型は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、他の間質細胞またはさまざまな細胞型または特定の系譜への関与レベルの造血前駆体を含み得るこれらの臓器である。いくつかの実施形態では、ａ）ＩＬ４０発現細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞であってもよい；ｂ）ＩＬ４０結合分子は、抗−ＩＬ４０抗体またはＩＬ４０受容体であってもよい。ｃ）選択細胞は、血液、体液、細胞懸濁液または患者サンプルから選択することができる；ｄ）選択細胞は、ＩＬ４０発現細胞を調べるための調査ツールであり得る；ｅ）また、選択細胞が血球である場合、選択細胞は、ｉ）選択細胞により作製された免疫グロブリンのｍＲＮＡ供給源；またはｉｉ）完全ヒト化抗体の新規作製方法の供給源であり得る；
またはｆ）ａ）〜ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【００２１】
本方法の更なる実施形態では、ＩＬ４０が関与する疾患の治療を必要とする対象における、ＩＬ４０が関与する疾患の治療方法が提供される。本方法は、治療有効量の選択細胞を対象へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患はＩｇＡ欠損症候群、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、または別のリンパ腫若しくは白血病；リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、強皮症、グレーブス病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、特発性肺胞線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎または別の自己免疫疾患である。
【００２２】
別の態様では、対象における活性化Ｂ細胞の検出方法が提供される。本方法は、対象中でのＩＬ４０濃度を測定することを含み、ＩＬ４０濃度が対照よりも上昇する場合には、活性化Ｂ細胞が示唆される。本方法では、例えば、
ａ）ＩＬ４０濃度は、免疫検出技術により測定することができる；
ｂ）本方法は、これらに限定されないが、例えばインターロイキン６、インターロイキン１０及び特定の免疫グロブリンなど別のバイオマーカーを測定すること更に含むことができる；
ｃ）本方法は、自己免疫疾患またはリンパ腫の診断を必要とする患者において、自己免疫疾患またはリンパ腫を診断することができ、濃度の上昇により、リンパ腫または自己免疫疾患が示唆される；
ｄ）ＩＬ４０濃度の上昇により、リンパ腫または自己免疫疾患のＩＬ４０産生サブタイプを決定することができる；または
ｅ）混合ａ）〜ｄ）のいずれかを組み合わせたものである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、免疫検出方法はＥＬＩＳＡ法、組織学的方法、蛍光活性化細胞選別、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量分析法、免疫組織化学的方法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法、ウエスタンブロッティング法またはドットブロッティング法である。
【００２４】
別の態様では、リンパ腫または自己免疫疾患の治療を必要とする対象におけるリンパ腫または自己免疫疾患の治療方法が提供される。この方法は、治療有効量の抗−ＩＬ４０抗体またはＩＬ４０配列含有核酸を対象または対象の腫瘍、組織または細胞へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、中和抗−ＩＬ４０抗体であってもよく、また、核酸はアンチセンスＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡはＲＮＡｉ分子である。
【００２５】
別の態様では、対象におけるＩＬ４０産生細胞の同定方法が提供される。本方法は、例えば、免疫組織化学的方法またはインサイチュハイブリダイゼーションにおいてＩＬ４０産生細胞を同定するために、プローブとして抗−ＩＬ４０抗体またはＩＬ４０配列含有核酸を使用することを含む。ＩＬ−４０抗体を使用して、フローサイトメトリーによりＩＬ４０産生細胞を検出することができるか、または免疫組織化学的方法を実施することができ、ＩＬ４０配列含有核酸プローブを使用して、ＩＬ−４０を産生する細胞から得られたｍＲＮＡのノーザンブロット法を行うことができる。このＩＬ４０配列を使用して、ＩＬ４０産生細胞から得たｍＲＮＡでリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためにプライマーをデザインすることができる。このＩＬ４０配列プローブを使用して、インサイチュハイブリダイゼーションによりＩＬ４０産生細胞を同定することができる。
【００２６】
更なる態様では、ＩＬ４０受容体の同定方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法には、
ａ）ＩＬ４０、標識ＩＬ４０、Ｈｉｓ−タグＩＬ４０、ビオチン標識ＩＬ４０、またはこれらの組み合わせによりＩＬ４０応答細胞の標識を行うことと、標識細胞を単離、精製及び／または分離することを含む。これらのラベルにより標識された細胞は、例えば、ＨＩＳ−タグに対する蛍光色素標識特異的抗体を用いることにより、また、蛍光活性化セルソーターを介してサンプルを実行することにより、または、ビオチン標識ＩＬ４０の場合、類似した方法において蛍光色素標識ストレプトアビジンを使用することによって分離することができる。または、
ｂ）ＩＬ４０、標識ＩＬ４０、Ｈｉｓ−タグＩＬ４０、ビオチン標識ＩＬ４０、またはこれらの組み合わせによりＩＬ４０応答細胞の標識を行うことと、標識細胞を単離、精製及び／または分離することを含み、本細胞は、ＩＬ４０受容体が発現する真核細胞または細菌由細胞である；
ｃ）酵母２ハイブリッド系においてＩＬ４０に結合するタンパク質を同定する；または
ｄ）ＩＬ４０受容体発現細胞由来のメンブレン調製からのＩＬ４０結合タンパク質を免疫沈降させる。例えば、水性培地中において少量のガラスビーズ、セラミックビーズまたは鋼鉄ビーズを細胞サンプルと混合したものを用いて、ＩＬ４０受容体を発現する細胞を破壊することができる。この混合物に対して、攪拌及び振盪により高水準攪拌を行う。ビーズは細胞と衝突し、細胞を破壊して、細胞間成分を放出させる。均質化中、機械的剪断（ボルテックス）を適度に行い、遠心分離によって分離できる最良のメンブレンまたは細胞内調製物となる。標識（ＨＩＳ−タグであってもよい）に対して抗体を使用することにより、タンパク質複合体（その受容体に結合された標識ＩＬ４０など）の免疫沈降を達成することができる。免疫沈降の分析及び配列決定により、この複合体中に存在するタンパク質が同定されるものとする。
【００２７】
別の態様では、ＩＬ４０またはその機能的変異体の使用方法が提供される。本方法は、以下となるように免疫細胞をＩＬ４０または機能的変異体に曝露することを含む：
ａ）インビトロまたはインビボにおいてＢ細胞の成長及び分化を促進する；
ｂ）ハイブリドーマ培養物の成長を増大させる；
ｃ）ハイブリドーマ培養物により抗体生成物が増加する；または
ｄ）例えば、ヒト、イヌ、マウス、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、またはヒツジなど異なる哺乳類種由来のＩＬ４０を使用することにより、組織または細胞の種発生源を決定する。
【００２８】
例えば、Ｂリンパ球は、さまざまなサイトカイン（ＩＬ４、ＩＬ６）及びＢ細胞受容体（抗−免疫グロブリン）を刺激する抗体、またはＣＤ４０受容体（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０受容体に対する抗体）に結合する分子を補充した標準的組織培養培地において培養によってインビトロで成長し、分化し得る。これらの条件により、Ｂリンパ球の成長及び／または分化を招く。Ｂ細胞の分化を支持することで既知の他のサイトカインとしては、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ、ＩＬ５，ＩＬ１３及びＣＸＣＬ１３が挙げられる。正常Ｂ細胞のＢ細胞骨髄腫または他の腫瘍細胞との融合から得られるＢ細胞ハイブリドーマは、ハイブリドーマ（ＩＬ６）の成長を支持するサイトカインを補充した選択的培地（ハイブリドーマの成長を支持するため）においてインビトロで培養され得る。
【００２９】
自己免疫、自己免疫疾患またはリンパ腫に関与する前述の組成物または方法のいずれかにおいて、
自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、乾癬、グレーブス病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、またはシェーグレン症候群であってもよく、
リンパ腫は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉腫、または多発性骨髄腫であってもよい。
【００３０】
治療するまたは治療を含む前述の組成物または方法のいずれかにおいて、抗体、ペプチド、タンパク質または核酸を局所的または全身に送達することができる。
【００３１】
診断の、診断、診断するまたは診断法／セラノスティクス法を含む前述の組成物または方法のいずれかにおいて、本方法は、生検または組織学的サンプルなど、例えば、血清、血液、体液、腫瘍、組織、または細胞などのサンプルにて実施することができる。
【００３２】
抗体、ペプチド、タンパク質または核酸分子を含む前述の組成物または方法のいずれかにおいて、以下の製剤処方において本分子であり得る。
ａ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤またはそれらを組み合わせたものを含む；
ｂ）滅菌製剤として使用される；
ｃ）これらに限定されないが、抗−ＴＮＦａ抗体（Ｒｅｍｉｃａｄｅ，Ｈｕｍｉｒａ）；抗−ＢＡＦＦ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）；抗−ＣＤ２０（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）；及び抗−ＣＤ３０（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）など、自己免疫疾患またはリンパ腫を治療するための別の治療薬を含む；
ｄ）例えば、エマルション、ミセルなどの緩効性または徐放性製剤である；
ｅ）例えば、リポソーム、包接錯体、担体などの標的投与形態である；または
ｆ）ａ）〜ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明を更に完全に理解するためには、添付図面と共に考慮される以下の発明を実施するための形態を参照する。
【図１Ａ】Ｃ１７ｏｒｆ９９は、胎児肝臓、骨髄、及び活性化Ｂ細胞内に発現する新規サイトカインであることを示すパネルである。図１Ａ）正常ヒト組織及び免疫細胞内でのＣ１７ｏｒｆ９９の発現。Ｃ１７ｏｒｆ９９ｍＲＮＡの発現プロファイルを示すＢＩＧＥ（Ｂｏｄｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）データベースのデータ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｇｅｎｅａｒｒａｙ（Ｕ１３３２．０）を用いるヒトマイクロアレイデータ）。Ｘ軸は器官系別で示す。ＣＮＳ（中枢神経系）、Ｇｕｔ（胃腸）、Ｓｔｒｕｃｔ（構造）、Ｖａｓｃ（血管系）、Ｒｅｓｐ（呼吸器）、Ｅｎｄｏ（内分泌腺）、Ｕｒ（泌尿器）、Ｒｅｐ（生殖器）、Ｉｍｍ＿Ｔ（免疫組織）、Ｉｍｍ＿Ｃ（免疫細胞）、Ｄｅｖ（発生）。Ｙ軸は、Ｃ１７ｏｒｆ９９（２３６９８１＿ａｔ）に対応して設定されたプローブのハイブリダイゼーション強度を示す。
【図１Ｂ】Ｃ１７ｏｒｆ９９は、胎児肝臓、骨髄、及び活性化Ｂ細胞内に発現する新規サイトカインであることを示すパネルである。図１Ｂ）シグナルペプチドを示すＣ１７ｏｒｆ９９ヒトアミノ酸配列（配列番号１）。
【図１Ｃ】Ｃ１７ｏｒｆ９９は、胎児肝臓、骨髄、及び活性化Ｂ細胞内に発現する新規サイトカインであることを示すパネルである。図１Ｃ）２９３ＨＥＫ細胞に形質移入されたｐＴＴ５Ｖ５Ｈ８−Ｃ１７ｏｒｆ９９の上清のウェスタンブロット。２９３ＨＥＫ細胞は、ｐＴＴ５Ｖ５Ｈ８−Ｃ１７ｏｒｆ９９または空ベクターのいずれかで形質移入した。上清を収集し、ＧＥ  ＨｉｓＴｒａｐ精製カラムを用いて精製し、抗−Ｈｉｓ  ｍＡｂ、その後、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体を用いて、ウェスタンブロットを行った。
【図１Ｄ】Ｃ１７ｏｒｆ９９は、胎児肝臓、骨髄、及び活性化Ｂ細胞内に発現する新規サイトカインであることを示すパネルである。図１Ｄ）ヒト胎児肝臓及び骨髄におけるＲＴ−ＰＣＲによるＣ１７ｏｒｆ９９の発現の確認。
【図１Ｅ】Ｃ１７ｏｒｆ９９は、胎児肝臓、骨髄、及び活性化Ｂ細胞内に発現する新規サイトカインであることを示すパネルである。図１Ｅ）１０の哺乳類種におけるＣ１７ｏｒｆ９９のアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ解析。Ｃ１７ｏｒｆ９９相同体は、有胎盤哺乳類（真獣類）、有袋類、及び単孔類に限定した。
【図２】ＩＬ４０の発現がマウス及びヒトにおいて類似していることを示すグラフのパネルである。図２Ａ）市販のＲＮＡ由来のヒトサンプルのｑＲＴ−ＰＣＲ解析。図２Ｂ）市販のＲＮＡ由来のマウス組織のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図３】ヒトＩＬ４０タンパク質（配列番号２）とマウスＩＬ４０タンパク質（配列番号３）とのアミノ酸配列の比較。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、解析を実施した。コンセンサス配列（配列番号：４）も示す。
【図４Ａ】ヒト活性化Ｂ細胞及びマウス活性化Ｂ細胞においてＩＬ４０が発現することを示すグラフのパネルである。図４Ａ）抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ＋ＩＬ４を用いたヒト休止Ｂ細胞及びヒト活性化Ｂ細胞のＩＬ４０及びＴＳＰＡＮ３３の２４時間ｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図４Ｂ】ヒト活性化Ｂ細胞及びマウス活性化Ｂ細胞においてＩＬ４０が発現することを示すグラフのパネルである。図４Ｂ）１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ＋ＩＬ−４を用いた休止または刺激条件下のマウス脾細胞のＩＬ４０及びＴＳＰＡＮ３３の２４時間ｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図４Ｃ】ヒト活性化Ｂ細胞及びマウス活性化Ｂ細胞においてＩＬ４０が発現することを示すグラフのパネルである。図４Ｃ）ＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ−４により刺激されたＩＬ４０及びＴｓｐａｎ３３に対して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓由来のＦＡＣＳ精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の８時間、２４時間、７２時間、及び９６時間ｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図４Ｄ】ヒト活性化Ｂ細胞及びマウス活性化Ｂ細胞においてＩＬ４０が発現することを示すグラフのパネルである。図４Ｄ）２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＦＮγまたはＴＧＦβにより３日間刺激した脾細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図４Ｅ】ヒト活性化Ｂ細胞及びマウス活性化Ｂ細胞においてＩＬ４０が発現することを示すグラフのパネルである。図４Ｅ）抗−ＣＤ４０及びサイトカインの組み合わせにより刺激されたＩＬ４０及びＴｓｐａｎ３３の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図５Ａ】ヒト細胞株及びＢ細胞株においてＩＬ４０のｑＲＴ−ＰＣＲ解析のグラフのパネルである。図５Ａ）休止及び刺激条件下において、ＩＬ４０の発現に関して、ヒト２Ｅ２Ｂ細胞及びヒトジャーカットＴ細胞を測定した。
【図５Ｂ】ヒト細胞株及びＢ細胞株においてＩＬ４０のｑＲＴ−ＰＣＲ解析のグラフのパネルである。図５Ｂ）休止及び刺激条件下において、ＩＬ４０の発現に関して、マウスＡ２０−２Ｊマウス細胞を測定した。
【図６Ａ】マウス脾細胞由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞のＦＡＣＳ精製結果を示すパネルである。図６Ａ）選別前のマウス脾細胞におけるＣＤ１９＋細胞。
【図６Ｂ】マウス脾細胞由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞のＦＡＣＳ精製結果を示すパネルである。図６Ｂ）選別後のマウス脾細胞におけるＣＤ１９＋細胞。
