(57)【要約】  本発明は、バイオセンサー、細胞モデル、及び生物活性剤との接触に対するイオン応答又は電位応答をモニタするためのそれらの使用方法を提供する。バイオセンサーは標的化ドメインと感知ドメインとレポートドメインとを含み得る。バイオセンサーは、目的の実験細胞又は病的細胞を代表するように再プログラム化された細胞に導入され得る。バイオセンサーを発現するモデル細胞を推定生物活性剤と接触させて、可能性のある活性を決定することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞の膜にインテグレートするように適合された膜貫通ドメイン；
Ｎａ＋、Ｈ＋、又はＫ＋濃度に感受性を有する電位感知ドメイン；及び、
蛍光レポーターが５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で蛍光を発するように適合される、蛍光レポータードメイン；
を含む電位センサーペプチドコンストラクトであって、
前記蛍光レポータードメインが、前記電位感知ドメインのコンホメーション変化に応答して蛍光発光特性を変化させるように適合される、電位センサーペプチドコンストラクト。
【請求項２】
前記膜貫通ドメインと電位感知ドメインとが異なる、請求項１に記載の電位センサーペプチド。
【請求項３】
前記電位感知ドメインが、
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と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載の電位センサーペプチド。
【請求項４】
前記配列が、Ｉ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、又はＲ２３８を保持する、請求項３に記載の電位センサーペプチド。
【請求項５】
前記配列がＲ２３５及びＩ１２３を保持する、請求項４に記載の電位センサーペプチド。
【請求項６】
前記蛍光レポータードメインが、
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と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載の電位センサーペプチド。
【請求項７】
前記コンストラクトが配列番号１及び配列番号２の両方のペプチド配列を含む、請求項１に記載の電位センサーペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の電位センサーをコードする核酸コンストラクト。
【請求項９】
ＮＬＳタグ及び繊毛タグからなる群から選択されるタグ配列をさらに含む、請求項８に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０】
前記ＮＬＳタグがペプチド配列：
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を含む、請求項９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１に記載の電位センサーを含むヒト細胞。
【請求項１２】
前記ヒト細胞がｉＰＳＣ由来細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ヒト細胞が線維芽細胞又は血球細胞に由来する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
トロポニンＥＦハンドドメイン；
カルシウム結合ＥＦハンドドメイン；及び
蛍光レポーターが５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で発光するように適合される、蛍光レポータードメイン；
を含むカルシウムセンサーペプチドコンストラクトであって、
前記蛍光レポータードメインが、前記ＥＦハンドドメインの１つ以上のコンホメーション変化に応答して蛍光発光特性を変化させるように適合される、カルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項１５】
前記カルシウム結合ドメインがカルモジュリンペプチド配列を含む、請求項１４に記載のカルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項１６】
前記カルシウム結合ドメインが
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と少なくとも８０％同一である、請求項１４に記載のカルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項１７】
前記ＥＦハンド結合ドメインが、
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と少なくとも８０％同一である、請求項１４に記載のカルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項１８】
前記蛍光レポータードメインが、
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と少なくとも９０％同一である、請求項１４に記載のカルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項１９】
配列番号４及び
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の両方のペプチド配列を含む、請求項１４に記載のカルシウムセンサーペプチドコンストラクト。
【請求項２０】
請求項１４に記載のカルシウムセンサーをコードする核酸コンストラクト。
【請求項２１】
ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、ＥＲタグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、ミトコンドリアタグ、シナプシンタグ、細胞内コンパートメントタグ、シナプス小胞タグ、及び繊毛タグからなる群から選択されるタグ配列をさらに含む、請求項２０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２２】
請求項１４に記載のカルシウムセンサーを含むヒト細胞。
【請求項２３】
前記ヒト細胞がｉＰＳＣ由来細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ヒト細胞が線維芽細胞又は血球細胞に由来する、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２５】
線維芽細胞の再プログラム化方法であって、
Ｅボックスプロモーターを有するヒト時計遺伝子及びヒトＢｍａｌ１／２／３／４遺伝子を含む１つ以上のコンストラクトで前記線維芽細胞を形質転換するステップと；
前記線維芽細胞の概日リズムを同期させるステップと；
前記線維芽細胞の転写調節制御を修飾するステップであって、それにより前記線維芽細胞を誘導性多能性幹細胞に変換するステップと；
前記幹細胞を誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞（アストロサイトを含む、ｉＧ）、又は誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）に再プログラム化するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記転写制御を修飾するステップが、前記線維芽細胞の系統に好適な特異的転写因子を提供するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記転写因子が、概日調節エレメントで修飾された前記線維芽細胞の細胞系統に特異的な転写因子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写因子が、Ｅボックスプロモーター、人工Ｅボックス様プロモーター配列タグ、及び合成転写エンハンサーエレメントからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記形質転換コンストラクトが、請求項１に記載の電位センサーをコードする核酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記形質転換コンストラクトが、請求項１４に記載のカルシウムセンサーをコードする核酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ｉＮ細胞及びｉＧ細胞を共培養してインビトロ足場に３Ｄモデルを作成するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
活性薬剤のスクリーニング方法において、
請求項２５の１つ以上の細胞を、前記電位センサー又はカルシウムセンサーをコードする核酸で形質転換するステップと；
前記細胞において前記電位センサー又はカルシウムセンサーを発現させるステップと；
前記細胞を候補活性薬剤と接触させるステップと；
前記薬剤に応答した前記電位センサー又はカルシウムセンサーの蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の変化を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
前記薬剤が、小分子化学ライブラリ；受容体に対するリガンド、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド又はリプレッサー；リガンド、神経伝達物質；又はイオンチャネルのリプレッサーからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
低い、中程度の、又は高いスループットのアッセイフォーマットを使用して前記生細胞をイメージングするステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年９月５日に出願されたＡｎｇｅｌａ  Ｈｕａｎｇによる先行米国仮特許出願第６１／８７３，９５０号明細書、Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓに対する優先権及びその利益を主張する。この先行出願の全開示は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、活性薬剤スクリーニング、電気インパルスのモニタリング用の、及びシグナル伝達をモニタするための方法及び組成物の分野に関する。本発明は、例えば代表性のある宿主細胞の標的領域における特異的な生物活性を検出するための組成物を提供する。方法は、再プログラム化されたヒト細胞を、例えば細胞におけるイオン環境の変化又は電位ポテンシャルの検出に特異的な標的化されたセンサーコンストラクトで形質転換することを含む。
