(57)【要約】  本発明は、ナノポア技法に基づき、標的オリゴヌクレオチドに相補性を有する配列を含んでいる１つ以上のプローブ、プローブの３’末端、５’末端、又は両末端での末端伸長部ならびに末端に結合するラベルを用いて新規かつ改善されたオリゴヌクレオチド多重検出法を提供する。改善されたプローブとプローブセットは、miRNAのような別個の標的オリゴヌクレオチドの感受性で、選択的かつ直接的な多重検出、識別及び定量化を可能にする。本発明の検出法は、患者の組織サンプル中のmiRNAレベルに基づき、非侵襲的かつ費用効率のよい診断法として使用してもよい。
2016517275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子を含んでいるプローブ分子のセットであって、その際、少なくとも２つのプローブ分子は、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、
その際、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、その際、第一のプローブ分子のポリマーラベルは、第二のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、ナノポア系において第一及び第二の標的核酸の独立した検出を提供する、前記プローブ分子のセット。
【請求項２】
第一及び第二のプローブ分子のポリマーラベルは、それらの個々の標的とハイブリダイズし、かつナノポア系において印加電圧をかけた際に別個のシグネチャコンダクタンス遮断を提供する、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項４】
ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項５】
ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項６】
キャプチャ領域と末端伸長部は、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項７】
末端伸長部は、キャプチャ領域の３’末端に共有結合される、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項８】
末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項９】
プローブセットは、少なくとも１つの付加的なプローブ分子を含み、該プローブ分子は、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’末端又は３’末端に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、付加的なプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一及び第二の標的核酸とは別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、またその際、各々の付加的なプローブ分子のポリマーラベルは、第一のプローブ分子、第二のプローブ分子及び他の付加的なプローブ分子のいずれかのポリマーラベルとは異なっていて、かつナノポア系において第一、第二及び付加的な標的核酸の独立した検出を提供する、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１０】
プローブセットは、３、４、６又は８個のプローブ分子を含み、その際、前記プローブ分子の各々のキャプチャ領域は、別個の標的核酸に対して相補性を有する別個の配列を含み、またその際、前記プローブ分子の各々のポリマーラベルは、他のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、かつナノポア系において各プローブに相補性を有する各標的核酸の独立した検出を提供する、請求項９に記載のプローブセット。
【請求項１１】
標的核酸は、別個のゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA、成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA、ノンコーディングRNA、核酸バイオマーカー又は合成アプタマー分子である、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１２】
プローブ分子の核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１３】
第一のプローブ分子又は第二のプローブ分子の少なくとも１つの核酸キャプチャ領域は、その相補的標的核酸の全配列と相補的な配列を含む、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１４】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルと第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、それらの重合の量の点で異なる、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１５】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、かつ第二のプローブ分子の伸長部に付着しているラベルは、第一のプローブ分子に付着しているポリエチレングリコールとは異なる長さのポリエチレングリコールである、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１６】
付加的な別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含んでいるキャプチャ領域と、場合により末端領域とを有するプローブを更に含み、その際、前記プローブはポリマーラベルを欠如しており、かつ付加的な別個の標的核酸の独立した検出を提供する、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項１７】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している、請求項１から１６までのいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項１８】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置する末端伸長部の２〜５番目の残基に付着している、請求項１７に記載のプローブセット。
【請求項１９】
ナノポア系を用いてサンプル中の少なくとも２つの別個の一本鎖標的核酸を検出する方法において、該方法は、
ａ）サンプルと少なくとも２つのプローブ分子のセットとを接触させ、かつプローブ分子をサンプル中に存在するいずれかの標的核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイズされたサンプルを形成すること、
その際、プローブ分子のセットは少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子とを含み、その両方は、
（ｉ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
（ｉｉ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
（ｉｉ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸とハイブリダイズし、また、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸領域とハイブリダイズし、その際、第一のプローブ分子のポリマーラベルは、第二のプローブ分子のポリマーラベルとは異なっている；
ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中で、前記ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体をナノポア中で捕捉し、かつ前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸との、アンジッピング・プロセスによる前記系のナノポアを通る移行を促進するのに十分な電圧をかけること、及び
ｃ）経時的に前記ナノポア系中の電流パターンを分析すること、
その際、サンプル中の前記別個の一本鎖の標的核酸の存在が、ナノポア中のそれぞれ別個にハイブリダイズされたプローブと標的核酸との捕捉に相応する２個の別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される
を含む前記方法。
【請求項２０】
サンプル中の第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在は、別個のシグネチャコンダクタンス遮断である別個のシグネチャ電流遮断を生じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在は別々に検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
プローブセットは、少なくとも１つの付加的な標的核酸の存在を別々に検出できる１つ以上の付加的なプローブ分子を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
付加的なプローブは、付加的な別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含んでいるキャプチャ領域と、場合により末端領域とを有するプローブであり、前記プローブはポリマーラベルを欠如している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸は、別個のゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA、成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA、ノンコーディングRNA、核酸バイオマーカー又は合成アプタマー分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
プローブ分子の核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
第一のプローブ分子又は第二のプローブ分子の少なくとも１つの核酸キャプチャ領域は、その相補的標的核酸の全配列と相補的な配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
キャプチャ領域と末端伸長部とは、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
末端伸長部は、キャプチャ領域の３’末端に共有結合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルと第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、その重合の量の点で異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、第二のプローブ分子の伸長部に付着しているラベルは、第一のプローブ分子に結合されるポリエチレングリコールとは異なる長さのポリエチレングリコールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している、請求項１９から３４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置する末端伸長部の２番目から５番目の残基に付着している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
