(57)【要約】  本発明は、非β細胞にインスリン産生を誘導する方法または非β細胞をインスリン産生細胞に変換させる方法に関し、かつ、糖尿病を予防および／または治療する方法および糖尿病に罹患した被験体の感受性を予測する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の予防および／または治療に用いられる、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニスト。
【請求項２】
前記アンタゴニストが、Ｓ９６１、Ｓ６６１、２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体、ワートマニン、ＰＸ−８６６、ＳＦ１１２６、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８およびＰＦ−０５２１２３８４からなる群より選択される、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記アンタゴニストが配列番号１８のＳ９６１である、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
糖尿病の予防および／または治療に用いられる、（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載されるアンタゴニストと、（ｉｉ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞とを含んでなる、組成物。
【請求項５】
前記非β細胞が、膵α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞および末梢細胞からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記転写因子がＰｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１からなる群より選択される、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記アンタゴニストまたは前記組成物が、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法によって同定された糖尿病に罹患した被験体に使用するためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンタゴニストまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストと、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項９】
インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞からのインスリン産生を刺激する工程を含んでなる、非β細胞にインスリン産生を誘導する方法。
【請求項１０】
インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞からのインスリン産生を刺激する工程を含んでなる、非β細胞をインスリン産生細胞に変換させる方法。
【請求項１１】
前記非β細胞が、膵α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞および末梢細胞からなる群より選択される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
インスリンのシグナル伝達経路の遮断が、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記非β細胞とインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストとを接触させることによって行われる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
インスリンのシグナル伝達経路の遮断が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、糖尿病に罹患した被験体にインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することによって行われる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストが、Ｓ９６１、Ｓ６６１、２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体、ワートマニン、ＰＸ−８６６、ＳＦ１１２６、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８およびＰＦ−０５２１２３８４からなる群より選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を誘導することによって、非β細胞を改変する工程、および
ｂ）インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、工程ａ）で得られた改変非β細胞のインスリン産生を刺激する工程
を含んでなる、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記転写因子が、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インスリンのシグナル伝達経路の阻害能を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞を試験化合物に曝露する工程、
ｂ）インスリン産生細胞である前記細胞の数を、試験化合物の存在下および非存在下で決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）で決定したインスリン産生細胞の数の２つの値を比較する工程を含み、
試験化合物の存在下でのインスリン産生細胞の数が、非存在下での数よりも多かった場合に、その試験化合物はインスリンのシグナル伝達経路を阻害可能であるとする、方法。
【請求項１８】
治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを、被験体の必要に応じて投与することを含む糖尿病の治療に対する、糖尿病に罹患した被験体の感受性を予測する方法であって、前記被験体の非β細胞に、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１９】
前記転写因子が、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを、被験体の必要に応じて投与することを含んでなる、糖尿病を予防および／または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の治療に関し、さらに詳細には、膵β細胞以外の細胞（「非β細胞」）をインスリン産生細胞に変換させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０１２年に、全世界の糖尿病患者は約３億４千７百万人と推定されており、この数はなお増加し続けている（世界保健機関のデータによる）。糖尿病は世界中で発生しているが、先進国においてより多くみられる（特に２型）。しかしながら、将来の有病率が最も高くなるのはアジアおよびアフリカであると予想されており、おそらく２０３０年までには患者の大部分がそれらの地域にみられるであろうと考えられている。
【０００３】
糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生しない場合か、または産生されたインスリンを身体が有効に利用できない場合に起こる慢性疾患である。インスリンは、血糖を調節するホルモンである。高血糖症、すなわち血糖値が高くなった状態は、制御されていない糖尿病において一般的にみられる影響であり、これが長期にわたると、多くの身体システム、特に神経および血管に深刻な損傷が引き起こされる。基礎となる異常によって、糖尿病は２つの主な型である１型および２型に分類される。１型糖尿病、すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、患者の膵腺にインスリン産生β細胞が存在しない。２型糖尿病、すなわち非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）では、患者のβ細胞の機能が損なわれており、インスリンの作用に変化がみられる。
【０００４】
現在、１型糖尿病患者にはインスリンの注射による治療が行われ、一方でほとんどの２型糖尿病患者には、β細胞の機能を刺激する薬剤または患者の組織のインスリンに対する感受性を増大させる薬剤を用いた治療が行われている。２型糖尿病の治療のために現在用いられている薬物としては、アルファグルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、メトホルミンおよびインスリンが挙げられる。
【０００５】
糖尿病を治療するための別のアプローチは、細胞置換に基づいた治療法である。しかしこの方法は、適合性ある機能的なインスリン産生β細胞を多数供給することが困難であるという問題に直面している。インスリン産生β細胞の数を増やす一つの方法は、個々の患者に内在する別のタイプの細胞の再プログラミングを介することである。近年の研究によれば、特定の誘導条件下では、膵臓のα細胞とβ細胞の間に顕著な可塑性が存在することが明らかにされており、形質転換されたα細胞によるインスリン産生経路の可能性が示唆されている。ほとんどすべてのβ細胞を破壊し、再生した成体マウスのモデルでは、グルカゴン＋インスリン＋移行状態の二ホルモン性（ｂｉ−ｈｏｒｍｏｎａｌ）を経由して、α細胞から新規のインスリン産生細胞がある割合で産生された（Ｔｈｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：１１４９−１１５４）。
【０００６】
生活習慣、食事制限および薬物治療を通した治療法ならびに患者管理の進歩にもかかわらず、糖尿病の治療および管理を成功させるための組成物および方法が、なお強く必要とされている。膵臓のα細胞およびβ細胞を含む細胞間の可塑性、ならびにそのような可塑性を促進し得る薬剤を利用する可能性をより良く理解することによって、患者の治療の可能性を増大させ、かつ生活の質を改善する、新しい治療上の戦略がもたらされ得る。
【０００７】
インスリン受容体アンタゴニストであるＳ９６１は、ラットに、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性および貯蔵エネルギーの枯渇を引き起こす（Ｖｉｋｒａｍ  ａｎｄ  Ｊｅｎａ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９８：２６０−２６５）。
【０００８】
真菌ペニシリウムフニクロスムのステロイド代謝産物であるワートマニンは、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に特異的な、共有結合性の阻害剤である。ワートマニンについては、インターフェロンβ−１ａによって治療した多発性硬化症の患者の再発に対する臨床試験が行われている。ワートマニンの誘導体であるＰＸ−８６６は、経口投与した際に、新規かつ強力な、ＰＩ３Ｋの非可逆的阻害剤としての効力を示している。ＰＸ−８６６については、現在、ヒトの主要な癌に対する単独および併用療法を含む治験が行われている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１の態様は、インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞からのインスリン産生を刺激する工程を含む、非β細胞にインスリン産生を誘導する方法を提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様は、インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞からのインスリン産生を刺激する工程を含む、非β細胞をインスリン産生細胞に変換する方法に関する。
【００１１】
本発明の第３の態様は、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを、必要に応じて治療上有効な量被験体に投与する工程を含む、糖尿病を予防および／または治療する方法に関する。
【００１２】
本発明の第４の態様は、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストと組み合わせて、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞を自家移植または同種移植する工程を含む、必要に応じて被験体の糖尿病を予防および／または治療する方法に関する。
【００１３】
本発明の第５の態様は、糖尿病の治療および／または予防のための薬剤の製造における、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストの使用に関する。
【００１４】
本発明の第６の態様は、糖尿病の予防および／または治療のための薬剤の製造における、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストと組み合わせた、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞の使用である。
【００１５】
本発明の第７の態様は、糖尿病の予防および／または治療に用いられる、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストに属する。
【００１６】
本発明の第８の態様は、糖尿病の予防および／または治療に用いられる、（ｉ）前記アンタゴニストおよび（ｉｉ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞を含む組成物に関する。
【００１７】
本発明の第９の態様は、インスリンのシグナル伝達経路の阻害能を有する化合物をスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞を試験化合物に曝露する工程、
ｂ）インスリン産生細胞である前記細胞の数を、試験化合物の存在下および非存在下で決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）で決定したインスリン産生細胞の数の２つの値を比較する工程を含み、
試験化合物の存在下でのインスリン産生細胞の数が、非存在下での数よりも多かった場合に、その試験化合物はインスリンのシグナル伝達経路を阻害可能であることが示されたとする。
【００１８】
本発明の第１０の態様は、治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することを含む糖尿病の治療に対する、糖尿病に罹患した被験体の感受性を予測する方法を提供し、該方法は、前記被験体の非β細胞に、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を検出する工程を含む。
【００１９】
本発明の第１１の態様は、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストと、任意に、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞とを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
本発明のその他の特色および利点は、以下の詳細な説明によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、ＤＴを用いたβ細胞の除去後、Ｐｄｘ１によって成熟α細胞にインスリン産生が誘導されたことを示した図である。（Ａ）用いた導入遺伝子を示す。（Ｂ）実験計画を示す。（Ｃ）α細胞を含む膵島（ＹＦＰ＋）はすべてインスリンを産生している。（Ｄ）インスリン産生細胞の数は、ＤＴによる処置後のαＰｄｘ１ＯＥマウスの膵臓において増加している。（Ｅ）ＤＴによる処置後の成熟α細胞に由来する大多数のインスリン陽性細胞はＰｄｘ１を発現している。（Ｆ）ＤＴによる処置後のαＰｄｘ１ＯＥマウスでは、再プログラミングされたα細胞（ＹＦＰ＋Ｉｎｓ＋）の数が増加している。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、成熟α細胞にＰｄｘ１を異所性に発現させると、グルカゴン産生が阻害されるが、未変化のβ細胞集団の存在下ではインスリン産生は誘導されないことを示した図である。（Ａ）実験計画を示す。（Ｂ）αＰｄｘ１ＯＥマウスでは、膵グルカゴンの量が減少している。（Ｃ）未変化のβ細胞集団の存在下では、ほとんどのα細胞が、Ｐｄｘ１を介したインスリン産生に対して抵抗性である。対照的に、Ｐｄｘ１は大多数のα細胞（ＹＦＰ＋）からのグルカゴン産生を効率的に阻害する。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ＤＴを用いたβ細胞の除去後、成熟α細胞にＰｄｘ１を発現するマウスでは、膵インスリンの量が増加し、外来のインスリンをあまり必要としなくなったことを示した図である。（Ａ〜Ｂ）ＤＴによる処置後、αＰｄｘ１ＯＥマウスの高血糖は低くなる傾向がみられる。（Ｃ）αＰｄｘ１マウスでは、血糖値を２５ｍＭ未満に維持するために必要とされるインスリンの量が少ない。（Ｄ）αＰｄｘ１ＯＥマウスの膵インスリン量が改善されたことは、インスリンペレットの必要性が少なくなったことと関連する。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＤＴを用いたβ細胞の除去後、成熟α細胞にＰｄｘ１を異所性に発現させると、グルカゴンの産生が阻害されることを示した図である。（Ａ）ＤＴ後のαＰｄｘ１ＯＥマウスでは、グルカゴンを発現する細胞の数は減少している。（Ｂ）ＤＴ後のＰｄｘ１陽性α細胞の大部分は、グルカゴンを産生していない。（Ｃ）ＤＴ後のα細胞にＰｄｘ１が発現されると、膵グルカゴンの量は迅速に減少する。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、部分的なβ細胞の除去後、α細胞にＰｄｘ１を異所性に発現させると、インスリンの産生が誘導されることを示した図である。（Ａ）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いてβ細胞の除去を行う実験計画を示す。（Ｂ）ＲＩＰ−ＤＴＲ半接合体の雌における、ＤＴを用いたβ細胞除去の実験計画を示す。（Ｃ）ＳＴＺを用いて大多数のβ細胞を除去した後、Ｐｄｘ１を発現するα細胞のほとんどはインスリンを産生する。（Ｄ）部分的（５０％）なβ細胞の除去によって、Ｐｄｘ１を発現するα細胞の一部にインスリンの産生がみられる。
