(57)【要約】本発明は、病的な細胞性細胞傷害性T細胞（CTL）応答と関連のある疾患を治療または予防するための方法に用いるための、感覚受容体と選択的に結合するかまたは感覚受容体の発現を選択的に変化させる化合物に関する。さらに、本発明は、患者におけるCTL応答に対する細胞抵抗性を診断するための方法に用いるための感覚受容体を検出するための手段にも関する。本発明は、インビトロでCTL応答に対する細胞の抵抗性を判定するための方法、およびCTLに対する細胞の応答に影響を及ぼす作用物質を同定するための方法をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病的な細胞性細胞傷害性T細胞（CTL）応答と関連のある疾患を治療または予防するための方法に用いるための、感覚受容体と選択的に結合するかまたは感覚受容体の発現を選択的に変化させる化合物であって、好ましくは疾患が、新生物、特に癌、自己免疫疾患、感染症および移植片対宿主病からなる群より選択される、化合物。
【請求項２】
感覚受容体が細胞表面に局在する受容体であり、好ましくは該感覚受容体が、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される、請求項1記載の使用のための化合物。
【請求項３】
特に新生物、特に癌に罹患した患者における活性化CTLに対する免疫応答を増強し、好ましくは、
CTL応答を妨げる表面受容体の局所表面濃度および／もしくはT細胞結合活性を低下させ；かつ／または
（i）感覚受容体の発現を低下させる化合物、好ましくは、該感覚受容体をコードするmRNAに対して相補的な干渉RNA、特に低分子干渉リボ核酸（siRNA）もしくは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、および
（ii）特に抗体もしくは感覚受容体結合性断片である、該感覚受容体に対するT細胞結合活性を妨げる化合物
からなる群より選択される、請求項1または2記載の使用のための化合物。
【請求項４】
特に自己免疫疾患および／または移植片対宿主病に罹患した患者において、活性化CTLに対する免疫応答を抑制し、好ましくは、
CTL応答を妨げる表面受容体の量および／もしくはT細胞結合活性が増強され；かつ／または
（i）感覚受容体をコードする遺伝物質、
（ii）該感覚受容体の発現を増強する化合物、および
（iii）CTLを妨げる表面ポリペプチドをT細胞と架橋させる化合物、特に架橋性抗体または抗体断片
からなる群より選択される、請求項1〜2のいずれか記載の使用のための化合物。
【請求項５】
1つまたは複数のさらなる免疫調節化合物と組み合わせて用いられる、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用のための化合物。
【請求項６】
患者におけるCTL応答に対する細胞抵抗性を診断するための方法に用いるための感覚受容体を検出するための手段。
【請求項７】
感覚受容体と選択的に結合する少なくとも1種の化合物を含み、好ましくは該化合物が標識されており、特に蛍光性に標識され、造影剤によって標識され、スピン標識され、かつ／または放射性に標識されており、特に該化合物が抗体またはその感覚受容体結合性断片である、請求項6記載の使用のための手段。
【請求項８】
感覚受容体が細胞表面に局在する受容体であり、好ましくは該感覚受容体が、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される、請求項6または7記載の使用のための手段。
【請求項９】
患者が新生物、自己免疫疾患、感染症および／または移植片対宿主病に罹患しており、特に該患者が新生物に罹患しており、特に該新生物が癌である、請求項6〜8のいずれか一項記載の使用のための手段。
【請求項１０】
インビトロでCTL応答に対する細胞の抵抗性を判定するための方法であって、
（i）CTL応答に対する抵抗性に関して試験しようとする細胞を提供する段階、
（ii）該細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する段階、および
（iii）該感覚受容体の該量を、該感覚受容体をその表面に持たない同等の細胞の、および／またはCTL応答に対する高度の抵抗性が生じるような量をその表面に有する同等の細胞の標準値と比較する段階
を含む、方法。
【請求項１１】
段階（ii）が、
細胞を、
（a）少なくとも1種の感覚受容体と選択的に結合する少なくとも1種の化合物であって、好ましくは標識されており、特に蛍光性に標識され、造影剤によって標識され、スピン標識され、かつ／もしくは放射性に標識されており、特に抗体またはその感覚受容体結合性断片である、化合物；ならびに／または
（b）少なくとも1種の感覚受容体の少なくとも1種のアンタゴニストであって、特に該感覚受容体に対して相補的な干渉RNA、特に低分子干渉リボ核酸（siRNA）もしくは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である、アンタゴニスト
と接触させること、
少なくとも1種のアンタゴニストと接触させた細胞を少なくとも1種のCTLとともにコインキュベートし、その後にCTL活性を決定することであって、好ましくは以下のうち1つによってCTL活性を決定する、こと：
（i）少なくとも1種のCTLとともにコインキュベートした細胞の生存度を決定し、かつ該生存度を、該アンタゴニストによって処理していない同等の細胞およびCTLを含む試料のそれと比較すること、または
（ii）CTL活性にとって典型的なポリペプチド、例えば1つもしくは複数のインターフェロン（IFN）、1つもしくは複数のインターロイキン（IL）および／または1つもしくは複数の腫瘍壊死因子（TNF）などの排出を決定し、かつ結果を該アンタゴニストによって処理していない同等の細胞およびCTLを含む試料のそれと比較すること
を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
CTLに対する細胞の応答に影響を及ぼす作用物質を同定するための方法であって、
（i）CTL応答を妨げる少なくとも1種の表面ポリペプチド、特に感覚受容体を発現し、かつさらに生物発光を可能にするポリペプチド、特にルシフェラーゼも発現する細胞を提供する段階、
