(57)【要約】  患者において、癌と関連する遺伝子変異を経時的にモニタリングするための方法を提供する。また、対象のために、治療又は療法を選択及び／又は適用する方法も提供する。【選択図】図１
2016536013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において、癌と関連する遺伝子変異を経時的にモニタリングする方法であって、
（a）患者から体液サンプルを得ること；
（b）該サンプルにおいて、セルフリーDNA（cfDNA）における変異の量を定量的又は半定量的に決定すること；並びに
（c）（a）及び（b）をその後、繰り返すこと、
を含む、方法。
【請求項２】
体液が血清又は血漿である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
体液が尿である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
変異が、APC、BRAF、CDK4、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER3、PDGFR1、PDGFR2、AKT1、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプター、EZH2、FLT3、HER2、IDH1、IDH2、JAK2、KIT、KRAS、c-Myc、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、p53、p16、又はRb1遺伝子におけるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
変異が、BRAF V600E、又はKRAS変異G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V若しくはG13Dである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
試験がシーケンシングを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
PCRがドロップレットデジタルPCRである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
PCRが、約50ヌクレオチド未満の配列を増幅する、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
PCRが、野生型バージョンの遺伝子の増幅を抑制するブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて実施される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
変異について非検出を指定する閾値が、野生型ステータスのターゲット遺伝子を有する健常対象又は疾患対象由来の体液サンプルを検証することにより確立される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（a）及び（b）が、少なくとも2回繰り返される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
患者が、変異についての試験を以前に受けたことがない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
患者が、変異を有する遺伝子の産生物を標的とする医薬での治療を受けている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
患者が、変異を有する遺伝子の産生物を標的としない医薬での治療を受けている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
変異の量が定量的に決定される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
変異の量が半定量的に決定される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
決定される変異の量を腫瘍量と比較することをさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
決定される変異の量が、変異がモニタリングされる時点のいずれかにて、腫瘍量と比較されない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍量の評価が、ラジオグラフィー、コンピューター断層撮影（CT）スキャン、陽電子放射断層撮影法（PET）、又はPET/CTスキャンによる、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
対象のために、治療又は療法を選択及び／又は適用する方法であって、請求項1〜20のいずれか一項に従って遺伝子変異をモニタリングすること；並びに当該検出に基づき治療又は療法を選択及び／又は適用することを含む、方法。
【請求項２２】
モニタリングすることにより、治療又は療法に対する低反応性又は非反応性を同定し、選択及び／又は適用することが、異なる治療又は療法を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
モニタリングすることにより、有効な治療又は療法を同定し、選択及び／又は適用することが、同じ治療又は療法を継続することを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
