(57)【要約】  マルチプレックス次世代核酸シーケンシングのためのサンプルを調製するための方法、組成物及びキットが本明細書に記載される。本方法は、バーコード混同キメラを最小にする、インラインバーコードの使用、低コストの精製手順、及び/又は配列決定のための所望の量のポリヌクレオチドを生成するための定量的増幅を伴う。【選択図】図2
2016520326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定のためのサンプルにおいてバーコード混同キメリズム(barcode confusing chimerism)の発生率を減少させる方法であって、複数のサンプルのそれぞれを第一のアダプター及び第二のアダプターとインキュベートするステップを含み、ここで、
(i)各サンプルは、それぞれが2つの5'-リン酸化平滑末端を有する、複数の二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、
(ii)各第一のアダプターは、第一の部分的二本鎖フラグメント、及び非リン酸化平滑末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドバーコードを含む、部分的二本鎖であり、全ての第一のアダプターは同じ第一のフラグメントを有するが、固有のバーコードを有し、第一のアダプターのいずれの鎖も40塩基以下の長さであり、さらに、各バーコードは、6塩基対(bp)〜8bpの長さであり、同一である2個以下の連続ヌクレオチドを有し、任意の他のバーコードとは少なくとも2bpが相違し、
(iii)各第二のアダプターは、非リン酸化平滑末端を有する部分的二本鎖であり、全ての第二のアダプターは同じ配列を有し、いずれの鎖も40塩基以下の長さであり、
インキュベーションは、標的ポリヌクレオチドが一方の末端で第一のアダプターにライゲートし、他方の末端で第二のアダプターにライゲートするのに適した条件下で行われる、方法。
【請求項２】
配列決定のためのサンプルを調製する方法であって、
(a)複数のサンプルのそれぞれを第一のアダプター及び第二のアダプターとインキュベートするステップ、ここで、
(i)各サンプルは、それぞれが2つの5'-リン酸化平滑末端を有する、複数の二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、
(ii)各第一のアダプターは、第一の部分的二本鎖フラグメント、及び非リン酸化平滑末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドバーコードを含む、部分的二本鎖であり、全ての第一のアダプターは同じ第一のフラグメントを有するが、固有のバーコードを有し、第一のアダプターのいずれの鎖も40塩基以下の長さであり、さらに、各バーコードは、6塩基対(bp)〜8bpの長さであり、同一である2個以下の連続ヌクレオチドを有し、任意の他のバーコードとは少なくとも2bpが相違し、
(iii)各第二のアダプターは、非リン酸化平滑末端を有する部分的二本鎖であり、全ての第二のアダプターは同じ配列を有し、いずれの鎖も40塩基以下の長さであり、インキュベーションは、標的ポリヌクレオチドが一方の末端で第一のアダプターにライゲートし、他方の末端で第二のアダプターにライゲートするのに適した条件下で行われ、
(b)アダプターとライゲートされた標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドにライゲートされない遊離アダプターから、サイズ選択ビーズ又はカラムで精製するステップ、
(c)標的ポリヌクレオチドにニックトランスレーションを行い、完全二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップ、
(d)ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドをビーズ又はカラムで精製するステップ、
(e)サンプルをプールし、プールされたサンプルを得るステップ、
(f)第一のフラグメントに部分的に相補的な第一のプライマー及び第二のアダプターに部分的に相補的な第二のプライマーを用いて、プールされたサンプルにおいてPCR増幅を行い、プライマーの取り込みにより、両末端に配列決定に適した配列を有するアンプリコンを得るステップ、及び
(g)アンプリコンに定量的PCR(qPCR)を行い、配列決定のための所望の量のポリヌクレオチドを有するサンプルを得るステップ
を含む、方法。
【請求項３】
バーコードが、バーコード間の相違を最大にするために、インプットとしてサンプル数を必要とする選択法によって選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択法が、バーコードの各対の間のヌクレオチドの相違を表す数値を含む、バーコードのマトリックスを生成するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(f)の前に、所望の領域又は配列の、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを選択するステップをさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
選択が、配列特異的プローブを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一のフラグメント及び第二のアダプターに相補的なプライマーを用いて、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを増幅するステップをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
アンプリコンを配列決定するステップをさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列決定が、合成による配列決定(sequencing by synthesis)を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定されたポリヌクレオチドを、ライゲートされたバーコード配列によって、サンプルのうちの1つに由来するものと同定するステップをさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
精製が、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズを用いて行われる、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一のフラグメントのより長い鎖が、CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号1)の配列を有する、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第一のプライマーが、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(配列番号3)の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第二のアダプターのより長い鎖が、CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT(配列番号2)の配列を有する、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第二のプライマーが、CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACC(配列番号4)の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
qPCRが、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号5)の配列を有する第一のプローブ及び/又はCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT(配列番号6)の配列を有する第二のプローブを用いて行われる、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
バーコードが、表1から選択される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
