(57)【要約】  本発明は、マイクロバイオリアクター中での閉じ込めにより微生物を培養するための新規な方法に関する。前記方法は、一連の液滴を前方に移動させるためのキャリア流体が流れる毛細管チューブを使用することを含み、前記毛細管チューブは、前記微生物の培養が起こるマイクロバイオリアクターを含み、ここで、前記マイクロバイオリアクターが気体であるスペーサー流体によって分離されている。マイクロバイオリアクター(5)の直径は、毛細管チューブ(8)の直径よりも小さく、前記スペーサー流体のバブル(6)のサイズは、前記毛細管チューブ(8)の直径の2から10倍の範囲内である。方法は、糸状菌又はプランクトン藻類等の微生物を培養するために使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管チューブ(8)内部で、液滴の界面を改変し得る微生物の培養が起こるマイクロバイオリアクター(5)から形成された一連の前記液滴を前方に移動させることを意図したキャリア流体を含む形式の、マイクロバイオリアクター(5)中での閉じ込めによる微生物の培養のための方法であって、前記マイクロバイオリアクター(5)がスペーサー流体によって分離されており、前記スペーサー流体が気体であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記気体が、空気であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記気体が、窒素と二酸化炭素の混合物であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロバイオリアクター(5)の直径が、前記毛細管チューブ(8)の直径よりも小さいことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロバイオリアクター(5)の前記直径が、前記毛細管チューブ(8)の直径の80%から85%の間であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記スペーサー流体が、前記毛細管チューブ(8)の直径の2から10倍の範囲内のサイズを有するバブル(6)の形態であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記キャリア流体が、水で飽和した貯蔵所由来であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養された微生物が、糸状菌であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記糸状菌が、コウジカビ又はクロコウジカビであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
培養された微生物が、プランクトン藻類であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記藻類が、コナミドリムシであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロバイオリアクター中での閉じ込めによる微生物の培養のための新規な方法を対象とする。
【０００２】
より詳細には、本発明は、閉じ込められた培地中での微生物の培養の長いインキュベーション時間(>24時間)にわたる動態学的モニタリングを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
特に仏国特許第11/00659号から、閉じ込められた培地中で微生物の培養を行うことが知られている。この出願は、水性貯蔵所(reservoir)中での微生物の閉じ込めによる反応の動態学的モニタリングのための方法及びデバイスを特に記載している。この方法は、チューブ中でスペーサー流体(spacer fluid)によって分離され、キャリア流体(carrier fluid)によって運ばれる、一連の水性貯蔵所内の水性貯蔵所の配列を参照することに基づく。しかしながら、前記方法では、界面を改変することになる増殖又は生物活性を有する微生物を試験することができない。かかる場合では、24時間以降、貯蔵所の完全性がもはや保たれなくなり、すなわち貯蔵所が一緒に合流するか又はより小さい貯蔵所に更に細かく分かれる。いったん少なくとも1つの貯蔵所が失われ参照もできなくなると、且つ/又は例えば漏出により前記貯蔵所の1つのサイズが変動する場合、実験結果の解釈は不可能になる。この後者の場合では、内部で測定される代謝産物の濃度は、濃度効果により人工的に増加させることになり、前記貯蔵所に含有された微生物が対象の代謝産物の上位生産者であることによっては増加させられない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】仏国特許第11/00659号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
