(57)【要約】  少なくも２０人の様々なドナーの胚体外の万能性または多能性幹細胞を使用して、化学的および生物学的物質に対するヒト応答差を予測する方法。一実施形態では、胚体外の万能性または多能性幹細胞は分化している。この方法は、遺伝的に多様な集団においてインビトロにおける化学的および生物学的物質に対するヒト応答差を予測し、解明するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的物質または化学的物質に対するヒトの応答を予測するための方法であって、
前記生物学的物質または化学的物質を、少なくとも２０人の遺伝的に異なるドナーから得られた胚体外幹細胞と、予め決定された期間インビトロにおいて一緒にすること、
前記細胞に対する効果について試験すること、および
各ドナーから得られた細胞に関する結果を分析すること
を含む方法。
【請求項２】
各ドナーから得られた結果を対照と比較することにより、物質がヒトに対して有効であるか、または有害であるかを予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚体外幹細胞が万能性または多能性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胚体外幹細胞を前記生物学的物質または化学的物質と一緒にする前に増殖させ、分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ドナーがヒト新生児である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胚体外幹細胞が少なくとも３００人の遺伝的に多様なドナーから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
胚体外幹細胞が少なくとも１０００人の遺伝的に多様なドナーから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ドナー間変動、ドナー相互変動、またはドナー内変動を最小限に抑えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
予め決定された選択／排除基準を有するドナーを排除し、産生プロセスの一貫性を維持し、統計学的クラスタリング技法を利用することによって、変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
予め決定された選択／排除基準を有するドナーを排除するか、または予め決定された期間内に予め決定された同じ地理的位置で生まれた新生児にドナーを限定することによって、ドナー間の変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
予め決定された排除基準が、予め決定された有害な出生前状態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
予め決定された選択基準が、ドナーを予め決定された期間内に予め決定された同じ地理的位置で生まれた新生児に限定することである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
全ドナーのＤＮＡを配列決定し、ヒト参照ゲノムと整列しないＤＮＡ配列を有するドナーを排除することによって変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
産生プロセスの一貫性を維持することによって、幹細胞の増殖および／または分化中の変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
特定の反応の標的集団内での出現率または生物学的物質もしくは化学的物質に対する反応の特定のサイズの出現率を推定する方法であって、
ａ．標的集団を同定すること、
ｂ．所望するレベルの分析判定に由来する分析に必要なサンプルのサイズを決定すること、
ｃ．化学的物質または生物学的物質に対する特定の反応に関連した集団の既知の表現型を決定すること、
ｄ．同定した表現型による反応の出現率の既知の差から各部分集団のサンプルサイズ、および集合レベルの必要な精度を決定すること、
ｅ．比例的に表すことによって実現するよりも高い精度レベルが部分サンプルレベルで必要ならば、部分サンプルのサイズを調整すること、
ｆ．化学的物質または生物学的物質に対する反応の可能性または大きさに影響を及ぼす能力を有することが確認されたその他の要素全てについて無作為性を維持しながら、必要とされる各表現型についての十分なドナー数を選択すること、
ｇ．増殖または分化しない任意のドナーを、同じ表現型を有する置換ドナーで置換すること、
ｈ．各部分サンプル内の結果の統計学的分析を実施することにより、層別化したサンプル結果を集団推定まで拡大すること
を含む方法。
【請求項１６】
サブコホートと外部因子との間の統計学的関係を同定するためにコホートをサブコホートに細分することによって、少なくとも２０人のドナーから得られた幹細胞のコホートの反応を比較し対比させるための複数の試験の結果を分析する方法であって、下記：
１．試験中にデータを収集する反応の１定量的測定値を選択して、次に
ａ．各測定値の定量的スコアに基づいて最低から最高までコホートのメンバーに順番を付けること、
ｂ．第２のメンバーのスコアから第１のメンバーのスコアを差し引くことによって、コホートの第１のメンバーとコホートの第２のメンバーとの間のスコアの増分を決定すること、
ｃ．各スコアの平均増分を計算すること、
ｄ．任意の隣接する２つのメンバーの間の増加が、平均増加を、予め決定された比、例えば２対１よりも多く、超える場合を変曲点として標識すること、
ｅ．変曲点間にあるメンバーのいかなる群も別のサブコホートとして扱うこと、
ｆ．同定した外部要素に対して様々なサブコホートの比較対比統計的検定を実施すること、
２．
ａ．各次元が前記の１ａで分析した１測定値に対応する、Ｎ次元のマトリクスにメンバーの順番を整列させること、
ｂ．各軸を前記の１ｅで定義したコホートに細分すること、
ｃ．マトリクスにおけるコホートの各共通部分を占めるメンバーを同定することによって新たな一連のコホートを作出すること、
ｄ．同定した外部要素に対して新たに定義したサブコホートの比較対比統計的検定を実施すること
によって、次元を交差することが定義されたサブコホートを作出し、分析すること
の１つまたは複数を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、幹細胞を使用して化学的および生物学的物質に対するヒト応答差を予測する方法を対象とし、より具体的には、遺伝的に多様な集団における化学的および生物学的物質に対するヒト応答差を予測し、解明するための、胚体外の万能性（pluripotent）幹細胞または多能性（multipotent）幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
長い年月をかけて、科学者等は、ヒト間の遺伝子の違いが疾患、アレルゲン、生物学的薬剤、医薬品およびその他の化学物質を含む様々な物質に対する個々の反応において重要な役割を果たすことを認識した（Ｍａｎｒｙ等、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２０１３；３：ａ０１２４５０；Ｇｅｅｌｅｈｅｒ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：Ｒ４７（２０１４））。しかし、科学者等がこれらの差を系統的に分析する能力は厳しく限定されていた。
【０００３】
例えば、人間が直接または間接的に接触するようになる可能性がある医薬品、工業化学物質、生物学的薬剤ならびにその他の化合物および物質は、一般に販売される前に安全性および有効性を試験しなければならない。しばしば、これらの薬物、化学物質、化合物および物質は、規制試験または臨床試験を受けないか、または市場に導入された後で回収されると、開発者等の投資した莫大な時間、努力および資金の損失を引き起こす。
【０００４】
遺伝的に異なるヒトにおける感染性疾患の伝染を調べたときにも同様の限界が認められた。疫学は、将来的な発生ではなく過去の発生の研究に限定したものである。症例／対照実験は、健常な個体を感染性疾患に曝露するという倫理学的問題のため、不適切であることが多い。動物モデルではヒトの遺伝子多様性は反映されない。そして、古典的な細胞ベースのモデルを使用したインビトロにおける試験は、単一の対象の細胞の供給には限りがあること、または少数の対象を代表する組織のプールであること（初代細胞をベースにしたアッセイの場合）、または代表的な反応ではない可能性があること（例えば、腫瘍をベースにした、もしくは操作された細胞モデルにおいて）によって限定される。
【０００５】
近年、科学者等は万能性幹細胞、特にヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を使用して、化学的または生物学的薬剤に対する反応について試験するためのインビトロ実験を実行し始めた。これらは、化学的または生物学的なある種の薬剤に対する「ヒト」応答の予備的な指標として価値があることが分かってきた。しかし、このような幹細胞をベースにした試験はほとんど「典型的な」または「代表的な」ヒト応答の指標を提供するためだけに使用されてきており、すなわち、試験は、実際には、人類全体の唯一の代表として役立つ単一のドナーから得られた単一の細胞系のｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣ（またはこのような細胞の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）派生細胞もしくは分化細胞）に対して行われてきた。これらの試験は、応答におけるドナー間の変動を検出することは企図しない。
【０００６】
最近、科学者等は、既に診断された症状または特定の化学的薬剤と反応する素因を備えた患者および特定の遺伝的特徴を共有するこれらの患者の血族からｈｉＰＳＣを作出し、関連した遺伝的プロファイルを共有する人々が類似の反応を共有することが多いことを確かめるためにこれらのｈｉＰＳＣを使用した（Ｍａｎｒｙ等、（２０１３）、前述）。
【０００７】
