(57)【要約】  本開示は、腫瘍細胞において選択的に複製することができる変異ワクシニアウイルス株を提供する。本開示は、腫瘍を予防するかつ治療するための変異ワクシニアウイルス株の使用も提供する。
2016520298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞において選択的に複製することができ、正常細胞に対して減少した病原性を有する変異ワクシニアウイルス株。
【請求項２】
ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質を発現することができないように、ウイルスのゲノムにおける２つのワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子のコード配列が完全にまたは部分的にトランケートされている、請求項１に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項３】
ウイルスが機能的に活性なセルピンタンパク質を発現することができないように、ウイルスのゲノムにおけるセルピン遺伝子のコード配列が完全にまたは部分的にトランケートされている、請求項１または２に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項４】
ウイルスが機能的に活性なアンキリンタンパク質を発現することができないように、ウイルスのゲノムにおけるアンキリン遺伝子のコード配列が完全にまたは部分的にトランケートされている、請求項１から３のいずれか一項に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項５】
ｖ２０１３０７の受託番号で寄託されている、請求項１に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項６】
対応する非変異ワクシニアウイルスよりも小さいプラークを作る、請求項１に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項７】
腫瘍細胞がＨｅｐａｌ−６、ＭＣＦ−７、ＴＣａ８１１３、ＡＣＣ−Ｍ、ＬＮＣａＰ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ５４９、７４０２、７７２１およびＨｅｌａ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の変異ワクシニアウイルス株。
【請求項８】
標的遺伝子を腫瘍細胞に選択的に送達し、腫瘍細胞において標的遺伝子を発現させるためのベクターとしての、請求項１から６のいずれか一項に記載の変異ワクシニアウイルス株の使用。
【請求項９】
標的遺伝子を請求項１から６のいずれか一項に記載の変異ワクシニアウイルスのゲノム中に挿入することを含む、組換え遺伝子産物を作製するための方法。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか一項に記載の変異ワクシニアウイルスの核酸配列および標的遺伝子の核酸配列を含む、組換え遺伝子産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、新規な変異ワクシニアウイルス株、その使用およびそれを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、癌治療に関する研究において多くの注目を集めてきた。腫瘍細胞における治療遺伝子の形質導入効率および発現効率は、遺伝子治療法に重要である。様々な手法が、腫瘍細胞における遺伝子形質導入効率および発現効率を改善するために開発されてきた。様々なウイルスが、目的の遺伝子を腫瘍細胞に運搬するためのベクターとして使用される可能性について研究され、試験されてきた。しかしながら、腫瘍細胞のためのウイルスベクターの安全性および選択性は、遺伝子治療の候補としてウイルスベクターを選択する際に懸念される主要な問題である。
【０００３】
ワクシニアウイルスは、天然痘を引き起こすウイルスと密接な関連があり、天然痘根絶プログラムにおける生ワクチンとして使用されてきた。近年、ワクシニアウイルスは、遺伝子治療を受けている対象に目的の遺伝子を運搬し、送達するためのベクターとして研究の対象になっている。
【０００４】
ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に位置するワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子の２つのコピーを含む。ＶＧＦタンパク質は、高度にグリコシル化された７７残基の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ポリペプチドである。ＶＧＦタンパク質は、ウイルス感染の初期に発現され、分泌され、ワクシニア感染のために周囲の細胞をプライムするマイトジェンとして作用し、ワクシニアウイルス感染において重大な役割を果たすことが示された（非特許文献１）。
【０００５】
ワクシニアウイルスは、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子も含有する。セルピン遺伝子は、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子のファミリーである。セルピンは、凝固の調節、フィブリン溶解、免疫応答、炎症、腫瘍浸潤およびアポトーシスなどの複数の生物学的機能に潜在的に関与している（非特許文献２を参照されたい）。アンキリン遺伝子は、種々の複合的（integral）な膜タンパク質のための結合部位を有し、タンパク質間相互作用に関与する生物学的プロセスにおいて重大な役割を果たすタンパク質のファミリーをコードする（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（１９８８）：８６６−７４
