(57)【要約】  本発明は固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼに関し、プロリン特異的エンドプロテアーゼはアミノジメチレンで官能基化されたメタクリレートを含む担体に固定化されており、担体は１００〜４００μｍの粒径範囲を有する。本発明は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法にも関し、本方法において、ビールは固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロリン特異的エンドプロテアーゼが、ジメチレンで官能基化されたメタクリレートを含む担体に固定化された、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
【請求項２】
前記担体が１００〜４００μｍの粒径範囲を有する、請求項１に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
【請求項３】
前記担体が１５００〜２１００Åの細孔径分布ｄ５０を有する、請求項１または２に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
【請求項４】
プロリン特異的エンドプロテアーゼがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼ。
【請求項５】
アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、前記プロリン特異的エンドプロテアーゼを前記担体に固定化するステップと、前記固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法。
【請求項６】
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼが、０．０１〜０．０７ｗ／ｗの酵素：担体比で前記担体に固定化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記固定化ステップが１０〜５０℃の間の温度で実施される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固定化ステップが６〜８のｐＨで実施される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定化ステップが４〜４８時間の間で実施される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．マッシュを調製するステップと、
ｂ．ビールを発酵させるステップと、
ｃ．前記ビールを安定化させるステップと
を含むビールの製造方法であって、前記ビールが請求項１〜４のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされて、ビールが製造される方法。
【請求項１２】
固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが、ビールを安定化させている間、または安定化させた後にインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーションが０〜２０℃の間の温度で実施される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インキュベートステップがグルテンの加水分解を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
グルテンを無毒性断片に加水分解させるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが使用されるビールの製造方法とに関する。
【０００２】
［背景］
プロリン特異的エンドプロテアーゼは細菌および真菌に由来し得る酵素であり、例えば、国際公開第２００２／０４６３８１号パンフレットに開示されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼである。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、タンパク質がその鎖中にプロリル残基を含有する場所で、タンパク質を切断することができる。国際公開第２００２／０４６３８１号パンフレットは、このようなプロリン特異的エンドプロテアーゼがビールなどの飲料のヘイズを低減するために使用可能であることを開示している。ビールのヘイズは、主として、タンパク質−ポリフェノール凝集体からなる。ヘイズを低減するために、ビールの発酵中または安定化段階において、プロリン特異的エンドプロテアーゼを麦芽汁に添加することができる。
【０００３】
国際公開第２００５／０２７９５３号パンフレットは、ビールのマッシングまたは発酵中にプロリン特異的エンドプロテアーゼを添加すると、プロリン特異的エンドプロテアーゼがビール中のグルテンレベルを低減したことを開示している。
【０００４】
例えばビールの製造方法において、プロリン特異的エンドプロテアーゼの再利用を可能にするために、国際公開第２００３／１０４３８２号パンフレットには、酵素を固定化し、最終製品中に酵素が存在したままであるリスクを最小限にすることが提案された。
【０００５】
酵素の固定化は数十年前から知られている（“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｓｅ  Ｍ．Ｇｕｉｓａｎ，２００６，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．を参照）。酵素固定化の最も一般的な手順は、共有結合、封入（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）、マイクロカプセル化および架橋である。
【０００６】
しかしながら、ビール中のヘイズを形成するタンパク質−ポリフェノール凝集体またはグルテンなどの部分的または完全に不溶性の基質に対して、酵素が活性なままであるプロリン特異的エンドプロテアーゼの適切な固定化は開示されていない。
