(57)【要約】  対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するためのアッセイ、キット、方法および装置を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するためのキットであって、対象から採られるサンプル中のコペプチンを検出するのに特異的な抗体検出アッセイを含み、サンプルは妊娠第１三半期の間に採られる、前記キット。
【請求項２】
サンプルは血液、血清、血漿または尿のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
サンプルは尿である、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
アッセイは検査ストリップまたはＥＬＩＳＡを含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
対照と比較して約１／４倍分コペプチンレベルが上昇していると、対象の妊娠中の子癇前症発生が予測される、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
抗体検出アッセイはバソプレシンおよびニューロフィジンＩＩも検出する、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
妊娠第１三半期の間に対象から尿サンプルを採取すること；および
対照と比較した場合のコペプチンレベルの差を、抗体検出アッセイを用いて測定すること
を含む、対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測する方法。
【請求項８】
対象の子宮動脈および臍動脈の少なくとも１つにおいてドプラ速度計測値を取得することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するためのキットであって、対象から採られるサンプル中のＬＮＰＥＰを検出するのに特異的な酵素検出アッセイを含む前記キット。
【請求項１０】
酵素検出アッセイは抗体検出アッセイである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
酵素検出アッセイは酵素活性アッセイである、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
コペプチンに特異的な抗体検出アッセイをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
対照と比較して約１／４倍分ＬＮＰＥＰレベルが減少し、コペプチンレベルが上昇していると、対象の妊娠中の子癇前症発生が予測される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
対象が子癇前症を発症する素因を有するか否かを予測するための検査装置であって、
バソプレシン遺伝子のタンパク質産物を検出するための検査アッセイを含む基板；
サンプル添加領域；および
リードアウト領域
を含み；
使用者が対象由来のサンプルを添加すると、該検査装置は使用者に、対象が妊娠しているか否か、および対象が子癇前症を発症する素因を有するか否かを示す情報を与える、前記検査装置。
【請求項１５】
基板はプラスチック、ガラス、金属、セルロース材料、ポリマー、布地およびそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の検査装置。
【請求項１６】
サンプル添加領域はリードアウト領域と流体で接続している、請求項１４に記載の検査装置。
【請求項１７】
使用者が対象由来のサンプルをサンプル添加領域に添加すると、１つまたはそれ以上の検査アッセイが装置内に係合され得る、請求項１４に記載の検査装置。
【請求項１８】
使用者に与えられる情報はリードアウト領域内のしるしを含む、請求項１４に記載の検査装置。
【請求項１９】
装置により与えられた情報を解釈するための取扱説明書をさらに含む、請求項１４に記載の検査装置。
【請求項２０】
複数の検査アッセイを含む、請求項１４に記載の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により各々が本明細書に組み入れてある、２０１３年２月８日にいずれも申請された米国出願番号第６１／７６２，８３１号および第６１／７６２，８３０号、ならびに２０１３年１１月１３日に申請された米国出願番号第６１／９０６，０７４号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界中の妊娠全体のうち１０％までが、高血圧のために困難なものとなる。米国では、妊娠全体のうち５〜７％にあたる、１年あたり約３００，０００件の妊娠で子癇前症に罹るが、これは母体−胎児の罹患および死亡全体のうち、１５％もの過剰な割合に相当する。子癇前症は発育不全、羊水過少、胎児死亡、母体の発作、卒中、脳血管出血および母体死亡のような、即時の母体−胎児の罹患を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。子癇前症の既往歴のある母親は将来、心筋梗塞を含めた心臓病および卒中に罹るリスクが高い（非特許文献２〜４）。子癇前症の妊娠による出生児も幼児期の残りの時期に、または成人になってから卒中（非特許文献５）、てんかん（非特許文献６）、ならびに代謝、栄養および血液疾患（非特許文献７）に罹るリスクが高い。子癇前症は明らかに、胎児および母親のいずれに対しても、即時のおよび長期にわたる影響があるが、その病理はよく分かっていない。そのため、子癇前症に対する予防、治療および根治のための療法はまだない。子癇前症に対する唯一にして真の治療法は、胎児および機能していない胎盤の娩出である。この娩出は早産であることが多く、さらなる病的な状態および致死性をもたらす（非特許文献１）。この事実は、子癇前症の処置を可能にする適切な一元化された経路を見出すことの重要性を強調している。
【０００３】
神経下垂体ホルモンのアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ；図１）は、ヒトおよび動物モデルにおける血圧および血液組成の、既知の制御因子である。ＡＶＰは、アフリカ系アメリカ人（非特許文献８）および老人（非特許文献９）を含めた特定の集団、ならびにうっ血性の心不全（非特許文献１０）または腎不全（非特許文献１１）を有する患者では血圧コントロールの重要な因子である。このホルモンは低レニン性高血圧（非特許文献１２）の患者で特に病因となっていると考えられ、低レニン性高血圧はヒトの本態性高血圧集団において高レニン性高血圧（１６％）（非特許文献１３）より大きな割合（２７％）を占める。
【０００４】
ＡＶＰが子癇前症を発症させる役割を担う可能性を支持する証拠がある。コペプチンはＡＶＰと共に翻訳され、ＡＶＰに対し１：１の化学量論比で血漿中に放出される（図１）。コペプチンは循環血液中でＡＶＰよりもはるかに安定であるため、このペプチドの測定値の方が、ＡＶＰを直接測定した値よりもはるかに一定しており、かつ信頼できる。ヒトでは、後期の三半期（ｌａｔｅ−ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）の血漿コペプチンレベルは、子癇前症の重症度、および関連する異常なドプラ速度計測値との相関が示されている（非特許文献１４、１５）。しかし、妊娠初期のコペプチンの発現パターンは決定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｎｔｉｌｌａｎ  ＭＫ、Ｓａｎｔｉｌｌａｎ  ＤＡ、Ｓｉｇｍｕｎｄ  ＣＤおよびＨｕｎｔｅｒ  ＳＫ、「Ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  ａ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ？」、Ｄｒｕｇ  ｎｅｗｓ  ＆  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、２２号、５３１〜５４１頁、２００９年
【非特許文献２】Ｇａｒｏｖｉｃ  ＶＤおよびＨａｙｍａｎ  ＳＲ、「Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、３号、６１３〜６２２頁、２００７年
【非特許文献３】Ｌｙｋｋｅ  ＪＡ、Ｌａｎｇｈｏｆｆ−Ｒｏｏｓ  Ｊ、Ｓｉｂａｉ  ＢＭ、Ｆｕｎａｉ  ＥＦ、Ｔｒｉｃｈｅ  ＥＷおよびＰａｉｄａｓ  ＭＪ、「Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｔｈｅｒ」、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、５３：号、９４４〜９５１頁、２００９年
【非特許文献４】Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ  ＥＢ、Ｖａｔｔｅｎ  ＬＪ、Ｓｍｉｔｈ  ＧＤおよびＲｏｍｕｎｄｓｔａｄ  ＰＲ、「Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、１１４号、９６１〜９７０頁、２００９年
【非特許文献５】Ｋａｊａｎｔｉｅ  Ｅ、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＪＧ、Ｏｓｍｏｎｄ  Ｃ、Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇ  ＫおよびＢａｒｋｅｒ  ＤＪ、「Ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ：  ｔｈｅ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ｂｉｒｔｈ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ」、Ｓｔｒｏｋｅ；  ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、４０号、１１７６〜１１８０頁、２００９年
【非特許文献６】Ｗｕ  ＣＳ、Ｓｕｎ  Ｙ、Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｍ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｊ、Ｎｅｓｓ  ＲＢ、Ｈａｇｇｅｒｔｙ  ＣＬおよびＯｌｓｅｎ  Ｊ、「Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｉｎ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２２号、１０７２〜１０７８頁、２００８年
【非特許文献７】Ｗｕ  ＣＳ、Ｎｏｈｒ  ＥＡ、Ｂｅｃｈ  ＢＨ、Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｍ、Ｃａｔｏｖ  ＪＭおよびＯｌｓｅｎ  Ｊ、「Ｈｅａｌｔｈ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｂｏｒｎ  ｔｏ  ｍｏｔｈｅｒｓ  ｗｈｏ  ｈａｄ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ：  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、２０１号、２６９．ｅ２６１〜２６９．ｅ２１０頁、２００９年
【非特許文献８】Ｂａｋｒｉｓ  Ｇ、Ｂｕｒｓｚｔｙｎ  Ｍ、Ｇａｖｒａｓ  Ｉ、Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ＭおよびＧａｖｒａｓ  Ｈ、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ  ｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：  ｒａｃｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１５号、５４５〜５５０頁、１９９７年
【非特許文献９】ｄｅ  Ｐａｕｌａ  ＲＢ、Ｐｌａｖｎｉｋ  ＦＬ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＣＩ、Ｎｅｖｅｓ  Ｆｄｅ  Ａ、Ｋｏｈｌｍａｎｎ  Ｏ、Ｊｒ．，  Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＡＢ、Ｇａｖｒａｓ  ＩおよびＧａｖｒａｓ  Ｈ、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ  ｔｏ  ｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、６号、７９４〜７９８頁、１９９３年
