(57)【要約】  グラム陰性菌系統が、分類不可能なインフルエンザ菌のNT013、NT017及びNT022等の少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質を不活性化することによって作成される。この系統由来の小胞が、ワクチン接種に有用である。【選択図】図１
2016520040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているグラム陰性菌由来の小胞、及び(b)薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質がノックアウトされている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が、NTHiのNT013、NT022及びNT017のいずれか1つ、又はそのホモログ、オルソログ若しくはパラログから選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
グラム陰性菌が、分類不可能なインフルエンザ菌、髄膜炎菌及び百日咳菌から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
グラム陰性菌が、分類不可能なインフルエンザ菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
グラム陰性菌が、分類不可能なインフルエンザ菌ではない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ワクチンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
グラム陰性菌に対する免疫剤としての使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物に有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物においてグラム陰性菌による感染を防ぎ、又は治療する方法。
【請求項１１】
哺乳動物に請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、哺乳動物において抗体応答を高める方法。
【請求項１２】
少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているグラム陰性菌由来の小胞と、薬学的に許容可能な担体を混合するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項１３】
いかなる生菌及び/又は全細菌も含まない、請求項１〜６のいずれか一項に規定されるグラム陰性菌の小胞を含む、組成物。
【請求項１４】
細菌の培養物から小胞を得るステップを含む、少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているグラム陰性菌由来の小胞を調製する方法。
【請求項１５】
培地での増殖中に、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌より、より大量の小胞を培地中に放出し、並びに/又は異なるタンパク質含有量及び/若しくは組成を有する小胞を産生する、請求項１〜６のいずれか一項に規定されるグラム陰性菌。
【請求項１６】
グラム陰性菌を調製する方法であって、培地において増殖させる場合に、修飾により細菌が、出発細菌よりも大量の小胞を培地中に放出するように、且つ/又は出発細菌と異なるタンパク質含有量及び/若しくは組成を有する小胞を放出するように、1つ以上のLytM触媒ドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子を修飾するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、国際出願PCT/EP2013/058459号(2013年4月24日出願)の利益を主張し、その全内容は、全ての目的について、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特に免疫原性組成物、例えばワクチンに使用するための、グラム陰性菌由来の小胞の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
グラム陰性菌は、細胞エンベロープの膨圧のために、増殖中にその外膜から小胞を自然発生的に放出する場合がある。そのような小胞の形成は、ある種の細菌成分の崩壊によって促進され得、例えば引用文献1及び2は、大腸菌(E. coli)のTol-Pal系を崩壊させて、増殖中に小胞を培地中に放出する系統を提供した。小胞はまた、細菌全体の崩壊によっても生産され得る。既知の小胞生産方法として、界面活性剤処理(例えばデオキシコレート(deoxycholate)による)を用いる方法[3及び4]、界面活性剤フリーの方法[5]、又はソニケーション[6]等が挙げられる。
【０００４】
これらの小胞(典型的にブレブ及び外膜小胞(OMV)と呼ばれる場合がある)は、免疫原性細胞表面関連ペリプラズム分泌抗原が豊富であり、(例えば髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)血清群Bに対する)ワクチンとして用いられてきた([7])。小胞はアジュバントとして作用する、抗原に対する強い免疫応答を誘発する化合物を含有するため、この使用に特に適している。このように、小胞は、免疫系について、精製抗原性タンパク質又は他の細菌成分よりも、本来の細菌に近い模倣体である。しかしながら、小胞は細菌に由来するので、典型的には、エンドトキシンのような反応源性(reactogenic)の細菌成分を取り除く処理を必要とする。これは、界面活性剤処理等によって達成され得る[8]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、これらの小胞、特にワクチンとして用いられ得る小胞を調製するための、さらに向上した成分を提供することである。本発明の具体的な一目的は、小胞の生産に適合させたグラム陰性菌を提供することである。例えば、細菌は、小胞の高い収率、タンパク質含有量及び/又は組成が変更された小胞、及び交差防御有効性が向上した小胞を提供するのに適合させ得る。
【０００６】
特にインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に関して、広範囲のインフルエンザ菌系統に対して保護するワクチンを提供する必要がある。インフルエンザ菌は、新しいニッチに適応して広範囲の疾患を引き起こす能力が高い可変性の微生物である。適応度、病原性及びコロニー形成因子が変化して、微生物は異なる組織及び宿主に適応することができる。したがって、潜在的な抗原は、高い選択圧に曝され、結果として、異なる系統間で配列可変性を有する場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
グラム陰性菌は、膜構造の2枚の連続する層によって、外部媒体から隔てられている。これらの構造体は、細胞質膜及び外膜(OM)と呼ばれ、構造的且つ機能的に異なっている。外膜は、病原性細菌のそれぞれの宿主との相互作用において重要な役割を果たす。結果的に、表面曝露細菌分子は、宿主免疫応答にとって重要なターゲットの代表例であり、そのため外膜成分は、ワクチン、診断及び治療試薬を提供するのに魅力的な候補となっている。
【０００８】
本発明は、LytM触媒ドメインを共通して有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子の突然変異又は欠失が、細菌細胞分裂及び細菌表現型の大きな変化をもたらすことを記載する。発明者らはまた、前記突然変異又は欠失が、OMV又は外膜小胞として知られている小胞の放出をもたらす一方で、同じ野生型NTHi系統はOMVを通常放出しないことも示した。
【０００９】
発明者らは、LytM触媒ドメインを含有するタンパク質の正常な発現が崩壊している(即ち、タンパク質が不活性化されている)グラム陰性菌を作成し、これらの細菌が、小胞の調製に有利となり得る特性を有することを観察した。これらの特性として、小胞を形成する傾向の増大、並びに結果として生じる小胞中に存在するタンパク質の性質及び/又は量の変化が挙げられる。大腸菌において、LytMドメインを有する分裂機構の2つの成分(EnvC及びNlpD)が、細胞分離の原因となる細胞壁ヒドロラーゼ(アミダーゼ)(AmiA、AmiB、及びAmiC)の直接的調節剤であることは周知であった[9]。大腸菌中のLytMメタロプロテアーゼが、娘細胞分離に絶対的に必要とされることも知られている。
【００１０】
特に好ましい一実施形態において、NT013及び/又はNT022を欠失させることによって、細菌の細胞分裂が影響を受けるだけでなく、通常OMVを放出しないNTHI系統内で外膜小胞(OMV)が驚くほど産生且つ放出されることが記載されている。
【００１１】
特に、以下でより詳細に示されるように、分類不可能なインフルエンザ菌(NTHi)において、NT013の欠失により、例えば欠失のないNHTiと比較すると、小胞放出の増大、並びに結果として生じる小胞のタンパク質含有量及び/又は組成の変化が生じることが示された。
【００１２】
以下でより詳細に示されるように、例えば欠失のないNHTiと比較すると、NTHiにおけるNT017の欠失により、結果として生じる小胞のタンパク質含有量及び/又は組成の変化が生じる。
【００１３】
以下でより詳細に示されるように、例えば欠失のないNHTiと比較すると、NTHiにおけるNT022の欠失により、小胞の放出の増大、並びに結果として生じる小胞のタンパク質含有量及び/又は組成の変化が生じる。
【００１４】
変異した細菌の増殖速度は、既知のTolR変異体の増殖速度とは異なり、野生型の増殖速度に匹敵し得る。
【００１５】
したがって、本発明は、少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているグラム陰性菌、及び当該細菌から小胞を調製する方法を提供する。本発明はまた、この細菌から得た又は得られる小胞、及びこれらの小胞を含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は特に、ワクチンとして用いられ得る。
【００１６】
ゆえに、本発明は、少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているグラム陰性菌を提供する。一実施形態において、これは、培地での増殖中に、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌より、より大量の小胞を培地中に放出する細菌、且つ/又は異なるタンパク質組成を有する小胞を放出する細菌をもたらす。場合によっては、少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質は、発現されない。
【００１７】
本発明はまた、培地での増殖中に、1つ以上のLytM触媒ドメイン含有タンパク質が、修飾のない同じ細菌よりも大量の小胞を培地中に放出するような修飾、且つ/又は修飾のない同じ細菌と異なるタンパク質含有量及び/若しくは組成を有する小胞を放出するような修飾を有するグラム陰性菌を提供する。
【００１８】
特に、本発明はまた、本発明の抗原(例えばNT013、NT017及びNT022)の1つ以上がノックアウトされているNTHi細菌を提供する[10]。ノックアウト細菌を生産するための技術は周知であり、NTHi系統からの遺伝子ノックアウトが、例えば引用文献11に報告されている。
【００１９】
本発明はまた、本発明の抗原(例えばNT013、NT017及びNT022)の1つ以上がその活性を抑制する突然変異を有するNTHI細菌を提供する。抗原をコードする遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変える、又はその発現を無効にする突然変異を有することとなる。突然変異は、欠失、置換及び/又は挿入を含んでよく、いずれも1つ以上のアミノ酸を含み得る。
【００２０】
一実施形態は、本発明の抗原(例えばNT013、NT017及びNT022)をコードする1つ以上の遺伝子の欠失を提供する。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、LytM触媒ドメインを有するポリペプチドをコードするNTHI遺伝子を提供する。概して、メタロプロテアーゼは、その触媒ドメイン中にHxH及びHxxxDアミノ酸ドメインを含有すると同定されている。好ましくは、これらの1つ以上の遺伝子は、NT013、NT022又はNT017のいずれか1つをコードしている。
【００２２】
好ましい実施形態は、NT013、NT022又はNT017のいずれか1つをコードする1つ以上の遺伝子の欠失があるNTHI系統を提供する。例えば、欠失される遺伝子は、エリスロマイシン抵抗性カセット等の抗生物質抵抗性カセットで置換されてよい。上記された全てのポリペプチドは共通してLytM触媒ドメインを有し、且つ全てメタロプロテアーゼであることが見出された。
【００２３】
NT013及びNT022中のLytMドメインは保存されていることも見出された。NT013触媒活性部位は、C末端部分にて以下のアミノ酸モチーフ-HKGD-及び-HLH-によって表される。NT022触媒活性部位は、C末端にて以下のアミノ酸のモチーフ-NKGID-及び-KLH-によって表される。
【００２４】
本発明はまた、グラム陰性菌を調製する方法であって、培地において増殖させる場合に、修飾により細菌が、出発細菌よりも大量の小胞を培地中に放出するように、且つ/又は出発細菌と異なるタンパク質含有量及び/若しくは組成を有する小胞を放出するように、1つ以上のLytM触媒ドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子を修飾するステップを含む方法を提供する。変異ステップは、遺伝子を不活性化する(例えば、変異させる、又は欠失させる)ことができる。
【００２５】
本発明の変異細菌は、特に、NTHi抗原(例えば、本発明の抗原(例えばNT013、NT017及びNT022))を含み、且つ免疫原として用いられ得る細菌外膜小胞を調製するのに有用である。
【００２６】
本発明のOMVを過剰産生するNTHi細菌を生じさせる方法もまた提供され、当該方法は、以下の1つ以上のプロセスによってグラム陰性菌の系統を遺伝的に修飾することを含む:(a)1つ以上のTol遺伝子の発現を下方制御するように系統を操作すること、且つ(b)ペプチドグリカン関連部位を含むタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を変異させて、タンパク質のペプチドグリカン結合活性を弱めること、(c)LytM触媒ドメインを共通して有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子の突然変異又は欠失。特に好ましい一実施形態において、NTHiは、活性NT013、NT022遺伝子及び/又はいずれのTol遺伝子[11]、[10]も発現し得ない。一実施形態において、修飾は、LytM触媒ドメインを共通して有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子の突然変異又は欠失である。
【００２７】
本発明はまた、例えば本明細書中で参照される任意の方法を用いて、本発明の細菌から単離された又は得られる小胞を提供する。この小胞は、ワクチンの成分として有用である。
【００２８】
本発明はまた、グラム陰性菌、例えばNTHiの小胞を調製するプロセスであって、外膜が小胞を形成するように、本発明のグラム陰性、例えばNTHi細菌を処理するステップを含むプロセスを提供する。
【００２９】
本発明はまた、グラム陰性菌の、例えばNTHiの小胞を調製するプロセスであって、外膜が小胞を自然発生的に生じさせる条件下で、本発明のグラム陰性、例えばNTHi細菌を培養するステップを含むプロセスを提供する。
【００３０】
本発明はまた、小胞を調製するプロセスであって、細菌による培地中への小胞の放出を可能とする条件下で増殖した本発明の細菌を含む培地から、小胞を分離するステップを含むプロセスを提供する。このプロセスによって調製された小胞は、ワクチンを含む医薬組成物の成分として用いられ得る。
【００３１】
本発明はまた、細菌による培地中への小胞の放出を可能とする条件下で増殖させた本発明の細菌を含む培地を提供する。小胞は、この培地から精製され得る。
【００３２】