【０００７】
本発明の目的は、不溶性基質に対して十分に活性である固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼである。
【０００８】
［概要］
本開示は、１００〜４００μｍの粒径範囲を有するアミノ官能基化メタクリレートを含む担体に固定化された、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼに関する。意外にも、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテンなどの大きい基質に対するその酵素活性を残すだけでなく、より低い温度における遊離酵素の相対活性と比べて、このより低い温度においてより高い相対活性を示すことが分かった。
【０００９】
また本開示は、アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、０．０１〜０．０７ｗ／ｗの酵素：担体比でプロリン特異的エンドプロテアーゼをアミノ官能基化メタクリレート担体に固定化するステップと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法にも関する。
【００１０】
また本開示は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法にも関し、本方法において、ビールは固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。
【００１１】
［詳細な説明］
本明細書には、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体に固定化された固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが開示されている。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、１００〜４００μｍの粒径範囲を有する。好ましくは、アミノ官能基化メタクリレートポリマーを含む担体は１５０〜３５０μｍの粒径範囲を有し得る。好ましくは、メタクリレートポリマーは、ジメチレンによってアミノ官能基化されている。
【００１２】
有利に、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、１５００〜２１００Åの細孔径分布ｄ５０、例えば１６００〜２０００Åの細孔径分布ｄ５０を有する担体に固定化される。細孔径分布ｄ５０は当業者に既知の用語であり、累積分布の５０％である細孔径の値であると定義される。
【００１３】
通常、プロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのアミノ官能基化メタクリレート担体は、４０ｍ２／ｇよりも大きい、例えば４５ｍ２／ｇよりも大きい、または５０ｍ２／ｇよりも大きい表面積を有する。プロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのメタクリレート担体は、通常、５８〜７０％、例えば６０〜６８％、または６２〜６６％の水分保持率を有する。水分保持率は、本明細書では、完全に水和した担体の重量と完全に乾燥した担体の重量との間の比率であると定義される。
【００１４】
意外にも、本明細書に開示される担体に固定化されたプロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きい高分子および／またはタンパク質−ポリフェノール凝集基質、例えばヘイズ、例えばビールヘイズに対して活性なままであるだけでなく、グルテン、例えば大麦グルテンを加水分解することもできることが分かった。
【００１５】
本明細書に開示される担体に固定化されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する酵素は、タンパク質またはペプチドがその鎖中にプロリル残基を含有する場所で、ペプチドまたはタンパク質を切断することができる任意の適切な酵素であり得る。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）などの細菌または真菌起源、例えば、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、スフィンゴモナス・カプスラタ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来し得る。本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、酵素分類ＥＣ３．４．２１．２６に属する。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、プロリン残基のカルボキシ末端側端部でペプチド結合を加水分解して、Ｃ末端プロリンを有するペプチドおよび／またはポリペプチド断片をもたらす酵素である。
【００１６】
固定化という文言は、本明細書では、酵素がメタクリレート担体などの担体に結合されることを示すために使用される。酵素の固定化は、当業者に知られている担体上におけるまたは担体に対する酵素の吸着、封入または架橋によって達成することができる。（“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｓｅ  Ｍ．Ｇｕｉｓａｎ，２００６，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃを参照）。
【００１７】
本開示は、架橋によってメタクリレート担体に固定化されたプロリン特異的エンドプロテアーゼを提供する。
【００１８】
一実施形態では、本開示は、アミノ官能基化メタクリレート担体中のアミノ基を二官能性架橋剤により活性化するステップと、プロリン特異的エンドプロテアーゼを担体に固定化するステップと、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを製造するステップとを含む、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造方法に関する。
