(57)【要約】【課題】組換え活性遺伝子２遺伝子ターゲッティングベクター、そのベクターが導入された兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産とその製造方法および活用。【解決手段】本発明は、Ｒａｇ−２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ２）遺伝子ターゲッティングベクター、そのベクターが導入された兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産とその製造方法および活用に関する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に用いて突然変異体胚芽を生成する段階を含む、組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産方法。
【請求項２】
前記タレンは、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターの形態で用いて当該細胞を形質感染させて行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の生産方法によって生産された組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタ。
【請求項４】
細胞にブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位を認知して当該遺伝子配列またはその周辺の変形を誘導可能なＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターとモノマー赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）遺伝子、配列番号１からなるプログラム化可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ｎｕｃｌｅａｓｅのターゲット配列、エンハンサー緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびＨ−２ＫＫ遺伝子を含むレポーターベクターを一緒に導入して、前記ＲＦＰ、ＧＦＰおよびＨ−２ＫＫポジティブの細胞を組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２がターゲッティングされた細胞に分類する方法。
【請求項５】
前記Ｈ−２ＫＫの検出は、抗体によって行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＦＰおよびＧＦＰの発現は、流動細胞分析法によって検出することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞。
【請求項８】
前記細胞は、ＲＡＧ２ノックアウトミニブタ線維芽細胞の細胞株ＫＣＴＣ１２４９６であることを特徴とする請求項７に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒａｇ−２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ２）遺伝子ターゲッティングベクター、そのベクターが導入された兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産とその製造方法および活用に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症複合免疫欠乏症（Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、以下、「ＳＣＩＤ」という）は、ヒトから観察される（非特許文献１）；しかし、治療剤は、ヒトＳＣＩＤタイプを反映する動物モデルに制限されていることによって開発が進まなかった。ブタはヒトと類似の生理的な特性を共有し、げっ歯類モデルに比べてより高い類似性を有する多くのヒト疾患を複製する（非特許文献２）。したがって、ＳＣＩＤブタは、ヒト疾患を複製するモデルを代表することができる。また、ブタＳＣＩＤモデルは、癌研究、細胞移植、および薬物の開発研究に使用できる。
【０００３】
組換え活性遺伝子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ２、以下、「ＲＡＧ２」という）は、ヒトにおける常染色体（ａｕｔｏｓｏｍａｌ）関連ＳＣＩＤ疾患に関与する（非特許文献３）。ＲＡＧ２において突然変異は損傷したＢおよびＴ細胞を引き起こし、ＲＡＧ２はＶ（Ｄ）Ｊ再配列に重要であるため、適応免疫システムを破壊する（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００４−００７４１０８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２２，６２５−６５５（２００４）
【非特許文献２】Ｗｈｙｔｅ，Ｊ．Ｊ．＆Ｐｒａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ７８，８７９−８９１（２０１１）
【非特許文献３】Ｖｉｌｌａ，Ａ．，Ｓａｎｔａｇａｔａ，Ｓ．，Ｂｏｚｚｉ，Ｆ．，Ｉｍｂｅｒｔｉ，Ｌ．＆Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏ，Ｌ．Ｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９，８７−９７（１９９９）
【非特許文献４】Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ６８，８５５−８６７（１９９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の必要性によってなされたものであって、その目的は、ＳＣＩＤ表現型を引き起こす遺伝工学的ブタを生産する効果的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に用いて突然変異体胚芽を生成する段階を含む、組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産方法を提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、前記タレンは、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターの形態で用いて当該細胞を形質感染させて行われることが好ましいが、これに限定されない。
【０００９】
また、本発明は、前記本発明の生産方法によって生産された組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタを提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、細胞にブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位を認知して当該遺伝子配列またはその周辺の変形を誘導可能なＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターとモノマー赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）遺伝子、配列番号１からなるプログラム化可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ｎｕｃｌｅａｓｅのターゲット配列、エンハンサー緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびＨ−２ＫＫ遺伝子を含むレポーターベクターを一緒に導入して、前記ＲＦＰ、ＧＦＰおよびＨ−２ＫＫポジティブの細胞を組換え活性遺伝子（ＲＡＧ）２がターゲッティングされた細胞に分類する方法を提供する。
