(57)【要約】  本開示は、細胞透過機能を有するペプチドを単離する方法を提供し、これらのペプチドは、細胞膜を介したそれらのトランスロケーション後にのみ、ビオチン化分子として検出される。本開示はまた、ペプチドの細胞透過機能を検証するための、又はこのようなペプチドを単離するためにそれ自体で使用され得る方法を提供し、これらのペプチドは、検出可能なカーゴ、例えば、カーゴ毒素又は機能的GFPの補完に必要とされる緑色蛍光タンパク質(GFP)の断片を細胞質中に輸送するそれらの能力によって、検出可能である。本開示はまた、公知のCPP、例えば、TAT、VP22、トランスポータン及びペネトラチンとは構造的に異なり、細胞膜をトランスロケートし、エンドソームから逃避することが可能な、細胞透過機能を有する非標準的ペプチドを提供する。開示されたペプチドは、細胞中に治療的及び診断的カーゴを輸送する際に、有用性を有する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドを決定又は同定する方法であって、
(i)ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させるステップであって、該メンバーは、融合タンパク質をディスプレイする足場を含み、融合タンパク質の各々は、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含み、前記接触させるステップは、メンバーの少なくともディスプレイされた融合タンパク質が宿主細胞に侵入するのに十分な時間及び条件下である、ステップと、
(ii)宿主細胞の膜をトランスロケートした少なくとも融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるような時間及び条件下で宿主細胞をインキュベートするステップと、
(iii)(a)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物中のビオチン化融合タンパク質の存在を検出するステップであって、ビオチン化融合タンパク質の存在は、候補ペプチド部分が細胞膜をトランスロケートしたことを示す、ステップ、及び/又は
(b)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物から少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を単離するステップ、及び/又は
(c)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物から少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を回収するステップ
を含むプロセスを実施することによって、宿主細胞の膜をトランスロケートした候補ペプチド部分を決定又は同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
メンバーは、足場と融合タンパク質との間に共有結合的連結をさらに含み、共有結合的連結は、細胞又はその細胞内区画内の環境への曝露によって切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内環境は、細胞の細胞質の還元性環境を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
共有結合的連結は、ジスルフィド結合である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
メンバーは、宿主細胞のエンドソームに侵入しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(i)における接触させるステップは、メンバーの少なくともディスプレイされた融合タンパク質が宿主細胞のエンドソームに侵入するのに十分な時間及び条件下であり、ステップ(ii)におけるインキュベートするステップは、宿主細胞のエンドソームをトランスロケートした少なくとも融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるような時間及び条件下であり、ステップ(iii)における決定又は同定するステップは、宿主のエンドソームをトランスロケートした候補ペプチド部分を、ステップ(iii)において決定又は同定するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
メンバーは、インタクトで宿主のエンドソームをトランスロケートする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
メンバーは、足場と融合タンパク質との間にアミノ酸配列をさらに含み、該配列は、酵素基質部位を含み、前記メンバーは、前記酵素基質部位に対して作用する酵素と反応して融合タンパク質から足場を切断し、切断された融合タンパク質は、宿主細胞のエンドソームに侵入する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
切断された融合タンパク質は、宿主細胞のエンドソームをトランスロケートする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ビオチン化メンバーを検出及び/又は単離及び/又は回収するステップを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ビオチン化融合タンパク質を検出及び/又は単離及び/又は回収するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
非ビオチン化メンバーは、内因性ビオチンリガーゼ活性を有さない細胞において産生されることによって、非ビオチン化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
内因性ビオチンリガーゼ活性を有さない細胞において非ビオチン化メンバーを産生するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非ビオチン化メンバーは、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有するビオチンリガーゼを有する細胞において産生されることによって、非ビオチン化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有するビオチンリガーゼを有する細胞において非ビオチン化メンバーを産生するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(ii)の後及びステップ(iii)の前に、宿主細胞を、ビオチンリガーゼの活性を阻害する薬剤と共にインキュベートするステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤は、ピロリン酸塩又はアデノシン5'一リン酸(AMP)塩を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ピロリン酸塩は、コロイド金属ピロリン酸塩、二ナトリウムピロリン酸塩、四ナトリウムピロリン酸塩、カリウムピロリン酸塩、カルシウムピロリン酸塩又はイノシトールピロリン酸塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
AMP塩は、二ナトリウム塩、カルシウム塩又はマグネシウム塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
薬剤は、カオトロピック塩を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
薬剤は、発現されたビオチンリガーゼの結合についてビオチンリガーゼ基質ドメインと競合することが可能なビオチンアナログを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤は、アセトニトリルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
細胞膜を破壊することなく、宿主細胞の膜と会合したメンバーを除去するために、ステップ(i)において宿主細胞を処理するステップをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞を処理するステップは、細胞膜を破壊することなく、宿主細胞にとって外的なメンバーを除去及び/又は不活性化するのに十分な時間及び条件下で、宿主細胞をプロテアーゼと共にインキュベートするステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼは、トリプシン又はキモトリプシン又はサーモリシン又はヘパリナーゼ又はスブチリシン又はプロテイナーゼKである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を処理するステップは、宿主細胞の膜と会合したメンバーを除去するのに十分な時間及び条件下で、宿主細胞を洗浄するステップを含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ(i)の前に複数の非ビオチン化メンバーを分画し、それによって、各々が正味の正の電荷又は正味の負の電荷又は正味の中性電荷を有するメンバーの1つ以上のプールを得るステップ、及び次いで、メンバーの1つ以上のプールを使用してステップ(i)を実施するステップをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
複数の非ビオチン化メンバーを分画するステップは、イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップ、及びメンバーの1つ以上のプールを回収するステップを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換体の使用を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換体の使用を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
イオン交換クロマトグラフィーは、バッチプロセスである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
イオン交換クロマトグラフィーは、移動床プロセスである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
メンバーのプールは、2若しくは3若しくは4若しくは5若しくは6若しくは7若しくは8若しくは9若しくは10若しくは11若しくは12の等電点(pI)、又は2〜10若しくは2〜9若しくは2〜8若しくは2〜7若しくは2〜6若しくは2〜5若しくは2〜4若しくは2〜3若しくは3〜10若しくは4〜10若しくは5〜10若しくは6〜10若しくは7〜10若しくは8〜10若しくは9〜10若しくは3〜9若しくは4〜9若しくは5〜9若しくは6〜9若しくは7〜9若しくは8〜9若しくは3〜8若しくは3〜7若しくは3〜6若しくは3〜5若しくは3〜4若しくは4〜8若しくは5〜8若しくは6〜8若しくは7〜8若しくは4〜7若しくは4〜6若しくは4〜5若しくは5〜7若しくは6〜7若しくは5〜6の範囲のpIを有する、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、宿主細胞の内因性ビオチンリガーゼである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞は、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有する内因性ビオチンリガーゼを発現し、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する高い親和性を有する組換えビオチンリガーゼである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞は、内因性ビオチンリガーゼ活性を欠き、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、組換えビオチンリガーゼである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸と作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ、プロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの構成的発現を付与する、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ、プロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの誘導性発現を付与し、前記方法は、宿主細胞におけるビオチンリガーゼの発現を誘導するのに十分な条件下で、(i)において宿主細胞を増殖させるステップをさらに含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
ビオチンリガーゼをコードする遺伝子構築物で安定に又は一過性に形質転換された宿主細胞を産生するステップをさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、又は配列番号2に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10(配列番号3)によって規定されるアミノ酸配列を含み、式中、X1は任意のアミノ酸であり、X2は、L、V、I、W、F、Y以外の任意のアミノ酸であり、X3は、F又はLであり、X4は、E又はDであり、X5は、A、G、S又はTであり、X6は、Q又はMであり、X7は、I、M又はVであり、X8は、E、L、V、Y又はIであり、X9は、W、Y、V、F、L又はIであり、X10は、好ましくは、R、Hであるか、又はD若しくはE以外の任意のアミノ酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
X1はNであり、X2はDであり、X3はFであり、X4はEであり、X5はAであり、X6はQであり、X7はIであり、X8はEであり、X9はWであり、X10はHである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、配列GLNDIFEAQKIEWHE(配列番号4)を含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号5に示されるアミノ酸配列、又は配列番号5の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、アミノ酸配列TVVCIVEAMKLFIEI(配列番号6)を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号7に示されるアミノ酸配列、又は配列番号7の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、アミノ酸配列DVIVVLEAMKMEHPI(配列番号8)を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号9に示されるアミノ酸配列、又は配列番号9の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、アミノ酸配列QPVAVLSAMKMEMII(配列番号10)を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、アミノ酸配列DTLCIVEAMKMMNQI(配列番号13)を含む、請求項４１、４５、４７又は４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号14に示されるアミノ酸配列、又は配列番号14の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号15に示されるアミノ酸配列、又は配列番号15の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号16に示されるアミノ酸配列、又は配列番号16の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号17に示されるアミノ酸配列、又は配列番号17の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号18に示されるアミノ酸配列、又は配列番号18の配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアントによってコードされ、前記バリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ビオチンリガーゼは、宿主細胞の特定の細胞内位置にビオチンリガーゼを指向させることが可能なポリペプチド局在化シグナルに融合される、請求項３７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチド局在化シグナルは、核局在化シグナルである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリペプチド局在化シグナルは、ゴルジ局在化配列である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ポリペプチド局在化シグナルは、ミトコンドリア局在化配列である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞は、細菌細胞である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞は、真核生物細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
真核生物細胞は、植物細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
真核生物細胞は、哺乳動物細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
真核生物細胞は、霊長類細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
哺乳動物細胞は、マウス細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
ヒト細胞は、HEK293細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
足場は、バクテリオファージである、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
バクテリオファージは、ビオチンリガーゼを発現しない細菌細胞において産生される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
バクテリオファージは、ビオチンリガーゼ基質ドメインを非効率的にビオチン化するビオチンリガーゼを発現する細菌細胞において産生され、前記方法は、ステップ(i)の前にビオチン化メンバーから非ビオチン化メンバーを単離するステップをさらに含み、それによって、非ビオチン化メンバーを提供する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
バクテリオファージは、ビオチンリガーゼを発現する細菌細胞において産生され、前記細胞は、ビオチンリガーゼ基質ドメインを含むポリペプチドをさらに含み、細胞性ビオチンリガーゼは、前記メンバーに優先して前記ポリペプチドをビオチン化し、それによって、非ビオチン化メンバーを提供する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
ポリペプチドは、複数のビオチンリガーゼ基質ドメインを含み、それによって、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインと比較した、ポリペプチドの優先的なビオチン化を提供する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ポリペプチドは、3つのビオチンリガーゼ基質ドメインを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
融合タンパク質は、1つのビオチンリガーゼ基質ドメインを有する、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７６】
ポリペプチドは、足場部分をさらに含む、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
足場部分は、低分子ユビキチン関連改変因子ペプチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
バクテリオファージは、糸状ファージである、請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
糸状ファージは、細胞の内膜を通る融合タンパク質のトランスロケーションを促進するシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された、融合タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
コードされた融合タンパク質は、糸状ファージのコートタンパク質に連結される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
コートタンパク質は、pIII又はpVII又はpVIII又はpIXである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
糸状ファージは、M13である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
シグナルペプチドは、融合タンパク質をシグナル認識粒子(SRP)経路に指向させる、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
シグナルペプチドは、DsbAシグナルペプチド、TorTシグナルペプチド、又はTolBシグナルペプチド又はSfmシグナルペプチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
シグナルペプチドは、DsbAシグナルペプチドであり、DsbAシグナルペプチドは、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
シグナルペプチドは、TorTシグナルペプチドであり、TorTシグナルペプチドは、配列番号21に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
シグナルペプチドは、TolBシグナルペプチドであり、TolBシグナルペプチドは、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
シグナルペプチドは、Sfmシグナルペプチドであり、Sfmシグナルペプチドは、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
シグナルペプチドは、融合タンパク質を一般的分泌(SEC)経路に指向させる、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
シグナルペプチドは、Lamシグナルペプチド、MalEシグナルペプチド、MglBシグナルペプチド、OmpAシグナルペプチド又はPelシグナルペプチドである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
シグナルペプチドは、Lamシグナルペプチドであり、Lamシグナルペプチドは、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
シグナルペプチドは、MalEシグナルペプチドであり、MalEシグナルペプチドは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
シグナルペプチドは、MglBシグナルペプチドであり、MglBシグナルペプチドは、配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
シグナルペプチドは、OmpAシグナルペプチドであり、OmpAシグナルペプチドは、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
シグナルペプチドは、PelBシグナルペプチドであり、PelBシグナルペプチドは、配列番号31に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
シグナルペプチドは、融合タンパク質をツインアルギニントランスロケーション(twin-arginine translocation)(TAT)経路に指向させる、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
バクテリオファージは、Tファージである、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
Tファージは、T3である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
Tファージは、T4である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
Tファージは、T7である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
非ビオチン化メンバーは、足場上での融合タンパク質のin vitroディスプレイ方法のために産生される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
足場は、リボソームである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
足場は、RepAタンパク質である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
足場は、DNAピューロマイシンリンカーである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
融合タンパク質は、宿主細胞の表面結合タンパク質と相互作用する部分をさらに含み、該部分と表面結合タンパク質との間の相互作用は、少なくとも融合タンパク質の宿主細胞への結合を誘導し、及び/又は少なくとも融合タンパク質の細胞取り込みを誘導する、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
融合タンパク質は、宿主細胞の表面上にディスプレイされた多糖と相互作用する部分をさらに含み、該部分と多糖との間の相互作用は、少なくとも融合タンパク質の宿主細胞への結合を誘導し、及び/又は少なくとも融合タンパク質の細胞取り込みを誘導する、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
融合タンパク質は、特定の細胞型へのメンバーの標的化を指向する部分をさらに含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
融合タンパク質は、宿主細胞中への侵入の際に表現型を誘導することが可能な部分をさらに含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
表現型は、致死の表現型である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記部分は、シェフェルジン(shepherdin)である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
ステップ(iii)における候補ペプチド部分を決定又は同定するステップは、宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物を、ビオチン結合性分子へのビオチン化融合タンパク質の結合に十分な時間及び条件下で、固体支持体に結合したビオチン結合性分子と接触させるステップ、及びビオチン化融合タンパク質を回収するステップを含む、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
ビオチン結合性分子は、アビジン若しくはニュートラアビジン若しくはストレプトアビジン又はそれらのバリアントを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
固体支持体は、ビーズ、カラム、膜、マイクロウェル又は遠心管の形態である、請求項１１１又は１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
固体支持体は、ビーズであり、ビーズは、ガラスビーズ又はマイクロビーズ、磁性ビーズ又は常磁性ビーズである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
細胞内位置にカーゴ部分を輸送することが可能な細胞透過性ペプチドを同定する方法であって、
(a)請求項１〜１１４のいずれか一項に記載の方法を実施して、細胞膜をトランスロケートした候補ペプチド部分を決定又は同定するステップ、
(b)細胞膜をトランスロケートすることが可能なペプチドを含む少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を回収するステップ、
(c)回収されたビオチン化融合タンパク質の少なくとも該ペプチドをコードする核酸配列を得るステップ、
(d)該ペプチドを産生するステップ、並びに
(e)機能的アッセイを実施して、該ペプチドが細胞の細胞内位置にカーゴ部分をトランスロケートする能力を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１１６】
機能的アッセイは、
(f)試験細胞を毒素コンジュゲートと接触させるステップであって、毒素コンジュゲートは、毒素又はその触媒性サブユニットを含むカーゴに連結されたペプチドを含み、前記接触させるステップは、毒素コンジュゲートが試験細胞に侵入するのに十分な時間及び条件下である、ステップ、
(g)毒素コンジュゲートが試験細胞の生存度を低減させるのに十分な時間及び条件下で試験細胞をインキュベートするステップ、
(h)試験細胞の低減された生存度を検出するステップであって、試験細胞の低減された生存度は、該ペプチドが、細胞の細胞内位置に毒素又は触媒性サブユニットをトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１７】
毒素コンジュゲートは、試験細胞にとって致死である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
毒素コンジュゲートの発現を検出することは、蛍光標識細胞分取(FACS)を実施するステップを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
毒素は、ジフテリア毒素断片Aを含む、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
毒素は、コレラ毒素サブユニットA1を含む、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
毒素は、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素である、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
毒素は、リボソーム不活性化タンパク質を含む、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
リボソーム不活性化タンパク質は、I型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
I型リボソーム不活性化タンパク質は、バーゲニング(bargaining)である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
I型リボソーム不活性化タンパク質は、ゲロニンである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
I型リボソーム不活性化タンパク質は、サポリンである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
リボソーム不活性化タンパク質は、II型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
II型リボソーム不活性化タンパク質は、志賀毒素の断片A1である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
II型リボソーム不活性化タンパク質は、リシンである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
II型リボソーム不活性化タンパク質は、アブリンである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
II型リボソーム不活性化タンパク質は、ニグリン(nigrin)である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３２】
リボソーム不活性化タンパク質は、III型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３３】
毒素コンジュゲートを産生するステップをさらに含む、請求項１１６〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
機能的アッセイは、
(f)試験細胞において第1の部分を発現させるステップであって、第1の部分は、検出可能な分子の第1の断片を含む、ステップ、
(g)試験細胞への第2の部分の結合及び試験細胞による第2の部分の取り込みに十分な時間及び条件下で、試験細胞を、検出可能な分子の第2の断片を含むカーゴ部分に連結されたペプチドを含む第2の部分と接触させるステップ、
(h)第1の部分及び第2の部分が検出可能な分子を構成する又は検出可能な部分の活性を生じるのに十分な時間及び条件下で、試験細胞をインキュベートするステップ、並びに
(i)試験細胞において検出可能な分子を検出するステップであって、前記検出は、該ペプチドが、試験細胞の細胞内位置に第2の断片をトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３５】
構成される検出可能な分子は、蛍光分子である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
検出可能な分子の断片は、GFP 11タグを含むアミノ酸配列を含み、検出可能な分子の断片は、GFP 1-10検出子を含むアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
GFP 11タグは、配列番号81に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
GFP 11タグは、足場分子をコードする核酸に連結される、請求項１３６又は１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
足場分子は、低分子ユビキチン関連改変因子ペプチド又はチューブリンペプチド又はβ-アクチンペプチド又はセンチリン又はMal又はSumo又はMyD88を含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
GFP 1-10検出子は、配列番号86に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
機能的アッセイは、
(f)線維芽細胞を含む試験細胞を、ペプチドと細胞の細胞内局在化において機能的であり線維芽細胞の異なる細胞型への分化を媒介する転写因子とを含む、融合タンパク質と接触させるステップ、
(g)試験細胞を、それらの分化が生じるのに十分な時間及び条件下でインキュベートするステップ、並びに
(h)分化した細胞を検出するステップであって、分化した細胞は、該ペプチドが、試験細胞の細胞内位置に該転写因子をトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４３】
転写因子はOCT-4であり、分化細胞はリンパ球である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
転写因子はMYOD1であり、分化細胞は筋芽細胞である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
線維芽細胞は、ヒト起源の初代線維芽細胞である、請求項１４２〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
分化した細胞は、顕微鏡又は蛍光標識細胞分取(FACS)によって検出される、請求項１４２〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2013年6月26日出願のオーストラリア特許出願第2013902347号及び2013年8月13日出願のオーストラリア特許出願第2013903038号及び2014年5月9日出願のオーストラリア特許出願第2014901714号に対して条約による優先権を主張し、これらの内容は各々、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般に、薬科学の分野、特に、器官及び/又は組織及び/又は細胞及び/又は細胞内局在への治療化合物及びペプチドなどの分子の標的化に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの生物学的に活性な化合物は、細胞質の内側、核又は他のオルガネラ内のいずれかにおいてそれらの治療作用を発揮するために、細胞内送達を必要とする。特定の器官、組織、細胞又は細胞内局在への選択的送達は、非標的の器官、組織、細胞又は細胞内局在における望ましくない副作用を回避又は最小化するために、非常に望ましい。従って、治療的に有益な分子を効率的かつ選択的に送達する能力は、薬物開発にとって重要である。
【０００４】
20年よりも前、塩基性の正に荷電したアミノ酸、例えば、Arg、Lys又はHisからほぼ構成される特定の短い配列が、細胞の原形質膜を通って、結合したカーゴ分子を輸送する能力を有することが発見された。これらの塩基性配列は、一般に、細胞透過性ペプチド(CPP)又はタンパク質形質導入ドメイン(PTD)と呼ばれる。先行技術のCPPは、一般に、哺乳動物細胞の膜系を通ってトランスロケートする能力、1つ以上の細胞内区画中に局在化する能力、及びカーゴ分子、例えば、薬物若しくは他の治療剤、又は画像化剤などの診断剤の細胞内送達を媒介する能力を特徴とする、しばしば20残基長と50残基長との間の、短いカチオン性及び/又は両親媒性のペプチド配列である。
【０００５】
ほぼ間違いなく、最も広く研究され利用されるCPPは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)の転写のトランス活性化因子(transactivator of transcription)(TAT)タンパク質由来のペプチドである。全長タンパク質の残基47〜57を含むHIV-1 Tatタンパク質の正に荷電した断片は、培養哺乳動物細胞を透過する。Tatの発見以降、例えば、ペネトラチン(アンテナペディアホメオドメインの断片)及びvp22(ヘルペスウイルス構造タンパク質VP22由来)などの他のポリカチオン性CPPが同定されており、別個のカーゴを、in vitro及びin vivoで細胞の細胞質及び核中にトランスロケート及び送達するそれらの能力について特徴付けられている。例示的な公知のCPPは、表1中に示される。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
CPPがそれらの細胞内在化を達成する正確な機構(複数可)は、幾分議論の余地があった。しかし、ほとんどのCPPがエンドサイトーシス機構を介して内在化されるという点では、意見が一致している。いくつかのエンドサイトーシス経路が存在し、クラスリン依存的エンドサイトーシス、カベオラ/脂質ラフト媒介性エンドサイトーシス又はマクロピノサイトーシスが含まれ得る。ポリカチオン性CPPの細胞侵入における第1のステップは、このポリカチオンと原形質膜の負に荷電したヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)との間の静電相互作用であると考えられる。これに基づいて進めると、CPPの電荷分布及び両親媒性は、細胞内在化に重要な因子であると考えられ、CPPと原形質膜上のプロテオグリカンとの間の静電相互作用におそらく影響を与える。細胞表面との接触後のCPPのエンドサイトーシスは、CPPの二次構造、(存在する場合)CPPが連結されるカーゴの性質、細胞型、及び膜組成を含む、種々のパラメーターによって駆動されると考えられる。このように、細胞内在化は、複雑で多角的なプロセスである。
【０００８】
特定のCPPがそれらの細胞結合及び取り込みを促進するいくつかの共通する特徴、例えば、ポリカチオン性配列及び両親媒性配列を共有し得るにもかかわらず、全てのCPPが、それらの一次構造、例えばアミノ酸配列において、配列単独に基づいて細胞表面に結合する能力及び/又は細胞に侵入する能力を容易に予測するのに十分な類似性を有しているわけではない。二次構造及び/又は三次構造の考慮が、細胞取り込みをどうやってもたらすことができるかは、理解されていない。
【０００９】
エンドサイトーシス後、内在化されたCPPは、分解を回避するためにエンドソームから逃避し、意図した細胞内の目的地にそのカーゴを送達する必要がある。エンドソームからの逃避は、高分子カーゴの効率的な細胞内送達のためのボトルネックをもたらし得る。例えば、エンドソーム逃避の効率は、Tat、ペネトラチン、Rev、VP22及びトランスフェリンについては低いようである。例えば、Sugitaら、Br. J. Pharmacol. 153, 1143-1152 (2008)。リポソーム中でのCPP-カーゴコンジュゲートの送達は、エンドサイトーシス小胞からのそれらの逃避を補助し得る。例えば、El-Sayedら、AAPS J. 11, 13-22 (2009)。さらに、インフルエンザのHA2配列(Wadiaら、Nat Med. 10, 310-315, 2004)などの融合性ペプチドを含めることによっても、エンドソーム逃避をいくらか増強できるが、細胞透過性ペプチドの大部分はエンドソーム中に残留する。それらの取り込み後にエンドサイトーシス小胞から効率的に逃避する能力を有するCPPが、いまだ必要とされている。
【００１０】
薬物カーゴの送達のための公知のCPPのin vivo有用性に対する1つの制限は、それらの非選択性である。多くの既存のCPPのin vivoでの一般化された取り込みは、特に、標的化された薬物作用が有利若しくは必要である場合、又は器官若しくは組織型の非特異的標的化が望ましくない副作用をもたらし得る場合に、それらの臨床適用を制限し得る。ポリカチオン性中心の存在についてのCPPの選択が、内在化プロセスの開始を促進できるペプチドを提供し得るにもかかわらず、正に荷電した、一次構造について選択されたペプチドは、細胞膜の外葉中のHSPG及びリン脂質の遍在性を考慮すると、細胞選択的ではない可能性がある。
【００１１】
異なる細胞、組織、器官への、及び器官系を通る薬物送達が関与する多くの臨床適用への提供範囲を提供するには、現在、細胞型選択的CPPの多様性は不十分である。タイトジャンクション(TJ)、側底膜及び頂端膜は、特に静脈内投与される場合、全ての細胞型中へのCPPの通過を制限するように機能し得る。血液脳関門(BBB)は、脳を取り囲む血管を裏打ちする内皮タイトジャンクションに位置し、血液精巣関門(BTB)及び血液精巣上体関門(blood-epididymis barrier)(BEB)の主要な物理的及び/又は薬理学的及び/又は生理学的成分(複数可)は、それぞれ精細管(セルトリ細胞)及び精巣上体管を裏打ちする隣接する上皮細胞間のタイトジャンクションからなる。このような物理的関門及び/又は薬理学的関門及び/又は生理学的関門は、側底膜及び/又は頂端膜における能動的な輸送体及びチャネルの存在によっても提供され得る。HIV-1 Tat由来ペプチド、ペネトラチン及びVP22は、in vitro及びin vivoの両方において、これらの関門を通る及び特定の細胞型における限定的な細胞取り込みを有するようである。例えば、Trehin及びMerkle, Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 209-223 (2004)を参照のこと。従って、CPPの既存のバンクは、全ての細胞型へ治療カーゴを送達するには十分でない可能性があり、これは、CPPのさらなる機能的多様性の必要性を示唆する。
【００１２】
安全性は、任意の治療剤の臨床適用について特に懸念され、ヒト又は動物の身体の1つ以上の細胞、組織、器官に、又は器官系を通ってカーゴを送達するために利用されるCPPについてまさしくそれが当てはまる。例えば、両親媒性ペプチドは、細胞膜を透過することによって細胞毒性であり得、例えば、Sugitaら、Brit J Pharmacol 153, 1143-1152 (2008)、それらの両親媒性が脂質膜とのそれらの相互作用及び引き続く内在化にとって重要である場合、このようなペプチドの細胞毒性を低減させることは、単純な問題ではない可能性がある。同様に、10μgの投薬量におけるペネトラチンの線条体内注射は、神経毒性細胞死を引き起こすことが実証されており、40〜100μMの濃度におけるin vitro送達は、細胞溶解及び他の細胞毒性効果を誘導することが実証されている。例えば、Trehin及びMerkle, Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 209-223 (2004)。ポリ-L-アルギニンペプチドも細胞膜損傷を誘導し、細胞関門の透過性を増加させ、上皮細胞間の細胞-細胞接触をin vitroで低減させ、ラット肺の胸膜腔中に注射される場合に炎症応答を誘導することが報告されている。例えば、Trehin及びMerkle, Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 209-223 (2004)。従って、公知のCPPと比較して低い又は低減された細胞毒性副作用を有するCPPが、いまだ必要とされている。
【００１３】
公知のCPPの制限の多くは、エンドソームからのそれらの取り込み及び/若しくは放出、並びに/又は細胞型選択性及び/若しくは組織型選択性及び/若しくは器官選択性、並びに/又は物理的関門及び/若しくは薬理学的関門及び/若しくは生理学的関門を通る能力、並びに/又はそれらの安全性制限を決定するための適切な試験が行われる前の、当該分野におけるそれらの同定及びそれらの引き続く採用に使用されるプロセスの結果である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Sugitaら、Br. J. Pharmacol. 153, 1143-1152 (2008)
【非特許文献２】El-Sayedら、AAPS J. 11, 13-22 (2009)
【非特許文献３】Wadiaら、Nat Med. 10, 310-315, 2004
【非特許文献４】Trehin及びMerkle, Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 209-223 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ファージディスプレイアプローチは、細胞透過性ペプチドの同定のために首尾よく適用されており、同時に調べられる多くのペプチドを用いてハイスループット様式で実施され得る場合には、効率的である。例えば、Kamadaら、Biol Pharm Bull 30, 218-223 (2007)。新たなCPPの発見のためのファージディスプレイスクリーニング技術の広範な首尾よい使用にもかかわらず、既存のスクリーニング方法は、細胞取り込みの属性を超えるものについてペプチドを必ずしも選択するわけではなく、細胞内在化又は送達の検証を提供することができない。CPPを同定及び単離するための改善された方法が、いまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明につながる研究において、本発明者らは、細胞透過活性を有し、好ましくは以前に公知のCPP単離方法に勝る利点をもたらす、ペプチド又はそのアナログ及び/若しくは誘導体を決定、同定及び/又は単離する改善された方法を開発しようとした。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「細胞透過性ペプチド」又は「CPP」又は同様の用語は、膜系を通ってトランスロケートすることが可能であり、細胞内で内在化することが可能なペプチジル化合物を意味すると解釈すべきである。
【００１８】
「ペプチジル化合物」とは、ペプチドを含む組成物、又はペプチドのアナログなどの、その構造がペプチドに基づく組成物を意味する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」は、少なくとも5又は6又は7又は8又は9又は10個の連続するアミノ酸又はアミノ酸様残基を含む、好ましくは、少なくとも80重量％又は85重量％又は90重量％又は95重量％又は99重量％のアミノ酸を含む、全長タンパク質以外の化合物を意味すると解釈すべきである。ペプチドは一般に、少なくとも200残基又は190残基又は180残基又は残基又は160残基又は150残基又は140残基又は130残基又は120残基又は110残基又は100残基の上限長さを有するが、ペプチドは、その範囲(複数可)内の任意の長さを含む、10〜20残基又は10〜30残基又は10〜40残基又は10〜50残基又は10〜60残基又は10〜70残基又は10〜80残基又は10〜90残基又は10〜100残基の範囲の長さを有し得る。定義されるようなペプチドは、例えば、ゲノムDNA断片の増幅又はmRNAの逆転写によって天然に存在する核酸の断片由来の核酸中のオープンリーディングフレームの翻訳によって発現され得る。一例では、ペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、天然において供給源生物によって使用されるオープンリーディングフレームと同じである。別の一例では、ペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、天然には使用されないオープンリーディングフレームである。従って、ペプチドは、原核生物ゲノム又はコンパクトな真核生物ゲノムを有する生物に直接的又は間接的に由来する核酸の発現産物であり得る。或いは、ペプチドは、合成核酸の発現産物であり得る。
【００２０】
対照的に、「ペプチドコンジュゲート」は、アミノ酸の重量百分率に関して制限がない、ペプチド及び非ペプチジル部分を含む分子である。
【００２１】
本明細書に例示するように、本発明者らは、それらのネイティブ環境において細胞透過活性を有することが知られていない又は予測されていない原核生物ゲノム及び/又はコンパクトな真核生物ゲノムのゲノム断片由来の発現産物である単離されたタンパク質ドメインを発現するファージディスプレイライブラリーのホールセルバイオパニングを使用する。これらの発現されたタンパク質ドメインは、天然に存在するオープンリーディングフレームの断片由来の発現産物であり得るか、又はそのネイティブの文脈では、若しくは合成核酸からは翻訳されない核酸によってコードされ得る。本発明者らは、特徴付けられていない核酸、例えば、配列決定されていない核酸又はアノテーションされていない配列の寄与を低減させるため、及びスクリーニングされている発現されたタンパク質ドメインの多様性を増強するために、このような核酸供給源の使用を採用した。理論によって束縛されないが、このアプローチは、改善された構造的安定性及び/若しくはプロテアーゼ抵抗性及び/若しくは生物学的適合性並びに/又は低減された毒性を示すタンパク質ドメインをコードするように進化したヌクレオチド配列を富化すると考えられる。
