(57)【要約】  本発明は、トロンビン活性の安定化において有用な化合物、化合物を含むトロンビン組成物、化合物を使用する方法、及びトロンビン活性を安定化させることができる化合物を同定する方法に関する。化合物は、好ましくは、トロンビンのガンマループを含むか又はそれと相互作用する単離ペプチドである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物であって、前記化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩、及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩からなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
前記化合物が、前記トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記単離ペプチドが、直鎖状又は環状である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記トロンビンガンマループのアミノ酸配列が、配列番号１に記載されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記単離ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項６】
前記単離ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項７】
前記単離ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項８】
前記単離ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項９】
前記単離ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ガンマループ相互作用分子が、単離相互作用ペプチド、その誘導体又は塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記単離相互作用ペプチドが、トロンビンペプチドである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記単離相互作用ペプチドが、直鎖状又は環状である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記単離相互作用ペプチドが、配列番号７、９、１０、又は１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記単離相互作用ペプチドが、配列番号７、９、１０、又は１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記単離相互作用ペプチドが、ランダムペプチドライブラリから得られる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１６】
前記単離相互作用ペプチドが、直鎖状又は環状である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記単離相互作用ペプチドが、配列番号１２又は１３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記単離相互作用ペプチドが、配列番号１２又は１３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物と、薬理学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
トロンビンと、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物と、薬理学的に許容し得る賦形剤とを含む、トロンビン製剤。
【請求項２１】
約１ＩＵ／ｍＬ〜１０，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
約１０ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２３】
約１０ＩＵ／ｍＬ〜１，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２４】
前記化合物が、約０．０１ｍＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
前記化合物が、約０．１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
前記化合物が、約０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２７】
フィブリンシーラント成分として使用するための、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
外表面にラベルが貼付されている密閉容器内に収容される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物、請求項１９に記載の組成物、又は請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２９】
トロンビン活性を安定化させる方法であって、前記トロンビンを請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１９に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
液体形態のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供することと、
ｂ）試験化合物のセットを提供することと、
ｃ）（ａ）の前記単離ペプチドを（ｂ）の前記化合物のセットと接触させることと、
ｄ）前記ペプチドに結合する１つ又は２つ以上の試験化合物を同定することと、を含み、
前記結合が、トロンビン活性の安定化で使用するための可能性のある化合物を示す、方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）で同定された前記１つ又は２つ以上の化合物を単離することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
液体形態のトロンビンの活性の安定化における効果について、工程（ｄ）で同定された前記１つ又は２つ以上の化合物を試験することを更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２〜１８のいずれか一項に記載の化合物をコードする、単離核酸配列。
【請求項３４】
プロモータエレメントに機能的に連結している、請求項３３に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、ＥＦＳ−ウェブを介してＡＳＣＩＩフォーマットで本願と同時に提出された配列表を含み、参照することによりその全体を本願に援用する。２０１３年１０月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名で、サイズは４バイトである。
【０００２】
（発明の分野）
トロンビン活性を安定化させ、トロンビンの貯蔵寿命を延長するのに有用な化合物、それを含む組成物及び製剤、並びに方法を本明細書に提供する。具体的には、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、及びトロンビンのガンマループと相互作用することができる単離ペプチド、使用することによって液体トロンビン製剤中のトロンビン活性を安定化させる組成物、製剤、及び方法を本明細書に開示する。更に、トロンビン活性を安定化させることができる化合物を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
トロンビンは、幾つかの止血生成物において活性成分として機能するセリンプロテアーゼである。例えば、フィブリンシーラントは、典型的に、フィブリノーゲン成分及びトロンビン成分を含む。両成分を混合したとき（例えば、出血している創傷又は外科的切開に塗布したとき）、トロンビンは、フィブリノーゲンを切断し、フィブリンポリマーが形成される。液体形態の濃縮精製トロンビンは、主に自己消化の結果、長期間の保存中に活性の低下を示す。
【０００４】
トロンビンの生物活性を維持し、自己消化性分解を防ぐために、液体トロンビンを含有する止血製剤は、特別な取り扱いを必要とする。例えば、液体トロンビン製剤は、貯蔵寿命の安定性を維持するために冷凍するか又はプロテアーゼ阻害剤を添加することを必要とする。診療所では、冷凍は、常に実行可能である訳ではなく、様々なプロテアーゼ阻害剤が混ざっていると、トロンビンの活性に悪影響を与えることがある。
【０００５】
トロンビンから、凍結乾燥医薬調製品を作製することができ、これは、使用時に溶解させた後で用いられる。しかし、液体調製品は、使用前に溶媒に溶解させる追加の工程なしに容易に投与できる点で、凍結乾燥調製品に比べて有利である。
【０００６】
トロンビンを安定化させるための他の公知の組成物及び方法は、満足のいくものではなく、例えば、以下が挙げられる：様々な非特異的成分を含む（例えば、アルブミン等のバルク担体タンパク質、様々な安定化糖類、一般的なプロテアーゼ阻害剤等）；有効であり得るが、使用中にトロンビンを不活化又は阻害してその有効性を低下させ得るトロンビン活性の阻害剤を含むトロンビンの製剤。使用中の阻害を避ける又は低減するために、使用前に阻害剤、ひいてはトロンビンを希釈する必要がある場合がある。低用量トロンビンの製剤は、より多量の製剤を投与する必要がある。
【０００７】
国際公開第２００８１５７３０４号には、ベンジルアルコール又はクロロブタノールから選択される保存剤及びスクロースを用いてトロンビン溶液を安定化させる方法が開示されている。更なる特許公報は、トロンビンと非特異的な阻害剤とを含む組成物を提供し、したがって、トロンビン−トロンビン自己消化作用に有効に対向することができない。例えば、米国特許第４４０９３３４号には、トロンビン自体を阻害しない少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤及び少なくとも１つの六配位子キレート形成剤と共に、トロンビン及び安定剤としての血清アルブミンを含む、固体又は溶解形態の安定化トロンビン調製品が開示されている。
【０００８】
欧州特許第０２７７０９６  Ｂ１号は、精製トロンビン、ポリオール、及び酢酸イオン又はリン酸イオンのいずれかを含有するバッファを含有する安定なトロンビン組成物を提供し、調製品のｐＨは、約５．０〜約６．０である。
【０００９】
欧州特許第０４７８８２７  Ｂ１号は、ＨＥＰＥＳバッファ、チオメルサール、コラーゲンの部分的加水分解によって得られるゼラチンの３つの安定剤の混合物、及び任意でポリブレンを含む安定なトロンビン組成物を提供する。
【００１０】
米国特許第７３５１５６１号には、トロンビン、及び安定剤としてのベンズアミジン又はｐ−アミノベンズアミジンを含み、更に、安定剤としての塩化カルシウム又は塩化ナトリウム、少なくとも１つのバッファ物質、及びヒスチジン、マンニトール、コハク酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、又はアルギニンのうちの少なくとも１つを含む安定なトロンビン調製品が開示されている。
【００１１】
米国特許出願公開第２００９１３６４７４号（米国特許第８３９４３７２号）は、セリンプロテアーゼ；前記セリンプロテアーゼの可逆性阻害剤（例えば、ベンズアミジン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、アミノベンズアミジン）；及び安定剤（例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含む安定化セリンプロテアーゼ組成物を提供する。
【００１２】