（ii）段階（i）の細胞を、関心対象の少なくとも1種の作用物質と接触させる段階、
（iii）段階（ii）から得られた細胞を、CTL、およびCTLの抗原受容体を段階（ii）の細胞の細胞表面分子と架橋させる作用物質とともにコインキュベートする段階、
（iv）段階（iii）から得られた生細胞を回収する段階、
（v）段階（iv）から得られた細胞のサイトゾルの生物発光を決定する段階、ならびに
（vi）少なくとも1種の作用物質と接触させた細胞の生物発光を、作用物質と接触させていない、かつ／または1種もしくは複数の他の薬剤と接触させた陰性対照の細胞と比較する段階
を含む、方法。
【請求項１３】
感覚受容体が、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
CTLが、予備活性化CD8+ T細胞、特にCD3特異的抗体および／またはCD28特異的抗体を通じてのT細胞受容体（TCR）刺激によって予備活性化されたCD8+ T細胞である、請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
作用物質が、典型的には細胞表面に局在し、かつ／または細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをコードするメッセンジャーリボ核酸（mRNA）に対して相補的な干渉RNA、特に低分子干渉リボ核酸（siRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病的な細胞性細胞傷害性T細胞（CTL）応答と関連のある疾患を治療または予防するための方法に用いるための、感覚受容体と選択的に結合するかまたは感覚受容体の発現を選択的に変化させる化合物に関する。さらに、本発明は、患者におけるCTL応答に対する細胞抵抗性を診断するための方法に用いるための感覚受容体を検出するための手段にも関する。本発明は、インビトロでCTL応答に対する細胞の抵抗性を判定するための方法、およびCTLに対する細胞の応答に影響を及ぼす作用物質を同定するための方法をさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
今日では、末梢性免疫寛容が、いくつかの疾患において、例えば癌などにおいて重要な役割を果たし、自己免疫障害を防ぐ上でも重要な役割を果たすことがよく知られている。癌患者において、腫瘍細胞は多くの場合、免疫チェックポイントを利用して免疫認識を遮断し、それによって免疫療法に対する抵抗性を課している（Rabinovich et al., 2007、およびZitvogel et al., 2006）。このため、免疫療法が奏効するかどうかは、腫瘍の免疫感受性もしくは抵抗性に応じた患者の効率的な層別化、または各々の免疫チェックポイント経路の機能的遮断にかかっている（Pardoll, 2012）。
【０００３】
免疫感受性および／または免疫チェックポイント経路の機能的遮断と関連のある疾患の治療に非常に有望な治療戦略の多くは、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を典型的には伴うT細胞ベースの免疫療法、例えば例示的なT細胞ベースの癌免疫療法などと関連がある。現在の最先端の癌免疫療法‐抗原特異的ワクチン、または腫瘍特異的CTLを用いる養子細胞療法‐により、一方では、患者において機能的に効力のあるT細胞応答を誘導するためのプロトコールも開発されている（Gao et al., 2013）。
【０００４】
しかし、これらの治療法は、特異的T細胞の攻撃に対する癌細胞の抵抗性という欠点に直面している（Rabinovich et al., 2007）。事実、T細胞ベースの癌免疫療法の奏効性は、CTLによる死滅に対する多くの腫瘍の抵抗性が制約となっている。
【０００５】
このため、今日でも依然として、無視できない数の患者がT細胞ベースの免疫療法に十分には反応していない。
【０００６】
そのような抵抗性については、これまでのところ、その理由も明らかになっておらず、それを克服する満足のいく治療アプローチも得られていない。特定の免疫療法の効率に関する予想を得ることを少なくとも可能にする満足のいく診断アプローチさえも、今日までは得られていない。
【０００７】
これらの問題を克服するための取り組みは、腫瘍とT細胞との間のCD80／86-CTLA4相互作用およびPDL1-PD1相互作用のそれぞれによって課せられる主要な免疫調節経路を解明することによって行われてきた（Blank et al., 2004、およびChambers et al., 2001）。これらの表面表現タンパク質に対する遮断抗体は抗腫瘍免疫をブーストすることができ、臨床試験にも適用されて成果を上げている（Brahmer et al., 2012, Topalian et al., 2012, van Elsas et al., 1999, FDA press release of March 25, 2011 "FDA approves new treatment for a type of late-stage skin cancer" and Weber, 2007）。
【０００８】
しかしながら、臨床試験では、これらの分子の腫瘍内発現を伴わない、無視できない数の不応性患者が報告されている（Topalian et al., 2012）。現実には、腫瘍に対する免疫寛容はいくつかの免疫阻害経路間の相乗的協同作用によって維持されており、そのことが、1つの免疫チェックポイントノード（node）だけを遮断しても依然として腫瘍エスケープが起こる理由の説明とされている（Berrien-Elliott et al., 2013、およびWoo et al., 2012）。依然として、そのような免疫阻害経路において重要な役割を果たす分子的因子はほとんど明らかになっていない。その理由の1つは、腫瘍とT細胞との間の異種細胞間相互作用の質的ならびに量的な分析を可能にする堅牢なハイスループットアッセイがないために、免疫チェックポイント分子の包括的検出が技術的に困難であるためである。これまでのところ、CTL応答の減退に役割を果たすそのような分子的因子を同定するための戦略としては、抗腫瘍免疫活性の指標としてのインターフェロン-γ（IFN-γ）の放出に依拠するごく少数のものが当技術分野において確立しているに過ぎない（Bellucci et al., 2012、およびHill and Martins, 2006）。その上、これまでに開発された方法は、免疫細胞によるIFN-γ分泌のみでは細胞性細胞傷害作用と必ずしも相関しないことから、かなり不十分である（Bachmann et al., 1999、およびSlifka et al., 1999）。