概して、現行のテクノロジーは、24時間より長い時間にわたる全ての型の微生物の効率的な閉じ込めを可能にしない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、微生物の型、それらの生物活性及び増殖速度にかかわらず、生活環全体を研究することを可能にすることである。
【０００７】
より詳細には、マイクロバイオリアクター中での閉じ込めによる微生物の培養のための本発明の方法は、一連の液滴を前方に移動させることを意図したキャリア流体が循環する毛細管チューブを含む形式であり、前記マイクロバイオリアクターがスペーサー流体によって分離されており、この流体は気体である。
【０００８】
本発明の1つの好ましい実施形態によれば、前記微生物の培養が起こるマイクロバイオリアクターの直径は、前記毛細管チューブの直径よりも小さい。
【０００９】
有利に、前記スペーサー流体のバブルのサイズは、前記毛細管チューブの直径の2から10倍の範囲内である。
【００１０】
本発明の方法は、表示としてのみ示される図を参照する以下の記述を読めばよりよく理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】最新式の液滴の連なり(droplet train)の構成を模式的に例示する図である。
【図２】その内部で最新式の液滴の連なりが循環する毛細管の縦断面図である。
【図３】その内部で本発明による液滴の連なりが循環する毛細管の縦断面図である。
【図４】本発明の方法において使用されるデバイス組立の単純化された例示を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図1に例示されるように、通常、液滴の連なりは、3つの相互に非混和性の相(I)、(II)及び(III)から形成され、各相は、貯蔵所(例示せず)に由来し、バルブ(例えばソレノイドバルブ又は空気作動バルブ、例示せず)は、前記液滴が形成される十字路交差点に向かって集まっているそれらのそれぞれのチューブ1、2及び3中への種々の相の放出を可能にし、その1つの枝4は、その内部で液滴の連なりが循環する毛細管チューブである。本発明の説明において更に詳細に述べるが、相(I)は、キャリア流体を形成し、相(II)は、微生物が培養される液滴を形成し、相(III)は、スペーサー流体を形成する。種々の液滴間のサイズ及び間隔は、交差点の形状及び相の注入流速間の比に依存する。最終的に、相(II)の液滴内部での微生物の封入は、ポアソンの法則に従う。
【００１３】
従来技術、特に仏国特許第11/00659号は、以前記載された液滴の連なりがどのように形成されるかを教示しているが、本発明は、前記液滴の連なりを得るこの方法とは関係がない。
【００１４】
図2は、液滴5が一緒に合流することを防ぐスペーサー流体6の液滴によって互いに分離された、微生物が発達することになる反応混合物を含有する液滴5から形成された従来の液滴の連なりの部分のより明瞭な図を提供する;液滴5及び6は、毛細管チューブ8内部のキャリア流体7によって前方へ運ばれ、前記キャリア流体7は、液滴の移動と毛細管8の潤滑の両方を可能にし、連続した液滴5間のコンタミネーションを防ぐ。毛細管チューブは、2mmより小さい内径を有するチューブを意味する。
【００１５】
上記のように、液滴の連なりは、3つの非混和性の相から形成される。キャリア流体(I)は、ほとんどの場合、マイクロバイオリアクター中に含有される微生物にいかなる毒性も有さない全フッ素置換油(「液体Teflon」)である。連なりの適切な形成を保証し、液滴間のコンタミネーションのあらゆる問題を避けるために、キャリア油は、他の相よりも毛細管への高い親和性を有する。
【００１６】
第2の水性相(II)は、細胞及び培地を含有する。
【００１７】
最後に、第3の相(III)は、最初の2つと混合しない。第3の相は、炭化水素又は鉱物油等の液体から形成することができる。
【００１８】
これらの液滴中での微生物の培養を可能にする最新式の液滴の連なりの形成について再度述べるが、ここで本発明の説明は、既知の方法でなされた改善に焦点を置き、それによって前記方法の欠点を克服することとする。
【００１９】
本発明の説明の残部において、微生物が培養される液滴5は、マイクロバイオリアクター5と称する。
【００２０】
本発明の方法は、種々の微生物、特に糸状菌及びプランクトン藻類に適用することができる。
【００２１】
糸状菌は、キャリア液体を通して1つのマイクロバイオリアクターから別のマイクロバイオリアクターに広がる能力がある疎水性の線維(菌糸)を形成する。炭化水素からなる液体スペーサーが使用される場合、線維は、隣接するマイクロバイオリアクターまでそれを通じて完全に通過することができることになる。それらは、マイクロバイオリアクター/炭化水素界面で、次第に十分に毛細管の横断面を妨げることになるバイオフィルムを形成する可能性もある。この現象は、連なりの破壊及び実験の終わりにつながる。
【００２２】