【００１９】
意外にも、本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスを用いると、遊離酵素の相対活性と比べて、より低い温度においてより高い相対活性を有する固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが得られることが分かった。
【００２０】
メタクリレート担体は、例えばジメチレンまたはヘキサメチレンスペーサー、好ましくはジメチレンスペーサーによってアミノ官能基化され得る。
【００２１】
二官能性架橋剤によるアミノ官能基化メタクリレートのアミノ基の活性化は酵素の担体への固定化をもたらす。好ましくは、架橋剤はグルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドによるアミノ基の活性化は、当業者に知られている任意の適切な方法で実施され得る。
【００２２】
酵素を担体に固定化するためのプロセスの間、任意の適切な酵素：担体比、例えば０．０１〜０．０７ｗ／ｗの酵素：担体比、または０．０２〜０．０６ｗ／ｗの酵素：担体比、または０．０３〜０．０５ｗ／ｗの酵素：担体比が適用され得る。本明細書に開示される固定化プロセスにおいて表示された酵素：担体比では、遊離酵素と同等の活性を有するメタクリレート担体上の固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが得られることが分かった。
【００２３】
好ましくは、本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、１０〜５０℃、例えば１５〜４０℃の温度、例えば２０〜３０℃の温度で実施される。
【００２４】
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、任意の適切なｐＨ、例えば６〜８のｐＨ、または６．５〜７．５のｐＨで実施され得る。ｐＨを望ましいレベルに保持するために任意の緩衝液、例えば、２０〜１５０ｍＭ、または４０〜１２０ｍＭ、または６０〜１００ｍＭ、例えば７０〜９０ｍＭの塩濃度を有する緩衝液が使用され得る。適切な緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液であり得る。
【００２５】
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを固定化するためのプロセスは、４〜４８時間、例えば８〜３６時間、または１０〜２４時間実施され得る。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの、グルテン、例えば大麦グルテンを加水分解するための使用に関する。
【００２７】
グルテンは、小麦、ライ麦、大麦およびオート麦で見られるプロリンおよびグルタミンが豊富なタンパク質の群であり、グルテニンおよびプロラミンに細分することができる。グルテンのプロラミン画分だけが、グルテン不耐性の人々および／またはセリアック病を患っている人々にアレルギー反応を生じさせる。種々の穀類中のプロラミンは、一般に、小麦ではグリアジン、大麦ではホルデイン、ライ麦ではセカリン、およびオーツ麦ではアベニンと示される。本開示の目的のために、グリアジンという文言は、全ての異なる穀類のプロラミン画分を示すために使用することができる。
【００２８】
別の実施形態では、本開示は、マッシュを調製するステップと、ビールを発酵させるステップと、ビールを安定化させるステップとを含むビールの製造方法に関し、本方法において、ビールは本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートされる。
【００２９】
ビールは、本明細書では、ビールの製造方法の任意の段階における液体を示すために使用される。ビールは、消費の準備が整った液体であってもそうでなくてもよい。ビールという文言は麦芽汁またはグリーンビールも含む。
【００３０】
多数の異なるビールの製造方法があり、これらは当業者には既知である。通常、ビールの醸造方法は大麦などの穀類の製粉およびマッシングを含み、得られたマッシュはろ過され、麦芽汁が得られる。次に、麦芽汁は、全ての残留酵素活性を不活性化するために沸騰され、続いて、麦芽汁は酵母を播種される。本開示に従う方法におけるビールの発酵は、麦芽汁に酵母を播種し、麦芽汁中の酵母をインキュベートして、利用可能な糖をアルコールに発酵させることを含む。この発酵は、一次発酵とも呼ばれる。この一次発酵から得られる「グリーン」ビールはまだ、いくらかの沈降していない酵母と、比較的高レベルの望ましくないフレーバー成分、特にジアセチルおよびアセチルアルデヒドなどのジケトンとを含有している。
【００３１】
一次発酵の後に、二次発酵とも呼ばれる熟成段階が続く。本明細書に開示される方法におけるビールの発酵は、一次および二次発酵を含み得る。熟成段階は、ジケトンなどの望ましくないフレーバー成分をより良好な味成分に変換することが意図される。
【００３２】
熟成の後、ビールは安定化される。安定化段階はポリフェノール−タンパク質凝集体の形成を促進させることが意図され、その沈殿を可能にする。意外にも、ビールを本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすると、ポリフェノール−タンパク質凝集体の形成が低減または防止されることが分かった。さらに、ビールを本明細書に開示される固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすると、ビール中のグルテン（グリアジン）含量が低減されることが分かった。
【００３３】
従って、一実施形態では、本開示はビール中のグルテンを低減するための方法に関し、本方法は、ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートする（ここで、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはビール中に存在するグルテンの少なくとも一部を加水分解する）ことと、ビール中のグルテンを低減することとを含む。従って、ビールの製造方法における固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートは、グルテンの加水分解を含む。
