(57)【要約】  本発明は、プロキネチシン受容体（ＰＲＯＫＲ）に結合する抗体およびその使用方法を提供する。本発明のある特定の実施形態によれば、前記抗体はヒトＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２に結合する完全ヒト抗体である。本発明は、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２に結合する抗体を含む。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、１つまたはそれ以上のＰＲＯＫＲのプロキネチシン（ＰＫ）媒介性活性化を遮断することができる。本発明の抗体は、プロキネチシンシグナリングにより媒介される様々な疾患および障害の処置にとって有用である。
2016502520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロキネチシン受容体（ＰＲＯＫＲ）に特異的に結合し、ＰＲＯＫＲのプロキネチシン媒介性活性化を遮断する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１および細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１に特異的に結合するが、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２には結合しない、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
ＰＲＯＫＲ１のプロキネチシン−１（ＰＫ１）媒介性活性化を遮断する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
ＰＲＯＫＲ１のプロキネチシン−２（ＰＫ２）媒介性活性化を遮断する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
ＰＲＯＫＲ１のプロキネチシン−１（ＰＫ１）媒介性活性化およびＰＲＯＫＲ１のプロキネチシン−２（ＰＫ２）媒介性活性化を遮断する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜２０ｎＭのＰＫ１で刺激されたＰＲＯＫＲ１発現細胞を用いるカルシウム動員アッセイにおいて測定された場合、２０ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化を遮断する、請求項６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜２０ｎＭのＰＫ１で刺激されたＰＲＯＫＲ１発現細胞を用いるカルシウム動員アッセイにおいて測定された場合、１０ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化を遮断する、請求項９に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜２０ｎＭのＰＫ２で刺激されたＰＲＯＫＲ１発現細胞を用いるカルシウム動員アッセイにおいて測定された場合、６０ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ２媒介性活性化を遮断する、請求項７に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜２０ｎＭのＰＫ２で刺激されたＰＲＯＫＲ１発現細胞を用いるカルシウム動員アッセイにおいて測定された場合、２０ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ２媒介性活性化を遮断する、請求項１１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、および１６２／１７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列の対を含む参照抗体と、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１または細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２への結合について競合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、および１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、および１６２／１７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列の対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１４に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号４−６−８−１２−１４−１６；２０−２２−２４−２８−３０−３２；３６−３８−４０−４４−４６−４８；５２−５４−５６−６０−６２−６４；６８−７０−７２−７６−７８−８０；８４−８６−８８−９２−９４−９６；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；および１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６からなる群からそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１５に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項１７】
（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、および１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；ならびに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、および１６２／１７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列の対を含む、請求項１７に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疼痛を処置、または緩和するための方法。
【請求項２１】
疼痛が侵害受容性疼痛、内臓痛、または炎症性疼痛である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
疼痛が炎症、術後切開、神経障害、骨折、熱傷、骨粗鬆症性骨折、骨のがん、痛風、片頭痛、および線維筋痛からなる群から選択される状態に関連する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疼痛ががん関連疼痛である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロキネチシン受容体（ＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２）に結合する、および／またはそれを遮断する抗体、およびその抗原結合断片、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロキネチシン（ＰＫ１およびＰＫ２）は、分泌型多機能ケモカイン様ペプチドである。プロキネチシンは、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１またはＰＫＲ１）およびプロキネチシン受容体２（ＰＲＯＫＲ２またはＰＫＲ２）と呼ばれる２つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）との相互作用を介してその生物学的機能を発揮する。ＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２は互いに約８７％の全アミノ酸配列同一性を有する。ＰＫ１およびＰＫ２はそれぞれＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２と相互作用する。細胞レベルで、プロキネチシン受容体の活性化は、カルシウム動員、ホスホイノシチド代謝回転の刺激およびＭＡＰキナーゼシグナリング経路の活性化をもたらす。多細胞レベルでは、プロキネチシンは血管形成活性を示し、細胞増殖および移動を誘導する。プロキネチシンおよびその受容体は、いくつかのヒトがんの発症に関連し、侵害受容および疼痛の伝達に関与することも示されている（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＭｏｎｎｉｅｒおよびＳａｍｓｏｎ、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９６：１４４〜１４９頁
【非特許文献２】Ｎｅｇｒｉら、２００９、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８５：１４５〜１５７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロキネチシンシグナリング系は、様々な疾患および障害の処置および／または防止のための潜在的な標的である。したがって、プロキネチシン受容体（ＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２）などの、プロキネチシンシグナリング経路の１つまたはそれ以上の成分を標的化し、モジュレートする新規治療剤が当業界で必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、プロキネチシン受容体（ＰＲＯＫＲ）に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、特に、ＰＲＯＫＲ媒介性シグナル伝達を阻害するため、ならびにＰＲＯＫＲ活性またはプロキネチシンシグナリングにより引き起こされるか、またはそれと関連する疾患および障害を処置するために有用である。ある特定の実施形態によれば、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を用いて、それを必要とする対象における疼痛を処置、または緩和することができる。
【０００６】
本発明の抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体）であってもよく、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、機能に影響する、例えば、残留するエフェクター機能を除去するように改変することができる（Ｒｅｄｄｙら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３頁）。
【０００７】
本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、および１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＰＲＯＫＲ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
本発明はまた、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合断片も提供する。
【０００９】
本発明はまた、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、および１６２／１７０からなる群から選択されるＨＣＶＲとＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列の対を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【００１０】
本発明はまた、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメインと、配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインとを含む抗体または抗体の抗原結合断片も提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態においては、前記抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、および１６８／１７６からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列の対を含む。
【００１２】
本発明はまた、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、および１６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインをさらに含む抗体またはその断片も提供する。
【００１３】
本発明のある特定の非限定的な例示的抗体および抗原結合断片は、それぞれ、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ）；２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えば、Ｈ２Ｍ６３８５Ｎ）；３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えば、Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ）；５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えば、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ）；６８−７０−７２−７６−７８−８０（例えば、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ）；８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えば、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ）；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（例えば、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（例えば、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ）；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（例えば、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（例えば、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ）；および１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ４Ｈ６７０６Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１４】
関連する実施形態においては、本発明は、抗体または断片が配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、および１６２／１７０からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列から誘導される重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗ＰＲＯＫＲ抗体またはその抗原結合断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当業界で周知であり、これを用いて本明細書に開示される特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いることができる例示的な慣例としては、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、およびＡｂＭの定義が挙げられる。一般的な用語では、Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づくものであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の位置に基づくものであり、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの手法の間の妥協である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８頁（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８〜９２７２頁（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するための公共データベースも利用できる。参照抗体のＣＤＲが同定されたら、参照抗体と同一であるか、または実質的に類似する結合特性を示す新しい抗体を、当業界で日常的な方法を用いて容易に作製することができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、抗ＰＲＯＫＲ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を担持する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞も、抗体の生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、生成された抗体を回収することによる抗体を生成する方法と同様、本発明により包含される。
