(57)【要約】  本発明は、特に骨固定インプラントの分野における骨量減少速度を測定するための方法に関する。本発明の方法は、ａ）エクスビボ試料中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する工程；及びｂ）工程ａ）で得られた値を一つ以上の検量線中に内挿することによって、進行中の周縁骨レベルの減少の関数として、骨量減少速度を決定する工程を含む。また、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットに関する。さらに、本発明は、進行中の分解の潜在的な確立の明瞭なデータを臨床医が迅速かつ正確に提供することを可能にする方法及びキットに関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨量減少速度を測定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）エクスビボ試料中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた値を一つ以上の検量線中に内挿することによって、進行中の周縁骨レベルの減少の関数として、骨量減少速度を決定する工程。
【請求項２】
エクスビボ試料が、体液又は組織であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液が、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は脳脊髄液、及び／又は滑液、及び／又は腹膜液、及び／又は唾液であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液が、歯肉溝滲出液であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記体液が、インプラント周縁間隙液であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、骨、及び／又は結合組織、及び／または骨髄、及び／又は軟骨、及び／又は歯肉、及び／又は粘膜であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が、骨、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることを特徴とする、請求項２又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカーが、ＴＲＡＰ，ＯＰＧ，ＣａｔＫ，ＲＡＮＫ，ＲＡＮＫＬ，オステオカルシン、ＩＬ−６，ＤＫＫ−１，ＭＭＰ−８，ＴＩＭＰ−１，ｔＰＡ，ＰＡＩ−２，カテプシンファミリーの一員、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ），アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ），ＴＧＦ−βスーパーファミリーからのマーカー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ），スクレロスチン、ノッギン、又はこれらのいずれかの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーが、ＴＲＡＰ，ＯＰＧ，ＣａｔＫ，オステオカルシン、又はこれらのいずれかの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記定量が、核酸の定量によって行なわれることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記定量が、ｑＰＣＲ，及び／又はノーザンブロットによって行なわれることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記一つ以上の検量線が、骨量減少速度とマーカーの発現レベル／マーカーの比率又はこれらの組み合わせとの間の線形関係、及び／又は二次関係、及び／又は三次関係、及び／又は四次関係、及び／又は同次多項式関係、及び／又は指数関係、及び／又は対数関係を与えることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記一つ以上の検量線が、骨量減少速度とマーカーの発現レベル／マーカーの比率又はこれらの組み合わせとの間の線形関係を与えることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
決定された骨量減少速度が、骨に影響を与える病気の存在又は非存在の指標であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
決定された骨量減少速度が、骨支持インプラント及び／又は歯に影響を与える病気の存在又は非存在の指標であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記病気が、関節炎、及び／又は慢性関節リウマチ、及び／又は乾癬性関節炎、及び／又は骨粗しょう症、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記病気が、インプラント周縁の病気であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記病気が、歯周病であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１９】
０．２ｍｍ／年以下の骨量減少速度が、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラムの指標であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
１〜１．５ｍｍ／年の範囲の骨量減少速度が、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラム、及び数ヶ月以内の引き続いての訪問の指標であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
２．０ｍｍ／年以上の骨量減少速度が、手術治療の指標であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２３】
キットが、試料採集装置をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
試料採集装置が、滅菌ペーパーポイント、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることを特徴とする、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
キットが、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
キットが、本発明の方法を実行するための指示書をさらに含むことを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
キットが、試料を中央検査室に送付するための容器をさらに含むことを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
キットが、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はこれらの組み合わせを定量するために必要な要素をさらに含むことを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
キットが、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカー又はこれらの組み合わせを特異的に認識する少なくとも一つの基質及び少なくとも一つの検出可能なラベルを含むことを特徴とする、請求項２２〜２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に骨固定インプラントの分野における骨量減少速度を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、多数の歯科用インプラントリハビリテーション法が実行されている。インプラント治療が成功する大多数の場合とは対照的に、特定の数の患者は、インプラント周縁の病気（ＰＩ）を発展させる。いくつかの場合では、機械的創面切除及び３％過酸化水素での洗浄を伴う非手術的治療が、十分に効果的な治療であるかもしれない。持続するインプラント周縁の病気の場合には、表面創面切除と組み合わされた切除手術がしばしば実行される。病気のインプラント部位における骨欠陥（例えば、骨ピーク）の手術的矯正によって、ポケットの深さは、減少されることができ、口腔衛生を容易にする軟組織形態を与える。しかし、患者の中には、治療に十分良好に反応せず、良好なプラーク制御及びインプラント周縁の粘膜の最小の炎症の代わりに、化膿及び進行性の骨量減少を含む徴候がいくつかの場合には再発しうる。かかる逆戻りの理由は、わかっていない。インプラント周縁の病気の病理学の理解の向上、及びさらに初期の検出及び介入を可能にするさらに敏感な診断ツールの開発に対する要望が間近になっている。これにより、感受性の患者におけるインプラント治療の予測可能性を増大させる。さらに、骨量減少の徴候を示すインプラントの生存率を増大させるため、病気の進行の初期段階における臨床介入が望ましい。これは、起こりうる進行中の骨吸収の初期の確立を要求し、従って、さらに敏感な技術が必要とされる。
【０００３】
骨吸収は、骨吸収細胞である破骨細胞によって媒介される。破骨細胞は、単核食細胞によって形成される。損傷された骨を置換する新しい骨は、骨形成細胞である骨芽細胞によって付着される。骨芽細胞は、間葉性間質細胞によって形成される。再モデル化プロセスに関与する様々な他の細胞タイプは、全身性因子（例えば、ホルモン、リンホカイン、成長因子、及びビタミン）及び局所因子（例えば、サイトカイン、接着分子、リンホカイン、及び成長因子）によって緊密に制御される（ＷＯ２０１２／０６１９０７）。
