(57)【要約】  ＨＡ赤血球凝集素及び／またはインフルエンザＢ型赤血球凝集素の新規なコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびにその配列を発現する遺伝子構築物／ベクター及びワクチンを本明細書に提供する。また、提供されるワクチンを用いて１つ以上のインフルエンザＡ型血清型及び／もしくはインフルエンザＢ型血清型、またはそれらの組み合わせに対する免疫応答の発生方法も、本明細書に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種コンセンサスサブタイプワクチンであって、種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を提供し、かつ少なくとも１つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む、ワクチン。
【請求項２】
前記コンセンサス赤血球凝集素抗原が、Ｈ１赤血球凝集素、Ｈ２赤血球凝集素、Ｈ３赤血球凝集素、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記Ｈ１赤血球凝集素が、ＨＳ０９、Ｈ１Ｂｒｉｓ、Ｈ１ＴＴ、Ｈ１Ｕ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記Ｈ３赤血球凝集素が、Ｈ３ＨＡ−１、Ｈ３ＨＡ−２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のワクチン。
【請求項５】
前記インフルエンザＢ型赤血球凝集素が、ＢＨＡ−１、ＢＨＡ−２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のワクチン。
【請求項６】
ＨＳ０９が、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１Ｂｒｉｓが、配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１ＴＴが、配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１Ｕが、配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項７】
ＨＳ０９が、配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１Ｂｒｉｓが、配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１ＴＴが、配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ１Ｕが、配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項８】
Ｈ３ＨＡ−１が、配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ３ＨＡ−２が、配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項９】
Ｈ３ＨＡ−１が、配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
Ｈ３ＨＡ−２が、配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項１０】
ＢＨＡ−１が、配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
ＢＨＡ−２が、配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＢＨＡ−１が、配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、
ＢＨＡ−２が、配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１２】
哺乳動物における種々のインフルエンザ株に対する交差反応性の誘導方法であって、それを必要とする前記哺乳動物に請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々が前記哺乳動物に別々に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々が前記哺乳動物に同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
単離された核酸分子であって、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする核酸配列、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメント、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１６】
単離された核酸分子であって、
配列番号１、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号２３、配列番号１３、配列番号２５、
配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、
配列番号１のフラグメント、配列番号１９のフラグメント、配列番号２１のフラグメント、配列番号３５のフラグメント、配列番号３７のフラグメント、配列番号２３のフラグメント、配列番号１３のフラグメント、配列番号２５のフラグメント、
配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１７】
調節エレメントに操作可能に連結された、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１８】
第１及び第２の核酸配列を含む組成物であって、前記第１の核酸配列が請求項１５に記載の配列を含み、
前記第２の核酸配列が、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びそれらのフラグメントのうちの１つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む、組成物。
【請求項１９】
第１及び第２の核酸配列を含む組成物であって、前記第１の核酸配列が請求項１６に記載の配列を含み、
前記第２の核酸配列が、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びそれらのフラグメントのうちの１つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む、組成物。
【請求項２０】
哺乳動物の免疫応答の誘導方法であって、前記哺乳動物に請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の核酸配列を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８７，１８２号に対する優先権の利益を主張するものであり、その各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、改良されたインフルエンザウイルスワクチン、インフルエンザに対する免疫応答を誘導する改良された方法、ワクチン接種を受けたインフルエンザ哺乳動物宿主対感染したインフルエンザ哺乳動物宿主を診断するためならびにインフルエンザに対して個体を予防的及び／または治療的に免疫するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザ（通常、フルと呼ばれる）は、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスにより引き起こされる感染症である。インフルエンザウイルスまたはフルウイルスは、トリ及び哺乳動物に感染する。オルトミクソウイルス科の５つの属のうちの３つがインフルエンザウイルスである：インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及びインフルエンザＣ型。これらのうち、インフルエンザＡ型が最も一般的である。
【０００４】
インフルエンザは通常、咳またはくしゃみにより生じたエアロゾル中の空気を介して及びウイルスを含む体液または汚染された表面との直接接触により伝染する。インフルエンザの季節的流行は世界中で発生し、１年に数十万人が死亡する。年によっては、流行病が起こり、数百万人が死亡する。さらに、家畜（特に家禽類及びブタ）も、年に一度の流行病及び時々起こる流行病に感染しやすく、多数の動物が死に、大きな金銭的損失が生じる。
【０００５】
インフルエンザウイルスは構造的に似ており、同様な分子成分で構成される約８０〜１２０ｎｍのほぼ球状または繊維状のウイルス粒子を有する。ウイルスタンパク質及びウイルスＲＮＡを含む中心コアは、ウイルス粒子が生成される細胞に由来する１つの脂質コート及び２つの異なる糖タンパク質で構成されるウイルスエンベロープに囲まれている。ウイルスエンベロープ内にはさらに２つの異なる糖タンパク質が固定されており、これらは表面上で外側に向かって突出した部分を含む。
【０００６】
インフルエンザウイルスＲＮＡゲノムは通常、８個の異なる一本鎖マイナス鎖ＲＮＡセグメントとして与えられ、これらが１１個のタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコードするゲノムの１１個のウイルス遺伝子を構成している。８個のＲＮＡセグメントは以下の通りである：１）赤血球凝集素をコードするＨＡ（１個のビリオンを作るのに約５００分子の赤血球凝集素が必要）；２）ノイラミニダーゼをコードするＮＡ（１個のビリオンを作るのに約１００分子のノイラミニダーゼが必要）；３）核タンパク質をコードするＮＰ；４）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）をコードするＭ（１個のビリオンを作るのに約３０００個のマトリックスタンパク質分子が必要）；５）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個の別個の非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＥＰ）をコードするＮＳ；６）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＡ；７）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いてＲＮＡポリメラーゼ及びＰＢ１−Ｆ２タンパク質（アポトーシスを誘導する）をコードするＰＢ１；及び８）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＢ２。
【０００７】
これら１１個のタンパク質のうち、赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ウイルスエンベロープ中に固定されてウイルス粒子の外面に存在する２つの大きな糖タンパク質である。これらのタンパク質は、インフルエンザに対する免疫応答の免疫原となる。ＨＡは、標的細胞へのウイルスの結合及び標的細胞中へのウイルスゲノムの侵入を仲介するレクチンであり、単一遺伝子産物ＨＡ０として発現され、その後、宿主のプロテアーゼによりプロセシングされて２個のサブユニットＨＡ１及びＨＡ２を生成し、これらは一緒になってインフルエンザウイルス粒子表面上で複合体を形成する。ＮＡは、感染細胞中で新たに生成された成熟ウイルス粒子の放出に関与する。
【０００８】
インフルエンザＡ型ウイルスには１６個のＨＡ血清型及び９個のＮＡ血清型が知られている。ウイルス粒子中に存在する異なる血清型を特定することによりウイルスは通常記述される。例えば、Ｈ１Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ１、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスであり、Ｈ５Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ５、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスである。Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３血清型ならびにＮ１及びＮ２血清型だけが通常ヒトに感染する。
【０００９】
インフルエンザ株は通常、種または属に特異的である。すなわち、ブタに感染できるインフルエンザ株（ブタインフルエンザウイルス）は通常、ヒトまたはトリには感染せず、トリに感染できるインフルエンザ株（トリインフルエンザウイルス）はヒトまたはブタに感染せず、ヒトに感染できるインフルエンザ株（ヒトインフルエンザウイルス）はトリまたはブタに感染しない。しかし、インフルエンザ株は、変異して、１つの種から別の種に感染可能になることがある。例えば、ブタにだけ感染する株（ブタインフルエンザ）が、変異または組み換えにより、ヒトだけまたはブタ及びヒトの両方に感染できる株になることがある。「ブタインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前はブタに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ１Ｎ１株等）である（すなわち、ブタインフルエンザウイルスはブタ起源ヒトインフルエンザまたはブタ由来ヒトインフルエンザである）。「トリインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前にトリに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ５Ｎ１株等）である（すなわちトリインフルエンザウイルスはトリ起源ヒトインフルエンザまたはトリ由来ヒトインフルエンザである）。
【００１０】
先進国の多くの人々及び時には家畜に、インフルエンザに対するワクチン接種が季節的に行われる。ワクチンによって誘導される免疫応答は特定のサブタイプのウイルスに特異的なため、使用されるワクチンの防御効果は限定的である。毎年、その年にどの種類及び株のウイルスが循環するかについての国際的調査及び科学者の予測に基づいて、異なるインフルエンザワクチンが開発及び投与される。ウイルスは、セグメントの変異、組み換え、及び再構築により大きく変化する。したがって、ある年に与えられたワクチンは、翌年に広く伝染する季節性の株に対して防御効果を有しないと考えられる。
【００１１】
アメリカ疾病管理予防センターが一般に奨励する「インフルエンザ予防接種（ｆｌｕ  ｓｈｏｔ）」は通常３種類の死菌／不活化インフルエンザウイルス、すなわち１つのＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、１つのＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、及び１つのＢウイルスを含む。そのため、サブタイプの予測及びそのサブタイプに対する特異的ワクチンの利用可能性によりワクチン接種が制限されていることは明らかである。
【００１２】
動物及びヒト疾患に対するワクチン接種のための核酸配列の直接投与が研究され、所望の抗原の必要な発現を得、それによる免疫原性応答を得るため、そして究極的にはこの技術を成功させるために、効果的かつ効率的な核酸送達手段に多くの努力がなされてきた。
【００１３】
ＤＮＡワクチンには、生菌弱毒ウイルス及び組み換えタンパク質ベースのワクチンを初めとする従来のワクチン接種法と比べて多くの概念的利点がある。ＤＮＡワクチンは、安全であり、安定しており、生成が容易であり、かつ前臨床試験においてヒトに十分耐性があり、プラスミド統合の形跡をほとんど示さない。［Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９］。さらに、ＤＮＡワクチンは、ベクターに対する予め存在する抗体の力価にワクチンの有効性が影響されないため、反復投与に非常に適している［Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３］。しかしながら、ＤＮＡワクチンの臨床的な採用における１つの主要な障害は、より大きな動物へ移動するときにプラットフォームの免疫原性が減少することである［Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０］。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、免疫グロブリンリーダー配列の添加等、ＤＮＡワクチン免疫原等の工学における最近の技術の進歩により、ＤＮＡワクチンの発現及び免疫原性が改善され、［Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１；Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９；Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３］、また、電気穿孔等のプラスミド送達システムにおける技術が最近開発された［Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８；Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９；Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３］。さらに、研究は、コンセンサス免疫原の使用は、単独の天然抗原と比較して、細胞性免疫応答の幅を増大させることができることを示唆した［Ｙａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４］。
【００１４】
プラスミドＤＮＡ等の核酸配列を送達する方法の１つは電気穿孔（ＥＰ）技術である。この技術は、ブレオマイシン等の抗がん薬を送達するためのヒト臨床試験、及び多数の動物種における多くの前臨床研究において使用されてきた。
【００１５】
免疫原性インフルエンザコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸構築物、及びインフルエンザの複数の株に対する広範な交差応答である哺乳動物における免疫応答を誘導するのに有用な組成物に対するニーズが依然として存在する。インフルエンザの複数の株に対する交差防御の能力を含む、個体を処置するための、経済的でありかつ多くのインフルエンザサブタイプに有効な、インフルエンザに対する効果的なワクチンに対するニーズがある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ワクチンが種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を提供する多種コンセンサスサブタイプのワクチンを提供する。一実施形態において、ワクチンは、少なくとも１つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。
一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｈ１赤血球凝集素、Ｈ２赤血球凝集素、Ｈ３赤血球凝集素、及びインフルエンザＢ型赤血球凝集素、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
一実施形態において、Ｈ１赤血球凝集素は、ＨＳ０９、Ｈ１Ｂｒｉｓ、Ｈ１ＴＴ、Ｈ１Ｕ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
一実施形態において、Ｈ３赤血球凝集素は、Ｈ３ＨＡ−１、Ｈ３ＨＡ−２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態において、インフルエンザＢ型赤血球凝集素は、ＢＨＡ−１、ＢＨＡ−２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態において、ＨＳ０９は、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２１】
一実施形態において、Ｈ１Ｂｒｉｓは、配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２２】
一実施形態において、Ｈ１ＴＴは、配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２３】
