(57)【要約】家禽から調製されたブロス組成物が開示される。選択された家禽原材料を処理して、高いタンパク質含量を有するブロスを取得する。ある特定のアミノ酸が、自家製ブロスおよび他の市販の製品と比較して、相対的により高い濃度で存在する。開示されたブロス組成物は、関節疾患を予防および／または処置する際に有効であり、他の栄養的および健康的利益もまた提供し得る。一態様では、開示された方法に従って調製された組成物は、より高い濃度の、特定の有益な化合物を有し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家禽パーツから調製された組成物であって、該組成物が、コンドロイチン硫酸を含み、コンドロイチン硫酸の量が、酵素的消化およびＬＣ−ＵＶ検出アッセイを使用することによって測定した場合、総乾燥固体の少なくとも７重量％である、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、アミノ酸プロリンおよびヒスチジンを含み、プロリンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも４：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プロリンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも６：１である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記プロリンが、前記組成物中に固体ベースで少なくとも８％（ｗ／ｗ）存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
グリシンをさらに含み、該グリシンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも６：１であり、該グリシンが、前記組成物中に固体ベースで少なくとも１２％（ｗ／ｗ）存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記グリシンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも１０：１である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ヒドロキシプロリンをさらに含み、該ヒドロキシプロリンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも４：１であり、該ヒドロキシプロリンが、前記組成物中に固体ベースで少なくとも７％（ｗ／ｗ）存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒドロキシプロリンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも６：１である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記プロリンの量が、総アミノ酸の少なくとも１０重量％である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
ヒドロキシプロリンをさらに含み、該ヒドロキシプロリンの量が、総アミノ酸の少なくとも８重量％である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、１または複数の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を含み、該ＢＣＡＡの量が、該組成物中の総アミノ酸の少なくとも５重量％である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＢＣＡＡの量が、前記組成物中の総アミノ酸の少なくとも６重量％である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、液体形態であり、該組成物が、１または複数のポリフェノールを含み、該ポリフェノールの濃度が、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイに基づいて、少なくとも４，０００μｇ／ｍｌ  ＧＡＥ（没食子酸当量）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
総タンパク質の少なくとも９０％が、１０ｋＤと７０ｋＤとの間の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ショウガ、コーヒー抽出物、チョウセンニンジン、緑茶、ヤナギ樹皮またはボスウェリアなどの他の植物、クルクミン／ウコン、オメガ−３脂肪酸、魚油、オキアミ油、藻類油、Ｐｙｃｎｏｇｅｎｏｌフランス海岸松樹皮抽出物、ブドウ種子抽出物、アマニ抽出物、リボヌクレアーゼ、アンジオゲニン、ラクトフェリン、リボヌクレアーゼ富化ラクトフェリン、Ｓ−アデノシルメチオニン、コラーゲン、コラーゲンタンパク質、コラーゲンペプチド、ゼラチン、アボカド不けん化物（ＡＳＵ）、ダイズ不けん化物（ＡＳＵ）、ホップ球果の抽出物、卵殻膜、乳汁に由来するポリペプチド、カゼイン、乳清、ＭＳＭ（メチルスルホニルメタン）、Ｙｕｃｃａ、デビルズクロー、ブロメライン、グルタミン酸、ココア、セイヨウイラクサ、ビタミンＥ、ビタミンＤ３、クルミ抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の補充された成分をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の補充された成分が、前記コラーゲン、コラーゲンタンパク質、コラーゲンペプチドおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
９９９：１と１：９９９との間の水分タンパク質比率（ＭＰＲ）を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記家禽パーツがニワトリに由来する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記家禽パーツがシチメンチョウに由来する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
家禽パーツから組成物を調製するための方法であって、
（ａ）２ｃｍよりも小さい平均サイズを有する小片へと、ニワトリ全体またはそのパーツを切るステップ、
（ｂ）７０℃と１５０℃との間の温度で、約８〜３６０分間にわたって、ステップ（ａ）の該小片を調理するステップ、および
（ｃ）不溶物を除去して、液体形態の該組成物を取得するステップ
を含み、
前記組成物中のコンドロイチン硫酸の量が、総乾燥固体の少なくとも７重量％である、方法。
【請求項２１】
前記家禽パーツがシチメンチョウに由来する、請求項２０に記載の方法に従って調製された組成物。
【請求項２２】
疾患を予防または処置するための方法であって、家禽パーツから調製された組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、該被験体が、該疾患に対して感受性であるか、または該疾患を有しており、該組成物が、コンドロイチン硫酸を含み、コンドロイチン硫酸の量が、酵素的消化およびＬＣ−ＵＶ検出アッセイを使用することによって測定した場合、総乾燥固体の少なくとも７重量％であり、該疾患が、関節疾患、炎症、自己免疫疾患、糖尿病、代謝障害、認知障害およびそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
