(57)【要約】  本開示は、糸状菌細胞における異種タンパク質の産生に有用な組成物及び方法に関する。
2016523552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ活性が低下又は欠如している少なくとも１つの内在性プロテアーゼと、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドとを含む糸状菌細胞であって、以下のプロテアーゼ：ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５、ｐｅｐ９、ａｍｐ１及びｓｅｐ１の１つ以上のプロテアーゼ活性が低下又は欠如している、糸状菌細胞。
【請求項２】
トリコデルマ(Trichoderma)菌細胞、ミセリオフトラ(Myceliophthora)菌細胞、アスペルギルス(Aspergillus)菌細胞、ニューロスポラ(Neurospora)菌細胞、ペニシリウム(Penicillium)細胞、フサリウム(Fusarium)細胞又はクリソスポリウム(Chrysosporium)菌細胞である、請求項１に記載の糸状菌細胞。
【請求項３】
全プロテアーゼ活性が、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４０％以下、好ましくは６％以下に低下している、請求項１又は２に記載の糸状菌細胞。
【請求項４】
さらに、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２からなる群より選択される少なくとも３つ又は４つのプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下しているか、又は検出不可能である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項５】
少なくとも８つのプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記８つのプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記８つのプロテアーゼが、
ａ．ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ２
ｂ．ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ１、
ｃ．ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｓｅｐ１
ｄ．ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ９、又は
ｅ．ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２
のいずれかである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項６】
少なくとも９つのプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記９つのプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記９つのプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項７】
少なくとも１０のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１０のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１０のプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項８】
少なくとも１１のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１１のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１１のプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項９】
（ｉ）少なくとも１２のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１２のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１２のプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７であるか；
（ｉｉ）少なくとも１３のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３のプロテアーゼが、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；又は
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかであるか；
（ｉｉｉ）少なくとも１４のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４のプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２であるか；又は
（ｉｖ）少なくとも１５のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５のプロテアーゼをコードする遺伝子がそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５のプロテアーゼが、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項１０】
少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０又はそれ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、さらに、少なくとも１つ以上のさらなる突然変異を含み、さらなる突然変異がそれぞれ、対応するさらなるプロテアーゼ活性を低下又は消失させ、前記少なくともさらなるプロテアーゼが、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される、請求項９に記載の糸状菌細胞。
【請求項１１】
哺乳動物ポリペプチドが、抗体及びその抗原結合フラグメント、成長因子、インターフェロン、サイトカイン並びにインターロイキンからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項１２】
活性が低下しているＡＬＧ３をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項１３】
ＡＬＧ３をコードする遺伝子が、対応する活性を低下又は消失させる突然変異を含む、請求項１２に記載の糸状菌細胞。
【請求項１４】
さらに、
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、及び、場合により
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の糸状菌細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の糸状菌細胞を提供すること、及び
ｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養すること、
を含み、
前記異種ポリペプチドが、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞において産生される異種ポリペプチドと比較して増加した安定性を示す、方法。
【請求項１６】
異種ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の糸状菌細胞を提供すること、
ｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養すること、及び
ｃ）前記異種ポリペプチドを精製すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、糸状菌細胞における異種タンパク質の産生に有用な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
真核生物タンパク質、特に治療タンパク質（例えば、免疫グロブリン）の翻訳後修飾は、多くの場合、タンパク質の適切なフォールディング及び機能に必要である。標準的な原核生物発現系は、このような修飾に必要な適切な機構を欠くため、これらの治療タンパク質の生産では、別の発現系を使用しなければならない。真核生物タンパク質が翻訳後修飾を有しない場合でさえ、原核生物発現系は、多くの場合、適切なフォールディングに要求される必要なシャペロンタンパク質を欠く。酵母及び真菌は、単純な培地中で大規模に成長させ得るので低い生産コストが可能になり、酵母及び真菌は、哺乳動物細胞に見られるのと類似の機能を果たす翻訳後機構及びシャペロンを有するため、タンパク質を発現させるための魅力的な選択肢である。さらに、酵母細胞及び真菌細胞の比較的単純な遺伝子構成だけではなく、より複雑な真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞又は昆虫細胞）も操作するためのツールが利用可能である（De Pourcq et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87(5):1617-31）。これらの利点にもかかわらず、多くの治療タンパク質は依然として、哺乳動物細胞（これらは、ネイティブなヒトタンパク質に最も類似する翻訳後修飾を有する治療タンパク質を産生するのに対して、酵母及び真菌により天然に産生される翻訳後修飾は、哺乳動物細胞に見られるものとは異なることが多い）において生産されている。
【０００３】
この欠陥に対処するために、ネイティブなヒトタンパク質に見られるものにより密接に類似する翻訳後修飾を産生する酵母及び真菌の新たな株が開発されている。したがって、酵母細胞及び真菌細胞を使用して、より複雑なタンパク質を発現させることが新たな関心対象になっている。しかしながら、業界の焦点は、長期間にわたって哺乳動物細胞培養技術に当てられていたため、真菌細胞発現系（例えば、Trichoderma）は、哺乳動物細胞培養ほど十分に確立されておらず、したがって、哺乳動物タンパク質を発現させる際の欠点に悩まされている。
【０００４】
したがって、当技術分野では、好ましくは高い発現レベルで、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリン）を安定的に産生し得る改善された糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能である糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）であって、増加したレベルで産生される異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）を含む組成物が本明細書に記載される。異種ポリペプチドの安定性を改善する方法、及びプロテアーゼ活性が低下している異種ポリペプチドを作製する方法が本明細書にさらに記載される。以下のプロテアーゼ：ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１の１個以上の活性が低下しているか、又は検出不可能である糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）を含む組成物が本明細書にさらに記載される。
【０００６】
したがって、一態様は、プロテアーゼ活性が低下又は欠如している少なくとも１個の内在性プロテアーゼと、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドとを含む糸状菌細胞であって、以下のプロテアーゼ：ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ２の１個以上のプロテアーゼ活性が低下又は欠如している糸状菌細胞を含む。特定の一実施態様では、ポリペプチドの産生レベルは、プロテアーゼ活性が低下していない対応する糸状菌細胞において産生される同じポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高い。
【０００７】
先の実施態様と組み合わせ得る別の態様では、それは、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能である糸状菌細胞であって、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を含む。特定の実施態様では、細胞がAspergillus細胞である場合、全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親Aspergillus細胞の全プロテアーゼ活性の５０％以下に低下している。
【０００８】
先の実施態様と組み合わせ得る一実施態様では、糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４９％以下、４０％以下、３１％以下、６％以下に低下している。
【０００９】
特定の実施態様では、少なくとも３個のプロテアーゼの発現レベルが低下又は消失している。特定の実施態様では、３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含む。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、３個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１及びｓｌｐ１である。他の実施態様では、３個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｇａｐ１、ｓｌｐ１及びｐｅｐ１である。
【００１０】
特定の実施態様では、前記菌細胞は、４個の内在性プロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能であり；前記４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含む。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、４個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１及びｇａｐ１である。
【００１１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、３個又は４個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、３個又は４個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される。特定の実施態様では、３個又は４個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２及びｔｓｐ１から選択される。
【００１２】
他の実施態様では、前記菌細胞は、５個の内在性プロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能であり；前記５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含む。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、５個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４である。他の実施態様では、５個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｇａｐ２である。
【００１３】
特定の実施態様では、前記菌細胞は、６個の内在性プロテアーゼの活性が低下しているか、又は検不出可能であり；前記６個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含む。特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む６個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記６個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２及びｐｅｐ４である。
【００１４】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される３〜６個のプロテアーゼのそれぞれの活性が低下しているか、又は検出不可能である３〜６個のプロテアーゼを有する。
【００１５】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む７個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記７個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４及びｐｅｐ３である。
【００１６】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む８個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記８個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３及びｐｅｐ５である。
【００１７】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、活性が低下しているさらなるプロテアーゼを有し、前記さらなるプロテアーゼをコードする遺伝子は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記さらなるプロテアーゼは、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７及びｓｌｐ８から選択される。
【００１８】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む８個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記８個のプロテアーゼコード遺伝子は、
ａ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ１、
ｂ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ２、
ｃ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｓｅｐ１、
ｄ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ９、又は
ｅ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２
のいずれかである。
【００１９】
場合により、先の実施態様の特定の一実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をさらに含む。
【００２０】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む９個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記９個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２及びｓｅｐ１である。場合により、このような実施態様の特定の一実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をさらに含む。
【００２１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む１０個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記１０個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１及びｓｌｐ８である。場合により、このような実施態様の特定の一実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をさらに含む。
【００２２】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む１１個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記１１個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８及びａｍｐ２である。場合により、このような実施態様の特定の一実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をさらに含む。
【００２３】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む１２個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記１２個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２及びｓｌｐ７である。
【００２４】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、少なくとも１３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかである。
【００２５】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、少なくとも１４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２である；
【００２６】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、少なくとも１５個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである。
【００２７】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個又はそれ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記細胞は、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７からなる群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３からなる群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５からなる群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９からなる群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７からなる群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２８】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、グリコシル化されている。
【００２９】
特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体及びその抗原結合フラグメント、成長因子、インターフェロン、サイトカイン並びにインターロイキンから選択される。特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、免疫グロブリン又は抗体又はそれらのＦｃフラグメントである。特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）から選択される。
【００３０】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、非哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様では、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００３１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、活性が低下しているか、又は検出不可能である、マンノシルトランスフェラーゼ酵素であるＡＬＧ３をさらに含有する。特定の実施態様では、ＡＬＧ３をコードする遺伝子は、対応する活性を低下又は消失させる突然変異を含有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。
【００３２】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、活性が低下していることが望ましいプロテアーゼの発現を低下させる突然変異を有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、プロテアーゼをコードする遺伝子内の欠損である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の一部の欠損である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の一部の点突然変異を有する。
【００３３】
他の実施態様では、１個以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の低下又は消失は、ｉ）１個のプロテアーゼ、又はｉｉ）ｐｅｐ型プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、ｇａｐ型プロテアーゼ（proteae）、セドリシンプロテアーゼ及びｓｌｐ型プロテアーゼからなる群より選択される２個以上のプロテアーゼに対して特異的なＲＮＡｉ構築物からもたらされる。特定の実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５及び／又はｓｌｐ６に対して特異的である。
【００３４】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含有する。特定の実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、ポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１のポリヌクレオチドによってコードされ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、第２のポリヌクレオチドによってコードされる。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、マンノシダーゼＩＩ及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。特定の実施態様では、前記菌細胞は、α１，２マンノシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を含有し、前記酵素は、ターゲティングペプチド、例えば、対応する酵素の適切な局在化のための異種ターゲティングペプチドをさらに含む。特定の実施態様では、ターゲティングペプチドは、配列番号５８９〜５９４から選択される。
【００３５】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、Trichoderma菌細胞、Myceliophthora菌細胞、Aspergillus菌細胞、Neurospora菌細胞、Fusarium若しくはPenicilium菌細胞又はChrysosporium菌細胞である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、Trichoderma reeseiである。
【００３６】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記菌細胞は、ｐｅｐ４プロテアーゼについて野生型である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１プロテアーゼについて野生型である。
【００３７】
別の態様は、ａ）先の実施態様のいずれかの糸状菌細胞を提供すること；及びｂ）異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記異種ポリペプチドが、プロテアーゼ活性が低下していない（例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない）対応する親糸状菌細胞において産生される異種ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する方法を含む。別の態様は、ａ）先の実施態様のいずれかの糸状菌細胞を提供すること；ｂ）異種ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること、及びｃ）前記異種ポリペプチドを精製することによって、異種ポリペプチドを作製する方法を含む。
【００３８】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記糸状菌細胞は、担体タンパク質をさらに含有する。特定の実施態様では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤を含む培地中で培養する。特定の実施態様では、ＳＢＴ１及びキモスタチンから選択される１個又は２個のプロテアーゼ阻害剤を有する培地中で培養する。特定の実施態様では、例えば、国際公開公報第２００５０４７３０２号に記載されているさらなる共発現若しくは共培養、例えばＳＢＴＩ若しくはＢＢＩ、又は国際公開公報第２００９０７１５３０号に記載されているｓｌｐ阻害剤、例えばｐｅｐｃ阻害剤を用いて、本発明にしたがって、プロテアーゼ活性（protease activites）が低下又は消失する。
【００３９】
特定の実施態様では、前記方法にしたがって産生される異種ポリペプチドは、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド、好ましくは抗体又はそのＦｃグリコシル化フラグメントであり、前記ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン又はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンからなる。他の実施態様では、前記方法にしたがって産生される異種ポリペプチドは、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド、好ましくは抗体又はそのＦｃグリコシル化フラグメントであり、前記ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）は、複合体Ｎ−グリカン、例えばＧ０、Ｇ１又はＧ２グリコシル化形態又はそのフコシル化形態ＦＧ０、ＦＧ１及びＦＧ２からなる。特定の実施態様では、前記方法にしたがって産生される異種ポリペプチドは、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド、好ましくは抗体又はそのＦｃグリコシル化フラグメントであり、前記ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）は、ハイブリッドＮ−グリカンからなる。特定の実施態様では、前記方法にしたがって産生される異種ポリペプチドは、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド、好ましくは抗体又はそのＦｃグリコシル化フラグメントであり、前記ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）は、Ｇ１又はＧ２  Ｎ−グリカンからなる。別の態様は、上記の方法により入手可能な異種ポリペプチド、好ましくは抗体又はそのＦｃグリコシル化フラグメントを含む。
【００４０】
別の態様は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能であるTrichoderma菌細胞又は近縁種（Myceliophthora菌細胞、Aspergillus菌細胞、Neurospora菌細胞、Penicillium細胞、Fusarium細胞又はChrysosporium菌細胞を含む）であって、対応する親菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物のポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞又は近縁種を含む。
【００４１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、活性が低下しているか、又は検出不可能である以下のプロテアーゼ：ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１の１個以上をさらに含有する。
【００４２】
特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞において、少なくとも３個のプロテアーゼの発現レベルが低下又は消失している。特定の実施態様では、少なくとも３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含む。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、ｇａｐ１、ｓｌｐ１及びｐｅｐ１から選択される、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を有する３個のプロテアーゼコード遺伝子を含む。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における哺乳動物ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメント又は免疫グロブリンであり、少なくとも３個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む４個のプロテアーゼコード遺伝子を含有し、このような突然変異を有する前記４個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１及びｇａｐ１である。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む５個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記５個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における哺乳動物ポリペプチドは、成長因子、インターフェロン、サイトカイン又はインターロイキンであり、活性が低下している３個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７及び場合によりｔｓｐ１から選択される。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む５個のプロテアーゼコード遺伝子を含み、このような突然変異を有する前記５個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｇａｐ２である。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む６個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記６個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２及びｐｅｐ４である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異をそれぞれが含む７個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、前記７個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４及びｐｅｐ３である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそ��ぞれが含む８個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記８個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３及びｐｅｐ５である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそれぞれが含む８個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記８個のプロテアーゼコード遺伝子は、
（ｉ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ１；
（ｉｉ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ａｍｐ２；
（ｉｉｉ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｓｅｐ１；
（ｉｖ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ９；又は、
（ｖ）ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２
のいずれかから選択される。
【００４３】
このような実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させるさらなる突然変異をさらに含み得る。
【００４４】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそれぞれが含む９個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記９個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１である。このような実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させるさらなる突然変異をさらに含み得る。
【００４５】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそれぞれが含む１０個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記１０個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８である。このような実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させるさらなる突然変異をさらに含み得る。
【００４６】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそれぞれが含む１１個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記１１個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２である。このような実施態様では、前記細胞は、ｔｓｐ１のプロテアーゼ活性を低下又は消失させるさらなる突然変異をさらに含み得る。
【００４７】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、対応するプロテアーゼ活性を低下する突然変異をそれぞれが含む１２個のプロテアーゼコード遺伝子を有し、このような突然変異を有する前記１２個のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７である。
【００４８】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、少なくとも１３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかである。
【００４９】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、少なくとも１４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２である；
【００５０】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、少なくとも１５個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである。
【００５１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、活性が低下しているか、又は検出不可能である１個以上のさらなるプロテアーゼをさらに含有する。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における１個以上のさらなるプロテアーゼの発現レベルが低下又は消失している。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における１個以上のさらなるプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、１個以上のさらなるプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７及びｓｌｐ８から選択される。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、１個以上のさらなるプロテアーゼコード遺伝子は、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される。
【００５２】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、活性が低下しているか、又は検出不可能であるＡＬＧ３をさらに含有する。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞におけるＡＬＧ３コード遺伝子は、対応する活性を低下又は消失させる突然変異を含有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、α−１，２マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における遺伝子の発現を低下又は消失させる。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞における遺伝子の欠損である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞におけるプロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の一部の欠損である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、突然変異は、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞におけるプロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の一部の点突然変異である。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含有する。特定の実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞のポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１のポリヌクレオチドによってコードされ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、Trichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞の第２のポリヌクレオチドによってコードされる。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞は、マンノシダーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。特定の実施態様では、前記プロテアーゼはそれぞれ、配列番号１、１７、３７、５８、６６、８２、９８、１１８、１２９、１６６及び１８２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。特定の実施態様では、Trichoderma菌細胞における全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない対応するTrichoderma親細胞の全プロテアーゼ活性の４９％以下、４０％以下、３１％以下、６％以下に低下している。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記細胞は、対応する親Trichoderma菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、対応する親Trichoderma菌細胞における全長型ポリペプチドの産生レベルよりも高いレベルで、全長型で産生される。
【００５３】
別の態様は、ａ）先の実施態様のいずれかのTrichoderma菌細胞を提供すること；及びｂ）異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記異種ポリペプチドが、プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法を含む。別の態様は、ａ）先の実施態様のいずれかのTrichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞を提供すること；ｂ）異種ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること、及びｃ）前記異種ポリペプチドを精製することによって、異種ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン若しくは抗体又はそのグリコシル化Ｆｃフラグメント）を作製する方法を含む。先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、前記糸状菌細胞は、担体タンパク質をさらに含有する。特定の実施態様では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、１０重プロテアーゼ欠損株Ｍ６３３（４８−７０Ｃ；Ｍ６５９は、再精製したＭ６３３である）の作製を示すサザンブロット分析を示す。図Ａは、ｓｅｐ１  ＯＲＦの予想シグナルを示す：Ｍ１２４（Δ０）及びＭ５７４（Δ９）の７．５kb、トランスフォーマントのシグナルはなし。図Ｂは、ｓｅｐ１  ５’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ１２４の７．５kb、トランスフォーマントの３．１kb、ｐＴＴｖ２５５の３．９kb。図Ｃは、ｓｅｐ１  ３’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ１２４の７．５kb、トランスフォーマントの３．９kb、ｐＴＴｖ２５５の３．９kb。
【図２】図２は、１１重プロテアーゼ欠損株Ｍ７５０（５４−１３１−２）の作製を示すサザンブロット分析を示す。図Ａは、ｓｌｐ８  ＯＲＦの予想シグナルを示す：Ｍ１２４（Δ０）及びＭ６５９（Δ１０）の５．６kb、トランスフォーマントのシグナルはなし。全てのサンプルに見られるかすかなシグナルパターンは、非特異的バックグラウンドである。図Ｂは、ｓｅｐ８  ５’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ６５９の５．６kb、トランスフォーマントの２．９kb、ｐＴＴｖ３３０の６．７kb。図Ｃは、ｓｅｐ８  ３’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ６５９の５．６kb、トランスフォーマントの４．２kb、ｐＴＴｖ３３０の６．７kb。株Ｍ７５１（５４−１５９−１）は、両方のプローブで複数のシグナルを示しているが、これは、いくつかの欠損カセットのゲノムへの組み込み、及びおそらくはさらにゲノム再編成を示している。
【図３】図３は、１２重プロテアーゼ欠損株Ｍ８９３（５９−６Ａ）の作製を示すサザンブロット分析を示す。図Ａは、ａｍｐ２  ＯＲＦの予想シグナルを示す：Ｍ１２４（Δ０）及びＭ７５０（Δ１１）の５．５kb、トランスフォーマントのシグナルはなし。図Ｂは、ａｍｐ２  ５’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ１２４及びＭ７５０の５．５kb、トランスフォーマントの３．６kb、ｐＴＴｖ３２７の６．６kb。全てのサンプルで約７kbに見られるシグナルは、非特異的バックグラウンドである。図Ｃは、ａｍｐ２  ３’フランクの予想シグナルを示す：Ｍ１２４及びＭ７５０の５．５kb、トランスフォーマントの４．５kb、ｐＴＴｖ３２７の６．６kb。
【図４】図４は、９重プロテアーゼ欠損株の２４ウェル培養を示す。クエン酸二アンモニウム、１００mM ＰＩＰＰＳ、２０g/Lビール粕抽出物、４０g/Lラクトースを含む硫酸アンモニウム不含ＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、２８℃で振盪しながら、培養物を成長させた。培養上清 ０．５μlからのインターフェロンアルファ２ｂ発現のイムノブロット。
【図５】図５は、インターフェロンを発現する９プロテアーゼ欠損株の発酵槽培養を示す。ＴｒＭＭ＋２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース、４０g/Lソルボース（ｐＨ４．５）中で、株を成長させた。上清 ０．１μl由来のインターフェロンアルファ２ｂを検出するイムノブロット。標準量のインターフェロン ５０、１００及び２００ngを使用して、標準曲線を作成した。
【図６】図６は、Ｔｒｉａｂ１２５及びＴｒｉａｂ１２６発酵で培養したＭ６７４の上清中のインターフェロンアルファ２ｂの産生レベルを示すイムノブロットを示す。
【図７】図７は、ｓｌｐ２サイレンシング株及びコントロールＭ５７７株の２４ウェル培養を示す。クエン酸二アンモニウム、１００mM ＰＩＰＰＳ、２０g/Lビール粕抽出物、４０g/Lラクトースを含む硫酸アンモニウム不含ＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、２８℃で振盪しながら、培養物を成長させた。培養上清０．２μlからのインターフェロンアルファ２ｂ発現のイムノブロット。
【図８】図８は、２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）を使用して、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせた、発酵槽におけるＭ９６０株及びＭ９６１株の培養を示す。上清 ０．０５μl由来のインターフェロンアルファ２ｂを検出するイムノブロット。インターフェロン標準は、４００、２００、１００、５０及び２５ngであった。
【図９】図９は、選択した糸状菌のａｍｐ１及びａｍｐ２の系統樹を示す。
【図１０】図１０は、選択した糸状菌のｓｅｐ１の系統樹を示す。
【図１１】図１１は、選択した糸状菌のｐｅｐ９の系統樹を示す。
【図１２】プロテアーゼ阻害剤で処理した２４ウェル培養物におけるＦＧＦ２１産生。ＦＧＦ２１標準曲線を用いてイムノブロッティングによって、６日目の上清サンプルをアッセイした。一次抗体及び基準物質は、Ｎｏｖａｒｔｉｓが提供しているものであった。使用前に、ＴＢＳＴで一次抗体を２μg/mlに希釈した。ＴＢＳＴでヤギ抗ウサギ二次（Bioradヤギ抗ウサギAP #170-6518）を１：１０，０００希釈した。
【図１３】４〜６日目のＭ３９３コントロール株及び新たなＦＧＦ２１トランスフォーマントからのＦＧＦ２１及びＣＢＨＩ発現を検出するイムノブロット。新たなトランスフォーマントは、Ｍ１０７６のトランスフォーメーションによるものである。ＣＢＨＩ担体が６０kD付近に検出され、ＦＧＦ２１を含まない産物が１０kDに検出された。
【図１４】抗ＦＧＦ２１抗体を使用して、阻害剤の有無の下におけるＭ１２００株及びＭ１２０５株の培養由来の発酵サンプルからのＦＧＦ２１発現を検出するイムノブロット。定量のために、標準量のＦＧＦ２１が各ブロットに含まれている。１レーン当たり０．１μlがロードされるように、上清を希釈した。