トロンビンの様々な態様について記載している非特許文献としては、Ｐｏｚｚｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）「Ｒｉｇｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  ｌｏｏｐ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｎａ（＋）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」（Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．１５９（１）：６〜１３）；Ｍａｒｉｎｏ，Ｆ．（２０１０）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｎｄ  ＰＡＲ１」（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９１４５〜５２）；Ｂａｈ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）「Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ＊  ｆｏｒｍ  ｔｕｒｎｓ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ」（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４；２８４（３０）：２００３４〜４０）；Ｙａｎｇ  Ｌ（２００４）「Ｈｅｐａｒｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」（Ｂｌｏｏｄ．１０４（６）：１７５３〜９）；及びＲｙｄｅｌ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）「Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ」（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９（３５）：２２０００〜６）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、その生物活性を保持しながら、自己消化性分解に対してトロンビンを安定化するのに有用な特異的化合物が必要とされている。好ましくは、かかる化合物は、濃縮液体トロンビン製剤と共に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
トロンビン活性を安定化させる優れた能力を有する化合物を本明細書において提供する。化合物は、液体製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができ、トロンビンの貯蔵寿命を延長するのに有用である。理論に束縛されるものではないが、化合物は、フィブリノーゲンを含む異種物質に対するトロンビン活性を保ちながら、トロンビンの自己消化を完全に又は部分的に阻害する。
【００１５】
１つの利点は、フィブリノーゲンを活性化するために、化合物を含む安定化トロンビンを直接用いることができる点である。安定化トロンビンは、希釈することなく、及び／又は溶液から化合物を除去することなく用いることができる。
【００１６】
化合物は、更に、強力でありかつ低濃度で用いることができるので、安定化トロンビン製剤を基質に添加する際に容易に希釈される点で有益である。更に、化合物を含む組成物又は製剤、化合物を用いる方法、及びこのような化合物を同定する方法も提供する。
【００１７】
１つの態様では、液体製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物であって、化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩、及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩からなる群から選択される、化合物を本明細書において提供する。幾つかの実施形態では、トロンビンガンマループのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列ＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫを含む。
【００１８】
幾つかの実施形態では、化合物は、ガンマループペプチド、このようなペプチドの誘導体若しくは塩、又はこのような誘導体の塩を含む単離ペプチドである。
【００１９】
幾つかの実施形態では、化合物は、単離ガンマループペプチド、このようなペプチドの誘導体若しくは塩、又はこのような誘導体の塩である。
【００２０】
幾つかの実施形態では、ペプチドは、直鎖状であるか又は環化されている。
【００２１】
幾つかの実施形態では、単離ガンマループペプチドは、直鎖状である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、直鎖状単離ガンマループペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む。
【００２３】
好ましい実施形態では、直鎖状単離ガンマループペプチド、その誘導体又は塩は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
幾つかの実施形態では、単離ペプチドは、トロンビンガンマループ配列、及びガンマループに隣接する１つ又は２つ以上のアミノ酸を含む。
【００２５】
幾つかの実施形態では、単離ペプチドは、ペプチドの各末端に３〜４個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、例えば、自然界でトロンビンガンマループアミノ酸配列に隣接しているアミノ酸であってよい。様々な実施形態では、単離ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＧＮＬＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫＧＱＰＳ）を有する。
【００２６】
幾つかの実施形態では、単離ガンマループペプチドは、環化されている。
【００２７】
幾つかの実施形態では、環化単離ガンマループペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、環化単離ペプチドは、ガンマループアミノ酸配列の両末端にシステイン残基を含み、配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＣＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫＣ）を有する。
【００２８】
幾つかの実施形態では、化合物は、トロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩である。
【００２９】
様々な実施形態では、相互作用分子は、単離相互作用ペプチド若しくはその誘導体、単離抗体若しくはその抗体断片、ヌクレオチドアプタマー若しくはペプチドアプタマー、又はこのような分子の塩から選択される。好ましい実施形態では、相互作用分子は、単離相互作用ペプチド又はその誘導体若しくは塩である。
【００３０】
様々な実施形態では、単離相互作用ペプチドは、トロンビンのガンマループペプチドを含まない単離トロンビンペプチドであり、そのアミノ酸配列は、直鎖状トロンビンアミノ酸配列又はトロンビンの非直鎖状の面対向型折り畳みアミノ酸配列に由来する。例えば、トロンビンペプチドのアミノ酸配列は、トロンビンの三次元構造に基づき得、必ずしもトロンビンペプチドの一次配列を含むものではない。幾つかの実施形態では、単離トロンビンペプチドは、配列番号７、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、単離トロンビンペプチドは、配列番号７、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、単離トロンビンペプチド、その誘導体又は塩は、直鎖状ペプチドである。別の実施形態では、単離トロンビンペプチド、その誘導体又は塩は、環状である。幾つかの実施形態では、環状トロンビンペプチドは、配列番号７、９、１０、又は１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、アミノ末端及びカルボキシ末端のそれぞれにシステイン残基を有する。
【００３１】
様々な実施形態では、単離相互作用ペプチド、その誘導体又は塩は、ランダムペプチドライブラリから得られる。幾つかの実施形態では、ランダム単離相互作用ペプチドは、配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ランダム単離相互作用ペプチドは、直鎖状ペプチドである。幾つかの実施形態では、ランダム単離相互作用ペプチドは、配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ランダム単離相互作用ペプチドは、環状ペプチドである。幾つかの実施形態では、環状ペプチドは、配列番号１２又は１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、アミノ末端及びカルボキシ末端のそれぞれにシステイン残基を含む。
【００３２】
第２の態様では、液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物を含む組成物であって、化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩、及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩から選択される、組成物を本明細書において提供する。幾つかの実施形態では、化合物は、トロンビン活性を安定化させる、例えば、トロンビンの生物活性を著しく損なわせることなくトロンビンの自己消化を阻害するのに有効な量で組成物中に存在し；薬理学的に許容し得る賦形剤である。幾つかの実施形態では、トロンビンの生物活性は、フィブリノーゲンのフィブリンへの切断を含む。
【００３３】
別の態様では、トロンビンと、製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物であって、化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩、及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩から選択される、化合物と、薬理学的に許容し得る賦形剤とを含む、トロンビン製剤を本明細書において提供する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、製剤又は組成物は、約１ＩＵ／ｍＬ〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、約１０ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、又は好ましくは約１０ＩＵ／ｍＬ〜１，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有するトロンビンを含む。
【００３５】
製剤又は組成物の好ましい実施形態では、化合物は、単離ペプチド、このようなペプチドの誘導体若しくは塩、又はこのような誘導体の塩である。
【００３６】
幾つかの実施形態では、相互作用分子は、トロンビン由来ペプチドであるか、又はランダムペプチドライブラリから得られる。
【００３７】
幾つかの実施形態では、化合物は、トロンビン由来ペプチドである。
【００３８】
幾つかの実施形態では、化合物、例えば、ペプチドは、組成物又は製剤中に、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、又は約０．５ｍＭの濃度で存在する。
【００３９】
１つの実施形態の範囲内で、化合物、組成物、又は製剤は、外表面にラベルが貼付されている密閉容器内に収容されている。幾つかの実施形態では、製剤又は組成物は、フィブリンシーラント成分として使用するために調製される。
【００４０】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に開示する化合物と、化合物を使用して液体製剤中のトロンビンを安定化させるための説明書とを含むキットを特徴とする。好ましい実施形態では、化合物は、単離ペプチド、このようなペプチドの誘導体若しくは塩、又はこのような誘導体の塩である。
【００４１】
更に別の態様では、トロンビン活性を安定化させる方法であって、トロンビンを、トロンビン活性を安定化させるのに有効な量のトロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体若しくは塩、又はトロンビンのガンマループと相互作用する分子と接触させることを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態では、トロンビン活性の安定化は、その生物活性を著しく損なわせることなくトロンビンの自己消化を阻害することを含む。
【００４２】
更に別の態様では、トロンビン活性を安定化させる方法であって、トロンビンを本明細書に開示する化合物又は組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、液体形態のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供することと、
ｂ）試験化合物のセットを提供することと、
ｃ）（ａ）の単離ペプチドを（ｂ）の試験化合物のセットと接触させることと、
ｄ）ａ）のペプチドに結合する１つ又は２つ以上の試験化合物を同定することと、を含み、
結合が、トロンビン活性の安定化で使用するための可能性のある化合物を示す、方法を本明細書において提供する。
【００４４】
幾つかの実施形態では、方法は、工程（ｄ）で同定された１つ又は２つ以上の化合物を単離する工程を更に含む。
【００４５】
別の態様では、液体形態のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）固相に結合しているトロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供することと、
