(57)【要約】  本発明は、組成物を局所的に外科的に適用することにより腰痛治療において使用するための、再吸収性担体および少なくとも１種の抗菌剤を含む組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｏｄｉｃ変化の１型もしくは２型として分類される腰痛の治療において、または感染性脊椎椎間板炎由来の腰痛の治療において、前記腰痛を患っている対象の腰椎間板および／または隣接椎骨、靱帯、筋肉、および／または関節に局所的に外科的にもしくは内視鏡的に適用することにより、または経皮注射することにより使用するための、少なくとも１種の抗菌剤を添加した再吸収性担体を含む組成物であって、前記再吸収性担体が再吸収性ヒドロゲルである、組成物。
【請求項２】
前記再吸収性ヒドロゲルが、水、および濃度１重量％〜３０重量％でヒアルロン酸誘導体またはその塩を含むヒドロゲルであり、前記ヒアルロン酸誘導体が分子量５０，０００〜３，５００，０００Ｄａを有するヒアルロン酸またはその塩であり、それに分子量３，０００〜９００，０００Ｄａを有する生分解性生体適合性ポリエステルの鎖が、前記誘導体がヒアルロン酸のＤ−グルクロン酸／Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの繰り返し単位１００個につき前記ポリエステル鎖１〜１５個を含むような量で連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
−  濃度０．０１重量％〜３０重量％の１種または複数の抗生物質、
−  濃度０．０１重量％〜３０重量％の１種または複数の抗真菌薬、
−  濃度０．０１重量％〜２０重量％の１種または複数の金属、
−  濃度０．０１重量％〜５０重量％の１種または複数の生体活性ガラス、ならびに
−  濃度０．０１重量％〜２０重量％のＮ−アセチル−システインおよびさらなる抗菌性システイン誘導体、ならびに
−  濃度０．０１重量％〜２０重量％のアスコルビン酸またはその塩
の中で選択される少なくとも１種の抗菌剤を含み、
前記重量パーセントの上記全てが組成物の総重量に対して算出される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
−  前記１種または複数の抗生物質が、ダプトマイシン、チゲサイクリン、テラバンシン、クロラムフェニコール、フシジン酸、バシトラシン、リファンピシン、エタンブトール、ストレプトマイシン、イソニアジド、グリコペプチド、アミノグリコシド、セファロスポリン、マクロライド、オキサゾリジノン、キノロンおよびフルオロキノロン、ポリミキシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ならびにペニシリンから選択され、
−  前記１種または複数の抗真菌薬が、ポリエン系抗真菌薬、イミダゾール系およびトリアゾール系抗真菌薬、アリルアミン、エキノカンジン、ならびにグリセオフルビンから選択され、
−  前記１種または複数の金属が、銀、亜鉛、銅、コバルト、チタン、およびニッケルから選択され、
−  前記生体活性ガラスがガラスＳ５３Ｐ４であり、
−  前記アスコルビン酸の塩が、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の塩から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記グリコペプチドが、テイコプラニンおよびバンコマイシンから選択され、前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、およびネチルマイシンから選択され、前記セファロスポリンが、セファゾリン、セフォキシチン、セフォタキシム、セフロキシム、およびモキサラクタムから選択され、前記マクロライドがエリスロマイシンであり、前記オキサゾリジノンがリネゾリドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｘ線不透過性化合物をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｘ線不透過性化合物が硫酸バリウムである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
水中の前記抗菌剤と、凍結乾燥され、使用まで使い捨ての無菌キットに個包装された前記再吸収性担体を混合することにより調製される、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腰痛治療のための生体活性化合物の担体としての生体再吸収性組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腰痛は、通院および整形外科治療、ならびに運動技能の低下の主な原因であり、あらゆる国で何百万人もの患者が罹患している。腰痛は医療分野においても、英語の用語「腰部痛（low back pain）」またはその頭字語ＬＢＰで知られており、これは本記載の残りの部分において採用されるであろう。
【０００３】