【図１５】プロテアーゼ阻害剤処理の有無の下における２４ウェル培養で成長させたＭ１２００株からのＦＧＦ２１発現を検出するイムノブロット。ペプスタチン、キモスタチン、１，１０−フェナントロリンを最終濃度１０μMで使用し、ＳＢＴＩを０．１mg/mlで使用した。１ウェル当たり培養上清＋オレンジＬＳＢ ２μlをロードした。一般に、全抗ＦＧＦ２１抗体を使用して、産生された全ての形態のＦＧＦ２１を検出したが、右下のブロットでは、Ｎ末端抗体を使用して、Ｎ末端含有形態を検出した。また、右下のブロットでは、抗ＣＢＨＩ抗体を検出に使用した。
【図１６】プロテアーゼ阻害剤処理の有無の下における２４ウェル培養で成長させたＭ１２００株からのＦＧＦ２１発現を検出するイムノブロット。ペプスタチン、キモスタチン、１，１０−フェナントロリンを最終濃度１０μMで使用し、ＳＢＴＩを０．１mg/mlで使用した。１ウェル当たり培養上清＋オレンジＬＳＢ ２μlをロードした。全抗ＦＧＦ２１抗体及びＣ末端抗体を使用して、Ｃ末端及び全ての形態のＦＧＦ２１タンパク質を検出した。左のブロットでは、抗ＣＢＨＩ抗体を検出に使用した。
【図１７】２４ウェル培養で発現されたＭＡＢ０１重鎖を示すイムノブロット。各上清 ０．５μlを４〜１５％ゲルにロードした。ＴＢＳＴで１：１０，０００希釈した抗ＩｇＧ重鎖ＡＰコンジュゲート（Sigma# A3188）を用いて、検出した。PromegaＡＰ基質を用いて、展開した。
【図１８】ＭＡＢ０１重鎖を示すイムノブロット。各上清 ０．０５μlを４〜１５％ゲルにロードした。ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈した抗ヒトＦｃ抗体IRDye 700 DXコンジュゲート（Rockland #609-130-003）を用いて、重鎖を検出した。Odyssey CLx near infrared imager (Li-Cor)を使用して、７００nmの蛍光を検出した。
【図１９】図１９は、欠損の影響を受けやすいプロテアーゼのサブセットの系統樹を示す。
【図２０】図２０は、各プロテアーゼ欠損上清及び親株Ｍ１２４由来の培養上清の正規化したプロテアーゼ活性データをグラフで示す。最初の５つの株ではｐＨ５．５において、及び最後の３つの欠損株ではｐＨ４．５において、プロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性は、緑色蛍光カゼインに対するものである。６プロテアーゼ欠損株は、野生型親株のわずか６％であり、７プロテアーゼ欠損株のプロテアーゼ活性は、６プロテアーゼ欠損株の活性よりも約４０％低かった。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
本発明は、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している糸状菌細胞において、リコンビナント異種ポリペプチドを作製する改善された方法に関する。本発明はさらに、以下のプロテアーゼ：ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１の活性が低下又は欠如している糸状菌細胞において、リコンビナント異種ポリペプチドを作製する改善された方法に関する。本発明は、糸状菌細胞における特定の組み合わせの内在性プロテアーゼの活性を低下させると、様々な組換え発現異種タンパク質（例えば、免疫グロブリン及び成長因子）の発現及び安定性が増加するという驚くべき発見に部分的に基づくものである。他の者が、不活性化された１個以上のプロテアーゼを有するTrichoderma菌細胞を作製しているが、いずれのプロテアーゼが、特定の種類のタンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質）の発現及び安定性の増加に最も関連するかに関するガイダンスは提供されていない。例えば、国際公開公報第２０１１／０７５６７７号では、Trichodermaにおいてノックアウトすることができる特定のプロテアーゼが開示されており、複数のプロテアーゼが欠損しているTrichoderma菌細胞がさらに開示されている。
【００５６】
しかしながら、国際公開公報第２０１１／０７５６７７号では、いかなる哺乳動物タンパク質の発現例も記載されていないので、いずれのプロテアーゼが、哺乳動物タンパク質（例えば、免疫グロブリン又は成長因子）の発現及び安定性に対して悪影響を及ぼすのかに関するいかなるガイダンスも提供されていない。さらに、国際公開公報第２０１１／０７５６７７号では、単一のプロテアーゼが欠損している３つの異なる各菌株における単一真菌タンパク質の異種発現が開示されている。したがって、当業者であれば、国際公開公報第２０１１／０７５６７７号は、各単一プロテアーゼの不活性化が異種タンパク質の産生に十分であると教示していると読み取る可能性があるであろう。Yoonら(2009, Appl. Microbiol Biotechnol 82: 691-701, 2010: Appl. Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-010-2937-0)は、Aspergillus oryzaeにおける異種タンパク質の産生について、５重プロテアーゼ遺伝子破壊株及び１０重プロテアーゼ遺伝子破壊株の構築を報告した。１０プロテアーゼ破壊細胞は、多数のプロテアーゼ遺伝子が破壊されているにもかかわらず、キモシンの産生収量をわずか３．８倍改善するにすぎない。Van den Homberghらは、Aspergillus nigerの３重プロテアーゼ遺伝子破壊株を報告した。このデータでは、プロテアーゼ活性の低下が示されているが、本明細書に記載されるいかなる哺乳動物タンパク質産生の例も存在しない。国際公開公報第２００２０６８６２３号では、Aspergillus nigerのａｍｐ１、ｓｅｐ１及びｐｅｐ９プロテアーゼがさらに報告されており、国際公開公報第２０１２０４８３３４号では、Myceliophtora thermophilaのａｍｐ２、ｓｅｐ１及びｐｅｐ９プロテアーゼが報告されている。他の報告では、糸状菌株におけるｓｅｐ１プロテアーゼのクローニング及び特性評価が記載されている（国際公開公報第２０１１０７７３５９号、国際公開公報第２００９１４４２６９号、国際公開公報第２００７６２９３６号及び国際公開公報第２００２０４５５２４号）。国際公開公報第２０１２０３２４７２号及び国際公開公報第２００６１１０６７７号では、ｐｅｐ９のクローニング及び特性評価も記載されている。
【００５７】
本出願人らは、驚くべきことに、複数のプロテアーゼが、糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）における全プロテアーゼ活性の低下、異種タンパク質の産生の増加、及び発現後の異種タンパク質の安定化に関連することを示した。特に、本発明者らは、これらのプロテアーゼを精製し、異種タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質）の分解に最も関連する活性を有するものを決定することによって、（ゲノム中の単にコードされているのものとは対照的に）Trichoderma菌細胞で実際に発現されるプロテアーゼを同定した。加えて、本発明者らは、特定のプロテアーゼ活性に関与する遺伝子を欠損させることによって、全プロテアーゼ活性の実質的な低下が達成されこれが、このような欠損を含有する糸状菌細胞において産生されるタンパク質の量及び品質の両方の点で、タンパク質安定化の増加と相関しており、前記細胞における全長異種タンパク質の産生の増加をもたらしたことを確認した。また、少なくとも３個のプロテアーゼ遺伝子の活性を低下させるように操作したTrichoderma菌細胞は、全長哺乳動物タンパク質（例えば、抗体）、治療タンパク質又は抗体変異体（例えば、Ｆａｂ又は単一ドメイン抗体）の産生の予想外の相乗的な増加をもたらしたことが見出された。換言すれば、産生された全長哺乳動物タンパク質の量は、１個又は２個のプロテアーゼ遺伝子欠損のみを含有するTrichoderma菌細胞において産生された量の合計よりも多かった。したがって、国際公開公報第２０１１／０７５６７７号とは対照的に、本発明者らは、細胞における少なくとも３個のプロテアーゼの活性を低下又は消失させることによって、糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）におけるインタクトな異種タンパク質の産生を達成することができることを示した。
【００５８】
したがって、本開示の特定の態様は、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如していることによって、増加したレベルの異種タンパク質を産生する糸状菌細胞であって、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を提供する。換言すれば、異種タンパク質の産生レベルの所望の増加は、少なくとも３個のプロテアーゼ活性が低下している糸状菌細胞における異種タンパク質の産生レベルを、このような活性が低下していないが、増加レベルを示す細胞と他の点では同一である糸状菌細胞のものと比較することにより決定可能である。
【００５９】
本開示の他の態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示の糸状菌細胞であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を提供すること；及びｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記異種ポリペプチドが、前記プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法を提供する。
【００６０】
本開示のさらに他の態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示の糸状菌細胞であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を提供すること；ｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること；及びｃ）前記異種ポリペプチドを精製することによって、異種ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００６１】
本開示の特定の態様はまた、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如していることによって、増加したレベルの哺乳動物ポリペプチドを産生するTrichoderma菌細胞であって、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親Trichoderma菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供する。換言すれば、異種タンパク質の産生レベルの所望の増加は、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているTrichoderma菌細胞における異種タンパク質の産生レベルを、このような活性が低下していないが、増加レベルを示す細胞と他の点では同一であるTrichoderma菌細胞のものと比較することにより決定可能である。
【００６２】
本開示の特定の態様はまた、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される少なくとも１個以上のプロテアーゼの活性が低下又は欠如していることによって、増加したレベルの哺乳動物ポリペプチドを産生するTrichoderma菌細胞を提供する。
【００６３】
本開示の他の態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下している本開示のTrichoderma菌細胞であって、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供すること；及びｂ）前記哺乳動物ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、哺乳動物ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記哺乳動物ポリペプチドが、前記プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法を提供する。
【００６４】
本開示の他の態様は、ａ）ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される少なくとも１個以上のプロテアーゼの活性が低下している本開示のTrichoderma菌細胞であって、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供すること；及びｂ）前記哺乳動物ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、哺乳動物ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記哺乳動物ポリペプチドが、前記プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法を提供する。
【００６５】
本開示のさらなる態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下している本開示のTrichoderma菌細胞であって、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供すること；ｂ）前記哺乳動物ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること；及びｃ）前記哺乳動物ポリペプチドを精製することによって、哺乳動物ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００６６】
定義
本明細書で使用される「免疫グロブリン」は、互いに共有結合している重鎖及び軽鎖を含有する多量体タンパク質であって、抗原と特異的に結合することができる多量体タンパク質を指す。免疫グロブリン分子は、数種類の分子（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）を含む大きな分子ファミリーである。
【００６７】
本明細書で使用される「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけではなく、抗原に結合することができるそのフラグメントを指す。これらとしては、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Winter et al. Nature 349:293-99225, 1991；米国特許第４，８１６，５６７２２６号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメント及びＦｖ分子；非共有結合ヘテロ二量体［２２７、２２８］；単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（例えば、Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5897-83, 1988を参照のこと）；二量体及び三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（例えば、Pack et al. Biochem 31, 1579-84, 1992;及びCumber et al. J. Immunology 149B, 120-26, 1992を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann et al. Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan et al. Science 239, 1534-36, 1988；及び英国特許出願公開第２，２７６，１６９号を参照のこと）；並びにこのような分子から得られた任意の機能的フラグメント、並びに非従来のプロセス（例えば、ファージディスプレイ）によって得られた抗体が挙げられる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当技術分野で周知である。
【００６８】
本明細書で使用される「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、複数の連続する重合アミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。本発明の目的のために、典型的には、ペプチドは、最大５０個のアミノ酸残基を含む分子であり、ポリペプチドは、５０個超のアミノ酸残基を含む。ペプチド又はポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、コドンによってコードされない天然に存在するアミノ酸残基、及び天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。本明細書で使用される「タンパク質」は、任意のサイズのペプチド又はポリペプチドを指し得る。
【００６９】
本発明のプロテアーゼ
本明細書に記載される本発明は、細胞に見られる少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能であることによって、増加したレベルの異種ポリペプチド（例えば、哺乳動物ポリペプチド）を産生する糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）に関する。異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞に見られるこのようなプロテアーゼは、通常、発現されたリコンビナントポリペプチドの有意な分解を触媒する。したがって、異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞におけるプロテアーゼの活性を低下又は消失させることによって、発現されたポリペプチドの安定性が増加し、ポリペプチドの産生レベルの増加、及び一部の状況では、産生されるポリペプチドの品質の改善（例えば、分解されたものではなく全長）がもたらされる。
【００７０】
限定されないが、アスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びセドリシンプロテアーゼを含むプロテアーゼ。このようなプロテアーゼを同定し、糸状菌細胞から単離し、試験して、それらの活性の低下が、糸状菌細胞からのリコンビナントポリペプチドの産生に影響を与えるかを決定し得る。プロテアーゼを同定及び単離するための方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、親和性クロマトグラフィー、ザイモグラムアッセイ及びゲル電気泳動が挙げられる。次いで、リコンビナントポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド又は哺乳動物ポリペプチド）を発現する糸状菌細胞から同定されたプロテアーゼをコードする遺伝子を欠損させ、欠損が、細胞の全プロテアーゼ活性を、例えば、対応する親糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４９％以下又は３１％以下のレベルに低下させるか；並びに、発現されるリコンビナントポリペプチドの産生レベルを、例えば、対応する親糸状菌細胞における産生レベルよりも２倍高く増加させるかを決定することによって、同定したプロテアーゼを試験し得る。遺伝子を欠損させ、全プロテアーゼ活性を測定し、産生されるタンパク質のレベルを測定するための方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法が挙げられる。「対応する親糸状菌細胞」は、プロテアーゼ活性が低下及び消失していない対応する細胞を指す。
【００７１】
アスパラギン酸プロテアーゼ
アスパラギン酸プロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解にアスパラギン酸残基を使用する酵素である。典型的には、アスパラギン酸プロテアーゼは、高度に保存された２個のアスパラギン酸残基をそれらの活性部位に含有し、酸性ｐＨで最適に活性である。真核生物（例えば、Trichoderma菌）由来のアスパラギン酸プロテアーゼとしては、ペプシン、カテプシン及びレニンが挙げられる。このようなアスパラギン酸プロテアーゼは、先祖遺伝子の重複から生じたものと考えられる２つのドメイン構造を有する。このような重複事象と一致して、各ドメインの全体的なフォールディングは類似しているが、２つのドメインの配列は相違し始めている。各ドメインは、触媒アスパラギン酸残基の一方に寄与する。活性部位は、アスパラギン酸プロテアーゼの２つのドメインにより形成されたクレフトにある。真核生物アスパラギン酸プロテアーゼは、ポリペプチドをアスパラギン酸プロテアーゼであると同定するのに役立ち得る保存されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００７２】
Trichoderma菌細胞では、１５個のアスパラギン酸プロテアーゼが同定されている：ｐｅｐ１（ｔｒｅ７４１５６）、ｐｅｐ２（ｔｒｅ５３９６１）、ｐｅｐ３（ｔｒｅ１２１１３３）、ｐｅｐ４（ｔｒｅ７７５７９）、ｐｅｐ５（ｔｒｅ８１００４）、ｐｅｐ６（ｔｒｅ６８６６２）、ｐｅｐ７（ｔｒｅ５８６６９）、ｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）、ｐｅｐ９（ｔｒｅ７９８０７）、ｐｅｐ１０（ｔｒｅ７８６３９）、ｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）、ｐｅｐ１２（ｔｒｅ１１９８７６）、ｐｅｐ１３（ｔｒｅ７６８８７）、ｐｅｐ１４（ｔｒｅ１０８６８６）及びｐｅｐ１６（ｔｒｅ１１０４９０）。
【００７３】
ｐｅｐ１
適切なｐｅｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep1（配列番号１）、Hypocrea lixii gi|11558498（配列番号２）、Trichoderma asperellum gi|47027997（配列番号３）、Trichoderma atroviride jgi|Triat2|297887（配列番号４）、Trichoderma virens jgi|TriviGv29_8_2|81777（配列番号５）、Aspergillus fumigatus jgi|Trire2|afm:Afu5g13300（配列番号６）、Aspergillus oryzae gi|94730408（配列番号７）、Metarhizium anisopliae gi|322712783（配列番号８）、Gibberella zeae gi|46126795（配列番号９）、Fusarium venenatum gi|18448713（配列番号１０）、Fusarium oxysporum gi|342879173（配列番号１１）、Grosmannia clavigera gi|320591399（配列番号１２）、Verticillium alboatrum gi|302422750（配列番号１３）、Chaetomium globosum gi|116182964（配列番号１４）、Neurospora crassa gi|85110723（配列番号１５）、Neurospora tetrasperma gi|336463990（配列番号１６）、Myceliophthora thermophila gi367030924（配列番号４９１）、Penicillium chrysogenum gi255953325（配列番号４９２）、Aspergillus niger gi350639535（配列番号４９３）、Aspergillus nidulans gi67541436（配列番号４９４）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００７４】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ１プロテアーゼは、配列番号１〜１６、配列番号４９１〜４９４から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１〜１６、配列番号４９１〜４９４から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００７５】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ１は、T. reesei  ｐｅｐ１である。T. reesei  ｐｅｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１と１００％の同一性を有する。
【００７６】
ｐｅｐ２
適切なｐｅｐ２プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep2（配列番号１８２）、T atroviride jgi|Triat2|142040（配列番号１８３）、T virens jgi|TriviGv29_8_2|53481（配列番号１８４）、Cordyceps militaris CM01 gi|346326575（配列番号１８５）、Neurospora crassa gi 85111370（配列番号４９５）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００７７】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ２プロテアーゼは、配列番号１８２〜１８５、配列番号４９５から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１８２〜１８５、配列番号４９５から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００７８】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ２は、T. reesei  ｐｅｐ２である。T. reesei  ｐｅｐ２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１８２に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１８２と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１８２と１００％の同一性を有する。
【００７９】
ｐｅｐ３
適切なｐｅｐ３プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep3（配列番号１７）、T atroviride jgi|Triat2（配列番号１８）、T virens、jgi|TriviGv29_8_2（配列番号１９）、Hypocrea lixii gi|145583125（配列番号２０）、Trichoderma asperellum gi|51860175（配列番号２１）、Aspergillus niger gi|317025164（配列番号２２）、Aspergillus fumigatus gi|159122534（配列番号２３）、Aspergillus niger gi|134054572（配列番号２４）、Cordyceps militaris、gi|346318620（配列番号２５）、Glomerella graminicola gi|310800156（配列番号２６）、Fusarium oxysporum gi|342871221（配列番号２７）、Grosmannia clavigera gi|320591121（配列番号２８）、Botryotinia fuckeliana gi|12002205（配列番号２９）、Thielavia terrestris gi|346997107（配列番号３０）、Sclerotinia sclerotiorum gi|156055954（配列番号３１）、Chaetomium globosum gi|116197829（配列番号３２）、Neurospora tetrasperma gi|336472132（配列番号３３）、Neurospora crassa gi|85102020（配列番号３４）、Neosartorya fischeri gi|119467426（配列番号３５）、Penicillium marneffei gi|212534792（配列番号３６）、M. thermophila gi367025909（配列番号４９６）、P. chrysogenum gi255947264（配列番号４９７）、A. oryzae 391870123（配列番号４９８）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００８０】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ３プロテアーゼは、配列番号１７〜３６、配列番号４９６〜４９８から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１７〜３６、配列番号４９６〜４９８から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００８１】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ３は、T. reesei  ｐｅｐ３である。T. reesei  ｐｅｐ３によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１７に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１７と５０％上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１７と１００％の同一性を有する。
【００８２】
ｐｅｐ４
適切なｐｅｐ４プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep4（配列番号３７）、T virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号３８）、T atroviride jgi|Triat2（配列番号３９）、Trichoderma aureoviride gi|193735605（配列番号４０）、Aspergillus niger gi|145232965（配列番号４１）、Aspergillus fumigatus gi|70999520（配列番号４２）、Aspergillus clavatus gi|121705756（配列番号４３）、Nectria haematococca gi|302899226（配列番号４４）、Glomerella graminicola gi|310796316（配列番号４５）、Cordyceps militaris gi|346322842（配列番号４６）、Gibberella zeae gi|46138535（配列番号４７）、Metarhizium anisopliae gi|322708430（配列番号４８）、Fusarium oxysporum gi|342882947（配列番号４９）、Metarhizium acridum gi|322700747（配列番号５０）、Verticillium dahliae、gi|346973691（配列番号５１）、Botryotinia fuckeliana gi|154309857（配列番号５２）、Chaetomium globosum gi|116203505（配列番号５３）、Thielavia terrestris gi|347001590（配列番号５４）、Magnaporthe oryzae gi|39973863（配列番号５５）、Tuber melanosporum gi|296417651（配列番号５６）、Neurospora crassa gi|85094599（配列番号５７）、M. thermophila gi367031892 gi255947264（配列番号４９９）、P. chrysogenum gi255936729 gi255947264（配列番号５００）、 A. oryzae gi169770745 gi255947264（配列番号５０１）、 A. nidulans gi67524891 gi255947264（配列番号５０２）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００８３】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ４プロテアーゼは、配列番号３７〜５７、配列番号４９９〜５０２から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号３７〜５７、配列番号４９９〜５０２から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ４は、T. reesei  ｐｅｐ４である。T. reesei  ｐｅｐ４によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号３７に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号３７と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号３７と１００％の同一性を有する。
【００８５】
ｐｅｐ５
適切なｐｅｐ５遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep5（配列番号５８）、T virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号５９）、T atroviride jgi|Triat2|277859（配列番号６０）、Metarhizium acridum gi|322695806（配列番号６１）、Fusarium oxysporum gi|156071418（配列番号６２）、Cordyceps militaris gi|346324830（配列番号６３）、Gibberella zeae gi|46124247（配列番号６４）、Verticillium dahliae gi|346978752（配列番号６５）、M. thermophila gi367019798（配列番号５０３）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００８６】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ５プロテアーゼは、配列番号５８〜６５、配列番号５０３から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５８〜６５、配列番号５０３から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００８７】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ５は、T. reesei  ｐｅｐ５である。T. reesei  ｐｅｐ５によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号５８に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号５８と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５８と１００％の同一性を有する。
【００８８】
ｐｅｐ７
適切なｐｅｐ７遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep7（配列番号１８６）、Trichoderma atroviride jgi|Triat2（配列番号１８７）、Trichoderma virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号１８８）、Glomerella graminicola gi|310800487（配列番号１８９）、Metarhizium acridum gi|322700577（配列番号１９０）、Thielavia terrestris gi|347003264（配列番号１９１）、Podospora anserine gi|171680938（配列番号１９２）、Chaetomium thermophilum gi|340905460（配列番号１９３）、Verticillium dahliae gi|346975960（配列番号１９４）、Myceliophthora thermophila gi|347009870、gi367026634（配列番号１９５）、Neurospora crassa gi|85090078（配列番号１９６）、Magnaporthe oryzae gi|39948622（配列番号１９７）、Chaetomium globosum gi|116191517（配列番号１９８）、Magnaporthe oryzae gi|39970765（配列番号１９９）、A. nidulans gi67522232（配列番号５０４）、A. niger gi350630464（配列番号５０５）、A. oryzae gi317138074（配列番号５０６）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００８９】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ７プロテアーゼは、配列番号１８６〜１９９、配列番号５０４〜５０６から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１８６〜１９９、配列番号５０４〜５０６から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００９０】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ７は、T. reesei  ｐｅｐ７である。T. reesei  ｐｅｐ７によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１８６に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１８６と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１８６と１００％の同一性を有する。
【００９１】
ｐｅｐ８
適切なｐｅｐ８遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep8 EGR48424（配列番号５０７）、Trichoderma virens EHK19238（配列番号５０８）、Trichoderma atroviride EHK40047（配列番号５０９）、Neurospora tetrasperma EGO53367（配列番号５１０）、Myceliophthora thermophila XP_003658897（配列番号５１１）、Neurospora crassa XP_965343(配列番号５１２）、Metarhizium anisopliae EFZ03501（配列番号５１３）、Thielavia terrestris XP_003656869（配列番号５１４）、Fusarium oxysporum EGU79769（配列番号５１５）及びGibberella zeae XP_381566（配列番号５１６）、Magnaporthe oryzae XP_°°3714540.1（配列番号５１７）、P. chrysogenum XP_002557331（配列番号５１８）、A. oryzae XP_001822899.1（配列番号５１９）、A. nidulans XP_664091.1（配列番号５２０）、A. niger EHA24387.1（配列番号５２１）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００９２】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ８プロテアーゼは、配列番号５０７〜５２１から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５０７〜５２１から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００９３】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ８は、T. reesei  ｐｅｐ８である。T. reesei  ｐｅｐ８によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号５０７に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号５０７と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５０７と１００％の同一性を有する。
【００９４】
ｐｅｐ９
適切なｐｅｐ９遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep9 79807（配列番号７５０）、Trichoderma virens 158334（配列番号７５１）、Trichoderma atroviride 90832（配列番号７５２）、 Fusarium graminicola XP_384573.1(配列番号７５３）、Neurospora crassa XP_001727974.1（配列番号７５４）、Myceliophthora thermophila XP_003667167.1(配列番号５２８） 、Aspergillus oryzae XP_001821372.2（配列番号５２９）、Aspergillus niger ABM05950.1（配列番号７５５）、Aspergillus fumigatus XP_752122.1（配列番号７５６）、Aspergillus nidulans XP_662026.1（配列番号７５７）、Penicillium Wisconsin XP_002565726.1（配列番号７５８）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００９５】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ９プロテアーゼは、配列番号７５０〜７５８から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７５０〜７５８から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００９６】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ９は、T. reesei  ｐｅｐ９である。T. reesei  ｐｅｐ９によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７５０に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号７５０と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７５０と１００％の同一性を有する。
【００９７】
ｐｅｐ１１
適切なｐｅｐ１１遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep11 EGR49498（配列番号５２２）、Trichoderma virens EHK26120（配列番号５２３）、Trichoderma atroviride  EHK41756（配列番号５２４）、 Fusarium pseudograminearum EKJ74550（配列番号５２５）、Metarhizium acridum EFY91821（配列番号５２６）及びGibberella zeae XP_384151(配列番号５２７）、M. thermophila XP_003667387.1(配列番号５２８） 、N. crassa XP_960328.1（配列番号５２９）及びそれらのホモログが挙げられる。
【００９８】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ１１プロテアーゼは、配列番号５２２〜５２９から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５２２〜５２９から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【００９９】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ１１は、T. reesei  ｐｅｐ１１である。T. reesei  ｐｅｐ１１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号５２２に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号５２２と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５２２と１００％の同一性を有する。
【０１００】
ｐｅｐ１２
適切なｐｅｐ１２遺伝子の例としては、限定されないが、Trichoderma reesei pep12 EGR52517（配列番号５３０）、Trichoderma virens pep12 EHK18859（配列番号５３１）、Trichoderma atroviride  pep12 EHK45753（配列番号５３２）、Fusarium pseudograminearum pep12 EKJ73392（配列番号５３３）、Gibberella zeae pep12 XP_388759（配列番号５３４）及びMetarhizium anisopliae pep12 EFY95489（配列番号５３５）、N. crassa XP_964574.1（配列番号５３６）、M. thermophila XP_003659978.1（配列番号５３７）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１０１】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ１２プロテアーゼは、配列番号５３０〜５３７から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５３０〜５３７から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１０２】
いくつかの実施態様では、ｐｅｐ１２は、T. reesei  ｐｅｐ１２である。T. reesei  ｐｅｐ１２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号５３０に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号５３０と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号５３０と１００％の同一性を有する。
【０１０３】
ｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４及びｐｅｐ１６
他のアスパラギン酸プロテアーゼとしては、限定されないが、T. reesei ｐｅｐ６＿（Ｔｒｅ６８６６２、配列番号８８０）、ｐｅｐ１０＿（Ｔｒｅ７８６３９、配列番号８８１）、ｐｅｐ１３＿（Ｔｒｅ７６８８７、配列番号８８２）、ｐｅｐ１４＿（Ｔｒｅ１０８６８６、配列番号８８３）又はｐｅｐ１６＿（Ｔｒｅ１１０４９０、配列番号８８４）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１０４】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４、ｐｅｐ１６プロテアーゼは、配列番号８８０〜８８４から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８８０〜８８４から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１０５】
トリプシン様セリンプロテアーゼ
トリプシン様セリンプロテアーゼは、トリプシンのものと類似の基質特異性を有する酵素である。トリプシン様セリンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解にセリン残基を使用する。典型的には、トリプシン様セリンプロテアーゼは、正電荷のアミノ酸残基の後ろにあるペプチド結合を切断する。真核生物（例えば、Trichoderma菌）由来のトリプシン様セリンプロテアーゼとしては、トリプシン１、トリプシン２及びメソトリプシンが挙げられる。このようなトリプシン様セリンプロテアーゼは、一般に、活性部位のセリンを求核性にするのに有用な電荷リレーを形成する３個のアミノ酸残基（例えば、ヒスチジン、アスパラギン酸及びセリン）の触媒トライアドを含有する。真核生物トリプシン様セリンプロテアーゼは、グリシン及びセリンの骨格アミド水素原子により形成される「オキシアニオンホール」（これは、ポリペプチドをトリプシン様セリンプロテアーゼであると同定するのに役立ち得る）をさらに含む。
【０１０６】
Trichoderma菌細胞では、１個のトリプシン様セリンプロテアーゼが同定されている：ｔｓｐ１（ｔｒｅ７３８９７）。下記のように、ｔｓｐ１は、リコンビナントポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）の発現に有意な影響を与えることが実証されている。
【０１０７】
国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例３で考察されているように、セリンプロテアーゼがTrichodermaから精製され、哺乳動物タンパク質を分解する複数のプロテアーゼ活性を有することが示された。これらの活性のうち、ｔｓｐ１は、トリプシン様セリンプロテアーゼとして同定された。次いで、Trichoderma菌細胞からｔｓｐ１プロテアーゼ遺伝子を欠損させ、ｔｓｐ１の欠損によって、全プロテアーゼ活性の有意な低下が達成され、細胞により産生される哺乳動物タンパク質の安定性の増加がもたらされたことが実証された。
【０１０８】
適切なｔｓｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei tsp1（配列番号６６）、Trichoderma atroviride jgi|Triat2|298187（配列番号６７）、jgi|TriviGv29_8_2（配列番号６８）、Hypocrea lixii gi|145583579（配列番号６９）、Hypocrea lixii gi|63025000（配列番号７０）、Sclerotinia sclerotiorum gi|156052735（配列番号７１）、Botryotinia fuckeliana gi|154314937（配列番号７２）、Phaeosphaeria nodorum gi|169605891（配列番号７３）、Leptosphaeria maculans gi|312219044（配列番号７４）、Verticillium dahliae gi|37992773（配列番号７５）、Cochliobolus carbonum gi|1072114（配列番号７６）、Metarhizium acridum gi|322695345（配列番号７７）、Metarhizium anisopliae gi|4768909（配列番号７８）、gi|464963（配列番号７９）、Gibberella zeae gi|46139299（配列番号８０）、Metarhizium anisopliae（配列番号８１）、A. nidulans gi67523821（配列番号５３８）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１０９】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｔｓｐ１プロテアーゼは、配列番号６６〜８１、配列番号５３８から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号６６〜８１、配列番号５３８から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、ｔｓｐ１は、T. reesei  ｔｓｐ１である。T. reesei  ｔｓｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号６６に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号６６と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号６６と１００％の同一性を有する。