【００２２】
一例では、本発明は、細胞透過性ペプチド及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む実質的にビオチン化されていない融合タンパク質を、非ビオチン化メンバーをビオチン化することが可能なビオチンリガーゼを発現する細胞に提供し、非ビオチン化メンバーが宿主細胞に侵入するのに十分な時間及び条件で宿主細胞をインキュベートし、次いで、融合タンパク質又はそのビオチンリガーゼ基質ドメインのビオチン化形態の細胞内局在を決定することによって、ペプチドの細胞輸送、例えば、細胞膜を通る、及び/又は細胞内区画中への、及び/又は細胞内区画からのペプチドのトランスロケーションをモニタリングする方法を提供する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「細胞輸送」は、その最も広い文脈において、細胞内又は細胞間のタンパク質の移動を含む。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「ビオチンリガーゼ」は、アクセプタータンパク質の別個のドメイン又はその断片、例えば、ビオチンリガーゼ基質ドメインの、特定のリジン残基にビオチンを酵素的に結合させるタンパク質又はその断片を意味すると解釈すべきである。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ビオチンリガーゼ基質ドメイン」は、ビオチン化されることが可能な、又はビオチン基が結合され得る、タンパク質ドメインを意味すると解釈すべきである。用語「実質的にビオチン化されていない融合タンパク質」は、1つ以上の分子へのビオチン基の共有結合を意味すると解釈すべきである。用語「ビオチン化形態」は、少なくとも1つのビオチン基が結合したメンバーを意味すると解釈すべきである。
【００２６】
別の一例では、本発明は、細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドを決定又は同定する方法であって、
(a)ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の実質的にビオチン化されていないメンバーと接触させるステップであって、これらのメンバーは、融合タンパク質をディスプレイする足場を含み、融合タンパク質の各々は、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含み、前記接触させるステップは、メンバーの少なくともディスプレイされた融合タンパク質が宿主細胞に侵入するのに十分な時間及び条件下である、ステップと、
(b)宿主細胞の膜をトランスロケートした少なくとも融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるような時間及び条件下で宿主細胞をインキュベートするステップと、
(c)(i)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物中のビオチン化融合タンパク質の存在を検出するステップであって、ビオチン化融合タンパク質の存在は、候補ペプチド部分が細胞膜をトランスロケートしたことを示す、ステップ、及び/又は
(ii)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物から少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を単離するステップ、及び/又は
(iii)宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物から少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を回収するステップ
を含むプロセスを実施することによって、宿主細胞の膜をトランスロケートした候補ペプチド部分を決定又は同定するステップと
を含む方法を提供する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「複数の実質的にビオチン化されていないメンバー」は、1つよりも多いメンバー、例えば、各メンバーがその混合物又はライブラリー中の任意の他のメンバーとは別々にディスプレイされ得るにもかかわらず、メンバーの混合物又は混合物として提示されるメンバーのライブラリーを意味すると、広く解釈すべきである。
【００２８】
好ましくは、これらのメンバーは、足場と融合タンパク質との間に共有結合的連結を含み得、この共有結合的連結は、細胞又はその細胞内区画内の環境への曝露によって切断可能である。例えば、この共有結合的連結は、ジスルフィド結合、又は酸切断可能な連結、又はpH切断連結、例えばヒドラゾン結合であり得る。一例では、この細胞内環境は、細胞の細胞質の還元性環境を含み得、この共有結合的連結は、ジスルフィド結合である(例えば、Austinら、Pro. Nat. Acad. Sci U.S.A 102 17987-17992, 2005)。或いは、これらのメンバーは、足場と融合タンパク質との間にアミノ酸配列を含み得、この配列は、酵素基質部位を含み、前記メンバーは、この酵素基質部位に対して作用する酵素と反応して融合タンパク質から足場を切断し、切断された融合タンパク質は、宿主細胞のエンドソームに侵入する。
【００２９】
この例では、ステップ(ii)におけるインキュベートするステップは、宿主細胞のエンドソームをトランスロケートした切断された融合タンパク質が、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるような時間及び条件下であり得、ステップ(iii)における決定又は同定するステップは、宿主のエンドソームをトランスロケートした候補ペプチド部分を、ステップ(iii)において決定又は同定するステップを含む。
【００３０】
なお別の好ましい一例では、これらのメンバーは、例えば、融合タンパク質の半減期を延長させることによって、及び/若しくは宿主細胞への融合タンパク質の正確な提示を補助することによって、発現された融合タンパク質を安定化させるための、又はそれに特定のコンフォメーションをとらせるための、或いは、宿主細胞と共にいくつかの他の機能を実施させるための、ドメインをさらに含む。例えば、発現された融合タンパク質を安定化させるためのドメインには、プロテインAベースのドメイン(例えば、Nordら、Nat Biotechnol 15 772-777, 1997)又はリポカリンベースのドメイン(例えば、Skerraら、FEBS J. 275 2677-2683, 2008)又はフィブロネクチンベースのドメイン(例えば、Dineenら、BMC Cancer 8 352, 2008)又はアビマー(avimer)ドメイン(例えば、Silvermanら、Nat Biotechnol 23 1556-1561, 2005)又はアンキリンベースのドメイン(例えば、Zahndら、J Biol. Chem. 281 35167-35175, 2006)又はCDRと類似するループを有するIgドメインに対して顕著な構造的相同性を有するタンパク質折り畳みに基づくセンチリン(centyrin)ドメインが含まれ得る。
【００３１】
例えば、結合、侵入及び局在化の検出を促進するための1つ以上の検出可能なレポーター分子、例えば、フルオロフォア、ハロアルカン、放射活性標識、着色粒子、ラテックスビーズ、ナノ粒子、量子ドット、又はベータラクタマーゼなどの安定な酵素で標識されるメンバーは、本発明の範囲内である。
【００３２】
或いは、これらのメンバーは、足場と融合タンパク質との間に不安定な連結、例えば、エステル結合又は特異的プロテアーゼ部位を含み得、その結果、一旦メンバーがサイトゾルに放出されると、これは、エステラーゼ又はプロテアーゼによって切断されて、蛍光を発し得る。このようなエステラーゼ切断可能な色素の一例は、Oregon Green 488カルボン酸ジアセテート(カルボキシ-DFFDA)-6-異性体である。
【００３３】
一例では、これらのメンバーは、宿主細胞のエンドソームに侵入しない。或いは、これらのメンバーは、インタクトで宿主のエンドソームをトランスロケートする。
【００３４】
ステップ(i)における接触させるステップは、メンバーの少なくともディスプレイされた融合タンパク質が宿主細胞のエンドソームに侵入するのに十分な時間及び条件下であり得る。この例では、ステップ(ii)におけるインキュベートするステップは、宿主細胞のエンドソームから外にトランスロケートした少なくとも融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるような時間及び条件下であり得、ステップ(iii)における決定又は同定するステップは、宿主のエンドソームをトランスロケートした候補ペプチド部分を、ステップ(iii)において決定又は同定するステップを含む。
【００３５】
なお別の一例では、この方法は、ビオチン化メンバーを検出及び/又は単離及び/又は回収するステップをさらに含む。或いは、又はさらに、この方法は、ビオチン化融合タンパク質を検出及び/又は単離及び/又は回収するステップを含む。
【００３６】
従って、本発明は、1つ以上の細胞膜を透過する能力を有するペプチドを同定及び/又は単離するための、ペプチドをコードする核酸の非常に多様なプールのスクリーニングを提供する。その最も広い文脈では、本発明は、特定の細胞型とは関係なく、細胞トランスロケーション能力を有するペプチドを提供する。しかし、本発明はまた、例えば、結合及び/若しくは1つ以上の異なる細胞型中への取り込みについての又はそれらに対する1回以上のラウンドの選択を実施することによって、細胞型特異性/選択性を有するペプチドを提供し得、並びに/或いは、例えば、細胞生存についての1回以上のラウンドの選択を実施することによって、低い毒性を有するペプチドを提供し得る。細胞型選択性及び/又は低い毒性に関するこのようなさらなるスクリーニングが、例えば、WO 2012/159164に記載されるように実施され得る。
【００３７】
本発明は、当該分野で公知の方法と比較して、CPP様特性を有するペプチドの増強を提供する。例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、本発明のプロセスは、ペプチドのプールを提供し得、このプールにおいて、検証前に同定又は単離されたペプチドの少なくとも約20％又はペプチドの少なくとも約21％又は少なくとも約22％又はペプチドの少なくとも約23％又はペプチドの少なくとも約24％又はペプチドの少なくとも約25％又はペプチドの少なくとも約26％又はペプチドの少なくとも約27％又はペプチドの少なくとも約28％又はペプチドの少なくとも約29％又はペプチドの少なくとも約30％が、1つ以上のCPP様特性を有する。CPP様特性は、例えば、CPPの公知のデータベース上のそれらの一次配列の比較によって決定される。
【００３８】
本発明のプロセスを実施することによってモニタリング又は単離又は同定される特に好ましいペプチドは、例えば、自律的に、又はそれらの環化などによってそのように誘導されることによって、二次構造若しくは三次構造又はペプチド折り畳み或いは折り畳みのアセンブリを形成し、ここで、この構造(複数可)は、細胞の膜をトランスロケートすることにおけるペプチドの機能性を増強する。例えば、CPP様二次構造特徴、例えば、アルファ-ヘリックス及び/又はコイル特性を含む1つ以上の折り畳みを有するペプチドは、本発明の文脈内である。例えば、本発明のプロセスは、例えば、細胞膜を通る透過又はトランスロケーションを補助するために、ベータ-シートを含む折り畳みの低減された提示を有するペプチドを富化し得る。例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、本発明のプロセスは、約85％未満低減されたベータシート組成又は約80％未満低減されたベータシート組成又は約75％未満低減されたベータシート組成又は約70％未満低減されたベータシート組成又は約65％未満若しくは60％未満若しくは55％未満若しくは50％未満低減されたベータシート組成を有するペプチドのプールを提供し得る。
【００３９】
或いは、又はさらに、本発明のプロセスは、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、低減された疎水性を有するペプチドプールを提供し得る。例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、本発明のプロセスは、約75％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約70％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約65％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約60％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約55％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約50％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約45％未満低い含量の疎水性ペプチド又は約40％未満低い含量の疎水性ペプチド又は35％低い含量の疎水性ペプチド又はおよそ約35〜70％未満低い含量の疎水性ペプチドを有するペプチドのプールを提供し得る。
【００４０】
或いは、又はさらに、本発明のプロセスは、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、より高い等電点(pI)を有するペプチドプールを提供し得る。例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、本発明のプロセスは、少なくとも約8.5又は8.6又は8.7又は8.8又は8.9又は9.0又は9.5又は10.0又は10.5の平均pIを有するペプチドのプールを提供し得る。
【００４１】
或いは、又はさらに、本発明のプロセスは、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、より高い平均電荷を有するペプチドプールを提供し得る。例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む非ビオチン化融合タンパク質のビオチン化を必要としないプロセスと比較して、本発明のプロセスは、少なくとも約2.0又は2.1.又は2.2又は2.3又は2.4又は2.5又は2.6又は2.7又は2.8又は2.9又は3.0又は3.1又は3.2又は3.3又は3.4又は3.5又は3.6又は3.7又は3.8又は3.9又は4.0又は4.1又は4.2又は4.3又は4.4又は4.5又は4.6又は4.7又は4.8又は4.9又は5.0の平均電荷を有するペプチドのプールを提供し得る。
【００４２】
当業者に知られるように、上述の効果は、例えば、本明細書の表4又は表7によって記載されるように、本発明のプロセスを実施することによって単離又は同定されたペプチドのプールのアミノ酸組成において反映され得る。
【００４３】
これらの非ビオチン化メンバーは、内因性ビオチンリガーゼ活性を有さない細胞において産生されることによって、非ビオチン化され得る。別の一例では、この方法は、内因性ビオチンリガーゼ活性を有さない細胞において非ビオチン化メンバーを産生するステップをさらに含む。用語「内因性ビオチンリガーゼ活性」は、本明細書で使用する場合、生物、組織又は細胞が、内因性ビオチンリガーゼを発現することを意味すると解釈すべきである。
【００４４】
或いは、これらの非ビオチン化メンバーは、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有するビオチンリガーゼを有する細胞において産生されることによって、非ビオチン化され得る。本明細書で使用する場合、用語「低い親和性」は、ネイティブビオチンリガーゼ基質の25％未満又は20％未満又は15％未満又は10％未満又は5％未満又は4％未満又は3％未満又は2％未満又は1％未満の活性を意味すると解釈すべきである。
【００４５】
或いは、これらの非ビオチン化メンバーは、これらのメンバーが発現及び(例えば、sec分泌経路を介して)分泌される場合に、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して活性ではあるが、ビオチンリガーゼ基質ドメインにアクセスできないビオチンリガーゼを有する細胞において産生され、それによって、ビオチン化を効果的に回避することによって、非ビオチン化され得る。
【００４６】
なお別の一例では、この方法は、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有するビオチンリガーゼを有する細胞において非ビオチン化メンバーを産生するステップをさらに含む。
【００４７】
この方法は、ステップ(ii)の後及びステップ(iii)の前に、宿主細胞を、ビオチンリガーゼの活性を阻害する1種以上の薬剤と共にインキュベートするステップをさらに含み得る。この薬剤は、ピロリン酸塩及び/又はアデノシン5'一リン酸(AMP)塩を含み得る。このピロリン酸塩は、コロイド金属ピロリン酸塩又は二ナトリウムピロリン酸塩又は四ナトリウムピロリン酸塩又はカリウムピロリン酸塩又はカルシウムピロリン酸塩又はイノシトールピロリン酸塩であり得る。例えば、このピロリン酸塩は、0.4mM若しくは0.5mM若しくは0.6mM若しくは0.7mM若しくは0.8mM若しくは0.9mM若しくは1mM若しくは2mM若しくは5mM若しくは10mM若しくは20mMの濃度、又は0.4mM〜20mM若しくは0.5mM〜20mM若しくは0.6mM〜20mM若しくは0.7mM〜20mM若しくは0.8mM〜20mM若しくは0.9mM〜20mM若しくは1mM〜20mM若しくは2mM〜20mM若しくは5mM〜20mM若しくは10mM〜20mMの範囲の濃度を有し得る。このAMP塩は、二ナトリウム塩、又はカルシウム塩若しくはマグネシウム塩であり得る。一例では、この薬剤は、100mM以上又は150mM以上又は200mM以上又は250mM以上又は300mM以上の濃度でAMP塩を含み得る。或いは、又はさらに、この薬剤は、カオトロピック塩を含み得る。或いは、又はさらに、この薬剤は、発現されたビオチンリガーゼの結合についてビオチンリガーゼ基質ドメインと競合することが可能なビオチンアナログを含み得る。ビオチンアナログの例は、当該分野で公知であり、例えば、Blanchardら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 466-471 (1999)、Levertら、J. Biol. Chem 277 16347-16350 (2002)、Eisenberg J. Bacteriol. 123 248-254 (1975)に記載されている。別の一例では、この薬剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含み得る。或いは、又はさらに、この薬剤は、アセトニトリルを含み得る。
【００４８】
なお別の一例では、この方法は、細胞膜を破壊することなく、宿主細胞の膜と会合したメンバーを除去するために、ステップ(i)において宿主細胞を処理するステップをさらに含む。「膜と会合した」とは、そのペプチドが、特定の細胞の膜を介してペプチドを輸送することが可能であるか、又はその特定の細胞においてペプチドを内在化することが可能な機構以外によって、細胞と物理的関係にあることを意味する。例えば、宿主細胞を処理するステップは、細胞膜を破壊することなく、宿主細胞にとって外的なメンバーを除去及び/又は不活性化するのに十分な時間及び条件下で、宿主細胞をプロテアーゼと共にインキュベートするステップを含み得る。
【００４９】
このプロテアーゼは、トリプシン又はキモトリプシン又はサーモリシン又はヘパリナーゼ又はスブチリシン又はプロテイナーゼKであり得る。別の一例では、細胞を処理するステップは、宿主細胞の膜と会合したメンバーを除去するのに十分な時間及び条件下で、宿主細胞を洗浄するステップを含み得る。この例では、この細胞は、細胞の生存度若しくは生存と適合性であるか又は別の細胞が対象のプロセス中の下流においてこのペプチドを内在化する能力に悪影響を与えない、緩衝液又は培地を使用してn回洗浄され得、ここで、nは、1と等しい又は1よりも大きい値を有する整数、例えば、1若しくは2若しくは3若しくは4若しくは5若しくは6若しくは7若しくは8若しくは9若しくは10である。
【００５０】
なお別の一例では、この方法は、ステップ(i)の前に複数の非ビオチン化メンバーを分画し、それによって、各々が正味の正の電荷又は正味の負の電荷又は正味の中性電荷を有するメンバーの1つ以上のプールを得るステップ、及び次いで、メンバーの1つ以上のプールを使用してステップ(i)を実施するステップをさらに含み、例えば、メンバーのプールは、2若しくは3若しくは4若しくは5若しくは6若しくは7若しくは8若しくは9若しくは10若しくは11若しくは12の等電点(pI)、又は2〜10若しくは2〜9若しくは2〜8若しくは2〜7若しくは2〜6若しくは2〜5若しくは2〜4若しくは2〜3若しくは3〜10若しくは4〜10若しくは5〜10若しくは6〜10若しくは7〜10若しくは8〜10若しくは9〜10若しくは3〜9若しくは4〜9若しくは5〜9若しくは6〜9若しくは7〜9若しくは8〜9若しくは3〜8若しくは3〜7若しくは3〜6若しくは3〜5若しくは3〜4若しくは4〜8若しくは5〜8若しくは6〜8若しくは7〜8若しくは4〜7若しくは4〜6若しくは4〜5若しくは5〜7若しくは6〜7若しくは5〜6の範囲のpIを有し得る。例えば、複数の非ビオチン化メンバーを分画するステップは、イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップ、及びメンバーの1つ以上のプールを回収するステップを含む。好ましくは、このイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換体の使用を含む。或いは、又はさらに、このイオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換体の使用を含む。このようなアニオン交換体又はカチオン交換体は、当該分野で周知であり、市販されている。一例では、このイオン交換クロマトグラフィーは、バッチプロセスである。別の一例では、このイオン交換クロマトグラフィーは、移動床プロセスである。
【００５１】
一例では、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、宿主細胞の内因性ビオチンリガーゼであり得る。或いは、非ビオチン化メンバーをビオチン化するために使用される宿主細胞は、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する低い親和性を有する内因性ビオチンリガーゼを発現し得、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対する高い親和性を有する組換えビオチンリガーゼである。本明細書で使用する場合、用語「高い親和性」は、ネイティブビオチンリガーゼ基質の75％超又は80％超又は85％超又は90％超又は95％超又は96％超又は97％超又は98％超又は99％超の活性を意味すると解釈すべきである。
【００５２】
好ましくは、この組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸と作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ、このプロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの構成的発現を付与する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、その最も広い文脈で解釈すべきであり、例えば、発生的刺激及び/若しくは外部刺激に応答して又は組織特異的様式で、核酸(例えば、導入遺伝子)の発現を変更するさらなる調節エレメント(例えば、上流の活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー)あり又はなしで、正確な転写開始のために必要とされるTATAボックス又はイニシエーターエレメントを含む、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。本発明の文脈では、用語「プロモーター」はまた、そのプロモーターが作動可能に連結される核酸(例えば、導入遺伝子及び/又は選択可能なマーカー遺伝子及び/又は検出可能なマーカー遺伝子)の発現を付与、活性化又は増強する、組換え核酸、合成核酸若しくは融合核酸又は誘導体を記述するために使用される。好ましいプロモーターは、発現をさらに増強するため、並びに/又はこの核酸の空間的発現及び/若しくは時間的発現を変更するための、1つ以上の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含み得る。用語「構成的発現」は、本明細書で使用する場合、全ての生理学的条件下での発現を含むと解釈すべきである。例えば、構成的発現を付与するプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター又はオパインプロモーター又は植物ユビキチンプロモーター又はイネアクチン-1プロモーター又はトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター又はサルウイルス40初期プロモーター(SV40)又はサイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV)又はヒトユビキチンCプロモーター(UBC)又はヒト伸長因子1αプロモーター(EF1A)又はマウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター(PGK)又はCMV初期エンハンサーとカップリングしたニワトリβ-アクチンプロモーター(CAGG)又はコピアトランスポゾンプロモーター(COPIA)又はアクチン5Cプロモーター(ACT5C)であり得る。
【００５４】
或いは、この組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ得、このプロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの誘導性発現を付与し、この方法は、宿主細胞におけるビオチンリガーゼの発現を誘導するのに十分な条件下で、(i)において宿主細胞を増殖させるステップをさらに含む。用語「誘導性発現」は、本明細書で使用する場合、その最も広い文脈で、生物的因子の存在若しくは非存在による、又は非生物的因子の存在若しくは非存在による、又は特定の発生段階における、又は特定の細胞内局在化における、又は化学的因子の存在若しくは非存在による、又は物理的因子の存在若しくは非存在による、遺伝子発現の活性化を意味すると解釈すべきである。誘導性発現を付与するプロモーターは、当該分野で公知であり、例えば、Weberら、Methods Mol. Bio. 267 451-466 (2004)、Dohnら、Methods Mol. Bio. 223, 221-235 (2003)、Tingら、Methods Mol. Med 105 23-46 (2004)、Borghi Methods Mol. Bio. 665 65-75 (2010)に記載されている。本明細書で使用する場合、用語「細胞内位置」は、サイトゾル、エンドソーム、核、小胞体、ゴルジ、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、例えば、葉緑体若しくはアミロプラスト若しくは有色体若しくは白色体、核、細胞骨格、中心小体、微小管形成中心(MTOC)、アクロソーム、グリオキシソーム、メラノソーム、筋原線維、核小体、ペルオキシソーム、ヌクレオソーム又は微小管を含むと解釈すべきである。或いは、又はさらに、この組換えビオチンリガーゼは、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物において遺伝子構築物によってコードされ得、この遺伝子構築物は、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含み、このプロモーターは、ビオチンリガーゼの遍在的発現又は組織特異的発現のいずれかを付与する。本明細書で使用する場合、用語「組織特異的発現」は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物内の任意の組織又は細胞型を意味すると解釈すべきである。例えば、この組換え体は、特定の組織の細胞質又は核において発現され得る。
【００５５】
別の一例では、この方法は、組換えビオチンリガーゼをコードする遺伝子構築物で安定に又は一過性に形質転換された宿主細胞を産生するステップをさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「安定に形質転換された」は、核ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA又はプラスチドDNAへの、外因性核酸の一部又は全ての組込みを意味すると解釈すべきである。本明細書で使用される用語「一過性に形質転換された」とは、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA又はプラスチドDNA中にいまだ組み込まれていない外因性核酸の一部又は全ての、細胞への導入を指す。或いは、この方法は、組換えビオチンリガーゼをコードする遺伝子構築物を発現するトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を産生するステップをさらに含み得る。
【００５６】
或いは、本発明の宿主細胞は、内因性ビオチンリガーゼ活性を欠き得、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、組換えビオチンリガーゼである。好ましくは、この組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ得、このプロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの構成的発現を付与する。或いは、この組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ得、このプロモーターは、宿主細胞にビオチンリガーゼの誘導性発現を付与し、この方法は、宿主細胞におけるビオチンリガーゼの発現を誘導するのに十分な条件下で、(i)において宿主細胞を増殖させるステップをさらに含む。別の一例では、この方法は、ビオチンリガーゼをコードする遺伝子構築物で安定に又は一過性に形質転換された宿主細胞を産生するステップをさらに含む。或いは、又はさらに、この組換えビオチンリガーゼは、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物において遺伝子構築物によってコードされ得、この遺伝子構築物は、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含み、このプロモーターは、ビオチンリガーゼの組織特異的発現を付与する。本明細書で使用する場合、用語「組織特異的発現」は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物内の任意の組織又は細胞型を意味すると解釈すべきである。例えば、この組換えビオチンリガーゼは、特定の組織の細胞質又はミトコンドリア又は核において発現され得る。
【００５７】
或いは、この組換えビオチンリガーゼは、ビオチンリガーゼをコードする核酸に作動可能に接続されたプロモーターを含む遺伝子構築物によってコードされ得、このプロモーターは、宿主細胞内の特定の細胞内位置におけるビオチンリガーゼの発現を付与する。このようなプロモーターは、当該分野で周知であり、市販されている。
【００５８】
ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号2若しくは5若しくは7若しくは9若しくは14〜18のいずれか1つに示されるアミノ酸配列、又は本明細書の配列表のいずれか1つによって例示されるビオチンリガーゼに対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するそれらのバリアントを含み得、このバリアントは、ビオチンリガーゼ活性を有する。例えば、ステップ(i)において発現されるビオチンリガーゼは、配列番号2又は5又は7又は9又は14〜18のいずれか1つに対して少なくとも80％又は90％又は95％又は99％同一であるアミノ酸配列によってコードされ得る。
【００５９】
別の一例では、このビオチンリガーゼは、宿主細胞の特定の細胞内位置にビオチンリガーゼを指向させることが可能なポリペプチド局在化シグナルに融合され得る。例えば、このポリペプチド局在化シグナルは、核局在化シグナルであり得る。いくつかの核局在化シグナルが、当該分野で公知であり、例えば、Kalderonら、Cell 39 499-509 (1984)、Blankら、EMBO 10 4159-4167 (1991)、Emmottら、EMBO Rep. 10 231-238 (2009)、Robbinsら、Cell 64 615-623 (1991)、Schmidt-Zachmannら、J. Cell Sci. 105,799-806 (1993)によって記載されている。或いは、このポリペプチド局在化シグナルは、ゴルジ局在化配列であり得る。いくつかのゴルジ局在化配列が当該分野で公知であり、例えば、Liuら、Mol. Biol. Cell. 18 1073-1082 (2007)、Kjer-Nielsenら、J. Cell Sci. 112 1645-1654 (1999)によって記載されている。或いは、このポリペプチド局在化シグナルは、ミトコンドリア局在化配列であり得る。いくつかのミトコンドリア局在化配列が当該分野で公知であり、例えば、Neupert Annu. Rev. Biochem. 66 863-917 (1997)、Plathら、Cell 18 795-807 (1998)、Rapaport EMBO Rep. 4 948-952 (2003)、Beinert, Chem. Rev. 96 2335-2374 (1996)、Regev-Rudzkiら、J. Cell Sci. 121 2423-2431 (2008)、Hortonら、Chem. Biol. 14 375-382 (2008)、Yousifら、Chembiochem 17 1939-1950 (2009)及びYousifら、Chembiochem 17 2081-2088 (2009)によって記載されている。
【００６０】
ビオチンリガーゼ基質ドメインは、LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10(配列番号3)によって規定されるアミノ酸配列を含み得、式中、X1は任意のアミノ酸であり、X2は、L、V、I、W、F、Y以外の任意のアミノ酸であり、X3は、F又はLであり、X4は、E又はDであり、X5は、A、G、S又はTであり、X6は、Q又はMであり、X7は、I、M又はVであり、X8は、E、L、V、Y又はIであり、X9は、W、Y、V、F、L又はIであり、X10は、好ましくは、R、Hであるか、又はD若しくはE以外の任意のアミノ酸である。好ましくは、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10(配列番号3)によって規定されるアミノ酸配列を含み得、式中、X1はNであり、X2はDであり、X3はFであり、X4はEであり、X5はAであり、X6はQであり、X7はIであり、X8はEであり、X9はWであり、X10はHである。より好ましくは、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００６１】
或いは、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、配列番号4、6、8、10、12又は13に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００６２】
一例では、これらの宿主細胞は、細菌細胞である。別の一例では、これらの宿主細胞は、細胞壁が除去された植物細胞のプロトプラストを含む、多細胞生物の真核生物細胞、好ましくは動物細胞又は植物細胞である。好ましい例では、これらの細胞は、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞は、マウス細胞、げっ歯類細胞、ハムスター細胞、ヒト細胞、霊長類細胞、ニワトリ細胞などである。特に好ましい宿主細胞は、HEK 293細胞、CHO-K1、NIH-3T3、HeLa又はCOS-7細胞である。
【００６３】
特に好ましい一例では、足場は、バクテリオファージである。
【００６４】
このバクテリオファージは、ビオチンリガーゼを発現しない細菌細胞において産生され得る。或いは、このバクテリオファージは、ビオチンリガーゼ基質ドメインを非効率的にビオチン化するビオチンリガーゼを発現する細菌細胞において産生され、この方法は、ステップ(i)の前にビオチン化メンバーから非ビオチン化メンバーを単離するステップをさらに含み、それによって、非ビオチン化メンバーを提供する。
【００６５】
或いは、このバクテリオファージは、ビオチンリガーゼを発現する細菌細胞において産生され、これらの細胞は、ビオチンリガーゼ基質ドメインを含むポリペプチドをさらに含み、この細胞性ビオチンリガーゼは、これらのメンバーに優先してこのポリペプチドをビオチン化し、それによって、非ビオチン化メンバーを提供する。例えば、このポリペプチドは、複数のビオチンリガーゼ基質ドメインを含み得、それによって、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインと比較した、このポリペプチドの優先的なビオチン化を提供する。例えば、このポリペプチドは、2又は3又は5又は6又は7又は8又は9又は10個のビオチンリガーゼ基質ドメインを含み得る。特に好ましい一例では、このポリペプチドは、3つのビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。この例によれば、この融合タンパク質は、1つのビオチンリガーゼ基質ドメインを有し得る。なお別の一例では、このポリペプチドは、足場部分をさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「足場部分」は、その最も広い文脈において、安定な三次構造又は安定な四次構造をとるタンパク質又はポリペプチドを意味すると解釈すべきである。例えば、この足場部分は、低分子ユビキチン関連改変因子ペプチドであり得る。
【００６６】
好ましくは、このバクテリオファージは、糸状ファージである。例えば、この糸状ファージは、M13ファージ又はf1ファージ又はfdファージ又はIKeファージ又はIf1若しくはIf2ファージであり得る。特に好ましい一例では、この糸状ファージは、M13である。
【００６７】
一例では、糸状ファージは、細胞の内膜を通る融合タンパク質のトランスロケーションを促進するシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された、融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００６８】
例えば、このシグナルペプチドは、融合タンパク質をシグナル認識粒子(SRP)経路に指向させ得る。例えば、このシグナルペプチドは、DsbAシグナルペプチド、TorTシグナルペプチド、TolBシグナルペプチド又はSfmシグナルペプチドであり得る(例えば、Steinerら、Nat. Biotech 24, 823-831, 2006)。好ましくは、このシグナルペプチドは、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むDsbAシグナルペプチド、又は配列番号21に示されるアミノ酸配列を含むTorTシグナルペプチド、又は配列番号22に示されるアミノ酸配列を含むTolBシグナルペプチド、又は配列番号23に示されるアミノ酸配列を含むSfmシグナルペプチドである。或いは、このシグナルペプチドは、融合タンパク質を一般的分泌(SEC)経路に指向させ得る。例えば、このシグナルペプチドは、Lamシグナルペプチド、MalEシグナルペプチド、MglBシグナルペプチド、OmpAシグナルペプチド又はPelシグナルペプチドであり得る(例えば、Steinerら、Nat. Biotech 24, 823-831, 2006)。好ましくは、このシグナルペプチドは、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むLamシグナルペプチド、又は配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むMalEシグナルペプチド、又は配列番号26に示されるアミノ酸配列を含むMglBシグナルペプチド、又は配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むOmpAシグナルペプチド、又は配列番号31に示されるアミノ酸配列を含むPelBシグナルペプチドであり得る。或いは、このシグナルペプチドは、融合タンパク質をツインアルギニントランスロケーション(twin-arginine translocation)(TAT)経路に指向させ得る。例えば、このシグナルペプチドは、AmiAシグナルペプチド、AmiCシグナルペプチド、CueOシグナルペプチド、DmsAシグナルペプチド、FdnGシグナルペプチド、FhuDシグナルペプチド、HyaAシグナルペプチド、HybOシグナルペプチド、MdoDシグナルペプチド、NapAシグナルペプチド、NrfCシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、TorAシグナルペプチド、TorZシグナルペプチド又はYcdBシグナルペプチドであり得る(例えば、Tullman-Ercekら、J. Biol. Chem. 282 8309-8316, 2007)。好ましくは、このシグナルペプチドは、配列番号29に示されるアミノ酸配列を含むTorAシグナルペプチドであり得る。
【００６９】
特に好ましい一例では、このシグナルペプチドは、pelB、gIII、ompA、phoA、malE、torA及びsufIからなる群より選択される。例えば、本発明者らは、p15a ori、誘導性ラムノースプロモーター及び強いリボソーム結合部位(RBS)を有する低コピー数プラスミドpD881を使用して、大腸菌(E.coli)ペリプラズムにおける組換えのコドン最適化されたBirAタンパク質の発現のレベルに対する、11種の異なるシグナルペプチドの影響を試験し、pelB、gIII、ompA、phoA、malE、torA又はsufIが、DELFIAにおいてビオチンリガーゼ基質(Avi V5)の測定可能なビオチン化を提供するが、基質の低いビオチン化だけが、ompT、dsbA又はtorTを使用して生じることを実証した。
【００７０】
さらに好ましい一例では、このシグナルペプチドは、pelBリーダー又はgIIIリーダー又はompAリーダー又はphoAリーダー又はmalEリーダーを含む、pelB、gIII、ompA、phoA及びmalEからなる群より選択されるSEC経路リーダーである。このようなリーダーは、大腸菌などの細菌細胞における機能的BirAタンパク質の増強された発現及び増強されたペリプラズム局在化を提供する。
【００７１】
別の一例では、このビオチンリガーゼは、ペリプラズムにおけるビオチンリガーゼの正確な折り畳みの容易化を改善又は増強するために、細菌細胞、例えば、大腸菌のペリプラズムにおいて、ペリプラズムシャペロン及び/又はペプチジル-プロリルイソメラーゼと共発現される。特に好ましい一例では、例えばSchlapschyら、PEDS, 19(8), pp.385-390 (2006)によって記載されるようなFpkA及び/又はSurAが、細菌細胞のペリプラズムにおける折り畳みを改善するために、BirAと共発現される。
【００７２】
これらの例では、コードされた融合タンパク質は一般に、糸状ファージのコートタンパク質に連結される。例えば、このコートタンパク質は、pIIIコートタンパク質又はpVIコートタンパク質又はpVIIコートタンパク質又はpVIIIコートタンパク質又はpIXコートタンパク質であり得る。好ましくは、このコートタンパク質は、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むpIIIコートタンパク質である。或いは、このコートタンパク質は、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むpVIIIコートタンパク質である。
【００７３】
別の一例では、このバクテリオファージは、Tファージであり得る。例えば、このTファージは、T3ファージ又はT4ファージ又はT7ファージであり得る。特に好ましい一例では、このTファージは、T7ファージである。
【００７４】
別の一例では、このバクテリオファージは、溶原性バクテリオファージであり得る。
【００７５】
別の一例では、このバクテリオファージは、ラムダファージであり得る。
【００７６】
なお別の一例では、非ビオチン化メンバーは、足場上での融合タンパク質のin vitroディスプレイ方法のために産生され得る。例えば、このin vitroディスプレイは、リボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイ又はmRNAディスプレイであり得る。この例では、この足場は、リボソーム又はRepAタンパク質又はDNAピューロマイシンリンカー又はRNAピューロマイシンリンカー又は核酸であり得る。
【００７７】
一例では、この融合タンパク質は、宿主細胞の表面結合タンパク質と相互作用し得る部分をさらに含み、この部分とこの表面結合タンパク質との間の相互作用は、少なくともこの融合タンパク質の宿主細胞への結合を誘導し、及び/又は少なくともこの融合タンパク質の細胞取り込みを誘導する。
【００７８】
或いは、この融合タンパク質は、宿主細胞の表面上にディスプレイされた受容体と相互作用し得る部分をさらに含み、この部分とこの受容体との間の相互作用は、少なくともこの融合タンパク質の宿主細胞への結合を誘導し得、及び/又は少なくともこの融合タンパク質の細胞取り込みを誘導し得る。この部分とこの受容体との間の相互作用は、例えば、Dohertyら、Annu. Rev. Biochem. 78 857-902 (2009)によって記載されるように、内在化を開始させ得る。
【００７９】
或いは、この融合タンパク質は、宿主細胞の表面上にディスプレイされた多糖と相互作用する部分をさらに含み、この部分とこの多糖との間の相互作用は、少なくともこの融合タンパク質の宿主細胞への結合を誘導し、及び/又は少なくともこの融合タンパク質の細胞取り込みを誘導する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「多糖」は、単糖ポリマーが、2個以上の連結された単糖を含み得ることを意味すると解釈すべきである。用語「多糖」には、とりわけ、アミノ官能化多糖誘導体及びカルボキシル官能化多糖誘導体などの多糖誘導体も含まれる。
【００８１】
別の一例では、この融合タンパク質は、特定の細胞型へのメンバーの標的化を指向する、及び/又は宿主細胞中への侵入の際に表現型を誘導する、1つ以上の部分をさらに含み得る。例えば、この部分は、メンバーが宿主細胞に侵入する場合に、致死の表現型を誘導するために使用され得る。例えば、この部分は、シェフェルジン(shepherdin)(例えば、Plesciaら、Cancer Cell 7 457-468, 2005)又はYB1由来のPRKYLRSVGなどのペプチド(例えば、Lawら、PLoS ONE 5 e12661, 2010)であり得る。
【００８２】
ステップ(iii)における候補ペプチド部分を決定又は同定するステップは、宿主細胞又はその細胞溶解物若しくは抽出物を、ビオチン結合性分子へのビオチン化融合タンパク質の結合に十分な時間及び条件下で、固体支持体に結合したビオチン結合性分子と接触させるステップ、及びビオチン化融合タンパク質を回収するステップ、を含み得る。例えば、このビオチン結合性分子は、アビジン若しくはニュートラアビジン若しくはストレプトアビジン又はそれらのバリアントを含む。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「固体支持体」は、1つ以上の結合剤が適用され得る任意の固体(可撓性又は剛性)基材を含むと解釈すべきである。例えば、この固体支持体は、ビーズ、カラム、膜、マイクロウェル又は遠心管の形態であり得る。好ましくは、この固体支持体は、ビーズであり得、このビーズは、ガラスビーズ又はマイクロビーズ、磁性ビーズ又は常磁性ビーズである。
【００８４】
本明細書で使用する場合「候補ペプチド部分」は、任意の単離された核酸、同定及び/又は特徴付けられた核酸を使用して産生されたペプチドを含むと解釈すべきである。例えば、候補ペプチド部分をコードする核酸は、病原性生物、例えば、病原性細菌及びウイルスのゲノムDNA及び/又はcDNA断片を含み得る。特に好ましい一例では、候補ペプチド部分をコードする核酸は、細菌及び/若しくは古細菌及び/若しくはウイルスゲノムのコード領域及び/若しくは非コード領域、並びに/又はコンパクトなゲノムを有する真核生物のコード領域及び/若しくは非コード領域から、産生され得る。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法によってモニタリング又は同定されるペプチドは、カーゴ分子、例えば、蛍光分子、又は毒素若しくはその触媒性サブユニット/断片、又はマルトース結合タンパク質、又はウイルス粒子を、細胞に送達することにおいて機能的である。本発明のプロセスを実施することによって同定及び/又は単離若しくは精製されるペプチドは、ペプチド、又はそのアナログ及び/若しくは誘導体と細胞若しくは細胞内位置への送達のための少なくとも1つのカーゴとを含むコンジュゲートに容易に製剤化される。コンジュゲートは、少なくとも1つのペプチド又はそのアナログ及び/若しくは誘導体を、診断上又は治療上有用なカーゴ分子に連結することによって産生され得る。少なくとも1つのこのようなコンジュゲートと医薬的に許容される担体又は賦形剤とを含む、例えば非経口投与のために製剤化された医薬組成物も産生される。カーゴ分子は、コンジュゲートが細胞膜を通るのに十分な時間及び条件下で、細胞を、少なくとも1つのこのようなコンジュゲート又は医薬組成物と接触させることによって、細胞膜を通って容易に輸送され、及び/又は細胞内若しくは細胞内位置内に容易に内在化されることも明らかである。
【００８６】
従って、本発明は、カーゴ部分を細胞内位置に輸送することが可能な細胞透過性ペプチドを同定する方法であって、細胞の細胞内位置にカーゴ部分をトランスロケートするペプチドの能力を決定するための機能的アッセイを実施するステップを含む方法も提供する。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「細胞内位置」は、サイトゾル、エンドソーム、核、小胞体、ゴルジ、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、例えば、葉緑体若しくはアミロプラスト若しくは有色体若しくは白色体、核、細胞骨格、中心小体、微小管形成中心(MTOC)、アクロソーム、グリオキシソーム、メラノソーム、筋原線維、核小体、ペルオキシソーム、ヌクレオソーム又は微小管、或いは、細胞質膜又は核膜などの細胞質表面を含むと解釈すべきである。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「カーゴ部分」は、その最も広い意味で、任意の小分子、炭水化物、脂質、核酸(例えば、DNA、RNA、siRNA二重鎖若しくは一重鎖分子、又はmiRNA)、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、バクテリオファージ若しくはウイルス粒子、合成ポリマー、樹脂、ラテックス粒子、色素、又はリンカー若しくはスペーサー分子、例えば、炭素スペーサー若しくは低い免疫原性のアミノ酸からなるリンカーを介して直接的又は間接的にペプチドに共有結合的に連結される他の検出可能な分子を含む。一例では、このカーゴ部分は、治療的有用性又は診断的有用性を有する分子を含み得る。或いは、このカーゴ部分は、毒素又はその断片の毒素サブユニットであり得る。