【図６】ＤＴを用いたβ細胞の除去後、インスリンのシグナル伝達が低下することを示した図である。ＤＴの使用後にインスリンシグナル伝達のほとんどの構成要素が低下する。インスリンの競合物質（Ｓ９６１）、ＩＧＦ１−Ｒ受容体アンタゴニスト（ＰＰＰ）、およびＰＩ３キナーゼ阻害剤（ワートマニン）の作用部位を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｐｄｘ１を発現するα細胞が、インスリンのシグナル伝達の阻害後にインスリンを産生することを示した図である。（Ａ）実験計画を示す。（Ｂ）Ｐｄｘ１を発現するα細胞は、Ｓ９６１およびワートマニン（「Ｗｏｒｔ」）の投与後にインスリンを産生するが、ＰＰＰによる処置後には産生しない。
【図８】α細胞が、インスリン／ＩＧＦ１シグナル伝達の欠如によってインスリンを発現する傾向があることを示した図である。（Ａ）用いた導入遺伝子を示す。（Ｂ）実験計画を示す。
【図９】ヒトα細胞が、インスリン産生を再プログラム可能であることを示した図である。（Ａ）実験計画を示す。（Ｂ）グルカゴン＋／インスリン＋である非α細胞のパーセンテージを示す。（Ｃ）インスリン＋／グルカゴン＋であるα細胞のパーセンテージを示す。
【００２２】
図中、「ＯＥ」は過剰発現、「ＤＴ」はジフテリア毒素、「Ｉｎｓ」は「インスリン」、「Ｇｃｇ」はグルカゴンを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で用いられる用語「α細胞」、「β細胞」、「δ細胞」、「ＰＰ細胞」および「ε細胞」は、膵臓に見出される５種の細胞カテゴリーを意味する。「α細胞」または「アルファ細胞」は、膵ランゲルハンス島内にある内分泌細胞であり、これはヒト島細胞のおおよそ３５％を占め（Ｂｒｉｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５３（９），１０８７−１０９７）、血中のグルコース濃度を上昇させるペプチドホルモンであるグルカゴンの合成および分泌に関与する。「β細胞」または「ベータ細胞」は、同じように膵ランゲルハンス島内にある別のタイプの細胞であり、これはヒト島細胞のおおよそ５４％を占める（Ｂｒｉｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００５、上記）。β細胞の主要な機能は、血中グルコース濃度を低下させる機能をもたらすホルモンであるインスリンの製造、貯蔵および放出である。β細胞は、貯蔵されたインスリンの一部を分泌しながらさらに多くのインスリンを産生することによって、血中グルコース濃度の一過性の増大に迅速に応答する。「δ細胞」、「デルタ細胞」および「Ｄ細胞」は、胃、腸および膵ランゲルハンス島に見出されるソマトスタチン産生細胞である。「Ｆ細胞」または「ＰＰ細胞」は、膵ランゲルハンス島に見出される膵ポリペプチド産生細胞を意味する。「イプシロン細胞」または「ε細胞」は、ランゲルハンス島に見出される、グレリンホルモンを産生する内分泌細胞である。
【００２４】
用語「非β細胞」は、膵β細胞ではないいずれかの細胞を指す。この用語には、膵α細胞（「アルファ細胞」）、膵δ細胞（「デルタ細胞」）、膵ＰＰ細胞、ε細胞（「イプシロン細胞」）、肝臓由来の細胞および腸由来の細胞のような、消化管に付随する神経内分泌細胞、および皮膚由来の細胞のような末梢細胞が含まれる。
【００２５】
本明細書で用いられる「β細胞に特徴的な転写因子」は、膵臓の発生およびβ細胞の分化に関わる転写因子、ならびに成熟β細胞の遺伝子発現を調節する転写因子を指す。β細胞に発現されるこれらの転写因子としては、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ１が挙げられる（ＭＥ  Ｃｅｒｆ，２００６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５５：６７１−６７９）。これらの転写因子のうち、Ｐｄｘ−１は、膵臓の初期発生、β細胞の分化および成熟β細胞の維持に対して鍵となる転写因子であるとみなされている。ＮＫファミリーメンバーであり、ホメオドメインタンパク質であるＮｋｘ２．２の活性がβ細胞の成熟には必要であるが、その遠隔ホモログ（ｄｉｓｔａｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）であるＮｋｘ６．１（ＮＫ６ホメオボックス１）はβ細胞の増殖を制御する。
【００２６】
本明細書で用いられる「Ｐｄｘ−１」は、「Ｉｐｆ−１」、「Ｉｄｘ−１」、「Ｉｕｆ−１」、「Ｍｏｄｙ４」、「Ｓｔｆ−１」、「Ｐｄｘ−１」とも称される、ヒトまたはマウスの「膵臓および十二指腸ホメオボックス１」を指す。マウスでは、Ｐｄｘ−１タンパク質は２８４アミノ酸を有し、その配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号（ＮＰ＿０３２８４０．１）として開示されており（配列番号１）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８８１４として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、Ｐｄｘ−１タンパク質は２８３アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２００．１として開示されており（配列番号２）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００８１８３として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｐｄｘ−１は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｐｄｘ−１タンパク質は、インスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、島アミロイドポリペプチド、および２型グルコース輸送体（ＧＬＵＴ２）を含む幾つかの遺伝子の転写活性化因子である。
【００２７】
本明細書で用いられる「Ｎｋｘ６．１」は、「Ｎｋｘ６Ａ」または「Ｎｋｘ６−１」とも称される、ヒトまたはマウスの「Ｎｋ６ホメオボックス１」を指す。マウスでは、Ｎｋｘ６．１タンパク質は３６５アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５９２０４．１として開示されており（配列番号３）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４４９５５として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、Ｎｋｘ６．１タンパク質は３６７アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１５９．２として開示されており（配列番号４）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６１６８として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｎｋｘ６．１は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。膵臓では、Ｎｋｘ６．１はβ細胞の発生に必要であり、これは標的遺伝子のプロモーター領域内のＡＴリッチ配列に結合する強力な二機能性の転写制御因子である（Ｉｙｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １８（６）：１３６３−１３７５）。
【００２８】
本明細書で用いられる「Ｎｋｘ２．２」は、「Ｎｋｘ２Ｂ」または「Ｎｋｘ２−２」とも称される、ヒトまたはマウスの「Ｎｋ２ホメオボックス２」を指す。マウスでは、Ｎｋｘ２．２タンパク質は２７３アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ３８１６０．１として開示されている（配列番号５）。ヒトでは、Ｎｋｘ２．２タンパク質は２７３アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２５００．１として開示されており（配列番号６）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５０９として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｎｋｘ２．２は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｎｋｘ２．２は、膵島における細胞の運命の決定および神経管腹側の細胞パターン形成に必要とされる。Ｎｋｘ２．２は、補助抑制因子であるＧｒｏｕｃｈｏ−４（Ｇｒｇ４）との相互作用を通して、神経管腹側のパターン形成を調節する転写抑制因子として作用する（Ｍｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｅｌｌ  １０４：８６１−８７３）。この相互作用はｔｉｎｍａｎ（ＴＮ）ドメインと称されるモチーフを介したものである。このｔｉｎｍａｎ（ＴＮ）ドメインは転写抑制因子であるエングレイルド内のエングレイルド相同性１ドメインのコア領域と配列相同性を有し、これを介してＧｒｇ／ＴＬＥタンパク質と相互作用する（Ｊｉｍｅｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：３０７２−３０８２）。発生途中の膵臓では、Ｎｋｘ２．２は、時間的または細胞特異的な環境に応じて、転写抑制因子または活性化因子として機能するようである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３１２３６−３１２４８）。
【００２９】
本明細書で用いられる「Ｐａｘ４」は、「ＭＯＤＹ９」、「ＫＰＤ」、または「ペアードドメイン遺伝子４」とも称される、ヒトまたはマウスの「ペアードボックス遺伝子４」を指す。マウスでは、Ｐａｘ４タンパク質は３４９アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号アクセッション番号ＢＡＡ２４５１６として開示されており（配列番号７）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１１０３８として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、Ｐａｘ４タンパク質は３５０アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｏ４３３１６として開示されており（配列番号８）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６１９３として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｐａｘ４は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｐａｘ４は、胎児の発生および癌の増殖に決定的な役割を果たす。Ｐａｘ４遺伝子は膵島の発生に関連しており、マウスでの研究によって、インスリン産生β細胞の分化におけるこの遺伝子の役割が示された。
【００３０】
本明細書で用いられる「Ｐａｘ６」は、「無虹彩症ＩＩ型タンパク質」、「ＡＮ２」または「ｏｃｕｌｏｒｈｏｍｂｉｎ」とも称される、ヒトまたはマウスの「ペアードボックス遺伝子６」を指す。マウスでは、Ｐａｘ６タンパク質は４２２アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ３６９５７として開示されており（配列番号９）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２４４１９８として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、Ｐａｘ６タンパク質は４２２アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２７１として開示されており（配列番号１０）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００２８０として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｐａｘ６は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｐａｘ６は、眼、鼻、中枢神経系および膵臓の発生に重要な機能を有する。Ｐａｘ６は膵島α細胞の分化に必要とされ、グルカゴン、インスリンおよびソマトスタチンプロモーターに共通のエレメントへの結合に対してＰＡＸ４と競合する。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＭａｆＡ」は、「ｈＭａｆＡ」または「ＲＩＰＥ３ｂ１」とも称される、「膵β細胞特異的転写活性化因子」を指す。マウスでは、ＭａｆＡタンパク質は３５９アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９１９３３１．１として開示されており（配列番号１１）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９７３５７として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、ＭａｆＡタンパク質は３５３アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９６３８８３．２として開示されており（配列番号１２）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０８３２６９として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語ＭａｆＡは、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｗａｎｇらによって開示されるように（２００７，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５０（２）：３４８−３５８）、ＭａｆＡはＤＮＡに結合して、Ｇｌｕｔ２およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、ならびにＧｌｕｔ２、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、ＧＬＰ−１受容体、プロホルモン転換酵素１／３のようなその他の遺伝子の転写を活性化する。
【００３２】