しかし、前記の取り組みではいずれも、遺伝的に多様な集団において特定の化学的もしくは生物学的な薬剤もしくは物質に対する応答の変動を究明できない。これらの取り組みによって、応答の今まで認識されなかった変動または応答の遺伝的原因の変動を発見することもできない。結果として、これらの取り組みによって、遺伝的プロファイルと観察された反応の間の今まで知られていない関係を判別するための方法を提供することはできない。
【０００８】
したがって、化学的および生物学的物質に対するヒト応答の分布を理解するためには、有効なインビトロにおける試験が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞を使用して、集団の遺伝子および表現型が多様な部分において、医薬品、工業化学物質、生物学的薬剤（例えば、病原性細菌もしくはウイルス、抗体、タンパク質、ＤＮＡおよびその誘導体、ＲＮＡおよびその誘導体など）、ワクチン、またはその他の化合物もしくは薬剤（それだけに限らない）を含む化学的および生物学的な物質に対するヒト応答差を予測し解明するための方法を本明細書で提供する。本明細書で提供した方法には、胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞の全変種を使用した、化学的および生物学的物質全種のための毒性試験および（医薬品試験およびワクチン試験の場合）効率試験の両方、ならびに疾患の研究（感受性、伝染性、病原性および機能獲得の研究（それだけに限らない）を含む）が含まれる。
【００１０】
一実施形態では、この方法は、羊水、臍帯血および新生児尿を含む様々な新生児体液から非侵襲的技法または侵襲が最小限に抑えられた技法を使用して得ることができる羊水由来幹細胞（それだけに限らない）などの新生児生物学的サンプルから得られた胚体外万能性幹細胞を使用した、医薬化合物に対する毒性応答のヒト間の応答差の試験である。要約すると、万能性またはより広い多能性の胚体外幹細胞は、厳格な基準に合致するように、かつ特定の遺伝的に多様化した集団を表すように注意深く選択しスクリーニングした多数（Ｎ＞２０）の新生児の羊水などの容易に入手できる生体液源から単離する。細胞を増殖させ、必要ならば、同じドナーの細胞のコピー間および／またはドナー間のプロセス変動の既知の原因を十分に最小限に抑える厳しく定義された手順によって、機能的な細胞種に分化させる。毒性があるクラス、毒性がないクラス、毒性が中程度であるクラス、および毒性が高いクラスであることが実証された医薬化合物をドナーから得られたこれらの幹細胞（またはそれらの派生細胞）に適用し、これらの実証された化学物質に対して十分応答する細胞を毒性応答の良好な指標であると判定し、すなわち、試験した様々なドナーの細胞間には、これらの細胞が遺伝的に多様な集団におけるヒト毒性応答差に関して十分な指標として有用であることを示すのに十分な応答の違いがある。
【００１１】
遺伝的に多様な集団間の毒性反応を予測する方法に従って、多数（最低でも２０人、好ましくは３００人、より好ましくは１０００人）の遺伝的に多様なドナーの胚体外の万能性またはより広い多能性の幹細胞を単離する。遺伝的に多様なドナーの例には、両性のドナーおよび複数の人種のドナーなどの多様な集団が含まれる。幹細胞は、羊水（それだけに限らない）などの様々な供給源から単離することができる。所与のドナーの細胞を単離し、この選択した特定の細胞のために本明細書に参考として組み込んだ米国特許第７，５６９，３８５号Ｂ２に記載されたプロセスなど当業者に既知の方法を使用して研究室の状況で増殖させる。収集時に、ドナーの表現型およびその他の確認に役立つものを記録し、将来の比較試験のために各細胞系に識別番号を割り当ててもよい。その後、標準的な企業プロトコルを使用して、しかし細胞自体の遺伝的プロファイル以外の変動原因を最小限に抑えるために、プロセス、装置および継代数を独自に厳しく制御した集団の倍加／継代によって細胞系を増殖させる。その後細胞系を凍結保存などによって保存する。
【００１２】
その後、標準的な企業プロトコルを使用して細胞系を解凍して再度継代し、多数の様々なドナーの細胞系を使用して、例えば、所与の細胞系の細胞を所与の薬物に所与の濃度で所与の長さの時間曝露し、次に関心のある終了点（細胞生存率など（それだけに限らない））を示すバイオマーカーを付加し、もしあれば、ドナー集団のどの部分が他と異なった大きさの反応を経験したかに関するデータをプロットすることによって、毒性応答を正確に測る。いくつかの技法のいずれかを使用していくつかの側面のいずれかの反応差を測定することができる。例えば、細胞毒性は１つまたは複数の染色試験によって評価することができる。
【００１３】
多数のドナーからの細胞系の様々な毒性応答を分析し、試験した細胞系の間の応答差を分析し、有害反応を経験しやすい代表的ヒト集団の全パーセントまたは重要な表現型特性、例えば、有害反応を最も経験しやすい代表的ヒト集団内の個々の性別もしくは人種（それだけに限らない）を含む様々な有用なデータを提供する。
【００１４】
最後に、場合によっては個体を反応の定量的範囲に基づいてサブコホートに群分けして、遺伝子に関連した分析を実施し、特定の対立遺伝子または対立遺伝子の組み合わせが統計学的にこのような反応差に関連するかどうかを決定する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書では、胚体外の万能性または多能性幹細胞の全変種を使用して、集団の遺伝的および表現型が多様な部分において、医薬品、工業化学物質またはその他の化合物、分子、生物学的薬剤（例えば、病原性細菌もしくはウイルス、抗体、タンパク質、ＤＮＡおよびその誘導体、ＲＮＡおよびその誘導体など）またはワクチン（それだけに限らない）を含む化学的および生物学的物質に対するヒト応答を予測する方法について記載する。
【００１６】
（定義）
【００１７】
用語「胚体外幹細胞」または「胚体外の万能性（pluripotent）幹細胞もしくは多能性（multipotent）幹細胞」は、本明細書では胚性幹細胞ではないが胎児／新生児の細胞であり（胎児／新生児と同じＤＮＡを有することによって定義される）、幹細胞を妊娠中に収集するか、出生後に収集するかにかかわらず、子宮中、または胎児／新生児中心組織および体液中にある間、胎児／新生児の任意の１種または複数の器官（羊水、胎盤、胎盤の絨毛膜絨毛、臍帯、臍帯血および羊膜嚢（それだけに限らない）を含む）において見いだすことができる任意の万能性幹細胞もしくは多能性幹細胞として定義する。この用語はまた特に、本明細書で定義したように、出生後３日以内に排泄される乳児の尿中に見いだされた任意の幹細胞を含む。
【００１８】
「比較対照統計的検定」という用語は、本明細書では、刺激応答実験において、コホートまたはサブコホートの相対的挙動または相対的挙動の原因を任意のその他のコホートまたはサブコホートの挙動または挙動の原因と比較して推測を引き出す任意の数学的もしくは統計的検定と定義する。この定義は特に、算術的平均、中央値および範囲の比較、ゲノムワイド関連解析、エキソームまたはその他の部分的ゲノム関連解析ならびにコホートおよびサブコホートの遺伝子発現もしくはプロテオミクス発現の比較（それだけに限定しない）を含む。
【００１９】
用語「ドナー間」とは、本明細書では１ドナーと別のドナーとの間の区別と定義する。この語句は、ドナー自身またはこのようなドナーから採取した細胞もしくはドナーから採取した細胞から得られた細胞を意味することができる。
【００２０】
用語「ドナー内」とは、本明細書では１実験手順の単一コピーに関与する単一ドナーの細胞群と同じ実験のその他のコピーまたはその他の実験に関与する同じドナーのその他の細胞群との区別と定義する。
【００２１】
用語「相互反復」とは、本明細書では１実験内のドナー内細胞群における結果の比較と定義する。
【００２２】
用語「相互ドナー」とは、本明細書では１ドナーの細胞と別のドナーの細胞の間の結果の比較と定義する。
【００２３】
本明細書で使用した用語「万能性（pluripotent）」とは、３つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）のいずれかに分化することができる幹細胞を意味するために定義する。
【００２４】
本明細書で使用した用語「多能性（multipotent）」とは、複数の細胞種（限定はしない）に分化することができる幹細胞を意味するために定義する。
【００２５】
（方法の概要）
【００２６】
科学的理解の重要な新展望を開くために、対象となる集団（例えば、米国の集団）の遺伝的な多様性を集合的に表す多数のドナーの細胞の大規模な供給と、細胞産生、試験投与および試験後の解析の終始一貫したプロセスとを結びつける強固なインビトロにおける基盤を本明細書で提供する。
【００２７】
例えば、医薬品などの化学物質の毒性試験の場合、ある種の潜在的に不都合な、しかし比較的稀にしか起こらない医薬品、工業化学物質ならびにその他の化合物および物質に関連した結果をインビトロ試験によって同定することができる。これによって、ヒトが接触する可能性がある医薬品、工業化学物質ならびにその他の化合物および物質を作出、製造または分配しようとする人々または研究機関の時間、努力および資金を節約することができる。さらに、これは、有害物質をより防御し、多数の新たな価値のある物質を低価格でより迅速に市場に送り出すことができ、社会全体にとって大いに有益であろう。
【００２８】
第２の例として、疾患の調査の場合、本発明の方法は、科学者にとって感染性の疾患の変異の伝達率の違いを直接調べるために使用することができる反復可能な手段となる。この手段は、いくつかの集団が新たな疾患に他よりも罹りやすいかどうかを検出するのに有用である。これらは、犠牲者の複数世代を経た疾患の変異として機能獲得の違いを直接分析するために使用することができる。そして、様々な小集団におけるワクチンおよび／または治療の相対的有効性について、従来のインビトロを基盤にした方法で可能なよりも効果的に学習するために利用することができる。
【００２９】
遺伝子の違いによる特定の化学的物質または生物学的物質に対する応答の変動は研究したほとんどの参加者で比較的小さいことが多く（Ｈａｒｒｉｌｌ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９：１５０７〜１５１５（２００９））、外部からの変動の原因が多いので、インビトロを基盤にした方法の強固さを高めるには、多数のドナーの細胞のサンプルを単純に集めるよりもはるかに多くが必要で、ドナーそれぞれに対する実験を繰り返すことも必要である。したがって、このような外部からの「ノイズ」が遺伝子の違いによる「シグナル」を隠してしまわないことを確実にするには多くの余分な工程およびプロトコルが必要である。