一実施形態において、Ｈ１Ｕは、配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２４】
一実施形態において、ＨＳ０９は、配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２５】
一実施形態において、Ｈ１Ｂｒｉｓは、配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２６】
一実施形態において、Ｈ１ＴＴは、配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２７】
一実施形態において、Ｈ１Ｕは、配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２８】
一実施形態において、Ｈ３ＨＡ−１は、配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２９】
一実施形態において、Ｈ３ＨＡ−２は、配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３０】
一実施形態において、Ｈ３ＨＡ−１は、配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３１】
一実施形態において、Ｈ３ＨＡ−２は、配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３２】
一実施形態において、ＢＨＡ−１は、配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３３】
一実施形態において、ＢＨＡ−２は、配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３４】
一実施形態において、ＢＨＡ−１は、配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態において、ＢＨＡ−２は、配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３６】
本発明はまた、哺乳動物における種々のインフルエンザ株に対する交差反応性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、それを必要とする哺乳動物に本発明のワクチンを投与することを含む。一実施形態において、本発明のワクチンは、少なくとも１つのコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。
【００３７】
一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々は、哺乳動物に別々に投与される。一実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原の各々は、哺乳動物に同時に投与される。
【００３８】
配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６、配列番号６に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号６のフラグメント、配列番号６のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号９のフラグメント、配列番号９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２７、配列番号２７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２７のフラグメント、配列番号２７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２９、配列番号２９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２９のフラグメント、配列番号２９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３１、配列番号３１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３１のフラグメント、配列番号３１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３３、配列番号３３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３３のフラグメント、配列番号３３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及び配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子が本明細書において提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの態様において、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７をコードする核酸配列、配列番号７をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号７をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号７をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１０をコードする核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２８をコードする核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３０をコードする核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３２をコードする核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３４をコードする核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及び配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択される単離された核酸分子が存在する。
【００４０】
以下を含む組成物が提供される：ａ）以下のうちの１つ以上からなる群から選択される第１の核酸配列のうちの１つ以上：配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６、配列番号６に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号６のフラグメント、配列番号６のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号９のフラグメント、配列番号９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２７、配列番号２７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２７のフラグメント、配列番号２７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２９、配列番号２９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２９のフラグメント、配列番号２９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３１、配列番号３１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３１のフラグメント、配列番号３１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３３、配列番号３３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３３のフラグメント、配列番号３３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及び配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及びｂ）以下のうちの１つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする第２の核酸配列のうちの１つ以上：インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼ、またはそれらのフラグメント。
【００４１】
また、以下を含む組成物が提供される：ａ）以下のうちの１つ以上からなる群から選択される第１の核酸配列のうちの１つ以上：配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７をコードする核酸配列、配列番号７をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号７をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号７をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１０をコードする核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２８をコードする核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３０をコードする核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３２をコードする核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３４をコードする核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及び配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；及びｂ）以下のうちの１つ以上からなる群から選択されるタンパク質をコードする第２の核酸配列：インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼ、またはそれらのフラグメント。
【００４２】
いくつかの態様において、以下等の組み合わせを有し得るワクチンが存在する：
ａ）  インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第１のインフルエンザ核酸配列Ｈ１赤血球凝集素のうちの１つ以上であって、以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号９のフラグメント、配列番号９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１０をコードする核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
ｂ）  インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第１のインフルエンザ核酸配列Ｈ３赤血球凝集素のうちの１つ以上であって、以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２７、配列番号２７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２７のフラグメント、配列番号２７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２９、配列番号２９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２９のフラグメント、配列番号２９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２８をコードする核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３０をコードする核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
ｃ）  インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である、第１のインフルエンザ核酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素のうちの１つ以上であって、以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３１、配列番号３１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３１のフラグメント、配列番号３１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３３、配列番号３３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３３のフラグメント、配列番号３３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３２をコードする核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３４をコードする核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
【００４３】
本発明のいくつかの態様は、調節エレメントに操作可能に連結された本発明の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００４４】
本発明のいくつかの態様では、そのような核酸分子及び／または組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を誘導する方法が提供される。
【００４５】
本発明の別の態様では、感染から個体を防御する方法が提供される。方法は、このような核酸配列または組成物を含む予防有効量の核酸分子を投与するステップであって、核酸配列が前述の個体の細胞中で発現され、インフルエンザの１つ以上の株に対する防御免疫応答が誘導される、投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する防御免疫応答である。
【００４６】
本発明のいくつかの態様では、インフルエンザに感染した個体を処置する方法が提供される。方法は、前述の個体に、治療有効量のそのような核酸分子及び／または組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、免疫応答はインフルエンザの複数の株に対する広範な交差応答である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】２９９９塩基対の骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）のマップを示す図である。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位が塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニング部位は、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルが塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣオリジンが塩基２３２０〜２９９３にある。  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づき、ｐＧＸ２００９の骨格として使用されたｐＶＡＸ１の配列中に以下の変異が見つかった：Ｃ＞Ｇ  ２４１  ＣＭＶプロモーター中Ｃ＞Ｔ  １９４２  骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）の下流Ａ＞−  ２８７６  骨格、カナマイシン遺伝子の下流Ｃ＞Ｔ  ３２７７  ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）中、高コピー数の突然変異（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５を参照されたい）Ｇ＞Ｃ  ３７５３  ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ  Ｏｒｉの末端中塩基対２、３、及び４は、ＣＭＶプロモーター上流の骨格中でＡＣＴからＣＴＧに変化している。
【図２】ｐＨ１ＨＡ０９とも呼ばれるプラスミドｐＧＸ２００９の２つのマップを示す図である。プラスミドｐＧＸ２００９（配列番号５）の核酸配列は、Ｃ末端に連結されたＨＡタグ（配列番号１８）を含むコンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１にコードされるアミノ酸配列番号２）のＮ末端に連結されたＩｇＥリーダー（アミノ酸配列番号１７）を含むコンセンサスＨ１タンパク質構築物（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）のコード配列を含む。コンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）は、ＳｗｉＨｕｍ  Ｃｏｎ  ＨＡ及びＨ１ＨＡ０９とラベルされている。
【図３】プラスミドｐＧＸ２００６のマップを示す。プラスミドｐＧＸ２００６の核酸配列（配列番号８）は、Ｈ２ＨＡとラベルされたコンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）のコード配列を含む。
【図４】免疫化したフェレットの血清を用いて実施された赤血球凝集抑制試験から得られたデータを示す図である。
【図５】新規なＨ１Ｎ１株で免疫されたまたは免疫されていないフェレットの暴露結果を示す図である。
【図６】種々のＨ１ＨＡインフルエンザ株間の遺伝子関係を示す、最近２０年間にわたる株の遺伝子のインフルエンザＨ１赤血球凝集素（Ｈ１ＨＡ）遺伝子樹を示す。
【図７Ａ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｂ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｃ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｄ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｅ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｆ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図７Ｇ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図８Ａ】種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図８Ｂ】種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図８Ｃ】種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ１Ｕ（配列番号３５）、ＨＳ０９（配列番号１）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ；配列番号１９）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１−ＴＴ；配列番号２１）、コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図９Ａ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したモルモット（コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す；９Ａはデータポイントを示し、９Ｂは平均及び標準偏差を示す。
【図９Ｂ】種々の季節性ウイルスに対する、免疫化したモルモット（コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す；９Ａはデータポイントを示し、９Ｂは平均及び標準偏差を示す。
