(57)【要約】  本発明は、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤、免疫親和性カラム並びにその調製方法およびその応用に関する。本発明の免疫吸着剤は、固体ベクターと、前記固体ベクターとカップリングするアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５とを含有し、前記アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５のアフラトキシンＢ１に対する５０％阻害濃度ＩＣ５０ は、０．６６ｎｇ／ｍＬであり、アフラトキシンＢ２、Ｇ１、Ｇ２、及びＭ１に対する交叉反応率は、ぞれぞれ２２．６％、１０．９５％、３２．１％および２６％であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表され、遺伝子コード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表される。本発明のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、テスト機器に乗る前のサンプル抽出液を精製および濃縮することに用いられ、そして、該免疫親和性カラムは何度も繰り返す使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体ベクターと、
該固体ベクターとカップリングするアフラトキシンに対するナノ抗体と、を含有し、
前記アフラトキシンに対するナノ抗体は、アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５であり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表され、その遺伝子コード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されることを特徴とするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤。
【請求項２】
前記アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５の相補性決定領域のアミノ酸配列のそれぞれは、ＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表され、
相補性決定領域の遺伝子コード配列のぞれぞれは、ＣＤＲ１の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表され、ＣＤＲ２の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表され、ＣＤＲ３の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されることを特徴とする請求項１に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤。
【請求項３】
前記固体ベクターは、アガロースゲル、またはシリカマイクロスフィアであることを特徴とする請求項１に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤の調製方法であって、
前記固体ベクターとしてシリカマイクロスフィアを用いる場合、
シリカマイクロスフィア１〜５ｇを秤量し、純水とｐＨ６のリン酸緩衝液で交互に洗い流し、さらにｐＨ６のリン酸緩衝液５〜２５ｍＬを量取しシリカマイクロスフィアを溶解させ、シリカマイクロスフィアの全体がサスペンドするように攪拌し、シリカマイクロスフィアのサスペンションを獲得し、
そしてｐＨ６のリン酸緩衝液１〜５ｍＬを用いて２〜１０ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を溶解させ、それをシリカマイクロスフィアのサスペンションに滴加し、
最後に、７０〜３５０ｍｇのカルボジイミドを秤量し、前記シリカマイクロスフィアのサスペンションに快速的に添加し、４℃で攪拌しながら１８〜２２ｈ反応させた後に、シリカマイクロスフィアを固体ベクターとするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を得ること、また、
前記固体ベクターとしてアガロースゲルを用いる場合、
０．３〜１ｇのアガロースを秤量し、１ｍＭのＨＣｌ溶液を用いて繰り返し洗い流し、そして、アガロースゲルを５〜１５ｍＬのカップリング緩衝液に溶解させ、さらに、０．６〜２ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を添加し、室温において１〜２ｈ攪拌し反応させ、アガロースゲル溶液を得て、
アガロースゲル溶液中のアガロースゲルとカップリングしない抗体溶液を濾過してから、カップリング緩衝液を用いてアガロースゲルを洗い流し、そして、０．１ＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加し、室温下に２ｈ反応させ、その後に、０．１Ｍ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液と０．１Ｍ、ｐＨ４．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液によって交互に洗い流し、アガロースゲルを固体ベクターとするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤を得て、
前記カップリング緩衝液は、ｐＨ８．３の０．１Ｍ ＮａＣＯ３または０．５Ｍ ＮａＣｌであること、
を特徴とするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤の調製方法。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか１項に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を搭載するアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラム。
【請求項６】