【０００９】
その結果、CTL応答の減退に役割を果たす分子的因子はこれまでにごく少数しか同定されておらず、免疫抑制性リガンドもほとんど同定されていない。このため、現在も、これらを標的とするそのような分子的因子および化合物を分子標的構造として同定することは、叶えられていない需要として依然として存在する。
【００１０】
驚いたことに、本発明者らは、感覚受容体が、病的なCTL応答を診断または治療することを目的としてCTL応答を調節または媒介することのできる、効力のある分子標的構造であることを同定した。
【００１１】
これに関連して、CTL応答の効力のあるメディエーターとしての役を果たし、特にCTL応答を増強するいくつかの化合物が同定されており、そのような化合物の包括的同定を可能にする迅速ハイスループットスクリーニング方法が提供されている。同定された化合物は、病的なCTL応答と関連のある疾患を治療および／または診断するための効力のある医薬物質、特に癌を治療および／または診断するための免疫抑制分子としての役を果たしうることを示すことができた。
【発明の概要】
【００１２】
第1の局面において、本発明はしたがって、病的な細胞性細胞傷害性T細胞（CTL）応答と関連のある疾患を治療または予防するための方法に用いるための、感覚受容体と選択的に結合するかまたは感覚受容体の発現を選択的に変化させる化合物について言及する。
【００１３】
本発明の全体を通じて用いられる、「化合物」という用語は、感覚受容体と選択的に結合する、あらゆる分子、塩または分子複合体もしくは分子凝集体として、最も広い意味に解釈されうる。化合物は荷電性であっても非荷電性であってもよく、水溶性であっても水に不溶性であってもよい。好ましくは、それは水に少なくとも部分的に可溶性である。化合物は、500Daよりも高くない分子量を有する1つもしくは複数の種類の低分子、500Daよりも高い分子量を有する1つもしくは複数の種類の高分子量化合物、またはそれらの混合物であるかまたはそれを含んでよい。
【００１４】
治療または診断に関連して用いる場合には‐それがインビボであれインビトロであれ‐本発明の意味での化合物を「医薬」、「医薬化合物」、「治療薬」、「治療用化合物」、「医薬物質」、「作用物質」、「診断薬」、「診断用化合物」、「診断用物質」、「診断ツール」などと呼んでもよい。
【００１５】
好ましくは、化合物は、500Daよりも高い分子量、より好ましくは1kDaよりも高い、さらにより好ましくは2kDaよりも高い、さらにより好ましくは3kDaよりも高い、さらにより好ましくは4kDaよりも高い、さらにより好ましくは5kDaよりも高い、さらにより好ましくは10kDaよりも高い、さらにより好ましくは20kDaよりも高い、さらにより好ましくは50kDaよりも高い、さらにより好ましくは100kDaよりも高い分子量を有する、1つまたは複数の種類の高分子量化合物であるか、またはそれを含む。化合物はアミノ酸モイエティーを含んでもよく、または含まなくてもよい。化合物は主としてアミノ酸モイエティーを含むこと、すなわち、ポリペプチド鎖であるかまたはそれを含むことが非常に好ましい。ポリペプチドは、本明細書で用いる場合、アミノ酸モイエティーがアミド結合を介して別のアミノ酸モイエティーと接続されたものによって主に構成される任意の化合物であってよい。ポリペプチドに含まれるアミノ酸モイエティーの数は、少なくとも3アミノ酸のモイエティーから最大で数百アミノ酸までのモイエティーであってよい。ポリペプチドをペプチドまたはタンパク質と呼ぶこともできる。
【００１６】
特に好ましくは、本発明による化合物は、抗体もしくはその感覚受容体結合性断片であるか、またはそれを含む。最も好ましくは、本発明による化合物は、抗体またはその感覚受容体結合性断片である。
【００１７】
さらに、本発明による化合物は、任意で他の分子とコンジュゲートまたは結合されてもよく、それは好ましくは、融合タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）、1つもしくは複数の脂質もしくはリピドイド、1つもしくは複数の低分子色素（例えば、蛍光性色素もしくはUV／可視色素（例えば、p-ニトロフェニルモイエティー、クーマシーブリリアントブルーG-250）、1つもしくは複数の量子ドット、1つもしくは複数の結合モイエティー（例えば、ビオチン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、または例えば、1つもしくは複数の活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、グルタルアルデヒド誘導体、カルボジイミド誘導体またはそれらの組み合わせを含むモイエティー）、1つもしくは複数の不溶性および／もしくは可溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（HPMA）、ポリエチレンイミン（PEI））、1つもしくは複数の抗体／抗体もしくはそれらの誘導体（例えば、Fab断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、フレキシボディ、タンダブ（tandab））、1つもしくは複数のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド（CPP）、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）、シグナル伝達ペプチドなど）、1つもしくは複数のスピン標識、1つもしくは複数の酵素標識（例えば、ペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、マイクロビーズもしくはナノビーズ（例えば、官能化シリカビーズ、多糖ベースのビーズ）、ポリマーソームおよび／またはリポソームのことを指しうるが、これらには限定されない。