医療研究は、人口の約８０％が一生のうちにＬＢＰを患うことを示している。ＬＢＰを有する多くの人々にとって、痛みは数回再発するようであり、慢性的な腰痛は４５才未満の若い成人の活動における主要な制限因子である。米国における疫学的研究は、ＬＢＰの年間有病率約５〜２０％を明らかにしている。この疾患は患者の日常生活を妨げ、彼らの生活の質を低下させる。この状態に伴う費用は莫大であり、直接医療費、および仕事での生産性の低下などの間接費用の両方を含む。腰痛は健康問題だけでなく、社会経済的問題でもある。
【０００４】
腰痛は一般的に、変性脊椎障害の結果であり、その強度は通常、画像診断法により、具体的には磁気共鳴画像法により評価される。この方法は、椎体終板および軟骨下の骨における変性変化を強調することができる。
【０００５】
この障害の程度は一般的に、ＭＴ  Ｍｏｄｉｃおよび彼のスタッフのいくつかの論文が発表された後に採用された、経験的尺度を参照して測定される。この点については、具体的には論文「Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｋ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｂｏｄｙ  ｍａｒｒｏｗ  ｗｉｔｈ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ」Ｍｏｄｉｃら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９８８；１６６（１、パート１）、１９３〜１９９ページを参照のこと。この方法に従って、ＭＣｓ（「Modic変化（Modic Changes）」から）として知られる、通常の状態と比較した磁気共鳴信号の３段階の偏差によって椎骨変化が評価される。炎症期としても知られるＩ型は、線維組織の炎症により特定され、Ｔ１Ｗスキャンでの低信号強度およびＴ２Ｗスキャンでの高信号強度を特徴とする。脂肪期として知られるＩＩ型は、椎体終板およびその下の領域における脂肪細胞の高度の沈着を特徴とし、Ｔ１Ｗスキャンでの高信号強度およびＴ２Ｗスキャンでの同等の信号または中〜高信号により特定される。最後に、骨硬化期としても知られるＩＩＩ型は、Ｔ１ＷおよびＴ２Ｗスキャンの両方での低信号強度を特徴とする。病因は完全には解明されていないが、ＭＣｓスケールは椎間板の形態学的変化を特性評価するのに有用な手段である。研究から、ＭＣの有病率は、各型における無症状の患者に対して異なる割合で、慢性的な背部痛を有する患者において１８％〜６２％の範囲で変化することが明らかになっている。具体的には、ＭＣｓＩ型およびＩＩ型は慢性的な背部痛を有する患者において高い有病率を有し、無症状のボランティアにおいてはまれであることが観察された。論文「Ｍｏｄｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ，  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ」ＨＢ  Ａｌｂｅｒｔら、Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ、２００８、７０（２）、３６１〜３６８ページに記載される研究において、ＭＣｓ値、特にＩ型、および慢性的ＬＢＰの間に強い相関関係が見出され、このことは終板の裂溝における変化およびその後の炎症反応の病理学的結果を反映している。
【０００６】
いくつかのごく最近の研究では、ＭＣｓ値により測定された変化が、主に（ただしこれだけに限らず）嫌気性細菌による局所的な軽度の感染に起因すると考えられている。ＬＢＰの発生についてのこの機構への最初の言及は、引用されたＡｌｂｅｒｔらの論文により報告されている。この考えられるＬＢＰの起源について報告しているさらなる論文は、「Ｄｏｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｉｓｃ  ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  Ｍｏｄｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｖｅｒｔｅｂｒａｅ？」、Ｈ．Ｂ．Ａｌｂｅｒｔら、Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．（２０１３）、２２、６９０〜６９６ページ、および、２０１３年５月にインターネット上で発表され、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｐａｌｍｂｅａｃｈｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／２０１３／０５／ｌｏｗ−ｂａｃｋ−ｐａｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ−ｔｏ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ／で入手可能な論文「Ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」である。