【非特許文献２】Ｋｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２（２００４）：１４１−９
【非特許文献３】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（２００６）：１５１６８−７８
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本開示は、腫瘍細胞において選択的に複製することができる変異ワクシニアウイルス株に関する。いくつかの実施形態において、変異ウイルス株は、減少した病原性を有する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、ウイルスのゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子のコード配列が、全体的または部分的にトランケートされている、変異ワクシニアウイルス株を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、ウイルスのゲノムにおけるセルピン遺伝子のコード配列が、全体的または部分的にトランケートされている、変異ワクシニアウイルス株を提供する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、ウイルスのゲノムにおけるアンキリン遺伝子のコード配列が、全体的または部分的にトランケートされている、変異ワクシニアウイルス株を提供する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質を発現することができないように、ＶＧＦ遺伝子のコード配列をウイルスゲノムから完全にまたは部分的にトランケートすることを含む、変異ワクシニアウイルス株を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質、セルピンタンパク質およびアンキリンタンパク質を発現することができないように、ＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子のコード配列をウイルスゲノムから完全にまたは部分的にトランケートすることを含む。
【００１２】
別の態様において、本開示は、標的遺伝子を腫瘍細胞に選択的に送達し、腫瘍細胞において標的遺伝子を発現させるためのベクターとしての変異ワクシニアウイルスの使用を提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、標的遺伝子を本開示の変異ワクシニアウイルスのゲノム中に挿入することを含む、組換え遺伝子産物を作製するための方法を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書で記載した変異ワクシニアウイルスの核酸配列および標的遺伝子の核酸配列を含む、組換え遺伝子産物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ワクシニアウイルス株ＴｉａｎＴａｎのストックからクローンニングしたウイルスによって形成されたプラークを示す図である。プラーク精製された（plaque-purified）ウイルスのそれぞれを、ＢＳＣ−４０細胞上に別々に播種し、２日間培養し、固定し、クリスタルバイオレットで染色し、撮影した。次いで、ＩｍａｇｅＪ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（２０１２）：６７１−５）を使用して、各ウイルスクローンに関して各皿からランダムに選択した２０のプラークの面積サイズを測定した。オリジナルのストックは、大きいプラークと小さいプラークの両方の混合物を含有するように思われる。プラーク精製されたウイルスを、２つの群に分離した。そのうち、一方の群（例えばＴＰ０３、ＴＰ１１およびＴＰ１２）は、より小さいプラークを産生し、他方の群（例えばＴＰ０５、ＴＰ１３およびＴＰ１８）は、より大きいプラークを産生する。２つの群のプラークサイズ間の差は、統計的に有意である（Ｐ＜０．００１）。
【図２】ＢＳＣ−４０細胞に感染後のＴＰ０３型ワクシニアウイルスおよびＴＰ０５型ワクシニアウイルスの力価を示す図である。ＢＳＣ−４０細胞を、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）（すなわちＭＯＩ＝０．０１）でＴＰ０３およびＴＰ０５ウイルスにそれぞれ感染させ、３７℃でインキュベートし、凍結融解によって採取し、ウイルスの収量を、ＢＳＣ−４０細胞上での滴定によって測定した。ＴＰ０３ウイルスは、ＴＰ０５ウイルスよりも遅く、低い力価に増殖する。２つの株の間の増殖速度差は、統計的に有意である（Ｐ＜０．０１）。
【図３】テロメア欠失の存在を確認するための、ＰＣＲおよびサザンブロット結果を示す図である。ＴＴ００４Ｆ（配列番号：１）、ＴＴ０１１Ｒ（配列番号：２）およびＴＴ０１０Ｆ（配列番号：３）を、ＰＣＲのためのプライマーとして使用した。図３Ａは、ＴＰ０３およびＴＰ０５左テロメア領域へのＰＣＲプライマーの結合部位を示す。図３Ｂは、それぞれ、プライマー対として、ＴＴ０１０ＦおよびＴＴ０１１Ｒ、またはＴＴ００４ＦおよびＴＴ０１１Ｒを使用した、ＴＰ０３、ＴＰ０５、ＴＰ１１、ＴＰ１２、ＴＰ１３、ＴＰ１８、ＴＰ０５およびプール（ウイルスの未精製のストック）のＰＣＲ結果を示す。図３Ｃは、ＴＰ０３、ＴＰ１１、ＴＰ０５、ＴＰ１３およびプールにおける左および右ＴＩＲをコードするＳｃａＩで消化したＤＮＡのサザンブロット結果を示す。