本発明はまた、本発明の細菌の培養中に、培地中に放出される小胞を含む組成物を提供する。この組成物は、生細菌及び/又は細菌全体を全く含まない。この組成物及び/又はその成分は、ワクチンの調製に用いられ得る。
【００３３】
本発明の小胞を含む医薬組成物は、医療において、例えば感染を治療又は予防する方法において、及び抗体応答を高める方法において用いられ得る。
【００３４】
本発明はまた、小胞を含む組成物であって、小胞が、本発明の細菌を増殖させた培地を0.22μmフィルタにより濾過した後に得られる濾液中に存在する、組成物を提供する。この組成物及び/又はその成分は、ワクチンの調製に用いられ得る。
【００３５】
LytMドメイン含有タンパク質
本発明に従えば、1つ以上のLytMドメイン含有タンパク質が、グラム陰性菌において修飾されている。典型的には、これは(例えば突然変異又は欠失による)不活性化である。これにより、細菌は、培地での増殖中に、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌より、(i)より大量の小胞、並びに/又は(ii)異なるタンパク質含有量及び/若しくは組成を有する小胞を放出し得る。種々の修飾がなされてよい。
【００３６】
ペプチダーゼのリソスタフィン型のメタロプロテアーゼ(LytM)は広く分布しており、バクテリオファージ、グラム陽性菌及びグラム陰性菌において見られる。触媒LytMドメインを含有するメタロプロテアーゼは、M23ペプチダーゼファミリーに属しており[12]、このドメインは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の分泌自己溶解酵素において初めて同定された[13]。
【００３７】
LytMドメイン、及びそれ故にLytMドメイン含有タンパク質は、一般に、大腸菌のEnvC、NlpD及びYebA、非莢膜形成(分類不可能な)インフルエンザ菌のNT013、NT017又はNT022等の既知のLytMドメイン含有タンパク質由来のLytMドメインとの配列同一性に基づいて同定され得る。
【００３８】
ゆえに、LytMドメインは典型的に、本明細書中で参照される任意のLytMドメインの配列と少なくとも30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%の配列同一性を有する。LytMドメイン含有タンパク質は、LytMドメインを含有する。LytMドメイン及びLytMドメイン含有タンパク質の例示的な配列が、以下に提供される。
【００３９】
【表１】
2016520040.tif 000003
2016520040.tif 000004
【００４０】
抗原NT013は、TPRリピート含有タンパク質、またシトクロムc熟成ヘムリアーゼサブユニットCcmH2という注釈が付される。これは、系統86-028NPにおいてNTHI0532として公開された。NT013は、メタロプロテアーゼタンパク質ファミリーに属するという注釈が付され、且つLytM触媒ドメインを有する。
【００４１】
NT013抗原は、本来のN末端42アミノ酸配列(配列番号1のアミノ酸1から42)を有する。本来のN末端42アミノ酸配列のないNT013抗原は、配列番号85によって表される。
【００４２】
抗原NT017は、86-026NP系統において生存タンパク質SurA様タンパク質NTHI0915という注釈が付された。
【００４３】
NT017抗原は、本来のN末端20アミノ酸配列(配列番号3のアミノ酸1から20)を有する。本来のN末端42アミノ酸配列のないNT017抗原は、配列番号86によって表される。
【００４４】
抗原NT022は、系統NP86-028由来のNTHI0830という注釈が付され、考えられる外膜抗原性リポタンパク質Bであると同定された。これはFi176系統からクローニング且つ発現された。これは、LytM触媒ドメインを含有すること、並びに表面曝露及び分泌されることが見出された。
【００４５】
NT022抗原は、本来のN末端18アミノ酸配列(配列番号5のアミノ酸1から18)を有する。本来のN末端18アミノ酸配列のないNT022抗原は、配列番号87によって表される。
【００４６】
LytMドメイン含有タンパク質のホモログが種々のグラム陰性菌において見出され、例が以下の表に記載されている。
【００４７】
【表２】
2016520040.tif 000005
【００４８】
LytMドメインは、モチーフHxxxD(配列番号13)及び/又はHxH、例えばHKGVD(配列番号14)、HRGVD(配列番号15)、HTGID(配列番号16)、HLHを含有してよい。他の具体的なモチーフとして、NKGVD(配列番号17)、TKGID(配列番号18)、NKGID(配列番号19)、QLH、RLH、KLH、WKGVF(配列番号20)、WRGLV(配列番号21)、WKGMV(配列番号22)、GLY、SLY、ALYが挙げられる。
【００４９】
NTHi抗原即ちタンパク質は、文献、例えば「NTHI」ナンバリング(系統86-028NPのゲノム由来)の命名規則を参照することによって先に定義されている。そのような規則は、引用文献14(特に表1)においてより詳細に説明されている。ゆえに、本明細書中で参照される任意の抗原即ちタンパク質の例示的なアミノ酸及びヌクレオチドの配列は、示された系統についての公開の配列データベースにおいて(機能的な注釈等の付加的な情報と一緒に)容易に見出され得るが、本発明は、86-028NP系統由来の配列に限定されない。いくつかの他のNTHI系統のゲノム配列が入手可能である(ここでも、引用文献14の表1参照)。標準的な検索及びアラインメント技術を、これらの(又は他の)更なるゲノム配列のいずれにおいても、本明細書中に与えられる任意の特定の配列のホモログを同定するのに用い得る。さらに、入手可能な配列は、他の種及び系統からの相同配列の増幅用のプライマーを設計するのに用いられ得る。ゆえに、本発明は、これらの具体的な種及び系統、又は例示された配列が見出される系統に限定されず、むしろ他のグラム陰性、例えばNTHI系統由来のそのような変異体及びホモログ、そのような変異体及びホモログが見出される種及び系統の使用、並びに非天然の変異体を包含する。一般に、特定の配列番号の適切な変異体として、その対立遺伝子変異体、その多型形態、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その突然変異体等が挙げられる。本発明の実施形態において、LytMドメイン含有タンパク質として、NTHiのNT013、NT022又はNT017のホモログ、オルソログ又はパラログがある。
【００５０】
ゆえに、例えば、本発明に用いられる、即ち本発明を行う中で修飾されるポリペプチド又はタンパク質は、本明細書中の配列番号と比較して、1つ以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9等)のアミノ酸置換、例えば保存的置換(即ち、あるアミノ酸の、同類の側鎖を有する別のアミノ酸との置換)を含んでよい。遺伝的にコードされるアミノ酸は概して、4つファミリー:(1)酸性、即ちアスパルテート、グルタメート、(2)塩基性、即ちリジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)無極性、即ちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び(4)非荷電極性、即ちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。一般に、これらのファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物活性に大きな影響を及ぼさない。ポリペプチド即ちタンパク質はまた、配列番号の配列に対して1つ以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9等)の単一アミノ酸の欠失を含んでもよい。ポリペプチドはまた、配列番号の配列に対して1つ以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9等)の挿入(例えば、1、2、3、4又は5つの各アミノ酸)を含んでもよい。
【００５１】
同様に、本発明に用いられる、即ち本発明を行う中で修飾されるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含んでよい:
(a)配列リストに開示される配列と同一である(即ち、100%同一)、
(b)配列リストに開示される配列と配列同一性を共有する(例えば30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又はそれ以上)、
(c)(a)若しくは(b)の配列と比較して、別個の位置にあってもよいし、連続していてもよい1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10(又はそれ以上)の単一アミノ酸の改変(欠失、挿入、置換)を有し、且つ/又は
(d)ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて、配列リスト由来の特定の配列とアラインされた場合、N末端からC末端へのxアミノ酸の各移動ウインドウ(pアミノ酸(p>x)にまで伸長するアラインメントについて、ウインドウはp-x+1である)が、少なくともx・y個の同一アラインドアミノ酸を有し、xは、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200から選択され、yは、0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99から選択され、x・yが整数でなければ、最も近い整数になるように四捨五入される。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Needleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム[15]であり、デフォルトのパラメータを用いる(例えば、ギャップオープニングペナルティ=10.0であり、ギャップ伸張ペナルティ=0.5であり、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる)。このアルゴリズムは、EMBOSSパッケージ[16]内のneedleツールで簡便に実装されている。
【００５２】
グループ(c)内で、欠失又は置換は、N末端及び/又はC末端にあってもよいし、2つの末端間にあってもよい。ゆえに、末端切除が欠失の例である。末端切除は、最大40(又はそれ以上)のアミノ酸の欠失を、N末端及び/又はC末端に含んでよい。N末端切断は、例えばリーダーペプチドを取り除いて、異種宿主における組換え発現を促進することができる。C末端切除は、例えばアンカー配列を取り除いて、異種宿主における組換え発現を促進することができる。
【００５３】
一般に、抗原が、NTHI配列等の配列リスト由来の配列と同一でない配列を含む場合(例えば、それに対する配列同一性が<100%である配列リストを含む場合、又はそのフラグメントを含む場合)、個々の例において、抗原は、配列リスト由来の各NTHI配列を認識する抗体を誘発させ得ることが好ましい。
【００５４】
一部の実施形態において、LytM含有タンパク質は、NTHiのNT013及びNT022、又はそれらのホモログ、オルソログ若しくはパラログから選択される。
【００５５】
一部の実施形態において、LytM含有タンパク質は、NTHiのNT017、又はそのホモログ、オルソログ若しくはパラログである。
【００５６】
細菌
本発明のグラム陰性菌は典型的に、非莢膜形成(分類不可能な)インフルエンザ菌系統(NTHi)である。しかしながら、これは、異なるグラム陰性菌であってよく、髄膜炎菌(特に血清群B)及び百日咳菌が挙げられる。一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌は、非莢膜形成(分類不可能な)インフルエンザ菌系統ではない。
【００５７】
本発明で用いられる例示的な種として、大腸菌(Escherichia)属、赤痢菌属、ナイセリア属、モラクセラ(Moraxella)属、ボルデテラ属、ボレリア(Borrelia)属、ブルセラ(Brucella)属、クラミジア(Chlamydia)属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、シュードモナス属、エルシニア属、ヘリコバクター属、サルモネラ属、ビブリオ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属等のいずれかの種が挙げられる。特に、細菌は、赤痢菌属種(志賀赤痢菌(S. dysenteriae)、フレキシネル赤痢菌(S. flexneri)、ボイド赤痢菌(S. boydii)又はソンネ赤痢菌(S. sonnei)等)であってよい。或いはまた、ナイセリア属種、例えば非病原性の種(ナイセリア・バシフォルミス(N. bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(N. cinerea)、ナイセリア・エロンガータ(N. elongata)、ナイセリア・フラベッセンス(N. flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(N. lactamica)、ナイセリア・マカカエ(N. macacae)、ナイセリア・ムコサ(N. mucosa)、ナイセリア・ポリサッカレア(N. polysaccharea)、ナイセリア・シッカ(N. sicca)又はナイセリア・スブフラバ(N. subflava)、特にナイセリア・ラクタミカ等)であってよい。或いはまた、ナイセリア属の病原性種(例えば淋菌又は髄膜炎菌)が用いられてよい。他の例では、細菌は、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・オヴィス(Brucella ovis)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、インフルエンザ菌(分類不可能な系統を含む)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、緑膿菌、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、ピロリ菌、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)(チフス菌(serovar typhi)及びネズミチフス菌(serovar Typhimurium)並びにパラチフス菌(serovar paratyphi)及び腸炎菌(serovar enteritidis)が挙げられる)、コレラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ、肺炎桿菌、プロテウス属(例えばプロテウス・ミラビリス)、シトロバクター(Citrobacter)属、セラチア属(例えば霊菌)、エルウイニア(Erwinia)属、パスツレラ(Pasteurella)属、ペスト菌、大腸菌等であってよい。光合成グラム陰性菌が用いられてもよい。典型的には、細菌はコンピテント系統である。この特徴により、細菌の遺伝的修飾が促進される。
【００５８】
グラム陰性菌は、球菌、桿菌又は球桿菌等の形状に基づいて定義され得るので、細菌は、グラム陰性球菌であってもグラム陰性桿菌であってもグラム陰性球桿菌であってもよい。
【００５９】
グラム陰性菌は、プロテオバクテリア門であってもよく、例えば、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア又はアシディチオバシリア(Acidithiobacillia)から選択される綱に属する。グラム陰性菌は、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア又はアシディチオバシリアから選択される綱に属していなくてもよい。
【００６０】
一部の実施形態において、細菌はヒトにコロニーを形成する。一部の実施形態において、細菌はヒトに対して病原性である。
【００６１】
一部の実施形態において、細菌は、標準的な培養条件下で増殖されると、小胞を産生する。他の実施形態において、細菌は、標準的な培養条件下で増殖されると、小胞を産生しない。
【００６２】