【０００７】
例えば上記最後の２つの論文で開示されているように、抗生物質の長期にわたる全身投与が、ＭＣｓの１型と関連するＬＢＰの治療において有効であることが証明されている。しかしこの治療方法は、その持続時間によりさらに悪化させた全身に対する抗生物質治療の既知の副作用という明らかな禁忌を有する。
【０００８】
さらに考えられる腰痛の原因は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、マイコバクテリア、嫌気性細菌、および菌類を含む、１種または複数の細菌または寄生生物により引き起こされる感染性脊椎椎間板炎である。
【０００９】
したがって、既知の方法の欠点を有しておらず、椎間板、椎体および椎骨構造、ならびに隣接組織における、考えられる病原微生物の処置を特に対象とする、腰痛治療のための方法を利用可能にする必要性がいまだ感じられる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明に従って、ここに添付される特許請求の範囲の第１項で定義されるように、ＭＣｓの１型もしくは２型として分類される腰部痛の治療において使用するための、または感染性脊椎椎間板炎による腰部痛の治療のための抗菌剤を添加した、再吸収性ヒドロゲルである再吸収性担体を含む組成物により、公知の技術における問題が克服される。組成物は、腰椎間板および／または隣接椎骨（Ｌ１〜Ｓ１）、靱帯、筋肉、ならびに関節において局所的に適用され、適用は開腹術もしくは注射により、または顕微鏡手術もしくは経皮的手技を用いて実施される。
【００１１】
上記の使用のための本組成物のさらなる重要な特徴が、以下の詳細な記載において開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トルイジンブルー染色、フクシン酸、およびファストグリーン、ならびに倍率１０ｘによる光学顕微鏡により得られた、埋め込み後１２週の、以下の実施例４で開示される材料の組織画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の組成物は、抗菌剤を添加した、再吸収性ヒドロゲルである再吸収性担体を含む。再吸収性担体により、材料は、その中で抗菌成分が分散することができ、一度生物中に入ると、その後、刺激を引き起こす可能性のある残留物を生じることなく、生物により分解または代謝することができるように意図される。
【００１４】
本発明による好ましい担体の１つは、本出願人名義の国際特許出願第ＷＯ２０１０／０８６４２１Ａ１号で開示されるヒアルロン酸誘導体のヒドロゲルである。このヒドロゲルは、水、および濃度１重量％〜３０重量％でヒアルロン酸誘導体（HA）またはその塩を含み、このヒアルロン酸誘導体は、分子量５０，０００〜３，５００，０００Ｄａのヒアルロン酸から開始し、このポリマー鎖に分子量３，０００〜９００，０００Ｄａの生分解性生体適合性ポリエステルを、前記誘導体がヒアルロン酸のＤ−グルクロン酸／Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの繰り返し単位１００個につき前記ポリエステル鎖１〜１５個を含むような量で結合させることにより得られる。この組成物、およびこれらの誘導体を調製する方法は、特許出願ＷＯ２０１０／０８６４２１Ａ１の７ページ２５行目から１０ページ２０行目までに詳細に開示されている。この出願においては具体的にポリエステル、具体的にポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリカプロラクトンとして開示されており、それらの混合物およびコポリマーが、好ましくはそれらのカルボキシル末端官能基をジシクロヘキシルカルボジイミドと、次いで良好な脱離基、例えばイミド、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を有する産物と反応させることにより活性化される。同時にＨＡは、例えばセチルトリメチルアンモニウム（CTA）または好ましくはテトラブチルアンモニウム（TBA）などのそのアンモニウム塩に転換され、その後、触媒としてのジエチルアミン（DEA）の存在下でポリエステル−ＮＨＳと反応し、その結果、ＮＨＳにより活性化されたポリエステルのカルボキシル官能基と、ＨＡのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のヒドロキシル基との縮合が起こる。
【００１５】
抗菌剤は異なる種類であってもよく、以下のうち１種または複数を含んでいてよい。
−  抗生物質、例えばダプトマイシン、チゲサイクリン、テラバンシン、クロラムフェニコール、フシジン酸、バシトラシン、リファンピシン、エタンブトール、ストレプトマイシン、イソニアジド、グリコペプチド（テイコプラニンおよびバンコマイシンなど）、アミノグリコシド（ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、およびネチルマイシンなど）、セファロスポリン（セファゾリン、セフォキシチン、セフォタキシム、セフロキシム、およびモキサラクタムなど）、マクロライド（エリスロマイシンなど）、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）、キノロンおよびフルオロキノロン、ポリミキシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ならびにペニシリン。これらの薬剤は、濃度０．０１重量％〜３０重量％の範囲で、本発明の組成物に使用される。
