(57)【要約】  共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルであって、（ｉ）デキストランと、（ｉｉ）修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とに基づくものであり、当該ヒドロゲル中では前記デキストランと、前記修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とが、リン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステル共有結合により互いに結合されている、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。【特許請求の範囲】
【請求項１】
共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルにおいて、
（ｉ）デキストランと、（ｉｉ）修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とに基づくものであり、当該ヒドロゲル中では前記デキストランと、前記修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とが、リン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステル共有結合により結合されている、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項２】
請求項１のヒドロゲルにおいて、
前記ヒアルロン酸及び／又はその塩は、トリメタリン酸ナトリウムによって修飾されたヒアルロン酸及び／又はその塩である、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項３】
請求項２のヒドロゲルにおいて、
前記トリメタリン酸ナトリウムによって修飾されたヒアルロン酸及び／又はその塩におけるリン酸濃度は、０．０１から４mEq/gの間であり、より望ましくは、０．１から２mEq/gの間であることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１つのヒドロゲルにおいて、
前記ヒドロゲルにおけるリン酸濃度は、０．１から３mEq/gの間であり、より望ましくは、０．１から２mEq/gの間であることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項５】
デキストランと、修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とに基づく共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルの調製方法において、
（ａ）デキストラン溶液を準備する。
（ｂ）前記デキストラン溶液に、水酸化ナトリウムのような水酸化アルカリ溶液を加えることにより、前記デキストランの少なくとも一つの水酸基を活性化して、活性化デキストラン溶液を得る。当該ステップ（ｂ）で加える水酸化アルカリの濃度は、０．１Ｍから１Ｍの間であり、望ましくは０．１Ｍから０．５Ｍの間である。
（ｃ）前記活性化デキストラン溶液に、トリメタリン酸ナトリウムを加える。
（ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記溶液に、修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩を加える。
の各ステップを行い、
前記ステップ（ａ）から（ｄ）は、１８から２５℃の間で行われることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルの調製方法。
【請求項６】
請求項５の方法において、
前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は同時に行われ、前記トリメタリン酸ナトリウムと、前記修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とは、前記ステップ（ｂ）で得られた前記溶液に、同時に加えられることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルの調製方法。
【請求項７】
請求項５又は６の方法において、
前記ステップ（ｄ）にて加える前記ヒアルロン酸及び／又はその塩は、トリメタリン酸ナトリウムによって修飾されたヒアルロン酸であることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルの調製方法。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか１つの方法において、
前記修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩は、粉末の形で加えられることを特徴とする、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルの調製方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか１つのヒドロゲル、又は、請求項５から８のいずれか１つ
の方法により得られるヒドロゲルにおいて、
単独で、もしくは幹細胞であっても良い細胞と共に細胞治療のために移植する薬剤、湿潤状態で局所的に適用する薬剤、活性分子及び有効成分を送達する薬剤、又は、再生医療に用いる薬剤の調製のための共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項１０】
請求項９のヒドロゲルにおいて、
人及び／又は動物の再生医療用薬剤の調製に用いる共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項１１】
請求項９又は１０のヒドロゲルにおいて、
活性分子及び有効成分は、以下の
・線維芽細胞成長因子（FGFs）、及び／又は
・血小板由来性成長因子（PDGFs）、及び／又は
・形質転換増殖因子（TGFs）、及び／又は
・血管内皮成長因子（vEGF）、及び／又は
・骨誘導性成長因子（BMPs）
