(57)【要約】本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染、特にＨ１Ｎ１感染の治療又は予防のためのＰＡＲ４アンタゴニストを含む、方法及び組成物（例えば医薬組成物）を提供する。ＰＡＲ４アンタゴニストは、ＰＡＲ２アゴニスト又はＰＡＲ１アンタゴニストと組み合わせ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療法又は予防法に使用するためのプロテアーゼ活性化受容体−４（ＰＡＲ−４）アンタゴニスト。
【請求項２】
前記Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１ウイルスである、請求項１記載の使用のためのＰＡＲ−４アンタゴニスト。
【請求項３】
前記ＰＡＲ−４アンタゴニストが、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子有機化合物、アプタマー、ペプデュシン、ポリヌクレオチド、又は抗体からなる群より選択される、請求項１又は２記載の使用のためのＰＡＲ−４アンタゴニスト。
【請求項４】
前記ＰＡＲ−１アンタゴニストが、ペプデュシンである、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用のためのＰＡＲ−４アンタゴニスト。
【請求項５】
前記ペプデュシンが、ペプデュシンＰ４ｐａｌ−１０である、請求項４記載の使用のためのＰＡＲ−４アンタゴニスト。
【請求項６】
前記被験体が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用のためのＰＡＲ−４アンタゴニスト。
【請求項７】
（ｉ）少なくとも１つのＰＡＲ−４アンタゴニスト、及び
（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）アゴニスト又は少なくとも１つのＰＡＲ−１アンタゴニスト
を含む、医薬組成物。
【請求項８】
被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の治療法又は予防法に使用するための請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防のために同時、別々、又は順次使用するための配合製剤としての、
（ｉ）少なくとも１つのＰＡＲ−４アンタゴニスト、及び
（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）アゴニスト又は少なくとも１つのＰＡＲ−１アンタゴニスト
を含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防のための方法及び組成物（例えば医薬組成物）を提供する。
【０００２】
発明の背景：
流行性ウイルス感染は、感冒から生命を脅かすインフルエンザ、ウエストナイル感染及びＨＩＶ感染に至るまでのヒトの病気のための、生命及び収入の世界中における重大な損失の原因である。時宜を得た検出、診断及び処置は、流行性、大流行性及び家畜流行性の状況において、疾病の蔓延を制限する上で重要である。特に、ウイルスの構築及び増殖を迅速に阻害する予防剤及び治療剤は、処置処方計画において特に有用である。
【０００３】
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、非常に伝染性が高く、かつ著しい罹患率及び死亡率でヒト及び動物を苦しめる、急性呼吸器感染を引き起こす。従って、新規かつ改良された抗ウイルス医薬の必要性が臨床分野において存在する。本発明はこれらの必要性を充足する。
【０００４】
宿主自然免疫系の活性化は、ＩＡＶ感染の蔓延及び有害な作用を制御することを目的とする。しかしながら、感染部位におけるサイトカイン遊離の調節不全及び好中球の強力な動員に起因する過剰な炎症応答もまた、重度の肺炎症及びＩＡＶの発病増加を媒介し得る。従って、ＩＡＶ感染の最中のサイトカイン調節不全はしばしば、ＩＡＶの致命的な転帰に関連する。
【０００５】
呼吸器におけるウイルス複製部位は、細胞外プロテアーゼが大量に存在するという複雑な微小環境を示す。これらの中のいくつかのプロテアーゼ（トリプシン、トリプターゼ）は、ウイルス複製（Riteau B. et al. 2006; LeBouder F. et al. 2008）及び自然免疫応答の両方において役割を果たし得る。なぜなら、それらはプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）（Steinhoff M. et al. 2005; Vergnolle N. et al. 2008）と呼ばれる受容体ファミリーの活性化を通した炎症過程の重要なメディエーターであるからである。
【０００６】
現在までに、種々のプロテアーゼによって活性化される４つのＰＡＲがクローニングされている（ＰＡＲ１〜４）。プロテアーゼによる受容体の切断後、新たに放出されたアミノ末端配列が該受容体に結合して、内部で該受容体を活性化する。
【０００７】
肺ＩＡＶ感染における又は一般的にウイルス感染におけるＰＡＲ４の役割が記述されたことはなかった。しかしながら、上昇したＰＡＲ４レベルが、ＩＡＶ感染マウスの気道において観察され（Lan RS. et al. 2004）、このことは、ウイルス疾病の発病におけるこの受容体の役割を示唆する。インビボ又はインビトロにおけるＰＡＲ４活性化／不活性化についての具体的な役割は、ウイルス感染の脈絡で記載されたことはなかった。
【０００８】
発明の要約：
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防において使用するためのＰＡＲ４アンタゴニストに関する。
【０００９】
発明の詳細な説明：
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するための方法及び組成物（例えば医薬組成物）を提供する。
【００１０】
本発明者らは実際に、インフルエンザの発病におけるＰＡＲ４の役割を調査し、ＰＡＲ４の活性化はＩＡＶ感染の発病性を増加させたが、ＰＡＲ４アンタゴニストはＩＡＶ感染から防御することを示した。
【００１１】
従って、本発明の第一の態様は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に使用するためのＰＡＲ４アンタゴニストに関する。
【００１２】
本明細書において使用する「Ａ型インフルエンザウイルス感染」という用語は、赤血球凝集素（Ｈ１〜Ｈ１５）及びノイラミニダーゼ（Ｎ１〜Ｎ９）発現に基づいた血清型を考慮することなく、Ａ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる全ての感染を指す。本発明によって考えられている例示的なＡ型インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、及びＨ１０Ｎ７が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。好ましい実施態様において、本発明によるインフルエンザウイルス型はＨ１Ｎ１である。
【００１３】
その最も広義な意味において、「処置する」又は「処置」という用語は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の進行を逆行、軽減、阻害すること、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスの増殖を阻害することを指す。特に、Ａ型インフルエンザウイルス感染の「予防」又は「予防的な処置」は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の症状を予防する本発明の化合物の投与を指し得る。
【００１４】
投与量及び投与頻度は、処置が予防的か又は治療的かに依存して変更され得る。予防的な適用においては、比較的低用量が、比較的希な間隔で、長い期間かけて投与される。一部の被験体は、その残りの人生ずっと処置を受け続ける。治療的適用においては、疾病の進行が減少又は終了するまで、好ましくは被験体が疾病の症状の部分的又は完全な回復を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が時に必要とされる。その後、被験体は、予防的処方計画を投与されてもよい。
【００１５】
予防的適用においては、ＰＡＲ４のアンタゴニストを含有する組成物を、Ａ型インフルエンザウイルス感染をまだ患っていない患者に投与する。もっと正確には、それらは、このような疾患を発症するリスクがあるか、又はその素因を有する被験体に向けられる。このような適用は、被験体が、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する患者の抵抗性を増強させるか、又はＡ型インフルエンザウイルス感染の進行を遅延させることを可能とする。
【００１６】
本明細書において使用する「プロテアーゼ活性化受容体−４」、「プロテイナーゼ活性化受容体−４」又は「ＰＡＲ４」又は「ＰＡＲ−４」という用語は互換的に、トロンビンによる切断によりＮ末端繋留リガンドを露出することによって活性化されるＧタンパク質共役受容体を指す。この用語は、天然のＰＡＲ４並びにその変異体及び改変形を含み得る。ＰＡＲ４は任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒト及び非ヒト霊長類）のＰＡＲ４、特にヒトのＰＡＲ４である。ヒトプロテイナーゼ活性化受容体４前駆体のアミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿００３９４１として公開されている。