モニタリングすることにより、変異の消失を同定し、選択及び／又は適用することが、治療を中止することを含む、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2013年10月19日出願の米国仮特許出願第61/893,216号、2014年4月8日出願の米国仮特許出願第61/977,085号、2014年4月9日出願の米国仮特許出願第61/977,609号、及び2014年8月21日出願の米国仮特許出願第62,040,363号（これらは全て、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の背景
（1）本発明の分野
本発明は、全体として、癌変異（cancer mutations）に関する。より具体的には、本発明は、癌変異を経時的にモニタリングするための方法を提供し、それは治療選択肢を評価するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
（2）関連技術の説明
癌組織や循環細胞中の核酸、及び体液中に存在するセルフリー（cell-free：cf）核酸は、そのような遺伝子変化と関連する癌又は他の疾患を有する個体を同定及び選択するのに役立ち得る。例えば、Spindler et al., 2012; Benesova et al., 2013; Dawson et al., 2013; Forshew et al., 2012; Shaw et al., 2012を参照。いくつかのデータは、血中の変異DNA量が、腫瘍量（tumor burden）と相関し、耐性変異の出現を同定するために使用され得ることを示唆する（Forshew et al., 2012; Murtaza et al., 2013; Dawson et al., 2013; Diaz et al., 2012; Misale et al., 2012; Diehl et al., 2008）。しかし、血液又は尿中のcfDNAの定量的又は半定量的な測定が、治療決定を行う際に利用するのに足りるほど正確に腫瘍量を反映するかどうかは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
腫瘍量を経時的にモニタリングすることにより治療の有効性を決定する、更なる非侵襲的方法が必要とされている。本発明は、そのニーズに対応する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨
本発明は、癌治療が、治療過程にわたる様々な時点で尿又は血液中のcfDNAを測定することによりモニタリングされ得る、との発見に一部基づく。
【０００６】
従って、いくつかの実施態様において、患者において、癌と関連する遺伝子変異を経時的にモニタリングするための方法を提供する。当該方法は、
（a）患者から体液サンプルを得ること；
（b）該サンプルにおいて、セルフリー（cell free）DNA（cfDNA）における変異の量を定量的又は半定量的に決定すること；並びに
（c）（a）及び（b）をその後、繰り返すこと、
を含む。
【０００７】
また、対象のために、治療（treatment）又は療法（therapy）を選択及び／又は適用する方法も提供する。当該方法は、上記方法により遺伝子変異をモニタリングすること、並びに当該検出に基づき治療又は療法を選択及び／又は適用することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、ターゲット遺伝子配列における28〜30 bpのフットプリントのための例示的な2ステップアッセイデザインを説明する。
【図２】図2は、BRAF V600E変異を同定するためのポジティブ及びネガティブコントロールを示す実験結果のグラフである。
【図３】図3は、治療前、治療の間及び治療後の、転移性メラノーマ患者のBRAF V600Eモニタリングの結果を示すグラフである。疾患の有意な再発はいずれも観察されない。
【図４】図4は、治療前、治療の間及び治療後の、遠隔転移を有する大腸癌（metastatic colorectal cancer）患者のBRAF V600Eモニタリングの結果を示すグラフである。疾患の再発が観察される。
【図５】図5は、治療前及び治療の間の、虫垂癌を有する患者のBRAF V600Eモニタリングの結果を示すグラフである。
【図６】図6は、治療の間の、転移性非小細胞肺癌患者のBRAF V600Eモニタリングの結果を示すグラフである。療法に対する耐性が観察される。
【図７】図7は、治療されていない転移性非小細胞肺癌患者のBRAF V600Eモニタリングの結果を示すグラフである。疾患の進行が観察される。
【図８】図8は、進行再発大腸癌（advanced colorectal cancer）患者の尿、血漿及び組織サンプル間における、KRASステータス（status）の高い一致率（concordance）を示す実験結果のダイアグラムである。
【図９】図9は、転移性癌患者の治療又は療法に対する反応性と関連する、BRAF V600E変異を含むcfDNAのモニタリングを示す実験結果のダイアグラムである。ctDNAは、cfDNA中に存在する「血中循環腫瘍（circulating tumor）DNA」を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「又は（or）」の使用は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「及び／又は（and/or）」を含むことが意図される。
【００１０】