から選ばれている、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか１つのヒドロゲルを、骨誘導能及び／又は骨伝導能のために用いる、使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸系ヒドロゲルの分野に関係する。特に、ヒアルロン酸をデキストランと共架橋することで得られるリン酸化ヒドロゲルと、その調製方法に関係する。更に、本発明は、当該ヒドロゲルを有効成分のカプセル化及び徐放に利用すること、人間及び動物の再生医療における細胞に利用することにも関係する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナン又はヒアルロン酸（CAS番号9004-61-9、本文書中ではHAと略記することもある）は、グリコサミノグリカン類に属する。二糖のポリマー、より詳しくは非硫酸性の直鎖グリコサミノグリカンであって、グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンとが交互のベータ-1,4及びベータ-1,3グリコシド結合により結合した繰り返し単位を有する（the journal Progress in Histochemistry & Cytochemistry, 29 (2): 1-81, 1994によるTammi 他の公表、"Hyaluronan metabolism in skin"を参照せよ）。
【０００３】
ヒアルロン酸は、多くの哺乳類の組織、より具体的には細胞外基質において見いだされる。その水分子を保持する能力により、主な役割は組織の水分補給である。その分子質量が約２MDaを越え、質量分率が０．１％を越えると、ヒドロゲルを形成する。その分子質量及び質量分率から、組織によって、例えば関節、特に関節液中には、ヒドロゲルの形で存在する。ヒアルロン酸は他の役割も果たす。例えば、細胞移動、組織の分化、血管新生及び免疫細胞の制御等の生物学的現象の制御である。従って、従来技術では、この分子の大きく異なる機能を分子量に基づいて帰属している。
【０００４】
ヒアルロン酸は、体内でヒアルロニダーゼと呼ばれるグループの酵素により分解される（Life Sciences 80 (2007), p. 1921-1943にて公開された記事、"The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase: A biological overview" by K.S. Girish and K. Kemparajuを参照せよ）。この過程には他の酵素が関係する。
【０００５】
ヒアルロン酸系のヒドロゲルは既知であって、数多く医学的に用いられており、特に、皮膚の再生、美容整形及び皮膚病学において注射用に、又は、整形外科において軟骨及び骨関節の再生（例えば、膝の関節内補充療法）で用いられている。また、研究及び細胞治療のための細胞培養培地、化学療法にも用いられている。
【０００６】
調製及び使用の形態により、注射用のヒアルロン酸系ヒドロゲルは、３つの特徴的な種類に分類可能と思われる。
・「伝導性(conductive)」ヒドロゲル、単独で又は他のポリマーと共に架橋されたヒアルロ酸（ＨＡ）であって、美容整形手術において小じわを埋めるため又は関節内補充療法（恒常性の回復）の際に使用される。
・「誘導的(inductive)」ヒドロゲル、成長因子及び／又は他のいわゆる生理活性分子を含む架橋されたヒアルロン酸であって、生体内（in situ）送達に用いられる。
・複数の構成物、つまりポリマー、タンパク質及び細胞を含む細胞移植用のヒドロゲル。
【０００７】
人間又は動物用の薬品として用いるためには、ヒドロゲルは数多くの基準を満たさなければならない（M.N. Collins and C. Birkinshaw, "Hyaluronic acid base scaffolds for tissue engineering - A review", Carbohydrate Polymers 92 (2013), 1262-1279; 2013; G.D. Prestwich, "Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine", J. Controlled Release 155 (2011), 193-199等を参照せよ）。例えば、ヒドロゲルは生分解性であり、生物適合性を備え、吸収性であることが要求され、生理学的な条件において使用が容易でなければならない。
【０００８】
通常、「生物適合性」との語は、非生物材料が生物のシステムに接触して、ホストに対する望ましい反応を伴う特定の機能を果たすことを意味する。
【０００９】
コラーゲンは、糖タンパク質類であり、吸収性で且つ注射可能な充填製品として、長い間用いられてきた。しかしながら、コラーゲンには不利な点がある。つまり、アレルギー反応が起こるおそれ、及び生体内（in vivo）で急速に分解するおそれがある。
【００１０】
これらの理由で、コラーゲンに代えてヒアルロン酸塩が使われるようになった。ヒアルロン酸塩は、その起源及び調製方法（動物、バイオテクノロジー）によらずアレルギー反応を起こさないし、生物適合性がある。
【００１１】
今日、ヒアルロン酸のヒドロゲルは、特にその塩及び／又は誘導物は、化粧品の分野において非常に多く用いられており、小じわ及び皮膚の疵の補填で特に顕著である。
【００１２】
ヒアルロン酸及びその塩自体を単独でヒドロゲルの製造に用いても良いが、他のポリマー（コラーゲン、ゼラチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、その他）と共に用い、他の構成物との相乗効果を促進して、より確実に細胞外基質を模倣することもできる。
【００１３】
ヒアルロン酸は、鎖に沿ってカルボキシル基、ヒドロキシル基及びアセトアミド基を有するので、化学的に修飾可能である。これらの基は、一方では架橋に、他方では新しい生物学的機能を提供するか、又は、元来の生物学的及び／又は物理化学的性質を改善するために用いることができる。架橋は、２つの多糖鎖の間及び／又は同じ鎖の２つの箇所の間に結合を作ることを伴う。その結果、粘度及び／又は分子質量が増加し、他の物理的及び物理化学的性質の変更を促進する。
【００１４】
従って、ヒアルロン酸からヒドロゲルを調製するには数多くの可能性がある。
【００１５】
文献FR 2918377 には、少なくとも１つの強く架橋した第１の多糖ゲルと、少なくとも１つの弱く架橋した第２の多糖ゲルとを含み、第１の多糖ゲルは第２の多糖ゲルに対して共有結合している結合性の共架橋ゲルが記載されている。強く架橋したゲル及び弱く架橋したゲルは、ヒアルロン酸ナトリウム系であり、架橋剤は1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE)）であることが好ましいとされている。