この問題を解決するために、スペーサー流体として気体を使用することが可能であることが発見され、これは、本発明の方法の特徴の1つである。しかしながら、マイクロバイオリアクターが大きすぎ、毛細管との実質的な接触表面積を有する場合、糸状菌の発達による妨害の現象が同様に起こる可能性がある。これは、線維の相互作用による毛細管8とマイクロバイオリアクター5との間のコンタミネーション及び液滴の連なり安定性の問題を引き起こす。
【００２３】
プランクトン藻類に関して、液滴の連なりの端部で、自己乳化の現象が水性マイクロバイオリアクター5及びスペーサーバブル6において観察された。これは、別の相中である相の液滴が両方の形式の区画で自発的に形成されることを意味する。最も可能性の高い説明は、マイクロバイオリアクター中の藻類と一緒に共存する細菌の存在である。これらの細菌は、界面活性剤を合成する能力があり、それによって自己乳化を促進し、液滴の連なりの崩壊をもたらす。
【００２４】
プランクトン藻類の場合、スペーサー流体としての気体の使用は、自己乳化の問題を解決するのに十分である。
【００２５】
しかしながら、糸状菌の場合、この置換は、連なりの安定性を保証するのに不十分である。そこで解決策は、毛細管チューブ8の壁と線維の相互作用を減少させるためにマイクロバイオリアクター5のサイズを減少させることであり、これは、本発明の方法の別の特徴である。
【００２６】
スペーサー流体として使用することができる種々の気体の中でも、空気の使用が有利であり、これは第1に、空気の湿潤特性のため、第2に、空気は、固形培地における発酵の状態に近い状態を提供するためである。
【００２７】
実施形態の1つの変形によれば、窒素/二酸化炭素の混合物がスペーサー流体として使用される。この混合物は光合成活性を促進するため、培養される微生物が藻類である場合、この流体は特に有利である。
【００２８】
気体混合物の形態とすることができる、使用されるスペーサー流体にかかわらず、前記スペーサー流体は:
-  キャリア流体及びマイクロバイオリアクターの内容物と非混和性でなければならず;
-  微生物と相互作用してはならない、すなわち微生物は、スペーサー流体中で増殖する又は繁殖することができてはならない;
-  微生物の増殖に有毒、すなわち有害であってはならない。
【００２９】
本発明の方法の1つの好ましい実施形態によれば、マイクロバイオリアクター5の直径は、毛細管チューブ8の直径よりも小さく;より好ましくは、マイクロバイオリアクター5の直径は、毛細管チューブ8の直径の80%から85%の間の範囲内にある。前記配置は、マイクロバイオリアクター5中で培養される微生物が糸状菌である場合、特に有利である。80%の値未満では、スペーサー流体6を形成している連続的な空気のバブルがマイクロバイオリアクター5の下側に接触し、これがスペーサーバブル6とマイクロバイオリアクター5の合流を急速に引き起こすことになるリスクがある。
【００３０】
糸状菌の増殖に使用される液滴の連なりは、以下の操作モードに従って有利に調製される。
【００３１】
糸状菌の胞子が、PGS培地(グルコース10g/L、膵臓ペプトン6g/L、MgSO4 7H2O 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、FeSO4 7H2O 0.5mg/L、5に調整されたpH)に懸濁される。キャリア液体は、Novec HFE-7500フッ化油からなる。連なりは、長さが15mで0.75mmの内径を有するFEPの毛細管チューブに連結している内径0.5mmの十字路交差点で形成される。PGS培地及びHFE油は、5.0及び3.5mL/hのそれぞれの流速でシリンジポンプによって注入される。空気は、長さが50cmで内径0.2mmのチューブを通して0.5バールの圧力でソレノイドバルブを経由して注入される。このチューブは、十分な水力学的抵抗性が構成されて、均一な連なりを産出することを可能にする。長さが10cmの空気のバブルが連なりの各端部上に注入され、連なりの閉じ込めを可能にする。
【００３２】
更に、藻類及び糸状菌の増殖に関して、スペーサー空気のバブル6がマイクロバイオリアクター5内部の生物活性(呼吸及び光合成)により経時的に減少することが観察された。結果として、スペーサーバブル6が本発明の方法を開始する際に小さすぎる場合、そのいくつかが消滅し、分離したマイクロバイオリアクター5の合体につながる時が来る。有利に、90hを超える間の安定な連なりを得るために、スペーサーバブル6のサイズは、毛細管チューブ8の内径よりも少なくとも10倍大きくなければならない。
【００３３】
研究された動態は、長期にわたるものであり、端部効果が生じることが観察された。これは、その隣にあるものとのマイクロバイオリアクター5の合体につながり得る、連なりの両方の端部でのマイクロバイオリアクター5のサイズの縮小をもたらす。この効果も、空気が蒸発を促進するスペーサー流体として使用されるという事実に関連している。この現象を克服するために、本発明の方法の1つの好ましい実施形態では、キャリア流体貯蔵所が、連なりの再循環を可能にする水で飽和されている。
【００３４】