（ｉｉ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
（ｉｉ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含んでいるプローブ分子であって、その際、前記プローブ分子はナノポア系における標的核酸の検出を提供する前記プローブ分子。
【請求項３８】
ａ）核酸キャプチャ領域は、
ｉ）標的核酸とハイブリダイズできる、又は
ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズでき、かつ標的核酸の配列と相補的な配列を含む；
ｂ）末端伸長部は、核酸キャプチャ領域の３’末端に共有結合されるポリ（ｄＣ）（27-33）である、及び
ｃ）ポリマーラベルは、ポリ（ｄＣ）末端伸長部に付着している、
請求項３７に記載のプローブ分子。
【請求項３９】
標的核酸は、ゲノムDNA、mRNA、未熟若しくは成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA若しくはRNA、核酸バイオマーカー又は合成アプタマーである、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４０】
核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４１】
核酸キャプチャ領域は、標的核酸の全配列と相補的な配列を含む、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４２】
ポリ（ｄＣ）末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（30）末端伸長部である、請求項３８に記載のプローブ分子。
【請求項４３】
末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、ホモポリマー又はヘテロポリマーである、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４４】
ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４５】
ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４６】
ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される、請求項４５に記載のプローブ分子。
【請求項４７】
キャプチャ領域と末端伸長部は、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される、請求項３７又は３８に記載のプローブ分子。
【請求項４８】
末端伸長部は、キャプチャ領域の３’末端に共有結合されている、請求項３７に記載のプローブ分子。
【請求項４９】
末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される、請求項３７に記載のプローブ分子。
【請求項５０】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している、請求項３７又は３８のいずれか１項に記載のプローブ分子。
【請求項５１】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置する末端伸長部の２〜５番目の残基に付着している、請求項５０に記載のプローブ分子。
【請求項５２】
ナノポア系を用いてサンプル中の少なくとも１つの別個の一本鎖標的核酸を検出する方法において、該方法は、
ａ）サンプルと、請求項３７又は３８に記載の少なくとも１つのプローブ分子のセットとを接触させ、プローブ分子をサンプル中に存在するいずれかの標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたサンプルを形成すること、
その際、プローブ分子のセットは少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子を含む、
ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中の前記ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体をナノポア中で捕捉し、かつ前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのアンジッピング・プロセスによる前記系のナノポアを通る移行を促進するのに十分な電圧をかけること、及び
ｃ）経時的に前記ナノポア系中の電流パターンを分析すること、
その際、サンプル中の前記別個の一本鎖標的核酸の存在が、前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのナノポアを通る移行に相応する別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交互参照
本国際特許出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８５８９号の利益を請求するものであり、その全体を本明細書中に参照してそのまま組み込むこととする。
【０００２】
交付文書
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号R01GM079613による政府支援のもと作成されたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の挿入
配列表は、２８３１バイトのサイズで（MS−Windows（登録商標）で測定）、２０１４年３月１３日に作成されたファイル名“13 UMC050_SEQ LIST_ST25.txt”でUSPTO’s EFSシステムにより国際出願の一部分として提供され、かつ本明細書中に参照してそのまま組み込むこととする。
【０００４】
発明の背景
ナノポアは、溶液を両側に分ける隔膜中に組立てられた分子スケールのポア構造体である。ポアを貫通する個々の標的分子は、ポアコンダクタンスを特徴的に遮断し、結果として標的の同定と量子化の両方に関するシグネチャを生じる。ナノポアテクノロジーは、様々なバイオ技術用途、特に次世代DNAシーケンシング20-23に固有の単分子のプラットフォームを提供する。miRNA検出では、ナノポアセンサーはプログラム可能なDNAプローブを使用し、標的に特異的なシグネチャシグナルを生じ、かつピコモラー以下のレベルのmiRNA（癌に関連するmiRNAのようなもの）を定量でき、かつmiRNAファミリーメンバー間で一本鎖ヌクレオチドの違いを識別できる。このアプローチは、定量的miRNA検出、疾患マーカーの発見及び癌のような疾患の非侵襲的初期診断に潜在的に有用である。
【０００５】
以前に開示されたナノポアに基づく多重検出系には、多様な二価金属イオンのナノポア検出が含まれ、これはポアルーメン中で設計されたキレート剤を使用し、別個のシグネチャ24を生じ、かつ分子アダプターを使用し、薬剤25、エナンチオマー26,27及びヌクレオチド28,29を含む構造類似化合物を識別する。
【０００６】
多様なタンパク質は、ポリマーを認識基に付与することによりナノポア中でも検出された30。ナノポアのβ−バレルを通って移行する遊離ポリエチレングリコール（PEG）の種々の長さは、ナノポアコンダクタンスレベルにより分けることができる33。ポリペプチドでラベルされたDNAは、ナノポア中に捕捉される場合にシグネチャを生じることもできると報告されている31。タグ付け法に関しては、ペプチドタグでのDNAの化学変性は、DNA移行速度を遅くするだけではなく、一塩基突然変異32を含む個々のDNA断片31の感度を高めるシグネチャを生じることもできる。ナノポアは、単分子マススペクトロメトリーとしても機能し、ポアを通って移行する種々の大きさのポリ（エチレングリコール）（PEG）ポリマーを分析しており33、また最近ではナノポアは、５’−ホスフェート−改変ヌクレオチドから放出される種々の大きさの４個のPEGタグを検出することにより４塩基を識別することが示されてきた34。クラウンタグでの化学変性により、個々のDNA非塩基部位は、ナノポアを通る電気泳動的移行の間に検出できる35。しかし、各ポアは、１つのオリゴヌクレオチドを測定するハイスループットのナノポアアレイの開発は、なお挑戦段階である。
【０００７】
ナノポア検出の臨床適用への挑戦のうちの１つは、通常は特異的疾患診断には１種類のmiRNAよりも複数のmiRNAから成るバイオマーカーパネルの正確な検出を必要とすることである。例えば、３個のmiRNAのバイオマーカーであるmiR-155、miR-182及びmiRNA-197の組合せは、感度８１％及び特異度８７％まで肺癌の識別能を高めることができる4。これには複数のmiRNAの同時検出が必要である。
【０００８】
従って、改善された感度、迅速なプロセス及び費用効率が良くならびに多重検出を提供するためにナノスケールのポア構造に基づいた新規オリゴヌクレオチド検出法を提供する必要がある。
【０００９】
概要
以下の部分の明細書、図面及び表に記載のプローブ分子、プローブ分子のセット、ナノポア、ブローブ分子を含んでいるキット、プローブ分子のセット及びナノポアならびに関連する使用法が提供される請求項である。プローブ分子の使用、標的核酸を検出するためのプローブ分子のセットも明細書中で提供される。
【００１０】
本明細書中で提供されているものは、少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子を含んでいるプローブ分子のセットであり、その際、少なくとも２つのプローブ分子は、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、またその際、第一のプローブ分子のポリマーラベルは、第二のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、かつナノポア系において第一及び第二の標的核酸の独立した検出を提供する。
【００１１】