【００１６】
文献US 6586493には、架橋基により置換された部分的に不飽和の多糖と、非血管新生性のヒアルロン酸との混合物から得られたヒドロゲルが記載されている。混合物の架橋は、フリーラジカルである重合開始材、特にアセトフェノン（光開始材）を加えることで行われる。この方法には大きな欠陥がある。というのは、フリーラジカル重合の結果生じる多数の分解生成物が、生じたゲル中に補足される場合があるからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、多糖系の新規なヒドロゲルであって、分解の増加に対する優れた抵抗を有し、細胞毒性が無く、注射可能であり、生物適合性であって、美容手術、皮膚科、眼科、軟骨及び骨関節再生の整形外科、人間及び動物の再生医療に使用可能なヒドロゲルの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルであって、（ｉ）デキストラン及び（ｉｉ）修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩に基づいており、デキストラン及びヒアルロン酸（及び／又はその塩、修飾されていても良い）は、リン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステルにより結合されている、ヒドロゲルに関する。
【００１９】
ヒアルロン酸又はその塩は、トリメタリン酸ナトリウムにより修飾されたホスホリルヒアルロン酸（及び／又はその塩）であるのが望ましい。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、トリメタリン酸ナトリウムにより修飾されたヒアルロン酸（及び／又はその塩）のリン酸塩濃度は、０．０１mEq/gから４mEq/gの間、より望ましくは０．１mEq/gから２mEq/gの間である。
【００２１】
本発明の他の実施形態では、ヒドロゲルのリン酸塩濃度は０．１mEq/gから３mEq/gの間、より望ましくは０．１mEq/gから２mEq/gの間である。
【００２２】
また、本発明は、共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルを、デキストランと、修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とに基づいて調製する方法に関し、そのステップで、
（ａ）デキストラン溶液を準備する。
【００２３】
（ｂ）前記デキストラン溶液に水酸化アルカリ溶液、例えば素酸化ナトリウムを加えることにより、デキストランの少なくとも１つの水酸基を活性化して、活性化デキストラン溶液を得る。
【００２４】
（ｃ）前記活性化デキストラン溶液に、トリメタリン酸ナトリウムを加える。
【００２５】
（ｄ）修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩を、ステップ（ｃ）にて得た溶液に加える。の各ステップを行う。
【００２６】
望ましくは、本方法のステップ（ｃ）及び（ｄ）は同時に行い、トリメタリン酸ナトリウムと、修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩とを、ステップ（ｂ）にて得た溶液に同時に加える。
【００２７】
望ましくは、本方法のステップ（ａ）から（ｄ）は、１８℃から２５℃の間の温度にて行う。
【００２８】
本方法のある実施形態では、ステップ（ｂ）にて加える水酸化アルカリの濃度は０．１Ｍから１Ｍの間であり、望ましくは０．１Ｍから０．５Ｍの間である。
【００２９】
本方法の別の実施形態では、ステップ（ｄ）にて加えるヒアルロン酸及び／又はその塩は、トリメタリン酸ナトリウムによって修飾されたヒアルロン酸である。
【００３０】
望ましくは、修飾されていても良いヒアルロン酸及び／又はその塩は、粉末の形で加えられる。
【００３１】
本発明は、本発明の方法により得られるヒドロゲルにも関係する。本発明の方法により得られたヒドロゲルにより、細胞治療のために単独で又は細胞（幹細胞であっても良い）と共に移植する薬剤、湿潤状態で局所的に適用する薬剤、活性分子及び有効成分、より具体的には成長因子、望ましくは繊維芽細胞成長因子（fibroblast growth factors (FGFs)）、血小板由来性成長因子（platelet derived growth factors (PDGFs)）、形質転換増殖因子（transformation growth factors (TGFs)）、血管内皮成長因子（vascular endothelium growth factors (vEGF)）、骨誘導性成長因子（osteoinductive growth factors (BMPs)）から選ばれた成長因子を送達するための薬剤、又は、再生薬剤、より具体的には人間及び／又は動物の再生薬剤に用いられる薬剤が調製される。
【００３２】
本発明の最後の目的は、本発明のヒドロゲルを、骨誘導能（osteoconductivity）及び／又は骨伝導能（osteoinductivity）のため、つまり、骨の再生のために用いることである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図１〜図８は、本発明の所定の面を図示するものである。
【図１】図１は、赤外線スペクトル（ＩＲ）であって、本発明（例１）の方法における反応混合物の赤外線プロフィールの変化を、ヒアルロン酸とトリメタリン酸ナトリウムを同時に添加した時点から２４時間について示す（曲線ａ：添加後２２分、曲線ｂ：添加後３２分、曲線ｃ：添加後４２分、曲線ｄ：添加後５２分、曲線ｅ：添加後１２０分、曲線ｆ：２５℃にて２４時間後得たゲル）。ｘ軸はｃｍ−１にて表す波数であり、ｙ軸は透過度（％、無次元）である。
【図２】図２は、水酸化アルカリ濃度及びトリメタリン酸ナトリウム濃度がデキストランの共架橋に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明に従って調製した共架橋ヒドロゲルの２４時間後の３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、３規定のＮａＯＨの存在下、２５℃におけるトリメタリン酸ナトリウムの２つの３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５は、強酸性媒体（４ＮのＨＣｌ）中における加水分解によって脱水されたゲルの試料中のリン酸量を決定できる３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。