【背景技術】
【０００３】
細胞の電位ポテンシャル及び内部イオン環境に対する変化の検出は、細胞の生物活性のモニタリングにおいて有用であり得る。例えば、多くの細胞は、Ｇタンパク質受容体へのリガンドの結合に応答して内部カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度の著しい変化を被る。別の態様において、特定の細胞は、例えばシナプスにおける神経伝達物質との接触に応答して、膜の電位ポテンシャルの大きい変化を被る。かかる細胞変化は細胞の重要な機能に関与し、細胞の健康、機能、又は発生プロセスの指標となり得る。
【０００４】
遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター（ＧＥＣＩ）は、細胞のＣａ２＋濃度の全般的なモニタリングを可能にするために開発された。例えばＬｏｏｇｅｒ（米国特許出願公開第２０１２／００３４６９１号明細書）を参照されたく、ここではカルモジュリンペプチド配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターを有するコンストラクトと組み合わされる。Ｃａ２＋結合に応答したカルモジュリンペプチドのコンホメーション変化によってＧＦＰ蛍光の効率が変化し、発光プロファイル及び強度の変化がもたらされる。ＧＥＣＩで形質転換された細胞は、概して、例えばシグナル伝達リガンド又は阻害薬に応答した内部Ｃａ２＋濃度の変化に関してモニタすることができる。Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ（米国特許出願公開第２００９／００３５７８８号明細書）もまた参照されたく、ここではＦＲＥＴドナー及びアクセプターがトロポニンペプチド配列によって分けられ、Ｃａ２＋の結合時に蛍光変化がもたらされる。しかしながら、かかるＧＥＣＩはそのシグナル分解能が限られており、多細胞／３Ｄ構造を貫通する能力、及び利用可能な該当の細胞型の範囲が限られている。典型的には、従来技術のシステムは、細胞単層からの二次元の顕微鏡的シグナル検出を対象とする。
【０００５】
多くの場合、シグナル伝達研究は、実際の目的の細胞を代表するものではない細胞型で行われる。例えば、研究者はシグナル伝達剤及び有望な治療薬をげっ歯類又は不死化細胞株においてインビトロで研究するよう制限され得るが、これは多くの場合にヒト細胞又は臨床患者で再現されない結果をもたらす。例えば、研究者は初代細胞株に癌遺伝子を導入することにより、例えば選択の細胞型に分化させて、研究用の宿主細胞を作製し得る。しかしながら、この過程の経過後には、細胞は、生物活性剤との接触に通常どおり応答するものとして頼ることができない。Ｗｅｉｓｓ（米国特許第７，１０１，７０９号明細書）は多能性マウス神経幹細胞の調製方法を開示している。細胞を分化させて、いくらか免疫特権があるＣＮＳ部位に移植し得る。この場合もまた、細胞は多くの研究にとって代表性がなく、シグナル検出は免疫化学的手段に限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の観点から、目的とする生きている動物系に存在する細胞及び組織を代表するモデル細胞システムが必要とされている。それが特定の細胞内部位に標的化し得るセンサーペプチドコンストラクトを有するならば望ましい。代表性のある細胞のモック組織においてインビトロで三次元シグナル検出が可能なシステムが利用可能であったならば、利益が実現し得る。本発明は、これらの特徴及び以下を考察することで明らかになるであろう他の特徴を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本バイオセンサーは相補的な特徴を組み合わせることにより、シグナル伝達に関連する細胞内変化をインビボで検出する。本バイオセンサーは、種々のコンテクストで有用性が見出される。例えば、ヒトｉＰＳＣ由来の細胞型におけるバイオセンサーは、特定の病態を発現する細胞の２Ｄ又は３Ｄ細胞モデルをイメージングするよう機能し得る。かかるモデルは、化学的効果、生物学的効果、治療効果、及び毒性効果に関する候補薬物化合物のスクリーニング及び評価において有用であり得る。
【０００８】
合成の及び遺伝的にコードされたバイオセンサーは、ヒト細胞におけるカルシウム（Ｃａ２＋）濃度のレポーターとして機能し得る。バイオセンサーは、細胞内コンパートメント、例えば、核、細胞質、原形質、特定の膜表面などを標的化する構造を有し得る。バイオセンサーは、任意選択で、ヒト細胞コンパートメントにおける細胞電位変化のレポーターとして機能し得る。例えば、電位センサーは、ナトリウム（Ｎａ＋）及びカリウム（Ｋ＋）濃度の差又は変化に起因する膜ポテンシャルの変動を評価及びレポートすることができる。
【０００９】
バイオセンサーは、細胞型特異的様式で機能するように構成し得る。例えば、バイオセンサーは、特定の細胞型、例えば、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、アストロサイト、心筋細胞、不死化ヒト癌細胞株、ＨＳＣ、ＮＰＣ、一般にヒト細胞及び／又はＭＳＣに特異的なプロモーター配列を含むように遺伝子修飾することができる。
【００１０】
一実施形態において、バイオセンサーは電位センサーである。電位センサーには、例えば、膜貫通ドメインと電位感受性ドメインとレポータードメインとを含むペプチドコンストラクトが含まれ得る。例えば、電位センサーコンストラクトは、ヒト細胞の膜にインテグレートするように適合された膜貫通ドメインと、Ｈ＋、Ｎａ＋及び／又はＫ＋濃度に感受性を示す電位感知ドメインと、蛍光レポータードメインとを含み得る。蛍光レポーターは５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で蛍光を発するように適合され得る。バイオセンサーは、局所電位ポテンシャルに応答して（例えば、電位感知ドメインの）コンホメーションを変化させることにより、蛍光レポータードメインによる蛍光発光特性の変化をもたらすように適合され得る。多くの実施形態において、膜貫通ドメインと電位感知ドメインとは異なるドメインである（例えば、異なる非相同配列を有するか、又は異なる親ペプチドに由来する）。
【００１１】
電位センサーシステムの特定の実施形態において、電位センサーペプチドは、
【化１】
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と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含む電位感知ドメインを含む。好ましい実施形態において、電位センサーペプチド配列は、Ｉ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５及び／又はＲ２３８残基を保持する。より好ましい実施形態では、電位センサードメインペプチドであって、配列が少なくともＲ２３５及びＩ１２３を保持する。
【００１２】
電位センサーシステムの一部の実施形態では、蛍光レポータードメインペプチドは、
【化２】
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と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含む蛍光ドメインを含む。
【００１３】
特定の実施形態において、電位センサーペプチドコンストラクトは、配列番号１及び配列番号２の各々と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のペプチド配列を含む。
【００１４】
別の本発明の態様は、本明細書に記載される電位センサーのいずれかをコードする核酸コンストラクトを含む。さらに、核酸コンストラクトは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）タグ、ミトコンドリア局在化タグ、及び繊毛タグからなる群から選択されるタグ配列を含み得る。さらに、核酸コンストラクトは、ペプチド配列：
【化３】
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と少なくとも８０％の同一性を含むＮＬＳタグを含み得る。
【００１５】
本願の発明の寄与には、本明細書に記載される電位センサーを含むヒト細胞が含まれる。好ましい実施形態において、ヒト細胞はｉＰＳＣ由来細胞である。例えば、細胞は、線維芽細胞又は血球細胞を多能性状態又は不死状態に誘導することによって得られ得る。多くの場合、細胞はヒト患者由来の細胞型に由来する。
【００１６】
本発明のバイオセンサーはカルシウムセンサーを含む。例えば、カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、カルシウム結合ドメインとＥＦハンドトロポニン様結合ドメインと蛍光レポータードメインとを含み得る。多くの場合に蛍光レポーターは５００ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長で発光するように適合される。蛍光レポータードメインは、例えばＥＦハンドトロポニン様ドメインのコンホメーション変化に応答して蛍光発光特性を変化させるように適合され得る。
【００１７】
カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、カルモジュリンペプチド配列を含むカルシウム結合ドメインを含み得る。例えば、カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、
【化４】
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と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のカルシウム結合ドメインを含み得る。
【００１８】
カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、
【化５】