【００１６】
一実施形態においては、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、および１６１からなる群から選択される核酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＨＣＶＲを含む抗体またはその断片を提供する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、および１６９からなる群から選択される核酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＶＲを含む抗体またはその断片を提供する。
【００１８】
本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、および１６７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、および１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ３ドメインとを含む抗体または抗体の抗原結合断片も提供する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、および１６５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、および１７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、および１７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む抗体またはその断片も提供する。
【００２０】
ある特定の実施形態によれば、前記抗体またはその断片は、配列番号１および９（例えば、Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ）、１７および２５（例えば、Ｈ２Ｍ６３８５Ｎ）、３３および４１（例えば、Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ）、４９および５７（例えば、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ）、６５および７３（例えば、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ）、８１および８９（例えば、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ）、９７および１０５（例えば、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ）、１１３および１２１（例えば、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ）、１２９および１３７（例えば、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ）、１４５および１５３（例えば、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ）、または１６１および１６９（例えば、Ｈ４Ｈ６７０６Ｐ）の核酸配列によりコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２１】
本発明は、グリコシル化パターンが改変された抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。いくつかの適用においては、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用であり得る。
【００２２】
別の態様において、本発明は、抗ＰＲＯＫＲ抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＰＲＯＫＲ抗体と第２の治療剤との組合せを含む組成物を特徴とする。一実施形態においては、第２の治療剤は、抗ＰＲＯＫＲ抗体と有利に組み合わされた任意の薬剤である。抗ＰＲＯＫＲ抗体と有利に組み合わせることができる薬剤の例としては、限定されるものではないが、ＰＲＯＫＲ活性を阻害する他の薬剤（他の抗体もしくはその抗原結合断片、ペプチド阻害剤、低分子アンタゴニスト、天然生成物などを含む）および／またはＰＲＯＫＲに直接結合しないが、それにも拘らずＰＲＯＫＲ媒介性活性、もしくはシグナル伝達を阻害する、遮断する、もしくは減衰させる薬剤が挙げられる。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、治療方法が本発明の抗体または抗体の抗原結合断片を含む治療上有効量の医薬組成物を投与することを含む、抗ＰＲＯＫＲ抗体または本発明の抗体の抗原結合部分を用いてＰＲＯＫＲ活性を阻害するための方法を提供する。処置される障害は、ＰＲＯＫＲ活性の除去、阻害または減少により改善、改良、阻害または防止される任意の疾患または状態である。抗ＰＲＯＫＲ抗体または本発明の抗体断片は、ＰＲＯＫＲと、１つまたはそれ以上のプロキネチシンとの相互作用を遮断するように機能することができる。
【００２４】
本発明はまた、患者におけるＰＲＯＫＲ活性と関連するか、またはそれにより引き起こされる疾患または障害の処置のための薬剤の製造における、抗ＰＲＯＫＲ抗体または本発明の抗体の抗原結合部分の使用も含む。
【００２５】
他の実施形態は以下の詳細な説明の精査から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにかけられたマウスのオープンフィールド行動（ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の概要を示す図である。示されるように、マウスを、水のみ、ＤＳＳのみ、ＤＳＳ＋アイソタイプ対照抗体、またはＤＳＳ＋抗体Ｈ４Ｈ６３８５Ｎのいずれかで処置した。図１Ａは、不動時間の程度（秒）を示す；図１Ｂは、移動した総距離（ｃｍ）を示す；図１Ｃは、立ち上がり計数を示す；および図１Ｄは、立ち上がり時間（秒）を示す。全パラメータを、６０分の試験期間にわたって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を説明する前に、本発明が記載される特定の方法および実験条件に限定されず、そのようなものとして方法および条件が変化してもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定されることは意図されないことも理解されるべきである。
【００２８】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で用いられる用語「約」は、特定の記載される数値を参照して用いられる場合、その値が１％以下で記載された値から変化してもよいことを意味する。例えば、本明細書で用いられる場合、表現「約１００」は、９９および１０１ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００２９】
本明細書に記載のものと類似するか、または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。
【００３０】
定義
本明細書で用いられる表現「プロキネチシン受容体」、「ＰＲＯＫＲ」、「ＰＫＲ」などは、ＰＲＯＫＲ１とＰＲＯＫＲ２の両方を包含することが意図される。用語「ＰＲＯＫＲ１」および「ＰＲＯＫＲ２」は、非ヒト種に由来するものと特定されない限り（例えば、「マウスＰＲＯＫＲ１」、「マウスＰＲＯＫＲ２」、「サルＰＲＯＫＲ１」、「サルＰＲＯＫＲ２」など）、ヒトＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２タンパク質を指す。ヒトＰＲＯＫＲ１は、配列番号１７７のアミノ酸配列を有する。ヒトＰＲＯＫＲ２は、配列番号１７８のアミノ酸配列を有する。マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ＰＲＯＫＲ１は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６７３５６．２に記載のアミノ酸配列を有する；マウスＰＲＯＫＲ２は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿６５９１９３．３に記載のアミノ酸配列を有する；ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＰＲＯＫＲ１は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿６２０４３３．１に記載のアミノ酸配列を有する；ラットＰＲＯＫＲ２は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿６２０４３４．１に記載のアミノ酸配列を有する；カニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＰＲＯＫＲ１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＨＨ５５６２５．１に記載のアミノ酸配列を有する；およびカニクイザルＰＲＯＫＲ２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＨＨ６５５２８．１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３１】
「抗ＰＲＯＫＲ抗体」は、ＰＲＯＫＲ１もしくはＰＲＯＫＲ２のいずれか、またはＰＲＯＫＲ１とＰＲＯＫＲ２の両方に特異的に結合する抗体を意味する。本明細書で用いられる場合、「ＰＲＯＫＲに結合する抗体」または「抗ＰＲＯＫＲ抗体」は、ＰＲＯＫＲタンパク質の可溶性断片（例えば、ＰＲＯＫＲ１もしくはＰＲＯＫＲ２［例えば、本明細書の実施例４を参照されたい］のＮ末端細胞外部分、または１つもしくはそれ以上の細胞外ループを含むポリペプチド）に結合する抗体、およびその抗原結合断片を含む。表現「ＰＲＯＫＲに結合する抗体」または「抗ＰＲＯＫＲ抗体」はまた、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２に結合する抗体も含む。表現「細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ」は、ＰＲＯＫＲタンパク質の少なくとも一部（例えば、Ｎ末端細胞外部分および／または１つもしくはそれ以上の細胞外ループ）が細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分に接近可能となるように、１つまたはそれ以上のＰＲＯＫＲタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面上に発現されることを意味する。「細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ」は、細胞の表面上に天然に発現されるＰＲＯＫＲならびに細胞表面上に発現されるように人工的に操作されたＰＲＯＫＲを含む。
【００３２】
「細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１に特異的に結合する」抗体は、細胞表面上にＰＲＯＫＲ１を発現する細胞を検出可能に結合するが、細胞表面上にＰＲＯＫＲ１を発現しない同等の細胞には検出可能に結合しない抗体を意味する。同様に、「細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する」抗体は、細胞表面上にＰＲＯＫＲ２を発現する細胞に検出可能に結合するが、細胞表面上にＰＲＯＫＲ２を発現しない同等の細胞には検出可能に結合しない抗体を意味する。抗体が細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２に結合するかどうかを評価するための例示的な方法は、本明細書の実施例３に例示されるような、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）である。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、特定の抗原（例えば、ＰＲＯＫＲ）に特異的に結合するか、またはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と、重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。本発明の異なる実施形態においては、抗ＰＲＯＫＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然的もしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列を、２つ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて定義することができる。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成のものである、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片を、例えば、ＤＮＡをコードする抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインの操作および発現を含むタンパク質分解的消化または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を用いて、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知である、および／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーなど）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に、または分子生物学技術を用いることにより操作して、例えば、１つもしくはそれ以上の可変および／もしくは定常ドメインを好適な構成中に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作出する、アミノ酸を改変する、付加する、もしくは欠失させるなどすることができる。
【００３５】
抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で用いられる表現「抗原結合断片」内に包含される。
【００３６】
抗体の抗原結合断片は、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、一般には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、または一致した少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片においては、ＶＨおよびＶＬドメインを、互いに対して任意の好適な配置に置くことができる。例えば、可変領域は二量体であってもよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
【００３７】