【図７】ＩＬ４０転写がＬＰＳ＋ＴＧＦβによって誘発されることを示すグラフである。ＩＬ−４、ＬＰＳまたはＬＰＳ及びＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＧＦβの組み合わせにより刺激されたマウス脾細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図８Ａ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ａ）ＩＬ４０−／−マウスの発生に使用される標的構造体。
【図８Ｂ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ｂ）ＷＴ（左）及びＩＬ４０−／−（右）マウスの脾臓の写真である。
【図８Ｃ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ｃ）ＷＴ及びＩＬ４０−／−マウスの脾臓におけるＣＤ１９＋（Ｂ細胞）対ＣＤ３ｅ＋（Ｔ細胞）の比率。フローサイトメトリーにより測定。この数値は、少なくとも３つの独立した実験の代表値を示す。
【図８Ｄ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ｄ）ＷＴ及びＩＬ４０欠損マウス（ｎ＝５匹／群）における脾臓サイズ（左）、重量（中間）及び全リンパ球数（右）の測定。この数値は、少なくとも３つの独立した実験の代表値を示す。
【図８Ｅ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ｅ）ＷＴ及びＩＬ４０欠損マウス（ｎ＝５）におけるＣ（左）とＴ細胞及びＢ細胞の全数から得られる比率のグラフである。この数値は、少なくとも３つの独立した実験の代表値を示す。
【図８Ｆ】ＩＬ４０欠損マウスは、変形Ｂ細胞表現型を有することを示すパネルである。図８Ｆ）サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定された野生型及びＩＬ４０−／−マウスにおけるＩｇＧ（左）及びＩｇＡ（右）の血清値（ｎ＝５）。この数値は、少なくとも３つの独立した実験の代表値を示す。
【図９】ＷＴ及びＩＬ４０−／−コロニーからの遺伝子型決定のＰＣＲ確認結果を示す写真である。２５０ｂｐ（ＩＬ４０ゲノムＤＮＡ）及び２００ｂｐ（ネオマイシン構造体）にて明らかなバンドが確認される。ＷＴマウス由来のＤＮＡは、ＩＬ４０ゲノムＤＮＡのみを含有し、欠失を有するマウスは、ネオマイシン構造体のみを保持する。ヘテロ接合体は、ＩＬ４０ゲノムＤＮＡ及びネオマイシン構造体をいずれも含有する。
【図１０】ＩＬ４０−／−マウスは、体重増加において異常を有さないことを示すグラフである。３〜６週のＷＴ由来マウス及びＩＬ４０−／−マウスの体重（ｇ）を測定した。ｎ＝５。
【図１１Ａ】ＩＬ４０−／−マウスは、胸腺におけるＴ細胞の発現において異常を有さないことを示すパネルである。図１１Ａ）リンパ球を測定した。ＣＤ３ｅの発現にゲート設定し、その後、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４対ＣＤ８の発現を測定した。
【図１１Ｂ】ＩＬ４０−／−マウスは、胸腺におけるＴ細胞の発現において異常を有さないことを示すパネルである。図１１Ｂ）陽性細胞の割合。図は、２つの独立した実験から得た実験結果を示す。ｎ＝３。
【図１２Ａ】ＩＬ４０−／−マウスは、休止脾臓からのＢ２細胞の腹腔由来のＢ１細胞においてＩｇＡの産生に異常を有さないことを示すパネルである。脾臓細胞または腹腔細胞のゲート設定は、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、またはＢ２細胞の集団を認識する／ゲート設定するために、ＣＤ５またはＢ２２０＋細胞の亜集団で行い、その後、フローサイトメトリーによってＩｇＡの発現を測定した（ｎ＝３）。
【図１２Ｂ】ＩＬ４０−／−マウスは、休止脾臓からのＢ２細胞の腹腔由来のＢ１細胞においてＩｇＡの産生に異常を有さないことを示すパネルである。脾臓細胞または腹腔細胞のゲート設定は、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、またはＢ２細胞の集団を認識する／ゲート設定するために、ＣＤ５またはＢ２２０＋細胞の亜集団で行い、その後、フローサイトメトリーによってＩｇＡの発現を測定した（ｎ＝３）。
【図１２Ｃ】ＩＬ４０−／−マウスは、休止脾臓からのＢ２細胞の腹腔由来のＢ１細胞においてＩｇＡの産生に異常を有さないことを示すパネルである。脾臓細胞または腹腔細胞のゲート設定は、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、またはＢ２細胞の集団を認識する／ゲート設定するために、ＣＤ５またはＢ２２０＋細胞の亜集団で行い、その後、フローサイトメトリーによってＩｇＡの発現を測定した（ｎ＝３）。
【図１２Ｄ】ＩＬ４０−／−マウスは、休止脾臓からのＢ２細胞の腹腔由来のＢ１細胞においてＩｇＡの産生に異常を有さないことを示すパネルである。脾臓細胞または腹腔細胞のゲート設定は、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、またはＢ２細胞の集団を認識する／ゲート設定するために、ＣＤ５またはＢ２２０＋細胞の亜集団で行い、その後、フローサイトメトリーによってＩｇＡの発現を測定した（ｎ＝３）。
【図１２Ｅ】ＩＬ４０−／−マウスは、休止脾臓からのＢ２細胞の腹腔由来のＢ１細胞においてＩｇＡの産生に異常を有さないことを示すパネルである。脾臓細胞または腹腔細胞のゲート設定は、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、またはＢ２細胞の集団を認識する／ゲート設定するために、ＣＤ５またはＢ２２０＋細胞の亜集団で行い、その後、フローサイトメトリーによってＩｇＡの発現を測定した（ｎ＝３）。
【図１３Ａ】ＩＬ４０欠損マウスは、Ｐｒｏ、Ｐｒｅまたは未成熟Ｂ細胞集団において異常を有さないことを示すパネルである。図１３Ａ）Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋細胞で骨髄滲出液細胞のゲート設定を行い、ＩｇＭ対ＣＤ４３の発現に関して測定した。代表的実験結果は、２つの独立した実験から得た。
【図１３Ｂ】ＩＬ４０欠損マウスは、Ｐｒｏ、Ｐｒｅまたは未成熟Ｂ細胞集団において異常を有さないことを示すパネルである。図１３Ｂ）３匹の別のマウスに関して測定された細胞の割合。代表的実験結果は、２つの独立した実験から得た。
【図１３Ｃ】ＩＬ４０欠損マウスは、Ｐｒｏ、Ｐｒｅまたは未成熟Ｂ細胞集団において異常を有さないことを示すパネルである。図１３Ｃ）３匹の別のマウスに関して測定された細胞総数。代表的実験結果は、２つの独立した実験から得た。
【図１４Ａ】Ｂ細胞の脾細胞集団は、結果得られたＩＬ４０欠損マウスにおいて正常であることを示すパネルである。図１４Ａ）マウスは、Ｂ２２０＋細胞でゲート設定を行い、その後、ＩｇＭ対ＩｇＤの発現に関して染色した。Ｎ＝３マウス／群。
【図１４Ｂ】Ｂ細胞の脾細胞集団は、結果得られたＩＬ４０欠損マウスにおいて正常であることを示すパネルである。図１４Ｂ）その後、ＩｇＭ対ＩｇＡの発現に関して、Ｂ２２０＋細胞を測定した。Ｎ＝３マウス／群。
【図１４Ｃ】Ｂ細胞の脾細胞集団は、結果得られたＩＬ４０欠損マウスにおいて正常であることを示すパネルである。図１４Ｃ）Ｂ２２０＋細胞を７ＡＡＤで染色し、細胞生存度を測定した。Ｎ＝３マウス／群。
【図１５Ａ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。図１５Ａ）バイエル腺叢における全胚中心（Ｂ２２０＋ＰＮＡ＋）細胞の測定。ｎ＝５。図１５Ａは、３つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）である。
【図１５Ｂ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。図１５Ｂ）Ｂ２２０＋ＰＮＡｈｉリンパ球でゲート設定したＩｇＡ分泌プラズマ細胞の測定。ｎ＝５。図１５Ｂは、３つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）である。
【図１５Ｃ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。図１５Ｃ）ＩｇＡスイッチ細胞、Ｂ２２０ｌｏ−ｈｉＰＮＡ＋リンパ球の総数の測定。ｎ＝５。図１５Ｃは、３つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）である。
【図１５Ｄ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。図１５Ｄ）糞塊中の総ＩｇＡの測定。ｎ＝１０。１５Ｅ）泌乳雌の乳腺において、ＩＬ４０転写が上方調節されている。１週齢及び３週齢のバージン、妊娠及び泌乳マウスの乳腺から入手したｑＲＴ−ＰＣＲ解析。図１５Ｄは、３つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）である。
【図１５Ｅ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。図１５Ｅ）泌乳雌の乳腺において、ＩＬ４０転写が上方調節されている。
【図１５Ｆ】ＩＬ４０−／−マウスは、バイエル腺叢におけるＩｇＡ産生細胞において異常を有することを示すパネルである。バージン、妊娠、泌乳１週及び泌乳３週マウスの乳腺から入手したｑＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図１６Ａ】ＩＬ４０−／−マウスは、インビトロ誘導アッセイ中にＣＳＲを受ける能力において固有のＢ細胞を有さないことを示すパネルである。以下により４日間刺激されたマウス脾細胞のＣＳＲの誘導：図１６Ａ）ＬＰＳ＋抗−ＢＣＲ＋ＴＧＦβ（ＩｇＡスイッチ）。代表的データは、少なくとも２つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）から得た。
【図１６Ｂ】ＩＬ４０−／−マウスは、インビトロ誘導アッセイ中にＣＳＲを受ける能力において固有のＢ細胞を有さないことを示すパネルである。以下により４日間刺激されたマウス脾細胞のＣＳＲの誘導：図１６Ｂ）ＬＰＳ＋ＩＬ−４（ＩｇＧスイッチ）。代表的データは、少なくとも２つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）から得た。
【図１６Ｃ】ＩＬ４０−／−マウスは、インビトロ誘導アッセイ中にＣＳＲを受ける能力において固有のＢ細胞を有さないことを示すパネルである。以下により４日間刺激されたマウス脾細胞のＣＳＲの誘導：図１６Ｃ）ＬＰＳ＋ＩＦＮγ（（ＩｇＧ３スイッチ）、フローサイトメトリーにより測定。代表的データは、少なくとも２つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）から得た。
【図１６Ｄ】ＩＬ４０−／−マウスは、インビトロ誘導アッセイ中にＣＳＲを受ける能力において固有のＢ細胞を有さないことを示すパネルである。以下により４日間刺激されたマウス脾細胞のＣＳＲの誘導：図１６Ｄ）ＬＰＳ＋ＩＬ−４によるＩｇＧプラズマ細胞の刺激。代表的データは、少なくとも２つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）から得た。
【図１６Ｅ】ＩＬ４０−／−マウスは、インビトロ誘導アッセイ中にＣＳＲを受ける能力において固有のＢ細胞を有さないことを示すパネルである。代表的データは、少なくとも２つの独立した実験の代表値（少なくとも３匹／群）から得た。
【図１７】ヒトｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ２が活性化Ｂ細胞において発現することを示すグラフである。ヒト組織の発現プロファイルは、ＢＩＧＥから得た。
【図１８】ＩＬ４０がＴ細胞ではなく、Ｂ細胞にのみに影響を及ぼすことを示すパネルである。休止（左）及び活性化（右）条件下でのＷＴ及びＩＬ４０−／−マウス脾細胞由来の「Ｂ細胞」及び「Ｔ細胞」遺伝子のマイクロアレイ解析。
【図１９Ａ】ＭＲＬＦａｓ1pr/1prマウスでのＩＬ４０の増加を示すパネルである。ＣＤ１９の発現に対して正規化したＭＲＬ／ｆａｓlpr/1prマウス由来の全脾細胞のＩＬ４０及びＴｓｐａｎ３３の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｓｐａｎ３３の発現に関して、９週齢（検出可能な病理学なし）、２４週齢（軽度の耳部損傷を有無に関わらずリンパ節症）及び３６週齢（耳部かつ顔に病変を伴うリンパ節症）のマウスを比較した。ｎ＝５。
【図１９Ｂ】ＭＲＬＦａｓ1pr/1prマウスでのＩＬ４０の増加を示すパネルである。ＣＤ１９の発現に対して正規化したＭＲＬ／ｆａｓlpr/1prマウス由来の全脾細胞のＩＬ４０及びＴｓｐａｎ３３の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｓｐａｎ３３の発現に関して、９週齢（検出可能な病理学なし）、２４週齢（軽度の耳部損傷を有無に関わらずリンパ節症）及び３６週齢（耳部かつ顔に病変を伴うリンパ節症）のマウスを比較した。ｎ＝５。
【図２０】ＩＬ４０がＴ細胞ではなく、Ｂ細胞に結合していることを示すパネルである。
【図２１】ヒトＩＬ４０タンパク質をコードするｃＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
遺伝子Ｃ１７ｏｒｆ９９の遺伝子産物に関連した抗体、ペプチド、タンパク質及び核酸は、さまざまな実施形態に含まれる。さまざまな種のＣ１７ｏｒｆ９９遺伝子のヌクレオチド配列及びＣ１７ｏｒｆ９９ｃＤＮＡ及びさまざまな種由来のＣ１７ｏｒｆ９９遺伝子産物のアミノ酸配列は、以下の受け入れ番号を有する（すべてが本明細書に参照として援用される）：ヒトＣ１７ＯＲＦ９９：ＮＭ＿００１１６３０７５；マウスＣ１７ＯＲＦ９９：ＮＭ＿０２９９６４（全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイト（ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ・ｇｏｖ）を参照されたい）。本明細書で使用するとき、Ｃ１７ｏｒｆ９９遺伝子産物はインターロイキン−４０（ＩＬ４０またはＩＬ−４０）とも称される。
【００３５】
抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなど、任意の免疫結合剤である。また、抗体は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子であってもよく、また、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、シングルドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体断片が挙げられる。さまざまな抗体ベース構造体及び断片の調製及び使用のための技術は、当業者に周知である。抗体の調製及び特性付けのための手段も当業者に周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、を参照されたい）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、例えば、再現性及び大規模生産など、特定の利点を有すると認識されている。このため、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ及びニワトリさえも起源とするモノクローナル抗体が予想される。
【００３６】
広範の動物種においてＩＬ４０に対するポリクローナル抗体の調製が可能である。典型的には、抗血清の産生に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。免疫原性の増大には、補助剤の使用及びこれらに限定されないが、例えば、アオガイヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンなどの担体タンパク質との共役が公知の手技である。
【００３７】
モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第４，１９６，２６５号（参照によって本明細書に援用される）に例示されているものなど、既知の技術を使用して、迅速に調製することができる（４０〜４４）。典型的には、この技術は、例えば、精製または部分的精製タンパク質、ペプチドまたはドメインなどの選択された免疫原組成物で好適な動物を免疫化することを含む。本免疫化組成物は、効率よく抗体産生細胞を刺激する方法で投与する（４５〜４７）。ハイブリドーマ分泌モノクローナル抗体は、単離することができる。
【００３８】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、所望の場合、濾過、遠心分離及びＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィーなどのさまざまなクロマトグラフ法を用いて、更に精製することができる（４７）。
【００３９】