本明細書で用いられる「Ｎｇｎ３」は、「Ａｔｏｈ５」、「Ｍａｔｈ４Ｂ」、「ｂＨＬＨａ７」、または「Ｎｅｕｒｏｇ３」とも称される、ヒトまたはマウスの「ニューロゲニン３」を指す。マウスでは、Ｎｇｎ３タンパク質は２１４アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３８４９．３として開示されており（配列番号１３）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００９７１９として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、Ｎｇｎ３タンパク質は２１４アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６６２７９．２として開示されており（配列番号１４）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２０９９９として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語Ｎｇｎ３は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。Ｎｇｎ−３は内分泌前駆細胞に発現しており、膵臓および腸における内分泌細胞の発生に必要とされる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５５（３）：２７０−８０）。Ｎｇｎ３は、神経外胚葉内の神経前駆体細胞の決定に関与する、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子ファミリーに属する（Ｇｒａｄｗｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ  ９７（４））。Ｓｅｒａｆｉｍｉｄｉｓらによって開示されるように（２００８，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２６：３−１６）、Ｎｇｎ３タンパク質はＤＮＡに結合して、ＮｅｕｒｏＤ、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、ＨｅｙＬ、インスリノーマ関連１（ＩＡ１）、Ｎｋ２．２、Ｎｏｔｃｈ、ＨｅｓＳ、Ｉｓｌ１、ソマトスタチン受容体２（Ｓｓｔｒ２）遺伝子およびその他の遺伝子の転写を活性化する。
【００３３】
本明細書で用いられる「ＮｅｕｒｏＤ１」は、「Ｂｅｔａ２」、「Ｂｈｆ−１」、「ｂＨＬＨａ７３」、または「ＮｅｕｒｏＤ」とも称される、ヒトまたはマウスの「神経原性分化１」を指す。マウスでは、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質は３５７アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ９４６１１として開示されており（配列番号１５）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０８９４として開示される配列の遺伝子によってコードされる。ヒトでは、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質は３５６アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列はＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４９１として開示されており（配列番号１６）、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５００として開示される配列の遺伝子によってコードされる。本明細書で用いられる用語ＮｅｕｒｏＤ１は、種の変異型、ホモログ、実質的に相同な変異型（天然または合成の）、対立遺伝子形、突然変異体、およびタンパク質の構造または機能に不利な影響を及ぼさない保存された置換、付加、欠失を含むそれらの等価物もまた包含する。ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質は、その他のｂＨＬＨタンパク質とヘテロ二量体を形成して、Ｅボックスとして知られる特異的ＤＮＡ配列を含む遺伝子の転写を活性化する。ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質は、インスリン遺伝子の発現を調節し、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子の変異によってＩＩ型糖尿病がもたらされる。
【００３４】
一般に「インスリンのシグナル伝達経路（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）」または「インスリンのシグナル伝達経路（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）」との表現は、細胞によるグルコースの取り込みの調節を導く、細胞表面のインスリン受容体（インスリン受容体ＩＲ）へのインスリンの結合に始まり、細胞質内での生化学反応までの、一連の反応を意味する。
【００３５】
用語「相同」が、遺伝子変異型またはポリペプチド変異型に対して用いられる場合、この用語は参照遺伝子またはポリペプチドと実質的に相同な遺伝子変異型またはポリペプチド変異型を意味するが、これらのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、参照遺伝子またはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とは異なっており、別の種に由来するものであるか、または１以上の欠失、挿入または置換の結果としての天然もしくは合成変異型に相当するものである。実質的に相同であるとは、変異型ヌクレオチド配列が、参照遺伝子または同等な遺伝子、すなわち他の種において同じように機能する遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同等であることを意味する。実質的に相同であるとは、変異型アミノ酸配列が、参照ポリペプチドまたは同等なポリペプチド、すなわち他の種において同じように機能するポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同等であることを意味する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視および／または計算によって、またはさらに簡単には、Ｃｌｕｓｔａｌパッケージバージョン１．８３のようなコンピュータプログラムを用いた配列情報の比較によって決定することができる。遺伝子の変異型は、少なくとも１の保存的に置換されたアミノ酸、すなわち所定のアミノ酸残基が同様な生理化学的特性を有する残基によって置換されたアミノ酸、を有する配列を含んでよい。一般に、未変性のポリペプチドに存在する１以上のアミノ酸の置換は保存的に為されなければならない。保存された置換の例としては、単数または複数の活性化ドメインの外側に起こるアミノ酸の置換、および参照ポリペプチドの二次構造および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換が挙げられる。保存された置換の例としては、一つの脂肪族残基の別の脂肪族残基による置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａが互いに置換されること、または一つの極性残基の別の極性残基による置換、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎとの間での置換が挙げられる。その他のこのような保存された置換、例えば、同様な疎水特性を有する全領域の置換は公知である（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１）。本発明には、天然の変異型も包含される。このような変異型の例は、オルタナティブｍＲＮＡスプライシング現象からもたらされたタンパク質、または未変性タンパク質のタンパク質分解性切断からもたらされたタンパク質であって、未変性の場合の生物学的特性が保持されたタンパク質である。例えば、「保存されたアミノ酸置換」には、未変性ではない残基による未変性のアミノ酸残基の置換も含まれてよく、この場合、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷は、わずかに影響されるか、もしくはまったく影響されない。所望のアミノ酸置換（保存��れているか、保存されていないかにかかわらず）は、そのような置換が所望される際に、当業者によって決定することができる。
【００３６】
インスリンのシグナル伝達経路の「アンタゴニスト」との用語は、インスリンシグナル伝達に関連する生物分子の活性に対して、完全に、または部分的に拮抗する分子を指すものとして定義される。アンタゴニストには、非ペプチド構造エレメントを含むペプチド類似体として定義される「ペプチド模倣薬」が包含され、このペプチドは、天然の親ペプチドにみられる単数または複数の生物作用を模倣可能であるか、またはこれに拮抗可能である。ペプチド模倣薬にはもはや、酵素的に切断可能なペプチド結合のような、古典的なペプチドの特性はみられない。アンタゴニストには抗体も包含される。インスリンのシグナル伝達経路の「アンタゴニスト」には、Ｓ９６１、Ｓ６６１（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３７６：３８０−３８３；Ｖｉｋｒａｍ  ａｎｄ  Ｊｅｎａ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９８：２６０−２６５）、および２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体（Ｋｎｕｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７，１２，ｅ５１９７２）のようなインスリン受容体の公知のアンタゴニスト、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、例えばワートマニンまたはＰＸ−８６６（（４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ，Ｅ）−１−（（ジアリルアミノ）メチレン）−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−２，７，１０−トリオキソ−１，２，４，４ａ，５，６，６ａ，７，８，９，９ａ，１０−ドデカヒドロインデノ［４，５−ｈ］イソクロメン−５−イルアセテート）およびＳＦ１１２６（（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１４−（カルボキシメチル）−８−（３−グアニジノプロピル）−１７−（ヒドロキシメチル）−３，６，９，１２，１５−ペンタオキソ−１−（４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−クロメン−２−イル）モルホリノ−４−イウム）−２−オキサ−７，１０，１３，１６−テトラアザオクタデカン−１８−オエート）のようなワートマニンの誘導体、ＧＤＣ−０９４１（４−（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−（（４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル）メチル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル）モルホリン）、ＸＬ−１４７（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール−５−イルアミノ）キノキサリン−２−イル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド）、ＸＬ−７６５（２−アミノ−８−エチル−４−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン）、Ｄ−８７５０３（Ｎ−［３−（４−ヒドロキシフェニル）ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−Ｎ’−２−プロペン−１−イルチオウレア）、Ｄ−１０６６６９（Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−［（４−メチルフェニル）アミノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］ウレア）、ＧＳＫ−６１５（）、ＣＡＬ−１０１（イデラリシブ、５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンとも称される）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５���またはＢＥＺ−２３５、２−メチル−２−｛４−［３−メチル−２−オキソ−８−（３−キノリニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル｝プロパン−ニトリル）、ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）（Ｓａｕｖｅｕｒ−Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３７，２６５−２７２）、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０、５−［２，６−ジ（４−モルホリニル）−４−ピリミジニル］−４−（トリフルオロメチル）−２−ピリジンアミンとも称される）、ＧＤＣ−００３２（１Ｈ−ピラゾール−１−アセトアミド、４−［５，６−ジヒドロ−２−［３−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］イミダゾ−［１，２−ｄ］［１，４］ベンゾオキサゼピン−９−イル］−α，α−ジメチル−）、ＢＡＹ８０−６９４６（５−ピリミジンカルボキサミド、２−アミノ−Ｎ−［２，３−ジヒドロ−７−メトキシ−８−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］イミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル］−）、ＩＰＩ−１４５（（Ｓ）−３−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）エチル）−８−クロロ−２−フェニルイソキノリン−１（２Ｈ）−オン）、ＢＹＬ−７１９（（Ｓ）−Ｎ１−（４−メチル−５−（２−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）ピリジン−４−イル）チアゾール−２−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボキサミド）、ＢＧＴ−２２６（８−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−（ピペラジン−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２（３Ｈ）−オン）、ＰＦ−０４６９１５０２（２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン）、ＧＤＣ−０９８０（（Ｓ）−１−（４−（（２−（２−アミノピリミジン−５−イル）−７−メチル−４−モルホリノチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−６−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）−２−ヒドロキシ−プロパン−１−オン）、ＧＳＫ−２１２６４５８（２，４−ジフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−５−（４−（ピリダジン−４−イル）キノリン−６−イル）ピリジン−３−イル）ベンゼンスルホンアミド）、ＰＦ−０５２１２３８４（Ｎ−［４−［［４−（ジメチルアミノ）−１−ピペリジニル］カルボニル］フェニル］−Ｎ’−［４−（４，６−ジ−４−モルホリニル−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］ウレア）（Ａｋｉｎｌｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，８８）が包含される。インスリンのインスリン受容体への結合によって開始される、細胞内でのインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストもまた包含され、このようなアンタゴニストとしてはＴａｎｉｇｕｃｈｉらにより開示されるインスリンシグナル伝達ネットワークの決定的な中心点（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌ���ｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，７，８５−９６）およびＳｉｄｄｌｅにより開示される標的（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１１，４７，Ｒ１−Ｒ１０）が挙げられる。
【００３７】