【００１７】
本明細書において使用する「アンタゴニスト」という用語は、特異的に結合し、受容体を通したシグナル伝達を阻害して、該受容体によって媒介される応答を完全に遮断又は検出可能な程度に阻害することができる作用物質を指す。例えば、本明細書において使用する「ＰＡＲ４アンタゴニスト」という用語は、経路のシグナル伝達及びさらには生物学的応答を開始するためのＰＡＲ４に結合して完全に又は部分的に不活性化する、天然又は合成の化合物である。ＰＡＲ−４アンタゴニスト活性は、当業者の一般的な知識の範囲内である様々な公知の方法によって評価され得る。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明によるＰＡＲ４アンタゴニストは、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子有機化合物、アプタマー、ペプデュシン、ポリヌクレオチド又は抗体であり得る。
【００１９】
好ましくは、前記ＰＡＲ−４アンタゴニストはペプデュシンである。ペプデュシンは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の第一細胞内ループ（il loop）又はそのフラグメントの第一ドメイン、及び第一ドメインに付着した第二ドメインを含む、改変されたペプチドであり、該第二ドメインは、天然若しくは非天然の細胞透過性部分又は膜繋留部分である。具体的な実施態様において、ペプデュシンはレトロインベルソ異性体として合成され得、これは逆方向配列及び逆のキラリティーのペプチドを含む。例えば、Jameson et al. Nature 368:744-746 (1994)及びBrady et al. Nature 368:692-693 (1994)を参照されたい。Ｄ−エナンチオマー及び逆合成を組み合わせることの正味の結果は、各アミド結合におけるカルボニル基及びアミノ基の位置が交換され、一方、各α炭素における側鎖基の位置は保存されるというものである。例えば、ペプチドモデルが、配列ＡＢＣを有するＬ−アミノ酸から形成されたペプチドである場合、Ｄ−アミノ酸から形成されたレトロインベルソペプチド類似体は、配列ＣＢＡを有するだろう。Ｄ−アミノ酸の鎖を合成してレトロインベルソペプチドを形成する手順は当技術分野において公知である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル（theyl）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、及び２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末端をブロックする基も有用である。ペプチドの荷電アミノ末端及びカルボキシ末端のブロックは、疎水性細胞膜を通っての細胞中への該ペプチドの透過を増強するという追加の利点を有する。
【００２０】
「細胞透過性部分」は、細胞外空間から細胞の細胞内区画への物質の移動を媒介する、化合物又は官能基を含む。細胞透過性部分は、連結された物質（例えば、本発明のＧＰＣＲペプチド又はフラグメント）を細胞質内に又は細胞膜の細胞質側空間に往復させる。例えば、細胞透過性部分は疎水性部分である。疎水性部分は、例えば、少なくとも約１１アミノ酸長の混合配列ペプチド又はホモポリマーペプチド、例えばポリロイシン若しくはポリアルギニンである。該物質は、ペプチド、例えば本発明のＧＰＣＲフラグメント又はペプチド模倣体であり得る。細胞透過性部分は、少なくとも１０個連続したアミノ酸、例えばＧＰＣＲ膜貫通ヘリックスドメインの１〜１５アミノ酸を含み得る。
【００２１】
「膜繋留部分」は、細胞膜と会合するか又は結合する化合物又は官能基を含む。従って、膜繋留部分は、膜繋留部分が付着している該物質（すなわち本発明のＧＰＣＲフラグメント又はペプチド模倣体）を、標的細胞の膜の近くにもってくる。細胞膜は真核生物又は原核生物の細胞膜である。膜繋留部分は、望ましくは、疎水性部分である。疎水性部分は、１０アミノ酸未満の長さの混合配列ペプチド又はホモポリマーペプチド、例えばポリロイシン若しくはポリアルギニンを含み得る。膜繋留部分は、ＧＰＣＲ膜貫通ヘリックスドメインの少なくとも１〜７個連続したアミノ酸を含み得る。好ましくは、膜繋留部分は、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインの少なくとも１０個連続したアミノ酸（しかし１６個未満のアミノ酸）であり；より好ましくは、膜繋留部分は、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインの少なくとも１５個連続したアミノ酸である。膜繋留部分はまた、コレステロール、リン脂質、ステロイド、スフィンゴシン、セラミド、オクチルグリシン、２−シクロヘキシルアラニン、又はベンゾリルフェニルアラニンも含む。他の膜繋留部分は、Ｃ１若しくはＣ２アシル基、又はＣ３〜Ｃ８脂肪酸部分、例えばプロピオノイル（Ｃ３）；ブタノイル（Ｃ４）；ペンタノイル（Ｃ５）；カプロイル（Ｃ６）；ヘプタノイル（Ｃ７）；及びカプリロイル（Ｃ８）を含む。膜繋留部分は、ペプデュシンにおけるＧＰＣＲフラグメントのＣ末端アミノ酸、Ｎ末端アミノ酸、又はＮ末端とＣ末端アミノ酸の間のアミノ酸に付着し得る。
【００２２】
ペプデュシンアプローチは非常に有利である。なぜなら、それは、細胞内受容体構造の多様性を、新規治療剤の生成のために、及びインビボ条件下における受容体−Ｇタンパク質共役の機序の描写のための両方に利用することを可能とするからである。この戦略によって実施されるペプデュシンはまた、該ペプデュシンがＧタンパク質ではなくむしろ該受容体に主に標的化するような程度まで、より選択的であることが判明し得る。これらの受容体に繋留したペプデュシンアンタゴニストを生成することができ、これは、どのシグナル伝達経路がその天然の環境の状況で所与の受容体によって活性化されるかを決定するのに有用であり得る。
【００２３】
ペプデュシンは、ＰＡＲ−４の機能を損なうことによってトロンビンによって誘発される血小板の活性化を阻害し得る。しかしながら、本発明者らは、全く初めて、ＩＡＶ感染の処置における、ＰＡＲ４標的化ペプデュシンの新規な役割を同定する責任を果たした。
【００２４】
好ましくは、前記ＰＡＲ４アンタゴニストはペプデュシンＰ４ ｐａｌ−１０である。本明細書において使用する「ペプデュシンＰ４ｐａｌ−１０」という用語は、「Ｎ−パルミトイル−SGRRYGHALR−NH2」又は「Ｐ４ｐａｌ−１０」とも呼ばれるが、これは、以下の式：Ｃ６５Ｈ１１１Ｎ２１Ｏ１４を有するＰＡＲ４の選択的アンタゴニストペプチドを指す。該アンタゴニストは文献に記載され、また市販されている。実際に、ペプデュシンＰ４ｐａｌ−１０は、Incelligen社及びPolypeptide Laboratories社によって市販されている。
【００２５】
別の実施態様において、前記ＰＡＲ４アンタゴニストはｔｃＹ−ＮＨ２（trans−シナモイル−YPGKF-NH2）である。「ｔｃＹ−ＮＨ２」（trans−シナモイル−YPGKF−NH2）は、Tocris Biosciences及びSigma Aldrichから市販されているペプチドである。
【００２６】
本発明の別の実施態様において、ＰＡＲ４アンタゴニストは、低分子有機化合物である。「低有機分子」という用語は、医薬品に一般的に使用される有機分子と同じサイズの分子を指す。この用語は生物学的な巨大分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。好ましい低有機分子は、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、ＰＡＲ４アンタゴニストは、アンタゴニストＰＡＲ４抗体又は抗原結合分子である。特記しない限り、本明細書において使用する「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方だけでなく、その抗原に対する特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、及び一本鎖（ｓＦｖ）の改変された抗体分子を含むがそれに限定されるわけではない）も含む。この用語はさらに、特記して除外しない限り、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに、このような抗体が産生され得る環境においては、ヒト抗体も含む。
【００２８】
これらの抗ＰＡＲ４作用物質は、ＰＡＲ４により媒介されるシグナル伝達活性、例えばＰＡＲ４により媒介されるインターロイキン分泌に拮抗することができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を調製するための一般的な方法は、当技術分野において周知である。例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983);及びCole et al., pp. 77-96、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985を参照されたい。
【００２９】