【０１１１】
スブチリシンプロテアーゼ
スブチリシンプロテアーゼは、スブチリシンのものと類似の基質特異性を有する酵素である。スブチリシンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解にセリン残基を使用する。一般に、スブチリシンプロテアーゼは、３つのアミノ酸（アスパラギン酸、ヒスチジン及びセリン）の触媒トライアドを含有するセリンプロテアーゼである。これらの触媒残基の配置は、Bacillus licheniformis由来のプロトタイプスブチリシンと共通している。真核生物（例えば、Trichoderma菌）由来のスブチリシンプロテアーゼとしては、フリン、ＭＢＴＰＳ１及びＴＰＰ２が挙げられる。真核生物トリプシン様セリンプロテアーゼは、オキシアニオンホール中にアスパラギン酸残基をさらに含む。スブチリシンプロテアーゼｓｌｐ７は、セドリシンプロテアーゼｔｐｐ１にも類似する。
【０１１２】
Trichoderma菌細胞では、７個のスブチリシンプロテアーゼが同定されている：ｓｌｐ１（ｔｒｅ５１３６５）；ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）；ｓｌｐ３（ｔｒｅ１２３２３４）；ｓｌｐ５（ｔｒｅ６４７１９）、ｓｌｐ６（ｔｒｅ１２１４９５）、ｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）及びｓｌｐ８（ｔｒｅ５８６９８）。
【０１１３】
ｓｌｐ１
適切なｓｌｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp1（配列番号８２）、Trichoderma atroviride jgi|Triat2（配列番号８３）、Trichoderma atroviride jgi|Triat2（配列番号８４）、Trichoderma virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号８５）、Hypocrea lixii gi|145583581（配列番号８６）、Metarhizium acridum gi|322694632（配列番号８７）、Fusarium oxysporum gi|342877080（配列番号８８）、Gibberella zeae gi|46139915（配列番号８９）、Epichloe festucae gi|170674476（配列番号９０）、Nectria haematococca gi|302893164（配列番号９１）、Sordaria macrospore gi|336266150（配列番号９２）、Glomerella graminicola gi|310797947（配列番号９３）、Neurospora tetrasperma gi|336469805（配列番号９４）、Neurospora crassa gi|85086707（配列番号９５）、Magnaporthe oryzae gi|145608997（配列番号９６）、Chaetomium globosum gi|116208730（配列番号９７）、M. thermophila gi367029081（配列番号５３９）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１１４】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ１プロテアーゼは、配列番号８２〜９７、配列番号５３９から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８２〜９７、配列番号５３９から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ１は、T. reesei  ｓｌｐ１である。T. reesei  ｓｌｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号８２に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号８２と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８２と１００％の同一性を有する。
【０１１６】
ｓｌｐ２
適切なｓｌｐ２プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp2（配列番号９８）、T atroviride jgi|Triat2（配列番号９９）、T virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号１００）、Hypocrea lixii gi|115111226（配列番号１０１）、Aspergillus fumigatus gi|70997972（配列番号１０２）、Nectria haematococca gi|302915240（配列番号１０３）、Gibberella zeae gi|46105128（配列番号１０４）、Isaria farinose gi|68165000（配列番号１０５）、Glomerella graminicola gi|310797854（配列番号１０６）、Epichloe festucae gi|170674491（配列番号１０７）、Metarhizium acridum gi|322697754（配列番号１０８）、Acremonium sp. F11177 gi|147225254（配列番号１０９）、Ophiostoma piliferum gi|15808807（配列番号１１０）、Neurospora tetrasperma gi|336463649（配列番号１１１）、Chaetomium thermophilum gi|340992600（配列番号１１２）、Metarhizium flavoviride gi|254351265（配列番号１１３）、Podospora anserine gi|171680111（配列番号１１４）、Magnaporthe oryzae gi|39943180（配列番号１１５）、Sclerotinia sclerotiorum gi|156058540（配列番号１１６）、Talaromyces stipitatus gi|242790441（配列番号１１７）、M. thermophila gi367021472（配列番号５４０）、A. niger gi145237646（配列番号５４１）、A. oryzae gi169780712（配列番号５４２）、P. chrysogenum gi255955889（配列番号５４３）、A. nidulans gi259489544（配列番号５４４）、N. crassa gi85084841（配列番号５４５）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１１７】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ２プロテアーゼは、配列番号９８〜１１７、配列番号５４０〜５４５から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号９８〜１１７、配列番号５４０〜５４５から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ２は、T. reesei  ｓｌｐ２である。T. reesei  ｓｌｐ２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号９８に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号９８と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号９８と１００％の同一性を有する。
【０１１９】
ｓｌｐ３
適切なｓｌｐ３プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp2（配列番号１６６）、T. atroviride jgi|Triat2（配列番号１６７）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号１６８）、Hypocrea koningii gi|124295071（配列番号１６９）、Purpureocillium lilacinum gi|130750164（配列番号１７０）、Metarhizium anisopliae gi|16215677（配列番号１７１）、Hirsutella rhossiliensis gi|90655148（配列番号１７２）、Tolypocladium inflatum gi|18542429（配列番号１７３）、Metacordyceps chlamydosporia gi|19171215（配列番号１７４）、Cordyceps militaris gi|346321368（配列番号１７５）、Fusarium sp. gi|628051（配列番号１７６）、Neurospora tetrasperma gi|336471881（配列番号１７７）、Chaetomium globosum gi|116197403（配列番号１７８）、Neurospora crassa gi|85084841（配列番号１７９）、Fusarium oxysporum gi|56201265（配列番号１８０）、Gibberella zeae gi|46114268（配列番号１８１）、M. thermophila gi367026259（配列番号５４６）、A. nidulans gi67538776（配列番号５４７）、A. oryzae gi169771349（配列番号２２２）、A. niger gi470729（配列番号２２３）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１２０】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ３プロテアーゼは、配列番号１６６〜１８１、配列番号５４６〜５４７、配列番号２２２〜２２３から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１６６〜１８１、配列番号５４６〜５４７、配列番号２２２〜２２３から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ３は、T. reesei  ｓｌｐ３である。T. reesei  ｓｌｐ３によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１６６に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１６６と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１６６と１００％の同一性を有する。
【０１２２】
ｓｌｐ５
適切なｓｌｐ５プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp5（配列番号２００）、T. atroviride jgi|Triat2（配列番号２０１）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号２０２）、Hypocrea lixii gi|118161442（配列番号２０３）、Fusarium oxysporum gi|342883549（配列番号２０４）、Gibberella zeae gi|46135733（配列番号２０５）、Glomerella graminicola gi|310796396（配列番号２０６）、Nectria haematococca gi|302927954（配列番号２０７）、Cordyceps militaris gi|346319783（配列番号２０８）、Neurospora crassa gi|85094084（配列番号２０９）、Neurospora tetrasperma gi|336467281（配列番号２１０）、Verticillium dahliae gi|346971706（配列番号２１１）、Thielavia terrestris gi|347001418（配列番号２１２）、Magnaporthe oryzae gi|145605493（配列番号２１３）、M. thermophila gi367032200（配列番号５４８）、P. chrysogenum gi62816282（配列番号５４９）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１２３】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ５プロテアーゼは、配列番号２００〜２１３、配列番号５４８〜５４９から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２００〜２１３、配列番号５４８〜５４９から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ５は、T. reesei  ｓｌｐ５である。T. reesei  ｓｌｐ５によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２００に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号２００と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２００と１００％の同一性を有する。
【０１２５】
ｓｌｐ６
適切なｓｌｐ６プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp6（配列番号２１４）、T. atroviride jgi|Triat2（配列番号２１５）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号２１６）、Hypocrea virens gi|29421423（配列番号２１７）、Hypocrea lixii gi|145583127（配列番号２１８）、Trichoderma hamatum gi|30144643（配列番号２１９）、Aspergillus fumigatus gi|2295（配列番号２２０）、Aspergillus terreus gi|115391147（配列番号２２１）、Aspergillus oryzae gi|169771349（配列番号２２２）、Aspergillus niger gi|470729（配列番号２２３）、Glomerella graminicola gi|310794714（配列番号２２４）、Gibberella zeae gi|46114946（配列番号２２５）、Fusarium oxysporum gi|342873942（配列番号２２６）、Nectria haematococca gi|302884541（配列番号２２７）、Neosartorya fischeri gi|119500190（配列番号２２８）、Verticillium alboatrum gi|302413161（配列番号２２９）、Glomerella graminicola gi|310790144（配列番号２３０）、N. crassa gi85090020（配列番号５５０）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１２６】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ６プロテアーゼは、配列番号２１４〜２３０、配列番号５５０から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２１４〜２３０、配列番号５５０から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ６は、T. reesei  ｓｌｐ６である。T. reesei  ｓｌｐ６によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２１４に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号２１４と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２１４と１００％の同一性を有する。
【０１２８】
ｓｌｐ７
適切なｓｌｐ７プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp7（配列番号２３１）、T. atroviride jgi|Triat2（配列番号２３２）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2（配列番号２３３）、Metarhizium anisopliae gi|322710320（配列番号２３４）、Nectria haematococca gi|302915000（配列番号２３５）、Myceliophthora thermophila gi|347009020、gi367024935（配列番号２３６）、Gibberella zeae gi|46137655（配列番号２３７）、Thielavia terrestris gi|346996549（配列番号２３８）、Magnaporthe oryzae gi|145610733（配列番号２３９）、A. nidulans gi67541991（配列番号５５１）、P. chrysogenum gi255933786（配列番号５５２）、A. niger gi317036543（配列番号５５３）、A. oryzae gi169782882（配列番号５５４）、N. crassa gi85109979（配列番号５５５）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１２９】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ７プロテアーゼは、配列番号２３１〜２３９、配列番号５５１〜５５５から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２３１〜２３９、配列番号５５１〜５５５から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ７は、T. reesei  ｓｌｐ７である。T. reesei  ｓｌｐ７によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２３１に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号２３１と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２３１と１００％の同一性を有する。
【０１３１】
ｓｌｐ８
適切なｓｌｐ８プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei slp8（配列番号２４０）、T. atroviride jgi|Triat2|198568（配列番号２４１）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2|33902（配列番号２４２）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１３２】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号２４０〜２４２から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２４０〜２４２から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ｓｌｐ８は、T. reesei  ｓｌｐ８である。T. reesei  ｓｌｐ８によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２４０に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号２４０と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号２４０と１００％の同一性を有する。
【０１３４】
ｓｌｐ様プロテアーゼ
他のｓｌｐ様プロテアーゼとしては、限定されないが、ｓｌｐ５７４３３（Ｔｒｅ５７４３３配列番号８８５）、ｓｌｐ３５７２６＿（Ｔｒｅ３５７２６配列番号８８６）、ｓｌｐ６０７９１＿（Ｔｒｅ６０７９１配列番号８８７）又はｓｌｐ１０９２７６＿（Ｔｒｅ１０９２７６配列番号８８８）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１３５】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６プロテアーゼは、配列番号８８５〜８８８から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８８５〜８８８から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１３６】
グルタミン酸プロテアーゼ
グルタミン酸プロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合を加水分解する酵素である。グルタミン酸プロテアーゼは、ペプスタチンＡ非感受性であるので、ペプスタチン非感受性酸性プロテアーゼと称されることもある。以前は、グルタミン酸プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼと同じグループであり、酸性プロテアーゼと総称されることも多かったが、グルタミン酸プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼと非常に異なる活性部位残基を有することが最近見出されている。
【０１３７】
Trichoderma菌細胞では、２個のグルタミン酸プロテアーゼが同定されている：ｇａｐ１（ｔｒｅ６９５５５）及びｇａｐ２（ｔｒｅ１０６６６１）。
【０１３８】
ｇａｐ１
適切なｇａｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei gap1（配列番号１１８）、T. atroviride jgi|Triat2|40863（配列番号１１９）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2|192684（配列番号１２０）、Aspergillus flavus gi|238499183（配列番号１２１）、Aspergillus niger gi|145251555（配列番号１２２）、Aspergillus terreus gi|115491521（配列番号１２３）、gi|37154543（配列番号１２４）、gi|48425531（配列番号１２５）、gi|351873（配列番号１２６）、Thielavia terrestris gi|346997245（配列番号１２７）、Penicillium chrysogenum gi|255940586（配列番号１２８）、 M. thermophila gi367026504（配列番号５７４）、A. oryzae gi317150886（配列番号５７５）、N. crassa gi85097968（配列番号５７６）、A. niger gi131056（配列番号５７７）、P. chrysogenum gi255930123（配列番号５７８）、A. niger gi145236956（配列番号５７９）、A. oryzae gi169772955（配列番号５８０）、A. niger gi145249222（配列番号５８１）、A. nidulans gi67525839（配列番号５８２）、A. oryzae gi169785367（配列番号５８３）、P. chrysogenum gi255955319（配列番号５８４）、M. thermophila gi367019352（配列番号５８５）、A oryzae gi391863974（配列番号５８６）、M. thermophila gi367024513（配列番号５８７）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１３９】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｇａｐ１プロテアーゼは、配列番号１１８〜１２８、配列番号５７４〜５８７から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１１８〜１２８、配列番号５７４〜５８７から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１４０】
いくつかの実施態様では、ｇａｐ１は、T. reesei  ｇａｐ１である。T. reesei  ｇａｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１１８に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１１８と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１１８と１００％の同一性を有する。
【０１４１】
ｇａｐ２
適切なｇａｐ２プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei gap2（配列番号１２９）、T. atroviride jgi|Triat2|298116（配列番号１３０）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2|30331（配列番号１３１）、jgi|TriviGv29_8_2|225131（配列番号１３２）、Aspergillus flavus gi|238499183（配列番号１３３）、Aspergillus niger gi|145251555（配列番号１３４）、Aspergillus nidulans gi|67901056（配列番号１３５）、Aspergillus clavatus gi|121711990（配列番号１３６）、Aspergillus fumigatus gi|70986250（配列番号１３７）、Penicillium marneffei gi|212534108（配列番号１３８）、Talaromyces stipitatus gi|242789335（配列番号１３９）、Grosmannia clavigera gi|320591529（配列番号１４０）、Neosartorya fischeri gi|119474281（配列番号１４１）、Penicillium marneffei gi|212527274（配列番号１４２）、Penicillium chrysogenum gi|255940586（配列番号１４３）、gi|131056（配列番号１４４）、M. thermophila gi367030275（配列番号５８８）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１４２】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｇａｐ２プロテアーゼは、配列番号１２９〜１４４、配列番号５８８から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１２９〜１４４、配列番号５８８から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、ｇａｐ２は、T. reesei  ｇａｐ２である。T. reesei  ｇａｐ２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１２９に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１２９と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１２９と１００％の同一性を有する。
【０１４４】
他のｇａｐ様プロテアーゼとしては、限定されないが、ｇａｐ３（Ｔｒｅ７０９２７配列番号８８９）又はｇａｐ４＿（Ｔｒｅ５７５７５配列番号８９０）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１４５】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｇａｐ３又はｇａｐ４プロテアーゼは、それぞれ配列番号８８９又は配列番号８９０から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８８９〜８８９から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１４６】
セドリシンプロテアーゼ
セドリシンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解にセリン残基を使用する酵素である。セドリシンプロテアーゼは、一般に、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸の固有の触媒トライアドを含有する。セドリシンプロテアーゼはまた、オキシアニオンホール中にアスパラギン残基を含有する。真核生物（例えば、Trichoderma菌）由来のセドリシンプロテアーゼとしては、トリペプチジルペプチダーゼが挙げられる。
【０１４７】
適切なｔｐｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei tpp1（配列番号１４５）、T. atroviride jgi|Triat2|188756（配列番号１４６）、T. virens jgi|TriviGv29_8_2|217176（配列番号１４７）、Aspergillus fumigatus gi|70993168（配列番号１４８）、Aspergillus oryzae gi|169776800（配列番号１４９）、Aspergillus niger gi|145236399（配列番号１５０）、Aspergillus clavatus gi|121708799（配列番号１５１）、Aspergillus niger gi|145239871（配列番号１５２）、Aspergillus clavatus gi|121714541（配列番号１５３）、Aspergillus terreus gi|115387645（配列番号１５４）、Aspergillus fumigatus gi|70982015（配列番号１５５）、Sclerotinia sclerotiorum gi|156045898（配列番号１５６）、Botryotinia fuckeliana gi|154321758（配列番号１５７）、Neosartorya fischeri gi|119499774（配列番号１５８）、Talaromyces stipitatus gi|242798348（配列番号１５９）、Penicillium marneffei gi|212541546（配列番号１６０）、Gibberella zeae gi|46114460（配列番号１６１）、Fusarium oxysporum gi|342890694（配列番号１６２）、Grosmannia clavigera gi|320592937（配列番号１６３）、Verticillium alboatrum gi|302406186（配列番号１６４）、Verticillium dahliae gi|346971444（配列番号１６５）、A. fumigatus CAE51075.1（配列番号５５６）、A. oryzae XP_001820835.1（配列番号５５７）、P. chrysogenum XP_002564029.1（配列番号５５８）、A. nidulans XP_664805.1（配列番号５５９）、P. chrysogenum XP_002565814.1（配列番号５６０）、M. thermophila XP_003663689.1（配列番号５６１）、N. crassa XP_958412.1（配列番号５６２）、A. niger XP_001394118.1（配列番号５６３）、A. fumigatus CAE17674.1（配列番号５６４）、A. niger XP_001400873.1（配列番号５６５）、A. fumigatus CAE46473.1（配列番号５６６）、A. oryzae XP_002373530.1（配列番号５６７）、A. nidulans XP_660624.1（配列番号５６８）、P. chrysogenum XP_002562943.1（配列番号５６９）、A. fumigatus CAE17675.1（配列番号５７０）、A. fumigatus EAL86850.2（配列番号５７１）、N. crassa XP_961957.1（配列番号５７２）、A. oryzae BAB97387.1（配列番号５７３）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１４８】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｔｐｐ１プロテアーゼは、配列番号１４５〜１６５、配列番号５５６〜５７３から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１４５〜１６５、配列番号５５６〜５７３から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、ｔｐｐ１は、T. reesei  ｔｐｐ１である。T. reesei  ｔｐｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１４５に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号１４５と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号１４５と１００％の同一性を有する。
【０１５０】
他のセドリシン様プロテアーゼとしては、限定されないが、ｓｅｄ２（Ｔｒｅ７０９６２、配列番号８９１）、ｓｅｄ３＿（Ｔｒｅ８１５１７配列番号８９２）又はｓｅｄ５＿（Ｔｒｅ１１１８３８配列番号８９３）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１５１】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５プロテアーゼは、配列番号８９１〜８９３から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８９１〜８９３から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１５２】
アミノペプチダーゼプロテアーゼ
アミノペプチダーゼは、タンパク質又はペプチド基質のアミノ末端からのアミノ酸の切断を触媒する。それらは、動物界及び植物界全体に広く分布しており、膜成分のような多くの細胞内小器官、細胞質に見られる。全てではないが、これらのペプチダーゼの多くは、亜鉛金属酵素である。ａｍｐ２は、二官能性酵素である。それは、アミノペプチダーゼ活性を有するロイコトリエンＡ４加水分解酵素である（ＥＣ３．３．２．６）。
【０１５３】
Trichoderma菌細胞では、２個のアミノペプチダーゼが同定されている：ａｍｐ１（ｔｒｅ８１０７０）及びａｍｐ２（ｔｒｅ１０８５９２）。
【０１５４】
ａｍｐ１
適切なａｍｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei amp1 81070（配列番号７５９）、 T. virens 74747（配列番号７６０）、T. atroviride  147450（配列番号７６１）、F. graminicola  XP_386703.1（配列番号７６２）、A. nidulans CBF75094.1（配列番号７６３）、A.niger  EHA21022.1（配列番号７６４）、A. oryzae XP_001727175.1（配列番号７６５）、A.fumigatus  XP_749158.1（配列番号７６６）、M. thermophila  XP_003667354.1（配列番号７６７）、 F.graminicola  XP_385112.1（配列番号７６８）、P. Chrysogenum  XP_002567159.1（配列番号７６９）、 A. fumigatus  XP_748386.2（配列番号７７０）、A. oryzae  XP_001819545.1（配列番号７７１）、 A. nidulans  XP_681714.1（配列番号７７２）、N. crassa  XP_957507.1（配列番号７７３）、M. thermo  XP_003665703.1（配列番号７７４）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１５５】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはａｍｐ１プロテアーゼは、配列番号７５９〜７７４から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７５９〜７７４から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、ａｍｐ１は、T. reesei  ａｍｐ１である。T. reesei  ａｍｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７５９に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号７５９と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７５９と１００％の同一性を有する。
【０１５７】
ａｍｐ２
適切なａｍｐ２プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei amp2 108592（配列番号７７５）、T. virens 73611(配列番号７７６）、T. atroviride 284076（配列番号７７７）、F. graminicola XP_390364.1（配列番号７７８）、N. crassa XP_960660.1（配列番号７７９）、M. thermophila XP_003662184.1（配列番号７８０）、A. oryzae XP_001826499.2（配列番号７８１）、A. niger XP_001390581.1（配列番号７８２）、A. nidulans XP_663416.1（配列番号７８３）、A. fumigatus XP_755088.1（配列番号７８４）、P. chrysogenum XP_002558974.1（配列番号７８５）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１５８】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはａｍｐ２プロテアーゼは、配列番号７７５〜７８５から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７７５〜７８５から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、ａｍｐ２は、T. reesei  ａｍｐ２である。T. reesei  ａｍｐ２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７７５に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号７７５と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７７５と１００％の同一性を有する。
【０１６０】
ｓｅｐプロテアーゼ
ｓｅｐプロテアーゼは、Ｓ２８サブタイプに属するセリンプロテアーゼである。それらは、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジンの触媒トライアドを有する：セリンは求核物質として作用し、アスパラギン酸は求電子物質として作用し、ヒスチジンは塩基として作用する。これらのセリンプロテアーゼとしては、いくつかの真核生物酵素、例えばリソソームＰｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩ及び胸腺特異的セリンペプチダーゼが挙げられる。
【０１６１】
適切なｓｅｐ１プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei sep1 124051（配列番号７８６）、T. virens 39211（配列番号７８７）、T. atroviride 296922（配列番号７８８）、A. niger CAK45422.1（配列番号７８９）、A. fumigatus EDP53789.1（配列番号７９０）、N. crassa XP_958301.1（配列番号７９１）、M. thermophila XP_003664601.1（配列番号７９２）、M. graminicola XP_384993.1（配列番号７９３）、M. thermophila XP_003658945.1（配列番号７９４）、F. graminicola XP_382380.1（配列番号７９５）、A. niger XP_001395660.1（配列番号７９６）、M. thermophila XP_003659734.1（配列番号７９７）、N. crassa XP_964374.1（配列番号７９８）、A. fumigatus XP_756068.1（配列番号７９９）、A. oryzae EIT77098.1（配列番号８００）、P. chrysogenum XP_002560028.1（配列番号８０１）、A. oryzae EIT71569.1（配列番号８０２）、A. nidulans CBF79006.1（配列番号８０３）、A. niger  XP_001400740.2（配列番号８０４）、A. oryzae BAE57999.1（配列番号８０５）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１６２】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｓｅｐ１プロテアーゼは、配列番号７８６〜８０５から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７８６〜８０５から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、ｓｅｐ１は、T. reesei  ｓｅｐ１である。T. reesei  ｓｅｐ１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７８６に示されている。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号７８６と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号７８６と１００％の同一性を有する。
【０１６４】
亜鉛メタロプロテアーゼ
亜鉛メタロプロテアーゼは、触媒活性に亜鉛を必要とするプロテアーゼ酵素である。
【０１６５】
Trichoderma菌細胞では、５個のメタロプロテアーゼが同定されている：ｍｐ１（ｔｒｅ１２２７０３）、ｍｐ２（ｔｒｅ１２２５７６）、ｍｐ３（ｔｒｅ４３０８）、ｍｐ４（ｔｒｅ５３３４３）、ｍｐ５（ｔｒｅ７３８０９）。
【０１６６】
ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４及びｍｐ５
適切なｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４及びｍｐ５プロテアーゼの例としては、限定されないが、Trichoderma reesei ｍｐ１（配列番号８７５）、Trichoderma reesei ｍｐ２（配列番号８７６）、Trichoderma reesei ｍｐ３（配列番号８７７）、Trichoderma reesei ｍｐ４（配列番号８７８）、Trichoderma reesei ｍｐ５（配列番号８７９）及びそれらのホモログが挙げられる。
【０１６７】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼ、典型的にはｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４又はｍｐ５プロテアーゼは、配列番号８７５〜８７９から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８７５〜８７９から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１６８】
他のプロテアーゼ
他の適切なプロテアーゼの例としては、限定されないが、
＞プロテアーゼ６５７３５（配列番号８９４）、プロテアーゼ７７５７７（配列番号８９５）、プロテアーゼ８１０８７（配列番号８９６）、プロテアーゼ５６９２０（配列番号９００）、プロテアーゼ１２２０８３（配列番号９１１）、プロテアーゼ７９４８５（配列番号９１０）、プロテアーゼ１２０９９８（配列番号９０１）又はプロテアーゼ６１１２７（配列番号９１２）からなる群より選択されるTrichoderma reeseiグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９（配列番号９０５）、プロテアーゼ５８３８７（配列番号９２１）、プロテアーゼ７５１５９（配列番号９１８）、プロテアーゼ５６８５３（配列番号９１４）又はプロテアーゼ６４１９３（配列番号９０８）からなる群より選択されるTrichoderma reeseiグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２（配列番号９０６）、プロテアーゼ８０７６２（配列番号９１３）、プロテアーゼ２１６６８（配列番号９１９）、プロテアーゼ８１１１５（配列番号９０７）、プロテアーゼ８２１４１（配列番号９０２）、プロテアーゼ２３４７５（配列番号９０９）からなる群より選択されるTrichoderma reeseiグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０（９０３）、プロテアーゼ２２７１８（配列番号９０４）、プロテアーゼ４７１２７（配列番号８９９）、プロテアーゼ６１９１２（配列番号９２０）、プロテアーゼ８０８４３（配列番号８９７）、プロテアーゼ６６６０８（配列番号９２３）、プロテアーゼ７２６１２（配列番号８９８）、プロテアーゼ４０１９９（配列番号９１７）からなる群より選択されるTrichoderma reeseiグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０（配列番号９１５）、プロテアーゼ１１１６９４（配列番号９１６）、プロテアーゼ８２５７７（配列番号９２２）からなる群より選択されるTrichoderma reeseiグループＥプロテアーゼ
及びそれらのホモログ
が挙げられる。
【０１６９】
したがって、特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼは、配列番号８９４〜９２３から選択されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、前記プロテアーゼは、配列番号８９４〜９２３から選択されるアミノ酸配列と１００％の同一性を有する。
【０１７０】
相同プロテアーゼ
本開示の他の実施態様は、本開示のプロテアーゼと相同のプロテアーゼの活性を低下させることに関する。本明細書で使用される「相同性」は、参照配列と第２の配列の少なくともフラグメントとの間の配列類似性を指す。ホモログは、当技術分野で公知の任意の方法により、好ましくは、参照配列を、単一の第２の配列若しくは配列のフラグメントと、又は配列のデータベースと比較するためのＢＬＡＳＴツールを使用することにより同定し得る。下記のように、ＢＬＡＳＴでは、同一性及び類似性の割合に基づいて配列を比較する。
【０１７１】
「同一の」又は「同一性」の割合という用語は、２つ以上の核酸又はアミノ酸配列との関連では、同じものである２つ以上の配列又はサブ配列を指す。２つの配列は、比較ウィンドウ又は以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は手動アラインメント及び目視検査により測定された指定領域にわたる最大一致について比較及びアライメントした場合、２つの配列が同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する場合、「実質的に同一」である（すなわち、特定の領域にわたり、又は、特定されない場合、全体配列にわたり、２９％の同一性、場合により３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）。場合により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）の長さである領域にわたり、あるいはより好ましくは１００〜５００若しくは１０００以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００、若しくはそれ以上のアミノ酸）の長さである領域にわたり存在する。
【０１７２】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、それと、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要である場合、サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができるか、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列の配列同一性の割合を計算する。２つの配列を同一性について比較する場合、配列が連続的である必要はないが、任意のギャップが、全体的な同一性の割合を低下させ得るペナルティを保有し得る。ｂｌａｓｔｎの場合、デフォルトパラメータは、Ｇａｐオープニングペナルティ＝５及びＧａｐエクステンションペナルティ＝２である。ｂｌａｓｔｐの場合、デフォルトパラメータは、Ｇａｐオープニングペナルティ＝１１及びＧａｐエクステンションペナルティ＝１である。
【０１７３】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、限定されないが、２０〜６００、通常は、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０を含む、連続位置の数のいずれか１つのセグメントへの参照を含み、配列は、２つの配列を最適にアライメントした後、連続位置の同じ数の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3):443-453のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448の類似性方法についての検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、又は手動アラインメント及び目視検査により［例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)を参照のこと］行うことができる。
【０１７４】
配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに適切なアルゴリズムの２つの例は、それぞれAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402及びAltschul et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアが、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、それは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、特定の正の値の閾値スコアＴと一致する又は満たす。Ｔは、近隣ワードスコア閾値として言及される（Altschul et al.、上記を参照）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸張される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアを、パラメータＭ（マッチ残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用し、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸張は、以下の場合に停止している：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下落する；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロ以下に行く；あるいは、いずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス［Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919を参照のこと］、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を使用する。