一部の実施形態において、細菌は、カウロバクター(Caulobacter)属ではなく、例えばカウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)ではない。一部の実施形態において、細菌は大腸菌属ではなく、例えば大腸菌ではない。一部の実施形態において、細菌はヘリコバクター属ではなく、例えばピロリ菌ではない。一部の実施形態において、細菌はナイセリア属ではなく、例えば淋菌でもなければ髄膜炎菌でもない。一部の実施形態において、細菌はエルシニア属ではなく、例えばペスト菌ではない。一部の実施形態において、細菌はエルシニア属ではなく、例えばペスト菌ではない。一部の実施形態において、細菌はH.ソムニ(H. somni)ではない。
【００６３】
一部の実施形態において、細菌は、ベータプロテオバクテリア綱のものであり、LytM含有タンパク質は、NT013、NT017及びNT022から選択され、場合によっては、NTNiのNT017及びNT022、又はそれらのホモログ、オルソログ若しくはパラログから選択される。
【００６４】
一部の実施形態において、細菌は、グラム陰性球桿菌であり、LytM含有タンパク質は、NT013、NT017及びNT022から選択され、場合によっては、NTNiのNT013及びNT017、又はそれらのホモログ、オルソログ若しくはパラログから選択される。
【００６５】
一部の実施形態において、細菌は、グラム陰性球菌であり、LytM含有タンパク質は、NT013、NT017及びNT022から選択され、場合によっては、NTNiのNT017及びNT022、又はそれらのホモログ、オルソログ若しくはパラログから選択される。
【００６６】
細菌が髄膜炎菌である場合、LytM含有タンパク質は例えば、NMB1483、NMB0315及びNMB1333から選択されてよい。
【００６７】
細菌が百日咳菌である場合、LytM含有タンパク質は例えば、BP1721、BP2956、BP0608、BP2919、BP3015及びBP1017から選択されてよい。
【００６８】
他の突然変異
崩壊したLytM触媒ドメイン含有タンパク質を有することに加えて、本発明のグラム陰性菌は有利には、野生型系統と比較して1つ以上の更なる変化を含んでよい。これらの変化は、例えば、ヒトワクチンにおいて有毒又は不所望であろう成分を細菌から取り除くために用いられてよい。
【００６９】
細菌はまた、小胞産生のための他の適合化を含有してもよい。特に、細菌は典型的には、前記配列のない同じ細菌と比較して、細菌がより大量の小胞を産生するように、1つ以上の配列が存在するゲノムを含む。小胞産生を増大させる配列は、小胞産生系統に配列を加えるか欠失させて、小胞産生に及ぼす影響を判定することによって同定され得る。例として、任意のTol遺伝子の不活性化又は欠失が挙げられる[10,11]。
【００７０】
例えば、付加的な修飾、例えばlpxL1、lgtB、porA、frpB、synX、lgtA、mltA及び/又はlstの1つ以上におけるノックアウトがあり得る。
【００７１】
一部の実施形態において、細菌が、引用文献17及び18〜20に開示されるノックアウト及び/又は過剰発現突然変異の1つ以上を含んでよい。修飾に適した遺伝子として、以下が挙げられる:(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/又はTbpB[18];(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/又はTbpB;(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/又はTbpB;及び(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、及び/又はSynC。
【００７２】
細菌が、以下の特徴の1つ以上又は全てを有してよい:(i)LOSを末端切除するための、LgtB及び/又はGalEの下方制御又はノックアウト、(ii)TbpAの上方制御、(iii)NhhAの上方制御、(iv)Omp85の上方制御、(v)LbpAの上方制御、(vi)NspAの上方制御、(vii)PorAのノックアウト、(viii)FrpBの下方制御又はノックアウト、(ix)Opaの下方制御又はノックアウト、(x)Opcの下方制御又はノックアウト、(xii)cps遺伝子複合体の欠失。末端切除されたLOSは、シアリル-ラクト-N-ネオテトラオースエピトープを含まないものであってよく、例えばガラクトース欠損LOSであってよい。LOSは、α鎖を有していなくてよい。
【００７３】
そのような突然変異は特に、髄膜炎菌において記載されてきた。
【００７４】
付加的な抗原
場合によっては、細菌は、前記配列のない同じ細菌と比較して、細菌が1つ以上の付加的な抗原を含む小胞を産生するように、1つ以上の配列が存在するゲノムを含む。これらの付加的な抗原は典型的に、その対応する野生型系統において細菌中に見出されない。例えば、付加的な抗原として、髄膜炎菌(特に血清群B)、病原性大腸菌、コレラ菌、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)及びストレプトコッカス・アガラクティアエ(Streptococcus agalactiae)から選択される細菌由来の1つ以上のタンパク質抗原があり得る。他の適切な細菌として、炭疽菌(Bacillus anthracis)、赤痢菌属、クラミジア属、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、癩菌(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、連鎖球菌属、シュードモナス属、赤痢菌属、カンピロバクター属、サルモネラ属(例えばサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium))、エルシニア属(例えばペスト菌)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、ナイセリア属、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及びヘリコバクター属が挙げられる。同様に、付加的な抗原は、1つ以上のウイルスタンパク質抗原、例えば、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ラブドウイルス科又はトガウイルス科のウイルス由来の抗原、例えばHIV又はインフルエンザ由来の抗原であり得る。付加的な抗原はまた、任意の病原体由来の1つ以上のタンパク質抗原であってもよい。付加的な抗原はまた、癌細胞由来の1つ以上の抗原、例えば1つ以上の腫瘍性タンパク質であってもよい。したがって、細菌由来の小胞は、付加的な抗原を免疫系に提示するための送達系として用いられ得る。したがって、ゲノム中に存在する1つ以上の配列は、小胞中の付加的な抗原の発現を導くことができる。配列は、細菌の染色体中に統合されてもよいし、非統合ゲノム要素、例えばプラスミド中に存在してもよい。例えば、細菌における発現を制御することが可能となるように、配列を1つ以上の発現ベクター内に含むことが有効である。例えば、各配列が、適切な発現カセット中にあるのがよい。典型的には、配列は、付加的な抗原を、小胞における効果的な発現のために必要とされる任意の調節配列(即ち、プロモーター、シグナル配列、シャペロン、分泌経路機構等)と一緒にコードする遺伝子を含むこととなる。当業者は、グラム陰性菌、特に大腸菌におけるそのような異種遺伝子の発現方法を、また異種タンパク質が小胞中に存在するようにこの発現を導く方法を知っている(例えば引用文献21、22、23等参照)。例えば、タンパク質は、ペリプラズム区分化(periplasmic compartmentalization)に適したリーダーペプチドに融合されてよい。タンパク質がこのようにしてペリプラズムをターゲットとする場合、ワクチンとして投与する前に、例えばソニケーション及び/又は界面活性剤を用いて、小胞を崩壊させることが有用であり得る。これにより、小胞からのタンパク質の放出が促進される一方で、他の小胞成分のアジュバント活性が保持される。同様に、タンパク質は、内膜及び/又は外膜における区分化のために、リポタンパク質として、「脂質化ボックス」が続くリーダー配列に融合されてよい。タンパク質がこのように膜をターゲットとする場合、典型的には、小胞の内側又は外側のいずれかに配向することとなる。この配向は、例えばナイセリア属の種において、内在性の「フリップ/フロップ」機構の作用によって変わり得る。タンパク質はまた、膜貫通領域に融合されてもよいし、且つ/又は、外膜における抗原区分化のための内在性膜タンパク質、例えばポーリンに融合されてもよい。発現効率もまた、グラム陰性菌の優先度に合致するように配列内のコドン使用を修飾することによって、最適化され得る(引用文献24)。
【００７５】
変異体の調製
本発明のグラム陰性菌は、従来の突然変異誘発技術を用いて、野生型又は他の出発系統から簡便に調製され得る。LytMドメイン含有タンパク質又は遺伝子の修飾(例えば不活性化)が、種々の方法で達成されてよく、例えば、そのプロモーターにおける欠失又は突然変異による、その開始コドンの欠失又は突然変異による、早期停止コドンの導入による、コード領域の全部又は一部(例えば少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、95%)の欠失による、ノックアウトによる方法等である。アイソジェニックノックアウト変異体が好ましい。ノックアウト突然変異が、遺伝子のコード領域内に位置してもよいし、その転写調節領域内(例えばそのプロモーター内)にあってもよい。ノックアウト突然変異は、抗原をコードするmRNAのレベルを、野生型細菌によって産生されるレベルの<1%、好ましくは<0.5%、より好ましくは<0.1%、最も好ましくは0%にまで引き下げることとなる。生じたグラム陰性菌において、所望の遺伝子をコードするmRNAは不在である、且つ/又はその翻訳は(例えば、典型的には、野生型レベルの1%未満、好ましくは<0.5%、より好ましくは<0.1%、最も好ましくは0%にまで)抑制される。
【００７６】
本発明のグラム陰性菌は、マーカー遺伝子を、不活性化された遺伝子中に、又は不活性化された遺伝子の代わりに含有してよく、例えば抗生物質、例えばエリスロマイシン抵抗性マーカーがある。これは、相同組換えを用いて達成されてよい。マークされていない欠失(即ち、マーカー遺伝子の導入のない欠失)が用いられてもよい。
【００７７】
一部の実施形態において、少なくとも1つのLytMドメイン含有タンパク質は、例えば、その正常な機能を実行しないように、又は低いレベルで実行するように、不活性化される。これは、発現されるタンパク質の量の低下によって、且つ/又は発現されるタンパク質の活性の低下によって起こり得る。ゆえに、タンパク質をコードする遺伝子において、(例えば突然変異又は欠失による)不活性化があってよい。一実施形態において、LytMドメイン含有タンパク質は、修飾されていないタンパク質が発現されるレベルの90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、1%未満のレベルで発現される。LytMドメイン含有タンパク質は、発現されなくてもよい。一実施形態において、発現されたLytMドメイン含有タンパク質の活性は、修飾されていないタンパク質の活性の90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、1%未満である。LytMドメイン含有タンパク質は、非機能的であり得る。
【００７８】
一部の実施形態において、突然変異及び/又は欠失が、LytMドメイン中になされてよい。先に定義されたように、LytMドメイン及び/又はLytMドメイン含有タンパク質を非機能的にする、又は機能を低下させる突然変異及び/又は欠失が選択されてよい。
【００７９】
或いはまた、欠失又は突然変異は、LytMドメイン含有タンパク質の活性又は機能を低下させてよい。欠失又は突然変異は、LytMドメイン中にあってもよいし、タンパク質中の他の部分にあってもよい。例えば、欠失又は突然変異は、1つ以上のドメインを欠いている(例えば、LytMドメインを欠いている)発現タンパク質をもたらし得る。例えば小胞調製に適した、グラム陰性系統を調製するプロセスに、得られた修飾細菌を培養して細菌培養物を提供するステップが続いてよい。
【００８０】
グラム陰性菌を増殖させる培養条件は、当該技術において周知である。例えば、グラム陰性菌は、有機窒素源(例えばAla、Arg、Asn、Aspを含有するアミノ酸混合物等。カザミノ酸が用いられてもよい)、炭素源としてのグリセロール、その他を用いて増殖されてよい。培地中にL-アスパラギン酸を含めることが特に有用であり、窒素源及び炭素源の双方として機能し得る。
【００８１】
小胞を生産する方法
本発明はまた、本発明の小胞を調製する方法、及びこの方法によって得られた又は得られる小胞を提供する。当該方法は、細菌の培養物から小胞を得るステップを含む。小胞は、小胞を形成する細菌の外膜の崩壊又は外膜由来のブレブ形成によって得られ得る。ゆえに、用語「小胞」は典型的には、OMV、ブレブ、マイクロ小胞(MV[25])及び「本来のOMV」(「NOMV」[26])を意味する。これはまた、典型的には、界面活性剤抽出されたOMV(DOMV)及び変異体由来OMV(m-OMV)を意味してもよい。用語「膜抗原のための汎用化されたモジュール」は、変異細菌から得られた小胞に用いられ得る。
【００８２】
ゆえに、小胞は、小胞の放出を可能とする条件下で、適切な細菌、例えば本発明の細菌を培養することによって得られ得るので、本発明の細菌から小胞を調製する方法は、小胞の放出を可能とする条件下で、適切な細菌、例えば本発明の細菌を培養することを含んでもよいし、追加的に含んでもよい。
【００８３】
ブレブ(MVが挙げられる)は、細菌増殖中に自然発生的に生じ、培地中に放出される天然に存在する膜小胞である。自然発生的に放出されたブレブの培地からの分離が、外膜の意図的な崩壊(例えば、界面活性剤処理又はソニケーションによる)を含む方法よりも便利であるため、本発明の小胞は好ましくはブレブである。さらに、内膜及び細胞質汚染が実質的にない。当該小胞は典型的に、電子顕微鏡検査によって、35〜120nm又は20〜100nmの直径、例えば50nmの直径を有し、培地から精製され得る。精製は理想的には、例えば、小胞を通過させ得るが無傷細菌を通過させ得ない、0.22μmフィルタ等のフィルタを用いるサイズベースの濾過法によって、又は低速遠心分離を用いて細胞をペレット化する一方で小胞を懸濁させたままにすることによって、生細菌及び/又はインタクトな細菌から小胞を分離することを含む。2ステージのサイズ濾過プロセスを含む好ましい方法が、引用文献27に記載されている。
【００８４】
ゆえに、培地とは違い、本発明の小胞含有組成物は概して、生死に拘らず、全細菌を実質的に含まないこととなる。小胞のサイズは、例えばフィルタ滅菌に典型的に用いられるような濾過法によって全細菌から小胞が容易に分離され得ることを意味する。小胞は標準的な0.22μmフィルタを通過することとなるが、0.22μmフィルタは他の物質によって急速に詰まる場合があるので、0.22μmフィルタを用いる前に、細孔サイズが減少していく一連のフィルタを通すフィルタ滅菌の連続ステップを実行することが有用であり得る。前述のフィルタの例として、細孔サイズが0.8μm、0.45μm等のものがあろう。
【００８５】
一部の実施形態において、OMVは、細菌から人工的に調製されてもよいし、界面活性剤処理(例えばデオキシコレート又はサルコシルによる)を用いて、又は非界面活性剤手段(例えば、引用文献28参照)によって調製されてもよい。小胞を形成する技術は、界面活性剤を沈殿させない程度に高いpH[31]で、細菌を胆汁酸塩界面活性剤(例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸等の塩(デオキシコール酸ナトリウム[29及び30]は、ナイセリア属を処理するのに好ましい))で処理することを含む。ソニケーション、均質化、マイクロ流動化、空洞化、浸透圧ショック、粉砕、フレンチプレス、混合等の技術を用いる他の技術が、界面活性剤の実質的不存在下で実行され得る[28]。界面活性剤を用いない、又は少量の界面活性剤を用いる方法により、NspA等の有用な抗原が保持され得る[28]。ゆえに、方法は、デオキシコレートが約0.5%以下(例えば約0.2%、約0.1%、<0.05%又はゼロ)であるOMV抽出バッファを用いてよい。
【００８６】
小胞の調製に有用なプロセスが引用文献32に記載されており、高速遠心分離の代わりにというのではなく、粗OMVの限外濾過を含む。プロセスは、限外濾過が行われた後の超遠心分離のステップを含んでよい。
【００８７】