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を固相抽出管に入れ、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液を添加し自然に沈殿させ、その後、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄してから、０．０２ｗｔ％のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液中に保存し、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを得ることを特徴とする請求項５に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの調製方法。
【請求項７】
前記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを用いて、テスト機器に乗る前のサンプル抽出液を精製および濃縮することを特徴とする請求項５に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの応用。
【請求項８】
まず、調製し得たアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを純水で洗い流し、続いてサンプル抽出液を添加し、最後に、純水で溶離し、液体が流しきれてからメタノールで再度溶離し、溶離液を収集し、前記溶離液が、直接にテスト機器に乗せられる精製および濃縮したサンプル抽出液であることを特徴とする請求項７に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤、免疫親和性カラム並びにその調製方法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフラトキシンは、主にアスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）及びアスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）の分泌に由来する二次代謝産物であり、ヒトおよび動物に様々な害を引き起こす可能性のある天然毒性化合物である。アフラトキシンは、現在２０種以上が発見され、主に、アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）、Ｂ２（ＡＦＢ２）、ＡＦＧ及び Ｍ１（ＡＦＭ１）などを含む。その中、ＡＦＢ１の毒性が最も強く、その毒性がシアン化カリウムの１０倍であり、ヒ素の６８倍である。早くも１９９３年に、アフラトキシンＢ１が、世界保健機関（ＷＨＯ）のがん研究機関によって、最強の既知発癌化学物質の一つ、即ちＩ類発癌物質と区分された。我が国は、アフラトキシンの汚染が比較的にひどい区域であり、さまざまな食品および農産物、特にトウモロコシ、ピーナッツおよびそれらの製品は、アフラトキシンに汚染される可能性がある。よって、アフラトキシンの検出、特に快速測定を強化し、各種の食品や農産物の健康情報をタイムリーに理解および把握することは、我が国の食品安全性の保証に重要な意味を有する。
【０００３】
従来のアフラトキシンの検出方法として、薄層クロマトグラフィー、精密機器分析方法、および免疫学的分析方法が挙げられる。その中、薄層クロマトグラフィーは、アフラトキシンの検定に早くも用いられ、最も一般的に使用される検出方法であり、該方法は、特別な装置設備が不要で、通常の実験室内で行うことが可能だが、試薬の投与量が多く、操作が複雑であり、また、その他にも成分により深刻な干渉を齎すため、精度が悪くて、正確に定量することができず、且つ研究室の職員および周辺環境への汚染に大きな被害を齎すため、快速的なオンサイト検出に適用することができない。精密機器分析方法は、主に蛍光分光光度法および高速液体クロマトグラフィーを含む。それらの方法は、高感度、良好な精度であるが、アフラトキシンサンプルの浄化度が高く要求され、従来のサンプル前処理技術、例えば、液体−液体抽出、固相抽出、固相マイクロ抽出などは、処理プロセスが複雑であり、特異性は強くない。よって、快速かつ有効なサンプル前処理技術を確立することは、アフラトキシン検出分析において解決すべく主要なボトルネックとなっている。免疫親和性カラムは、新規かつ効率的なサンプル前処理技術であり、抗原−抗体の間の特異的可逆結合に基づいて、複雑なサンプルにおける標的物質に対する富化精製を達成する。免疫親和性カラムと液体クロマトグラフ、蛍光スペクトロスコピー、及びＥＬＩＳＡ法とを組み合わせて、農作物及び食品中のアフラトキシン検出に広く応用することができる。
【０００４】
現在、アフラトキシン免疫親和性カラムの調製は、主に伝統的な抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）をアガロースゲル、シリカマイクロスフィアなどとカップリングさせることによって調製し得る。伝統的な抗体は、使用中に活性の退化が速くて、市販の従来の免疫親和性カラムは、重複使用可能な回数が少なすぎるという技術課題を有する。一方、ナノ抗体は、ラクダ科の動物の体内に自然に存在する重鎖抗体であり、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤及び免疫親和性カラムに関する報道はまだない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤、免疫親和性カラム並びにその調製方法およびその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的を達成するために、本発明で用いられる実施態様は、下記のとおりである。
固体ベクターと、該固体ベクターとカップリングするアフラトキシンに対するナノ抗体と、を含有し、前記アフラトキシンに対するナノ抗体は、アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５であり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表され、その遺伝子コード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されることを特徴とするアフラトキシンに対するナノ抗体の免疫吸着剤。
【０００７】