本明細書における用語「β細胞の除去」は、例えばジフテリア毒素およびストレプトゾトシンをそれぞれ用いて、膵臓にアポトーシスまたは壊死を起こすことによる、全体的または部分的なβ細胞の減少を意味する。β細胞の大量除去は、Ｎａｇｌｉｃｈら（ｃｅｌｌ，１９９２，６９（６）：１０５１−１０６１）またはＳａｉｔｏら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，１９（８）：７４６−７５０）に開示されるように、ジフテリア毒素受容体をホモ接合性にトランスジェニック発現させた後、ジフテリア毒素を投与することによって達成される。β細胞の部分的な除去は、ジフテリア毒素受容体をヘテロ接合性にトランスジェニック発現させた後、上記のようにジフテリア毒素を投与するか、またはＬｅｎｚｅｎ，２００８，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００８；５１：２１６−２６に開示されるようにストレプトゾトシンを用いることによって達成される。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「糖尿病」は、グルコース不耐性をもたらす、比較的または絶対的なインスリンの欠乏によって特徴付けられる慢性疾患を指す。この用語は、患者が高血糖である代謝疾患群としての糖尿病も網羅する。本明細書で用いられる用語「糖尿病」には、自己免疫による膵臓のインスリン産生β細胞の破壊からもたらされる糖尿病の型である「１型糖尿病」、インスリン抵抗性およびインスリンの比較的な欠乏に関連した、血中の高グルコースによって特徴付けられる代謝性疾患である「２型糖尿病」、事前に糖尿病と診断されてはいない女性が、妊娠中に高い血中グルコース濃度を示す状態である「妊娠糖尿病」、インスリン産生に影響を及ぼす遺伝子の変化によって、６か月未満で診断される糖尿病の稀な型である「新生児糖尿病」、および単一遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性糖尿病の稀な型である「若年発症成人型糖尿病」（ＭＯＤＹ）が包含される。本明細書で用いられる「治療」および「治療する」などは、一般に所望の薬理的および生理的効果を得ることを意味する。この効果は、疾病、症状もしくはそれらの状態を予防するかまたは部分的に予防するという点で予防的であってよく、かつ／または疾病、状態、症状もしくは疾病が原因である有害作用を部分的または完全に治癒させるという点で治療的であってもよい。本明細書で用いられる用語「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾病のいずれの治療も網羅し、（ａ）疾病にかかりやすい傾向があるようだが、まだそれと診断されていない被験体に、例えば初期の無症状時に予防的な治療介入を行うことによって疾病の発生を予防すること、および（ｂ）疾病を抑制すること、すなわちその発生を停止させること、または疾病を軽減させること、すなわち、これは例えば損傷の改善または修復のような、疾病および／またはその症状もしくは状態を後退させることに起因する、が包含される。特に、本発明の方法、使用、製剤および組成物は、糖尿病の治療において、かつ／または糖尿病の進行の予防において有用である。糖尿病に関して、疾病または疾患の予防には、例えば個体の血縁者の中で過去に糖尿病を発症した者がいることにより、糖尿病発生のリスクがあると同定された個体における糖尿病の出現または発生の予防が包含される。糖尿病の「予防／治療」との用語は、既に糖尿病と診断された個体の安定化も網羅する。「安定化」は、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性非ケトン状態、低血糖症、糖尿病性昏睡、呼吸器感染症、歯周病、糖尿病性心筋症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性足病変、糖尿病性網膜症、冠動脈疾患、糖尿病性筋壊死、末梢血管疾患、脳卒中、糖尿病性脳症のような合併症を誘導する糖尿病の進行の予防または遅延を意味する。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「被験体」は、哺乳類を指す。例えば、本発明によって意図される哺乳類としては、ヒト、霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用げっ歯類などが挙げられる。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、本発明の少なくとも１のアンタゴニスト、組成物またはその医薬製剤の量であって、想定される細胞、組織、系、動物、またはヒトにおいて生物学的または医薬的な応答を誘発する量を指す。一実施形態によれば、有効量は、治療される疾病または状態の症状を緩和するための「治療上有効な量」である。別の実施形態によれば、有効量は、予防される疾病または状態の症状を予防するための「予防上有効な量」である。本明細書において、この語には、疾病の進行を減少させるため、糖尿病の合併症を明らかに遅延、減少または阻害させるために十分な、活性化されたアンタゴニストの量であって、想定される応答が誘発される量（すなわち「阻害の有効量」）も包含される。
【００４１】
本発明による治療の「有効性」との用語は、本発明の使用または方法に応答した、疾病の経過における変化に基づいて測定可能である。例えば、糖尿病治療の有効性は、安定的に制御された血中グルコース濃度および／または血中糖化ヘモグロビン濃度の定期的なモニターによって測定可能である。
【００４２】
用語「医薬製剤」は、単数または複数の有効成分の生物学的活性がはっきりと有効となるような形の製剤であって、前記製剤を投与され得る被験体に対して毒性のある追加成分を含まない製剤を指す。
【００４３】
細胞にインスリン産生を誘導する本発明の方法
第１の態様によれば、本発明は、非β細胞にインスリン産生を誘導する方法であって、インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞からのインスリン産生を刺激する工程を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明に従った、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞は、例えば前記転写因子を、被験体の糖尿病状態の結果として自然に発現し得るか、または、例えばβ細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現させるための、遺伝子工学またはその他の手段による誘導の結果として、人工的に発現し得る。
【００４５】
特定の実施形態によれば、本発明は非β細胞にインスリン産生を誘導する方法を提供し、この方法は、
ａ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を誘導することによって、前記非β細胞を改変する工程、および
ｂ）インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、工程ａ）で得られた改変非β細胞のインスリン産生を刺激する工程を含む。
【００４６】
別の態様によれば、本発明の方法は非β細胞をインスリン産生細胞に変換させる方法に関し、該方法は、インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を既に発現している非β細胞のインスリン産生を刺激する工程を含む。
【００４７】
上述したように、本発明に従った、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞は、前記転写因子を、被験体の糖尿病状態の結果として自然に発現し得るか、または、β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現させるための、遺伝子工学またはその他の手段による誘導の結果として、人工的に発現し得る。
【００４８】
一実施形態によれば、本発明の方法は非β細胞をインスリン産生細胞に変換させる方法に関し、該方法は、
ａ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を誘導することによって、前記非β細胞を改変する工程、および
ｂ）インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、工程ａ）で得られた改変非β細胞のインスリン産生を刺激する工程を含む。
【００４９】
本発明の方法のさらなる実施形態によれば、工程ｂ）で得られた細胞の少なくとも１０％、詳細には少なくとも２０％、さらに詳細には少なくとも３０％、さらになお詳細には少なくとも４０％がインスリン産生細胞である。
【００５０】
本発明の方法の別の実施形態によれば、工程ｂ）で得られた細胞によって産生されるインスリンの量は、被験体における血中グルコース濃度の制御能を有意に改善するために十分である。血中グルコースの測定方法は、当業者に公知である。
【００５１】
特定の態様によれば、本発明の方法は膵α細胞をインスリン産生細胞に変換させる方法に関し、該方法は、
ａ）膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を誘導することによって、前記α細胞を改変する工程、および
ｂ）インスリンのシグナル伝達経路を遮断することによって、工程ａ）で得られた改変細胞のインスリン産生を刺激する工程を含み、
これによれば、工程ｂ）で得られた細胞の少なくとも１０％、詳細には少なくとも２０％、さらに詳細には少なくとも３０％、さらになお詳細には少なくとも４０％がインスリン産生細胞である。
【００５２】
本発明の方法は、ランゲルハンス島が含まれるものが包含される、分離細胞、培養細胞、組織またはその切片を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ、または動物、特に非ヒト哺乳類、例えばマウスのような実験用げっ歯類の全身を用いたｉｎ  ｖｉｖｏに応用可能である。
【００５３】
本発明の方法は、膵α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞、例えば肝臓由来の細胞および腸由来の細胞、ならびに皮膚由来の細胞のような末梢細胞を包含する、様々な非β細胞型に応用可能である。
【００５４】
膵組織、ならびにα細胞、β細胞、δ細胞およびε細胞を包含する島細胞は、ヒト島細胞の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）（Ｂｒａｍｓｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１２３，ｐ１２７５−１２８４）のような、当該技術分野における標準法に従って分離することができる。肝臓由来の細胞および腸由来の細胞のような、消化管に付随する神経内分泌細胞、およびこれらの細胞を含む組織は、当業者に公知の標準法に従って分離することができる。皮膚由来の細胞のような末梢細胞、およびこれらの細胞を含む組織は、当業者に公知の標準法に従って分離することができる。
【００５５】
本発明に従った、膵β細胞に特徴的な転写因子には、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１が包含される。
【００５６】
特定の実施形態によれば、本発明の方法の工程ａ）は、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１からなる群より選択される、β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を、前記非β細胞、特に膵α細胞に誘導することによって行われる。
【００５７】
さらに特定の実施形態によれば、本発明の方法の工程ａ）は、Ｐｄｘ−１の発現を、前記非β細胞、特に膵α細胞に誘導することによって行われる。
【００５８】
別の特定の実施形態によれば、本発明の方法の工程ａ）は、恒常性または誘導性プロモーターの制御下に置かれたＰｄｘ−１遺伝子のコード配列を含む核酸を、前記非β細胞、特に膵α細胞にトランスフェクトすることで、前記細胞にＰｄｘ−１の発現を誘導することによって行われる。
【００５９】
特定の実施形態によれば、本発明の方法の工程ａ）は、Ｎｋｘ６．１またはＮｋｘ２．２の発現を、前記非β細胞、特に膵α細胞に誘導することによって行われる。
【００６０】
本発明によれば、β細胞に特徴的な転写因子の発現の誘導は、恒常性または誘導性プロモーターの制御下に置かれた前記転写因子の遺伝子のコード配列を含む核酸を、非β細胞にトランスフェクトすることによって行われる。
【００６１】
本発明の方法において、前記非β細胞にトランスフェクトするための核酸はベクター（ウイルス性または非ウイルス性ベクターのいずれか）の形であり、この核酸は、微小気泡、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥデキストランを介したトランスフェクション、ポリブレンを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入法、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および微粒子銃のような、当該技術分野における標準法を用いて前記細胞内に送達される。
【００６２】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のインスリン産生を刺激する工程は、前記膵臓の非β細胞が含まれる膵島組織において、組織レベルまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、例えば、Ｎａｇｌｉｃｈら（ｃｅｌｌ  １９９２，６９（６）：１０５１−１０６１）またはＳａｉｔｏら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，１９（８）：７４６−７５０）に開示されるような、ジフテリア毒素受容体をトランスジェニック発現させた後のジフテリア毒素の投与による、またはＬｅｎｚｅｎ（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２００８；５１：２１６−２２６）に開示されるようなストレプトゾトシンの使用による、β細胞の除去（部分的または全体的）によって実行される。
【００６３】
別の実施形態によれば、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を誘導する工程は、上記のようなβ細胞の除去（部分的または全体的）によっても実行される。
【００６４】
別の実施形態によれば、インスリンのシグナル伝達経路を遮断する工程は、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記非β細胞とインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストとを接触させることによって実行される。
【００６５】
別の実施形態によれば、インスリンのシグナル伝達経路を遮断する工程は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、糖尿病に罹患した被験体にインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することによって実行される。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態によれば、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストは、Ｓ９６１、Ｓ６６１、もしくはそれらの誘導体、および２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体のようなインスリン受容体アンタゴニスト、またはＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばワートマニンまたはＰＸ−８６６およびＳＦ１１２６のようなワートマニンの誘導体、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８、およびＰＦ−０５２１２３８４、またはインスリン受容体に結合したインスリンによって開始される、インスリンの細胞内シグナル伝達経路のアンタゴニストである。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストは、配列番号１８の配列で示される、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１である。
【００６８】
本発明の治療方法および使用
本発明の別の態様は、治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを、被験体の必要に応じて投与することを含む、糖尿病を予防および／または治療する方法に関する。
【００６９】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記アンタゴニストは、Ｓ９６１、Ｓ６６１、それらの誘導体、および２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体のようなインスリン受容体アンタゴニスト、ならびにＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばワートマニンまたはＰＸ−８６６およびＳＦ１１２６のようなワートマニンの誘導体、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８、およびＰＦ−０５２１２３８４、ならびにインスリン受容体に結合したインスリンによって開始される、インスリンの細胞内シグナル伝達経路のアンタゴニストからなる群より選択される。
【００７０】
特定の実施形態によれば、糖尿病を予防および／または治療するための本発明の方法は、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、またはＮｅｕｒｏＤ１のような、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞、特に膵α細胞を自家移植または同種移植することをさらに含む。
【００７１】
自家移植は、治療される被験体から分離した非β細胞に由来する改変細胞の移植であり、一方で同種移植は、治療される被験体ではないが、同じ種に属する被験体から分離した非β細胞に由来する改変細胞の移植である。