【００１８】
最も好ましくは、化合物は抗体またはその感覚受容体結合性断片である。
【００１９】
本発明の全体を通じて用いられる、「抗体」という用語は、そのエピトープに対する選択的結合を可能にするあらゆる免疫グロブリン（Ig）として、最も広い意味で解釈されうる。本発明に関連して、エピトープは感覚受容体の一部を形成し、ここでそのエピトープは例えば、線状エピトープまたは構造エピトープであってよい。典型的には、抗体は、B細胞またはそれに由来する細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞）によって産生される。抗体はポリクローナル性でもモノクローナル性でもよいが、好ましくはそれはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者には、すべてが共通の親細胞の子孫、すなわち典型的にはクローンである完璧に同一な細胞によって産生される単一特異性である抗体として周知である。対照的に、ポリクローナル抗体は、いくつかの異なる免疫細胞から生じ、典型的にはさまざまなエピトープと結合する。
【００２０】
本発明の全体を通じて用いられる、抗体の感覚受容体結合性断片は、抗体から生じ、そのエピトープ、すなわち感覚受容体と選択的に結合し、かつ典型的には抗体よりも長さの短い、任意のポリペプチド配列であってよい。例示的には、感覚受容体結合性断片は、Fab断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、フレキシボディまたはタンダブであってよいが、これらには限定されない。
【００２１】
または、化合物が、感覚受容体と選択的に結合する非抗体性ポリペプチド、例示的にはその天然または人工の結合パートナー、例えば、細胞内および／または細胞間シグナル伝達に役割を果たすホルモン、サイトカインまたはポリペプチドなどであってもよい。
【００２２】
または、化合物が、感覚受容体によって検出される分子、例えば、嗅覚受容体として機能する感覚受容体によって認識される嗅覚化合物などであってもよい。
【００２３】
好ましくは、化合物は、感覚受容体の1つもしくは複数の細胞外ドメイン、すなわち細胞の外表面に存在する分子構造と選択的に結合するか、または分泌された感覚受容体もしくは分泌されたそのドメインと結合する。しかし、代替的に、化合物が任意で、細胞内に入って、それ故に感覚受容体の細胞内ドメインを標的とすることも可能であることに留意されたい。これは例示的には、化合物が500Da以下の分子量を有する低分子であってオクタノール／水分配係数が1〜5である場合、ならびに／または化合物が、その分子量とは無関係に、例えば、細胞透過性ペプチド（CPP）、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）、シグナル伝達ペプチド、正荷電および／もしくは両親媒性化合物（例えば、正荷電および／または両親媒性脂肪酸）、正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（PEI）、グアニジニウムモイエティーを含むポリマー）、両親媒性ペプチドもしくはポリマー、ミセルおよび／もしくはリポソームから選択される、1つもしくは複数の取り込みメディエーターとコンジュゲートもしくは複合体化される場合が考えられる。
【００２４】
当業者は、CTL応答を強くしようとする場合には干渉RNAならびに感覚受容体遮断抗体が特に好ましい作用物質であり、一方、CTL応答を弱めようとする場合にはT細胞-感覚受容体架橋抗体が特に好ましい作用物質であると考えられることを把握しているであろう。
【００２５】
本発明の全体を通じて用いられる、「感覚受容体と選択的に結合する」という用語は、化合物と感覚受容体との間の、特異的でかなり安定した相互作用の形成として、最も広い意味で解釈されうる。
【００２６】
「結合」とは、本明細書で用いる場合、共有結合であっても非共有結合であってもよく、好ましくは非共有結合である。当業者には、非共有結合の形成には水素結合および静電結合の形成のほかに、ファンデルワールス力、疎水性力およびΠ-Π電子相互作用も役割を果たすことが公知であろう。本発明に関連して用いる場合、結合は好ましくは、解離平衡定数（kd）が10μM未満、1μM未満、100nM未満、10nM未満、またはさらには1nM未満である相互作用の形成である。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「選択的に結合すること」とは、結合が、特定の分子標的、すなわち、特定の感覚受容体、または特定の分子標的の一群、例えば、感覚受容体の特定のクラスもしくはサブクラスに対して特異的であることを意味する。したがって、好ましくは、特定の分子標的または特定の分子標的の特定の一群に対する結合親和性は、他の標的、すなわち例示的な他のポリペプチド、特に他の膜結合性受容体に対するよりも、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも2000倍、少なくとも5000倍、少なくとも10000倍、少なくとも105倍、またはさらには少なくとも106倍の親和性を有する。
【００２８】
「感覚受容体の発現を選択的に改変する」という用語は、感覚受容体の産生の何らかの特定の変化を誘導または誘発するという最も広い意味で用いられる。
【００２９】
「発現」とは、本明細書で用いる場合、CTLとの特異的相互作用を可能にしうる感覚受容体の産生という、その最も広い意味を意味する。この相互作用は、感覚受容体とCTLとの間の直接的な相互作用であってもよく、または、任意で1つまたは複数の（可溶性）受容体を介する、感覚受容体とCTLとの間の間接的な相互作用であってもよい。したがって、発現は、転写および翻訳、ならびに任意でスプライシングおよび翻訳後修飾を含みうる。これらの段階のうち任意のものが、化合物による影響を受けてもよく、または影響を受けなくてもよい。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「発現を変化させる」とは、感覚受容体の発現の度合いが、化合物と接触させない点を除いて同等の条件下で培養した同等の細胞のものと比較して変化していることを意味する。
