(57)【要約】  本発明は、混合栄養条件下、特に不連続及び／又は変化する照明条件下、及び／又は従属栄養条件下で、細胞密度及び所望の分子の生産性の両方を増大させることができる、培養細胞によるバイオマス生産方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスの生産方法であって、以下の工程：
ａ）発酵槽中、連続モードで、混合栄養又は従属栄養条件下、細胞を培養する工程；及び
ｂ）混合栄養条件下、半連続モードで操作されるｎ個の発酵槽に、工程ａ）で得られた細胞及びそれらの培養物を連続及び逐次的に供給する工程、ここでｎは２以上の整数である；
を含む、方法。
【請求項２】
前記混合栄養条件下での細胞の培養が、時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記照明の強度が変化し、その振幅が５〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５〜４００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜２００回起こる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記照明がフラッシュの形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）における培養が、強度５０〜２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、並びに持続時間が約１秒の１０分の１〜５分、好ましくは１秒〜１分、及び１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜３６０回の、フラッシュの存在下で実施される、請求項１
〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）における培養が、強度５０〜２，０００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、並びに持続時間が約１秒の１０分の１〜５分、好ましくは１秒〜１分、及び１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜３６０回の、フラッシュの存在下で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ａ）及び／又はｂ）における培養が、濃度５ｍＭ〜１．１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭの濃度の有機炭素含有基質の存在下で実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の培養が、４８〜２００時間、好ましくは７２〜９６時間実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、混合栄養条件下で、天然又は人工照明に応答して代謝活性を誘導することが可能な、原核若しくは真核単細胞生物、多細胞動物、植物又は真菌生物から単離された真核細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記真核又は原核単細胞生物が、海洋性又は淡水性、光合成性又は非光合成性の、原生生物、酵母又はシアノバクテリアから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核単細胞生物が、以下の属：シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ツラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オドンテラ（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）、ファエオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、モノドゥス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、イソクライシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ニツシア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）及び／又はテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）の種から選択される混合栄養性原生生物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記真核単細胞生物が、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及びヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）種から選択される混合栄養性原生生物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
シゾキトリウム、オーランチオキトリウム及びクリプテコジニウム属の種が、シゾキトリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  ３６、シゾキトリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １３２０、シゾキトリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １４９１、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３１１、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ  ３１、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３１９、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １４７９、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３２５、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）ＦＣＣ  ３０、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）ＦＣＣ  １３８４、及びクリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）ＦＣＣ  １３４８株から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
テトラセルミス、セネデスムス、クロレラ、ニツシア及びヘマトコッカス属の種が、テトラセルミス・ｓｐ．（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５６３、セネデスムス・アブンダンス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｂｕｎｄａｎｓ）ＦＣＣ  ２３、セネデスムス・ｓｐ．（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １４８３、及びセネデスムス・オブリクウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）ＦＣＣ  ４、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）ＦＣＣ  ２、クロレラ・ｓｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５５３クロレラ・ｓｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５２０、ニツシア・ｓｐ．（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １６８７、ヘマトコッカス・ｓｐ．（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １６４３株から選択される、請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂ）で得たバイオマスを回収する１つ以上の更なる工程を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオマスが、乾燥重量１Ｌあたり３０ｇ以上、好ましくは５０〜１５０ｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオマスが、アルコール、有機酸、脂肪酸、多糖類、テルペン、例えばボトリオコッケン（ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｅｎｅ）、色素、例えばカロテノイド、アミノ酸、酵素、ビタミン、抗生物質、薬理活性を有する化合物、例えば外来又は組換えタンパク質、及び色素から選択される１つ以上の所望の分子を含有する、請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオマスが、乾燥重量の１０％以上、好ましくは３０±５％を占める、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマスが、油相中に５％、好ましくは２０〜３０％の所望の脂肪酸、及び／又は乾燥物質中に０．１％〜１％の色素を含有する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記所望の分子が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、オレイン酸、フコキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン及びベータカロテンから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記脂質及び／又は色素を回収する１つ以上の工程、任意で当該脂質からＥＰＡ及び／又はＤＨＡ及び／又はＡＲＡ及び／又は色素を抽出する１つ以上の工程を更に含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）が１５〜２４℃で実施される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
以下：
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０８７／３で寄託された、シゾキ        トリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  ３６；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）  に、番号ＣＣＡＰ  ４０８７／４で寄託された、シゾ        キトリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １３２        ０；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０８７／５で寄託された、シゾキ        トリウム・ｓｐ．（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １４９１        ；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３で寄託された、オーラ        ンチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎ        ｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３１１；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０６２／２で寄託された、オーラ        ンチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎ        ｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ  ３１；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４で寄託された、オーラ        ンチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎ        ｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３１９；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６で寄託された、オーラ        ンチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎ        ｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １４７９；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５で寄託された、オーラ        ンチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎ        ｇｒｏｖｅｉ）ＦＣＣ １３２５；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  １１０４／３で寄託された、クリプ        テコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）Ｆ        ＣＣ  ３０；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  １１０４／５で寄託された、ＦＣＣ          １３８４；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  １１０４／４で寄託された、クリプ        テコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）Ｆ        ＣＣ  １３４８；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ６６／８５で寄託された、テトラセ        ルミス・ｓｐ．（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５６３；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２７６／７８で寄託された、セネデ        スムス・アブンダンス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｂｕｎｄａｎｓ）ＦＣＣ          ２３；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２７６／７９で寄託された、セネデ        スムス・ｓｐ．（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １４８３；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２７６／７７で寄託された、セネデ        スムス・オブリクウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）ＦＣＣ          ４；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２１１／１２９で寄託された、クロ        レラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）ＦＣＣ          ２；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２１１／１３０で寄託された、クロ        レラ・ｓｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５５３；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ２１１／１３１で寄託された、クロ        レラ・ｓｐ．（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １５２０；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  １０５２／２２で寄託された、ニツ        シア・ｓｐ．（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １６８７；
−  ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎ        ｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に、番号ＣＣＡＰ  ３４／１８で寄託された、ヘマトコ        ッカス・ｓｐ．（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＦＣＣ  １６４３；
から選択される株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混合栄養条件下、特に不連続及び／又は変化する照明条件下、及び／又は従属栄養条件下で、細胞密度及び所望の分子の生産性の両方を増大させることができる、培養細胞によるバイオマス生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明のバイオマスの生産方法は、発酵槽中、連続モードで、混合栄養又は従属栄養条件下、細胞を培養する工程、及び混合栄養条件下、又は従属栄養条件下、半連続モードで操作される発酵槽に、当該生産された細胞及びそれらの培養物を供給する工程を含む。
【０００３】
斯かる方法は、細胞及び、特に、原核又は真核単細胞生物に適用可能である。この方法は、特に、光合成細胞、即ち、特に原生生物の、混合栄養条件下、天然又は人工照明に反応しての、代謝活性を誘導できる細胞に適用可能である。この方法は、バイオマスの密度及びそのように培養された細胞中の所望の分子、特に脂質及び／又はカロテノイド、より具体的にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はアラキドン酸（ＡＲＡ）及び／又はα−リノレン酸（ＡＬＡ）及び／又はリノレン酸及び／又はオレイン酸の生産性の、両方を増大させることができる。
【０００４】
生物供給源による粗材料の生産は、現在の環境保護の側面を考慮すると益々重要になっている。動物及び植物細胞、或いは微生物は、現在、農業食物（例えばアルコール、有機酸、脂肪酸、多糖類、色素、アミノ酸、酵素又はビタミン）、医薬（抗体、薬理活性を有する化合物、外来又は組換えタンパク質）、化粧品（色素、有機化合物、例えば酸、多糖類及び脂肪酸）、及び石油化学産業（バイオ燃料、又は燃料、潤滑剤及び生物プラスチックに転換できる中間体製品）に有用な分子の生産手段として使用されている。
【０００５】
例えば、原生生物は、幾つかの種が、顕著な量の回収可能な化合物、例えば脂質、特に多不飽和脂肪酸を蓄積又は分泌できるため、現在多くの産業的計画に供されている。
【０００６】
細胞による所望の分子の生産は、産業スケールで、一般に発酵方法によって実施される。産業スケールで発酵を実施するために、幾つかの要素、例えば原生生物の場合、株に依存した培養条件（独立栄養、混合栄養又は従属栄養）、温度、照明条件、発酵槽のサイズ等を考慮しなければならない。例えば、培養は、１リットル容器中で、実験室内で、光バイオリアクター中で、及び１００，０００リットル容器中で、又はオープンポンド（数ヘクタール）中で実施されてもよい。しかしながら、人力や培養モニタリングの容易さ等の他の要素やエネルギーのコストが、理想的な培養条件を開発するためには考慮されなければならない。