ヒト化モノクローナル抗体は、起源抗原の特異性を保持しつつ、遺伝子工学技術を用いて修飾され、定常領域及び／または可変領域フレームワーク配列をヒト配列に置き換えた動物発生源抗体である。このような抗体は、概して、ヒト抗原に対して特異性を有するげっ歯類抗体から誘導される。このような抗体は、概して、インビボでの治療的適用に有用である。この戦略により、外来性抗体に対する宿主反応が減少し、かつヒトエフェクター機能の選択が可能になる。したがって、本発明のいくかの実施形態には、マウス、ラットまたはヒト定常及び／または可変領域ドメイン、二重特異性抗体、組換え型及び遺伝子操作抗体及びそれらの断片を担持する他の種由来のキメラ抗体と同様に、ＩＬ４０に対するヒト化抗体が含まれる。ヒト化免疫グロブリンの産生技術は、当業者に既知である（４４、４７〜５１）。例えば、米国特許第５，６９３，７６２号は、１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲの）を有するヒト化免疫グロブリンの産生方法及びその組成物について開示している。無処置抗体に混ぜ合わせるとき、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、抗原に対してタンパク質またはエピトープを含有する他の化合物などのドナー免疫グロブリンと実質的に同一の親和性を保持する。本分野での他の教示の例としては、米国特許第６，０５４，２９７号：同５，８６１，１５５号：及び同６，０２０，１９２号が挙げられる（具体的には、すべてが参照によって援用される）。患者の疾患に対して「カスタム」作製された抗体の発現方法も同様に公知であり、こうした「カスタム」作製抗体も意図される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態としては、ＩＬ４０ペプチドまたはタンパク質が挙げられる。ある実施形態では、自然発生ＩＬ４０タンパク質は、ＩＬ４０変異型、例えば、置換変異型、欠失変異型及び／または挿入変異型と置換することができる。
【００４１】
置換変異型は、タンパク質内で更に１つ以上の部位でのアミノ酸の交換を含有する。置換は、通常、形状及び／または電荷が類似しているアミノ酸の交換が関与する同類置換である。欠失変異型では、未変性タンパク質の１つ以上の残基が欠失している。挿入突然変異体または変異型としては、タンパク質中の非未端点において１つ以上のアミノ酸の添加が挙げられる。変異型は、自然発生ＩＬ４０タンパク質配列に対して、約８０％以上の同一性、約８５％以上の同一性、または約９０％以上の同一性、約９５％以上の同一性、約１００％以上の同一性を有していてもよい。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＶｉｅｗまたはＭＡＦＦＴ配列比較プログラムを用いて配列比較を実施することができる。比較配列では、１つのタンパク質と別のタンパク質との比較セグメントは、比較されるアミノ酸長さの約１００％、または比較されるアミノ酸長さの約９５％、約８５％、または約８０％であってもよい。比較長さは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸以上であってもよい。変異型は、一般の自然配列のように特定の物理化学的または機能的特徴を維持していてもよく、他の変異型は、構造的及び機能的特徴の修飾された組み合わせを有してもよい。したがって、いくつかの実施形態としては、例えばＩＬ４０受容体と結合する、またはＩｇＡ応答に対するＢ細胞の分化に関与するなど、いくつかのまたはすべてのＩＬ４０の機能を有する機能的活性ＩＬ４０変異型が挙げられる。また、いくつかの実施形態としては、ＩＬ４０アゴニストまたはＩＬ４０アンタゴニストとして機能する変異型が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異型としては自然発生ヒトＩＬ４０配列または他の種の自然発生ＩＬ４０配列と同一である配列は含まない。機能的活性ＩＬ４０ペプチド及びＩＬ４０ペプチド変異型を包含するなど、ＩＬ４０ペプチド及びこれらの置換変異型、欠失変異型及び／または挿入変異型並びにＩＬ４０アゴニストまたはＩＬ４０アンタゴニストとして機能するＩＬ４０ペプチド及びＩＬ４０ペプチド変異型もまた意図される。いくつかの実施形態では、ペプチド変異型は、ヒトまたは他の種のＩＬ４０内に存在する自然発生アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列は含まない。
【００４２】
ある実施形態としては、ＩＬ４０タンパク質の切頭型または他のセグメントとの融合が挙げられ、記載された機能を示す。融合タンパク質は、第二のタンパク質のすべてまたは一部に結合されているすべてのまたは一部のＩＬ４０を含有することができる。例えば、１つのタンパク質のＣ末端は、他のタンパク質のＮ末端に結合してもよい。あるいは、タンパク質は、例えば、インテグリン、フィブロネクチン受容体または他の膜糖タンパク質と非共有結合により結合されていてもよい。ＩＬ４０タンパク質は、自然発生ＩＬ４０アミノ酸配列またはそれらの変異型を含有することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸変異型が関与していないか、またはアミノ酸変異型に加えて、ＩＬ４０誘導体が提供される。こうした誘導体の例としては、グリコシル化修飾ＩＬ４０タンパク質、例えば、ポリエチレングリコールによって修飾されたタンパク質（ＰＥＧ化）などの化学修飾ＩＬ４０タンパク質、及び例えば131Ｉ標識ＩＬ４０、ビオチン−ＩＬ４０などのＩＬ４０抱合体が挙げられる。
【００４４】
本発明のいくつの実施形態としては、自然発生ＩＬ４０タンパク質またはそれらの変異型など、ＩＬ４０タンパク質のすべてまたは一部をコードする核酸が挙げられる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。核酸は、例えば、発現を目的とした別の核酸配列に共役結合されてもよく、検出を目的とした標識に共役結合されてもよく、または検出を目的とした化学的誘導体に共役結合されてもよい。例えば、核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの標識に共役結合されてもよく、ビオチンなどの化学的誘導体に共役結合されてもよい。
【００４５】
核酸は、ＩＬ４０ヌクレオチド配列の増幅または合成のためのプライマーとして、またはＩＬ４０ヌクレオチド配列の同定のためのプローブとして利用することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０ｃＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、核酸はアンチセンス分子である。
【００４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチド及び／または修飾若しくは置換オリゴヌクレオチドであってもよいリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーである。さまざまな実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＩＬ４０標的配列にハイブリッド形成されているヌクレオチド配列が挙げられ、例えば、プライマー結合部位として使用するための追加の５’及び／または３’フランキング配列を挙げることができる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、これに限定されるものではないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（例えば、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなど）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（例えば、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートなど）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びにこれらの類縁体に連結される正常な３’−５’連結、並びに２’−５’連結を有する及びヌクレオシド単位の近接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に連結される逆極性を有するボラノホスフェートなどの修飾オリゴヌクレオチド主鎖が挙げられる。また、種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も挙げられる。こうした修飾主鎖オリゴヌクレオチドの調製は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号及び同第５，７５０，６６６号に提供されて教示されており、これらはすべて参照により本明細書に援用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン及び合成は、当該技術分野において周知である（５２）。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列をデザインするためのコンピュータープログラムも利用可能である（５３）。
【００４７】
ペプチド、タンパク質及び核酸の標準的産生方法及び作製方法が適用されてもよい。組換え型核酸コード構造体のデザインなどの標準的組換え方法が開発されてもよい。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｄ．Ａ．  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２０１１を参照されたい。発現ベクター、例えば、コード領域に操作可能に連結されたプロモーターなどが発明され得る。組換え型酵母菌及び組換え型哺乳類細胞などの組換え型原核生物細胞及び組換え型真核生物細胞など、ベクターを含む細胞が提供される。互換性のある発現方法論も開発することができる。
【００４８】
例えば、ＩＬ４０タンパク質またはタンパク質変異型をコードするポリヌクレオチドを、所望の宿主細胞中で機能的であるプロモーターの制御下に配置してもよい。非常に広範のプロモーターが公知であり、また、特定用途に応じて本発明の実施形態の発現ベクター中で使用可能である。通常は、選択されたプロモーターは、そのプロモーターが活性となる細胞に依存する。例えば、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写末端部位などの他の発現制御配列も任意により含まれる。１つ以上のこれらの制御配列を含む構造体は、「発現カセット」と称される。したがって、本発明の実施形態は、関連のある機能的タンパク質をコードする核酸が所望の原核または真核宿主細胞中に多く発現するために導入される発現カセットを提供する（例えば、Ｒｅａｍ  Ｗ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｋ．Ｇ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．２０１２を参照されたい）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、均質性が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％または９０％であるペプチドまたはタンパク質の実質的に純粋である組成物が含まれ、約９２％、９５％、９８％、または９９％以上の均質性も含まれる。精製されたペプチド及びタンパク質は、例えば、抗体産生の免疫原として、免疫細胞中での誘導分化、成熟またはタンパク質発現のための活性剤として、または医薬組成物中の治療薬として使用可能である。
【００５０】
ＩＬ４０の濃度は、核酸またはタンパク質濃度で測定され得る。例えば、細胞中でのＩＬ４０  ｍＲＮＡの発現量を測定することができるか、または活性化Ｂ細胞中に存在するＩＬ４０タンパク質の量を測定することができる。これらに限定されないがＰＣＲ、マイクロアレイ法またはノーザンブロット法などの方法を用いて、ｍＲＮＡの定量化を行うことができる（５４、５５）。タンパク質の定量化は、これらに限定されないが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量分析法、蛍光免疫測定法、化学発光分析法、生物発光分析法、またはウエスタンブロッティング法、抗−タンパク質特異的抗体を含むＦＡＣＳ（細胞によって産生するため）などの免疫検出法を使用して実施可能である。制御値は、制御細胞集団または１つ以上の制御対象からのＩＬ４０濃度の平均値または中央値であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、対象がＩＬ４０が関与する疾患を有しているという診断の後に本明細書に記載のものなどの治療が行われてもよい。例えば、診断の後に治療有効量のＩＬ４０アンタゴニストを、自己免疫またはリンパ腫と診断された対象に投与すること、またはＩＬ４０ヌクレオチド配列を含有する治療的有効量のオリゴヌクレオチドを対象へ投与することを含む治療が行われ得る。
【００５２】
いくつかの実施形態は、本発明のさまざまな実施形態の治療的使用を伴う。これらの実施形態では、対象は、本発明のさまざまな実施形態の抗体、ペプチド、タンパク質若しくは核酸またはこれらの任意の組み合わせであってもよい治療的有効量の活性剤を投与され得る。治療的有効量は、個人の状態の薬物治療に対する対象の健全性を促進するか、または改善する量である。例えば、任意の期間の対象の寿命の延長、対象の状態に寄与し得る対象への疼痛の減少、疾病の重症度の低下、治療薬の治療的効果の増大、病態または疾患の予後の改善、治療薬の投与量または投与頻度の減少、治療の侵襲性が低下している対象の治療計画の変更、及び治療薬による副作用の重症度または頻度の減少である。リンパ腫または白血病について、治療上の利益としては、疾患の新生物発生の減少または遅延、過剰増殖の低減、腫瘍成長の低下、転移の遅延、癌細胞または腫瘍細胞増殖率の低下も挙げられる。対象への活性物質の投与量は、熟練の施術者が好適な量を決定することができる対象の体重、投与態様及び疾患の適応症及び重症度に応じて変化する。
【００５３】
いくつかのケースでは、ＩＬ４０遺伝子またはＩＬ４０ｃＤＮＡ配列を含むアンチセンス分子は、ＩＬ４０が関与する疾患を有する対象において、ＩＬ４０の発現を低下させるために治療薬として使用され得る。例えば、アンチセンス分子はｓｉＲＮＡであってもよい。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法において使用するための小型阻害物質ＲＮＡ二重鎖である。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡが小型二本鎖セグメント（ｓｉＲＮＡ）に切断される自然発生遺伝子サイレンシングプロセスであり、その後、タンパク質−ＲＮＡ複合体（「ＲＩＳＣ」と称する）と関連し、標的ｍＲＮＡが切断される（５６）。さまざまな実施形態において、ｓｉＲＮＡは、その標的ＩＬ４０ｍＲＮＡに対して相補度が変動し、サイズ１８〜３０の塩基対であってもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡとしては、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方またはその両方の５’及び／または３’末端部での不対塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖の二重鎖であるか、または二重鎖領域を形成するためにヘアピン構造体を形成する一本鎖であってもよい。ｓｉＲＮＡのデザイン及び合成は、当該技術分野において周知である（５７）。また、ｓｉＲＮＡをデザインするためのコンピュータープログラムも利用可能である（５８）。他のＲＮＡｉ分子としては、ゲノム的にコードするＲＮＡであり、ＩＬ４０の遺伝子発現を調整し得るミクロＲＮＡが挙げられる。
【００５４】
対象は、ヒト、イヌ、マウス、ネコ、または、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヤギまたはヒツジなどの他の哺乳類であってもよい。いくつかの実施形態では、対象はＩＬ４０が関与する疾患の疑いのある対象である。いくつかの実施形態では、対象はＩＬ４０が関与する疾患の治療の必要のある対象または患者である。
【００５５】
解析、診断及びテラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）用のサンプルは、ヒト、イヌ、マウス、ネコ、または、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヤギまたはヒツジなどの他の哺乳類由来であってもよい。
【００５６】
異なる投与用製剤（滅菌、バッファ、緩効性、徐放性安定剤、軟膏など）は、最適の投与経路に依存して使用可能である。例えば、Ｎｉａｚｉ  Ｓ．Ｋ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２０１２を参照されたい。ＩＬ４０／ＩＬ４０受容体相互作用の抗炎症性アゴニストまたはアンタゴニストを用いた場合と同様に、治療効果を最適化するために他の確立された薬剤と組み合わせて使用可能である。加えて、本化合物（複数可）は、１つの製剤戦略において他の治療と組み合わせて使用してもよい。薬理変化体を使用して、所望の薬物動態学成果（分泌、半減期、溶解度、または分泌経路の最適化）を得ることができる。