【００３１】
好ましくは、感覚受容体の発現を変化させるとは、感覚受容体の発現を減少させることである。この場合、好ましくは、化合物は干渉性リボ核酸（iRNAまたはRNAi）分子である（サイレンシング性RNAとしても知られる）。本発明の全体を通じて、干渉RNAは、好ましくは低分子干渉リボ核酸（siRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、または干渉RNAと同じように機能するRNA類似体である。当業者は、本発明に関連したsiRNAは、典型的には、関心対象の感覚受容体をコードするメッセンジャーリボ核酸（mRNA）に対して相補的であることを把握しているであろう。
【００３２】
しかし、本発明による化合物が、別の化合物、例えば、感覚受容体の機能的形態の産生に対して低下性の影響を及ぼす低分子、例えば、シグナル伝達に影響を及ぼすホルモンもしくはサイトカイン、または感覚受容体の発現に干渉する細胞透過性ホルモンもしくはサイトカインのいずれかなどであってもよい。インビボで対象に投与される場合、化合物は、特にそれがRNAまたはその類似体である場合には、典型的には、例えば、リポソームもしくはポリマーソーム内への封入、可溶性ポリマーとのコンジュゲーションもしくは複合体化、マイクロビーズもしくはナノビーズ内への封入もしくはそれとのコンジュゲーション、または1つもしくは複数の両親媒性作用物質との複合体化などによって、分解に対して安定化されることは把握されているであろう。
【００３３】
または、感覚受容体の発現を変化させることが、感覚受容体の発現を増加させることであってもよい。その場合は、好ましくは、化合物は、感覚受容体をコードする遺伝物質、特に感覚受容体をコードするデオキシリボ核酸（DNA）であるか、またはそれを含む。しかし、それが、別の化合物、例えば、感覚受容体の機能的形態に対して正の影響を及ぼす低分子、例えば、シグナル伝達に影響を及ぼすホルモンもしくはサイトカイン、または感覚受容体の発現に干渉する細胞透過性ホルモンもしくはサイトカインのいずれかなどであってもよい。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「発現を選択的に変化させる」とは、関心対象の特定の感覚受容体または特定の感覚受容体の一群、例えば、感覚受容体の特定のクラスもしくはサブクラスの発現の度合いが特異的に変化することを意味する。したがって、好ましくは、細胞における特定の感覚受容体または感覚受容体の特定の一群の発現は、化合物と接触させない点を除いて同等の条件下で培養した同等の細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも500％、またはさらには少なくとも1000％変更されている。
【００３５】
本明細書において用いられる、感覚受容体と選択的に結合するか、または感覚受容体の発現を選択的に変化させる化合物は、
（i）化合物感覚受容体と選択的に結合する；かつ／もしくは
（ii）化合物感覚受容体の発現を選択的に変化させる、
遺伝物質をコードする遺伝物質であるか、またはそれを含んでもよい。
【００３６】
本発明の全体を通じて用いられる、「遺伝物質」という用語は、発現させようとする遺伝情報の伝達を可能にするあらゆる材料、例えば、例示的にはデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、モルホリノロックド核酸（LNA）、ならびにグリコール核酸（GNA）およびトレオース核酸（TNA）、2'-O-メチル-置換RNA、またはそれらのうち2つまたはそれを上回るものの組み合わせであるがこれらには限定されないものとして、最も広い意味で解釈されうる。遺伝物質は任意で、より大きな分子の一部を形成してもよく、かつ／または1つもしくは複数の他の分子によって複合体化されてもよい。遺伝物質は線状構造または環状構造を有する分子を有してもよく、またはその中に含まれてもよい。遺伝物質は任意で、ベクターの一部を形成してもよい。当業者は、数多くの適したベクター、例えば、ウイルスもしくはウイロイド、プラスミド、原核（例えば、細菌）細胞および／または真核細胞（例えば、植物細胞、真菌（例えば、酵母）細胞もしくは動物細胞（例えば、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞）などに精通しているであろう。インビボで対象に投与される場合、遺伝物質は典型的には、例えば、リポソーム、ポリマーソーム内への封入、可溶性ポリマーとのコンジュゲーションもしくは複合体化、マイクロビーズもしくはナノビーズ内への封入もしくはそれとのコンジュゲーション、または1つもしくは複数の両親媒性作用物質との複合体化などによって、分解に対して安定化されることは把握されているであろう。
【００３７】
最も好ましくは、化合物は、特定の感覚受容体または感覚受容体の一群と選択的に結合する、抗体、特にモノクローナル抗体である。
【００３８】
前述した種類の化合物はすべて、病的な細胞性CTL応答と関連のある疾患を治療するための方法に用いることができる。
【００３９】
「細胞傷害性T細胞」という用語およびその略号「CTL」は、本明細書で用いる場合、特に新生物細胞、感染している細胞、特にウイルス感染細胞、および／または他の病的な状態にある細胞において細胞死を誘導することができる任意のTリンパ球という最も広い意味で解釈されうる。これに関連して、「細胞傷害性T細胞」、「CTL」、「細胞傷害性TC」、「細胞傷害性Tリンパ球」、「Tキラー細胞」、「細胞溶解性T細胞」および「キラーT細胞」という用語は互換的に解釈されうる。細胞傷害性T細胞は、細胞傷害性CD8+ T細胞であってよい。典型的には、本発明に関連したCTLは、他の細胞の表面に提示された特定の分子構造の認識を可能にする少なくとも1種のT細胞受容体（TCR）を、その表面に有する。そのような分子構造は、典型的には、他の細胞の表面に主要組織適合複合体（MHC）クラスIとの複合体中にある形で提示される抗原であると考えられ、そこでそれらはCTLによって認識されうる。TCRがその抗原に対して特異的であるならば、それはMHCクラスIと抗原との前記複合体と結合して、CTL応答が起こり、すなわち他の細胞が破壊される。好ましくは、本発明に関連して用いられるCTLは、哺乳動物CTL、特にヒトCTLであり、そのためCTL応答はヒトCTL応答である。
