(57)【要約】  本発明は、マンガンスーパーオキシドジムスターゼの変異体タンパク質及びその使用に関する。特に、本発明のタンパク質は、医学的及び診断的適用を有する。特に、腫瘍の、過剰のフリーラジカルを特徴とする疾患の、神経炎症性疾患の治療及び/又は予防のための。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号3又は配列番号1のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項２】
配列番号3又は配列番号1のヌクレオチド配列を大腸菌(E.coli)に導入する工程を含む方法によって得られる、請求項1に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項３】
以下の群:配列番号4、配列番号2に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項４】
TAG配列を含む、請求項3に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項５】
医学的及び/又は診断的使用のための、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項６】
過剰のフリーラジカルを特徴とする疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断において使用するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項７】
前記疾患が、心臓、冠動脈又は末梢血管疾患を含めた血管疾患、拡張型心筋症、動脈瘤、癌、慢性閉塞性肺疾患又はCOPD、認知症、及び神経変性障害、加齢、糖尿病、関節リウマチを伴う自己免疫障害、眼疾患、特に、網膜の又は水晶体の疾患、白内障、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の群に属する、請求項6に記載の過剰のフリーラジカルを特徴とする疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断において使用するためのタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項８】
抗炎症及び/又は抗酸化剤として使用するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項９】
神経炎症性疾患の予防及び/又は治療において使用するための、請求項8に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１０】
前記神経炎症性疾患が神経変性疾患である、請求項9に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１１】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、鬱病、大脳基底核疾患、アテローム性動脈硬化症、卒中、外傷、物質使用障害、筋萎縮性側索硬化症、ミトコンドリア脳症からなる群から選択される、請求項10に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１２】
単独で、又は賦活薬としてその他の療法と組み合わせて、腫瘍病理の治療及び/又は予防及び/又は診断において使用するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１３】
前記腫瘍病理が、白血病、好ましくは、急性リンパ性白血病である、請求項12に記載のタンパク質,その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１４】
前記腫瘍病理が、神経芽細胞腫である、請求項12に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１５】
前記腫瘍病理が、成体又は小児対象に影響を及ぼす、請求項12から14のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１６】
白内障の治療及び/又は予防において使用するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１７】
損傷、好ましくは致死量未満の線量の陽子照射によって誘導される損傷の放射線防護療法又は予防において使用するための、請求項1から16のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１８】
請求項3又は4に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、その機能的変異体、誘導体及び断片。
【請求項１９】
請求項17に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項3又は4に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を効率的に発現できるベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２１】
請求項1から17のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片と、適した賦形剤及び/又は希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
眼の投与のための請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を含む、腫瘍疾患の診断のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガンスーパーオキシドジムスターゼの変異体タンパク質及びその使用に関する。特に、本発明のタンパク質は、医学的適用及び診断的適用を有する。特に、腫瘍の、過剰のフリーラジカルを特徴とする疾患の、神経炎症性疾患の治療及び/又は予防のためである。
【背景技術】
【０００２】
近年、MnSODの新規アイソフォームがヒト脂肪肉腫細胞系統(LSA)から発見され、単離された。LSA型MnSODは、アミノ酸82における単一のトレオニンからイソロイシンへの置換により野生型ヒトMnSODとは異なっており、そのMW(およそ30kDa)は、従来のMnSOD(24kDa)のものよりも大幅に大きい。さらに、通常ミトコンドリアマトリックスに留まったままの野生型MnSODとは異なり(Hunterら、1997年)、LSA型MnSODは、脂肪細胞から培地中に放出される(Manciniら、2006年)。Manciniら(Manciniら、2008年)によって実証されたように、組換えLSA型MnSOD(rMnSOD)は、正常細胞に対する細胞傷害性効果を伴わずに、エストロゲン受容体を発現する癌細胞に浸透し、死滅させる特徴的な能力を有する。rMnSODの腫瘍毒性(oncotoxic)活性は、低レベルのカタラーゼを有する腫瘍及び白血病細胞の両方における酸化体のレベルの上昇による(Picaら、2010年)。
【０００３】
白血病は、世界中で最も一般的な小児悪性腫瘍である。酸化的ストレス代謝の撹乱が、形質転換された腫瘍細胞の共通の特徴であることが、広範な証拠から示されてきた(Skarsteinら、2000年)。抗酸化物質の変更及び酸素反応性種の生成の増大の両方が、発癌のいくつかの段階において役割を果たす(Malyszczakら、2005年)。「酸化的損傷」インシデントに起因するラジカル媒介性DNA損傷は、転写シグナル変換経路の停止又は誘導、複製エラー及びゲノム不安定性につながり、突然変異誘発、発癌及び加齢に関与する第1の段階に相当する(Cookeら、2003年;Valkoら、2006年)。
【０００４】
白血病細胞は、酸化的遮断の反復状態下にあるので、非白血病細胞よりも多量のROSを産生する(Al-Gayyarら、2007年;Battistiら、2008年)。さらに、酸化的ストレスは、酸化刺激の強度に応じてアポトーシスを阻害する場合も、促進する場合もある。実際、アポトーシスは、中程度の酸化刺激によって誘導され、強い酸化効果によって壊死が誘導される(Valkoら、2006年)。おそらくは、突然変異又は増幅に起因するこれらの経路の重要な成分をコードする遺伝子の変更又は細胞表面受容体の上流活性化のために、MAPK及びPI3K経路の構成的活性化がヒト癌において頻繁に起こるという証拠がある(Schubbertら、2007年;Courtneyら、2010年)。これらの経路の構成的活性化による調節解除されたシグナル伝達は、制御されない細胞成長及び生存につながり、発癌性形質転換及び進行をもたらし得る(De Lucaら、2012年)。
【０００５】
スーパーオキシドジムスターゼ(SOD)及びカタラーゼは、最も効率的な酵素的抗酸化物質である。ヒト組織には3種のSOD、すなわち細胞質Cu/Zn-SOD、細胞外Cu/ZnSOD(ecSOD)及びミトコンドリアMnSODが存在する(Wannら、1994年)。MnSODは、細胞質において合成され、次いで、ミトコンドリアマトリックス中に入れられ、そこで、続いて、その成熟した、酵素的に活性な形態に切断される。種々のヒト癌の種類における抗酸化酵素に関する報告されたデータは、議論を引き起こしている。さらに、抗酸化酵素(SOD、CAT)及び非酵素的抗酸化物質のレベルの変更は、多数のヒト癌細胞において明白である(Mc Eligotら、2005年)。急性リンパ性白血病(ALL)及び慢性リンパ性白血病では、SOD及びCAT活性が低下することが示されている(Oltraら、2001年)。例えば、CAT活性は、健常な対象と比較して、LLAの新規に診断された患者において、緩解誘導及び緩解維持患者において低下する(Battistiら、2008年)。種々の癌の種類及びステージの中でのSOD発現レベルは不均一性を示し、これは、種々の癌の種類の中での酸化的ストレスの異なる最適レベル及び酸化的ストレスに応じた代替経路の使用の両方と関連している可能性がある。
【０００６】
最近、癌細胞におけるミトコンドリア変更が、癌治療の標的として認識された(Barbosaら、2012)年。治療の最近の進歩にもかかわらず、T-ALLを有する小児のおよそ25%及び成人の50%〜70%が、治療抵抗性疾患を発症し(Goldenbergら、2003年)、その保因者は、予後不良である(Bassanら、2004年)。本発明において、本発明者は、rMnSOD(ロング型及びショート型)生物学的機能を、小児ハイリスクT-ALL及びジャーカット細胞に対するその腫瘍毒性効果並びにMAPK及びAKT経路によって媒介されるアポトーシス及び細胞増殖に対するその影響を調べるために評価した。ヒトMnSODの医学的及び診断的使用は、EP0284105、Manciniら、2006年、WO03/072768、Ruggieroら、2013年、WO2008/063802、Kanwarら、2007年に示されている。しかし、依然としてMnSODに基づいた治療薬及び診断薬が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】EP0284105
【特許文献２】WO03/072768
【特許文献３】WO2008/063802
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、rMnSODの全cDNAを配列決定し、3'末端にrMnSODのC末端部分をコードする遺伝子配列が、以下に示される世界的なデータベース(UniProtKB / Swiss-Prot: P04179.1)に寄託された天然分子(MnSOD野生型(wild-type)又は野生型(w. type))のものとは長さ及び配列において異なることを観察した。
【０００９】
MnSOD野生型のアミノ酸配列及び遺伝子発現(UniProtKB / Swiss-Prot: P04179.1、配列番号5)
【００１０】
【化１】
2016536016.tif 000002
【００１１】
MnSOD野生型のヌクレオチド配列(ヒト(Homo sapiens)スーパーオキシドジムスターゼ2、ミトコンドリア(SOD2)、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写物変異体1、mRNA
NCBI参照配列:NM 000636.2、配列番号6)
【００１２】
【化２】
2016536016.tif 000003
【００１３】
本発明では、2種の合成遺伝子を製造し、以下のように、一方は、アクロニムsp24-MnSOD_Sint又はrMnSODロング型を用いて同定されるもの(配列番号1)及び対応する組換えタンパク質SP24-MnSOD_SINT又はrMnSODロング型(配列番号2)並びにアクロニムrMnSODショート(配列番号3)を用いて同定されるもう1つのもの及び対応する組換えタンパク質SP6-MnSOD又はrMnSODショート型(配列番号4)である:
【００１４】
rMnSODロング型のヌクレオチド配列(配列番号1)
【００１５】
【化３】
2016536016.tif 000004
【００１６】
rMnSODロング型のアミノ酸配列(配列番号2)
【００１７】
【化４】
