(57)【要約】  本発明は、上皮間葉移行(EMT)に関連した疾患、特に線維症及び癌の治療において有用な物質を同定する方法及びアッセイに関する。本発明は、ポリペプチド及び核酸標的物、これらの標的物を基にしたsiRNA配列及び標的物に対する抗体を提供する。本発明は更に、上皮間葉移行に関連した疾患、特に線維症及び癌の治療における使用のための、標的物を基にしたsiRNA配列及び標的物に対する抗体を含有する医薬組成物に関する。本発明は更に、上皮間葉移行を阻害するインビトロ方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を決定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程；並びに
e)上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
【請求項２】
上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；並びに、
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程；並びに
e) 上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。 
【請求項３】
上皮間葉移行に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する上皮細胞集団と接触させる工程；
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；
c)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程；並びに
d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つ上皮間葉移行を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
【請求項４】
上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)EMTに関連した特性を測定する工程；並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
【請求項５】
上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させるか、又は配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と接触させる工程；
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程；
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、EMTの阻害又は減少を生じるか又はこれに関連している工程：を含む、前記方法。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が、線維化疾患である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、癌である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、検出可能な標識と結合されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、インビトロ無細胞調製物中に存在する、請求項1、2、4、又は5記載の方法。
【請求項１２】
前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、細胞内に存在する、請求項1、2、4又は5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、該ポリペプチドを天然に発現する、請求項3又は12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、該ポリペプチドを発現するように操作されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項12〜14記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、上皮細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、ヒト上皮細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト気管支上皮細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記特性が、上皮間葉移行のマーカー(EMTマーカー)の放出及び／又は発現の阻害である、請求項1〜4記載の方法。
【請求項２０】
前記特性が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、細胞フィブロネクチン(FN)、E-カドヘリン、可溶性フィブロネクチン、及びビメンチンからなる群から選択されるマーカーの発現及び／又は放出である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記マーカーが、MMP10、フィブロネクチン、E-カドヘリン及び可溶性フィブロネクチンからなる群から選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、上皮間葉移行を誘導する因子(EMT誘導性因子)により誘発されている、請求項16〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記EMT誘導性因子が、TGFβ、IL-1β、TNFα、及び細菌チャレンジからなる群から選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記因子が、TGFβ、IL-1β及び無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザの組合せを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記被験化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
【請求項２６】
前記被験化合物が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
哺乳類細胞中のベクターが、該化合物を発現する、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記アンチセンスポリヌクレオチド、該siRNA又は該shRNAが、センス鎖に相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで該センス鎖が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の17-25の連続ヌクレオチドから選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
前記siRNA又はshRNAが、該センス鎖を更に含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が、抗体又は抗体断片である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
上皮間葉移行に関連した疾患の治療に使用するための、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが、モノクローナル抗体である、請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記アンタゴニストが、単鎖抗体である、請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３５】
上皮間葉移行に関連した疾患の治療に使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含有する医薬組成物であって、ここで該物質が、配列番号:4-5、1-3及び6-17からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、前記医薬組成物。
【請求項３６】
請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物であって、ここで該疾患が、線維化疾患又は癌である、前記医薬組成物。
【請求項３７】
前記疾患が、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病から選択される、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項３８】
前記疾患が、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、肥満細胞腫、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌及び子宮平滑筋肉腫から選択される、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項３９】
前記疾患が、癌転移である、請求項32〜35のいずれか一項記載の上皮間葉移行に関連した疾患の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項４０】
上皮間葉移行を阻害するインビトロ方法であって：
上皮細胞の集団を、配列番号:21-22、18-20及び23-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性及び／又は発現のインヒビターと接触させる工程を含む、前記インビトロ方法。
【請求項４１】
前記インヒビターが、抗体である、請求項40記載の方法。 
【請求項４２】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
前記インヒビターが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択され、ここで該インヒビターが、該ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の技術分野)
本発明は、分子生物学及び生化学の分野である。本発明は、線維化疾患の治療に有用な物質、特に上皮間葉移行(EMT)を阻害する物質を同定する方法に関する。EMTの阻害は、EMTが重要な役割を果たす疾患の予防及び／又は治療において有用である。特に本発明は、線維化疾患及び癌の予防及び／又は治療において使用するための物質を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮間葉移行(EMT)は、上皮細胞が間葉細胞へ転換する間のプロセスである。一般に、そのようなプロセスは、可逆的であり、且つ細胞接着及び細胞運動性により特徴づけられる。このプロセスは、通常E-カドヘリン発現の抑制を伴い、且つ生成された間葉細胞は、新たな遊走性、侵襲性及び線維形成性の特性により特徴づけられる。EMTは、重要な生物学的プロセスであり、胚形成及び通常の創傷治癒において重要な役割を果たす(Hayの文献、2005)。EMTは組織修復に寄与するが、これはまた様々な機序を通じて、臓器線維症を有害に引き起こし、且つ癌腫の進行を促進することもあり得る。EMTは、癌の進行及び転移において役割を果たすことが示された(Thieryの文献、2002)。EMTはまた、肺を含む様々な臓器における、退行性線維障害の病理に寄与することも確定されている(Wilsonの文献、2009；Lekkerkerkerらの文献、2012)。
【０００３】
肝臓の肝細胞及び胆管上皮細胞(Firrincieliらの文献、2010；Choiらの文献、2009)並びに肺の上皮細胞は、EMTを介した線維症に寄与し得る。これらの上皮細胞は、それらの上皮表現型を喪失し、線維芽細胞-様特性を獲得し、且つ低下した細胞接着及び増加した運動性を示す。このプロセスの間に、上皮細胞は、それらの細胞極性を喪失し、上皮細胞-細胞間接着及び細胞-マトリクス間接着の接触のリモデリングを受ける。接着分子の減少は、細胞が上皮層から剥離し、且つ損傷部位又は炎症部位へと移動することを可能にし、これらはそこでそれらの前線維化作用を発揮する。E-カドヘリン及び一部のサイトケラチンなどの極性化された上皮細胞のEMT代表的マーカーが喪失される間に、他方でビメンチン及びN-カドヘリンなどの間葉細胞のマーカー、又は例えばα-平滑筋アクチン(α-SMA)などの筋線維芽細胞のマーカーが獲得される(Zavadilらの文献、2005)。いくつかの研究は、EMTは、TGFβへの曝露時に、ヒト肺上皮細胞株及び初代気管支上皮細胞において起こり得ることを明らかにしている(Camaraの文献、2010；Kasaiの文献、2005)。このプロセスの正確な機序は、依然研究の必要性がある。TGFβは、損傷部位に誘引されるマクロファージを含む活性化された炎症細胞により主に引き出され、且つTGFβ 2型受容体(TGFBR2)に結合し、これは次にTGFβ 1型受容体(TGFBR1)と複合体を形成することがわかっている。この複合体は、Smad2及びSmad3との、引き続きSmad4との複合体が活性化されるシグナル伝達カスケードを始動する。Smadの活性化された複合体は、核へと移行され、遺伝子転写を誘導する。TGFβはEMTに必須であるように見えるが、他の因子がこのプロセスに影響し得る。IL-1β及びTNFαなどの炎症性サイトカイン(Borthwickらの文献、2010；Camaraらの文献、2010)、並びに細菌(Borthwickらの文献、2011)及びウイルス(Shimamuraらの文献、2010)も、サイトカインそれら自身がEMT誘導能を有さなくとも、EMTのTGFβ-誘導したマーカーを増強することが示された。このプロセスの正確な機序は、依然更に研究される必要性がある。
【０００４】
EMTの調節のいくつかの例は、リポカリン2(WO2006/078717)又はGAPR-1タンパク質のレギュレーター(WO2007/038264)を利用する。WO2007/069839は、EMT阻害のための物質の調製に関するエリスロポエチン(EPO)の使用を開示している。これは更に、EPOを使用する線維症の予防及び治療の方法を説明している。
【０００５】
US2006/234911は、EMTを逆行することが可能であるキナーゼインヒビターを含有する医薬組成物を開示している。選択された開示されたインヒビターは、TGFβ、RhoA又はp38 MAPキナーゼのインヒビターである。同様に、本発明は、線維症又は癌に罹患している患者においてEMTを逆行する方法を説明する。
【０００６】
既知の標的及びこれらの標的のインヒビターは、依然多くの挑戦を有する。例えば、TGFβにより調節される多くのプロセスが存在し、且つTGFβに対するインヒビターの使用は、正常な細胞機能に必須の細胞プロセスにも影響を及ぼす。その結果、そのようなインヒビターは、癌又は線維化状態に罹患している患者においていくつかの二次作用を誘起する。従って、新規薬物標的及び治療を同定するより効果的な方法を開発するために、EMTの更なる理解が必要である。
【０００７】
過去数十年にわたり、肺におけるEMTプロセスを調節する分子機序を明らかにするためのインビトロモデル及びインビボモデルを開発するために、多くの努力が払われている。多くの研究が、肺上皮内の分子プロセス又は細胞プロセスに関するインビトロモデルとして、肺由来の様々な細胞株(例えば、A549、NCI-H292、BEAS2B及び16HBE)に焦点を当てており、且つこれらはそれらの効果を発揮するために上皮細胞が利用するシグナル伝達経路の現在の理解にかなり寄与している。しかし、細胞株は、形質転換変異を保持し、且つ異常な染色体コピー数を有することが多いので、細胞株は、分子プロセスを研究するための最良のモデルを常に提供するわけではない。加えて、膨大な細胞の継代及び変動する培養条件は、追加の遺伝子変化及び転写後変化を導入し、分子及び細胞機能に影響を及ぼし、且つ異なる報告間で不一致を引き起こすことがある。
【０００８】
従って細胞株の使用は、特定の分子経路への偏り、又は重要な細胞プロセスが見過ごされるリスクを導入することがある。初代細胞の及び好ましくは患者由来の初代細胞の利用は、そのようなリスクを最小化し、且つEMTに関与した分子プロセスにおけるより良い洞察を提供するであろう。
【０００９】
最後に、より良く且つより関連したEMTのインビトロモデルが、必要である。生理学的に関連のある状態の患者-由来の細胞を利用するより機能的な細胞アッセイを設定することは、利点であろう。次にそのようなアッセイは、EMTに関連した疾患、特に線維症及び癌腫の治療のための新規薬物標的、及び新規化合物を同定するための機能性ゲノム試験を行うために利用することができる。
【発明の概要】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、本明細書に開示された標的物(TARGET)の発現及び／又は活性を阻害する物質は、EMTのマーカーの発現及び／又は放出の阻害により示されるように、上皮間葉移行(EMT)を阻害することが可能であるという発見を基にしている。特に、MMP10、フィブロネクチン、E-カドヘリン及び／又は可溶性フィブロネクチンの放出又は発現の抑制は、インジケーターの例である。従って、本発明は、EMTにおいて役割を果たす標的物、標的物の発現及び／又は活性をダウンレギュレートすることが可能な物質のスクリーニング方法、並びにEMTに関連した疾患、特に線維症及び癌腫の予防及び／又は治療におけるこれらの物質の使用を提供する。本発明は、EMTの生物学、特に上皮間葉移行に関連した線維化障害に関与している標的物を提供する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患及び癌の発症に関与しているかそうでなければ関連している標的物を提供する。
【００１１】
本発明は、EMTに関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：被験化合物を、標的物ポリペプチド、それらの断片及び構造的機能性誘導体と接触させる工程；被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性又は該ポリペプチドの活性を決定する工程；被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程； EMTに関連した特性を測定する工程；並びに、EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すか、又は該ポリペプチドの活性を阻害することができるかのいずれかの化合物を同定する工程：を含む、方法に関連している。
【００１２】
本発明は更に、EMTに関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させ、且つ標的物ポリペプチドを発現させる工程；該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；EMTに関連した特性を測定する工程；並びに、該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つEMTを阻害する化合物を同定する工程：を含む、方法に関連している。
【００１３】
本発明は、EMTを阻害する化合物を同定する方法であって：被験化合物を、標的物ポリペプチド、それらの断片及び構造的機能性誘導体と接触させる工程；被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性又は該ポリペプチドの活性を決定する工程；被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；EMTに関連した特性を測定する工程；並びに、EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示し、及び／又は該ポリペプチドの活性を阻害することができる化合物を同定する工程：を含む、方法に関連している。
【００１４】
本発明は、EMTを阻害する化合物を同定する方法であって：被験化合物を、標的物ポリペプチド、それらの断片又は構造的機能性誘導体と接触させる工程；被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性、又は該ポリペプチドの発現若しくは活性を決定する工程；並びに、該ポリペプチドへの結合親和性を示し、及び／又は該ポリペプチドの発現若しくは活性を阻害することができる化合物として、EMTを阻害する化合物を同定する工程：を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた：
a)EMTに関連した疾患の治療において使用するための、標的物ポリペプチドへ特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含む、医薬組成物、
b)線維化状態の治療において使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含む、医薬組成物であって、ここで該物質が、EMTに関連した疾患の治療において使用するための、標的物ポリペプチドをコードしている選択された核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又はこれから操作された核酸配列を含む、医薬組成物：に関する。
【００１６】
別の本発明の態様は、EMTを阻害するインビトロ方法であって、上皮細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させる工程を含む方法に関連している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1は、EMTアッセイの概略図を示す。
【００１８】
【図２】図2は、完全一次スクリーンのフィブロネクチン(FN)及びメタロプロテイナーゼ-10(MMP10)の両方のリードアウトに関する、陰性対照(N1、N2及びN3)、陽性対照(P1、P2、P3、P4及びP5)並びに試料(S)の四分位範囲(IQR)値を示す。点線は、IQRカットオフ値-1.5を示す。
【００１９】
【図３】図3は、再スクリーンプレートのレイアウトを示し、ウェルG02は、偽(mock)形質導入した。
【００２０】
【図４】図4は、フィブロネクチン(FN)及びメタロプロテイナーゼ-10(MMP10)の両方のリードアウトに関する、対照及び試料の再スクリーンにおけるメソスケールディスカバリープラットフォーム(MSD)シグナル値を示す。E：偽処理；S：試料。
【００２１】
【図５】図5は、バリデーションプレートのレイアウトを示す。ウェルG02は、試料を含まないが、9種のソースプレートについて偽形質導入した。
【００２２】
【図６】図6は、フィブロネクチン(FN)、メタロプロテイナーゼ-10(MMP10)及びCellTiter-Blue(CTB)蛍光の3つのリードアウトを伴う、オン標的スクリーンの概略的アッセイ概要を示す。
【００２３】
【図７】図7は、オン標的プレートのレイアウトを示し、ウェルG02は、18種のプレートの12種において偽形質導入した。
【００２４】
【図８】図8は、FN及びMMP10の「オン標的」スクリーンの対照性能を示す。MSDシグナルをプロットした。T-：トリガーなし、T+：トリガーのみ、及びS：試料。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（詳細な説明）
（定義）
下記の用語は、以下に提示された意味を有することが意図され、且つ本発明の説明及び意図された範囲を理解する上で有用である。
【００２６】
用語「物質」（agent）は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、天然の生成物及び小型分子を含む、任意の分子を意味する。特に用語物質は、被験化合物又は薬物候補化合物などの化合物を含む。
【００２７】
用語「活性阻害性物質」又は「活性阻害する物質」は、細胞内で通常発現される特定のポリペプチド又はタンパク質の活性と選択的に干渉するか又は干渉することが可能であるように設計された物質、例えば、ポリペプチド、小分子、化合物などを意味する。
【００２８】
用語「アゴニスト」とは、最も広い意味で、受容体を刺激する物質及び受容体に結合する物質をいう。
【００２９】