本明細書で使用する場合、用語「サンプル」とは、アナライトアッセイが望まれるアナライトを含有し得るいずれをもいう。多くの場合、アナライトは、cf核酸分子、例えば、BRAFの全て又は一部をコードするDNA又はcDNA分子などである。サンプルは、生物学的サンプル、例えば、生物学的液体又は生物学的組織などであってよい。生物学的液体の例として、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、ヒト、動物、植物、細菌、真菌又はウイルス構造の構造材料の1つを形成する、通常、その細胞間物質と一緒になった特定の種類の細胞の凝集体であり、これには、結合組織、上皮組織、筋組織及び神経組織が含まれる。生物学的組織の例としては、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈及び個々の細胞（複数可）も挙げられる。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「患者」は哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ又はブタなどであり得る。多くの場合、哺乳動物はヒトである。
【００１２】
本発明は、癌及び他の疾患と関連する遺伝子変異が、治療過程にわたる様々な時点で尿又は血液中のcfDNAを測定することにより正確にモニタリングされ得る、との発見に一部基づく。この発見の有効性は実施例に示されており、該実施例では、治療の様々な時点での、尿及び血液中のcfDNAにおける変異の定量的な測定が、X線撮影測定により評価されるように腫瘍量と相関しており、また治療不成功までの期間（time-to-failure on therapy）により評価されるように治療反応性と相関していた。かかる測定は、治療選択肢を評価する際に使用され得る。
【００１３】
従って、いくつかの実施態様において、患者において、遺伝子変異を経時的にモニタリングするための方法を提供する。当該方法は、
（a）患者から体液サンプルを得ること；
（b）該サンプルにおいて、DNAにおける変異の量を定量的又は半定量的に決定すること；並びに
（c）（a）及び（b）をその後、繰り返すこと、
を含む。
【００１４】
様々な実施態様において、遺伝子変異は癌と関連する。
【００１５】
DNAを有すると想定される任意の体液がこれらの方法に利用され得る。体液の非限定的な例として、末梢血、血清、血漿、尿、リンパ液、羊水及び脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。実施例で説明するものなど、特に特定の実施態様において、体液は、血清、血漿又は尿である。
【００１６】
いくつかの場合、当該方法は、遺伝子変化の量を定量的に決定し、別の測定と定量的に比較し得るように、定量的に実施される。他の場合、当該方法は、遺伝子変化の量を決定し、次いで別の測定と比較して、単に互いに対する相対的な増加又は減少を決定し得るように、半定量的に実施される。
【００１７】
これらの方法は、任意の癌と関連する任意の変異が、これらの方法により正確にモニタリングされると予測されることから、任意の特定の癌における任意の特定の遺伝子変異に狭く限定されない。かかる遺伝子の非限定的な例は、APC、BRAF、CDK4、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER3、PDGFR1、PDGFR2、AKT1、エストロゲンレセプター（Estrogen Receptor）、アンドロゲンレセプター（Androgen Receptor）、EZH2、FLT3、HER2、IDH1、IDH2、JAK2、KIT、KRAS、c-Myc、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、p53、p16、又はRb1遺伝子である。いくつかの実施態様において、変異は、BRAF遺伝子又はKRAS遺伝子におけるものである。これらの遺伝子における例示的変異は、BRAF V600E、並びにKRAS変異G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V及びG13Dである。
【００１８】
BRAF V600Eとの関連が、メラノーマ（-50％）（Davies et al., 2002; Curtin et al., 2005）、甲状腺乳頭癌（-40％）（Puxeddu et al., 2004）、ランゲルハンス細胞組織球症（Langherans cell histiocytosis）（57％）（Badalian-Very et al., 2010）及び様々な固形腫瘍（より低頻度）（Davies et al., 2002; Brose et al., 2002; Tie et al., 2011）を含む様々なヒト新生物で報告されている。
【００１９】
セリン／スレオニンキナーゼRAFファミリーのメンバーであるBRAFタンパク質は、細胞の生存、増殖及び分化を制御するのに重要な役割を担うRAS-RAF-MAPKシグナリング経路の一部である（Keshet and Seger, 2010）。BRAF変異は、MEK-ERK経路を恒常的（constitutively）に活性化し、細胞の増殖、生存を高め、最終的には腫瘍性形質転換（neoplastic transformation）を導く（Wellbrock and Hurlstone, 2010; Niault and Baccarini, 2010）。BRAFが変異したヘアリー細胞白血病（HCL）ケースはすべて、V600Eホスホミメティック（phospho-mimetic）置換（BRAF活性化セグメント内で生じ、恒常的な様式で、そのキナーゼ活性を顕著に高めるもの）を保有した（Wan et al., 2004）。
【００２０】
多くの場合、BRAF変異はBRAF V600E変異であり、該変異では、配列番号2の600位又はアミノ酸残基600にて、バリン（Val又はV）残基がグルタミン酸（Glu又はE）に置換される。代替的又は追加的に、BRAF変異は、配列番号1の1860位における、チミン（T）ヌクレオチドについてのアデニン（A）での置換である。