【図６】図６は、トリメタリン酸ナトリウムにより修飾されたヒアルロン酸（ＨＨ）がヒト皮膚線維芽細胞の分裂増殖に与える影響を、濃度及び修飾の程度（450nmの分光測光により読み取られる）の関数として示すグラフである。
【図７】図７は、ＮａＣｌ溶液中で２４時間、本発明のヒドロゲルと接触させた後に、ヒドロゲルに吸収されなかった線維芽細胞成長因子の質量分率を比較するグラフである。
【図８】図８は、本発明のヒドロゲルがセルの分裂増殖、特に、"循環血管内皮前駆細胞(Circulating endothelial progenitor)”呼ばれる幹細胞の分裂増殖に与える影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（定義）
本発明の開示において、「ヒアルロン酸」との語は、ヒアルロン酸塩を含む。
【００３５】
「リン酸化ヒドロゲル」は、ヒドロゲルであって、その化学構造が少なくとも一つのリン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステル共有結合を含む。
【００３６】
「共架橋剤」の語は、二つの異なる多糖の間に共有結合を形成することのできる試薬を意味し、多糖は、より具体的には、修飾されていても良いヒアルロン酸、若しくはその塩、又はデキストリンである。共架橋剤は、同じ多糖の架橋を行うことで知られる架橋剤から選ばれる。従って、本発明の場合には、「共架橋剤」及び「架橋剤」の語は同じ化学物質（トリメタリン酸ナトリウム等）を指す。
【００３７】
「共架橋多糖ヒドロゲル」は、共有結合により結合された少なくとも二つの多糖が含まれるヒドロゲルを指す。
【００３８】
「共架橋リン酸化多糖ヒドロゲル」は、リン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステル共有結合により結合された少なくとも二つの多糖が含まれるヒドロゲルを指し、以下に示すとおりである（Ｒ１及びＲ２は、順に、第１及び第２の置換多糖を示す）。
【００３９】
【化１】
2016517906.tif 000002
【００４０】
「修飾されたヒアルロン酸」（本文書中ではＨＨの略記も行う）は、様々な有機基による置換が（少なくとも部分的に）行われたヒアルロン酸（又はその塩）を指す。
【００４１】
以下の本発明の詳細な説明において、言及される反応機構は仮説及び発見的（heuristic）なモデルに過ぎず、発明の範囲を限定するものではない。
【００４２】
（詳細な説明）
本発明に関係して、出願人は、修飾されていても良いヒアルロン酸又はその塩から、活性化デキストリンと混合された状態で、トリメタリン酸ナトリウムを架橋剤として、生物化学的性質の改善された共架橋リン酸化ヒドロゲルを得られることを実証した。出願人は、本発明の目的が、共架橋リン酸化ヒドロゲルを得ることで実現されることを実証し、これは以下に詳しく述べる特定の最適化された方法によって得られる。
【００４３】
本発明によると、ヒアルロン酸は、生理学的に許容できる塩の形で使用されても良いし、修飾されていても良い。
【００４４】
第１の面によると、本発明は、共架橋リン酸化ヒドロゲルの調製方法に関し、当該方法は、下記の各ステップを含む。
【００４５】
（ａ）デキストラン溶液を準備する。
【００４６】
（ｂ）前記デキストラン溶液に、水酸化アルカリ（例えば水酸化ナトリウム）溶液を加えることにより、デキストランの少なくとも一つのヒドロキシル基を活性化する。このステップの結果、前記少なくとも一つのヒドロキシル基がアルコラート基に変わり、デキストランは「活性化デキストラン」に変わる。これは次の反応による。
【００４７】
【化２】
2016517906.tif 000003
【００４８】
（ｃ）前記活性化デキストラン溶液に、トリメタリン酸ナトリウムを加える。このステップにより、活性化デキストランの架橋が行われる。これは、デキストランのアルコラート基の酸素が、トリメチルホスフェートのリンに求核攻撃することで、以下の反応スキーム１．１のように行われる。以下の反応スキームによる架橋の際には、複数の反応が生じることがある（DexONaから伸びる矢印は、デキストランのアルコラート基の酸素による、トリメチルホスフェートのリンに対する求核攻撃を象徴している）。
【００４９】
――反応スキーム１：活性化デキストランにおける有りうる架橋反応――
【００５０】
【化３】
2016517906.tif 000004
【００５１】
【化４】
2016517906.tif 000005
【００５２】
（ｄ）ヒアルロン酸（ＨＡ）、選択として修飾されたヒアルロン酸（ＨＨ）又はその塩を、ステップ（ｃ）で得られた溶液に加える。好ましくは、この追加は、ヒアルロン酸（修飾されていても良く、それらの塩でも良い）の溶液ではなく粉末で行う。ヒアルロン酸（ＨＡ又はＨＨ）の追加の間、及び、ヒドロゲルの形成の間、反応媒体は攪拌し続ける。このステップ中の温度は、１８℃から２５℃の間であることが望ましい。
【００５３】
このステップ（ｄ）により、活性化デキストランと、修飾されていても良いヒアルロン酸又はその塩との共架橋が起こり、共架橋リン酸化ヒドロゲルが形成される。混合物は、ヒドロゲルが得られるまで攪拌する。反応時間は、典型的には、ヒドロゲルが形成されるまで１０から４０分の間（望ましくは２０から３０分の間）である。この後、固定されたヒドロゲルは室温（典型的には１８〜２５℃）に置かれ、反応を終了させる。フーリエ変換赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）により分析すると、多糖鎖上にリン酸エステルが存在することが分かる（図１と、例中に示された説明とを参照）。
【００５４】
従って、本発明によるリン酸化ヒドロゲルは、第１の多糖（デキストラン）と、第２の多糖（修飾されていても良いヒアルロン酸又はその塩）とを含み、これらの前記多糖はリン酸ジエステル及び／又はポリリン酸ジエステル共有結合により、互いに結合されている。
【００５５】
