(57)【要約】  様々な診断方法および解析方法で使用することができる非常に感度のよい磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）が得られる、ＭＮＰの調製方法を開示する。ＭＮＰは、超常磁性を示し、巨大磁気抵抗センサ（ＧＭＲＳ）での特段の使用が見出されている。ＭＮＰは、ナノ粒子のサイズの範囲を１０〜２０ナノメートル、粒子サイズ分布を非常に小さい±２ナノメートル以下に調整することを可能にするプロセスによって作製される。ＭＮＰは、様々なマーカーでタグ付けすることができ、それにより、多くの分析アッセイ、細胞選別技術、画像診断法、薬物送達法、および癌治療での使用が見出されている。本発明のＭＮＰは、２０００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出することができる。
2016522983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５℃で次式を満たす、粒子１個あたりの液体状態ＡＣ磁化率を有し、
χ／Ｎ≧Ａ（Ｄ−１３）
式中、
χが、１００ＨｚでのＡＣ磁化率であり、
Ｎが、ＭＮＰの数であり、
Ｄが、ナノメートル単位でのナノ粒子の直径であり、
Ａが、
【数１】
2016522983.tif 000008
と等しく、５＊１０−１７〜２＊１０−１６の値の範囲である、磁性ナノ粒子。
【請求項２】
前記χ／Ｎの値が、５＊１０−１６以上である、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項３】
２０００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項４】
１０００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項５】
１００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項６】
１０〜２５ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有し、オレイン酸およびオレイルアミンの界面活性剤被膜を有し、オレイン酸と酸化鉄のモル比およびオレイルアミンと酸化鉄のモル比がそれぞれ別々に１：１〜２．５：１である、酸化鉄磁性ナノ粒子。
【請求項７】
１３〜２０ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有する、請求項６に記載の酸化鉄磁性ナノ粒子。
【請求項８】
１３〜１８ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有する、請求項６に記載の酸化鉄磁性ナノ粒子。
【請求項９】
磁場リポーター粒子として使用され、磁場センサによって検出可能である、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１０】
前記磁場センサが、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサ、超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）、またはホールセンサのうちの１種である、請求項９に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１１】
タンパク質、抗体、および酵素からなる群から選択される少なくとも１種の生体分子をさらに含む、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１２】
鉄フェライト、磁鉄鉱、マグヘマイト、またはこれらの混合物を含む、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１３】
少なくとも１種のポリエチレングリコールでさらに表面修飾されている、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールが、スクシニル−ポリエチレングリコール、メトキシ−ポリエチレングリコール、アミン−ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物のうちの少なくとも１種を含む、請求項１３に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の生体分子が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、およびこれらの混合物のうちの少なくとも１種を含む、請求項１１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１６】
各々の磁性ナノ粒子が、単一磁区を含む、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項１７】
制限視野回折分析によって測定されるような非常に規則的な結晶構造を有する、請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月２７日出願の米国仮特許出願第６１／８０５，５３９号および２０１４年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／９３３，９８９号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
なし。
【０００３】
本発明は、一般には磁性ナノ粒子、より詳細には超常磁性である磁性ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００４】
磁性ナノ粒子、例えば、磁性支援型細胞選別用途のためのＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）；およびＯｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製の磁性ナノ粒子が、当技術分野で知られている。これらは、磁性支援型細胞選別、タンパク質の単離、ＲＮＡおよびＤＮＡセグメントの単離、イムノアッセイ、ならびに他の診断法における使用が見出されている。磁性ナノ粒子はまた、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）およびトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）のセンサ素子などの磁場センサ素子を使用する生物学的センサ用途のためのタグとして使用されている。ＧＭＲセンサの構造および使用は、文献に記載されており、例えば、「Ｇｉａｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｈｅｎｇ  Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ＳＰＩＥ、７０３５巻、７０３５０Ｅ（２００８）；「Ｔｈｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ」、Ｉｌｉａ  ＦｉｓｈｂｅｉｎおよびＲｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｌｅｖｙ、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻、８９０頁（２００９年１０月１５日）；ならびに「Ｇｉａｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＰＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」、Ｌｉａｎｇ  Ｘｕら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２４、９９頁（２００８）を参照されたい。