【００２１】
ホモ・サピエンス（Homo sapiens）v-rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログB1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1：BRAF）は、以下のmRNA配列によりコードされる（NM_004333、配列番号1）（該配列中、コーディング配列を太字とし、アミノ酸残基600に対するコーディング配列には下線を付し、拡大する）：
【００２２】
【化１−１】
2016536013.tif 000003
【化１−２】
2016536013.tif 000004
【００２３】
ホモ・サピエンス（Homo sapiens）v-rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログB1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1：BRAF）は、以下のアミノ酸配列によりコードされる（NP_004324、配列番号2）（該配列中、アミノ酸残基600を太字とし、下線を付し、拡大する）：
【００２４】
【化２】
2016536013.tif 000005
【００２５】
癌の非限定的な例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳又は神経系の癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌（colorectal cancer）、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド癌、消化管間質癌、ホジキン病、腸癌、カポジ肉腫、腎癌、大腸の癌（large intestine cancer）、喉頭癌、下咽頭癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、非HCLリンパ系悪性腫瘍（ヘアリー細胞バリアント（hairy cell variant）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、脾びまん性赤脾髄小型B細胞リンパ腫（splenic diffuse red pulp small B-cell lymphoma）（SDRPSBCL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、全身性肥満細胞症、又は脾性リンパ腫／白血病分類不能（splenic lymphoma/leukemia unclassifiable）（SLLU））、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、成人軟部組織肉腫、皮膚癌、皮膚の基底細胞癌（basal cell skin cancer）、皮膚の扁平上皮細胞癌（squamous cell skin cancer）、皮膚の基底細胞及び扁平上皮細胞癌、メラノーマ、胃癌、小腸癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍。
【００２６】
非HCLリンパ系悪性腫瘍の非限定的な例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヘアリー細胞バリアント（HCL-v）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、脾びまん性赤脾髄小型B細胞リンパ腫（SDRPSBCL）、脾性白血病／リンパ腫分類不能（SLLU）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、全身性肥満細胞症、及び脾性リンパ腫／白血病分類不能（splenic lymphoma/leukemia unclassifiable）（SLLU）。
【００２７】
本明細書に記載の方法の様々な実施態様において、患者はヒトである。患者は、任意の年齢のものであってよく、乳児（infants）、幼児（toddlers）、子供（children）、未成年（minors）、成人（adults）、年配者（seniors）及び高齢者（elderly）の個体を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、変異は、当分野で既知の任意の方法により決定又は定量化され得る。非限定的な例として、MALDI-TOF、HR融解曲線分析（HR-melting）、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング（single-molecule sequencing）、プローブの使用、パイロシーケンシング、第二世代ハイスループットシーケンシング（second generation high-throughput sequencing）、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、又はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用する方法、例えば、デジタルPCR（digital PCR）、定量PCR、若しくはアレル特異的PCR（ここでは、プライマー又はプローブが、可変（variable）遺伝子配列と相補的である）などが挙げられる。いくつかの実施態様において、PCRは、例えば実施例に記載するような、ドロップレットデジタルPCR（droplet digital PCR）である。これらの方法のいくつかにおいて、変異は、野生型配列とともに定量化されて、変異配列のパーセンテージが決定される。他の方法において、変異のみが定量化される。
【００２９】
