(57)【要約】  ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン化合物、それらの化合物を含む製剤、ならびにタンキラーゼ１および２阻害剤としてのそれらの使用。【化１】2016536308.tif 000077 【選択図】なし
2016536308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物またはその医薬的に許容可能な塩：
【化１】
2016536308.tif 000072
（式中、
Ｙが
【化２】
2016536308.tif 000073
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である）。
【請求項２】
Ｙが
【化３】
2016536308.tif 000074
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｙが
【化４】
2016536308.tif 000075
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１もしくは２に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項４】
Ｙが
【化５】
2016536308.tif 000076
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１もしくは２に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項５】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリルもしくはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２、または４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンまたはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２、３、または５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン  ４−メチルベンゼンスルホン酸塩である、請求項１、２、３、５、または７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
患者における、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
療法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１２】
結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんの治療に使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｗｎｔシグナリングは、３種類の細胞内情報伝達カスケードをトリガーし、それには、β−カテニンが媒介する標準的経路、非標準的な平面内細胞極性経路、およびＷｎｔ／カルシウム経路が含まれる。進化的に保存された標準的Ｗｎｔ情報伝達経路は、多数の細胞プロセス（細胞増殖、分化、接着、および維持を含むもの）を制御する。細胞内でβ−カテニンタンパク質レベルを制御する標準的経路は、Ｗｎｔリガンドが細胞表面のＦｒｉｚｚｌｅｄおよびリポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）５／６共受容体に結合する際に開始される。そして、次に、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３（腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）、Ａｘｉｎ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３α／β（ＧＳＫ３））破壊複合体からキナーゼＧＳＫ３が取り除かれるのを促進する。
【０００２】
Ｗｎｔ結合が存在すると（オン状態）、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｗｎｔ経路のタンパク質）が活性化されて、次に破壊複合体からＧＳＫ３を引き寄せ、よってサイトゾルのβ−カテニンの蓄積、核へのβ−カテニンの移行、Ｔ細胞因子／リンパ系エンハンサー因子（ＴＣＦ／ＬＥＦ）ファミリー転写因子との相互作用、および標準的Ｗｎｔ経路応答遺伝子の転写を導く。Ｗｎｔリガンドの非存在下（オフ状態）では、サイトゾルのβ−カテニンは恒常的にリン酸化され、そして、ユビキチン化の標的とされ、プロテアソームにより分解される。
【０００３】
２種類の相同性の高いヒトタンキラーゼのアイソフォームであるタンキラーゼ１および２（ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２）は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素ファミリーのメンバーであって、βＮＡＤ＋を基質として使用してタンパク質の翻訳後修飾を触媒し、標的タンパク質にＡＤＰリボース部分を連続的に付加（ポリＡＤＰリボシル化またはＰＡＲシル化）する。タンキラーゼのタンパク質基質の１つは、Ａｘｉｎ（β−カテニン破壊複合体の濃度限定要素）である。ＰＡＲシル化は分解のためにＡｘｉｎに印を付ける。タンキラーゼ阻害はＡｘｉｎの安定化、Ｗｎｔ情報伝達阻害およびβ−カテニンの分解を導く。
【０００４】
Ｗｎｔ情報伝達経路を活性化する変異は、幅広い範囲のがんに見いだされ、そして、腫瘍の発生、維持、および／または進行に寄与すると考えられる。従って、タンキラーゼ活性阻害は、がん（例、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを含む）、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん（非小細胞肺がんを含む）、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、および急性骨髄性白血病）の治療における有力なアプローチとなるように見える。
【０００５】
標準的Ｗｎｔ／β−カテニン情報伝達経路を阻害する医薬品を同定する多大な努力がなされてきた。国際公開第２０１３／１１７２８８号にあるＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２阻害剤が知られている。
【０００６】
国際公開第２０１３／１１７２８８号があるが、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２阻害活性を有する化合物を見つける必要性がある。他のＰＡＲＰよりもＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２を選択的に阻害する化合物を見出すさらなる必要性もある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例６の化合物である８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン４−メチルベンゼンスルホン酸塩の代表的ＸＲＰＤパターンである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の１つの態様は、式Ｉ：
【化１】
2016536308.tif 000003
（式中、
Ｙが
【化２】
2016536308.tif 000004
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である）
の化合物またはその医薬的に許容可能な塩である。
【０００９】
好ましくは、本発明のさらなる態様は、
Ｙが
【化３】
2016536308.tif 000005
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１０】
好ましくは、本発明の別の態様は、
Ｙが
【化４】
2016536308.tif 000006
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様は、
Ｙが
【化５】
2016536308.tif 000007
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１２】
本発明の好ましい態様は、化合物：
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩である。
【００１３】
本発明の別の好ましい態様は、化合物：
２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリルもしくはその医薬的に許容可能な塩である。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、阻害を必要とするがん患者においてタンキラーゼ１および２を阻害する方法であって、前記患者に治療的有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、患者中の、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、本発明は、療法に使用するための式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんの治療に使用するための式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんの治療のための医薬を製造するための式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００２０】
用語「患者」は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」は、限定はされないが、ヒトを含む。
【００２１】
用語「トリプルネガティブ乳がん」は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲストロン受容体（ＰＲ）、およびホルモン上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）を検査して陰性であった腫瘍サンプルを特徴とする乳がんのことを指す。
【００２２】
「治療的有効量」または「有効量」は、がん患者中でＷｎｔ／β−カテニン情報伝達経路を阻害して、標的がん細胞を破壊するか、または患者のがんの進行を遅延もしくは停止させるのに必要な、化合物、その医薬的に許容可能な塩、または化合物もしくはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与量を意味する。化合物またはその医薬的に許容可能な塩の期待される投与量は、０．１〜２００ｍｇ／患者／日の範囲にある。好ましい投与量は、１〜１７５ｍｇ／患者／日の範囲にあると期待される。最も好ましい投与量は、５〜１５０ｍｇ／患者／日の範囲にあると期待される。患者の治療に必要な正確な投与量と治療期間の長さは、疾患のステージおよび重症度とともに個々の患者の特定の必要性や応答を考慮して医師により決定される。一日当たりを基本とする投与量として表されるが、投与計画を調整して、患者により適する治療効果を提供し、ならびに、望ましくない薬動力学効果を管理および／または緩和してもよい。毎日の投薬に加え、１日おきの投薬（Ｑ２Ｄ）；１日おきの投薬を５日間に渡り行い、その後２日間休薬する（Ｔ．Ｉ．Ｗ．）；または２日おき（Ｑ３Ｄ）も適正な場合がある。
【００２３】
用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、患者の罹患するがんへの全ての範囲の介入（例、活性化合物を投与して、一若しくは複数の症状を緩和、減速、または後進させ、および、もしがんが除去されないにしてもがんの進行を遅延させること）を含むよう意味する。治療される患者は哺乳動物であり、特に、人間である。
【００２４】
本発明の化合物は、医薬的に許容可能な担体を使用する医薬組成物として、好ましくは処方され、各種経路で投与される。好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物とそれらを調製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（レミントン：調剤の科学と実践）（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，第１９編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）を参照されたい。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−５，６，７，８−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンまたはその医薬的に許容可能な塩を、医薬的に許容可能な担体および、任意ではあるが、特に、特定のがん型の治療用の他の治療成分と共に含む。
【００２５】
本発明の化合物は、多くの無機および有機酸と反応して、医薬的に許容可能な酸付加塩を形成することができる。そのような医薬的に許容される塩とそれら塩を調製するための一般的方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、「ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ（医薬用塩ハンドブック：特性、選択、および使用）」（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；およびＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ（医薬用塩）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照されたい。
【００２６】
実施例１等の本発明の化合物の名前は：８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−５，６，７，８−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（ＩＵＰＡＣ）である。またの名は、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン，５，６，７，８−テトラヒドロ−８−メチル−２−［４−（２−ビリミジニルメチル）−１−ピペラジニル］−（ＣＡＳ）である。別の名前を、本発明の化合物を一義的に同定するために使用してもよい。
【００２７】
式Ｉの化合物が単一の立体異性体として図示されると理解されたい。特定の置換基により、ラセミ混合物または２種類の立体異性体を可能にするキラル中心が生じる場合がある。他に記載されない限り、本明細書中で使用される場合、特定の化合物への参照は、個々の立体異性体およびその名の化合物を含むラセミ混合物を含むことを意味する。特定の立体異性体を、エナンチオマー的に純粋または濃縮した出発物質を使用する立体特異的合成法により調製する場合がある。出発物質、中間体、またはラセミ混合物のいずれかの特異的立体異性体を、当該技術分野で周知の技術により分離することができる。その技術には、例えば、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（有機化合物の立体化学），Ｅ．Ｉ．ＥｌｉｅｌとＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ１９９４）およびＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（エナンチオマー、ラセミ体、および分析），Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．ＣｏｌｌｅｔとＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ１９９１）中に見られるものがあり、キラル固定相上のクロマトグラフィー、酵素的分離、またはジアステレオマー塩等の、その目的のために形成されたジアステレオマーの分別結晶化もしくはクロマトグラフィーが含まれる。キラル化合物を単離またはその異性体に分離するが、絶対配置または旋光度が定まっていない場合、その異性体は、キラルクロマトグラフィーからそれぞれ溶出される順序に対応して、任意ではあるが、異性体１および異性体２として表記される。もし、キラルクロマトグラフィーが合成初期に開始される場合、同じ表記を、引き続く中間体や実施例にも適用する。
【００２８】
当業者は、式Ｉの化合物が互変異性平衡で存在し得ることを認識する。説明目的で、その平衡を以下に示す。
【化６】
2016536308.tif 000008
【００２９】
便宜上、４−オキソ型を、式Ｉに図示し、対応する命名法を、本明細書を通して使用する。しかしながら、そのような図示は、対応する互変異性ヒドロキシ型を含む。
【００３０】
本発明の化合物の合成に初期出発物質として用いられる化合物は、周知であり、市販されてはいない範囲ではあるが、当業者に一般的に採用される標準的手順により、提示される具体的参照文献を使用して容易に合成されるか、または、一般的教科書中に見いだされる。
【００３１】
既知の手順および方法の例には、一般的教科書（例、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ出版社，１９８９；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１−１０刊，１９７４−２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５編，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．ＳｍｉｔｈおよびＪｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４編，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．ＣａｒｅｙおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ出版社，２０００等、およびそこに引用される参考文献）に記載されるものが含まれる。
【００３２】
さらに、以下のスキームに記載されるある中間体は、一又は複数の窒素保護基を含む場合がある。様々な保護基は、実施される特定の反応条件および特定の変換に応じて、各場合において同一または異なってもよい。保護および脱保護条件は、当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第４編、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓとＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、２００７を参照されたい）。
【００３３】
