(57)【要約】本技術は、白斑を予防または治療する方法を提供する。本方法は、芳香族カチオン性ペプチドを有効量で投与して、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象に見られるものなどのメラニン細胞変性を治療または改善することを提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、白斑を患っているか、またはその危険性がある対象に、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。本技術は、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与による、哺乳動物または哺乳類細胞における白斑の治療、改善、または予防に関する。【選択図】図１
2016540762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン細胞変性を引き起こす生化学的または代謝経路を崩壊することにより哺乳類細胞を処置するための方法であって、前記細胞を治療有効量のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその薬学的に許容される塩と接触させ、それによりメラニン細胞変性を処置または改善することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞が、インサイチュまたはエクスビボのいずれかである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記メラニン細胞変性が、ビオプテリン、フェノール、またはカテコールの代謝異常に起因する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記メラニン細胞変性が、４−ＴＢＰなどのフェノール／カテコール誘導体への曝露によって引き起こされるストレスに起因する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項５】
前記メラニン細胞変性が、自己免疫反応に起因する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項６】
前記メラニン細胞変性が、少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う、請求項１に記載の前記方法。
【請求項７】
前記遺伝子突然変異が、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３からなる群にある、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
白斑の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、治療有効量のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより白斑の少なくとも１つの症状を治療または改善することを含む、前記方法。
【請求項９】
前記症状が、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、皮膚、粘膜（口及び鼻の内側を覆う組織）、網膜、または生殖器の色素脱失、及び頭毛、睫毛、眉、または髭の早期白色化または灰色化からなる群より選択される、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１０】
白斑が、自己免疫性甲状腺疾患（橋本甲状腺炎及びグレーブス病）、悪性貧血、リウマチ性関節炎、乾癬、Ｉ型糖尿病、アジソン病、セリアック病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスのうちの１つ以上を伴う、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１１】
白斑が、少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記遺伝子突然変異が、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３からなる群にある、請求項１１に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、経口、局所、系統、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与される、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞蓄積及び哺乳類細胞の細胞毒性死滅を低減させるための方法であって、前記細胞を治療有効量のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその薬学的に許容される塩と接触させ、それによりＴ細胞蓄積及び前記細胞周辺の細胞毒性死滅を低減させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
対象における進行性表皮色素脱失の速度を低下させるための方法であって、それを必要とする前記対象に、治療有効量のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより表皮色素脱失を治療または改善することを含む、前記方法。
【請求項１６】
１つ以上の芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために対象を特定するための診断アッセイであって、前記対象が白斑と診断され、
前記対象から組織を切除することであって、前記組織が、白斑の発現型または症状を呈する、切除することと、
前記組織からメラニン細胞を単離することと、
前記単離されたメラニン細胞を培養することと、
前記メラニン細胞を少なくとも２つの群に分けることと、
第１のメラニン細胞群を少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドで処置することと、
第２のメラニン細胞群をビヒクル対照で処置することと、
前記第１及び第２のメラニン細胞群を少なくとも１つの治療効果についてアッセイすることと、
前記第１のメラニン細胞群の前記少なくとも１つの治療効果を、前記第２のメラニン細胞群の前記少なくとも１つの治療効果と比較することと、を含む、前記診断アッセイ。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの治療効果が、ミトコンドリア膜電位の増加、ＡＴＰ産生の増加、細胞生存または増殖の増加、及びメラニン産生の増加からなる群より選択される１つ以上の治療効果である、請求項１６に記載の前記診断アッセイ。
【請求項１８】
前記第１及び第２のメラニン細胞群の前記少なくとも１つの治療効果を、白斑と診断されていない少なくとも１名の対象由来のメラニン細胞からアッセイされた少なくとも１つの治療影響と比較することをさらに含む、請求項１６に記載の前記診断アッセイ。
【請求項１９】
前記対象が、前記対象が全体表の１５％〜５０％を侵す非区域性白斑（ＮＳＶ）の確定診断を有し、ＮＳＶが頭及び首を侵し、３ヶ月の期間にわたる安定したまたは緩徐進行性の白斑であること、前記対象が少なくとも１３歳であること、及び前記対象が少なくとも２×２ｃｍの大きさの少なくとも１つの白斑病変を有することからなる群より選択される１つ以上の基準に基づいて処置の候補者として選択される、請求項１６に記載の前記診断アッセイ。
【請求項２０】
前記対象由来の未処置のメラニン細胞と比較して、前記対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞において、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生が約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％増加した場合、前記対象が少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために選択される、請求項１６に記載の前記診断アッセイ。
【請求項２１】
前記対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞の前記ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生が、約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％だけ正常レベルに戻った場合、前記対象が少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために選択され、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の正常レベルが、白斑と診断されていない少なくとも１名の対象由来のメラニン細胞をアッセイすることによって確立される、請求項１６に記載の前記診断アッセイ。
【請求項２２】
白斑と診断された対象の芳香族カチオン性ペプチド治療を監視するためのアッセイであって、芳香族カチオン性治療を受けている白斑対象の１つ以上の罹患皮膚領域から組織を切除することと、前記組織からメラニン細胞を単離することと、前記単離されたメラニン細胞を培養することと、前記単離されたメラニン細胞を少なくとも１つの治療効果についてアッセイすることと、前記治療効果を、メラニン細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の正常化されたレベルと比較することと、を含む、前記アッセイ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの治療効果が、ミトコンドリア膜電位の増加、ＡＴＰ産生の増加、細胞生存または増殖の増加、及びメラニン産生の増加からなる群より選択される１つ以上の治療効果である、請求項２２に記載の前記アッセイ。
【請求項２４】
芳香族カチオン性ペプチドでの処置の前記治療効果を、前記芳香族カチオン性ペプチドでの処置前の前記白斑対象由来のメラニン細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の最初のレベルと比較することをさらに含む、請求項２２に記載の前記アッセイ。
【請求項２５】
白斑療法の有効性を決定するためのスクリーニングアッセイであって、
白斑と診断された対象の罹患皮膚領域から組織を切除することと、前記組織からメラニン細胞を単離することと、前記単離されたメラニン細胞を培養することと、前記メラニン細胞を２つ以上の群に分けることと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つを少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドで処置することと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つをビヒクル対照で処置することと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つを白斑療法で処置することと、前記メラニン細胞を芳香族カチオン性ペプチド及び前記白斑療法での処置による治療効果についてアッセイすることと、芳香族カチオン性ペプチドでの処置の前記治療効果を前記白斑療法での処置の前記治療効果と比較することと、を含む、前記スクリーニングアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月２日出願の米国出願第６１／９１０，７４２号の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本技術は、概して、白斑を予防及び治療する組成物及び方法に関する。具体的には、本技術の実施形態は、芳香族カチオン性ペプチドを有効量で投与して、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象に見られるものなどのメラニン細胞の変性を治療または改善することに関する。
【背景技術】
【０００３】
読者の理解を支援するために以下の説明が提供される。提供される情報または引用される参照文献のいずれも、先行技術であるとは認められない。
【０００４】
白斑は、皮膚色素に関与している細胞、メラニン細胞が破壊される色素異常症である。その結果、白色の斑点が体の異なる部位の皮膚に現れる。斑点は、最初は小さいが、それらは、多くの場合、大きくなり、形状が変化する。白斑病変は、どこにでも現れ得るが、最も一般的には、末端部、粘膜（口及び鼻の内側を覆う組織）、網膜、及び生殖器で見られる。他の症状としては、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、及び白斑による影響を受けた領域で成長する毛髪の早期白色化または灰色化が挙げられる。ブラックライトをこの疾患の初期段階で使用して、特定し、かつ治療の有効性を決定することができる。白斑を有する皮膚は、ブラックライトに曝露されると、反応を有しない健康な皮膚と対照的に、黄色、緑色、または青色に輝く。
【０００５】
局所ステロイド療法、ソラレン光化学療法、及び色素脱失を含む多数の薬物療法は、白斑の出現を減少させることができる。しかしながら、これらの治療法はそれぞれ、効能における障害、ならびに／または皮膚収縮、重度の日焼け、水疱形成、色素過剰、白内障、炎症、吐き気、嘔吐、そう痒、異常な毛髪成長、及び皮膚癌などの副作用を伴う。さらには、外科的療法は、一部の白斑患者に対してのみに適しており、感染症、瘢痕化、水疱形成、及び異常色素の危険性が伴うため、最適ではない。故に、効果的かつ安全に白斑に対抗する治療戦略が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本技術は、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩の、それを必要とする対象への投与による、哺乳動物または哺乳類細胞における白斑の治療、改善、または予防に関する。いくつかの態様において、本技術は、本明細書に開示されるように芳香族カチオン性ペプチドを投与することによって、メラニン細胞の変性を治療、改善、または予防することを、対象、またはそれを必要とする哺乳類細胞において行うことに関する。いくつかの実施形態において、哺乳類対象は、白斑の危険性があるか、またはそれを患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、メラニン細胞生存に影響を与える遺伝子突然変異を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、ＮＬＲＰ１における突然変異を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはそれにかかりやすい。いくつかの実施形態において、対象は、ＴＹＲにおける突然変異を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはそれにかかりやすい。いくつかの実施形態において、メラニン細胞の変性は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う。いくつかの実施形態において、遺伝子突然変異は、以下の遺伝子または遺伝領域、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３のうちの１つ以上における突然変異を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、インサイチュ、エクスビボ、またはインビボのいずれかである。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、生化学的または代謝経路異常に起因する。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、ビオプテリン、フェノール、またはカテコールの代謝異常に起因する。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、４−第３ブチルフェノールなどのフェノール／カテコール誘導体への曝露によって引き起こされるストレスに起因する。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、自己免疫応答に起因する。
【０００８】
白斑の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩を投与し、それにより白斑の少なくとも１つの症状を治療または改善することを含む方法もまた本明細書に開示される。
【０００９】
開示される方法のいくつかの実施形態において、白斑の症状は、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、皮膚、粘膜（口及び鼻の内側を覆う組織）、網膜、または生殖器の色素脱失、及び頭毛、睫毛、眉、または髭の早期白色化または灰色化のうちの任意の１つ以上を含み得る。
【００１０】
開示される方法のいくつかの実施形態において、白斑は、黒色腫、自己免疫性甲状腺疾患（橋本甲状腺炎及びグレーブス病）、悪性貧血、リウマチ性関節炎、乾癬、Ｉ型糖尿病、アジソン病、セリアック病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスのうちの１つ以上を伴い得る。
【００１１】
開示される方法のいくつかの実施形態において、白斑は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う。開示される方法のいくつかの実施形態において、遺伝子突然変異は、以下の遺伝子または遺伝領域、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３のうちの１つ以上にある。
【００１２】
いくつかの態様において、メラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞を治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩と接触させ、それによりメラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類対象に存在する。
【００１３】
いくつかの態様において、４−第３ブチルフェノールへの曝露によって誘発されるメラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞を治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩と接触させ、それにより４−第３ブチルフェノールへの曝露によって誘発されるメラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善することを含む。
【００１４】