さらに、具体的なＰＡＲ４アンタゴニスト抗体が当技術分野において開示されている。抗体は、任意の哺乳動物又はトリ起源（ヒト、ネズミ科の動物（マウス又はラット）、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ウマ、又はニワトリを含む）であり得る。いくつかの代替選択肢において、抗体は二重特異的であり得る。該抗体は、該抗体への任意のタイプの分子の共有結合的な付着によって改変され得る。例示あって制限するものではないが、該抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンド若しくは他のタンパク質への連結、又は当技術分野において公知の他の改変によって改変された、抗体を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はその組合せの使用を含む、当技術分野において公知の多種多様な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の、例えば、Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)に教示されている技術を含む、ハイブリドーマ技術を使用して、又は当技術分野において公知の他の標準的な方法によって生成され得る。
【００３０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真核生物クローン、原核生物クローン、又はファージクローンを含む、１つのクローンに由来する抗体を指し、それが生成された方法を指すものではない。例えば、適切な抗体は、ファージディスプレイ技術又は他の技術によって生成され得る。さらに、制限するものではないが、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ法、及び、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することはできるトランスジェニックマウスの使用によるなどの、多種多様な技術によって作製され得る。例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに又は相同的組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入することができる。抗体はまた、これらの抗体をコードするポリヌクレオチドの発現によって生成され得る。さらに、本発明による抗体を、マーカー配列、例えばペプチドタグに融合させて精製を容易にすることができる；適切なタグはヘキサヒスチジンタグである。該抗体をまた、当技術分野において公知の方法によって診断剤又は治療剤にコンジュゲートさせ得る。このようなコンジュゲートを調製する技術は当技術分野において周知である。これらのモノクローナル抗体、並びに、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び一本鎖抗体を調製する他の方法は当技術分野において公知である。
【００３１】
ＰＡＲ４の生化学的活性又はシグナル伝達活性を阻害又は抑制する化合物に加えて、ＰＡＲ４の発現を抑制することができるか又はＰＡＲ４の細胞内レベルをダウンレギュレートすることのできる化合物もまた、本発明の実施に使用することができる。ＰＡＲ４の発現の抑制又はその細胞内レベルのダウンレギュレーションは、対照細胞（ＰＡＲ４アンタゴニスト化合物で処置されていない細胞）におけるＰＡＲ４と比較して、調べた細胞（例えば、ＰＡＲ４アンタゴニスト化合物と接触させておいた細胞）におけるＰＡＲ４の発現の減少又は非存在を指す。ＰＡＲ４のレベル又は発現は、対照細胞におけるＰＡＲ４のレベル又は発現と比較して、少なくとも約１０％（例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）減少又は低減し得る。上記に示されているように、発現の抑制又はＰＡＲ４の細胞内レベルのダウンレギュレーションは、ＰＡＲ４遺伝子がｍＲＮＡへ転写されるレベル又はＰＡＲ４のｍＲＮＡが対応タンパク質へ翻訳されるレベルのいずれでも実施され得る。いくつかの実施態様において、阻害性ヌクレオチドが、ＰＡＲ４の発現を抑制することによって、ＰＡＲ４により媒介される心臓リモデリング又はＰＡＲ４の他の作用に拮抗するために使用され得る。これらは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び合成ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、又は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。いくつかの好ましい実施態様において、ＰＡＲ４の発現に標的化されたｓｉＲＮＡが使用される。二本鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡによる内因性遺伝子の機能及び発現への干渉は、様々な生物において示されている。例えば、A. Fire et al., "Potent and Specific Genetic Interference by Double-Stranded RNA in Caenorhabditis elegans" Nature 391 :806-811 (1998); J.R. Kennerdell & R.W. Carthew, "Use of dsDNA- Mediated Genetic Interference to Demonstrate that frizzled and frizzled 2 Act in the Wingless Pathway," CeJ 95:1017-1026 (1998); F. Wianni & M. Zernicka- Goetz, "Specific Interference with Gene Function by Double-Stranded RNA in Early Mouse Development," Nat. Cell Biol. 2:70-75 (2000)を参照されたい。ｓｉＲＮＡは、自己相補的配列を含むヘアピンループ、又は二本鎖配列を含み得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には、１００塩基対未満であり、例えば、約３０ｂｐ又はそれよりも短くあり得、相補的ＤＮＡ鎖の使用又は合成アプローチを含む、当技術分野において公知のアプローチによって作製され得る。このような二本鎖ＲＮＡは、鋳型の両方向から解読された一本鎖ＲＮＡのインビトロでの転写、並びに、センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖のインビトロでのアニーリングによって合成され得る。ＰＡＲ４に標的化する二本鎖ＲＮＡはまた、ＰＡＲ４遺伝子（例えばヒトＰＡＲ４遺伝子）が逆方向反復配列によって隔てられて逆方向にクローニングされているｃＤＮＡベクター構築物から合成され得る。細胞へのトランスフェクション後、ＲＮＡが転写され、相補鎖が再度アニーリングする。ＰＡＲ４遺伝子を標的化する二本鎖ＲＮＡを、適切な構築物のトランスフェクションによって細胞（例えば腫瘍細胞）に導入することができる。
【００３２】
典型的には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉は、翻訳レベルで媒介される；換言すれば、これらの干渉ＲＮＡ分子は、対応するｍＲＮＡ分子の翻訳を妨げ、その分解に至る。ＲＮＡ干渉はまた転写レベルでも作用し得、これらの干渉ＲＮＡ分子に対応するゲノム領域の転写を遮断することも可能である。
【００３３】
これらの干渉ＲＮＡの構造及び機能は当技術分野において周知であり、例えば、R.F. Gesteland et al., eds, "The RNA World" (3rded, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2006), pp. 535-565（これはこの参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。［０１１０］これらのアプローチのために、ベクターへのクローニング及びトランスフェクション法も当技術分野において周知であり、例えば、J. Sambrook & D. R. Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)（これはこの参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００３４】
