(57)【要約】ゲル様３Ｄ足場を形成するインスリンおよびグルコース特異性酵素を封入する、逆に荷電したデキストランナノ粒子からなる注射可能なナノネットワークによる、インスリンのグルコース媒介送達などの治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の「スマート」送達のための系。実施例によって実証されるように、この系は、高血糖状態で効果的に解離してインスリンを放出し、グルコースのグルコン酸への触媒的転換、および続くポリマーマトリクスの分解が容易になる。この製剤設計は、自己調節された糖尿病管理と長期的な糖尿病管理の両方についての送達戦略を提供する。
2016517885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の制御放出のための注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワーク製剤であって、
酸分解性ポリマーマトリクス、
応答性シグナル伝達成分、および
治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤
を含む粒子を含み、
第１の複数の該粒子が表面に第１の非ゼロ電荷を有し、第２の複数の該粒子が表面に第２の反対の非ゼロ電荷を有し、それらが相互作用して注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワークを形成し、
該応答性シグナル伝達成分が生理学的成分の存在下で酸を生成し、該酸が該ポリマーを分解して該治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を放出する製剤。
【請求項２】
前記薬剤が、インスリンもしくはインスリン類似体またはインスリン濃度を増加させる薬剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記応答性シグナル伝達成分が、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含む、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼの酸分解性ポリマーマトリクスに対する比（ｗ／ｗ）が１：１００〜１：１５である、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記グルコースオキシダーゼとカタラーゼが４：１の比（ｗ／ｗ）で存在する、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
その表面に正電荷を有する前記第１の複数の粒子と、その表面に負電荷を有する前記第２の複数の粒子が相互作用してゲルを形成する、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記第１の複数の粒子中の該粒子のゼータ電位および前記第２の複数の粒子中の該粒子のゼータ電位が、５〜１５ｍＶの大きさを有する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
前記第１の複数の粒子中の前記粒子が、表面改質剤をさらに含む、請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
前記表面改質剤が、キトサンまたはアルギネートである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記粒子が、３５０ｎｍ未満の流体力学的半径を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
前記酸分解性ポリマーマトリクスが、架橋性ポリマーおよび酸分解性架橋剤を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
前記酸分解性ポリマーマトリクスが、複数の加水分解可能な部分を有するポリマーを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
高血糖状態下で解離し、通常のグルコースレベルで実質的に解離しない、請求項２に記載の製剤。
【請求項１４】
４００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度で８時間後に解離する、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
正常なグルコースレベルで１５時間後に実質的に解離しない、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１６】
グルコース濃度が正常な状態と高血糖状態の間で周期的に変動する場合、インスリンまたはインスリン類似体またはインスリン濃度を増加させる薬剤の放出が脈動的である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１７】
投与を必要とする個体に有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製剤を投与するステップを含む、処置を必要とする患者を処置する方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、インスリンもしくはインスリン類似体またはインスリン濃度を増加させる薬剤であり、前記個体が１型または２型の糖尿病を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
正常血糖、正常な糖化アルブミンレベルまたはより高いボディコンディションスコアを維持するために、前記製剤を投与するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血液グルコース濃度を７０〜１３０ｍｇ／ｄＬまたは９０〜１１０ｍｇ／ｄＬの間で維持するのに有効な量で投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１３年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８１７，７５２号および２０１３年８月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８６４，０６９号の利益を主張する。２０１３年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８１７，７５２号および２０１３年８月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８６４，０６９号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、グルコースレベルに応答した治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤のためのスマートまたは相互作用的な送達系に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
真性糖尿病は、血液中のグルコースの蓄積を伴うグルコース調節の障害である。正常な個体において、インスリンは基本的に、時間当たり０．５〜１．０単位の範囲で通常分泌され、そのレベルは食事後に増加する。食事の後の血液グルコースレベルの上昇に応答して、膵臓は多量の（ａ  ｂｏｌｕｓ  ｏｆ）インスリンを分泌し、これは、細胞中へのグルコースの取り込みを刺激し、肝臓にグルコース産生を低下させるようにシグナル伝達することによって、血液グルコースを正常なレベルへ戻す。食事に応答したインスリン放出には通常２つの段階がある。初期段階（肝グルコース産生の停止に関与している）は、摂食の２〜１５分以内に起こるインスリン放出のスパイクである。後期段階の放出は約２時間続く。食間に、肝臓はグリコーゲン貯蔵を取り崩してグルコースを脳や他の組織に提供する。
【０００４】
膵臓が十分な量のインスリンを産生できなくなるかまたはその能力が低下するため、あるいは、細胞がインスリンを合成および／または放出できなくなるかまたはその能力が低下するために、糖尿病は慢性的な高血糖症をもたらす結果となる。糖尿病患者においては、最初の段階の応答の効果が低下するかまたはそれがなく、食後のグルコースレベルの上昇がもたらされる。糖尿病は、世界中で２億８５００万人に影響を及ぼす主要な公衆衛生上の問題であり、この人数は、２０３０年までに４億５０００万を超えると予測されている（Ｗｉｌｄら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２７巻：１０４７〜１０５３頁（２００４年）。グルコース制御の機能不良は、１）膵臓のｆ３細胞の自己免疫媒介による破壊に起因する不十分なインスリン分泌（１型糖尿病）、または２）インスリン抵抗性と分泌の両方の障害（２型糖尿病）（Ｐｉｃｋｕｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．、２４巻：６０４〜６１０頁（２００８年）；Ｓｔｕｍｖｏｌｌら、Ｌａｎｃｅｔ、３６５巻：１３３３〜１３４６頁（２００５年）；およびＫａｈｎ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３巻：１０６６〜１０８４頁（１９９４年）によって起こる。
【０００５】
頻繁な皮下インスリン注射および血液グルコースレベルの定期的モニタリングは、１型糖尿病患者および一部の２型糖尿病患者の処置に必須のものである（Ｏｗｅｎｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３５８巻：７３９〜７４６頁（２００１年））。しかし、そうした自己投与は骨の折れることであり、欠くことのできない患者の関与を必要とする。より重要なことは、開ループインスリン送達として公知であるこの処置は、高度に動的な血液グルコース濃度のため、正常血糖を維持しない（Ｊｅａｎｄｉｄｉｅｒら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、３５巻：１７９〜１９８頁（１９９９年）；Ｏｗｅｎｓら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．、１巻：５２９〜５４０頁（２００２年））。正常レベルに、より近いグルコース濃度に対する厳重な管理の欠如は、肢の切断、失明および腎不全などの多くの慢性合併症の原因となり、致命的な低血糖症をもたらす恐れがある（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３２９巻：９７７〜９８６頁（１９９３年））。したがって、膵臓のような、血液グルコースレベルに応答してインスリンを連続的にかつ知的な方法で放出できる合成的な閉ループデバイスが非常に望まれている（Ｋｕｍａｒｅｓｗａｒａｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｄｅｖｉｃｅｓ、６巻：４０１〜４１０頁（２００９年）；Ｒａｖａｉｎｅら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１３２巻：２〜１１頁（２００８年））。
【０００６】
グルコースレベルに応答した連続的放出を実現するための直接的な戦略は、グルコースモニタリング部分とセンサー誘導インスリン放出部分を１つの系に統合することである。これまで、いくつかのグルコース応答性製剤およびデバイスが開発されてきており、それは主に以下の３つのカテゴリー：１）グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）ベースの酵素反応誘導応答系；２）結合レクチンタンパク質Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ）ベースの応答系、および３）フェニルボロン酸（ＰＢＡ）ベースの合成グルコース結合系（Ｒａｖａｉｎｅら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３２巻：２〜１１頁（２００８年））に由来する。
【０００７】
ＧＯｘベースの系は、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含む、半透性のイオン的に帯電した膜で分離されたコンパートメントを含み、Ｌｏｓｓｅｆらに対する米国特許第４，３６４，３８５号に記載されている。Ｔａｙｌｏｒに対する米国特許第６，４１０，０５３号は、グルコース濃度の変化に応じて、可逆的にグルコースと結合しインスリンを放出できる、デキストラン／コンカナバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａマトリクス中に固定されたインスリンを開示している。ＰＢＡは、フェニル置換基およびホウ素と結合した２つのヒドロキシル基を含むボロン酸である。ＰＢＡおよびその誘導体は、グルコースおよびフルクトースなどのポリオール分子と複合体を形成し、ポリ（ビニルアルコール）などのポリオールと安定なヒドロゲルを形成することができる（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．、１４巻：２８９〜２９３頁（１９９７年））。ＰＢＡがポリオールと結合する能力は、様々な方法で利用されており、グルコース結合インスリン送達系が提供されている。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびＰＢＡから得られたヒドロゲルは、ｐＨ９でグルコース濃度に応じて膨潤し収縮する。この系は、受容体の化学構造をフェニル環上で、電子求引基で改変することによって、生理学的ｐＨ条件で動作するように改変された。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、４巻（５号）：１４１０〜６頁（２００３年））。他の研究者は、ＰＢＡ部分をインスリンと直接カップリングさせて、グルコース結合インスリンを提供している。例えば、Ｈｏｅｇ−Ｊｏｈｎｓｏｎらによる米国特許公開第２００３０１８６８４６号は、アリールボロネート部分などのビルトイン型のグルコースセンサーを有するインスリン誘導体でできたインスリン送達系を開示している。
【０００８】
これらのグルコースインスリン送達系にはいくつかの限界がある。タンパク質関与型のプラットホームは、生理学的条件下では変性のため、長期間にわたって活性であることはない。ＧＯｘベースの反応は、追加的な溶存酸素を必要とする。ＣｏｎＡは著しい細胞毒性を示す。これらは、その埋め込み型（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ）の用途を制限している（Ｒａｖａｉｎｅら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３２巻：２〜１１頁（２００８年））。ＰＢＡ系については、生理学的ｐＨまたはその近傍でグルコースに応答して機能するデバイスを設計するという課題が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，３６４，３８５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４１０，０５３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３０１８６８４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、生理学的ｐＨまたはその近傍でのグルコース濃度の変化に応答性である、非毒性の相互作用的な、すなわち「スマート」なインスリン送達系を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、生理学的ｐＨでのインスリン濃度の変化に応答するスマートインスリン送達系を投与することによって、血液グルコースレベルの制御を必要とする患者における血液グルコースレベルを制御する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の制御放出のための注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワーク製剤を開発した。この製剤は、酸分解性ポリマーマトリクス、グルコースなどの生理学的成分に応答する成分、および治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤で形成された粒子を含み、第１の複数の粒子は表面に第１の非ゼロ電荷を有し、第２の複数の粒子は表面に第２の反対の非ゼロ電荷を有し、これらの粒子は相互作用して注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワークを形成し、応答性酸成分は生理学的成分の存在下で酸を生成し、酸はポリマーを分解して治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を放出する。
【００１３】
膵臓の活動を模倣し、グルコースレベル変化に応じてインスリンを放出できる人工的な「閉ループ」系は、患者のコンプライアンスおよび健康を改善することができる。自己調節されたインスリンの送達のためのグルコース媒介放出戦略は、インスリンおよびグルコース特異性酵素をロードされたデキストランナノ粒子などの逆に荷電したポリマーナノ粒子間の静電相互作用によって形成される、注射可能であり酸分解性のポリマーネットワークを使用する。グルコース媒介インスリン送達を可能にする注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワーク（ナノネットワークと指定）は、グルコース調節インスリン送達のための酸分解性および生体適合性のマトリクス材料として、化学修飾されたデキストラン（ｍ−デキストランと指定）を使用することが好ましい。製剤の分解が酵素活性、酸化還元条件または光照射などの刺激によって引き起こされる場合、他のマトリクス材料を使用することができる。この組成物は、どちらも酸分解性ポリマーマトリクス中に封入したインスリン、グルコース酸化酵素（「ＧＯｘ」）を有する、第１の複数の粒子および第２の複数の粒子を含む。酸分解性ポリマーマトリクスは好ましくは改質されたデキストランポリマーである。第１の複数の粒子は、正のゼータ電位を付与するキトサンなどの表面コーティングをさらに有する。第２の複数の粒子は、負のゼータ電位を付与するアルギネートなどの表面コーティングを有する。組み合わせて、第１の複数の粒子と第２の複数の粒子はナノネットワークゲルを形成する。このゲルは、せん断条件下で注射可能であり、非せん断条件下で剛性を有する。ナノ複合材ベースの多孔質構造体は、高血糖状態で存在する場合、グルコースのグルコン酸への触媒的転換によって解離してインスリンを放出する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインスリン放出は、グルコース濃度に応答した脈動プロファイルで調整することができる。
【００１４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験は、上記製剤が、分解性ナノネットワークを皮下投与された１型糖尿病マウスにおいて、改善されたグルコース制御を提供したことを示している。開発されたナノネットワークの単一注射は、正常血糖状態（＜２００ｍｇ／ｄＬ）の血液グルコースレベルを、少なくとも最大で１０日間の安定化を容易にした。