2016536016.tif 000005
【００１８】
下線:リーダーペプチドの配列、イタリック体:C末端の突然変異タンパク質配列
【００１９】
ショートrMnSODのヌクレオチド配列(配列番号3)
【００２０】
【化５】
2016536016.tif 000006
【００２１】
タンパク質のrMnSODショート型アミノ酸配列(配列番号4)
【００２２】
【化６】
2016536016.tif 000007
【００２３】
説明文:GAATTC:EcoRI制限部位;AAGCTT:HindIII制限部位;ATG:タンパク質のロングテールの開始
【００２４】
酵素活性、腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果、正常細胞及び腫瘍細胞中に内部移行する能力並びに新規タンパク質のマンガンの定量的投与量を、比較MnSODと比較して調べた。
【００２５】
SP24-MnSOD_Sint(rMnSODロング型)及びSP6-MSOD_SINT(rMnSODショート型)は、以下を特徴とする:
1.野生型タンパク質と比較して、溶解される大部分のバッファーにおけるより大きな溶解度。
2.大腸菌における発現後の精製の改善された安定性及び高い性能。
3.その他の同様のタンパク質(配列番号7及び配列番号8)と比較した場合の、細胞に浸透する高い能力。
【００２６】
本発明において、本発明者はまた、白血病T細胞、ジャーカット細胞及び正リンパ球に対するrMnSOD (ロング型及びショート型)の有効性を試験した。結果から、白血病T細胞は、rMnSOD(ロング型及びショート型)を内部移行でき、rMnSOD(ロング型及びショート型)は、健常細胞に対して毒性効果を示すことなく、白血病細胞の99%のアポトーシスを引き起こすことが確認される。本発明者は、光学顕微鏡及び電子顕微鏡を使用して、0.067μMのrMnSODロング型濃度が、アポトーシス誘導に対して最も効果的であると決定し、ウエスタンブロット解析は、0.067μMのrMnSODロング型を用いる処理が白血病細胞においてアポトーシス促進性タンパク質Baxの高発現及び抗アポトーシス性タンパク質Bcl-2の低発現をもたらすと示した。シグナル変換経路に関しては、ERKリン酸化の発現のわずかな低下を示すジャーカット細胞を除いて、処理後に影響が観察されなかった。本発明者は、ショート型を用いた場合も同様の結果を得た。これらの結果は、rMnSODロング型又はショート型が、健常な細胞にとっては毒性ではなく、T細胞白血病の有効な治療選択肢であったことを示唆する。
【００２７】
本発明は、配列番号3又は配列番号1のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を提供する。好ましくは、タンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片は、宿主生物、好ましくは、細菌、より好ましくは、大腸菌(E.coli)中に配列番号3又は配列番号1のヌクレオチド配列を導入する工程を含むプロセスによって得られる。本発明の特定の実施形態では、タンパク質は、以下の群:配列番号4、配列番号2に含まれるアミノ酸配列、それらの機能的変異体、誘導体及び断片を含む。より特定の実施形態では、本発明のタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片は、TAG配列を含む。本発明の配列番号2又は配列番号4を含むか、又はそれからなるタンパク質の機能的変異体、誘導体及び断片は、タンパク質の生物学的特性及び治療効果を維持する。本発明において、本発明の関連において使用されるような、用語「突然変異」又は「誘導体」又は「変異体」は、標的配列における単一アミノ酸の置換、欠失及び/又は付加として理解され得る。好ましくは、本発明における標的配列の突然変異は、置換である。置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸又は遺伝的にコードされないアミノ酸を用いて行われ得る。遺伝的にコードされないアミノ酸の例として、ホモシステイン、ヒドロキシプロリン、オルニチン(omithin)、ヒドロキシリシン、シトルリン、カルニチンなどがある。
【００２８】
本発明のタンパク質は、強力な抗酸化作用及び抗炎症作用を有し、過剰のフリーラジカルを生成する酸化的不均衡の任意の状況において成功裏に適用される。本発明は、医学的及び/又は診断的使用のための、好ましくは、例えば、心臓、冠動脈又は末梢血管疾患を含めた血管疾患、拡張型心筋症、動脈瘤、癌、慢性閉塞性肺疾患又はCOPD、認知症及び神経変性障害、加齢、糖尿病、関節リウマチを伴う自己免疫障害、眼疾患、特に、網膜の又は水晶体の疾患、白内障、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)のような、過剰のフリーラジカルを特徴とする疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断において使用するための、上記で定義されるようなタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を指す。
【００２９】
本発明のタンパク質は、移植臓器を、冷虚血の状態で15時間にわたって保存することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質は、シクロスポリン-Aを用いて治療されていた生物において糸球体濾過の回復を可能にする。
【００３１】
本発明のタンパク質は、肝硬変において門脈圧亢進症の値を90%低下させる。本発明のタンパク質は、高線量の紫外線に曝露された眼の保護を行い、したがって、白内障を予防し、致死量未満の線量の陽子線に曝露された生物を保護する。本タンパク質は、特に、網膜における又は拡張型心筋症におけるフリーラジカルの過剰の存在によって引き起こされる損傷に対して保護する。
【００３２】
或いは、上記で定義されるようなタンパク質、機能的変異体、誘導体及び断片は、神経炎症性疾患、すなわち、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、鬱病、大脳基底核疾患、アテローム性動脈硬化症、卒中、外傷、物質使用障害、筋萎縮性側索硬化症、ミトコンドリア脳症からなる群から選択される神経変性疾患の予防及び/又は治療において使用するためのような、抗炎症及び/又は抗酸化剤として使用するためのものである。
【００３３】
本発明のタンパク質は、癌細胞、特に、白血病、神経芽細胞腫、黒色腫及び乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌に対して特異的及び選択的細胞傷害性活性を発揮する。本発明のタンパク質は、同じ理由で、その他の腫瘍療法の賦活薬として臨床的に適用され得る。
【００３４】
次いで、上記で定義されるような本タンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片は、腫瘍病理の治療及び/又は予防及び/又は診断において使用するためのものであり、好ましくは、腫瘍病理は、白血病、より好ましくは、急性リンパ性白血病である。或いは、腫瘍病理は、神経芽細胞腫である。
【００３５】
腫瘍病理が、成体又は小児対象に影響を及ぼす可能性がある。
【００３６】
特定の実施形態では、上記で定義されるような本タンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片は、白内障の治療及び/又は予防において使用されるものである。
【００３７】
特定の実施形態では、上記で定義されるようなタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片は、好ましくは、致死量未満の線量の陽子照射によって誘導される損傷の放射線防護療法又は予防において使用するためのものである。
【００３８】
上記で定義されるようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列、その機能的変異体、誘導体及び断片は、本発明の範囲内であり、前記ヌクレオチド配列を含むベクターは、上記で定義されるようなタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を効率的に発現できる。また、前記ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞も本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態は、上記で定義されるようなタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片と、適した賦形剤及び/又は希釈剤及び/又は担体とを含む医薬組成物を指す。特定の態様では、組成物は、眼の投与のためのものである。本発明の医薬組成物は、診断的適用のために又は治療的適用のために使用され得る。
【００４０】
正確な処方、投与様式及び投与量は、患者の状態に従って個々のG.P.によって選択され得る。投与は、単回用量で行われても、間隔をあけた用量で反復的に行われてもよい。投与量及び間隔は、治療効果及び/又は診断効果を得るために個々に調整でき、これが、患者の症状の低減又は生存の延長をもたらす。
【００４１】
当然ながら投与される組成物の実際の量は、治療及び/又は診断しようとする患者、その体重、疾病の重症度、投与方法及び処方医師の考えに応じたものとなる。適した1日投与量は、0.001〜10mg/kg、特に、0.1〜5mg/kgとなる。投与は、周知の方法によって、例えば、注射、特に、静脈内、筋肉内、経粘膜、皮下又は腹腔内注射及び/又は経口、局所、鼻腔、吸入、エアゾール及び/又は直腸適用などによって、実施され得る。投与は、局所でも全身でもよい。さらに、本発明のタンパク質、本発明の変異体、誘導体又は生物学的に活性な断片は、医療装置又は薬物(ミクロスフェア)の放出及びビヒクル系の表面上及び/又は内側に可逆的に固定しても、及び/又は吸着させてもよい。医療装置及びミクロスフェアは、医療装置の若しくはミクロスフェアの表面での、又は表面を覆う水平面でのその結合、含浸及び/又は吸着によって本発明のタンパク質、本発明の変異体、誘導体又は生物学的に活性な断片を可逆的にローディングできる。医療装置又はミクロスフェアが生体液と接触していると、可逆的に固定された、本発明のタンパク質、その変異体、誘導体又は生物学的に活性な断片は、放出される。したがって、医療装置及びミクロスフェアは、放出の薬理学的治療によって必要とされるような制御放出又は持続放出を確実にする、その放出速度論が制御され得るような方法において、本発明の本質である分子を溶出するツールとして作用する。医療装置をコーティングし/含浸させ、ミクロスフェアをローディングする方法は、これらの技術の専門家には周知である。
【００４２】
本発明の本質は、本発明のタンパク質の相同体、誘導体、等価物及び断片である。
【００４３】
本明細書において、用語「等価物」とは、本発明のタンパク質の少なくとも1種の活性を有するタンパク質を意味する。「相同体」は、本発明のタンパク質と比較していくつかの変化を及ぼすタンパク質を意味する。これらの変化は、欠失、末端切断、伸長、キメラ融合及び/又は突然変異であり得る。等価物ペプチドの中で、80%を超える相同性を示すものが好ましい。
【００４４】
「誘導体」とは、化学修飾されているか又は非天然アミノ酸を含有する、突然変異された、末端切断された、及び/又は伸長された可能性がある任意のペプチドを指す。本発明のペプチドは、必要に応じて、例えば、グリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によってin vitro及び/又はin vivoで修飾されてもよく、例えば、当技術分野で公知の合成又は組換え技術によって得てもよい。
【００４５】
本明細書において、用語「変異体」とは、すべての種類の変異体(対立遺伝子、突然変異など)を指し、ヒト(Homo sapiens)において配列番号1又は3によってコードされるタンパク質とは異なる種におけるタンパク質も含む。これらの相同分子種の一例としては、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、ニワトリ(Gallus gallus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)及びゼブラフィッシュ(Danio rerio)における対応するタンパク質が挙げられる。
【００４６】
本明細書において、用語「誘導体」とは、配列番号1と又は配列番号2と少なくとも75%、好ましくは、少なくとも85%、例えば、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも95%の同一性パーセンテージを有するタンパク質を指す。
【００４７】
本発明において、「断片」とは、少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも15個のアミノ酸の、一例として少なくとも20個のアミノ酸の長さを有するタンパク質を指す。本発明において、断片及び誘導体のすべては、全タンパク質の同一の治療特性を有する。
【００４８】