本明細書において使用される用語「アンタゴニスト」は、受容体への結合時に生物学的反応それ自体は誘起しないが、アゴニスト-媒介性反応をブロックするか又は鈍らせる物質、或いはアゴニスト結合を防止するか又は減少させ、これによりアゴニスト-媒介性反応を防止するか又は減少させる物質を説明するように使用される。
【００３０】
用語「アッセイ」は、化合物を含む物質の特異的特性を測定するために使用される任意のプロセスを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物の集合から化合物の活性を基に化合物を特徴づけるか又は選択するために使用されるプロセスを意味する。
【００３１】
用語「結合親和性」は、2種以上の化合物が非共有的関係でどの程度強力に互いに会合するかを説明する特性である。結合親和性は、定性的(「強」、「弱」、「高」若しくは「低」など)又は定量的(KDの測定など)に特徴づけることができる。
【００３２】
用語「担体」は、医薬組成物に媒体、バルク及び／又は使用に適した形状を提供するために、医薬組成物の製剤に使用される無毒の物質を意味する。担体は、賦形剤、安定剤、又は水性pH緩衝液などの1以上の然る物質を含むことができる。生理的に許容し得る担体の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸を含む水溶性又は固形の緩衝成分；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約10残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の糖類；EDTAなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又は、TWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(登録商標)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００３３】
用語「複合体」は、2種以上の化合物が互いに結合、接触又は会合した場合に作製された実体を意味する。
【００３４】
用語「化合物」は、本発明のアッセイ及び方法に結びつけて説明される「被験化合物」又は「薬物候補化合物」の文脈で、本明細書において使用される。従って、これらの化合物は、合成により又は天然の給源から誘導された、有機化合物又は無機化合物を含む。本化合物は、無機化合物、又はポリヌクレオチド(例えば、siRNA若しくはcDNA)、脂質、又はホルモン類縁体などの有機化合物を含む。他の被験バイオポリマー性有機化合物は、ポリペプチドリガンド、酵素、受容体、チャネル、抗体又は抗体複合体を含む、約2〜約40個のアミノ酸からなるペプチド、及び約40〜約500個のアミノ酸からなるより大きいポリペプチドが挙げられる。
【００３５】
用語「状態」又は「疾患」は、症状(すなわち、病気)の顕性の提示又は異常な臨床指標(例えば、生化学指標又は細胞指標)の出現を意味する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状若しくは異常な臨床指標の遺伝リスク若しくは環境リスク又はそれらを発症する素因をいう。
【００３６】
用語「接触」又は「接触する」は、インビトロシステム又はインビボシステムのいずれかにおいて、少なくとも2つの部分を一緒にすることを意味する。
【００３７】
用語「ポリペプチドの誘導体」は、例えば該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べアミノ酸変異を有するポリペプチドなどの、該ポリペプチドの近接アミノ酸残基の部分配列を含み、且つタンパク質の生物活性を維持する、それらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関する。誘導体は更に、該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べ、追加の天然の、改変された、グリコシル化された、アシル化された又は天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。これはまた、例えば該アミノ酸配列に共有的又は非共有的に結合されたリポーター分子又は他のリガンドなどの、該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べ、1以上の非-アミノ酸置換基、又は異種アミノ酸置換基を含むこともできる。
【００３８】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、例えば該ポリヌクレオチドの天然に存在する形の核酸配列に比べ核酸変異を有し得るポリヌクレオチドなど、該ポリヌクレオチドの核酸残基の部分配列を含む、DNA-分子、RNA-分子、及びオリゴヌクレオチドに関する。誘導体は更に、PNA、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチル-ホスホロチオエートなど修飾された骨格、天然に存在しない核酸残基、又はメチル-、チオ-、スルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのリポーター分子を伴う核酸を含むことができる。
【００３９】
用語「内在性」とは、哺乳類が天然に生成する物質を意味するものとする。用語「酵素」、「プロテアーゼ」、「キナーゼ」又は「G-タンパク質共役受容体(‘GPCR’)」に関して内在性は、それが哺乳類(例えば、ヒトであるが、これに限定されるものではない)により天然に生成されることを意味するものとする。対照的に、この文脈において用語非-内在性は、それが哺乳類(例えば、ヒトであるが、これに限定されるものではない)により天然に生成されないことを意味するものとする。両方の用語は、インビボ及びインビトロの両システムを説明するために使用することができる。例えば、非限定的に、スクリーニングアプローチにおいて、内在性又は非-内在性標的物は、インビトロスクリーニングシステムに関してであってよい。非限定的な更なる例として、哺乳類のゲノムが非-内在性標的物を含むように操作される場合、インビボシステムによる候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
【００４０】
用語「発現可能な核酸」は、タンパク質性分子、ペプチド又はポリペプチドをコードしている又はコードすることが可能である核酸を意味し、且つRNA分子、又はDNA分子を含むことができる。
【００４１】
用語「発現」は、形質導入による過剰発現を含む、内在性発現及び非-内在性発現の両方を含む。
【００４２】
用語「発現阻害性物質」又は「発現阻害する物質」は、例えば、細胞内で又は細胞により通常発現される特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び／又は発現と選択的に干渉するか又は干渉することが可能であるように設計されたポリヌクレオチドなどの、物質を意味する。より特定の及び例として、「発現阻害性物質」は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードしているポリリボヌクレオチド配列内の少なくとも約15〜30個、特に少なくとも17個の連続ヌクレオチドと同一又は相補的なヌクレオチド配列を含むDNA又はRNA分子を含む。そのような発現阻害性分子の例としては、リボザイム、マイクロRNA、二本鎖siRNA分子、自己相補的一本鎖siRNA分子、遺伝子アンチセンス構築体、及び、修飾され安定化された骨格を伴う合成RNAアンチセンス分子が挙げられる。
【００４３】
用語「RNAiインヒビター」とは、細胞又は生物において、RNA干渉機能又は活性をダウンレギュレート、減少又は阻害することができる任意の分子をいう。RNAiインヒビターは、RISCなどのタンパク質成分、又はmiRNA若しくはsiRNAなどの核酸成分を含む、RNAi経路の任意の成分の機能と相互作用又は干渉することにより、RNAiをダウンレギュレート、減少又は阻害する(例えば、RNAiが媒介した標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング)ことができる。RNAiインヒビターは、細胞又は生物において、RISC、miRNA、若しくはsiRNA又はRNAi経路の他の成分の機能と相互作用するか又は干渉する、siNA分子、アンチセンス分子、アプタマー、又は小型分子であることができる。RNAiの阻害(例えば、RNAiが媒介した標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング)により、本発明のRNAiインヒビターは、標的遺伝子の発現を調節する(例えば、ダウンレギュレートする)ために使用することができる。
【００４４】
本明細書で使用される用語「マイクロRNA」又は「miRNA」又は「miR」は、当該技術分野において一般に受け容れられたその意味をいう。より詳細には、この用語は、mRNA切断、翻訳抑制／阻害、又はヘテロクロマチンのサイレンシングのいずれかによる、標的メッセンジャーRNAの発現を調節する小型の二本鎖RNA分子をいう(例えば、Ambrosの文献、2004, Nature, 431, 350-355；Barrelの文献、2004, Cell, 116, 281-297；Cullenの文献、2004, Virus Research., 102, 3-9；Heらの文献、2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531；Yingらの文献、2004, Gene, 342, 25-28；及び、Sethupathyらの文献、2006, RNA, 12:192-197参照)。本明細書において使用されるこの用語は、天然に存在することができる成熟一本鎖miRNA、前駆体miRNA(pre-miR)、及びそれらの変種を含む。場合によっては、用語「miRNA」はまた、miRNA一次転写物及び二重鎖miRNAを含む。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチドの断片」は、完全配列と実質的に類似しているが、必ずしも同一ではない活性を示す、近接核酸残基の部分配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の態様において、「断片」は、該完全配列の核酸配列の少なくとも5個の核酸残基(好ましくは、少なくとも10個の核酸残基、少なくとも15個の核酸残基、少なくとも20個の核酸残基、少なくとも25個の核酸残基、少なくとも40個の核酸残基、少なくとも50個の核酸残基、少なくとも60個の核酸残基、少なくとも70個の核酸残基、少なくとも80個の核酸残基、少なくとも90個の核酸残基、少なくとも100個の核酸残基、少なくとも125個の核酸残基、少なくとも150個の核酸残基、少なくとも175個の核酸残基、少なくとも200個の核酸残基、又は少なくとも250個の核酸残基)の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをいうことができる。
【００４６】
用語「ポリペプチドの断片」は、近接アミノ酸残基の部分配列を含み、且つ完全配列と実質的に類似しているが、必ずしも同一ではない機能又は発現活性を示す、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノマー、サブユニット及び酵素に関する。特定の態様において、「断片」は、該完全配列のアミノ酸配列の少なくとも5個のアミノ酸残基(好ましくは、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも25個のアミノ酸残基、少なくとも40個のアミノ酸残基、少なくとも50個のアミノ酸残基、少なくとも60個のアミノ残基、少なくとも70個のアミノ酸残基、少なくとも80個のアミノ酸残基、少なくとも90個のアミノ酸残基、少なくとも100個のアミノ酸残基、少なくとも125個のアミノ酸残基、少なくとも150個のアミノ酸残基、少なくとも175個のアミノ酸残基、少なくとも200個のアミノ酸残基、又は少なくとも250個のアミノ酸残基)のアミノ酸配列を含む、ペプチド又はポリペプチドをいうことができる。
【００４７】
用語「ハイブリダイゼーション」は、それにより核酸鎖が、塩基対合を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補塩基間の水素結合の形成により、2つの核酸配列の間で形成された複合体をいう。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中に形成される(例えば、C0t又はR0t分析)か、又は溶液中に存在する1つの核酸配列と固相(例えば、紙、メンブレン、フィルター、チップ、ピン若しくはガラススライド、又は細胞若しくはそれらの核酸が固定されている任意の他の好適な基板)上に固定された別の核酸配列の間に形成されることができる。用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチドとこの請求されたポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度、温度、及び当該技術分野において周知の他の条件により規定することができる。特に、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇は、ストリンジェンシーを増大することができる。用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について、5×SSC及び65℃と実質的に同等の塩及び温度の条件をいう。しかし当業者は、そのような「標準ハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中のナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列長さ及び濃度、ミスマッチの割合、ホルムアミドの割合などを含む特定の条件によって決まることを理解するであろう。また「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なものは、ハイブリダイズする2つの配列が、RNA-RNA、DNA-DNA又はRNA-DNAのいずれであるかである。そのような標準ハイブリダイゼーション条件は、周知の方式に従い当業者により容易に決定され、ここでハイブリダイゼーションは、典型的には予測又は決定されたTm以下の10-20NCで、望ましいならば、比較的高ストリンジェンシーの洗浄を伴う。
【００４８】
用語「反応」と関連する用語「阻害する」又は「阻害している」とは、反応が、化合物の非存在下とは対照的に、化合物の存在下で減少又は妨害されることを意味する。
【００４９】
用語「阻害」とは、タンパク質又はポリペプチドの発現又は活性の非存在又は最小化を生じるような、プロセスの減少、ダウンレギュレーション、又はプロセスの刺激の排除をいう。
【００５０】
用語「誘導」とは、タンパク質又はポリペプチドの発現、増強された発現、活性、又は増大された活性を生じる、プロセスの誘導、アップレギュレーション、又は刺激をいう。
【００５１】
用語「リガンド」は、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。
【００５２】
用語「医薬として許容し得る塩」とは、本明細書に開示された標的物の発現又は活性を阻害する化合物の無毒の無機及び有機の酸付加塩、及び塩基付加塩をいう。これらの塩は、本発明において有用な化合物の最終の単離及び精製期間に、現場で調製され得る。
【００５３】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質(標的物など)、タンパク質性分子、タンパク質の断片、高分子タンパク質のモノマー又は一部、ペプチド、オリゴペプチド及び酵素(キナーゼ、プロテアーゼ、GPCRなど)に関する。
【００５４】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の形状の、及びセンス方向又はアンチセンス方向のポリ核酸、ストリンジェント条件下で特定のポリ核酸とハイブリダイズする相補性ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約60％が相同である、及びより特定するとその塩基対の70％が、特に80％、最も特定すると90％、及び特定の実施態様においてその塩基対の100％が共通である、ポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、及びそれらの合成類縁体を含む。これはまた、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホロチオエートなどの、修飾された骨格を持つ核酸も含む。ポリヌクレオチドは、約10から約5000塩基、特に約100から約4000塩基、より特定すると約250から約2500塩基の範囲で、長さが変動する配列により説明される。一つのポリヌクレオチド実施態様は、長さ約10から約30の塩基から構成される。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、より一般的には低分子干渉RNA(siRNA−二本鎖siRNA分子又は自己相補性一本鎖siRNA分子(shRNA))として説明される、約17から約22ヌクレオチドのポリリボヌクレオチドである。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチル-ホスホロチオエートなど修飾された骨格を伴う核酸、又は天然に存在しない核酸残基、又はメチル-、チオ-、スルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、若しくはその検出を促進するためのリポーター分子を含む核酸である。本明細書のポリヌクレオチドは、特定の標的DNA配列の異なる鎖に対し「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、これらのポリヌクレオチドは、それらの各鎖とハイブリダイズするのに十分に相補性でなければならないことを意味する。従って、必要なポリヌクレオチド配列は、標的配列の正確な配列を反映しない。例えば、非-相補的ヌクレオチド断片は、該ポリヌクレオチドの5'末端に結合され、該ポリヌクレオチド配列の残りは、この鎖と相補的である。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下でそれらとハイブリダイズするか、又は伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために、鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非-相補的塩基又はより長い配列が、このポリヌクレオチドへ散在されることができる。
【００５５】
用語「予防する」又は「予防」とは、疾患-原因物質に曝露され得る対象、又は疾患発症の前に疾患の素因のある対象において、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクの低下(すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも一つが発症しないことを引き起こす)をいう。
【００５６】
用語「発症予防」は、用語「予防」に関連し、且つこれを包含しており、その目的が、疾患の治療若しくは治癒よりもむしろ予防である方策又は手順をいう。発症予防的方策の非限定的例は、ワクチン投与；例えば不動状態(immobilization)に起因した血栓症のリスクのある入院患者への低分子量ヘパリンの投与；並びに、マラリアが風土病であるか又はマラリアとの接触リスクの高い地理的領域を訪問する前の、クロロキンなどの抗-マラリア薬の投与を含み得る。
【００５７】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳類を含む。
【００５８】
用語「標的物」又は「標的物（複数）」は、本明細書記載のアッセイにより同定され、且つEMTに関与することが決定されたタンパク質を意味する。用語標的物又は標的物（複数）は、代替の種の形状、アイソフォーム、並びにスプライシング変種、対立遺伝子変種、選択的インフレームエクソン、及び代替部位若しくは中途終止部位若しくは開始部位などの変種を含むか又は企図し、これは、表1に記されたような、それらの既知の若しくは認められたアイソフォーム若しくは変種を含む。NCBI寄託番号は、当業者が転写物及びポリペプチドを同定するのを補助するために提供されている。しかし用語標的物又は標的物（複数）は、これらの配列の特定の型に限定されず、且つこれらの配列に対応する核酸及びポリペプチドの機能的変種を包含している。
【００５９】
「治療的有効量」又は「有効量」は、医師又は他の臨床従事者により考えられるか又は容認される、対象において又は対象の生物学的反応又は医学的反応を引き起こす化合物又は物質の量を意味する。
【００６０】
用語任意の疾患又は障害を「治療する」又は「治療」とは、一実施態様において、疾患又は障害を改善する(すなわち、疾患を阻止するか、又はそれらの臨床症状の少なくとも一種の出現、程度若しくは重症度を軽減する)ことをいう。従って「治療する」とは、治療的処置及び発症予防的若しくは予防的方策の両方をいう。治療を必要とするものは、既に障害を伴うものに加え、障害が予防されるべきものを含む。本明細書で使用される関連用語「治療」とは、障害、症状、疾患又は状態を治療する行為をいう。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、対象により認識されるものではない、少なくとも一つの理学的パラメータの改善をいう。更に別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、理学的(例えば、認識できない症状の安定化)、生理学的(例えば、理学的パラメータ又は生理学的に測定可能なパラメータの安定化)、又は両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することをいう。更なる実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、疾患の進行を遅らせることに関係する。
【００６１】
用語「ベクター」はまた、プラスミドに加え、組換えウイルスなどのウイルスベクター又は組換えウイルスをコードしている核酸に関係する。
【００６２】
用語「脊椎動物細胞」は、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、有袋類及び哺乳類の種を含む、脊椎構造を有する動物由来の細胞を意味する。好ましい細胞は、哺乳類種に由来し、最も好ましい細胞は、ヒト細胞である。哺乳類の細胞は、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス及びラットなどのマウス類、並びにウサギを含む。
【００６３】
用語「EMT」又は「上皮間葉移行」とは、通常基底膜とその基底面を介して相互作用する極性化された上皮細胞が、増強された遊走能、侵襲性、アポトーシスに対する増強された抵抗性、及び大きく増大されたECM成分の生成を含む、間葉細胞表現型を推測することができる複数の生化学的変化を受けることを可能にするプロセスをいう。
【００６４】
用語「EMTに関連した疾患」とは、EMTプロセスの基礎となる原因の一つを有する任意の状態又は疾患をいう。そのような疾患は、線維化疾患及び癌を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書において使用される用語「線維化疾患」とは、特に細胞外マトリクスの過剰な若しくは異常な生成、沈着に起因した、過剰な又は持続性の瘢痕化により特徴づけられる疾患をいい、且つ細胞及び／若しくはフィブロネクチン及び／若しくはコラーゲンの異常な蓄積、並びに／又は増大した線維芽細胞動員に関連しているものであり、且つ例えば心臓、腎臓、肝臓、関節、肺、胸膜組織、腹膜組織、皮膚、角膜、網膜、骨格筋及び消化管などの、個々の臓器又は組織の線維症を含むが、これらに限定されるものではない。特定の態様において、用語線維化疾患とは、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病をいう。より特定すると、用語「線維化疾患」は、特発性肺線維症(IPF)をいう。
【００６６】
