(57)【要約】  生体内への挿入を意図した医用デバイスは、組織接触表面を有する非生分解性基材を含み、前記組織接触表面はＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルによって少なくとも部分的に被覆されている。本発明者らは、ＶＩ型コラーゲンによるコーティングが好気性および嫌気性のヒト病原菌に対する抗微生物特性を提供することを見出した。さらに、ＶＩ型コラーゲンと生来の免疫系との間の予期しない相乗効果が得られた。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内への挿入を意図した医用デバイスであって、前記医用デバイスが、組織接触表面を有する非生分解性基材を含み、前記組織接触表面がＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルによって少なくとも部分的に被覆されている、医用デバイス。
【請求項２】
前記ＶＩ型コラーゲンが未変性のミクロフィブリルとして存在する、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項３】
前記未変性のミクロフィブリルが、保存されたＮ−およびＣ−末端の球状ドメインを含む、請求項２に記載の医用デバイス。
【請求項４】
前記非生分解性基材が、金属、セラミックまたはプラスチック材料から選択される生体適合性材料を含む、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項５】
前記非生分解性基材が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルトおよびイリジウム、ならびにそれらの合金からなる群から選択される金属材料を含む、請求項４に記載の医用デバイス。
【請求項６】
前記非生分解性基材がセラミック材料を含む、請求項４に記載の医用デバイス。
【請求項７】
前記医用デバイスが、耐荷重性インプラントである、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項８】
前記医用デバイスが歯科インプラントまたはその部品である、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項９】
前記歯科インプラントまたはその部品が、歯科固定具、歯科支台およびワンピース歯科インプラントから選択される、請求項８に記載の医用デバイス。
【請求項１０】
前記医用デバイスが骨に固定された聴覚デバイスである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医用デバイス。
【請求項１１】
前記医用デバイスがステントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医用デバイス。
【請求項１２】
前記医用デバイスがシャントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医用デバイス。
【請求項１３】
前記医用デバイスが整形外科インプラントである、請求項１から７のいずれか一項に記載の医用デバイス。
【請求項１４】
前記表面が１ｎｍ〜５０ｎｍ、たとえば５ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の層厚を有するＶＩ型コラーゲンの層で被覆された、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項１５】
前記ＶＩ型コラーゲンがリンカー分子を介して前記表面に結合している、請求項１に記載の医用デバイス。
【請求項１６】
医用デバイスの表面を被覆する方法であって、
（ｉ）組織接触表面を有する非生分解性基材を準備すること、
（ｉｉ）任意に、リンカー分子を前記組織接触表面に結合させること、および
（ｉｉｉ）前記組織接触表面の少なくとも一部を、ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを含む溶液と接触させて、前記ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを前記表面および／または前記リンカー分子に結合させること
を含む方法。
【請求項１７】
工程ｉｉ）が、
（ｉｉ−ａ）前記リンカー分子および溶媒を含む溶液を物品の表面に適用すること、および
（ｉｉ−ｂ）前記溶媒を除去すること
によって実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記リンカー分子がポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｉｉｉ）が、
（ｉｉｉ−ａ）ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルおよび溶媒を含む溶液を前記表面に適用すること、
（ｉｉｉ−ｂ）前記表面に前記溶液を適用させた前記基材をインキュベートすること、および
（ｉｉｉ−ｃ）前記溶媒を除去すること
によって実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを含む前記溶液が、１０ｎＭ〜１０μＭの範囲のコラーゲンフィブリル濃度を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＶＩ型コラーゲンが未変性のミクロフィブリルとして存在する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生体内への挿入を意図した非生分解性医用デバイスであって、ＶＩ型コラーゲンによって被覆された組織接触表面を含む医用デバイスに関する。本発明はまた、そのようなデバイスを製造する方法に関する。
【背景】
【０００２】
埋込み型医用デバイスは、患者の体内において多くの疾患および病状の処置、治療または治癒のために用いられ得る。埋込み型医用デバイスは、体の部分を置きかえるため（たとえば歯科および整形外科インプラント、眼内レンズ）に用いられ、または内部組織もしくは臓器の構造を補正し、または修復するため（たとえば血管ステント）に用いられる。埋込み型医用デバイスはまた、薬剤送達ビヒクルとしても用いられ得る。
【０００３】
たとえば、歯科インプラントシステムは、損傷を受けた、または喪失した自然の歯を置きかえるために広く用いられている。そのようなインプラントシステムにおいては、自然の歯根を置きかえるために、通常チタンまたはチタン合金から作られた歯科固定具（スクリュー）が患者の顎骨に固定される。次いで、骨組織から歯肉軟組織を通して患者の口内に突出する人工歯の部分にコアを構築するために支台構造が固定具に結合される。前記支台の上に補綴物またはクラウンが最後に設置され得る。
【０００４】
生体組織と接触することを意図したいかなる型の医用デバイスにおいても、生体適合性は重要な課題である。さもなければ患者の健康を損ない、および／またはデバイスの故障を引き起こすかも知れない、局所的ならびに全身的な副作用を避けるために、多くの中でもとりわけ異物反応、凝血形成および感染のリスクに対処し、これらを最小化しなければならない。このことは特に恒久的インプラントの場合に当てはまる。さらに、インプラントおよびその長期機能性を確実にするためには、インプラントの周囲の組織の治癒または再生が重要である場合が多い。これは耐荷重性インプラント、たとえば歯科または整形外科インプラントにおいて特に重要である。
【０００５】
歯科固定具においては、骨組織とインプラントとの間に強い接着が必要である。軟組織との接触を意図したインプラント、たとえば歯肉軟組織の中に部分的に位置することになる支台においては、軟組織との適合性もインプラントの全体としての機能性のために重要である。典型的には、歯科インプラントシステムの埋め込みの後、支台は歯肉組織によって部分的にまたは完全に取り囲まれる。医学的および審美的な理由の両方により、歯肉組織はインプラントの周囲で迅速かつしっかりと治癒することが望ましい。口腔粘膜と歯科インプラントとの間の緊密なシールは、口腔の微生物環境に対するバリアとして働き、インプラントの成功のために重要である。これは口腔衛生が悪く、および／または骨もしくは粘膜の質が適切でない患者には、特に重要である。治癒が悪い、または軟組織とインプラントとの間の接着が悪いと、感染およびインプラント周囲炎のリスクが高くなり、これにより究極的には骨の再吸収およびインプラントの失敗が引き起こされることがある。
【０００６】
医用デバイスの埋め込みを成功させる可能性を高めるために、たとえば新組織形成の速度を高めること、および／または組織とインプラントの結合が望ましい場合にインプラント表面への組織の接着の速度を高めること、または感染のリスクを低減させることなどの、いくつかの戦略がある。新組織形成の促進は、たとえば種々の表面改質および／または表面上への生物活性剤の沈着によって達成できる。歯科インプラントに関連する感染のリスクは、今日では予防的手段、たとえば口腔衛生を良好に保つことによって、主に対処されている。歯科インプラントの表面にいったんバイオフィルムが形成されると、抗菌剤を適用することによってこれを除去することは困難である。歯科インプラントの周囲の骨または軟組織における感染（インプラント周囲炎）の場合には、時には抗生物質、防腐剤、および／または超音波もしくはレーザー治療と組み合わせられる機械的デブリードマンが基本的な要素である。