分子式がNa3P3O9であるトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＰＭ：Sodium trimetaphosphate、CAS 番号7785-84-4）は人体に無毒であり（例えば、K. Woo and P.A. Seib, Carbohydrate Polymers 1997 (33), 263-271 を参照）、食品産業で一般に用いられている。トリメタリン酸ナトリウムは求核攻撃を受けてSTMP環が開くことがある。多糖アルコラートのトリメタリン酸ナトリウムに帯する求核攻撃を説明する反応メカニズムは、科学文献にて提案されている（Carbohydrate Research 342 (2007) p. 943-953にて公開されてた記事"High-resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy studies of polysaccharides cross-linked by sodium trimetaphosphate: a proposal for the reaction mechanism" by S. Lack et al. を参照）。
【００５６】
架橋剤及び共架橋剤としてトリメタリン酸ナトリウムを用いることは、本発明の方法において主要な点である。というのは、これによって水に不溶な架橋リン酸化多糖が得られるからである。加えて、この化学薬品の特定の使い方と、修飾されていても良いヒアルロン酸又はその塩及びデキストランの間の相乗効果とにより、本発明の共架橋リン酸化多糖ヒドロゲルは、単純に架橋されたヒアルロン酸ヒドロゲル（つまり、他の多糖を加えること無しに、ヒアルロン酸がそれ自体と架橋されている）よりも、ヒアルロニダーゼ（体内でのヒアルロン酸の分解を担う酵素）による酵素分解に対する耐性に優れている。最後に、本発明によるヒドロゲルは、細胞増殖に関して非常に明瞭に改善されている。
【００５７】
共架橋リン酸化ヒドロゲルを調製する条件について、以下に示す。
【００５８】
初めに、トリメタリン酸ナトリウムを用いて、架橋デキストラン系のヒドロゲルを作成する。デキストランの架橋反応は、２ステップで起こる。第１ステップでは、デキストランの最も反応性が高いヒドロキシル基（デキストランのＣ２におけるヒドロキシル基）が活性化されてデキストランアルコラート（本文献では活性化デキストランとも呼ばれる）が形成され、それに続いて、トリメタリン酸ナトリウムに対するデキストランアルコラートの求核攻撃が起こる（上記の反応スキームを参照）。
【００５９】
架橋反応の際に、副反応が観察される。それらは、特に、形成されたリン酸エステル架橋の塩基性加水分解であり、ヒドロゲルが可溶性となる（下記の反応スキームno.2を参照）。他の副反応は、トリメタリン酸ナトリウムが塩基性分解によってトリポリリン酸ナトリウム（TPP：sodium tripolyphosphate）となる反応である（下記の反応スキームno.3を参照）。これらの副反応は、本発明の場合には望ましくない。
【００６０】
――反応スキーム２：リン酸架橋の塩基性加水分解の例――
【００６１】
【化５】
2016517906.tif 000006
【００６２】
――反応スキーム３：トリメタリン酸ナトリウムがトリポリリン酸（ＴＰＰ）となる塩基性分解――
【００６３】
【化６】
2016517906.tif 000007
【００６４】
これらの副反応を制限するために、発明者は、水酸化アルカリ及びトリメタリン酸ナトリウムＳＴＭＰの濃度について最適な範囲を発見した（図２を参照：水酸化アルカリ濃度は、図２では、デキストランの活性化段階における水酸化アルカリ濃度として示されている。ＳＴＭＰ濃度は、反応媒体（デキストラン＋水酸化アルカリ＋ＳＴＭＰ）におけるＳＴＭＰ濃度によって示されている）。ヒドロキシド濃度は、好ましくは０．５Ｍと５Ｍとの間であり、これによりデキストランのヒドロキシル基を活性化する。望ましい実施形態では、前記の活性化段階におけるヒドロキシド濃度は０．５Ｍから１Ｍの間である。同様に、反応媒体中でのＳＴＮＭＰ濃度は、望ましくは０．２６Ｍから１Ｍの間であり、これは、０．１から０．４の間である［ＳＴＭＰ］／［ＯＨ］比に対応する。実際、ヒドロキシド濃度が５Ｍを越えると、リン酸架橋の塩基性加水分解が促進されて、デキストランの架橋が損傷する。更に、ＳＴＭＰ濃度が０．２６Ｍを下回ると架橋は観察されず、濃度が１Ｍを越えると、ＳＴＭＰは水に不溶となる。
【００６５】
望ましくは、本発明による方法は、１８℃から２５℃の間で行われる。実際のところ、反応媒体の温度が上昇すると、溶液のゲル化時間を短くする影響があるとしても、形成されたリン酸架橋の加水分解が促進される。これが、形成されたリン酸架橋の加水分解を抑制するために、本方法を室温で行うことがより望ましい理由である。１８℃を下回ると、架橋反応が非常に遅くなる。
【００６６】
説明した調製方法において、異なる各ステップは塩基性の媒体中で行われ、そのｐＨ値は実質的に同じである。各ステップは、ｐＨが８と１４の間、より望ましくは８と１０の間の塩基性媒体中で行われる。
【００６７】
本発明による特に有利な実施形態では、修飾されていても良いヒアルロン酸マスアアその塩が、トリメタリン酸ナトリウムと同時に（且つ別々に）反応媒体に加えられる。このように、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）とは組み合わせられる。出願人は、最も良いゲル化の結果をこの方法によって観測した。実際、塩基性媒体中におけるヒアルロン酸（又は修飾されたヒアルロン酸）の安定性に関しては、それをトリメタリン酸ナトリウムと同時に加えるのが有利である。このＨＡ及び／又はＨＨの追加は粉末の形で行うのが望ましく、トリメタリン酸ナトリウムについても同じである。これにより、架橋が増加すると共に、溶液の形で追加する場合に対して副反応の程度が小さくなる。粉末の形で行う（より望ましい）か溶液の形で行う（望ましさでは劣る）かのどちらの場合についても、一方でＨＡ及び／又はＨＨ、他方でトリメタリン酸ナトリウムの追加は、異なる場所で行うのが望ましい。つまり、別々の各粉末及び／又は各溶液の追加は、反応混合物の異なる場所において行う。
【００６８】
望ましくは、本発明による方法にて用いるヒアルロン酸（ＨＡ及び／又はＨＨ）は、１０から５０００ｋＤａの間、望ましくは１０から１２００ｋＤａの間、より望ましくは２５から１２００ｋＤａの間の分子質量を有する。この選択は、修飾されていても良く且つリン酸化されたヒアルロン酸を含む本発明によるヒドロゲルの使用目的により、その分子質量ごとの生物学的効果によって動機づけられる。つまり、