【００１５】
治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の制御放出のための注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワーク製剤を開示する。この製剤は、応答性ポリマーマトリクス、例えば酸分解性ポリマーマトリクス、応答性シグナル伝達手段、例えば応答性成分または組成物（その例には、応答性シグナル伝達成分、応答性酸成分および応答性酸シグナル伝達成分が含まれる）、および治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を含む粒子を含むことができる。第１の複数の粒子は表面に第１の非ゼロ電荷を有し、第２の複数の粒子は表面に第２の反対の非ゼロ電荷を有する。逆に荷電した粒子は、相互作用して注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワークを形成する。応答性成分は生理学的成分の存在下で酸を生成し、酸はポリマーを分解して治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を放出する。
【００１６】
一部の実施形態では、薬剤は、インスリンもしくはインスリン類似体、インスリン濃度、インスリンレベル、内因性インスリンを増加させる薬剤またはその組合せである。一部の実施形態では、応答性シグナル伝達手段は、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含む応答性シグナル伝達成分である。これは、グルコース応答性シグナル伝達成分の例である。一部の実施形態では、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼの酸分解性ポリマーマトリクスに対する比（ｗ／ｗ）は１：１００〜１：１５である。一部の実施形態では、グルコースオキシダーゼとカタラーゼは４：１の比（ｗ／ｗ）で存在する。
【００１７】
一部の実施形態では、その表面に正電荷を有する第１の複数の粒子と、その表面に負電荷を有する第２の複数の粒子は相互作用してゲルを形成する。一部の実施形態では、第１の複数の粒子中の粒子のゼータ電位および第２の複数の粒子中の粒子のゼータ電位は、５〜１５ｍＶの大きさを有する。一部の実施形態では、第１の複数の粒子中の粒子は、表面改質剤をさらに含むことができる。一部の実施形態では、表面改質剤はキトサンまたはアルギネートである。一部の実施形態では、その粒子は３５０ｎｍ未満の流体力学半径を有する。
【００１８】
一部の実施形態では、応答性ポリマーマトリクスは酸分解性ポリマーマトリクスであり、その酸分解性ポリマーマトリクスは、架橋性ポリマーおよび酸分解性架橋剤を含む。一部の実施形態では、酸分解性ポリマーマトリクスは、複数の加水分解可能な部分を有するポリマーを含む。一部の実施形態では、上記製剤は、高血糖状態下で解離し、正常なグルコースレベルで実質的に解離しない。一部の実施形態では、上記製剤は、４００ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度で８時間後に解離する。一部の実施形態では、上記製剤は、正常なグルコースレベルで１５時間後に実質的に解離しない。一部の実施形態では、グルコース濃度が正常な状態と高血糖状態の間で周期的に変動する場合、インスリンもしくはインスリン類似体またはインスリン濃度を増加させる薬剤の放出は脈動的である。
【００１９】
投与を必要とする個体に有効量の本明細書で開示するような注射可能なポリマーナノ粒子架橋ネットワーク製剤を投与するステップを含む、処置を必要とする患者を処置する方法も開示する。一部の実施形態では、薬剤はインスリンもしくはインスリン類似体またはインスリン濃度を増加させる薬剤であり、個体は１型または２型の糖尿病を有する。一部の実施形態では、正常血糖、正常な糖化（ｇｌｙｃａｌａｔｅｄ）アルブミンレベルまたはより高いボディコンディションスコアを維持するために、この製剤を投与する。一部の実施形態では、血液グルコース濃度を７０〜１３０ｍｇ／ｄＬまたは９０〜１１０ｍｇ／ｄＬの間で維持するのに有効な量の製剤を投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、左側にキトサンでコーティングしたｍ−デキストランナノ粒子（ＮＰ）、右側にアルギネートでコーティングしたｍ−デキストランナノ粒子（ＮＰ）を表す図であり、それぞれは封入されたインスリン、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を含む。図１Ｂは、アセタール改質デキストランポリマーｍ−デキストランの構造を表す図である。図１Ｃは、キトサンでコーティングした粒子とアルギネートでコーティングした粒子の混合によるナノネットワーク（ＮＮ）ゲルの形成を表す図である。ＧＯｘはグルコースをグルコン酸に転換し、それによってｐＨを低下させる。ＮＮおよびＮＰは分解し、それによってインスリンを放出する。図１Ｄは、高血糖症の糖尿病マウスへのＮＮゲルの皮下注射を表す図である。グルコース媒介ＮＮ分解は正常血糖を促進する。
【００２１】
【図２】図２は、ｍ−デキストランの合成および酸分解の概略図である。
【００２２】
【図３】図３Ａは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を介した酵素反応の概略図である。図３Ｂは、ＧＯｘおよびＣＡＴの異なる重量比での存在下、３７℃での、０．５ｍＬの４００ｍｇ／ｄＬグルコース食塩溶液中におけるｐＨ低下を示す、経時的（分）なｐＨのグラフである。
【００２３】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＨｅＬａ細胞と共に２４時間培養した後の、キトサンまたはアルギネートでコーティングした空のｍ−デキストランナノ粒子（図４Ａ）およびそれらの分解生成物（図４Ｂ）の濃度（マイクログラム／ｍｌ）の関数としての、細胞生存率（パーセント）のグラフである。
【００２４】
【図５】図５は、３７℃で、４００ｍｇ／ｄＬグルコースと共にインキュベーションした、ナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））の粘度およびせん断減粘性（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）挙動の経時的なグラフである。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ナノネットワークのグルコース応答性分解およびインスリン放出を示すグラフである。図６Ａは、ナノネットワークを含む異なるインキュベーション溶液における関連するｐＨ変化のグラフであり；図６Ｂは、３７℃での異なるグルコース濃度における、ナノネットワークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの累積インスリン放出のグラフであり；図６Ｃは、インスリン放出の速度をグルコース濃度の関数として示す、ナノネットワークの自己調節されたプロファイルのグラフである。データ点は、ａ）、ｄ）およびｅ）における平均値±ＳＤ（ｎ＝２）を表す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ナノネットワークのグルコース応答性分解およびインスリン放出を示すグラフである。図６Ａは、ナノネットワークを含む異なるインキュベーション溶液における関連するｐＨ変化のグラフであり；図６Ｂは、３７℃での異なるグルコース濃度における、ナノネットワークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの累積インスリン放出のグラフであり；図６Ｃは、インスリン放出の速度をグルコース濃度の関数として示す、ナノネットワークの自己調節されたプロファイルのグラフである。データ点は、ａ）、ｄ）およびｅ）における平均値±ＳＤ（ｎ＝２）を表す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ナノネットワークのグルコース応答性分解およびインスリン放出を示すグラフである。図６Ａは、ナノネットワークを含む異なるインキュベーション溶液における関連するｐＨ変化のグラフであり；図６Ｂは、３７℃での異なるグルコース濃度における、ナノネットワークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの累積インスリン放出のグラフであり；図６Ｃは、インスリン放出の速度をグルコース濃度の関数として示す、ナノネットワークの自己調節されたプロファイルのグラフである。データ点は、ａ）、ｄ）およびｅ）における平均値±ＳＤ（ｎ＝２）を表す。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、１型糖尿病処置のためのナノネットワークのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のグラフである。１×ＰＢＳ、ナノネットワーク封入インスリンおよび酵素（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、ナノネットワーク封入インスリンだけ（ＮＮ（Ｉ））、酵素だけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））または純粋なインスリン溶液を皮下注射した後のＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスにおける血液グルコースレベル（７Ａ）および血漿ヒトインスリン濃度（７Ｃ）。投与時間にわたって正常血糖範囲（＜２００ｍｇ／ｄＬ）内にある、異なる群におけるマウス数の変化を図７Ｂに示す。ＰＢＳ、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）、ＮＮ（Ｉ）、ＮＮ（Ｅ）およびインスリン溶液で処置されたマウスの糖化アルブミンパーセンテージを図７Ｄに示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データ点は平均値±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、１型糖尿病処置のためのナノネットワークのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のグラフである。１×ＰＢＳ、ナノネットワーク封入インスリンおよび酵素（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、ナノネットワーク封入インスリンだけ（ＮＮ（Ｉ））、酵素だけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））または純粋なインスリン溶液を皮下注射した後のＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスにおける血液グルコースレベル（７Ａ）および血漿ヒトインスリン濃度（７Ｃ）。投与時間にわたって正常血糖範囲（＜２００ｍｇ／ｄＬ）内にある、異なる群におけるマウス数の変化を図７Ｂに示す。ＰＢＳ、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）、ＮＮ（Ｉ）、ＮＮ（Ｅ）およびインスリン溶液で処置されたマウスの糖化アルブミンパーセンテージを図７Ｄに示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データ点は平均値±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、１型糖尿病処置のためのナノネットワークのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のグラフである。１×ＰＢＳ、ナノネットワーク封入インスリンおよび酵素（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、ナノネットワーク封入インスリンだけ（ＮＮ（Ｉ））、酵素だけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））または純粋なインスリン溶液を皮下注射した後のＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスにおける血液グルコースレベル（７Ａ）および血漿ヒトインスリン濃度（７Ｃ）。投与時間にわたって正常血糖範囲（＜２００ｍｇ／ｄＬ）内にある、異なる群におけるマウス数の変化を図７Ｂに示す。ＰＢＳ、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）、ＮＮ（Ｉ）、ＮＮ（Ｅ）およびインスリン溶液で処置されたマウスの糖化アルブミンパーセンテージを図７Ｄに示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データ点は平均値±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、１型糖尿病処置のためのナノネットワークのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のグラフである。１×ＰＢＳ、ナノネットワーク封入インスリンおよび酵素（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、ナノネットワーク封入インスリンだけ（ＮＮ（Ｉ））、酵素だけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））または純粋なインスリン溶液を皮下注射した後のＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスにおける血液グルコースレベル（７Ａ）および血漿ヒトインスリン濃度（７Ｃ）。投与時間にわたって正常血糖範囲（＜２００ｍｇ／ｄＬ）内にある、異なる群におけるマウス数の変化を図７Ｂに示す。ＰＢＳ、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）、ＮＮ（Ｉ）、ＮＮ（Ｅ）およびインスリン溶液で処置されたマウスの糖化アルブミンパーセンテージを図７Ｄに示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データ点は平均値±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。
【００２７】
【図８】図８は、１×ＰＢＳ、インスリンおよび酵素を封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、インスリンだけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｉ））、酵素だけを封入したナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））または純粋なインスリン溶液を皮下注射した後のＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスにおける血液グルコースレベルの１２時間モニタリングのグラフである。
【図９】図９は、ナノネットワークのｉｎ  ｖｉｖｏでのグルコース応答性を示すグラフである。ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）の注射後６日で、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）で処置した群において、ｉ．ｖ．グルコース耐性テストを実施し（１．５ｇ／ｋｇ体重）、健常なマウスと比較した。データを平均値±ＳＤ（ｎ＝５）として表す。
【００２８】
【図１０】図１０はｉｎ  ｖｉｖｏでの生体適合性を示すグラフであり、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）およびＮＮ（Ｉ）で処置されたＳＴＺ誘発Ｃ５７Ｂ６糖尿病マウスの注射部位における、塊（ｌｕｍｐ）の大きさの経時的な変化のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用する「親水性の」は、有機溶媒と比較して、水に対してより高い親和性を有し、したがって水へのより高い溶解度を有する分子を指す。化合物の親水性は、水（または緩衝水溶液）とオクタノール、酢酸エチル、塩化メチレンまたはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどの水非混和性有機溶媒との間のその分配係数を測定することによって定量することができる。平衡に達した後、有機溶媒中より水中に、より高い濃度の化合物が存在すれば、その化合物は親水性であるとみなされる。
【００３０】
本明細書で使用する「疎水性の」は、水と比較して、有機溶媒に対してより高い親和性を有し、したがって有機溶媒へのより高い溶解度を有する分子を指す。化合物の疎水性は、水（または緩衝水溶液）とオクタノール、酢酸エチル、塩化メチレンまたはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどの水−非混和性有機溶媒との間のその分配係数を測定することによって定量することができる。平衡に達した後、水中より有機溶媒中に、より高い濃度の化合物が存在すれば、その化合物は疎水性であるとみなされる。
【００３１】
本明細書で使用する「ヒドロゲル」は、微細分散した半固体状態のポリマー分子のゼラチン様コロイドまたは凝集体を指し、そのポリマー分子は外部相または分散相中にあり、水（または水溶液）は内部相または分散相を形成している。一般に、ヒドロゲルは少なくとも９０重量％の水溶液である。
【００３２】
本明細書で使用する「ペプチド」は、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」を含み、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって一緒に連結されているα−アミノ酸残基の鎖を指す。ペプチドの長さは、下端で、自己集合性ペプチドを形成するのに必要な最小数のアミノ酸によってのみ制限される。
【００３３】
本明細書で使用する「小分子」は、２，０００ダルトン未満、１，５００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、７５０ダルトン未満または５００ダルトン未満の分子量を有する、有機もしくは有機金属化合物などの分子を指す。この小分子は、親水性、疎水性または両親媒性の化合物であってよい。
【００３４】
本明細書で使用する「オリゴマー（の）（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ）」という用語は、主に複数のモノマー単位からできているものを説明するものであり、一般に「オリゴマー」と称される。オリゴマーは、１０ダルトン〜１５，０００ダルトン、１００ダルトン〜１０，０００ダルトンまたは５００ダルトン〜５，０００ダルトンの分子量を有することができる。オリゴマーは、３〜１００個のモノマー単位、４〜５０個のモノマー単位または５〜２５個のモノマー単位を有することができる。
【００３５】