【０００７】
埋め込まれた医用デバイスの部位における感染を予防するためのより良い方法に対する、当技術分野におけるニーズがある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、この問題を少なくとも部分的に克服すること、および生体組織と医用デバイスの接触に際して感染のリスクを低減する表面を有する医用デバイス、たとえばインプラントを提供することである。
【０００９】
本発明の第１の側面によれば、このおよびその他の目的は、生体内への挿入を意図した医用デバイスであって、医用デバイスが、組織接触表面を有する非生分解性基材を含み、組織接触表面がＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルによって少なくとも部分的に被覆されている、医用デバイスによって達成される。
【００１０】
コラーゲンは、多くの組織および臓器の細胞外マトリックスの主成分を形成するタンパク質である。種々の組織において少なくとも２８種の異なった型のコラーゲンが発見されている。コラーゲンＶＩ型（「ＶＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩ、ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＶＩまたはｔｙｐｅ  ＶＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）」とも表される）は、哺乳類の細胞外マトリックスに遍在する成分である。ここで用いる「ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリル」または「ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリル」は、末端−末端で凝集したＶＩ型コラーゲン分子のテトラマーから形成されたフィラメント構造を指す。そのようなミクロフィブリルは、１〜５０ｎｍ、たとえば５〜２０ｎｍの範囲の幅および０．１〜１０μｍ、たとえば０．５〜５μｍの範囲の長さを有し得る。
【００１１】
本発明者らは、ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルで被覆された生体材料が好気性および嫌気性のヒト病原菌に対する抗微生物特性を提供することを見出した。注目すべきことに、抗微生物効果は表面上に存在するＶＩ型コラーゲンによって発現し、おそらく表面からのＶＩ型コラーゲンの顕著な放出は何ら関与していないようであった。したがって、表面の抗微生物性は、抗微生物物質を放出するデバイスに比べて減衰しにくいことがある。実験結果より、表面の抗微生物効果は長期間にわたって保持され得ることが示唆される。したがって本発明の態様による医用デバイスは、インプラントまたは医用デバイスを手術によって患者に埋め込んだ後、より良い感染防止を提供する。
【００１２】
さらに、ＶＩ型コラーゲンの抗微生物特性と生来の免疫系、特に好中球との間の相乗効果が見出された。これは驚くべきことであった。多形核好中球（ＰＭＮ）の主要な生物学的機能は細菌を貪食し、破壊し、処分することであるので、ＰＭＮの動員によって既に死滅した細菌を除去することがせいぜい期待されていた。その代り、ＰＭＮが刺激されて好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を産生して細菌を表面に閉じ込め、それにより細菌がさらに広がることが阻止され、またＶＩ型コラーゲンによって迅速に殺滅されることが、思いがけなく見出された。さらに、ＶＩ型コラーゲンによる殺菌は、驚くべきことにＰＭＮおよびこれから放出されるプロテアーゼの存在によって増強される。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、このＰＭＮ刺激効果は、少なくとも部分的に、そのままのＮ−およびＣ−末端ドメインを含むＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリル構造によるものであり、創傷の自然の生物学的環境を模倣していると考えられ、未知の免疫および炎症プロセスからも恩恵を受けていると考えられる。
【００１３】
したがって、好中球がＶＩ型コラーゲンで被覆された医用デバイスと接触する状況、たとえば手術中またはインプラントもしくは医用デバイスの部位で出血および／または炎症を引き起こす何らかの処置中において、本発明の医用デバイスを用いることによって抗菌効果がさらに増強されることになる。
【００１４】
典型的には、ＶＩ型コラーゲンはＮ−およびＣ−末端の球状ドメインが保存された未変性の（native）ミクロフィブリルとして存在し得る。
【００１５】
本発明の態様において、非生分解性基材は、金属、セラミックまたはプラスチック材料から選択される生体適合性材料を含む。たとえば、非生分解性基材は、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルトおよびイリジウム、ならびにそれらの合金からなる群から選択される金属材料を含む。他の態様において、基材はセラミック材料、たとえばジルコニアを含んでもよい。
【００１６】
本発明の態様において、医用デバイスは硬組織、たとえば骨、および／または軟組織への埋め込みを意図した手術用インプラントであってもよい。
【００１７】
本発明の態様において、医用デバイスは耐荷重性インプラントであってもよい。
【００１８】
たとえば、医用デバイスは歯科固定具等の歯科インプラントまたはその部品、たとえば歯科固定具、歯科支台またはワンピース歯科インプラントであってもよい。他の場合において、医用デバイスは骨に固定された聴覚デバイスであってもよい。あるいは、医用デバイスは整形外科インプラントであってもよい。
【００１９】
本発明の態様において、医用デバイスはステントまたはシャントであってもよい。
【００２０】
本発明の態様において、医用デバイスの組織接触表面はＶＩ型コラーゲンの層で被覆され得る。任意に、リンカー分子を介してＶＩ型コラーゲンを表面に結合させてもよい。ＶＩ型コラーゲンの層は１ｎｍ〜５０ｎｍ、たとえば５ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の層厚を有し得る。層は不連続でも、即ち下の表面を完全に覆わなくてもよい。
【００２１】
別の側面において、本発明は医用デバイスの表面を被覆する方法であって、
（ｉ）組織接触表面を有する非生分解性基材を準備すること、
（ｉｉ）任意に、リンカー分子を前記組織接触表面に結合させること、および
（ｉｉｉ）前記組織接触表面の少なくとも一部を、ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを含む溶液と接触させて、前記ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを前記表面および／または前記リンカー分子に結合させること
を含む方法を提供する。
【００２２】
リンカー分子はポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を含んでもよい。
【００２３】
本発明の態様において、工程ｉｉ）は、
（ｉｉ−ａ）リンカー分子および溶媒を含む溶液を物品の表面に適用すること、および
（ｉｉ−ｂ）前記溶媒を除去すること
によって実施され得る。
【００２４】
あるいは、またはさらに、工程ｉｉｉ）は、
（ｉｉｉ−ａ）ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルおよび溶媒を含む溶液を前記表面に適用すること、
（ｉｉｉ−ｂ）前記表面に前記溶液を適用させた基材をインキュベートすること、および
（ｉｉｉ−ｃ）前記溶媒を除去すること
によって実施され得る。
工程ｉｉｉ−ｂ）は、物品を４〜４０℃の範囲の温度に少なくとも１０分間、保持することによって実施され得る。
【００２５】
本発明の態様において、ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを含む溶液は、１０ｎＭ（１５０ｎｍ／ｍｌ）〜１０μＭ（１５０μｇ／ｍｌ）、たとえば０．５〜５μＭ、たとえば１〜２μＭの範囲のコラーゲンフィブリル濃度を有し得る。
【００２６】
また本発明の第２の側面を形成する方法において、ＶＩ型コラーゲンは好ましくは未変性のミクロフィブリルとして存在し得る。
【００２７】
本発明は、特許請求の範囲に記載した特徴のあり得る組み合わせの全てに関連することに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓとともにそれぞれ０時間（左列）、２４時間（中央列）および４８時間（右列）インキュベートした種々の表面の走査電子顕微鏡写真を示す。表面は以下の通りであった。チタン表面（Ｔｉ、最上行）、ＩＶ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ｃＶＩ、上から２行目）、ポリ−Ｌ−リジン、ＰＬＬで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ、上から３行目）ならびにポリ−Ｌ−リジンおよびＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ、最下行）。スケールバーは１０μｍを表す（全ての画像において同一スケール）。