−  組成物中の濃度０．０１重量％〜３０重量％の、ポリエン系抗真菌薬、イミダゾール系およびトリアゾール系抗真菌薬、アリルアミン、エキノカンジン、ならびにグリセオフルビンのファミリーに含まれるものの中で選択される抗真菌薬。
−  組成物中の濃度０．０１重量％〜２０重量％の、場合によってナノサイズの銀を含有する製剤の形態での銀、亜鉛、銅、コバルト、チタン、およびニッケルの中で選択される１種または複数の金属。
−  組成物中の濃度０．０１重量％〜５０重量％の生体活性ガラス、例えば生体活性ガラスＳ５３Ｐ４。
−  組成物中の濃度０．０１重量％〜２０重量％のＮ−アセチルシステインおよびその他の抗菌性システイン誘導体。
−  濃度０．０１重量％〜２０重量％のアスコルビン酸ならびにその、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の塩。
【００１６】
本発明において、個々の成分の重量パーセントは全て、それらを含む組成物の総重量に対して算出される。
【００１７】
本発明の組成物は、具体的には使用する時点まで低温でそのように維持されうる抗生物質のために、外科的適用の直前にその成分を混合することにより調製可能である。この目的のため、２つの成分の使い捨ての無菌キットを調製することが可能である。使用の直前に成分を混合することで、組成物に添加されるべき抗菌成分の量における高い汎用性も実現する。この量は腰部の障害の程度に応じて、適用時に外科医により決定されうる。
【００１８】
上記の２つの基剤成分以外に、組成物はさらなる成分、例えば組成物の位置およびその再吸収の程度をＸ線撮影で評価できるようにするため、Ｘ線不透過性化合物（例えば硫酸バリウム）を含んでいてよい。
【００１９】
腰椎間板および／または隣接椎骨、靱帯、筋肉、および／または関節に、ヒドロゲルの形態の本組成物を局所的に外科的にもしくは内視鏡的に適用することによる、または経皮注射することによる、Ｍｏｄｉｃ変化の１型もしくは２型として分類される腰痛、または感染性脊椎椎間板炎由来の腰痛を患っている患者の治療方法も、本発明の主題である。
【００２０】
本発明の組成物は、多かれ少なかれ侵襲性でありうる外科的方法により局所的に適用される。
【００２１】
開腹術による適用が可能であり、この場合、患者は組成物を適用する領域をさらすために、皮膚の切開によって下層部分の実際の手術を受ける。この技術は上記の生体再吸収性担体のいずれか１つを含む組成物に適している。
【００２２】
別の方法では、顕微鏡手術手法、例えば経皮的または内視鏡的手法による、より侵襲性の低い方法が使用可能である。この場合、組成物は好ましくは、生体再吸収性担体として流体材料、例えば前述の改変ヒアルロン酸のヒドロゲルを使用することにより調製される。
【００２３】
両方の場合（開腹術または経皮的／内視鏡的手法）で、組成物の適用のための手術中、椎間板ならびに／または関心領域に隣接する組織および骨の創面切除（「デブリードマン」）を実施することも可能である。これは、最小侵襲性もしくは内視鏡キュレット、電動カッター、高周波、および／または食塩水による繰り返し洗浄を使用して行われうる。
【００２４】
例えば、典型的な経皮的適用において、疾患を有する椎間板は、まず画像増強装置または他のＸ線装置によって場所を特定される。続いて直径が漸増するカニューレが導入され、材料が椎間板および／または隣接する骨もしくは関節構造から採取され、微生物学的および場合によって組織的評価に送られる。特殊な手段を用いる病変の掻爬および病変の洗浄がその後、好ましくは食塩水により行われる。この時点で、抗菌剤を添加したヒドロゲルが調製され、先に洗浄された病変に経皮的経路により導入される。
【００２５】
以下の実施例は、本発明を限定することなく例示するために提供される。
【実施例】
【００２６】
実施例１
再吸収性担体の調製
以下の実施例で試験されるヒドロゲルは、本明細書において以下に報告される、本出願人名義の特許出願第ＷＯ２０１０／０８６４２１号の実施例１〜３で開示されている、凍結乾燥形態で調製されたヒアルロン酸およびポリ乳酸の誘導体ＨＡ−ＰＬＡ（Ｂ）であり、これがその後、同じ出願の実施例５で開示されているヒドロゲルに転換される。
【００２７】
分子量１５００ｋＤａを有するヒアルロン酸（HA）１ｇを、ｐＨ０．５を有するＨＣｌ水溶液１００ｍｌ中に溶解させ、放置して３７℃で２４時間反応させる。生じた産物は、サイズ排除クロマトグラフィー分析ＳＥＣにより決定された平均分子量２３０ｋＤａを有する。この産物に、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（TBA-OH）を、ｐＨ７が得られるまで添加する。反応混合物はその後、徹底的な透析を受ける。
【００２８】