【００３４】
ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、ビールの製造方法における任意の適切な段階で実施され得る。好ましくは、ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、ビールが透明な液体である段階において実施される。例えば、ビールの製造方法は、安定化段階においてまたは安定化段階の後に、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートを含む。しかしながら、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ビール醸造方法の任意の他の段階で添加され、ヘイズの形成を防止または低減し、そして／あるいはグルテンを無毒性断片に加水分解してもよい。本明細書で使用される場合、グルテンの無毒性断片への加水分解は、グルテンのグリアジン画分が加水分解されることを意味する。
【００３５】
好ましくは、ビールの製造方法における固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートは、−１〜２０℃の温度、例えば０〜１５℃の温度、または１〜１０℃の温度、または２〜８℃の温度で実施される。意外にも、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテンを加水分解可能であり、これらの低い温度でビール中のヘイズを低減できることが分かった。
【００３６】
ビールを固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは、バッチモードまたは連続モードで実施され得る。プロリン特異的エンドプロテアーゼのインキュベートが連続モードで実施される場合、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼをカラムに充填することができ、このカラムは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼを保持し、ビールがカラム中を流れることを可能にする。適切なカラムは、カラムの上部および底部に篩を含むことができる。ビール中の不溶性材料の量に応じて、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは流動床カラムまたは充填床カラムに充填され得る。このようなカラムの調製は当業者に知られている。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼと接触させる際、ビールは透明な液体である。
【００３７】
安定化の後、ビールは、瓶、缶または樽にパッケージングすることができる。
【００３８】
別の実施形態では、本開示は、グルテンの加水分解のための固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用に関する。好ましくは、固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ビールの製造方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ａｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ基質を用いて決定された、異なる担体に固定化されたＥｎｄｏＰｒｏの酵素活性である。酵素の活性は、４０５ｎｍにおける吸光度の時間内の増大として決定される（ＯＤ４０５ｎｍ／分）。
【図２】固定化および非固定化ＥｎｄｏＰｒｏを用いた、麦芽汁中のグリアジンの低減である。
【図３】４０℃（最適温度）における活性と比べた、４℃における固定化および非固定化ＥｎｄｏＰｒｏの相対活性である。
【００４０】
［実施例］
［材料および方法］
［プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＥｎｄｏＰｒｏ）］
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＥｎｄｏＰｒｏ）は、当該技術分野において既知の方法によって、プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＧＩ：２１７２５３６３；タンパク質受入番号：ＡＸ４５８６９９）をコードする遺伝子を含有するＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株を発酵させることにより作製した。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株の発酵後に得られた発酵ブロスをさらに限外ろ過に提出した。最終ＥｎｄｏＰｒｏサンプルにおけるプロリル特異的活性は１２．４ＰＰＵ／ｍｌであり、４０％のジオキサンを含有する０．１Ｍのクエン酸／０．２Ｍのリン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中２ｍＭのＮ−カルボベンゾキシ−グリシン−プロリン−ｐ−ニトロアニリド（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ）を用いて決定された。
【００４１】
１ｍｌのこの緩衝液（ｐＨ４．６）に、２５０μｌの基質溶液を添加した後、１００μｌの酵素溶液を添加した。反応混合物を３７℃でインキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ分光光度計を用いて遊離ｐＮＡの放出を４０５ｎｍにおいて分光光度的に測定した。活性は、プロリンプロテアーゼ単位（ＰＰＵ）で表される。１ＰＰＵは、記載される検定条件下で１分間にＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡから１μｍｏｌのｐＮＡを放出させるために必要とされる酵素の量であると定義される。濃度を計算するために、１０５００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を使用した。