ｂ）ガンマループ配列を提供することと、
ｃ）試験標識化合物のセットを提供することと、
ｄ）ｂ）のガンマループ配列の存在下及び非存在下で、（ａ）の単離ペプチドを（ｃ）の試験化合物のセットと接触させることと、
ｅ）ガンマループ配列の存在下及び非存在下で、固相に結合している標識試験化合物のレベルを測定することと、を含み、
ガンマループ配列の存在下及び非存在下において実質的に変化しない標識レベルが、化合物がトロンビン活性を安定化させるための候補であることを示す、方法を本明細書において提供する。
【００４６】
標識は、蛍光、放射性標識、又は当該技術分野において公知の任意の他の標識であってよい。
【００４７】
幾つかの実施形態では、方法は、液体形態のトロンビンの活性の安定化におけるその効果について、１つ又は２つ以上の同定された又は候補の化合物を試験する工程を更に含む。
【００４８】
幾つかの実施形態では、方法は、Ａ−液体形態のトロンビンの活性の安定化におけるその効果について、及びＢ−異種基質、例えば、フィブリノーゲンに対する活性についてペプチドを最小限しか阻害しない又は全く阻害しないことについて、１つ又は２つ以上の同定された又は候補の化合物を試験する工程を更に含む。
【００４９】
方法の幾つかの実施形態では、トロンビンガンマループは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、試験化合物のセットは、ランダムペプチドライブラリ、化学化合物ライブラリ、抗体ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、アプタマーライブラリ等から得られる。幾つかの実施形態では、化合物は、安全かつ非免疫原性である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、化合物は、単離ペプチドである。幾つかの実施形態では、ペプチドは、化学的に又は組み換えによって合成される。様々な実施形態では、単離核酸配列によってコードされている組み換えペプチドを提供する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜３、７、又は９〜１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本明細書に開示するペプチドをコードしている単離核酸配列、及びプロモータエレメントに機能的に連結された、このようなペプチドをコードしている核酸配列を含むベクターを本明細書において提供する。更に、このようなベクターを含む宿主細胞を提供する。ＤＮＡ配列は、標準的な遺伝コード（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」）を用いて推定することができる。
【００５２】
本発明のこれら及び他の態様並びに実施形態は、以下の本発明の詳細な説明及び図面を参照して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】プロトロンビン分子の図を提供する。プロトロンビンの活性化中に切断される配列を、薄い灰色のシルエットとして示す。成熟アルファ−トロンビン配列を黒で示す。ガンマループペプチド配列は、トロンビン一次配列においてシルエットで描かれており、プロトロンビン分子の下に別個に示す（矢印によって示す、配列番号１）。配列番号２は、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端に３つ及び４つのアミノ酸が隣接しているガンマループ配列（角括弧で囲まれている）を含むペプチドである。
【図２Ａ】トロンビンに対してアルギニン＊ＨＣｌ（「アルギニン」）が有する阻害効果を示す。液体トロンビンにアルギニンを添加すると、０．５％（ｗ／ｖ）においてトロンビン活性が５０％低下し、２％（ｗ／ｖ）においてはトロンビン活性が＞９５％低下する。
【図２Ｂ】３７℃において、様々な濃度のアルギニンを用いて得られた濃縮トロンビンの安定化レベルを示す。
【図２Ｃ】漸増量のガンマループペプチドを液体トロンビン（１０００ＩＵ／ｍＬ）に添加する、又は一定（３％  ｗ／ｖ）のアルギニン濃度を液体トロンビン（１０００ＩＵ／ｍＬ）に添加する、又はペプチド若しくは阻害剤を全く添加しないことによって得られるトロンビン安定化レベルの増加（時間がたっても残存している活性％）を示す。３７℃で７２及び１４４時間後における１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンの残存活性を測定した。
【図２Ｄ】ガンマペプチドの濃度を増大させることによるトロンビン活性（１０ＩＵ／ｍＬトロンビンで測定）の阻害％を示す。  図３Ａ〜３Ｆは、本明細書に開示するペプチドによるトロンビンの安定化又は不安定化レベルを示すグラフである。１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンを、指定の通り、０．５ｍＭの様々なペプチドと共にバイアル内でインキュベートした。３７℃で０、３、及び７日間インキュベートした後、個々のバイアルにおける残存活性を測定した。トロンビンの直接活性部位阻害剤であるベンズアミジンを０．５ｍＭで対照として用いた。ペプチド又は阻害剤を全く添加しない対照群も含まれる。結果を群毎に分ける：
【図３Ａ】ガンマループに結合することができるランダムペプチドによる、トロンビンの安定化レベル（残存活性％を測定することによって示される）を示すグラフである。Ｒｎｄ３１６（配列番号１２）をランダム１として図中に示す。  Ｒｎｄ１５５（配列番号１３）をランダム２として図中に示す。
【図３Ｂ】直鎖状ペプチド（配列番号２）及び分子内Ｓ−Ｓ結合を介して環化したペプチド（「ＣＳ」；配列番号３）の両ガンマペプチドを用いた、液体トロンビンの安定化（残存活性％を測定することによって示される）を示すグラフである。
【図３Ｃ】環化変異体ガンマループペプチド（配列番号４［ＡＬ−ｃｙｃ＿Ｅ０３Ｎ］、配列番号５［ＡＬ−ｃｙｃ＿Ｎ０８Ｙ］、及び配列番号６［ＡＬ−ｃｙｃ＿Ｇ１０Ｌ］）を用いた、トロンビン活性の安定化レベル（残存活性％として示す）を示すグラフである。
【図３Ｄ】トロンビン由来ペプチドＴｈｒ−１１１（配列番号８）を用いた、トロンビン活性の不安定化レベル（残存活性％として示す）を示す。
【図３Ｅ】トロンビン由来ペプチドＴｈｒ−０６９（配列番号７）を用いた、トロンビン活性の安定化レベル（残存活性％として示す）を示すグラフである。
【図３Ｆ】システイン残基がセリンに置換されている直鎖化ペプチド（配列番号９［Ｔｈｒ＿０３１＿ＣＳ］、配列番号１０［Ｔｈｒ＿０３２＿ＣＳ］、及び配列番号１１［Ｔｈｒ＿１３６＿ＣＳ］）を用いた、トロンビン活性の安定化レベル（残存活性％として示す）を示すグラフである。
【図４Ａ】ガンマループ／結合ペプチド（阻害は、グラフに示す残存活性％から計算することができる）：トロンビン由来ペプチド（Ｔｈｒ  ０３１  ＣＳ［配列番号９］、Ｔｈｒ  ０３２  ＣＳ［配列番号１０］）；環状ガンマペプチド［配列番号３］；ペプチドＲｎｄ  ３１６［配列番号１２］、及び直鎖状ガンマペプチド［配列番号１］によるトロンビン阻害のレベル（％）を示す。
【図４Ｂ】ガンマループ／結合ペプチド（阻害は、グラフに示す残存活性％から計算することができる）：トロンビン由来ペプチド（Ｔｈｒ  ０３１  ＣＳ［配列番号９］、Ｔｈｒ  ０３２  ＣＳ［配列番号１０］）；環状ガンマペプチド［配列番号３］；ペプチドＲｎｄ  ３１６［配列番号１２］、及び直鎖状ガンマペプチド［配列番号１］によるトロンビン阻害のレベル（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本開示は、１つには、化合物、特に、トロンビンガンマループ配列を含むか、又はトロンビンガンマループと相互作用する特定の単離ペプチドが、トロンビン液体製剤中のトロンビン活性を安定化させることができるという知見に基づいている。
【００５５】
「トロンビン活性の安定化」とは、例えば、トロンビン自己消化活性の低減を指す。
【００５６】
また、「トロンビン活性の安定化」とは、トロンビン水溶液、例えば、濃縮トロンビン溶液として、例えば室温で、１日間超保存したとき、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換活性を含む、異種基質に対するトロンビンの生物活性を著しく損なわせることなく、トロンビン活性を維持することを指す場合もある。
【００５７】
「室温」とは、約２０℃〜約２８℃、又は２２℃〜約２６℃の温度を含むことを意味する。
【００５８】
用語「安定化」とは、例えば、初期トロンビン活性に比べて、約８０％〜約１００％（例えば、約９０〜１００％）のレベルで、トロンビン液体製剤内のトロンビン活性を維持することを意味する。
【００５９】
用語「初期トロンビン活性」とは、例えば、冷凍トロンビン製剤を解凍した直後、トロンビン粉末を再構成した直後、及び／又はトロンビンを自己分解させる条件（例えば、１０ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬトロンビン以上の濃度で、例えば、２〜８℃で１ヶ月間超；室温で１日間超）下で液体トロンビンを保存する前に、トロンビン液体製剤中で測定される、フィブリノーゲンに対するトロンビンの活性を指す。
【００６０】
直鎖状若しくは環状（すなわち、分子内Ｓ−Ｓ結合）ガンマループペプチド、又はトロンビンガンマループの連続アミノ酸配列を含有する直鎖状若しくは環状ペプチド；トロンビンのガンマループと相互作用することが知られているペプチド；及びガンマループと結合相互作用を示すランダムに選択されたペプチドが、液体トロンビンを安定化させることが見出された。
【００６１】
ガンマループ配列（配列番号２及び配列番号３）を含むペプチドは、直鎖状であろうと環状であろうと、トロンビン活性の効率的な安定化を示すことが見出された。環状ガンマペプチド（配列番号３）は、０．５ｍＭでトロンビンを約７％しか阻害せず、直鎖状ガンマペプチド（配列番号１）は、約２０％の阻害を示した。
【００６２】
ガンマループの残基Ｅ、Ｎ、又はＧが変異している環状ペプチド（それぞれ、配列番号４、５、及び６）によるトロンビンの安定化は、非効率であることが見出された。
【００６３】
ガンマループに対する初期結合に基づいてランダムライブラリから選択した２つのランダムペプチド（配列番号１２及び１３）からは、トロンビンの安定化効果が得られた。
【００６４】
分子、例えば、ペプチドのガンマループに対する結合は、その安定化潜在能の優れた予測指標であると考えられる。
【００６５】
ガンマループペプチドと相互作用することができる２つのトロンビン由来ペプチド［Ｔｈｒ  ０３１  ＣＳ（配列番号９）］、Ｔｈｒ  ０３２  ＣＳ（配列番号１０）］は、トロンビンに対する安定化効果を示し、同濃度でトロンビンに対してわずかな阻害効果（例えば、０．５ｍＭのペプチド：１３〜１４％阻害）を示した。
【００６６】
配列番号２、３、７、９、１０、１１、１２、及び１３に記載の配列を有するペプチドは、液体水性トロンビンを安定化させることができることが見出された。
【００６７】
本発明に従って見出された分子／ペプチドを含む安定化トロンビンは、例えば、分子／ペプチドを希釈及び／又は除去することなく、フィブリノーゲンを活性化させるために直接用いることができる。
【００６８】
安定性試験については、ペプチドと共に又はペプチド無しで保存した後の１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンを用いることができ、活性化試験は、本明細書に記載する通り実施することができる。希釈（１：１００）は、活性の測定前に実施することができる。
【００６９】
阻害試験については、１０ＩＵ／ｍＬトロンビンの凝固活性を、（希釈していない）ペプチドの存在下又は非存在下で測定することができる。
【００７０】
フィブリノーゲンに対するトロンビン活性は、トロンビンの凝固活性を測定することによって評価することができる。凝固活性は、例えば欧州薬局方アッセイ（０９０３／１９９７）の変法によって直接、及び／又は斜面上における移動距離を測定すること（すなわち、落下試験モデル）等によって間接的に、あるいは当該技術分野で公知の任意の他の方法によって測定することができる。
【００７１】
トロンビンガンマループ配列を含むか、又はトロンビンガンマループと相互作用する化合物、例えば、単離ペプチドを本明細書において提供する。更に、水性液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物を同定する方法を本明細書において提供する。
【００７２】
液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物を本明細書において提供する。化合物は、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩；並びにトロンビンガンマループ相互作用分子、及びその誘導体又は塩からなる群から選択される。
【００７３】
トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含むペプチド及びトロンビンガンマループ相互作用分子は、インタクトなアルファトロンビンとは異なる。
【００７４】
アミノ酸
アミノ酸及びペプチドの配列は、一般的に、以下の表Ａ中に示すように略記する。
【００７５】