【０００７】
いずれにしても、細胞は、生産すべき分子の収率を増大させる最適な条件下で培養されるのが望ましい。
【０００８】
バイオマス生産の分野で通常使用される、３種類の発酵方法が存在する。
【０００９】
−不連続（又は「バッチ」）モード：
タンクに滅菌した培養培地を充填し、ここに種菌を播種する。培地への顕著な添加物の添加を要さずに（主にｐＨ調整剤や脱泡剤）、発酵が起こる。体積は一定で、バイオマスの生産性は比較的低い。発酵の最後に、発酵槽が空にされ、その内容物は置き換えられる。
【００１０】
−半連続（又は「フェド−バッチ」）モード：
この生産方法は、培養中に漸進的に栄養物質を導入することに基づく。このモードは、一般に、発酵槽中に高い細胞密度を達成するために使用される。
【００１１】
−連続モード：
この方法において、通常「ケモスタット」と呼ばれる発酵槽が使用され、その中に新鮮な培地が連続的に添加され、一方培養液は連続的に抜き取られて、培養体積が一定に維持される。
【００１２】
細胞の増殖速度は、栄養物質の供給の速度を変化させ、一方細胞又は株の各種類の生理学的限界（特定のプロセス条件下でのその特定の最大増殖速度（μｍａｘ）に依存する）を順守することによりモニタリングできる。
【００１３】
連続モードは、バイオマスの増殖と所望の代謝物の生産との間の平衡に対応する所定の生理的平衡状態における微生物の培養を可能とする。
【００１４】
平衡状態において、定常速度での細胞増殖及び培養のパラメーターは、一定を維持する（ｐＨ、体積、溶存酸素濃度、栄養素及び産物の濃度、細胞密度等）。
【００１５】
連続モードは、特に、以下の利点を有する：
−バイオマスの全体の生産コストが低下する（洗浄、滅菌及び培養操作、発酵レベルでの装備の不動化の減少）；
−生産性（１時間あたりに生産されるバイオマスの量）が増大する；
−バイオマスの連続的な回収が、装備の寸法を最大化することにより下流の操作を促進することを可能とする。
【００１６】
しかしながら、前記連続プロセスは欠点も有り、特に、所望の分子の生産が細胞の増殖相から離れている、又は部分的に離れているときに不利となる。従って、所望の物質がこの最適の増殖相の外側に有る場合（例えば培養終期、培養の定常期の期間内）、経済的関心に適合した性能を得ることが困難である。
【００１７】
連続モードに関連した他の制約は：
−大量の廃液の管理（バイオマスの濃度の低下）、
−消費されなかった材料（残留物質）の損失も、下流のプロセス（抽出、乾燥等）に一定の影響を有することである。
【００１８】
ＵＳ６１５６７０は、従属栄養条件下、懸濁した細胞を培養する方法を記載しており、当該培養は半連続モードで開始され、連続モードで続行される。この方法は、細胞のエネルギー代謝を変化させ、乳酸塩の生産を変化させることが可能で、高い細胞密度を維持することを可能とする。使用される細胞は好ましくは哺乳類細胞、又は他の動物供給源（昆虫、魚等）である。
【００１９】
出願ＷＯ２００３／０２０９１９は、生物生産物を取得するための、高い細胞密度で動物又は植物細胞を培養するための幾つかのユニットを有するシステムに関する。この方法は、特に、半連続モードでの前培養発酵槽及び連続モードでの培養発酵槽を使用する。当該方法は、相乗的な方式で実施を可能にする異なるユニットの特別な配置に基づいている。
【００２０】
出願ＵＳ２００９／０２６３８８９は、細胞性脂質、例えばＤＨＡの生産のための、原生生物、特にシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）又はトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の、従属栄養条件下での培養方法に関する。当該培養は不連続モードで開始され、連続モードで継続され、又は半連続モードでの培養の中間工程を含む。
【００２１】
出願ＷＯ２０１２／０７４５０２は、異なる光独立栄養微生物、特に藻類、珪藻、シアノバクテリア、光細菌又は植物の培養方法及びシステムを記載し、当該方法において、「生物性」（他の生物に由来する）又は「非生物性」（無機物又は他の手段によって生産された）刺激剤が、代謝物の生産を生じさせ、又は増大するために使用される。この刺激剤は、照明と組み合わせて使用され得る。この方法は、光独立栄養及び混合栄養、又は光独立栄養及び従属栄養の培養条件を組み合わせる。
【００２２】
現在、発酵槽中、連続モードで、混合栄養又は従属栄養条件下、細胞を培養する工程（増殖工程）、及び混合栄養条件下、又は従属栄養条件下、半連続モードで操作される発酵槽に、当該生産された細胞及びそれらの培養物を供給する工程（「熟成」工程）が、所望のバイオマス及び分子の生産性を増大できることが見出されている。
【００２３】
有利な場合、そのように生産された方法は、特に、以下の長所を有する。
【００２４】
−連続モードで生産されたバイオマスは、良好な増殖速度を有する；
【００２５】
−細胞の質量は、半連続モードでの培養の間に、所望の分子が蓄積することによって、顕著に増大する；
【００２６】
−細胞の増殖と所望の分子の生産とは物理的に分離されており、各工程における培養パラメーター（照明、温度、ｐＨ、ｐＯ２、撹拌等）を最適に出来る；
【００２７】
−連続モードにおける増殖相は、培養物を熟成発酵槽に供給し、それは、不連続（バッチ）培養又は半連続（フェド−バッチ）培養を引き起こす、洗浄及び滅菌に伴う生産停止相を顕著に減少できる；
【００２８】
−連続的生産モードと比較して、本発明の方法は、最適な組成でバイオマスを取得することが可能で、即ち、所望の分子の蓄積に適した熟成相の間の物理化学的パラメーターの使用が、連続モードでの生産と比較して、生産性を顕著に改善できる；
【００２９】
−本発明の方法は、熟成相が連続モードである場合と比較して廃液が少なく、これは、１リットルあたりの収量を増大させ、等量のバイオマスのために再処理すべき廃液の量を減少できる。
【００３０】
想定される所望の分子は、特に、色素、例えばフコキサンチン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチン、（エキソ）多糖類、アミノ酸、ビタミン、脂質、特に脂肪酸、より具体的には多不飽和脂肪酸である。これらの中で、オメガ−３系の幾つかの高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）（「多不飽和脂肪酸」ＰＵＦＡ−ω３）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ又はＣ２０：５  ω３）及びその前駆体のリノレン酸（ＡＬＡ又はＣ１８：５ ω３）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ又はＣ２２：６ ω３）、及びオメガ−６系（ＰＵＦＡ−ω６）、特にアラキドン酸（ＡＲＡ又はＡＡ又はエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４ ω６）、及びその前駆体のリノール酸は、確認された栄養学的重要性を有し、治療的用途に関する優れた性能を有する。一不飽和脂肪酸、特にオレイン酸も、所望の分子として想定される。
【００３１】
漁業産業で生産される魚油は、現在、この種類の脂肪酸の主要な商業的供給源である。しかしながら、これらの油には新しい用途（水産業における食品添加物、マーガリンへの添加）が見付かっている一方で、集約的な漁業活動によって、海産魚類の供給源は乏しくなりつつある。
【００３２】
従って、これらのＥＰＡ、ＤＨＡ、ＡＬＡ及びＡＲＡ等の脂肪酸の新しい供給源を探索して、この種類の多不飽和脂肪酸の市場での将来の需要増大に備えなければならない。
【００３３】
酢酸、プロパン酸、及び酪酸等の短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ７）、ラウリン酸等の中鎖脂肪酸（Ｃ８〜Ｃ１２）も、微生物から、特に原生生物から取得される分子である。
【００３４】
更に、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチン、ルテイン又はフコキサンチン等のカロテノイドも、微生物によって生産される所望の分子である。それらは一般に色素として使用されるが、抗酸化剤として人間の健康において重要な役割を有する。最後にそれらは免疫系を刺激する能力を有する。
【００３５】
ルテイン及びゼアキサンチンは、摂取後に血中に吸収され、人間の網膜中に蓄積されるカロテノイドである。ルテインは、青色光によって引き起こされる眼球及び皮膚の病変に関するリスクを減少させる。それは特に、老人性黄斑変性（ＡＲＭＤ）の予防に寄与する。
【００３６】
更に、「マイコスポリン様アミノ酸」又は「ＭＡＡ」として知られる分子は、海洋性細菌、シアノバクテリア、真菌及び他の様々な海洋生物等の微生物によって生産される所望の分子である。
【００３７】
更に、幾つかの微生物によって生産されるエキソ多糖類も所望の分子であり、それらは、テクスチャー剤（ｔｅｘｔｕｒｉｚｅｒ）として農業食物調製物の組成に入り、又は艶消し（ｍａｔｔｉｆｙ）剤若しくはテクスチャー剤等として美容製剤の成分として用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の方法は、産業スケールでの、脂肪酸及び／又は色素の生産のための任意の種類の細胞、特に原生生物の培養に関する。
【００３９】
淡水又は海洋に生息する原生生物種の多くは、一般に独立栄養性、即ちそれらは光合成のみによって増殖できる。それらにとって、環境中の有機炭素含有基質の存在は好ましくなく、それらの増殖を改善しない。しかしながら、様々な種類及び起源の特定の種類の原生生物は、厳密に独立栄養性でないことが見出されている。従って、それらの一部の従属栄養生物は、光が全く存在しない条件下で、酸化的代謝（発酵又は呼吸）によって、即ち糖等の有機炭素含有基質を使用して、それを炭素及びエネルギーの単一の供給源として、増殖することができる。
【００４０】
増殖に尚も光合成が不可欠な他の原生生物種は、環境中に存在する有機物と光合成の両方を使用できる。これらの中間的な種類は、混合栄養生物と呼ばれ、光と有機炭素含有基質の存在を利用することが出来る。
【００４１】
「混合栄養」藻類の具体的な特徴は、それらの代謝に関連しており、光合成と酸化的代謝を同時に実行できる。両方の種類の代謝が、当該藻類の増殖に対して全体的に有利な効果を有する［Ｙａｎｇ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：８７−１０２］。
【００４２】
混合栄養生物と見做される他の生物も存在する。例えば、パラコッカス・パントトロフス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）等の原生生物、及び植物のジオアエア・ムシプラ（Ｄｉｏｎａｅａ  ｍｕｓｃｉｐｕｌａ）は、光からエネルギーを引き出すことが出来る。
【００４３】
混合栄養種の中で、「光従属栄養」種の場合、酸化的代謝（発酵又は呼吸）によってのみ増殖するが、光が、例えば屈光性（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）（光に関連して方向設定する能力）、有性生殖サイクルの惹起、又はより一般的には光が当たったときの代謝の変化等の、光受容体を介した細胞に対する影響を有する。これらのメカニズムは、海洋性の糸状新菌類や原生生物等の多くの生物において知られている。
【００４４】
本発明において、「混合栄養」細胞、生物又は微生物は、光及び有機炭素含有基質を使用して増殖できる、細胞、生物又は微生物を意味し、また、増殖以外の他の機能、例えばカロテノイドのような分子を生産するために光を使用するものは、「光従属栄養」という。従って、「混合栄養」細胞は、混合栄養条件下で、天然又は人工の照明に応答して、代謝活性を誘導できる。
【００４５】
いずれにしても、微生物、細胞において、生産すべき所望の分子、特に脂肪酸及び／又は色素の収量を増大させる最適の条件下で培養するのが望ましい。
【００４６】
特に、より効率的でより良好なコスト効果の高い産業的実施のために、従来技術に記載されるものよりも良好な収率で、バイオマス、脂質及びカロテノイドを取得できるのが望ましい。従って、可能な限り高い収率であるのが好ましい（例えば乾燥物質１Ｌあたり８０ｇ超、乾燥物質の合計重量に対して脂肪酸３０重量％超、及び乾燥物質の合計重量に対してカロテノイド３０重量％超）。
【課題を解決するための手段】
【００４７】
詳細な説明
第一の側面において、本発明は、バイオマスの生産方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）「トップ発酵槽」という発酵槽中、連続モードで、混合栄養又は従属栄養条件下、細胞を培養する工程；及び
ｂ）混合栄養条件又は従属栄養条件下、好ましくは混合栄養条件下、半連続モードで操作されるｎ個の、「熟成発酵槽」という発酵槽に、工程ａ）で得られた細胞及びそれらの培養物を連続的に供給する工程、ここでｎは２以上、好ましくは２〜１０の整数である；
を含む。
【００４８】
一つの態様において、本発明は、混合栄養又は従属栄養で増殖する工程、及び混合栄養条件下で所望の分子を蓄積する工程を含む、培養方法に関する。
【００４９】
「混合栄養条件」は、光及び有機炭素含有基質の供給が有る培養を意味する。
【００５０】
「従属栄養条件」は、暗黒下、有機炭素含有基質の供給が有る培養を意味する。
【００５１】
「原生生物」は、全ての単細胞真核微生物を意味する。微細藻類（クロレラ、テトラセルミス、ニツキア等）、単細胞真菌類（シゾキトリウム、オーランチオキトリウム等）、又は従属栄養性鞭毛虫（クリプテコジニウム等）は、原生生物の群の一部を形成する。
【００５２】
「株」は、天然の株だけでなく、当該天然の株の突然変異をも意味する。
【００５３】
「突然変異」は、元の株に由来する生物で、当該株の遺伝子プールが、天然の方法により、又は当業者に知られるランダムな突然変異を生産できる物理化学的方法（ＵＶ等）により、又は遺伝子操作方法により改変されたものを意味する。
【００５４】
工程ａ）は、顕著な細胞増殖を達成出来る細胞の増殖相である。一般に、この目標を達成するために、培養する細胞の種類、及び生産すべき所望の分子の種類に依存して、特定の培養培地（細胞への供給溶液）が選択される。例えば、原生生物の場合、培養培地は、主要栄養素、微量元素及びビタミンを含有する供給溶液に富む。当該培養培地は、従属栄養又は混合栄養モードでの培養を可能とする、有機炭素含有基質を含有する。
【００５５】
工程ｂ）は、所望の分子の蓄積の相である。好ましくは、この相は、代謝をこれらの所望の分子の蓄積に好ましく向かわせることを可能とする第二の供給手段を用いる。例えば、原生生物による脂質の製造の場合、この方向付けは、炭素の濃度と容易に吸収される炭素の濃度との比率（Ｃ／Ｎ比）を増大させることによりなされる。
【００５６】
実際に、連続モードを実行する第一の発酵槽は、細胞の増殖（工程ａ））を可能とし、この増殖発酵槽からの送出の流れ（又は排出）は、熟成タンクを供給し、そこでのバイオマスは、所望の分子が蓄積している（工程ｂ））。
【００５７】
本発明のこの態様において、前記方法は、「不連結（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ）」と呼ばれる方法として記載され得て、工程ａ）の増殖相と工程ｂ）の熟成相は、物理的及び時間的に分離される。
【００５８】
本発明のバイオマスの生産方法の連続モードでの細胞の培養の工程ａ）、又は「増殖工程」は、当業者に知られる発酵槽、例えば「ケモスタット」中で実施されてもよい。
【００５９】
工程ａ）の培養の開始は、通常の方法で実施される（図１）。上流で前培養工程が実施され、連続的なバイオマスの生産を開始するのに望ましい細胞濃度、即ち２〜５０  ｇ／Ｌ、好ましくは５〜４０  ｇ／Ｌを得てもよい。
【００６０】
一般に、クライオチューブからのスケールの増大は、幾つかの前培養工程を経て実施される。例えば、それは、エルレンマイヤー中での２つの工程（前培養１及び前培養２）、並びに発酵槽中での１つの工程（前発酵槽）の３つの工程で行われてもよい。エルレンマイヤー中での増殖は、不連続（バッチ）モードで起こる。一般に、前発酵槽も、不連続モードで起こる。
【００６１】
例えば、前記培養は、２０ｍｌ  エルレンマイヤーでの培養から２ｌ  エルレンマイヤーでの培養に、そして不連続（バッチ）モードでの発酵槽での培養に（前発酵槽）、そして連続（トップ発酵槽）モードでの発酵槽での培養に漸進的に進み得る。例えば、不連続モードでの発酵槽の容積は４０Ｌで、トップ発酵槽の容積は４０００Ｌである。
【００６２】
トップ発酵槽での培養の開始は、その間に連続的な体制が達成されない、即ち細胞の増殖が安定しない、又は相内で新鮮な培地を供給する速度に同調しない、構築相を有する。それは、「平衡を達成する」相であり、「定常状態を達成する相」ともいえる。この「定常状態を達成する相」は、培養される微生物の増殖速度に、より正確には特定の増殖速度又はμｍａｘに依存する期間を有する。例えば、この期間は５〜２００時間、好ましくは１０〜１００時間であってもよい。
【００６３】
一般に、一旦定常状態に達すると、トップ発酵槽から熟成発酵槽への排出速度は、新鮮な培養培地を供給する速度に相当する流速で構築される。この排出は、所望の体積が移動するまで第一の熟成発酵槽に供給し、そして当該排出は、他の熟成タンクに方向転換される。当業者は、培養される細胞の種類、生産される所望の分子、及びその態様に係る熟成タンクの容量に従い、必要な播種物の体積をどうやって決定するかを知っている。この播種物の体積は、培養される細胞に依存して、熟成発酵槽の容積の１０〜９０％であってもよく、例えば熟成発酵槽の体積の約２０％，  ３０％，  ４０％，  ５０％，  ６０％，  ７０％、又は８０％である。
【００６４】
熟成発酵槽への排出は、公知の装備を使用して標準的な様式で実施される。
【００６５】
一般に、工程ａ）で使用されるのと異なる培養培地が、熟成相で採用される。異なる態様において、培養培地は、トップ発酵槽からの排出を起源とする播種と同時に、又はその前に、又はその後に、熟成発酵槽に供給される。
【００６６】
工程ａ）の発酵槽における培養の体積は、熟成発酵槽中の培養に必要な培養の最終体積の関数として決定される。一般に、トップ発酵槽の体積は、それを供給する熟成発酵槽の体積の約５〜１００％、好ましくは１０％〜５０％、より好ましくは約２０％である。例えば、体積４０００Ｌのトップ発酵槽は、２００００Ｌの熟成発酵槽に供給できる。ｎ個の熟成発酵槽の体積が異なる場合、最大の発酵槽の体積がトップ発酵槽の体積を決定し得る。
【００６７】
工程ａ）で使用する培養培地は、培養する細胞の特性に従い選択される。
【００６８】
細菌、真菌又は酵母の培養において、所定の方法のために特定の培地が開発され得る。しかしながら、最少培地又は富化栄養培地（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｕｍ）が使用されてもよく、酵母又は原生生物の増殖用にＶｅｒｄｕｙｎ培養培地や、最近の増殖用にＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ）培地等が使用され得る。植物細胞の培養において、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ型の培地が使用され得る。動物細胞の培養において、例えば、ＤＭＥＭ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）が使用され得る。
【００６９】
一般に、特に細菌、原生生物又は真菌等の微生物の培養において、特に、工程ａ）における培養培地は、一般に、窒素源及びリン酸源、及び有機炭素含有基質を含有する。後者は、混合栄養モードでの培養を可能とする。
【００７０】