いくつかの態様において、表皮細胞内のＴ細胞蓄積及び細胞毒性活性を低減させることによってメラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞を治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩と接触させ、それにより表皮細胞内のＴ細胞蓄積及び細胞毒性活性を低減させることによってメラニン細胞変性及び色素脱失を治療、予防、または改善することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類対象に存在する。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示は、白斑の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の芳香族カチオン性ペプチドもしくはその薬学的に許容される塩、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上の追加の治療薬の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、
少なくとも１個の正味の正電荷と、
最低で４個のアミノ酸と、
最大で約２０個のアミノ酸と、
３ｐｍがｒ＋１以下の最大値である、最小数の正味の正電荷（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係と、ａが１である場合にｐｔも１であり得ることを除いて、２ａがｐｔ＋１以下の最大値である、最小数の芳香族基（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係とを有するペプチドである。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、２ｐｍは、ｒ＋１以下の最大値であり、ａは、ｐｔと等しくてもよい。芳香族カチオン性ペプチドは、最低で２個または最低で３個の正電荷を有する水溶性ペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１個以上の非天然型アミノ酸、例えば、１個以上のＤ−アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端におけるアミノ酸のＣ末端カルボキシル基はアミド化される。特定の実施形態において、ペプチドは、最低で４個のアミノ酸を有する。ペプチドは、最大で約６個、最大で約９個、または最大で約１２個のアミノ酸を有し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、Ｎ末端にチロシンまたは２’，６’−ジメチルチロシン（Ｄｍｔ）残基を含む。例えば、ペプチドは、式Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2または２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有し得る。別の実施形態において、ペプチドは、Ｎ末端にフェニルアラニンまたは２’，６’−ジメチルフェニルアラニン残基を含む。例えば、ペプチドは、式Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2または２’，６’−Ｄｍｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有し得る。特定の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、式Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を有する。
【００１８】
一実施形態では、ペプチドは、式Ｉによって定義され、
【化１】
2016540762.tif 000003
式中、Ｒ1及びＲ2は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
【化２】
2016540762.tif 000004
【化３】
2016540762.tif 000005
【化４】
2016540762.tif 000006
Ｒ3及びＲ4は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
ｎは１〜５の整数である。
【００１９】
特定の実施形態では、Ｒ1及びＲ2は水素であり、Ｒ3及びＲ4はメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は、全て水素であり、ｎは４である。
【００２０】
一実施形態では、ペプチドは、式ＩＩによって定義され、
【化５】
2016540762.tif 000007
式中、Ｒ1及びＲ2は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
【化６】
2016540762.tif 000008
【化７】
2016540762.tif 000009
【化８】
2016540762.tif 000010
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
ｎは１〜５の整数である。
【００２１】
特定の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は、全て水素であり、ｎは４である。別の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ11は、全て水素であり、Ｒ8及びＲ12は、メチルであり、Ｒ10はヒドロキシルであり、ｎは４である。
【００２２】
芳香族カチオン性ペプチドは、様々な方法で投与され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、経口、局所、鼻腔内、腹腔内、静脈内、皮下、または経皮（例えば、イオン導入法によって）投与され得る。いくつかの実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、冠動脈内経路または動脈内経路によって投与される。
【００２３】
一実施形態において、本技術は、白斑の治療、改善、または予防を、それを必要とする哺乳類対象において行うための方法、ならびに／または本明細書に開示されるように芳香族カチオン性ペプチドを投与することによって、メラニン細胞変性の治療及び改善を、それを必要とする対象において行うための方法を提供し、本方法は、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を対象に投与し、それにより白斑及び／またはその兆候もしくは症状を予防または治療することを含む。一実施形態において、本方法は、１つ以上の追加の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。一実施形態において、哺乳類対象は、白斑の危険性があるか、またはそれを患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、メラニン細胞変性を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、メラニン細胞生存に影響を与える遺伝変異を特徴とする疾患及び状態を患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、ＮＬＲＰ１における突然変異を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、ＴＹＲにおける突然変異を特徴とする疾患もしくは状態を患っているか、またはその危険性が高い。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に開示されるように芳香族カチオン性ペプチドを投与することによって治療される。
【００２４】
別の態様において、本技術は、１つ以上の芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために対象を特定するための診断アッセイを提供し、本アッセイは、対象から組織を切除することであって、該組織が白斑の発現型または症状を呈する、切除することと、該組織からメラニン細胞を単離することと、単離されたメラニン細胞を培養することと、メラニン細胞を少なくとも２つの群に分けることと、第１のメラニン細胞群を少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドで処置することと、第２のメラニン細胞群をビヒクル対照で処置することと、第１及び第２のメラニン細胞群を少なくとも１つの治療効果についてアッセイすることと、第１のメラニン細胞群の少なくとも１つの治療効果を第２のメラニン細胞群の少なくとも１つの治療効果と比較することとを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療効果は、ミトコンドリア膜電位の増加、ＡＴＰ産生の増加、細胞生存または増殖の増加、及びメラニン産生の増加からなる群より選択される１つ以上の治療効果である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本アッセイはまた、第１及び第２のメラニン細胞群の少なくとも１つの治療効果を、白斑と診断されていない少なくとも１名の対象由来のメラニン細胞からアッセイされた少なくとも１つの治療影響と比較することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、対象は、対象が全体表の１５％〜５０％を侵す非区域性白斑（ＮＳＶ）の確定診断を有し、ＮＳＶが頭及び首を侵し、３ヶ月の期間にわたる安定したまたは緩徐進行性の白斑であること、対象が少なくとも１３歳であること、及び対象が少なくとも２×２ｃｍの大きさの少なくとも１つの白斑病変を有することからなる群より選択される１つ以上の基準に基づいて、処置の候補者として選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、対象由来の未処置のメラニン細胞と比較して、対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞において、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％の増加がある場合、対象は、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生が、約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％だけ正常レベルに戻った場合、対象は、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置のために選択され、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の正常レベルは、白斑と診断されていない少なくとも１名の対象由来のメラニン細胞をアッセイすることによって確立される。
【００３０】
別の態様において、本技術は、白斑と診断された対象の芳香族カチオン性ペプチド治療を監視するためのアッセイを提供し、本アッセイは、芳香族カチオン性ペプチド治療を受けている白斑対象の１つ以上の罹患皮膚領域から組織を切除することと、該組織からメラニン細胞を単離することと、単離されたメラニン細胞を培養することと、単離されたメラニン細胞を少なくとも１つの治療効果についてアッセイすることと、該治療効果をメラニン細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の正常化されたレベルと比較することとを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療効果は、ミトコンドリア膜電位の増加、ＡＴＰ産生の増加、細胞生存または増殖の増加、及びメラニン産生の増加からなる群より選択される１つ以上の治療効果である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本アッセイはまた、芳香族カチオン性ペプチドでの処置の治療効果を、芳香族カチオン性ペプチドでの処置前の白斑対象由来のメラニン細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の最初のレベルと比較することを含む。
【００３３】
別の態様において、本技術は、白斑療法の有効性を決定するためのスクリーニングアッセイを提供し、本アッセイは、白斑と診断された対象の罹患皮膚領域から組織を切除することと、該組織からメラニン細胞を単離することと、単離されたメラニン細胞を培養することと、メラニン細胞を２つ以上の群に分けることと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つを少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドで処置することと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つをビヒクル対照で処置することと、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つを白斑療法で処置することと、メラニン細胞を芳香族カチオン性ペプチド及び白斑療法での処置による治療効果についてアッセイすることと、芳香族カチオン性ペプチドでの処置の治療効果を白斑療法での処置の治療効果と比較することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】白斑（ＶＨＭ）と診断されたヒト対象由来のメラニン細胞の０μＭ、１．５μＭ、及び２．０μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での７日間の処置が、処置されたＶＨＭのミトコンドリア膜電位を増加させたことを示すグラフである。処置されたＶＨＭ及び未処置のＶＨＭのミトコンドリア膜電位を、同様に０μＭ、１．５μＭ、及び２．０μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で７日間処置された、白斑（ＮＨＭ）を有しないヒト対象由来のメラニン細胞のミトコンドリア電位と比較した。
【図２】白斑（ＶＨＭ）と診断されたヒト対象由来のメラニン細胞の２．０μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での３日間の処置が、未処置のＶＨＭメラニン細胞（即ち、０μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）と比較して、処置されたＶＨＭメラニン細胞のＡＴＰ産生を増加させたことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本技術のある特定の態様、形態、実施形態、変形、及び特徴は、本技術の実質的な理解を提供するために、種々のレベルの詳細で以下に記述されることが理解される。本技術は、芳香族カチオン性ペプチドを有効量で投与して、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象に見られるものなどのメラニン細胞の変性を治療または改善することを含む方法を提供する。
【００３６】
本明細書に記載される芳香族カチオン性ペプチドは、中性（無塩）ペプチドとして発生し得る、及び使用され得るが、本説明は、本明細書に記載されるペプチドの全ての塩、ならびにペプチドのそのような塩を使用する方法を包含することが意図される。一実施形態において、ペプチドの塩は、薬学的に許容される塩を含む。薬学的に許容される塩は、薬品または薬剤としてヒト及び／または動物に投与され得、投与時に、遊離化合物（中性化合物または無塩化合物）の生物活性の少なくとも一部を保持する塩である。塩基性ペプチドの所望の塩は、化合物を酸で処理することにより、当業者に既知の方法によって調製され得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、及びリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。有機酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、スルホン酸、及びサリチル酸が挙げられるが、これらに限定されない。アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩などのアミノ酸を有する塩基性ペプチドの塩もまた調製され得る。酸性ペプチドの所望の塩は、化合物を塩基で処理することにより、当業者に既知の方法によって調製され得る。酸性ペプチドの無機塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩などのアルカリ金属及びアルカリ土類塩、アンモニウム塩、ならびにアルミニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
酸ペプチドの有機塩の例としては、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、及びトリエチルアミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。リジン塩などのアミノ酸を有する酸性ペプチドの塩もまた調製され得る。本技術はまた、ジアステレオマー、鏡像異性体、及びシス／トランス（Ｅ／Ｚ）異性体を含む、ペプチドの全ての立体異性体及び幾何異性体を含む。本技術はまた、ラセミ混合物を含むがそれに限定されない、立体異性体及び／または幾何異性体の混合物を任意の比率で含む。
【００３８】
定義