前記組成物が、アミノ酸プロリンおよびヒスチジンをさらに含み、プロリンとヒスチジンとの比率が、重量で少なくとも４：１である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記有効量が、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のストレス誘導性の発現を有意に低減させる該組成物の量である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、該組成物を投与した被験体において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現を少なくとも５０％低減させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記有効量が、ＣＯＸ１活性を有意に阻害することなく、前記被験体においてＣＯＸ−２活性を少なくとも２０％阻害する前記組成物の量である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物によって発揮されるＣＯＸ２とＣＯＸ１との阻害の比率が、２と３０との間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記有効量が、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、侵害受容（疼痛）を有意に低減させる該組成物の量である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、炎症または自己免疫疾患であり、前記組成物が、該組成物を受けていない対照被験体におけるｍｉＲＮＡの発現と比較して、前記有効量の該組成物を受けている前記被験体において、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡの発現を減少させ、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡが、配列番号１〜１６および１８〜２６からなる群から選択されるメンバーである、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が、糖尿病または代謝障害であり、前記組成物が、該組成物を受けていない対照被験体におけるｍｉＲＮＡの発現と比較して、前記有効量の該組成物を受けている前記被験体において、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡの発現を減少させ、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡが、配列番号２８〜３３からなる群から選択されるメンバーである、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が、認知障害であり、前記組成物が、該組成物を受けていない対照被験体におけるｍｉＲＮＡの発現と比較して、前記有効量の該組成物を受けている前記被験体において、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡの発現を減少させ、少なくとも１つの該ｍｉＲＮＡが、配列番号３４〜４３からなる群から選択されるメンバーである、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年７月８日に出願された米国仮特許出願第６１／８４３，６６２号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願には、本明細書に記載された配列を正確に再現する、コンピューター読み取り可能な形態の配列表が付随する。
【背景技術】
【０００３】
ニワトリブロスは、チキンパーツ（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｐａｒｔｓ）またはニワトリ全体の調理から取得されるエキスを含む複雑な混合物である。異なるニワトリブロスは、異なるブロスの変動する栄養的および健康的価値を説明し得る異なる組成を有し得る。ニワトリブロスの１つの主要な構成要素は、多くの他のタンパク質と共に、アルブミンで構成される可溶性タンパク質である。多数の他の化合物が、ニワトリブロス中に存在する。かかる化合物の例には、例えば、とりわけ、鉱物、有機化合物、ヌクレオチド、代謝物、脂質、リン脂質、ビタミンが含まれる。
【０００４】
伝統的な家庭風ニワトリブロスは、長時間にわたって水および／または蒸気中で１または複数の家禽パーツを調理することによって調製される。異なる原材料から調製されたブロスは、異なる組成を有し得る。同じ原材料を使用した場合であっても、調理プロセスのわずかなバリエーションは、異なる構成要素プロファイルを有するブロスを生じ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、家禽から調製されたブロス組成物、ならびにそれを調製および使用する方法を提供することによって、当該分野を進歩させる。一実施形態では、開示された組成物は、例えば、ニワトリ、シチメンチョウまたは他の鳥類などの家禽から調製され得る。別の実施形態では、開示された組成物は、他の動物供給源由来のパーツを使用して調製され得る。別の実施形態では、開示された組成物は、ブロス、ストック、抽出物または粉末の形態であり得る。
【０００６】
一態様では、開示された方法に従って調製された組成物は、より高い濃度の、特定の有益な化合物を有し得る。別の態様では、特定の有益な化合物は、現在市場で入手可能な他のブロス製品と比較して、より高い程度まで、開示された組成物において富化され得る。別の態様では、１または複数の成分が、ニワトリブロスとは一般に関連しない特定の健康的利益を達成するために、このブロス中に補充され得る。かかる補充物の例には、ショウガ、コーヒー抽出物、チョウセンニンジン、緑茶、ヤナギ樹皮またはボスウェリア（ｂｏｓｗｅｌｌｉａ）などの他の植物、クルクミン／ウコン、オメガ−３脂肪酸、魚油、オキアミ油、藻類油、Ｐｙｃｎｏｇｅｎｏｌフランス海岸松樹皮抽出物、ブドウ種子抽出物、アマニ抽出物、リボヌクレアーゼ、アンジオゲニン、ラクトフェリン、リボヌクレアーゼ富化ラクトフェリン、Ｓ−アデノシルメチオニン、コラーゲン、コラーゲンタンパク質またはコラーゲンペプチド、ゼラチン、アボカド／ダイズ不けん化物（ＡＳＵ）、ホップ球果の抽出物、卵殻膜、乳汁に由来するポリペプチド、例えば、カゼインまたは乳清、ＭＳＭ（メチルスルホニルメタン）、Ｙｕｃｃａ、デビルズクロー、ブロメライン、グルタミン酸、ココア、セイヨウイラクサ（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｎｅｔｔｌｅ）、ビタミンＥ、ビタミンＤ３、クルミ抽出物などが含まれ得るが、これらに限定されない。一態様では、開示されたブロスは、有意な量のコラーゲン、コラーゲンタンパク質および／またはコラーゲンペプチドを含み得る。別の態様では、有意な量のコラーゲン、コラーゲンタンパク質および／またはコラーゲンペプチドは、開示されたブロス中に天然に存在し得る。別の態様では、有意な量のコラーゲン、コラーゲンタンパク質および／またはコラーゲンペプチドは、開示されたブロス中に補充物として添加され得る。
【０００７】
家庭風の調理では、ニワトリまたはシチメンチョウのブロスは、開放容器中で長期間にわたって、または加圧容器中、高温下で調理することによって作製され得る。対照的に、本開示は、独自の組成を有するブロス生成物、およびそれを調製する方法を提供する。原材料を選択および調製する方法、原材料を調理する方法、ならびに得られたブロスを分離および精製する方法もまた、本明細書に開示される。
【０００８】
一実施形態では、家禽または他の動物供給源由来の原材料は、種々の有益な化合物の抽出を最大化するために、高い程度まで粉砕され得る。一態様では、これらの原材料は、約２ｃｍ未満、１ｃｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、または２ｍｍ未満のサイズまで、減じられ得る。調理前の、小さいサイズの粒子への家禽パーツの機械的処理は、特定の化合物の抽出を最大化することを助け得る。別の実施形態では、これらの家禽パーツは、調理前に、非常に小さいサイズの粒子へと機械的に処理されているので、より穏やかな調理条件（例えば、６０〜１００℃の温度）およびより短い調理時間（約８分〜３００分）が、処理された家禽パーツからブロスを取得するために使用され得る。このような、より穏やかかつより短い調理は、従来の処理および調理方法が使用される場合には他の方法で不活性化される特定の化合物の不活性化を防止することを助け得る。かかる化合物の保存は、本明細書で開示された方法に従って調製されていない他のブロス生成物に対して、開示されたブロスを試験する場合に観察される優れた健康的利益を説明し得る。
【０００９】
別の実施形態では、骨および軟骨を有する家禽パーツは、サイズが５ｍｍ（ミリメートル）未満、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍまたは１ｍｍの微細な小片にまで、機械的に分離および粉砕され得る。一態様では、骨から残留肉を除去するためのステップは行われない。これらの小さい小片は、特定のブロス画分および／または化合物の抽出を最大化するために、約７０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、または１５０℃の高さで、少なくとも８分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間もしくは６時間またはそれより長い時間にわたって、調理され得る。
【００１０】