本明細書において使用される用語「癌」とは、皮膚又は例えば、非限定的に乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃若しくは腸管などの、体内臓器の細胞の悪性又は良性の成長をいう。癌は、隣接組織へ浸潤し、且つ例えば、骨、肝臓、肺又は脳などの遠位臓器へ拡散(転移)する傾向がある。本明細書において使用される用語癌は、転移性腫瘍細胞型(非限定的に、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫及び肥満細胞腫など)及び組織癌腫型(非限定的に、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非-小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌並びに子宮平滑筋肉腫)の両方を含む。特に用語「癌」は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍/ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉腫及び悪性線維性組織球腫)、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳及び脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T-細胞性リンパ腫、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌(胃の癌)、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌(肝癌)、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫(膵内分泌腫瘍)、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、肝癌、非-小細胞肺癌、小細胞肺癌、バーキットリンパ腫、皮膚T-細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、髄上皮腫、メラノーマ、中皮腫、口腔癌、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌(asopharyngeal)、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非-小細胞肺癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵臓癌、乳頭腫症、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌(腎臓癌)、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌(胃の癌)、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、T-細胞リンパ腫、睾丸癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウイルムス腫瘍をいう。より詳細には、用語「癌」は、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、肥満細胞腫、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非-小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌及び子宮平滑筋肉腫を含む。より具体的態様において、用語「癌」は、EMTに関連した及び／又は相関した癌、より詳細には癌転移に関連している。
【００６７】
（標的物）
本出願人の発明は、EMTに関連した状態及び障害の、より特定すると線維化疾患及び癌の治療、予防及び緩和に関連している。
【００６８】
本発明は、上皮間葉移行(EMT)の天然に存在するインビボプロセスの科学的に実証された代替物を提供するのに適したインビトロ(無細胞又は細胞ベース)アッセイシステムを開発するための、本発明者らの集中的な研究を基にしている。EMTのプロセスは、線維症及び癌の進展に関与することがわかっているが、これは複雑なプロセスである。本発明は、EMTを阻害することができる化合物の同定、従って線維症及び癌腫の治療及び／又は予防に有用である化合物の同定に適した、個別の及び定量可能なインビトロパラメータを使用する、天然のシステムの人工モデルを提供する。
【００６９】
本発明は、本化合物を標的物を発現している細胞と接触させること、並びに本化合物の存在及び／又は非存在下で、EMTの阻害の相対量又は程度を決定することを含む、EMTに関連した疾患を治療するのに有用な、特にEMTを減少及び／又は阻害するのに有用な、薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。本発明は、本化合物を標的物を発現している細胞と接触させること、並びに標的物の発現又は活性の阻害の相対量又は程度を決定することを含み、これにより標的物の発現又は活性の阻害は、本化合物の存在及び／又は非存在下での、EMTの阻害又は減少に関連しているか又はこれを生じるEMTに関連した疾患を治療するのに有用な、特にEMTを減少又は阻害するのに有用な、薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。そのような方法は、該移行を阻害するように作用する標的タンパク質を同定するために使用することができ；或いは、これらは、標的物タンパク質の発現又は活性をダウンレギュレート若しくは阻害する化合物を同定するために使用することができる。本発明は、標的物の発現又は活性が測定され得る条件下で、本化合物を標的物と接触させること、並びに標的物の発現又は活性が、本化合物の存在下で変更されたかどうかを決定すること、上皮細胞の集団を、該被験化合物と接触させること、並びにEMTに関連した特性を測定することを含む、線維症を治療するのに有用な薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。そのような方法の例は、当業者により設計され且つ決定され得る。特定のそのような例証的方法が、本明細書に提供されている。
【００７０】
本発明は、「実施例」において以下に説明されるスクリーンの結果として同定される、標的物ポリペプチド及びそれらをコードしている核酸は、線維症、特にEMTに関連した因子であるという、本発明者らの発見を基にしている。標的物ポリペプチド及び／又はそれらをコードしているポリヌクレオチドの低下した活性又は発現は、低下又は阻害されたEMTの原因となるか、これと相関又は関連している。或いは、標的物ポリペプチド及び／又はそれらをコードしているポリヌクレオチドの低下した活性又は発現は、EMTのマーカーの減少の原因となるか、これと相関又は関連している。
【００７１】
本発明の特定の実施態様において、標的物ポリペプチドは、表1に列記された配列番号:18-34からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００７２】
【表１】
2016522675.tif 000002
【００７３】
本発明の特定の実施態様は、配列番号:18、19、27及び29として同定されるキナーゼ標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:20として同定される転移酵素標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:21-22、23-26及び33-34として同定される分泌型/細胞外標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:30として同定される受容体標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:31として同定されるGPCR標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:32として同定される輸送体標的物を含む。
【００７４】
（発明の方法）
一態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)EMTに関連した特性を測定する工程；並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
【００７５】
更なる態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)EMTに関連した特性を測定する工程；並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
【００７６】
一態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を同定及び／又は測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)EMTの阻害又は減少に関連した又は指標とする特性を測定する工程；並びに
e)EMTを阻害又は減少し、且つ該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
【００７７】
前記方法の更なる態様において、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体は、配列番号:1-17からなる群から選択され得る。
【００７８】
これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。本方法の特定の態様において、工程(c)及び(d)は、工程(a)及び(b)を実践する前に行うことができる。例えば、最初に、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関する情報が分かっていないような化合物のセットのスクリーニングアッセイを行うことができる。或いは、ポリペプチドドメインについて結合親和性を有すると同定された化合物のセット、又はポリペプチドのインヒビターであると同定された化合物のクラスを、スクリーニングすることができる。
【００７９】
別の態様において、工程(a)-(d)の方法はまた、被験化合物をマクロファージの集団と接触させ、被験化合物の標的物ポリペプチドへの結合親和性及び上皮間葉移行に関連した特性を測定し、並びに上皮間葉移行を阻害することが可能であり且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定することにより、細胞-ベースのアッセイにおいて同時に行うこともできる。
【００８０】
化合物のポリペプチド標的物との結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore(登録商標))の使用、標識された化合物による飽和結合分析により(例えば、Scatchard及びLindmo分析)、示差UV分光計、蛍光偏光アッセイ、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR(登録商標))システム、蛍光共鳴エネルギー移動、及び生物発光共鳴エネルギー移動によるなどの、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。化合物の結合親和性はまた、解離定数(Kd)で又はIC50若しくはEC50として表すこともできる。IC50は、別のリガンドの該ポリペプチドへの結合の50％阻害に必要とされる化合物の濃度を表す。EC50は、標的物機能を測定する任意のアッセイにおいて最大効果の50％を得るのに必要とされる濃度を表す。解離定数Kdは、リガンドがどの程度良好にポリペプチドへ結合するかの測定値であり、これは、該ポリペプチドの結合部位の正確に半分を飽和するのに必要とされるリガンド濃度と等しい。高親和性結合を持つ化合物は、例えば100nM〜1pMの範囲である、低いKd、IC50及びEC50値を有し；中等度-から低-結合親和性は、例えばマイクロモル範囲の、高いKd、IC50及びEC50値に関連している。
【００８１】
一態様において、アッセイ方法は、標的物ポリペプチドを、マイクロモル範囲の結合親和性を示す化合物と接触させることを含む。ある態様において、示された結合親和性は、少なくとも10マイクロモルである。ある態様において、結合親和性は、少なくとも1マイクロモルである。ある態様において、結合親和性は、少なくとも500ナノモルである。
【００８２】
特定の態様において、被験化合物は、標的物クラスに結合するその能力を基に、又は標的物クラスに結合する能力を有する化合物の公知のライブラリーから、選択される。
【００８３】
更なる態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞集団と接触させる工程；
d)上皮間葉移行に関連した特性を測定する工程；並びに
e)上皮間葉移行を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
【００８４】
追加の態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させる工程；
d)EMTに関連している特性を測定する工程；並びに
e)EMTを阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
【００８５】
更なる態様において、本発明は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって： 
a)被験化合物を、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と、接触させる工程；
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程；
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、EMTの阻害又は減少を生じるか又はこれに関連している工程：を含む、方法に関する。
【００８６】
前記方法の追加の態様において、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はそれらの機能性誘導体は、配列番号:1-17からなる群から選択され得る。
【００８７】
これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。本方法の特定の態様において、工程(c)及び(d)は、工程(a)及び(b)を実践する前に行うことができる。例えば、最初に、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関する情報が分かっていないような化合物のセットのスクリーニングアッセイを行うことができる。或いは、ポリペプチドドメインについて結合親和性を有すると同定された化合物のセット、又はポリペプチドのインヒビターであると同定された化合物のクラスを、スクリーニングすることができる。
【００８８】
表1は、同定されたポリペプチドのクラスを含む、出願者の本明細書に例示されたEMTアッセイにおけるノックダウンライブラリーを用い同定された標的物を列挙している。標的物は、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、酵素、イオンチャネル、GPCR、及び細胞外タンパク質を含む、ポリペプチドクラスにおいて同定されている。当業者は、無細胞調製に加え、細胞-ベースのアッセイの両方においてそれらのクラスの活性を測定する様々な方法を知っているであろう。様々な方法が存在し、且つ特定の標的に適合されている。それらの適合は、慣習的実験に関する問題であり、現存する技術及び方法に頼っている。いくつかの例証的方法を、本明細書に記載している。
【００８９】
イオンチャネルは、膜タンパク質複合体であり、且つそれらの機能は、生体膜を超えたイオンの拡散を促進することである。膜、又はリン脂質二重層は、親水性で帯電した分子に対し、疎水性低誘電性障壁を構築する。イオンチャネルは、膜の疎水性内部を超える高伝導性の親水性経路を提供する。イオンチャネルの活性は、古典的パッチクランプ法を用い、測定することができる。ハイスループット蛍光-ベースの又はトレーサー-ベースのアッセイも、イオンチャネル活性を測定するために、広範に利用可能である。これらの蛍光-ベースのアッセイは、イオンチャネルを開閉するいずれかのそれらの能力を基に、膜を超える特異的蛍光色素の濃度の変化により、化合物をスクリーニングする。トレーサー-ベースのアッセイの場合、細胞内又は細胞外のトレーサーの濃度の変化は、放射能測定又はガス吸収分析により測定される。
【００９０】
プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することにより、化合物による阻害を決定する具体的方法は、当該技術分野において周知である。伝統的に、標的プロテアーゼにより切断され得る基質であるペプチド配列を介して、蛍光基が消光物質に連結されている基質が使用される。リンカーの切断は、蛍光基と消光物質を分離し、蛍光の増加を生じる。
【００９１】
G-タンパク質共役受容体(GPCR)は、エフェクタータンパク質を活性化することが可能であり、結果的に細胞内のセカンドメッセンジャーレベルの変化を生じる。配列番号:31により表される標的物は、GPCRである。GPCRの活性は、そのようなセカンドメッセンジャーの活性レベルを測定することにより、測定することができる。細胞内の2種の重要で有用なセカンドメッセンジャーは、サイクリックAMP(cAMP)及びCa2+である。それらの活性レベルは、ELISA若しくは放射能技術によるか、又はCa2+と接触した場合に蛍光若しくは化学発光シグナルを生じる基質を使用することにより直接的に、或いはレポーター遺伝子分析により間接的にのいずれかで、当業者に公知の方法により、測定することができる。1種以上のセカンドメッセンジャーの活性レベルは通常、プロモーターにより制御されるレポーター遺伝子により決定され、ここでプロモーターは、該セカンドメッセンジャーに反応する。そのような目的で当該技術分野において公知で使用されるプロモーターは、細胞内のサイクリック-AMPレベルに反応するサイクリック-AMP反応性プロモーター、及び細胞内の細胞質Ca2+-レベルに感受性があるNF-AT反応性プロモーターである。レポーター遺伝子は通常、容易に検出可能な遺伝子産物を有する。レポーター遺伝子は、宿主細胞において安定して感染されるか又は一過性にトランスフェクションされるかのいずれかであることができる。有用なレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、増強された緑色蛍光タンパク質、不安定化された緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼがある。
【００９２】
別の態様において、本関連は、上皮間葉移行(EMT)に関連した疾患の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させ、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程；
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び／又は量を測定する工程；
c)EMTに関連した特性を測定する工程；並びに
d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つEMTを阻害又は減少する化合物を同定する工程：を含む、方法に関係する。
【００９３】
更なる態様において、本関連は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、上皮細胞の集団と接触させ、配列番号:18-34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程；
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び／又は量を測定する工程；
c)EMTに関連した特性を測定する工程；並びに
d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つEMTを阻害する化合物を同定する工程：を含む、方法に関係する。
【００９４】
特定の態様において、標的物への結合又は活性の測定に関連した本発明の方法工程は、該標的物ポリペプチドを発現するように操作された哺乳類細胞、特にヒト細胞の集団で行われる。代替の態様において、本発明の方法は、該標的物ポリペプチドを発現するように操作された上皮細胞の集団を用いて行われる。これは、当業者に公知の好適な技術を使用し、細胞内の標的物ポリペプチドの発現により達成され得る。具体的実施態様において、これは、当業者に公知の好適な技術を使用し、細胞における標的物ポリペプチドの過剰発現により達成され得る。或いは、本発明の方法は、該標的物ポリペプチドの天然の発現が分かっているマクロファージの集団により行われてもよい。
【００９５】
特定の態様において、標的物ポリペプチドの発現及び／又は量の測定と、上皮間葉移行に関連した特性の測定は、マクロファージ細胞の異なる集団を用い、個別の工程において行うことができる。工程(b)及び(c)における測定はまた、逆順で行うことができる。これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。
【００９６】
具体的実施態様において、本発明の方法は、異常な上皮間葉移行により特徴づけられる線維化状態の治療に有用な化合物を同定するために使用される。
【００９７】
別の実施態様において、本発明の方法は、異常な上皮間葉移行により特徴づけられる癌の治療に有用な化合物を同定するために使用される。
【００９８】
ポリペプチドの活性又は発現を測定する一つの特定の手段は、抗体などのポリペプチド結合物質を使用し、該ポリペプチドの量を決定すること、又は生物学的測定若しくは生化学的測定において該ポリペプチドの活性を、例えばキナーゼポリペプチドの標的のリン酸化の量を決定することである。
【００９９】
標的物遺伝子発現(mRNAレベル)は、当業者に周知の技術を用い、測定することができる。そのような技術の特定例は、ノーザン分析又はリアルタイムPCRを含む。それらの方法は、試料中の標的物をコードしている核酸の存在の指標であり、これによりポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関させる。
【０１００】
細胞集団は、例えば培地内での直接インキュベーションによるか、又は細胞への核酸導入によるなど、異なる手段により、化合物へ又は化合物の混合物へ曝露することができる。そのような導入は、例えば、裸の単離されたDNA又はRNAの直接トランスフェクションによるか、又は組換えベクターなどの送達システムの手段によるなど、多種多様な手段により達成されてよい。リポソーム、又は他の脂質-ベースのベクターなどの他の送達手段も、使用されてよい。特に、核酸化合物は、組換えウイルスなどの、(組換え)ベクターにより、送達される。
【０１０１】
インビボにおける標的物調節の更なる評価を含む、本発明において同定された物質又は化合物の更なる又は追加のスクリーニング、評価及び／又は検証のために、線維症のインビボ動物モデルを、当業者は利用することができる。そのような動物モデルは、肺線維症に関するブレオマイシンモデル、照射モデル、シリカモデル、(誘導性)トランスジェニックマウスモデル、FITCモデル、及び養子移入モデルなど(Mooreらの文献、2008)、腎線維症に関するCOL4A3-欠損モデル、腎毒性血清腎炎モデル、及び一側性尿管閉塞モデル(Zeisbergらの文献、2005)、並びに肝線維症に関するCCL4中毒モデル(Starkelらの文献、2011)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の方法における上皮細胞の集団は、純粋でなければならないことはなく、特定程度の純度が要求される。該細胞の一部が上皮細胞である哺乳類細胞の集団は、本発明の方法の実践に十分である。マクロファージ細胞の数又は量は、EMTにおいて、有意な又は関連する変化が存在するかどうかを決定するのに十分でなければならないか、或いはEMTマーカー又は因子における有意な減少又は増加などの、差異を評価するのに十分でなければならない。上皮細胞の集団はまた、臓器から直接入手するか、或いは好適な培地を用い成長させることができることは理解されるべきである。上皮細胞の集団を作製する技術は、当業者に公知である。
【０１０３】