【００１１】
本発明の一実施形態において、前記Ｈ−２ＫＫの検出は、抗体によって行うことが好ましく、
本発明の他の実施形態において、前記ＲＦＰおよびＧＦＰの発現は、流動細胞分析法によって検出することが好ましいが、これに限定されない。
【００１２】
また、本発明は、タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の２番染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を提供する。
【００１３】
前記細胞は、２０１３年１０月２日付で大韓民国大田市儒城区所在の韓国生命工学研究院遺伝子銀行（生物資源センター）に受託番号ＫＣＴＣ１２４９６ＢＰとして寄託した。
【００１４】
以下、本発明を説明する。
【００１５】
本発明において、本発明者らは、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が伴ったＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）−媒介遺伝子ターゲッティングを用いてＳＣＩＤ表現型を引き起こす２つのタイプの遺伝工学的ブタを生産する効果的な方法を報告する。
【００１６】
ブタＲＡＧ２をターゲットするために、特定ＴＡＬＥＮｓを考案し、Ｔｏｏｌｇｅｎ（Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）で合成した。そのＴＡＬＥＮｓは、ＲＡＧ２のエクソン２上で突然変異を引き起こすように考案した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮ認知部位を含むレポーターをＴＡＬＥＮセットを適切に発現する細胞を同定するのに使用した（図３および図１Ｂ）。考案されたＴＡＬＥＮｓの活性をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にレポーターを有するＴＡＬＥＮセットを挿入して認証した（図１Ｃ）。認証後、ＴＡＬＥＮｓおよびレポーターをコーディングする構築物を電気穿孔法によってブタ線維芽細胞に挿入した。４８時間後、細胞をＧＦＰ陽性細胞に対して分類し（図４）。９６−ウェルプレートに各ウェルあたり細胞１つずつプレーティングした。１０日後、細胞を継代し、その細胞の半分を遺伝型分析に使用した。
【００１７】
予測されたＴＡＬＥＮ切断部位の、隣接する小さいＰＣＲ切片（約４００ｂｐ）のシーケンシングは、ＲＡＧ２グループのすべてでＴＡＬＥＮｓ由来挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）の存在を示した；ＲＡＧ２に対して全体５７コロニーをスクリーニングする（表１のプライマー情報参照）。遺伝子ターゲッティングの効率は、ＲＡＧ２に対しては４２．１％（２４／５７）であった。
【００１８】
本発明者らは、ＲＡＧ２ＴＡＬＥＮｓで誘導された細胞において１４％（８／５７）の対立形質遺伝子変形が観察された（図５）。本発明で使用されたＴＡＬＥＮｓはターゲット部位に特異的であるので、本発明者らは、オフ（ｏｆｆ）−ターゲット切断を観察することができなかった（図６および表２）。ターゲッティング確認された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に使用した（図７）。
【００１９】
ＳＣＮＴによって７３３個の突然異を有する初期胚芽を生産して、４匹の代理雌ブタ（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｇｉｌｔｓ）にそれぞれ移植した後、２５日頃、超音波で妊娠の有無をした。１３匹のＲＡＧ２突然変異体が生まれ、また、そのうち３匹はまだ生まれる（図８および表３）。遺伝子型は、それらブタはＲＡＧ２のターゲットされた突然変異を有することを示した（図１Ｄ）。
【００２０】
興味深いことに、本発明者らは、単一細胞コロニーからＲＡＧ２の単一または対立形質遺伝子変形を有するＲＡＧ２突然変異体を製造した。特に、すべてのＲＡＧ２遺伝工学ブタは１つの対立形質上に同一の変形を持ったが、一部のブタは異なる対立形質上にさらに異なる変形を持った。単一対立遺伝子性突然変異体は、３ヌクレオチドの欠失によって１アミノ酸代替および１アミノ酸の欠損を有し（ＲＡＧ２＋／Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ）、二重対立遺伝子性突然変異体は、１４ヌクレオチドの欠損によって同一の変形と異なる対立遺伝子上に未熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終結コドンの形成を有する（ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７）。
【００２１】
ＲＡＧ２二重対立遺伝子突然変異体（ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７）の遺伝子型は、ベータプロペラ部位で複数種のＲＡＧ２で欠損および代替されたアミノ酸が高く保存されるため、その突然変異体は機能的なＲＡＧ２が欠損し得ることを示唆する（図９）。
【００２２】
１７日野生型、ＲＡＧ２単一および二重対立遺伝子性突然変異体を犠牲させて剖検した。胸腺はＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタからは検出されなかったのに対し、ＲＡＧ２＋／Δ１４０、Ｓ１４１Ｈブタは、野生型と大きさが類似する胸腺を持った（図２Ａ）。また、二重対立遺伝子性突然変異体の脾臓の大きさは、対照群ブタに比べてより小さかった（図２Ｂおよび図２Ｃ）。これは、マウスで観察されたのと一致し、免疫的欠損はＲＡＧ２＋／Δ１４０，Ｓ１４１Ｈブタから検出されることを示唆する。ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタの脾臓由来免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色は、白髄（ｗｈｉｔｅ  ｐｕｌｐ）が胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）および動脈周囲リンパ鞘（ｐｅｒｉａｒｔｅｒｉｏｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｈｅａｔｈ；ＰＡＬＳ）の形成および希薄なＢおよびＴ細胞を有する低形成であることを示す（図２Ｄおよび図１０）。反面、ＲＡＧ２＋／Δ１４０，Ｓ１４１Ｈ  ｐｉｇｓブタ由来ＢおよびＴ細胞のレベルは正常であった。類似して、脾臓白血球の流動細胞分析は、ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタは成熟ＢおよびＴ細胞が不足することを示した（図２Ｅ）。４週モニタリングの間に、本発明者らは、野生型、ＲＡＧ２単一対立遺伝子型、および二重対立遺伝子型突然変異体の間に体重増加の差を観察した。すべてのブタは、２週までは類似する体重増加を示したが；ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ｐｉｇｓブタの体重は停滞した（図２Ｆ）。４週後、ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体は、単一対立遺伝子型突然変異体に比べてより小さかった。その動物を非−特異的な無菌（ＳＰＦ）ハウジングで生育し、最後のＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタは２９日に死亡した。残りのＲＡＧ２単一対立遺伝子型突然変異体は元気で正常に成長した。