【００４０】
細胞が組織の一部を形成しうることは明らかであろう。その場合は、罹患組織を治療することができる。組織は臓器の一部を形成することができる。その場合は、罹患臓器を治療することができる。
【００４１】
本明細書において、「治療すること」という用語は、対象に何らかの薬物療法または非薬物療法を受けさせるという最も広い意味で解釈されてよく、ここでそのような治療法は好ましくは薬物療法であり、対象は病的なCTL応答を有する患者である。
【００４２】
本明細書において、「予防すること」という用語は、対象に何らかの薬物療法または非薬物療法を受けさせて、対象がそのような病的なCTL応答を発症するのを防ぐという最も広い意味で解釈されてよく、ここでそのような治療法は好ましくは薬物療法であり、対象は病的なCTL応答を発症するリスクのある患者である。
【００４３】
本発明に関連して用いる場合、「患者」という用語は、それがヒトであるかまたは動物であるか、および臨床症状が起こるかまたは起こらないかに関係なく、化合物が投与される任意の対象という最も広い意味で解釈されうる。好ましくは、患者はヒト患者である。好ましくは、患者は、病的なCTL応答を発症している、かつ／または病的なCTL応答を発症するリスクがある。
【００４４】
本発明の全体を通じて用いられる、「疾患」という用語は、臨床症状が起こるかまたは起こらないかに関係なく、病的な細胞性CTL応答が起こるあらゆる病的状態として、最も広い意味で解釈されうる。病的状態とは、健康な状態とは異なるあらゆる状態のことである。
【００４５】
細胞性CTL応答が起こると、これは典型的には、CTLと接触した細胞の死滅をもたらす。本発明に関連して用いられる細胞は、CTL応答に関与しうる任意の細胞、すなわち、好ましくは哺乳動物起源の細胞、特にヒト起源の細胞である。最も好ましくは、細胞は異常増殖細胞、例えば、新生物細胞、特に癌細胞などに関与する。その場合は、腫瘍抵抗性が媒介されうる。
【００４６】
CTL応答が弱すぎる場合には、病的な細胞、例えば、新生物細胞または感染細胞などが、誤って除去されない（死滅しない）ことがある。その場合は、例示的には、新生物、特に癌が起こりうるか、または感染が助長されうる。
【００４７】
その反対に、CTL応答が強すぎる場合には、死滅させることを意図していない細胞、すなわち典型的には健常な細胞も死滅することがある。その場合は、例示的には、健常細胞が死滅して組織が誤って害を被る自己免疫疾患が起こること、または組織もしくは臓器全体を移植片から宿主患者に移植する場合に前記組織または臓器が望まれない拒絶を受けること（移植片対宿主病）がありうる。
【００４８】
したがって、1つの好ましい態様において、治療しようとする疾患は、新生物、特に癌、自己免疫疾患、感染症および移植片対宿主病からなる群より選択される。
【００４９】
本明細書で用いる場合、新生物は、特定の細胞の異常な分裂速度に典型的には起因する、新たな組織の何らかの形成、特に新規な組織塊の異常形成という最も広い意味で解釈されうる。これは、例えば化生または異形成といった、新生物の初期段階も含みうる。新生物は、細胞分裂速度および組織増殖に影響を及ぼす外部刺激に依存することもあれば、依存しないこともある。新生物は、良性、前癌性（上皮内癌組織）または悪性（癌）であってよい。癌にはすべての癌性細胞、すなわち、腫瘍塊および／または1つもしくは複数の転移の一部を形成する細胞が含まれる。
【００５０】
これに関連した癌は、当技術分野において公知の任意の種類の癌であってよい。それは固形腫瘍を形成するかまたは形成しない癌であってもよいが、好ましくは固形腫瘍を形成するかまたは形成しない癌である。例示的には、癌には、癌腫（上皮細胞に由来する癌、例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌および結腸癌）、肉腫（結合組織、典型的には間葉細胞に由来するがん、例えば、骨がん、軟骨がん、脂肪のがん、または神経細胞がんなど）、リンパ腫および白血病（造血細胞に由来するがん、例えば血液がんなど）、精上皮腫／未分化胚細胞腫（生殖細胞腫瘍、多能性細胞に由来する癌、例えば、精巣癌または卵巣癌）、黒色腫および芽細胞腫（未熟前駆細胞または胚組織に由来するがん）などが非限定的に含まれうる。好ましくは、癌は癌腫、肉腫、精上皮腫／未分化胚細胞腫、黒色腫（皮膚細胞に由来する癌）または芽細胞腫である。さらにより好ましくは、癌は癌腫、特に乳癌である。
【００５１】
自己免疫疾患は、典型的には、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の不適切な免疫応答（自己免疫）によって生じる。これはある特定の臓器に限られることもあれば、異なる場所にある1つもしくは複数の組織がかかわることもある。
【００５２】
本発明に関連した感染症とは、当技術分野において公知のあらゆる感染症、好ましくはウイルス感染症、特に免疫系が機能不全となる、すなわち過剰反応する（例えば、インフルエンザのいくつかの形態）かまたは反応が弱くなる（ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ヘルペス、疣贅）ウイルス感染症のことである。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「移植片対宿主病」または「GVHD」とは、特に幹細胞または骨髄移植の状況で起こるが、それだけでなく他の形態の組織移植の状況でも起こる、同種組織移植後に起こる一般的な合併症という最も広い意味で解釈されうる。
【００５４】
最も好ましくは、本発明に関連した疾患は、癌、特に乳癌などの固形癌である。
【００５５】
本発明の全体を通じて用いられる、「感覚受容体」という用語は、環境的影響の認識を可能にするあらゆる分子構造、特に前記環境的影響が特定の化合物（嗅覚受容体）および／または物理的影響、例えば光照射（光受容体）、温度など、または機械的影響、例えば、接触／圧（機械受容体）などの存在であるようなものとして、最も広い意味で解釈されてよい。本発明に関連して、特に特定の化合物（すなわち、化学感覚）または光照射の存在を認識する感覚受容体は大きな役割を果たす。感覚受容体は、本発明に関連して、免疫チェックポイント分子として機能しうる。