上記の実施態様において、前記アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５の相補性決定領域のアミノ酸配列のそれぞれは、ＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表され、相補性決定領域の遺伝子コード配列のぞれぞれは、ＣＤＲ１の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表され、ＣＤＲ２の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表され、ＣＤＲ３の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表される。
【０００８】
上記の実施態様において、前記固体ベクターは、アガロースゲル、またはシリカマイクロスフィアである。
【０００９】
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤の調製方法であって、
前記固体ベクターとしてシリカマイクロスフィアを用いる場合、
シリカマイクロスフィア１〜５ｇを秤量し、純水とｐＨ６のリン酸緩衝液で交互に洗い流し、さらにｐＨ６のリン酸緩衝液５〜２５ｍＬを量取し、シリカマイクロスフィアを溶解させ、シリカマイクロスフィアの全体がサスペンドするように攪拌し、シリカマイクロスフィアのサスペンションを獲得し、
そしてｐＨ６のリン酸緩衝液１〜５ｍＬを用いて２〜１０ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を溶解させ、それをシリカマイクロスフィアのサスペンションに滴加し、
最後に、７０〜３５０ｍｇのカルボジイミドを秤量し、前記シリカマイクロスフィアのサスペンションに快速的に添加し、４℃で攪拌しながら１８〜２２ｈ反応させた後に、シリカマイクロスフィアを固体ベクターとするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を得ること、また、
前記固体ベクターとしてアガロースゲルを用いる場合、
０．３〜１ｇのアガロースゲルを秤量し、１ｍＭのＨＣｌ溶液を用いて繰り返し洗い流し、そして、アガロースゲルを５〜１５ｍＬのカップリング緩衝液に溶解させ、さらに、０．６〜２ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を添加し、室温において１〜２ｈ攪拌し反応させ、アガロースゲル溶液を得て、
アガロースゲル溶液中のアガロースゲルとカップリングしない抗体溶液を濾過してから、カップリング緩衝液を用いてアガロースゲルを洗い流し、そして、０．１ＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加し、室温下に２ｈ反応させ、その後に、０．１Ｍ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液と０．１Ｍ、ｐＨ４．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液によって交互に洗い流し、アガロースゲルを固体ベクターとするアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤を得て、
前記カップリング緩衝液は、ｐＨ８．３の０．１Ｍ ＮａＣＯ３または０．５Ｍ ＮａＣｌである。
【００１０】
上記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を搭載するアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラム。
【００１１】
上記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの調製方法であって、前記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫吸着剤を固相抽出管に入れ、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液を添加し自然に沈殿させ、その後、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄してから、０．０２ｗｔ％のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液中に保存し、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを得る。
【００１２】
上記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの応用であって、前記アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを用いて、テスト機器に乗る前のサンプル抽出液を精製および濃縮する。具体的な操作は、下記のとおりである。まず、調製し得たアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを純水で洗い流し、続いてサンプル抽出液を添加し、最後に、純水で溶離し、液体が流しきれてからメタノールで再度溶離し、溶離液を収集し、前記溶離液が、直接にテスト機器に乗せられる精製および濃縮したサンプル抽出液である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の有益な効果は、下記のとおりである。
（１）本発明に記載のアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５は、アフラトキシンＢ１に対する５０％阻害濃度ＩＣ５０が０．６６ｎｇ／ｍＬであり、アフラトキシンＢ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１に対する交叉反応率が、それぞれ２２．６％、１０．９５％、３２．１％及び２６％である。調製し得たアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、そのカラム容量が５００〜６００ｎｇであり、アフラトキシンＢ１に対する標準品の平均添加回収率が、８０〜１００ｗｔ％である。
【００１４】
（２）本発明のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、安定性が高くて、耐高温、耐アルカリ性、及び耐有機試薬性が高いなどのメリットがあり、カラムの棚期間が長くて、また多数回繰り返し使用することができ、テスト機器に乗る前のサンプル抽出液の精製および濃縮に用いられる。
【００１５】