【００８９】
本発明は、細胞内位置にカーゴ部分を輸送することが可能な細胞透過性ペプチドを同定する方法であって、
(a)本発明の方法を実施して、細胞膜を介してトランスロケートした候補ペプチド部分を決定又は同定するステップ、
(b)細胞膜をトランスロケートすることが可能なペプチドを含む少なくとも1つのビオチン化融合タンパク質を回収するステップ、
(c)回収されたビオチン化融合タンパク質の少なくともこのペプチドをコードする核酸配列を得るステップ、
(d)ペプチドを産生するステップ、並びに
(e)機能的アッセイを実施して、このペプチドが細胞の細胞内位置にカーゴ部分をトランスロケートする能力を決定するステップ
を含む方法も提供する。
【００９０】
一例では、この機能的アッセイは、
(f)試験細胞を毒素コンジュゲートと接触させるステップであって、毒素コンジュゲートは、毒素又はその触媒性サブユニット/断片を含むカーゴに連結されたペプチドを含み得、接触させるステップは、毒素コンジュゲートが試験細胞に侵入するのに十分な時間及び条件下であり得る、ステップ、
(g)毒素コンジュゲートが試験細胞の生存度を低減させるのに十分な時間及び条件下で試験細胞をインキュベートするステップ、並びに
(h)試験細胞の低減された生存度を検出するステップであって、試験細胞の低減された生存度は、このペプチドが、細胞の細胞内位置に毒素又は触媒性サブユニット/断片をトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含み得る。
【００９１】
本明細書に記載するように、用語「毒素コンジュゲート」は、毒素又はその触媒性サブユニット/断片を含むカーゴに連結されたペプチドを含むと解釈すべきであり、例えば、この毒素コンジュゲートは、試験細胞にとって致死であり得る(例えば、Dosioら、Toxins 3 848-883, 2011)。
【００９２】
任意の当該分野で認識された方法が、試験細胞の生存度を決定するために使用され得る。例えば、細胞の生存度を決定することは、FACSなどによって、細胞の倍加速度、例えば、細胞が分裂するために必要とされる時間の期間、例えば、核酸含量又は細胞計数を決定するステップを含む。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「低減された生存度」とは、細胞が分裂できないこと、又は毒素コンジュゲートの非存在下で細胞が分裂するためにかかる時間の10倍未満若しくは9倍未満若しくは8倍未満若しくは7倍未満若しくは6倍未満若しくは5倍未満若しくは4倍未満若しくは3倍未満若しくは2倍未満若しくは1.5倍未満で細胞が分裂する能力によって示されるような、内在化された毒素コンジュゲートの存在下での細胞の生存度を指す。
【００９４】
別の一例では、細胞の生存度は、細胞生存度を示す1種以上の代謝基質又は酵素のレベルを測定することによって決定され、細胞における1種以上の代謝基質又は酵素の低減されたレベルは、その細胞の低減された生存度を示す。一例では、アデノシン三リン酸(ATP)のレベルは、例えば、ルシフェラーゼ酵素の基質を提供する細胞ATP産生によって、細胞溶解物の存在下でルシフェリンの発光における増加を測定することによって、決定され得る。別の一例では、レダクターゼ酵素活性のレベルは、例えば、細胞レダクターゼ酵素の存在下での、テトラゾリウム塩色素、例えば、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2<5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MMT)又は2,3-6w-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド(XTT)の、対応するホルマザンへの還元が関与する比色アッセイによって、決定され得る。別の一例では、結合した及び/又は内在化された毒素コンジュゲートの存在下での細胞の生存度は、このペプチドの非存在下での細胞におけるレベルの50％超又は60％超又は70％超又は80％超又は85％超又は90％超又は95％超であるATPのレベル及び/又はレダクターゼのレベルによって示される。より好ましくは、結合した及び/又は内在化された毒素コンジュゲートの存在下での細胞の生存度は、このペプチドの存在下及び非存在下でのATP及び/又はレダクターゼのレベルと同じレベルによって示される。
【００９５】
この毒素は、ジフテリア毒素断片を含み得る。或いは、この毒素は、コレラ毒素サブユニットA1を含み得る。或いは、この毒素は、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素を含み得る。或いは、この毒素は、リボソーム不活性化タンパク質を含み得る。例えば、このリボソーム不活性化タンパク質は、I型リボソーム不活性化タンパク質であり得る。好ましくは、このI型リボソーム不活性化タンパク質は、ボウガニン(bouganin)又はゲロニン又はサポリンであり得る。或いは、このリボソーム不活性化タンパク質は、II型リボソーム不活性化タンパク質であり得る。好ましくは、このII型リボソーム不活性化タンパク質は、志賀毒素の断片A1、又はリシン若しくはアブリン、又はニグリン(nigrin)であり得る。或いは、このリボソーム不活性化タンパク質は、III型リボソーム不活性化タンパク質であり得る。
【００９６】
好ましくは、この毒素は、ボウガニンポリペプチドである。好ましくは、このボウガニンは、その一部分中に提示される、CPP活性が確認されるべき候補CPPペプチド又はCPP断片又は公知のCPPをさらに含む、配列番号120〜132のいずれか1つに示される融合タンパク質構築物において発現される。好ましくは、CPP活性が確認されるべき候補CPPペプチド又はCPP断片又は公知のCPPは、ボウガニン融合タンパク質のN末端部分中、例えば、その残基2の後に、或いはボウガニン融合タンパク質のC末端部分中、例えば、そのC末端の2若しくは3若しくは4若しくは5残基以内に、又はそのC末端において提示される。
【００９７】
毒素コンジュゲートの発現を検出することは、蛍光標識細胞分取(FACS)又はライブ共焦点顕微鏡を実施するステップを含み得る。この方法は、毒素コンジュゲートを産生するステップをさらに含み得る。
【００９８】
別の一例では、この機能的アッセイは、
(f)試験細胞において第1の部分を発現させるステップであって、第1の部分は、検出可能な分子の第1の断片を含む、ステップ、
(g)試験細胞への第2の部分の結合及び試験細胞による第2の部分の取り込みに十分な時間及び条件下で、試験細胞を、検出可能な分子の第2の断片を含むカーゴ部分に連結されたペプチドを含む第2の部分と接触させるステップ、
(h)第1の部分及び第2の部分が検出可能な分子を構成する又は検出可能な部分の活性を生じるのに十分な時間及び条件下で、試験細胞をインキュベートするステップ、並びに
(i)試験細胞において検出可能な分子を検出するステップであって、この検出は、このペプチドが、試験細胞の細胞内位置に第2の断片をトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含み得る。
【００９９】
一例では、検出可能な分子の第1の断片及び第2の断片は、同じではない。従って、検出可能な分子の機能性に重要な2つの異なる断片が、この例に従って機能的な検出可能な分子を産生するために再構成され得る。第1の断片及び第2の断片が、機能的な検出可能な分子を産生するために再構成されるダイマー性の検出可能な分子の2つの異なるポリペプチドモノマーを含むことは、全体的にこの例の範囲内である。
【０１００】
別の一例では、検出可能な分子の第1の断片及び第2の断片は、同じである。第1の断片及び第2の断片が、機能的な検出可能な分子を産生するために再構成されるダイマー性の検出可能な分子の2つの同一のポリペプチドモノマーを含むことは、全体的にこの例の範囲内である。
【０１０１】
構成される検出可能な分子は、当該分野で周知の方法を使用して検出可能な蛍光分子であり得る。例示的な蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP)又は高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)又はAcGFP又はTurboGFP又はEmerald又はAzami Green又はZsGreen、EBFP、又はSapphire又はT-Sapphire又はECFP又はmCFP又はCerulean又はCyPet又はAmCyanl又はMidori-Ishi Cyan又はmTFPl(Teal)又は高感度黄色蛍光タンパク質(EYFP)又はTopaz又はVenus又はmCitrine又はYPet又はPhiYFP又はZsYellowl又はmBanana又はKusabira Orange又はmOrange又はdTomato又はdTomato-Tandem又はAsRed2又はmRFPl又はJRed又はmCherry又はHcRedl又はmRaspberry又はHcRedl又はHcRed-Tandem又はmPlum又はAQ 143が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１０２】
検出可能な分子の断片は、GFP 11タグを含むアミノ酸配列を含み得、検出可能な分子の断片は、GFP 1-10検出子を含むアミノ酸配列を含み得る(例えば、Cabantousら、Nat. Biotechnol. 23 102-107, 2005)。好ましくは、このGFP 11タグは、配列番号81に示されるアミノ酸配列を含み得、このGFP 1-10検出子は、配列番号86に示されるアミノ酸配列を含み得る。用語「スプリットGFP補完」は、GFP 11タグ及びGFP 1-10検出子を使用する機能的アッセイの任意の及び全ての形態に言及するために、本明細書の実施例において使用される。
【０１０３】
一例では、GFP 11タグをコードする核酸は、足場及びGFP 11を含む融合ポリペプチドが産生されるように、足場分子をコードする核酸に連結される。例えば、この足場分子には、低分子ユビキチン関連改変因子ペプチド又はチューブリンペプチド又はβ-アクチンペプチド又はプロテインAベースのドメイン(例えば、Nordら、Nat Biotechnol 15 772-777, 1997)又はリポカリンベースのドメイン(Skerraら、FEBS J. 275 2677-2683, 2008)又はフィブロネクチンベースのドメイン(例えば、Dineenら、BMC Cancer 8 352, 2008)又はアビマードメイン又はSumo(例えば、Silvermanら、Nat Biotechnol 23 1556-1561, 2005)又はアンキリンベースのドメイン(例えば、Zahndら、J Biol. Chem. 281 35167-35175, 2006)、又はCDRと類似するループを有するIgドメインに対して顕著な構造的相同性を有するタンパク質折り畳みに基づくセンチリンドメイン又はMyD88又はT細胞分化タンパク質Mal又はウイルス癌遺伝子、例えば、v-relトリ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログAによってコードされるタンパク質RelAが含まれ得る。
【０１０４】
このGFP 11タグは、CPP、若しくはCPP活性についてスクリーニングされているペプチドを含み得、又は或いは、このGFP 1-10検出子は、CPP、若しくはCPP活性についてスクリーニングされているペプチドを含み得る。
【０１０５】
検出可能な分子を検出するステップは、蛍光ベースのアッセイ、例えば、蛍光標識細胞分取(FACS)若しくは蛍光顕微鏡若しくはライブ共焦点顕微鏡又はこれらの組み合わせを実施して、フルオロフォア(複数可)を検出するステップを含み得る。例えば、細胞におけるGFP活性の再構成を決定するために顕微鏡法を実施することにおいて、これらの細胞は、本明細書に記載するように、GFP1-10及びGFP 11断片を含む構築物でトランスフェクトされ得、次いで、細胞の接着を促進するための荷電表面を有するものなどのチャンバースライド中に播種され得る。例えば、抗生物質を欠く培地250uL中で、CHO-K1細胞は、5×104細胞/ウェルで播種され得、HCC-827細胞は、7.5×104細胞/ウェルで播種され得、最大8〜16時間、例えば一晩、静置され、接着させる。接着後、組換えタンパク質が、ウェルから培地、例えば60μLの培地を除去し、およそ等しい体積のタンパク質、例えば、タンパク質の40μMの作業ストック溶液60μLを添加し、それによって、1ウェル当たり10μMのタンパク質最終濃度を生じることによって、添加され得る。最大48時間、好ましくは8〜24時間又は8〜16時間のさらなるインキュベーション期間の後、培地は、ピペットを使用するなどして穏やかに細胞から除去され、これらの細胞は、製造者の指示に従って、市販のキット、例えば、Molecular Probes、Life TechのImage-iT Fix-Permキットを使用するなどして、固定又は透過処理される。それに接着した固定された細胞を有するスライドが洗浄され、例えば、DPBS中のBSAを使用してブロッキングされ、蛍光が、ActinRed 555 Ready Probes Reagentなどのフルオロフォアの存在下で細胞をインキュベートすることによって可視化され、次いで洗浄され、例えばDAPI/PBSを使用して染色され、洗浄され、軽く乾燥させ、蛍光顕微鏡によって可視化される。
【０１０６】
本明細書に例示するように、本発明者らは、GFP 11タグなどの断片がCPP又は細胞生存度に対する有害効果を含むCPP様活性についてスクリーニングされているペプチドに共有結合的に連結される場合、機能的GFPの再構成を達成することにおいて、いくつかの課題に直面した。特に、本明細書の図13〜22に示されるデータは、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞におけるスプリットGFP活性の再構成を決定することを含む機能的アッセイが、(i)再構成されたGFPの蛍光を決定することによって、細胞中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド取り込みを検出するため、及び/又は(ii)細胞のエンドソームからの連結されたカーゴタンパク質の逃避をモジュレートするCPPの能力を決定するために、有用であることを示している。
【０１０７】
それにもかかわらず、適切な蛍光シグナル及び細胞生存度を達成する際の困難は、このような共有結合的に連結されたさらなるペプチジル部分の非存在下での、単離されたGFP 11タグ及びGFP 1-10検出子断片の効率的な再構成である。本発明者らは、断片の再構成のレベルを反映するシグナルが、GFP 11融合物、好ましくは、GFP 11及びさらなるポリペプチド断片、例えばMyD88ペプチド断片、Sumoペプチド断片又はβ-アクチンペプチド断片を含む融合物を使用することによって増強されるが、これらのさらなるポリペプチドを発現する細胞の生存度は可変性であることを見出した。例えば、本明細書の図14に示されるデータは、MyD88-GFP 11断片を含む断片及びGFP1-10断片による細胞の共トランスフェクションが、主に円形細胞において再構成された細胞内GFPの高密度ポケットを生じること、β-アクチン-GFP 11断片を含む断片及びGFP1-10断片による細胞の共トランスフェクションが、細胞質のあらゆる場所に、樹状特徴において濃縮されたスプリットGFP標識の散在性の局在化を生じること、RelA-GFP 11断片を含む断片及びGFP1-10断片による細胞の共トランスフェクションが、細胞質のあらゆる場所に、時折核から排除されたスプリットGFPの散在性の局在化を生じること、並びにMal-GFP 11断片を含む断片及びGFP1-10断片による細胞の共トランスフェクションが、細胞質のあらゆる場所に散在し、複数の小さい焦点において濃縮されるスプリットGFP発現を生じることを実証する。細胞生存度は、Mal-GFP 11融合物又はβ-アクチン-GFP 11融合物を発現する細胞についてより高かったが、MyD88-GFP 11融合物又はRelA-GFP 11融合物の発現は、細胞生存度を低減させた。
【０１０８】
或いは、又はさらに、検出可能な分子の一方の断片又は両方の断片をコードする核酸は、ex vivoで検出可能な分子の再構成のレベルを増強するためのヒトコドン使用頻度のために最適化され得る。図15によって本明細書に例示されるように、このようなヒトコドン最適化は、少なくとも再構成されたGFP 11及びGFP 1-10断片について、ヒト細胞においてスプリットGFPシグナルを改善する。好ましくは、このGFP1-10コード核酸は、ヒト最適化され補正されたアミノ酸配列(本明細書では「hGFP1-10(g)」)を産生するために、適切な位置において市販のGFP 1-10の変異体ヌクレオチドAでGを置換することによって、さらに改変されている。好ましくは、ヒトコドン最適化され補正されたGFP 1-10配列は、ヒト細胞においてpcDNA4/TOベクター(本明細書では「hGFP1-10(g)/TO」)から発現される。好ましくは、このようなコドン最適化されたGFP 1-10は、上昇した再構成を達成するために、Mal-GFP 11又はMyD88-GFP 11融合構築物と共に使用される。より好ましくは、このようなコドン最適化されたGFP 1-10は、高い又は増強された又は耐容可能な細胞生存度で機能的GFPの上昇した再構成を達成するために、Mal-GFP 11融合構築物と共に使用される。
【０１０９】
さらなる一例では、リンカーが、足場とGFP 11との間に配置され得る。例えば、このリンカーは、最大25アミノ酸残基長又は最大20アミノ酸残基長、例えば、20アミノ酸残基又は19アミノ酸残基又は18アミノ酸残基又は17アミノ酸残基又は16アミノ酸残基又は15アミノ酸残基又は14アミノ酸残基又は13アミノ酸残基又は12アミノ酸残基又は11アミノ酸残基又は10アミノ酸残基又は9アミノ酸残基又は8アミノ酸残基又は7アミノ酸残基又は6アミノ酸残基又は5 20アミノ酸残基又は4アミノ酸残基を含み得る。
【０１１０】
さらなる一例では、この方法は、タグ及び検出子融合物(複数可)のin vitro補完を含むプロセスを実施するステップをさらに含み、それによって、試験されているCPPについての検出可能な分子の最適な再構成を提供する融合ポリペプチドの組み合わせを決定する。これは、検出可能な分子の再構成に対するCPPの有害効果を最小化するためである。例えば、特定の試験CPPは、ヒトコドン最適化されたhGFP1-10(g)/TO構築物でトランスフェクトされたヒト細胞、例えば、HCC-827(高い受容体発現)において、及び非ヒト細胞、例えば、CHO-K1(陰性の受容体発現)細胞において、異なる足場及びGFP 11との融合物として発現され得、スプリットGFP補完は、生細胞集団に対してゲートするフローサイトメトリーなどによってGFP蛍光を測定することによって検出され得る。このシグナルは、好ましくは用量応答性である。好ましくは、このシグナルは、総生細胞集団におけるパーセントGFP陽性細胞として表され、pcDNA3-eGFPなどの異なる構築物による各細胞株の独立したトランスフェクションについて決定されるような、トランスフェクション効率のレベルについて標準化される。この好ましい試験の例示的なワークフローは、本明細書の図19によって提供される。
【０１１１】
任意の細胞株が、本明細書に記載される機能的アッセイを実施するために使用され得る。好ましい細胞株は、HCC-827細胞などのヒトHCC細胞、又はCHO細胞若しくはHEK細胞などの非ヒト細胞である。好ましいCHO細胞は、CHO-K1細胞であり、好ましいHEK細胞は、HEK-293細胞である。
【０１１２】
なお別の一例では、この機能的アッセイは、
(f)線維芽細胞を含む試験細胞を、ペプチドと細胞の細胞内局在化において機能的であり線維芽細胞の異なる細胞型への分化を媒介する転写因子とを含む、融合タンパク質と接触させるステップ、
(g)試験細胞を、それらの分化が生じるのに十分な時間及び条件下でインキュベートするステップ、並びに
(h)分化した細胞を検出するステップであって、分化した細胞は、そのペプチドが、試験細胞の細胞内位置にこの転写因子をトランスロケートしたことを示す、ステップ
を含み得る。
【０１１３】
一例では、これらの線維芽細胞は、ヒト起源の初代線維芽細胞、例えば、ヒト皮膚線維芽細胞又は癌腫関連線維芽細胞であり得る。
【０１１４】
好ましくは、この転写因子はOCT-4であり、これらの分化細胞はリンパ球である(例えば、Szaboら、Nature 25, 521-526, 2010)。より好ましくは、この転写因子はMYOD1であり、これらの分化細胞は筋芽細胞である(例えば、Fijiiら、Brain Dev. 28, 420-425, 2006)。
【０１１５】
分化した細胞を検出することは、顕微鏡又は蛍光標識細胞分取(FACS)を実施するステップを含み得る。
【０１１６】
本発明は、スタンドアローンプロセスとして、又は他のペプチドから推定CPPを単離若しくは同定するための任意のスクリーニングを実施することから隔離されて、本明細書の任意の例に従って記載されるような機能的アッセイを実施するステップを含む、CPPの活性を決定するための方法にも拡張されることを理解すべきである。例えば、本発明は、明らかに、再構成されたGFPの蛍光を決定することによる細胞中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド取り込みの検出のために、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞においてスプリットGFP活性の再構成を決定するステップを含む、本明細書の任意の例に従って記載されるような機能的アッセイを実施するステップを含む、CPPの活性を決定するための方法を提供する。
【０１１７】
さらなる一例では、本発明は、配列番号83及び/又は配列番号84及び/又は配列番号85及び/又は配列番号86及び/又は配列番号87及び/又は配列番号88及び/又は配列番号89及び/又は配列番号90及び/又は配列番号91及び/又は配列番号92及び/又は配列番号93及び/又は配列番号94及び/又は配列番号95及び/又は配列番号96及び/又は配列番号97及び/又は配列番号98及び/又は配列番号99及び/又は配列番号100及び/又は配列番号101及び/又は配列番号102及び/又は配列番号103及び/又は配列番号104及び/又は配列番号105及び/又は配列番号106及び/又は配列番号107及び/又は配列番号108及び/又は配列番号109及び/又は配列番号110及び/又は配列番号111及び/又は配列番号112及び/又は配列番号113及び/又は配列番号114及び/又は配列番号115及び/又は配列番号116及び/又は配列番号117及び/又は配列番号118及び/又は配列番号119を含む配列番号83〜119のうちのいずれか1つ以上に示されるアミノ酸配列を含む、組換えCPP又は合成CPPを提供する。
【０１１８】
さらなる一例では、本発明は、配列番号83〜119のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の少なくとも約15又は20又は25又は30又は35個の連続するアミノ酸を含む、配列番号83〜119のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の少なくとも約5又は6又は7又は8個の連続するアミノ酸を含む組換えCPP又は合成CPPを提供する。この文脈では、本明細書に開示される全長CPPのこのような断片は、それらが、CPP活性について本明細書で例示されたスクリーニングのうちの1つ以上において試験した場合に、それらが由来する基礎CPPと、必ずしも同じ大きさの機能性ではないが、同じ機能性を有するという意味で、機能的CPPであることを、理解すべきである。
【０１１９】
本発明の特に好ましいCPP及びCPP断片は、約23アミノ酸残基長よりも長く、好ましくは少なくとも約25又は26又は27又は28又は29又は30又は31又は32又は33又は34又は35又は36又は37又は38又は39又は40残基長である。
【０１２０】
さらなる一例では、本発明は、(i)本発明の任意の例に従う本発明の組換えCPP若しくは合成CPP又はCPP断片、例えば、配列番号83〜119のうちの1つ以上によって規定されるCPP又はその機能的CPP断片、及び(ii)このCPP又はCPP断片に共有結合したカーゴ分子を含むコンジュゲート分子を提供する。このカーゴは、小分子、炭水化物、脂質、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、細胞、バクテリオファージ粒子、ウイルス粒子、合成ポリマー、樹脂、ラテックス粒子又は色素であり得る。或いは、又はさらに、このカーゴは、診断試薬、例えば、検出可能に標識された分子、例えば、フルオロフォア、放射活性標識、発光分子、ナノ粒子、造影剤若しくは量子ドットを含み得る、又はこれらからなり得る。或いは、又はさらに、このカーゴは、蛍光若しくは着色分子であり得る検出可能な分子にその細胞透過性基質を変換する酵素を含み得る、又はこのような酵素からなり得る。例えば、このカーゴは、CCF4-AMを含む基質の存在下でβ-ラクタマーゼ活性を示し得る。或いは、又はさらに、このカーゴは、中枢神経系の疾患若しくは状態、又は癌において有用性を有する治療試薬又は診断試薬を含み得る、或いはこれらからなり得る。
【０１２１】
さらなる一例では、本発明は、細胞膜を通ってカーゴ分子を輸送する、又は細胞内若しくは細胞内位置内にカーゴ分子を内在化させる方法であって、コンジュゲートが細胞膜を通るのに十分な時間及び条件下で、細胞を、本明細書の任意の例に従う少なくとも1つのコンジュゲートと接触させるステップを含む方法を提供する。この方法は、さらに、配列番号83〜119のうちの1つ以上によって規定されるCPP又はその機能的CPP断片などの、本明細書の任意の例に従って記載される本発明のCPP又はCPP断片に、カーゴ分子を会合させるステップ又は共有結合的に連結させるステップを含むプロセスによって、コンジュゲートを産生するステップを含み得る。
【０１２２】
本明細書を通じて、特記しない限り、又は文脈が他を要求しない限り、単一のステップ、問題の組成物、問題のステップの群又は組成物の群に対する言及は、これらのステップ、問題の組成物、問題のステップの群又は組成物の群のうちの1つ及び複数(例えば、1つ以上)を包含すると解釈すべきである。
【０１２３】
本明細書に記載される各実施形態は、特記しない限り、各々及び全ての他の実施形態に、変更すべきところは変更して、適用されるべきである。
【０１２４】
当業者は、本明細書に記載される発明が、具体的に記載されているもの以外のバリエーション及び改変を受けやすいことを理解する。本発明は、全てのこのようなバリエーション及び改変を含むと理解すべきである。本発明は、個々に又は集合的に、本明細書で言及される又は示されるステップ、特徴、組成物及び化合物の全て、並びにこれらのステップ又は特徴のうちの任意の及び/又は全ての組み合わせ又は任意の2つ以上も含む。
【０１２５】
本発明は、例示目的のみを意図した本明細書に記載される具体的な実施形態によっては、その範囲を限定すべきでない。機能的に等価な産物、組成物及び方法は、明らかに、本明細書に記載されるような本発明の範囲内である。
【０１２６】
本発明は、特記しない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成及び免疫学の従来の技術を使用して、過度の実験なしに実施される。このような手順は、例えば、以下のテキスト中に記載されている:
【０１２７】
2016523088.tif 000004
【０１２８】
本発明は、以下の非限定的な例にさらに記載され、及び/又は図面中に示される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図1aは、pNp3誘導体ベクターPelB-Avitag-pIIIのコードされたpIII融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターPelB-Avitag-pIIIは、大腸菌細胞のペリプラズムへの任意の発現されたポリペプチドの搬出を指向するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びにファージコートタンパク質pIII(pIII)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。  図1bは、pNp3誘導体ベクターDsbA-Avitag-pIIIのコードされたpIII融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターDsbA-Avitag-pIIIは、大腸菌細胞のペリプラズムへの任意の発現されたポリペプチドの搬出を指向するための、DsbAリーダーシグナルペプチド(DsbA)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びにファージコートタンパク質pIII(pIII)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。  図1cは、pNp3誘導体ベクターTorA-Avitag-pIIIのコードされたpIII融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターTorA-Avitag-pIIIは、大腸菌細胞のペリプラズムへの任意の発現されたポリペプチドの搬出を指向するための、TorAリーダーシグナルペプチド(TorA)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びにファージコートタンパク質pIII(pIII)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図２】競合的デコイ基質として機能するように設計された、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合された3つのタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)を含む融合ポリペプチドの略図を示す図である。
【図３】ウエスタンブロット分析によるビオチン化メンバーの検出の写真表示を示す図である。融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージの形態の足場を含むメンバーを、内因性ビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞において産生した。分子量マーカータンパク質(レーン1)、PelB-Avitag-pIII融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージ(レーン2及び3)、DsbA-Avitag-pIII融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージ(レーン4、5)、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)を欠く融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージ。DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質は、内因性ビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞中ではビオチン化されない。
【図４Ａ】pNp8誘導体ベクターPelB-Avitag-pVIIIのコードされたpIVII融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターPelB-Avitag-pVIIIは、大腸菌細胞のペリプラズムへの任意の発現されたポリペプチドの搬出を指向するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(10 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びにファージコートタンパク質pVIII(pVIII)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図４Ｂ】pNp8誘導体ベクターDsbA-Avitag-pVIIIのコードされたpIVII融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターDsbA-Avitag-pVIIIは、大腸菌細胞のペリプラズムへの任意の発現されたポリペプチドの搬出を指向するための、DsbAリーダーシグナルペプチド(DsbA)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(10 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びにファージコートタンパク質pVIII(pVIII)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図５】ウエスタンブロット分析によるビオチン化の検出の写真表示を示す図である。融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージの形態の足場を含むメンバーを、内因性ビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞において産生した。分子量マーカータンパク質(レーン1)、DsbA-Avitag-pIII融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージ(レーン4、5)、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)を欠く融合タンパク質をディスプレイする糸状バクテリオファージ(陰性コントロール、レーン9)、ビオチン化CD40L融合タンパク質(陽性コントロール、レーン10)。DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質は、内因性ビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞中ではビオチン化されない。
【図６Ａ】pJuFo-pIIIと称される発現ベクターによってコードされるPelB-c-Jun-pIII融合タンパク質の略図を示す図である。PelB-c-Jun-pIII融合タンパク質は、ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、Fosのc末端ロイシンジッパーとのヘテロダイマー形成のための、Jun(c-Jun)のc末端ロイシンジッパーをコードする核酸、並びにpIIIカプシドタンパク質、を含む。
【図６Ｂ】pJuFo-pIIIと称される発現ベクターによってコードされるPelB-c-Fos-Avitag融合タンパク質の略図を示す図である。PelB-c-Fos-Avitag融合タンパク質は、ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、Jun(c-Jun)のc末端ロイシンジッパーとのヘテロダイマーの形成のための、Fosペプチド(c-Fos)のc末端をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、並びに融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図７Ａ】pJuFo-pVIIIと称される発現ベクターによってコードされるPelB-c-Jun-pVIII融合タンパク質の略図を示す図である。PelB-c-Jun-pVIII融合タンパク質は、ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、Fosのc末端ロイシンジッパーとのヘテロダイマー形成のための、Jun(c-Jun)のc末端ロイシンジッパーをコードする核酸、並びにpVIIIカプシドタンパク質、を含む。
【図７Ｂ】pJuFo-pVIIIと称される発現ベクターによってコードされるPelB-c-Fos-Avitag融合タンパク質の略図を示す図である。PelB-c-Fos-Avitag融合タンパク質は、ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、PelBリーダーシグナルペプチド(PelB)をコードする核酸、Jun(c-Jun)のc末端ロイシンジッパーとのヘテロダイマーの形成のための、Fosペプチド(c-Fos)のc末端をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avi-tag)をコードする核酸、並びに融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図８Ａ】T7Select-Avitag-Nと称される発現ベクターによってコードされるコードされたCP 10-Avitag-N融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターT7Select-Avitag-Nは、ファージディスプレイを目的とした、10Bカプシドタンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、並びに配列番号4に示されるビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図８Ｂ】T7Select-Avitag-Cと称される発現ベクターによってコードされるCP 10-Avitag-N融合タンパク質の略図を示す図である。発現ベクターT7Select-Avitag-Cは、ファージディスプレイを目的とした、10Bカプシドタンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素(HA)タグをコードする核酸、並びにビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、を含む。候補ペプチド部分のサブクローニングを可能にするEcoRI制限酵素部位も示される。
【図９】ウエスタンブロット分析によるビオチン化の検出の写真表示を示す図である。CP 10-Avitag融合タンパク質をディスプレイするTファージの形態の足場を含むメンバーを、SUMO-(Avitag)3融合タンパク質を発現する大腸菌細胞において産生した。分子量マーカータンパク質(レーン1)、SUMO-(Avitag)3融合タンパク質を発現する細胞において産生されたCP 10B Avitag融合タンパク質をディスプレイするTファージ(レーン2、3、4、5)、SUMO-(Avitag)3融合タンパク質を発現する細胞において産生されたCP 10B Avitag融合タンパク質をディスプレイするTファージ(レーン6)。CP 10B Avitag融合タンパク質は、SUMO-(Avitag)3融合ポリペプチドの存在下では大腸菌細胞中ではビオチン化されないが、CP 10B Avitag融合タンパク質は、SUMO-(Avitag)3融合ポリペプチドの発現を欠く大腸菌細胞中ではビオチン化される。
【図１０】組み合わされた転写-翻訳系における使用のためのSITS-Avitagベクターの略図を示す図である。SITS-Avitagベクターは、種非依存的翻訳配列(SITS)をコードする核酸、ヘキサヒスチジンタグ(6 His)をコードする核酸、及びビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitag)をコードする核酸、を含む。
【図１１】ウエスタンブロット分析によるビオチン化の検出の写真表示を示す図である。メンバーを、組換えビオチンリガーゼの補充あり及びなしの真核生物無細胞タンパク質発現系において産生した。分子量マーカータンパク質(レーン1)、組換えビオチンリガーゼの非存在下で真核生物無細胞タンパク質発現系において産生されたSITS-Avitag融合タンパク質(レーン2、4、6及び8)、組換えビオチンリガーゼの存在下で真核生物無細胞タンパク質発現系において産生されたSITS-Avitag融合タンパク質(レーン3、5、7及び9)。種非依存的翻訳ドメイン及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む融合タンパク質は、in vitro翻訳系中ではビオチン化されない。
【図１２】ウエスタンブロット分析によるビオチン化の検出の写真表示を示す図である。非ビオチン化メンバーを、HEK 293細胞において、並びに外因性ビオチンの補充あり及びなしの組換えビオチンリガーゼ(BirA*)細胞を発現するトランスフェクトされたHEK 293細胞において、インキュベートした。分子量マーカータンパク質(レーン1)、哺乳動物細胞においてインキュベートしたメンバー(レーン5、7及び9)、組換えビオチンリガーゼを発現するトランスフェクトされたHEK 293細胞においてインキュベートしたメンバー(レーン6、8及び10)。培養培地に、ビオチンを補充した(レーン7及び8)。M-PER細胞溶解物(レーン9、10)に、外因性ビオチンを補充した(レーン9及び10)。BirA*を発現するトランスフェクトされたHEK 293細胞は、外因性ビオチンの非存在下ではより低いレベルではあるが、培養物中のインタクトなHEK 293細胞に又はM-PER細胞溶解物に添加される外因性ビオチンあり又はなしで、非ビオチン化メンバーをビオチン化する。
【図１３Ａ】GFP 1-10及びGFP 11断片を使用する本発明の機能的アッセイにおけるGFP活性の再構成に対するCPP及びカーゴの影響を示すグラフ表示を示す図である。図上に示されるS11コントロール(中黒の棒)は、横座標上に示される濃度における未改変のGFP 11断片であった。GFP 11融合タンパク質は、横座標上に示される濃度で、GFP 11断片及び公開されたCPP TAT(TAT_S11)、HA2TAT(HA2TAT_S11)若しくはPEP1(PEP1_S11)、又はPYC35(PYC35_S11)、PYR01(PYR01_S11)、PYR02(PYR02_S11)、PYR03(PYR03_S11)若しくはPYR04(PYR04_S11)と称されるカーゴタンパク質、を含んだ。蛍光はy軸上に示される。データは、in vitroでの機能的GFP活性の再構成に対するさらなるペプチド特徴の有害効果を示す。
【図１３Ｂ】GFP 1-10及びGFP 11断片を使用する本発明の機能的アッセイにおけるGFP活性の再構成に対する足場部分の影響を示すグラフ表示を示す図である。GFP 1-10断片を、pcDNA4ベクター骨格において、ヒトコドン使用頻度のために最適化した。図上に示されるS11コントロールは、未改変のGFP 11断片であった。GFP 11融合タンパク質は、GFP 11断片、及び足場部分MyD88(MyD88_S11)、β-アクチン(β-アクチン_S11)、Sumo(Sumo_S11)、又はPYC35_Sumo(PYC35_Sumo_S11)、TAT_Sumo(TAT_Sumo_S11)若しくはPYR01_Sumo(PYR01_Sumo_S11)と称されるカーゴ-足場融合部分、を含んだ。MyD88_S11及びmGFP1-10構築物の存在下での活性について標準化された相対的蛍光が、y軸上に示される。データが、mGFP1-10及びGFP 11を発現する構築物によるHEK293細胞の一過性トランスフェクションは、検出可能なレベルのGFP蛍光を生じないが、足場の付加が、機能的GFPの再構成を改善することを示している。
【図１４】mGFP 1-10及び足場-GFP 11融合タンパク質でトランスフェクトされたHEK-293細胞における再構成されたGFP(スプリットGFP)の局在化を示す写真表示のコピーを示す図である。パネルAは、MyD88_S11+mGFP1-10共トランスフェクションが、主に円形細胞において濃縮された細胞内GFPの高密度ポケットを生じることを示す。細胞は、示された他のGFP 11融合物と比較して最も明るい蛍光を有した。パネルBは、β-アクチン_S11+mGFP1-10共トランスフェクションが、強い蛍光、細胞質のあらゆる場所に、樹状特徴において濃縮されたスプリットGFP標識の散在性の局在化を生じること、及び細胞形態が、示された他のGFP 11融合物よりも樹状であることを示す。パネルCは、RelA-GFP 11融合物(RelA_S11)+mGFP1-10共トランスフェクションが、中程度〜低い蛍光、細胞質のあらゆる場所に、時折核から排除されたスプリットGFPの散在性の局在化を生じることを示す。パネルDは、Mal-GFP11融合物(Mal_S11)+mGFP1-10共トランスフェクションが、低い蛍光ではあるが、細胞質のあらゆる場所に散在し、複数の小さい焦点において濃縮されるスプリットGFP発現を生じることを示す。
【図１５】mGFP 1-10並びに足場-GFP 11融合タンパク質MyD88_S11、β-アクチン_S11及びMal-S11によるトランスフェクションの24時間後(上)及び48時間後(下)の細胞における再構成されたGFP(スプリットGFP)活性に対するGFP 1-10コドン使用頻度の影響を示すグラフ表示を示す図である。構築物は横座標上に示される。MyD88_S11及びmGFP1-10構築物の存在下での活性について標準化された各構築物についての相対的蛍光を、y軸上に示す。これらのGFP 1-10構築物は、pcDNA4(mGFP 1-10)から発現される市販のmGFP1-10(「A」バリアント)、pcDNA4/TOベクター[TO hGFP1-10(a)]若しくはpcDNA4/HMベクター[HM hGFP1-10(a)]から発現される市販のmGFP1-10(「A」バリアント)のヒト化バリアント、又はpcDNA4/TOベクター[TO hGFP1-10(g)]若しくはpcDNA4/HMベクター[HM hGFP1-10(a)]から発現される市販のmGFP1-10(「G」バリアント)の補正されたヒト化バリアントを含んだ。データは、市販のGFP 1-10における変異及び/又はヒトコドン使用頻度の補正が、Mal_S11+mGFP1-10で共トランスフェクトされた細胞について特にスプリットGFP活性の再構成を増強すること、並びにこの活性が、最大で少なくとも48時間にわたってトランスフェクトされた細胞において持続することを示している。データは、pcDNA4/TOベクター(hGFP1-10(g)/TO)からのヒトコドン最適化され補正されたGFP 1-10配列の発現が、機能的アッセイにおいてスプリットGFP活性の増強された再構成を生じることを示唆している。
【図１６】GFP 11+GFP 1-10断片を発現する単離されたHEK-293細胞におけるスプリットGFP活性の再構成に対する、足場/カーゴとGFP 11断片との間に位置付けられた異なるリンカーの影響を示すグラフ表示を示す図である。横座標上に示されるGFP 11融合物は以下である:MyD88-GFP 11融合物(MyD88)、Mal-GFP 11融合物(Mal)、β-アクチン-GFP 11融合物(β-アクチン)、Sumo-GFP 11融合物(Sumo)、及び受容体結合ドメイン(RBD)-GFP 11融合物(RBD)。各構築物についての平均蛍光をy軸上に示す。陰性コントロールは、GFP 11断片(白抜き棒、S11なし)又はリンカー(黒塗り棒、S11v3)を欠いた。使用したリンカーは、以下の通りであった:GSSGGSSGGSSGGSSGからなる16マーのアミノ酸配列(S11v4)、GGTGGSGGAGGTGGSGGAからなる18マーのアミノ酸配列(S11v5)、GTTGGTTGGGTGGSからなる14マーのアミノ酸配列(S11v6)、及びAPAPAPAPAPからなる10マーのアミノ酸配列(S11v7)。
【図１７】GFP 11+GFP 1-10断片を発現する単離されたHEK-293細胞におけるスプリットGFP活性の再構成に対するカーゴタンパク質の影響を示すグラフ表示を示す図である。GFP 1-10ベクターpcDNA4/TOベクター[TO hGFP1-10(a)]又はpcDNA4/HMベクター[HM hGFP1-10(a)]でトランスフェクトされたHEK-293細胞が、横座標上に示される。MyD88_S11及びmGFP1-10構築物の存在下での活性について標準化された、細胞に添加された各GFP 11構築物についての相対的蛍光が、y軸上に示される。カーゴペプチドを欠くGFP 11構築物は、以下であった:MyD88-GFP 11融合物(MyD88_S11)、Mal-GFP 11融合物(Mal_S11)、β-アクチン-GFP 11融合物(β-アクチン_S11)、及びSumo-GFP 11融合物(Sumo_S11)。カーゴペプチドを含むGFP 11構築物は、以下のようなSumo-GFP 11融合物(Sumo_S11)融合構築物のバリアントであった:PYC35-Sumo-GFP 11融合物(PYC35_Sumo_S11)、PYR01-Sumo-GFP 11融合物(PYR01_Sumo_S11)、及びTAT-Sumo-GFP 11融合物(TAT_Sumo_S11)。データは、カーゴペプチドが、ペプチドの細胞透過活性とは独立して、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する単離されたHEK-293細胞においてスプリットGFP活性の再構成をモジュレートできることを示している。CPPではないPYC35は、Sumo_S11蛍光に対して影響を示さなかったが、共にCPP活性を示すTAT及びPYR01は、50％を上回って、Semo_S11の蛍光を減少させた。全ての部分が、HEK293細胞において一過性にトランスフェクトされた構築物から発現されたので、この効果は、CPP取り込み活性とは独立であった。同じ効果が、示された2つの異なるhGFP1-10発現構築物について観察された。これらのデータは、in vitroのスプリットGFP活性の再構成に対する特定のカーゴ融合ペプチドの影響を試験するためにin vitro補完を実施することの利益を示唆している。
【図１８】GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞におけるスプリットGFP活性の再構成が、再構成されたGFPの蛍光を決定することによって、異なる細胞株中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチドの取り込みを検出することを示す、グラフ表示を示す図である。横座標上に示された構築物は、RBD-GFP 11融合ポリペプチド(RBD_S11)に連結されたCPP TAT、PYR01、PYJ04又はPYJ05を含んだ。陰性コントロールは、HisMBP又はCPPなしのRBD-GFP 11融合ポリペプチドであった。pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定されたトランスフェクション効率について標準化した、総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率を、y軸上に示す。細胞は、ヒトHCC-827細胞又はCHO-K1細胞のいずれかであった。蛍光を、示したように、2.5μMタンパク質、5μMタンパク質、10μMタンパク質、20μMタンパク質、40μMタンパク質又は80μMタンパク質について決定した。異なるCPPは各々、hGFP1-10(g)/TOで一過性にトランスフェクトされたHCC-827(高い受容体発現)細胞及びCHO-K1(陰性の受容体発現)細胞の両方において、受容体結合ドメイン(RBD)カーゴタンパク質及びGFP 11(S11v4)との融合物として発現させた。スプリットGFP補完を、生細胞集団に対してゲートするフローサイトメトリーを使用してGFP蛍光を測定することによって検出した。データは、蛍光シグナルが、試験した各構築物について用量応答的であり、新鮮な及び凍結したタンパク質サンプルについて取得可能であったことを示している。