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と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のＥＦハンド結合ドメインを含み得る。
【００１９】
カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、
【化６】
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と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の蛍光レポータードメインを含み得る。
【００２０】
カルシウムセンサーペプチドコンストラクトは、配列番号４及び配列番号５の各々と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のペプチド配列を含み得る。
【００２１】
本明細書に記載される別の本発明の態様は、本明細書に記載される任意のカルシウムセンサーをコードする核酸コンストラクトを含む。さらに、核酸コンストラクトはタグ配列を含み得る。例えば、タグ配列は、ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、ＥＲタグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、及び／又は繊毛タグなどの標的化配列を含み得る。
【００２２】
本願の発明の寄与には、本明細書に記載される任意のカルシウムセンサーを含むヒト細胞が含まれる。好ましい実施形態において、ヒト細胞はｉＰＳＣ由来細胞である。例えば、細胞は線維芽細胞又は血球細胞に由来し得る。
【００２３】
本発明は、細胞の再プログラム化及びモニタリング方法を含む。例えば、線維芽細胞の再プログラム化方法には、Ｅボックスプロモーターを有するヒト時計遺伝子及びヒトＢｍａｌ１／２／３／４遺伝子を含む１つ以上のコンストラクトによる線維芽細胞の形質転換、線維芽細胞の概日リズムの同期、線維芽細胞の転写調節制御の修飾（それにより線維芽細胞を誘導性多能性幹細胞に変換する）、及び誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞（アストロサイトを含む、ｉＧ）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又は誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）への幹細胞の再プログラム化が含まれ得る。ヒト細胞型の概日リズムを使用した再プログラム化方法の多くにおいて、形質転換コンストラクトは、本明細書に記載される電位センサー又は本明細書に記載されるカルシウムセンサーをコードする核酸を含む。
【００２４】
本方法は、例えば、線維芽細胞の系統に好適な特定の転写因子を提供することにより転写制御を修飾するステップを含み得る。転写因子には、ヒト細胞型の概日リズムを使用して再プログラム化するための概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター、人工Ｅボックス様プロモーター配列タグ、概日リズム周期を変更し又は同期させる化学剤、又は合成転写エンハンサーエレメント）を含むように修飾された線維芽細胞の細胞系統に特異的な因子が含まれ得る。
【００２５】
細胞組成物は、ｉＮ細胞とｉＧ細胞との共培養によってインビトロで足場上に３Ｄモデルを作製することをさらに含み得る。また、ヒト癌細胞株及び癌幹細胞を、標準的な培養ハードウェア及び条件を用いて３Ｄスフェロイド方式で培養することができる。本発明のバイオセンサーコンストラクトを使用して、得られた組織をイメージングし、細胞電位ポテンシャル及び／又はカルシウムレベルの変化を例えばリアルタイムでモニタすることができる。
【００２６】
本明細書に記載されるカルシウム及び電位バイオセンサーと同様の論理を用いてヘム結合及びＡＴＰ結合バイオセンサーを設計することができる。両方のバイオセンサーとも、それぞれヘム分子又はＡＴＰに結合する特異的ドメインを伴い遺伝的にコードされる。これらのバイオセンサーは、ドメイン結合に起因するコンホメーション変化に起因して強度が変わる蛍光レポーター（６００ｎｍ〜７００ｎｍ範囲）に結合される。単一の蛍光又はインテンシオメトリック（ｉｎｔｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）レポーターの代替例では、バイオセンサードメインを様々な波長の一対のＦＲＥＴ蛍光レポーターに結合させてＦＲＥＴセンサーとなるようにし得る。
【００２７】
本発明の方法は、細胞のカルシウム又は電位ポテンシャルに影響を及ぼす薬剤をスクリーニングするための組成物及び技法を含む。例えば、活性薬剤のスクリーニング方法は、電位センサー又はカルシウムセンサーをコードする核酸で１つ以上の細胞を形質転換するステップと、細胞において電位センサー又はカルシウムセンサーを発現させるステップと、細胞を候補活性薬剤と接触させるステップと、薬剤に応答した電位センサー又はカルシウムセンサーの蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の変化を検出するステップとを含み得る。典型的な薬剤としては、例えば小分子化学ライブラリのメンバーを挙げることができる。例えば、薬剤は、ＧＰＣＲ、膜チャネル、受容体、及び／又は関連するシグナル伝達経路との相互作用によってもたらされる活性に関して考察され得る。
【００２８】
さらに、本方法は、低い、中程度の、及び／又は高いスループットのアッセイフォーマットによる生細胞のイメージングにおいて有用であることが想定される。例えば、本発明のバイオセンサーコンストラクトを形質転換され、且つそれを発現する、３Ｄアレイ中の細胞を、例えば顕微鏡イメージングシステムを使用してリアルタイムで観察することができる。任意選択で、表面培養又は浮遊培養下のバイオセンサー細胞を、共焦点イメージング、ＦＡＣＳソーター、ＣＣＤビデオイメージングなどを使用してモニタすることができる。
【００２９】
３Ｄヒト癌細胞モデルは、ライブラリスクリーニングハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法を使用した薬物候補に対する腫瘍応答の改良された予測手段として用いられている。かかる研究に用いられる細胞は不死化癌細胞株に限られない。スクリーニングには癌幹細胞、初代組織細胞、及び３Ｄプリント組織型を使用することができる。
【００３０】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の装置又は生物学的システムに限定されず、それらは当然ながら異なってもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明するために過ぎず、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。従って、例えば、「表面（ａ  ｓｕｒｆａｃｅ）」に対する言及は２つ以上の表面の組み合わせを含み；「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」に対する言及は細菌の混合物を含むなどする。
【００３１】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の試験の実施には、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な任意の方法及び材料を使用し得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。本発明を記載及び特許請求するにあたり、下記に示す定義に従い以下の用語を用いる。
【００３２】
ｉＰＳＣは誘導性多能性幹細胞を指す；ｉＮは誘導性ニューロンを指す；ｉＧは誘導性グリア細胞（アストロサイトを含む）を指す；及びｉＮＰＣは誘導性神経前駆細胞。
【００３３】
近赤外は約６００ｎｍ〜約１４００ｎｍの範囲の光波長を指す。
【００３４】
用語「保存変異体」は、保存された機能をもたらす所与の配列の修飾を含む。例えば、核酸の文脈では、遺伝子コードの縮重のため、「サイレント置換」（即ち、コードされたポリペプチドに変化をもたらさない核酸配列における置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の黙示的な特徴である。
【００３５】
同様に、ペプチド配列の文脈における保存変異体も機能を保持すると予想され得る。例えば、Ｇｕｏ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｈａｎｇｅ”，（ＰＮＡＳ  １０１：９２０５−１０；２００４）は、「タンパク質の構造がその機能的有用性とどのように関係付けられるのかに関する詳細な知識がなくとも．．．」当業者がペプチドの修飾に成功し得ることを実証している。Ｇｕｏは、僅か２５％のランダム突然変異が実質的な活性喪失を引き起こすことを見出している。Ｇｕｏは、当業者がどのように活性部位の位置、αヘリックス、βシート、疎水性相互作用、ターン及びループ、保存部位などを考慮すれば、例えば重要な位置での置換回避によるか又は保存的アミノ酸置換を用いて活性の喪失を知的に回避し得るかを広範に考察している。さらに、Ｇｕｏは、彼の「データベースが、タンパク質機能に対する突然変異の効果を予測するための価値のあるリソースであり得る．．．」ことを述べている。既知の構造への置換は予測可能であり、構造情報を有するものを持っている。従って、アミノ酸配列中の１個又は数個のアミノ酸が別の極めて類似した特性のアミノ酸で置換される保存的アミノ酸置換はまた、開示されるコンストラクトに極めて類似していると容易に特定され、機能を保持しているものと予想される。当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸又は僅かな割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未満）を変化させ、付加し又は欠失させる個々の置換、欠失、又は付加が、改変によってアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換がもたらされる「保存的に修飾された変異」であることを認識するであろう。従って、本発明の列挙されるポリペプチド配列の「保存的変異」には、ポリペプチド配列の中の僅かな割合、典型的には５％未満、より典型的には２％又は１％未満のアミノ酸の、同じ保存的置換群の保存的に選択されたアミノ酸による置換が含まれる。