【０００４】
インプラント周縁の病気の診断は、骨量減少の放射線証拠と組み合わされた臨床測定に一般的に基づいている。インプラント周縁の炎症は、しばしば、ポケットの形成及び深化、インプラント周縁の上皮封止の破壊、プロービングでの出血（ＢｏＰ）、化膿、及び進行性の骨量減少に臨床的に解釈される。これらの診断方法は、しばしば、インプラント支持組織における広範囲の病的変化の指標として、インプラント周縁の病気の診断のために組み合わせられて使用される。かかる診断方法の限定された感度及び／又は特異性は、病的変化の初期検出を困難にする。
【０００５】
インプラント周縁の病気のための潜在的な予後及び診断ツールとしてのプラーク試料における歯肉溝滲出液中の遺伝子マーカーの分析を使用することの有効性は、多数の著者によって様々な結果を伴って研究されている。
【０００６】
しばしば研究されているマーカーは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）であり、これは、免疫制御、炎症、及び結合組織の代謝を含むいくつかの生物学的過程に関与するプロ炎症性サイトカインである。ＩＬ−１βは、骨吸収を刺激し、骨形成を阻害する（Ｐａｎａｇａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９６，１１：７９４−７９９）。ＩＬ−１βは、マクロファージによって主に生産されるが、好中球性の顆粒球を含む他の細胞によっても生産される。いくつかの研究によれば、インプラント周縁の病気の徴候を示すインプラントの周りの間隙液中のＩＬ−１βの存在が示されている。有意に上昇したレベルが、健康な部位と比べて（Ｐａｎａｇａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９６，１１：７９４−７９９；Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９５，１０：６９６−７０１；Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：６３７−６４３）、及びインプラント周縁の粘膜炎の部位と比べて（Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：６３７−６４３）、インプラント周縁の炎症について報告されており、インプラント周縁の炎症の初期の徴候を有する患者と進行した徴候を有する患者とを比べたときにも報告されている。しかし、Ｈｕｌｔｉｎら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  ＩｍｐＩ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：３４９−３５８）は、インプラント周縁の炎症と健康な部位との間にＩＬ−１βの発現に差がないという矛盾する結果を示した。
【０００７】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、プロ炎症性マーカーであり、好中球のための化学走化因子である。それは、歯周病（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２，２６８−２７６；Ｇｏｕｔｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｎｔ  ２０１２；２０１２：３６２９０５）及びインプラント周縁の炎症（Ｐｅｔｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２０１０，３９（５）：４７８−８５）における微生物侵入に対する生来の免疫応答の制御に関与する。Ｎｏｗｚａｒｉら（Ｃｌｉｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ  ２００８，１０（３）：１６６−１７３）は、健康な対象におけるインプラント及び歯の周りのサイトカインの存在を研究し、歯と比べてインプラントの周りでＩＬ−８の２倍の増大を見出している。
【０００８】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、造血、炎症、免疫応答、及び骨ホメオスタシスを制御するために様々な細胞によって生産される多機能性サイトカインである（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００８，２８３：１１５３５−１１５４０）。インプラント周縁の病気を有する対象からの唾液試料中のＩＬ−６のレベルは、Ｌｉｓｋｍａｎｎら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ２００６，２１（４）：５４３−５０）の研究において、健康な対象からの唾液試料と比べて有意に上昇した。Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｄｅｎｔ  ２００６，２６：１３５−１４１）は、健康なインプラント部位と比べてインプラント周縁の炎症を有する失敗インプラントにおいて、統計的に高いレベルのＩＬ−６を測定した。
【０００９】
破骨細胞は、単核細胞／マクロファージの系譜の先祖細胞から生じる骨吸収細胞である。破骨細胞形成の過程は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの一員であるＮＦ−κΒリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によって調整されている。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞形成を誘導するが、そのアンタゴニストであるＯＰＧは、破骨細胞形成を阻害する（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：３３７−３４２；Ｌｅｉｂｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００８，１１４３：１２３−１５０）。ＯＰＧは、破骨細胞のアポトーシスを減少させることも見出されている（Ｃｈａｍｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００８，２１６（２）：５３６−４２）。ＲＡＮＫＬ及びＯＰＧは、骨芽細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞によって分泌される（Ｃｏｒｒａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１，２２６（９）：２２７９−２２８６）。ＲＡＮＫＬは、活性化されたＴ細胞によっても発現される（Ｓａｉｄｅｎｂｅｒｇ−Ｋｅｒｍａｎａｃ’ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．２００２，１３（２）：１４４−５３）。ＯＰＧとＲＡＮＫＬの間の平衡のアンバランスは、歯周病などの骨破壊を含む病気に関係しているかもしれないと示唆されている。例えば、Ｂｏｓｔａｎｃｉら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００７，３４：３７０−３７６）は、歯肉溝滲出液中のＲＡＮＫＬ及びＯＰＧのレベルは、歯周病では反対方向に制御されているが、歯肉炎ではそうでないこと、従って、有意に低いＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ比率が、歯周病の様々な度合いを示す歯と比べて健康な歯の周りの歯肉溝滲出液中で記録されたことを示した。それにもかかわらず、インプラント周縁間隙液中のＯＰＧ及び可溶性ＲＡＮＫＬの二つの研究は、臨床パラメータとの統計学的に有意な相関を示すことに失敗した（Ａｒｉｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００８，１９：２８３−２８８；Ｍｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ  ２００６，８（３）：１３５−１４１）。しかし、両方の研究において、多数の試料がアッセイの検出限界の外側であり、統計学的計算から除外されたか又は０であるとしてカウントされた。このため、著者は、示されたデータはこれらの制限に関して解釈されるべきであると結論付けている。関節炎の病因についてのＯＰＧの役割も研究されている。例えば、Ｌｉｕら（Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）．２０１０，１２３（１１）：１４０７−１２）は、循環ＯＰＧのレベルは、初期の慢性関節リウマチを有する対象において上昇することを報告している。Ｗｎｔタンパク質が、幹細胞の維持及び増殖を促進することができること（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３（６９３８）：４４８−５２）、及びＷｎｔ信号伝達が、骨芽細胞形成のための主要な役割を果たすこと（Ｙａｖｒｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，２００７，６（４）：２７９−２９４）が示されている。
【００１０】
カテプシンＫ（ＣａｔＫ）は、活性な破骨細胞で高度に発現される骨吸収マーカーである。健康な部位と比べたインプラント周縁の炎症部位における高いＣａｔＫ発現が証明されている（Ｓｔｒｂａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００６；３３：３０２−３０８）。
【００１１】