（３）本発明のアフラトキシンに対するナノ抗体は、遺伝子工程手段で生産され、コストが低く、製造に便利などのメリットを有し、よって、調製し得たアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、通常の抗体親和性カラムと比べて、さらに有利である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（実施例１）
アフラトキシンに対するナノ抗体の遺伝子バンク構築およびナノ抗体の調製
１．動物免疫
２歳のオスのアルパカ１匹を購入して、アフラトキシンＢ１抗原（ＡＦＢ１-ＢＳＡ, Ｓｉｇｍａ公司）を免疫した。２００μｇアフラトキシンＢ１抗原を不完全フロイントアジュバントと乳化してから、アルパカに対して皮下に数点注射した。２週間あけて１回免疫を行って、毎回の免疫後７−１０日にアルパカに対して静脈血を採って、間接ＥＬＩＳＡ法を用いて血清抗体価を測定して、抗体価が最も高い免疫後に、血１０ｍＬを採って、総ＲＮＡを抽出した。
【００１７】
２．ｃＤＮＡバンクの構築
（１）総ＲＮＡの抽出
アルパカの血清抗体価の最も高い免疫を選んで、免疫後７−１０日に、アルパカに対して静脈血１０ｍＬを採って、総ＲＮＡを抽出した。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＬｅｕｋｏＬＯＣＫ総ＲＮＡ分離試薬キットを用いて、アルパカ血液中の総ＲＮＡを抽出した。
【００１８】
（２）ｃＤＮＡの合成
ステップ（１）で獲得した総ＲＮＡをテンプレートとして、ｏｌｉｇｏ (ｄＴ) １５をプライマーとして、Ｐｒｏｍｅｇａ社の逆転写酵素説明書に基づいて逆転写反応を起こして、合成ｃＤＮＡ第一の鎖を合成して、ｃＤＮＡバンクを獲得した。
【００１９】
３．アフラトキシンに対するナノ抗体の遺伝子バンクの構築
（１）上記ステップ（２）で合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｒ１、ＦまたはＲ２、Ｆをプライマーとして、ＰＣＲの増幅を行ってアルパカ重鎖抗体の可変領域遺伝子、即ちＶＨＨ遺伝子を得た。ｃＤＮＡ２μｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）２μｌ、ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μｌ、Ｆプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μｌ、Ｒ１（またはＲ２）プライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μｌ、ＤＮＡ酵素０．１μｌ、無菌純水３７．９μｌ乃至５０μｌのそれぞれを取って、渦巻きによって均一に混合させて、短時間の遠心分離の後、ＰＣＲによる増幅反応を行った。反応条件は、下記のとおりであった。９４℃で２ｍｉｎ変性させた。９４℃で３０ｓ変性させて、そして、５５℃で３０ｓアニーリングして、さらに６８℃で１ｍｉｎ伸ばして、そのように３０回循環させた。６８℃で５ｍｉｎ伸ばした。
【００２０】
Ｒ１：５−ＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣ ＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＧ -３’、
Ｒ２：５’−ＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧ -３’、
Ｆ：５’−ＴＣＣＴＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣ ＣＡＧＫＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ-３’。
その中、下線部分で表示したプライマー配列は、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ｈｉｓ）と相同遺伝子座であり、Ｒ１、Ｆをプライマーとして、４回のＰＣＲ増幅反応を行った後に、Ｒ２、Ｆをプライマーとしてさらに６回ＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ産物は、０．７％のアガロースゲルによって電着分離した後に、試薬キット用いて４５０ｂｐサイズのＤＮＡ断片を純化し回収した。
【００２１】
（２）ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ｈｉｓ）ベクターの構築
ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクタープラスミドをテンプレートとして、上流プライマーであるｐ５Ｅ ＳｆｉＩ−Ｆ： ５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣ−３’（Ｓｆｉ Ｉ）と、下流プライマーであるｐ５Ｅ Ｎ−Ｐ−Ｈ−Ｒ： ５’−ＧＡＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＴＣ−３’によって、ｐＣＡＮＴＡＢ５ＥベクタープラスミドにおいてＳｆｉ ＩからＮｏｔＩまでの間のＤＮＡ断片に対してＰＣＲ増幅を行って、ｐ５Ｅ−ｈｉｓ断片を得た。その後に、該ｐ５Ｅ−ｈｉｓ断片に対して、まずＳｆｉＩのシングルダイジェト（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）処理を行って、そしてＰｓｐｏＭＩのシングルダイジェト処理を行って、ｐ５Ｅ−ｈｉｓ（ＳｆｉＩ／ＰｓｐｏＭＩ） 粘着末端を得た。ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクタープラスミドに対して、まずＳｆｉＩのシングルダイジェト処理を行って、そしてＮｏｔ Ｉのシングルダイジェト処理を行って、ｐ５Ｅ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）粘着末端を得た。最後に、ｐ５Ｅ-ｈｉｓ（ＳｆｉＩ／ＰｓｐｏＭＩ） 粘着末端とｐ５Ｅ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）粘着末端を連結して、ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ｈｉｓ）ベクターを得た。
【００２２】
（３）ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ（ｈｉｓ）のダブルダイジェト（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）処理