具体的実施態様において、本方法は、試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含むことができる。好適な対照は、偽陽性の読み値を防ぐことを確実にするために適所に常に配置される。本発明の特定の実施態様において、スクリーニング法は、化合物を好適な対照と比較する追加工程を含む。一実施態様において、対照は、被験化合物と接触されない細胞又は試料であってよい。代替の実施態様において、対照は、標的物を発現しない細胞であってよく；例えば、そのような実施態様の一態様において、被験細胞は、標的物を天然に発現し、且つ対照細胞は、例えば標的物の発現を阻害又は妨害するsiRNAなどの物質と接触されてよい。或いは、そのような実施態様の別の態様において、細胞は、その未変性状態では、標的物を発現せず、且つ被験細胞は、標的物を発現するように操作され、その結果この実施態様において、対照は、形質転換されない未変性細胞であることができる。対照はまた、代わりに上皮間葉移行の公知のインヒビター又は上皮間葉移行に対しいかなる有意な作用も有さないことがわかっている化合物を利用することもできる。対照の例は本明細書に記載されているが、これは限定としてとらえられるべきではなく；当業者の範囲内で、使用される実験条件に関して適した対照が選択される。
【０１０４】
陰性対照の例は、任意の化合物により処理されていない細胞、EMTのインヒビターではないことが分かっている化合物、EMTに関連した経路と干渉しないことがわかっている化合物により処理された細胞を含むが、これらに限定されるものではない。陽性対照の例は、SMAD3、SMAD4、TGFβR、フィブロネクチンの活性又は発現を阻害することがわかっている化合物と接触された細胞、TGFβ受容体シグナル伝達を阻害することがわかっている化合物と接触された細胞を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、本発明の方法における結合及び活性の試験は、インビトロ無細胞調製物中で行われる。
【０１０５】
代替の実施態様において、本発明の方法における結合及び活性の試験は、細胞中で行われる。
【０１０６】
本発明の方法の特定の態様において、活性及び結合の試験は、哺乳類細胞、特にヒト細胞において行われる。より詳細には、これらの工程は、上皮細胞において行われる。具体的実施態様において、該細胞は、気管支上皮細胞である。
【０１０７】
ポリペプチドを発現している細胞は、該ポリペプチドを天然に発現する細胞であってよいか、又は細胞は、該ポリペプチドを発現するようにトランスフェクトされてよいことは理解されなければならない。また、細胞は、該ポリペプチドを過剰発現するように形質導入されてよいか、又は異なるようにアッセイ又は評価され得る該ポリペプチドの非-内在型を発現するようにトランスフェクトされてよい。
【０１０８】
細胞において標的物ポリペプチドを発現しているポリヌクレオチドは、ベクター内に含まれてよい。ポリ核酸は、核酸配列の発現を可能にするシグナルに機能的に連結され、且つ特に組換えベクター構築体を利用し、細胞へ導入され、一旦ベクターが細胞へ導入されると、該核酸を発現するであろう。アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターシステムを含む、様々なウイルス-ベースのシステムが利用可能である。全ては、標的細胞において標的物ポリペプチドを導入し発現するために使用することができる。
【０１０９】
特定の実施態様において、本発明のアッセイ方法は、上皮間葉移行のマーカー(EMTマーカー)の放出又は発現の阻害の測定に関与している。
【０１１０】
多くのEMTマーカーが、当業者に公知である。そのようなマーカーの選択は、具体的アッセイデザインに関連した、試薬の利用可能性、実践されるアッセイ方法の規模及び他の因子によって決まる。具体的実施態様において、EMTマーカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、細胞フィブロネクチン(FN)、E-カドヘリン、可溶性フィブロネクチン、及びビメンチンからなる群から選択される。具体的実施態様において、EMTマーカーは、MMP10、フィブロネクチン、E-カドヘリン及び可溶性フィブロネクチンからなる群から選択される。
【０１１１】
アッセイ設定及びスループットに応じて左右される、そのようなマーカーを測定する手段は、当業者に公知である。ヒトELISAは市販されているが、それらの感度は、低レベルのこれらのマーカーを検出するのに常に十分とは限らない。従って、アッセイは、シグナル伝達分子が、抗体により特異的に捕獲され且つ検出されるサンドイッチイムノアッセイとして、メソスケールディスカバリープラットフォーム(MSD)(Meso Scale Discovery社、メリーランド州、米国)上で最適化され得る。MSD技術は、プレートの底に一体化された炭素電極を備えたマイクロ-プレートを利用し；生物学的試薬は、単純に受動吸着によりその炭素へ固定され、高い生物活性を維持する。MSDアッセイは、超高感度検出のために、電気-化学発光標識を使用する。この検出プロセスは、マイクロ-プレートの底に配置された電極で始まる。電極の近傍の標識のみが励起され、低下したバックグラウンドシグナルが検出される。そのようなアッセイのための抗体は、様々な製造業者から購入することができ、当業者は、アッセイを行うための正確な抗体を選択する立場にある。
【０１１２】
或いは、EMTマーカーの発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)を含む公知の方法を用いて、測定することができる。qPCRは、PCRを基にした実験技術であり、これは標的化されたDNA分子を増幅し且つ同時に定量するために使用される。DNA試料中の1以上の特異的配列に関して、リアルタイムPCRは、検出及び定量の両方を可能にする。この量は、コピーの絶対数又はDNAインプット又は追加の規準化遺伝子に対し規準化された場合の相対量のいずれかであることができる。
【０１１３】
具体的実施態様において、本発明の方法は、EMTを誘導する因子(EMT誘導性因子)により誘発された細胞を利用する。そのような因子の多くは、文献に記載されており、且つこれらは当業者に周知である。特定の実施態様において、本発明の方法は、TGFβ、IL-1β、TNFα、及び細菌性チャレンジからなる群から選択される1以上のEMT誘導性因子により誘発された細胞を利用する。細菌性チャレンジは、模倣細菌の損傷をインビボにおいて起こすために、UV死滅させた細菌に細胞を曝露し、且つ線維性プロセスに影響を及ぼし得る。
【０１１４】
より特定の実施態様において、アッセイ方法は、TGFβ、TNFα及び無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザの組合せにより誘発される細胞を使用し、行われる。
【０１１５】
（候補化合物）
（発現阻害性物質）
本発明の方法の特定の実施態様において、被験化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される。
【０１１６】
これらの方法の特別な実施態様は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、配列番号:18-34をコードしているポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号:1-17に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同である低分子干渉RNA(siRNA)又はマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択される発現-阻害性物質を含み、その結果この発現阻害性物質は、標的物ポリリボヌクレオチドの標的物ポリペプチドへの翻訳を妨害する。
【０１１７】
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は、特に、標的物ポリペプチドをコードしている核酸又は対応するメッセンジャーRNAの全て又は一部と特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸断片である。加えて、その一次転写物のスプライシングを阻害することにより、標的物ポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列の発現を減少するアンチセンス核酸が、設計され得る。任意の長さのアンチセンス配列が、標的物をコードしている核酸の発現をダウンレギュレート又はブロックすることが可能である限りは、これが本発明の実践に適している。特に、このアンチセンス配列は、長さが少なくとも約15〜30、特に少なくとも17ヌクレオチドである。アンチセンス核酸の調製及び使用、アンチセンスRNAをコードしているDNA、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は、当該技術分野において公知である。
【０１１８】
より具体的実施態様において、被験化合物は、標的物ポリヌクレオチドの約17〜約30近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれから操作された核酸配列を含む。
【０１１９】
当業者は、標的物の阻害及びマクロファージの代替活性化マクロファージへの分化において効果的なアンチセンス核酸及びオリゴヌクレオチドの選択プロセスを促進し且つ簡略化するために、いくつかの戦略のいずれかを容易に利用することができる。オリゴヌクレオチドとmRNA分子の相補的配列の間の結合エネルギーの予測又は熱力学指数の計算を、利用することができる(Chiangらの文献、(1991) J. Biol. Chem. 266:18162-18171；Stullらの文献、(1992) Nucl. Acids Res. 20:3501-3508)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二次構造を基に選択することができる(Wickstromらの文献、(1991) 「癌及びAIDSのアンチセンス核酸療法の展望(Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS)」、Wickstrom編集、Wiley-Liss社、ニューヨーク、7-24頁；Limaらの文献、(1992) Biochem. 31:12055-12061)。Schmidt及びThompson(米国特許第6,416,951号)は、RNAをオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること、及びインターカレーション色素の存在下でハイブリダイズすることによりハイブリダイゼーションのキネティックスをリアルタイムに測定すること、又は標識を組込み且つ非標識オリゴヌクレオチドの存在下での色素又は標識のシグナルの分光学的特性を測定することを含む、機能的アンチセンス物質を同定する方法を説明している。加えて、例えば、自己相補性の非存在、ヘアピンループの非存在、安定したホモ二量体及び二重鎖形成の非存在(kcal/molで予測されたエネルギーにより評価される安定性)を含む、当業者により認められた様々な基準を利用し、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス標的を予測する、様々なコンピュータプログラムのいずれかを利用することができる。そのようなコンピュータプログラムの例は、容易に利用可能であり、当業者に公知であり、且つOLIGO 4又はOLIGO 6プログラム(Molecular Biology Insights社、Cascade, CO)、及びOligo Techプログラム(Oligo Therapeutics社、Wilsonville, OR)を含む。加えて、本発明に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下でのオリゴヌクレオチドライブラリー、又は核酸分子のライブラリーのスクリーニング、並びに標的RNA又は核酸にハイブリダイズするものの選択により同定されることができる(例えば、米国特許第6,500,615号参照)。Mishra及びToulmeもまた、標的に結合するオリゴヌクレオチドの選択的増幅を基に選択手順を開発した(Mishraらの文献、(1994) Life Sciences 317:977-982)。オリゴヌクレオチドはまた、RNAse Hによる標的RNAの切断を媒介するそれらの能力による、切断断片の選択及び特徴づけによっても、選択することができる(Hoらの文献、(1996) Nucl Acids Res 24:1901-1907；Hoらの文献、(1998) Nature Biotechnology 16:59-630)。オリゴヌクレオチドの作製及びRNA分子のGGGAモチーフへの標的化も、説明されている(米国特許第6,277,981号)。
【０１２０】
アンチセンス核酸は、特にオリゴヌクレオチドであり、専らデオキシリボ-ヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、又はそれら両方の組合せからなり得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、望ましいならば、安定性及び／又は選択性を向上するために、化学修飾されることができる。本発明のために想定されたいくつか特定のオリゴヌクレオチドの具体例は、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間連結、又は短鎖ヘテロ原子式若しくは複素環式糖間連結を含むものを含む。オリゴヌクレオチドは、細胞内ヌクレアーゼにより分解されやすいので、これらの修飾は、例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素の代わりのイオウ基の使用を含むことができる。この修飾は、ホスホロチオエート連結と称される。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性で、ポリアニオン性であり、且つ内在性ヌクレアーゼに対し抵抗性である。加えて、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがその標的物部位にハイブリダイズする場合、RNA-DNA二重鎖は、内在性酵素リボヌクレアーゼ(RNase)Hを活性化し、これはハイブリッド分子のmRNA成分を切断する。オリゴヌクレオチドはまた、1以上の置換された糖部分を含むことができる。特定のオリゴヌクレオチドは、2'位に下記の1つを含む：OH、SH、SCH3、F、OCN、ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；又は、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基及び同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾を、オリゴヌクレオチドの他の位置に、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位及び5'末端ヌクレオチドの5'位に行うことができる。
【０１２１】
加えて、ホスホロアミダイト及びポリアミド(ペプチド)連結を伴うアンチセンスオリゴヌクレオチドを、合成することができる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に対し非常に抵抗性である。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的物部位への結合の安定性を増強し且つこれを促進するために、化学基を糖部分の2'炭素及びピリミジンの5炭素(C-5)に付加することができる。修飾は、2'-デオキシ、O-ペントキシ、O-プロポキシ、O-メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾された塩基に加え、当業者に公知の他の修飾を含むことができる。
【０１２２】
標的物のレベルを低下する発現-阻害性物質の別の型は、リボザイムである。リボザイムは、触媒ドメインと基質結合ドメインとを個別に有する触媒的RNA分子(RNA酵素)である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性により、及び恐らくその標的物配列との非水素結合相互作用により一緒にされる。触媒部分は、標的物RNAを特異的部位で切断する。リボザイムの基質ドメインは、特定されたmRNA配列へこれを向けるように操作することができる。リボザイムは、標的物mRNAを認識し、その後これに相補的塩基対合により結合する。一旦これが正確な標的物部位へ結合されたならば、リボザイムは、酵素のように働き、標的物mRNAを切断する。リボザイムによるmRNAの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するその能力を破壊する。一旦リボザイムがその標的物配列を切断したならば、これは放出され、且つ他のmRNAで結合及び切断を繰り返すことができる。
【０１２３】
リボザイム型の例は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウイルス、グループIイントロン又はRNaseP RNA(RNAガイド配列に会合されている)モチーフ又はニューロスポラVS RNAモチーフを含む。ハンマーヘッド構造又はヘアピン構造を有するリボザイムは、これらの触媒RNA分子は、真核プロモーターから細胞内で発現され得るので、容易に調製される(Chenらの文献、(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9)。本発明のリボザイムは、好適なDNAベクターから、真核細胞において発現され得る。望ましいならば、リボザイムの活性は、第二のリボザイムによる、一次転写物からのその放出により増強される(Venturaらの文献、(1993) Nucleic Acids Res. 21:3249-55)。
【０１２４】
リボザイムは、転写後に標的物mRNAへハイブリダイズする配列が側方に位置したリボザイム触媒ドメイン(20ヌクレオチド)と、オリゴデオキシリボヌクレオチドを組合せることにより、化学合成することができる。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして使用することにより、増幅される。この増幅産物は、真核発現ベクターへクローニングされる。
【０１２５】
リボザイムは、DNA、RNA、又はウイルスベクターへ挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核RNAポリメラーゼI(pol I)、RNAポリメラーゼII(pol II)、又はRNAポリメラーゼIII(pol III)のプロモーターから駆動される。pol II又はpol IIIプロモーター由来の転写物は、全ての細胞において高レベルで発現され；所与の細胞型における所与のpol IIプロモーターのレベルは、近くの遺伝子調節配列により左右されるであろう。原核RNAポリメラーゼ酵素が、好適な細胞において発現される場合には、原核RNAポリメラーゼプロモーターも使用される(Gao及びHuangの文献、(1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72)。これらのプロモーターから発現されたリボザイムは、哺乳類細胞において機能し得ることが示されている(Kashani-Sabetらの文献、(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15)。
【０１２６】
特定の実施態様において、本発明の方法は、センス鎖と相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むアンチセンスポリヌクレオチド、siRNA又はshRNAを用いて実践され、ここで該センス鎖は、標的物ポリヌクレオチドの17-25連続ヌクレオチドから選択される。
【０１２７】
特定の阻害性物質は、低分子干渉RNA(siRNA、特に低分子ヘアピンRNA、“shRNA”)である。siRNA、特にshRNAは、サイレンシングされるRNAと配列が相同である二本鎖RNA(dsRNA)により、遺伝子サイレンシングの転写後プロセスを媒介する。本発明のsiRNAは、配列番号:1-17に記載された配列の群から選択された、より特定すると配列番号:46-75に記載された配列の群から選択された、近接17-25ヌクレオチド配列に相補的又は相同である、センス鎖15-30、特に17-30、最も特定すると17-25ヌクレオチド、並びに該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖15-30、特に17-30、最も特定すると17-25、より具体的には19-21ヌクレオチドを含む。より特定すると、本発明のsiRNAは、配列番号:46-75を含む配列の群から選択されるセンス鎖を含む。最も特定のsiRNAは、互いに100％相補的であるセンス鎖及びアンチセンス鎖並びに標的物ポリヌクレオチド配列を含む。特にsiRNAは更に、センス鎖及びアンチセンス鎖を連結するループ領域を含む。
【０１２８】
本発明の自己相補性一本鎖shRNA分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーにより接続されたセンス部分とアンチセンス部分を含む。特にループ領域配列は、長さ4-30ヌクレオチド、より特定すると長さ5-15ヌクレオチド、及び最も特定すると長さ8又は12ヌクレオチドである。最も特定の実施態様において、リンカー配列は、
【化１】
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である。自己相補性一本鎖siRNAは、ヘアピンループを形成し、通常のdsRNAよりもより安定している。加えて、これらはベクターからより容易に作製される。
【０１２９】
アンチセンスRNAと類似したsiRNAは、核酸分解に対する抵抗性を確実にするか、又は活性を増強するか、又は細胞分布を増強するか、又は細胞取り込みを増強するように修飾されることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド間の連鎖、修飾された核酸塩基、修飾された糖及び／又はsiRNAの1以上の部分若しくは複合体への化学連鎖からなることができる。ヌクレオチド配列は、siRNA設計則に従わないヌクレオチド配列と比べ標的物配列の改善された減少をもたらすという、siRNA設計則に従い選択される(これらの規則の考察及びsiRNAの調製例について、WO 2004/094636及びUS 2003/0198627が引用により本明細書中に組み込まれている)。
【０１３０】
特定の阻害性物質は、マイクロRNA("miRNA"と称す)を含む。miRNAは、低分子の非コードRNAであり、標的メッセンジャーRNA(mRNA)転写物上の相補部位への結合により遺伝子発現を制御する多くの真核種において認められる調節分子のクラスに属する。
【０１３１】
インビボにおいて、miRNAは、およそ70ヌクレオチドのpre-miRNAへ核内でプロセッシングされるより大型のRNA前駆体(pre-miRNAと称される)から作製され、pre-miRNAは、不完全なステムループ構造へフォールドされる。これらのpre-miRNAは、細胞質内で追加のプロセッシング工程を受け、ここで長さ18-25ヌクレオチドの成熟miRNAが、RNaseIII酵素によりpre-miRNAヘアピンの片側から切断される。
【０１３２】
miRNAは、2つの様式で遺伝子発現を調節することが示されている。第一に、miRNAと正確に相補性であるタンパク質-コードしているmRNA配列に結合するmiRNAは、RNA-媒介型干渉(RNAi)経路を誘導する。メッセンジャーRNA標的は、RISC複合体中のリボヌクレアーゼにより切断される。第二の機序においては、メッセンジャーRNA転写物上の不完全な相補性部位に結合するmiRNAは、転写後レベルで遺伝子調節を指示するが、それらのmRNA標的は切断しない。植物及び動物の両方において同定されたmiRNAは、それらの遺伝子標的に対し翻訳制御を発揮するためにこの機序を使用する。
【０１３３】
（低分子量化合物）
特定の薬物候補化合物は、低分子量化合物である。例えば分子量500ダルトン以下の低分子量化合物は恐らく、生物学的システムにおいて良好な吸収及び浸透を有し、且つ結果的に分子量500ダルトンを上回る化合物よりも成功する薬物候補である可能性がより大きい(Lipinskiらの文献、2001)。ペプチドは、別の特定の薬物候補化合物クラスを構成する。ペプチドは、優れた薬物候補であることができ、妊娠促進ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの、商業的に価値のあるペプチドの複数の例が存在する。天然の化合物は、薬物候補化合物の別の特定のクラスである。そのような化合物は、天然の供給源中に発見され、且つそこから抽出され、これはその後合成されることができる。脂質は、別の特定の薬物候補化合物のクラスである。