【００５７】
これらの正確な投与量は、治療目的に依存し、当業者が既知の技術を使用して確認できる。例えば、Ａｎｓｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  （１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１〜３）、Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０８２４７７０８４６，  ０８２４７６９１８Ｘ，  ０８２４７１２６９２，０８２４７１６９８１：Ｌｌｏｙｄ  （１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ；及びＰｉｃｋａｒ（１９９９）Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓを参照されたい。従来技術で公知なとおり、タンパク質の分解、全身投与対局所送達、新規プロテアーゼ合成率、並びに年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時期、薬物相互作用及び状態の重症度の調整は、必須であってもよく、また当業者によっていくつかの実験で確認し得る。
【００５８】
さまざまな薬学的に許容可能な賦形剤は当業者において周知である。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容可能な賦形剤」としては、組成物の活性成分と混ぜ合わせたとき、成分が生物活性を保持することができ、対象の免疫系との破壊的反応を招くことのない材料が挙げられる。このようなものとしては、安定剤、防腐剤、塩若しくは糖複合体または結晶などを挙げることもできる。例えば、Ｎｉａｚｉ  Ｓ  ．Ｋ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２０１２を参照されたい。
【００５９】
例示的薬学的担体としては、滅菌水性非水性溶液、懸濁液及び乳濁液が挙げられる。例としては、これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型エマルションなどのエマルション、及びさまざまな種類の湿潤剤などの標準的薬学的賦形剤が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びエチルオレエートなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性溶液／水性溶液、エマルションまたは塩類溶液及び緩衝媒体などの懸濁液が挙げられる。親ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース及びデキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液また凝固油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養素補液、電解質補液（例えば、リンガーデキストロースをベースとしたものなど）が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、緩効性粒子、ガラスビーズ、包帯、眼へのインサート及び局所形態などの固体基質中に導入される。投与経路としては、局所、全身、呼吸器系、経口、眼、インプラント、膣内、肛門、座薬、除放デバイスなどが挙げられる。
【００６０】
核酸化合物のインビボ投与については、核酸は、遊離（または「裸」）核酸として投与されることができ、または核酸の細胞標的への送達を増大させる送達剤と共に配合することができる。送達剤の例としては、これらに限定されないが、リポソーム、カチオン性脂質、ＰＥＧ化ポリカチオン、カチオン性ブロックコポリマー及びポリエチレンアミン複合体が挙げられる（５９）。
【００６１】
本明細書内の別の項で記載した適応症用の既存の治療薬は、ＩＬ４０／ＩＬ４０受容体相互作用のアゴニスト／アンタゴニストを組み合わせて、または引き続いて、治療成果を最適化するために使用することができる。
【００６２】
本明細書に記載のＩＬ４０遺伝子、ｃＤＮＡ核酸、ペプチドまたはタンパク質は、ヒトＩＬ４０ヌクレオチドまたはアミノ酸配列をベースにしていてもよく、またはイヌ、マウス、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ若しくはウマなど、別の哺乳類由来のヌクレオチド及びアミノ酸配列をベースにしていてもよい。同様に、抗−ＩＬ４０抗体を作製するために使用される抗原は、ヒトＩＬ４０抗原をベースにしてもよく、またはイヌ、マウス、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギまたはヒツジなどの別の哺乳類由来のＩＬ４０抗原をベースにしていてもよい。
【００６３】
本発明は、添付の例を参照することによって更に理解されてもよく、これらの例は目的を説明することのみを意図するものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を制限するために構築されるものではない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
序論
近年特性が決定されたサイトカイン産生Ｂ細胞のサブセット、すなわち、Ｂ調節細胞（Ｂｒｅｇ／Ｂ１０）、Ｂエフェクタ−１（Ｂｅｌ）及びＢエフェクタ−２（Ｂｅ２）細胞により、炎症及び自己免疫疾患におけるＢ細胞の役割が抗体生成物に優ることを示すエビデンスが示される。特に、これらは、サイトカイン生成能力を示す。本明細書では、インターロイキン−４０（ＩＬ４０）と称された活性化Ｂ細胞により作製された新規サイトカインについて記載する。ＩＬ４０は、マウス及びヒトの両者の胎児肝臓及び骨髄において発現する未同定遺伝子（Ｃ１７ＯＲＦ９９）によってコードされる。また、ＣＤ４０Ｌ（またはＬＰＳ）によって刺激されたＢ細胞中に発現する。その産生は、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）によって増強され、ＩＦＮγによって阻害される。ＩＬ４０は２４ｋＤの分泌タンパク質であり、他の既知のサイトカインとの関連はない。Ｉｌ４０欠損マウス（Ｉｌ４０-/-）は、巨脾腫また改変Ｂ細胞表現型を呈し、パイエル板では、ＣＤ１９＋Ｂ細胞数の増大及びＩｇＡ産生細胞数の低下を有する。ＩＬ４０の転写は、泌乳乳腺において誘導される。更に、ＩＬ４０の転写がＳＬＥ患者由来のＰＢＭＣ内及びＭＲＬＦａｓ1pr/1prマウス由来の脾細胞内で上昇する。ＩＬ４０はＢ細胞の発現及び分化への多面効果を有する新規Ｂ細胞誘導サイトカインであると結論付けられる。
【００６５】
サイトカインは、細胞の成長、分化、炎症の調節及び造血に影響を与える活性を有する多面性分泌タンパク質の大規模な多様スーパーファミリーである（１、２）。ヒトの疾患を調節するサイトカインを介するメカニズムの解明において、新規サイトカイン及びそれらの受容体の同定は中心的であった。この情報は、これらの疾患の診断、治療及び予防に重要であった（３）。これらの重要性を考慮すると、例えば配列予測ソフトウエア及びデータベース検索など、新規サイトカインの検索に強い関心があった（４）。これによって、多くのサイトカインの同定が得られ、そのうちの最も多くは、遺伝子重複から発生する可能性の高いスーパーファミリーに属している。
（Ａ）サイトカインとしてのＩＬ４０の同定
【００６６】
本発明者らは、新規サイトカインの検索に関心を持っていた。この目的を達成するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ２．０  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（５，６）をベースとするＢｏｄｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＢＩＧＥ）として公知のヒトの身体における遺伝子発現の包括的データベースを用いた。このデータベースは、現在、１０５の異なるヒト組織／細胞型由来のゲノム規模での発現データを含有し、かつ、リンパ系組織並びに休止及び活性化されたＢリンパ球及びＴリンパ球の両者が挙げられる。免疫系において重要な新規遺伝子を同定するために、非免疫組織と比較したとき、リンパ球若しくは骨髄細胞のいずれかまたは免疫系の組織（骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺、扁桃）において多く発現した遺伝子に関してＢＩＧＥデータベースを検索した。このスクリーニングにより、リンパ系組織に関連した５１１の遺伝子及び免疫細胞に関連した１５６９を得て、ここ数十年において同定され、記述されたすべての免疫系遺伝子を実質上同定した（ほとんどのサイトカイン及びケモカイン遺伝子を含む）。重要なことに、３５の新規の良好でない特性決定された遺伝子が同定され、免疫系において多く発現されている膜貫通または分泌タンパク質のいずれかをコードすることが予測された。本発明者らは、近年これらの遺伝子、ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３３（ＴＳＰＡＮ３３）、活性化Ｂ細胞によって発現する膜貫通タンパク質の例を公表した（７）。
Ｂ.ＩＬ４０は、Ｂ細胞により産生されたサイトカインである。
【００６７】
胎児肝臓、骨髄及び活性化Ｂ細胞に発現する新規低分子分泌タンパク質をコードするこれらの遺伝子Ｃ１７ｏｒｆ９９の別の１つの特性決定について記述している。本発明者らは、活性化Ｂ細胞により産生された低分子分泌タンパク質であるという事実も含め、典型なサイトカイン特性を有するために、この分子をインターロイキン４０（ＩＬ４０）と称した。ＩＬ４０は、活性化時にＢ細胞により産生され、その生成物は、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−１３）またはＴＧＦβにより増強される。逆に、その生成物はＩＦＮγ、Ｔｈ１サイトカインによって阻害される。Ｉｌ４０-/-マウスは、脾臓中でのＢ細胞数の増加を有する巨脾症を示す。更に、Ｉｌ４０−／−マウスは、腸パイエル板内、ＩｇＡ産生部位での胚中心数及び全ＩｇＡ分泌Ｂ細胞が少ない。Ｉｌ４０とＩｇＡとの結合は、乳腺において泌乳の発生時にＩｌ４０が誘導される観測結果によって更に示唆される。最終的に、ＭＲＬＦａｓ(1pr/1pr)マウス（ＳＬＥマウスモデル）由来の脾細胞においてＩｌ４０転写が増加していることが判明し、自己免疫疾患において関与し得ることが示唆される。
【００６８】
結果
Ａ．新規サイトカインの同定
アノテーションされていない免疫系関連遺伝子（Ｃ１７ｏｒｆ９９）は、ＢＩＧＥデータベースの解析を介して最初に同定した。Ｃ１７ｏｒｆ９９ｍＲＮＡは、胎児肝臓、骨髄及び３０時間抗−ＣＤ４０＋ＩＬ−４により活性化させたＢ細胞において多く発現し、他の部位での発現は、ほとんどまたはまったく認められない。すべての組織及びＣ１７ｏｒｆ９９の発現の平均強度の完全なリストを表１に提示する。ヒト遺伝子は、予測された２０のアミノ酸（図１Ｂ）のＮ末端シグナル配列を有する２６５のアミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有し、２４５のアミノ酸（約２７ＫＤａ）の成熟タンパク質が予測される。ＢＩＧＥデータベースにおいてＩＬ４０の発現の完全なリストは、表１に提供される。霊長類、イヌ及びマウスなどの哺乳類において相同遺伝子が同定された（６０３０４６８Ｂ１９Ｒｉｋ、７２％のタンパク質配列変換）が、ニワトリ及びゼブラフィッシュ（図２）中には存在しなかった。遺伝子は、造血臓器（ホメオスタシス）（９）においてかつ活性化Ｂリンパ球（炎症性）（２）によって産生された低分子分泌タンパク質（８）をコードするため、ＩＬ４０（図１）と称している。ＢＩＧＥの発現プロファイルは、ヒト組織ＲＮＡ（図２Ａ）のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を使用して、マウスＲＮＡサンプルの同等の収集を用いて確認し、これは、免疫系関連組織及び特に骨髄においてマウス相同体が多くかつ特異的に発現していることが示された（図２Ｂ）。Ｐｆａｍ  ｓｅａｒｃｈから、ＩＬ４０は、現在公知のいかなるサイトカインファミリーにも属さずに（データに図示せず）、ＩＬ４０が造血臓器及び活性化Ｂ細胞において産生された新規サイトカインであることがわかる。
【表１】
2016540506.tif 000002
【００６９】
本試験の前に、Ｃ１７ｏｒｆ９９は、遺伝子の調査において分泌タンパク質として同定し、シグナル配列を予測した（１０）。ＩＬ４０が分泌されていることを確かめるために、ヒトＩＬ４０ｃＤＮＡをＢ細胞活性化及び分化のバーキットリンパ腫モデルであるヒト２Ｅ２Ｂ細胞からクローン化し（１１）、インフレームをｐＴＴ５のクローニング部位に挿入し（１２）、その結果、Ｃ末端８ｘＨｉｓタグとの融合タンパク質をコードする組換え型遺伝子となる。その後、ＨＥＫ２９３細胞をｐＴＴ５一Ｉｌ４０構造体または対照として空のベクターにより形質移入し、１日目及び３日目に上清を収集し、組換え型ＩＬ４０タンパク質の存在について解析した。抗−Ｈｉｓ抗体を用いた精製上清の親和力のウエスタンブロッティング法により、ｐＴＴ５−Ｉ１４０構造体により形質移入された細胞のみに約２７ｋＤのタンパク質を検出し（図１Ｃ）、ＩＬ４０が分泌タンパク質であることを確認する。
【００７０】
Ｂ．ＩＬ４０は、活性化Ｂ細胞により産生される。
例えばＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５などのサイトカインの多くは、リンパ球の個体発生及び活性化の両方において機能を有するため（１３）、本発明者らは、ＩＬ４０は更にこれらのプロセスに関与している可能性があると仮定した。ＢＩＧＥデータベースにおけるその発現パターンから、Ｂ細胞がＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ−４により刺激されるとき、ＩＬ４０の発現が増加していることがわかる。この点を確認するために、休止または活性条件下において、ＰＢＭＣから精製されたヒトＢ細胞におけるＩＬ４０の転写を抗−ＣＤ４０＋ＩＬ−４を用いて２４時間測定し（図４Ａ）、ＴＳＰＡＮ３３の発現と比較した（本発明者らが近年記述したＢ細胞活性化マーカー）（７）。ＩＬ４０の転写は、ＴＳＰＡＮ３３（ｐ＝０．０１）と共に５０倍を超えて（ｐ＝０．００２）上方制御したところ、活性化されたヒトＢ細胞によるＩＬ４０の発現が示された。これらの実験は、休止または活性条件下においてヒト２Ｅ２及びジャーカット（Ｔ細胞株）を使用して繰り返し行った（２Ｅ２活性化用の抗−ＣＤ４０ｍＡｂ及び抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８）（図５Ａ）。ＩＬ４０転写は、活性化２Ｅ２細胞においてのみ誘導された。ＬＰＳ＋ＩＬ−４によって活性化されたマウス脾細胞（図４Ｂ）及び同一条件下にて刺激されたＡ２０−２ＪマウスＢ細胞（図５Ｂ）と類似の結果が得られた。ＩＬ４０転写の反応速度を測定するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来のＣｄｌ９+Ｂ細胞（図６）にＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ−４により、８時間、２４時間、７２時間及び９６時間刺激を与え、Ｉｌ４０及びＡｉｃｄａ（遺伝子コードＡＩＤ、活性化Ｂ細胞において免疫グロブリンクラススイッチに関与する酵素（１４））；遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図４Ｃ）。ＩＬ４０  ｍＲＮＡを８時間以内で上方制御し、その発現は９６時間以上上昇し続けた。
【００７１】
活性化Ｂ細胞は、刺激に依存してＴｈ１型（Ｂｅ１由来）またはＴｈ２（Ｂｅ２由来）サイトカインを分泌することが示されたため（１５）、ＩＬ４０の発現をサイトカインによって同様に調節したか否かを判断する必要があった。
【００７２】
マウス脾細胞においてＣＤ４０（図４Ｅ）またはＴＬＲ４（図７）の刺激は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＦＮγまたは組み合わせたものを混ぜ合わせた（図４Ｄ）。ＩＬ４０転写はＴｈ２サイトカインの刺激時に誘発され（ＩＬ−４及び／またはＩＬ−１３、約８倍）、ＩＦＮγ（Ｔｈ１サイトカイン）は３倍増加させたのみであった。抗−ＣＤ４０の刺激によりＩＬ４０の転写が２０倍以上増加した。興味深いことに、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ４またはＩＬ１３）は、抗−ＣＤ４０の刺激のみの場合よりもほぼ２倍以上のＩＬ４０の産生と協同しており、その一方でＩＦＮγにより、抗−ＣＤ４０単独で観測されたレベルの半分までＩＬ４０の発現が減少した。更に、抗−ＣＤ４０＋ＴＧＦβによる刺激により最も高いレベルのＩＬ４０の産生が誘導された（図４Ｅ）。本発明者らは、抗−ＣＤ４０の刺激時にＩＬ４０の産生が誘導され、Ｔｈ２サイトカイン及びＴＧＦβにより協同され、ＩＦＮγにより阻害されると結論付けている。
【００７３】