約3％未満の増幅産物が、バーコード混同キメリズムから生成される、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれが表1から選択される異なるバーコードを含む、少なくとも48個のポリヌクレオチド配列を含むキット。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが部分的に二本鎖であり、ここで、バーコードが非リン酸化平滑末端を有する二本鎖である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
それぞれが表1から選択される異なるバーコードを含む、96個のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
ゲノムDNAのサンプルにおいてコピー数の変動を検出する方法であって、
(i)請求項２に記載されるように、配列決定のための試験サンプルを調製するステップ、
(ii)請求項２に記載されるように、配列決定のための対照サンプルを調製するステップ、
(iii)目的の位置で試験サンプル及び対照サンプルに定量的配列決定アッセイを行うステップ、及び
(iv)試験サンプル中の目的の位置で配列決定されたゲノムDNAの量を、対照サンプル中の目的の位置で配列決定されたゲノムDNAの量と比較するステップであって、対照サンプルと比較した試験サンプル中の配列決定されたゲノムDNAの量の相違が、試験サンプルにおけるコピー数の変動を示す、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２３】
バーコードが、バーコード間の相違を最大にするために、インプットとしてサンプル数を必要とする選択法によって選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
選択法が、バーコードの各対の間のヌクレオチドの相違を表す数値を含む、バーコードのマトリックスを生成するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ(f)の前に、所望の領域又は配列の、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを選択するステップをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
選択が、配列特異的プローブを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第一のフラグメント及び第二のアダプターに相補的なプライマーを用いて、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを増幅するステップをさらに含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
アンプリコンを配列決定するステップをさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
配列決定が、合成による配列決定(sequencing by synthesis)を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列決定されたポリヌクレオチドを、ライゲートされたバーコード配列によって、サンプルのうちの1つに由来するものと同定するステップをさらに含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
精製が、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズを用いて行われる、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
第一のフラグメントのより長い鎖が、CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号1)の配列を有する、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
第一のプライマーが、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(配列番号3)の配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第二のアダプターのより長い鎖が、CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT(配列番号2)の配列を有する、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第二のプライマーが、CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACC(配列番号4)の配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
qPCRが、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号5)の配列を有する第一のプローブ及び/又はCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT(配列番号6)の配列を有する第二のプローブを用いて行われる、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
バーコードが、表1から選択される、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
約3％未満の増幅産物が、バーコード混同キメリズムから生成される、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、マルチプレックス次世代シーケンシング(NGS)のための低コストのサンプル調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA配列決定技術は飛躍的に進歩してきた。最近では、ハイスループットシーケンシング(又は次世代シーケンシング)技術は、配列決定プロセスを並列化し、一度に数千又は数百万の配列を生成する。超ハイスループットシーケンシングでは、500,000もの、合成による配列決定(sequencing-by-synthesis)の操作が並行して実行され得る。次世代シーケンシングは、コストを下げ、業界標準の色素-ターミネーター法より大幅にスピードを向上させる。
【０００３】
大規模並列シグネチャーシーケンシング(MPSS)は、以前の次世代シーケンシング技術の1つであった。MPSSは、アダプターライゲーション、それに続くアダプターデコーディング、4つのヌクレオチドの増分における配列解読の複雑なアプローチを用いる。この方法により、配列特異的なバイアス又は特定の配列の喪失の影響を受けやすくなった。
【０００４】
ポロニーシーケンシング(polony sequencing)は、インビトロ対タグライブラリー(in vitro paired-tag library)を、エマルジョンPCR、自動化顕微鏡、及びライゲーションベースの配列決定化学と組み合わせ、大腸菌(E. coli)ゲノムを配列決定した。この技術は、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)のSOLiDプラットフォームに組み込まれた。
【０００５】
454ピロシーケンシング(pyrosequencing)は、油溶液中の水滴内部でDNAを増幅し(エマルジョンPCR)、各液滴は、単一のプライマー被覆ビーズに結合した単一DNA鋳型を含有し、それは、その後クローン性コロニーを形成する。シーケンシング機械は、それぞれが単一のビーズ及びシーケンシング酵素を含有する、多くのピコリットル容量のウェルを含有する。ピロシーケンシングは、新生DNAに添加された個々のヌクレオチドの検出のための光を生成するルシフェラーゼを使用し、組み合わされたデータは、配列リードアウト(sequence read-out)を生成するために使用される。
【０００６】