用語「医薬上許容される」又は「許容される」賦形剤とは、生理学的に耐容され、通常、ヒトに投与された場合に急性胃ぜん動、めまいなどといったアレルギー反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書において、用語「医薬上許容される」とは、監督官庁によって承認されたことを意味する。用語「賦形剤」とは、ともに化合物が投与される希釈剤、アジュバント又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、水及びピーナッツオイル、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などといった石油、動物、植物性のもの又は合成起源のものを含めたオイルなどのなどの滅菌液体であり得る。水の塩溶液又は水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が、特に、注射用溶液のための担体として使用されることが好ましい。適した医薬担体は、EW Martinによって「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００４９】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、RNA又はDNA、好ましくは、DNAを指す。このようなDNAは、二本鎖である場合も一本鎖である場合もある。
【００５０】
好ましくは、ヌクレオチドは、本発明のタンパク質の配列をコードする配列を含む。
【００５１】
本発明のヌクレオチドはまた、先に定義されたペプチドのコード配列並びにリーダー配列又はプロタンパク質の配列などのさらなるコード配列並びに/又はさらなる配列UTR及びTAG配列などの非コード配列を含み得る。本明細書において、用語「ベクター」とは、発現ベクターを指し、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。このようなベクターは、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNA、ワクシニア、アデノウイルス、ポックストリ、仮性狂犬病などのウイルスDNAとの組合せに由来するベクターを含み得る。多数の適したベクターが、当技術分野の専門家には公知であり、市場で入手可能である。例として、以下のベクターが提供されている。細菌:pQE70、pQE60、pQE-9(QIAGEN社)、PBS、pDIO、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNHl[ベータ]a、pNH18A、pNH46A (STRATAGENE社)、ptrc99a、pKK223 -3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia社)。真核生物:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、PSG(STRATAGENE)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia社)。しかし、宿主において複製可能であり、生存可能である限り任意のその他のベクターを使用できる。ポリヌクレオチド配列、好ましくは、ベクター中のDNA配列は、直接mRNA合成のために適当な発現制御配列(プロモーター)と機能し得る形で連結される。このようなプロモーターの例として、本発明者は、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、LTRレトロウイルスなどの原核生物又は真核生物のプロモーターを言及できる。発現ベクターはまた、最初の翻訳及び転写ベクターのためのリボソーム結合部位を含有する。後者はまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
【００５２】
さらに、ベクターは、好ましくは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性など、又は大腸菌におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための1種又は複数の選択マーカー遺伝子を含有する。
【００５３】
本明細書において、用語「遺伝子操作された宿主細胞」は、ヌクレオチドを用いて、又はこれまでに記載されたベクターを用いて形質導入された、形質転換された、又はトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００５４】
適当な宿主細胞の実例として、本発明者は、大腸菌、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、Sf9などの昆虫細胞、CHO又はCOSなどの動物細胞、植物細胞などを言及でき、適当な宿主の選択は、適用分野の専門家によって考慮される。
【００５５】
上記の宿主細胞は、動物細胞であることが好ましく、より好ましくは、ヒト細胞である。宿主細胞への先に記載されたヌクレオチド又はベクターの導入は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション又はエレクトロポレーションを用いるトランスフェクションなどのこの技術分野の専門家によって周知の方法によって達成され得る。
【００５６】
本発明の組成物は、1種又は複数の添加物(例えば、安定化剤、保存料)を含み得る。
【００５７】
本発明によれば、本発明の組成物の又はペプチドの「有効量」とは、所望の生物学的効果を達成するのに、すなわち、細胞中に浸透し、それと化学的に組み合わされるどんなものもその中で放出するのに十分である量である。有効投与量は、患者の年齢、性別、健康及び体重、あるとすれば併用治療の種類、治療の頻度及び所望の効果の性質に応じて決まることが理解される。以下に提供される有効用量の範囲は、本発明を制限するものではなく、用量間隔を示唆するものではない。しかし、好ましい投与量は、この技術分野の専門家によって理解され、過度の実験を行わずに決定可能であるように、個々の対象に合わせられ得る。ペプチド、ヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞は、先に記載されたとおりである。
【００５８】
上記で定義されるようなタンパク質、その機能的変異体、誘導体及び断片を含む、腫瘍疾患の診断のためのキットは、本発明の範囲内である。
【００５９】
本発明は、以下の図を参照し、非限定的な例を用いて示される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】網膜に光が当てられた光干渉断層法による微小視野検査(oct microperimetrical examination)、網膜領域の良好な反応を示す、赤0から緑16の域によって光刺激に対する網膜感受性を評価するスポットを示す図である。この患者について、治療前には、1つの緑色域しかなく(図1)、大部分は赤色域であった。1年の、1日2回のrMnSODロング型(100μg/10ml)を含有する2滴の点眼薬の投与からなる治療後、緑色領域が5個であった(図2)。対象の領域は、治療前の患者の状態を示す図と同一である。写真を重ね合わせることによって、その完全一致を観察することが可能である。これは、一周りの時間後に写真に撮られている同一網膜領域であることを実証し、また、実験の適切な実行及びその信頼性も実証する。
【図２】網膜に光が当てられた光干渉断層法による微小視野検査(oct microperimetrical examination)、網膜領域の良好な反応を示す、赤0から緑16の域によって光刺激に対する網膜感受性を評価するスポットを示す図である。この患者について、治療前には、1つの緑色域しかなく(図1)、大部分は赤色域であった。1年の、1日2回のrMnSODロング型(100μg/10ml)を含有する2滴の点眼薬の投与からなる治療後、緑色領域が5個であった(図2)。対象の領域は、治療前の患者の状態を示す図と同一である。写真を重ね合わせることによって、その完全一致を観察することが可能である。これは、一周りの時間後に写真に撮られている同一網膜領域であることを実証し、また、実験の適切な実行及びその信頼性も実証する。
【図３】(A)紫外線照射に60分間に曝露され、MnSODロング型で処理されたウサギの眼を示す図であり、水晶体は構造的に無傷である。(B)紫外線照射に60分間曝露され、比較MnSOD野生型で処理されたウサギの眼を示す図であり、レンズは破壊されている。
【図４】増殖アッセイ及び成長阻害を示す図である。72時間の成長後及び0.067μM  rMnSODロング型を用いる5時間の処理後の、MTT解析を使用することによる、T-ALL細胞、ジャーカット細胞及びリンパ球の生存。(A)トリパンブルー排除アッセイによる細胞生存力を示す図である。結果は、3回の独立実験の平均である。(B)96時間の成長後のジャーカット細胞株、T-ALL及びリンパ球の自然増殖曲線を示す図である。
【図５】アポトーシス誘導に対するrMnSODロング型の効果を示す図である。(A)対照と比較した、0.067μM  rMnSODロング型を用いる処理後の、PI及びアネキシンVを用いてジャーカット細胞の二重標識後のFACS解析を示す図である。(B)0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理した後の、細胞周期の異なる相におけるジャーカット細胞の分布を示す図である。
【図６】(A)光学顕微鏡での標識された細胞のパーセンテージを示す図である。(B)種々の濃度のrMnSODロング型を用いる5時間の処理後のトリパンブルー試験における標識された細胞のパーセンテージを示す図である。対照は、標識を示さなかった。
【図７】(A〜F)漸増濃度のrMnSODロング型を用いて処理したジャーカット細胞を示す図である。パネルのすべての細胞は、ジアミノベンジジン反応によって示される、抗rMnSODに対する強い褐色の細胞質及び核免疫反応を示した。A)0,0067μM  rMnSODロング型は、最初の核及び細胞質断片化のような軽度のプレアポトーシス変化のみをもたらすが、0.067μM  rMnSODロング型(B、C、D、E)は、核及び細胞質両レベルで明確な、進行したアポトーシス断片化につながり、最後に、0.67μM  rMnSODロング型(F)は、細胞酸化還元の能力を超え、細胞膜破裂につながる可能性が極めて高い濃度である。(G〜J)漸増濃度のrMnSODロング型を用いて処理されたリンパ球を示す図である。すべての細胞は、ジアミノベンジジン反応によって示される、抗rMnSODに対する強い褐色の細胞質及び核免疫反応を示す。G)対照細胞;H)及びI)は、アポトーシスの徴候を全く有さない健全な状態を示す、それぞれ、0.0067及び0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理された細胞である;J)細胞膜破裂を示す、0.67μM  rMnSODロング型を用いて処理された細胞。これは、細胞酸化還元の能力を超える濃度濃度である可能性が極めて高い。
【図８】アポトーシス指数。rMnSODロング型処理後のアポトーシスジャーカット細胞のパーセンテージ。
【図９】(A〜F)15nmコロイド金粒子によって示される抗rMnSODロング型を用いる免疫反応後のTEMによるジャーカット細胞を示す図である。A〜B)最初のプレアポトーシス核切り込み及びわずかな細胞質断片化を示す、0.0067μM  rMnSODロング型を用いて処理された細胞;C)及びD)明確な核及び細胞質アポトーシス断片化につながる、0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理された細胞;E〜F)膜破裂を示す、0.67μM  rMnSODを用いて処理された細胞。(G〜L)それぞれ、漸増濃度のrMnSODロング型を用いて処理し、続いて、抗rMnSODロング型及び15nmコロイド金粒子を用いる免疫提示したリンパ球。G)及びH)対照細胞;I)及びJ)健全な状態を示す、0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理したリンパ球、一方、K)及びL)では、0.67μM  rMnSODロング型を用いて処理されたリンパ球は、細胞損傷を示す。
【図１０】ウエスタンブロットアッセイ及びタンパク質発現のソフトウェア解析を示す図である。T-ALL細胞(A)、ジャーカット細胞株(B)及びリンパ球(C)を、0.0067〜0.67μMの範囲の最終濃度でのrMnSODロング型処理後のBcl-2、Bax、ERK及びAKTのリン酸化を調べるために処理した。実験は、少なくとも3回の異なる回数実施し、結果は、常に同様であった。UC:未処理細胞。ハウスキーピングタンパク質を用いて正規化された、T-ALL(D)、ジャーカット(E)及びリンパ球(F)におけるBcl-2、Bax、pERK及びpAKTの発現と関連しているバンドのスキャンを、専用のソフトウェアを用いて実施し、バンドの強度を任意単位として表した(%、3回の異なる実験の平均)。
【図１１】反応性酸素種の蛍光分光解析を示す図である。(A)NACを用いて又は用いずに処理した対照ジャーカット細胞。(B)NACとともに又は伴わずに、次いで、rMnSODロング型とともにプレインキュベートしたジャーカット細胞。結果は、3回の実験の平均である。