本明細書で使用する「酵素」という用語は、一般に、酵素類の１つまたはその組合せを指すことができる。酵素変異体（例えば組み換え技術によって作製された）は、「酵素」という用語の意味に包含されることを理解されたい。
【００３６】
本明細書で使用する「ポリマー（の）（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）」という用語は、主に「ポリマー」からできているものを説明するものである。「ポリマー」という用語は、当技術分野で一般に認識されている。「ポリマー（の）」という用語は、これらに限定されないが、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマーなど、ならびにインターポリマー、および上記のすべてのブレンドおよび組合せを含むものと広く解釈すべきである。本明細書で使用するポリマー成分は一般に、１ｋＤａ超、５ｋＤａ超または１０ｋＤａ超の分子量を有する。
【００３７】
「取り込ませる（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」および「封入した（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）」という用語は、所望の用途における活性薬剤の持続放出などの放出を可能にする、組成物中にかつ／または組成物上にそうした薬剤を取り込む、製剤化するあるいは他の方法で包含することを指す。これらの用語は、それによって、治療薬剤または他の材料がポリマーマトリクス中に取り込まれる、任意の方法を意図する。その任意の方法としては、例えば、そうしたポリマーのモノマーに（共有結合相互作用、イオン相互作用または他の結合相互作用によって）結合させる、物理的混和、その薬剤を該ポリマーのコーティング層中に包む、該ポリマー中に取り込ませる、該ポリマーマトリクス全体に分散させる、該ポリマーマトリクスの表面に付加する（共有結合相互作用または他の結合相互作用によって）、該ポリマーマトリクスの中に封入する等が挙げられる。「共組み込み（ｃｏ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」または「共封入（ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、対象組成物中への、治療薬剤または他の材料および少なくとも１つの他の治療薬剤または他の材料の組み込みを指す。
【００３８】
本明細書で使用する「ナノ粒子」は一般に、約１ｎｍから最大で、これに限定されないが約１ミクロンまでを含む、好ましくは３ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有する任意の形状の粒子を指す。球形を有するナノ粒子は通常「ナノスフェア」と称される。ナノ粒子のサイズは、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）および蛍光相関分光（ＦＣＳ）を含む当技術分野で公知の様々な方法を使用して実験的に決定することができる。
【００３９】
本明細書で使用する「生体適合性」および「生物学的に適合性」は一般に、任意の代謝産物またはその分解生成物と一緒に、一般にレシピエントに対して非毒性であり、レシピエントに対して重大な有害作用を引き起こさない材料を指す。一般的に言えば、生体適合性材料は、個体に投与した場合、重大な炎症性、免疫性または毒性の応答を引き起こさない材料である。
【００４０】
「生分解性ポリマー」および「生体浸食性ポリマー」は本明細書では互換的に使用され、一般に、生理学的条件下で、酵素作用または加水分解によって分解するかまたは浸食され（ｅｒｏｄｅ）、被験体によって代謝、排除または排出され得る、より小さい単位または化学種となるポリマーを指す。分解時間は、ポリマー組成、形態、例えば空隙率、粒子寸法および環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の関数である。適切な分解時間は数時間から数週間、より好ましくは数時間から数日間である。例えば、ポリマーは、１時間〜１４日間、３時間〜７日間、１２時間〜７日間または１８時間〜２日間の期間にわたって分解することができる。
【００４１】
「ゼータ電位」という用語は、本明細書では、これらに限定されないが、界面にわたって生じる電位の勾配を意味するために使用される。この用語は、特に、ナノ粒子の表面での界面にわたって生じる電位勾配を指し、また、表面電荷も指す。粒子の移動速度は、表面電荷の量および印加される場の強度に依存する。正のゼータ電位を有する粒子は負極の方へ移動し、同様に、負のゼータ電位を有する粒子は正極の方へ移動する。移動の速度を決定するためには、移動する粒子に、電場でレーザーを照射させる。その粒子の動きを、入射光と比較した反射光における周波数シフトで測定する。周波数シフトの量は移動スピードに依存する。これがいわゆるドップラー周波数シフト（ドップラー効果）である。ドップラー周波数から、波長、散乱角および粒子の移動速度を誘導することができる。電気泳動移動度は、移動スピードと電界強度の比によって決定される。ゼータ電位は、電気泳動移動度に正比例し、通常ｍＶで表される。本明細書で使用する「ゼータ電位」は、そのゼータ電位および粒子サイズ分布が、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによる９０Ｐｌｕｓ粒子サイズ分析器を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された場合に、定義される。
【００４２】
本明細書で互換的に使用される「スマート送達系」または「相互作用的送達系」という用語は、送達の速度が、送達の必要性を示す１つもしくは複数の刺激に応答性である１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤のための送達系を指す。すなわち、非限定的な例として、例えばスマートインスリン送達系は、インスリンを、送達系の近傍のグルコースレベルに依存する速度で送達する。
【００４３】
全応答、すなわち、放出されたインスリンの全量またはポリマーマトリクスの分解の全量は、分解を促進するのにｐＨが十分酸性である全時間、すなわち、正常血糖を回復させるのに要する時間量に依存する。その応答は、脈動的であることが好ましく、生理学的ｐＨ７．４でインスリンがほとんどまたは全く放出されない（分解がほとんどないか全くない）ことが好ましい。本明細書に記載する酸分解性ポリマーは、ｐＨ５よりｐＨ７．４の溶液で、有意に低い分解速度を有するべきである。好ましい実施形態では、ポリマーは、３７℃、ｐＨ５．０で５分間〜２４時間の分解半減期を有するが、ｐＨ７．４では、少なくとも１２時間から２５０日間のより長い半減期を有するべきである。一部の実施形態では、酸性ｐＨでの生体活性材料の迅速な放出、および生理学的ｐＨでの生体活性材料の遅い放出を容易にするために、ポリマーは、３７℃、ｐＨ５．０で約５〜３０分間、約２〜５時間または約２４時間の半減期を有し、他方３７℃、ｐＨ７．４で約９０日間、約１８０日間または約２５０日間の半減期を有することが有用であり得る。一部の実施形態では、改質ポリヒドロキシル化ポリマーは、７．４より高いｐＨで大部分が安定であるが、好ましくは約５のｐＨで加水分解する。
【００４４】
本明細書で使用する「脈動的」または「脈動的放出」という用語は、被験体への単回投与からの複数用量の放出を指す。個々の用量は、送達系の製剤および用途に応じて、様々な間隔で投与することができる。スマート脈動送達系は、１つもしくは複数の刺激に応答して、複数用量の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を投与することができ、送達されるその投薬量は、刺激の目標値からの偏位に応答していることが好ましい。非限定的な例として、スマート脈動インスリン送達系は、正常血糖の期間は、インスリンをほとんど送達しないかまたは全く送達しないが、正常血糖からの偏位に敏感な低血糖状態に応答して、好ましくは正常血糖グルコースレベルを回復するのに十分な量で、適量のインスリンを送達することが好ましい。
【００４５】
放出される量は、そのｐＨ、その例としてインスリン送達系に応答したｐＨ、および生理学的ｐＨに局所的に回復するまでの時間に依存し、より一般的には、放出される量は、外部刺激の正常値からの偏位、および正常値に戻るのに必要な時間に依存するはずである。
【００４６】
本明細書で使用する「リガンドとアクセプターの対」という用語は、生体適合性リガンドとアクセプターの任意の組合せを指すことができ、そのリガンドは、排他的にまたは主として、アクセプターと会合する。その会合は、これらに限定されないが、非共有結合相互作用（すなわち、例えばイオン性、ファン・デル・ワールス力、静電的等）または共有結合相互作用の１つもしくは複数を含むことができる。リガンドおよび／またはアクセプターは、天然由来のものであっても合成のものであってもよい。リガンドは、核酸、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、プロテオグリカン、炭水化物、脂質、小分子等であってよい。受容体は、細胞表面受容体またはその類似体もしくは誘導体などの天然由来の受容体であってよく、あるいは合成受容体であってもよい。受容体は、タンパク質、炭水化物、脂質および／または核酸であってよい。リガンドとアクセプターの対は、高い親和性で結合することが好ましい。「高親和性」で結合するリガンドとアクセプターの対は、１μＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または１００ｐＭ未満の解離定数で結合する。
【００４７】
ＩＩ．制御された応答性インスリン放出のためのスマートナノネットワーク
血液グルコースレベルに応答してインスリンを連続的かつ知的な方法で放出できる人工的な膵臓様の合成閉ループデバイスを開発した。この注射可能なゲル様ナノネットワークは、インスリンの長期間送達のために、マトリクス材料として酸分解性および生体適合性のデキストランなどの材料を使用する。グルコースオキシダーゼを取り込むことによって、ナノネットワークは、高血糖症状態下で効果的に解離することができる。これは、グルコース応答性の仕方での自己調節ベースのインスリン送達系の開発に適している。
【００４８】
このアプローチで使用されるバルクポリマーマトリクスは、高度に生体適合性で、生分解性である。代表的なポリマーには、デキストラン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、キトサン、アルギネートおよびポリ（ベータ−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）が含まれる；
ペイロードを有するナノネットワークは皮下注射によって直接投与することができる；
小さなナノ粒子のサイズならびにナノネットワークの多孔質構造は、試薬の完全な接触ならびに容易な拡散のために、大きな表面積を提供する；
ナノネットワーク構造は、ほぼゼロ次の動力学で薬物放出を調整することができる；
ナノネットワークを介したペイロード（インスリン）の封入効率は高い（すなわち、４０〜６０％）；および
マトリクス材料の分解性を調整して、放出プロファイルを調整することができる。
【００４９】
機能的観点から、例で実証すると、
【００５０】
ナノネットワークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインスリン放出プロファイルは、顕著な脈動パターンを示し、高血糖レベル（４００ｍｇ／ｄＬ）で高い放出速度であり、正常レベル（１００ｍｇ／ｄＬ）で低い放出速度である。これは、自己調節ベースの閉ループ送達系のためには非常に望ましいことである；
【００５１】
ナノネットワークは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続したインスリン放出ならびにインスリン活性放出の長期の薬理学的持続期間（最大で７〜１０日間）を示す。注射用量ならびに分解特性またはマトリクス材料を調整することによって、活性持続期間をさらに改善することができる。
【００５２】
インスリンの長期間のグルコース応答性の送達のためのこのナノネットワークベースのプラットホームは、最適化された場合、閉ループインスリン送達のための最近のアプローチを凌ぐ利点を有している。これは、スマートさと安全性の両方の目的のための競争力のある送達ツールである。さらに、インスリンの輸送のほかに、このプラットホームは、インスリン類似体、他のタンパク質／ペプチドおよび小分子の抗炎症薬を含む他の治療薬剤の送達または共送達に拡張することもできる。糖尿病管理のためのデバイスおよび治療方法の相当な市場規模を考慮して、持続した長期間の放出、知的な応答、投与の容易さ、良好な生体適合性および簡易な調製で特定される戦略は、明らかに広範な関心をもたらす。
【００５３】
ナノネットワークの概略図を図１Ａ〜１Ｃに示す。逆に荷電した分解性ナノ粒子は静電力により、相互作用し自己集合して凝集性ゲル様ネットワークを生み出す。生成されたゲルネットワークは、グルコースとＧＯｘの間の最大の相互作用のため表面積と体積の大きな比をもたらす、安定な三次元の多孔質構造を形成する（図２Ｂ）。この設計の材料は、ほぼゼロ次の動力学２５でペイロードを放出するはずである。さらに、ナノネットワークは、加えられるせん断力が増加するのにしたがって、粒子−粒子相互作用の中断に起因したせん断減粘性挙動をもたらす。外力が取り除かれると、強い凝集特性が回復され、これは、好都合な成形および注入を可能にする（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００５４】
例は、一方のタイプが、そのヒドロキシ基が２エトキシプロペンで第三エーテルに転換されている改質デキストランナノ粒子から形成され、他方のタイプがアルギネートで形成されている、２つのタイプのナノ粒子から形成されたゲルを示す。粒子表面は、キトサンまたはアルギネートでコーティングされて、表面にそれぞれ正または負の電荷を生成する。次いで、荷電粒子はゲルを形成する。これらの粒子は、インスリンおよびＧＯｘ／ＣＡＴ（グルコースオキシダーゼ／カタラーゼ（ｃａｔｙｌａｓｅ）をロードされる。ＧＯｘ／ＣＡＴ系はグルコースを局所的なｐＨ変化へと変換する。改質ポリマーはｐＨ応答性である。
【００５５】
Ａ．応答性ポリマーマトリクス
バルクポリマーマトリクスは、高度に生体適合性および生分解性であるべきである。バルクポリマーマトリクスは、１つまたは複数の外部刺激に対して応答性である生分解速度を有するべきである。外部刺激は、ｐＨ、温度、１つもしくは複数の化学剤または酵素剤の濃度、放射線等を含むことができる。好ましい一連の実施形態では、バルクポリマーマトリクスの生分解速度は、局所ｐＨに対して応答性である。
【００５６】
代表的なポリマーには、多糖、例えばアルギネート、キトサン、デキストラン、マンナン、プルラン、ヒアルロン酸（ＨＡ）ならびにキサンタンゴムのホモポリマーおよびコポリマー；生分解性ポリエステル、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）およびポリカプロラクトン；アクリレートおよびメタクリレートポリマー、例えば２−（ヒドロキシエチル）メタクリレートおよびそのコポリマーが含まれる。一部の実施形態では、生分解速度を、コポリマー中の繰り返し単位の比を変えることによって調整することができる。例えば、ポリマーマトリクスがポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である場合、生分解速度は、ポリマー中の乳酸とグリコール酸の比を変えることによって、制御された形で、数日間から数カ月まで変化させることができる。一部の実施形態では、ポリマーマトリクスを形成するポリマーを改質して、１つもしくは複数の外部刺激に対する応答性を提供するまたはそれを増強させることができる。これらは、好ましくは親水性ポリマーである。例えば、一部の実施形態では、多糖などの生分解性ポリマーを、ｐＨ応答性であるように改質する。
【００５７】
好ましい実施形態では、バルクポリマーマトリクスの生分解速度は、局所ｐＨに対して応答性である。薬物送達において有用なｐＨ感受性ポリマーの例には、ポリアクリルアミド、フタレート誘導体、例えば炭水化物の酸フタレート（ａｃｉｄ  ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、アミロースアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、他のセルロースエステルフタレート、セルロースエーテルフタレート、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルエチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルアセテートハイドロジェンフタレート、フタル酸酢酸セルロースナトリウム、デンプン酸フタレート（ｓｔａｒｃｈ  ａｃｉｄ  ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、スチレン−マレイン酸ジブチルフタレートコポリマー、スチレン−マレイン酸ポリビニルアセテートフタレートコポリマー、スチレンおよびマレイン酸コポリマー、ポリアクリル酸誘導体、例えばアクリル酸およびアクリル酸エステルコポリマー、ポリメタクリル酸およびそのエステル、ポリアクリル酸メタクリル酸コポリマー、セラックならびに酢酸ビニルおよびクロトン酸コポリマーが含まれる。
【００５８】
好ましい実施形態では、バルクポリマーマトリクスを形成するポリマーを改質して局所ｐＨに対する応答性を提供するまたは増大させる。例えば、一部の実施形態では、ポリマーは、可逆的に改質されたヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化ポリマーである改質ポリヒドロキシル化ポリマーであり、そのヒドロキシル基は、酸分解性官能基を特徴とするように改質されている。例示的な酸分解性官能基は、アセタール、芳香族アセタール、ケタール、ビニルエーテル、アルデヒドまたはケトンであってよい。ポリヒドロキシル化ポリマー中のヒドロキシル基は改質されており、それによって、改質ポリヒドロキシル化ポリマーに、酸分解性、ｐＨ感受性および一般に水への不溶性が付与される。ポリヒドロキシル化ポリマーは、これらに限定されないが、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）ヒドロキシル化ポリマー、多糖、炭水化物、ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、例えばポリセリンおよび他のポリマー、例えば２−（ヒドロキシエチル）メタクリレートを含む予め形成された天然ポリマーまたはヒドロキシル含有ポリマーであってよい。改質ポリヒドロキシル化ポリマーを形成させるために使用できる多糖の例には、これらに限定されないが、デキストラン、マンナン、プルラン、マルトデキストリン、デンプン、セルロースおよびセルロース誘導体、ゴム（例えば、キサンタン、イナゴマメ等）ならびにペクチンが含まれる。一実施形態では、多糖はデキストランまたはマンナンである。
【００５９】
改質ポリヒドロキシル化ポリマー中のヒドロキシル基の可逆的改質を行って、そのポリマー中のヒドロキシル基の少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％が改質されている、改質ヒドロキシル基を提供することができる。