多くの実施態様において、DNAは、セルフリーDNA（「cfDNA」）である。いくつかの実施態様において、増幅又は検出されるDNA分子は、ゲノムDNAである。他の実施態様において、増幅又は検出される分子は、cDNAである。
【００３０】
当業者ならば、本明細書に記載の方法のいずれかのために、任意の変異配列をPCR増幅するために有用なプライマーを決定できる。いくつかの実施態様において、PCRは、例えば、米国特許出願公開公報第US/2010/0068711号などに記載されるように、約50ヌクレオチド未満の配列を増幅する。他の実施態様において、PCRは、例えば、図1で説明するように（以下の実施例1も参照）、或いは米国特許第8,623,603号又は米国仮特許出願第62/039,905号などに記載されるように、野生型バージョンの遺伝子の増幅を抑制するブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて実施される。多くの実施態様において、1つ以上のプライマーは、当分野で知られるように、外因性又は異種配列（例えば、アダプター又は「タグ」配列など）を含み、その結果、得られた増幅分子は、天然に存在しない配列を有する。
【００３１】
cf核酸における遺伝子変化（変異）の存在に対する検出限界は、1つ以上のネガティブコントロール（例えば、健常なコントロール対象由来又は検証された細胞株由来）及び複数の患者サンプルからのデータを評価することにより決定されてよい。任意選択で、限界は、偽陰性のパーセンテージを最小化することに一部基づき決定されてよく、偽陰性のパーセンテージを最小化することは偽陽性を最小化するよりも重要だからである。BRAF V600Eについての非限定的な閾値の1セットは、いずれの変異体も存在しない又は野生型のみとの決定のために、cf核酸のサンプル中、変異が約0.05％未満；「ボーダーライン」として約0.05％から約0.107％の範囲、及び検出される変異として約0.107％超として定義される。他の実施態様において、変異について非検出を指定する閾値は、対応する野生型配列と比較して、変異の検出が約0.1％未満、約0.15％未満、約0.2％未満、約0.3％未満、約0.4％未満、約0.5％未満、約0.6％未満、約0.7％未満、約0.8％未満、約0.9％未満、又は約1％未満と設定される。
【００３２】
ボーダーラインの指定はまた、望まれる相対量の偽陽性及び偽陰性を含む、任意の基準に従って設定され得る。
【００３３】
当然のことながら、追加の患者サンプルを含めることにより、各カテゴリーについて異なる閾値の決定が、或いはまた「ボーダーライン」カテゴリーの排除がもたらされ得る。偽陽性に対して望ましい量の偽陰性が、閾値に影響を与えるだろう。
【００３４】
これらの方法の「得ること」及び「決定すること」のステップは、治療選択肢又は適用される治療の有効性を決定する補助となるのに十分なデータを得るために、必要なだけ何度でも繰り返され得る。いくつかの実施態様において、これらのステップは、毎週、毎月、2ヶ月ごとに、3ヶ月ごとに、4ヶ月ごとに、又はこれらの時点の合間に任意の間隔で、実施される。
【００３５】
いくつかの実施態様において、患者は、遺伝子における変異についての試験を以前に受けたことがない。それらの状況において、当該方法は、特異的変異が癌に関与するかどうか、及び変異を有する遺伝子の産生物を標的とする医薬が有効となり得るかどうかを決定するために使用される。例えば、BRAF V600E変異が存在する場合、患者は、ベムラフェニブ、ソラフェニブ又はダブラフェニブなどのBRAF阻害剤で治療され得る。
【００３６】
いくつかの実施態様において、患者は既に試験されており、変異が決定されており、その後の試験は、疾患の進行及び／又は治療の有効性を評価するためのものである。いくつかの場合、検出することにより、治療又は療法に対する非反応性を同定してよく、選択及び／又は適用することが、異なる治療又は療法を含む。他の場合、検出することにより、治療又は療法に対する反応性を同定してよく、選択及び／又は適用することが、同じ治療又は療法の継続を含む。更なる実施態様において、モニタリングすることは、例えば、再発の可能性がある、「無病（disease free）」と判断された治療患者などの患者の監視である。
【００３７】
従って、これらの方法は、癌を含む様々な疾患に対する開示される治療又は療法の維持を確認するため；或いは該疾患に対する治療又は療法を変更するため、に使用されてよい。その関連で、本明細書において、対象のために治療又は療法を選択及び／又は適用する方法を提供する。当該方法は、上記方法により遺伝子変異をモニタリングすること、並びに当該検出に基づき治療又は療法を選択及び／又は適用することを含む。
【００３８】
これらの方法のいくつかの実施態様において、モニタリングすることにより、治療又は療法に対する低反応性又は非反応性を同定し、選択及び／又は適用することが、異なる治療又は療法を含む。他の実施態様において、モニタリングすることにより、有効な治療又は療法を同定し、選択及び／又は適用することが、同じ治療又は療法を継続することを含む。更なる実施態様において、モニタリングすることにより、変異の消失（elimination）を同定し、選択及び／又は適用することが、治療を中止することを含む。
【００３９】
治療又は療法を変更することの範囲内で、本開示は、非限定的な例として、該治療又は療法を増やすこと；該治療又は療法を、任意選択で該治療又は療法を終結させるところまで、減らすこと；該治療又は療法を、別の治療又は療法の開始とともに終結させること；及び該治療又は療法を調整（adjusting）すること、を含む。治療又は療法を調整することの非限定的な例には、該療法を、任意選択で1つ以上の更なる治療又は療法と組み合わせて、減らす又は増やすこと；或いは、該治療又は療法を、1つ以上の更なる治療又は療法を追加しつつ、維持すること、が含まれる。