この種類の培地の例は、改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ ｇ／Ｌ，  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ３ｇ／Ｌ，  ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４ ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ，  パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ，  塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ，  ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ，  消泡剤０．１ｍＬ／Ｌ）であり、これに有機炭素含有基質が添加される。
【００７１】
培養培地の他の例は、以下の構成の培地（海水塩２５  ｇ／Ｌ，  ＫＮＯ３ ３  ｇ／Ｌ，  ＮａＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，  ２．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ ２４ ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＳｉＯ３ ９Ｈ２Ｏ  ０．３  ｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １ ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０  ｍｇ／Ｌ，  酵母抽出物２ｇ／Ｌ，  ビオチン０．１５  ｍｇ／Ｌ，  塩酸チアミン９．５  ｍｇ／Ｌ，  ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ，  消泡剤０．１  ｍＬ／Ｌ）に、有機炭素含有基質を添加したものである。
【００７２】
本発明の一つの態様において、前記有機炭素含有基質の濃度は、５  ｍＭ〜１．１  Ｍ  （０．９〜２００  ｇ／Ｌ）、好ましくは５０  ｍＭ〜８００  ｍＭ  （９〜１４４  ｇ／Ｌ）である。
【００７３】
好ましくは、当該有機炭素含有基質は、グルコース、セルロース誘導体、乳酸塩、澱粉、ラクトース、サッカロース、酢酸塩及び／又はグリセロールの純粋なもの又は混合物である。
【００７４】
前記培養培地中に含有される有機炭素含有基質は、複合分子又は複数の基質の混合物からなるものであってもよい。トウモロコシ、小麦又はジャガイモ等に由来する澱粉の生物変換で得た産物、特に小サイズの分子からなる澱粉加水分解物は、本発明の混合栄養培養に適した有機炭素含有基質を形成する。
【００７５】
培養に十分な濃度を維持するために、本培養方法の過程で、培養培地に追加の基質が添加される。当業者は、どのように有機炭素含有基質のレベルの維持を保証するかを承知している。
【００７６】
好ましくは、好ましくは、前記有機炭素含有基質は、３００ｍＭ以上の濃度のグルコース、グリセロールを含有する。
【００７７】
例えば、ＤＨＡの生産のためのオーランチオキトリウム属の原生生物の株の工程ａ）の培養は、グルコース濃度５〜２００  ｇ／Ｌ、好ましくは３０〜１００  ｇ／Ｌ、より好ましくは３０〜６０  ｇ／Ｌの、生理食塩水培養培地（海水塩１０〜２０Ｌ、好ましくは１５ｇ／Ｌ）中で実施され得る。一つの態様において、前記培養培地は、濃度１〜５０  ｇ／Ｌ、好ましくは２〜２５  ｇ／Ｌのマグネシウム塩やカリウム塩等の主要栄養素も含有する。一つの態様において、前記培地は、好ましくは１．５〜７．５  ｇ／Ｌのアンモニウム塩を含有する。また、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン、及び銅、ニッケル及び鉄の塩等、原生生物の培養における通常の様式で使用される微量元素も含有する。これらの微量元素の濃度の典型的な値は、各微量元素において０．０２〜１５ｍｇ／Ｌである。例えば、マグネシウム及び亜鉛塩は２〜４ｍｇ／Ｌで存在し、コバルト及びモリブデン塩は少量存在し、例えば０．０１〜０．０４ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．０３ｍｇ／Ｌである。銅及びニッケル塩は１〜４ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌで存在する。一般に、鉄塩は他の塩より顕著なレベルで存在し、例えば８〜１５ｍｇ／Ｌのレベルである。
【００７８】
他の態様において、前記マグネシウム塩は存在する。一つの態様において、前記培地は、ビタミン、例えばチアミン、ビタミンＢ１２、パントテン酸塩及び任意で安定化剤をも含有する。
【００７９】
非常に高いオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）密度（１〜３ｘ１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を達成するのに適した本発明の態様において、下記表１の「初期培地」という培養培地が使用される。
【００８０】
【表１】
2016523554.tif 000002
【００８１】
「初期培地」は、連続培養を開始するのに使用され得る培地に対応する。そして「供給溶液」は、発酵槽に連続的に供給するのに使用され得る。
【００８２】
一般に、例えば原生生物、細菌及び酵母において、トップ発酵槽中のバイオマス濃度が平衡に達したとき、約５〜１００  ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜７０  ｇ／Ｌのバイオマス濃度で、トップ発酵槽からの排出は連続的かつ持続的に、半連続モードを実行する異なる熟成発酵槽に供給すると見做される。細胞の培養は、前記発酵槽中で混合栄養又は従属栄養条件下で維持され（「熟成」工程）、所望の分子が生産される。従って、一般に、工程ｂ）における熟成発酵槽への供給は、トップ発酵槽が定常状態で細胞密度が一定となったときに開始される。例えば、原生生物の培養において、この細胞密度は、１ｍＬあたり１０７〜１０９細胞であり得る。酵母においては、この細胞密度は、１ｍＬあたり１０８〜１０９細胞であり得る。細菌においては、この細胞密度は、１ｍＬあたり１０９〜１０１０細胞であり得る。
【００８３】
工程ｂ）における熟成発酵槽への供給は、（一般に）連続で実施され、即ち、ｎ番目の熟成発酵槽に、トップ発酵槽からの排出物が供給され、その後、ｎ＋１番目の熟成発酵槽に順番が回る。
【００８４】
熟成発酵槽に播種するのに使用される種菌の体積は、一般に、培養される細胞、生産される所望の分子、及び移動前の熟成発酵槽に必要な体積、及び所望の分子の生産の工程に依存する。例えば、原生生物、酵母及び細菌の場合、当該体積は、熟成発酵槽中の細胞懸濁物の最終体積の１０〜７０％、好ましくは２０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％である。
【００８５】
一般に、所望の播種物の体積が熟成発酵槽ｎにおいて達成されたら、次の（ｎ＋１）熟成発酵槽（又は「熟成容器」）に供給され、そして次の（ｎ＋２）熟成発酵槽に供給される。
【００８６】
一つの態様において、熟成発酵槽中の培養は停止され、そして当該発酵槽は、所望の分子の生産が所望のレベルに達したとき、例えば、オーランチオキトリウム属の原生生物の場合、ＤＨＡのタイターが５〜３０ｇ／Ｌ、及び／又はカロテノイド色素のタイターが乾燥バイオマス１ｇあたり０．１〜１０ｍｇとなったときに排出される。
【００８７】
排出は、所望の分子の抽出に関するバイオマスの処理を可能とする装置における標準的な方法で実施される。排出後、熟成発酵槽は、一般に、発酵槽のタンク内に備わっている装備の特定の部品で洗浄され、そしてそれは滅菌される。
【００８８】
例えば（表２及び図１の表を参照）、７２ｈの熟成発酵槽中での培養時間において、最初の日（Ｄ）に、熟成発酵槽１は充填され、他の熟成発酵槽は待機し；Ｄ＋１日に、熟成発酵槽２は充填され（培養物Ｎ＋２）、熟成発酵槽１は培養途中であり；Ｄ＋２日に、熟成発酵槽３が充填され、熟成発酵槽１及び２は培養途中であり；Ｄ＋３日に、熟成発酵槽１は洗浄され、熟成発酵槽４は充填され、熟成発酵槽２及び３は培養途中である。
【００８９】
【表２】
2016523554.tif 000003
【００９０】
トップ発酵槽により供給される熟成発酵槽の数は２つより多く、一般に、この数は、当該発酵槽及びそれらに関連する装備を保存するのに利用できるスペースによってのみ限定される。一般に、この熟成発酵槽の数は２〜１０、好ましくは２〜６個である。
【００９１】
本発明の一つの態様において、熟成培養の時間は、１０〜２００時間、好ましくは２０〜１００時間である。表に例示したサイクルは、時間に応じて変化する。例えば、細菌細胞において、熟成培養の時間は１５〜７２時間の間で変化する。例えば植物細胞において、熟成培養の時間は、４８〜２００時間の間で変化する。
【００９２】
原生生物、細菌及び酵母の培養において、半連続モードでの培養工程は、一般に、各発酵槽において２４〜２００ｈ、好ましくは４８〜９６ｈ、より好ましくは７２〜９６ｈで実施される。
【００９３】
工程ｂ）における培養培地の組成は、維持されるべき残留の増殖を可能としつつ、所望の分子の蓄積を促進することを可能とする。「残留の増殖」とは、工程１の増殖速度の１〜９０％であるが、所望のバイオマス及び分子の生産性の改善を可能とする増殖を意味する。
【００９４】
例えば原生生物による脂質の生産において、連続培養における増殖速度は０．０５〜０．２０  ｈ−１、好ましくは０．１０  ｈ−１である。
【００９５】
前記増殖速度は、時間中の集団数の増大を特徴付ける。斯かる増殖速度（μ）は、以下の式によって求められる。
μ＝  （ｌｎ  Ｎ２-  ｌｎ  Ｎ１）  ／  （ｔ２-  ｔ１）
Ｎ１は、時間ｔ１でのバイオマスの量、Ｎ２は、時間ｔ２におけるバイオマスの量である。バイオマスの量は、光学密度、細胞密度又は乾燥重量で表現され得る。時間ｔ１及びｔ２は、時間（ｈｏｕｒｓ）で表され得る。μの値はｈ−１  （１／ｈｏｕｒ）で表される。
【００９６】
半連続培養の工程ｂ）における発酵に使用される培養培地は、培養する細胞の性質に従って選択される。好ましくは、この培養培地は、好ましくは１つ以上の所望の分子を蓄積させるように培養された細胞の代謝を誘導することを可能とする。幾つかの細胞において、培養培地中の要素の制限は、分子の蓄積の促進を可能とする方法である。例えば窒素の制限の期間中に脂質の蓄積を増大し得る原生生物が想定され得る。窒素の制限とは、細胞の正常な増殖を確保するのに不十分な培地中の窒素の濃度を意味し、これは、炭素を脂質の形態で蓄積することを促進する代謝の変化をもたらす。斯かる代謝の変化は、Ｃ／Ｎ比（炭素濃度と容易に吸収される窒素の濃度との比率）を増大させることによっても達成される。
【００９７】
しかしながら、前記培養培地は、有機炭素含有基質を含有しており、混合栄養又は従属栄養増殖が可能である。典型的には、原生生物培養において、有機炭素は、１０〜９０  ｇ／ｌ（５５  ｍＭ〜５００  ｍＭ）の濃度で存在する。
【００９８】
一般に、脂質又は色素の生産のための原生生物の熟成の工程ｂ）における培養は、約２０〜２００  ｇ／Ｌ  （０．１〜１．１Ｍ）の有機炭素含有基質、約１〜１５ ｇ／Ｌのアンモニウム及び０．９〜３．５  ｇ／Ｌのリン酸塩を含有する生理食塩水培養培地（海水塩１０〜３０ｇ／Ｌ）中で実施され得る。例えば、オーランチオキトリウム株によるＤＨＡの生産において、培養培地（トップ発酵槽由来の細胞懸濁物の体積から、及び濃縮供給溶液の体積から再構築される）は、１００〜２００  ｇ／Ｌのグルコース、約５〜１０ｇ／Ｌのアンモニウム、及び１〜２ｇ／Ｌのリン酸塩を含有する。一つの態様において、前記培養培地は、主要栄養素、微量元素及びビタミンも含有する。
【００９９】
一つの態様において、前記熟成工程で使用される栄養溶液は、炭素源（例えばグルコース又はグリセロール）、窒素源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）、リン酸源（例えばＫＨ２ＰＯ４）を含有する。好ましくは、Ｃ（炭素）、Ｎ（窒素）及びＰ（リン酸塩）の間の比率（Ｃ／Ｎ／Ｐ）は５３０：１１：１であり、但し常に窒素が数倍多い又は少ない、及び／又はリン酸塩が２倍多い又は少ないことが想定され、例えば、下記の比率５３０：２２：１．５３０：５．５：１；  ５３０：２２：０．５；  ５３０：１１：２；  ５３０：２２：２；  ５３０：５．５：０．５；  ５３０：１１：０．５；  ５３０：５．５：２が使用され得る。
【０１００】
一般に、カロテノイド色素の生産のための酵母の株の熟成の工程ｂ）における培養は、約１０〜１００  ｇ／Ｌの有機炭素含有基質、約０．１５〜１５  ｇ／Ｌのアンモニウム及び約０．９〜９  ｇ／Ｌのリン酸塩を含有する培地中で実施され得る。例えば、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）によるアスタキサンチンの生産において、２０  ｇ／Ｌのグルコース、約３  ｇ／Ｌのアンモニウム及び１  ｇ／Ｌのリン酸を含有する培養培地が使用される。
【０１０１】
一般に、アミノ酸の生産のための細菌の株の熟成の工程ｂ）における培養は、約２０〜８０  ｇ／Ｌの有機炭素含有基質、約１０〜２０ｇ／Ｌの尿素及び約１〜１０ｇ／Ｌのリン酸塩を含有する培地中で実施され得る。例えば、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）によるＬ−メチオニンの生産において、５０  ｇ／Ｌのグルコース、約１０ｇ／Ｌのアンモニウム及び５ｇ／Ｌのリン酸を含有する培養培地が使用される。
【０１０２】
一つの態様において、工程ｂ）は、工程ａ）よりも低温で実施される。発明者らは、この態様において、工程ｂ）が工程ａ）と同一の温度で実施された場合と比較して、脂質、特にＤＨＡの生産される量が増大すること見出した。実際に、本発明の方法において、増殖に最適の温度は、ＤＨＡの生産の最適温度よりも高い。一般に、工程ｂ）は、工程ａ）が実施される温度よりも１〜８℃低い温度で実施される。例えば、培養の工程ａ）は２５℃で実施され、工程ｂ）は、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、又は２３℃で実施され得る。例えば培養の工程ａ）は２２℃で実施され、工程ｂ）は、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃で実施され得る。例えば培養の工程ａ）は２７℃で実施され、工程ｂ）は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃又は２６℃で実施され得る。
【０１０３】
低い温度も、色素の蓄積を促進する。
【０１０４】
本発明における培養方法は、混合栄養条件及び／又は従属栄養条件下で実施され、即ち工程ａ）及び工程ｂ）は、独立して、従属栄養条件下又は独立栄養条件下で実施され得る。一つの態様において、工程ａ）は従属栄養条件下で、工程ｂ）は混合栄養条件下で実施される。他の態様において、工程ａ）は混合栄養条件下で、工程ｂ）は従属栄養条件下で実施される。他の態様において、工程ａ）及びｂ）は、従属栄養条件下で実施される。例えば、この態様は、従属栄養条件下で良く増殖する原生生物、細菌又は酵母に適している。他の態様において、工程ａ）及びｂ）は、混合栄養条件下で実施される。例えば、この最後の態様は、光からエネルギーを引き出せる、原生生物又は細菌、酵母及び他の光合成細胞に適している。例えば、シゾキトリウム又はオーランチオキトリウム属の原生生物、のストック属のシアノバクテリア、又はロドトルラ属の酵母が想定され得る。
【０１０５】
より具体的には、前記混合栄養条件は、時間中不連続及び／又は変化する照明条件であってもよい。特に、照明はフラッシュの形態である。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。これらのフラッシュの持続時間は、「低頻度」での光の供給に適している。この最後の態様において、照明条件（光の供給）は、「低頻度」である。
【０１０６】
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。
【０１０７】
一つの態様において、フラッシュの持続時間は１／１５００００〜１／１０００秒である。これらのフラッシュの持続時間は「高頻度」の照明条件がふさわしい；即ちフラッシュの頻度がそれぞれ１５０ｋＨｚ〜１ｋＨｚである。
【０１０８】
照明条件（光の供給）が「高頻度」である場合のこの態様において、フラッシュは、１時間あたり３．６  ｘ  １０５〜５．４  ｘ  １０９回発生する。この態様において、光の変化は、１ｋＨｚ〜１５０ｋＨｚ、即ち１秒あたり１，０００〜１５０，０００フラッシュの頻度を有すると言われる。ほんはつめいのこの最後の態様における光の供給は、「高頻度と呼ばれる。
【０１０９】
１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。
【０１１０】
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。
【０１１１】
「変化する照明」は、光の強度が通常１時間あたり２回以上変化することを意味する。本発明の方法に適した照明条件の例は、フランス特許出願Ｎｏ．  １０５７３８０に記載されている。
【０１１２】
好ましくは前記照明は様々な強度を有し、その振幅は一般に５  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１〜２，０００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５０〜１，５００、より好ましくは５０〜２００ μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１である。
【０１１３】
好ましい態様において、前記照明は強度が変化し、その振幅は、５μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１〜１，０００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５〜４００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化は、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜２００回起こる。
【０１１４】
これらの変化は、一般に、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは５０〜５００回、より好ましくは１００〜２００回起こり得る。これらの培養条件は、所定の光量の供給を可能とする。この照明は、不連続及び／又は変化する照明の相を含み得て、その強度の変化は、同一又は異なる振幅を有し得る。
【０１１５】
培養の変化する及び／又は不連続な照明は、特に混合栄養モードでの培養に使用されるとき、細胞、特に原生生物、原核微生物、酵母及び植物又は動物細胞の発達に、又は所望の分子の生産に対して望ましい影響をもたらし、その生産性を増大させることを可能とする。理論に拘束されず、発明者らは、細胞への不連続及び／又は変化する光の供給は、増殖に望ましい「ストレス」を引き起こし、脂質の合成を促進する効果を有すると考える。この現象は、天然の細胞が、生息環境の制約に耐えるために脂質の蓄えを蓄積する傾向にあるという事実によって部分的に説明され得る。
【０１１６】
本発明の１つの態様において、混合栄養条件の場合に、工程ａ）の培養は、フラッシュの存在下で実施される。当該フラッシュの強度は５０〜２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で、持続時間はおよそ１秒の１０分の１〜５分間、好ましくはおよそ１秒〜１分間、そしてフラッシュの回数は、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜３６０回である。
【０１１７】
本発明の一つの態様において、工程ｂ）の培養は、フラッシュの存在下で実施される。当該フラッシュの強度は２００〜２０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で、持続時間はおよそ１秒の１０分の１〜１０分間、好ましくはおよそ１秒の１０分の１〜５分間、そしてフラッシュの回数は、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２０〜１０００回である。