【図２】図２はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉとともにそれぞれ０時間（左列）、２４時間（中央列）および４８時間（右列）インキュベートした種々の表面の走査電子顕微鏡写真を示す。表面は以下の通りであった。チタン表面（Ｔｉ、最上行）、ＩＶ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ｃＶＩ、上から２行目）、ポリ−Ｌ−リジン、ＰＬＬで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ、上から３行目）ならびにポリ−Ｌ−リジンおよびＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ、最下行）。スケールバーは１０μｍを表す（全ての画像において同一スケール）。
【図３】図３はＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍとともにそれぞれ０時間（左列）、２４時間（中央列）および４８時間（右列）インキュベートした種々の表面の走査電子顕微鏡写真を示す。表面は以下の通りであった。チタン表面（Ｔｉ、最上行）、ＩＶ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ｃＶＩ、上から２行目）、ポリ−Ｌ−リジン、ＰＬＬで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ、上から３行目）ならびにポリ−Ｌ−リジンおよびＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ、最下行）。スケールバーは１０μｍを表す（全ての画像において同一スケール）。
【図４】図４はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａとともにそれぞれ０時間（左列）、２４時間（中央列）および４８時間（右列）インキュベートした種々の表面の走査電子顕微鏡写真を示す。表面は以下の通りであった。チタン表面（Ｔｉ、最上行）、ＩＶ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ｃＶＩ、上から２行目）、ポリ−Ｌ−リジン、ＰＬＬで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ、上から３行目）ならびにポリ−Ｌ−リジンおよびＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ、最下行）。スケールバーは１０μｍを表す（全ての画像において同一スケール）。
【図５】図５はそれぞれＳ．ｍｉｔｉｓ（左列）、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（左から２列目）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ （右から２列目）およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（右列）と４８時間インキュベートした後の、それぞれＴｉ／ＰＬＬ（上行）およびＴｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ（下行）の表面の走査電子顕微鏡写真を示す。見られるように、ＶＩ型コラーゲンの存在下（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ）では殺菌が白色矢印で示す細胞膜の崩壊および細胞質の浸出として目視可能である。スケールバーは２μｍを表す（全ての画像において同一スケール）。
【図６】図６は、それぞれＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（「ＶＩ型コラーゲン」と記載、上行）およびＴｉ表面（「対照」、下行）の上でインキュベートしたＳ．ｍｉｔｉｓの走査電子顕微鏡写真を示す。新鮮な細菌の０．１％溶液を表面に毎日添加した。ＶＩ型コラーゲンの存在下で細菌の増殖は有意に阻害された。スケールバーは１０μｍを表す。
【図７】図７は、それぞれＶＩ型コラーゲンで被覆したＴｉ表面（「ＶＩ型コラーゲン」と記載、上行）およびＴｉ表面（「対照」、下行）の上でインキュベートしたＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの走査電子顕微鏡写真を示す。新鮮な細菌の０．１％溶液を表面に毎日添加した。ＶＩ型コラーゲンの存在下で細菌の増殖は有意に阻害された。スケールバーは１０μｍを表す。
【図８】図８は、セラミック歯科支台（上行）およびチタンスクリュー（下行）の上で多形核好中球（ＰＭＮ）によって産生される好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）における細菌（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）のトラップの走査電子顕微鏡写真を示す。ＳＥＭ画像は拡大倍率を増大させて（スケールバーは１ｍｍ、１００μｍ、２０μｍおよび５μｍを示す）、ＰＭＮによって放出されたＮＥＴに細菌がどのようにトラップされるかを示す。
【図９】図９は、ＶＩ型コラーゲンで被覆されたＴｉ表面（Ｔｉ／ＰＬＬ／ｃＶＩ）上におけるＰＭＮ  ＮＥＴによるトラップを示す走査電子顕微鏡写真を表す。ＰＭＮはＮＥＴを放出し、それに細菌が付着してトラップされる（白色矢印で示す）。スケールバーは５μｍを表す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｓ．ｍｉｔｉｓとそれぞれ０分（上行）および１２０分（下行）インキュベートした、ＰＬＬをリンカーとして用いてＶＩ型コラーゲンで被覆した（ｃＶＩ、右列））、もしくは被覆していない（対照、左列））チタンスクリュー（図１０Ａ）の表面におけるＰＭＮ  ＮＥＴによる細菌のトラップおよび殺滅の走査電子顕微鏡写真を示す。膜の気泡形成（白色矢印で示される）によって証明されるように、ＶＩ型コラーゲンの存在下で細菌の構造的一体性は急速に損なわれる。ＶＩ型コラーゲンによるコーティングがない場合には、細菌はＮＥＴにトラップされたままであるが、殺滅されない。スケールバーは２μｍを表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｓ．ｍｉｔｉｓとそれぞれ０分（上行）および１２０分（下行）インキュベートした、ＰＬＬをリンカーとして用いてＶＩ型コラーゲンで被覆した（ｃＶＩ、右列））、もしくは被覆していない（対照、左列））セラミック支台（図１０Ｂ）の表面におけるＰＭＮ  ＮＥＴによる細菌のトラップおよび殺滅の走査電子顕微鏡写真を示す。膜の気泡形成（白色矢印で示される）によって証明されるように、ＶＩ型コラーゲンの存在下で細菌の構造的一体性は急速に損なわれる。ＶＩ型コラーゲンによるコーティングがない場合には、細菌はＮＥＴにトラップされたままであるが、殺滅されない。スケールバーは２μｍを表す。
【図１１】図１１はポリペプチド鎖、ＶＩ型コラーゲンモノマー、および未変性のＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルを含むＶＩ型コラーゲンの種々の構造を模式的に表す。
【詳細な説明】
【００２９】
本発明者らは、ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリル、特に未変性のミクロフィブリルによって少なくとも部分的に被覆された組織接触表面を有する医用デバイスが、顕著な抗菌効果を提供することを見出した。これは特に埋込み型医用デバイスについて、極めて望ましいことである。さらに、ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルによって被覆された表面が、期待以上の免疫刺激効果を示すことが見出された。
【００３０】
ここで用いる「ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリル」または「ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリル」は、末端−末端で凝集したＶＩ型コラーゲン分子のテトラマーから形成されたフィラメント構造を指す。本発明は好ましくは未変性のミクロフィブリルを用いる。これは、ミクロフィブリル構造が生体組織中に発見されるＶＩ型コラーゲンの未変性形に対応することを意味する。対照的に、非未変性のミクロフィブリルは、たとえばＮ−および／またはＣ−末端の球状ドメインにおいて、部分的に分解することがある。未変性のミクロフィブリルは、Ｓｐｉｓｓｉｎｇｅｒ  Ｔ，  Ｅｎｇｅｌ  Ｊ，  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  １９９５；  １４：４９９−５０５に記載された方法により、ウシ角膜コラゲナーゼを用いて組織試料から分離することができる。有利なことに、この方法によって球状ドメインが保存される。対照的に、たとえばペプシンを用いる方法では球状ドメイン中のミクロフィブリルが開裂し、それにより部分的に分解した、非未変性のＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルが生じる。