【００２３】
本発明において、本発明者らは、ＳＣＮＴによって伴ったＳＣＩＤブタはＴＡＬＥＮ媒介の遺伝子ターゲッティングによって効果的に生産できることを示した。ＴＡＬＥＮ構築物を有するレポーターベクターの使用は、高い比率の変形を誘導した。ターゲッティングベクターがゲノムに挿入される通常の遺伝子ターゲッティングと異なり、本発明は、ゲノムにいかなる特徴も残さない遺伝工学的ブタを生産可能にする。本発明の間に生成された遺伝工学的ブタは、ヒトにおいてＯｍｅｎｎ症侯群を呈し得る１番目のブタモデルを含むＳＣＩＤ研究のためのモデルとして使用できる（ブタは米国国立ブタ研究資源センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手可能である。http://nsrrc.missouri.edu/）。
【発明の効果】
【００２４】
重症複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ）表現型を有するブタは、幹細胞治療、癌研究および異種移植を開発するのに役立つ。本発明者らは、ＴＡＬＥＮ−媒介ターゲッティングを通して２つのタイプのＳＣＩＤブタ、ＲＡＧ２ノックアウトの生成を記述する。ＲＡＧ２の二重対立遺伝子型変形は、未検出胸腺およびＢおよびＴ細胞の不足を有する白髄の低形成によって裏付けられる免疫欠損を引き起こした。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＴＡＬＥＮｓを用いたＳＣＩＤブタの生成。（図１Ａ）ＲＡＧ２のＴＡＬＥＮ媒介ノックアウトの図式的な説明。（図１Ｂ）ＴＡＬＥＮ認知部位を含む供与体レポーターベクター。供与体レポーターベクターにおけるＴＡＬＥＮ認知部位の切断はＧＦＰの発現を誘導。（図１Ｃ）インビトロで考案されたＴＡＬＥＮｓの認証。ＧＦＰの発現はＴＡＬＥＮｓがＨＥＫ２９３Ｔ細胞で供与体レポーター遺伝子とトランスフェクションされる時にのみ検出できる。（図１Ｄ）遺伝工学的に製造されたブタの遺伝子型。
【図２−１】図２は、Ｏｍｅｎｎ症侯群を示すＳＣＩＤブタの特性究明。（図２Ａ）ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体で胸腺の不存在。（図２Ｂ）野生型、単一−および二重対立遺伝子型突然変異体ブタの脾臓の大きさ。ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体が野生型および単一対立遺伝子型突然変異体と比べてより小さい脾臓を有する。（図２Ｃ）野生型、単一−および二重対立遺伝子型突然変異体ブタの脾臓の重量。ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異が他のものよりも軽い脾臓を有する。（図２Ｄ）二重対立遺伝子型突然変異体ブタにおいてＳＣＩＤ表現型；脾臓でＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞）およびＣＤ３（Ｔ細胞）のＩＨＣ染色はＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体がＢおよびＴ細胞がほとんどないことを示した。野生型および単一対立遺伝子型突然変異体では、Ｂ細胞は胚中心周辺で観察され、Ｔ細胞は主にＰＡＬＳに存在した。しかし、二重対立遺伝子型突然変異体でＢまたはＴ細胞の数が大きく減少し、これら細胞は群集から見られず、脾臓間質（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｓｔｒｏｍａ）内に希薄な個別細胞で現れた。
【図２−２】（図２Ｅ）野生型ブタと比較して、ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体の脾臓でＢ（ＣＤ２１）およびＴ（ＣＤ３）細胞の著しい減少を示す流動細胞分析の結果。単に２−３％の二重対立遺伝子型突然変異体由来脾臓細胞のみがＢ細胞またはＴ細胞マーカーに対するポジティブ。（図２Ｆ）対照群、単一および二重対立遺伝子型突然変異体ブタの体重。ＲＡＧ２二重対立遺伝子型突然変異体は２週後に体重増加が止まった。
【図３】図３は、ＴＡＬＥＮｓによってターゲットされた細胞の富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための代替（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）レポーターベクターの構築。（ａ）レポーターベクターは、モノマーＲＦＰ遺伝子、プログラム化可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ｎｕｃｌｅａｓｅのターゲット配列（左および右側半分−部位）、エンハンサーＧＦＰおよびＨ−２ＫＫ遺伝子（ａの上段パネル）。仮に、ＧＦＰおよびＨ−２ＫＫ配列がプログラム化可能なｎｕｃｌｅａｓｅ活性の不存在によってフレームの外にあれば、単にＲＦＰ遺伝子のみが発現する。プログラム化可能なｎｕｃｌｅａｓｅによる二本鎖切断がそのターゲット配列に挿入される時、その切断はＮＨＥＪ（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ）によって復旧され、たびたびフレームシフト突然変異を引き起こす。そのような突然変異はＧＦＰをＲＦＰとフレーム内で作ることができ、ｍＲＦＰ−ｅＧＦＰ−Ｈ−２ＫＫ融合蛋白質の発現を誘導する（ａの下部パネル）。（ｂ）２つのシステム：Ｈ−２ＫＫ抗体による磁石分離およびＲＦＰおよびＧＦＰの発現による流動細胞分析法によって分類されたｍＲＦＰ＋ｅＧＦＰ＋Ｈ−２ＫＫ＋細胞でｎｕｃｌｅａｓｅ−誘導された突然変異の富化。細胞内に、レポータープラスミドおよび染色体ターゲット部位を記載。突然変異を黒いスポットで示す。
【図４Ａ】図４は、ＴＡＬＥＮｓを投入した後、ＧＦＰポジティブ細胞のＦＡＣＳソーティング。（図４Ａ）トランスフェクション４８時間後、ＲＦＰおよびＧＦＰの高い同時発現。（図４Ｂ）矢印下段ボックスはＧＦＰポジティブ細胞を示す。強いＧＦＰを発現するトップ１０％の細胞を分類し、９６−ウェルプレートに位置させる。ＧＦＰポジティブ細胞の範囲は２３．０％から３８．０％。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｂ】図４は、ＴＡＬＥＮｓを投入した後、ＧＦＰポジティブ細胞のＦＡＣＳソーティング。（図４Ａ）トランスフェクション４８時間後、ＲＦＰおよびＧＦＰの高い同時発現。（図４Ｂ）矢印下段ボックスはＧＦＰポジティブ細胞を示す。強いＧＦＰを発現するトップ１０％の細胞を分類し、９６−ウェルプレートに位置させる。ＧＦＰポジティブ細胞の範囲は２３．０％から３８．０％。スケールバー＝２０μｍ。
【図５】図５は、ＴＡＬＥＮを用いたＲＡＧ２の単一−および二重対立遺伝子変形。ＴＡＬＥＮ結合位置に隣接のＰＣＲ産物を示す。いくつかの場合、ＲＡＧ２の明らかな二重対立遺伝子変形を示す野生型の大きさにはＰＣＲバンドがない（レーン１４）。そのＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲル上にローディングする。
