(57)【要約】被検体から採取される材料サンプル中の化学物質を検出するための方法であって、ドナー生物から得られる物質サンプルを調製する工程と；前記物質サンプル中の少なくとも１つの活性薬剤の存在を確認するのに適したコントロール要素を、前記物質サンプルと結びつける工程と；前記コントロール要素の状態の変化に基づき、前記活性薬剤の存在または非存在を確認する工程とを含み、前記コントロール要素が、一時的な器官により自律的に栄養を与える能力を有する、少なくとも１つの生きている生物を含み、前記一時的な器官が、前記生きている生物自体に結び付けられ、外の環境から栄養物質を得ることなく、栄養物質を供給することができるものである、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取される材料サンプル中の化学物質を検出するための方法であって、前記被検体は、ヒトまたは動物であり、特に胎児毒性因子を検出するために、
物質サンプル、好ましくは、ドナー生物から得られる有機流体および／または組織の一部を含む物質サンプルを調製する工程と；
前記物質サンプル中の少なくとも１つの活性薬剤の存在を確認するのに適したコントロール要素を、前記物質サンプルに結び付ける工程と；
前記コントロール要素の状態の変化に基づき、前記活性薬剤の存在または非存在を確認する工程とを含み、
前記コントロール要素が、一時的な器官により自律的に栄養を与える能力を有する、少なくとも１つの生きている生物を含み、前記一時的な器官が、前記生きている生物自体に結び付けられ、外の環境から栄養物質を得ることなく、栄養物質を供給できるものである、方法。
【請求項２】
前記生きている生物が、Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ網および両生類網のＸｅｎｏｐｕｓ属に属する少なくとも１種類の魚を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記魚が、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ種または「ゼブラフィッシュ」であり、好ましくは、遺伝子型が「ＡＢ」型の株に属するＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏであり、前記魚は、さらに好ましくは、受精後の成長および／または細胞増殖が１２０時間以下の寿命を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記魚が、Ｏｒｙｚｉａｓ  Ｌａｔｉｐｅｓ種または「メダカ」であり、前記魚は、好ましくは、受精後の成長および／または細胞増殖が２８８時間以下の寿命を有する、請求項２に記載の方法。
前記両生類は、Ｘｅｎｏｐｕｓ属であり、前記両生類は、好ましくは、受精後の成長および／または細胞増殖が９６時間以下の寿命を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生きている生物は、「卵黄嚢」型などの一時的な器官によって自身に自主的に栄養を供給することができ、前記一時的な器官は、生きている生物自体と一体的に成長する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記コントロール要素を、物質サンプルと結び付ける工程は、以下の副次的な工程：
所定数の生きている生物を、採取した物質サンプルに暴露し、前記所定数の生きている生物は、好ましくは、受精からの成長および／または細胞増殖の時間が７２時間以下のＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏの少なくとも２０個の胚である工程と；
前記Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏの同じ群の胚、好ましくは、１０個の胚を、それぞれの確認容器に入れる工程と；
前記物質サンプルを前記確認容器に加え、前記物質サンプルが、ドナー被検体から採取した血清および／または血漿を含む工程とを含む、
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記確認容器が、培養プレートの少なくとも２個の隣接するウェルを含み、前記培養プレートは、好ましくは、合計で２４ウェルを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性薬剤の存在または非存在を確認する工程は、胎児毒性因子（ＥＴＦ）の非存在または存在を確認するために設計されており、以下の副次的な工程：
環境との相互作用、好ましくは、前記培養プレートの確認容器中、胚と物質サンプルとの相互作用を、１２時間、または好ましくは、１２時間を複数回から、最大で４８時間までの範囲の相互作用期間維持する工程と；
前記１２時間および／または前記１２時間の複数回が終了した後、死亡した胚の数を計測する工程と；