Solexaシーケンシングでは、DNA分子及びプライマーは、最初にスライドに結合され、ポリメラーゼで増幅され、当初は「DNAコロニー」と称された、局所的クローン性コロニーが形成される。配列を決定するために、4種類の可逆的ターミネーター塩基(RT-塩基)が添加され、取り込まれないヌクレオチドは、洗い流される。ピロシーケンシングとは異なり、DNA鎖は、一度に1つのヌクレオチドが伸長され、画像取得は、遅延時点で行われることができ、DNAコロニーの大きなアレイを、単一のカメラから撮影した連続画像によって撮ることを可能にする。
【０００７】
SOLiD技術は、ライゲーションによる配列決定を用いる。ここで、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールは、配列決定された位置に応じて標識される。オリゴヌクレオチドはアニールされ、ラーゲートされる; DNAリガーゼによる、マッチしている配列についての優先的ライゲーションは、その位置でのヌクレオチドの情報を与えるシグナルをもたらす。配列決定の前に、DNAは、エマルジョンPCRによって増幅される。得られたビーズは、それぞれが同じDNA分子の単一コピーを含み、スライドガラス上に置かれる。結果は、Solexaシーケンシングに匹敵する量及び長さの配列である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
配列決定のコストが大きく低減し、サンプル、特に多数のサンプルを調製するコストが、比較的高くなる。したがって、同時に複数のサンプルを処理することができる、低コストの改良されたサンプル調製法に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
マルチプレックス次世代シーケンシングのためのサンプルを調製するための方法、組成物及びキットが本明細書に記載される。本方法は、バーコード混同キメラ(barcode-confusing chimera)を最小にする、インライン(in-line)バーコードの使用、低コストの精製手順、及び/又は配列決定のための所望の量のポリヌクレオチドを生成するための定量的増幅を含む。
【００１０】
一実施形態では、本開示は、配列決定のためのサンプルにおいてバーコード混同キメリズム(barcode confusing chimerism)の発生率を減少させる方法であって、複数のサンプルのそれぞれを第一のアダプター及び第二のアダプターとインキュベートするステップを含み、ここで、(i)各サンプルは、それぞれが2つの5'-リン酸化平滑末端を有する、複数の二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、(ii)各第一のアダプターは、第一の部分的二本鎖フラグメント、及び非リン酸化平滑末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドバーコードを含む、部分的二本鎖であり、全ての第一のアダプターは同じ第一のフラグメントを有するが、固有のバーコードを有し、第一のアダプターのいずれの鎖も40塩基以下の長さであり、さらに、各バーコードは、6塩基対(bp)〜8bpの長さであり、同一である2個以下の連続ヌクレオチドを有し、任意の他のバーコードとは少なくとも2bpが相違し、(iii)各第二のアダプターは、非リン酸化平滑末端を有する部分的二本鎖であり、全ての第二のアダプターは同じ配列を有し、いずれの鎖も40塩基以下の長さであり、インキュベーションは、標的ポリヌクレオチドが一方の末端で第一のアダプターにライゲートし、他方の末端で第二のアダプターにライゲートするのに適した条件下で行われる、方法を提供する。
【００１１】
一実施形態では、配列決定のためのサンプルを調製する方法であって、(a)複数のサンプルのそれぞれを第一のアダプター及び第二のアダプターとインキュベートするステップ、ここで、(i)各サンプルは、それぞれが2つの5'-リン酸化平滑末端を有する、複数の二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、(ii)各第一のアダプターは、第一の部分的二本鎖フラグメント、及び非リン酸化平滑末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドバーコードを含む、部分的二本鎖であり、全ての第一のアダプターは同じ第一のフラグメントを有するが、固有のバーコードを有し、第一のアダプターのいずれの鎖も40塩基以下の長さであり、さらに、各バーコードは、6塩基対(bp)〜8bpの長さであり、同一である2個以下の連続ヌクレオチドを有し、任意の他のバーコードとは少なくとも2bpが相違し、(iii)各第二のアダプターは、非リン酸化平滑末端を有する部分的二本鎖であり、全ての第二のアダプターは同じ配列を有し、いずれの鎖も40塩基以下の長さであり、インキュベーションは、標的ポリヌクレオチドが一方の末端で第一のアダプターにライゲートし、他方の末端で第二のアダプターにライゲートするのに適した条件下で行われ、(b)アダプターとライゲートされた標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドにライゲートされない遊離アダプターから、サイズ選択ビーズ又はカラムで精製するステップ、(c)標的ポリヌクレオチドにニックトランスレーションを行い、完全二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップ、(d)ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドをビーズ又はカラムで精製するステップ、(e)サンプルをプールし、プールされたサンプルを得るステップ、(f)第一のフラグメントに部分的に相補的な第一のプライマー及び第二のアダプターに部分的に相補的な第二のプライマーを用いて、プールされたサンプルにおいてPCR増幅を行い、プライマーの取り込みにより、両末端に配列決定に適した配列を有するアンプリコンを得るステップ、及び(g)アンプリコンに定量的PCR(qPCR)を行い、配列決定のための所望の量のポリヌクレオチドを有するサンプルを得るステップを含む、方法が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ゲノムDNAのサンプルにおいてコピー数の変動を検出する方法であって、(i)請求項２に記載されるように、配列決定のための試験サンプルを調製するステップ、(ii)請求項２に記載されるように、配列決定のための対照サンプルを調製するステップ、(iii)目的の位置で試験サンプル及び対照サンプルに定量的配列決定アッセイを行うステップ、及び(iv)試験サンプル中の目的の位置で配列決定されたゲノムDNAの量を、対照サンプル中の目的の位置で配列決定されたゲノムDNAの量と比較するステップであって、対照サンプルと比較した試験サンプル中の配列決定されたゲノムDNAの量の相違が、試験サンプルにおけるコピー数の変動を示すステップを含む方法が本明細書に開示される。
【００１３】
いくつかの態様では、バーコードは、バーコード間の相違を最大にするために、インプットとしてサンプル数を必要とする選択法によって選択される。いくつかの態様では、選択法は、バーコードの各対の間のヌクレオチドの相違を表す数値を含む、バーコードのマトリックスを生成するステップを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、本方法は、ステップ(f)の前に、所望の領域又は配列の、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを選択するステップをさらに含む。いくつかの態様では、選択は、配列特異的プローブを含む。いくつかの態様では、本方法は、第一のフラグメント及び第二のアダプターに相補的なプライマーを用いて、ニックトランスレートされた標的ポリヌクレオチドを増幅するステップをさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様では、本方法は、アンプリコンを配列決定するステップをさらに含む。いくつかの態様では、配列決定は、合成による配列決定(sequencing by synthesis)を含む。いくつかの態様では、本方法は、配列決定されたポリヌクレオチドを、ライゲートされたバーコード配列によって、サンプルのうちの1つに由来するものと同定するステップをさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様では、上記方法の精製は、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズを用いて行われる。