【図１２】細胞培養(神経芽細胞腫SK-N-BE細胞株)のin vitroモデルによってrMnSODロング型の効果を調べた。組換えタンパク質は、ニューロン様細胞によって迅速に内部移行され、5〜6時間培養した後に毒性の徴候を有していた。写真は、rMnSODロング型処理後の細胞形態の変化を示す。A)未処理細胞;B)rMnSODロング型を投与された細胞は、1時間後に、対照培養物(A)と比較して、細胞質の退縮のために丸い形状を示す;C) rMnSODロング型に曝露された細胞は、6時間処理した後に進行中の細胞死の特徴を示す;位相差顕微鏡40X倍率。
【図１３】rMnSODロング型は、1時間の処理後に未分化及び分化SK-N-BEによって内部移行される。写真は、抗rMnSODロング型ポリクローナル抗体を用いて免疫染色された組換えタンパク質の細胞内局在性を示す。rMnSODロング型は、緑色であり、核は青色である。A)及びB)未分化細胞;C)及びD)分化細胞;位相差顕微鏡(A、C);蛍光顕微鏡(B、D);40X倍率。
【図１４】rMnSODロング型投与は、脳皮質におけるサイトカイン発現を調節する。A)Abeamメンブレン抗体アレイによる複数のシトシンの同時検出は、生理学的又は病理プロセスにおける個々の因子の役割を解明する炎症因子をスクリーニングするための強力なツールを提供する。rMnSODロング型処理したマウス及び対照マウスから解剖した脳皮質ホモジネートを用いてメンブレンをプローブした。B)グラフは、未処理サンプル(n=8)に対する、試験において検出された40種の炎症因子の発現のパーセンテージの比較を表す。写真は、rMnSODロング型処理マウスにおける炎症性タンパク質の幅広い下方制御を示し、表(C)に列挙される4種のサイトカイン(赤色バー)が大幅に減少した。さらに、4種のタンパク質は、任意の統計的有意性に到達するという発現減少境界の傾向を示した(緑色バー)。1種のタンパク質のみが、rMnSODロング型処理後に増大する、わずかな、統計上有意ではない傾向を示す(C)。(D)結果のまとめの表。
【図１５】総LDH(洗浄剤処理によって誘導された細胞溶解から得られた)のパーセントとして表される、培養上清中へのLDH放出を示す図である。およそ3%のLDHが、未処理培養物の培地中に見出された。rMnSODを、正常(MCF-10)又は腫瘍(MCF-7)起源のその他のヒト哺乳動物上皮細胞株に対する及びさまざまな非哺乳動物形質転換細胞(OVCAR-3、MiaPaCa、A-375)に対するその細胞分裂停止効果及び細胞溶解効果について試験した。rMnSODロング型Manciniは、MCF-7細胞培養物をそのLDH含量の97%を培地中に放出するよう誘導した(洗浄剤処理によって誘導した人工LDH放出と比較されるように)のに対し、比較rMnSOD(Abeam)の12.20%及び比較rMnSOD(Sigma)の7.30%に対して、この組換えタンパク質の適用の際にMCF-10細胞培養上清においてLDH活性の極めて少ない増加を検出できた。腫瘍由来MIA PaCa-2、OVCAR-3、A375細胞はすべて、rMnSODロング型Mancini誘導性死滅に対して際立った感受性を示した。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６１】
Sp24-MnSoD_Sint(rMnSODロング型)及びSp6-MnSOD_Sint(rMnSODショート型)の製造
2種の組換え合成タンパク質を調製した。24aaのリーダーペプチドを保持する第1のもの、第2のものは、6aaから構成されるリーダーペプチドを保持する。両タンパク質は、同一効果/機能を発揮する。
【００６２】
組換えタンパク質rMnSODショート(639bpのコード配列)及びrMnSODロング(693bpのコード配列)の製造及び精製のプロトコール
それぞれタンパク質のN末端の長さが異なるrMnSODをコードする2種の異なるヌクレオチド配列rMnSODショート(639bp)及びrMnSODロング(693bp)を、制限部位EcoRIから5'HindIII及び3'を使用して発現ベクターpET21a+(Novagen社)中にクローニングした。具体的には、2種の合成された遺伝子配列は、rMnSODロングのヌクレオチド配列の配列番号1(rMnSODロングのアミノ酸配列は、配列番号2である)及びショートrMnSODのヌクレオチド配列の配列番号3(rMnSODショートのアミノ酸配列は、配列番号4である)である。
【００６３】
得られた組換え構築物(pET21a+_rMnSODショート及びpET21a+rMnSODロング)を、造業者によって提供されたプロトコールに従ってBL21細胞(Novagen社)へ形質転換した。
【００６４】
各構築物を用いて形質転換された細胞を、フラスコ中のアンピシリン(100mg/ml)を補給したLB培地(Luria-Bertani)に播種し、0.4〜0.8OD/mlの間の光学濃度に到達するまで撹拌下37℃でインキュベートした。
【００６５】
0.1mmのIPTG(イソプロピル-β-D-l-チオガラクトピラノシド)の添加し、25℃、撹拌下で培養物をインキュベートすることによって各組換えタンパク質の発現を誘導した。
【００６６】
4時間成長させた後、培養を停止し、遠心分離によって細胞を培養培地から分離する。
【００６７】
細胞ペレットを、T7・Tag結合/洗浄バッファー(キット精製T7・Tag(登録商標)アフィニティー精製キット、Novagen社によって提供される)に再懸濁し、超音波処理に供する。
【００６８】
次いで、細胞溶解物を、カラムT7・Tag抗体アガロース(キット精製T7・Tag(登録商標)アフィニティー精製キット、Novagen社によって提供される)上にローディングし、製造業者によって提供された使用説明書に従って精製した。
【００６９】
精製タンパク質を含有する溶液を、0.22μmのカットオフを有するフィルターを用いる無菌での濾過によって滅菌する。野生型SODウシタンパク質は、SIGMA社(コードS 969715KU)から購入した。
【実施例２】
【００７０】
本発明のタンパク質ととものインキュベーション後の腫瘍細胞からのLDH放出によって評価されるような、連続培養物中のヒト腫瘍細胞に対する合成sp24-MnSODの細胞傷害性効果
材料及び方法
細胞
合成遺伝子から誘導した組換えタンパク質の細胞傷害性活性の評価のために使用される細胞は、以下であり、以下に示される供給源から入手した。
【００７１】
ATCC HTB-22(商標)から得たMCF-7細胞(ヒト乳癌)、European Collection of Cell Cultures (ECACC、Salisbury、Wiltshire、UK)から得たA-2780 (ヒト卵巣癌腫細胞)、Huh7(JCRB043 NIBIO JCRB Cell Bank、National Institute of Biomedical Innovationによるヒト肝細胞腫細胞)、ATCC HTB 81から得たDU145(ヒト前立腺癌の細胞)及び最後にATCC CRL 1619(商標)から得たA375(ヒト黒色腫細胞)、MiaPaCa-2(ATCC-CRL-1420(商標)、OVCAR-3(ATCC-HTB-161)、MCF-10(ATCC-CRL-10317)。
【００７２】
すべての細胞は、10%ウシ胎児血清を補給したダルベッコ改変イーグル培養培地中で成長させ、加湿雰囲気中37℃のインキュベーター中で維持した。
【００７３】
細胞毒性アッセイ
組換えタンパク質sp24-MnSODによって誘導された細胞溶解を、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出によって測定した。タンパク質を、0.06から1μMの範囲の濃度で対数増殖にある細胞MCF-7、A-2780、HUH-7、DU-145、A375に添加した。上清培養培地中へのLDHの放出は、Promega製のCytotox 96非放射性細胞毒性アッセイキットをPromegaによって提供された使用説明書に従って使用して種々の時間(24h)で定量化した。実験は、異なる調製物を使用して3連で実施した。
【００７４】
結果
【００７５】
【表１】
2016536016.tif 000008
【００７６】
1.5μMの濃度のsp24-MnSODを24時間インキュベーションした後、細胞からの酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出は、細胞毒性、従って、細胞に応じて変動する死滅率を示す。極めて注目すべきことは、野生型タンパク質が、細胞傷害性活性を、タンパク質sp24-MnSODのものと比較して極めて弱く発揮することである。
【００７７】
sp6-MnSOD (rMnSODショート型)を用いた場合にも同一効果が観察された。
【実施例３】
【００７８】
原子吸収分光法による、野生型MnSODによって発現される量と比較した、sp24-MnSOD合成(又はrMnSODロング型)中に存在するマンガンの評価
材料及び方法
マンガンスーパーオキシド(hMnSOD)は、ミトコンドリア金属酵素であり、22kDaから構成される4個の同一モノマー単位からなる。各モノマーは、分子の中心に、マンガン(II)/(III)イオンを含有し、それが3個のヒスチジン残基、アスパラギン酸残基及び溶媒分子と連結している三方晶錐体によって囲まれている(Jan-Ling Hsuら、1996年、Karuppiah Chockalingamら、2006年)。
【００７９】
マンガンは、原子吸収分光法の試験によって一般的に定量される。測定は、ゼーマン効果を用いるバックグラウンド補正を備えた黒鉛炉を使用して実施する。組み込まれたプラットフォーム「Lvov型」上に置かれた黒鉛THGA(Perkin-Elmer社)用いてコーティングされた熱分解性パイプを使用して、金属を定量した。2.5% HNO3(Spectrascan社)中のMgの規定液を、3点での構成曲線の構築のための母液として使用した。各測定は、3連で実施した。修飾マトリックスを添加した(0.015mg Pd及び0.01mg Mg(NO3)2)。Mnの定量的分析に先立ってSODサンプルのタンパク質濃度を、Protein Assay Bio-Rad(Lowry)を使用して評価した。
【００８０】
結果
rMnSODロング型中に含有されるマンガンの量の評価が、Table II(表2)に報告されている。
【００８１】
【表２】
2016536016.tif 000009
【００８２】
rMnSODロング型の原子吸収解析は、各モノマー中に、0.014個に等しいいくつかのマンガン原子が存在することを示した。これらのデータは、マンガンは、rMnSOD中の主要な金属ではないことを示唆する。しかし、MnSOD野生型の試験は、各モノマーについて0.6〜0.7個のマンガン原子の存在を示した。
【００８３】
sp6-MnSOD (rMnSODショート型)を用いても同様の結果が観察された。
【実施例４】
【００８４】
ヒト網膜に対する合成sp24-MnSOD(rMnSODロング型)の保護的及び回復性活性
材料及び方法
機器(America Technologies社、CanadaのSpectral OCT/SLO Otinophthalmic)(Spaide RFら、2008年、Fenolland JRら、2011年)を用いる光干渉断層法による微小視野検査。
【００８５】
点眼薬(洗眼液)の調製
100mlの0.9%生理食塩水溶液に100μgのsp24-MnSODを溶解することによって点眼薬溶液を調製した。次いで、溶液に10mgの塩化ベンズアルコニウムを添加した。溶液のpHを7.00に調整した。
【００８６】
近視性網膜症の3人の患者に12ヶ月間、1日2回2滴の点眼調製物を投与した。
【００８７】
結果
「光干渉断層法による微小視野検査」アッセイから、網膜中のスポットを観察した。スポットは、0(赤色)から16(緑色)の範囲の各領域の、光刺激を検出して、透過する網膜の感受性を定量的に評価する。後者は、最適網膜機能の指標である。上記で示したような患者で実施した最初の試験は、単一の緑色領域を示したが、領域のほとんどは赤色であった(図1)。12カ月間、毎日患者に投与されたsp24-MnSODを含有する点眼薬調製物の使用後、網膜領域の検査は、5つの緑色領域の存在を示した(図2)。この結果は、罹患領域の網膜細胞が2倍になり、光シグナルを検出及び透過できることを示唆する。この結果は、rMnSODロング型をベースとする点眼薬の修復有効性及びアッセイの信頼性を実証する。
【００８８】
sp6-MnSOD (rMnSODショート型)を用いても同様の結果が観察された。
【実施例５】
【００８９】
紫外線に対する曝露後の合成p24-MnSODを含有する点眼薬の使用による白内障形成の阻害
眼構造の紫外線照射に対する曝露によって引き起こされる酸化的ストレスは、白内障形成において重要な役割を果たす。本発明において、本発明者は、sp24-MnSOD-合成が、石英ランプjeloprotect-二重照射220v-w 30-2540アンペアによって発せられた高線量の紫外線照射(UV)に曝露されたウサギ眼の水晶体に対する保護を提供できたか否かを評価しようとした(McCourt EAら、2010年、Fujiwara Tら、2009年).