【００３６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）をヒト細胞に組み込み、且つヒスタミン（２０μＭ）、カルバコール（２０μＭ）、及びイオノマイシン（２０μＭ）で刺激したグラフを示し、平均応答は対照と比べて９〜１２倍である。ヒスタミン：細胞内カルシウムの増加を刺激する既知の物質。カルバコール：既知の緑内障治療用薬剤；抗アポトーシス剤、ａＣＨＲアゴニスト、及びＴＮＦ−α阻害薬。イオノマイシン：研究において細胞内カルシウムレベルを上昇させるために使用されるイオノフォア。
【図２】ＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）含有細胞をヒスタミン（２０μＭ）、及びカルボキシアミドトリアゾール（２０μＭ）で刺激したグラフを示す。ヒスタミン：細胞内カルシウムの増加を刺激する既知の物質。カルボキシアミノイミダゾール（ＣＡＩ）：経口活性薬剤、非電位作動型カルシウムチャネル遮断薬。
【図３】ＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）組込み細胞が、ｐＨ３、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、ＥＤＴＡ、及びＣａ２＋Ｍｇ２＋不含溶液に応答することを示す。
【図４】単一の２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２刺激によるＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）、ＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）、及びＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）細胞応答を示す。
【図５】ＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）：ｐＨ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡに対する細胞応答を示す。
【図６】Ｕ２−ＯＳヒト骨芽細胞腫細胞を使用したＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）応答を示す。
【図７】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカービメンチン抗体を用いる。ヒトビメンチンは中間径フィラメントタイプであり、中枢神経系の神経前駆細胞／幹細胞によって発現される。
【図８】光透過顕微鏡視野におけるＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞を示す。
【図９】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１０】光透過像におけるＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞を示す。
【図１１】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーＧＦＡＰ抗体を用いる。ＧＦＰ（グリアフィラメントタンパク質）はクラスＩＩＩ中間径フィラメントであり、中枢神経系の発生の間にアストロサイトを他のグリア細胞と区別する細胞特異的マーカーである。
【図１２】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１３】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトアストロサイト細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１４】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒト神経前駆細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１５】Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＣａｌ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１６】Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＭｉｔｏ（商標）バイオセンサーを示す。
【図１７】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーＯ４抗体を用いた。
【図１８】Ｔ３ホルモン（７０ｎｇ／ｍｌ）で誘導した６日後のＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞を示す。免疫組織化学はバイオマーカーミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体を用いる。
【図１９】Ｔｅｍｐｏの専売神経上皮細胞で発現するＴｅｍｐｏＶｏｌ（商標）バイオセンサーを示す。
【図２０】ＴｅｍｐｏのｉＰＳ由来ヒトドーパミン作動性ニューロンを示す。免疫組織化学はバイオマーカーチミンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いる。
【図２１】Ｌｉｐｉｄｕｒｅをコーティングした９６ウェルＵ字型プレートを使用して３Ｄスフェロイドモデルとして試験したＴｅｍｐｏの不死化神経上皮細胞を示す。図示されるスフェロイドの直径＝２５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、バイオセンサーコンストラクト、コンストラクトを受け取るのに有用な細胞を調製するための再プログラム化方法、及び例えば生細胞における活性薬剤又はシグナルの存在を検出するための、バイオセンサーを用いたアッセイ方法を含む。
【００３９】
バイオセンサーは、概して、特定の細胞内部位における電位又はイオンを感知し、且つパラメータの変化に相関する個別的なシグナルを提供するように協働する様々な相補的ドメイン構造を含む。特に有用な実施形態において、バイオセンサーは、特定の種（例えばヒト）、目的の細胞型を代表する細胞、又は目的の病態を発現する細胞で発現する。バイオセンサーを発現する細胞は条件又は薬剤に曝露され、細胞応答を示すシグナルに関してモニタされ得る。
【００４０】
バイオセンサー概要
本発明のバイオセンサーは、概して、例えば位置決め、感知、及びレポートを提供することに特化した構成要素を含むように操作される。センサー核酸コンストラクトの発現において、ペプチド産物は細胞内に、例えば、シャペロン又は移行配列、疎水性親和性、又はリガンド／受容体相互作用によって位置決めされ得る。感知ドメインは、典型的には、変化した細胞内条件又はシグナルイオン若しくは分子の結合に応答してコンホメーションを変化させる。レポートドメインは、典型的には、関連する感知ドメインのコンホメーション変化に応答して変化する検出可能シグナルを呈する。
【００４１】
バイオセンサーの細胞内位置は、任意選択で、標的化ドメイン又は「タグ」によって制御することができる。バイオセンサーによっては、細胞内位置は一般化され、又は受動的に決定される。例えば、センサーは概して核及び／又は細胞質全体に分散してもよい。他の場合には、バイオセンサーシグナルの機能又は特異性が、特定の細胞内膜又は細胞小器官における局在化に依存してもよい。バイオセンサータグの例としては、膜と相互作用するように仕向けられた疎水性ペプチド、細胞質中に分散するように仕向けられたイオン性ペプチド、バイオセンサーを特定のコンパートメントに仕向けるシャペロン配列、及び／又は受容体に仕向けられるリガンドが挙げられる。細胞内シグナル伝達の研究及び薬剤スクリーニングアッセイにおいて有用なタグとしては、例えば、ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、小胞体（ＥＲ）タグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、繊毛タグなどを挙げることができる。
【００４２】
バイオセンサーの感知ドメインは、変化した物理的状態、リガンドの結合、又はイオン環境の変化に応答してコンホメーションが変化する。このコンホメーション変化によって、例えば、関連するレポータードメインのコンホメーション変化が起こり、又はレポータードメインの位置が変わり、それによりシグナルが増強され又は減弱し得る。感知ドメインは、ペプチドの結合、核酸の結合、プロテアーゼとの相互作用、ホスファターゼとの相互作用、ｐＨの変化、イオン強度の変化、電位ポテンシャルの変化などに応答してコンホメーションが変化し得る。
【００４３】
バイオセンサーのレポータードメインは、当該技術分野において公知の任意の適切なタイプのものであってよい。しかしながら、好ましい実施形態では、レポーターは１つ以上のペプチドドメインを含み、例えばそのためレポーターはインビボ系で容易に用いることができる。典型的にはペプチドレポータードメインは、特定のインテロゲーティング励起光波長に応答して特定の蛍光発光を提供する。センサードメインコンホメーション変化の文脈ではＦＲＥＴ戦略が有効であってもよく、例えばここではバイオセンサーコンストラクトが対になったドナー／アクセプターペプチドペアを含む。特定の実施形態において、レポータードメインは赤色乃至近赤外スペクトルの発光を提供するように適合され、それによって例えば細胞層又は組織層を通じた三次元でのシグナルの通過及び検出を可能にする。例えば、比較的透過性のあるレポーター発光シグナルは、５００ｎｍ〜１４００ｎｍ、５５０ｎｍ〜９００ｎｍ、６００ｎｍ〜８５０ｎｍ、６５０ｎｍ〜８００ｎｍ、又は約７００ｎｍの範囲であり得る。例示的実施形態において、レポータードメインは、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなど、ドメインのそれらの内因性蛍光に寄与する蛍光増強性のアミノ酸を含む。任意選択で、レポータードメインは、所望の長波長発光を提供するように天然で翻訳後修飾される領域を含み得る。例えば、赤色領域で発光するドメインは、４−（ｐ−ヒドロキシベンジリデン）−イミダゾリジン−５−オン構造に修飾される内部セリン−チロシン−グリシン配列がフルオロフォアの由来である修飾緑色蛍光タンパク質であり得る。
【００４４】