別の実施形態では、開示された方法に従って調製されたブロスは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した場合、他の市販のブロス製品から得られたものとは異なるタンパク質プロファイルを示す。一態様では、開示された組成物中の総タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％または９０％は、１０ｋＤ（キロダルトン）と７０ｋＤとの間の分子量を有する。別の態様では、開示された組成物中のタンパク質の少なくとも９５％は、１００ｋＤ未満の分子量を有する。別の態様では、これらの方法は、被験体による同化を増強するために、１０ｋＤ未満、５ｋＤ、またはさらには３ＫＤ未満まで、ブロス中のタンパク質の分子量をさらに低減させるために使用され得る。例として、タンパク質を消化する１または複数の酵素が、ブロス中のタンパク質の分子量を低減させるために使用され得る。
【００１１】
別の実施形態では、開示された組成物は、アミノ酸プロリンおよびヒスチジンを含み得、プロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも４：１である。一態様では、プロリンは、この組成物中に固体ベースで少なくとも８％（ｗ／ｗ）、１０％またはそれ超存在する。別の態様では、プロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも６：１である。
【００１２】
別の実施形態では、開示された組成物は、アミノ酸グリシンおよびヒスチジンを含み得、グリシンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも６：１である。一態様では、グリシンは、この組成物中に固体ベースで少なくとも１２％、１４％またはそれ超（ｗ／ｗ）存在する。別の態様では、グリシンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも１０：１である。
【００１３】
別の実施形態では、開示された組成物は、アミノ酸ヒドロキシプロリンおよびヒスチジンを含み得、ヒドロキシプロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも４：１である。一態様では、ヒドロキシプロリンは、この組成物中に固体ベースで少なくとも７％、８％またはそれ超（ｗ／ｗ）存在する。別の態様では、ヒドロキシプロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも６：１である。
【００１４】
別の実施形態では、開示された組成物は、プロリン、グリシン、ヒドロキシプロリンおよびヒスチジンを含み得る。一態様では、グリシンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも６：１である。別の態様では、グリシンは、この組成物中に固体ベースで少なくとも１２％（ｗ／ｗ）存在する。別の態様では、プロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも４：１である。別の態様では、ヒドロキシプロリンとヒスチジンとの比率は、重量で少なくとも６：１である。
【００１５】
別の実施形態では、開示された組成物は、プロリンおよび他のアミノ酸を含み得、プロリンの量は、この組成物中の総アミノ酸の少なくとも１０重量％である。別の実施形態では、開示された組成物は、グリシンおよび他のアミノ酸を含み得、グリシンの量は、この組成物中の総アミノ酸の少なくとも２０重量％である。別の実施形態では、開示された組成物は、ヒドロキシプロリンおよび他のアミノ酸を含み得、ヒドロキシプロリンの量は、この組成物中の総アミノ酸の少なくとも８重量％である。
【００１６】
別の実施形態では、開示された組成物は、１または複数の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）（例えば、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）を含み得、この組成物中のＢＣＡＡは、他のブロス生成物中のＢＣＡＡのレベルよりも高いレベルで存在する。一態様では、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む総ＢＣＡＡの量は、この組成物中の総アミノ酸の少なくとも５重量％、６重量％または７重量％である。
【００１７】
別の実施形態では、本開示に従って調製されたブロス生成物は、９９９：１と１：９９９との間、または２００：１と１０：１との間の水分タンパク質比率（ＭＰＲ）を有し得る。例として、２００：１のＭＰＲは、その生成物が、２００部の水および１部の肉（タンパク質）を含むことを意味する。別の実施形態では、本開示に従って調製されたブロス生成物は、１５０：１と４０：１との間、または１３５：１と６７：１との間の水分タンパク質比率（ＭＰＲ）を有し得る。
【００１８】
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、軟骨中に豊富であり、関節の健康に有益であることが報告されている。ブロスが調製される原材料およびプロセスの選択は、開示された組成物中の相対的に高いレベルのコンドロイチン硫酸に寄与し得る。本開示の一実施形態では、このブロス組成物は、酵素的消化およびＬＣ−ＵＶ検出アッセイを使用することによって測定した場合、この組成物中に総乾燥固体の少なくとも６重量％、７重量％、８重量％または１０重量％のコンドロイチン硫酸を含み得る。例えば、本明細書で参照によって本開示中に組み込まれる、Ｊｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、９０巻、３号、６５９〜６９頁（２００７年）を参照のこと。
【００１９】
一態様では、この組成物は、いつでも消費できる液体形態であり得るか、またはストックなどの濃縮液体形態であり得る。別の態様では、この組成物は、粉末またはペーストなどの固体形態であり得る。
【００２０】
一実施形態では、この組成物は、１または複数のポリフェノールを含み得、このポリフェノールの濃度は、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイに基づいて、少なくとも４，０００μｇ／ｍｌ  ＧＡＥ（没食子酸当量）である。
【００２１】
本明細書に開示されたブロスは、上記独自の組成を特徴とし得る。これらのブロスは、これらのブロスが調製される方法もまた特徴とし得る。さらに、開示されたブロスは、それらが被験体に提供し得る健康的利益においても独自である。被験体は、２つの群に分けられ得、一方の群は、開示されたブロス生成物の有効量を毎日摂取（または消費）し、他方の群は、水または他のブロス生成物を摂取する。次いで、種々の指標が測定され得、２つの群間で比較され得る。
【００２２】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、被験体に投与される場合、この組成物を投与していない被験体と比較して、その被験体において疼痛を有意に低減させ得る。本開示の目的のために、「有意に」とは、処置群と対照群との間の観察された差異が、統計的に有意であることを意味する。
【００２３】
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、炎症に関与するサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存的酵素のファミリーである。別の実施形態では、この組成物は、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、前記組成物を投与した被験体において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のストレス誘導性の発現を有意に低減させ得る。一態様では、この組成物は、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、前記組成物を投与した被験体において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現を、２０％、３０％、５０％またはそれ超低減させる。
【００２４】
別の実施形態では、開示された組成物は、ＣＯＸインヒビタースクリーニングアッセイを使用することによって測定した場合、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２の活性を実質的に阻害し得る。一態様では、ＣＯＸ−２の阻害は、この組成物を投与していない被験体と比較して、２０％、３０％または４０％超である。別の態様では、開示された組成物は、ＣＯＸインヒビタースクリーニングアッセイを使用することによって測定した場合、ＣＯＸ１の有意な阻害を引き起こさない。別の態様では、本組成物によって発揮されるＣＯＸ２とＣＯＸ１との阻害の比率、即ち、ＣＯＸ２／ＣＯＸ１は、２と３０との間、５と２０との間、または１０と２０との間である。
【００２５】