Ｃ．ＩＬ４０-/-マウスは、Ｂ細胞ホメオスタシスにおいて欠陥を有する。
ＩＬ４０の生物活性の特性を更に決定するために、ＩＬ４０（６０３０４６８Ｂ１９Ｒｉｋ）遺伝子の標的欠失を有する突然変異マウス株を得た（図８ａ、遺伝子型の決定を確認するには図９を参照されたい）。ＩＬ４０−／−マウスは、生存可能であり、かつ受精し、体重増加または身体の大きさに欠陥はない（図１０）。それぞれ、胸腺、腹腔、脾臓及び骨髄におけるＴ細胞サブセット（図１１）、Ｂ１／Ｂ２の細胞比率（図１２）、プラズマ細胞及び胚中心細胞のＢ細胞成熟（図１３）、及びｐｒｏ／ｐｒｅ／未成熟Ｂ細胞集団（図１４）を比較し、ＷｔとＩＬ４０−／−マウスとでは有意差のないことが判明した。しかし、６週齢までにＩＬ４０−／−マウスは巨脾症を呈し、ＩＬ４０−／−マウスでは、長さ（０．０９４０±０．００４対０．１３６０±０．０１５１ｃｍ、ｐ＝０．００５）、腫瘤（０．１０１８±０．００５対０．１３６６±０．０１４７ｇ、ｐ＝０．０２８５）及び総細胞数（７６．０３±６．８７対９６．３４±２．１５＊１０＾６細胞、ｐ＝０．０２２４）が増大した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞対Ｔ細胞（ＣＤ３＋）との比率を比較したとき、ＩＬ４０−／−マウスは、Ｗｔマウスと比較して、Ｔ細胞に対してより高い比率のＢ細胞を含むことが明らかになり、この差は統計的に有意であった（４．４対３．４、ｐ＝０．０８６（図８Ｃ）。更に、ＩＬ４０−／−マウスでは、ＩｇＧｌ及びＩｇＡはこれらの野生型（ＷＴ）対応物（それぞれ、６１６対１８９μｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０５及び１０対２１μｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０３）を上回る血清レベルの上昇を示した（図８Ｆ）。これらのデータからＩｌ４０−／−マウスにおけるＢ細胞のホメオスタシスが変化する可能性が示唆され、かつ、Ｉｌ４０は、Ｂ細胞の分化／生存において任意の役割を果たし得ることが示唆される。
【００７４】
Ｄ．ＩＬ４０／マウスは、より少ないＩｇＡ産生細胞を有する。
ＩＬ４０-/-マウスは、血清ＩｇＡ値の上昇を示すと考えられるため、粘膜免疫と結合した抗体イソタイプ、パイエル板、消化管の免疫監視に関与するリンパ結節関連の腸におけるプラズマ及び胚中心細胞の量を比較した（１５）。パイエル板は、天然胚中心及びＩｇＡ分泌プラズマ細胞を含む（１６）。胚中心細胞（Ｂ２２０+ＰＮＡ+）の存在に関して、ＷＴ及びＩＬ４０-/-マウスのパイエル板から単細胞懸濁液を調製し、染色した（図１５ａ）。ＩｇＡスイッチ胚中心細胞（ＰＮＡ+Ｂ２２０hiＩｇＭloＩｇＡ+）（図１５Ｂ）及び全ＩｇＡスイッチ細胞（Ｂ２２０lo-hiＰＮＡ+ＩｇＡ+）（図１５Ｃ）をフローサイトメトリーにより測定した（１７〜１９）。ＩＬ４０-/-マウスは、２倍超の胚中心細胞の減少（ｎ＝５、ｐ＝０．０００５）、ＩｇＡスイッチ胚中心細胞では２．５倍の減少（ｎ＝５、ｐ＝０．０００１）、及び全ＩｇＡ陽性細胞（ＰＮＡ+胚中心Ｂ２２０hi及びＢ２２０neg-loプラズマ細胞）では１０倍の減少（ｎ＝５、ｐ＝０．０００１）が認められた。更に、Ｗｔ及びＩｌ４０-/-マウスの糞塊中のＩｇＡ濃度は、ＥＬＩＳＡ（図１５Ｄ）により測定し、ＩｇＡ陽性細胞の欠失が粘膜におけるＩｇＡ分泌レベルに影響を与えるか否かを判断した。Ｗｔマウスと比較して、ＩＬ４０-/-の糞塊中のＩｇＡ値は２倍の減少が認められた（ｎ＝１０、ｐ＝０．００６）。ＩｇＡの欠失がＩＬ４０-/-マウス中に存在することにより、ＩＬ４０が乳腺に発現するか否かを調査した。図１５Ｅに示すように、乳腺内での泌乳時にＩＬ４０の発現が誘導される。総合すれば、これらの観測結果からＩｇＡ応答におけるＩＬ４０の役割が示唆される。
【００７５】
これらの変化は、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）機構（２０、２１）での欠陥または欠陥、胚中心応答（増殖（２２）、生存（２３）、活性化（２４））の成熟での欠陥に起因し得る。最初に可能性のある機構として特定するために、ＷＴ及びＩｌ４０-/-Ｂ細胞におけるインビトロでのＣＳＲの誘発を実施し、得られたＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＡのクラススイッチはフローサイトメトリーを使用して監視した（図１６を参照されたい）。ＷｔとＩｌ４０-/-ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３スイッチ細胞との間で差異は認められず、Ｉｌ４０-/-Ｂ細胞（ｐ＝０．０３）においてＩｇＡスイッチのわずかな増加のみ認められた。したがって、本発明者らは、Ｉｌ４０-/-マウスのパイエル板におけるＩｇＡ産生細胞の欠乏は、ＣＳＲを受ける能力の欠陥によるものではないと結論付ける。
【００７６】
ＩＬ４０応答遺伝子の同定
その後、本発明者らは、ＩＬ４０がリンパ球に及ぼす効果をより詳細に調査することにした。この目的を達成するために、遺伝子アレイを用いて、休止及びＷＴまたはＩｌ４０-/-マウスのリンパ節から得たリンパ球を刺激したＬＰＳ+ＩＬ−４に関する国際的な遺伝子発現解析を実施した。
【００７７】
遺伝子プロファイルの２つの群：休止または活性化条件下で、ＷＴマウス対ＩＬ４０-/-マウスにおいて上方制御されている遺伝子（表２）及びＩＬ４０-/-マウス対ＷＴマウスにおいて上方制御されている遺伝子（表３）の特性を決定した。予測したとおり、最も特異的な発現遺伝子はＩＬ４０であった。興味深いことに、上位４番目に特異的に発現した遺伝子はｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ２（Ｓｙｎｇｒ２）であった。Ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ２は、中枢神経系のニューロン中に発見されるｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎファミリーに属しているが、そのファミリーメンバーとは異なり、Ｓｙｎｇｒ２は、中枢神経系内に発現するものではない。ＳＹＮＧＲ２の発現プロファイルを決定するために、ＳＹＮＧＲ２の発現部位に関してＢＩＧＥデータベースを解析した（図１７。ＢＩＧＥにおけるＳＹＮＧＲ２の最上発現部位に関して表４を参照されたい）。ＳＹＮＧＲ２は、活性化Ｂ細胞、単細胞及びヒト結腸によって発現すると判断された。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００７８】
近年では、ＩＬ４０は活性化Ｂ細胞により産生されると判断されているが、ＩＬ４０の標的細胞は明らかになっていない。ＩＬ４０がＢ細胞またはＴ細胞の遺伝子発現に作用するか否かを判断するために、ＷＴマウスサンプルとＩｌ４０-/-マウスサンプルにおいて、ＣＤ８１、ＣＤ８６、Ｍｓ４ａｌ（ＣＤ２０）、ＩＬ−４及びＳｔａｔ６など、「Ｂ細胞の活性化／分化」に関与する遺伝子」と考えられる５０の遺伝子とＣＤ３（３遺伝子）、Ｃｘｃｒ４、Ｉｌ２α及びＩＦＮγなど、「Ｔ細胞の活性化／分化」に関与する遺伝子」と考えられる３８の遺伝子とを比較した（表５）。ＩＬ４０がＴ細胞に作用するとき、ＩＬ４０が存在しないことにより（ＩＬ４０-/-サンプルにおいて）、Ｂ細胞ではなくＴ細胞に影響を及ぼすものであり、反対に、ＩＬ４０がＢ細胞に作用するとき、Ｂ細胞活性化遺伝子の差が予期される（図１８）。更には、ＩＬ４０が双方の細胞型に作用するとき、双方の遺伝子セットは変化するものとする。休止状態では、Ｂ細胞発現遺伝子のみがＷＴとＩＬ４０-/-マウスとの間で特異的に発現するが、この差は、統計上有意ではなかった（ｐ＝０．０９）（これはおそらく、Ｔ細胞との比較に使用されたリンパ節サンプルでのＢ細胞の数がより少ないためである）。しかし、ＬＰＳ＋ＩＬ−４により刺激されたサンプルにおいて（Ｔ細胞遺伝子ではなく）、Ｂ細胞は、特異的に発現した唯一の細胞であった（ｐ＝０．０１８）。これらの結果により、ＩＬ４０応答細胞がＢ細胞であることが強く示唆される。
【表５−１】
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【表５−２】
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【００７９】
ＩＬ４０は、全身性エリテマトーデスにおいて上方制御される。
自己免疫疾患では、多くの場合、例えばＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＢＬｙＳなどの既知のＢ細胞サイトカインの量の異常調節が行われるため（７）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のＭＲＬ／Ｆａｓ1pr/1prマウスモデル由来の脾細胞におけるＩＬ４０のｍＲＮＡの発現を測定した。このモデルでは、マウスは、抗−ｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）抗体の産生と共に全身的自己免疫値及び免疫性糸球体腎炎の上昇を示し、そのいずれもがＳＬＥの特徴である。幼若マウスは正常であると考えられ、９週の時点で目に見える症状は示さなかった。２４週までにリンパ腺症及びいくつかの皮膚病変を伴う中間狼瘡症状が発現し、３６週までに完全な狼瘡症状が明らかになり、多くの場合死に至る（２５）。ＩＬ４０ｍＲＮＡの発現（図１９）が増加することが判明した。マウスモデルにおいて検出されたＩＬ４０値の上昇により、ＩＬ４０の異常調節がＳＬＥの病理学に関与する場合もあり、また、本疾患の治療の対象を示し得ることが示唆される。
【００８０】
これらのヒト遺伝子の機能的特性付けにおいて有意な進歩があったが、それらの大多数においては、情報はほとんどまたはまったくなかった。実際に、コンセンサスコード配列（ＣＣＤＳ）（２６、２７）プロジェクトでは、１８，６７３の遺伝子番号（公表１４）が列挙されており、そのうちの１３６６９のみが記述名（ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ヒト遺伝子命名委員会）を有する（２８）。このため、５，０００を超えるＣＣＤＳエントリーには有用な名前はなく、ほとんどが確実に特性が決定されていない状態である。これらの研究を阻害する別の合併症では、研究するための試薬を欠いている。本明細書では、本発明者らは、未同定遺伝子Ｃ１７ｏｒｆ９９によってコードされるＩＬ４０と称される新規サイトカインの同定に関して報告している。Ｃ１７ｏｒｆ９９は、最初は、ヒト遺伝子発現のＢＩＧＥデータベースの解析を介して同定された８６の遺伝子セットの一部として同定された（２９）。これらの発現パターンは、体内の他の場所に発現がほとんどまたはまったく認められず、膜貫通または分泌タンパク質のいずれかをコードすることが予測されている細胞器官または免疫系のいずれかと関連している。本発明者らは、近年、この方法を使用して同定した新規Ｂ細胞活性化分子（ＴＳＰＡＮ３３）の同定についても報告している（７）。ＩＬ４０／Ｃ１７ｏｒｆ９９は、本発明者らがこの解析の一部として報告している第２の遺伝子である。
【００８１】
新規サイトカインインターロイキン−４０（ＩＬ４０）としてＣ１７ｏｒｆ９９によりコードされたタンパク質の同定は、いくつかの因子に基づく。第１に、発現が免疫系のいくつかの組織及び細胞に制限される低分子分泌タンパク質であり、他の多くの公知のサイトカインに関する発現プロファイルに類似している。本発明者らは、骨髄におけるＩＬ４０の発現に関して調査を開始し、他のサイトカインと対照的に、骨髄間質細胞ではなく、リンパ液により発現したことを見出した。ＢＩＧＥデータベースにおいて活性化された末梢血Ｂ細胞により、わずかではあるが、ＩＬ４０が有意に発現することから、更にこれがＢ細胞生成物であったことが示唆された。ＩＬ４０は、低分子分泌タンパク質をコードし、その発現が、前炎症状態下で培養されたＢ細胞中において誘発され、さまざまなサイトカインによって調節されている。総合すれば、本発明者らは、Ｃ１７ｏｒｆ９９は、新規Ｂ細胞誘導サイトカインをコードしていると結論付ける。
【００８２】
近年まで、もっとも公知であるサイトカインは、近年特徴が明らかになったものであっても、公知のサイトカインファミリーに属している。例えば、ＩＬ３７は、インターロイキンファミリ１ーのメンバーである。これにより、同定が促進される。その一方で、ＩＬ４０は、任意の公知サイトカインファミリーには属さない。本発明者らは、哺乳類において相同遺伝子を同定したが、ニワトリまたはゼブラフィッシュでは同定しなかった。このことは、その機能が哺乳類の免疫系に制限され得ることを示している。
【００８３】
実際に、本発明者らは、ＩＦＮγ、Ｔｈ１サイトカインではなく、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−１３）の存在下において、抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（またはＣＤ４０Ｌ、若しくはＬＰＳ）による活性化時に、Ｂ細胞内でＩＬ４０が誘導されると判断した。ＩＬ４０は、ＴＧＦβの存在下における活性化により最も有意に誘導される。これまでＢ細胞機能上でＴＧＦβに寄与していたいくつかの機能は、間接的にＩＬ４０によって媒介されてもよい。ＴＧＦβがＢ細胞の増殖（３０）及びＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３及びＩｇＥへのＣＳＲを同時に阻害し、ＩｇＡ及びＩｇＧ２ｂに対するＣＳＲを誘導する。
【００８４】
Ｂ細胞条件でのＴＧＦβノックアウト（３１）またはＴＧＦＲ（３０）（もしくはＴＧＦＲの成分、すなわちＳｍａｄ２-/-（３２））マウスは、パイエル板中でのＩｇＡの産生において欠陥を有するが、胚中心細胞の頻度及び数の増大並びに他のイソタイプのすべてに対するＣＳＲは増加した。ＩＬ４０-/-マウスは、パイエル板のＩｇＡ産生細胞中に欠陥を有するが、胚中心細胞が減少していることから、この欠陥の機構はＴＧＦβまたはＴＧＦＲ欠失マウスから分離されていることが示唆される。更に、内因性ＴＧＦβは、ＣＳＲのインビトロ脾細胞の誘導中においてすべてのイソタイプに対してＣＳＲには必須である。内因性ＴＧＦβが阻害されることによりすべてのイソタイプのＣＳＲが減少し（３３）するため、ＬＰＳ及びＴｈｌまたはＴｈ２サイトカインによるインビトロ誘導中、Ｉｌ４０-/-マウス由来のＢ細胞でもＣＳＲに欠陥を有することはないが、ＩｇＡスイッチのわずかな増加は認められた。ＧＣ及びＩｇＡ産生細胞内の欠陥は、例えば、活性化（ＣＤ４０またはＢ７欠失マウス）（３４）、増殖（Ｃｃｎｄ３-/-マウス）（２２）、生存（Ｐｄｃｄ１ｌｇ２-/-、ＣＤ２７４-/-Ｐｄｃｄ１ｌｇ２-/-及びＰｄｃｄ１-/-マウス）（３５）、または基底膜への移動（ＦＴＹ７２０によるＳ１Ｐ阻害）（３６）など、ＧＣ応答の欠陥により発生したと考えられる点に注意することが重要である。しかし、これらの欠陥はいずれも、脾臓においてＢ細胞数の増加を有するが、パイエル板における胚中心細胞及びＩｇＡ分泌細胞の数が少ないＩｌ４０-/-マウスの表現型に類似している。また、Ｉｌ４０-/-マウスの糞便中のＩｇＡ数が少ないことを明らかにした。ＴＧＦβでは、活性化Ｂ細胞によるＩｌ４０の産生を強く増強し、また乳腺における泌乳時にＩｌ４０が誘導される。総合して考えると、これらの観測結果から、Ｉｌ４０がＩｇＡ応答に対するＢ細胞の分化に関与していることがわかる。
【００８５】
近年では、分泌サイトカインを介する炎症誘発性または抗炎症性応答のスキューイングにおいて、Ｂ細胞は、Ｔ細胞との相互作用を有することがわかっているため（３７）、Ｂ細胞サブセットによって産生されるサイトカインは、免疫調節の主要調節因子として認識されている。リウマチ性関節炎（ＲＡ）及びＳＬＥなどの自己免疫疾患の治療における治療戦略として、特異的サイトカイン相互作用の改変により需要が増加しているため、活性化Ｂ細胞により産生される新規サイトカインを発見することは非常に有用である（３８、３９）。更に、Ｂ細胞は、多くのヒト自己免疫疾患に関与していることがわかっており、このため、Ｂ細胞により産生された新規サイトカインを同定することにより、Ｂ細胞媒介病態の理解に寄与することになる。
【００８６】
本明細書において、本発明者らは、周辺域において活性化Ｂ細胞により排他的に産生された新規サイトカインであるＩＬ４０に関する最初の報告について記述している。これまでにＩＬ４０に関する報告が存在しないため、その確実な経路及びシグナル伝達機構は明らかになっていない。本発明者らは、マイクロアレイ解析により、ＷＴとＩｌ４０-/-マウスのリンパ節とを比較したとき、ほとんどのＢ細胞遺伝子が変化したことを明らかになったため、ＩＬ４０は、自己分泌シグナル伝達において活性化Ｂ細胞により機能し得ると考えている。また、免疫応答の調節におけるＢ細胞サイトカインの関与を理解するにあたって、Ｂ細胞の分化に伴う新規サイトカインの発見も重要である。更に、ＩＬ４０-/-転写は、ＳＬＥマウス及びＳＬＥヒトにおいて増加していることから、ＩＬ４０の異常調節が自己免疫疾患に関与し得ることが示唆される。
【００８７】
方法：
Ｂ細胞、ＣＳＲ及びプラズマ細胞の分化