【図１０Ａ】は、種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したモルモット（コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す；１０Ａはデータポイントを示し、１０Ｂは平均及び標準偏差を示す。
【図１０Ｂ】は、種々の流行性ウイルスに対する、免疫化したモルモット（コンボ（４Ｈ１Ｕ、ＨＳ０９、ＣｏｎＢｒｉｓ、及びＣｏｎＴＴ全て））の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す；１０Ａはデータポイントを示し、１０Ｂは平均及び標準偏差を示す。
【図１１Ａ】１１Ａ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４１０８／２００９流行性株、１１Ｂ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９流行性株のうちのいずれかに対して（ＨＳ０９及びＨ１Ｕの組み合わせで免疫化した）フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの２００９Ｈ１メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。
【図１１Ｂ】１１Ａ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４１０８／２００９流行性株、１１Ｂ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９流行性株のうちのいずれかに対して（ＨＳ０９及びＨ１Ｕの組み合わせで免疫化した）フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの２００９Ｈ１メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。
【図１１Ｃ】１１Ａ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４１０８／２００９流行性株、１１Ｂ）Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９流行性株のうちのいずれかに対して（ＨＳ０９及びＨ１Ｕの組み合わせで免疫化した）フェレットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された力価グラフと、インフルエンザの２００９Ｈ１メキシコ株で暴露したときのフェレットの生存の割合を示すグラフとを示す。
【図１２】種々のＢＨＡ株間の遺伝子関係を示す、最近２０年間の株の遺伝子のインフルエンザＢ型赤血球凝集素（ＢＨＡ）遺伝子樹を示す。
【図１３Ａ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１３Ｂ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１３Ｃ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１３Ｄ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１３Ｅ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１３Ｆ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１４Ａ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１４Ｂ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１４Ｃ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１５Ａ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）の、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１５Ｂ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）の、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１５Ｃ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）の、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１５Ｄ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）の、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の予め免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１６Ａ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１６Ｂ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１６Ｃ】種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１７Ａ】は、種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意：図１５Ａ〜Ｄ、１６Ａ〜Ｃ、及び１７Ａ〜Ｃにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット（ＢＨＡ−２から別途送達されるＢＨＡ−１）であるが、一方、コンボ（混合）でＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２は、混合されて同時に送達された。
【図１７Ｂ】は、種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意：図１５Ａ〜Ｄ、１６Ａ〜Ｃ、及び１７Ａ〜Ｃにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット（ＢＨＡ−２から別途送達されるＢＨＡ−１）であるが、一方、コンボ（混合）でＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２は、混合されて同時に送達された。
【図１７Ｃ】は、種々のウイルスに対する免疫前（「プレ」）、投与後１（「ＰＤ１」）、投与後２（「ＰＤ２」）、または投与後３（「ＰＤ３」）、ＢＨＡ−１（配列番号１３）、ＢＨＡ−２（配列番号２５）、コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２の両方）の免疫化したモルモットの血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。注意：図１５Ａ〜Ｄ、１６Ａ〜Ｃ、及び１７Ａ〜Ｃにおいて、「コンボ」サンプルは、別途コンボで免疫化したモルモット（ＢＨＡ−２から別途送達されるＢＨＡ−１）であるが、一方、コンボ（混合）でＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２は、混合されて同時に送達された。
【図１８】種々のＨ３ＨＡ株間の遺伝子関係を示す、最近２０年間の株の遺伝子のインフルエンザＨ３赤血球凝集素（Ｈ３ＨＡ）遺伝子樹を示す。
【図１９Ａ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１９Ｂ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１９Ｃ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１９Ｄ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図１９Ｅ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ａ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ｂ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ｃ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ｄ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ｅ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【図２０Ｆ】種々のウイルスに対する、免疫化したマウス（未処置、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３）、コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２の両方）の血清で実施された赤血球凝集抑制試験から生成された抑制力価のいくつかのグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
インフルエンザＡ型Ｈ１及びＨ２の各々のコンセンサスアミノ酸配列（本明細書でそれぞれ「コンセンサスＨ１Ｓ」または「ＨＳ０９」（配列番号２）及び「コンセンサスＨ２」または「Ｈ２ＨＡ」（配列番号７）と呼ばれる）、合成ハイブリッドコンセンサスＨ１インフルエンザＡ赤血球凝集素アミノ酸配列（本明細書で「コンセンサスＵ２」または「Ｈ１Ｕ２」（配列番号１０）と呼ばれる）、コンセンサスのアミノ酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素（本明細書で「コンセンサスＢＨＡ」または「ＢＨＡ−１」（配列番号１４）と呼ばれる）、コンセンサスアミノ酸配列Ｈ１Ｂｒｉｓ赤血球凝集素「ＣｏｎＢｒｉｓまたは「Ｈ１Ｂｒｉｓ」（配列番号２０）、コンセンサスアミノ酸配列Ｈ１ＴＴ赤血球凝集素「ＣｏｎＴＴ」「Ｈ１ＴＴ」（配列番号２２）、コンセンサスアミノ酸配列Ｈ３赤血球凝集素または「Ｈ３ＨＡ−２」（配列番号２４）、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素または「ＢＨＡ−２」（配列番号２６）、コンセンサスアミノ酸配列Ｈ３赤血球凝集素または「Ｈ３ＨＡ−３」（配列番号２８）、コンセンサスアミノ酸配列Ｈ３赤血球凝集素または「Ｈ３ＨＡ−４」（配列番号３０）、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素または「ＢＨＡ−３」（配列番号３２）、コンセンサスアミノ酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素または「ＢＨＡ−４」（配列番号３４）、合成ハイブリッドコンセンサスＨ１インフルエンザＡ型赤血球凝集素「コンセンサスＵ」または「Ｈ１Ｕ」（配列番号３６）、及びコンセンサスアミノ酸配列Ｈ３赤血球凝集素または「Ｈ３ＨＡ−１」（配列番号３８）が提供され、これらは、インフルエンザに対する哺乳動物の防御を提供することができる。加えて、コンセンサスＨ１アミノ酸配列、コンセンサスＨ２アミノ酸配列、コンセンサスＵ２アミノ酸配列、及び／またはコンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの態様において、ＨＳ０９アミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号３）、Ｈ２ＨＡアミノ酸配列（例えば、配列番号６）、Ｈ１Ｕ２アミノ酸配列（例えば、配列番号９または配列番号１１）、ＢＨＡ−１アミノ酸配列（例えば、配列番号１３または配列番号１５）、Ｈ１Ｂｒｉｓアミノ酸配列（例えば、配列番号１９）、Ｈ１ＴＴアミノ酸配列（例えば、配列番号２１）、Ｈ３ＨＡ−２アミノ酸配列（例えば、配列番号２３）、ＢＨＡ−２アミノ酸配列（例えば、配列番号２５）、Ｈ３ＨＡ−３アミノ酸配列（例えば、配列番号２７）、Ｈ３ＨＡ−４アミノ酸配列（例えば、配列番号２９）、ＢＨＡ−３アミノ酸配列（例えば、配列番号３１）、ＢＨＡ−４アミノ酸配列（例えば、配列番号３３）、Ｈ１Ｕアミノ酸配列（例えば、配列番号３５）、及びＨ３ＨＡ−１アミノ酸配列（例えば、配列番号３７）を含むタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【００４９】
科学的理論により限定されるものではないが、多種インフルエンザサブタイプに対して幅広く免疫応答（体液性、細胞性、または両方）を誘発するために使用できるワクチンは、以下のうちの１つ以上を含み得る：１）コンセンサスＨ１ＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサスＨ１ＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質、３）コンセンサスＨ２ＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２ＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質、５）コンセンサスＨ１Ｕ及び／またはＨ１Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＨ１Ｕ及び／またはＨ１Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００５０】
以下の構成要素の２つ以上を使用して及び／または組み合わせて、免疫方法を実施し、ワクチンを調製することができる：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質、３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質、５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。インフルエンザに対するより広い処置のために、インフルエンザＡ型のＨ１〜Ｈ１６、インフルエンザＡ型のＮ１〜Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、インフルエンザＢ型ノイラミニダーゼ等の１つ以上のその他のインフルエンザタンパク質及び／またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を以下の構成要素の１つ以上と一緒に使用して及び／または組み合わせて免疫化方法を行い、ワクチンを調製することができる：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質、３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質、５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００５１】
１．定義。
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別様に明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。
【００５２】
本明細書における数値範囲の記載には、その間にある同じ精度の各数値が明確に意図される。例えば、６〜９の範囲には、６及び９に加えて７及び８の数値が意図され、６．０〜７．０の範囲には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明確に意図される。
【００５３】
ａ．アジュバント
本明細書において、「アジュバント」とは、後述するＤＮＡプラスミド及びコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００５４】
ｂ．抗体
本明細書において、「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥクラスの抗体、またはフラグメント、またはそのフラグメントもしくは派生物（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及び単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにその派生物を含む）を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、またはその混合物であってよい。
【００５５】
ｃ．コード配列
本明細書において、「コード配列」または「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列はさらに、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内での発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに操作可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルを含み得る。
【００５６】
ｄ．相補体
本発明において、「相補体」または「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間におけるワトソン・クリック（例えばＡ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を形成できる核酸を意味する。
【００５７】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書において、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」とは、特定のインフルエンザ抗原の多種サブタイプのアラインメント分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列が調製され得る。コンセンサス配列を含むタンパク質及び／またはそのようなタンパクをコードする核酸分子を含むワクチンを用いて、特定のインフルエンザ抗原の多種サブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導することができる。コンセンサスインフルエンザ抗原には、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２等のインフルエンザＡ型のコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列、またはインフルエンザＢ型のコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列が含まれ得る。
【００５８】
ｆ．一定電流
本明細書において、「一定電流」とは、組織または前述の組織を画定する細胞が、同じ組織に送達される電気パルスの期間中に受けるまたは経験する電流を意味する。電気パルスは本明細書に記載の電気穿孔デバイスによって送達される。本明細書に提供される電気穿孔デバイスがフィードバックエレメントを有する、好ましくは即時的フィードバックを有するので、この電流は、電気パルス存続期間中、前述の組織中で一定のアンペア数である。フィードバックエレメントにより、パルス期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定することができ、電気穿孔デバイスが電気パルス（マイクロ秒のオーダー）を通して同じ組織中及びパルス間で電流が一定になるように電気エネルギー出力を変化させる（例えば電圧を上げる）ことが可能になる。いくつかの実施形態において、フィードバックエレメントは制御器を含む。
【００５９】
ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
「電流フィードバック」または「フィードバック」は同じ意味で使用することができ、電極間で組織中の電流を測定することと、及びそれに基づいて電流を一定レベルに維持するためにＥＰデバイスから送達されるエネルギー出力を変化させることとを含む、所定の電気穿孔デバイスの能動的な応答を意味する。この一定レベルは、パルス列または電気処置の開始前に、使用者により予め設定される。フィードバックは、電気穿孔デバイスの電気穿孔部品、例えば制御器により達成することができ、電気穿孔デバイスの電気回路が、電極間の組織中の電流を連続的に監視し、監視された電流（すなわち組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、監視される電流が予め設定されたレベルに維持されるように連続的にエネルギー出力を調整することができる。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時的であり得る。