【０１１８】
本発明の一つの態様において、照明条件に拘らず、培養物に供給される光の強度は、細胞密度に応じて変化する。培養物が高密度になる程、光の強度は高くなり得る。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞数であり、当業者に公知の技術によって測定される。
【０１１９】
例えば、原生生物、細菌及び酵母において、培養の初期段階で、細胞密度が１ｍｌあたり約１０７  〜５ｘ１０７個で、フラッシュの持続時間が１秒〜６０分、回数が１時間あたり２〜３６０回で変化するとき、光の強度は、５０〜２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５０〜１５０  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１であってもよい。前記培養の細胞密度が１ｍｌあたり１０８〜１０９個に達したとき、光の強度は１００〜５００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、例えば好ましくは２００〜４００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１に増大させられ得る。最後の段階で培養物の細胞密度が１ｍｌあたり１０９〜１０１０個に達したとき、光の強度は２００〜８００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、例えば好ましくは２００〜５００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１に増大させられ得る。
【０１２０】
本発明の工程ｂ）における原生生物、細菌及び酵母の培養において、フラッシュの持続時間が１秒の１０分の１〜３０分、回数が１時間あたり２〜３６００回で変化する場合、光の強度は２００〜２０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、例えば好ましくは３００〜１０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１に増大させられる。
【０１２１】
幾つかの態様において、例えば、フラッシュの持続時間が１分未満、又は１秒未満である場合、光の強度は上記の値よりも大きくなり得る。
【０１２２】
下記のように（表３Ａ及び３Ｂ）、本発明の方法に関する原生生物は、グループ１（非光合成）及びグループ２（光合成）の２つのカテゴリーに分類される。一般に、グループ１の株は、光の要求が低く、又はグループ２と比較して、増殖するための、及び所望の分子を生産するための、光の利用が異なる。一方、個々の株は、異なる光の要求を有し得る。当業者は、その株の要求に応じて、培養時の株に従って、正しい光のパラメーターを如何にして調節するかを承知している。
【０１２３】
本発明の一つの態様において、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属（グループ１）に属する株の培養は、光の強度２５〜１２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは７５〜８００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、より好ましくは１５０〜６００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で実施され得る。この態様において、光の強度は１時間に２〜２００回変化する。強度変化の振幅は５〜４００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、７０〜３００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、より好ましくは１００〜２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１である。
【０１２４】
本発明の一つの態様において、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属（グループ１）に属する株の培養は、フラッシュ照明下で実施される。
【０１２５】
例えば、グループ１の属の培養は強度２００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、１時間あたり３０回のフラッシュ照明下で実施される。
【０１２６】
本発明の他の態様において、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属（グループ２）に属する株の培養は、光の強度１０〜８００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは２５〜６００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、より好ましくは７５〜２５０μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で実施され得る。この態様において、光の強度は１時間に２〜３６００回変化する。強度変化の振幅は５〜４００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、７０〜３００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、より好ましくは１００〜２００  μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１である。本発明の一つの態様において、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属（グループ２）に属する株の培養は、フラッシュ照明下で実施される。
【０１２７】
例えば、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属の培養は、強度１００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、１時間あたり１２０回のフラッシュ照明下で実施される。
【０１２８】
例えば、一つの態様において、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属の株の培養は変化する照明下で実施され、当該光の強度は５０〜１００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で、１時間あたり１２０回変化する。
【０１２９】
例えば、一つの態様において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の株の培養は変化する照明下で実施され、当該光の強度は１００〜１５０μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で、１時間あたり６０回変化する。
【０１３０】
例えば、一つの態様において、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属の株の培養は変化する照明下で実施され、当該光の強度は２００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１で、１時間あたり３０回変化する。
【０１３１】
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。
【０１３２】
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１３３】
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１３４】
培養物への光の供給は、発酵槽の外壁の周囲に配置された光源によってなされ得る。時計が、光源所定の照明時間においてこれらの光源の発光を引き起こす。好ましい態様において、工程ａ）及び／又は工程ｂ）の照明は、発酵槽の内部の発光装置によって確保される。従って、照明の有効性は、外側に配置された光源からの窓を介して光が透過する設計と比較して、良好である。前記照明装置は、ブレードに、又は処理される体積中に浸漬したチューブ部分上に、またはタンクの下部又は上部に、組み込まれて装着された回転部分に配置され得る。本発明の好ましい態様において、前記照明装置は、発酵槽の内部のバッフルに位置する。そのような装置は、フランス特許出願Ｎｏ．１３５３６４１に記載されている。前記発酵槽は、従って、バッフルにより担持される複数の光源を備え、当該バッフルは、回転混合部品の動作の下でバイオマス内の撹拌を妨げる機能を有する。これらの光源は、好ましくは、これらのバッフルの少なくとも一部の中に、バイオマスに適合し、タンク内の光を散乱させられる厚さを有する材料中に、部分的に又は完全に被包される。
【０１３５】
好ましい適切な材料は、食品基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）を含む）に対する良好な適合性、良好な熱伝導係数を併せ持つ、ポリスルホンである。ポリスルホンは、微生物の体積に対する熱の除去を可能とし、半透明の特性は、当該材料の厚さが１ｍｍ〜５ｃｍである場合、光の良好な透過を可能とする。更に、この材料は、洗剤又は酸による洗浄又は滅菌のための熱処理後にも、その特性を維持する。この望ましい特性の組み合わせは変化してもよく、他の材料、例えばポリウレタン、ポリプロピレン、アクリル材料又はポリカーボネート等が選択されてもよい。
【０１３６】
好ましくは、前記光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であり、それらは、実走及び応用の両方において、調整が容易である。そのような光源の発光スペクトルは非常に多様で、白色ＬＥＤ（日光を再現する）が有り、またスペクトル範囲が限定された（例えば赤色、青色又は緑色中心の）ＬＥＤも有る。そのような光源は、電球やランプよりも熱の発生が少なく、更にそれらの寸法は、バッフルのプレートの主要な機能に影響を与える厚みの増大をもたらさずにバッフルの表面に配置できる程十分に小さい。
【０１３７】
光源のスペクトルは、有利な場合、可視範囲であるが、必要に応じ、可視光範囲外、例えばＵＶ（滅菌も含んで実施する場合等）、又は赤外線（処理する体積内に熱を発生させることを目的として実施する場合等）を含み得る。
【０１３８】
光源は、非常に多様な調整条件（モニタリング又は管理条件ともいう）を有し得る。
【０１３９】
本発明の方法は、培養によって得られるバイオマスの収量が増大するという利点を有する。この方法は、所望の分子の蓄積を増大させるという利点も有する。これらの所望の分子の例として、以下のものが挙げられる：アルコール、例えば一級アルコール、二級アルコール、アルコールのエステル及び脂肪アルコール、脂肪酸（ＦＡ）、例えば短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）、超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、又は多不飽和脂肪酸、極性若しくは無極性官能基を有する分岐脂肪酸、水酸化脂肪酸、脂肪酸のエステル及びイソ脂肪鎖脂肪酸、脂質、例えば糖脂質、グリセロ糖脂質、リン脂質又はグリセロリン脂質、長鎖脂質、スフィンゴ脂質、ステリド及びセリド、不鹸化脂質、例えばテルペン、ステロイド（ステロール：フィトステロール、コレステロール、ビタミンＤ及び他のビタミン）及びプロスタグランジン、エステル、アルカン、アルケン、アルデヒド、ケトン、有機酸、抗酸化剤、多糖類、色素、アミノ酸、ＭＡＡ、アミノ酸の偽ペプチドポリマー、例えばシアノフィシン酵素又はビタミン、抗生物質、薬理活性を有する化合物、毒素、外来又は組換えタンパク質、有機化合物、例えば酸、生物燃料として使用出来る分子、テルペン、例えばボトリオコッケン、又は燃料に転換できる中間産物。ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等の生物プラスチックの生産に使用される分子も想定される。
【０１４０】
特に、この方法は、多不飽和脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はアラキドン酸（ＡＲＡ）及び／又はα−リノレン酸（ＡＬＡ）及び／又はリノレン酸及び／又はオレイン酸及び／又はカロテノイド、特にルテイン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、フコキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチンを含有する、培養細胞を富化するという利点を有する。
【０１４１】
本発明の方法、好ましくは混合栄養モードにおける工程ａ）及び／又はｂ）を有する態様に従って培養できる細胞の種類は、混合栄養培養で増殖できる、全ての原核又は真核、光感受性の単細胞生物に対応する。更に、混合栄養モードで増殖する能力は、産業的実施に適合する所望のバイオマス又は分子の生産性を達成することを可能とすることが望ましい。「光感受性」とは、混合栄養条件下で、天然又は人工照明に応答して、代謝活性を誘導することが出来る細胞を意味する。この代謝活性は、例えば、色素の合成又は光合成活性であってもよい。
【０１４２】
本発明の方法で培養できる細胞は、好ましくは、混合栄養モードでの工程ａ）及び／又はｂ）を含む態様に従い、動物、植物又は真菌から単離された光感受性の真核細胞、多細胞生物又は光感受性真核又は原核単細胞生物から選択され得る。
【０１４３】
本発明の方法に従って培養できる原核微生物は、例えば、限定されないが、シアノバクテリア、特に体外多糖類（ｅｘｏ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を合成するＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．種、又は脂質、多糖類又は色素等の産業的に重要な分子を合成する海洋性細菌［Ｓｔａｆｓｎｅｓ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｆｅｂ；４８（１）：１６−２３］が挙げられる。
【０１４４】
真核微生物としては、海洋性及び淡水生原生生物、酵母又はシアノバクテリアが挙げられる。これらの微生物は、光合成性又は非光合成性であり得る。非光合成性原生生物は、例えば、混合栄養条件下で培養して、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びカロテノイド、例えばアスタキサンチン又はカンタキサンチンを同時に生産する、Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ綱、特にＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属のものが挙げられる。原生生物Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｂｒｅｖｉｒｏｓｔｒｉｓは、混合栄養条件下で培養してエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びカロテノイド色素を同時に生産する、真核光合成微生物である。酵母等の他の光合成真核微生物も、本発明の方法を使用して、好ましくは混合栄養モードでの工程ａ）及び／又はｂ）を含む態様に従って培養され得る。
【０１４５】
光感受性真核細胞として、例えば、多細胞生物から単離され、混合栄養条件下で増殖できる、真核細胞も使用され得る。この種類の生物は、真菌、動物又は植物であってもよい。増殖及び生産相の間の光の供給は、光合成活性や、例えば光誘導性の色素の生合成経路の活性化等の光活性化代謝を維持することを可能とする。多細胞生物由来の真核細胞としては、カルスから得られた未分化植物細胞があり、これは、培養培地に植物ホルモンを添加することによって、未分化状態で維持できる。あるいは、インビトロで培養できるように不死化プロセスによって処理された動物細胞であってもよい。
【０１４６】
本発明の方法に利用できる所望の混合栄養性原生生物は、例えばＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ及び／又はＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種から選択される。
【０１４７】
好ましい側面において、所望の原生生物は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属の種、特にＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種から選択される。
【０１４８】
カロテノイドに関しては、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  （アスタキサンチン）、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ（フコキサンチン）、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ（カンタキサンチン又はアスタキサンチン）及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ（ルテイン）の原生生物が特に有利である。
【０１４９】
表３Ａ及び３Ｂは、本発明によって同定された新規株を示しており、これらは、ブダペスト条約の規定に従い、２０１４年７月８日に、下記表に示したＣＣＡＰアクセッション番号で、ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，  Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｄｕｎｓｔａｆｆｎａｇｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｏｂａｎ，  Ａｒｇｙｌｌ  ＰＡ３７１ＱＡ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に寄託された。これらの株によって生産される分子も示している。従って、本発明は、これらの株に関する。
【０１５０】
これらの属は２つのグループを構成し、グループ１は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属に属する株によって構成される。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍは単細胞の真菌で、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍは、従属栄養性鞭毛虫である。これらの属の例は下記表３Ａに示されており、グループ１と示されている。一つの態様において、本発明の方法は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属の培養物に関する。
【０１５１】
第二のグループ２は、光合成性、即ち葉緑体を有する株で構成される。これらの原生生物Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属は、微細藻類として分類される。一つの態様において、本発明の方法は、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の培養物に関する。
【０１５２】
【表３Ａ】
2016523554.tif 000004
【０１５３】
【表３Ｂ】
2016523554.tif 000005
【０１５４】
本発明は、表３Ａ及び３Ｂの新規株にも関する。これらの株は、混合栄養特性及び高収率の脂肪酸及び／又はカロテノイド、特にルテイン、フコキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン及びβ−カロテン、及び有機成分に富む培地中で１０μＥ超の照明下で培養可能なことをもって選択された。これらの培地は、当業者に周知である。
【０１５５】