特定の実施態様において、第一及び第二のプローブ分子のポリマーラベルは、それらの個々の標的とハイブリダイズし、かつナノポア系において印加電圧をかけた際に別個のシグネチャコンダクタンス遮断を提供する。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される。特定の実施態様において、ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される。前記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、キャプチャ領域と末端伸長部とは、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される。前記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部はキャプチャ領域の３’末端に共有結合される。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基（abase）、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される。上記プローブセットのうちいずれかの特定の実施態様において、プローブセットは、少なくとも１つの付加的なプローブ分子を含み、これは、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’又は３’末端に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、付加的なプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一及び第二の標的核酸とは別個である標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、またその際、他の各々の付加的なプローブ分子のポリマーラベルは、第一のプローブ分子、第二のプローブ分子及び他のプローブ分子のいずれとも異なり、かつナノポア系において第一、第二の標的及び他の標的核酸の独立した検出を提供する。前記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、プローブセットは、３、４、６又は８個のプローブ分子を含み、その際、各々のプローブ分子のキャプチャ領域は、別個の標的核酸に対して相補性を有する別個の配列を含み、またその際、各々のプローブ分子のポリマーラベルは、他のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、かつナノポア系における各プローブに相補性を有する各々の標的核酸の独立した検出を提供する。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、標的核酸は、別個のゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA、成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA、ノンコーディングRNA、核酸バイオマーカー又は合成アプタマー分子である。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、プローブ分子の核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、第一のプローブ分子又は第二のプローブ分子の少なくとも１つの核酸キャプチャ領域は、その相補的標的核酸の全体配列と相補的な配列を含む。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様では、第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルと第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルとは、それらの重合の量の点で異なる。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様では、第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、第二のプローブ分子の伸長部に付着しているラベルは、第一のプローブ分子に結合されるポリエチレングリコールとは異なる長さのポリエチレングリコールである。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、プローブセットは、付加的な別個の標的核酸に対して相補性を有する配列と、場合により末端領域とを含んでいるキャプチャ領域を有するプローブを更に含むことができ、その際、該プローブは、ポリマーラベルを欠如しており、他の別個の標的核酸の独立した検出を提供する。前記プローブセットのいずれかの特定の実施例では、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している。上記プローブセットのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置する末端伸長部の２番目から５番目の残基に付着している。
【００１２】
また、本明細書中で提供されているものは、ナノポア系を用いてサンプル中で、少なくとも２個の別個の一本鎖標的核酸を検出する方法であり、該方法は、
ａ）サンプルと少なくとも２つのプローブ分子のセットとを接触させ、該プローブ分子をサンプル中に存在するいずれかの標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたサンプルを形成すること、
その際、プローブ分子のセットは少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子とを含み、その両方は、
（ｉ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
（ｉｉ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
（ｉｉ）末端伸長部のうち少なくとも１つに付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸とハイブリダイズし、その際、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸領域とハイブリダイズし、またその際、第一のプローブ分子のポリマーラベルは、第二のプローブ分子のポリマーラベルとは異なっている；
ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中で、ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ナノポア中に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体を捕捉し、ハイブリダイズされたプローブと標的核酸との前記系のアンジッピング・プロセスによるナノポアを通る移行を促進するのに十分な電圧をかけること、及び
ｃ）経時的に前記ナノポア系中の電流パターンを分析すること
を含み、その際、サンプル中の別個の一本鎖標的核酸の存在が、ナノポア中のそれぞれ別個にハイブリダイズされたプローブと標的核酸との捕捉に相応する２個の別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、サンプル中の第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在とは、別個のシグネチャコンダクタンス遮断である別個のシグネチャ電流遮断を生じる。
【００１３】
前記方法のいずれかの特定の実施態様において、第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在は、別々に検出される。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、プローブセットは、少なくとも１つの付加的な標的核酸の存在を別々に検出できる１つ以上の付加的なプローブ分子を更に含む。特定の実施態様において、付加的なプローブとは、付加的な別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含んでいるキャプチャ領域と、場合により末端領域とを有するプローブであり、その際、該プローブはポリマーラベルを欠如している。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、標的核酸は別個のゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA、成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA、ノンコーディングRNA、核酸バイオマーカー又は合成アプタマー分子である。特定の実施態様において、プローブ分子の核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、第一のプローブ分子又は第二のプローブ分子の少なくとも１つの核酸キャプチャ領域は、その相補的な標的核酸の全配列と相補的な配列を含む。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、キャプチャ領域と末端伸長部は、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部はキャプチャ領域の３’末端に共有結合されている。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部はポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルと、第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルとは、それらの重合量が異なる。
【００１４】
前記方法のいずれかの特定の実施態様において、第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、第一のプローブ分子に付着しているポリエチレングリコールとは異なる長さのポリエチレングリコールである。前記方法のいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着されている。上記方法のいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置する末端伸長部の２番目から５番目の残基に付着されている。
【００１５】
また、本明細書中で提供されるものは、
（ｉ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
（ｉｉ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方に共有結合している末端伸長部、及び
（ｉｉ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含むプローブ分子であり、該プローブ分子は、ナノポア系において標的核酸を検出するために提供される。
【００１６】
特定の実施態様において、核酸キャプチャ領域は
（ｉ）標的核酸とハイブリダイズすることができる、又は
（ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズすることができ、また標的核酸の配列と相補的な配列を含む、
（ｂ）末端伸長部は、核酸キャプチャ領域の３’末端に共有結合されるポリ（ｄＣ）（27-33）である、及び
（ｃ）ポリマーラベルは、ポリ（ｄＣ）末端伸長部に付着している。
【００１７】
上記プローブのいずれかの特定の実施態様では、標的核酸はゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA若しくは成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA若しくはRNA、核酸バイオマーカー、又は合成アプタマーである。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである。上記プローブのいずれかの特定の実施態様では、核酸キャプチャ領域は、標的核酸の全配列と相補的な配列を含む。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、ポリ（ｄＣ）末端伸長部はポリ（ｄＣ）（30）末端伸長部である。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、ホモポリマー又はヘテロポリマーである。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、ポリグリコールは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーから成る群から選択される。前記プローブのいずれかの特定の実施態様において、キャプチャ領域と末端伸長部は、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される。前記プローブのいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部はキャプチャ領域の３’末端に共有結合している。