【０１３４】
（抗体）
別の薬物候補化合物の好ましいクラスは、抗体である。本発明はまた、標的物に対して向けられた抗体も提供する。これらの抗体は、細胞内の標的物へ結合するように内在性に産生されるか、又は細胞の外側に存在する標的物ポリペプチドに結合するように組織に添加されてよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、更にはFAb断片及びFAb発現ライブラリーの産物、並びにFv断片及びFv発現ライブラリーの産物も含む。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、ポリクローナル抗体が、本発明の実践において使用され得る。当業者は、ポリクローナル抗体の調製方法を知っている。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化物質及び望ましいならばアジュバントの1回以上の注射により、哺乳類において産生され得る。通常、免疫化物質及び／又はアジュバントは、哺乳類に、皮下若しくは腹腔内の反復注射により注射されるであろう。抗体はまた、無傷の標的物タンパク質若しくはポリペプチドに対して、又は標的物タンパク質若しくはポリペプチドの断片、複合体を含む誘導体、若しくは細胞膜に包埋された標的物など他のエピトープに対して、又は抗体可変領域のライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーなどに対しても産生され得る。
【０１３６】
免疫化物質を、免疫化される哺乳類において免疫原性であることが公知であるタンパク質に複合することも有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。使用することができるアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコラート)を含む。当業者は過度の実験を行うことなく、免疫化プロトコールを選択することができる。
【０１３７】
一部の実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の方法を用い、調製することができる。本発明のモノクローナル抗体は、該抗体に対する免疫応答の開始(mounting)から宿主を保護するために「ヒト化」されてよい。「ヒト化抗体」は、その相補性決定領域(CDR)並びに／又は軽鎖及び／若しくは重鎖可変ドメインフレームワークの他の部分が、非-ヒト免疫グロブリンに由来するが、その分子の残余部分は、1以上のヒト免疫グロブリンに由来するものである。ヒト化抗体はまた、ドナー又はアクセプターの非修飾軽鎖又はキメラ軽鎖に会合されたヒト化重鎖、又はその逆を特徴とする抗体も含む。抗体のヒト化は、当該技術分野において公知の方法により達成することができる(例えば、Mark及びPadlanの文献、(1994)「実験薬理学ハンドブック(The Handbook of Experimental Pharmacology)」、113号の「第4章  モノクローナル抗体のヒト化」、Springer-Verlag社、New York参照)。トランスジェニック動物を使用し、ヒト化抗体を発現することができる。
【０１３８】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野において公知の様々な技術を使用し、作製することができる(Hoogenboom及びWinterの文献、(1991) J. Mol. Biol. 227:381-8；Marksらの文献、(1991) J. Mol. Biol. 222:581-97)。Coleらの技術及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Coleらの文献、(1985) 「モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R. Liss、77頁；Boernerらの文献、(1991). J. Immunol., 147(1):86-95)。
【０１３９】
単鎖抗体の作製のための当該技術分野において公知の技術は、標的物に対する単鎖抗体を作製するために適応させることができる。これらの抗体は、一価抗体であることができる。一価抗体の調製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現に関与している。重鎖は、重鎖の架橋を防止するために、一般にFc領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連のあるシステイン残基は、架橋を防止するために、別のアミノ酸残基により置換されるか、又は欠失される。
【０１４０】
二重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる抗原に、好ましくは細胞-表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに結合特異性を持つ、モノクローナル性であり、好ましくはヒト又はヒト化された抗体である。存在する場合、この結合特異性の一つは、標的物の一つのドメインについてであり；他方は、標的物の別のドメインについてである。
【０１４１】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。従来、二重特異性抗体の組換え作製は、2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を基にしており、ここで2つの重鎖は、異なる特異性を有する(Milstein及びCuelloの文献、(1983) Nature 305:537-9)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム類別のために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10種の異なる抗体分子の可能性のある混合物を作製し、そのただ一種のみが、正確な二重特異性構造を有する。アフィニティクロマトグラフィー工程は、通常この正確な分子の精製を実現する。同様の手順が、Trauneekerらの文献、(1991) EMBO J. 10:3655-9において明らかにされている。
【０１４２】
本発明の方法の特別な態様は、標的物ポリペプチドと選択的に相互作用することが可能である細胞内結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの誘導された発現により、標的物ポリペプチドの発現をダウンレギュレーション又はブロックすることに関連している。細胞内結合タンパク質は、そこで発現され且つポリペプチドの機能を中和する細胞内のポリペプチドと選択的相互作用又は結合することが可能である活性阻害性物質及び任意のタンパク質を含む。特に細胞内結合タンパク質は、配列番号:18-34の標的物ポリペプチドのエピトープへの結合親和性を有する抗体、特に中和抗体、又は抗体若しくは中和抗体の断片である。より特定すると、細胞内結合タンパク質は、単鎖抗体である。
【０１４３】
（医薬組成物、関連した使用及び方法）
標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又は断片、並びにアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される発現阻害性物質は、EMTに因果関係があるか又はこれに起因する哺乳類における状態の治療のために治療薬として使用することができる。
【０１４４】
本発明は、EMTに関連した疾患の治療において使用するための、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物に関する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患又は癌を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供する。
【０１４５】
特定の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法であって、標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又はそれらの断片を含有する1以上の医薬組成物の状態を治療する又は状態を予防する有効量を投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患又は癌を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供する。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該疾患は、癌腫である。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患の治療及び／又は発症予防において使用するための標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又はそれらの断片を提供する。具体的実施態様において、該疾患は、線維化疾患又は癌から選択される。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該疾患は、癌腫である。
【０１４７】
更に別の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患の治療又は発症予防のための医薬品の製造において使用するための、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体若しくはそれらの断片、又は標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体若しくはそれらの断片を含有する医薬組成物を提供する。具体的実施態様において、該状態は、線維化疾患又は癌から選択される。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該疾患は、癌腫である。
【０１４８】
本方法の特定の投与計画は、対象におけるEMTのレベルを低下するのに十分な期間、及び好ましくは該状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を、EMTに関連した疾患に罹患している対象へ投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、線維化疾患に罹患しているか又はこれを発症し易い対象患者へ、該患者におけるEMTに関連した疾患を各々軽減又は防止するのに十分な期間、及び好ましくは該状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を投与することを含む。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維化疾患又は癌である。
【０１４９】
本発明は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される、該物質を含有する組成物に更に関し、ここで該物質は、配列番号:1-17からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む。これらの物質は、そうでなければ本明細書において発現阻害性物質と称される。
【０１５０】
特定の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法であって、該発現阻害性物質を含有する1種以上の医薬組成物の状態を治療する又は状態を予防する有効量を投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患又は癌を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供する。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患の治療及び／又は発症予防において使用するための発現阻害性物質を提供する。具体的実施態様において、該疾患は、線維化疾患又は癌から選択される。特定の実施態様において、該状態は、癌腫である。
【０１５２】
更に別の態様において、本発明は、EMTに関連した疾患の治療又は発症予防のための医薬品の製造において使用するための、発現阻害性物質、又は該発現阻害性物質を含有する医薬組成物を提供する。具体的実施態様において、該疾患は、線維化疾患又は癌から選択される。
【０１５３】
本方法の特定の投与計画は、EMTのレベルを低下するのに十分な期間、及び好ましくは該疾患の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、発現阻害性物質の有効量を、EMTに関連した疾患に罹患している対象へ投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、EMTに関連した疾患に罹患しているか又はこれを発症し易い対象患者へ、該患者におけるEMTを各々軽減又は防止するのに十分な期間、及び好ましくは該疾患の原因となるEMTプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、該疾患は、線維化疾患又は癌である。
【０１５４】
特定の態様において、該線維化疾患は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病から選択される。
【０１５５】
別の態様において、該癌は、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、肥満細胞腫、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非-小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽細胞腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌及び子宮平滑筋肉腫から選択される。より具体的な態様において、該癌は、EMTに関連した及び／又は相関した癌、より特定すると癌転移である。
【０１５６】
本発明の別の態様は、標的物ポリペプチドの発現の阻害が可能であり且つ発現阻害性物質として説明されたポリヌクレオチドを発現することが可能なDNA発現ベクターを含有する組成物に関する。
【０１５７】
本発明は、標的物遺伝子の発現、具体的にはEMTに関連したそれらの標的物遺伝子の発現を調節するのに有用な、及び小型核酸分子を使用するRNA干渉(RNAi)によりそのような状態を治療するのに有用な、化合物、組成物、及び方法を提供する。特に本発明は、標的物遺伝子並びに／又は標的物遺伝子発現及び／若しくは活性の経路に関与した他の遺伝子の発現を調節するために使用される、小型核酸分子、すなわち、低分子干渉核酸(siNA)分子であり、非限定的に低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロ-RNA(miRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)及び環状RNA分子を含む方法を特徴としている。
【０１５８】
これらの組成物及び方法の特定の態様は、標的物と選択的に相互作用することが可能である細胞内結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの誘導された発現により、標的物の発現をダウンレギュレーション又はブロックすることに関する。細胞内結合タンパク質は、そこでポリペプチドが発現され且つその機能が中和される細胞内のポリペプチドと選択的に相互作用するか又は結合することが可能な任意のタンパク質を含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号:18-34からなる群から選択される標的物のエピトープに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は、単鎖抗体である。
【０１５９】
本発明の抗体は、単にボーラスとして、時間をかけた注入、又はボーラスとして及び時間をかけた注入の両方で投与されるよう、送達されてよい。当業者は、タンパク質についてよりもポリヌクレオチドについての様々な製剤を利用することができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【０１６０】
この組成物の特定の実施態様は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、配列番号:1-17からなる群から選択される標的物をコードしているポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号:1-17からなる群から選択される標的物をコードしているポリリボヌクレオチドの部分に十分に相同であり、その結果siRNA又はマイクロRNAは、標的物ポリリボヌクレオチドの標的物ポリペプチドへの翻訳と相互作用する低分子干渉RNA(siRNA)及びマイクロRNAからなる群から選択される発現-阻害する物質を含む。
【０１６１】
細胞において、発現阻害性物質を発現するポリヌクレオチド、又は標的物ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドは、特にベクター内に含まれる。このポリ核酸は、核酸配列の発現が可能なシグナルへ、機能的に連結され、且つ好ましくは一旦ベクターが細胞へ導入されるとアンチセンス核酸を発現する組換えベクター構築体を利用し細胞へ導入される。様々なウイルス-ベースのシステムが、利用可能であり、これはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスベクター系を含み、且つ全て、標的細胞において発現-阻害する物質のポリヌクレオチド配列又は標的物ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを導入及び発現するために使用され得る。
【０１６２】
特に、本発明の方法において使用されるウイルスベクターは、複製欠損である。そのような複製欠損のベクターは、感染細胞内でのウイルスの複製に必要である少なくとも1つの領域を通常パッケージしているであろう。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術により、除外するか(全体又は一部)、又は非機能性とするかのいずれかであることができる。これらの技術は、全体の除去、置換、部分欠失又は必須(複製に)領域への1以上の塩基の付加を含む。そのような技術は、遺伝子操作技術を使用するか又は変異誘発剤による処理により、インビトロにおいて(単離されたDNAにおいて)又はインサイチュにおいて行うことができる。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子を封入するのに必要である、そのゲノムの配列を保持する。
【０１６３】
好ましい実施態様において、ウイルスエレメントは、アデノウイルスに由来している。好ましくは、ビヒクルは、アデノウイルスキャプシドにパッケージされたアデノウイルスベクター、又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体を含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よくわかっている。アデノウイルスベクターに関する多くのツールが存在し、且つ開発され続けており、結果的に、アデノウイルスキャプシドを、本発明のライブラリーの組込みのための好ましいビヒクルとしている。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染することが可能である。しかし、異なるアデノウイルス血清型は、細胞に関する異なる選好を有する。本発明のアデノウイルスキャプシドを好ましい実施態様に入れることができる標的細胞集団と一緒にし且つ拡大するために、ビヒクルは、少なくとも2種のアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含む。好ましいアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型17、45及び51である。これらのキメラベクターの技術又は構築及び発現は、US 2003/0180258及びUS 2004/0071660に開示されており、これらは引用により本明細書中に組み込まれている。
【０１６４】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルス後期タンパク質又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス線維タンパク質は、ある種の細胞にビヒクルを標的化するため、又は細胞へのビヒクルの増強された送達を誘導するために使用されることが好ましい。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスキャプシド全体又はそれらの機能性部分、それらの類縁体、及び／若しくは誘導体を形成することができる、全てのアデノウイルス後期タンパク質を本質的にコードしている。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスE2A又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞においてアデノウイルス由来の核酸の少なくとも一部の複製を促進する、少なくとも1種のE4-領域タンパク質又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。本出願の実施例において使用されるアデノウイルスベクターは、本発明の治療法において有用なベクターの例である。
【０１６５】
本発明のいくつかの実施態様は、レトロウイルスベクターシステムを使用する。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスであり、それらの構築は当該技術分野において公知である。レトロウイルスベクターは、MoMuLV(“モロニーマウス白血病ウイルス”)、MSV(“モロニーマウス肉腫ウイルス”)、HaSV(“ハーベイ肉腫ウイルス”)；SNV(“脾臓壊死ウイルス”)； RSV(“ラウス肉腫ウイルス”)及びフレンドウイルスなどの、様々な型のレトロウイルスから構築され得る。レンチウイルスベクターシステムも、本発明の実践において使用され得る。
【０１６６】
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス(“AAV”)が利用される。AAVウイルスは、感染細胞のゲノムへ安定した位置指定様式で組込まれる、比較的サイズが小さいDNAウイルスである。これらは、細胞の成長、形態又は分化にいかなる作用も誘導することなく、細胞の幅広いスペクトルに感染することができ、且つヒト病理に関与するようには見えない。
【０１６７】
先に考察したように、組換えウイルスを使用し、本発明において有用なポリヌクレオチド物質をコードしているDNAを導入することができる。本発明の組換えウイルスは、概して、投与量約104〜約1014pfuの形状に製剤化され且つ投与される。AAV及びアデノウイルスの場合、約106〜約1011pfuの投与量が特に使用される。用語pfu(“プラーク形成単位”)は、ビリオン浮遊液の感染力に対応しており、且つこれは好適な細胞培養物を感染させ、形成されたプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定する技術は、先行技術において良く説明されている。
【０１６８】
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド物質は、1以上の調節領域に連結されてよい。好適な1又は複数の調節領域の選択は、慣習的な様式であり、当業者のレベル内である。調節領域は、プロモーターを含み、且つエンハンサー、サプレッサーなどを含むことができる。
【０１６９】