生じた塩ＨＡ−ＴＢＡを凍結乾燥により回収し、１Ｈ−ＮＭＲ分析（Ｄ２Ｏ）により特性評価し、ＴＢＡとの交換が収率１００％で起こったことを確認する。ＨＡ−ＴＢＡの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）スペクトルは、δ  ０．９７（ｍ，１２Ｈ，Ｎ＋−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）４）；δ  １．４０（ｍ，８Ｈ，Ｎ＋−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）４）；δ  １．６４（ｍ，８Ｈ，Ｎ＋−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）４）；δ  ２．０４（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３）；δ  ３．８２（ｍ，８Ｈ，Ｎ＋−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）４）で信号を示す。
【００２９】
次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を伴うポリ乳酸（PLA）のポリエステルを、論文「Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ」、Ｙｏｏ  Ｈ．Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００４）９６：２７３〜２８３に記載されている、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（PLGA）の合成経路に従って調製する。
【００３０】
平均分子量８ｋＤａを有するＰＬＡ２．４ｇを、ジクロロメタン３０ｍｌ中に溶解させる。この溶液にまず縮合剤ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）０．２５ｇを添加し、次いでＮＨＳ０．１４ｇを添加し、室温で２４時間反応を起こさせる。この期間後、反応混合物を、ジクロロメタンを部分的に留去することにより濃縮し、産物をエタノール中で沈殿させ、同じ溶媒中で繰り返し洗浄する。そのようにして得られた固体をその後、減圧下で濾過および乾燥させる。出発ＰＬＡの量に対して８０重量％超の収率で白色結晶固体が得られる。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるＰＬＡのカルボキシル基の活性化が起こったことを裏付けている。ＰＬＡのＮＨＳに連結したモル数および単一鎖のモル数間の比として表される誘導体化度は９０％である。
【００３１】
産物ＰＬＡ−ＮＨＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は、δ  １．５  ｅ  δ  １．６（ｄ，３Ｈ，Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＨ；δ，３Ｈ，Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−；δ  ２．８０（ｍ，４Ｈ，ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；δ  ４．３  ｅ  δ  ５．２（ｍ，１Ｈ，Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＨ；ｍ，１Ｈ，Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−）で信号を示す。
【００３２】
上記のように調製された、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩ＨＡ−ＴＢＡおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを伴うポリ乳酸のポリエステルＰＬＡ−ＮＨＳを反応させ、以下のようにヒアルロン酸およびポリ乳酸ＨＡ−ＰＬＡのヒドロゲルを得た。
【００３３】
ＨＡ−ＴＢＡ６００ｍｇを、触媒ジエチルアミン（DEA）５７６μｌの存在下で無水ＤＭＳＯ４８ｍｌ中に溶解させた。次いで、ＰＬＡ−ＮＨＳ３．６ｇを無水ＤＭＳＯ６ｍｌ中に溶解させることにより溶液を調製した。次いでこの溶液を、１時間の期間中に、最初のＨＡ−ＴＢＡ溶液に一滴ずつ添加した。ＰＬＡ−ＮＨＳのモル数およびＨＡのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のモル数間の名目比は０．５であった。
【００３４】
４０℃のアルゴン無水雰囲気下での２４時間後、ＴＢＡをＮａ＋と交換するために、反応混合物をＤｏｗｅｘナトリウム交換樹脂に通した。次いで溶出液を蒸留水に対し透析してＤＭＳＯを除去し、次いで冷凍し、凍結乾燥させた。この固体をアセトンで繰り返し洗浄し、さらに乾燥させる。
【００３５】