前記物質サンプルに、前記胎児毒性因子（ＥＴＦ）の定量的な存在または化学活性のレベルに比例し、定量的に相関関係にある毒性のレベルを割り当てる工程とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記毒性のレベルは、死んだ胚の数が、前記培養プレートの前記確認容器に入れられた胚の合計数の５０％を超える場合に、「毒性」であると同定されるか、または、前記毒性のレベルは、死んだ胚の数が、前記培養プレートの前記確認容器に入れられた胚の合計数の５０％〜３０％である場合に、「中程度に毒性」であると同定されるか、または、前記毒性のレベルは、死んだ胚の数が、前記培養プレートの前記確認容器に入れられた胚の合計数の２０％以下である場合、「非毒性」であると同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
胎児毒性因子（ＥＴＦ）の存在または非存在を確認する工程の結果に基づいて、ドナー被検体に対して操作する工程も存在し、前記ドナー被検体に対して操作する工程は、免疫抑制剤を暴露することを含み、好ましくは、
免疫グロブリンおよび／またはサイトカイン産生の抑制因子の注入、さらにもっと好ましくは、静脈投与； および／または
ドナー被検体またはドナー被検体に結び付けられる人工授精の宿主として適した培地へのプロゲステロンおよび／またはプロゲステロン油の局所適用； 
ビタミン、非ビタミンまたは栄養補助化合物、または天然および／または植物療法の活性成分、および他の栄養補助食品を投与すること、
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体（例えば、繁殖力のある年齢の女性）から採取できる材料サンプルにおいて、異なる影響（例えば、胚の成長または生存能力の維持に対する有害な影響）を発揮し得る１以上の化学物質を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日利用可能な臨床統計学から知られているように、原因が確認されていない再発性流産の事象に苦しむ患者の約４０％は、血液中のいわゆる「胎児毒性因子」（頭字語ＥＴＦを用いて省略される）の存在により特徴付けられる。これらの因子は生体機能と相関関係にある一連の分子であり、これにより、受胎期または妊娠初期に、胚が、将来母体となる体内で誤って異物と判断され、この胚を排除するために特定の免疫応答が進行する。
【０００３】
近年の臨床研究から、母体中のＥＴＦの存在と、突発性の不妊の無視できない症例数（または、誤って、いわゆる子宮内膜症に起因するとされた不妊症の症例数）との相関関係が知られており、この相関関係は、種々の臨床的リスクの「マーカー」として、ＥＴＦの中心的な役割の指標となっている。
【０００４】
言い換えると、胚の受胎の困難さおよび／または流産の発生などをあらかじめ予測できるようにするには、ＥＴＦを診断するためのシステムが根本的に重要である。この点について、今日利用可能な従来技術（まだ実験段階であると考えられる）は、マウスの胚または生きた細胞培養物の使用を想定している。
【０００５】
利用可能な試験媒体の種類にかかわらず、公知の方法では、患者の血液サンプルを使用し、患者の血液サンプルから白血球を抽出し、次いで、その活性化を確実にする（または、言い換えると、免疫応答を刺激する）胚性因子存在下で培養し、その後、白血球細胞の抽出／活性化から得られる、いわゆる「馴化培地」（実験室の専門用語ではＣＭと省略される）を、分析に使用される有機物質と接触させる（例えば、マウスの胚が使用される場合、後者は、ＣＭと共にインキュベートして３日後に観察される）。
【０００６】
この暴露の後、胚が死亡した場合、患者の血清中に毒性物質（これらは一般的にＥＴＦの定義に入る）が存在していると推測される。一方、これとは対照的に、胚が正常に成長する場合、この試験は陰性とされる。
【０００７】
または、ＪＥＧ−３型の細胞培養物と共にＣＭをインキュベートし、３日後に細胞の死亡レベルを評価する（このレベルは、ＥＴＦの存在の指標となると考えられる）。
【０００８】
上にまとめたＥＴＦの存在を確認するための方法には、いくつかの不都合な点がある。例えば、操作にかかる費用、プロトコルの実施及びその結果の作成の速度、低い統計学的「ロバスト性」及び操作の柔軟性の点で不都合がある。特に、操作の複雑さを伴う培地と反応させる「生体材料」（マウスの胚またはＪＥＧ−３細胞）の選択は、費用の観点、及び試験有機材料自体の成長／培養／発育という観点で不都合がある。
【０００９】
さらに、公知の試験プロセスでの「動物モデル」の使用は、倫理的な問題を引き起こすことがあり、臨床試験プロセスにおける動物モデルの使用に対するメディアおよび世論の注目／嫌悪感を増すことがある。ＥＴＦを同定するための試験（明らかな診断目的のある試験）の場合には、この種の試験における動物モデルの「法による」制限／禁止がされる可能性があり、実際に、この試験を行うことはほぼ完全に不可能である。また、ＥＴＦを同定するためのこのような試験は、この試験がまぎれもなく診断試験であるため、（動物モデルの使用が許容される可能性があるか、または継続して許容され得る）治験条件下で行なわれる試験と同様のものであるとはみなすことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、従来技術の欠点を克服する、物質（特に、毒性物質、例えば、ＥＴＦの定義に結びつく物質）を検出するための方法を着想することである。