【００１７】
いくつかの態様では、第一のフラグメントのより長い鎖は、CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号1)の配列を有する。いくつかの態様では、第一のプライマーは、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(配列番号3)の配列を含む。
【００１８】
いくつかの態様では、第二のアダプターのより長い鎖は、CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT(配列番号2)の配列を有する。いくつかの態様では、第二のプライマーは、CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACC(配列番号4)の配列を含む。
【００１９】
いくつかの態様では、qPCRは、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号5)の配列を有する第一のプローブ及び/又はCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT(配列番号6)の配列を有する第二のプローブを用いて行われる。
【００２０】
いくつかの態様では、バーコードは、表1から選択される。
【００２１】
いくつかの態様では、約3％未満の増幅産物は、バーコード混同キメリズムから、本方法の1つ以上のPCR増幅ステップの間に生成される。いくつかの態様では、約2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、又は0.01％未満の増幅産物は、バーコード混同キメリズムに起因して生成される。
【００２２】
一実施形態では、それぞれが表1から選択される異なるバーコードを含む、少なくとも48個のポリヌクレオチド配列を含むキットも提供される。
【００２３】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは部分的に二本鎖であり、ここで、バーコードは非リン酸化平滑末端を有する二本鎖である。いくつかの態様では、キットは、それぞれが表1から選択される異なるバーコードを含む、96個のポリヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ−Ｄ】図1A〜Dは、本技術の一実施形態のサンプル調製及び配列決定プロセスを説明する。
【図１Ｅ−Ｆ】図1E〜Fは、本技術の一実施形態のサンプル調製及び配列決定プロセスを説明する。
【図２】図2は、コピー数の変動の検出において本明細書に開示される方法の使用を説明し、該方法は、単一のマルチプレックスハイブリダイゼーションを含んだ。本明細書に開示されるように、ゲノムDNAサンプルを、バーコードを含む第一のアダプター、及び第二のアダプターとインキュベートした。DMD遺伝子において1つの重複を有するサンプルを、三角で表す。DMD遺伝子においてヘテロ接合性欠失を有するサンプルを、四角で表す。SGCG遺伝子においてホモ接合性欠失を有するサンプルを、菱形で表す。正常サンプルを、星(正常1)及び円(正常2)で表す。コピー数の変動は明らかに検出可能であり、正常サンプルと比較して、予想される正規化カバレッジを実証した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次世代シーケンシングに供された又は供されるアンプリコンのDNA配列を独立に確認するためのプライマー、方法、試薬及びキットが本明細書に記載される。
【００２６】
本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句を以下に定義する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、別段の指示がない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数も含む。したがって、例えば、「オリゴヌクレオチド(an oligonucleotide)」への言及は、複数のオリゴヌクレオチド分子を含み、「標識(a label)」への言及は、1つ以上の標識への言及であり「プローブ(a probe)」への言及は、1つ以上のプローブへの言及であり、「核酸(a nucleic acid)」への言及は、1つ以上のポリヌクレオチドへの言及である。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、別段の指示がない限り、数値に言及する場合、用語「約」は、列挙された値のプラス又はマイナス10％を意味する。
【００２９】
用語「増幅」又は「増幅する」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸をコピーする方法を含み、それにより、選択された核酸配列のコピー数を増加させる。増幅は、指数関数的又は線形的であってよい。標的核酸は、DNA又はRNAであってよい。このようにして増幅された配列は、「アンプリコン」としても公知の「増幅産物」を形成する。本明細書中以下に記載される例示的方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた増幅に関係するが、核酸の増幅のための多数の他の方法が当技術分野で公知である(例えば、等温法、ローリングサークル法等)。当業者は、これらの他の方法が、PCR法の代わりに又はPCR法と共に使用され得ることを理解する。例えば、PCR Protocols, Innis et al., 編, Academic Press, San Diego, CA 1990中のSaiki, “Amplification of Genomic DNA” pp. 13-20; Wharam et al., Nucleic Acids Res., 29(11):E54-E54, 2001; Hafner et al., Biotechniques, 30(4):852-56, 858, 860, 2001; Zhong et al., Biotechniques, 30(4):852-6, 858, 860, 2001を参照。
【００３０】
PCRの重要な特徴は「熱サイクリング」であり、これは、本文脈では、少なくとも3つの異なる温度を通した繰り返しサイクルを含む：(1)典型的に95℃での、融解/変性、(2)プライマーと標的との相同の領域の融点(Tm)によって決定される温度での、標的DNAへのプライマーのアニーリング、及び(3)ポリメラーゼに依存した温度、最も一般的には72℃での伸長。次いで、これらの3つの温度は、何回も繰り返される。熱サイクリングプロトコールはまた、典型的には、延長された変性の最初の期間を含み、伸長の延長期間で終わる。
【００３１】
プライマーのTmは、他の要因のうち、長さ、G+C含有量、及び緩衝液条件に応じて変化する。本明細書中で使用される場合、Tmは、目的の反応に使用される緩衝液中のTmを指す。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「検出すること」は、標的の存在を示す検出可能な標識からのシグナルを観察すること指す。より具体的には、検出することは、特定の配列を検出する文脈で使用される。
【００３３】
用語「相補体」、「相補的」又は「相補性」は、ポリヌクレオチド(すなわち、オリゴヌクレオチド又はゲノム核酸等のヌクレオチドの配列)に関して本明細書中で使用される場合、塩基対合則によって関連する。核酸配列の相補体は、本明細書中で使用される場合、一方の配列の5'末端が他方の3'末端と対になるように核酸配列と整列させた場合、「逆平行結合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列5'-A-G-T-3'は、配列3'-T-C-A-5'に相補的である。天然の核酸には一般に見られない特定の塩基が、本開示の核酸に含まれてもよく、それらとしては、例えば、イノシン及び7-デアザグアニンが挙げられる。相補性は完全である必要はない; 安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基対又はマッチしない塩基を含有してもよい。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、並びにミスマッチ塩基対の発生率を含むいくつかの変数を考慮して、経験的に、二重鎖の安定性を決定することができる。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であってもよい。又は、核酸間に「完全な(complete)」、「完全な(total)」又は「完全な(full)」相補性があってもよい。