本明細書で使用する場合のある特定の用語の定義が以下に提供される。別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、概して、本技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形、及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、薬剤、薬物、またはペプチドの対象への「投与」は、その意図される機能を行うための対象への化合物の導入または送達のいずれの経路も含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）、または局所などを含む、任意の好適な経路よって実行することができる。いくつかの実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、冠動脈内経路または動脈内経路によって投与される。投与は、自己投与、及び他者による投与を含む。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１個のアミノ基及び少なくとも１個のカルボキシル基を含有する任意の有機分子を指すために使用される。典型的には、少なくとも１個のアミノ基は、カルボキシル基に対してα位である。「アミノ酸」という用語は、天然型アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然型アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を含む。天然型アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然型アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα−炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然型アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然型アミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの周知の三文字記号、または一文字記号のいずれかによって称され得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の治療及び／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、白斑またはメラニン細胞変性に伴う１つ以上の症状の予防またはその軽減をもたらす量を指す。治療または予防用途の文脈において、対象に投与される組成物の量は、疾患の種類及び重症度、ならびに全般的な健康、年齢、性別、体重、及び薬物耐性などの個体の特徴に依存することになる。それは、疾患の程度、重症度、及び種類にも依存することになる。当業者であれば、これら及び他の因子に応じて適切な用量を決定することができるであろう。本組成物はまた、１つ以上の更なる治療化合物と組み合わせて投与することができる。本明細書に記載される方法において、芳香族カチオン性ペプチドは、メラニン細胞変性の１つ以上の兆候または症状を有する対象に投与され得る。例えば、芳香族カチオン性ペプチドの「治療有効量」とは、メラニン細胞変性の生理学的影響が最低でも改善されるレベルを意味する。治療有効量は、１回以上の投与で与えられ得る。いくつかの実施形態において、白斑の兆候、症状、または合併症としては、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、皮膚、粘膜、網膜、または生殖器の色素脱失、及び頭毛、睫毛、眉、または髭の早期白色化または灰色化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはペプチドは、その物質が由来する細胞または組織源由来の細胞物質または他の混入ポリペプチドを実質的に含まないか、あるいは化学的に合成されたときに化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。例えば、単離された芳香族カチオン性ペプチドは、薬剤の診断的または治療的使用に干渉する物質を含まない。かかる干渉物質としては、酵素、ホルモン、ならびに他のタンパク質性及び非タンパク質性溶質を挙げることができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「正味の電荷」という用語は、ペプチド中に存在するアミノ酸が帯びる正電荷の数と負電荷の数との差し引きを指す。本明細書では、正味の電荷は生理学的ｐＨで測定されることが理解される。生理学的ｐＨで正に帯電する天然型アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−ヒスチジンが挙げられる。生理学的ｐＨで負に帯電する天然型アミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン酸が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義に使用され、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸、即ち、ペプチド同配体を含むポリマーを意味する。ポリペプチドは、ペプチド、グリコペプチド、またはオリゴマーと通常称される短鎖と、タンパク質として一般に称される長鎖との両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該技術分野で周知である化学的修飾技法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本明細書で使用する場合、疾患または状態の「予防」または「予防する」は、統計サンプルにおいて、対照サンプルと比べて、該サンプルにおける疾患もしくは状態の発生を減少させるか、あるいは対照サンプルと比べて、疾患もしくは状態の１つ以上の症状の発症を遅延させるか、またはその重症度を軽減させる化合物を指す。本明細書で使用する場合、白斑を予防することは、自己免疫応答を予防すること、細胞毒性、及び４−第３ブチルフェノールへの曝露に関連したアポトーシスを抑制すること、または毛髪もしくは表皮細胞の進行性色素脱失を阻害し、それによりメラニン細胞変性の悪影響を予防または改善することを含む。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「別々の」治療的使用という用語は、少なくとも２つの活性成分を異なる経路で同時にまたは実質的に同時に投与することを指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「連続した」治療的使用という用語は、少なくとも２つの活性成分を異なるときに投与することを指し、投与経路は、同一であるか、または異なる。より具体的には、連続した使用は、活性成分のうちの１つを、他の活性成分（単数または複数）の投与を開始する前に完全に投与することを指す。故に、活性成分のうちの１つを、他の活性成分（単数または複数）を投与する前に、数分、数時間、または数日かけて投与することが可能である。この場合には同時治療は存在しない。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「同時の」治療的使用という用語は、少なくとも２つの活性成分を同じ経路で同時にまたは実質的に同時に投与することを指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、個々の有機体、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであることができる。
【００５１】
「相乗的治療効果」は、２つの薬剤の組み合わせによって生み出され、かついずれか一方の薬剤単独の個別投与から別途生じるものを超過する、相加を上回る治療効果を指す。したがって、低用量のこれらの薬剤のうちの１つまたは両方を白斑の治療に使用することで、増加した治療有効性及び減少した副作用をもたらし得る。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」または「改善」という用語は、標的とされる病態または疾患を予防するか、または減速させる（減少させる）ことを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される方法に従って、治療量の芳香族カチオン性ペプチドを投与された後、対象がメラニン細胞変性における観察可能な及び／または測定可能な減少を示す場合、対象は白斑の治療に成功している。また、記載されるような医学的状態の治療または予防の種々の形態が、完全な治療または予防だけでなく完全に満たない治療または予防を含む「実質的な」を意味するように意図されており、そこである生物学的または医学的に関連性のある結果が達成されることも理解されたい。
【００５３】
白斑の病因
白斑は、皮膚色素に関与している細胞、メラニン細胞が破壊される色素異常症である。その結果、白色の斑点が体の異なる部位の皮膚に現れる。斑点は、最初は小さいが、それらは、多くの場合、大きくなり、形状が変化する。白斑病変は、どこにでも現れ得るが、最も一般的には、末端部、粘膜（口及び鼻の内側を覆う組織）、網膜、及び生殖器で見られる。他の症状としては、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、及び白斑による影響を受けた領域で成長する毛髪の早期白色化または灰色化が挙げられる。ブラックライトは、この疾患の初期段階において特定のため、及び治療の有効性を決定するために、使用され得る。白斑を有する皮膚は、ブラックライトに曝露されると、反応を有しない健康な皮膚と対照的に、黄色、緑色、または青色に輝く。
【００５４】
非区域性白斑（ＮＳＶ）は、色素脱失の斑点の位置に何らかの形態の対称性を伴う。ＮＳＶの種類としては、汎発型白斑、全身型白斑、四肢顔面型白斑、粘膜型白斑、及び限局型白斑が挙げられる。最も一般的な分類である汎発型白斑（ＧＶ）は、発症の平均年齢約２４歳、男女ほぼ同頻度で発生し、世界の人口のほぼ０．５％が罹患している。民族性による変化はないが、この病気は、より黒い皮膚色を有する個体にとっては、はるかに明白であり、故に、精神的に苦痛を伴い得る。
【００５５】
分節型白斑（ＳＶ）は、ＮＶＳとは外観、原因、及び有病率が異なる。ＳＶは、脊髄からの後根と関連のある皮膚の領域に影響を及ぼす傾向があり、ほとんどの場合、片側性である。ＳＶは、ＮＳＶよりもはるかに速く広がり、治療をしなければ、ＳＶは、経過がはるかに不変／固定的であり、自己免疫疾患を伴わない。
【００５６】
白斑病変は、炎症性細胞、特に細胞毒性及びヘルパーＴ細胞ならびにマクロファージの浸潤を有する。白斑を有する患者はまた、橋本甲状腺炎、グレーブス病、悪性貧血、リウマチ性関節炎、乾癬、Ｉ型糖尿病、アジソン病、セリアック病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスを含む、少なくとも１つの他の自己免疫疾患を有する可能性が高い。さらに、ＧＶの近年の全ゲノム関連解析が、合計１７個の確認されたＧＶ感受性遺伝子座、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３を特定している。これらの感受性遺伝子座の実質的に全てが、既知の免疫調節タンパク質をコードし、多くが、ＧＶと疫学的に関連する他の自己免疫疾患に対する遺伝子感受性を伴っていた。１つの例外は、メラニン細胞内のメラニン生合成の鍵酵素及びＧＶ内の主要自己抗原であるチロシナーゼをコードするＴＹＲである。それにもかかわらず、通常、自己抗原はそれ自身だけで有害な免疫応答を生成しないため、ＧＶ内の自己免疫応答の明確な要因は、まだ特定されていない。
【００５７】
白斑の正確な原因は解明されていない。しかしながら、疫学的証拠は、白斑が遺伝的素因及び未知の環境要因の両方を伴う複雑な病気であることを示す。白斑を有する人の約３０パーセントがこの病気を持つ家系員を有する。しかしながら、親が白斑を患っているとしても、白斑にかかる子どもはわずか５〜７パーセントであり、白斑を有する大半の人は、この病気の家族歴を持たない。したがって、ＧＶは、多遺伝子の多因子性遺伝を示唆する非メンデル性パターンを呈する。これらのデータは、遺伝的因子が人の白斑に対する感受性を決定するのにかなり重要であることを示す。それにもかかわらず、双子研究は、遺伝子は疾病病因において重要な役割を果たすにもかかわらず、非遺伝的因子も、それを超えてはいないにしても同じように重要であることを示している。ＧＶの多くの異なる環境危険因子が提案されているが、メラニン細胞が消失するか、または非機能的になる正確な機序は、不明のままである。
【００５８】
本技術は、本明細書に開示されるような芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を投与することによって、メラニン細胞変性の治療または改善を、それを必要とする対象において行うことに関する。本技術は、本明細書に開示されるような治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を、それを必要とする対象に投与することによる、哺乳動物における白斑の治療、改善、または予防に関する。
【００５９】
本技術の芳香族カチオン性ペプチド
本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、水溶性かつ高度に極性である。これらの特性にもかかわらず、本ペプチドは、細胞膜を容易に貫通することができる。芳香族カチオン性ペプチドは、典型的には、ペプチド結合によって共有結合した最低３個のアミノ酸または最低４個のアミノ酸を含む。芳香族カチオン性ペプチド中に存在するアミノ酸の最大数は、ペプチド結合によって共有結合した約２０個のアミノ酸である。好適には、アミノ酸の最大数は、約１２個、または約９個、または約６個である。
【００６０】
いくつかの態様において、本技術は、芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも１個の正味の正電荷と、最低で３個のアミノ酸と、最大で約２０個のアミノ酸と、
３ｐｍが＋１以下の最大数である、正味の正電荷の最少数（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係と、
ａが１である場合にｐｔも１であり得ることを除いて、２ａがｐｔ＋１以下の最大数である、芳香族基の最少数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係とを有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2またはＤ−Ａｒｇ−２’,６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、表５（以下を参照のこと）のペプチドのうちの１つ以上を含む。
【００６２】
一実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、式Ｉによって定義され、
【化９】
2016540762.tif 000011
式中、Ｒ1及びＲ2は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
【化１０】
2016540762.tif 000012
【化１１】
2016540762.tif 000013
【化１２】
2016540762.tif 000014
Ｒ3及びＲ4は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
ｎは１〜５の整数である。
【００６３】
特定の実施形態では、Ｒ1及びＲ2は水素であり、Ｒ3及びＲ4はメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は、全て水素であり、ｎは４である。
【００６４】
一実施形態では、ペプチドは、式ＩＩによって定義され、
【化１３】
2016540762.tif 000015
式中、Ｒ1及びＲ2は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
【化１４】
2016540762.tif 000016
【化１５】
2016540762.tif 000017
【化１６】
2016540762.tif 000018
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は各々独立して、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含むハロゲンから選択され、
ｎは１〜５の整数である。
【００６５】
特定の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は、全て水素であり、ｎは４である。別の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ11は、全て水素であり、Ｒ8及びＲ12は、メチルであり、Ｒ10はヒドロキシルであり、ｎは４である。
【００６６】
一実施形態において、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、芳香族とカチオン性アミノ酸が交互になったコア構造モチーフを有する。例えば、ペプチドは、以下に示す式ＩＩＩ〜ＶＩのいずれかによって定義されるテトラペプチドであってもよく、
芳香族−カチオン性−芳香族−カチオン性（式ＩＩＩ）
カチオン性−芳香族−カチオン性−芳香族（式ＩＶ）
芳香族−芳香族−カチオン性−カチオン性（式Ｖ）
カチオン性−カチオン性−芳香族−芳香族（式ＶＩ）
式中、芳香族は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、及びシクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）からなる群から選択される残基であり、カチオン性は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、及び２−アミノ−ヘプタン酸（Ａｈｅ）からなる群から選択される残基である。
【００６７】
本明細書に開示されるペプチドは、薬学的に許容される塩として製剤化され得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物などの患者への投与に許容される、塩基または酸から調製された塩（例えば、所与の投薬レジメンに対して許容される哺乳類安全性を有する塩）を意味する。しかしながら、これらの塩は、患者への投与を意図していない中間化合物の塩など、必ずしも薬学的に許容される塩である必要はないことを理解されたい。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機塩基または有機塩基、及び薬学的に許容される無機酸または有機酸に由来し得る。加えて、ペプチドが、アミン、ピリジン、またはイミダゾールなどの塩基性部分と、カルボン酸またはテトラゾールなどの酸性部分との両方を含有するとき、双性イオンが形成され得、本明細書で使用する用語「塩」に含まれる。薬学的に許容される無機塩基由来の塩としては、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及び亜鉛塩などが挙げられる。薬学的に許容される有機塩基由来の塩としては、置換アミン、環式アミン、天然型アミンなどを含む、第１級、第２級、及び第３級アミン、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール，２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｄｉｎｅ）、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。薬学的に許容される無機酸由来の塩としては、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸、またはヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸、及び硫酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される有機酸由来の塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸、及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸、及びトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチジン酸、馬尿酸、及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸、及び３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、及びコハク酸）、グルコロン（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ）酸、マンデル酸、粘液酸、ニコチン酸、パモン酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンフォスルホン（ｃａｍｐｈｏｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸、エジシリック（ｅｄｉｓｙｌｉｃ）酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、及びｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸などの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩は酢酸塩である。加えてまたはあるいは、いくつかの実施形態では、塩はトリフルオロ酢酸塩である。加えてまたはあるいは、いくつかの実施形態において、塩は酒石酸塩である。