【図６】図６は、ＲＡＧ２突然変異ブタ由来ＲＡＧ２遺伝子のオフ−ターゲット分析。上段）ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、ＲＡＧ２遺伝子と最高ホモロジーを有する７ｌｏｃｉで追加的なオフ−ターゲット突然変異を示さない；ＳＭ：サイズマーカー、レーン１：ＭＡＮ２Ａ１；２：ＦＡＭ８２Ａ；３：ＭＴＤＨ；４：ＴＲＩＭ３１；５：ＰＣＳＫ２；６、ＰＲＫＡＣＢ；７，ＧＣＦＣ２。下段）オフ−ターゲット突然変異を排除するためのＲＡＧ２関連配列の遺伝子および配列ホモロジー。上段ケース：ＴＡＬＥＮ結合部位；下段ケース；ＴＡＬＥＮ切断部位；赤色ホモログｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ。
【図７】図７は、ＳＣＮＴのための候補細胞コロニーを同定するためのＰＣＲ配列の結果。ＴＡＬＥＮｓの投入はＮＨＥＪによってＴＡＬＥＮ結合部位近傍で多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を誘導。多型性のタイプを分析し、ＳＣＮＴのための細胞コロニーとして使用する。
【図８】図８は、本発明の間に生産されたＳＣＩＤブタモデルのイメージ。ブタの遺伝的背景はＭｉｎｎｅｓｏｔａミニブタ。
【図９】図９は、ＲＡＧ２の保存されたドメイン上に突然変異（ａ）ＲＡＧ２突然変異由来の予測された蛋白質配列。１４ｂｐの欠損が未成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終結コドンを引き起こす。（ｂ）ＲＡＧ２突然変異由来の予測された蛋白質配列。３ｂａｓｅ  ｐａｉｒの損失が欠損と１アミノ酸のミスマッチを引き起こす。（ｃ）変形したアミノ酸は複数種で大きく保存される。これはその突然変異体が機能のないＲＡＧ２を有することを示唆する。
【図１０】図１０は、ＲＡＧ２二重突然変異体で脾臓の発生学的損傷。二重対立遺伝子突然変異体由来のＨ＆Ｅ染色された切片は胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）および動脈周囲リンパ鞘（ｐｅｒｉａｒｔｅｒｉｏｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｈｅａｔｈ；ＰＡＬＳ）形成の欠損を有する白髄（ｗｈｉｔｅ  ｐｕｌｐ）の形成低下を示す。
【図１１】図１１は、ＲＡＧ２の４週後の二重−および単一−対立遺伝子突然変異体のイメージ。ＲＡＧ２二重−対立遺伝子突然変異体は２週後に体重増加が止まった。４週後、ＲＡＧ２二重−および単一−対立遺伝子突然変異体ブタの間には表現型に区別される差がある。
【図１２】図１２は、エピソームプラスミドを用いてヒトｉＰＳＣを生成することを示す。（Ａ）臍帯成長（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）のためのプラスミド形質感染後１４日目のｉＰＳＣコロニーの位相対照イメージ。（Ｂ）無支持細胞培養（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）条件の分離したｉＰＳＣコロニーのイメージ。（Ｃ−Ｅ）全分化能核蛋白質ＰＯＵ５Ｆ１（Ｃ）、ＮＡＮＯＧ（Ｄ）、および細胞表面分子ＳＳＥＡ−４（Ｅ）が細胞で発現した。下のパネルは４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた核染色を示す。バー＝ＡおよびＢの場合に２００μｍ、Ｅの場合に１００μｍ。
【図１３】図１３は、ｔｅｒａｔｏｍａｓｉｎ  ＲＡＧ２突然変異ブタの成長の進行を示す。（ａ）１０００万個の細胞が注射されたブタ。注射後約１２〜１４日後に注射部位で成長が検出された。（ｂ）５百万個の細胞が注射されたブタ。注射後５週後に成長が検出された。矢印は可能なテラトーマ成長の部位を示す。単一対立形質（ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ）ＲＡＧ２突然変異体の場合、成長が観察されなかった。
【図１４】図１４は、ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタにおけるテラトーマ形成を示す。（Ａ）耳の下に１０００万個の細胞の注射後１６日目（上の図、赤色矢印）および４週目（下側）における腫瘍の外形図。（Ｂ）注射部位から得たカプセル状腫瘍の全体形状。（Ｃ−Ｏ）腫瘍の組織学的検査結果。切片をＨ＆Ｅ（耳部位の腫瘍から得たＣ−Ｆ）によって、そして診断抗原免疫組織化学の範囲（Ｇ−Ｏ）に対して染色した。Ｃは組織をより低い倍率で眺めたものである。（スケールバー：２００μｍ）。（ＭおよびＮ）造血マーカーに陽性の細胞がテラトーマ内に存在した。（Ｏ）テラトーマ内の未分化ＰＯＵ５Ｆ１＋細胞の存在（緑色蛍光、ＰＯＵ５Ｆ１；青色、ＤＮＡに対するＤＡＰＩ染色）。（スケールバー：２００μｍ）。
【図１５】図１５は、腫瘍の進行が比較的遅い場合、第２ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタの脇腹部位で形成されたテラトーマの組織学的分析結果を示す。腫瘍切片は、第１突然変異ブタのテラトーマで観察されたものより比較的筋肉が少ない組織と胞嚢が多い構造を有する組織の乱れた（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）混合物を含有した。（ａ）テラトーマ切片の低倍率図；（ｂ−ｄ）三胚葉の存在を示す代表的な切片（Ｂ内胚葉；Ｃ中胚葉；Ｄ外胚葉）。バー＝１００μｍ。
【図１６】図１６は、ヒト起源のテラトーマを示す。ヒト特異的ミトコンドリアマイトフュージン１（ＭＦＮ１）の断片をＰＣＲを用いて増幅した。ヒトアンプリコンの予想された大きさは２３６ｂｐであった。１、ヒトｉＰＳＣ＃１細胞株（ｌｉｎｅ）由来のゲノムＤＮＡ；２、ヒトｉＰＳＣ＃２細胞株由来のゲノムＤＮＡ；３、受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として使用されたＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタ由来のゲノムＤＮＡ；４、テラトーマ由来のゲノムＤＮＡ；（−）、陰性対照群（ＤＮＡ無し）。
【図１７】図１７は、造血マーカーを用いた染色結果を示す。（ａ、ｂ）造血マーカーに対して陽性の細胞がテラトーマ内に存在した。（ｃ）テラトーマ内の未分化ＰＯＵ５Ｆ１＋細胞の存在（緑色蛍光、ＰＯＵ５Ｆ１；青色、ＤＮＡに対するＤＡＰＩ染色）。
【００２６】
ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタがヒトｉＰＳＣｓの増殖および分化を支持するか否かを確認するために、本発明者らは、非統合プラスミドベクターを用いたリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）によりヒト臍帯線維芽細胞から生成された全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞株由来の細胞をブタに皮下注射して、その細胞にテラトーマが発生するか否かを確認した。注射前に、その細胞はアルカリ性ホスファターゼに対して陽性であり、全分化マーカー［ＰＯＵ  ｃｌａｓｓ５  ｈｏｍｅｏｂｏｘ１（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｎａｎｏｇ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＮＡＮＯＧ）、段階特異的胚芽抗原３（ＳＳＥＡ−３）］を発現した（図１２ｃ〜１２ｅ）。ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタは免疫が低下したので、この実験に使用された第２グループの新生コブタは独立して飼育され、その動物と接触するすべての人々は病源菌露出を最小化するために個人保護具（ＰＰＥ）を着ていた。