ある特定の実施形態においては、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有してもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な構成の例としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ−２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上記に列挙された例示的構成のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の構成において、可変および定常ドメインを、互いに直接連結するか、または完全な、もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域により連結することができる。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中で隣接する可変および／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなっていてもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いに、および／または１つもしくはそれ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合による）と非共有的会合にある、上記に列挙された可変および定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。
【００３８】
完全な抗体分子と同様、抗原結合断片は一特異的または多特異的（例えば、二特異的）であってもよい。抗体の多特異的抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、それぞれの可変ドメインは別々の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二特異的抗体形式などの任意の多特異的抗体形式を、当業界で利用可能な日常的な技術を用いて本発明の抗体の抗原結合断片の文脈における使用のために適合させることができる。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異により、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列から誘導されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは意図されていない。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（以下でさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５頁を参照されたい）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作出もしくは単離された抗体などの、組換え手段により調製、発現、作出または単離された全てのヒト抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態においては、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を用いる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異）にかけられ、かくして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、それと関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内には自然に存在しないであろう配列である。
【００４１】
ヒト抗体は、ヒンジ異種性に関連する２つの形態で存在し得る。１つの形態においては、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４鎖構築物を含む。第２の形態においては、二量体は鎖間ジスルフィド結合により連結されず、共有的に共役された軽鎖と重鎖とを含む約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製の後でも、分離するのは極めて困難であった。
【００４２】
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプ中の第２の形態の出現頻度は、限定されるものではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的相違に起因する。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域中の単一のアミノ酸置換は、第２の形態の出現（Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５頁）を、典型的にはヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルにまで有意に低下させることができる。本発明は、例えば、生成において、所望の抗体形態の収率を改善することが望ましいであろうヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域中に１つまたはそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「単離された抗体」は、その天然の環境の少なくとも１つの成分から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するか、もしくは天然に生成される組織もしくは細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程にかけられた抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４４】
本明細書で用いられる「中和」または「遮断」抗体は、ＰＲＯＫＲへの結合が、（ｉ）プロキネチシン（例えば、ＰＫ１もしくはＰＫ２）とＰＲＯＫＲとの間の相互作用を阻害する；（ｉｉ）ＰＲＯＫＲのプロキネチシン媒介性活性化を阻害するか、もしくは減衰させる；および／または（ｉｉｉ）ＰＲＯＫＲの少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。ＰＲＯＫＲ中和または遮断抗体により引き起こされる阻害は、それが適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＰＲＯＫＲ阻害を検出するための例示的アッセイは、当業界で公知であり、本明細書の実施例に例示される。
【００４５】
本明細書に開示される抗ＰＲＯＫＲ抗体は、抗体が誘導される対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列とを比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかから誘導され、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、抗体が誘導される生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異される（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列突然変異」と呼ばれる）、抗体、およびその抗原結合断片を含む。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列突然変異またはその組合せを含むいくつかの抗体および抗原結合断片を容易に生成することができる。ある特定の実施形態においては、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てを、抗体が誘導された元の生殖系列配列中に見出される残基に復帰変異させる。他の実施形態においては、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される突然変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見出される突然変異残基のみを、元の生殖系列配列に復帰変異させる。他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基を、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々誘導された生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に突然変異させる。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列突然変異の任意の組合せを含んでもよく、例えば、ある特定の個々の残基は特定の生殖系列配列の対応する残基に突然変異されるが、元の生殖系列配列と異なるある特定の他の残基は維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に突然変異される。一度得られたら、１つまたはそれ以上の生殖系列突然変異を含有する抗体および抗原結合断片を、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善または増強されたアンタゴニストまたはアゴニスト生物学的特性（場合によって）、低下した免疫原性などの１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本発明に包含される。
【００４６】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。
【００４７】
用語「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が１つより多いエピトープを有してもよい。かくして、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは、立体的または直線的であってもよい。立体的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸により生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により生成されるものである。ある特定の環境においては、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含んでもよい。
【００４８】
核酸またはその断片を指す場合、用語「実質的な同一性」または「実質的に同一である」とは、適切なヌクレオチド挿入または欠失に関して別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列された場合、以下に考察されるようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定された場合、少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基におけるヌクレオチド配列同一性が存在する。参照核酸分子に対する実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の例においては、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じか、または実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。
【００４９】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似する」とは、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いるＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性または類似性の程度のパーセントを、置換の保存的性質について補正するために上方調整することができる。この調整を行うための方法は、当業者には周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１頁を参照されたい。類似する化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜１４４５頁に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有する任意の変化である。
【００５０】
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドに関する配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換などの、様々な置換、欠失および他の改変に割当てられた類似性の尺度を用いて類似する配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間または野生型タンパク質およびその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータと共に用いることができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列を、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムである、デフォルトまたは推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上掲）。本発明の配列を、異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いる、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２頁を参照されたい。
【００５１】
抗体の生物学的特性
本発明は、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１および／または細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、本発明は、（ａ）細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２ではなく細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１に特異的に結合する；（ｂ）細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１ではなく細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する；または（ｃ）細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ１と細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲ２とに特異的に結合する、抗ＰＲＯＫＲ抗体を提供する。抗ＰＲＯＫＲ抗体を、ＰＲＯＫＲを発現する細胞への抗体結合の検出を可能にする任意のアッセイ形式を用いて細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲに特異的に結合する能力について試験および評価することができる。抗体が細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲに特異的に結合するかどうかを決定するために用いることができる例示的なアッセイ形式は、本明細書の実施例３に例示される。この実施例においては、ＰＲＯＫＲを通常は発現しない細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）をＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２を発現するように操作し、ＰＲＯＫＲを発現する細胞への抗体結合を、検出可能に標識された二次抗体を用いるフローサイトメトリーにより決定する。細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲへの「特異的抗体結合」とは、フローサイトメトリーによる検出可能な結合を示す細胞のパーセンテージが１％より高いことを意味する。このアッセイ形式において１％〜１０％の結合パーセンテージを示す抗体は一般に、「弱い」結合を有すると見なされるが、それにも拘らず、本開示の目的のためには「細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲに特異的に結合する」抗体であると考えられる。しかしながら、ある特定の実施形態によれば、細胞表面に発現されたＰＲＯＫＲへの特異的抗体結合は、フローサイトメトリーにより検出可能な結合を示す細胞のパーセンテージが１０％より高い、２０％より高い、３０％より高い、４０％より高い、５０％より高い、またはそれ以上であることを意味する。
【００５２】