バイオセンサーコンストラクトは、例えば上述のドメインタイプの２つ、３つ、又は４つを種々の機能構成のいずれでも含むことができる。例えば、任意の順序のセンサードメイン及びレポータードメインがバイオセンサーを構成し得る。多くの場合に、本発明のバイオセンサーは少なくとも３つのドメイン、例えば、標的化ドメインとセンサードメインとレポートドメインとを含む。これらの３つのドメインは任意の順序であってよく、しかし典型的には標的化ドメインがコンストラクトの一方の端部にあり、センサーが中央にあって、レポーターが第２の端部にある。特定の構成では、バイオセンサーコンストラクトは以下の順序（Ｃ末端／Ｎ末端又はＮ末端／Ｃ末端）：センサー／レポーター；標的化／センサー／レポーター；標的化／レポーター／センサー；標的化／レポーター１／センサー／レポーター２（例えば、ＦＲＥＴ）；レポーター１／センサー／レポーター２；センサー／レポーター１／レポーター２；及び標的化／センサー／レポーター１／レポーター２であってもよい。
【００４５】
典型的には、ドメインは、共通に翻訳される単一線状ペプチドコンストラクトにおいて一体に連結されている。任意選択で、コンストラクトは、別のドメインと同じペプチド鎖にない１つ以上のドメインを含み得る。例えば、別個のドメインが、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用、キレート化、リガンド／受容体相互作用、抗体／抗原相互作用などで会合し得る。
【００４６】
ある場合には、単一のドメインが２つ以上の機能を有し得る。例えば、センサードメインが、標的化ドメインとして機能する構造も有し得る。一実施形態において、ドメインは、センサー（例えばリガンド応答性イオンチャネル）及び膜特異的標的化ドメインの両方として働く一連の膜貫通ドメインを有し得る。別の態様において、センサードメインはまた、例えば別個のレポータードメインとのＦＲＥＴペアのドナー又はクエンチャーメンバーとして働くレポーター機能も含み得る。
【００４７】
電位感知バイオセンサー
本発明の電位センサーは、上記に記載する態様の多くを含み、このセンサードメインは電位ポテンシャルの変化に応答する。例えば、電位センサーは、局所環境における静電的影響、例えば、それが結合している膜にわたる電位差に感受性を有し得る。任意選択で、電位センサーは局所イオン環境に感受性を有する。生細胞において、電位ポテンシャルは通常、Ｈ＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋及び／又はＮａ＋の絶対濃度、又は膜にわたるこれらのイオンの濃度差に関係する。従って、電位センサードメインは、典型的には、静電力、Ｈ＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋及び／又はＮａ＋濃度に感受性を有するドメインを含む。かかるセンサーは、筋細胞、心臓細胞、及び神経細胞などの比較的電気活性の高い細胞に関連して特に有用である。
【００４８】
重要なことには、かかる電位センサーは、特異的に細胞内部位におけるイオン／電位状態を標的化し及びレポートするように構成され得る。例えば、コンストラクトは、コンストラクトを細胞内コンパートメント又は表面、例えば、核、筋形質（ｓａｃｒｏｐｌａｓｍａ）、細胞膜、神経軸索、繊毛、又はシナプスなどに仕向ける標的化ドメインを含み得る。従って、概して細胞でシグナル伝達をモニタすることができるのみならず、細胞成分レベルでより特異的な電位差効果を可視化することができる。
【００４９】
本発明の典型的な電位感受性バイオセンサーは、膜貫通ドメインと電位感知ドメインとレポータードメインとを含む。場合によっては、膜貫通ドメインが標的化ドメイン及び／又は電位感知ドメインとして働き得る。一実施形態では、電位センサーは膜貫通／センサー／レポーターの順序でドメインを有する。好ましい実施形態において、レポーターは、例えば赤色乃至近赤外領域で発光する蛍光ペプチドである。
【００５０】
好ましい電位バイオセンサーコンストラクトは、イオンチャネル膜貫通ペプチドとイオンチャネル電位感知ペプチドドメインと蛍光ペプチドとの組み合わせを含む。例示的実施形態において、電位センサーは、修飾された膜貫通ペプチドと、修飾された電位と、赤色発光を提供するように修飾された蛍光タンパク質とを含む。コンストラクトのドメインは、典型的には修飾された進化的突然変異生成としてバイオインフォマティクス／データベース配列の組み合わせから構成される。
【００５１】
特定の電位感知ドメインにおいて、配列は
【化７】
2016536337.tif 000010
を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本電位センサードメインは、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。機能は、保存的置換であって且つ配列が以下のアミノ酸残基：Ｉ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、又はＲ２３８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全てを保持する場合、最良に保存されるものと予想される。多くの実施形態において、Ｒ２３５及びＩ１２３の保存が、最適な電位センサー機能の保持に特に有用であり得る。
【００５２】
電位センサーペプチドの特定のレポータードメインにおいて、配列は
【化８】
2016536337.tif 000011
を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本蛍光レポーターセンサードメインは、配列番号２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。
【００５３】
本発明の好ましい電位感知バイオセンサーは、配列番号１の電位センサーと配列番号２の蛍光レポーターとの両方、及び／又は上記で考察したとおりのそれらの保存変異体を含む。
【００５４】
カルシウムイオン感知バイオセンサー
本発明のカルシウムセンサーコンストラクトは、一般にバイオセンサーに関して上記に記載する態様の多くを含むが、センサードメインはカルシウムイオンレベルの変化に応答性を有する。例えば、カルシウムセンサーは、典型的には特定の親和性でＣａ２＋を結合し、局所Ｃａ２＋濃度に応じてコンホメーションをある程度変化させる。Ｃａ２＋は、細胞型に依存して、且つ誘導されたシグナルの影響に応じて劇的に変わり得る。例えば、Ｃａ２＋は、筋細胞、神経細胞、Ｇタンパク質制御シグナルに応答する細胞、アポトーシスを受ける細胞などをモニタするための情報を提供し得る。生細胞では、Ｃａ２＋レベルは多くの場合に細胞内部位によって変わる。本カルシウムセンサーは、センサーを膜の任意の細胞内コンパートメント、例えば、液胞、核、細胞質、シナプス、小胞体などに仕向ける標的化ドメインを含み得る。
【００５５】
カルシウムセンサードメインは、典型的には１つ以上のカルシウム結合タンパク質の一部に相同なペプチドである。例えば、カルシウム結合ドメインは、カルモジュリン、カレクシチン、パルブアルブミン、Ｓ１００タンパク質、カルシニューリンなどに見られる進化配列と同様の配列を有し得る。センサーの役割としては、カルシウム濃度の変化に伴いペプチド又はペプチド断片がコンホメーションを変化させることで十分である。コンホメーションの変化によってレポーター基の位置が変わり、典型的には発光プロファイル又は強度が変化する。現代のタンパク質工学技術を用いて、レポーターの転位置を引き起こすエンハンスメント（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）を、例えば誘導された接触又はレポーターそれ自体の誘導されたコンホメーション変化によって増強し又は抑えるように操作することができる。
【００５６】
好ましいカルシウムバイオセンサーコンストラクトは、カルモジュリン及びトロポニンモチーフを含むカルシウム結合ドメイン（即ち、ＥＦハンドドメイン）と蛍光ペプチドとのタンデムアレイの組み合わせを含む。例示的実施形態において、カルシウムセンサーは、カルモジュリン、トロポニンからの修飾されたカルシウム結合ドメインと、赤色発光を提供するように修飾された蛍光タンパク質とを含む。コンストラクトのドメインは、典型的には、修飾された進化的突然変異生成としてバイオインフォマティクス／データベース配列の組み合わせから構成される。
【００５７】
特定のカルシウム結合ドメインにおいて、配列は、
【化９】
2016536337.tif 000012
を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本カルシウム結合ドメインは、配列番号４と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。
【００５８】
カルシウムセンサーペプチドの特定のＥＦハンドドメインにおいて、配列は、
【化１０】
2016536337.tif 000013
を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本ＥＦハンドドメインは、配列番号５と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。
【００５９】
カルシウムセンサーペプチドの特定のレポータードメインにおいて、配列は、
【化１１】
2016536337.tif 000014
を含む。配列の保存的変異は、実質的な有用機能を保持するものと予想される。本蛍光レポーターセンサードメインは、配列番号６と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含むペプチドを含む。
【００６０】
本発明の好ましいカルシウム感知バイオセンサーは、配列番号４、５、６、及び７で同定されるドメインの１つ、２つ、３つ又はそれ以上、及び／又は上記で考察したとおりのそれらの保存変異体を含む。
【００６１】
ヒト細胞におけるバイオセンサーコンストラクト
本明細書に記載されるバイオセンサーは、細胞に組み込むことで、細胞内の電位及びイオン状態をモニタすることができる。例えば、バイオセンサーペプチドドメインをコードする核酸コンストラクトを、当該技術分野において公知のとおり、真核細胞に形質転換し又はトランスフェクトし、例えば適切なプロモーターを使用して発現させることができる。細胞は好ましくはヒトであり、例えばヒトシグナル伝達及び病状の研究向けに、信頼できる宿主細胞モデルの利益が提供される。細胞は好ましくは、幹細胞又は目的の特定の細胞型に分化した細胞である。