本発明の発現ベクターにおいて使用することができるプロモーターは、構成的プロモーター及び調節された(誘導性)プロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主に応じて原核又は真核であることができる。本発明の実践に有用な原核生物(バクテリオファージを含む)プロモーターを挙げると、lac、lacZ、T3、T7、ラムダPr、P1、及びtrpプロモーターがある。本発明の実践に有用な真核生物(ウイルスを含む)プロモーターを挙げると、偏在性プロモーター(例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン)、治療的遺伝子プロモーター(例えば、MDR型、CFTR、VIII因子)、組織特異性を発揮し且つトランスジェニック動物において利用される動物転写制御領域を含む組織-特異性プロモーター、例えば、マスト細胞において活性のあるキマーゼ遺伝子制御領域(Liaoらの文献、(1997), Journal of Biological Chemistry, 272,: 2969-2976)、リンパ球様細胞において活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlらの文献、(1984) Cell 38:647-58；Adamesらの文献、(1985) Nature 318:533-8；Alexanderらの文献、(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44)、精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞において活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederらの文献、(1986) Cell 45:485-95)、骨髄細胞において活性のあるβグロビン遺伝子制御領域(Mogramらの文献、(1985) Nature 315:338-40；Kolliasらの文献、(1986) Cell 46:89-94)、CMVプロモーター及びビスナLTR(Sidiropoulosらの文献、(2001), Gene Therapy, 8:223-231)がある。
【０１７０】
本発明の実践において使用することができる他のプロモーターは、分裂細胞において優先的に活性化されるプロモーター、刺激に反応するプロモーター(例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体)、テトラサイクリン-調節される転写モジュレーター、サイトメガロウイルス最初期、レトロウイルスLTR、メタロチオネイン、SV-40、E1a、及びMLPプロモーターを含む。本発明の実践において使用することができる更なるプロモーターは、樹状細胞、単球、好中球、マスト細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞などの炎症に寄与するマクロファージ又は他の細胞型において、活性があり及び／又は発現されるプロモーターを含む。 
【０１７１】
追加のベクターシステムは、ポリヌクレオチド物質の患者への導入を促進する非-ウイルスシステムを含む。例えば、所望の配列をコードしているDNAベクターは、リポフェクションによりインビボにおいて導入され得る。リポソーム-媒介性トランスフェクションで遭遇された困難を制限するように設計された合成カチオン脂質を使用し、マーカーをコードしている遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる(Felgnerらの文献、(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7)；Mackeyらの文献、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31；Ulmerらの文献、(1993) Science 259:1745-8を参照)。カチオン脂質の使用は、負帯電された核酸の封入を促進し、また負帯電された細胞膜との融合を促進することができる(Felgner及びRingoldの文献、(1989) Nature 337:387-8)。核酸の導入に特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許公報WO 95/18863及びWO 96/17823、並びに米国特許第5,459,127号に開示されている。インビボにおいて特定の臓器へ外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実践的利点を有し、トランスフェクションを特定の細胞型に指示することは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳などの、細胞が不均一な組織において特に利点である。脂質は、標的化を目的として、他の分子と化学的に結合されてよい。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体、又は非-ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合され得る。例えば、陽イオン性オリゴペプチド(例えば国際特許公報WO 95/21931)、DNA結合タンパク質由来のペプチド(例えば国際特許公報WO 96/25508)、又は陽イオン性ポリマー(例えば国際特許公報WO 95/21931)など、他の分子も、インビボにおいて核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。
【０１７２】
裸のDNAプラスミドとして、インビボにおいてDNAベクターを導入することも可能である(米国特許第5,693,622号、第5,589,466号及び第5,580,859号参照)。治療目的の裸のDNAベクターは、当該技術分野において公知の方法、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、又はDNAベクター輸送体の使用などにより、所望の宿主細胞へ導入することができる(例えば、Wilsonらの文献、(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7；Wu及びWuの文献、(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4；Hartmutらの1990年3月15日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号；Williamsらの文献、(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照)。受容体-媒介性DNA送達法も、使用することができる(Curielらの文献、(1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54；Wu及びWuの文献、(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32)。
【０１７３】
生物学的に適合性のある組成物は、固形、液体、ゲル、又は他の形状であることができる組成物であり、そこでは本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、及び抗体は、活性のある形状で、例えば生物活性に作用することが可能な形状で維持される。例えば、本発明の化合物は、標的物に対する逆のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有し；核酸は、標的物のメッセージを複製、翻訳するか、又はその相補的mRNAにハイブリダイズすることができ；ベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、且つ前述のアンチセンス、抗体、リボザイム又はsiRNAを発現することができ；抗体は、標的物ポリペプチドドメインに結合する。
【０１７４】
特定の生物学的に適合性のある組成物は、塩イオンを含有する、例えばトリス、リン酸塩、又はHEPES緩衝液などを用い緩衝されている水溶液である。通常塩イオン濃度は、生理的レベルに類似している。生物学的に適合性のある溶液は、安定化剤及び保存剤を含んでよい。より好ましい実施態様において、生体適合性のある組成物は、医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、皮下、及び眼球内経路による投与のために製剤化され得る。非経口的投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射又は輸注技術を含むことを意味する。この組成物は、望ましいならば標準の周知の無毒の生理的に許容し得る担体、アジュバント及びビヒクルを含有する単位用量製剤で非経口的に投与されてよい。
【０１７５】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で当該技術分野において周知の医薬として許容し得る担体を使用し、製剤化することができる。そのような担体は、患者により摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化された医薬組成物であることができる。経口使用のための医薬組成物は、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、活性化合物を固形賦形剤と一緒にし、任意に得られた混合物を粉砕し、且つ望ましいならば好適な賦形剤の添加後に、顆粒の混合物を処理することにより調製することができる。好適な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールを含む糖質；トウモロコシ、小麦、コメ、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、又はカルボキシメチル-セルロースナトリウムなどの、セルロース；アラビアゴム及びトラガカントを含むガム；並びに、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質である。望ましいならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの、崩壊剤又は可溶化剤を添加してもよい。糖衣錠コアは、濃縮された糖溶液などの好適なコーティングと複合して使用することができ、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニル-ピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー液、及び好適な有機溶媒若しくは溶媒混合物も含むことができる。製品識別のため、又は活性化合物の量、すなわち用量を特徴づけるために、染料又は顔料を、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０１７６】
経口的に使用することができる医薬調製品は、ゼラチンで製造されたプッシュ-フィットカプセル、並びにゼラチンとグリセロール又はソルビトールなどのコーティングで製造された軟密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、乳糖又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意に安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定剤を含む又は含まずに、脂肪油、液体、又は液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解又は懸濁することができる。
【０１７７】
特定の無菌注射用調製品は、無毒の非経口的に許容し得る溶媒又は希釈剤中の溶液又は懸濁液であることができる。医薬として許容し得る担体の例は、食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水(例えば、リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム、又はそのような塩の混合物)、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、並びにそれらの組合せである。1,3-ブタンジオール及び無菌の不揮発性油は、好都合なことに溶媒又は懸濁媒体として利用される。合成モノ-又はジ-グリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を利用することができる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射用調製品における使用が認められる。
【０１７８】
本発明の化合物又は組成物は、高分子担体(類)、生分解性若しくは生体模倣マトリクスとの又はスカフォールドとの投与と組み合わせるか又はそれらの中に包埋することができる。担体、マトリクス又はスカフォールドは、組成物が組込み及び発現されることを可能にし、且つ細胞の添加又は細胞の存在と適合性がある任意の物質であることができる。特に、担体マトリクス又はスカフォールドは、主として非免疫原性であり、且つ生分解性である。生分解性物質の例としては、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、ヒアルロン酸、腸線縫合糸材料、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、アルギン酸塩、綿又は他の天然に存在する生分解性物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。マトリクス又はスカフォールド材料を、投与又は移植前に、例えばエチレンオキシドによる処理又はγ線照射又は電子線照射により、滅菌することは好ましい。加えて、以下を含むが、これらに限定されるものではない多くの他の材料を、スカフォールド又はフレームワーク構造を形成するために使用することができる：ナイロン(ポリアミド)、ダクロン(ポリエステル)、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物(例えばポリ塩化ビニル)、ポリカーボネート(PVC)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE、テフロン)、サーマノックス(TPX)、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、及びポリ乳酸-グリコール酸(PLGA)などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、及び様々なポリヒドロキシアルカン酸エステル、並びにそれらの組合せ。適したマトリクスは、高分子メッシュ又はスポンジ及び高分子ヒドロゲルを含む。特定の実施態様において、マトリクスは、1年未満の期間かけて、より特定すると6ヶ月未満かけて、最も特定すると2〜10週間かけて、生分解性である。このポリマー組成物並びに製造方法は、分解速度を決定するために使用することができる。例えば、漸増量のポリ乳酸とポリグリコール酸の混合は、分解時間を短縮する。使用することができるポリグリコール酸のメッシュは、例えば、手術用備品会社(例えば、Ethicon社、N.J)から、商業的に入手することができる。概して、これらのポリマーは、水、緩衝された塩溶液などの水溶液、帯電された側基を有する水性アルコール溶液、又はそれらの一価のイオン性塩中に、少なくとも部分的に可溶性である。
【０１７９】
組成物媒体はまた、薬物吸収スポンジとして働くことができる親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの、任意の生体適合性又は非-細胞毒性のホモ-又はヘテロ-ポリマーから調製されるヒドロゲルであることができる。特にエチレン及び／又はプロピレンオキシドから得られるものなど、それらのいくつかは、商業的に入手可能である。ヒドロゲルは、例えば外科的介入時に、治療される組織の表面上に直接沈着され得る。
【０１８０】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明の物質をコードしている複製欠損組換えウイルスベクター及びポロキサマーなどのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロキサマーの例は、市販されている、無毒の生体適合性のあるポリオールであるポロキサマー407(BASF社、Parsippany, N.J.)である。組換えウイルスにより含浸されたポロキサマーは、例えば外科的介入時に、治療される組織の表面上に直接沈着されてよい。ポロキサマーは、ヒドロゲルと本質的に同じ利点を有するが、より低い粘度を有する。
【０１８１】
本活性物質は、例えば各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルなど、例えば界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルション中に、閉じ込められることもできる。そのような技術は、「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(1980)、第16版、Osol, A.編集において明らかにされている。
【０１８２】
持続放出調製品を調製することができる。持続放出調製品の適例は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、成形された製品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成された注射用ミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間以上にわたり分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内に留まる場合、これらは37℃での湿潤への曝露の結果として変性するか又は凝集し、結果的に生物活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。論理的戦略を、関与した機序に応じた安定化のために考案することができる。例えば凝集機序が、チオ-ジスルフィド交換を介した分子間S-S結合形成であることがわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、好適な添加剤の使用、及び具体的ポリマーマトリクス組成物の開発により達成され得る。
【０１８３】
本明細書において使用される治療的有効量は、症状又は状態を改善する、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストの量を意味する。そのような化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における、例えば、ED50(集団の50％における治療効果用量)及びLD50(集団の50％の致死量)など、標準調剤手順により決定することができる。致死量対治療効果用量の比は、治療指数であり、且つこれは比LD50／ED50として表すことができる。大きい治療指数を示す医薬組成物は、特別である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒト使用のための用量範囲の処方において使用される。そのような化合物の用量は、特に毒性がほとんど又は全くないED50を含む、循環濃度の範囲内に存在する。用量は、利用される剤形、患者の感受性、及び投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【０１８４】
任意の化合物に関して、治療的有効量は、細胞培養アッセイ、又は通常マウス、ウサギ、イヌ又はブタの動物モデルのいずれかで、最初に推定され得る。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲及び投与経路を実現するために使用される。その後そのような情報を使用し、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。正確な用量は、治療される患者の観点から個々の医師により選択される。用量及び投与は、活性部分の十分なレベルを提供するか又は所望の作用を維持するように、調節される。考慮され得る追加の因子は、患者の病態の重症度、年齢、体重及び性別；食餌、治療の望ましい期間、投与方法、投与の時間と頻度、併用薬(複数可)、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応を含む。長期間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度を基に、3〜4日毎、毎週、又は2週間に1回投与されてよい。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は、様々な方法で対象へ投与することができる。これらは、当該技術分野において公知の他の方法により、標的化された組織へ直接添加されるか、カチオン脂質と複合されるか、リポソーム内にパッケージされるか、又は標的化された細胞へ送達されてよい。所望の組織への局所投与は、直接注射、経皮吸収、カテーテル、注入ポンプ又はステントにより行うことができる。DNA、DNA／ビヒクル複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に局所的に投与される。代替の送達経路は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口(錠剤又は丸剤の形状)、局所的、全身的、眼球、腹腔内及び／又は髄腔内送達を含むが、これらに限定されるものではない。リボザイム送達及び投与の例は、SullivanらのWO 94/02595に提供されている。
【０１８６】
本発明の発現-阻害する物質又は抗体の対象患者への投与は、自己投与及び他者による投与の両方を含む。患者は、マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化により影響される、存在する疾患若しくは医学的状態について治療の必要性があるか、又は疾患及び医学的状態を予防若しくはリスクを低減するために、発症予防的処置が望まれ得る。本発明の発現阻害性物質は、対象患者へ、経口、経皮、吸入により、注射、経鼻、経直腸又は持続放出製剤により、送達され得る。
【０１８７】
（インビトロ方法）
本発明はまた、EMTを阻害するインビトロ方法も提供し、該方法は、上皮細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させることを含む。特定の実施態様において、該インヒビターは抗体である。代替の実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。
【０１８８】
本発明は更に、EMTを阻害するインビトロ方法に関し、該方法は、上皮細胞の集団を、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択されるインヒビターと接触させることを含み、ここで該インヒビターは、標的物ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列と相補的又はこれから操作された核酸配列を含む。
【０１８９】
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写レベルで実現され得る。本発明のアンチセンス核酸は、特に標的物ポリペプチドをコードしている核酸又は対応するメッセンジャーRNAの全て又は一部と、特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸断片である。加えて、その一次転写物のスプライシングを阻害することにより、標的物ポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列の発現を減少するアンチセンス核酸が設計され得る。標的物をコードしている核酸の発現をダウンレギュレーション又はブロックすることが可能である限りは、任意の長さのアンチセンス配列が、本発明の実践に適している。特に、アンチセンス配列は、長さが、少なくとも約15〜30、特に少なくとも17ヌクレオチドである。アンチセンス核酸の調製及び使用、アンチセンスRNAをコードしているDNA、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は、当該技術分野において公知である。
【実施例】
【０１９０】
（実施例）