本発明はまた、ＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２の１つまたはそれ以上の可溶性断片に結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。例えば、ＰＲＯＫＲタンパク質のＮ末端細胞外部分の全部または一部を含むＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２の可溶性断片に特異的に結合する抗体が本明細書に提供される。この型の可溶性ＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２構築物の例は、本明細書の実施例４に例示される。実施例４に示されるように、ヒトＦｃ成分に融合された、ＰＲＯＫＲ１のアミノ酸１〜６２（配列番号１７７）またはＰＲＯＫＲ２のアミノ酸１〜５３（配列番号１７８）を含む融合タンパク質を、表面プラズモン共鳴（２５℃、ｐＨ７．４）により抗ＰＲＯＫＲ抗体への結合について試験した。実施例４のアッセイ形式、または類似するアッセイを用いて、可溶性ＰＲＯＫＲ分子への抗ＰＲＯＫＲ抗体の結合を、例えば、平衡解離定数（ＫＤ）および／または解離半減期（ｔ１／２）に関して定量することができる。
【００５３】
かくして、本発明は、例えば、本明細書の実施例４に定義されるアッセイ形式または実質的に類似するアッセイを用いる表面プラズモン共鳴により測定された場合、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１．５ｎＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５５０ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４５０ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満のＫＤで可溶性ヒトＰＲＯＫＲ１（例えば、Ｎ末端部分）に結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体を提供する。
【００５４】
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例４に定義されるアッセイ形式または実質的に類似するアッセイを用いる表面プラズモン共鳴により測定された場合、約５分より長い、約１０分より長い、約１５分より長い、約２０分より長い、約２５分より長い、約３０分より長い、約３５分より長い、約４０分より長い、約４５分より長い、約５０分より長い、約５５分より長い、約６０分より長い、約７５分より長い、約１００分より長い、約１５０分より長い、約２００分より長い、もしくは約２５０分より長い、またはそれ以上である解離半減期（ｔ１／２）で可溶性ヒトＰＲＯＫＲ１（例えば、Ｎ末端部分）に結合する、抗ＰＲＯＫＲ抗体およびその抗原結合断片も含む。
【００５５】
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例４に定義されるアッセイ形式または実質的に類似するアッセイを用いる表面プラズモン共鳴により測定された場合、約１５０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６５ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、またはそれ以下のＫＤで可溶性ヒトＰＲＯＫＲ２（例えば、Ｎ末端部分）に結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体も提供する。
【００５６】
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例４に定義されるアッセイ形式または実質的に類似するアッセイを用いる表面プラズモン共鳴により測定された場合、約１分より長い、約２分より長い、約３分より長い、約４分より長い、約５分より長い、約１０分より長い、約２０分より長い、約３０分より長い、約４０分より長い、またはそれより長い解離半減期（ｔ１／２）で可溶性ヒトＰＲＯＫＲ２（例えば、Ｎ末端部分）に結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体およびその抗原結合断片も含む。
【００５７】
本発明はまた、ＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２のプロキネチシン媒介性活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体およびその抗原結合断片も含む。ＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２のプロキネチシン媒介性活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力を、例えば、本明細書の実施例５に例示されるアッセイ形式を用いて測定することができる。このアッセイでは、通常はヒトＰＲＯＫＲを発現しない細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３細胞）を操作してＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２を発現させる。このアッセイ形式では、ＰＲＯＫＲ活性化の程度は、抗ＰＲＯＫＲ抗体の存在下または非存在下での、プロキネチシン−１（ＰＫ１）またはプロキネチシン−２（ＰＫ２）を用いる処置後（例えば、約１〜２０ｎＭのＰＫ１またはＰＫ２の濃度を用いる）のカルシウム動員により示される。このアッセイ形式でのプロキネチシン媒介性ＰＲＯＫＲ活性化の阻害を、ＩＣ５０値（すなわち、ＰＫ媒介性カルシウム流動を５０％阻害するのに必要とされる抗体の濃度）として、または遮断率として算出する。本発明は、（ａ）ＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化；（ｂ）ＰＲＯＫＲ１のＰＫ２媒介性活性化；（ｃ）ＰＲＯＫＲ２のＰＫ１媒介性活性化；および／または（ｄ）ＰＲＯＫＲ２のＰＫ２媒介性活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。例えば、本発明は、実施例５のアッセイ形式（例えば、約１ｎＭ〜約２０ｎＭのＰＫ１を用いる）、または実質的に類似するアッセイを用いて測定された場合、約２０ｎＭ未満、約１８ｎＭ未満、約１６ｎＭ未満、約１４ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、またはそれ以下のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。本発明はまた、実施例５のアッセイ形式（例えば、約１ｎＭ〜約２０ｎＭのＰＫ２を用いる）、または実質的に類似するアッセイを用いて測定された場合、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または約２０ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＲＯＫＲ１のＰＫ２媒介性活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。
【００５８】
本発明はまた、様々な動物疼痛モデルにおける疼痛応答を阻害するか、または減少させる抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。
【００５９】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体に関する他の生物活性は、本明細書に記載の実施例を考慮すれば当業者には明らかである。
【００６０】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、（ａ）Ｎ末端細胞外領域（配列番号１７７のアミノ酸１〜６２）；（ｂ）細胞外ループ１（配列番号１７７のアミノ酸１２０〜１４６）；（ｃ）細胞外ループ２（配列番号１７７のアミノ酸２０１〜２３２）；および／または細胞外ループ３（配列番号１７７のアミノ酸３０４〜３２２）からなる群から選択されるＰＲＯＫＲ１分子の１つまたはそれ以上の領域またはセグメント内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。
【００６１】
本発明はまた、（ａ）Ｎ末端細胞外領域（配列番号１７８のアミノ酸１〜５４）；（ｂ）細胞外ループ１（配列番号１７８のアミノ酸１１０〜１３７）；（ｃ）細胞外ループ２（配列番号１７８のアミノ酸１９３〜２２１）；および／または細胞外ループ３（配列番号１７８のアミノ酸２９７〜３１０）からなる群から選択されるＰＲＯＫＲ２分子の１つまたはそれ以上の領域またはセグメント内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。
【００６２】
抗体が結合するエピトープは、ＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２の任意の前記領域またはセグメント内に位置する３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一の連続的配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＰＲＯＫＲ分子の１つまたはそれ以上の上記領域またはセグメント内に位置する複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。例えば、本発明の抗体は、ＰＲＯＫＲ１のＮ末端細胞外領域内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸ならびにＰＲＯＫＲ１の１つまたはそれ以上の細胞外ループ内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することができる。
【００６３】
当業者には公知の様々な技術を用いて、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載のもの、アラニン走査突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３〜４６３頁）、およびペプチド切断分析などの日常的な交叉−遮断アッセイが挙げられる。さらに、エピトープ切出し、エピトープ抽出および抗原の化学的改変などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的な用語では、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識した後、抗体を重水素で標識されたタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体で保護された残基（重水素標識されたままである）以外の全ての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析にかけることによって、抗体が相互作用する特定のアミノ酸と一致する重水素標識された残基を示す。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１）  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照されたい。抗原／抗体複合体のＸ線結晶分析をエピトープマッピング目的で用いることもできる。
【００６４】
本発明は、本明細書に記載された特定の例示的抗体のいずれか（例えば、Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ、Ｈ２Ｍ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０６Ｐなど）と同じエピトープに結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体をさらに含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載された特定の例示的抗体のいずれか（例えば、Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ、Ｈ２Ｍ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０６Ｐなど）とＰＲＯＫＲ１および／またはＰＲＯＫＲ２への結合について競合する抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。
【００６５】
当業者であれば、当業界で公知の日常的な方法を用いることにより、抗体が参照抗ＰＲＯＫＲ抗体と同じエピトープに結合するか、またはそれとの結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＰＲＯＫＲ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体をＰＲＯＫＲタンパク質に結合させる。次に、試験抗体がＰＲＯＫＲ分子に結合する能力を評価する。試験抗体が参照抗ＰＲＯＫＲ抗体との飽和結合後にもＰＲＯＫＲに結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＰＲＯＫＲ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その他方で、試験抗体が参照抗ＰＲＯＫＲ抗体との飽和結合後にＰＲＯＫＲ分子に結合することができない場合、試験抗体は本発明の参照抗ＰＲＯＫＲ抗体により結合したエピトープと同じエピトープに結合することができる。次いで、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を実行して、試験抗体の結合の観察された欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的遮断（もしくは別の現象）が観察された結合の欠如の原因となるかどうかを確認することができる。この種の実験を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当業界で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の一方の抗体が、競合結合アッセイにおいて測定された場合に、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％阻害する場合、２つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５〜１５０２頁を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を減少させるか、または排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が他方の結合を減少させるか、または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を減少させるか、または排除するアミノ酸突然変異のサブセットのみが他方の結合を減少させるか、または排除する場合、２つの抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
【００６６】
抗体が参照抗ＰＲＯＫＲ抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法を２つの向きで行う：第１の向きにおいては、参照抗体を、飽和条件下でＰＲＯＫＲタンパク質に結合させた後、試験抗体のＰＲＯＫＲ分子への結合を評価する。第２の向きにおいては、試験抗体を、飽和条件下でＰＲＯＫＲ分子に結合させた後、参照抗体のＰＲＯＫＲ分子への結合を評価する。両方の向きにおいて、第１の（飽和）抗体のみがＰＲＯＫＲ分子に結合することができる場合、試験抗体と参照抗体はＰＲＯＫＲへの結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する必要はないが、重複エピトープまたは隣接エピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【００６７】
ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を作成する方法は、当業界で公知である。任意のそのような公知の方法を本発明の文脈において用いて、ヒトＰＲＯＫＲに特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【００６８】