【００６０】
ｈ．分散電流
本明細書において、「分散電流（ｄｅｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ）」とは、本明細書に記載されている電気穿孔デバイスの種々の針電極アレイから送られる電流のパターンであって、パターンが、電気穿孔されている組織の任意の領域において電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小化するか好ましくは除去するものを意味する。
【００６１】
ｉ．有効
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物に効果的に結合するか、またはそれを送達するのに十分な量である。
【００６２】
ｊ．電気穿孔
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「電気運動強化」（「ＥＰ」）とは、生体膜に微細通路（孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、及び水等の生体分子が、細胞膜の一方の側面から反対側に通過することを可能にする。
【００６３】
ｋ．コードする
「コードする」は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）、またはそれらから結果として得られたアミノ酸の定義された配列及び生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的な配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を生成する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。両方のコーディング鎖、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表において提供されるヌクレオチド配列、及び遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用される非コーディング鎖は、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産生物をコードすることを指し得る。
【００６４】
ｌ．フィードバック機構
本明細書において、「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）のいずれかによって実施されるプロセスであって、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルス送達の前、間、及び／または後）を受け取り、予め設定された値（好ましくは電流）と比較し、送達されるエネルギーパルスを予め設定された値に調整するプロセスを意味する。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実施され得る。
【００６５】
ｍ．フラグメント
核酸配列に関して本明細書に使用される「フラグメント」とは、例えば、インフルエンザＡ型のＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡ型のＨ２赤血球凝集素、またはインフルエンザＢ型の赤血球凝集素を含む、全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。フラグメントは、コンセンサスアミノ酸配列をコードし、配列番号１、６、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、及び３７を含む、このような配列を構築する種々のヌクレオチド配列と、配列番号２、７、１０、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び３８をコードするヌクレオチド配列とのうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡフラグメントであり得る。ＤＮＡフラグメントは、ＩｇＥまたはＩｇＧ配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。ＤＮＡフラグメントの長さは、ヌクレオチド３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、７２０個以上、７８０個以上、８４０個以上、９００個以上、９６０個以上、１０２０個以上、１０８０個以上、１１４０個以上、１２００個以上、１２６０個以上、１３２０個以上、１３８０個以上、１４４０個以上、１５００個以上、１５６０個以上、１６２０個以上、１６８０個以上、１７４０個以上、１８００個以上、１８６０個以上、１８２０個以上、１８８０個以上、１９４０個以上、２０００個以上、２６００個以上、２７００個以上、２８００個以上、２９００個以上、２９１０個以上、２９２０個以上、２９３０個以上、２９３１個以上、２９３２個以上、２９３３個以上、２９３４個以上、２９３５個以上、２９３６個以上、２９３７個以上、または２９３８個以上であり得る。ＤＮＡフラグメントは、ヌクレオチド１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７２０個未満、７８０個未満、８４０個未満、９００個未満、９６０個未満、１０２０個未満、１０８０個未満、１１４０個未満、１２００個未満、１２６０個未満、１３２０個未満、１３８０個未満、１４４０個未満、１５００個未満、１５６０個未満、１６２０個未満、１６８０個未満、またはヌクレオチド１７４０個未満、１８００個未満、１８６０個未満、１８２０個未満、１８８０個未満、１９４０個未満、２０００個未満、２６００個未満、２７００個未満、２８００個未満、２９００個未満、２９１０個未満、２９２０個未満、２９３０個未満、２９３１個未満、２９３２個未満、２９３３個未満、２９３４個未満、２９３５個未満、２９３６個未満、２９３７個未満、または２９３８個未満であり得る。
【００６６】
ポリペプチド配列との関連における「フラグメント」とは、例えばインフルエンザＡ型のＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡ型のＨ２赤血球凝集素、またはインフルエンザＢの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドを意味する。フラグメントは、配列番号２、７、１０、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び３８を含む本発明の種々のポリペプチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチドフラグメントであり得る。ポリペプチドフラグメントは、ロスアラモス国立研究所のＨＡ配列データベース等の公的に利用可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも１つの抗原性エピトープと接触するように分析される可能性がある。ポリペプチドＨＡフラグメントは、ＩｇＥまたはＩｇＧ等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列をさらに含むことができる。ポリペプチドフラグメントの長さは、アミノ酸３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、または７１０個以上であり得る。ポリペプチドフラグメントの長さは、アミノ酸１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７００個未満、７０１個未満、７０２個未満、７０３個未満、７０４個未満、７０５個未満、７０６個未満、７０７個未満、７０８個未満、７０９個未満、または７１０個未満であり得る。
【００６７】
ｎ．遺伝子構築物
本明細書に使用される際、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞内での発現を指示することができる、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに操作可能に結合される開始及び終結シグナルが含まれる。本明細書に使用される際、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に操作可能に結合される、必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
【００６８】
ｏ．同一
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して本明細書に使用される「同一な」または「同一性」とは、その配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適にアライメントし、指定の領域にわたり２つの配列を比較し、同一の残基が両方の配列に発生する位置の数を判定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を、指定領域内の位置の合計数で除し、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって、計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つ以上の末端の食い違いをもたらし、指定の比較領域が、単一の配列のみを含む場合は、単一の配列の残基を、計算の分子ではなく、分母に含める。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。同一性は、手作業またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実施することができる。
【００６９】
ｐ．インピーダンス
「インピーダンス」は、フィードバック機構を議論する時に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
【００７０】
ｑ．免疫応答
本明細書において、「免疫応答」とは、インフルエンザ赤血球凝集素コンセンサス抗原等の抗原の導入に応答した、宿主免疫系（例えば哺乳動物の免疫系）の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答の形態であってもよく、体液性応答の形態であってもよく、両方であってもよい。
【００７１】
ｒ．核酸
本明細書に使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合で一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述もまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、記述された一本鎖の相補鎖を包含する。所与の核酸と同じ目的に核酸の多くのバリアントを用いることができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブをもまた包含する。
【００７２】
核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、二本鎖配列部分及び一本鎖配列部分の両方を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡの両方）であってもよく、ＲＮＡであってもよく、または核酸がデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得るハイブリッドであってもよい。核酸は、化学合成法または組み換え法によって、得ることができる。
【００７３】
ｓ．操作可能に連結された
本明細書において、「操作可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、空間的に関係する（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）プロモーターの制御下における遺伝子の発現を意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置してもよく、３’（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子の距離は、プロモーターが由来する遺伝子中におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で既知のように、この距離はプロモーター機能を消失させることなく変えることができる。
【００７４】
ｔ．プロモーター
本明細書において、「プロモーター」とは、細胞中での核酸の発現を付与、活性化、または促進できる合成または天然由来分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに強化する、ならびに／またはその空間的発現及び／もしくは一時的発現を変化させる、１つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターはさらに、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位性のエンハンサーまたは抑制エレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、動物等を起源とし得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００７５】
ｕ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複雑な混合物において等、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、環境によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核濃度下で）であり得る（標的配列が、過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％は、平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または別の塩）、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）で少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートまたは５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣで洗浄、ならびに６５℃で０．１％ＳＤＳ。
【００７６】
ｖ．実質的に相補的
本明細書に使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、または２０７０以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００７７】
ｗ．実質的に同一
本明細書において、「実質的に同一」とは、第１の配列が第２の配列の相補体に実質的に相補的である場合、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸領域にわたって、または核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。
【００７８】
ｘ．サブタイプまたは血清型
本発明において、「サブタイプ」または「血清型」は同じ意味で使用されており、インフルエンザウイルスに関して、インフルエンザウイルスの遺伝的バリアントを意味し、１つのサブタイプは免疫系によって異なるサブタイプとは別に認識される。
【００７９】
ｙ．バリアント
本明細書において、核酸と関連して使用される「バリアント」とは、（ｉ）参照されているヌクレオチド配列の一部またはフラグメント；（ｉｉ）参照されているヌクレオチド配列またはその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照されている核酸またはその相補体と実質的に同一な核酸；または（ｉｖ）参照されている核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００８０】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸が異なっているが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮することによって、特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指標は、その疎水性及び電荷の考察に基づく。類似のハイドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、依然としてタンパク質の機能を保持することは、当該技術分野で既知である。一態様において、±２のハイドロパシー指標を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用することでも、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換が判明し得る。ペプチドとの関連においてアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することが可能となり、これは、抗原性及び免疫原性と十分に相関性があることが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。同様な親水性値のアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性等の生物学的活性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施され得る。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値のいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この見解と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、寸法、及び他の特性によって明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
【００８１】
ｚ．ベクター
本明細書に使用される「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【００８２】
範囲：本開示を通して、本発明の種々の態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式における記載は、便宜上及び簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値が具体的に開示されていると考えるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６等の部分範囲が具体的に開示されていると考えるべきである。これは、範囲の広さに関わらず適用される。
【００８３】
２．インフルエンザ抗原
本明細書は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原を提供する。この抗原は、哺乳動物において、１つ以上のインフルエンザ血清型に対する、例えば２００９Ｈ１Ｎ１ブタ起源インフルエンザ等の１つ以上の流行性株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、哺乳動物において、１つ以上のインフルエンザ血清型に対する、例えばブタ由来ヒトインフルエンザの１つ以上の株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、抗インフルエンザ免疫応答を誘導できる免疫原としてそれらを特に効果的にするエピトープを含み得る。
【００８４】
抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、そのバリアント、そのフラグメント、またはその組み合わせを含み得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＡ型血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ型血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ型血清型Ｈ１の複数の株の異なる集合に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＢ型に由来し得る。抗原は、免疫応答を誘導し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原性エピトープを含有し得る。抗原は、無傷のインフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。抗原は、１つの血清型の複数のインフルエンザＡ型ウイルス株（血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡ型ウイルス株等）の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。抗原は、２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列またはその一部の組み合わせに由来し得るハイブリッドコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡ型ウイルス株等の１つの血清型の複数のインフルエンザＡ型ウイルス株の異なる集合に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。
【００８５】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、アミノ酸１〜３４３が前駆体ＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ１サブユニットに対応しかつアミノ酸３４４〜５６６がＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ２サブユニットに対応する、配列番号２（コンセンサスＨ１アミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原はまた、配列番号２０（Ｈ１Ｂｒｉｓ）または配列番号２２（Ｈ１ＴＴ）を含むタンパク質等の、Ｈ１ＨＡ株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号７（Ｈ２ＨＡ）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号２４（Ｈ３ＨＡ−２）、配列番号２８（Ｈ３ＨＡ−３）、配列番号３０（Ｈ３ＨＡ−４）、または配列番号３８（Ｈ３ＨＡ−１）を含むタンパク質等の、Ｈ３ＨＡ株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、各々が互いに異なる集合の配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であり得る。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の例は、配列番号１０（Ｈ１Ｕ２）または配列番号３６（Ｈ１Ｕ）を含むタンパク質である。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号１４（ＢＨＡ−１）、配列番号２６（ＢＨＡ−２）、配列番号３２（ＢＨＡ−３）、または配列番号３４（ＢＨＡ−４）を含むタンパク質等の、インフルエンザＢ型株からの赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
【００８６】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、１つ以上の付加的アミノ酸配列エレメントをさらに含み得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含み得る。ＩｇＥリーダーアミノ酸配列は配列番号１７であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出できる固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含み得る。そのような免疫原性タグの例は、コンセンサス赤血球凝集素Ｃ末端に連結され得る９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。ＨＡタグアミノ酸配列は配列番号１８であり得る。いくつかの実施形態において、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列及びＣ末端にＨＡタグをさらに含み得る。
【００８７】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはそのフラグメント及びバリアントからなるコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列またはそのフラグメント及びバリアントを含むコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
【００８８】
コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号２）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグまたはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方等の付加的エレメントをさらに含むものが含まれる。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むコンセンサスＨ１タンパク質の例は配列番号４であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）に連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結されたコンセンサスＨ１アミノ酸コード配列（配列番号２）を含む。
【００８９】
コンセンサスＨ２タンパク質の例としては、コンセンサスＨ２アミノ酸配列（配列番号７）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグまたはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方をさらに含むものが含まれる。
【００９０】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグまたはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むものが含まれる。コンセンサスＵ２タンパク質の例は配列番号１２であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）を含む。
【００９１】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢ赤血球凝集素タンパク質の例としては、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）からなり得るものが含まれ、あるいは、ＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグまたはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含み得る。コンセンサスＢＨＡタンパク質の例は配列番号１６であり、これは、Ｎ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）を含む。
【００９２】
コンセンサス赤血球凝集素タンパク質は、コンセンサス赤血球凝集素核酸、そのバリアント、またはそのフラグメントにコードされ得る。異なる株及びバリアントの複数の異なる赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサス赤血球凝集素タンパク質と異なり、コンセンサス赤血球凝集素核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサス赤血球凝集素タンパク質配列が由来する複数の異なる赤血球凝集素配列中の特定のアミノ酸配列をコードするのに使用されるものとは異なってよい。コンセンサス核酸配列は、最適化されたコドン及び／または最適化されたＲＮＡであってよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、５’非翻訳領域中にコザック配列を含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は赤血球凝集素コード配列の５’にある。Ｎ末端リーダーは分泌を促進し得る。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端にあってよく、それをコードする配列はＨＡコード配列の３’にある。免疫原性タグの与える固有のエピトープに対して容易に入手可能な抗体があるため、それにより、そのような抗体を試験中に用いてタンパク質の発現を検出及び確認することができる。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端のＨタグであり得る。
【００９３】
コンセンサス赤血球凝集素核酸は、配列番号２、配列番号７、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、または配列番号３８のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。配列番号２、配列番号７、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、または配列番号３８をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ、配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号３７であり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸は、ＩｇＥリーダーアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もしくはＨＡタグアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列またはその両方をさらに含んでよい。配列番号１７はＩｇＥリーダーポリペプチド配列である。配列番号１８はＨＡタグポリペプチド配列である。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む赤血球凝集素コンセンサス核酸の例としては、配列番号４、配列番号１２、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子が含まれる。配列番号４、配列番号１２、または配列番号１６をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ配列番号３、配列番号１１、または配列番号１５であり得る。
【００９４】
３．遺伝子構築物及びプラスミド
本明細書において赤血球凝集素抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物は、赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む機能性染色体外分子として細胞中に存在し得る。赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む遺伝子構築物は、セントロメアを含む線状ミニ染色体、テロマー、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。
【００９５】
遺伝子構築物はまた、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組み換えワクチンを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、細胞内に生存する、弱毒化された生きた微生物または組み換え微生物ベクター中の、遺伝子材料の一部であってもよい。
【００９６】
遺伝子構築物は、赤血球凝集素核酸の遺伝子発現の調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【００９７】
組成物は、以下の１つ以上の核酸配列を含み得る：配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、または配列番号３７。組成物は、以下のうちの１つ以上からなる群から選択される赤血球凝集素コンセンサス抗原をコードする第１の核酸配列を含み得る：インフルエンザＡ型コンセンサス赤血球凝集素Ｈ１抗原、インフルエンザＡ型コンセンサス赤血球凝集素Ｈ２抗原、インフルエンザＡ型コンセンサス赤血球凝集素Ｈ１Ｕ及び／またはＨ１Ｕ２抗原、ならびにインフルエンザＢ型コンセンサス赤血球凝集素タンパク質ＢＨＡ、このＢＨＡは、配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、または以下の１つ以上をコードする核酸配列：配列番号２、配列番号７、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、または配列番号３８を含むことができ；かつ１つ以上の追加の核酸配列（複数可）をさらに含むことができ、この核酸配列が、以下からなる群から選択される１つ以上のタンパク質（複数可）をコードする：本明細書に提供されるコンセンサス配列のうちの１つ以上を含む、インフルエンザＡ型赤血球凝集素タンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＡ型ノイラミニダーゼＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素（ＢＨＡ）及びインフルエンザＢ型ノイラミニダーゼ（ＢＮＡ）。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、同じ核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、ヒト細胞中で機能する調節エレメントの制御下にあってよい。付加的コード配列は、インフルエンザの１つ以上の株の１つ以上のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＢＨＡ、及びＢＮＡをコードしてもよく、または血清型を有する複数の株に由来するコンセンサスであってよく、または２つ以上のコンセンサス配列に由来する配列を含むハイブリッドであってもよい。
【００９８】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成し得る。ベクターは、哺乳動物中で免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサス赤血球凝集素抗原を哺乳動物細胞中で発現することができる。ベクターは組み換え体であってよい。ベクターはコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってよい。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞はコンセンサス赤血球凝集素抗原の発現が起こる条件下で培養及び維持される。
【００９９】
ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含んでよく、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の上流であり得る開始コドン及びコンセンサス赤血球凝集素の下流であり得る終止コドンをさらに含んでよい。開始及び終止コドンは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列とインフレームであり得る。ベクターはまた、コンセンサス赤血球凝集素コード配列に操作可能に連結されたプロモーターも含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列に操作可能に連結されるプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。プロモーターはさらに、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであってもよい。このようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載され、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１００】
ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナルを含んでもよく、これはＨＡコード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１０１】
ベクターはさらに、コンセンサス赤血球凝集素コーティングの上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーがＤＮＡ発現に必須であってもよい。エンハンサーはヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー（ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するエンハンサー等）であり得る。ポリヌクレオチド機能の強化は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び国際公開第９４／０１６７３７号に記載され、各々の内容は、参照により完全に組み込まれる。
【０１０２】
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、細胞内でベクターの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のｐＶＡＸ１（図１）、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これはエプスタインバーウイルス複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、組み込まれることなく多コピーのエピソーム複製を可能にする。ベクターは、上記の図面の簡単な説明の図１に関するパラグラフに記載されているような変化を有するｐＶＡＸ１であり得る。ベクターの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製能欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【０１０３】
ベクターはさらに、ベクターが投与される哺乳動物またはヒトの細胞中における遺伝子発現に良く適し得る調節配列を含み得る。コンセンサス赤血球凝集素コード配列は、宿主細胞中でのコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含んでよい。
【０１０４】
ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質産生に使用可能なｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターはまた、酵母のサッカロミセス・セレビシエ株におけるタンパク質生成に使用可能なｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターはまた、昆虫細胞におけるタンパク質生成に使用可能なＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞でのタンパク質産生に使用可能なｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターは、参照により完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む、日常的な技術及び容易に入手可能な開始物質によってタンパク質を生成するための発現ベクターまたは系であってもよい。
【０１０５】