【０１７５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じ得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸への試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【０１７６】
上記配列同一性のパーセンテージ以外で、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという別の指標は、下記のように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけにより異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、下記のように、２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイゼーションすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを使用して、その配列を増幅することができることである。
【０１７７】
本明細書に開示されるように、本発明のプロテアーゼはまた、上記に開示されるプロテアーゼ遺伝子によってコードされるプロテアーゼの保存的に改変された変異体であるプロテアーゼを含み得る。本明細書で使用される「保存的に改変された変異体」は、コードされるアミノ酸配列に対する個々の置換、欠失又は付加であって、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすものを含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間ホモログ及びアレルへの付加であり、これらを除外しない。以下の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【０１７８】
選択された糸状菌のアスパラギン酸、スブチリシン、グルタミン酸及びセドリシンプロテアーゼの系統樹は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号に記載されている。
【０１７９】
本発明のプロテアーゼの活性を低下させる方法
本開示のさらなる態様は、異種ポリペプチド（例えば、哺乳動物ポリペプチド）を発現する糸状菌細胞に見られるプロテアーゼの活性を低下させることに関する。
【０１８０】
糸状菌細胞に見られるプロテアーゼの活性は、当業者に公知の任意の方法により低下させることができる。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、プロテアーゼの活性の低下は、例えば、プロモーター改変又はＲＮＡｉにより、プロテアーゼの発現を低下させることにより達成される。
【０１８２】
他の実施態様では、プロテアーゼの活性の低下は、プロテアーゼをコードする遺伝子を改変することにより達成される。このような改変の例としては、限定されないが、ノックアウト突然変異、切断突然変異、点突然変異、ミスセンス突然変異、置換突然変異、フレームシフト突然変異、挿入突然変異、重複突然変異、増幅突然変異、転座突然変異又は逆位突然変異が挙げられ、これらは、対応するプロテアーゼ活性の低下をもたらす。目的のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの突然変異を生成する方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、ランダム突然変異誘発及びスクリーニング、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、挿入突然変異誘発、化学的突然変異誘発及び照射が挙げられる。
【０１８３】
特定の実施態様では、プロテアーゼコード遺伝子の一部（例えば、触媒ドメインをコードする領域、コード領域、又はコード領域の発現に必要なコントロール配列）が改変される。遺伝子のこのようなコントロール配列は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、遺伝子の発現に影響を及ぼすのに十分な部分）であり得る。例えば、プロモーター配列を不活性化して発現の欠如をもたらし得るか、又はより弱いプロモーターでネイティブなプロモーター配列を置換して、コード配列の発現を低下させ得る。改変候補の他のコントロール配列としては、限定されないが、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター及び転写アクチベータが挙げられる。
【０１８４】
リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子はまた、遺伝子の発現を消失又は低下させるための遺伝子欠損技術を利用することにより改変され得る。遺伝子欠損技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それにより、それらの発現を消失させる。このような方法では、遺伝子の欠損は、遺伝子に隣接する５’及び３’領域を連続的に含有するように構築されたプラスミドを使用して相同組換えにより達成され得る。
【０１８５】
リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子はまた、遺伝子、又は遺伝子の転写若しくは翻訳に必要なそのコントロール配列において１つ以上のヌクレオチドを導入、置換及び／又は除去することにより改変され得る。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトのために、ヌクレオチドを挿入又は除去し得る。このような改変は、当技術分野で公知の方法（限定されないが、部位特異的突然変異誘発及びｐｅＲ生成された突然変異誘発を含む）により達成され得る（例えば、Botstein and Shortie, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Bioi. 57: 157; Ho et al., 1989, Gene 77: 61; Horton et al., 1989, Gene 77: 61;及びSarkar and Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404を参照のこと）。
【０１８６】
加えて、リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼをコードする遺伝子は、遺伝子に相同な核酸フラグメントを含有する破壊核酸構築物であって、相同性の領域の重複を作製し、構築物ＤＮＡを重複領域間に組み込む破壊核酸構築物を遺伝子に挿入することによる遺伝子破壊技術により改変され得る。非機能的遺伝子産物がもたらされるように、挿入された構築物が遺伝子のプロモーターをコード領域から分離するか又はコード配列を遮断する場合、このような遺伝子破壊は、遺伝子発現を消失させ得る。破壊構築物は、単に、遺伝子に相同な５’及び３’領域を伴う選択可能なマーカー遺伝子であり得る。選択可能なマーカーは、破壊された遺伝子を含有するトランスフォーマントの同定を可能にする。
【０１８７】
リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子はまた、遺伝子変換のプロセスにより改変され得る（例えば、Iglesias and Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189:5 73-76を参照のこと）。例えば、遺伝子変換において、遺伝子に対応するヌクレオチド配列を、in vitroで突然変異誘発し、欠陥ヌクレオチド配列を生産し、次いで、それをTrichoderma株にトランスフォーメーションし、欠陥遺伝子を生産する。相同組換えにより、欠陥ヌクレオチド配列は、内在性遺伝子を置換する。欠陥ヌクレオチド配列はまた、欠陥遺伝子を含有するトランスフォーマントの選択のためのマーカーを含有することが望ましい場合がある。
【０１８８】
リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子はまた、遺伝子のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を使用し、確立されたアンチセンス技術により改変され得る（例えば、Parish and Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157を参照のこと）。特に、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であって、株において転写され得、前記細胞において産生されるｍＲＮＡにハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列を導入することによって低下又は不活化され得る。相補的なアンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイゼーションすることを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量は、このようにして低下又は消失する。
【０１８９】
加えて、リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼをコードする遺伝子はまた、確立されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術により改変され得る（例えば、国際公開公報第２００５／０５６７７２号及び国際公開公報第２００８／０８００１７号を参照のこと）。
【０１９０】
リコンビナントポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子はまた、当技術分野で周知の方法（限定されないが、化学的突然変異誘発を含む）を使用して、ランダム又は特異的突然変異誘発により改変され得る（例えば、Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris and D.W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, New York, 25 1970を参照のこと）。遺伝子の改変は、糸状菌細胞を、突然変異誘発及び遺伝子の発現が低下又は不活化している突然変異体細胞についてのスクリーニングに供することにより実施され得る。特異的又はランダムであり得る突然変異誘発は、例えば、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用、適切なオリゴヌクレオチドの使用、ＤＮＡ配列をｐｅＲ生成突然変異誘発に供すること、又はそれらの任意の組み合わせにより実施され得る。物理的及び化学的突然変異誘発剤の例としては、限定されないが、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。このような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、Trichoderma細胞をインキュベーションし、適切な条件下で選んだ突然変異誘発剤の存在において突然変異誘発し、次いで、遺伝子の発現が低下又は欠如している突然変異体について選択することにより実施される。
【０１９１】
特定の実施態様では、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの突然変異又は改変は、プロテアーゼ活性が検出不可能である改変プロテアーゼをもたらす。他の実施態様では、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの改変は、プロテアーゼ活性が、対応する非改変プロテアーゼと比較して少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低い、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１，０００％、又はそれ以上低い改変プロテアーゼをもたらす。
【０１９２】
特定の実施態様では、例えば、Trichoderma細胞において、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの突然変異又は改変は、対応する親Trichoderma細胞の全プロテアーゼ活性の４９％以下（典型的には、少なくとも２個の異なるプロテアーゼ遺伝子における突然変異を有する）又は３１％以下（典型的には、少なくとも３個の異なるプロテアーゼ遺伝子における突然変異を有する）又は１３％以下（典型的には、少なくとも４個の異なるプロテアーゼ遺伝子における突然変異を有する）又は１０％以下（典型的には、少なくとも５個の異なるプロテアーゼ遺伝子に突然変異を有する）又は６．３％以下（典型的には、少なくとも６個の異なるプロテアーゼ遺伝子に突然変異を有する）又は５．５％以下（典型的には、少なくとも７個の異なるプロテアーゼ遺伝子に突然変異を有する）への全プロテアーゼ活性の低下をもたらす。
【０１９３】
本発明の異種ポリペプチド
本明細書における本発明はさらに、細胞に見られるプロテアーゼの活性を低下させることによって、このような異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞における異種ポリペプチドの産生を増加させることに関する。
【０１９４】
本明細書で使用される「異種ポリペプチド」は、本開示の糸状菌細胞において天然に見られない（すなわち、内在性の）ポリペプチド、又は内在性型ポリペプチドと比較して上昇したレベルで糸状菌細胞において発現されるポリペプチドを指す。特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様では、異種ポリペプチドは、非哺乳動物ポリペプチドである。
【０１９５】
哺乳動物ポリペプチド
本開示の哺乳動物ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意の哺乳動物ポリペプチドであり得る。本明細書で使用される「哺乳動物ポリペプチド」は、哺乳動物においてネイティブに発現されるポリペプチド、哺乳動物においてネイティブに発現されるポリペプチドに由来するポリペプチド又はそのフラグメントである。哺乳動物ポリペプチドはまた、生物学的活性を保持するペプチド及びオリゴペプチドを含む。本開示の哺乳動物ポリペプチドはまた、結合してコード産物を形成する２つ以上のポリペプチドを含み得る。本開示の哺乳動物ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全アミノ酸配列の組み合わせを含有する融合ポリペプチドをさらに含み得る。哺乳動物ポリペプチドはまた、開示される哺乳動物ポリペプチド及びハイブリッド哺乳動物ポリペプチドのいずれかの天然に存在するアレルの及び人工変異を含み得る。
【０１９６】
哺乳動物ポリペプチドは、天然グリコシル化ポリペプチド又は天然非グリコシル化ポリペプチドであり得る。
【０１９７】
適切な哺乳動物ポリペプチドの例としては、限定されないが、免疫グロブリン、抗体、抗原、抗菌ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、サイトカイン、インターロイキン、イムノモデュレーター、神経伝達物質、レセプター、レポータータンパク質、構造タンパク質及び転写因子が挙げられる。
【０１９８】
適切な哺乳動物ポリペプチドの具体例としては、限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）抗体フラグメント、Ｆｖ分子、単鎖Ｆｖ抗体、二量体抗体フラグメント、三量体抗体フラグメント、機能的抗体フラグメント、イムノアドヘシン、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロンα２ｂ、線維芽細胞成長因子２１、ヒト血清アルブミン、ラクダ抗体及び／又は抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、多量体単一ドメイン抗体並びにエリスロポエチンが挙げられる。
【０１９９】
適切な哺乳動物タンパク質の他の例としては、限定されないが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルクロノイルエステラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ホスホリパーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、ウロキナーゼ、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン及びエラスチンが挙げられる。
【０２００】
非哺乳動物ポリペプチド
本開示の非哺乳動物ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意の非哺乳動物ポリペプチドであり得る。本明細書で使用される「非哺乳動物ポリペプチド」は、非哺乳動物生物（例えば、真菌細胞）においてネイティブに発現されるポリペプチド、非哺乳動物においてネイティブに発現されるポリペプチドに由来するポリペプチド又はそのフラグメントである。非哺乳動物ポリペプチドはまた、生物学的活性を保持するペプチド及びオリゴペプチドを含む。本開示の非哺乳動物ポリペプチドはまた、結合してコード産物を形成する２つ以上のポリペプチドを含み得る。本開示の非哺乳動物ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全アミノ酸配列の組み合わせを含有する融合ポリペプチドをさらに含み得る。非哺乳動物ポリペプチドはまた、開示される非哺乳動物ポリペプチド及びハイブリッド非哺乳動物ポリペプチドのいずれかの天然に存在するアレルの及び人工変異を含み得る。
【０２０１】
適切な非哺乳動物ポリペプチドの例としては、限定されないが、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼが挙げられる。
【０２０２】
異種ポリペプチドの産生
目的の異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して、異種ポリペプチドの産生のための栄養培地中で細胞を培養することによって、活性が低下している少なくとも３個のプロテアーゼを含有する本開示の糸状菌細胞により産生される。例えば、適切な培地中で、ポリペプチドが発現及び／又は単離されることを可能にする条件下で実施される実験室又は工業的発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ又は固体発酵）により、細胞を培養し得る。培養は、当技術分野で公知の方法を使用して、炭素源及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は、商業的な供給業者から入手可能であるか、又は（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおいて）公開された組成にしたがって調製され得る。分泌されたポリペプチドは、培地から直接回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは、細胞溶解物から得られ得る。
【０２０３】
活性が低下している少なくとも３個のプロテアーゼを含有する本開示の糸状菌細胞により産生される目的の異種ポリペプチドは、異種ポリペプチドに対して特異的な当技術分野で公知の方法を使用して検出され得る。これらの検出方法としては、限定されないが、特異的抗体の使用、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー、酵素産物の形成、酵素基質の消失及びＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられ得る。例えば、酵素アッセイを使用して、酵素の活性を決定し得る。多くの酵素について、酵素活性を決定するための手順は、当技術分野で公知である（例えば、O. Schomburg and M. Salzmann (eds.), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990を参照のこと）。
【０２０４】
得られた異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により単離され得る。例えば、目的の異種ポリペプチドは、限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発及び沈殿を含む従来の方法により培養培地から単離され得る。次いで、単離された異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の様々な手順（限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製用の等電点電気泳動（ＩＥＦ）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）又は抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）によりさらに精製され得る。
【０２０５】
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調製
本開示の異種ポリヌクレオチドの配列は、当技術分野で公知の任意の適切な方法（限定されないが、直接的な化学合成又はクローニングを含む）により調製される。直接的な化学合成の場合、核酸ポリマーの形成は、典型的には、３’ブロッキング及び５’ブロッキングヌクレオチドモノマーを、成長中のヌクレオチド鎖の末端５’ヒドロキシル基に連続付加することを含み、各付加は、付加されたモノマー（これは、典型的には、リン誘導体、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミダイトなどである）の３’位の成長鎖の末端５’ヒドロキシル基の求核攻撃により行われる、。このような方法論は当業者に公知であり、関連するテキスト及び文献に記載されている［例えば、Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett 21:719-722；米国特許第４，５００，７０７号；米国特許第５，４３６，３２７号；及び米国特許第５，７００，６３７号］。加えて、所望の配列は、適切な制限酵素を使用してＤＮＡを分割し、ゲル電気泳動を使用してフラグメントを分離し、当業者に公知の技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）の利用などによって、ゲルから所望の核酸配列を回収することによって、自然供給源から単離され得る。
【０２０６】
本開示の各異種ポリヌクレオチドを、発現ベクターに組み込むことができる。「発現ベクター」又は「ベクター」は、宿主細胞にトランスダクション、トランスフォーメーション又は感染させ、それにより、細胞に、核酸及び／又はタンパク質の発現を、細胞にネイティブなもの以外に関して、あるいは、細胞にネイティブではない様式において起こさせる化合物及び／又は組成物を指す。「発現ベクター」は、宿主細胞により発現されるべき核酸（通常はＲＮＡ又はＤＮＡ）の配列を含有する。場合により、発現ベクターはまた、宿主細胞（例えば、ウイルス、リポソーム、タンパク質コーティングなど）中への核酸の侵入を達成するのを助けるための材料を含む。本開示における使用に企図される発現ベクターは、その中に、核酸配列を、任意の好ましい又は必要な作動エレメントと共に挿入することができるものを含む。さらに、発現ベクターは、宿主細胞中に移され、その中で複製され得るものでなければならない。好ましい発現ベクターは、プラスミド、特に、十分に文書化されている、及び、核酸配列の転写に好ましい又は必要な作動エレメントを含む制限部位を有するものである。このようなプラスミド並びに他の発現ベクターは、当技術分野で周知である。
【０２０７】
個々のポリヌクレオチドの組み込みは、例えば、発現ベクター（例えば、プラスミド）中の特定部位を切断するための制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ）の使用を含む公知の方法によって達成され得る。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端に相補的な配列を有する末端を有するか、又は有するように合成されるポリヌクレオチドにアニールし得る一本鎖末端を産生する。アニーリングを、適切な酵素（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を使用して実施する。当業者により理解されるように、発現ベクター及び所望のポリヌクレオチドの両方が、多くの場合、同じ制限酵素を使用して切断され、それにより、発現ベクターの末端及びポリヌクレオチドの末端が互いに相補的であることを確実にする。加えて、ＤＮＡリンカーを使用し、発現ベクター中への核酸配列の連結を促進し得る。
【０２０８】
一連の個々のポリヌクレオチドを、当技術分野（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）で公知の方法を利用することにより組み合わせ得る。
【０２０９】
例えば、所望の各ポリヌクレオチドを、最初に、別々のＰＣＲにおいて生成することができる。その後、特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ産物の末端が相補的配列を含むようにする。ＰＣＲ産物を混合、変性及び再アニーリングする場合、それらの３’末端に一致配列を有する鎖がオーバーラップし、互いのプライマーとして作用することができる。ＤＮＡポリメラーゼによるこのオーバーラップの伸長によって、本来の配列が一緒に「スプライシング」される分子が産生される。このように、一連の個々のポリヌクレオチドが、一緒に「スプライシング」され、その後、宿主細胞中に同時にトランスダクションされ得る。したがって、複数の各ポリヌクレオチドの発現が影響を受ける。
【０２１０】
個々のポリヌクレオチド又は「スプライシングされた」ポリヌクレオチドは、次いで、発現ベクターに組み込まれる。本開示は、ポリヌクレオチドが発現ベクターに組み込まれるプロセスに関して限定されない。当業者であれば、発現ベクター中にポリヌクレオチドを組み込むために必要な工程を熟知している。典型的な発現ベクターは、リボソーム結合部位、例えば、長さ３〜９ヌクレオチド及びE. coliにおける開始コドンの上流３〜１１ヌクレオチドに位置付けられるヌクレオチド配列と共に、１つ以上の調節領域により先行される所望のポリヌクレオチドを含有する。Shine and Dalgarno (1975) Nature 254(5495):34-38及びSteitz (1979) Biological Regulation and Development (ed. Goldberger, R. F.), 1:349-399 (Plenum, New York)を参照のこと。
【０２１１】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、コントロール配列が、ＤＮＡ配列又はポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に置かれ、コントロール配列がポリペプチドの発現を導くようにする構成を指す。
【０２１２】
調節領域は、例えば、プロモーター及びオペレーターを含有するそれらの領域を含む。プロモーターを所望のポリヌクレオチドに作動可能に連結し、それにより、ポリヌクレオチドの転写をＲＮＡポリメラーゼ酵素によって開始する。オペレーターは、プロモーターに隣接する核酸の配列であり、それはタンパク質結合ドメインを含み、そこに、リプレッサータンパク質が結合することができる。リプレッサータンパク質の非存在下では、転写は、プロモーターによって開始する。存在する場合、オペレーターのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、それにより、転写を阻害する。このように、転写のコントロールは、使用される特定の調節領域及び対応するリプレッサータンパク質の存在又は非存在に基づいて達成される。例としては、ラクトースプロモーター（Ｌａｄリプレッサータンパク質が、ラクトースと接触した場合、コンフォメーションを変化させ、それにより、Ｌａｄリプレッサータンパク質がオペレーターに結合することを防止する）及びトリプトファンプロモーター（トリプトファンと複合体を形成した場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合するコンフォメーションを有する；トリプトファンの非存在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しないコンフォメーションを有する）が挙げられる。別の例は、ｔａｃプロモーターである（de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(1):21-25を参照のこと）。当業者により理解されるように、これらの及び他の発現ベクターを本開示で使用し得るが、この点において、本開示は限定されない。
【０２１３】
任意の適切な発現ベクターを使用して、所望の配列を組み込み得るが、容易に入手可能な発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、例えばｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、pMＲｌ００、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９、ｐＲＳ４２６；並びにバクテリオファージ、例えばＭ１３ファージ及びλファージなどが挙げられる。当然のことながら、このような発現ベクターは、特定の宿主細胞についてだけ適し得る。しかしながら、当業者であれば、任意の特定の発現ベクターが、任意の所定の宿主細胞について適切であるかを、ルーチン実験によって容易に決定することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞中に導入することができ、次いで、生存及びベクター中に含まれる配列の発現についてモニタリングされる。加えて、関連テキスト及び文献を参照することができ、それらは、発現ベクター及び任意の特定の宿主細胞へのそれらの適合性を記載している。
【０２１４】
本発明の目的（本明細書に記載される所望の異種ポリペプチド、酵素及び１つ以上の触媒ドメインの発現を含む）に適切な発現ベクターは、構成的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結された所望の異種ポリペプチド、酵素又は触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。このようなポリヌクレオチドに作動可能に連結するのに特に適切なプロモーターの例としては、以下の遺伝子由来のプロモーターが挙げられる：ｇｐｄＡ、ｃｂｈ１、Aspergillus oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus nigerの中性α−アミラーゼ、Aspergillus nigerの酸安定α−アミラーゼ、Aspergillus nigerのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Aspergillus awamoriのｇｌａＡ、Rhizomucor mieheiのリパーゼ、Aspergillus oryzaeのアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeのトリオースホスフェートイソメラーゼ、Aspergillus nidulansのアセトアミダーゼ、Aspergillus oryzaeのアセトアミダーゼ、Fusarium oxysporumのトリプシン様プロテアーゼ、真菌エンドα−Ｌ−アラビナーゼ（ａｂｎＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ（ａｂｆＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ（ａｂｆＢ）、真菌キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、真菌フィターゼ、真菌ＡＴＰシンテターゼ、真菌サブユニット９（ｏｌｉＣ）、真菌トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、真菌アルコール脱水素酵素（ａｄｈＡ）、真菌α−アミラーゼ（ａｍｙ）、真菌アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）、真菌アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、真菌グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母ラクターゼ、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ、細菌α−アミラーゼ、細菌Ｓｐｏ２及びＳＳＯ。また、このような適切な発現ベクター及びプロモーターの例は、国際公開公報第２０１２／０６９５９３号（これは、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０２１５】
本発明の糸状菌細胞により産生される異種ポリペプチドを含む医薬組成物
別の態様では、本発明は、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下している本開示の糸状菌細胞であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞により産生される１つ以上の目的の異種ポリペプチド（例えば、哺乳動物ポリペプチド）を含有する組成物（例えば、医薬組成物）であって、薬学的に許容し得る担体と一緒に製剤化された組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の医薬組成物はまた、併用療法で投与され得る（すなわち、他の薬剤と組み合わせられ得る）。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の治療薬剤と組み合わせ、目的の哺乳動物ポリペプチドを含み得る。
【０２１６】
本明細書で使用される「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合性の、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適切である。投与の経路に応じて、活性化合物、すなわち、目的の哺乳動物ポリペプチドを、酸及び化合物を不活化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料を使用してコーティングし得る。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る塩を含み得る。「薬学的に許容し得る塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩であって、いかなる望ましくない毒物学的効果も生じさせない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性無機酸（例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など））に由来するもの、並びに非毒性有機酸（例えば、脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸など）に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど））に由来するもの、並びに非毒性有機アミン（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど）に由来するものが挙げられる。
【０２１８】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容し得る抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容し得る抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）；及び（３）金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。
【０２１９】
本発明の医薬組成物に用いられ得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用により、分散剤の場合には、必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
【０２２０】
これらの組成物はまた、補助剤（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤）を含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順により、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）の包含により、確実にされ得る。また、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物中に含めることが望ましい場合がある。加えて、注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによりもたらされ得る。
【０２２１】
薬学的に許容し得る担体は、滅菌注射可能溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌水溶液又は分散剤及び滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も、組成物に組み込まれ得る。
【０２２２】
治療組成物は、典型的には、滅菌されてなければならず、製造及び保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高い薬物濃度に適切な他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用により、分散の場合には、必要な粒子サイズの維持により及び界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収を、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチン）を含むことによりもたらすことができる。
【０２２３】
無菌注射可能溶液は、活性化合物を、必要量で、適切な溶媒中に、要求に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを伴い組み込むこと（無菌精密ろ過が続く）により調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基礎分散媒体及び上に列挙するものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に組み込むことにより調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合には、特定の調製方法は真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、それによって、有効成分プラス以前に無菌ろ過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末がもたらされる。
【０２２４】
単一投与形態を産生するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、処置されている被験体、及び特定の投与様式に依存して変動し得る。単一投与形態を産生するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を産生する組成物の量であり得る。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容し得る担体との組み合わせにおいて、有効成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは有効成分の約１％〜約３０％の範囲であろう。
【０２２５】
投与計画を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供する。例えば、単回ボーラス投与してもよく、いくつかに分割された用量を経時的に投与してもよく、あるいは、用量を、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に低下又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位形態において非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、処置される被験体のための単位投与量として適切な物理的に分離した単位を指す；各単位は、必要な薬学的担体に関連する所望の治療効果を産生するように計算された活性化合物の所定量を含む。本発明の投与単位形態のための仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成される特定の治療効果、並びに（ｂ）個人における感受性の処置のためのこのような活性化合物を配合する当技術分野に固有の限界により指示され、直接的に依存する。
【０２２６】
目的の哺乳動物ポリペプチドの投与のために、特に、哺乳動物ポリペプチドが抗体である場合、投与量は、宿主体重の約０．０００１〜１００mg/kg、より通常には０．０１〜５mg/kgの範囲である。例えば、投与量は、０．３mg/kg体重、１mg/kg体重、３mg/kg体重、５mg/kg体重、若しくは１０mg/kg体重又は１〜１０mg/kg体重の範囲内であり得る。例示的な処置計画は、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１カ月毎に１回、３カ月毎に１回又は３〜６カ月毎に１回の投与を伴う。抗体についての特定の投与計画は、静脈内投与を介した１mg/kg体重又は３mg/kg体重を含み得るが、抗体は以下の投与スケジュールの１つを使用して与えられる：（ｉ）６投与量について４週間毎、次に３カ月毎；（ｉｉ）３週間毎；（ｉｉｉ）３mg/kg体重１回、それに続く１mg/kg体重、３週間毎。
【０２２７】
あるいは、目的の哺乳動物のポリペプチドは、徐放製剤として投与され得、この場合に必要な投与頻度はより少ない。投与量及び頻度は、患者において投与される物質の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。投与量及び投与頻度は、処置が予防的又は治療的であるかに依存して変動し得る。予防用途では、比較的少ない投与量を、比較的低頻度の間隔で長期間にわたり投与する。一部の患者は、彼らの残りの人生にわたり処置を受け続ける。治療用途では、比較的短い間隔での比較的高い投与量が、疾患の進行が低下又は終結するまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで必要とされることもある。その後、予防計画を患者に行い得る。
【０２２８】
本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルを、変動させてもよく、患者への毒性を伴わず、特定の患者、組成物及び投与様式についての所望の治療応答を達成するために有効である有効成分の量を得るようにする。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態学的な要因（用いられる本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩、若しくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療の持続期間、他の薬物、用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因を含む）に依存する。
【０２２９】
本開示の免疫グロブリンの「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度における減少、疾患症状のない期間の頻度及び持続時間における増加、又は疾患の罹患に起因する機能障害若しくは身体障害の防止をもたらす。例えば、腫瘍の処置について、「治療有効投与量」は、好ましくは、細胞成長又は腫瘍成長を、未処置の被験体と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％だけ阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の阻害する能力を検証することにより評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによるin vitroでのものである。治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させ得るか、そうでなければ、被験体における症状を寛解し得る。当業者であれば、被験体のサイズ、被験体の症状の重症度、及び選択された特定組成物又は投与の経路などの要因に基づいてこのような量を決定することができるであろう。
【０２３０】
本開示の組成物は、１つ以上の投与の経路によって、当技術分野で公知の様々な方法の１つ以上を使用して投与され得る。当業者により理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変動する。本発明の結合部分のための特定の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口の投与の経路（例えば、注射又は注入による）が挙げられる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含む。
【０２３１】
あるいは、本開示の哺乳動物ポリペプチドは、非注射経路、例えば局所、表皮又は粘膜の投与経路など（例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下又は局所）によって投与され得る。
【０２３２】
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体、例えば、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含むコントロール放出製剤などを使用して調製され得る。生物分解性生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸）を使用し得る。このような製剤の多くの調製方法は特許されているか、又は当業者に一般に公知である。（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと）。
【０２３３】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを使用して投与され得る。例えば、特定の実施態様では、本発明の治療組成物は、無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第４，９４１，８８０号；米国特許第４，７９０，８２４号；又は米国特許第４，５９６，５５６号に開示されているデバイス）を使用して投与され得る。周知のインプラント及び本発明に有用なモジュールの例としては、米国特許第４，４８７，６０３号（薬物をコントロール速度で分注するための移植可能な微量注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４８６，１９４号（皮膚を通じて薬物を投与するための治療デバイスを開示している）；米国特許第４，４４７，２３３号（厳密な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４４７，２２４号（継続的な薬物送達のための変動流量の移植可能な注入装置を開示している）；米国特許第４，４３９，１９６号（マルチチャンバー区画を有する浸透薬物送達系を開示している）；及び米国特許第４，４７５，１９６号（浸透薬物送達系を開示している）が挙げられる。
【０２３４】
特定の実施態様では、本開示の哺乳動物ポリペプチドの使用は、治療抗体を使用して処置され得る任意の疾患の処置のためのものである。
【０２３５】
本発明の糸状菌細胞
本明細書における本発明はまた、異種ポリペプチドを発現する細胞、及び異種ポリペプチドの分解を触媒する細胞に見られる少なくとも３個のプロテアーゼの活性を低下又は消失させることによって、糸状菌細胞における異種ポリペプチド（例えば、哺乳動物ポリペプチド）の産生のレベルを増加させることに関する。異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞に見られるプロテアーゼの活性を低下又は消失させることによって、発現されたリコンビナントポリペプチドの安定性が増加し、異種ポリペプチドの産生レベルの増加がもたらされる。糸状菌細胞に見られるプロテアーゼの活性は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子を改変することによって低下され得る。
【０２３６】
「糸状菌細胞」(“Filamentous fungal cells”)は、真菌亜門及び卵菌亜門（subdivision Eumycota and Oomycota）の全ての糸状形態からの細胞を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）。糸状菌細胞は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）による栄養成長は単細胞葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性であり得る。
【０２３７】
任意の糸状菌細胞は、プロテアーゼ活性を減少させるために、核酸の配列を使用してトランスフォーメーションされた、及び／又は改変若しくは突然変異された後に依然として生存可能である限り、本開示に使用され得る。好ましくは、糸状菌細胞は、必要な核酸配列のトランスダクション、タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質）のその後の発現、又は得られた中間体により悪影響を受けない。
【０２３８】
適切な糸状菌細胞の例としては、限定されないが、Acremonium、Aspergillus、Fusarium、Humicola、Mucor、Myceliophthora、Neurospora、Penicillium、Scytalidium、Thielavia、Tolypocladium又はTrichoderma株由来の細胞が挙げられる。特定の実施態様では、糸状菌細胞は、Trichoderma種、Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Cryptococcus、Chrysosporium、Chrysosporium lucknowense、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Myrothecium、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia又はTolypocladium株に由来する。
【０２３９】
本開示のAspergillus菌細胞としては、限定されないが、Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus clavatus、Aspergillus flavus、Aspergillus foetidus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae又はAspergillus terreusが挙げられ得る。
【０２４０】
本開示のNeurospora菌細胞としては、限定されないが、Neurospora crassaが挙げられ得る。