【００６８】
本明細書に開示される本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、当該技術分野で公知の方法のうちのいずれかによって合成され得る。タンパク質を化学的に合成するための好適な方法としては、例えば、液相及び固相合成、ならびにＳｔｕａｒｔ及びＹｏｕｎｇによって、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）及びＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）中で説明されているものが挙げられる。組み換えペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）、及びＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｅｄｓ．中でそれぞれ説明されているものなど、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、及び微生物学における従来の技法を使用して生成され得る。
【００６９】
芳香族カチオン性ペプチド前駆体は、当該術分野で既知の化学的合成（例えば、溶液及び個相を使用した化学的ペプチド合成）または組み換え合成のいずれかによって作製され得る。本技術の例えばアミド化された芳香族カチオン性ペプチドの前駆体は、同様の様式で作製され得る。いくつかの実施形態において、組み換え産生は、圧倒的に費用効率が高いと考えられている。いくつかの実施形態において、前駆体は、同様に当該技術分野で既知のアミド化反応により活性ペプチドに変換される。例えば、酵素的アミド化は、米国特許第４，７０８，９３４号ならびに欧州特許公開第０  ３０８  ０６７号及び同第０  ３８２  ４０３号に記載されている。組み換え産生は、芳香族カチオン性ペプチドの所望の活性形態への前駆体の変換に触媒作用を及ぼす前駆体及び酵素の両方に使用され得る。かかる組み換え産生は、アミド化生成物への前駆体の変換についてさらに記載するＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１（１９９３）ｐｐ．６４−７０で論じられる。アミド化中、α−ケト酸が分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、式中、Ｒが、アリール、Ｃ１〜Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化Ｃ１〜Ｃ４炭化水素部分、及びＣ１〜Ｃ４カルボン酸からなる群より選択される、α−ケト酸などのケト酸、またはその塩もしくはエステルが、カタラーゼ補因子の代わりに使用され得る。これらのケト酸の例としては、ピルビン酸エチル、ピルビン酸及びその塩、ピルビン酸メチル、ベンゾイルギ酸及びその塩、２−ケト酪酸及びその塩、３−メチル−２−オキソブタン酸及びその塩、ならびに２−ケトグルタル酸及びその塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
いくつかの実施形態において、組み換え芳香族カチオン性ペプチドの産生は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを有する可溶性融合タンパク質としてグリシン伸長前駆体を大腸菌内で産生することによって進行し得る。α−アミド化酵素は、活性芳香族カチオン性ペプチドへの前駆体の変換に触媒作用を及ぼす。その酵素は、例えば、上に引用したＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ論文に記載されるようなチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で組み換え産生される。他のアミド化ペプチドの前駆体は、同様の様式で産生され得る。アミド化または他の追加の官能基を必要としないペプチドもまた同じ様式で産生され得る。他のペプチド活性剤は、市販されているか、当該技術分野で既知の技術により産生され得る。
【００７１】
本ペプチドは、任意選択で、１つ以上の非天然型アミノ酸を含む。最適には、本ペプチドは、天然型のアミノ酸を有さない。非天然型アミノ酸は、左旋性（Ｌ−）、右旋性（Ｄ−）、またはこれらの混合物であってもよい。非天然型アミノ酸は、生体における正常な代謝プロセスでは典型的には合成されず、タンパク質中に天然に存在しないアミノ酸である。加えて、非天然型アミノ酸はまた、好適には、一般的なプロテアーゼによって認識されない。非天然型アミノ酸は、ペプチド中の任意の位置で存在し得る。例えば、非天然型アミノ酸は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端との間の任意の位置に存在し得る。
【００７２】
非天然型アミノ酸は、例えば、天然型アミノ酸中には見られないアルキル、アリール、またはアルキルアリール基を含み得る。非天然型アルキルアミノ酸のいくつかの例としては、α−アミノ酪酸、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸、及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。非天然型アリールアミノ酸のいくつかの例としては、オルト、メタ、及びパラアミノ安息香酸が挙げられる。非天然型アルキルアリールアミノ酸のいくつかの例としては、オルト、メタ、及びパラアミノフェニル酢酸、ならびにγ−フェニル−β−アミノ酪酸が挙げられる。非天然型アミノ酸は、天然型アミノ酸の誘導体を含む。天然型アミノ酸の誘導体は、例えば、１つ以上の化学基の天然型アミノ酸への付加を含んでもよい。
【００７３】
例えば、１つ以上の化学基は、フェニルアラニンまたはチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’、もしくは６’位のうちの１つ以上、またはトリプトファン残基のベンゾ環の４’、５’、６’、もしくは７’位のうちの１つ以上に付加することができる。基は、芳香環に付加することができる任意の化学基であり得る。かかる基のいくつかの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、またはｔ−ブチルなどの分枝または非分枝Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキルオキシ（即ち、アルコキシ）、アミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ、及びＣ１〜Ｃ４ジアルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ）、ニトロ、ヒドロキシル、ハロ（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）が挙げられる。天然型アミノ酸の非天然型誘導体のいくつかの特定の例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
【００７４】
ペプチドにおけるアミノ酸の修飾の別の例は、ペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシル基の誘導体化である。誘導体化の一例は、アンモニア、または第１級もしくは第２級アミン、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、もしくはジエチルアミンを用いたアミド化である。誘導体化の別の例としては、例えば、メチルまたはエチルアルコールを用いたエステル化が挙げられる。別のかかる修飾としては、リジン、アルギニン、またはヒスチジン残基のアミノ基の誘導体化が挙げられる。例えば、かかるアミノ基はアクリル化することができる。いくつかの好適なアシル基としては、例えば、アセチルまたはプロピオニル基など、上述のＣ１〜Ｃ４アルキル基のうちのいずれかを含むベンゾイル基またはアルカノイル基が挙げられる。
【００７５】
非天然型アミノ酸は、好適には、一般的なプロテアーゼに対して耐性または非感受性である。プロテアーゼに対して耐性または非感受性である非天然型アミノ酸の例としては、上述の天然型Ｌ−アミノ酸ならびに非天然型Ｌ−及び／またはＤ−アミノ酸のうちのいずれかの右旋性（Ｄ−）形態が挙げられる。Ｄ−アミノ酸は、通常はタンパク質中で発生しないが、細胞の通常のリボソームタンパク質合成機構以外の手段によって合成されるある特定のペプチド抗生物質中で見られる。本明細書で使用する場合、Ｄ−アミノ酸は、非天然型アミノ酸であると見なされる。
【００７６】
プロテアーゼ感受性を最小限にするために、ペプチドは、アミノ酸が天然型であるか非天然型であるかにかかわらず、一般的なプロテアーゼによって認識された５個未満、または４個未満、または３個未満、または２個未満の隣接Ｌ−アミノ酸を有するべきである。最適には、ペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみを有し、Ｌ−アミノ酸を有さない。ペプチドがアミノ酸のプロテアーゼ感受性配列を含む場合、アミノ酸のうちの少なくとも１つは、非天然型Ｄ−アミノ酸であることによりプロテアーゼ耐性を与える。プロテアーゼ感受性配列の例としては、エンドペプチダーゼ及びトリプシンなどの、一般的なプロテアーゼによって容易に開裂される２つ以上の隣接塩基性アミノ酸が挙げられる。塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられる。
【００７７】
芳香族カチオン性ペプチドは、ペプチドにおけるアミノ酸残基の総数と比較して、生理学的ｐＨでの正味の正電荷の最小数を有するべきである。生理学的ｐＨでの正味の正電荷の最小数は、以下で（ｐｍ）と称される。ペプチドにおけるアミノ酸残基の総数は、以下で（ｒ）と称される。以下で論じられる正味の正電荷の最小数は、全て生理学的ｐＨである。「生理学的ｐＨ」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物の身体の組織及び臓器の細胞における正常なｐＨを指す。例えば、ヒトの生理学的ｐＨは、通常約７．４であるが、哺乳動物における正常な生理学的ｐＨは、約７．０〜約７．８の範囲の任意のｐＨでもあり得る。
【００７８】
典型的には、ペプチドは、正に帯電したＮ末端アミノ基及び負に帯電したＣ末端カルボキシル基を有する。これらの電荷は、生理学的ｐＨで互いに相殺される。正味の電荷の計算例として、Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇペプチドは、１個の負に帯電したアミノ酸（即ち、Ｇｌｕ）及び４個の正に帯電したアミノ酸（即ち、２個のＡｒｇ残基、１個のＬｙｓ、及び１個のＨｉｓ）を有する。したがって、上記のペプチドは３個の正味の正電荷を有する。
【００７９】
一実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、３ｐｍがｒ＋１以下の最大数である、生理学的ｐＨでの正味の正電荷の最小数（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係は以下の通りである。
【表１】
2016540762.tif 000019
【００８０】
別の実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、２ｐｍがｒ＋１以下の最大数である、正味の正電荷の最小数（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐｍ）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係は以下の通りである。
【表２】
2016540762.tif 000020
【００８１】
一実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐｍ）及びアミノ酸残基の総数（ｒ）は等しい。別の実施形態では、ペプチドは、３個もしくは４個のアミノ酸残基、及び最低で１個の正味の正電荷、または最低で２個の正味の正電荷、または最低で３個の正味の正電荷を有する。
【００８２】
芳香族カチオン性ペプチドが、正味の正電荷の総数（ｐｔ）と比較して、芳香族基の最小数を有することも重要である。芳香族基の最小数は、以下で（ａ）と称される。芳香族基を有する天然型アミノ酸としては、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンといったアミノ酸が挙げられる。例えば、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐヘキサペプチドは、２個の正味の正電荷（リジン残基及びアルギニン残基が寄与する）、及び３個の芳香族基（チロシン残基、フェニルアラニン残基、及びトリプトファン残基が寄与する）を有する。
【００８３】
芳香族カチオン性ペプチドはまた、ｐｔが１である場合にａも１であり得ることを除いて、３ａがｐｔ＋１以下の最大数である、芳香族基の最小数（ａ）と生理学的ｐＨでの正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係を有する。この実施形態では、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係は以下の通りである。
【表３】
2016540762.tif 000021
【００８４】
別の実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、２ａがｐｔ＋１以下の最大数である、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係を有する。この実施形態では、芳香族アミノ酸残基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐｔ）との関係は以下の通りである。
【表４】
2016540762.tif 000022
【００８５】
別の実施形態では、芳香族基の数（ａ）及び正味の正電荷の総数（ｐｔ）は等しい。
【００８６】
カルボキシル基、特にＣ末端アミノ酸の末端カルボキシル基が、例えばアンモニアで好適にアミド化されて、Ｃ末端アミドを形成する。あるいは、Ｃ末端アミノ酸の末端カルボキシル基が、任意の第１級または第２級アミンでアミド化され得る。第１級または第２級アミンは、例えば、アルキル、特に、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールアミンであってもよい。したがって、ペプチドのＣ末端にあるアミノ酸は、アミド、Ｎ−メチルアミド、Ｎ−エチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミド、Ｎ−フェニルアミド、Ｎ−フェニル−Ｎ−エチルアミド基に変換され得る。芳香族カチオン性ペプチドのＣ末端に発生しないアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸残基の遊離カルボキシレート基も、これらがペプチド内に発生する場合にはアミド化され得る。これらの内部位置でのアミド化は、上記のアンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンのうちのいずれかで行われ得る。
【００８７】
一実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、２個の正味の正電荷及び少なくとも１個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。特定の実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、２個の正味の正電荷及び２個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。
【００８８】
芳香族カチオン性ペプチドとしては、以下のペプチド例が挙げられるが、これらに限定されない。
【表５−１】
2016540762.tif 000023
【表５−２】
2016540762.tif 000024
【表５−３】
2016540762.tif 000025
【表５−４】
2016540762.tif 000026
【表５−５】
2016540762.tif 000027
【表５−６】
2016540762.tif 000028
【表５−７】
2016540762.tif 000029
【表５−８】
2016540762.tif 000030
【表５−９】
2016540762.tif 000031
【表５−１０】
2016540762.tif 000032
Ａｌｄ＝β−（６’−ジメチルアミノ−２’−ナフトイル）アラニン
ａｔｎＤａｐ＝β−アントラニロイル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
Ｂｉｏ＝ビオチン
Ｃｈａ＝シクロへキシルアラニン
ｄ５＝重水素
Ｄａｂ＝ジアミノ酪酸
Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸
Ｄｍｐ＝ジメチルフェニルアラニン
Ｄｍｔ＝ジメチルチロシン
ｄｎｓＤａｐ＝β−ダンシル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
Ｈｍｔ＝２’−ヒドロキシ，６’−メチルチロシン
Ｍｍｔ＝２’−メチルチロシン
Ｔｍｔ＝Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン
【００８９】
一実施形態において、ペプチドは、μ−オピオイド受容体作動薬活性を有する（即ち、それらはμ−オピオイド受容体を活性化する）。μ−オピオイド受容体作動薬活性を有するペプチドは、典型的には、Ｎ末端（即ち、第１のアミノ酸位置）にチロシン残基またはチロシン誘導体を有するペプチドである。チロシンの好適な誘導体としては、２'−メチルチロシン（Ｍｍｔ）、２’，６’−ジメチルチロシン（２’,６’−Ｄｍｔ）、３’，５’−ジメチルチロシン（３’５’Ｄｍｔ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン（Ｔｍｔ）、及び２’−ヒドロキシ−６’−メチルチロシン（Ｈｍｔ）が挙げられる。
【００９０】