【００６０】
ポリヒドロキシル化ポリマーの選択および改質の程度は、合成の容易さ、溶解性、市販の試薬、所望する酸分解性ポリマーの種類、ローディング効率、ポリマーからなる薬物送達系の分散性、毒性およびアセタール結合の加水分解速度などの因子にもとづき得る。分解生成物は生体適合性であり、生分解性であることが好ましい。例えば、分解生成物は非免疫原性で非毒性であるべきであり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が当業者によって是認されるサイズおよび／または毒性レベルが好ましい。
【００６１】
改質ポリヒドロキシル化ポリマーは、ペンダントアセタールで改質された多糖であってよく、したがってアセタール誘導化多糖を提供することができる。一部の実施形態では、改質ポリヒドロキシル化ポリマーは、アセタール誘導化デキストラン、アセタール誘導化マンナンまたはアセタール誘導化ポリビニルアルコール、好ましくはアセタール誘導化デキストランである。
【００６２】
改質ヒドロキシル基において改質された官能性（例えば、アセタールまたはケタール）結合を有する改質ポリマーは、酸触媒作用による加水分解によって分解されて、完全に排出することができるより低い分子量化合物に分解するはずである。これらのポリマーの加水分解速度は、遅い分解から速い分解への官能基（例えば、アセタールまたはケタール）結合の変更、改質の程度または改質の疎水性によって変えることができ、したがって、薬物送達のための広範な放出動力学を提供することができる。したがって、異なる酸感受性を有する様々な酸分解性結合をポリマー骨格に取り込むことができ、ポリマーの加水分解速度のより高度な制御が可能にすることが意図される。
【００６３】
好ましい実施形態では、本明細書に記載する本発明の酸分解性ポリマーは、ｐＨ５よりｐＨ７．４で、溶液中での有意に遅い分解速度を有するべきである。好ましい実施形態では、ポリマーは、好ましくは３７℃、ｐＨ５．０で５分間〜２４時間の分解半減期を有するが、ｐＨ７．４では少なくとも１２時間〜２５０日間のより長い半減期を有するべきである。一部の実施形態では、酸性ｐＨでの生体活性材料の迅速な放出を容易にし、生理学的ｐＨでの生体活性材料の放出を遅延させるために、ポリマーは、３７℃、ｐＨ５．０で約５〜３０分間、約２〜５時間または約２４時間の半減期を有し、３７℃、ｐＨ７．４で約９０日間、約１８０日間または約２５０日間の半減期を有することが有用であり得る。一部の実施形態では、改質ポリヒドロキシル化ポリマーは７．４より高いｐＨで大部分が安定であるが、好ましくは約５のｐＨで加水分解する。一実施形態では、改質ポリマーは、一般的な有機溶媒中に溶解性であって様々な材料に加工するのを容易にする。別の実施形態では、これらの改質ポリマーは水溶性ではない。
【００６４】
製剤の分解が酵素活性、酸化還元条件または光照射などの他の刺激によって引き起こされる場合、他のマトリクス材料を使用することができる。
【００６５】
Ｂ．応答性シグナル伝達手段
一部の実施形態では、バルクポリマーマトリクスは、目的の外部刺激に対して応答性である分解速度を有する。例えば、特定の酵素を検出したら生物活性薬剤を送達するように設計された組成物は、その特定の酵素の存在によって増加する生分解速度を有するポリマーを含むことができる。他の実施形態では、その組成物は、所望の刺激を、ポリマーマトリクスの生分解に影響を及ぼす局所的な変化に転換させる応答性シグナル伝達手段を含むことができる。例えば、ｐＨ応答性ポリマーマトリクスを含む組成物は、特定の被検体の存在を検出し、応答してｐＨを局所的に変化させることができるシグナル伝達手段を含むことができる。好ましい実施形態では、組成物は、グルコース濃度に応答して１つまたは複数のパラメーターを局所的に変化させることができるグルコース応答性シグナル伝達手段を含む。例えば、ｐＨ応答性ポリマーマトリクス、および血液グルコースレベルに応答してｐＨを局所的に変化させることができるシグナル伝達成分を含む組成物を提供する。
【００６６】
酵素は、細菌、真菌または酵母菌などの任意の適切な供給源に由来し得る。応答性シグナル伝達手段として適切に取り込むことができる酵素の種類には、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼが含まれる。好ましい酵素には、オキシドレダクターゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびラッカーゼならびにカタラーゼが含まれる。当業者は、応答性シグナル伝達手段の全量は、応答性ポリマーマトリクスの量およびそのシグナル伝達手段の活性レベルに依存することを理解されよう。一部の実施形態では、応答性ポリマーマトリクスは、上記した酸分解性ポリマーおよびＧＯｘ／ＣＡＴシグナル伝達手段を含み、好ましくは、全酵素とポリマーの比（ｗ／ｗ）は、１：１０００〜１：１、好ましくは１：５００〜１：２、より好ましくは１：１００〜１：１５である。グルコースオキシダーゼは、基本的に（ｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）、グルコースを酸化してグルコン酸を生成させることができる限り、好ましくは、カタラーゼと組み合わせて使用した場合に過酸化物も生成できる、グルコースオキシダーゼ活性を示す任意の生体適合性酵素であってよい。市販のグルコースオキシダーゼには、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ  Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手できるＧＬＵＺＹＭＥ（商標）２．５００  ＢＧ、ＧＬＵＺＹＭＥ（商標）１００００ＢＧおよびＧＬＵＺＹＭＥ（商標）ＭＯＮＯ  １００００ＢＧ、ＤＳＭから入手できるＦＥＲＭＩＺＹＭＥ（商標）ＧＯ  １０．０００およびＦＥＲＭＩＺＹＭＥ（商標）ＧＯ  １５００、Ａｍａｎｏから入手できるＨＹＤＥＲＡＳＥ（商標）１５およびＨＹＤＥＲＡＳＥ（商標）ＨＣ、またはＧｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ．から入手できるＯＸＹＧＯ（登録商標）が含まれ、市販のカタラーゼには、ＴＥＲＭＩＮＯＸ（商標）およびＴＥＲＭＩＮＯＸ  Ｕｌｔｒａ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＣａｔａｌａｓｅ  Ｔ１００Ｔ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）が含まれる。
【００６７】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）は、以下の反応で示される、酸素の存在下で、グルコースのグルコン酸への転換を触媒する酵素である。
【化１】
2016517885.tif 000003
【００６８】
ＧＯｘを用いる従来のグルコース応答性系は一般に、酵素を生体材料内に捕捉するかまたは固定し、グルコース濃度が増加するのに応じたｐＨの局所的な低下を引き起こす。例えば、Ｇｏｒｄｉｊｏら、Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２０１１年、２１巻（１号）：７３〜８２頁；Ｆｉｓｃｈｅｌ−Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８８年、８５巻（７号）：２４０３〜２４０６頁；およびＴｒａｉｔｅｌら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０００年、２１巻（１６号）：１６７９〜１６８７頁を参照されたい。この戦略にもとづいて、Ｂｒａｔｌｉｅら、Ａｄｖ．  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍａｔｅｒ．  ２０１２年、１巻：２６７〜２８４頁およびＲａｖａｉｎｅら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８年、１３２巻（１号）：２〜１１頁に記載されているものなどのいくつかのバルクヒドロゲル系が開発されている。しかし、これらなどのバルクヒドロゲル系は、物質移動の限界のため、グルコース濃度の変化に対して、遅い応答を示す。他方、ＧＯｘ含有膜は、機械的強度が劣っており、早過ぎるインスリン漏出がもたらされる問題がある。
【００６９】
コロイド状ヒドロゲル材料は、グルコース濃度の変化に対する迅速な応答を提供することができる。その組成物は、ＧＯｘとカタラーゼ（ＣＡＴ）の両方を含むことができる。カタラーゼ酵素は、グルコースのグルコン酸へのＧＯｘ媒介酸化において消費されるＯ２を提供することによってＧＯｘ酵素と組み合わせて機能する（図３Ａに示したように）。生成したＨ２Ｏ２は、ＣＡＴによって転換されてＯ２へ戻り、グルコースの転換のための酸素の供給源および高い推進力を提供する。
【００７０】
酵素の全量は、複数の因子、特に、ポリマーマトリクスの全量および酵素の活性レベルに依存する。
【００７１】
実施例１は、３．５ｍｇの全酵素（ＧＯｘおよびＣａｔ）および２４０ｍｇの改質デキストランを有する。当業者は、応答性シグナル伝達手段の全量が、応答性ポリマーマトリクスの量およびシグナル伝達手段の活性レベルに依存することを理解されよう。一部の実施形態では、応答性ポリマーマトリクスは、上記した酸分解性ポリマーおよびＧＯｘ／ＣＡＴシグナル伝達手段を含み、好ましくは全酵素とポリマーとの比（ｗ／ｗ）は、１：１０００〜１：１、好ましくは１：５００〜１：２、より好ましくは１：１００〜１：１５である。グルコースオキシダーゼは、基本的に、グルコースを酸化してグルコン酸を生成させることができる、好ましくは、カタラーゼと組み合わせて使用した場合に過酸化物も生成できる、グルコースオキシダーゼ活性を示す任意の生体適合性酵素であってよい。
【００７２】
一部の実施形態では、ＧＯｘとＣＡＴとの重量比は、グルコースレベルが変化するのに応答して酵素混合物の能力を増強させるように最適化される。ＧＯｘとＣＡＴとの重量比は１：１００〜１００：１であってよいが、好ましくはその比は１：１〜８：１である。一部の実施形態では、ＧＯｘ／ＣＡＴ系の応答は、約４：１のＧＯｘとＣＡＴとの重量比で最適化される。
【００７３】
応答性シグナル伝達手段は、ポリマーマトリクスに取り込むことができ、粒子の表面にコーティングすることができ、異なる生分解性粒子中に封入することができ、あるいは、その組成物とは別個に投与することができる。好ましい実施形態では、応答性シグナル伝達手段を、組成物中に、好ましくは応答性ポリマーマトリクス中に取り込む。
【００７４】
応答性シグナル伝達手段は、上記したＧＯｘ／ＣＡＴシグナル伝達手段などの１つまたは複数の酵素を含むことができる。この目的に適した酵素は、任意の酵素であってよい。適切な酵素には、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ラクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、ニトリラーゼおよびその混合物が含まれる。ヒドロラーゼは基質を加水分解するものであり、それらには、これらに限定されないが、プロテアーゼ（細菌性、真菌性、酸性、中性またはアルカリ性）、アミラーゼ（アルファまたはベータ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼおよびその混合物が含まれる。特に目的とする酵素は、オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼである。
【００７５】
一部の実施形態では、１つまたは複数のオキシダーゼをＣＡＴと組み合わせて含む応答性ヒドロゲル組成物を提供する。必要に応じてＣＡＴと組み合わせて使用できる酵素の例には、グルコースオキシダーゼ、α−ヒドロキシオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびフルクトースデヒドロゲナーゼが含まれる。例えば、ｐＨ応答性ポリマーマトリクスならびにアルコールオキシダーゼとカタラーゼの酵素組合せを含むヒドロゲル組成物（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を、血液アルコールレベルに応答して１つまたは複数の活性薬剤を送達するために使用することができる。
【００７６】
Ｃ．表面改質剤
一部の実施形態では、粒子を、表面改質剤でコーティングする。表面改質剤を、ある電荷を有する粒子を作製するためか、あるいは、異なる電荷を有する粒子を作製するため、すなわち、２つまたはそれ超の複数の粒子を作製するために、塗布することができるが、ここで、１つの複数の粒子が、より大きな強度の電荷（より強い負またはより強い正の）を有し得るか、または、異なる複数の粒子と比較して反対の電荷を有することができる。図１Ａおよび図１Ｂに示すように、反対電荷のナノ粒子を、ゲルを作製するために使用することができる。表面改質剤は、本来的に、小分子、オリゴマーの分子またはポリマーの分子であってよい。表面改質剤は、電荷、電荷密度、ゼータ電位、機械的強度、剛性、色、表面粗度、磁気モーメント、または表面の部分の存在および密度に関連した１つもしくは複数の特性を改質することができる。その部分は、粒子間に、特異的または非特異的な誘引（結合）相互作用を生み出す部分を含むことができる。例示的な部分は、リガンドおよびアクセプター対、例えば抗原／抗体対、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプター、ならびに架橋性部分を含むことができる。例えば、第１の複数の粒子は、複数のアクセプター部分を提供する表面改質剤を有することができ、ここで、第２の複数の粒子は、アクセプターを特異的に結合する複数の標的リガンドを提供する表面改質剤を有することができ、それによって、異なる粒子間に強い誘引相互作用を生み出すことができる。同様に、複数の水素結合ドナーを提供する表面を有する粒子は、複数の水素結合アクセプターを提供する粒子に対して強い誘引相互作用を有する。
【００７７】
一部の実施形態では、表面改質剤は、好ましくは高親和性で結合する１つまたは複数のリガンド／アクセプター対を含む。高親和性リガンド／アクセプター対は文献で公知である。例示的な高親和性リガンド／アクセプター対には、ＦＫ５０６／ＦＫＢＰ１２、メトトレキサート／ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＰＰＩ−２４５８／メチオニンアミノペプチダーゼ、ビオチン／ストレプトアビジン四量体、ヒルジン／トロンビン、ＺＦＶＰ（Ｏ）Ｆ／カルボキシペプチダーゼおよびクロロアルカン／ハロアルカンデハロゲナーゼが含まれる。高親和性結合対を決定する方法は公知であり、高親和性リガンド／アクセプター対を同定するために使用することができる。
【００７８】
一部の実施形態では、表面改質剤は、１つまたは複数の水素結合ドナーおよび／または１つまたは複数の水素結合アクセプターを含むことができる。例示的な水素結合ドナーは、アルコール、フェノール、カルボン酸、第一級および第二級アミン、ホスホン酸、リン酸エステル、スルホン酸および硫酸を含む、利用できるヒドロキシ基またはアミノ基を有する部分を含む。単糖は遊離−ＯＨ基を含み、したがって単糖、二糖、オリゴ糖および多糖は、例示的な水素結合ドナーである。糖を含む例示的な表面改質剤には、ポリマー、例えばアルギネート、キトサン、ポリビニルアルコール、セルロースおよびセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸セルロース、セルロースアセテートフタレート、クロスカルメロース、ヒプロメロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、カラギーナン、シクロデキストリン、デキストリン、ポリデキストロース、トウモロコシデンプンのような他のデンプン、アミラーゼ、アミロペクチンおよびデンプングリコール酸ナトリウム、リンゴ酸、トレハロース、プロピレングリコール、グリセロール、モノステアリン酸グリセロールのような糖または小分子、ソルビトール、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、マンニトール、グルコース、デキストロース、イドース、ガラクトース、タロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、デキストレート、ラクトース、スクロースおよびマルトースのような糖、ステアリン酸、ビタミンＥおよびその誘導体が含まれる。例示的な水素結合アクセプターは、例えば−ＣＯ−および＝Ｎ−を含む部分を含む自由原子価電子対を有する、電気陰性基、例えば酸素、窒素、硫黄等を含む。例示的な水素結合アクセプターは、窒素含有基、例えばアミン、アミド、イミン、イミド、ニトリルおよび尿素ならびに芳香族窒素ベースの官能基、例えばピリジン、イミダゾール等、ならびにカルボキシレート基（カルボン酸、カルボン酸エステル）、ホスホネート、スルホキシド、スルホンおよびカルバメートを含む。
【００７９】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、生理学的ｐＨで反対電荷を有するポリマーでできており、他の実施形態では、ナノ粒子は同じポリマーでできており、粒子の１つもしくは複数の群は、正電荷または負電荷を有する生体適合性材料でコーティングされている。例えば、逆に荷電したナノ粒子を得るためには、図１Ｂに示すように、ヒトにおいて使用される２つの多糖である、キトサンおよびアルギネートなどの多糖を表面改質剤として使用して、ナノ粒子をコーティングして、正の表面と負の表面の両方をそれぞれ導入することができる。
【００８０】
一部の実施形態では、異なる粒子の群は、反対の電荷（反対の符号）を有することができるか、あるいは、同じ符号のものであるが、表面の電荷の大きさまたは量が異なっている電荷を有することができる。一部の実施形態では、本来電荷を有するポリマーマトリクスの反対電荷を有するかまたは表面改質剤からの電荷によって反対電荷を有する粒子は、一緒になってゲルを形成することができる。荷電した表面改質剤は、好ましくは生理学的ｐＨまたはその近傍で正または負の電荷を有する小分子、オリゴマーまたはポリマーを含むことができる。一部の実施形態では、荷電した表面改質剤は、粒子の表面の界面活性剤であってよい。例示的な正に荷電した界面活性剤（カチオン性界面活性剤）は、塩化ベンザルコニウム（アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド）；セチルピリジニウムクロリド；およびセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｒｎ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））を含むことができる。例示的な負に荷電した界面活性剤（アニオン性界面活性剤）は、ジラウロイルホスホグリセロール（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］；ホスファチジン酸；飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸；不飽和脂肪酸、例えばパルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸；デオキシコール酸；コール酸；カプリル酸；グリココール酸；グリコデオキシコール酸；ラウロイルサルコシン；および硫酸ｎ−ドデシルを含むことができる。