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、末端伸長部は、ポリ（ｄＣ）（27-33）、ポリ（ｄＧ）（27-33）、ポリ（ｄＡ）（27-33）、ポリ（ｄＴ）（27-33）及びポリ（ｄＮ）（27-33）（Ｎは、シトシン、グアノシン、アデノシン、チミン、非塩基、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのいずれかの組合せである）から成る群から選択される。上記プローブのうちいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置している末端伸長部の残基に付着している。上記プローブのいずれかの特定の実施態様において、ポリマーラベルは、キャプチャ領域への共有結合から５’又は３’に位置している末端伸長部の２〜５番目の残基に付着している。また、提供されるものは、少なくとも１つの別個の一本鎖標的核酸を検出する方法であり、該方法は次を含む：（ａ）サンプルを、上記プローブ分子のいずれかの少なくとも１つのセットと接触させて、プローブ分子をサンプル中に存在する標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたサンプルを形成させ、その際、プローブ分子のセットは、少なくとも第一のプローブ分子と第二のプローブ分子を含む；（ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中で、ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ナノポア中に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体を捕捉し、かつハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのアンジッピング・プロセスによる系のナノポ���を通る移行を促進するのに十分な電圧をかける；及びｃ）経時的にナノポア系中の電流パターンを分析し、その際、サンプル中の別個の一本鎖の標的核酸の存在が、ハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのナノポアを通る移行に相応する別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される。
【００１８】
図面の説明は以下の通りである：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、プローブによりコード化されたナノポアを用いる核酸の多重検出の原理を示す。モデル（左）に示されているように、miRNA・プローブハイブリッドは、α−ヘノリジンタンパク質ナノポア中に捕捉されている。各プローブは、特徴的タグ（赤）でラベルされている。種々のmiRNAは、異なってタグ付けされているプローブの使用により検出される。ノナポアの感知ゾーン中に捕捉されたこれらのタグ付けされたプローブ（左）は、別個のコンダクタンスレベルでシグネチャ遮断を生じることができる（右）。結果として、サンプル中の複数のmiRNAは、それらのシグネチャプロファイルに基づいて同定でき、かつ各タイプのシグネチャの出現度を数えることにより正確に量子化できる。
【図２】図２は、クリックケミストリーにより、PEG8とプローブであるmiR-155−プローブ−Ｃ３０−アルキン２とのコンジュゲーションについてのMALDI-TOF-MSスペクトロスコピーの結果を示している。
【図３】図３は、種々のバーコードタグを有する４個のプローブとハイブリダイズしたmiR-155のシグネチャ電流遮断を示している。バーコード設計は、４個の識別可能な電流遮断レベルを生じ、これは特定のタイプのプローブに対する各遮断の正確なアサイメントを可能にした。１０mM Tris（pH 7.5）で緩衝された１M KCl中、＋１２０mVで電流を記録した。
【図４】図４は、様々にコード化された４個のプローブとハイブリダイズした４個のmiRNAによって生じたシグネチャ電流遮断を示す。特に、miR-155は変性無しのプローブにより、miR-182-5pはPEG3タグ付けプローブにより、miR-210はPEG-8タグ付けプローブにより及びmiR-21はPEG24-タグ付けプローブにより検出された。バーコード設計は、識別不可能な電流遮断レベルを有する４タイプのシグネチャを生じた。各タイプのシグネチャは、プローブによりコード化された１種類のmiRNAに相応する。１０mM Tris（pH 7.5）で緩衝された１Ｍ  ＫＣｌ中＋１２０mVで電流を記録した。
【図５】図５は、１つのナノポア中での複数のmiRNAの同時検出を示す電流トレースを示す。４個のmiRNAは溶液中に存在する。miR-155は変性無しのプローブにより、miR-182-5pはPEG3タグ付けプローブにより、miR-210はPEG-8タグ付けプローブにより及びmiR-21はPEG24タグ付けプローブにより検出された。連続して生じるシグネチャ遮断は、種々の電流レベルを特徴とし、そのプローブと結合する種々のmiRNAを示している。
【図６】図６は、複数のmiRNA検出において計測したシグネチャ遮断の電流振幅ヒストグラムを示している。４個のmiRNAは、溶液中に存在している。miR-155は変性無しのプローブにより、miR-182-5pはPEG3タグ付けプローブにより、miR-210はPEG-8タグ付けプローブにより及びmiR-21はPEG24タグ付けプローブにより検出された。４個の別々の振幅ピークは、混合物中に共存する４個のmiRNAに割り当てられる。各ピークを覆っている面積は、miRNAの全遮断数とみなされる。これはmiRNA濃度に直線状に相関する。
【図７】図７は、例示的なナノポア感知システムの図式的説明を示している。図７に示されているように、感知チャンバー（１）は、シスコンパートメント（２）とトランスコンパートメント（３）を含み、これらはパーティション（４）により分けられている。両方のコンパートメントは、予め選択された１M KClのような記録溶液で満たされている。パーティション（４）は、１つの開口部（５）を有し、その真ん中の領域では、上方に脂質二重層が形成されており、ナノポア（６）は脂質二重層を通って差し込まれている。電力（７）は、２つのコンパートメント中の一組の電極を介して負荷される電圧を提供する；電流検出器、例えば、ピコ−アンペア増幅器（８）が連結されて電流変化をモニターする。試験に際し、標的オリゴヌクレオチドの混合サンプル（９）及びその相補的プローブ（１０）をシスコンパートメント（２）中に装填した。
【図８ａ】図８ａは、例示的な検出の間に記録された例示的な電流トレース、電流遮断事象の増幅された電気的特徴を説明している。
【図８ｂ】図８ｂは、電流遮断に関連する相応するアンジッピング−移行事象の図式的説明とを説明している。
【００２０】
詳細な説明
上記のことを鑑み、本発明の幾つかの利点が達成及び獲得されることが分かるであろう。
【００２１】
定義
本明細書で使用されているように、“シグネチャコンダクタンス遮断”というフレーズは、空のナノポアを通過する電流（Ｉ）に対するナノポア中に所定の核酸／プローブ複合体を捕捉することにより得られる電流遮断（Ｉb）の比率（Ｉb／Ｉ）を意味する。
【００２２】
本明細書で使用されているように、“相補性”という用語は、互いにハイブリダイズできる２個の核酸を指して使用される場合には、完全に又は部分的に相補的な核酸を意味する。従って、プローブ核酸は、相補性の領域に１個、２個、３個、４個又はそれより多くの塩基の不適合がある場合には、標的核酸に対して相補性を示すことができる。
【００２３】
先行する定義のいずれかが本明細書中に参照して組み込まれている特許文献又は非特許文献に提供されている定義と不一致である限りにおいて、本明細書中に記載されている特許又は非特許参考文献、又はその他の場所で見出される特許又は非特許文献において、先行する定義が本明細書で使用されることになると解釈される。
【００２４】
実施態様の更なる説明
複数のフォーマット中で別個の一本鎖オリゴヌクレオチドを感知的、選択的及び直接的に検出し、識別ならびに定量化できるようにする頑健なナノポア感知システムが本明細書中で提供される。更に本発明の感知技法は、複数のフォーマット中で別個のmiRNAを識別するためにも使用できる。更に本発明の技法は、非侵襲的及び費用効率のよい初期診断ならびに患者の血液サンプル中のマーカーを連続的にモニタリングする可能性もある。
【００２５】
１つの幅広い態様では、本発明はプローブ、ナノポア、前記プローブ及びナノポアを含むキット、並びに関連する使用法にむけられ、これはサンプル中の２つ又はそれより多い別個のオリゴヌクレオチド標的の多重分析を提供する。特定の実施態様では、多重検出に使用されるプローブセットは“シグネチャ”電流遮断事象を提供し、これは第一のプローブと別個の第一のプローブ標的核酸との相互作用から生じる事象を、別個の第二のプローブと第二のプローブ標的核酸との相互作用から生じる他の事象と識別する。特定の実施態様では、別個のプローブ分子／標的核酸複合体から生じる識別事象で使用されるシグネチャ電流遮断事象は、“シグネチャコンダクタンス遮断”であり、これは空のナノポアを通過する電流（Ｉ）に対するナノポア中に捕捉される所定の核酸／プローブ複合体から得られる電流遮断（Ｉb）の比率（Ｉb／Ｉ）は、ナノポア中の種々の核酸／ポア複合体を捕捉することから得られる比率（Ｉb／Ｉ）と識別できる。種々のプローブ分子／標的核酸ハイブリダイズ複合体を識別するために使用されるシグネチャ電流遮断事象の特徴には、次のもののうち少なくとも１つを含むことができるが、これに限定されるわけではない：ｉ）様々な期間の電流遮断；ｉｉ）別個の電流遮断レベルの様々な数；ｉｉｉ）バックグランド電流遮断とは異なる種々の大きさの電流遮断レベルの出現頻度；又はｉ）、ｉｉ）又はｉｉｉ）のいずれかの組合せ。
【００２６】
特定の実施態様では、別個のプローブ分子／標的核酸複合体から生じる識別事象において使用されるシグネチャ電流遮断事象は、次のものうち少なくとも１つである：ｉ）様々な期間の電流遮断；ｉｉ）別個の電流遮断レベルの様々な数；ｉｉｉ）バックグランド電流遮断とは異なる種々の大きさの電流遮断レベルの出現頻度；ｉｖ）シグネチャコンダクタンス遮断；又は（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）のいずれかの組合せ。
【００２７】
特定の実施態様では、シグネチャ事象は、平らな脂質二重層系でα−ヘモリシン（αHL）又は遺伝子操作されたその変異体により形成されるタンパク質ナノポアを含むナノポア系で提供される。特定の実施態様では、シグネチャ事象は、単一タンパク質ナノポアが埋まっているヒドロゲルにカプセル封入された脂質二重層により、又はマイクロドロプレット二重層系により形成されるバイオチップ中で提供することもできる。バイオチップとマイクロドロプレット二重層系は、記載されている（Shim and Gu; Stochastic Sensing on a Modular Chip Containing a Single-Ion Channel Anal. Chem. 2007, 79, 2207-2213; Bayley H. et al. Droplet interface bilayers. Mol. Biosyst. 4, 1191-1208 (2008)）。
【００２８】
特定の実施態様では、シグネチャ事象を合成ナノポアにおいて提供することもできる。合成ナノポアには、窒化ケイ素又はグラフェンを含むナノポアが含まれるが、これらに限定されるわけではない。デュアルコンパートメントナノポア系の一般的な特徴は、図７に記載されている。プローブ／標的核酸ハイブリダイゼーション複合体の捕捉から生じる電流遮断事象の一般的な特徴、及びそれに引き続くプローブと標的のアンジッピンングと移行は図８に記載されている。ＰＣＴ公報WO2012009578には、デュアルコンパートメントナノポア系及びプローブ／標的核酸ハイブリダイゼーション複合体の捕捉から生じる電流遮断、ならびにそれに引き続くプローブと標的のアンジッピングと移行が記載されている。ＰＣＴ公報WO2012009578を参照して本明細書にそのまま取り入れることとする。