【０２４１】
特定の実施態様では、糸状菌細胞は、Aspergillus細胞ではない。
【０２４２】
特定の実施態様では、糸状菌細胞は、Trichoderma (T. reesei)、Neurospora (N. crassa)、 Penicillium (P. chrysogenum)、Aspergillus (A. nidulans、A. niger及びA. oryzae)、Myceliophthora (M. thermophila)及びChrysosporium (C. lucknowense)からなる群より選択される。
【０２４３】
特定の実施態様では、糸状菌細胞は、Trichoderma菌細胞である。本開示のTrichoderma菌細胞は、野生型Trichoderma株又はその突然変異体に由来し得る。適切なTrichoderma菌細胞の例としては、限定されないが、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、Trichoderma atroviride、Trichoderma virens、Trichoderma viride；及びそれらの別の性形態（すなわち、Hypocrea）を含む。
【０２４４】
糸状菌細胞の遺伝子を破壊し、糸状菌細胞を培養するための一般的な方法は、例えば、Peniciliumについては、Kopke et al. (2010) Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes. Appl Environ Microbiol. 76(14):4664-74. doi: 10.1128/AEM.00670-10において、Aspergillusについては、Maruyama and Kitamoto (2011), Targeted Gene Disruption in Koji Mold Aspergillus oryzae, in James A. Williams (ed.), Strain Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 765, DOI 10.1007/978-1-61779-197-0_27において；Neurosporaについては、Collopy et al. (2010) High-throughput construction of gene deletion cassettes for generation of Neurospora crassa knockout strains. Methods Mol Biol. 2010;638:33-40. doi: 10.1007/978-1-60761-611-5_3において；及びMyceliophthora又はChrysosporiumについては、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／００００４５号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９８／０６４９６号に開示されている。
【０２４５】
糸状菌細胞の構成成分
本開示の特定の態様は、少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下しているか、又は検出不可能である糸状菌細胞であって、増加したレベル（例えば、少なくとも２倍増加したレベル）で産生される異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞に関する。本開示の他の態様は、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１から選択される少なくとも２個、３個又は４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下しているか、又は検出不可能であるTrichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞に関する。本開示の他の態様は、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される以下のプロテアーゼの１個以上のプロテアーゼ活性が低下しているか、又は検出不可能であるTrichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞に関する。本開示の他の態様は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択されるプロテアーゼから選択される少なくとも２個、３個又は４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下しているか、又は検出不可能であるTrichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞であって、対応する親Trichoderma菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞又は近縁種菌細胞に関する。特定の実施態様では、糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又はそれ以上のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している。
【０２４６】
プロテアーゼの発現の低下
本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞における少なくとも３個のプロテアーゼの活性の低下は、プロテアーゼの発現の低下又は消失の結果であり得る。いくつかの実施態様では、少なくとも３個のプロテアーゼの発現の低下又は消失は、触媒ドメイン、コード領域又は各プロテアーゼをコードする遺伝子のコード領域の発現に必要なコントロール配列の改変の結果である。他の実施態様では、プロテアーゼの発現の低下又は消失は、遺伝子、又は、各プロテアーゼをコードする遺伝子の転写若しくは翻訳に必要なそのコントロール配列における、１つ以上のヌクレオチドの導入、置換及び／又は除去の結果である。いくつかの実施態様では、プロテアーゼの発現の低下又は消失は、プロテアーゼの内在性プロモーター又はその一部に対する導入、組換え、又は異種プロモーターによる置換の結果である。本明細書における「異種プロモーター」は、作動可能に連結されたプロモーターＤＮＡ配列であって、プロテアーゼに非ネイティブなものを意味する。いくつかの実施態様では、異種プロモーターは、プロテアーゼがその内在性プロモーターによって発現される対応する親糸状菌細胞における活性と比較して、プロテアーゼ活性を低下する。プロテアーゼの欠損が真菌の成長、胞子形成又は機能に影響を与える場合、例えば、細胞の必須段階（例えば、胞子形成）中にはプロテアーゼが発現されるが、異種タンパク質の産生中には、プロテアーゼがその内在性プロモーターによって発現される対応する親糸状菌株と比較して、プロテアーゼ発現が低下又は消失するように、異種プロモーターを選択する。
【０２４７】
いくつかの実施態様では、異種プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである。いくつかの実施態様では、異種プロモーターは、フラビン含有モノオキシゲナーゼ遺伝子（Ｔｒｅ７６２３０）、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔｒｅ４９０４８）及びｓｌｐ８プロテアーゼ遺伝子（Ｔｒｅ５８６９８）の群より選択される。
【０２４８】
いくつかの実施態様では、異種プロモーターによって低下又は消失するプロテアーゼは、ｓｌｐ２、例えばTrichoderma菌細胞又は近縁種におけるｓｌｐ２である。いくつかの特定の実施態様では、例えば、Trichoderma又は近縁種におけるｓｌｐ２の内在性プロモーターは、フラビン含有モノオキシゲナーゼ遺伝子（Ｔｒｅ７６２３０）、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔｒｅ４９０４８）及びｓｌｐ８プロテアーゼ遺伝子（Ｔｒｅ５８６９８）の群より選択される異種プロモーターで置換される。詳細は、実施例４１に示されている。
【０２４９】
いくつかの実施態様では、本発明の糸状菌細胞は、異種プロモーターを有する少なくとも１個の内在性プロテアーゼであって、プロテアーゼ活性が低下又は欠如している少なくとも１個の内在性プロテアーゼと、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドとを含み、前記細胞は、以下のプロテアーゼ：ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１の１個以上、並びに場合によりｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される１個以上のさらなるプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如している。
【０２５０】
さらなる実施態様では、プロテアーゼの発現の低下又は消失は、各遺伝子に相同な核酸フラグメントをそれぞれが含有する破壊核酸構築物であって、相同性の領域の重複を作製し、構築物ＤＮＡを重複領域間に組み込む破壊核酸構築物を、各プロテアーゼをコードする遺伝子に挿入することの結果である。他の実施態様では、プロテアーゼの発現の低下又は消失は、各プロテアーゼをコードする遺伝子の遺伝子変換の結果である。さらに他の実施態様では、プロテアーゼの発現の低下又は消失は、各プロテアーゼをコードする各遺伝子に対して特異的なアンチセンスポリヌクレオチド又はＲＮＡｉ構築物による結果である。一実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ｐｅｐ型プロテアーゼ）、トリプシン様セリンプロテアーゼ（例えば、ｔｓｐ１）、グルタミン酸プロテアーゼ（例えば、ｇａｐ型プロテアーゼ）、スブチリシンプロテアーゼ（例えば、ｓｌｐ型プロテアーゼ）又はセドリシンプロテアーゼ（例えば、ｔｐｐ１又はｓｌｐ７プロテアーゼ）をコードする遺伝子に対して特異的である。一実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、ｓｌｐ型プロテアーゼをコードする遺伝子に対して特異的である。一実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５又はｓｌｐ６をコードする遺伝子に対して特異的である。一実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、２個以上のプロテアーゼに対して特異的である。一実施態様では、２個以上のプロテアーゼは、ｐｅｐ型プロテアーゼのいずれか１個、トリプシン様セリンプロテアーゼのいずれか１個、ｓｌｐ型プロテアーゼのいずれか１個、ｇａｐ型プロテアーゼのいずれか１個、メタロプロテアーゼのいずれか１個及び／又はセドリシンプロテアーゼのいずれか１個である。一実施態様では、２個以上のプロテアーゼは、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５及び／又はｓｌｐ６である。一実施態様では、ＲＮＡｉ構築物は、表２２．２の核酸配列のいずれか１つを含む。
【０２５１】
いくつかの実施態様では、プロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含有する。他の実施態様では、突然変異は、各プロテアーゼの発現を低下又は消失させる。さらなる実施態様では、突然変異は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させるノックアウト突然変異、切断突然変異、点突然変異、ミスセンス突然変異、置換突然変異、フレームシフト突然変異、挿入突然変異、重複突然変異、増幅突然変異、転座突然変異、逆位突然変異である。
【０２５２】
いくつかの実施態様では、突然変異は、プロテアーゼコード遺伝子の欠損である。他の実施態様では、突然変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードするプロテアーゼコード遺伝子の一部の欠損である。さらに他の実施態様では、突然変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードするプロテアーゼコード遺伝子の一部の点突然変異である。
【０２５３】
糸状菌細胞のプロテアーゼ遺伝子を破壊する別の方法は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系、又はクラスタ化された規則的な空間ショートパリンドロームリピートを含む。ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系は、新規な遺伝子編集技術である（特定の遺伝子をサイレンシング、増強又は変更する）。ｃａｓ９遺伝子と、特別設計されたＣＲＩＳＰＲとを含有するプラスミドを挿入することによって、生物のゲノムを任意の所望の位置で切断し得る。Ｃａｓ９遺伝子は、化膿連鎖球菌のＩＩ型細菌ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。遺伝子産物ＣＡＳ９ヌクレアーゼは、特定のゲノムターゲティングＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡと複合体形成し、ＤＮＡ切断活性の高い部位特異性を有する。様々な異種生物において、ＣＡＳ９は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼとして機能し得ることが最近示されている（Mali et al. 2013: Rna guided human genome engineering via Cas9. Science 339:823-826; Cong et al 2013: Multiplex genome engineering using CRISPR-Cas systems. Science 339:819-823; Jiang et al 2013: RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol 31:233-239; Jinek et al. 2013: RNA programmed genome editing in human cells. eLife 2:e00471; Hwang et al. 2013: Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotech 31:227-279. DiCarlo et al 2013: Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. NAR 41:4336-4343）。
【０２５４】
ガイドＲＮＡ合成は、通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されるプロモーターから行われており、酵母ではＳＮＲ５２  ｓｎｏＲＮＡプロモーターが最も一般的に使用されており、植物及び動物ではＵ３／Ｕ６  ｓｎｏＲＮＡプロモーターが最も一般的に使用されている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されるプロモーターは、転写後修飾、５’キャップ、５’／３’ＵＴＲ及びポリＡテイルのために、ガイドＲＮＡ合成に不適切であると考えられている。しかしながら、ガイドＲＮＡ配列が自己プロセシングリボザイム配列に隣接する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターを使用し得ることが最近実証されている。次いで、一次転写産物が自己触媒切断を受け、所望のｇＲＮＡ配列が生成される（Gao and Zhao 2014: Self processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNA’s in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology e-publication ahead of print; March 2014）。
【０２５５】
実施例２１では、T. reeseiにおける異種タンパク質の効率的な産生に影響を与え、及び／又はこれを妨げる様々なプロテアーゼコード遺伝子を破壊する方法が例示されている。表２１．１に示されているガイドＲＮＡ配列、及びTrichoderma細胞における対応するプロテアーゼ遺伝子を破壊するためのそれらの使用も本発明の一部である。
【０２５６】
プロテアーゼ遺伝子の組み合わせ
本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個又はそれ以上のアスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼを含有し得る。特定の実施態様では、前記プロテアーゼは、ｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子、ｇａｐ型プロテアーゼ遺伝子、ｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子、ａｍｐ型プロテアーゼ、ｓｅｐ型プロテアーゼ及びｍｐ型プロテアーゼによってコードされる。いくつかの実施態様では、ｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ６、ｐｅｐ８、ｐｅｐ  ９、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１１及びｐｅｐ１２、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４、ｐｅｐ１６から選択される。他の実施態様では、ｇａｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される。他の実施態様では、ｇａｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｇａｐ３又はｇａｐ４から選択される。さらなる実施態様では、ｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３及びｓｌｐ７から選択されるか；又はｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７及びｓｌｐ８から選択されるか、又はｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７及びｓｌｐ８及びｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６から選択される。特定の好ましい実施態様では、ｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｓｌｐ１である。特定の実施態様では、ａｍｐ型プロテアーゼは、ａｍｐ１及びａｍｐ２から選択される。さらなる実施態様では、ｓｅｐ型プロテアーゼは、ｓｅｐ１、ｓｅｄ２、ｓｅｄ３及びｓｅｄ５から選択される。さらなる実施態様では、ｍｐ型メタロプロテアーゼは、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４及びｍｐ５から選択される。他の実施態様では、前記プロテアーゼは、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｓｅｐ１、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、ｓｌｐ８、ｇａｐ１、ｇａｐ２及びｔｐｐ１から選択される遺伝子によってコードされる。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される第２の群のプロテアーゼコード遺伝子と場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１から選択される第１の群のプロテアーゼの少なくとも２個、３個又は少なくとも４個のプロテアーゼの発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される第２の群のプロテアーゼコード遺伝子と場合により組���合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される以下のプロテアーゼの１個以上の発現レベルが低下又は欠如している。特定の実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１及びｓｌｐ１から選択される少なくとも３個のプロテアーゼコード遺伝子の発現レベルが低下又は欠如している。他の実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、ｇａｐ１、ｓｌｐ１及びｐｅｐ１から選択される少なくとも３個のプロテアーゼコード遺伝子の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１及びｇａｐ１の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４及びｓｌｐ１の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１及びｓｌｐ３の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３及びｐｅｐ３の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３及びｐｅｐ２の発現レベルが低下又は欠如している。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２及びｐｅｐ５の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５及びｔｓｐ１の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１及びｓｌｐ７の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、少なくとも１２個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１２個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１２個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７である。他の実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、
（ｉ）少なくとも１３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；又は
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかであり、
（ｉｉ）前記細胞は、少なくとも１４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２であり；
（ｉｉｉ）前記細胞は、少なくとも１５個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである。
【０２５８】
他の実施態様では、本発明の糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、上記プロテアーゼにおける１３個、１４個又は１５個の突然変異によって、及び１個以上の突然変異をさらに含むことによって、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個又はそれ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、さらなる突然変異はそれぞれ、対応するさらなるプロテアーゼ活性を低下又は消失させ、前記さらなるプロテアーゼは、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される。
【０２５９】
いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ７及びｓｌｐ８の発現レベルが低下又は欠如している。いくつかの実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１，ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ７、ｓｌｐ８及びｇａｐ２の発現レベルが低下又は欠如している。
【０２６０】
特定の実施態様では、糸状菌細胞は、プロテアーゼ活性が低下している少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個又はそれ以上のプロテアーゼを有し、野生型活性を有する対応するプロテアーゼはそれぞれ、配列番号１〜１６；１７〜３６；３７〜５７；５８〜６５；６６〜８１；８２〜９７；９８〜１１７；１１８〜１２８；１２９〜１４４；１６６〜１８１；１８２〜１８５；４９１〜５８８、配列番号７５０〜８０５又は配列番号８７５〜９２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。糸状菌細胞が、１個以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下しているTrichoderma菌細胞である実施態様では、野生型活性を有する対応するプロテアーゼはそれぞれ、配列番号１、１７、３７、５８、６６、８２、９８、１１８、１２９、１６６、１８２、５０７、５２２、５３０、７５０、７５９、７７５、配列番号７８６又は配列番号８７５〜９２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【０２６１】
異種ポリペプチド
本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、異種ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様では、異種ポリペプチドは非哺乳動物ポリペプチドである。
【０２６２】
糸状菌細胞が、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、非グリコシル化哺乳類ポリペプチド、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド又はそれらの組み合わせ（限定されないが、免疫グロブリン、抗体、成長因子及びインターフェロンを含む）であり得る。いくつかの実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは免疫グロブリン又は抗体である。糸状菌細胞が、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する実施態様では、糸状菌細胞、例えばTrichoderma菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される少なくとも３個又は４個のプロテアーゼと場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１から選択される少なくとも２個、３個又は少なくとも４個のプロテアーゼコード遺伝子発現が低下又は欠如し得る。糸状菌細胞が、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有するいくつかの実施態様では、例えば、Trichoderma菌細胞、前記細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される１個以上のさらなるプロテアーゼコード遺伝子と場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される以下のプロテアーゼの１個以上の発現レベルが低下又は欠如している。特定の好ましい実施態様では、前記細胞、例えば、Trichoderma菌細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１及びｇａｐ１の発現が低下又は欠如している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２及びｓｌｐ３の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３及びｔｓｐ１の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１及びｐｅｐ１の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１及びｇａｐ１の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４及びｐｅｐ３の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３及びｐｅｐ２の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２及びｐｅｐ５の発現が低下している。いくつかの実施態様では、前記細胞、例えば、Trichoderma細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、少なくとも１２個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１２個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１２個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７である。他の実施態様では、前記細胞、例えば、Trichoderma細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、
（ｉ）少なくとも１３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかであり；
（ｉｉ）少なくとも１４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２であり；又は
（ｉｉｉ）少なくとも１５個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである。
【０２６３】
他の実施態様では、前記細胞、例えば、Trichoderma細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、上記プロテアーゼにおける１３個、１４個又は１５個の突然変異によって、及び１個以上の突然変異をさらに含むことによって、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個又はそれ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、さらなる突然変異はそれぞれ、対応するさらなるプロテアーゼ活性を低下又は消失させ、前記さらなるプロテアーゼは、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される。
【０２６４】
他の実施態様では、前記糸状菌細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する。前記糸状菌細胞、例えば、Trichoderma菌細胞が、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する実施態様では、前記糸状菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される少なくとも３個若しくは４個のプロテアーゼ、又はｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７及びｔｓｐ１から選択される少なくとも３個若しくは少なくとも４個のプロテアーゼコード遺伝子と場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｓｅｐ１から選択される少なくとも２個、３個又は４個のプロテアーゼの発現が低下又は欠如し得る。
【０２６５】
前記糸状菌細胞が、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有するいくつかの実施態様では、例えば、Trichoderma細胞、前記細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される第２の群のプロテアーゼコード遺伝子と場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２、ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される以下のプロテアーゼの１個以上の発現レベルが低下又は欠如している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１及びｇａｐ２の発現が低下している。
【０２６６】
特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１及びｇａｐ２の発現が低下している。他の実施態様では、前記細胞、例えばTrichoderma菌細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２及びｐｅｐ４の発現が低下している。さらなる実施態様では、前記細胞は、成長因子をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４及びｐｅｐ５から選択されるｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子の発現が低下している。
【０２６７】
特定の好ましい実施態様では、成長因子はＩＧＦ−１であるか、又はインターフェロンはインターフェロンα２ｂである。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１及びｐｅｐ４の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４及びｓｌｐ７の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７及びｓｌｐ２の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２及びｐｅｐ２の発現が低下している。
【０２６８】
特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２及びｐｅｐ３の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３及びｐｅｐ５の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５及びｓｌｐ１の発現が低下している。特定の実施態様では、前記細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｓｌｐ１及びｔｓｐ１の発現が低下している。
【０２６９】
いくつかの実施態様では、前記細胞、例えばTrichoderma細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、少なくとも１２個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１２個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１２個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７である。他の実施態様では、前記細胞、例えば、Trichoderma細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、
（ｉ）少なくとも１３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１３個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１３個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ７；
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｓｌｐ３
のいずれかであり；
（ｉｉ）少なくとも１４個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１４個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１４個のプロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２であり；又は
（ｉｉｉ）少なくとも１５個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、前記１５個のプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異を含み、前記１５個のプロテアーゼは、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ１；又は、
＞ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｐｅｐ２、ｓｅｐ１、ｓｌｐ８、ａｍｐ２、ｐｅｐ９、ｓｌｐ２、ｍｐ５
のいずれかである。
【０２７０】
他の実施態様では、前記糸状菌細胞、例えば、Trichoderma細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン又はインターロイキンをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有し、上記１３個、１４個又は１５個のプロテアーゼにおける突然変異を有し、さらに１個以上のさらなる突然変異を含むことによって、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個又はそれ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如しており、さらなる突然変異はそれぞれ、対応するさらなるプロテアーゼ活性を低下又は消失させ、前記さらなるプロテアーゼは、
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択される。
【０２７１】
特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍又はそれ以上高いレベルで産生される。他の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、対応する親糸状菌細胞における全長型ポリペプチドの産生レベルよりも高いレベルで、全長型で産生される。
【０２７２】
糸状菌細胞が、非哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する実施態様では、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼであり得る。糸状菌細胞が、非哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する実施態様では、糸状菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１及びｇａｐ２から選択される３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は少なくとも６個のプロテアーゼコード遺伝子と場合により組み合わせて、ｐｅｐ９、ａｍｐ１、ａｍｐ２  ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４、ｍｐ５及びｓｅｐ１から選択される少なくとも２個、３個又は４個のプロテアーゼの発現が低下しているか、又は検出不可能である。特定の実施態様では、非哺乳動物ポリペプチドは、対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍又はそれ以上高いレベルで産生される。他の実施態様では、非哺乳動物ポリペプチドは、対応する親糸状菌細胞における全長型ポリペプチドの産生レベルよりも高いレベルで、全長型で産生される。
【０２７３】
さらなるプロテアーゼの活性の低下
いくつかの実施態様では、本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞はまた、１個以上のさらなるプロテアーゼの活性が低下している。特定の実施態様では、１個以上のさらなるプロテアーゼの発現レベルが低下している。特定の好ましい実施態様では、１個以上のさらなるプロテアーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、対応するプロテアーゼ活性を低下させる突然変異を含む。１個以上のさらなるプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ７、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、ｓｌｐ８であり得るか、又は
＞アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ６、ｐｅｐ１０、ｐｅｐ１３、ｐｅｐ１４又はｐｅｐ１６；
＞ｓｌｐ様プロテアーゼｓｌｐ５７４３３、ｓｌｐ３５７２６、ｓｌｐ６０７９１又はｓｌｐ１０９２７６；
＞ｇａｐ様プロテアーゼｇａｐ３又はｇａｐ４；
＞セドリシン様プロテアーゼｓｅｄ２、ｓｅｄ３又はｓｅｄ５；
＞プロテアーゼ６５７３５、プロテアーゼ７７５７７、プロテアーゼ８１０８７、プロテアーゼ５６９２０、プロテアーゼ１２２０８３、プロテアーゼ７９４８５、プロテアーゼ１２０９９８又はプロテアーゼ６１１２７の群より選択されるグループＡプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ２１６５９、プロテアーゼ５８３８７、プロテアーゼ７５１５９、プロテアーゼ５６８５３又はプロテアーゼ６４１９３の群より選択されるグループＢプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ８２４５２、プロテアーゼ８０７６２、プロテアーゼ２１６６８、プロテアーゼ８１１１５、プロテアーゼ８２１４１、プロテアーゼ２３４７５の群より選択されるグループＣプロテアーゼ；
＞プロテアーゼ１２１８９０、プロテアーゼ２２７１８、プロテアーゼ４７１２７、プロテアーゼ６１９１２、プロテアーゼ８０８４３、プロテアーゼ６６６０８、プロテアーゼ７２６１２、プロテアーゼ４０１９９の群より選択されるグループＤプロテアーゼ；又は
＞プロテアーゼ２２２１０、プロテアーゼ１１１６９４、プロテアーゼ８２５７７の群より選択されるグループＥプロテアーゼ
からなる群より選択されるプロテアーゼをコードする遺伝子であり得る。
【０２７４】
特定の実施態様では、糸状菌細胞がAspergillus細胞である場合、全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親Aspergillus細胞における全プロテアーゼ活性の５０％以下に低下している。
【０２７５】
特定の実施態様では、本開示の細胞（例えば、Trichoderma細胞）において、全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない対応する親糸状菌細胞における全プロテアーゼ活性の４９％以下、３１％以下、１３％以下、１０％以下、６．３％以下又は５．５％以下に低下している。
【０２７６】
さらなる組換え改変
特定の実施態様では、本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞はまた、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼの活性が低下している。ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３０）は、ドリチル−リン酸Ｄ−マンノース由来のα−Ｄ−マンノシル残基を膜脂質連結オリゴ糖に移転する。典型的には、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ａｌｇ３遺伝子によってコードされる。したがって、特定の実施態様では、糸状菌細胞は、ａｌｇ３遺伝子によってコードされる活性である、ＡＬＧ３の活性が低下している。いくつかの実施態様では、ａｌｇ３遺伝子は、対応するＡＬＧ３活性を低下させる突然変異を含有する。特定の実施態様では、ａｌｇ３遺伝子を糸状菌細胞から欠損させる。
【０２７７】
他の実施態様では、本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞において内在性であり得るか、又はそれは宿主細胞に異種性であり得る。これらのポリヌクレオチドは、ゴルジからＥＲに輸送される高マンノースグリカンを発現する糸状菌細胞に特に有用であり、有効なエキソ−α−２−マンノシダーゼ切断を伴わない。α−１，２−マンノシダーゼは、グリコシドヒドロラーゼファミリー４７（cazy.org/GH47_all.html）に属するマンノシダーゼＩ型酵素であり得る。特定の実施態様では、α−１，２−マンノシダーゼは、cazy.org/GH47_characterized.htmlに記載されている酵素である。特に、α−１，２−マンノシダーゼは、糖タンパク質を切断するＥＲ型酵素（例えば、ＥＲ−α−マンノシダーゼＩ  ＥＣ３．２．１．１１３酵素のサブファミリーの酵素）であり得る。このような酵素の例としては、ヒトα−２−マンノシダーゼ１Ｂ（ＡＡＣ２６１６９）、哺乳動物ＥＲマンノシダーゼの組み合わせ、又は糸状菌酵素、例えばα−１，２−マンノシダーゼ（ＭＤＳ１）（T. reesei  ＡＡＦ３４５７９；Maras M et al J Biotech. 77, 2000, 255）などが挙げられる。ＥＲ／ゴルジ発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、ターゲティングペプチド（例えば、ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ又はＥＲ若しくは初期ゴルジタンパク質の一部）と融合されるか、又は動物若しくは植物のマンノシダーゼＩ酵素の構造をターゲティングする内在性ＥＲによって発現される。例えば、Callewaert et al. 2001 Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1,2-α-D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichia pastoris. FEBS Lett 503: 173−178を参照のこと。
【０２７８】
さらなる実施態様では、本開示の糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する。このような触媒ドメインは、非哺乳動物細胞において複合体Ｎ−グリカンを発現させるのに有用である。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩ；ＧｎＴＩ；ＥＣ２．４．１．１０１）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋３−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ＜＝＞ＵＤＰ＋３−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ（Ｒは、グリカンアクセプターにおけるＮ連結オリゴ糖の残部を表す）を触媒する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素の任意の部分である。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩＩ；ＧｎＴＩＩ；ＥＣ２．４．１．１４３）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋６−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ＜＝＞ＵＤＰ＋６−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ（Ｒは、グリカンアクセプターにおけるＮ連結オリゴ糖の残部を表す）を触媒する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することができるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素の任意の部分である。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの例は、国際公開公報第２０１２／０６９５９３号に見られ得る。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、単一のポリヌクレオチドによってコードされ得る。特定の実施態様では、単一のポリヌクレオチドは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する融合タンパク質をコードする。あるいは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１のポリヌクレオチドによってコードされ得る。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、第２のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０２７９】
糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞がＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含有する実施態様では、細胞はまた、マンノシダーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。マンノシダーゼＩＩ酵素は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５のＭＡＮ５構造を切断して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３を生成することができ、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインの作用と組み合わせた場合にはＧ０を生成することができ；さらに、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインの作用と共にＧ１及びＧ２を生成することができる。特定の実施態様では、マンノシダーゼＩＩ型酵素は、グリコシドヒドロラーゼファミリー３８（cazy.org/GH38_all.html）に属する。このような酵素の例としては、ヒト酵素ＡＡＣ５０３０２、D. melanogaster酵素（Van den Elsen J.M. et al (2001) EMBO J. 20: 3008-3017）、ＰＤＢ参照１ＨＴＹの３Ｄ構造を有するもの、及びＰＤＢ中の触媒ドメインに参照される他のものが挙げられる。ＥＲ／ゴルジ発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、例えば、国際公開公報第２０１２／０６９５９３号に記載されているターゲティングペプチド、又は配列番号５８９〜５９４のターゲティングペプチドを使用して、Ｎ末端ターゲティングペプチドと融合される。マンノシダーゼＩＩ型マンノシダーゼの触媒ドメインによるトランスフォーメーションの後、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３又はＧ０を有効に産生する株が選択される。
【０２８０】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、糸状菌細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。