一実施形態では、本開示に従って調製された組成物の有効量を被験体に投与することによって、種々の疾患を予防または処置するための方法が、本明細書に提供される。別の実施形態では、開示された方法は、処置を必要とする被験体を同定するステップをさらに含み得る。一態様では、この被験体は、疾患の１または複数に対して感受性であり得る。別の態様では、この被験体は、疾患の１または複数を既に有していてもよい。これらの疾患の例には、関節疾患、炎症、自己免疫疾患、糖尿病、代謝障害、認知障害およびそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２６】
一態様では、この有効量は、この組成物を投与していない対照被験体と比較して、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のストレス誘導性の発現を有意に低減させる組成物の量であり得る。別の態様では、この組成物は、有効量のこの組成物を投与していない対照被験体と比較して、この組成物を投与した被験体において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現を、少なくとも５０％低減させ得る。
【００２７】
別の態様では、この有効量は、ＣＯＸ１活性を有意に阻害することなく、この被験体においてＣＯＸ−２活性を少なくとも２０％阻害する組成物の量であり得る。別の態様では、この組成物によって発揮されるＣＯＸ２とＣＯＸ１との阻害の比率は、２と３０との間である。
【００２８】
別の態様では、この有効量は、有効量のこの組成物を投与していない対照被験体と比較して、侵害受容（疼痛）を有意に低減させる組成物の量である。
【００２９】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節できる小さいＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、多くの炎症性疾患の発達および進行に関与している。一実施形態では、被験体に投与される場合、この組成物は、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、有効量の前記組成物を投与した被験体において、ｍｉＲＮＡの発現を減少させ得る。かかるｍｉＲＮＡの例には、配列番号１〜１６、１８〜２６および２８〜４３が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００３０】
一実施形態では、開示された方法は、炎症および／または自己免疫疾患を予防および／または処置することを助ける。一態様では、この組成物は、有効量のこの組成物を受けていない対照被験体における同じｍｉＲＮＡの発現と比較して、有効量のこの組成物を受けている被験体において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を減少させる。これらの方法に関連するｍｉＲＮＡの例には、例えば、配列番号１〜１６および１８〜２６のうちの１または複数が含まれる。
【００３１】
別の実施形態では、開示された方法は、糖尿病および／または代謝障害を予防および／または処置することを助ける。一態様では、この組成物は、有効量のこの組成物を受けていない対照被験体における同じｍｉＲＮＡの発現と比較して、有効量のこの組成物を受けている被験体において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を減少させる。これらの方法に関連するｍｉＲＮＡの例には、例えば、配列番号２８〜３３のうちの１または複数が含まれる。
【００３２】
別の実施形態では、開示された方法は、認知障害を予防および／または処置することを助ける。一態様では、この組成物は、有効量のこの組成物を受けていない対照被験体における同じｍｉＲＮＡの発現と比較して、有効量のこの組成物を受けている被験体において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を減少させる。これらの方法に関連するｍｉＲＮＡの例には、配列番号３４〜４３のうちの１または複数が含まれるが、これらに限定されない。認知障害の例には、例えば、とりわけ、統合失調症、自閉症、アルツハイマー病が含まれる。
【００３３】
別の実施形態では、被験体に投与される場合、この組成物は、前記組成物を投与していない対照被験体と比較して、有効量の前記組成物を投与した被験体において、ｍｉＲＮＡの発現を増加させ得る。かかるｍｉＲＮＡの例には、配列番号１７および配列番号２７が含まれ得るが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質の染色による、タンパク質プロファイルを示す図である。
【図２】図２は、ＰＫＡの上方調節が、市販の製品ＴＳＮが給餌された動物と比較して、ＡＡＣ１ブロスが給餌された動物において有意に抑制されることを示す図である。
【図３】図３は、市販の製品と比較したＡＡＣ１の侵害防御（ｎｏｃｉｆｅｎｓｉｖｅ）応答を示す図である。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質の染色および分子量分布の定量による、タンパク質プロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
ニワトリスープおよびニワトリブロスは、何世紀にもわたって、ヒトでの消費のために利用可能であった。ニワトリスープまたはブロスの種々の健康的利益を示す多くの研究が実施されている。従来の家庭風の方法によれば、ニワトリスープまたはブロスは、長期間にわたって、水の深鍋中でニワトリ全体または大きいチキンパーツを煮ることによって調製される。化合物の一部は、調理の間または処理の間に失われている可能性があり、他の化合物は、チキンパーツから抽出されていない可能性があるので、この方法に従って調製されたスープまたはブロスは、スープまたはブロスの健康促進効果を最大化していない可能性がある。
【００３６】
本開示は、調理する前にチキンパーツを処理することによる、および苛酷な処理条件に起因した活性の喪失を同時に最小化しつつ、有益な化合物の抽出を最大化するために、処理温度および調理時間を制御することによる、改善された方法を提供する。
【００３７】
家禽由来の特別に選択された原材料は、高いタンパク質含量を有するブロスを取得するために、開示された方法に従って処理される。特定のアミノ酸が、自家製ブロスまたは他の市販の製品と比較して、相対的により高い濃度で存在する。本明細書に記載される種々の動物研究において示されるように、開示されたブロス組成物は、関節疾患および基礎をなす病理を予防および／または処置する際に有効であることを証明し得る。これらの組成物は、炎症を減少させるなどの、他の栄養的および健康的利益もまた提供し得る。
【００３８】
用語「ブロス」および「スープ」とは、少なくとも１種の溶質を含む液体組成物を指し、液体形態または固体形態のいずれかの、調理済み（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｓｅｒｖｅ）形態、濃縮物、ストックを指すためにも使用され得る。
【００３９】
本開示の家禽ブロスは、有意な量の異なるアミノ酸を含み得る。かかるアミノ酸は、ブロス中に、タンパク質の形態で、または遊離アミノ酸として、存在し得る。総アミノ酸は、タンパク質の形態で存在するアミノ酸および遊離アミノ酸として存在するアミノ酸の両方を含む。本開示の目的のために、ブロス組成物中の異なるアミノ酸の比率とは、総アミノ酸間の比率を指す。
【００４０】
用語「乾燥固体」または「固体」とは、本明細書で使用する場合、全ての自由液体が液体組成物から除去された後に残存する、液体組成物の構成成分を指す。水性ブロスの場合、この自由液体は水である。
【００４１】
用語「投与する」とは、経口摂取などによる、個体への材料の送達を意味する。
【００４２】
用語「被験体」は、ヒトを含む哺乳動物を指すために使用される。
【００４３】
用語「実質的に」とは、少なくとも１０〜２０％を意味する。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、実施形態の例示のみを目的として提供されており、限定を意図しない。原材料、試薬、化学物質および他の材料は、例示的な構成成分または試薬として提示され、種々の改変が、本開示の範囲内で、上述の議論を考慮してなされ得る。本開示中に特記しない限り、実施例に記載されるような系およびアッセイにおいて使用される構成成分、試薬、プロトコールおよび他の方法は、例示のみを目的としている。
【００４５】
（実施例１）
シチメンチョウパーツからのブロスの調製
この実施例では、シチメンチョウパーツを使用してブロスを調製し、このブロスの全体的な品質および潜在的な健康的利益を決定した。簡潔に述べると、原料のシチメンチョウを機械的に分離し、それらのパーツを、２ｍｍ未満のサイズまで微細に粉砕して、抽出を最大化した。シチメンチョウ由来の小さいサイズのパーツを、蒸気中１９５°Ｆで約１５分間またはそれ未満、穏やかに調理した。次いで、このブロスを、デカントすることによって不溶性画分から分離した。ブロス中の遊離脂肪もまた、遠心分離機によってブロスから除去した。このブロスを、市販のエバポレーター中で濃縮し、冷却し、販売のために包装した。