本明細書中に使用される略語を、Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１，１９８４に従って定義する。他の略語を、以下のように定義する。「ＡＰＣ」は、腺腫様多発結腸ポリープを指す；「ＢＩＤ」は、１日２回の投薬を指す；「ビオチン化ＮＡＤ＋」は、６−ビオチン−１７−ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドを指す；「ＢＯＣ」は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを指す；「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指す；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指す；「ＤＭＡＰ」は、４−ジメチルアミノピリジンを指す；「ＤＭＥＭ」は、ダルベッコ改変イーグル培地を指す；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指す；「ＤＰＢＳ」は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を指す；「ＤＴＴ」は、ジチオトレイトールを指す；「ＥＤＣＩ」は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを指す；「ＥＧＦＰ」は、改変型緑色蛍光タンパク質を指す；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指す；「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指す；「Ｆｌａｇタグ」は、Ｆｌａｇペプチド（Ｎ末端からＣ末端へ）ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６）を指す；「ＨＥＫ」は、ヒト胎児腎臓を指す；「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピぺラジンエタンスルホン酸を指す；「ＨＯＡｃ」は、酢酸を指す；「ＨＲＰ」は、ホースラディッシュパーオキシダーゼを指す；「ＩＰＡｍ」は、イソプロピルアミンを指す；「ＭＥＭ」は、最小必須培地を指す；「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指す；「ＭＯＩ」は、感染多重度を指す；「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジー情報センター）を指す；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指す；「ＲＰＭＩ」は、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ローズウエルパーク記念研究所）を指す；「ＳＣＸ」は、シリカに結合させた強陽イオン交換フェニルスルホン酸の精製カラムを指す；「ＳＣＸ−２」は、シリカに結合させた強陽イオン交換プロピルスルホン酸の精製カラムを指す；「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指す；「ＴＢＳ」は、トリス緩衝液を指す；「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指す；「ＴＢＭＥ」は、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを指す；「ＴＭＢペルオキシダーゼ」は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンを指す；「トリス」は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指す；および「Ｘ−Ｐｈｏｓ」は、２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニルを指す。
【００３４】
本発明の化合物またはその塩は、当該技術分野で既知の各種方法により調製可能である。その方法のいくつかを、以下のスキーム、調製例、および実施例中で解説する。記載される各経路の特異的合成工程を様々なやり方で組み合わせるか、または、互いに異なるスキーム由来の工程と組み合わせて、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を調製してもよい。以下のスキーム中の各工程での生成物を、当該技術分野で周知の従来法（抽出、蒸発、析出、クロマトグラフィー、ろ過、倍散、および結晶化を含むもの）によりリカバーする場合がある。以下のスキーム中では、他に規定がない限り、全ての置換基を前述のように定義する。試薬と出発物質は、当業者が容易に入手できる。
【化７】
2016536308.tif 000009
【００３５】
スキーム１は、ＴＦＡ塩、中性物質（７）、および（７）のトリフルオロボラン酸メチル塩としての、８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（６）の形成を図示する。
【００３６】
工程Ａでは、保護型２−ピペラジン−１−イル−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（３）を、保護型ピペラジン−１−カルボキサミド塩酸塩（１）とエチル２−クロロニコチネート（２）と環化して得る。反応は、不活性溶媒（例、ＤＭＦ）中で、強塩基（例、ｔｅｒｔ−ブトキシドカリウム）の存在下、５０〜１２０℃の温度で進行する。好ましい保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであるが、他のカルバメート保護基も使用可能である。
【００３７】
工程Ｂでは、保護型２−ピペラジン−１−イル−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（３）を、ヨウ化メチルを使用してメチル化して、四級塩である保護型ヨウ化８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８イウム−４−オン（４）（ＺはＩ、スキーム１）を得る。反応は、オートクレーブにて、不活性溶媒（例、ＴＨＦまたはジオキサン）中で、５０〜１２０℃の温度で、４〜２４時間進行する。また、メチル硫酸塩は、約６０〜８０℃で加熱して、極性非プロトン溶媒（例、ＤＭＦ）中で、化合物（３）にジメチル硫酸を加えることにより形成可能である。溶液を、室温で、ＴＭＢＥ含有容器へと移して、ＺがＣＨ３ＯＳＯ３である生成物（４）を析出させる。
【００３８】
スキーム１の工程Ｃでは、四級塩（４、ＺがＩ）を還元して、保護型８−メチル−２−ピペルジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（５）を得る。還元は、ＤＭＦ／ＴＦＡが約１０／１の混合物中で、還元剤（例、シアノホウ水素化ナトリウム）を使用して達成可能である。ＴＦＡおよび還元剤は、０〜５℃の温度で加えるが、温度は１５℃よりも上昇しないようにする。反応を、その後、室温で、約１２〜２４時間続行させる。追加的量のＴＦＡおよび還元剤を、冷却しながら加えて、反応を完了するようにしてもよい。
【００３９】
また、工程Ｃは、還元剤（例、酸化白金）を用いてメチル硫酸塩（４、ＺがＣＨ３ＯＳＯ３）を還元し、極性溶媒（例、ＭｅＯＨ）中、約１５５ｐｓｉで水素付加することにより、化合物（５）を得ることでも達成可能である。
【００４０】
工程Ｄでは、ピペラジニル環を脱保護して、８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（６）を得る。保護基（例、ＢＯＣ）の除去のための酸性条件は、当該技術分野で周知である。好ましい条件では、ＤＣＭとＴＦＡの１／１混合物を、室温で、２〜２４時間使用して、存在するＴＦＡが２〜４当量のＴＦＡ塩として生成物を得る。塩形態は、解析はしないが、重量により計算する。
【００４１】
工程Ｅが示すのは、上述したように保護基の脱保護を行って、ＴＦＡ塩を得るが、それは、アンモニア／ＭｅＯＨを使用するＳＣＸカラムまたはイオン交換樹脂を用いて中和して、中性物質（７）を得ることができる。ピラジン環の窒素を、溶媒（例、ＴＨＦ）中で、ブロモメチルトリフルオロホウ酸カリウムを使用してメチルトリフルオロボラン酸塩に変換して、工程Ｆの化合物８に示される塩形態を得ることもできる。
【化８】
2016536308.tif 000010
【００４２】
スキーム２は、塩形態（６）、中性物質（７）、またはメチルトリフルオロボラン酸塩（８）からの、式Ｉの化合物の形成を説明する。
【００４３】
中間体（６）、（７）、および（８）から式Ｉの化合物を形成させる多くのやり方（例、（還元的アルキル化用の適切なアルデヒドもしくはケトン、アルキル化用の適切なハライド試薬、または鈴木カップリング用のボロン酸試薬の入手可能性または合成に依存する）アルキル化、還元的アルキル化、鈴木カップリング）がある。ＴＦＡアミン塩（６）または中性アミン（７）を、還元的アルキル化またはアルキル化において使用して、式Ｉの化合物を得てもよい。還元的アルキル化は、当該技術分野で周知であり、室温で適切な溶媒（例、ＤＭＦ）中にて、還元剤（例、シアノホウ水素化ナトリウム）を使用する、または、室温で適切な溶媒（例、ＤＣＭ）中にて、他の還元剤（例、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド）を使用するアミンとアルデヒドの反応に関わる。所望ならば、触媒量のメタノールを、ＤＭＦおよびシアノホウ水素化ナトリウムと共に使用して、反応を先へとさらに早く進行させることも可能である。適切なアリールメチルハライドを使用し、溶媒（例、アセトニトリルまたはＤＣＭ）中にて、適切な有機塩基（例、トリエチルアミン）または無機塩基（例、炭酸カリウム）を用いて、ＴＦＡアミン塩（６）または中性物質（７）をアルキル化することもできる。ヨウ化ナトリウムを、インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で使用して、クロロメチル基質を、より反応性のあるヨウ化メチル基質へと変換し、適切なピラジン、ピリジン、またはピリミジンのアルキル化を完了してもよい。反応物は、室温で、１〜３日撹拌して、式Ｉの化合物を得る場合がある。
【００４４】
化合物（８）は、鈴木パラジウム触媒クロスカップリング条件下でアリールハライドとカップリングさせて、Ｎ−メチルヘテロアリールで置換した生成物を形成可能である。化合物８であるメチルトリフルオロボラン酸塩は、別の変形形態を提供して、式Ｉの化合物を調製する。当業者は、そのようなクロスカップリング反応を促進するのに有用な各種条件があることを認識する。従って、適切なパラジウム試薬は、酢酸パラジウム（ＩＩ）および適切な有機リン試薬（例、塩基（炭酸セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、または第三リン酸カリウム一水和物）を有するＸ−ｐｈｏｓ）を含む。他の適する有機リンおよびパラジウム試薬には、ビス（トリフェニルホスフィン）塩化パラジウム（ＩＩ）、トリシクロヘキシルホスフィンを有するトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）塩化パラジウム（ＩＩ）、またはテトラキストリフェニルホスフィンパラジウムが含まれる。
【００４５】
任意選択の工程では、式Ｉの化合物の医薬的に許容される塩（例、塩酸塩）を、標準的条件下、適切な溶媒中で、式Ｉの遊離塩基化合物を適切な酸と反応させて形成させる場合がある。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護の際に同時に起こる場合がある。
【実施例】
【００４６】
以下の調製例および実施例は、本発明をさらに説明する。異なるように注記されない限り、本明細書中で説明される化合物を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）Ｄｒａｗバーション４．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）、ＩＵＰＡＣＮＡＭＥ  ＡＣＤＬＡＢＳ、またはＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１２．０を使用して、命名および番号付する。
【００４７】
逆相精製方法の全体説明
システム：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００  ＬＣＭ／ＭＳにＭａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＭＳＤ）質量分析計およびＬｅａｐ自動サンプラー／画分回収装置を搭載したもの；カラム：７５×３０ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ、５μ粒子サイズカラムに１０×２０ｍｍガードを有するもの；溶媒システム：Ａ：１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ１０、水相として）、Ｂ：ＡＣＮ（有機相として）；流速：８５ｍＬ／分；方法：各方法の勾配を、方法名の中で、開始％Ｂ−終了％Ｂ（例、高ｐＨ  １３−４８）として表記する。勾配を以下のように設定する：０〜１分（開始％Ｂで保持）、１〜８分（開始％Ｂから終了％Ｂまでの勾配）、８〜８．１分（終了％Ｂ〜１００％Ｂまでの傾斜）、８．１〜９分（１００％Ｂで保持）。
【００４８】
調製例１
４−メトキシピリミジン−２−カルバルデヒド
【化９】
2016536308.tif 000011
【００４９】
ＤＣＭ（５ｍＬ）中で、塩化オキサリル（１ｍＬ、ＤＣＭ中で２．０Ｍ）と４−メトキシピリミジン−２−メタノール（３００ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）を合わせて−７８℃へ冷却する。ＤＭＳＯ（０．３３ｍＬ、４．７１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２時間撹拌する。トリエチルアミン（０．６６ｍＬ、４．７１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩室温へと温める。水（５ｍＬ）を加え、１時間撹拌し、そして、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして、減圧下で濾液を濃縮して、淡褐色固形物を得て、さらなる精製なしに使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  アルデヒドピーク９．９４（ｓ，１Ｈ）。一より多い化合物の混合物のため、残りのピークは帰属可能ではない。
【００５０】
調製例２
４−メチルピリミジン−２−カルバルデヒド
【化１０】
2016536308.tif 000012
【００５１】
（４−メチルピリミジン−２−イル）メタノールを使用して、基本的には調製例１に記載されるように４−メチルピリミジン−２−カルボキサルデヒドを調製して、標題化合物を得て、さらなる精製なしに使用する。１Ｈ  ＮＭＲ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．０６（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），２．６５（ｓ，３Ｈ）。
【００５２】
調製例３
４−（トリフルオロメチル）−２−ビニル−ピリミジン
【化１１】
2016536308.tif 000013
【００５３】
バイアル中で、２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）ピリミジン（２５０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）、ビニルトリフルオロホウ酸カリウム（１８４ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（１．３４ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（５ｍＬ）、および水（０．５ｍＬ）を合わせる。窒素気流を使って１分間脱気する。ビス（トリフェニルホスフィン）塩化パラジウム（ＩＩ）（４８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を加え、バイアルを封止し、そして、混合物を８５℃で３日間加熱する。冷却し、ＤＣＭで混合物を希釈し、ケイ藻土を通してろ過し、そして、減圧下で濾液をろ過して、標題化合物（０．２００ｇ、８４％）を得て、さらなる精製なしに使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．９４（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＸ＝１７．３，ＪＢＸ＝１０．４７），６．７４（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＢ＝１．５４，ＪＡＸ＝１７．３），５．８４（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＢ＝１．５４，ＪＢＸ＝１０．４７）。
【００５４】
調製例４
５−メチル−２−ビニル−ピリミジン
【化１２】
2016536308.tif 000014
【００５５】
２−コロ（ｃｈｏｒｏ）−５−メチルピリミジンを使用して、基本的には調製例３に記載されるように標題化合物を調製し、さらなる精製なしに使用する（２２０ｍｇ、９４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．３８（ｓ，２Ｈ），６．７３（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＸ＝１７．４，ＪＢＸ＝１０．７），６．４１（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＢ＝１．８，ＪＡＸ＝１７．４），５．５４（ＡＢＸ，１Ｈ，ＪＡＢ＝１．８，ＪＢＸ＝１０．７），２．１６（ｓ，３Ｈ）。
【００５６】
調製例５
４−（トリフルオロメチル）ピリミジン−２−カルバルデヒド
【化１３】
2016536308.tif 000015
【００５７】
４−（トリフルオロメチル）−２−ビニル−ピリミジン（２００ｍｇ、０．８４ｍｏｌ）と、過ヨウ素酸ナトリウム（７３７ｍｇ、３．４５ｍｍｏｌ）および四酸化オスミウム、高分子結合体（２９２ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を，ジオキサン（３ｍＬ）および水（１ｍＬ）中で合わせ、そして、混合物を室温で一晩撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）および水（５ｍＬ）で希釈する。混合物をガラスウールを通してろ過し、複数の層を分離する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、そして濾液を濃縮して、標題化合物（４０ｍｇ、２０％）を得る。その粗製物質をさらなる精製なしに使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  アルデヒド１０．１６（ｓ，１Ｈ）。一より多い化合物の混合物のため、残りのピークは帰属可能ではない。
【００５８】
調製例６
５−メチルピリミジン−２−カルバルデヒド
【化１４】
2016536308.tif 000016
【００５９】
２−クロロ−５−メチル−ピリミジンを使用して、基本的には調製例５に記載されるように５−メチルピリミジン−２−カルバルデヒドを調製し、標題化合物（９０ｍｇ、４４％）を得て、さらなる精製なしに使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．０６（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｓ，２Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ）。