【０２８１】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、糸状菌細胞は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する。一般に、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙグリコシルトランスフェラーゼファミリー７（cazy.org/GT7_all.html）に属する。有用なβ４ＧａｌＴ酵素の例としては、β４ＧａｌＴ１、例えば、ウシBos taurus酵素ＡＡＡ３０５３４．１（Shaper N.L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (6), 1573-1577 (1986)）、ヒト酵素（Guo S. et al. Glycobiology  2001, 11:813-20）及びハツカネズミ酵素ＡＡＡ３７２９７（Shaper, N.L. et al. 1998 J. Biol. Chem. 263 (21), 10420-10428）が挙げられる。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明の特定の実施態様では、糸状菌細胞はまた、ＵＤＰ−Ｇａｌ４エピメラーゼ及び／又はＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明の特定の実施態様では、宿主細胞を培養する場合、ラクトースをグルコースの代わりに炭素源として使用し得る。培養培地は、ｐＨ４．５〜７．０又は５．０〜６．５であり得る。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに場合によりＵＤＰ−Ｇａｌ４エピメラーゼ及び／又はＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含有する本発明の特定の実施態様では、二価陽イオン（例えば、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋）を細胞培養培地に追加し得る。
【０２８２】
先の実施態様と組み合わせ得る特定の実施態様では、宿主細胞におけるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルは、野生型宿主細胞における活性レベルと比較して低下している。特定の実施態様では、糸状菌は、ｏｃｈｌ遺伝子の発現レベルが、野生型糸状菌細胞における発現レベルと比較して低下している。
【０２８３】
別の態様は、糸状菌細胞においてＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン［すなわち、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ］を生産する方法であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞であって、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルが、野生型糸状菌細胞における活性レベルと比較して低下している糸状菌細胞を提供する工程、及び前記糸状菌細胞を培養してＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを生産する工程を含み、前記Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンが、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する方法を含む。特定の実施態様では、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンは、異種ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）に相当する。
【０２８４】
別の態様は、糸状菌細胞において複合体Ｎ−グリカン（すなわち、末端ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３構造を含むＮ−グリカン）、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛すなわち、Ｇ０、すなわちＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝グリカンを生産する方法であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞であって、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルが、野生型糸状菌細胞における活性レベルと比較して低下しており、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む糸状菌細胞を提供する工程、並びに前記糸状菌細胞を培養して、前記複合体Ｎ−グリカン、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを生産する工程を含み、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンが、前記糸状菌細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する方法を含む。特定の実施態様では、複合体Ｎ−グリカン、例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）に相当する。特定の実施態様では、前記複合体Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３及び／又はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３である。
【０２８５】
別の態様は、糸状菌細胞においてＧ１若しくはＧ２  Ｎ−グリカン又はそれらの混合物、例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛すなわち、Ｇ１、すなわちＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝又はＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝及び／又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛すなわち、Ｇ２、すなわちＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｇａｌβ４  ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝グリカンを生産する方法であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞であって、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性レベルが、野生型糸状菌細胞における活性レベルと比較して低下しており、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びＧａｌＴ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む糸状菌細胞を提供する工程、並びに前記糸状菌細胞を培養して、Ｇ１若しくはＧ２  Ｎ−グリカン又はそれらの混合物を生産する工程を含み、Ｇ１グリカンが、前記糸状菌細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成するか、又はＧ２グリカンが、前記糸状菌細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する方法を含む。特定の実施態様では、Ｇ１グリカンは、ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する。特定の実施態様では、Ｇ２グリカンは、ポリペプチドの全Ｎ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する。
【０２８６】
特定の実施態様では、複合体Ｎ−グリカンを生産する方法は、異なるグリカンの混合物を生成するであろう。複合体Ｎ−グリカン又はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、このようなグリカン混合物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％）又は少なくとも９０％若しくはそれ以上を構成し得る。特定の実施態様では、ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％）又は少なくとも９０％若しくはそれ以上は、このようなグリカン混合物からなる。特定の実施態様では、複合体並びにＧ１及び／又はＧ２  Ｎ−グリカンを生産する方法は、異なるグリカンの混合物を生成するであろう。複合体Ｎ−グリカン、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇ１及び／又はＧ２は、このようなグリカン混合物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％）又は少なくとも９０％若しくはそれ以上を構成し得る。特定の実施態様では、ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％）又は少なくとも９０％若しくはそれ以上は、このようなグリカン混合物からなる。
【０２８７】
特定の実施態様では、ハイブリッドＮ−グリカンを生産する方法が望ましい。本明細書で使用される「ハイブリッド」という用語は、非置換の末端マンノース残基（高マンノース型グリカン中に存在する）及びＮ−アセチルグルコサミン連結を有する置換マンノース残基（例えば、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ）の両方を含むグリカンを意味する。このような実施態様では、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチド及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドで、Ｍａｎ５｛すなわち、Ｍａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝を発現する糸状菌細胞（例えば、T. reesei株）をトランスフォーメーションし、糸状菌細胞を培養してハイブリッドＮ−グリカンを生産し、ハイブリッドＮ−グリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎ−グリカンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（モル％）を構成する。特定の実施態様では、ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％（mol％）は、ハイブリッドＮ−グリカンからなる。
【０２８８】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、複合体、ハイブリッド、Ｇ１及びＧ２  Ｎ−グリカンをアミノ酸、ペプチド及びポリペプチドから選択される分子に結合させ得る。特定の実施態様では、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、複合体、ハイブリッド、Ｇ１及びＧ２  Ｎ−グリカンを異種ポリペプチドに結合させる。特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、グリコシル化タンパク質である。特定の実施態様では、グリコシル化ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２８９】
特定の実施態様では、グリコシルトランスフェラーゼ、例えばＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ若しくはＧａｌＴ、又はグリコシルヒドロラーゼ、例えばα−１，２−マンノシダーゼ若しくはマンノシダーゼＩＩは、触媒ドメインに連結されたターゲティングペプチドを含む。本明細書で使用される「連結された」という用語は、ポリペプチドの場合にはアミノ酸残基の２つのポリマー、又はポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチドの２つのポリマーが、互いに隣接して直接カップリングされているか、又は同じポリペプチド若しくはポリヌクレオチド内にあるが、介在アミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより分離されていることを意味する。本明細書で使用される「ターゲティングペプチド」は、リコンビナントタンパク質を糸状菌細胞内の小胞体（ＥＲ）又はゴルジ装置（ゴルジ）に局在化することができるリコンビナントタンパク質の任意の数の連続するアミノ酸残基を指す。ターゲティングペプチドは、触媒ドメインのＮ末端又はＣ末端であり得る。特定の実施態様では、ターゲティングペプチドは、触媒ドメインのＮ末端である。特定の実施態様では、ターゲティングペプチドは、ＥＲ又はゴルジ膜への直接的な結合を提供する。ターゲティングペプチドの構成成分は、ＥＲ又はゴルジ装置中に通常存在する任意の酵素に由来し得る。このような酵素としては、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジタンパク質並びにＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１及びＯＣＨ１酵素が挙げられる。適切なターゲティングペプチドは、国際公開公報第２０１２／０６９５９３号に記載されている。一実施態様では、ＧｎＴＩ又はＧｎＴＩＩのターゲティングペプチドは、ヒトＧｎＴＩＩ酵素である。他の実施態様では、ターゲティングペプチドは、TrichodermaＫｒｅ２、Ｋｒｅ２様、Ｏｃｈ１、Ａｎｐ１及びＶａｎ１に由来する。一実施態様では、ターゲティングペプチドは、配列番号５８９〜５９４の群より選択される。
【０２９０】
本発明の糸状菌細胞の使用
本明細書における本発明はさらに、異種ポリペプチドの安定性を改善するために、及び異種ポリペプチドを作製するために、少なくとも３個のプロテアーゼのプロテアーゼ活性が低下又は欠如している本開示の糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）であって、増加したレベルで産生される異種ポリペプチド（例えば、哺乳動物ポリペプチド）をコードするリコンビナントポリヌクレオチドを含有する本開示の糸状菌細胞（例えばTrichoderma菌細胞）のいずれかを使用する方法に関する。タンパク質の安定性を測定する及び異種ポリペプチドを作るための方法は周知であり、限定されないが、本開示に記載される全ての方法及び技術を含む。
【０２９１】
したがって、本開示の特定の実施態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示の糸状菌細胞であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を提供すること；及びｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記異種ポリペプチドが、前記プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法に関する。本開示の他の実施態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示のTrichoderma菌細胞であって、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供すること；及びｂ）前記哺乳動物ポリペプチドが発現されるように前記細胞を培養することによって、哺乳動物ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、前記哺乳動物ポリペプチドが、前記プロテアーゼをコードする遺伝子の突然変異を含有しない宿主細胞と比較して増加した安定性を有する方法に関する。糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、「本発明の糸状菌細胞」という表題のセクションに記載されている任意の細胞であり得る。ポリペプチドの安定性を測定する方法、及び糸状菌細胞及びTrichoderma菌細胞を培養するための方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、本開示に記載される全ての方法及び技術を含む。
【０２９２】
特定の実施態様では、異種ポリペプチド又は哺乳動物ポリペプチドの安定性は、対応する親糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞において発現される異種ポリペプチド又は哺乳動物ポリペプチドと比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍又はそれ以上増加している。
【０２９３】
本開示の他の実施態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示の糸状菌細胞であって、異種ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有する糸状菌細胞を提供すること；ｂ）前記異種ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること；及びｃ）前記異種ポリペプチドを精製することによって、異種ポリペプチドを作製する方法に関する。本開示のさらなる実施態様は、ａ）少なくとも３個のプロテアーゼの活性が低下又は欠如している本開示のTrichoderma菌細胞であって、哺乳動物ポリペプチドをコードするリコンビナントポリヌクレオチドをさらに含有するTrichoderma菌細胞を提供すること；ｂ）前記哺乳動物ポリペプチドが発現されるように前記宿主細胞を培養すること；及びｃ）前記哺乳動物ポリペプチドを精製することによって、哺乳動物ポリペプチドを作製する方法に関する。糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞は、「本発明の糸状菌細胞」という表題のセクションに記載されている任意の細胞であり得る。糸状菌細胞及びTrichoderma菌細胞を培養し、ポリペプチドを精製する方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、本開示に記載される全ての方法及び技術を含む。
【０２９４】
特定の実施態様では、糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞を、ｐＨ３．５〜７；ｐＨ３．５〜６．５；ｐＨ４〜６；ｐＨ４．３〜５．７；ｐＨ４．４〜５．６；及びｐＨ４．５〜５．５から選択されるｐＨ範囲で培養する。特定の実施態様では、抗体を生産するために、糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞を、ｐＨ４．７〜６．５；ｐＨ４．８〜６．０；ｐＨ４．９〜５．９；及びｐＨ５．０〜５．８から選択されるｐＨ範囲で培養する。
【０２９５】
いくつかの実施態様では、異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様では、異種ポリペプチドは、非哺乳動物ポリペプチドである。
【０２９６】
特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）抗体フラグメント、Ｆｖ分子、単鎖Ｆｖ抗体、二量体抗体フラグメント、三量体抗体フラグメント、機能的な抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、多量体単一ドメイン抗体、イムノアドヘシン、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インスリン及びエリスロポエチンから選択される。他の実施態様では、哺乳動物タンパク質は、免疫グロブリン又はインスリン様成長因子１である。さらに他の実施態様では、哺乳動物タンパク質は、抗体である。さらなる実施態様では、哺乳動物ポリペプチドの収量は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５グラム／リットルである。特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、抗体、場合により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。さらなる実施態様では、抗体の収量は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５グラム／リットルである。さらなる他の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは、成長因子又はサイトカインである。さらなる実施態様では、成長因子又はサイトカインの収量は、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５グラム／リットルである。さらなる実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、抗体は、さらなるアミノ酸残基を有しない天然抗体Ｃ末端及びＮ末端の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％を含有する。他の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、抗体は、いかなるＣ末端又はＮ末端アミノ酸残基も欠如していない天然抗体Ｃ末端及びＮ末端の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％を含有する。
【０２９７】
哺乳動物ポリペプチドが細胞培養物から精製される特定の実施態様では、哺乳動物ポリペプチドを含有する培養物は、産生されるポリペプチドの質量の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満である質量パーセンテージを構成するポリペプチドフラグメントを含有する。特定の好ましい実施態様では、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、ポリペプチドフラグメントは、重鎖フラグメント及び／又は軽鎖フラグメントである。哺乳動物ポリペプチドが抗体であり、前記抗体が細胞培養物から精製される他の実施態様では、抗体を含有する培養物は、産生される抗体の質量の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満である質量パーセンテージを構成する遊離の重鎖及び／又は軽鎖を含有する。ポリペプチドフラグメントの質量パーセンテージを決定する方法は当技術分野で周知であり、ＳＤＳ−ゲルからのシグナル強度の測定を含む。
【０２９８】
さらなる実施態様では、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから選択される。
【０２９９】
開示される方法のいずれかの特定の実施態様では、前記方法は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上又は５個以上のプロテアーゼ阻害剤を提供するさらなる工程を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、哺乳動物ポリペプチドと同時発現されるペプチドである。他の実施態様では、阻害剤は、アスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼから選択されるプロテアーゼファミリーからの少なくとも２個、少なくとも３個又は少なくとも４個のプロテアーゼを阻害する。
【０３００】
開示される方法のいずれかの特定の実施態様では、糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞はまた、担体タンパク質を含有する。本明細書で使用される「担体タンパク質」は、糸状菌細胞又はTrichoderma菌細胞に内在性であり、これらにより高度に分泌されるタンパク質の部分である。適切な担体タンパク質としては、限定されないが、T. reeseiのマンナナーゼＩ（Ｍａｎ５Ａ又はＭＡＮＩ）、T. reeseiのセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ又はＣＢＨＩＩ）（例えば、Paloheimo et al Appl. Environ. Microbiol. 2003 December; 69(12): 7073-7082を参照のこと）又はT. reeseiのセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のそれらが挙げられる。いくつかの実施態様では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１である。他の実施態様では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１コア領域及びＣＢＨ１リンカー領域の部分を含む切断T. reesei  ＣＢＨ１タンパク質である。いくつかの実施態様では、担体、例えばセロビオヒドロラーゼ又はそのフラグメントなどを、抗体軽鎖及び／又は抗体重鎖に融合する。いくつかの実施態様では、担体、例えばセロビオヒドロラーゼ又はそのフラグメントなどを、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロンα２ｂ、線維芽細胞成長因子２１又はヒト血清アルブミンに融合する。いくつかの実施態様では、担体−抗体融合ポリペプチドは、Ｋｅｘ２切断部位を含む。特定の実施態様では、Ｋｅｘ２又は他の担体切断酵素は、糸状菌細胞に内在性である。特定の実施態様では、担体切断酵素は、糸状菌細胞に異種性であり、例えば、酵母由来の別のＫｅｘ２タンパク質又はＴＥＶプロテアーゼである。特定の実施態様では、担体切断酵素を過剰発現させる。特定の実施態様では、担体は、T. reesei  ＣＢＨ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＥＧＲ４４８１７．１）のＮ末端部分の約４６９〜４７８アミノ酸からなる。一実施態様では、異種糖タンパク質（例えば、抗体）をコードするポリヌクレオチドは、担体タンパク質としてＣＢＨ１触媒ドメイン及びリンカーをコードするポリヌクレオチド、並びに／又はｃｂｈ１プロモーターをさらに含む。特定の実施態様では、本発明の糸状菌細胞は、ＫＥＸ２プロテアーゼを過剰発現する。一実施態様では、異種糖タンパク質（例えば、抗体）は、内在性真菌ポリペプチド、プロテアーゼ部位、例えばＫｅｘ２切断部位、並びに異種タンパク質、例えば抗体重鎖及び／又は軽鎖を含む融合構築物として発現される。Ｋｅｘ２切断部位の前にある有用な２〜７アミノ酸の組み合わせは、例えば、Mikosch et al. (1996) J. Biotechnol. 52:97-106; Goller et al. (1998) Appl Environ Microbiol. 64:3202-3208; Spencer et al. (1998) Eur. J. Biochem. 258:107-112; Jalving et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:363-368; Ward et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:2567-2576; Ahn et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:833-839; Paloheimo et al. (2007) Appl Environ Microbiol. 73:3215-3224; Paloheimo et al. (2003) Appl Environ Microbiol. 69:7073-7082;及びMargolles-Clark et al. (1996) Eur J Biochem. 237:553-560に記載されている。
Suitable carrier proteins     include, without limitation, those of T. reesei mannanase I (Man5A,     or MANI)... or T. reesei cellobiohydrolase I (CBHI).
those of（のそれら）の対応箇所なし。
実施例から、これらのタンパク質に、各々対応する担体タンパク質があるのではなく、これらのタンパク質に由来する（＝その断片である）担体タンパク質を用いる模様。
【０３０１】
本発明をその特定の具体的な実施態様と併せて説明したが、上記説明は、本発明の範囲を例示するためのものであり、限定するものではないことを理解すべきである。本発明に関係する分野の当業者であれば、本発明の範囲内の他の態様、利点及び改変が明かであろう。
【０３０２】
本発明につき記載してきたが、以下の実施例は、限定ではなく例示を目的として本発明を例証するために示すものである。
【実施例】
【０３０３】
国際公開公報第２０１３／１０２６７４号（この内容は、参照により本明細書に組み入れられる）の実施例１〜２３では、Trichoderma reesei及び対応するプロテアーゼ活性が欠損したT. reesei細胞における特定のプロテアーゼの同定が記載されている。
【０３０４】
実施例１−欠損プラスミドの作製
選択に使用したマーカーがｐＴＴｖ２１３又はｐＴＴｖ１９４由来のｐｙｒ４−ｈｇｈ又はｐｙｒ４であったことを除いて、基本的には、ｐｅｐ１欠損プラスミドｐＴＴｖ４１について国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１に記載されているように、以下の欠損プラスミドを構築した。
【０３０５】
ａｍｐ１欠損プラスミド
５’フランキング領域の９５８bp及び３’フランキング領域の９９４bpを、ａｍｐ１欠損プラスミドｐＴＴｖ２４０の基礎として選択した。ａｍｐ１  ５’フランクの末端から３６７bpのストレッチをダイレクトリピートフラグメントとして使用した。表１−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これらのフラグメントを増幅した。フランキング領域のＰＣＲに使用したテンプレートは、T. reesei野生型株ＱＭ６ａ由来のものであった。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、標準的な実験方法を使用してgel extraction kit (Qiagen)によって、正しいフラグメントをゲルから単離した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ２１３（Δｐｅｐ２−ｐｙｒ−ｈｐｈ、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１４を参照のこと）から、ｐＴＴｖ２４０に使用したｐｙｒ４−ｈｐｈ選択マーカーを得た。ｐｙｒ４−ｈｇｈマーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ａｍｐ１  ５’ダイレクトリピートと３’フランクとの間に導入した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であり、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１に記載されているように、酵母相同組換え法を使用して、５’フランク、３’フランク、５’ダイレクトリピート、ｐｙｒ４−ｈｐｈマーカー及びベクター骨格を用いて、プラスミドｐＴＴｖ２４０を構築した。ａｍｐ１欠損プラスミド（ｐＴＴｖ２４０、表１−１）は、ａｍｐ１ローカスの欠損をもたらし、ＡＭＰ１（ｔｒｅ８１０７０）の完全なコード配列をカバーする。
【表１】
2016523552.tif 000003
【０３０６】
ａｍｐ２欠損プラスミド
５’フランキング領域の９１８bp及び３’フランキング領域の９７８bpを、ａｍｐ２欠損プラスミドｐＴＴｖ２７１の基礎として選択した。表１−２に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これらのフラグメントを増幅した。フランキング領域のＰＣＲに使用したテンプレートは、T. reesei野生型株ＱＭ６ａ由来のものであった。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、標準的な実験方法を使用してgel extraction kit (Qiagen)によって、正しいフラグメントをゲルから単離した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１９４（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ−ｈｐｈ）からｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であり、酵母相同組換え法を使用して、５’フランク、３’フランク、ｐｙｒ４−ｈｐｈマーカー及びベクター骨格を用いて、プラスミドｐＴＴｖ２７１を構築した。
【０３０７】
別のａｍｐ２欠損プラスミド（ｐＴＴｖ３２７）を以下のように作製した。ａｍｐ２  ５’フランクの末端から３１１bpのストレッチをダイレクトリピートフラグメントとして使用した。表１−３に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これらのフラグメントを増幅した。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、正しいフラグメントをゲルから単離した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ２１０（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）からｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ａｍｐ２  ５’ダイレクトリピートと３’フランクとの間に導入した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であり、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１に記載されているように、プラスミドを構築した。これらのａｍｐ２欠損プラスミド（ｐＴＴｖ２７１及びｐＴＴｖ３２７）は、ａｍｐ２ローカスにおける２１４３bpの欠損をもたらし、ＡＭＰ２（ｔｒｅ１０８５９２）の完全なコード配列をカバーする。
【表２】
2016523552.tif 000004
【表３】
2016523552.tif 000005
【０３０８】
ｓｅｐ１欠損プラスミド
第１のｓｅｐ１欠損プラスミドｐＴＴｖ２１０は、５’フランキング領域の１０９９bp及び３’フランキング領域の８０６bp、ダイレクトリピートフラグメントとしてｓｅｐ１  ５’フランクの末端から３００bpのストレッチ、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重選択マーカー、並びにT. reeseiネイティブｋｅｘ２の発現構築物（ｔｒｅ１２３５６１；プロモーターｃＤＮＡ１−ｋｅｘ２−ターミネーターｃｂｈ２）を含有していた。表１−４に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、ｐｙｒ４を除く全ての他のフラグメントを増幅した。フランキング領域、ダイレクトリピート、ｋｅｘ２及びターミネーターのＰＣＲに使用したテンプレートは、T. reesei野生型株ＱＭ６ａ由来のものであった。ｃＤＮＡ１プロモーター及びｈｐｈマーカーのテンプレートは、プラスミドであった。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１８１からｐｙｒ４マーカーを得た（ｐＴＴｖ１８１は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例４に記載されている）。ｐｙｒ４−ｈｐｈマーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｓｅｐ１  ５’ダイレクトリピートと３’フランクとの間に導入した。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、gel extraction kit (Qiagen)によって、正しいフラグメントをゲルから単離した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。上記のように酵母相同組換え法を使用して、上記全８個のフラグメント及びベクター骨格を用いて、プラスミドｐＴＴｖ２１０を構築した。
【０３０９】
ＡｓｃＩ消化によってｐＴＴｖ２１０からＫＥＸ２過剰発現カセットを除去することによって、第２のｓｅｐ１欠損プラスミドｐＴＴｖ２４７を構築した。アガロースゲル電気泳動でフラグメントを分離し、gel extraction kit (Qiagen)によって、ベクター部分をゲルから単離した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び標準的な実験方法を使用してセルフライゲーションによって、ｐＴＴｖ２４７をクローニングした。
【０３１０】
第３のｓｅｐ１欠損プラスミドｐＴＴｖ２５５を以下のように作製した。５’フランキング領域の１０９９bp及び３’フランキング領域の８０６bpを基礎として選択し、ｓｅｐ１  ５’フランクの末端から３００bpのストレッチをダイレクトリピートフラグメントとして使用した。表１−４に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これらのフラグメントを増幅した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１８１（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４）からｐｙｒ４カセットを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｓｅｐ１  ５’ダイレクトリピートと３’フランクとの間に導入した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であり、上記のように酵母相同組換えを使用して、プラスミドを構築した。
【０３１１】
欠損プラスミドｐＴＴｖ２１０、ｐＴＴｖ２４７及びｐＴＴｖ２５５は、ｓｅｐ１ローカスにおける２５１９bpの欠損をもたらし、ＳＥＰ１（ｔｒｅ１２４０５１）の完全なコード配列をカバーする。
【表４】
2016523552.tif 000006
2016523552.tif 000007
【０３１２】
ｐｅｐ９欠損プラスミド
５’フランキング領域の９１８bp及び３’フランキング領域の９７８bpを、ｐｅｐ９欠損プラスミドｐＴＴｖ２６７の基礎として選択した。表１−５に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これらのフラグメントを増幅した。フランキング領域のＰＣＲに使用したテンプレートは、T. reesei野生型株ＱＭ６ａ由来のものであった。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、gel extraction kit (Qiagen)によって、正しいフラグメントをゲルから単離した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１９４（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ−ｈｐｈ）からｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ベクター骨格はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であり、酵母相同組換え法を使用して、５’フランク、３’フランク、ｐｙｒ４−ｈｐｈマーカー及びベクター骨格を用いて、プラスミドを構築した。このｐｅｐ９欠損プラスミド（ｐＴＴｖ２６７、表１−５）は、ｐｅｐ９ローカスにおける１４４８bpの欠損をもたらし、ＰＥＰ９（ｔｒｅ７９８０７）のコード配列の大部分をカバーする。
【表５】
2016523552.tif 000008
【０３１３】
骨格として上記プラスミドｐＴＴｖ２６７を使用して、第２のｐｅｐ９欠損プラスミドｐＴＴｖ４２１を構築した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐｙｒ４  ５ＤＲを有するｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーをｐＴＴｖ２６７から除去した。ＮｏｔＩ消化によって、ｅｇｌ２欠損を有するｐＴＴｖ２６４由来のプラスミドから新たなマーカーｐｙｒ４−ｈｐｈを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＦｓｅＩ部位を、ｐｅｐ９  ３’ダイレクトリピートと５’フランクとの間に導入した。ｐｅｐ９  ３’フランクの始端から３２１bpのストレッチをダイレクトリピートフラグメントとして使用した。ｃｂｈ２ターミネーターの一部を、クローニングにおけるブリッジとして使用した。表１−６に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これら２つのフラグメントを増幅した。
【０３１４】
骨格として上記プラスミドｐＴＴｖ４２１を使用して、第３のｐｅｐ９欠損プラスミドｐＴＴｖ４２６を構築した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーをｐＴＴｖ４２１から除去した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１８１（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４）からｐｙｒ４マーカー遺伝子を得た。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してクイックライゲーションによって、プラスミドｐＴＴｖ４２６のクローニングを室温で行った。エレクトロポレーションによって、ライゲーション混合物の一部をE. coliにトランスフォーメーションした。いくつかのクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験方法を使用して、正しいライゲーションをスクリーニングした。配列決定によって、マーカーの正しいライゲーション及び方向をさらに確認した。これらのｐｅｐ９欠損プラスミド（ｐＴＴｖ４２１及びｐＴＴｖ４２６、表１−６）は、ｐｅｐ９ローカスにおける１４４８bpの欠損をもたらし、ＰＥＰ９（ｔｒｅ７９８０７）のコード配列の大部分をカバーする。
【表６】
2016523552.tif 000009
【０３１５】
ｓｌｐ７欠損プラスミド
表１−７のさらなるプライマーを使用したことを除いて、基本的にはｐＴＴｖ２６９について記載されているように、ｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）欠損プラスミドｐＴＴｖ３２９を構築し、ｐＴＴｖ２１０（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）からｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを得、ＡｓｃＩ部位を、ｓｌｐ７  ５’ダイレクトリピートと３’フランクとの間に導入した。
【表７】
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【０３１６】
ｓｌｐ３欠損プラスミド
ｓｌｐ３（ｔｒｅ１２３２３４）欠損プラスミドｐＴＴｖ１１６は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例３に記載されている。このプラスミドは、ｓｌｐ３ローカスにおける１５９７bpの欠損をもたらし、ＳＬＰ３の完全なコード配列をカバーする。
【０３１７】
骨格としてｐＴＴｖ１１６を使用して、第２のｓｌｐ３欠損プラスミドｐＴＴｖ４２０をクローニングした。ＮｏｔＩ消化によって、マーカーをｐＴＴｖ１１６から除去した。ＮｏｔＩ消化によって、ｅｇｌ２欠損を有するｐＴＴｖ２６４由来のプラスミドから新たなマーカーｐｙｒ４−ｈｐｈを得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位をカセットの両側に導入した。ＦｓｅＩ部位を、ｓｌｐ３  ３’ダイレクトリピートと５’フランクとの間に導入した。ｓｌｐ３  ３’フランクの始端から３００bpのストレッチをダイレクトリピートフラグメントとして使用した。ｃｂｈ２ターミネーターの一部を、クローニングにおけるブリッジとして使用した。表１−８に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、これら２つのフラグメントを増幅した。アガロースゲル電気泳動で産物を分離し、gel extraction kit (Qiagen)によって、正しいフラグメントをゲルから単離した。上記のように酵母相同組換え法を使用して、プラスミドを構築した。
【０３１８】
骨格として上記プラスミドｐＴＴｖ４２０を使用して、第３のｓｌｐ３欠損プラスミドｐＴＴｖ４２５を構築した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーをｐＴＴｖ４２０から除去した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１８１（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４）からｐｙｒ４マーカー遺伝子を得た。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してクイックライゲーションによって、プラスミドｐＴＴｖ４２５のクローニングを室温で行った。エレクトロポレーションによって、ライゲーション混合物の一部をE. coliにトランスフォーメーションした。いくつかのクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験方法を使用して、正しいライゲーションをスクリーニングした。配列決定によって、マーカーの正しいライゲーション及び方向をさらに確認した。これら３つのｓｌｐ３欠損プラスミド（ｐＴＴｖ１１６、ｐＴＴｖ４２０及びｐＴＴｖ４２５；表１−８）は、ｓｌｐ３ローカスにおける１５９７bpの欠損をもたらし、ＳＬＰ３の完全なコード配列をカバーする。
【表８】
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【０３１９】
ｓｌｐ２  ＲＮＡｉを有するｐｅｐ２欠損プラスミド
ベクターｐＴＴｖ２１７及びｐＴＴｖ２６３（両ベクターはｓｌｐ２をサイレンシングする）における選択マーカーをｐｙｒ４−ｈｇｈ二重マーカーに変更した。ＮｏｔＩ制限酵素でベクターを消化し、アガロースゲルからベクターを精製した。ＮｏｔＩ消化によって、ｐＴＴｖ１９４（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ−ｈｇｈ）からｐｙｒ４−ｈｇｈカセットを得た。新たな二重マーカー及びベクターを一緒にライゲーションし、化学的にコンピテントなＤＨ５α  E. coliにトランスフォーメーションした。得られたベクターｐＴＴｖ３７６及びｐＴＴｖ４０５を増幅及び精製した。
【０３２０】
実施例２−ｓｅｐ１欠損を有する１０重プロテアーゼ欠損株（Ｍ６５９）の作製
１０重プロテアーゼ欠損株を作製するために、基本的には、Ｍ１９５株（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去について国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例３に記載されているように、ｐｙｒ４マーカーの除去を９重欠損株Ｍ５７４（国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１４に記載）に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３２１】
表２５−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認した。１０重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られた株を、株番号Ｍ５９７と命名した。
【０３２２】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩでプラスミドｐＴＴｖ２５５（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、９重プロテアーゼ欠損株Ｍ５９７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２、ｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションした。基本的には、ｐｙｒ４選択を使用してＭ１８１株及びＭ１９５株について国際公開公報第２０１３／１０２６７４号に記載されているように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。
【０３２３】
トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表２−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表２−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。上記方法を使用して選択したクローン（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）からのサザン分析によって、ｓｅｐ１の欠損を確認した。クローン４８−７０Ｃを株番号Ｍ６３３と命名した。さらなる単一細胞精製工程をＭ６３３株に適用して、１０重プロテアーゼ欠損株Ｍ６５９（クローン４８−７０Ｃ−２）を得た。
【表９】
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【０３２４】
実施例３−ｓｌｐ８欠損を有する１１重プロテアーゼ欠損株（Ｍ７５０）の作製
スブチリシン様プロテアーゼｓｌｐ８（ｔｒｅ５８６９８）欠損プラスミドｐＴＴｖ３３０は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１２に記載されている。
【０３２５】
１１重プロテアーゼ欠損株を作製するために、基本的には上記のように、ｐｙｒ４マーカーの除去を１０重欠損株Ｍ６３３に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３２６】
表３−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認し、１１重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られた株を、株番号Ｍ６３７（クローン１−Ｇ）と命名した。
【０３２７】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩ＋ＳｂｆＩでプラスミドｐＴＴｖ３３０（Δｓｌｐ８−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、１０重プロテアーゼ欠損株Ｍ６３７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１、ｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションした。基本的には上記のように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。
【０３２８】
トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表３−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングし、予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表３−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。上記方法を使用して選択したクローン（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）からのサザン分析によって、ｓｌｐ８の欠損を確認した。クローン５４−１３１−２を株番号Ｍ７５０と命名した。
【表１０】
2016523552.tif 000013
【０３２９】
実施例４−ａｍｐ２欠損を有する１２重プロテアーゼ欠損株（Ｍ８９３）の作製