・分子質量が小さい、つまり５０ｋＤａ未満、望ましくは２５から５０ｋＤａの間、より望ましくは１０から５０ｋＤａの間であるヒアルロン酸は、血管新生効果を生じさせるために望ましい。
・分子質量が５０から３００ｋＤａの間のヒアルロン酸は、細胞の増殖及び移転のために望ましい。
・分子質量が８００ｋＤａを越えて５０００ｋＤａまでのヒアルロン酸は、組織の保湿のために望ましい。
【００６９】
望ましくは、本発明による方法にて用いられるデキストランは、１０ｋＤａから２０００ｋＤａの間、望ましくは４０ｋＤａから５００ｋＤａの間の分子質量を有する。これは、本発明によるヒドロゲルの使用目的に伴う理由と同じである（これによる有利さは、ＨＡ及びＨＨの分子質量に関するものに比べれば強くないとしても）。
【００７０】
特に望ましい実施形態において、本発明による方法のステップ（ｄ）［このステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）と同時に行っても良い］において加えるヒアルロン酸は、トリメタリン酸ナトリウムによって修飾されている。この修飾ヒアルロン酸の合成は、２ステップで行われる。活性化と呼ばれる第１のステップでは、ヒアルロン酸の水酸基を活性化するために、水酸化ナトリウム水溶液を加える。この活性化段階は、ｐＨ８未満の塩基性で行うのが望ましい（さもないと、新しい副反応、つまり環状トリメタリン酸の自発的開環が起こることがある）。その後、修飾と呼ばれるステップを、トリメタリン酸ナトリウムをアルコレートの形でヒアルロン酸溶液に追加することにより行う。
【００７１】
本発明による方法のステップ（ｄ）の後、修飾され、リン酸化されたヒアルロン酸を、当業者なら熟知する定型の方法で純化及び乾燥する。特に、修飾ヒアルロン酸はエタノール（又はアセトン）中で沈殿させて、共架橋剤の微量残渣分を除去した後、浸透水に対して透析する。これは、ｐＨ及び電気伝導度が浸透水に近くなるまで行う（ｐＨ５．６＝及び電気伝導度＜３０μｓ／ｃｍ）。このように純化したヒアルロン酸は、凍結乾燥しても良い。
【００７２】
発明者は、本発明によるヒドロゲルのヒアルロニダーゼによる酵素分解は、デキストラナーゼによる酵素分解よりも速く、それぞれの酵素による分解は、ヒドロゲルが強固に共架橋されていると遅くなる。
【００７３】
本発明のヒドロゲルを細胞培地として（特に細胞治療の研究において）用いるためには、重要なのは、リン酸によるヒアルロン酸の修飾の程度である。細胞増殖の改善は、リン酸含量が０．０１ｍＥｑ／ｇになって初めて観測される。含量は、望ましくは少なくとも０．０５ｍＥｑ／ｇであり、より望ましくは少なくとも０．１ｍＥｑ／ｇである（単位“ｍＥｑ／ｇ”は、“ミリ当量／ｇ”とも呼ばれ、ミリモル／生成物のグラム数に相当する）。
【００７４】
本発明による生成物は、数多くの利点を有し、特に、以下の性質に優れている：物理化学的性質、生体適合性、移植、酵素分解への耐性、細胞毒性の無いこと。この結果は、ヒアルロン酸とデキストランとの共架橋を最適化し、共架橋リン酸化多糖に基づくヒドロゲルを調製したことにより得られた。
【００７５】
我々は、例として、本発明によるヒドロゲルの使用目的を幾つかここに示す。
【００７６】
本発明によるヒドロゲルを細胞治療に用いるには、本発明によるヒドロゲルを調製し、適切な細胞栄養物（アミノ酸等）及び成長因子を組み入れる。この生成物は、凍結乾燥及び／又は凍結された形で保存することができる。凍結乾燥された生成物を再水和した後、ヒドロゲルは、局所的に（例えば、創傷被覆材（dressing）として）又は注射の形で用いられる。
【００７７】
本発明によるヒドロゲルを有効成分の送達システムに用いるには、本発明によるヒドロゲルを粉末の形で調製し、水和し（生理学的漿液、又は、所定量の有効成分、例えば、成長因子及び／又は抗炎症剤及び／又は抗生物質又は多血小板血漿と共に、所望の粘ちょう度（consistency）を有するヒドロゲル（飽和ゲル）を得るために）、生成物を目的の場所（例えば、微小骨折、微小裂傷、腱又は筋肉の裂傷）に適用する。
【００７８】
本発明の他の目的、特徴及び長所を以下の例において説明するが、これはどのような形にも発明を限定するものではない。
【００７９】
――例１：ヒアルロン酸（ＨＡ）及びデキストランを用いた共架橋ヒドロゲルの調製（本発明による方法）――
（ｉ）０．５ＭのＮａＯＨ溶液によるデキストランの水酸基の活性化
０．９グラムのデキストラン１００（CAS 番号 9004-54-0; 100,000 g/mol）を５０mlの水に入れて溶液とした後、５mlの水酸化ナトリウムＮａＯＨ、０．５Ｍを当該溶液に加えた。混合物を３０分間、室温で攪拌し続けた。
【００８０】
（ｉｉ）０．１グラムのヒアルロン酸（５００Ｋ、分子量４００〜６００ｋＤａ、ＨＡ／（ＨＡ＋デキストラン）の比＝１０％）と、１．０２グラムのトリメタリン酸ナトリウム（架橋剤として使用される）とを同時にステップ（ｉ）の溶液に追加した（粉末の形で、空間的には場所を空けて）。
【００８１】
混合物を室温にてゲル化するまで攪拌し続けた後、得られたゲルを２５℃に５時間維持した。
【００８２】
（ｉｉｉ）ヒドロゲルの洗浄、純化及び乾燥
ヒドロゲルをステンレス鋼の篩の上で粉末化し、アセトン溶液中に集めた。ｐＨを観測しながら、水中での洗浄を複数回、洗浄水についてｐＨ＜７が得られるまで行った。洗浄ステップを行う度に、セルロースアセテート濾紙を用いてブフナー漏斗上でヒドロゲルを濾過した。最後にアセトン洗浄を行い、ヒドロゲルを真空下、６０℃の炉で乾燥した。
【００８３】
（ｉｖ）化学的特性評価
ＩＲ分光法による、ヒアルロン酸（５００Ｋ、分子量６００Ｄａ）及びデキストランＴ１００の共架橋反応の変化を、図１に示す。実験条件は次の通りである。
【００８４】
Perkin Elmer Instruments社のＦＴ−ＩＲ、“Spectrum One”分光装置を用い、分析はＡＴＲ（attenuated total reflection、減衰全反射）探針により行う。
【００８５】
主要なＩＲ吸収帯の特性を、下記の表１に示す。
【００８６】
表１：主要なＩＲ吸収帯の特性
【００８７】
【表１】
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【００８８】
共架橋反応の期間に、ＩＲ分光による反応を観測すると、アルコラートがトリメタリン酸ナトリウムに求核攻撃することが示される。１級アルコールの特性帯（1006cm-1）が、２級アルコールの特性帯（1153 cm-1）を代償に減少する。1260 cm-1及び906 cm-1におけるＩＲ吸収帯は、ホスホン酸エステル及びリン酸エステル（リン酸ジエステル結合）の生成を示す。