ベクターはｐＧＸ２００９またはｐＧＸ２００６であってよく、これはコンセンサス赤血球凝集素抗原を発現させるために使用することができる。ベクターｐＧＸ２００９（４７３９ｂｐ、図２；配列番号５）は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１によりコードされるアミノ酸配列番号２）に連結したＩｇＥリーダー配列（配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列番号１２）を含むコンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）をコードする核酸配列を有する改変ｐＶＡＸ１プラスミドである。ベクターｐＧＸ２００６（４６２８ｂｐ；図３、配列番号８）は、コンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）をコードする核酸配列を有するｐＶＡＸ１プラスミドである。代替的に、ｐＧＸ２００６（またはｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に類似のＤＮＡプラスミド骨格ｐＶＡＸ１において、核酸挿入は、Ｈ２ＨＡ配列を以下のうちのいずれか１つと交換できる：配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、または以下のうちの１つ以上をコードする核酸配列：配列番号２、配列番号７、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、または配列番号３８；または本明細書に記載の任意のフラグメント及びバリアント。
【０１０６】
配列をコードするコンセンサス赤血球凝集素を含む、本明細書に記載の遺伝子構築物及び構成要素は、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素またはノイラミニダーゼタンパク質等の他のインフルエンザタンパク質を発現するために使用され得、それによって、インフルエンザＡ型タンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、またはノイラミニダーゼタンパク質のための配列をコードすることが、配列コードするコンセンサス赤血球凝集素の代わりに含まれる。
【０１０７】
４．薬学的組成物
約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む本発明に係る薬学的組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ以上と、２）最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム以下、または最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム以下、または最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ以下との間で含まれる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。
【０１０８】
本発明に係る薬学的組成物は、使用される投与形態に従って製剤化される。薬学的組成物が注射可能な薬学的組成物である場合、それらは無菌であり、発熱性物質を含まず、微粒子を含まない。好ましくは等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好ましい。安定化剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、製剤に血管収縮剤が添加される。
【０１０９】
好ましくは、薬学的組成物はワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。
【０１１０】
１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を哺乳動物で生じさせることができるワクチンを本明細書に提供する。ワクチンは上記の遺伝子構築物を含み得る。ワクチンは、各々が１つ以上のインフルエンザＡ型血清型（Ｈ１〜Ｈ１６インフルエンザＢ赤血球凝集素、またはその組み合わせなど）に対する複数のベクターを含み得る。ワクチンは、１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含み得る。ワクチンが２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、全てのそのような配列が１つの核酸分子上に存在してもよく、そのような配列の各々が異なる核酸分子上に存在してもよい。代替的に、２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子及び２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子を含み得る。加えて、１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢ型ノイラミニーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質のコード配列をさらに含んでもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ワクチンはタンパク質を含み得る。いくつかのワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡ等の１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢ型ノイラミニダーゼからなる群から選択される１つ以上の他のタンパク質を含み得る。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１つ以上の他のタンパク質と組み合わせて１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。
【０１１２】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１つ以上を含む複数の同じまたは異なるプラスミドを含み得る。ＤＮＡワクチンは、１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含み得る。ＤＮＡワクチンが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、そのような全配列が１つのプラスミド上に存在してもよく、そのような配列の各々が異なるプラスミド上に存在してもよく、いくつかのプラスミドが１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含んで、他のプラスミドが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有してもよい。加えて、ＤＮＡワクチンは、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質のための配列をコードする１つ以上のコンセンサスをさらに含み得る。このような付加的コード配列は、互いに異なりかつコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１つ以上を含むプラスミドとは異なるプラスミド上に存在してもよく、同じプラスミド上に存在してもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザ抗原をコードする核酸配列をインフルエンザ抗原と組み合わせて含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、Ｈ１（Ｈ１Ｕ及びＨ１Ｕ２を含む）、Ｈ２、Ｈ３、及びＢＨＡ等の１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１つ以上の１つ以上の他のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１（Ｈ１Ｕ及びＨ１Ｕ２を含む）、Ｈ２、Ｈ３、及びＢＨＡ等の１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１つ以上の１つ以上の他のタンパク質を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ｈ１（Ｈ１Ｕ及びＨ１Ｕ２を含む）、Ｈ２、及びＢＨＡのうちの１つ以上をコードするものを含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、コンセンサスＨ１Ｕ及び／またはＨ１Ｕ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／２６９，８２４号に開示されている１つ以上のインフルエンザ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第１２／３７５，５１８号（本明細書において配列番号３６）及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号９）のＨ１赤血球凝集素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１１）からのＨ３赤血球凝集素をコードする核酸配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡのうちの１つ以上を含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＵ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号の１つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第１２／３７５，５１８号（本明細書において配列番号３７）及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１０）のＨ１赤血球凝集素を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１２）に開示されるＨ３赤血球凝集素を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質及び／またはコンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／またはコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列、３）米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１２）に開示される赤血球凝集素Ｈ３タンパク質及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１１）に開示される赤血球凝集素Ｈ３タンパク質をコードする核酸配列の組み合わせを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／またはコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列、２）米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１０）もしくは米国特許出願第１２／３７５，５１８号（本明細書において配列番号３７）に開示される赤血球凝集素Ｈ１タンパク質及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号９）もしくは米国特許出願第１２／３７５，５１８号（本明細書において配列番号３６）に開示される赤血球凝集素Ｈ１タンパク質をコードする核酸配列、３）米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１２）に開示される赤血球凝集素Ｈ３タンパク質及び／または米国特許出願第１２／２６９，８２４号（本明細書において配列番号１１）に開示される赤血球凝集素Ｈ３タンパク質をコードする核酸配列の組み合わせを含む。
【０１１８】
好ましくは、本明細書に提供される抗原の組み合わせは、広範囲のインフルエンザの季節性株及びさらにインフルエンザの流行性株に対して交差反応性を提供するワクチン接種を受けた哺乳動物における血清変換を引き起こすワクチンに対して製剤化できる。血清変換及び広い交差反応性は、インフルエンザの異なる赤血球凝集素株に対して阻害力価を測定することによって判定することができる。好ましい組み合わせは、以下の群からの少なくとも１つの抗原を含む：１）コンセンサスＨ１赤血球凝集素、２）コンセンサスＨ２赤血球凝集素、３）コンセンサスＨ３赤血球凝集素、及び４）インフルエンザＢ赤血球凝集素；より好ましい組み合わせは、以下の群からの少なくとも１つの抗原を含む：１）コンセンサスＨ１赤血球凝集素、２）コンセンサスＨ３赤血球凝集素、及び３）インフルエンザＢ型赤血球凝集素。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、以下のような組み合わせを有することができる：
ａ）インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第１のインフルエンザ核酸配列Ｈ１赤血球凝集素のうちの１つ以上は以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１、配列番号１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１のフラグメント、配列番号１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号９のフラグメント、配列番号９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９、配列番号１９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１９のフラグメント、配列番号１９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１、配列番号２１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２１のフラグメント、配列番号２１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３５、配列番号３５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３５のフラグメント、配列番号３５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１０をコードする核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードする核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードする核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３６をコードする核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
ｂ）インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第１のインフルエンザ核酸配列Ｈ３赤血球凝集素のうちの１つ以上は以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号２３、配列番号２３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２３のフラグメント、配列番号２３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２７、配列番号２７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２７のフラグメント、配列番号２７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２９、配列番号２９に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２９のフラグメント、配列番号２９のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３７、配列番号３７に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３７のフラグメント、配列番号３７のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードする核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２８をコードする核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３０をコードする核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３０をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３８をコードする核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３８をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
ｃ）インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能である第１のインフルエンザ核酸配列インフルエンザＢ型赤血球凝集素のうちの１つ以上は以下から選択される：
以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１３のフラグメント、配列番号１３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５、配列番号２５に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２５のフラグメント、配列番号２５のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３１、配列番号３１に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３１のフラグメント、配列番号３１のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３３、配列番号３３に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３３のフラグメント、配列番号３３のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１４をコードする核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号１４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードする核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号２６をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３２をコードする核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３２をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３４をコードする核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメント、配列番号３４をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記のａ）、ｂ）、及びｃ）に加えて、この組み合わせはまた、インフルエンザウイルスの複数の株に対して、哺乳動物において広範な交差反応性の免疫応答を生じさせることが可能であるインフルエンザ核酸配列Ｈ２赤血球凝集素のうちの１つ以上を含むことができ、これは以下から選択される：配列番号６、配列番号６に少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６のフラグメント；配列番号６のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７をコードする核酸配列；配列番号７をコードする核酸配列に少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７をコードする核酸配列のフラグメント；及び配列番号７をコードする核酸配列のフラグメントに少なくとも９５％相同な核酸配列。