ゆえに、適切なグラム陰性菌、例えば本発明の細菌を、その外膜が小胞を形成するように処理することによって小胞が得られ得るので、本発明の細菌から小胞を調製する方法は、適切なグラム陰性菌、例えば本発明の細菌を、外膜が小胞を形成するように処理することを含んでもよいし、追加的に含んでもよい。
【００８８】
より大量の小胞の放出
NT013又はNT022が不活性化されているNHTi変異体が、野生型NTHiよりも大量の小胞を放出することが示された。
【００８９】
一実施形態における本発明の細菌は、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌と比較して、より大量の小胞を培地中に放出することができる。これは、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌と比較して、少なくとも10、20、50、100、150、200、250、500、600、700、800、900、1000%の増大となり得る。
【００９０】
或いはまた、明示されるように、本発明は、例えばLytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌と比較して、グラム陰性菌からの小胞産生を増大させる方法であって、少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質を細菌中で修飾する、例えば不活性化することを含む方法を提供する。場合によっては、細菌は培養される。
【００９１】
タンパク質組成が異なる外膜小胞の生産
少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質が不活性化されているNHTi変異体は、野生型NTHiと異なるタンパク質組成を有する小胞を生じることが示された。
【００９２】
具体的には、野生型NHTi由来の小胞と比較して、NT013変異体由来の小胞は、リポタンパク質の量が増大し、ペリプラズムタンパク質の量が増大し、外膜タンパク質の量が減少し得る。
【００９３】
野生型NHTi由来の小胞と比較して、NT017変異体由来の小胞は、細胞質タンパク質の量が増大し、且つ外膜タンパク質の量が減少し得る。
【００９４】
野生型NHTi由来の小胞と比較して、NT022変異体由来の小胞は、リポタンパク質の量が増大し、ペリプラズムタンパク質の量が増大し、外膜タンパク質の量が減少し得る。
【００９５】
リポタンパク質NT069(NTHI1957という注釈が付される)及びNTHI0353は、野生型NHTi由来の小胞と比較して、NTHi NT013及びNT022変異体小胞におけるレベルが増大していることが見出され得る。
【００９６】
ペリプラズムセリンプロテアーゼHhoAは、野生型NHTi由来の小胞と比較して、NTHi NT013変異体小胞におけるレベルが増大し、且つ/又はNTHi NT017及びNT022変異体小胞におけるレベルが減少していることが見出され得る。
【００９７】
外膜タンパク質NTHI1668は、野生型NHTi由来の小胞と比較して、NTHi NT013、NT017及びNT022変異体小胞のレベルが増大していることが見出され得る。豊富且つ可変的なタンパク質である外膜タンパク質P2は、NTHi NT013、NT017及びNT022変異体小胞におけるレベルが減少していることが見出され、外膜タンパク質P5のレベルもまた、野生型NHTi由来の小胞と比較して変化している。小胞中で非常に豊富であるP2及びP5の存在は、ヘモフィラス属OMVに対して生じる血清中の交差反応性の欠如に寄与すると考えられるので、P2及び/又は総P2+P5の減少は、例えば交差反応性が向上した小胞の生産に有利であり得る。
【００９８】
ゆえに、本発明の小胞は、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌と比較して、タンパク質の総量、リポタンパク質の量、ペリプラズムタンパク質の量、外膜タンパク質の量、及び/又は細胞質タンパク質の量に差異(例えば、少なくとも10、20、50、100、150、200、250、500、600、700、800、900、1000%の増減)があり得る。
【００９９】
ゆえに、本発明の小胞は、LytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌由来の小胞と比較して、1つ以上のタンパク質、例えば(i)NHTi P2、(ii)NHTi P5、及び(iii)総NHTi P2+NHTi P5から選択される外膜タンパク質の量に差異(例えば、少なくとも10、20、50、100、150、200、250、500、600、700、800、900、1000%の増減)があり得る。NTHi P2及びP5が言及されるが、小胞が異なるグラム陰性菌に由来する場合、その細菌におけるP2又はP5ホモログ、オルソログ又はパラログが増減され得る。
【０１００】
ゆえに、本発明は、例えばLytM触媒ドメイン含有タンパク質が活性である同じ細菌と比較して、グラム陰性菌由来の小胞中のタンパク質の総量、リポタンパク質の量、ペリプラズムタンパク質の量、外膜タンパク質の量、及び/又は細胞質タンパク質の量を変更する方法であって、細菌中の少なくとも1つのLytM触媒ドメイン含有タンパク質を修飾する、例えば不活性化することを含む方法を提供する。場合によっては、細菌は培養される。外膜タンパク質はP2及び/又はP5であってもよい。改変は、先に定義されたものであってよい。
【０１０１】
免疫原性組成物及び薬物
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明に従うワクチンは、予防的(即ち、感染を予防すること)であってもよいし、治療的(即ち、感染を治療すること)であってもよいが、典型的には予防的となろう。
【０１０２】
ゆえに、組成物は、薬学的に許容可能であるのがよい。組成物は、通常、抗原に加えて、例えば典型的に、1つ以上の医薬担体及び/又は賦形剤をはじめとする成分を含むこととなる。そのような成分に関する徹底的な議論が、引用文献33で入手可能である。
【０１０３】
したがって、本発明は、(a)本発明の小胞及び(b)薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。当該組成物は、医薬用途に適している。本発明はまた、そのような組成物を調製するプロセスであって、本発明の小胞を薬学的に許容可能な担体と混合するステップを含むプロセスを提供する。医薬組成物は好ましくは、免疫原性組成物である。
【０１０４】
薬学的に許容可能な担体は、組成物を受け入れる患者に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない、過度の毒性なく投与され得るあらゆる物質であってよい。薬学的に許容可能な担体として、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等の液体が挙げられ得る。湿潤剤又は乳化剤等の補助物質、pH緩衝物質等(例えば安定化剤、防腐剤)が、そのようなビヒクル中に存在してもよい。適切な担体に関する詳細な議論が、引用文献33で入手可能である。
【０１０５】
組成物は概して、水性形態で哺乳動物に投与されることとなる。しかしながら、投与前、組成物は非水性形態であってよい。例えば、水性形態で製造されてから、そのまま水性形態で充填され、分配され、且つ投与されるワクチンもあるが、製造中に凍結乾燥されて、使用時に水性形態に再構成されるワクチンもある。ゆえに、本発明の組成物は、凍結乾燥された製剤のように、乾燥していてよい。
【０１０６】
組成物は、チオメルサール又は2-フェノキシエタノール等の防腐剤を含んでよい。しかしながら、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない(即ち5μg/ml未満)、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。防腐剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【０１０７】
熱的安定性を向上させるために、組成物は温度保護剤を含んでよい。そのような剤の更なる詳細が以下に提供される。
【０１０８】
浸透圧を調節するために、ナトリウム塩等の生理的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム(NaCl)が好ましく、NaClは1から20mg/ml、例えば約10±2mg/mlにて存在してよい。存在してよい他の塩として、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が挙げられる。
【０１０９】
組成物は概して、オスモルが200mOsm/kgから400mOsm/kg、好ましくは240〜360mOsm/kgとなり、より好ましくは290〜310mOsm/kgの範囲に入ることとなる。
【０１１０】
組成物は、1つ以上のバッファを含んでよい。典型的なバッファとして、以下が挙げられる:リン酸バッファ、トリスバッファ、ホウ酸バッファ、コハク酸バッファ、ヒスチジンバッファ(特に水酸化アルミニウムアジュバントを有する)、又はクエン酸バッファ。バッファは典型的に、5〜20mMの範囲で含まれることとなる。
【０１１１】
組成物のpHは概して、5.0から8.1、より典型的には6.0から8.0、例えば6.5から7.5、又は7.0から7.8となる。
【０１１２】
組成物は好ましくは、滅菌されている。組成物は好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量あたり<1EU(エンドトキシンユニット(標準的な指標))、好ましくは用量あたり<0.1EUしか含有しない。組成物は好ましくは、グルテンフリーである。
【０１１３】
組成物は、単一免疫化用の材料を含んでもよいし、多重免疫化(即ち「複数用量」キット)用材料を含んでもよい。防腐剤を含むことが、複数用量の構成において好ましい。複数用量組成物に防腐剤を含むことの代わりに(又は加えて)、組成物は材料の除去のための無菌アダプターを有する容器内に含有されてよい。
【０１１４】
ヒトワクチンは典型的に、約0.5mlの投薬容量で投与されるが、小児には2分の1の用量(即ち約0.25ml)が投与されてもよい。
【０１１５】
本発明の免疫原性組成物はまた、1つ以上の免疫調節剤を含んでもよい。好ましくは、1つ以上の免疫調節剤として、1つ以上のアジュバントが挙げられる。アジュバントとして、TH1アジュバント及び/又はTH2アジュバントが挙げられ得、以下でさらに議論される。
【０１１６】
本発明の組成物に用いられ得るアジュバントとして、限定されないが、以下が挙げられる:
・アルミニウム塩及びカルシウム塩等の鉱物塩、例えば、水酸化物(例えばオキシ水酸化物)、リン酸塩(例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)及び硫酸塩等[例えば、引用文献34の第8及び9章参照]、
・スクアレン-水エマルジョン等の水中油エマルジョン、例えばMF59(5% Squalene、0.5% Tween 80及び0.5% Span 85、ミクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化されている)[引用文献34の第10章、また、引用文献35〜37、及び引用文献38の第12章参照]、完全フロイントアジュバント(CFA)及び不完全フロイントアジュバント(IFA)、
・QS21[39]及びISCOM[引用文献34の第23章]等のサポニン製剤[引用文献34の第22章]、
・ウイロゾーム及びウイルス様粒子(VLP)[40〜46]、
・細菌又は微生物誘導体、例えば腸内細菌リポ多糖(LPS)の非有毒誘導体等、脂質A誘導体[47、48]、IC-31(商標)[55](26merの配列5’-(IC)13-3’(配列番号23)を含むデオキシヌクレオチド及び11merのアミノ酸配列KLKLLLLLKLK(配列番号24)を含むポリカチオンポリマーペプチド)等の免疫刺激性オリゴヌクレオチド[49〜54]、並びにADPリボシル化毒素及びその無毒化誘導体[56〜65]、
・ヒト免疫調節物質、例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[66、67])、インターフェロン(例えばインターフェロンγ)、マクロファージコロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子等のサイトカイン、
・キトサン及びその誘導体等の生体接着剤及び粘膜接着剤、エステル化ヒアルロン酸微小球[68]、又はポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類及びカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体等の粘膜接着剤[69]、
・生物分解性且つ非毒性である材料(例えばポリ(αヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等)から形成される微粒子(即ち、直径約100nmから約150μm、より好ましくは直径約200nmから約30μm、最も好ましくは直径約500nmから約10μmの粒子)、
・リポソーム[引用文献34の第13及び14章、引用文献70〜72]、
・ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル[73]、
・PCPP製剤[74及び75]、
・ムラミルペプチド、例えばN-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-1-アラニル-d-イソグルタミン(nor-MDP)、及びN-アセチルムラミル-1-アラニル-d-イソグルタミニル-1-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミンMTP-PE)、
・イミダゾキノリン（imidazoquinolone）化合物、例えばイミキモド及びその相同物(例えば「レジキモド3M」)[76及び77]が挙げられる。
【０１１７】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンはまた、先で同定された1つ以上のアジュバントの態様の組合せを含んでもよい。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明で用いられ得る:(1)サポニン及び水中油エマルジョン[78]、(2)サポニン(例えばQS21)+非毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)[79]、(3)サポニン(例えばQS21)+非毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)+コレステロール、(4)サポニン(例えばQS21)+3dMPL+IL-12(任意で+ステロール)[80]、(5)3dMPLの、例えばQS21及び/又は水中油エマルジョンとの組合せ[81]、(6)10%スクアレン、0.4% Tween 80(商標)、5%プルロニックブロックポリマーL121、及びthr-MDPを含有し、サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化され、又はボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルジョンが生じたSAF、(7)2%スクアレン、0.2% Tween 80、並びにモノホスホリル脂質A(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)及び細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMPL+CWS(Detox(商標))からなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分を含有するRibi(商標)アジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem)、並びに(8)1つ以上の鉱物塩(アルミニウム塩等)+LPSの非毒性誘導体(3dMPL等)。
【０１１８】
免疫賦活剤として作用する他の物質が、引用文献34の第7章に開示されている。
【０１１９】