【００４２】
タンパク質濃度は、Ｋｊｅｌｄａｈｌを用いて決定された１４６ｍｇ／ｇであると推定した。
【００４３】
［酵素担体］
ＥｎｄｏＰｒｏの固定化のためにＰｕｒｏｌｉｔｅ  ＥＣＲ酵素担体を使用した。担体の主要な特性は表１に要約される。
【００４４】
【表１】
2016522688.tif 000002
【００４５】
［全窒素の決定］
Ｋｊｅｌｄａｈｌを用いてサンプルの全窒素（Ｎ）を決定した（Ｂｒａｄｓｔｒｅｅｔ，Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｂ．“Ｔｈｅ  Ｋｊｅｌｄａｈｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ．”（１９６５））。Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｏｄｏ  ＨＢ４３−Ｓ（ハロゲン）を用いる測定の前に固定化酵素を有するビーズを乾燥させた。６．２５＊Ｎの変換係数を用いてタンパク質を計算した。
【００４６】
［麦芽汁中のグリアジン含量の決定］
グリアジン含量は、グルテン含量の尺度として決定した。麦芽汁中のグリアジンの分析的検出は、ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）グリアジン競合的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はＲ５抗体（Ｍｅｎｄｅｚ）に基づいており、Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ（ＣＯＤＥＸ  ＳＴＡＮ  １１８−１９７９）によって推奨される。定量限界はグリアジン５ｐｐｍ（＝グルテン１０ｐｐｍ）である。
【００４７】
一般に、グリアジン含量に係数２を乗じることによって、グリアジン含量はグルテンに変換され得る。しかしながら、原材料においてグルテンに関するグリアジン画分は異なり得るので、この値は絶対的ではない（Ｄｉａｚ−Ａｍｉｇｏ  ＆  Ｐｏｐｐｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．２，２０１２）。
【００４８】
［ビール中のグリアジン含量の決定］
ビール中のグリアジンの分析的検出は、ＲＩＤＡ（登録商標）ＱＵＩＣＫグリアジンキット（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）を用い、製造業者の説明書に従って決定した。この方法はＲ５抗体（Ｍｅｎｄｅｚ）に基づいており、Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ（ＣＯＤＥＸ  ＳＴＡＮ  １１８−１９７９）によって推奨される。検出限界は、グリアジン２．５ｐｐｍ（＝グルテン５ｐｐｍ）である。
【００４９】
［実施例１．異なるＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体におけるＥｎｄｏＰｒｏの固定化］
ＥｎｄｏＰｒｏの固定化の前に、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体ＥＣＲ８３１０、−８３１９および−８４１７を、０．０２ＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中２％のグルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）により１時間予め活性化した後、同じ緩衝液により未反応グルタルアルデヒドを３回洗い流した。Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＥＣＲ８２１４担体は、活性化を必要としなかった。ＥＣＲ８２１４ビーズは、同じ緩衝液により３回洗浄しただけで、そのまま使用した。最後に、ガラスフィルタを用いてビーズをろ過し、半乾燥ビーズを使用するまで貯蔵した。固定化のために、１／１０（ｗ／ｖ）のビーズ／緩衝液比でビーズを緩衝液と混合し、表２に示されるような酵素負荷で可溶性ＥｎｄｏＰｒｏをビーズ／緩衝液混合物に添加した。
【００５０】
【表２】
2016522688.tif 000003
【００５１】
室温で連続して一晩振とうさせた後、０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）によりビーズを３回洗浄した。最後に、固定化ＥｎｄｏＰｒｏを含有するビーズを同じ緩衝液中に懸濁させ、４℃で貯蔵した。
【００５２】
［実施例２．４つの異なるＰｕｒｏｌｉｔｅ担体に固定化されたＥｎｄｏＰｒｏの酵素活性］
ＥｎｄｏＰｒｏ活性は、アセタート−アラニン−アラニン−プロリン−ｐ−ニトロアニリン（Ａｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ）を基質として用いて、ＯＤ４０５ｎｍ／分として決定した。時間内に形成された遊離ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の量はＥｎｄｏＰｒｏ活性の尺度であり、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ分光光度計を用いて４０５ｎｍにおいて分光光度的に決定した。
【００５３】
非固定化Ｅｎｄｏｐｒｏまたは４つのＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体の１つに固定化された固定化Ｅｎｄｏｐｒｏを、マイクロタイタープレート内の０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）に添加した。０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）中の３ｍＭのＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ（最終濃度）ストックを添加する前に、酵素を４０℃で５分間インキュベートした。動的測定を開始し、曲線の勾配から活性を計算した。酵素の活性は、基質Ａｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡからの遊離ｐＮＡの結果として、時間内の４０５ｎｍにおける吸光度の増大として決定される（ＯＤ４０５ｎｍ／分）。