【表１】
2016535990.tif 000003
【００７６】
１つの実施形態では、当該技術分野において公知の通り、単離ペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸が、類似体又はバイオシミラーアミノ酸で置換されている（同類置換）アミノ酸類似体配列が用いられる。
【００７７】
アミノ酸は、Ｌ型、Ｄ型、又はこれらの誘導体（例えば、擬アミノ酸、官能化アミノ酸（例えば、フッ素化アミノ酸等）、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸等）であってよい。
【００７８】
トロンビン
トロンビンは、別のセリンプロテアーゼ（第Ｘａ因子）によってチモーゲンであるプロトロンビン（第ＩＩ因子）を切断することによって生成されるセリンプロテアーゼである。ヒトトロンビンは、ａによって接合されている２本のポリペプチド鎖で構成される２９５アミノ酸のタンパク質である。
【００７９】
チモーゲンであるプロトロンビン（図１に示す）は、残基２７１で切断され、全体のＮ末端の２７１アミノ酸が除去される。残基３２０において第Ｘａ因子によって更に分子内切断されることにより、単一のＳ−Ｓ結合を介して結合している重鎖及び軽鎖で構成される２９５アミノ酸のポリペプチド（ヒト）である活性アルファトロンビン分子が生成される（Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ  Ｊ，（２０１３）「Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｊｕｎ；１１  Ｓｕｐｐｌ  １：２６５〜７６）。セリンプロテアーゼであるトロンビンは、ベータ（残基３８２及び３９４）又はガンマ（残基４４３及び残基４７４）部位において他のトロンビン分子を切断することによって、自身の分解（「自己消化」）を開始して、それぞれ、ベータ及びガンマトロンビンを生成することができる。
【００８０】
これらループが古典的なトロンビン認識部位を含有することもなく、この切断がループ内の特定の残基に対して特異的でもない。むしろ、これらループは、両方とも可撓性であり、露出しており、特に高トロンビン濃度において適切な基質が不十分であるために切断される（例えば、Ｃｈａｎｇ，ＪＹ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８６）２４０：７９７〜８０２，「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｙｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」；Ｒｙｄｅｌ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９（３５）：２２０００〜６．「Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ」；Ｐｏｚｚｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．２０１１，１５９（１）：６〜１３「Ｒｉｇｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  ｌｏｏｐ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｎａ（＋）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ」を参照）。インビボにおけるトロンビンの不活化は、この機序（自己消化）を介して進行するのではなく、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮ）である抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）との特異的相互作用（ヘパリンによって架橋）を介して進行する。
【００８１】
トロンビン（及び第Ｘ因子等の幾つかの他の相同なセリンプロテアーゼ、更にはプロテインＣ等）とＡＴＩＩＩとの相互作用は、ガンマループを介して媒介される（例えば、Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４，１０４（６）：１７５３〜９，「Ｈｅｐａｒｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」；及びＭａｒｉｎｏ，Ｆ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１０，２８５（２５）：１９１４５〜５２．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｎｄ  ＰＡＲ１」を参照）。
【００８２】
ヒト及び非ヒトトロンビンを本発明において用いることができる。トロンビンは、例えば、止血剤として及び組織接着剤の成分として、医学的に用いられる。
【００８３】
１つの態様では、ａ）トロンビンと；ｂ）トロンビン活性を安定化させることができる化合物であって、化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩；及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩からなる群から選択される、化合物と；薬理学的に許容し得る賦形剤とを含むトロンビン製剤を本明細書において提供する。
【００８４】
長期間保存する場合、トロンビン及び化合物を含む製剤を、滅菌バイアル、アンプル、又は他の容器に分注し、次いで、密封する。１つの実施形態では、シールを通して注射器を用いて安定化トロンビン組成物を取り出すことができるシールを用いる。容器は、薬学分野又は医療機器分野における標準的技法に従ってラベルを付けてよい。
【００８５】
本発明の１つの実施形態では、容器は、ゼラチン又はコラーゲン系マトリクス等のスカホールドを収容する第２の容器と共にキットにおいて提供される。別の実施形態では、容器は、フィブリノーゲンを含む成分を含む第２の容器と共にキットにおいて提供される。キットは、更に、噴霧器、注射器等の適用装置及び／又は希釈剤及び／又は使用説明書を更に含んでもよい。
【００８６】
使用中、安定化トロンビン製剤は、容器から直接用いてもよく、又は所望の濃度に更に希釈してもよく、一般的に、製剤中のトロンビン活性は、約１ＩＵ／ｍＬ〜約１０，０００ＩＵ／ｍＬ、典型的に、約１０ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、又は１０ＩＵ／ｍＬ〜１，０００ＩＵ／ｍＬであるが、実際の濃度は、ユーザ（例えば、医師、看護士、衛生兵）によって、すなわち、個々の患者の必要性及び出血の重篤度に従って決定される。安定化トロンビンを、出血している組織に塗布して、それ自体の止血を達成してもよく、スカホールド又はマトリクス、例えば、吸収性スカホールド又はマトリクスと併用してもよい。また、安定化トロンビン製剤を、組織接着剤、フィブリンシーラント、又はフィブリン糊の成分として用いてもよい。当技術分野において公知のこれら及び他のトロンビンの用途は、開示する安定化トロンビンについて企図される。様々な開腹及び腹腔鏡手術において、例えば、漏出をふさぐ、止血剤／出血を止める、癒着を防止する、治癒を促進する、構造を接合するためにシーラントとして使用することを含む、様々な分野におけるフィブリン糊の多数の用途が報告されている。
【００８７】
好ましい止血スカホールドは、天然の若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー若しくは合成吸収性ポリマー、又はこれらの混合物である。天然の若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマーの例は、タンパク質、多糖類、及びこれらの組み合わせである。タンパク質としては、プロトロンビン、トロンビン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ヘパリナーゼ、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、組織因子、バトロキソビン、アンクロッド、エカリン、フォンウィルブラント因子、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、血小板表面糖タンパク質、バソプレシン、バソプレシン類似体、エピネフリン、セレクチン、凝血促進毒素、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板活性化剤、止血活性を有する合成ペプチド、及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。多糖類としては、セルロース、アルキルセルロース、例えば、メチルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩類、アルギネート、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸類、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、及び上記のいずれかの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。合成吸収性ポリマーの例は、脂肪族ポリエステルポリマー、コポリマー、及び／又はこれらの組み合わせである。
【００８８】
プロトロンビン／トロンビン分子及びガンマループ鎖配列を図１に示す。
【００８９】
定義
本明細書において使用するとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ以上の」を意味する。
【００９０】
本明細書において使用するとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ又は２つ以上の更なる特徴、工程、構成要素、又はこれらの群の追加を排除するものではない。
【００９１】
数値の前に用語「約」が記載されている場合、用語「約」は、＋／−１０％を示すことを意図する。
【００９２】
本明細書において使用するとき、用語「ペプチド」は、約５〜約１００個の連続アミノ酸、又はアミノ酸の類似体の単離化合物を意味するように広く用いられる。ペプチドの定義には、例えば、１つ又は２つ以上のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸、ペプトイド等を含む）を含有するペプチド、置換結合及び当技術分野において公知の他の修飾を有するペプチドが含まれ、天然及び非天然（例えば、合成）の両方を含む。したがって、合成ペプチド、環化、分枝状ペプチド等が定義内に含まれる。本発明において用いるのに好適なペプチドの非限定的な長さとしては、５〜１００残基長（アミノ酸及び／又は類似体）（又はこれらの間の任意の整数）、５〜２０残基長、６〜７５残基長、１０〜２５残基長、２１〜７５残基長、７５〜１００残基長のペプチドが挙げられる。典型的に、本発明で有用なペプチドは、意図する用途に好適な最大長さを有し得る。好ましくは、ペプチドは、約５〜３０残基長、例えば、約５〜３０連続アミノ酸残基；例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０連続アミノ酸残基、好ましくは、約１０〜１７又は１０〜１５残基長である。
【００９３】
更に、本明細書に記載するペプチド、例えば、合成ペプチドは、それに共有結合しているか又はそれと非共有的に会合している標識若しくはトレーサー、リンカー、又は他の化学部分（例えば、ビオチン、色素）等の更なる分子を含んでもよい。このような部分は、更に、ペプチドと化合物、例えば、トロンビンガンマループペプチドとの相互作用を促進し得る、かつ／又は安定化トロンビンの検出若しくは定量を支援し得る。
【００９４】
また、ペプチドという用語は、１つ又は２つ以上の非天然アミノ酸を含む、１つ又は２つ以上の置換、付加、及び／又は欠失を有する本発明のアミノ酸配列の誘導体を含む。好ましくは、誘導体は、任意の野性型又は参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性、より好ましくは、任意の野性型又は本明細書に記載する参照配列に対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す。ペプチド誘導体は、ペプチドが、所望の活性、例えば、トロンビンの安定化を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変、例えば、欠失、付加、及び置換（一般的に、自然界では保存的）を含んでもよい。これら改変は、部位特異的変異誘発を通じた意図的なものであってもよく、合成、若しくはタンパク質を産生する宿主の変異、又はＰＣＲ増幅に起因する誤り等を通して偶発的に生じたものであってもよい。更に、本明細書には、ペプチドの薬学的に許容し得る塩類、及びこのような塩類の誘導体が包含される。
【００９５】