【００４６】
（実施例２）
チキンパーツからのブロスの調製
この研究では、ニワトリの骨および軟骨を含む切り刻んだチキンパーツを、６時間超にわたって２５０ｏＦよりも高い温度で、水中で調理して、特定のブロス画分および／または化合物の抽出を最大化した。このプロセスから取得したブロスを、内部参照として「ＡＡＣ１」と称した。より具体的には、ＵＳＤＡは、主要な筋肉を除去した後に残存する切り刻まれた原料のニワトリ骨であって、市販の大きいステンレス鋼調理タンク中の水中で調理した、ニワトリ骨を検査した。調理後、液体ブロス部分を、デカントすることによってニワトリ固体から分離した。このブロスを、市販のエバポレーター中で濃縮し、次いで、スプレー乾燥させ、ラベル付きコンテナ中に包装した。
【００４７】
（実施例３）
異なるブロスのタンパク質およびアミノ酸プロファイルを比較する
タンパク質は、例えば、酵素として機能すること、細胞の情報伝達を促進すること、および構造的支持を細胞に提供することを含む、生物学的系において多彩な機能を実施する、アミノ酸の１または複数の鎖から構成される大きい分子である。ヒトならびに他の動物は、必須アミノ酸を合成するために必要な酵素を欠くので、それらの食餌の一部として消費されるタンパク質から、必須アミノ酸を得る。タンパク質の摂取は、消化プロセスを介した、アミノ酸へのタンパク質の分解をもたらす。次いで、これらのアミノ酸は、筋肉の産生および維持におけるタンパク質生合成、グルコース産生において使用され得、食餌窒素供給源として機能し得、必要に応じて燃料供給源として機能し得る。この研究の目的は、自家製生成物と比較して、ニワトリブロスＡＡＣ１中のタンパク質の濃度およびサイズ範囲を決定することであった。
【００４８】
本開示に従って調製した１つの試料（ＡＡＣ１）および家庭風の調理方法に従って調製した別の試料（自家製）を比較した。ＡＡＣ１についてのパーセント固体（ｗ／ｖ）は、８％固体であったが、自家製についての百分率（ｗ／ｖ）は、１．７％固体であった。
【００４９】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によってタンパク質の量を決定する前に、各試料を、最終１％ｗ／ｖ溶液になるように、蒸留水中に希釈した。標準曲線を、ウシ血清アルブミン（０〜３．５μｇ／μＬ）を使用して作成した。全ての試料を、三連で分析した。総タンパク質の量を、５９５ｎｍの波長においてプレートリーダーを使用して決定した。結果を表１に示す。
【表１】
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【００５０】
ＡＡＣ１（８％）試料および自家製（１．７％）試料中のパーセント固体における差異について補正するために、ＡＡＣ１および自家製についての１％溶液に基づくタンパク質値に、それぞれの出発％固体を乗算した。ＡＡＣ１および自家製についての総タンパク質の最終的な調整された量は、表２に示される。
【表２】
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【００５１】
各試料のタンパク質プロファイルを決定するために、等体積のＡＡＣ１試料および自家製試料（１５．６μｌ）を、各々Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液および還元剤と混合し、９５℃で５分間加熱し、４〜１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル上で分離した。タンパク質の相対的サイズ範囲を、市販のタンパク質標準（４．５ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲）との比較によって決定した。１５０Ｖの一定の電圧を、このゲルに３０分間印加して、各試料中のタンパク質の分離を可能にした。タンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用して、このゲルにおいて視覚化した。
【００５２】
結果を図１に示す。レーン１は、自家製ブロスについてのタンパク質プロファイルを示し、レーン２は、ＡＡＣ１ブロスについてのタンパク質プロファイルを示し、レーン３は、分子量標準である。これらのタンパク質プロファイルに基づくと、ＡＡＣ１は、自家製生成物よりも、およそ３倍多いタンパク質から構成される。自家製生成物中のタンパク質は、大きいタンパク質（最大約３００〜５００ｋＤ）および小さいタンパク質（約５〜１５ｋＤ）の両方を含む、より広い範囲の分子量分布を示した。対照的に、ＡＡＣ１中のタンパク質の大部分（即ち、５０％超）は、７０ｋＤａと１５ｋＤａとの間の分子量を有する。
【００５３】
個々のアミノ酸含量もまた分析した。以下の表３は、家庭風の方法を使用して調製したブロス組成物ならびに他の市販の製品と比較した、開示された方法に従って調製したブロス組成物の個々のアミノ酸含量を示す。
【表３】
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【００５４】
（実施例４）
異なるブロス中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）のレベルを比較する
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、軟骨において見出される重要な構造化合物であり、関節の健康に関与する。ＣＳは、ｉＮＯＳ、ＰＧＥ２、ＣＯＸ−２（Ｇｗｅｎｄｏｌｙｎ、Ｓｐｉｎｅ  ２０１１年）およびＮＦｋＢ（Ｖａｌｌｉｅｒｅｓ、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、２０１０年）などの多くの炎症メディエーターのレベルを低減させることが示されている。この研究の目的は、種々のニワトリブロス試料中のＣＳの量を決定することであった。ニワトリブロスを、酵素的消化およびＬＣ−ＵＶ検出を使用して、総ＣＳについて分析した（Ｊｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００７年）。結果を、標準試料と比較した曲線上の面積として、定量限界を８ｍｇコンドロイチン硫酸／ｇ乾燥材料として計算した（表４）。試験した全てのニワトリブロスの中で、ＡＡＣ１は、最も大きい量のＣＳ（８．７９７％ｗ／ｗ）を有した。
【表４】
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【００５５】
（実施例５）
異なるニワトリブロス中のポリフェノールの濃度の比較
異なるニワトリブロス中のポリフェノールの濃度を、改変Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法を使用して決定した（Ｓｌｉｎｋａｒｄ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、１９７７年）。ポリフェノールは、抗酸化特性および抗炎症特性を有することが公知の化学化合物のクラスである。ＡＡＣ１および家庭風ブロスの両方がポリフェノールを含んだが、ＡＡＣ１は、４８２８．８μｇ／ｍＬ  ＧＡＥのポリフェノールを含み、これは、同じ種類のチキンパーツから作製した自家製ブロス（６８７．７μｇ／ｍＬ  ＧＡＥ）よりも、およそ７倍高いＧＡＥのポリフェノールである。
【００５６】
（実施例６）
ＣＯＸファミリーの酵素に対するブロス組成の効果
ＣＯＸファミリーの酵素は、プロスタグランジンなどのプロスタノイドの合成を担う。ＣＯＸ−１は、構成的に活性であるが、ＣＯＸ−２は誘導性であり、したがって、炎症および疼痛の間に上方調節される。ＣＯＸ−１に影響することなくＣＯＸ−２活性化を遮断する化合物は、ＣＯＸ−１活性を遮断することによって媒介される望ましくない副作用を引き起こすことなく炎症を遮断するそれらの能力に起因して、特に重要である。開示された方法に従って調製したニワトリブロスによるＣＯＸ阻害のレベルおよび特異性を調査した。
【００５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＯＸ酵素インヒビターアッセイ（Ａｂｃａｍ）を使用して、ニワトリブロス試料を、製造業者のプロトコールに従って、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性を遮断するそれらの能力についてアッセイした。結果を表５に示す。
【表５】
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【００５８】