モノクローナル抗体を作成するためのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術または他の類似する方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＰＲＯＫＲに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験セクションに記載されるように、抗体を、親和性、選択性、エピトープなどの所望の特徴について特性評価および選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または改変型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４を作成する。選択される定常領域は特定の使用に応じて変化してもよいが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域中に存在する。
【００６９】
生物学的同等物
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体および抗体断片は、記載の抗体のアミノ酸配列から変化するが、ヒトＰＲＯＫＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異体抗体および抗体断片は、親配列と比較した場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載の抗体のものと本質的に同等である生物活性を示す。同様に、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗ＰＲＯＫＲ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そのような変異体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記で考察されている。
【００７０】
例えば、２つの抗原結合タンパク質、または抗体が、吸収の速度および程度が同様の実験条件下で同じモル用量で、単回用量または複数回用量で投与された場合に有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、それらは生物学的同等物であると考えられる。いくつかの抗体がその吸収の程度において同等であるが、その吸収速度において同等ではない場合、それらは同等物または薬学的代替物と考えられ、吸収速度におけるそのような差異が意図的であり、標識に反映され、例えば、慢性的使用に対する有効体内薬物濃度の獲得にとって必須ではなく、試験される特定の製剤について医学的に有意でないと考えられるため、さらに生物学的同等物であると考えることができる。
【００７１】
一実施形態においては、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、および効力における臨床的に意義のある差異が存在しない場合、生物学的に同等である。
【００７２】
一実施形態においては、参照製剤と生物製剤との間で患者を１回またはそれ以上切替えることができ、そのような切替えを行わない継続療法と比較した場合、免疫原性の臨床的に意義のある変化、または有効性の減少などの有害な効果の危険性の増大が予想されない場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。
【００７３】
一実施形態においては、２つの抗原結合タンパク質が両方とも、使用条件について共通の作用機序により、そのような機序が公知である程度で作用する場合、それらは生物学的に同等である。
【００７４】
生物学的同等性を、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法により証明することができる。生物学的同等性の尺度としては、例えば、（ａ）抗体またはその代謝物の濃度が血液、血漿、血清、または他の生物学的液体中で時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの試験；（ｂ）ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏでのバイオアベイラビリティデータと相関し、それを合理的に予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの試験；および（ｄ）抗体の安全性、効能、またはバイオアベイラビリティもしくは生物学的同等性を確立する十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【００７５】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体の生物学的に同等な変異体を、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を作製するか、または生物活性にとって必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることにより構築することができる。例えば、生物活性にとって必須ではないシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸と置き換えて、復元時の不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除するか、または除去する突然変異を含む抗ＰＲＯＫＲ抗体変異体を含んでもよい。
【００７６】
種選択性および種交叉反応性
本発明は、ヒトＰＲＯＫＲ（例えば、細胞表面に発現されたヒトＰＲＯＫＲ１および／または細胞表面に発現されたヒトＰＲＯＫＲ２）に結合するが、他の種に由来するＰＲＯＫＲには結合しない抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む。本発明はまた、ヒトＰＲＯＫＲ（例えば、細胞表面に発現されたヒトＰＲＯＫＲ１および／または細胞表面に発現されたヒトＰＲＯＫＲ２）に結合し、１つまたはそれ以上の非ヒト種に由来する１つまたはそれ以上のＰＲＯＫＲタンパク質にも結合する抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。本発明はまた、ヒトＰＲＯＫＲ１および／またはヒトＰＲＯＫＲ２のプロキネチシン媒介性活性化を遮断するが、１つまたはそれ以上の非ヒトＰＲＯＫＲのプロキネチシン媒介性活性化を遮断しない抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。本発明はまた、ヒトＰＲＯＫＲ１および／またはヒトＰＲＯＫＲ２のプロキネチシン媒介性活性化を遮断し、１つまたはそれ以上の非ヒトＰＲＯＫＲのプロキネチシン媒介性活性化も遮断する、抗ＰＲＯＫＲ抗体も含む。
【００７７】
例えば、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体は、ヒトＰＲＯＫＲ１および／またはヒトＰＲＯＫＲ２に結合する、および／またはそれを遮断し、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２の１つまたはそれ以上に結合する、および／または遮断する（または場合によっては結合しない、もしくは遮断しない）ことができる。例えば、本明細書の実施例５に示されるように、本発明のある特定の例示的抗体は、ヒトＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化ならびにサルＰＲＯＫＲ１（例えば、Ｈ４Ｈ６６９６、Ｈ４Ｈ６６９８、Ｈ４Ｈ６７０１およびＨ４Ｈ６３８５）のＰＫ１媒介性活性化を遮断する。その他方で、抗体Ｈ１Ｍ６３８６は、ヒトＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化の強力な遮断を示したが、サルＰＲＯＫＲ１のＰＫ１媒介性活性化のいかなる検出可能な遮断も示さなかった。本発明の例示的抗ＰＲＯＫＲ抗体の他の交叉反応／交叉遮断パターンは、本明細書に提供される実施例を精査すれば当業者には明らかである。
【００７８】
多特異的抗体
本発明の抗体は、一特異的、二特異的、または多特異的であってもよい。多特異的抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよいか、または１つより多い標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８〜２４４頁を参照されたい。本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するか、またはそれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片を、別の抗体または抗体断片などの１つまたはそれ以上の他の分子的実体に機能的に連結し（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有的会合または別の方法による）、第２の結合特異性を有する二特異的または多特異的抗体を生成することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＰＲＯＫＲまたはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるか、または治療部分にコンジュゲートされた、二特異的抗体を含む。本発明は、ＰＲＯＫＲ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二特異的抗体を含む。
【００７９】
本発明の文脈において用いることができる例示的な二特異的抗体形式は、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインが少なくとも１アミノ酸によって互いに異なり、少なくとも１アミノ酸の相違が、アミノ酸の相違を欠く二特異的抗体と比較してプロテインＡに対する二特異的抗体の結合を減少させる、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を含む。一実施形態においては、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによればＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少させるか、または無効化する突然変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによればＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣＨ３内に見出すことができるさらなる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二特異的抗体形式に関する変動は、本発明の範囲内にあると企図される。
【００８０】
治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および移動、送達、許容性などの改善を提供する他の薬剤と共に製剤化される。複数の好適な製剤を、あらゆる薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出すことができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水乳濁液、Ｃａｒｂｏｗａｘ乳濁液（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、およびＣａｒｂｏｗａｘを含有する半固形混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８〜３１１頁も参照されたい。
【００８１】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢および大きさ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化してもよい。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って算出される。本発明の抗体を成人患者におけるＰＲＯＫＲ活性に関連する状態または疾患を処置するために用いる場合、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内投与するのが有利であり得る。状態の重篤度に応じて、処置の頻度および期間を調整することができる。抗ＰＲＯＫＲ抗体を投与するための有効用量およびスケジュールを、経験的に決定することができる；例えば、患者の進行を定期的評価によりモニタリングし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、用量の種間スケーリングを、当業界で周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１頁）。
【００８２】
例えば、リポソーム中への封入、微粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスなどの、様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために用いることができる（例えば、Ｗｕら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）。導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。前記組成物を、任意の都合のよい経路により、例えば、輸注またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚系列（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収により投与し、他の生物活性剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局部的であってもよい。
【００８３】
本発明の医薬組成物を、標準的な針と注射筒を用いて皮下的または静脈内的に送達することができる。さらに、皮下的送達に関しては、ペン型送達デバイスが本発明の医薬組成物を送達する際に容易に応用できる。そのようなペン型送達デバイスは再使用可能であるか、または使い捨てであってもよい。再使用可能なペン型送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換式カートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の医薬組成物の全部が投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。次いで、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいては、交換式カートリッジはない。むしろ、使い捨てのペン型送達デバイスは、デバイス内の容器中に保持された医薬組成物を予め充填されてくる。一度、容器の医薬組成物が空になったら、デバイス全体を廃棄する。
【００８４】
いくつかの再使用可能なペン型および自己注射型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下的送達に応用できる。例としては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下的送達に応用できる使い捨てペン型送達デバイスの例としては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられる。
【００８５】
ある特定の状況においては、前記医薬組成物を、制御放出系において送達することができる。一実施形態においては、ポンプを用いることができる（Ｌａｎｇｅｒ、上掲；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１頁を参照されたい）。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いることができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態においては、制御放出系を、組成物の標的の近くに置き、かくして、ほんの少量の全身用量を必要とすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上掲、ｖｏｌ．２、１１５〜１３８頁を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁による概説で考察されている。
【００８６】
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴などのための剤形を含んでもよい。これらの注射可能な調製物を、公共的に公知の方法により調製することができる。例えば、注射可能な調製物を、例えば、注射のために従来通り用いられる滅菌水性媒体または油性媒体中に上記の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化することにより調製することができる。注射のための水性媒体として、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と共に用いることができる、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤などを含有する等張性溶液がある。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と共に用いることができる、ゴマ油、ダイズ油などが用いられる。かくして調製された注射液を、好ましくは適切なアンプル中に充填する。