得られた誘導体ＨＡ−ＰＬＡのＦＴ−ＩＲスペクトルは、３５４０ｃｍ−１（ＨＡのνａｓＯＨ＋νａｓＮＨ）でバンド、１７５７ｃｍ−１（ＰＬＡのνａｓＣＯＯ）、１６２３ｃｍ−１（ＨＡのａｍｉｄｅ  Ｉ）、１４５６ｃｍ−１（ＰＬＡのνａｓ，ＣＨ３）、１３８２ｃｍ−１（ＰＬＡのνｓＣＨ３）、１１８９ｃｍ−１（ＰＬＡのエステル基のνｓＣ−Ｏ−Ｃ）、１０８９ｃｍ−１および１０４８ｃｍ−１（ＨＡのνアルコールおよびエーテルＣ−Ｏ）でバンドを示す。
【００３６】
誘導体ＨＡ−ＰＬＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ  ９０：１０）は、δ  １．２５  ｅ  δ  １．４５（２ｄ，−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−  ｄｉ  ＰＬＡ）；δ  １．８５（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３  ｄｉ  ＨＡ）  δ  ５．１  ｐｐｍ（ｍ，−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−  ｄｉ  ＰＬＡ）を示す。
【００３７】
ＨＡ−ＰＬＡ誘導体のＰＬＡにおける誘導体化度（DD, %）は、（PLA鎖のメチル基に由来するものと考えられる）δ  １．２５およびδ  １．４５におけるプロトンに関する２つのピークの積分によるＰＬＡ鎖の数、ならびに−ＮＨＣＯＣＨ３基に由来すると考えられるδ  １．８５におけるプロトンに関する積分による、ＨＡ中に存在するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の数を評価し、次いで、式：ＤＤ＝（PLAのN.モル／グルコサミン単位のN.モル）×１００を適用することにより算出される。上記のように調製されたＨＡ−ＰＬＡ（Ｂ）誘導体について算出された誘導体化度は３．５であった。
【００３８】
実施例２
再吸収性担体を生体ガラスと組み合わせることによる本発明の組成物の調製、および組み合わせのｐＨ変化の管理
この試験のために、ＢｏｎＡｌｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｌｔｄの生体活性ガラス（S53P4）を使用する。この生体ガラスは４５μｍ未満のサイズの微粒子形態である。使用される再吸収性担体は、ＷＯ２０１０／０８６４２１の実施例５で開示されるように調製されたヒドロゲルである。以下で使用される水は、注射用水である。
【００３９】
最初に、生体ガラス２５０ｍｇを水１ｍｌと混合することにより得られる懸濁液のｐＨを測定する。混合直後に、急速に分離するゼラチン状の懸濁液が形成される。生体ガラスを水と混合した直後に測定されたｐＨ値は１１．６である。
【００４０】
生体ガラスを吸収性担体と混合する手順は以下の通りである。実施例１で上記のように調製された、シリンジ中の無菌凍結乾燥形態の再吸収性担体６０ｍｇを水１ｍｌで水和させる。一度水和が完了すると、生体ガラスＳ５３Ｐ４  ２５０ｍｇを添加する。生体ガラスと混合された試料のｐＨ値を、１、２、４、６、２４、４８、７２および９６時間後に測定する。
【００４１】
混合物の外見は、観察した９６時間の間変化しないゼラチン状の塊である。組成物は２４時間後わずかに流動性が高くなるのみである。測定されたｐＨ値は以下の通りである。
−  混合直後に測定されたｐＨは１０．３である
−  １時間後に測定されたｐＨは９．９である
−  ２時間後に測定されたｐＨは９．９である
−  ４時間後に測定されたｐＨは９．６である
−  ６時間後に測定されたｐＨは９．６である
−  ２４時間後に測定されたｐＨは９．３である
−  ４８時間後に測定されたｐＨは９．１である
−  ７２時間後に測定されたｐＨは９．１である
−  ９６時間後に測定されたｐＨは９．０である。
【００４２】
したがって、生体活性ガラスを有するヒドロゲルの組成物のｐＨ値が、非特異的な抗菌活性が現れる９超の値に実質的に維持されることが観察され、このことは生体ガラスに特有である。
【００４３】
実施例３
抗菌活性の評価
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンなどの抗生物質、ならびにＮ−アセチルシステイン（NAC）と組み合わせた、実施例１で上記のように調製された再吸収性担体の抗菌活性を評価した。ＥＵＣＡＳＴガイドライン（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）による微量液体希釈法を用いて、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）を評価した。
【００４４】
各細菌分離株の標準化接種材料を、上記物質の段階希釈物を入れた９６ウェルプレートに接種した。適切な雰囲気下で、３７℃で１８時間インキュベーションした後、細菌の視認可能な増殖を阻害することができる薬剤の最低の濃度をＭＩＣと定義した。ヒドロゲルの形態の再吸収性担体を入れた３つの異なるシリンジを使用し、各シリンジには試験される３種の抗菌産物のうち１種を入れ、以下のように調製した。
【００４５】
実施例１で上記のように調製された凍結乾燥形態の再吸収性担体６０ｍｇを、以下の濃度で評価される抗菌産物を含有する注射用水１ｍｌでもどした。