【００３４】
用語「検出可能な標識」は、本明細書中で使用される場合、プローブに結合し、ゲノム核酸又は参照核酸にハイブリダイズしたプローブを同定するために使用される、分子若しくは化合物又は分子群若しくはプローブ群を指す。
【００３５】
ポリヌクレオチドの文脈における「フラグメント」は、少なくとも約2ヌクレオチド、少なくとも約5ヌクレオチド、少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約100ヌクレオチドである、二本鎖又は一本鎖のいずれかの、一連のヌクレオチド残基を指す。
【００３６】
用語「同一性」及び「同一の」とは、配列間の同一性の程度を指す。部分的同一性又は完全な同一性があり得る。部分的に同一の配列は、別の配列と100％未満同一である配列である。部分的に同一の配列は、少なくとも70％又は少なくとも75％、少なくとも80％又は少なくとも85％、又は少なくとも90％又は少なくとも95％の全体的な同一性を有し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」、「精製された」又は「実質的に精製された」とは、それらの天然の環境から取り出され、単離又は分離され、それらが天然で結合している他の成分から少なくとも60％遊離し、好ましくは75％遊離し、最も好ましくは90％遊離している、核酸等の分子を指す。したがって、単離された分子は、実質的に精製された分子である。
【００３８】
用語「マルチプレックスPCR」は、本明細書中で使用される場合、同じ反応容器内の2種以上の生成物の同時の増幅及び検出を提供するアッセイを指す。各生成物は、異なるプライマー対を使用してプライミングされる。マルチプレックス反応は、異なる検出可能部分で検出可能に標識されている、各生成物に特異的なプローブをさらに含み得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる短いポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、一般に、約10、11、12、13、14、15、20、25、又は30〜約150ヌクレオチド(nt)の長さであり、より好ましくは約10、11、12、13、14、15、20、25、又は30〜約70ntである。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、かつDNA又はRNAポリメラーゼの存在下でプライマーの3'末端へのヌクレオチドの付加を導くオリゴヌクレオチドである。プライマーの3'ヌクレオチドは、最適な伸長及び/又は増幅のために、対応するヌクレオチド位置における標的配列と一般に同一であるべきである。用語「プライマー」は、合成され得るプライマーの全ての形態を含み、ペプチド核酸プライマー、ロックド(locked)核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識プライマー等を含む。本明細書中で使用される場合、「フォワードプライマー」は、DNAのアンチセンス鎖に相補的なプライマーである。「リバースプライマー」は、DNAのセンス鎖に相補的である。
【００４１】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド(例えば、プローブ又はプライマー)は、適切な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズ」する。本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズすること」とは、オリゴヌクレオチド一本鎖が、規定されたハイブリダイゼーション条件下で塩基対合を介して相補鎖とアニールするプロセスを指す。これは、2つの相補的なポリヌクレオチド間の特異的な、すなわち非ランダムな、相互作用である。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の結合の強度)は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドのTm等の要因によって影響される。
【００４２】
用語「アダプター」は、2つの他のDNA分子の末端を連結するために、又は配列決定等の他の操作のための共通の鋳型を提供するために使用される、短い、化学的に合成されたDNA分子を指す。
【００４３】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、2つの核酸配列が高度の相補性を共有することを示す。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容アニーリング条件下で形成し、その後の任意の洗浄ステップの後にハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングのための許容条件は、当業者によって日常的に決定可能であり、例えば、約6×SSCの存在下での65℃で生じ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄ステップが行われる温度に関して、部分的に表され得る。このような温度は、典型的には、規定されたイオン強度及びpHでの特異的配列についての熱融点(Tm)よりも約5℃〜20℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度及びpH下)である。Tmを計算するための式、及び核酸ハイブリダイゼーションのための条件は当技術分野で公知である。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、それが目的の標的にハイブリダイズすることができ、目的ではない核酸に実質的にハイブリダイズすることができない場合、核酸に「特異的」である。高レベルの配列同一性が好ましく、それは、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％の配列同一性を含む。配列同一性は、当技術分野で周知のアルゴリズム(例えば、BLAST)を用いる、デフォルトの設定を使用した市販のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。
【００４５】
用語「目的の領域」とは、配列決定される核酸の領域を指す。
【００４６】
用語「生物学的サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、目的の核酸を含有するサンプルを指す。生物学的サンプルは、臨床サンプル(すなわち、患者から直接得られる)又は単離された核酸を含んでよく、細胞性又は無細胞性の液体及び/若しくは組織(例えば、生検)サンプルであってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、被験体から採取される組織又は体液から得られる。サンプルの供給源としては、限定されないが、痰(処理済み又は未処理)、気管支肺胞洗浄(BAL)、気管支洗浄(BW)、全血、又は任意の種類の単離された血液細胞(例えば、リンパ球)、体液、脳脊髄液(CSF)、尿、血漿、血清、又は組織(例えば、生検材料)が挙げられる。試験サンプル及び参照サンプルを得る方法は、当業者に周知であり、以下に限定されないが、吸引、組織切開、血液若しくは他の液体の引き抜き(drawing)、外科的若しくは針生検、パラフィン包埋組織の収集、体液の収集、糞便の収集等を含む。本文脈において、生物学的サンプルは、好ましくは、血液、血清又は血漿である。用語「患者サンプル」は、本明細書中で使用される場合、疾患の診断及び/又は治療を求めているヒトから得られたサンプルを指す。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、ヒト等の哺乳動物を指すが、別の動物、例えば家庭用動物(domestic animal)(例えば、イヌ、ネコ等)、農用動物(farm animal)(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等)又は実験動物(例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等)であってもよい。用語「患者」は、目的の遺伝子多型を有する又は有することが疑われる「被験体」を指す。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「コピー数の変動」は、DNAの1つ以上のセクションの異常な数のコピーを有する細胞をもたらす、ゲノム内のDNAの変更を指す。ヒトゲノムにおいて、コピー数の変動は、DNAの1つ以上のセクションのホモ接合性若しくはヘテロ接合性の重複(duplication)若しくは増幅(multiplication)、又はDNAの1つ以上のセクションのホモ接合性若しくはヘテロ接合性の欠失を含み得る。