【００６０】
調製例７
２−（ブロモメチル）−４−クロロ−ピリミジン
【化１５】
2016536308.tif 000017
【００６１】
バイアル中で、２−メチル−４−クロロピリミジン（２００ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、四塩化炭素（５ｍＬ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（３０４ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）、およびベンゾイルパーオキシド（３８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を合わせ、２分間窒素を流し、封止し、そして、８０℃で一晩加熱する。その粗製反応混合物をさらなる精製なしに使用する。ＧＣ−ＭＳ  ｍ／ｅ：（７９ＢＲ／８１Ｂｒ２０５／２０７（Ｍ＋）。
【００６２】
調製例８
２−（クロロメチル）ピラジン
【化１６】
2016536308.tif 000018
【００６３】
２−ピラジニルメタノール（２．０ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍＬ）中に溶解し、そして、窒素下で撹拌しながら０℃に冷却する。塩化チオニル（４．６３ｍＬ、６３．６ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下し、そして、２５℃に温める。室温で１６時間撹拌する。混合物を濃縮し、その後、ＤＣＭで希釈する。粗製溶液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮する。粗製残渣をＤＣＭ中に溶解し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９５：５〜１００％のＥｔＯＡｃ勾配）により精製し、標題化合物を淡黄色オイルとして得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．６７（ｓ＝２Ｈ），８．５０−８．５５（ｍ，２Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ）。
【００６４】
調製例９
２−（ブロモメチル）−３−クロロ−ピラジン
【化１７】
2016536308.tif 000019
【００６５】
２−クロロ−３−メチル−ピラジン（５．０ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（６．９２ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）、ベンゾイルパーオキシド（０．４７１ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）、および四塩化炭素（５０ｍＬ）を一緒に加え、１６時間窒素下で加熱して還流する。反応混合物を２５℃へ冷却し、そして、ヘキサンで希釈する。混合物をろ過し、減圧下で液体を濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９５：５〜４０：６０への勾配）により精製して、標題化合物を褐色オイル（３．９３ｇ、４９％）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．６６（ｓ＝２Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【００６６】
調製例１０
メチル３，５−ジフルオロピリジン−２−カルボキシレート
【化１８】
2016536308.tif 000020
【００６７】
３，５−ジフルオロピリジン−２−カルボン酸（１．４ｇ、８．８ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（３０ｍＬ）を一緒に加え、そして、０℃に冷却する。ＭｅＯＨ（３ｍＬ）、ＤＭＡＰ，（１．３２ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（２．１ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を加える。混合物を室温へと温まるようにし、一晩撹拌する。減圧下で反応混合物を濃縮し、そして、シリカゲルのクロマトグラフィー（１０／１の石油エーテル／ＥｔＯＡｃで溶出するもの）により残渣を精製し、標題化合物（１．０３ｇ、７２％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６８】
調製例１１
（３，５−ジフルオロ−２−ピリジル）メタノール
【化１９】
2016536308.tif 000021
【００６９】
メチル３，５−ジフルオロピリジン−２−カルボキシレート（１．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）および２Ｍの水素化ホウ素リチウムを、ＴＨＦ（１５ｍＬ、２３ｍｍｏＬ）中に一緒に加える。混合物を、２日間室温で撹拌する。減圧下で濃縮し、そして、ＤＣＭで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製し、標題化合物（０．４４８ｇ、６０％）を得る。
【００７０】
調製例１２
２−（クロロメチル）−３，５−ジフルオロピリジン
【化２０】
2016536308.tif 000022
【００７１】
（３，５−ジフルオロ−２−ピリジル）メタノール（２００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（４ｍＬ）、ＤＭＦ（０．１ｍＬ）、および塩化チオニル（１ｍＬ）を一緒に加え、そして、混合物を４時間撹拌する。４Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を使ってｐＨを約７．０に調整し、そして、混合物をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出する。有機部分を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、そして、濃縮して、標題化合物（１８２ｍｇ、８１％）をオレンジ色のオイルとして得る。
【００７２】
調製例１３
ｔｅｒｔ−ブチル４−カルバミミドイルピペラジン−１−カルボキシレート塩酸塩
【化２１】
2016536308.tif 000023
【００７３】
１０Ｌのジャケット反応槽に、ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（１５００ｇ、８．０５４ｍｏｌ）およびＤＭＦ（４．０５Ｌ）を入れる。溶液ができるまで撹拌する。１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミドＨＣｌ（１１８０ｇ、８．０５４ｍｏｌ）、次にジイソプロピルエチルアミン（１０４１ｇ、８．０５４ｍｏｌ）を、１５分かけて、２２〜２８℃で加える。５時間５５〜６０℃で加熱し、その後２０℃へ冷却する。反応混合物を、ＴＢＭＥ（３０Ｌ）の入った５０Ｌジャケット反応槽へ、１５〜２０分かけて移し、そして、ＤＭＦ（４００ｍＬ）を使って移送ラインをゆすぐ。懸濁物を１時間２０℃で撹拌し、その後、３つの別々の２６ｃｍブフナー漏斗を通してろ過する。各生成物ケーキを、ＴＭＢＥ（２×１０００ｍＬ）で洗浄し、そして、６０℃で一晩、真空オーブン中で乾燥して、標題化合物（１８９８ｇ、８９％）を白色固形物として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １．４１（ｓ，９Ｈ），３．４２−３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３３−３．４２（ｍ，４Ｈ），７．７７（ｓ，４Ｈ）。
【００７４】
調製例１４
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【化２２】
2016536308.tif 000024
【００７５】
２２Ｌの丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル４−カルバミミドイルピペラジン−１−カルボキシレート塩酸塩（１８９７ｇ、７．１６５ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０．１Ｌ）、およびエチル２−クロロニコチネート（１２６６ｇ、６．８２４ｍｏｌ）を入れる。温度が徐々に１７から６２℃に上昇するようにしながら、５５分かけてｔｅｒｔ−ブトキシド（１２９３ｇ、１１．５２ｍｏｌ）を少しずつ加える。反応物を１００℃で２．５時間加熱する。反応混合物を２０℃へと冷却し、水（１５．２Ｌ）の入った３０Ｌジャケット反応槽へ、ＤＭＦ（３５０ｍＬ）を使って移して、反応槽と移送ラインをゆすぐ。ｐＨが５〜６になるまで、３Ｎの塩酸（１．５２Ｌ）を導入し、２時間２０℃で懸濁物を撹拌する。生成物を、３つの別々の２６ｃｍブフナー漏斗を通してろ過することにより回収し、各ケーキを水（３×１．５Ｌ）で洗浄する。ケーキを合わせて、それらを水（１５．０Ｌ）中に懸濁し、そして、６０分間２０℃で撹拌する。生成物を、２つの別々の２６ｃｍブフナー漏斗を通してろ過することにより回収し、各ケーキを水（２×１．５Ｌ）で洗浄する。固形物を６０℃の真空オーブンで２４時間乾燥し、黄色固形物として標題の化合物（１３３２ｇ、５９％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １．４３（ｓ，９Ｈ），３．３６−３．４９（ｍ，４Ｈ），３．６２−３．７６（ｍ，４Ｈ），７．１３−７．２０（ｍ，１Ｈ），８．２２−８．２７（ｍ，１Ｈ），８．６２−８．７０（ｍ，１Ｈ）。
【００７６】
調製例１５
ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート，硫酸メチル
【化２３】
2016536308.tif 000025
【００７７】
２０Ｌのジャケット反応槽に、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１３３１ｇ、４．０１７ｍｏｌ）およびＤＭＦ（６．６６Ｌ）を入れる。ジメチル硫酸（５８３ｇ、２．８３ｍｏｌ）を、５〜１０分かけて加え、そして、３８℃へと僅かに発熱する物質が観察される。溶液を３０分間６３〜７３℃へと加熱する。その後、さらにジメチル硫酸（５０．７ｇ、０．４０２ｍｏｌ）を導入し、そして、３０分間６８〜７３℃で加熱する。反応物サンプルには、２．０％の出発物質が残っている。さらにジメチル硫酸（５０．７ｇ、０．４０２ｍｏｌ）を加え、そして、６８〜７３℃で加熱する。サンプルには、再度、１．３％の出発物質が残っている。反応物を２０℃へ冷却し、２０〜３０分かけて、ＴＢＭＥ（２６．６Ｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートおよび種（１ｇ）の入った５０Ｌジャケット反応槽へ、ＤＭＦ（３００ｍＬ）を使用して移して、反応槽と移送ラインをゆすぐ。懸濁物を、一晩２０℃で一晩撹拌し、そして、３つの別々の２６ｃｍブフナー漏斗を使用してろ過により生成物を回収する。各ケーキを、ＴＢＭＥ（３×１．３Ｌ）でゆすぎ、３部を合わせて、物質をＴＭＢＥ（１３．３Ｌ）中に懸濁し、１時間２０℃で撹拌し、そして、生成物を２つの別々の２６ｃｍブフナー漏斗上に回収する。各産物ケーキを、ＴＢＭＥ（３×２．０ｍＬ）で洗浄し、そして、５５〜６０℃で１６時間、真空オーブン中で乾燥して、標題化合物（１８１２ｇ、９８％）を黄色固形物として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １．４４（ｓ，９Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．４５−３．５５（ｍ，４Ｈ），３．８０−３．９５（ｍ，４Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ），７．４０−７．４５（ｍ，１Ｈ），８．７２−８．７６（ｍ，１Ｈ），８．８６−８．９１（ｍ，１Ｈ）
【００７８】
調製例１５  種晶形成
【化２４】
2016536308.tif 000026
【００７９】
２５０ｍＬの反応槽に、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１５ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）を入れる。ジメチル硫酸（６．２８ｇ、４９．８ｍｍｏｌ）を１部で、撹拌中の混合物（３４℃へ僅かに発熱する物質が観察される）へ加える。得られる溶液を３時間６８〜７３℃で加熱する。ジメチル硫酸（０．５７ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を加え、そして、さらに１時間６８〜７３℃で撹拌する。２０℃へと冷却し、ＴＢＭＥ（３００ｍＬ）入り１Ｌフラスコへ滴下して移す。粘性のある固形物が撹拌可能な懸濁物へと変化するのを観察し、そして、２０℃で一晩撹拌し、ブフナー漏斗上でろ過する。生成物ケーキを、ＴＢＭＥ（３×３５ｍＬ）で洗浄し、そして、ＴＢＭＥ（１００ｍＬ）中に懸濁する。懸濁物を１時間２０℃で撹拌し、ブフナー漏斗上でろ過し、そして、ケーキをＴＢＭＥ（２×３５ｍＬ）で洗浄する。固形物を１６時間、５５〜６０℃の真空オーブン中で乾燥して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート，硫酸メチル（１８．８４ｇ、収率９１％）（ＨＰＬＣ純度９５％）を得る。
【００８０】
調製例１６
ヨウ化ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【化２５】
2016536308.tif 000027
【００８１】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１１５．４３ｇ）、ＴＨＦ（１．４Ｌ）、およびヨウ化メチル（２４ｍＬ）を、機械式撹拌機付き２ＬのＰａｒｒオートクレーブ中で合わせる。オートクレーブを封止し、そして、２２時間７０℃で加熱しながら反応物を撹拌する。反応物を室温へと冷却し、得られる山吹色のスラリーを、ＭｅＯＨを使用して丸底フラスコへと移し、スラリーを濃縮し、そして、得られる固形物を５０〜６０℃の真空オーブン中で乾燥して、標題化合物を黄色固形物（１６７．４４ｇ、１００％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４６．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝１．１６分。
【００８２】
調製例１７
ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【化２６】
2016536308.tif 000028
【００８３】
２ガロンの圧力容器に、ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート，硫酸メチル（８８１ｇ、１．９２７ｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（４．９Ｌ）を入れる。酸化白金（１％ｗ／ｗ、８．８１ｇ）を加え、そして、水素を使って１５５ｐｓｉへと加圧する。２２〜２８℃で４時間撹拌する。触媒を回収するためフィルターカートリッジを通してろ過する。二回目の水素付加の濾液と合わせることになる濾液を取っておく。ろ過前に、別の部分のｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート，硫酸メチル（９２５ｇ，２．０２３ｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（５．０Ｌ）、および酸化白金（１％ｗ／ｗ、９．２５ｇ）の反応を繰り返し、二つの濾液を合わせて、そして、オイル状の残渣へと濃縮する。残渣をＤＣＭ（９．３Ｌ）中に溶解し、そして、０．１ＮのＨＯＡｃ水溶液（２×２．０Ｌおよび２×１．１Ｌ）と０．５ＭのＮａＯＨ（８．０Ｌ）で洗浄する。水（４．０Ｌ）を加え、そして、０．１ＮのＨＯＡｃ水溶液（約１．９Ｌ）を使ってｐＨ６〜７へと調整する。層を分離して、そして、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、約４．５Ｌの体積へ濃縮し、そして、ＥｔＯＡｃ（１６．０Ｌ）を加えて生成物を結晶化する。懸濁物を約４．５Ｌの体積へ濃縮し、０〜５℃に冷却し、そして、ろ過により生成物を回収する。ケーキを、ＥｔＯＡｃ（２×２．０Ｌおよび２×１．１Ｌ）で洗浄し、そして、５５〜６５℃で１６時間、真空オーブン中で乾燥して、標題化合物（１１８５ｇ、７７％）を白色固形物（非常に静電的）として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １．４５（ｓ，９Ｈ），１．７６−１．８８（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２ｈ），３．０４（ｓ，３Ｈ），３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６０−３．７０（ｍ，４Ｈ），５．０１（ｓ，１Ｈ），１２．１−１２．３（ｂｒｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２０．００，２１．６３，２８．８１，３６．５５，４４．９９，５０．２０，８０．３８，８５．８５，１５２．３８，１５５．１５，１６０．１４，１６４．０３。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５０．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８４】
調製例１７  代替的合成
丸底フラスコに、ヨウ化ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イウム−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１６７．４４ｇ、３５３．７６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（８１５ｍＬ）を入れ、そして、氷浴中で、内部温度０〜５℃へと冷却する。トリフルオロ酢酸（８０．２５ｍＬ、１．０６ｍｏｌ）を、内部温度を１５℃以下に維持する速度（４５分）で加える。反応物を内部温度０〜５℃へと冷却し、そして、シアノホウ水素化ナトリウム（６６．６９ｇ、１．０６ｍｏｌ）を、温度を１５℃以下に維持する速度（約５０分）で加える。２５℃へと温めながら、１８時間反応物を撹拌する。反応物を再び０〜５℃へと冷却し、そして、トリフルオロ酢酸（８０．２５ｍＬ、１．０６ｍｏｌ）を、温度を１５℃以下に維持するような速度（１０分）で加え、その後、シアノホウ水素化ナトリウム（６６．６９ｇ、１．０６ｍｏｌ）を、温度を１５℃以下に維持するような速度（１０分）で加える。２５℃へと温めながら、一晩反応物を撹拌する。反応物を再び０〜５℃へと冷却し、そして、トリフルオロ酢酸（２６．６ｍＬ、０．３４５ｍｏｌ）を、温度を１０℃以下に維持するような速度（５分）で加え、その後、シアノホウ水素化ナトリウム（２２．３ｇ、０．３４５ｍｏｌ）を、１０分かけて２部で加える。２５℃へと温めながら、一晩撹拌する。１２Ｌのバケツに頭上式撹拌機を取り付け、それに、炭酸水素ナトリウム（２９７．１８ｇ、３．５４ｍｏｌ）および水（７．２Ｌ）を入れる。３０分間かけて分離漏斗を使用して、粗製反応混合物を重炭酸塩溶液へと加え、ガスの発生を観察する。混合物を２時間撹拌し、その後、一晩２５℃で静置する。得られる固形物をろ過により回収し、そして、水とジエチルエーテルとでゆすぐ。固形物を約６０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、ベージュ色固形物として標題の化合物（１１１．３４ｇ、９０％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５０．０［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝１．９３分。