【００９０】
材料及び方法
普通のNZWウサギ(Charles River code 052)を、2滴/眼/日15日間投与する、0.9% NaCl+10mgの塩化ベンズアルコニウムに溶解した100μgのsp24-MnSOD-合成を含有する、10mlの洗眼液(collyrium)の存在下又は非存在下で曝露させた。試験の最後に、ウサギを屠殺し、眼を組織学的に分析して、構造的修飾を研究した。同様に、陰性対照として、比較野生型MnSODを含有する点眼薬を、同一濃度及び同一組成で使用した。
【００９１】
結果
合成sp24-MnSODを含有する点眼薬を用いるUVに曝露した眼の治療は、ウサギの水晶体に対してタンパク質が大きな保護的役割を果たすと示した。保護は、正常な透明度を示した水晶体の完全性の維持によって証明された(図3A)。この結果は、合成-sp24-MnSODが、UV照射(ランプ220-v-w-2540 30アンペア)によって引き起こされた酸化的ストレスを低減すること及び眼の構造、特に、水晶体(crystalline)が損傷を受けるのを防ぐことを示唆する。比較MnSOD野生型を含有する同様の点眼薬を用いるウサギ眼の治療は、完全に陰性の結果を与え、この場合には、レンズが完全に破壊されたことを示す(図3B)。結論として、紫外線照射に曝露したウサギ眼における合成sp24-MnSODを含有する点眼薬の投与は、白内障形成のプロセスに対して相当な保護を与えた。
【００９２】
sp6-MnSOD(rMnSODショート型)を用いても同様の効果が観察された。
【００９３】
したがって、本発明のタンパク質は、白内障の予防及び/又は治療のために使用できる。
【実施例６】
【００９４】
白血病細胞に対する本発明のタンパク質の効果
材料及び方法
培養細胞
Pediatric Oncology Unit of Second University of NaplesでT-細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)と診断され治療された1人の患者からリンパ性白血病細胞を採取し、Ficoll Hystopaque密度勾配遠心分離を使用して骨髄によって精製した。診断での患者の臨床特徴:年齢3歳、白血球数197000/μL、FAB分類L2、良好なプレドニゾンレスポンダー及び初期T免疫表現型。
【００９５】
健常なドナーから得た白血病リンパ芽球、ジャーカット細胞及びリンパ球(対照として)を、1% Penstrep及び10% FBSを補給したRPMI培地中、l×106個細胞/mLの密度で、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で培養した。
【００９６】
細胞生存力アッセイ
細胞生存力を、MTT[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイによって分析した。細胞を、96ウェルプレート中に、100μLの最終容量中、l×103個細胞/ウェルの密度で播種した。次いで、細胞を加湿雰囲気中37℃でインキュベートして、対数増殖を可能にした。72時間成長させた後、細胞を0.0067μM〜0.67μMの範囲の最終濃度のrMnSODロング型を用いて5時間処理した。処理から5時間で、細胞を37℃で10% MTTに3時間曝露させて、代謝的に活性な細胞と反応させることによってホルマザン結晶を形成した。ホルマザン結晶を1Nのイソプロパノール/HCL10%溶液に37℃で30分間溶解した。次いで、595nmでの吸光度を求めた。式:細胞生存力(%)-(処理ウェルの吸光度-ブランク対照ウェルの吸光度)/(陰性対照ウェルの吸光度-ブランク対照ウェルの吸光度)×100%によって細胞生存力を求めた。対照細胞(白血病リンパ芽球、ジャーカット細胞及びリンパ球)は、同一条件下であるがrMnSODロング型又はショート型の非存在下で培養した。すべての実験は3連で実施した。
【００９７】
細胞周期分析
ジャーカット細胞を、l×106個の密度で播種し、次いで、加湿雰囲気中37℃で24時間インキュベートした。翌日、0.067μMのrMnSODロング型を用いて5時間細胞を加湿雰囲気中37℃で処理した。インキュベーション後、細胞を1×PBSで洗浄し、ペレットにし、ヨウ化プロピジウム(PI)溶液(0.1%クエン酸ナトリウム、0.1% NP40中、50mg PI、pH7.4)を用いて4℃、暗所で30分間染色した。FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson社、San Jose、CA)を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。細胞周期を評価するために、ModFITソフトウェア(Becton Dickinson社)によってFL2(均等目盛り)としてPI蛍光を集めた。各点について3連で20000事象を分析することによって、細胞内DNA含量評価を実施した。各実験は、5%未満のS.D.をもたらした。
【００９８】
DNAフローサイトメトリーによるアポトーシスの評価
Annexin-V-FITC染色によってアポトーシス細胞死を分析した。Annexin-V-FITCは、アポトーシスの初期段階の間に細胞膜の内葉から外葉へと転位置したホスファチジルセリン残基と結合する。Annexin-Vキット(MedSystems Diagnostics社、Wien、Austria)を使用してアポトーシス細胞標識を実施した。ジャーカット細胞を1×106個の密度で播種し、次いで、加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。次いで、細胞を0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理し、37℃で5時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、1,500rpmで5分間遠心分離した。ペレットを1×PBSで洗浄し、結合バッファー(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2)中でAnnexin-V-FITCとともに4℃で30分間インキュベートした。アポトーシス細胞の分析は、フローサイトメトリー(FACScan、Becton Dickinson社)によって実施した。各サンプルについて10×104の事象を獲得した。分析は3連で実施した。
【００９９】
光学顕微鏡での免疫細胞化学
リンパ性白血病細胞、ジャーカット細胞及びリンパ球を、0.0067〜0.67μMの範囲の最終濃度のrMnSODロング型の存在下又は非存在下で5時間インキュベートした。続いて、サイトスピンを使用して、スライド上で細胞をスメアさせた。スメアをザンボニ溶液(4%パラホルムアルデヒド、15%ピクリン酸)で60分間固定し、次いで、1×PBSを用いて洗浄し、3%過酸化水素とともに5分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。DAKO LSA+System HRPキットを使用して免疫染色を実施した。ウサギ抗rMnSOD-Lp(1:200)をスライド上で30分間インキュベートし、続いて、ビオチン化二次抗体とともに30分間及びペルオキシダーゼ標識されたストレプトアビジンとともに30分間インキュベートした。反応を完了するために、基質-色素原溶液を使用した。スメアをヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【０１００】
アポトーシス指数の決定
各サンプルのいくつかの領域からアポトーシス細胞及び小体をカウントした。アポトーシス指数(AI)を、パーセンテージで表される、1000個の腫瘍細胞あたりのアポトーシス細胞及び/又は小体の数として推定した。
【０１０１】
透過型電子顕微鏡でのイムノゴールド法
白血病細胞及びリンパ球の両方を、0.0067〜0.67μMの範囲の最終濃度のrMnSODロング型の存在下又は非存在下で6時間インキュベートした。次いで、細胞を、0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファー中、0.1%グルタルアルデヒド及び4%パラホルムアルデヒドを使用して室温で60分間固定し、0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファーで2回洗浄した。次いで、サンプルを1% OsO4を用いて10分間処理し、脱水し、Epon812中に包埋し、60℃で24時間重合した。Leica Ultracut UCTウルトラミクロトームを使用して超薄切片を調製し、ニッケルグリッド上にマウントした。続いて、切片をクエン酸バッファー中で抗原賦活化に付し、10%過酸化水素とともに10分間インキュベートし、PBS 0.9%で5分間3回洗浄し、PBS中、BSA 1%及びグリシン0.15%中で30分間インキュベートした。サンプルを、1%BSAを有するTris-HCl0.05mol/L中、ポリクローナルウサギ抗rMnSOD-Lp(1:20)とともに4℃で一晩インキュベートし、PBS 0.9%で10分間3回洗浄し、0.1% BSAで希釈した(1 :10)15nmコロイド金とコンジュゲートしているロバ抗ウサギ二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。切片をPBS(pH7.4)及び蒸留水で洗浄し、その後、酢酸ウラシル及びクエン酸鉛を用いて対比染色した。超薄切片をLEO 912AB Zeiss透過型電子顕微鏡を使用して検査した。
【０１０２】
タンパク質抽出及びウエスタンブロット解析
プロテアーゼ阻害剤(4μL/mL PMSF、2μL/mLアプロチニン及びペプスタチン、1μL/mLオルトバナジン酸Na)を有する溶解バッファー(1M Tris-HCl pH8、5M NaCl、0.5M NaF、100% NP40)を使用して、タンパク質抽出を氷上で30分間実施した。細胞溶解物を20,000g、4℃で2分間遠心分離し、上清からタンパク質を抽出した。ブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad社)を使用して総タンパク質濃度を決定した。ウエスタンブロット解析のために、30μgの総タンパク質を10%ポリアクリルアミドゲルに流し、PVDFメンブレン(Millipore社、Marlborough、MA)上にブロッティングした。メンブレンをTBSバッファー(2mM Tris、13.7mM NaCl、0.1% tween-20、pH7.6)に溶解した5%脱脂粉乳中で一晩ブロッキングした。すべての洗浄は、TBSバッファーで実施した。Bcl-2(100)、Bax(N20)、AKT(H-136)、pAKT(Ser473)、ERK(G-12)及びpERK(E-4)に対する一次抗体(Santacruz Biotechnology社) (1:500)を使用して免疫ブロット法を実施し、1時間インキュベートした。二次抗体(Santacruz Biotechnology社 1:5000)を室温で1時間インキュベートした。化学発光系(ECL-Amersham社)を使用してバンドを可視化した。各バンドの強度をCCDカメラを用いて獲得し、Quantity One 1-D分析ソフトウェア(Biorad Laboratories社)を用いて分析した。結果を、各サンプル中のα-アクチン発現のレベルに対して正規化した。
【０１０３】
反応性酸素種の検出