【００３１】
指令２００７／４７／ｅｃは、医用デバイスを、「製造者によって具体的に診断および／または治療目的に使用することが意図され、その適切な応用に必要なソフトウェアを含め、製造者によって人における使用が意図されているあらゆる器械、装置、器具、ソフトウェア、材料、またはその他の物品であって、単独で、または組み合わせで使用されるもの」と定義している。本発明の場合には、生体組織と接触することを意図した医用デバイス、即ち身体、身体の部分または臓器に適用され、挿入され、埋め込まれ、またはその他の方法で接触させることを意図したあらゆる器械、装置、器具、材料またはその他の物性の物品のみを考慮する。さらに、前記身体、身体の部分または臓器は、ヒトまたは動物、典型的には哺乳類の対象であり得る。しかし好ましくは医用デバイスはヒト対象者を意図している。上記定義に含まれる医用デバイスは、たとえばインプラント、カテーテル、シャント、チューブ、ステント、子宮内デバイス、および補綴物である。
【００３２】
特に、医用デバイスは生体組織への埋め込みまたは体腔への挿入を含む対象者の身体もしくは身体の部分への挿入を意図した医用デバイスであり得る。
【００３３】
本発明の医用デバイスは生体組織との短期間の、延長された、または長期間の接触を意図し得る。医用デバイスの生物学的評価のためのＩＳＯ  １０９９３−１に記載された定義によれば、「短期間」は２４時間未満の期間を意味する。さらに、同じ基準によれば「延長された」は２４時間から３０日までの期間を指す。したがって、同じ基準によれば「長期間」は３０日を超える期間を意味する。即ち、いくつかの態様においては、本発明の医用デバイスは対象者の体内において数か月、数年、または一生にもわたって残存することを意図した恒久的インプラントであり得る。
【００３４】
ここで用いる用語「インプラント」は、少なくともその一部を脊椎動物、特に哺乳類、たとえばヒトの体内に埋め込むことを意図したあらゆるデバイスをその範囲内に含む。インプラントは、生体構造を置きかえるため、および／または身体の任意の機能を修復するために用いられる。一般に、インプラントは１つまたはいくつかのインプラント部品からなっている。たとえば、歯科インプラントは通常、二次的なインプラント部品、たとえば支台および／または修復歯と結合した歯科固定具を含む。しかし、他の部品がそれに連結される場合であっても、埋め込みを意図した任意のデバイス、たとえば歯科固定具が単独でインプラントと称されることもある。
【００３５】
「生体適合性」は、生体組織との接触の際にそれ自体で組織に対して不都合な生物学的反応（たとえば炎症またはその他の免疫反応）を惹起しない材料を意味する。
【００３６】
「軟組織」は、骨または軟骨ではない任意の組織型、特に哺乳類の組織型を意味する。医用デバイスが適する軟組織の例としては、これだけに限らないが、結合組織、線維組織、上皮組織、血管組織、筋肉組織、粘膜、歯肉、および皮膚が挙げられる。
【００３７】
コラーゲンは、多くの組織および臓器の細胞外マトリックスの主成分を形成するタンパク質である。種々の組織において少なくとも２８種の異なった型のコラーゲンが発見されている。コラーゲンＩ型（Ｉ型コラーゲン）は骨および結合組織において最も多い形態である。コラーゲンＩＩ型は軟骨に多い。ＩＩＩ型コラーゲンは血管壁の主成分であるが、軟骨にも存在する。コラーゲンＩＶ型は基底膜の成分である。個々のコラーゲン分子は３つのポリペプチド鎖（プロα鎖とも称される）からなっており、それぞれがαへリックスを形成し、緊密に絡み合って三重へリックス構造となっている。異なった型のコラーゲンはポリペプチド鎖のアミノ酸配列、ならびに二次構造および／または三次構造に関しても異なっている。
【００３８】
コラーゲンＶＩ型（「ＶＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩ、ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＶＩまたはｔｙｐｅ  ＶＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）」とも表される）は、哺乳類の細胞外マトリックスに遍在する成分である。これは結合組織に存在し、基底膜と会合していることが多い。図１１に示すように、α１、α２、およびα３ポリペプチド鎖がヘテロトリマー形成で会合してＶＩ型コラーゲンモノマー１０を形成する。ある場合にはα３鎖が追加的な組織特異的鎖によって置きかえられることがある。４つのモノマーが側部の会合によって整列してテトラマーとなり、複数のテトラマーが末端−末端で凝集して、細い、ビーズを有するフィラメント形状のミクロフィブリル２０を形成する。そのようなミクロフィブリルは、未変性のミクロフィブリルとも称され、典型的には０．５〜５μｍの範囲の長さおよび約１０〜１５ｎｍの幅を有する。
【００３９】
興味深いことに、その生物学的環境において未変性のコラーゲンミクロフィブリルは典型的には酵素分解に感受性がない。これはＶＩ型コラーゲンの生体力学的な組織安定剤としての生物学的役割によるものと考えられ、組織容量、血管新生および免疫細胞の侵入に重要である。
【００４０】
ＶＩ型コラーゲンのＮ−およびＣ−末端の球状ドメインはフォンウィレブランド因子Ａ型のドメインと相同性を共有しており（Ｓｐｅｃｋｓ  Ｕ，  Ｍａｙｅｒ  Ｕ，  Ｎｉｓｃｈｔ  Ｒ，  Ｓｐｉｓｓｉｎｇｅｒ  Ｔ，  Ｍａｎｎ  Ｋ，  Ｔｉｍｐｌ  Ｒ，  Ｅｎｇｅｌ  Ｊ，  Ｃｈｕ  ＭＬ，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９２；  １１：４２８１−４２９０）、溶液中のＶＩ型コラーゲンは、グラム陽性細菌であるＡ、ＣおよびＧストレプトコッカスに対する抗微生物活性を有することが示された（Ａｂｄｉｌｌａｈｉ  Ｓ．  Ｍ．，  Ｂａｌｖａｎｏｖｉｃ  Ｓ．，  Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ  Ｍ，  Ｍｏｅｒｇｅｌｉｎ  Ｍ．，  Ｊ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎ  ２０１２；  ４：３７１−３７６２）。本発明者らはここで、ＶＩ型コラーゲンがデバイスの表面に被覆された場合に細菌に対して有効であるだけでなく、生来の免疫調節効果をも有していることを示した。これは、治癒および組織再生に極めて有益であると思われる。感染の際には、細菌がＰＭＮ細胞を刺激して好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を分泌させ、これが細菌をトラップし、固定化する。最近の結果は、ＮＥＴにおける殺菌はＶＩ型コラーゲンで被覆した表面においてより顕著に有効であることを示している（図９、図１０Ａ−１０Ｂ）。さらに、ＶＩ型コラーゲンによる殺菌は、驚くべきことにＰＭＮおよびこれから放出されるプロテアーゼの存在によって増強される。これらを併せると、ＶＩ型コラーゲンは細菌のコロニー形成の発生を最小化することによって臨床的状況における創傷治癒のために有益であることが、結果から示唆される。
【００４１】
これらの考察および結果に鑑み、本発明者らは、生体内への挿入を意図した医用デバイスであって、医用デバイスが、組織接触表面を有する非生分解性基材を含み、前記組織接触表面がＶＩ型コラーゲンによって少なくとも部分的に被覆されている、医用デバイスを提案する。
【００４２】
本発明の態様による医用デバイスは、任意の好適な生体適合性材料、たとえば埋込み型デバイスに用いられる材料から作ることができる。典型的には、医用デバイスは組織接触表面を有する基材を含む。
【００４３】
「組織接触表面」は、生体組織との接触（短期間の、延長された、または長期間の）を意図した表面を意味する。
【００４４】
基材は、たとえばチタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルトおよびイリジウム、ならびにそれらの合金からなる群から選択される１つ以上の材料を含む生体適合性金属または金属合金から作られる。あるいは、医用デバイスの基材は、生体適合性セラミック、たとえばジルコニア、チタニア、形状記憶金属セラミックおよびそれらの組み合わせから作られる。医用デバイスが歯科支台として用いられ、またはその部品を形成する態様においては、基材は好ましくは金属材料から作られる。
【００４５】
酸素と接触すると、金属であるチタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、ニオブおよびそれらの合金は直ちに反応して不活性の酸化物を形成する。したがって、これらの材料の物品の表面は実質的に常に薄い酸化物層によって覆われている。チタン基材の自然の酸化物層は主として二酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ2）からなっており、少量のＴｉ2Ｏ3、ＴｉＯおよびＴｉ3Ｏ4を含む。
【００４６】