【非特許文献１０】Ｇａｖｒａｓ  Ｈ、「Ｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ」、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１６号、５８７〜５９３頁、１９９０年
【非特許文献１１】Ａｒｇｅｎｔ  ＮＢ、Ｂｕｒｒｅｌｌ  ＬＭ、Ｇｏｏｄｓｈｉｐ  ＴＨ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＲおよびＢａｙｌｉｓ  ＰＨ、「Ｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３９号、２９５〜３００頁、１９９１年
【非特許文献１２】Ｓｈａｈ  ＤＭ、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＡＳ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔｓ、８号、１４４〜１５２頁、２００６年
【非特許文献１３】Ｌａｒａｇｈ  ＪＨ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｌｏｗ−ｒｅｎｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ａ  ｂｅｎｉｇｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、４４号、９７１〜９７４頁、１９７１年
【非特許文献１４】Ｆｏｄａ  ＡＡおよびＡｂｄｅｌ  Ａａｌ  ＩＡ、「Ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃｏｐｅｐｔｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｔ  ｃｅｓａｒｅａｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｇｉｎａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ、１６５号、２１５−２１８頁、２０１２年
【非特許文献１５】Ｚｕｌｆｉｋａｒｏｇｌｕ  Ｅ、Ｉｓｌｉｍｙｅ  Ｍ、Ｔｏｎｇｕｃ  ＥＡ、Ｐａｙａｓｌｉ  Ａ、Ｉｓｍａｎ  Ｆ、Ｖａｒ  ＴおよびＤａｎｉｓｍａｎ  Ｎ、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｏｐｅｐｔｉｎ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ」、Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、３７号、１１９８〜１２０２頁、２０１１年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するためのキットは、妊娠第１三半期の間に対象から採られるサンプル中のコペプチンを検出するのに特異的な抗体検出アッセイを含む。
【０００７】
一実施形態では、サンプルは血液、血清、血漿または尿のうち少なくとも１つを含む。
【０００８】
さらなる実施形態では、サンプルは尿である。
【０００９】
キットの別の実施形態では、アッセイは検査ストリップ（ｔｅｓｔ  ｓｔｒｉｐ）またはＥＬＩＳＡを含む。
【００１０】
さらなる実施形態では、対照と比較して約１／４倍分コペプチンレベルが増加していると、対象の妊娠中における子癇前症発生が予測される。
【００１１】
別の実施形態では、抗体検出アッセイはバソプレシンおよびニューロフィジンＩＩも検出する。
【００１２】
第２の態様では、対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測する方法は、妊娠第１三半期の間に対象から尿サンプルを採取するステップ、および対照と比較した場合のコペプチンレベルの差を、抗体検出アッセイを用いて測定するステップを含む。一実施形態では、方法は、対象の子宮動脈および臍動脈の少なくとも１つにおいてドプラ速度計測値を取得するステップをさらに含む。
【００１３】
第３の態様では、対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するためのキットは、対象から採られるサンプル中のＬＮＰＥＰを検出するのに特異的な酵素検出アッセイを含む。
【００１４】
一実施形態では、酵素検出アッセイは抗体検出アッセイである。
【００１５】
さらなる実施形態では、酵素検出アッセイは酵素活性アッセイである。
【００１６】
別の実施形態では、キットは、コペプチンに特異的な抗体検出アッセイをさらに含む。
【００１７】
別の実施形態では、対照と比較して約１／４倍分ＬＮＰＥＰレベルが減少し、コペプチンレベルが上昇していると、対象の妊娠中の子癇前症発生が予測される。
【００１８】
第４の態様では、対象が子癇前症を発症する素因を有するか否かを予測するための検査装置は、バソプレシン遺伝子のタンパク質産物を検出するための検査アッセイを含む基板、サンプル添加領域およびリードアウト領域を含む。使用者が対象由来のサンプルを添加すると、検査装置は使用者に、対象が妊娠しているか否か、および対象が子癇前症を発症する素因を有するか否かを示す情報を与える。
【００１９】
装置の一実施形態では、基板はプラスチック、ガラス、金属、セルロース材料、ポリマーおよび布地ならびにそれらの組合せのうち少なくとも１つを含む。
【００２０】
装置の別の実施形態では、サンプル添加領域はリードアウト領域と流体で接続している。
【００２１】
装置のさらなる実施形態では、使用者が対象由来のサンプルをサンプル添加領域に添加すると、検出アッセイが装置内に係合され得る。
【００２２】
装置の別の実施形態では、使用者に与えられる情報はリードアウト領域内のしるし（ｉｎｄｉｃｉｕｍ）を含む。
【００２３】
装置のさらなる実施形態では、装置は、それにより与えられた情報を解釈するための取扱説明書をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態では、検査装置は複数の検査アッセイを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】バソプレシン（ＡＶＰ）遺伝子のタンパク質産物を表す図である。シグナル配列はこのタンパク質を細胞外への輸送（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｏｒｔ）へと標的化する。次いでアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）が、ＡＶＰ担体タンパク質のニューロフィジンＩＩ、およびコペプチンと共に１：１のモル比で産生および放出される。ＡＶＰは血漿中で非常に短い半減期を示すが、一方、コペプチンははるかに安定であり、主に尿へとクリアランスされ、そこでイムノベースのアッセイにより容易に検出され得る（３、５）。
【図２】本明細書で検討される検査アッセイを表す図である。パネルＡは、未使用の検査アッセイ装置を表す。パネルＢは、使用者がサンプルを添加した装置であって、サンプルが、子癇前症のリスクが高くない（陰性符号）妊娠女性（陽性符号）に由来することを示している前記装置を表す。パネルＣは、使用者がサンプルを添加した装置であって、サンプルが、子癇前症のリスクが高い妊娠女性に由来すること（二重陽性符号）を示している前記装置を表す。
【図３】ｓＲＡマウスでのバソプレシン上昇を示す図である。Ａ：メスｓＲＡおよび対照動物の視索上核（ＳＯＮ、上および中央の行、４匹の別個の動物由来）および室傍核（ＰＶＮ、下の列、２匹の別個の動物由来）内のアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）に対する免疫反応性。ｓＲＡ動物で、ＳＯＮの交叉後部分内の、ＡＶＰに対する免疫反応性の強いニューロン数が増えていることに注意されたい。ＯＮ、視索；３Ｖ、第三脳室。バー＝２００μｍ。Ｂ：同腹仔対照およびｓＲＡマウス（各群につきｎ＝３匹のメス）のＰＶＮおよびＳＯＮ全体における免疫反応性細胞断片であって、連続４つの切片（２００μｍ間隔）で直径が１０μｍを超える前記断片の、片側あたりの合計数。Ｃ：血漿コペプチンレベル（ｎ＝４匹のオス＋４匹のメスの対照、４匹のオス＋４匹のメスのｓＲＡ）。Ｄ：尿コペプチン濃度、尿の１日総体積、および尿へと失われるコペプチンの１日総量（ｎ＝１２匹のオス＋５匹のメスの対照、１０匹のオス＋７匹のメスのｓＲＡ）。データは全て平均±標準誤差である。＊対照に対しＰ＜０．０５。
【図４】バソプレシン受容体アンタゴニストに対する血圧の反応を示す図である。Ａ：ベースラインの、およびＶ１Ａ／Ｖ２に対する非ペプチド・アンタゴニストであるコニバプタンを慢性的に１０日間皮下注入（２２ｎｇ／時間）した場合の、テールカフにより監視した収縮期血圧（ＢＰ）（ｎ＝２匹のオス＋４匹のメスの対照、２匹のオス＋４匹のメスのｓＲＡ）。メスｓＲＡマウスでの、Ｖ１Ａ／Ｖ２受容体に対する非選択的アンタゴニストであるコニバプタン（２２ｎｇ／時間）の皮下注入に先立つ３日間、および皮下注入中の１８日間における、１時間ごとのテレメトリ血圧（Ｂ、ＭＡＰ）および心拍数（Ｃ、ＨＲ）の記録を示す。Ｄ：コニバプタン注入実験の間の（ＢおよびＣの）歩行による自発的身体活動の回数。Ｅ：ベースラインの、およびＶ２選択的アンタゴニストであるトルバプタンを慢性的に１０日間皮下注入（２２ｎｇ／時間）した場合の、テールカフにより監視した収縮期ＢＰ（ｎ＝４匹のオス＋５匹のメスの対照、４匹のオス＋６匹のメスのｓＲＡ）。Ｆ：ベースラインの、およびトルバプタンを１０日間皮下注入した後の、ｓＲＡマウス（ｎ＝４匹のメス）における無線テレメトリＭＡＰ記録の時間ごとの平均（薬物×時間、Ｐ＝０．０２９）。データは全て平均±標準誤差である。＊対照に対しＰ＜０．０５、†ベースラインのｓＲＡに対しＰ＜０．０５。
【図５】腹部大動脈の血管反応性を示す図である。Ａ：１００ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌに対する最大収縮反応（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）。ＢおよびＣ：ＰＧＦ２αに対して最大の半分を収縮させた後の、段階的用量のアセチルコリンおよびニトロプルシドナトリウムに対する弛緩反応。Ｄ〜Ｈ：段階的用量のアルギニンバソプレシン、フェニレフリン、エンドセリン−１、アンジオテンシンＩＩおよびプロスタグランジン−Ｆ２α（ＰＧＦ２α）に対する収縮反応（ｎ＝６匹のオス対照、５匹のオスｓＲＡ）。データは全て平均±標準誤差である。＊対照に対しＰ＜０．０５。
【図６】腸間膜動脈の血管反応性を示す図である。Ａ：１００ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌに対する最大収縮反応。Ｂ：段階的用量のアルギニンバソプレシン、フェニレフリンおよびエンドセリン−１に対する収縮反応（ｎ＝６匹のオス対照、６匹のオスｓＲＡ）。Ｃ：カルシウムを含まない条件の下、７５ｍｍＨｇの内腔圧で維持した腸間膜動脈の外直径および内腔直径、壁厚、中膜の内腔に対する比率、および断面積。Ｄ：ＡＶＰ  Ｖ１Ａ受容体、エンドセリン−１  ＥＴＡ受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ＥＴＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＧＳ２およびＲＧＳ５のｍＲＮＡの、腸間膜動脈での発現（Ｖ１Ａ、ＲＧＳ２およびＲＧＳ５；ｎ＝４匹のオス＋５匹のメスの対照、４匹のオス＋３匹のメスのｓＲＡ。ＥＴＡ、ｎ＝４匹のオス対照、４匹のオスｓＲＡ）。データは全て平均±標準誤差である。＊対照に対しＰ＜０．０５。
【図７】血清電解質を示す図である。Ａ：血清ナトリウム濃度。Ｂ：血清イオン化カルシウム濃度（ベースライン：ｎ＝８匹のオスおよび１２匹のメスの対照、５匹のオスおよび８匹のメスのｓＲＡ；トルバプタン：ｎ＝４匹のオスおよび５匹のメスの対照、４匹のオスおよび６匹のメスのｓＲＡ）。データは全て平均±標準誤差である。＊対照に対しＰ＜０．０５。†ベースラインのｓＲＡに対しＰ＜０．０５。
【図８】子癇前症女性の保存サンプル中のコペプチンレベルに対する手始めのＥＬＩＳＡスクリーニングを示す図である。
【図９】妊娠三半期ごとの母体血漿コペプチン、シスタチンＣおよびバソプレシン分解酵素（ＬＮＰＥＰ）タンパク質の濃度を示す図である。（Ａ）非妊娠女性および正常圧の妊娠女性と比較して、最終的に子癇前症を発症した女性では、血漿コペプチン濃度は３つの妊娠三半期の全てにおいて有意に上昇していた。コペプチンが妊娠６週もの早い時期から著しく上昇していたことは重要である。（Ｂ）血漿シスタチンＣは、子癇前症を経た女性でも、子癇前症を経なかった女性でも同様に胎齢の影響を受けた。（Ｃ）血漿ＬＮＰＥＰは、胎齢による、および子癇前症についての状況による変化を実質的に受けなかった。＊非妊娠サンプル、および胎齢をマッチさせた対照の妊娠サンプルに対し、Ｐ＜０．０５。