【００８７】
有利には、上記の経口的または非経口的使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量中の剤形に調製する。単位用量中のそのような剤形としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上記抗体の量は、一般には、単位用量中の剤形あたり約５〜約５００ｍｇである；特に、注射液の形態では、上記抗体が約５〜約１００ｍｇで含有され、他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有されるのが好ましい。
【００８８】
抗体の治療的使用
本発明は、抗ＰＲＯＫＲ抗体を含む治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示される任意の抗ＰＲＯＫＲ抗体、またはその断片を含んでもよい。本明細書で用いられる表現「それを必要とする対象」は、ＰＲＯＫＲ活性に関連するか、もしくはそれにより引き起こされる疾患もしくは障害の１つもしくはそれ以上の症状もしくは兆候を示すか、またはそうでなければＰＲＯＫＲシグナリングの阻害もしくは減少から利益を得る、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００８９】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を用いて処置することができる例示的疾患および障害としては、疼痛状態（例えば、急性、慢性、または突出痛）が挙げられる。本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を用いて処置できる疼痛状態の型の例としては、侵害受容性疼痛、内臓痛（例えば、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、膵炎、子宮内膜症、慢性骨盤痛症候群などに由来する疼痛）、ならびに炎症（例えば、炎症性筋肉痛）、術後切開疼痛（例えば、術後疼痛）、神経障害（例えば、糖尿病性神経障害）に関連する疼痛、坐骨神経痛、ヘルペス後神経痛、筋膜疼痛症候群、関節炎、鎌状細胞、腸神経虚血、跛行疼痛、骨折、熱傷、骨粗鬆症性骨折、痛風、片頭痛、線維筋痛、複合性局所疼痛症候群、急性ヘルペス疼痛などが挙げられる。
【００９０】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体は、がん関連疼痛を処置または防止するためにも有用である。「がん関連疼痛」は、例えば、骨に転移したがん（例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、肉腫、腎臓がん、多発性骨髄腫など）に由来する疼痛などの骨のがんによる疼痛を含む。「がん関連疼痛」はまた、例えば、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性グリオーマ、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、またはメラノーマなどのがん性状態とより一般的に関連する疼痛も含む。
【００９１】
本発明の抗体はまた、病的血管新生（例えば、腫瘍、血管新生眼障害など）に関連する、および／またはそれにより引き起こされる疾患および障害を処置するのに有用であり得る。本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を用いて処置することができる他の疾患および障害としては、例えば、消化管の障害（例えば、平滑筋収縮を含む）、ヒルシュスプルング病、多嚢胞性卵巣症候群、カルマン症候群、関節リウマチ、および変形性関節症が挙げられる。本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体は、不妊適用（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に用いることもできる。
【００９２】
組合せ療法および製剤
本発明は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と共に、本明細書に記載の例示的抗ＰＲＯＫＲ抗体のいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体と組み合わせるか、またはそれと共に投与することができる例示的なさらなる治療剤としては、例えば、抗ＮＧＦ抗体、抗ＰＡＲ２抗体、抗ＡＳＩＣ抗体（例えば、抗ＡＳＩＣ１、抗ＡＳＩＣ２、抗ＡＳＩＣ３、および抗ＡＳＩＣ４抗体）、抗ＧＦＲα抗体などの他の疼痛緩和バイオ医薬品、ならびに抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、オピオイド、および／またはＮＳＡＩＤなどの非生物治療剤が挙げられる。
【００９３】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの低分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブもしくはエルロチニブ］）、別のＥＧＦＲファミリーのアンタゴニスト、例えば、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の低分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号を参照されたい（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬアンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などの、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示された抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５ＰなどのＵＳ２０１１／００２７２８６に開示された抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン抗体）、ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体）などの１つまたはそれ以上のがん治療剤と組み合わせるか、またはそれと共に投与することもできる。
【００９４】
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体と共に有益に投与することができる他の薬剤としては、低分子サイトカイン阻害剤などのサイトカイン阻害剤およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインに結合する抗体、またはその対応する受容体のアンタゴニスト、ならびに抗ＩｇＥ抗体、抗ＴＮＦ抗体などが挙げられる。
【００９５】
さらなる治療活性成分を、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体の投与の直前に、それと同時に、またはその直後に投与することができる；（本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」抗ＰＲＯＫＲ抗体の投与と考えられる）。本発明は、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体が本明細書の他の場所に記載される１つまたはそれ以上のさらなる治療活性成分と同時に製剤化された医薬組成物を含む。
【００９６】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、複数回用量の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、規定の時間経過にわたって対象に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、複数回用量の本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で用いられる場合、「連続的に投与すること」は、抗ＰＲＯＫＲ抗体の各用量を、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）で隔てられた異なる日に対象に投与することを意味する。本発明は、単回初期用量の抗ＰＲＯＫＲ抗体、次いで、１つまたはそれ以上の第２の用量の抗ＰＲＯＫＲ抗体、次いで場合により１つまたはそれ以上の第３の用量の抗ＰＲＯＫＲ抗体を患者に連続的に投与することを含む方法を含む。
【００９７】
用語「初期用量」、「第２の用量」および「第３の用量」とは、本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体の投与の時間的順序を指す。かくして、「初期用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）である；「第２の用量」は、初期用量の後に投与される用量である；および「第３の用量」は第２の用量の後に投与される用量である。初期、第２の、および第３の用量は、全て同じ量の抗ＰＲＯＫＲ抗体を含有してもよいが、一般的には投与の頻度に関して互いに異なっていてもよい。しかしながら、ある特定の実施形態においては、初期、第２の、および／または第３の用量中に含有される抗ＰＲＯＫＲ抗体の量は、処置の経過中に互いに変化する（例えば、必要に応じて上方または下方に調整される）。ある特定の実施形態においては、２以上（例えば、２、３、４または５）の用量を、「負荷用量」として処置レジメンの開始時に投与した後、その後の用量を低い頻度ベース（例えば、「維持用量」）で投与する。
【００９８】
本発明の１つの例示的実施形態においては、それぞれの第２および／または第３の用量を、直前の用量の１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２以上）週後に投与する。本明細書で用いられる語句「直前の用量」とは、複数回の投与の順序における、介在する用量がない順序においてすぐ次の用量の投与前に患者に投与される抗ＰＲＯＫＲ抗体の用量を意味する。
【００９９】
本発明のこの態様による方法は、任意数の第２および／または第３の用量の抗ＰＲＯＫＲ抗体を患者に投与することを含んでもよい。例えば、ある特定の実施形態においては、単一の第２の用量のみを患者に投与する。他の実施形態においては、２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８以上）の第２の用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態においては、単一の第３の用量のみを患者に投与する。他の実施形態においては、２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８以上）の第３の用量を患者に投与する。
【０１００】
複数の第２の用量を含む実施形態においては、それぞれの第２の用量を、他の第２の用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、それぞれの第２の用量を、直前の用量の１〜２週間後に患者に投与することができる。同様に、複数の第３の用量を含む実施形態においては、それぞれの第３の用量を、他の第３の用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、それぞれの第３の用量を、直前の用量の２〜４週間後に患者に投与することができる。あるいは、第２および／または第３の用量を患者に投与する頻度は、処置レジメンの経過にわたって変化してもよい。投与の頻度を、臨床検査後に個々の患者の必要性に応じて医師によって処置の経過中に調整することもできる。
【０１０１】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、例えば、診断目的で、試料中の１つまたはそれ以上のＰＲＯＫＲタンパク質、またはＰＲＯＫＲ発現細胞を検出および／または測定するために用いることもできる。例えば、抗ＰＲＯＫＲ抗体、またはその断片を、ＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断するために用いることができる。ＰＲＯＫＲの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、検出可能な標識またはリポーター分子で標識された本発明の抗ＰＲＯＫＲ抗体と接触させることを含んでもよい。あるいは、未標識の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、それ自身検出可能に標識された二次抗体と共に診断適用において用いることができる。検出可能な標識またはリポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。試料中のＰＲＯＫＲを検出または測定するのに用いることができる特定の例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１０２】
本発明によるＰＲＯＫＲ診断アッセイにおいて用いることができる試料としては、通常の、または疾病的条件下で、検出可能な量のＰＲＯＫＲタンパク質、またはその断片を含有する患者から得られる任意の組織または液体試料が挙げられる。一般的には、健康な患者（例えば、異常なＰＲＯＫＲレベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中におけるＰＲＯＫＲのレベルを、最初にＰＲＯＫＲのベースラインレベルまたは標準レベルを確立するために測定する。次いで、ＰＲＯＫＲのこのベースラインレベルを、ＰＲＯＫＲ関連疾患または状態を有することが疑われる個体から得られた試料中で測定されたＰＲＯＫＲのレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図されるものではない。用いられる数（例えば、量、温度など）に関する精度を確保するための努力が為されたが、いくらかの実験誤差および偏差が説明されるべきである。別途指摘されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその近辺である。
【実施例１】
【０１０４】
プロキネチシン受容体に対するヒト抗体の作成
抗ＰＲＯＫＲ抗体を作成するために、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、ヒトＰＲＯＫＲ１またはヒトＰＲＯＫＲ２のいずれかを発現するように操作されたマウス線維芽細胞系（ＭＧ８７）で免疫した。ヒトＰＲＯＫＲを発現するように操作された細胞を用いる細胞結合アッセイにより、抗体免疫応答をモニタリングした。所望の免疫応答が達成された場合、脾細胞を収獲し、マウスミエローマ細胞と融合させて、その生存能力を維持し、ハイブリドーマ細胞系を形成させた。ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、ＰＲＯＫＲ特異的抗体を生成する細胞系を同定した。この技術を用いて、Ｈ１Ｍ６３８６ＮおよびＨ２Ｍ６３８５Ｎと命名された抗体を含む、抗ＰＲＯＫＲキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）が得られた。
【０１０５】
抗ＰＲＯＫＲ抗体はまた、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載のように、ミエローマ細胞に融合することなく抗原陽性Ｂ細胞から直接単離された。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＰＲＯＫＲ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた；この様式で作成された例示的抗体は、以下のように命名された：Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、およびＨ４Ｈ６７０６Ｐ。
【０１０６】
本実施例の方法に従って作成された例示的な抗ＰＲＯＫＲ抗体のある特定の生物学的特性を、以下に記載の実施例で詳細に説明する。
【実施例２】
【０１０７】
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１は、選択された抗ＰＲＯＫＲ抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列の対ならびにその対応する抗体識別子を記載する。