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件下で増殖し、脂肪酸及び／又はカロテノイドを生産することが出来る、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ及び  Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の任意の種にも利用できる。
【０１５６】
前記微細藻類がChlorella属である場合、それらは、C. acuminata、C. angustoellipsoidea、C. anitrata、C. antarctica、C. aureoviridis、C. autotrophica、C. botryoides、C. caldaria、C. candida、C. capsulata、C. chlorelloides、C. cladoniae、C. coelastroides、C. colonialis、C. communis、C. conductrix、C. conglomerata、C. desiccata、C. ellipsoidea、C. elongata、C. emersonii、C. faginea、C. fusca、C. glucotropha、C. homosphaera、C. infusionum、C. kessleri、C. koettlitzii、C. lacustris、C. lewinii、C. lichina、C. lobophora、C. luteo-viridis、C. marina、C. miniata、C. minor、C. minutissima、C. mirabilis、C. mucosa、C. mutabilis、C. nocturna、C. nordstedtii、C. oblonga、C. oocystoides、C. ovalis、C. paramecii、C. parasitica、C. parva、C. peruviana、C. photophila、C. pituita、C. pringsheimii、C. protothecoides、C. pulchelloides、C. pyrenoidosa、C. regularis、C. reisiglii、C. reniformis、C. rotunda、C. rubescens、C. rugosa、C. saccharophila、C. salina、C. simplex、C. singularis、C. sorokiniana、C. spaerckii、C. sphaerica、C. stigmatophora、C. subsphaerica、C. terricola、C. trebouxioides、C. vannielii、C. variabilis、C. viscosa、C. volutis、C. vulgaris、C. zopfingiensis種から選択される。有利な場合、本発明のChlorella属は、C. sorokiniana又はC. vulgaris種から選択される藻類であり得る。
【０１５７】
前記微細藻類がScenedesmus属である場合、それらは、S. abundans、S. aciculatus、S. aculeolatus、S. aculeotatus、S. acuminatus、S. acutiformis、S. acutus、S. aldavei、S. alternans、S. ambuehlii、S. anhuiensis、S. anomalus、S. antennatus、S. antillarum、S. apicaudatus、S. apiculatus、S. arcuatus、S. aristatus、S. armatus、S. arthrodesmiformis、S. arvernensis、S. asymmetricus、S. bacillaris、S. baculiformis、S. bajacalifornicus、S. balatonicus、S. basiliensis、S. bernardii、S. bicaudatus、S. bicellularis、S. bidentatus、S. bijuga、S. bijugatus、S. bijugus、S. brasiliensis、S. breviaculeatus、S. brevispina、S. caribeanus、S. carinatus、S. caudato-aculeolatus、S. caudatus、S. chlorelloides、S. circumfusus、S. coalitus、S. costatogranulatus、S. crassidentatus、S. curvatus、S. decorus、S. denticulatus、S. deserticola、S. diagonalis、S. dileticus、S. dimorphus、S. disciformis、S. dispar、S. distentus、S. ecornis、S. ellipsoideus、S. ellipticus、S. falkatus、S. fenestratus、S. flavescens、S. flexuosus、S. furcosus、S. fuscus、S. fusiformis、S. gracilis、S. graevenitzii、S. grahneisii、S. granulatus、S. gujaratensis、S. gutwinskii、S. hanleyi、S. helveticus、S. heteracanthus、S. hindakii、S. hirsutus、S. hortobagyi、S. houlensis、S. huangshanensis、S. hystrix、S. incrassatulus、S. indianensis、S. indicus、S. inermis、S. insignis、S. intermedius、S. javanensis、S. jovais、S. jugalis、S. kerguelensis、S. kissii、S. komarekii、S. lefevrei、S. linearis、S. littoralis、S. longispina、S. longus、S. luna、S. lunatus、S. magnus、S. maximus、S. microspina、S. minutus、S. mirus、S. morzinensis、S. multicauda、S. multiformis、S. multispina、S. multistriatus、S. naegelii、S. nanus、S. notatus、S. nygaardii、S. oahuensis、S. obliquus、S. obtusiusculus、S. obtusus、S. olvalternus、S. oocystiformis、S. opoliensis、S. ornatus、S. ovalternus、S. pannonicus、S. papillosum、S. parisiensis、S. parvus、S. pecsensis、S. pectinatus、S. perforatus、S. planctonicus、S. plarydiscus、S. platydiscus、S. pleiomorphus、S. polessicus、S. polydenticulatus、S. polyglobulus、S. polyspinosus、S. praetervisus、S. prismaticus、S. producto-capitatus、S. protuberans、S. pseudoarmatus、S. pseudobernardii、S. pseudodenticulatus、S. pseudogranulatus、S. pseudohystrix、S. pyrus、S. quadrialatus、S. quadricauda、S. quadricaudata、S. quadricaudus、S. quadrispina、S. raciborskii、S. ralfsii、S. reginae、S. regularis、S. reniformis、S. rostrato-spinosus、S. rotundus、S. rubescens、S. scenedesmoides、S. schnepfii、S. schroeteri、S. securiformis、S. semicristatus、S. semipulcher、S. sempervirens、S. senilis、S. serrato-perforatus、S. serratus、S. serrulatus、S. setiferus、S. sihensis、S. smithii、S. soli、S. sooi、S. spicatus、S. spinoso-aculeolatus、S. spinosus、S. spinulatus、S. striatus.、S. subspicatus、S. tenuispina、S. terrestris、S. tetradesmiformis、S. transilvanicus、S. tricostatus、S. tropicus、S. tschudyi、S. vacuolatus、S. variabilis、S. velitaris、S. verrucosus、S. vesiculosus、S. westii、S. weberi、S. wisconsinensis、S. wuhanensis、S. wuhuensis種から選択される。有利な場合、本発明のScenedesmus属は、S. obliquus又はS. abundans種から選択される藻類であり得る。
【０１５８】
前記微細藻類がNitzschia属である場合、それらは、Nitzschia、N. abbreviata、N. abonuensis、N. abridia、N. accedens、N. accommodata、N. aciculariformis、N. acicularioides、N. acicularis(全ての変種を含む）、N. acidoclinata、N. actinastroides、N. actydrophila、N. acula、N. acuminata(全ての変種を含む）、N. acuta、N. adamata、N. adamatoides、N. adapta、N. adducta、N. adductoides、N. admissa、N. admissoides、N. aequalis、N. aequatorialis、N. aequora、N. aequorea、N. aerophila、N. aerophiloides、N. aestuari、N. affinis、N. africana、N. agnewii、N. agnita、N. alba、N. albicostalis、N. alexandrina、N. alicae、N. allanssonii、N. alpina、N. alpinobacillum、N. amabilis、N. ambigua、N. americana、N. amisaensis、N. amphibia、N. amphibia(全ての変種を含む）、N. amphibioides、N. amphicephala、N. amphilepta、N. amphioxoides、N. amphioxys(全ての変種を含む）、N. amphiplectans、N. amphiprora、N. amplectens、N. amundonii、N. anassae、N. andicola、N. angularis(全ての変種を含む）、N. angulata、N. angustata(全ての変種を含む）、N. angustatula、N. angustiforaminata、N. aniae、N. antarctica、N. antillarum、N. apiceconica、N. apiculata、N. archibaldii、N. arcuata、N. arcula、N. arcus、N. ardua、N. aremonica、N. arenosa、N. areolata、N. armoricana、N. asperula、N. astridiae、N. atomus、N. attenuata、N. aurantiaca、N. aurariae、N. aurica、N. auricula、N. australis、N. austriaca、N. bacata(全ての変種を含む）、N. bacillariaeformis、N. bacilliformis、N. bacillum、N. balatonis、N. balkanica、N. baltica、N. barbieri(全ての変種を含む）、N. barkleyi、N. barronii、N. barrowiana、N. bartholomei、N. bathurstensis、N. bavarica、N. behrei、N. bergii、N. beyeri、N. biacrula、N. bicapitata(全ての変種を含む）、bicuneata、N. bifurcata、N. bilobata(全ての変種を含む）、N. birostrata、N. bisculpta、N. bita、N. bizertensis、N. blankaartensis、N. bombiformis、N. borealis、N. bosumtwiensis、N. braarudii、N. brebissonii(全ての変種を含む）、N. bremensis(全ての変種を含む）、N. brevior、N. brevirostris、N. brevissima(全ての変種を含む）、N. brevistriata、N. brightwellii、N. brittonii、N. brunoi、N. bryophila、N. buceros、N. bukensis、N. bulnheimiana、N. buschbeckii、N. calcicola、N. caledonensis、N. calida(全ての変種を含む）、N. californica、N. campechiana、N. capensis、N. capitata、N. capitellata(全ての変種を含む）、N. capuluspalae、N. carnicobarica、N. carnico-barica、N. challengeri、N. chalonii、N. chandolensis、N. chardezii、N. chasei、N. chauhanii、N. chungara、N. chutteri、N. circumsuta、N. clarissima、N. clausii、N. clementei、N. clementia、N. clevei、N. closterium(全ての変種を含む）、N. coarctata、N. cocconeiformis、N. communis(全ての変種を含む）、N. commutata、N. commutatoides、N. compacta、N. compressa(全ての変種を含む）、N. concordia、N. confinis、N. conformata、N. confusa、N. congolensis、N. constricta(全ての変種を含む）、N. consummata、N. corpulenta、N. costei、N. coutei、N. creticola、N. cucumis、N. cursoria、N. curta、N. curvata、N. curvilineata、N. curvipunctata、N. curvirostris(全ての変種を含む）、N. curvula(全ての変種を含む）、N. cuspidata、N. cylindriformis、N. cylindrus、N. dakariensis、N. davidsonii、N. dealpina、N. debilis、N. decipiens、N. delauneyi、N. delicatissima、N. delicatula、N. delognei、N. denticula(全ての変種を含む）、N. denticuloides、N. desertorum、N. dianae、N. diaphana、N. diducta、N. didyma、N. dietrichii、N. dilatata、N. diluviana、N. dippelii、N. directa、N. diserta、N. disputata、N. dissipata(全ての変種を含む）、N. dissipatoides、N. distans(全ての変種を含む）、N. distantoides、N. divaricata、N. divergens、N. diversa、N. diversecostata、N. doljensis、N. draveillensis、N. droebakensis、N. dubia(全ての変種を含む）、N. dubiformis、N. dubioides、N. ebroicensis、N. eglei、N. elegans、N. elegantula、N. elegens、N. elliptica、N. elongata、N. entomon、N. epiphytica、N. epiphyticoides、N. epithemiformis、N. epithemioides、N. epithemoides(全ての変種を含む）、N. epsilon、N. erlandssonii、N. erosa、N. etoshensis、N. examinanda、N. eximia、N. famelica、N. fasciculata、N. febigeri、N. ferox、N. ferrazae、N. fibula-fissa、N. filiformis(全ての変種を含む）、N. flexa、N. flexoides、N. fluminensis、N. fluorescens、N. fluvialis、N. fogedii、N. fonticola(全ての変種を含む）、N. fonticoloides、N. fonticula、N. fontifuga、N. forfica、N. formosa、N. fossalis、N. fossilis、N. fragilariiformis、N. franconica、N. fraudulenta、N. frauenfeldii、N. frequens、N. frickei、N. frigida(全ての変種を含む）、N. frustuloides、N. frustulum(全ての変種を含む）、N. fruticosa、N. fundi、N. fusiformis、N. gaarderi、N. gaertnerae、N. gandersheimiensis、N. garrensis、N. gazellae、N. geitleri、N. geitlerii、N. gelida(全ての変種を含む）、N. geniculata、N. gessneri、N. gieskesii、N. gigantea、N. gisela、N. glabra、N. glacialis(全ての変種を含む）、N. glandiformis、N. goetzeana(全ての変種を含む）、N. gotlandica、N. graciliformis、N. gracilis(全ての変種を含む）、N. gracillima、N. graciloides、N. gradifera、N. graeffii、N. grana、N. grandis、N. granii(全ての変種を含む）、N. granulata(全ての変種を含む）、N. granulosa、N. groenlandica、N. grossestriata、N. grovei、N. gruendleri、N. grunowii、N. guadalupensis、N. guineensis、N. guttula、N. gyrosigma、N. habirshawii、N. habishawii、N. hadriatica、N. halteriformis、N. hamburgiensis、N. hantzschiana(全ての変種を含む）、N. harderi、N. harrissonii、N. hassiaca、N. heidenii、N. heimii、N. hemistriata、N. heteropolica、N. heuflerania、N. heufleriana(全ての変種を含む）、N. hiemalis、N. hiengheneana、