「同じ原料パーツ由来の家庭風ブロス」と標識したブロスは、ＡＡＣ１を調製するために使用した原材料と同じ原材料を用いて、伝統的な家庭風調理方法を使用して調製したブロスであった。上の表５に示すように、ニワトリブロスＡＡＣ１は、他の市販の製品または「同じ原料パーツ由来の家庭風ブロス」と比較して、ＣＯＸ−２酵素活性の４０％超の阻害を有して、ＣＯＸ−２阻害対ＣＯＸ−１阻害の最大の比率（１８．３４）を示した。
【００５９】
（実施例７）
プロテインキナーゼＡを調節することによる、関節疾患に対する開示されたブロスの効果
顎関節障害（Ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＴＭＤ）は、顎関節（ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ）もしくは顎関節（ｊａｗ  ｊｏｉｎｔ）（ＴＭＪ）、咀嚼の筋肉、または両方に影響を与える疾患である。ＴＭＤは、三叉神経系中に位置するニューロンおよびグリア細胞の活性化によって引き起こされると考えられている（Ｔｊａｋｋｅｓら、２０１０年）。ＴＭＤ症状の罹患率は、様々な発生率を有する一般集団で最大９３％であると報告されている（Ｚｈａｏら、２０１１年）。ＴＭＤのさらなる発達は、この障害の慢性に感作された状態の発達もまたもたらし得る。
【００６０】
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、末梢神経系および中枢神経系において炎症促進性分子として作用するサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存的酵素のファミリーのメンバーである。感覚侵害受容ニューロンによる増加したレベルのＰＫＡ発現が、慢性感作状態の間に報告されている。この研究の目的は、市販のブロス、家庭風ブロスおよび本開示に従うブロスの効果を研究することであった。これらの種々の生成物は、ＴＭＤに対していくぶんかの効果を有する特定の抗炎症性分子を含み得る。これらの分子は、ＴＭＤの発症および進行を調節する際に、ＰＫＡを介してそれらの効果を発揮し得る。
【００６１】
３つのニワトリブロス（ＡＡＣ１、ＴＳＮおよび自家製ブロス）を、この研究において調査した。ブロスＡＡＣ１（８％固体）を、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で調製した。最初に、５ｇの粉末化ブロスを、清浄なオートクレーブしたビン中に配置した。次いで、このビンに、１Ｌの印まで濾過水を満たし、この混合物を撹拌して、粉末を水に溶解させた。自家製風ブロス（１．７％）もまた、対照として試験した。ＡＡＣ１および自家製風ブロスの比較を可能にする投与量を達成するために、この自家製ブロスを、６２．５ｍＬのストックブロスを配置し、このブロスを１Ｌに希釈することによって、濾過水で１６倍希釈した。市販のブロスＴＳＮもまた、別の対照として試験した。ＴＳＮを、ＡＡＣ１の濃度と類似の濃度で試験することを確実にするために、ＴＳＮについての溶液（３３．３％固体）を、類似の様式で作製した。このＴＳＮブロスを、ストックブロスの稠度が非ゼラチン状になるまで、温めた。ブロスを、１６．７ｇの増分へと量り分け、上記のように、清浄なビン中に配置した。次いで、このビンに、１Ｌの印まで濾過水を満たした。次いで、全ての溶液を、温かな超音波処理浴中に３０分間配置して、ブロスの全ての構成成分を均等に可溶化させた。ブロスを、ＴＭＤ誘導の前の２週間にわたる給水ビンによる投与を介して動物に投与するまで、冷蔵庫中で貯蔵した。
【００６２】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２００ｇ〜３００ｇ）を、この研究において使用した。これらのラットを、３つの群に分け、各々の群に、水、市販の製品（ＴＳＮ）、または本開示に従って調製したＡＡＣ１ブロスを給餌した。
【００６３】
機械的ストレスを各群に適用し、三叉神経脊髄路核（ＳＴＮ）を含む上部脊髄組織の試料を取得し、免疫染色のために処理した。免疫染色の前に、スライドを室温に配置し、１×ＰＢＳで５分間覆った。ＰＢＳを除去し、液体を、５％正常ロバ血清−０．１％  ｔｒｉｔｏｎ溶液で２０分間置き換えた。次いで、組織を、５ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。ウサギ抗ラットＰＫＡの作業希釈物（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ；１：５００）を、５％正常ロバ血清を使用して作製した。一次抗体を、室温で３時間にわたって組織上でインキュベートした（１００μｌ／組織）。次いで、試料を、５ｍＬの０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳおよび２ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８（登録商標）の作業希釈物を、１×ＰＢＳ中に１：２００でストック抗体を希釈することによって作製した。二次抗体を、光から保護しながら、室温で１時間にわたって試料スライド上でインキュベートした（１００μｌ／組織）。スライドを、５ｍＬの０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳおよび２ｍＬの１×ＰＢＳで再度洗浄し、蛍光色素ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光封入剤を使用した蛍光分析用に封入処理した。スライドにカバーガラスをかけ、透明なマニキュア液を使用して密封し、顕微鏡画像を収集するまで、４℃で貯蔵した。
【００６４】
アポトーム（ａｐｏｔｏｍｅ）を備えたＺｅｉｓｓ  Ｚ１イメージャーを使用して、三叉神経節のＶ３領域およびＳＴＮの髄質角（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｈｏｒｎ）の１０×Ｚ−Ｓｔａｃｋｅｄ画像を獲得した。Ｚｅｎ  ２０１１ソフトウェアを使用して、分析前に、各画像のバックグラウンドを均等にバランスさせた。グレースケールのｊｐｅｇ画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにおいて開き、ここで、等しいサイズの面積を有する１０個の非重複関心領域（ＲＩＯ）を、各画像においてタンパク質発現を表す領域中に配置し、積分した画素密度を測定した。バックグラウンド強度もまた、類似の手順を介して獲得し、平均した。次いで、各画像から獲得した平均バックグラウンド強度を、目的の領域からの各積分した密度値から差し引いた。差し引かれた積分した密度を平均し、変化倍数を、ＴＭＤ対照レベルからの平均変化±ＳＥＭとして計算した。統計的差異を、ＳＰＳＳソフトウェアにおいてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を使用して決定し、ｐ≦０．０５の場合に異なるとみなした。
【００６５】
図２中のデータは、長期開口によって引き起こされる上昇したＰＫＡレベルが、水または市販の製品（ＴＳＮ）のいずれかを消費している動物におけるレベルと比較した場合に、ＡＡＣ１給餌動物において大きく抑制されるという証拠を提供する。表６において、いくつかの実験の結果を、その平均強度を１と等しくした水と比較した場合の、免疫染色の強度における平均変化倍数としてまとめる。
【表６】
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【００６６】
本明細書に開示されるＡＡＣ１ブロスは、市販の製品と比較した場合に、関節ストレス後のＳＴＮにおけるＰＫＡのレベルをモジュレートするより大きい能力を示した。ＡＡＣ１および自家製ブロスの組成における差異に基づいて、本発明者らは、ＡＡＣ１が、ＳＴＮにおけるＰＫＡレベルのストレス誘導性の上昇を抑制するにあたり、有意により良いことを予測した。
【００６７】
（実施例８）
他のブロス生成物と比較した、ＡＡＣ１の侵害防御応答
顎関節障害（ＴＭＤ）は、侵害受容インプットにおける減少にもかかわらず、疼痛の挙動および感覚の継続を特徴とする（Ｈｅｒｂら、２００６年）。増加した感受性は、関節、筋肉、靱帯および腱の感覚神経支配を提供する神経の慢性に感作された状態の発達に帰せられ得る。ＴＭＤ患者は、彼らの症状が、彼らの人生の他の局面に負に影響を与えると報告することが多い（Ｓｅｓｓｌｅ、２００８年）。一部のＴＭＤ患者は、彼らの毎日の活動を限定または最小化し得る防衛挙動改変を発達させる。この防衛挙動を、「侵害防御」挙動と称する。この研究の目的は、ＡＡＣ１ニワトリブロスが、機械的刺激に応答したＴＭＪのストレス誘導性の侵害防御挙動を低減させ得るか、およびその性能が、自家製ブロスおよび市販の製品と如何にして匹敵するかを決定することであった。
【００６８】