【００３０】
したがって、このようなインビトロにおける調査を実施するための強固な基盤は、概念が単純であるが、実行に移すのが極めて難しい２つの基準を満たさなければならない、すなわち、（１）同じ実験においてドナー間の反応の著しい変動の唯一の原因がドナーの遺伝的プロファイルの違いでなければならず、かつ（２）同じドナーおよび異なる物質が関与する２つの同一の実験の間の反応の著しい変動の唯一の原因が物質の性質でなければならない。
【００３１】
したがって、多様化した集団の化学的物質または生物学的物質に対する応答の変動を決定する場合の遺伝子の役割を判別する能力には、以下にさらに詳細に説明するような適切な細胞種の新たな選択、コホートにおけるドナーの厳密な選択規則、産生プロセスの一貫性および統計学的クラスタリング技法を含む、プラットフォームの様々な要素に対するいくつかの新たな取り組みを組み合わせることが必要である。
【００３２】
（適切な細胞種の新たな選択）
【００３３】
ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣは、今日まで最もよく知られており、最も広く使用されてきた。しかし、いずれも本明細書で記載した方法には適していない。
【００３４】
遺伝的に多種多様な集団の大サンプルを支持するために十分な数のｈＥＳＣ細胞系を開発するのを唯一妨げているのは倫理的な問題である。さらに、ｈＥＳＣ細胞系は作出するのに費用がかかる。さらに、胚の原料（すなわち、体外受精法で廃棄された胚）が手に入っても、家族歴などのドナーの表現型の情報が常に入手できるわけではない。
【００３５】
ｈｉＰＳＣにはいくつかの問題が存在する。まず、ほとんどの科学者等は、１つの薬剤に対する応答の対象間の違いの唯一の最も大きな要因は遺伝的プロファイルの差である一方、２つのその他の要素、対象の年齢および対象が生涯を通じて曝露された環境もまた役割を担い、したがって、遺伝子の役割を隠す可能性があることを受け入れている。年齢の異なるドナーから誘導されたｈｉＰＳＣには、独特の年齢特異的影響（テロメア短縮など）ならびに各ドナーそれぞれの曝露環境歴（汚染、直接的な化学物質曝露、疾患歴および病歴ならびに食習慣（それだけに限らない）を含む）が入り込んでいて、したがって、遺伝子のみの効果を判別する能力を鈍らせる。さらに、ドナーの細胞を万能性に誘導するプロセスには、遺伝子材料を細胞に挿入することが必要で、したがって研究すべきゲノムそのものが汚染する可能性がある。さらに、誘導プロセスは長く複雑で、１ドナーから別のドナーへのプロセスにおける未知の変動のため、別々のドナーの細胞間の変動の外部原因を導く「余分な」機会が多く存在する。現在の新たなｈｉＰＳＣ系の開発に伴う低い収率、高い失敗率、結果的に高くなった費用に加えて、これらの制限がある。
【００３６】
胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞は、妊娠および新生児出産に関連した胚以外の組織または体液から得られ、収集および単離時に既に万能性またはより広く多能性であり、上記問題が回避される。細胞を収集するために胚を破壊する必要がないので倫理的問題がなく、全ドナーが同じ年齢で（出産後すぐに採取された組織から選択する場合）、ドナーは全て類似の環境（すなわち、出生前の環境のみ）に曝露されている。万能性または多能性を実現するために遺伝子操作を必要とせず、したがって、ＤＮＡ混入またはプロセスに基づいた変動の可能性が回避される。
【００３７】
数多くの刊行物が胚体外幹細胞の有望な用途として「薬物スクリーニング」を挙げているが、必要な実際的方法について記載したものはない。したがって、本発明の方法は、化学的物質または生物学的物質の影響を試験するための実験における胚体外細胞の使用を最初に表したものであり、当然のことながら広範な範囲のヒト遺伝子の多様性においてこのような影響を試験するための使用を表している。
【００３８】
（コホートにおけるドナーの厳密な選択規則）
【００３９】
幹細胞ドナーのコホートの設計は、遺伝子多様性の役割について任意の結論の中核となる。例えば、無作為に選択したコホートの最小サイズは、求める正確さのレベルに対応しなければならない。例えば、対象となる集団において出現率が１パーセントである効果（または基礎となる遺伝子パターン）の少なくとも１例が観察される確率９５パーセントを実現するためには、少なくとも約３００のコホートサイズが最低限必要である。別の例として、対象となる集団において出現率が１４パーセントである効果（または基礎となる遺伝子パターン）の少なくとも１例が観察される確率９５パーセントを実現するためには、少なくとも約２０のコホートサイズが最低限必要である。
【００４０】
さらに、コホートの各メンバーは、調査中の化学的物質もしくは生物学的物質に対するドナーの反応に影響を有することが知られている、または有する可能性が疑われる遺伝子以外の要素全てのドナー間の標準化を最大限にするような方法で選択しなければならない。例えば、アルコール、薬物または煙草を使用するドナー候補の母親による出生前環境の違いは、コホートから排除するための理由となるだろう。さらに、母親による外部からの環境（汚染に対する曝露差など）の完全な制御は不可能であるが、全ドナーの意図的に選択された狭い範囲の妊娠および出産期間中に、重大または異常な汚染問題（例えば、核廃棄物汚染、深刻な化学物質流出、給水汚染など）を経験しなかったことが知られている単一の都市もしくは地域に出身地を限定することによって、外部環境曝露による影響を最小限にする可能性が高められる。
【００４１】
（産生プロセスの一貫性）
【００４２】
産生プロセスにおける極めて高い一貫性は、（１）実験内の単一のドナーの反復において、（２）単一実験内のドナーにおいて、および（３）複数の実験間の同一ドナーにおいて必要である。生物学的研究における通常の環境下で、各実験について別々にプロトコルを設計する。本発明の方法に必要な一貫性のレベルを実現するためには、全実験についてプロトコルの多くを予めの確立し、標準化しなければならない。標準的な操作手順は生物学的研究において日常的に使用されていることは当業者にはよく知られている。
【００４３】
例えば、一実験内の単一のドナーの反復において産生の高い一貫性を実現するために（前記（１））、設定内の全実験で使用した単一ドナーの細胞全てはほぼ同時に作出するべきで、増殖プロセス中に部分集団に分割せず、設定内の全実験は同じもしくは同等のロボット装置で実質的に同一のプロトコルを使用して、好ましくは実質的に同一の試薬を使用して実施するべきである。
【００４４】
単一実験内のドナーにおいて産生の高い一貫性を実現するためには（前記（２））、科学者等が、集団倍加／継代の数が胚体外幹細胞のゲノムおよび応答性の両方に影響を及ぼし得ることを発見したので（Ｃｈｅｎ，ＷＱ等、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：５２８５〜９５（２００９））、全ドナーが細胞増殖プロセス中に継代した集団倍加の数は全ドナーにおいて狭い範囲内に維持しなければならない。
【００４５】
複数の実験において同一ドナー間の産生の高い一貫性を実現するために（前記（３））、設定内の全実験は、同じもしくは同等のロボット装置で実質的に同一のプロトコルを使用して、好ましくは実質的に同一の試薬を使用して実施しなければならず、設定内の全実験で使用した単一ドナーの細胞は全てほぼ同時に作出しなければならず、増殖プロセス中に部分集団に分割しない。
【００４６】
（統計学的クラスタリング技法）
【００４７】
ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）およびその他のゲノム解析法の分野への新しいものを含めた統計学的クラスタリング技法の適用は、本明細書で提供した方法で利用するために有用な技法である。化学的薬剤もしくは生物学的薬剤に対する反応差とゲノムプロファイルの違いとの関連は、様々な組み合わせで作用する複数の遺伝子の結果であることが多いことは文献によく報告されている。しかし、今日までは、反応と広範な遺伝子多様性との間の関係の調査を支持する唯一のデータ源が臨床データ（多くの「ノイズ」源があるので、最も基本的な相違にのみ信頼することができる）であったので、反応差の根底にある対立遺伝子を探索するゲノム研究（ゲノムワイド関連解析など）は、対象（ドナーと類似）を症例対対照に二分する手法に限定されてきた。本発明の反応の程度をずっと正確に測定することが可能ならば、単一の測定による反応の程度に基づいて、または同時に複数の測定に対する反応の程度にも基づいて、ドナーを任意の数のサブコホートに確実に分類することが可能である。これによって、今までこの分野では使用されたことがない多くの統計学的技法を適用する扉が開かれる。
【００４８】
（方法）
【００４９】
本明細書で提供した方法の実施形態は、好ましくは以下の工程、すなわち、多数の特定のドナーの胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞のサンプルを収集、単離および増殖させ収集する工程、化学的物質もしくは生物学的物質応答の様々なレベルを測定するための一連の終点パラメータおよび終点指標を定義する工程、細胞に調査中の化学的もしくは生物学的物質を施す工程、試薬またはバイオマーカーを添加して（またはその他の試験機構を使用して）細胞を試験する工程、ならびにドナー対ドナーに基づいた結果を比較してドナーサンプルのどのくらいのパーセントが関心のある閾値に達するかを決定する工程を含む。本明細書で提供した方法の一実施形態の各工程を以下のように詳細に説明する。
【００５０】
（サンプル収集、単離および増殖）
【００５１】
対象となる多数のドナーから必要量の胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞を入手する。本明細書で提供した方法は全種類の胚体外の万能性または多能性幹細胞を使用することを含んでいるが、例示のために、羊水由来万能性幹細胞を使用したこの実施形態においてこの方法を説明する。
【００５２】