水酸化アルミニウム及び/又はリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、抗原は概してこれらの塩に吸着される。リン酸カルシウムが、別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組合せとして、CpG及びミョウバン、又はレジキモド及びミョウバン等のTh1及びTh2アジュバントの組合せが挙げられる。リン酸アルミニウム及び3dMPLの組合せが用いられてよい(これは、肺炎球菌の免疫化に有効であると報告されている[82])。MF59アジュバントの使用は、特にIM(筋肉内)又はIP(腹膜内)免疫化の場合に、好ましい。
【０１２０】
本発明の組成物は、細胞媒介免疫応答及び液性免疫応答を誘発し得る。この免疫応答は、好ましくは、NTHIへの曝露直後に応答し得る長期持続性(例えば、中和)抗体及び細胞媒介免疫を誘導することとなる。
【０１２１】
T細胞の2つのタイプ、CD4及びCD8細胞は概して、細胞媒介免疫及び液性免疫を開始且つ/又は増強するのに必須であると考えられる。CD8 T細胞は、CD8共受容体を発現し得、一般に細胞毒性Tリンパ球(CTL)と呼ばれている。CD8 T細胞は、MHCクラスI分子上に示される抗原を認識し、又はこれと相互作用することができる。
【０１２２】
CD4 T細胞はCD4共受容体を発現し得、一般にヘルパーT細胞と呼ばれている。CD4 T細胞は、MHCクラスII分子に結合する抗原性ペプチドを認識することができる。MHCクラスII分子との相互作用直後に、CD4細胞は、サイトカイン等の因子を分泌し得る。この分泌されたサイトカインは、B細胞、細胞毒性T細胞、マクロファージ、及び免疫応答に関与する他の細胞を活性化し得る。ヘルパーT細胞又はCD4+細胞はさらに、2つの機能的に異なるサブセットに分割され得る:TH1表現型及びTH2表現型であり、これらはサイトカイン及びエフェクター機能が異なる。
【０１２３】
活性化TH1細胞は、細胞性免疫を増強し(抗原特異的CTL産生の増大が挙げられる)、従って細胞内感染に対する応答に特に価値がある。活性化TH1細胞は、IL-2、IFN-γ及びTNF-βの1つ以上を分泌し得る。TH1免疫応答は、マクロファージ、NK(ナチュラルキラー)細胞及びCD8細胞毒性T細胞(CTL)を活性化することによって、局所炎症反応をもたらし得る。TH1免疫応答はまた、B及びT細胞の増殖をIL-12で刺激することによって、免疫応答を拡張するように作用し得る。TH1刺激B細胞は、IgG2aを分泌し得る。
【０１２４】
活性化TH2細胞は抗体産生を増強するので、細胞外感染に対する応答に価値がある。活性化TH2細胞は、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10の1つ以上を分泌し得る。TH2免疫応答は、IgG1、IgE、IgA及び将来の保護のための記憶B細胞の産生をもたらし得る。
【０１２５】
免疫応答の増強として、TH1免疫応答及びTH2免疫応答の増強の1つ以上が挙げられ得る。
【０１２６】
TH1免疫応答として、CTLの増大、TH1免疫応答と関連するサイトカイン(IL-2、IFN-γ及びTNF-β等)の1つ以上の増大、活性化マクロファージの増大、NK活性の増大、又はIgG2aの産生の増大の1つ以上が挙げられ得る。好ましくは、TH1免疫応答の増強として、IgG2a産生の増大が挙げられるであろう。
【０１２７】
TH1免疫応答は、TH1アジュバントを用いて誘発されてよい。TH1アジュバントは概して、アジュバントなしの抗原の免疫化と比較して、IgG2a産生レベルの増大を誘発することとなる。本発明での使用に適したTH1アジュバントとして、例えばサポニン製剤、ウイロゾーム及びウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチド等の免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、本発明での使用に好ましいTH1アジュバントである。
【０１２８】
TH2免疫応答として、TH2免疫応答と関連するサイトカイン(IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10等)の1つ以上の増大、又はIgG1、IgE、IgA及び記憶B細胞の産生の増大の1つ以上が挙げられ得る。好ましくは、TH2免疫応答の増強として、IgG1産生の増大が挙げられるであろう。
【０１２９】
TH2免疫応答は、TH2アジュバントを用いて誘発されてよい。TH2アジュバントは概して、アジュバントなしの抗原の免疫化と比較して、IgG1産生レベルの増大を誘発することとなる。本発明での使用に適したTH2アジュバントは、例えば、ミネラル含有組成物、油-エマルジョン、並びにADPリボシル化毒素及びその無毒化誘導体が挙げられる。アルミニウム塩等のミネラル含有組成物が、本発明での使用に好ましいTH2アジュバントである。
【０１３０】
好ましくは、本発明として、TH1アジュバント及びTH2アジュバントの組合せを含む組成物が挙げられる。好ましくは、そのような組成物は、TH1及びTH2応答の増強、即ち、アジュバントなしの免疫化と比較して、IgG1及びIgG2a産生の双方の産生増大を誘発する。更により好ましくは、TH1及びTH2アジュバントの組合せを含む組成物は、単一のアジュバントによる免疫化と比較して(即ち、TH1アジュバントだけによる免疫化又はTH2アジュバントだけによる免疫化と比較して)、TH1及び/又はTH2免疫応答の増大を誘発する。
【０１３１】
免疫応答は、TH1免疫応答及びTH2応答の一方であっても双方であってもよい。好ましくは、免疫応答は、TH1応答の増強及びTH2応答の増強の一方又は双方を提供する。
【０１３２】
免疫応答の増強は、全身免疫応答及び粘膜免疫応答の一方であっても双方であってもよい。好ましくは、免疫応答は、全身免疫応答の増強及び粘膜免疫応答の増強の一方又は双方を提供する。好ましくは、粘膜免疫応答は、TH2免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、IgA産生の増大を含む。
【０１３３】
細菌感染は、身体の種々の領域に影響を及ぼし得るので、本発明の組成物は、種々の形態で調製されるのがよい。例えば、組成物は、注射可能薬物として、液体の溶液又は懸濁液として調製されてよい。注射前の溶液中、懸濁液中、液体ビヒクルに適した固体の形態もまた、調製されてよい(例えば凍結乾燥された組成物又はスプレー凍結乾燥された組成物)。組成物は、例えば軟膏、クリーム又は粉末として、局所的投与用に調製されてよい。組成物は、例えば錠剤若しくはカプセルとして、スプレーとして、又はシロップ(風味が付いていてもよい)として、経口投与用に調製されてよい。組成物は、例えば吸入器を用いる微粉末又はスプレーとして、肺投与用に調製されてよい。組成物は、坐薬又はペッサリーとして調製されてよい。組成物は、例えば滴として、鼻、耳、又は眼投与用に調製されてよい。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されているキットの形態であってよい。そのようなキットは、液体形態の1つ以上の抗原及び1つ以上の凍結乾燥された抗原を含んでよい。
【０１３４】
組成物が使用前に即座に調製され得(例えば、成分が凍結乾燥された形態で示される場合)、且つキットとして提示される場合、キットは2つのバイアルを含んでもよいし、1本の予め充填されたシリンジ及び1本のバイアルを含んでもよく、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化させるために用いられる。
【０１３５】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、抗原の免疫学的に有効な量、及び必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量の個体への投与が、単一の用量において、又は一連の部分として、治療又は予防に有効であることが意味する。この量は、治療される個体の健康及び物理的条件、年齢、治療される個体の分類群(例えばヒト以外の霊長類、霊長類等)、個体の免疫系の、抗体を合成する能力、所望される保護の程度、ワクチンの製剤形態、医学的状況を治療する医者の評価、並びに他の関連する要因に応じて変化する。量は、ルーチン治験を通して決定され得る比較的広い範囲に入ることとなると予想される。複数の抗原が組成物中に含まれる場合、2つの抗原が互いに同じ用量で存在してもよいし、異なる用量で存在してもよい。
【０１３６】
先に述べたように、組成物は、温度保護剤を含んでよく、この成分は特に、アジュバント化組成物(特にアルミニウム塩等のミネラルアジュバントを含有するもの)において有用であり得る。引用文献83に記載されているように、液体温度保護剤は、その凝固点を下げるために、例えば凝固点を0℃未満に下げるために、水性ワクチン組成物に加えられてよい。ゆえに、組成物は、0℃未満であるがその凝固点よりも高く保存されて、熱的分解が妨げられ得る。温度保護剤はまた、組成物の凍結を可能にする一方で、凍結及び解凍後に、ミネラル塩アジュバントを凝集又は沈殿から保護し、且つ高い、例えば40℃を超える温度にて組成物を保護することもできる。出発水性ワクチン及び液体温度保護剤は、液体温度保護剤が、最終混合物の1〜80容量%をなすように混合されてよい。適切な温度保護剤は、ヒト投与にとって安全であり、水中に容易に混合でき/可溶性であるべきであり、且つ組成物中の他の成分(例えば抗原及びアジュバント)にダメージを与えるべきでない。例として、グリセリン、プロピレングリコール及び/又はポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。適切なPEGは、200〜20,000Daに及ぶ平均分子量を有し得る。好ましい実施形態において、ポリエチレングリコールは約300Da(「PEG-300」)の平均分子量を有し得る。
【０１３７】
小胞の微粒子性質のために、最終ワクチン産物は、外見が濁った懸濁液となり得る。この外見は、微生物汚染が容易に目に見えないことを意味するので、ワクチンは抗菌剤を含有するのがよい。ワクチンが複数用量容器中に包装される場合、このことは特に重要である。含めるのに好ましい抗菌物質として、2-フェノキシエタノール及びチメロサールがある。しかしながら、水銀防腐剤(例えばチメロサール)を用いないことが好ましく、組成物が水銀を約25ng/ml未満しか含有しないことが好ましい。より好ましくは、組成物は水銀フリーである。
【０１３８】
小胞ワクチン(例えば髄膜炎菌用)の先の研究が、小胞を投与するための医薬、薬量学及び製剤化ガイダンスを提供している。本発明の組成物中の小胞の濃度は概して、10から500μg/ml、好ましくは25から200μg/ml、より好ましくは約50μg/ml又は約100μg/mlであろう(小胞中の総タンパク質に換算して表されている)。より低い用量が、血清転換に有効であり得る。ゆえに、本発明の組成物中の小胞の濃度は、1ng/mlから10μg/ml、1ng/mlから1μg/ml、又は0.5μg/mlから50μg/mlの範囲にあってよい。0.5mlの投薬容量が、注射に典型的である。
【０１３９】
組成物は、他の免疫調節剤と共に投与されてよい。
【０１４０】
免疫化
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を高める方法であって、本発明の組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。免疫応答は好ましくは保護的であり、且つ好ましくは抗体及び/又は細胞媒介性免疫が関与する。当該方法は、ブースター応答を高め得る。
【０１４１】
本発明はまた、医療に用いるための、又は医薬としての、例えば哺乳動物において免疫応答を高めるのに(例えば免疫原性組成物として、又はワクチンとして)用いるための本発明の組成物を提供する。
【０１４２】
免疫応答は、グラム陰性菌に対してであってよい。
【０１４３】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を高めるための、又は哺乳動物において疾患を予防するための医薬の製造における本発明の組成物、及び哺乳動物において免疫応答を高めるための、又は哺乳動物において疾患を予防するための医薬の製造における本発明の小胞の使用を提供する。
【０１４４】
これらの使用及び方法によって哺乳動物における免疫応答を高めることによって、哺乳動物は細菌、例えばインフルエンザ菌等のグラム陰性菌の感染から保護され得る。
【０１４５】
本発明は種々の異なる血清型のインフルエンザ菌に対して有効であるが、分類不可能なインフルエンザ菌(NTHI)による感染に由来する疾患からの保護に特に有用であり得る。本発明に従えば、感染が、例えば、中耳炎(急性中耳炎が挙げられる)、気管支炎、結膜炎、副鼻腔炎、尿路感染症、肺炎、菌血、敗血症性関節炎、喉頭蓋炎、肺炎、蓄膿、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、下気道感染症又は髄膜炎から選択される疾患又は症状と関連してよい。本発明は、細菌がエウスタキオ管を介して喉から中耳に移動し、そこで中耳にコロニーが形成されるのを防止する免疫応答を誘発することによって、中耳の炎症を治療若しくは予防するのに、又はCOPD疾患を治療若しくは予防するのに特に有用である。
【０１４６】
本発明はまた、第1の成分及び第2の成分を含むキットであって、第1の成分及び第2の成分はどちらも、先に記載された本発明の組成物でないが、第1の成分及び第2の成分は組み合わされて、先に記載された本発明の組成物を提供することができるキットを提供する。キットは、以下の1つ以上を含む第3の成分をさらに含んでよい:説明書、シリンジ若しくは他の送達デバイス、アジュバント又は薬学的に許容可能な調製溶液。
【０１４７】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物が予備充填された送達デバイスを提供する。
【０１４８】
哺乳動物は好ましくは、ヒト、例えばヒト患者である。ワクチンが予防に用いられる場合、ヒトは好ましくは小児(例えば幼児又は乳児)又は10代である。ワクチンが治療に用いられる場合、ヒトは好ましくは10代又は大人である。小児用に意図されるワクチンが、例えば安全性、投薬量、免疫原性等を評価するために、大人に投与されてもよい。哺乳動物(例えばヒト、例えば患者)は、自身の疾患、又は雌、例えば女性の妊娠(「母体免疫化」)によるリスクがあってもよい。
【０１４９】
治療的処置の有効性をチェックする一方法が、本発明の組成物の投与後の、細菌、例えばインフルエンザ菌の感染を監視することを含む。予防的処置の有効性をチェックする一方法が、組成物の投与後の、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的(IgG1及びIgG2aの産生レベルをモニタリングする等)且つ/又は粘膜的(IgAの産生レベルをモニタリングする等)にモニタリングすることを含む。試験対象(例えば、12〜16ヵ月齢の小児又はチンチラモデル等の動物モデル[84])に本発明の組成物を投与してから、IgGのELISA力価(GMT)をはじめとする標準パラメータを判定することによって、本発明の組成物の免疫原性が判定されてよい。これらの免疫応答は概して、組成物の投与からおよそ4週後に判定され、且つ組成物の投与前に判定された値と比較されることとなる。組成物の複数回用量が投与される場合、複数回の投与後判定がなされてよい。典型的には、抗原特異的血清抗体応答が、免疫化後であるがチャレンジ前に判定される一方、抗原特異的粘膜抗体応答が、免疫化後且つチャレンジ後に判定される。
【０１５０】
ワクチン組成物の有効性はまた、動物モデル、例えばモルモット、チンチラ又はマウスの、細菌、例えばインフルエンザ菌による感染における、ワクチン組成物による免疫化研究によってin vivo判定されてもよい。そのような1つのモデルが、引用文献85に記載されている。
【０１５１】
本発明のワクチン組成物の有効性をin vivo判定するのに用いられ得る他の有用な動物モデルが、引用文献86に記載されている。
【０１５２】
本発明の組成物は概して、患者に直接投与されることとなる。直接送達は、非経口注射(例えば皮下、腹膜内、静脈内、筋肉内、又は組織の間隙空間)、又は直腸、経口(例えば、錠剤、スプレー)、膣、局所的、経真皮又は経皮的(transdermal or transcutaneous)、鼻腔内、眼内、耳内、肺内その他の粘膜投与によって達成され得る。
【０１５３】
本発明は、全身性免疫及び/又は粘膜免疫を誘発するのに、好ましくは全身性免疫及び/又は粘膜免疫の増強を誘発するのに、用いられ得る。
【０１５４】
好ましくは、全身性免疫及び/又は粘膜免疫の増強は、TH1及び/又はTH2免疫応答の増強に反映される。好ましくは、免疫応答の増強として、IgG1及び/又はIgG2a及び/又はIgAの産生の増大が挙げられる。