オステオカルシン（ＯＣ）は、骨石化作用及びカルシウムホメオスタシスに関与する骨のカルシウム結合タンパク質である。Ｍｕｒａｔａら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００２，１３：６３７−６４３）は、健康な部位と比べて粘膜炎の部位からのインプラント周縁間隙液（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔ  ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）（ＰＩＣＦ）においてＯＣ発現が増大するが、インプラント周縁の炎症の部位と粘膜炎の部位又は健康なインプラント部位の間にＯＣレベルの差は見られないことを示した。
【００１２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、損傷した組織からのコラーゲンの分解及び除去に関与するタンパク質分解酵素である。ＭＭＰは、リポ多糖及びサイトカインなどの刺激への応答において、炎症部位に存在する細胞によって分泌される（Ａｂｏｙｏｕｓｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９８，１３：６８９−６９６）。コラゲナーゼ及びゼラチナーゼは、ＭＭＰスーパーファミリーの二つのサブファミリーである。Ｋｉｖｅｌａｅ−Ｒａｊａｍａｅｋｉら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００３，１４：１５８−１６５）の発見によれば、ＭＭＰ−８（コラゲナーゼ−２）の増大したレベルは、炎症性のインプラント周縁の病気の活性相と関連しているかもしれない。ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）の発現も研究されている。Ｍａら（Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌ  Ｒｅｓ  ２００３，１４：７０９−７１３）は、ＭＭＰ−９と骨レベルの間の関連を示したが、Ａｂｏｙｏｕｓｓｅｆら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９８，１３：６８９−６９６）は、健康な部位とインプラント周縁の炎症の部位の間に有意差があることを示すことができなかった。
【００１３】
ＭＭＰとマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の間のアンバランスは、細胞外マトリックス、基底膜、及び歯槽骨の分解を引き起こし、従って、歯周病を引き起こすと考えられている（Ｓｏｒｓａ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００４，１０：３１１−３１８）。唾液中のＭＭＰ−８，ＴＩＭＰ−１、及び特にそれらの比率が、進行した歯周病の検出における潜在的な候補であることが示唆されている（Ｇｕｒｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１０，３７：４８７−４９３）。
【００１４】
プラスミノーゲン系は、生理学的及び病理学的な組織再モデル化における細胞外タンパク質分解において、中心的な重要性を有する（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９９，８２：２５９−２７０）。プラスミンは、多くの細胞外タンパク質を分解することができかつ潜在的なコラゲナーゼ及び他のメタロプロテイナーゼを活性化することができる広範囲に活性なプロテアーゼである。（Ｗｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９７７，２９６：１０１７−１０２３；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １９９２，１４：４５５−４６３）。プラスミンは、非コラーゲン性ＥＣＭタンパク質を開裂することによって細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して直接作用し、及び様々な結合組織タンパク質に対する特異性で、他の酵素の全範囲のプロフォーム、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のプロフォームを活性化することによって間接的に作用する。プラスミノーゲン系と他の組織分解系との間の相互作用を通して、プラスミノーゲンは、重要な主要なタンパク質分解の潜在的能力を示し、その活性化の厳密な制御は、組織の一体性を維持するために重要である。プラスミンは、プラスミノーゲンアクチベーター（二つのタイプのセリンプロテアーゼが同定されている：ウロキナーゼ型、ｕ−ＰＡ及び組織型、ｔ−ＰＡ）によって、その不活性な前駆体プラスミノーゲンから形成される。プラスミノーゲンアクチベーターは、プラスミノーゲンアクチベーターのインヒビター（ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２）によって、生物分子１：１共有結合複合体の形成を通して特異的に阻害される。ｔＰＡ及びＰＡＩ−２のレベルは、健康な部位からの歯肉溝滲出液よりも炎症部位からの歯肉溝滲出液において高いことが示されている（Ｋｉｎｎｂｙ，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，３８３：８５−９２）。比較的増大したレベルのＰＡＩ−２は、妊娠及び歯周病における組織保護機能に関連している（Ｋｉｎｎｂｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ  Ｒｅｓ  １９９６，３１：２７１−２７７；Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ  Ｒｅｓ  ２００２，３７：６０−６５）。
【００１５】
インプラント周縁の病気のための様々な治療代替案が提案されている。非手術的治療（例えば、接近手術なしでの創面切除）は、インプラント周縁の粘膜炎の場合には成功するだろうが、インプラント周縁の炎症を示す部位についてはそれほど効果的でないように見える（Ｒｅｎｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００８，３５（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３０５−３１５）。臨床データによれば、全身抗生物質との組み合わせでの表面脱汚染を含む開放創面切除などの手術治療は、インプラント周縁の炎症の障害にとっては有効な治療選択肢でありうる（Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００８，３５（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３１６−３３２）。しかし、現在に至るまで、一般的な治療法は存在せず、進行したインプラント周縁の炎症は、治療するのが困難である。インプラントの稜領域の周りの周縁骨は、通常、インプラントの健康状態の重要な指標である。稜骨のレベルは、最初のインプラント手術の時点でのインプラントの稜位置から測定されることができる。骨量減少を評価する最も一般的な方法は、放射線評価による方法である。従って、骨レベルは、放射線写真上で測定されることができ、固定物と、インプラントに対して中位及び遠位の周縁骨の稜に対するその隣接点との間の接合点からの距離として定義されることができる（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）。もちろん従来の放射線写真は、インプラント本体の周りの骨量減少の中位又は遠位の側面をモニターするにすぎない（Ｍｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ２００８，１７（１）：５−１５）。進行中の骨量減少についての明確な情報の欠如は、インプラント周縁の病気の不要な又は不正確な治療を生じる。インプラント周縁の骨レベルは、通常、診断時に撮影された放射線写真から決定される。骨レベルは、正常な骨レベルと比較され、より早い時点で撮影された一つ以上の放射線写真が、骨量減少を評価するために使用される。しかし、放射線写真は、骨の状況の静止画像を与える。従って、骨の脱石化の証拠は、進行中の病気の活性を必ずしも意味しない。これは、歯周病の骨レベルについても当てはまる。歯周病の進行についてのデータは、連続的な過程を示さず、代わりに、活性のバースト（悪化）、寛解、及び不活性な期間を示す（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）。それに加えて、放射線写真の限定された感度は、いくつかの病気に関与する病理学的な骨分解過程の極めて初期の段階の検出をほとんど可能にしない。さらに、全ての放射線写真の検査は、適切で再現性のある投影技術を使用して行なわれることが重要である。放射線写真に対して行なわれる測定の精度は、低く、特に、小さな平均骨量減少に関するときはそうである。このことは、これらの解釈に含まれる困難性を示唆する。さらに、骨量減少速度は、長い期間内、通常は一年間かけてのみ測定されることができ（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）、患者を頻繁に放射線にさらすことを必要とする。従って、インプラント周縁の炎症及び歯周病の患者における進行中の骨分解の確立は、個別化された患者治療の精度を増大させるための必要条件である。
【００１６】
インプラントの成功は、インプラント装着の一年目において１．５ｍｍを超えない、及びそれ以降の年において０．２ｍｍを超えない骨量減少速度を考慮に入れる。極めて進行性の骨量減少は、インプラント周縁の炎症、インプラントの過剰装着、又はインプラント部位での治癒能力を阻害する最適でないインプラント配置の指標である。インプラント周縁の炎症及び歯周病は、二相様式で進行し、そこでは、骨量減少を伴う活性相の後に、骨量減少を伴わないか又は有意でない骨量減少しか伴わない不活性相が続く（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）。従って、もし骨量減少速度が特定レベルで一定に留まるなら、インプラント又は歯がもはや固定骨によって支持されなくなるまでいくらかの時間がかかる。それは、インプラント又は歯の長さ、及び残りの周囲骨の加重担持能力に依存する。