Ｓｆｉ Ｉのシングルダイジェト処理
下記のように反応液を配合した。
ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ（ｈｉｓ） ｖｅｃｔｏｒ ３０μｌ
Ｓｆｉ Ｉ １μｌ
１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ｄｄＨ２Ｏ 残量分 （全体１００μｌ）
５０℃の水浴で２ｈ保温した後に、アガロースゲルＤＮＡ純化試薬キットを用いて回収した。
【００２３】
Ｎｏｔ Ｉのダイジェト（ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）処理
下記のように、反応液を配合した。
ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ（ｈｉｓ）の、Ｓｆｉ Ｉシングルダイジェト処理産物 ３０μｌ
Ｎｏｔ Ｉ Ｉ １μｌ
１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ｄｄＨ２Ｏ 残量分 （全体１００μｌ）
３７℃の水浴で４ｈ保温した後に、アガロースゲルＤＮＡ純化試薬キットを用いて回収した。
（４）ＶＨＨ遺伝子と、ダブルダイジェト処理したｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ（ｈｉｓ）ベクターとの連結
下記のようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎの連結を行った。
Ｓｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉダブルダイジェト処理したｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ （ｈｉｓ）ｖｅｃｔｏｒ １２０ｎｇ
ＶＨＨ遺伝子 ４０ｎｇ
５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ １μｌ
ｄｄＨ２Ｏ残量分 （全体１０μｌ）
３７℃の水浴で１５ｍｉｎ保温した後に、５０℃の水浴でさらに１５ｍｉｎ保温して、その直後に氷上に５５ｍｉｎ置いて、４０μＬのＴＥ緩衝液を添加して、アガロースゲルＤＮＡ純化試薬キットを用いて回収して−２０℃で保存し用意した。
（５）連結産物の電気変換
上記連結産物５μｌを採って、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１エレクトロポレーション−コンピテントセルにいれて、均一に混合させてから、あらかじめ冷却した０．１ ｃｍの電気変換カップ (Ｂｉｏ−ＲＡＤ)に入れて、氷上に１０ｍｉｎ放置した。その後、Ｂｉｏ−ｒａｄ電気変換器上に電気変換させて、電気変換条件は、下記のとおりであった。１．８ ｋＶ、２００ Ω、２５ μＦ。電気変換の直後、電気変換カップに１ｍＬの２ＹＴ液体培地を添加して吹き付けてから、滅菌したきれいな１５ｍＬのテストチューブに入れて、３７℃でゆっくり振りながら１ｈ回復させた。２μｌの菌液を採って倍に希釈してからＬＢセファレキシンタブレットにコーティングして、３７℃で１晩転置して、翌日にコロニー数を計数してバンク容量を計算した。
【００２４】
（６）アフラトキシンに対するナノ抗体遺伝子バンクの回収
上記電気変換を１０回行って、回復後の菌液のすべてを２００ｍＬのＳＢ培地に移して、３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００値が０．５となるまでシェイキングして、そして、１ｍＬ、１×１０１２ｐｆｕの補助ファージＭ１３ＫＯ７を添加して、３７℃で１ｈ静置した後に、続いて２ｈシェイキングして、最終濃度７０μｇ／ｍＬであるカナマイシンを添加して、さらに１晩シェイキングした。翌日に、１晩経過した菌を４℃、１００００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して、上清を無菌の遠心分離ボトルにうつして、さらに１／４体積の５ｘ ＰＥＧ／ＮａＣｌを添加して、氷上に２ｈ静置した後に、４℃、１００００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離して、１０ｍＬ無菌の再懸溶液（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１×プロテアーゼ阻害剤、０．０２％ ＮａＮ３及び０．５％ ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液を含有する）で沈殿を溶解させて、ファージに回収したアフラトキシンに対するナノ抗体遺伝子バンクを得た。
【００２５】
４．アフラトキシンＢ１ナノ抗体のパンニング
ＡＦＢ１−ＢＳＡ（１μｇ／ウェル）及び３％のＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（陰性対照組とする）でそれぞれＥＬＩＳＡプレートをコーティングして、４℃で１晩コーティングした。翌日に、コーティングバッファーを捨てて、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、そして、３％の脱脂粉乳−ＰＢＳで１ｈ閉じた。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、ＡＦＢ１−ＢＳＡをコーティングしているウェルに上記救たアフラトキシンに対するナノ抗体遺伝子バンク５０μｌを添加して、３７で１ｈ培養した。ＰＢＳＴでプレートを１０回洗浄して、各ウェルに１００μｌ、１００ｎｇ／ｍＬのＡＦＢ１溶液を添加して、室温（２０℃〜３０℃）で３０ｍｉｎシェイキングしながら溶離した。溶離液を、ＡＦＢ１−ＢＳＡをコーティングしているウェルに移して、３７℃で１ｈ培養した（非特異的吸着の除去）。培養後に、上清を取って、２ｍＬの対数増殖期まで成長したＴＧ１菌液を感染成長して、３７℃で２０ｍｉｎ感染成長した。そして、１μｌ、１０μｌを取って、それぞれＬＢセファレキシンタブレットにコーティングして、３７℃の培養オーブンにて１晩静置して、翌日にタブレット上のコロニー数を数いて、溶離液中のファージの力価を確定した。また、残った感染成長したＴＧ１菌液を６ｍＬのＳＢ培地に移して、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを１．５μｌ添加して、３７で１ｈシェイキングした。