好ましい実施形態では、最小限のドナー数は約２０人、より好ましくは約３００人、最も好ましくは約１，０００以上である。サンプルバンク中のドナーの数が増加するにつれて、試験によって、より広範な集団における有害反応の出現率が、比較的希な反応であってもより良好に予測することができる。例えば、既に指摘したように、３００人のドナーの無作為サンプルは、サンプリングした集団において１パーセント以上の出現率を有する任意の現象（この場合、試験する物質に対する有害反応の起こしやすさを含む）の少なくとも１例を含有する確率は９５パーセントである。
【００５３】
ドナーは、（１）医薬化合物に対する毒性反応の違いに関連した外部から判別可能な表現型全ての交差を定義すること、この実施形態では、表現型は性別および人種に限定される（Ｗｅｎｗｉ等、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２７：１７〜２５（２０１３）参照）、（２）各サブコホート内の十分な統計学的表示を可能とする手法で全サンプルサイズを細分すること、および（３）遺伝子の違い以外の既知の疑わしい変動源を軽減し、除去するために厳しい選択／排除基準を設定することによって、ヒト集団の層別化したサンプルを構築するために選択する。具体的に、ドナーは、以下を有するドナーを排除することによって除外される。
１．１つまたは複数の既知の遺伝子異常を有する任意のドナー。
２．体液収集前または収集中に処置を必要とする新生児の危機の証拠があった場合（吸引および酸素供給などの呼吸器処置が容認される）。
３．出産前に実験的手順を受けた、または実験生成物もしくは電離放射線の曝露を受けた母親、胎児または新生児。
４．胎児死亡または重大な胎児異常。
５．研究者の見解では、幹細胞を含有するには羊水の適切性が困難となり得る先天性欠陥（腎機能障害など）を有する乳幼児。
６．外尿道口狭窄（膀胱下尿道閉塞など）のため尿流が妨害され得る先天性欠陥を有する乳幼児。
７．妊娠３５〜３９週以外の妊娠期間。
８．妊娠中治療薬／薬物／アルコール／煙草もしくはニコチン生成物のいずれかおよび全ての使用を明らかにすることをのぞまない母親。
９．複雑な妊娠（先天性欠陥または染色体異常の証拠、早期分娩など）。
１０．有害な妊娠の結果となる危険性の増加に関連した重大な母性の医学的疾患（例えば、妊娠糖尿病を含むいかなる糖尿病、狼瘡、妊娠高血圧または妊娠高血圧腎症を含むいかなる高血圧疾患、心疾患、腎不全）。
１１．ＨＩＶ、肝炎、髄膜炎、淋病、梅毒または研究者等が乳児に伝播する可能性があると考えている任意の疾患などの伝染性疾患の母子感染の証拠。
１２．分類Ａ感染性疾患の存在および／またはＨＩＶ、肝炎、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、連鎖球菌（それだけに限らない）の存在。
１３．母親の輸血またはｒｈｏｇａｍを含む血液製剤の受容の履歴。
１４．この妊娠（体液サンプルを収集するために使用した妊娠）における、処置を必要とする羊水指標が５ｃｍ未満と確認された低羊水（羊水過少症）の証拠。
１５．妊娠中の処方薬の使用（悪心のための制吐剤およびビタミン補給剤、乳児分娩のため（鎮痛剤、抗生物質など）は除く）。
１６．妊娠中のＦＤＡによってまだ承認されていない治験薬の使用。
１７．精神運動刺激剤、幻覚剤、アヘン剤、マリファナ、類似麻薬、アルコール、煙草またはニコチン生成物を含む妊娠中の乱用薬物の摂取。
１８．産母が染色体損傷、先天性欠陥または慢性的な健康障害を引き起こすことが知られている閾値を超えたいかなる生物学的または化学的危険に曝露されたことがわかっている場合。
【００５４】
さらに、それぞれの部分サンプルに必要な数に達するための必要条件として、地理的位置および出産時期は、外部汚染などの出生前環境のいかなる違いも最小限に抑えるために、最大限実行可能な程度まで狭くする。さらに、収集方法、組織保存方法（必要ならば）および輸送方法は、全ドナーについて厳密に標準化する。
【００５５】
本明細書に参考として組み込んだ米国特許第７，５６９，３８５号Ｂ２に記載された方法など当業者に既知の方法にしたがって、所与のドナーの羊水由来幹細胞を単離し増殖させる。しかし、ドナーからドナーの処理における変動の一般的なレベルの変動すらも防ぐために、さらなる必要条件が課される。例えば、ドナー全体に対する手順は全て、実質的に同一のロボット装置および実質的に同一の試薬を使用して実施することが好ましい。さらに、特定のドナーについてそのプロトコルによって十分な結果を得ることができないならば、ドナーにおける細胞挙動の個々の変動に対応することが必要なのでプロトコルを調整するよりもドナーをコホートから排除し交換する。次に、細胞が最初に継代したら、例えば、トリパンブルー排除染色またはその他の生死判別法によって細胞生存率を測定する。
【００５６】
最適な細胞増殖は好ましくは以下の通りに実施する。
１．同型の自動化装置で、各ドナーにその他のドナー全てと同じプロトコルを使用して各増殖操作を実施する。
２．以下の１つまたは複数によって、ドナー全てについて同じようになるようにロボット操作を実施する環境を制御する。
ａ．ＨＥＰＡ空気フィルターを含む生物学的キャビネットに装置を入れる。
ｂ．温度を指定した範囲内に制御する。
ｃ．湿度を指定した範囲内に制御する。
ｄ．大気組成を指定した範囲内に制御する。
ｅ．曝露する光の光源、波長および強度を指定した範囲内に制御する。
ｆ．細胞を曝露するノイズレベルを指定した範囲内に制御する。
ｇ．細胞を曝露する任意の電磁場の存在を指定した範囲内に制御する。
【００５７】
胚体外幹細胞は、細胞が増殖する世代数が増加するにつれて遺伝子組成物およびそれらの反応レベルの両方が「ふらつく」ことが当業者には知られている。したがって、本明細書で提供した細胞増殖の標準的プロトコル（前述した単離および初期継代段階について記載したドナー相互の一貫性を確実にするために必要な同レベルのさらなるプロセス制御を含む）に加えて、以下によって全ドナーにおいて集団倍加世代数の一貫性を確実に高くすることをプロセスに含めることが好ましい。
１．計画した実験全てを実施するために必要なコホートの各メンバーからの最小限の細胞数を計算する。
２．各ドナーの増殖プロセスは単一の細胞から開始すると仮定して、必要な最小限の細胞数に達するために必要な集団倍加目標数を計算する。
３．単一の細胞から各ドナーの増殖プロセスを始める。
４．以下の２つの条件、細胞の必要数に到達すること、または倍加の「目標」数を２つ超越することのいずれかが満たされるまで、各細胞系の集団を増殖させる。２つの条件を満たすために必要な実際の倍加数は突き止めなければならない。
５．集団倍加目標数プラス２の範囲内に必要な細胞数が到達しなかったドナーはいずれもコホートから排除する。
【００５８】
さらに、集団の倍加が間違った結果をもたらす遺伝子のふらつきを引き起こさなかったことを確実にするために、各ドナーの全ゲノムを完全に配列決定し（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡのＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒなどの自動シークエンサーを利用することが好ましい）、得られたゲノムをヒト参照ゲノムと比較する（「Ｅ．ｐｌｕｒｉｂｕｓ  ｕｎｕｍ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３１（２０１０年１０月）参照）。ゲノムが整列しないいかなるドナーもコホートから取り除き、置換する。
【００５９】
同定するために場合によって各ドナーに番号を割り当てる。同定によって研究者等は後の比較研究で使用するドナーの人種、性別および家族の病歴を判別することができる。ドナー両親はまた、ドナーの個人的な病歴などを将来調べるために研究者が接触することを許可することができる。
【００６０】
胚体外幹細胞は、当業者によく知られた実証された１種または複数の分化技法を使用していくつかの「下流（ｄｏｗｎｌｉｎｅ）」または「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」細胞種（胚様体およびその他の３次元構造、心筋細胞、肝細胞および／またはニューロンなど（それだけに限らない））のいずれかに分化することができる。
【００６１】
最適な分化は好ましくは以下の通りに実現する。
１．各分化操作は、同型の自動化装置で、各ドナーにその他のドナー全てと同じプロトコルを使用して実施する。
２．以下の１つまたは複数によって各ドナーについて同じようになるようにロボット操作を実施する環境を制御する。
ａ．ＨＥＰＡ空気フィルターを含む生物学的キャビネットに装置を入れる。
ｂ．温度を指定した範囲内に制御する。
ｃ．湿度を指定した範囲内に制御する。
ｄ．大気組成を指定した範囲内に制御する。
ｅ．曝露する光の光源、波長および強度を指定した範囲内に制御する。
ｆ．曝露する細胞のノイズレベルを指定した範囲内に制御する。
ｇ．細胞を曝露する電場または磁場の存在を指定した範囲内に制御する。
ｈ．行う実験に適するように各ドナーの細胞を分取し、全ドナーの分取全てを一斉に凍結保存し、それによって全実験単位の凍結解凍の回数を同一にした。
【００６２】
（様々な応答レベルを測定するための終点パラメータおよび終点指標の定義）
【００６３】
閾値点は、どのドナーサンプルが試験する化合物に対して著しい反応を有するかを決定するために定義する。特定のドナーが所与の範囲にあることがわかると、後でドナー間変動を調べることが可能である。例えば、結果に基づいて、ドナーが特定の程度の毒性反応を経験する可能性に対する人種、性別または遺伝子の特色および／または後成的な特色の影響を調べるために、比較研究を場合によって実施する。さらに、場合によって比較研究は、異常値の２つの集団、例えば、所与の薬物に対して最低１０％反応を示す１集団と、所与の薬物に対して最高１０％反応を示す別の集団を採用して、それらの間の差を調べることによって使用する。このような比較は、研究者等が、どの要素が集団の様々な部分をある種の有害反応の危険に陥らせるのかを理解する助けとなり有用である。
【００６４】
（調査中の化学的物質または生物学的物質に対する曝露）
【００６５】
基本的な幹細胞であろうと、それらの「下流（ｄｏｗｎｌｉｎｅ）」の派生細胞のいずれかであろうと、マイクロタイターアッセイプレートに播種することなどによって細胞を培養し、次に予め決定された期間、例えば３日間（それだけに限らない）対象となる化学的物質または生物学的物質に曝露する。注目すべきことに、対象となる化合物の結果は、５−ＦＵ、サッカリン、ＡＴＲＡ、ヒドロキシウレア、１３−シス−ＲＡまたはその他の標準的物質など（それだけに限らない）の既知の毒性を有する内部標準の結果と比較することによって較正する。変動を最小限に維持するために、化学的物質または生物学的物質の全てを溶解するために同じ媒体（例えば、ＤＭＳＯ）を使用することが好ましい。