【００５４】
図１は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体ＥＣＲ８３１０、−８３１９および−８４１７に固定化されたＥｎｄｏｐｒｏが活性を示したことを実証する。Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体ＥＣＲ８２１４に固定化されたＥｎｄｏＰｒｏについては、活性は検出されなかった。従って、この特定の調製物のさらなる研究は実施しなかった。
【００５５】
［実施例３．固定化ＥｎｄｏＰｒｏを用いることによる麦芽汁からのグリアジンの除去］
Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）担体ＥＣＲ８３１０、−８３１９および−８４１７に固定化されたＥｎｄｏｐｒｏがグルテンに対して同様に活性であるかどうかを試験するために、１５ｍｌの反応管において、１０ｍｌの麦芽汁に０．０５ｍｇの酵素、固定化および遊離ＥｎｄｏＰｒｏ（対照）をそれぞれ添加した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎ，Ｔｒａｉｎ−Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｂａｔｃｈ  ｎｕｍｂｅｒ：４／２０１３）。
【００５６】
混合物を室温で一晩振とうさせた。翌日、方法において記載されるプロセスにより麦芽汁中のグルテン含量を決定した。図２の結果は、麦芽汁中の残留グリアジン含量を示す。
【００５７】
本発明者らは、実施例１において記載されるプロセスに従ってＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＥＣＲ８３１９担体に固定化されたとき、固定化ＥｎｄｏＰｒｏが大きいタンパク質基質に対して最良の活性を有することを見出した。比較して、異なる条件（ｐＨ８．２、モル濃度３５ｍＭ、酵素負荷８０ｍｇ／ｇ担体）下で同じ担体に固定化されたとき、グルテンに対して約半分の活性しか得られなかった（データは示さず）。
【００５８】
［実施例４．４０℃に対して４℃における固定化および遊離ＥｎｄｏＰｒｏの相対活性］
４０℃における活性と比べて、４℃の相対活性を決定するために、非固定化および固定化ＥｎｄｏＰｒｏ  Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＥＣＲ８３１９（上記のように固定化された調製物）酵素を、３ｍＭのＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡを含む全容積が１ｍｌの０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）に添加した。温度調節ミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において反応混合物を９００ｒｐｍで振とうさせた。上澄みサンプルを１分毎にとり、０．５ＭのＨＣｌ（サンプル／ＨＣｌ比  ５０／１（ｖ／ｖ））により反応を停止した。４０５ｎｍにおける吸光度は、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ分光光度計を用いて測定した。４℃における傾斜（ＯＤ４０５ｎｍ／分）を、最適活性温度４０℃における傾斜と比較した。固定化Ｅｎｄｏｐｒｏの絶対的な活性は、４℃および４０℃においてそれぞれ０．５３および１．８５ＯＤ４０５ｎｍ／分であり、非固定化Ｅｎｄｏｐｒｏはそれぞれ０．０６および０．６５ＯＤ４０５ｎｍ／分であった。４０℃の活性を１００％に設定した。
【００５９】
図３は、４℃における固定化ＥｎｄｏＰｒｏの相対活性が非固定化ＥｎｄｏＰｒｏの相対活性よりも３倍高いことを示す。
【００６０】
［実施例５．４℃および１５℃における固定化ＥｎｄｏＰｒｏによるビール中のグリアジンの変換］
実施例１に記載される、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＥＣＲ８３１９調製物に固定化された３つの異なる容積の固定化ＥｎｄｏＰｒｏ（表３）を、ピペットで５０ｍｌのビールに入れた（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎ、Ｔｒａｉｎ−Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｂａｔｃｈ  ｎｕｍｂｅｒ：４２／２０１２）。ローラー−ミキサーにおいて、混合物を４℃および１５℃でそれぞれインキュベートした。１ｍｌのビールサンプルを、０．５、１、１９および２４時間後に取り出した。サンプル中の残留グリアジンは、方法において記載されるプロセスによって決定した。結果は表３に示され、ビール中のグリアジンの低減が示される。全体的に見て、固定化ＥｎｄｏＰｒｏは、４℃の温度において、１５℃と同一または同様の程度までビール中のグリアジンを分解することができる。２４時間後、グリアジンは全てのサンプルで検出できない限界（ＬＯＤ２．５ｐｐｍ）まで分解された。より高い用投与量の固定化ＥｎｄｏＰｒｏ（１０ｍｌ）を用いることにより、グリアジンは、１時間のインキュベーション後でも、検出できない限界まで分解され得る。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
［結論］
実施例１〜５に示される結果は、本発明に従う固定化プロリン特異的エンドプロテアーゼが、グルテンなどの複雑な基質を変換可能であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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