【発明の概要】
【００１７】
進行中の骨量減少についての明瞭な情報の欠如は、骨に影響を与える病気の不必要な、又は不正確な治療をもたらすおそれがあるので、個別化された患者治療及び病気の予後の精度を増大させるために、骨量減少速度を迅速にかつ正確に確立することが極めて望ましい。本発明の文脈において、骨量減少速度は、進行中の骨分解の尺度として定義されることができる。換言すると、骨量減少速度は、本発明を使用して、経時的な骨レベルの変動として定義されることができる。より好ましくは、本発明は、発現レベルを口腔中の周縁骨レベルとうまく関連付ける。これは、臨床医が関連治療を計画して提供することを大いに助ける。放射線写真の限定された感度は、これらの病気に関与する病理学的骨分解過程の極めて初期の段階の検出をほとんど可能にしない。得られた放射線写真は、試験時の周縁骨レベルについての情報を提供するが、進行中の骨分解の明瞭な確立を提供しない。さらに、従来の放射線写真を使用した周縁骨レベル変化の測定についての定量限界は、０．４７ｍｍであると以前に見積もられている（Ａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）。従って、骨に影響を与える病気を有する患者における進行中の骨分解の迅速な確立は、患者の診断及び治療の精度を増大させるための必要条件である。これは、患者を頻繁に放射線にさらすことも回避する。
【００１８】
従って、本発明は、骨量減少速度を測定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法を提供する：
ａ）エクスビボ試料中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた値を一つ以上の検量線中に内挿することによって、進行中の周縁骨レベルの減少の関数として、骨量減少速度を決定する工程。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。本発明は、進行中の分解の潜在的な確立の明瞭なデータを臨床医が迅速かつ正確に提供することを可能にする方法及びキットを提供する。それは、放射線装置への露出が少ないことを意味し、試験結果を骨レベルとうまく関連付ける。
【００２０】
用語及び略号
ＣａｔＫ      カテプシンＫ
ｃＤＮＡ      相補的ＤＮＡ
Ｃｑ          定量サイクル
ＤＫＫ−１    Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−１
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
ＥＣＭ        細胞外マトリックス
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＡＰＤＨ    グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＣＦ        歯肉溝滲出液
ＨＰＲＴ１    ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＩＬ          インターロイキン
ＭＣ          粘膜炎
ＭＭＰｓ      マトリックスメタロプロテイナーゼ
ｍＲＮＡ      メッセンジャーＲＮＡ
ＯＣ          オステオカルシン
ＯＰＧ        オステオプロテゲリン
ＰＡＩ−２    プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）
ＰＩ          インプラント周縁の炎症
ＰＩＣＦ      インプラント周縁間隙液
ｑＰＣＲ      定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＡＮＫＬ    ＮＦ−κΒリガンドの受容体アクチベーター
ＲＮＡ        リボ核酸
ＳＥＱ        配列
ＴＩＭＰｓ    マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター
ｔＰＡ        組織プラスミノーゲンアクチベーター
ＴＲＡＰ      酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ
ＵＢＣ        ユビキチンＣ
ｕＰＡ        ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
ＹＷＨＡＺ    チロシン３／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、
ゼータポリペプチド
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＴＲＡＰと骨量減少速度との間の相関を示す。骨分解速度は、Ｘ軸に示されている（ｍｍ／年）。Ｙ軸は、ＴＲＡＰのレベル（正規化された発現）を示す。
【００２２】
【図２】図２は、ＴＲＡＰ／ＯＣと骨量減少速度との間の相関を示す。骨分解速度は、Ｘ軸に示されている（ｍｍ／年）。Ｙ軸は、ＴＲＡＰ／ＯＣのレベル（正規化された発現）を示す。
【００２３】
【図３】図３は、ＣａｔＫ／ＯＣと骨量減少速度との間の相関を示す。骨分解速度は、Ｘ軸に示されている（ｍｍ／年）。Ｙ軸は、ＣａｔＫ／ＯＣのレベル（正規化された発現）を示す。
【００２４】
【図４】図４は、ＯＰＧと骨量減少速度との間の相関を示す。骨分解速度は、Ｘ軸に示されている（ｍｍ／年）。Ｙ軸は、ＯＰＧのレベル（正規化された発現）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な記述は、本発明の個別の特徴の特定の及び／又は好ましい変形例を開示する。本発明は、本発明の二つ以上の特徴について記述された二つ以上の特定の及び／又は好ましい変形例を組み合わせることによって作成された特に好ましい実施形態としても考えられる。
【００２６】
本発明は、骨量減少速度を測定する方法を提供する。この方法は、（ｉ）エクスビボ試料中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する工程；及び（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた値を一つ以上の検量線中に内挿することによって、骨量減少速度を決定する工程を含む。本発明者らは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はそれらのうちの二つ以上のものの間の比率が骨量減少速度に関連することを示した。これは、骨量減少速度の迅速かつ高感度の決定を可能にする。これは、本発明以前には実行することが不可能であった。骨量減少速度は、骨に影響を与える病気の存在又は非存在の指標であることができる。さらに、骨量減少速度は、患者が特定の治療を受けるべきであるということを示すことができる。
【００２７】
用語「一つ以上の検量線中に内挿する」は、既知の値、又は決定された値の間の値を推定するという意味で本明細書中では使用される。
【００２８】
インプラントは、連続した観察においてのみ、骨一体化されていると判断されることができる。なぜなら、界面変化は、徐々に生じることがあり、少なくとも短期間の放射線写真の解像度レベルでは明らかでないことがあるからである（Ａｌｂｒｅｋｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＯＭＩ  １９８６，１（１）：１１−２５）。本発明は、骨量減少速度の迅速な検出のための方法を提供し、患者が不必要な放射線にさらされることを防止し、診断のための、及び／又は好適な治療法を選択するための、及び／又はインプラントの予後を推定するための有用な情報を臨床医に提供する。
【００２９】
本発明の文脈において、骨量減少速度は、進行中の骨分解の尺度として定義されることができる。換言すると、骨量減少速度は、経時的な骨レベルの変動として定義されることができる。時間間隔は、介入後の特定の相（例えば、治癒相、装着相、手術後相）（病気の組み合わせでの手術の効果及び／又は介入の効果）を検出するために好適に選択される。例えば喫煙者であるか、又は糖尿病を有するか、又は他の点で骨量減少の危険にさらされているカテゴリーの患者を追跡することが重要であるかもしれない。骨一体化された歯科用インプラントという特定の場合には、骨レベルは、固定物と、インプラントに対して中位及び遠位の周縁骨の稜に対するその隣接点との間の接合点からの距離として定義されることができる。
【００３０】
エクスビボ試料は、体液又は組織であることが好ましい。体液は、口腔液、及び／又は血液、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は脳脊髄液、及び／又は滑液、及び／又は腹膜液、及び／又は唾液であることができ、好ましくは歯肉溝滲出液であり、より好ましくは、インプラント周縁間隙液である。
【００３１】
組織は、骨、及び／又は骨に隣接する組織、及び／又は結合組織、及び／または骨髄、及び／又は軟骨、及び／又は歯肉、及び／又は粘膜、及び／又はインプラント支持組織、及び／又はインプラントに隣接する骨、及び／又は歯に隣接する骨であることができる。
【００３２】
エクスビボ試料（そこから骨量減少速度が測定される）は、対象の体液又は組織から得られることができる。好ましくは、エクスビボ試料は、滅菌ペーパーポイント（ｐａｐｅｒ  ｐｏｉｎｔ）などの一つ以上の滅菌吸収体を、インプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入して、その場で少なくとも６０秒間放置することによって得られる。好ましくは、三つ以上の滅菌ペーパーポイントが溝／ポケット中に挿入される。
【００３３】