したがって、医用デバイスがチタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、ニオブまたはそれらのいずれかの合金の１つ以上を含む態様においては、医用デバイスは典型的には自然の金属酸化物表面層を有する。そのような自然の金属酸化物層は、次にＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルの層によって少なくとも部分的に覆うことができる。
【００４７】
本発明の他の態様において、医用デバイス、特に基材は、典型的にはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）ならびにそれらの任意の組み合わせおよびコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーから作られる。
【００４８】
本発明の態様において、医用デバイスは生体組織との短期間の、延長された、または長期間の接触が意図されている。たとえば、本発明の医用デバイスは、典型的には一時的または恒久的に身体の機能または構造を置きかえ、または修復することが意図されたインプラントであり得る。
【００４９】
典型的には、医用デバイスの表面の少なくとも一部は軟組織との接触が意図されており、この軟組織接触表面の少なくとも一部はＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルのコーティングを有している。たとえば、医用デバイスは、主としてまたはもっぱら、軟組織、たとえば歯科支台と接触することが意図されたインプラントであり得る。あるいは、医用デバイスは部分的に骨に、および部分的に軟組織に挿入されるインプラントであり得る。そのようなインプラントの例としては、ワンピース歯科インプラントおよび骨に固定された
聴覚デバイス（骨固定型補聴器とも称される）が挙げられる。インプラントの一部のみが軟組織と接触することが意図される場合には、ＶＩ型コラーゲンを含むコーティングは、少なくとも軟組織接触表面の一部に施されることが好ましい。
【００５０】
医用デバイスは、軟骨との接触にも適している。
【００５１】
他の態様において、医用デバイスは哺乳類、特にヒトの骨組織、たとえば顎骨、大腿骨または頭蓋骨との接触が意図され得る。そのような医用デバイスの例としては、歯科固定具および整形外科インプラントが挙げられる。
【００５２】
本発明の態様において、組織接触表面は粗面であり得る。基材の表面粗さ、したがって任意にはＶＩ型コラーゲンで被覆することによって形成される医用デバイスの表面も、少なくとも０．０５μｍ、典型的には少なくとも０．１μｍ、たとえば少なくとも０．２μｍの平均表面粗さＲaを有し得る。少なくとも０．２μｍの平均表面粗さ（Ｒa）を有する表面はバイオフィルム形成をより受けやすいと考えられるので、ここで述べるＶＩ型コラーゲンのコーティングは、少なくとも０．２μｍの表面粗さを有する医用デバイスに特に有利であり、さらにより大きな表面粗さを有する医用デバイスにおけるバイオフィルム形成を防止するための有用性は増大する。例として、チタン基材を含む歯科支台の表面粗さは約０．２〜０．３μｍであり得る。ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルのコーティング層はその下の表面粗さを保持し得る。
【００５３】
さらに、本発明の態様において、医用デバイスの組織接触表面は、少なくとも１つの追加的なバイオ分子を含み得る。
【００５４】
本発明の医用デバイスは、表面に直接、またはリンカー分子を介して、ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルで表面を被覆することによって製造することができる。リンカー分子を用いる態様においては、最初にリンカー分子が表面に結合され、続いてコラーゲンミクロフィブリルが前記リンカー分子に結合される。しかし、リンカー分子を用いない態様においては、たとえば表面を清浄化し、もしくは正味の電荷を与えて、ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルの結合を増強するために、任意に表面を化学的または物理的に処理してもよい。たとえば、表面をその親水性を増大させる表面処理に供してもよい。
【００５５】
コラーゲンフィブリルを結合させた後、たとえばインプラントまたはその部品として使用する前に、医用デバイスを任意に穏和な滅菌処理に供してもよい。
【００５６】
本発明の態様によるＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルは、リンカー分子を使用する場合も使用しない場合も、表面に被覆した際、任意の配向を取ることができる。
【００５７】
たとえば、ＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルは、コラーゲンミクロフィブリルを含む溶液を表面に適用することによって、医用デバイスの表面に適用することができる。溶液は、少なくともＶＩ型コラーゲンで被覆される表面を覆う溶液の薄膜を残す任意の従来の手法によって表面に適用することができる。そのような方法としては、溶液を表面に噴霧すること、注ぐことおよび滴下すること、ならびに表面を溶液に浸漬することが挙げられる。
【００５８】
溶液は、１０ｎＭ〜１０μＭ、たとえば０．５〜５μＭ、たとえば１〜２μＭの範囲の濃度のＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルの水溶液であってもよい。
【００５９】
ＶＩ型コラーゲン溶液の薄膜を表面に適用した後、医用デバイスを少なくとも１０分間、典型的には少なくとも３０分間、たとえば約４５分間、また数時間まで、典型的には１時間までの間、インキュベートしてもよい。インキュベーションは４０℃以下、典型的には４〜４０℃の範囲の温度、たとえば室温（１５〜２５℃）で行ってもよい。医用デバイスは加湿室内でインキュベートしてもよい。湿潤雰囲気中デバイスをインキュベートすることは有利である。それは、これにより溶媒が表面からあまりに急速に蒸発しないことが保証されるからである。本発明の態様において用いられる加湿室は、典型的にはその中に部品が設置され、その中に無菌水の貯槽または無菌水を浸したティッシュも存在する、閉じた室を意味する。工業用の設備においては、加湿室は湿度７５〜１００％に制御された室であってもよい。しかし、加湿室は必要ではなく、適用した溶液の早すぎる乾燥は、周囲湿度においても避けられることに注意されたい。
【００６０】
インキュベーション（溶媒の蒸発）の後、典型的には表面をたとえば無菌水または適切な緩衝液によって洗浄して残存溶液を除去し、任意に、好適な滅菌処理、たとえばＵＶもしくはγ線照射、またはエチレンオキシドガスを用いる化学滅菌に供してもよい。
【００６１】
リンカー分子を用いる本発明の態様において、リンカーは典型的にはＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルを適用する前に表面に結合される。リンカーは、たとえば静電的相互作用、疎水的相互作用、または共有結合等の任意の好適な手段によって表面に結合され得る。特に、リンカー分子は静電的相互作用を介して表面に結合され得る。たとえば、負電荷を有する表面、たとえばチタン製物品の酸化チタン表面の上に、正電荷を有するリンカー分子、たとえばポリ−Ｌ−リジンを結合させることができる。必要であれば、電荷を得るために既知の方法で表面を処理または改質してもよい。
【００６２】
リンカー分子の溶液を表面に適用することによってリンカー分子を表面に結合させ、好ましくはそれにより表面を前記溶液で完全に覆うことができる。典型的には、表面を前もってたとえばエタノールで洗浄し、次いで乾燥する。リンカー分子の溶液は、任意の従来の手法、たとえば溶液を表面に噴霧すること、注ぐこともしくは滴下すること、または表面を溶液に浸漬することによって適用することができる。
【００６３】
ポリ−Ｌ−リジンの場合には、表面に適用される溶液は０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であってもよく、典型的には約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＰＬＬの溶液であってもよい。
【００６４】
医用デバイスの表面にリンカー溶液を適用した後、溶媒を除去し、表面に結合したリンカー分子を残す。たとえば、医用デバイスを高温、たとえば４０〜６０℃の範囲、典型的には約６０℃で処理することによって、溶媒を蒸発させてもよい。溶媒を蒸発させるために必要な時間は、１０分〜２時間、典型的には３０分〜１時間の範囲である。
【００６５】
任意に、本発明の態様において、物品の表面にリンカー溶液を適用した後、医用デバイスを数分間、たとえば１〜１０分間、インキュベートし、引き続いて表面に既に結合したリンカー分子を除くリンカー溶液を濯ぎ水、たとえば無菌水で濯ぐことによって洗浄し、その後、物品を上記のように高温に供する。溶媒または濯ぎ剤を蒸発させた後、リンカー分子が結合した表面を任意にたとえば無菌水で洗浄し、乾燥させ、または乾燥するに任せる。
【００６６】
リンカー分子で被覆した表面に上述のようにしてコラーゲンフィブリルを含む溶液を適用することによって、コラーゲンミクロフィブリルをリンカー分子に結合させることができる。コラーゲンフィブリルを含む溶液は、少なくともコラーゲンフィブリルで被覆される表面を覆う溶液の薄膜を残す任意の従来の手法によって表面に適用することができる。そのような方法としては、溶液を表面に噴霧すること、注ぐことおよび滴下すること、ならびに表面を溶液に浸漬することが挙げられる。