【０１２１】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、及び同第５，６７６，５９４号に開示され、これらは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体内に統合することを阻害する、エレメントまたは試薬をさらに含んでもよい。ワクチンは赤血球凝集素抗原のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは細胞中に導入することができる。
【０１２２】
ワクチンは、上記の遺伝子構築物または抗原を含む組み換えワクチンであり得る。ワクチンはまた、１つ以上のタンパク質サブユニットの形態の１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原、１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１つ以上の死菌インフルエンザ粒子、または１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１つ以上の弱毒化インフルエンザ粒子を含み得る。弱毒化ワクチンは、１つ以上のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを用いるワクチン、弱毒化生菌ワクチン、及び死菌ワクチン、ならびにサブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンであり得る。外来抗原を送達するために組み換えベクターを使用する弱毒化生ワクチン、サブユニットワクチン、及び糖タンパク質ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、及び同第６，５８９，５２９号に記載され、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
ワクチンは、世界の特定の地域、例えば、アジアのインフルエンザＡ型血清型に対するベクター及び／またはタンパク質を含み得る。ワクチンは、現在はヒトに感染するブタ起源のインフルエンザＡ型血清型に対するものであってよい。ワクチンは、世界の特定の地域のインフルエンザＢ型に対するベクター及び／またはタンパク質を含み得る。ワクチンは、ヒトに感染するインフルエンザＢ型に対するものであってよい。ワクチンは、インフルエンザＡ型及び／またはＢ型の１つ以上の株に対する１つ以上のベクター及び／または１つ以上のタンパク質を含んでもよい。
【０１２４】
提供されるワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、免疫応答を誘導し得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原に対して、また、インフルエンザウイルスの多種サブタイプに対して幅広く、抗体及び／またはキラーＴ細胞が生成され得る。そのような抗体及び細胞を単離してもよい。
【０１２５】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１２６】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で、ワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレン等の小胞体を含み得、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物との併用で、投与することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターワクチンまた、脂質、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０を参照されたい）として、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソームを含む、リポソーム等のトランスフェクション促進剤、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、またはその他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１２７】
薬学的に許容される賦形剤はアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であってもよく、あるいはワクチン中で上記プラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される。アジュバントは、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはその組み合わせであり得る。
【０１２８】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能性フラグメントが挙げられる。
【０１２９】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願され、参照により完全に組み込まれる米国特許出願第０２１，５７９号に記載のような、遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよい。
【０１３０】
５．送達方法
インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導し得る特に効果的な免疫原とするためのエピトープを含む赤血球凝集素抗原の遺伝子構築物及びタンパク質を提供するための薬学的製剤、好ましくはワクチンを送達する方法を本明細書に提供する。ワクチン送達方法はまたはワクチン接種方法は、治療的及び／または予防的免疫応答を誘導するようになされ得る。ワクチン接種プロセスは、哺乳動物において、２００９ブタ起源Ｈ１Ｎ１等のＨ１Ｎ１血清型、または他の季節性及び／もしくは流行性の種類を含む多種インフルエンザサブタイプに対する免疫応答を生成することができる。ワクチンを個体に送達して、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を強化することができる。ワクチンの送達は、細胞内に発現され、細胞表面に送達されると、免疫系によって認識されて、細胞性、体液性、または細胞性かつ体液性の応答を誘導する、核酸分子として、ＨＡ抗原をトランスフェクションすることであり得る。ワクチン送達を用いて、本明細書に記載されるワクチンを哺乳動物に投与することによって、複数のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を、哺乳動物において誘導または誘発することができる。
【０１３１】
哺乳動物へのワクチン送達後、ベクターが哺乳動物の細胞内に入った後、トランスフェクト細胞は、コンセンサス抗原、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの少なくとも１つを含む、対応するインフルエンザタンパク質を発現及び分泌する。これらの分泌されたタンパク質、または合成抗原は、免疫系によって異物として認識されることになり、それによって、免疫応答を開始することになり、これには、この抗原に対して作製される抗体及びこの抗原に特異的なＴ細胞応答が含まれ得る。いくつかの実施例において、本明細書に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、準備刺激された免疫系を有することになり、インフルエンザウイルス株で暴露されると、準備刺激された免疫系は、体液性、細胞性、またはその両方を通じてかに関係なく、それ以降のインフルエンザウイルスの急速な排除を可能にするであろう。ワクチンを個体に送達して、個体の免疫系の活性を調節し、それによって、免疫応答を強化することができる。
【０１３２】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンの形態で送達することができ、ＤＮＡワクチンの送達方法は、米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６号に記載され、これらはいずれも参照により完全に組み込まれる。
【０１３３】
ワクチンは、哺乳動物において免疫応答を誘発するように哺乳動物に投与され得る。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
【０１３４】
ａ．他の抗原とアジュバントとの組み合わせ
本明細書に記載の薬学的組成物、好ましくはワクチンは、インフルエンザＡ型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ型赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼをコードする１つ以上の他のインフルエンザタンパク質または遺伝子と組み合わせて投与され得る。ワクチンは、アジュバントをコードする遺伝子またはタンパク質と組み合わせて投与され得、アジュバントとしては以下を挙げることができる：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２８、ＩＬ−３３、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体形態のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  リガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、もしくはＴＡＰ２、またはそれらの機能性フラグメント。
【０１３５】
ｂ．投与経路
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入経由、口腔投与経由、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内、またはそれらの組み合わせを含む種々の経路で投与され得る。獣医学的用途については、本組成物を、通常の獣医学診療に従って、好適に許容される剤形として、投与することができる。獣医師であれば、特定の動物に対して最も適切な投与の投薬レジメン及び経路を容易に判定することができる。ワクチンは、従来型のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎ）」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波等の他の物理的方法によって、投与することができる。
【０１３６】
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組み換えワクチン等の組み換えベクターあり及びなしでのＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含む、いくつかの周知の技術によって、哺乳動物に送達することができる。ＨＡ抗原は、ＤＮＡ注射を介して、インビボ電気穿孔を伴って、送達されてもよい。
【０１３７】
ｃ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、細胞膜に可逆孔の形成をもたらすのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することが可能な電気穿孔デバイスを使用して、達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者によって入力された事前設定電流に類似の一定電流である。電気穿孔デバイスは、電気穿孔部品と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリと、を備え得る。電気穿孔部品は、制御器、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形記録装置、入力エレメント、状態報告エレメント、通信ポート、メモリー部品、電源、及び電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスの種々のエレメントのうちの１つ以上を含み、それを組み込むことができる。電気穿孔は、インビボ電気穿孔デバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して達成し、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進することができる。
【０１３８】
電気穿孔部品は、電気穿孔デバイスの１つのエレメントとして機能してよく、他のエレメントは電気穿孔部品と通信する別個のエレメント（または部品）である。電気穿孔部品は、電気穿孔デバイスの２つ以上のエレメントとして機能してよく、電気穿孔部品とは別個の電気穿孔デバイスのさらなる別のエレメントと通信してよい。１つの電気機械的または機械的デバイスの一部として存在する電気穿孔デバイスのエレメントは、１つのデバイスとしてまたは互いに通信する別個のエレメントとして機能し得るエレメントに限定されなくてもよい。電気穿孔部品は、所望の組織において一定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができることもあり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、電極アセンブリは、電気穿孔部品からのエネルギーパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルス送出中、中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、電気穿孔部品にインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができ、電気穿孔部品により送達されるエネルギーパルスを調整して一定電流を維持することができる。
【０１３９】
複数の電極がエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。複数の電極は、使用者によって電気穿孔部品に入力されたプログラム配列下において電極の制御によりエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。プログラム配列は、配列中に送達される複数のパルスを含み得、複数のパルスの各パルスは、電極の１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、電極のうちの１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
【０１４０】
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアによって実施され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは即時的（すなわち、応答時間を測定するための利用可能な技術による決定で実質的に即時的）である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定することができ、インピーダンスをフィードバック機構へと伝達し、フィードバック機構はこのインピーダンスに応答して、予め設定された電流に近い値に一定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達中、一定電流を連続的かつ即時的に維持し得る。
【０１４１】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進することができる電気穿孔デバイス及び電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．により提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載のものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するために使用可能な他の電気穿孔デバイス及び電気穿孔法には、２００７年１０月１７日に出願された同時係属中でありかつ共同で所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号が挙げられ、これは、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号（これらの全ては、それらの全体が本明細書に組み込まれる）に対して米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて利益を主張する。
【０１４２】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム及びそれの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な一定電極パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、及び電源を備え得る。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。次いで、皮下注射針により、選択された組織中に生体分子が送達される。プログラム可能な一定電流パルス制御器が作動され、一定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された一定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を促進にする。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．によって出願された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞内への生体分子の導入を効果的に促進するために使用可能な電気穿孔デバイスについて記載している。この電気穿孔デバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される、動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、使用者制御及びパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイの電極間に、一連のプログラム可能な一定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、一連の針電極、注射針用の中央注射チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクを備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または器官に深く浸透するように適合させることができる。電極アレイの構成により、（選択された生体分子を送達するための）注射針も標的臓器中に完全に挿入され、電極によって予め輪郭付けられた領域で、注入物が標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載されている電極は、好ましくは長さ２０ｍｍ、２１ゲージである。
【０１４５】
さらに、電気穿孔デバイス及びその使用を組み込むいくつかの実施形態に企図される、次の特許に記載されるものである電気穿孔デバイスが存在する：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、及び２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、あらゆる種類のデバイスを使用してＤＮＡの送達を考察する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号に提供される主題を取り扱う特許、及びＤＮＡの注射方法に注目した、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号が、本明細書に企図される。上記の特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
ｄ．ワクチンを調製する方法
本明細書に記載のＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製するための方法を本明細書に提供する。哺乳動物の発現プラスミドへの最終サブクローニング後、ＤＮＡプラスミドは、当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞培養物を大規模な発酵タンクに植え付けるために使用することができる。