【００８５】
調製例１８
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）塩
【化２７】
2016536308.tif 000029
【００８６】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（４６．８ｇ、１３３．９ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（１００ｍＬ）を一緒に加える。１５分かけてトリフルオロ酢酸（８０ｍＬ、１．０９ｍｏｌ）を加え、そして、一晩２５℃で撹拌する。減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）を加え、そして、減圧下で４回再濃縮して、標題化合物を、わずかに灰色がかった白色固形物（６９．６８５ｇ、粗製分１００％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２５０．０［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝０．５３分。
【００８７】
調製例１９
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；トリ−２，２，２−トリフルオロ酢酸
【化２８】
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【００８８】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１９６．０ｇ、５６０．８ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（７８３ｍＬ）を一緒に加える。濁った懸濁物を氷浴中で、内部温度４℃へと冷却し、そして、撹拌しながら１０分かけてトリフルオロ酢酸（２５４ｍＬ）を加える。室温で４２時間撹拌する。減圧下で揮発物を除去し、ＤＣＭ中に溶解する。減圧下で揮発物を除去し、そして、４０℃で一晩、真空下で乾燥して、標題化合物（４３１．５ｇ、９９％）を白色固形物として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．９６（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．４９（ｂｒ  ｓ，ＴＦＡ／水，９Ｈ），３．７８（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．１５（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．０４（ｓ，３Ｈ），２．３７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．７６（ｐｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ。
【００８９】
調製例２０
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；テトラ−２，２，２−トリフルオロ酢酸
【化２９】
2016536308.tif 000031
【００９０】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（０．２９ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（３ｍＬ）、およびトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を一緒に加える。反応物を室温で４時間撹拌する。混合物を濃縮および残渣をＤＣＭ中に溶解し（２×）、そして、混合物を濃縮する。１時間真空下で乾燥して、標題化合物（０．５５６ｇ、９５％）を得て、それは、精製または解析なしに使用する。
【００９１】
調製例２１
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３０】
2016536308.tif 000032
【００９２】
丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート（７３０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１５ｍＬ）、およびトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を入れ、そして、反応物を室温で３時間撹拌する。減圧下で濃縮し、残渣をメタノール中に溶解し、イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ４−４００（５．５ｇ）を加え、そして、混合物を室温で一晩撹拌する。混合物をろ過し、そして、メタノール中の７Ｍアンモニアでイオン交換樹脂を洗浄する。濾液と洗浄液を合わせ、そして、減圧下で濃縮して、標題化合物をオレンジ色の固形物（３８５ｍｇ、９５％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２５０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００９３】
代替的調製例２１
ＤＣＭ（３０ｍＬ）を用いて、１０ｇのＳＣＸ−２カラムを事前に洗浄し、そして、ＤＣＭ（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）（０．５ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）溶液をロードする。カラムをＤＣＭ（３０ｍＬ）、その後、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、そして、２ＭのＮＨ３／ＭｅＯＨ（６０ｍＬ）で溶出する。減圧下で生成物を含む画分を濃縮して、標題の化合物（０．２６ｇ、１００％）を得る。
【００９４】
調製例２２
トリフルオロ−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ボラヌイドカリウム
【化３１】
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【００９５】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（２５０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解し、そして、ブロモメチルトリフルオロホウ酸カリウム（２０８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加える。９０分間８０℃で加熱し、その後、窒素気流下で濃縮する。アセトン（３０ｍＬ）と炭酸水素力リウム（１００ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加え、そして、室温で一晩撹拌する。固形物をろ過により除去し、減圧下で濾液を濃縮して、わずかに灰色がかった白色固形物として標題の化合物（２７３ｍｇ、７３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３０  ［Ｍ−Ｋ＋］−。
【００９６】
実施例１
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３２】
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【００９７】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；トリ−２，２，２−トリフルオロ酢酸（４０９ｇ、５３１ｍｍｏｌ）を、５Ｌ抽出漏斗中のＤＣＭ（２．０Ｌ）に溶解する。窒素で漏斗をパージし、そして、それに頭上式機械型撹拌機を備え付ける。ピリミジン−２−カルボキサルデヒド（６６．６ｇ、６１６ｍｍｏｌ）を加え、４０分間撹拌する。その後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２２５．１ｇ、１０６０ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、そして、その添加直後に、２０〜３６℃の発熱体が観察される。反応物を室温で一晩撹拌する。得られる発熱体を冷却器で制御しながら、反応物を慎重に１０Ｌ反応槽内の２０℃の１ＭのＮａＯＨ（２．３２Ｌ）中へ注ぐ。１ＮのＮａＯＨ（２．５５Ｌ）を用いて、ｐＨを８〜９へと調整する。有機層を回収し、ＤＣＭ（２．３２Ｌ）を使って水層を抽出する。有機層を合わせ、窒素気流下で一晩濃縮および乾燥して、標題化合物（１９３ｇ、１００％粗製品）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  （ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．７６（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．１８７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），２．９６（ｓ，３Ｈ），２．５４（ｍ，２Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），１．７２（ｐｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）。精製のために、このロットを他の４つのロットと合わせる（２０３ｇ）。シリカろ過（直径２０ｃｍで、高さ８ｃｍ）により精製し、そして、９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中の１０％２ＭのＮＨ３を用いて溶出して、標題化合物（１６２ｇ、８４％）を得る。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．７４（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），３．７８−３．６９（ｍ，４Ｈ），３．２７−３．１９（ｍ，２Ｈ），３．０３（２，３Ｈ），２．６８−２．５９（ｍ，４Ｈ），２．４７−２．３８（ｍ，２Ｈ），１．８８−１．７６（ｍ，２Ｈ）。
【００９８】
実施例１  代替的合成
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オントリ−２，２，２−トリフルオロ酢酸（２０３．２３ｇ、３４４ｍｍｏｌ）、ピリミジン−２−カルバルデヒド（４０ｇ、３７０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（３４３ｍＬ）を合わせ、均質な溶液が得られるまで撹拌する（３０分）。氷浴中で溶液を冷却し、シアノホウ水素化ナトリウム（２５ｇ、３９７ｍｍｏｌ）を５ｇの部分で、その５分後、１０ｇの部分で加える。１．５時間撹拌し、そして、シアノ水素化ホウ素の最後の１０ｇを加える。温度を２５℃以下に維持しながら３０分撹拌する。反応物を一晩撹拌し、そして、２５℃に温まるようにする。頭上式撹拌機を備えた、炭酸水素ナトリウム（１１５ｇ、１．３７ｍｏｌ）および水（３５０ｍＬ）入りビーカー（４Ｌ）に、反応混合物を注ぎ込む。混合物を２０分間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を加え、そして、３０分間撹拌する。約３０分かけて、混合物をケイ藻土（７００ｇ）に注ぎ通して、約１時間重力式ろ過する。その後、真空を適用して、ＥｔＯＡｃ（２×１Ｌ）を用いてケイ藻土をゆすぐ。有機層を合わせて濃縮し、粗重量１１７ｇの粘性のある黄色オイルを得る。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、勾配）によりそのオイルを精製する。得られる物質を５０℃の真空オーブン中で乾燥して、標題化合物を白色泡状固形物（４４．２２ｇ、３８％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４２．３［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝０．９６分。
【００９９】
実施例２
２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３３】
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【０１００】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；テトラ２，２，２−トリフルオロ酢酸（０．５５６ｇ、０．７８８ｍｍｏｌ）、３−クロロピコリンアルデヒド（５５７．８７ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を一緒に加え、その後、シアノホウ水素化ナトリウム（１４８．６ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を加える。反応物を、５日間室温で撹拌する。反応物をＣＨＣｌ３（７５ｍＬ）で希釈し、そして、飽和ＮａＨＣＯ３とブラインで洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して乾燥する。粗生成物を、ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、標題化合物（２１４ｍｇ、７２％）を得る。ＬＣ  ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７５．３（３５Ｃｌ）（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０１】
以下の実施例３、４、および５を、実施例２に記載される手順に基本的に従って調製する。それには、適切なアルデヒドまたはケトンを使用し、２時間から４８時間まで、室温で撹拌し、反応が完了するのをモニターし、必要ならばシアノホウ水素化ナトリウムをさらに加え、そして、さらに２４時間撹拌する。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
実施例６
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン４−メチルベンゼンスルホン酸塩
【化３４】
2016536308.tif 000037
【０１０４】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（２７４．５ｍｇ、０．８０４ｍｍｏｌ）をエタノール（０．５ｍＬ）に加え、そして、トルエンスルホン酸一水和物（１６０ｍｇ）を加える。超音波破砕して、暗琥珀赤色の溶液を得る。ヘプタン（５ｍＬ）を加え、混合物にふたをかぶせ、撹拌し、そして、混合物を８０℃へ加熱する。混合物は固化して、茶褐色の固形物となる。混合物を３０分間撹拌し、固形物を真空ろ過により回収し、そして、空気乾燥させて、標題の化合物（３８７ｍｇ、９４％）を得る。
【０１０５】
実施例６  粉末Ｘ線回折法
結晶性固形物のＸＲＰＤパターンを、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）とＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回折装置上で３５ｋＶおよび５０ｍＡで稼働しながら得る。サンプルを、２θでの４〜４０°で、２θでのステップサイズ０．００８７°及びスキャン速度０．５秒／ステップを用い、並びに０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定アンチスキャッターおよび９．５ｍｍの検出器スリットを用いてスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダに詰めて、滑面をガラススライドを用いて得る。結晶学技術分野において周知なのは、任意の所定の結晶形に関して、回折ピークの相対強度が、複数因子（例、結晶形態および晶癖）から生じる優先配向に起因して異なる可能性があることである。優先配向の効果が存在する場所では、ピーク強度が変化するが、多形体の特徴的ピーク位置は変化しない。例えば、米国薬局方３５−国民医薬品集３０章＜９４１＞粉末Ｘ線回折法（ＸＲＰＤ）による結晶性および部分的結晶性固形物の特徴解析、公定、２０１２年１２月１日〜２０１３年５月１日を参照されたい。さらに、任意の所定の結晶形に関して、ピーク角度位置が若干変化する場合があるということも結晶学技術分野では周知である。例えば、サンプルを解析する温度若しくは湿度の変動、サンプル変位、または内部標準の存在若しくは非存在に起因して、ピーク位置はシフト可能である。本件では、２θでの±０．２のピーク位置変動は、記載される結晶形の明白な同定を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮にいれることにする。結晶形の確認は、区別可能な（°（２θ）単位での）複数ピーク、典型的にはより顕著な複数ピークの任意のユニークな組み合わせに基づいて実行する。外気温および相対湿度で得られる結晶形回折パターンを、８．８５および２６．７７°（２θ）でのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整した。
【０１０６】
実施例６の調製サンプルをＣｕＫａ線源を使用してＸＲＰＤパターンにより特徴解析したところ、以下の表１に示すような回折ピーク（２θ値）を有している。具体的には、回折角度０．２°の許容誤差を有する１２．０２、１２．９３、１５．１７、１９．２４および２３．２１からなる群より選択される一又は複数のピークと組み合わされる７．６８のピークを、前記パターンは含む。
【０１０７】
【表２】
2016536308.tif 000038
【０１０８】
実施例７
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３５】
2016536308.tif 000039
【０１０９】
実施例８
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、異性体１
【化３６】
2016536308.tif 000040
【０１１０】
実施例９
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、異性体２
【化３７】
2016536308.tif 000041