バイオマーカー（以下、マーカーと称する）は、客観的に測定されて、正常な生物学的過程、病気の過程、及び治療介入への薬理学的応答の指標として評価される物質として定義されることができる。バイオマーカーは、健康状態、病気の発症、治療応答、及びその結果をモニターするために使用されることができる分子である（Ｚｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１，３（２）：４５−５２）。
【００３４】
破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連するマーカーは、骨の代謝（骨代謝回転、及び／又は骨形成、及び／又は骨吸収及び／又は骨再モデル化）に関連するマーカーであり、当該技術分野では周知である（即ち、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２；Ｓｅｉｂｅｌ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ２００５，２６：９７−１２２；Ｗａｔｔｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９９，４５（８）Ｂ：１３５９−１３６８；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９７，３０（８）：５７３−５９３）。
【００３５】
破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連するマーカー、又はそれらの組み合わせ、又はそれらの比率は、特に限定されず、ＴＲＡＰ、及び／又はＯＰＧ、及び／又はＣａｔＫ、及び／又はＲＡＮＫ、及び／又はＲＡＮＫＬ、及び／又はオステオカルシン、及び／又はＩＬ−６、及び／又はＤＫＫ−１、及び／又はＭＭＰ−８、及び／又はＭＭＰ−２、及び／又はＴＩＭＰ−１、及び／又はｔＰＡ、及び／又はＰＡＩ−２、及び／又はカテプシンファミリーからの他のマーカー、及び／又は骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、及び／又はＴＧＦ−βスーパーファミリーからのマーカー、及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及び／又はスクレロスチン（Ｓｏｓｔ（硬結性骨化症の遺伝子）からのタンパク質生成物）、及び／又はノッギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、又はこれらの組み合わせの一つ以上であることができる。好ましくは、これらのマーカー又はマーカーの比率は、骨量減少速度とマーカーの発現レベル又はマーカーの比率との間の線形関係を与えるようなものであり、例えば、ＴＲＡＰ、及び／又はＯＰＧ、及び／又はＣａｔＫ、及び／又はオステオカルシン、及び／又はＴＲＡＰ／ＯＣ、及び／又はＣａｔｋ／ＯＣである。代替的に、骨量減少速度とマーカーの発現レベル又はマーカーの比率との間の二次関係、及び／又は三次関係、及び／又は四次関係、及び／又は同次多項式関係、及び／又は指数関係、及び／又は対数関係を与えるマーカー又はマーカーの比率が好ましい。
【００３６】
本発明のマーカーは、以下のアクセッション番号によって同定されることができる。
インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ｂ）：ＮＭ＿０００５７６．２
インターロイキン−６（ＩＬ−６）：ＮＭ＿０００６００．３
マトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ８）：ＮＭ＿００２４２４．２
酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）：ＮＭ＿００１６１１．３
カテプシンＫ：ＮＭ＿０００３９６
オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）：ＮＭ＿００２５４６
ＮＦ−κＢリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）：ＮＭ＿００３７０１．３
インターロイキン−８（ＩＬ８）：ＮＭ＿０００５８４．３
ヒトのｄｉｃｋｋｏｐｆ  １ホモログ（アフリカツメガエル）（ＤＫＫ１）：ＮＭ＿０１２２４２．２
マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）：ＮＭ＿００３２５４．２
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＮＭ＿０００９３０．３
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）（ＰＡＩ−２）：ＮＭ＿００１１４３８１８．１
オステオカルシン（ＰＭＦ１又はＯＣ）：ＮＭ＿００１１９９６５４．１
【００３７】
好ましくは、二種、三種、四種、五種、六種又はそれ以上のマーカーの発現レベル又はその比率が、骨量減少速度についてのさらに正確な情報を得るために測定される。
【００３８】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−１（ＤＫＫ−１）は、Ｗｎｔ信号伝達アンタゴニストであり、骨芽細胞の分化を減少させる。ＤＫＫ−１の上昇した全身レベルが、慢性関節リウマチを有する患者で（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）．２０１０，１２３（１１）：１４０７−１２）、及び乾癬性関節炎を有する患者で（Ｄａｌｂｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２０１０，１２（４）：Ｒ１６４）測定されている。
【００３９】
酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は、破骨細胞のラッフリングされた縁から分泌され、オステオポンチン（これは、脱リン酸化前には破骨細胞に対する固定として作用する）を脱リン酸化して、破骨細胞の移動及びさらなる骨吸収を可能にする（Ｍｉｎｋｉｎ，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ，１９８２，３４：２８５−２９０）。
【００４０】
エクスビボ試料中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率を定量する方法は、特に限定されず、核酸（例えばｍＲＮＡ）を定量する方法、及び／又はタンパク質を定量する方法（例えばＲＴ−ｑＰＣＲ（以下、ｑＰＣＲと称する））、及び／又はノーザンブロット、及び／又は免疫アッセイ、及び／又はＥＬＩＳＡ、及び／又は放射線免疫アッセイ、及び／又は磁気免疫アッセイ、及び／又は蛍光免疫アッセイ、及び／又は免疫沈降、及び／又は表面プラスモン共鳴、及び／又はウエスタンブロット、及び／又は免疫組織化学、及び／又はこれらのいずれかの組み合わせから選択されることができる。定量のための好ましい方法は、ｑＰＣＲである。実験手順は、通常、試料処理工程（即ち、抽出）を含む。
【００４１】
一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率の定量は、一種以上の参照遺伝子によって正規化されることができる。正規化は、参照遺伝子の発現レベルに対する関心のある遺伝子の発現レベルの比率を報告することを含む。参照遺伝子は、自由に利用できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラムを使用して選択されることができる。好ましくは、参照遺伝子は、安定に発現されるものであり、それらの豊富さが試料中の合計量（ｑＰＣＲの場合は、ｍＲＮＡの合計量）との強い相関を示すものである。より好ましくは、参照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ，ＹＷＨＡＺ，ＵＢＣ、及び／又はＨＰＲＴ−１から選択され、これらの中でもＹＷＨＡＺ及びＵＢＣが好ましい。
【００４２】
本発明の参照遺伝子は、以下のアクセッション番号によって同定されることができる。
ＹＷＨＡＺ（参照遺伝子）：ＮＭ＿００１１３５７０２．１
ＵＢＣ（参照遺伝子）：ＮＭ＿００１１３５７０２．１
【００４３】
本発明の文脈では、マーカーの発現レベルは、（ｉ）濃度、又は（ｉｉ）マーカーについて特異的な検出シグナル、又は（ｉｉｉ）数学的変換による、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に関連する値を意味することができる。
【００４４】
ｑＰＣＲの場合、相対的な遺伝子発現レベルは、各アッセイに対してΔΔＣｑ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０２−４０８）を使用して、そして各遺伝子の遺伝子発現を参照遺伝子によって正規化することによって計算されることが好ましい。参照遺伝子は、自由に利用できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラム（ｗｗｗ．ｍｄｌ．ｄｋ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍ．Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０）を使用して選択されることができる。正規化された遺伝子発現は、各対象について、対数変換の後で以下の式を使用して計算されることができる：遺伝子ｇの正規化された発現＝（Ｃｑ（ｎ）−Ｃｑ（ｇ））。式中、Ｃｑ（ｇ）は、遺伝子ｇについての増幅サイクル数であり、Ｃｑ（ｎ）は、対象から採集された試料についての正規化因子（選択された参照遺伝子についての増幅サイクルの平均数）である。
【００４５】
ｑＰＣＲの場合、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率は、対応するアンプリコンの定量によっても定量されることができる。アンプリコンは、天然の又は人工の増幅又は複製事象の源及び／又は生成物である一片のＤＮＡ又はＲＮＡとして定義されることができる。本発明の場合は、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はその比率の定量のための好ましいアンプリコンは、以下のものである：
インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ｂ）：配列番号１
インターロイキン−６（ＩＬ−６）：配列番号２
マトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ８）：配列番号３
酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）：配列番号４
カテプシンＫ：配列番号５
オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）：配列番号６
ＮＦ−κＢリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）：配列番号７
インターロイキン−８（ＩＬ８）：配列番号８
ヒトのｄｉｃｋｋｏｐｆ  １ホモログ（アフリカツメガエル）（ＤＫＫ１）：配列番号９
マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）：配列番号１０
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：配列番号１１
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタータイプ２（セルピンＢ２）（ＰＡＩ−２）：配列番号１２
オステオカルシン（ＰＭＦ１又はＯＣ）：配列番号１３
ＹＷＨＡＺ（参照遺伝子）：配列番号１４
ＵＢＣ（参照遺伝子）：配列番号１５
【００４６】
本発明の方法では、一つ以上の検量線は、骨量減少速度とマーカーの発現レベル又はマーカーの比率との間の線形関係、及び／又は二次関係、及び／又は三次関係、及び／又は四次関係、及び／又は同次多項式関係、及び／又は指数関係、及び／又は対数関係を与えてもよい。好ましくは、検量線は、骨量減少速度とマーカーの発現レベル又はマーカーの比率との間の線形関係を与えてもよい。検量線は、それに内挿されるべきエクスビボ試料について使用されるのと同じ一つ以上のマーカー及び／又はその比率及び同じ定量技術を使用して確立されることができる。
【００４７】
本発明の方法は、骨に影響を与える病気の存在又は非存在、好ましくは、骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える病気の存在又は非存在を示すために使用されることができる。より好ましくは、前記病気は、インプラント周縁の病気、及び／又は歯周病、及び／又は関節炎、及び／又は慢性関節リウマチ、及び／又は乾癬性関節炎、及び／又は骨粗しょう症、又はこれらの組み合わせであり、これらの中でも、インプラント周縁の病気が好ましい。
【００４８】
インプラント周縁の病気（骨分解の存在下でのインプラント周縁の炎症とも称される）は、支持骨の減少を生じる、インプラントの周りの組織に機能的に影響を与える炎症過程として定義される（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５：３１−３８）。粘膜炎は、軟組織の炎症、膨張、プロービングに対する出血としてしばしば言及されるが、骨量減少の徴候は有さない。
【００４９】
本発明の方法は、インプラントの予後の評価のためにも使用されることができる。
【００５０】
本発明者らは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する特定のマーカーの発現レベル、又は二種以上のマーカーの間の比率、又はこれらの組み合わせと骨量減少速度との間の関連について研究し、骨の影響を与える病気のための診断因子としてそれらを使用することを可能にした。従って、本発明によれば、骨に影響を与える病気、好ましくは骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える病気を有するかどうかについて、個別の患者を診断することができる。
【００５１】
本発明者らは、インプラント治療を受けている患者から得られたインプラント周縁間隙液中の破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する特定のマーカーの発現レベル又は二種以上のマーカーの間の比率が、骨量減少速度に関連することを示した。この方法は、骨量減少速度の迅速な決定を提供し、これは、インプラント周縁の病気を診断して適切な治療を選択するために必要である。
【００５２】
本発明の方法を使用すれば、貧弱な補綴構造から生じる過剰装着による骨量減少速度を検出することができ、狭い歯槽稜における大きすぎるインプラントの配置による骨量減少を提出することができ、及びインプラント配置が薄すぎる骨部分を生じる他の場合を検出することができる。従って、臨床医は、適切な治療を提供するだろう。従って、患者を放射線にさらすことは不要であり、臨床医は、治療を選択して患者の予後を確立するために、放射線写真によって評価される測定可能レベルの骨分解が進行するまで待つ必要がない。
【００５３】
骨量減少速度が測定されるエクスビボ試料は、骨に影響を与える病気、好ましくは骨包囲インプラント及び／又は歯に影響を与える病気を有していることができるか又は有していないことができる患者から得られることができる。好ましい患者は、一つ以上のインプラントを有する患者であり、より好ましくは、骨固定インプラントを有する患者である。インプラントは、歯科用インプラント、及び／又は股関節インプラント、及び／又は膝関節インプラントであることができる。
【００５４】
好ましくは、患者は、インプラント支持組織に影響を与える病気、及び／又は骨支持インプラントに影響を与える病気、及び／又は歯の周りの組織に影響を与える病気（例えば、インプラント周縁の炎症、及び／又は粘膜炎、及び／又は歯周病、及び／又は歯肉炎）、又はこれらの組み合わせを有するか、及び／又は有する可能性がある。より好ましくは、前記患者は、インプラント周縁の病気を有するか、及び／又は有する可能性がある。代替的に、患者は、骨に影響を与える病気（例えば、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨粗しょう症など）を有するか、及び／又は有する可能性がある。
【００５５】
患者のエクスビボ試料中のＴＲＡＰ，ＴＲＡＰ／ＯＣ，ＣａｔＫ／ＯＣ、及びＯＰＧのうちの１，２，３，４，又は５、又は６種の発現レベルは、ｑＰＣＲによって定量されることができる。骨量減少速度の決定は、定量工程で得られた一つ以上の値を検量線中に内挿することによって実行されることができる。好ましくは、この情報は、適切な治療及び／又は病気の予後の指標である。
【００５６】
０．２ｍｍ／年以下の骨量減少速度は、ケア口腔衛生（ｃａｒｅ  ｏｒａｌ  ｈｙｇｉｅｎｅ）治療の標準を含む治療及び維持プログラムの指標であることができる。
【００５７】
１〜１．５ｍｍ／年の範囲の骨量減少速度は、ケア口腔衛生治療の標準を含む治療及び維持プログラム、及び数ヶ月以内の引き続いての訪問の指標であることができる。
【００５８】
２．０ｍｍ／年以上の骨量減少速度は、手術治療の必要性の指標であることができる。
【００５９】
インプラント装着後の初年度中の１．５ｍｍ／年を超えない骨量減少速度、又はその後の０．２ｍｍ／年未満の骨量減少速度は、口腔衛生のための標準プログラムの指標であることができる。
【００６０】
インプラント装着後の初年度の後の０．２〜２．０ｍｍ／年の骨量減少速度は、口腔衛生のための標準プログラム、及び数ヶ月以内の引き続いての訪問の指標であることができる。もし骨量減少速度が１．５〜２．０ｍｍ／年に維持されるのなら、臨床医は、その部位の手術治療を行なうことができる。
【００６１】
インプラント挿入後の初年度中の１．５ｍｍ／年を超える骨量減少速度は、不正確なインプラント配置又は不十分なインプラント装着の指標であることができ、手術治療の指標であることができる。インプラント挿入後の初年度の後の２．０ｍｍ／年を超える高い骨量減少速度は、手術治療の指標であることができる。
【００６２】
用語「ヒト対象」、「対象」、及び「患者」は、本願では相互に交換可能に使用される。用語「状態」、及び「病気」は、本願では相互に交換可能に使用される。
【００６３】
さらに、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。特定の治療の指標である骨量減少速度の値は、このキットを使用して与えられることができる。このキットの助けによって、患者の骨量減少速度が計算されることができる。本発明のキットは、試料採集装置を含むことができる。試料採集装置は、限定されず、体液又は組織などの試料を採集するための装置である。好ましくは、試料採集装置は、インプラント周縁間隙液の試料を採集するために使用される。試料採集装置は、滅菌ペーパーポイントなどの吸収体、及び／又は注射器、及び／又は生検装置であることができる。好ましくは、試料採集装置は滅菌吸収体であり、より好ましくは、滅菌ペーパーポイントである。
【００６４】
本発明のキットは、試料を保存するための保存媒地をさらに含むことができる。保存媒地の目的は、生物学的試料を保存することであり、下流の分析のために試料の一体性及び生存性を維持するように処方されたいかなる媒地であることもできる。好ましくは、保存媒地は、ＲＮＡアーゼの阻害剤を含むことができる。より好ましくは、保存媒地は、ＲＮＡＬａｔｅｒ保存媒地（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）である。
【００６５】
本発明のキットは、本発明の方法を実行するための指示書をさらに含むことができる。
【００６６】
本発明のキットは、試料を中央検査室に送付するための容器をさらに含むことができる。中央検査室では、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はこれらの組み合わせが定量されることができる。発現レベルの値を一つ以上の検量線中に内挿することは、中央検査室で実行されることができる。代替的に、キットは、一つ以上の検量線を含むことができ、発現レベルは、その中に内挿されて、骨量減少速度と相関されることができる。