【００５６】
好ましくは、本発明に関連した感覚受容体は、主として1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む。しかし、それが任意でオプシンなどの補因子をさらに含んでもよく、かつ／または任意でレチナールをさらに含んでもよいことは把握されているであろう。さらに、補因子の多くはGタンパク質と会合していることがあり、かつ／またはカルシウムチャンネルとして機能することもある。
【００５７】
最も好ましくは、本発明に関連した感覚受容体はGタンパク質共役受容体（GPCR）であってよく、特に前記GPCRはロドプシン様ファミリーのGPCRに属する受容体であり、最も詳細にはそれはクラスAロドプシン様ファミリーのGタンパク質共役受容体（GPCR）である。
【００５８】
1つの好ましい態様において、感覚受容体は、細胞表面に局在する受容体であって、好ましくは、前記感覚受容体は、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される。
【００５９】
「細胞表面に」という用語は、受容体が1つもしくは複数の膜貫通ドメインを含んでよく、部分的もしくは全体的に原形質膜中に組み込まれていてよく、かつ／または膜、または1つもしくは複数の膜貫通ドメインを含むポリペプチドと結びついていてもよく、かつ／または部分的もしくは全体的に原形質膜に組み込まれていてもよい。したがって、そのような感覚受容体を「表面受容体」と呼んでもよい。
【００６０】
本発明の全体を通じて用いられる、「嗅覚受容体」、「匂い受容体」、「味覚受容体(taste receptor)」および「味覚受容体(gustatory receptor)」という用語は、当技術分野において公知の味および／またはにおいの知覚を可能にするあらゆる受容体として、互換的に解釈されてよい。多くの化合物について、味とにおいは同じ受容体によって認識されており、知覚としても完全には分離できないことが広く知られている。すなわち、これらの2種類の知覚は、受容体のある独特の群によって認識される。例示的には、嗅覚受容体は、味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）であってよい。これに関連して、「味覚受容体2型」、「ファミリー2の味覚受容体」および「TAS2R」という用語は、互換的に解釈されてよい。例示的には、それは、ファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）であってよい。例示的には、それは鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）またはフェロモン受容体であってよい。
【００６１】
1つの好ましい態様において、化合物は、特に新生物、特に癌に罹患した患者における活性化CTLに対する免疫応答を増強し、ここで好ましくは、CTL応答を妨げる表面受容体の局所表面濃度および／またはT細胞結合活性が低下する。
【００６２】
本明細書において、表面受容体の活性の低下は、感覚受容体の発現の低下、受容体の局所濃度の低下、かつ／または化合物をそれと結合させること、および／もしくはT細胞相互作用側をアロステリック性に変更することによってその結合親和性を低下させることのいずれかによる、前記受容体のT細胞相互作用側の遮断による受容体の遮断による結果であってよい。最も好ましくは、結合側は、化合物、例えば特に各々の感覚受容体に対する抗体などが結合することによって遮断される。
【００６３】
したがって、1つの好ましい態様において、本発明による化合物は、
（i）感覚受容体の発現を低下させる化合物、好ましくは、前記感覚受容体をコードするmRNAに対して相補的な干渉RNA、特に低分子干渉リボ核酸（siRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、および
（ii）前記感覚受容体に対するT細胞結合活性を妨げる化合物、特に抗体または感覚受容体結合性断片である前記化合物、
からなる群より選択される。
【００６４】
上述したように、その反対のこと、すなわち、感覚受容体-T細胞相互作用の増強が有益な治療効果を有することもあり、特にCTL応答を抑制しようとする場合にはそうである。
【００６５】
したがって、1つの代替的な好ましい態様において、化合物は、特に自己免疫疾患および／または移植片対宿主病に罹患した患者において、活性化CTLに対する免疫応答を抑制し、好ましくは、CTL応答を妨げる表面受容体の量および／またはT細胞結合活性が増強される。
【００６６】
1つのさらにより好ましい態様において、化合物はその場合、
（i）感覚受容体をコードする遺伝物質、
（ii）前記感覚受容体の発現を増強する化合物、および
（iii）CTLを妨げる表面ポリペプチドをT細胞と架橋させる化合物、特に架橋性抗体または抗体断片、
からなる群より選択される。
【００６７】
CTL応答の増強ならびにCTL応答の抑制を意図する場合、本発明による化合物は、単独の薬剤として用いてもよく、または、1つもしくは複数の免疫阻害経路に関与する1つもしくは複数のさらなる免疫調節化合物と組み合わせ、それによって「免疫モジュラトーム（immune modulatome）」の一部となってもよい。
【００６８】
1つの好ましい態様において、化合物は、1つまたは複数のさらなる免疫調節化合物と組み合わせて用いられる。
【００６９】
例示的には、そのようなさらなる免疫調節化合物は、インターロイキン（例えば、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13）、サイトカイン（例えば、インターフェロン、G-CSF、イミキモド）、ケモカイン（例えば、CCL3、CCL26、CXCL7）、シトシンリン酸-グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、糖質コルチコイド、免疫抑制抗体および／または腫瘍壊死因子α（例えば、TNFα）であってよい。
【００７０】