【図１９】再構成されたGFPの蛍光を決定することによって、細胞中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド取り込みの検出のために、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞におけるスプリットGFP活性の再構成を決定するステップを含む、本発明の機能的アッセイのワークフローを示す略図を示す図である。
【図２０Ａ−Ｂ】スプリットGFP活性の再構成を決定するステップを含む本発明の機能的アッセイが、異なる細胞株において機能することを示すグラフ表示を示す図である。パネルAは、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたCHO-K1細胞を使用した。パネルBは、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたHCC-827細胞を使用した。横座標上に示される構築物は、RBD-GFP11カーゴ融合ポリペプチド(RBD_S11)又はチオレドキシン-GFP 11カーゴ融合ポリペプチドに連結されたCPP TAT又はPYJ01を含んだ。陰性コントロールは、HisMBP、又はCPPを欠く若しくはCPPの代わりに第2のカーゴタンパク質PYC35を含むカーゴ融合ポリペプチドであった。蛍光を、示されるように、5μMタンパク質、10μMタンパク質、20μMタンパク質及び40μMタンパク質について決定した。pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定したトランスフェクション効率について標準化した、総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率は、総生細胞集団の％GFP陽性細胞を調整しなかった場合の安定な細胞株HEK293/GFP1-10を除いて、y軸上に示される。データは、機能的アッセイにおいてGFP活性の再構成を提供する唯一の検証されたCPP TAT及びPYJ01と共に、CPPを欠いたアッセイについてのベースライン蛍光を、用量依存的様式で、試験した異なる細胞株について示す:CHO-K1(接着性、げっ歯類、受容体発現について陰性)、HCC-827(接着性、ヒト、受容体発現について強く陽性)、HEK293(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)、HEK293/GFP1-10(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性、モノクローナルのhGFP1-10(g)/TOで安定に形質転換された)、及びK562(非接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)。
【図２０Ｃ−Ｄ】スプリットGFP活性の再構成を決定するステップを含む本発明の機能的アッセイが、異なる細胞株において機能することを示すグラフ表示を示す図である。パネルCは、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたHEK-293細胞を使用した。パネルDは、hGFP1-10(g)/TOベクターで安定に形質転換されたHEK-293細胞を使用した。横座標上に示される構築物は、RBD-GFP11カーゴ融合ポリペプチド(RBD_S11)又はチオレドキシン-GFP 11カーゴ融合ポリペプチドに連結されたCPP TAT又はPYJ01を含んだ。陰性コントロールは、HisMBP、又はCPPを欠く若しくはCPPの代わりに第2のカーゴタンパク質PYC35を含むカーゴ融合ポリペプチドであった。蛍光を、示されるように、5μMタンパク質、10μMタンパク質、20μMタンパク質及び40μMタンパク質について決定した。pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定したトランスフェクション効率について標準化した、総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率は、総生細胞集団の％GFP陽性細胞を調整しなかった場合の安定な細胞株HEK293/GFP1-10を除いて、y軸上に示される。データは、機能的アッセイにおいてGFP活性の再構成を提供する唯一の検証されたCPP TAT及びPYJ01と共に、CPPを欠いたアッセイについてのベースライン蛍光を、用量依存的様式で、試験した異なる細胞株について示す:CHO-K1(接着性、げっ歯類、受容体発現について陰性)、HCC-827(接着性、ヒト、受容体発現について強く陽性)、HEK293(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)、HEK293/GFP1-10(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性、モノクローナルのhGFP1-10(g)/TOで安定に形質転換された)、及びK562(非接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)。
【図２０Ｅ】スプリットGFP活性の再構成を決定するステップを含む本発明の機能的アッセイが、異なる細胞株において機能することを示すグラフ表示を示す図である。パネルEは、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたK562細胞を使用した。横座標上に示される構築物は、RBD-GFP11カーゴ融合ポリペプチド(RBD_S11)又はチオレドキシン-GFP 11カーゴ融合ポリペプチドに連結されたCPP TAT又はPYJ01を含んだ。陰性コントロールは、HisMBP、又はCPPを欠く若しくはCPPの代わりに第2のカーゴタンパク質PYC35を含むカーゴ融合ポリペプチドであった。蛍光を、示されるように、5μMタンパク質、10μMタンパク質、20μMタンパク質及び40μMタンパク質について決定した。pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定したトランスフェクション効率について標準化した、総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率は、総生細胞集団の％GFP陽性細胞を調整しなかった場合の安定な細胞株HEK293/GFP1-10を除いて、y軸上に示される。データは、機能的アッセイにおいてGFP活性の再構成を提供する唯一の検証されたCPP TAT及びPYJ01と共に、CPPを欠いたアッセイについてのベースライン蛍光を、用量依存的様式で、試験した異なる細胞株について示す:CHO-K1(接着性、げっ歯類、受容体発現について陰性)、HCC-827(接着性、ヒト、受容体発現について強く陽性)、HEK293(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)、HEK293/GFP1-10(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性、モノクローナルのhGFP1-10(g)/TOで安定に形質転換された)、及びK562(非接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)。
【図２１】hGFP1-10(g)/TOで一過性にトランスフェクトされた細胞株における高度に精製されたCPP-カーゴ-GFP 11の取り込みを示す写真表示を示す図である。陰性コントロールは、カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド、即ち、CPPなしを使用した。カーゴは受容体結合ペプチドRBDであり、CPPはPYJ01であった。カーゴ-GFP 11(RBD_S11)及びCPP-カーゴ-GFP 11融合物(PYJ01_RBD_S11)を各々、10μM濃度でCHO-K1細胞又はHCC-827細胞に添加した。データは、RBD_S11構築物及びhGFP1-10(g)/TO構築物でトランスフェクトした場合、いずれの細胞株も再構成されたスプリットGFP活性を有さなかったが、高い核スプリットGFP活性が、PYJ01_RBD_S11構築物及びhGFP1-10(g)/TO構築物の両方でトランスフェクトした細胞について検出されたことを示している。これは、特に、細胞のエンドソームからの融合ポリペプチドの逃避を実証するための、CPP活性を決定するための機能的アッセイの有用性を実証している。
【図２２】標準的CPPペプチドを使用した細胞中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド取り込みの検出のための、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞におけるスプリットGFP活性の再構成を決定することを含む本発明の機能的アッセイの能力を示すグラフ表示を示す図である。構築物は、各々30μM濃度で、横座標上に示されるカーゴ-GFP 11融合ポリペプチドに連結された図の右側に示される標準的CPPを含んだ。陽性コントロールは、30μMのAKTA精製したTAT-RBD-GFP 11(TAT_RBD_S11v4)又はPYJ01-RBD-GFP 11(PYJ01_RBD_S11v4)融合タンパク質であった。陰性コントロールはCPPを欠き、水平の破線は、陰性コントロールについての最大閾値蛍光を示す。試験した細胞株は、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたHCC-827細胞、又はhGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトされたCHO-K1細胞、又はhGFP1-10(g)/TOベクターで安定に形質転換されたHEK-293細胞であった。AKTA精製されたPYJ01-RBD-GFP 11及びhGFP1-10(g)/TO構築物の存在下での活性について標準化された各構築物についての相対的蛍光を、y軸上に示す。データは、標準的CPP TAT、PYJ01、VP22、SAP及びPTD4の活性を確認するが、全ての他の標準的CPPは、GFP蛍光の検出によって測定される辺縁のスプリットGFP補完を示す。VP22、SAP及びPTD4は、TAT及びPYJ01と比較して低減された活性を示した。
【図２３】この機能性を有さないこと(「スプリットGFP陰性」)が本明細書で実証されたペプチドの平均アミノ酸組成と比較した、本発明のスプリットGFP補完アッセイにおける機能的GFPの再構成によって決定される、細胞の細胞質中にGFP11を輸送する能力を有する(「スプリットGFP陽性」)ことが本明細書で実証されたペプチドの平均アミノ酸組成を示すグラフ表示を示す図である。データは、一般に、このアッセイが、アミノ酸組成に関して識別しないが、より高い組成のシステイン(C)、グルタミン酸(E)又はリジン(K)を有するペプチドに対して選択し得ることを示している。しかし、本発明者らは、より高い組成のシステイン(C)及び/又はグルタミン酸(E)及び/又はリジン(K)が、特定のペプチドのCPP活性に悪影響を及ぼし得るという可能性を排除していない。
【図２４】この機能性を有さないこと(「スプリットGFP陰性」)が本明細書で実証されたペプチドの平均電荷、疎水性及びPSI構造予測特性と比較した、本発明のスプリットGFP補完アッセイにおける機能的GFPの再構成によって決定される、細胞の細胞質中にGFP11を輸送する能力を有する(「スプリットGFP陽性」)ことが本明細書で実証されたペプチドの平均電荷、疎水性、長さ及びPSI構造予測特性を示すグラフ表示を示す図である。データは、正味の電荷、pH6.8における疎水性に関して顕著な差異が存在すること、及びこのアッセイが、ペプチドについて予測された構造又はペプチド長さに関して識別しないことを示している。本発明者らは、スプリットGFP陰性であるペプチドがCPP活性を示す可能性が本質的に低いという可能性を排除していない。
【図２５】公知のCPP(「標準的(canonical)CPP」)の平均アミノ酸組成と比較した、本発明のスプリットGFP補完アッセイにおける機能的GFPの再構成によって決定される、細胞の細胞質中にGFP11を輸送する能力を有する(「スプリットGFP陽性Phylomer」)ことが本明細書で実証された本発明の単離されたCPPの平均アミノ酸組成を示すグラフ表示を示す図である。データは、標準的CPPが、高いレベルのアラニン(A)及びアルギニン(R)を有するが、本発明のエンドソームビオチン化トラップ及びスプリットGFP補完アッセイの両方において陽性である本発明のCPPは、高いレベルのリジン(K)、アルギニン(R)及びプロリン(P)を有することを示している。本発明のCPPと標準的CPPとの間のフェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)及びスレオニン(T)のレベルにおける差異も高度に顕著である。
【図２６】公知のCPP(「標準的CPP」)の平均電荷、疎水性、長さ及びPSI構造予測特性と比較した、本発明のスプリットGFP補完アッセイにおける機能的GFPの再構成によって決定される、細胞の細胞質中にGFP11を輸送する能力を有する(「スプリットGFP陽性Phylomer」)ことが本明細書で実証された本発明の単離されたCPPの平均電荷、疎水性及び長さを示すグラフ表示を示す図である。データは、標準的CPPと本発明のCPPとの間の正味の電荷、疎水性及びペプチド長さの各々において顕著な差異を示し、本発明のペプチドが、非標準的CPPの新たな構造的クラスを提示し得ることを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
細胞輸送
本発明は、特記しない限り、又は文脈が細胞輸送のより狭い解釈を必要としない限り、限定することなく、細胞輸送のモニタリングを包含する。
【０１３１】
分子が、細胞中に、細胞から外に、及び細胞内で、種々の機構のうちのいずれか1つ以上によって輸送され得ることを当業者は認識している。膜輸送には、原形質膜又は細胞内膜などの生体膜を通る分子の輸送が関与する。細胞内膜の例には、例えば、小胞体膜、核膜、ゴルジ体膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、リソソーム膜、初期エンドソーム膜、後期エンドソーム膜及びリサイクリングエンドソーム膜が含まれる。
【０１３２】
本発明の一例では、エンドサイトーシスがモニタリングされる。エンドサイトーシスは、細胞が細胞外材料を内在化する機構である(Conner及びSchmid, Nature 422, 37-44, 2003)。真核生物細胞では、内在化は、クラスリン依存的エンドサイトーシス又はクラスリン非依存的エンドサイトーシスを介して生じ得る。エンドサイトーシスの異なる機構が同時に生じ得ることも理解される。
【０１３３】
一例では、このエンドサイトーシスは、クラスリン依存的エンドサイトーシスである。クラスリン依存的エンドサイトーシスは、細胞中への分子及び原形質膜構成物の侵入について最も特徴付けられた機構である。同定されているクラスリン依存的機構には、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシス、及び細胞接着分子補助されるエンドサイトーシスが含まれる。これらのプロセスでは、細胞内小胞は、典型的には、クラスリンによって被覆された膜における陥入を形成する。
【０１３４】
一例では、このエンドサイトーシスは、クラスリン非依存的エンドサイトーシスである。クラスリン非依存的経路には、例えば、マクロピノサイトーシス、カベオラ/ラフト媒介性エンドサイトーシス、クラスリン及びカベオラ非依存的エンドサイトーシスが含まれる。
【０１３５】
好ましくは、このクラスリン非依存的経路は、マクロピノサイトーシスを含む。マクロピノサイトーシスには、葉状仮足のアクチン依存的形成又は広範な膜ラッフリングと、その後の、細胞内での別個の液胞、即ちマクロピノソーム(macropinosome)の形成が関与し得る(Swanson及びWatts, Trends Cell Biol. 5, 424-428, 1995)。
【０１３６】
或いは、このクラスリン非依存的経路は、カベオラ非依存的エンドサイトーシスを含む。クラスリン非依存的及びカベオラ非依存的経路の例には、例えば、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、Cdc42依存的エンドサイトーシス、GPI富化エンドサイトーシス区画(GPI-enriched endocytic compartment)(GEEC)依存的エンドサイトーシス、IL-2依存的エンドサイトーシス、RhoA依存的エンドサイトーシス及び円形背側(circular dorsal)ラッフリングが含まれる。例えば、Mayor及びPagano, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 603-612 (2007)、Hoonら、Mol. Cell Biol. 32, 4246-4257 (2012)、Kirkhamら、J. Cell Biol.168, 465-476 (2005)を参照のこと。
【０１３７】
本発明のなお別の一例では、ファゴサイトーシス及び/又はピノサイトーシス及び/又は逆行性輸送がモニタリングされる。ファゴサイトーシス、ピノサイトーシス及び逆行性輸送経路は、例えば、Johannes及びPopoff, Cell 135, 1175-1187 (2008)並びにLieu及びGleeson, Histol. Histopathol. 26, 395-408. (2011)によって記載されている。
【０１３８】
本発明のなお別の一例では、トランスサイトーシスが、細胞内膜を通る、又は1つの細胞表面から別の細胞表面への分子の輸送を決定するために、モニタリングされる。一例では、トランスサイトーシスされる分子は、受容体に結合し得る。次いで、受容体-リガンド複合体が、エンドサイトーシスによって細胞に侵入して、小胞を形成する。反対側の細胞表面に送達されるトランスサイトーシス小胞が引き続いて形成され、この場所で、これらは、原形質膜と融合し、それらの内容物を放出する。トランスサイトーシスは、頂端表面から側底表面へ、又は側底細胞表面から頂端細胞表面へのいずれかの方向で生じ得る。
【０１３９】
本発明のなお別の一例では、エキソサイトーシスが、細胞からの、及び細胞外環境中への分子の輸送を決定するためにモニタリングされる。
【０１４０】
広く定義されるような、又は本明細書の任意の具体的な例に従うペプチドの細胞輸送をモニタリングするための方法は、生物学的膜を通る候補ペプチド部分の移動をモニタリングするステップ、又は1つの細胞内位置から別の細胞内位置への候補ペプチド部分の移動をモニタリングするステップを含み得る。上述の説明から明らかなように、原形質膜を通る候補ペプチド部分の移動は、クラスリン依存的エンドサイトーシス並びに/又はクラスリン非依存的エンドサイトーシス並びに/又はクラスリン及びカベオラ非依存的エンドサイトーシス並びに/又はファゴサイトーシス並びに/又はピノサイトーシスによって媒介され得る。
【０１４１】
一例では、本発明に従って産生されたビオチン化メンバー又は融合タンパク質の輸送は、標準的なフローサイトメトリー及び/又は蛍光標識細胞分取(FACS)及び/又は蛍光顕微鏡及び/又はライブ共焦点顕微鏡を使用して、宿主細胞において分析される。このような可視化方法は、宿主細胞内のビオチン化メンバー又は融合タンパク質の局在化を決定するために、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに共有結合されたビオチンを検出する。
【０１４２】
一例では、ペプチドの細胞輸送をモニタリングするステップは、エンドソーム又はエンドソーム-リソソーム以外の細胞内位置、例えば、サイトゾル、核、小胞体、ゴルジ、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、例えば、葉緑体若しくはアミロプラスト若しくは有色体若しくは白色体、核、リボソーム、細胞骨格、中心小体、微小管形成中心(MTOC)、アクロソーム、グリオキシソーム、メラノソーム、筋原線維、核小体、ペルオキシソーム、ヌクレオソーム又は微小管における、ビオチン化メンバーの局在化を決定するステップを含む。
【０１４３】
別の一例では、ペプチドの細胞輸送をモニタリングするステップは、細胞の内膜系の小胞中以外の細胞内位置、例えば、サイトゾル、核、小胞体、ゴルジ、ミトコンドリア、プラスチド、核、リボソーム、細胞骨格、中心小体、微小管形成中心(MTOC)、アクロソーム、グリオキシソーム、メラノソーム、筋原線維、核小体、ペルオキシソーム、ヌクレオソーム又は微小管における、ビオチン化メンバーの局在化を決定するステップを含む。
【０１４４】
或いは、ペプチドの細胞輸送をモニタリングするステップは、適切なレポーター分子、例えば、フルオロフォア、放射活性標識、発光分子、色素などで、ディスプレイされた融合タンパク質、例えば、足場上にディスプレイされた融合タンパク質を標識するステップ、及び細胞内のレポーター分子の局在化を決定するステップを含み、エンドソーム若しくはエンドソーム-リソソーム又は内膜系の他の小胞以外の細胞内位置における、融合タンパク質に結合したレポーター分子の局在化は、エンドソーム又はエンドソーム-リソソームからのそのペプチドの放出を示す。
【０１４５】
融合タンパク質を標識するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Chen及びTing, Curr. Opin. Biotechnol. 16, 35-40 (2005)又はSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)によって記載されている。
【０１４６】
さらなる一例では、ペプチドの細胞輸送をモニタリングするステップは、エンドソーム中にトラップされたビオチン化メンバーと、エンドソームから逃避したビオチン化メンバーとの間を識別するステップを含む。一例では、エンドソームから逃避したビオチン化メンバーは、細胞の内膜系の小胞中以外の細胞内位置、例えば、サイトゾル、核、小胞体、ゴルジ、ミトコンドリア、プラスチド、核、リボソーム、細胞骨格、中心小体、微小管形成中心(MTOC)、アクロソーム、グリオキシソーム、メラノソーム、筋原線維、核小体、ペルオキシソーム、ヌクレオソーム又は微小管中に、実質的に存在する。エンドソーム中にトラップされたビオチン化メンバーと、エンドソームから逃避したビオチン化メンバーとの間を識別するための例示的な方法は、本発明の方法に記載されるように、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに共有結合したビオチンの存在を検出するステップを含む。
【０１４７】
少なくともこの融合タンパク質が宿主細胞の膜をトランスロケートするのに十分な時間及び条件下で、細胞を非ビオチン化メンバーと接触させることによって、非ビオチン化メンバーが細胞膜を通って容易に輸送され得ること、及び/又は宿主細胞内に容易に内在化され得ることは、明らかである。
【０１４８】
非ビオチン化メンバーの構造
候補ペプチド部分
本発明の方法において使用される候補ペプチド部分は、核酸、例えば、ゲノム断片、或いはそれら由来の増幅された核酸、又はmRNA若しくはcDNAによってコードされることによる、合成分子又は組換え分子であり得る。
【０１４９】
好ましい候補ペプチド部分は、天然に存在するタンパク質全体を含まない。一例では、この候補ペプチド部分は、少なくとも約15アミノ酸長を含む。好ましいペプチドは、約300アミノ酸未満又は約200アミノ酸未満又は約150アミノ酸未満又は約125アミノ酸未満又は約100アミノ酸未満又は約90アミノ酸未満又は約80アミノ酸未満からなる。
【０１５０】
別の一例では、好ましい候補ペプチドは、二次構造特徴を有する、例えば、発現された場合に、折り畳み又はタンパク質ドメインを形成する/生じる。好ましくは、このペプチドは、宿主細胞において発現された場合に、折り畳み又はタンパク質ドメインを自律的に生じる。構造化されていない候補ペプチドも使用され得、例えば、ペプチドにシステイン残基を導入することによって、及び/又はペプチド中に位置するシステイン残基間の分子内ジスルフィド連結を促進することによって、折り畳み又は二次構造を形成するように任意選択で誘導され得る。好ましくは、誘導された二次構造形成は、折り畳み又はタンパク質ドメインの機能性を妨害しないように、折り畳み又はタンパク質ドメインに寄与すると考えられるアミノ酸残基のいずれかの側にシステイン残基を位置付けるステップを含む。一例では、システイン残基は、候補ペプチドのN末端及び/又はC末端に付加され、これらのペプチドは、それらの環化を促進する適切な酸化還元条件に供され、それによって、二次構造形成を誘導する。
【０１５１】
一例では、この候補ペプチドは、当該分野で公知の及び本明細書に記載される任意の方法に従って産生される合成ペプチド分子である。例えば、ペプチドは、1つ以上の保護基を一般に使用して、1つのアミノ酸のカルボキシル基又はC末端を別のアミノ酸のアミノ基又はN末端にカップリングすることによって合成され得、これは、ペプチドのC末端で始まりペプチドのN末端で終わる。液相合成又は固相合成が使用され得、固相合成が好ましい。ペプチドの固相合成のための方法は、当該分野で周知である。例えば、参照によって組み込まれる、本明細書の参考文献[11]〜[16]を参照のこと。例えば、以下も参照のこと:Stewartら、Solid phase peptide synthesis (第2版). Rockford: Pierce Chemical Company. p. 91 (1984)、Athertonら、Solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press. (1989)、Hermkensら、Tetrahedron 53 (16), 5643-5678 (1997)、及びAlbericio,Solid-phase Synthesis: A Practical Guide (第1版). Boca Raton: CRC Press. p. 848 (2000)。
【０１５２】
合成候補ペプチドは、一般に、タンパク質ドメインを含み、好ましくは、タンパク質ドメインは、CPP活性又はPTD活性と関連することが知られていない。このタンパク質ドメインは、通常はCPP又はPTD活性と関連しないタンパク質ドメインの配列などの、全長タンパク質のアミノ酸配列内に含まれるアミノ酸配列を含み得る。或いは、このタンパク質ドメインは、任意の公知のタンパク質において以前には記載されていない未知のアミノ酸配列を含み得る。再び、本発明の方法における使用のためのこのような候補ペプチドは、好ましくは、CPP活性又はPTD活性と関連することが知られていないタンパク質ドメインを含む。
【０１５３】
別の一例では、この候補ペプチドは、mRNAの翻訳によって、又はDNAの転写及びそのRNA転写物の引き続く翻訳によって産生される、組換えペプチド分子である。このような組換えペプチドの産生における使用のための核酸断片は、一般に、ポリペプチドを産生するためにin vivo又はex vivo又はin vitroで翻訳されることが可能なオープンリーディングフレームを含む。好ましくは、この候補ペプチドは、公知の細胞透過性ペプチド(CPP)又はタンパク質形質導入ドメイン(PTD)のアミノ酸配列及び/又は二次構造を有さない。
【０１５４】
一例では、候補ペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、天然のオープンリーディングフレーム、即ち、タンパク質合成において天然に使用されるオープンリーディングフレームである。このような天然のオープンリーディングフレームの場合、本発明の方法における使用のための候補ペプチドをコードする核酸断片は、好ましくは、完全なオープンリーディングフレームによって天然にコードされる全長タンパク質のタンパク質ドメインを含む。より好ましくは、このタンパク質ドメインは、CPP活性又はPTD活性と関連することが知られていない。
【０１５５】
或いは、このオープンリーディングフレームは、非天然又は合成又は人工である、即ち、このオープンリーディングフレームは、全長遺伝子のmRNA転写物の翻訳において通常は天然には使用されない遺伝子断片のリーディングフレームを含むことなどに起因して、天然のオープンリーディングフレームではない。当業者は、DNAが、6つの可能なオープンリーディングフレームを含むことを承知しているが、これらは、全てが天然に使用されるわけではない。非天然のオープンリーディングフレームの場合、本発明の方法における使用のための候補ペプチドをコードする核酸断片は、天然に使用されるオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドとは異なるペプチドをコードする。一例では、このコードされたペプチドは、これまで知られていない。好ましくは、本発明の方法における使用のためのこのような候補ペプチドは、CPP活性又はPTD活性と関連することが知られていないタンパク質ドメインを含む。
【０１５６】
本発明の方法における使用のための組換え候補ペプチドを産生するために必要とされるものは、ペプチド又はタンパク質ドメインをコードするのに十分な長さのオープンリーディングフレームだけであることが、上述の説明から明らかである。
【０１５７】
核酸断片は、当業者に公知の種々の方法のうちの1つ以上によって生成され得る。
【０１５８】
一例では、核酸断片は、ゲノムDNA由来である。種々の生物からゲノムDNAを単離する方法は、当該分野で公知である。ゲノムDNAは、例えば、PureLink Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen)、Wizard Genomic DNA Purificationキット(Promega)、QIAampキット(Qiagen)、Genomic DNA Purificationキット(Thermo Scientific)又はPrepEase Genomic DNA Isolationキット(Affymetrix)などの市販のキットを使用しても、単離され得る。
【０１５９】
別の一例では、核酸断片は、相補的DNA(cDNA)由来である。当業者は、cDNAが、例えば、トリ逆転写酵素(AMV)逆転写酵素又はモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素を使用した、RNAの逆転写によって生成されることを承知している。このような逆転写酵素及びそれらの使用のための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Powerscriptキット(Clontech)、Superscript IIキット(Invitrogen)、Thermoscriptキット(Invitrogen)、Titaniumキット(Clontech)又はOmniscript(Qiagen)などの市販のキットにおいて取得可能である。単離されたRNAからcDNAを生成する方法も、当該分野で一般に公知であり、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)に記載されている。さらに、mRNAを単離し、cDNAを合成するためのキットは、QiagenのRNeasy Protect Miniキット、RNeasy Protect Cell Miniキットなど、市販されている。
【０１６０】
断片は、いくつかの方法のいずれか1つ、例えば、機械的剪断(例えば、超音波処理による、又は微細なゲージの針に核酸を通過させることによる)及び/若しくはヌクレアーゼ(例えば、Dnase 1)による消化及び/若しくは4塩基制限酵素部位を認識する頻繁に切断する酵素などの1つ以上の制限酵素による消化によって、並びに/或いは放射線、例えば、ガンマ線照射若しくは紫外線照射及び/又は増幅によるDNAの処理によって、ゲノムDNA又はcDNAを含むDNAから生成される。適切な方法は、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)又はSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)に記載されている。
【０１６１】
DNA断片の増幅が好ましいが、それは、DNA断片の増幅が、本発明の方法における引き続くステップにおける使用のための制限酵素切断部位の導入を促進するからである。一例では、1以上の生物(複数可)から単離された核酸断片のコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は等温増幅方法によって、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド又は縮重オリゴヌクレオチドを使用して、生成される。このようなランダムオリゴヌクレオチド又は縮重オリゴヌクレオチドは、好ましくは、適切な核酸ベクター中への増幅された核酸のクローニングを可能にするための制限酵素認識配列を含む。オリゴヌクレオチドを生成する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait編, 1984) IRL Press, Oxford、テキスト全体、並びに特に、Gait, pp l-22、Atkinsonら、pp35-81、Sproatら、pp 83-115、及びWuら、pp 135-151によるその中の論文に、記載されている。PCRを実施する方法も、McPhersonら、PCR A Practical Approach, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 1991によって、詳細に記載されている。
【０１６２】
本発明を実施する際の使用のための核酸断片は、好ましくは、例えば、アエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumeficians)、アクイフェックス・エオリカス(Aquifex aeolicus)、アルカエオグロブス・フルギドゥス(Archeglobus fulgidis)、バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、ヤギ流産菌(Brucella melitensis)、ブタ流産菌(Brucella suis)、ブフネラ属(Bruchnera)種、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・ニューモニエ、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、クラミジア・ムリダルム(Chlamydia muridarum)、クロロビウム・テピドゥム(Chlorobium tepidum)、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、ディノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、大腸菌、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)Rd、ハロバクテリウム属(Halobacterium)種、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、ラクチス乳酸菌(Lactococcus lactis)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、メタノコッカス・ヤンナスキイ(Methanococcus jannaschii)、メソリゾビウム・ロチ(Mesorhizobium loti)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマ・ペネトランス(Mycoplasma penetrans)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、肺マイコプラズマ(Mycoplasma pulmonis)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、オセアノバチルス・イヘイエンシス(Oceanobacillus iheyensis)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、プチダ菌(Pseudomonas putida)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、リケッチア・コノリイ(Rickettsia conorii)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、チフス菌(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)MR-1、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a、アルファルファ根粒菌(Sinorhizobium meliloti)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア、ミュータンス菌(Streptococcus mutans)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトマイセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、シネコシスティス属(Synechocystis)種、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、サーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、かいよう病菌病原型シトリ(Xanthomonas axonopodis pv., Citri)、ザントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス(Xanthomonas campestris pv., Campestris)、ピアス病菌(Xylella fastidiosa)及びペスト菌(Yersinia pestis)などの1種又は2種以上の原核生物に由来する。
【０１６３】
或いは、又はさらに、これらの核酸断片は、例えば、ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ネズミバベシア(Babesia microti)、ウシ(Bos taurus)、線虫(Caenorhabditis elegans)、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ハイイロオオカミ(Canis lupus)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、デバリオマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、シオミドロ(Ectocarpus siliculosus)、ニワトリ盲腸コクシジウム(Eimeria tenella)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、ニワトリ(Gallus gallus)、ダイズ(Glycine max)、ヘミセルミス・アンデルセニイ(Hemiselmis andersenii)、ヘミセルミス・アンデルセニイ、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、ラカンセア・クルイベリ(Lachancea kluyveri)、ラカンセア・サーモトレランス(Lachancea thermotolerans)、カニクイザル(Macaca fascicularis)、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)、ナウモボジマ・カステリイ(Naumovozyma castellii)、ネオスポラ・カニナム(Neospora caninum)、ネオスポラ・カニナム、ウサギ(Oryctolagus cuniculus)、オストレオコッカス・ルシマリヌス(Ostreococcus lucimarinus)、オストレオコッカス・ルシマリヌス、ヨツヒメゾウリムシ(Paramecium tetraurelia)、ラット(Rattus norvegicus)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ソルガム(Sorghum bicolor)、キンカチョウ(Taeniopygia guttata)、タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)、ブドウ(Vitis Vinifera)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)及びトウモロコシ(Zea mays)などの1種又は2種以上の真核生物に由来する。
【０１６４】
真核生物由来の好ましい核酸断片は、コンパクトなゲノムを有する1種又は2種以上の真核生物に由来する。本明細書で使用する場合、用語「コンパクトなゲノム」は、約1700メガ塩基対(Mbp)未満の、好ましくは、100Mbp未満の一倍体ゲノムサイズを意味すると解釈すべきである。コンパクトなゲノムを優先することは、より大きい真核生物ゲノムと比較した、非転写配列又はイントロン配列の低い豊富さから生じ、これが、候補ペプチドを産生するために使用される核酸プールにおける天然のオープンリーディングフレームの提示を増強する。この目的に適切なコンパクトなゲノムを有する例示的な真核生物には、シロイヌナズナ、ガンビアハマダラカ、マレー糸状虫(Brugia malayi)、線虫、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、ニワトリ盲腸コクシジウム、アイメリア・アセルブリナ(Eimeria acervulina)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、メダカ(Oryzias latipes)、イネ(Oryza sativa)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii)、クルーズ肉胞子虫(Sarcocystis cruzi)、出芽酵母(Saccharomyces cerevesiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、トラフグ(Takifugu rubripes)、タイレリア・パルバ(Theileria parva)、マミズフグ(Tetraodon fluviatilis)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ブルーストリパノソーマ(Tryponosoma brucei)及びクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)が含まれる。
【０１６５】
或いは、又はさらに、これらの核酸断片は、例えば、T7ファージ、HIV、ウマ動脈炎ウイルス、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス(lactate dehydrogenase-elevating virus)、レリスタッドウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、サル出血熱ウイルス、トリ腎炎ウイルス1、シチメンチョウアストロウイルス1、ヒトアストロウイルス(astero virus)1型、2型又は8型、ミンクアストロウイルス1、ヒツジアストロウイルス1、トリ伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルス、マウス肝炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、SARSコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス(acute bee paralysis virus)、アブラムシ致死麻痺ウイルス(aphid lethal paralysis virus)、黒色女王蜂児病ウイルス(black queen cell virus)、コオロギ麻痺ウイルス(cricket paralysis virus)、ショウジョウバエCウイルス(Drosophila C virus)、ヒメトビPウイルス(himetobi P virus)、カシミールミツバチウイルス(kashmir been virus)、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス(plautia stali intestine virus)、ムギクビレアブラムシウイルス(rhopalosiphum padi virus)、タウラ症候群ウイルス(taura syndrome virus)、サシガメウイルス(triatoma virus)、アルクルマウイルス(alkhurma virus)、アポイウイルス(apoi virus)、細胞融合剤ウイルス(cell fusing agent virus)、シカマダニウイルス(deer tick virus)、デングウイルス1型、2型、3型又は4型、日本脳炎ウイルス、カミティリバーウイルス(Kamiti River virus)、クンジンウイルス、ランガットウイルス、跳躍病ウイルス、モドックウイルス(modoc virus)、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス(Montana myotis leukoencephalitis virus)、マレー渓谷脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、タマナコウモリウイルス(Tamana bat virus)、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ヨコセウイルス(yokose virus)、C型肝炎ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス1又は2、ブタコレラウイルス、ペスチウイルスキリン(pestivirus giraffe)、ペスチウイルストナカイ(pestivirus reindeer)、GBウイルスC、G型肝炎ウイルス、GB型肝炎ウイルス(hepatitis GB virus)、バクテリオファージMi l、バクテリオファージQbeta、バクテリオファージSP、腸内細菌ファージ(enterobacteria phage)MX1、腸内細菌NL95、バクテリオファージAP205、腸内細菌ファージfr、腸内細菌ファージGA、腸内細菌ファージKU1、腸内細菌ファージMl 2、腸内細菌ファージMS2、シュードモナスファージPP7、エンドウマメひだ葉モザイクウイルス(pea enation mosaic virus)-1、オオムギ黄化萎縮ウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス-GAV、オオムギ黄化萎縮ウイルス-MAW、オオムギ黄化萎縮ウイルス-PAS、オオムギ黄化萎縮ウイルス-PAV、マメ科植物葉巻ウイルス(bean leafroll virus)、大豆萎縮ウイルス(soybean dwarf virus)、ビート退緑ウイルス(beet chlorosis virus)、ビートマイルド黄化ウイルス(beet mild yellowing virus)、ビート西部萎黄ウイルス、穀物黄化萎縮ウイルス(cereal yellow dwarf virus)-RPS、穀物黄化萎縮ウイルス-RPV、カボチャアブラムシ伝搬黄萎ウイルス(cucurbit aphid-borne yellows virus)、ポテト葉巻ウイルス(potato leafroll virus)、カブ黄化ウイルス(turnip yellows virus)、サトウキビ黄葉ウイルス(sugarcane yellow leaf virus)、ウマ鼻炎Aウイルス(equine rhinitis A virus)、口蹄疫ウイルス、脳心筋炎ウイルス、タイロウイルス、ウシエンテロウイルス���ヒトエンテロウイルスA、B、C、D又はE、ポリオウイルス、ブタエンテロウイルスA又はB、未分類エンテロウイルス、ウマ鼻炎Bウイルス、A型肝炎ウイルス、アイチウイルス(aichi virus)、ヒトパレコウイルス1、2又は3、ユンガンウイルス(ljungan virus)、ウマライノウイルス3、ヒトライノウイルスA及びB、ブタテッショウウイルス1、2〜7、8、9、10又は11、トリ脳脊髄炎(encephalomyehtis)ウイルス、カクゴウイルス(kakugo virus)、サルピコルナウイルス1、アウラウイルス(aura virus)、バーマフォレストウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イグボオラウイルス(igbo ora virus)、マヤロウイルス(mayaro virus)、オケルボウイルス(ockelbo virus)、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、サギヤマウイルス(sagiyama virus)、サケ膵臓病ウイルス(salmon pancrease disease virus)、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、シンドビス様ウイルス(sindbus-like virus)、睡眠病ウイルス(sleeping disease virus)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎(encephalomyehtis)ウイルス、風疹ウイルス、ブドウ斑紋ウイルス(grapevine fleck virus)、トウモロコシラヤドフィノウイルス(maize rayado fino virus)、オーツブルー萎縮ウイルス(oat blue dwarf virus)、ハヤトウリモザイクティモウイルス(chayote mosaic tymovirus)、ナスモザイクウイルス、エリシマム潜在ウイルス(erysimum latent virus)、ケネディア黄化モザイクウイルス(kennedya yellow mosaic virus)、オノニス黄化モザイクウイルス(ononis yellow mosaic virus)、ホオズキ斑紋ウイルス(physalis mottle virus)、カブ黄化モザイクウイルス(turnip yellow mosaic virus)並びにポインセチアモザイクウイルス(pomsettia mosaic virus)からなる群より選択されるウイルスなどの1種又は2種以上のウイルスに由来する。
【０１６６】
或いは、又はさらに、これらの核酸断片は、1つ又は2つ以上の十分に特徴付けられたゲノムに由来する。十分に特徴付けられたゲノムは、真核生物、例えば、原生生物、渦鞭毛藻類、藻類、植物、真菌、カビ、無脊椎動物、脊椎動物など、又は原核生物、例えば、細菌、真正細菌、シアノバクテリアなど、又はウイルスの、コンパクトなゲノムであり得る。「十分に特徴付けられた」とは、ゲノムが実質的に配列決定されていること、例えば、各寄与するゲノムの少なくとも約60％が配列決定されていること、及び/又はゲノムが約120未満のC値(pg)を有することを意味する。配列決定されたゲノムの量を決定するための方法は、当該分野で公知である。さらに、配列決定された配列に関する情報は、例えば、NCBI又はTIGRのデータベースなどの公に入手可能な供給源から容易に取得され、それによって、ゲノムの多様性の決定を容易にする。当業者は、用語「C値」が、例えば、Plant DNA C-values Database(Bennett及びLeitch, 2003)又はAnimal Genome Size Database(Gregory, 2001)などのC-value Databaseを参照することなどによって決定される、ピコグラムでの生物の一倍体又は配偶子核DNA含量を指すことを承知している(Swift, 1950)。