【図４】１２の一般的なＶＡＣＶ株の左テロメア領域における遺伝子欠失の位置の比較を示す図である。丸を付けた縦棒は、左ＴＩＲ境界を表す。ＴＰ０３は、ウイルスゲノムの左テロメア領域におけるＶＧＦ遺伝子中まで広がる欠失を含む。
【図５】１２の一般的なＶＡＣＶ株の右テロメア領域における遺伝子欠失の位置の比較を示す図である。丸を付けた縦棒は、右ＴＩＲ境界を表す。ＴＰ０３は、ウイルスゲノムの右テロメア領域におけるＶＧＦ遺伝子中まで広がる欠失を含む。
【図６】ＴＰ０５型ウイルスの末端逆方向反復における５．７ｋｂｐ断片に位置する遺伝子を列挙した表である。この５．７ｋｂｐ断片は、ＴＰ０３型ウイルスから欠損している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
変異ワクシニアウイルス株
本開示の発明者らは、増強した安全性および腫瘍選択性を有する変異ワクシニアウイルス株を、ワクシニアウイルス株ＴｉａｎＴａｎから同定し、単離した。本発明者らは、サル腎臓ＢＳＣ−４０細胞上で培養した場合、ＴｉａｎＴａｎ株ワクシニアウイルスが様々な面積サイズを有するプラークを作ったことを発見した。プラークは、一般的に２つの型に分けることができ、一方の型は、他方の型よりも有意に小さい面積サイズを有する。クローニングおよびスクリーニングを通して、本発明者らは、ウイルスを２つの株に分離することができた。一方は、より小さいプラーク面積サイズを有するＴＰ０３型であり、他方は、より大きいプラーク面積サイズを有するＴＰ０５型である。いくつかの実施形態において、ＴＰ０３型は、ＴＰ０５型のプラークの面積サイズの約半分である面積サイズを有するプラークを有する（図１）。いくつかの実施形態において、ＴＰ０３型ワクシニアウイルスによって形成される小さいプラークのサイズは、ＴＰ０５型ワクシニアウイルスの大きいプラークのサイズの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、または約８０％未満とすることができる。プラークの面積サイズは、米国特許第４，２１３，９６５号、米国特許第５，６９０，９４０号および米国特許第７，０３７，５０８号において記載されているウイルスによって形成されるプラークの平均半径、直径、または面積を測定することによって決定することができる。
【００１６】
ＴＰ０３型は、非分裂宿主細胞上でＴＰ０５型よりも低い感染多重度を有することも見出された。いくつかの実施形態において、ＴＰ０３型の感染多重度は、ＴＰ０５型の感染多重度の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、または約５０％未満である（図２）。より低い感染多重度は、減少した病原性を示し得る。ウイルスの感染多重度は、ウイルスに感染した細胞または組織のウイルス力価または免疫組織化学的検査結果を測定することによって決定することができる。ウイルス力価の減少または改善された免疫組織化学的検査結果は、病原性の減少を示し得る。病原性評価の詳細な説明は、米国特許第７，７４０，８６７号および米国特許第７，７３２，１８８号において見出され得る。
【００１７】
さらに、ウイルスの病原性を、当技術分野で通常使用される他の方法、例えば、動物生存または宿主細胞増殖研究によって評価することができる。動物生存研究に関して、ウイルスを動物中に注入することができ、種々のウイルスでの感染後に生存している動物の百分率を記録して、生存曲線を作成する、および／またはＬＤ５０を決定することになる。より高い生存率またはより長い生存時間またはより高いＬＤ５０をもたらすウイルスは、減少した病原性、したがって増強された安全性を有すると考えることができる。
【００１８】
ＴＰ０３型およびＴＰ０５型ウイルスの遺伝子配列を、当技術分野で既知の標準的な配列決定方法を使用して決定した（例えば、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（２０１１）：１３０４９−６０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１７（２００３）：１６５−８６を参照されたい）。配列決定結果により、ＴＰ０３型がウイルスのゲノムにおける大きい欠失を含有する変異株である一方、ＴＰ０５型はオリジナルのＴｉａｎＴａｎウイルス株を代表する、ワクシニアウイルスのほぼ完全なゲノムを含有することが明らかになった。図４および５は、ＴＰ０３型およびＴＰ０５型ウイルスの左テロメアおよび右テロメアの模式図を示す。ＴＰ０３型の遺伝子欠失は、ウイルスの左および右テロメア逆方向反復（ＴＩＲ）における対称的な５．７ｋｂｐの欠失であり、ここでＶＧＦ遺伝子の両方のコピーのプロモーターおよびＮ末端が欠失しており、セルピン（ＳＰＩ−１）遺伝子、アンキリン遺伝子およびいくつかの他の遺伝子も欠失している。ＴＰ０３型ウイルスにおける遺伝子欠失およびＴＰ０５型ウイルスにおける対応するホモログ遺伝子を、図６に示す表中に列挙する。
【００１９】
ＴＰ０３型ウイルス株を、ブダペスト条約規定の下で、Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）で、ＣＣＴＣＣ受託番号第ｖ２０１３０７号として２０１３年４月８日に寄託した。