【０１５５】
投薬量は、単回用量スケジュールによってもよいし、多回用量スケジュールによってもよい。多回用量は、一次免疫化スケジュール及び/又はブースター免疫化スケジュールに用いられ得る。多回用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路又は異なる経路、例えば非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブースト等によって与えられてよい。多回用量は典型的に、少なくとも1週(例えば約2週、約3週、約4週、約6週、約8週、約10週、約12週、約16週等)間隔で投与されることとなる。
【０１５６】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児及び大人の双方を治療するのに用いられ得る。ゆえに、ヒト患者は、1歳未満であっても、1〜5歳であっても、5〜15歳であっても、15〜55歳であっても、55歳以上であってもよい。ワクチンを受けるのに好ましい患者として、高齢者(例えば≧50歳、≧60歳、好ましくは≧65歳)、若者(例えば≦5歳)、入院患者、医療従事者、軍人、妊婦、慢性疾患患者又は免疫不全患者がいる。しかしながら、ワクチンは、これらのグループにのみ適しているだけでなく、より一般の集団にも用いられ得る。
【０１５７】
本発明によって生産されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同じとき(例えば同じ医学的診察又はヘルスケア専門センター若しくはワクチン接種センターへの訪問中)に、例えばはしかワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、接合型インフルエンザ菌b型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌接合型ワクチン(四価のA-C-W135-Yワクチン等)、呼吸系発疹ウイルスワクチン等と実質的に同じ時に、患者に投与されてよい。
【０１５８】
粘膜免疫化
本発明は、粘膜免疫化用の本発明の組成物を提供する。本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を高める方法であって、哺乳動物にそのような免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は好ましくは、粘膜を介して(粘膜表面に)投与され、例えば鼻腔内に投与されてよい。
【０１５９】
細菌のADPリボシル化毒素、及び/又はその無毒化誘導体が存在してよく、これは例えば、大腸菌易熱性エンテロトキシン(「LT」)に由来してよい。誘導体は、Aサブユニット中に無毒化突然変異を有してよく、例えばこれはLT-K63又はLT-R72であってよい。特に、これはLT-K63であってよい。他の実施形態において、これはLT-K63ではない。
【０１６０】
本発明の組成物及びLT-K63アジュバントの鼻腔内投与が好ましい。これは、鼻咽頭、肺及び血液中のインフルエンザ菌の細菌負荷を減少させ、且つ感染した哺乳動物の生存率を増大させ得る。
【０１６１】
本発明の組成物の更なる抗原性成分
本発明はまた、少なくとも1つの分類不可能なインフルエンザ菌の抗原又は少なくとも1つの更なる分類不可能なインフルエンザ菌の抗原をさらに含む組成物を提供する。
【０１６２】
本発明はまた、分類不可能なインフルエンザ菌の抗原でない少なくとも1つの抗原をさらに含む組成物を提供する。
【０１６３】
特に、本発明はまた、本発明の1つ以上のポリペプチド、及び以下の更なる抗原の1つ以上を含む組成物を提供する:
-髄膜炎菌血清群A、B、C、W135及び/又はY由来の抗原
-肺炎球菌由来の糖又はポリペプチド抗原[例えば87、88、89]
-不活性化ウイルス等の、A型肝炎ウイルス由来の抗原[例えば90、91]
-表面及び/又はコア抗原等の、B型肝炎ウイルス由来の抗原[例えば91、92]
-ジフテリアトキソイド[例えば引用文献93の第3章]又はCRM197変異体[例えば94]等のジフテリア抗原
-破傷風トキソイド[例えば引用文献93の第4章]等の破傷風抗原
-。場合によってはパータクチン及び/又は凝集原2及び3と組み合わせてもよい[例えば引用文献95及び96]、百日咳菌由来の抗原、例えば百日咳菌由来の百日咳ホロトキシン(PT)及び糸状ヘマアグルチニン(FHA)
-百日咳全細胞性抗原
-インフルエンザ菌B由来の糖抗原[例えば97]
-IPV等のポリオ抗原[例えば98、99]
-はしか、おたふく風邪及び/又は風疹抗原[例えば引用文献93の第9、10及び11章]
-ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼ表面タンパク質等のインフルエンザ抗原[例えば引用文献93の第19章]
-モラクセラ・カタラーリス由来の抗原[例えば100]
-ストレプトコッカス・アガラクティアエ(B群連鎖球菌)由来のタンパク質抗原[例えば101、102]
-ストレプトコッカス・アガラクティアエ(B群連鎖球菌)由来の糖抗原
-化膿連鎖球菌(A群連鎖球菌)由来の抗原[例えば102、103、104]
-黄色ブドウ球菌由来の抗原[例えば105]
-呼吸系発疹ウイルス由来の抗原、例えば組換えタンパク質F
-ジフテリア(D)、破傷風(T)、百日咳(非細胞成分)(Pa)、B型肝炎(rDNA)(HBV)、灰白髄炎(不活性化)(IPV)及びインフルエンザ菌b型(Hib)接合型ワクチン(沈降)を含むワクチン組成物、例えばInfanrix-hexa。
【０１６４】
組成物は、これらの更なる抗原の1つ以上を含んでよい。RSVワクチン及び/又はDTPa含有ワクチンとの組合せが特に興味深い。
【０１６５】
毒性のタンパク質抗原は、必要な場合、無毒化されてよい(例えば化学的手段及び/又は遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化[96])。
【０１６６】
ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、破傷風抗原及び百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア及び百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア及び破傷風抗原を含むこともまた好ましい。ゆえに、DTPの組合せが好ましい。
【０１６７】
糖抗原は好ましくは、接合体の形態である。接合体用の担体タンパク質として、ジフテリア毒素、破傷風毒素、髄膜炎菌外膜タンパク質[106]、合成ペプチド[107、108]、ヒートショックタンパク質[109、110]、百日咳タンパク質[111、112]、インフルエンザ菌由来のタンパク質D[113]、サイトカイン[114]、リンホカイン[114]、連鎖球菌タンパク質、ホルモン[114]、増殖因子[114]、ディフィシル菌(C. difficile)由来の毒素A又はB[115]、鉄取り込みタンパク質[116]等が挙げられる。好ましい担体タンパク質として、ジフテリア毒素のCRM197変異体がある[117]。
【０１６８】
組成物中の抗原は典型的に、それぞれ少なくとも1μg/mlの濃度で存在することとなる。一般に、与えられるあらゆる抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分なものとなるであろう。
【０１６９】
本発明の免疫原性組成物中にタンパク質抗原を用いる代わりとして、抗原をコードする核酸(好ましくはDNA、例えばプラスミドの形態)が用いられてよい。
【０１７０】
抗原は好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。
【０１７１】
全般
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」及び「なる」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、Xから排他的になってもよいし、付加的な何か、例えばX+Yを含んでもよい。
【０１７２】
数値xに関する用語「約」は、任意選択的なものであり、例えば、x±10%を意味する。
【０１７３】
用語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Yが「実質的にない」組成物は、Yが完全になくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１７４】
2つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインされた場合に、2つの配列を比較してアミノ酸が同じであるパーセンテージを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当該技術において知られているソフトウェアプログラムを用いて判定され得、例えば引用文献118の第7.7.18部に記載されている。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティが12、ギャップ伸張ペナルティが2、BLOSUMマトリックスが62であるアフィンギャップ検索を用いる、Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって判定される。Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは周知であり、引用文献119に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】NTHi LytM因子の発現及び細胞内局在位置(subcellular localization)。(A)NT013、NT017及びNT022に対する特異性が高められた抗血清を用いて、異なる細胞コンパートメント抽出物へのウェスタンブロット分析が実行された。1-組換えタンパク質、2-総抽出物WT、3-総抽出物KO、4-外膜タンパク質WT、5-外膜タンパク質KO、6-ペリプラズム画分WT、7-ペリプラズム画分KO、8-上清WT、9-上清KO。赤色の矢印は、特異的なシグナルを示す。予想されるように、特異的反応性は、変異体系統で観察されない。しかしながら、抗血清は、特徴付けられなかったノックアウト系統にも存在する他の特異的でないバンドと交差反応する。(B)タンパク質NT022の表面局在位置を確かめる、Hi176野生型系統及び176ΔNT022変異体の免疫蛍光顕微鏡分析。細菌は赤色であり、LytM因子は緑色である。(C)NTHiにおけるLytMタンパク質局在位置のモデル。
【図２】NTHi Hi176野生型及びLytM変異体の表現型特徴付け。16時間37℃での液体静置培養増殖での凝集表現型(A)、1ミリリットルあたりのCFU(B)。CFUカウントが、2つの異なるODにて実行された。176ΔNT017系統は、親系統と類似の増殖速度及びCFUを有する一方、176ΔNT013及び176ΔNT022変異体は、増殖速度が低下した増殖及びより低いCFUを示した。(C)176ΔNT013及び176ΔNT022系統の細菌凝集を示す共焦点画像であり、細菌は赤色に染色され、Dapiは青色である。
【図３】LytM変異体の共焦点電子顕微鏡写真。(A)Hi176wt、176ΔNT013及び176ΔNT022の共焦点画像であり、細菌は赤色に染色され(対総細菌)、DAPIは青色である。(B)176wt、176ΔNT013及び176ΔNT022の走査電子顕微鏡写真。変異体176ΔNT017は、野生型系統と比較して、なんら差異を示さない(データ示さず)。
【図４】LytM変異体における隔膜形成。Hi176wt及びLytM変異体の透過電子顕微鏡写真。赤色の矢印は、変異体176ΔNT013及び176ΔNT022において隔膜形成が損なわれていることを示す。
【図５】変異体176ΔNT013及び176ΔNT022が、野生型系統よりも多くのOMVを放出している。Hi176WT、176ΔNT013及び176ΔNT022変異体及びそれらの各OMV調製物の透過電子顕微鏡写真。赤色の矢印は、細菌表面から放出されるOMVを示す。
【図６】OMVの分析。野生型、176ΔNT013及び176ΔNT022系統から調製されたOMVのクーマシー染色SDS PAGEゲル(A)。質量分析法による同定が、選択されたバンドに実行された(B)。NF-κB-ルシフェラーゼリポーターカセット及びTLR2(C)又はTLR4/MD2/CD14(D)を安定して発現するHEK293細胞を用いたルシフェラーゼアッセイ。TLR受容体の刺激は、順次希釈されたOMVとの6時間のインキュベーション後のNF-κB誘導ルシフェラーゼ活性を測定することによって評価される。IL-6及びTNFαのレベルは、wt及び変異体系統(E〜F)から精製されたOMVにより、希釈を異ならせて刺激された(O.N.)hPBMCにおいて測定された。
【図７】OMV中に見出されるタンパク質の分析。
【図８】OMV中のリポタンパク質。WT、ΔtolR、Δ17由来のOMVは、類似した量のリポタンパク質を有する一方で、Δ13及びΔ22変異体は、リポタンパク質、特にNTHI1957及びNTHI0353リポタンパク質が豊富である。
【図９】OMV中のペリプラズムタンパク質。主要なペリプラズムタンパク質は、ペリプラズムセリンプロテアーゼdo HhoA(protease do HhoA)である。これは特に、Δ13に由来する小胞から真である。WTから生じたOMVと比較して、ΔtolR及びΔ22に由来するOMVは、ペリプラズムタンパク質が豊富である。WTから生じたOMVと比較して、Δ17に由来するOMVは、少量のペリプラズムタンパク質を含有する。
【図１０】OMV中の外膜タンパク質。OMVの各タイプから、最も豊富な外膜タンパク質は、nt099(外膜タンパク質P2)及びnt092(外膜タンパク質P5)である。Δ13及びΔ22に由来するOMVについて観察される外膜タンパク質の量の主な低下は、P2の低下による。
【図１１】OMV中のタンパク質の相対量。変異体系統によって産生されるOMV中に見出されるタンパク質nt067、nt014、nt022及びnt016の、野生型系統と比較した相対量。
【図１２】MC58Δ1483及び野生型細菌のDAPI染色。
【図１３】MC58Δ1483及び野生型細菌のTEM(A)及びSEM(B)分析。
【図１４】MC58Δ1483及び野生型細菌によって産生された小胞のタンパク質分析。
【図１５】BP1721ノックアウト細菌及び野生型細菌のDAPI染色。
【図１６】NlpDホモログについての多重アラインメント。
【図１７】YebAホモログについての多重アラインメント。
【図１８】EnvCホモログについての多重アラインメント。
【図１９】Bp W28 9G/129KΔNlpD及び野生型細菌によって産生された小胞のタンパク質分析。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
（実施例）
分類不可能なインフルエンザ菌(NTHi)の単一ノックアウト変異体を、3つのLytMメタロプロテアーゼ:NTHI0532(NT013)、NTHI0915(NT017)及びNTHI0830(NT022)について作成した。これらの変異体は、外膜小胞(OMV)の放出増大を引き起こす細胞表面障害を示した。さらに、これらのタンパク質は、細菌の細胞分裂及び病因に関係していることが示された。特に、NT013及びNT022は、ペプチドグリカン切断及び細胞分割にとって重要である。NT017は、NTHiコロニー形成及び宿主免疫回避に対して強い影響力を有する。
【０１７７】
方法
細菌系統及び増殖条件
NTHi系統176を本研究に用いた。これは、中耳から得た分離株についての、フィンランド人の中耳炎コホート研究の一部であった。NTHiを、チョコレート寒天polivitex(BioMerieux)上で5%CO2下37℃でインキュベートして培養した。ヘミン(Fluka Biochemika)及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD、Sigma)をそれぞれ10μg/mL補ったブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(Difco Laboratories)を、流体増殖培地として用いた。大腸菌系統DH5α、HK100及びBL21(DE3)(Invitrogen)を、LytMタンパク質のクローニング及び発現に用いた。これらを、ルーリアベルターニ(LB)培地中で37℃にて培養し、必要な場合には100μg/mLアンピシリンを補った。
【０１７８】
細胞培養