【０１０８】
【表１】
2016502520.tif 000003
【０１０９】
抗体は、典型的には以下の命名法に従って本明細書で呼ばれる：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ４Ｈ」）、次いで、数字識別子（例えば、表１に示されるような「６３８６」、「６３８５」、「６６６３」など）、次いで、「Ｐ」または「Ｎ」の接尾辞。かくして、この命名法によれば、抗体を、例えば、「Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ」、「Ｈ２Ｍ６３８５Ｎ」、「Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ」などと本明細書で呼ぶことができる。本明細書で用いられる抗体記号表示上のＦｃ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１  Ｆｃを有するが、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する。当業者であれば理解できるように、特定のＩｇＧアイソタイプ（例えば、「Ｈ４Ｈ」）を有する抗体を、日常的な方法を用いて異なるＩｇＧアイソタイプ（例えば、Ｈ１Ｈ、Ｈ１Ｍ、Ｈ２Ｍなど）を有する抗体に変換することができる；しかし、任意の事象において、表１に示される数字識別子で示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、結合特性はＦｃドメインの性質に関係なく同一であるか、または実質的に類似すると予想される。
【実施例３】
【０１１０】
フローサイトメトリーによる細胞表面ＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２への抗ＰＲＯＫＲ抗体の結合の決定
実施例１に従って作成された抗ＰＲＯＫＲ抗体を、ヒト、マウス、およびサルＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２に結合する能力について試験した。これらの実験のためにＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＰＲＯＫＲ１；ヒトＰＲＯＫＲ２；マウスＰＲＯＫＲ１；マウスＰＲＯＫＲ２；カニクイザルＰＲＯＫＲ１；またはカニクイザルＰＲＯＫＲ２を発現するように操作した。ＰＲＯＫＲ発現細胞系への抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体の結合を、フローサイトメトリーにより測定した。実験プロトコールを以下に記載し、結果を表２にまとめる。
【０１１１】
接着細胞をＰＢＳ中の１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて収集した後、洗浄し、５％ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳ中に再懸濁した。結合実験のために、それぞれの抗ＰＲＯＫＲ抗体を、５％ＦＢＳを含む５００μｌのＰＢＳ中で２５０，０００個の細胞に添加した（最終抗体濃度１３ｎＭ）。室温で２０分間インキュベートした後、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を洗浄した。次いで、ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５−１３５−２０５）またはマウスＦｃ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、＃５５０８２６）のいずれかを認識し、アロフィシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｙａｎｉｎ）にコンジュゲートした二次抗体を、最終濃度１３．３ｎＭで細胞混合物に添加した。氷上で２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に再懸濁した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーター上で選別および分析して、候補抗体による相対的結合を決定した。二次抗体のみを含有する細胞試料を、ＦＡＣＳゲーティングのための陰性対照として用いた。抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体で染色された細胞のヒストグラムを、二次抗体のみで染色された細胞と比較した。二次抗体のみについて観察されたシグナルよりも高いＰＲＯＫＲ  ＦＡＣＳ結合シグナルを示す細胞のパーセンテージ（「結合パーセンテージ」）を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）により算出した。結合パーセンテージが１０％より高かった場合、抗ＰＲＯＫＲ抗体で染色された試料を、ＦＡＣＳ陽性と記録した（表１中の「Ｐｏｓ」）。結合パーセンテージが１％より低いか、またはシグナルが親細胞上で検出された場合（すなわち、バックグラウンドシグナル）、抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体で染色された試料を、ＦＡＣＳ陰性として記録した（表１中の「Ｎｅｇ」）。結合パーセンテージが１％〜１０％であった場合、抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体で染色された試料を、弱いと記録した（表１中の「弱い」）。ＮＤ＝決定されず。
【０１１２】
【表２】
2016502520.tif 000004
【０１１３】
表２に示されるように、５つの抗体は、ヒトＰＲＯＫＲ１を発現する細胞に、およびヒトＰＲＯＫＲ２を発現する細胞に結合した：Ｈ４Ｈ６６６３Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ２Ｍ６３８５ＮおよびＨ１Ｍ６３８６Ｎ（Ｈ２Ｍ６３８５ＮおよびＨ１Ｍ６３８６ＮについてはヒトＰＲＯＫＲ１を発現する細胞に弱くしか結合しない）。試験した抗体のうちの２つは、ヒトＰＲＯＫＲ１を発現する細胞に結合したが、ヒトＰＲＯＫＲ２を発現する細胞には結合しなかった：Ｈ４Ｈ６６９０ＰおよびＨ４Ｈ６６９６Ｐ。
【０１１４】
ヒトＰＲＯＫＲ１を発現する細胞およびヒトＰＲＯＫＲ２を発現する細胞に結合した抗体Ｈ４Ｈ６６９８ＰおよびＨ４Ｈ６７０１Ｐは、マウスおよびサルのＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２を発現する細胞への陽性結合も示した。ヒトＰＲＯＫＲ１を発現する細胞に弱くしか結合しなかった抗体Ｈ２Ｍ６３８５Ｎは、マウスおよびサルＰＲＯＫＲ１への結合について陰性であったが、マウスおよびサルＰＲＯＫＲ２への結合について陽性であった。
【０１１５】
かくして、本実施例により示されるように、本発明は、（ａ）ヒトＰＲＯＫＲ１およびヒトＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する抗体；（ｂ）ヒトＰＲＯＫＲ１およびヒトＰＲＯＫＲ２、ならびに非ヒト種（例えば、マウスおよびサル）に由来するＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２に特異的に結合する抗体；ならびに（ｃ）ヒトＰＲＯＫＲ１に特異的に結合するが、ヒトＰＲＯＫＲ２には結合しない抗体を含む。本実施例に特に例示されるもの以外の、結合特異性パターンを有する抗ＰＲＯＫＲ抗体もまた、本発明の範囲内にあることが企図される。
【実施例４】
【０１１６】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２への抗ＰＲＯＫＲ抗体結合に関する平衡結合定数の決定
平衡解離定数（ＫＤ値）を、２５℃でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ４０００）アッセイを用いる表面動力学により実施例１に従って作成された選択精製された抗ＰＲＯＫＲ抗体への抗原結合について決定した。これらの実験のために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップへの直接アミンカップリングにより作出されたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ−１００８−３８）またはマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ−１００８−３９）表面のいずれか上に抗体を捕捉した。動力学実験を、ランニングバッファーと試料バッファーの両方としてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）を用いて実行した。抗原−抗体会合速度を、２つの濃度（２５および１００ｎＭ）のヒトＰＲＯＫＲ１（１−６２）−ｈＦｃ（配列番号１７９）とヒトＰＲＯＫＲ２（１−５３）−ｈＦｃ（配列番号１８０）の両方を、捕捉された抗体表面上に注入することによって測定した。抗体−抗原会合を９０秒間モニタリングしたが、解離を３６０秒間モニタリングした。動的結合速度（Ｋａ）および解離速度（Ｋｄ）定数を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェアバージョン２．０ｃを用いてデータから決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａおよびｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｄとして算出した。結果を表３（ＰＲＯＫＲ１結合）および表４（ＰＲＯＫＲ２結合）に示す（ＮＢ＝観察された結合なし）。
【０１１７】
【表３】
2016502520.tif 000005
【０１１８】
【表４】
2016502520.tif 000006
【０１１９】
表３に示されるように、１１種の抗ＰＲＯＫＲ抗体が、１９７ｐＭ〜１０．６ｎＭの範囲のＫＤ値でヒトＰＲＯＫＲ１（１−６２）−ｈＦｃタンパク質への結合を示した。表４に示されるように、１１種の抗ＰＲＯＫＲ抗体のうちの６種が、２．４１ｎＭ〜１２９ｎＭの範囲のＫＤ値でヒトＰＲＯＫＲ２（１−５３）−ｈＦｃタンパク質への結合を示した。５種の抗体（Ｈ１Ｍ６３８６Ｎ、Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９０Ｐ、およびＨ４Ｈ６７０６Ｐ）は、このアッセイ形式においてヒトＰＲＯＫＲ２（１−５３）−ｈＦｃタンパク質への測定可能な結合を示さなかった。
【実施例５】
【０１２０】
ＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２を安定に発現するように操作された細胞中でプロキネチシン媒介性カルシウム動員を阻害する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力
リガンドであるプロキネチシン１（ＰＫ１）およびプロキネチシン２（ＰＫ２）によるＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２の活性化を遮断する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、以下に記載されるような細胞に基づくアッセイを用いて決定した。
【０１２１】
ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＰＲＯＫＲ１（２９３／ｈＰＲＯＫＲ１）、ヒトＰＲＯＫＲ２（２９３／ｈＰＲＯＫＲ２）、マウスＰＲＯＫＲ１（２９３／ｍＰＲＯＫＲ１）、ラットＰＲＯＫＲ１（２９３／ｒＰＲＯＫＲ１）、カニクイザルＰＲＯＫＲ１（２９３／ｍｆＰＲＯＫＲ１）またはカニクイザルＰＲＯＫＲ２（２９３／ｍｆＰＲＯＫＲ２）のいずれかを安定に発現するように改変した。これらの実験のために、ＰＲＯＫＲ発現細胞系を、完全増殖培地［ＤＭＥ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃９０３３）、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３０００Ａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ＧＩＢＣＯ、＃１０３７８）、および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ、＃１１８１１−０９８）］中で維持した。
【０１２２】
細胞内カルシウムレベルを、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷカルシウムアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｆ３６２０６）を用いて測定した。ヒトＰＫ１またはヒトＰＫ２依存的カルシウム動員を阻害する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力を評価するために、ＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２を発現する細胞を、完全増殖培地中に２０，０００〜５０，０００個の細胞／ウェルで９６穴アッセイプレート中に播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩増殖させた。次の日、製造業者の仕様書通り、細胞培養培地をＦｌｕｏ−４  ＮＷキットアッセイバッファー＋カルシウム指示染料と置き換えた。阻害曲線のために、抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体を、１７ｐＭ〜１μＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、１時間インキュベートした（３７℃で３０分のインキュベーション、次いで、室温で３０分のインキュベーション）。次いで、ヒトＰＫ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；＃ＣＲＶ０１５Ｂ）またはｈＰＫ２（ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃ．；＃４０−１９０）をそれぞれの抗体用量応答のために添加して、一定のリガンド濃度を達成した（対応する表に示される）。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ高効率細胞スクリーニングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて少なくとも５０秒間にわたって毎秒測定した。ｈＰＫ１およびｈＰＫ２用量応答曲線のために、それぞれのリガンドを、７０ｐＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で抗体を含まない細胞に添加した後、ＲＦＵ値を測定した。最大−最小ＲＦＵを、それぞれのウェルについて算出し、ＥＣ５０／ＩＣ５０値を８または１２点の応答曲線上での４パラメータロジスティック方程式から決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。結果を表５〜表８に示す。表８に示される実験については、１ｎＭのｈＰＫ１が両アッセイにおいて用いられた定常濃度であった。
【０１２３】
【表５】
2016502520.tif 000007
【０１２４】
【表６】
2016502520.tif 000008
【０１２５】
【表７】
2016502520.tif 000009
【０１２６】
【表８】
2016502520.tif 000010
【０１２７】
１１種の抗ＰＲＯＫＲ１抗体を、２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の阻害について試験した。表６に示されるように、４種の抗体（Ｈ４ＨＭ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐ、およびＨ４Ｈ６６９６Ｐ）が、６．３ｎＭ〜１３．１ｎＭの範囲のＩＣ５０値で９８％を超えるＰＲＯＫＲ１活性を遮断した。別の抗ＰＲＯＫＲ抗体であるＨ１Ｍ６３８６Ｎは、１４．９ｎＭのＩＣ５０値で２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞のｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の９２％超を遮断した。４種の抗ＰＲＯＫＲ抗体（Ｈ４Ｈ６６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ６６７１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６８０Ｐ、Ｈ４Ｈ６７０６Ｐ）が、１１．２ｎＭ〜１６．４ｎＭの範囲のＩＣ５０値で２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の４５％〜６０％を遮断した。２種の抗ＰＲＯＫＲ抗体（Ｈ４Ｈ６６６３ＰおよびＨ４Ｈ６６９０Ｐ）が、２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の２５％未満を遮断した。