【００６６】
培養した細胞は、複数の濃度（好ましくは７つ）で試験し、反復を実施する。研究期間中、細胞は、数日後に定期的に増殖培地を対応する増殖因子および一定曝露レベルを維持するために必要な試験化合物用量を含有する新鮮な培地に交換するなど標準的細胞培養手順を使用して、培養して維持する。
【００６７】
各プロセス工程が各ドナーの各反復において、およびその他の全ドナーについては全ドナーにおいて実質的に同一に実施されるように、前記工程は全て、ロボットによる体液操作マシン、インキュベーターなどを使用して実施することが好ましい。これらには、各プロセス工程の順番、採用する特定の作用、各工程の時期および工程の間隔、ならびに使用する特定の試薬が含まれる（それだけに限らない）。
【００６８】
（機構試験の追加）
【００６９】
試薬またはバイオマーカーなどの機構試験を細胞に加えて、様々な有害作用（ミトコンドリア活性または細胞壁の損傷など（それだけに限らない））について試験する。あるいは、心筋細胞のマルチ電極アレイ（Ｍｕｌｔｉ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙ）分析（それだけに限らない）などのその他の確立された試験を実施する。
【００７０】
その後、結果はＧＥ  Ｉｎｃｅｌｌ  ２２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）などの定量的プレートリーダー（それだけに限らない）などの適切な機器によって読み取る。
【００７１】
ロボット流体操作装置および、例えば、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ  １５０（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）などのその他のロボット装置などの自動化手段を使用して全工程を実施することが最も好ましい。
【００７２】
（ドナー対ドナーをベースにした比較結果）
【００７３】
ある種の物質を類似のクラスの物質に対して試験する方法を知っていると有用な比較が可能である（例えば、１つのスタチンを様々なその他のスタチンと比較して、その他のドナーに対してあまり有害ではないが、ある種のドナーサンプルに対して同等の薬物よりも有害であるか、または有害でないかを知ることができる）。
【００７４】
結果は、複数の統計学的技法を使用してドナー対ドナーをベースにして比較する。
【００７５】
（本発明の方法の好ましい実施形態）
【００７６】
本明細書で提供した方法の好ましい一実施形態では、医薬品、工業化学物質、またはその他の化合物もしくは物質を、ヒト胚毒性または発生上の毒性の様々な測定値についてスクリーニングし、遺伝子多様性に基づいて様々なドナー間の毒性応答差を予測し、解明する。
【００７７】
医薬品におけるヒト毒性の基本的な１試験は、試験する医薬化合物が存在していても胚が生存可能で、通常のように３つの胚葉に分化するかどうかを決定することである。
【００７８】
いくつかの業界標準プロトコルのいずれかを使用して、胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞の１種または複数の変種を胚様体に分化させ、次に候補化合物を得られた胚様体に、指示したインキュベーション期間投与することによって試験を実施する。次に、バイオマーカーを使用して３つの胚葉全てが存在するかどうかを決定する。３つの胚葉全てが存在することは試験化合物が有害ではないことを示し、一方、１つ、２つ、または３つの胚葉全てが存在しないことは毒性作用があることを示す。胚様体の生存能を決定するために、細胞生存および／または細胞死を場合によって評価する。
【００７９】
このスクリーニング方法によって、遺伝的に多様なドナーにおける胚様体内の毒性結果の分析が可能で、薬物製造者は、（１）たとえ非常に低い発生率で生じても（例えば、集団の１％もしくは２％のみでも）胚様体内の有害な毒性反応を同定すること、（２）候補薬物の開発を継続するかまたは停止するかを決定すること、および（３）有害反応を経験したドナーと経験していないドナーとの間の違いを理解することが可能で、このスクリーニング方法は、薬物製造者が有害反応を排除するために化合物を改変すること、および／または臨床試験のために特定の患者を適切に選択するかまたはモニターすること、および／または候補薬物をある種の遺伝的プロファイルを有する患者に投与するべきではないという適切な警告を行うことを補助するために有用である。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書で提供した方法を使用した医薬品、工業化学物質、またはその他の化合物もしくは物質の組織特異的毒性試験を使用し、遺伝子多様性に基づいて様々なドナー間の毒性応答差を予測し、解明する。
【００８１】
前述したように、本明細書で記載した方法は、基本的な未分化型の、もしくは「上流（ｕｐｌｉｎｅ）」の胚体外の万能性もしくは多能性幹細胞を利用するか、または１つもしくは複数のよく実証された分化技法を使用して胚体外の万能性もしくは多能性幹細胞が分化することができるいくつかの「下流（ｄｏｗｎｌｉｎｅ）」の細胞種のいずれかを利用する。分化した細胞の例には、心筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、筋細胞、上皮細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、ニューロン、胚様体またはその他の３次元構造が含まれる（それだけに限らない）。
【００８２】
特定の細胞種への分化によって研究者等は試験する化合物が体の特定の組織または器官に毒性作用を示すかどうかを知ることができるので、これは有利である。このようにして、人間が直接または間接的に遭遇し得る医薬品、工業化学物質、ならびにその他の化合物および物質は、遺伝的に多様なドナーにおいて様々な細胞種によって毒性について試験することができる。
【００８３】
例えば、前記で触れたように、胚体外の万能性または多能性幹細胞は、医薬製剤の心臓毒性について試験するために心筋細胞に分化させる。毒性は、いくつかの染色試験のいずれかを使用して、および／または電気的活性または拍動数の違いを研究するために微小電極アレイまたはその他の心臓のイオンチャンネルを使用した試験によって評価する。心臓のイオンチャンネルに既知の遺伝子変種があり、多くがこれから同定されるならば、医薬製剤（またはその他の化合物もしくは物質）の遺伝的に多様な集団サンプルにおける有害な毒性反応について試験し、それらが非常に低い発生率で生じているかどうかを決定する。
【００８４】
別の例のように、パーキンソン病は、脳のドーパミン作動性ニューロンの損失が特徴で、遺伝的および環境の危険因子が知られている。いくつかの遺伝子がパーキンソン病の危険性増加に関連しているが（アルファ−シヌクレイン、パーキン、ＤＪ１、Ｐｉｎｋ１、ＬＲＲＫ２など）、遺伝的根拠がまだ決定されていない家族例もある。さらに、ロテノン、パラコートおよびメンネブなどの農薬がドーパミン作動性ニューロンに毒性を有し、パーキンソン病発症の危険因子である。したがって、パーキンソン病の遺伝的危険因子または家族歴を有する一群のドナーの、ドーパミン作動性ニューロンに分化した胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞を、比較のためにパーキンソン病に家族的に関係がないドナーの有無にかかわらずに、現在市販されているかまたは開発中の工業化学物質に対する毒性反応の増加について試験する。これによって、製造者は製品の健康被害をより理解することができ、製品挿入物または製品ラベルに適切な警告を含めることができる。
【００８５】
本明細書で提供した方法によって、医薬品、工業化学物質、ならびにその他の化合物および物質の遺伝的に多様なドナーにおける特定の細胞種内での毒性結果の分析が可能で、製造者は、（１）たとえ非常に低い発生率で生じても（例えば、集団の１％もしくは２％のみでも）特定の細胞種における有害な毒性反応を同定すること、（２）候補薬物の開発を継続するかまたは停止するかを決定すること、および（３）有害反応を経験したドナーと経験していないドナーとの間の違いを理解することが可能で、この方法は、薬物製造者が有害反応を排除するために化合物を改変すること、および／または臨床試験のために特定の患者を適切に選択するかまたはモニターすること、および／または候補薬物がある種の遺伝的プロファイルを有する患者に投与するべきではないという適切な警告を行うことを補助するために有用である。
【００８６】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、遺伝子多様性に基づいて様々なドナー間の有効な応答差を予測し解明するために、医薬品またはその他の化合物もしくは物質の組織特異的な有効性試験のために使用する。
【００８７】
さらに、本明細書で記載した方法は、基本／上流（ｕｐｌｉｎｅ）の胚体外の万能性幹細胞もしくは多能性幹細胞、または１つまたは複数のよく実証された分化技法を使用して胚体外の万能性幹細胞もしくは多能性幹細胞が分化することができるいくつかの下流（ｄｏｗｎｌｉｎｅ）細胞種（心筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、筋細胞、軟骨芽細胞、上皮細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、ニューロン、胚様体または３次元構造が含まれる（それだけに限定されない））のいずれかを利用する。
【００８８】
特定の細胞種への分化によって、研究者等は試験する化合物が体の特定の組織または器官内で有効な効果を示すか示さないかを知ることができるので、これは有益である。このようにして、医薬品ならびにその他の化合物および物質は、遺伝的に多様なドナーにおいて様々な細胞種への有効性について試験することができる。
【００８９】