N. hierosolymitana、N. hoehnkii、N. holastica、N. hollerupensis、N. holsatica、N. homburgiensis、N. hudsonii、N. hummii、N. hungarica(全ての変種を含む）、N. hustedti、N. hustedtiana、N. hyalina、N. hybrida(全ての変種を含む）、N. hybridaeformis、N. ignorata(全ての変種を含む）、N. iltisii、N. impressa、N. improvisa、N. incerta、N. incognita、N. inconspicua、N. incrustans、N. incurva(全ての変種を含む）、N. indica、N. indistincta、N. inducta、N. inflatula、N. ingenua、N. inimasta、N. innominata、N. insecta、N. insignis(全ての変種を含む）、N. intermedia(全ての変種を含む）、N. intermissa、N. interrupta、N. interruptestriata、N. invicta(全ての変種を含む）、N. invisa、N. invisitata、N. iranica、N. irregularis、N. irremissa、N. irrepta、N. irresoluta、N. irritans、N. italica、N. janischii、N. jelineckii、N. johnmartinii、N. juba、N. jucunda、N. jugata(全ての変種を含む）、N. jugiformis、N. kahlii、N. kanakarum、N. kanayae、N. kavirondoensis、N. kerguelensis、N. kimberliensis、N. kittlii、N. kittonii、N. knysnensis、N. kolaczeckii、N. kotschyi、N. kowiensis、N. krachiensis、N. krenicola、N. kuetzingiana(全ての変種を含む）、N. kuetzingii、N. kuetzingioides、N. kurzeana、N. kurzii、N. kuetzingiana(全ての変種を含む）、N. labella、N. labuensis、N. lacrima、N. lacunarum、N. lacunicola、N. lacus-karluki、N. lacustris、N. lacuum、N. laevis、N. laevissima、N. lagunae、N. lagunensis、N. lamprocampa(全ての変種を含む）、N. lanceola(全ての変種を含む）、N. lanceolata(全ての変種を含む）、N. lancettula、N. lancettuloides、N. lange-bertalotii、N. latens、N. latestriata、N. latiuscula、N. lauenbergiana、N. lauenburgiana、N. lecointei、N. leehyi、N. legleri、N. lehyi、N. leistikowii、N. lesbia、N. lesinensis、N. lesothensis、N. leucosigma、N. levidensis(全ての変種を含む）、N. liebetruthii(全ての変種を含む）、N. ligowskii、N. limicola、N. limulus、N. linearis(全ての変種を含む）、N. lineata、N. lineola、N. linkei、N. lionella、N. littoralis(全ての変種を含む）、N. littorea、N. longa、N. longicollum、N. longirostris、N. longissima(全ての変種を含む）、N. lorenziana(全ての変種を含む）、N. lucisensibilis、N. lunaris、N. lunata、N. lurida、N. luzonensis、N. macaronesica、N. macedonica、N. macera、N. machardyae、N. macilenta(全ての変種を含む）、N. magnacarina、N. mahihaensis、N. mahoodii、N. maillardii、N. major、N. majuscula(全ての変種を含む）、N. makarovae、N. manca、N. mancoides、N. manguini、N. marginata、N. marginulata(全ての変種を含む）、N. marina、N. martiana、N. maxima、N. media、N. medioconstricta、N. mediocris、N. mediterranea、N. metzeltinii、N. microcephala(全ての変種を含む）、N. migrans、N. minuta、N. minutissima、N. minutula、N. miramarensis、N. miserabilis、N. mitchelliana、N. modesta、N. moissacensis(全ての変種を含む）、N. mollis、N. monachorum、N. monoensis、N. montanestris、N. morosa、N. multistriata、N. nana、N. natalensis、N. natans、N. nathorsti、N. navicularis、N. navis-varingica、N. navrongensis、N. neglecta、N. nelsonii、N. neocaledonica、N. neoconstricta、N. neofrigida、N. neogena、N. neotropica、N. nereidis、N. nicobarica、N. nienhuisii、N. normannii、N. notabilis、N. nova、N. novae-guineaensis、N. novae-guineensis、N. novaehollandiae、N. nova-zealandia、N. nyassensis、N. oberheimiana、N. obesa、N. obliquecostata、N. obscura、N. obscurepunctata、N. obsidialis、N. obsoleta、N. obsoletiformis、N. obtusa(全ての変種を含む）、N. obtusangula、N. oceanica、N. ocellata、N. oliffi、N. omega、N. osmophila、N. ossiformis、N. ostenfeldii、N. ovalis、N. paaschei、N. pacifica、N. palacea、N. palea(全ての変種を含む）、N. paleacea、N. paleaeformis、N. paleoides、N. palustris、N. pamirensis、N. panduriformis(全ての変種を含む）、N. pantocsekii、N. paradoxa(全ての変種を含む）、N. parallela、N. pararostrata、N. partita、N. parvula(全ての変種を含む）、N. parvuloides、N. paxillifer、N. peisonis、N. pelagica、N. pellucida、N. pennata、N. peragallii、N. perindistincta、N. perminuta、N. perpusilla(全ての変種を含む）、N. perspicua、N. persuadens、N. pertica、N. perversa、N. petitiana、N. philippinarum、N. pilum、N. pinguescens、N. piscinarum、N. plana(全ての変種を含む）、N. planctonica、N. plicatula、N. plioveterana、N. polaris、N. polymorpha、N. ponciensis、N. praecurta、N. praefossilis、N. praereinholdii、N. princeps、N. procera、N. prolongata(全ての変種を含む）、N. prolongatoides、N. promare、N. propinqua、N. pseudepiphytica、N. pseudoamphioxoides、N. pseudoamphioxys、N. pseudoamphyoxys、N. pseudoatomus、N. pseudobacata、N. pseudocapitata、N. pseudocarinata、N. pseudocommunis、N. pseudocylindrica、N. pseudodelicatissima、N. pseudofonticola、N. pseudohungarica、N. pseudohybrida、N. pseudonana、N. pseudoseriata、N. pseudosigma、N. pseudosinuata、N. pseudostagnorum、N. pubens、N. pulcherrima、N. pumila、N. punctata(全ての
変種を含む）、N. pungens(全ての変種を含む）、N. pungiformis、N. pura、N. puriformis、N. pusilla(全ての変種を含む）、N. putrida、N. quadrangula、N. quickiana、N. rabenhorstii、N. radicula(全ての変種を含む）、N. rautenbachiae、N. recta(全ての変種を含む）、N. rectiformis、N. rectilonga、N. rectirobusta、N. rectissima、N. regula、N. reimeri、N. reimerii、N. reimersenii、N. retusa、N. reversa、N. rhombica、N. rhombiformis、N. rhopalodioides、N. richterae、N. rigida(全ての変種を含む）、N. ritscheri、N. robusta、N. rochensis、N. rolandii、N. romana、N. romanoides、N. romanowiana、N. rorida、N. rosenstockii、N. rostellata、N. rostrata、N. ruda、N. rugosa、N. rupestris、N. rusingae、N. ruttneri、N. salinarum、N. salinicola、N. salpaespinosae、N. salvadoriana、N. sansimoni、N. sarcophagum、N. scabra、N. scalaris、N. scaligera、N. scalpelliformis、N. schoenfeldii、N. schwabei、N. schweikertii、N. scutellum、N. sellingii、N. semicostata、N. semirobusta、N. separanda、N. seriata(全ての変種を含む）、N. serpenticola、N. serpentiraphe、N. serrata、N. sibula(全ての変種を含む）、N. sigma(全ての変種を含む）、N. sigmaformis、N. sigmatella、N. sigmoidea(全ての変種を含む）、N. silica、N. silicula(全ての変種を含む）、N. siliqua、N. similis、N. simplex、N. simpliciformis、N. sinensis、N. sinuata(全ての変種を含む）、N. smithii、N. sociabilis、N. socialis(全ての変種を含む）、N. solgensis、N. solida、N. solita、N. soratensis、N. sp.、N. spathulata(全ての変種を含む）、N. speciosa、N. spectabilis(全ての変種を含む）、N. sphaerophora、N. spiculoides、N. spiculum、N. spinarum、N. spinifera、N. stagnorum、N. steenbergensis、N. stellata、N. steynii、N. stimulus、N. stoliczkiana、N. stompsii(全ての変種を含む）、N. strelnikovae、N. stricta、N. strigillata、N. striolata、N. subaccommodata、N. subacicularis、N. subacuta、N. subamphioxioides、N. subapiculata、N. subbacata、N. subcapitata、N. subcapitellata、N. subcohaerens(全ての変種を含む）、N. subcommunis、N. subconstricta、N. subcurvata、N. subdenticula、N. subfalkata、N. subfraudulenta、N. subfrequens、N. subfrustulum、N. subgraciloides、N. subinflata、N. subinvicta、N. sublaevis、N. sublanceolata、N. sublica、N. sublinearis、N. sublongirostris、N. submarina、N. submediocris、N. subodiosa、N. subpacifica、N. subpunctata、N. subromana、N. subrostrata、N. subrostratoides、N. subrostroides、N. subsalsa、N. subtilioides、N. subtilis(全ての変種を含む）、N. subtubicola、N. subvitrea、N. suchlandtii、N. sulcata、N. sundaensis、N. supralitorea、N. tabellaria、N. taenia、N. taeniiformis、N. tantata、N. tarda、N. taylorii、N. temperei、N. tenella、N. tenerifa、N. tenuiarcuata、N. tenuirostris、N. tenuis(全ての変種を含む）、N. tenuissima、N. tergestina、N. terrestris、N. terricola、N. thermalis(全ての変種を含む）、N. thermaloides、N. tibetana、N. tirstrupensis、N. tonoensis、N. towutensis、N. translucida、N. tropica、N. tryblionella(全ての変種を含む）、N. tsarenkoi、N. tubicola、N. tumida、N. turgidula、N. turgiduloides、N. umaoiensis、N. umbilicata、N. umbonata、N. vacillata、N. vacua、N. valdecostata、N. valdestriata、N. valens、N. valga、N. valida(全ての変種を含む）、N. vanheurckii、N. vanoyei、N. vasta、N. ventricosa、N. vermicularioides、N. vermicularis(全ての変種を含む）、N. vermicularoides、N. vexans、N. victoriae、N. vidovichii、N. vildaryana、N. villarealii、N. virgata、N. visurgis、N. vitrea(全ての変種を含む）、N. vivax(全ての変種を含む）、N. vixnegligenda、N. vonhauseniae、N. vulga、N. weaveri、N. weissflogii、N. westii、N. williamsiii、N. wipplingeri、N. witkowskii、N. wodensis、N. woltereckii、N. woltereckoides、N. wuellerstorfii、N. wunsamiae、N. yunchengensis、N. zebuana、N. zululandicaである。
【０１５９】
有利な場合、本発明のNitzschia属は、N. sp.種から選択される藻類であり得る。
【０１６０】
前記微細藻類がHaematococcus属である場合、それらはH. allmanii、H. buetschlii、 H. capensis、 H. carocellus、H. droebakensis、 H. grevilei、H. insignis、H. lacustris、H. murorum、 H. pluvialis、 H. salinus、H、sanguineis、H. thermalis、 H. zimbabwiensisから選択される種であってもよい。
【０１６１】
前記微細藻類がCrypthecodinium属である場合、それらはC. cohnii、C. setenseから選択される種であってもよい。
【０１６２】
前記微細藻類がAurantiochytrium属である場合、それらはA. limacinum、A. mangroveiから選択される種であってもよい。
【０１６３】
前記微細藻類がSchizochytrium属である場合、それらはS. aggregatum、S. limacinum、S. mangrovei、S. minutum、S. octosporumから選択される種であってもよい。
【０１６４】
前記微細藻類がTetraselmis属である場合、それらはT. alacris、T. apiculata、T. arnoldii、T. ascus、T. astigmatica、T. bichlora、T. bilobata、T. bolosiana、T. chui、T. contracta、T. convolutae、T. cordiformis、T. desikacharyi、T. elliptica、T. fontiana、T. gracilis、T. hazenii、T. helgolandica、T. impellucida、T. incisa、T. inconspicua、T. indica、T. levis、T. maculata、T. marina、T. mediterranea、T. micropapillata、T. rubens、T. striata、T. subcordiformis、T. suecica、T. tetrabrachia、T. tetrathele、T. verrucosa、T. viridis、T. wettsteiniiから選択される種であってもよい。
【０１６５】
本発明の一つの態様において、糸状真菌の培養は、本発明で記載しているような、通気した発酵槽中で、機械的に撹拌しながら実施され得る。しかしながら、前記培養は、当業者に公知の適切な撹拌条件下、せん断の効果を限定して、糸状の細胞又は単離された細胞の混合栄養条件下での培養を可能とするように実施される。これらの生物の代謝に対する光の効果は公知であり、色素等の産業上重要な代謝物は、混合栄養条件下での培養の間に生産され得る［Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （Ｐｒａｈａ）．  ２０１３  Ａｐｒ  ２．  Ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．  Ｃａｉ  Ｍ，  Ｆａｎｇ  Ｚ，  Ｎｉｕ  Ｃ，  Ｚｈｏｕ  Ｘ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ．］。
【０１６６】
本発明に従って培養され得る真菌の属は、例えば、ＡＲＡの生産においてはＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、クエン酸の生産においてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【０１６７】