−  ゲンタマイシン：２５６μｇ／ｍｌ
−  バンコマイシン：２５６μｇ／ｍｌ
−  Ｎ−アセチルシステイン：１００ｍｇ／ｍｌ。
【００４６】
得られた結果を以下の表１にまとめる。表１では、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびＮＡＣでもどされたヒドロゲルが、単独で試験された抗菌物質と比較してどの程度低いＭＩＣを有するか、ならびにその結果、単独で試験された各薬剤の試験に対して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対する抗菌活性がより高いことが観察できる。唯一の例外がＳ．ａｕｒｅｕｓにおけるヒドロゲル＋バンコマイシンであり、バンコマイシン単独と同じＭＩＣをどうあっても維持する。これらの結果に基づくと、本発明の組成物における、ヒドロゲルおよび試験された３種の抗菌物質間の相互作用が、単一での抗菌活性の増幅を引き起こすという結論となる。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
実施例４
抗生物質バンコマイシンとの組み合わせ後の、ヒドロゲルの形態の再吸収性担体のレオロジー安定性の管理
本発明の組成物の安定性を検査するため、室温（２５℃未満）および温度２〜８℃（冷蔵庫）の両方で、０、４時間、８時間および２４時間時点での組成物の粘度測定を実施することにより、抗生物質バンコマイシンとの組み合わせ後の、ヒドロゲルの形態の再吸収性担体の粘度変動を評価した。
【００４９】
具体的には、実施例１で上記のように調製された、凍結乾燥再吸収性担体１２０ｍｇを抗生物質バンコマイシンの２％水溶液２ｍｌでもどした。実施例１と同じ手順に従って、ただし異なる時間で調製された、シリンジ中の無菌再吸収性担体の２つのバッチ１および２について試験を実施した。
【００５０】
バッチ１およびバッチ２として得られた２種のヒドロゲルの粘度を以下の時間で試験する。
・  ０時間（バンコマイシンによる水和直後）
・  それぞれ室温および温度２〜８℃で４時間
・  それぞれ室温および温度２〜８℃で８時間
・  それぞれ室温および温度２〜８℃で２４時間。
【００５１】
結果を以下の表２に開示する。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
実施例５
インビボ研究における、本発明の再吸収性ヒドロゲル埋め込み後の局所的効果の評価
本ヒドロゲルの埋め込みの局所的効果の評価を、動物実験に関する現行の法律（Ｌｅｇ．Ｎｏ．１１６／９２）およびボローニャ（イタリア）のｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｉｚｚｏｌｉ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＵＮＩ  ＥＮ  ＩＳＯ  １０９９３−２、２００９の規則に厳密に従って行った。
【００５４】
上記のように調製された組成物ヒドロゲル＋バンコマイシンの外科的埋め込みによりウサギ動物モデルで試験を実施し、埋め込みからしばらく時間が経過した後局所的効果の後の評価を実施した。この評価試験の結果は、ヒドロゲルの形態の本発明の組成物が、実験的条件下で、および考慮した時間中に、骨に対するいかなる炎症反応および／または骨組織の変性プロセスの原因にもならないことを示している。さらに、異なる組織形態計測的パラメーター、具体的には本発明のヒドロゲルを注射された動物における骨膜周囲長、内骨面周囲長、骨髄腔面、皮質骨面、皮質骨幅を評価し、陽性対照として作用するヒドロゲルで処置された動物に対していかなる有意差も検出しなかった。陽性対照として作用するヒドロゲルは、骨組織の回復において証明された有効性を有するヒアルロン酸ナトリウム塩の市販品、すなわち、関節内で使用するための注射溶液の形態で、Ｆｉｄｉａ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ（Abano Terme, Padua, Italy）により製造される製品ＨＹＡＬＧＡＮ（登録商標）からなる。
【００５５】
本発明の組成物および対照のヒドロゲルの埋め込みから１２週で行われた組織的および組織形態計測的研究は、骨組織における構造的および形態計測的変化がないことを示している。定性的評価は、埋め込み部位にまだ存在する、本発明の組成物および対照材料の両方の残留物の存在、ならびに新骨形成領域を伴う結合組織の形成を検出した。
【００５６】
図１は、本発明のヒドロゲル埋め込み後１２週の動物から採取された組織試料についての、トルイジンブルー、フクシン酸、およびファストグリーン染色、ならびに倍率１０ｘによる光学顕微鏡の組織画像を示す。図１の画像において、矢印は新骨形成の最初のプロセスを伴う、残留材料（M）を取り巻く結合組織の存在を示している（緑色に着色された領域）。
【図１】
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【国際調査報告】
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