３つのニワトリブロス（ＡＡＣ１、ＴＳＮおよび自家製ブロス）を、この研究において調査した。ブロスＡＡＣ１（８％固体）を、０．５％（ｗ／ｖ）で作製し、自家製風ブロス（１．７％）を、ＡＡＣ１と自家製ブロスとの間のパーセント固体の比率の公平な比較を可能にする用量で試験した。したがって、自家製ブロスを、６２．５ｍＬのストックブロスを配置し、このブロスを１Ｌに希釈することによって、濾過水で８倍希釈した。類似の濃度において競合する市販のブロスを試験するために、ＴＳＮについての溶液（３３．３％固体）を、このブロスを、ストックブロスの稠度が非ゼラチン状になるまで温めたという改変を伴って、類似の様式で作製した。
【００６９】
ブロスを、１６．７ｇの増分へと量り分け、上記のように、清浄なビン中に配置した。次いで、このビンに、１Ｌの印まで濾過水を満たした。次いで、全ての溶液を、温かな超音波処理浴中に３０分間配置して、ブロスの全ての構成成分を均等に可溶化させた。ＴＭＤ誘導の前の２週間にわたる給水ビンによる投与を介して動物に投与するまで、ブロスを、冷蔵庫中に配置した。
【００７０】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２００ｇ〜３００ｇ）を、１２時間／明暗サイクルで、室内で食料および水の両方を制限なく入手できる、清浄な標準的なプラスチックラットケージ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）中に別々に収容した。試験前の連続する３日間、動物を、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ｄｕｒｈａｍ動物保持デバイス（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰＡ）に５分間入らせて、試験条件に順応させた。この順応期間の間に、顔の咬筋中およびＴＭＪ領域中に位置する毛包および表皮の刺激を、ピペットチップでその領域を穏やかに擦ることによって行った。この刺激を使用して、試験手順に対する動物の状態を改善し、こうして、試験フィラメントに対する偽反応の数を低減させた。ベースライン侵害防御挙動を、十分に確立されたｖｏｎ  Ｆｒｅｙ法の改変バージョンを利用することによって評価した。一連の較正されたｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを、咬筋の上の皮膚領域に対して、漸増する力で適用した。適用前に、筋肉を、試験フィラメントの先端で触診して、適切な配置を保証した。配置が確立されると、実験条件について盲検の科学者が、フィラメントにおける屈曲を達成するために、その位置に対して十分な力をかけた。その領域への力の開始後かつフィラメントの屈曲の前に観察された反応を、１人の他の科学者が確認し、記録した。各フィラメントを５回適用し、各特定の較正されたフィラメントの５回の適用から得られた反応の数として記録した。測定値を、各動物の右および左の両方の咬筋にわたって収集して一緒に平均し、５回のうちの反応の複合平均数を得た。ベースライン読み取りは、全てのニワトリブロス生成物の２週の給餌前であり、ＴＭＤ誘導の２４時間前にもう一度読み取った。
【００７１】
機械的に誘導されたＴＭＤ病理を経験している動物において、２時間後、３日後または７日後の侵害防御応答の数を測定した。図３に示されるこの研究の結果は、ＡＡＣ１が、機械的に誘導されたＴＭＤ病理を経験している動物において、２時間後、３日後または７日後の侵害防御応答の数を有意に低減させることを実証している。ＡＡＣ１は、水のみを消費したＴＭＤ動物と比較して、侵害防御応答の数を有意に減少させる。ＴＳＮ製品は、測定したいずれの時点においても、侵害防御応答における減少を引き起こさなかった。したがって、生成物ＡＡＣ１は、長期開口ＴＭＤモデルから生じる慢性炎症を経験している動物において、侵害防御挙動を低減させるが、この能力は、市販の製品によっては示されない。上記実施例から得られた結果、ならびにこの実施例において提示されたデータに基づいて、本発明者らは、自家製ブロス生成物が、ＴＭＪのストレス誘導性の侵害防御応答を有意には低減させないことを予測した。
【００７２】
（実施例９）
エピジェネティックな変化を介した種々の疾患に対するブロスの効果
この研究の目的は、神経学的炎症状態および疾患の発症および回復に関与するｍｉＲＮＡに対するニワトリブロスの毎日投与の効果を評価することであった。ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む動物のゲノムを調節することにおいて重要な役割を果たす、小さいＲＮＡ分子（典型的には、約２２ヌクレオチド長）である。これらの分子は、何千もの遺伝子の遺伝子発現を制御する。重要なことに、ｍｉＲＮＡの発現における変化は、多くの炎症状態および疾患状態の発症および進行に関与する。
【００７３】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２００ｇ〜３００ｇ）を、１２時間／明暗サイクルで、室内で食料および水の両方を制限なく入手できる、清浄な標準的なプラスチックラットケージ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）中に別々に収容した。ニワトリブロスＡＡＣ１（８％固体）および自家製風ブロス（１．７％固体）を、この試験において使用した。ブロスＡＡＣ１を、１０ｇ（１％）の粉末化ブロスを、清浄なオートクレーブしたビン中に配置することによって、１％（ｗ／ｖ）で作製した。次いで、このビンに、１Ｌの印まで濾過水を満たした。ＡＡＣ１と自家製風ブロスとの間のパーセント固体の比較比率を維持するために、この自家製ブロスを、１２５ｍＬのストックブロスを配置し、このブロスを１Ｌに希釈することによって、濾過水で８倍希釈した。次いで、溶液を、温かな超音波処理浴中に３０分間配置して、ブロスの全ての構成成分を溶液中に均等に移動させた。ブロスを、使用するまで冷蔵庫中に配置した。動物は、合計４週間にわたって２日毎に、３００ｍＬのブロスを受けた。三叉神経脊髄路核（ＳＴＮ）および前頭皮質（ＦＣ）試料を、動物から獲得し、膵臓組織試料を、腹部切開を介して取得した。抽出した後、組織を、液体窒素中で即座に凍結させ、ＲＮＡが抽出できるようになるまで、−２０℃で貯蔵した。
【００７４】
組織を計量し、６００μｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）中に配置した。組織を、清浄なＲＮＡａｓｅフリーのフードにおいて、プラスチック乳棒を使用してホモジナイズした。組織を完全にホモジナイズした後、６００μｌのＴＲＩｚｏｌを各試料に添加し、数回反転させて、完全な混合を確実にした。混合した後、１２０μｌのクロロホルムを各チューブ中に配置し、迅速に反転させた。次いで、試料を、氷上に５分間配置した。５分後、試料を、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離して、有機層および水性層を分離した。分離した後、ＲＮＡ含有水性層を取り出し、清浄な１．５ｍＬチューブ中に配置した。この時点で、さらなる１２０μｌのクロロホルムを各チューブ中に配置し、迅速に反転させた。試料を、氷上で５分間再度インキュベートし、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。分離した後、ＲＮＡ含有水性層を取り出し、清浄な１．５ｍＬチューブ中に配置した。ＲＮＡを沈殿させるために、１ｍＬの氷冷イソプロパノールを、各チューブ中に配置した。次いで、各試料を、数回反転させて、完全な混合を保証した。次いで、試料を、−２０℃で３０分間インキュベートし、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。ＲＮＡペレットを、最初に視覚化し、イソプロパノールを除去した。次いで、ＲＮＡペレットを、ＲＮＡａｓｅフリーの７５％エタノールで洗浄し、７，５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで、エタノールを除去し、ＲＮＡペレットを乾燥させた。次いで、ペレットを、ＲＮＡａｓｅフリーの水中に再懸濁し、−２０℃に配置した。
【００７５】
ｃＤＮＡを、製造業者のマニュアルに従ってｍｉＳｃｒｉｐｔ  ２  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡ試料（２５０ｎｇ）から取得した。試料を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、９５℃で５分間インキュベートした。このサイクルを１回完了し、その時点で、試料を氷上に配置した。アッセイしない試料を、貯蔵のために即座に−２０℃に配置し、アッセイする試料を、製造業者のハンドブックに記載されるように、２００μｌのＲＮＡａｓｅフリーの水で即座に希釈した。