【０１２８】
また、５種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表６に示されるように２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の阻害について試験した。１種の抗ＰＲＯＫＲ抗体、Ｈ４ＨＭ６３８５Ｎが、５５．１ｎＭのＩＣ５０値で２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の７７％超を遮断したが、２種の抗ＰＲＯＫＲ抗体（Ｈ１Ｍ６３８６ＮおよびＨ４Ｈ６７０１Ｐ）が１６．２ｎＭおよび３００ｎＭを超えるＩＣ５０値でカルシウム動員の約６７％〜５７％を遮断した。２種の抗ＰＲＯＫＲ抗体（Ｈ４Ｈ６６９６ＰおよびＨ４Ｈ６６９８Ｐ）が、３００ｎＭを超えるＩＣ５０値で２９３／ｈＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の約４０％および３３％を遮断した。
【０１２９】
また、１０種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表６に示されるようにヒトＰＲＯＫＲ２機能の阻害についても試験した。Ｈ４Ｈ６７０１Ｐは、これらのアッセイ条件下で２９３／ｈＰＲＯＫＲ２細胞のｈＰＫ１またはｈＰＫ２媒介性カルシウム動員を遮断した。この抗体は、ｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の約４９％およびｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の約６１％を、両方とも３００ｎＭを超えるＩＣ５０値で遮断した。他の試験した抗体はいずれも、２９３／ｈＰＲＯＫＲ２細胞のｈＰＫ１またはｈＰＫ２媒介性カルシウム動員を遮断しなかった。
【０１３０】
５種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表７に示されるようにカニクイザルＰＲＯＫＲ１を発現する細胞中でｈＰＫ１媒介性カルシウム流動を阻害するその能力についてさらに試験した。４種の抗体（Ｈ４Ｈ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６Ｐ、およびＨ４Ｈ６６９８Ｐ）は、６．４ｎＭ〜３２．９ｎＭの範囲のＩＣ５０値で２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の９０％超を遮断した。１種の抗体、Ｈ１Ｍ６３８６Ｎは、２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム動員を測定可能な程度には遮断しなかった。また、４種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表７に示されるようにカニクイザルＰＲＯＫＲ１を発現する細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム流動を阻害するその能力についても試験した。１種の抗ＰＲＯＫＲ抗体、Ｈ４Ｈ６３８５Ｎは、５１．８ｎＭのＩＣ５０値で２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の約９４％を遮断した。別の抗ＰＲＯＫＲ抗体、Ｈ４Ｈ６６９８Ｐは、６３．９ｎＭのＩＣ５０値で２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の約８６％を遮断した。試験した他の２種の抗ＰＲＯＫＲ抗体（Ｈ４Ｈ６６９６ＰおよびＨ４Ｈ６７０１Ｐ）は、３００ｎＭを超えるＩＣ５０値で２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ１細胞中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の約６８％および５１％を遮断した。これらの４種の抗体を、表７に示されるようにサルＰＲＯＫＲ２を発現する細胞中でのｈＰＫ１またはｈＰＫ２媒介性カルシウム流動を阻害するその能力についても試験した。Ｈ４Ｈ６７０１Ｐは、ｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の約２１％およびｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の６１％を、両方とも３００ｎＭを超えるＩＣ５０値で遮断した。他の３種の試験した抗体は、これらのアッセイ条件下で２９３／ＭｆＰＲＯＫＲ２細胞のｈＰＫ１またはｈＰＫ２媒介性カルシウム動員を遮断しなかった。
【０１３１】
７種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表８に示されるようにマウスＰＲＯＫＲ１を発現する細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム流動を遮断する能力について試験した。Ｈ４Ｈ６７０１Ｐは、３００ｎＭを超えるＩＣ５０値で２９３／ｍＰＲＯＫＲ１細胞のｈＰＫ１媒介性カルシウム動員の約２１％を遮断し、他の６種の試験した抗体はこのアッセイにおいて遮断しなかった。４種の抗ＰＲＯＫＲ抗体を、表８に示されるようにラットＰＲＯＫＲ１を発現する細胞中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム流動を遮断する能力について試験した。試験した抗ＰＲＯＫＲ抗体はいずれも、これらのアッセイ条件下でｈＰＫ１による２９３／ｒＰＲＯＫＲ１の刺激を遮断しなかった。
【実施例６】
【０１３２】
ＰＲＯＫＲ１またはＰＲＯＫＲ２の誘導的発現のために操作された細胞中でのプロキネチシン媒介性カルシウム動員を阻害する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力
リガンドであるプロキネチシン１（ＰＫ１）およびプロキネチシン２（ＰＫ２）によるプロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）およびプロキネチシン受容体２（ＰＲＯＫＲ２）の活性化を遮断する抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体の能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、以下に記載のような細胞に基づくアッセイを用いて決定した。
【０１３３】
ＣＨＯ細胞を、ヒトＰＲＯＫＲ１（ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１）、ヒトＰＲＯＫＲ２（ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ２）、マウスＰＲＯＫＲ１（ＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ１）、またはマウスＰＲＯＫＲ２（ＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ２）のいずれかの誘導的発現のために改変した。これらの実験のために、ＰＲＯＫＲ発現細胞系を作成し、完全増殖培地［ＤＭＥ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃９０３３）、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３０００Ａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ＧＩＢＣＯ、＃１０３７８）、および５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ、＃１１８１１−０９８）］中で維持した。ＰＲＯＫＲ発現を誘導するために、ＣＨＯ細胞系を、０．５ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下で１６〜２４時間増殖させた。非誘導細胞を、同一の様式であるが、ドキシサイクリンの非存在下で取り扱った。ＦＡＣＳにより決定されたように、ＰＲＯＫＲ表面染色は誘導因子の非存在下であってもＣＨＯ細胞上に存在したが、誘導因子の存在下よりも低レベルで存在した。
【０１３４】
製造業者の仕様書通りにＦｌｕｏ−４  ＮＷカルシウムアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｆ３６２０６）を用いて、細胞内カルシウムレベルを測定した。ヒトＰＫ１またはヒトＰＫ２依存的カルシウム動員を阻害する抗ＰＲＯＫＲ抗体の能力を評価するために、ＣＨＯ細胞系をドキシサイクリンの存在下または非存在下で増殖させた。次いで、Ｆｌｕｏ−４  ＮＭアッセイバッファー中に１２５，０００個の細胞／ウェルで９６穴アッセイプレート中に細胞を播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした後、等量のＦｌｕｏ−４  ＮＷキットアッセイバッファー＋カルシウム指示染料を各ウェルに添加した。阻害曲線のために、抗ヒトＰＲＯＫＲ抗体を、１．０μＭ〜１．３ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、１時間インキュベートした（３７℃で３０分間のインキュベーション、次いで、室温で３０分間のインキュベーション）。次いで、一定濃度のｈＰＫ１またはｈＰＫ２（対応する図面に示される）を、抗体と共に予めインキュベートした細胞に添加し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて少なくとも５０秒間、毎秒測定した。ｈＰＫ１およびｈＰＫ２用量応答曲線のために、それぞれのリガンドを、１０ｐＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で抗体を含まない細胞に添加し、ＲＦＵを抗体阻害曲線についてと同様に測定した。最大−最小ＲＦＵをそれぞれの濃度について算出し、ＥＣ５０／ＩＣ５０値を、８または１２点応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式から決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。リガンドのＥＣ５０値または平均ＥＣ５０値（±ＳＥＭ）を、表９に示す。
【０１３５】
【表９】
2016502520.tif 000011
【０１３６】
４種の抗ＰＲＯＫＲ１抗体を、非誘導または誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１、ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ２、ＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ１、およびＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ２細胞系中でのｈＰＫ１およびｈＰＫ２媒介性カルシウム動員の阻害について試験した。非誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１細胞系中での遮断結果を、表１０に示す。
【０１３７】
【表１０】
2016502520.tif 000012
【０１３８】
表１０に示されるように、試験した４種全ての抗体（Ｈ４ＨＭ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６ＰおよびＨ４Ｈ６６９８Ｐ）が、３．１ｎＭ〜１４．２ｎＭの範囲のＩＣ５０値で非誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１細胞系（ｈＰＲＯＫＲ１低発現細胞）中でのｈＰＫ１媒介性カルシウム流動をベースラインレベル近くまで遮断した。これらの同じ抗体はまた、１９．１ｎＭ〜２７．４ｎＭの範囲のＩＣ５０値で非誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１細胞系中でのｈＰＫ２媒介性カルシウム流動をベースラインレベル近くまで遮断した。ＰＫ１またはＰＫ２のいずれかを用いるリガンド活性化の後に誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ１細胞系（ｈＰＲＯＫＲ１を高度に発現する細胞）中で遮断は観察されなかった。試験した抗体はいずれも、誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ２細胞系中でｈＰＫ１またはｈＰＫ２媒介性カルシウム流動の遮断を示さなかった。非誘導ＣＨＯ／ｈＰＲＯＫＲ２細胞のリガンド活性化は弱く、一貫性がなかった（データは示さない）ため、抗体遮断を評価することができなかった。試験した抗ＰＲＯＫＲ抗体はいずれも、同一のアッセイ条件下でｈＰＫ１またはｈＰＫ２を用いる非誘導または誘導ＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ１およびＣＨＯ／ｍＰＲＯＫＲ２細胞系の刺激を遮断しなかった。
【０１３９】
本実施例の結果は、抗ＰＲＯＫＲ抗体Ｈ４Ｈ６３８５Ｎ、Ｈ４Ｈ６７０１Ｐ、Ｈ４Ｈ６６９６ＰおよびＨ４Ｈ６６９８ＰがＰＫ１およびＰＫ２媒介性ＰＲＯＫＲ１シグナリングを効率的に遮断することを確認するものである。
【実施例７】
【０１４０】
ＤＳＳ誘導性大腸炎のモデルにおける抗ＰＲＯＫＲ抗体の効能
本実施例においては、７日間の経口デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、飲料水中の４％ｗ／ｖ）または水対照の投与後のオープンフィールド行動における変化を減衰させる抗ＰＲＯＫＲ抗体Ｈ４Ｈ６３８５Ｎの能力を評価した。
【０１４１】
マウスＰｒｏｋｒ１遺伝子のコード配列が対応するヒトＰＲＯＫＲ１配列と置き換えられたヒト化Ｐｒｏｋｒ１マウスを、この実験において用いた（雄と雌の混合、２１〜３１週齢）。別のマウスコホートは３０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のアイソタイプ対照抗体、３０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のＨ４Ｈ６３８５Ｎを受けたか、または注射を受けなかった。ＤＳＳ投与を、抗体投与の２４時間後に開始した。次いで、全てのマウスを自動化オープンフィールド装置（Ｋｉｎｄｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳｍａｒｔＦｒａｍｅ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）中で試験した。
【０１４２】
ＤＳＳ誘導性大腸炎はオープンフィールドアッセイの４つのパラメータを確実に変化させることが以前に観察された：不動に消費された時間（不動性）、探索活動の総量（総距離）、マウスがその後肢で立ち上がる回数（立ち上がり）およびマウスがその後肢で立ち上がるのに消費する時間量（立ち上がり時間）。それぞれの行動を実行するのに消費する全時間の合計または６０分間の試験期間にわたるそれぞれの行動の総計（必要に応じて）として表される、この実験の結果を、図１Ａ〜図１Ｄに示す（全データを群平均±ＳＥＭとして表す。各コホートはｎ＝８〜９／群である）。
【０１４３】
図１Ａ〜図１Ｄにまとめられたように、ＤＳＳ投与の前に例示的抗ＰＲＯＫＲ抗体Ｈ４Ｈ６３８５Ｎで処置されたマウスは、同等のＤＳＳ投与条件にかけられた未処置のマウスおよびアイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して改善されたオープンフィールド行動（すなわち、不動性の減少、総距離の増加、および立ち上がりの増加）を示した。
【０１４４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を制限されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が、前記説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2016502520.tif 000013
【配列表】
2016502520000001.app
【国際調査報告】
2016502520.tif 000014
2016502520.tif 000015