【００６２】
核酸コンストラクトは、本明細書に記載される任意のバイオセンサーをコードし得る。例えば、コンストラクトは、電位センサードメイン、カルシウムセンサードメイン、標的化ドメイン、及び／又はレポータードメインの組み合わせをコードし得る。一実施形態において、核酸コンストラクトは、機能性バイオセンサーを提供するドメインの組み合わせを含むペプチド鎖の発現を仕向ける一過性発現ベクター構成要素を含む。例えば、核酸は、カルシウム結合ドメインとトロポニンドメインとレポータードメインとの組み合わせを含む単一のペプチド鎖を発現し得る。別の例において、核酸コンストラクトは、少なくとも膜貫通ドメインと電位感知ドメインとレポータードメインとの組み合わせを含むペプチドをコードし得る。
【００６３】
核酸発現コンストラクトの他の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１、２、３、４、５、６、及び／又は７のいずれかのペプチドをコードする配列を含む。電位バイオセンサーとして機能する特定の実施形態において、ベクターは、配列番号１及び２のペプチドをコードする核酸配列の組み合わせを、例えば、膜貫通ドメイン、例えばＧタンパク質ドメイン又はイオンチャネルドメインをコードする配列と共に含み得る。かかるコンストラクトは、配列番号１及び／又は配列番号２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の機能性ペプチド配列をコードし得る。好ましい実施形態において、コンストラクトは、少なくともＩ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、及び／又はＲ２３８のアミノ酸を保持する配列番号１の相同体をコードする。多くの実施形態において、Ｒ２３５及びＩ１２３の保存が、最適な電位センサー機能の保持に特に有用であり得る。カルシウム感知バイオセンサーとして機能する他の実施形態では、ベクターは、配列番号４、５、６、及び／又は７のペプチドをコードする核酸配列の組み合わせを含み得る。かかるコンストラクトは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び／又は配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一の機能性ペプチド配列をコードし得る。
【００６４】
上記の発現ベクターの有用な核酸コンストラクトは、標的化タグ、例えば、ＮＬＳタグ、脂質膜タグ、ＥＲタグ、ゴルジタグ、エンドソームタグ、ミトコンドリアタグ、及び／又は繊毛タグなどをコードするさらなる配列を含み得る。例えば、標的化タグは、配列番号３のペプチドタグ配列をコードする配列と少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
【００６５】
本発明は、本明細書で考察されるバイオセンサーを含む細胞を含む。例えば、バイオセンサーペプチドをコードする核酸コンストラクトが選択の真核細胞に形質導入又はトランスフェクトされ得る。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物、最も好ましくはヒトに由来する。多くの実施形態において、細胞は不死化幹細胞、又は幹細胞から完全に若しくは部分的に分化した細胞である。
【００６６】
本バイオセンサーとの関連において、細胞は初めにヒト患者試料から得られてもよい。かかる細胞の利点は、それらが当該の患者にとっての活性薬剤及び条件変化に対する極めて代表性の高い応答を提供し得ることである。従って、かかる細胞モデルは、当該の患者にとっての候補治療薬の作用様式又は有効性に関する情報を提供する可能性が高い。例えば、かかる細胞モデルは、自己免疫疾患、神経系疾患、癌、糖尿病、又は遺伝的欠陥による病態などの特定の病状を有する患者に個別に合わせたテーラーメイド治療を特定する助けとなり得る。
【００６７】
或いは、モデルは、遺伝子工学技術によって導入される目的の特定の非内因性遺伝子を有する細胞を用いてもよい。例えば、目的の遺伝子は、目的の受容体分子、Ｇタンパク質共役受容体、又はイオンチャネルをコードし得る。典型的には、宿主細胞は、研究における目的の細胞型の代表性が最も高い細胞である。かかるモデル細胞は、例えばシグナル伝達のモニタリング又は目的の遺伝子の調節に活性を有する候補薬剤のスクリーニングにおいて、より代表性の高い結果を提供するのに有用であり得る。
【００６８】
細胞モデルは、生きている動物に由来する細胞の初代培養物から入手可能な誘導性細胞から得られてもよい。例えば、線維芽細胞又は循環血液からの未分化細胞を誘導して多能性細胞を提供することができる。細胞の状態を幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞に仕向けることにおいて後成的プロセスが中心的な役割を果たし得ることは注目に値する。Ｌｉｓｔｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ４７１（７３３６）：６８−７３，２０１１）において、種々の異なる多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の誘導能を有する異常なエピゲノミックなプログラム化が見出された。女性の肺線維芽細胞、脂肪細胞、及び包皮線維芽細胞が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣ遺伝子を使用して誘導多能性状態に再プログラム化された。ｉＰＳＣは、ＤＮＡメチル化パターンを含む多くの特徴が胚性幹細胞と類似していることが見出された。かかる概念を用いることにより、例えば以下に記載するさらなる概日同期化技法と組み合わせて、細胞を再プログラム化することができる。
【００６９】
不死化遺伝子の作用による誘導に加え、細胞シグナル伝達は、分化を左右する後成的プロセスに影響を及ぼすことが見出された。Ｂａｙｌｉｎ（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８（１０）：１０３３−８，２０１０）の研究において、いくつかのシグナル伝達経路が胚性幹細胞の誘導及び維持並びにそれらの分化に重要であると示唆された。例えば、成長因子のシグナル伝達経路は細胞分化の後成的調節において役割を果たし得る。これらの成長因子には、例えば、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及び骨形成タンパク質が含まれる。誘導及び分化に重要な別の因子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路であり得る。
【００７０】
細胞同期に対する概日リズムの影響を、多能性（ｐｌｕｏｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）細胞の誘導に用いることができる。例えば、ヒト時計遺伝子及びヒトＢｍａｌ１／２／３／４遺伝子並びにそれらのＥボックスプロモーターを使用して細胞を誘導性多能性幹細胞に再プログラム化することができる。一態様において、かかる再プログラム化によって線維芽細胞ｉＰＳＣを作成し、さらに、所望に応じて誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞、又は誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を提供するように仕向けることができる。各細胞型の再プログラム化因子は、典型的には細胞系統に特異的な転写調節因子である。各因子は、概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター又は人工Ｅボックス様プロモーター配列タグなど）によって制御されるように修飾され得る。かかるプロモーター配列は各転写調節因子に付加することができ、ひいてはヒト時計及びＢｍａｌ遺伝子によって調節される新規転写制御エレメントを形成し得る。
【００７１】
本明細書に記載されるバイオセンサーシステムを補完するため、誘導細胞を併せて「組織」構造において、例えば三次元で培養することができる。このようにして目的の細胞間接触を、例えば近赤外レポーターシグナルの形態で利用可能な透過イメージングを使用して研究することができる。例えば、ｉＮ及びｉＧの共培養を調製してニューロン構造の３Ｄモデルを作成することができる。この構造は、例えば共焦点顕微鏡観察用に、例えばレポーターシグナルに対して不透過性でない材料を使用した適切に構造化された足場を例えば使用して、さらに制御することができる。
【００７２】
モデル細胞におけるバイオセンサーを使用したスクリーニング及びアッセイ方法
例えば目的のモデル細胞となるように操作されたバイオセンサーコンストラクトは、目的とする生命科学研究及び臨床病理学試験に関連性のあるアッセイ及びスクリーニング結果を、より高い予測性をもって提供することができる。即ち、特定の表現型に分化した適切な細胞型における標的化された本バイオセンサーは、例えば従来技術の異種型モデルと比べ、モデル化された生物における通常の応答を予測する可能性がより高いモデルを提供することができる。
【００７３】
モデルシステムの調製における最初のステップは、目的の細胞型及び検出するシグナルを同定することであり得る。例えば、特定の神経学的病状を調べるため、例えばｉＰＳ細胞から分化したモデル細胞において、電位センサーを細胞膜に標的化することを選択し得る。或いは、モデルＣＭＬ細胞に誘導された造血芽細胞及びカルシウム感知バイオセンサーコンストラクトからのシグナル伝達を使用して血液細胞癌を調べることを決定し得る。典型的には、バイオセンサーコンストラクトは、例えばＣＭＶ構成的プロモーター又は細胞型特異的プロモーターを使用して、細胞において一過性に発現させる。
【００７４】
モデルシステムが樹立されると、単一細胞において、又は細胞のアレイにわたり、バイオセンサーをモニタすることができる。例えば、細胞をシグナル伝達剤に曝露して、細胞型が当該の薬剤、例えばサイトカイン又は候補小分子生物活性剤に応答するかどうかを確かめることができる。任意選択で、細胞を目的のペプチド（例えば、腫瘍関連抗原又は癌遺伝子）の第２の発現コンストラクトとコトランスフェクトし、シグナル伝達経路における外部遺伝子の任意の影響をモニタすることができる。
【００７５】