実験１日目に、５百万または１０００万個の細胞を右耳の基部近くに皮下注射し、左脇腹に皮下注射した（二重対立形質ブタ、ｎ＝３；単一対立形質ブタ、ｎ＝２）。１匹の二重対立形質突然変異ブタは腫瘍形成の何らかの兆候もなく７日目に不詳の原因で死んだが、他の２匹は２つの注射部位のそれぞれで腫瘍を発生した。腫瘍形成はＳＣＩＤマウスの場合の数週の平均時間と比較して早めに発生した。１０００万個の細胞が注射された１匹の二重対立形質突然変異ブタの耳部位の下で１２日目に触知可能な腫瘍が観察された（図１４ａおよび図１３）。２８日目に、この腫瘍はカプセル状で、硬く、部分的に胞嚢があり（大きさ３．４ｘ２．５ｃｍ；重量３．６ｇ）（図１４ａおよび図１４ｂ）、宿主に副作用を誘発しないと見られた。剖検時、これを５つの切れに切断し、組織の切片をＨ＆Ｅ染色により調べた。それぞれの腫瘍切片は、組織の乱れた（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）混合物を含有した（図１４ｃ）。横紋筋（中胚葉）（図１４ｃおよび図１４ｅ）が特に明らかであり、その腫瘍の全体にわたって組織の不規則に分布した島（ｉｓｌａｎｄ）を形成した。種々の他の部位は腺状（ｇｌａｎｄｕｌａｒ−ｌｉｋｅ）構造をなした上皮のような細胞を含んでいる。これらは分泌上皮、すなわち、杯細胞を有する上皮（内胚葉）（図４ｄ）および神経上皮（外胚葉）（図４ｆ）を含んでいる。ＣＴＮＮＢ１およびＶＷＦ［カテニンおよびフォンヴィレブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＷＦ））：内胚葉］（図４ｇおよび４ｊ）、ＤＥＳおよびＡＣＴＧ２（デスミン（ｄｅｓｍｉｎ）および非筋組織アクチン：中胚葉）（図４ｈおよび４ｋ）、およびＧＦＡＰおよびＥＮＯ２（グリア原線維酸性蛋白質および神経細胞−特異的エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）：外胚葉）（図４ｉおよび４ｌ）に対する抗体を用いた免疫組織化学的分析により全体的な組織学的評価結果を確認した。また、造血系および全分化能細胞のマーカーに対して陽性の細胞が確認された（図１７）。第２二重対立形質突然変異ブタは７．５週から耳部位（５百万個の細胞が注射された）および脇腹（１０００万個の細胞が注射された）で、より遅く成長するより小さな腫瘍（０．７５ｇおよび０．３５ｇ）を形成した。第２ブタの左脇腹の注射部位に隣接した腹腔で追加の腫瘍が確認された。比較的筋肉の少ない組織および胞嚢が多い構造（図１５ａ）が第２ブタ由来の腫瘍で観察されたが、すべての三胚葉の誘導体が相変らず存在した（図１５ｂ〜１５ｄ）。同一の細胞がそれぞれのブタに使用されたため、テラトーマ特徴のかかる差はｉＰＳＣ源（ｓｏｕｒｃｅ）に起因することができない。
【００２７】
また、ヒト−特異的ＭＦＮ１（ミトコンドリアマイトフュージン−１）由来のアンプリコンがヒトｉＰＳＣ細胞株のＤＮＡから、および突然変異ブタのＤＮＡ由来でないその誘導されたテラトーマから成功的に増幅されたため（図１６）、その腫瘍は、ブタ起源でない、ヒト起源であることが明らかであった。
【００２８】
ＲＡＧ２Δ１４０、Ｓ１４１Ｈ／Δ１４０−５２７ブタが同種ブタ細胞を受容できるかを調べるために、本発明者らは、満たされた（ｐａｃｋｅｄ）上皮層から主に構成された固形腫瘍を、ヌードマウスで発生した、前にブタ栄養膜幹細胞と推定されたものを末梢に隣接した横紋筋の島に注射した。このような同一の細胞は、１７日目にブタにやや類似のカプセル状腫瘍を提供した。マウス由来のものと同様に、このような腫瘍は主に上皮組織の層で構成された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、非限定的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するための意図で記載されたもので、本発明の範囲は下記の実施例によって制限されると解釈されない。
【００３０】
本発明に使用された動物およびすべての実験は、ミズーリ大学の動物実験倫理委員会の承認を受けた。
【００３１】
実施例１：細胞トランスフェクションおよび遺伝子ターゲッティング
遺伝子ターゲッティングのために、２−３百万の細胞を、レポーターベクターを有するＴＡＬＥＮ構築物でトランスフェクションさせた；２μｇの各構築物／百万細胞あたり。それら細胞をＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、４９０Ｖ、１ｍｓｅｃ、３パルスでその構築物で電気穿孔した。その後、４８時間、Ｔ７５フラスコでプレートした細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰを用いてＧＴＰポジティブ細胞に対して分類した。その分類された細胞を９６−ウェルプレートでプレートした。１０日後、半分の細胞を遺伝子型のために使用した。ＴＡＬＥＮＳを挿入した後、ｉｎｄｅｌの存在を調べるために、ＴＡＬＥＮ切断部位周辺のゲノムＤＮＡの切片をＰＣＲで増幅した。培養細胞由来ゲノムＤＮＡを細胞破砕バッファーを用いて分離した後、そのゲノムＤＮＡをＰＣＲに使用した。増幅のためのＰＣＲ条件は、９５℃で２分の初期変性、３２サイクルの変性のための９４℃で３０秒、アニーリングのための５５℃で３０秒、拡張のための７２℃で３０分を伴った（表１のＰＣＲプライマーセットについては参照）。ＰＣＲ産物の予測された大きさは、ＩＬ２ＲＧに対しては４１７ｂｐであり、ＲＡＧ２に対しては４２６ｂｐであった。そのＰＣＲ産物を、ｉｎｄｅｌの存在を同定するためにシーケンシングした。
【００３２】
実施例２：体細胞核移植（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）
ＳＣＮＴ胚芽を生産するために、雌ブタ由来卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）をＡＲＴ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。その卵母細胞を成熟培地（ＴＣＭ１９９  ｗｉｔｈ  ２．９ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５μｇ／ｍｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌ  ｐ−ＦＳＨ、０．９１ｍＭ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．５ｍＭ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ、１０％ブタ卵胞液、２５ｎｇ／ｍｌ  ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）でオーバーナイト輸送して、２４時間後に新鮮培地にトランスファーした。４０−４２時間の成熟後、卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌｓ）を０．１％ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅの存在下でボルテキシングして、その卵母細胞から除去した。操作の間、卵母細胞を７．０μｇ／ｍｌ  ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂが補充された操作培地に位置させた。中期ＩＩ板（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｐｌａｔｅ）を含む隣接した原形質部分に沿った極体を除去し、供与細胞を薄いガラス毛細管を用いて囲卵腔（ｐｅｒｉｖｉｔｅｌｌｉｎｅ  ｓｐａｃｅ）に位置させた。