一実施形態では、μ−オピオイド受容体作動薬活性を有するペプチドは、式Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2は、アミノ酸であるチロシン、アルギニン、及びリジンが寄与する３個の正味の正電荷を有し、アミノ酸であるフェニルアラニン及びチロシンが寄与する２個の芳香族基を有する。Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2のチロシンは、式２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する化合物を産生するために修飾された、２’，６’−ジメチルチロシンなどのチロシンの誘導体であり得る。２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2は、６４０の分子量を有し、生理学的ｐＨで正味３個の正電荷を担持する。２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2は、エネルギーの面で独立した様式で、いくつかの哺乳類細胞型の原形質膜を容易に貫通する（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．，３０４：４２５−４３２，２００３）。
【００９１】
あるいは、他の例では、芳香族カチオン性ペプチドは、μ−オピオイド受容体作動薬活性を有しない。例えば、慢性疾患状況または状態などの長期治療中、μ−オピオイド受容体を活性化する芳香族カチオン性ペプチドの使用は、禁忌であり得る。これらの場合、芳香族カチオン性ペプチドの潜在的な副作用または中毒作用は、ヒト患者または他の哺乳動物の治療レジメンにおいて、μ−オピオイド受容体を活性化する芳香族カチオン性ペプチドの使用を不可能にし得る。可能性のある副作用は、鎮静、便秘、及び呼吸抑制を含み得る。そのような場合、μ−オピオイド受容体を活性化しない芳香族カチオン性ペプチドが適切な治療であり得る。μ−オピオイド受容体作動薬活性を有さないペプチドは、概して、Ｎ末端（即ち、アミノ酸位置１）にてチロシン残基またはチロシンの誘導体を有さない。Ｎ末端のアミノ酸は、チロシン以外のいずれの天然型または非天然型アミノ酸であってもよい。一実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸は、フェニルアラニンまたはその誘導体である。フェニルアラニンの例示的な誘導体としては、２’−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｐ）、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’，６’−Ｄｍｐ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルフェニルアラニン（Ｔｍｐ）、及び２’−ヒドロキシ−６’−メチルフェニルアラニン（Ｈｍｐ）が挙げられる。
【００９２】
μ−オピオイド受容体作動薬活性を有しない芳香族カチオン性ペプチドの例は、式Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。あるいは、Ｎ末端フェニルアラニンは、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’,６’−Ｄｍｐ）などのフェニルアラニンの誘導体であり得る。一実施形態において、２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2のアミノ酸配列は、ＤｍｔがＮ末端にないように再配置される。μ−オピオイド受容体作動薬活性を有しないそのような芳香族カチオン性ペプチドの例は、式Ｄ−Ａｒｇ−２’,６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を有する。
【００９３】
本明細書に列挙されるペプチドの好適な置換変異体は、保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸は、以下のように、それらの物理化学的特徴に従ってグループ分けすることができる。
（ａ）非極性アミノ酸：Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ（Ｇ）Ｃｙｓ（Ｃ）、
（ｂ）酸性アミノ酸：Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）、
（ｃ）塩基性アミノ酸：Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）、
（ｄ）疎水性アミノ酸：Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）Ｉｌｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）、及び
（ｅ）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）Ｈｉｓ（Ｈ）。
【００９４】
同じグループ中の別のアミノ酸によるペプチド中のアミノ酸の置換は、保存的置換と称され、元のペプチドの物理化学的特徴を保存し得る。対照的に、異なるグループの別のアミノ酸によるペプチド中のアミノ酸の置換は、概して、元のペプチドの特徴を改変する傾向が強い。
【００９５】
μ−オピオイド受容体を活性化するペプチドの例としては、表６に示される芳香族カチオン性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【表６−１】
2016540762.tif 000033
【表６−２】
2016540762.tif 000034
【表６−３】
2016540762.tif 000035
【表６−４】
2016540762.tif 000036
Ｄａｂ＝ジアミノ酪酸
Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸
Ｄｍｔ＝ジメチルチロシン
Ｍｍｔ＝２’−メチルチロシン
Ｔｍｔ＝Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン
Ｈｍｔ＝２’−ヒドロキシ，６’−メチルチロシン
ｄｎｓＤａｐ＝β−ダンシル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
ａｔｎＤａｐ＝β−アントラニロイル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
Ｂｉｏ＝ビオチン
【００９６】
μ−オピオイド受容体を活性化しないペプチドの例としては、表７に示される芳香族カチオン性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【表７】
2016540762.tif 000037
Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン
【００９７】
表６及び７に示すペプチドのアミノ酸は、Ｌ−構成またはＤ−構成のいずれかであり得る。
【００９８】
本ペプチドは、当該技術分野で公知の方法のうちのいずれかによって合成され得る。タンパク質を化学的に合成するための好適な方法としては、例えば、Ｓｔｕａｒｔ及びＹｏｕｎｇによって、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）及びＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）中で説明されているものが挙げられる。
【００９９】
本技術を実践する際には、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、及び組み換えにおける多くの従来の技法が使用される。これらの技法は、公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）、及びＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｅｄｓ．中でそれぞれ説明されている。
【０１００】
白斑を予防、改善、または治療するための芳香族カチオン性ペプチドの使用
概要．いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を投与することを含む、白斑及び／または白斑の症状の予防、改善、または治療のための療法を提供する。したがって、例えば、１つ以上の芳香族カチオン性ペプチドは、（１）他の活性剤もしくは芳香族カチオン性ペプチドとの組み合わせ製剤において、共製剤化されて、単独もしくは同時に送達または投与され得るか、（２）別々の製剤として交互にまたは並行して送達され得るか、（３）当該技術分野で既知の任意の他の併用療法レジメンによるものであり得る。交互療法において送達されるとき、本明細書に記載される方法は、例えば、別々の溶液、乳状液、懸濁液、錠剤、丸剤、またはカプセル剤内で、または別々の注射器内の異なる注射によって、活性成分を連続して投与または送達することを含み得る。同時療法では、有効用量の２つ以上の活性成分が一緒に投与されるが、一般に、交互療法中には、有効用量の各活性成分は、連続して、即ち、順次に投与される。様々な順序の断続的な併用療法もまた使用され得る。芳香族ペプチド及び他の活性剤のそのような組み合わせを投与することは、医学的疾患及び状態を患い、治療を必要とする対象に治療有効量で投与されるとき、相乗的生物学的効果をもたらすことができる。そのような手法の利点は、低用量の芳香族カチオン性ペプチド及び／または他の活性剤が、対象における白斑を予防、改善、または治療をするために必要とされ得ることである。さらに、治療の潜在的副作用は、低用量の芳香族カチオン性ペプチド及び／または他の活性剤の使用によって回避され得る。
【０１０１】
本明細書に記載される芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、疾患を予防または治療するのに有用である。具体的には、本開示は、白斑を有するまたはそれを有する疑いのある対象を治療する予防方法及び治療方法の両方を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、ＮＬＲＰ１またはＴＹＲにおける遺伝子突然変異によって引き起こされるメラニン細胞変性を呈する対象を治療する予防方法及び治療方法の両方を提供する。したがって、本方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを、それを必要とする対象に投与して、対象におけるメラニン細胞変性を低減させることによって、対象における白斑の予防及び／または治療を提供する。いくつかの実施形態において、本技術は、本明細書に開示されるような治療有効量の芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩を、それを必要とする対象に投与することによる、哺乳動物における白斑の治療、改善、または予防に関する。
【０１０２】
ペプチド複合体の予防的及び治療的使用
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を予防または治療するのに有用である。具体的には、本開示は、白斑を患っている、その危険性があるか、またはそれに罹患しやすい対象を治療する予防方法及び治療方法の両方を提供する。したがって、本方法は、有効量の少なくとも１つの芳香族ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酒石酸塩もしくはトリフルオロ酢酸塩を、それを必要とする対象に投与することによる、対象における白斑の予防及び／または治療を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、白斑を予防、治療、または改善することを目的として、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドを投与される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、有効量の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩の投与は、治療を目的として、対象における白斑の１つ以上の症状を緩和または除去する。治療用途では、組成物または薬品を、疾患の発症におけるその合併症及び中間病理学的発現型を含む、白斑の症状を治癒させるか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、白斑を患っている疑いがあるか、または既にそれを患っている対象に投与する。いくつかの実施形態において、有効量の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩の対象への投与は、白斑の１つ以上の兆候または症状を変化させる。限定するものではなく例として、白斑の兆候及び症状としては、皮膚（例えば、顔、首、手、腕、脚、膝、生殖器、及び唇の皮膚）上の乳白色の斑点（色素脱失）の産生、毛髪（例えば、頭毛、睫毛、眉、または髭）の早期白色化または灰色化、口の内側を覆う組織における色の損失、及び網膜内層の色の喪失または変化が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなものとして、本開示は、白斑に苦しむ個体を治療する方法を提供する。白斑を患っている対象は、例えば、当該技術分野で既知の任意の診断的または予測的アッセイによって特定することができる。
【０１０４】
予防用途では、有効量の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩の薬学的組成物または薬品を、疾患の生化学的、組織学的、及び／または行動学的症状、その合併症、ならびに疾患の発現中に提示される中間病理学的発現型を含む、疾患の危険性を排除するかもしくは減少させる、重症度を軽減させるか、またはその発病を遅延させるのに十分な量で、疾患または状態に罹患しやすいか、あるいはその危険性のある対象に投与する。白斑の危険性のある対象は、例えば、当該技術分野で既知の任意の診断的または予測的アッセイによって特定することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩の投与は、疾患または障害を予防するか、あるいはその進行が遅延するように、異常の特徴である症状の顕現の前に行う。適切な化合物は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０１０５】
本技術の芳香族カチオン性ペプチドの生物学的効果の決定。
種々の実施形態では、好適なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の芳香族カチオン性ペプチド系治療薬、及びその投与が治療に適応となるどうかを決定する。様々な実施形態において、インビトロアッセイを、代表的動物モデルを用いて行い、所与の芳香族カチオン性ペプチド系治療薬が、メラニン細胞のＴ細胞蓄積及び／または細胞毒性死滅を減少させることなど、メラニン細胞変性を低減させることに所望の効果を発揮するかどうかを決定することができる。治療で使用するための化合物は、ヒト対象における試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ブタ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがこれらに限定されない好適な動物モデル系で試験し得る。同様に、インビボ試験についても、当該技術分野で既知の動物モデル系のうちの任意のものを、ヒト対象への投与前に使用することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、当該技術分野で公知のアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、表皮細胞が白斑の一般的な誘導因子である１００または２５０μＭの４−第３ブチルフェノール（４−ＴＢＰ）に曝露された後に、細胞毒性を測定するアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、１００または２５０μＭの４−ＴＢＰに曝露された表皮細胞の生存率を測定するアッセイによって決定される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、自己皮膚外植片内のメラニン細胞抗原特異的Ｔ細胞蓄積及び細胞毒性活性を測定するアッセイによって決定される。自己皮膚外植片モデルの詳細説明については、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２９：２２２０−２２３２（２００９）を参照されたい。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、白斑マウスモデルの毛における進行性色素脱失を、背側の毛を引き抜く前及び引き抜いた２週間後に測定するアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、白斑マウスにおける眼の色素の存在を測定するアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、白斑マウスのジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性を測定するアッセイによって決定される。白斑マウスモデルの詳細説明については、Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，８７（３）：２９９−３０４（１９８６）を参照されたい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、白斑の養子移入マウスモデルにおける表皮色素脱失を測定するアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、メラニン細胞変性は、白斑の養子移入マウスモデルにおけるチロシナーゼＲＮＡ発現を測定するアッセイによって決定される。白斑の養子移入マウスモデルの詳細説明については、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３２：１８６９−１８７６（２０１２）を参照されたい。
【０１１０】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２',６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩での、白斑を有する対象の治療的及び予防的治療は、メラニン細胞変性を低減し、それにより白斑の症状を改善する。白斑の症状としては、光過敏性の増大、ジニトロクロロベンゼンに対する接触感受性応答の低下、皮膚、粘膜、網膜、または生殖器の色素脱失、及び頭毛、睫毛、眉、または髭の早期白色化または灰色化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
投与の形態及び有効用量
細胞、臓器、または組織をペプチドと接触させるための当業者に既知の任意の方法を用いてよい。好適な方法としては、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ法が挙げられる。インビボ法は、典型的には、上記のものなどの芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳動物、好適にはヒトに投与することを含む。治療用にインビボで使用する場合、芳香族カチオン性ペプチドは、有効量（即ち、所望の治療効果を有する量）で対象に投与する。用量及び投薬レジメンは、対象における感染の程度、治療指数などの使用する特定の芳香族カチオン性ペプチドの特徴、対象、及び対象の病歴に依存することになる。