【０１１１】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）塩（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、２−アセチルピリミジン（０．３８ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）、シアノホウ水素化ナトリウム（０．２０ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を合わせ、そして、室温で２０時間撹拌する。さらに２−アセチルピリミジン（０．３８ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）およびシアノホウ水素化ナトリウム（０．２０ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で一晩加熱する。窒素気流下で４日間、そのＤＭＦを蒸発させ、そして、ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨを用いて溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物である実施例７（３３０ｍｇ、４４％）をラセミ体として得る。
【０１１２】
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅ（登録商標）Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−２カラム（２．１×２５ｃｍ、５μｍ）のＳＦＣを用いて分離する。移動相：４０％ＥｔＯＨ（０．２％ＩＰＡｍ）／二酸化炭素。流速：７０ｍＬ／分。検出：２２５ｎｍ。第一溶出ピークを異性体１として得て、第二溶出ピークを異性体２として得る。
【０１１３】
実施例８、異性体１：１３５ｍｇ、純度９９．２５％であるが、０．７５％の異性体２を不純物として有する（ＴＲ＝４．５９分；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−２カラム（２．１×２５ｃｍ、５μｍ）、移動相：４０％ＥｔＯＨ（０．２％ＩＰＡｍ）／二酸化炭素、流速：５ｍＬ／分、検出：２２５ｎｍ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１４】
実施例９、異性体２：１２１ｍｇ、純度９６．６３％であるが、３．３６％の異性体１を不純物として有する（ＴＲ＝５．９１分；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−２カラム（２．１×２５ｃｍ、５μｍ）、移動相：４０％ＥｔＯＨ（０．２％ＩＰＡｍ）／二酸化炭素、流速：５ｍＬ／分、検出：２２５ｎｍ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１５】
実施例１０
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルプロピル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３８】
2016536308.tif 000042
【０１１６】
実施例１１
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルプロピル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、異性体１
【化３９】
2016536308.tif 000043
【０１１７】
実施例１２
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルプロピル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、異性体２
【化４０】
2016536308.tif 000044
【０１１８】
実施例７、８、および９に記載される手順に基本的に従って、実施例１０、１１、および１２を調製する。それには、１−（２−ピリミジニル）−１−プロパノンを使用し、そして、ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。同一条件を使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより、二度目の精製を行う。その後、さらなる精製を、高ｐＨプレップＨＰＬＣ（カラム：１５０ｇの高分解能Ｃ１８ゴールド；初期：５％アセトニトリル／９５％の１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（５％ＭｅＯＨを用いたもの）〜６０％アセトニトリル／４０％炭酸水素アンモニウム（５％ＭｅＯＨを用いたもの）の勾配を３０分で、検出波長２３９、２５４、２８０、および２９０ｎｍ）により行い、標題化合物である実施例１０（１４０ｍｇ、１８％）を得る。Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−４カラムを使用すること以外は実施例８および９のために記載した条件を使用するＳＦＣを用いて、得られるエナンチオマーの混合物を分離する。
【０１１９】
実施例１１、異性体１：５０ｍｇ、純度＞９９．９％（ＴＲ＝４．２６分；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−４カラム（２．１×２５ｃｍ、５μｍ）、移動相：４０％ＥｔＯＨ（０．２％ＩＰＡｍ）／二酸化炭素、流速：５ｍＬ／分、検出：２２５ｎｍ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２０】
実施例１２、異性体２：４７ｍｇ、純度＞９９．９％（ＴＲ＝５．６７分；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｘ（登録商標）セルロース−４カラム（２．１×２５ｃｍ、５μｍ）。移動相：４０％ＥｔＯＨ（０．２％ＩＰＡｍ）／二酸化炭素。流速：５ｍＬ／分。検出：２２５ｎｍ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２１】
実施例１３
２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４１】
2016536308.tif 000045
【０１２２】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）塩（０．５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４−メトキシピリミジン−２−カルバルデヒド（１５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）、およびシアノホウ水素化ナトリウム（１３６ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を合わせ、そして、室温で３日間撹拌する。ＭｅＯＨで希釈し、ＳＣＸ−２カラムに吸着させ、ＭｅＯＨでゆすぎ、その後、ＭｅＯＨ中の２ＭのＮＨ３で溶出し、濃縮し、そして、ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題の化合物（４３ｍｇ、１１％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７２．１（Ｍ＋Ｈ）＋、ＴＲ＝１．５１９分。
【０１２３】
以下の実施例を、実施例１３の手順に基本的に従って調製する。それには、適切なアルデヒドと適切なクロマトグラフィーを使用する。
【０１２４】
【表３】
2016536308.tif 000046
【０１２５】
実施例２０
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４２】
2016536308.tif 000047
【０１２６】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）（２０．３１ｇ、３４．３４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１１４ｍＬ）中に懸濁させ、そして、窒素でパージする。３−フルオロピリジン−２−カルバルデヒド（５．２６ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）を加え、６０分間撹拌する。その後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１４．５６ｇ、６８．６８ｍｍｏｌ）を１部で加え、そして、還流される発熱体が観察される。撹拌し、反応物を１時間かけて室温へと冷却させる。０．５ＭのＮａＯＨ（２００ｍＬ）に注ぎ込み、そして、２ＭのＮａＯＨでｐＨを７〜８に調整する。有機層を回収し、ＤＣＭ（２×２００ｍＬ）を使って水層を抽出する。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして、濃縮してオイルを得る。８カラム容量の９５％ＤＣＭ／５％ＭｅＯＨと８カラム容量の９０％ＤＣＭ／１０％ＭｅＯＨを用いて溶出するシリカゲルクロマトグラフィー（４００ｇ）により精製して、ＨＰＬＣ純度が＞９７％の標題の化合物（７．５９ｇ、６１．７％）とＨＰＬＣ純度が８７％の２．６４ｇ（２１．５％）の付加的生成物も得る。ＬＣＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５９．１（Ｍ＋１）＋。
【０１２７】
実施例２１
２−［４−［（２−メトキシフェニル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４３】
2016536308.tif 000048
【０１２８】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）塩（０．２５ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、２−メトキシベンズアルデヒド（０．２１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１５ｍＬ）、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）、およびシアノホウ水素化ナトリウム（１００ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）を合わせ、そして、室温で１２時間撹拌する。メタノールで希釈し、ＳＣＸ−２カラムに吸着させ、ＭｅＯＨでゆすぎ、その後、ＭｅＯＨ中の２ＭのＮＨ３で溶出し、濃縮し、そして、逆相クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー（高ｐＨ  ２１−５５）のための一般的方法を参照されたい）により精製して、標題の化合物（２２３ｍｇ、５９％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２９】
適切なアルデヒドを使用して実施例２１に基本的に記載されるようにして、以下の化合物を調製する。
【０１３０】
【表４】
2016536308.tif 000049
【０１３１】
実施例２８
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン，ジヒドロクロリド
【化４４】
2016536308.tif 000050
【０１３２】
２つのバイアル中、各ＤＣＭ（５ｍＬ）に、ジオキサン（１ｍＬ，４ｍｍｏｌ）中の４ＭのＨＣｌおよび２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（０．１１７ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を加える。バイアルを１時間振とうし、１つのバイアルに合わせ、その後、窒素気流下で一晩蒸発させる。物質を真空オーブン中で一晩乾燥させて、標題の化合物（０．２８ｇ、収率９９％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５９．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝１．０４分。
【０１３３】
実施例２１〜２７の適切な化合物を使用して実施例２８に基本的に記載されるようにして、以下の化合物を調製する。
【０１３４】
【表５−１】
2016536308.tif 000051
【表５−２】
2016536308.tif 000052
【０１３５】
実施例３７
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ベンゾニトリル；ビス−２，２，２−トリフルオロ酢酸
【化４５】
2016536308.tif 000053
【０１３６】
ＤＭＦ（３．２ｍＬ）中の８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）（０．３６４ｇ，０．７６ｍｍｏｌ）の溶液を、２−シアノベンズアルデヒド（０．４９９ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）と合わせ、そして、室温で１時間撹拌する。シアノホウ水素化ナトリウム（０．１４３ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を加え、そして、室温で一晩撹拌する。水中に注ぎ込み、ろ過により回収を試みる。フィルターが詰まるのを観察し、その後、２ＮのＮａＯＨおよびＮａＣｌ（水溶液）を加え、そして、粗生成物を酢酸エチルへと（３×）抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮する。９８％ＤＣＭ／２％エタノール均一溶媒で１０分間、そして、９５％ＤＣＭ／５％エタノールへと段階的勾配をなし、そして、４５分間維持して溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。５％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）／９５％水（０．１％ＴＦＡ）〜５４％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）／４６％水（０．１％ＴＦＡ）へと勾配させて溶出する調製用逆相クロマトグラフィーによりさらに精製して、標題化合物（４８．１ｍｇ、１０．７％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６５．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３７】
実施例３８
２−［４−［（２−クロロフェニル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４６】
2016536308.tif 000054
【０１３８】
２−クロロ−５−メチル−ピリミジン２−クロロベンズアルデヒドを使用して、実施例３７に基本的に記載されるように、標題化合物を調製する。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ３〜１０％ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ３への勾配）により粗製物質を精製する。ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨから物質を再結晶化して、白色固形物（８３ｍｇ、２９％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７４．３（３５Ｃｌ）［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３９】
実施例３９
２−［４−［（５−フルオロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４７】
2016536308.tif 000055
【０１４０】
トリフルオロ−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ボラヌイドカリウム（２７３ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、２−クロロ−５−フルオロピリミジン（９８ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（７２３ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（７１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）、および水（１ｍＬ）を合わせ、窒素気流を用いて２分間脱気する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（１７ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で一晩加熱する。酢酸エチルと水との間で混合物を分け、そして有機層を分離する。硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、そして、濾液を減圧下で濃縮する。得られる残渣を、ＤＣＭ〜９０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（２０ｍｇ、７．５％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６０．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４１】
実施例４０
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリル
【化４８】
2016536308.tif 000056
【０１４２】
２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（１６７ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、そして、窒素気流を用いて１分間脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（９２ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）およびシアン化亜鉛（１８７ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）を加え、そして、１２０℃で一晩、混合物を加熱する。反応物を冷却し、そして、ＭｅＯＨで希釈する。混合物を、１０ｇのＳＣＸ−２カラムへと移し、そして、ＭｅＯＨ中の２ＭのＮＨ３で溶出する。濃縮し、得られる残渣を、逆相クロマトグラフィー（高ｐＨ  ９−２９）によりさらに精製して、標題化合物（３５ｍｇ、２４％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４３】
実施例４１
２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化４９】
2016536308.tif 000057
【０１４４】
２−（ブロモメチル）−４−クロロ−ピリミジン（３２２ｍｇ，１．５５ｍｍｏｌ）（四塩化炭素（５ｍＬ）中の粗製溶液としてのもの）、ＤＣＭ（２ｍＬ）、トリエチルアミン（０．６５ｍＬ、４．６５ｍｍｏｌ）、および８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）（７３９ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を合わせ、そして、２５℃で３日間撹拌する。ＤＣＭと水との間で反応混合物を分け、水層をＤＣＭで抽出する。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。得られる残渣の精製を、質量を指針とするＳＦＣ（カラム：４−ニトロベンゼンスルホンアミド、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ社、１５０×３０ｍｍ、流速＝１００ｍＬ／分；方法：９５％ＣＯ２／ＭｅＯＨ中の１４ｍＭアンモニア均質溶液を３０秒、その後、６０％ＣＯ２／ＭｅＯＨ中の１４ｍＭアンモニアへの勾配を３３０秒かけて勾配をなし、その後、５０％ＣＯ２／ＭｅＯＨ中の１４ｍＭアンモニアへの傾斜を１０秒かけてなし、そして、３０秒維持するもの）により行って、アンモニア塩不純物を有する７１ｍｇの所望の生成物を得る。生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０）によりさらに精製して、標題化合物（２８ｍｇ、５％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７６．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４５】