【００７２】
本発明によれば、非β細胞は、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストの投与よりも前に、これと同時に、またはこれと連続的に、被験体へ投与することができる。
【００７３】
非β細胞の自家移植または同種移植を含む、糖尿病を予防および／または治療するための本発明の方法において有用な非β細胞は、α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞、例えば肝臓由来の細胞および腸由来の細胞、ならびに皮膚由来の細胞のような末梢細胞を包含する、様々な膵臓の非β細胞であってよい。
【００７４】
別の態様によれば、本発明は、糖尿病を予防および／または治療するための薬剤の製造における、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストの使用を提供する。
【００７５】
本発明の使用の特定の実施形態によれば、前記アンタゴニストは、Ｓ９６１、Ｓ６６１、またはそれらの誘導体、および２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体のようなインスリン受容体アンタゴニスト、ならびにＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばワートマニンまたはＰＸ−８６６およびＳＦ１１２６のようなワートマニンの誘導体、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８、およびＰＦ−０５２１２３８４、ならびにインスリン受容体に結合したインスリンによって開始される、インスリンの細胞内シグナル伝達経路のアンタゴニストからなる群より選択される。
【００７６】
別の実施形態によれば、糖尿病を予防および／または治療するために、本発明のアンタゴニストの使用は、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、またはＮｅｕｒｏＤ１のような、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞、特に膵α細胞の使用と組み合わされる。
【００７７】
さらなる実施形態によれば、糖尿病を予防および／または治療するための本発明の方法ならびに使用は、糖尿病に罹患した被験体の、本発明の治療に対する感受性を予測するための下記方法に従って同定された被験体に応用される。
【００７８】
別の態様によれば、本発明は、治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することを含む治療に対する、糖尿病に罹患した被験体の感受性を予測する方法を提供し、該方法は、前記被験体由来の非β細胞に、Ｐｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、またはＮｅｕｒｏＤ１のような、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子の発現を検出する工程を含む。
【００７９】
当該技術分野において公知のいずれかの方法が、体液中の転写因子のタンパク質濃度の決定および前記転写因子の遺伝子の転写量の決定を含む、前記転写因子の発現の決定のために用いられてよい。考えられる方法としては、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、マススペクトロメトリー、マイクロアレイ分析およびＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００８０】
本発明の一実施形態によれば、ＥＬＩＳＡはサンドイッチアレイから構成され、ここでは分析されるタンパク質に対する一つの型の抗体（「一次」抗体）によって従来のマイクロタイタープレートをコートする。次にこのプレートをブロックした後、試料または標準試料を添加する。インキュベーション後に一次抗体を添加し、続いて、適切な標識、例えば発色による検出のための酵素を結合させた、一次抗体に対する別の型の抗体（「二次」抗体）を添加する。最後に、標識を検出および定量するために、標識に対する基質を加えてプレートを発色させ、分析するタンパク質の存在およびその量を測定する。標識が発色による検出のための酵素である場合、結合させた酵素の基質は発色反応を起こす基質である。次にマイクロプレートリーダーを用いて発色反応を検出し、標準試料と比較する。
【００８１】
適切な抗体の一組（「一次」および「二次」抗体）は、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ロバまたはウマの組み合わせのいずれかである。モノクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナル抗体または抗体断片の使用も可能である。適切な標識は、発色性の標識、すなわち基質を検出可能な色または蛍光化合物に変換させる酵素、分光標識、例えば蛍光標識または可視色を呈する標識、その標識に特異的なさらなる化合物によって発現し、検出および定量が容易になる親和性標識、標準ＥＬＩＳＡ法で用いられるその他のいずれかの標識である。
【００８２】
タンパク質を検出するためのその他の好ましい方法は、自動化された市販の分析ロボットによる、単一抗体と化学発光検出とを用いた、放射性免疫測定法または競合的免疫アッセイである。微粒子によって増強された蛍光、蛍光偏光法、またはマススペクトロメトリーもまた用いられてよい。検出装置、例えばマイクロアレイは、分析したタンパク質の読み取りシステムとして有用な要素である。
【００８３】
非β細胞における、膵β細胞に特徴的な転写因子の発現量を決定する方法には、前記転写因子の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析も包含される。
【００８４】
特定の実施形態によれば、膵β細胞に特徴的な転写因子、特にＰｄｘ−１の発現を、前記被験体由来の非β細胞に検出する工程は、
ａ）前記被験体由来の生体試料を供給すること、
ｂ）前記試料と前記転写因子に対する抗体とを接触させることであって、この接触は、前記試料中の転写因子の前記抗体への、抗原−抗体相互作用を介した結合に十分な条件下で行われること、
ｃ）抗原−抗体複合体を検出することであって、前記複合体の存在が、前記被験体由来の非β細胞における前記転写因子の発現を示していること
を含む。
【００８５】
上記実施形態の特定の態様によれば、前記転写因子に対する抗体は蛍光標識されており、抗原−抗体複合体の存在は、蛍光の検出を介して検出される。
【００８６】
別の実施形態によれば、膵β細胞に特徴的な転写因子、特にＰｄｘ−１の発現を、前記被験体由来の非β細胞に検出する工程は、
ａ）前記被験体由来の生体試料、特に膵生検試料を供給すること、
ｂ）ａ）の前記試料から全ＲＮＡを抽出すること、
ｃ）工程ｂ）で得られたＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した後、前記転写因子の遺伝子を増幅するために適したプライマーを用いて定量ＰＣＲを行うこと、
ｄ）工程ｃ）で得られた、前記転写因子の遺伝子に特異的なＰＣＲ産物を検出することであって、前記ＰＣＲ産物の存在が、前記被験体由来の非β細胞、特に膵α細胞における前記転写因子の遺伝子発現を示していること
を含む。
【００８７】
さらなる実施形態によれば、膵β細胞に特徴的な転写因子、特にＰｄｘ−１の発現を検出する工程は、膵臓の非β細胞、例えばα細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞、例えば肝臓由来の細胞および腸由来の細胞、または皮膚由来の細胞のような末梢細胞に応用される。
【００８８】
上記の本発明の実施形態によれば、生体試料には、組織生検試料、皮膚掻爬、または口腔スワブが包含される。
【００８９】
さらに別の実施形態によれば、治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することを含む治療に対する、糖尿病に罹患した被験体の感受性を予測する方法は、前記生体試料中の、前記転写因子を発現する非β細胞の割合を決定することをさらに含み、ここで前記転写因子を発現する非β細胞、例えば膵α細胞の割合が１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％または２０％であるか、またはそれよりも高い場合、治療上有効な量のインスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを投与することを含む治療に対する、前記被験体の感受性が示される。
【００９０】
本発明に従ったスクリーニング方法
本発明のさらに別の態様によれば、インスリンのシグナル伝達経路の阻害能を有する化合物のスクリーニング方法が提供され、この方法は、
ａ）β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子を発現する非β細胞、特にα細胞を、試験化合物に曝露する工程、
ｂ）試験化合物の存在下および非存在下において、インスリン産生細胞である前記細胞の数を決定する工程、
ｃ）工程ｂ）で決定したインスリン産生細胞の数である２つの値を比較する工程であって、
試験化合物の存在下でのインスリン産生細胞の数が、試験化合物の非存在下で決定した数に比較して多い場合、この試験化合物はインスリンのシグナル伝達経路を阻害可能であることが示される工程
を含む。
【００９１】
免疫蛍光染色法のような公知のいずれかの方法が、インスリン産生細胞の数を決定するために用いられてよい。
【００９２】
本発明の薬剤および組成物
一態様によれば、本発明は、糖尿病の予防および／または治療に用いられる、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストを提供する。
【００９３】
別の態様によれば、本発明は、糖尿病の予防および／または治療に用いられる、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストおよびＰｄｘ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＭａｆＡ、Ｎｇｎ３、およびＮｅｕｒｏＤ１のような、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞、特に膵α細胞を含む組成物を提供する。
【００９４】
上記２つの態様の特定の実施形態によれば、前記アンタゴニストは、Ｓ９６１、Ｓ６６１、またはそれらの誘導体、および２つのＢ２９リジンの間で架橋された（Ｂ２９−Ｂ’２９）共有結合性のインスリン二量体のようなインスリン受容体アンタゴニスト、ならびにホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、例えばワートマニンまたはＰＸ−８６６およびＳＦ１１２６のようなワートマニンの誘導体、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、Ｄ−８７５０３、Ｄ−１０６６６９、ＧＳＫ−６１５、ＣＡＬ−１０１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ブパリシブ（ＢＫＭ−１２０とも称される）、ＧＤＣ−００３２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＩＰＩ−１４５、ＢＹＬ−７１９、ＢＧＴ−２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ＧＳＫ−２１２６４５８、およびＰＦ−０５２１２３８４、ならびにインスリン受容体に結合したインスリンによって開始される、インスリンの細胞内シグナル伝達経路のアンタゴニストからなる群より選択される。
【００９５】
Ｓ９６１は配列番号１８で示されるアミノ酸配列のペプチドである（２つのシステインがジスルフィド結合によって連結され、前記ペプチドはＣ末端にカルボン酸基を有する）。
【００９６】
Ｓ６６１は配列番号１７で示されるアミノ酸配列のペプチドである（２つのシステインがジスルフィド結合によって連結され、前記ペプチドはＣ末端にアミド基を有する）。
【００９７】
ペプチドアンタゴニストであるＳ６６１およびＳ９６１は、Ｓｃｈａｆｆｅｒらによって記載される（２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３７６：３８０−３８３）Ｆｍｏｃ法を用いたマイクロ波による固相ペプチド合成によって、および大腸菌内での生合成によって、それぞれ合成される。
【００９８】
以下の式で表されるワートマニンは、真菌ペニシリウムフニクロスムのステロイド代謝産物であり、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に特異的な共有結合性の阻害剤である。
【化１】
2016517404.tif 000002
【００９９】
ワートマニンの誘導体としては、国際公開第２０１１／１５３４９５号に記載される類似体、特に式ＩＡまたはＩＢで表される類似体が挙げられる。
【化２】
2016517404.tif 000003
（式中、
−−は任意の結合を表し、
ｎは１〜６を表し、
Ｙはヘテロ原子を表し、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、不飽和アルキル、非直鎖アルキル、環状アルキル、および置換アルキルから選択されるか、またはＲ１およびＲ２は共に原子へ結合してヘテロシクロアルキル基を形成し、
Ｒ３は存在しないか、Ｈ、またはＣ１−Ｃ６置換もしくは非置換アルキルを表し、
Ｒ４は（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５、（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ５、（Ｓ＝Ｏ）Ｒ５、（ＳＯ２）Ｒ５、（ＰＯ３）Ｒ５、（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６を表し、
Ｒ５は置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルを表し、かつ
Ｒ６は置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルを表す。）
【０１００】
ワートマニンの誘導体としては、式ＩＩＡまたはＩＩＢで表される化合物がまた挙げられる。
【化３】
2016517404.tif 000004
（式中、Ｙはヘテロ原子を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、不飽和アルキル、非直鎖アルキル、環状アルキル、および置換アルキルから選択されるか、またはＲ１およびＲ２はＹと共に複素環を形成する。）
【０１０１】
ワートマニンの誘導体としては、以下の式で表されるＰＸ−８６６もまた挙げられる。
【化４】
2016517404.tif 000005
【０１０２】
本発明によれば、前記非β細胞は、前記インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストの使用よりも前に、これと同時に、またはこれと連続的に使用することができる。
【０１０３】
本発明に従って使用するための非β細胞は、α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、ε細胞、消化管に付随する神経内分泌細胞、例えば肝臓由来の細胞および腸由来の細胞、ならびに皮膚由来の細胞のような末梢細胞を包含する、様々な膵臓の非β細胞であってよい。
【０１０４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、糖尿病に罹患した被験体、好ましくは哺乳類の被験体、最も好ましくはヒト被験体を治療するための医薬組成物および方法を提供し、前記医薬組成物は、本明細書に記載する本発明の薬剤、および任意に、本明細書に記載する非β細胞を含む。
【０１０５】
特に前記医薬組成物は、本明細書に記載する本発明の薬剤および本明細書に記載する非β細胞を含む。
【０１０６】
本発明の薬剤は、小分子（例えば抗生物質）、ペプチド、ペプチド模倣薬、キメラタンパク質、天然または非天然タンパク質、核酸由来のポリマー（例えばＤＮＡおよびＲＮＡアプタマー、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、またはＬＮＡ）、融合タンパク質（例えば、インスリン受容体に対するアンタゴニスト活性を有する融合タンパク質）、抗体アンタゴニスト（例えば抗インスリン受容体中和抗体）を包含する。
【０１０７】
本発明はまた、インスリンのシグナル伝達経路に対するアンタゴニストと、膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞とを含む医薬組成物も提供する。
【０１０８】
本発明の医薬組成物または製剤は、いずれかの形である本発明の薬剤と、本明細書に記載する非β細胞とを含み得る医薬製剤として投与されてもよい。
【０１０９】