二本鎖ＲＮＡに加えて、ＰＡＲ４に標的化する他の核酸作用物質、例えばアンチセンス核酸もまた、本発明の実施に使用することができる。アンチセンス核酸は、特定の標的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。細胞において、一本鎖アンチセンス分子はそのｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖形態にあるｍＲＮＡを翻訳しない。それ故、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に干渉し、従って、ｍＲＮＡへと転写される遺伝子の発現に干渉する。アンチセンス法は、インビトロにおいて多くの遺伝子の発現を阻害するために使用されている。例えば、CJ. Marcus- Sekura, "Techniques for Using Antisense Oligodeoxy ribonucleotides to Study Gene Expression," Anal. Biochem. 172:289-295 (1988); J. E. Hambor et al., "Use of an Epstein-Barr Virus Episomal Replicon for Anti-Sense RNA-Mediated Gene Inhibition in a Human Cytotoxic T-CeIl Clone," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4010-4014 (1988); H Arima et al., "Specific inhibition of lnterleukin-10 Production in Murine Macrophage-Like Cells by Phosphorothioate Antisense Oligonucleotides," Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 8:319-327 (1998);及びW.-F. Hou et al., "Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides Directed to Individual Calmodulin Gene Transcripts on the Proliferation and Differentiation of PC12 Cells," Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 8:295-308 (1998)（これらは全てこの参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。アンチセンス技術はさらに、C. Lichtenstein & W. Nellen, eds., "Antisense Technology: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1997)（これはこの参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。［０１１１］ヒト及び多くの他の哺乳動物からのＰＡＲ４ポリヌクレオチド配列は全て、当技術分野において描出されている。公知の配列に基づいて、ＰＡＲ４に標的化する阻害性ヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ）を、当技術分野において周知の方法を使用して容易に合成することができる。
【００３５】
本発明によって考えられる他の例示的なＰＡＲ４アンタゴニストは、以下の文書（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に記載のものを含むがそれに限定されるわけではない：
−  欧州特許第６６６７ ３４５号；
−  欧州特許第１ １６６ ７８５号；
−  日本国特許第２００２０８０３６７号；
−  欧州特許第１ ３３１ ２３３号；
−  米国特許第２００６１０６０３２号；
−  国際公開公報第２００９１２４１０３号；
−  国際公開公報第２００８／０８６０６９号；
−  国際公開公報第２００６／０５２７２３号；及び
−  Adams MN et al, Structure, function and pathophysiology of protease activated receptors, Pharmacol Ther. 2011 Jun;130(3):248-82。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に使用するためのＰＡＲ４アンタゴニストをスクリーニングするための方法に関する。例えば、スクリーニング法は、ＰＡＲ４への、又はＰＡＲ４若しくはその融合タンパク質を有する細胞若しくは膜への候補化合物の結合を、候補化合物に直接的に又は間接的に関連付けられたラベルを用いて測定し得る。さらに、スクリーニング法は、ＰＡＲ４を不活性化する該候補化合物の能力を測定すること、又は定性的に若しくは定量的に検出することを含み得る。
【００３７】
特定の実施態様において、本発明のスクリーニング法は、以下からなる工程を含む：
ａ）ＰＡＲ４を表面上に発現している複数の細胞を準備すること；
ｂ）該細胞を候補化合物と共にインキュベートすること；
ｃ）該候補化合物がＰＡＲ４に結合し、不活性化するかどうかを決定すること；及び
ｄ）ＰＡＲ４に結合し、不活性化する候補化合物を選択すること。
【００３８】
特定の実施態様において、本発明のスクリーニング法はさらに、工程ｄ）で選択された候補化合物をＡ型インフルエンザウイルス感染の動物モデルに投与して、該候補化合物の防御効果を検証することからなる工程を含む。
【００３９】
一般的に、このようなスクリーニング法は、ＰＡＲ４をその表面上に発現している適切な細胞を準備する工程を含む。特に、ＰＡＲ４をコードする核酸を使用して細胞をトランスフェクトし、本発明の受容体を発現させ得る。このようなトランスフェクション工程は、当技術分野において周知の方法によって成し遂げられ得る。特定の実施態様において、該細胞は、ＰＡＲ４をまだ発現していないと報告された哺乳動物細胞（例えば上皮細胞）からなる群より選択され得る。
【００４０】
本発明のスクリーニング法は、このような細胞をスクリーニングしようとする化合物と接触させ、このような化合物がＰＡＲ４を不活性化させるかどうかを決定することによって、ＰＡＲ４アンタゴニストを決定するために使用され得る。
【００４１】
本発明の１つの実施態様によると、候補化合物は、以前に合成された化合物のライブラリー、又は構造がデータベースにおいて決定された化合物のライブラリー、又は新規合成された化合物若しくは天然化合物のライブラリーから選択され得る。候補化合物は、（ａ）タンパク質又はペプチド、（ｂ）核酸、及び（ｃ）有機化合物又は化学物質（天然又は非天然）の群から選択され得る。
【００４２】
候補化合物を用いてのＰＡＲ４の不活性化は、当業者の様々な公知の方法によって試験され得る。
【００４３】
本発明の別の目的は、必要とする被験体にＰＡＲ４アンタゴニストを投与することを含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療法又は予防法に関する。
【００４４】
本明細書において使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばブタ及び霊長類を示す。好ましくは、本発明による被験体はヒトである。
【００４５】
ＰＡＲ４アンタゴニストは、以下に定義されているような医薬組成物の形態で投与され得る。
【００４６】
好ましくは、本発明のＰＡＲ４アンタゴニストは、治療有効量で投与される。「治療有効量」によって、あらゆる医学的処置に妥当するように、合理的なベネフィット／リスク比でＡ型インフルエンザウイルス感染を治療又は予防する本発明によるＰＡＲ４アンタゴニストの十分量を意味する。
【００４７】
本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されると理解すべきである。任意の特定の患者についての具体的な治療有効投与量レベルは、処置される欠陥及び欠陥の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知である同様な因子を含む、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは、十分に当業者の技能範囲内である。
【００４８】
しかしながら、製品の１日量は、１日あたり成人あたり０．０１〜１，０００mgの幅広い範囲にわたり変化し得る。好ましくは、該組成物は、処置される患者への投与量の症状による調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの活性成分を含む。医薬品は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg（体重）/日から約２０mg/kg/日の投与量レベルで、特に約０．００１mg/kg/日から７mg/kg/日で供給される。ＰＡＲ４アンタゴニストは、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと配合して、治療用組成物を形成し得る。
【００４９】
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、適切な場合は特にヒトに投与されたときに、有害な反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化助剤を指す。
【００５０】
本発明の医薬組成物において、活性成分を、単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁液又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。好ましくは、本発明による医薬組成物は、好ましくは、鼻腔内投与剤形で投与される。
【００５１】
好ましくは、医薬組成物は、注射することのできる製剤のために薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性で無菌の塩類水溶液（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は、場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水が添加されると注射液を構成することを可能とする、乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。