【０１６７】
好ましくは、各寄与するゲノムの少なくとも約70％が配列決定されており、より好ましくは、各寄与するゲノムの少なくとも約75％が配列決定されている。なおより好ましくは、各寄与するゲノムの少なくとも約80％が配列決定されている。
【０１６８】
或いは、又は配列決定されたゲノムの割合によるそれらの特徴付けに加えて、核酸が由来する好ましい生物は、100未満又は60未満又は40未満又は30未満又は20未満又は18未満又は16未満又は14未満又は12未満又は10未満又は9未満又は8未満又は7未満又は6未満又は5未満又は4未満又は3未満又は2未満又は1未満又は0.9未満又は0.8未満又は0.7未満又は0.6未満又は0.5未満又は0.4未満又は0.3未満又は0.2未満又は0.1未満のC値を有する。
【０１６９】
十分に特徴付けられたゲノムを有する好ましい生物には、例えば、アクチノバチルス・プルロニューモニエ血清型(Actinobacillus pleuropneumoniae serovar)、アエロピュルム・ペルニクス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium lumeficians)、ガンビアハマダラカ、アクイフェックス・エオリカス、シロイヌナズナ、アルカエオグロブス・フルギドゥス、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、バチルス・ハロデュランス(Baccilus halodurans)、枯草菌、バクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)、ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス(Bdellovibrio bacteriovorus)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、パラ百日咳菌(Bordetella parapertussis)、ライム病ボレリア、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)、ヤギ流産菌、ブタ流産菌、ブフネラ・アフィディコラ(Bruchnera aphidicola)、マレー糸状虫、線虫、カンピロバクター・ジェジュニ、カンディダトゥス・ブロヒマニア・フロリダヌス(Candidatus blochmannia floridanus)、カウロバクター・クレセンタス、クラミジア・ムリダルム、トラコーマクラミジア、クラミドフィラ・キャビエ(Chlamydophilia caviae)、クラミジア・ニューモニエ、クロロビウム・テピドゥム、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、クロストリジウム・アセトブチリクム、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficient)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、Q熱コクシエラ(Coxiella burnetii)、ゼブラフィッシュ、デクロロモナス・アロマチカ(Dechloromonas aromatica)、ディノコッカス・ラディオデュランス、キイロショウジョウバエ、ニワトリ盲腸コクシジウム、アイメリア・アセルブリナ、赤痢アメーバ、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)、大腸菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ジオバクター・サルフレドゥセンス(Geobacter sulfurreducens)、グロエオバクター・ビオラセウス(Gloeobacter violaceus)、軟性下疳菌(Haemophilis ducreyi)、インフルエンザ菌(Haemophilus injluenzae)、ハロバクテリウム、ヘリコバクター・ヘパティカス(Helicobacter hepaticus)、ピロリ菌、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクチス乳酸菌、レプトスピラ・インテロガンス血清型ライ(Leptospira interrogans serovar lai)、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、メソリゾビウム・ロチ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ(Methanocaldocossus jannaschii)、メタノコッコイデス・ブルトニイ(Methanococcoides burtonii)、メタノピュルス・カンドレリ(Methanopyrus kandleri)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・マゼイ・ゴエル(Methanosarcina mazei Goel)、メタノサーモバクター・サーマオートトロフィクス(Methanothermobacter thermautotrophicus)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、ライ菌、結核菌、マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)株R、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasnia genitalium)、マイコプラズマ・ペネトランス、肺炎マイコプラズマ、肺マイコプラズマ、ナノアルカエウム・エクウィタンス(Nanoarchaeum eqziitans)、髄膜炎菌、ニトロソモナス・ユーロピア(Nitrosomonas europaea)、ノストック(Nostoc)、オセアノバチルス・イヘイエンシス、タマネギ萎黄病ファイトプラズマ(Onion yellows phytoplasma)、メダカ、イネ、パスツレラ・マルトシダ、フォトラブズス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、ピレルラ(Pirellula)、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ネズミマラリア原虫、ジンジバリス菌(Porphyromonas gingivalis)、プロクロロコッカス・マリヌス(Prochlorococcus marinus)、プロクロロコッカス・マリヌス、プロクロロコッカス(Prochlorococcus)、緑膿菌、プチダ菌、シリンゲ菌(Pseudomonas syringae)、ピュロバクルム・アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum)、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、パイロコッカス・ホリコシイ、青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、リケッチア・コノリイ、発疹チフスリケッチア、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)、出芽酵母、サルモネラ菌(Salmonella enterica)、サルモネラ・チフィムリウム、クルーズ肉胞子虫、マンソン住血吸虫、分裂酵母、シェワネラ・オネイデンシス、シゲラ・フレックスネリ、アルファルファ根粒菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・アガラクチア、ミュータンス菌、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・セリカラー、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、シネコシスティス属種、トラフグ、マミズフグ、タイレリア・パルバ、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス、サーモプラズマ・アシドフィルム、サーモプラズマ・ボルカニウム、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)、サーモトガ・マリティマ、トキソプラズマ原虫、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)、梅毒トレポネーマ、トロフェリマ・ウィッペリ(Tropheryma whipplei)、ブルーストリパノソーマ(Tryponosoma brucei)、クルーズトリパノソーマ、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、コレラ菌、腸炎ビブリオ(Vibro parahaemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibro vulnificus)、ウィグルスウォルシア・ブレビパルピス(Wigglesworthia brevipalpis)、キイロショウジョウバエのボルバキア・エンドシンビオント(Wolbachia endosymbiont of Drosophilia melanogaster)、ウォリネラ・サクシノゲネス(WOlinella succinogenes)、かいよう病菌病原型シトリ、ザントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス、ピアス病菌、及びペスト菌からなる群より選択される生物が含まれる。
【０１７０】
十分に特徴付けられたゲノムを有する生物のさらなる例には、以下が含まれる:
a)緑膿菌、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、セレウス菌、枯草菌、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ライム病ボレリア、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、カウロバクター・ビブリオイデス(Caulobacter vibrioides)(クレセンタス)、クロロビウム・テピドゥム、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、ディノコッカス・ラディオデュランス、デスルホビブリオ・ブルガリス(Desulfovibrio vulgaris)、ジオバクター・サルフレドゥセンス、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、ピロリ菌、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラ(Legionella pneumophila subsp. Pneumophila)、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクロシス(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)、結核菌、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria menigitidis)、ジンジバリス菌、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナス・パルストリス、ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Thyphimurium)、ストレプトマイセス・アベルミティリス、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌及びサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritime)から選択される細菌種、並びに
b)ハロアーキュラ・マリスモルツイ(Haloarcula marismortui)、ハロフェラックス・ボルカニ(Haloferax volcanii)、スルホロブス・ソルファタリカス、ハロバクテリウム・サリナルム(Halobacterium salinarum)、アルカエグロブス・フルギダス(Archeaoglobus fulgidis)、パイロコッカス・ホリコシイ、メタノコッカス・ヤンナスキイ、アエロパイラム・ペルニクス及びサーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanicum)から選択される古細菌種、並びに
c)ヒトヘルペスウイルス5(CMV)(株AD-169)、ワクシニアウイルス、ヒトヘルペスウイルス1(HSV-1)(株KOS)、ヒトヘルペスウイルス3(水痘帯状疱疹ウイルス)(株エレン(Ellen))、ヒトアデノウイルスCセロタイプ1(HAdV-1)(株アデノイド71)、ヒトアデノウイルスB、亜種B2、セロタイプ14(HAdV-14)、コロナウイルス(株229E)、パラインフルエンザウイルス4b、麻疹ウイルス(イチノセ(Ichinose)-B95a)、パラインフルエンザウイルス2、パラインフルエンザウイルス1株C35)、パラインフルエンザウイルス3、ムンプス(Mumps)(株エンダーズ(Enders))、ヒト呼吸器多核体ウイルスB(株B1)、ライノウイルスB17(感冒)、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、ヒトパピローマウイルス6b型、B型肝炎ウイルス(クローンAM6)、A型インフルエンザウイルス(H1N1)、ヒトアデノウイルスCセロタイプ2(HAdV-2)、デング1型ウイルス、ヒトヘルペスウイルス4(エプスタイン・バーウイルス(Ebstein-Barr virus))、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫ウイルス(Karposis sarcoma virus))、ザイールエボラウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス(Lake Victoria marburgvirus)、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルスB、水疱性口内炎インディアナウイルス、C型インフルエンザウイルス、アデノ随伴ウイルス2、口蹄疫ウイルス(Foot-and-mouth virus)、A型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス1(エコーウイルス22)、サルウイルス40、ロタウイルスA、レオウイルス1型、トリ白血病ウイルスRSA(RSV-SRA)/ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1及びシンドビスウイルスから選択されるウイルス。
【０１７１】
さらなる一例では、本明細書のいずれかの例に従って記載される1つ以上の真核生物ゲノム及び/又は1つ以上の原核生物ゲノム及び/又は1つ以上のウイルス由来の核酸断片の組み合わせが、使用され得る。
【０１７２】
一旦産生されると、これらの核酸断片は、寄与するゲノムのうちのより高度に発現される遺伝子に向かう任意のバイアスを低減させるために、標準化され得る。核酸を標準化する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)又はSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)及びSoaresら、Curr. Opinion Biotechnol. 8, 542-546, (1997)、並びにそれらにおいて引用される参考文献に記載されている。Soaresによって記載される方法の1つは、高度に発現される配列に向かうライブラリーのバイアスを低減させるために、再会合ベースの速度論を使用する。或いは、cDNAは、Kopczynskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9973-9978, (1998)に記載されるように、磁性ビーズに結合したゲノムDNAへのハイブリダイゼーションを介して標準化される。これは、磁性ビーズからの溶出物におけるcDNA配列のおよそ等しい提示を提供する。1種又は2種以上の原核生物又はコンパクトな真核生物由来のcDNAを使用して産生された標準化された発現ライブラリーは、本発明によって明らかに企図される。或いは、各寄与するゲノム由来の断片は、それらの相対的ゲノムサイズ又はC値と比例した重量による量で、プールに合わされる。
【０１７３】
これらの核酸断片は、1つ以上の富化されたサンプルを生じるために、核酸断片のサブセットについて富化され得る。本明細書で使用する場合、用語「富化された」は、一般に、サンプル中の特定の核酸種の相対的濃度を増加させることによって、サンプル中の核酸の複雑度を低減させる任意のプロセスを指すために、その最も広い文脈で使用される。一例では、これらの核酸断片は、反復性の領域及び/又は低メチル化領域を除去することによって、より低いコピー数の領域について富化され得る(Rabinowiczら、Nature Genet. 23, 305-308, 1999、Petersonら、Genome Res. 12, 795-807, 2002、Springerら、Plant Physiol. 136, 3023-3033, 2004、Shaginaら、Biotechniques. 45, 455-459, 2010)。
【０１７４】
これらの核酸断片は、コードされた候補ペプチド部分が、元の核酸断片によってコードされるペプチドと比較して1つ以上のアミノ酸が変わるように、1つ以上のヌクレオチド又はコドンの変異誘発又は置換又は欠失又は挿入を含むプロセスによっても、改変され得る。この元の核酸断片は、天然中、即ち、それが由来した遺伝子中と同じヌクレオチド配列を有し得るか、又は異なる配列を含み得る、即ち、それ自体が中間体バリアントであり得る。好ましい変異は、宿主細胞のコドン選択性を満たすためなどに、コードされたペプチド中に異なるアミノ酸を生じる。変異原性PCR、ランダム変異を誘導する細菌細胞において核酸を発現させること、部位特異的変異誘発、又は変異原性剤、例えば、放射線、ブロモ-デオキシ-ウリジン(BrdU)、エチルニトロソウレア(ethylnitrosurea)(ENU)、エチルメタンスルホン酸(EMS)ヒドロキシルアミン若しくはリン酸トリメチルへの宿主細胞の曝露などの種々の方法が、核酸のオープンリーディングフレーム中に1つ以上の変異を導入するために使用され得る。変異原性PCRでは、これらの核酸断片は、好ましくは、それらの誤取り込みを生じるのに十分なマンガンの存在下及びdNTPの濃度で、増幅される。例えば、それらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる、Dieffenbach(編)及びDveksler(編)(PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995)、Leungら、Technique 1, 11-15 (1989)、Shafkhaniら、BioTechniques 23, 304-306, (1997)を参照のこと。キットの変異原性PCRを実施するための市販の手段は、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech)又はGeneMorph Random Mutagenesis Kit(Stratagene)など、公に入手可能である。
【０１７５】
候補ペプチドを産生する際の使用のための好ましい核酸断片が、約45〜約600連続するヌクレオチドからなる長さ、又は約300連続するヌクレオチドからなる平均長さを有するオープンリーディングフレームを含むことが、上述の説明から明らかである。この範囲からのいくらかのバリエーションが許容され、唯一の要求は、平均して、生成された核酸断片が、約少なくとも約15〜約100アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約20〜約100アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも約30〜約100アミノ酸長を含む候補ペプチド部分をコードすることであることが、理解されるべきである。
【０１７６】
それらのサイズ又は分子量に従って核酸断片を分離する方法は、当該分野で公知であり、例えば、上記断片化方法、並びにアガロースゲル電気泳動、パルスフィールドゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、密度勾配遠心分離及びサイズ排除クロマトグラムを含む群から選択される分離の方法が含まれる。
【０１７７】
ビオチンリガーゼ基質ドメイン
ビオチンは、ATP依存的カルボキシル化、トランスカルボキシル化、及び特定の脱カルボキシル化反応においてタンパク質結合補酵素として機能する、細胞代謝の重要な補因子である。特に、ビオチンのカルボキシル基は、アクセプタータンパク質、即ち、ビオチンリガーゼ基質ドメインの特定のリジン残基のイプシロン-アミノ基に、共有結合される。C末端又はN末端において融合タグとして使用される場合、ビオチンリガーゼ基質ドメインは、融合タンパク質のin vivo又はin vitroの部位特異的ビオチン化を可能にする。
【０１７８】
このビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、大腸菌由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質のビオチン結合ドメイン(Swiss-Prot No. P0ABD8、Chapman-Smith及びCronan, J. Nutr. 129, 477S-484S, 1999)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)由来のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼサブユニットのビオチン結合ドメイン(Swiss-Prot No. P13187、Schwarzら、J. Biol. Chem. 263, 9640-9645, 1988)、プロピオニバクテリウム・シェルマニー(Propionibacterium shermanii)のトランスカルボキシラーゼの1.3 Sサブユニットのビオチン結合ドメイン(Swiss-Prot No. P02904、Samolsら、J. Biol. Chem 263, 6461-6464, 1988)、パイロコッカス・ホリコシイOT3由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼビオチンカルボキシル担体タンパク質サブユニットのビオチン結合ドメイン(Swiss-Prot No. O57883、Bagautdinovら、Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 63, 334-337, 2007)、アクイフェックス・エオリカス由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質のビオチン結合ドメイン(O67375、Clarkeら、Eur J Biochem. 270,1277-87, 2003)、枯草菌由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質のビオチン結合ドメイン(P49786、Bowerら、J Bacteriol.177, 7003-7006, 1995)、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)由来のアセチル-補酵素Aカルボキシラーゼカルボキシルトランスフェラーゼサブユニットアルファのビオチン結合ドメイン(A1B4I6)、ヒトピルビン酸カルボキシラーゼのビオチン結合ドメイン(P11498、Campeau及びGravel, J. Biol. Chem. 276, 12310-12316, 2001)、ヒトプロピオニル-CoAカルボキシラーゼのビオチン結合ドメイン(P05165、Campeau及びGravel, J. Biol. Chem. 276, 12310-12316, 2001)、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)由来のピルビン酸カルボキシラーゼのビオチン結合ドメイン(Q58628)、トマト(Lycopersicon esculentum)由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質のビオチン結合ドメイン(Hoffmanら、Nucleic Acid Res. 15, 3928, 1987)、又は出芽酵母由来のARC1のビオチン結合ドメイン(P46672、Kim J Biol Chem. 279, 42445-42452, 2004)などの、十分に特徴付けられたビオチンリガーゼ基質ドメインを含み得る。
【０１７９】
別の一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、大腸菌由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な13アミノ酸の配列(配列番号3)、大腸菌由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な15アミノ酸の配列(配列番号4)、枯草菌由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な15アミノ酸の配列(配列番号6)、M.ヤンナスキイ(M. jannaschii)由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な15アミノ酸の配列(配列番号8)、出芽酵母由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な15アミノ酸の配列(配列番号10)、又は出芽酵母由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な配列である15アミノ酸(配列番号12)などの、酵素的にビオチン化されることが可能な最小ペプチド認識配列を含み得る。
【０１８０】
最小ペプチド認識配列を同定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Kimら、J. Biol. Chem. 279, 42445-42452 (2004)及びSchwarzら、J. Biol. Chem. 263, 9640-9645, (1988)に記載されている。
【０１８１】
なお別の一例では、大腸菌由来のビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されることが可能な認識可能な市販のビオチン結合ドメイン、例えば、Bioease Tag(Invitrogen)、AviTag(Avidity)又はPinPointベクター(Promega)などが使用され得る。
【０１８２】
ビオチンリガーゼ基質ドメインをコードする核酸は、好ましくは単離又は合成され得る。これに関して、ビオチンリガーゼ基質ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列は、逆翻訳などの、当該分野で公知の及び/又は本明細書に記載される方法を使用して同定され得る。このような核酸は、次いで、合成手段又は組換え手段によって産生される。例えば、この核酸は、例えば、増幅(例えば、PCR又はスプライス重複伸長を使用する)などの公知の方法を使用して単離される。このような単離のための方法は、当業者に明らかであり、及び/又は、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987),Sambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)に記載されている。
【０１８３】
ビオチンリガーゼ基質ドメインをコードする核酸の産生のための他の方法は、当業者に明らかであり、本発明によって包含される。例えば、この核酸は、合成手段によって産生され得る。核酸を合成するための方法は、Gait(編)(Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984)に記載されている。オリゴヌクレオチド合成のための方法には、例えば、ホスホトリエステル及びホスホジエステル法(例えば、Narangら、Meth. Enzymol 68, 90, 1979)並びに支持体上での合成(例えば、Beaucageら、Tetrahedron Letters 22, 1859-1862, 1981)、並びにホスホラミデート(phosphoramidate)技術、Caruthers, M. H.ら、「Methods in Enzymology」, Vol. 154, pp. 287-314 (1988)、並びに「Synthesis and Applications of DNA and RNA」, S. A. Narang,編者, Academic Press, New York, 1987及びそれらの中に含まれる参考文献に記載される他のものが含まれる。
【０１８４】
融合タンパク質
この候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインは、共有結合によって連結され得る。共有結合は、本明細書で定義する場合、例えば、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを融合タンパク質として発現させることによって取得され得る、ペプチド結合であり得る。候補ペプチド及びビオチンリガーゼ基質ドメインの相対的位置は、改変され得る。一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、候補ペプチド部分のN末端の上流に位置付けられる。別の一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、候補ペプチド部分のN末端に隣接している。なお別の一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、候補ペプチド部分のC末端に隣接している。なお別の一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、候補ペプチド部分のC末端の下流に位置付けられる。
【０１８５】
融合タンパク質の構築のための方法は、当業者に公知である。例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)を参照のこと。
【０１８６】
一例では、この候補ペプチド部分及び少なくとも1つのビオチンリガーゼ基質ドメインは、隣接して、即ち、介在するリンカー分子、スペーサー分子、検出可能な標識又は他のアミノ酸なしに、連結される。このような立体配置では、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインは、一般に隣接している。
【０１８７】
別の一例では、この候補ペプチド部分及び少なくとも1つのビオチンリガーゼ基質ドメインは、隣接せずに、即ち、さらなる分子によって分離されて、連結される。このような立体配置では、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメイン(複数可)は、一般に隣接しないが、互いに対して上流又は下流である。
【０１８８】
この候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインは共に、融合タンパク質中に単一コピーで存在し得、候補ペプチド部分は、単一コピーとして存在することが特に好ましい。
【０１８９】
一部の例では、複数のコピーの候補ペプチド部分及び/又はビオチンリガーゼ基質ドメインが、融合タンパク質中に存在し得る。好ましくは、複数コピーのビオチンリガーゼ基質ドメインが、融合タンパク質中に提示され得る。好ましくは、複数コピーのビオチンリガーゼ基質ドメインが存在する場合、これらは、同じビオチンリガーゼ基質ドメインである。好ましくは、2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10個又はそれ以上のコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインが存在し、単一コピーの候補ペプチド部分に融合される。例えば、複数のビオチンリガーゼ基質ドメインは、互いに対して隣接して又は隣接せずに連結され得、これらは、候補ペプチド部分に隣接して又は隣接せずに連結され得る。これら複数のビオチンリガーゼ基質ドメインは、候補ペプチド部分のC末端若しくはその後に、又は候補ペプチド部分のN末端若しくはその前に、位置付けられ得る。或いは、この候補ペプチド部分は、1つ以上のビオチンリガーゼ基質ドメインが、候補ペプチド部分のN末端又はその前に位置付けられ、1つ以上のビオチンリガーゼ基質ドメインが、候補ペプチド部分のC末端又はその後に位置付けられるように、複数のビオチンリガーゼ基質ドメイン間に位置付けられ得る。
【０１９０】
候補ペプチド部分とビオチンリガーゼ基質ドメインとの間の隣接しない連結を達成するため、及びビオチンリガーゼ基質ドメイン間の隣接しない連結を達成するための好ましい分子は、リンカー分子、スペーサー分子及び検出可能な標識、並びに/又は他のアミノ酸から選択される。
【０１９１】
一例では、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン若しくはポリアスパラギン若しくはポリアルギニン若しくはポリリジン若しくはポリグルタミン若しくはポリオルニチン若しくはポリアラニン若しくはポリセリン、又はグリシン及び/若しくはアスパラギン及び/若しくはアルギニン及び/若しくはリジン及び/若しくはグルタミン及び/若しくはオルニチン及び/若しくはアラニン及び/若しくはセリンを含むミックスマー(mixmer)が使用される。好ましいアミノ酸リンカーは、ビオチンリガーゼ基質ドメインから候補ペプチドを分離するため、又は互いから複数のビオチンリガーゼ基質ドメインを分離するための、2又は3又は4又は5又は6個の連続するアミノ酸を含む。好ましいリンカーは、宿主細胞プロテアーゼ酵素の認識部位の配列を形成せず、及び/又はより可撓性の連結を提供する。ポリグリシン及び/又はポリセリン及び/又はポリアラニンリンカー並びにそれらのミックスマーが、特に好ましい。
【０１９２】
別の一例では、2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10個の炭素原子をタンデムで含む脂肪族分子、及び任意選択で、2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10個の炭素原子及び1つ以上のさらなるヘテロ原子、例えば、硫黄、酸素又はNH基を含むヘテロ脂肪族(heteroaliphatic)分子などの、炭素スペーサーが使用される。p-フェニレンジアミン及び/又はm-フェニレンジアミンを含む芳香族ジアミンスペーサーも使用され得る。好ましいスペーサーは、候補ペプチドとビオチンリガーゼ基質ドメインとの間の立体干渉を防止するために、回転自由度を有する結合を含む。
【０１９３】
なお別の一例では、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ若しくはドデカヒスチジンタグ、FLAGタグ、Mycタグ、赤血球凝集素(HA)タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タグ、V5エピトープタグ又は蛍光タンパク質などのペプチドタグを含む検出可能な標識が、使用され得る。蛍光タンパク質は、当該分野で公知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、並びにYFP(黄色蛍光タンパク質)及びDsRedなどのその色彩バリアントが含まれる。
【０１９４】
例えば、1つ以上のリンカー及び/又はスペーサー及び/又は検出可能な標識は、候補ペプチド部分のN末端の上流に、若しくは候補ペプチド部分のN末端に隣接して、若しくは候補ペプチド部分のC末端に隣接して、若しくは候補ペプチド部分のC末端の下流に、又はビオチンリガーゼ基質ドメインのN末端の上流に、若しくはビオチンリガーゼ基質ドメインのN末端に隣接して、若しくはビオチンリガーゼ基質ドメインのC末端に隣接して、若しくはビオチンリガーゼ基質ドメインのC末端の下流に、位置付けられ得る。融合ペプチド中の候補ペプチド及びビオチンリガーゼ基質ドメイン(複数可)の数及び相対的配向に依存して、1つ以上のリンカー及び/又はスペーサー及び/又は検出可能な標識は、候補ペプチド部分のN末端の上流かつビオチンリガーゼ基質ドメインのC末端の下流に、又は候補ペプチド部分のC末端の下流かつビオチンリガーゼ基質ドメインのN末端の上流に、位置付けられ得る。
【０１９５】
なお別の一例では、この融合タンパク質は、宿主細胞の表面上のタンパク質又は多糖と相互作用する1つ以上のさらなる部分を含む。例えば、Zielloら、Mol. Med. 16, 222-229 (2010)、Sahayら、J. Control. Release. 145, 182-195 (2010)を参照のこと。この部分の位置付けは、融合タンパク質のN末端又はC末端に存在し得る。或いは、又はさらに、部分は、本明細書で上記したリンカー又はスペーサー又は検出可能な標識を導入するのに適切な任意の位置において、この融合タンパク質に対して内部に位置付けられ得る。一例では、このような部分と表面結合したタンパク質又は多糖との間の相互作用は、宿主細胞への融合タンパク質の結合を誘導又は促進又は増強する。別の一例では、このような部分と表面結合したタンパク質又は多糖との間の相互作用は、融合タンパク質の細胞取り込みを誘導又は促進又は増強する。なお別の一例では、このような部分と表面結合したタンパク質又は多糖との間の相互作用は、(i)宿主細胞への融合タンパク質の結合及び(ii)融合タンパク質の細胞取り込みを、誘導又は促進又は増強する。
【０１９６】
非ビオチン化メンバーの産生
本明細書に例示するように、非ビオチン化メンバーのプールは、例えば、米国特許第5,821,047号及び米国特許第6,190,908号に記載されるような、融合タンパク質がバクテリオファージの表面上にディスプレイされるファージディスプレイ技術を使用して産生される。記載された根本原理は、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む第1の核酸の、例えばpIIIコートタンパク質、pVIコートタンパク質、pVIIコートタンパク質、pVIIIコートタンパク質、pIXコートタンパク質などのファージコートタンパク質又は10Bカプシドタンパク質をコードする配列を含む第2の核酸への融合に関する。次いで、これらの配列は、適切なベクター、例えば、細菌細胞において複製することが可能なベクター中に挿入される。次いで、例えば大腸菌などの適切な細胞が、この組換えベクターで形質転換される。これらの細胞にはまた、核酸断片が作動可能に連結された未改変形態のコートタンパク質をコードするヘルパーファージ粒子が感染し得る。形質転換された感染宿主細胞は、粒子の表面上に1つよりも多いコピーの融合タンパク質を含む組換えファージミド粒子を形成するのに適切な条件下で培養される。この系は、例えば、λファージ、T4ファージ、M13ファージ、T7ファージ及びバキュロウイルスを含む群から選択されるウイルス粒子などのウイルス粒子の生成において有効であることが示されている。
【０１９７】
非ビオチン化メンバーのプールを産生するための代替的な方法は、mRNAのin vitro翻訳を含む。適切な抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌S30抽出物、SF9又はSF21昆虫細胞溶解物、リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)抽出物、並びにカップリングされた転写/翻訳系などが、無細胞タンパク質発現に使用され得る。対応するアッセイ系は、種々の供給元から市販されている。
【０１９８】
代替的な一例では、非ビオチン化メンバーのプールは、リボソームディスプレイ技術を使用して産生される。このような方法は、融合タンパク質をコードする核酸が、例えば遺伝子構築物由来の、適切なプロモーター配列及びリボソーム結合配列と作動可能に接続されて配置されることを必要とする。好ましいプロモーター配列は、バクテリオファージT3及びT7のプロモーターである。好ましくは、融合タンパク質をコードする核酸は、スペーサー配列、及びターミネーター配列が除去された改変ターミネーター配列と作動可能に接続されて配置される。本明細書で使用する場合、用語「スペーサー配列」は、ペプチドに融合されるペプチドをコードする一連の核酸を意味すると理解すべきである。スペーサー配列によってコードされるペプチドは、翻訳後にリボソームトンネル内に保持されたままで、ペプチドが自由に折り畳まれ、別のタンパク質又は核酸と相互作用するのを可能にするので、このスペーサー配列は、遺伝子構築物中に組み込まれる。好ましいスペーサー配列は、例えば、糸状ファージM13の遺伝子IIIのアミノ酸211〜299をコードする核酸である。ディスプレイライブラリーは、当該分野で周知の方法を使用してin vitroで転写及び翻訳され、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)及びSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)に記載されている。
【０１９９】
in vitroでの転写及び翻訳のための系の例には、例えば、PromegaのTNT in vitro転写及び翻訳系が含まれる。発現反応を氷上で冷却することで、一般に、翻訳を終結させる。リボソーム複合体は、ペプチド及び/又はそのコードするmRNAからの解離に対して、例えば、酢酸マグネシウム又はクロラムフェニコールなどの試薬の添加によって、安定化される。
【０２００】
或いは、非ビオチン化メンバーのプールは、例えば、Tabuchi, Biochem Biophys Res Commun. 305, 1-5, 2003に記載されるようなリボソーム不活性化ディスプレイ技術、又は共有結合ディスプレイ技術を使用して産生される。
【０２０１】
なお別の一例では、非ビオチン化メンバーのプールの産生は、融合タンパク質が細菌細胞の表面上にディスプレイされる細菌ディスプレイを含むプロセスを含む。次いで、発現された融合タンパク質をディスプレイする細胞が、例えば、米国特許第5,516,637号に記載されるように、バイオパニングに使用される。或いは、非ビオチン化メンバーのプールは、例えば、米国特許第6,423,538号に記載されるような酵母ディスプレイ技術、又は例えば、Strenglinら、EMBO J. 7, 1053-1059, 1988に記載されるような哺乳動物ディスプレイ技術を使用して、産生され得る。
【０２０２】
非ビオチン化メンバーのプールの産生に使用される細胞は、例えば、融合タンパク質中で発現されるビオチンリガーゼ基質ドメインに依存して変動し得る。一例では、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、非ビオチン化メンバーを産生するために使用される細胞とは異なる生物に由来する。例えば、非ビオチン化メンバーが哺乳動物細胞において産生されなければならない場合、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、好ましくは、例えば、原核生物上界(Prokaryotae)モネラ界(例えば、細菌)、原生生物界(例えば、原生動物)、菌界又は植物界などの異なる界由来の生物由来である。別の一例では、非ビオチン化メンバーが細菌細胞において産生されなければならない場合、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、好ましくは、例えば、菌界、植物界又は動物界などの界由来の生物由来である。例えば、Cronanら、FEMS Microbio. Lett. 130, 221-229, 1995は、組換えビオチンリガーゼを発現する大腸菌CY918細胞の産生を記載している。
【０２０３】
別の一例では、非ビオチン化メンバーは、例えば、野生型ビオチンリガーゼの発現レベルの50％未満又は60％未満又は70％未満又は80％未満又は90％未満又は95％未満の、野生型ビオチンリガーゼと比較して低減されたレベルの発現を有するビオチンリガーゼを発現する細胞において産生される。なお別の一例では、非ビオチン化メンバーは、野生型ビオチンリガーゼと比較して低減された活性、例えば、野生型ビオチンリガーゼと比較して50％未満又は60％未満又は70％未満又は80％未満又は90％未満又は95％未満の活性を有するビオチンリガーゼを発現する細胞において産生される。なお別の一例では、非ビオチン化メンバーは、内因性ビオチンリガーゼ活性を欠く細胞、例えば、非機能的内因性ビオチンリガーゼを発現する細胞、又は融合ペプチドのビオチンリガーゼ基質ドメイン(複数可)をビオチン化するのに十分なレベルのビオチンリガーゼ活性を発現しない細胞において、産生される。内因性ビオチンリガーゼ活性を欠く細胞は、組換えビオチンリガーゼを発現し得る。ビオチンリガーゼ活性は、一般に、例えば、Purushothamanら、PLoS ONE 3, e2320 (2008)によって記載されるように、ビオチンリガーゼ基質ドメイン中への放射能標識されたビオチンの時間依存的取り込みをモニタリングすることによって、決定される。
【０２０４】
遺伝子発現及び/又は活性を変更するための方法は、当業者に明らかであり、例えば、ビオチンリガーゼをコードするゲノム配列の欠失若しくは破壊、変異誘発、例えば、トランスポゾン変異誘発若しくは放射線変異誘発若しくは化学物質変異誘発、遺伝子不活性化又は遺伝子サイレンシングが含まれる。
【０２０５】
好ましい一例では、遺伝子サイレンシングが、細胞においてビオチンリガーゼ発現を低減させるために使用される。遺伝子サイレンシングは、例えば、Hoganら(Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, 第2版又はPorteusら, Mol. Cell. Biol, 23: 3558-3565, 2003に記載されるような「ノックアウト」技術を使用して誘導される。この例では、ビオチンリガーゼ遺伝子がノックアウトされた細胞又は動物は、例えば、とりわけ、蛍光タンパク質、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質、又はβ-ガラクトシダーゼ、又は例えば、ネオマイシン若しくはゼオシン抵抗性についての抗生物質抵抗性タンパク質、又は融合タンパク質、例えば、β-ガラクトシダーゼ-ネオマイシン抵抗性タンパク質、β-geoなどの1つ以上の陽性選択可能なマーカーをコードする異種核酸のいずれかの側に位置するビオチンリガーゼ標的遺伝子に対して相同性の2つの領域を含む置換ベクターを使用して産生される。このベクターは、ベクター中の相同性の領域と標的ビオチンリガーゼ遺伝子との間の相同組換えに十分な条件下で、ビオチンリガーゼを発現する細胞中に導入される。相同組換えは、機能的酵素をコードするビオチンリガーゼ遺伝子配列の、ビオチンリガーゼ活性について非機能的な又はあまり機能的でない配列をコードする置換ベクター配列による置き換えをもたらす、少なくとも2回の組換え事象又は二重交差事象によって、一般に進行する。より具体的には、ベクター中の相同性の各領域は、標的遺伝子中の相同性の領域間に位置する核酸を置き換えるベクター中の異種核酸をもたらす少なくとも1回の組換え事象を誘導する。
【０２０６】
例えば、組換え、例えば、酵素Creを使用する2つのLoxP部位間に位置する核酸の組換えを使用する、目的の遺伝子をノックアウトするための代替的方法が、当業者に明らかである。
【０２０７】
或いは、遺伝子サイレンシングは、例えば、RNA干渉を使用して、例えば、Hannon及びConklin, Methods Mol Biol. 257, 255-266 (2004)、又はアンチセンス技術、例えば、Sahuら、Curr. Pharm. Biotechnol. 8, 291-304 (2007)、又はリボザイム、例えば、Barrel及びSzostak, Science 261, 1411-1418 (1993)、又は三重らせんを形成することが可能な核酸、例えば、Helene, Anticancer Drug Res. 6, 569-584 (1991)、又はPNAオリゴヌクレオチド、例えば、Hyrupら、Bioorganic & Med. Chem. 4, 5-23 (1996)若しくはO'Keefeら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 14670-14675 (1996)、又は部位特異的変異誘発、例えば、Yanら、Gene Therapy 16, 581-588 (2009)、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えば、Duraiら、Nucleic Acids Res. 33, 5978-5990 (2005)を使用して、誘導される。
【０２０８】
なお別の一例では、非ビオチン化メンバーは、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して低い親和性、例えば、酵素がその標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して有する親和性の25％未満の親和性を有するビオチンリガーゼを発現する細胞において産生される。この例での使用に好ましいビオチンリガーゼは、酵素がその標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して有する親和性の20％未満又は15％未満又は10％未満又は5％未満又は4％未満又は3％未満又は2％未満又は1％未満の親和性を有する。「標準的ビオチンリガーゼ基質ドメイン」は、例えば同じ生物由来であることによって、ビオチンリガーゼが天然に作用することが公知のアミノ酸配列を含むビオチンリガーゼ基質ドメインを意味する。大腸菌由来のビオチンリガーゼ基質ドメインに対して低い親和性を有する例示的なビオチンリガーゼには、出芽酵母ビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P48445)、枯草菌ビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P0C175)、又はメタノコッカス・ヤンナスキイビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. Q59014)が含まれる。別の一例では、大腸菌ビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P06709)は、酵母由来のビオチンリガーゼ基質ドメインに対して低い親和性を有する。
【０２０９】