実施例４２
８−メチル−２−［４−（ピラジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化５０】
2016536308.tif 000058
【０１４６】
８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンビス−（２，２，２−トリフルオロ酢酸）（５００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．７３ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（７８．５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（７ｍＬ）を合わせる。２−（クロロメチル）ピラジン（２０１ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で７２時間撹拌する。反応物をＤＣＭで希釈し、そして、生成物をＤＣＭ中へ抽出する。有機部分を飽和ＮａＨＣＯ３とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮する。得られる残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中の２ＭのＮＨ３、９０：１０）により精製して、標題化合物を黄色固形物（２４９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、７０％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４２．０［Ｍ＋Ｈ］＋，ＴＲ＝０．９９分。
【０１４７】
適切なハロ−メチルピラジンを使用して実施例４２に記載される手順に基本的に従って、以下の化合物を調製する。
【０１４８】
【表６】
2016536308.tif 000059
【０１４９】
実施例４５
２−［４−［（３，５−ジフルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化５１】
2016536308.tif 000060
【０１５０】
２−（クロロメチル）−３，５−ジフルオロピリジン（１８２ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、８−メチル−２−ピペラジン−１−イル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（２６０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．２ｇ、１５ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（５ｍＬ）を加え、そして、混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして、（ＭｅＯＨ／ＤＣＭが１／２０のもので溶出する）シリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製し、標題化合物（１６０ｍｇ、４３％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７７．２（Ｍ＋Ｈ）＋，ＴＲ＝１．１１分。
【０１５１】
がんは、異種性の疾患集合体としての認識が高まってきており、その疾患の発症と進行は、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管新生、浸潤、ならびに細胞および組織微小環境への転移を制御する一又は複数の遺伝子の活性または機能異常により誘導される。「がん」遺伝子の機能変異または異常は、天然のＤＮＡ多型、ゲノムコピー数の変化（増幅、欠失、染色体喪失、または複製を介するもの）、遺伝子と染色体構造の変化（染色体転位、逆位、または遺伝子発現の制御異常を導く他の再編成を介するもの）、および点突然変異から生じる場合がある。がん性新生物は、一つの異常遺伝子機能から誘導可能であり、そして、同一の異常遺伝子機能により維持されるか、または、その維持と進行は、さらなる異常遺伝子活性化もしくは機能により悪化させられる場合がある。
【０１５２】
上記した遺伝学的染色体異常の他には、各がんはまた、ゲノムのエピジェネティック修飾（ＤＮＡメチル化、ゲノム刷り込み、およびアセチル化、メチル化、またはリン酸化によるヒストン修飾を含むもの）を含む場合がある。エピジェネティック修飾は、悪性の誘導および／または維持に役割を演じる場合がある。
【０１５３】
生検、免疫表現型解析、および他の検査によるがん悪性の診断は、公知であり、日常的に使用される。高分解能染色体バンド解析技術および最新の染色体イメージング技術に加えて、がんが疑われる症例における染色体異常は、細胞遺伝学的分析（例、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型分析、スペクトル核型決定法（ＳＫＹ）、多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、一塩基多型アレイ（ＳＮＰチップ）、ならびに、当業者に既知で使用される他の診断用検査および解析用検査）を介して決定可能である。
【０１５４】
Ｗｎｔ／β−カテニン情報伝達経路の重要な部分は、β−カテニン破壊複合体による下流エフェクターβ−カテニンのタンパク質分解制御である。β−カテニン破壊複合体の主要な構成要素は、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）、Ａｘｉｎ、およびＧＳＫ３α／βである。Ｗｎｔ経路活性化の非存在下では、サイトゾルのβ−カテニンは恒常的にリン酸化され、そして、分解の標的とされる。Ｗｎｔ刺激の際に、β−カテニン破壊複合体は解離し、それによりサイトゾルのβ−カテニンの蓄積、核への移行、およびＷｎｔ標準経路応答遺伝子の転写を導く。
【０１５５】
標準的Ｗｎｔ／β−カテニン情報伝達経路を阻害する医薬品を同定する多大な努力がなされてきた。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２阻害剤（例、ＸＡＶ９３９、Ｈｕａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１，６１４；ＪＷ５５、Ｗａａｌｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１２，７２（１１），２８２２；Ｇ００７−ＬＫ、Ｌａｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１３，７３（１０），３１３２；ＴＮＫＳ６５６、Ｓｈｕｌｔｚら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１３年７月１１日オンライン出版（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊｍ４００８０７ｎ）；およびＷＯ２０１３／１１７２８８）が知られている。これらの努力にもかかわらず、臨床用のＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２阻害治療剤は、この時点で出現していない。
【０１５６】
β−カテニン破壊複合体の構成要素に影響を与える変異またはＷｎｔタンパク質の過剰発現により媒介されて、したがって、β−カテニンの安定化を導く経路の異常活性が、がんで観察さている。特に、ＡＰＣの短縮型変異が、直腸結腸がんの最も頻繁な遺伝子変化である（Ｍｉｙａｋｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９４，５４，３０１１−２０；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，１，２２９−３３；およびＰｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５９，２３５−７）。また、Ｗｎｔ情報伝達経路の負の制御因子であるＡｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２変異が、それぞれ肝細胞がんおよび結腸直腸がんの患者で同定された（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２，２１，４８６３−７１；Ｌｉｕ，Ｗ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，１４６−７；Ｌａｍｍｉ，Ｌ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２００４，７４，１０４３−５０）。これらの体細胞変異により、β−カテニンのＷｎｔ非依存的安定化およびβ−カテニン媒介転写の恒常的活性化が生じる。
【０１５７】
異常なＷｎｔ情報伝達経路活性は、いくつかのがん（Ｗａａｌｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１２，７２，２８２２−２８３２；Ｂｕｓｃｈら，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１３，１３，２１１；Ｙａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１１，３０，４４３７−４４４６；Ｄｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２０１３，１２，１１８０−１１８９；Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，２００７，１７，４５−５１；およびＢａｒｋｅｒ，Ｎ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，２００６，５，９９７−１０１４）（結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、すい臓がん、前立腺がん、およびグリオブラストーマを含むもの）と関係があるとされている。異常なＷｎｔ／β−カテニン経路の情報伝達活性は、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）（Ｇｒｏｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，６８，６９６９−６９７７）；多発性骨髄腫（Ｑｉａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３，２２，１５３６−１５４５およびＣｈｉｍら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００７，２１，２５２７−２５３６）；マントル細胞リンパ腫（Ｇｅｌｅｂａｒｔら，Ｂｌｏｏｄ，２００８，１１２，５１７１−５１７９）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｈｅｉｄｅｌら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１２，１０（４）：４１２−４２４）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｙｓｅｂａｅｒｔら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００６，２０，１２１１−１２１６）と関係があるとされている。
【０１５８】
β−カテニン分解は、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）である酵素タンキラーゼ１およびタンキラーゼ２の阻害を介して、Ａｘｉｎ／ＡＰＣ／ＧＳＫ３α／β破壊複合体が安定化されることにより促進可能であることが分かっている（Ｈｕａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１，６１４−６２０）。
【０１５９】
以下のインビトロおよびインビボ試験は、ｈＴＮＫＳ１およびｈＴＮＫＳ２阻害における、例示および試験化合物である式Ｉまたはその医薬的に許容可能な塩のＷｎｔ／β−カテニン情報伝達経路の阻害活性と効力、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡｘｉｎ２の安定化、ＰＡＲＰ１阻害に対する選択性、Ｗｎｔ誘導性遺伝子発現の減少、ならびにインビボ抗腫瘍活性を実証する。これらのアッセイは、ヒト臨床における化学療法剤作用を示すものとして、当業者に一般的に認識される。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の阻害は、Ｗｎｔ／β−カテニン情報伝達経路の異常活性化に対して効果的であると考えられる。Ｗｎｔ／β−カテニン情報伝達経路の阻害活性および効力に証拠を与えるアッセイを、実質的に以下のように実施するか、または、同様なデータを与えるような同様なアッセイにより実施する場合がある。
【０１６０】
アッセイ
一般的に、市販材料を用い且つ当業者に既知および日常的に使用される手順により、細胞株を作製する。
【０１６１】
ｈＴＮＫＳ酵素活性の化合物による阻害を実証するための生化学アッセイ
ｈＴＮＫＳ１およびｈＴＮＫＳ２の酵素活性の評価には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であって、３８４ウェル形式のプレートに結合させたテロメア反復配列結合因子１（ＴＲＦ１）タンパク質（ＮＣＢＩ、アクセション番号ＮＰ＿０５９５２３．２（配列番号１））へ取り込まれるポリＡＤＰリボースを検出するものを使用する。組換え型ｈＴＮＫＳ１（ＮＣＢＩ、アクセション番号ＮＰ＿００３７３８．２（配列番号２）酵素またはｈＴＮＫＳ２（ＮＣＢＩ、アクセション番号ＮＰ＿０７９５１１．１（配列番号３））酵素を用いるこのアッセイは、ビオチン化ＮＡＤ＋を使用し、そして、組換え型ｈＴＲＦ１へのその取り込みを、ストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体とＴＭＢペルオキシダーゼ基質を使って発色シグナルを生成させて測定する。組換え型Ｆｌａｇタグ付きｈＴＲＦ１タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有する全長ヒトＴＲＦ１タンパク質を発現させることにより作製する。組換え型Ｆｌａｇ−ｈＴＮＫＳ１（Ｑ８３Ｐの変異を有する）タンパク質を、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（インビトロジェン（商標）；インビトロジェンユーザーマニュアル、バージョンＦ，２０１０年９月４日付け；およびインビトロジェン解説マニュアル、２００２年２月２７日付け）の製造元のプロトコルに従って、バキュロウイルス中で、Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有する全長ヒトＴＮＫＳ１を発現することにより作製する。ｈＴＲＦ１およびｈＴＮＫ１上のＦｌａｇタグは、それらの酵素の精製のためだけに使用し、その他、ＥＬＩＳＡアッセイには関わらない。
【０１６２】
Ｆｌａｇ−ＴＲＦ１を、ＴＢＳコーティング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて５μｇ／ｍｌに希釈し、そして、２５μｌを、コーニング３７００プレート（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ  ＃ＣＬＳ３７００）の各ウエルに加える。プレートを４℃で一晩インキュベートする。次の日に、プレートを、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファー（ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０２５８．０１を使用して１０×濃縮物から調製するもの）に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃７９４９）を含むもの）で３回洗浄し、その後、１×ＰＢＳ（ロッシュ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ  ＃１１６６６７８９００１）中の５０μｌの１％カゼインブロックバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ＃３７５２８）を使用して、室温で１．５時間ブロッキングを行う。ブロッキング後、プレートを、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄する。総量２５μｌの（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１５５６８−０２５）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ロッシュ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ  ＃１１３３２４８１００１）および１．０％のＤＭＳＯ）中の、２μｇ／ｍｌのＦｌａｇ−ｈＴＮＫＳ１、９．５μＭのＮＡＤ＋（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｎ０６３２）、０．５μＭのビオチン−ＮＡＤ＋（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ＃４６７０−５００−０１）、および１０μＭ〜４ｎＭ終濃度に希釈された化合物を使用して、酵素アッセイをセットアップする。反応物を、室温で１２０分インキュベートし、そして、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーでプレートを３回洗浄して反応を停止させる。ビオチン−ＮＡＤ＋取り込みの検出は、洗浄バッファーで１：３０００に希釈した２５μｌ／ウエルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ  ＃ＲＰＮ１２３１Ｖ）を使って実行し、室温で６０分間インキュベートする。プレートを、その後、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄する。これに引き続いて、室温で１５分間、２５μｌ／ウエルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ＃５０−７６−０２および＃５０−６５−０２）を用いてインキュベーションし、そして、２５μｌ／ウエルの２ＮのＨ２ＳＯ４を使用して反応を停止させる。吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎモデル２１０３を使用して、４５０ｎｍで測定する。
【０１６３】