【０００５】
磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）は、そのサイズ範囲が約３ナノメートル（ｎｍ）〜約５０ｎｍである場合、超常磁性を示し、この性質は、細胞選別法、生物分析アッセイ、および巨大磁気抵抗センサ（ＧＭＲＳ）様式の作製に使用されている。
【０００６】
現在入手可能なものよりも高い磁気センサ応答を有するＭＮＰを提供することが望まれている。これにより、より低レベルの分析物の検出が可能になり、感度が向上する。この技術は、ＧＭＲＳ素子を使用するシステムにおいてより高感度の応答を生じさせる際に利用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「Ｇｉａｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｈｅｎｇ  Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ＳＰＩＥ、７０３５巻、７０３５０Ｅ（２００８）
【非特許文献２】「Ｔｈｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ」、Ｉｌｉａ  ＦｉｓｈｂｅｉｎおよびＲｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｌｅｖｙ、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻、８９０頁（２００９年１０月１５日）
【非特許文献３】「Ｇｉａｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＰＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」、Ｌｉａｎｇ  Ｘｕら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２４、９９頁（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
概括していえば、本発明は、様々な用途で使用することができる、非常に小さなサイズ分布および非常に高いＡＣ磁化率を有する磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
例を挙げると、本発明によりＭＮＰを作製する一方法は、アセチルアセトン鉄Ｆｅ（ａｃａｃ）３、１，２−ヘキサデカンジオール、オレイン酸、オレイルアミンを、大量のトリオクチルアミン中において非反応性ガスブランケット下で１２０℃に加熱しながら１時間混合するステップであって、オレイン酸とアセチルアセトン鉄のモル比およびオレイルアミンとアセチルアセトン鉄のモル比が、それぞれ別々に１：１〜２．５：１である、ステップと；混合物を２００℃に２時間加熱するステップと；次いで、混合物を２℃／分の速度で３５０℃の還流温度まで加熱し、２時間還流するステップと；次いで、熱源を取り除いて、混合物を室温に冷却するステップと；次いで、混合物にエタノールを添加して、磁性ナノ粒子を沈殿させ、遠心分離でそれらを回収するステップとを含み得る。
【００１０】
別の一実施形態では、本発明は、水分散性ＭＮＰ、例えば、１０〜２５ナノメートル（ｎｍ）、好ましくは１３〜２０ｎｍ、最も好ましくは１３〜１８ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有し、オレイン酸およびオレイルアミンの界面活性剤被膜を有し、オレイン酸と酸化鉄のモル比およびオレイルアミンと酸化鉄のモル比がそれぞれ別々に１：１〜２．５：１である酸化鉄磁性ナノ粒子などを含む。
【００１１】
別の一実施形態では、本発明は、２５℃で液体状態において次式を満たす、粒子１個あたりのＡＣ磁化率を有するＭＮＰを含む。
χ／Ｎ≧Ａ（Ｄ−１３）
式中、
χは、１００ＨｚでのＡＣ磁化率であり、
Ｎは、ＭＮＰの数であり、
Ｄは、ナノメートル単位でのナノ粒子の直径であり、
Ａは、
【００１２】
【数１】
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と等しく、５＊１０−１７〜２＊１０−１６の値の範囲である。
本明細書および特許請求の範囲では、用語「液体状態において」は、磁性ナノ粒子を液体中に懸濁させていることを意味する。好ましい液体は水であるが、測定されるＡＣ磁化率は、水と類似の粘度を有する他の液体に類似しているであろう。例として、水と非常に類似した粘度を有する他の液体には、リン酸緩衝生理食塩水、生物学的緩衝液、クロロホルム、トルエン、ヘキサン、メタノール、およびエタノールがある。磁性ナノ粒子を非常に高粘度の液体に懸濁させた場合、ＡＣ磁化率は低減するであろうが、これは非常に高粘度の液体の場合のみ予期される。
【００１３】
本発明の上記その他の特徴および利点は、好ましい実施形態の詳細な説明から当業者にはより明らかになるであろう。詳細な説明に添付する図面について以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】１５ｎｍ±０．５ｎｍのサイズを有する磁性ナノ粒子のサイズ分布を表す図である。
【図１Ｂ】図１Ａの磁性ナノ粒子に関するχ＿実部（上トレース）およびχ＿虚部（下トレース）の理論値のプロットを示す図である。
【図２Ａ】１５ｎｍ±２．０ｎｍのサイズを有する磁性ナノ粒子のサイズ分布を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの磁性ナノ粒子に関するχ＿実部（上トレース）およびχ＿虚部（下トレース）の理論値のプロットを示す図である。
【図３Ａ】１５ｎｍ±５．０ｎｍのサイズを有する磁性ナノ粒子のサイズ分布を表す図である。
【図３Ｂ】図１Ａの磁性ナノ粒子に関するχ＿実部（上トレース）およびχ＿虚部（下トレース）の理論値のプロットを示す図である。
【図４Ａ】２５℃で１００Ｈｚの周波数に正規化した後、サイズ分布を±１ｎｍと仮定して、ピーク粒子サイズに対してχ＿実部の理論値をプロットした図である。
【図４Ｂ】１００Ｈｚおよび２５℃に正規化した状態で、ピーク粒子サイズを１５ｎｍと仮定して、サイズ分布を±０．５〜±５ｎｍに変化させて計算したχ＿実部の理論値をプロットした図である。
【図５】本発明による磁性ナノ粒子を作製するプロセスの概略図である。
【図６Ａ】０．０００１〜１．０ｍｇ／ｍｌのビオチンを含有する一連の分析物溶液で被膜した巨大磁気抵抗センサ（ＧＭＲＳ）に曝露させた後の、本発明により調製したストレプトアビジン標識磁性ナノ粒子から得られたＧＭＲＳシグナルの、曝露時間に対する一連のプロットを示す図である。
【図６Ｂ】０．０００１〜１．０ｍｇ／ｍｌのビオチンを含有する一連の分析物溶液で被膜したＧＭＲＳに曝露した後の、市販のＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのストレプトアビジン標識磁性ナノ粒子から得られたＧＭＲＳシグナルの、曝露時間に対する一連のプロットを示す図である。