なお別の一例では、非ビオチン化メンバーは、複数のビオチンリガーゼ基質ドメインを含む第2の融合ポリペプチドを発現する細胞において産生され、それによって、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインと比較して、ポリペプチドの優先的なビオチン化を提供する。例えば、このポリペプチドは、2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10個のビオチンリガーゼ基質ドメインを含み得る。この例によれば、第2の融合ポリペプチドは、細胞ビオチンリガーゼについて非ビオチン化メンバーと競合するのに十分な数のビオチンリガーゼ基質ドメインを含むことが好ましい。或いは、又はさらに、この第2の融合ポリペプチドは、一般に、非標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインと比較して、標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインに対してより高い親和性を有する細胞ビオチンリガーゼについて、非ビオチン化メンバーの非標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインと競合するための、1つ以上の標準的ビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。例えば、この非ビオチン化メンバーは、大腸菌由来の1つ以上のビオチンリガーゼ基質ドメインを含む第2の融合ポリペプチドを発現する大腸菌細胞において産生され得、この非ビオチン化メンバーは、酵母由来の1つ以上のビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。
【０２１０】
非ビオチン化メンバーのビオチン化
宿主細胞
非ビオチン化メンバーをビオチン化するために好ましい宿主細胞は、原核生物細胞である。適切な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌(例えば、BL21、DH5α、XL-1-Blue、JM105、JM110及びRosetta)、枯草菌、サルモネラ属(Salmonella)種及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の株が含まれる。より好ましくは、宿主細胞は、真核生物細胞である。適切な哺乳動物細胞には、例えば、ヒトGM12878、K562、H1ヒト胚性、Hela、HUVEC、HEPG2、HEK-293、H9、MCF7、及びJurkat細胞、マウスNIH-3T3、C127、及びL細胞、サルCOS1及びCOS7細胞、ウズラ(quail)QC1-3細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの細胞株が含まれる。一例では、これらの宿主細胞は、初代哺乳動物細胞、即ち、(とりわけ、胚盤胞、胚、幼生段階及び成体を含む任意の発生段階における)生物から直接取得された細胞である。一部の例では、本発明の宿主細胞は、多細胞生物の一部を構成する。言い換えると、本発明は、本明細書に定義されるような少なくとも1つの宿主細胞を含むトランスジェニック生物の使用を包含する。この目的のために好ましい多細胞生物には、例えば、植物(例えば、シロイヌナズナ又はタバコ(Nicotinia tabacum))、又は線虫、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、トラフグ、ムス属(Mus)種及びラッタス属(Rattus)種からなる群より選択される動物などの、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために短い生活環を有する生物が含まれる。
【０２１１】
細胞集団及び細胞株を培養するための適切な培養培地及び培養条件は、当該分野で公知である。宿主細胞によって発現されたビオチンリガーゼによるビオチンリガーゼ基質ドメインの酵素的ビオチン化に必要かつ十分な条件に関して、実験的に決定され得る。一部の例では、培養培地には、ビオチンが補充され得る。例えば、培養培地には、培養培地中に、1μM又は2μM又は3μM又は4μM又は5μM又は6μM又は7μM又は8μM又は9μM又は10μM又は20μM又は30μM又は40μM又は50μM又は60μM又は70μM又は80μM又は90μM又は100μM又は200μMの最終濃度になるように、ビオチンが補充され得る。当業者は、例えば、100mM NaCl又は5％グリセロール又は50mM硫酸アンモニウムなどの、生物学的緩衝液中に一般に存在する一部の試薬が、ビオチンリガーゼ活性を低減させることも、承知している。
【０２１２】
ビオチンリガーゼ
当該分野で公知の任意のビオチンリガーゼは、そのビオチンリガーゼが、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインを酵素的にビオチン化することが可能であることを条件として、本発明の方法に使用され得る。このビオチンリガーゼは、ビオチンカルボキシル基と融合タンパク質のリジンのアミノ基との間のアミド連結を介した、ビオチンリガーゼ基質ドメインを含む融合タンパク質へのビオチンの共有結合を触媒する酵素であることが、当業者に理解される。
【０２１３】
一例では、このビオチンリガーゼは、宿主細胞によって内因的に発現される。
【０２１４】
或いは、宿主細胞によって発現されるビオチンリガーゼは、組換えビオチンリガーゼである。一部の例では、この組換えビオチンリガーゼは、原核生物ビオチンリガーゼである。或いは、このビオチンリガーゼは、真核生物ビオチンリガーゼである。適切なビオチンリガーゼには、例えば、枯草菌由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P0C175)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. Q5ACJ7)、大腸菌由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P06709)、インフルエンザ菌由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P46363)、ヒト(Homo sapiens)由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P50747)、メタノコッカス・ヤンナスキイ由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. Q59014)、マウス(Mus musculus)由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. Q920N2)、髄膜炎菌セログループA由来のビオチンリガーゼ(Swiss Prot Q9JWI7)、髄膜炎菌セログループB由来のビオチンリガーゼ(Swiss-ProtQ9JXF1)、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P29906)、出芽酵母由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P48445)、サルモネラ・チフィリウム由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. P37416)又は分裂酵母由来のビオチンリガーゼ(Swiss-Prot No. O14353)が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「Swiss-Prot」は、Basel University 4056. Basel、SwitzerlandのSwiss Institute of Bioinformaticsのタンパク質配列データベースを意味すると解釈すべきである。
【０２１５】
宿主細胞によって発現されるビオチンリガーゼは、例えば、融合タンパク質中で発現されるビオチンリガーゼ基質ドメインに依存して、変動し得る。一例では、宿主細胞によって発現されるビオチンリガーゼは、宿主細胞とは異なる生物由来である。例えば、宿主細胞が哺乳動物細胞でなければならない場合、このビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、原核生物上界モネラ界(例えば、細菌)、原生生物界(例えば、原生動物)、菌界又は植物界などの異なる界由来の生物由来であり得る。
【０２１６】
ビオチンリガーゼの同定のための方法は、当該分野で公知である。例えば、ビオチンリガーゼは、NCBI, Bethesda, Md.を含むいくつかの供給源から入手可能な、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)によって提供される配列比較アルゴリズムを使用して同定され得る。BLASTソフトウェアスイートは、既知のヌクレオチド配列を、種々のデータベース由来の他のポリヌクレオチド配列とアラインするために使用される「blastn」、及び既知のアミノ酸配列を、1つ以上のデータベース由来の1つ以上の配列とアラインするために使用される「blastp」を含む、種々の配列分析プログラムを含む。2つのヌクレオチド配列の直接的なペアワイズ比較に使用される、「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも利用可能である。
【０２１７】
ビオチンリガーゼをコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して単離され得る。PCRの方法は、当該分野で公知であり、例えば、Dieffenbach(編)及びDveksler(編)(PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995)に記載されている。一般に、PCRのために、少なくとも約20ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも25ヌクレオチド長を含む2つの非相補的核酸プライマー分子が、核酸鋳型分子の異なる鎖にハイブリダイズされ、この鋳型の特異的核酸分子コピーが、酵素的に増幅される。増幅後、増幅された核酸は、当該分野で公知の、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)又はSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)に記載される方法を使用して単離される。
【０２１８】
或いは、ビオチンリガーゼをコードする核酸は、当業者に公知の化学的方法を使用して合成され得る。例えば、合成ペプチドは、固相、液相若しくはペプチド縮合の公知の技術、又はそれらの任意の組み合わせを使用して調製され、天然の及び/又は非天然のアミノ酸を含み得る。
【０２１９】
ビオチンリガーゼのコード配列は、既知のコドン使用頻度選択性に従って、宿主細胞(例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞)における使用のために改変され得ることも当業者に理解される。コドン使用頻度選択性は、1つの種のヌクレオチドのDNA配列を、別の種のヌクレオチドのDNA配列に変形させることによって、目的の遺伝子の翻訳効率を増加させることによって、生きた生物におけるタンパク質発現を最大化する技術である(Puigboら、Nucleic Acids Res. 35, W126-W131, 2007)。
【０２２０】
一例では、このビオチンリガーゼは、このビオチンリガーゼを宿主細胞の特定の細胞内位置に指向させることが可能なポリペプチド局在化シグナルに融合される。細胞内ポリペプチド局在化配列は、当該分野で公知であり、例えば、哺乳動物、ショウジョウバエ(Drosophila)、細菌及びウイルスのシグナル配列ドメインへの直接的なアクセスを提供するSignal Sequence Databaseウェブサイト上に記載されている。コンピュータープログラム又はアルゴリズムを使用して細胞内ポリペプチド局在化配列を予測するための方法も当該分野で公知であり、例えば、SIGNAL-BLASTなどのオンラインソフトウェアパッケージを介してアクセスされる(Frank及びSippl, Bioinformatics 24, 2171-2176, 2008)。
【０２２１】
増幅/合成の後、このビオチンリガーゼは、組換え手段によって発現され得る。例えば、このビオチンリガーゼをコードする核酸は、プロモーター、又は細胞系若しくは生物において発現を調節することが可能な他の調節配列と、作動可能に接続されて配置され得る。
【０２２２】
細菌細胞中での発現に適切な典型的なプロモーターには、例えば、laczプロモーター、Ippプロモーター、温度感受性λL若しくはλRプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター又は半人工プロモーター、例えば、IPTG誘導性tacプロモーター若しくはlacUV5プロモーターが含まれる。細菌細胞において本発明の核酸断片を発現させるためのいくつかの他の遺伝子構築物系が、当該分野で周知であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)、米国特許第5,763,239号(Diversa Corporation)及びSambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 第3版  2001)に記載されている。
【０２２３】
細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のための多数の発現ベクターが記載されており、例えば、とりわけ、PKC30(Shimatake及びRosenberg, Nature 292, 128, 1981)、pKK173-3(Amann及びBrosius, Gene 40, 183, 1985)、pET-3(Studier及びMoffat, J. Mol. Biol. 189, 113, 1986)、pCRベクタースイート(Invitrogen)、pGEM-T Easyベクター(Promega)、pL発現ベクタースイート(Invitrogen)、アラビノース誘導性プロモーターを含むpBAD/TOPO又はpBAD/thio-TOPOシリーズのベクター(Invitrogen)であって、そのうちの後者は、発現されたタンパク質のコンフォメーション制約のためのTrxループを有する融合タンパク質を産生するためにも設計される、ベクター、pFLEXシリーズの発現ベクター(Pfizer)、pQEシリーズの発現ベクター(QIAGEN)、又はpLシリーズの発現ベクター(Invitrogen)が含まれる。
【０２２４】
例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、出芽酵母及び分裂酵母を含む群から選択される酵母細胞などの酵母細胞における発現のために適切な典型的なプロモーターには、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PH05プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター又はTEF1プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０２２５】
酵母細胞における発現のための発現ベクターが好ましく、これには、例えば、pACTベクター(Clontech)、pDBleu-Xベクター、pPICベクタースイート(Invitrogen)、pGAPZベクタースイート(Invitrogen)、pHYBベクター(Invitrogen)、pYD 1ベクター(Invitrogen)、及びpNMT 1、pNMT41、pNMT81 TOPOベクター(Invitrogen)、pPC86-Yベクター(Invitrogen)、pRHシリーズのベクター(Invitrogen)、pYESTrpシリーズのベクター(Invitrogen)が含まれる。
【０２２６】
哺乳動物細胞における発現のための好ましいベクターには、例えば、pcDNAベクタースイート(Invitrogen)、pTARGETシリーズのベクター(Promega)及びpSVベクタースイート(Promega)が含まれる。
【０２２７】
細菌細胞におけるビオチンリガーゼの発現のための市販のベクターも利用可能であり、これには、例えば、大腸菌株AVB 99及びAVB 101(Avidity)が含まれる。
【０２２８】
宿主細胞を形質転換及びトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)及び他の実験教科書中に見出され得る。
【０２２９】
一例では、核酸は、例えば、エレクトロポレーション又は塩化カルシウム媒介性形質転換を使用して、原核生物細胞中に導入される。別の一例では、核酸は、例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈降、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、Lipofectamine(Invitrogen)及び/又はcellfectin(Invitrogen)を使用することなどによる、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、PEG媒介性DNA取り込み、エレクトロポレーション、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス又はレトロウイルスによる形質導入、及びDNAコートされたタングステン又は金粒子を使用することなどによる微粒子銃を使用して、哺乳動物細胞中に導入される。なお別の一例では、核酸は、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、プロトプラストのPEG媒介性形質転換、植物組織の粒子媒介性銃、及び植物細胞又はプロトプラストのマイクロインジェクションなどの従来の技術を使用して、植物細胞中に導入される。或いは、核酸は、例えば、エレクトロポレーション及びPEG媒介性形質転換などの従来の技術を使用して、酵母細胞中に導入される。
【０２３０】
ビオチン化メンバーを決定又は同定する
ビオチン化融合タンパク質の存在は、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに共有結合したビオチンの存在を検出することによって、決定され得る。ビオチン結合性分子、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン又はカプトアビジン(captavidin)などは、検出されるビオチン化タンパク質の存在を検出するために使用され得る。例えば、Laitinenら、Trends Biotechnol. 25, 269-277 (2007)、Moragら、Anal. Biochem. 243, 257-263 (1996)、Moragら、Biochem. J. 316, 193-199 (1996)、Vermetteら、J. Colloid Interface Sci. 259, 13-26 (2003)を参照のこと。他の例では、ビオチン結合性分子、例えば、抗ビオチン抗体などは、ビオチン化タンパク質を検出するために使用され得る。
【０２３１】
ビオチン化融合タンパク質は、蛍光色素標識されたビオチン結合性分子を使用して、可視化され得る。適切な蛍光色素には、例えば、TAMRA色素(例えば、Hsuら、Clin. Chem. 47, 1373-1377, 2001)、BODIPY色素(例えば、Hechtら、ChemistryOpen 2, 25-38, 2013)、CHROMEO色素(例えば、Active Motif)、DyLight Fluor色素(例えば、Sarkarら、J. Photochem. Photobiol. B. 98, 35-39, 2010)、スルホローダミン色素、例えば、Texas Red、リサミンローダミンBスルホニルクロリドなど、フルオレセイン及び例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル(CFSE)を含むその誘導体(例えば、Liu J. Fluoresc. 19, 915-920, 2009)、シアニン色素、例えば、Cy2、Cy3、Cy3.5 Cy5、Cy5.5など(例えば、Kricka Ann. Clin Biochem. 39 114-129, 2002)又はAlexa Fluor Dyes(例えば、Panchuck-Voloshinaら、J. Histochem. Cytochem. 47, 1179-1188, 1999)が含まれ得る。
【０２３２】
或いは、ビオチン化融合タンパク質は、酵素で標識されたビオチン結合性分子を使用して可視化され得る。一部の例では、この酵素は、ペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)又はβ-グルクロニダーゼ(GUS)又はベータ-ガラクトシダーゼ又はキサンチウム(xanthium)オキシダーゼ又はホスファターゼ、例えば、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼ、例えば、ホタル(Photinus pyralis)のホタルルシフェラーゼ又はウミシイタケ(Renilla reniformis)のレニラ(Renilla)ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、オプロフォラス(Oplophorus)ルシフェラーゼ、ルシフェリン利用性ルシフェラーゼ、セレンテラジン利用性ルシフェラーゼなど、及びそれらの任意の適切なバリアント又は変異体であり得る。
【０２３３】
ビオチンの存在を検出するための他の方法は、当該分野で公知であり、例えば、Haugland及びBhalgat, Methods Mol. Biol. 4, 1-12 (2008)、Masonら、Methods Mol. Biol. 303, 35-50 (2005)、Hofstetter Anal. Biochem. 284, 354-366 (2000)、Praulら、Biochem Biophys Res Commun 247, 312-314 (1988)、Santos及びChaves, Braz. J. Med. Biol. Res. 30, 837-842 (1997)、Kin及びSuh, Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 115, 57-61 (1996)、Hoeltke Biotechniques 18, 900-907 (1994)並びにDunn Methods Mol. Biol. 32, 227-232(1994)によって記載されている。
【０２３４】
一部の例では、融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに共有結合したビオチンの存在を検出する前に、これらの宿主細胞は、ビオチンリガーゼの活性を阻害する薬剤と共にインキュベートされ得る。ビオチンリガーゼの活性を阻害することは、宿主細胞溶解物においてでたらめなビオチン化が生じるのを防止し得る。ビオチンリガーゼの活性を阻害する薬剤は、例えば、ピロホスフェート、ビオチニル-5'AMP、ビオチノール(biotinol)-アデニレート及びビオチンアナログなどが、当業者に明らかである。
【０２３５】
融合タンパク質を単離するための方法は、当該分野で周知であり、これには、とりわけ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー)、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、ディスクゲル電気泳動及び免疫沈降が含まれる。例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,  第3版  2001)及び他の実験教科書を参照のこと。これらの方法は、本発明のビオチン化融合タンパク質を単離するために適用され得る。
【０２３６】
機能的アッセイ
好ましい一例では、細胞透過性ペプチドを同定するための方法は、宿主細胞においてビオチン化されることによって同定される候補ペプチド部分の機能性を確認するために、1つ以上のさらなる機能的アッセイを実施するステップを含み得る。例示的な機能的アッセイは、カーゴ分子に細胞透過性ペプチドを連結させるステップ、及び試験細胞又は試験細胞内の細胞内位置へのカーゴの送達についてアッセイするステップを含む。
【０２３７】
一例では、カーゴは、候補ペプチド部分に共有結合的に連結される。カーゴと候補ペプチド部分とを共有結合的に連結するための方法は、ネイティブケミカルライゲーション、クリックケミストリー、チオ-アミンカップリング、カルボジイミドコンジュゲート化、酵素的コンジュゲート化、スルホサクシニミジルスベロイル(sulfosuccinimidylsuberyl)連結、生化学的タンパク質ライゲーション又はソリュブルハンドリング(soluble handling)コンジュゲート化を実施することを含む。カーゴを候補ペプチド部分にコンジュゲート化するための他の手段には、Nagaharaら、Nat Med. 4, 1449-1453 (1998)、Gait, Cell Mol Life Sci. 60, 844-853 (2003)、Moulton及びMoulton, Drug Discovery Today. 9, 870-875 (2004)、Zatsepinら、Curr Pharmaceutical Design. 11, 3639-3654 (2005)によって一般に記載される方法が含まれる。
【０２３８】
或いは、カーゴは、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用又は静電相互作用又は金属親和性相互作用によって、候補ペプチド部分に非共有結合的に連結され得る。例えば、Morrisら、Nucleic Acids Res. 35, e49-e59 (2007)。
【０２３９】
一例では、このカーゴは、蛍光色素を含む。適切な蛍光色素には、例えば、TAMRA色素(例えば、Hsuら、Clin. Chem. 47, 1373-1377, 2001)、BODIPY色素(例えば、Hechtら、ChemistryOpen 2, 25-38, 2013)、CHROMEO色素(例えば、Active Motif)、DyLight Fluor色素(例えば、Sarkarら、J. Photochem. Photobiol. B. 98, 35-39, 2010)、スルホローダミン色素、例えば、Texas Red、リサミンローダミンBスルホニルクロリドなど、フルオレセイン及び例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル(CFSE)を含むその誘導体(例えば、Liu J. Fluoresc. 19, 915-920, 2009)、シアニン色素、例えば、Cy2、Cy3、Cy3.5 Cy5、Cy5.5など(例えば、Kricka Ann. Clin Biochem. 39 114-129, 2002)又はAlexa Fluor Dyes(例えば、Panchuck-Voloshinaら、J. Histochem. Cytochem. 47, 1179-1188, 1999)が含まれる。
【０２４０】
別の一例では、このカーゴは、毒素を含む。適切な毒素には、例えば、植物、細菌又は真菌のタンパク質毒素由来のドメインが含まれ得る。本明細書で使用する場合、「植物毒素」、「細菌毒素」及び「真菌毒素」は、それぞれ、植物、細菌又は真菌によって産生される任意の毒素を指す。このような毒素には、例えば、それらの作用機構及び/又は構造的構成に従って分類される毒素、例えば、ADPリボシル化毒素、N-グリコシダーゼ含有リボソーム不活性化毒素など、並びに、例えば、炭疽毒素、百日咳毒素、コレラ毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀毒素、百日咳毒素、ウェルシュ菌イオタ毒素、クロストリジウム・スピロフォルム(Clostridium spiroforme)毒素、クロストリジウム・ディフィシル毒素、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)C2毒素及びセレウス菌栄養殺虫性(vegetative insecticidal)タンパク質を含む、別々の細胞結合ドメイン及び触媒性ドメインを含むバイナリー細菌毒素が含まれる。好ましくは、この毒素は、試験細胞において内在化された場合に、細胞死又は障害された細胞生存を引き起こし得る。一部の例では、この毒素コンジュゲートは、それが内在化される細胞の50％超又は60％超又は70％超又は80％超又は90％超又は95％超又は97％超又は98％超又は99％超において、細胞死を誘導し得る。
【０２４１】
細胞生存度又は細胞毒性を決定する方法は、例えば、プレート生存度アッセイ、コロニー退縮アッセイ、プレーティングアッセイ、及び代謝活性の検出に基づく蛍光定量的/比色増殖指標アッセイなど、当該分野で公知である。一例では、細胞生存度は、例えば、トリパンブルー又はヨウ化プロピジウムなどの色素を排除する生存試験細胞の膜の能力に基づいて決定される。生きた試験細胞は、このような色素を排除し、染色されなくなる。対照的に、膜の完全性を喪失した死んだ又は瀕死の試験細胞は、これらの色素を細胞質に侵入させ、試験細胞内の種々の化合物又はオルガネラの染色を可能にする。当業者に明らかなように、いくつかの細胞生存度アッセイ及び細胞毒性アッセイも市販されている。
【０２４２】
別の一例では、このカーゴは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(Kretschmer-Kazemi及びSczakiel Nucleic Acids Res. 31, 4417-4424, 2003)又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド、例えば、Popplewellら、Methods Mol. Bio. 867, 143-167 (2012)、又は低分子干渉RNA、例えば、Julianoら、J. Drug. Target. 21, 27-43 (2013)又はmicroRNA、例えば、Deleavey及びDamha, Chem. Bio 19, 937-954 (2012)又はペプチド-核酸(PNA)、例えば、Nielsen Curr. Opin. Biotechnol. 10, 71-75 (1999)又はホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、Koleら、Nat. Rev. Drug Discov. 11, 125-140又はロックド核酸、例えば、Koshkinら、Tetrahedron 54, 3607-3630 (1998)などのオリゴヌクレオチドを含む。
【０２４３】
なお別の一例では、このカーゴは、磁性ナノ粒子を含む。候補ペプチド部分を磁性ナノ粒子にコンジュゲート化するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Lewinら、Nat Biotechnol. 18, 410-414 (2000)によって記載されている。
【０２４４】
さらなる一例では、このカーゴは、量子ドットを含む。量子ドットと候補ペプチド部分とをカップリングするための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Liuら、J. Nanosci. Nanotechnol. 10, 7897-7905 (2010)によって記載されている。
【０２４５】
別の一例では、このカーゴは、例えば、架橋ポリスチレン、架橋N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、架橋デキストラン、リポソーム又はミセルを含む粒子を含む。一部の例では、この粒子は、機能的分子のための担体又はコンテナとして機能し得る。この機能的分子は、細胞の内側で機能を発揮することが可能な任意の分子、例えば、化学療法分子、例えば、ドキソルビシンであり得る(例えば、Rousselleら、J Pharmacol Exp Ther. 296, 124-131 (2001)。
【０２４６】
他の例では、このカーゴは、ウイルス粒子、例えば、Nigatuら、J Pharm Sci. 102, 1981-1993 (2013)又はタンパク質、例えば、Snyder及びDowdy, Expert Opin. Drug Deliv. 2, 43-51 (2005)若しくはElliott及びO'Hare, Cell 88, 223-233 (1997)又はプラスミド、例えば、Rittnerら、Mol Ther. 5, 104-114 (2002)又はリポソーム、例えば、Joliot及びProchiantz Nat. Cell Biol. 6, 189-196 (2004)を含む。
【０２４７】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、さらに記載される。
【実施例】
【０２４８】
[実施例1]
候補ペプチド部分の産生
この実施例は、候補ペプチドをコードする核酸を使用した、候補ペプチド部分、例えば、ペプチドライブラリー、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリー又は他のペプチドディスプレイ足場の産生を実証する。
【０２４９】
候補ペプチドをコードする核酸の高度に多様な混合物を、基本的に米国特許第7,270,969号に記載されるように、細菌ゲノム及びコンパクトなゲノムを有する真核生物のコード領域及び非コード領域から産生し、本明細書の以下に記載するように、供給源ゲノムの選択における、及び以下の実施例に記載されるような核酸によってコードされるペプチドの発現のために使用されるベクターにおけるバリエーションに供した。米国特許第7,270,969号の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５０】
簡潔に述べると、核酸を、以下の細菌種及び古細菌種から単離した:
【０２５１】
2016523088.tif 000005
【０２５２】
核酸断片を、タグ化ランダムオリゴヌクレオチドを使用するPCRの複数の連続的ラウンドを使用してこれらのゲノムの各々から生成し、多様なゲノム供給源から産生した核酸断片の混合物を、制限エンドヌクレアーゼMfeIで消化し、例えば、製造業者の指示に従ってQIAquick PCR精製カラム(QIAGEN)を使用して精製し、足場上での引き続くディスプレイのために、遺伝子構築物の適合性のEcoRI部位中へのライゲーションのために保持した。
【０２５３】
或いは、又はさらに、同じ手順を使用して、以下の細菌及び古細菌を使用して、バクテリオファージライブラリーなどの足場を産生する:
【０２５４】
2016523088.tif 000006
2016523088.tif 000007
【０２５５】
或いは、又は上記ゲノム供給源に加えて、候補ペプチドのライブラリーを、米国特許第7,270,969号に提供される教示に従って、バクテリオファージ足場上に以下のゲノムのうち少なくとも約20種由来の増幅された核酸断片を発現させることによって産生する:
a)緑膿菌、クロストリジウム・ディフィシル、アシネトバクター・バウマンニ、エロモナス・ハイドロフィラ、セレウス菌、枯草菌、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、百日咳菌、ライム病ボレリア、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ、カウロバクター・ビブリオイデス(クレセンタス)、クロロビウム・テピドゥム、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、ジフテリア菌、ディノコッカス・ラディオデュランス、デスルホビブリオ・ブルガリス、ジオバクター・サルフレドゥセンス、インフルエンザ菌、ピロリ菌、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラ、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクロシス、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、ジンジバリス菌、ロドバクター・スフェロイデス、ロドシュードモナス・パルストリス、ネズミチフス菌、ストレプトマイセス・アベルミティリス、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌及びサーモトガ・マリティマから選択される細菌種由来の断片、並びに
b)ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロフェラックス・ボルカニ、スルホロブス・ソルファタリカス、ハロバクテリウム・サリナルム、アルカエグロブス・フルギダス、パイロコッカス・ホリコシイ、メタノコッカス・ヤンナスキイ、アエロピュルム・ペルニクス及びサーモプラズマ・ボルカニウムから選択される古細菌種由来の断片、並びに
c)ヒトヘルペスウイルス5(CMV)(株AD-169)、ワクシニアウイルス、ヒトヘルペスウイルス1(HSV-1)(株KOS)、ヒトヘルペスウイルス3(水痘帯状疱疹ウイルス)(株エレン)、ヒトアデノウイルスCセロタイプ1(HAdV-1)(株アデノイド71)、ヒトアデノウイルスB、亜種B2、セロタイプ14(HAdV-14)、コロナウイルス(株229E)、パラインフルエンザウイルス4b、麻疹ウイルス(イチノセ-B95a)、パラインフルエンザウイルス2、パラインフルエンザウイルス1株C35)、パラインフルエンザウイルス3、ムンプス(株エンダーズ)、ヒト呼吸器多核体ウイルスB(株B1)、ライノウイルスB17(感冒)、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、ヒトパピローマウイルス6b型、B型肝炎ウイルス(クローンAM6)、A型インフルエンザウイルス(H1N1)、ヒトアデノウイルスCセロタイプ2(HAdV-2)、デング1型ウイルス、ヒトヘルペスウイルス4(エプスタイン・バーウイルス)、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫ウイルス)、ザイールエボラウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルスB、水疱性口内炎インディアナウイルス、C型インフルエンザウイルス、アデノ随伴ウイルス2、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス1(エコーウイルス22)、サルウイルス40、ロタウイルスA、レオウイルス1型、トリ白血病ウイルスRSA(RSV-SRA)/ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1及びシンドビスウイルスから選択されるウイルス由来の断片。
【０２５６】
[実施例2]
発現ベクターpNp3を使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイする糸状バクテリオファージを産生するための、発現ベクターpNp3又はその誘導体を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０２５７】
pNp3と称されるベクター構築物は、ヘキサヒスチジン(6His)タグ、赤血球凝集素(HA)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン及びM13 pIIIコートタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むM13ベクターである。このベクターpNp3を、図1a、1b及び1cに示すように、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する15アミノ酸のビオチンリガーゼ基質ドメインとインフレームで融合された候補ペプチド部分を含む融合タンパク質を発現するように改変した。pNp3を使用して産生した融合タンパク質を、糸状バクテリオファージM13を含む足場上に、引き続いてディスプレイする。
【０２５８】
図1aは、以下の成分をインフレームで含む、pNp3誘導体ベクターPelB-Avitag-pIIIのコードされたpIII融合タンパク質を示す:
1.ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、軟腐病菌(Erwinia carotovora)CEペクチン酸リアーゼB(PelB)リーダーペプチド又はシグナルペプチド(配列番号31)。
2.融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6His、配列番号33)。
3.融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素タグ(HA、配列番号39)。
4.配列番号4に示されるAvitag配列を含むビオチンリガーゼ基質ドメイン。
【０２５９】
一例では、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸を、PelBリーダーペプチドとヘキサヒスチジンタグコード配列との間に位置付けられるベクター構築物(配列番号50)のEcoRI部位に導入する。
【０２６０】
別の一例では、pNp3と称される発現構築物をさらに改変して、DsbAタンパク質のシグナルペプチド(配列番号20)をコードする核酸を含むベクターDsbA-Avitag-pIIIを産生した。例えば、Steinerら、Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006)。次いで、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸を、図1bに示すように、ベクター構築物(配列番号44)のEcoRI部位に導入する。
【０２６１】
別の一例では、pNp3と称される発現構築物をさらに改変して、TorAタンパク質のシグナルペプチド(配列番号29)をコードする核酸を含むベクターTorA-Avitag-pIIIを産生した。例えば、Buchananら、FEBS. 582, 3979-3984 (2003)。次いで、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸を、図1cに示すように、ベクター構築物(配列番号47)のEcoRI部位に導入する。
【０２６２】
別の一例では、pNp3と称される発現構築物を、ヘキサヒスチジンタグコード配列をコードする核酸と赤血球凝集素タグをコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２６３】
別の一例では、pNp3と称される発現構築物を、赤血球凝集素タグをコードする核酸をコードする核酸とAvitagをコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２６４】
別の一例では、pNp3と称される発現構築物を、Avitagドメインをコードする核酸とpIIIコートタンパク質をコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２６５】
標準的な部位特異的変異誘発を実施して、pNp3発現ベクターの任意の領域中にユニークなEcoRI部位を導入する。
【０２６６】
代替的な一例では、本明細書のいずれかの例に記載されるpNp3と称される発現構築物又はその誘導体をさらに改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)をコードする核酸によって、ヘキサヒスチジンタグ(6His)をコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を導入することによって改変して、タンデムに10個のヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２６７】
別の例では、ベクター中の候補ペプチド及びAvitagドメインの位置を、互いに対して、及びコートタンパク質の上流に位置付けられた他のドメインに対して、改変する。例えば、このAvitagドメインを、候補ペプチド部分のC末端に隣接して、及び6His若しくは10Hisドメイン又はHAドメインのN末端に隣接して、位置付ける。これらのベクター中のタグドメインの相対的位置は可変性であり、それらの性能にとって重要ではない。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２６８】
なお別の一例では、非ビオチン化メンバーを、大腸菌細胞において、本明細書の任意の実施形態に従って記載されるpNp3発現ベクター又はその誘導体ベクターを発現させることによって産生する。このような一例では、これらの細菌細胞を、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合したAvitagドメイン(配列番号4)を含むビオチンリガーゼ基質ドメインの3つのタンデムコピーを含むSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチド(図2)を発現するように形質転換する。例えば、Hayら、Mol. Cell 18, 1-12 (2005)。この例では、これらの発現されたタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、確率論的な観点においてビオチン化活性について競合することがあまりできない、pNp3ベクター誘導体上に存在する単一コピーのAvitagドメインとは対照的に、タンデムコピーのAvitagドメインに対してより高い親和性を有する細菌細胞の発現を介してモル濃度過剰の基質に曝露される内因性ビオチンリガーゼ酵素によって、pNp3ベクター誘導体のビオチンリガーゼ基質ドメインに優先してビオチン化される。
【０２６９】
ウエスタンブロット分析を、in vitroビオチン化タンパク質の検出のために実施した。簡潔に述べると、サンプルを、Laemmli緩衝液中に希釈し、5分間煮沸した。変性サンプルを、標準的な手順を使用することによって、4〜12％ Bis-trisゲル上で分離し、PVDF膜(Life Technologies、Invitrogen)上にブロットした。膜を、4℃で一晩5％スキムミルク/PBS中でブロッキングした。膜を、0.05％ Tween-20を含む1×PBS(PBS-T)中でリンスし、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗ビオチンストレプトアビジン(SA-HRP)(希釈1:1,000)と共に、室温で1時間インキュベートした。膜をPBS-T中で洗浄し、Western Cキット(Bio-Rad)を使用して現像した。
【０２７０】
図3に示すように、DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現しない大腸菌細胞中ではビオチン化されないが、PelBシグナルペプチドを含む融合タンパク質を発現するベクターは、このような細胞中でビオチン化される。例えば、図3、レーン2〜5及び7を参照のこと。これは、非ビオチン化メンバーが、DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質を発現するM13上にディスプレイされるという結論を支持する。
【０２７１】
PelB-Avitag-pIIIベクターから非ビオチン化メンバーを産生するために、このベクターを使用してアセンブルしたM13を、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現する大腸菌細胞を使用して産生する。
【０２７２】
TorA-Avitag-pIIIベクターから非ビオチン化メンバーを産生するために、このベクターを使用してアセンブルしたM13を、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現する大腸菌細胞を使用して産生する。
【０２７３】
[実施例3]
発現ベクターpNp8を使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイする糸状バクテリオファージを産生するための、発現ベクターpNp8又はその誘導体を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０２７４】
pNp8と称されるベクター構築物は、ヘキサヒスチジン(10His)タグ、赤血球凝集素(HA)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン及びM13 pVIIIコートタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むM13ベクターである。このベクターpNp8を改変して、図4a及び4bに示すように、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する15アミノ酸のビオチンリガーゼ基質ドメインとインフレームで融合された候補ペプチド部分を含む融合タンパク質を発現させた。pNp8を使用して産生した融合タンパク質を、糸状バクテリオファージM13を含む足場上に、引き続いてディスプレイする。
【０２７５】
図4aは、以下の成分をインフレームで含む、pNp8誘導体ベクターPelB-Avitag-pVIIIのコードされたpVIII融合タンパク質を示す:
1.ファージディスプレイを目的として、発現された融合タンパク質を細菌ペリプラズム及び細胞表面に標的化するための、軟腐病菌CEペクチン酸リアーゼB(PelB)リーダーペプチド又はシグナルペプチド(配列番号31)。
2.融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)。
3.融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、赤血球凝集素タグ(HA、配列番号39)。
4.配列番号4に示されるAvitag配列を含むビオチンリガーゼ基質ドメイン。
【０２７６】
一例では、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸を、PelBリーダーペプチドとヘキサヒスチジンタグコード配列の間に位置付けられるベクター構築物(配列番号56)のEcoRI部位に導入する。
【０２７７】
別の一例では、pNp8と称される発現構築物をさらに改変して、DsbAタンパク質のシグナルペプチド(配列番号20)をコードする核酸を含むベクターDsbA-Avitag-pVIIIを産生した。例えば、Steinerら、Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006)。次いで、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸を、図4bに示すように、ベクター構築物(配列番号44)のEcoRI部位に導入する。
【０２７８】
別の一例では、pNp8と称される発現構築物を、ドデカヒスチジンタグコード配列をコードする核酸と赤血球凝集素タグをコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２７９】
別の一例では、pNp8と称される発現構築物を、赤血球凝集素タグをコードする核酸をコードする核酸とAvitagドメインをコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２８０】
別の一例では、pNp8と称される発現構築物を、Avitagドメインをコードする核酸とpVIIIコートタンパク質をコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０２８１】
標準的な部位特異的変異誘発を実施して、pNp8発現ベクターの任意の領域中にユニークなEcoRI部位を導入する。
【０２８２】
代替的な一例では、本明細書のいずれかの例に記載されるpNp8と称される発現構築物又はその誘導体をさらに改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ヘキサヒスチジンタグ(6His、配列番号33)をコードする核酸によって、ドデカヘキサヒスチジンタグ(10His)ドメインをコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を除去することによって改変して、タンデムに6つのヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２８３】