【００４９】
多重化された(multiplexed)サンプル調製
本開示は、マルチプレックス配列決定のためのサンプル調製法を提供する。マルチプレックス配列決定は、複数のサンプルからの、ゲノムDNA等のポリヌクレオチドを含むプールされたサンプルを用いて行うことができる。典型的には、これらの複数のサンプルは、ジェノタイピング解析のための異なる被験体からのゲノムDNA等の、類似配列のポリヌクレオチドを含有する。適切な標識化なしに、特定のポリヌクレオチドが由来する被験体を同定することは困難である。
【００５０】
サンプルに由来する全てのポリヌクレオチドフラグメントに連結されるポリヌクレオチドバーコード(又は単に「バーコード」)の使用を伴う、ポリヌクレオチドサンプルを標識化する方法が本明細書に開示される。マルチプレックス実験では、各サンプルは、他のサンプルによって使用される他のバーコードとは異なるバーコードを使用する。配列決定ステップ中又は配列決定後のデータ分析中に、そのようなバーコードは、その後、配列決定されたポリヌクレオチドの供給源を同定するために使用され得る。
【００５１】
誤読、すなわち、塩基の誤った同定は、次世代シーケンシングによくあり、高い精度の配列同定に対する必要性の欠如又は配列決定されたフラグメントの重複のために許容され得る。しかしそのような誤読は、バーコードを読み違えている場合、サンプルの誤認につながり得る。したがって、これは、バーコードの設計及び使用に対する課題を提示する。
【００５２】
バーコードの使用に伴う別の問題は、バーコード混同キメリズムである。Kircher et al., Nucleic Acid Res., 40(1):e3, 8 pages (2012)は、バーコード(インデックス)当たり、プールされたPCR及び配列決定の間のキメラ形成に起因して0.3％の混入率を見出した。「ジャンピングPCR」とも称されるプロセスである、プールされた増幅及び/又はプールされた配列決定の間のキメラ形成に起因するバーコード混入は、PCR中の鋳型スイッチング及び組換えのために生じると考えられる(Kircher et al., 第2頁、左欄、第二段落)。他の研究では、混入率は、5％〜7.5％と高いことが見出された(例えば、Li and Stoneking, Genome Biol. 13(5):R34, 15 pages (2012)を参照)。驚くことではないが、Broad Institute of MIT and Harvardで開発されたGATKソフトウェアの最近のバージョンでは、混入フィルターが、サンプル中の約5％のフラグメントを表すそのような混入を除去するために使用される。
【００５３】
用語「バーコード混同キメリズム(barcode confusing chimerism)」は、PCRプライマー結合のための配列、及びサンプル識別のための1つ以上のバーコード配列を提供するアダプターにライゲートされた標的ポリヌクレオチドのPCR増幅との関連で本明細書中で使用される。複数の標的ポリヌクレオチドが、1つの鋳型として、一緒に増幅され、アダプター/バーコードのそれらの包含によって、標的ポリヌクレオチド間の組換えに起因して1つのPCR増幅においてアンプリコンを生成する場合、バーコード混同キメリズムが生じる。換言すれば、バーコード混同キメリズムは、異なるサンプルに割り当てられた(及び以前にそのフラグメントにライゲートされた)バーコード配列にPCR増幅中に結合された、1つのサンプルに由来する配列フラグメントの結果である。
【００５４】
本技術は、他の既存の方法に比べてコスト削減を向上させる、バーコード混同キメリズムをもたらさない又は最小レベルのバーコード混同キメリズムをもたらす、サンプル調製法を提供する。いくつかの態様では、プールサンプルがマルチプレックスサンプル調製法を用いて調製された後、1つ以上のPCR増幅ステップ中に生成された増幅産物の約3％未満が、バーコード混同キメリズムから生じる。いくつかの態様では、約2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、又は0.01％未満の増幅産物は、このようなキメリズムから生成される。
【００５５】
断片化、平滑化、5-リン酸化、ライゲーション、及びニックトランスレーション
図1Aを参照すると、2つのアダプターが、サンプル中の各ポリヌクレオチドフラグメントの両端に付加される。ポリヌクレオチドフラグメント、例えば断片化ゲノムDNAは、超音波処等の当技術分野で公知の方法により調製することができる。超音波処理を用いて、例えば、周波数又は出力を調整することにより、所望の平均長のフラグメントを得ることができる。いくつかの態様では、フラグメントは、少なくとも約50塩基対(bp)の長さであり、あるいは、少なくとも約100bp、150bp、又は200bpである。いくつかの態様では、フラグメントは、約1000bp以下の長さであり、あるいは、約500bp、400bp、300bp又は250bp以下の長さである。
【００５６】
次いで、断片化されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるアダプターにライゲートされ得るように平滑化及び5'-リン酸化されてよい。このプロセスは、NEB Quick Blunting Kit(登録商標)等の市販のキットを用いて行うことができる。
【００５７】
両方のアダプターは、部分的に二本鎖である。第一のアダプター(図1Aのフラグメントの上端に示される)は、二本鎖バーコード領域、及び部分的に二本鎖のアダプター領域(「第一のフラグメント」と称される)を含む。図1Aに例示される第一のフラグメントは、配列CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号1)を有するより長い鎖、及び9塩基の長さであり、かつ配列番号1のヌクレオチド20〜28に相補的であるより短い鎖を含む。
【００５８】
図1Aに例示するように、バーコードは、6bpの長さである(「XXXXXX」として示される)。しかし、バーコードはより長くてもよいこと、例えば、7bp又は8bpであってもよいことが理解される。いくつかの実施形態では、バーコードは、4bpを超える長さであり、すなわち、5bpを超える、6bpを超える、7bpを超える、8bpを超える、9bpを超える、10bpを超える、12bpを超える、20bpを超える、又は25bpを超える。いくつかの実施形態では、バーコードは、25bp未満、20bp未満、15bp未満、12bp未満、又は10bp未満である。これらのバーコードは、配列決定ステップの間に配列決定されるが、配列決定に対する追加の大きな負荷を生じない。
【００５９】
第一のフラグメントは、その後のPCR増幅及び/又は配列決定のために有用な配列を含むことができる。しかし、このような配列は、PCR又は配列決定プライマーの全長を含む必要はない。いくつかの態様では、第一のアダプターの全長は(より長い鎖を考慮して)、40塩基以下である。いくつかの態様では、全長は、39塩基、又は38塩基、37塩基、36塩基、35塩基、34塩基、33塩基、32塩基、31塩基又は30塩基以下である。
【００６０】
同様に、第二のアダプター(図1Aの下半分)は、部分的に二本鎖であり、第二のアダプターの長さは(より長い鎖を考慮して)、40塩基、39塩基、又は38塩基、37塩基、36塩基、35塩基、34塩基、33塩基、32塩基、31塩基又は30塩基以下である。図1Aに例示される第二のアダプターは、CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT(配列番号2)の配列を有するより長い鎖、及び9塩基の長さであり、かつ配列番号2のヌクレオチド21〜33に相補的であるより短い鎖を有する。
【００６１】