【図１０】いかなる共変量についても調整していない母体血漿コペプチンの的中率を示す図である。後の子癇前症発症を予測するツールとしての、共変量についての補正なしでのコペプチンの有用性についての受診者動作特性（ＲＯＣ）分析。
【図１１】バソプレシンはＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスで子癇前症様の表現型を誘導するのに十分であることを示す図である。（Ａ）バソプレシン注入は繁殖力を有意に低減した。Χ２  Ｐ＜０．００５。（Ｂ）バソプレシン注入は、妊娠マウスで高血圧および蛋白尿を誘導するようである。（Ｃ）バソプレシン注入による相当な胎児発育不全を示している、胎齢１８日の胎児の例の画像。（Ｄ）糸球体内皮症を示している、腎皮質の電子顕微鏡写真。上の２つのパネルは、生理食塩水を注入した動物に由来し、その糸球体基底膜の厚さは正常範囲内であった（細い白矢印）。下の２つのパネルは、バソプレシンを注入した動物に由来する。余分な内皮細胞膜が存在し（太い黒矢印）、基底膜は、高電子密度物質により著しく厚くなっている（太い白矢印）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は少なくとも部分的には、コペプチンレベルを妊娠中の初期に測定することが、対象が妊娠の残りの時期に子癇前症を発症するかの診断となるという発見に基づく。さらに、バソプレシンおよび他のペプチドホルモンを分解する亜鉛依存性アミノペプチダーゼであるＬＮＰＥＰ（ロイシル／シスチンアミノペプチダーゼ）の血清レベルを測定することも、対象が妊娠の残りの時期に子癇前症を発症するかの診断となると考えられる。子癇前症発症についてのこれらの指標を検出するためのアッセイおよび方法は、対象の子宮動脈および臍動脈の少なくとも１つにおけるドプラ速度計測を含めた、子癇前症に関する追加のアッセイと組み合わせ、さらに併せて１つとすることができる。異数性に関する血清スクリーニング、および当技術分野で知られている他のアッセイなどの追加のアッセイを、本明細書で開示するアッセイと組み合わせる可能性もさらに検討される。こうすることにより、単一の装置を使用して、母体および／または胎児に影響し得る複数の条件に関しスクリーニングすることができる。
【００２７】
一実施形態では、コペプチンおよび／またはＬＮＰＥＰレベルを測定することにより子癇前症発症を診断するためのアッセイには、抗体の媒介による検出などのような、可溶性Ｆｌｔ−１（ｓ−Ｆｌｔ−１）および／またはＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）を測定するための手段をさらに組み入れてもよい。ｓＦｌｔ−１（可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１、これはＶＥＧＦ受容体１としても知られる）は、血管新生促進因子ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）およびＰｌＧＦに結合し、その遊離型の循環レベルを低減する。追加のマーカーをコペプチンと共に、またはコペプチンに加えて評価して、子癇前症を予測することもできる。このマーカーには例えば、ｓＥｎｇ、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、子宮動脈ドプラ、ｈＣＧ、インヒビン、ｐａｐｐ−ａ、ａｆｐ、エストリオール、項部浮腫測定、ＩＬ−１βまたはＩＬ−６のようなインターロイキン、高感度Ｃ反応性タンパク質およびＰＡＰＰ−Ａのような、子癇前症に関連するいずれのバイオマーカーも含まれる。
【００２８】
別の実施形態では、既に子癇前症と診断された患者において、コペプチンレベルを単独で、または他の子癇前症マーカーと共に測定すると、悪化していく疾患の予後が予測され、また外来での待機的管理、入院での待機的管理、または胎児の即娩出など、さらなる管理の決定を医師が下す際の補助となり得る。
【００２９】
対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測するための、検討されるキットは、対象から採られるサンプル中のコペプチンおよび／またはＬＮＰＥＰを少なくとも検出するのに特異的な１つまたはそれ以上の抗体検出アッセイまたは他のアッセイ（検査アッセイ）を含むことができる。サンプルは対象から妊娠初期に、例えば妊娠第１三半期に採る。それより後の、第２および第３三半期を含めた妊娠段階のサンプルも測定する可能性もさらに検討される。加えて、妊娠前のサンプルも、妊娠女性に対する対照として、および／またはそれ自体を予測サンプル（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅｓ）として評価することもできる。本明細書では抗体に基づく検出アッセイを検討するが、他の検査アッセイまたは検出アッセイ、例えばコペプチン特異的およびＬＮＰＥＰ特異的アッセイ、またはバソプレシン遺伝子のタンパク質産物に特異的ないかなるアッセイも、当技術分野で知られているものは本明細書で検討する。これには例えば、タンパク質特異的および／またはペプチド特異的アッセイ、酵素活性アッセイ（酵素検出アッセイ）ならびにマススペクトメトリが含まれる。キットは、陽性および陰性対照サンプル、アッセイ試薬ならびに説明書をさらに含むことができる。
【００３０】
本開示で検討するサンプルとしては、全血、血清および／または血漿を含めた血液画分、尿、組織、細胞、ならびに例えば汗および涙を含めた体液が挙げられる。好まれるサンプルの１つは血漿である。好まれる別のサンプルは血清である。好まれる別のサンプルは尿である。一実施形態では、キットは、血漿、血清または尿に対し使用できる抗体検出アッセイを含む。換言すれば、いかなる身体サンプルも、単一アッセイに使用することができる。
【００３１】
さらなる実施形態ではアッセイとして、検査ストリップ、ＥＬＩＳＡ、または抗体に基づく他のアッセイもしくは他の標的特異的アッセイ、例えば、酵素活性を利用した発色手段などにより、標的とする酵素の存在を検出する酵素活性アッセイなどが挙げられ得る。検査ストリップは、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（エルクハート、ＩＮ）に対する米国特許第６，２１０，９７１号または第５，７３３，７８７号（各々が、参照により本明細書に組み入れてある）に記述されているような従来の方式で製造することができる。検査ストリップが、標的とするエピトープの付着を、当技術分野で知られている１つまたはそれ以上の発色、発蛍光または発光反応の開始と共役させ、所望の標的が結合したことを示すようにする可能性が検討される。さらに検査ストリップは、支持材料の層に結合した代謝物を固定する能力のある吸収性基板とみなすこともできる。よく知られた固相支持体としては、紙、セルロース、合成樹脂から作られる布、例えばナイロンまたは不織布を挙げることができる。吸収性材料は通常、ガラス繊維または合成ポリマーシートのような支持材料の層に結合して、構造上の支持となる。他の適切な固相支持体も本明細書で検討する。
【００３２】
さらには、２つ（またはそれ以上、例えば３つもしくは４つ）のアッセイを単一のアッセイ装置内に組み合わせてもよい。例えば、発色手段またはその他の手段（例えば、尿検査または他のサンプルに基づく手段）を用いる妊娠検査などである。この実施形態では、妊娠検査に加え、子癇前症を予測するための１つまたはそれ以上の検査を含めることになる。この実施形態では、妊娠についての「陽性」結果（対象は妊娠中）は第１のしるしで示し、子癇前症検査についての「陽性」結果（子癇前症の素因を示す）第２のしるしで示すことができる。
【００３３】
別の実施形態では、妊娠、ならびにコペプチンおよびＬＮＰＥＰのような複数の子癇前症予測マーカーに関して検査する３つの検査アッセイを検討する。こうすることにより、妊娠に伴う子癇前症の予測の、単一検査での特異度を高くすることができる。
【００３４】
検査アッセイは、最終使用者（例えば、妊娠中でかつ子癇前症のリスクがあるか否かを知りたい女性など）が購入できる単回使用の装置内に組み入れてもよい。この検査アッセイ装置は、単一個または複数個の検査装置に尿、血液、およびある種の別のサンプルを添加し、検査アッセイを約１分、約５分、約１０分、約１５分または約１時間など、規定の時間の間インキュベートし、その結果を、検査アッセイ装置購入時のパッケージに付随していた、または検査アッセイ装置自体に付いていた解読キー（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｋｅｙ）と比較することにより利用できる。検討している検査装置１０を図２に示す。検査装置１０は、基板１２、サンプル添加領域１４およびリードアウト領域１６を有する。基板は例えば、プラスチック、ガラス、金属、セルロース材料、ポリマー、布地およびそれらの組合せから作ることができる。サンプル添加領域１４は、基板１２内および／または基板の表面上において、リードアウト領域１６と流体でつながっていてもよい。流体連通は、１つまたはそれ以上のマイクロ流体チャネル、芯、および毛管作用を引き起こすよう適用された空隙などによるものでよい。使用者が対象由来のサンプルをサンプル添加領域１４に添加すること、または補助的な物質（例えば、液体担体および／またはアッセイ試薬）を添加することによって、１つまたはそれ以上の検査が係合され得る。補助物質の例としては、水、生理食塩水、ｐＨ緩衝剤、変色剤、タンパク質、酵素および／またはペプチドが挙げられる。インキュベーション時間経過後、検査アッセイは、検査結果を示すリードアウトを、使用者に対しリードアウト領域１６に表示することができる。パネルＢは、検査装置１０に添加するサンプルが、子癇前症（マイナス符号により示される）の素因のない妊娠女性（プラス符号により示される）に由来していたケースを表す。パネルＣは、検査装置１０に添加するサンプルが、子癇前症の素因のある妊娠女性（二重陽性符号）に由来していたケースを表す。この装置では、如何なるしるしを用いてもよい。さらに、検査装置に添加するサンプルが非妊娠女性に由来していたケースでは、符号は二重陰性であることも、何もないこともあり得る（示してはいない）。
【００３５】
サンプル中のコペプチンレベルが対照と比較して増加していると、対象の妊娠中の子癇前症発生が予測されると考えられる。例えば、約１／１００倍、もしくは約１／５０倍、もしくは約１／２５倍、もしくは約１／１６倍、もしくは約１／８倍、もしくは約１／４倍、もしくは約２倍分の増加、またはそれより大きい、もしくはそれ未満の増加である。
【００３６】
同様に、サンプル中のＬＮＰＥＰレベルが対照と比較して減少していると、対象の妊娠中の子癇前症発生が予測されると考えられる。例えば、約１／１００倍、もしくは約１／５０倍、もしくは約１／２５倍、もしくは約１／１６倍、もしくは約１／８倍、もしくは約１／４倍、もしくは約２倍分の減少、またはそれより大きい、もしくはそれ未満の減少である。
【００３７】
一実施形態では、対象の子癇前症発生の可能性を診断または予測する方法は、妊娠第１三半期の間に対象から、尿のようなサンプルを採取するステップ、サンプル中のコペプチンレベルを、抗体検出アッセイまたは他のアッセイを用いて測定するステップ、および対象のコペプチンレベルを対照と比較することにより、妊娠の残りの時期に対象が子癇前症を発症する可能性が高いか否かを決定するステップを含むことができる。アッセイからは、例えば変色、発光、発光強度の変化、濃度測定、または基板の乳白度／半透明度の変化によりデータを得ることができる。これらのデータはさらに、対照との比較でプロットすることのできるデータポイントへと変換してもよい。
【００３８】
方法は、対象の子宮動脈および臍動脈の少なくとも１つにおいてドプラ速度計測値を取得するステップをさらに含むことができる。
【００３９】
妊娠初期とは、少なくとも無月経が２０週になる前、より好ましくは、少なくとも妊娠が約１６週、または約１２週、または約８週、または約４週になる前のことを意味する。妊娠の初期が第１三半期の間のこともある。
【００４０】
「患者」または「対象」とは、メスの対象、例えばヒトを意味する。本明細書で検討する対照には、年齢をマッチさせた妊娠している健康な単一対象、または年齢をマッチさせた妊娠している健康な複数人の対象の集団、または妊娠している健康な複数人の対象、または妊娠の残りの時期に子癇前症を発症する者を１人も含まない、妊娠している健康な複数人の対象の集団に由来する血清および／もしくは尿サンプルが含まれ得る。加えて、所定の対照は、所定の陰性対照であってもよい。所定の陰性対照には例えば、妊娠中に子癇前症を発症した１人または複数人の対象が含まれる。
【００４１】
本明細書で検討する抗体検出アッセイとしては、抗体または抗体のサブパートを用いて、着目する特定分子を標的とするアッセイを挙げることができる。分子の検出は、抗体を分子に付着させ、これに、抗体または抗体のサブパートと会合している例えば蛍光分子、酵素、色原体、化学発光または放射化学およびそれらの組合せのようなインジケータを組み合わせることにより、行うことができる。さらには、着目する分子、例えばコペプチンまたはＡＶＰ遺伝子の他のタンパク質産物を、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析およびそれらの組合せにより測定する可能性も想定される。