【００５２】
注射に使用するのに適した剤形は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。
【００５３】
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中において調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、並びに油中において調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。
【００５４】
ＰＡＲ４アンタゴニストを、中性形又は塩形の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミン基を用いて形成）を含み、これらは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどからも導かれ得る。
【００５５】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを使用することによってもたらされ得る。
【００５６】
無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙された他の様々な成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体及び上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分が得られる。
【００５７】
製剤時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【００５８】
水溶液での非経口投与については、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤をまず十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を等張NaCl溶液１mlに溶解し、皮下点滴療法液１０００mlに添加するか又は提案された注入部位に注射し得る。投与量の幾分の変動が、処置される被験体の容態に依存して必然的に起こるだろう。投与責任者は、いずれにしても、個々の被験体に対する適切な投与量を決定するだろう。
【００５９】
ＰＡＲ４アンタゴニストは、治療混合物内に、１用量あたり、約０．０００１から１．０mg、又は約０．００１から０．１mg、又は約０．１から１．０、又はさらには約１０mgほどを含むように製剤化され得る。複数の投与量を投与しても良い。
【００６０】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形は、例えば、錠剤、又は経口投与のための他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形を含む。
【００６１】
本発明によると、ＰＡＲ４アンタゴニストは、Ａ型インフルエンザウイルス感染の処置のための、１つ以上の異なる活性な薬学的作用物質、好ましくは活性な薬学的作用物質と組み合わせて製剤化され得る。このような作用物質は、非常に異なる生化学的経路によって作用して、特に有益な治療結果をもたらし得、これは当業者には周知である。本発明によると、１つ以上の活性作用物質は、共投与される単独療法製剤として、又は単一の共製剤として送達され得る。
【００６２】
好ましい実施態様において、活性作用物質の１つはＰＡＲ１アンタゴニスト又はＰＡＲ２アゴニストである。
【００６３】
本発明のさらなる目的は、
（ｉ）少なくとも１つのＰＡＲ−４アンタゴニスト、及び
（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）アゴニスト又は少なくとも１つのＰＡＲ−１アンタゴニスト
を含む医薬組成物に関する。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に同時に、別々に又は順次使用するための、配合製剤としての、
（ｉ）少なくとも１つのＰＡＲ−４アンタゴニスト、及び
（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）アゴニスト又は少なくとも１つのＰＡＲ−１アンタゴニスト
を含む製品に関する。
【００６５】
本明細書において使用する「ＰＡＲ２」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロテアーゼ活性化受容体−２を指す。この用語は、天然のＰＡＲ２並びにその変異体及び改変形を含み得る。ＰＡＲ２は、任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒト及び非ヒト霊長類）のＰＡＲ２、特にヒトのＰＡＲ２である。
【００６６】
本明細書において使用する「ＰＡＲ２アゴニスト」という用語は経路のシグナル伝達及びさらなる生物学的過程を開始するためにＰＡＲ２に結合して活性化する、天然又は合成の化合物である。ＰＡＲ−２アゴニスト活性は、様々な公知の方法によって評価され得る。例えば、Hollenbergの方法（Hollenberg, M. D., et al., Cati. J. Physiol. Pharmacol., 75,832-841 (1997)）、Kawabataの方法（Kawabata, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. , 288,358-370 (1999)）及びHawthorneの方法（Howthorne et al., A High-Throughput Microtiter Plate-Based Calcium Assay for the Study 0f Protease-Activated Receptor 2 Activation, Analytical l3iochemistry 290,378-379 (2001)）をＰＡＲ２アゴニスト活性の評価に使用し得る。
【００６７】
１つの実施態様において、本発明によるＰＡＲ２アゴニストは、低有機分子であり得る。本発明によって考えられる例示的なＰＡＲ２アゴニストは、米国特許出願公開公報第２００７１２３５０８号及び第２００８３１８９６０号（これらは参照により本開示に組み入れられる）に記載のものを含むがそれに限定されるわけではない。他の例としては、Graddil LR et al. 2008に記載のもの、より特定するとＡＣ−５５５４１［Ｎ−［［１−（３−ブロモ−フェニル）−（Ｅ）−エチリデン−ヒドラジノカルボニル］−（４−オキソ−３，４−ジヒドロ−フタラジン−１−イル）−メチル］−ベンズアミド］及びＡＣ−２６４６１３［２−オキソ−４−フェニルピロリジン−３−カルボン酸［ｔ（３−ブロモ−フェニル）−（Ｅ／Ｚ）−エチリデン］−ヒドラジド］が挙げられる。
【００６８】
別の実施態様において、本発明によるＰＡＲ２アゴニストは、HOOC-SLIGRL-NH2（配列番号５）又はHOOC-SLIGKV-NH2（配列番号６）であり得るＰＡＲ２活性化ペプチドである。
【００６９】
別の実施態様において、本発明のＰＡＲ２アゴニストは、HOOC-LIGRLO-NH2、HOOC-フロオリル(Fluoryi)-LIGRLO-NH2及びtrans−シナモイル−LIGRLO（tc）-NH2からなる群より選択され得るＰＡＲ２活性化ペプチド誘導体であり得る。
【００７０】
本発明によって考えられる他のＰＡＲ２活性化ペプチド誘導体は、一般式（Ｉ）：
Ｚ−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯ−ＮＨ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＣＯ−Ｒ（Ｉ）
（式中、
Ｚは、置換基を有していても有していなくてもよいアリール基、又は、置換基を有していても有していなくてもよいヘテロアリール基を表し；ｎは０、１又は２を表し；ＡＡ１−ＡＡ２はＬｙｓ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｌｅｕを表し；かつ、Ｒは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）
又はその塩によって示される、国際特許出願公開公報第Ｗ００３／１０４２６８（これは、参照により本開示に組み入れられる）に記載されたものを含む。
【００７１】
Ｚとしてのアリール基は、６〜３０個の炭素原子、好ましくは６〜１４個の炭素原子、特に例えば好ましくはフェニル基及びナフチル基を有する、単環型、多重環型、又は縮合環型の炭素環基であり得る。Ｚとしてのヘテロアリール基は、５〜７員環単環型、多重環型、又は縮合環型の複素環基であり得、該基は、少なくとも１〜３個の窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子を環内に含み、特に例えばフリル基、チエニル基、ピリジル基、又はキノリニル基を好ましくは含む。
【００７２】
Ｚとしてのアリール基又はヘテロアリール基は、置換基を有していても有していなくてもよく、これは、本発明のペプチド誘導体の活性に対して有害な作用を及ぼさない任意のアリール基又はヘテロアリール基を含むがそれに限定されず、特に、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、フェニル基、フェニル低級アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシル基、及びカルボキシル基を含む。