両方のアダプターは、その平滑末端でリン酸化されておらず、そのため、アダプターは、自己ライゲートすることができず、所望の配列決定標的であるポリヌクレオチドフラグメントとのみライゲートすることができる。このようなライゲーションは、市販のリガーゼ又はリガーゼキットを用いて当技術分野における方法で行うことができる。
【００６２】
いくつかの態様では、ライゲーションは、ポリヌクレオチドフラグメント間の二量体の形成を低減するために、ポリヌクレオチドフラグメントよりも高い濃度でのアダプターの濃度を用いて行われる。一態様では、アダプターのモル濃度は、全てのポリヌクレオチドフラグメントのモル濃度より少なくとも5倍高い。別の態様では、差は少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍、200倍又は1000倍である。
【００６３】
ライゲーションすると、ライゲーション産物の約半分は、第一のアダプター及び第二のアダプターを含有する。約半分は、2つの第一のアダプター又は2つの第二のアダプターのいずれかを含有する。両端に同一のアダプターを有するポリヌクレオチドは、その後のステップにおいて、第一のアダプター及び第二のアダプターを有するポリヌクレオチドに比べて、増幅されることができず又は効率的に増幅されることができず、増幅及び配列決定プロセスを妨害しない傾向がある。
【００６４】
ポリヌクレオチドフラグメントのみがライゲーションの前に5'-リン酸化されるため、ライゲーション産物は、ライゲーション部位に2つのニック(図1Aに示される)を含有する。さらに、ライゲーション産物の両端はアダプターに由来する一本鎖領域を有するため、いくつかの態様では、ニックを埋め、より短い鎖を伸長するために、その後のニックトランスレーションステップが行われる。このような手順は、例えば、当技術分野で公知であり市販されている、鎖置換(strand displacing)DNAポリメラーゼを用いて行うことができる。
【００６５】
所望の場合、ニックトランスレートされたポリヌクレオチドフラグメント(図1B)は、場合により、ポリヌクレオチドフラグメントの濃度を高めるために、PCRによって増幅され得る。
【００６６】
バーコード設計
本発明のバーコードには、いくつかの要件がある。第一に、1つのサンプルで使用されるバーコードは、一緒にプールされ配列決定される全ての他のサンプルで使用されるバーコードとは相違しなければならない。潜在的な配列決定エラーのために、一塩基エラーがサンプル誤認を生じないように、より大きな相違が好ましい。第三に、96ウェル又は384ウェルプレートフォーマットを利用して、数十のサンプル、又はさらに多くのサンプルが一度に処理されるため、バーコードの短い長さを考慮すると、バーコードがどれだけ相違し得るかには限界がある。
【００６７】
本開示は、バッチ内のバーコード間の相違を最大化するために、バーコードを設計し、選択する方法を提供する。
【００６８】
バーコードが6bpの長さであれ、7bpの長さであれ、又は8bpの長さであれ、バーコードには限られた数の可能な配列しかない。2個以下の連続した塩基が同じであってよく、各バーコードは、任意の他のバーコードとは少なくとも2bp相違しなければならないというさらなる制限があり、配列の総数はさらに低減される。いくつかの態様では、各バーコードは、任意の他のバーコードとは少なくとも3bp相違する。
【００６９】
いくつかの態様では、本方法は、上記の基準に適合する、可能なバーコードのマトリックス、リスト、又はデータベースの生成を伴う。マトリックスは、例えば、バーコード間の相違を表す数値をさらに含む。あるいは、バーコードは、相違が明らかであるように、バイナリーコード又はハミングコード(Hamming code)として表される。所望の数のバーコードを有し、それらの間の相違が最大化された、サブセクション(例えば、サブマトリックス)が同定され得るようなやり方で、マトリックスはバーコードの組織化を可能にする。
【００７０】
例えば、所望のサンプル処理フォーマットが96ウェルプレートにおけるものである場合、96個のメンバーのサブマトリックスが同定され得る。96個のバーコードの実例リストが以下の表1に提供される。
【００７１】
【表１】
2016520326.tif 000003
2016520326.tif 000004
【００７２】
いくつかの態様では、本方法は、少なくとも5、6、7、8、9、10、20、30、40、48、50、60、70、80又は90個のサンプルの調製を伴う。したがって、対応する数のバーコードは、必要に合わせて、サブマトリックス(例えば、表1)から選択され得る。
【００７３】
クリーンアップ
例えば、ポリヌクレオチドの断片化後、ライゲーション後、ニックトランスレーション後、及び/又はPCR増幅後を含めた、先行する手順の各ステップ後に、クリーンアップを行うことができる。クリーンアップの目的は、所望の生成物を「精製」することである。精製という用語は、ここで使用される場合、存在する必要がない、サンプル中の全ての成分の除去を必要としない。その代わりに、精製プロセスは、除去することが意図される成分(「混入物」)と比べて、サンプル中の所望の成分の濃度を高める。
【００７４】
クリーンアップの1つの目的は、サンプルから、塩、緩衝液、ヌクレオチド、より小さいポリヌクレオチド、例えばアダプターを除去することである。この文脈において、サイズ選択ビーズ又はカラムが好適であると考えられるが、他の方法も使用することができる。サイズ選択ビーズ又はカラムは、分子量における相違によって、サンプル中の成分を分離することができる。その一例は、固相可逆的固定化(SPRI)ビーズ、例えばAgencourt Bioscience Corporation(Beverly, MA)から市販されているものである。
【００７５】
いくつかの態様では、各ステップの後の各サンプルのクリーンアップは、同じビーズ又はカラムを用いて行われる。換言すれば、ライゲーション後のサンプルを精製するために使用されるビーズ又はカラムは、ニックトランスレーション及び/又はPCR増幅後に、同じサンプルを精製するために再び使用(「リサイクル」)され得る。これは、サンプル調製コストをより一層低減させることに必ず役立つ。
【００７６】
サンプルプーリング(sample pooling)、選択及び濃縮
ニックトランスレートされたポリヌクレオチドフラグメントは、すでに識別バーコードを含有しているため、プールされ分析される準備ができている。いくつかの態様では、選択を用いて、配列決定されることが望まれている配列、例えば特定の遺伝子又はエキソン、を濃縮することができる。いくつかの態様では、アダプターは配列決定プライマー全体を含むには短すぎることがあり得るため、ポリヌクレオチドフラグメントは、適切なプライマーを用いて濃縮増幅中に伸長され得る(すなわち、図1B〜図1C)。
【００７７】
多くの方法が、配列選択に利用できる。一例では、相補的な配列を有するポリヌクレオチドフラグメントを捕捉するために、適切な核酸プローブがベイト(bait)として固体支持体上に固定化される。この関連において、比較的短いアダプターを使用する本技術は、異なるポリヌクレオチドフラグメント上のアダプター間の結合に起因するポリヌクレオチドフラグメントの非特異的捕捉を低減することに役立つことは注目される。選択は、コストを節約するために、プールされたサンプルに対して行うことができる。しかし所望の場合、選択は、各サンプルのために個別に行うことができる。
【００７８】
いくつかの態様では、プールされたサンプル中のポリヌクレオチドフラグメントは、その後の増幅及び/又は配列決定のための完全なプライマーを組み込むために、ポリヌクレオチドフラグメントを伸長するプライマーを用いたPCR増幅に供される。いくつかの態様では、PCR増幅は、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いる。第一のプライマーは、第一のアダプターの第一のフラグメントに相補的な第一の部分、及び第一の部分との組み合わせでその後の配列決定を可能にする第二の部分を含有する。同様に、第二のプライマーは、第二のアダプターに相補的な第一の部分、及び第一の部分との組み合わせでその後の配列決定を可能にする第二の部分を含有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、これらのプライマーを組み込むと(図1C参照)、ポリヌクレオチドフラグメントは、各末端に、イルミナ(Illumina)のプラットフォーム上で次世代シーケンシングを可能にするための適切な配列を含有する。図1E〜Fに示すように、ポリヌクレオチドフラグメントに付加された追加のヌクレオチドは、フローセルオリゴ(flow cell oligo)に結合し、クラスター生成に使用することができる領域、及びMiSeq、HiSeq、若しくは他のイルミナ適合配列決定プライマーに結合するための別の領域を含む。