【００８９】
収集されたヒドロゲルの３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（Bruker 250 MHz −ＮＭＲリン分析；モード：プロトン照射；振動数：１０１ＭＨｚ）も分析し（溶媒はＤ２Ｏ）、図３に示す。特性信号が、変位δ＝−４．３ppm；δ＝−１０．５ ppm；δ＝−１９．５ppmに存在することから、リン酸エステルの生成が確認される。
【００９０】
（v）リン酸エステル含量の測定
本発明により得られたヒドロゲルを用いて、リン酸エステルの定量分析を行った。脱水の後、酸性媒体（ＨＣｌ、４Ｎ）中で、下記の条件にて加水分解した。
【００９１】
【化７】
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【００９２】
糖単位に結合しているリン酸エステル及びポリリン酸ジエステルを、酸性媒体中で加水分解する。処理の後、これらをオルトリン酸のモノマー単位に変換する。３１Ｐ ＮＭＲにより、特性変位−０．６４の信号が得られ、これはオルトリン酸の特性である。このようにして、加水分解物に含まれるリン酸エステルの量が測定できる。基準としては、フェニルホスホン酸、ＰｈＰＯ３Ｈ２を用いた（図５を参照）。
【００９３】
リン酸エステル含量：１．０６ｍＥｑ／ｇ（１ｍＥｑ／ｇは、分析した脱水ゲルのグラム毎に生成するリン酸１ミリモルに相当する）。
【００９４】
――例２：トリメタリン酸ナトリウム（ＴＭＰ）により修飾されたヒアルロン酸（ＨＨ）の調製：リン酸化ヒアルロン酸の獲得――
この例の提案は、本発明の方法によるステップ（ｄ）に使用できる修飾ヒアルロン酸を調製することである。
【００９５】
０．２０グラムのヒアルロン酸（Sigma Aldrich - CAS 番号 9004-61-9 - 500K, 400-600 kDa）、分子質量分布が４００ｋＤａから６００ｋＤａの範囲であるもの、を３０ｍｌの水に入れて溶液とした。その後、０．３ｍｌの水酸化ナトリウムＮａＯＨ（CAS 番号: 1310-73-2）を０．１Ｍ、溶液に加えた。混合物を、室温で３０分間攪拌した。
【００９６】
０．０９グラムのトリメタリン酸ナトリウム（Sigma Aldrich CAS 番号 7785-84-4）を１０ｍｌの水に溶解させて、活性化ヒアルロン酸溶液に加えた。混合物を、室温で３時間攪拌した。
【００９７】
その後、反応媒体を１Ｍ塩酸溶液（CAS 番号 7-647-01-0）により中和し、ｐＨ値を６付近に到達させて、９７％エタノール（Sigma Aldrich - CAS 番号 64-17-5）により沈殿させた。
【００９８】
沈殿を浸透水に溶解し、透析膜内で４８時間、透析した。その後、溶液をAmicon（登録商標）セル（ミリポア）内に濃縮し、凍結乾燥した。
【００９９】
―細胞増殖試験―
この試験は、ヒアルロン酸の修飾が、ヒト真皮線維芽細胞の増殖に関して及ぼす影響を定量化することを目的とする。細胞増殖は、ＥＬＩＳＡ試験、つまり、ブロモデオキシウリジン（BrdU ELISA kit - Roche）が取り込まれたことの確認により評価した。BrdUは、ＤＮＡの窒素塩基の類似体であり、細胞分裂中のＤＮＡが複写される際に取り込まれる。この後、BrdUを特定の抗体及びこれと組み合わせられた酵素により検知することができ、更に比色定量を行って、細胞増殖を評価することができる。
【０１００】
その前駆体に比べて、修飾ヒアルロン酸は、その修飾の度合いと濃度とに依存して、数多くの挙動を有する（図６及び下の表２を参照）。：
・どの濃度においても、増殖の改善は見られない（HH015、HH016、HH017、HH023及びHH024）。
・同程度の増殖の改善が見られたが、その最適濃度はAH1200の場合よりも低い：HH020及びHH025（０．１又は０．２５mg/mlのピークを、AH1200の０．５又は１mg/mlのピークと比較して）。
・非常に明瞭な増殖の改善が見られた：HH021及びHH022。
【０１０１】
表２：修飾ヒアルロン酸の化学特性
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
――例３：修飾ヒアルロン酸（ＨＨ）及びデキストランを用いた共架橋ヒドロゲルの調製（本発明による方法）――
（ｉ）０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液によるデキストランの水酸基の活性化
０．９グラムのデキストランＴ１００（CAS 番号 9004-54-0; Mw = 100,000 g/mol）を５０ｍｌの水に入れて溶液とした後、５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムを当該溶液に加えた。溶液を３０分間、室温にて攪拌した。
【０１０４】
（ｉｉ）修飾ヒアルロン酸（HH22）及び架橋剤の追加
１．０２グラムのトリメタリン酸ナトリウム及び０．２グラムの修飾ヒアルロン酸（HH22）を、ステップ（ａ）の溶液に同時に追加した（粉末の形で、空間的には場所を空けて）。混合物を室温にてゲル化するまで攪拌した後、得られたゲルを２５℃に５時間維持した。
【０１０５】
（ｉｉｉ）ヒドロゲルの洗浄、純化及び乾燥
ヒドロゲルをステンレス鋼の篩の上で粉末化し、アセトン溶液中に集めた。
【０１０６】
ｐＨを観測しながら、水中での洗浄を複数回、洗浄水についてｐＨ＜７が得られるまで行った。洗浄ステップを行う度に、セルロースアセテート濾紙を用いてブフナー漏斗上でヒドロゲルを濾過した。最後にアセトン洗浄を行い、ヒドロゲルは真空下、６０℃の炉で乾燥した。
【０１０７】
（ｉＶ）細胞毒性
デキストラン及び修飾ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルの存在下における細胞の付着及び増殖能力を評価するために、本発明によるヒドロゲルが細胞毒性を有していないことを試験した。このために、培地への物質の放出を評価した。乾燥ヒドロゲルを６ウェルの培養皿（ヒドロゲル毎に６ウェル）に置き、４ｍｌの培地により膨潤させた：
・ウェルのうち３つについて、ＤＭＥＭ（（ＤＭＥＭ＝Dulbecco's Modified Eagle's Medium、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地- PAA）、アミノ酸、金属塩（ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ３）、グルコース及びビタミン（葉酸、ニコチンアミド、リボフラビン及びビタミンＢ１２））＋２．５％ＦＢＳ（fetal bovine serum、ウシ胎児血清- PAA）。