【００６７】
コラーゲンフィブリルを含む溶液は、１０ｎＭ〜１０μＭ、たとえば０．５〜５μＭ、たとえば１〜２μＭの範囲の濃度のＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルの水溶液であってもよい。
【００６８】
コラーゲン溶液の薄膜を表面に適用した後、医用デバイスを少なくとも１０分間、典型的には少なくとも３０分間、たとえば約４５分間、また数時間まで、典型的には１時間までの間、インキュベートしてもよい。インキュベーションは４０℃以下、典型的には４〜４０℃の範囲の温度、たとえば室温（１５〜２５℃）で行ってもよい。医用デバイスは加湿室内でインキュベートしてもよい。湿潤雰囲気中デバイスをインキュベートすることは有利である。それは、これにより溶媒が表面からあまりに急速に蒸発しないことが保証されるからである。本発明の態様において用いられる加湿室は、典型的にはその中に部品が設置され、その中に無菌水の貯槽または無菌水を浸したティッシュも存在する、閉じた室を意味する。工業用の設備においては、加湿室は湿度７５〜１００％に制御された室であってもよい。しかし、加湿室は必要ではなく、適用した溶液の早すぎる乾燥は、周囲湿度においても避けられることに注意されたい。
【００６９】
インキュベーション（溶媒の蒸発）の後、典型的には表面をたとえば無菌水または適切な緩衝液によって洗浄して残存溶液を除去し、任意に、好適な滅菌処理、たとえばＵＶもしくはγ線照射、またはエチレンオキシドガスを用いる化学滅菌に供してもよい。
【００７０】
本発明の方法によって得られるコラーゲンフィブリルコーティングには、さらなる変更が可能であることが予測できる。たとえば、上記のように生物活性物質をコラーゲンフィブリルコーティングに適用することができる。さらに、またはあるいは、たとえば医用デバイスを埋め込んだ後のインビボにおけるフィブリルの分解速度を低減させるために、表面に結合させた後でコラーゲンフィブリルを架橋することができる。
【００７１】
実験
Ａ．材料および方法
１．細菌
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは、Ｊｕｌｉａ  ＤａｖｉｅｓおよびＧｕｎｎｅｌ  Ｓｖｅｎｓａｅｔｅｒ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，  Ｍａｌｍｏｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｍａｌｍｏｅ，  Ｓｗｅｄｅｎ）から恵与を受けた。Ｓ．ｍｉｔｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは、５％ＣＯ2を含む湿潤雰囲気中３７℃で、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中で一夜増殖させた。Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは、嫌気性条件下の湿潤雰囲気中３７℃で、ペプトン酵母グルコース（ＰＹＧ）培地中で増殖させた。
【００７２】
２．ＶＩ型コラーゲン
ＶＩ型コラーゲンはＡｂｄｉｌｌａｈｉら（２０１２）が記載したようにしてウシ角膜からコラゲナーゼ消化によって分離した。仔ウシの眼を近傍の屠畜場から入手した。角膜を細切し、コラゲナーゼで抽出し、続いてＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂによってゲル濾過した。
【００７３】
３．チタンのコーティング
箔から直径５ｍｍのチタン円環をパンチで切り出した。円環を最初にクロロホルムで、次いで蒸留水で洗浄する。風乾後、ポリ−Ｌ−リジン（０．２ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを所望のチタン片に適用した。次いで片を６０℃で２時間、インキュベートしなければならない。その後、チタンを再び蒸留水で洗浄し、風乾する。その間に、１２ウェルプレートのウェルにＶＩ型コラーゲン溶液１ｍＬを適用する。最後に所望のチタン円環をＶＩ型コラーゲン溶液に浸漬して４℃で一夜インキュベートする。翌朝、チタンを風乾し、分析を行った。
【００７４】
４．細菌の付着
付着分析のため、Ｓ．ｍｉｔｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは１０ｍＬのＴＨＢ中で一夜、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは嫌気性条件下、ＰＹＧ培地で増殖させ、翌日、４℃、３５００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。嫌気性菌種であるＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについては、嫌気箱の中で手順を実施した。次いでペレットを１０ｍＬのＰＢＳＴで希釈し、ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００は１に調整し、ＰＢＳＴで２倍に希釈しなければならない。細菌溶液５００μＬを、調製したチタン円環を入れた各ウェルに適用し、５％ＣＯ2、３７℃で０、３０および２４０分間、インキュベートした。
【００７５】
試料を５００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳを除き、０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム中の２．５％グルタルアルデヒドからなるＥＭ−ｆｉｘ５００μＬで置きかえた。試料をＥＭ−ｆｉｘ中で一夜インキュベートした。以下の工程は熟練した技師が行った。カコジル酸塩緩衝液を用いた洗浄工程を行い、次いで一連の脱水を行った。そのため試料を５０％、７０％および９５％のエタノールで５分間、２回、さらに純エタノールで３０分間および１時間、インキュベートした。試料を乾燥させるために、液体ＣＯ2を用いてエタノールをその臨界点に到達させて気体にした。この工程を１０分間、３回行った。その後、試料をマウントし、金／パラジウム２０ｎｍ寒天で被覆した。走査電子顕微鏡ＸＬ  ３０  ＦＥＧで試料を精査し、ＡｎａｌｙＳＩＳ  ＩＴＥＭソフトウェアで画像を処理した。
【００７６】
５．殺菌分析
５．１  ＦＡＣＳのためのＢａｃＬｉｇｈｔ
フローサイトメトリー分析によって単細胞の性質を決定することができる。本研究において細菌細胞を染色するためにＢａｃＬｉｇｈｔ染色を用いた。それにより、一集団中における生菌と死菌の量を区別することができる。
【００７７】
細菌を標準的条件下、ＴＨＢ中で一夜増殖させた。一夜経過した培養液１ｍＬを翌日、９ｍＬの新鮮なＴＨＢに移した。ＯＤ６００が０．４に達するまで、細菌を標準的条件下でインキュベートした。４℃、３５００ｒｐｍ、１０分間で細菌をペレット化した。上清を廃棄し、冷却した１０ｍＬのＴＧ緩衝液でペレットを希釈した。ＯＤを測定し、細菌溶液を２度目にペレット化した。上清を廃棄した後、冷却したＴＧ緩衝液で細菌量を１％に調整した。溶液をＴＧで１０倍に希釈し、溶液２０μＬを１．５ｍＬの反応チューブに移した。ＶＩ型コラーゲン８０、１６０、２００または５００μＬを１．５ｍＬの反応チューブに適用した。陰性対照として８０μＬのＴＧ緩衝液を加えた。陽性対照として３００μＬのＬＬ−３７を加えた。試料を０、２、２４および４８時間インキュベートし、１００倍に希釈した５μＬのＰＩおよびＳＴＹＯ９で染色した。ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いて試料を測定した。
【００７８】
５．２  走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＳＥＭを用いて、被覆されたチタン表面への細菌の付着を精査することができる。
【００７９】
ＳＥＭのため、細菌をＯＤ６００が１になるまで一夜増殖させた。Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは嫌気性条件下、ＰＹＧ培地で増殖させ、一方Ｓ．ｍｉｔｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉはＴＨＢ中で増殖させた。嫌気性菌種は嫌気箱の中で処理した。培養液をペレット化し、１０ｍＬのＰＢＳＴで希釈した。ＯＤ６００を１に調整した後、細菌懸濁液をＰＢＳＴで２倍に希釈した。この懸濁液５００μＬを、被覆されたチタン円環を入れた２４ウェルプレートの各ウェルに適用した。細菌を３７℃で２時間インキュベートしてチタン表面に付着させた。この後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、５００μＬのＴＨＢを加えて細菌を増殖させた。細菌を３７℃で０分、４、２４および４８時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを５００μＬのＰＢＳで３回洗浄し、０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム中の２．５％グルタルアルデヒドからなるＥＭ−ｆｉｘで細菌を固定した。試料をＥＭ−ｆｉｘと一夜インキュベートした。以下の工程は熟練した技師が行った。カコジル酸塩緩衝液を用いた洗浄工程を行い、次いで一連の脱水を行った。そのため試料を５０％、７０％および９５％のエタノールで５分間、２回、さらに純エタノールで３０分間および１時間、インキュベートした。試料を乾燥させるために、液体ＣＯ2を用いてエタノールをその臨界点に到達させて気体にした。この工程を１０分間、３回行った。その後、試料をマウントし、金／パラジウム２０ｎｍ寒天で被覆した。走査電子顕微鏡ＸＬ  ３０  ＦＥＧで試料を精査し、ＡｎａｌｙＳＩＳ  ＩＴＥＭソフトウェアで画像を処理した。