【０１１２】
有効量は、医師及び臨床医によく知られている方法によって、前臨床試験または臨床試験中に決定し得る。本方法に有用な有効量のペプチドは、それを必要とする哺乳動物に、薬学的化合物を投与するためのある数の公知の方法のうちのいずれかによって投与することができる。ペプチドは、全身または局所投与され得る。
【０１１３】
ペプチドは、薬学的に許容される塩として製剤化されてもよい。「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物などの患者への投与に許容される、塩基または酸から調製された塩（例えば、所与の投薬レジメンに対して許容される哺乳類安全性を有する塩）を意味する。しかしながら、これらの塩は、患者への投与を意図していない中間化合物の塩など、必ずしも薬学的に許容される塩である必要はないことを理解されたい。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機塩基または有機塩基、及び薬学的に許容される無機酸または有機酸に由来し得る。加えて、ペプチドが、アミン、ピリジン、またはイミダゾールなどの塩基性部分と、カルボン酸またはテトラゾールなどの酸性部分との両方を含有するとき、双性イオンが形成され得、本明細書で使用する用語「塩」に含まれる。薬学的に許容される無機塩基由来の塩としては、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及び亜鉛塩などが挙げられる。薬学的に許容される有機塩基由来の塩としては、置換アミン、環式アミン、天然型アミンなどを含む、第１級、第２級、及び第３級アミン、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール，２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｄｉｎｅ）、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。薬学的に許容される無機酸由来の塩としては、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸、またはヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸、及び硫酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される有機酸由来の塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸、及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸、及びトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチジン酸、馬尿酸、及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸、及び３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、及びコハク酸）、グルコロン（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ）酸、マンデル酸、粘液酸、ニコチン酸、パモン酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンフォスルホン（ｃａｍｐｈｏｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸、エジシリック（ｅｄｉｓｙｌｉｃ）酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、及びｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸などの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩は、酢酸塩、酒石酸塩、またはトリフルオロ酢酸塩である。
【０１１４】
本明細書に記載の本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、本明細書に記載の障害の治療または予防のための対象への単独または組み合わせでの投与のために、薬学的組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には、活性剤及び薬学的許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬剤投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１１５】
薬学的組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内、または皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオン導入、及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張性を調整するための薬剤といった成分を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアル中に封入することができる。患者または治療する医師の簡便性のために、投薬製剤は、治療コース（例えば、７日間の治療）に必要な全ての機器（例えば、薬物のバイアル、希釈剤のバイアル、注射器、及び注射針）を含むキット中に提供され得る。
【０１１６】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与に対しては、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、非経口投与のための組成物は、滅菌でなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される必要がある。
【０１１７】
芳香族カチオン性ペプチド組成物は担体であることができ、この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には求められる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメラソールなどによって達成することができる。グルタチオン及び他の抗酸化剤を含めることで、酸化を予防することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含める。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１１８】
滅菌の注射可能な溶液は、活性成分を、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと共に、求められる量で適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒、及び上に列挙したものからの求められる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌の注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、典型的な調製方法は、活性成分に加えて、事前に滅菌濾過したその溶液からの任意の更なる所望の成分の粉末を得ることができる、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。
【０１１９】
経口組成物は、概して、不活性希釈剤及び可食担体を含む。経口治療薬投与の目的に対しては、活性化合物は、賦形剤と組み合わせ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、口内洗浄液としての使用のために液状担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤及び／または補助剤物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤などの香味剤といった成分または類似の性質の化合物のうちのいずれをも含有することができる。
【０１２０】
吸入による投与については、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガス、または噴霧器を含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾル噴霧の形態で送達され得る。かかる方法はとしては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されているものが挙げられる。
【０１２１】
本明細書に記載の本技術の芳香族カチオン性ペプチドの全身投与も、経粘膜または経皮手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与のために、浸透させるバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で概して既知であり、例えば、経粘膜投与のために、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧器の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野で概して既知である、軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。一実施形態では、経皮投与は、イオン導入法によって行われ得る。
【０１２２】
本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、担体系において製剤化されてもよい。担体は、コロイド系であり得る。コロイド系は、リポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。一実施形態では、治療用ペプチドは、ペプチド完全性を維持しながら、リポソーム中にカプセル化する。当業者であれば理解するように、リポソームを調製するための種々の方法が存在する。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．，３３：３３７−４６２（１９８８）、Ａｎｓｅｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい）。リポソーム製剤は、クリアランスを遅延させ、細胞取り込みを増加させることができる（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７−８）：９１５−９２３（２０００）を参照されたい）。活性剤は、可溶性、不溶性、透過性、不透過性、生分解性、もしくは胃保持性ポリマーまたはリポソームを含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される成分から調製される粒子中に充填することもできる。かかる粒子としては、ナノ粒子、生分解性ナノ粒子、微粒子、生分解性微粒子、ナノスフェア、生分解性ナノスフェア、ミクロスフェア、生分解性ミクロスフェア、カプセル剤、乳剤、リポソーム、ミセル、及びウイルスベクター系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
担体は、ポリマー、例えば、生分解性、生体適合性ポリマーマトリックスであることもできる。一実施形態では、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、タンパク質完全性を維持しながら、ポリマーマトリックス中に埋め込むことができる。ポリマーは、ポリペプチド、タンパク質、あるいは多糖などの天然型、またはポリα−ヒドロキシ酸などの合成型であってもよい。例としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、及びこれらの組み合わせから作製される担体が挙げられる。一実施形態では、ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸グリコール酸共重合体（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリックスは、ミクロスフェア及びナノスフェアを含む、種々の形態及びサイズで調製及び単離することができる。ポリマー製剤は、長期間の治療効果につながり得る。（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７−８）：９１５−９２３（２０００）を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー製剤は、臨床試験で使用されている。（Ｋｏｚａｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：５４８−５５２（１９９８）を参照されたい）。
【０１２４】
ポリマーミクロスフェア持続放出製剤の例は、ＰＣＴ国際公開第ポリマーミクロスフェア持続放出製剤の例は、９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙら）、米国特許第５，６７４，５３４号及び同第５，７１６，６４４号（共にＺａｌｅら）、ＰＣＴ第９６／４００７３号（Ｚａｌｅら）、及びＰＣＴ国際公開第００／３８６５１号（Ｓｈａｈら）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号及び同第５，７１６，６４４号、ならびにＰＣＴ国際公開第９６／４００７３号は、塩によって凝集に対して安定化されるエリスロポエチンの粒子を含有するポリマーマトリックスを説明している。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、移植及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの本技術の芳香族カチオン性ペプチドを身体からの急速な排除に対して保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤は、既知の技法を使用して調製することができる。物質は、例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体を有する特定の細胞を標的化したリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているものなどの、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【０１２６】
本技術の芳香族カチオン性ペプチドを製剤化して、細胞内送達を強化することができる。例えば、リポソーム送達システムが当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：６９８−７０８（１９９５）、Ｗｅｉｎｅｒ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４（３）：２０１−９（１９９４）、及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３（１２）：５２７−３７（１９９５）を参照されたい。Ｍｉｚｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１００：６３−６９（１９９６）は、タンパク質をインビボとインビトロとの両方で細胞に送達するための融合性リポソームの使用を説明している。
【０１２７】
本技術の芳香族カチオン性ペプチドの用量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。いくつかの実施形態では、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、高い治療指数を呈する。毒性副作用を呈する本技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用してもよいが、非罹患細胞への可能性のある損傷を最小限に抑え、それにより副作用を減少させるために、かかる化合物を標的化する罹患組織の部位への送達システムの設計には注意を払うべきである。
【０１２８】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する用量範囲の製剤化に使用することができる。かかる化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、用いる製剤及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で異なり得る。本方法で使用するいずれの本技術の芳香族カチオン性ペプチドについても、治療有効用量は、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１２９】
典型的には、治療または予防効果を達成するのに十分な本技術の芳香族カチオン性ペプチドの有効量は、体重１キログラム当たり１日約０．０００００１ｍｇ〜体重１キログラム当たり１日約１０，０００ｍｇの範囲である。好適には、用量範囲は、体重１キログラム当たり１日約０．０００１ｍｇ〜体重１キログラム当たり１日約１００ｍｇである。例えば、用量は、毎日、隔日、もしくは３日ごとに、体重当たり１ｍｇ／ｋｇもしくは体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ、または毎週、隔週、もしくは３週間ごとに、１〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。一実施形態では、ペプチドの単回用量は、体重１キログラム当たり０．００１〜１０，０００マイクログラムの範囲である。一実施形態では、担体における芳香族カチオン性ペプチド濃度は、送達される１ミリリットル当たり０．２〜２０００マイクログラムの範囲である。例示的な治療は、１日１回または１週間に１回の投与を伴う。治療用途では、比較的短い間隔での比較的高い用量が、疾患の進行が減少するかまたは終止するまで、かつ対象が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、求められる場合がある。その後、患者は、予防レジメンを施され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、１０−１２〜１０−６モル、例えば、約１０−７モルの標的組織でのペプチドの濃度として定義し得る。この濃度は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇまたは体表面積による等価用量の全身投薬で送達され得る。投薬スケジュールは、標的組織での治療濃度を維持するように最適化される。いくつかの実施形態では、これらの用量は、単回の１日１回または週１回投与によって投与されるが、連続投与（例えば、非経口注入または経皮適用）も含んでもよい。いくつかの実施形態では、本技術の芳香族カチオン性ペプチドの投与量は、「低」、「中」、または「高」用量レベルで提供される。一実施形態では、約０．０００１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈ、好適には約０．００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈの低用量が提供される。一実施形態では、約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、好適には約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈの中用量が提供される。一実施形態では、約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、好適には約０．５〜約２ｍｇ／ｋｇ／ｈの高用量が提供される。