【００８１】
一部の実施形態では、粒子を、１つもしくは複数の架橋剤、例えば熱的活性化またはＵＶ活性化された架橋剤を含む表面改質剤でコーティングする。そうした架橋剤には、生理学的温度で、または熱をかけることによって活性化される熱架橋剤が含まれる。そうした熱架橋剤は、多官能性イソシアネート、アジリジン、多官能性（メタ）アクリレートおよびエポキシ化合物を含むことができる。例示的な架橋剤には、１，６−ヘキサンジオールジアクリレートなどの二官能性アクリレート、または当業者に公知のものなどの多官能性アクリレートが含まれる。ＵＶ活性化架橋剤を、粒子を架橋させるために使用することもできる。そうしたＵＶ架橋剤は、ベンゾフェノンおよび４−アクリルオキシベンゾフェノンを含むことができる。
【００８２】
一部の実施形態では、粒子は、荷電されたポリマー、すなわちカチオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーである表面改質剤でできている、またはそれでコーティングされている。例示的なカチオン性ポリマーには、ポリアリルアミン（ＰＡＨ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）；ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＬＡ）；ポリビニルアミン；ポリ（ビニルベンジル−トリ−Ｃｉ−Ｃ４−アルキルアンモニウム塩）；ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピリジニウム塩）；ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアリル−Ｎ，Ｎ−ジ−Ｃｉ−Ｃ４−アルキル−アンモニウムハライド）；および／またはポリアミノアミドの直鎖状および分枝状ホモポリマーおよびコポリマーが含まれる。例示的なカチオン性ポリマーは、ヒドロキシエチルセルロースとジアリルジメチルアンモニウムクロリドのコポリマー、アクリルアミドとジアリルジメチルアンモニウムクロリドのコポリマー、ビニルピロリドンとジメチルアミノエチルメタクリレートメトサルフェートのコポリマー、アクリルアミドとベータメタクリリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー、ポリビニルピロリドンとイミダゾールイミンメトクロリドのコポリマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドとアクリル酸のコポリマー、ビニルピロリドンとメタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー、メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムとメタクリロイルオキシエチルジメチルアセチルアンモニウムのコポリマーのメトサルフェート、四級化ヒドロキシエチルセルロース；ジメチルシロキサン３−（３−（（３−ココアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロポキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｐｏｘｙ））プロピル基末端アセテート；アミノエチルアミノプロピルシロキサンとジメチルシロキサンのコポリマー；アミノエチルアミノプロピルシロキサン／ジメチルシロキサン−コポリマーのポリエチレングリコール誘導体、およびカチオン性シリコーンポリマーを含むことができる。例示的なアニオン性ポリマーには、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡ）、マレイン酸、フマル酸、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリアミド酸（ｐｏｌｙａｍｉｄｏ  ａｃｉｄ）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（ポリ−（ＡＭＰＳ））、アルキレンポリホスフェート、アルキレンポリホスホネート、炭水化物ポリホスフェートまたは炭水化物ポリホスホネート（例えば、テイコ酸）の直鎖状および分枝状のホモポリマーまたはコポリマーが含まれる。メタクリル酸の合成アニオン性コポリマーの例には、アクリル酸またはメタクリル酸と、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ−ビニルピロリドンを含むビニルモノマーとの共重合生成物が含まれる。例示的なアニオン性のバイオポリマーまたは改質バイオポリマーには、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、例えばヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸、フコイダン、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−グルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギネート、ペクチン、ジェラン、カルボキシアルキルキチン、カ���ボキシメチルキトサンおよび硫酸化多糖が含まれる。
【００８３】
一部の実施形態では、粒子上での相互作用の性質および／または表面改質剤の密度を調整して、粒子間の誘引相互作用の強度を制御することができる。一部の実施形態では、これらの変化を用いて、得られるゲルの物理的特性、すなわち、非せん断条件における剛性またはせん断条件における流動性、ゲルの全体的な機械的強度等に影響を及ぼすことができる。改変できる例示的な物理的特性には、引張強度、伸び、曲げ強度、曲げ弾性率、せん断下での粘度等が含まれる。
【００８４】
Ｄ．治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤
本明細書に記載する組成物は、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の、応答性がありかつ／または制御された送達のために使用することができる。一部の実施形態では、これらの組成物は単一の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤、すなわちインスリンだけを含む。他の実施形態では、複数の薬剤を、応答性のある仕方または制御された仕方で、一緒にまたは独立に送達することができる。例えば、一部の実施形態では、第１の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の継続的な持続放出を提供し、同時に、特定の刺激に対して応答性のある第２の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の放出を提供することが有利であり得る。そうした実施形態では、第１の薬剤を、当技術分野で公知のような標準的な持続放出ポリマーマトリクスを含むポリマー粒子中に組み込むことができる。第２の薬剤は、本明細書に記載するような応答性ポリマーマトリクスを含むポリマー粒子中に組み込むことができる。糖尿病の処置における、特定の非限定的な例について、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤などの糖尿病用医薬の継続した送達を提供し、同時に、検出された血液グルコースレベルの増加に応答してインスリンの送達を提供することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、これは、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤を封入した持続放出粒子（すなわち、ＰＬＧＡ粒子）と、インスリンを封入したグルコース応答性粒子（本明細書での実施例に記載されている改質デキストラン粒子など）の両方を含むネットワークゲル組成物を提供することによって遂行される。
【００８５】
好ましい実施形態では、インスリンまたはインスリン類似体を含む組成物を提供する。「インスリン」は、血液中の糖グルコース（ｓｕｇａｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ）のレベルを制御する、膵臓によって作られる天然ペプチドホルモンを指す。インスリンは、細胞がグルコースを使用できるようにする。本明細書で使用する「インスリン類似体」は、１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置き換えられているかまたは除去されている、あるいは、Ｎ末端またはＣ末端での１つもしくは複数のアミノ酸残基の付加によってＡ鎖および／またはＢ鎖が延長されており、血液中のグルコースのレベルを制御するが、その薬物動態が天然由来のインスリンとは異なっているヒトインスリンを指す。インスリン類似体の例には；Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ  Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ  ＮＰＨ、ＮＰＨ  Ｉｌｅｔｉｎ  ＩＩおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  ＣｏｍｐａｎｙによってＨｕｍｕｌｉｎ  Ｎの名称で市販されているイソフェンインスリンとしても公知である、ＮＰＨインスリンが含まれ、これは、糖尿病を有する人の血糖レベルの管理を助けるために与えられる中間作用型（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ａｃｔｉｎｇ）インスリンである。８０年代に、ブタ／ウシインスリンからこれらのインスリンに切り替えられた後に、多くの人から問題点が報告された。その問題には、気分／性格の変化、記憶問題および無自覚性低血糖（ｈｙｐｏ−ｕｎａｗａｒｅｎｅｓｓ）が含まれる。
【００８６】
Ｌｉｓｐｒｏ。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙは、速効型インスリン類似体として「ｌｉｓｐｒｏ」で、最初のインスリン類似体を有した。これは、Ｈｕｍａｌｏｇという商標名のもとで販売されている。これは、組み換えＤＮＡ技術によって、Ｂ鎖のＣ末端上の最後から２番目のリシンおよびプロリン残基が逆転されるように操作された。この改変は、インスリン受容体結合を変えないが、インスリンの二量体および六量体の生成をブロックした。これは、より多くの量の活性モノマーインスリンが、食後（食事後）の注射に利用されることを可能にした。
【００８７】
Ａｓｐａｒｔ。Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋは「ａｓｐａｒｔ」を作製し、これを速効型インスリン類似体として、ＮｏｖｏＬｏｇ／ＮｏｖｏＲａｐｉｄ（ＵＫ−ＣＡＮ）として販売した。これは、組み換えＤＮＡ技術によって、アミノ酸、Ｂ２８（これは通常プロリンである）がアスパラギン酸残基で置換されるように作製された。配列が酵母菌ゲノムに挿入され、その酵母はインスリン類似体を発現し、次いでこれを、バイオリアクターから収穫した。この類似体も六量体の生成を防止して、より即効性のインスリンをもたらす。これは、皮下注射用のＣＳＩＩポンプおよびＦｌｅｘｐｅｎ、Ｎｏｖｏｐｅｎ送達デバイスでの使用が承認されている。
【００８８】
グルリジン。グルリジンは、インスリンポンプでの通常のシリンジ、またはＯｐｔｉｃｌｉｋ  Ｐｅｎによる使用が承認されているＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓからの、より新しい速効型インスリン類似体である。標準的なシリンジ送達も選択肢である。これは、Ａｐｉｄｒａの名称のもとで販売されている。ＦＤＡに承認されているラベルによれば、その急速な発現およびより短い作用時間の点で、通常のヒトインスリンと異なると記述されている。
【００８９】
等電点シフトインスリン
通常の未修飾インスリンは生理学的ｐＨで可溶性である。等電点ををシフトさせた類似体が作製されており、それによりこれらは溶解平衡で存在し、そこにおいて大部分は析出するが徐々に血流中に溶解して最終的には腎臓によって排出される。これらのインスリン類似体は、インスリンの基礎レベルを置き換えるために使用され、最大で２４時間にわたって有効であり得る。しかし、インスリンデテミルなどの一部のインスリン類似体は、初期のインスリン変種のような脂肪ではなくアルブミンと結合し、長期間の使用（例えば、１０年超）による結果は全く発表されていない。
【００９０】
グラルギンインスリン。Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓは、より長く持続するインスリン類似体としてグラルギンを開発し、Ｌａｎｔｕｓという商標名のもとで販売している。これは、３つのアミノ酸を改変することによって作製された。２つの正に荷電したアルギニン分子をＢ鎖のＣ末端に付加させ、それらは等電点を５．４から６．７へシフトさせ、グラルギンをやや酸性のｐＨでより可溶性にし、生理学的ｐＨで溶解性をより小さいものにしている。グリシンによるＡ鎖の２１位での酸感受性アスパラギンの置き換えは、アルギニン残基の脱アミノ化および二量化の回避を必要とする。これらの３つの構造的な変更および亜鉛を含む製剤化は、生合成ヒトインスリンと比較した場合、持続的な作用をもたらす。ｐＨ４．０の溶液を注射した場合、その物質の大部分は析出し、生物学的に利用可能ではない。少量は直ちに使用可能であり、残りは、皮下組織中に隔離される。グラルギンを使用すると、少量の析出物質は血流中の溶液へと移動し、インスリンの基礎レベルは最大で２４時間維持される。皮下インスリングラルギンの作用の開始は、ＮＰＨヒトインスリンよりいくらか遅い。組成中に亜鉛が存在しないので、これは透明な溶液である。
【００９１】
デテミルインスリン。Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋはインスリンデテミルを作製し、これを、インスリンの基礎レベルを維持するための長期持続型インスリン類似体として、Ｌｅｖｅｍｉｒという商標名で販売している。インスリンの基礎レベルを最大で２０時間維持できるが、その時間は、明らかに、注射される用量のサイズによって影響を受ける。このインスリンは、血清アルブミンに対して高親和性を有しており、その作用期間を増加させる。
【００９２】
糖尿病用医薬
例示的な糖尿病用医薬には、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアニド、チアゾリジンジオン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤またはＤＰＰ−４阻害剤が含まれる。スルホニル尿素は、膵臓のベータ細胞を刺激して、より多くのインスリンを放出する。クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）は、現在でも使用されている唯一の第一世代のスルホニル尿素である。第二世代のスルホニル尿素は第一世代薬物より、少ない用量で使用される。３つの第二世代薬物：グリピジド（ＧｌｕｃｏｔｒｏｌおよびＧｌｕｃｏｔｒｏｌ  ＸＬ）、グリブリド（Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、ＧｌｙｎａｓｅおよびＤｉａｂｅｔａ）およびグリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）がある。メグリチニドは、やはりベータ細胞を刺激してインスリンを放出させる薬物である。レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）およびナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）はメグリチニドである。メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）はビグアニドである。ビグアニドは、主に、肝臓によって産生されるグルコースの量を減少させることによって、血液グルコースレベルを低下させる。ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）およびピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）は、チアゾリジンジオンと称される薬物のグループに入る。これらの薬物は、インスリンが、筋肉や脂肪の中でより良く機能するのを助け、また、肝臓におけるグルコース産生も低下させる。ＤＰＰ−４阻害剤は、低血糖症を引き起こさずに、Ａ１Ｃを改善するのを助ける。これらは、体内における天然由来化合物、ＧＬＰ−１の分解を防止することによって機能する。ＧＬＰ−１は、体内の血液グルコースレベルを低下させるが、非常に急速に分解する。そのため、薬物自体として注射された場合には十分に機能しない。ＧＬＰ−１を分解させる過程に介入することによって、ＤＰＰ−４阻害剤は、それを体内でより長期に活性を保ち、それが高くなったときだけ、血液グルコースレベルを低下させるようにする。シタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ）およびサキサグリプチン（ＯＮＧＬＹＺＡ）は、現在販売されている２つのＤＰＰ−４阻害剤である。
【００９３】
ある特定の好ましい実施形態では、糖尿病用医薬の持続放出を、高いグルコースレベルに応答したインスリンまたはインスリン類似体の応答性放出と組み合わせて提供することによって、応答的な仕方で一緒にまたは独立に送達できるインスリンおよび１つまたは複数の追加の糖尿病用医薬を含む組成物を提供する。
【００９４】
インスリンおよびインスリン類似体に加えて、他の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を封入して疾患または障害を処置する、またはそれを管理することができる。これらは小薬物、タンパク質またはペプチド、核酸分子、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、多糖、脂質ならびにその組合せを含むことができる。
【００９５】
封入した具体的な治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤は、処置される状態に依存する。例えば、血液のアルコールレベルに応答するポリマーマトリクスを含む組成物においては、アルコール依存症または他の依存症を処置するために一般に使用される１つもしくは複数の薬物、すなわちジスルフィラムまたはカルシウムカルバミド（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂａｍｉｄｅ）、ジアゼパムまたはリブリウム（ｌｉｂｒｉｕｍ）、あるいはアヘン剤アンタゴニスト、例えばナロキソン、ナルトレキソン、シクラゾシン、ジプレノルフィン、エタゾシン、レバロルファン（ｌｅｖａｌｏｒｐｈａｎ）、メタゾシンまたはナロルフィンを使用することが有利であり得る。
【００９６】