【００４０】
いくつかの場合、セルフリー（cf）核酸の観察により、治療又は療法の開始後、変異を含むcf核酸レベルの上昇が同定される。当該上昇後、観察は、レベルが低下する屈曲点（inflection point）に達し得るか、或いは増加し続け得る。屈曲点の存在は、治療又は療法に対する反応性を決定するために使用されてよく、それにより、維持又は減らされ得る。療法の治療を開始する前のレベルと同じであるか又はそれよりも低い、当該レベルの継続的な低下は、反応性を一層裏付けるものである。
【００４１】
屈曲点の不存在は、治療又は療法に対する抵抗性を示し、そのため、それに続いて、治療又は療法の投与を終結させてよく、或いは疾患又は障害に対する少なくとも1つの更なる治療又は療法を患者に投与してよく、治療又は療法を伴う対象の治療を減らし且つ疾患又は障害に対する少なくとも1つの更なる治療又は療法を対象に投与してよい。
【００４２】
他の場合、屈曲点及びレベルの低下後、更なる屈曲点が観察され得る。これは、治療又は療法に対する抵抗性の発現を示し得、それに続いて、治療又は療法の投与を終結させてよく、或いは疾患又は障害に対する少なくとも1つの更なる治療又は療法を対象に投与してよく、或いは療法を伴う対象の治療を減らし且つ疾患又は障害に対する少なくとも1つの更なる療法を対象に投与してよい。
【００４３】
いくつかの側面において、変異のモニタリングは、例えば、ラジオグラフィー、コンピューター断層撮影（CT）スキャン、陽電子放射断層撮影法（positron emission tomography：PET）、又はPET/CTスキャンなどにより、腫瘍量（tumor burden）を決定すること、及び該腫瘍量と、決定される変異の量とを比較することにより達成される。これは、モニタリングされている変異が、実際に腫瘍ドライバーであるかどうかを決定するため又はこれを確認するために有用である。
【００４４】
他の側面において、決定される変異の量は、1回、2回以上又は全ての変異モニタリング時のいずれかにおいて、腫瘍量と比較されない。本明細書に記載の変異モニタリング手順の信頼性を考慮して、腫瘍量の評価は、各時点で実施される必要はなく、従って、患者は腫瘍量の評価を省くことができる。
【００４５】
更なる側面において、モニタリングすることは、不成功までの期間（time-to-failure）パラメーターと関連する変異を評価することを含む（すなわち、変異を対象とする治療は、一定の有効性期間後、不成功となることが知られている）。これらの側面において、モニタリングすることは、例えば、変異の濃度が前回の評価よりも上昇するときなど、不成功が生じるであろうときをより正確に予測するのに役立ち得る。
【００４６】
本開示の治療及び療法は、癌療法の全ての様式（modalities）を含む。これらの様式の非限定的な例として、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び手術が挙げられる。放射線療法の非限定的な例として、体外照射療法、例えば、光子（γ線）、電子又は陽子などを用いて；定位放射線療法、例えば、小さなターゲットに対して単回高用量又は複数分割用量（multiple fractionated doses）を用いて；ブラキセラピー；及び全身放射性同位体（systemic radioactive isotopes）が挙げられる。
【００４７】
化学療法の非限定的な例として、以下が挙げられる：細胞毒性薬；代謝拮抗薬、例えば、葉酸拮抗薬、プリン拮抗薬及びピリミジン拮抗薬など；生物学的反応修飾物質（biological response modifiers）、例えば、インターフェロンなど；DNA損傷剤、例えば、ブレオマシンなど；DNAアルキル化剤及び架橋剤、例えば、ニロトソウレア及びベンダムスチンなど；酵素的活性剤（enzymatic activities）、例えば、アスパラギナーゼなど；ホルモンアンタゴニスト、例えば、フルベストラント及びタモキシフェンなど；アロマターゼ阻害剤；モノクローナル抗体；抗生物質、例えば、マイトマイシンなど；白金錯体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど；プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブなど；紡錘体毒（spindle poison）、例えば、タキサン若しくはビンカ、又はいずれかの誘導体など；トポイソメラーゼI及びII阻害剤、例えば、アントラサイクリン、カンプトテシン及びポドフィロトキシンなど；チロシンキナーゼ阻害剤；抗血管新生薬；及びシグナル伝達阻害剤。
【００４８】
ホルモン療法の非限定的な例として、ホルモンアンタゴニスト療法、ホルモンアブレーション（hormone ablation）、ビカルタミド、エンザルタミド、タモキシフェン、レトロゾール、アビラテロン、プレドニゾン、又は他のグルココルチコステロイドが挙げられる。免疫療法の非限定的な例として、抗癌ワクチン及び改変リンパ球（modified lymphocytes）が挙げられる。
【００４９】
いくつかの場合、治療又は療法の維持又は変更は、これらの様式の1つの範囲内である。他の場合、治療又は療法の維持又は変更は、これらの様式の2つ以上の間である。当然のことながら、熟練の臨床医ならば、特定の癌又は腫瘍タイプなど、所与の障害又は疾患に対して認められ承認される治療又は療法を承知しており、そのため、治療又は療法の維持又は変更は、該疾患又は障害で知られるものの範囲内となり得る。
【００５０】
本開示はまた、一部分において、開示する方法を実施するためのキットも提供する。当該キットは、BRAF変異と特異的に結合する特異的結合剤、及び本明細書に記載するような方法を実施するための説明書を含んでよい。