本発明は、以下に提供される実施例を使用し、更に例示される。実施例は、慣習的適合を使用し、特定の型の条件、規模又は細胞型に容易に改変及び適合させることができることは、当業者には明らかであろう。
【０１９１】
実施例1は、EMT一次アッセイの設定、及び該アッセイを使用する一次スクリーンを説明する。
【０１９２】
実施例2は、実施例1の一次スクリーンからのヒットの再-スクリーンを説明する。
【０１９３】
実施例3は、EMT2バリデーションアッセイを説明する。
【０１９４】
実施例4は、追加のshRNA構築体を使用する「オン標的」バリデーション、及びshRNA構築体の毒性評価を説明する。
【０１９５】
実施例5は、同定されたヒットをバリデートするためのATPlite二次毒性アッセイを説明する。
【０１９６】
実施例6は、HBECにおける全トランスクリプトーム配列決定を説明する。
【０１９７】
（実施例1.  EMTアッセイ一次スクリーン）
（1.1  バックグラウンド）
気道リモデリング及び線維症は、線維症の病理の重要な特徴である。上皮間葉移行(EMT)は、線維芽細胞-様細胞の数の増加及び線維症に繋がるコラーゲンの過剰生成における機序として提唱されている。いくつかの研究が、EMTは、TGFβへの曝露時に、ヒト肺上皮細胞株及び初代気管支上皮細胞において起こり得ることを明らかにしている。EMTのいくつかの共通マーカーを使用する特別なTGFβ-誘導性EMTアッセイが、初代ヒト気管支上皮細胞(HBEC)において開発された。
【０１９８】
（1.2  細胞培養及びドナー）
HBECは、Dept of Pulmonology(LUMC、ライデン、オランダ)から入手した。HBECは、肺腫瘍の手術を受けた患者の肺切除組織に由来した。気管支上皮細胞を、プロテアーゼ消化により単離し、予め説明されたように培養した(van Weteringの文献、2000)。3名のドナーを、全ての実験を通じて使用した。一次スクリーン及びオン-標的分析には、ドナーBr299を使用し、再スクリーンには、ドナーBr291を、及び二次アッセイにおける標的バリデーションには、ドナーBr282を使用した。3名のドナーは全員、COPD患者であった。
【０１９９】
表2：実施例を通じて使用したドナーのまとめ
【表２】
2016522675.tif 000004
【０２００】
（1.3  FN及びMMP10リードアウト）
MMPは、細胞外マトリクス(ECM)タンパク質を切断する能力を有する。これらのタンパク質はまた、コラーゲン、及びフィブロネクチンなどの他のタンパク質、線維症を引き起こす誘発時に瘢痕組織を構成することが分かっているタンパク質を含むことができる。MMPの中で、MMP10は、ECMの切断に関与し、従って、関心対象のMMP-誘導する線維症経路を説明するバリデーションにおけるリードアウトとして使用される。MMP10は、MSDにより試験した。増加したレベルのMMP10は、COPDドナー及び非-COPDドナーの両方において、NTHiによる誘発時に検出される。
【０２０１】
FN及びMMP10は、SECTOR(登録商標)イメージャー6000装置(MSD社)上のメソスケールディスカバリープラットフォーム(MSD)を用い測定した。MMP10は、MSD (製品番号L211A-1、MSD社)からの特注のアッセイを、製造業者の指示に従い用いて測定した。FNは、研究室で開発したアッセイを用いて測定した。これにMSD 384-ウェル標準プレート(製品番号L21XA-4、MSD社)を、抗-ヒトFN1捕獲抗体(製品番号AF1918、R&D Systems社)によりコーティングした。試料の添加後、ビオチン化された抗-ヒトFN1検出抗体(製品番号BAF1918、R&D Systems社)及び引き続きSULFO-TAG-ストレプトアビジン(製品番号R32AD-5、MSD社)を添加した。更なるシグナル検出を、SECTOR(登録商標)イメージャー6000装置(MSD社)において標準の製造業者の推奨に従い行った。
（1.4  トリガー）
UV照射した無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザ(NTHi)のバッチを作製した。細菌を、2.9×108/mL(NTHi)のアリコートにおいて照射し、使用時まで-80℃で貯蔵した。0.5ng/mL TGFβ-1、5ng/mL TNFα及び0.5×107 UV-死滅させたNTHi細菌/mLの組合せを、細胞を誘発するために使用した。
【０２０２】
（1.5  陽性対照及び陰性対照）
ホタルルシフェラーゼを標的化する3種の陰性対照(ffluc_v19、ffluc_v21、ffluc_v24)、及び5種の陽性対照shRNAウイルス(SMAD3_v3、SMAD4_v5及びv7、TGFβR1_v1及びTGFβR2_v7)を、カラム7の各ライブラリープレートに添加した。
【０２０３】
表3：一次スクリーンに使用した対照のまとめ
【表３】
2016522675.tif 000005
【０２０４】
（1.6  統計的受入れ基準）
一次スクリーンソースプレートの受入れ基準は、下記であった：
・スピアマン相関＞0.4又はカッパ値＞0.2
・リードアウトとして分泌型フィブロネクチン(FN)を使う一次スクリーンに使用した少なくとも1種の陽性対照は、2つ組でIQR＜-1.5を有するものとする
・分泌型フィブロネクチンFNを使う一次スクリーンに使用した3種の陽性対照(P1、P2、P5)中2種は、陰性対照ウイルスの平均と比べ＞40％の阻害を生じるものとする
・リードアウトとして分泌型MMP10を使う一次スクリーンに使用した少なくとも3種の陽性対照は、2つ組でIQR＜-1.5を有するものとする。
【０２０５】
これらの基準を満たさなかったプレートは、再度、再スクリーンした。
【０２０６】
（1.7  プロトコール）
12,000種以上のアデノウイルスshRNA構築体を含むアデノウイルスライブラリーを、一次スクリーンにおいてスクリーニングした。完全スクリーンは、143×96-ウェルプレートからなり、生物学的2つ組で行った。EMTアッセイの概略図は、図1に示している。
【０２０７】
一次スクリーンは、COPDドナーBr299のHBECにおいて6個のバッチにおいて行った。EMTアッセイは、2500個細胞/ウェルの密度で播種したCOPDドナーから得られたヒト気管支上皮細胞(HBEC)において行った。アデノウイルス形質導入は、細胞播種後1日目に行った。EMTを誘導する選択したトリガー組合せ(0.5ng/mL TGFβ1＋5ng/mL TNFα＋0.5×107 UV-死滅させたNTHi細菌/mL)を、形質導入後5日目に添加した。上清を細胞の誘発後3日目に収集した。フィブロネクチン(FN)及びマトリクス・メタロプロテイナーゼ-10(MMP10)濃度を、MSDプラットフォームを用いて測定した。FNは、主要リードアウトと考えた。
【０２０８】
MOI 4を使用し、これらの細胞を、アデノウイルスライブラリーにより形質導入した。各スクリーンバッチは、対照パネル及び非形質導入条件を含む余分なプレートを含んだ。各バッチの完了後、FN及びMMP10を余分なプレートで測定し、これらの結果を全バッチに関する品質チェックとして利用した。6個のバッチ全てのデータ解析の完了後、1.6に記載の受入れ基準に合致しなかった35プレートは反復することを決定した。
【０２０９】
（1.8  データ解析）
どの統計学的方法をデータ解析に使用するかを決定するために、全てのデータ点の度数分布プロットを作製した。この度数分布プロットは、歪みのある非ガウス分布を示す。従って四分位範囲(IQR)-ベースの正規化法が、最も適用可能であり、その理由はこの方法は、異常値に対し感度が低いからである。IQR法は、データ分散の測定として中央値(Q2)及び四分位範囲(Q3-Q1)を使用する。高度に歪みのあるデータセットを解析する場合、インヒビター又はアクチベーターのいずれが興味深いかに応じ、各々、例えば中央値及び(Q1-Q2)又は中央値及び(Q3-Q2)のデータ拡散の代替測定を採用することが可能である。カットオフ値の選択は、誤差率(ヒットを非ヒットとして同定する確率)を決定する。
【０２１０】
（1.9  結果）
図2において、一次スクリーンにおいて評価したフィブロネクチン及びMMP10のリードアウトに関する全てのソースプレートの生物学的2つ組のドットプロットを示している。陰性対照と陽性対照の間の分離は、両方のリードアウトについて観察された。表4に、一次スクリーンに関するアッセイパラメータの概要を示している。両方のリードアウトについて、平均スピアマン相関は、0.4を上回り、且つ平均カッパ値は、0.2を上回った。IQRカットオフ値-1.5での平均ヒット率は、FN及びMMP10について、各々、5.5％及び8.5％であった。
【０２１１】
表4：IQRカットオフ値-1.5での一次スクリーンにおけるFN及びMMP10に関するヒット率及び相関パラメータ 
【表４】
2016522675.tif 000006
【０２１２】
結論において、一次スクリーンは、陽性対照ウイルスと陰性対照ウイルスの間の明確な分離、並びに相関パラメータ(スピアマン相関値及びカッパ統計値を使用)を明らかにした。IQRカットオフ値-1.5を下回るスコアを伴う全てのダブルFNヒットを含む構築体(n＝695)、IQRカットオフ値-1.3を下回るFNに関するダブルヒットであり、且つIQRカットオフ値-1.5を下回るMMP10に関するダブルヒットである追加の構築体(n=142)が、選択された。これらのヒットの2つのセットから、104のヒットの重複が存在し、従って591のダブルの独自のFNヒットが同定された。この一次スクリーンから、733種のウイルス(スクリーニングされたウイルス総数の5.9％)を、再-スクリーンに進めた。
【０２１３】
表5：ヒットコーリングオプションのまとめ。ヒットコーリングに使用したカットオフ値は、FNに関してIQR＜-1.5又は-1.3、及びMMP10に関してIQR＜-1.5である。ダブルは、両方の生物学的2つ組が、IQRカットオフ値を下回ることを示している。
【表５】
2016522675.tif 000007
【０２１４】
（実施例2.  EMTアッセイを使用する再-スクリーン）
（2.1  バックグラウンド）
再-スクリーンにおいて、一次スクリーンからのヒットを、異なるCOPD HBECドナーであるBr291について新たに再増殖されたウイルスを使用し、再度スクリーニングした。
【０２１５】
（2.2  陽性対照及び陰性対照及びプレートレイアウト）
アッセイ設定は、一次スクリーンに類似したものを維持したが、異なるプレートレイアウトを伴った。陰性対照の分布を基にしたヒットコーリングを可能にするために、プレートレイアウトは、少なくとも30％の陰性対照を含んだ。5種の陽性対照は、再-スクリーンについても使った(表6参照)。再-スクリーンにおいて使用したプレートレイアウトは、図3に示している。陽性対照TGFβR1_v1は、FN1_v3と交換した。このshRNA対照は、FNリードアウトにおける陽性対照として使用したが、MMP10リードアウトにおいては使用しなかった。
【０２１６】
表6：EMT再-スクリーンに使用した対照のまとめ
【表６】
2016522675.tif 000008
【０２１７】
（2.3  再-スクリーンプロトコール）
一次スクリーンからの733のヒットウイルスを、14×96-ウェルプレートからなる1バッチにおいて試験した。再-スクリーンは、一次スクリーンと同じプロトコールを使用し(実施例1)、生物学的2つ組で行った。
【０２１８】
（2.4  データ解析）
データ解析に関して、FN及びMMP10生データは、対数変換し、引き続き陰性対照を基にしたロバストZスコアを用い、正規化した。ロバストZスコアは、リードアウト値から陰性対照の中央値を減算したものを陰性対照のMAD(中央絶対偏差値)で除算することにより計算した。陽性対照の93％及び96％は、各々、FN及びMMP10に関する2つ組のカットオフ値-2を下回り、且つほとんどの陰性対照は、2つ組においてカットオフ値-2を上回るので、ロバストZ-スコアのカットオフ値-2を選択した。FNは、主要リードアウトであり、従ってヒットコーリングに関してFN結果のみを使用することを決定した。
【０２１９】
（2.5  結果）
図4において、再スクリーンの対照性能が示されている。両方のリードアウトについて、陽性対照と陰性対照の明らかな分離が認められた。MMP10リードアウトの陰性対照の値は、非形質導入試料よりも低かったが、このことはFNリードアウトについては認められなかった。生物学的反復の間に高い相関が認められ、平均スピアマン順位相関係数値は、FNに関して0.84(0.68〜0.89)及びMMP10に関して0.92(0.58〜0.98)であった。
【０２２０】
表7に、ロバストZ-スコアカットオフ値-2を使用する再スクリーンにおける、対照性能及びヒット率のまとめを提示している。このカットオフ値を使用し、447種のFNダブルヒットを選択した。配列決定時に、これらのヒットの12種は除外した。従って、合計438種の確認された候補標的を、標的バリデーションに進めた。
【０２２１】
表7：ロバストZ-スコアカットオフ値-2を使用するEMT1再スクリーンにおける、FN及びMMP10リードアウトに関する対照性能及びヒット率のまとめ
【表７】
2016522675.tif 000009
* 陽性対照FN1_v3は、この計算から除外した
【０２２２】
（実施例3.  EMT2バリデーションアッセイ）
（3.1  バックグラウンド）
リードアウトとして細胞マーカーを使用するEMTアッセイ(EMT2と称す)を、再-スクリーンにおいて438種の確認された候補標的物をバリデーションするための、二次アッセイとして利用した。この二次アッセイの目的は、抗-FN抗体及び抗-E-カドヘリン抗体による免疫染色後の、InCell 2000装置(GE Healthcare社)上のハイコンテンツイメージングにより測定した、E-カドヘリン及びフィブロネクチンの異なるリードアウトの細胞発現率を使用し、EMTアッセイにおける再-スクリーンにおいて同定された標的をバリデーションすることであった。
【０２２３】
（3.2  細胞及びドナー）
ドナーBr282を、バリデーションスクリーンに使用した。細胞は、実施例1に記載したプロトコールに従い入手した。
【０２２４】
（3.3  対照及びプレートレイアウト）
再スクリーンプレートのレイアウトを基にしたレイアウトは、プレート効果又は周縁効果を減少するために、96-ウェルプレートの60個の内側ウェルを使用した(図5)。更に、ヒットコーリングを促進するために、プレートの30％は陰性対照に使用した。これらの対照の改善された分布は、プレート作用のより良い解析を可能にした。ウェルG02は、試料を含まなかったが、9個のソースプレートについて偽形質導入された。
【０２２５】
（3.4  リードアウト）
EMTバリデーションアッセイとは異なるリードアウトを、使用した。E-カドヘリンとフィブロネクチンの比(Ecad/FN)を、EMTに関するリードアウト指標として選択した。
【０２２６】
（3.5  プロトコール）
バリデーションアッセイはトリガーの添加後、細胞を、PBS中の4％ホルムアミドにより72時間固定し、引き続きFN及びE-カドヘリンの細胞発現を、InCell 2000装置上で、ハイコンテンツイメージングを使用し測定したこと以外は、一次スクリーンアッセイ(実施例1)と同様に行った。
【０２２７】
（3.6  データ解析）
対照性能を、データ分布の解析により、更に評価した。バリデーションスクリーンの対照及び試料は、対数正規分布を示し、従って解析前に対数変換した。次にロバストZ-スコアを、リードアウト値から陰性対照の中央値を減算したものを陰性対照のMAD(中央絶対偏差値)で除算することにより計算した。
【０２２８】
（3.7  結果）
平均スピアマン順位相関係数0.7(範囲0.57〜0.81)を、予め設定したカットオフ値0.4を超えた全てのソースプレートについて認めた。ロバストZ-スコアカットオフ値-1.1でのバリデーションスクリーンの、対照ヒット率及び試料ヒット率のまとめを、表xxに提示している。強力なシングルヒットであったが、生物学的反復ヒットがこのカットオフ値を通過しなかった一部の追加標的は、ヒット選択に含んだ。陰性対照の平均を下回った反復との強力なヒットを含むよう、閾値を、各反復セットについて設定した(反復1：-1.92及び＜0、反復2：＜0及び-1.32)。これらのカットオフ値を使用し、96種のヒットを選択した。これらのヒットの配列解析は、配列においてリードスルーを伴う1種のウイルス及び標的RNAがタンパク質をコードしなかった1種のウイルスを明らかにした。補正後、これは、94種の標的を生じ、これらをオン標的解析に進め、且つバリデーションされた候補標的と称した。
【０２２９】
表8：EMT2バリデーションスクリーンに関する対照性能及びヒット率のまとめ
【表８】
2016522675.tif 000010
【０２３０】
（実施例4.  オン-標的アッセイ及び毒性評価）
（4.1  バックグラウンド）
EMT2バリデーションアッセイにおいて同定された94種の確認された候補標的物を、オン標的スクリーンにおける評価のために選択した。当業者に公知の技術及び方法を使用し、同じ標的に対する複数のアデノウイルス-shRNA構築体(平均5種)を作出した。確認された候補標的は、少なくとも2つの独立したshRNA構築体(オリジナルのshRNA構築体を含む)が、一次スクリーンに類似しているオン標的アッセイにおいてヒットとして同定された場合に、オン標的と考えた。従って、新たに増殖された構築体を、EMT1アッセイにおいて試験した。
【０２３１】
オン標的活性の試験に加え、細胞生存度を、Promega社からのCell Titer Blue(登録商標)(CTB)細胞生存度アッセイを行うことにより、同じアッセイで評価した。細胞生存度は、毒性作用に起因した偽陽性を除外するために試験した。確認された候補標的は、非形質導入細胞と比べ、30％未満の細胞毒性を有することとする。Cell Titer Blue(登録商標)アッセイは、生存細胞の、590nmでレドックス色素レサズリンを蛍光生成物レソルフィンに変換する能力を基にしている。より生存力のある細胞が存在する場合、より高い蛍光シグナルが測定される。
【０２３２】
（4.2  細胞及びドナー）
COPDドナーBr299由来のHBECを、オン標的スクリーンにおいて使用し、且つ実施例1と同じプロトコールを使用し入手した。
【０２３３】
（4.3  陽性対照及び陰性対照）
表9：「オン標的」アッセイにおいて使用した陽性対照及び陰性対照のまとめ
【表９】
2016522675.tif 000011
【０２３４】
（4.4  「オン標的」スクリーンに関するスクリーニングプロトコール）
アッセイは、図6に示したように設定した。96種のオリジナルのヒットを含む、94種の遺伝子(18ソースプレート)を標的化する616種のshRNAウイルスのセットを、オン標的スクリーンにおいて試験した。再スクリーンと同様のプレートレイアウトを使用した(図7)。陰性対照の分布を基にしたヒットコーリングを可能にするために、プレートフォーマットは、少なくとも30％の陰性対照を含んだ。オン標的スクリーンに含まれたshRNAの可能性のある細胞毒性作用の決定を可能にするために、スタウロスポリン標準曲線を、各ソースプレート上で使った。CTB蛍光により測定された細胞生存度の30％の低下は、毒性作用とみなした。
【０２３５】
（4.5  CTBプロトコール）
スタウロスポリン濃度曲線を、減少した細胞生存度の対照として、全ての36細胞プレートに添加した(2倍希釈で1〜0.03μMの範囲)。スタウロスポリン濃度0.04μMで、細胞のみでの誘発と比べ、細胞生存度の30％の減少が認められた。この濃度は、標準曲線の第一及び第二の最低濃度の間であった。上清収集後、CTBを含む培地を、細胞に添加し、細胞を、37℃及び5％CO2で6時間インキュベーションし、引き続きEnVision(登録商標)マルチラベルリーダー(Perkin Elmer社)上で蛍光リードアウトを得た。
【０２３６】
（4.6  データ解析）
EMT再スクリーン(実施例2)と同じ解析を、「オン標的」データに適用し、データは、対数変換し、引き続き陰性対照を基にロバストZ-スコア正規化した。ロバストZ-スコアカットオフ値-1.25を、両方のリードアウトに選択した。このカットオフ値で、全ての陽性対照は、ヒットと同定されたが、陰性対照の＜4％は偽陽性ヒットと取り上げた。
【０２３７】
同様のデータ正規化を、CTBデータについて行った。これは、対数変換し、引き続きロバストZ-スコアをベースに陰性正規化した。標準曲線の最低濃度の平均Z-スコア(0.03μM)は、対照パネル及びトリガーのみの試料と同じ範囲であった。次の濃度(0.06μM)で、Z-スコアは明確に減少し、これは標準曲線においてトリガーのみと比べ細胞生存度の30％減少を引き起こす、0.04μMスタウロスポリンに相当した。従って、濃度曲線の2種の最低スタウロスポリン濃度の間で、ロバストZ-スコアカットオフ値-10の設定を決定した。
【０２３８】
（4.7  結果）
図8は、陰性及び陽性対照ウイルス、並びに616種の試料ウイルスのFN及びMMP10測定から得られた、生データを示している。陰性対照と陽性対照の間の明確な分離が、FN及びMMP10の両方において認められた。陽性対照5(FN1_v3)は、MMP10に影響を及ぼさなかった。FNに関して0.78(0.68〜0.93)及びMMP10に関して0.82(0.68〜0.92)の平均スピアマン順位相関係数値で、生物学的反復間で、高い相関が認められた。
【０２３９】
表10において、ロバストZ-スコアカットオフ値-1.25を使用するオン標的スクリーンの対照性能及びヒット率のまとめを提示している。96種のオリジナルのヒットのうち、93種は、オン標的スクリーンにおけるダブルFNヒットとして同定され、これは97％のヒット確認を示している。このカットオフ値を使用し、合計254種のダブルFNヒット及び139種のダブルMMP10ヒットを同定した。これらのダブルヒット間の重複は、74ヒットであり、これは総FNダブルヒットの29％であった。細胞毒性に起因した偽陽性を除外するために、オン標的作用の評価前に、CTBデータを解析した。
【０２４０】
表10：ロバストZ-スコアカットオフ値-1.25を使用するEMTオン標的スクリーンにおけるFN及びMMP10リードアウトに関する対照性能及びヒット率のまとめ
【表１０】
2016522675.tif 000012
【０２４１】
* 陽性対照FN1_v3は、この計算から除外した。
【０２４２】
CTBデータに関するロバストZ-スコアカットオフ値-10の使用は、42種のダブル毒性ウイルス及び29種のシングル毒性ウイルスをもたらし、これは合計71種の毒性ウイルスを生じた。この毒性ウイルス群は、46種のダブルFNヒット及び26種のダブルMMP10ヒットからなり；そのうちの19種は、FN及びMMP10の両方についてダブルヒットであった。96種のオリジナルヒットのうちの13種のオリジナルヒットは、これらの71種の毒性ヒットの一部であり、従って疑陽性結果として廃棄した。
【０２４３】
（4.8  結果のまとめ）
オン標的スクリーンは、EMT1及びCTBの両アッセイを含んだ。両方のアッセイに関して、ロバストZ-スコアカットオフ値を選択し、これは、CTBアッセイにおいて毒性ではないFN及びMMP10ダブルヒットの選択をもたらした。表11において、オン標的であることが認められた「確認された候補標的」の同定に繋がる、選択されたヒットの数のまとめを提示している。FNダブルヒットであり且つオン標的スクリーンにおいて毒性でない80種のオリジナルヒットのうち、62種が、同じ標的を標的化した追加のノックダウン構築体を有し、且つ更にダブルFNヒットであった。従って、これらの62種の標的は、「オン標的」と称した。同様の選択を、MMP10について行い、これは、MMP10に関する29種のオン標的をもたらした。7種の標的は、FN及びMMP10の両方に関してオン標的であることがわかった。62種のFNオン標的を、標的発現解析及び優先順位付けに進めた。
【０２４４】
表11：FN及びMMP10の両リードアウトに関するロバストZ-スコアカットオフ値-1.25を使用し、細胞毒性を考慮する(CTBロバストZ-スコアカットオフ値：-10)、オン標的スクリーンにおける標的ヒットの数。
【表１１】
2016522675.tif 000013
【０２４５】
（実施例5.  ATPlite二次毒性アッセイ）
（5.1  バックグラウンド）
加えて、標的ウイルスにより引き起こされる可能性のある毒性を評価するために、第二の毒性アッセイを、ATPlite(Perkin Elmer社)アッセイを用いて開発した。このアッセイにより、代謝活性のある細胞により生成されるATPは、ルシフェラーゼ及びD-ルシフェリンと反応し、光を放出する。このアッセイは、D-ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ-媒介性及びATP-依存性変換を基にし、発光を生じる。ルミネセンスとして測定される放出された光は、試料中のATP濃度に比例し、結果的に生存細胞の数に比例する。