【００７３】
ハロゲン原子は、例えば、塩素原子、フッ素原子、及び臭素原子を含む。低級アルキル基は、好ましくは、１〜１５個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、直鎖状又は分岐状の低級アルキル基であり、これは例えば、メチル基及びエチル基を含む。低級アルコキシ基は好ましくは、１〜１５個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の低級アルコキシ基を含み、これは例えばメトキシル基及びエトキシル基を含む。
【００７４】
フェニル低級アルキル基における低級アルキル基は、アルキレン基、例えば低級アルキル基、例えばメチレン基及びエチレン基を含む。
【００７５】
この低級アルキル基、低級アルコキシ基、フェニル基、及びフェニル低級アルキル基についての置換基はさらに、ハロゲン原子などで置換されていてもよい。
【００７６】
本発明による一般式（Ｉ）におけるＺ基は、例えば、置換された又は置換されていないフェニル基、ナフチル基、フリル基、チエニル基、ピリジル基、及びキノリル基を含み、特に、例えば、フェニル基、４−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，５−ジメトキシフェニル基、４−フェネチルフェニル基、３−フェネチルフェニル基、２−フェネチルフェニル基、４−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、２−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基、３，４−ジニトロフェニル基、４−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、２−メチルフェニル基、２，４−ジメチルフェニル基、３，５−ジメチルフェニル基、４−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、２−フルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、２，４，５−トリフルオロフェニル基、４−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、２−フェニルフェニル基、２−フリル基、３−フリル基、５−メトキシ−２−フリル基、５−メチル−２−フリル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、４−メトキシ−１−ナフチル基、４−メチル−１−ナフチル基、４−メトキシ−２−ナフチル基、４−メチル（niethyl）−２−ナフチル基、４−ピリジル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、２−メチル−４−ピリジル基、４−メチル−２−ピリジル基、２−チエニル基、３−チエニル基、３−メチル−２−チエニル基、４−メチル−２−チエニル基、４−メチル−３−チエニル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、４−キノリル基、４−メチル−６−キノリル基などを含む。
【００７７】
本発明による一般式（Ｉ）において、ｎは０、１又は２を示し、下付き文字「ｎ」を有する基は、Ｚ基に結合している。ｎが０の場合、Ｚ基は直接カルボニル基に結合し；ｎが１である場合、ｚ基はメチレン基を通してカルボニル基に結合し；及び、ｎが２である場合には、Ｚ基はエチレン基を通してカルボニル基に結合している。一般式（Ｉ）におけるＲは−ＯＨ若しくは−ＮＨ２、又はその塩を表す。
【００７８】
本発明によると、一般式（Ｉ）におけるＡＡ１−ＡＡ２は、互いに結合した２種類のアミノ酸を表す。アミノ酸ＡＡ１は好ましくはＬｙｓ又はＡｒｇであるが、ＡＡ２は好ましくはＶａｌ又はＬｅｕである。ＡＡ１及びＡＡ２は、Ｎ末端からＣ末端への方向に沿って配列ＡＡ１−ＡＡ２において互いに結合している。好ましくはＡＡ１−ＡＡ２はＬｙｓ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｌｅｕを含む。
【００７９】
別の実施態様において、本発明によるＰＡＲ２アゴニストは、ＰＡＲ２を活性化することが知られているプロテアーゼである。例えば、トリプシン及びトリプターゼは、ＰＡＲ２の重要なアゴニストである。トリプシン及びトリプターゼはＰＡＲ２を切断して、繋留リガンドであるSLIGRL（配列番号１）（ラット及びマウスＰＡＲ２）を露出し、これはその後、切断された受容体の細胞外ループＩＩの保存領域に結合する。第ＶＩＩａ因子又は第Ｘａ因子などの特定の凝固因子もまた、ＰＡＲ２を活性化することができる。他の例としては、上皮細胞に由来するプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ、及び膵外性トリプシン酵素などが挙げられる。
【００８０】
別の実施態様において、ＰＡＲ２アゴニストは、抗体（この用語は抗体フラグメントを含む）からなり得る。特に、ＰＡＲ２アゴニストは、該抗体が受容体を活性化するようにＰＡＲ２に対して作られた抗体からなり得る。別の実施態様において、ＰＡＲ２アゴニストはアプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替物となっている分子クラスである。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を高い親和性及び特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載のように、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（SELEX）を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーにおいて、各メンバーは、最終的に化学的に修飾されたユニーク配列の鎖状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、用途及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法（Colas et al., 1996）によってコンビナトリアルライブラリーから選択された大腸菌（E.coli）チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって提示されるコンフォメーション的に拘束された抗体可変領域からなる。その後、上記されているようにＰＡＲ２に対するアプタマーを発生させた後、当業者はＰＡＲ２を活性化するものを容易に選択することができる。
【００８１】
本明細書において使用する「プロテアーゼ活性化受容体−１」、「プロテイナーゼ活性化受容体−１」又は「ＰＡＲ１」又は「ＰＡＲ−１」という用語は互換的に、トロンビンによる切断によってＮ末端繋留リガンドを露出させることによって活性化されるＧタンパク質共役受容体を指す。ＰＡＲ１はまた、「トロンビン受容体」及び「凝固第ＩＩ因子受容体前駆体」としても知られる。例えば、Vu, et al., Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin, et al, J Clin Invest (1992) 89(2):35I-55；及びＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００１９９２を参照されたい。ＰＡＲ１の細胞外ドメインへの繋留リガンドの分子内結合は、細胞内シグナル伝達及びカルシウム流入を誘起する。例えば、Traynelis and Trejo, Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5；及びHollenberg, et al, Can J Physiol Pharmacol. (1997) 75(7):832-41を参照されたい。典型的には、本発明によるＰＡＲ１アンタゴニストは、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子有機化合物、アプタマー、ペプデュシン、ポリヌクレオチド又は抗体であり得る。
【００８２】
１つの実施態様において、投与されたＰＡＲ１アンタゴニストは、ＰＡＲ１シグナル伝達活性を阻害する。これらの方法のいくつかは、ペプチド模倣体であるＰＡＲ１アンタゴニスト、例えば、ＲＷＪ−５６１１０又は（［α］Ｓ）−Ｗ−［（１Ｓ）−３−アミノ−１−［［｛フェニルメチル）アミノ］カルボニル］プロピル］−［α］−［［［［［１−（２，６−ジクロロフェニル）メチル］−３−（１−ピロリジニルメチル）−１Ｈ−インドール−６−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］−３，４−ジフルオロベンゼンプロパンアミドを使用する。
【００８３】
別の実施態様において、ＰＡＲ１アンタゴニストは低分子有機化合物である。「低有機分子」という用語は、一般的に医薬品に使用される有機分子と同等なサイズの分子を指す。この用語は、生物学的な巨大分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい低有機分子は、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。好ましい実施態様において、ＰＡＲ１アンタゴニストは、低有機分子ＳＣＨ−７９７９７であり、これは（Ｎ３−シクロプロピル−７−｛［４−（１−メチルエチル）フェニル］メチル）−７Ｈ−ピロロ［３，２−ｆ］キナゾリン−１，３−ジアミン）である。