本研究に用いた組織培養細胞は、Chang上皮細胞(Wong-Kilbourne誘導体、クローン1-5c-4、ヒト結膜、ATCC(登録商標)CCL-20.2(商標))及びHEK293(ヒト腎臓、ATCC(登録商標)CRL1573(商標))である。Chang細胞を、25mM Hepes、15mM L-グルタミン、抗生物質及び10%(vol/vol)熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS、Invitrogen Corporation)を補ったダルベッコの修飾イーグル培地(D-MEM、Gibco)中で維持した。これを5%CO2下37℃にて増殖させた。
【０１７９】
TLR2又はTLR4/MD2/CD14及びNF-κB-ルシフェラーゼリポーターカセットを安定して発現するHEK293細胞を、10%熱不活性化FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、5μg/mlピューロマイシン、250μg/mlハイグロマイシン(プラスHEK293-TLR4細胞について10μg/mlブラストサイジン)を補った、4.5g/mlグルコースを含有するDMEM中で培養した。
【０１８０】
LytMタンパク質をコードする遺伝子のクローニング
LytM遺伝子を、ポリメラーゼ不完全プライマー伸張(PIPE)法(119)によってpET15b+ベクター(Novagen)中にクローニングした。手短には、シグナルペプチドを取り除いて、各タンパク質をコードする配列をHI176ゲノムDNAからPCRによって増幅した。PCRにより、不完全な伸張産物の混合物が生じた。プライマー設計によって、ショートオーバーラップ配列を、この不完全伸張混合物の末端に導入し、これにより相補鎖がアニーリングし、且つハイブリッドベクター−挿入体の組合せを生産させた。続いて、大腸菌HK100細胞[120]を、ベクター−挿入体ハイブリッドで形質転換した。単一のアンピシリン抵抗性コロニーを、組換えプラスミドの存在についてPCRによって選択且つチェックした。陽性クローン由来のプラスミドを単離し、コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞中にサブクローニングした。
【０１８１】
組換えタンパク質の発現及び精製
タンパク質精製のために、NTHI0532、NTHI0915及びNTHI0830を発現する大腸菌BL21(DE3)系統の1つの単一コロニーを、LB+アンピシリン中に播種して、37℃にて一晩増殖させ、新鮮なLB培地中に希釈し、0.6〜0.8のODになるまで30℃にて増殖させた。1mMイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG、Sigma)の添加によって、タンパク質過剰発現を4時間誘導した。組換え体6×His-融合タンパク質を、親和性クロマトグラフィーによってNi2+-接合chelating fast-flow Sepharose 4B樹脂(Pharmacia)上で精製した。純度は、クーマシーブルーで染色するSDS-PAGE電気泳動によってチェックした。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Thermo Scientific)を用いて判定した。
【０１８２】
ノックアウト変異体の構築
NTHI0532、NTHI0915及びNTHI0830の欠失変異体は、それぞれの全遺伝子の、エリスロマイシン抵抗性カセットとの対立遺伝子置換によって構築した。3つの遺伝子の上流領域及び下流領域を、以下にリストするプライマーを用いたPCRによって増幅し、Stratagene pSC-A TOPOベクター中にクローニングした。エリスロマイシン抵抗性カセットを、pIM13プラスミドから精製した。上流領域、抵抗性カセット及び下流領域を含有する構築体をアセンブルした。得られたプラスミドを線状にして用いて、176NTHi系統を、MIVプロトコル[121]を用いて形質転換した。得られたノックアウト系統を、PCR、ウェスタンブロット及び遺伝子座配列決定法によって確かめた。
【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
ポリクローナル抗血清の調製
4匹のCD1マウスの群を免疫化して、ポリクローナル抗血清を産生させた。10μgの精製タンパク質を各マウスに用いた。組換えタンパク質を、アルミニウムの存在下で腹膜内に与えた。第2(21日目)及び第3(35日目)のブースター用量を投与した。血液サンプルを49日目に採取した。
【０１８５】
処理は、内部動物倫理委員会組織のガイドラインに従って実行した。
【０１８６】
細胞分画及びウェスタンブロット分析
ヘモフィラス属系統をBHI中で5%CO2下37℃にて、中期対数期まで増殖させた。
【０１８７】
全細胞溶解物及びペリプラズム画分を、EpicentreのPeriPreps Periplastingキットを用いて精製した。外膜タンパク質(OMP)を、Carloneら[122]によって記載される迅速手順に従うサルコシル-不溶性に基づいて回収した。
【０１８８】
培養上清を調製するために、細菌を4℃にて10分間13000gで収集した。1mlの培養上清を、0.22mmフィルタで濾過して、50%TCAの容量で4℃にて1時間沈殿させた。
【０１８９】
30分間の13000gでの遠心分離後、獲得されたペレットを70%エタノールで一度洗浄し、1×サンプルローディングバッファ中に再懸濁させた。
【０１９０】
各細胞画分のタンパク質を、NuPAGE Gel Systemを用いたSDS-PAGE電気泳動によって、製造者の説明書(Invitrogen)に従って分離し、クーマシーブルー染色よって、又はウェスタンブロット分析用ニトロセルロースメンブレン上に移すことによって明らかにした。
【０１９１】
ウェスタンブロットを、標準的な手順に従って実行した。組換えNTHI0532、NTHI0915及びNTHI0830(1:1000に希釈した)に対して高めたポリクローナルマウス抗血清、並びに二次抗体としての、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(DAKO)にコンジュゲートした抗マウス抗血清により、様々なLytMタンパク質を同定した。Super Signal Chemiluminescent Substrate(Pierce)及びOpti 4CN Substrate Kit (Bio-Rad)により、製造者の説明書に従ってバンドを視覚化した。
【０１９２】
共焦点顕微鏡法
NTHi表面上のLytMタンパク質の存在を、共焦点画像を用いてチェックした。ノックアウト変異体をネガティブコントロールとして用いた。細菌を指数増殖期まで増殖させ、4%パラホルムアルデヒド(Sigma)中で固定した。複数回の洗浄後、ポリリシンコーティングしたスライド上に細菌を広げて、PBS+3%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma)により室温で30分間ブロッキングした。サンプルを洗浄し、特異的抗血清(1:1000)により室温で15分間インキュベートした。LytM抗血清をインタクトなKO細菌に予め吸着させて、交差反応性を最小にした。細菌をPBSで何回か洗浄し、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(1:400)(Molecular Probes)とインキュベートした。ラベル付けしたサンプルに、ProLong(登録商標)Gold antifade reagent with DAPI(Molecular Probes)を乗せて、ZeissLSM710共焦点顕微鏡で分析した。
【０１９３】
走査及び透過電子顕微鏡法
電子顕微鏡検査を、176wt及びノックアウト系統に実行して、細菌の形態構造の障害を観察した。細菌を指数増殖期まで増殖させ、PBSで洗浄し、2.5%グルタルアルデヒド及び2.5%パラホルムアルデヒドを含有するカコジレートスクロースバッファ中で一晩固定した。続いてサンプルを、カコジレートバッファ中1%OsO4及び0.15%ルテニウムレッド中で後固定し、1%酢酸ウラニルでブロッキングし、アセトンの連続希釈により脱水した。
【０１９４】
続いて、SEMのために、サンプルを、Balzers Union CPD 020中でCO2を用いた臨界点法によって乾燥させ、Balzers MED 010ユニットにおいて金でスパッターコーティングして、JEOL JSM 5200電子顕微鏡で観察した。TEMのために、サンプルを、先に記載したように固定且つ脱水してから、Epon系樹脂中に包埋した。ダイヤモンドナイフを用いたReichert Ultracutミクロトームで薄片をカットして、コロジオン銅グリッド上に収集し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色して、JEOL 1200 EX II電子顕微鏡で観察した。
【０１９５】
外膜小胞の調製
200mlのBHI培養において指数増殖期まで細菌を増殖させ、本来の外膜小胞(OMV)を、WT及び変異体系統から単離した。続いて細菌を遠心分離して上清を濾過し、プロテアーゼ阻害剤及びEDTAを加えて4℃で一晩そのままにした。上清を最大200000×gで3時間超遠心分離にかけて、OMVを含有する最終ペレットをPBS中に再懸濁させた。
【０１９６】
質量分析法
SDS-PAGEクーマシー染色バンドを切り取って、50mM NH4HCO3 50%アセトニトリル中で脱色した。乾燥ステップの後、バンドを、5mM NH4HCO3中12.5ng/mlトリプシンで37℃にて一晩ゲル内消化した。反応を、0.1%の最終濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)の添加によって停止させて、サンプルをMALDI-TOF質量分析にかけた。消化溶液の1μlをPACターゲット(Proteomics、Bruker Daltonics用にセットしたPrespotted AnchorChip 96)上にスポットし、室温で空気乾燥させた。スポットを、0.6μlの70%(vol/vol)エタノール、0.1%(vol/vol)TFA溶液で洗浄した。ターゲット上にプレスポットした標準を用いて、ペプチド質量スペクトルを外見的に較正した。ペプチド分子量の判定は、MALDI-TOF/TOF質量分析測定器UltraFlex(Bruker Daltonics、Bremen, GmbH)を用いて実行した。337nm(N2レーザー)でのレーザー脱離によって生じたイオンを、25kVの加速電圧にてリフレクターモードで記録した。一般に、おおよそ200の単一スペクトルを、シグナル/ノイズ比の改善のために蓄積し、FlexAnalysis(バージョン2.4、Bruker Daltonics)によって分析した。ペプチド質量フィンガープリントを、インフルエンザ菌86-028NPデータベースに対するMASCOT検索を用いて、以下のパラメータを用いて実行した:(i)切断の見逃し許容数1、(ii)可変修飾としてのメチオニン酸化、(iii)ペプチド許容度75ppm。MASCOTスコアリング確率及び系によって定義される有意なヒットのみを考慮した。
【０１９７】
反応原性アッセイ
ルシフェラーゼアッセイのために、HEK293-TLR2及びHEK293-TLR4細胞を、microclear 96ウェルボトムプレート中、選択抗生物質のない完全培地の90μl内に播種した。一晩のインキュベーション後、1mg/mlから始めて、PBSで1:2に希釈した異なる濃度のOMV(10μl/ウェル)で6時間、細胞を二反復刺激した。続いて、培地を捨て、細胞を20μlのPassive Lysis Buffer(Promega)で、室温にて20分間溶解した。LMax II384マイクロプレートリーダ(Molecular Devices)を用いて、100μl/ウェルLuciferase Assay Substrate (Promega)の添加により、ルシフェラーゼレベルを測定した。各サンプル由来の生の光単位(Raw light units)(RLU)を、コントロールサンプル(PBS)のRLUで割って、誘導倍数(FI)として表した。
【０１９８】
Ficoll(Amersham Biosciences)密度勾配遠心分離を用いて、健康なドナーのバフィコートからPBMC(末梢血単核細胞)を単離した。microclear 96ウェルボトムプレート中、10%の熱不活性化FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミンを補ったRPMI(GIBCO)の180μl内に細胞をシーディングした。1mg/mlから始めて、PBSで1:2に希釈した異なる濃度のOMV(20μl/ウェル)で一晩、細胞を刺激した。Mesoscale Assay Human-Proinflammatory 7-spot (MSD Technology)を用いて、製造者の説明書に従い、炎症サイトカインを検出する。
【０１９９】
結果
NTHiのNT013、NT017及びNT022は、他のグラム陰性菌によって発現される、以前に特徴付けられたいくつかのLytM-タンパク質とかなりの相同性を示す。特に、YebA、EnvC及びNlpD等の細胞分裂プロセスに関与することが知られている大腸菌タンパク質はそれぞれ、NT013と49%、NT017と40%、NT022と43%のアミノ酸同一性を示す。LytM触媒ドメインは、NTHiと大腸菌タンパク質との間で最も保存されている領域であり、実際、相同性パーセンテージはこの特異的ドメインについて最大で79%になる。
【０２００】
LytMタンパク質は、NTHiコンパートメント上に異なって分配されている
LytMタンパク質NT013、NT017及びNT022の発現及び細胞内局在位置を確認するために、3つのLytMタンパク質をコードする遺伝子の単一欠失変異体を、NTHi176系統において作成した。各LytM組換えタンパク質に対して高められた特異的抗血清によるイムノブロッティングが実行されて、ペリプラズム、外膜及び上清画分における発現レベルが判定された。
【０２０１】
図1Aに示されるように、NT013は外膜タンパク質抽出物において、NT017はペリプラズム画分において検出された一方で、NT022は全ての画分において見出された。コントロールについて、どの抗血清も、各ノックアウト変異体系統由来の細胞調製物におけるNT013、NT017及びNT022に相当する53kDa、46kDa及び42.5kDaの特異的バンドを認識しなかった(図1A)。
【０２０２】
驚くべきことに、NT013について染色された細菌の共焦点免疫蛍光顕微鏡観察により、細菌表面上のタンパク質の特異的シグナルが明らかにされず、ウェスタンブロット分析によってNT013が外膜画分中に存在することが見出されたため、これは、NT013が外膜の内側層に結合し得たことを示している。予想されるように、ペリプラズム画分において見出されたNT017は、共焦点顕微鏡分析によって陰性であり、NT022は、細菌表面上に曝露されていることが確かめられた(図1B)。興味深いことに、抗原は、分裂隔膜に近い特定の焦点の細菌表面上に位置が変えられているようである(図1B)。タンパク質局在位置のモデルが、図1Cに示されている。
【０２０３】
176ΔNT013及び176ΔNT022は、異常な細胞形態構造及び重度の細胞分離障害を示す
NTHi LytMタンパク質であるNT013及びNT022が細胞分離において役割を果たしたか否かを調査するために、単一のアイソジェニックノックアウト変異体(176ΔNT013及び176ΔNT022)が、固体培地又は液体培地で培養されて、野生型系統と比較された。これらは、光顕微鏡法によって視覚化されたコロニー形態構造において、差異を示さなかった。突然変異の効果を評価するために、ノックアウト系統を、液体BHI中で37℃にて増殖させた。WT及び変異体の増殖速度に有意な差異はなかったが、凝集の表現型が、176ΔNT013及び176ΔNT022の液体培養物に観察され(図2A)、共焦点画像によって確かめられた(図2C)。細菌のコロニー数もまた、寒天チョコレートプレート上に連続希釈してプレーティングした培養物により、2つの異なるODにて測定された。176ΔNT013及び176ΔNT022の1ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU)は、野生型Hi176及び176ΔNT017よりもかなり低く、実際に、176ΔNT013及び176ΔNT022に由来するCFUはそれぞれ、親系統に対して約10%及び1%のみである(図2B)。
【０２０４】