【図７】０．０００１〜１．０ｍｇ／ｍｌのビオチンを含有する一連の分析物溶液で被膜したＧＭＲＳに曝露した後の、市販のＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢのビオチン抗体標識磁性ナノ粒子から得られたＧＭＲＳシグナルの、曝露時間に対する一連のプロットを示す図である。
【図８】図６Ａおよび図７に示す結果のいくつかの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す図であり、詳細には、図８Ａおよび図８Ｃは、１ｍｇ／ｍｌの分析物および０．０００５ｍｇ／ｍｌの分析物のレベルにおける本発明により調製したＭＮＰのサンプル４からの結果をそれぞれ示す図であり、一方、図８Ｂおよび図８Ｄは、１ｍｇ／ｍｌの分析物および０．０００５ｍｇ／ｍｌの分析物のレベルにおけるＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢの磁性ナノ粒子からの結果をそれぞれ示す図である。
【図９】本発明により調製した磁性ナノ粒子のいくつかの使用を示す概略図である。
【図１０Ａ】液体状態においての本発明により調製した磁性ナノ粒子と、同様の液体状態においての市販の磁性ナノ粒子とを比較したＡＣ磁化率および相対シグナル強度を示す図である。
【図１０Ｂ】液体状態においての本発明により調製した磁性ナノ粒子と、同様の液体状態においての市販の磁性ナノ粒子とを比較したＡＣ磁化率および相対シグナル強度を示す図である。
【図１０Ｃ】液体状態においての本発明により調製した磁性ナノ粒子と、同様の液体状態においての市販の磁性ナノ粒子とを比較したＡＣ磁化率および相対シグナル強度を示す図である。
【図１１】本発明により調製した磁性ナノ粒子と、市販の磁性ナノ粒子とを比較した透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真および制限視野回折（ＳＡＤ）パターンに見られる結晶化度を示す図である。
【図１２】本発明により調製した磁性ナノ粒子のヒステリシスループを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の作製、ならびに診断および医療用途におけるそれらの使用を対象とする。現在市販されているＭＮＰは十分なシグナル対ノイズ比を有するが、検出限界をより下げるためにシグナル強度の向上が常に求められている。本発明者らは、非常に向上した感度およびシグナル対ノイズ比を有するＭＮＰを作製した。これらのＭＮＰは、ストレプトアビジンなどの有用なリポータータグでタグ付けすることができる。感度およびシグナル対ノイズ比が向上した理由は現在のところよく理解されていないが、本発明により調製したＭＮＰのいくつかの独特な特性と関係があるように見える。これらの特性には、ＭＮＰの非常に厳格な粒子サイズ制御、ＭＮＰ表面上のより低レベルな界面活性剤、およびＭＮＰのより高い結晶化度が含まれる。これらの特性を組み合わせることで、明確な単一の磁区構造を有し、非常に高いシグナル対ノイズ比を有し、外部磁場への感度が増強されたＭＮＰが製造される。これらの改変により、最新のＭＮＰは、多くの高感度磁場センシングのアッセイおよび環境のための磁気リポーター材料として様々な役割において非常に有用である。本ＭＮＰは、磁性ナノ粒子の検出に従来必要とされてきた外部磁場レベルよりはるかに低い外部磁場レベルで検出することができる。
【００１６】
本発明のＭＮＰは、１０〜３０ナノメートルの理論上のサイズ範囲を有する。これらは、鉄、磁鉄鉱としても知られる、Ｆｅ３Ｏ４を含む酸化鉄、および他の周知の磁性材料、例えば、鉄フェライト、磁鉄鉱、マグヘマイト、またはこれらの混合物などの磁性体をベースとしている。他の磁性材料としては、ニッケル、コバルト、これらの金属の合金、およびいくつかの希土類金属を含有しているものも挙げられる。最新のＭＮＰは、強磁性材料、フェリ磁性材料、および超常磁性材料から調製することができる。フェリ磁性および強磁性の材料は、その温度がそれのキュリー温度より低ければ自発磁性であり、それのキュリー温度より高ければ、磁気秩序がないことを意味する常磁性である。フェリ磁性材料は、高い抵抗率および異方性特性を有する。
【００１７】
ＧＭＲおよびＴＭＲなどの磁場センサは、強磁性層と非磁性層との交互層から構成された薄膜ラミネートに観察される量子力学的磁気抵抗効果に基づいている。非磁性層は、ＧＭＲでは非磁性導電層として使用され、ＴＭＲでは非磁性絶縁体層として使用される。観察される重要な効果は、隣接する強磁性層の磁化が平行配列にあっても反平行配列にあっても生じる電気抵抗において予想される変化よりもはるかに大きく、実際には巨大な変化である。層が平行配列にある場合、全抵抗は低く、層が反平行配列にある場合、全抵抗は比較的高い。磁気抵抗効果は、外部磁場に基づいて材料の電気抵抗に依存する。磁気抵抗素子では、磁場に基づいて観察される抵抗の変化は、異方性磁気抵抗より非常に大きいが、通常は数％のみである。磁化方向は、外部磁場の印加により制御することができる。ＧＭＲ効果は、磁場センサの作製に使用され、この磁場センサは、ハードディスクドライブのデータの読み取りおよびバイオセンサの作製に使用されたり、微小電気機械システム中で使用されたりする。ＧＭＲＳの表面にＭＮＰを結合させると、ＧＭＲＳの抵抗の変化として検出される磁性の変化が引き起こされ得る。ＧＭＲＳの感度のおかげで、抵抗の検出可能な変化を生じさせるのに結合させなければならないＭＮＰはほんの少しである。
【００１８】
これらのＭＮＰが使用を見出し得る別の分野は、上述した細胞選別技術の作製においてである。本ＭＮＰは、細胞表面上の抗原または別の細胞マーカーにそれぞれ結合させることができる抗体または官能性化合物を担持させるために表面修飾することができる。これにより、抗原または細胞マーカーを有する細胞が磁気量を有するようになる。標識された細胞と標識されていない細胞との混合物を磁気カラムに注ぎ通すことによって、対象の細胞を単離することができる。ＭＮＰでタグ付けされた細胞は、磁化されたカラム中に保持され、他の細胞は洗い出される。次いで、磁場を除去することにより、タグ付き細胞を放出させることができる。ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社は、ＭＡＣＳ（登録商標）（磁性支援型細胞選別）キットおよび磁気選別カラムを販売している。この技術を使用して、ＭＮＰが細胞表面上の抗原に直接結合する直接磁気標識化、または最初に一次抗体で細胞を標識し、次いで、ＭＮＰが抗体もしくは抗体に結合した官能基に結合する間接磁気標識化を行うことができる。標識化すると、磁気的に標識された細胞の正の選択、磁気的に標識された細胞による望ましくない細胞の除去、除去後の正の選択、または２連続の正の選択を含む様々な手段によって、細胞を単離することができる。これらの技術は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃなどによって十分に開発されており、当業者に周知である。
【００１９】
本発明のＭＮＰは、そのサイズのために超常磁性を示す。超常磁性は、小さな強磁性およびフェリ磁性ナノ粒子に現われる磁性形態である。この磁性形態では、磁化は、温度の影響下でランダムに方向を反転する。２つの反転間の時間は、ネール緩和時間と呼ばれる。通常、フェリ磁性または強磁性材料は、それのキュリー温度より高い温度において、磁場がない状態で正味の磁化を有さない常磁性状態への転移が起こり、超常磁性材料では、キュリー温度より低い温度においてこれが起こる。超常磁性を生じさせるには、ＭＮＰのサイズを、粒子が単一の磁区であることを意味する単一区になるように十分に小さくしなければならない。典型的なサイズ範囲は、材料に応じて３〜５０ｎｍの範囲にある。