【００８０】
６．ＶＩ型コラーゲンの長期活性
チタン表面上でＶＩ型コラーゲンがどの程度長期に活性であるかを検討するため、実験装置に毎日、新たな細菌を適用した。
【００８１】
実験のため、通常通りチタンを被覆した。細菌を標準的条件下、ＴＨＢ中で一夜増殖させた。翌朝、一夜経過した培養液１ｍＬを９ｍＬの新鮮なＴＨＢに移し、細菌溶液のＯＤ６００が０．４に達するまでインキュベートした。４℃、３５００ｒｐｍ、１０分間で細菌をペレット化した。冷却した１０ｍＬのＴＧ緩衝液でペレットを再懸濁し、ＯＤを測定した。細菌を再度ペレット化し、細菌量を１％に調整した。次いでこの溶液を１０倍（０．１％溶液）に希釈した。細菌溶液５００μＬを、チタン薄片を入れた各ウェルに適用し、０分、４時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間インキュベートした。次いで試料をＥＭ−ｆｉｘで固定し、電子顕微鏡観察のために調製した。細菌溶液は毎日、新鮮な０．１％溶液で置きかえた。
【００８２】
７．ＶＩ型コラーゲンに対するγ線照射の効果
歯科インプラントをγ線照射で工業的に滅菌する。照射がＶＩ型コラーゲンに影響するかを検討するため、長期研究を行った。通常通りチタンを被覆し、γ線照射で処理した。
【００８３】
８．口腔内細菌による好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の活性化
生来の免疫系が歯科インプラント上で増殖する口腔内細菌とどのように反応するかを精査するため、チタンスクリューおよび支台をＰＬＬまたはｐＬＬ／ｃＶＩのいずれかで被覆し、Ｓ．ｍｉｔｉｓまたはＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉとインキュベートした。
【００８４】
８．１  歯科インプラントのコーティング
スクリューおよび支台を最初にクロロホルム、続いて脱イオン水で洗浄し、２４ウェルプレートに適用した。インプラントが覆われるまで、５００μＬのポリ−Ｌ−リジンを加えた。ｐＬＬが乾燥するまでインプラントを６０℃でインキュベートした。次いでインプラントを脱イオン水で洗浄して未結合のｐＬＬを除いた。ＶＩ型コラーゲンで被覆されたスクリューおよび支台を１．５ｍＬの反応チューブに適用した。インプラントが完全に覆われるまでＶＩ型コラーゲンを加え、次いで４℃で一夜インキュベートした。翌日、ＶＩ型コラーゲンを除き、インプラントを風乾した。
【００８５】
８．２  細菌の調製
細菌を標準的条件下、ＴＨＢ中で一夜増殖させた。翌日、細菌溶液１ｍＬを９ｍＬの新鮮なＴＨＢに加えた。ＯＤ６００が０．４に達するまで、細菌を増殖させた。次いで４℃、３５００ｒｐｍ、１０分間で細菌をペレット化した。上清を廃棄し、冷却した１０ｍＬのＴＧ緩衝液でペレットを希釈した。ＯＤを測定し、細菌溶液を２度目にペレット化した。上清を廃棄した後、冷却したＴＧ緩衝液で細菌量を１％に調整した。好中球を分離するまで、細菌を氷上に保存した。
【００８６】
８．３  好中球の分離
好中球を分離するため、２０ｍＬのｐｏｌｙｍｏｒｐｈ−ｐｒｅｐ（商標）を５０ｍＬのファルコンチューブにピペットで入れた。健常供血者の血液をヘパリン入りの６ｍＬのチューブに採集し、室温で３０分間インキュベートした。分画を混合することなく、２０ｍＬの血液の上にｐｏｌｙｍｏｒｐｈ−ｐｒｅｐの層を重ねた。種々の血液成分を分離するため、ファルコンチューブを５００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心の後、種々の層が見られた。好中球層を取り出し、新しいファルコンチューブに移した。次いで好中球を２倍量の１×ＰＢＳで洗浄し、５００×ｇ、２０℃で１０分間遠心した。次いで混在する赤血球を２．７ｍＬの無菌ミリポア水で１０秒間、溶解させた。３００μＬの１０×ＰＢＳで反応を停止させた。体積を１５ｍＬに調整し、試料を２５０×ｇ、２０℃で５分間遠心した。全ての赤血球が溶解するまで、この工程を繰り返さなければならない。ペレットを５００ｍＬのナトリウム培地（５．６ｍＭのグルコース、１２７ｍＭのＮａＣｌ、１０．８ｍＭのＫＣｌ、２．４ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１．６ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、および１．８ｍＭのＣａＣｌ2を含み、ＮａＯＨでｐＨを７．３に調整した）で希釈し、Ｌｕｎａ（商標）自動細胞計数器を用いて細胞を計数した。試料あたりの細胞の量を計算し、対応する体積の好中球懸濁液を、スクリュー、支台および細菌溶液を含む１．５ｍＬの反応チューブごとに加えた。試料を０、３０、６０および１２０分間インキュベートし、１ｍＬのＥＭ−ｆｉｘ（０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム中の２．５％グルタルアルデヒド）に移した。ＳＥＭのための調製は熟練した技師が行った。
【００８７】
９．統計解析
ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０を用いてデータを解析した。実験は少なくとも２回、独立に行った。クリスタルバイオレットを用いる殺菌分析は３重試験、蛍光顕微鏡によるＢａｃＬｉｇｈｔ生菌計数は２重試験を行った。クリスタルバイオレットを用いる殺菌分析および蛍光顕微鏡によるＢａｃＬｉｇｈｔのデータについて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。被覆していないウェルでインキュベートした細菌から得られたデータを陽性対照とした。有意差はｐ＜０．０００１について＊＊＊＊と表す。
【００８８】
Ｂ．結果
１．細菌の付着
付着の程度を試験するため、被覆したチタン表面上で細菌をインキュベートし、走査電子顕微鏡で解析した。４時間のインキュベーションの後、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの両方の検出できる細菌量がいくらか増加していた。異なったコーティングの間では、目視できる細菌の付着には差異がない。嫌気性菌種であるＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは、表面上で同程度の付着を示した。これらの結果に鑑み、殺菌分析において付着の程度を適切にするため、細菌を２時間インキュベートした。
【００８９】
２．殺菌分析
２．１  ＦＡＣＳのためのＢａｃＬｉｇｈｔ
生菌量を決定するため、ＦＡＣＳを用いる生存率解析を行った。死菌を染色するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた。ＶＩ型コラーゲンで処理したＳ．ｍｉｔｉｓについては、低いＳＴＹＯ９シグナルが検出された。インキュベーションの０分後のみ、１６０μＬのコラーゲンで処理した細菌の約１５％が生存している。ＰＩについては、ＶＩ型コラーゲンで処理した細菌のシグナルは、１６０、２００および５００μＬで処理した細菌における約８０％の最大値まで経時的に増大した。
【００９０】
Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉについては、４８時間のインキュベーションで、ＳＴＹＯ９で染色した細菌の僅かな増加が見られる。ＰＩについては、全ての表面処理のシグナルがより高かった。ＶＩ型コラーゲンで処理したＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの最大のシグナルは、１６０μＬのｃＶＩで処理した細菌についての２時間のインキュベーション後に検出された。その後、シグナルは再び減少する。したがって、ＶＩ型コラーゲンによって惹起される殺菌がＦＡＣＳによって安定的に証明された。死菌を染色するＰＩのシグナルは、Ｓ．ｍｉｔｉｓで予想されたように増大した。ＶＩ型コラーゲンは用量に依存せず２時間以内に病原菌を殺滅した。Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉを異なった量のＶＩ型コラーゲンとインキュベートした場合も同じ効果が観察された。２時間のインキュベーションの後に、最大の殺菌が検出された。その後、いくつかの生残菌が再び増殖を始め、ＰＩのシグナルが低下し、一方ＳＴＹＯ９のシグナルが増大した。これらの結果は、ＳＥＭによる生存率の結果と一致する。
【００９１】
２．２  走査電子顕微鏡
種々のコーティングを有するチタン表面における殺菌を、４８時間にわたって走査電子顕微鏡によって解析した。種々の菌種についての代表的な画像を、図１〜図４に示す。