【００５１】
当業者は、本明細書で述べる既知の技術又は等価な技術の詳細の説明のために一般的な参照テキストを参照し得る。これらのテキストには以下が含まれる：Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.（2005）; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（3rd edition）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York（2000）; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics（1975）, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition（1990）。これらのテキストは、当然のことながら、本開示の一側面を構成又は使用する際にも参照され得る。
【００５２】
好ましい実施態様を以下の実施例に記載する。本明細書における特許請求の範囲内の他の実施態様は、本明細書で開示するような本発明の仕様又は実施を考慮すれば、当業者に明らかとなるだろう。実施例とともにその仕様は、単なる例示として考慮されるべきであって、本発明の範囲及び精神は、実施例に続く特許請求の範囲に示されることが意図される。
【実施例】
【００５３】
実施例1. 材料及び方法
以下の方法をその後の実施例で利用した。
【００５４】
患者尿サンプル
転移した癌を有する全部で27人の患者（それら腫瘍サンプルは、CLIA認定ラボ（CLIA-certified laboratory）により、BRAFにおける変異（20人の患者）及びKRASにおける変異（7人の患者）について既に試験された）が予め登録された。
【００５５】
cfDNA変異分析のために、単回又は複数回の連続尿サンプル（90〜110 ml、又は24時間蓄尿（24 hour urine collection））を、ベースライン、並びに療法の間及び療法後に得た。
【００５６】
2ステップアッセイデザイン
ターゲット変異遺伝子配列における28〜30塩基対のフットプリントのために2ステップアッセイデザインを開発した。このアッセイデザイン（及び当分野で既知の他のアッセイ）は、様々な組織又は体液における任意のサイズの配列、例えば、400未満、300未満、200未満、150 bp未満、100 bp未満、50 bp未満、40 bp未満、35 bp未満、又は30 bp未満などの配列を増幅するのに有用である。
【００５７】
図1は、アッセイデザインを要約したものであり、これには、サンプル中に存在する野生型遺伝子配列と比較してターゲット変異遺伝子配列のコピー数を増加させるための第一の事前増幅ステップが含まれる。事前増幅は、野生型DNAの増幅を減じるために、野生型配列と相補的である（しかし、変異配列とは相補的でない）、野生型（非変異）抑制「WTブロッカー」オリゴヌクレオチドの存在下で実施する。事前増幅は、第二のステップにおける増幅を促進するために、5’末端にてアダプター（又は「タグ」）を含むプライマーを用いて実施する。
【００５８】
第二のステップは、定量的なデジタルドロップレットPCR（digital droplet PCR）のために、第一のステップで使用されるプライマー末端のタグと相補的なプライマーと、変異配列と相補的なTaqMan（レポーター）プローブオリゴヌクレオチドとを用いた、更なる増幅である。
【００５９】
アッセイ開発
各変異（BRAF V600E、KRAS G12D、又はKRAS G12V）を有する細胞株をポジティブコントロールとして使用した。野生型BRAF及びKRASとして確認される細胞株をネガティブコントロールとして使用した。図2を参照のこと。
【００６０】
変異検出のための閾値は、分類木を用いて、50の健常コントロール及び39の患者サンプルからのデータを評価することにより決定した。偽陰性のパーセンテージを最小化することを、偽陽性を最小化するよりも重視した。
【００６１】
BRAF V600Eについての非限定的な閾値のセットを以下と定義した：非検出又は野生型として、＜0.05％；「ボーダーライン」として、0.05％から0.107％の範囲、及び検出される変異として、＞0.107％。サンプルあたりのKRAS G12変異カウントを、CLIAにより同定されるG12健常（野生型）及びG12変異サンプルを確認するための非限定的な手段として使用した：野生型として、＜234の変異フラグメント；及び検出される変異として、489〜2825の変異フラグメント。
【００６２】
実施例2. cfDNAにおけるBRAF V600E変異
2ステップアッセイの感度を、CLIAラボ（CLIA laboratory）によりBRAF V600E変異を有すると同定された癌を有する19人の患者の尿サンプルにて最初に評価した。表1に示すように、CLIA V600Eと尿cfDNA V600E変異及び「ボーダーライン」との一致率は95％であった。
【００６３】
【表１】
2016536013.tif 000006
【００６４】
組織におけるBRAF V600E変異の存在（CLIAラボによる）と尿cfDNA V600E変異との更なる一致が、ベースライン尿サンプル（治療前）及び任意の評価時点の尿サンプルの両方で観察された。それらの結果を表2及び3に示す。
【００６５】
【表２】
2016536013.tif 000007
【００６６】
【表３】
2016536013.tif 000008
【００６７】
さらに、表4に示すように、BRAF V600E変異を有するcfDNAは、進行癌（advanced cancer）患者由来の組織サンプルにおけるその存在と相関する。大腸（colorectal）癌、NSCLC（非小細胞肺癌）、卵巣癌、メラノーマ、甲状腺乳頭癌及び他の癌を有する患者の尿中にて、BRAF V600E変異が検出された。開示するV600Eアッセイは、組織バイオプシーと比較して高い一致率を実証した（試験した任意の時点にて、尿中で88％が検出された；33の対象のうち29）。