【００４２】
抗体検出アッセイの一例はＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡには、コペプチン、またはバソプレシンおよびニューロフィジンＩＩのような、バソプレシン（ＡＶＰ）遺伝子のタンパク質産物のうち共発現している他の領域（図１）の抗原またはエピトープに特異的な抗体を含めてもよい。抗原は、天然もしくは合成タンパク質もしくはその断片、多糖または核酸であってもよい。当業者ならば、抗原は免疫応答を誘導し、抗体産生を誘発することがあることを知っている。抗体は、異物の存在に応答して合成された分子であってもよく、この場合、各抗体は、その合成を刺激したその外来物質に対し特異的親和性を有する。抗体の特異的親和性は、分子全体を抗原としたものである必要はなく、エピトープと称する特定の部位、に対するものであってもよい（Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、５７４頁、（２００６）、これは本明細書に、全体が記載されているとみなせる形で参照によって組み入れてある）。抗体は例えば、タンパク質に結合する、または他の抗原結合特性のある天然もしくは合成タンパク質もしくはその断片、または核酸（例えば、アプタマー）であってもよい。抗体は、それだけに限らないが、外来タンパク質、微生物および毒素への曝露を含めた抗原刺激に応答し、産生され得る。パネルを、パネル中の抗原に特異的な抗体を少なくとも１つ含むサンプルと接触させると、抗原と、抗原に特異的な抗体との間で免疫複合体が形成される。当分野の通常の技術の１つにより、抗原−抗体免疫複合体の形成を、当分野で一般に用いられる手法で評価することができる。本明細書において検討される免疫複合体の形成を評価するための他の適切なアッセイの例としては、ファージ・イムノブロットおよびラジオイムノアッセイが挙げられる。例えば、（Ｄｕｂｏｖｓｋｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：６７５〜６８３頁（２００７）、これは本明細書に、全体が記載されているとみなせる形で参照によって組み入れてある）を参照されたい。
【００４３】
本明細書で別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の通常の一技術者によって一般に解釈され、かつ出版物を参照することによって解釈されるのと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書中の様々な実施形態が、「含む」という言い回しを用いて表現されるが、様々な状況下で、関連する実施形態が「からなる」または「から本質的になる」という言い回しを用いて記述されることもある点は、理解されたい。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語は、１つまたはそれ以上のことを指し、例えば「１つの免疫グロブリン分子」とは、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン分子を表すものと解釈される点は、注意されたい。したがって「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用する。
【００４５】
以下の実施例は、本発明で好まれるマーカーおよび方法を呈示する。しかしこれらの実施例は例示のために提供するのであって、本明細書ではそのいずれも、本発明の範囲全体を限定するものと取るべきでない点は理解されたい。付録Ａに含めた付随事項は、参照によって組み入れてある。
実施例
【実施例１】
【００４６】
トランスジェニックにより脳内レニン−アンジオテンシン系を活性化したマウスの高血圧は、バソプレシン依存性である。
脳内における局所組織のレニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）活性は、血圧上昇の発現および維持において、高血圧の多くの型で関与している。脳内ＲＡＳ活性が高血圧で因果的役割を担うことを具体的に示す証拠は、様々なげっ歯類モデルから得られている。これら多くのモデルとしては、アンジオテンシンの末梢注入モデル（５９、７７、１００）、血漿レニンの上昇している（１８）および抑制されている（３６、４８、６５）モデルの両方、心因性（５５）、寒冷曝露（８２）、腎損傷（９６）、睡眠時無呼吸（１６）モデル、トランスジェニック・ラットのＴＧＲ（ｍＲｅｎ２）２７（８３）、ならびに高塩濃度の食餌で維持したダール食塩感受性ラット（３６）および高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）（４７、６１、９５）の両方が挙げられる。脳内アンジオテンシンによる血圧への効果を説明する機構が主に２つ記述されている。第１に、視索上部（ＳＯＮ）および視床下部室傍核（ＰＶＮ）内のＲＡＳの作用により、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ、抗利尿ホルモン、ＡＤＨまたはアルギプレシンとしても知られる）の産生および放出が刺激される（６、１３、２２、３８、６６、６９、８３）。第２に、後脳および脳幹でのＲＡＳの作用により、圧反射機能および交感神経出力（ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｏｕｔｐｕｔ）が変化する（２８、３２）。興味深いことに、ＡＶＰを発現するニューロン集団はＰＶＮから後脳および脊髄に投射しており、また交感神経活動の制御に関与するとみられる。このことから、ＡＶＰの媒介するクロストークがこれら２つの機構の間にある可能性が示唆される。
【００４７】
いくつかの研究は、不均一なヒト対象群において、ＡＶＰが血圧コントロールに実質的な役割を担っている証拠を記述できなかったが（６３）、特定のヒト集団では、ＡＶＰは血圧コントロールに顕著に寄与するものとして意味づけられている（２５、６２）。具体的には、アフリカ系アメリカ人（４）、老人（１９）、およびうっ血性の心不全（２５）または慢性腎不全（３）を有する患者は皆、ＡＶＰ依存性の血行力学的変化を示す（９）。これらのヒト集団が皆、低レベルの循環レニンを示す点は重要である（９８）。低レニン性高血圧はヒト本態性高血圧において、高レニン性高血圧（１６％）（４９）よりも大きな（２７％）割合を占める。したがって、特定の高血圧患者集団に対する降圧療法としてＡＶＰを治療標的とすることが、あまりに早い段階で見落とされてしまっていた可能性については、なんとも言えない。
【００４８】
本発明者らはこれらの知見を総合するなかで、ＡＶＰの上昇は、脳内ＲＡＳ活性の慢性的上昇による高血圧を引き起こし、かつ維持するのに必要なのだろうか、という問いを立て、この文脈でのＡＶＰの作用機序を探ることとなった。本発明者らは、脳内ＲＡＳのトランスジェニックによる活性化は血漿ＡＶＰを上昇させることになることと、ＡＶＰの作用は、血管収縮と腎機能変化との何らかの組合せを介して脳内ＲＡＳが高血圧を誘導するのに必要とされることとを仮定した。これらの仮定を検証するために本発明者らは、自分達の研究室で以前に開発した特別なトランスジェニック動物モデルを利用した（２７、７１）。このダブルトランスジェニック・モデル（「ｓＲＡ」モデル）は、レニンの媒介するアンジオテンシノーゲン切断の種特異性を利用して、脳特異的なＲＡＳの活性亢進を引き起こす。本発明者らは以前に、これらの動物が強い慢性高血圧、多飲、多尿、および安静時代謝率の上昇を示すことを実証している。ｓＲＡマウスは、腎臓の交感神経活性が上昇しているにもかかわらず、血漿ＡＶＰレベルの上昇および循環ＲＡＳの抑制を示すことも、本発明者らが以前に確定している点は重要である（２７）。今回、本発明者らはこのモデルにおいて、ニューロンでのＡＶＰ免疫染色の上昇（視索上核特異的に）、１日あたりのＡＶＰ分泌の増加、ｓＲＡマウスの脈管構造がＡＶＰに対し強く脱感作していること、ならびにＶ２  ＡＶＰ受容体によるシグナル伝達が、高血圧および低ナトリウム血症の維持に必要であることを示す。これらの知見から、ＡＶＰが、ｓＲＡマウスでの高血圧において主要な役割を担っていることが強調される。
【００４９】
材料と方法：
動物。動物を用いる作業は全て、アイオワ大学動物実験委員会（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認を受け、国立衛生研究所の「実験動物の管理と使用に関する指針」に従って行った。
【００５０】
ダブルトランスジェニック（ｓＲＡ）マウスは、以前に記述されているように作製した（２７、７１）。手短に言えば、ヒト・レニンをニューロン特異的なシナプシン・プロモーターの転写制御下で発現する「ｓＲ」マウスを、ヒト・アンジオテンシノーゲンをその本来のプロモーターの転写制御下で発現する「Ａ」マウスと掛け合わせた（１１１１０／２  Ｘ  ４２８４／１系統）。ヒト・アンジオテンシノーゲンは、反応の種特異性からヒト・レニンのみにより切断されて、アンジオテンシンＩを生ずる。ＲＡＳの活性亢進はこれにより、ｓＲＡ子孫でトランスジーンの発現が重なっている部位に局限される（すなわち、通常アンジオテンシノーゲンを産生する、中枢神経系の小区画）。
【００５１】
免疫組織化学。脳内ＡＶＰの免疫組織化学的検出は、アルギニン８−バソプレシンの最初の６アミノ酸に対応する合成ペプチドに対するウサギ・ポリクローナル抗体（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、バーリンゲーム、ＣＡ）を使用し、厚さ５０μｍの切片に対して行った。切片は、４％パラホルムアルデヒドおよび０．５％グルタルアルデヒドで灌流固定した６つの脳（ｓＲＡが３つ、野生型が３つ）から切り出し、１：１，０００希釈した抗体中において４℃で２４時間インキュベートした。ｓＲＡマウスの方の脳には、識別のために「刻み目」を入れ、野生型動物由来の切片と共にインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体およびアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼとインキュベートした後、３，３’−ジアミノベンジジンを色原体として用い、免疫反応性を検出した。体軸方向に沿った位置についてマッチさせた４切片を各動物からとり、ＰＶＮおよびＳＯＮ内の、ＡＶＰで免疫染色される１０μｍより大きな断片をＮＩＨ製のＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計数した。
【００５２】
血圧（テールカフ）。今回初めて本発明者らは、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＰ−２０００テールカフ血圧モニタリング・システムを使用し、以前に記述されているように（７９）、ｓＲＡマウスの血圧を調べた。手短に言えば、暖めた拘束ケージ（ｗａｒｍｅｄ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｂｏｘｅｓ）に動物を１週間毎日順応させた。順応後、２週間の間、各動物の収縮期血圧の測定値３０回分の平均を毎日とって、ベースライン血圧を評価した。コニバプタン（バプリゾール、ＹＭ０８７、皮下投与で２２ｎｇ／時間、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはトルバプタン（ＯＰＣ−４１０６１、皮下投与で２２ｎｇ／時間、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、別個の組のマウスに対し浸透圧ミニポンプ（モデル１００４、Ａｌｚｅｔ）で送達した。浸透圧ミニポンプを埋め込んだ後、圧力を１０日間毎日記録して薬物効果を評価した。
【００５３】
血圧（テレメトリ）。以前に報告されているように（２７）、無線テレメトリによって基本的に頸動脈から血圧を記録した。手短に言えば、テレメータ・プローブ（ｔｅｌｅｍｅｔｅｒ  ｐｒｏｂｅ）（ＤＳＩ、モデルＴＡ１１ＰＡ−Ｃ１０）を、ケタミン−キシラジン麻酔下で総頸動脈に挿入した。＞２日間回復させた後、血圧、心拍数および自発的身体活動を、データクエスト・プログラム（ＤＳＩ）を用いて５分毎に３０秒間記録した。ベースラインを記録した後、イソフルラン麻酔下で肩甲骨間を切り込んで背中の皮下腔に埋め込んだ浸透圧ミニポンプによって、コニバプタンおよびトルバプタンを慢性的にマウスに送達した。
【００５４】