「ガンマループペプチド」とは、配列番号１に記載の１０個の連続アミノ酸配列、具体的には、配列ＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫ（ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＴＲＰ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＬＹＳ）のペプチドを意味する。理論に束縛されるものではないが、トロンビンガンマループの配列は、このタンパク質ファミリーの伝統的な付番方式に従ってウシキモトリプシンにおける残基１４５〜１５０に相同でありかつ対応し、一般的な露出ループ構造を維持していることがＸ線結晶構造解析を用いて示されている。トロンビンガンマループに相同な配列は、トロンビンガンマループの誘導体と考えられ得る。
【００９６】
「トロンビン」又は「トロンビンポリペプチド」は、血液凝固カスケードの一部であり、フィブリノーゲンをフィブリンの不溶性鎖に変換するとともに、他の凝固関連反応を触媒する、哺乳類セリンプロテアーゼである。ヒトでは、プロトロンビンは、Ｆ２遺伝子によってコードされており、得られるポリペプチドは、凝固カスケードにおいてタンパク質分解的に切断されてトロンビンを形成する。トロンビンは、特に、幾つかの止血生成物において活性成分として機能する。例えば、フィブリンシーラントは、典型的に、フィブリノーゲン成分及びトロンビン成分を含む。両成分を混合したとき（例えば、出血している創傷に塗布したとき）、トロンビンは、フィブリノーゲンを切断し、フィブリンポリマーが形成される。
【００９７】
当業者は、本明細書に記載するペプチドが、「ペプチド模倣薬」を含むペプチドの誘導体として合成され得ることを認識するであろう。ペプチド模倣薬又は「ペプチド模倣剤」は、実際には完全にペプチドではないが、それが構造的に基づくペプチドの生物活性を模倣する分子である。このようなペプチド模倣薬としては、非天然アミノ酸を含有するペプチド様分子が挙げられる。ペプチド模倣薬は、１つ又は２つ以上のアミノ酸が類似体を含んでよく、例えば、レトロ−インベルソ修飾等のアミノ結合アイソスター；還元アミノ結合；メチレンチオエーテル若しくはメチレンスルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランス−オレフィン若しくはフルオロオレフィン結合；１，５−二置換テトラゾール環；ケトメチレン若しくはフルオロケトメチレン結合；又は別のアミドアイソスターを含有するペプチド様分子であり得る。また、この用語は、１つ又は２つ以上のＮ置換グリシン残基を含む分子（「ペプトイド」）及び他の合成アミノ酸又はペプチドを含む。（ペプトイドの説明については、例えば、米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；及び同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３〜４７３；及びＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７〜９３７１を参照）。当業者は、これら及び他のペプチド模倣薬が、本明細書において使用されるとき、用語「ペプチド模倣薬」の意味に含まれることを理解する。
【００９８】
ペプチドのアミノ酸配列は、従来の表記法に従って表記され、Ｎ末端におけるアミノ基（ＮＨ２）は、配列の左側に記載され、Ｃ末端におけるカルボキシル基は、その右側に記載される。
【００９９】
本明細書に開示するペプチドは、従来の塩形成反応によって生理学的に許容し得る塩を形成し得る。このような塩は、塩酸、硫酸、及びリン酸等の無機酸との塩；乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、及びパルミチン酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びアルミニウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物との塩及び炭酸塩；並びにトリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、及びアルギニン等のアミンとの塩を含んでよい。
【０１００】
鎖間及び鎖内ジスルフィド結合の両方が形成され得、このようなジスルフィド結合の形成によって形成されたペプチドは、本発明に包含される。
【０１０１】
１つの実施形態では、本明細書に開示するペプチドは、化学的に合成される。他の実施形態では、本明細書に開示するペプチドは、インビボで、又は原核生物若しくは真核生物の宿主細胞において組み換えＤＮＡを発現させることによってエキソビボで生成される。
【０１０２】
他の実施形態では、本明細書に開示するペプチドは、インビボで、又は原核生物若しくは真核生物の宿主細胞において本明細書に開示する化合物をコードしている核酸配列を含むベクターを発現させることによってエキソビボで生成される。
【０１０３】
用語「単離ポリヌクレオチド」、「単離核酸配列」、及び「単離核酸分子」は、本明細書において互換的に用いられる。単離「ポリヌクレオチド」は、二本鎖及び一本鎖配列の両方を含んでよく、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルス、並びにレトロウイルス）由来のゲノムＲＮＡ及びＤＮＡ配列、原核生物ＤＮＡ、又は真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ、並びに合成ＤＮＡ配列を指すが、これらに限定されない。また、この用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体を含む配列を包含し、ネイティブ配列対して欠失、付加、及び置換等の改変（一般的に、自然界では保存的）を含む。ポリヌクレオチドの改変は、例えば、宿主細胞におけるペプチドの発現を促進することを含む、任意の数の効果を有し得る。典型的に、ポリヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又は更に多くのアミノ酸のペプチドをコードする。
【０１０４】
「ポリヌクレオチドコード配列」、又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（又は「制御エレメント」）の制御下におかれたとき、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン、及び３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終止配列は、コード配列の３’側に位置し得る。典型的な「制御エレメント」としては、プロモータ等の転写調節因子、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、及びポリアデニル化配列；並びに翻訳の開始を最適化するための配列、例えば、シャイン・ダルガーノ（リボソーム結合部位）配列、コザック配列（すなわち、例えば、コード配列の５’側に位置する翻訳を最適化するための配列）、リーダー配列（異種又はネイティブ）、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、及び翻訳終止配列等の翻訳調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。プロモータとしては、誘導性プロモータ（プロモータに機能的に連結しているポリヌクレオチド配列の発現が、アナライト、補助因子、調節タンパク質等によって誘導される）、抑制性プロモータ（プロモータに機能的に連結しているポリヌクレオチド配列の発現が、アナライト、補助因子、調節タンパク質等によって含まれる）、及び構成的プロモータを挙げることができる。
【０１０５】
「機能的に連結している」とは、このように記載されている成分が通常の機能を実行するようになっているエレメントの配置を指す。したがって、コード配列に機能的に連結している所与のプロモータは、適当な酵素が存在しているとき、コード配列を発現させることができる。プロモータは、その発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、プロモータ配列とコード配列との間に未翻訳であるが転写されている介在配列が存在してもよく、それでも、プロモータ配列は、コード配列に「機能的に連結していると」考えることができる。
【０１０６】
核酸分子を説明するために本明細書において使用されるとき、「組み換え」核酸分子は、その起源又は操作に基づいて、（１）自然界で会合するポリヌクレオチドの全て又は一部に会合しない；かつ／又は（２）自然界で連結する以外のポリヌクレオチドに連結する、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組み換え」とは、タンパク質又はポリペプチドに関して用いるとき、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、及び単細胞実体として培養された原核微生物又は真核生物細胞株を意味する他のこのような用語は、互換的に用いられ、コンストラクト、ベクター、又は他の転写ＤＮＡのレシピエントとして用いることができるか又は用いられている細胞を指し、トランスフェクトされている起源細胞の後代を含む。単一親細胞の後代は、偶発的又は意図的変異によって、起源親と形態又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補物が必ずしも完全に同一でない場合もある。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在等、関連する特性によって特徴付けられる親に十分類似している親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれ、上記用語によって網羅される。
【０１０７】
「単離」とは、ポリヌクレオチド又はペプチドに言及するとき、指定の分子又は化合物が、自然界で分子又は化合物がみられる生物全体から分離されており、別個のものであることを意味するか、あるいは、ポリヌクレオチド又はペプチドが自然界ではみられないとき、ポリヌクレオチド又はペプチドをその意図する目的のために用いることができるように、他の生物学的巨大分子を十分に含まないことを意味する。
【０１０８】
本明細書において使用されるとき、分子、例えば、ペプチドは、例えば、ファンデルワールス力及び静電力等の非共有結合力を介してペプチド又はタンパク質と会合する場合、別のペプチド又はタンパク質と「相互作用する」又は「結合する」（例えば、トロンビンガンマループ相互作用分子とトロンビン）と言われる。分子、例えば、ペプチドは、タンパク質における別のドメインよりも特定のドメインに対してより高い親和性及び／又はより高い特異性で会合する場合、タンパク質における特定のドメイン（例えば、トロンビンガンマループ）と「優先的に相互作用する」と言われる。幾つかの実施形態では、分子、例えば、ペプチドは、トロンビンのガンマループに優先的に結合する。優先的相互作用は、必ずしも、各ペプチドの特定のアミノ酸残基及び／又はモチーフ間の相互作用を必要とするものではないと理解されたい。
【０１０９】
「トロンビン活性」及び「トロンビンの生物活性」は、トロンビンが媒介する、タンパク質を含む異種基質の変換、例えば、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換に加えて、第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子への変換、第ＸＩ因子の第ＸＩａ因子への変換、第ＸＩＩＩ因子の第ＸＩＩＩａ因子への変換、及び第Ｖ因子の第Ｖａ因子への変換を含むことを意味する。「異種基質」は、トロンビン以外の基質、好ましくはタンパク質基質である。幾つかの実施形態では、トロンビン活性は、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を指す。用語「トロンビンの（生物）活性を著しく損なわせることなく」とは、無阻害／不安定化トロンビンと比べて、及び／又は初期トロンビン活性と比べて、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又はそれ以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のレベルで、フィブリノーゲンに対するトロンビン活性を保持することを指す。
【０１１０】
本明細書において使用されるとき、用語「自己消化」又は「自己分解」とは、トロンビンの、不活性又は部分活性型への好ましくない分子分解を指す。
【０１１１】
本明細書に開示する好ましい化合物は、例えば、例えばフィブリノーゲンに対する、トロンビン活性を著しく損なわせることなく、トロンビンの自己消化を低減すること等によって、トロンビン活性を安定化させることができる化合物である。
【０１１２】
１つの実施形態では、安定化水性液体トロンビン製剤は、２〜８℃の温度で１ヶ月間超；３７℃で７２時間；及び／又は３７℃で１４４時間保存について安定である。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、化合物は、例えば、液体形態で２〜８℃の温度で１ヶ月間；約３７℃で７２時間；約３７℃で１４４時間保存した後、トロンビンの自己消化を約６０％〜約１００％、又は約６０％〜約９５％、好ましくは約７０％〜約９０％阻害し、約６０％〜約１００％、又は約６０％〜約９５％、約７０％〜約９０％、好ましくは約８０％〜約９５％トロンビンの生物活性を保持する。