細胞サンプルを、10mM NAC(Sigma- Aldrich、Saint Louis、USA)を用いて、又は用いずに、37℃で20分間前処理し、0.067μM  rMnSODロング型とともに5時間インキュベートし、次いで、細胞を1×PBSを用いて洗浄し、10μM  2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA-Cayman社、Baverno、Italy)とともに37℃で20分間インキュベートした。細胞中に拡散したDCFH-DAを、細胞性エステラーゼによって非蛍光2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)に脱アセチル化し、これは、ROSによって高度に蛍光性2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCF)に迅速に酸化される。蛍光強度は、細胞サイトゾル内のROSレベルに比例し;蛍光強度は、484nmでの励起及び530nmでの発光を用いる日立(モデルU-2000)ダブルビーム分光蛍光光度計(spectrofiuorimeter)を使用して評価した。並行ブランクを含めることによってバックグラウンド蛍光(ホモジネートの非存在下でのDCFH-DAの変換)を補正した。
【０１０４】
結果
ヒトT-ALL細胞、ジャーカット細胞及びリンパ球に対する成長阻害に対するrMnSODロング型の効果。細胞を3日間培養し、モニタリングして、トリパンブルー排除アッセイ及びMTT試験(Table III(表3))を使用して細胞濃度及び増殖を評価した。
【０１０５】
【表３】
2016536016.tif 000010
【０１０６】
rMnSODロング型の最適用量を用いて実験を実施するために、本発明者は、rMnSODロング型処理の際のジャーカット及びT-ALLの用量依存性生存率を最初に決定した。本発明者は、トリパンブルー排除アッセイ及びMTT試験に基づいて、0.003μM  rMnSODロング型を用いる5時間の処理後に5%未満の細胞死を観察したのに対し、0.067μM  rMnSODロング型を用いる5時間の処理によって細胞生存力の大幅な低下が誘導された(約30%、示されていないデータ)。したがって、タンパク質発現のアポトーシス誘導性変更を最小にするために、0.067μM  rMnSODロング型をその後の実験のために選択した。
【０１０７】
詳細には、72時間成長させた後に、細胞を培養で0.067μM  rMnSODロング型を用いて5時間処理した。本発明者は、MTT試験を用いて、1% T-ALL細胞、40%ジャーカット及び70%リンパ球の増殖率を観察した(図4A)。さらに、同一条件で実施したトリパンブルー排除アッセイを用いて、本発明者は、99% T-ALL細胞、60%ジャーカット及び30%リンパ球の成長阻害を観察した(図4B)。ジャーカット細胞株、T-ALL及びリンパ球の自然増殖曲線を正規化対照として使用した。これらの曲線は、48時間後にジャーカット細胞の成長の増大、リンパ球成長の低減を示し、48時間〜96時間後にT-細胞ALLの成長のわずかな低減とそれに続く安定化を示した(図4C)。
【０１０８】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１０９】
アポトーシス誘導に対するrMnSODロング型の効果
0.067μM  rMnSODを用いる処理後、本発明者は、上記で記載したように、Annexin-V-FITC及びPIを用いて染色した後に、FACS分析によるジャーカット細胞に対するアポトーシスの誘導を評価した。図5及びTable IV(表4)に示されるように、対照細胞と比較してアポトーシス細胞の大幅な増大が検出された。詳細には、本発明者は、5時間の0.067μM  rMnSODロング型を用いる処理が、5%の未処理細胞に対してジャーカット細胞の23.7%においてアポトーシスを誘導することを見出した。
【０１１０】
【表４】
2016536016.tif 000011
【０１１１】
図5(B)は、ジャーカット細胞におけるヨウ化プロピジウム(PI)組込み後の細胞周期FACS分析を示す。本発明者は、0.067μM  rMnSODロング型は、未処理細胞と比較した場合に細胞周期分布において大幅な変化を誘導しないことを観察した。
【０１１２】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１１３】
光学顕微鏡
3種の細胞集団でそれぞれ0.0067、0.067及び0.67μM  rMnSODロング型を用いて5時間実施した処理は、以下のパーセンテージの標識された細胞をもたらした:培養白血病T細胞の40%、60%及び76%;ジャーカット細胞の60%、73%及び100%並びにリンパ球の60%、70%及び75%、対照は、標識を示さなかった(図6A)。全体的に、これらの結果は、主に細胞質免疫反応性と少しの核免疫反応性を示したので(図7A〜F;H〜J)、ほとんどの細胞がrMnSODを内部移行したことを示す。試験したrMnSODロング型の3つの濃度の結果として生存力のパーセンテージが、図6Bに報告されている。rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１１４】
白血病T細胞及びジャーカット細胞
0.67μM  rMnSODロング型を用いて処理したT白血病細胞及びジャーカット細胞は、細胞質及び核陽性並びに細胞膜の破裂を示した(図7F;9E〜F)。対照的に、0.0067及び0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理した両細胞は、細胞質陽性並びに早期及び完全核及び細胞質断片化のプレアポトーシス変化を示した(図7A〜E;9A〜D)。
【０１１５】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１１６】
リンパ球
0.67μM  rMnSODロング型を用いて処理したリンパ球は、細胞質及びわずかな核陽性並びに細胞膜の破裂を示した(図7J;9K〜L)のに対し、0.0067又は0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理した細胞は、形態変更を示さなかった(図7H〜J;9I〜L)。リンパ球(rMnSODを用いて処理しなかった)は、陽性を示さなかった(図7G;9G〜H)。これらの知見は、一緒になって、0.0067及び0.067μM  rMnSODロング型が、白血病細胞のみのアポトーシスを引き起こし、代わりに、0.67μM  rMnSODロング型は毒性濃度であることを示す。
【０１１７】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１１８】
アポトーシス指数の決定
アポトーシス核及び細胞質断片化の両方を示す細胞の数が、図8に報告されている。各サンプルのいくつかの領域からアポトーシス細胞及び小体をカウントした。パーセンテージで表された、1000個の腫瘍細胞あたりのアポトーシス細胞及び/又は小体の数としてアポトーシス指数(AI)を推定した。rMnSODロング型処理は、培養されたALL患者細胞及びジャーカット細胞株の両方においてアポトーシスを誘導し、リンパ球に対する有害作用を伴わない。実際、0.067μM  rMnSODロング型が、in vitroで白血病T細胞の及びジャーカット細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されており、処理後に、rMnSODロング型を用いる処理後に1% T-ALL細胞、40%ジャーカット及び70%リンパ球の生存率が観察される(MTTアッセイによって)。rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１１９】
透過型電子顕微鏡
本発明者は、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、0.0067、0.067及び0.67μMのrMnSODを用いて処理された白血病T細胞、ジャーカット細胞及びリンパ球によるrMnSODロング型の内部移行を確認した。TEM結果は、主に細胞質おいて、時には、ミトコンドリアエンベロープの付近に分散されたコロイド金粒子(10nm)を示し(図9A〜F;I〜L)、rMnSODロング型が細胞に入ることを確認した。rMnSODロング型の内部移行は、核及び細胞質アポトーシス断片において(図9C〜D)及び損傷を受けた細胞(図9E〜F)において明白であった。5時間の処理後に細胞質中に分布する(図9I〜L)10nm金粒子の存在によって示されるように、rMnSODロング型もまたリンパ球に入る。未処理細胞では、標識は観察されなかった(図9G〜H)。
【０１２０】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１２１】
生存経路に対するrMnSODロング型処理
より詳細にはrMnSODロング型による成長阻害の機序を決定するために、本発明者は、rMnSODを用いる処理後のアポトーシスプロフィールを分析した。特に、本発明者は、0.0067〜0.67μMのrMnSODの範囲の最終濃度での白血病T細胞、ジャーカット細胞及びリンパ球におけるBcl-2及びBaxの発現を評価する。
【０１２２】
白血病T細胞の0.067μM  rMnSODロング型を用いる処理は、非処理細胞と比較して、プロアポトーシスBaxの発現を誘導し、Bcl-2の発現を抑制する(図10A〜D)。0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理したジャーカット細胞もまた、Baxの発現の増大及びBcl-2の発現の低減を示した(図10B〜E)。逆に、0.067μM  rMnSODロング型を用いるリンパ球の処理は、非処理対応物と比較してBcl-2又はBax発現に影響を及ぼさなかった(図10C〜F)。
【０１２３】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１２４】
増殖経路に対するrMnSODロング型処理
rMnSODロング型が、増殖経路の重要な制御因子に対して作用するかどうかを分析するために、本発明者は、AKT及びERKリン酸化を基礎レベルに対して評価する。本発明者は、rMnSODロング型処理は、すべての試験サンプルにおいてAKTリン酸化に影響を及ぼさないことを見出した。rMnSODロング型処理後にT-ALL細胞において及びリンパ球においてリン酸化ERKの発現の変化はもたらされなかった(図10A、C)が、ジャーカット細胞ではリン酸化ERKの発現のわずかな減少が検出され(図10B)、したがって、複数の経路の変更を有するモデルであるジャーカット細胞を除いて、rMnSODロング型処理後の成長阻害は、MAP/ERKキナーゼ経路によって影響を受けないが、アポトーシス経路によって影響を受ける可能性があるということを示す。
【０１２５】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１２６】
反応性酸素種の検出
N-アセチルシステイン(NAC)は、図11に示されるように、rMnSOD誘導性ROS生成の遮断をもたらした。実際、10mM NACは、0.067μM  rMnSODを用いるインキュベーション後にDCF低減を誘導したが、NACを用いない処理は、対照に匹敵する蛍光を示した。これらのデータは、0.067μM  rMnSODロング型が、予測されるように対照においてよりもかなり多量のROS生成を誘導することを示唆する。
【０１２７】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１２８】
白血病細胞が高レベルの反応性酸素種を生成し、フリーラジカルに対する酵素の保護的役割の撹乱を有することは周知である。癌の種類による細胞抗酸化機序及びROS生成のこの可変性は、新生細胞形質転換を作製するのに有効であるが、アポトーシスを引き起こすのには十分でないROS生成につながる、抗酸化防御のレベルによって説明することができる。ますます増大する証拠によって、細胞寿命及び細胞死の調節におけるROSの重要な役割が実証される。ROSの毒性は、免疫応答を活性化できる。
【０１２９】