【００２０】
本発明により作製したＭＮＰに観察された最初の結果は、高レベルのシグナルの実現には平均サイズおよびサイズ分布が極めて重要であるということであった。詳細には、ＭＮＰは、好ましくは直径が１０〜２５ｎｍ、より好ましくは直径が１３〜２０ｎｍ、最も好ましくは直径が１３〜１８ｎｍである。１５ｎｍ±１ｎｍのサイズの本発明によるＭＮＰを使用して、一連の計算を行った。ＤＣ磁化率とＡＣ磁化率の関係を表す式（下記の式１）およびネール−アレニウスの式（下記の式２）に基づいた一連の計算において、本ＭＮＰの応答性へのサイズおよびサイズ分布の影響を見ることができる。
【００２１】
【数２】
2016522983.tif 000004
式中、
χは、ＡＣ磁化率であり、
χ０は、ＤＣ磁化率であり、
ｉは、−１の平方根であり、
ωは、周波数であり、
τは、緩和時間であり、これは応答時間と見なすことができる。
【００２２】
式２
τＮ＝τ０ｅｘｐ（ＫＶ／ｋＢＴ）
式中、
τＮは、ネール緩和時間であり、
τ０は、試行時間または試行周波数と呼ばれる材料依存の時定数であり、典型的な値として１０−９〜１０−１０秒を有し、
Ｋは、材料依存の定数、ナノ粒子のマグネト異方性エネルギー密度であり、
Ｖは、ナノ粒子の体積であり、
ｋＢは、ボルツマン定数であり、
Ｔは、温度である。
【００２３】
式１において、ＡＣ磁化率χは、シグナルを高め、最大感度を引き出すのに必要なχ＿実部と、エネルギーの散逸を表し、最小限にするのに必要なχ＿虚部とに分解することができる。これらの式を使用して、２５℃で液体状態においての図１〜４のデータを得た。図１Ａでは、１５ｎｍのピーク直径を有し、サイズ分布を±０．５ｎｍと仮定したＭＮＰに関するサイズ分布を示している。図１Ｂでは、計算したχ＿実部を上トレースに示し、計算したχ＿虚部を下トレースに示している。計算したχ＿実部が、示された周波数範囲にわたって本質的に一定のままであり、約０．４２のレベルであることが分かる。図２Ａおよび２Ｂのデータは、ピーク直径が同じ１５ｎｍでもサイズ分布を±２ｎｍに増大したので、χ＿実部値が特に１００Ｈｚ超の周波数で低下し始め、χ＿虚部値が上昇し始めたことを示している。図３Ａおよび３Ｂでは、サイズ分布が±５ｎｍ、ピーク直径が１５ｎｍの場合のデータを示している。ここで、χ＿実部の初期値がより低く、周波数が増大するにつれて非常に劇的に低下していることが分かる。１０００Ｈｚにおけるχ＿実部の値は、直径が１５ｎｍ、サイズ分布が±０．５ｎｍの場合の計算値の約半分である。図４Ａでは、ＭＮＰサイズを変化させ、２５℃で１００Ｈｚの周波数および±１ｎｍのサイズ分布に正規化した後、χ＿実部の値をプロットした。このデータは、ピーク直径が１５〜１８ｎｍの範囲にある場合、このサイズ分布では理論上のＡＣ磁化率ピークの正規化された値が約０．５であることを示している。図４Ｂでは、１００Ｈｚおよび２５℃に正規化した状態で、ピーク直径を１５ｎｍと仮定し、サイズ分布を±０．５〜±５ｎｍに変化させて、χ＿実部を計算した。このデータは、サイズ分布が±２ｎｍを超えたとき、χ＿実部の計算値にかなり劇的な低下があることを示している。
【００２４】
図１〜４のデータに基づき、酸化鉄ＭＮＰに関して、理論的には、１５〜１８ｎｍのサイズおよび±２ｎｍのサイズ分布を有するナノ粒子を使用すべきであることが分かる。本発明者らは、ＧＭＲセンサ用途での結果が劇的によくなり、ＭＮＰの有用性を劇的に向上させる見込みがある、ストレプトアビジン（ＳＡ）を被膜したＭＮＰを形成するプロセスを開発した。プロセスの概要を、図５に概略的に示している。
【００２５】
例を挙げると、本発明による一プロセスでは、１０〜２０ｎｍのサイズを有する酸化鉄ＭＮＰを、以下の工程に従って調製する。第１ステップにおいて、２ｍｍｏｌのアセチルアセトン鉄Ｆｅ（ａｃａｃ）３を、１０ｍｍｏｌの１，２−ヘキサデカンジオール、２〜４．５ｍｍｏｌのオレイン酸、２〜４．５ｍｍｏｌのオレイルアミン、および１０ｍＬのトリオクチルアミンと混合する。あるいは、トリオクチルアミンの代わりに、１−オクタデケン、またはベンジルエーテル、ジオクチルエーテル、もしくはジフェニルエーテルなどのエーテルを使用することができる。混合物を、アルゴンまたは窒素などの非反応性ガスブランケット下で磁気的に撹拌し、１２０℃に１時間加熱する。次に、混合物を２００℃に２時間加熱する。次いで、混合物を、２℃／分の速度で還流温度の３５０℃までゆっくりと加熱し、２時間還流する。次いで、熱源を除去して、混合物を室温の２５℃に冷却する。混合物が室温の２５℃に達したら、エタノール４０ｍＬを混合物に添加し、ＭＮＰを沈澱させ、遠心分離で分離する。次いで、ＭＮＰを、エタノールおよびエタノールとクロロホルムとの混合液中で数回洗浄し、遠心分離で収集する。次いで、ＭＮＰをクロロホルム中に懸濁させ、使用するまで保存する。あるいは、ＭＮＰをヘキサンまたはトルエンなどの他の有機溶媒中で保存してもよい。本発明者らは、オレイン酸およびオレイルアミンのレベルを２〜９ｍｍｏｌの間に調整して、アセチルアセトン鉄のモル値に対するこれらの界面活性剤のモル比がそれぞれ別々に１：１〜５：１になるようにすると、作製するＭＮＰのサイズを調整できることを見出した。アセチルアセトン鉄が２ｍｍｏｌの場合、オレイン酸およびオレイルアミンのレベルを２〜４．５ｍｍｏｌの間に調整することによって、本出願で良好な性質を示す、約１０〜２５ｎｍの粒子サイズを有するＭＮＰが作製される。したがって、好ましくは、オレイン酸およびオレイルアミンとアセチルアセトン鉄のモル比は、それぞれ別々に１：１〜２．５：１である。これらの好ましい比は、ＭＮＰの作製に一般に使用されるもの、すなわち３以上〜１よりかなり低い。本発明者らは、オレイン酸およびオレイルアミンのレベルが４．５ｍｍｏｌから２ｍｍｏｌに減少したとき、ＭＮＰのサイズが増大することを見出した。したがって、本発明のプロセスにおいて、好ましくは、界面活性剤のオレイン酸およびオレイルアミンは、酸化鉄をベースとする磁性ナノ粒子の合成中に使用される。好ましくは、オレイン酸とアセチルアセトン鉄のモル比およびオレイルアミンとアセチルアセトン鉄のモル比は、それぞれ別々に１：１〜２．５：１である。
【００２６】
製造時、上述のＭＮＰは、ＭＮＰ上に界面活性剤のオレイン酸およびオレイルアミンの被膜を有し、生物学的または水ベースの溶媒には分散しない。製造したＭＮＰは、非常に疎水性である。最も望ましいシステムに有用であるためには、ＭＮＰが水または生物学的ベースの溶媒系および高濃度塩溶液においてコロイド懸濁物として残留できるように、ＭＮＰを表面修飾しなければならない。第１ステップとして、市販されているほとんどのＭＮＰはトルエン中に保存されているが、そのトルエンをクロロホルムと交換しなければならず、したがって、トルエンを除去するために、トルエン中のＭＮＰを遠心分離で収集して洗浄する。ＭＮＰにトリオクチルアミンを添加し、混合後、ＭＮＰを遠心分離にかけ、上澄液を除去し、ＭＮＰを取っておく。ＭＮＰを洗浄するために、これを数回行う。最終洗浄の後、ＭＮＰをクロロホルム中に懸濁させる。本発明によるＭＮＰは一般にクロロホルムに保存されるため、この洗浄ステップは任意選択である。
【００２７】