ここで、本発明の方法の実施形態の一例を、記載する。
1/溶液の調製:
-  標的占有率に相当する濃度を有する培地中の微生物の懸濁液(細胞の数/マイクロバイオリアクター)
-  追加された全フッ素置換界面活性剤を有する(0.06%)水で飽和した全フッ素置換油
2/以下のものを有する液滴の連なりの産出:
-  キャリア流体:HFE-7500全フッ素置換油+0.06%界面活性剤
-  スペーサー流体:圧縮空気
-  反応物:微生物の懸濁液
3つの流体の流速/圧力の比を調整して、以下のものを得る:
a)チューブ8の内径の80から85%の間のマイクロバイオリアクター5のサイズ;
b)チューブ8の内径の少なくとも3倍のスペーサーバブル6のサイズ。
上記のa)及びb)で与えたサイズ特徴を、図3に示す。
3/液滴の連なりの始め及び終わりで長いバブル6の形態のスペーサー流体の末端プラグを追加する。
4/画像解析を通した液滴の連なりの品質管理(80%<マイクロバイオリアクターのサイズ<85%)。
5/検出器9の前の液滴の連なりの前方及び後方移動を通した動態学的モニタリング。
6/各マイクロバイオリアクターについて記録されたデータの解析。
【００３５】
表示の目的で、以下の表は、種々のパラメーター(スペーサー流体、マイクロバイオリアクター又はスペーサー流体のバブルのサイズ)を一緒にグループ化し、これらのパラメーターの関数としての微生物の最大のインキュベーション時間を示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
上記の表では、以下の微生物が培養された:
-  試験1〜7及び11についてコウジカビ(Aspergillus Oryzae)(糸状菌);
-  試験8〜10についてクロコウジカビ(Aspergillus Niger)(糸状菌);
-  試験12〜13についてコナミドリムシ(Chlamydomonas Reinhardti)(単細胞藻類)。
【００３８】
上記の糸状菌に関して、安定性の観点からの最良の結果は、試験9、10及び11において得られた。
【００３９】
本発明の方法によってもたらされた改善を用いて、当業者がこれまで到達することができなかった長期間にわたって、マイクロバイオリアクター中の増殖及び生物活性動態をモニターすることが可能であることを実証することができた。
【００４０】
藻類及び酵母は、それらの増殖中にキャリア油/培地バリアを通過しないが、それらの増殖中に微生物によって分泌される代謝産物による表面張力の低下が連なりの安定性に経時的に影響することを念頭に置くと、この閉じ込め方法は、培地の液滴とチューブの壁の間の相互作用を減少させる液滴の連なりの増加した安定性をもたらす。最後に、気体のバブルの使用は、酸素(糸状菌の呼吸)又は二酸化炭素(藻類の光合成)の貯蔵所として働くことによって、気体交換の制御を可能にすることができる。
【００４１】
マイクロバイオリアクター5は、数百から数千の試料によって変動し得る一次元の連なりに配置されている。各マイクロバイオリアクター5は、連なりにおけるそのランクによって同定される。したがって、マイクロバイオリアクターの連なりの統合性は、長期間にわたる反応を保証するために必須である。マイクロバイオリアクター5は、潤滑フィルムを保存し、再循環を通してマイクロバイオリアクターの均質化を引き起こすために、連続的に移動に設定されている。図3に例示したように、ある方向に、次いで他の方向に検出器9の前で連なりを通過させることによって、各マイクロバイオリアクター5内部の反応を経時的にモニターすることが可能である。常に再循環ループを保証する同じ方向に検出器の前でマイクロバイオリアクター5の連なりを通過させて、各マイクロバイオリアクター内部で起こっている反応の経時的なモニタリングを可能にすることも可能である。
【００４２】
この検出器9は、マイクロバイオリアクターの連なりが一方向に、次いで他の方向に循環することを可能にする、特にポンプ11及びバルブ12(例えば、ソレノイドバルブ又は空気作動バルブ)を含むインキュベーションモジュール10に統合されており、連なりは、セクションAで充填され、次いでセクションBに向かって検出器9の前を移動される。出口13の存在は、いったん実験が終了すると、望ましくないマイクロバイオリアクター5の除去及び回路の洗浄を可能にする。相(I)、(II)及び(III)を含有する種々の貯蔵所を有する、液滴の連なりが図1に従って形成される(マイクロバイオリアクター及び流体のバブル)モジュールである、モジュール14は、現在のシステムを完全にする。
【符号の説明】
【００４３】
1  チューブ
2  チューブ
3  チューブ
5  マイクロバイオリアクター
6  スペーサー流体
7  キャリア流体
8  毛細管チューブ
9  検出器
10  インキュベーションモジュール
11  ポンプ
12  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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