脾臓細胞をＦＢＳ（１０％）、５０ｍＭβ−メルカプトエタノール及び１ｘ抗生物質−抗かび物質混合物（１５２４０−０６２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）の入ったＲＰＭＩ中で３７°Ｃにて４８ウェルプレートで再懸濁し、以下の試薬により刺激した：ＩｇＡへのＣＳＲに関して、大腸菌由来のＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）（０５５：Ｂ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び抗−ＩｇＤデキストラン（Ｆｉｎａ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。更に、ＩｇＧへのＣＳＲ用のｒｍＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）とＩｇＧ３へのＣＳＲ用のＩＦＮ−γ（５０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．）とを組み合わせてＬＰＳを使用した。表面Ｉｇを解析するために、ＦＩＴＣ−抗−マウスＩｇＧｌ（クローンＡ８５−１）、抗−マウスＩｇＧ２ａ（クローンＲ１９−１５）、抗−マウスＩｇＧ２ｂ（クローンＲ１２−３）、抗−マウスＩｇＧ３（クローンＲ４０−８２）または、抗−マウスＩｇＡ（クローンＣ１０−３）ラットｍＡｂ及びＰＥ−抗−マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（クローンＲＡ３−６Ｂ２）ラットｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による染色後、第４日目に細胞を収集した。細胞はＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳにより解析した。
【００８８】
パイエル板Ｂ細胞をフィリコエリトリン（ＰＥ）−標識抗−マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｒａｔｍＡｂ（ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦＩＴＣ−標識ＰＮＡ（Ｅ−Ｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）、７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＡＰＣ−標識ＩｇＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより解析した。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲを用いて、所与のサンプル中のＩＬ４０ｍＲＮＡの量を測定することができる。この目的では、さまざまなマシンは利用可能であり、それぞれが正確なｍＲＮＡを増幅し、測定するために、特定のプライマーのデザインを必要とする。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ））を使用した。
【００９０】
実施例２
ＩＬ４０受容体運搬細胞の同定
ＩＬ４０受容体を運搬している細胞を判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓を収集し、均質化し、ＦＡＣＳチューブ（０．５×１０Ｅ６細胞／チューブ）に入れた。まず、脾臓を氷上で３０分間、ＦＡＣＳブロックバッファにてインキュベートした。次に、氷冷ＦＡＣＳ洗浄により１回細胞を洗浄して、組換え型Ｈｉｓ−タグＩＬ４０（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間氷上でインキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、氷上でウサギ抗−６ｘ  Ｈｉｓ標識抗体（１：５００希釈）で３０分間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ（１：２００希釈）、イソタイプ対照または他の細胞表面染色抗体に共役結合されたヤギ抗−ウサギ二次抗体でインキュベートした。結果は図２０に示す。この実験から、ＩＬ４０はＢ細胞に結合するが、Ｔ細胞に結合しないことがわかった。
【００９１】
実験で使用した試薬：
ウサギ抗−６ｘＨｉｓタグ抗体（Ａｂｅａｍ、カタログ番号ａｂ９１０８）
ＦＩＴＣロバ抗−ウサギ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０６４０３）
ウサギＩｇＧイソタイプ対照（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−２０２７）
ＰＥ抗−マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０３２０７）
ＡＰＣ抗−マウスＣＤ８ｂ．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１４０４０９）
ＰＥ抗−マウスＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３０７）
ＡＰＣ抗−マウスＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１５５１１）
【００９２】
実施例３
受容体発現細胞のサイトカインに対する機能的応答。細胞においてＩＬ４０によって調節するバイオマーカー遺伝子を見出すために、脾臓、リンパ節、胸腺または骨髄などの免疫器官由来細胞をさまざまな量の組換え型マウスまたはヒトＩＬ４０（使用される細胞の発生源に依存して）と共にインキュベートし、その後、細胞をこれらの遺伝子のｍＲＮＡに転写させるために、数時間（６時間、８時間、２４時間）インキュベートした。その後、細胞を採取して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの遺伝子アレイを用いてマイクロアレイ解析のために処理した。標準的技術を用いてｍＲＮＡを調製し、マイクロアレイを用いて、ハイブリダイゼーションのためにｃＤＮＡを産生している。マイクロアレイを読み取り、データは専有Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウエアにより解析した。遺伝子は制御されている。
【００９３】
実施例４
アゴニストまたはアンタゴニストの機能に関するＩＬ４０配列変異型の評価。受容体発現細胞の機能的応答を使用して、アゴニストまたはアンタゴニストを監視することができる。この目的を達成するために、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか一方を用いて受容体発現細胞をインキュベートし、ｑＰＣＲによりＩＬ４０応答遺伝子の発現を監視することができる。これらの遺伝子の量により、ＩＬ４０がその受容体に結合できるか否かが示される。キラー細胞は、これらのキラー細胞においてＩＬ４０によって誘導される遺伝子と同一の遺伝子誘導するＩＬ４０アゴニストを用いてインキュベートする。ＩＬ４０及びそれぞれの候補アンタゴニストを用いてキラー細胞をインキュベートした場合、アンタゴニストにより、これらのバイオマーカー遺伝子の誘導をブロックするものとする。
【００９４】
実施例５
受容体構造の同定の予測的実施例。サイトカインの受容体は、いくつかのタンパク質鎖から構成され得る。良好な結果をもたらす確立された方法を使用して、後述のようないくつかの可能な方法を使用してＩＬ４０受容体を同定することができる。
【００９５】
方法Ａ：種子方法、ｃＤＮＡライブラリ、及びクローン結合試験。ｃＤＮＡライブラリにより、ＩＬ４０に結合することが既知の細胞を調製することができる。いずれの細胞がＩＬ４０に結合するかは、ＩＬ４０を放射能タグで標識し、ラジオイムノアッセイを実施することによって決定することができる。別の方法としては、Ｈｉｓ−タグＩＬ４０を使用して、細胞に結合することができ、また、抗−Ｈｉｓ抗体を使用して、受容体を発現する細胞へのサイトカインの結合を検出することができる。Ｈｉｓの代わりにＦＬＡＧなどの他の標識を使用することができる。一旦、受容体を発現する細胞が同定されると、これらの細胞のｃＤＮＡライブラリを作製することができ、ＨＥＫ２９３またはＢＡＦ３細胞などの細胞をｃＤＮＡライブラリークローンのプールにより形質移入することができる。現在、ＩＬ４０に結合するこれらの細胞は、上述のとおり監視することができる。蛍光性標識細胞は、フローサイトメトリーにより選別することができ、ｍＲＮＡの供給源として使用するように培養することができる。このｍＲＮＡを使用して、ＩＬ４０受容体鎖の発現も担う所与の細胞に形質移入されたライブラリからｃＤＮＡをクローニングすることができる。ｃＤＮＡ構造体における特定の配列を使用して、その細胞中で見出されるライブラリｃＤＮＡの他に、ＰＣＲ用にプライマーをデザインすることができる。ＩＬ４０受容体が構成される鎖の数とは関係なく、本方法を使用することができ、唯一の相違点は、陽性細胞が同定される頻度である。
【００９６】
方法Ｂ：生化学的方法、リガンドの標識及び結合複合体の単離。このリガンドをＨｉｓ若しくはＦＬＡＧ（またはその他）などのタグにより標識し、ＩＬ４０受容体を発現する細胞由来の膜を用いてインキュベートすることができる。さまざまな洗剤を添加して、受容体を結合し、抗−Ｈｉｓまたは抗−Ｆｌａｇ抗体により免疫沈降させたゲル中で複合体を奏功させることができるリガンドの能力を最適化することができる。この方法は、ＩＬ４０受容体が有する鎖の数に関係なく使用するものとする。得られた免疫沈降バンドを単離して、配列を決定し、バイオインフォマティクスを使用して、各タンパク質をコードする遺伝子の同一性を判定することができる。
【００９７】
方法Ｃ：遺伝的方法；２ハイブリッドシステム。ＩＬ４０相互作用タンパク質は、２つの酵母菌ハイブリッド系を用いて同定することができる。ＩＬ４０は、融合タンパク質（例えば、ＧＡＬＢＤ）として調製し、その潜在的に相互作用するタンパク質は、ＧＡＬＡＤで標識された融合タンパク質として調製することができる。この場合、ＩＬ４０は「餌」であり、相互作用タンパク質は「餌食」である。サッカロマイセス・セレヴィシエにおいてこの系の試験を行い、この酵母菌系は、相互作用タンパク質により報告された遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を招くことになる。ＬａｃＺ遺伝子に発現する酵母菌は、２つのタンパク質の良好な相互作用（相補性）が発現する酵母菌である。この系により、ＩＬ４０受容体を構成するいくつかのタンパク質を同定することができる。
【００９８】
実施例６
抗体の産生
方法Ａ：マウスまたはウサギポリクローナル；免疫的選択。抗体は、組換え型ヒト、マウスまたはラットＩＬ４０により動物を免疫化することにより、作製することができる。ヒツジ、ヤギ、ロバまたはウマは、免疫化することができる。いくつかの免疫化量を用いることができ、また、抗体の作製は、ＥＬＩＳＡによって監視することができる。一旦所望の応答が得られると、免疫化させた動物を出血させることにより、また血清を得ることにより、抗体を採取することができる。
【００９９】
方法Ｂ：マウスまたはラットモノクローナル抗体。マウスをＩＬ４０により免疫化し、マウスの応答を監視し、かつＩＬ４０に対して強い応答を示すものを選択することによって、ヒトＩＬ４０に対するモノクローナル抗体を作製することができる。脾臓を得て、骨髄腫細胞に対してポリエチレングリコールまたは類似の融合試薬により融合して、ハイブリドーマを産生する。得られたハイブリドーマをインビトロで成長させ、ＨＡＴ培養液を用いて選択し、ハイブリドーマを選択的に成長させることができる。得られたハイブリドーマをクローン化し、産生された抗体は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン、ＦＡＣＳまたは免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることができる。
【０１００】
ファージディスプレイを用いる抗体の作製。マウスをヒトＩＬ４０により免疫化し、これらの脾臓を使用して、ファージディスプレイライブラリを生成する。その後、組換え型ＩＬ４０に結合する能力に関して、このライブラリをスクリーニングする。良好なファージディスプレイクローンを同定し、抗体の結合部位の配列情報を得るためにこれらの配列を得る。分子生物学技術を用いて得られた抗体に遺伝子操作を行い、適切な完全ヒト抗体とすることができる。
【０１０１】
実施例７
サイトカインの発現のための核酸構造体
方法１：ヒトまたはマウス由来の細胞、ＩＬ４０ｍＲＮＡの発現を使用して、固定オリゴ−ｄＴを用いるＲＴ−ＰＣＲを実施することができる。次にＩＬ４０のためにデザインされたプライマーを用いて、ＩＬ４０ｃＤＮＡを増幅することができる。このｃＤＮＡを哺乳類、細菌または昆虫プラスミドベクターなどの高発現ベクターに挿入することができる。各系では、ＩＬ４０遺伝子を含有するこのｃＤＮＡを適切な受容個体細胞に挿入して、その細胞がＩＬ４０タンパク質を産生することができるようにインキュベートすることができる。これらの細胞の上清を採取して、生化学的方法を用いてＩＬ４０を精製するために使用する。ヒトＩＬ４０  ｃＤＮＡ配列（配列番号４）を図２１に示す。
【０１０２】
方法２：方法１と同様ではあるが、方法１にはないエクソン／イントロンに特異的なプライマーをデザインすることによって、ＩＬ４０ｍＲＮＡのクローニングスプライシング変異体のクローニングを行う。
【０１０３】
方法３：標識遺伝子またはレポーター遺伝子をコードする配列を挿入して、融合タンパク質を作製することができる点以外は方法１と同様である。融合タンパク質を使用して、ＩＬ４０産生細胞を検出することができる。ウェスタンブロット法または親和性精製では、標識融合タンパク質も使用することができる。
【０１０４】
方法４：プロモーターを異なる遺伝子の高誘導性または高活性プロモーターと置換することができる点以外は、方法１と同様である。これにより、最終発現系において導入遺伝子の発現を制御することができる。
【０１０５】
実施例８
ＩＬ４０タンパク質の作製及び精製のための上記核酸構造体の使用
方法１：陽性または陰性選択剤（ネオマイシン／βガラクトシダーゼ／ＧＦＰ）と共にＩＬ４０ｃＤＮＡインサートを含有するプラスミドベクター構造体を使用して、ＩＬ４０ｃＤＮＡが挿入されるベクターに依存して、哺乳類（ＨＥＫ、ＨＥＬＡなど）細胞株、昆虫細胞または細菌に形質移入することができる。プラスミドを発現する形質転換／形質移入細胞は、正の選択または負の選択を行い、組換え型プロテインを産生することのない細胞を除去することができる。高用量組換え型ＩＬ４０は、形質移入細胞／形質転換細胞の上清または溶解産物から直接得ることができる。
【０１０６】
方法２：別の方法では、ＩＬ４０ｃＤＮＡインサートを含むベクターにより形質移入／形質転換した細胞の溶解産物で化学的沈殿を実施して、濃縮量のタンパク質を得ることができる。化学的方法としては、塩、ｐＨ、有機溶剤、金属イオン、非イオン性ポリマー、すべてのタンパク質を非特異的に沈殿させる方法が挙げられる。組換え型タンパク質を含有する溶解産物は、化学的沈殿剤と共に混合する。沈殿物は、低速遠心分離またはデカントすることにより採取することができる。次により小さい沈殿剤がメンブレンを通過することができるような透析チューブを介して透析することにより沈殿物を再懸濁し、そのチューブ内にタンパク質を保持することができる。沈殿物は、組換え型タンパク質など、濃縮した量の全タンパク質を含有することになる。
【０１０７】
方法３：別の方法では、抗−ＩＬ４０抗体または電磁ビーズに連結させた組換え型ＩＬ４０受容体を含むカラムを用いて、ＩＬ４０ｃＤＮＡインサートを含むベクターにより形質移入／形質転換した細胞の溶解産物で親和性精製を実施することができる。このカラムを洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去することができる一方で、組換え型ＩＬ４０とビーズに連結された抗体との結合を維持することができる。次に、ｒＩＬ４０と抗−ＩＬ４０抗体との間の相互作用に影響を及ぼすｐＨまたは塩の変化を用いて、カラムを溶出させることができる。
【０１０８】
方法４：別の方法では、ＩＬ４０ｃＤＮＡインサートを含むベクターにより形質移入／形質転換した細胞の溶解産物は、メンブレンを介するサイズ排除を用いて収集し、濃縮させることができる。３０ＫＤ未満のタンパク質に対してのみ貫通可能なメンブレンを含有する遠心分離カラムを使用することができる。次に、３０ＫＤ未満のタンパク質を収集し、その中には、形質移入／形質転換細胞から作製した高用量の組換え型ＩＬ４０を含むものとする。
【０１０９】
方法５：別の方法では、ＩＬ４０ｃＤＮＡインサートを含むベクターにより形質移入／形質転換した細胞の溶解産物は、高速液体クロマトグラフィーを用いて収集し、精製することができる。各タンパク質が分析物と別々に相互作用するため、組換え型ＩＬ４０を含有する分画を収集することができる。
【０１１０】
実施例９
ＩＬ４０受容体発現細胞の単離（ＦＡＣＳ単離）