【００２０】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質を発現しないように、人工的にトランケートされたＶＧＦ遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスも提供する。「機能的に活性な」という用語は、タンパク質などの分子に関して使用される場合、分子がその活性状態で少なくとも１つの機能または活性を行うことができることを意味する。機能または活性は、例えば、生物学的、生理学的、免疫学的機能または活性を表すが、これらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおける両方のＶＧＦ遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるＶＧＦ遺伝子がトランケートされている。好ましい実施形態において、両方のＶＧＦ遺伝子が、完全にトランケートされている。いくつかの実施形態において、ＶＧＦ遺伝子は、近接するまたは近接していない、各ＶＧＦ遺伝子における少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００以上の近接するヌクレオチドの欠失によってトランケートされている。
【００２２】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なセルピンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたセルピン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスも提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるセルピン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるセルピン遺伝子がトランケートされている。好ましい実施形態において、セルピン遺伝子は、完全にトランケートされている。いくつかの実施形態において、セルピン遺伝子は、近接するまたは近接していない、各セルピン遺伝子における少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７００、９００以上の近接するヌクレオチドの欠失によってトランケートされている。
【００２３】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なアンキリンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたアンキリン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスも提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるアンキリン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるアンキリン遺伝子がトランケートされている。好ましい実施形態において、アンキリン遺伝子は、完全にトランケートされている。いくつかの実施形態において、アンキリン遺伝子は、近接するまたは近接していない、各アンキリン遺伝子における少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００以上の近接するヌクレオチドの欠失によってトランケートされている。
【００２４】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質およびセルピンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたＶＧＦ遺伝子およびセルピン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子およびセルピン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるＶＧＦおよびセルピン遺伝子のそれぞれがトランケートされている。好ましい実施形態において、ワクシニアウイルスゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子およびセルピン遺伝子の全ては、完全にトランケートされている。
【００２５】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質およびアンキリンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたＶＧＦ遺伝子およびアンキリン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子およびアンキリン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるＶＧＦおよびアンキリン遺伝子のそれぞれがトランケートされている。好ましい実施形態において、ワクシニアウイルスゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子およびアンキリン遺伝子の全ては、完全にトランケートされている。
【００２６】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なアンキリンタンパク質およびセルピンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたアンキリン遺伝子およびセルピン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるアンキリン遺伝子およびセルピン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるアンキリンおよびセルピン遺伝子のそれぞれがトランケートされている。好ましい実施形態において、ワクシニアウイルスゲノムにおけるアンキリン遺伝子およびセルピン遺伝子の全ては、完全にトランケートされている。