したがって、新規治療的介入の開発は、発癌を誘導できるその過度の蓄積の「非自己」作用及び傷害性作用に対する保護的細胞傷害性の両方におけるROSの二様性に取り組まなければならない(Mandaら、2009年)。同様に、rMnSODロング型は、健常細胞を酸素化しながら癌細胞のアポトーシス死を誘発できる作用の二様性も示すか、又はカタラーゼの過酸化物を酸素と水に形質転換する能力を超える場合に、腫瘍細胞及び健常細胞の両方において壊死を誘導できる(Manciniら、2006年)。そのため、酸化還元バランスが、発癌制御の主な機序であると思われる(Mandaら、2009年;Barbosaら、2012年)。この研究では、本発明者は、rMnSODロング型処理が、培養ALL患者細胞及びジャーカット細胞株の両方においてアポトーシス誘導し、リンパ球に対しては有害作用がないことを実証した。実際、本発明者は、0.067μM  rMnSODロング型は、in vitroにおいて白血病T細胞の及びジャーカット細胞のアポトーシス引き起こすことを示し、また本発明者は、rMnSODを用いる処理後に1% T-ALL細胞、40%ジャーカット及び70%リンパ球の生存率を観察した(MTTアッセイによって)。さらに、本発明者は、白血病T細胞において、0.067μM  rMnSODロング型が、プロアポトーシスタンパク質Baxを上方制御し、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2を阻害することを示した。このデータは、rMnSODの存在下でのプロアポトーシスBax遺伝子発現の強力な上方制御を確認する乳癌細胞でのManciniら(Manciniら、2006年)と一致し、この処理が、アポトーシスカスケードを誘導し得ることを示唆する。rMnSODの存在下で腫瘍細胞において検出された抗アポトーシスBcl-2遺伝子発現の強力な阻害(Manciniら、2008)によって、アポトーシス機序の関与の可能性が示唆された。さらに、0.067μM  rMnSODロング型を用いて処理された細胞のFACS分析は、対照細胞と比較して、ジャーカット細胞の23.7%におけるアポトーシス細胞の明らかな増大を示した。
【０１３０】
興味深いことに、白血病細胞は、H2O2中に存在するフリーラジカルを変換する外因性rMnSODロング型を内部移行した。特に、カタラーゼは、H2O2を分子酸素に解毒するが、普通、白血病細胞では、健常細胞においてよりも少量である(Battistiら、2008年)。したがって、rMnSODロング型を用いる処理は、H2O2の蓄積及びその後の白血病細胞の死滅につながり得る。対照的に、リンパ球は、このカタラーゼ活性の低下を示さず、高レベルの内因性H2O2産生を耐容できる。しかし、0.67μM  rMnSODロング型の濃度は、白血病細胞にとって、及びリンパ球にとって毒性であり;実際、この濃度で、rMnSODロング型は、酵素MnSODとカタラーゼの間に生じる化学量論的不均衡による壊死を誘導する。rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１３１】
結論として、本知見は、rMnSODロング型及びショート型は、白血病のための関連するさらなる処理としてとして考えることができ、特に、低濃度のrMnSODロング型又はショート型は、癌細胞に対して特異的に毒性でありながら、健常細胞に対して保護効果を有すると思われると示唆する。酸化還元バランスの治療標的役割に関する現在の知見によれば(Barbosaら、2012;Mandaら、2009年)、これらの結果は、良好な治療効率を達成し、副作用のない、rMnSODロング型及びショート型の作用を示唆する。
【実施例７】
【０１３２】
神経芽細胞腫に対するrMnSODロング型の効果
長い及び短いリーダーペプチドを有する組換えヒトマンガンスーパーオキシドジムスターゼ(rMnSOD)の新規アイソフォームの効果を、細胞培養物(神経芽細胞腫(neuroblastome)SK-N-BE細胞細胞培養物)のin vitroモデルにおいて調べた。いくつかの一連の証拠が、新規分子が抗癌剤として作用することを示唆した。
【０１３３】
この仮説を評価するために、本発明者は、本発明者のニューロン様細胞培養物を、長い及び短いリーダー配列を有する2種の異なるrMnSODロング型を用いて処理した。
【０１３４】
その特定の培地で成長している細胞を、培養培地に添加したrMnSOD(ロング及びショートrMnSOD)の存在下でインキュベートした。両タンパク質の細胞毒性を調べるために、ロング型を用いる図12(a〜b〜c)において例示されるような細胞変性の誘導について細胞を光学顕微鏡の検査に付した。
【０１３５】
両組換えタンパク質は、ニューロン様細胞によって迅速に内部移行され、細胞に対して腫瘍原性活性を示し、5〜6時間の培養後に毒性の徴候を有する。
【０１３６】
方法
20000個の神経芽細胞腫SK-N-BE細胞を、10%FCS(GIBCO)を補給したMEM培地を有する24マルチウェル(FALCON)に播種した。24時間後、各ウェルにロング及びショートrMnSOD(1.25μM)を添加した。24及び48時間後、細胞をPBSを用いて2回洗浄した。次いで、両タンパク質rMnSODの細胞傷害性活性を(Int. J. of Cancer-123、2684-2695、2008年)に記載される方法に従って、LDH試験を使用して評価した。
【０１３７】
結果
結果は、神経芽細胞腫SK-N-BE細胞に対するrMnSODロング型の細胞傷害性効果は、その死滅効果をもたらす(図12a〜c)ことを示す。
【０１３８】
rMnSODショート型を用いても同様の効果が観察された。
【０１３９】
結論として、これらのデータは、2種の組換えアイソフォーム(短い及び長いリーダー配列を有する)MnSODは、神経芽細胞腫細胞SK-N-BEにとって細胞傷害性であることを示唆し、これは、神経芽細胞腫の治療におけるその使用を示唆する。
【実施例８】
【０１４０】
脳炎症に対するrMnSODロング型の効果
中年マウスのin vivo動物モデルによってrMnSODロング型の効果を調べた。いくつかの一連の証拠が、rMnSODロング型が、酸化的ストレス及び組織炎症を強力に鈍らせることができることを示唆した。これらの生物学的プロセスは、生理学的加齢及び病理学的神経変性に関与する臨床成分を有すると思われ、したがって、rMnSODロング型の活性が、これらのプロセスを部分的に調節し得ること、その有害面効果のいくつかを低減する可能性があることを示唆する。
【０１４１】
この仮説を評価するために、本発明者は、rMnSODロング型を用い慢性鼻腔内投与(50μl/日中、2μgのタンパク質)によって中年のマウスBalb-C(18ヶ月齢)を処理した。本知見は、学習及び記憶タスクにおいて挙動の相違は観察されなかったが、対照と比較した処理されたマウスの大脳皮質の生化学的分析は、炎症経路に関与する5種のタンパク質(BLC、CD30L、Fasリガンド、Kc、TNFR2)の発現の大幅に低減したパターンを示し、IL-1β及びI-Tacについて観察された低タンパク質発現傾向と同等であったことを示す(図14)。
【０１４２】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１４３】
材料及び方法
マウス皮質組織におけるサイトカインレベルの同時検出
複数のマウスサイトカインの同時検出を、マウスサイトカイン抗体アレイメンブレン(Abeam、Cambridge、UK)を製造業者の使用説明書に従って用いて実施した。メンブレン上に、97種のマウスサイトカインに対する抗体、陽性(ビオチンがコンジュゲートしているIgGタンパク質)及び陰性(アレイ上にプリントした抗体を希釈するために使用したバッファー)対照をスポッティングした。手短には、rMnSODロング型及び生理食塩水溶液を用いて処理したマウスの皮質組織を、ホモジナイズし、遠心分離によって清澄化したプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファーを用いて溶解した。メンブレンを、ブロッキングバッファーとともに室温(RT)で30分間、次いで、ブロッキングバッファー中の500μgの総タンパク質とともに約4℃で一晩インキュベートした。洗浄バッファーIでの3回の洗浄及び洗浄バッファーIIでの3回の洗浄の後、メンブレンをビオチンがコンジュゲートしている抗サイトカインとともに4℃で一晩インキュベートした。洗浄バッファーIでの3回の洗浄及び洗浄バッファーIIでの3回の洗浄の後、メンブレンを、HRPがコンジュゲートしているストレプトアビジンとともに4℃で一晩インキュベートした。検出バッファーを用いて化学発光シグナルが示された。メンブレンをイメージングシステムに移し、2分間露光させた。バックグラウンド(陰性対照プローブ)から生デンシトメトリーデータを差し引き、複数のアレイにわたって結果を比較するために陽性プローブシグナルに対して正規化した。
【０１４４】
結論として、これらのデータは、ロング型又はショート型としての本発明のマンガンスーパーオキシドジムスターゼの組換えアイソフォームは、神経細胞の内側に入り、脳タンパク質発現を修飾することができることを示唆する。これは、革新的な療法を開発するための可能性ある医薬ツールとしての、中枢神経系に対する、特に、神経変性疾患におけるその効果を示唆する。
【実施例９】
【０１４５】
本発明のrMnSODロング型とショート型と、異なる組換えMnSODの間の比較
本タンパク質(ロング及びショートrMnSOD)の腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を、2種のその他のヒト組換え型SOD2との比較において調べた:
第1に、配列番号7(SIGMAと呼ばれる)は、ヒト組換えSOD2、24個のアミノ酸のリーダーペプチドを有し、C末端の5個のアミノ酸を有さない、全長GSTタグ付きタンパク質であり;
第2に、配列番号8(Abeamと呼ばれる)は、ヒト組換えSOD2、24個のアミノ酸のリーダーペプチドを有さず、タグを有さず、C末端の5個のアミノ酸を有さない、全長タンパク質である。
【０１４６】
比較rMnSODの配列(SIGMAと名付けられた、配列番号7):
【０１４７】
【化７】
2016536016.tif 000012
【０１４８】
比較rMnSODの配列(Abcamと名付けられた、配列番号8):
【０１４９】
【化８】
2016536016.tif 000013
【０１５０】
2種の比較組換えタンパク質の細胞傷害性効果を、1.5μMの濃度でLDHアッセイによって評価し(Table V(表5))、本発明のrMnSODタンパク質(rMnSOD Long Mancini及びrMnSOD Short Mancini)によって達成される効果と比較した。
【０１５１】
【表５】
2016536016.tif 000014
【０１５２】
結果はまた、図15に示されている。4種の種々のrMnSOD処理の際に誘導された細胞溶解を、LDH酵素の放出によって測定した。指数関数的に増殖する培養物に1.5μMの最終濃度にrMnSODを添加した(別に示されない限り)、培地上清中へのLDHの放出を、Promega製のCytoTox 96非放射性細胞毒性アッセイキットを製造業者の推奨に従って使用して適用後の示された時間で測定した。実験は、異なるrMnSOD調製物(rMnSOD long Mancini、rMnSOD long Mancini rMnSOD SIGMA及びrMnSOD Abeam)を使用して3連で実施し、LDH放出は洗浄剤処理の際に放出された総LDHの割合として表した。
【０１５３】
総LDH(洗浄剤処理によって誘導された細胞溶解)のパーセンテージとして表される、培養上清へのLDH放出。およそ3%のLDHが、未処理培養物の培地において見出された。rMnSODを、正常(MCF-10)又は腫瘍(MCF-7)起源のその他のヒト哺乳動物上皮細胞株に対する、種々の非哺乳動物形質転換細胞(OVCAR-3、Mia PaCa、A-375)に対するその細胞分裂停止及び細胞溶解効果について試験した。rMnSOD(ロング及びショート)Manciniは、MCF-7細胞培養物をそのLDH含量の97%〜98.10%を培地中に放出するよう誘導した(洗浄剤処理によって誘導される人工LDH放出と比較して)が、rMnSOD Abeamの12.20%及びrMnSOD Sigmaの7.30%に対して、この組換えタンパク質の適用の際のMCF-10細胞培養上清におけるLDH活性の極めて小さな増大しか検出できなかった。腫瘍由来MIA PaCa-2、OVCAR-3、A375細胞はすべて、rMnSODs Mancini誘導性死滅に対して際立った感受性を示した。