【０１４７】
本発明のＥＰデバイスで使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知のデバイス及び技術との組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、認可され、２００７年５月２３日付で出願された同時係属中の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの実施形態において、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術はまた、米国特許出願第６０／９３９７９２号に加えて、認可された特許である２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載のものを含む、当業者に一般的に既知の種々のデバイスまたは手順を含むか、またはそれらを組み込む。上で参照された出願及び特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
実施例
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、単に説明のために記載されることを理解されたい。上述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途及び状況に適合するように、本発明に種々の変更及び修正を行うことができる。したがって、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０１４９】
実施例１
ｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９）−２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素抗原をコードするプラスミド
ｐＧＸ２００９（Ｈ１ＨＡ０９）の骨格は、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある改変発現ベクターｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。元のｐＶＡＸ１をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し（カタログ番号Ｖ２６０−２０）、−２０℃に維持した。前述の通り、配列分析により、ｐＧＸ２００９の骨格として使用するｐＶＡＸ１の配列とＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶＡＸ１配列との間の差を明らかにした。差は前述の通りである。
【０１５０】
プラスミドｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９ともいう）は、コンセンサス２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素分子をコードする核酸配列を含む。コンセンサス配列を生成するために使用した７９個の一次配列をインフルエンザ配列データベースから選択した。
【０１５１】
種々のインフルエンザＡ型赤血球凝集素Ｈ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の寄託番号はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける以下の寄託番号に対応する。括弧内にない寄託番号はヌクレオチド配列及びそれらによりコードされるアミノ酸配列のさらなる一覧を開示している。括弧内の寄託番号は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース中の対応するアミノ酸配列のエントリーのものである。
寄託番号は以下の通りである：ＧＱ３２３５７９．１（ＡＣＳ７２６５７．１）、ＧＱ３２３５６４．１（ＡＣＳ７２６５４．１）、ＧＱ３２３５５１．１（ＡＣＳ７２６５２．１）、ＧＱ３２３５３０．１（ＡＣＳ７２６５１．１）、ＧＱ３２３５２０．１（ＡＣＳ７２６５０．１）、ＧＱ３２３４９５．１（ＡＣＳ７２６４８．１）、ＧＱ３２３４８９．１（ＡＣＳ７２６４７．１）、ＧＱ３２３４８６．１（ＡＣＳ７２６４６．１）、ＧＱ３２３４８３．１（ＡＣＳ７２６４５．１）、ＧＱ３２３４５５．１（ＡＣＳ７２６４１．１）、ＧＱ３２３４５１．１（ＡＣＳ７２６４０．１）、ＧＱ３２３４４３．１（ＡＣＳ７２６３８．１）、ＧＱ２９３０７７．１（ＡＣＳ６８８２２．１）、ＧＱ２８８３７２．１（ＡＣＳ５４３０１．１）、ＧＱ２８７６２５．１（ＡＣＳ５４２６２．１）、ＧＱ２８７６２７．１（ＡＣＳ５４２６３．１）、ＧＱ２８７６２３．１（ＡＣＳ５４２６１．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２８６１７５．１（ＡＣＳ５４２５８．１）、ＧＱ２８３４８８．１（ＡＣＳ５００８８．１）、ＧＱ２８０７９７．１（ＡＣＳ４５０３５．１）、ＧＱ２８０６２４．１（ＡＣＳ４５０１７．１）、ＧＱ２８０１２１．１（ＡＣＳ４５１８９．１）、ＧＱ２６１２７７．１（ＡＣＳ３４９６８．１）、ＧＱ２５３４９８．１（ＡＣＳ２７７８７．１）、ＧＱ３２３４７０．１（ＡＣＳ７２６４３．１）、ＧＱ２５３４９２．１（ＡＣＳ２７７８０．１）、ＦＪ９８１６１３．１（ＡＣＱ５５３５９．１）、ＦＪ９７１０７６．１（ＡＣＰ５２５６５．１）、ＦＪ９６９５４０．１（ＡＣＰ４４１８９．１）、ＦＪ９６９５１１．１（ＡＣＰ４４１５０．１）、ＦＪ９６９５０９．１（ＡＣＰ４４１４７．１）、ＧＱ２５５９００．１（ＡＣＳ２７７７４．１）、ＧＱ２５５９０１．１（ＡＣＳ２７７７５．１）、ＦＪ９６６９７４．１（ＡＣＰ４１９５３．１）、ＧＱ２６１２７５．１（ＡＣＳ３４９６７．１）、ＦＪ９６６９６０．１（ＡＣＰ４１９３５．１）、ＦＪ９６６９５２．１（ＡＣＰ４１９２６．１）、ＦＪ９６６０８２．１（ＡＣＰ４１１０５．１）、ＧＱ２５５８９７．１（ＡＣＳ２７７７０．１）、ＣＹ０４１６４５．１（ＡＣＳ２７２４９．１）、ＣＹ０４１６３７．１（ＡＣＳ２７２３９．１）、ＣＹ０４１６２９（ＡＣＳ２７２２９．１）、ＧＱ３２３４４６．１（ＡＣＳ７２６３９．１）、ＣＹ０４１５９７．１（ＡＣＳ２７１８９．１）、ＣＹ０４１５８１．１（ＡＣＳ１４７２６．１）、ＣＹ０４０６５３．１（ＡＣＳ１４６６６．１）、ＣＹ０４１５７３．１（ＡＣＳ１４７１６．１）、ＣＹ０４１５６５．１（ＡＣＳ１４７０６．１）、ＣＹ０４１５４１．１（ＡＣＳ１４６７６．１）、ＧＱ２５８４６２．１（ＡＣＳ３４６６７．１）、ＣＹ０４１５５７．１（ＡＣＳ１４６９６．１）、ＣＹ０４１５４９．１（ＡＣＳ１４６８６．１）、ＧＱ２８３４８４．１（ＡＣＳ５００８４．１）、ＧＱ２８３４９３．１（ＡＣＳ５００９５．１）、ＧＱ３０３３４０．１（ＡＣＳ７１６５６．１）、ＧＱ２８７６１９．１（ＡＣＳ５４２５９．１）、ＧＱ２６７８３９．１（ＡＣＳ３６６３２．１）、ＧＱ２６８００３．１（ＡＣＳ３６６４５．１）、ＣＹ０４１６２１．１（ＡＣＳ２７２１９．１）、ＣＹ０４１６１３．１（ＡＣＳ２７２０９．１）、ＣＹ０４１６０５．１（ＡＣＳ２７１９９．１）、ＦＪ９６６９５９．１（ＡＣＰ４１９３４．１）、ＦＪ９６６９８２．１（ＡＣＰ４１９６３．１）、ＣＹ０３９５２７．２（ＡＣＱ４５３３８．１）、ＦＪ９８１６１２．１（ＡＣＱ５５３５８．１）、ＦＪ９８１６１５．１（ＡＣＱ５５３６１．１）、ＦＪ９８２４３０．１（ＡＣＱ５９１９５．１）、ＦＪ９９８２０８．１（ＡＣＱ７３３８６．１）、ＧＱ２５９９０９．１（ＡＣＳ３４７０５．１）、ＧＱ２６１２７２．１（ＡＣＳ３４９６６．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２９００５９．１（ＡＣＳ６６８２１．１）、ＧＱ３２３４６４．１（ＡＣＳ７２６４２．１）、ＧＱ３２３４７３．１（ＡＣＳ７２６４４．１）、ＧＱ３２３５０９．１（ＡＣＳ７２６４９．１）、ＧＱ３２３５６０．１（ＡＣＳ７２６５３．１）、ＧＱ３２３５７４．１（ＡＣＳ７２６５５．１）、及びＧＱ３２３５７６．１（ＡＣＳ７２６５６．１）。アミノ酸配列をＮＣＢＩ配列データベースからダウンロードし、アラインメント及びコンセンサス配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いて生成した。発現を促進するために、非常に効率的なリーダー配列であるＩｇＥリーダーを開始コドンの上流にインフレームで融合させた。より高レベルで発現させるために、この融合遺伝子のコドン使用頻度をヒト遺伝子のコドン偏位に適合させた。さらに、ＲＮＡの最適化も行った：ＧＣ含量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域及び内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位等のシス作用性配列モチーフを避けた。全体配列はＧｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成により生成された。改変された合成Ｈ１ＨＡ０９遺伝子は、長さが１８１８ｂｐであり（配列番号３）、Ｇｅｎｅａｒｔにより、ＢａｍＨ１及びＸｈｏＩの部位でｐＶＡＸ１にクローニングされた（図２）。
【０１５２】
実施例２
ＨＳ０９インフルエンザ（ｐＧＸ２００９）免疫化したフェレット
インフルエンザの好ましいモデルであるフェレットを用いて実験を行った。フェレットを、プラスミドｐＧＸ２００９を用いて免疫化した（挿入部ＨＳ０９（配列番号１）を含む配列番号５）。
動物：４群×５頭／群及び４頭の１対照群＝合計２４フェレット（雄）
期間：１８週間（暴露含む）
用量：０．２ｍｇプラスミド
【０１５３】
プロトコル概要：フェレットをＤＮＡワクチン群に無作為に割り振った。動物を実験０日目、２８日目、及び５６日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコルに従い、ケタミン／ミダゾラムカクテル、イソフルラン、または同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザＤＮＡワクチンの組み合わせを用いて筋肉内（ＩＭ）にワクチン接種を行った。第１群及び第２群は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応一定電流電気穿孔（ＥＰ）デバイスを０．５Ａｍｐ、５２ミリ秒パルス、パルス間０．２秒、発火遅延４秒、合計３パルスで用いて、直ちに電気穿孔した。対照動物は未処置対照とした（プラスミドなし、ＥＰなし）。フェレットをケージ中で麻酔から回復させ、２４時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
【０１５４】
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。８４日目に、１ｍｌのＭＸ１０（Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９、５×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて鼻腔内感染により動物を暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候（体重、温度等）を毎日監視した。感染後１、３、６、９、及び１５日目（ｄｐｉ）に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を１５日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムＰＣＲによりウイルス負荷を調べるためのＲＮＡｌａｔｅｒ、感染性ウイルスを調べるための培地（ＴＣＤＩ５０）、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
【０１５５】
ＨＡＩ力価
フェレットを放血させ、血清サンプルを直ちにドライアイス上に保存し、処理のためにＢＩＯＱＵＡＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に発送した。血清を３部の酵素で１部の血清を希釈することによって受容体破棄酵素を処理し、３７℃での水浴で一晩インキュベートした。酵素を３０分間５６℃でのインキュベーションによって不活性化し、続いて、１／１０の最終希釈のために６部のリン酸緩衝食塩水を添加した。ＨＡＩ試験をＶ底９６−ウェルマイクロ力価プレート内でウイルスの４つの赤血球凝集ユニット及び１％の赤血球を使用して実施した。ＨＡＩ試験のために使用されるウイルス（Ｈ１Ｎ１／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９株）は、ＣＤＣのインフルエンザ分岐から得られる。図４は、免疫化（３回免疫化）したフェレットの血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験を示す。力価が、＞１：４０であるものを「防御」と見なす。点線は１：４０のマークを示す。３回免疫化後は全ての動物が１：４０のマークを超えていた。
【０１５６】
暴露研究
図５は、免疫化したフェレット及び免疫されていないフェレットを新規なＨ１Ｎ１株ＭＸ１０（Ａ／メキシコ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９）に暴露した結果を示す。免疫化されたフェレットは全て生存したが、未処置フェレットは１５日の期間内に７５％が死亡した。
【０１５７】
実施例３
Ｈ１赤血球凝集素組み合わせ研究
種々の動物（マウス、モルモット、及びフェレット）を使用して実験を行った。動物は、骨格ｐＶＡＸ１を有するプラスミド構築物、異なる挿入を有する各構築物を使用して免疫化した。
図７Ａ〜Ｇ、８Ａ〜Ｃ、９Ａ〜Ｂ、１０Ａ〜Ｂ、１１Ａ〜Ｃにおいて：未処置（ｐＶＡＸ１のみ）、Ｈ１Ｕ１（配列番号３５挿入部を有するｐＶＡＸ１）、ＨＳ０９（配列番号５）、ＣｏｎＢｒｉｓ（またはＨ１Ｂｒｉｓ）（配列番号１９挿入部を有するｐＶＡＸ１）、ＣｏｎＴＴ（またはＨ１ＴＴ）（配列番号２１挿入部を有するｐＶＡＸ１）、
図１３Ａ〜Ｆ、１４Ａ〜Ｃ、１５Ａ〜Ｄ、１６Ａ〜Ｃ、１７Ａ〜Ｃにおいて：未処置（ｐＶＡＸ１のみ）、ＢＨＡ−１（配列番号１３挿入部を有するｐＶＡＸ１）、ＢＨＡ−２（配列番号２５挿入部を有するｐＶＡＸ１）、ＢＨＡ−３（配列番号３１挿入部を有するｐＶＡＸ１）、ＢＨＡ−４（配列番号３３挿入部を有するｐＶＡＸ１）。
図１９Ａ〜Ｅ、２０Ａ〜Ｆにおいて、未処置（ｐＶＡＸ１のみ）、Ｈ３ＨＡ−１（配列番号３７挿入部を有するｐＶＡＸ１）、Ｈ３ＨＡ−２（配列番号２３挿入部を有するｐＶＡＸ１）、Ｈ３ＨＡ−３（配列番号２７挿入部を有するｐＶＡＸ１）、Ｈ３ＨＡ−４（配列番号２９挿入部を有するｐＶＡＸ１）。
【０１５８】
用量：０．２ｍｇプラスミド
プロトコル要約：動物をＤＮＡワクチン群に無作為に割り振った。動物を実験０日目、２８日目、及び５６日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコルに従い、ケタミン／ミダゾラムカクテル、イソフルラン、または同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザＤＮＡワクチンの組み合わせを用いて筋肉内（ＩＭ）にワクチン接種を行った。第１群及び第２群を、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応一定電流電気穿孔（ＥＰ）デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ、ＰＡ）を用いて、０．５Ａｍｐ、５２ミリ秒パルス、パルス間０．２秒、発火遅延４秒、合計３パルスで、直ちに電気穿孔した。対照動物は未処置対照とした（プラスミドなし、ＥＰなし）。この動物をケージ中で麻酔から回復させ、２４時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
【０１５９】
ＨＡＩ試験
動物を放血させ、血清サンプルを直ちにドライアイス上に保存し、処理のためにＢＩＯＱＵＡＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に発送した。血清を３部の酵素で１部の血清を希釈することによって受容体破棄酵素を処理し、３７℃での水浴で一晩インキュベートした。酵素を３０分間５６℃でのインキュベーションによって不活性化し、続いて、１／１０の最終希釈のために６部のリン酸緩衝食塩水を添加した。ＨＡＩ試験をＶ底９６−ウェルマイクロ力価プレート内でウイルスの４つの赤血球凝集ユニット及び１％の赤血球を使用して実施した。ＨＡＩ試験のために使用されるウイルス（Ｈ１Ｎ１／メキシコ／２００９株）は、ＣＤＣのインフルエンザ分岐から得られる。
【０１６０】
Ｈ１研究：
コンボ（４つのＨ１抗原全て）をワクチン接種されたマウスが１０株のうち９株に対して防御力価を示したことを実験は示した（図７Ａ〜７Ｆ、及び図８Ａ〜Ｃ）。これは、株全体にわたる堅牢な交差反応性を示す。同様に、コンボを接種されたモルモットは１０株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した（図９Ａ〜Ｂ及び１０Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【０１６１】
インフルエンザＢ型研究：
コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２抗原の両方）でワクチン接種されたマウスが９株のうちの４株に対して防御力価を示した（図１３Ａ〜１３Ｃ及び図１４Ｃ）が、一方で２株が境界１：４０を示したことを実験は示した（図１３Ｄ及び図１４Ａ）。個体の抗原は、９株のうちの４株（ＢＨＡ−１）及び９株のうちの３株（ＢＨＡ−２）に対して防御力価を示した。同様に、コンボを接種されたモルモットは１０株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した（図９Ａ〜Ｂ及び１０Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【０１６２】
コンボ（ＢＨＡ−１及びＢＨＡ−２抗原の両方）でワクチン接種されたモルモットが１０株のうちの１０株全てに対して防御力価を示したことを実験は示した（投与後３「ＰＤ３」を参照）。一方で、単独の抗原での免疫化はこのような交差防御を提供せず、ＢＨＡ−１が１０株のうちの７株に対して唯一の防御力価を提供する（図１５Ａ〜Ｄ及び図１６Ａ〜Ｃ）。
【０１６３】
Ｈ３研究
コンボ（Ｈ３ＨＡ−１及びＨ３ＨＡ−２抗原の両方）でワクチン接種されたマウスが１１株のうちの４株（図１９Ａ〜Ｄ）に対して防御力価、２株に対して近い防御力価を示したことを実験は示した（図１９Ｅ及び図２０Ｆ）。一方で、単独の抗原は、Ｈ３ＨＡ−１（図１９Ａ〜Ｄ）の場合に１１株のうちの４株に対して交差防御を示すが、ＨＡＩ力価は残りの株のいずれにおいても呈されなかった。コンボＨ３混合は、単独の１つのＨ３抗原よりも若干広い交差防御を示した。
【０１６４】
暴露研究
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。８４日目に、１ｍｌのＭＸ１０（Ａ／メキシコ／２００９、５×１０５  ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて鼻腔内感染によりフェレットを暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候（体重、温度等）を毎日監視した。感染後１、３、６、９、及び１５日目（ｄｐｉ）に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を１５日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムＰＣＲによりウイルス負荷を調べるためのＲＮＡｌａｔｅｒ、感染性ウイルスを調べるための培地（ＴＣＤＩ５０）、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
【０１６５】
ワクチン接種されたＨ１ＨＡ−暴露
ＨＳ０９及びＨ１Ｕをワクチン接種されたフェレットは、５匹のフェレット全てが感染後１４日間生き延びたときに免疫防御を示したが、一方で未処置の５匹のうち１匹のみが生き残った。図１１Ａ〜Ｃを参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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