【００８４】
さらに別の実施態様において、ＰＡＲ１アンタゴニストは、抗体（この用語は抗体フラグメントを含む）からなり得る。特に、ＰＡＲ１アンタゴニストは、該抗体がＰＡＲ１により媒介されるシグナル伝達活性（例えば、ＰＡＲ１により媒介されるインターロイキン分泌）に拮抗するようにＰＡＲ１に対して作られた抗体からなり得る。具体的なＰＡＲ１アンタゴニスト抗体は、当技術分野において開示されている。例えば、R. R. Vassallo, Jr. et al. "Structure-Function Relationships in the Activation of Platelet Thrombin Receptors by Receptor-Derived Peptides," J. Biol. Chem. 267:6081-6085 (1992) ("Vassallo, Jr. et al. (1992")); L.F. Brass et al., "Structure and Function of the Human Platelet Thrombin Receptor," J. Biol. Chem. 267: 13795-13798 (1992) ("Brass et al. (1992)"); 及びR. Kaufmann et al., "Investigation of PAR-1-Type Thrombin Receptors in Rat Glioma C6 Cells with a Novel Monoclonal Anti-PAR-1 Antibody (Mab COR7-6H9), J. Neurocytol. 27:661-666 (1998) ("Kaufmann et al. (1998)")（この両方がこの参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００８５】
本発明の別の態様は、Ａ型インフルエンザウイルスの複製を阻害するためのＰＡＲ４アンタゴニストに関する。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、被験体がＡ型インフルエンザウイルス感染の素因があるかどうかを試験する方法に関し、この方法は、該被験体からの生物学的試料を、以下について分析する工程を含む：
（ｉ）ＰＡＲ４遺伝子及び／又はその関連プロモーターにおける突然変異の存在の検出、及び／又は
（ｉｉ）ＰＡＲ４遺伝子の発現の分析。
【００８７】
本明細書において使用する「生物学的試料」という用語は、血液又は血清などの被験体からの任意の試料を指す。
【００８８】
ＰＡＲ４遺伝子の突然変異を検出するための典型的な技術は、制限断片長多型、ハイブリダイゼーション技術、ＤＮＡシークエンス、エキソヌクレアーゼ抵抗性、マイクロシークエンス、ｄｄＮＴＰを使用した固相伸張、ｄｄＮＴＰを使用した溶液中における伸張、オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基多型を検出するための方法、例えば動的なアレル特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーション連鎖反応、ミニシークエンス、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲと又は分子ビーコンと併用した単標識又は二重標識プローブを用いてのアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及びその他の技術を含み得る。
【００８９】
ＰＡＲ４遺伝子の発現の分析は、転写された核酸又は翻訳されたタンパク質の発現の検出のための、多種多様な周知の方法のいずれによってでも評価され得る。
【００９０】
好ましい実施態様において、ＰＡＲ４遺伝子の発現は、該遺伝子のｍＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ前駆体、例えば新生ＲＮＡの発現を分析することによって評価される。該分析は、被験体からの生物学的試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって評価され得る。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、サザン又はノザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、例えば定量ＰＣＲ（TaqMan）、及びプローブアレイ、例えばGeneChip（商標）（ＤＮＡアレイ（AFF YMETRIX）を含むがそれに限定されるわけではないハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅アッセイに使用することができる。
【００９１】
有利には、ＰＡＲ４遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（実験実施態様は米国特許第４，６８３，２０２号に示されている）、リガーゼ連鎖反応（BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991）、自家持続配列複製法（GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990）、転写増幅システム（KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989）、Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ（LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、又は任意の他の核酸増幅法による核酸増幅過程、そしてその後の、当業者に周知の技術を使用した増幅された分子の検出などの、核酸増幅の過程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子の検出のために、このような分子が非常に少量しか存在しない場合には、特に有用である。本明細書において使用する増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域（それぞれプラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆）にアニーリングすることができ、その間の短い領域を含む、１対の核酸分子として定義される。一般的には、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０から２００ヌクレオチド長の領域にフランキングする。適切な条件下及び適切な試薬を用いれば、このようなプライマーは、該プライマーによってフランキングされるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
【００９２】
別の好ましい実施態様において、ＰＡＲ４遺伝子の発現は、前記遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現を分析することによって評価される。該分析は、抗体（例えば放射標識された、発色団により標識された、フルオロフォアにより標識された、又は酵素により標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質との、又は、タンパク質／リガンド対（例えばビオチンストレプトアビジン）のタンパク質若しくはタンパク質のリガンドとの抗体コンジュゲート）、又はＰＡＲ４遺伝子から翻訳されたタンパク質に特異的に結合する抗体フラグメント（例えば一本鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を使用して評価され得る。
【００９３】
前記分析は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着検定法（ＲＩＡ）を含むがそれに限定されるわけではない、当業者には周知の多種多様な技術によって評価され得る。
【００９４】
本発明の方法は、被験体からの生物学的試料中のＰＡＲ２遺伝子の発現レベルを、対照における該遺伝子の正常な発現レベルと比較することを含み得る。正常な発現レベルと比較して、被験体の生物学的試料中の該遺伝子の有意により高い発現レベルは、患者が、Ａ型インフルエンザウイルス感染を発症する素因があることの徴候である。ＰＡＲ２遺伝子の「正常な」発現レベルは、Ａ型インフルエンザウイルス感染に全く罹患していない被験体の生物学的試料中の該遺伝子の発現レベルである。好ましくは、前記の正常な発現レベルは、対照試料（例えば、あらゆるＡ型インフルエンザウイルス感染に罹患していない健康な被験体からの試料）において評価され、好ましくは、数個の対照試料における該遺伝子の平均発現レベルにおいて評価される。
【００９５】
本発明によると、被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防は、呼吸器促迫症候群の治療又は予防ではない。
【００９６】