【００３３】
次に、再構築された胚芽を融合培地（０．３Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）で、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、１．２ｋＶ／ｃｍで３０ｓｅｃの間に２つのＤＣパルス（１秒間隔）によって融合した。融合後に、融合した胚芽を、暗条件で１０分間２００μＭのｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、そして、８ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌで３０分間完全に活性化させた。その後、胚芽をＰｏｒｃｉｎｅ  Ｚｙｇｏｔｅ  Ｍｅｄｉａ３（ＰＺＭ３）３で０．５μＭヒストンジアセチラーゼ阻害剤のｓｃｒｉｐｔａｉｄで１４−１６時間培養した。翌日、そのＳＣＮＴ胚芽を代理体にトランスファーした。胚盤胞トランスファーのために、その胚芽をｓｃｒｉｐｔａｉｄで洗浄し、ＰＺＭ３で、１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦの存在下、さらに５日培養した。ＳＣＮＴ胚芽を代理体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）の膨大腺（ａｍｐｕｌｌａｒｙ−ｉｓｔｈｍｉｃ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に手術的にトランスファーした。
【００３４】
実施例３：免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＩＨＣのために、１０％ホルマリンを有する中性バッファーで固定化された組織を使用した。その組織をＩＨＣのためにスライド上で充填した。内生的なｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を先に３％ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅで抑制した。サンプルをＢｏｒｇ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒで前処理した後、背景Ｓｎｉｐｅｒ溶液でブロッキングした。洗浄後、サンプルをＢ細胞（ＣＤ７９Ａ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−＃Ｍｏｂ１１８、１：１００）またはＴ細胞（ＣＤ３；ＤＡＫＯ−＃Ａ０４５２、１：４００）に特異的な１次抗体で培養した。培養後、サンプルを洗浄し、ＨＲＰ付着した２次抗体で培養した。その後、サンプルを、その信号を見るために、Ｒｏｍｕｌｉｎ  Ｒｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓで染色した。また、サンプルを、背景を提供するために、ＩＰ  ＦＬＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで染色した。Ｔｈｅ  Ｂｏｒｇ、Ｓｎｉｐｅｒ、Ｒｏｍｕｌｉｎ  ＲｅｄおよびＩＰ  ＦＬＸ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎはいずれもＢｉｏｃａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）から購入した。すべての顕微鏡写真はＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０高解像デジタル顕微鏡カメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）が具備されたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得た。
【００３５】
実施例４：流動細胞分析法
安楽死させた野生型および二重対立遺伝子型コブタ由来脾臓の部分を１０％ウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に集めて、メス刃で研ぎ、２０ｇａ．針を通して数回吸入し、７０ｍのナイロンメッシュ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通して押出した。その後、脾臓細胞懸濁液を、赤血球を破砕するために、Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５分培養した後、５分間２００×ｇでペレット化した。その上澄液を捨てた後、そのペレットを冷蔵染色バッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に再富化し、細胞をヘマサイトメーターで計数した。その後、細胞を２００μＬの染色バッファーに５×１０６細胞のアリコートに分けた。ＦＩＴＣ−付着したマウスａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＣＤ２１、マウスａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＣＤ３ε、およびマウスａｎｔｉ  Ｔ−２マイコトキシンＩｇＧ１ｋ（ｉｓｏｔｙｐｅ対照群）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を細胞に０．５μｇ／１×１０６細胞として添加し、暗条件下、４℃で培養した。その後、細胞を２回洗浄し、新鮮な染色バッファーに再富化した。細胞を、ミズーリ大学のＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ施設でＣｙＡｎ  ＡＤＰ流動細胞分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて分析した。データを、Ｓｕｍｍｉｔ  ｖ４．３ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。
【００３６】
実施例５：オフ（Ｏｆｆ）−ターゲット分析
本発明で使用されたＴＡＬＥＮｓ由来の推定オフターゲット配列を同定するために、バイオインフォマティクス方法を、最近、ブタゲノムアセンブリ（Ｓｓｃｒｏｆａ１０．２）由来の各ＴＡＬＥＮ結合部位に類似の配列を同定するのに使用した。ＰＣＲプライマーをヌクレオチド差の数に基づく隣接した最も類似のオフターゲット部位を考案した。この部位を基盤（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物で増幅し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅアッセイを用いてオフ−ターゲッティングイベントのテストを行った（表２および３）。ＰＣＲ増幅後、３００−５００ｎｇのＰＣＲ産物（１０−１５μｌ）を新鮮なチューブに伝達し、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒプログラム：（９５℃、２分、９５℃から８５℃まで秒あたり−２℃ずつ、８５℃から２５℃まで秒あたり−０．１℃、無限定的に４℃）に従って変性しリアニーリングした。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅと１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーを添加し、４２℃で３０分間培養した。その後、その反応を氷上に直ちに位置させ、６ＸＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ中止バッファーと６Ｘ染料をその反応に添加した。そのサンプルを２．０％アガロースゲル上で電気泳動した。