【００１１】
特に、本発明の一目的は、操作費用を最低限にする方法を行うことであり、ＥＴＦが存在し得る状態に暴露される大量の材料を与え、従って、結果という観点で、定性的および定量的な優れた信頼性を有する多数の試験（また、可能ならば、同じ被検体から採取したサンプルについて、反復して、または並行して行う試験）を行うことを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のこれらの目的および他の目的は、実施形態の非限定的な例および添付される１つ以上の請求項において、本明細書で以下に示される方法を用いて達成される。
【００１３】
本方法は、実質的に、実験室での試験手順の典型的な工程を含み、すなわち、
−物質サンプル（典型的には、ドナーの身体に由来する有機流体および／または組織の一部を含み得る）を調製する工程と；
−前記物質サンプル中の少なくとも１つの活性薬剤の存在を確認するのに適したコントロール要素を、前記物質サンプルと合わせる工程と；
−前記コントロール要素の状態（物理学的状態、化学的状態または生物学的状態）の変化に基づき、前記活性薬剤の存在または非存在を確認する工程とを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好都合なことに、本方法は、コントロール要素が、生きている生物自体と関連し、栄養物質を供給することができる（すなわち、外の環境から栄養物質を得ることなく）一時的な器官によって自主的に栄養を与える能力を有する少なくとも１つの生きている生物を含むことを想定している。
【００１５】
本発明にかかるコントロール要素のこの特性の具体的な定義によって、十分な程度の組織と全体的な成長を伴う生物を使用することができ、その結果、制御の観点から、この材料は、「動物」とはみなされないだけではなく、「生体材料」ともみなされず、従って、動物を用いた試験に対する規則によって規制される分野（実験分野）には含まれない。この点を、本明細書の記載において以下にもっとよく説明する。
【００１６】
詳細に述べると、本発明に従って選択可能な生きている生物が、条鰭（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）綱に属する魚を少なくとも含んでいてもよく、典型的には、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏと呼ばれる種（「ゼブラフィッシュ」の一般名でも知られる）を含んでいてもよいことがわかるだろう。もっとさらに詳細には、遺伝子型が「ＡＢ」型の株に属するＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏを選択することができる。
【００１７】
または、本発明の方法は、試験および分析を行うための生きている生物として、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ種の魚（「ニホンメダカ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｒｉｃｅ  ｆｉｓｈ）」の一般名、または「メダカ」の名称でも知られる）を選択することによってことによって行うことができる。
【００１８】
または、上述のモデルの代替例として、Ｘｅｎｏｐｕｓ属を含む両生類。
【００１９】
本発明の具体的な特徴によれば、可能な生物（例えば、上に提示される２種類の魚と両生類）を、専門用語で「卵黄嚢」と呼ばれる一時的な器官（その他、現在の英語科学用語に従えば、単に卵黄とも呼ばれる）または生きている生物自体と一体的に成長する同様の一時的な器官によって自主的に栄養を与える能力を有するような生体形態で使用する。Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ種の魚を使用する場合、この生きている生物が、寿命に達するまで、または、（標準的な温度で）受精から１２０時間成長するまでは使用可能であり、一方、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ種の魚を使用する場合、この生きている生物が、寿命に達するまで、または、受精から２８８時間成長するまでは使用可能である。Ｘｅｎｏｐｕｓの場合には、幼生の段階は水生動物であり、受精から約９６時間成長するまでは卵黄が保存される。この段階の後は、外から栄養を受け取る。Ｘｅｎｏｐｕｓは、ＥＵによって、正式な実験動物モデルであるとされている。
【００２０】
ここで、この時間の閾値を超えると、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ（または、その状況に応じて、Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓまたはＸｅｎｏｐｕｓ）の胚は、卵黄嚢に存在するすべての栄養を使い果たし、栄養の観点から外の環境に依存するようになることを注記しておくべきである。この時点から、制御の観点で動物とみなされ、その結果、動物実験の規制を受ける（操作費用や、大スケールでの実験室での実験を行う費用のかなりの増加を伴う）。