第２ステップは、ＭＮＰをより親水性にする官能性化合物によるＭＮＰの表面修飾である。使用し得る一プロセスは、脂質−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＭＮＰを表面修飾し、それにより、ＭＮＰをより親水性にすることである。当業者に周知の他の表面修飾プロセスを使用してもよい。本発明に有用な官能性脂質−ＰＥＧとして、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（メトキシ−ＰＥＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［スクシニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（スクシニル−ＰＥＧ）；および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈｎａｏｌａｍｉｎｅ）−Ｎ−［スクシニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アミン−ＰＥＧ）のアンモニウム塩が挙げられる。表面は、スクシニル−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧとスクシニル−ＰＥＧとの混合物、アミン−ＰＥＧ、またはアミン−ＰＥＧとメトキシ−ＰＥＧとの混合物で修飾することができる。一例のプロセスでは、官能性脂質−ＰＥＧをクロロホルムに溶解させ、次いで、ＭＮＰを含むクロロホルムに添加し、５分以上反応させる。次いで、ＭＮＰの表面上の界面活性剤との疎水反応を介して、官能性脂質−ＰＥＧをＭＮＰの表面に結合させる。
【００２８】
反応が完了したら、ＭＮＰをアルゴンガス気流下で乾燥させる。次いで、残留クロロホルムを８０℃で真空除去する。次いで、残留脂質−ＰＥＧを除去するために、何回かの水洗浄を経て、遠心分離によりＭＮＰを収集する。次いで、脂質−ＰＥＧが結合した水分散性ＭＮＰに、当技術分野で周知の表面修飾をさらに施すことができる。本発明の実験では、一プロセスにおいて、脂質−ＰＥＧ修飾の後、ＭＮＰにストレプトアビジン（ＳＡ）修飾を施す。ストレプトアビジンは、周知の化合物ビオチンのビタミンＢ７に非常に高い親和性を有する周知のタンパク質生体分子である。ビオチンはまた、ビタミンＨまたは補酵素Ｒとして知られている。アビジンは、ビオチンに高い親和性を有する別のタンパク質生体分子である。ストレプトアビジン−ビオチン結合およびアビジン−ビオチン結合は、多くの診断システム、細胞選別プロセス、および免疫学的アッセイにおいて使用されている。ＭＮＰをアミン−ＰＥＧで修飾すると、例えば、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いた周知の反応を使用して、脂質−ＰＥＧ官能基にストレプトアビジンを結合させることができる。ＥＤＣ反応は、脂質−ＰＥＧのアミン基とストレプトアビジン上のカルボキシル基との間を架橋するのに使用される。一般に、この反応は、４℃において一晩で行うことができる。スクシニル−ＰＥＧを使用した場合、既知のＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ反応（ここで、スルホ−ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドである）を使用して、ストレプトアビジンの結合を実現することができる。この反応は、一般に、４℃で一晩または室温で約２時間行われる。次いで、未反応のＮＨＳおよびＥＤＣを、ＭＮＰを保持し、非磁性成分はすべて通過させる磁気カラムを介して洗浄することによって除去する。何回かの洗浄後、磁気カラムを止め、ＭＮＰを収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散させることができる。ＭＮＰとストレプトアビジンとの間の反応、および標識済みＭＮＰとＧＭＲＳ上のビオチンとの間の反応を安定化させるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または試薬ブロックＡＣＥなどのキャリアタンパク質を任意選択で添加することができる。一例では、図５に示すように、脂質−ＰＥＧで表面修飾され、ストレプトアビジンを結合させたＭＮＰが最終的に得られる。表面修飾されたＭＮＰは、この時点で水分散性であり、生物系および緩衝液中で非常に安定である。本発明によるＭＮＰはまた、表面修飾物として他の多くの生体分子を含むことができる。例えば、これらの他の生体分子として、タンパク質、抗体、または酵素を挙げることができる。
【００２９】
上述のように、ＭＮＰの使用の１つは、ＧＭＲＳを使用するセンサ用途にある。ＧＭＲＳは、非磁性層と磁気層が交互にある薄膜のラミネート配列から構成されている。層は、厚さが約２〜３０ｎｍ程度で非常に薄い。これらのＧＭＲセンサでは、磁場が少し変化すると、抵抗率に巨大な変化が起こる。本発明により調製したＭＮＰの有用性を試験するために、様々な市販のＭＮＰ、および本発明により調製した一連のＭＮＰに関して、ＧＭＲＳシグナルを評価した。ある実験では、使用するＧＭＲＳをビオチン−ＢＳＡで最初に被膜し、それにより、ストレプトアビジンで被膜したＭＮＰが、ＧＭＲＳに結合して、検出され得る抵抗の変化を生じるようにした。さらに、本発明により調製したＭＮＰの結果を、ＳＡに共役した市販のＭＮＰを使用して得られた結果と比較した。市販製品のＭＮＰサイズは、製造元の文献から得た。本発明により作製したＭＮＰの粒子サイズは、水またはクロロホルム中にＭＮＰを分散させ、次いで、グリッド上でそれを乾燥させ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用してカウントすることにより推定した。使用し得る粒子サイズ評価の別法は、既知のディスク遠心分離技術であるが、これは粒子サイズをより確実に推定する。観察されたデータを以下の表１に報告する。電磁単位ｅｍｕ／（Ｏｅ  ｍｇ）は、酸化鉄の単位重量（ｍｇ）あたりのＡＣ磁化率の実数値部分である。固体状態のＡＣ磁化率は、方法論に定められるように、固体状態の磁性粒子を用いて、３００ケルビン、すなわち約２７℃で振幅５Ｏｅの周波数１００ＨｚでＡＣ超伝導量子干渉素子（ＡＣ  ＳＱＵＩＤ）を使用して得られる。約０．１〜５ｍｇ／ｍｌの試験ＭＮＰをＧＭＲＳに曝露した後のＧＭＲＳシグナル値を報告するが、その値は、市販のＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰを使用した際の標準値に対する観測値の比である。ＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰは、デキストランのマトリクスで結集される約１０ｎｍ以下のγ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子のクラスターから構成されている。γ−Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子は小サイズなので、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡ粒子は、超常磁性であり、約５０ｎｍの全径を有し、約１０％の磁性材料を含有している。試験したＯｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製の磁性ナノ粒子もまた、市販のナノ粒子である。したがって、１未満のＧＭＲＳシグナル値は、試験サンプルがＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰより低い応答を示したことを意味し、１以上の値は、試験サンプルがＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰより応答したことを意味する。
【００３０】
【表１】
2016522983.tif 000005