【０１１４】
用語「親和性」とは、結合の強度を指し、解離定数（Ｋｄ）として定量的に表すことができる。本明細書に開示する分子、例えば、ペプチドは、トロンビンの別のドメインとの相互作用よりも、少なくとも２倍高い親和性、より好ましくは、少なくとも５倍高い親和性、更により好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０倍高い親和性でトロンビンのガンマループと相互作用することができる。結合親和性（すなわち、Ｋｄ）は、標準的な技術を用いて求めることができる。
【０１１５】
用語「有効量」とは、例えば、フィブリノーゲンに対するトロンビン活性（例えば、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換）を実質的に保持しながら、トロンビンを安定化するために必要な、本明細書に開示する化合物の量を指す。トロンビンを安定化するために本発明を実施するために用いられる化合物の有効量は、組成物／製剤中のトロンビンの濃度に依存して変動し得る。このような量は、「有効量」と呼ばれる。
【０１１６】
「薬学的に許容し得る」又は「薬理学的に許容し得る」担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、及びビヒクルは、一般的に、本明細書に開示する組成物の活性成分と反応しない、不活性、非毒性の固体若しくは液体のフィラー、希釈剤、又は封入材料を指す。許容し得る賦形剤としては、生理食塩水；酢酸若しくは酢酸塩；カルシウム、ナトリウム、及び塩化物イオン；マンニトール；アルブミン；又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
用語「接触」は、本明細書において最も広義で用いられ、任意の種類の複合作用を指す。接触としては、混合、混和、及び／又は添加が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ペプチド合成
本明細書に開示するペプチドは、合成（例えば、個々のアミノ酸から化学的にペプチドを合成する）及び組み換え方法（例えば、ペプチドをコードしているＤＮＡを合成し、ＤＮＡを用いて組み換えペプチドを産生する）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の方法に従って合成することができる。
【０１１９】
ペプチドの化学的合成：本明細書に開示するペプチド及びペプチドをコードしているＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法によって化学的に合成することができる。ペプチドを合成するための好適な方法は、Ｓｔｕａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９８４），「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９７）によって記載されている。例えば、固相合成法又は液相合成法を用いてよい。固相合成は、通常、適当な保護基でアミノ基を保護することによって実施される。例えば、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）若しくはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、又はこれらの組み合わせを用いてよい。１つの例では、本明細書に開示するペプチドは、以下の工程によって合成される：１）産生されるペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸残基を、アミノ酸のａ−ＣＯＯＨ基を介して、反応溶媒に不溶性の固相材料に結合させるか、又はこのような固相材料を購入する工程、２）ペプチドのＮ末端に向かう方向において、ａ−ＣＯＯＨ基以外の対応するアミノ酸又はペプチド断片のａ−アミノ基等の他の官能基を保護した後、対応するアミノ酸又はペプチド断片を、工程１）のアミノ酸に縮合させることによって結合させる工程、３）ａ−アミノ基等のペプチド結合を形成するアミノ基の保護基を、結合したアミノ酸又はペプチド断片から除去する工程、４）所望のペプチドに対応するペプチド鎖を形成するために、工程２）及び３）を繰り返して、ペプチド鎖を延長する工程、５）産生されたペプチド鎖を固相材料から分離し、保護された官能基から保護基を除去する工程、及び６）ペプチドを精製して、所望のペプチドを得る工程。
【０１２０】
固相材料、並びに溶媒及び縮合剤は、当該技術分野において周知である。
【０１２１】
ＤＮＡの化学的合成及び発現：本明細書に開示するペプチドをコードしているＤＮＡを複製し、多様なクローニング及び発現ベクターにおいて多様な宿主細胞に挿入した後に組み換えペプチドを発現させるために用いることができる。宿主は、原核生物であっても真核生物であってもよい。ＤＮＡは、化学的に合成してよい。（例えば、哺乳類、昆虫、又は植物細胞、細菌、ファージ、及び酵母において使用するための）ＤＮＡ及びクローニングベクターを合成するのに好適な方法を利用可能である。融合タンパク質の形態で発現し得る組み換えペプチドは、当該技術分野において公知の方法によって精製される。
【０１２２】
本発明の実施において有用な化合物
液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させる化合物及び方法であって、トロンビン活性の安定化が、例えば、トロンビンの生物活性を著しく損なわせることなく、自己消化活性を低減又は阻止することを指す、化合物及び方法を本明細書において提供する。化合物は、トロンビンガンマループペプチドのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体若しくは塩；又は単離相互作用ペプチド、単離抗体若しくはその抗体断片、ヌクレオチドアプタマー、及びペプチドアプタマー、このような分子の誘導体若しくは塩であってよいトロンビンガンマループ相互作用分子からなる群から選択される。
【０１２３】
トロンビンのガンマループと相互作用する分子は、例えば、本明細書に開示する方法を用いて、スクリーニングにおいて同定することができ、また、トロンビン活性を安定化させる能力について試験することができる。幾つかの実施形態では、相互作用分子は、単離ペプチド、このようなペプチドのペプチド模倣薬、又はこのようなペプチドの塩である。相互作用ペプチドの例は、本明細書、例えば、配列番号７、及び９〜１３に提供される。
【０１２４】
ペプチドは、直鎖状であってもよく、分枝状であってもよく、環化されていてもよい。例えば、配列番号１及び２によって表されるペプチドは、直鎖状であり、配列番号３によって表されるペプチドは、環状である。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、相互作用分子は、単離抗体、このような抗体の断片、又はこのような抗体の塩である。用語「抗体」とは、特に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ抗体を指し、特に、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。１つの実施形態では、抗体は、トロンビンガンマループに対する抗体であり、トロンビンガンマループに対して作製された抗体であり、かつ／又はトロンビンガンマループを認識する。この用語は、抗原結合ドメインを含む抗体全体又は抗体断片、例えば、Ｆｃ部分を有しない抗体、単鎖抗体、ミニ抗体、抗体の可変抗体結合ドメインのみから本質的になる断片等を指す。また、この用語は、その抗原又は受容体と選択的に結合する能力を保持する抗体断片等の抗体誘導体を包含し、特に、以下の通り例示される：
（１）酵素パパインにより抗体全体を消化して軽鎖及び重鎖の一部を生成することによって産生され得る抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片であるＦａｂ、
（２）抗体の（Ｆａｂ’）２は、後で還元することなく酵素ペプシンで抗体全体を処理することによって得ることができる、ジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ断片の二量体である。
（３）２本の鎖として発現する軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片として定義されるＦｖ、並びに
（４）遺伝的に融合した単鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されている軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子として定義される単鎖抗体（ＳＣＡ）。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、相互作用分子は、アプタマー、又はこのようなアプタマーの塩である。アプタマーは、標的タンパク質に結合し、一般的に、非特異的作用を示さない、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、当業者に公知の任意の核酸改変に従って、安定性又は他の所望の品質について改変することができる。アプタマーに対する改変は、５’若しくは３’末端、又は任意の内部の規定の改変部位等、分子のどこにでも導入することができる。チオアプタマーは、特定のヌクレオシド間ホスホリル部位における硫黄修飾を含有し、強化された安定性、ヌクレアーゼ耐性、標的親和性、及び／又は選択性を有し得るアプタマーである。チオアプタマーの例としては、ホスホロモノチオエート（Ｓ−ＯＤＮ）及びホスホロジチオエート（Ｓ２−ＯＤＮ）オリゴデオキシチオアプタマーが挙げられる。アプタマー及びチオアプタマーについての更なる情報は、米国特許第５，２１８，０８８号及び同第６，４２３，４９３号に見出すことができる。
【０１２７】
本発明の実施において有用な例示的な化合物の詳細を以下の実施例、及び本明細書に組み込まれる配列表に提供する。
【０１２８】
スクリーニング方法
トロンビン活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法を本明細書において提供する。したがって、液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供することと、
ｂ）試験化合物のセットを提供することと、
ｃ）（ａ）の前記単離ペプチドを（ｂ）の前記試験化合物のセットと接触させることと；
ｄ）ペプチドに結合する１つ又は２つ以上の化合物を同定することと、を含み、
結合が、トロンビン活性の安定化において化合物の可能性のある使用を示す、方法を提供する。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、方法は、工程ｄ）において同定された１つ又は２つ以上の化合物を単離する工程、及び／又はトロンビン活性を安定化させる能力について、工程ｄ）で同定された１つ又は２つ以上の化合物を試験する工程を更に含む。
【０１３０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を十分に説明するのに寄与するものとして解釈すべきである。
【実施例】
【０１３１】
実施例１：トロンビン活性アッセイ
その精製及び濃縮型の水性液体トロンビン１０００国際単位ＩＵ／ｍＬは、室温で自己消化されて、例えば、異種基質に対する活性が著しく失われることがある。例えば、異種基質に対するトロンビン活性は、液体トロンビン製剤を室温で長期間（例えば、７２〜１４４時間）インキュベートしたとき、特に、自己消化性分解によって低下する。水性液体溶液中における異種基質に対するトロンビン活性の低下は、許容温度（例えば、３７℃）下で長期間後、トロンビン活性を測定することによって評価することができる。以下の実験では、トロンビンの安定性に対するペプチドの効果を、様々な条件下で試験した。
【０１３２】
水性液体精製及び濃縮トロンビン（１０００ＩＵ／ｍＬ；約１０μＭと等価）を分注し、３日間（７２時間）、７日間（１６８時間）、及び１４日間（３３６時間）、３７℃のインキュベータ内に置いた。インキュベートする前に、指定量の様々な試験ペプチド、又は対照トロンビン阻害剤：ベンズアミジン若しくはアルギニン＊ＨＣｌ（「アルギニン」）をトロンビンサンプルに添加した。用いた具体的なペプチド、その濃度、及びトロンビン阻害剤は、各実施例に示す。インキュベート期間後、トロンビン活性を試験するまでサンプルを−８０℃で冷凍した。トロンビン活性アッセイ試験直前に、全てのサンプルを解凍し、希釈バッファ（０．４％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．９％塩化ナトリウム、及び１％  ＢＳＡ、ｐＨ＝７．５）で１００倍希釈して、サンプル中のトロンビン濃度をアッセイの仕様の範囲内（４〜１０ＩＵ／ｍＬ）にし、サンプル中の試験ペプチドを無視できる濃度に希釈した。
【０１３３】