【００６７】
代替的に、本発明のキットは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーの発現レベル又はこれらの組み合わせを定量するために必要な要素をさらに含むことができる。この場合、キットは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカー又はこれらの組み合わせを特異的に認識する少なくとも一つの基質及び少なくとも一つの検出可能なラベルを含むことができる。
【００６８】
定量がｍＲＮＡの定量によって実行される場合、前記キットは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーを検出して定量するために、一つ以上のプライマー配列も含むことができる。
【００６９】
定量がタンパク質の定量によって実行される場合、前記キットは、破骨細胞及び／又は骨芽細胞の活性に関連する一種以上のマーカーを検出して定量するために、一つ以上の基質も含むことができる。好ましい基質は、抗体であり、この抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はこれらのフラグメントであることができる。キットは、一次抗体、二次抗体、及び標識化された抗体をさらに含むことができる。
【００７０】
これらの場合、キットは、発現レベルの値を内挿して骨量減少速度を決定するために、一つ以上の検量線も含むことができる。
【００７１】
キットは、本発明の実施形態のいずれかの方法において使用されることが好ましいが、キットの用途は、特に限定されない。
【００７２】
本明細書中で使用される表現「一つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」は、１及び１以上のいかなる数の個別化された列挙（例えば、２，３，４，５，６など）も含む。本明細書中で使用される表現「一つより大きい（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」又は「いくつかの（ｓｅｖｅｒａｌ）」は、１より大きいいかなる数の個別化された列挙（例えば、２，３，４，５，６など）も含む。
【００７３】
他に明記されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中では、「含む」によって導入されたリストの部材に加えて、さらなる部材が所望により存在していてもよいということを示すために使用される。しかし、本発明の特定の実施形態として、用語「含む」が、さらなる部材が存在する可能性を包含しないことも想定される。つまり、この実施形態のために、「含む」は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の意味を有するものとして理解されるべきであることも想定される。
【実施例】
【００７４】
実施例１：検量線
対象
これは、非無作為の、片側ブラインド（ｂｌｉｎｄｅｄ）の（試料分析者）、制御された臨床実験的研究であり、スウェーデンのＧｏｅｔｅｂｏｒｇ大学の地方論理委員会によって承認された（Ｄｎｒ：６５２−１０）。この研究は、健康なインプラント部位を有する２５人の対象、インプラント周縁の粘膜炎の部位を有する２５人の対象、及びインプラント周縁の炎症の明らかな臨床的徴候を有する２５人の対象を含んでいた。研究は、単一の評価時点に限定された。研究参加者は、スウェーデンのＧｏｅｔｅｂｏｒｇのＢｒａｎｅｍａｒｋ  Ｃｌｉｎｉｃでの計画されたインプラント維持セッションに参加した、歯科用インプラントで以前にリハビリされた対象から選択された。各対象は、研究に関連する手順が実行される前に、インフォームドコンセントのプロセスに参加し、インフォームドコンセント書類（ＩＣＦ）に日付を入れて署名した。対象１人あたり一つのインプラント部位が評価され、選択された部位は、以下に記述される基準に基づいて、健康な（ＨＩ）部位、粘膜炎（ＭＣ）の部位、又はインプラント周縁の炎症（ＰＩ）の部位として分類された。インプラント周縁間隙液（ＰＩＣＦ）は、インプラント部位あたり三つのプールされたペーパーポイントを使用してインプラント部位から採集された。試料分析及び統計に関与する全ての人は、対象の身元を知らされず、試料分析に関与する人は、試料の種類（ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ）を知らされなかった。遺伝子マーカーの発現の分析は、独立した試験検査室（Ｔａｔａａバイオセンター、Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）によって実行された。
【００７５】
算入／除外基準
本研究に参加するために、各対象は、表１に与えられる一般基準１〜５のそれぞれを満たしていた。ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ群のいずれかに含めるために、対象は、表２，３，４にそれぞれ与えられる算入基準を満たしている必要があった。全ての三つの群についての除外基準は、表５に与えられている。対象の健康状態及び治療（例えば、抗炎症治療、骨粗しょう症、糖尿病、未制御の上皮小体機能亢進症、コルチコイド、及び骨同化治療、悪性腫瘍の病歴、タバコ及び／又は他のニコチン含有製品の使用）は、除外基準ではなかったが、かかる状態、治療、及び使用は、症例報告書（ＣＲＦ）に記録された。抗生物質治療を除く、対象の登録の３０日前より後に受け取られた全ての正規の処方薬物、及び／又は他の正規の治療は、許可され、ＣＲＦに記録された。研究登録の３ヶ月前より後の抗生物質治療は、禁止された。
【００７６】
対象の年齢、性別、口腔の健康状態、Ｍｏｍｂｅｌｌｉの改変された出血指数（ｍＢＩ）、改変されたプラーク指数（ｍＰＩ）、インプラント周縁のポケットの深さ（ＰＩＰＤ）、付着した粘膜の高さ、及び化膿の存在も、全ての対象についてＣＲＦに記録され、定量された。
【００７７】
両群における対象の登録は、有資格基準を満たした対象について、引き続いて行なわれた。算入期間は、約１年であり、全ての三つの群の対象は、全期間にわたって登録された。
【００７８】
無作為化は、適用可能でなかった。臨床試験及びＰＩＣＦ試料採集を行なう臨床研究者は、研究パラメータを知らされていた。試料分析に関与する全ての他の人は、対象の身元を知らされなかった。ＰＩＣＦ試料のｑＰＣＲ分析の実行に関与する人は、試料の種類（ＨＩ，ＭＣ又はＰＩ）を知らされなかった。統計分析の実行に関与する人は、研究集団を知らされていた。
【００７９】
試料採集
ＰＩＣＦ試料採集は、以下のようにして行なわれた。三つの滅菌ペーパーポイント（Ｒｏｅｋｅ，Ｃｏｌｔｅｎｅ，ドイツ）は、インプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入され、選択されたインプラント部位について少なくとも６０秒間その場に放置された。三つのペーパーポイントは、ＲＮＡＬａｔｅｒ保存媒地（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を含む一つの２ｍｌプラスチックチューブ（マイクロチューブ、２ｍｌ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，ドイツ）に直ちに移された。即ち、三つの試料がプールされた。チューブを取り扱うときは、清潔な手袋が常に使用された。ペーパーポイントは、保存媒地中に完全に浸漬された。プールされた試料は、試料採集日に、常温でＢｒａｎｅｍａｒｋ  Ｃｌｉｎｉｃから、遺伝子マーカーの分析のために地方の検査室に移送された。
【００８０】
試料の取り扱い及び分析
ｑＰＣＲ試料の分析は、ＴＡＴＡＡバイオセンターＡＢ（Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）で、Ｈａｌｌら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）によって以前に記述された標準手順に従って行なわれた。手短に述べると、ペーパーポイントに付着した細胞からのＲＮＡは、ＴＡＴＡＡバイオセンターで抽出された。次に、細胞は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，スウェーデン）を製造者の指示に従って使用して精製された。キット中に含まれる担持ＲＮＡは、抽出中のＲＮＡの損失を最小限にするために使用された。ＲＮＡは、ＢｉｏＲａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を製造者の指示に従って、５μｌのＲＮＡを使用してｃＤＮＡに変換された。ｃＤＮＡは、５０μｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）中に希釈された。次に、試料の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析が行なわれた。分析された生化学的マーカーは、表６に示される。Ｐｅｒｆｅｃｔａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，米国）、及び２μｌのｃＤＮＡテンプレート、及び０．４μＭのフォワード及びリバースプライマーが、ｑＰＣＲに使用された。各ｃＤＮＡ試料は、二連で定量された。以下の温度プロトコールが使用された：酵素活性化を９８℃で３分間、その後、９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間を４５サイクル。蛍光検出は、最後の温度サイクル中にＦＡＭ／ＳＹＢＲチャネルで行なわれた。実験は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，ドイツ）で行なわれた。増幅後、解離／融解曲線が、特定の生成物が生成されたことを確認するために作成された。相対的遺伝子発現レベルは、Ｃｑ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５：４０２−４０８）を使用して、各アッセイについて９０％の効率を使用して、及び各遺伝子の遺伝子発現を、自由に利用できるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ１７プログラムを使用して選択された二つの参照遺伝子（ＵＢＣ及びＹＷＨＡＺ）によって正規化することによって計算された。二つの遺伝子は、四つの遺伝子ＧＡＰＤＨ，ＹＷＨＡＺ；ＵＢＣ，ＨＰＲＴ−１をプログラム中で実行した後に選択された。四つの正規化遺伝子の選択は、我々の以前の実施可能性研究（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ  ２０１１，４（４）：３７１−３８２）からの結果に基づいていた。そこでは、九つの参照遺伝子が調査され、ペーパーポイントを使用したＰＩＣＦ試料採集が使用された。主要な基準は、参照遺伝子の発現における変動は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群内及び群間で最小であるべきであるということであった。