【００３１】
データは、いくつかの興味深い傾向を示している。本発明により調製したＭＮＰについていうと、センサのシグナル値に関して、１５〜２０ｎｍの範囲の粒子が、１０ｎｍより小さい粒子サイズの場合より良好な性能を示したことは明らかである。これは上記の理論上のデータに適合する。より大きなこれらの粒子においてｅｍｕ／Ｏｅ  ｍｇ値が非常に低いにもかかわらずである。さらに、本発明により調製したＭＮＰは、３種の市販のＯｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製サンプルよりも非常に良好な性能を示し、そのサイズ範囲が１０ｎｍ超の場合、標準のＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰよりも非常に良好な性能を示した。ある場合には、本発明によるＭＮＰは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰから得られたシグナルの４倍のシグナルを生じた。これは非常に低いｅｍｕ／Ｏｅ  ｍｇ値を有するにもかかわらずある。
【００３２】
別の分析実験では、上記の表１の本発明のＭＮＰサンプル４の感度を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製のいくつかのＭＮＰと比較した。詳細には、比較するＭＮＰは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢ（ビオチンに対する抗体に共役させたＭＮＰ）およびＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡであった。この試験は、分析物で被膜した後に試験ＭＮＰに曝露させたＧＭＲＳセンサに対する分析物のレベルを増大させることにより引き起こされる抵抗変化の量を判定することであった。図６Ａでは、ＭＮＰを、表１のサンプル４として本発明により調製した。ＲＥＦ、ＲＥＦ２、およびＮ２の曲線は、対照値である。本発明のサンプル４のデータは、０．０００１ｍｇ／ｍｌの分析物が、抵抗に関して、ＲＥＦ、ＲＥＦ２、およびＮ２の対照値と区別できなかったことを示している。曲線はすべてほとんど重なり合っている。０．０００５ｍｇ／ｍｌの分析物から、抵抗の検出可能な変化が始まっている。０．００５ｍｇ／ｍｌのレベルでは、抵抗に有意な変化があり、９０分後に抵抗変化が８，０００ｐｐｍの横ばい状態に達する。ｐｐｍ値は、粒子の付いていないＧＭＲＳの抵抗を基準にして、センサに付けた磁性ナノ粒子によって引き起こされた抵抗変化として定義されている。０．０５ｍｇ／ｍｌのレベルでは、１５，０００ｐｐｍ以上の抵抗レベルで横ばい状態に達している。最後に、１ｍｇ／ｍｌレベルの分析物では、約１７，０００ｐｐｍの抵抗で横ばい状態に達している。これは、市販のＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡのＭＮＰに関する図６Ｂに示す結果と完全に異なっている。このサンプルでは、分析物レベルが０．０５ｍｇ／ｍｌになるまで検出可能な抵抗変化が見られず、より低いレベルおよび対照の曲線はすべて重なり合っている。０．０５ｍｇ／ｍｌの分析物レベルでは、約２，２００ｐｐｍの抵抗で値が横ばい状態に達している。この値は、図６Ａにおいての、このレベルの分析物の抵抗が１５，０００ｐｐｍ以上の横ばい状態を示しているという結果をはるかに下回っている。図６Ｂにおける１ｍｇ／ｍｌの分析物の値は、約３，８００ｐｐｍの抵抗値で横ばい状態に達しており、これはまた図６Ａに見られる約１７，０００の値をはるかに下回っている。図７に示す結果を参照すると、市販のＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳＡよりも感度がよいが、本発明により調製したサンプル４よりも感度が低いことが分かる。ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢに関しては、０．００５ｍｇ／ｍｌの分析物レベルで抵抗の検出可能な変化が見られ始め、約２，９００ｐｐｍの抵抗値で横ばい状態に達している。０．０５ｍｇ／ｍｌの分析物レベルは、約５，０００ｐｐｍの抵抗で横ばい状態に達している。最後に、１ｍｇ／ｍｌの分析物レベルは、６，０００ｐｐｍの抵抗値で横ばい状態に達している。ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢに関する値はすべて、本発明により調製したＭＮＰを使用した分析物と同じレベルでは、図６Ａに見られる結果をはるかに下回っている。これらの結果は、本ＭＮＰが、市販のＭＮＰよりも非常に感度がよく、その有用性の劇的な増大に希望を与えるものであることを示している。
【００３３】
図８Ａ〜Ｄは、図６Ａおよび図７に示す結果のいくつかのＳＥＭ写真を示している。詳細には、図８Ａおよび図８Ｃは、１ｍｇ／ｍｌの分析物および０．０００５ｍｇ／ｍｌの分析物のレベルにおけるサンプル４からの結果をそれぞれ示す。図８Ｂおよび図８Ｄは、１ｍｇ／ｍｌの分析物および０．０００５ｍｇ／ｍｌの分析物のレベルにおけるＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢからの結果をそれぞれ示す。また、ｐｐｍに対する抵抗の実際の横ばい値を各図の隣に示す。さらに、これらの結果は、本発明により調製したＭＮＰに見られる感度の劇的な増大を示すものである。
【００３４】
図９は、本ＭＮＰが現在入手可能なものより感度のよいＧＭＲＳの作製に使用される一方法の概略である。概略に示すように、ＭＮＰは、ストレプトアビジンのようなバインダー官能基と共役させることができる。対象の細胞または分析物に対する検出抗体は、ビオチンへの官能性共役を含む。これにより、ＭＮＰは、検出抗体に結合し、次いで、バイオマーカー上の抗原に結合できるようになる。ＧＭＲＳの表面は、バイオマーカー上の別の抗原に対する捕捉抗体で被膜される。このシステムにより、概略に示すような検出可能なサンドイッチが作製される。この技術は、より感度のよいＧＭＲＳを調製することができるので、多くの用途でのＧＭＲＳの有用性を高める見込みがある。本発明により調製したＭＮＰはまた、例えば、以下のものの造影剤として：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）；磁性粒子画像法（ＭＰＩ）；免疫学的分析アッセイ；細胞、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡを単離するための分離技術；ＭＮＰでタグ付けされた薬物と所望の標的細胞または臓器にその薬物を誘導するための磁場とを使用する薬物送達；ＭＮＰを使用して癌または腫瘍細胞中に高熱（ハイパーサーミア（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ））を発生させる癌細胞または腫瘍の治療的処置などの用途を含む多くの分野での使用が見出されるであろう。ハイパーサーミア用途では、ＭＮＰは、ホストに注入された後に癌細胞に移動するか、または直接腫瘍に注入される。次いで、外部から印加する交流磁場を使用して、ＭＮＰ中の磁場の方向を変え、その後、磁場を緩和させると、熱放散が生じ、正常細胞よりも熱に敏感な癌または腫瘍細胞を優先的に死滅させる。本発明によるＭＮＰの別の使用は、当技術分野で周知のように磁場の使用により凝集および脱凝集が起こるので、調整可能な粘度を有し得る強磁性流体を作製するために流体中で高レベルのＭＮＰを使用するものである。
【００３５】