１２重プロテアーゼ欠損株を作製するために、基本的には上記のように、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーの除去を１１重欠損株Ｍ７５０に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３３０】
表４−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認した。加えて、５mMウリジンを含む又は含まないハイグロマイシンプレートにおいても、クローンを試験した。ウリジンが補充されていないプレートでは、及びハイグロマイシンがプレートに含まれていた場合には、成長が観察されなかった。１２重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られたマーカーフリー株を、株番号Ｍ７８０（クローン１ＡＨ）と命名した。
【０３３１】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩ＋ＳｂｆＩでプラスミドｐＴＴｖ３２７（Δａｍｐ２−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット ６μg超を使用して、１１重プロテアーゼ欠損株Ｍ７８０（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１Δｓｌｐ８、ｐｙｒ４−、ｈｐｈ−）をトランスフォーメーションした。基本的には上記のように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。
【０３３２】
トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表４−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表４−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。選択したクローン（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）からのサザン分析によって、ａｍｐ２の欠損を確認した。クローン５９−６Ａを株番号Ｍ８９３と命名した。
【表１１】
2016523552.tif 000014
【０３３３】
実施例５−欠損Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１Δｓｌｐ８Δａｍｐ２Δｓｌｐ７を有する１３重プロテアーゼ欠損株の作製
１３重プロテアーゼ欠損株を作製するために、上記のように、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーの除去を１２重欠損株Ｍ８９３（５９−６Ａ。ｐＴＴｖ３２７を含むＭ７８０）に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３３４】
表５−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認した。加えて、５mMウリジンを含む又は含まないハイグロマイシンプレートにおいても、クローンを試験した。ウリジンが補充されていないプレートでは、及びハイグロマイシンがプレートに含まれていた場合には、成長が観察されなかった。１３重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られたマーカーフリー株を、株番号Ｍ９０１（クローン１Ａ２）と命名した。
【０３３５】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩ＋ＳｂｆＩでプラスミドｐＴＴｖ３２９（Δｓｌｐ７−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）を消化し、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約１０μgを使用して、１２重プロテアーゼ欠損株Ｍ９０１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１Δｓｌｐ８Δａｍｐ２、ｐｙｒ４−、ｈｐｈ−）をトランスフォーメーションした。上記のように、プロトプラストの調製を行った。プロトプラスト用に改変したトランスフォーメーション方法を使用して、トランスフォーメーションを行った。この方法では、上記のようにＤＮＡをプロトプラストに導入したが、プレーティング用の培地及び方法は変更した。トランスフォーメーションプレート及び１番目の寒天は、浸透安定化のために１Ｍソルビトールを含有するポテトデキストロース寒天培地であった。プロトプラストを１番目の寒天に追加し、混合し、ＰＤ寒天プレートに注入し、室温で数（２〜４）時間再生させた。短時間再生させた後、１０g/lソルボース、１０g/lセロビオース、１０g/l酵母抽出物、１Ｍソルビトール、５g/l（ＮＨ４）２ＳＯ４（＋寒天及び塩）及び１５０μg/mlハイグロマイシンＢを含有する２番目の寒天を１番目の寒天の上に注入した。
【０３３６】
トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表５−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表５−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。
【表１２】
2016523552.tif 000015
【０３３７】
実施例６−ｓｌｐ３を有する１３重プロテアーゼ欠損株の作製
１３重プロテアーゼ欠損株を作製するために、上記のように、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーの除去を１２重欠損株Ｍ８９３に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３３８】
表６−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認した。加えて、５mMウリジンを含む又は含まないハイグロマイシンプレートにおいても、クローンを試験した。１３重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られたマーカーフリー株を、株番号Ｍ９０１（クローン１Ａ２）と命名した。
【０３３９】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩでプラスミドｐＴＴｖ４２５（Δｓｌｐ３−ｐｙｒ４）を消化し、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、１２重プロテアーゼ欠損株Ｍ９０１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１Δｓｌｐ８Δａｍｐ２、ｐｙｒ４−、ｈｐｈ−）をトランスフォーメーションした。上記のように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表６−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングし、予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表６−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。
【表１３】
2016523552.tif 000016
【０３４０】
実施例７−ｐｅｐ９を有する１３重プロテアーゼ欠損株の作製
１３重プロテアーゼ欠損株を作製するために、基本的には上記のように、ｐｙｒ４−ｈｐｈ二重マーカーの除去を１２重欠損株Ｍ８９３に適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行って、選択したクローンが単一細胞に由来することを確認した。
【０３４１】
表７−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、最終クローンを確認した。クローンの大部分について、ブラスターカセットの除去の成功に対応するシグナルが得られた。５mMウリジンを含む又は含まない最少培地プレートにクローンをプレーティングすることによって、ブラスターカセットの除去をさらに確認した。加えて、５mMウリジンを含む又は含まないハイグロマイシンプレートにおいても、クローンを試験した。１３重プロテアーゼ欠損株の作製に使用した得られたマーカーフリー株を、株番号Ｍ９０１（クローン１Ａ２）と命名した。
【０３４２】
ベクター配列を除去するために、ＭｓｓＩでプラスミドｐＴＴｖ４２６を消化し、アガロースゲルから正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、１２重プロテアーゼ欠損株Ｍ９０１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｓｅｐ１Δｓｌｐ８Δａｍｐ２、ｐｙｒ４−、ｈｐｈ−）をトランスフォーメーションした。上記のように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。トランスフォーマントを最初のストリークとして採取した。正しい組み込みについて、（表７−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングし、予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表７−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。
【表１４】
2016523552.tif 000017
【０３４３】
実施例８−インターフェロン産生株Ｍ５７７からの９重プロテアーゼ欠損株の作製
ａｍｐ１欠損を有する９重欠損株の作製
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドｐＴＴｖ２４０（Δａｍｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、インターフェロンアルファ２ｂを産生する８重プロテアーゼ欠損株Ｍ５７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５；国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１８を参照のこと）をトランスフォーメーションした。基本的には上記のように、ハイグロマイシン選択を使用して、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。
【０３４４】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表８−１に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すトランスフォーマントを単一細胞クローンに精製し、表８−１に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。クローン１０８Ａを株番号Ｍ６６９と命名した。
【表１５】
2016523552.tif 000018
【０３４５】
ｓｌｐ７欠損を有する９重欠損株の作製
セリンプロテアーゼｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）欠損プラスミドｐＴＴｖ２６９は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１１に記載されている。
【０３４６】
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドｐＴＴｖ２６９（Δｓｌｐ７−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、８重プロテアーゼ欠損株Ｍ５７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５。上記を参照のこと）をトランスフォーメーションした。基本的には上記のように、ハイグロマイシン選択を使用して、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。
【０３４７】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表８−２に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すトランスフォーマントを単一細胞クローンに精製し、表８−２に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。クローン５．６４を株番号Ｍ６７３と命名した。
【表１６】
2016523552.tif 000019
【０３４８】
ａｍｐ２欠損を有する９重欠損株の作製
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドｐＴＴｖ２７１（Δａｍｐ２−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、８重プロテアーゼ欠損株Ｍ５７７をトランスフォーメーションした。
【０３４９】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表８−３に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すトランスフォーマントを単一細胞クローンに精製し、表８−３に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。クローン２４Ａを株番号Ｍ６７４と命名した。
【表１７】
2016523552.tif 000020
【０３５０】
ｓｅｐ１欠損を有する９重欠損株の作製
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドｐＴＴｖ２４７（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、８重プロテアーゼ欠損株Ｍ５７７をトランスフォーメーションした。
【０３５１】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表８−４に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表８−４に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。クローン４７．１を株番号Ｍ６６８と命名した。
【表１８】
2016523552.tif 000021
【０３５２】
ｐｅｐ９欠損を有する９重欠損株の作製
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドｐＴＴｖ２６７（Δｐｅｐ９−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、８重プロテアーゼ欠損株Ｍ５７７をトランスフォーメーションした。
【０３５３】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表８−５に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表８−５に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。トランスフォーマント７７を株番号Ｍ６７１と命名した。
【表１９】
2016523552.tif 000022
【０３５４】
実施例９−２４ウェル培養においてインターフェロンを産生する９重プロテアーゼ欠損株
クエン酸二アンモニウム、１００mM ＰＩＰＰＳ、２０g/Lビール粕抽出物、４０g/Lラクトースを含む硫酸アンモニウム不含ＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、２８℃で振盪しながら、２４ウェル培養において、９重プロテアーゼ欠損株を成長させた。イムノブロッティングを行って、インターフェロンアルファ２ｂを検出した。各上清 ０．５μlを４〜２０％基準ゲルにロードすることができるように、水で上清を希釈した。ＬＳＢ＋ＢＭＥと混合し、９５℃で５分間加熱した。Turbo semi-dry blotterによって、タンパク質をニトロセルロースに７分間転写した。５％ミルクＴＢＳＴ溶液で、ニトロセルロース膜を１時間ブロッキングした。ＴＢＳＴで０．５μg/mlに希釈したマウス抗インターフェロンアルファ２ｂ抗体（Abcam #ab9386）を用いて、インターフェロンタンパク質を検出した。一次抗体を膜と共に室温で振盪しながら１時間インキュベーションした。一次抗体を除去し、ＴＢＳＴで膜を洗浄した。二次抗体は、ＴＢＳＴで１：１０，０００希釈したヤギ抗マウスＡＰコンジュゲート（BioRad cat#170-6520）であった。二次抗体を室温で振盪しながら１時間インキュベーションし、抗体を除去し、膜を室温で振盪しながら１時間洗浄した。ＡＰ基質（Promega）を使用して、ブロットを現像した。
【０３５５】
７日目の培養サンプルを観察したところ、インターフェロンの安定性に対する劇的な効果があった。ｓｌｐ７及びａｍｐ２欠損株は、インターフェロンを産生し続けたが、Ｍ５７７コントロール並びにａｍｐ１及びｓｅｐ１欠損株では、インターフェロンは安定ではなかった。結果を図４に示す。
【０３５６】
実施例１０−発酵槽培養においてインターフェロンを産生する９重プロテアーゼ欠損株
インターフェロンを発現する９重プロテアーゼ欠損株を、バッチ培養として発酵槽で培養した。ＴｒＭＭ＋２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボース（ｐＨ４．５）中、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせて、それらを成長させた。これらの培養を行い、培養コードＦＴＲ１０８＿Ｒ１（Ｍ６６８）、ＦＴＲ１０８＿Ｒ２（Ｍ６６９）、ＦＴＲ１０８＿Ｒ６（Ｍ６７３）及びＦＴＲ１０８＿Ｒ７（Ｍ６７４）を割り当てた。
【０３５７】
１ウェル当たり０．１μLをロードすることができるように、水及びサンプル緩衝液で上清を希釈した。２４ウェル培養について上記したように、インターフェロンアルファ２ｂを検出するためのイムノブロッティング法を行った。
【０３５８】
発酵槽培養の結果は、図５に見ることができる。５０、１００及び２００ngに相当する標準量のインターフェロンを使用して、標準曲線を作成した。親Ｍ５７７のコントロール培養では、３日目において０．８４g/Lのインターフェロンが産生された。ａｍｐ２プロテアーゼ欠損を有するＭ６７４株は、全体で最も改善された株であり、３日目において２．４g/Lをもたらした。ａｍｐ２プロテアーゼ欠損は、インターフェロン産生の２．９倍の改善をもたらした。ｓｌｐ７プロテアーゼ欠損株Ｍ６７３は、４日目において２．１g/Lを達成した。これは、親株Ｍ５７７に対して２．５倍の改善であった。Ｍ６６８におけるｓｅｐ１プロテアーゼ欠損は、１．３８g/Lのインターフェロンを分泌した。また、株Ｍ６７１におけるｐｅｐ９欠損は、インターフェロン発現レベルを１．０３g/Lに改善した。これらの培養条件下では、ａｍｐ１欠損を有するＭ６６９株は、０．３６g/Lを産生した（データは示さず）。
【０３５９】
また、ＳＢＴＩ阻害剤を追加して又は追加せずに、株Ｍ６７４（Δａｍｐ２）を培養した。培地は、ＴｒＭＭ＋２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボース（ｐＨ４．５）であり、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせた。Ｔｒｉａｂ１２５培養は、ＳＢＴＩ阻害剤なしで行い、Ｔｒｉａｂ１２６は、ＳＢＴＩ阻害剤を供給して行った（ターゲット濃度０．４mg/ml）。
【０３６０】
ＳＢＴＩ阻害剤は、インターフェロン発現レベルを改善した（図６を参照のこと）。ベースレベルは、４日目において１．４g/Lであったが、阻害剤処理によって、インターフェロン発現を５日目において４．５g/Lに増加させることができた。阻害剤の追加により、発現ピークの日が５日目までシフトしたが、これにより、上清中のインターフェロンの安定性がより高いことが示された。
【０３６１】
０．０２５μlを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに容量１０μlでロードすることができるように、水で上清を希釈した。ＴＢＳＴで１μg/mlに希釈したAbcam (#ab9386)抗ＩＦＮ−α２ｂ抗体を用いて、免疫検出を行った。二次抗体は、ＴＢＳＴで１：５０００希釈したBio-rad（#170-6520）ヤギ抗マウスＩｇＧＡＰコンジュゲート二次抗体であった。全長ＩＦＮ−α２ｂ ２００ng、１００ng及び５０ngに相当するタンパク質標準をゲルにロードした。
【０３６２】
実施例１１−インターフェロン産生株Ｍ７８８（Ｍ５７７のｐｙｒ４−）からのｐｅｐ２欠損及びｓｌｐ２  ＲＮＡｉを有する９重プロテアーゼ欠損株Ｍ９６０の作製
インターフェロン産生株Ｍ５７７は、最後のプロテアーゼ欠損を行ったｐｅｐ５ローカスにおいてｐｙｒ４マーカーを有していた。ｐｙｒ４ループアウトマーカーを除去するために、Ｍ５７７株を５ＦＯＡプレートにプレーティングした。ｐｙｒ４マーカーの存在及び組み込みをチェックするために、生存しているコロニーをＰＣＲによってスクリーニングした。ウリジンを含む及び含まない最小培地寒天プレートにおいて、ＰＣＲによって二重マーカーを有していなかったクローンを試験した。ウリジンを含まないプレートで成長することができなかったクローンを、マーカーループアウトクローンとして選択した。１つのｐｙｒ４陰性クローンを選択して、株Ｍ７８８とした。スクリーニングに使用したプライマーを以下の表１１−１に示す。
【表２０】
2016523552.tif 000023
【０３６３】
欠損カセットを除去するために、ＰｍｅＩでプラスミドを消化し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して、正しいフラグメントを精製した。欠損カセット約５μgを使用して、インターフェロンアルファ２ｂを産生する８重プロテアーゼ欠損株Ｍ７８８（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５、ｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションした。基本的には上記のように、プロトプラストの調製及びトランスフォーメーションを行った。ｐｅｐ２ローカス（ｔｒｅ５３９６１）に組み込まれるように、サイレンシングカセットを設計した。
【０３６４】
トランスフォーマントを採取し、選択プレートにストリークした。正しい組み込みについて、（表１１−２に記載されているプライマーを使用して）ＰＣＲによって、成長中のストリークをスクリーニングした。予想シグナルを示すクローンを単一細胞クローンに精製し、表１１−２に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、再スクリーニングした。ｐＴＴｖ３７６のトランスフォーメーションは、Ｍ９６０と命名した株をもたらし、ｐＴＴｖ４０５は、Ｍ９６１株をもたらした。
【表２１】
2016523552.tif 000024
【０３６５】
ｐＴＴｖ３７６及びｐＴＴｖ４０５のトランスフォーメーションによる２個のトランスフォーマントを２４ウェル培養で成長させて、それらのインターフェロン産生をコントロール株Ｍ５７７に対して比較した。クエン酸二アンモニウム、１００mM ＰＩＰＰＳ、２０g/Lビール粕抽出物、４０g/Lラクトースを含む硫酸アンモニウム不含ＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、２８℃で振盪しながら、株を成長させた。２連のウェルをトランスフォーマントに使用した。５日目に採取した２４ウェル培養物由来のサンプルをイムノブロッティングに使用した。各上清 ０．２μlを４〜２０％基準ゲルにロードすることができるように、水で上清を希釈した。ＬＳＢ＋ＢＭＥと混合し、９５℃で５分間加熱した。BioRad Turbo semi-dry blotterによって、タンパク質をニトロセルロースに７分間転写した。５％ミルクＴＢＳＴ溶液で、ニトロセルロース膜を１時間ブロッキングした。ＴＢＳＴで０．５μg/mlに希釈したマウス抗インターフェロンアルファ２ｂ抗体（Abcam #ab9386）を用いて、インターフェロンタンパク質を検出した。一次抗体を膜と共に室温で振盪しながら１時間インキュベーションした。一次抗体を除去し、ＴＢＳＴで膜を洗浄した。二次抗体は、ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈したヤギ抗マウスIRDye 680RDコンジュゲート（Li-cor #926-68070）であった。二次抗体を室温で振盪しながら１時間インキュベーションした。二次抗体を除去し、膜をスキャンする前に、ＴＢＳＴで膜を室温で１時間洗浄した。Odyssey CLx near infrared imaging system (Li-cor, Inc.)を使用して、膜を７００nmでスキャンした。
【０３６６】
２４ウェル培養の結果は、図７に見ることができる。ｓｌｐ２をサイレンシングした株は両方とも、大量のインターフェロンを産生した。最良のｐＴＴｖ４０５トランスフォーマントである４０５ｂは、４２７mg/Lのインターフェロンを産生し、株番号Ｍ９６０を割り当てた。最良のｐＴＴｖ３７６トランスフォーマントである３７６ａは、最大５３４mg/Lのインターフェロンを産生し、Ｍ９６１株と名付けた。コントロール株（Ｍ５７７）は、最大２００mg/Lをもたらした。この培養ではそれぞれ、Ｍ９６１株は、コントロール株と比較して２．７倍多いインターフェロンを産生し、Ｍ９６０では２．１倍多かった。
【０３６７】
発酵
１Ｌ発酵槽においてバッチ培養として、２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせて、２つの株を培養した。それぞれ株Ｍ９６０及びＭ９６１を用いて、Ｔｒｉａｂ１５２及びＴｒｉａｂ１５３培養を行った。１ウェル当たり上清 ０．０５μLがロードされるように、水及びローディング色素で上清サンプルを希釈した。インターフェロンについて上記のように、検出のためのイムノブロッティングを行った。発現濃度を決定するために、４００、２００、１００、５０及び２５ngに相当する標準量のインターフェロンを使用して、標準曲線を作成した。
【０３６８】
Ｔｒｉａｂ１５２培養では、Ｍ９６０株は、３日目において１．４g/Lを産生し（図８）、Ｍ５７７株は、３日目において１．２g/Lを産生した（データは示さず）。株Ｍ９６１は、４日目において３．２g/Lを達成したが、これは、親株Ｍ５７７よりも２．７倍多いインターフェロンであった。
【０３６９】
実施例１２−プロテアーゼ欠損株への異種タンパク質の導入
本発明のプロテアーゼ欠損株のいずれかにおいて、ＭＡＢ０１抗体産生T. reesei株を作製するために、上記のようにハイグロマイシン及びアセトアミドを選択に使用して、ＭＡＢ０１軽鎖及び重鎖構築物（ｐＴＴｖ９８、ｐＴＴｖ９９、ｐＴＴｖ６７、ｐＴＴｖ１０１、ｐＴＴｖ１０２及び／又はｐＴＴｖ２２３。国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１〜３も参照のこと）で株をトランスフォーメーションした。リツキシマブ抗体を生産するために、ＣＢＨＩ担体と融合した重鎖と、ＣＢＨＩ担体と融合した軽鎖とを調和されて（harmonised）有する構築物を、上記のように、プロテアーゼ欠損T. reesei株にトランスフォーメーションする。
【０３７０】
本発明の様々なプロテアーゼ欠損バックグラウンドにおいて、様々な抗体フラグメント（Ｆａｂ、多量体単一ドメイン抗体（ｓｄ−Ａｂ）及びｓｃＦＶ）を発現させるために、実施例２３の方法が適用可能である。この目的のために適用する遺伝子発現カセットの構造は、通常、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）遺伝子の調節要素（プロモーター及びターミネーター）をベースとするものである。ＣＢＨＩタンパク質の触媒ドメインを改変してイントロン配列を除去し、融合パートナーとして使用して、抗体フラグメントの発現及び分泌を増強する。Ｋｅｘ２プロテアーゼの認識モチーフを融合パートナー間に挿入して、ＣＢＨＩ担体タンパク質からの抗体フラグメントの同時分泌放出を促進し、発現カセットを相同領域に隣接させて、T. reesei  ｃｂｈ１ローカスへのターゲティング組み込みを可能にする。
【０３７１】
記載されているように、精製発現カセットでプロテアーゼ欠損T. reesei株をトランスフォーメーションし、適切な選択マーカーについて選択する。それぞれ構築物の５’フランキング領域フラグメントの外側のフォワードプライマー、及び改変ＣＢＨＩ触媒ドメインの内側のリバースプライマー（５’組み込み）、並びに選択マーカー遺伝子の内側のフォワードプライマー、及び３’フランキング領域フラグメントの外側のリバースプライマー（３’組み込み）を使用して、ｃｂｈ１ローカスへの発現カセットの相同組み込みについて、トランスフォーマントをＰＣＲによってスクリーニングする。上記と同じプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲによって、破壊カセットの適切な組み込みを再確認し、ｃｂｈ１オープンリーディングフレームにターゲティングされるプライマーの組み合わせを使用することによって、親ＣＢＨＩローカスの欠如を確認する。サザンハイブリダイゼーションを適用して、全てのクローンについて、破壊カセットの正しい組み込みをさらに確認する。
【０３７２】
トランスフォーメーションしたT. reesei株を、前記のように発酵及びフラスコ振盪条件で培養する。培養過程でサンプルを収集し、例えば上記のように、アフィニティー液体クロマトグラフィーによって、産生レベルを分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製サンプルの品質をチェックする。
【０３７３】
実施例１３−プロテアーゼ欠損株の糖鎖工学
Ｇ０産生株の作製
ａｌｇ３欠損プラスミドｐＴＴｇ１５６（ヒト全長ＧｎＴ１及びヒト全長ＧｎＴ２）及びｐＴＴｇ１７３（ヒトＧｎＴ１及び全長ヒトＧｎＴ２の触媒ドメインとのＫＲＥ２  Ｎ末端融合物）の作製は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１９に記載されている。
【０３７４】
ｐＴＴｇ１５６及びｐＴＴｇ１７３のＰｍｅＩフラグメントでＭＡＢ０１発現T. reesei株をトランスフォーメーションする。不定量のトランスフォーマント（構築物に応じて１００〜１７０）を選択プレートに採取し、ＰＣＲスクリーニングに基づいて、５’組み込み及び３’組み込みについて肯定的な結果を有するクローンを、単一胞子プレーティングのために選択し、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１９の表１９．３に記載されているプライマーを使用して、組み込み及びａｌｇ３欠損について、再スクリーニングする。ＰＣＲスクリーニングした株をフラスコ振盪及び発酵培養に供し、適切な日数以内にサンプルを得、サンプルを抗体濃縮及びグリカン分析に供する。
【０３７５】
ＧｌｃＮａｃＭａｎ５産生株の作製
ヒトＧｎＴ１プラスミドｐＴＴｖ２７４（ヒトＧｎＴ２のＮ末端部分）、ｐＴＴｖ２７５（T. reesei  Ｋｒｅ２のＮ末端部分）及びｐＴＴｖ２７８（T. reesei  Ｏｃｈ１のＮ末端部分）のターゲティングペプチド及び触媒ドメインの融合タンパク質のためのプラスミドの作製は、国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例２１に記載されている。
【０３７６】
ＰｍｅＩによって、トランスフォーメーションのためのフラグメントを上記プラスミドから放出させる。全てのフラグメントをＭＡＢ０１（又は、リツキシマブなどの抗体）発現株に個々にトランスフォーメーションし、基本的には上記のように、プロトプラストのトランスフォーメーションを行う。
【０３７７】
ｅｇｌ２ローカスへの５´組み込み及び３´組み込みについて、選択ストリークで十分に成長中のクローンをスクリーニングする。両方の組み込みについて陽性のクローンを、ｅｇｌ２  ＯＲＦの喪失についてさらにスクリーニングする。単一胞子プレーティングによって、所望の結果を示すクローンを精製し、単一胞子由来のクローンが純粋な組み込み株であることをＰＣＲによって確認する。選択した株をフラスコ振盪及び発酵培養に供し、適切な日数以内にサンプルを得、サンプルを抗体濃縮及びグリカン分析に供する。
【０３７８】
Ｎ−グリカン分析では、製造業者の説明書にしたがってProtein G HP MultiTrap 96-well filter plate (GE Healthcare)を使用して、培養上清からＭＡＢ０１を精製し、ＭＡＢ０１標準曲線に対するＵＶ吸光度によって、抗体濃度を決定する。２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）中のPNGase F (ProZyme Inc.)を使用して、＋３７℃で一晩反応させて、エタノール沈殿及びＳＤＳ変性した抗体から、Ｎ−グリカンを放出させる。Hypersep C-18 and Hypersep Hypercarb (Thermo Scientific)を用いて、放出されたＮ−グリカンを精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析する。
【０３７９】
実施例１４−プロテアーゼホモログ
T. reesei  ｓｅｐ１、ａｍｐ１、ａｍｐ２及びｐｅｐ９ホモログを他の生物から同定した。
【０３８０】
クエリとしてTrichoderma reeseiプロテアーゼアミノ酸配列を使用して、National Center for Biotechnology Information (NCBI) non-redundant amino acid databaseを使用して、ＢＬＡＳＴ検索を行った。DOE Joint Genome Instituteのウェブサイト（それぞれTrichoderma virens Gv29-8 v2.0及びTrichoderma atroviride v2.0）を使用して、Trichoderma virens及びTrichoderma atrovirideのＢＬＡＳＴ検索を行った。EBIが提供しているClustalW2又はClustal Omegaアライメントツールを使用して、ＢＬＡＳＴ検索からの配列ヒットをアライメントした。配列アラインメントを使用して、系統樹も作成した。
【０３８１】
図９は、選択した糸状菌のａｍｐ１及びａｍｐ２の系統樹を示す。
【０３８２】
図１０は、選択した糸状菌のｓｅｐ１の系統樹を示す。
【０３８３】
図１１は、選択した糸状菌のｐｅｐ９の系統樹を示す。
【０３８４】
実施例１５−プロテアーゼ欠損T. reesei株のプロテアーゼ活性測定
EnzChek protease assay kit (Molecular probes #E6638、緑色蛍光カゼイン基質)にしたがって、２〜７日目の１重〜７重プロテアーゼ欠損株由来の上清サンプルから、タンパク質濃度を決定した。簡潔に言えば、クエン酸ナトリウム緩衝液で上清を希釈して、全タンパク質濃度を等しくし、１サンプル当たり３連のウェルを使用して、等量の希釈上清をブラック９６ウェルプレートに追加した。クエン酸ナトリウム緩衝液で作製したカゼインＦＬ希釈ストックを、上清を含有する各ウェルに追加し、プレートをプラスチック袋でカバーして３７℃でインキュベーションした。２時間後、３時間後及び４時間後に、ウェルからの蛍光を測定した。４８５nmの励起及び５３０nmの発光を使用してVarioskan fluorescent plate readerによって、読み取りを行った。製造業者のプロトコールにしたがってスクシニル化カゼイン（QuantiCleave protease assay kit, Pierce #23263）を使用して、数回のプロテアーゼ活性測定を実施した。
【０３８５】
ｐｅｐ１の単一欠損は、プロテアーゼ活性を１．７倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１の２重欠損は、プロテアーゼ活性を２倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１の３重欠損は、プロテアーゼ活性を３．２倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１／ｇａｐ１の４重欠損は、野生型Ｍ１２４株と比較して、プロテアーゼ活性を７．８倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１／ｇａｐ１／ｇａｐ２の５重欠損は、プロテアーゼ活性を１０倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１／ｇａｐ１／ｇａｐ２／ｐｅｐ４の６重欠損は、プロテアーゼ活性を１５．９倍低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１／ｇａｐ１／ｇａｐ２／ｐｅｐ４／ｐｅｐ３の７重欠損は、プロテアーゼ活性を１８．２倍低下させた。
【０３８６】
図２０は、（１重〜７重欠損突然変異体由来の）各プロテアーゼ欠損上清及び親株Ｍ１２４由来の培養上清の正規化したプロテアーゼ活性データをグラフで示す。最初の５つの株ではｐＨ５．５において、及び最後の３つの欠損株ではｐＨ４．５において、プロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性は、緑色蛍光カゼインに対するものである。６重プロテアーゼ欠損株は、野生型親株のわずか６％であり、７重プロテアーゼ欠損株のプロテアーゼ活性は、６重プロテアーゼ欠損株の活性よりも約４０％低かった。
【０３８７】
実施例１６−１３重プロテアーゼ欠損株におけるＩＧＦ１産生
いかなる担体切断部位及び精製タグも含まないＣＢＨＩ担体との融合タンパク質としてＩＧＦ１を発現させるために、ｃｂｈ１プロモーター、ターミネーター及び３’フランク及びａｍｄＳマーカーを含有するプラスミドから、ＩＧＦ１発現カセットを作製した。ネイティブなＣＢＨ１プロモーター及びターミネーターのコントロール下のｃｂｈ１ローカスに組み込まれるように、この構築物を設計した。ＰｍｅＩでこの発現構築物をベクターから切り出し、標準的な方法によって精製した。ＡｍｄＳ選択マーカーを使用して、Trichodermaのトランスフォーメーションを行って、１３重プロテアーゼ欠損株Ｍ１０７６を得た（ｐｅｐ９（ｔｒｅ７９８０７）を欠損させることによって、Ｍ９０１からＭ１０７６を作製した）。ｃｂｈ１  ｏｒｆの喪失、及びローカスへの発現カセットの適切な組み込みについて、トランスフォーマントをＰＣＲによってスクリーニングした。
【０３８８】
ＣＢＨＩ担体の配列：
（配列番号９２４）
【０３８９】
発現されるＩＧＦ１タンパク質の配列：
（配列番号９２５）
【０３９０】
１リットル発酵槽において、２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、１００g/Lセロビオース、４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、プロテアーゼ阻害剤を使用せずに、Ｍ１１４０を発酵槽培養Ｔ１８９で成長させた。４８時間後に、温度を２８℃〜２２℃にシフトさせた。
【０３９１】
イムノブロッティングによって、発現レベルをチェックした。１ウェル当たり上清 ０．０１２５μlを４〜２０％基準ゲルにロードすることができるように、オレンジＬＳＢでサンプルを希釈した。イムノブロッティングを行って、ＩＧＦ１及びＣＢＨＩ発現を二重検出した。ＴＢＳＴで０．２５μg/mlに希釈したウサギ抗ＩＧＦ１（Abcamウサギポリクローナル抗体、ab9572）、及びＴＢＳＴで１：１０，０００希釈した抗ＣＢＨＩ  ｍａｂ２６１を用いて、検出を行った。二次抗体は、ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Li-Cor #926-68071, IRDye 680RDヤギ抗ウサギＩｇＧ）であった。ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈したLi-Cor #926-32210 IRDye 800CWヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、抗マウスＣＢＨＩ抗体を検出した。ＴＢＳＴで１時間洗浄し、ＴＢＳでリンスした。LI-COR Odyssey CLx Infrared Imaging Systemを用いて、フィルタを７００nm及び８００nmでスキャンした。
【０３９２】
４４時間〜１６２時間において、ＩＧＦ１標準曲線と比較して、ＩＧＦ１発現を測定した。発現した融合タンパク質は、約７０kDであった。７１時間の時点において、発現レベルは３．５g/Lであった。測定した最高の発現レベルは、９２時間の時点の７．９g/Lであった。１１６時間の時点において、発現レベルは、６．６g/Lに低下した。このバッチ培養では、１１６時間後において、ＩＧＦ１発現は有意に低下した。ＣＯ２ピークは９２時間付近であったが、これは、発現ピークとよく相関していた。１１６時間後において、ＩＧＦ１タンパク質は担体から分解され、サンプル中では、ＣＢＨＩタンパク質のみが見られた。７１時間から１６２時間まで、ＣＢＨＩ発現を観察することができた。この培養では、プロテアーゼ阻害剤を使用しなかった。１３個のプロテアーゼ欠損は、ＩＧＦ１の安定性を改善した。より少ないプロテアーゼ欠損を有する株において、より高い産生レベルを達成するためには、プロテアーゼ阻害剤が必要であり得る。Ｍ１１４０の場合、より多くのセルロースを培養に使用すれば、より高い産生レベルを達成することが可能であろう。
【０３９３】
プロテアーゼ欠損を有しない株Ｍ１２４において、ＣＢＨＩ−ＴＥＶ部位−ＩＧＦ１融合タンパク質を産生するために、Ｍ２３１産生株を作製した。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をＣＢＨＩ担体とＩＧＦ１との間に入れた。ＩＧＦ１は非常に安定しており、上清への分泌後に、主に融合形態で残存していた。この発現構築物は、ＣＢＨＩ担体−ＴＥＶ切断部位−ＩＧＦ１タンパク質配列を含有しており、ネイティブなプロモーター及びターミネーターのコントロール下のｃｂｈ１ローカスに組み込まれるように設計した。トランスフォーメーション後、ｃｂｈ１  ｏｒｆの喪失、及びｃｂｈ１ローカスへの発現カセットの適切な組み込みについて、トランスフォーマントをＰＣＲによってスクリーニングした。最終的なトランスフォーマントをＭ２３１と名付けた。
【０３９４】
Ｍ２３１を作製するのに使用したＣＢＨＩ担体配列は、ＣＢＨ１のＣ末端アミノ酸「．．．ＴＴＴＧＳＳ」の後ろにおいて、アミノ酸「ＰＧＰ」がＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱ）の前に含まれていたことを除いて、上記ＩＧＦ１の場合と同じものであった。
【０３９５】
発現構築物がＴＥＶ切断部位の前にｓｔｒｅｐＩＩタグ及びスペーサーを含んでいた以外はＭ２３１と同様に、ＩＧＦ１変異体を産生する第２の株（ＢＶＳ８５７と称す）を作製した。発現カセットを、ネイティブなｃｂｈ１プロモーター及びターミネーターのコントロール下のｃｂｈ１ローカスに組み込んだ。ＰｍｅＩでベクターを消化し、発現カセットをゲル精製し、Ｍ１９４株にトランスフォーメーションし、ＡｍｄＳ選択を使用して選択した。ｃｂｈ１  ｏｒｆの喪失、及びｃｂｈ１ローカスへの発現カセットの適切な組み込みについて、トランスフォーマントをＰＣＲによってスクリーニングした。得られた株Ｍ２３６株は、ＣＢＨＩ−ｓｔｒｅｐｔＩＩタグ−３ｘ（ＧＧＧＳ）−ＴＥＶ部位−ＢＶＳ８５７融合タンパク質を産生した。精製を可能にするために、ｓｔｒｅｐＩＩタグ（便利なことに、これは、ＴＥＶプロテアーゼ処理によって後で除去することができる）を追加した。
【０３９６】
ＩＧＦ１株Ｍ２３１は、プロテアーゼ欠損を有しないが、ＢＶＳ８５７株Ｍ２３６は、ｐｅｐ１及びｔｓｐ１プロテアーゼ欠損を有する。これらの株は両方とも、安定ＣＢＨＩ−ＩＧＦ１融合物を上清中に発現した。キモスタチン（２０μM）及びペプスタチン（１０μM）阻害剤の存在下、１Ｌ発酵槽において、Ｍ２３１及びＭ２３６を培養した。２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、１００g/Lセロビオース、４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、３日目、４日目及び５日目にキモスタチン及びペプスタチン阻害剤を追加して、両株を培養した。４８時間後に、温度を２８℃〜２２℃にシフトさせた。
【０３９７】
イムノブロッティングによって、産生レベルを評価した。０．０２５μlをＩＧＦ１標準と共に４〜２０％基準ゲルに容量１０μlでロードすることができるように、オレンジＬＳＢでＭ２３１培養上清を希釈した。上清 ０．０５μlがＢＶＳ８５７標準と共に４〜２０％基準ゲルの各ウェルにロードされるように、Ｍ２３６培養上清を希釈した。ＴＢＳＴで０．２５μg/mlに希釈したウサギ抗ＩＧＦ１（Abcamウサギポリクローナル抗体、ab9572）、及びＴＢＳＴで１：１０，０００希釈した抗ＣＢＨＩ  ｍａｂ２６１を用いて、両ブロットを検出した。二次抗体は、ＴＢＳＴで１：３００００希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Li-Cor #926-68071, IRDye 680RDヤギ抗ウサギＩｇＧ）であった。ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈したLi-Cor #926-32210 IRDye 800CWヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、抗マウスＣＢＨＩ抗体を検出した。ＴＢＳＴで１時間洗浄し、ＴＢＳでリンスした。Li-Cor Odyssey CLx Infrared Imaging Systemを用いて、フィルタを７００nm及び８００nmでスキャンした。
【０３９８】
株Ｍ２３１は、１１８時間の時点において、最大１９g/LのＩＧＦ１をＣＢＨＩ担体融合物として産生することができることを実証した。イムノブロットでは、融合タンパク質は、７５kD付近に泳動した。ＣＢＨＩ−ＩＧＦ１融合タンパク質の発現レベルは、７２時間の時点において２g/L、９５時間の時点において１０g/L、１０１時間の時点において１６g/L、及び１１８時間の時点において１９g/Lであった。４９時間〜１１８時間において、前記ＣＢＨＩ発現レベルが、バッチ培養を通じて蓄積した。
【０３９９】
株Ｍ２３６の場合、１０１時間の時点において、最大７g/LのＢＶＳ８５７変異体をＣＢＨＩ担体融合物として産生することができた。イムノブロットでは、融合タンパク質は、７５kD付近に泳動した。ＣＢＨＩ−ＢＶＳ８５７融合タンパク質の発現レベルは、７２時間の時点において２．７g/L、９５時間の時点において６．２g/L、１０１時間の時点において７．０g/L、１１８時間の時点において５．１g/L、及び１４０時間の時点において２．５g/Lであった。ＣＢＨＩ担体融合物として、これらのＩＧＦ１タンパク質は両方とも、上清中に安定発現される。
【０４００】
プロテアーゼの効果を確認するために、キモスタチン及びペプスタチン阻害剤の有無の下、発酵槽において、Ｍ２３６  ＩＧＦ１−ＢＶＳ８５７産生株をさらに培養した。４０g/Lセルロースを使用して、この株を阻害剤と共に予め培養した。２０g/L酵母抽出物、８０g/Lセルロース、１００g/Lセロビオース、４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中、３日目、４日目及び５日目にキモスタチン及びペプスタチン阻害剤を追加して又は追加せずに、Ｍ２３６株を培養した。４８時間後に、温度を２８℃〜２２℃にシフトさせた。
【０４０１】
株Ｍ２３６（プロテアーゼ阻害剤の追加なし）において、７１〜１１５時間に採取した上清サンプルでは、ＣＢＨＩ−ＢＶＳ８５７融合タンパク質及び遊離タンパク質を検出することができなかった。その時間内では、上清に蓄積しているＣＢＨＩ担体タンパク質のみを検出することができた。キモスタチン及びペプスタチン阻害剤の存在下で成長させた同じ株は、１０４時間の時点において最大９g/LのＣＢＨＩ−ＢＶＳ８５７融合物を産生した。ＢＶＳ８５７−ＣＢＨＩ融合タンパク質は、７５kDに検出された。決定した発現レベルは、７１時間の時点において３．０g/L、９２時間の時点において６．３g/L、９８時間の時点において４．９g/L、１０４時間の時点において９．０g/L、及び１１５時間の時点において７．８g/Lであった。ＣＢＨＩ担体レベルは、培養を通じて増加し、１１５時間の時点において最大であった。したがって、ＢＶＳ８５７−ＣＢＨＩの産生レベルの改善は劇的であり、プロテアーゼ阻害によるものであった。
【０４０２】
４０g/Lのセルロースを使用すると、１０１時間の時点において、ＢＶＳ８５７−ＣＢＨＩについて７．０g/Lの産生レベルが達成され、８０g/Lのセルロースでは、１０４時間の時点において、産生レベルは９．０g/Lであった。これは、より多くのセルロースを培養培地に追加することによって、より高い産生レベルが達成されることを実証している。
【０４０３】
製造業者のプロトコールにしたがってｓｔｒｅｐタグアフィニティーカラム（IBA GmbH）によって、Ｍ２３６由来のＣＢＨＩ−ｓｔｒｅｐｔＩＩタグ−３ｘ（ＧＧＧＳ）−ＴＥＶ部位−ＢＶＳ８５７融合タンパク質を精製した。培養上清（６００μl）をカラムにアプライし、洗浄緩衝液１０容量で洗浄した。２．５mMデスチオビオチンを含有する溶出緩衝液でカラムを溶出した。４〜２０％基準ゲル上で画分を泳動し、ゲルコードブルークマシー染色で染色した。溶出画分＃２及び＃３は、ＢＶＳ８５７融合タンパク質が泳動するはずの７５ｋＤよりもわずかに小さい濃縮タンパク質を含有していた。
【０４０４】
溶出画分＃２をＴＥＶタンパク質切断効率の試験に使用した。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Invitrogen, catalog# 12575-015）を使用して、様々な量の酵素と共に８℃で一晩インキュベーションした。イムノブロットでは、標準量のＩＧＦ１を使用して、各反応物中に存在するＩＧＦ１の量を定量した。ＴＥＶの量を変化させて、その有効性を評価した（０、１μl、５μl、１０μl又は１５μl）。ＴＥＶ（５μl）＋ＢＶＳ８５７コントロール（４μg）では、ＢＶＳ８５７に対するいかなる有意なＴＥＶプロテアーゼ活性もないと思われることが示された。担体融合サンプル中のＩＧＦ１のベースライン量は、６８７ngであった。ＴＥＶ酵素 １μL（１０単位）を使用すると、８℃、１６時間後において融合物の４６％が変換された。５μl（５０単位）の量では、融合物の約９５％が変換された。ＴＥＶ１０μl（１００単位）を使用すると、これは９７％でピークに達した。イムノブロットにおいて、ＴＥＶ酵素は、２５kDaのバックグラウンド染色をもたらした。ネイティブなＩＧＦ１のサイズで放出されたＢＶＳ８５７産物を、１０kDa付近に容易に観察することができたが、標準曲線の範囲を下回っていた。ＰＭＳＦを反応緩衝液に使用したが、それは、担体から放出された後のＢＶＳ８５７の分解に関与するプロテアーゼ活性を中和しないと思われた。この物質を産生する株は、２個のプロテアーゼ欠損しか有していなかったので、プロテアーゼ阻害剤を使用して、プロテアーゼ活性をコントロールしようとした。この実験では、上清からＣＢＨＩ融合タンパク質をアフィニティー精製するために、内部ｓｔｒｅｐＩＩタグを使用することができ、ＩＧＦ１などのモデルタンパク質を放出するために、ＴＥＶ切断部位が効率的に切断されることが示された。
【０４０５】
実施例１７−１３重プロテアーゼ欠損株におけるＦＧＦ２１発現株
Ｍ３６９（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２。国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例４を参照のこと）において、ハイグロマイシンマーカーを含有する、ｃｂｈ１ローカスにターゲティングされるＦＧＦ２１発現カセットを有するベクターを使用して、第１のＦＧＦ２１産生株を作製した。ＰｍｅＩでベクターを消化し、Ｍ３６９株へのトランスフォーメーションのために処理し、ハイグロマイシンによってトランスフォーマントを選択した。分泌タンパク質が遊離ＦＧＦ２１タンパク質となるように、発現構築物は、ＣＢＨＩ担体−ＮＶＩＳＫＲ  ｋｅｘ２部位−ＦＧＦ２１融合タンパク質を産生した。ローカスへの正しい組み込み、及びｃｂｈ１  ｏｒｆの欠如をＰＣＲによって確認した。
【０４０６】
ＣＢＨＩ担体配列は、上記ＩＧＦ１の場合と同じものであり、その後ろにＮＶＩＳＫＲ  Ｋｅｘ２断部位及びＦＧＦ２１配列がある：
（配列番号９２６）
【０４０７】
プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡ、キモスタチン又は大豆トリプシン阻害剤の有無の下で、Ｍ３９３株を成長させた。阻害剤を追加しないコントロールウェルのために、独立したウェルを選択した。クエン酸二アンモニウム、１００mM ＰＩＰＰＳ、２０g/Lビール粕抽出物、４０g/Lラクトースを含む硫酸アンモニウム不含ＴｒＭＭ ３ml（ｐＨ４．５に調整）中で、この株を成長させた。湿度８５％において、２４ウェルプレートを８００rpmで振盪した。空気透過性膜でプレートをカバーし、培養物を６日間成長させた。
【０４０８】
阻害剤を３日目に最初に追加し、次いで、６日目まで毎日追加した。３日目から、サンプル ２００μlを培養ウェルから採取した。菌糸体を１３ｋで５分間スピンダウンし、上清を収集した。培養上清から、５μl＋ＬＳＢを４〜２０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードし、１：１０，０００希釈したウサギ抗ＦＧＦ２１（２μg/ml）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体を用いて、ニトロセルロース上で、イムノブロッティングを行った。定量のために、ＦＧＦ２１標準をブロットに含めた。
【０４０９】
ＦＧＦ２１は、プロテアーゼ分解に対して非常に感受性であった。処理なしの場合、６日目において、わずか約２mg/Lの全タンパク質を産生することができ、これらのごく一部は、全長物質であった（図１２）。１０μMペプスタチンＡを培養物に追加すると、６日目において、産生を最大１６０mg/Lに改善することができた。阻害剤の存在下では、主要分解産物が１８kD付近に検出された。ペプスタチンＡに加えて、ＳＢＴＩ又はキモスタチンを追加しても、さらなる利益が得られなかった。ＳＢＴＩを追加すると、培養サンプルがより酸性になったので、産生レベルに対して悪影響があった。ペプスタチンＡ及びＳＢＴＩの組み合わせは、２０４mg/Lの全ＦＧＦ２１の産生を可能にしたので、最も多くの利益をもたらした。発現レベルは、単一の阻害剤の存在下では１〜１２mg/Lの範囲内であり、未処理培養物では約１mg/Lに達した。ＦＧＦ２１を有効に産生するためには、アスパラギン酸プロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの両方を阻害することが重要であった。
【０４１０】
発酵槽において、ＴｒＭＭ＋２％酵母抽出物、４％セルロース、８％セロビオース、４％ソルボース（ｐＨ４．５）中で、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせて、Ｍ３９３株を培養した。イムノブロッティングによってＦＧＦ２１発現を分析したところ、３日目において、最も高い発現レベルが見られ、１０kD分解産物が１３０mg/Lで産生された。全長ＦＧＦ２１は観察されなかった。５重プロテアーゼ欠損株で産生された場合、ＦＧＦ２１は非常にプロテアーゼ感受性であった。阻害剤処理又はプロテアーゼ欠損によって、より大きなプロテアーゼ活性の低下が必要とされるであろう。２４ウェル培養において阻害剤を使用すると、大量のタンパク質が観察されたが、これは、ＦＧＦ２１はよく分泌されるが、分解に対して非常に感受性であったことを示唆している。
【０４１１】
ＡｍｄＳマーカーを有するＦＧＦ２１発現ベクターを株Ｍ１０７６及びＭ１０８５（ｓｌｐ７欠損とｐｙｒ４−ハイグロマイシン二重マーカー）にトランスフォーメーションした。
【０４１２】
ＡｍｄＳマーカーをＮｏｔＩフラグメントとしてｐＴＴｖ２４９から取り出し、予め作製したｐＴＴｖ１７４  ＦＧＦ２１発現ベクターにそれを追加することによって、ｐＴＴｖ４７０ベクターを作製した。選択マーカーを単に交換して、新たなベクターを作製した。発現カセットｐＴＴｖ１７４及びｐＴＴｖ４７０は、同一であった。ＰｍｅＩでｐＴＴｖ４７０ベクターを消化し、発現カセットをゲル精製し、ＡｍｄＳマーカーを有するＦＧＦ２１発現カセットを２個の１３重プロテアーゼ欠損株Ｍ１０７６（ｐｅｐ９欠損）及びＭ１０８５（ｓｌｐ７欠損を有するＭ９０１）にトランスフォーメーションした。ＡｍｄＳ選択の後、正しい５’及び３’組み込み、並びにｃｂｈ１オープンリーディングフレームの有無について、得られたトランスフォーマントをＰＣＲによってスクリーニングした。使用したプライマーペアを以下の表１７．１に示す。
【表２２】
2016523552.tif 000025
【０４１３】
トランスフォーメーションした株の両方について、陽性のトランスフォーマントが見られた。Ｍ１０７６のトランスフォーメーションから１３個の良好なトランスフォーマントが得られ、Ｍ１０８５から２個の良好なトランスフォーマントが得られた。これらのトランスフォーマントを２４ウェル培養で培養し、先のＦＧＦ２１産生株Ｍ３９３と比較した。ＰＩＰＰＳを含む１０g/L酵母抽出物、２０g/Lセロビオース、１０g/Lソルボース（ｐＨ４．５）中で、トランスフォーマント及びコントロールを成長させた。１×１０７個の胞子を培養培地 ５０mlに追加し、培養培地＋胞子 ３mlを各ウェルに追加（胞子６×１０５個／各ウェル）することによって、培養を開始した。４日目、５日目及び６日目に、各培養上清 １００μlを収集した。菌糸体をスピンダウンし、オレンジＬＳＢを上清に追加し、サンプルを５分間加熱した。１ウェル当たり上清＋ＬＳＢ ５μL及び２μlを４〜２０％基準ＴＧＸゲルにロードした。ゲルを泳動し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。
【０４１４】
発現したＦＧＦ２１をイムノブロッティングによって検出した。ＴＢＳＴでウサギ抗ＦＧＦ２１抗体を２μg/mlに希釈した。得られたストック濃度は３６００μg/mlであった（Novartis）。ＴＢＳＴでヤギ抗ウサギ二次IRDye 680を１：３０，０００希釈した。一次抗体及び二次抗体のインキュベーションを室温で振盪しながら１時間行った。担体ＣＢＨＩレベルを検出するために、ＴＢＳＴで抗ＣＢＨＩ抗体ｍａｂ２６１を１：１０，０００希釈した。ＴＢＳＴでヤギ抗マウスIRDye 800二次抗体を１：３０，０００希釈した。ＴＢＳＴで膜を１時間洗浄し、ＴＢＳでリンスした。ブロットを７００及び８００nmでスキャンした。
【０４１５】
ＦＧＦ２１及びＣＢＨＩ発現について、４日目、５日目及び６日目のサンプルを分析した。Ｍ３９３コントロール株と、１３個のプロテアーゼ欠損を有する新たなトランスフォーマントとの差は劇的であった。分泌されたＦＧＦ２１は、１０kD産物として主に観察された。４日目のＭ３９３上清では、この産物は、かすかに見えるに過ぎなかったが、全１３個の新たなトランスフォーマント由来の上清では、大量に発現されていた（図１３）。後日、ＦＧＦ２１は、Ｍ３９３株から検出されなかった。遊離ＣＢＨＩ担体は、全てのＭ３９３コントロールサンプル及び新たなＦＧＦ２１トランスフォーマントで発現されていた。これにより、全ての株が、ＣＢＨＩ担体及びＦＧＦ２１タンパク質の両方を分泌したが、Ｍ３９３株では、ＦＧＦ２１に対するプロテアーゼ活性が非常に大きかったことが示された。新たなトランスフォーマントにおける８個のさらなるプロテアーゼ欠損は、ＦＧＦ２１の安定性を劇的に改善した。４個のトランスフォーマント＃２４、３６、４８及び７３は、９個の他のトランスフォーマント（transformatants）と比較してより多量のＣＢＨＩ及びＦＧＦ２１を産生すると思われた。５日目及び６日目において、差は特に明らかであった。サザン分析後、これは、ＦＧＦ２１発現カセットの複数の組み込みに起因すると決定した。より低い発現レベルは、単一コピーの組み込みに対応する。Ｍ３９３株は、５個のプロテアーゼ欠損を有するが、生産した新たな株は、１３個のプロテアーゼ欠損を有する。Ｍ１０８５株のトランスフォーメーションによるトランスフォーマントを並行して行った。結果は、図１６に見られるものと同様であった。Ｍ１０８５ベースの株はまた、１０kDのＦＧＦ２１産物を主に産生したが、４日目において、わずかな１７kD産物が見られた。
【０４１６】
いくつかのトランスフォーマントについて、サザンブロット分析を行った。放射性検出を使用してサザンブロットによって、Ｍ１０７６株由来のトランスフォーマント番号＃２０、２４、３６、４８、５５、７３並びにＭ１０８５由来の＃４及び３９を分析した。組み込みをチェックするために、ＰｓｔＩでゲノムＤＮＡを消化した。ｃｂｈ１プロモーター及びｃｂｈ１  ３’フランクのプローブとして、２つのＰＣＲフラグメントを使用した。
【０４１７】
フラグメントを作製するのに使用したプライマーを以下に記載する。
ｃｂｈ１プロモータープローブ、７９９bpのフラグメント、３５ng/μl（チューブ標識５’プローブ）
Ｔ１７３＿ｐｃｂｈ１＿ｓｅｑ＿ｒ１  ＣＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧ（配列番号９３３）
Ｔ１６７９  ＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧ（配列番号９３４）
ｃｂｈ１  ３’フランクプローブ、７９６bpフラグメント、３２．２ng/μl（チューブ標識３’プローブ）
Ｔ１７８＿ｃｂｈ１３ｆｌａｎｋ＿ｓｅｑ＿ｆ２  ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＡＧ（配列番号９３５）
Ｔ１６８０  ＴＧＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡ（配列番号９３６）
【０４１８】
ｃｂｈ１ローカスに正しく組み込まれた場合、ＰｓｔＩによる消化及び両プローブによる検出により、２本のバンドが３．９kb及び４kbに生じるはずである。有効には、１本のバンドのみが４kbに存在するであろう。ネイティブなｃｂｈ１ローカスは、シグナルを６．７kb付近に生じさせる。トランスフォーマント番号２０、５５、４及び３９は、予想される組み込みバンドを４kbに示した。これらは、ｃｂｈ１ローカスへの明らかな単一組み込みであるように見える。２４ウェル培養研究から分かるように、これらのトランスフォーマントは、他のトランスフォーマントの多くよりも低い発現レベルを示した。最も高い発現レベルは、トランスフォーマント＃２４、３６、４８及び７３から見られ、それと同時に、サザンブロッティングにおいてさらなる組み込みシグナルが示された。全てのトランスフォーマントにおいて、非特異的なバンドが２．３kbに存在していた。
【０４１９】
複数コピーを含有するトランスフォーマント＃２４及び＃４８をＭ１２００及びＭ１２０１と名付けた。トランスフォーマント＃２０及び＃５５由来の単一コピー株をＭ１２０２及びＭ１２０３と名付けた。Ｍ１０８５ベースの株由来のトランスフォーマント＃４及び＃３９をＭ１２０４及びＭ１２０５と名付けた（これらは、単一コピー株であった）。
【０４２０】
１Ｌ発酵槽において、プロテアーゼ阻害剤の有無の下で、ＦＧＦ２１産生株を培養した。Ｍ１２００、Ｍ１２０１、Ｍ１２０４及びＭ１２０５株を用いて、培養を行った。２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、１００g/Lセロビオース、４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中で、これらの株を培養した。３日目、４日目及び５日目に、ペプスタチン、キモスタチン及びＳＢＴＩ阻害剤をＭ１２００及びＭ１２０５培養物に追加した。１ウェル当たり上清 ０．１μlを４〜２０％基準ＰＡＧＥゲルにロードすることができるように、オレンジサンプル緩衝液で上清サンプルを希釈した。
【０４２１】
上記のようにイムノブロッティングによって、発現したＦＧＦ２１を検出した。
【０４２２】
Ｍ１２００の培養は、１０ｋＤ産物を主に産生したが、最大１７kDのより高分子量の産物が存在していた（図１４）。全長ＦＧＦ２１は、２０ｋＤに泳動した。５日目において、２．０g/Lの１０kD産物が存在していた。阻害剤を使用すると、分泌ＦＧＦ２１の安定性が増加した。この場合、主要産物は１７ｋＤであり、５日目において、最大２．０g/Lを産生した。阻害剤処理によって、全長型ＦＧＦ２１を０．２g/Lで産生することができた。これは、全長であると思われた。Ｍ１２０５の培養は、５日目において、２．４g/Lの１０kDバンドを産生した。阻害剤処理すると、ＦＧＦ２１産物の安定性が増加して、４日目において、１７kD形態の主産物が３．５g/Lで生成し、全長産物が０．２g/Lで生成した（図１４）。Ｍ１２０１の培養からのサンプルは、発酵槽システムの技術的な問題があった（分析は示さず）。Ｍ１２０４株を分析したところ、５日目において、同様の発現レベル（２．５g/L）の１０kD産物を生じさせた。１０kD産物は、２日目において最低であり、５日目において最高であった。
【０４２３】
阻害剤処理により、ＦＧＦ２１タンパク質を十分に安定化することが可能であることが実証された。ＦＧＦ２１を産生するためのさらなるプロテアーゼ欠損（プロテアーゼ阻害剤の追加なし）としては、限定されないが、ｓｌｐ２、ｐｅｐ８及びｐｅｐ１１が挙げられる。
【０４２４】
ＦＧＦ２１産生株の阻害剤研究
いずれのクラスのプロテアーゼが、ＦＧＦ２１タンパク質の分解に最も寄与するかを調査するために、本発明者らは、２４ウェル培養において個々のプロテアーゼ阻害剤を試験した。
【０４２５】
キモスタチン及びＳＢＴＩは、Ｍ１２００株において依然として発現されているＳＬＰ２及びＳＬＰ７スブチリシンプロテアーゼを阻害することが公知である。ペプスタチンは、上清に分泌されることが公知のＰＥＰ８、ＰＥＰ１１、ＰＥＰ１２などのアスパラギン酸プロテアーゼを阻害する。１，１０−フェナントロリンは、Trichodermaによって分泌される亜鉛メタロプロテアーゼを主にターゲティングする。ＰＩＰＰＳで緩衝化した１０g/L酵母抽出物、２０g/Lセロビオース、１０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中で、２４ウェルのフォーマットでＭ１２００株を培養した。キモスタチン、フェナントロリン及びペプスタチンを最終濃度１０μMで使用し、ＳＢＴＩを０．１mg/mlで使用した。２連のウェルで各処理を行い、４つのウェルで未処理コントロールを培養した。
【０４２６】
１×１０７個の胞子を培養培地 ５０mlに追加し、培養培地＋胞子 ３mlを各ウェルに追加（胞子６×１０５個／各ウェル）することによって、培養を開始した。４日目、５日目及び６日目に、各培養上清 １００μlを収集した。菌糸体をスピンダウンして、上清のみを除去した。オレンジＬＳＢを追加し、サンプルを５分間加熱した。１ウェル当たり上清＋ＬＳＢ ２μLを４〜２０％基準ＴＧＸゲルにロードした。ゲルを泳動し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。
【０４２７】
上記のようにイムノブロッティングによって、発現したＦＧＦ２１を検出した。一部の場合では、商業的に購入したAbcam (#ab66564)のＮ末端抗体ウサギポリクローナル抗体、及びAbcam (#ab137715)のＣ末端ウサギポリクローナル抗体を使用した。
【０４２８】
阻害剤処理なしの場合、Ｍ１２００株は、１０kD産物を主に産生したが、４日目のサンプルにおいて、いくらかの大きな形態が見られた（図１５）。キモスタチン処理により、タンパク質の安定性が改善されて、１７kDが主要産物になった。キモスタチン処理後、少量の全長型が見られ、二量体形態が３７kD付近に存在していた。ペプスタチン、ＳＢＴＩ及び１，１０−フェナントロリン処理は、１０kD形態の発現レベルをわずかに改善した。しかしながら、キモスタチン及びペプスタチンを組み合わせると、安定化に対する相乗効果があった。併用処理は、全長型のほぼ完全な安定化を促進し、低分子量の産物を減少させた。これは、主に全長ＦＧＦ２１を可視化することができた６日目の培養サンプルにおいて最も明らかであった。二量体の出現は、この処理の場合に最も強かった。二量体の適切な形成は、分子が、二量体化に必要なＣ末端システイン残基を有することを示している。
【０４２９】
また、Ｎ末端抗体及びＣ末端抗体を用いて、培養サンプルをプローブした。キモスタチン及びペプスタチンによる二重処理により、全長産物が生成され、Ｎ末端抗体及びＦＧＦ２１標準に対して反応した（図１５）。Ｃ末端抗体を使用して、５日目のサンプルで産生されたＦＧＦ２１を検出すると、キモスタチン又はキモスタチン／ペプスタチンで処理した場合に２つの産物が観察された（図１６）。これらは、全長タンパク質及び最低１０ｋＤ態であると思われる。キモスタチン処理は、タンパク質のＣ末端を安定化するのに十分であった。Ｎ末端を維持するためには、キモスタチン及びペプスタチンの両方が必要であった。
【０４３０】
４日目のイムノブロットのデータを定量して、いずれの阻害剤が最も有効であったかを比較した。１，１０−フェナントロリン処理は、産生されるＦＧＦ２１の総量を最も改善したが、これは、亜鉛メタロプロテアーゼが関与したであろうことを示している（表１７．２）。ｍｐ１、ｍｐ２、ｍｐ３、ｍｐ４及びｍｐ５などの多くの候補がある。全長型は、スブチリシン及びアスパラギン酸プロテアーゼによって分解されると思われる。ＳＬＰ２プロテアーゼが、安定性の主な問題である可能性が最も高く、例えば、遺伝子を欠損させること、遺伝子をサイレンシングすること、又は遺伝子のプロモーターを変更することによって対処することができる。上清で見出されたアスパラギン酸プロテアーゼＰＥＰ８、ＰＥＰ１１及びＰＥＰ１２の欠損又はサイレンシングは、ＦＧＦ２１の安定性をさらに増加させ得る。いくつかの実施態様では、ＦＧＦ２１２の全長産生は、株Ｍ１２００では２個のプロテアーゼ（proteses）、ｓｌｐ２及びｐｅｐ８の欠損しか必要としない可能性がある。
【表２３】
2016523552.tif 000026
【０４３１】
実施例１８−そのプロモーターの置換によるｓｌｐ２発現の低下
ｓｌｐ２は、成長及び胞子形成にある程度影響を及ぼすので、ｓｌｐ２プロモーターを、より低いレベルで発現されるプロモーターと置換した（最後の実施例に記載されている条件では、全ての中で、特定されているプロテアーゼｓｌｐ２  ｍＲＮＡが最高レベルで発現された）。
【０４３２】
胞子形成誘導性フラビン含有モノオキシゲナーゼ遺伝子ｔｒｅ７６２３０、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子ｔｒｅ４９０４８、及びｓｌｐ８プロテアーゼ遺伝子ｔｒｅ５８６９８由来のプロモーターを、ｓｌｐ２プロモーターローカスへの置換に選択した。全ての遺伝子は、ｓｌｐ２で見られるものよりも低いレベルで適度に発現されると思われた。
【０４３３】
３つの遺伝子由来のプロモーター領域をＰＣＲによって増幅し、ｓｌｐ２フランキング配列（これは、これらのプロモーターを新たなｓｌｐ２プロモーターとして正しい位置に誘導する）を有するベクターに挿入した。プロモーターカセットは、新たなプロモーターの上流においてハイグロマイシンマーカーを含有する。ＰｍｅＩでベクターを消化し、置換用プロモーター構築物をゲル精製し、ハイグロマイシン選択条件下でＭＡＢ０１産生株Ｍ５０７にトランスフォーメーションした。各トランスフォーマントからの２個のトランスフォーマントを単離し、それぞれＭ７７３／Ｍ７７４、Ｍ７７５／Ｍ７７６及びＭ７７７／Ｍ７７８と名付けた。
【０４３４】
ｔｒｅ７６２３０プロモーター置換のためのプロモーター配列：
（配列番号９３７）
【０４３５】
ｔｒｅ４９０４８プロモーター置換のためのプロモーター配列：
（配列番号９３８）
【０４３６】
ｔｒｅ５８６９８プロモーター置換のためのプロモーター配列：
（配列番号９３９）
【０４３７】
２４ウェルプレートにおいて、１％酵母抽出物、２％セロビオース、１％ソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）を使用して、これらのトランスフォーマント及びＭ５０７コントロール株を培養した。５日目、６日目及び７日目において、サンプルを採取した。ＡＰコンジュゲート抗体を用いて、イムノブロッティングを行って、重鎖及び軽鎖を検出した。１レーン当たり０．５μlがロードされるように、培養上清を希釈した。ＡＰ基質を用いて、検出を可視化した。
【０４３８】
Ｍ７７３／Ｍ７７４及びＭ７７７／Ｍ７７８トランスフォーマントでは、重鎖は、明らかにより安定していた（図１７）。最も印象的な点は７日目にある。Ｍ５０７重鎖はほぼ完全に分解されるが、Ｍ７７３／Ｍ７７４重鎖は非常によく残存している。他の顕著な特徴は、上限の分解産物が３７kDにないことであった。いくつかの小さい分解産物のみが２８kD付近にある。Ｍ７７３／Ｍ７７４株は十分に成長したが、Ｍ７７７／Ｍ７７８株はそれ程十分に成長せず、胞子形成に問題があった。したがって、好ましい株は、Ｍ７７３又はＭ７７４であろう。カゼインによる全プロテアーゼ活性の測定は相関しており、Ｍ７７３／Ｍ７７４及びＭ７７７／Ｍ７７８は、プロテアーゼ活性が低いことを示した。
【０４３９】
イムノブロッティング（immunblotting）によって軽鎖を検出したところ、Ｍ７７３及びＭ７７４における軽鎖は、コントロールと比較して少なかった。Ｍ７７７及びＭ７７８株では、軽鎖が特に少なかった。Ｍ７７５及びＭ７７６の軽鎖の量は、コントロールと類似していた。ブロットで見られた軽鎖の量と、検出された全免疫グロブリンとは、よく一致していると思われた。これらの培養物から全ＩｇＧを測定したところ、Ｍ７７５及びＭ７７６（これらは、コントロールと非常に類似していた）を除く全てのプロモーター交換株は、抗体発現が低かった（表１８．１）ことを示していた。Ｍ７７３／Ｍ７７４株は、Ｍ５０７の半分未満のレベルであった。したがって、この小規模培養フォーマットでは、一部のプロモーター置換株の成長に影響を与えるものが存在し得る。
【表２４】
2016523552.tif 000027
【０４４０】
Ｍ７７４及びＭ７７５株を発酵させた。ＴｒＭＭ＋２０g/l酵母抽出物、４０g/lセルロース、８０g/lセロビオース及び４０g/lソルボース（ｐＨ５．５）中、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせて、２つの株を１０日間培養した。同じ条件下で、及び１２０g/lセルロースを使用した類似条件下で、コントロール株Ｍ６６７を培養した。イムノブロッティング及び全免疫グロブリンの決定のために、サンプルを採取した。１ウェル当たり０．０５μlが４〜１５％ゲルにロードされるように、上清を希釈した。ＴＢＳＴで１：１０，０００希釈したＡＰコンジュゲート抗体（Ａ３８１８）を用いて、軽鎖を検出するためのイムノブロッティングを行った。ＴＢＳＴで１：３０，０００希釈した抗ヒトＦｃ抗体IRDye 700 DXコンジュゲート（Rockland #609-130-003）を用いて、重鎖を検出した。Odyssey CLx near infrared imager (Li-Cor)を使用して、７００nmの蛍光を検出した。
【０４４１】
Ｍ７７４から産生されたＭＡＢ０１重鎖は、極めて良好であるように見えた（図１８）。結果は、２４ウェル培養で見られたものと類似していた。唯一の主要分解産物が２５kD付近に存在していた。典型的には、重鎖は、Ｍ７７５によって産生されたもののように見える。通常、分解バンドは、３８ｋＤ、２８ｋＤ及び１０ｋＤに存在する。スブチリシン切断部位はＭＡＢ０１重鎖のＮ末端のより近くに存在し、高いｓｌｐ２発現がなければ、重鎖はもはやその位置で切断されないので、１０kD産物及び３８kD産物の消失は、ＳＬＰ２活性の低下によって説明することができる。プロテアーゼがヒンジ領域で重鎖を切断すると、２８kD産物が生じる。ヒンジの切断部位は、セドリシン又はトリプシン様プロテアーゼにより典型的なものである。それらは、ＳＬＰ２に起因するものではないと思われる。ヒンジ及びその近くのＮ末端部位が両方とも切断されると、１０ｋＤ産物が生じる。
【０４４２】
Ｍ７７４及びＭ７７５の軽鎖の量及び担体結合率の間に、明らかな差は見られなかった。上記２４ウェル培養データに見られるように、Ｍ７７５は最適なコントロール株ではないが、Ｍ５０７と非常に類似している。このデータはまた、ＳＬＰ２が、担体−軽鎖融合物を切断しないと思われることを示唆している。そうでなければ、ｓｌｐ２発現レベルが低下すると、担体結合物質の量は劇的に増加するであろう。
【０４４３】
全抗体量を比較したところ、Ｍ７７４株は、Ｍ７７５よりもわずかに優れていた（表１８．２）。重鎖のイムノブロットについても、全抗体量が記載されている。７日目及び８日目において、最大の差が見られ、両方の日において、Ｍ７７４は５．３g/Lを産生した。これらの日において、Ｍ７７５は４．４及び４．６g/Lを産生した。全長抗体の量を測定及び比較したところ、最も重要な差が観察された。Ｍ７７４は、よりインタクトな重鎖を産生した。７日目において、Ｍ７７４株は７１％の全長を産生し、Ｍ７７５は３７％の全長であった。Ｍ７７４株は、６５％の全長抗体を最大１０日間維持することができたのに対して、Ｍ７７５株は、１４％の全長物質しか産生しなかった。品質の点では、（ｓｌｐ２遺伝子サイレンシング構築物を有する）コントロール株Ｍ６６７は、Ｍ７７４と類似していた（表１８．２）。しかしながら、同じ培養条件下で、Ｍ６６７産生株は、１０日目において６．１g/Lに達するレベルで、わずかに多い量の全抗体を産生した。セルロースを増加させると（１２０g/L）Ｍ６６７株は、１０日目において、７．１g/L程度の全抗体を産生することができた（表１８．２）。
【０４４４】
これらのデータから、ＳＬＰ２活性を低下させるための別のアプローチを作製した。ＳＬＰ２プロモーターの置換は、ＳＬＰ２プロテアーゼの低発現につながり、極めて少ない重鎖の分解をもたらした。成長及び胞子形成に対するいくらかの効果が依然として観察されたが、それらは、ＳＬＰ２遺伝子の完全な欠損で見られたものよりもかなり弱かった。胞子形成誘導性プロモーターをｓｌｐ２に与えることによって、この胞子形成関連問題に対処した可能性がある。Ｍ７７４で見られた成長障害は、発酵プロセスの改変によって補償することができる。
【表２５】
2016523552.tif 000028
2016523552.tif 000029
【０４４５】
別個の一連の発酵槽培養において、Ｍ５０７親株をＭ６４６  ｓｌｐ２欠損株及びＭ７７４  ｓｌｐ２プロモーター変更株と比較した。ＴｒＭＭ＋２０g/l酵母抽出物及び１２０g/lセルロース及び５０％グルコース／１２．５％ソルボースフィード（ｐＨ５．５）中で、４８時間の時点で温度を２８°〜２２°にシフトさせて、それらを成長させた。５日目及び６日目のサンプルについて、抗重鎖抗体及び抗軽鎖抗体を用いて、イムノブロッティングを行って、産生された重鎖及び軽鎖の品質及び相対量を可視化した。
【０４４６】
Ｍ５０７は、Ｍ６４６及びＭ７７４株よりも速く成長を開始したが、培養の後半では、それらはＭ５０７に追い付いた。イムノブロットで見られるように、これら３つの株によって産生された遊離軽鎖の量に有意差はなかった。Ｍ６４６株では、ＣＢＨＩ担体に結合した軽鎖の量がわずかに多かった。Ｍ６４６サンプルから、少量の担体結合重鎖が検出されたが、Ｍ７７４株で見られた量はさらに少なかった。Ｍ５０７株では、これを検出することができなかった。この観察結果は、上清中において、又は潜在的には細胞内において、ＳＬＰ２が、ＣＢＨＩ担体−抗体融合タンパク質のプロセシングにある程度関与し得ることを示唆している。
【０４４７】
Ｍ７７４株は、ｓｌｐ２欠損株Ｍ６４６と類似の重鎖分解パターンを示した。株は両方とも、Ｍ５０７親株で見られた１０kD分解産物及び３８kD分解産物が欠如していた。イムノブロットでは、Ｍ６４６及びＭ７７４の重鎖は、５０kDのフルサイズ産物及び２５kDの１つの主要分解産物のみを示した。Ｍ６４６及びＭ７７４株における全長重鎖の量は、Ｍ５０７と比較して多かった。コントロールＭ５０７の重鎖は、２つのさらなる分解産物を１０kD及び３８kDに示した。これは、ＳＬＰ２プロテアーゼが、これらの産物の産生に実際に関与していたことを示している。これらの培養条件下では、６日目の時点において産生された全ＭＡＢ０１抗体の量は、Ｍ７７４株とＭ５０７株との間で類似しており、２．８g/Lに達した（表１８．３）。Ｍ７７４及びＭ５０７株が同量の全免疫グロブリンを産生したとしても、重鎖分解産物の欠如を考慮すれば、Ｍ７７４物質の品質は非常に優れていた。
【表２６】
2016523552.tif 000030
【０４４８】
実施例１９−１４重プロテアーゼ欠損株−ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）プロモーターのｔｒｅ７６２３０プロモーターへの変更
ＳＬＰ２活性が低下している１４重プロテアーゼ欠損株を作製するために、ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）ローカスにターゲティングされるプラスミドのＭｓｓＩフラグメントで１３重プロテアーゼ欠損株Ｍ１０７７（Ｍ１０７６のｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションして、胞子形成誘導性遺伝子ｔｒｅ７６２３０プロモーターでｓｌｐ２プロモーターを置換した。
【０４４９】
ｐｙｒ４選択のために、標準的なプロトプラストトランスフォーメーション法を使用して、トランスフォーメーションを行った。トランスフォーメーションを２倍にスケーリングした（すなわち、プロトプラスト ５００μlを使用）。使用したＤＮＡの総量は、約１４．６μgであった。トランスフォーメーションプレート上で成長中のコロニーを選択プレート上に採取し、表１９．１に示されているプライマーを使用して、欠損カセットの正しい組み込みについてスクリーニングした。組み込みシグナルを示す選択クローンを、単一胞子精製によって精製し、再スクリーニングした。１回の精製ラウンドの後、３個のトランスフォーマント由来のクローンは純粋であると思われ、組み込みシグナルは強力であった。胞子懸濁のために、各トランスフォーマント由来の２個の純粋な同胞クローンをＰＤ＋１Ｍソルビトールにプレーティングした。
【表２７】
2016523552.tif 000031
【０４５０】
ｓｌｐ２プロモーター置換株のサザン分析
２回のｓｌｐ２プロモーター置換トランスフォーメーションによる３つの生物学的クローンを、ＤＮＡ抽出のために、２４ウェルプレートにおいて、親株Ｍ１０７６と共に培養した。３日後、真空ろ過によって菌糸体を回収し、凍結し、凍結乾燥した。Easy-DNA kit (Invitrogen)を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出し、表１９．１のプライマーを使用してＰＣＲによって、サンプルを分析した。クローンはいずれも、ｓｌｐ２プロモーターの強力なシグナルを示さなかったが、いくつかのクローンについては、予想サイズに対応する非常に少量の産物が見られた。
【０４５１】
全ての分析について、Ｍ１２４、Ｍ１０７６及び６つのΔｓｌｐ２プロモーター置換株由来のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した（Δｓｌｐ２プロモーター、５’及び３’フランク）。フランク分析から株Ｍ１２４を除外した。両フランク分析のために、ＭｓｓＩでコントロールプラスミドを消化した。ハイブリダイゼーションのためのプローブを作製するのに使用したプライマーを表１９．２に示す。
【表２８】
2016523552.tif 000032
【０４５２】
サザン分析により、全てのクローンが、純粋なｓｌｐ２プロモーター交換クローンであることが確認された。加えて、クローンの大部分は、５’及び３’フランクプローブによる予想シグナルのみを示すので、ゲノムへの欠損カセットの単一組み込みを証明している。１個のクローン（７８−２８Ｂ）は、ゲノムに組み込まれたカセットの余分なコピーを有する可能性がある。クローン７８−６Ａをコレクションのために保存し、コードＭ１１６２と命名した。ｓｌｐ２プロモーターを交換したクローンは、胞子形成能がやや遅くて低いと思われる。
【０４５３】
Ｍ１１６２の発酵槽培養
Ｍ１１６２株を培養し、株Ｍ１０７６と比較した。前培養物を通常の２日間ではなく３日間成長させた。２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース、４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中で、Ｍ１１６２を発酵させた。Ｍ１１６２株は、その元になったＭ１０７６よりも少し遅く成長した。Ｍ１０７６のＣＯ２ピークは７５時間の時点できたが、Ｍ１１６２は、９４時間の時点であった。
【０４５４】
プロテアーゼ活性の測定
発酵槽培養サンプルのプロテアーゼ活性を分析した。サンプルを１mg/ml全タンパク質に調整することができるように、培養サンプルの全タンパク質濃度を測定した。全ての希釈上清 １００μlを９６ウェルプレートに追加した。１サンプル当たり３連のウェルを使用した。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で作製したＦＬカゼイン希釈ストック（１０μg/ml）１００μlを各ウェルの上清に追加した。バイアルのカゼインストック溶液は１０００μg/mlであり、ＰＢＳ ２００μLに最初に再懸濁した。各サンプルについて、希釈上清１００μl及びクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）１００μlのバックグラウンドコントロールを使用した。プラスチック袋でカバーしたプレートを３７℃でインキュベーションした。２時間後、３時間後及び４時間後に、プレートからの蛍光を測定した。４８５nmの励起及び５３０nmの発光を使用して蛍光プレートリーダーによって、読み取りを行った。
【０４５５】
Ｍ１１６２株から得られた上清のプロテアーゼ活性は、Ｍ１０７６株と比較して極めて低かった。ｓｌｐ２プロモーターの変更によって、ＳＬＰ２プロテアーゼ活性は重大な影響を受けた。その結果、カゼインに対するプロテアーゼ活性は、３日目において３．６倍低く、４日目において２．５倍低かった（表１９．３）。
【表２９】
2016523552.tif 000033
【０４５６】
実施例２０−ＩＦＮ−α２ｂを発現する１３重プロテアーゼ欠損株の作製
インターフェロンアルファ２ｂを発現する１３重欠損株を２段階で作製した。最初に、１２個のプロテアーゼ欠損Δ（ｐｅｐ１  ｔｓｐ１  ｓｌｐ１  ｇａｐ１  ｇａｐ２  ｐｅｐ４  ｐｅｐ３  ｐｅｐ５  ｐｅｐ２  ｓｅｐ１  ｓｌｐ８  ａｍｐ２）を含有するＭ８９３由来のインターフェロン産生株を上記のように作製した。（完全なｃｂｈ１プロモーター及びｃｂｈ１ターミネーター配列を有するが、ＩＦＮ−α２Ｂ、ＧＧＧＧＧ−ＮＶＩＳＫＲと共に挿入されるＣＢＨ１コード遺伝子配列を欠くプラスミド由来の）ｐＴＴｖ４０１のＭｓｓＩフラグメントでＭ８９３プロトプラストをトランスフォーメーションした。ｐＴＴｖ４０１カセットは、アセトアミド選択マーカーを有しており、ｃｂｈ１ローカスにターゲティングされた。
【０４５７】
Ｍ８９３トランスフォーマントを選択プレートにストリークし、ｃｂｈ１ローカスへの正しい組み込みについて、ＰＣＲスクリーニングした。Phire Plant Direct kit (Thermo Scientific, F-130)を使用して、ＰＣＲスクリーニングを行った。スクリーニングプライマーを表４３．１に記載する。株をＭ１０１２と名付けた。
【表３０】
2016523552.tif 000034
【０４５８】
ｃｂｈ１ローカスにおいて、Ｍ１０１２が１つのＩＦＮ−α２ｂ発現カセットを有することをサザン分析によって確認した。Ｍ１０１２胞子を５−ＦＯＡプレートにプレーティングして、ｐｙｒ４マーカーをループアウトした。コロニーを採取し、５−ＦＯＡプレートにストリークした。１０個のコロニーについて、単一細胞のプレーティングを行い、ＰＣＲによってサブクローンをスクリーニングして、ｐｙｒ４ループアウトを確認した。スクリーニングプライマーを表２０．２に記載する。ｐｙｒ４ループアウトの正しいシグナルを示すクローンをＰＤプレートにストリークし、選択したクローンについて、＋／−ウリジンプレート試験を行った。Ｍ１０１２のｐｙｒ４陰性クローン１−１をＭ１０６５と名付け、ｐｙｒ４陰性クローン２−１をＭ１０６６と名付けた。
【表３１】
2016523552.tif 000035
【０４５９】
ＩＦＮ−α２ｂ発現を有する１３重プロテアーゼ欠損株を作製するために、（ｐｙｒ４−ハイグロマイシン選択マーカーを導入／交換することによって、ｐＴＴｖ１１５から作製した）ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）欠損ベクターｐＴＴｖ４５７のＭｓｓＩフラグメントでＭ１０６５プロトプラストをトランスフォーメーションした。プロトプラスティング及びトランスフォーメーションを上記のように行った。ｐＴＴｖ４５７  Ｍ１０６５トランスフォーマントを選択プレートにストリークし、ｓｌｐ２ローカスへの正しい組み込みについて、ＰＣＲスクリーニングした。ＰＣＲスクリーニングプライマーを表２０．３に記載する。ｓｌｐ２  ＯＲＦシグナルを示さなかった３個のトランスフォーマントをＰＤ＋１Ｍソルビトールプレートにストリークした。
【表３２】
2016523552.tif 000036
【０４６０】
最良のクローンをＭ１１０６と命名し、１Ｌ発酵槽において、２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、１００g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５）中で、コントロール株Ｍ９６１と共に培養した。セロビオースの先の標準量は８０g/Lであったので、コントロール培地（２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース及び４０g/Lソルボースを含むＴｒＭＭ（ｐＨ４．５））中でも、Ｍ９６１株を培養した。
【０４６１】
イムノブロッティングによって培養サンプルを分析して、インターフェロンの発現を定量した。上清 ０．０５μlを１０μlで４〜２０％基準ｐａｇｅゲルにロードすることができるように、サンプルを希釈した。４００、２００、１００、５０及び２５ngに相当する標準量のインターフェロンも同じゲルにロードした。インターフェロン抗体（Abcam #ab9386；ＴＢＳＴで１μg/mlに希釈）をブロット膜と共に１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴで洗浄した。二次抗体IRDye 680（Li-Cor #926-68070；ＴＢＳＴで１：３０，０００に希釈）を１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴで洗浄し、７００nmでスキャンした。
【０４６２】
全てのイムノブロットにおいて、インターフェロンは、約１７kDの１本のバンドとして検出された。少量の担体結合インターフェロンが約７５kDに検出されたが、大部分は遊離型であった。Ｍ９６１株は、９５時間の時点において３．２g/Lのインターフェロン産生レベルを達成した（表２０．２）。より高濃度のセロビオースの存在下では、インターフェロン産生レベルは、９５時間の時点において７．９g/Lに達し、発現は８９時間から９９時間まで安定しており、そのレベルは７．４g/L以上であった。より多くのプロテアーゼを欠損させた場合の最大産生レベルをチェックするために、３〜５日目にキモスタチン（２０μM）及びペプスタチン（１０μM）を追加した同じ培地中で、Ｍ９６１株を成長させた。プロテアーゼ阻害剤処理により、インターフェロン産生レベルは、１４０時間の時点において１０．７g/Lに上昇した。Ｍ１１０６の培養中、インターフェロンの発現は、９０時間から１２１時間まで見られた。最高量は、４．３g/Lであると測定された（表２０．４）。株Ｍ１１０６は、やや遅く成長した：Ｍ１１０６は、１２１時間の時点において４．３g/Lに達したのに対して、Ｍ９６１は、９０時間の時点において７．４g/Lに達した。
【表３３】
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【０４６３】
実施例２１−ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系を使用した遺伝子欠損T. reesei株の作製
Ｃ末端タグ付き核局在化シグナル（ｎｌｓ）を有するＣａｓ９ヌクレアーゼ配列は、Trichoderma reeseiにおける発現のためにコドン最適化されている。基本的なクローニングベクター及び標準的な手順を使用して、構成的ｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣターミネーター配列のコントロール下で、配列をクローニングする。最終的なＣａｓ９ヌクレアーゼ発現ベクターを以下の要素から構築する：ｐｅｐ４プロテアーゼ（又は、任意の他の適切なプロテアーゼ）ローカス５’フランキング配列＋ｐｇｐｄＡ−Ｃａｓ９−ｎｌｓ−ｔｔｒｐＣカセット＋ｐｙｒ４−ｈｙｇＲ二重選択カセット及びｐｙｒ４ループアウト配列＋ｐｅｐ４プロテアーゼローカス３’フランキング配列。酵母組換え法を利用することによって、ｐＲＳ４２６骨格に対してベクターを構築する；ＰＣＲプライマーを用いて、ベクター要素間のオーバーラップを生成する。ｐｅｇ媒介プロトプラストトランスフォーメーション法によって、野生型T. reesei  Ｍ１２４株、又は上記で作製した、若しくは国際公開公報第／２０１３／１７４９２７号又は国際公開公報第／２０１３／１０２６７４号における任意の他のT. reesei株に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現ベクターをトランスフォーメーションして、同時にｐｅｐ４プロテアーゼ欠損を生成する。次いで、作製した株Ｃａｓ９＿Ｍ１２４を、DiCarlo et al. 2013 (Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems; NAR 41:4336-4343)に記載されているように、ＰＣＲによって作製した一過的ｇＲＮＡカセットのトランスフェクションのためのバックグラウンド株として使用する。あるいは、Saccharomyces由来のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  ＳＮＲ５２プロモーター−及びＳＵＰ４  ３’フランキング領域をTrichodermaホモログで置換する。ＣＡＳ９ヌクレアーゼの正確なゲノムターゲティングに必要なガイドＲＮＡをプロモーターと３’フランキング領域との間に配置する。ガイドＲＮＡは、所望のゲノムターゲットに相補的な２０ｎｔ長の配列と、それに続いて、ＮＧＧ  ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に相補的な３ｎｔの配列と、ＣＡＳ９活性に必要な一定の３’部分とから構成される。異種タンパク質の産生に有害な様々なプロテアーゼ及び糖酵素について、例示的なガイドＲＮＡを表２１．１に示す。ゲノムターゲットは、加水分解酵素、又はTrichoderma reeseiのグリカン生合成経路の酵素の中から選択される。エレクトロポレーションによって、又は他の基本的な遺伝子導入方法によって、（単一及び複数の）一過的ガイドＲＮＡカセットをＣａｓ９＿Ｍ１２４プロトプラストに導入する。所望のゲノムターゲット配列に対してＣＡＳ９が生成する点突然変異によって引き起こされるプロテアーゼ活性の低下に基づいて、プロテアーゼ欠損クローンを選択する。グリカン生合成経路にターゲティングされる点突然変異を有するクローンは、グリカンプロファイリングによって選択することができる。単一胞子精製の後、ゲノムターゲットローカスのＰＣＲ増幅、及びＰＣＲ産物の配列決定によって、選択したクローンを特性評価して、遺伝子を不活性化する点突然変異を検証する。
【０４６４】
ガイドＲＮＡを産生するための別の方法は、Gao and Zhao 2014 (Self-processing of ribozyme flanked RNA’s into guide RNA’s in vitro and in vivo for CRISPR mediated genome editing; Journal of Integrative plant biology, 56:343−349)に記載されているように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されるプロモーターから配列又は複数の配列を発現させ、自己プロセシングリボザイム配列を有するガイドＲＮＡを隣接させることである。図１９は、欠損の影響を受けやすいプロテアーゼのサブセットの系統樹を示す。
【表３４】
2016523552.tif 000038
2016523552.tif 000039
2016523552.tif 000040
【０４６５】
実施例２２−Trichoderma reesei株Ｍ６２９及びＭ５０７を用いたトランスクリプトーム分析
標準的な（strandard）酵母抽出物及びビール粕抽出物培養培地を含む発酵槽において、Trichoderma reesei株Ｍ６２９（ＭＡＢ０１、ｐｃＤＮＡ１−（Ｋｒｅ２）ｈｕＧｎｔ１、ｐｇｐｄＡ−（ｎａｔ）ｈｕＧｎｔ２、Δｐｅｐ１  ｔｓｐ１  ｓｌｐ１  ｇａｐ１  ｇａｐ２  ｐｅｐ４  ｐｅｐ３）（国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例１９に記載されている）及びＭ５０７（ＭＡＢ０１、Δｐｅｐ１  ｔｓｐ１  ｓｌｐ１  ｇａｐ１  ｇａｐ２  ｐｅｐ４  ｐｅｐ３）（国際公開公報第２０１３／１０２６７４号の実施例６に記載されている）を培養した。１日目、３日目及び４日目（酵母抽出物培地）並びに１日目、３日目及び５日目（ビール粕抽出物培地）に収集したサンプルから、標準的な方法で全ＲＮＡを精製した。キットの説明書にしたがってMachery-Nagel nucleotrap mRNA kitを用いて、全ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを精製した。IlluminaTruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kitを用いて、ｃＤＮＡへの変換及び配列決定のための調製を行った。配列決定のために、Illumina hiScanSQ sequencer（１００＋８（インデックス）＋１００サイクル、ペアエンドラン）を用いて、２５０〜４５０ベースペア（base pare）の産物を収集した。
【０４６６】
統計分析では、シーケンスリードを以下のように操作した。配列決定に由来する９１３４個のジーンリードをクリーニングし（すなわち、全ての値がゼロであるか、又は全条件の平均が０．１未満の遺伝子を除外した）、８５２５個のジーンリードを得た。他の同定されているTrichodermaプロテアーゼ又は他の糸状菌（Aspergillus、Neurospora）のものとの配列類似性に基づいて、８５２５個の遺伝子からプロテアーゼ遺伝子候補を同定した。以下のプロテアーゼは、（ＦＰＫＭ値；フラグメント／エクソン１キロベース／マッピングされたフラグメント１００万個によれば）異なる時点及び／又は培養条件において、一定の又はレギュレーションされた発現レベルを示すので、欠損させるべきである：メタロプロテアーゼｍｐ１（ＴＲ１２２７０３）、プロテアーゼ（ＴＲ８０８４３）、ペプチダーゼ（ＴＲ７２６１２）、プロテアーゼ（ＴＲ４７１２７）、ペプチダーゼ（ＴＲ７７５７７）、ｐｅｐ１３（ＴＲ７６８８７）、プロテアーゼ（ＴＲ５６９２０）、カルボキシペプチダーゼ（ＴＲ１２０９９８）、プロテアーゼ（ＴＲ６５７３５）、ペプチダーゼ（ＴＲ８２１４１）、メタロプロテアーゼ（ＴＲ１２１８９０）、ペプチダーゼ（ＴＲ２２７１８）、ペプチダーゼ（ＴＲ２１６５９）、ｍｐ５（ＴＲ７３８０９）、プロテアーゼ（ＴＲ８２４５２）、ペプチダーゼ（ＴＲ８１１１５）、ペプチダーゼ（ＴＲ６４１９３）、プロテアーゼ（ＴＲ２３４７５）、ペプチダーゼ（ＴＲ７９４８５）、ｍｐ３（ＴＲ４３０８）、プロテアーゼ（ＴＲ１２２０８３）、カルボキシペプチダーゼ（ＴＲ６１１２７）、ペプチダーゼ（ＴＲ８０７６２）、ペプチダーゼ（ＴＲ５６８５３）、ペプチダーゼ（ＴＲ２２２１０）、プロテアーゼ（ＴＲ１１１６９４）、ｍｐ４（ＴＲ５３３４３）、ｍｐ２（ＴＲ１２２５７６）、プロテアーゼ（ＴＲ４０１９９）、プロテアーゼ（ＴＲ７５１５９）、ａｍｐ２（ＴＲ１０８５９２）、プロテアーゼ（ＴＲ２１６６８）、ａｍｐ１（ＴＲ８１０７０）、プロテアーゼ（ＴＲ６１９１２）、プロテアーゼ（ＴＲ５８３８７）、プロテアーゼ（ＴＲ８２５７７）、プロテアーゼ（ＴＲ８１０８７）、ｐｅｐ１０（ＴＲ７８６３９）、ｐｅｐ１６（ＴＲ１１０４９０）、ｐｅｐ７（ＴＲ５８６６９）、ｐｅｐ１４（ＴＲ１０８６８６）、ｐｅｐ６（ＴＲ６８６６２）及びプロテアーゼ（ＴＲ６６６０８）。
【０４６７】
実施例２３−ｍｐ１又はｍｐ５欠損株の作製
酵母相同組換えを使用して、メタロプロテアーゼｍｐ１（ｔｒｅ１２２７０３）欠損プラスミドｐＴＴｖ４６８を構築した。このプラスミドは、ｐｙｒ４マーカーをループアウトするためのｍｐ１  ３’ダイレクトリピートを有する。（プラスミドｐＴＴｖ１９４由来のｈｙｇｒ−ｐｙｒ４二重マーカーを有するプラスミド由来の）ＮｏｔＩ消化プラスミドを骨格として使用した。表２３．１に記載されているオリゴを使用してＰＣＲによって、ｍｐ１  ３’ダイレクトリピート及びｐｙｒ４マーカーを構築した。上記のように、酵母相同組換えクローニングを使用して、ｐＴＴｖ４６８ベクターをアセンブルした。
【表３５】
2016523552.tif 000041
【０４６８】
１５重プロテアーゼ欠損株を作製するために、ｐＴＴｖ４６８のＭｓｓＩフラグメントで１４重プロテアーゼ欠損株Ｍ１１９９（Ｍ１１６２のｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションした。ｐｙｒ４選択のために、標準的なプロトプラストトランスフォーメーション法を使用して、トランスフォーメーションを行った。トランスフォーメーションプレートで成長中のコロニーを選択プレートに採取し、表２３．２に示されているプライマーを使用して、欠損カセットの正しい組み込みについてスクリーニングした。
【表３６】
2016523552.tif 000042
【０４６９】
酵母相同組換えを使用して、メタロプロテアーゼｍｐ５（ｔｒｅ７３８０９）欠損プラスミドｐＴＴｖ４６９を構築した。このプラスミドは、ｐｙｒ４マーカーをループアウトするためのｍｐ５  ３’ダイレクトリピートを有する。表２３．３に記載されているプライマーを使用してＰＣＲによって、ｍｐ５  ３’ダイレクトリピート及びｐｙｒ４マーカーを構築した。
【表３７】
2016523552.tif 000043
【０４７０】
別の１５重プロテアーゼ欠損株を作製するために、ｐＴＴｖ４６９のＭｓｓＩフラグメントで１４重プロテアーゼ欠損株Ｍ１１９９（Ｍ１１６２のｐｙｒ４−）をトランスフォーメーションした。ｐｙｒ４選択のために、標準的なプロトプラストトランスフォーメーション法を使用して、トランスフォーメーションを行った。トランスフォーメーションプレートで成長中のコロニーを選択プレートに採取し、表２３．４に示されているプライマーを使用して、欠損カセットの正しい組み込みについてスクリーニングした。
【表３８】
2016523552.tif 000044
【０４７１】
実施例４７−ｓｌｐ３欠損を有する１３重プロテアーゼ欠損株の作製
Δｓｌｐ３を有する１３重プロテアーゼ欠損株を作製するために、ｐＴＴｖ４２５のＭｓｓＩフラグメントで１２重プロテアーゼ欠損株Ｍ９０１（Ｍ８９３のｐｙｒ４−）トランスフォーメーションした。クローンのトランスフォーメーション及びスクリーニングを上記のように実施した。１個の独自のトランスフォーマントを得、３回の精製ラウンドの後に、ＰＣＲによってクローンを再チェックした（表６−１を参照のこと）。サブクローンをＭ１０７５と名付けた。
【図１Ａ】
2016523552.tif 000045
【図１Ｂ】
2016523552.tif 000046
【図１Ｃ】
2016523552.tif 000047
【図２Ａ】
2016523552.tif 000048
【図２Ｂ】
2016523552.tif 000049
【図２Ｃ】
2016523552.tif 000050
【図３】
2016523552.tif 000051
【図４】
2016523552.tif 000052
【図５】
2016523552.tif 000053
【図６】
2016523552.tif 000054
【図７】
2016523552.tif 000055
【図８】
2016523552.tif 000056
【図９】
2016523552.tif 000057
【図１０】
2016523552.tif 000058
【図１１】
2016523552.tif 000059
【図１２】
2016523552.tif 000060
【図１３】
2016523552.tif 000061
【図１４】
2016523552.tif 000062
【図１５】
2016523552.tif 000063
【図１６】
2016523552.tif 000064
【図１７】
2016523552.tif 000065
【図１８】
2016523552.tif 000066
【図１９】
2016523552.tif 000067
【図２０】
2016523552.tif 000068
【配列表】
2016523552000001.app
【国際調査報告】
2016523552.tif 000069
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