【００２１】
実施の観点から、コントロール要素を物質サンプルと合わせる工程は、以下の副次的な工程を含む。
【００２２】
−第１に、所定数の生きている生物を、採取した物質サンプルに暴露する（例えば、受精からの成長時間が７２時間以下のＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏの少なくとも２０個の胚と考えてもよい）。
【００２３】
−同じ群の胚（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏまたはＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓまたはＸｅｎｏｐｕｓの胚、例えば、１０のうちの２群）を、適切な確認容器に入った特定の培地に入れる。適切な確認容器は、例えば、培養プレートの２個の隣接するウェルであってもよい（また、培養プレートは２４ウェルを含んでいてもよい）。
【００２４】
−物質サンプルは、典型的には、ドナー被検体から採取した血清であってもよいが、これを適切な濃度で、すぐ上に述べた培地に加える。
【００２５】
活性薬剤の存在／非存在を確認する工程の実施に関し、簡便には、いわゆる「胎児毒性因子（ＥＴＦ）」の非存在／存在を確認するために設計されてもよく、以下の副次的な工程を含んでいてもよいことを注記しておく。
【００２６】
−環境との相互作用（典型的には、培養プレートのウェル中、胚と物質サンプルとの相互作用）を、１２時間（または、ある場合には、１２時間を複数回、最大で４８時間まで）と定義される相互作用期間維持する。
【００２７】
−すぐ上に述べた１２時間および／または上に定義した複数回の１２時間が終了したらすぐに、死亡した胚の数を計測する。
【００２８】
−毒性のレベルを割り当てる。毒性のレベルは、物質サンプル中に存在する胎児毒性因子（ＥＴＦ）の化学活性のレベルに比例し、定量的に相関関係にある。
【００２９】
本発明の方法によれば、物質サンプルの分類は、以下のパラメータ表現に従って定義することができる。
【００３０】
−物質サンプルの毒性のレベルは、死んだ胚の数が、確認容器に入れられた胚の合計数の５０％を超える場合に、「毒性」であると同定される。
【００３１】
−物質サンプルの毒性のレベルは、死んだ胚の数が、確認容器に入れられた胚の合計数の５０％〜３０％である場合に、「中程度に毒性」であると同定される。または、死んだ胚の数が、確認容器に入れられた胚の合計数の２０％以下である場合、「非毒性」であると同定される。
【００３２】
毒性のレベルを試験し、定性的／定量的に決定する工程の後に利用可能な操作の可能性という観点から、胎児毒性因子（ＥＴＦ）の存在／非存在を確認する工程の結果に基づいて、ドナー被検体に対して作業をすることができる。簡便には、このドナー被検体に対する可能な作業は、例えば、
−免疫グロブリンおよび／またはサイトカイン産生の抑制因子の注入（典型的には、静脈から注入）、
−ドナー被検体またはドナー被検体に関連する人工授精の宿主作成プロセスに適した培地のプロゲステロンおよび／またはプロゲステロン油の局所適用、および／または
−ビタミン、非ビタミンまたは栄養補助化合物、または天然および／または植物療法の活性成分、および他の栄養補助食品の投与
という手段によって、ドナー被検体に免疫抑制剤を暴露することからなっていてもよい。
【００３３】
本発明は、特に、操作費用と、試験によって得られる結果の質との比率を最適化するという観点で、種々の利点を達成する。
【００３４】
特に、本発明に従ってこの点を考慮すると、大量の「生体材料」を開発する可能性によって、経済的な培養種、「生体材料」として作用し得る非常に大量の標本で構成される「試験場」を短い時間で保有することができ、その結果、迅速な実施時間（および非常に信頼性が高い毒性試験）を保証することができる。
【００３５】
さらに、（現在の規則で法的に分類されているような胚の使用ではなく）生物学実験での実施において今日適用されている正式な定義に従う、いわゆる「生体材料」の使用によって、動物実験の複雑かつ制限の多いルールの規制を受けることを避けることができ、プロセス全体を迅速に、もっと効率的にし、実験室の生産性および多数の試験を実施する可能性の両方を高める。
【００３６】
従って、本発明の方法は、受精から１２０時間成長するまでのゼブラフィッシュの胚（または、受精から２８８時間成長するまでのメダカの胚、または受精から約９６時間を超えて成長することができないＸｅｎｏｐｕｓの胚）で行われ、この時間制限の範囲内では、現行の規則によっては「動物」と分類することができない。同時に、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ種（または同様の種、例えば、上述の種）に属する生物を用いることによって、ＥＴＦが存在し得る状態を生成しつつある生きた器官／系を簡便に暴露することができ、それによって、正確かつ現実的な応答（典型的には、「インビボ」モデルによって得られる）によるフィードバックのみを完結することができる。
【国際調査報告】
2016520322.tif 000002
2016520322.tif 000003