【０１５４】
次いで、本発明のrMnSODロング型及びショート型は、その他の形態のrMnSODと比較して改善された特性を示す。
【実施例１０】
【０１５５】
肝硬変及び移植のための臓器に対する本発明の組換えMnSODの効果
高い酸化的ストレスは、硬変における肝血管抵抗の増大において、肝臓線維症を促進することによって、及び肝血管緊張を増大することによって主な役割を果たす。本発明者の研究は、rMnSODの使用が、硬変ラットにおいて酸化的ストレス及び門脈圧亢進症を低減するための新規治療戦略であり得るか否かを調べることを目的としたものであった。rMnSODロング型(i.p.15μg/Kg/日)又はそのビヒクルを用いて7日間処理したCCl4及びBDL硬変ラットでは、平均動脈圧(MAP)、門脈圧(PP)及び門脈血流(PBF)又は小腸間膜動脈流(SMABF)を尺度とした。さらに、CCl4-硬変ラットでは、本発明者は、アセチルコリンに対する肝血管拡張反応、シリウスレッド染色を用いて肝臓線維症及びa-平滑筋アクチン(a-SMA)タンパク質発現によって肝星細胞活性化を評価した。rMnSODロング型処理は、内臓血流の大幅な変化を伴わずに、CCl4ー又はBDL硬変ラットのいずれかにおいてPPを大幅に低下させ、これは、肝血管抵抗の低減を示唆した。MAPは修飾されなかった。PPの低減は、肝臓線維症及びa-SMAタンパク質発現の大幅な低減並びにアセチルコリンに対する血管拡張反応の改善と関連していた。
【０１５６】
硬変ラットへの慢性rMnSODロング型投与は、全身の血行動態に対して有害な効果を伴うことなく、肝血管抵抗を低減することによって門脈圧を低下させ、硬変において門脈圧亢進症を処理するためのさらなる療法として考えられる新規抗酸化薬を構成し得ることを示唆する。
【０１５７】
肝臓移植の際の冷貯蔵及び温再潅流(CS+WR)傷害による肝微小循環性機能不全は、酸化的ストレスによって部分的に媒介され、早期の移植片機能不全につながり得る。これは、特に、脂肪変性ドナーが考慮される場合に関連する。本発明者は、CS+WRを受けている肝臓の微小循環、実質傷害及び内皮機能に対するrMnSODの効果を特性決定することを目的とした。
【０１５８】
rMnSODロング型又はそのビヒクルとともに冷保存され、次いで温再灌流された一次培養肝臓内皮細胞において、酸化ストレス及び酸化窒素を決定した。対照及び脂肪変性ラットには、肝臓獲得の30分前にrMnSODロング型の単回用量又はそのビヒクルを与え、移植片を0時間(対照群)又は16時間冷保存した。1時間温再潅流した後、肝微小循環、内皮機能及び表現型及び肝臓傷害を分析した。冷貯蔵溶液へrMnSODロング型を添加する抗酸化作用も、CS+WRを受けているラット及びヒト肝臓において評価した。
【０１５９】
CS+WR後に、肝臓内皮は、スーパーオキシドの上昇及び酸化窒素レベルの消失を示し;これらの有害な効果は、rMnSODによって防がれた。CS+WR対照及び脂肪変性ラット肝臓は、肝臓損傷、炎症、酸化的ストレス及び低酸化窒素と一緒に、著しく悪化した微小循環及び急性内皮機能不全発生を示した。rMnSODロング型は、酸化的ストレスを著しく鈍らせ、これは、肝臓損傷及び微小循環性撹乱の全体的な改善と関連していた。冷貯蔵溶液へのrMnSODロング型添加が、ラット及びヒト肝臓組織の両方を保護するその抗酸化能を維持した。
【０１６０】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１６１】
rMnSODロング型及びショート型は、移植のための肝臓獲得の品質を十分に高める新規の高度に効果的な療法に相当する。
【実施例１１】
【０１６２】
ROSに対する、特に、拡張型心筋症(CMD)のモデルにおける、本発明の組換えMnSODの効果
材料及び方法
ROS測定アッセイ
腎臓においてROSのレベルを測定するために、本発明者は、(Borrelliら、2011年)に記載されるように2'7'ジクロロフルオレセイン(dichloroflurescin)ジアセテートアッセイを実施した。in vivo治療の最後に、ラットに麻酔をし、次いで、失血によって屠殺し、右腎臓を-80℃で迅速に保存した。後に、腎臓を氷上で解凍し、秤量した。腎臓を、5mLのTris-Hcl 40mM(pH7.4)中でUltraturraxを用いてホモジナイズした。タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイによって評価した。500μMストックから、アッセイのために2'7'ジクロロフルオレセインジアセテート5μM(Molecular Probes)を利用した。組織サンプルを10000〜2500倍の範囲で希釈した。分光光度計Jasco FP-777を使用して種々の時間(T0、T10、T30)で480〜525nmのスペクトルを分析した。ROSのレベルは、組織のグラム及びタンパク質のマイクログラムに対して正規化した強度蛍光(IF)として表した。
【０１６３】
結果
【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
これらの実験の結果は、2μgのrMnSODロング型及びCMDを有する患者に由来する1mlの血清とともの5分のみのインキュベーション後に、ROSの量が強く低減したことを実証し、これは、rMnSODロング型の連続注入i.v.が、患者においてCMDを低減し得ることをことを示唆する。
【０１６６】
rMnSODショート型を用いた場合に、同様の効果が観察された。
【０１６７】
次いで、rMnSODロング型及びショート型は、CMDの治療にとって有用である。
【実施例１２】
【０１６８】
陽子照射に曝露されたマウスにおける本発明の組換えMnSODの保護効果
材料及び方法
合同原子核研究所(Joint Institute for Nuclear Research)のPhasotron(Dubna)で利用可能な陽子を用いる致死量未満の全身照射のモデルを使用して、本発明者らは、rMnSODの放射線防護効果を調べるために、マウスにおいて急性放射線照射症候群の骨髄形態を再構築した。24gの平均体重を有する雄(CBAxC57B16)F1 SPFマウスを、4Gyの線量で171MeV陽子線に曝露し、次いで、rMnSOD又は塩化ナトリウム生理学的溶液のいずれかを用いて皮下処理した。
【０１６９】
結果
照射後、rMnSOD(ロング)を用いる6部の毎日の皮下処理が、胸腺及び脾臓質量の、及びマウス末梢血における白血球の数の回復の統計上有意な加速を提供した。対照的に、照射された、生理学的溶液を用いて処理されたマウスは、曝露の7日後にこれらの正の効果を実証しなかった。照射されたマウスの骨髄中の有核細胞の数は、照射の7日後に対照群におけるその基礎レベルをさらに超えた。したがって、rMnSOD処理群は、その正常な特徴の相当な高回復を実証した。
【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
0.5mLの容量でのrMnSOD溶液(0.5mLあたり1μg)又は塩化ナトリウム生理学的溶液(SCPS)のいずれかを用いて皮下処理した種々の動物群の照射。照射された動物の3群にrMnSODを与えた。これらのうち2つを、照射の直後に1回のみ処理し、それぞれ、43時間及び7日目に試験した。3番目の群には、照射のすぐ後の第1の注射で開始するrMnSODを用いる1日6部の処理を与え、曝露後7日目に試験した。SCPSを与えた3つのその他の照射群を、rMnSODのものと同一期間で処理し、試験した。対照の非照射群には処理を施さなかった。
【０１７２】
免疫系の臓器の状態及び赤血球産生に対する結果は、致死量未満の線量の陽子照射によって誘発される急性放射線照射疾患の治療においてrMnSODの治療効果を示す。
【０１７３】
rMnSODショート型を用いた場合に同様の効果が観察された。
【０１７４】
その結果、rMnSODロング型及びショート型は、致死量未満の線量の陽子照射によって誘発される損傷の治療及び/又は予防にとって有用である。
【０１７５】
(参考文献)
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図７（１−２）Ａ】
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【図７（１−２）Ｂ】
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【図７（１−２）Ｃ】
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【図７（１−２）Ｄ】
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【図７（２−２）Ｅ】
2016536016.tif 000027
【図７（２−２）Ｆ】
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【図７（２−２）Ｇ】
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【図７（２−２）Ｈ】
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【図７（２−２）Ｉ】
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【図７（２−２）Ｊ】
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【図９（１−２）Ａ】
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【図９（１−２）Ｂ】
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【図９（１−２）Ｃ】
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【図９（１−２）Ｄ】
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【図９（１−２）Ｅ】
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【図９（１−２）Ｆ】
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【図９（２−２）Ｇ】
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【図９（２−２）Ｈ】
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【図９（２−２）Ｉ】
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【図９（２−２）Ｊ】
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【図９（２−２）Ｋ】
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【図９（２−２）Ｌ】
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【図１０】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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