【００２７】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦ、セルピンおよびアンキリンタンパク質を発現することができないように、人工的にトランケートされたＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子を有する組換え変異ワクシニアウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスのゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子は、完全にまたは部分的にトランケートされており、例えば、９９％を超える、９８％を超える、９５％を超える、９０％を超える、８５％を超える、８０％を超える、７５％を超える、７０％を超える、６５％を超える、６０％を超える、５５％を超える、５０％を超える、４５％を超える、４０％を超える、３５％を超える、３０％を超える、２５％を超える、２０％を超える、１５％を超える、１０％を超えるＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子のそれぞれがトランケートされている。好ましい実施形態において、ワクシニアウイルスゲノムにおけるＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子、およびアンキリン遺伝子の全ては、完全にトランケートされている。
【００２８】
ウイルスゲノムにおける遺伝子トランケーションは、当技術分野で既知の様々な方法、例えば、相同組換えによって作製することができる。相同組換えは、ヌクレオチド配列が２つの類似したまたは同一の核酸分子間で交換される、遺伝的組換えの型である。相同組換えは、標的領域中への相同組換えのためのレポーター遺伝子を含有するワクシニアシャトルプラスミドを最初に作るステップ、天然のワクシニアウイルスで適した宿主細胞を感染させるステップ、ワクシニアシャトルプラスミドで天然のワクシニアウイルスをトランスフェクトして、標的領域中へのシャトルプラスミドの相同組換えを可能にするステップ、およびレポーター遺伝子産物に従って陽性のプラークを単離するステップによって行うことができる。ワクシニアウイルスシャトルベクターをデザインするための方法は、Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８５（２０１２）：１７５−８３；Ｂｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １５８（１９９５）：１５７−６２；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ６８（１９８８）：１−１０；Ｆａｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６４（１９９０）：３１０８−１１によって記載されているように、当技術分野で既知である。
【００２９】
別の態様において、本開示は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質を発現することができないように、ＶＧＦ遺伝子のコード配列を完全にまたは部分的にウイルスゲノムからトランケートすることを含む、変異ワクシニアウイルス株を作製する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルスが機能的に活性なセルピンタンパク質を発現することができないように、セルピン遺伝子のコード配列を完全にまたは部分的にウイルスゲノムからトランケートすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルスが機能的に活性なアンキリンタンパク質を発現することができないように、アンキリン遺伝子のコード配列を完全にまたは部分的にウイルスゲノムからトランケートすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルスが機能的に活性なＶＧＦタンパク質、セルピンタンパク質およびアンキリンタンパク質を発現することができないように、ＶＧＦ遺伝子、セルピン遺伝子およびアンキリン遺伝子のコード配列を完全にまたは部分的にウイルスゲノムからトランケートすることを含む。
【００３０】
ワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＴｉａｎＴａｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｙｅｔｈ（Ｄｒｙｖａｘとしても知られている）、１ＨＤ−Ｊ、およびＩＨＤ−Ｗ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ、Ｄａｉｒｅｎ  Ｉ、ＬＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、ＬＩＶＰ、ＷＲ  ６５−１６、およびＣｏｎｎａｕｇｈｔを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
変異ウイルス株の使用