本発明はさらに以下の図面及び実施例によって説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するとは解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】ＩＡＶ感染の発病におけるＰＡＲ４の役割。Ａ：ＰＡＲ−４アゴニストを用いて処置された又は処置されていない、ＩＡＶに感染させたマウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させておらず、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させたマウスにおける肺ウイルス力価におけるＰＡＲ４アゴニストの投与の影響。
【図１Ｂ】ＩＡＶ感染の発病におけるＰＡＲ４の役割。Ａ：ＰＡＲ−４アゴニストを用いて処置された又は処置されていない、ＩＡＶに感染させたマウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させておらず、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させたマウスにおける肺ウイルス力価におけるＰＡＲ４アゴニストの投与の影響。
【図１Ｃ】ＩＡＶ感染の発病におけるＰＡＲ４の役割。Ａ：ＰＡＲ−４アゴニストを用いて処置された又は処置されていない、ＩＡＶに感染させたマウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させておらず、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させたマウスにおける肺ウイルス力価におけるＰＡＲ４アゴニストの投与の影響。
【図２Ａ】感染マウスの肺の炎症におけるＰＡＲ４アゴニストの役割。Ａ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の全タンパク質の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の炎症性サイトカインの漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの肺の組織病理学的検査。
【図２Ｂ】感染マウスの肺の炎症におけるＰＡＲ４アゴニストの役割。Ａ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の全タンパク質の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の炎症性サイトカインの漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの肺の組織病理学的検査。
【図２Ｃ】感染マウスの肺の炎症におけるＰＡＲ４アゴニストの役割。Ａ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の全タンパク質の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の炎症性サイトカインの漸進的変化。Ｃ：ＩＡＶに感染させ、ＰＡＲ４アゴニストを用いて処置された／処置されていない、マウスの肺の組織病理学的検査。
【図３Ａ】炎症及びウイルス複製におけるＰＡＲ４アンタゴニストの役割。Ａ：ＩＡＶに感染させ、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いて処置された／処置されていない、マウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させ、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の全タンパク質及び炎症性サイトカインの漸進的変化。
【図３Ｂ】炎症及びウイルス複製におけるＰＡＲ４アンタゴニストの役割。Ａ：ＩＡＶに感染させ、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いて処置された／処置されていない、マウスの生存率及び体重の漸進的変化。Ｂ：ＩＡＶに感染させ、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いて処置された／処置されていない、マウスにおけるＢＡＬ中の全タンパク質及び炎症性サイトカインの漸進的変化。
【００９８】
実施例：
ＰＡＲ４は、ＩＡＶ感染の発病に寄与する
ＩＡＶ感染の発病におけるＰＡＲ４の役割を調べるために、マウスに、種々なＰＦＵのＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／３４（非致死量又は５０％致死量）を接種し、処置せず放置するか又はＰＡＲ４活性化ペプチド（１００μg）を用いて刺激した。図１Ａに示されているように、ＰＡＲ−４活性化ペプチドを用いて処置されたマウスは、非処置対照マウスと比較して、死亡率及び体重減少を有意に増加させた。これとは対照的に、ＰＡＲ４アゴニストを用いての非感染マウスの処置は、マウスの生存率にも体重にも影響を及ぼさず、このことは、生存率及び体重減少に対するＰＡＲ４アゴニストの作用は、ＩＡＶ感染を必要としたことを示す（図１Ｂ）。従って、ＰＡＲ４活性化により、ＩＡＶ感染の発病性は増加した。
【００９９】
ＰＡＲ４及びウイルス複製
ウイルス複製におけるＰＡＲ４の役割についてのさらなる洞察を得るために、マウスを、ＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／３４（非致死量）を用いて感染させ、ＰＡＲ４アゴニスト（１００μg）を用いて処置したか又は処置しなかった。その後、感染ウイルス力価を、感染マウスの肺において評価した。図１Ｃに示されているように、ＰＡＲ４アゴニストで処置されたマウスと処置されなかったマウスの間で接種から３日後及び６日後に肺のウイルス力価における有意な差異は観察されなかった。従って、ＰＡＲ４アゴニストの有害な作用は、肺におけるウイルス複製とは独立している可能性が高かった。
【０１００】
ＰＡＲ４アゴニストは、感染マウスの肺の炎症を増加させる
重度の炎症はＩＡＶの発病の主原因となり得るので、その後、本発明者らは、ＩＡＶ感染によって誘発された炎症応答におけるＰＡＲ４アゴニストの役割を調べた。この目的を達成するために、ＰＡＲ４アゴニスト（１００μg）で処置された又は処置されなかった感染マウス（非致死量）のＢＡＬ液（気管支肺胞洗浄液）中の全タンパク質の量を評価した。非処置マウスと比較して、ＰＡＲ４アゴニストによる処置は、感染から６日後にＢＡＬ中の全タンパク質だけでなく（図２Ａ）、ＩＬ−６、ＩＬ１−β、ＭＩＰ−２応答のレベル（図２Ｂ）も有意に増加させる。この差異は、ＩＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ及びＫＣサイトカインについては観察されなかった。また、組織病理学的検査は、ＰＡＲ４アゴニストによる処置が、非処置マウスと比較して、処置された感染マウスからの肺中の細胞浸潤液を増加させたことを示した（図２Ｃ）。従って、ＰＡＲ４の活性化は、感染マウスの肺における特定のサイトカインのＩＡＶにより誘発された産生を増加させ得る。
【０１０１】
ＰＡＲ４アンタゴニストは、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染から防御する
本発明者らは次に、ＰＡＲ４シグナル伝達の薬理学的阻害が、ＩＡＶ感染の経過を変化させ得るかどうかを調べた。この目的を達成するために、本発明者らは、ＩＡＶ感染の経過に対する、ＰＡＲ４アンタゴニストのペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０の効果を調べた。マウスを致死量のＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（４０又は６０％致死量）に感染させた場合、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０（１０μg）を用いての処置は、体重減少及び死亡からマウスを防御した（図３Ａ）。従って、ＰＡＲ４の遮断は、マウスをＩＡＶ感染から防御し、これは、ＰＡＲ４がこのモデルにおいてＩＡＶの発病に寄与するという考えと矛盾がない。
【０１０２】
炎症及びウイルス複製は、ＰＡＲ４アンタゴニストによって減弱する
本発明者らはその後、ＰＡＲ４シグナル伝達の遮断は、インビボにおいてＩＡＶにより誘発された炎症の低減をもたらすかどうかを決定した。マウスを、致死量のＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／３４に感染させ、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いて処置したか又は処置せず、そしてＢＡＬを回収した。図３Ｂに示されているように、ペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０を用いての処置は、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、接種から６日後（ただし３日後ではない）のＢＡＬ中の全タンパク質のレベルだけでなく、ＩＬ−６、ＩＬ１−β、ＭＩＰ−２、及びＩＦＮ−γのレベルも有意に減少させた。これとは対照的に、感染マウスのＢＡＬ中において、ＲＡＮＴＥＳ及びＫＣのレベルは、どのようなペプデュシンｐ４ｐａｌ−１０処置であろうと類似していた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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