本発明の組成物と、従来から用いられているアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤とは、医薬組成物の剤形およびその単位剤形に共に含まれてよく、このような剤形は、経口で使用するための、錠剤もしくは充てんしたカプセルのような固体、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤、もしくはこれらを充てんしたカプセルとして、または注射もしくは持続点滴によって非経口（皮下および皮内を含む）使用するための無菌注射用溶液として用いられてよい。注射用組成物は、典型的には、注射用の無菌生理食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水、または当該技術分野において公知であるその他の注射用担体を基にしたものである。このような医薬組成物およびその単位剤形は、成分を、さらなる有効化合物もしくは成分と共に、またはそれらなしで、従来の割合によって含んでよく、このような単位剤形は、使用が意図された一日の投与量の範囲に釣り合った、いずれかの適切な有効量の有効成分を含んでよい。
【０１１０】
適切なアジュバントの例としては、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ）、アルミニウム化合物のような、アルミニウムを基にした鉱物（一般にミョウバンと称される）、ＡＳＯ１−４、ＭＦ５９、リン酸カルシウム、リポソーム、Ｉｓｃｏｍ、その安定化型であるポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ）を含むポリイノシン・ポリシチジン酸（ｐｏｌｙＩＣ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モンタニド、ＰＬＧ、フラジェリン、ＱＳ２１、ＲＣ５２９、ＩＣ３１、イミキモド、レシキモド、ＩＳＳおよび線維芽細胞刺激リポペプチド（ＦＳＬ１）が挙げられる。
【０１１１】
本発明の組成物は液体製剤であってよく、限定はされないが、水性または油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。該組成物は、使用前に水またはその他の適切なビヒクルを用いて再構成される、乾燥製剤として処方されてもよい。このような液体製剤は添加物を含んでもよく、添加物としては、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存料が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルおよび水素化食用油脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエートおよびアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。保存料としては、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。分散剤または湿潤剤としては、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の組成物は、埋め込みまたは筋肉内注射によって投与され得るデポ製剤として処方されてもよい。
【０１１３】
本発明の固体組成物は、従来の方法によって、錠剤または舐剤の形に処方されてよい。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは従来の賦形剤を含んでよく、賦形剤としては、結合剤、注入剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液成分およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。注入剤としては、ラクトース、糖、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウムおよびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤としてはラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。錠剤は、当該技術分野において公知の方法に従ってコートされてもよい。
【０１１４】
本発明の化合物は、持続放出製剤として、または持続放出薬物送達系から投与することもできる。
【０１１５】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、皮下、筋肉内または腹腔内注射用であるか、または経口摂取用である。
【０１１６】
別の特定の態様によれば、本発明の組成物は、反復投与による送達に適応させることができる。
【０１１７】
さらなる材料および処方工程の技術などについては、参照によって本明細書に取り込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓの第５部に記載されている。
【０１１８】
単回または複数回用量として個体に投与される投与量は、薬物動態特性、被験体の状態および特性（性、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、併用している治療、治療の頻度ならびに所望の効果のような、様々な因子に依存して変動する。
【０１１９】
投与方法
本発明の組成物は、静脈内注射、動脈内、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内、包膜内、経口経路、皮膚への塗布、外科手術中の直接の組織灌流、またはそれらの組み合わせを含む、いずれかの方法によって投与されてよい。
【０１２０】
本発明の組成物は、組成物の徐放を可能にする植込錠の形、および速度を遅く調節した静脈内点滴によって投与されてもよい。
【０１２１】
本発明の組成物の送達方法としては、抗糖尿病薬を送達するための、経口、筋肉内および皮下のような公知の送達方法が挙げられる。
【０１２２】
併用
本発明によれば、本発明の薬剤および組成物、ならびにそれらの医薬製剤は、単独で投与してよいか、またはインスリン、ビグアナイド、スルホニル尿素、アルファグルコシダーゼ阻害剤、食事によるグルコース制御因子、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、インクレチン模倣薬、ＤＰＰ−４阻害剤（グリプチン）のような糖尿病の治療に有用な共薬剤と併用して、または本明細書に記載される膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞と併用して投与してもよい。
【０１２３】
本発明は、本発明の薬剤または組成物およびその医薬製剤の投与を包含し、前記薬剤または組成物は、治療上有効な量の、その他の療法、糖尿病の治療に有用な共薬剤、または膵β細胞に特徴的な少なくとも１の転写因子をコードする核酸のトランスフェクションによって改変された非β細胞よりも前に、これらと同時に、またはこれらと連続的に、個体へ投与される。
【０１２４】
前記共薬剤または前記非β細胞と同時に投与される、本発明の薬剤もしくは組成物またはその医薬製剤は、同じかまたは単数もしくは複数の異なった組成物中で、同じかまたは単数もしくは複数の異なった投与経路によって投与することができる。
【０１２５】
一実施形態によれば、本発明の薬剤または組成物を、少なくとも１の糖尿病の治療に有用な共薬剤および少なくとも１の薬剤的に許容される担体と組み合わせて含む医薬製剤が提供される。
【０１２６】
被験体
一実施形態によれば、本発明の被験体は糖尿病に罹患した被験体である。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、本発明の被験体は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、新生児糖尿病、または若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）に罹患した被験体である。
【０１２８】
特定の実施形態によれば、本発明の被験体は、その膵細胞が、β細胞に特徴的な転写因子、特にＰｄｘ−１を発現するα細胞由来の細胞を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％含む被験体である。
【０１２９】
別の特定の実施形態によれば、本発明の被験体は、その膵β細胞が、糖尿病に罹患していない被験体に比較して６０％を超えて減少している被験体である。
【０１３０】
本明細書に引用する参照文献は、その全体が参照によって取り込まれる。本発明の範囲は、本明細書に記載する特定の実施形態によって限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様についての単一の例証を意図したものであり、機能的に等価な方法および構成要素も本発明の範囲内である。実際に、本発明の様々な改変が、本明細書に記載したものに加えて、前述の記載および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。このような改変は、添付の請求項の範囲内にあることが意図されたものである。
【０１３１】
本発明について記載してきたが、以下の実施例の目的は例示のみであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３２】
次の略語はそれぞれ以下のように定義される：ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＤＯＸ（ドキシサイクリン）、ｈ（時間）、μｌ（マイクロリットル）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、ｍｇ（ミリグラム）、ＰＰＰ（ピクロポドフィリン）。
【０１３３】
材料および方法
マウス
すべてのトランスジェニックマウスについては以前に記載されている（Ｔｈｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４（７２９２）：１１４９−５４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５；２５（１６）：１６８０−５；Ｋａｗａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．９（４）：３５０−６１）。
【０１３４】
ジフテリア毒素（ＤＴ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、Ｓ９６１、ピクロポドフィリン（ＰＰＰ）、ワートマニンおよびインスリンによる治療
以前に記載されたように（Ｔｈｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上記）、ＤＴ（Ｓｉｇｍａ）は腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した。ＤＯＸ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）は飲用水に添加した。Ｓ９６１（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）（Ｖｉｋｒａｍ  ａｎｄ  Ｊｅｎａ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３９８（２）：２６０−５）は、２００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重を、１日２回、４日間連続して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＰＰＰ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）およびワートマニン（Ｓｉｇｍａ）は、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ体重および１ｍｇ／ｋｇ体重を、１日１回、５日間連続してｉ．ｐ．注射した。マウスは、血糖値が２５ｍＭを超えた場合に、皮下インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）を１週間ごとに投与された。
【０１３５】
生理学的試験
膵臓のグルカゴンおよびインスリンの量の測定（免疫測定法）、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析、ならびに組織学的および形態学的分析は、これまでの記載に従って行った（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１１３（４）：１２５７−６５；Ｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３４（１５）：２７１９−２５）。
【０１３６】
免疫蛍光法
クリオスタット切片の厚さは１０μｍとした。使用した抗体は、ウサギおよびモルモット抗Ｐｄｘ１（Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔより供与。それぞれ１／５０００および１／７５０）、モルモット抗ブタインスリン（ＤＡＫＯ、１／４００）、マウス抗ブタグルカゴン（１／１０００）、マウス抗ソマトスタチン（ＢＣＢＣ  Ａｂ１９８５、１／２００）、ウサギ抗ＧＦＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１／４００）、ウサギ抗Ｃペプチド１（ＢＣＢＣ  Ａｂ１０４４、１／５００）、ウサギ抗Ｃペプチド２（ＢＣＢＣ  Ａｂ１０４２、１／５００）であった。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  ４０５、４８８、６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、またはＴＲＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のいずれかが結合していた。切片は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰＥ共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１３７】
ヒト細胞画分の分離
ヒト膵島は、ジュネーブ大学細胞分離および移植センター（Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ）から入手した。わずかに改変した、以前に記載された方法（Ｄｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，１８３−１９４）に従い、島をアキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃にて１２分間インキュベートすることで単一細胞の懸濁液を調製した後、α細胞表面抗体（ＨＰａ１またはＨＰａ２）と、それに続く二次抗体によって染色した。膵α細胞の豊富な画分を得るため、ＦＡＣＳＡｒｉａ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＭｏｆｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）システムを用いてＨＰａ１／２陽性細胞を選別した。前方散乱、側方散乱およびパルス幅パラメータ、ならびにＤＡＰＩまたはＰＩを用いたネガティブ染色によって単一の島細胞にゲートをかけた。ＨＰａ１／２＋のゲートは、ＨＰａ１またはＨＰａ２抗体なしで染色した試料のプロファイルに基づいて確立した。選別した細胞は、サイトスピン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＢｏｓｃｏら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１０，５９，１２０２−１２１０）によって記載されるカニンガムチャンバーを用いて、染色および分析を行った。
【０１３８】
実施例１：β細胞の除去およびＰｄｘ１活性によって誘導される、大量のα細胞のインスリン産生細胞への変換
すべてのα細胞へＰｄｘ１の発現を促進することで、それらの再プログラミングが促進されるか否かを決定するため、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の投与によって、α細胞の誘導性と非可逆性の確認およびα細胞におけるＰｄｘ１の外来性発現が同時に可能となる、αＰｄｘ１ＯＥと名付けられた５倍トランスジェニックマウスを作製した（図１Ａ）。αＰｄｘ１ＯＥマウスは、グルカゴン‐ｒｔＴＡ（α細胞特異的なリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子発現システム）、ＴｅｔＯ‐ｃｒｅ（ＤＯＸ活性化ｒｔＴＡ依存性ｃｒｅ発現因子）、ＣＡＧＳＴＯＰｆｌｏｘｅｄ‐Ｐｄｘ１（ｃｒｅを介したＰｄｘ１発現因子）、ｒｏｓａ２６‐ＳＴＯＰｆｌｏｘｅｄ‐ＹＦＰ（ｃｒｅを介したＹＦＰレポーター）、ＲＩＰ‐ＤＴＲ（ＤＴを介したβ細胞キラー）導入遺伝子を有していた。対照マウスはＣＡＧ‐ＳＴＯＰｆｌｏｘｅｄ‐Ｐｄｘ１導入遺伝子を有していないため、α細胞の確認のみが可能であり、α細胞において外来性のＰｄｘ１は過剰発現されない（図１Ａ）。Ｐｄｘ１が、α細胞のインスリン産生細胞への再プログラミングを促進するか否かについて判定するため、２か月齢のマウスをＤＯＸによって２週間処置し（パルス）、ＤＯＸの終了後３か月目に安楽死させた（チェイス）（図２Ａ）。健常な成体マウスでは、α細胞にＰｄｘ１を持続的に発現させると、ｉ）グルカゴン産生の阻害（図２Ｂ〜Ｃ）およびｉｉ）成熟α細胞の非常に小さな画分（＜３％）におけるわずかなインスリン産生（図２Ｃ）がもたらされた。これらの結果は、ほとんどの成熟α細胞が、通常のβ細胞集団の条件において外来性のＰｄｘ１を発現させても、インスリンの産生に抵抗性であることを示している。