【０１３１】
当業者であれば、疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の全般的な健康及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載の治療組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。
【０１３２】
本方法に従って治療される哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ラット、マウス、及びウサギなどの実験動物を含む、いずれの哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１３３】
本技術の芳香族カチオン性ペプチドのプロドラッグ形態の投与
本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、プロドラッグ形態で投与することができる。プロドラッグは、それ自体は比較的不活性であるが、酵素変換などのインビボでの化学的または生物学的プロセスにより、それらが使用される対象に導入されるとき、活性化合物に変換する芳香族カチオン性ペプチドの誘導体である。好適なプロドラッグのさらなる説明は、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５中、Ｒ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００４中、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ（ｅｄ．），Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．５０７），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８７中、及びＥ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ，ＡＰｈＡＡｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９７６  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ａｃａｄｅｍｙ，１９７７中に提供される。
【０１３４】
本技術の芳香族カチオン性ペプチド及び他の治療薬を用いた併用療法
いくつかの実施形態では、本技術の芳香族カチオン性ペプチドは、白斑の予防、改善、または治療のために、１つ以上の更なる治療薬と併用してもよい。例えば、白斑の治療は、典型的には、局所ステロイドクリームであるモノベンゾンの塗布、またはソラレン光化学療法の施行を伴う。加えて、非限定的な例として、抗生物質、ホルモン、抗新生物剤、免疫調節剤、皮膚病薬、抗血栓剤、及び抗貧血剤も投与し得る。
【０１３５】
一実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、局所ステロイド、局所もしくは経口ソラレン、モノベンゾン、または光化学療法からなる１つ以上の治療薬と組み合わされる。
【０１３６】
一実施形態では、更なる治療薬を本技術の芳香族カチオン性ペプチドと組み合わせて対象に投与することで、相乗的治療効果を生み出すようにする。「相乗的治療効果」は、２つの治療薬の組み合わせによって生み出され、かついずれか一方の治療薬単独の個別投与から別途生じるものを超過する、相加を上回る治療効果を指す。したがって、低用量のこれらの治療薬のうちの１つまたは両方を白斑の治療に使用することで、増加した治療有効性及び減少した副作用をもたらし得る。
【０１３７】
いずれの場合にも、複数の治療薬（例えば、本技術の芳香族カチオン性ペプチドを含むが、これに限定されない）は、任意の順序で、またはさらには同時に投与してもよい。同時の場合には、複数の治療薬は、単回の統合形態で、また複数の形態で適用し得る（例示目的のみで、単個の丸剤または２個の別個の丸剤のいずれかとして）。治療薬のうちの１個を複数投薬で与えてもよく、あるいは両方を複数投薬として与えてもよい。同時でない場合には、複数投薬間のタイミングは、０週間超から４週間未満までで異なり得る。加えて、組み合わせ方法、組成物、及び製剤は、２個の薬剤の使用に限定されない。
【０１３８】
芳香族カチオン性ペプチドを使用した診断法
いくつかの実施形態において、本技術の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っている対象が少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置を受ける候補者であるかどうかを決定するために診断アッセイにおいて使用される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象は、以下の基準、対象が全体表の１５％〜５０％を侵す非区域性白斑（ＮＳＶ）の確定診断を有すること、ＮＳＶが頭及び首を侵すこと、３ヶ月の期間にわたる安定したまたは緩徐進行性の白斑、対象が少なくとも１３歳であること、及び対象が少なくとも２×２ｃｍの大きさの少なくとも１つの白斑病変を有することのうちの１つ以上の基準を使用するが、これらに限定されない基準を使用して、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩での処置の候補者として選択される。加えて、またはあるいは、いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象は、対象が白斑の家族歴を持っているか、対象が少なくとも１つの自己免疫疾患を患っているか、または対象が１つ以上の遺伝子において変異を有する場合、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチドでの処置の候補者として選択され、該遺伝子としては、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、自己免疫疾患としては、橋本甲状腺炎、グレーブス病、悪性貧血、リウマチ性関節炎、乾癬、Ｉ型糖尿病、アジソン病、セリアック病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドでの処置に好適な白斑と診断された対象を特定するための診断法は、以下のステップ、白斑と診断された対象由来の１つ以上の罹患皮膚領域（例えば、白斑の発現型を示す皮膚の領域）から組織を切除すること、該組織からメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を単離すること、単離されたメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を培養すること、メラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を２つ以上の群に分けること、メラニン細胞群及び／またはケラチン生成細胞群のうちの少なくとも１つを少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）で処置すること、メラニン細胞群及び／またはケラチン生成細胞群のうちの少なくとも１つをビヒクル対照（即ち、芳香族カチオン性ペプチドでの処置なし）で処置すること、メラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を治療効果についてアッセイすること、ならびに処置された及び未処置のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞に対する少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）の治療効果を比較することのうちの１つ以上の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、メラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を治療効果についてアッセイすることは、ミトコンドリア膜電位の増加、ＡＴＰ産生の増加、細胞生存または増殖の増加、及びメラニン産生の増加のうちの１つ以上をアッセイすることを含むが、これに限定されない。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象由来の処置された及び未処置のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞に対する芳香族カチオン性ペプチドの治療効果は、白斑と診断されていない対象由来のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞と比較される。いくつかの実施形態において、対象が、白斑の発現型（例えば、顔、首、手、または膝上の白色皮膚の斑点）を発現しないか、以下の遺伝子、ＮＬＲＰ１、ＴＹＲ、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩＩ、ＰＴＰＮ２２、ＸＢＰ１、ＩＬ２ＲＡ、ＬＰＰ、ＲＥＲＥ、ＦＯＸＰ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＲ６、ＧＺＭＢ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、Ｃ１ＱＴＮＦ６、及びＦＯＸＰ３のうちの１つ以上において遺伝子変異を発現しないか、自己免疫疾患を有しないか、または白斑の家族歴を持たない場合、対象は白斑を患っていないと見なされる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象は、白斑と診断された対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞内のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生において、同じ対象由来の未処置のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞と比較して、約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％の増加がある場合、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）、またはその薬学的に許容される塩での処置のために選択される。
【０１４３】
加えて、またはあるいは、いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象は、白斑と診断された対象由来の芳香族カチオン性ペプチド処置されたメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生が、約１％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜３０％、または１５％〜２５％だけ正常レベルに戻った場合、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）、またはその薬学的に許容される塩での処置のために選択される。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の正常レベルは、白斑と診断されていない１名以上の対象由来のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞をアッセイすることによって確立される。限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の正常レベルは、白斑と診断されていない少なくとも３つの異なる対象由来のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生を平均することによって確立される。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、白斑と診断された対象が本技術の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩での処置を受けた後、芳香族カチオン性ペプチド処置を受けている対象は、芳香族カチオン性ペプチド処置の１つ以上の治療効果について監視される。限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、芳香族カチオン性ペプチド処置を監視することは、以下のステップ、芳香族カチオン性処置を受けている白斑対象の１つ以上の罹患皮膚領域から生検組織を切除すること、該組織からメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を単離すること、単離されたメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を培養すること、単離されたメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞を芳香族カチオン性処置による治療効果についてアッセイすること、芳香族カチオン性ペプチドでの処置の治療効果をメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の正規化されたまたは標準化されたレベルと比較すること、ならびに芳香族カチオン性ペプチドでの処置の治療効果を芳香族カチオン性ペプチドでの処置前の白斑対象由来の芳香族カチオン性ペプチドでの処置前の白斑対象由来のメラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞の細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の最初のレベルと比較することのうちの１つ以上の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アッセイされる治療効果は、メラニン細胞内のミトコンドリアのミトコンドリア膜電位の増加、メラニン細胞内のＡＴＰ産生の増加、メラニン細胞内の細胞生存または増殖の増加、及びメラニン細胞によるメラニン産生の増加のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、細胞エネルギー、メラニン産生、及び／または細胞増殖の「正規化された」または「標準化された」レベルは、白斑と診断されていない対象由来のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生メラニン細胞及び／またはケラチン生成細胞の正常レベルを指す。限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、ミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生の正常レベルは、白斑と診断されていない少なくとも３つの異なる対象由来のミトコンドリア膜電位、ＡＴＰ産生、細胞生存、細胞増殖、またはメラニン産生を平均することによって確立される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本技術の少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑のための療法の有効性を決定するためにスクリーニングアッセイにおいて使用される。いくつかの実施形態において、有効性が決定される白斑療法は、少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩での処置と比較される。
【０１４７】
限定するものではなく例として、いくつかの実施形態において、白斑療法の有効性を決定するためのスクリーニングアッセイは、白斑と診断された対象の罹患皮膚領域から組織を切除すること、該組織からメラニン細胞を単離すること、単離されたメラニン細胞を培養すること、メラニン細胞を２つ以上の群に分けること、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つをＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置すること、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つをビヒクル対照で処置すること（即ち、未処置の細胞）、メラニン細胞群のうちの少なくとも１つを白斑療法で処置すること（即ち、有効性が決定される白斑療法）、メラニン細胞をＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2及び白斑療法での処置による治療効果についてアッセイすること、ならびにＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での処置の治療効果を白斑療法での処置と同じ治療と比較することの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アッセイされる治療効果は、メラニン細胞内のミトコンドリアのミトコンドリア膜電位の増加、メラニン細胞内のＡＴＰ産生の増加、メラニン細胞内の細胞生存または増殖の増加、及びメラニン細胞によるメラニン産生の増加のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、白斑療法は、白斑療法でのメラニン細胞の処置がＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのメラニン細胞の処置より大きいもしくはそれに等しい治療効果を有する場合、効果的と見なされる。
【０１４８】
別の実施形態において、白斑療法の有効性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該技術分野で既知の任意の白斑マウスモデルからのマウスを少なくとも２つの群に分けること、少なくとも１つのマウス群を白斑療法で処置すること（即ち、有効性が決定される白斑療法）、少なくとも１つのマウス群を少なくとも１つの芳香族カチオン性ペプチド、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置すること、少なくとも１つのマウス群をビヒクル対照で処置すること（即ち、未処置のマウス）、及びマウスに対する白斑療法及び芳香族カチオン性処置の治療効果を比較することの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、比較される治療効果は、マウスの毛皮の白色斑点の減少、マウスのメラニン細胞内のミトコンドリアのミトコンドリア膜電位の増加、マウスのメラニン細胞内のＡＴＰ産生の増加、マウスのメラニン細胞内の細胞生存または増殖の増加、及びマウスのメラニン細胞によるメラニン産生の増加を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、白斑療法は、白斑療法でのマウスの処置がＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのマウスの処置より大きいもしくはそれに等しい治療効果を有する場合、効果的と見なされる。