【００９２】
ＳＥＭ画像において、４８時間のインキュベーションの間にＴｉおよびＴｉ／ｐＬＬ上でインキュベートしたＳ．ｍｉｔｉｓ（図１）およびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（図２）について、菌量の増加が見られた。Ｓ．ｍｉｔｉｓの画像と比較して、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉはより強い増殖を示した。２４時間のインキュベーションの後に多層が現われ、４８時間まで増加した。対照的に、これらの細菌をｔｉ／ｃＶＩおよびｔｉ／ｐＬＬ／ｃＶＩ上でインキュベートした場合には、細菌数の減少および死菌数または少なくとも気泡形成した菌数の増加が見られた（図１、図２）。２４〜４８時間のインキュベーションでは、菌数は殆ど増加しなかった。この期間に、死細胞の層の上に細菌が沈降することによって、いくつかのコロニーが形成されていた。
【００９３】
チタンまたはｐＬＬで被覆したチタンの上での４時間のインキュベーションの後には健常な細菌が観察された。これらの条件下ではＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは既に多層コロニーの構築を開始する。この菌種をＶＩ型コラーゲンで処理すると、４時間のインキュベーションの後に細菌の量が減少した。小胞膜複合体の気泡形成および細菌内容物の放出が観察された。
【００９４】
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについての殺菌をそれぞれ図３および図４に示す。ＶＩ型コラーゲンで処理しなかった試料については、４８時間のインキュベーションの間に両方の細菌において菌量の増加が見られた。２４時間後、両方の菌種はＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉで見られたものと同様の大量のバイオフィルムの構築を開始する。対照的に、ＶＩ型コラーゲンによる処理により、４時間のインキュベーションで既に細菌数の顕著な減少がもたらされる。表面には僅かな細菌のみが検出される。生残した僅かな菌は再び分裂を始め、これは４８時間のインキュベーションの間に細菌数の増加として見られた。ＶＩ型コラーゲンで処理しなかった細菌と比較して、細菌の増殖は低減した。
【００９５】
この実験により、Ｓ．ｍｉｔｉｓをＶＩ型コラーゲンで処理すると、ＶＩ型コラーゲンで処理しなかったＳ．ｍｉｔｉｓと比較して、４時間のインキュベーション後に表面は空白であるように見えることが示された。より高い拡大倍率においては、試験した全ての菌種において殺菌効果が見られた（図５、左列）。細菌膜は小胞を形成し、個々の細胞は未処理の細菌と比較して膨潤しているように見える。最後に、細菌はＤＮＡを含むそれらの内容物を放出する。Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｄｉｉをＶＩ型コラーゲンで処理しない場合、これは２４時間のインキュベーションの後に大量のバイオフィルムを形成する。しかし、この菌種をＶＩ型コラーゲンとインキュベートすると、ＶＩ型コラーゲンとの４時間のインキュベーションの後には表面は殆ど空白であり、これは殺菌に関連している。２４時間後には僅かなコロニーが検出され、これはインキュベーション４８時間まで増殖する。未処理のＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉと比較して、この病原菌に対するＶＩ型コラーゲンの効果は明白に見ることができる。より高い拡大倍率では、未処理の細菌と比較してＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉはＶＩ型コラーゲンによる処理によって崩壊したことが明確であった（図５、左から２番目の列）。膜の崩壊はＳ．ｍｉｔｉｓと同じ程度には起こらなかったが、それでも細菌内容物の放出が観察された。
【００９６】
嫌気性病原菌においては、ＶＩ型コラーゲンで被覆した表面は２４時間のインキュベーションの後に殆ど細菌が存在していないように見える（図３、図４）。
【００９７】
総括すると、図１〜図４により、４８時間のインキュベーションの間、ＴｉおよびＴｉ／ＰＬＬ表面の全ての場合において、増殖する細菌量の増加が観察される。４８時間後、全ての細菌はバイオフィルムの厚い層で表面全体を覆うまでに増殖してしまう。対照的に、ｃＶＩまたはｐＬＬ／ｃＶＩで被覆したチタンの上では僅か４時間のインキュベーションの後に、大量の死細菌ならびに膜小胞の気泡形成および溶解（bleeding）している細菌が検出され、これは２４時間後にはより明白に目視できる効果である。細菌はその内容物を放出し始めた。対照的に、ＶＩ型コラーゲンとインキュベートしなかった細菌は健常に見え、球虫（coccids）の形成を開始していた。
【００９８】
Ｓ．ｍｉｔｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉを用いた長期研究の間に、同様の観察を行った。５日の間、毎日、被覆したチタン表面に新たな細菌を適用した。Ｓ．ｍｉｔｉｓ（図６）においても、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（図７）においても、ＶＩ型コラーゲンで処理したチタン表面に病原菌を適用した場合には、細菌の増殖が阻害された。未処理の細菌は、ＶＩ型コラーゲンで被覆した表面上で増殖する細菌よりもずっと速く増殖できた。これらを総合すると、ＶＩ型コラーゲンの抗微生物効果は少なくとも５日間、安定であることがこれらの実験によって示される。歯科インプラントについて、このことは、ＶＩ型コラーゲンでインプラントを被覆することによって、手術後の口腔内病原菌の第一波の間の感染を防止できるであろうということを意味している。
【００９９】
３．ＶＩ型コラーゲンによるコーティングの長期活性およびγ線照射
ＶＩ型コラーゲンの長期活性を、γ線照射で処理した試験表面についても５日間、観察した。毎日、新鮮な０．１％の細菌溶液を適用した。ＶＩ型コラーゲンによる処理がない場合には、９６時間のインキュベーションの間、Ｓ．ｍｉｔｉｓとＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの両方において細菌量は大幅に増加する。これと比較して、ＶＩ型コラーゲンの存在によって僅か２時間のインキュベーションの後に殺菌が惹起される。生残したいくらかの細菌がその後、分裂を開始するが、ＶＩ型コラーゲンで処理しなかった細菌と同様ではない。γ線照射で工業的に滅菌した、被覆したチタン上で同じ実験を行った場合、通常の被覆チタンと比較して差異は観察されなかった。ＶＩ型コラーゲンを含む設定においては、２時間後に殺菌が観察された。
【０１００】
４．口腔内細菌による好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の活性化
好中球の存在下、独立した実験で、チタンスクリュー上（図８、下行）および支台上（図８、上行）でそれぞれ、Ｓ．ｍｉｔｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉをインキュベートした。図９および図１０Ａ−Ｂにおいて、口腔内病原菌に対する好中球の効果を詳細に観察することができる。図１０Ａ（スクリュー）および図１０Ｂ（支台）は、Ｓ．ｍｉｔｉｓの殺滅およびＮＥＴの形成を示す（ＮＥＴは図中の矢印で示す）。ＶＩ型コラーゲンの存在下で、死滅する細菌が即時に（インキュベーション０分）見られた。効果は１２０分のインキュベーションの間に増強され、広範囲の膜の気泡形成および細胞質の浸出によって可視化される。病原菌をＶＩ型コラーゲンで処理しない場合には、１２０分後にＮＥＴｏｓｉｓによる殺滅が観察されるが、その程度はかなり少ない（図１０）。Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉについてもＶＩ型コラーゲンによるコーティングの同様の効果が見られる。スクリューと支台の表面では差異は見られなかった。
【０１０１】
生来の免疫系はＶＩ型コラーゲンの機能を支持および増強しているようであり、逆も真であると考えられる。歯科インプラントを適用している間、生来の免疫系は出血を介してインプラントおよび口腔内病原菌と接触する。歯科学に対しては、これはＶＩ型コラーゲンで被覆したインプラントで処置された患者が細菌感染に対して極めて良好に保護されることを意味している。
【０１０２】
参考文献
1.  Spissinger T, Engel J, Matrix Biol 1995; 14:499-505
2.  Specks U, Mayer U, Nischt R, Spissinger T, Mann K, Timpl R, Engel J, Chu ML, EMBO J 1992; 11:4281-4290
3.  Abdillahi S. M., Balvanovic S., Baumgarten M, Moergelin M., J Innate Immun 2012; 4:371-376
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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