【００８０】
図1Cに示される実例PCR産物は、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(配列番号3)の第一のプライマー、及びCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACC(配列番号4)の第二のプライマーを用いて増幅される。
【００８１】
定量的PCR
プールされたサンプルは、(1)ポリヌクレオチドフラグメントの濃度をさらに増加させ、(2)適切な量のアンプリコンがその後の配列決定のために回収され得るようにアンプリコンを定量する、定量的PCR(qPCR)増幅ステップをさらに受けることができる。
【００８２】
いくつかの態様では、qPCRは、第一のプローブ、及び/又はプライマーに加えて第一のプローブを使用する。そのようなプローブの例としては、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号5、図1DにおいてP5_プローブ1として示される)、及びCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT(配列番号6、図1DにおいてP7_プローブ1として示される)が挙げられる。いくつかの態様では、使用されるプライマーは、AATGATACGGCGACCACCGAGATC(配列番号7、図1DにおいてilluPE_qPCR_Fとして示される)、及びCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC(配列番号8、図1DにおいてilluPE_qPCR_Rとして示される)の配列を有する。
【００８３】
いくつかの態様では、プローブは、1つ以上の検出可能な標識を含む。例えば、各プローブは、一方の末端にフルオロフォア(例えば、ヘキサクロロフルオレセイン(HEX))を含むことができる。さらに、そのようなプローブは、他方の末端にクエンチャー(例えば、IDTのブラックホールクエンチャー1)をさらに含むことができる。2つのプローブの使用は、qPCRにおけるより高い定量精度を可能にする。
【００８４】
配列決定及びデータ解析
qPCR後、所望の量のポリヌクレオチドが配列決定のために使用される。いくつかの態様では、配列決定は、次世代プラットフォーム上で、例えばイルミナの合成による配列(sequence-by-synthesis)プラットフォーム上で行われる。断片化ポリヌクレオチドの両端に付加された配列は、フラグメントが、いずれかの又は両方の末端で、フローセル(flow cell)に結合されることを可能にする。配列決定は、いずれかの鎖のいずれかの末端から行うことができる(図1E〜F)。
【００８５】
いずれかの末端から、配列決定は、バーコードを組み込んでいるポリヌクレオチドの配列を同定することができる。次いで、時折の誤読が生じた場合でも、本明細書に開示されるようにバーコード間の最大化された相違を考えると、同定されたバーコード配列を使用して、配列決定後のデータ解析ステップの間、フラグメントを、特定のサンプルに対応するものと同定することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、目的の位置でのコピー数の変動を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、コピー数の変動を検出するための本明細書に開示される方法の使用は、バックグラウンドノイズを最小にする、ハイブリダイゼーション条件の単一セットを提供する利点を有する。いくつかの実施形態では、コピー数の変動を検出する場合、コピー数の分析は、対照サンプルとの比較に基づく。いくつかの実施形態では、コピー数の変動を検出する場合、マルチプレックスランにおけるサンプルのほとんどが、コピー数に関して正常であると考えることができる場合、コピー数の分析は、マルチプレックスランにおける他のサンプルとの比較に基づく。いくつかの実施形態では、コピー数の分析は、全配列アウトプットにおけるサンプル変動性に対する、サンプルについての正規化を含む。いくつかの実施形態では、コピー数分析の精度を補助するために、目的の位置以外の領域における全配列アウトプットも分析される。
【００８７】
組成物及びキット
本技術を実施するのに適した組成物及びキットも提供される。一実施形態は、それぞれが異なるバーコードを含む、少なくとも48個のポリヌクレオチド配列を含む組成物及びキットを提供する。いくつかの態様では、バーコードは、表1から選択される。いくつかの態様では、組成物又はキットは、少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、94、95又は96個のそのようなポリヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖であり、ここで、バーコードは非リン酸化平滑末端を有する二本鎖である。いくつかの態様では、開示された方法を実行するために、組成物又はキットは、本明細書に記載のように、緩衝液、溶媒、プレート、及び/又は酵素をさらに含む。
【００８９】
したがって、本開示は、好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されその中に具体化される選択的特徴、改変、改良及び変化が当業者によって用いられ、そのような改変、改良及び変化は本開示の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。本明細書に提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本開示の範囲を限定することは意図されない。
【００９０】
本開示は、広く一般的に、本明細書に記載されている。一般的な開示内に入る、より狭い種及び亜属のグループのそれぞれも、開示の一部を形成する。これは、切り出し材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の対象物を取り除く但し書き又は否定的限定を有する本開示の一般的な記述を含む。
【００９１】
さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本開示がまた、それによって、マーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバー又はサブグループに関して記載されていることを認識する。
【００９２】
全ての刊行物、特許出願、特許、及び本明細書に記載されるその他の参考文献は、それぞれが個々に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００９３】
本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素、限定の不在下で適切に実施されてもよい。したがって、例えば、用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含む(containing)」等は、拡張的にかつ限定なしに読まれる。さらに、本明細書で用いられる用語及び表現は、説明及び非限定の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用には、示され記載された特徴又はその部分の任意の等価物を排除する意図はないが、種々の改変が、特許請求の範囲に記載の開示の範囲内で可能であることが認識される。
【００９４】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載される。
【図１Ａ−Ｄ】
2016520326.tif 000005
【図１Ｅ−Ｆ】
2016520326.tif 000006
【図２】
2016520326.tif 000007
【配列表】
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【国際調査報告】
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