診断薬剤は単独で放出されても、また、治療剤および／または予防剤と組み合わせて放出されてもよい。その例には、放射性核種、放射線不透過分子およびＭＲＩ、Ｘ線または超音波検出可能な分子が含まれる。
【００９７】
Ｅ．添加剤
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、非毒性の不活性固体、半固体または液体フィラー、賦形剤、封入材料または任意の種類の製剤化助剤を意味する。Ｇｅｎｎａｒｏによる編集の、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５年は、医薬組成物の製剤化、およびその調製のための公知の技術において使用される様々な担体を開示している。
【００９８】
その製剤は、その粒子、およびインスリンまたはインスリン類似体およびグルコース応答性成分を封入する得られるゲルだけからなるか、あるいは、滅菌水、滅菌緩衝食塩水または他の標準的な添加剤などの１つもしくは複数の添加剤を含むことができる。
【００９９】
ＩＩ．応答性組成物の作製方法
Ａ．ナノネットワークゲルの作製方法
相互作用して安定な三次元の足場を形成するナノ粒子またはミクロ粒子などの逆に荷電した粒子を使用してコロイド状ナノネットワークゲルを加工することができる。すなわち、コロイドゲルを、モールドしかつ／または成形して、様々な用途のための応答性薬物送達足場にすることができる。この成形は、安定な構造を形成させるために埋め込みの前に実施することができ、また、インサイチュで安定な構造を形成させるために埋め込みの間に実施することもできる。足場は、形状特異的な組織足場の加工が容易になるように、せん断下での所望の程度の展性（ｍａｌｌｅａｂｉｌｉｔｙ）および強い静的付着性（ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｈｅｓｉｏｎ）を有して形作ることができる。また、荷電ポリマーを、製造工程の間に荷電粒子の１つに代えて用いて、荷電粒子および逆に荷電したポリマーを有するコロイドゲルを作製することができる。したがって、本明細書での記載は、荷電ポリマーで置き換えられた１つの荷電粒子を含むことができる。
【０１００】
コロイドゲルは、生分解性粒子および／または生体安定な粒子から調製することができる。粒子の少なくとも１つは、応答的な仕方で、すなわち１つもしくは複数条件の変化に応答して送達される、応答性薬物送達ポリマーマトリクスおよび治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を含む。したがって、その粒子の少なくとも一部は、ポリマー性であることが好ましい。追加の粒子は、ポリマー、有機物、無機物、セラミック、鉱物、およびその組合せなどであってよい。コロイドゲルは、生分解性ポリマーおよび鉱物などの２つ以上の種類の粒子を含むことができる。
【０１０１】
コロイド状ゲルは、形状特異的なマイクロスケール材料の加工を可能にする偽塑性挙動を示す高濃度で、逆に荷電したナノ粒子から調製することができる。これらの材料の凝集強度は、治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の所望の放出に加えて、所望の機械的および物理的特性を有する、ナノネットワークゲルの設計を容易にするために利用することができる静電力、ファン・デル・ワールス力、および立体障害などの粒子間の相互作用に依存する。
【０１０２】
図１Ａ〜１Ｃは、治療足場として使用するための埋め込み体（ｉｍｐｌａｎｔ）に形成および／またはモールドすることができるネットワークゲルを調製するための１つのプロセスの概略図を提供する。図１Ａに示すように、正のキトサンでコーティングした粒子と負のアルギネートでコーティングした粒子を組み合わせて、多孔質コロイドゲルを調製することができる（図１Ｃ）。一部の実施形態では、次いで、このコロイドゲルをモールドして、様々な形状のいずれかを有し得る埋め込み体にすることができる。しばしば、この形状は、埋め込みに適した形態となる。次いで、埋め込み体を、組み込んで、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の応答性送達のための治療足場を提供することができる。一部の実施形態では、ネットワークゲル埋め込み体は、標準的な注射針での注射を可能にする、せん断条件下での粘度を有する。好ましい実施形態では、埋め込み体は、血液グルコースレベルに応答したインスリンまたはインスリン類似体の送達を提供する（図１Ｃ）。
【０１０３】
一部の実施形態では、正の粒子と負の粒子を組み合わせて、粒子で構成されたネットワークである多孔質コロイドゲルを調製することができる。このコロイドゲルは、実質的に本明細書に記載する通りであり、コロイド状ネットワークゲルの形態で細孔を有するマトリクスを形成させるように負の粒子と会合している正の粒子のネットワークを含む。コロイド状ゲルは、注射器から注射される、管を通過する、または撹拌されることなどからのせん断力がコロイドゲルに加えられる場合、正の粒子と負の粒子は解離し、その結果ペーストを形成するかまたはコロイドゲルにいくらかの流動性の増加を提供することを特徴とするせん断減粘性を有する。したがって、この粒子ネットワークは一時的に破壊されて、流動性を提供することができる。この流動性はペーストの流動性と類似しており、その結果、コロイド状ゲルはモールド可能であり、スパチュラや他の用具で成形することができる。せん断力がかけられていない場合、正の粒子と負の粒子は再度組み合わせて多孔質コロイド状ネットワークゲルを形成することができる。次いで、せん断が加えられていない場合、コロイドゲルを構造的にしっかりした形態に構築することができる。したがって、構築されたコロイドゲルを埋め込み体として使用し、体内の部位に注入して、モールド可能でかつ成形可能な埋め込み体をインサイチュで提供することができる。
【０１０４】
コロイド状ゲル足場は、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の持続送達のために使用することができ、それは、第１の複数の正に荷電した生体適合性粒子および第２の複数の負に荷電した生体適合性粒子を含むことができる。正の粒子と負の粒子は、イオン性の相互作用または他の相互作用によって一緒に結合し、それによってコロイドゲルの形態で三次元のマトリクスを形成することができる。必要に応じて、マトリクスは、粒子によって画定され、粒子間に配置された複数の細孔を含むことができる。これらの細孔は、それらの粒子より小さくてよく、または、複数の生細胞を受け入れるのに十分な大きさであってもよい。例えば、細孔は、粒子間の間隙の空間であっても、またより大きい細孔であってもよい。したがって、細孔は、小分子、高分子、および細胞などを保持するような寸法であってよい。また、結合した粒子は、複数の細孔内の細胞およびその粒子から調製された足場上の細胞と相互作用するのに十分な表面積を有することもできる。
【０１０５】
生体適合性粒子は、第１および第２のセットの粒子を含むことができる。一般に、第１のセットの粒子は正に荷電しており、第２のセットの粒子は負に荷電しているか、またはその逆も同じである。さらに、第１のセットの粒子は、荷電タイプ以外の第１の特徴をもつことができる。第２のセットの粒子は、第１の特徴とは異なる、荷電タイプ以外の第２の特徴をもつことができる。例えば、第１および第２の特徴は、組成物；ポリマー；粒子サイズ；粒子サイズ分布；ゼータ電位；電荷密度；生物活性薬剤の種類；生物活性薬剤の組合せの種類；生物活性薬剤濃度；生物活性薬剤の量；生物活性薬剤放出の速度；機械的強度；柔軟性；剛性；色；放射線透過性；または放射線不透過性から独立に選択することができる。
【０１０６】
逆に荷電した粒子を、混じり合った空間分布へと組み合わせ、それによって、正の粒子が負の粒子と会合してマトリクスを形成するようにすることができる。いくつかの例では、マトリクスの一部は、一方のタイプの電荷をもつ粒子を他のタイプの電荷をもつ粒子より多く有することができ、他方のタイプの粒子は、より高い電荷密度を有することができる。すなわち、コロイドゲルマトリクスを形成させるために、より低い電荷密度を有するより多くの粒子を、より高い電荷密度を有するより少ない粒子と組み合わせることができる。
【０１０７】
一実施形態では、応答性薬物送達足場として使用するためのコロイドゲルは、その粒子のうちの１つだけをポリマーで置き換えることによって調製することができる。これは、複数の負に荷電した粒子と組み合わせた複数の正に荷電したポリマー、または複数の正に荷電した粒子と組み合わせた複数の負に荷電したポリマーを含むことができる。荷電ポリマーは様々な分子量をもつことができるが、より大きくかつ／またはより長いポリマーは有用であり、より粒子様（ｍｏｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌｉｋｅ）であり得る。ポリマーは分枝状、架橋状または直鎖状であってよい。荷電ポリマーは、その粒子と類似した電荷密度を含むことができる。また、ポリマーは、電荷を担持する複数の単位を有することもできる。応答性薬物送達足場として使用するための本明細書に記載する特性を有するコロイドゲルを調製するために、ポリマーを正の粒子かまたは負の粒子に代えて用いてもよく、このポリマーの反対電荷の粒子をそれと組み合わせることができる。
【０１０８】
逆に荷電した粒子で応答性薬物送達足場を作製するプロセスは、適切な治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の選択に応じて、様々な用途に適し得る、よく結合された多孔質のマトリクスを首尾よくもたらす。このプロセスを、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）でできた粒子を使用して、多孔質の生体適合性および生分解性の足場を作製するのに使用することができる。さらに、異なるサイズの粒子を使用して、多孔性のパターンを足場内に作製することができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、正電荷を有する第１のセットの粒子を提供し；送達しようとする応答性ポリマーマトリクスおよび治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を含む１つまたは両方のセットを備えた、負電荷を有する第２のセットの粒子を提供し；第１のセットと第２のセットの粒子を組み合わせて、粒子によって画定され、粒子間に配置された複数の細孔を有する三次元のマトリクスを形成させる。その複数の粒子は、細胞が、複数の細孔内を通過することを可能にするのに十分な表面積を有する。三次元のマトリクスは、第１のセットと第２のセットの粒子を混じり合って含むことができ、その結果、正の粒子は、マトリクスを形成するように、負の粒子と隣接し、それとイオン的に会合している。
【０１１０】
逆に荷電した粒子の懸濁液を所定の形状のモールドに、所定の流動プロファイルで流し込む（形状特異的な材料の製作を可能にするため）ことによって、足場を製作することができる。会合し、連続した材料を形成するように、逆に荷電した粒子を組み合わせ、一緒に混合することができる。このプロセスは、市販のプログラム可能なシリンジ型ポンプ（例えば、モーター駆動のシリンジ型ポンプ）を利用して、逆に荷電した粒子をモールド中にポンプ輸送することができる。これで、これらのタイプのポンプを、逆に荷電した粒子組成物とともに使用して、様々な特徴を有する三次元の薬物送達足場を作製することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、逆に荷電した粒子組成物のフリーフォーム印刷を使用して、プリンティング、モールディングまたはカッティングによって成形して、正確な構造を示す三次元の微細周期性ネットワークを作製できるコロイド状ゲルを形成させることができる。さらに、コロイドゲルを、モールドし凍結乾燥して、より剛性の構造を作製するか、またはインサイチュでの足場形成として直接注入することができる。塩化ナトリウム、塩、油、パラフィン（ｐａｒａｆｉｎ）、ポリマーまたは界面活性剤などのポロゲンの足場への適用は、様々なサイズの細孔を生み出して、相互接続した細孔３−Ｄ構造を増強させることができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、粒子ベースの足場を調製する方法は、第１のセットの正の粒子の第１の液体懸濁液を調製するステップ；応答性ポリマーマトリクスおよび治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を含む第１のセット、第２のセットまたは両方のセットを有する、第２のセットの負の粒子の第２の液体懸濁液を調製するステップ；第１の液体懸濁液をモールドに導入するステップ；第１の液体懸濁液のモールドへの導入の前、その間および／またはその後に第２の液体懸濁液をモールドに導入するステップ；マトリクスを形成するように、正電荷を負電荷と会合させて、第１および第２のセットの粒子をモールドにモールディングするステップのいずれか１つを含むことができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、第１の粒子と第２の粒子を組み合わせ、次いで、被験体の体内に導入してマトリクスを形成させることができる。次いで、マトリクスを、必要に応じてまたは所望に応じて成形することができる。例えば、第１の粒子組成物を、第２の粒子組成物と組み合わせて、その組み合わせた組成物を、被験体の体内の所望の位置に配置（ｄｅｐｏｓｉｔ）することができる。したがって、組成物を、埋め込みの前に事前成形するか、または被験体の体内に配置された後、成形させることができる。
【０１１４】
一実施形態では、粒子は、固定された表面要素（例えば、ＲＧＤ付着配列（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））を含むことができる。そうした要素の勾配を生み出す固定された表面要素を有する粒子の分布は、細胞移動に影響を及ぼすことができる。
【０１１５】
応答性薬物送達足場を、改善された系をもたらすことができる逆に荷電した単分散粒子から作製して、粒子サイズおよび粒子ベースの足場上の電荷密度の効果を調査することができる。均一粒子を、ランダムなサイズの粒子と比較して近接して詰め込んで、細孔サイズおよび足場の空隙率に対するより良好な制御を提供することができ、足場の機械的完全性を十分に助けることができる。さらに、バルク足場における粒子からの分子の局所放出は、個々の粒子サイズおよびポリマー特性に関係している。均一粒子ベースの足場に関連した再現性および予測可能性は、それらを、薬物送達足場に、より適切なものすることができる。様々な電荷密度を、単一の足場において使用することもできる。
【０１１６】
一部の実施形態では、２つまたはそれ超の異なるポリマー（例えば、コポリマー、例えばジブロックコポリマーおよびホモポリマー）を使用することによって、粒子の特性を制御することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、多量の封入治療薬剤を有する、例えば約０．２〜約４０重量パーセント、または約０．２〜約３０重量パーセント、例えば約０．２〜約２０重量パーセントもしくは約１〜約１０重量パーセントの治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を含むことができるナノ粒子を形成する。
【０１１７】
一部の実施形態では、ナノエマルジョンプロセスが、治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を封入するのに使用され、ここで、第１のポリマー（例えばＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ）および／または第２のポリマー（デキストロースなどの改質多糖）を有機溶液と混合して第１の有機相を形成させる。そうした第１の相は、約５〜約５０重量％の固体、例えば約５〜約４０％の固体または約１０〜約３０％の固体、例えば約１０％、１５％、２０％の固体を含むことができる。第１の有機相を第１の水溶液と組み合わせて第２の相を形成させることができる。有機溶液は、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、酢酸イソプロピル、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、ベンジルアルコール、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０またはＳｐａｎ８０およびその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、有機相は、ベンジルアルコール、酢酸エチルおよびその組合せを含むことができる。第２の相は約１〜５０重量％、例えば５〜４０重量％の固体であってよい。水溶液は、必要に応じて、コール酸ナトリウム、酢酸エチルおよびベンジルアルコールの１つまたは複数と組み合わせた水であってよい。
【０１１８】
例として、油相または有機相には、非溶媒（水）と部分的にしか混和性でない溶媒を使用することができる。したがって、十分低い比で混合した場合、および／または有機溶媒で事前飽和された水を使用した場合、油相は液体のままで留まる。油相を液滴として水溶液中に乳化し、例えばホモジナイザーまたはソニケーターなどの高エネルギー分散システムを使用して、せん断をかけてナノ粒子にすることができる。あるいは「水相」としても公知である、エマルジョンの水性部分は、コール酸ナトリウムからなる界面活性剤溶液であってよく、酢酸エチルおよびベンジルアルコールで事前飽和されていてよい。
【０１１９】
第２の相を乳化してエマルジョン相を形成させるステップは、１つまたは２つの乳化ステップで実施することができる。例えば、一次エマルジョンを調製し、次いで乳化して微細なエマルジョンを形成させることができる。一次エマルジョンは、例えば、簡単な混合、高圧ホモジナイザー、プローブ型ソニケーター、撹拌バーまたはローターステータホモジナイザーを使用して形成させることができる。例えばプローブ型超音波装置または高圧ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ＾）の使用によって、例えばホモジナイザーに１、２、３回またはそれ超の回数かけることによって、一次エマルジョンを、微細エマルジョンにすることができる。例えば、高圧ホモジナイザーを使用する場合、使用する圧力は、約５０００〜約１５０００ｐｓｉまたは約９９００〜約１３２００ｐｓｉ、例えば９９００または１３２００ｐｓｉであってよい。
【０１２０】
溶媒の抽出を完結させ、粒子を固化させるために、溶媒の蒸発かまたは希釈が必要であり得る。抽出の動力学およびよりスケールアップ可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）プロセスに対するより良い制御のために、水性クエンチによる溶媒希釈を使用することができる。例えば、エマルジョンを、有機溶媒のすべてを溶解させるのに十分な濃度まで冷水に希釈して、クエンチ相を形成させることができる。クエンチングは、約５℃またはそれ未満の温度で少なくとも部分的に実施することができる。例えば、クエンチングにおいて使用される水は、室温より低い温度｛例えば、約０〜約１０℃または約０〜約５℃）であってよい。
【０１２１】