別の例では、ベクター中の候補ペプチド及びAvitagドメインの位置を、互いに対して、及びコートタンパク質の上流に位置付けられた他のドメインに対して、改変する。例えば、このAvitagドメインを、候補ペプチド部分のC末端に隣接して、及び6His若しくは10Hisドメイン又はHAドメインのN末端に隣接して、位置付ける。これらのベクター中の種々のタグドメインの相対的位置は可変性であり、それらの性能にとって重要ではない。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２８４】
一例では、非ビオチン化メンバーを、大腸菌細胞において、本明細書の任意の実施形態に従って記載されるpNp8誘導体ベクターを発現させることによって産生する。このような一例では、これらの細菌細胞を、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合したAvitagドメイン(配列番号4)を含むビオチンリガーゼ基質ドメインの3つのタンデムコピーを含むSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチド(図2)を発現するように形質転換する。例えば、Hayら、Mol. Cell 18, 1-12 (2005)。この例では、これらの発現されたタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、確率論的な観点においてビオチン化活性について競合することがあまりできない、pNp8ベクター誘導体上に存在する単一コピーのAvitagドメインとは対照的に、タンデムコピーのAvitagドメインに対してより高い親和性の発現を介してモル濃度過剰の基質を有する細菌細胞に曝露される内因性ビオチンリガーゼ酵素によって、pNp8ベクター誘導体のビオチンリガーゼ基質ドメインに優先してビオチン化される。
【０２８５】
ウエスタンブロット分析を、in vitroビオチン化タンパク質の検出のために実施した。簡潔に述べると、サンプルを、Laemmli緩衝液中に希釈し、5分間煮沸した。変性サンプルを、標準的な手順を使用することによって、4〜12％ Bis-trisゲル上で分離し、PVDF膜(Life Technologies、Invitrogen)上にブロットした。膜を、4℃で一晩5％スキムミルク/PBS中でブロッキングした。膜を、0.05％ Tween-20を含む1×PBS(PBS-T)中でリンスし、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗ビオチンストレプトアビジン(SA-HRP)(希釈1:1,000)と共に、室温で1時間インキュベートした。膜をPBS-T中で洗浄し、Western Cキット(Bio-Rad)を使用して現像した。
【０２８６】
図5に示すように、DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現しない大腸菌細胞中ではビオチン化されない。例えば、図3、レーン4及び5を参照のこと。これは、非ビオチン化メンバーが、DsbAシグナルペプチドを含む融合タンパク質を発現するM13上にディスプレイされるという結論を支持する。
【０２８７】
PelB-Avitag-pVIIIベクターから非ビオチン化メンバーを産生するために、このベクターを使用してアセンブルしたM13を、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現する大腸菌細胞を使用して産生する。
【０２８８】
[実施例4]
発現ベクターpJuFo-pIII又は発現ベクターpJuFo-pVIIIを使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイする糸状バクテリオファージを産生するための、発現ベクターpJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０２８９】
pJuFo-pIIIと称されるベクター構築物は、PelBリーダーペプチド、c-JunのC末端ロイシンジッパードメイン及びM13カプシドタンパク質、pIIIを含む第1の融合タンパク質(図6a)(配列番号60)、並びにPelBリーダーペプチド、c-FosのC末端ロイシンジッパードメイン、ヘキサヒスチジン(6His)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)及び赤血球凝集素(HA)タグを含む第2の融合タンパク質(図6b)(配列番号61)をコードする。
【０２９０】
pJuFo-pIIIを含むM13ファージは、PelB-cJun-pIII融合タンパク質をディスプレイし、大腸菌においてトランスでPelB-cFos-Avitag融合タンパク質を発現する。c-Jun及びc-Fosのロイシンジッパードメインのダイマー化は、Avitagドメインを含むヘテロダイマー性融合タンパク質を産生する。このベクターpJuFo-pIIIは、PelB-cFos-Avitagドメイン融合物をコードする核酸の3'側、例えば、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のHAタグをコードする核酸の3'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。この挿入は、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質とのインフレーム融合物として発現される候補ペプチドを生じる。pJuFo-pIIIのヌクレオチド配列は、配列番号59に示される。
【０２９１】
一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、図6bに示すように、ベクター構築物(配列番号59)のEcoRI部位に導入する。
【０２９２】
pJuFo-pVIIIと称されるベクター構築物は、PelBリーダーペプチド、c-JunのC末端ロイシンジッパードメイン及びM13カプシドタンパク質、pVIIIを含む第1の融合タンパク質(図7a)(配列番号63)、並びにPelBリーダーペプチド、c-FosのC末端ロイシンジッパードメイン、ヘキサヒスチジン(6His)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)及び赤血球凝集素(HA)タグを含む第2の融合タンパク質(図7b)(配列番号64)をコードする。
【０２９３】
pJuFo-pVIIIを含むM13ファージは、PelB-cJun-pVIII融合タンパク質をディスプレイし、大腸菌においてトランスでPelB-cFos-Avitag融合タンパク質を発現する。c-Jun及びc-Fosのロイシンジッパードメインのダイマー化は、Avitagドメインを含むヘテロダイマー性融合タンパク質を産生する。このベクターpJuFo-pVIIIは、PelB-cFos-Avitagドメイン融合物をコードする核酸の3'側、例えば、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のHAタグをコードする核酸の3'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。この挿入は、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質とのインフレーム融合物として発現される候補ペプチドを生じる。pJuFo-pVIIIのヌクレオチド配列は、配列番号62に示される。
【０２９４】
一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、図7bに示すように、ベクター構築物(配列番号62)のEcoRI部位に導入する。
【０２９５】
別の一例では、pJuFo-pIII又はpJuFo-pVIIIと称される発現ベクターをさらに改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)をコードする核酸によって、ヘキサヒスチジンタグ(6His)ドメインをコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を導入することによって改変して、タンデムに10個のヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２９６】
別の一例では、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIIIと称される発現構築物をさらに改変して、DsbAタンパク質のシグナルペプチド(配列番号20)をコードする核酸によってPelBシグナルペプチドをコードする核酸を置き換える。例えば、Steinerら、Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006)。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２９７】
なお別の一例では、ベクター中の候補ペプチド及びAvitagドメインの位置を、互いに対して、及び他のドメインに対して、改変する。例えば、このAvitagドメインを、候補ペプチド部分のC末端に隣接して、及び6His若しくは10Hisドメイン又はHAドメインのN末端に隣接して、位置付ける。これらのベクター中の種々のタグドメインの相対的位置は可変性であり、それらの性能にとって重要ではない。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０２９８】
一例では、非ビオチン化メンバーを、大腸菌細胞において、本明細書の任意の実施形態に従って記載されるpJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体を発現させることによって産生する。このような一例では、これらの細菌細胞を、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合したAvitagドメイン(配列番号4)を含むビオチンリガーゼ基質ドメインの3つのタンデムコピーを含むSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチド(図2)を発現するように形質転換する。例えば、Hayら、Mol. Cell 18, 1-12 (2005)。この例では、これらの発現されたタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体上に存在する単一コピーのAvitagドメインよりも、タンデムコピーのAvitagドメインに対してより高い親和性を有する細菌細胞の内因性ビオチンリガーゼ酵素によって、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに優先してビオチン化される。
【０２９９】
DsbAタンパク質のシグナルペプチドを含む誘導体pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII発現ベクターから非ビオチン化メンバーを産生するために、M13を、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現しない大腸菌細胞においてアセンブルする。
【０３００】
[実施例5]
発現ベクターpJuFo-pIII又は発現ベクターpJuFo-pVIIIを使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイする糸状バクテリオファージを産生するための、発現ベクターpJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３０１】
pJuFo-pIIIと称されるベクター構築物は、PelBリーダーペプチド、c-JunのC末端ロイシンジッパードメイン及びM13カプシドタンパク質、pIIIを含む第1の融合タンパク質(図6a)(配列番号60)、並びにPelBリーダーペプチド、c-FosのC末端ロイシンジッパードメイン、ヘキサヒスチジン(6His)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)及び赤血球凝集素(HA)タグを含む第2の融合タンパク質(図6b)(配列番号61)をコードする。
【０３０２】
pJuFo-pIIIを含むM13ファージは、PelB-cJun-pIII融合タンパク質をディスプレイし、大腸菌においてトランスでPelB-cFos-Avitag融合タンパク質を発現する。c-Jun及びc-Fosのロイシンジッパードメインのダイマー化は、Avitagドメインを含むヘテロダイマー性融合タンパク質を産生する。このベクターpJuFo-pIIIは、PelB-cFos-Avitagドメイン融合物をコードする核酸の3'側、例えば、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のHAタグをコードする核酸の3'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。この挿入は、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質とのインフレーム融合物として発現される候補ペプチドを生じる。pJuFo-pIIIのヌクレオチド配列は、配列番号59に示される。
【０３０３】
一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、図6bに示すように、ベクター構築物(配列番号59)のEcoRI部位に導入する。
【０３０４】
pJuFo-pVIIIと称されるベクター構築物は、PelBリーダーペプチド、c-JunのC末端ロイシンジッパードメイン及びM13カプシドタンパク質、pVIIIを含む第1の融合タンパク質(図7a)(配列番号63)、並びにPelBリーダーペプチド、c-FosのC末端ロイシンジッパードメイン、ヘキサヒスチジン(6His)タグ、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)及び赤血球凝集素(HA)タグを含む第2の融合タンパク質(図7b)(配列番号64)をコードする。
【０３０５】
pJuFo-pVIIIを含むM13ファージは、PelB-cJun-pVIII融合タンパク質をディスプレイし、大腸菌においてトランスでPelB-cFos-Avitag融合タンパク質を発現する。c-Jun及びc-Fosのロイシンジッパードメインのダイマー化は、Avitagドメインを含むヘテロダイマー性融合タンパク質を産生する。このベクターpJuFo-pVIIIは、PelB-cFos-Avitagドメイン融合物をコードする核酸の3'側、例えば、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のHAタグをコードする核酸の3'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。この挿入は、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質とのインフレーム融合物として発現される候補ペプチドを生じる。pJuFo-pVIIIのヌクレオチド配列は、配列番号62に示される。
【０３０６】
一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、図7bに示すように、ベクター構築物(配列番号62)のEcoRI部位に導入する。
【０３０７】
別の一例では、pJuFo-pIII又はpJuFo-pVIIIと称される発現ベクターをさらに改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)をコードする核酸によって、ヘキサヒスチジンタグ(6His)ドメインをコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を導入することによって改変して、タンデムに10個のヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３０８】
別の一例では、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIIIと称される発現構築物をさらに改変して、DsbAタンパク質のシグナルペプチド(配列番号20)をコードする核酸によってPelBシグナルペプチドをコードする核酸を置き換える。例えば、Steinerら、Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006)。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３０９】
なお別の一例では、ベクター中の候補ペプチド及びAvitagドメインの位置を、互いに対して、及び他のドメインに対して、改変する。例えば、このAvitagドメインを、候補ペプチド部分のC末端に隣接して、及び6His若しくは10Hisドメイン又はHAドメインのN末端に隣接して、位置付ける。これらのベクター中の種々のタグドメインの相対的位置は可変性であり、それらの性能にとって重要ではない。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３１０】
一例では、非ビオチン化メンバーを、大腸菌細胞において、本明細書の任意の実施形態に従って記載されるpJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体を発現させることによって産生する。このような一例では、これらの細菌細胞を、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合したAvitagドメイン(配列番号4)を含むビオチンリガーゼ基質ドメインの3つのタンデムコピーを含むSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチド(図2)を発現するように形質転換する。例えば、Hayら、Mol. Cell 18, 1-12 (2005)。この例では、これらの発現されたタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII又はそれらの誘導体上に存在する単一コピーのAvitagドメインよりも、タンデムコピーのAvitagドメインに対してより高い親和性を有する細菌細胞の内因性ビオチンリガーゼ酵素によって、PelB-cFos-Avitag融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインに優先してビオチン化される。
【０３１１】
このDsbAタンパク質のシグナルペプチドを含む誘導体pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII発現ベクターから非ビオチン化メンバーを産生するために、M13を、本明細書の図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現しない大腸菌細胞においてアセンブルする。
【０３１２】
[実施例5]
発現ベクターT7Selectを使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイするTバクテリオファージを産生するための、発現ベクターT7Select-Avitag-N、T7Select*-Avitag-N又はそれらの誘導体を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３１３】
T7Select-Avitag-Nと称されるベクター構築物を、T7Select 10-3b(Novagen)(配列番号81)を鋳型として使用して、融合タンパク質の中コピー数ディスプレイのために生成した。このT7Select-Avitag-Nベクターは、ヘキサヒスチジン(6His)タグ(配列番号33)、赤血球凝集素(HA)タグ(配列番号39)、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)(配列番号4)及び10Bカプシドタンパク質(CP 10B)を含む融合タンパク質をコードする(図8a)。このベクターT7Select-Avitag-Nは、Avitagドメインをコードする核酸の5'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。T7Select-Avitag-Nのヌクレオチド配列は、配列番号65に示される。
【０３１４】
別の一例では、T7Select-Avitag-Nと称される発現構築物を、Avitagドメインの下流に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変した(T7Select-Avitag-C)(図8b)。T7Select-Avitag-Nのヌクレオチド配列は、配列番号65に示される。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクター構築物のEcoRI部位に導入する。
【０３１５】
T7Select*-Avitag-Nと称されるベクター構築物を、T7Select 1-1b(Novagen)(配列番号82)を鋳型として使用して、融合タンパク質の低コピーディスプレイのために生成した。このT7Select*-Avitag-Nベクターは、ヘキサヒスチジンタグ(6His、配列番号33)、赤血球凝集素タグ(HA、配列番号39)、ビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン、配列番号4)及び10Bカプシドタンパク質(CP 10B)を含む融合タンパク質をコードする(図8a)。このベクターT7Select-Avitag-Nは、Avitagドメインをコードする核酸の5'側に位置付けられたEcoRI部位を含み、実施例1に記載されるように産生した候補ペプチド部分をコードする核酸の挿入を提供する。T7Select*-Avitag-Nのヌクレオチド配列は、配列番号67に示される。
【０３１６】
別の一例では、T7Select*-Avitag-Nと称される発現構築物を、Avitagドメインの下流に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変した(T7Select-Avitag-C)。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクター構築物のEcoRI部位に導入する。
【０３１７】
別の一例では、本明細書のいずれかの例に記載されるT7Select-Avitag-N若しくはT7Select*-Avitag-Nと称される構築物、又はそれらの誘導体を、ヘキサヒスチジンタグをコードする核酸と赤血球凝集素タグをコードする核酸との間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０３１８】
別の一例では、本明細書のいずれかの例に記載されるT7Select-Avitag-N若しくはT7Select*-Avitag-Nと称される構築物、又はそれらの誘導体を、赤血球凝集素タグをコードする核酸とAvitagドメインとの間に位置付けられたユニークなEcoRI部位を生成するように改変する。実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、改変されたベクターのEcoRI部位に導入する。
【０３１９】
標準的な部位特異的変異誘発を実施して、T7Select-Avitag-N若しくはT7Select*-Avitag-N又はそれらの誘導体中にユニークなEcoRI部位を導入する。
【０３２０】
別の一例では、本明細書のいずれかの例に記載されるT7Select-Avitag-N若しくはT7Select*-Avitag-Nと称される構築物、又はそれらの誘導体を改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)をコードする核酸によって、ヘキサヒスチジンタグをコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を導入することによって改変して、タンデムに10個のヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３２１】
別の一例では、ベクター中の候補ペプチド及びAvitagドメインの位置を、互いに対して、及びコートタンパク質の下流に位置付けられた他のドメインに対して、改変する。例えば、このAvitagドメインを、候補ペプチド部分のC末端に隣接して、及び6His若しくは10Hisドメイン又はHAドメインのN末端に隣接して、位置付ける。これらのベクター中の種々のタグドメインの相対的位置は可変性であり、それらの性能にとって重要ではない。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３２２】
非ビオチン化メンバーを、大腸菌細胞において、本明細書のいずれかの例に記載されるT7Select-Avitag-N若しくはT7Select*-Avitag-N、又はそれらの誘導体を発現させることによって産生する。このような一例では、これらの細菌細胞を、低分子ユビキチン様改変因子(SUMO)タンパク質に融合したAvitagドメインの3つのタンデムコピーを含むSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチド(図2)を発現するように形質転換する。例えば、Hayら、Mol. Cell 18, 1-12 (2005)。この例では、これらの発現されたタンデムコピーのビオチンリガーゼ基質ドメインは、例えば、確率論的な観点においてビオチン化活性について競合することがあまりできない、pNp3ベクター誘導体上に存在する単一コピーのAvitagドメインとは対照的に、タンデムコピーのAvitagドメインに対してより高い親和性の多コピーベクターの複数の産物からの発現を介してモル濃度過剰の基質を有することに曝露される細菌細胞の内因性ビオチンリガーゼ酵素によって、T7Select誘導体のビオチンリガーゼ基質ドメインに優先してビオチン化される。
【０３２３】
図9に示すように、本明細書に記載されるT7Selectベクターから発現されたCP 10B Avitag融合タンパク質は、図2に示されるSUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドの存在下で、大腸菌細胞においてビオチン化されない。例えば、図9、レーン2〜5を参照のこと。対照的に、このT7Selectベクターは、SUMO-(Avitag)3融合デコイポリペプチドを発現しない大腸菌細胞においてビオチン化される。これは、非ビオチン化メンバーがT7ファージ上にディスプレイされるという結論を支持する。
【０３２４】
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイする糸状バクテリオファージを産生するための、発現ベクターT7Selectを使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３２５】
[実施例6]
ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して低い親和性を有する内因性ビオチンリガーゼを発現する細胞を使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイするバクテリオファージを産生するための、ビオチンリガーゼ基質ドメインに対して低い親和性を有する内因性ビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３２６】
本明細書の任意の先行する例に従って記載されるpNp3、pNp8、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII、T7Select-Avitag-N及びT7Select*-Avitag-Nと称される発現構築物又は任意のそれらの誘導体を、配列番号12に示される15アミノ酸の酵母ビオチンリガーゼ基質ドメインをコードするようにさらにコードする核酸によって、それらのAvitagドメインを置き換えることによって改変する(Chenら、J. Am. Chem. Soc. 129, 6619-6620, 2007)。
【０３２７】
非ビオチン化メンバーを、内因性大腸菌ビオチンリガーゼを発現する細胞及び/又は哺乳動物ビオチンリガーゼを発現する細胞などの大腸菌細胞において、バクテリオファージを産生することによって生成する。
【０３２８】
[実施例7]
内因性ビオチンリガーゼ活性を欠く細胞を使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、非ビオチン化メンバーをディスプレイするバクテリオファージを産生するための、内因性ビオチンリガーゼ活性を欠き組換えビオチンリガーゼを発現する大腸菌細胞を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３２９】
非ビオチン化メンバーを、本明細書の任意の先行する例に従って記載されるpNp3、pNp8、pJuFo-pIII、pJuFo-pVIII、T7Select-Avitag-N及びT7Select*-Avitag-N又は任意のそれらの誘導体を発現させることによって生成し、配列番号9に示される出芽酵母のビオチンタンパク質リガーゼで形質転換した大腸菌CY918細胞(Cronanら、FEMS Microbio. Lett. 130 221-229, 1995)において産生する。
【０３３０】
この例では、これらの融合タンパク質のAvitagは、内因性ビオチンリガーゼ活性を欠く細菌細胞、及びベクター上に存在するAvitagドメインに対する不十分な活性を有する出芽酵母の発現されたビオチンリガーゼによって、ビオチン化されない。
【０３３１】
[実施例8]
無細胞タンパク質合成を使用した非ビオチン化メンバーの産生
この実施例は、真核生物無細胞タンパク質発現系を使用した非ビオチン化メンバーの産生を実証する。
【０３３２】
SITS-Avitagと称されるベクター構築物を、pLTE-6H-N(PEF Brisbane)を使用して、組み合わされた転写-翻訳系における使用のために生成した。このSITS-Avitagベクターは、種非依存的翻訳ドメイン(SITS)、ヘキサヒスチジンタグ(6His、配列番号33)及びビオチンリガーゼ基質ドメイン(Avitagドメイン)(配列番号4)を含む融合タンパク質をコードする(図10)。SITS-Avitagのヌクレオチド配列は、配列番号76に示される。
【０３３３】
一例では、SITS-Avitagと称される発現構築物をさらに改変して、融合タンパク質の検出及び/又は精製のための、ドデカヒスチジンタグ(10His、配列番号35)をコードする核酸によって、ヘキサヒスチジンタグ(6His)ドメインをコードする核酸を置き換える。或いは、これらのベクターを、最大4つのさらなるヒスチジン残基をコードする核酸を導入することによって改変して、タンデムに10個のヒスチジン残基をコードする対応するベクターを産生する。標準的な手順を、このような改変に対して使用する。
【０３３４】
一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、重複伸長PCRを使用して、ヘキサヒスチジンタグをコードする核酸とAvitagドメインをコードする核酸との間で、SITS-Avitagと称される発現構築物又はその誘導体に導入する。
【０３３５】
別の一例では、実施例1に記載される候補ペプチド部分をコードする核酸を、重複伸長PCRを使用して、Avitagドメインの下流で、SITS-Avitagと称される発現構築物又はその誘導体に導入する。
【０３３６】
非ビオチン化メンバーを、製造業者の指示(PEF Brisbane)に従って、リーシュマニア・タレントラエ抽出物(LTE)in vitro翻訳系において、本明細書のいずれかの例に記載されるSITS-Avitag又はその誘導体を発現させることによって産生する。
【０３３７】
図11に示すように、種非依存的翻訳ドメインを含む融合タンパク質は、リーシュマニア・タレントラエ抽出物(LTE)in vitro翻訳系においてビオチン化されない。例えば、図11、レーン3、5、7及び9を参照のこと。これは、非ビオチン化メンバーが真核生物無細胞タンパク質発現系において産生されるという結論を支持する。
【０３３８】
[実施例9]
組換えビオチンリガーゼを発現する宿主細胞の産生
この実施例は、組換えビオチンリガーゼを発現する真核生物宿主細胞の産生を実証する。
【０３３９】
pBirAと称されるベクター構築物を、pACYC-184(New England BioLabs)(配列番号80)を鋳型として使用して、組換え大腸菌ビオチンリガーゼ(BirA、配列番号2)の発現のために生成した。pBirAのヌクレオチド配列は、配列番号71に示される。
【０３４０】
pBirA*と称されるベクター構築物を、Mecholdら、J. Biotech. 116, 245-249 (2005)によって以前に記載されたように、哺乳動物のコドン最適化したビオチンリガーゼ(BirA*、配列番号79)の発現のために生成した。pBirA*のヌクレオチド配列は、配列番号77に示される。
【０３４１】
ベクターpBirA及びpBirA*を、エレクトロポレーションを使用して、HEK 293細胞中にトランスフェクトした。BirA又はBirA*のいずれかを安定に発現する細胞を、標準的な分子生物学プロトコールを使用して選択した。
【０３４２】
別の一例では、ベクターpBirA及びpBirA*を、CHO-K1、NIH-3T3、HeLa及びCOS-7細胞中にトランスフェクトする。BirA又はBirA*のいずれかを安定に発現する細胞を、標準的な分子生物学プロトコールを使用して選択する。
【０３４３】
図12に示すように、BirA*を発現するトランスフェクトされたHEK 293細胞は、外因性ビオチンの非存在下ではより低いレベルではあるが、培養物中のインタクトなHEK 293細胞に又はM-PER細胞溶解物に添加される外因性ビオチンあり又はなしで、非ビオチン化メンバーをビオチン化する。
【０３４４】
[実施例10]
組換えビオチンリガーゼの宿主細胞発現を増強する
この実施例は、ビオチンリガーゼ基質の検出可能なビオチン化に十分なレベルで、宿主細胞において組換えビオチンリガーゼを産生するための好ましいリーダー配列及び発現条件を実証する。
【０３４５】
コドン最適化した大腸菌BirA遺伝子を、高コピーラムノース誘導性プラスミドpD864(DNA2.0, Inc.、USA)中に、そのプラスミドの強いRBSの後ろにクローニングし、それによって、BirAの発現がラムノース誘導性プロモーター(pRham)の作動可能な制御下にあるプラスミドpD864_BirAを産生した。この組換え発現構築物を、大腸菌BL21細胞中に形質転換し、細胞を、25℃で16時間、カルベニシリンを含むLuria Broth(LB)(LB/Carb50)及び0.15％(w/v)グルコース中で培養して、BirA発現の誘導を防止し、又は或いは、0.05％(w/v)グルコース及び0.1％(w/v)ラムノースを含むLB/Carb50培地中ではあるが同じ条件下で培養して、BirA発現の初期の誘導を提供し、或いは、0.15％(w/v)グルコース及び0.1％(w/v)ラムノースを含むLB/Carb50培地中で培養して、BirA発現の後期誘導を提供した。これらの条件下で、BirA発現は、ラムノースを培地に添加した場合に、細胞全体溶解物又はそれらの可溶性画分のSDS/PAGEを使用して、検出可能であった。0.15％(w/v)グルコース及び0.1％(w/v)ラムノースを含むLB/Carb50培地中で25℃で16時間培養した細胞は、検出可能なプロモーターの漏れなしに、細胞溶解物の可溶性画分において高いレベルでBirAを発現した。
【０３４６】
発現されたBirAタンパク質が機能的であったことを実証するために、in vitroビオチン化試験(IVB)を実施したが、この試験において、2μl又は6μlの細胞溶解物を、60μlの最終反応体積中、50mMビシン緩衝液pH8.3、10mM MgOAc/ATP、50μM D-ビオチン、及びV5-aviと称されるavi-tag化ペプチド(GLINDIFEAQKIEWHEGSSGKPIPNPLLGLDST)からなる40μMビオチンリガーゼ基質中で、各々30℃で90分間インキュベートした。反応物を、600rpmに設定したミキサー中で継続的に混合した。インキュベーション後、30μlの各反応物を、標準的な手順に従うDELFIAのために引き出したが、ここで、ユーロピウム標識されたストレプトアビジン(1:500)の結合及び結合したペプチドの時間分解蛍光によって検出されるビオチン化ペプチドは、プレートリーダーを使用して決定される(340nmの波長における励起、615nmの波長における発光)。データは、自己誘導されたpD864_BirA培養物由来の溶解物が、市販の精製BirA酵素(Genecopeia)と等価なレベルで、試験ペプチドAvi-V5をビオチン化することを実証している。
【０３４７】
発現されたBirAがファージディスプレイされたavi-tagもビオチン化することを実証するために、pNp3誘導体ベクターpNp3 DsbA 6His CG3avi(実施例2)を、1/30、1/60、1/120、1/240、1/480及び1/960の希釈で、大腸菌において産生した細胞質BirA溶解物と混合し、反応物を、上記段落において記載したようにインキュベートした。データは、BirA溶解物が、1/960(v/v)にまで希釈した場合であっても、ファージディスプレイされたビオチンリガーゼ基質に向かう検出可能なビオチン化活性を有したことを示した。
【０３４８】
まとめると、高コピープラスミドpD864からラムノース誘導性酵素としてBirAを発現させることによって、pBirAcmからの発現によって取得されたレベルと比較して約50〜100倍高いレベルの可溶性BirA酵素が取得可能であった(データ示さず)。pD864_BirAの溶解物は、市販の精製BirA酵素と同程度まで、avi-tag化ペプチド及びファージをビオチン化することが可能であることが示された。
【０３４９】
ペリプラズムにおけるBirA発現レベルに対するリーダーペプチドの影響を決定するために、BirAを、低コピープラスミドpD881(DNA2.0 Inc.、USA)から、11の異なるリーダーペプチドのうちの1つを有する融合タンパク質として発現させた。このプラスミドベクターpD881は、カナマイシン抵抗性選択可能マーカー遺伝子、強いRBS及び低コピーp15a複製起点を含む。コドン最適化した大腸菌BirA遺伝子を、プラスミドpD881中に、そのプラスミドの強いRBSの後ろにクローニングし、それによって、BirAの発現がラムノース誘導性プロモーター(pRham)の作動可能な制御下にあるプラスミドpD881_BirAを産生した。各リーダー配列を、プロモーターとBirAコード配列との間に別々に挿入して、pD881_peri_BirAベクターのファミリーを産生した。試験した11のリーダー配列は、以下の通りであった:
a.SEC経路リーダー配列(翻訳後トランスロケーション-未折り畳みタンパク質)
pelB:軟腐病菌ペクチン酸リアーゼリーダー(22アミノ酸残基長)
gIII:M13由来gIIIリーダー(18アミノ酸残基長)
ompA:大腸菌外膜タンパク質3aリーダー(21アミノ酸残基長)
phoA:大腸菌アルカリホスファターゼPhoAリーダー(21アミノ酸残基長)
malE:マルトース結合タンパク質リーダー(26アミノ酸残基長)
ompC:大腸菌外膜タンパク質Cリーダー(21アミノ酸残基長)
ompT:大腸菌外膜プロテアーゼリーダー(20アミノ酸残基長)
B.SRP経路リーダー配列(翻訳同時トランスロケーション-ペリプラズム中で折り畳まれたタンパク質)
dsbA:タンパク質ジスルフィドイソメラーゼIリーダー(19アミノ酸残基長)
torT:torCADの調節タンパク質のリーダー(18アミノ酸残基長)
C.TAT経路リーダー配列(翻訳後トランスロケーション-折り畳みタンパク質)
torA:TMAOレダクターゼリーダー(43アミノ酸残基長)
sufI:(Ftsp)細胞分裂装置の大腸菌成分のリーダー(31アミノ酸残基長)。
【０３５０】
細胞を培養し、発現を、本明細書に上記したように、培地中でラムノース及びグルコースを使用して誘導した。細胞溶解物のSDS/PAGEは、SRP経路リーダー配列TorT又はDsbAを使用した場合を除いて、BirAが発現されたことを示した。
【０３５１】
発現されたBirAタンパク質が各場合において機能的であることを実証するために、自己誘導されたpD881_peri_BirA培養物由来の可溶性画分を使用して、in vitroビオチン化試験(IVB)を本明細書で上記したように実施した。データは、BirAを、SEC経路リーダー、即ち、pelB、gIII、ompA、phoA若しくはmalE、又はTAT経路リーダーtorA若しくはsufIとの融合タンパク質として発現させた場合、細胞のpD881_peri_BirA溶解物における測定可能なBirA活性を示した。対照的に、BirAを、SEC経路リーダーompC若しくはompT、又はSRP経路リーダーdsbA若しくはtorTとの融合タンパク質として発現させた場合、細胞溶解物からの測定可能な活性は存在しなかった、又は低い活性のみが存在した。BirAタンパク質のウエスタンブロット免疫検出は、SEC経路リーダーが、正確にプロセシングされたが、SRP経路リーダー及びTAT経路リーダーは、部分的にしかプロセシングされず、従って、細菌細胞のペリプラズム中に効率的に輸送されないことを示した。
【０３５２】
[実施例11]
宿主細胞の膜をトランスロケートするペプチドを決定又は同定する
この実施例は、ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させ、次いで、宿主細胞の膜をトランスロケートしたメンバーによって発現された融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるように、これらの宿主細胞をインキュベートし、ビオチン化形態にある融合タンパク質を検出することによってこれらのビオチン化メンバーを決定又は同定し、常磁性ストレプトアビジンビーズを使用してビオチン化融合タンパク質を単離/回収することによる、細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの決定/同定を実証する。
【０３５３】
非ビオチン化メンバーを、上述の例に記載したように産生し、次いで、ビオチンリガーゼ酵素を発現するHEK-293、CHO-K1、NIH-3T3、HeLa又はCOS-7細胞と接触させる。
【０３５４】
一例では、これらのメンバーのビオチン化の後に、HEK 293細胞を回収し、回収された細胞のアリコートを溶解させ、実施例2に記載されるように、これらの細胞溶解物をウエスタンブロット分析に供する。ビオチン化メンバーを含むサンプルを、Laemmli緩衝液中に希釈し、5分間煮沸する。変性ビオチン化メンバーを、標準的な手順を使用することによって、4〜12％ Bis-trisゲル上で分離し、PVDF膜(Life Technologies、Invitrogen)上にブロットする。膜を、4℃で一晩5％スキムミルク/PBS中で一晩ブロッキングする。膜を、0.05％ Tween-20を含む1×PBS(PBS-T)中でリンスし、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗ビオチンストレプトアビジン(SA-HRP)(希釈1:1,000)と共に、室温で1時間インキュベートする。膜をPBS-T中で洗浄し、Western Cキット(Bio-Rad)を使用して現像する。
【０３５５】
別の一例では、これらのメンバーのビオチン化の後に、HEK 293細胞を回収し、回収された細胞のアリコートを溶解させ、これらの細胞溶解物をプルダウンアッセイに供する。簡潔に述べると、常磁性ストレプトアビジンビーズ[Dynabeads M-280 SA又はMyOne]を、1mLの1％ BSA/PBS/0.05％ Tween-20(PBT)中で4℃で1時間洗浄することによってブロッキングし、1mLのPBT中に再懸濁する。2.5mg/mLのビーズを、ビオチン化されたファージディスプレイされたペプチドの各調製物に添加する(2×1010CFU)。結合を、ロッキングプラットホーム上で4℃で1時間実施し、その後結合において1mLのPBS中で3回洗浄する。
【０３５６】
[実施例12]
細胞膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの回収
この実施例は、ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させ、次いで、宿主細胞の膜をトランスロケートしたメンバーによって発現された融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるように、これらの宿主細胞をインキュベートし、ビオチン化形態にある融合タンパク質を検出することによってこれらのビオチン化メンバーを決定又は同定し、ビオチン化融合タンパク質を単離/回収することによる、細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの決定/同定を実証する。
【０３５７】
核酸の高度に多様な混合物を、実施例1に記載されるように産生し、それぞれ実施例2及び実施例3に記載されるようにベクターDsbA-Avitag-pIII及びDsbA-Avitag-pVIII中にクローニングして、複数の非ビオチン化メンバー、即ち、融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージ足場を含む、バクテリオファージライブラリーを産生したが、これらの融合タンパク質は各々、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。
【０３５８】
これらのメンバーをビオチン化するために、大腸菌ビオチンリガーゼ(BirA)を発現するHEK 293細胞を24時間増殖させ、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1回洗浄してデブリを除去し、その後、少なくともディスプレイされた融合タンパク質がHEK 293細胞に侵入するのに十分な時間にわたって、ファージディスプレイライブラリー(およそ5×1012ファージ)と接触させた。反応を停止させるために、細胞を、DMEMで2回洗浄し、37℃で30分間〜1時間HBSS中でスブチリシンと共にインキュベートし、次いで、HBSS中のPMSFをこの培養物に添加し、これを、室温で15分間インキュベートした。外的に結合したファージを除去した処理細胞を、遠心分離によって収集し、DMEMで2回洗浄し、10mMピロリン酸塩溶液(PPi)を補充したM-PER緩衝液中で室温で溶解させて、ビオチンリガーゼ活性を阻害又は低減させた。
【０３５９】
ビオチン化される、細胞膜をトランスロケートしたペプチドを決定又は同定するために、細胞溶解物中のビオチン化融合タンパク質を検出した。まとめると、プルダウンを、細胞溶解物に対して、本明細書の実施例10に記載されたように基本的に実施して、内在化されたビオチン化メンバーを回収した。4〜5回の間の反復ラウンドのバイオパニングを、各スクリーニングのために実施した。
【０３６０】
これらの融合ペプチドを、融合ペプチドをディスプレイするバクテリオファージを回収し、核酸増幅によってこれらのメンバーを回収し、融合ペプチドをコードするこれらのメンバーのヌクレオチド配列を決定することによって、特徴付けた。次いで、融合ペプチドの候補ペプチド部分の推定アミノ酸配列を、以下によって分析した:
i.CD Hitクラスタリングプログラムを使用したペアワイズアラインメント、
ii.両親媒性、疎水性、電荷、サイズ、並びにアミノ酸組成、例えば、アルギニン及びリジン残基の存在についての、ペプチドの特徴付け、
iii.予測された二次構造の特徴付け、並びに
iv.ペプチドの新規性を決定するためのデータベースクエリー。
【０３６１】
バイオインフォマティクスは、PSIPREDアルゴリズムを使用した。例えば、McGuffinら、Bioinformatics 16 404-405 (2000)。データベースクエリーを、708の実験的に検証されたCPPのデータセットに基づく細胞透過効率のin silico予測を提供する、データベースCellPPD: Designing of Cell Penetrating Peptidesにおいて利用可能な公知のCPPのデータベースを使用して実施した。特に、CellPPDは、ペプチド中のCPP様モチーフの同定を含む、それらの配列に基づいて単離又は同定されたペプチドの各プールにおける、CPP様特性を有するペプチドの予測を可能にする。例えば、Gautamら、J. Translational Med. 11, 74 (2013)を参照のこと。
【０３６２】
CD Hitクラスタリングプログラムを、CPP様モチーフを同定するための50％よりも高い配列同一性を含む種々のクラスタリング閾値、及びミスマッチエラーを防止するための90％よりも高いクラスタリング閾値を、重複(redundant)配列を排除するための100％よりも高い配列同一性において、使用して実行した。実施したクラスタリング分析により、本発明のスクリーニング方法を使用することによって同定されたペプチドの大部分が、独自であること、又は1回提示されること、例えば、「シングルトン」であることが明らかになった。これは、メンバーの集団において低い頻度で提示される又は稀であるCPP様ペプチドを同定するためのこの方法の力を示す。高いレベルの配列多様性も、回収されたペプチド内で観察され、このことは、複数のメンバーが、本発明の方法を使用することによって同定可能な、新たな稀なクラスのCPP様ペプチドの供給源を提供することを示唆している。複数コピーの特定の配列も、回収された融合ペプチド中に存在し、これは、この方法の再現性を示している。
【０３６３】
機能的アッセイ(複数可)によるそれらの検証前の、ビオチン化メンバーによってコードされる回収されたペプチドの、バクテリオファージライブラリー、即ち、選択前の複数のメンバーのバイオインフォマティクス分析を、表2に提供する。提供されたデータは、各段階におけるペプチドプールのCPP様特性を示す。
【０３６４】
表2及び表3に提示されるデータは、本発明の方法の性能が、このファージライブラリー中に含まれるペプチドよりも高い平均長さ及び分子量のペプチドの回収、並びに低減された疎水性を有しアルファ-ヘリックスを形成する荷電ペプチドの回収に向かう明瞭なシフトを生じたことを示す。対照的に、回収されたペプチドにおけるβ-シートコンフォメーションの提示は、インプット非ビオチン化メンバーによってコードされるβ-シートコンフォメーションの割合と比較して低減され得る。これは、他のタンパク質機能性と比較してより高い割合の、CPP様特性を有するペプチドを示す、回収されたペプチドプールにおけるアルファ-ヘリックス構造の一般により高い提示及びβ-シートコンフォメーションのより低い提示の反映であり得る。負に荷電した残基と反対の、正に荷電した残基についての特異的富化、及びアルファヘリックスについての特異的富化は、細胞膜の二重層などの脂質二重層をトランスロケートすることが可能なペプチドの特性と、完全に一致している。
【０３６５】
回収されたペプチドの配列分析はまた、CPP様特性を有する49のペプチドが、スクリーニングしたおよそ5×1012のバクテリオファージのプールから、本明細書に記載される本発明の方法を使用して回収されたが、インプットファージライブラリーのランダムプールの約29のペプチドが、CPP様特性を有したことを示した。これは、本発明の方法を実施することによる、CPP様特性を有するペプチドについての富化を実証している。
【０３６６】
【表２】
2016523088.tif 000008
【０３６７】
PSIPREDアルゴリズムを使用して行った二次構造予測分析の結果を、表3に提供する。
【０３６８】
【表３】
2016523088.tif 000009
【０３６９】
本発明者らはまた、細胞に侵入したメンバーを回収するための、非ビオチン化メンバーの選択的ビオチン化に依存しない方法を使用して得られた結果に対して、本発明の方法を使用して得られた結果を比較し、例示的なデータを表4に提供する。このような比較方法は、WO 2012/159164中に記載されている。データは、本発明の方法が、CPP様特性を有するペプチドの改善された定性的回収及び定量的回収を提供することを示している。