原生生物Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍは、ＤＨＡの生産のために、本発明の方法に従って培養され得る。好ましくは、当該培養は、本発明の好ましい態様に従って実施され、ここで、工程ａ）及びｂ）は、混合栄養条件下で実施される。例えば、発明者らによって単離され、２０１３年６月２１日に、ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，  Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｄｕｎｓｔａｆｆｎａｇｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｏｂａｎ，  Ａｒｇｙｌｌ  ＰＡ３７１ＱＡ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に、アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託された、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  Ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＦＣＣ  １３２４株の培養において、ＤＨＡ及びアスタキサンチン及び／又はカンタキサンチンに富むバイオマスの生産が可能となる。ＤＨＡは、当該原生生物が含有する全脂質の４０％超、又は５０％超、又は６０％超を占め、カロテノイドはアスタキサンチン及び／又はカンタキサンチンに富み、これらは、乾燥物質の全重量に対して、０．１％超、又は０．１５％超、又は０．２５％超を占める。当該株の生産性（培養物１リットルあたり、１時間あたりの所望の産物の量）のレベルは、０．０１５  ｍｇ／Ｌ／ｈ、又は０．０２０ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は０．０２５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超を達成し得る（実施例１の表４）。
【０１６８】
本発明の一つの態様における植物細胞の培養は、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ科に属する植物Ａｄｏｎｉｓ  ａｎｎｕａの細胞懸濁物等が想定され得る。混合栄養条件下で培養すると、Ａｄｏｎｉｓ  ａｎｎｕａは、アスタキサンチン及びアドニルビン（β−カロテンからのアスタキサンチンの生合成の中間体代謝物）を生産し、これは、人体において、抗酸化活性及び抗腫瘍活性を有する。
【０１６９】
本発明の方法において、酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、その増殖速度、その油脂の豊富さ及びカロテノイド色素、ベータカロテンの合成のため、産業上注目されている。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓの培養は、増殖［Ｙｅｎ  ＨＷ，  Ｚｈａｎｇ  Ｚ．；  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２０１１  Ｏｃｔ；  １０２（１９）：９２７９−８１］及び色素の合成［Ｂｈｏｓａｌｅ  Ｐ，  Ｇａｄｒｅ  ＲＶ．；  Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；３４（５）：３４９−５３］にとって照明が有益であることが示されているため、本発明の方法において有利に想定され得る。不連結培養は、第一の相で細胞の増殖を指向し、第二の相で所望の油脂及び／又は色素の蓄積を指向する、物理化学及び／又は照明パラメーターを適用することを可能とする。
【０１７０】
本発明の幾つかの長所を表５に示す。表５は、本発明の方法と、不連続、半連続及び連続的方法における、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍによるバイオマスの生産、そして多不飽和脂肪酸に富む油脂の抽出の比較の結果を示す。本発明の（不連結）方法は、設備の洗浄及び滅菌のための生産停止の相を限定することにより、連続及び半連続（フェド−バッチ）の利点を組み合わせることが可能で、一方、熟成相によって得られるバイオマスの組成を最適にすることが出来る。
【０１７１】
有利な場合、本発明の態様における原生生物、酵母又は細菌の培養において、バイオマスの生産は、乾燥物質１Ｌあたり４０〜５０ｇ、好ましくは８０ｇ超である。例えば、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍの生産性は、１５０ｇ／Ｌである。
【０１７２】
また、前記原生生物のバイオマスは、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上の割合で脂肪分を含有する。例えば、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍの場合、バイオマスの脂肪分は３０％以上である。
【０１７３】
例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの株は、本発明の一つの態様に従い、混合栄養条件下、ＤＨＡ及びアスタキサンチンを生産する。バイオマスの収率は８０〜２００  ｇ／Ｌで、乾燥物質の３０〜６０％の脂質を含有し、その中で、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、４０〜６０％を占める。アスタキサンチンの収率は一般に乾燥物質の０．０１〜０．２％である。ＦＣＣ３６株は、これらの株の一例である。
【０１７４】
Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ＤＨＡ及びアスタキサンチン及び／又はカンタキサンチンを生産する。バイオマスの収率は８０〜２００  ｇ／Ｌで、乾燥物質の約５０％が脂質である。一般にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、脂肪酸の１５〜５０％を占め；アスタキサンチン及び／又はカンタキサンチンは、一般に乾燥物質の０．０１〜０．２％である。ＦＣＣ １３１１、ＦＣＣ  １３１９、ＦＣＣ  １３２５及びＦＣＣ  ３１は、これらの株の例として示され得る。
【０１７５】
Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属、特にＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ種の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ＤＨＡ及びカロテノイド、特にβ−カロテンを生産する。バイオマスの収率は５０〜２００  ｇ／Ｌで、乾燥物質の１０〜３０％が脂質である。一般にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、脂肪酸の１５〜５０％を占め；カロテノイド、特にβ−カロテンは、一般に乾燥物質の０．０１〜０．２％である。ＦＣＣ  １３８４、ＦＣＣ  １３４８及びＦＣＣ  ３０は、これらの株の例として示され得る。
【０１７６】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、特にＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ルテインを生産する。バイオマスの収率は６０〜１５０  ｇ／Ｌで、乾燥物質の０．１〜５％がルテインである。そうして生産されたバイオマスは、魚の養殖、特にスズキ及びタイの養殖を意図したワムシの給餌に特に適している。また、それは、免疫刺激及び解毒特性により、栄養補助食品としても使用される。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＦＣＣ  ２、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ＦＣＣ  １５５３及びＦＣＣ  １５２０は、これらの株の例として示され得る。
【０１７７】
Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属、特にＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｂｕｎｄａｎｓ種の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ＡＬＡ、オレイン酸及びルテインを生産する。バイオマスの収率は３０〜１００  ｇ／Ｌで、乾燥物質の１０〜６０％が脂質である。一般にアルファオレイン酸又はＡＬＡは、脂肪酸の１０〜５０％を占め、オレイン酸は全脂肪酸の２５〜５０％を占め、ルテインは、一般に乾燥物質の０．１〜５％である。Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ  ＦＣＣ  ４、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．  ＦＣＣ  １４８３及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｂｕｎｄａｎｓ  ＦＣＣ  ２３は、これらの株の例として示され得る。
【０１７８】
Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、特にＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ＥＰＡ及びＡＬＡを生産する。一般に、バイオマスの収率は３０〜８０  ｇ／Ｌで、乾燥物質の１０〜３０％が脂質である。一般にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、脂肪酸の１０〜２５％を占め、α−オレイン酸（ＡＬＡ）は、一般に脂肪酸の５〜２０％を占める。こうして生産されたバイオマスは、水産業における使用に特に適している。Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．  ＦＣＣ  １５６３は、これらの株の例として示され得る。
【０１７９】
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、アスタキサンチンを生産する。一般に、バイオマスの収率は５〜３０  ｇ／Ｌで、乾燥物質の０．１〜１５％が脂質である。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＦＣＣ １６４３株は、これらの株の例として示され得る。
【０１８０】
Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属の株は、本発明の一つの態様における混合栄養条件下、ＥＰＡ及びフコキサンチンを生産する。一般に、バイオマスの収率は４０〜１２０  ｇ／Ｌで、乾燥物質の１０〜５０％が脂質である。脂肪酸の１５〜５０％がエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）で、乾燥物質の０．１〜５％がフコキサンチンである。Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．  ＦＣＣ  １６８７株は、これらの株の例として示され得る。
【０１８１】
本発明において、混合栄養条件下、特に変化する及び／又は不連続の、特にフラッシュの形態の照明の存在下で培養される株は、所望の分子、特に脂質及び／又は色素を生産できる。一般に、従属栄養条件下で脂質及び色素を生産する、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ及びＮｉｔｚｓｃｈｉａ属に属する株の前記培養は、色素を殆ど又は全く生産しない。加えて、これらの種における、本発明の幾つかの態様に係る混合栄養モードで取得されたバイオマスの量は、従属栄養条件下で取得された量と等しいか、これを上回る（例えば約１０〜１８％上回る）。「従属栄養条件」は、培養培地は同一であるが暗黒下での培養条件をいう。
【０１８２】
従って、本発明は、原生生物の培養方法であって、混合栄養モードでの、特に変化する又は不連続、例えばフラッシュの形態での照明の存在下、特に多不飽和又は一不飽和脂肪酸及び／又はカロテノイド、特にルテイン、フコキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン及びβ−カロテンを生産するための方法に関する。
【０１８３】
好ましい態様において、前記バイオマスは、油相中に、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上の所望の脂肪酸成分を含有する。
【０１８４】
また、前記バイオマスは、油相中に、０．０１％以上、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上の所望の色素成分を含有する。
【０１８５】
有利な場合、本発明の方法は、更に、生産されたバイオマスから所望の分子を回収する１つ以上の工程を含む。例えば、本発明の方法は、疎水性材料（脂質及び／又は色素を含有する）を回収する１つ以上の工程、及び任意で、脂肪酸、特にＥＰＡ及び／又はＤＨＡ及び／又はＡＲＡ及び／又はＡＬＡ及び／又はオレイン酸を抽出する１つ以上の工程、及び／又は色素、特にルテイン、フコキサンチン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチンエキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチンをこの疎水性材料から抽出する１つ以上の工程を含む。
【０１８６】
所望の分子の回収は、公知の方法によって実施され得る。
【０１８７】
特に、所望の分子が脂肪酸である場合、本発明の方法は、任意で、更に、前記脂質からこの脂肪酸を抽出する１つ以上の工程を含む。ＥＰＡ、ＡＲＡ及びＤＨＡを含有する脂質の選択的抽出方法は、当業者に周知であり、例えば［Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．  （１９５９）；  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３７：９１１−９１７］に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】本発明の一つの態様に係る方法である「不連結方法」の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１８９】
本発明は、下記実施例において非限定的に例示される。
【実施例】
【０１９０】
実施例１
オーランチオキトリウム属ＦＣＣ  １３２４株によるＤＨＡ及びカンタキサンチンに富む油の生産を下記に示す。
【０１９１】
工程ａ）：
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、Ｒｕｓｈｔｏｎの設定（３刃インペラ下方排水）に従うシャフト上にマウントした３つの撹拌ローターを使用して実施された。溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。前記バイオリアクターは、透明なタンクを取り囲む外部照明システムを備える。光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり６０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０１９２】
前記リアクターに、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で調製した前培養物を播種した。前培養及びバイオリアクター中の培養は、改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ ｇ／Ｌ，  （ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ／Ｌ，  ＫＨ２ＰＯ４  １ ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４ ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４ ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ ｍｇ／Ｌ，  パントテン酸３．２ ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５ ｍｇ／Ｌ）中で実施された。使用する炭素含有基質は、３００ｍＭ〜１Ｍの濃度のグルコースである。
【０１９３】
新鮮な培地の連続的供給は、０．０８〜０．１５  ｈ−１の希釈レベルで、各成分の初期濃度の１０〜１５倍の濃縮培地を用いて実施される。当業者は、どのようにして連続的培養を実施し、供給流速を計算するかを決定し、また定常状態に達した時間を決定することが出来る。
【０１９４】
一旦定常状態に達すると、この培養槽からの連続的排出が、工程ｂ）の熟成発酵槽に供給される。
【０１９５】
工程ｂ）：
前記培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１０〜２０Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。後者の制御システム及びパラメーター化は、あらゆる点で、工程ａ）のものと類似している。
【０１９６】
前記リアクターに、工程ａ）から排出された培養体積の約５０％が播種され；同時に、タンクに、２倍に濃縮された培地が同一の流速で供給されることにより、以下の最終的な組成が得られる：海水塩１５  ｇ／Ｌ；グルコース６０〜１２０  ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．８  ｇＬ；  ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ；  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４  ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ。
【０１９７】
前記培養において、１時間あたり６０回のフラッシュが照射され、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は５００μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。
【０１９８】
培養のモニタリング
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０１９９】
全脂質の定量に関し、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。脂質抽出方法は、当業者に周知である。
【０２００】
カロテノイド、特にカンタキサンチンの定量のため、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。カンタキサンチンを含むカロテノイドの解析及び抽出方法は、当業者に周知である。
【０２０１】
表４：結果（ｎ＝３）
【表４】
2016523554.tif 000006
【０２０２】
表４は、本発明の（不連結）方法と、半連続及び連続的方法とを用いた場合における、オーランチオキトリウムによるＤＨＡに富む油脂の生産の比較データを表す。不連続、半連続及び連続的方法で引用される数値は、１年間以上の予測による、不連続、半連続及び連続培養における、発明者らのこの株及び他の類似の株を用いた従来の実験に基づく。
【０２０３】
【表５】
2016523554.tif 000007
【０２０４】
実施例２
高細胞密度、低脂質（５〜１０％）でバイオマスを連続的に生産し、その後、このバイオマスの熟成によって、脂肪酸を蓄積させる。
【０２０５】
工程ａ）：バイオマスの生産のための連続的培養