例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患の治療を開発する最終的な目標は、疾患の進行を遅延、停止または逆行させることである。今までのところ、神経変性疾患のためのほとんどの臨床試験は、主に臨床試験集団における効果が一貫しないために残念な結果となっている。神経変性疾患は１個の遺伝的危険因子、複数の遺伝的な危険因子の間の相互作用、または遺伝因子と環境因子の間の相互作用によって生じるので、様々な患者応答が予測される。これらの危険因子のいくつかは同定されているが、そのうちのほとんどはまだ同定されていない。
【００９０】
前述のように、パーキンソン病は、脳のドーパミン作動性ニューロンの損失が特徴で、既知および未知の遺伝的および環境的な危険因子がある。いくつかの遺伝子がパーキンソン病の危険性増加に関連しており（アルファ−シヌクレイン、パーキン、ＤＪ１、Ｐｉｎｋ１、ＬＲＲＫ２など）、遺伝的な根拠がまだ決定されたことがない家族例もある。したがって、パーキンソン病の遺伝的危険因子または家族歴を有するドナーならびにパーキンソン病に家族的関連を有さないドナーのサンプルからドーパミン作動性ニューロンに分化した胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞を、（既知のドーパミン作動性毒素の有無にかかわらず）有効な応答の増加、例えば、ドーパミン作動性表現型発現（例えば、チロシン水酸化酵素発現）または生存細胞の増加について試験する。これによって、製造者は試験している物質に応答しやすい患者集団をより理解することができる。
【００９１】
本明細書で記載した方法によって、医薬品ならびにその他の化合物および物質の遺伝的に多様なドナーにおける特定の細胞種内の有効な応答の分析が可能で、製造者は、（１）たとえ非常に低い発生率であっても（例えば、集団の１％もしくは２％のみでも）特定の細胞種における有効性を同定し、ドナーサンプルの一部の応答性が低いか応答性がないかを決定すること、（２）候補薬物の開発を継続するかまたは停止するかを決定すること、および（３）有効な応答を経験したドナーと経験していないドナーとの間の違いを理解することが可能で、この方法は、薬物製造者が応答を改善するために化合物を改変すること、および／または臨床試験のために特定の患者を適切に選択するかまたはモニターすること、および／または候補薬物がある種の遺伝的プロファイルを有する患者にのみ投与するべきであるという適切な標識を行うために有用である。
【００９２】
別の実施形態では、本明細書で提供した方法は、医薬品、工業化学物質またはその他の化合物もしくは物質の組織特異的な代謝のために使用する。
【００９３】
化学物質および化合物は、体内において肝臓のＣＹＰ４５０酵素によって主に代謝されるが、その他の酵素およびその他の組織内によっても代謝される。化学物質または化合物の分解は、その効果を消失させるか、より有効なもしくはより有効性の低い代謝物を生じるか、その毒性を消失させるか、または毒性の高いもしくは毒性の低い代謝物を生成するか、または薬物−薬物相互作用の危険性を増加させることができる。代謝酵素には既知および未知の遺伝子多様性があり、それらは薬物および代謝物の曝露レベルの変動を引き起こすことができ、次に有効性および毒性に影響を及ぼすことができる。したがって、遺伝子多様性を有するドナー群の肝臓細胞に分化した胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞は、有効性おび毒性の集団変動を導く可能性がある代謝の違いを同定するために有用である。
【００９４】
本明細書で提供した方法によって、医薬品、工業化学物質、ならびにその他の化合物および物質の遺伝的に多様なドナーにおける特定の細胞種内での化学物質および化合物の代謝変動の分析が可能で、製造者は、（１）たとえ非常に低い発生率で生じても（例えば、集団の１％もしくは２％のみでも）特定の細胞種における代謝物および代謝速度の変動を同定すること、（２）化学物質または化合物の開発を継続するかまたは停止するかを決定すること、および（３）化学物質または化合物の代謝の違いを理解することが可能で、この方法は、薬物製造者が集団におけるより一貫した代謝のために化学物質または化合物を改変すること、および／または臨床試験のために特定の患者を適切に選択するかまたはモニターすること、および／または候補薬物がある種の遺伝的プロファイルを有する患者に投与するべきではないという適切な警告を行うこと、またはある種の薬物−薬物相互作用に気づくことを補助するために有用である。
【００９５】
別の実施形態では、本明細書で記載した方法は、遺伝的に多様な集団において特定の組織種への一貫した分化を生じさせる化合物、生物学的薬剤またはその他の物質を同定するために有用である。
【００９６】
研究の最新分野は、幹細胞の特定の組織種への分化を誘導する化合物、生物学的薬剤またはその他の物質の同定に焦点を当てている。これには、遺伝子発現、受容体シグナル伝達または第２の伝令機構など（それだけに限らない）の細胞機構の操作が関与することが多い。このような化合物、薬剤または物質は、効率および毒性の試験（それだけに限らない）を含む様々な適用のために、幹細胞を特定の組織種に分化させるために商用に入手可能である。このような化合物、薬剤または物質はまた、脳卒中、脊髄損傷、神経変性疾患、筋萎縮症、循環器疾患、癌、糖尿病、肝疾患および骨粗鬆症などの（それだけに限らない）疾患または損傷による組織損失の内部修復のための医薬製剤の開発に有用である。
【００９７】
細胞機構に著しい遺伝子多様性があるならば、このような化合物、生物学的薬剤またはその他の物質は、多様な集団において特定の組織種（心筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞、上皮細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、ニューロン、胚様体または類似の３次元構造（それだけに限らない）を含む）への一貫した分化を生じにくくする。遺伝的に多様なドナーの一群の胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞は、ドナーサンプルにおける分化の一貫性について物質を試験するために有用である。
【００９８】
本明細書で提供した方法によって、化合物または生物学的薬剤によって生じた分化を分析して、（１）サンプルドナー集団内の特定の組織種への分化の発生率を決定し、（２）適切な分化を経験したドナーサンプルと経験していないドナーサンプルとの違いを理解するために表現型または遺伝的特色を同定することができ、この方法は、製造者が集団においてより一貫した分化のために化合物を改変し、および／または疾患もしくは損傷によって損失した組織の内部修復のために医薬製剤を投与する特定の患者を臨床試験について適切に選択またはモニターするのを補助するために有用である。
【００９９】
別の実施形態では、胚体外の万能性または多能性幹細胞は、遺伝的に多様な集団が感染性疾患の様々な変異の受けやすさを決定するために有用である。
【０１００】
特定の系統の感染性疾患（インフルエンザなど）の危険性を研究している科学者の重大な関心事は、感染しやすい集団の部分であり、特に危険性の高い可能性がある部分集団の同定である。
【０１０１】
しかし、科学界は個々の幹細胞を様々な疾患に感染させるプロトコルを開発してきたが（Ｒｏｂｉｎｔｏｎ  ＆  Ｄａｌｅｙ、「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  Ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４８１、２９５〜３０５（２０１２）参照）、科学界には集団全体の感染率を投影することができる遺伝的に多様な集団の適切な幹細胞モデルが不足していた。このことは大流行を引き起こし得る鳥インフルエンザの変異をモデル化する最近の試みによって実証されており、単純なヒト中心のモデルよりも動物モデル（具体的にはフェレット）の方が信頼されている（Ｈｅｒｆｓｔ，Ｓ等、「Ａｉｒｂｏｒｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｅｒｒｅｔｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６、１５３４〜１５４１（２０１２）参照）。
【０１０２】
この実施形態では、対象となる遺伝的に多様な集団の幅広い個体サンプルを表す多数のドナーの胚体外の万能性または多能性幹細胞は、マイクロタイタープレートの別々のウェルの溶液中に分配し、適切に培養する。次に、特定の疾患作用物質について既に確立された標準的プロトコルを使用して、問題の疾患を引き起こすことが知られている細菌またはウイルスに細胞を曝露する（ここで「引き起こす」とは少なくとも１人のヒトにおいて引き起こされること、または動物由来感染症の実験の場合は１動物種において引き起こされることを意味する）。例えば、曝露は、各ウェルに予め決定された量をピペットで入れることによって溶液中に既知の濃度の生物学的作用物質を送達することによって実現することができる。
【０１０３】
次にウェルを個々に、または適切ならば全体的に密封し、特定の作用物質のためのプロトコルに従って、特定の期間（通常、２４から７２時間）細胞をインキュベートする。このとき、またプロトコルに従って、感染性の溶液を細胞から分離し、細胞を洗浄し、各ウェルについて個々に試験を実施する。
【０１０４】
次に、各ウェルの結果を全体的に分析して、例えば、感染した集団の部分全て、表現型（人種および性別など）、または遺伝子型（本明細書の別のところで記載したように各ドナーから得られた全ゲノム配列によって）のいずれかを同定した部分集団について感染率が違うかどうかを決定する。
【０１０５】
元の感染作用物質が動物種に宿る場合、実験を反復するが、元の感染作用物質を元の実験でうまく感染した個々のドナーの細胞から単離した感染作用物質で置き換える。このようにして、科学者等はその作用物質が動物とヒトの間（すなわち、動物由来感染症）よりもヒト間で伝染する率が高い（または低い）ことが認められるように変異しているかどうかを学習する。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、本明細書で記載した方法のある種の態様をさらに例示するものであって、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１０７】