【００７６】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｐａｔｈｗａｙ−Ｆｏｃｕｓｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲアレイを使用して、Ｄｉａｂｅｔｉｃ、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＆  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ、およびＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｐａｔｈｗａｙｓに集中したパネルを使用して、ｍｉＲＮＡ発現における変化を決定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｘｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０×）、鋳型ｃＤＮＡおよびＲＮＡａｓｅフリーの水を、使用前に室温にした。清浄なＲＮＡａｓｅフリーの環境において、以下の構成成分を、製造業者のハンドブックに記載されるように、清浄なＲＮＡａｓｅフリーのレザバへと、以下の量で合わせた。混合した後、２５μｌの調製した反応物を、マルチチャネルピペットを使用して、９６ウェルのＰａｔｈｗａｙ  Ｆｏｃｕｓｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲプレートの各ウェル中にピペッティングした。ロードした後、試料を、提供された透明なプラスチック接着シートで覆い、各ウェルを個々に密封した。各プレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ機械中に配置し、ここで、プレートを、最初に９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、以下の条件で４０サイクルを行った：９４℃で１５秒間；５５℃で３０秒間；および７０℃で３０秒間。データ収集を、４０回の各サイクルの第２のステップの間に行った。
【００７７】
各実験を完了した後、生データを、ＯｎｅＳｔｅｐソフトウェア中にインポートした。分析前に、ベースラインを、プロトコールハンドブック中に列挙した製造業者の指示に従って確立した（サイクル２−増幅前に２サイクル、サイクル１５以下）。ベースラインは、初期サイクルにおけるノイズレベルであり、このとき、検出可能な増幅は存在しない。この時点で、閾値もまた、ハンドブック中に詳述される製造業者の指示に従って確立した。閾値を、曲線の対数線形範囲を含むように、対数増幅プロットを使用して設定した。この閾値を、全てのアレイについて１とした。この位置は、全ての対照試料について、閾値が、バックグラウンドノイズの上かつ曲線の線形部分の下半分に設定されるようにした。これらの条件下で、生ＣＴ値を得た。
【００７８】
ΔＣＴ値を得るために、各パネルについて、１つの対照試料（ｎ＝３）および１つのニワトリブロス試料（ｎ＝３）からの生ＣＴ値を、製造業者によって提供されるｍｉＳｃｒｉｐ  ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｗｅｂ−Ｂａｓｅｄソフトウェア中に置いた。データを、最低２つのハウスキーピング遺伝子に対して正規化したが、それは、典型的には、これらの遺伝子のレベルが、実験条件下で変化しないからである。適切なハウスキーピング遺伝子を選択した後、データを提出し、正規化したΔＣＴ値を、ウェブベースのソフトウェアによって計算した。次いで、データソフトウェアから得た値を、ｅｘｃｅｌのスプレッドシート中に置いた。ニワトリブロス試料についてΔΔＣＴ値を計算するために、以下の等式を使用した：ΔΔＣＴＡＡＣ１＝ΔＣＴ対照試料１−ΔＣＴＡＡＣ１試料１。対照発現からの変化倍数を決定するために、以下の等式を使用した：変化倍数＝２＾ΔΔＣＴＡＡＣ１試料１。３つの独立した実験から得られた変化倍数を平均し、平均変化倍数±ＳＤＥＶとして報告した。統計的有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕを介して決定し、ｐ≦０．０５の場合に有意と決定した。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表８】
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【表９】
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【００７９】
２８日間にわたって１％ニワトリブロスＡＡＣ１を給餌した動物から取得した脊髄試料は、対照試料で処置した動物において見出されるレベルと比較して、炎症に関与する２６種のｍｉＲＮＡの有意な抑制を示した。興味深いことに、ＡＡＣ１ブロスによって阻害されるもののなかには、Ｍａｐキナーゼホスファターゼ１を阻害することが示されている１０１ファミリーのｍｉＲＮＡがあった（表７を参照のこと）。１％ニワトリブロスＡＡＣ１を給餌した動物から取得した前頭皮質試料もまた、複数の神経学的疾患の発症に関与する１０種のｍｉＲＮＡの発現において、有意な低減を示した。これらの疾患には、自閉症、統合失調症、アルツハイマー病、脊髄小脳失調症およびプリオン病が含まれる。
【００８０】
合わせると、この研究からの結果は、ニワトリブロスＡＡＣ１が、中枢神経系の神経学的炎症、特定の神経学的疾患の発症および進行、ならびにメタボリックシンドロームの病理発生に関与する特定のｍｉＲＮＡのエピジェネティックな予防的調節において有益であり得ることを示唆している。これらのデータは、ニワトリブロスＡＡＣ１が、同じ原材料から調製した自家製生成物よりも、これらのｍｉＲＮＡを調節することにおいて有効であることを示唆している。
【００８１】
（実施例１０）
タンパク質プロファイルおよびタンパク質分子量分布の定量
この研究の目的は、ゲル電気泳動を介して、異なるニワトリブロス試料中のタンパク質プロファイルを識別することであった。ゲル電気泳動を、全ての試料に対して実施して、分子量によってタンパク質内容物を分離した。タンパク質内容物を、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎを使用して視覚化した。任意の識別可能なタンパク質バンドのおよその分子量を決定した。
【００８２】
２つの試料、ニワトリ由来のほとんどの主要なタンパク質を含む対照試料（レーン２）およびＡＡＣ１ブロス（レーン３）を、１％固体の最終濃度になるように、ＤＩ水中に希釈し、分子量（ＭＷ）マーカー（レーン１）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。主要タンパク質バンドの分布を定量した。異なるバンドパターンは、異なる処理方法の結果であり得る。図４に示すように、ＡＡＣ１は、この生成物を作製するために使用した製造プロセスに帰せられ得る高いレベルのタンパク質分解を示すスメアパターンを有した。ＡＡＣ１中のタンパク質の少なくとも９０％は、１０〜５０ｋＤの範囲内であった。これは、１０ｋＤ〜３００ｋＤのＭＷのかなり広い分布を示した対照試料とは対照的である。
【００８３】
本明細書に記載される全ての動物研究を、政府の法および規則に従って承認されたプロトコールを使用して実施した。変化が、上記の方法および系において、本明細書の範囲から逸脱することなしになされ得る。したがって、上記説明に含まれるまたは添付の図面に示される事項は、例示として解釈すべきであって、限定的な意味で解釈すべきでないことに、留意すべきである。以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載される包括的および具体的特徴、ならびに本方法および系の範囲の陳述をカバーすることを意図しており、これらは、言葉の問題として、それらの間に入ると言われ得る。
【００８４】
上記実施形態の各々は、特定のそれぞれの配向を有する種々の構成成分を用いて例示されているが、本開示に記載される系および方法は、種々の構成成分が種々の位置および相互の配向で位置付けられた種々の具体的な配置を採用し得、なおも本開示の精神および範囲の内に留まることを、理解すべきである。さらに、適切な等価物が、種々の構成成分の代わりに、または種々の構成成分に加えて使用され得、このような代用物またはさらなる構成成分の機能および使用は、当業者によく知られており、したがって、本開示の範囲内に入るとみなされる。したがって、本明細書の例は、例示的とみなすべきであって、限定的とみなすべきではなく、本開示は、本明細書中に与えられた詳細に限定すべきではなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で改変され得る。
【００８５】
特許、特許出願、科学論文および他の刊行物を含む、本開示中で引用された全ての参考文献は、本明細書で参照によって本出願中に組み込まれる。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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