【００２９】
本発明の特定の実施態様は、標的核酸を検出するための１つ以上のプローブ分子を提供する。特定の実施態様では、標的核酸は一本鎖の核酸であり、かつ特定の実施態様では、標的核酸はmiRNAである。プローブ分子の構造は次のものを含む：（ｉ）核酸キャプチャ領域；（ｉｉ）核酸キャプチャ領域に共有結合する１つ以上の末端伸長部；及び（ｉｉｉ）プローブ分子に付着されているラベル。核酸キャプチャ領域は、標的核酸にハイブリダイズし、その検出を可能にするプローブの部分である。通常の当業者のうち一人は、標的核酸が核酸配列を含むことを理解するであろう。特定の実施態様では、核酸キャプチャ領域は標的核酸の配列と相補的な配列を有する。標的核酸には、約１８〜約２４ヌクレオチド、ヌクレオ塩基の残基長さであるmiRNAが含まれるがこれに限定されるわけではない。特定の実施態様では、核酸キャプチャ領域は、標的核酸に相補的な少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチド又はヌクレオ塩基の残基を有する。一般的に、キャプチャ領域と標的核酸の間で相補的な配列の長さが長いほど、プローブはより特異的になる。特定の実施態様では、核酸キャプチャ領域は、標的核酸の全配列と相補的な配列を含む。本明細書中で提供されるプローブのキャプチャ領域は、標的分子を捕捉するために使用される。特定の実施態様では、キャプチャ領域は標的配列に完全に相補的であるか又は部分的に相補的であることができる。特定の実施態様では、キャプチャ領域は、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ（ＤＮＡ））又はａ，ｕ，ｇ，ｃ（ＲＮＡ）を含むオリゴヌクレオチド及び／又はイノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンのようなヌクレオシドを含む人工ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。特定の実施態様では、キャプチャ領域はロック核酸（LNA）又はペプチド核酸（PNA）を含むことができる。ロック核酸は、リボース環が２位−酸素と４位−炭素の間にメチレン結合を含む場合にはRNA誘導体を含む。ペプチド核酸（PNA）は、ヌクレオ塩基側鎖を有するペプチド骨格を含む。特定の実施態様では、LNA又はPNAキャプチャ領域は、天然ヌクレオ塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシル）、及び／又は、ヒポキサンチン、キサントシン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル及び５−メチルシトシンを含む人工ヌクレオ塩基を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。特定の実施態様では、オリゴヌクレオチド、LNA又はPNAのコポリマーを含むプローブキャプチャ領域が提供される。特定の実施態様では、プローブのキャプチャ領域は、標的核酸に相補的である少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチド又はヌクレオ塩基の残基を有するであろう。特定の実施態様では、プローブの中心領域は、標的核酸に相補的な少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個から約３０、３５、４０、又は５０個のヌクレオチド又はヌ��レオ塩基の残基のいずれかを有するであろう。特定の実施態様では、配列に挿入された合成ヌクレオチド又はヌクレオ塩基は、一本鎖ヌクレオチドの多形性、メチル化のような標的の特徴、又はmiRNAとその標的メッセンジャーRNAとの間の相互作用を識別することができるように、標的とのハイブリダイゼーションエネルギーを正確に調節することができる。
【００３０】
本明細書中で提供されるプローブ分子は、それらの５’及び／又は３’末端の一方又は両方で末端伸長部を含むことができる。
【００３１】
１つ以上の末端伸長部は、３’末端、５’末端、又は両方でキャプチャ領域に共有結合していてもよい。プローブ分子の末端伸長部は、いずれかの長さの、電荷を帯びた又は親水性ポリマーを含むことができる。特定の実施態様では、末端伸長部ポリマーは負に荷電した一本鎖核酸であることができる。このような核酸末端伸長部の利点には、極めて低コストでの合成及びpH、塩濃度及び温度による調節可能な電荷が含まれるが、これに限定されるわけではない。このような核酸伸長部は、ホモポリマー、ヘテロポリマー、コポリマー又はそれらの組合せを含むことができる。特定の実施態様では、このような核酸末端伸長部の長さは、約１又は２ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドの範囲であることができる。なお他の実施態様では、核酸伸長部は約５〜約４０ヌクレオチド、約１５〜約３５ヌクレオチドの長さの範囲、又は約２０〜約３５ヌクレオチドの長さの範囲であることができる。ここで提供される例示的な末端伸長部は、ホモポリマーポリ（ｄＣ）30である。しかし、CTCTCTCT…、又はCATCATCAT…、のようなジ−又はトリ−ヌクレオチドヘテロポリマーを含むヘテロポリマー配列も使用できるが、次のものに限定されるわけではない。非塩基は、塩基を有さないが、ホスフェートにより提供される負の電荷を有するヌクレオチドである。非塩基の大きさが通常のヌクレオチドよりも狭いので、近隣のヌクレオチドにより形成されるシグナルとは異なるシグネチャ事象を生じてもよい。特定の実施態様では、末端伸長部はポリ（ｄＣ）伸長部である。特定の実施態様では、末端伸長部はキャプチャ領域の３’末端に共有結合されるポリ（ｄＣ）伸長部である。ポリ（ｄＣ）伸長部の長さは、約３０ヌクレオチド又はヌクレオ塩基の残基であってもよく、例えば、２７と３３の間（ポリ（ｄＣ）（２７〜３３））であり、及び好ましくはポリ（ｄＣ）（３０）である。
【００３２】
プローブ分子末端伸長部は、ポリペプチドを含むこともできる。アミノ酸のより豊富な選択は、オリゴヌクレオチド末端伸長部よりもポリペプチド末端伸長部の配列及び官能性をよりプログラム可能なものにする。例えば、ポリペプチド末端伸長部は、最適化された位置への荷電性アミノ酸の挿入を可能にし、より識別可能なプローブ／標的シグネチャ事象を生じる。追及が理論に制限されないが、プローブ／標的複合体は、適切な電圧の下に正に荷電したポリペプチド末端伸長部を含むプローブを使用して選択的に捕捉でき、他方で、混合物中のその他の負に荷電した標的ではない全てのオリゴヌクレオチドはポアに侵入することを妨げられ、その結果、極めて選択的な検出を生じると考えられている。特定の実施態様では、ポリペプチド末端伸長部は、正電荷を有することができる２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる（すなわち、リジン及び／又はアルギニン及び／又はヒスチジン）。特定の実施態様では、正に荷電した十分な数の残基は、ポリペプチド末端伸長部に含まれ、プローブが標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる場合に正味の正電荷を提供する。正電荷を有する末端伸長部を含んでいるプローブがリジン、アルギニン又はヒスチジンのような残基により付与される特定の実施態様では、関連するナノポアに基づく検出法の性能は、酸性条件（すなわち、ｐＨ値が７未満の場合）下に、又は残基がプロトン化される条件下に向上させることができる。
【００３３】
従って、約１〜約６．９、１〜約６．０、約１〜約５．５、約３〜約５．５及びそのようなｐＨ値でこのようなプローブは使用される。特定の実施態様では、このようなペプチド末端伸長部の長さは約１又は２残基から約３０残基の範囲であることができる。なお他の実施態様では、ポリペプチド伸長部は、約５〜約２０残基、約８〜約２０残基、又は約８〜約１５残基の長さの範囲であることができる。例示的な実施態様では、正に荷電したアルギニン及びリジン残基を含むHIV-TATポリペプチドは、末端伸長部として使用できる。特定の実施態様では、標的オリゴヌクレオチドに相補的なプローブの中心領域は、正電荷を有するアミノ酸を含んでいる末端伸長部に共有結合するペプチド核酸を含むことができる。特定の実施態様では、ペプチド核酸を含んでいる中心領域は、正電荷を有するアミノ酸を含んでいる末端伸長部と組み合わせて使用され、プローブが標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる場合に、正味の正電荷を提供する。
【００３４】
特定の実施態様では、以下に限定されるわけではないが、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、チロキシンなどを含む芳香族側鎖を有するアミノ酸を含むポリペプチド末端伸長部を、ポリペプチド末端伸長部に挿入することができる。追及が理論により制限されないが、このような芳香族アミノ酸は芳香族の積み重ねを通ってポアと相互作用でき、かつナノポアに基づく検出法において得られるシグネチャで有用な変化を提供すると考えられている。
【００３５】
ラベルは、プローブ分子のキャプチャ領域、又はプローブ分子の３’若しくは５’末端伸長部に付着させることができる。特定の実施態様では、ラベルは、５’若しくは３’末端伸長部、又は５’若しくは３’末端伸長部の両方に付着している。またラベルは、３’末端伸長部又は３’末端ポリ（ｄＣ）伸長部に付着することもできる。ラベルはホモポリマー若しくはヘテロポリマーのようなポリマーであってもよい。特定の実施態様では、ラベルは少なくとも適度に親水性であるか又は親水性である。ポリマーラベルの実例には、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ポリアミン、ポリペプチド及びポリグリコールが含まれる。
【００３６】
ポリアミンに対する核酸の付着方法は、J. Med. Chem. 2003, 46, 5478-5483に記載されている。核酸に対するペプチドの付着方法は、Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 5565-5568に記載されている。ラベルはプローブ分子に共有的に付着してもよい。ラベルは、プローブ分子の残基中への反応性部分の挿入によりプローブ分子に付着できる。特定の実施態様では、ラベルはクリックケミストリーによりプローブ分子に付着できる。アジド基と末端アセチレンの間の金属接触反応を伴うクリックケミストリーは、少なくとも米国特許第7375234号に記載されている。これを本明細書に参照してそのまま取り入れることとする。ペプチドとオリゴ糖を含む様々な対象分子を核酸に結合するクリックケミストリーの適用も記載されている（El-Sagheer and Brown Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 1388-1405）。クリックケミストリーの適用にオリゴ糖を誘導化する方法は、記載されている（Chem. Lett. 2013, 42, 197-199）。プローブ分子をペプチド及びクラウンエーテルでラベリングする様々な技法は記載されている31, 32, 39。このように、Ｃｕ+接触によるクリックケミストリー、アジドと反応するシクロオクチンのようなシクロ化合物、マレイミドと反応するチオール基、メタンチオスルホネート（MTS）付着ホモ又はヘテロポリマーを使用する銅不含クリックケミストリー、ならびにヌクレオチド上にラベルできるチオール含有ピリジン変種を含む方法によりラベルをプローブに結合できるが、これらの方法により限定されるわけではない。１つの例示的かつ限定されないこの方法の実施態様は、以下の例４に記載されている。ラベルが３’末端伸長部に共有的に付着している特定の実施態様では、伸長部はキャプチャ領域の３’末端の９残基以内に位置するのが好ましく、キャプチャ領域の３’末端の２番目又は３番目の残基に位置するのが好ましい。その標的核酸とハイブリダイズする場合には、ハイブリダイズしたプローブ分子はナノポアのシグネチャコンダクタンスにおいて減少を生じ得る。同じ末端伸長部に共有結合しているが、ラベルを欠如している同じキャプチャ領域を含む他のプローブ分子と比べた場合に、ラベルされたプローブ分子はナノポアのシグナルコンダクタンスを下げる。