大動脈の血管反応性：腹部の大動脈輪を、以前に記述されているように（３０）、血管反応性について評価した。手短に言えば、マウスをペントバルビタールの過剰投与により安楽死させ（５０ｍｇ、腹腔内）、腹部大動脈を速やかに取り出し、以下を（ｍｍｏｌ／Ｌにて）含むクレブス緩衝液中に置いた：１１８．３  ＮａＣｌ、４．７  ＫＣｌ、１．２  ＭｇＳＯ４、１．２  ＫＨ２ＰＯ４、２５  ＮａＨＣＯ３、２．５  ＣａＣｌ２および１１グルコース。血管輪（長さは４〜５ｍｍ）は、３７℃の臓器槽中で酸素を含ませたクレブス緩衝液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）に懸濁し、スチール・フックにより力変換器に連結した。静止張力は４５分間にわたって０．５グラムに調節した。収縮反応を、ＡＶＰ（１０−１０〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）、フェニレフリン（ＰＥ、１０−８〜３ｘ１０−５）、エンドセリン−１（ＥＴ−１、１０−１０〜１０−７）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α、１０−７〜１０−４）およびアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ、１０−１０〜１０−７）に対する反応について検査した。ＰＧＦ２αによる最大下収縮（最大の４０〜５０％；３ｘ１０−６〜６ｘ１０−６）に続いて、アセチルコリン（１０−８〜３ｘ１０−５）およびニトロプルシドナトリウム（１０−９〜１０−５）に対する弛緩反応を決定した。
【００５５】
腸間膜動脈の血管反応性：腸間膜動脈の二次分枝を切開し、酸素を含ませ冷やした（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２および７４％Ｎ２）クレブス緩衝液中に置いた。動脈の１区域（長さ約１ｍｍ）を血管チャンバー（ｖｅｓｓｅｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）（ＤＭＴ）に移し、ガラスマイクロピペットを用いてカニューレ処置し、絹糸結紮により固定した。流れなしで、この動脈に徐々に４０ｍｍＨｇまで圧力をかけた。３０分平衡化した後、１００ｍＭのＫＣｌに対する収縮反応によって、血管の生存能力を検査した。次に、ＰＥ（１０−９〜１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ＡＶＰ（１０−１２〜１０−７ｍｏｌ／Ｌ）およびＥＴ−１（１０−１１〜１０−８ｍｏｌ／Ｌ）に対する血管の反応を評価した。動脈を次に、１０−５ｍｏｌ／Ｌのニトロプルシドナトリウムおよび２ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡを含むカルシウム非含有クレブス緩衝液で灌流して、この血管を最大限拡張させた。内直径および外直径は、７５ｍｍＨｇで測定した。壁厚、中膜／内腔の比率、および断面積（ＣＳＡ）は、Ｎｅｖｅｓら（５８）によって以前に記述されているように算出した。
【００５６】
遺伝子発現：腸間膜動脈（上腸間膜動脈は除外した）および腎臓を、液体窒素で急速凍結し、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（登録商標）抽出した。全ＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）ミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコールに従い単離した。濃度は、ナノドロップＮＤ−１０００を使用して決定した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを作製した。以下のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った：ＲＧＳ２（Ｍｍ００５０１３８５＿ｍ１）、ＲＧＳ５（Ｍｍ００５０１３９３＿ｍ１）、Ｖ１Ａ（Ｍｍ００４４４０９２＿ｍ１）、ＥＴＡ（Ｍｍ０１２４３７２２＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（４３５２９３２Ｅ）、またはＳＹＢＲ１８８グリーン・アッセイ（プライマー配列は表１：ＮＫＣＣ２、ＮＣＣ、ＮＨＥ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γ、ＮＫＡ−α、Ｖ２Ｒ、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＰＧＥＳおよびＵＴ１−Ａ）、これらはβ−アクチンに対し規格化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製ＳＹＢＲグリーン試薬を利用し、リアルタイム反応は全てＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５  ｉＣｙｃｌｅ（登録商標）を用いて行った。
【００５７】
【表１】
2016507753.tif 000002
【００５８】
血液および尿の分析：血漿は、顎下から出血させて全血をリチウムヘパリン被覆チューブに採取し、次に５，０００ｘｇで５分遠心することにより得た。上清は新しいチューブに移し、分析までは−８０℃で凍結させた。尿は、以前に記述されているように（２０）
、Ｎａｌｇｅｎｅ単一マウス代謝ケージ（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｕｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｃａｇｅｓ）を使用して採取した。コペプチンは、ＥＬＩＳＡキット（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、製造業者の指示に従って測定した。血液化学および尿クレアチニンは、ＣＨＥＭ８＋カートリッジ付きのハンドヘルドｉＳＴＡＴ臨床化学分析計（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して決定した。尿タンパク質は、ビシンコニン酸アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、製造業者の指示に従って決定した。
【００５９】
統計：データは、反復測定を適切に用いてＡＮＯＶＡで解析した。事後解析は、ボンフェローニ多重比較法も用いて行った。ＥＣ５０および最大反応の算出は、個々の用量反応データセットを４パラメータ・ロジスティック関数に当てはめることにより行った（ヒルスロープ法（Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ  ｍｅｔｈｏｄ））；ｙ＝最小＋（最大−最小）／（１＋（ｘ／ＥＣ５０）＾ヒルスロープ）。ｍＲＮＡの倍率変化は全て、リーバック法（Ｌｉｖａｋ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて算出した（５１）。解析的な比較は全て、ＳｉｇｍａＳｔａｔ／ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ）を用いて行った。データは全て、平均±標準誤差で表す。
【００６０】
結果：
予想通り（３９、９３）、ｓＲＡ動物および野生型動物のいずれでも、視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）、ＳＯＮ、ＰＶＮおよび円形の核（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉ）の細胞でＡＶＰに対する免疫反応性が観察された。ＡＶＰに対し免疫反応性の線維は、ＳＯＮおよびＰＶＮから正中隆起まで辿ることができた（図３Ａ）。ＳＣＮおよびＰＶＮの、ＡＶＰに対し免疫反応性のニューロン数にはｓＲＡ動物と野生型動物との間に明確な差はなかったが、ニューロンおよび線維の免疫反応性は一貫してｓＲＡ動物でより密であった。ｓＲＡ動物と野生型動物との間での最も著しい相違は、ｓＲＡ動物におけるＳＯＮの交叉後部分で検出される、ＡＶＰに対し免疫反応性のニューロン数が（図３Ａおよび３Ｂ）、野生型動物における交叉後部のＳＯＮに比較して２倍になっていることであった。コペプチンは、全長を翻訳されたＡＶＰプロタンパク質のＣＯＯＨ末端断片であり、したがってＡＶＰと１：１のモル比で翻訳される。コペプチンは、ＡＶＰよりもはるかに長い生物学的半減期を示すため、ＡＶＰそのものよりも慢性ＡＶＰ放出を見積る上で信頼できると提案されている（８４）。コペプチンレベルは、ｓＲＡマウス由来の血漿では顕著に減少している（図３Ｃ）。しかしサイズが小さいため（３８アミノ酸、４．２２ｋＤａ）、このタンパク質は腎臓により血漿から速やかにクリアランスされる。コペプチン濃度は、ｓＲＡマウス由来の尿で上昇しているようではあった、もっともその差は有意なものではなかった。しかし本発明者らが、ｓＲＡマウスで大きく増加している（約７倍）尿産生率について調整したところ、尿へクリアランスされるコペプチンの１日総量がｓＲＡマウスで大きく増加しているのは明らかであった（約２０倍、図３Ｄ）。これらのデータを総合すると、ｓＲＡマウスではＡＶＰ分泌が約２０倍増加していることが示される。尿へと失われるコペプチンの１日総量がこのように大きく異なるのは、尿クレアチニンの１日総量に対し規格化しても（８倍）（クレアチニン：対照で０．２０±０．０３に対し、ｓＲＡで０．４０±０．０５ｍｇ／日、Ｐ＜０．０１、コペプチン／クレアチニン：対照で４９±３６に対し、ｓＲＡで４０６±１７６ｐｇ／ｍｇ、Ｐ＝０．０５）、または尿タンパク質の１日総量に対し規格化しても（１０倍）（タンパク質：対照で４１±４に対し、ｓＲＡで８６±９ｍｇ／日、Ｐ＜０．０１、コペプチン／タンパク質：対照で１８０±１００に対しｓＲＡで１，８４５±６６５ｍｇ／ｍｇ、Ｐ＝０．０２）無くならなかった。
【００６１】
ベースライン条件でｓＲＡマウスは、テールカフにより容易に検出できる高血圧を示した（図４Ａ）。これらのデータによって、本発明者らが以前に公表したこのモデルにおける高血圧の測定値（２７、７１）であって、カニューレにより直接決定した、または無線テレメトリにより決定した測定値が再現された。ＡＶＰ  Ｖ１Ａ／Ｖ２受容体に対する非選択的な非ペプチド・アンタゴニストであるコニバプタンを、慢性的に皮下注入すると、ｓＲＡマウスの高血圧が完全に正常化した。ｓＲＡマウス代表例のベースラインおよび１８日間コニバプタン持続皮下注入時の血圧を連続的に記録したところ、心拍数の微減（図４Ｃ）と平行して徐々に、しかししっかりと血圧が低下していった（図４Ｂ）ことが示された。記録期間を通じて自発的身体活動が正常なままであったのは重要で、動物が手術およびコニバプタン注入のせいで嗜眠性であったわけでもなければ、かといって病気だったわけでもないことを示唆している（図４Ｄ）。
【００６２】
ｓＲＡマウスの高血圧における、異なるバソプレシン受容体サブタイプの相対的な寄与を細かく吟味するため、本発明者らは次に、Ｖ２に選択的なアンタゴニストであるトルバプタンを慢性的に皮下注入すると血圧がどうなるのか調べた。トルバプタンを慢性的に注入すると、コニバプタンで観察された（図４Ａ）のとほとんど同一の血圧正常化が引き起こされた（図４Ｅ）。この血圧低下が、無線テレメトリを使用して検査したｓＲＡマウスのコホートでも確認された点は重要である（図４Ｆ）。
【００６３】
ｓＲＡマウスの慢性高血圧およびバソプレシン特異的な変化についての証拠はさらに血管反応性アッセイからも得られた。まず、腹部の大動脈輪を、選択した血管収縮性化合物および血管拡張薬化合物への反応性について生体外で調べた。ｓＲＡマウス由来の大動脈輪は、塩化カリウムに対し正常な収縮反応を示した（図５Ａ）。腹部の大動脈輪は、血管拡張剤であるアセチルコリンに反応して右側への強いシフトを示すが（表２）、ニトロプルシドナトリウムには正常な反応を示す（図５、ＢおよびＣ）。これは、慢性高血圧モデルに典型的な内皮障害を示している。ＡＶＰレベルにおける慢性上昇を支持することには、ｓＲＡマウス由来の腹部大動脈は、ＡＶＰに対する収縮反応の強い抑制を示し（図５Ｄ）、これは、力価が右側にシフトする（低減される）傾向、および最大反応の有意な抑制の双方に反映されている（表２）。ＰＥ、ＥＴ−１、ＡＮＧ  ＩＩまたはＰＧＦ２αに対する収縮反応には、力価または効能の変化は観察されなかったことから（図５、Ｅ−Ｈ）、ｓＲＡの脈管構造変化がＡＶＰ特異的であることが示唆される。
【００６４】
【表２】
2016507753.tif 000003
【００６５】
より小さな動脈が末梢抵抗のコントロールに重要なことを考慮して、次に、腸間膜動脈の二次分枝の血管反応性を、圧力筋運動記録法を用いて調べた。腸間膜動脈分枝は、塩化カリウムに対する収縮反応の有意な低減を示した（図６Ａ）；しかしｓＲＡマウスでのこのＫＣｌ反応低下に対し、他の収縮反応を規格化してもデータの解釈に定性的影響はなかった（示してはいない）。腹部の大動脈輪と同様に、ｓＲＡマウス由来の腸間膜動脈は、右側にシフトする傾向、およびＡＶＰに対する最大反応の実質的な抑制（表２）を示した
（図６Ｂ）。
【００６６】