他の実施形態では、細胞は、低い、中程度の、又は高いスループットのアッセイフォーマットに補完的なアレイに分離することができる。例えば、細胞を推定候補薬剤のライブラリメンバーに別個に曝露するため、９６ウェルプレート、マイクロウェルアレイ、又はＦＡＣＳソーターに分注することができる。かかるアレイは標準的な蛍光検出機器を使用してレビューすることができる。任意選択で、アレイは、デジタルＣＣＤベースのカメラによって写真でレビューすることができる。さらなる特徴付けのため、例えば陽性又は陰性基準と比較したときのシグナルの変化をフラッギングすることができる。
【実施例】
【００７６】
以下の例は例示のために提供され、特許請求される本発明を限定するために提供されるものではない。本明細書に開示される発明概念には、細胞内条件に感受性を有する特定のバイオセンサー、そのバイオセンサーを発現する細胞、及び細胞をモニタして、例えば外部から加えられた薬剤の活性に関連する細胞内変化を検出する方法が含まれる。
【００７７】
実施例１−電位センサーコンストラクト
細胞内環境で使用される電位センサーが提供される。この電位センサーは、相互作用する構造的特徴の組み合わせを特徴とするペプチドコンストラクトである。発現したペプチドコンストラクトは、膜貫通ドメインと電位感知ドメインと蛍光レポーターとを含む。膜貫通はセンサーを選択の細胞の脂質膜にアンカリングし得る。電位感知ドメインは、例えば、周囲のイオン環境の変化又はアンカー膜にわたる電位ポテンシャルに感受性を有する極性基又はイオン基を含み得る。蛍光レポーターは、例えばコンストラクトの他のドメインのコンホメーション変化に感受性を有するように適合された蛍光ペプチド配列である。
【００７８】
膜貫通ドメインは、典型的には、膜の脂質と相互作用してコンストラクトをアンカリングする疎水性アミノ酸残基を含む。さらに、膜貫通ドメインは、併せてイオンチャネル又は電位開口型チャネルを含む複数の膜貫通構造を提供し得る。
【００７９】
例示的実施形態の電位感知ドメインは、以下のペプチド配列を含む。
【化１２】
2016536337.tif 000015
【００８０】
電位感知配列の注目すべき構造的特徴としては、低複雑度領域（アミノ酸６３〜７５）、膜貫通ドメイン（アミノ酸１０９〜１３１）、及びイオン輸送（アミノ酸１４９〜２４５）が挙げられる。コンホメーション応答作用に特に重要な残基としては、Ｉ１２３、Ｒ２２０、Ｒ２２６、Ｒ２２９、Ｒ２３５、Ｒ２３８；特に残基Ｒ２３５及びＩ１２３が挙げられる。
【００８１】
このコンストラクトにおいては、近赤外長波長特性フルオロフォア赤色強度が、残基Ｒ２３５及びＩ１２３の任意の変化に特に感受性を有するはずである。感知ドメイン及び膜貫通ドメインの（例えば、特に膜アンカー環境における）コンホメーション変化は、フルオロフォアドメイン発光の強度（ΔＦ）及びスペクトル輪郭の測定可能な実質的変化をもたらす。
【００８２】
以下は、有用な蛍光赤色レポータードメイン配列のサンプルである。
【化１３】
2016536337.tif 000016
【００８３】
実施例２−カルシウムセンサーコンストラクト
例示的カルシウムセンサーコンストラクトの構造的特徴は、カルモジュリン結合ドメインとトロポニンドメインと蛍光レポータードメインとの相補的な組み合わせを含む。コンストラクトは、コンストラクトを特定の細胞内部位又は環境に標的化する１つ以上のタグ配列をさらに含み得る。カルモジュリン様結合ドメイン及びトロポニン様ドメインを含むＥＦハンドドメインと、蛍光レポータードメインとのタンデムアレイの相補的な組み合わせ。蛍光レポーターは、例えばコンストラクトの他のドメインのコンホメーション変化に感受性を有するように適合された蛍光ペプチド配列である。
【００８４】
カルシウムセンサー構成要素は以下のとおり相互作用する。ＥＦハンドドメインに対するカルシウム結合がペプチドコンストラクトのコンホメーション変化及び表面疎水性変化を生じさせる。次に変化したカルシウム結合ドメインが蛍光レポータードメインと異なる形で相互作用し、フルオロフォア（ΔＦ）発光の強度の実質的且つ測定可能な変化を引き起こす。
【００８５】
例示的実施形態のカルシウム感知ドメインは、以下のペプチド配列を含む。
【化１４】
2016536337.tif 000017
【００８６】
赤色蛍光指示薬は、以下の近赤外レポータードメイン配列を含み得る。
【化１５】
2016536337.tif 000018
【００８７】
実施例３−標的化タグ
多くの場合、電位センサー又はカルシウムセンサーを特定の細胞内膜又はコンパートメントに仕向けることが有利である。本発明のバイオセンサーは、細胞標的に親和性を有するように適合されたペプチドセグメントを含み得る。
【００８８】
バイオセンサーを所望の細胞内部位に標的化させるのに有用な例示的ペプチド配列としては、例えば：
−ＮＬＳタグ（タンパク質配列）：
【化１６】
2016536337.tif 000019
−ＥＲタグ：
【化１７】
2016536337.tif 000020
−エンドソームタグ：
【化１８】
2016536337.tif 000021
−繊毛タグ：
【化１９】
2016536337.tif 000022
−ヒトエンドソーム配列タグ
【化２０】
2016536337.tif 000023
−配列番号１６  ヒトシナプシンタグ：
【化２１】
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−配列番号１７  ヒトシナプス小胞タグ：
【化２２】
2016536337.tif 000025
−ＴｅｍｐｏＥｎｄｏタンパク質配列；エンドソームタグを有するＴｅｍｐｏＶｏｌ
【化２３】
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が挙げられる。タグは（ほとんどの場合）各センサー−レポーターコンストラクトのＮ末端側である。
【００８９】
実施例４−細胞の再プログラム化方法
ヒト線維芽細胞は、多能性状態に再プログラム化することができる。次にかかる細胞をある程度まで分化させてバイオセンサー発現用の細胞型特異的モデルシステムを提供することができる。
【００９０】
線維芽細胞は、転写調節制御修飾と組み合わせた概日リズム（細胞同期）の誘導による方法を用いて、約１０日の間に誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラム化される。例えば、関連するＥボックスプロモーターを例えば使用して、ヒト時計遺伝子及びヒトＢｍａｌ１／２／３／４遺伝子を用いることができる。
【００９１】
各再プログラム化因子は、典型的には細胞系統に特異的な転写調節因子であり、各因子が概日調節エレメント（Ｅボックスプロモーター又は人工Ｅボックス様プロモーター配列タグ）によって制御されるように修飾される。プロモーター配列は各転写調節因子に付加され、ひいてはヒト時計及びＢｍａｌ遺伝子によって調節される新規転写エレメント及び制御を形成する。
【００９２】
線維芽細胞は、ｉＰＳＣと同様の手法を用いて、但しそれらの系統に好適な特定の転写因子によって、誘導性ニューロン（ｉＮ）、グリア細胞（アストロサイトを含む、ｉＧ）、及び誘導性神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）に再プログラム化することができる。
【００９３】
ｉＮ及びｉＧの共培養を実施することにより、専売のインビトロ足場を使用して、３Ｄモデルが作成される。
【００９４】
実施例５−再プログラム化された細胞のスクリーニング方法
本明細書に記載されるセンサーを再プログラム化細胞に導入し、それにより例えば細胞内のシグナル伝達部分の相互作用をモニタすることができる。さらに、再プログラム化細胞を候補薬剤分子に曝露して、薬剤が細胞内カルシウムレベル及び／又は細胞の電位ポテンシャルに及ぼす効果をモニタすることができる。
【００９５】
バイオセンサーをコードする核酸は、例えば標準的な電気穿孔技法を用いて、選択の発現用細胞に一過性に（４８時間）形質導入することができる。目的の遺伝子（ＧＰＣＲ、チャネル、受容体等）を発現させるため、細胞に対してさらなる遺伝子修飾を実施することができる。かかる細胞は、シグナル伝達相互作用及び生物活性剤を調べるための代表性のあるモデルとして働き得る。
【００９６】
一つの選択肢では、細胞は初めに患者試料から直接得られる。再プログラム化及びバイオセンサーの導入後、かかる細胞は、患者の応答を反映する可能性がより高いモデルシステム及びアッセイ結果を提供し得る。患者由来細胞の文脈では、例えば、患者線維芽細胞を多能性にし、例えば病態の標的細胞を反映するのに望ましい程度まで分化させ得る。目的の病態に応じて、バイオセンサーは、目的の部位に標的化され、関連する電位又はカルシウムレベルを検出し、且つ使用する検出システムに適切なシグナルを提供するように適合される。
【００９７】
別の選択肢では、目的の外部（例えば、非内因性）遺伝子が、調べようとする細胞に導入される。例えば、受容体分子、ＧＰＣＲ、又はチャネルなどの目的の遺伝子をヒトｃＤＮＡライブラリから分子クローニングした後、その遺伝子を細胞にトランスフェクトすることができる。バイオセンサーもまた細胞に導入され、細胞機能アッセイが実施される。このようにして、その遺伝子のコードされたペプチドを、関連性のある細胞のユニークな環境で調べることができる。かかるモデル細胞（例えば、異常な受容体を発現する再プログラム化ヒト細胞）は、他のインビトロアッセイと比べて関連する生きている動物の結果を反映する可能性が高いバイオセンサーシグナルを提供し得る。
【００９８】
以下は、典型的な実験計画である。目的の細胞がマルチウェルフォーマット（１２、２４、４８、９６、３８４、又は１５３８ウェルフォーマット）に播種される。標準的なトランスフェクション手順を用いてセンサー発現コンストラクトが導入される。トランスフェクションの３６〜４８時間後、センサーの発現レベルを正しく評価した後に細胞機能アッセイが開始される。各実験の刺激はアッセイする受容体又はチャネルの性質及び適用される関連性のある表現型／疾患条件は何かに依存する。目的の薬剤（例えば、特定の分子又はリガンド）が分かっている場合、それは、細胞に適用される液体溶液中に溶解される。
【００９９】
薬剤の適用前にベースラインを確立し得る。典型的には励起波長は約４５０〜５７０ｎｍに設定される。発光波長は典型的には約５００〜７００ｎｍの範囲である。蛍光は、露光時間約５００ｍｓで約３秒毎にサンプリングされる。実際の蛍光応答から減算され、開始蛍光値に対して正規化される、ベースライン蛍光レベル（例えば、２０データ点）を減算することによりΔＦ／Ｆが計算される。細胞又は組織の目的の領域毎に、ＩｍａｇｅＪ、Ｍａｔｌａｂ又は製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、ＢｉｏＴｅｋ等）のソフトウェアアルゴリズムによって開発された任意の専売ソフトウェアにおけるスクリプトを使用して、蛍光変化率が計算される。