【００３７】
プローブセットのプローブ分子に付着するラベルは、ポリマー分子、例えばホモポリマー及びヘテロポリマーであってもよいがこれらに限定されるわけではない。この実例には、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ポリペプチド、ポリアミン及びポリグリコールが含まれるがこれらに限定されるわけではない。使用できるポリグリコールラベルは、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（MPEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリブチレングリコール（PBG）及びこれらのコポリマーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。プローブ分子のセットに引き合いに出された特定の実施態様では、ある１つのプローブ分子のラベルは、該ラベルが異なるタイプのポリマー分子である点において他のプローブ分子のラベルとは異なる。特定の実施態様では、ある１つのプローブ分子のラベルは、該ラベルが同じタイプのポリマー分子であるが、しかしそれらの重合の量の点で異なる点において他のプローブ分子のラベルとは異なる。特定の実施態様では、第一のプローブ分子のポリ（dC）伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、付加的なプローブ分子のポリ（dC）伸長部に付着しているラベルもポリエチレングリコールであるが、第一のプローブ分子に付着しているポリエチレングリコールとは異なる長さのものであり、及び／又は他のプローブ分子に付着しているラベルとは異なる長さのものである。
【００３８】
種々の長さのポリエチレングリコール（PEG）の実例には、PEG3、PEG8及びPEG24が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
特定の実施態様では、ポアのトランス−開口部で負に荷電した環を有するナノポアを使用できる。この文脈上、ポアのトランス開口部とは、分子が出ると考えられるポアの部分であると解釈されるのに対して、ポアのシス開口部は分子が入ると考えられる部分であると解釈される。これらの実施態様では、ポアのトランス開口部で負に荷電した環は、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するように適切に合成及び／又は誘導化されたどのタイプのナノポアを使用しても得られると解釈される。このようなポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するナノポアには、タンパク質ナノポア及び合成ナノポアが含まれるがこれに限定されるわけではない。ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するタンパク質ナノポアには、α−ヘモリシンタンパク質の遺伝子操作された変異体が含まれるがこれに限定されるわけではない。特定の実施態様では、遺伝子操作されたαヘモリシン変異体は、K131D、K131E又はK131Hアミノ酸置換を含む黄色ブドウ球菌αヘモリシンを有することができる。
【００４０】
例示的かつ限定されない黄色ブドウ球菌αヘモリシン野生型配列は、WO2012009578に提供されている（配列番号２０として、核酸コード領域；配列番号２１：タンパク質コード領域、これらを各々参照してそのまま取り入れることとする）及びその他の場所で入手可能なもの（National Center for Bioinformatics or GenBank Accession Numbers Ｍ90536及びAAA26598）。例示的かつ限定されないK131D置換を含んでいる黄色ブドウ球菌αヘモリシン変異体は、WO2012009578に遺伝子配列番号２２として提供されている。特定の実施態様では、遺伝子操作されたαヘモリシン変異体は、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を提供する部分で誘導化された適切に誘導化変異体を含むことができる。置換又は誘導化し、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するタンパク質ナノポアを提供できる例示的野生型黄色ブドウ球菌のαヘモリシンタンパク質は、WO2012009578に配列番号２１として提供されている。しかし、ポアを形成できる他のヘモリシンの変異体も置換又は誘導化し、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するタンパク質ナノポアを提供できる。ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有する合成ナノポアもまた提供される。特定の実施態様では、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を有するこのような合成ナノポアには、ポアのトランス開口部で負に荷電した環を提供する部分で適切に誘導化された窒化ケイ素又はグラフェンナノポアが含まれるが、これに限定されるわけではない。PCT公報WO2012009578を参照して本明細書にそのまま取り入れることとする。
【００４１】
本発明の特定の実施態様は、少なくとも２個の標的核酸で検出するためのプローブ分子のセットを提供する。すなわち、種々の標的核酸の多重検出を可能にするか、又はラベル以外は構造が同一であるプローブ分子に付着されているときに種々のタイプのラベルの間での比較が可能となる。このプローブ分子のセットは、少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び第二のプローブ分子を含み、それぞれ本発明のプローブ分子の構造を含んでいる。特定の実施態様では、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は第一の標的核酸とハイブリダイズし、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は第二の標的核酸とハイブリダイズする。特定の実施態様では、第一のプローブ分子のラベルは第二のプローブ分子のラベルとは異なる。特定の実施態様では、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸の配列とハイブリダイズする配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸の配列とハイブリダイズする配列を含み、第一のプローブ分子のラベルは、第二のプローブ分子のラベルとは異なる。このように、第一の核酸標的にハイブリダイズするプローブ分子及びその結果として生じるナノポア検出系で検出されるそのシグナルを、第二の核酸標的にハイブリダイズするプローブ分子およびその結果生じるナノポア検出系で検出されるそのシグナルと識別することができる。特定の実施態様では、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸の配列と相補的な配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸の配列と相補的な配列を含む。
【００４２】
特定の実施態様では、第一のプローブ分子のラベルは、第二のプローブ分子のラベルとは異なる。特定の実施態様では、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸の配列と相補的な配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸の配列と相補的な配列を含み、かつ第一のプローブ分子のラベルは第二のプローブ分子のラベルとは異なり、このように第一の核酸標的に相補的な配列を含んでいるプローブ分子及びその結果生じるナノポア検出系で検出されるそのシグナルを、第二の核酸標的に相補的な配列を含んでいるプローブ分子及びその結果生じるナノポア検出系で検出されるそのシグナルと識別することができる。
【００４３】
プローブセットは、例えば、付加的な標的核酸を検出するために２つよりも多いプローブ分子を含んでいてもよい。付加的なプローブ分子は、第一の標的核酸の配列及び／又は第二の標的核酸の配列とは異なる標的核酸とハイブリダイズするか、又はハイブリダイズし、かつ相補的な配列を有していてもよい。付加的なプローブ分子は、第一のプローブ分子のラベル及び／又は第二のプローブ分子のラベルとは異なるラベルを含んでいてもよい。特定の実施態様では、付加的なプローブ分子はラベルを欠如していてもよい。特定の実施態様では、付加的なプローブ分子は、第一の標的核酸の配列と第二の標的核酸の配列とは異なる標的核酸の配列とハイブリダイズするか、又はハイブリダイズし、かつ相補的な配列を含んでいてもよく、また第一のプローブ分子のラベル及び第二のプローブ分子のラベルとは異なるラベルを含んでいてもよく、従って付加的なプローブ分子、ならびにそれらの結果生じるナノポア検出系において検出されるそのシグナルを、プローブ分子のセット中の第一、第二及び／又はその他の分子と識別することができる。
【００４４】
特定の実施態様において、それらの標的核酸にハイブリダイズする場合に、本発明のこの局面のハイブリダイズされたプローブ分子は、同じ末端伸長部に共有結合している同じキャプチャ領域を含んでいるが、ラベルを欠如しているプローブ分子と比べて、ナノポアのシグネチャコンダクタンスを下げるが、これはラベルを欠如したプローブ分子が標的核酸にハイブリダイズする場合である。１つのプローブ分子のラベルが付加的なプローブ分子のラベルと異なる場合、例えば、同じ末端伸長部に共有結合する同じキャプチャ領域を含んでいるが、異なるタイプのラベルを有するか、又は重合度の異なるラベルを有する異なるプローブ分子の場合は、ハイブリダイズされた第一のプローブ分子により引き起こされるナノポア検出系におけるシグネチャコンダクタンスの減少は、ハイブリダイズされた付加的なプローブ分子により引き起こされるシグネチャコンダクタンスにおける減少とは異なる。このことは、標的核酸にハイブリダイズした種々のプローブ及びそれらの結果として生じるそのシグナルを、本発明の複数のナノポア系において区別して検出できるようにする。１つのプローブ分子のラベルが付加的なプローブ分子のラベルと異なる場合、例えば、異なるタイプのラベルを有するか又は異なる重合度を有するラベルの場合、また異なるプローブ分子が異なる標的核酸にハイブリダイズする異なる核酸キャプチャ領域を有する場合には、ハイブリダイズされた第一のプローブ分子により引き起こされるシグネチャコンダクタンスにおける減少は、ハイブリダイズされた付加的なプローブ分子により引き起こされるシグネチャコンダクタンスにおける減少とは異なり、このことは種々の標的核酸にハイブリダイズした種々のプローブ及びそれらの結果として生じるそのシグナルを、本発明の複数のナノポア系において識別して検出可能にし、従って、複数の標的核酸の多重同定を可能にする。
【００４５】