【実施例】
【０１４９】
本技術を以下の実施例によってさらに例解するが、これらは、いかようにも限定的であると解釈されるべきでなはい。以下の実施例のそれぞれにおいて、本明細書に記載される任意の芳香族カチオン性ペプチドが使用され得る。限定するものではなく例として、以下の実施例で使用される芳香族カチオン性ペプチドは、２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、またはＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2であり得る。
【０１５０】
実施例１：Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での白斑メラニン細胞の処置
この実施例は、白斑と診断された対象から単離されたメラニン細胞のミトコンドリア膜電位及びＡＴＰ産生に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果を実証する。
【０１５１】
方法
ミトコンドリア膜電位：メラニン細胞を、白斑を有しない３名のヒト患者（ＮＨＭ）、及び白斑と診断された３名のヒト患者（ＶＨＭ）から単離及び培養した。各患者から培養されたメラニン細胞を３つの群に分け、各群を０μＭ、１．５μＭ、及び２μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置した。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を７日間毎日増殖培地に添加した。７日後、メラニン細胞のミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を、ＪＣ−１プローブで分析した（例えば、ＪＣ−１ミトコンドリア膜電位アッセイキット、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎを参照のこと）。図１は、３つのＮＨＭ培養及び３つのＶＨＭ培養からのメラニン細胞のミトコンドリア膜電位における平均変化を示す。
【０１５２】
ＡＴＰ産生：メラニン細胞を、白斑と診断された２名のヒト患者（ＶＨＭ）から単離及び培養した。各患者から培養されたメラニン細胞を２つの群に分け、各群を０μＭ及び２μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置した。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を３日間毎日増殖培地に添加した。３日後、メラニン細胞を溶解し、ＡＴＰレベルを蛍光光度測定によって測定した。各アッセイは３連で実施した。図２は、ＶＨＭ培養の処置された群及び未処置の群それぞれからのメラニン細胞内のＡＴＰの平均量を示す。
【０１５３】
結果
図１は、Ｄ−Ａｒｇ−２’,６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのＶＨＭメラニン細胞の処置が、ＶＨＭメラニン細胞のミトコンドリア膜電位をほぼ倍にしたことを示す。加えて、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのＶＨＭメラニン細胞の処置は、ＶＨＭメラニン細胞のミトコンドリア膜電位を未処置のＮＨＭメラニン細胞で見られるレベルに戻した。
【０１５４】
図２は、２μＭのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのＶＨＭメラニン細胞の処置が未処置のＶＨＭメラニン細胞と比較してＡＴＰ産生レベルを上昇させたことを示す。
【０１５５】
本結果は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での処置がＶＨＭメラニン細胞のミトコンドリア膜電位及びＡＴＰ産生を向上させることを示す。そのようなものとして、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2でのＶＨＭメラニン細胞の処置は、ＶＨＭメラニン細胞のミトコンドリアエネルギーを向上させる。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、細胞動力学を向上させること、及び／または白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象におけるメラニン細胞のミトコンドリア膜電位及びＡＴＰ産生の正規化に有用である。
【０１５６】
実施例２：メラニン細胞内の４−ＴＢＰ誘発された細胞毒性及びアポトーシスに対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の治療効果
この実施例は、４−ＴＢＰ誘発された白斑に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の治療効果を実証する。
【０１５７】
Ｙａｎｇ  ＆  Ｂｏｉｓｓｙ，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：２３７−２４５（１９９９）に記載される手順に従って、メラニン細胞を培養し、４−ＴＢＰで処置して白斑を誘発する。メラニン細胞の実験群を、４−ＴＢＰへの曝露後、１〜１０μｇのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置する。対照メラニン細胞群は、４−ＴＢＰのみに曝露する。
【０１５８】
結果
未処置のメラニン細胞は、４−ＴＢＰに曝露されないメラニン細胞（正常）と比較して、４−ＴＢＰへの曝露（白斑対照）の後に高レベルの細胞毒性及びアポトーシスを呈することが予期される。しかしながら、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置されたメラニン細胞は、４−ＴＢＰに曝露されていない正常のメラニン細胞と同様の細胞生存率、及び４−ＴＢＰ曝露の後の未処置のメラニン細胞よりも高い細胞生存率を示すことが予期される。
【０１５９】
これらの結果は、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩が、化学的に誘発された白斑に伴うアポトーシス及び細胞毒性の治療に有用であることを示す。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’,６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象において観察されるメラニン細胞変性及び色素脱失の治療、予防、または改善に有用である。
【０１６０】
実施例３：メラニン細胞内の４−ＴＢＰ誘発された細胞毒性及びアポトーシスに対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の予防効果
この実施例は、４−ＴＢＰ誘発された白斑に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の予防効果を実証する。
【０１６１】
メラニン細胞を、１〜１０μｇのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を用いて１週間培養する。メラニン細胞の対照群を、芳香族カチオン性ペプチドを用いずに並行して培養する。Ｙａｎｇ  ＆  Ｂｏｉｓｓｙ，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：２３７−２４５（１９９９）に記載される手順に従って、実験群及び対照群の両方を、続いて４−ＴＢＰで処置して白斑を誘発する。
【０１６２】
結果
対照群内のメラニン細胞は、４−ＴＢＰに曝露されないメラニン細胞（正常）と比較して、４−ＴＢＰへの曝露の後に高レベルの細胞毒性及びアポトーシスを呈することが予期される。しかしながら、４−ＴＢＰとの接触前にＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を用いて培養されたメラニン細胞は、４−ＴＢＰに曝露されていない正常のメラニン細胞と同様の細胞生存率、及び４−ＴＢＰ曝露の後の未処置のメラニン細胞よりも高い細胞生存率を示すことが予期される。
【０１６３】
これらの結果は、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩が、化学的に誘発された白斑に伴うアポトーシス及び細胞毒性の予防に有用であることを示す。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象において観察されるメラニン細胞変性及び色素脱失の治療、予防、または改善に有用である。
【０１６４】
実施例４：自己白斑皮膚外植片内のＴ細胞蓄積及び細胞毒性活性に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果
この実施例は、白斑皮膚外植片モデルにおけるＴ細胞蓄積及び細胞毒性活性に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果を実証する。
【０１６５】
活性白斑患者を２つの群にさらに分割する。対象Ｉ群は、１日用量０．２５ｍｇ／ｋｇ／日のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を１２週間投与され、一方、白斑対象ＩＩ群は、薬品ビヒクルで処置され、対照としての機能を果たす。パンチ生検は、白斑対象Ｉ群及びＩＩ群から隣接する脱色斑を得る。Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２９：２２２０−２２３２（２００９）中に説明される手順に従って、これらの生検を培養し、Ｔ細胞増殖を促進する。これらの病変部周囲のＴ細胞が浸潤し、皮膚組織微環境内のメラニン細胞を活発に死滅させる能力を、皮膚外植片アッセイを使用して試験する。自己皮膚外植片を、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２９：２２２０−２２３２（２００９）に記載される手順に従って生成する。病変部周囲のＴ細胞を、正常な有色素の自己皮膚外植片と２日間共培養する。Ｔ細胞を、皮膚外植片に浸潤させ、真皮表皮接合部にあるメラニン細胞に移動させる。皮膚外植片凍結切片を、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２９：２２２０−２２３２（２００９）に記載されるような免疫組織化学的検査または免疫蛍光検査によって、浸潤したＴ細胞、メラニン細胞、及びアポトーシスの存在について分析する。
【０１６６】
結果
未処置の白斑対象由来の自己皮膚外植片は、正常な対象から回収された皮膚外植片と比較して、高レベルのＴ細胞蓄積及びメラニン細胞破壊を呈することが予期される。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置された対象由来の皮膚外植片は、正常な対象から回収された皮膚外植片と同様のＴ細胞蓄積及びメラニン細胞生存率を示すことがさらに予期される。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置された対象由来の皮膚外植片は、未処置の白斑外植片よりも高いメラニン細胞生存率を示すことがさらに予期される。
【０１６７】
これらの結果は、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩が、白斑皮膚外植片モデルにおけるＴ細胞蓄積及び細胞毒性活性を抑制するのに有用であることを示す。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象において観察されるメラニン細胞変性及び色素脱失の治療、予防、または改善に有用である。
【０１６８】
実施例５：白斑マウスモデルの毛における進行性色素脱失に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果
この実施例は、白斑マウスモデルの毛における進行性色素脱失に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果を実証する。
【０１６９】
Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，８７：２９９−３０４（１９８６）に記載される白斑マウスを得る。白斑マウスを２つの群にさらに分割する。マウスＩ群は、背側の毛を引き抜く前に１日用量０．２５ｍｇ／ｋｇ／日のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を４週間投与され、一方、白斑マウスＩＩ群は、引き抜く前に薬品ビヒクルで処置される。無色素性毛の再増殖を、光学顕微鏡検査を介して監視する。
【０１７０】
結果
未処置の白斑マウスは、引き抜いた後に有色素の毛の白色の毛による進行性の置換を示すことが予期される。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置された白斑マウスは、未処置の白斑マウスと比較して、背側の毛を引き抜いた２週間後に進行性色素脱失の比率の減少を示すことがさらに予期される。
【０１７１】
これらの結果は、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩が、白斑マウスモデルの毛における進行性色素脱失の比率を、未処置の白斑対照と比べて、遅延または改善するのに有用であることを示す。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象において観察されるメラニン細胞変性及び色素脱失の治療、予防、または改善に有用である。
【０１７２】
実施例６：白斑の養子移入マウスモデルにおける表皮色素脱失に対するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の効果
Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３２：１８６９−１８７６（２０１２）に記載される白斑マウスを得る。この白斑の養子移入マウスモデルは、毛を残しながら表皮色素脱失を誘発することによってヒトの状態を再現する。これらのマウスを２つの群にさらに分割する。マウスＩ群は、１日用量０．２５ｍｇ／ｋｇ／日のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を４週間投与され、一方、白斑マウスＩＩ群は、薬品ビヒクルで処置され、対照としての機能を果たす。尾、鼻、及び足の肉球などの表皮組織内の色素の損失を、光学顕微鏡検査を介して監視する。
【０１７３】
結果
これらの未処置の白斑マウスは、尾、鼻、及び足の肉球などの表皮組織内の色素の進行性損失を示すことが予期される。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で処置された白斑マウスは、未処置の白斑マウスと比較して、表皮組織内の色素脱失の重症度の軽減を示すことがさらに予期される。
【０１７４】
これらの結果は、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩が、白斑の養子移入マウスモデルにおける表皮組織内の色素脱失の比率を減少させるのに有用であることを示す。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含むがこれに限定されない、本技術の芳香族カチオン性ペプチド、またはその薬学的に許容される塩、例えば、酢酸、酒石酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩は、白斑を患っているか、またはそれにかかりやすい対象において観察されるメラニン細胞変性及び色素脱失の治療、予防、または改善に有用である。
等価物
【０１７５】
本技術は、本技術の個別の態様の単個の例示として意図される本出願に記載の特定の実施形態に関して限定されない。本技術の多くの修正及び変形が、当業者には明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書に列挙するものに加えて、本技術の範囲内の機能的に同等の方法及び装置が、前述の説明から当業者には明らかであろう。かかる修正及び変形は、添付の特許請求の範囲内であると意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲の条項、及びかかる特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ限定される。本技術が、当然異なり得る、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生体系に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定的であるとは意図されないことを理解されたい。
【０１７６】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者であれば、本開示も、マーカッシュ群の任意の個別の構成員または下位群の構成員に関して説明されることを認識するであろう。
【０１７７】
当業者によって理解されるように、あらゆる目的で、特に書面での説明を提供することに関して、本明細書に記載される全ての範囲は、あらゆる可能性のあるそれらの下位範囲及び下位範囲の組み合わせも包含する。記載するいずれの範囲も、同じ範囲が、少なくとも等しく２分、３分、４分、５分、１０分などに分割されることを十分に説明しそれを可能にするものであると簡単に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、及び上部３分の１などに容易に分割され得る。また当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」などの全ての語は、引用される数を含み、続いて前述の下位範囲に分割され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々の要素を含む。故に、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群を指す（以降同様）。
【０１７８】
本明細書で言及または引用する全ての特許、特許出願、仮出願、及び出版物は、それらが本明細書の明白な教示に反しない限度において、全ての図面及び表を含むそれらの全体が参照により組み込まれる。
【０１７９】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に示される。
【図２】
2016540762.tif 000038
【図１】
2016540762.tif 000039
【国際調査報告】
2016540762.tif 000040