【００６８】
【表４】
2016536013.tif 000009
【００６９】
実施例3. cfDNAにおけるKRAS G12D変異
2ステップアッセイの感度を、CLIAラボによりKRAS G12D変異を有すると同定された癌を有する7人の患者の尿サンプルにおいても評価した。表5に示すように、CLIA G12Dと尿cfDNA G12D変異との一致率は100％であった。
【００７０】
【表５】
2016536013.tif 000010
【００７１】
進行期で未治療（treatment naive）の大腸癌患者20人から3〜5年間アーカイブしていた、対応する（matched）尿及び血漿サンプルを、KRAS変異について、対応する組織サンプルと比較して、本明細書に記載するように評価した。結果を図8に示し、図8は、3つすべてのサンプルタイプ間での高い一致率を説明する。
【００７２】
実施例3. cfDNA変異の長期的（longitudinal）評価
3人の患者にて、経時的に得られた一連の複数回の尿サンプルを上記のようにアッセイした。患者は、転移性メラノーマ（metastatic melanoma）（BRAF阻害剤及び化学療法で治療）、遠隔転移を有する大腸癌（metastatic colorectal cancer）（BRAF阻害剤及び抗EGFR抗体で治療）、及び虫垂癌（BRAF阻害剤及びキナーゼ阻害剤で治療）に罹患していた。
【００７３】
メラノーマ患者についての結果を図3に示す。患者の初期サンプルにおいて37.9％のシグナルが観察され、それに続いて療法を開始した。その後の4つのサンプルは、0.08％、0.83％、0.17％、及び0.04％の値を有した。治療終結後、尿cfDNAにおけるBRAF V600E変異の観察レベルは低いままであった。
【００７４】
大腸癌患者についての結果を図4に示す。患者の初期サンプルにおいて1.49％のシグナルが観察され、それに続いて療法を開始した。その後の4つのサンプルは、0.09％、0.00％、0.00％、及び0.00％の値を有した。治療終結後、尿cfDNAにおけるBRAF V600E変異の観察レベルは低いままであり、次いで増加し始めた。
【００７５】
虫垂患者についての結果を図5に示す。療法と同時であった患者の初期サンプルにおいて、3.43％のシグナルが観察された。その後の2つのサンプルは、0.45％及び0.02％の値を有した。
【００７６】
転移性非小細胞肺癌を有する4番目及び5番目の患者において、BRAF阻害剤に対する抵抗性が、1人の患者の治療の間に観察された（図6）。尿cfDNA尿中におけるBRAF V600E変異の増加は、未治療患者のものと類似した（図7）。
【００７７】
全体として、32人の転移性癌患者のうち17人において、連続的に集めた尿を試験することにより、BRAF V600Eの長期的な分析を実施した。尿セルフリーBRAF V600Eのダイナミクスは、17人の進行癌患者のうち13人において、療法に対する反応性（又は反応の欠如）と相関した（76％）。
【００７８】
実施例4. BRAF V600E変異の存在対治療反応のモニタリング
尿中のBRAF V600E cfDNAについて陽性であった17人の転移性癌患者のうち15人において、尿中のBRAF V600E cfDNA（又はctDNA、血中循環腫瘍DNA）を、疾患の進行及び／又は療法に対する反応性をモニタリングするために、経時的に評価した。図9に示すように、モニタリングは、検出可能なBRAF V600E cfDNA又はctDNAを有する転移性癌患者において、ターゲット療法の治療効果を追跡するために臨床的有用性を有する。
【００７９】
参考文献
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米国特許出願公開公報第US2010/0068711号。
米国仮特許出願第62/039,905号。
【００８０】
上記を考慮すると、本発明の複数の目的が達成され、他の利点が得られることが分かるだろう。
【００８１】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法及び組成（compositions）に様々な変更を加えることができるため、上の記載に含まれ、添付の図面に示される全ての事項は、説明目的であり、限定する意図ではないと解釈されるものとすることが意図される。
【００８２】
本明細書に引用した全ての参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の記載は、その著者らによる主張を要約することを単に意図するにすぎず、いずれかの参考文献が先行技術を構成することを容認するものではない。出願人らは、引用した参考文献の正確性及び適切性に異議を唱える権利を留保する。
【図１】
2016536013.tif 000011
【図２】
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【図３】
2016536013.tif 000013
【図４】
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【図５】
2016536013.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016536013.tif 000019
【配列表】
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【国際調査報告】
2016536013.tif 000020
2016536013.tif 000021