【００３７】
実施例６：ＴＵＮＥＬ分析
組織を０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、エタノール（７０％、９０％、および１００％）で脱水し、パラフィンワックスに包埋した。その切片（６μｍ）を再水和（キシレン５分；エタノール１００％、９５％、７０％、それぞれ２分）し、ＴＵＮＥＬ染色前に蒸留水で洗浄した。その切片を室温でプロテイナーゼＫ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で２０μｇ／ｍｌ）とともに、３０分間培養した。切片をＴＵＮＥＬミックスを具備した湿ったチャンバ（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｓｓ）にて室温で１０分間培養した。３回のＰＢＳ洗浄後、スライドをＤＡＰＩを具備したＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ（ＶＥＣＴＯＲ、ＵＳＡ）に装着した。
【００３８】
実施例７：細胞増殖分析
野生型、ＲＡＧ２単一対立形質、およびＲＡＧ２二重対立形質ブタ由来の細胞の増殖を、２４時間および４８時間後、培養物内の細胞数をカウントして測定した。ラミニンコーティングされた１２−ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに細胞を１ｘ１０４細胞／ウェルで接種した。０、２４および４８時間目に、それぞれのウェルの細胞数をカウントした。細胞を０．４％トリパンブルー染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色して生存率を確認した。それぞれの時点で細胞の数を、ＴＣ１０自動細胞カウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定したが、それぞれのブタ由来の３つの独立した試料が使用された。２４および４８時間目の細胞数の差を、統計学的分析システム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて比較した。
【００３９】
実施例８：ヒト臍帯線維芽細胞の誘導
ヒト臍帯組織を大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）から新鮮で無菌的に採取した。組織採取（プロジェクト＃１２０１１３２）はミズーリ大学の健康科学倫理委員会の承認を受けた。その組織をリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で２回以上洗浄して血液細胞を除去し、ＤＭＥＭ培地でハサミを用いて１?ｍｍ３の断片に細かく粉砕して、付着細胞を外植方法（ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｍｅｔｈｏｄ）により伝達した。その断片化された組織を、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、および４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含有したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）で０．１％ゼラチンコーティングされた４８−ウェルプレート（ウェルあたり１切れ）に位置させた後、４％Ｏ２／５％ＣＯ２／９１％Ｎ２の湿った雰囲気を含有する培養器にて３７℃で培養した。その培養物を最初５−７日間撹乱しない状態で維持し、Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加して、１次培養で細菌および真菌成長の危険を減少させた。次に、Ｐｒｉｍｏｃｉｎまたは他の抗生剤がない培地を、組織断片由来の線維細胞性付着細胞がウェル内で成長するまで２日ごとに補充した。その線維芽細胞成長は１週の培養後粉砕された組織の周辺で始まった。１０−１１日目に、その線維芽細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４８−ウェルプレートからＴ２５フラスコに移した。その細胞は、フラスコで約１４日目にコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達し、ｉＰＳＣへのリプログラミングのために膨張した。
【００４０】
実施例９：エピソームベクターを用いた臍帯線維芽細胞からｉＰＳＣｓの生成
通常のリプログラミング遺伝子であるＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＬＩＮ−２８以外にも、ｐ５３抑制および非形質転換Ｌ−ＭＹＣのためのｓｈＲＮＡを有するエピソームベクターを用いてＯｋｉｔａらが開発したプロトコルを用いて線維芽細胞をリプログラミングした。３μｇのエピソームプラスミドのＹ４結合体を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ機器（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡｍａｘａ  ＮＨＤＦ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）を用いて、製造会社の指示に従って、６ｘ１０５細胞内に電気穿孔により導入した。その機器内の電気穿孔プログラムである「Ｕ−０２０」を利用した。その細胞を、前記条件での培養により２〜４日間回復させた。細胞（２ｘ１０５）をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）コーティングされた１００ｍｍディッシュ（ｄｉｓｈ）に位置させた。翌日、その培養培地をｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）に入れ替えた。ヒトＥＳＣと類似のコロニーが形質導入後約１４日目に現れ、そのコロニーを、約２０日目に機械的に分離して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で無支持細胞培養（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）した。
【００４１】
実施例１０：ｉＰＳＣの免疫組織化学的検査
デジタルカメラＣｏｏｌｐｉｘ５０００（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を具備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１倒立顕微鏡を用いてｉＰＳＣのイメージを取得した。免疫蛍光分析のために、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされたカバースリップ上で細胞を成長させた。４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定し、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで３０分間透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した後、カバースリップをＰＢＳに溶解した５％ヤギ血清／５％ＢＳＡに１時間位置させた。次に、その細胞を適切に希釈した抗体であるＰＯＵ５Ｆ１（１：２００、ｓｃ−５２７９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＮＡＮＯＧ（１：１００、ａｂ１０９２５０、Ａｂｃａｍ）、およびＳＳＥＡ４（１：１００、＃４７５５ｐ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、４℃で一晩培養した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８または４８８−標識ヤギ抗−マウスまたはウサギ抗体（１：５００）とともに培養した。ＯＲＣＡ−ＡＧ  ＣＣＤカメラを具備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０倒立顕微鏡（http://www.biotech.missouri.edu/mcc/Olympus.html）を用いてイメージを取得した。