本明細書で記載した変異ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製することができ、腫瘍細胞に選択的に感染させるのに有用であり得る。本明細書では、「選択的に複製する」は、細胞のある型（例えば腫瘍細胞）における変異ウイルスの複製速度が、細胞の別の型（例えば正常細胞）における複製速度よりも有意に高いことを意味する。いくつかの実施形態において、変異ワクシニアウイルスは、正常細胞におけるよりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍高い腫瘍細胞における感染多重度を示す。いくつかの実施形態において、変異ワクシニアウイルスは、正常細胞におけるよりも、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％高い腫瘍細胞における感染多重度を示す。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本開示の変異ワクシニアウイルスは、肝癌細胞（例えばＨｅｐａｌ−６細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、７４０２細胞、および７７２１細胞）、乳癌細胞（例えばＭＣＦ−７細胞）、舌癌細胞（例えばＴＣａ８１１３細胞）、腺様嚢胞癌細胞（例えばＡＣＣ−Ｍ細胞）、前立腺癌細胞（例えばＬＮＣａＰ細胞）、ヒト胚腎細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）、肺癌細胞（例えばＡ５４９細胞）、および子宮頸癌細胞（例えばＨｅｌａ細胞）において選択的に複製することができる。
【００３３】
別の態様において、本開示の変異ワクシニアウイルスは、正常細胞に対して減少した病原性を有する。いくつかの実施形態において、変異ワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満の正常細胞における感染多重度を示す。
【００３４】
別の態様において、本明細書で記載した変異ワクシニアウイルスは、標的遺伝子を腫瘍細胞に選択的に送達し、腫瘍細胞において標的遺伝子を発現させるためのベクターとして使用することができる。本明細書では、「発現する」という用語は、ＤＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼによって読まれて、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ鎖を作製するプロセス、および／またはＲＮＡ配列がリボソームによって読まれて、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列によってコードされるペプチドを作製するプロセスを表す。
【００３５】
別の態様において、本開示は、標的遺伝子を本開示の変異ワクシニアウイルスのゲノム中に挿入することを含む、組換え遺伝子産物を作製するための方法を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書で記載した変異ワクシニアウイルスの核酸配列および標的遺伝子の核酸配列を含む、組換え遺伝子産物を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、このような標的遺伝子は、腫瘍細胞を殺すもしくは阻害することができる遺伝子、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強することができる遺伝子、腫瘍細胞の変異もしくは改変遺伝子を修復するもしくは置換することができる遺伝子、または腫瘍細胞を化学療法もしくは放射線療法に対してより感受性にすることができる遺伝子を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、コロニー刺激因子（例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））、幹細胞因子、エリスロポエチン、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびケモカインなどのサイトカインである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、熱ショックタンパク質などの抗原提示ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、腫瘍と関連し得るタンパク質に対するモノクローナル抗体、例えば、血管内皮増殖因子または腫瘍壊死因子に対するモノクローナル抗体をコードする。
【００３７】
標的遺伝子を、当技術分野で既知の従来の方法を使用して、変異ワクシニアウイルス中に挿入することができる。例えば、標的遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製し、標的遺伝子の各末端上の特異的な酵素部位を保有することができ、この酵素部位は、変異ワクシニアウイルスにおける同じまたは類似する酵素部位に相補的であり、標的遺伝子は、酵素部位での結合を通してウイルスと連結している。より詳細に関しては、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００３８】