そして、アンピシリンの最終濃度を５０μｇ／ｍＬまで調整して、さらに１ｈシェイキングして、１ｍＬの補助ファージＭ１３ＫＯ７（１×１０１２ｐｆｕ／ｍＬ）を添加して、３７℃で３０ｍｉｎ静置した。その後に、１００ｍＬ のＳＢ培地に移して、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）４６μｌを追加して、さらに２ｈシェイキングして、アンピシリンの最終濃度を７０μｇ／ｍＬまで調整して、３７℃で１晩シェイキングした。翌日に、菌液を１００００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心分離して、上清を取り除いて、１／４体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加して、氷上で２ｈ培養した。１２０００ｒｐｍ、４℃で２０ｍｉｎ遠心分離して、１％のＢＳＡ-ＰＢＳ溶液で沈殿を溶解させて、１回目パンニング増幅産物を得て、それを次回のパンニングに用いた。続いてのパンニングに、コーティング用抗原ＡＦＢ１-ＢＳＡの濃度は、それぞれ０．５μｇ／ウェル、０．１μｇ／ウェル、０．０５μｇ／ウェルであって、溶離液は、それぞれ、５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬのＡＦＢ１溶液であった。
【００２６】
５．陽性クローンの同定
４回パンニングした後に、２μｌの溶離液を倍に希釈してから対数増殖期まで成長したＴＧ１菌液を感染成長して、ＬＢセファレキシンタブレットにコーティングして、３７℃で１晩転置した。翌日に、３０個のクローンをランダムに取り出して、それぞれ３ｍＬのＳＢ―アンピシリン培地において、３７℃で６-８ｈシェイキングしながら培養して、ＯＤ６００が０．６程度になったら、３０μｌの補助ファージＭ１３ＫＯ７（１×１０１２ｐｆｕ／ｍＬ）を添加して、３７℃で３０ｍｉｎ静置した後に、続いて２ｈシェイキングして、最終濃度７０μｇ／ｍＬであるカナマイシンを添加して、さらに１晩シェイキングした。翌日に、菌液を４℃、１００００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して、上清を得た。
【００２７】
コーティングバッファーで最終濃度０．２μｇ／ｍlとなるようにＡＦＢ１-ＢＳＡを調製して、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートをコーティングして、ウェル毎に１００μｌとなって、また、別のＥＬＩＳＡプレートを取って、その中の３２ウェルについて３％のＢＳＡでコーティングして、４℃で１晩コーティングした。翌日に、コーティングバッファーを捨てて、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、そして、３％の脱脂粉乳−ＰＢＳで１ｈ閉じて、ＡＦＢ１の標準原液を取り１０％メタノール／ＰＢＳによって１００ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬの作動流体に調製して、ＡＦＢ１-ＢＳＡ抗原をコーティングしているウェルに添加して、各ウェルにさらに５０μｌの上記菌液上清を添加して、入れずの作動流体について３回繰り返し操作した。また、対照組として、ＢＳＡがコーティングしているウェルに１０％メタノール／ＰＢＳと５０μｌの上記菌液上清を添加して、プレートを軽くシェイキングして均一に混合させて、３７℃のオーブンにおいて１ｈ反応させた。ＰＢＳＴでプレートを１０回洗浄した後に、各ウェルに１００μｌのＰＢＳによって１：５０００の比率で希釈したＨＲＰ／ＡＮＴＩ-Ｍ１３を添加して、３７℃で１ ｈ保温した。ＰＢＳＴ でプレートを６回洗浄した後に、各ウェルに新たに調製したＴＭＢ基質溶液を添加して、３７℃で１５ ｍｉｎ保温した。各ウェルに２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５０μｌ添加し反応を中止させて、酵素標識装置によってそれぞれのＯＤ４５０値を測定した。ＢＳＡに対して吸着せず、ＡＦＢ１-ＢＳＡに対して吸着して、且つアフラトキシンを添加した後に競合が存在しているのは、陽性ファージクローンであって、それに基づいてスクリーニングして、吸光度と感度の高いウェルをスクリーニングし得て、ファージによって表されたアフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を得た。
【００２８】
間接競合ＥＬＩＳＡを用いてアフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５の抗体特異性を測定して、具体的には、交差反応率で表示して、測定方法は、下記のとおりであった。ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１、ＡＦＧ２及びＡＦＭ１の５種異なる標準原液を、１０％メタノール／ＰＢＳで段階的に１０つの異なる作動濃度に希釈して、同じ条件下に、間接競合ＥＬＩＳＡ方法で測定して、５種のアフラトキシンの競合ＥＬＩＳＡグラフーを順番に描画して、各自の阻害率が５０％となるときの標準品濃度を求めて、ＩＣ５０と表示して、また、下記の計算式で交差反応率を計算した。交差反応率（％）=（ＡＦＢ１ＩＣ５０／類似物ＩＣ５０）×１００％，前記類似物は、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１、ＡＦＧ２またＡＦＭ１であった。計算の結果、アフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５のアフラトキシンＢ１に対する５０％阻害濃度ＩＣ５０ は、０．６６ｎｇ／ｍＬであって、アフラトキシンＢ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１に対する交差反応率は、それぞれ２２．６％、１０．９５％、３２．１％及び２６％であった。よって、アフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５は、抗アフラトキシンＢ１の的特異性ナノ抗体であった。薬物耐性試験の結果によれば、アフラトキシンに対するナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５は、常規ネズミ源と兎源抗体と比べて、耐有機溶媒性能が３５％上がって、耐高温性能が、４６％上がった。
【００２９】