ＳＴａｒｔ４凝固装置（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて凝固時間を測定することによって、トロンビン活性を評価した。このアッセイは、欧州薬局方アッセイ手順１９９７、０９０３、ｐ．８５８の変法である。簡潔に述べると、トロンビン標準と、０．１％フィブリノーゲン含量のフィブリノーゲン溶液（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）とを混合することによって、検量線を作成した。次いで、その凝固時間によって、検量線から様々な試験サンプル中のトロンビン濃度を算出した（濃度は、検量線から外挿した）。
【０１３４】
ペプチドと共に又はペプチド無しで保存した後の１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンの安定性試験については、上記の通り試験を実施した。希釈（１：１００）は、活性の測定前に実施した。
【０１３５】
阻害試験については、１０ＩＵ／ｍＬのトロンビンの凝固活性を、ペプチドの存在下又は非存在下で測定した。
【０１３６】
実施例２：トロンビンの安定化に対するトロンビンガンマループのアミノ酸配列を含むペプチドの効果
トロンビンの形成中に切断されるプロトロンビン配列を、図１中に薄い灰色のシルエットとして示す。成熟アルファ−トロンビンポリペプチド配列を黒で示す。本明細書で利用するペプチド配列は、トロンビン一次配列においてシルエットで描かれており、分子の下に別個に示す（矢印によって示す）。ガンマループペプチド配列自体（配列番号１）を示し、Ｎ及びＣ末端の両方に隣接するアミノ酸を含むより長いペプチド内では角括弧で囲む（配列番号２；ＧＮＬＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫＧＱＰＳ；ＧＬＹ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＴＲＰ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＳＥＲ）。末端システイン残基を有するペプチドを合成することによって配列番号１を環化した（配列番号３；ＣＫＥＴＷＴＡＮＶＧＫＣ；ＣＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＴＲＰ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＣＹＳ）。これらペプチドは、標準的な方法によって合成した。
【０１３７】
隣接するアミノ酸を有するガンマループペプチド（配列番号２）及び環状ペプチド（配列番号３）を用いて、トロンビン自己消化活性の阻害について試験した。トロンビンの公知の活性部位阻害剤であるアルギニン＊ＨＣｌ（「アルギニン」）を、対照として用いた。図２Ａは、様々なアルギニン濃度においてトロンビン活性（１０ＩＵ／ｍＬトロンビンを用いて測定）に対してアルギニンが有する阻害効果を示す。図２Ｂは、（グラフ中に示す通り）様々な濃度のアルギニンと共に３７℃で最長４８時間インキュベートした後に測定したトロンビン％を示す。アルギニンについての動作レンジを速やかに得るために、濃縮トロンビンをより短時間（最長４８時間）用いた。アルギニンは、図２Ａにみられるその阻害効果に相関して、トロンビンの安定性に対して用量依存性効果を示す。
【０１３８】
図２Ｃは、漸増量のガンマループペプチド（配列番号２）又は一定濃度（３％  ｗ／ｖ）のアルギニンと共にインキュベートした後のトロンビンの残存活性を示す。このアッセイは、３７℃で７２及び１４４時間後における１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンの残存活性の測定に基づいていた。
【０１３９】
０．１ｍＭのペプチドでは、１４４時間後に安定化が既に検出され、０．２ｍＭでは、７２時間後に既に明らかであった。図２Ｄは、漸増濃度のペプチドによるトロンビン活性（１０ＩＵ／ｍＬトロンビンで測定）の阻害を示す。０．２ｍＭのペプチド濃度では、トロンビン活性は、それほど影響を受けない。
【０１４０】
結果：０．５〜５％（ｗ／ｖ）の範囲のアルギニンは、保存後にトロンビン活性を維持していた（図２Ｂ）。しかし、アルギニンの存在により、トロンビンの生物活性は損なわれた（図２Ａを参照）。０．５％（ｗ／ｖ）アルギニンでさえも、トロンビン活性の約５０％（ｗ／ｖ）が阻害され、２％（ｗ／ｖ）の濃度では＞９５％のトロンビン活性が阻害される（フィブリノーゲンを切断する能力によってアッセイしたとき；図２Ａ）。有効アルギニン濃度に基づいて、３％（ｗ／ｖ）アルギニンを、０．５ｍＭの濃度のガンマループペプチド（配列番号２；図２Ｃ）と比較した。驚くべきことに、０．５ｍＭの安定化濃度でペプチドを用いたとき、トロンビン活性が高いままであった（約８０％残存活性、図２Ｄを参照）。この同じ実験において、３％（ｗ／ｖ）アルギニンは、トロンビン活性の維持について７２時間ではあまり有効ではなく、１４４時間ではほんのわずかにしか有効ではなかった。これは、３％（ｗ／ｖ）アルギニン濃度が、トロンビンをほとんど完全に阻害すると推定することができる（図２Ａに基づいて）ので、重要である。
【０１４１】
０．５ｍＭの濃度のペプチドでは、フィブリノーゲンに対するトロンビン活性の低下がわずか２０％である（図２Ｄ）と共に、トロンビン安定性の増大が観察された（図２Ｃ）。理論に束縛されるものではないが、ガンマループペプチドは、少なくとも部分的に、トロンビンの分解のアロステリック阻害剤であると考えられる。
【０１４２】
実施例３：変異体ガンマループペプチドのスクリーニング
改善されたトロンビンへの結合を示し得るガンマループ変異体を同定するために、スクリーニングを実施した。これは、ガンマループペプチド変異体のアレイにおいて蛍光トロンビンを用いて実施した。最も高い結合効率を有する３つのこのような環化ペプチドを、フィブリノーゲンに対するトロンビン活性を損なわせることなくトロンビンを安定化させる能力について試験した（以下の実施例４を参照）。
【０１４３】
「ガンマループ」（配列番号１）は、トロンビンガンマループの野性型配列を示し；Ｅ０３Ｎは、（配列番号４における）位置３におけるグルタミン酸のアスパラギンによる置換を指し；Ｎ０８Ｙは、（配列番号５における）位置８におけるアスパラギンのチロシンによる置換を指し；Ｇ１０Ｌは、（配列番号６における）位置１０におけるグリシンのロイシンによる置換を指す。
【０１４４】
ペプチドのアミノ酸配列を、以下の本明細書における表１に示す：
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
実施例４：ガンマループ結合ペプチドのスクリーニング
実施例２に開示した結果に基づいて、ガンマループペプチドをベイトとして用いて、トロンビンの安定性に正の影響を与え得る更なるペプチドを見出した。この目的のために、幾つかのペプチドアレイと共にインキュベートした蛍光ガンマループペプチドを用いて、結合スクリーニングを実施した。
【０１４７】
トロンビン自体、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、トロンボモジュリン、ヘパリン補因子ＩＩ、ウシ膵トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、及びヒルジン、並びにトロンビンガンマループ配列の改変物等のトロンビンのガンマループと相互作用するタンパク質の配列にまたがる１，６７６個の１５量体ペプチドのライブラリを作成した。ＳＰＯＴ合成（Ｗｅｎｓｃｈｕｈ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５５：１８８〜２０６）を用いてペプチドを合成し、記載の通り官能化スライドガラス上に化学選択的に固定した（Ｐａｎｓｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ．Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ  ８：２９１〜２９９．２．）。各ペプチドをマイクロアレイ上にトリプリケートでプリントした。結合試験については、１００μｇの精製トロンビン（Ｏｍｒｉｘ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃８４５３６）で直接標識し、ブロッキングバッファ（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴ２０（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃３７５３６）で希釈した。マイクロアレイを、１０μｇ／ｍＬのＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０−トロンビン又はフルオレセイン標識環状ガンマループ由来ペプチドと共に、ＨＳ４８００マイクロアレイ処理ステーション（Ｔｅｃａｎ）において３０℃で１時間インキュベートした（Ｍａｓｃｈ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６６９：１６１〜１７２）。
【０１４８】
マイクロアレイを１ｘ  ＴＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、次いで、０．１ｘ  ＳＳＣ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、窒素流中で乾燥させた。各マイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ａｕｔｏｌｏａｄｅｒ  ４２００ＡＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ピクセルサイズ：１０μｍ）を用いてスキャンした。スポット認識ソフトウェアＧｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ７．０分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、シグナル強度を評価した。各ペプチドについて、３つのトリプリケートの平均シグナル強度を抽出した。更なる評価及び結果の表示を、統計学的計算及びグラフィクスソフトウェアＲ（バージョン２．１１．１、ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて実施した。
【０１４９】
あるアレイは、トロンビン配列に基づくペプチドを含んでいた。このライブラリから単離した任意のペプチドは、ガンマループと相互作用し得る、可能性のあるトロンビンタンパク質中の領域を反映し得る。第２のアレイは、幾つかの任意のペプチドがガンマループに対して親和性を示したランダムペプチドで構成されていた。最も強力な結合候補（ヒット）の蛍光を、０〜６５５３５（２１６）の任意の尺度で定量した。トロンビン活性を実施例１に記載の通り評価した。
【０１５０】
トロンビン由来ペプチドアレイ（Ｔｈｒ；配列番号７〜１１）及びランダムペプチドアレイ（Ｒｎｄ；配列番号１２〜１３）からスクリーニングにおいて同定された候補ペプチドのアミノ酸配列を、以下の本明細書における表２に示す。
【０１５１】
【表３】
2016535990.tif 000005
下線及び太字は、Ｓ置換である。
【０１５２】
これらペプチドの全て（実施例３で同定した「変異体ガンマループペプチド」、ランダムペプチド、トロンビン由来ペプチド、及び上記「ガンマループ結合ペプチド」）を、実施例２に記載の通り０．５ｍＭの濃度でトロンビン活性を安定化させる能力について試験した。
【０１５３】
結果を以下の通り、図中に示す。
図３Ａは、ガンマループに結合するランダム候補ペプチド（配列番号１２及び配列番号１３によって表されるランダムペプチド）を用いたトロンビン活性の安定化レベルを（残存活性％として）示す。
【０１５４】
図３Ｂは、ガンマループ配列、「直鎖状ガンマペプチド」（配列番号２）、及び分子内Ｓ−Ｓ結合を介する環状、「環状ガンマペプチド」（「ＣＳ」、配列番号３）を含むペプチドを用いたトロンビン活性の安定化レベルを（残存活性％として）示す。
【０１５５】
図３Ｃは、分子内Ｓ−Ｓ結合を介して環化されたガンマループ変異体ペプチドを用い、強化されたトロンビンへの結合を示す、トロンビン活性の安定化レベルを（残存活性％として）示す。
【０１５６】
図３Ｄは、トロンビン由来ペプチドＴｈｒ−１１１（配列番号８）を用いたトロンビン活性の安定化レベルを（残存活性％として示す）示す。結果は、Ｔｈｒ−１１１（配列番号８）のトロンビンへの結合が、トロンビン分解を増加させたことを示すが、活性部位で結合しているのではないように思われた。
【０１５７】
図３Ｅは、トロンビン由来ペプチドＴｈｒ−０６９（配列番号７）を用いたトロンビン活性の安定化レベルを（残存活性％として示す）示す。結果は、Ｔｈｒ−０６９（トロンビンに対して非常に弱い結合を示す配列番号７）もトロンビンの安定性に対して最小限の効果を示したことを示す。
【０１５８】
図３Ｆは、システイン残基がセリン残基によって置換されており、ガンマループに対して可変結合を示し、トロンビンが阻害されたときにその全てが若干の結合低減を示すトロンビン由来ペプチドの変異体を用いた、トロンビンの安定化レベルを（残存活性％として）示す。トロンビンペプチドのアミノ酸配列は、トロンビンの三次元構造に基づいており、必ずしもトロンビンペプチドの連続配列を含むものではない。トロンビン由来ペプチドの３つ変異体全てが、トロンビンを安定化させることができた。最も有効性の低いペプチドであるＴｈｒ−１３６ＣＳ（配列番号１１）は、最も弱い蛍光シグナルも有していた（表２、トロンビンに対して最も弱い結合）。