方法Ａ：単離、精製。ＩＬ４０受容体（複数可）を運搬している細胞を判定するために、マウス脾臓を収集し、均質化し、ＦＡＣＳチューブ（０．５ｅ６細胞／チューブ）に入れる。まず、ＦＡＣＳブロックバッファにより３０分間氷上で脾細胞をインキュベートする。次に、氷冷ＦＡＣＳ洗浄により１回細胞を洗浄して、組換え型Ｈｉｓ−タグＩＬ４０（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間氷上でインキュベートする。その後、細胞を２回洗浄し、ウサギ抗−Ｈｉｓタグ抗体（１：５００希釈）で氷上で３０分間インキュベートする。その後、細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ、イソタイプ対照または他の細胞表面染色抗体に共役結合されたヤギ抗−ウサギ二次抗体で３０分間インキュベートする。この実験から、ＩＬ４０はＢ細胞に結合し、陽性対照として使用できることがわかる。
【０１１１】
標識細胞は、ＦＩＴＣのこれらの発現をベースとしたフローサイトメトリーにより選別することができる。選別した細胞は、ＩＬ４０受容体を発現するものとする。
【０１１２】
方法Ｂ：細胞集団からの枯渇。毒素で標識したＩＬ４０（例えば、抗体薬物共役など）を使用して、ＩＬ４０受容体を発現する細胞を破壊することができる。ＩＬ４０受容体に対する抗体は、単独または抗体−薬物共役のいずれか一方を同じ目的で使用することもできる。
方法Ｃ：動物における細胞の枯渇。抗−ＩＬ４０受容体モノクローナル抗体の静脈内注射を使用して、ＩＬ４０受容体−発現細胞を枯渇させることができる。抗体は、「裸」抗体であるか、または抗体薬物共役であってもよい。
【０１１３】
実施例１０
ＩＬ４０の影響を発見するためのＩＬ４０トランスジェニックまたはノックアウトマウスの使用。ＩＬ４０-/-マウスを使用して、ＩＬ４０の機能を調査することができる。このマウスを公表した（Ｔａｎｇ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｓｎｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ２０１０．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：７４９−５５）。観察された唯一の表現型は、マウスを免疫化したとき、血清中でＩｇＧ１が上昇した。このマウス由来の免疫組織を得ることができ、異なる剤（Ｔ細胞では抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８；Ｂ細胞ではリポポリサッカリド（ＬＰＳ）または抗−ＣＤ４０及びＩＬ４；単球ではＬＰＳ）により活性化することができる。次にマイクロアレイ分析を行って野生型とＩＬ４０-/-組織との間に特異的に発現する遺伝子を同定することができる。さまざまな組織のフローサイトメトリーによりマウスも表現型となっているか、または血液化学検査並びに血球計数を実施することができる。癌、自己免疫疾患または感染性疾患など、さまざまな疾患モデルでマウスを使用することができる。
【０１１４】
ＩＬ４０-/-マウスのほかに、マウスの導入遺伝子として、ＩＬ４０が過剰発現することもあり得る。このため、インビボでのＩＬ４０の影響が拡大し、マウスモデルにおけるこのサイトカインの影響を調査する。この調査を行うために、マウスの胚の単一細胞への前核の注入により導入遺伝子を導入し、ゲノム内に集約させる。遺伝子は、遺伝子の発現がトリガーされ得るプロモーターの制御下にある。インビボでのＩＬ４０の過剰発現により、このサイトカインのインビボでの影響を理解する。得られたトランスジェニックＩＬ４０マウスの表現型により、インビボでのその機能を理解することができる。
【０１１５】
参考文献
以下の公開は、参照により本明細書に組み込まれる。
１．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｐａｓｔ，  ｐｒｅｓｅｎｔ，  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ２００１；７４（ｌ）：３〜８。
２．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ．Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓＥｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；３７  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３４−４５。
３．Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ  ＳＪ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｋ，  Ｇｒｚｅｇｏｒｚｅｗｓｋｉ  ＫＪ，  Ｂａｒｂｅｒ  ＭＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｐａｉｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ。Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
２０００；２７５（２５）：１９１６７〜７６。
４．Ｚｏｕ  Ｑ，  Ｗａｎｇ  Ｚ，  Ｇｕａｎ  Ｘ，  Ｌｉｕ  Ｂ，  Ｗｕ  Ｙ，  Ｌｉｎ  Ｚ．  Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ．  ＢｉｏＭｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．  ２０１３：２０１３：６８６０９０。
５．Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｈｅｖｅｒ  Ａ，  Ｗｉｌｌｈｉｔｅ  Ｄ，  Ｚｌｏｔｎｉｋ  Ａ，  Ｈｅｖｅｚｉ  Ｐ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００５；１９（１０）：１３５６〜８。
６．Ｒｏｔｈ  ＲＢ，  Ｈｅｖｅｚｉ  ｐ，  Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｗｉｌｌｈｉｔｅ  Ｄ，  Ｌｅｃｈｎｅｒ  ＳＭ，  Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ２０  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＮＳ．  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ２００６；７（２）：６７−８０。
７．Ｌｕｕ  ＶＰ，  Ｈｅｖｅｚｉ  Ｐ，  Ｖｅｎｃｅｓ−Ｃａｔａｌａｎ  Ｆ，  Ｍａｒａｖｉｌｌａｓ−Ｍｏｎｔｅｒｏ  ＪＬ，  Ｗｈｉｔｅ  ＣＡ，  Ｃａｓａｌｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＳＰＡＮ３３  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１３；１４９（３，  Ｐａｒｔ  Ｂ）：３８８〜９９。
８．Ｉｏａｎｎｉｄｏｕ  Ｅ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎ．  ２００６；１２（１９）：２３９７〜４０８。
９．Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  Ｌ，  Ｃｈｅｎｇ  ＡＭ，  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＨＥ，  Ｆｕｒｌｏｎｇｅｒ  Ｃ，  Ｖｅｓｅｌｙ  Ｓ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｒｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  Ｌｎｋ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２００２；１９５（１２）：１５９９〜６１１。
１０．Ｃｌａｒｋ  ＨＦ，  Ｇｕｍｅｙ  ＡＬ，  Ａｂａｙａ  Ｅ，  Ｂａｋｅｒ  Ｋ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  Ｄ，  Ｂｒｕｓｈ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  （ＳＰＤＩ），  ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｅｆｆｏｒｔ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００３；１３（１０）：２２６５〜７０。
１１．Ｘｕ  Ｚ，  Ｆｕｌｏｐ  Ｚ，  Ｗｕ  Ｇ，  Ｐｏｎｅ  ＥＪ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｍａｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  １４−３−３  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｃｒｕｉｔ  ＡＩＤ  ｔｏ  ５’−ＡＧＣＴ−３’−ｒｉｃｈ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１０；  １７（９）：１１２４〜３５。
１２．Ｌｏｉｇｎｏｎ  Ｍ，  Ｐｅｒｒｅｔ  Ｓ，  Ｋｅｌｌｙ  Ｊ，  Ｂｏｕｌａｉｓ  Ｄ，  Ｃａｓｓ  Ｂ，  Ｂｉｓｓｏｎ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｂｌｅ  ｈｉｇｈ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＦＮａｌｐｈａ２ｂ  ｉｎ  ＨＥＫ２９３  ｃｅｌｌｓ．  ＢＭＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２００８：８：６５。
１３．Ｍａ  Ａ，  Ｋｏｋａ  Ｒ，  Ｂｕｒｋｅｔｔ  Ｐ．  Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＩＬ−２，  ＩＬ−１５，  ａｎｄ  ＩＬ−７  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２００６：２４：６５７〜７９。
１４．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＢＲ，  Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ  ＦＮ．  Ｂｅｙｏｎｄ  ＳＨＭ  ａｎｄ  ＣＳＲ：ＡＩＤ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２００７：９４：２１５〜４４。
１５．Ｌｙｃｋｅ  ＮＹ，  Ｂｅｍａｒｋ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｎｇ  ｇｕｔ  ＩｇＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２：３：３２９。
１６．Ｆａｇａｒａｓａｎ  Ｓ，  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｋ，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｉｋｕｔａ  Ｋ，  Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＩｇＡ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１；４１３（６８５６）：６３９〜４３。
１７．Ｐａｒｋ  ＳＲ，  Ｚａｎ  Ｈ，  Ｐａｌ  Ｚ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉ  Ａ，  Ｐｏｎｅ  ＥＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ＨｏｘＣ４  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ＡＩＤ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＡＩＤ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２００９；１０（５）：５４０〜５０。
１８．Ｔｅｚｕｋａ  Ｈ，  Ａｂｅ  Ｙ，  Ｉｗａｔａ  Ｍ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｈ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｈ，  Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｇＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＴＮＦ／ｉＮＯＳ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．  ２００７；４４８（７１５６）：９２９〜３３。
１９．Ｃｈｅｎ  Ｌ，  Ｃｈｅｎ  Ｚ，  Ｂａｋｅｒ  Ｋ，  Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ＥＭ，  ｄａ  Ｃｕｎｈａ  ＡＰ，  Ｆｌａｋ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＥＡＣＡＭ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  Ｔｆｈ  ｃｅｌｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２；３７（５）：９３０〜４６。
２０．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｋ，  Ｆａｇａｒａｓａｎ  Ｓ，  Ｙａｍａｄａ  Ｓ，  Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｙ，  Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．  Ｃｌａｓｓ    ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  （ＡＩＤ），  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．  Ｃｅｌｌ．  ２０００；  １０２（５）：５５３〜６３。
２１．Ｒａｄａ  ｃ，  Ｄｉ  Ｎｏｉａ  ＪＭ，  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｐａｔｈｓ  ｔｏ  ｂｏｔｈ  Ｉｇ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａ／  Ｔ−ｆｏｃｕｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ．  ２００４；  １６（２）：１６３〜７１。
２２．Ｃａｔｏ  ＭＨ，  Ｃｈｉｎｔａｌａｐａｔｉ  ＳＫ，  Ｙａｕ  ＩＷ，  Ｏｍｏｒｉ  ＳＡ，  Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣ．  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１１  ；３１（１）：１２７〜３７。
２３．Ｄｕｒａｎｄｙ  Ａ，  Ｋｒａｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ．  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１３；１３（７）：５１９〜３３。
２４．Ｂｅｒｇｑｖｉｓｔ  Ｐ，  Ｇａｒｄｂｙ  Ｅ，  Ｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ａ，  Ｂｅｍａｒｋ  Ｍ，  Ｌｙｃｋｅ  ＮＹ．Ｇｕｔ  ＩｇＡ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ４０  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｏｃｃｕｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６：１７７（１１）：７７２〜８３。
２５．Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｋａｒｙｐｉｓ  Ｇ，  Ｈｉｐｐｅｎ  ＫＬ，  Ｖｅｇｏｅ  ＡＬ，  Ｒｕｉｚ  Ｐ，  Ｇｉｌｋｅｓｏｎ  ＧＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ＭＲＬｌｐｒ  ｍｉｃｅ．  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００６；７（２）：１５６〜６８。