腸間膜動脈はＰＥに対し正常な収縮反応を示し、効能も力価も変化していなかった。ｓＲＡマウス由来の腸間膜動脈はＥＴ−１に反応して、正常な最大反応と、わずかではあるものの統計的に有意な、力価の左側へのシフトとを示した。これらのデータから、より小さな動脈がｓＲＡマウスでＡＶＰ特異的に脱感作していることが確認される。これは、ＡＶＰはｓＲＡマウスで慢性的に上昇しているとする結論をさらに支持する。ｓＲＡマウス由来の腸間膜動脈はかなりの内向きユートロフィック（ｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）リモデリングを示し、これは、このモデルにおける慢性高血圧のさらなる証拠となる。対照マウスとｓＲＡマウスとの間で外直径に差は検出されなかったが（図６Ｃ）、壁厚増加のため内腔直径はｓＲＡマウスで有意に小さくなっていた。この結果、中膜の内腔に対する比率は増加していたが、断面積に有意な変化はなかった。
【００６７】
ＡＶＰに対する血管反応性の低減を解釈するために、本発明者らは次に、Ｖ１Ａ受容体の発現量を測定した。ｓＲＡマウス由来の腸間膜動脈は、Ｖ１Ａ受容体ｍＲＮＡの有意な抑制を示したが、ＥＴＡ受容体の発現に変化はなかった（図６Ｄ）。さらに、Ｇタンパク質調節因子２（ＲＧＳ２）の発現が選択的に下方制御されていたが、ＲＧＳ５の発現に変化はなかった。
【００６８】
血管のＶ１Ａが下方制御されていたのとは対照的に、ｓＲＡマウスの腎臓Ｖ２受容体およびアクアポリン−２のｍＲＮＡレベルは変化していなかった（表３）。ナトリウム／水素交換輸送体（ＮＨＥ）は減少傾向を（ＮＨＥ３、対照の０．６倍、Ｐ＝０．０８）、ＥＮａＣ−αサブユニットは上昇傾向をみせはしたが（ＥＮａＣ−α、対照の１０倍、Ｐ＝０．０８）、ｓＲＡマウスでの発現が有意な変化をみせた腎臓トランスポーターは、ナトリウム・クロリド共輸送体だけだった（ＮＣＣ、対照の５倍、Ｐ＜０．０５）。これらの腎臓遺伝子発現アッセイが、オスのｓＲＡおよび同腹仔対照マウスに対してのみ行われたこと、および群あたりの反復試料数が少なかった（各ｎ＝４）ために統計的検出力が低いことには注意されたい。したがって、ＮＨＥ３およびＥＮａＣ−αの変化がいずれも生理学的に有意な可能性はある。
【００６９】
【表３】
2016507753.tif 000004
【００７０】
最後に本発明者らは、ｓＲＡマウスの心血管表現型において、Ｖ２が媒介する機構をより直接的に探るために、トルバプタンに対する血液化学反応を調べた（表４）。本発明者らは以前に、ベースライン条件で、ｓＲＡマウスにおける約４ｍＭの低ナトリウム血症について記述した（２７）。本発明者らは今回、ｓＲＡマウスは低ナトリウム血症（図７Ａ）および低カルシウム血症（図７Ｂ）であり、トルバプタンを慢性的に送達すると、これらアンバランスの双方が矯正されたことを確定した（遺伝子型と薬物の相互作用は、いずれについてもＰ＜０．０５）。ｓＲＡマウスは塩化物イオン、総ＣＯ２、グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、ヘマトクリットおよびアニオンギャップの変化も示し、一方トルバプタン処置は、これらエンドポイントのいくつか（カリウム、塩化物イオンおよび血中尿素窒素）に影響しはしたが、遺伝子型と薬物の相互作用が明らかにならなかったことから、トルバプタン処置は、遺伝子型とは独立な形でこの影響を及ぼしていた（表４）。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
考察
本発明者ら今回、特別なダブルトランスジェニック・マウスモデルを調べて、脳内ＲＡＳにより誘導される高血圧にＡＶＰが必要であるとする仮定を検証した。脳を免疫組織化学的に調べたところ、視床下部視索上核の交叉後部分でＡＶＰレベルが上昇していることが明らかになったが、ｓＲＡマウスのＰＶＮ免疫染色に一貫した変化はなかった。高血圧において必要とされるＡＶＰシグナル伝達の役割を確認することになったのだが、バソプレシンＶ１Ａ／Ｖ２受容体の慢性的遮断は、ｓＲＡマウスの血圧正常化をもたらした。複数の動脈での、ＰＥ、ＥＴ−１、ＡＮＧ  ＩＩおよびＰＧＦ２αに対する血管反応性は、ｓＲＡマウスでさほど変化していなかったが、ＡＶＰに対する反応は大きく脱感作されていた。Ｖ２受容体の選択的阻害にはｓＲＡマウスにおいて強力な降圧作用があり、このモデルに典型的な低ナトリウム血症を正常化した。総合するとこれらのデータは、脳内ＲＡＳに由来する高血圧の維持において必要とされるＡＶＰ、これはＶ２受容体に作用するのだが、の役割を強く支持する。
【００７３】
ＡＶＰシグナル伝達の増強は、多くのモデルで高血圧の機構として提案されてきた。全身でＲＡＳの活性亢進がしっかりと制御されているマウスでも、またはトランスジェニックにより強く過剰発現しているマウスでも、高血圧の維持にはＡＶＰシグナル伝達が強まっている必要がある（１７、５７）。脳内ＲＡＳ活性の上昇に依存する酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）食塩高血圧は（３８、４８、６５）、ＡＶＰシグナル伝達にも依存する。ＤＯＣＡ食塩処置は血漿ＡＶＰレベルの上昇をもたらす（１４、５４、５６、９２）。アンジオテンシン変換酵素阻害剤であるカプトプリルのラットへの脳室内注入は、ＤＯＣＡ食塩高血圧を防止し、ＤＯＣＡ食塩高血圧を元に戻しもし、また血圧が低下しているにもかかわらず、この注入に伴って血漿バソプレシンレベルが低下した（３８）。ＤＯＣＡ食塩高血圧のＡＶＰへの依存性は、ＡＶＰ欠損ブラットルボローラットを用いた場合にも示された：これらの動物では、ＤＯＣＡ食塩による血圧上昇効果はかなり減少していたのだ（１４、９９）。様々な高血圧モデルでのこれらの知見を補完することには、グリアにおけるアンジオテンシノーゲン産生の低減を示すＴＧＲ（ＡＳｒＡＯＧＥＮ）ラットは低血圧で、血漿ＡＶＰレベルが低下している（７４）。これらの動物は、脳内におけるＡＶＰ  Ｖ１Ａ受容体発現パターンの変化も示し（１１）、これは脳内ＲＡＳ−ＡＶＰの相互作用があることをさらに支持する。Ｖ１Ａ  ＡＶＰ受容体欠損マウスは低血圧である。もっともこの場合、脳、血管、心臓、血小板および肝臓の受容体の相対的重要性は不明である（２、４６）。
【００７４】
ＡＶＰ産生および放出に対するＲＡＳの効果については、１９７０年の時点で既に報告されている。この年、ＢｏｎｊｏｕｒおよびＭｅｌｖｉｎ（６）は、イヌでレニンまたはアンジオテンシンＩＩを末梢投与すると、血漿ＡＶＰが用量依存的に増加することになるのを示した。脳内でのＡＶＰ放出に対しアンジオテンシンが直接作用するという証拠が、単離したラット神経下垂体を用いた生体外実験により得られた（２２）。脳弓下器官の電気破壊（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ）（３７）、または脳弓下器官からの遠心投射の離断（４５）のいずれによっても、静脈内ＡＮＧ  ＩＩに反応した、血漿中へのＡＶＰ放出が弱まる。したがって、ｓＲＡトランスジェニックマウスでの脳内ＡＶＰ染色の増加、およびコペプチンの（したがってＡＶＰの）１日放出量増加が今回示されたのは、予想通りであった。形態学および機能に関する証拠が、ＡＶＰ放出におけるＡＴ１受容体およびＡＴ２受容体の両方の役割を支持することから、特定のＲＡＳ受容体サブタイプとＡＶＰ上昇との因果関係を確立するためにさらなる研究が必要である。
【００７５】
ＳＯＮ内のＡＶＰに対する免疫反応性が大きく増大していることから、視索上核から神経下垂体への経路（ｓｕｐｒａｏｐｔｉｃｎｅｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）における、ＡＮＧ  ＩＩの媒介する活性亢進は、ｓＲＡマウスでＡＶＰ上昇をもたらすものとして意味づけられる。ＳＯＮへのＡＮＧ  ＩＩ注射は神経分泌細胞を脱分極させる（９３）。ＡＮＧ  ＩＩに対し免疫反応性のニューロンおよび軸索終末は、げっ歯類ＳＯＮ内で、ＡＶＰに対し免疫反応性のニューロンと混ざり合った形で見出され、またＡＮＧ  ＩＩおよびＡＶＰが共局在しているニューロンもある（３９）。したがっておそらく、ＳＯＮ内でのＡＮＧ  ＩＩの局所的産生および／または作用が、ＡＶＰ産生および分泌を制御している。
【００７６】
ＡＶＰは、少なくとも４つの受容体サブタイプに対する内在性アゴニストである。Ｖ１Ａ受容体サブタイプは主に脈管構造内で見出され、主にＧαｑ経由でシグナルを伝達し、血管収縮を媒介する。Ｖ１Ａ受容体はニューロンにも存在し、ｃＡＭＰ経由でシグナルを伝達して神経機能を制御しているようである（２、８９）。Ｖ１Ｂ受容体サブタイプは主に脳に見出され、Ｇαｑ経由でシグナルを伝達し、副腎皮質刺激ホルモンを刺激する。Ｖ２受容体サブタイプは主に腎臓ネフロンの集合管に見出され、Ｇαｓ経由でシグナルを伝達し、アクアポリンを動員して水の再吸収を刺激する。Ｖ２受容体が肺（２０）および小脳（４３）のような腎外組織で発現している証拠がいくつかあるが、これらの組織でのその生理的意義は不明である。最後に、ＡＶＰは、カリン−５としても知られるＶＡＣＭ−１受容体のアゴニストでもあり、内皮細胞および腎集合管でカルシウム動員を誘発する（７、８）。ｓＲＡマウスでは腸間膜動脈のＶ１Ａ受容体は下方制御されるものの、腎臓のＶ２受容体発現は変化していなかったことを本発明者らは確定したが、これは、ＡＶＰの媒介する腎臓での水貯留が、ｓＲＡマウスの高血圧においてより大きな役割を担っていることを示唆する可能性がある。本明細書で直接検証したわけではないが、この結論は、コニバプタンの効果の時間経過が遅いこと（効果が見られるのは数日注入してからである、図３Ｂ）、トルバプタンの降圧作用（図３、ＥおよびＦ）、ならびに抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）に典型的な（２４）、ベースライン低ナトリウム血症および低カルシウム血症のこのモデルでの正常化（表４および図６）により支持される。ＲＧＳ２は心血管系全体で発現し、Ｇαｑの媒介するＧＰＣＲシグナル伝達を負に制御するよう作用し、したがって収縮反応に対抗する（７５）。ヒト患者での研究から、ＲＧＳ２発現と血圧との間に負の相関があり、高血圧患者はＲＧＳ２発現の低減を、低血圧患者はＲＧＳ２発現の上昇を示すことが明らかにされた（３５、７５、９４）。同様の相関が高血圧性動物モデルで観察されており（１０、１１）、本研究でもやはり観察された（図５Ｄ）。ＲＧＳ２は組織特異的に制御されることが知られており、心血管組織内では、ＲＧＳ２は複数の二相性の機構によりコントロールされる（９７）。ホルモン／受容体の様々な組合せによるＧαｑの急性活性化はＲＧＳ２を急速に上方制御するが、これは負のフィードバック機構として働いている可能性がある。対照的に、Ｇαｑ系が慢性的に刺激されると、ＲＧＳ２発現の緊張性抑制が引き起こされるようである（１０、１１、８８、９７）。ＲＧＳ２欠損マウスは、末梢血管収縮の慢性的増強による強い高血圧を示す（３１、３４）。ＲＧＳ２ノックアウトマウス由来の血管平滑筋細胞では、バソプレシンに誘導されたカルシウムトランジェントが増強されており、このことは、ＲＧＳ２とＡＶＰシグナル伝達との関係を浮彫りにする。Ｖ１Ａ受容体はＧαｑシグナル伝達を利用することから（２、８９）、おそらくこの関係はＶ１Ａ受容体を介したものである（８６）。ＲＧＳ２ノックアウトマウスは、野生型動物よりもかなり深刻な、慢性高血圧に由来する標的臓器障害も示す（８１）。���ＧＳ２はさらに、アデニリルシクラーゼを調節することで腎臓でのｃＡＭＰシグナル伝達を弱める（２９、８５）。このアデニリルシクラーゼの調節は、Ｖ２受容体、ＧαｓおよびｃＡＭＰを介してＡＶＰシグナル伝達の調節をもたらしている可能性がある。実際、ＲＧＳ２の調節はインビボで、腎臓のＶ２受容体シグナル伝達およびＡＶＰの腎臓への効果に大きく影響する（７２）。したがって、様々な組織でのＲＧＳ２の調節は、ＡＶＰシグナル伝達の上昇とともに、慢性的に上昇した脳内ＲＡＳ活性の文脈における高血圧の維持に寄与しているのではないか、と推測したくなる。病理的状態ではＶ１Ａ受容体とＶ２受容体とが異なるパターンの制御下にあることは、以前に記述されている。Ｇｏｚｄｚら（２６）は以前に、高レニン性高血圧のＴＧＲ（ｍＲｅｎ２）２７ラットモデルでは、対照のスプラーグドーリーラットに比較して心臓Ｖ１Ａ受容体が上方制御されており、一方、腎臓のＶ２受容体は系統間で変化がないことを示した。Ｔｒｉｎｄｅｒら（８７）は以前に、１型糖尿病のストレプトゾトシン注射モデルでは、ラットは、Ｖ１受容体の肝臓および腎臓での発現の低減と、ＡＶＰに誘導されたイノシトールリン酸産生の低減とを示し、一方、腎臓のＶ２受容体、およびＡＶＰに誘導されたｃＡＭＰ産生はやはり変化がないことを示した。したがって、血管のＶ１Ａ受容体は下方制御され、ＡＶＰに対する血管反応性は脱感作されていたが、一方、腎臓のＶ２受容体およびその機能はさほど変化していなかったという本発明者らの観察は、前例がないわけではない。
【００７７】