本発明により調製した様々なサイズの一連のＭＮＰを、それらの液体状態のＡＣ磁化率に関して市販の磁性ナノ粒子と比較した。使用した市販の磁性ナノ粒子は、次のとおりであった：Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製１５ｎｍ粒子（ＯＮ  １５ｎｍ）；Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製２５ｎｍ粒子（ＯＮ  ２５ｎｍ）；Ｓｉｇｍａ製２０ｎｍ粒子（Ｓｉｇｍａ  ２０ｎｍ）；および上述のＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢナノ粒子。市販の磁性ナノ粒子のサイズは、製造元が指定したとおりである。様々な磁性ナノ粒子の液体状態のＡＣ磁化率は、Ａｃｒｅｏ  ＡＢ製のＡＣ磁化率計ＤｙｎｏＭａｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、水中の磁性ナノ粒子を用いて２５℃の温度で振幅５Ｏｅの周波数１００Ｈｚで測定した。上述のように、本明細書および特許請求の範囲では、用語「液体状態において」は、磁性ナノ粒子を液体中に懸濁させていることを意味する。好ましい液体は水であるが、測定されるＡＣ磁化率は、水と類似の粘度を有する他の液体に類似しているであろう。例として、水と非常に類似した粘度を有する他の液体には、リン酸緩衝生理食塩水、生物学的緩衝液、クロロホルム、トルエン、ヘキサン、メタノール、およびエタノールがある。磁性ナノ粒子を非常に高粘度の液体に懸濁させた場合、ＡＣ磁化率は低減するであろうが、これは非常に高粘度の液体の場合のみ予期される。次いで、生じたデータを一連の様々な方法でプロットした。すべての場合において、ｎｍ単位のＭＮＰのサイズを、計算されたＡＣ磁化率に対してＸ軸にプロットした。
【００３６】
図１０Ａでは、サイズを、ＭＮＰ材料１ｍｇあたりのＡＣ磁化率を意味する質量ＡＣ磁化率に対してプロットした。すべてのサンプルの粒子サイズを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で確認した。ＴＥＭ測定の前に、すべての磁性ナノ粒子を水に移動させた。市販の粒子の観察粒子サイズが、製造元が提示するサイズとは異なっていたことに注意されたい。いくつかの重要な情報が明らかになっている。他の市販の磁性ナノ粒子はすべて、材料１ｍｇあたりのＡＣ磁化率がＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢナノ粒子よりも低かった。Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製の２つのサイズの１５ｎｍおよび２５ｎｍ磁性ナノ粒子のＡＣ磁化率は、ｍｇ基準では同じであり、これは、これらの磁性ナノ粒子にはサイズ依存性がないことを意味していた。これは、本発明によるＭＮＰを使用した場合の結果と完全に異なっている。これらの本発明のＭＮＰに関して、材料１ｍｇあたりのＡＣ磁化率にはＭＮＰのサイズへの依存性がある。サイズが増大すると、１ｍｇあたりのＡＣ磁化率も、より小さなＭＮＰ粒子より３倍以上増大する。ＭＮＰのサイズが約１５〜２５ｎｍである場合、最も大きなサイズ依存性が見られる。
【００３７】
図１０Ｂでは、ｎｍ単位の磁性粒子サイズを、ナノ粒子１個あたりのＡＣ磁化率、数ＡＣ磁化率に対してプロットした。図１０Ａに示すように、市販の磁性ナノ粒子は、測定されたＡＣ磁化率へのサイズの影響をほとんど示さなかった。一方、本発明によるＭＮＰは、ナノ粒子サイズが増大すると、ナノ粒子１個あたりのＡＣ磁化率が明らかに増大することを示した。本発明によるＭＮＰに関する増大は非常に大きく、サイズが２５ｎｍのＭＮＰにおいて得られた値は、約１０ｎｍのＭＮＰに見られた値よりも約３０倍大きかった。
【００３８】
図１０Ｃでは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢナノ粒子と比較した相対シグナル強度を、粒子サイズに対してプロットしている。上述のように、他の市販の磁性ナノ粒子はすべて、ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢナノ粒子のシグナルよりも弱いシグナルをもたらす。本発明のＭＮＰは、そのサイズが１５ｎｍから２５ｎｍに増大したとき、シグナルの著しい増強を示す。このシグナルは、ＭＡＣＳ（登録商標）ＡＢナノ粒子に見られたシグナルよりもかなり大きく、ほぼ４倍大きい。図１０Ａ〜１０Ｃの結果は、本発明のＭＮＰが、市販の磁性ナノ粒子と比較して著しく高いＡＣ磁化率を有することを示している。ＡＣ磁化率の増強は、市販の磁性ナノ粒子と比較して著しく高いシグナルをもたらす。
【００３９】
市販の磁性ナノ粒子と比較して本ＭＮＰのＡＣ磁化率が著しく増強された理由として考えられるものを調査するために、ＭＮＰを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および制限視野回折（ＳＡＤ）処理にかけた。本発明によるＭＮＰ、すなわち、図１０Ａ〜１０ＣにおいてＡと指定した調製物から得られた断面ＴＥＭ画像、およびＯｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製２５ｎｍ磁性ナノ粒子の断面ＴＥＭ画像を、図１１Ａおよび１１Ｄにそれぞれ示す。本発明のＭＮＰのＴＥＭは、ＭＮＰが単一磁区であることを示しており、これは双極子のすべてが同一方向に配列しやすいことを意味している。Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製磁性粒子のＴＥＭは、複数の磁区を示している。ＳＡＤ画像およびそれらのグレー値グラフは、図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｅ、および１１Ｆに示す。これらの結果は、これらの２種の磁性ナノ粒子の結晶化度が非常に異なることを実証するものである。本発明によるＭＮＰは、明瞭なハロリングおよび明確なグレー値ピークを示している。これは、本発明によるＭＮＰの結晶構造が非常に規則的であることを示すものである。一方、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ製粒子の結果は、単一のぼやけた中心とぼやけた外リングを示している。これは、図１１ＤのＴＥＭ画像に見られる複数区を裏付けるものである。本ＭＮＰの非常に規則的な結晶構造および単一磁区が、本ＭＮＰのより高いＡＣ磁化率に部分的に関与していることが、理論付けられる。
【００４０】
図１２は、本発明による図１０Ａ〜１０ＣのサンプルＡのＭＮＰに関するヒステリシスループのグラフである。ループが非常に狭く、磁気の両方向でほとんど重なっていることが分かる。飽和に達するのに必要な場の強さは、磁性ナノ粒子の典型的な場合よりも非常に低い。磁場が小さい場合、ヒステリシスループの傾斜は、ＡＣ磁化率とほぼ等しい。ＭＮＰのような磁気リポーターは、それらの磁化を飽和させるのに十分な磁場の強さで一般に使用される。図１２の結果は、本ＭＮＰに関して、２０００Ｏｅ以下の場の強さでこれが実現され得ることを示している。これらの高ＡＣ磁化率のために、本発明によるＭＮＰは、約２５Ｏｅの場の強さでより高度に磁化し、これらの低い場の強さで磁気リポーター粒子として働くことができる。ＡＣ磁化率が高い磁性粒子は、磁気リポーター粒子を磁化するために２０００Ｏｅ未満、好ましくは１０００Ｏｅ未満、最も好ましくは１００Ｏｅ未満の低い磁場の強さを使用する磁場センサの特に重要な候補である。