Ｂ．治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の組み込み
コロイド状ゲルマトリクスの粒子は、刺激または状態に応答して放出される少なくとも１つの治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤、好ましくは、血液グルコースレベルが増加するのに応答して放出されるインスリンを含む。コロイドゲルマトリクスは、第１のセットの粒子中に含まれるまたはその上に配置される追加の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤も含むことができる（またはいずれかの電荷）。治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤は、連結された粒子間の間隙の空間中に配置されていてもよい。得られる足場を、所望濃度の薬剤をもたらすように配置して追加の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を放出することができる。必要に応じて、第２のセットの粒子は、その薬剤を実質的に欠いてよいか、または、第２の薬剤を含むことができる。第２の薬剤が、第２のセットの粒子中に含まれているかまたはその上に配置されている場合、第１の薬剤のその第１の所望濃度と同じかまたは異なっている第２の薬剤の所望濃度を生み出すように、足場を配置して、第２の薬剤を放出することができる。異なる薬剤は、正の粒子と負の粒子の両方の中にあるか、または別個の粒子の中であってよく、制御されかつ／または応答性の仕方で放出することができる。例えば、正の粒子は第１の薬剤を含むことができ、負の粒子は第２の薬剤を含むことができる。また、正の粒子は、２つ以上のタイプの薬剤を含むこともできる。さらに、同じ治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤が、正の粒子と負の粒子の両方の中にあってよい。これは、多様で複雑な構造の粒子を可能にし、その結果、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の所望の放出プロファイルを得ることができ、１つもしくは複数の刺激、１つもしくは複数の分子、例えば血液グルコースの濃度の変化、ｐＨの変化または温度の変化などに応答することができる。さらに、１つのタイプの薬剤を有する粒子を、コロイドゲルマトリクスの一方の側に優先的に配置することができ、異なるタイプの薬剤をそのマトリクスの異なる側または部分に配置することができる。異なる薬剤を有する異なる粒子の構造は、１つのタイプの粒子をモールド中の１つの位置に、異なるタイプの粒子を異なる位置に配置することによって、製造工程の間に遂行することができる。したがって、いくつかの異なるタイプの粒子の数は、複数の異なるタイプの治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤をその足場に提供するように、それぞれ生物活性薬剤を有することができる。
【０１２２】
したがって、第１のセットの粒子の第１の特徴は、粒子中に含まれているかまたはその上に配置されている第１の薬剤であってよく、第２のセットの粒子の第２の特徴は、粒子中に含まれているかまたはその上に配置されている第２の薬剤であってよい。一部の実施形態では、第１のセットまたは第２のセットの粒子の少なくとも１つは、生分解性ポリマーを含むことができる。例えば、これらの粒子は、ポリ−ラクチド−ｃｏ−グリコリドもしくはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡあるいは他の同様のポリマーまたはコポリマーを含むことができる。
【０１２３】
一実施形態では、足場は、第１もしくは第２の特徴と同じかまたは異なっている電荷以外の第３の特徴を有する、第３のセットの粒子を含むことができる。第３のセットの粒子は、マトリクスに関して正および負の粒子の空間位置と異なるかまたは同じ所定の空間位置を有することができる。また、第３のセットは正であっても、負であっても、また中性であってもよい。中性である場合、その粒子は、正／負の粒子のマトリクス中に捕捉されていても、またそれと化学的に結合していてもよい。
【０１２４】
一実施形態では、足場は、第１の末端および反対側の第２の末端を含むことができる。したがって、第１のセットの粒子は第１の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を有することができ、第１の末端は、第１のセットの大部分の粒子を有することができる。それに対応して、第２のセットの粒子は、第１の薬剤とは異なる第２の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤、および第２のセットの大部分の粒子を有する第２の末端を有することができる。粒子上の正の表面電荷と負の表面電荷は相互作用してゲルを形成する。
【０１２５】
薬物をロードした粒子を作製する方法は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ゲルを形成させる前に、ポリマー粒子に、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤をロードする。一部の実施形態では、ゲルが形成された後、１つもしくは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤を、例えば、ゲルをその薬剤を含む溶液中に浸漬させることによって、粒子中にロードする。好ましい実施形態では、その薬剤はインスリンまたはインスリン類似体である。ヒドロゲル中へと自己集合する成分を混合する前か後に、インスリンをヒドロゲル中にロードする。一部の実施形態では、応答性ポリマーマトリクスを有し、必要に応じて表面改質剤を有するインスリンをロードした粒子を最初に作製し、それらの粒子を組み合わせてゲルを形成させる。一実施形態では、すでに形成されており、応答性ポリマー粒子を含むヒドロゲルを、インスリン溶液とともにインキュベートしてインスリンを吸収させる。
【０１２６】
一部の実施形態では、治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤のすべてが、この段階で粒子中に封入されているわけではなく、薬物可溶化剤をクエンチされた相に加えて、可溶化した相を形成させる。薬物可溶化剤は、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ポリビニルピロリドン、シクロデキストラン、ドデシル硫酸ナトリウムまたはコール酸ナトリウムであってよい。例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を、クエンチされたナノ粒子懸濁液に加えて、遊離した薬物を可溶化させ、薬物結晶の生成を防止することができる。一部の実施形態では、薬物可溶化剤と治療薬剤の比は約１００：１〜約１０：１である。
【０１２７】
可溶化した相を濾過してナノ粒子を回収することができる。例えば、限外濾過膜を使用してナノ粒子懸濁液を濃縮し、有機溶媒、遊離薬物および他の加工助剤（界面活性剤）を実質的に排除することができる。
【０１２８】
例示的な濾過は、接線流濾過系を使用して実施することができる。例えば、ナノ粒子を保持するのに適した細孔サイズを有し、その一方で溶質、ミセルおよび有機溶媒は通過させることができる膜を使用することによって、ナノ粒子を選択的に分離することができる。約３００〜５００ｋＤａ（−５〜２５ｎｍ）の分子量カットオフを有する例示的な膜を使用することができる。
【０１２９】
ダイアフィルトレーションを、一定容積アプローチ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して実施することができる。これは、ダイア濾液（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）（冷脱イオン水、例えば約０℃〜約５℃または０〜約１０℃）を、濾液が懸濁液から除去されるのと同じ速度で、フィード懸濁液に加えることができることを意味する。一部の実施形態では、濾過は、約０℃〜約５℃または０℃〜約１０℃の第１の温度、および必要に応じて約２０℃〜約３０℃または１５℃〜約３５℃の第２の温度を使用する第１の濾過を含むことができる。例えば、濾過は、約０℃〜約５℃で約１０〜約２０ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）を処理することを含むことができる。別の実施形態では、濾過は、約０℃〜約５℃で約１〜約６のダイア容量を処理すること、および約２０℃〜約３０℃で少なくとも１つのダイア容量（例えば、約１〜約３または約１〜２のダイア容量）を処理することを含むことができる。
【０１３０】
必要に応じて、ナノ粒子懸濁液を精製し濃縮した後、粒子を、例えば
【化２】
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のデプスプレフィルターを使用して、１つ、２つまたはそれ超の滅菌および／またはデプスフィルターを通過させることができる。
【０１３１】
ナノ粒子を調製する例示的な実施形態では、治療薬剤、例えばインスリンおよびポリマー（ホモポリマーおよびコポリマー）の混合物からなる有機相を形成させる。この有機相を、約１：５比（油相：水相）で水相と混合することができる。ここで、水相は界面活性剤、および必要に応じて溶解した溶媒からなる。次いで、簡単な混合下、または、ローターステータホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せで一次エマルジョンを形成させることができる。次いで、例えば高圧ホモジナイザーの使用によって、一次エマルジョンを、微細エマルジョンへと形成させる。次いで、例えば混合下での脱イオン水への添加によって、そうした微細エマルジョンをクエンチすることができる。例示的なクエンチ液：エマルジョン比はおよそ約８：１であってよい。次いでＴＷＥＥＮ（登録商標）（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）の溶液をクエンチ液に加えて、例えば、全体として約１〜２％のＴＷＥＥＮ（登録商標）を達成することができ、これは遊離の封入されていないインスリンを溶解させるのに役立つことができる。次いで、形成されたナノ粒子を、遠心分離かまたは限外濾過／ダイアフィルトレーションで単離することができる。
【０１３２】
Ｃ．剤形
剤形は、薬学的に使用できる調製物に加工するのを容易にする公知の添加剤や助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、慣用的な方法で製剤化することができる。一実施形態では、注射する前は、その製剤は懸濁液の形態にある。
【０１３３】
薬物の製剤は、例えばＨｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９７５年）、ならびにＬｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．  Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，  Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０年）において論じられている。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１３４】
好ましい実施形態では、製剤は注射可能な製剤である。注射可能なインスリン製剤は、ゲル−封入インスリンを賦形剤中に懸濁させることによって作製することができる。懸濁液を滅菌し、単位注射投薬または複数注射投薬に適したバイアルに充填する。滅菌した注射可能な調製物を当技術分野で公知のようにして製剤化することができる。使用できる、許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液がある。注射可能な製剤は、例えば細菌保持フィルターで濾過するか、または、使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散できる、滅菌固体組成物の形態中に滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【０１３５】
ＩＶ．組成物の使用方法
Ａ．投与方法
製剤は、皮下、筋肉内または皮内に投与することができる。好ましい実施形態では、製剤を皮下注射する。一部の実施形態では、ゲルは、せん断条件下で予め形成された、注射可能なものである。そうした実施形態では、標準的な注射針を使用してゲルを注射することができる。一部の実施形態では、例えば第１および第２の複数の粒子をインサイチュで組み合わせてゲルを形成させることによって、または熱、ＵＶなどの光もしくはゲルを形成するいくつかの他の外部刺激を加えるとゲルを形成する粒子を組み合わせることによって、ゲルをインサイチュで形成させる。例えば、熱を加えるか、または一部の実施形態では、単に生理学的温度に上昇させることによって、熱的に活性化した架橋剤でコーティングした粒子を、インサイチュでゲル化させることができる。
【０１３６】
本明細書で使用する「投与量単位形態」は、患者が処置を受けるのに適した、物理的に別個のコンジュゲートの単位を指す。一実施形態では、その製剤は、患者における注射に続いて、基礎放出プロファイルで経時的に全身循環へとインスリンを放出するように設計されたインスリン製剤である。別の実施形態では、製剤は、患者における注射に続いて、非基礎放出プロファイルで経時的に全身循環へとインスリンを放出するように設計されている。例示的な非基礎放出プロファイルには、通常のヒトインスリン放出プロファイルおよび食事放出プロファイルが含まれる。一実施形態では、製剤は、患者における注射に続いて、通常のヒトインスリン放出プロファイルで経時的に全身循環へとインスリンを放出するように設計されている。別の実施形態では、製剤は、患者における注射に続いて、食事放出プロファイルで経時的に全身循環へとインスリンを放出するように設計されている。
【０１３７】
Ｂ．処置を受ける患者
応答性薬物送達足場またはゲルを含む組成物および製剤を、応答的な仕方で、治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤の送達を必要とする患者に投与することができる。好ましい一連の実施形態では、その患者は、血液グルコースレベルの増加に応答して、すなわち糖尿病のために、治療薬剤の投与を必要としている。
【０１３８】
一部の実施形態では、患者の血液グルコースレベルが上昇するのにしたがって、グルコースは、応答性シグナル伝達手段（例えば粒子中に封入したＧＯｘ／ＣＡＴ系）によってグルコン酸に変換される。グルコン酸は局所的にｐＨを低下させ、酸分解性ポリマーマトリクスの分解の増加をもたらす（本明細書に記載する改質デキストロースポリマーなどであるが、他のポリマーも使用できる）。分解されると、粒子は封入インスリンを放出する。その速度は血液グルコースのグルコン酸への変換に依存するので、封入インスリンはグルコース依存的な仕方で送達され得る。
【０１３９】
一部の実施形態では、患者の血液グルコースレベルが上昇するのにしたがって、グルコースは、ペプチドヒドロゲルのグルコースの結合部分（ｐｏｒｔｉｎｇ）と結合し、ゲル形成に寄与する相互作用を妨害する。図１Ｃに示すように、グルコースとの相互作用は、血液グルコース依存的な仕方で、インスリン製剤からの放出をもたらす。
【０１４０】
一部の実施形態では、インスリン製剤を、完全にインスリン依存性ではない患者に投与する。一実施形態では、この製剤は、患者に十分な量のインスリンをその日のうちに提供する。その結果、患者は、彼／彼女の血液グルコースレベルを安全な範囲に維持するのに追加のインスリン含有製剤を必要としない。患者は一般に、完全にはインスリン依存性ではない。
【０１４１】
別の実施形態では、製剤を、その日のうちに患者に投与されるインスリン含有製剤の１つとして、強化インスリン治療を受けている患者に投与する。製剤は、インスリンを基礎放出プロファイルで患者に送達することが好ましい。
【０１４２】
本明細書で使用する「血液グルコースレベルを制御すること」は、血液グルコース濃度を所望のレベル、一般に７０〜１３０ｍｇ／ｄＬまたは９０〜１１０ｍｇ／ｄＬで維持することを指す。
【０１４３】
好ましい実施形態では、糖尿病を有する患者に投与された場合、この製剤は、最大で５日間、１週間、２週間、１カ月または最大で２カ月間、正常血糖（正常な血糖レベル）を維持することができる。
【０１４４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されよう。
【実施例】
【０１４５】
すべての化学物質は、別段の指定のない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け入れたまま使用した。ヒト組み換えインスリン（Ｚｎ塩、２７．５ＩＵ／ｍｇ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。脱イオン水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＮａｎｏＰｕｒｅ精製装置で調製した（１８．２ＭΩ・ｃｍ−１超の抵抗）。
【０１４６】
（実施例１）
ｍ−デキストランの調製
簡単に述べると、１．０ｇのデキストラン（Ｍｎ約９〜１１ｋＤａ）を火炎乾燥した丸底フラスコに加え、窒素でパージした。１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドをフラスコに加え、デキストランが完全に溶解するまで撹拌した。ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ、１５．６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、続いて２−エトキシプロペン（４．１６ｍＬ、３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、窒素で手短にパージし、次いで反応物の蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封した。反応物を室温で３０分間撹拌し、ｍ−デキストランを得た。その時点で、反応物を、１ｍＬのトリエチルアミンを加えてクエンチした。次いで混合物を析出させ、塩基性水（ｐＨ＝約８）で３回洗浄して望ましくない分解を防止し、遠心分離により（８０００ｒｐｍ、１５分）収集した。生成物を凍結乾燥して残留水を除去し、白色固体を得た。ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３４８５、２９７１、２８６２、１４７１、１３７４、１２４６、１２０３、１０４７、８０６、７４６、５４９。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ５．２１  （ｂｒ，  １Ｈ），  ４．８７  （ｂｒ，  １Ｈ），  ４．１０−３．７０  （ｂｒ，  １２Ｈ），  ３．４６  （ｂｒ，  ４Ｈ），  １．３０  （ｂｒ，  １６Ｈ），  １．１１  （ｂｒ，  ８Ｈ）。
【０１４７】
（実施例２）
グルコース応答性ナノ粒子およびナノネットワークゲルの調製
材料および方法