本発明の特定の実施態様は、少なくとも２個の標的核酸で検出する多重方法を提供する。該方法の特定の実施態様では、標的核酸は一本鎖の核酸であり、また特定の実施態様では、一本鎖標的核酸はmiRNAである。標的核酸はサンプル中で検出される。実例には、組織、血液又は核酸を含有する他の体液及びそれらから誘導される核酸含有の液体のサンプルが含まれる。サンプルを、本明細書で記載した構造体を含んでいる少なくとも第一のプローブ分子と第二のプローブ分子のセットと接触させる。第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸の配列を認識する配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸の配列を認識する配列を含む。第一のプローブ分子のラベルは、第二のプローブ分子のラベルとは異なる。プローブ分子は、サンプル中の核酸標的とのハイブリダイズを可能にし、ハイブリダイズされた標的核酸・プローブ複合体のハイブリダイズされたサンプルを形成する。例示的ハイブリダイズ条件は、サンプルとプローブ分子を９５℃で１０分間接触させ、次にこの混合物を徐々に室温まで冷却させてハイブリダイズされたサンプルを形成する。ハイブリダイズされたサンプルは、デュアルチャンバーナノポア系のシス側に添加され、かつイオン流をこの系のナノポアに通過させる。シグネチャコンダクタンスを測定し、かつ経時的にナノポア系のイオン流パターンを分析することができる。コンダクタンスレベルの減少は、ナノポア中に捕捉されたハイブリダイズされたプローブの不活性化を示している。特定のラベルを有する第一のプローブ分子にハイブリダイズする第一の標的核酸のサンプル中の存在及び異なるラベルを有する第二の標的核酸の存在が、異なるレベルの減少したコンダクタンスを生じるので、第一のプローブ分子と第二のプローブ分子の存在と量を多重様式で別々に検出することができる。
【００４６】
複数の標的核酸又はオリゴヌクレオチドは、プローブ分子、プローブ分子セット、ナノポア、プローブ分子及びプローブ分子セットを含んでいるキット、ならびに本明細書で提供される方法におけるこのプローブ分子及びプローブ分子セットの関連した使用によって、多重アッセイにおいて検出可能であり、かつ他の標的核酸から識別できる。特定の実施態様では、標的は、細胞、体液、組織、細菌又はウイルスからの核酸又はその断片であることができる。特定の実施態様では、標的はPCR産物又は合成ヌクレオチドであることができる。特定の実施態様では、標的はゲノムDNA、mRNA、未熟miRNA、成熟miRNA、人工miRNA、ノンコーディングDNA若しくはRNA、核酸バイオマーカー、又は合成アプタマー分子を含むことができる。特定の実施態様では、miRNA標的は、プラズマ及びホルマリン固定及びパラフィン埋没組織のようないずれかの組織からの生体液からのRNA抽出物から由来していてよい。特定の実施態様では、標的核酸は、いずれかの核酸結合タンパク質と複合化した核酸断片、抗体、又は標的タンパク質と結合したアプタマーを含むことができる。特定の実施態様では、標的核酸は、これに限定されるわけではないが薬品を含む低分子量化合物と複合化された核酸断片を含むことができる。特定の実施態様では、標的は突然変異を有する配列、１ヌクレオチド遺伝子多型を有する配列、又はメチル化及びリン酸化のような化学変性を有する配列を含むことができる。
【００４７】
研究では、異常型miRNAレベルが多くの癌の進行と関連し、このことがmiRNAに癌のバイオマーカー2としての可能性があることを示している。miRNAは、著しい安定性3,4で組織から血液に放出することができ、循環性miRNAの検出が非侵襲的癌診断及び臨床3-5用の新規ストラテジーとなる。
【００４８】
本発明の特定の局面では、ラベル又はmiRNA6の増殖の必要が無く、循環性miRNAの正確な検出のためのナノポアの単分子センサーを提供する。例えば、肺癌患者のような癌患者からの循環性miRNAの検出が行われる。バーコードストラテジーは、一連のラベルコード化されたプローブを利用し、１つのナノポアの使用により多重のmiRNAバイオマーカーを同時検出する。これは新規の多重のmiRNA検出法である。各々のプローブはバーコードラベルで化学的にラベルされる（図１左のパネル）。ポアの感知ゾーンにおけるバーコードラベルの捕捉は、別個のシグネチャコンダクタンスレベルを生じ、これがプローブによりハイブリダイズされるmiRNAのタイプの同定を可能にする。図１の右のパネルにより示されているように、ラベル（Tag）１とラベル（Tag）２でラベルされたプローブは、２個の別個のシグネチャを生産する。コンダクタンスレベルを分けることにより、２つのプローブにより結合されたmiRNA種を識別することができ、かつ複数のmiRNAを１つのポア中で同時に検出できる。
【００４９】
実施例は本発明の原理を最も良く説明するために選択及び記載されているものであり、その実用は他の当業者が本発明を様々な実施態様において、及び試みようとする実際の使用に合うように様々な変更を加えて最も良く利用することを可能にする。
【００５０】
実施例
以下に開示された実施態様は単に本発明の代表であり、これを様々な形で具体化してもよい。従って、本明細書で開示された特殊な構造及び機能的詳細は限定されたものとしてみなされない。
【００５１】
例１  多重核酸検出
１．材料と方法
化学式：
１．１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（PEG3）（Jena Bioscience、ドイツ）
【化１】
2016517275.tif 000003
【００５２】
２．O−（２−アミノエチル）−O’−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール（PEG8）（Jena Bioscience、ドイツ）
【化２】
2016517275.tif 000004
【００５３】
３．１−［２−（２−２−［２−（２−２−［２−（２−２−［２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ−エトキシ）−エトキシ］−２−メトキシ−エタン（PEG24）（Jena Bioscience、ドイツ）
【化３】
2016517275.tif 000005
【００５４】
４．酢酸ナトリウム（CH3COONa, S8750-500G）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
５．臭化銅（I）（CuBr, 254185-10G）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
６．エタノール（CH3COOH, E7023-500ML）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
７．Tert−ブタノール（（CH3）3COH, 471712-100ML）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
８．ジメチルスルホキシド（DMSO, （CH3）2SO, D8418-50ML）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
９．トリス［（１−ベンジル−１H−１，２，３−トリアゾ−ル−４イル）メチル］アミン（TBTA, 678937-50MG）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
【化４】
2016517275.tif 000006
１０．ヌクレアーゼ不含水（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）。
【００５５】
ＤＮＡとＲＮＡ：
全てのmiRNAとそれらのDNAプローブ（標準設計）を統合DNA技術により合成した。各miRNAについて、１つのプローブが３’ポリ（C）30のオーバーハングに隣接し、その他はクリックケミストリーにより２番目と３番目のシトシンの間に、内部５−オクタジニルdUを挿入した。RNAとDNA配列は以下に記載してある：
【化５】
2016517275.tif 000007
【００５６】
【化６】
2016517275.tif 000008
【００５７】
１つのmiRNA／プローブをハイブリダイズするために、miRNA５００μM及びそのDNAプローブ５００μMを混合し、かつ９５℃未満で１０分間溶かし、かつ次に室温まで徐々に冷ました。複数のmiRNA／プローブをハイブリダイズするために、関与している全てのmiRNAとそれらのプローブ（様々なPEGタグ無しと有り）を全て２５０μMの濃度で、９５℃未満で１０分間混合した。次にナノポア実験のために混合物を徐々に室温まで冷ました。
【００５８】
装置：
以下の装置をクリックケミストリーに使用した：
１．コントロール環境系２５インキュベーターシェーカー（New Brunswick Scientific Co., INC., Edison, NJ）
２．遠心分離機5415C（Eppendorf, Hauppauge, NY）
３．Maxi Mix I Type 16700 Mixer（Thermolyne）
バーコードタグでのDNAプローブのラベリング：
クリックケミストリーによりDNAプローブをPEGタグでラベルした。クリックケミストリー反応は以下のスキームに示されている。特殊なプロトコールには以下のものが含まれる：
【化７】
2016517275.tif 000009
【００５９】
１．t-BuOH  1mlとDMSO ３mlを混合し、及び混合物を３：１のDMSO／ｔ−BuOH溶剤が得られるにボルテックスする。
【００６０】
２．CuBr１ｍｇを３：１DMSO／ｔ−BuOH溶剤７０μｌ中に溶かし、０．１M溶液を得られるようにする。この溶液は、新たに調製しなくてはならず、かつ貯蔵できない。
【００６１】
３．TBTA５４ｍｇを０．１M溶液中の３：１DMSO／ｔ−BuOH溶液１ｍL中に溶かし、かつ溶液を−２０℃で貯蔵する。
【００６２】
４．０．１M  CuBr溶液１０μｌを０．１M  TBTA溶液２０μｌに素早く加え、クリック溶液を得る。
【００６３】
５．クリック溶液（DMSO／ｔ−BuOH３：１中、０．１M  CuBr／０．１M  TBTA１：２）を使用前に新たに調製する。
【００６４】
６．アルキン変性一本鎖DNAプローブをミリポア水中に溶かし、２ｍM  DNA溶液を得る。
【００６５】
７．アジド変性PEGを３：１DMSO／ｔ−BuOH溶剤に溶かし、５０mM PEG溶液ｗを得る。
【００６６】
８．NaOAc０．２４６１ｇを１０ｍLミリポア水中に溶かし、０．３MNaOAc溶液を得る。
【００６７】
９．DNA溶液（２ｍM、２０nmol）１０μｌとPEG溶液（５０mM、５０nmol）２μｌを混合し、及び引き続き新たに調製したクリック溶液３μｌを混合物に加える。混合物をよく混合し、及び２５０rpmで室温（２５℃）で４時間混ぜる。
【００６８】
１０．反応混合物を０．３M  NaOAc（１２０μｌ）で希釈し、及びDNAを１．５ｍｌ冷エタノールを使用して沈殿させる。
【００６９】
１１．混合物を１２０００rpmで１０分間遠心分離し、次に上澄み液を取り除き、及び沈殿物を冷エタノール１ｍｌで２回洗浄し、及び混合物を１２０００rpmで１０分間遠心分離する。
【００７０】
１２．沈殿物（精製したラベルDNA）をヌクレアーゼ不含水１８μｌ中に再度溶解させ、更に精製せずに使用できる。
【００７１】
シングルチャネル・レコーディング：
１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの膜を、２つの同じテフロンチャンバーを分けるテフロン隔膜中の小さなオリフィス上に形成した。各チャンバーは、電解溶液２ｍLを含有している（１M  KCｌ、１０ｍM  Tris、pH7.4）。ヘモリシン１μｇ未満を撹拌しながら１つのチャンバー（本明細書中ではシスチャンバーと称される）に加え、コンダクタンスが上昇した後に、シングルチャネルの形成が示され、次にこのシングルチャネルをmiRNAに使用し始めた。miRNAとそのハイブリダイズされたプローブサンプル（すなわち、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体）をイオン流の記録のためにシス側に添加した。α−ヘモリシンチャネルを通過するイオン流をAxoPatch 200B増幅器（Molecular Devices社、Foster City, C.A）により測定した。データを増幅し、DigiData 144０A（Molecular Devices社）でデジタル化し、及びpClamp 10.0プログラム（Molecular Devices社）を使用してコンピューター上で保存した。データ分析は、pClamp suite softwareを使用して実施した。