２６．Ｐｒｕｉｔｔ  ＫＤ，  Ｈａｒｒｏｗ  Ｊ，  Ｈａｒｔｅ  ＲＡ，  Ｗａｌｌｉｎ  Ｃ，  Ｄｉｅｋｈａｎｓ  Ｍ，  Ｍａｇｌｏｔｔ  ＤＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  （ＣＣＤＳ）  ｐｒｏｊｅｃｔ：  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００９；１９（７）：１３１６〜２３。
２７．Ｈａｒｔｅ  ＲＡ，  Ｆａｒｒｅｌｌ  ＣＭ，  Ｌｏｖｅｌａｎｄ  ＪＥ，  Ｓｕｎｅｒ  ＭＭ，  Ｗｉｌｍｉｎｇ  Ｌ，  Ａｋｅｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｕｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｏｒｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＣＣＤＳ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．
Ｄａｔａｂａｓｅ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｕｒａｔｉｏｎ．  ２０１２：２０１２：ｂａｓ００８。
２８．Ｇｒａｙ  ＫＡ，  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ＬＣ，  Ｇｏｒｄｏｎ  ＳＭ，  Ｓｅａｌ  ＲＬ，  Ｗｒｉｇｈｔ  ＭＷ，  Ｂｒｕｆｏｒｄ  ＥＡ．
Ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ：  ｔｈｅ  ＨＧＮＣ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；４１（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ５４５〜５２。
２９．Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ  ＡＭ，  Ｔａｉ  ＫＰ，  Ｆｌｏｒｅｓ−Ｇｕｉｔｅｒｒｅｚ  ＪＰ，  Ｖｉｌｃｈｅｓ−Ｃｉｓｎｅｒｏｓ  Ｎ，  Ｋａｍｄａｒ  Ｋ，  Ｂａｒｂｏｓａ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  Ｏ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＸＣＬ１７  ｉｓ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｏａｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８８（１２）：６３９９−４０６。
３０．Ｃａｚａｃ  ＢＢ，  Ｒｏｅｓ  Ｊ．  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０００：１３（４）：４４３〜５１。
３１．Ｇｒｏｓ  ＭＪ，  Ｎａｑｕｅｔ  ｐ，  Ｇｕｉｎａｍａｒｄ  ＲＲ．Ｃｅｌｌ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８；１８０（１２）：８１５３〜８。
３２．Ｋｌｅｉｎ  Ｊ，  Ｊｕ  Ｗ，  Ｈｅｙｅｒ  Ｊ，  Ｗｉｔｔｅｋ  Ｂ，  Ｈａｎｅｋｅ  Ｔ，  Ｋｎａｕｓ  ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂ  ｃｅｌｌｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｓｍａｄ２  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＩｇＡ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６；１７６（４）：２３８９〜９６。
３３．Ｓｎａｐｐｅｒ  ＣＭ，  Ｗａｅｇｅｌｌ  Ｗ，  Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  Ｈ，  Ｄａｓｃｈ  ＪＲ．  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｏｆ  ａｌｌ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｂｙ  ＬＰＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９３：１５１（９）：４６２５〜３６。
３４．Ｗｏｎｇ  ＳＣ，  ０ｈ  Ｅ，  Ｎｇ  ＣＨ，  Ｌａｍ  ＫＰ。Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃａｌｌ  Ｔ−  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇａｎｄ  Ｂ７〜Ｈ２。Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２（４）：１３８１〜８。
３５．Ｇｏｏｄ−Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＫＬ，  Ｓｚｕｍｉｌａｓ  ＣＧ，  Ｃｈｅｎ  Ｌ，  Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ，  Ｔｏｍａｙｋｏ  ＭＭ，  Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ  ＭＪ．  ＰＤ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１０：１１（６）：５３５〜４２。
３６．Ｇｏｈｄａ  Ｍ，  Ｋｕｎｉｓａｗａ  Ｊ，  Ｍｉｕｒａ  Ｆ，  Ｋａｇｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｋｕｒａｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ＩｇＡ  ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＩｇＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８；  １８０（８）：５３３５〜４３。
３７．Ｈａｒｒｉｓ  ＤＰ，  Ｈａｙｎｅｓ  Ｌ，  Ｓａｙｌｅｓ  ＰＣ，  Ｄｕｓｏ  ＤＫ，  Ｅａｔｏｎ  ＳＭ，  Ｌｅｐａｋ  ＮＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０００；１（６）：４７５〜８２。
３８．Ｖｉｌｃｅｋ  Ｊ，  Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ．  Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２００４；２５（４）：２０１〜９。
３９．Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ．  Ｍａｎｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｖｅｒｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  ２００８；１１８（ｌｌ）：３５３３〜６。
４０．Ｎａｋａｍｕｒａ  ＲＭ  （１９８３）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １：  １６０〜１７２。
４１．Ｌｅｅｎａａｒｓ  Ｍ，  Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ  ＣＦ  （２００５）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．  ＩＬＡＲ  Ｊ  ４６：２６９〜２７９。
４２．Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，  Ｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ  （２０１１）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：３７１〜３８０。
４３．Ｓｉｅｇｅｌ  ＤＬ  （２００２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  ９：１５〜２２。
４４．Ｇｌａｓｓｙ  ＭＣ  （１９９３）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５４〜１６５。
４５．Ｂｕｔｌｅｒ  Ｍ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ−Ａｃｏｓｔａ  Ａ  （２０１２）  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９６：８８５〜８９４。
４６．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＫ，  Ｎａｅｓｔｅｄ  Ｈ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ，  Ｔｏｌｓｔｒｕｐ  ＡＢ，  Ｆｒａｎｄｓｅｎ  ＴＰ  （２０１２）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ：  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ５２６：  １３９〜１４５。
４７．Ｍａｒｉｃｈａｌ−Ｇａｌｌａｒｄｏ  ＰＡ，  Ａｌｖａｒｅｚ  ＭＭ  （２０１２）  Ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ  ｉｎ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２８：８９９〜９１６。
４８．Ｃｈｏｎ  ＪＨ，  Ｚａｒｂｉｓ−Ｐａｐａｓｔｏｉｔｓｉｓ  Ｇ  （２０１１）  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：４５８〜４６３。
４９．ＤｉＦｅｄｅ  Ｇ，  Ｂｒｏｎｔｅ  Ｇ，  Ｒｉｚｚｏ  Ｓ，  Ｒｏｌｆｏ  Ｃｅｒｖｅｔｔｏ  Ｃ，  Ｃｏｃｏｒｕｌｌｏ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈａｅｍａｔｏ  ｌｏｇｉｃａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１：１４３３〜１４４５。
５０．Ｃｈｉａｒｅｌｌａ  Ｐ  （２０１１）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６：２５８〜２６７。
５１．Ｋａｎｅｋｏ  Ｅ，  Ｎｉｗａ  Ｒ  （２０１１）  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１〜１１。
５２．Ｓｃｚａｋｉｅｌ  Ｇ  （２０００）  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ５：Ｄ１９４〜２０１。
５３．Ｆａｒ  ＲＫ，  Ｌｅｐｐｅｒｔ  Ｊ，  Ｆｒａｎｋ  Ｋ，  Ｓｃｚａｋｉｅｌ  Ｇ  （２００５）  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １５：２２３〜２３３。
５４．Ｐａｓｃａｌ，  Ｌ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，  ９：２４６．
５５．Ｇｒｙ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００９，  １０：３６５。
５６．Ｂａｋｈｔｉｙａｒｉ  Ｓ，  Ｈａｇｈａｎｉ  Ｋ，  Ｂａｓａｔｉ  Ｇ，  Ｋａｒｉｍｆａｒ  ＭＨ  （２０１３）  ｓｉＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ  ４：４５〜５７。
５７．Ｐｅｅｋ  ＡＳ，  Ｂｅｈｌｋｅ  ＭＡ  （２００７）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：１１０〜１１８。
５８．Ｂａｒａｎｏｖａ  Ａ，  Ｂｏｄｅ  Ｊ，  Ｍａｎｙａｍ  Ｇ，  Ｅｍｅｌｉａｎｅｎｋｏ  Ｍ  （２０１１）  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｔｒｉｎｇｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ．  ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ  ４：  １６８．
５９．Ｊｕｌｉａｎｏ，  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００８  Ｊｕｌｙ；  ３６（１２）：４１５８−４１７１。
【０１１６】
本発明は、好ましい実施態様に関連して記載してきが、当業者が速やかに理解するように、本発明の原理及び範囲を逸脱することなく変化形態及び変形形態を利用し得ることを理解すべきである。したがって、こうした変化形態は、本発明及び次の請求項の範囲内で実施され得る。
【図１Ａ】
2016540506.tif 000008
【図１Ｂ】
2016540506.tif 000009
【図１Ｃ】
2016540506.tif 000010
【図１Ｄ】
2016540506.tif 000011
【図１Ｅ】
2016540506.tif 000012
【図２】
2016540506.tif 000013
【図３】
2016540506.tif 000014
【図４Ａ】
2016540506.tif 000015
【図４Ｂ】
2016540506.tif 000016
【図４Ｃ】
2016540506.tif 000017
【図４Ｄ】
2016540506.tif 000018
【図４Ｅ】
2016540506.tif 000019
【図５Ａ】
2016540506.tif 000020
【図５Ｂ】
2016540506.tif 000021
【図６Ａ】
2016540506.tif 000022
【図６Ｂ】
2016540506.tif 000023
【図７】
2016540506.tif 000024
【図８Ａ】
2016540506.tif 000025
【図８Ｂ】
2016540506.tif 000026
【図８Ｃ】
2016540506.tif 000027
【図８Ｄ】
2016540506.tif 000028
【図８Ｅ】
2016540506.tif 000029
【図８Ｆ】
2016540506.tif 000030
【図９】
2016540506.tif 000031
【図１０】
2016540506.tif 000032
【図１１Ａ】
2016540506.tif 000033
【図１１Ｂ】
2016540506.tif 000034
【図１２Ａ】
2016540506.tif 000035
【図１２Ｂ】
2016540506.tif 000036
【図１２Ｃ】
2016540506.tif 000037
【図１２Ｄ】
2016540506.tif 000038
【図１２Ｅ】
2016540506.tif 000039
【図１３Ａ】
2016540506.tif 000040
【図１３Ｂ】
2016540506.tif 000041
【図１３Ｃ】
2016540506.tif 000042
【図１４Ａ】
2016540506.tif 000043
【図１４Ｂ】
2016540506.tif 000044
【図１４Ｃ】
2016540506.tif 000045
【図１５Ａ】
2016540506.tif 000046
【図１５Ｂ】
2016540506.tif 000047
【図１５Ｃ】
2016540506.tif 000048
【図１５Ｄ】
2016540506.tif 000049
【図１５Ｅ】
2016540506.tif 000050
【図１５Ｆ】
2016540506.tif 000051
【図１６Ａ】
2016540506.tif 000052
【図１６Ｂ】
2016540506.tif 000053
【図１６Ｃ】
2016540506.tif 000054
【図１６Ｄ】
2016540506.tif 000055
【図１６Ｅ】
2016540506.tif 000056
【図１７】
2016540506.tif 000057
【図１８】
2016540506.tif 000058
【図１９Ａ】
2016540506.tif 000059
【図１９Ｂ】
2016540506.tif 000060
【図２０】
2016540506.tif 000061
【図２１】
2016540506.tif 000062
【配列表】
2016540506000001.app
【国際調査報告】
2016540506.tif 000063
2016540506.tif 000064
2016540506.tif 000065