細菌の凝集表現型が細胞分離の不全のせいであったか否かを確認するために、発明者らは、共焦点走査電子顕微鏡検査を用い、これにより176ΔNT013及び176ΔNT022変異体は、直径及び形態構造が野生型と異なることが明確に示された(図3A及び図3B)。
【０２０５】
特に、176ΔNT013細胞は、野生型系統よりもおよそ4倍長く見え、中心部分で曲がっている。他方、176ΔNT022変異体はより長い鎖(最大0.1mm)を形成したが、明らかな形態差異は176ΔNT017について観察されなかった。同じ表現型が、異なる系統(Hi162)においてLytM変異体が生じた場合に観察され、そのような決定要素の機能的特性が遍在することが示された。
【０２０６】
この結果は、NT013及びNT022が細菌の分離に関与しているが、NTHi細胞増殖に必須でないことを示している。
【０２０７】
176ΔNT013及び176ΔNT022変異体は、外膜小胞を放出する
176ΔNT013及び176ΔNT022変異体における障害のある隔膜形成が、細菌の細胞表面の透過電子顕微鏡法(TEM)で観察された(図4)。さらに、これら双方の変異体の表面上でのブレブの排他的形成が強調された(図5)。
【０２０８】
この膜ブレブ形成は、グラム陰性菌によって自然に分泌される外膜小胞(OMV)の過剰産生によると考えられる。本来のOMVが、これらの2つの変異体及びHi176系統から精製されて、品質が確認され、且つOMV放出が定量化された。OMVの単離により、双方の変異体系統が、野生型系統に対してより多くの小胞を産生することが明らかとなった(図5)。OMV調製物のTEM分析により、見かけの直径が20から100nmの小胞の存在が確かめられた(図5)。LytM変異体におけるOMV過剰産生が定量化されて、WTに対して4倍の増大が示された(タンパク質の定量化について、ローリー法)。
【０２０９】
外膜小胞のタンパク質組成
各系統から抽出されたOMVのタンパク質組成を比較するために、サンプルがSDS-PAGEゲル上でランされて、クーマシーブルー染色が行われた(図6A)。タンパク質パターンは野生型及び変異体の系統間で類似したが、少しのバンドが異なる強度を示した。予想されるように、質量分析により、これらのバンドは、いくつかの知られている表面決定要素(HMW1及び2、HtrA、P2、P5及びOMP26が挙げられる)に関連付けられた(図6B)。知られているTolR変異体及び野生型との比較がなされた。
【０２１０】
選択されたバンドの質量分析に基づいて、変異体系統から精製されたOMVが、そのタンパク質含有量について分析され、野生型系統から精製されたOMVと比較された。
【０２１１】
ヘモフィラス属タンパク質が、細胞内での局在位置に従って5つのクラスに分類され、OMV中に存在する各クラス由来のタンパク質の量が測定された。差異が野生型と変異体との間で観察され、このことはOMV形成の異なる機構を示唆している(図7参照)。NT013及びNT022変異体のOMVは、リポタンパク質の量の増大及び外膜タンパク質の量の減少を示した。個々のタンパク質の量が、各クラス内で定量化された。リポタンパク質、ペリプラズムタンパク質及び外膜タンパク質のクラスの結果はそれぞれ、図8、図9及び図10に示されている。
【０２１２】
1つの差異が、変異体系統における外膜免疫優性タンパク質(タンパク質2及びタンパク質5)の量の減少である(図10及び以下の表参照)。特に野生型において、これらP2及びP5の量は、総量の約56%であり、ΔNT013においては31%にまで、ΔNT022においては23%にまで減少している。P2及びP5は非常に豊富且つ可変的なタンパク質であり、これらの存在は、ヘモフィラス属OMVに対して生じる血清における交差反応性の欠如の重要な理由の1つである。したがって、P2及びP5濃度が低い変異体OMVは、交差反応性を向上させるのに用いられ得る。
【０２１３】
【表４】
2016520040.tif 000007
【０２１４】
NT017変異体における毒性因子に関するプロテオミクスデータの要約が、以下に示される:
【０２１５】
【表５】
2016520040.tif 000008
【０２１６】
免疫学的研究が、野生型及び変異体由来のOMVに実行されて、OMVタンパク質パターンにおいて観察される差異が、LPS又はリポタンパク質成分によるTLRの活性化に影響し得るかが判定された。HEK293-hTLR2及びHEK293-hTLR4/CD14MD2細胞が、野生型及びノックアウト系統由来の、希釈が異なるOMVにより刺激された。有意差は検出されなかった(図6C/図6D)。
【０２１７】
さらに、同刺激が、ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)に施されて、炎症誘発性サイトカインの産生が測定された。有意差は観察されなかった(図6E/図6F)。
【０２１８】
髄膜炎菌におけるLytMタンパク質のノックアウト
3つのLytMタンパク質が髄膜炎菌MC58において同定された。これらはNMB1483、NMB0315及びNMB1333である。NMB1483は、2つのLysMドメイン及びM23ペプチダーゼファミリードメインを含有し、髄膜炎菌B群において見出されるNlpDホモログである。また、NMB0315は、M23ペプチダーゼファミリーに属するリソスタフィン型亜鉛依存性メタロペプチダーゼであり、HXHモチーフを含有する保存活性部位によって特徴付けられる。また、NMB1333は、M23ペプチダーゼファミリーに典型的な保存ドメインを示す。LytMタンパク質の遺伝子及びタンパク質配列は、髄膜炎菌において同定され、配列番号37〜配列番号42に示されている。
【０２１９】
【表６】
2016520040.tif 000009
【０２２０】
ノックアウト変異体が、髄膜炎菌の系統MC58において、遺伝子NMB1483(NlpD)について作成され、これはMC58Δ148と名付けられた。ノックアウト変異体の作成の詳細な説明が、他で記載されている[123]。
【０２２１】
遺伝子のコード配列とのフランキング領域が、以下のプライマーセットを用いて増幅された:
【０２２２】
【表７】
2016520040.tif 000010
【０２２３】
MC58における欠失変異体の作成に用いられるプラスミドは、pBS-UD1483_Eryであった。染色体対立遺伝子交換によって、遺伝子はエリスロマイシン抵抗性カセットで置換された。
【０２２４】
MC58Δ1483系統は、共焦点顕微鏡分析によって分析され、WT系統に対して、サイズが可変的である複数の凝集体の存在を示した。共焦点顕微鏡分析のために、細菌が、GC培地中で指数増殖期(OD600 0.5)まで増殖され、4%パラホルムアルデヒド中に固定されてから、DAPI染色された(図12参照)。
【０２２５】
細菌の細胞形態構造をさらに特徴付けるために、TEM(透過電子顕微鏡法)及びSEM(走査電子顕微鏡法)分析を実行した。TEM分析のために、細菌はまたGC培地中で指数増殖期(OD600 0.5)まで増殖された。TEM分析により、細菌の凝集体の存在が確かめられ、WT系統において観察される双球菌と比較して、異常な細胞形態構造がMC58Δ1483において示された。さらに、小胞の存在が、変異体系統において明確に目に見えた(図13A参照)。
【０２２６】
SEM分析のために、細菌はまたGC培地中で指数増殖期(OD600 0.5)まで増殖された。SEM分析によってもまた、3次元細菌凝集体及び異常な細胞形態構造の存在が、MC58Δ1483変異体において確かめられた(図13B参照)。
【０２２７】
MC58Δ1483変異体はまた、OMVを産生する能力について試験された。第1の実験において、系統MC58及びMC58Δ1483が、250mlのシェーカーフラスコ中の50ml MCDM I(髄膜炎既知組成培地I)(Meningitis chemically defined medium I)において、5%CO2下37℃で185rpmにて一晩インキュベートされて、静止期(OD6001.3〜1.5)まで増殖された。
【０２２８】
OMV単離のために、培養物は4℃で30分間3500rpmにて遠心分離されて、上清が、Stericupフィルタボトル(0.22μmの細孔サイズ)を用いて濾過された。
【０２２９】
続いて、サンプルが4℃で2時間35’000rpm(平均96’000×g)にて遠心分離されてから、PBSで洗浄されて、再度4℃で2時間35’000rpm(平均96’000×g)にて遠心分離された。上清の除去後、ペレットが200から500μlPBS中に再懸濁された。
【０２３０】
調製物の品質をチェックし、且つMC58 WT及びMC58Δ1483変異体系統によって産生された小胞の量を比較するために、OMVの同容量がSDS-PAGE分析のためにロードされて、タンパク質がクーマシーブルーで染色された。結果は、WT系統と比較して、MC58Δ1483変異体において異なるタンパク質パターンを示した。ローリーアッセイによる総タンパク質の定量化により、WT系統と比較して、変異体由来のOMV産生において2倍の増大が示された(図14A)。
【０２３１】
第2の実験において、系統MC58及びMC58Δ1483が、250mlのシェーカーフラスコ中の40mlのGC培地において、5%CO2下37℃で185rpmにてインキュベートされて、指数増殖期(OD600 0.5)まで増殖された。OMV単離のために、同じプロトコルが続いた。
【０２３２】
SDS-PAGE分析の結果は、MC58Δ1483変異体由来のOMVタンパク質のみを示した。WT系統由来のOMVの同容量がロードされた場合、タンパク質は検出されなかった。また、ローリーアッセイによる定量化により、WT系統由来の調製物中のOMVの不存在が確かめられた(図14B)。
【０２３３】
他のOMVが調製されて、サンプルの質量分析プロテオミクス分析が、指数増殖期及び静止増殖期にて実行される。主要な4CMenBワクチン抗原の存在が評価され、且つ比較される。
【０２３４】
百日咳菌におけるLytMタンパク質ノックアウト
6つの推定ペプチダーゼ:BP1721、BP2956、BP0608、BP2919、BP3015及びBP1017が、百日咳菌Tohama Iにおいて同定された。BP1721及びBP2919は、大腸菌由来のNlpD及びNTHi由来のNT022のように、Lys-Mドメイン(ペプチドグリカンへの結合に関与する)及びLyt-Mドメイン(リソスタフィン型メタロペプチダーゼ)の双方を有し、他の4つのタンパク質は、Lyt-Mドメインのみを有する。百日咳菌のNlpDホモログとして明確に同定され得るBP1721を除いて、遺伝子座構成は、様々なホモログの識別に役立たない。多重アラインメントにより、BP2956とNT013との間及びBP0608とNT017との間に、ペプチダーゼ触媒部位の高い保存が示された。遺伝子及びタンパク質の配列が、配列番号47〜58に示されている。BP1721は、NlpDホモログである。BP2956は、推定NT013/YebAホモログである。BP0608は、推定NT017/EnvCホモログである。
【０２３５】
【表８】
2016520040.tif 000011
【０２３６】
ノックアウト変異体が、百日咳菌の系統W28 9K-129Gにおいて、遺伝子BP1721(NlpDホモログ)について作成された。遺伝子のコード配列とのフランキング領域が、以下のプライマーセットを用いて増幅された:
【０２３７】
【表９】
2016520040.tif 000012
【０２３８】
遺伝子BP1721の欠失が、以下のように得られた:
【０２３９】
カナマイシン抵抗性カセットが、自殺ベクターpSORTP1中のBP1721フランキング領域間にクローニングされた。pSORTP1-BP1721KO構築体は、接合によって百日咳菌中に導入された。第1の乗換え事象後の染色体中へのプラスミドの統合が、ゲンタマイシン抵抗性(プラスミド骨格上に存在)及びカナマイシン抵抗性(プラスミド挿入体中に存在)について選択された。第2の乗換え事象及びBP1721遺伝子の、カナマイシンカセットとの置換後のプラスミドの損失が、ストレプトマイシン抵抗性(プラスミドは、ストレプトマイシンに対する感受性を与える)及びカナマイシン抵抗性について選択された。BP1721遺伝子の、カナマイシンカセットとの置換は、BP1721のフランキング領域の外側のプライマーを用い、且つコントロールとして百日咳菌W29 9K/129Gを用いたPCR増幅によって確かめられた。増幅産物の予想サイズは、WT系統について2189bp、KO系統について2574bpであった。用いられたプライマーは、BP1721 EXT 5' FOR: AACCTGGGCTTGAACTCC(配列番号63)、BP1721 EXT 3' REV: ACACCAGCCAGGTATTGA(配列番号64)であった。
【０２４０】
細胞分裂機構の変更によるであろう細胞凝集体が、細菌が液体培地中で増殖された際に既に培養物で目に見えた。その後、共焦点顕微鏡分析によって、細胞分裂障害が確かめられた。顕微鏡分析のために、液体培養物の50μlが、4%パラホルムアルデヒドで固定され、DAPI染色されて、DNAが可視化された。KO系統は、WT系統と比較して、重度の細胞チェイニング表現型(cell chaining phenotype)を明確に示した(図15参照)。
【０２４１】
系統Bp W28 9G/129K及びBp W28 9G/129K ΔNlpDが、250mlのシェーカーフラスコ中の40mlステナーショルトブロス(400μg/mlストレプトマイシンが補われている)において指数増殖期(OD600 4.3〜4.8)まで増殖され、35℃で180rpmにてインキュベートされた。
【０２４２】
OMV単離のために、培養物は4℃で45分間5000×gにて遠心分離されて、上清が、Stericupフィルタボトル(0.22μmの細孔サイズ)を用いて濾過された。続いて、サンプルが4℃で2時間96000×gにて遠心分離されてから、PBSで洗浄されて、再度4℃で2時間96000×gにて遠心分離された。上清の除去後、ペレットが200μl PBS中に再懸濁された。
【０２４３】
調製物の品質をチェックし、且つBp W28 9G/129K及びBp W28 9G/129K ΔNlpD系統によって産生された小胞の量を比較するために、OMVの同容量(10μl)がSDS-PAGE分析のためにロードされて、タンパク質がSimplyBlue(商標)SafeStain(Life Technologies)で染色された。結果は、WT系統と比較して、変異体において異なるタンパク質パターンを示した(図19参照)。
【０２４４】
ノックアウト変異体が、百日咳菌の系統W28 9K-129Gにおいて、遺伝子BP2956(推定NT013/YebAホモログ)について作成される。遺伝子のコーディング配列とのフランキング領域(太字)が、以下のプライマーセットを用いて増幅される:
【０２４５】
【表１０】
2016520040.tif 000013
【０２４６】
遺伝子BP2956の欠失が、以下のように得られる。クロラムフェニコール抵抗性カセットが、自殺ベクターpSORTP1中のBP2956フランキング領域間にクローニングされる。pSORTP1-BP2956KO構築体は、接合によって百日咳菌中に導入される。第1の乗換え事象後の染色体中へのプラスミドの統合が、ゲンタマイシン抵抗性(プラスミド骨格上に存在)及びクロラムフェニコール抵抗性(プラスミド挿入体中に存在)について選択される。第2の乗換え事象及びBP2956遺伝子の、カナマイシンカセットとの置換後のプラスミドの損失が、ストレプトマイシン抵抗性(プラスミドは、ストレプトマイシンに対する感受性を与える)及びクロラムフェニコール抵抗性について選択される。
【０２４７】
これらの欠失変異体系統は、細胞形態構造、OMV産生及びプロテオミクスの特徴付けのために分析される。特に、百日咳菌の最も免疫原性の高い抗原(Pt、FHA及び69K)の存在が評価される。最後に、これらの変異体は、百日咳菌の生理学及び/又は病原性における機能について、in vitroで分析され、産生されたOMVは、免疫原性及び交差反応性の研究において試験される。
【０２４８】
他の推定LytMタンパク質ホモログのノックアウト変異体:遺伝子のコーディング配列とのフランキング領域(太字)が、以下のプライマーセットを用いて増幅される:
【０２４９】
【表１１】
2016520040.tif 000014
【０２５０】
本発明が例を用いて記載されてきただけであること、及び本発明の範囲及び精神の範囲内にとどまる限り、修飾がなされてよいことが理解されよう。
2016520040.tif 000015
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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