デキストランナノ粒子は、改良された二重エマルジョン（水中油中水型）溶媒蒸発／抽出法によって調製した。簡単に述べると、２４０ｍｇのｍ−デキストランを含む５．８ｍＬの有機相（ジクロロメタン（ＤＣＭ））を、４５サイクル（６０％のデューティサイクルでそれぞれ１秒）の超音波処理によって、３５ｍｇのヒト組み換えインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）だけを含むか、または３．５ｍｇの酵素（４：１のグルコースオキシダーゼとカタラーゼとの重量比）と一緒に含む０．５ｍＬの水相で乳化した。続いて、一次エマルジョンを２５ｍＬのキトサンまたはアルギネート水溶液（１％）に直ちに注ぎ、４５サイクルの超音波処理にかけた。次いで、この二重エマルジョンを、１５０ｍＬのキトサン（Ｍｎ：６１２ｋＤａ；脱アセチル化度：９６．１％）またはアルギネート（Ｍｗ：１．６×１０５）水溶液（０．２％）に移した。混合した懸濁液を室温で撹拌し、蒸発によりＤＣＭを除去した。２時間後、得られたナノ粒子を、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して蒸留水中に懸濁させる手順を３回繰り返すことによって、清浄化し収集した。生成物を凍結乾燥により乾燥させ、４℃で保存した。ナノネットワークゲルを得るために、キトサンまたはアルギネートでコーティングしたナノ粒子を別々に脱イオン水（ｗ／ｖ＝２０％）中に分散させ、浴型ソニケーター（ｓｏｎｉｔａｔｏｒ）中で２分一緒に混合した（ｗ／ｗ＝１／１）。作製したナノネットワークゲルを、３０００ｒｐｍで３分の遠心分離にかけることによって、収集し４℃で保存した。
【０１４８】
インスリン封入ナノ粒子のロード能力（ＬＣ）および封入効率（ＥＥ）を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイにより、基礎補正としてインスリンフリーの粒子を使用して、非封入インスリンの量を測定することによって決定した。ＬＣおよびＥＥを、ＬＣ＝（Ａ−Ｂ）／Ｃ、ＥＥ＝（Ａ−Ｂ）／Ａとして計算した。ここで、Ａはインスリンの予測封入量であり、Ｂは採取溶液中の遊離インスリンの量であり、Ｃは粒子の全重量であった。
結果
【０１４９】
逆に荷電したナノ粒子を得るために、キトサンおよびアルギネートを、デキストランナノ粒子をコーティングするための表面改質剤として使用した。キトサンとアルギネートの両方を、デキストランナノ粒子上で、それぞれ正の表面電荷と負の表面電荷の両方を導入するために利用した。二重エマルジョン手順を使用して、２つのタイプのデキストラン粒子を、キトサンでコーティングした粒子について７．９±０．８ｗｔ％、およびアルギネートコーティング粒子について１１．４±０．１ｗｔ％のインスリンロード能力で別々に調製した。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で示されるように、キトサンでコーティングしたナノ粒子とアルギネートでコーティングしたナノ粒子はどちらも、ほぼ単分散の粒子サイズを有している。キトサンでコーティングした粒子およびアルギネートコーティングした粒子についての、動的光散乱法（ＤＬＳ）で決定された平均の流体力学的粒子サイズは、それぞれ３４０ｎｍおよび２９３ｎｍであった。両方の粒子のゼータ電位は、それぞれ１０．６±１．９ｍＶ（キトサンコーティング）および−１１．５±１．７ｍＶ（アルギネートコーティング）であった。均一で小さいサイズのこれらのナノ粒子は、凝集強度をもたらし、一方で反対のゼータ電位は、静電相互作用の結果として、密な粒子の詰め込みを促進した。
【０１５０】
逆に荷電したデキストランナノ粒子溶液を混合することによって、酵素とインスリンの両方をロードされた凝集性ナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）と指定）を作製した。ＳＥＭは、ナノ粒子が一緒に結合して、マイクロチャネルを有する３Ｄネットワークからなるバルク多孔質構造を形成したことを例示している。密に詰め込まれた凝集体からなるドメインの形成は、ナノネットワークの凝集特性が、粒子間の引力（凝集体）と反発力（細孔）の平衡によってもたらされていることを示している。
【０１５１】
逆に荷電した粒子間の相互作用をさらに検証するために、２つの異なる蛍光色素でコンジュゲートしたインスリンを、キトサンおよびアルギネートでコーティングしたナノ粒子中に封入した。３Ｄレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）は、得られたネットワーク中の粒子が、顕著な移動性なしで圧縮されていることを示している。
【０１５２】
ナノネットワークの注射可能性を調査するために、各ナノ粒子製剤および得られた同じ固形分含量を有するナノネットワークの粘度をせん断速度の関数として測定した（図５）。純粋なナノ粒子と比較した、低せん断速度でのナノネットワークの初期粘度によって、引力静電相互作用および密に詰まったナノ粒子詰め込みの形成が確認された。その凝集力は高いせん断速度で低下し、注射器によるナノネットワークの好都合な注射を可能にする低い粘度がもたらされた。
【０１５３】
（実施例３）
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出試験
材料および方法
ナノネットワークのグルコース応答性解離を試験するために、ゲルを微小遠心分離管に収集し、高血糖レベル（４００ｍｇ  ｄＬ−１）と正常レベル（１００ｍｇ  ｄＬ−１）の両方で、グルコースの非存在下または存在下、ＰＢＳ溶液とともにインキュベートした。
【０１５４】
ナノネットワークを調製した後、種々の溶液（ＰＢＳ、１００ｍｇ  ｄＬ−１または４００ｍｇ  ｄＬ−１グルコース、５００μＬ）を各管に加え、オービタルシェーカー上で、３７℃でインキュベートしてインスリンの放出を評価した。所定の時間点で、試料を遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０秒）にかけ、１２μＬの上清を分析用に取り出した。次いで、１２μＬの新鮮な溶液をその管に加えて一定容積を維持し、インキュベーターに戻した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを用いて全インスリン含量を測定した。ウェルの吸光度を５９５ｎｍで検出し、その濃度を、インスリン標準曲線、および酵素だけを含むナノネットワークを使用した較正曲線から内挿した。この材料の、グルコースレベルの周期的な変化に適応する能力を評価するために、各ナノネットワーク試料を最初に４００ｍｇ  ｄＬ−１グルコース（５００μＬ）中に３７℃で２時間インキュベートした。その時点で、試料を遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０秒）にかけ、上清を全部回収した。試料をＰＢＳで２回洗浄し、次いで１００ｍｇ  ｄＬ−１グルコース（５００μＬ）中でさらに２時間インキュベートした。このサイクルを何回も繰り返した。同様に、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを用いてインスリン濃度を決定した。
【０１５５】
結果
高血糖溶液に曝露されたナノネットワーク材料は、経時的に徐々に解離した。８時間後、インキュベートした溶液は、改質デキストランの天然デキストランへの完全な加水分解によって透明になった。その一方で、インキュベーション溶液の記録されたｐＨ値は、ネットワークの分解が、７．４から４．２への溶液ｐＨの低下と相関していることを立証しており、これにより、グルコースのグルコン酸への酵素的変換を確認された。対照的に、対照試料の両方（グルコースなしと１００ｍｇのｄＬ−１グルコース）は、８時間の時間経過で観察可能な解離を示さなかった。これは、溶液ｐＨの変化がないことと一致した（図３）。さらに、低いせん断速度でのナノネットワークの粘度は、高血糖条件に曝露した場合、ｐＨが低下するのにしたがった高分子電解質の電荷の変化に起因して凝集力が低下した結果として、徐々に低下した（図５）。ナノネットワークからの放出インスリンの全体的な高次構造は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルによって実証されている天然インスリンの高次構造に維持された。
【０１５６】
変動するグルコースレベルに応答したインスリン放出動力学を評価した。累積インスリン放出試験を実施し、図６Ａ〜６Ｃにプロットされているように、高血糖環境下で、ナノネットワークによって、より速いインスリン放出が達成されることが確認された。対照的に、ナノネットワークからの限られたインスリン放出が、正常なグルコースレベルおよびグルコースフリーのＰＢＳ緩衝液でのインキュベーションの１５時間以内に観察された。これらの結果も、上記で論じた解離応答と一致している。その一方で、インスリンの溶解性は酸性環境下で増加し、これはインスリン放出速度をさらに増強させる。
【０１５７】
グルコース濃度が、正常な血糖レベルと高い血糖レベルの間を２時間毎に数回繰り返して周期的に変動する場合、ナノネットワークのインスリン放出プロファイルは脈動パターンを呈した。ナノネットワークはグルコースレベルの変化に応答し、グルコースレベルが高血糖状態に切り替えられた場合、最大で３．６倍のインスリン放出速度の増加が得られた。さらに、高血糖レベルと正常血糖レベルの両方での放出速度は、最高点まで安定的に増加し、次いで徐々に減少した。放出速度の「加速期間」は、次第に弱まる凝集力、およびネットワークの解離した構造に帰することができる。集約すると、これらの結果は、ナノネットワークの分解および続くインスリン放出が、グルコース媒介によるｐＨ依存性の過程であることを示している。スマートバルブ系のように、ナノネットワークを介したインスリン放出は、高いグルコースレベルで促進され、低いグルコースレベルで阻害される。
【０１５８】
（実施例４）
ＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの試験
材料および方法
糖尿病処置のためのインスリンロードされたナノネットワークの効能を、ＳＴＺ誘発成体糖尿病マウス（雄Ｃ５７Ｂ６、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、ＵＳＡ）における血糖症の評価によってｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ＭＩＴの比較医学系（ＭＩＴ’ｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の監督のもとで、ＮＩＴ実験動物ケア原則（ＮＩＴ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従って、マウスをケアした。
【０１５９】
尾静脈から血液（約３μＬ）を採取し、Ｃｌａｒｉｔｙ  ＧＬ２Ｐｌｕｓグルコースモニター（ＶＷＲ、ＵＳＡ）を使用して測定することによって、投与前に、マウスの血液グルコースレベルを２日間連続的にテストした。ＰＢＳ溶液、インスリン溶液、ヒト組み換えインスリンおよび酵素をロードされたナノネットワーク、インスリンだけをロードされたナノネットワークまたは酵素だけをロードされたナノネットワークを投与する各群のために、８匹の糖尿病マウスを選択した。１５０μＬの水溶液またはナノネットワークを、１９ゲージの注射針を備えた１ｃｃ注射器を使用して、１％イソフルランで麻酔をかけたマウスの背中の皮下に注射した（インスリン用量：６０ｍｇ／ｋｇ）。各マウスのグルコースレベルを経時的に監視した（投与した日の最初の１２時間は３０分または２時間毎に、翌日以降は１日に１回、朝に）。
【０１６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのインスリン濃度を測定するために、血液試料（２５μＬ）をマウスの尾静脈から抜き取り、Ｓａｒｓｔｅｄｔ血清ゲルマイクロチューブに採取した。血清試料（５μＬ）を、アッセイするときまで−２０℃で凍結保存した。血漿インスリン濃度を、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を使用して決定した。全アルブミン濃度に対する糖化アルブミンの比を定量的に決定するために、採取した血清試料（７μＬ）を、マウス糖化アルブミンキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、ＵＳＡ）を使用して、投与１日前と投与後２週間分析した。
【０１６１】
ナノネットワークの生体適合性を評価するために、キトサンまたはアルギネートでコーティングしたナノ粒子およびそれらの分解生成物のＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性を、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１．２ｍｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度で評価した。
【０１６２】
結果
糖尿病処置のための、インスリンロードしたナノネットワークの効能を試験するため、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病マウス３１匹に、ＰＢＳ溶液、ヒト組み換えインスリン溶液、インスリンおよび酵素をロードされたナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ＋Ｉ））、インスリンだけをロードされたナノネットワーク（ＮＮ（Ｉ））および酵素だけをロードされたナノネットワーク（ＮＮ（Ｅ））を皮下注射した。次いで、各群における投与されたマウスの血液グルコース（ＢＧ）レベルを経時的に監視した。ＮＮ−ＥＩの１回の注射で処置された糖尿病マウスのＢＧレベルを、高血糖状態または低血糖状態のピークなしで、正常血糖（＜２００ｍｇ／ｄＬ）範囲に最大で１０日間安定的に維持した。
【０１６３】
処置されたマウスのいくつかについて、ＢＧレベルは、２週間超、正常血糖範囲で維持された。ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）群の平均ＢＧレベルは、インスリン含量の減少または封入インスリンの生物活性の喪失のため徐々に上昇したが、それでも、最大で３週間、もとのＢＧレベルより有意に低かった。それに対応して、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）注射されたマウスにおける血漿ヒトインスリンを、３週間にわたる時間経過で検出可能である。
【０１６４】
最初の１２時間でのＢＧレベルの急速な低下は、溶液部分に放出されるか、またはナノネットワークの表面に付着した、インスリンの初期バーストに起因しているようである。しかし、酵素触媒作用によって媒介される、ナノ粒子中に封入した残りのインスリンの後続する放出は、よりゆっくりと起こった。対照的に、ＮＮ（Ｉ）で処置されたマウスのＢＧレベルは、高血糖状態に戻る前に、２日間正常な範囲内のＢＧレベルに維持された。その一方で、インスリン溶液を注射されたマウスのＢＧレベルは、投与後２日目に、高血糖の範囲まで上昇した。酵素の非存在下では、ＮＮ（Ｉ）は酸性−分解事象を起こさず、効果的にインスリンを放出することができず、したがって、投与されたマウスのＢＧレベルは、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）で処置されたものより顕著に高かった。ローディングマトリクスなしで、純粋なインスリンは急速に消失し、投与の翌日に、血漿インスリン濃度の急速な低下がもたらされた。
【０１６５】
ＢＧレベルの低下に対する、グルコースの触媒的消費の影響の可能性を調査するために、糖尿病マウスをＮＮ（Ｅ）で処置した。しかし、酵素によるグルコースの転換は、ＢＧレベルを低下させることにおいて、検出可能な影響を示さなかった。グルコース応答性を、注射後６日での静脈内グルコース耐性テストによってｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）で処置されたマウスは、健常な動物と比較して、グルコース注射によってＢＧレベルの急速な低下を示し、次いでやや遅い低下を示し、最後に８０分で正常なＢＧレベルに達した。糖尿病管理の中期（２〜３週間）指標である、血清中の糖化アルブミンレベルもテストした。糖化アルブミン比（糖化アルブミン／全アルブミン）は、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）を投与２週間後に、１．６倍顕著に低下した。さらに、４週の投与期間後、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）で処置された群は、対照群と比較して、より高いボディコンディションスコアを獲得した。総合すると、分解性インスリンロードしたナノネットワークからの持続したインスリン放出、およびインスリン活性の薬理学的持続が観察された。
【０１６６】
試験したすべての濃度について、ｍ−デキストランベースのナノ粒子および関連する分解生成物は、細胞生存率の有意な低下を示さなかった（図４Ａおよび図４Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのナノネットワークの生体適合性および分解性をさらに調査するために、皮下注射に起因した皮膚の突起の大きさを経時的に監視した。図１０に示すように、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）で処置されたマウスの注射部位における平均の塊の大きさは徐々に縮小した。このことから、グルコース媒介分解が実質的に引き起こされていることが示唆された。４週間後、有意の皮膚突起を見出すことはできない。しかし、ＮＮ（Ｉ）で処置されたマウスについては、４週間後でも、塊の大きさは明らかに縮小していなかった。注射されたナノネットワークの組織学的応答は、最初の２週間、多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）（ＰＭＮ）およびマクロファージなどの炎症性細胞はＮＮ（Ｅ＋Ｉ）およびＮＮ（Ｉ）の両方に浸潤したことを示しており、このナノネットワーク領域は無血管および無細胞であり、フィブリンネットワークは、ナノネットワークを筋肉領域から分離していた。この炎症反応は、生体材料を皮下で埋め込んだ場合にしばしば起こる急性炎症に起因している可能性がある。４週間後、ＮＮ（Ｅ＋Ｉ）は完全に分解し、病変領域は結合組織で覆われていた。しかし、ＮＮ（Ｉ）を投与された試料においては、顕著な炎症性領域は依然として観察することができる。
【０１６７】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、開示されている本発明が属する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそのために引用されている資料を、具体的に参照により組み込む。
当業者は、慣行的な実験、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物のみの使用で、理解するか、または確認することができよう。そうした均等物は以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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