【０１００】
実施例６−ヒト細胞モデルを使用したスクリーニング及び発見
本明細書に記載されるバイオセンサー及びモデル細胞システムは、どのようなフォーマット及びコンテクストにおいても細胞間相互作用、シグナル伝達、及び細胞内応答のモニタリングに使用し得ることが想定される。例えば、以下の有用性が実現され得る。
【０１０１】
１）ヒトｉＰＳＣ由来のものを細胞型に用いてヒト疾患モデルの２Ｄ又は３Ｄ細胞モデルを作成することができ、及びバイオセンサーを使用して化学的、生物学的、薬物様、及び毒性化合物をスクリーニングし、それにより例えば候補薬物化合物を同定及び評価することができる。
【０１０２】
２）合成され且つ遺伝的にコードされたバイオセンサーをヒト細胞におけるＣａ２＋濃度のレポーターとして機能するように調製し、例えば、核、細胞質、細胞膜などの細胞内コンパートメントにおけるイベントを分析することができる。
【０１０３】
３）合成され且つ遺伝的にコードされたバイオセンサーを、例えば、核、細胞質、又は細胞膜などのコンパートメントにおいて、ヒト細胞の細胞電位変化のレポーターとして機能させることができる。電位センサーは、ナトリウム（Ｎａ＋）及びカリウム（Ｋ＋）濃度の変化に起因する膜ポテンシャルの変動を評価及びレポートし得る。
【０１０４】
４）バイオセンサーは細胞型特異的様式で使用することができる。例えば、本明細書の開示に基づき、細胞型、例えば、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、アストロサイト、心筋細胞、ＨＳＣ、ＮＰＣ、ＭＳＣ、癌細胞、癌幹細胞などに対する特異的プロモーター配列が含まれるようにバイオセンサーを遺伝的に修飾することができる。ヒト及び哺乳類細胞型は、一般に特に重要で興味深い。
【０１０５】
５）長波長範囲（例えば、５００ｎｍ〜７５０ｎｍ範囲）でシグナルを伝達するバイオセンサーを使用して、生物学的試料の三次元での相互作用を検出することができる。
【０１０６】
６）以下の配列（間もなく示す予定）と少なくとも７０％の同一性で配列同一性を有するバイオセンサーを使用すること。
【０１０７】
７）好都合に線維芽細胞又は血液に由来するヒト細胞モデルを使用して患者又は細胞型に特異的な情報を提供すること。
【０１０８】
８）血液又は線維芽細胞生検からのパーキンソン病患者由来誘導性多能性細胞（ｉＰＳＣ）を再プログラム化すると神経前駆細胞（ＮＰＣ）になる。この細胞に、電気穿孔又は化学的トランスフェクション方法（標準）を使用して適切なバイオセンサーが導入される。細胞をマルチウェルプレート（２４、４８、９５、又は１５００ウェルプレート）にプレーティングする。標準的なローディング方法によって化合物を細胞に適用する。蛍光励起が実験の開始となる。刺激溶液に洗浄溶液が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され、時間（ミリ秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロットされる。或いは、単一のインテンシオメトリックレポーターを使用した計算には、ベースライン応答の標準化及び化学的又は生物学的化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必要となり得る。
【０１０９】
９）罹患患者及び非罹患者から、血液又は線維芽細胞生検からのレット症候群患者由来誘導性多能性細胞（ｉＰＳＣ）が初代ニューロン、アストロサイト及びニューロンアストロサイト共培養物に誘導される。この細胞に、電気穿孔又は化学的トランスフェクション方法（標準）を使用してバイオセンサーが導入される。細胞がマルチウェルプレート（２４、４８、９５、又は１５００ウェルプレート）にプレーティングされる。標準的なローディング方法によって化合物が細胞に適用される。蛍光励起が実験の開始となる。刺激溶液に洗浄溶液が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され、時間（ミリ秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロットされる。或いは、単一のインテンシオメトリックレポーターを使用した計算には、ベースライン応答の標準化及び化学的又は生物学的化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必要となり得る。
【０１１０】
１０）自身の化合物（具体的には、生物学的製剤及び合成ペプチド）のライブラリの新規スクリーニング方法を探している初期乃至中期段階のバイオ製薬会社は、新規スクリーニング方法を必要とする。前駆細胞（ＮＰＣ、ＭＳＣ、ＨＳＣ）が作成され、その細胞に電位バイオセンサーが導入される。次に、細胞がマルチウェルプレート（２４、４８、９５、又は１５００ウェルプレート）にプレーティングされる。標準的なローディング方法によって化合物が細胞に適用される。蛍光励起が実験の開始となる。刺激溶液に洗浄溶液が続く。測定が取られ、蛍光（ΔＦ）及び比（ΔＦ／Ｆ）の変化が計算され、時間（ミリ秒乃至秒の時間フレーム）に対してプロットされる。或いは、単一のインテンシオメトリックレポーターを使用した計算には、ベースライン応答の標準化及び化学的又は生物学的化合物に応答した蛍光強度の変化の計算が必要となり得る。
【０１１１】
１１）ある会社が、生理学的に関連性のある細胞環境における候補化合物の効果を、例えば２Ｄ又は３Ｄモデルでヒト初代／由来／誘導細胞型及び共培養物を使用して評価する新規毒性学的技法を採りたいと考える。機器には、マルチプレート蛍光リーダー（例：ＴＥＣＡＮのＭ１０００Ｐｒｏ）又はハイコンテンツ細胞イメージャ（ＧＥのＩＮ  Ｃｅｌｌ  ６０００）が含まれ得る。
【０１１２】
１２）ある会社が、候補化合物に最も適切な遺伝子型を決定するため（臨床第１／２／３相試験及び評価のため）、患者由来細胞集団に対して薬物候補をスクリーニングしたいと考える（個人化した薬剤効能）。会社は二組のカスタムサービス−初めに前駆細胞型（ＮＰＣ、ＨＰＣ、又はＭＳＣ）を作製してスクリーニング用バイオセンサーを導入し；第二に特異的細胞型（ニューロン、グリア、心筋細胞、肝臓等）を作製してスクリーニング用バイオセンサーを導入するサービスの提供を受け得る。
【０１１３】
実施例７−２Ｄ対３Ｄヒト細胞モデル
従来、２Ｄの細胞培養モデルは単層として実施される。３Ｄでのヒト細胞の培養には、コーティング（例えば、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）コーティング又はＮｕｎｃ（登録商標））及び時に、Ｕ字型、Ｖ字型、又はＦ字型ディッシュ底を有する特殊な細胞培養ディッシュが必要である。近年、ヒト癌及び幹細胞分野における数多くの研究が３Ｄ培養の重要性を指摘している。３Ｄ培養により、癌細胞は腫瘍をスフェロイドとして形成することが可能になる（図２１を参照のこと。学術文献の多くが、３Ｄスフェロイドは薬物化合物に対する癌細胞応答の予測性が高いことを示唆している。従って、３Ｄスフェロイドモデルを使用することで、化学的化合物（薬物ライブラリにおける化学的化合物としても知られる）に対する腫瘍応答を予測する新規の改良されたモデルが提供される。
【０１１４】
実施例８−ＡＴＰバイオセンサー
ＡＴＰ感知は、特にミトコンドリアにおいて、細胞機能に重要である。哺乳類細胞に関して、ＡＴＰ測定値は代謝機能を示し、これはヒト突然変異又は多型に起因する病状、シグナル伝達経路の破壊、又はミトコンドリア機能不全に起因する機能不全の指標となり得る。従って、細胞レポーターとしてのＡＴＰバイオセンサーの開発には決定的な重要性がある。ＴｅｍｐｏのＡＴＰバイオセンサーは、ＡＴＰを感知してそれに結合するドメインと、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍ（励起／発光）範囲の蛍光レポーターであるドメインとを含む。
【０１１５】
ＡＴＰ結合バイオセンサー、ＴｅｍｐｏＡＴＰ：
【化２４】
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【０１１６】
実施例９−ヘムバイオセンサー
ヘム感知は、特にミトコンドリア機能の研究、並びに癌／腫瘍低酸素研究において、細胞機能に重要である（参考文献が必要？）。哺乳類細胞に関して、細胞代謝速度は酸素消費量によって測定され、代謝機能を示す。細胞モデルにおける機能不全及び異常は、細胞の疾患表現型（ヒト突然変異又は多型に起因する）、シグナル伝達経路の破壊、又はミトコンドリア機能不全に起因し得る。従って、細胞レポーターとしてのヘムバイオセンサーの開発には決定的な重要性がある。Ｔｅｍｐｏヘムバイオセンサーは、ヘム（アミノ酸残基１〜２０５）を感知してそれに結合するドメインと、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍ（励起／発光）範囲の蛍光レポーターであるドメインとを含む。
【０１１７】
酸素−ヘム結合バイオセンサー、ＴｅｍｐｏＨＥＭＥ
【化２５】
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【０１１８】
本明細書に記載される例及び実施形態は例示目的に過ぎず、それらを踏まえた様々な改良又は変更が当業者に示唆され得るとともに、本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれるものとされることが理解される。
【０１１９】
前述の発明は、明確さ及び理解のためいくらか詳細に記載されているが、当業者には、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形式及び詳細の様々な変更を行い得ることが明らかであろう。例えば、上記に記載される技術及び装置は全て、様々な組み合わせで使用することができる。本願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は、個々の各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献があらゆる目的から参照によって援用されることを個々に示された場合と同程度にあらゆる目的から全体として参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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