【００８１】
定量限界（ＬＯＱ）は、Ｃｑについて、全ての遺伝子について、分光光度計によって定量された精製ＰＣＲ生成物に基づいて決定された。各点において４連で５点の標準曲線が全てのアッセイについて作成され、１０〜１０６コピー数／μｌの濃度で１０倍希釈シリーズで実行された。決定されたＬＯＱ値より上の全てのデータは、分析から省略された。この手順は、データ分散を減少させ、データ分布を狭くし、これにより三つの対象群間の遺伝子発現の有意差の観察の可能性を増大させた。
【００８２】
ｑＰＣＲ分析が試料マトリックス（例えば化膿の存在）によって阻害されたかどうかを調査するために、ＰＩ群からの１４個の試料が、ＲＮＡスパイク（＃ＲＳ１２ＪＧ，ＴＡＴＡＡバイオセンターＡＢ）の既知の濃度でスパイク（ｓｐｉｋｅ）され、同じ濃度でスパイクされた水試料と比べられた。一つの試料が、ＰＩ群の１４人の対象から、化膿を示す一つのインプラント部位から滅菌吸引針で採集された。吸引針での試料採集部位は、ペーパーポイントでの試料採集部位と同じではなかったが、類似していた。吸引針（Ｍｅｔａｌ  Ｓｕｃｔｉｏｎ  Ｔｉｐ，０．７×７０ｍｍ  ２２Ｇ，Ｍｅｄｉｐｌａｓｔ，Ｍａｌｍｏｅ，スウェーデン）は、選択された部位のインプラント周縁の溝／ポケットの基部に挿入された。試料を含む針は、プラスチック製注射器（１ｍｌ，ＢＤ  Ｐｌａｓｔｉｐａｋ，Ｍｅｄｉｐｌａｓｔ，Ｍａｌｍｏｅ，スウェーデン）から直ちに除去され、やさしく折り曲げられ、一つの４．５ｍｌプラスチック凍結チューブ（Ｎｕｎｃ  ＣｒｙｏＴｕｂｅ  Ｖｉａｌｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，スウェーデン）中に入れられた。チューブの蓋は閉められ、チューブは、液体窒素で魔法瓶中で−１９６℃で凍結され、阻害分析のために検査室（ＴＡＴＡＡバイオセンター）に直ちに移送された。吸引針及びプラスチック製チューブを取り扱うときは、清潔な手袋が常に使用された。
【００８３】
統計方法
三つの研究群間の遺伝子マーカー発現レベルの差は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して評価された。データ分析において、対数データ変換が行なわれ、独立した試料間の差について９５％の信頼区間が使用された。
【００８４】
正規化された遺伝子発現は、各対象について、対数変換の後で以下の式を使用して計算された：遺伝子ｇの正規化された発現＝（Ｃｑ（ｎ）−Ｃｑ（ｇ））。式中、Ｃｑ（ｇ）は、遺伝子ｇについての増幅サイクル数であり、Ｃｑ（ｎ）は、対象から採集された試料についての正規化因子（選択された参照遺伝子についての増幅サイクルの平均数）である。分散分析は、ＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群において、正規化された遺伝子発現を使用して行なわれた。
【００８５】
もしＨＩ，ＭＣ及びＰＩ群間の可能な差の調査が二つの遺伝子マーカーのみを含むのなら、０．０５未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされるだろう。しかし、研究は、ＬＯＱ分析中にいくつかのマーカーが除外された後に八つの遺伝子マーカーを含んでいたので、集団有意性についてのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正が使用され、０．００６３未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされた。
【００８６】
各対象について計算された正規化された遺伝子発現は、同じ対象について同じ時点での放射線写真によって与えられる骨量減少についての情報と相関された。放射線写真検査技術は、当該技術分野では周知であり、Ａｈｌｑｖｉｓｔら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９０，５（２）：１５５−１６３）に記載されるようにして行なわれることができる。骨レベルは、放射線写真上で測定されることができ、固定物と、インプラントに対して中位及び遠位の周縁骨の稜に対するその隣接点との間の接合点からの距離として定義される。
【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
実施例２
ＴＲＡＰの発現レベルは、インプラント治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＴＲＡＰの発現レベルは、実施例１に記載されたようにｑＰＣＲによって定量される。得られた値は、検量線中に内挿され（即ち、図１）、前記患者の骨量減少速度が推定される。
【００９６】
実施例３
ＴＲＡＰ及びＯＣの発現レベルは、インプラント治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＴＲＡＰ及びＯＣの発現レベルは、実施例１に記載されたようにｑＰＣＲによって定量される。得られた値の比率（ＴＲＡＰ／ＯＣ）は、検量線中に内挿され（即ち、図２）、前記患者の骨量減少速度が推定される。
【００９７】
実施例４
ＣａｔＫ及びＯＣの発現レベルは、インプラント治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＣａｔＫ及びＯＣの発現レベルは、実施例１に記載されたようにｑＰＣＲによって定量される。得られた値の比率（ＣａｔＫ／ＯＣ）は、検量線中に内挿され（即ち、図３）、前記患者の骨量減少速度が推定される。
【００９８】
実施例５
ＯＰＧの発現レベルは、インプラント治療を受けた患者から得られたインプラント周縁間隙液において定量される。ＯＰＧの発現レベルは、実施例１に記載されたようにｑＰＣＲによって定量される。得られた値は、検量線中に内挿され（即ち、図４）、前記患者の骨量減少速度が推定される。
【００９９】
実施例６
実施例２〜５の一つ以上において、患者は、軟組織炎症を示すかもしれず、０．２ｍｍ／年までの骨量減少速度を示すかもしれない。この場合、臨床医は、対象にケア口腔衛生治療の標準プログラムを与えることができる。引き続いての訪問は、数ヶ月内又は一年以内に予定されることができる。
【０１００】
実施例７
実施例２〜５の一つ以上において、臨床医は、迅速で広範囲の骨分解が進行中である（骨量減少速度が２ｍｍ／年より大きい）と結論付け、対象に口腔衛生治療を与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。もし２回目の引き続いての訪問において骨量減少速度が２ｍｍ／年より大きいままなら、臨床医は、その部位の手術治療を行なうことを決定することができる。
【０１０１】
実施例８
実施例２〜５の一つ以上において、対象は、インプラント周縁の病気（即ち、インプラント周縁の炎症、膨張、赤味、化膿、及び病的なクレーター形状の周縁骨量減少）の明らかな徴候を示す。しかし、骨量減少速度は、０．２ｍｍ／年未満であり、臨床医は、手術治療は不要であると結論付け、対象に口腔衛生治療、維持プロトコールを与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。
【０１０２】
実施例９
別の実施例では、炎症及びプロービングに対する出血を示す対象から採集された試料は、ＴＲＡＰ／ＯＣの比率が０．２〜０．５ｍｍ／年の骨量減少速度に相当することを示す。臨床医は、骨分解は極めて低く、有意でないと結論付け、対象にケア口腔衛生プログラムの標準を与える。引き続いての訪問は、数ヶ月以内又は一年以内に予定される。
【０１０３】
実施例１０
さらなる実施例では、粘膜炎の同様の臨床徴候を示す別の対象から採集された試料は、ＴＲＡＰ／ＯＣの比率が２ｍｍ／年を超える骨量減少速度に相当することを示す。臨床医は、迅速で広範囲の骨分解が進行中であると結論付け、対象に口腔衛生治療を与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。もし２回目の引き続いての訪問においてＴＲＡＰ／ＯＣの比率が高いままであるなら、臨床医は、その部位の手術治療を行なうことを決定する。
【０１０４】
実施例１１
別の実施例において、対象は、インプラント周縁の病気（即ち、インプラント周縁の炎症、膨張、赤味、化膿、及び病的なクレーター形状の周縁骨量減少）の明らかな徴候を示す。しかし、ＴＲＡＰ／ＯＣの比率は、０．５ｍｍ／年未満の骨量減少速度に相当し、臨床医は、手術治療は不要であると結論付け、対象に口腔衛生治療プロトコールを与え、数ヶ月以内の引き続いての訪問を予定する。
【０１０５】
実施例９〜１１の対象を放射線にさらすことは必要ではなく、臨床医は、骨分解が二つの後者の実施例において放射線写真によって評価される測定可能なレベルに進行するまで待つ必要はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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