【０１３９】
次に、β細胞集団を減少させることによって、外来性にＰｄｘ１を発現させたα細胞がインスリンを産生することが可能な条件が表されるか否かについて試験した。以前に報告されたように（Ｔｈｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上記）、マウスにジフテリア毒素を注射してβ細胞をほとんど完全に除去し（ＤＴ、その後）、ＤＯＸを２週間投与して、両方のマウス群にＹＦＰによる非可逆的なα細胞の標識を誘導した後、αＰｄｘ１ＯＥのみにＰｄｘ１を外来性に発現させた（図１Ｂ）。すべてのマウスは、ＤＴ投与の直後に明らかな高血糖となり、血糖値が２５ｍＭを超えた場合には、糖尿病マウスを生存させるためにインスリンペレットを１週間に１回投与した。興味深いことに、αＰｄｘ１ＯＥマウスは、ＤＴ後に対照マウスと比較して血糖値が低い傾向を示し（図３Ａ〜Ｂ）、分析期間中に必要とされたインスリンペレットは著しく少なかった（ＤＴ後３．５か月、図３Ｃ）。加えて、β細胞集団の存在に変化がない場合、膵臓のインスリン量に変化はみられなかったが、ＤＴを介したβ細胞除去後のαＰｄｘ１ＯＥマウスではインスリン量が迅速に回復した（図３Ｄ）。明らかに、インスリン量とインスリンペレットの必要性の間には直接の負の相関が観察されたことから、膵臓のインスリン量が多いマウスでは、血糖値を２５ｍＭ未満に維持するために必要とされる外来性のインスリンは少ないことが示唆される。
【０１４０】
結局のところこれらの結果は、αＰｄｘ１ＯＥマウスの膵臓が、大量のβ細胞除去後に、対照と比較してさらに多くのインスリンを産生および分泌することを示唆している。組織的なレベルでは、ＤＴ後の大多数の島はインスリン産生細胞を失っており、対照ではほとんどの島がグルカゴンを発現するＹＦＰ標識α細胞から構成されている。一方で、ＤＴ後のαＰｄｘ１ＯＥマウスでは、α細胞を含む島はすべてインスリン＋細胞を含んでいたことから（図１Ｃ）、対照に比較してインスリン＋細胞の数が有意に増加していた（図１Ｄ）。β細胞の除去後、外来性のＰｄｘ１の発現によって、ほとんどのＹＦＰ＋α細胞ではインスリンの産生（図３Ｄ）とグルカゴンの阻害（図４）とが迅速に誘導された。Ｐｄｘ１を発現する成熟α細胞は、ＤＴ後に両方のインスリン遺伝子を発現したが、ソマトスタチンは発現しなかった（未提示）。ＤＴ後に、対照の島で観察された２５％の非常に少ないインスリン＋細胞は、ＹＦＰ陽性、すなわち再プログラミングされたα細胞であった。一方で、αＰｄｘ１ＯＥマウスの成熟α細胞に由来する細胞は、ほとんとすべてがインスリン産生細胞（９６％）であった（図１Ｅ）。ＤＴによる処置を行っていない対照マウスでは、インスリンを産生する成熟α細胞は存在しなかったが、成熟α細胞の小さな画分（２〜３％）のみが、ｉ）対照マウスにおける大量のβ細胞除去後、またはｉｉ）通常のβ細胞集団に外来性のＰｄｘ１を発現させた場合のいずれかにおいて、インスリンを産生するように再プログラミングされた（図１Ｆ）。一方で、αＰｄｘ１ＯＥにおいてｃｒｅを介した組換え（ＹＦＰ＋）が行われた成熟α細胞の約７０％が、外来性のＰｄｘ１発現と極度のβ細胞の除去との相乗作用によってインスリンを産生した（図１Ｆ）。
【０１４１】
ＤＴを介したβ細胞の除去前に外来性のＰｄｘ１を発現させた場合でも、インスリンの産生は効果的に誘発された（未提示）。重要なことは、外来性のインスリンによって少なくとも数週間治療された糖尿病マウスに外来性のＰｄｘ１を発現させると、α細胞におけるインスリンの産生が誘導可能だということである。後者の結果、および島中のインスリンおよびグルコースの循環濃度とは関係なく、成熟α細胞がインスリンを産生するように自立的に再プログラミングされる能力に一致して、外来性のＰｄｘ１発現は、ＤＴ非感受性（ＲＩＰ‐ＤＴＲ陰性）ＳＣＩＤマウスの腎被膜下に移植された、β細胞を除去した島由来のα細胞に、効率的なインスリン産生を誘導した（未提示）。まとめると、これらの知見によって、ほとんどすべてのβ細胞の除去（＞９９％）および外来性のＰｄｘ１発現後に、大多数のα細胞は、インスリンの産生を再プログラミング可能であることが示唆されるが、これは細胞の可塑性に関連した不均一なα細胞集団について意義を唱えるものである。
【０１４２】
並行して行った実験により、成熟α細胞におけるＮｋｘ６．１の誘導は、Ｐｄｘ１とは異なってグルカゴンの発現を遮断しないことが示された。しかしながらβ細胞の除去後に、Ｎｋｘ６．１ＯＥα細胞において、Ｎｋｘ６．１の活性は、インスリン産生とＰｄｘ１の誘導と同時にグルカゴンの遮断ももたらした（未提示）。
【０１４３】
同時に、これらの観察によって、β細胞を除去した島におけるＰｄｘ１またはＮｋｘ６．１の活性化によって示されるように、適切な条件下では、すべてのα細胞がインスリンを産生するように再プログラミングされる可塑性を有することが示唆される。
【０１４４】
実施例２：β細胞の部分的な除去は、成熟α細胞においてＰｄｘ１を介したインスリン産生を開始させるために十分である
部分的／準最適なβ細胞の除去後、Ｐｄｘ１が成熟α細胞のインスリン産生も開始させられるか否かを決定するため、対照およびαＰｄｘ１ＯＥマウスに高用量（２００ｍｇ／ｋｇ体重）のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を単回注射して、８０〜９０％のβ細胞を除去した。Ｐｄｘ１ＯＥマウスへのＳＴＺ注射後、高血糖状態になったマウスを、ＤＯＸによって２週間処置して、α細胞の標識とＰｄｘ１の発現とを誘導した（図５Ａ）。ＳＴＺ注射後１か月目に、両マウス群の島にはインスリン産生β細胞の著しい画分がなお観察されたことから、β細胞の除去は必ずしもＳＴＺを介したβ細胞除去によるものではないことが確認された。ＳＴＺによって処置した対照マウスでは、ほとんどすべてのＹＦＰ標識α細胞がインスリン陰性であった。一方で、αＰｄｘ１ＯＥの島において外来性にＰｄｘ１を発現するほとんどのα細胞（＞８０％）が、ＳＴＺ処置後にインスリンを産生した（図５Ｃ）。このことは、ＳＴＺを介したβ細胞の除去もまた、完全でないにもかかわらず、α細胞のインスリン産生を刺激する／その傾向を与えることを示唆している。
【０１４５】
次に、β細胞集団が約５０％減少した際、外来性のＰｄｘ１の発現が、α細胞にインスリンの産生を開始させるか否かについて試験した。ヘテロ接合性ＲＩＰ‐ＤＴＲの雌では、Ｘ連鎖性のランダムな不活化が、β細胞集団の半分にＤＴＲ発現を限定させることから、ＤＴ投与後に５０％のβ細胞の除去が可能となる（図５Ｂ）。したがって、ヘテロ接合性ＲＩＰ‐ＤＴＲ対照とαＰｄｘ１ＯＥの雌とをＤＴによって処置した後、ＤＯＸによって２週間処置した。注目すべきことに、ヘテロ接合性ＲＩＰ‐ＤＴＲの雌の血糖値はＤＴ後でも正常であったため、５０％のβ細胞集団は、血中グルコースの恒常性を確実にするために十分であったことが示唆される。ＤＴ後１か月目に、β細胞集団を５０％保持する対照の島において、グルカゴンを発現するＹＦＰ＋α細胞はインスリン陰性であった。驚くべきことに、５０％のβ細胞を除去した後の、血糖値が正常なαＰｄｘ１ＯＥの雌の島において、ＹＦＰ＋α細胞の約８％がインスリン産生細胞であった（図５Ｄ）。しかしながら、外来性のＰｄｘ１の発現によるα細胞のインスリン産生細胞への変換は、インスリンの需要が増大した状態である妊娠中には観察されなかった（データ未提示）。
【０１４６】
結論として、これらの観察はすべて、成熟α細胞のインスリン産生細胞への変換が少なくとも２つの現象を必要とすることを示している。すなわちＤＴもしくはＳＴＺを介した局所的なβ細胞の完全または部分的な除去が、成熟α細胞をインスリン産生細胞とするためには必須であると考えられる。この「プライミング工程」によって、すべてのα細胞がインスリンを発現するように準備される。すべての「プライムされた」α細胞は、外来性のＰｄｘ１の転写活性によって、インスリンを産生するようになる（「開始工程」）。
【０１４７】
重要なことに、ＳＴＺを介したβ細胞の除去後、α細胞にインスリンの発現を開始させるｐｄｘ１の能力は、ｉ）ＤＴ後のα細胞のプライミングはバイアスではなく、またＲＩＰ‐ＤＴＲマウスモデルに限定されたものでもないこと、およびｉｉ）インスリンの産生は、ＤＴ後のアポトーシスまたはＳＴＺ後の壊死のいずれかによるβ細胞死の機構にかかわらず、効果的に誘導可能であること、を強く示唆するものである。
【０１４８】
実施例３：島内のインスリンの欠乏によって、インスリン産生に対するα細胞のプライミングが開始される
これらの結果をまとめると、β細胞を除去することで、α細胞はインスリンを産生するように必ずプライムされると考えられる。しかしながら、α細胞のプライミングが物理的なβ細胞の除去によるものであるか、またはβ細胞により分泌される局所的な単数または複数の因子の欠乏によるものであるか、またはその両方であるかについては明らかでない。
【０１４９】
次に、β細胞の大量除去を含む局所的な島内のインスリン欠乏が（全身性のインスリン濃度ではなく）、Ｐｄｘ１を発現するα細胞にインスリンの産生を開始させるプライミングシグナルとなり得るか否かについて試験した。α細胞の変換は健常な正常血糖値のマウスでも起こることから、全身性のインスリンは観察されるα細胞の可塑性を引き起こすものではない。ほとんどすべてのβ細胞を除去した後の遺伝子発現の分析によって、β細胞を除去した島における、インスリン‐シグナル伝達カスケードの鍵となる遺伝子が迅速に減少することが明らかとなった。実際に、ＤＴ後７日目の島抽出物ならびにＦＡＣＳによって選別したα細胞における、インスリンのｍＲＮＡレベル、およびインスリン経路のさらに下流にある要素、例えばＩＲＳ１、ＰＩ３Ｋ、ＡｋｔおよびＰＫＡは、有意に減少していた（図６）。一方で、Ａｋｔによって負の制御を受けるＦｏｘＯ１は、ＤＴ後に分離した島およびα細胞の両方において増加していた。これらの結果により、β細胞の除去後に、α細胞におけるインスリンのシグナル伝達は鈍くなることが示される（図６、表）。
【０１５０】
β細胞を除去しない状態でインスリンを欠乏させた場合に、α細胞のインスリン産生がプライムされるか否かを調べるため、α細胞がＰｄｘ１を発現している（αＰｄｘ１ＯＥ）成体マウスを、インスリン受容体アンタゴニストであるＳ９６１（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）によって処置し、末梢組織および膵島におけるインスリンのシグナル伝達を鈍らせた（図７Ａ）。
【０１５１】
Ｓ９６１をｉｎ  ｖｉｖｏ投与した際の末梢作用によって高血糖が誘導された（未提示）。正常なβ細胞集団を有する健常成体マウスを５日間処置することによって、Ｐｄｘ１を発現するα細胞の１８％にインスリンの産生が誘導された（図７Ｂ）。ＩＧＦ‐１Ｒアンタゴニストであるピクロポドフィリン（ＰＰＰ）ではなく、ＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンのｉｎ  ｖｉｖｏ投与によっても、Ｐｄｘ１を発現するα細胞のインスリン産生が同様の効率で引き起こされた（図７Ｂ）。次に、成熟α細胞のインスリン受容体を条件的に不活化することで、インスリンシグナル伝達を絶対的にα細胞のレベルで局所的に阻害することによって、これらの細胞がインスリンを産生するようにプライムされるか否かについて評価した。１か月齢のマウスへのＤＯＸの投与によって、インスリン受容体の不活化、ＹＦＰα細胞の確認および外来性のＰｄｘ１発現が誘導された。
【０１５２】
結論としてまとめると、上記の観察によれば、所定の島に存在するβ細胞からのインスリンの局所的な恒常的放出によって、α細胞がインスリンを産生するようにプライミングされること、すなわちα細胞の変換が阻止されることから、インスリンはα細胞の可塑性に対する傍分泌の抑制因子として作用するというモデルが支持される。
【０１５３】
実施例４：α細胞におけるインスリン／ＩＧＦ１シグナル伝達の欠如によって、これらの細胞はインスリンを発現するようになる
β細胞集団がなお存在する状態で、α細胞特異的なインスリン／ＩＧＦ１の欠乏が、インスリンを産生するようにα細胞をプライムするか否かについて決定するため、「α−ｄＫＯ」および「α−ｄＫＯ‐Ｐｄｘ１ＯＥ」と命名されたトランスジェニックマウスを作製し、Ｐｄｘ１を発現するかまたは発現しない成熟α細胞においてインスリンおよびＩＧＦ１受容体（ＩＲおよびＩＧＦ１Ｒ）を同時に不活化させた（図８Ａ）。１か月齢のマウスに３週間ＤＯＸを投与して、α細胞特異的なＩＲ／ＩＧＦ１Ｒの不活化、Ｐｄｘ１の発現およびＹＦＰによる標識を誘導した（図８Ｂ）。
【０１５４】
２週間後、αｄＫＯマウスのα細胞はグルカゴン＋／インスリン−であったが、未変化のβ細胞集団も有するαｄＫＯ‐Ｐｄｘ１ＯＥ動物の、Ｐｄｘ１を発現するα細胞の３分の１は、グルカゴン−／インスリン＋であった。
【０１５５】
これらの結果から、α細胞におけるインスリン／ＩＧＦ１シグナル伝達の欠如が、α細胞にインスリンを発現させることが示される。
【０１５６】
実施例５：ヒトα細胞は、インスリンを産生するように再プログラミング可能である
ヒトα細胞が、インスリンの産生を可能にする可塑性を示すか否かについても、さらに決定を行った。ヒト１型糖尿病および２型糖尿病患者由来の島について検討を行うと、βおよびα細胞に特徴的な分泌顆粒を同時に含む細胞が観察された。糖尿病患者に二ホルモン性（ｂｉ−ｈｏｒｍｏｎａｌ）細胞が多くみられることは、β細胞の欠如およびインスリン抵抗性が、α細胞にインスリン遺伝子を発現させる条件であるという考えを支持するものである。
【０１５７】
このように、ヒトαおよび非α細胞画分は、糖尿病ではないドナーからフローサイトメトリーによって選別した。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００８（Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６２７−６３２）に記載されるように、２つの細胞群は、ＹＦＰまたはＹＦＰおよびＰｄｘ１をコードするアデノウイルスベクターのいずれかによって別々に形質導入した。島および島細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持する際に不安定となるため、形質導入した細胞は、Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ，２００７（Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７，１１８−１３０）に記載されるようにＮＳＧマウスの虹彩に移植した。宿主マウスは、免疫蛍光分析のため３週間後に安楽死させた（図９Ａ）。インスリンおよびグルカゴンを共に発現している細胞は、非α細胞分画（図９Ｂ）、またはＰｄｘ１の非存在下で系列を確認したα細胞（図９Ｃ）には観察されなかった。一方で、α細胞にＰｄｘ１の発現が誘導された場合、二ホルモン性（ｂｉｈｏｒｍｏｎａｌ）の再プログラミングされたα細胞の数が有意に増加した（図９Ｃ）。
【０１５８】
これらの結果により、マウスα細胞と同様に、糖尿病ではないドナー由来のヒトα細胞は、高血糖状態とは関係なく、膵臓外の位置で、血糖値が正常であるマウスのｉｎ  ｖｉｖｏで再プログラミングされてインスリンを産生することが明らかになった。
【０１５９】
実施例６：糖尿病マウスにおけるヒトα細胞の移植
ヒト島または精製された島細胞は、糖尿病（ＤＴまたはＳＴＺによる）もしくはインスリン抵抗性（インスリン受容体アンタゴニストであるＳ９６１による処置）とされたＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲマウスへ、または肥満のＮＳＧ−ｄｂ／ｄｂマウスへ移入される。β細胞を含まないヒト島を模倣するため、β細胞を除去した（島細胞の分離後、ＦＡＣＳによる選別およびβ細胞画分を含まない再集合／被包を行った）ヒト島も移植される。
【０１６０】
ヒト島試料は、ＮＳＧ宿主の腎被膜下または眼の前房に移植する（利用可能な島または島の再集合細胞の量に依存して）。
【０１６１】
特にβ細胞を含まないヒト島を模倣するために、再集合させた島をβ細胞を含まないようにして再構築した後、アルギン酸塩内に被包し、ＮＳＧ宿主の腹腔内に移入した。移植前に、変換を促進するため、ＧＦＰ（分析時の細胞系列の確認のため）およびＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１またはその他の再プログラミング因子を発現するアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターによってヒトα細胞に形質導入を行った。
【０１６２】
移植したマウスには、ＴＮＦα（炎症性のストレスをかけるため）、エピジェネティック修飾因子（クロマチンの変化を通して細胞の可塑性を促進するため）、またはαもしくはδ細胞への変換を促進するシグナル伝達経路の有効な修飾因子のような、様々な化合物をさらに投与した。
【０１６３】
マウスは、代謝パラメータを用いてモニターした。すなわち適当な時期に高血糖の経過観察、耐糖能試験（ＧＴＴ）およびヒト循環Ｃペプチドを測定して、高血糖からの回復およびグルコースの刺激によるヒトインスリン分泌を評価した。
【０１６４】