ｈＴＮＫＳ１に関しておよびｈＴＮＫＳ２を使用して上記した手順に実質的に従って、基本的に同様なＥＬＩＳＡアッセイを準備した。
【０１６４】
両方のｈＴＮＫＳアイソフォームに対して試験されるそれらの化合物の活性を、表７に示す。
【０１６５】
【表７−１】
2016536308.tif 000061
【表７−２】
2016536308.tif 000062
【０１６６】
表７中のデータは、試験した化合物が、ヒトタンキラーゼの両方のアイソフォームに対してインビトロ阻害活性を有する証拠を提供する。
【０１６７】
タンキラーゼ阻害剤の細胞ベースの活性を実証するためのＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２安定化アッセイ
改変型緑色蛍光タンパク質−Ａｘｉｎ２細胞（ＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２）を、Ｎ末端短縮型ＥＧＦＰタグ（アミノ酸２２８〜４６６；配列番号７）を含むＡｘｉｎ２コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞に安定的にトランスフェクションすることにより調製する。Ａｘｉｎ２レベルの変化、具体的にはＡｘｉｎ２の安定化を、３８４ウェル形式中で各種処理後に、安定細胞株におけるＥＧＦＰレベルを定量することによりモニターする。タンキラーゼ阻害の結果としてのＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２融合タンパク質の安定化を反映する蛍光の増加を、Ａｃｕｍｅｎレーザー走査型サイトメーター中でモニターする。
【０１６８】
５％ＦＢＳ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１００８２−１４７）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０２３７．０１）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃３５０５０−０６１）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２完全培地（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃９３−０１５２ＤＫ）中で、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＃ＣＲＬ−１５７３）を維持する。ＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２細胞は、ｐｃＤＮＡ３．１＋（製造元のプロトコルに従う、インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃Ｖ７９０２０）中に、短縮型（アミノ酸２２８〜４６６の）ＥＧＦＰ  Ｎ末端タグ（全長ＥＧＦＰ、ＮＣＢＩ、アクセション番号ＡＢＧ７８０３７．１（配列番号５））を含む全長ヒトＡｘｉｎ２（ＮＣＢＩ、アクセション番号ＮＰ＿００４６４６．３（配列番号４））を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして作製する。安定的ＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２細胞を、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１０１３１−０３５）を添加した上記ＨＥＫ２９３用完全培地中にて維持する。ＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２安定化アッセイは、ポリ−Ｄ−リジンでコートしたＢＤ３８４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ  ＃３５６６６３）中に、２０００個のＥＧＦＰ−Ａｘｉｎ２細胞／ウエルで播種し、３０μｌ／ウエルのＨＥＫ２９３用完全培地中にインキュベートし、そして、５％ＣＯ２、３７℃で一晩増殖させることにより実施する。１００％ＤＭＳＯ中の化合物を、１００ｎｌ／ウエルで細胞培地に直接加える。このアッセイで試験される化合物の終濃度は、（ＤＭＳＯの終濃度がこのアッセイで０．３３％となるようにして）３３μＭ〜１．７ｎＭである。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間、細胞を化合物とインキュベートする。そして、細胞を、室温で１５分間、２％の終濃度のホルムアルデヒドを使用して固定する。固定した細胞を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ＃ＢＰ１５１−５００）を含む４０μｌ／ウエルのＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０２６４．０１）中で、２回、２０分ずつ洗浄する。細胞を、その後、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃Ｐ３５６６）および５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｒ６５１３）を含む３０μｌ／ウエルのＰＢＳを使用して染色する。１０％ＥＧＦＰ／細胞を有するようにゲートしたＡｃｕｍｅｎモデルｅＸ３のＡｃｕｍｅｎレーザー走査型サイトメーターを使用して、ＥＧＦＰ強度を測定する。
【０１６９】
【表８−１】
2016536308.tif 000063
【表８−２】
2016536308.tif 000064
【０１７０】
表８のデータは、ＨＥＫ２９３細胞中で、試験化合物がＡｘｉｎ２を安定化する証拠を提供する。
【０１７１】
タンキラーゼ阻害剤の（対ＰＡＲＰ１）選択性を評価するためのヒトＰＡＲＰ１酵素アッセイ
ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）アッセイは、３８４ウェル形式のプレートに結合したヒストンタンパク質へ取り込まれるポリＡＤＰリボースを検出するＥＬＩＳＡである。組換え型ｈＰＡＲＰ１酵素を用いるこのアッセイは、ビオチン化ＮＡＤ＋を使用し、そして、ヒストンへのその取り込みを、ストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体とＴＭＢペルオキシダーゼ基質を使って発色シグナルを生成させて測定する。
【０１７２】
ヒストンを、コーティング緩衝液（５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９．４、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、２５μｌを、コーニング３７００プレートの各ウエルに加える。プレートを４℃で一晩インキュベートする。次の日に、プレートを、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファー（ＰＢＳ（１０×濃縮物から調製するもの）に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むもの）で３回洗浄し、その後、１×ＰＢＳ（ロッシュ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ  ＃１１６６６７８９００１）中の５０μｌの１％カゼインブロックバッファーを使用して、室温で１．５時間ブロッキングを行う。ブロッキング後、プレートを、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄する。（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１５５０８−０１３）、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１．０％ＤＭＳＯを含む）アッセイバッファー中の、０．０１Ｕ／μｌのｈＰＡＲＰ１（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ＃４６６８−５００−０１）、０．５×ＰＡＲＰカクテル、活性化ＤＮＡ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ＃４６７１−０９６−０３および＃４６７１−０９６−０６）および１０μＭ〜４ｎＭ終濃度に希釈した化合物を使用して、ＰＡＲＰ１酵素アッセイをセットアップする。反応物を、室温で６０分インキュベートし、そして、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーでプレートを３回洗浄して反応を停止させる。ビオチン−ＮＡＤ＋取り込みの検出は、洗浄バッファーで１：３０００に希釈した２５μｌ／ウエルのストレプトアビジン−ＨＲＰを使いて実施し、室温で６０分間インキュベートする。プレートを、その後、５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄する。これに引き続いて、室温で１５分間、２５μｌ／ウエルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ＃５０−７６−０２および＃５０−６５−０２）を用いてインキュベーションし、そして、２５μｌ／ウエルの２ＮのＨ２ＳＯ４を使用して反応を停止させる。吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎモデル２１０３を使用して、４５０ｎｍで測定する。
【０１７３】
【表９−１】
2016536308.tif 000065
【表９−２】
2016536308.tif 000066
【０１７４】
表９のデータは、ＰＡＲＰ１阻害と比較した場合の、タンキラーゼの各試験化合物による選択的阻害についての証拠を提供する。
【０１７５】
タンキラーゼ阻害剤がＷｎｔ誘導性遺伝子の発現を減少させる能力を測定するためのＤＬＤ−１  ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイ
ＤＬＤ−１細胞は、短縮型ＡＰＣタンパク質をコードする腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）遺伝子の変異を含む。このタンパク質は、破壊複合体に結合することができず、Ｗｎｔ経路を恒常的に活性化し、β−カテニンを核へと移行させ、そして、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子を活性化する。ＤＬＤ−１  ＴＯＰＦｌａｓｈは、ルシフェラーゼレポーターに連結されたＴＣＦ４プロモーターを安定的にトランスフェクションすることにより、ＤＬＤ−１（ヒト結腸直腸腺がん）細胞に由来するレポーター細胞株である。細胞溶解液中のルシフェラーゼ量を、９６ウェル形式における発光を測定することにより定量化する。
【０１７６】
ＤＬＤ−１細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、＃ＣＣＬ−２２１）を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ＃ＳＨ３００７０．０３）を含むＲＰＭＩ完全培地（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１１８７５−０９３）中で維持する。ＤＬＤ−１  ＴＯＰＦｌａｓｈ細胞を、製造元のプロトコルに従って、ＤＬＤ−１細胞にＣｉｇｎａｌ  Ｌｅｎｔｉ  ＴＣＦ／ＬＥＦレポーター（Ｌｕｃ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ  ＃ＣＬＳ−０１８Ｌ−８、ロット＃ＢＸ１６）を、ＭＯＩを１０で感染させることにより作製する。ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｅｎ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｈ９２６８）を、終濃度８μｇ／ｍｌで加え、そして、細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートする。次の日に、培地を、１０μｇ／ｍｌのピュロマイシン（クローンテック、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ  ＃６３１３０５）を含む新しい増殖培地へと交換する。そして、細胞を、５％ＣＯ２、３７℃でさらに３日間インキュベートして、安定細胞株を作製する。ＤＬＤ−１  ＴＯＰＦｌａｓｈ細胞を、コーニング９６ウェル白色／透明プレート（コーイング、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ  ＃３６１０）中に１０，０００細胞／ウエルで播種し、ＲＰＭＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３００２７．０１）、１０％ＦＢＳ、および１０μｇ／ｍｌのピュロマイシンを含む３０μｌ／ウエルの完全培地中でインキュベートし、そして、５％ＣＯ２、３７℃で一晩増殖させることにより、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイを実施する。１００％ＤＭＳＯ中の化合物を、０．２％ＢＳＡ（７．５％ＢＳＡから希釈したもの、インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１５２６０−０３７）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃３１９８５−０６２）中で２８．５倍希釈する。そして、５μｌの希釈した化合物を、３０μｌ細胞培養培地／ウエルに加える。このアッセイで試験される化合物の終濃度は、（ＤＭＳＯの終濃度がこのアッセイで０．４８％となるようにして）５０μＭ〜１．５ｎＭである。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間、細胞を化合物とインキュベートする。そして、インキュベーターからプレートを取り出して、３０分間室温に置く。（１５０ｍＭのＴｒｉｓ（１０８．１５ｍｌの１ＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび４１．８５ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｔ３２５３およびＴ−１５０３））、３ｍＭのＭｇＣｌ２および３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む１リットルのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶解バッファーに、２．２９６ｇのＤＴＴ（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｄ０６３２）、１．１５２ｇのＣｏＡ（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｃ３０１９）、０．２４８ｇのＡＴＰ（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ａ７６９９）、および０．４２ｇのルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ、Ｉｔａｓｃａ、ＩＬ  ＃Ｌ−８２４０）を溶解させることにより、ＢｕｇＬｉｔｅ（商標）（３×）試薬を調製する。プレートを室温に平衡化後、１８μｌの３×ＢｕｇＬｉｔｅ試薬を各ウエルに加え、そして、プレートを振とうさせながら３０分間室温でインキュベートする。Ｅｎｖｉｓｉｏｎモデル２１０３を使用して、発光を測定する。
【０１７７】
【表１０−１】
2016536308.tif 000067
【表１０−２】
2016536308.tif 000068
【０１７８】
表１０のデータは、試験化合物がＷｎｔ誘導性遺伝子の阻害剤であることを、ＴＯＰＦｌａｓｈ  Ｗｎｔレポーターアッセイにより測定して実証する。
【０１７９】
タンキラーゼ阻害剤のインビボ抗腫瘍活性の評価：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊ系統マウスは、Ａｐｃ遺伝子のコドン８５０に短縮型変異を保持し、３〜６ヶ月の年齢で腸ポリープおよび大腸直腸新生物を発症する。ＡＰＣ遺伝子の短縮は、Ｗｎｔ情報伝達経路の活性化を導き、β−カテニンレベルの上昇が、これらのマウスの前新生物／新生物病変においてしばしば検出される。
【０１８０】
タンキラーゼ阻害剤のインビボ抗腫瘍活性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊ系統マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック番号００２０２０）から購入し、１週間環境にならす。動物を２個のグループに分け、２５ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）の実施例１、または、ビヒクルのいずれかで６０日間連続して処置する。処置期間の最後に動物を屠殺して、小腸のポリープ数を、解剖顕微鏡下で計数する。表１１に示すように、実施例１の化合物で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊ系統マウスは、ビヒクルで処置した動物と比べた場合、小腸の腫瘍数が統計学的に有意に低い。
【０１８１】
【表１１】
2016536308.tif 000069
【０１８２】
表１１のデータは、実施例１を用いるインビボの処置が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／Ｊ系統マウスにおける腸ポリープ数を減少させることの証拠を提供する。
【０１８３】
コロニー形成アッセイ
また、実施例１の化合物を、４つの異なるヒト腫瘍細胞株に対するインビトロコロニー形成アッセイで試験する。三つはすい臓腫瘍（Ｃａｐａｎ−２、ＨＰＡＦ−ＩＩ、およびＰａｎｃ０４．０３）に由来し、一つは非小細胞肺がん（Ａ５４９）に由来する。市販材料を用い且つ当業者に既知および日常的に使用される手順により、このアッセイを実施する。
【０１８４】