別の態様において、本開示の変異ワクシニアウイルスおよび変異ワクシニアウイルスを含有する組換え遺伝子産物は、腫瘍を予防するかつ処置するために有用であり得る。腫瘍の例は、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌（結腸癌、直腸癌）、脳癌、乳癌、カルチノイド癌、子宮頸癌、内分泌癌、眼癌、胆嚢癌、頭頸部癌、カポジ肉腫癌、腎癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫癌、メラノーマ癌、中皮腫癌、骨髄腫癌、神経内分泌癌、食道癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫癌、脊髄癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腟癌、外陰癌、または子宮癌を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、本開示を理解することを援助するために記載し、本明細書に含まれる特許請求の範囲において規定した本発明の範囲をいかなる方法においても限定すると解釈すべきではない。
【００４０】
実施例１．ウイルス単離および特徴付け
ワクシニアウイルス（ＴｉａｎＴａｎ株）をＣｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｗｕｈａｎ、Ｈｕｂｅｉ）から入手し、サル腎臓ＢＳＣ−４０細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞およびウイルスを、５％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン、および１％抗生物質で補充した修飾イーグル培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気において培養した。
【００４１】
ＶＡＣＶ株ＴｉａｎＴａｎのストックからの２４のウイルスクローンを、ランダムに選択し、プラークをＢＳＣ−４０細胞上で精製した。プラーク精製されたウイルスのそれぞれを、ＢＳＣ−４０細胞を使用して、低い感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１）で２日間培養し、固定し、クリスタルバイオレットで染色し、撮影した。次いで、ＩｍａｇｅＪ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（２０１２）：６７１−５）を使用して、各ウイルスクローンに関して２０のプラークの面積サイズを測定した。プラークは、各皿からランダムに選択した。これらのウイルスは、２種類のプラークを作った。図１において示すように、より多い（２１／２４クローン）ＴＰ０３型（代表的なクローン：ＴＰ０３、ＴＰ１１、ＴＰ１２）のウイルスが、ＴＰ０５型（３／２４クローン）（代表的なクローン：ＴＰ０５、ＴＰ１３、ＴＰ１８）のウイルスの面積サイズの約半分の面積サイズを有するより小さいプラークを形成した。ウイルス単離の結果は、ウイルスストックが、ウイルスの少なくとも２つの変異型、すなわちＴＰ０３型およびＴＰ０５型を含有することを示唆していた。
【００４２】
ＴＰ０３およびＴＰ０５の力価も、ＢＳＣ−４０細胞をＭＯＩ＝０．０１でＴＰ０３およびＴＰ０５に感染させることによって、経時的にプロットした。ウイルスを、３７℃でインキュベートし、凍結融解によって採取し、各時点でのウイルスの収量を、ＢＳＣ−４０細胞上での滴定によって決定した。図２において示すように、各時点でのＴＰ０３の力価は、ＴＰ０５の力価よりも低く、ＴＰ０３の増殖速度がＴＰ０５の増殖速度よりも遅いことを示している。
【００４３】
実施例２．ＴＰ０３型ウイルスにおける５．７ｋｂｐの欠失の解析
ＴＰ０３型およびＴＰ０５型のＤＮＡ材料を精製し、配列決定した。配列決定結果によれば、ＴＰ０３型は、それぞれ、ＴＰ０３型ウイルスの左および右テロメア逆方向反復（ＴＩＲ）に位置する２つの５．７ｋｂｐの欠失により、ＴＰ０５型とは異なる。
【００４４】
ＴＰ０３型のＴＩＲにおける５．７ｋｂｐの欠失の存在を、ＰＣＲによって確認した。ＰＣＲの結果を、図３において示し、ここで図３Ａは、ＴＰ０３およびＴＰ０５の左テロメアの地図におけるＰＣＲにおいて使用したプライマー（ＴＴ００４Ｆ、ＴＴ０１０ＦおよびＴＴ０１１Ｒ）の結合部位を示す。順方向プライマーＴＴ０１０Ｆ（５’ＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣ３’（配列番号：３））および逆方向プライマーＴＴ０１１Ｒ（５’ＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＧＡ３’（配列番号：２））をＰＣＲにおいて使用した場合、ＴＰ０３型（ＴＰ０３、ＴＰ１１、ＴＰ１２）のＤＮＡ増幅は観察されず（図３Ｂ）、これは、プライマーＴＴ０１０Ｆの結合部位が、ＴＰ０３型における５．７ｋｂｐの欠失により除去されていることによる。順方向プライマーＴＴ００４Ｆ（５’ＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴ３’（配列番号：１））および逆方向プライマーＴＴ０１１ＲをＰＣＲにおいて使用した場合、ＴＰ０３型のＤＮＡ増幅が観察された（図３Ｂ）。
【００４５】