【０１０８】
・他の３つについて、ＤＭＥＭ＋１０％のＳＶＦ。
【０１０９】
３７℃のインキュベータ内に７２時間、ゲルを置いた。その後、培養上澄みを回収し、１２００ｒｐｍで５分間、遠心沈降し、上澄みからゲルの欠片を除去した。その後、４時間前に５０００のヒト真皮線維芽細胞（HDFa - Tebu Bio社製）を植え付けてHDFaが付着する時間があるようにした９６ウェルの培養皿に、２００μｌの各上澄みを加えた。各上澄みは、３つの独立したウェルで試験した。細胞は、３７℃のインキュベータに９６時間置かれ、その後、ＭＴＴ試験を行った。
【０１１０】
この試験は、テトラゾリウム塩がミトコンドリアの脱水素酵素によりホルマザンに分解されることに基づいており、ホルマザンは不溶なスミレ色の物質であってミトコンドリア内に蓄積される。０．６２５μｇ／ｍｌのＭＴＴ存在下にて、３７℃で４時間、細胞を培養した後、培地を流出させて除き、１００μｌのエタノール／ＤＭＳＯ同体積混合物を加えて結晶を溶解させた。結果を、波長５７０ｎｍの分光測光により読み取った。
【０１１１】
デキストラン及び修飾ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルのいずれも、ヒト真皮線維芽細胞に対する細胞毒性を持っていなかった。
【０１１２】
（ｖｉ）細胞培養試験
２つの実験条件を試験した：（ｉ）薄いヒドロゲル層への細胞の植え付け；（ｉｉ）ゲルを培地によって膨潤させる際に、ゲルに細胞を混合する。
【０１１３】
ヒドロゲルの存在下で７２時間の培養を行った後、細胞の生死を評価した。細胞のインキュベーションの後、ヒドロゲルを真核性ヒアルロニダーゼ酵素により消化した。回収した細胞に対し、生死をトリパンブルー色素排除試験法で試験した。幹細胞によるヒドロゲルのコロニー化を光学顕微鏡及び走査型顕微鏡により観察し、ヒドロゲル内に細胞が分布していることを確認した。
【０１１４】
――例４：線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）放出試験――
この例の目的は、本発明によるヒドロゲルが、分解されるに伴って、制御された形で成長因子を放散できる旨を実証することである。この例では、本発明による４つの実施例のリン酸化ヒドロゲル（DPD1、DPD2、DPD3及びDPD４）と、２つのコントロールのヒドロゲル（DP1及びDP2）とを合成した。コントロールのヒドロゲルDP1及びDP2は、デキストランのみからなる。各ヒドロゲルの組成は、以下の表３に示す。組成は、デキストランＴ００（100,000 ｇ／ｍｏｌ）及び／又はデキストランＴ５００（500,000 ｇ／ｍｏｌ）を含んでいても良い。
【０１１５】
表３：合成したヒドロゲルの組成
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
本発明によるヒドロゲルと線維芽細胞成長因子との親和性を確かめるために、成長因子放出試験を行った。合成したヒドロゲル（5 mg）を、膨潤させる際に成長因子（50 ng）と接触させた後、４℃にてリン酸緩衝生理食塩水（saline phosphate buffer solution：SPB）内に置いた。１２時間の相互作用の後、緩衝溶液を１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で１２時間置換し、更に１．５ＭのＮａＣｌ溶液で１２時間置換した。最後に、上澄み液を回収し、定量して、ヒドロゲルに吸着されなかった成長因子のパーセンテージを求めた。
【０１１８】
どのような理論にも制限されないが、塩化ナトリウム水溶液を用いると、イオン力を増加することにより、吸収されていない線維芽細胞成長因子を、試験したヒドロゲルから特異的に離脱させることができる。ヒドロゲル組成によって、線維芽細胞成長因子の吸収能力が異なる。図７に示すように、本発明によるヒドロゲル（DPD1、DPD2及びDPD3）は、ＮａＣｌ溶液に２４時間接触していた後にも、質量で４０％の成長因子を保持している。これに対し、デキストランのみからなるコントロールのヒドロゲル（DP1及びDP2）は、２４時間後には７０％を越える成長因子を放出している。
【０１１９】
従って、本発明によるヒドロゲルは、成長因子の制御された放出に用い得る。つまり、経時的に制御された放出が可能であり、ヒドロゲルが分解されるにつれて成長因子を放出することができる。
【０１２０】
――例５：細胞増殖試験――
この試験の目的は、本発明によるリン酸化ヒドロゲル内における細胞、特に幹細胞、より具体的には末梢循環血管内皮前駆細胞（circulating endothelial progenitor (CEP) cells）の増殖を試験することである。末梢循環血管内皮前駆細胞は幼若細胞であり、末梢血中に存在し、その生理学的な役割は血管の完全性を維持することである。これらは骨髄中で作られ、血液に移り、非常に希な細胞の集団を構成する。これらは、新しい血管を形成する際に、例えば血管病変に続く血管再生の過程において、一体化される。培養されると、これらの細胞は、内皮細胞コロニーを形成し、急速に強力な増殖力を得る。末梢循環血管内皮前駆細胞の培養は、ヒドロゲル培地上で行われ、これによって生存と増殖が可能となる。一般には、ゼラチンを培養の制御媒体として用いられる。
【０１２１】
これらの例では、異なる初期量のＣＥＰ幹細胞を試験し、４８時間の培養の後、存在するＣＥＰ細胞の計量を行った。結果を質量％により表し、ヒドロゲルの総質量に対して規格化した。この結果によると、図８の表に示すとおり、コントロールのヒドロゲルDP1及びDP2は、初期に導入した細胞の数に関わらず、細胞の増殖を促進しないか、又は、可能としてさえいない。本発明によるヒドロゲル、より具体的にはヒドロゲルDPD4は、細胞増殖を明確に促進する培地である。これは、初期に導入した３０００細胞が、当該ヒドロゲルに関して、１００％の増殖を可能としているからである（図８の結果を参照）。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2016517906.tif 000023
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