マウスは、移植後１または３か月目に分析のため安楽死させ、抗グルカゴン、抗ソマトスタチンおよび抗ＧＦＰ（ヒト細胞の確認）抗体による染色と組み合わせた、特異的な抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光法によって、可能性のある島細胞の可塑性現象の中でも、αおよびδ細胞の再プログラミングについて決定した。機能的なβ細胞の成熟度マーカー（ＭａｆＡ、Ｎｋｘ６．１、Ｕｃｎ３、Ｇｌｕｔ２など）に対する特異的抗体を用いて、インスリン産生細胞をさらに特徴付けた。
【０１６５】
アルギン酸塩を用いて被包した島／島細胞の回収によって、それらのＲＮＡ分析（ｑＰＣＲ）および／または単一細胞遺伝子のプロファイリング（ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が可能になる。エピジェネティック試験（ＤＮＡのメチル化）は、抽出したゲノムＤＮＡの量が十分であったときに行った。
【０１６６】
要約すると、これらの実験データによって、α細胞がインスリンを適切に感知できない場合に、α細胞はインスリンを産生するようになることを示している。末梢組織（脂肪、肝臓、筋肉）について主に記載されているが、インスリン抵抗性は、βまたはα細胞の機能障害に伴った病的状態において、島内にも発生する。インスリンの欠乏および抵抗性は、１型および２型糖尿病の両方に特徴的であることから、糖尿病患者のα細胞は、インスリンを産生するようにプライムされ得る。ヒトα細胞を特徴付ける二価の活性化／抑制クロマチンは、糖尿病の状態でさらに現れる、高い可塑性の可能性を示すこれらのα細胞に適合するものである。このような予測できない細胞変換の促進は、α細胞の再プログラミングによって新規なインスリン分泌細胞を作り出すことを目的とした治療戦略において開発され得る。特に、２型糖尿病患者におけるインスリンアンタゴニスト活性の、直観に反した一過性の誘導は、α細胞の変換を促進することによって、β細胞集団を補充することに役立つであろう。グルカゴン発現の消滅を包含する、α細胞からβ細胞への変換もまた、α細胞の欠乏による欠陥なしに、グルカゴン分泌による肝グルコースの動員を制限することで糖尿病に有益となる。
【０１６７】
配列表
配列番号１  マウスＰｄｘ−１タンパク質配列
MNSEEQYYAA TQLYKDPCAF QRGPVPEFSA NPPACLYMGR QPPPPPPPQF TSSLGSLEQG 
SPPDISPYEV PPLASDDPAG AHLHHHLPAQ LGLAHPPPGP FPNGTEPGGL EEPNRVQLPF 
PWMKSTKAHA WKGQWAGGAY TAEPEENKRT RTAYTRAQLL ELEKEFLFNK YISRPRRVEL 
AVMLNLTERH IKIWFQNRRM KWKKEEDKKR SSGTPSGGGG GEEPEQDCAV TSGEELLAVP 
PLPPPGGAVP PGVPAAVREG LLPSGLSVSP QPSSIAPLRP QEPR 
配列番号２  ヒトＰｄｘ−１タンパク質配列
MNGEEQYYAA TQLYKDPCAF QRGPAPEFSA SPPACLYMGR QPPPPPPHPF PGALGALEQG 
SPPDISPYEV PPLADDPAVA HLHHHLPAQL ALPHPPAGPF PEGAEPGVLE EPNRVQLPFP 
WMKSTKAHAW KGQWAGGAYA AEPEENKRTR TAYTRAQLLE LEKEFLFNKY ISRPRRVELA 
VMLNLTERHI KIWFQNRRMK WKKEEDKKRG GGTAVGGGGV AEPEQDCAVT SGEELLALPP 
PPPPGGAVPP AAPVAAREGR LPPGLSASPQ PSSVAPRRPQ EPR 
配列番号３  マウスＮｋｘ６．１タンパク質配列
MLAVGAMEGP RQSAFLLSSP PLAALHSMAE MKTPLYPAAY PPLPTGPPSS SSSSSSSSSP 
SPPLGSHNPG GLKPPAAGGL SSLGSPPQQL SAATPHGIND ILSRPSMPVA SGAALPSASP 
SGSSSSSSSS ASATSASAAA AAAAAAAAAA ASSPAGLLAG LPRFSSLSPP PPPPGLYFSP 
SAAAVAAVGR YPKPLAELPG RTPIFWPGVM QSPPWRDARL ACTPHQGSIL LDKDGKRKHT 
RPTFSGQQIF ALEKTFEQTK YLAGPERARL AYSLGMTESQ VKVWFQNRRT KWRKKHAAEM 
ATAKKKQDSE TERLKGTSEN EEDDDDYNKP LDPNSDDEKI TQLLKKHKSS GGSLLLHASE 
AEGSS 
配列番号４  ヒトＮｋｘ６．１タンパク質配列
MLAVGAMEGT RQSAFLLSSP PLAALHSMAE MKTPLYPAAY PPLPAGPPSS SSSSSSSSSP 
SPPLGTHNPG GLKPPATGGL SSLGSPPQQL SAATPHGIND ILSRPSMPVA SGAALPSASP 
SGSSSSSSSS ASASSASAAA AAAAAAAAAA SSPAGLLAGL PRFSSLSPPP PPPGLYFSPS 
AAAVAAVGRY PKPLAELPGR TPIFWPGVMQ SPPWRDARLA CTPHQGSILL DKDGKRKHTR 
PTFSGQQIFA LEKTFEQTKY LAGPERARLA YSLGMTESQV KVWFQNRRTK WRKKHAAEMA 
TAKKKQDSET ERLKGASENE EEDDDYNKPL DPNSDDEKIT QLLKKHKSSS GGGGGLLLHA 
SEPESSS 
配列番号５  マウスＮｋｘ２．２タンパク質配列
MSLTNTKTGF SVKDILDLPD TNDEDGSVAE GPEEESEGPE PAKRAGPLGQ GALDAVQSLP 
LKSPFYDSSD NPYTRWLAST EGLQYSLHGL AASAPPQDSS SKSPEPSADE SPDNDKETQG 
GGGDAGKKRK RRVLFSKAQT YELERRFRQQ RYLSAPEREH LASLIRLTPT QVKIWFQNHR 
YKMKRARAEK GMEVTPLPSP RRVAVPVLVR DGKPCHALKA QDLAAATFQA GIPFSAYSAQ 
SLQHMQYNAQ YSSASTPQYP TAHPLVQAQQ WTW 
配列番号６  ヒトＮｋｘ２．２タンパク質配列
MSLTNTKTGF SVKDILDLPD TNDEEGSVAE GPEEENEGPE PAKRAGPLGQ GALDAVQSLP 
LKNPFYDSSD NPYTRWLAST EGLQYSLHGL AAGAPPQDSS SKSPEPSADE SPDNDKETPG 
GGGDAGKKRK RRVLFSKAQT YELERRFRQQ RYLSAPEREH LASLIRLTPT QVKIWFQNHR 
YKMKRARAEK GMEVTPLPSP RRVAVPVLVR DGKPCHALKA QDLAAATFQA GIPFSAYSAQ 
SLQHMQYNAQ YSSASTPQYP TAHPLVQAQQ WTW 
配列番号７  マウスＰａｘ４タンパク質配列
MQQDGLSSVN QLGGLFVNGR PLPLDTRQQI VQLAIRGMRP CDISRSLKVS NGCVSKILGR 
YYRTGVLEPK CIGGSKPRLA TPAVVARIAQ LKDEYPALFA WEIQHQLCTE GLCTQDKAPS 
VSSINRVLRA LQEDQSLHWT QLRSPAVLAP VLPSPHSNCG APRGPHPGTS HRNRTIFSPG 
QAEALEKEFQ RGQYPDSVAR GKLAAATSLP EDTVRVWFSN RRAKWRRQEK LKWEAQLPGA 
SQDLTVPKNS PGIISAQQSP GSVPSAALPV LEPLSPSFCQ LCCGTAPGRC SSDTSSQAYL 
QPYWDCQSLL PVASSSYVEF AWPCLTTHPV HHLIGGPGQV PSTHCSNWP 
配列番号８  ヒトＰａｘ４タンパク質配列
MHQDGISSMN QLGGLFVNGR PLPLDTRQQI VRLAVSGMRP CDISRILKVS NGCVSKILGR 
YYRTGVLEPK GIGGSKPRLA TPPVVARIAQ LKGECPALFA WEIQRQLCAE GLCTQDKTPS 
VSSINRVLRA LQEDQGLPCT RLRSPAVLAP AVLTPHSGSE TPRGTHPGTG HRNRTIFSPS 
QAEALEKEFQ RGQYPDSVAR GKLATATSLP EDTVRVWFSN RRAKWRRQEK LKWEMQLPGA 
SQGLTVPRVA PGIISAQQSP GSVPTAALPA LEPLGPSCYQ LCWATAPERC LSDTPPKACL 
KPCWDCGSFL LPVIAPSCVD VAWPCLDASL AHHLIGGAGK ATPTHFSHWP 
配列番号９  マウスＰａｘ６タンパク質配列
MQNSHSGVNQ LGGVFVNGRP LPDSTRQKIV ELAHSGARPC DISRILQVSN GCVSKILGRY 
YETGSIRPRA IGGSKPRVAT PEVVSKIAQY KRECPSIFAW EIRDRLLSEG VCTNDNIPSV 
SSINRVLRNL ASEKQQMGAD GMYDKLRMLN GQTGSWGTRP GWYPGTSVPG QPTQDGCQQQ 
EGGGENTNSI SSNGEDSDEA QMRLQLKRKL QRNRTSFTQE QIEALEKEFE RTHYPDVFAR 
ERLAAKIDLP EARIQVWFSN RRAKWRREEK LRNQRRQASN TPSHIPISSS FSTSVYQPIP 
QPTTPVSSFT SGSMLGRTDT ALTNTYSALP PMPSFTMANN LPMQPPVPSQ TSSYSCMLPT 
SPSVNGRSYD TYTPPHMQTH MNSQPMGTSG TTSTGLISPG VSVPVQVPGS EPDMSQYWPR
LQ 
配列番号１０  ヒトＰａｘ６タンパク質配列
MQNSHSGVNQ LGGVFVNGRP LPDSTRQKIV ELAHSGARPC DISRILQVSN GCVSKILGRY 
YETGSIRPRA IGGSKPRVAT PEVVSKIAQY KRECPSIFAW EIRDRLLSEG VCTNDNIPSV 
SSINRVLRNL ASEKQQMGAD GMYDKLRMLN GQTGSWGTRP GWYPGTSVPG QPTQDGCQQQ 
EGGGENTNSI SSNGEDSDEA QMRLQLKRKL QRNRTSFTQE QIEALEKEFE RTHYPDVFAR 
ERLAAKIDLP EARIQVWFSN RRAKWRREEK LRNQRRQASN TPSHIPISSS FSTSVYQPIP 
QPTTPVSSFT SGSMLGRTDT ALTNTYSALP PMPSFTMANN LPMQPPVPSQ TSSYSCMLPT 
SPSVNGRSYD TYTPPHMQTH MNSQPMGTSG TTSTGLISPG VSVPVQVPGS EPDMSQYWPR
LQ 
配列番号１１  マウスＭａｆＡタンパク質配列
MAAELAMGAE LPSSPLAIEY VNDFDLMKFE VKKEPPEAER FCHRLPPGSL SSTPLSTPCS 
SVPSSPSFCA PSPGTGGGAG GGGSAAQAGG APGPPSGGPG TVGGASGKAV LEDLYWMSGY 
QHHLNPEALN LTPEDAVEAL IGSGHHGAHH GAHHPAAAAA YEAFRGQSFA GGGGADDMGA 
GHHHGAHHTA HHHHSAHHHH HHHHHHGGSG HHGGGAGHGG GGAGHHVRLE ERFSDDQLVS 
MSVRELNRQL RGFSKEEVIR LKQKRRTLKN RGYAQSCRFK RVQQRHILES EKCQLQSQVE 
QLKLEVGRLA KERDLYKEKY EKLAGRGGPG GAGGAGFPRE PSPAQAGPGA AKGAPDFFL 
配列番号１２  ヒトＭａｆＡタンパク質配列
MAAELAMGAE LPSSPLAIEY VNDFDLMKFE VKKEPPEAER FCHRLPPGSL SSTPLSTPCS 
SVPSSPSFCA PSPGTGGGGG AGGGGGSSQA GGAPGPPSGG PGAVGGTSGK PALEDLYWMS 
GYQHHLNPEA LNLTPEDAVE ALIGSGHHGA HHGAHHPAAA AAYEAFRGPG FAGGGGADDM 
GAGHHHGAHH AAHHHHAAHH HHHHHHHHGG AGHGGGAGHH VRLEERFSDD QLVSMSVREL 
NRQLRGFSKE EVIRLKQKRR TLKNRGYAQS CRFKRVQQRH ILESEKCQLQ SQVEQLKLEV 
GRLAKERDLY KEKYEKLAGR GGPGSAGGAG FPREPSPPQA GPGGAKGTAD FFL 
配列番号１３  マウスＮｇｎ３タンパク質配列
MAPHPLDALT IQVSPETQQP FPGASDHEVL SSNSTPPSPT LIPRDCSEAE VGDCRGTSRK 
LRARRGGRNR PKSELALSKQ RRSRRKKAND RERNRMHNLN SALDALRGVL PTFPDDAKLT 
KIETLRFAHN YIWALTQTLR IADHSFYGPE PPVPCGELGS PGGGSNGDWG SIYSPVSQAG 
NLSPTASLEE FPGLQVPSSP SYLLPGALVF SDFL 
配列番号１４  ヒトＮｇｎ３タンパク質配列
MTPQPSGAPT VQVTRETERS FPRASEDEVT CPTSAPPSPT RTRGNCAEAE EGGCRGAPRK 
LRARRGGRSR PKSELALSKQ RRSRRKKAND RERNRMHNLN SALDALRGVL PTFPDDAKLT 
KIETLRFAHN YIWALTQTLR IADHSLYALE PPAPHCGELG SPGGSPGDWG SLYSPVSQAG 
SLSPAASLEE RPGLLGATFS ACLSPGSLAF SDFL 
配列番号１５  マウスＮｅｕｒｏＤ１タンパク質配列
MTKSYSESGL MGEPQPQGPP SWTDECLSSQ DEEHEADKKE DELEAMNAEE DSLRNGGEEE 
EEDEDLEEEE EEEEEEEDQK PKRRGPKKKK MTKARLERFK LRRMKANARE RNRMHGLNAA 
LDNLRKVVPC YSKTQKLSKI ETLRLAKNYI WALSEILRSG KSPDLVSFVQ TLCKGLSQPT 
TNLVAGCLQL NPRTFLPEQN PDMPPHLPTA SASFPVHPYS YQSPGLPSPP YGTMDSSHVF 
HVKPPPHAYS AALEPFFESP LTDCTSPSFD GPLSPPLSIN GNFSFKHEPS AEFEKNYAFT 
MHYPAATLAG PQSHGSIFSS GAAAPRCEIP IDNIMSFDSH SHHERVMSAQ LNAIFHD 
配列番号１６  ヒトＮｅｕｒｏＤ１タンパク質配列
MTKSYSESGL MGEPQPQGPP SWTDECLSSQ DEEHEADKKE DDLETMNAEE DSLRNGGEEE 
DEDEDLEEEE EEEEEDDDQK PKRRGPKKKK MTKARLERFK LRRMKANARE RNRMHGLNAA 
LDNLRKVVPC YSKTQKLSKI ETLRLAKNYI WALSEILRSG KSPDLVSFVQ TLCKGLSQPT 
TNLVAGCLQL NPRTFLPEQN QDMPPHLPTA SASFPVHPYS YQSPGLPSPP YGTMDSSHVF 
HVKPPPHAYS AALEPFFESP LTDCTSPSFD GPLSPPLSIN GNFSFKHEPS AEFEKNYAFT 
MHYPAATLAG AQSHGSIFSG TAAPRCEIPI DNIMSFDSHS HHERVMSAQL NAIFHD 
配列番号１７  インスリン受容体アンタゴニストＳ６６１アミノ酸配列
GSLDESFYDW FERQLGGGSG GSSLEEEWAQ IQCEVWGRGC PSX
Ｘはアミド基により置換されたＣ末端カルボン酸基を有するＴｙｒであり、位置３３および４０の２つのＣｙｓはジスルフィド結合によって連結される。
配列番号１８  インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１アミノ酸配列
GSLDESFYDW FERQLGGGSG GSSLEEEWAQ IQCEVWGRGC PSY
位置３３および４０の２つのＣｙｓはジスルフィド結合によって連結される。
【図１】
2016517404.tif 000006
【図２】
2016517404.tif 000007
【図３】
2016517404.tif 000008
【図４】
2016517404.tif 000009
【図５】
2016517404.tif 000010
【図６】
2016517404.tif 000011
【図７】
2016517404.tif 000012
【図８】
2016517404.tif 000013
【図９】
2016517404.tif 000014
【配列表】
2016517404000001.app
【国際調査報告】
2016517404.tif 000015
2016517404.tif 000016
2016517404.tif 000017
2016517404.tif 000018