【０１５９】
表２及び図３Ａ〜３Ｆのデータは、以下を示す：
ガンマループ配列を含むペプチド（配列番号２及び配列番号３）は、直鎖状であろうと環状であろうと、トロンビン活性の同様の効率的な安定化を示した（図３Ｂ）。
【０１６０】
比較的弱いトロンビン相互作用ペプチド［例えば、Ｔｈｒ−０６９（配列番号７）］及びＴｈｒ−１３６ＣＳ［配列番号１１）］は、同じ群の類似のペプチドよりも弱い安定化効果を示した（図３Ｅ及び３Ｆ）。
【０１６１】
トロンビンと最も強い相互作用を有するペプチドＴｈｒ−１１１（配列番号８）は、トロンビンに対して不安定化効果を有していた（図３Ｄ）。
【０１６２】
ガンマループの残基Ｅ、Ｎ、又はＧにおける変異体である環状ペプチド（それぞれ、配列番号４、５、及び６）によるトロンビンの安定化は、非効率であった（図３Ｃ）。したがって、ガンマループペプチドとトロンビンとの間の相互作用は、特異的であり、重要な残基が変異した場合、結合親和性が増大し得るとしても、安定化効果は失われ得る。
【０１６３】
２つのランダムペプチド（配列番号１２及び１３）からは、いずれも、若干トロンビンの安定化効果が得られた（図３Ａ）。上記の通り、これらペプチドは、ガンマループに対する初期結合に基づいてランダムライブラリから選択され、これは、安定化能の優れた予測指標であると考えられる。
【０１６４】
実施例５：トロンビン阻害活性についてのペプチドの試験
トロンビン安定化活性を示したペプチドを、異種基質に対するトロンビンの活性に対する効果について試験した。
【０１６５】
アッセイは、実施例１に記載の通り実施した。
【０１６６】
図４Ａ及びＢは、ガンマループ／トロンビンガンマ結合ペプチドによるトロンビン阻害のレベルを示す（阻害は、グラフに示す残存活性％から算出することができる）。
【０１６７】
図４Ａは、いずれもトロンビンに対して若干の安定化効果を示した２つのトロンビン由来ペプチド［Ｔｈｒ  ０３１  ＣＳ（配列番号９）］、Ｔｈｒ  ０３２  ＣＳ（配列番号１０）］が、同濃度でトロンビンに対する阻害効果（例えば、０．５ｍＭのペプチド：１３〜１４％阻害）も示したことを示す。より高いペプチド濃度（１ｍＭ）では、阻害は３０％を超えた。環状ガンマペプチド（配列番号３）は、０．５ｍＭでトロンビンを約７％しか阻害しなかったが、直鎖状ガンマペプチド（配列番号１）は、約２０％の阻害を示した（図２Ｄ）。両ペプチドは、この濃度において同様のトロンビンの安定化効果を示した。ペプチドＲｎｄ  ３１６（配列番号１２）は、試験したいずれの濃度でもトロンビン活性の阻害を全く示さなかった。
【０１６８】
同濃度（０．５ｍＭ）におけるベンズアミジンは、このアッセイにおいて２０％の阻害を示し、これは、試験したペプチドのいずれよりも高かった。
【０１６９】
これらデータは、（ベンズアミジンの使用とは対照的に）トロンビン活性を損なわせることなく、トロンビンを安定化させるために特定のペプチドを使用することが可能であることを示す。
【０１７０】
図４Ｂは、直鎖状（配列番号１）及び環状（配列番号３）のトロンビンガンマループペプチドによるトロンビンの阻害（阻害は、グラフに示す残存活性％として算出することができる）を示す。
【０１７１】
環状ガンマペプチド（配列番号３）は、０．５ｍＭで約７％の阻害しか示さず、直鎖状ガンマペプチド（配列番号１）は、約２０％の阻害を示した。両ペプチドは、この濃度において同様のトロンビンの安定化効果を示した。
【０１７２】
要約すると、理論に束縛されるものではないが、３つの分類のペプチドがトロンビンを安定化させることが示される：
１）直鎖状若しくは環状（すなわち、分子内Ｓ−Ｓ結合）ガンマループペプチド、又はトロンビンガンマループの連続アミノ酸配列を含有する直鎖状若しくは環状ペプチド、
２）トロンビンと相互作用することが知られている（例えば、トロンビン自体）が、ガンマループへの結合を示す抗トロンビンＩＩＩ、トロンボモジュリン、又はその他も含み得る分子から選択されるペプチド、
３）ガンマループと結合相互作用を示すランダムに選択されるペプチド。
【０１７３】
一般的に、上記ペプチドは、トロンビンを安定化させるのと同じ濃度では、トロンビンを阻害しない。トロンビンは、活性である上に安定であるので、これらペプチドを用いて、液体製剤中のトロンビンの活性を安定化させ、その異種基質に対する活性を保持することができる。
【０１７４】
本明細書では様々な実施形態について説明してきたが、その実施形態に対して多くの改変及び変更を行ってもよい。また、特定の構成要素に関して材料を開示したが、他の材料を使用してもよい。以上の明細書及び以下の「特許請求の範囲」は、このような改変及び変更を全て網羅することを意図する。
【０１７５】
全体的に又は一部において、本明細書に参照により援用すると言われるいずれの特許、刊行物、又は他の開示資料も、援用される資料が既存の定義、記載、又は本開示に記載されている他の開示資料と矛盾しない程度にのみ本明細書に援用するものとする。このように及び必要な範囲で、本明細書に明瞭に記載されている開示は、参照により本明細書に援用される任意の矛盾する資料に優先するものとする。
【０１７６】
本出願のいずれの参照文献の引用又は指定も、このような参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１７７】
セクション見出しは、本明細書では、明細書の理解を容易にするために用いられ、必要に応じて限定するものと解釈すべきではない。
【０１７８】
〔実施の態様〕
（１）  液体トロンビン製剤中のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物であって、前記化合物が、トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩、及びトロンビンガンマループ相互作用分子、その誘導体又は塩からなる群から選択される、化合物。
（２）  前記化合物が、前記トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチド、その誘導体又は塩である、実施態様１に記載の化合物。
（３）  前記単離ペプチドが、直鎖状又は環状である、実施態様２に記載の化合物。
（４）  前記トロンビンガンマループのアミノ酸配列が、配列番号１に記載されている、実施態様１〜３のいずれかに記載の化合物。
（５）  前記単離ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、実施態様２又は３に記載の化合物。
【０１７９】
（６）  前記単離ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、実施態様２又は３に記載の化合物。
（７）  前記単離ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、実施態様２又は３に記載の化合物。
（８）  前記単離ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、実施態様２又は３に記載の化合物。
（９）  前記単離ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、実施態様２又は３に記載の化合物。
（１０）  前記ガンマループ相互作用分子が、単離相互作用ペプチド、その誘導体又は塩である、実施態様１に記載の化合物。
【０１８０】
（１１）  前記単離相互作用ペプチドが、トロンビンペプチドである、実施態様１０に記載の化合物。
（１２）  前記単離相互作用ペプチドが、直鎖状又は環状である、実施態様１１に記載の化合物。
（１３）  前記単離相互作用ペプチドが、配列番号７、９、１０、又は１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、実施態様１２に記載の化合物。
（１４）  前記単離相互作用ペプチドが、配列番号７、９、１０、又は１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、実施態様１２に記載の化合物。
（１５）  前記単離相互作用ペプチドが、ランダムペプチドライブラリから得られる、実施態様１０に記載の化合物。
【０１８１】
（１６）  前記単離相互作用ペプチドが、直鎖状又は環状である、実施態様１５に記載の化合物。
（１７）  前記単離相互作用ペプチドが、配列番号１２又は１３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩を含む、実施態様１６に記載の化合物。
（１８）  前記単離相互作用ペプチドが、配列番号１２又は１３に記載のアミノ酸配列、その誘導体又は塩から本質的になる、実施態様１６に記載の化合物。
（１９）  実施態様１〜１８のいずれかに記載の化合物と、薬理学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
（２０）  トロンビンと、実施態様１〜１８のいずれかに記載の化合物と、薬理学的に許容し得る賦形剤とを含む、トロンビン製剤。
【０１８２】
（２１）  約１ＩＵ／ｍＬ〜１０，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、実施態様２０に記載の製剤。
（２２）  約１０ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、実施態様２０に記載の製剤。
（２３）  約１０ＩＵ／ｍＬ〜１，０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有する、実施態様２０に記載の製剤。
（２４）  前記化合物が、約０．０１ｍＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、実施態様２０〜２３のいずれかに記載の製剤。
（２５）  前記化合物が、約０．１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で存在する、実施態様２４に記載の製剤。
【０１８３】
（２６）  前記化合物が、約０．５ｍＭの濃度で存在する、実施態様２４に記載の製剤。
（２７）  フィブリンシーラント成分として使用するための、実施態様２０〜２６のいずれかに記載の製剤。
（２８）  外表面にラベルが貼付されている密閉容器内に収容される、実施態様１〜１８のいずれかに記載の化合物、実施態様１９に記載の組成物、又は実施態様２０〜２７のいずれかに記載の製剤。
（２９）  トロンビン活性を安定化させる方法であって、前記トロンビンを実施態様１〜１８のいずれかに記載の化合物又は実施態様１９に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
（３０）  液体形態のトロンビンの活性を安定化させることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）トロンビンガンマループのアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供することと、
ｂ）試験化合物のセットを提供することと、
ｃ）（ａ）の前記単離ペプチドを（ｂ）の前記化合物のセットと接触させることと、
ｄ）前記ペプチドに結合する１つ又は２つ以上の試験化合物を同定することと、を含み、
前記結合が、トロンビン活性の安定化で使用するための可能性のある化合物を示す、方法。
【０１８４】
（３１）  工程（ｄ）で同定された前記１つ又は２つ以上の化合物を単離することを更に含む、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  液体形態のトロンビンの活性の安定化における効果について、工程（ｄ）で同定された前記１つ又は２つ以上の化合物を試験することを更に含む、実施態様３０又は３１に記載の方法。
（３３）  実施態様２〜１８のいずれかに記載の化合物をコードする、単離核酸配列。
（３４）  プロモータエレメントに機能的に連結している、実施態様３３に記載の核酸配列を含む、ベクター。
（３５）  実施態様３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【図１】
2016535990.tif 000006
【図２Ａ】
2016535990.tif 000007
【図２Ｂ】
2016535990.tif 000008
【図２Ｃ】
2016535990.tif 000009
【図２Ｄ】
2016535990.tif 000010
【図３Ａ】
2016535990.tif 000011
【図３Ｂ】
2016535990.tif 000012
【図３Ｃ】
2016535990.tif 000013
【図３Ｄ】
2016535990.tif 000014
【図３Ｅ】
2016535990.tif 000015
【図３Ｆ】
2016535990.tif 000016
【図４Ａ】
2016535990.tif 000017
【図４Ｂ】
2016535990.tif 000018
【配列表】
2016535990000001.app
【国際調査報告】
2016535990.tif 000019
2016535990.tif 000020
2016535990.tif 000021