【００４１】
要約すると、本発明のＭＮＰは、非常に感度のよい磁気リポーター材料の優れた候補である。ＭＮＰは、少なくとも１種の磁性材料で構成され、それらは、フェリ磁性、強磁性、または超常磁性の性質であり得る。ＭＮＰは、１０〜２５ｎｍ、好ましくは１３〜２０ｎｍ、最も好ましくは１３〜１８ｎｍのサイズを有する。好ましくは、サイズ分布は、±５ｎｍ、より好ましくは±２ｎｍである。ＭＮＰは、ＧＭＲＳ、ＴＭＲＳ、ＡＣ  ＳＱＵＩＤ、ホールセンサ、および当業者に知られているような他の磁気センサによって検出可能である。ＭＮＰは、２０００Ｏｅ未満、好ましくは１０００Ｏｅ未満、最も好ましくは１００Ｏｅ未満の磁場の強さにおいて検出可能である。好ましくは、本発明のＭＮＰは、２５℃で次式を満たす、粒子１個あたりの液体状態ＡＣ磁化率を有する。
χ／Ｎ≧Ａ（Ｄ−１３）
式中、
χは、１００ＨｚでのＡＣ磁化率であり、
Ｎは、ＭＮＰの数であり、
Ｄは、ナノメートル単位でのナノ粒子の直径であり、
Ａは、
【００４２】
【数３】
2016522983.tif 000006
と等しく、５＊１０−１７〜２＊１０−１６の値の範囲である。
好ましくは、χ／Ｎの値は、５＊１０−１６以上である。本発明によるＭＮＰは、明瞭なハロリングおよび顕著なグレー値ピークが規則的な構造および単一磁区を示しているＳＡＤ分析から分かるように、非常に規則的な結晶構造を有する。
【００４３】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、２５℃で次式を満たす、粒子１個あたりの液体状態ＡＣ磁化率を有する磁性ナノ粒子である。
χ／Ｎ≧Ａ（Ｄ−１３）
式中、
χは、１００ＨｚでのＡＣ磁化率であり、
Ｎは、ＭＮＰの数であり、
Ｄは、ナノメートル単位でのナノ粒子の直径であり、
Ａは、
【００４４】
【数４】
2016522983.tif 000007
と等しく、５＊１０−１７〜２＊１０−１６の値の範囲である。
【００４５】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、χ／Ｎの値が５＊１０−１６以上である磁性ナノ粒子を含む。
【００４６】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、２０００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である磁性ナノ粒子を含む。
【００４７】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、１０００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である磁性ナノ粒子を含む。
【００４８】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、１００Ｏｅ以下の磁場の強さにおいて検出可能である磁性ナノ粒子を含む。
【００４９】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、１０〜２５ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有し、オレイン酸およびオレイルアミンの界面活性剤被膜を有し、オレイン酸と酸化鉄のモル比およびオレイルアミンと酸化鉄のモル比がそれぞれ別々に１：１〜２．５：１である、酸化鉄磁性ナノ粒子を含む。
【００５０】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、１３〜２０ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有する、酸化鉄磁性ナノ粒子を含む。
【００５１】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、１３〜１８ナノメートルの粒子サイズ、±２ナノメートルのサイズ分布を有する、酸化鉄磁性ナノ粒子を含む。
【００５２】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、磁場リポーター粒子として使用され、磁場センサによって検出可能である、磁性ナノ粒子を含む。
【００５３】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、磁場センサが、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサ、超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）、またはホールセンサのうちの１種である、磁性ナノ粒子を含む。
【００５４】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、タンパク質、抗体、および酵素からなる群から選択される少なくとも１種の生体分子をさらに含む、磁性ナノ粒子を含む。
【００５５】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、鉄フェライト、磁鉄鉱、マグヘマイト、またはこれらの混合物を含む、磁性ナノ粒子を含む。
【００５６】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、少なくとも１種のポリエチレングリコールでさらに表面修飾されている、磁性ナノ粒子を含む。
【００５７】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、前記ポリエチレングリコールが、スクシニル−ポリエチレングリコール、メトキシ−ポリエチレングリコール、アミン−ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物のうちの少なくとも１種を含む、磁性ナノ粒子を含む。
【００５８】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、少なくとも１種の生体分子が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、およびこれらの混合物のうちの少なくとも１種を含む、磁性ナノ粒子を含む。
【００５９】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、各々の磁性ナノ粒子が単一磁区を含む、磁性ナノ粒子を含む。
【００６０】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、制限視野回折分析によって測定されるような非常に規則的な結晶構造を有する、磁性ナノ粒子を含む。
【００６１】
前述の発明は、関連する法的基準に従って説明してきたものであり、したがって、本明細書本文は、事実上、限定というよりはむしろ例示的なものである。開示した実施形態に対する変形および改変は、当業者にとって明らかであり、本発明の範囲内にある。したがって、本発明に与えられる法的な保護の範囲は、以下の特許請求の範囲を検討することによってのみ決定され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１２】
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【図８】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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