（実施例）
（インビトロにおいて医薬化合物および工業化学物質を毒性ついて試験するための胚体外幹細胞の使用）
【０１０８】
インビボ毒性を予測することが実証されており（マウスＥＳＣ）、既知の臨床毒物で試験された（マウスＥＳＣおよびヒトＥＳＣ）既に得られている対照細胞と比較して、新生児羊水から単離した胚体外幹細胞が既知のサイトトキシンと同じように反応するかどうかを決定するための実験を実施する。
【０１０９】
（試験対象）
【０１１０】
ヒト新生児由来細胞系の場合、新生児の母親は様々な病原体について分娩前にＯＢ／ＧＹＮによって試験する。受け取り時、サンプルには全てドナー情報および組織供給源に関連した固有の識別がつけられている。ヒトドナーのサンプルを処理して、羊水から最高３００種の細胞系を得る。各細胞系を細胞毒性試験のために増殖させる。細胞を複数のバイアルに入れ凍結させ、バイアル当たり細胞１〜２Ｍとする。凍結前に、細胞のマイコプラズマ混入について試験する。細胞の増殖および生存率をトリパンブルー排除法または類似の方法で凍結時に試験する。
【０１１１】
羊水細胞の最高３００個のドナーサンプルは、羊水由来の胚体外の万能性幹細胞または多能性幹細胞であり、ＣＤ−１１７は陰性であるが、その他のある種の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１など（それだけに限らない））については試験すると陽性であることが特徴づけられる。この細胞は、米国特許第７，５６９，３８５号に記載されている。
【０１１２】
（細胞系）
【０１１３】
必要ならば、単一のｍＥＳＣ系（マウスＥＳＣ  Ｄ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９３４）を使用して、予備的な較正、実際の試験など全てを実施する。この同じ系を以下に説明した試験細胞と同じ５種類の試験化合物の同じ７種類の濃度で試験する。
【０１１４】
さらに、ｈＥＳＣ系を参照系として用いる（Ｓｔｒｅｈｌ  ２００７；Ｍｅｈｔａ等、２００８）。すなわち、５種類の化合物の一部を使用したｍＥＳＣおよび試験細胞の結果を、ｈＥＳＣに対して実施した細胞毒性試験の既に公表された結果と比較する。
【０１１５】
（試験化合物）
【０１１６】
５種類の一般的に利用可能な試験化合物（医薬品および参照標準）および十分に立証された毒物：５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、陽性対照）、サッカリン（陰性対照）、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、１３−シスレチノイン酸（１３−シス−ＲＡ）およびヒドロキシ尿素（ＨＵ）。
【０１１７】
（細胞毒性試験の説明）
【０１１８】
最高３００種の細胞系のそれぞれについて１０日間の細胞毒性試験（ＳｅｉｌｅｒおよびＳｐｉｅｌｍａｎ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ６：９６１〜９７８）を、細胞培養によって観察された細胞増殖に基づく細胞播種濃度を使用して実施する（最初の想定はウェル当たり細胞５００個である）。５種類の化合物それぞれを７種類の濃度（および媒体対照）で、各濃度当たり５回反復して試験する。細胞は２〜３日毎に供給する。５種類の化合物の濃度範囲は以下の通りである。
【０１１９】
５−ＦＵ、０．０００１から１００ｕＭ
【０１２０】
ＡＴＲＡ、１３−シス−ＲＡおよびＨＵ、０．００１から１０００ｕＭ
【０１２１】
サッカリン、０．０１から１０，０００ｕＭ
【０１２２】
ＭＴＴ（３（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）細胞生存率アッセイは、細胞生存率を決するために試験の終了時（１０日目）に実施し、細胞系および化合物のそれぞれについて用量反応曲線を作成する。
【０１２３】
（細胞の獲得および維持）
【０１２４】
１）マウス胚細胞系（ｍＥＳＣ）は、ＡＴＣＣ（マウスＥＳＣ  Ｄ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９３４））から獲得する。ｍＥＳＣ細胞は、ＳｅｉｌｅｒおよびＳｐｉｅｌｍａｎ、２０１１（前述）で記載されたプロトコルにしたがって培養する。解凍後継代してから、ｍＥＳＣ細胞の万能性シグナルをその他の細胞系と比較するために、ＡＰ  Ｌｉｖｅ  Ｓｔａｉｎで試験した。
【０１２５】
２）細胞系の単離。細胞単離は、以下に概略を示した米国特許第７５６９３８５号で記載されたプロトコルに従う。
【０１２６】
約２５０ｍｌの新鮮な羊水を帝王切開による分娩を経験した女性から採集する。羊水は、１ｍｌ当たり約１〜２×１０４個の生細胞を含有していると推定される。研究室に到着したら、細胞を臨床用遠心分離器でペレットにし、１５ｍｌの「ＭＡＦＳＣ」培地に再懸濁する。ＭＡＦＳＣ培地は、１対１の比の低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭＣＤＢ  ２０１培地（ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から構成され、２％の限定ウシ胎児血清（ＨＹＣＬＯＮＥ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレン、リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＩＴＳ＋１、ＳＩＧＭＡ）、１ナノモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００μｍのアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）、４μｍ／ｍｌのゲンタマイシン、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）、１０ｎｇ／ｍｌのｒｒＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（Ｒ＆Ｄ）を含有する。
【０１２７】
細胞を播種するために、細胞播種直前に６ウェル培養皿のウェルを２．５ｍｌのフィブロネクチン（１０μｇフィブロネクチン／ｍｌ滅菌水の保存液）で室温にて１時間コーティングすることによって準備する。細胞を播種する前にフィブロネクチン溶液を除去し、フィブロネクチン溶液を除去した後はウェルを洗浄しない。次に、細胞を各ウェル内の２．５ｍｌの培地に接種する。接種の頃に万能細胞が存在するかどうかを決定するために細胞をＡＰ  Ｌｉｖｅ  Ｓｔａｉｎで試験する。
【０１２８】
ＭＡＦＳＣ培養中の細胞は、倒立位相差顕微鏡下では、４日毎に平均１回分裂するが、接種後８〜１２日で分裂が停止する大きな浮遊細胞のように見える。ＭＡＦＳＣ培養の増殖培地は、浮遊細胞が損失しないように確かめて、２日毎に完全ＭＡＦＳＣ培地に交換する。８〜１０日後、少数の接着細胞が出現し、１４〜１５日で＞１０５個の細胞の大きなコロニーに成長する。接種した生細胞２×１０４個当たり平均で０〜１個の接着コロニーが成長する。したがって、５ｍｌの新鮮な羊水のサンプルから３〜５個の接着細胞コロニーが生じ、６ウェル細胞培養群のウェルの大部分に１個のコロニー／クローンが生じる。
【０１２９】
細胞を次々とフィブロネクチンをコーティングしたより大きなフラスコ／容器に移す。細胞移動を実施するために、細胞を約４０％コンフルエンスのサブコンフルエント状態まで増殖させ、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで脱離させ、同じ培養条件下において１：３希釈で再度播種する。
【０１３０】
羊水の細胞を磁気ビーズ分離によるＳＳＥＡ４発現の陽性選択およびＣＤ１１７発現の欠如による陰性選択によって精製する。単離した細胞を組織培養プレートに移し、次にＭＡＦＳＣ培地を単離した細胞に添加し、ＭＡＦＳＣ培地を使用した標準的細胞培養条件を使用した培養で細胞を増殖させる。数回継代後、細胞のサンプルをＳＳＥＡ４およびＣＤ１１７発現のフローサイトメトリー分析のために採取し、細胞選択工程の有効性を確認する。細胞は、フローサイトメトリーを使用してＮａｎｏｇおよびＯｃｔ−４の発現によって万能性も試験する。細胞の数を増加させ、細胞毒性試験に十分な量を得るために増殖させる。細胞毒性試験中、細胞をＭＡＦＳＣ培地中で維持する。形態学的特性の観察は、細胞の通常の培養中に様々な段階で試験前に行うことに注意されたい。
【０１３１】
（細胞毒性試験の工程／手順）
【０１３２】
胚体外幹細胞およびｍＥＳＣ細胞は、細胞毒性試験において平行して試験することが理想的である。様々なドナーからの収集した細胞間に大きな時間差がある場合、細胞を同じような集団倍加／継代数で凍結保存し、細胞毒性試験の準備において一緒に解凍し増殖させることができる。
【０１３３】
１０日間の細胞毒性試験（ＳｅｉｌｅｒおよびＳｐｉｅｌｍａｎ、２０１１、（前述））を、培養中の増殖の観察に基づいて決定した最適な細胞播種濃度を使用して、最高３００種類の細胞系に実施する（最初の想定はウェル当たり細胞５００個である）。５種類の化合物それぞれを７種類の濃度（および媒体対照）で、濃度当たり５回反復して試験する。細胞は２日から３日毎に供給する（培地の約半分を除去し、適切な成長因子および試験化合物を含む同量の新鮮な培地と交換する）。化合物の濃度範囲は以下の通りである。
【０１３４】
５−ＦＵ、０．０００１から１００ｕＭ
【０１３５】
ＡＴＲＡ、１３−シス−ＲＡおよびＨＵ、０．００１から１０００ｕＭ
【０１３６】
サッカリン、０．０１から１０，０００ｕＭ
【０１３７】
ＭＴＴアッセイは、細胞生存率を決定する試験の終了時（１０日目）に実施し、細胞系および化合物のそれぞれについて用量反応曲線を作成する。
【０１３８】
アッセイの各ウェルは適切な時点で（化合物適用から１０日後）、生存している細胞の一部を定量的プレートリーダーを使用して決定する。
【０１３９】
得られたパーセントは、一連のエクセルスプレッドシート（依頼者が指定）に記録し、以下の通り結果を分析し表す。
【０１４０】
各回の反復について（いかなる対照も含む）、生存している細胞の最大パーセントおよび最小パーセントの差を決定する。
【０１４１】
反復の平均および平均（ＳＥＭ）の標準誤差を算出し、反復を図示するために使用する。
【０１４２】