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、３つの撹拌ローター：スパージャーの上方の撹拌シャフトの下端に配置された６枚の真っ直ぐな刃を有する１つのＲｕｓｈｔｏｎタービン、及び撹拌シャフト上に配置された３枚の刃の２つのプロペラを用いて実施された（撹拌ローター間の距離＝プロペラの直径×１．５）。
【０２０６】
溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。
光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり６０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０２０７】
発酵層は、バッフルに固定された内部照明システムを備える。
【０２０８】
光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり６０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０２０９】
前培養は、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で実施された。前記リアクターに、当該前培養物を１％播種し、不連続モードで培養した。
【０２１０】
最初の培地中に含有されていた基質が消費され、所望の細胞密度が達成されたら、一方からの培養培地の排出、及び他方からの供給溶液の供給が開始される。定常状態は、少なくとも５滞留時間後に達成される。当該定常状態が安定化すると、操作パラメーター（ベンチレーション流速、パワー消費、供給流速、ｐＨ、マッシュの体積）、当該マッシュ中の基質の残留濃度、並びに高分子濃度及び生産されたバイオマスの組成が、一定になる。
【０２１１】
ＦＣＣ１３２４株において、選択される供給溶液の組成及び選択される希釈レベルは、各日の培養槽の体積の２．４倍に相当する体積のマッシュを生産することを可能とする。
【０２１２】
前記体制は、５０時間の培養の終盤で安定と見なされる。当該体制が安定化したら、マッシュ中の残留グルコース濃度は約０ｇ／Ｌに安定化し、細胞密度は約３×１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに安定化し、これは、バイオマス約６５ｇ／Ｌに相当し、バイオマス中の脂質の量は、約５％（脂質ｇ／乾燥物質ｇ）に安定化する。連続モードにおける発酵は、合計で８９０時間継続され、その中で８１５時間は、安定化条件下でされた。
【０２１３】
この例において、供給溶液による希釈のレベルは、使用された培地及び使用された培養条件下での、その株の最大増殖速度の半分で設定された。
【０２１４】
前記培地の排出流速は、供給溶液の流速、及びｐＨを調整する液体の体積を考慮して調整される。
【０２１５】
バッチモードでの培養を開始するための培養培地の組成は、図１に詳述されている。
【０２１６】
連続培養の供給溶液は、１５ｇ／Ｌの市販の海水塩（例えばＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ  ｓａｌｔｓ）、１１０  ｇ／Ｌのグルコースを含有し、そして、前培養及び不連続培養で使用される培地が含有する量の約３倍に相当する濃度の、微量元素、主要栄養素及びビタミンを含有する。供給溶液に含有される他の成分については、表１に詳述されている。
【０２１７】
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０２１８】
全脂質の定量に関し、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。脂質抽出方法は、当業者に周知である。
【０２１９】
カロテノイド、特にカンタキサンチンの定量のため、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。カンタキサンチンを含むカロテノイドの解析及び抽出方法は、当業者に周知である。
【０２２０】
表６．連続培養で取得された定常状態の特性
【表６】
2016523554.tif 000008
【０２２１】
工程ｂ）熟成
連続培養で生産されたマッシュは、高い細胞密度のバイオマスで、脂質含量は非常に低い（５〜１０％）。このバイオマスを培養条件下の熟成タンク中に写し、そこでバイオマスは、非常に迅速に脂肪酸を蓄積する（２４時間以内に６５Ｇ／Ｌ）。これは、生産すべき脂肪酸に富んだバイオマスの高度な蓄積を可能とする。
【０２２２】
この例において、幾つかの熟成試験が、ケモスタットモードで操作された発酵槽に由来するマッシュから出発して実施された。培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、３〜５Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。後者の制御システム及び設定は、あらゆる点で工程ａ）におけるものと類似する。
【０２２３】
この例において記載された熟成試験において、連続培養から取り出した体積は、１回で取り出された。産業的な発酵において、この移動は、培養培地の排出によって漸進的に実施される。
【０２２４】
熟成タンク中で、Ｃ／Ｎ／Ｐ比が５３０：１１：１の栄養溶液が、取り出された体積に漸進的に添加される。
【０２２５】
当該栄養溶液は、炭素源（ここではグルコース）が枯渇した各時間で熟成タンクに添加される。
【０２２６】
熟成タンク中で実施された、供給される不連続培養物のモニタリングは、あらゆる点で、工程ａ）のものと同一のプロトコールに従い実施された。その結果を表７に示す。
【０２２７】
表７：２５℃及びｐＨ６．５で２４時間及び４８時間生産した乾燥物質、脂肪酸及びＤＨＡ（５回反復）
【表７】
2016523554.tif 000009
【０２２８】
実施例３
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属ＦＣＣ  １５２０株によるルテインの生産に特に使用され得るバイオマスの生産を、以下に示す。
【０２２９】
工程ａ）
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、Ｒｕｓｈｔｏｎの設定（３刃インペラ下方排水）に従うシャフト上にマウントした３つの撹拌ローターを使用して実施された。溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。前記バイオリアクターは、バッフルに固定された内部照明システムを備える。光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり３０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は６０秒、強度は５０〜１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０２３０】
前記リアクターに、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で調製した前培養物を播種した。前培養及びバイオリアクター中の培養は、以下の培地中で実施された。グルコース２０  ｇ／Ｌ；  ＫＮＯ３  ２  ｇ／Ｌ；  ＮａＨ２ＰＯ４  ０．５４  ｇ／Ｌ；  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ  ０．１７９  ｇ／Ｌ；  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．２４６５  ｇ／Ｌ；  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．０１４７  ｇ／Ｌ；酵母抽出物０．２５  ｇ／Ｌ；  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０１０３５  ｇ／Ｌ；  Ｈ３ＢＯ３  ０．００００６１  ｇ／Ｌ；  ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ  ０．０００１６９  ｇ／Ｌ；  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０００２８７  ｇ／Ｌ；  ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ０．０００００２５  ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）６ＭｏＯ２４．４Ｈ２Ｏ  ０．００００１２５  ｇ／Ｌ；塩酸チアミン（ビタミンＢ１）  ０．２  ｍｇ／Ｌ；ビオチン（ビタミンＨ）  ０．００１  ｍｇ／Ｌ；シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）  ０．００１  ｍｇ／Ｌ。
【０２３１】
新鮮な培地の連続的供給は、０．０８〜０．１５  ｈ−１の希釈レベルで、以下の培地を用いて実施される。グルコース２２４．５５  ｇ／Ｌ；  ＫＮＯ３  ２２．４５  ｇ／Ｌ；  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１６５  ｇ／Ｌ；  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ２．７７  ｇ／Ｌ；  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１７  ｇ／Ｌ；  Ｈ３ＢＯ３  ０．００１５  ｇ／Ｌ；  ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ  ０．００４２  ｇ／Ｌ；  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．００７２  ｇ／Ｌ；  ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ０．００００６２５  ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）６ＭｏＯ２４．４Ｈ２Ｏ  ０．０００３１２５  ｇ／Ｌ；塩酸チアミン（ビタミンＢ１）  ２．２４  ｍｇ／Ｌ；ビオチン（ビタミンＨ）  ０．０１１２  ｍｇ／Ｌ；シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）  ０．０１１２  ｍｇ／Ｌ。当業者は、どのようにして連続的培養を実施し、供給流速を計算するかを決定し、また定常状態に達した時間を決定することが出来る。
【０２３２】
一旦定常状態に達すると、この培養槽からの連続的排出が、工程ｂ）の熟成発酵槽に供給される。
【０２３３】
工程ｂ）：
前記培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１０〜２０Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。後者の制御システム及び設定は、あらゆる点で、工程ａ）のものと類似している。
【０２３４】
前記リアクターに、工程ａ）から排出された培養体積の約５０％が播種され；同時に、タンクに、２倍に濃縮された培地が同一の流速で供給されることにより、以下の最終的な組成が得られる：グルコース５００  ｇ／Ｌ；  ＫＮＯ３  ５０  ｇ／Ｌ；  ＮａＨ２ＰＯ４  １３．５  ｇ／Ｌ；  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ  ４．４７  ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ６．１６２５  ｇ／Ｌ；  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．３６７５  ｇ／Ｌ；  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．０８６  ｇ／Ｌ；  Ｈ３ＢＯ３  ０．０６１  ｇ／Ｌ；  ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ  ０．１６９  ｇ／Ｌ；  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．２８７  ｇ／Ｌ；  ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ０．００２５  ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）６ＭｏＯ２４．４Ｈ２Ｏ  ０．０１２５  ｇ／Ｌ；塩酸チアミン（ビタミンＢ１）  ５  ｍｇ／Ｌ；ビオチン（ビタミンＨ）  ０．０２５  ｍｇ／Ｌ；シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）  ０．０２５  ｍｇ／Ｌ。
【０２３５】
前記培養において、１時間あたり３回のフラッシュが照射され、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。
【０２３６】
培養のモニタリング
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０２３７】
カロテノイド、特にルテインの定量のために、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。ルテインを含むカロテノイドの抽出及び解析の方法は、当業者に周知である。
【０２３８】
表８：結果（ｎ＝３）
【表８】
2016523554.tif 000010
【図１】
2016523554.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスの生産方法であって、以下の工程：
ａ）発酵槽中、連続モードで、混合栄養又は従属栄養条件下、細胞を培養する工程；及び
ｂ）混合栄養条件下、半連続モードで操作されるｎ個の発酵槽に、工程ａ）で得られた細胞及びそれらの培養物を連続及び逐次的に供給する工程、ここでｎは２以上の整数である；
を含み、当該栄養条件下での細胞の培養が、時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で実施される、方法。
【請求項２】
前記照明の強度が変化し、その振幅が５〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５〜４００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が、１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜２００回起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記照明がフラッシュの形態である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）における培養が、強度５０〜２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、並びに持続時間が約１秒の１０分の１〜５分、好ましくは１秒〜１分、及び１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜３６０回の、フラッシュの存在下で実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）における培養が、強度５０〜２，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、並びに持続時間が約１秒の１０分の１〜５分、好ましくは１秒〜１分、及び１時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜３６０回の、フラッシュの存在下で実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ａ）及び／又はｂ）における培養が、濃度５ｍＭ〜１．１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭの濃度の有機炭素含有基質の存在下で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、混合栄養条件下で、天然又は人工照明に応答して代謝活性を誘導することが可能な、原核若しくは真核単細胞生物、多細胞動物、植物又は真菌生物から単離された真核細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記真核又は原核単細胞生物が、海洋性又は淡水性、光合成性又は非光合成性の、原生生物、酵母又はシアノバクテリアから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記真核単細胞生物が、以下の属：シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ツラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オドンテラ（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）、ファエオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、モノドゥス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、イソクライシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ニツシア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）及び／又はテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）の種から選択される混合栄養性原生生物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真核単細胞生物が、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及びヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）種から選択される混合栄養性原生生物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）で得たバイオマスを回収する１つ以上の更なる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマスが、アルコール、有機酸、脂肪酸、多糖類、テルペン、例えばボトリオコッケン（ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｅｎｅ）、色素、例えばカロテノイド、アミノ酸、酵素、ビタミン、抗生物質、薬理活性を有する化合物、例えば外来又は組換えタンパク質、及び色素から選択される１つ以上の所望の分子を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記所望の分子が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、オレイン酸、フコキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン及びベータカロテンから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂質及び／又は色素を回収する１つ以上の工程、任意で当該脂質からＥＰＡ及び／又はＤＨＡ及び／又はＡＲＡ及び／又は色素を抽出する１つ以上の工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂ）が１５〜２４℃で実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2016523554.tif 000012
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