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＃ＣＣＬ−１８５）は、１０％ＦＢＳ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１６０００−０４４）を含むＦ１２Ｋ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０５２６）中で維持する。Ｃａｐａｎ−２細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＃ＨＴＢ−８０）は、１０％ＦＢＳ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１６０００−０４４）を含むＭｃＣｏｙｓ５Ａ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０２００）中で維持する。ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＃ＣＲＬ−１９９７）は、１０％ＦＢＳ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１６０００−０４４）を含むＥＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３００２４）中で維持する。Ｐａｎｃ０４．０３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＃ＣＲＬ−２５５５）は、１５％ＦＢＳ（インビトロジェン、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  ＃１６０００−０４４）および２０μｇ／ｍｌのインスリン（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＃Ｉ９２７８）を含むＲＰＭＩ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３０２５５）中で維持する。６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ  ＃３５３０４６）中に、それぞれ、Ａ５４９細胞を２５０細胞／ウエルで播種し、Ｃａｐａｎ−２細胞を２０００細胞／ウエルで播種し、ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞を１０００細胞／ウエルで播種し、または、Ｐａｎｃ０４．０３細胞を２０００細胞／ウエルで播種し、そして、２ｍｌの完全培地中にインキュベートし、そして、５％ＣＯ２、３７℃で一晩増殖させる。次の日に、培地を除去し、各細胞株ごとに２ｍｌの新しい各増殖培地と交換する。１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中で１０００×濃縮物へと希釈する。そして、２μｌを、ウエル中の２ｍｌの培地に加えて、終濃度０．０３〜３μＭを達成する。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。３〜４日ごとに、前記のように、培地を除去し、各細胞株ごとに２ｍｌの新しい完全培地と交換する。培地交換後、新たな化合物を、上記のように加える。細胞を、化合物の存在下、合計１１日間インキュベートする。１１日目に、培地を除去し、そして、細胞を、５ｍｌのＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ  ＃ＳＨ３００２８）で一度洗浄する。２０％メタノール（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ  ＃ＭＸ０４９０−４）中のクリスタルバイオレット染料（０．５％クリスタルバイオレット（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、＃Ｃ３８８６）を、各ウエル（０．４ｍｌ）に加え、そして、１５分間室温でインキュベートする。ウエルを、その後、ＤＰＢＳで二度洗浄し、そして、Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ４０００（富士フィルム、東京、日本）を使用して、プレートの写真を撮る。各ウエル内のコロニー面積の解析を、富士フィルムコロニーバージョン１．１ソフトウエア（富士フィルム、東京、日本）を使用して実行する。
【０１８５】
【表１２】
2016536308.tif 000070
【０１８６】
表１２のデータは、実施例１の化合物が、試験する各細胞株に対するコントロールと比較する場合、コロニー形成を阻害することを証拠づける。
【０１８７】
【表１３】
2016536308.tif 000071
【０１８８】
配列表
配列番号１−ｈＴＲＦ１−タンパク質
ＭＡＥＤＶＳＳＡＡＰＳＰＲＧＣＡＤＧＲＤＡＤＰＴＥＥＱＭＡＥＴＥＲＮＤＥＥＱＦＥＣＱＥＬＬＥＣＱＶＱＶＧＡＰＥＥＥＥＥＥＥＥＤＡＧＬＶＡＥＡＥＡＶＡＡＧＷＭＬＤＦＬＣＬＳＬＣＲＡＦＲＤＧＲＳＥＤＦＲＲＴＲＮＳＡＥＡＩＩＨＧＬＳＳＬＴＡＣＱＬＲＴＩＹＩＣＱＦＬＴＲＩＡＡＧＫＴＬＤＡＱＦＥＮＤＥＲＩＴＰＬＥＳＡＬＭＩＷＧＳＩＥＫＥＨＤＫＬＨＥＥＩＱＮＬＩＫＩＱＡＩＡＶＣＭＥＮＧＮＦＫＥＡＥＥＶＦＥＲＩＦＧＤＰＮＳＨＭＰＦＫＳＫＬＬＭＩＩＳＱＫＤＴＦＨＳＦＦＱＨＦＳＹＮＨＭＭＥＫＩＫＳＹＶＮＹＶＬＳＥＫＳＳＴＦＬＭＫＡＡＡＫＶＶＥＳＫＲＴＲＴＩＴＳＱＤＫＰＳＧＮＤＶＥＭＥＴＥＡＮＬＤＴＲＫＳＶＳＤＫＱＳＡＶＴＥＳＳＥＧＴＶＳＬＬＲＳＨＫＮＬＦＬＳＫＬＱＨＧＴＱＱＱＤＬＮＫＫＥＲＲＶＧＴＰＱＳＴＫＫＫＫＥＳＲＲＡＴＥＳＲＩＰＶＳＫＳＱＰＶＴＰＥＫＨＲＡＲＫＲＱＡＷＬＷＥＥＤＫＮＬＲＳＧＶＲＫＹＧＥＧＮＷＳＫＩＬＬＨＹＫＦＮＮＲＴＳＶＭＬＫＤＲＷＲＴＭＫＫＬＫＬＩＳＳＤＳＥＤ
【０１８９】
配列番号２  −  ｈＴＮＫＳ１  −  タンパク質
ＭＡＡＳＲＲＳＱＨＨＨＨＨＨＱＱＱＬＱＰＡＰＧＡＳＡＰＰＰＰＰＰＰＰＬＳＰＧＬＡＰＧＴＴＰＡＳＰＴＡＳＧＬＡＰＦＡＳＰＲＨＧＬＡＬＰＥＧＤＧＳＲＤＰＰＤＲＰＲＳＰＤＰＶＤＧＴＳＣＣＳＴＴＳＴＩＣＴＶＡＡＡＰＶＶＰＡＶＳＴＳＳＡＡＧＶＡＰＮＰＡＧＳＧＳＮＮＳＰＳＳＳＳＳＰＴＳＳＳＳＳＳＰＳＳＰＧＳＳＬＡＥＳＰＥＡＡＧＶＳＳＴＡＰＬＧＰＧＡＡＧＰＧＴＧＶＰＡＶＳＧＡＬＲＥＬＬＥＡＣＲＮＧＤＶＳＲＶＫＲＬＶＤＡＡＮＶＮＡＫＤＭＡＧＲＫＳＳＰＬＨＦＡＡＧＦＧＲＫＤＶＶＥＨＬＬＱＭＧＡＮＶＨＡＲＤＤＧＧＬＩＰＬＨＮＡＣＳＦＧＨＡＥＶＶＳＬＬＬＣＱＧＡＤＰＮＡＲＤＮＷＮＹＴＰＬＨＥＡＡＩＫＧＫＩＤＶＣＩＶＬＬＱＨＧＡＤＰＮＩＲＮＴＤＧＫＳＡＬＤＬＡＤＰＳＡＫＡＶＬＴＧＥＹＫＫＤＥＬＬＥＡＡＲＳＧＮＥＥＫＬＭＡＬＬＴＰＬＮＶＮＣＨＡＳＤＧＲＫＳＴＰＬＨＬＡＡＧＹＮＲＶＲＩＶＱＬＬＬＱＨＧＡＤＶＨＡＫＤＫＧＧＬＶＰＬＨＮＡＣＳＹＧＨＹＥＶＴＥＬＬＬＫＨＧＡＣＶＮＡＭＤＬＷＱＦＴＰＬＨＥＡＡＳＫＮＲＶＥＶＣＳＬＬＬＳＨＧＡＤＰＴＬＶＮＣＨＧＫＳＡＶＤＭＡＰＴＰＥＬＲＥＲＬＴＹＥＦＫＧＨＳＬＬＱＡＡＲＥＡＤＬＡＫＶＫＫＴＬＡＬＥＩＩＮＦＫＱＰＱＳＨＥＴＡＬＨＣＡＶＡＳＬＨＰＫＲＫＱＶＴＥＬＬＬＲＫＧＡＮＶＮＥＫＮＫＤＦＭＴＰＬＨＶＡＡＥＲＡＨＮＤＶＭＥＶＬＨＫＨＧＡＫＭＮＡＬＤＴＬＧＱＴＡＬＨＲＡＡＬＡＧＨＬＱＴＣＲＬＬＬＳＹＧＳＤＰＳＩＩＳＬＱＧＦＴＡＡＱＭＧＮＥＡＶＱＱＩＬＳＥＳＴＰＩＲＴＳＤＶＤＹＲＬＬＥＡＳＫＡＧＤＬＥＴＶＫＱＬＣＳＳＱＮＶＮＣＲＤＬＥＧＲＨＳＴＰＬＨＦＡＡＧＹＮＲＶＳＶＶＥＹＬＬＨＨＧＡＤＶＨＡＫＤＫＧＧＬＶＰＬＨＮＡＣＳＹＧＨＹＥＶＡＥＬＬＶＲＨＧＡＳＶＮＶＡＤＬＷＫＦＴＰＬＨＥＡＡＡＫＧＫＹＥＩＣＫＬＬＬＫＨＧＡＤＰＴＫＫＮＲＤＧＮＴＰＬＤＬＶＫＥＧＤＴＤＩＱＤＬＬＲＧＤＡＡＬＬＤＡＡＫＫＧＣＬＡＲＶＱＫＬＣＴＰＥＮＩＮＣＲＤＴＱＧＲＮＳＴＰＬＨＬＡＡＧＹＮＮＬＥＶＡＥＹＬＬＥＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＧＧＬＩＰＬＨＮＡＡＳＹＧＨＶＤＩＡＡＬＬＩＫＹＮＴＣＶＮＡＴＤＫＷＡＦＴＰＬＨＥＡＡＱＫＧＲＴＱＬＣＡＬＬＬＡＨＧＡＤＰＴＭＫＮＱＥＧＱＴＰＬＤＬＡＴＡＤＤＩＲＡＬＬＩＤＡＭＰＰＥＡＬＰＴＣＦＫＰＱＡＴＶＶＳＡＳＬＩＳＰＡＳＴＰＳＣＬＳＡＡＳＳＩＤＮＬＴＧＰＬＡＥＬＡＶＧＧＡＳＮＡＧＤＧＡＡＧＴＥＲＫＥＧＥＶＡＧＬＤＭＮＩＳＱＦＬＫＳＬＧＬＥＨＬＲＤＩＦＥＴＥＱＩＴＬＤＶＬＡＤＭＧＨＥＥＬＫＥＩＧＩＮＡＹＧＨＲＨＫＬＩＫＧＶＥＲＬＬＧＧＱＱＧＴＮＰＹＬＴＦＨＣＶＮＱＧＴＩＬＬＤＬＡＰＥＤＫＥＹＱＳＶＥＥＥＭＱＳＴＩＲＥＨＲＤＧＧＮＡＧＧＩＦＮＲＹＮＶＩＲＩＱＫＶＶＮＫＫＬＲＥＲＦＣＨＲＱＫＥＶＳＥＥＮＨＮＨＨＮＥＲＭＬＦＨＧＳＰＦＩＮＡＩＩＨＫＧＦＤＥＲＨＡＹＩＧＧＭＦＧＡＧＩＹＦＡＥＮＳＳＫＳＮＱＹＶＹＧＩＧＧＧＴＧＣＰＴＨＫＤＲＳＣＹＩＣＨＲＱＭＬＦＣＲＶＴＬＧＫＳＦＬＱＦＳＴＭＫＭＡＨＡＰＰＧＨＨＳＶＩＧＲＰＳＶＮＧＬＡＹＡＥＹＶＩＹＲＧＥＱＡＹＰＥＹＬＩＴＹＱＩＭＫＰＥＡＰＳＱＴＡＴＡＡＥＱＫＴ
【０１９０】
配列番号３  −  ｈＴＮＫＳ２  −タンパク質
ＭＳＧＲＲＣＡＧＧＧＡＡＣＡＳＡＡＡＥＡＶＥＰＡＡＲＥＬＦＥＡＣＲＮＧＤＶＥＲＶＫＲＬＶＴＰＥＫＶＮＳＲＤＴＡＧＲＫＳＴＰＬＨＦＡＡＧＦＧＲＫＤＶＶＥＹＬＬＱＮＧＡＮＶＱＡＲＤＤＧＧＬＩＰＬＨＮＡＣＳＦＧＨＡＥＶＶＮＬＬＬＲＨＧＡＤＰＮＡＲＤＮＷＮＹＴＰＬＨＥＡＡＩＫＧＫＩＤＶＣＩＶＬＬＱＨＧＡＥＰＴＩＲＮＴＤＧＲＴＡＬＤＬＡＤＰＳＡＫＡＶＬＴＧＥＹＫＫＤＥＬＬＥＳＡＲＳＧＮＥＥＫＭＭＡＬＬＴＰＬＮＶＮＣＨＡＳＤＧＲＫＳＴＰＬＨＬＡＡＧＹＮＲＶＫＩＶＱＬＬＬＱＨＧＡＤＶＨＡＫＤＫＧＤＬＶＰＬＨＮＡＣＳＹＧＨＹＥＶＴＥＬＬＶＫＨＧＡＣＶＮＡＭＤＬＷＱＦＴＰＬＨＥＡＡＳＫＮＲＶＥＶＣＳＬＬＬＳＹＧＡＤＰＴＬＬＮＣＨＮＫＳＡＩＤＬＡＰＴＰＱＬＫＥＲＬＡＹＥＦＫＧＨＳＬＬＱＡＡＲＥＡＤＶＴＲＩＫＫＨＬＳＬＥＭＶＮＦＫＨＰＱＴＨＥＴＡＬＨＣＡＡＡＳＰＹＰＫＲＫＱＩＣＥＬＬＬＲＫＧＡＮＩＮＥＫＴＫＥＦＬＴＰＬＨＶＡＳＥＫＡＨＮＤＶＶＥＶＶＶＫＨＥＡＫＶＮＡＬＤＮＬＧＱＴＳＬＨＲＡＡＹＣＧＨＬＱＴＣＲＬＬＬＳＹＧＣＤＰＮＩＩＳＬＱＧＦＴＡＬＱＭＧＮＥＮＶＱＱＬＬＱＥＧＩＳＬＧＮＳＥＡＤＲＱＬＬＥＡＡＫＡＧＤＶＥＴＶＫＫＬＣＴＶＱＳＶＮＣＲＤＩＥＧＲＱＳＴＰＬＨＦＡＡＧＹＮＲＶＳＶＶＥＹＬＬＱＨＧＡＤＶＨＡＫＤＫＧＧＬＶＰＬＨＮＡＣＳＹＧＨＹＥＶＡＥＬＬＶＫＨＧＡＶＶＮＶＡＤＬＷＫＦＴＰＬＨＥＡＡＡＫＧＫＹＥＩＣＫＬＬＬＱＨＧＡＤＰＴＫＫＮＲＤＧＮＴＰＬＤＬＶＫＤＧＤＴＤＩＱＤＬＬＲＧＤＡＡＬＬＤＡＡＫＫＧＣＬＡＲＶＫＫＬＳＳＰＤＮＶＮＣＲＤＴＱＧＲＨＳＴＰＬＨＬＡＡＧＹＮＮＬＥＶＡＥＹＬＬＱＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＧＧＬＩＰＬＨＮＡＡＳＹＧＨＶＤＶＡＡＬＬＩＫＹＮＡＣＶＮＡＴＤＫＷＡＦＴＰＬＨＥＡＡＱＫＧＲＴＱＬＣＡＬＬＬＡＨＧＡＤＰＴＬＫＮＱＥＧＱＴＰＬＤＬＶＳＡＤＤＶＳＡＬＬＴＡＡＭＰＰＳＡＬＰＳＣＹＫＰＱＶＬＮＧＶＲＳＰＧＡＴＡＤＡＬＳＳＧＰＳＳＰＳＳＬＳＡＡＳＳＬＤＮＬＳＧＳＦＳＥＬＳＳＶＶＳＳＳＧＴＥＧＡＳＳＬＥＫＫＥＶＰＧＶＤＦＳＩＴＱＦＶＲＮＬＧＬＥＨＬＭＤＩＦＥＲＥＱＩＴＬＤＶＬＶＥＭＧＨＫＥＬＫＥＩＧＩＮＡＹＧＨＲＨＫＬＩＫＧＶＥＲＬＩＳＧＱＱＧＬＮＰＹＬＴＬＮＴＳＧＳＧＴＩＬＩＤＬＳＰＤＤＫＥＦＱＳＶＥＥＥＭＱＳＴＶＲＥＨＲＤＧＧＨＡＧＧＩＦＮＲＹＮＩＬＫＩＱＫＶＣＮＫＫＬＷＥＲＹＴＨＲＲＫＥＶＳＥＥＮＨＮＨＡＮＥＲＭＬＦＨＧＳＰＦＶＮＡＩＩＨＫＧＦＤＥＲＨＡＹＩＧＧＭＦＧＡＧＩＹＦＡＥＮＳＳＫＳＮＱＹＶＹＧＩＧＧＧＴＧＣＰＶＨＫＤＲＳＣＹＩＣＨＲＱＬＬＦＣＲＶＴＬＧＫＳＦＬＱＦＳＡＭＫＭＡＨＳＰＰＧＨＨＳＶＴＧＲＰＳＶＮＧＬＡＬＡＥＹＶＩＹＲＧＥＱＡＹＰＥＹＬＩＴＹＱＩＭＲＰＥＧＭＶＤＧ
【０１９１】
配列番号４  −  ｈＡｘｉｎ２  −タンパク質
ＭＳＳＡＭＬＶＴＣＬＰＤＰＳＳＳＦＲＥＤＡＰＲＰＰＶＰＧＥＥＧＥＴＰＰＣＱＰＧＶＧＫＧＱＶＴＫＰＭＰＶＳＳＮＴＲＲＮＥＤＧＬＧＥＰＥＧＲＡＳＰＤＳＰＬＴＲＷＴＫＳＬＨＳＬＬＧＤＱＤＧＡＹＬＦＲＴＦＬＥＲＥＫＣＶＤＴＬＤＦＷＦＡＣＮＧＦＲＱＭＮＬＫＤＴＫＴＬＲＶＡＫＡＩＹＫＲＹＩＥＮＮＳＩＶＳＫＱＬＫＰＡＴＫＴＹＩＲＤＧＩＫＫＱＱＩＤＳＩＭＦＤＱＡＱＴＥＩＱＳＶＭＥＥＮＡＹＱＭＦＬＴＳＤＩＹＬＥＹＶＲＳＧＧＥＮＴＡＹＭＳＮＧＧＬＧＳＬＫＶＶＣＧＹＬＰＴＬＮＥＥＥＥＷＴＣＡＤＦＫＣＫＬＳＰＴＶＶＧＬＳＳＫＴＬＲＡＴＡＳＶＲＳＴＥＴＶＤＳＧＹＲＳＦＫＲＳＤＰＶＮＰＹＨＩＧＳＧＹＶＦＡＰＡＴＳＡＮＤＳＥＩＳＳＤＡＬＴＤＤＳＭＳＭＴＤＳＳＶＤＧＩＰＰＹＲＶＧＳＫＫＱＬＱＲＥＭＨＲＳＶＫＡＮＧＱＶＳＬＰＨＦＰＲＴＨＲＬＰＫＥＭＴＰＶＥＰＡＴＦＡＡＥＬＩＳＲＬＥＫＬＫＬＥＬＥＳＲＨＳＬＥＥＲＬＱＱＩＲＥＤＥＥＲＥＧＳＥＬＴＬＮＳＲＥＧＡＰＴＱＨＰＬＳＬＬＰＳＧＳＹＥＥＤＰＱＴＩＬＤＤＨＬＳＲＶＬＫＴＰＧＣＱＳＰＧＶＧＲＹＳＰＲＳＲＳＰＤＨＨＨＨＨＨＳＱＹＨＳＬＬＰＰＧＧＫＬＰＰＡＡＡＳＰＧＡＣＰＬＬＧＧＫＧＦＶＴＫＱＴＴＫＨＶＨＨＨＹＩＨＨＨＡＶＰＫＴＫＥＥＩＥＡＥＡＴＱＲＶＨＣＦＣＰＧＧＳＥＹＹＣＹＳＫＣＫＳＨＳＫＡＰＥＴＭＰＳＥＱＦＧＧＳＲＧＳＴＬＰＫＲＮＧＫＧＴＥＰＧＬＡＬＰＡＲＥＧＧＡＰＧＧＡＧＡＬＱＬＰＲＥＥＧＤＲＳＱＤＶＷＱＷＭＬＥＳＥＲＱＳＫＰＫＰＨＳＡＱＳＴＫＫＡＹＰＬＥＳＡＲＳＳＰＧＥＲＡＳＲＨＨＬＷＧＧＮＳＧＨＰＲＴＴＰＲＡＨＬＦＴＱＤＰＡＭＰＰＬＴＰＰＮＴＬＡＱＬＥＥＡＣＲＲＬＡＥＶＳＫＰＰＫＱＲＣＣＶＡＳＱＱＲＤＲＮＨＳＡＴＶＱＴＧＡＴＰＦＳＮＰＳＬＡＰＥＤＨＫＥＰＫＫＬＡＧＶＨＡＬＱＡＳＥＬＶＶＴＹＦＦＣＧＥＥＩＰＹＲＲＭＬＫＡＱＳＬＴＬＧＨＦＫＥＱＬＳＫＫＧＮＹＲＹＹＦＫＫＡＳＤＥＦＡＣＧＡＶＦＥＥＩＷＥＤＥＴＶＬＰＭＹＥＧＲＩＬＧＫＶＥＲＩＤ
【０１９２】
配列番号５−ＥＧＦＰ−全長タンパク質
ＭＤＲＫＦＶＦＬＶＳＩＬＳＩＶＶＡＳＶＴＧＥＴＴＲＡＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴＳＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ
【０１９３】
配列番号６−Ｆｌａｇペプチド
ＤＹＫＤＤＤＤＫ
【０１９４】
配列番号７−ＥＧＦＰ−短縮型タンパク質アミノ酸２２８〜４６６
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ
【図１】
2016536308.tif 000078
【配列表】
2016536308000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月2日(2016.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物またはその医薬的に許容可能な塩：
【化１】
2016536308.tif 000079
（式中、
Ｙが
【化２】
2016536308.tif 000080
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である）。
【請求項２】
Ｙが
【化３】
2016536308.tif 000081
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｙが
【化４】
2016536308.tif 000082
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１もしくは２に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項４】
Ｙが
【化５】
2016536308.tif 000083
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
請求項１もしくは２に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項５】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリルもしくはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２、または４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンまたはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１、２、３、または５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン４−メチルベンゼンスルホン酸塩である、請求項１、２、３、５、または７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
配列番号７−ＥＧＦＰ−短縮型タンパク質アミノ酸２２８〜４６６
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  以下の式を有する化合物またはその医薬的に許容可能な塩：
【化５２】
2016536308.tif 000084
（式中、
Ｙが
【化５３】
2016536308.tif 000085
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である）。
［２］  Ｙが
【化５４】
2016536308.tif 000086
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
［１］に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［３］  Ｙが
【化５５】
2016536308.tif 000087
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
［１］もしくは［２］に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［４］  Ｙが
【化５６】
2016536308.tif 000088
であり；
Ｘが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−、または−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）Ｈ−であり；
Ｒ１が水素、ヒドロキシ、またはハロであり；
Ｒ２が水素、ハロ、−ＣＮ、−ＣＨ３、ＣＦ３、または−ＯＣＨ３である、
［１］もしくは［２］に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［５］  ８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩である、［１］、［２］または［３］のいずれかに記載の化合物。
［６］  ２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；
２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンもしくはその医薬的に許容可能な塩；または
２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリルもしくはその医薬的に許容可能な塩である、［１］、［２］、または［４］のいずれかに記載の化合物。
［７］  ８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンまたはその医薬的に許容可能な塩である、［１］、［２］、［３］、または［５］のいずれかに記載の化合物。
［８］  ８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン４−メチルベンゼンスルホン酸塩である、［１］、［２］、［３］、［５］、または［７］のいずれかに記載の化合物。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
［１０］  患者における、結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量の［１］〜［８］のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与することを含む、方法。
［１１］  療法に使用するための、［１］〜［８］のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［１２］  結腸直腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、髄芽腫、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、グリオブラストーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病であるがんの治療に使用するための［１］〜［８］のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【国際調査報告】
2016536308.tif 000089
2016536308.tif 000090