【０３７０】
[実施例13]
細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの回収及び特徴付け
この実施例は、ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させ、次いで、宿主細胞の膜をトランスロケートしたメンバーによって発現された融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるように、これらの宿主細胞をインキュベートし、ビオチン化形態にある融合タンパク質を検出することによってこれらのビオチン化メンバーを決定又は同定し、ビオチン化融合タンパク質を単離/回収することによる、細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの決定/同定を実証する。
【０３７１】
核酸の高度に多様な混合物を、実施例1に記載されるように産生し、実施例5に記載されるようにベクターT7Select-Avitag-N中にクローニングして、複数の非ビオチン化メンバー、即ち、融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージ足場を含む、バクテリオファージライブラリーを産生したが、これらの融合タンパク質は各々、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。
【０３７２】
これらのメンバーをビオチン化するために、大腸菌ビオチンリガーゼ(BirA)を発現するHEK 293細胞を24時間増殖させ、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1回洗浄してデブリを除去し、その後、少なくともディスプレイされた融合タンパク質がHEK 293細胞に侵入するのに十分な時間にわたって、ファージディスプレイライブラリー(およそ5×1012のファージ)と接触させた。反応を停止させるために、細胞を、DMEMで洗浄し、37℃で1〜5分間、2mLの0.25％トリプシン/EDTAと共にインキュベートした。細胞を、遠心分離によって収集し、DMEMで2回洗浄し、1mMピロリン酸塩溶液(PPi)を補充したM-PER緩衝液中で室温で溶解させて、ビオチンリガーゼ活性を阻害又は低減させた。
【０３７３】
【表４】
2016523088.tif 000010
2016523088.tif 000011
【０３７４】
ビオチン化される、細胞膜をトランスロケートしたペプチドを決定又は同定するために、細胞溶解物中のビオチン化融合タンパク質を検出した。まとめると、プルダウンを、細胞溶解物に対して、本明細書の実施例10に記載されたように基本的に実施して、内在化されたビオチン化メンバーを回収した。4〜5回の間の反復ラウンドのバイオパニングを、各スクリーニングのために実施した。
【０３７５】
これらの融合ペプチドを、融合ペプチドをディスプレイするバクテリオファージを回収し、核酸増幅によってこれらのメンバーを回収し、融合ペプチドをコードするこれらのメンバーのヌクレオチド配列を決定することによって、特徴付けた。次いで、融合ペプチドの候補ペプチド部分の推定アミノ酸配列を、以下によって分析した:
(i)CD Hitクラスタリングプログラムを使用したペアワイズアラインメント、
(ii)両親媒性、疎水性、電荷、サイズ、並びにアミノ酸組成、例えば、アルギニン及びリジン残基の存在についての、ペプチドの特徴付け、
(iii)予測された二次構造の特徴付け、並びに
(iv)ペプチドの新規性を決定するためのデータベースクエリー。
【０３７６】
バイオインフォマティクスは、PSIPREDアルゴリズムを使用した。例えば、McGuffinら、Bioinformatics 16 404-405 (2000)。データベースクエリーを、708の実験的に検証されたCPPのデータセットに基づく細胞透過効率のin silico予測を提供する、データベースCellPPD: Designing of Cell Penetrating Peptidesにおいて利用可能な公知のCPPのデータベースを使用して実施した。特に、CellPPDは、ペプチド中のCPP様モチーフの同定を含む、それらの配列に基づいて単離又は同定されたペプチドの各プールにおける、CPP様特性を有するペプチドの予測を可能にする。例えば、Gautamら、J. Translational Med. 11, 74 (2013)を参照のこと。
【０３７７】
CD Hitクラスタリングプログラムを、CPP様モチーフを同定するための50％よりも高い配列同一性を含む種々のクラスタリング閾値、及びミスマッチエラーを防止するための90％よりも高いクラスタリング閾値を、重複配列を排除するための100％よりも高い配列同一性において、使用して実行した。実施したクラスタリング分析により、本発明のスクリーニング方法を使用することによって同定されたペプチドの大部分が、独自であること、又は1回提示されること、例えば、「シングルトン」であることが明らかになった。これは、メンバーの集団において低い頻度で提示される又は稀であるCPP様ペプチドを同定するためのこの方法の力を示す。高いレベルの配列多様性も、回収されたペプチド内で観察され、このことは、複数のメンバーが、本発明の方法を使用することによって同定可能な、新たな稀なクラスのCPP様ペプチドの供給源を提供することを示唆している。複数コピーの特定の配列も、回収された融合ペプチド中に存在し、これは、この方法の再現性を示している。機能的アッセイ(複数可)によるそれらの検証前の、ビオチン化メンバーによってコードされる回収されたペプチドの、バクテリオファージライブラリー、即ち、選択前の複数のメンバーのバイオインフォマティクス分析を、表5に提供する。提供されたデータは、各段階におけるペプチドプールのCPP様特性を示す。PSIPREDアルゴリズムを使用して行った二次構造予測分析の結果を、表6に提供する。
【０３７８】
【表５】
2016523088.tif 000012
【０３７９】
【表６】
2016523088.tif 000013
【０３８０】
表5及び表6に提示されるデータは、本発明の方法の性能が、このファージライブラリー中に含まれるペプチドよりも高い平均長さ及び分子量のペプチドの回収、並びに低減された疎水性を有しアルファ-ヘリックスを形成する荷電ペプチドの回収に向かう明瞭なシフトを生じたことを示す。対照的に、回収されたペプチドにおけるβ-シートコンフォメーションの提示は、インプット非ビオチン化メンバーによってコードされるβ-シートコンフォメーションの割合と比較して低減され得る。これは、他のタンパク質機能性と比較してより高い割合の、CPP様特性を有するペプチドを示す、回収されたペプチドプールにおけるアルファ-ヘリックス構造の一般により高い提示及びβ-シートコンフォメーションのより低い提示の反映であり得る。負に荷電した残基と反対の、正に荷電した残基についての特異的富化、及びアルファヘリックスについての特異的富化は、細胞膜の二重層などの脂質二重層をトランスロケートすることが可能なペプチドの特性と、完全に一致している。
【０３８１】
回収されたペプチドの配列分析はまた、CPP様特性を有する66のペプチドが、スクリーニングしたおよそ5×1012のバクテリオファージのプールから、本明細書に記載される本発明の方法を使用して回収されたが、インプットファージライブラリーのランダムプールによってコードされる26のペプチドだけが、CPP様特性を有したことを示した。これは、本発明の方法を実施することによる、CPP様特性を有するペプチドについての富化を実証している。
【０３８２】
本発明者らはまた、細胞に侵入したメンバーを回収するための、非ビオチン化メンバーの選択的ビオチン化に依存しない方法を使用して得られた結果に対して、本発明の方法を使用して得られた結果を比較し、例示的なデータを表7に提供する。このような比較方法は、WO 2012/159164中に記載されている。
【０３８３】
【表７】
2016523088.tif 000014
2016523088.tif 000015
【０３８４】
表7上に提供されるデータは、本発明の方法が、CPP様特性を有するペプチドの改善された定性的回収及び定量的回収を提供することを示している。
【０３８５】
[実施例14]
細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの回収及び特徴付けのための代替的プロトコール
この実施例は、ビオチンリガーゼを発現する細菌宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させ、次いで、宿主細胞の膜をトランスロケートしたメンバーによって発現された融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるように、これらの宿主細胞をインキュベートし、ビオチン化形態にある融合タンパク質を検出することによってこれらのビオチン化メンバーを決定又は同定し、ビオチン化融合タンパク質を単離/回収することによる、細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの決定/同定を実証する。
【０３８６】
核酸の高度に多様な混合物を、実施例1に記載されるように産生し、実施例5に記載されるようにベクターT7Select-Avitag-N中にクローニングして、複数の非ビオチン化メンバー、即ち、融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージ足場を含む、バクテリオファージライブラリーを産生したが、これらの融合タンパク質は各々、候補ペプチド部分及びビオチンリガーゼ基質ドメインを含む。
【０３８７】
これらのメンバーをビオチン化するために、実施例10に記載されるベクターpD864_BirA又はpD881_BirAベクターを含む大腸菌を、その実施例に従って誘導して、コドン最適化されたBirAをペリプラズムにおいて過剰発現させる。BirAを発現する細胞を、遠心分離によって収集する。候補ペプチドを発現するPelB-Avitag-pVIII誘導体ファージ(図4a)のライブラリー(実施例3)を、PEGを使用して沈殿させ、400ul PBS中に再懸濁し、Streptavidin-SpinTrapカラム(GE healthcare)を通過させて、任意の微量の内因的にビオチン化されたファージを除去する。溶出剤を、遠心分離によって収集し、PBS中約1×1013cfu/mlの濃度に調整し、収集した細胞ペレットを、バクテリオファージ中に再懸濁する。ビオチン化反応を、上記実施例に記載される混合物に対して実施する。次いで、これらの細胞を、遠心分離によって収集し、PBS/ピロリン酸塩中で洗浄し、BugBusterタンパク質抽出試薬(Merck/Millipore)中での懸濁及び20分間振盪しながらのインキュベートによって溶解させる。ビオチン化バクテリオファージを含む細胞溶解物の可溶性画分を、遠心分離によって収集し、保持する。これらのビオチン化バクテリオファージを、製造業者の指示に従って、磁性Streptavidin-Dynabeads(MyOne、Invitrogen)に結合させる。ビーズ捕捉されたファージクローンを、細菌細胞培養物を直接感染させることによって、バイオパニングの引き続くラウンドのために増幅する。ファージを、陽性クローンのアリコートの連続希釈に対してこの手順を反復することによって精製して、このファージが細菌細胞のペリプラズム又は細胞質に侵入するのを可能にするペプチドをディスプレイする個々のファージクローンについて富化する。
【０３８８】
スクリーニングは、バイオパニングの各ラウンドにおいて取得されたDynabead溶出剤のアリコート(20μl)をアッセイすることによって、モニタリングされ得る。これらのファージを、SDS-PAGE分離し、ウエスタンブロッティングによってタンパク質をナイロンメ膜に移し、この膜を、TBS-Tween中3％(w/v)のBSAを使用してブロッキングし、ビオチン化融合ペプチドを、Streptavidin-HRPコンジュゲート(TBST中1:1000)及びECL検出を使用して検出する。
【０３８９】
単離及び精製されたバクテリオファージを、一次配列によって特徴付け、富化された配列について分析し、検証アッセイに供する。
【０３９０】
[実施例15]
細胞の膜をトランスロケートすることが可能なペプチドの構造的分析
この実施例は、上述の実施例に従って細胞の膜をトランスロケートすることが可能であることが示された38の代表的ペプチドの一次構造分析及び二次構造分析を実証する。これらのペプチドを、ビオチンリガーゼを発現する宿主細胞を、複数の非ビオチン化メンバーと接触させ、次いで、宿主細胞の膜をトランスロケートしたメンバーによって発現された融合タンパク質のビオチンリガーゼ基質ドメインが、発現されたビオチンリガーゼによって酵素的にビオチン化されるように、これらの宿主細胞をインキュベートし、ビオチン化形態にある融合タンパク質を検出することによってこれらのビオチン化メンバーを決定又は同定し、ビオチン化融合タンパク質を単離/回収することによって、単離した。単離されたペプチドの一次配列及びCDスペクトルを決定した。データを表8にまとめる。
【０３９１】
表8に提示されたペプチド(配列番号83〜119)のコンフォメーションを決定するために、CD分光光度法を、異なるpH条件を含む種々の条件下で、膜模倣SDSミセルの存在下で実施した。表8に示されるT08_HBM_0103_0031、T08_HBM_0104_0084、T09_HBM_0103_0167、C10_ABH_0203_0169、C20_ABH_0404_1869及びC20_ABH_0304_1746と称されるペプチド、並びにPYCJX-0901と称されるさらなるペプチドなどの、合成及び精製されたFITC標識ペプチド(Mimotopes、Australia)に特徴的な二次構造を、10mM NaF中でpH4.5及び7.2で、並びに25mM SDS/10mM NaF中でpH4.5及び7.2で、CDスペクトルを収集することによって決定した。コントロールペプチドは、TAT、トランスポータン及びペネトラチンであった。簡潔に述べると、ペプチドストック溶液を、Baxter水中に、1mMの濃度になるように可溶化した。CDスペクトルのために、ペプチドを、ペプチド構造に対するpHの影響を評価するために、10mM NaF pH4.5又はpH7.2のいずれか中に、0.3mg/ml、最終体積300ulになるように希釈した。ペプチドコンフォメーションに対するミセル媒体の影響を、元のペプチド/緩衝溶液に30ul 275mM SDS/10mM NaF pH4.5又はpH7.2を添加することによって決定した。スペクトルを、ペプチド1つ当たり記録した4回のスキャンで、190nmと260nmとの間で記録した。全てのスペクトルを平均し、適切な緩衝液及び緩衝液/SDSミックスの平均したブランクCDスペクトルの減算によって、ベースラインを補正した。データ処理を、Xcelにおいて実施し、Prismを用いてグラフをプロットした。データを表9にまとめる。
【０３９２】
【表８】
2016523088.tif 000016
2016523088.tif 000017
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【０３９３】
【表９】
2016523088.tif 000019
【０３９４】
本明細書の表8及び表9に提示されるデータは、本発明のスクリーニング方法が、公知のCPP、特に、HIV-1 TAT、トランスポータン及びペネトラチンなどの当該分野で使用される参照CPPであるCPPと比較して、新規構造的特性を有するCPPを単離することを実証する。特に、本明細書に記載されるビオチンリガーゼエンドソームトラップ方法論を使用して単離されたペプチドは、異なるpHにおいて、及びSDSミセルの存在下で、ユニークな及び異なるコンフォメーション特徴を示し、一般に、CPPについての標準的ヘリックス二次構造パラダイムに従わない。
【０３９５】
[実施例16]
スプリットGFP補完アッセイの開発
この実施例は、以下による、CPP機能性を検証するためのスプリットGFP補完アッセイの実施化に対する低減を実証する:(i)再構成されたGFPの蛍光を決定することによって、細胞中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチド取り込みを検出するステップ、及び/又は(ii)細胞のエンドソームからの連結されたカーゴタンパク質の逃避をモジュレートするCPPの能力を決定するステップ。
【０３９６】
機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)又は高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)又はAcGFP又はTurboGFPが、試験CPP、及び任意選択で足場タンパク質と融合したGFP 11タグ(配列番号81)を含む第1の部分、並びにGFP 1-10検出子(配列番号86)を含む第2の部分から、細胞中へのCPP媒介性取り込みに依存した様式で再構成される、スプリットGFPアッセイ。一般に、GFP 1-10を、細胞の細胞質において発現させ、GFP 11-試験CPPペプチドを、再構成がCPP依存的様式で生じるように、細胞と接触させる。再構成されたGFPを、蛍光標識細胞分取(FACS)若しくは蛍光顕微鏡若しくはライブ共焦点顕微鏡又はそれらの組み合わせによって検出する。
【０３９７】
スプリットGFP補完アッセイの開発のための本明細書で報告される実験において、CHO-K1細胞又はHCC-827細胞を、GFP1-10コード構築物及びGFP11融合タンパク質コード構築物でトランスフェクトした、又は、GFP 1-10を発現するトランスフェクトされた細胞を、次いで、GFP 11融合タンパク質と接触させた。本発明者らは、CPPスクリーニングのための実際的な適用において、これらのプロトコールが、GFP 11融合タンパク質と次いで接触させられるGFP 1-10を発現するトランスフェクトされた細胞を使用するために改変されることに気が付いた。
【０３９８】
スプリットGFP補完アッセイの開発のための本明細書で報告される実験において、GFP活性の再構成を、蛍光顕微鏡によって評価した。試験アッセイにおける蛍光顕微鏡のために、細胞を、抗生物質を欠く培地250uL中5〜7.5×104細胞/ウェルで、荷電表面を有するチャンバースライド中に播種し、静置し、一晩接着させた。接着後、組換えGFP11融合タンパク質を、ウェルから60μLの培地を除去し、およそ等しい体積のタンパク質の40μMの作業ストック溶液を添加することによって添加した。さらに一晩のインキュベーション期間の後、培地を、ピペットを使用するなどして穏やかに細胞から除去し、細胞を、製造者の指示に従ってImage-iT Fix-Permキット(Molecular Probes、Life Tech)を使用して、固定又は透過処理した。スライドを洗浄し、DPBS中のBSAを使用してブロッキングし、蛍光を、ActinRed 555 Ready Probes Reagentの存在下で細胞をインキュベートすることによって可視化し、次いで洗浄し、DAPI/PBSを使用して染色し、洗浄し、軽く乾燥させ、蛍光顕微鏡によって可視化した。
【０３９９】
実験の1つのセットにおいて、本発明者らは、GFP 1-10及びGFP 11断片を別々にコードする構築物を使用する本発明の機能的アッセイにおける、GFP活性の再構成に対する足場部分の影響を試験した。図13に提示されるデータは、mGFP1-10を発現する構築物及びGFP 11を発現する構築物によるHEK293細胞の一過性トランスフェクションが、検出可能なレベルのGFP蛍光を生じないが、GFP11コード構築物への足場コード核酸の付加が、機能的GFPの再構成を改善することを示している。本明細書の図14に提示されるデータは、以下を実証する:
1.GFP 1-10及びMyD88-GFP 11についての構築物による細胞の共トランスフェクションは、主に円形細胞において再構成された細胞内GFPの高密度ポケットを生じる、
2.GFP 1-10及びβ-アクチン-GFP 11についての構築物による細胞の共トランスフェクションは、細胞質のあらゆる場所に、樹状特徴において濃縮されたスプリットGFP標識の散在性の局在化を生じる、
3.GFP 1-10及びRelA-GFP 11についての構築物による細胞の共トランスフェクションは、細胞質のあらゆる場所に、時折核から排除されたスプリットGFPの散在性の局在化を生じる、並びに
4.GFP 1-10及びMal-GFP 11についての構築物による細胞の共トランスフェクションは、細胞質のあらゆる場所に散在し、複数の小さい焦点において濃縮されるスプリットGFP発現を生じる。
【０４００】
細胞生存度は、Mal-GFP 11融合物又はβ-アクチン-GFP 11融合物を発現する細胞についてより高かったことが示されたが、MyD88-GFP 11融合物又はRelA-GFP 11融合物の発現は、細胞生存度を低減させた。従って、本発明者らは、CPP活性を検証するための好ましいスプリットGFP補完アッセイプロトコールが、組換えCPP-Mal-GFP 11融合タンパク質又は組換えCPP-β-アクチン-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-CPP-GFP 11融合タンパク質又は組換えβ-アクチン-CPP-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-GFP11-CPP融合タンパク質又は組換えβ-アクチン-GFP11-CPP融合タンパク質と次いで接触させられる、GFP 1-10を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用することを考えた。
【０４０１】
図15に提供されるデータは、ヒト最適化され補正されたアミノ酸配列(本明細書では「hGFP1-10(g)」)を産生するために、適切な位置において市販のGFP 1-10の変異体ヌクレオチドAでGを置換することによる、GFPのヒトコドン最適化が、再構成されたGFP 11及びGFP 1-10断片から、ヒト細胞において再構成されたGFPシグナルを改善することを実証する。このデータは、コドン最適化されたGFP 1-10が、ヒト細胞においてpcDNA4/TOベクターから発現される場合に(「hGFP1-10(g)/TO」)、より高いレベルのGFP再構成が生じることも示している。従って、発明者らは、CPP活性を検証するための好ましいスプリットGFP補完アッセイプロトコールが、ベクターhGFP1-10(g)/TOでトランスフェクトされることによってhGFP1-10(g)を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用し、細胞を、組換えCPP-Mal-GFP 11融合タンパク質又は組換えCPP-β-アクチン-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-CPP-GFP 11融合タンパク質又は組換えβ-アクチン-CPP-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-GFP11-CPP融合タンパク質又は組換えβ-アクチン-GFP11-CPP融合タンパク質と接触させることを考えた。より好ましくは、これらの細胞を、組換えCPP-Mal-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-CPP-GFP 11融合タンパク質又は組換えMal-GFP11-CPP融合タンパク質と接触させて、増強された細胞生存度を有する機能的GFPの上昇した再構成を達成する。
【０４０２】
本発明者らは、融合タンパク質のMal又はβ-アクチン足場とGFP 11部分との間にリンカーを配置することの影響も試験した。本発明者らは、各々、MyD88-GFP 11融合物、Mal-GFP 11融合物、β-アクチン-GFP 11融合物、Sumo-GFP 11融合物又は受容体結合ドメイン(RBD)-GFP 11融合物をコードする構築物の文脈において、GSSGGSSGGSSGGSSGからなる16マーのアミノ酸配列(S11v4)、GGTGGSGGAGGTGGSGGAからなる18マーのアミノ酸配列(S11v5)、GTTGGTTGGGTGGSからなる14マーのアミノ酸配列(S11v6)又はAPAPAPAPAPからなる10マーのアミノ酸配列(S11v7)をコードする核酸の影響を試験した。各構築物についての平均蛍光を、図16に示す。図16に提供されるデータは、MyD88-GFP11融合タンパク質コード構築物又はMal-GFP11融合タンパク質コード構築物については、GFPの最適な再構成を得るためにリンカーを使用しないことが好ましいが、組換えβ-アクチン-GFP11融合タンパク質コード構築物又はSumo-GFP11融合タンパク質コード構築物又はRBD-GFP11融合タンパク質コード構築物については、最大18残基長の長さを有するリンカーが、GFPの再構成に対してほとんど又は全く悪影響なしに耐容され得ることを示している。従って、本発明者らは、CPP活性を検証するための好ましいスプリットGFP補完アッセイプロトコールが、ベクターhGFP1-10(g)/TOでトランスフェクトされることによってhGFP1-10(g)を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用し、細胞を、リンカーなしの組換えCPP-Mal-GFP 11若しくはMal-CPP-GFP 11若しくはMal-GFP11-CPP融合タンパク質のいずれかと、又は或いは最大約18残基長のリンカーあり若しくはなしの組換えCPP-β-アクチン-GFP 11若しくはβ-アクチン-CPP-GFP 11若しくはβ-アクチン-GFP11-CPP融合タンパク質と接触させることを考えた。
【０４０３】
本発明者らは、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する単離されたHEK-293細胞におけるスプリットGFP活性の再構成に対するカーゴタンパク質の影響も考慮した。HEK-293細胞を、GFP 1-10ベクターpcDNA4/TOベクター[TO hGFP1-10(a)]又はpcDNA4/HMベクター[HM hGFP1-10(a)]でトランスフェクトし、組換えGFP 11コード構築物をこれらの細胞に添加し、蛍光活性を、MyD88-GFP11及びmGFP1-10構築物を使用するトランスフェクションについて得られた蛍光に対して標準化された値として決定した。図17に提示されるデータは、カーゴペプチドが、そのペプチドの細胞透過活性とは独立して、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する単離されたHEK-293細胞におけるスプリットGFP活性の再構成をモジュレートできることを示している。これらのデータは、in vitroのスプリットGFP活性の再構成に対する特定のカーゴ融合ペプチドの影響を試験するために、in vitro補完を実施することの利点が存在することを示唆している。
【０４０４】
本発明者らは、GFP 11+GFP 1-10断片を発現する細胞におけるスプリットGFP活性の再構成が、異なる細胞株中へのCPP-カーゴ-GFP 11融合ポリペプチドの取り込みを検出することも示した。本発明者らは、pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定されるようなトランスフェクション効率について標準化された、総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率を決定した。蛍光を、hGFP1-10(g)/TOで一過性にトランスフェクトされ、次いで、CPP及び受容体結合ドメイン(RBD)カーゴタンパク質及びGFP 11を含む組換え融合タンパク質2.5〜80μMと接触させた、HCC-827(高い受容体発現)及びCHO-K1(陰性の受容体発現)細胞に対して決定した。スプリットGFP補完を、生細胞集団に対してゲートするフローサイトメトリーを使用してGFP蛍光を測定することによって検出した。図18に提示されるデータは、蛍光シグナルが、試験した各構築物について用量応答的であり、新鮮な及び凍結したタンパク質サンプルについて取得可能であったことを示している。
【０４０５】
本発明者らは、本発明のスプリットGFP補完アッセイが、CHO-K1細胞(接着性、げっ歯類、受容体発現について陰性)、HCC-827細胞(接着性、ヒト、受容体発現について強く陽性)、HEK293細胞(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)、HEK293/GFP1-10細胞(接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性、モノクローナルのhGFP1-10(g)/TOで安定に形質転換された)及びK562細胞(非接着性、ヒト、受容体発現について中程度/低く陽性)を含む異なる細胞株において、GFP 11のCPP媒介性取り込み及び機能的GFP活性の再構成を検証又は試験するために有効であることも示した。各細胞株を、hGFP1-10(g)/TOベクターで一過性にトランスフェクトし、これに、RBD-GFP 11カーゴ融合ポリペプチド(RBD_S11)又はチオレドキシン-GFP 11カーゴ融合ポリペプチドに連結された公知のCPP(TAT又はPYJ01)を添加した。陰性コントロールは、HisMBP、又はCPPを欠く、若しくはCPPの代わりに第2のカーゴタンパク質PYC35を含むカーゴ融合ポリペプチドであった。蛍光を、5〜40μMの細胞タンパク質に対して決定し、pcDNA3-eGFPによる各細胞株の独立したトランスフェクションにおいて決定されるようなトランスフェクション効率について標準化した、各総生細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率を決定した。図20に提示されるデータは、機能的アッセイにおいてGFP活性の再構成を提供する唯一の検証されたCPP TAT及びPYJ01と共に、CPPを欠いたアッセイについてのベースライン蛍光を、用量依存的様式で、試験した各異なる細胞株について示す。
【０４０６】
図21に提示されるデータは、hGFP1-10(g)/TOで一過性にトランスフェクトされたCHO-K1細胞又はHCC-827細胞中への高度に精製された組換えPYJ01-RBD-GFP11融合タンパク質の取り込みも確認する。陰性コントロールは、PYJ01 CPPを欠くRBD-GFP11融合ポリペプチドを使用した。同様に、図22に提供されるデータは、TAT、PYJ01、VP22、SAP及びPTD4を含むいくつかの異なる公知のCPPの活性を検証することによって、本発明のスプリットGFP補完アッセイを検証する。
【０４０７】
従って、この実施例に提供されるデータは、CPP活性を決定するためのスプリットGFP補完アッセイの有用性を実証する。この知見に基づいて進めて、本発明者らは、本明細書の図19に提示されるワークフローを開発した。このワークフローに従って、スプリットGFP補完アッセイは、ヒト細胞又は非ヒト細胞において、GFP11、及び任意選択で、Mal又はβ-アクチンなどの足場との融合物として、試験CPPを発現させるステップを含む。これらの細胞は、ヒトコドン最適化されたhGFP1-10(g)/TO構築物でトランスフェクトされたHCC-827(高い受容体発現)又はCHO-K1(陰性の受容体発現)細胞であり得る。次いで、スプリットGFP補完を、生細胞集団に対してゲートするフローサイトメトリーなどによってGFP蛍光を測定することによって検出する。このシグナルは、総生細胞集団におけるパーセントGFP陽性細胞として表され得、pcDNA3-eGFPなどの異なる構築物による各細胞株の独立したトランスフェクションについて決定されるような、トランスフェクション効率のレベルについて標準化され得る。この好ましい試験の例示的なワークフローは、本明細書の図19によって提供される。
【０４０８】
[実施例17]
スプリットGFP補完アッセイを使用した、ペプチドのCPP活性の検証
この実施例は、本明細書の上に記載したように開発したスプリットGFP補完アッセイを使用したCPP機能性の検証を実証し、本明細書に記載される本発明の方法によって同定されたCPPが、トランスポータン、VP22、ヒトカルシトニン(9-32)、Ypep、PEP1、SAP、Kaposi FGF及びPTD4を含む、公知の又はいわゆる「標準的」CPPの構造とは構造的に別個であることを実証する。
【０４０９】
本明細書に記載されるスプリットGFP補完アッセイを、以下のプロトコールに従って実施した。簡潔に述べると、HCC-827、CHO-K1、K562、H292及びJurkat細胞を、10％FCS(Novagen)及び100U/mL Pen/Strep(Gibco)を補充したRPMI(Gibco)+Glutamax(Gibco)培地において培養した。H292細胞は、それらの培地中の10mM HEPES(Gibco)も受け、HCC-827細胞は、10mM HEPES(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)及びNEAA(Gibco)も受けた。GFP1-10を発現するHEK-293、A549、C3H10T1/2、NIH3T3、SW620及びHEK-293細胞を、10％FCS(Bovogen)及びPen/Strep(Gibco)を補充したDMEM(Gibco)+Glutamax(Gibco)培地において培養し、安定な細胞株は、選択剤として200μMゼオシン(Invitrogen)も受けた。
【０４１０】
細胞を、1日前に1:2(v/v)若しくは1:3(v/v)で培養物を分割することによって(CHO-K1細胞)、又は4日前に1:8(v/v)で培養物を分割し(HCC-827細胞)、1日前に培地を置き換えることによって、又は播種の1日前に1:2(v/v)で培養物を分割することによって(GFP1-10を発現するように安定に形質転換されたHEK-293細胞)、エレクトロポレーションのために調製した。トランスフェクションの当日に、細胞を採取し、遠心分離によってペレット化し、PBSで洗浄し、遠心分離によって再度ペレット化し、その後、2×107細胞/mlの濃度でBuffer R(Invitrogen)中に再懸濁した。
【０４１１】
細胞を、Buffer R(Invitrogen)中の等体積のカラム精製したpcDNA4/TO_hGFP1-10g DNA(200μg/mL)と様々に組み合わせ、1×107細胞/mL及び100μg/mL DNAからなる混合物を得た。100μL Neon Transfection系(Invitrogen)トランスフェクションチップを使用して、100μLの細胞/DNA混合物を混合し、引き出し、3セットのトランスフェクション条件:1450V、20ms、1パルス(HCC-827及びHEK-293)、1230V、30ms、2パルス(A549)、又は1620V、10ms、3パルス(全ての他の細胞株)、のうちの1つを使用してトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞を、それらの培養培地の抗生物質を含まないバージョン中に希釈し、平底(懸濁細胞のためにはU底)96ウェルプレート中に、1ウェル当たり75μLを、1ウェル当たり7,500〜30,000細胞の範囲の密度で播種した。GFP1-10安定なHEK-293細胞を、5,000細胞/ウェルで播種した。プレートを、CHO-K1を除く全ての細胞株について、二連で播種した。
【０４１２】
プレートを、37℃、5％ CO2で16〜24時間インキュベートし、次いで、GFP11融合タンパク質(1ウェル当たり25μL、フィルター無菌pH7.4 PBS中に希釈)を、手動による穏やかなオシレーションを用いて添加した。プレートを、37℃、5％ CO2でさらなる20〜24時間にわたって、インキュベータ中に戻した。フローサイトメトリーのためにプレートを調製するために、これらを、PBSで洗浄し、トリプシンの存在下でインキュベートし、クエンチし、再懸濁し、FACSプレートに移し、その後、さらに冷PBSで洗浄した。細胞を、1ウェル当たり50μLのViolet Live/Dead染色(1％ FCSを含むPBS中に1:1000(v/v)希釈)で染色し、4℃で30分間インキュベートし、光から保護した。次いで、プレートを、1％ FCSを含む冷PBSで2回洗浄し、その後、1％ FCSを含む100μLの冷PBS中で、各ウェルを再懸濁した。
【０４１３】
フローサイトメトリーを、FSCのレーザー設定:360V、SSC:250V、Pacific Blue:250V、FITC:230V(Jurkat細胞について、これらの設定を、これらの細胞がより小さいことに起因して変動させた)を用いて、BD Fortessaフローサイトメーター上で実施した。収集する事象の最大数を、100,000、又は1ウェル当たり24秒の注入のうちの、最初に到達する方に設定した。データの分析を、FlowJo 10を使用して実施した。ほとんどの細胞株について、単一細胞集団を、FSC-H対FSC-Wをプロットすることによってゲートして、デブリ及び集団からの二重項(doublet)を排除した。次いで、この単一細胞集団を、FITC-A対Pacific Blue-Aでプロットし、健康なGFP補完された細胞集団が左下隅に現れ、この集団が、HisMBPタンパク質を添加したGFP1-10トランスフェクトされた細胞における単一細胞集団の0.5％に近づく(しかし0.5％を超えない)ように、クアドラント(quadrant)ゲートを配置した。
【０４１４】
エンドソームトラップアッセイにおいてそれらのビオチン化によって決定される細胞中への取り込みについて陽性であった38のペプチド(配列番号83〜119)の初期スクリーニングから試験した23のペプチドのうち、9つのペプチドは、スプリットGFP補完アッセイによって決定したように、CPP活性についても明らかに陽性であり、14のペプチドは、スプリットGFP補完アッセイによって決定したように、CPP活性について弱く陽性であった。これは、エンドソームトラッピングによる一次スクリーニングの特徴的能力についての高いレベルの検証を示す。
【０４１５】
本発明のスプリットGFP補完アッセイが、公知の又はいわゆる「標準的」CPP中に存在する構造的特徴への特徴的バイアスを有するか否かを決定するために、本発明者らは、スプリットGFP補完活性について陰性であるペプチドに対して、スプリットGFP補完活性について陽性であるCPPの構造的特性を比較した。
【０４１６】
実験の1つのセットにおいて、本発明者らは、この機能性を有さないこと(「スプリットGFP陰性」)が本明細書で実証されたペプチドのアミノ酸組成、正味の電荷、疎水性、長さ及び予測された二次構造と、本発明のスプリットGFP補完アッセイにおける機能的GFPの再構成によって決定される、細胞の細胞質中にGFP11を輸送する能力を有する(「スプリットGFP陽性」)ことが本明細書で実証されたペプチドのアミノ酸組成、正味の電荷、疎水性、長さ及び予測された二次構造を比較した。図23に提示されるデータは、一般に、このアッセイが、アミノ酸組成に関して識別しないが、より高い組成のシステイン(C)、グルタミン酸(E)又はリジン(K)を有するペプチドに対して選択し得ることを示している。図24に提示されるデータは、正味の電荷、pH6.8における疎水性に関して顕著な差異が存在すること、及びこのスプリットGFP補完アッセイが、ペプチドについて予測された構造又はペプチド長さに関して識別しないことを示している。本発明者らは、スプリットGFP陰性であるペプチドがCPP活性を示す可能性が本質的に低いという可能性を排除していない。
【０４１７】
実験のさらなるセットにおいて、本発明者らは、公知のCPP(「標準的CPP」)のアミノ酸組成、正味の電荷、疎水性、長さ及び予測された二次構造と、本発明の単離されたCPP(配列番号83〜119)のアミノ酸組成、正味の電荷、疎水性、長さ及び予測された二次構造を比較しようとした。図25に提示されるデータは、標準的CPPが、高いレベルのアラニン(A)及びアルギニン(R)を有するが、本発明のエンドソームビオチン化トラップ及びスプリットGFP補完アッセイの両方において陽性である本発明のCPPは、高いレベルのリジン(K)、アルギニン(R)及びプロリン(P)を有することを示している。本発明のCPPと標準的CPPとの間のフェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)及びスレオニン(T)のレベルにおける差異も、高度に顕著である。図26に提示されるデータはまた、標準的CPPと本発明のCPP(配列番号83〜119)との間の正味の電荷、疎水性及びペプチド長さの各々において顕著な差異を示し、本発明のペプチドが、非標準的CPPの新たな構造的クラスを提示し得ることを示唆している。
【０４１８】
[実施例18]
CPP機能性を検証するためのタンパク質阻害アッセイの開発
この実施例は、以下による、CPP機能性を検証するためのタンパク質阻害アッセイの実施化に対する低減を実証する:(i)ボウガニンポリペプチド及びCPP、及び任意選択で足場タンパク質部分を含む融合ポリペプチドを発現する細胞のアポトーシス及び低減された生存度を検出するステップであって、細胞へのボウガニンの輸送が、CPPによって媒介される、ステップ。
【０４１９】
本発明者らは、以下のような、本明細書の配列番号120〜132に示される融合タンパク質をコードする様々な異なる核酸構築物を、このアッセイを実施するために産生した:
1.ボウガニンをコードする配列を含み、以下をさらに含む、His-ボウガニン融合タンパク質構築物(配列番号120):(i)ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してN末端の、ヘキサヒスチジンをコードする配列、及び(ii)そのC末端部分におけるCPP配列の任意選択の付加を促進するための、ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してC末端の、配列GSGATAGSAATGGATGGSTSをコードする配列、
2.GSGATAGSAATGGATGGSTSをコードする配列が、融合タンパク質のソルターゼ(sortase)媒介性の標識化を促進するための、ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してC末端の、GGSGGTLPETGGをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号120と類似した、His-ボウガニン-LPETGG融合タンパク質構築物(配列番号121)、
3.GSGATAGSAATGGATGGSTSをコードする配列が、RBD受容体結合及び融合タンパク質のソルターゼ媒介性の標識化を促進するための、ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してC末端の、GGSGGTRBDGSSGGAGGAGGSLPETGGをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号120と類似した、His-ボウガニン-RBD-LPETGG融合タンパク質構築物(配列番号122)、
4.GSGATAGSAATGGATGGSTSをコードする配列が、RBD受容体結合及びそのC末端部分におけるCPP配列の任意選択の付加を促進するための、ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してC末端の、GGSGGTGGSRBDGTSGGTGGSをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号120と類似した、His-ボウガニン-RBD(第1世代)融合タンパク質構築物(配列番号123)、
5.GSGATAGSAATGGATGGSTSをコードする配列が、RBD受容体結合及びそのC末端部分におけるCPP配列の任意選択の付加を促進するための、ボウガニンをコードする配列とインフレームで、このボウガニンをコードする配列に対してC末端の、GSGTGSATSGSLAGSGATAGTGSGGSRBDGTGTASGGAGTGSGTSをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号120と類似した、His-ボウガニン-RBD(第2世代)融合タンパク質構築物(配列番号124)、
6.GSRBDGTGSGTGSATSGSLAGSGATAGTGSGをコードする配列が、RBD受容体結合及びそのC末端部分におけるCPP配列の任意選択の付加を促進するための、インフレームのヘキサヒスチジン-RBD-ボウガニンタンパク質を産生するための、ヘキサヒスチジンをコードする配列の下流かつボウガニンをコードする配列の上流に挿入されてはいるが、配列番号120と類似した、His-RBD-ボウガニン融合タンパク質(第1世代)構築物(配列番号125)、
7.ボウガニンをコードする配列のすぐ上流のTGSATSGSLAGSGATAGTGSGをコードする配列を欠いてはいるが、そのC末端部分におけるCPP配列の任意選択の付加の能力が保持されるような、配列番号125と類似した、His-RBD-ボウガニン融合タンパク質(第2世代)構築物(配列番号126)、
8.融合タンパク質の残基2の後のCPPをコードする配列の任意選択の挿入を促進するための、ボウガニンをコードする配列の上流で、このボウガニンをコードする配列とインフレームの、リンカーGGTSASGGAGTGSGをコードする配列、及びボウガニンをコードする配列の下流で、このボウガニンをコードする配列とインフレームの、ヘキサヒスチジンをコードする配列を含む、ボウガニン-His融合タンパク質構築物(配列番号127)、
9.ASGGAGTGSGをコードする配列が、ソルターゼコンジュゲート化及びRBD受容体結合を促進するための、GGGRBDGSSGGSSGGTをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号127と類似した、RBD-ボウガニン-His(第1世代)融合タンパク質構築物(配列番号128)、
10.GGTSASGGAGTGSGをコードする配列が、融合タンパク質の残基2の後にCPPをコードする配列を導入する能力を破壊することなくRBD受容体結合を促進するための、GGTGGSRBDGGSGGTGGSをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号127と類似した、RBD-ボウガニン-His(第2世代)融合タンパク質構築物(配列番号129)、
11.N末端配列MGGTSASGGAGTGSGをコードする配列が、RBD受容体結合を促進するための、N末端配列RBDGTGSGTGSATSGSLAGSGATAGTGSGをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号127と類似した、RBD-ボウガニン-His(第3世代)融合タンパク質構築物(配列番号130)、
12.融合タンパク質の残基2の後のCPPをコードする配列の導入を促進するための、RBD受容体結合ドメインの上流のMGGTSASGGAGTGSGGSをコードする配列をさらに含んではいるが、配列番号130と類似した、RBD-ボウガニン-His(第4世代)融合タンパク質構築物(配列番号131)、並びに
13.N末端配列MGGTSASGGAGTGSGをコードする配列が、融合タンパク質の残基2の後のCPPをコードする配列の導入を促進するための、N末端配列MGGTSGSGATAGSAATGGATGGSをコードする配列で置き換えられてはいるが、配列番号127と類似した、ボウガニン-RBD-His融合タンパク質構築物(配列番号132)であって、リンカー及びRBD-受容体結合ドメインをコードする配列は、C末端リンカー配列GGS及びヘキサヒスチジンコード配列の上流に位置付けられている、構築物。
【０４２０】
CPPの、ボウガニンタンパク質を細胞中にトランスロケートする能力、並びに細胞生存度を低減及び/又はアポトーシスを誘導する能力を試験するために、本明細書の表9に列挙されるものを含むCPPが、コードされたHis-ボウガニン-RBD融合タンパク質とインフレームで発現されるように、CPPを、配列番号123に示されるタンパク質構築物をコードするベクター中にクローニングした。CPPが、コードされたHis-RBD-ボウガニン融合タンパク質(配列番号125〜126)とインフレームで、このコードされたHis-RBD-ボウガニン融合タンパク質(配列番号125〜126)のC末端部分において発現されるように、又は或いは、CPPが、ボウガニン-His融合タンパク質(配列番号127)又はRBD-ボウガニン-His(配列番号131)融合タンパク質とインフレームで、このボウガニン-His融合タンパク質(配列番号127)又はRBD-ボウガニン-His(配列番号131)融合タンパク質のN末端部分において、即ち、融合タンパク質の残基2の後で発現されるように、表9中のT08_HBM_0104_0084と称されるペプチドをコードする核酸も、配列番号15〜127及び131の各々に示される融合タンパク質構築物をコードするベクター中に独立して導入した。
【０４２１】
ボウガニン融合タンパク質構築物の発現のために、細菌細胞培養物を、50μg/mlカナマイシンを含むLuria Broth(LB)において樹立した。簡潔に述べると、1mlの培養培地を、96深型ウェルプレートのウェルに添加し、細菌グリセロールストック接種材料を添加し、培養物を、250r.p.m.で振盪しながら30℃で一晩インキュベートした。次いで、一晩培養物を使用して、1.8Lの同じ培地を接種し、発現培養物の100mlアリコートを、250mlフラスコに移した。細胞の培養後、これらの細胞を、4000r.p.m.で15分間の遠心分離によって収集し、培地をデカントし、25mlの冷却PBSを、各細胞ペレットに添加した。これらのペレットを再懸濁し、50ml Falconチューブに移した。細胞を、前と同様に遠心分離によって採取し、上清をデカントし、細胞ペレットを凍結させた。次いで、細胞を、プロテアーゼインヒビターを含む2mlのBugBuster MasterMix中での懸濁によって溶解させ、溶解物を24ウェルプレートに移し、17,000×gで15分間(4℃)遠心分離し、上清を保持した。溶解物からの発現されたヘキサヒスチジン含有融合タンパク質の精製のために、24ウェルプレート中の0.5ml Ni Sepharose樹脂カラムを、5mlの水で洗浄し、300mM NaCl及び20mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウム5mlで平衡化した。これらの溶解物を、Ni Sepharose樹脂カラムに添加し、完全に混合し、未結合の材料を、重力流の下で流した。未結合のサンプルを、2アリコートの、各々10mlの同じ緩衝液、即ち、300mM NaCl及び20mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウムで、洗浄した。結合したヘキサヒスチジン含有融合タンパク質を、300mM NaCl及び500mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウム0.5mlを使用して溶出させた。溶出したタンパク質を、600μl PhyTIpsで脱塩した。発現された融合タンパク質(各脱塩サンプルの2μl)を、1ゲル当たり25mAで50分間、Tris-グリシン泳動緩衝液を使用して、SDS-PAGE(12％ TGXゲル、BioRad)によって分析した。タンパク質の定量化のために、サンプルを、0.22ミクロンPVDFフィルター(Millipore)を通過させ、BCAタンパク質アッセイを使用して定量化した。
【０４２２】
データ(示さず)は、細胞におけるボウガニンの発現が、用量依存的様式でタンパク質発現を阻害することを示している。CPP単独は、タンパク質発現に有害な影響を与えないが、ボウガニンのN末端又はC末端におけるCPPの連結は、72時間の期間にわたるタンパク質合成における顕著な低減を生じ、この効果は、細胞へのボウガニンの侵入を媒介することにおけるCPPの活性に帰され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ−Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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