【０２４６】
実施例4において同定された63種の標的から、最も興味深い21種の標的を、ATPliteアッセイにおける更なる評価のために選択した。21種の各標的について、オリジナル構築体を含む、2種の構築体を選択した。
【０２４７】
（5.2  プロトコール）
スタウロスポリン濃度曲線(2倍希釈で1〜0.03μMの範囲)を、毒性に関する参照として、各細胞プレートに添加し、且つATPliteリードアウトを行った。使用したスタウロスポリン最高濃度は、ルミネセンスをほぼバックグラウンドシグナルまで減少し、これはこれらのウェルにおける強い細胞毒性を示している。濃度0.06μMのスタウロスポリンは、トリガーのみと比べ、細胞生存度の30％の減少を生じた。
【０２４８】
（5.3  結果）
ATPliteアッセイにおいて生物学的反復間で、平均スピアマン順位相関0.55(0.52〜0.57)が、認められた。スタウロスポリン0.6μM処置は、30％毒性に対応することが示されている。対数変換及び陰性を基にしたロバストZ-スコア正規化後のデータを、結果の解析に使用した。0.6μMスタウロスポリンの平均Z-スコアは、-5.5であり、-5.5を下回る2つ組Z-スコアを有するshRNAは、毒性があると考えられた。標的化12遺伝子の試験した24種のウイルスはいずれも、2つ組で毒性があるとはみなされなかった。
【０２４９】
結論として、ここで試験した21種の標的は、ATPliteアッセイ及び実施例4に記載したCTBアッセイからのデータ間の高い相関を基に、2つ組の二次毒性アッセイにおいて毒性を示さない。
【０２５０】
（実施例6.  全トランスクリプトーム配列決定）
（6.1  バックグラウンド）
標的において同定されたmRNA発現を確認するために、mRNAをBr291細胞から単離し、全トランスクリプトーム配列決定を行った。線維化状態に関連するように、これらの標的は、該疾患の関連組織において発現されるものとする。標的のインビボ発現を確認するために、HBEC及び小気道上皮細胞(SAEC)を、組織溶液から得られたIPF患者組織試料から単離した。IPF組織からのHBEC及びSAECの単離は、COPDドナーと同様に行った(van Weteringの文献、2000に先に記載されたように)。
【０２５１】
全トランスクリプトーム配列決定又はmRNA-seqは、cDNA配列決定適用である。mRNA-seqは、mRNA集団全体をプロファイリングするために使用することができ、且つ全ての転写物のマッピング及び定量化が可能である。プローブ又はプライマーデザインが不要であるmRNA-seqは、読みの深さ(read depth)に応じ、単独の実験において遺伝子発現、新規転写物、新規アイソフォーム、選択的スプライシング部位、及び稀な転写物の分析に関して、ポリA-テールRNAから比較的不偏の配列情報を提供する能力がある。
【０２５２】
クラスター化及びDNA配列決定を、Illumina HiSeq 2000(Solexa社)上で行った。配列決定鋳型を、フローセル表面上に固定した。Illuminaフローセルは、顕微鏡スライドに類似した平面の光学的に透明な表面であり、これはその表面に結合したオリゴヌクレオチドアンカーの層(lawn)を含む。鋳型DNAは、標的DNAの末端へのオリゴヌクレオチドアンカーに相補的なアダプターのライゲーションにより調製する。適合された1本鎖DNAは、フローセルに結合され、固相「ブリッジ」PCRにより増幅される。各PCRサイクルにおいて、鋳型分子を曲げる(arching)ことにより、プライミングが起こり、結果的にアダプターはそのテザーされない末端で、フローセル表面の近傍で、遊離オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし且つこれによりプライミングされる。このプロセスは、クローン性に増幅された鋳型の雨滴パターンを生じる。配列決定は、発蛍光団により標識された可逆性塩基を使用する合成により、進む。標識されたターミネーター、プライマー、及びポリメラーゼを、フローセルに適用する。塩基伸長及び各クラスターの蛍光シグナルの記録後、配列決定試薬を洗浄除去し、標識を切断し、且つ組み込まれた塩基の3’末端を、次のヌクレオチド添加のための調製においてブロックを外す。各フローセルは、9600万〜1億2000万リード(クラスター)を含み、各々同じ鋳型の〜1,000コピーを含む。
【０２５３】
（6.2  COPDドナーBr291由来のHBEC、IPF患者由来のHBEC及びIPF患者由来のSAECにおける発現試験のための試料調製）
誘発されない細胞及び選択された組合せ誘発された細胞のRNAの単離のために、COPDドナーBr291及びBr299のHBEC、IPF患者のHBEC、及びIPF患者のSAECを、培養し且つ再スクリーンと同じ様式で96-ウェルプレートに播種した(実施例2参照)。誘発されない細胞由来のRNAを、1日目に収集し、その日に形質導入を行った。細胞は、6日目に誘発させ、誘発された細胞由来のRNAを、9日目に収集した。
【０２５４】
全RNAを、市販のRNA単離キット(RNeasy Mini Kit、Qiagen社)を用い、培養細胞から単離した。濃度及び純度を、NanoDrop 2000(Thermo Scientific社)を用い、チェックし、その後RNA-配列決定のためにmRNAを送付した。
【０２５５】
RNA試料(複数可)の品質及び完全性を、Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies社)を使用するRNA 6000 Lab-on-a-Chipにおいて分析した。試料品質は、試料調製の必要要件に合致した。Illumina(登録商標)mRNA-Seq試料調製キットを、試料の処理に使用した。試料調製は、Illuminaプロトコール「mRNA配列決定のための試料調製」(1004898 Rev. D)に従い行った。簡単に述べると、mRNAを、全RNAから、ポリ-T-オリゴ-付着した磁気ビーズを用いて単離した。mRNAの断片化後、cDNA合成を行った。これを、配列決定アダプターとのライゲーション及び生じた生成物のPCR増幅のために使用した。試料調製後の品質及び収量は、DNA 1000 Lab-on-a-Chip(Agilent Technologies社)により測定し、全ての試料は、品質管理を通過した。得られた生成物のサイズは、広範なサイズ分布300〜600bpを持つ予想された生成物と一致した。Br291 RNAを、全トランスクリプトーム配列決定に使用し、並びにBr299及びIPF HEBEC及びSAEC RNAを、リアルタイムPCRに使用した。
【０２５６】
Illumina HiSeq 2000(Illumina)を使用するクラスター化及びDNA配列決定を、製造業者のプロトコールに従い行った。合計6.5pmolのDNAを使用した。各々Read 1及びRead 2配列決定プライマーを使用する100サイクルの2つの配列決定の読みを、フローセルにより行った。オン標的スクリーンにおいて同定された63種の標的物中の39種から、cDNAを、市販のバリデートされたTaqMan(登録商標)アッセイ(Life Technologies社又はQiagen社)で、TaqMan(登録商標)Fast Advanced Master Mix(Life Technologies社、カタログ番号4444964)を使用し、LightCycler(登録商標)480リアルタイムPCRシステム(Roche Diagnostics社)上で定量した。試料の品質を確認するために、4種のハウスキーピング遺伝子のセットを試験した。
【０２５７】
（6.3  一次データ解析及び結果）
画像解析、塩基-コーリング、及び品質チェックを、Illuminaデータ解析ピペリン(pipeline)RTA v1.13.48及び／又はOLB v1.9及びCASAVA v1.8.2により行った。
【０２５８】
Illumina配列決定試行の品質を評価するために行ったQA解析は、Solexa技術を使用する良好な品質の標準試行のための品質測定法を基にした。フローセルの全てのレーンは、QA解析を通過した。加えて、Illumina社が供給したPhi Xコントロールを基にした詳細な誤差率情報を、報告した。Phi Xコントロールは、少量で試料へ添加される(読み値の最大5％)。Illumina対照DNAからの読み値を、データの処理時に、Illuminaピペリンにより取り除いた。誤差率は、Illuminaピペリン中のELANDアライナー(aligner)を使用し、Phi X参照ゲノムに対する品質フィルターを通過する読み値のアラインメント後に、算出した。全ての誤差率は、許容された基準内であった。
【０２５９】
（6.4  データ解析）
Illumina HiSeq 2000シークエンサーから得られた読み値は、最小閾値Q25及び最短長さ50塩基の品質スコアによりフィルタリングした。
【０２６０】
次に読み値は、各試料についてBowtie v0.12.7アライナーにより、ヒト参照ゲノム(hg19)とアラインメントした。新規アイソフォームを、デフォルトの設定及びマスクとしての既知のトランスクリプトームアノテーション(Homo_sapiens.GRCh37.65.gff)を使用し、Cufflinks v2.02パッケージにより同定した。各試料について新規アイソフォームの発見後、新たに検出されたアイソフォームを、全ての試料についてマージさせ、標準トランスクリプトームアノテーションに加えた。最後に、FPKM(断片数／転写物キロベース／マップされた100万の断片)値を、各試料について、Cufflinksにより計算し、デフォルトのCufflinksアウトプットにおいて報告した。FPKM値は、試料中の、従ってmRNA-配列解析及びスクリーニングアッセイに使用された細胞中のmRNAの定量的代表値である。高度に豊富なmRNAは、高いFPKM値を生じるのに対し、低いFPKM値は、低コピー数のmRNAを表す。
【０２６１】
（6.5  結果）
同定された12種の標的に関する結果は、表17に含んだ。オン標的スクリーンにおいて当初同定された63種の標的を、全トランスクリプトーム配列決定に供した。これらの63種の標的物の、選択された12種の標的物は、誘発条件下(+T)又は非誘発条件下(-T)で、FPKM値＞0.00を示し、これらの標的はHBECにおいて発現されることを確認した。リアルタイムPCR試験の結果は、12種の標的物全て、Br299細胞及び／又はIPF HBEC及びSAECにおいてCt値40以下を示し、これらの標的はこれらの細胞において発現されることを確認することを指摘している。
【０２６２】
（実施例7.  EMTアッセイにおける標的物に対するsiRNAの試験）
（7.1  バックグラウンド）
shRNAノックダウン構築体が、異なるmRNAの発現、その後意図されたmRNAの発現に対する作用、いわゆるオフ-標的作用を有することを排除するために、オン-標的バリデーションを、選択された標的物に対するsiRNA構築体を用い、確認された候補標的物により行った。
【０２６３】
（7.2  陽性対照及び陰性対照）
SMAD3及びSMAD4に対するsiRNAを、陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、陰性対照として使用した。
【０２６４】
（7.3  細胞培養）
HBECは、Dept of Pulmonology(LUMC、ライデン、オランダ)から入手した。HBECは、肺腫瘍の手術を受けた患者の肺切除組織に由来した。気管支上皮細胞は、プロテアーゼ消化により単離し、且つ既述のように培養した(van Weteringの文献、2000)。
【０２６５】
（7.4  siRNAスクリーンのアッセイプロトコール）
実験設定は、以下のようであった：0日目に、HBECの2500個細胞/ウェルを、32μg/mL PureColコーティング(Advanced Biomatrix社、カタログ番号5005-B)によりコートされた、96-ウェルプレートに播種した。3日後、siRNAトランスフェクションを行った。細胞を、Dharmafect 1(Thermo社、カタログ番号T-2001-03)0.02μL/ウェルを用いて、トランスフェクトした。OnTarget Plus siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、最終濃度20nMで、1ウェルにつき4種の構築体のスマートプールとして使用した。1日後、EMTを誘導する組合せトリガー(0.5ng/mL TGFβ1＋5ng/mL TNFα＋0.5×107 UV-死滅させたNTHi細菌/mL)を添加した。6日目に、スタウロスポリンを、対照ウェルの細胞に添加した(各プレート上1つの単独列)。7日目に、上清を収集した。同日、RNA単離を、標準MagMax全RNA単離キット(Ambion社、カタログ番号AM1830)を使用し行った。Cell Titer Blueアッセイ(Promega社、カタログ番号G808B)を、同日行った。FNは、実施例1に説明した様な研究室で開発したアッセイを使用し、SECTOR(登録商標)イメージャー6000装置(MSD)上でメソスケールディスカバリー(MSD)プラットフォームを使用し、測定した。
【０２６６】
（7.5  データ解析）
正規化された阻害率(NPI)解析を用い、siRNA構築体のリードアウトに対する作用を定量化した。計算において、SMAD3又はSMAD4 siRNAを陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNAを陰性対照として使用した。正規化された阻害率(NPI)は、試料測定値と陽性対照平均の差を、陽性対照と陰性対照の差により、除算することにより算出した。
【０２６７】
（実施例8.  線維症動物モデルにおける標的物発現）
（8.1  バックグラウンド）  インビボにおける標的物遺伝子の発現を試験するために、いくつかのマウス及びラット線維症モデルを試験し、腎臓、肺及び皮膚などの特定組織における発現を決定した。
【０２６８】
（8.2  マウスUUO(一側尿管閉塞)腎線維症モデル）
一側尿管閉塞を、Balb/c雌マウス(Harlan社-フランスより)において、1群あたりマウス10匹で作製した。0日目に、マウスに、腹腔内注射により麻酔をかけ、皮膚の切開後、左側尿管を切り離し、その長手方向に沿って2点を4.0絹糸で結紮した。その後尿管を、2つの結紮の間で切断した。無傷のマウスを、対照として使用した。マウスを、10又は21日後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
【０２６９】
（8.3  ラット5/6 NTX(5/6腎摘出)腎線維症モデル）
腎摘出術を、Sprague-Dawley雄ラット(CERJ社-フランスより)において、1群あたりラット10匹で作製した。0日目に、ラットに麻酔をかけ、皮膚の切開後、副腎を保護しながら、腎臓皮膜を除去した。腎門部を結紮し、右側腎臓を摘出した。左側腎臓の末端を、メスで切除し、5/6腎摘出を生じた。ラットを、4又は8週間後に屠殺した。
【０２７０】
（8.4  マウスBLM(ブレオマイシン)肺線維症モデル）
肺線維症を、ブレオマイシン静脈内投与について、CD1雄マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス6〜8匹で誘導し、且つブレオマイシン脊髄内投与について、C57/Bl6 J雌マウス(Janvier社より)において、1群あたりマウス14匹で誘導した。
【０２７１】
静脈内投与(i.v.)に関して、マウスには、ブレオマイシン(10mg/kg；100μl/マウス)又は対照として食塩水を、1日1回最初の5日間連続して静脈内注射した(Okuらの文献、2004)。マウスを、3又は6週間後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
【０２７２】
腹腔内(i.p)投与に関して、マウスに、麻酔液(18mL NaCl 0.9％＋0.5mLキシラジン(5mg/kg)＋1.5mLケタミン(75mg/kg))の腹腔内注射(容積10mL/kg以下)により麻酔をかけた。ブレオマイシン溶液2U/kg又は食塩水を、気管内経路により投与した(10mg/kg；40μL/マウス)。マウスを、3週間後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
【０２７３】
（8.5  マウス強皮症モデル）
強皮症は、Balb/c雌マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス15匹で誘導した。0日目に、マウスに、溶液(キシラジン5mg/kg、ケタミン75mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけ、剃毛した。ブレオマイシン1mg/ml溶液又は食塩水の容積100μlを、マウスの剃毛した背部へ、26g針により、皮下注射した。ブレオマイシンを、連続する3週間にわたり1週につき5日間注射した。合計の実験期間は、6週間であった。6週間後に、マウスを、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
【０２７４】
（8.6  動物線維症モデルにおける遺伝子発現及び調節）
インビボ実験の最後に、動物を屠殺し、組織(UUOモデルについて1/2マウス腎臓、5/6NTXモデルについて1/3ラット腎臓、マウス強皮症モデルについて皮膚小片、及びマウス肺線維症モデルについて肺一葉)を、RNALater(登録商標)安定化溶液(Ambion社、#AM7021)の入った、2ml-マイクロチューブ(Ozyme社、#03961-1-405.2)中に収集した。組織を、Precellys(登録商標)24組織ホモジナイザー(Bertin Technologies社)内で1.4mmセラミックビーズ(Ozyme社、#03961-1-103、BER1042)により破壊した。全RNAを単離し、組換えDNase消化に供し、Qiazol(登録商標)(Qiagen社、#79306)及びNucleoSpin(登録商標)RNAキット(Macherey-Nagel社、#740955.250)を製造業者の推奨に従い用い精製した。RNAを、RNase-非含有水60μlにより溶離した。RNAの濃度及び純度を、260、280及び230nmでの吸光度により決定した。cDNAを、全RNA 500ngから、高性能cDNA RTキット(Applied Biosystems社、#4368814)を使用する逆転写により、調製した。10倍希釈したcDNA調製品5μlを、リアルタイム定量的PCRに使用した。qPCRは、SYBR Green技術を使用するQiagen社からの遺伝子特異的プライマーにより行った。反応は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)中での、95℃で5分間の変性工程、続けて40サイクル(95℃で10秒間、60℃で30秒間)で実行した。
【０２７５】
下記の齧歯類β-アクチンプライマー(Eurogentec社)を使用した：
【化２】
2016522675.tif 000014
【０２７６】
マウス及びラットのアッセイ混合物は、下記表に列記している(表12)。
【０２７７】
表12.  マウス及びラットのアッセイ混合物(Qiagen社)
【表１２】
2016522675.tif 000015
【０２７８】
（8.7  データ解析）
各遺伝子の発現レベルは、対照動物におけるそれらの閾値サイクル(CT)値により推定した。
【０２７９】
遺伝子発現の相対変化の定量は、2-ΔΔCT法(ここで、ΔΔCT＝(CT.標的−CTβ-アクチン)罹患動物−(CT.標的−CTβ-アクチン)対照動物)を使用し、表した。2-ΔΔCT値の統計解析は、対照群に対する対応のないスチューデントt-検定を用いて行った(***：p＜0.001；**：p＜0.01；*：p＜0.05)。
【０２８０】
（8.8  結果）
全ての試験したmRNAは、線維化組織(腎臓、肺及び皮膚)において良好に発現された(表13参照)。 
【０２８１】
表13.  無傷の動物におけるmRNA発現レベル(Ct＞30：低度、25＜Ct＜30：中等度、Ct＜25：高度)
【表１３】
2016522675.tif 000016
【０２８２】
多くの遺伝子が、マウスUUOモデルにおいて、アップレギュレート又はダウンレギュレートされているのに対し、ごくわずかな調節が、ラットNTXモデル(4及び8週間)、並びに肺及び皮膚線維症モデルにおいて認められた。EFEMP2及びF2R遺伝子は、少なくとも1種のマウス線維症モデルにおいてアップレギュレートされている(表14参照)。
【０２８３】
表14.  線維症モデルのqPCR解析(倍率＞1.8：無傷の動物に対し有意な倍率の誘導；倍率＜-1.8：無傷の動物に対し有意な倍率の阻害；ns：有意な変化なし；***：p＜0.001；**：p＜0.01；*：p＜0.05)
【表１４】
2016522675.tif 000017
【０２８４】
表15.  一次スクリーン、再スクリーン、EMT2バリデーションアッセイにおける標的物の性能のまとめ
第一列は、標的物遺伝子記号を示す。2つ組みIQR-スコアは、一次EMT1 FN及びMMP10スクリーンについて示され、ここでカットオフ値は、FNに関する2つ組IQR≦-1.5、及び2つ組IQR≦-1.3を使用した。再スクリーンロバストZ-スコアは、FN及びMMP10の両方のリードアウトについて示されている。FNについて2つ組ロバストZのカットオフ値≦-2.0を使用した。EMT2バリデーションアッセイの結果は、2つ組Z-スコアで示し、2つ組ロバストZのカットオフ値≦-1.1を、以下の基準と組合せて使用した：反復1：-1.92及び＜0、反復2：＜0及び-1.32。
【表１５】
2016522675.tif 000018
【０２８５】
表16：  オン標的バリデーションにおける標的物の性能のまとめ
この表は、オン標的アッセイにおいて確認された標的物の性能のまとめを示す。確認された候補標的物遺伝子記号及びアデノウイルス構築体のノックダウン配列を示している。ヒットと考えられたshRNA、加えて当初ヒットであったshRNA(太字)の結果を示し、及び「両方」の列は、このshRNAが両方のOTアッセイにおいて再度ヒットであることを示している(はい/いいえ)。2つ組の結果は、標的スクリーンに関するEMTにおけるFN及びMMP10のリードアウトについて示されている。2つ組ロバストZのカットオフ値≦-1.25を使用した。毒性評価に関するCTB結果を示し、2つ組ロバストZ≦-10であった。ヒットは、FN阻害及びCTBアッセイにおける無毒作用を基に含んだ。二次ATPlite毒性アッセイを行い、2つ組ロバストZのカットオフ値を使用した。
【表１６】
2016522675.tif 000019
【０２８６】
表17.  標的物の発現のまとめ
標的物を、標的物の対応する遺伝子クラスと共に示している。発現データは、肺中の百万個当たりのESTとして示している。RNA-seqから得られた発現データは、実施例に記載のトリガーと組合せた、非誘発(T-)又は誘発(T+)のいずれかの、1名の健常HBECドナーBR291由来のFPKM値として示している。COPD HBECドナーBr299、IPF HBEC、及びIPF SAECのmRNA発現は、Ct値として示している。
【表１７】
2016522675.tif 000020
（参考文献）
【化３】
2016522675.tif 000021
【図１】
2016522675.tif 000022
【図２】
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【図３】
2016522675.tif 000024
【図４】
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【図５】
2016522675.tif 000026
【図６】
2016522675.tif 000027
【図７】
2016522675.tif 000028
【図８】
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【配列表】
2016522675000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月8日(2015.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2016522675.tif 000030
2016522675.tif 000031
2016522675.tif 000032
2016522675.tif 000033
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