【００４２】
実施例１１：テラトーマ形成
１日目に２つの個体由来の２つのヒトｉＰＳＣ細胞株（４〜９の継代数）を２５％Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液とともに、０．２ｍｌの体積で５匹のブタに皮下注射（部位あたり５百万または１０００万個の細胞）したが、その５匹のうち３匹は二重対立形質ＲＡＧ２変形を有し、２匹は対照群としてＲＡＧ２の単一対立形質変形を有した。その培養されたｉＰＳＣ細胞をディスパーゼ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびスクレイピングにより剥がした。遠心分離（２００ｘｇ、５ｍｉｎ）後、細胞ペレットを０．１ｍｌのｍＴｅＳＲ１培地に再懸濁し、同一体積の５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。次に、その細胞を氷上で冷やし、１ｍｌ注射器（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）にローディングした後、２２ゲージニードルを通してブタ１匹あたり２つの部位に注射したが、１つの部位は耳で、他の１つは脇腹であった。次に、形成される腫瘍を切断除去して、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリンに固定した。パラフィン包埋された組織を切片にした後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ブタのｉＰＳＣ（ｉＴＲ）から生成された栄養胚葉（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）表現型を発現するブタ細胞を二重対立形質ＲＡＧ２突然変異ブタのうちの１匹に移植した。ｉＴＲサブタイプ細胞株（ｐ２９）の千万個の細胞をＴｒｙｐＬＥおよびスクレイピングによって剥がした。細胞懸濁液をヒトｉＰＳＣとして製造して、左耳に皮下注射した。その細胞移植過程はブラインド方式で行ったが、その過程を行う個体はブタの遺伝的状態を知らなかった。
【００４３】
実施例１２：テラトーマの免疫組織化学的分析
免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析のために、組織を中性緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ、９９−９０９−１４）に溶解した１０％ホルマリンに固定し、パリピンに包埋し、ガラススライド上で切片（５μｍ）を作った。まず、その組織切片を３％水素ペルオキシダーゼで１時間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次に、その試料を抗原復旧用Ｂｏｒｇ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ＣＡ）溶液で前処理した後、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ＣＡ）溶液でブロッキングした。洗浄後、試料を１次抗体とともに培養した（表４）。培養後、試料を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合された２次抗体とともに培養した。検出のために、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ＋システム（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた。３，３−ジアミノベンジシン（ＤＡＢ）またはＲｏｍｕｌｉｎ  ＡＥＣ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）を用いて信号を視覚化した。また、その試料をＩＰ  ＦＬＸヘマトキシリンで染色して背景を提供した。すべての顕微鏡写真はＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０高解像度デジタル顕微鏡カメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を具備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。前記Ｂｏｒｇ、Ｓｎｉｐｅｒ、Ｒｏｍｕｌｉｎ  Ｒｅｄ、およびＩＰ  ＦＬＸヘマトキシリンはいずれもＢｉｏｃａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）から購入した。
【００４４】
実施例１３：テラトーマの源
テラトーマの源（ｓｏｕｒｃｅ）を確認するために、ヒト特異的ミトコンドリアマイトフュージン１遺伝子（ＭＦＮ１）を、ＰＣＲを用いて増幅した。ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、ヒトｉＰＳＣ、テラトーマ、およびテラトーマを有するＲＡＧ２突然変異ブタの尾由来の血液からゲノムＤＮＡを分離した。ＰＣＲ増幅のための条件は、９６℃で２分間初期変性後、９５℃で３０秒変性、５２℃で３０秒アニーリング、および７２℃で３０分拡張の、３２回の繰り返し（ｃｙｃｌｅ）であった。ＰＣＲ生成物を２．５％アガロースゲルにローディングした。そのＰＣＲ生成物の予測された大きさは２３６ｂｐであった。分析のためのプライマーはＦ：ＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号２）およびＲ：ＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＡ（配列番号３）であった。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１は、ＴＡＬＥＮｓによって誘導された遺伝型ＲＡＧ２突然変異に使用されたプライマー。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
表２は、ブタＲＡＧ２のオフ−サイトターゲッティングを同定するのに使用されたプライマーセット。
【００４９】
【表３】
2016536999.tif 000005
【００５０】
表３は、本発明における核移植の効率。
【００５１】
【表４】
2016536999.tif 000006
【００５２】
表４は、ＩＨＣのために使用される抗体です。
【受託番号】
【００５３】
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２４９６
受託日付：２０１３１００２
【００５４】
【表５】
2016536999.tif 000007
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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