本発明者らは以前、ベースライン条件で、メスｓＲＡマウスにおいて血漿ＡＶＰレベルが強く（２倍）上昇しており（１２：１２の明暗サイクルの明期に入ってから４時間で採取した）、またこの相違はオスでは検出されなかったことを示した（２７）。非常に短時間（４時間）水を制限した後になら、ｓＲＡのオスでも血漿ＡＶＰ濃度が２倍になった。なおこの水制限は、対照のオスでは血漿ＡＶＰに何らの効果も及ぼさなかった。本研究で本発明者らは、尿へと失われるコペプチン（この４ｋＤａペプチドをクリアランスする主要な機構である）がオスのマウスおよびメスのマウスのいずれでも同じであったことを確定した（図２Ｄ）。尿コペプチンの測定値はＡＶＰ分泌速度と関連し、一方、血漿ＡＶＰを直接測定した値はＡＶＰ分泌および分解／クリアランスの双方と関連する。したがってここで本発明者らは、ＡＶＰ分泌速度はオスｓＲＡマウスおよびメスｓＲＡマウスの双方で同様に上昇しており、しかしＡＶＰ分解／クリアランス速度に性別特異的な差があると仮定した。本研究においてＡＶＰ受容体の遮断が、いずれの性別でも効果的に高血圧を消散させたと確定したことは（図３）、この仮定をさらに支持する。ＡＶＰクリアランス機構の性別特異的な差に踏み込んだ研究は進行中である。
【００７８】
展望および重要性
まとめると本発明者らのデータは、脳内ＲＡＳ活性の上昇がＡＶＰ分泌の増加を誘発するとするモデルを支持する。ＡＶＰのＶ２受容体への作用は次に、血圧上昇および低ナトリウム血症に寄与する。本発明者らは、これらの効果は過剰の水貯留により媒介され、水貯留はこのモデルでの極度多飲と合わさると、おそらくは血圧利尿機構を介し、多尿の表現型に至ると仮定する。観察されたトルバプタン降圧作用の原因となるＶ２受容体の局在を本明細書で直接調べたわけではないものの、本発明者らは、Ｖ２受容体が腎集合管でのアクアポリン−２動員において果たすよく知られた機能に基づいて、ｓＲＡマウスでは、腎臓により媒介される機構が活性亢進しているのではないかと推測する。これらのデータは、ＳＩＡＤＨ（２４）、またはＡＶＰ産生増加もしくはクリアランスの低下により特徴付けられる他の疾患の実験モデルとしての、ｓＲＡマウスの使用を支持する可能性がある。アンジオテンシンペプチドの脳特異的形成および作用は、心血管系機能、体液バランスおよび代謝コントロールの制御、それどころか学習および記憶の制御をも目的として、かなりの関心を集めている。バソプレシンは、体液バランス、血圧制御および様々な挙動（つがいの絆、利他主義、学習、記憶、水分摂取および食物摂取）での役割についてもよく認知されており、その産生および放出が脳内でアンジオテンシンにより刺激されることもよく知られている。したがってバソプレシンを、アンジオテンシンによる高血圧の主要なメディエーターとして意味づけることにより、１）バソプレシンが、脳内ＲＡＳの新しく認められた他の機能（例えば、代謝コントロール、学習および記憶など）のメディエーターの候補として特定される；と同時に２）バソプレシンを産生する、アンジオテンシン感受性の脳内構造（例えば、視索上核）が、特に低レニン性高血圧を有する特定のヒト集団で、高血圧および他の障害を治療標的とするためにさらに一層研究するに値する可能性のある、主要な心血管制御中枢として特定される（３、４、９、１９、２５、４９、６２、６３、９８）。
【実施例２】
【００７９】
子癇前症を発症する可能性の高い母親の早期の臨床スクリーニングとしてのコペプチン。
出生前管理を開始する時点の妊娠女性を募って集めた。母体胎児組織バンク（ＭＦＴＢ：ｔｈｅ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｆｅｔａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）に登録した女性は、妊娠期間を通じて、臨床上必要な採血の際はいつでも研究用に母体血液サンプルを提供した。加えて、臨床上必要な検査または手順に由来する羊水サンプル、尿サンプル、胎児臍帯血および胎盤組織も集め、研究に利用した。母児の健康に関する短期および長期の臨床情報も抽出して、サンプルと関連付けた。これまでのところ、１５００人を超える女性がＭＦＴＢに現在登録し、２５，０００を超えるサンプルが分取されている。
【００８０】
子癇前症女性の保存サンプル中のコペプチンレベルに対する手始めのＥＬＩＳＡスクリーニングから、コペプチンレベルが第３三半期までに上昇する傾向にあることが示された（図８）。
【実施例３】
【００８１】
コペプチンに基づく第１三半期初期での子癇前症予測：バソプレシン分泌過多は、子癇前症病理における開始イベントなのか。
米国では、妊娠全体のうち５〜７％にあたる、１年あたり約３００，０００件の妊娠で子癇前症に罹るが、母体−胎児の罹患および死亡全体のうち、１５％もの過剰な割合が子癇前症により引き起こされている（７３）。子癇前症は胎児発育不全、母体−胎児の死亡、ならびに母児の将来における成人神経疾患および成人心血管疾患のような、即時のおよび長期にわたる母体−胎児の罹患を引き起こすことが知られている（２３、４０、５２、５３、９０、９１）。病理発生がよく分かっていないため、子癇前症に対する予防、治療および根治のための療法はまだない。この事から、子癇前症を予測および処置できるようになるために、適切な統一経路を見出すことの重要性が強調される。経路の候補の１つはバソプレシン経路である。
【００８２】
バソプレシンは、短い生物学的半減期を示す（血液中で５〜２０分程度）。したがって、このホルモンを直接測定するのは難しい。バソプレシンは、小さな不活性プロセグメントであるコペプチンと共に１：１の化学量論比で翻訳される。コペプチンは主に腎排泄により除去され、血漿中で非常に安定である。したがってコペプチンは、バソプレシン分泌の非常に有用なバイオマーカーである（３）。Ｚｕｌｆｉｋａｒｏｇｌｕら（１０１）は最近、子癇前症患者で、循環コペプチンが第２三半期後期／第３三半期初期に上昇することを記述した。さらに、アフリカ系アメリカ人、老人、およびうっ血性の心不全または腎不全の患者を含めた特定の集団はバソプレシン依存性高血圧を示す（３、４、９、１９）。これらの集団は、循環レニン−アンジオテンシン系の活性が低いことでも特徴付けられる。子癇前症の妊娠もまた、正常圧の妊娠に比べ、レニン−アンジオテンシン系の循環活性の低減を示すのは興味深い（３３）。これらのデータから本発明者らは、バソプレシン分泌過多が子癇前症発症の原因となり得る役割を果たすことと、新規の子癇前症予測バイオマーカーとして、コペプチンを妊娠初期に利用できる可能性があることとを仮定するに至った。
【００８３】
方法
バイオサンプルおよび臨床データの取得：母体の血漿および臨床患者の情報は、アイオワ大学ＩＲＢの承認（ＩＲＢ＃２００９１０７８４）を受けた母体胎児組織バンク（ＭＦＴＢ）から得た。このバンクには、出生前管理を開始する時点の妊娠女性を前向きに募って集めた。ＭＦＴＢ選択基準には、アイオワ大学病院＆診療所（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃｓ）で出生前管理を受けている英語話者で、＞１８歳のあらゆる女性が含まれた。ＭＦＴＢ除外規準には、囚人、ＨＩＶ＋またはＣ型肝炎陽性の女性が含まれた。ＭＦＴＢに登録した女性は、妊娠期間を通じて、臨床上必要な採血の際はいつでも研究用に母体血液サンプルを提供した。ＭＦＴＢの母体血液は全て一律に処理した。母体血漿およびバフィーコートを単離、分注し、−８０℃で保存した。ＭＦＴＢにより得られた母体および新生児の臨床データは、標準化データ抽出フォームを用いて、電子医療記録からデータ抽出により得た。抽出した臨床データは、本発明者らの２人（ＭＫＳおよびＤＡＳ）が日常的に、正確さおよび完全性について監視した。中央電子医療記録データベースに問い合わせることのできる、アイオワ大学の臨床およびトランスレーショナル科学研究所（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）のバイオインフォマティクス共同研究者により、追加のデータも抽出された。
【００８４】
コホート構築：子癇前症例についての選択基準には、ＵＩＨＣで娩出し、ＭＦＴＢに登録されており、娩出の時点では子癇前症という診断の下されていた女性が含まれた。子癇前症例の診断および分類は、米国産婦人科学会（ＡＣＯＧ）による、分析のための標準定義に基づいた（１）。これらの症例は、娩出の時点でのバンク参加者に対し、軽度および重度の子癇前症のＩＣＤ−９コード（６４２．４ｘ、６４２．５ｘ、６４２．７ｘ、６４２．９ｘ）をバイオインフォマティクスの問合せとして、ＭＦＴＢデータベースを相互参照することにより同定した。各症例候補の電子医療記録は、ＡＣＯＧ定義による子癇前症の診断を確証するために評価した。対照集団に関する、年齢をマッチさせた母体の血漿サンプル、および対応する臨床データは、ＭＦＴＢデータベースを利用することにより得た。サンプル採取時の胎齢は、三半期ごとに分類した：第１三半期（在胎週数が＜満１３周）、第２三半期（在胎週数が満１３〜２６周）、および第３三半期（在胎週数が＞満２６周）。
【００８５】
手順：母体血漿コペプチン濃度は全て２連で、ヒト・コペプチン（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ、ヒューストン、ＴＸ）に特異的な市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。アッセイは製造業者の指示に従って行った。このアッセイでの、ヒト・コペプチン用量の検出最低限度は５．４ｐｇ／ｍＬだった。アッセイ内変動係数は＜１０％、アッセイ間変動係数は＜１２％だった。妊娠期間を通じた腎機能またはバソプレシン分解がコペプチン濃度に影響するのか調べるために、血漿シスタチンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）およびバソプレシン分解酵素（ＬＮＰＥＰ、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ、ヒューストン、ＴＸ）を全サンプルについて２連で、市販のＥＬＩＳＡキットを利用して測定した。
【００８６】
動物試験：メスＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから８〜１２週の間の週齢のものを入手した。バソプレシン（２４０ｎｇ／時間）または生理食塩水ビヒクルを注入する浸透圧ミニポンプを、肩甲骨間を切り込んで皮下腔に挿入した。３日間回復させた後、メスをオスＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスと交配した。腟栓の存在は胎齢０．５日を示した。血圧は、交配前に、および在胎期間を通じテールカフ・プレチスモグラフィーにより追跡した。胎齢１８日にメスを屠殺剖検した。子の体重を記録した。母動物の腎臓切片を作製し、アイオワ大学病理部で電子顕微鏡により画像化した。試験は全て、アイオワ大学動物実験委員会による承認を受けた（ＡＣＵＲＦ＃１２１１２３９）。
【００８７】
統計解析：本研究の主要な目的は、子癇前症を発症した妊娠女性、および子癇前症を発症しなかった妊娠女性の間の、第１三半期におけるコペプチン濃度の差が、子癇前症発症を予測したか否かを決定することであった。Ｚｕｌｆｉｋａｒｏｇｌｕら（１０１）に基づいた在胎後期の母体血漿コペプチン濃度における、対照（３１０ｐｇ／ｍＬ）および軽度の子癇前症患者（６２０ｐｇ／ｍＬ）の間の効果の大きさの最小値と、報告された標準偏差の最大値である１８０ｐｇ／ｍＬと、８０％の検出力と、α＝０．０５とを用いた場合、必要とされる参加者は１群あたりたった７人である。変数を３つに節約した混合効果回帰モデルに対し十分なように、１群あたり最低３０サンプルを用いた。
【００８８】
統計解析は全てシグマプロット１２．０ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、カリフォルニア）で実行し、ＳＡＳ９．１ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ、ケアリー、ＮＣ）を用いて確証した。段階的回帰を用いてこのデータセットのためにモデルをつくり、交絡の可能性を評価した。ロジスティック回帰モデルを構築し、受診者動作特性曲線を回帰診断のために構築した。加えて、カテゴリカル変数についてはカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定を利用した。連続変数についてはスチューデントのｔ検定を、または正規性の基準を満たしていなかったならマンホイットニー検定を利用した。変数は全て０．０５の有意水準で検定した。
【００８９】
結果
本研究では合計３０人の対照（Ｃ）対象および５１人の子癇前症（Ｐ）対象を用いた。各参加者について第１（Ｃ＝１２、Ｐ＝２０）、第２（Ｃ＝１０、Ｐ＝２０）および第３（Ｃ＝３０、Ｐ＝５１）三半期における血漿サンプルの全セットを入手することはできなかった。母体の年齢、妊娠回数、ボディマス指数、慢性高血圧および既存の糖尿病の割合は、対照群と子癇前症群との間でほぼ同じだった（表５）。加えて、これらの群間の人種分布もほぼ同じで、現在のアイオワ国勢調査データに基づけばコーカソイドの人々が優勢なアイオワ集団を反映したものだった。母体のこれらの特徴のなかで子癇前症の既往歴だけが、対照群で子癇前症群よりも有意に高頻度だった（５３．３％対１７．７％、ｐ＝０．００２）。２群間で娩出の特徴を評価すると（表５）、典型的な差が群間で観察された。子癇前症群は、有意により低い娩出時の胎齢（３６．２週対３８．７週、Ｐ＝０．００１）、より高い双胎の割合（２１．６％対０％、Ｐ＝０．０１６）、およびより軽い出生体重（２７７７．０グラム対３４２４．０グラム、Ｐ＝０．０００１）を示した。これらの知見は、子癇前症に関連する既知の罹患と整合する：すなわち、早期娩出がより高いことと、双胎率がより高いことと、血管が原因となって、また娩出がより早いことによって出生体重がより軽いこととである（８０）。