【００７２】
２．結果
PEGタグでのDNAプローブのラベリング：
ナノポアセンサー中のプローブは、標的miRNAでハイブリダイズするためのキャプチャ領域と、３’末端に結合するポリ（ｄＣ）30オーバーハングとの２つの領域から成り、これはキャプチャ速度の増進に寄与し、及びmiRNA・プローブ複合体のシグネチャを形成する。ナノポア中に捕捉された場合に、ポリ（ｄＣ）30オーバーハングは、ポアのβ−バレル（５nm長さ）を曲がりくねって通り抜ける。コンダクタンスの変化は、この領域内の一本鎖DNAに極めて感受性がある。以前の研究は、この領域内の一本鎖DNAの１塩基を識別できることを示している36, 37。延長された一本鎖DNAに関しては、隣接するヌクレオチドの間の距離は、０．６〜０．７nm38である。これは、キャプチャ領域の隣の初めの８〜９個のシトシンだけがβ−バレルを占めることを意味する。ラベリング箇所は、好ましくはこれらの最初の８〜９シトシンの範囲内である。この箇所は好ましくはキャプチャ領域に近すぎてはならない（例えば、１番目のシトシン）。なぜならば、これはmiRNA・プローブのハイブリダイゼーションに影響を与え得るからである。他方で、ポアの入り口に近いラベリング（例えば６番目のシトシン）はあまり感受性ではなく、別個のシグネチャを生じるのが困難であり得る。従って、３番目のシトシンは、好ましいラベリング箇所であると考えられる。この研究では、プローブを種々のサイズのPEGでラベルし、シグネチャを別個のコンダクタンスのレベルに変化させる。クリックケミストリーを使用して、PEGとDNAプローブをコンジュゲートさせた。クリックケミストリーは簡素でありかつ迅速である；クリックケミストリーを可能にするPEGは市販されている（材料と方法の項目を参照）。ラベリングの手法は材料と方法の項目に記載されている。図２に結果が出されている質量分光法（MALDI-TOF-MS）は、PEGでラベルしたDNA生成物の高収率と高純度を示した（miR-155-プローブ-C30-アルキン2-PEG8により例示されている）。16457.86Daでのピークは、生成物miR-155-プローブ-C30-アルキン2-PEG8である。このピークを表１に示されているような２つの他のピークと比較した。
【００７３】
【表１】
2016517275.tif 000010
【００７４】
PEGサイズに依存するシグネチャコンダクタンス：
まず、PEGでタグ付けされたmiRNAプローブがどのようにナノポア電流遮断を変化させるかを試験するために、１つだけのmiRNAを標的として利用し、多重検出用にそれらを分離した。標的のmiRNAはmiR-155であった（材料と方法の項目を参照）。miR-155プローブをPEG3、PEG8、PEG24を含む種々の長さのPEGでラベルした。これらのプローブをラベリング無しのプローブと比較した。図３は、代表的なシグネチャが４個のmiRNA・プローブ複合体を遮断したことを示している。シグネチャ遮断の残余電流は、PEGの長さが伸びるにつれて一貫して減少した。PEGラベリング無しのプローブを使用し、シグネチャは、開口部でのポアコンダクタンスに対して１２％までコンダクタンスを下げた。相対的遮断レベル（Ｉb／Ｉ0）は、PEG3プローブについて７．６％まで下げ、PEG8プローブについて６．０％まで下げ、及びPEG24プローブについて１．９％まで下げた。これらのデータは、種々の長さのPEGでラベルしたプローブは、シグネチャの残余電流を変化させることができることを示した。
【００７５】
PEGの長さによるシグネチャコンダクタンスを調節するこのメカニズムは、他のmiRNAの検出にも普遍的であるように思われる。３つのmiRNA；miR-21、miR-210’及びmiR-182-5pを更に試験した。これらは、文献4,5によれば全ての肺癌に由来するmiRNAバイオマーカーである。各々のmiRNAに関して、４つのプローブを設計した。これらは、その標的にハイブリダイズする同一のキャプチャ領域を共有していた。１つのプローブはラベルせずに、他の３つはそれぞれPEG3、PEG８及びPEG24でラベルした。各miRNAとそのプローブの混合物をナノポアセンサーに加えた。各miRNA・プローブハイブリッドのシグネチャ電流レベル（Ib）及び相対的遮断レベル（Ib／I0）を測定し、表２で比較した。３つのmiRNA；miR-21、miR-210’及びmiR-182-5pは、miR-155と全く同じ傾向であることが明らかになった。すなわち、シグネチャコンダクタンスはPEGの長さが増すにつれて一貫して減少した。
【００７６】
全ての４個のmiRNAの結果は、共通のメカニズムを示している：ナノポアコンダクタンスはポアルーメンを占めているPEGタグに極めて感受性である。理論に制限されないが、PEGが長くなるにつれて、その体積が膨張し、これがポアのイオン経路内でより多くの空間を遮断すると考えられている。結果として、プローブ上のPEGの長さが増すことによりシグネチャコンダクタンスは減少する。
【００７７】
バーコード付きのプローブでの多重miRNAの検出：
同一にラベルしたプローブの比較（表２中、各Ib／Iの行）は、それらのmiRNA・プローブのシグネチャが同様のコンダクタンス（各PEGの行中、Ib／I）を共有し、miRNAを識別できないことを示している。しかし、試験されたどのmiRNA（各miRNAの列、Ib／I）も、様々にラベルしたプローブ生成物はそれらのシグネチャにおいて別個の遮断レベルを生成しているので、このようにラベルタイプを正確に識別できる。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
ナノポアを野生型α−ヘモリシンにより形成した。miR-155、miR-21、miR-210及びmiRNA-182-5pを含む４個のmiRNAを標的として選択した。４個のプローブを各miRNA用に設計した。それらのうち、１つのプローブは変性せず、かつ他の３つはバーコードとしての別個のタグとコンジュゲートさせた。各miRNAを各プローブとハイブリダイズさせ、それらのシグネチャ遮断の電流レベルを特徴づけた。太字の値は、多重検出実験に選択されたmiRNA・プローブハイブリッドのものであった（図４と５参照）。
【００８０】
４個のmiRNA用のプローブが異なってラベルされている場合には、全てのmiRNAの間で識別するために識別可能なシグネチャを生じることができると考えられている。正確な識別のために４個のmiRNAのシグネチャコンダクタンスを互いに十分に分けるために、標的のmiR-155には、最も高い残余電流を有するラベルしていないプローブ（Ib／I＝12%）を選択し、miR-21には、最も低い残余電流を有するPEG24-ラベルしたプローブ（Ib／I＝1.5%）を選択した。２つのレベルを仲介するために、miR-182-5pにはPEG3でラベルしたプローブ（Ib／I＝9.1%）を選択し、miR-210にはPEG8-ラベルしたプローブ（Ib／I＝5.6%）を選択した。このラベルタイプ／miRNA種の組合せは、種々のコンダクタンスの間のギャップを最大化し、種々のmiRNAの正確な識別を可能にする。図４は、このラベルタイプ／miRNA種の組合せの使用により、種々のmiRNAのシグネチャ遮断レベルを識別でき、これが多重検出を促進することを明らかに示している。多重検出試験では、miR-155、miR-182-5p、miR-210及びmiR-21を含む４個のmiRNAを異なってラベルされたそれらのプローブと混合した。多重miRNAハイブリダイズ混合物は、材料と方法の項目で記載したように調製した。この混合物をα−ヘモリシンポアのシス側に加えた。図５は、＋１２０mVでの混合物の電流トレースを示している。４個のシグネチャコンダクタンスレベルを明らかに同定でき、各々は、miRNAに相当する。スパイクのような短い遮断（＜１ms）も同定され、これはポアを通って迅速に移行する遊離miRNA又はDNAプローブにより生じる。シグネチャ事象の電流振幅ヒストグラムは、４つのピークがそれぞれがmiRNA種に相応することを明らかに証明している。高いコンダクタンスから低いものに、これらは特異的にラベルされたプローブを有するmiR-155、miR-182-5p、miR-210及びmiR-21の遮断レベルとそれぞれよく一致している。従って、これらはそれぞれmiR-155、miR-182-5p、miR-210及びmiR-21によるものであり得る。ヒストグラムは、シグネチャ数を計数することにより構築し、よってヒストグラム中の各ピークの下の面積は、各miRNAの濃度を評価するのに役立つ。
【００８１】
例２．プローブの末端伸長部領域にポリアミン、オリゴ糖及びペプチドラベルを付着させるための例示的方法
ポリアミンを核酸に結合する予め記載した方法（J. Med. Chem. 2003, 46, 5478-5483）により、様々なポリアミンをプローブの末端伸長部に結合できる。
【００８２】
ペプチドを核酸に結合する予め記載した方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 5565-5568）を使用して様々なペプチドをプローブの末端伸長部に結合できる。付着可能な例示的なペプチドには、次のものが含まれるがこれらに限定されるわけではない：His- His- His- His- His- His-Cys（配列番号１３）及びGly-Tyr-Tyr-Tyr-Cys（配列番号１４）。
【００８３】
オリゴ糖を核酸に結合する予め記載した方法（Chem. Lett. 2013, 42, 197-1990）を使用して、様々なオリゴ糖をプローブの末端伸長部に結合できる。
【００８４】
本発明をその特定の実施態様と関連して記載したが、本発明の装置は、更に変更できることが分かるであろう。本特許明細書は、一般に本発明の原則に従って本発明のいずれかの変更、使用又は改造も網羅する意図があり、かつこのような本発明の開示からの逸脱が本発明が付属する当該分野の公知若しくは慣行の範囲内にあること及びここに明記する前の本質的な特徴に該当すること及び添付した請求項の範囲内に従うことを含める。ここで提供されるものは、プローブ、プローブセットならびにプローブとプローブセットから成るキット及びナノポア系を用いてサンプル中で１つ以上の核酸を検出する方法である。本発明により含まれるこのようなプローブ、プローブセット、キット及び方法は、これにより記載及び請求されたいずれかの実施態様及び／又はこれにより記載及び請求されたいずれかの実施態様の組合せを含むことができる。
【００８５】
参考資料リスト
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【符号の説明】
【００８６】
１  感知チャンバー、  ２  シスコンパートメント、  ３  トランスコンパートメント、  ４  パーティション、  ６  ナノポア、  ７  電力、  ８  ピコ−アンペア増幅器、  ９  標的オリゴヌクレオチドの混合サンプル、  １０  相補的プローブ
【図１】
2016517275.tif 000012
【図２】
2016517275.tif 000013
【図３】
2016517275.tif 000014
【図４】
2016517275.tif 000015
【図５】
2016517275.tif 000016
【図６】
2016517275.tif 000017
【図７】
2016517275.tif 000018
【図８ａ】
2016517275.tif 000019
【図８ｂ】
2016517275.tif 000020
【配列表】
2016517275000001.app
【国際調査報告】
2016517275.tif 000021