１つの図に、ドナー全てについての特定の細胞種および特定の化合物の用量反応曲線を重ね合わせる。
【０１４３】
各細胞系について、試験化合物を比較する図を作成する。
【０１４４】
最後に、個々の細胞系の応答を反応の定量的範囲に基づいたサブコホートに群分けして、遺伝子に関連した分析を実施し、特定の対立遺伝子または対立遺伝子の組み合わせが統計学的にこのような反応差に関連するかどうかを決定する。
【０１４５】
添付の特許請求の範囲の方法は、本明細書で記載した特定の方法によって範囲を限定されず、これらの方法は特許請求の範囲の２、３の態様を例示するものであり、機能的に等価ないかなる方法も本開示の範囲内である。本方法の様々な改変は本明細書で示し記述したものに加えて、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。さらに、ある種の代表的な方法およびこれらの方法の態様のみを具体的に記載したが、特に引用していなくても、その他の方法および本方法の様々な特徴の組み合わせは、添付した特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。したがって、工程、要素、成分または構成要素の組み合わせは、本明細書で明白に記述することができるが、明白に記載されていなくても、工程、要素、成分または構成要素のその他の組み合わせ全てが含まれる。本明細書で引用した全出版物、特許、特許出願は、全目的のために全体を参考として本明細書に組み込む。
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月7日(2016.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的物質または化学的物質に対するヒトの応答差を予測するための方法であって、
前記生物学的物質または化学的物質を、少なくとも１０人の遺伝的に異なるヒトドナーから得られた胚体外幹細胞と、インビトロにおいて一緒にすること、
前記細胞に対する効果についてアッセイすること、
各ドナーから得られた細胞に対する効果を分析すること、
少なくとも１０人の遺伝的に異なるドナーから得られた胚体外幹細胞に対する効果の相違を特定すること、および
ドナー同士の相違を比較すること
を含み、
各ドナーに由来する効果の相違を比較することにより、前記生物学的物質または化学的物質がヒトに対して有する応答差を予測する、方法。
【請求項２】
各ドナーについての対照を用いることをさらに含み、前記対照は、前記生物学的物質または化学的物質と一緒にされていない、同じドナーに由来する胚体外幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚体外幹細胞が万能性または多能性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胚体外幹細胞を前記生物学的物質または化学的物質と一緒にする前に増殖させ、分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ドナーがヒト新生児である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
胚体外幹細胞が少なくとも２００人の遺伝的に異なるドナーから得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
胚体外幹細胞が少なくとも３００人の遺伝的に異なるドナーから得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ドナーを選択または排除することによって、非遺伝的なドナー間変動、非遺伝的なドナー相互変動、または非遺伝的なドナー内変動を最小限に抑えることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１０人の遺伝的に異なるドナーから得られた胚体外幹細胞に対する効果の相違を特定し、統計学的クラスタリング技法を利用することによって、非遺伝的なドナー間変動、非遺伝的なドナー相互変動、または非遺伝的なドナー内変動を最小限に抑えることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
都市（city）および地域（region）からなる群より選択される同じ地理的位置で生まれたヒト新生児であるドナーを選択することによって、非遺伝的なドナー間の変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーがヒト新生児であり、かつ下記：
既知の遺伝子異常を有すること；
体液収集前または収集中に処置を必要とする新生児の危機についての証拠があること；
出産前に実験的手順を受けた、または実験生成物もしくは電離放射線の曝露を受けたこと；
胎児死亡または重大な胎児異常；
羊水が幹細胞を含有するのに適切であることが困難となり得る先天性欠陥；
妊娠３５〜３９週以外の妊娠期間であること；
妊娠中の治療薬／薬物／アルコール／煙草もしくはニコチン生成物のいずれかおよび全ての使用を明らかにすることをのぞまない母親；
複雑な妊娠であること；
有害な妊娠の結果となる危険性の増加に関連した重大な母親の医学的疾患があること；
新生児に伝播する可能性がある伝染性疾患の感染の証拠を有する母親であること；
分類Ａ感染性疾患を有すること；
輸血または血液製剤の受容の履歴を有する母親であること；
低羊水の証拠があること；
妊娠中における、制吐剤、ビタミン補給剤、乳児分娩のための薬剤以外の処方薬の使用；
妊娠中における、ＦＤＡ未承認治験薬の使用；
妊娠中における乱用薬物の摂取；および
産母が染色体損傷、先天性欠陥、または慢性的な健康障害を引き起こすことが知られている閾値を超えた生物学的危険または化学的危険に曝露された母親であること；
からなる群より選択される１以上の基準に該当するドナーを排除することによって、非遺伝的なドナー間の変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ドナーがヒト新生児であり、かつ限られた期間内に生まれたドナーを選択することによって、非遺伝的なドナー間の変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
全ドナーのＤＮＡを配列決定し、配列をヒト参照ゲノムと整列させ、ヒト参照ゲノムと整列しないＤＮＡ配列を有するドナーを排除することによって、非遺伝的な変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
胚体外幹細胞が、前記生物学的物質または化学的物質と一緒にされる前に、一貫した産生プロセスの下で増殖および分化されることによって、非遺伝的な変動を最小限に抑える、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的物質もしくは化学的物質に対するヒトの標的集団での出現率または応答差の程度を予測する方法であって、
ａ．標的集団を同定すること、
ｂ．所望するレベルの判定に必要な標的集団のドナーの数を計数すること、
ｃ．化学的物質または生物学的物質に対する応答に関連する標的集団の既知の表現型を特定すること、
ｄ．各表現型について各ドナーから幹細胞を得ること、
ｅ．増殖および分化が可能な幹細胞を増殖および分化させ、増殖または分化しない任意のドナー由来の幹細胞を、同じ表現型を有する置換ドナー由来の幹細胞で置換すること、
ｆ．各表現型の各ドナー由来の分化した幹細胞を、前記生物学的物質または化学的物質と一緒にし、各表現型の各ドナー由来の分化した幹細胞に対する効果をアッセイし、各表現型の各ドナー由来の分化した幹細胞に対する効果と、同じドナー由来であるが前記生物学的物質または化学的物質と一緒にされていない、分化した幹細胞を含む対照に対する効果とを比較すること、および
ｇ．効果の統計学的分析を実施することであって、ドナー由来の分化幹細胞に対する前記生物学的物質または化学的物質の効果の差が、前記標的集団内の出現率または応答差の程度を予測すること
を含む方法。
【請求項１６】
２以上の生物学的物質または化学的物質に対する幹細胞のコホートの応答を比較および対比する２以上のアッセイの結果を分析する方法であって、
ａ．アッセイする２以上の生物学的物質または化学的物質の各々について少なくとも１０人の遺伝的に異なるドナーから得られた幹細胞または幹細胞由来の細胞のコホートに、１以上の生物学的物質または化学的物質を加え、前記幹細胞または幹細胞由来の細胞に対する効果をアッセイすること、
ｂ．前記効果の定量的計測を行うこと、
ｃ．サブコホートおよび／または生物学的物質もしくは化学的物質の統計的関係を特定する統計的または定量的な技法を用いて定量的計測を分析することにより、コホートをサブコホートに分割すること、
ｄ．前記２以上のアッセイの統計的関係を分析することにより、前記生物学的物質または化学的物質に対するサブコホートの応答を比較および対比すること
を含む方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、下記：
ｅ．ステップｂの定量的計測の各々について別々に、その計測の最低値からその計測の最高値までコホートのメンバーに順番を付けること、
ｆ．第２のメンバーの定量的計測値から第１のメンバーの定量的計測値を差し引くことによって、コホートの第１のメンバーとコホートの第２のメンバーとの間のステップｃの定量的計測の増分を決定すること、
ｇ．各定量的計測の平均増分を計算すること、
ｈ．コホートの任意の隣接する２つのメンバーの間の増加が、平均増加を、予め決定された比、例えば２対１よりも多く、超える任意の場合を変曲点として標識すること、
ｉ．変曲点間にあるメンバーのいかなる群も別のサブコホートとして同定すること、
ｊ．様々なサブコホートの比較対照統計的検定を実施すること
をさらに含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、下記：
ｋ．各次元が１測定値に対応する次元のマトリクスに、ステップｅのメンバーの順番を整列させること、
ｌ．各次元をコホートに細分すること、
ｍ．マトリクスにおけるコホートの各共通部分を占める各コホートのメンバーを同定することによって、サブコホートを作出すること、
ｎ．様々なサブコホートから得られる結果の比較対照統計的検定を実施すること
をさらに含む方法。
【国際調査報告】
2016523550.tif 000002