同時に、スクリーニングし得たアフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を含有するクローン菌液を、上海桑尼科技有限公司によって測定分析を行って、測定プライマーは、ファージベクターの通用プライマーＲ１：５’−ＣＣＡ ＴＧＡ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＡＧ ＣＣ-３’であった。得られたアフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されて、遺伝子コード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表された。その中、相補性決定領域のアミノ酸配列のそれぞれは、ＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されて、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されて、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されて、相補性決定領域の遺伝子コード配列のぞれぞれは、ＣＤＲ１の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されて、ＣＤＲ２の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されて、ＣＤＲ３の遺伝子コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表された。
【００３０】
６．アフラトキシンに対するナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５の調製と純化
（１）アフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を分泌できるＴＧ１菌液を採って、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ少量抽出試薬キットでプラスミドを抽出して、ＨＢ２１５１コンピテントセル中に変換し、そして、ＬＢセファレキシンタブレットにコーティングした。
（２）アフラトキシンＢ１ナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５プラスミドを含有するＨＢ２１５１コロニーを選択して、１００ｍＬのＳＢアミノベンジル液体培地に入れて、２５０ ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６００＝０．５-０．８まで培養して、２００μｌの０．５Ｍ ＩＰＴＧ溶液を添加して１晩誘導した。
【００３１】
（３）４℃、１００００ ｒｐｍで、１５ ｍｉｎ冷凍遠心分離した。無菌コンソールで注意深く上清を取り除いて、菌体沈殿物に対して、浸透ショック法を用いて可溶性蛋白の抽出を行って、上清のタンパク質を得た。該上清のタンパク質が０．２２μｍの濾膜を通して、平衡緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール；ｐＨ ７．４）を用いて１晩透析した。
【００３２】
（４）Ｈｉｓ６０のニッケルカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて抗体を純化する。まず、カラム体積１０倍分の平衡緩衝液を用いてニッケルカラムを洗い流して、ステップ（３）中の透析後の上清のタンパク質をＨｉｓ６０ニッケルカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に乗せて抗体を純化して、そして、カラム体積１０倍分の洗い流す用緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭの塩化ナトリウム、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ ７．４）でカラムを洗浄した。最後に、カラム体積１０倍分の溶離緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭの塩化ナトリウム、３００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ ７．４）で抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を溶離して、溶離液を収集して透析袋にいれて、０．０１Ｍ、ｐＨ ７．４のリン酸緩衝液で２−３日透析した後に濃縮して、小分けして−２０℃で保存し備用した。
【００３３】
（実施例２）
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤と免疫親和性カラムを調製
本実施例の免疫親和性吸着剤は、固体ベクター（シリカマイクロスフィア）と、該固体ベクターとカップリングするアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５とを含有し、その調製方法は、下記のとおりであった。１ｇのアクリルアミドシリカマイクロスフィアを秤量してコニカル瓶に入れて、純水とｐＨ６のリン酸緩衝液で該マイクロスフィアを交互に洗い流して、そして、ｐＨ６のリン酸緩衝液５ｍＬを量取しシリカマイクロスフィアを溶解させて、シリカマイクロスフィアの溶液を得た。該シリカマイクロスフィアの溶液を攪拌カップに移して、攪拌機をオンにして、シリカマイクロスフィアの全体をサスペンドさせて、そしてｐＨ６のリン酸緩衝液１ｍＬを用いて２ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を溶解させて、それを上記シリカマイクロスフィアの溶液に滴加した。続いて、７０ｍｇ のＥＤＣを量って、素早く上記攪拌カップに導入して、４℃で、攪拌しながら１８−２２ｈ反応させた後に、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤を得た。
【００３４】
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの調製