対照的に、ＴＴ０１０ＦおよびＴＴ０１１ＲをＰＣＲにおけるプライマー対として使用した場合、ＴＰ０５型のＤＮＡ増幅が観察されるが（図３Ｂ）、これはプライマーＴＴ０１０Ｆの結合部位がＴＰ０５型において保持されているからである。ＴＴ００４ＦおよびＴＴ０１１Ｒを、ＰＣＲにおけるプライマー対として使用した場合、ＴＰ０５型のＤＮＡ増幅は観察されなかったが（図３Ｂ）、これはＴＰ０５型におけるプライマー対間の距離が離れすぎており、プライマーがＰＣＲプライマーとして役立つことができないからである。ＴＰ０３型における５．７ｋｂｐの欠失を、サザンブロットによっても確認し、ここでウイルスＤＮＡを、ＳｃａＩで消化し、次いで０．７％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移し、ビオチン標識プローブでブロットした。ＴＰ０３型（ＴＰ０３、ＴＰ１１）、ＴＰ０５型（ＴＰ０５、ＴＰ１３）およびプールのＳｃａＩ消化ＤＮＡのサザンブロット結果を、図３Ｃに示す。サザンブロットにおいて使用したプローブは、欠失境界の右側に及ぶＤＮＡをコードし（図３Ａ）、したがってＴＰ０３型における５．７ｋｂ欠失は、ＴＰ０５型と比較して、左および右ＴＩＲをコードするＳｃａＩ断片を大きく短縮する。ウイルスの未精製ストック（図３Ｃにおけるプール）は、ＴＰ０３型とＴＰ０５型の両方のウイルスを含有することが示された（図３Ｃ）。
【００４６】
実施例３．ウイルスゲノム解析
様々なワクシニアウイルスの遺伝子配列を、配列類似性または相違を調べるために互いに比較する。解析したワクシニアウイルス株は、ＣＬ３、ＡＣＡＭ２Ｋ、ＲＰＸＶ、Ｄｕｋｅ、Ｌｉｓｔｅｒ、ＣＶＡ、Ｃｏｐ、ＷＲ、ＨＰＸＶおよびＴｉａｎＴａｎ（ＴＰ０３およびＴＰ０５）を含む。「ＴＰ００」は、すでに公表されているＴｉａｎＴａｎウイルス配列（ＡＦ０９５６８９）を表す。
【００４７】
ゲノムアセンブリをＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖ４．６）を使用して作成し、以前に記載されているように（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（２０１１）：１３０４９−６０）、ＧＡＴＵ（Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７（２００６）：１５０）を使用してアノテートした。バイオインフォマティクス解析を、Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（２００５）：Ｄ３１１−６；Ｕｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．７０（２０００）：５５−６４）およびＰｏｘｖｉｒｕｓ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ（Ｅｈｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（２００２）：１５４４−５）を使用して行った。これらおよび追加のバイオインフォマティクスツールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｃａで入手することができる。示したウイルスに関する遺伝子ＤＶＸ０５８からＤＶＸ１５５（ＶＡＣＶ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ遺伝子Ｆ９ＬからＡ２４Ｒ）の遺伝子ホモログ間のウイルス配列の配列比較を作成した。
【００４８】
一般的なワクシニアウイルス株の左テロメアに及ぶ約２０ｋｂｐの配列を使用して、ＢＬＡＳＴＮ探索を行った（図４）。左ＴＩＲ境界の位置（図４における丸を付けた縦棒）は、左ＴＩＲ境界を囲んでいる領域における種々の欠失の存在により、株間で変動する。ＴＰ０５は、より完全なＶＡＣＶ株に似ており、ＴＰ０５のＴＩＲは、他のＶＡＣＶ株のＴＩＲにもっともよく似ている。
【００４９】
遺伝子欠失の類似したパターンも、種々のＶＡＣＶゲノムの右テロメアにおいて見出される（図５）。ＴＰ０５株は大部分の他のＶＡＣＶ株に類似している右テロメアにおける遺伝子の相補物をコードする一方で、ＴＰ０３は他のＶＡＣＶ株と比較して、ＶＧＦ遺伝子中に広がるＴＩＲ境界（図５における棒を付けた丸）の右側でのユニークな欠失をコードする。
【００５０】
ＴＰ０３型ウイルスの対称的な５．７ｋｂｐの欠失に位置する遺伝子を、ＴＰ０５型ウイルスおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株のホモログ遺伝子と比較する。図６における表に示すように、ＴＰ０５およびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株と比較すると、ＴＰ０３型ウイルスは、セルピン遺伝子（ＳＰＩ−１）、アンキリン遺伝子およびいくつかの他の遺伝子が、ウイルスゲノムの両端上のＴＩＲから完全に除去されている。加えて、ＶＧＦ遺伝子のプロモーターおよびＮ末端領域も、ＴＰ０３  ＤＮＡの両端から除去されており、ＶＧＦ遺伝子の２５３ｂｐ  Ｃ末端領域のみが、ＴＰ０３  ＤＮＡの各末端上に残っている。
【受託番号】
【００５１】
変異ワクシニアウイルス株  ＴＰ０３型：ＣＣＴＣＣ受託番号第ｖ２０１３０７号
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１：TT004F、フォワードプライマー
配列番号２：TT011R、リバースプライマー
配列番号３：TT010F、フォワードプライマー
【図１】
2016520298.tif 000003
【図２】
2016520298.tif 000004
【図３】
2016520298.tif 000005
【図４】
2016520298.tif 000006
【図５】
2016520298.tif 000007
【図６】
2016520298.tif 000008
【配列表】
2016520298000001.app
【国際調査報告】
2016520298.tif 000009
2016520298.tif 000010