【００９０】
【表５】
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【００９１】
図９Ａから分かるように、母体血漿コペプチン濃度測定により、子癇前症を発症した妊娠女性のコペプチンの平均は、子癇前症でない対照女性に比較して、第１三半期（２０４５ｐｇ／ｍＬ対９０３ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００８）、第２三半期（１８０６ｐｇ／ｍＬ対７０６ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００１）および第３三半期（１８９０ｐｇ／ｍＬ対８２２ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０００６）で有意に上昇しているのが明らかになった。これらの群による血漿コペプチンの差はおそらく、腎機能およびバソプレシン分解の変化に関連するものではない。腎機能およびバソプレシン分解はそれぞれ血漿シスタチンＣおよびバソプレシン分解酵素をもって測定されるのだが、これらのレベルは各三半期において群間でほぼ同じだったからである（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【００９２】
コペプチンのこの有意な増加をもとに、本発明者らは各三半期について受診者動作特性曲線を構築して、母体血漿コペプチン濃度から子癇前症発症が予測されたかを調べた。さらに、コペプチン濃度の至適カットオフをこれらの曲線から決定した。図１０から分かるように、これらのＲＯＣはかなりの曲線下面積を、第１三半期（ＡＵＣ＝０．８０、ｐ＝０．００５）、第２三半期（ＡＵＣ＝０．８７、ｐ＝０．００２）および第３三半期（ＡＵＣ＝０．７２、ｐ＝０．００４）において示した。これらのデータから、母体血漿コペプチン濃度の平均から子癇前症発症が予測されることが示された。
【００９３】
さらに本発明者らは、臨床的に意味のある共変量が、特定の三半期で、子癇前症発症とコペプチン濃度との関連を変化させることになるのかを決定した。子癇前症の診断結果を従属変数として、ロジスティック回帰モデルを構築した。参加者を、特定の三半期について決定したカットオフを上回るか、または下回るかで二分した。三半期ごとに特有なカットオフ値（第１三半期：１０１８ｐｇ／ｍＬ、第２三半期：９４３ｐｇ／ｍＬ、第３三半期：８６０ｐｇ／ｍＬ）を用い、カットオフを上回るか、または下回るかの状態を独立変数とし、臨床的に意味のある共変量について調節しつつモデルを作製した。臨床的に意味のある共変量、例えば母体の年齢、ボディマス指数、糖尿病、慢性高血圧、子癇前症の既往歴、および双胎について調節しても、第１、第２および第３三半期においてコペプチン濃度は子癇前症発症と有意に関連した（表６）。第２三半期［コペプチン］カットオフおよび子癇前症の既往歴を含むモデルを例外とし、全モデルが有意に子癇前症発症を予測した。これらの結果から、コペプチン濃度は、子癇前症を発症することになる妊娠女性の血漿中では対照に比較して有意に上昇しているという、本発明者らの観察が正しいことが確認される。臨床的に意味のある産科的および血管性の共変量（ｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｖａｒｉａｔｅｓ）が交絡効果を及ぼす可能性にもかかわらず、このコペプチン濃度の強い上昇は第１三半期初期に起き、妊娠期間を通じて上昇したままとなる。最後になるが本発明者らは、バソプレシンの妊娠期間を通じた慢性的上昇は、マウスで子癇前症様の表現型を引き起こすのに十分であることを観察した。バソプレシン注入は妊娠率を有意に低減した（図１１Ａ）。このことは、生殖病態生理におけるこのホルモンの役割を浮彫りにする。妊娠に成功している間にバソプレシン注入すると、強い血圧上昇および明白な蛋白尿（図１１Ｂ）、相当な胎児発育不全（図１１Ｃ）ならびに特徴的な糸球体内皮症（図１１Ｄ）を含めた、子癇前症の主要な表現型をもたらす。
【００９４】
【表６】
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【００９５】
本発明者らのデータから、コペプチンは強力な子癇前症発症予測因子であることが立証される。在胎６週もの早い時期から妊娠期間を通じて、コペプチンから子癇前症発症が予測されることはさらに重要である。この知見は、子癇前症の予測における大きな進歩となる。現在のところ、ｓＦＬＴ−１およびエンドグリンのような抗血管新生因子が、子癇前症と診断される１２週前に上昇する（５０）。ｓＦＬＴ−１、エンドグリンおよび他の抗血管新生因子の追跡解析から、これらの因子は、診療に適用するには検査特性が良好でないことが示唆される（４４）。さらに、これらの因子の限界は、抗血管新生因子の全体が有意に変化するのは、早くても第２三半期と報告されていることである。
【００９６】
近年、第１三半期における子癇前症予測因子を同定しようと大いに試みられてきた。これらの研究には、第１三半期における循環血液中の高グリコシル化ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（４１）、インターロイキン−１β（７８）、高感度Ｃ反応性タンパク質（４２）および妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）（１５）が含まれている。これらの因子は、子癇前症を中程度に予測する上でも劣ることが示されている。抗血管新生マーカーが子癇前症の病理発生において有望であったことから、第１三半期において吟味されている。子宮動脈ドプラ（ＵＡＤ）解析と併用した場合、これらの因子からは子癇前症は中程度に（ＡＵＣ＝０．７４）しか予測されないことが示されている（６０）。第１三半期における子宮動脈ドプラ拍動指数の上昇は、子癇前症発症と相関する。Ｐｏｏｎらは、ＵＡＤを母体の既往歴および第１三半期における異数性マーカーと併せると、ＡＵＣ＝０．９６と、子癇前症の予測が非常に良好になり得ることを示した。ＵＡＤそれ自体はＡＵＣ＝０．９１である（６７、６８）。これは強力なツールになり得るが、信頼できるＵＡＤを得るには、音波検査者は、アッセイ間にかなりあるばらつきを減少させるために、胎児医学財団（ｔｈｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のような検証済みプログラムで相当な訓練を積む必要がある（６４）。このような訓練は、全ての病院環境で利用可能というわけではない可能性がある。明らかに、妊娠の可能な限り初期における単純な子癇前症予測因子を見出すことには有用性があり、コペプチンは最初の単純な単独予測バイオマーカーとなる。血漿コペプチン測定を他の既知の第１三半期におけるアッセイと併せるとさらに予測力が増大する可能性がある。胎盤の調節障害、内皮細胞機能不全、免疫（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、酸化ストレス、血管生物学的変化および血管新生を伴う複数の過程のため、子癇前症の単一の原因を見つけ出すのはほとんど不可能である。子癇前症は複数経路に起因する疾患なので、予測モデルをつくり、子癇前症処置のための治療方針を探し出すにはまず、上流の調節因子、またはこれら複数経路の誘導因子に着目することが必要な可能性がある。バソプレシンはこれらの経路の多くにとって最重要の位置を占める。コペプチンが、したがってまたバソプレシン分泌が妊娠最初期における新規の子癇前症診断バイオマーカーであると認めたことと、本発明者らのバソプレシン注入マウスモデルの結果とを総合すると、妊娠初期にバソプレシン分泌が増加すると子癇前症発症に寄与する可能性があるという仮定が支持される。アルギニンバソプレシンは、少量は特定の末梢組織で産生されるものの、大半は脳の視索上核および室傍核の大細胞性ニューロンで合成されるペプチドホルモンである。大細胞性ニューロンからの軸索投射先には脳下垂体後葉が含まれ、刺激によりバソプレシンが循環血液中に放出される。次にバソプレシンは複数の型の受容体に作用して、最終的に血液量および血管収縮を増加させ、また浸透圧を低減する（７０）。
【００９７】
バソプレシンが免疫活性であること、および子癇前症で免疫が開始されることにより、バソプレシンと子癇前症の病理発生との関連性は強まる。ＲｕｓｓｅｌｌおよびＷａｌｌｅｙ（７０）、ならびにＣｈｉｋａｎｚａおよびＧｒｏｓｓｍａｎ（１２）により総説されているように、バソプレシンは様々な免疫調節効果を有する。バソプレシンは作用部位および用量に応じて、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１β、インターフェロン−γ、β−エンドルフィンおよびプロスタグランジンＥ２、これらの多くは子癇前症で変化を被る、に影響し、また影響されることが知られている。バソプレシンは自己混合リンパ球反応を刺激することが知られている。バソプレシンは、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞および単球／マクロファージにより産生され、またこれらの細胞に対し作用する。高用量のバソプレシンは、ヒト皮膚線維芽細胞によるプロスタグランジンＥ２合成の増強を引き起こす。さらに、高血圧のバソプレシン欠損ブラットルボローラットは、好中球の増加を含め、循環血液中の免疫細胞の集団および機能についてかなりの変化を示す。これらのデータから、本研究で観察された、妊娠初期におけるバソプレシン分泌の増加、およびそれに伴う過剰な末梢免疫活性化と、それに続く子癇前症発症との間にリンクがある可能性が示唆される。したがって、本発明者らのデータなどに基づき、子癇前症を突然引き起こす免疫環境を創り出す上でバソプレシンが重要な役割を担い得ると、本発明者らは断定する。
【００９８】
本発明者らの研究は、母体胎児組織バンクの提供する臨床データの高い質、およびバイオサンプルの信頼性の恩恵を受けている。さらに、本発明者らの研究は、本発明者らが所望するアウトカムを評価するのに適切な検出力を備えていることにより、強固なものとなった。本発明者らの研究の弱点の１つは、アイオワの集団が主にコーカソイドなことである。コペプチンと子癇前症との関係は、臨床的共変量について調整しても頑健だが、本発明者らは、人種による分散を解析するのに適切な検出力は有していない。共変量について調整済みの有意な関連を見出すことはできても、上記の解析には、さらにサンプルサイズを大きくする必要があるだろう。
【００９９】
子癇前症を規定する分子現象の時間構成および臨床的関連にはこれまでのところ幾分の混乱があるが、これは、実質的に全ての既知の機構が、妊娠後期に立て続けに起きる、または発展するためである。本発明者らのデータははっきりと、妊娠初期にバソプレシン分泌が増加することを示しており、したがって他の既知の全機構はことごとく、バソプレシン作用の標的候補となる。これらの結果は、子癇前症予測における血漿バソプレシン／コペプチン測定値の有用性を強調し、またバソプレシンが子癇前症の原因となる役割を担う可能性と整合する。マウスでの本発明者らのデータは、バソプレシンが、子癇前症様の表現型を引き起こすのに十分であることを示しているが、バソプレシンによる子癇前症の誘導を媒介する組織、受容体および機構を明らかにするには今後の研究が必要である。子癇前症発症にバソプレシン・シグナル伝達が必要とされるのか、また疾患を処置するためにこの系を標的とするのは実用的なのかを評価するには、かなりの臨床試験を行う必要がある。最後になるが、過剰なバソプレシン分泌を誘導する機構を特定し、子癇前症を開始する事象（複数可）の理解を深めるには、さらなる研究が必要となるだろう。
【０１００】
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【図１】
2016507753.tif 000008
【図２】
2016507753.tif 000009
【図３】
2016507753.tif 000010
【図４】
2016507753.tif 000011
【図５】
2016507753.tif 000012
【図６】
2016507753.tif 000013
【図７】
2016507753.tif 000014
【図８】
2016507753.tif 000015
【図９】
2016507753.tif 000016
【図１０】
2016507753.tif 000017
【図１１】
2016507753.tif 000018
【配列表】
2016507753000001.app
【国際調査報告】
2016507753.tif 000019
2016507753.tif 000020
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