上記のように調製した免疫親和性吸着剤（０．２ｍＬ）を固相抽出管に入れて、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液を添加して自然に沈殿させた後に、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄して、０．０２ｗｔ％のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液中に保存して、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを得て、４℃で保存した。
【００３５】
（実施例３）
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤と免疫親和性カラムを調製
本実施例の免疫親和性吸着剤は、固体ベクター（アガロース）と、該固体ベクターとカップリングするアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５とを含有し、その調製方法は、下記のとおりであった。０．３ｇのアガロースを秤量して、１ｍＭの ＨＣｌ溶液を用いて繰り返し洗い流して、そして、アガロースを５ｍＬのカップリング緩衝液（０．１ＭのＮａＣＯ３または０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．３）に溶解させて、さらに、０．６ｍｇのアフラトキシンＢ１のナノ抗体２０１４ＡＦＢ−Ｇ１５を添加して、室温において１５０ｒｐｍの速度で攪拌しながら１ｈ反応させて、アガロースゲル溶液を得た。そして、該アガロースゲル溶液を砂コア漏斗にうつして、カップリングされていなかった抗体を含有する溶液を流せた。そして、アガロースゲル溶液の体積５倍分のカップリング緩衝液でアガロースゲルを洗い流して、アガロースゲル溶液の体積２倍分の閉鎖緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）をさらに添加して室温で２ｈ反応させた。その後、高ｐＨ緩衝液（０．１Ｍ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）と低ｐＨ緩衝液（０．１Ｍ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ４．０）で３回交互にゲルを洗い流して、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性吸着剤を得た。
【００３６】
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの調製：上記のように調製しえた免疫親和性吸着剤（０．２ｍＬ）を固相抽出管に入れて、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液を添加して自然に沈殿させた後に、ｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄して、０．０２ｗｔ％のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ ６、０．０１Ｍのリン酸緩衝液中に保存して、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムを得た。４℃で保存した。
【００３７】
（実施例４）
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムのカラム容量の測定
実施例２または実施例３で調製し得た免疫親和性カラムを１０ｍＬの純水で洗い流して、１０ｍＬの１０％メタノール／ＰＢＳで溶解したアフラトキシンＢ１の標準品溶液（濃度：１００ｎｇ／ｍＬ、アフラトキシンＢ１の含有量総計：１ｍｇ）をカラムに通して、結合されていないアフラトキシンを除去するように１０ｍＬの純水でカラムを洗い流して、最後に、５ｍＬのメタノール溶液で溶離して、１ｍＬ／管となるように管に分けて収集して、液体クロマトグラフ法を用いて溶離液中のアフラトキシンの含有量を測定する。測定結果に表されるように、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムのカラム容量は、５００〜６００ｎｇであった。該免疫親和性カラムを５回繰り返し使用後に、再度そのカラム容量を測定した結果、依然として４８０ｎｇまで達成した。その結果に表されるように、該免疫親和性カラムを繰り返し使用することができる。また、交叉反応の測定結果に表されるように、本発明に記載のアフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、同時にアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、及びＭ１と特異的に結合することができ、ゼアラレノン、嘔吐毒素、オクラトキシンなど他の真菌毒素と結合することがない。
【００３８】
（実施例５）
アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムの標準品添加回収率の測定
アフラトキシンを含有しないブランクサンプルであるピーナッツ、トウモロコシ、植物油、飼料のそれぞれ、各３部を秤量して、各部毎は５ｇであって、その中にそれぞれアフラトキシンＢ１の標準物質５０ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇを添加して、下記のように通常の方法によってサンプル抽出液を抽出した。１５ｍＬの７０％メタノール溶液（４％のＮａＣｌを含有する）を用いて、５０℃で１０分間超音波抽出を行って、その抽出液を濾紙で濾過した。４ｍＬの濾過液を取って、その中に２ｍＬの石油エーテルを添加して、渦巻きによって均一に混合させて、静置によって分層させた。下層の３ｍＬを取って、８ｍＬの純水を添加して、０．４５μｍの有機膜で濾過して、サンプル抽出液である濾過液を得た。実施例２または実施例３で調製し得た免疫親和性カラムを１０ｍＬの純水で洗い流して、その中、８ｍＬの上記サンプル抽出液を添加して、最後に１０ｍＬの純水でで溶離し、液体が流しきれた後に、１ｍＬのメタノールで再度に溶離して、溶離液を収集して高速液体クロマトグラフィーに乗せて、溶離液中のアフラトキシン含有量を測定して、そして、回収率を計算した。結果に表されるように、アフラトキシンに対するナノ抗体免疫親和性カラムは、アフラトキシンＢ１に対する平均回収率が８０〜１００ｗｔ％であった。
【配列表】
2016536353000001.app
【国際調査報告】
2016536353.tif 000002
2016536353.tif 000003
2016536353.tif 000004
2016536353.tif 000005