本発明はまた、本発明による化合物および／または本発明による検出のための手段、ならびに任意でさらに（i）1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または（ii）使用者マニュアルを含む、薬学的組成物およびキットにも関することが理解されるであろう。
【００７１】
本発明に関連して、「キット」という用語は、主張する治療法を行うために用いうる種々の生成物の組成物として、最も広い意味で解釈されうる。キットは、本発明による検出（すなわち、感覚受容体の検出）のための手段、薬学的に許容される担体、使用者マニュアル、シリンジ、針などを含みうる。任意で、手段を溶解させることも、または凍結乾燥させることもできる。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、手段の薬理学的受容を補助することのできるあらゆる物質を指すことができる。手段は経口的に投与されてもよく、または注射されてもよい。それは、乾燥形態で（例えば、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、チュワブルカプセルなどとして）、または液体として（例えば、噴霧剤、シロップ、ジュース、ゲル、液体、ペースト、注射液など）、薬学的に製剤化することができる。薬学的に許容される担体は、毒性が全くないかまたは低い溶媒、例えば、水、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エタノール、植物油、パラフィン油またはそれらの組み合わせであってよい。その上、薬学的に許容される担体は、1つもしくは複数の界面活性剤、1つもしくは複数の発泡剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）／ドデシル硫酸ナトリウム（SDS））、1つもしくは複数の着色剤（例えば、TiO2、食品用着色剤）、1つもしくは複数のビタミン、1つもしくは複数の塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩）、1つもしくは複数の湿潤剤（例えば、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、ポリデキストロース）、1つもしくは複数の酵素、1つもしくは複数の保存料（例えば、安息香酸、メチルパラベン）、1つもしくは複数のテクスチャー調整剤（例えば、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリエチレングリコール（PEG）、ソルビトール）、1つもしくは複数の乳化剤、1つもしくは複数の増量剤、1つもしくは複数の糖衣剤、1つもしくは複数の分離剤、1つもしくは複数の酸化防止剤、1つもしくは複数のハーブ抽出物および植物抽出物、1つもしくは複数の安定化剤、1つもしくは複数のポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（HPMA）、ポリエチレンイミン（PEI）、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリエチレングリコール（PEG））、1つもしくは複数の取り込みメディエーター（例えば、ポリエチレンイミン（PEI）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、細胞透過性ペプチド（CPP）、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）、抗菌ペプチドなど）、1つもしくは複数の抗体、1つもしくは複数の甘味剤（例えば、スクロース、アセスルファムK、サッカリンNa）、1つもしくは複数の対比染色色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、Cy色素、Alexa Fluor色素、S色素、ローダミン、量子ドットなど）、1つもしくは複数のホメオパシー成分、1つもしくは複数の味覚物質、ならびに／または1つもしくは複数の芳香剤を含んでもよい。
【００７３】
本発明は、感覚受容体によるCTL応答のモジュレーションに基づく治療アプローチに関するだけでなく、同じ発明概念に基づく、CTL応答に対する細胞抵抗性の診断にも関する。
【００７４】
したがって、1つのさらなる局面において、本発明は、患者におけるCTL応答に対する細胞抵抗性を診断するための方法に用いるために感覚受容体を検出するための手段に関する。
【００７５】
そのような方法は、他の用途に加えて、T細胞ベースの、特にCTLベースの治療法の有用性を予測することも可能にする。CTL応答が望まれる場合（例えば、癌患者、または感染症に罹患した患者において）であって、患者またはその内部の特定の組織がCTL応答に対してかなり強い抵抗性を持つことが明らかになった場合には、前記患者を治療している当業者は好ましくは、CTL応答に対する抵抗性を低下させる化合物によっても患者を治療することを考慮するであろう。これは好ましくは、本発明による化合物であってよい。代替的または追加的に、当業者が、患者を治療するのにCTLベース以外の方法を用いてもよい。その反対に、CTL応答が強過ぎるかまたは誤って起こっている場合（例えば、自己免疫に罹患した患者、または移植片対宿主病に罹患した患者において）には、前記患者を治療している当業者は好ましくは、CTL応答に対する抵抗性を増大させる化合物によっても患者を治療することを考慮するであろう。これは好ましくは、本発明による化合物であってよい。
【００７６】
「検出するための手段」という用語は、感覚受容体を検出するのに適するあらゆる化合物または組成物として、最も広い意味で解釈されうる。例示的には、手段は、感覚受容体と選択的に結合する化合物であるかまたはそれを含んでよい。
【００７７】
本明細書で用いる場合、「化合物」という用語は、本発明による化合物に関して上記に定義したような、最も広い意味で解釈されうる。
【００７８】
検出するための手段は、500Da以下の分子量を有する1つもしくは複数の種類の低分子であるかまたはそれを含んでもよく、500Daよりも高い分子量を有する1つもしくは複数の種類の高分子量化合物であるかまたはそれを含んでもよく、またはそれらの混合物であるかまたはそれを含んでもよい。好ましくは、検出するための手段は、1つまたは複数の種類の高分子量化合物であるかまたはそれを含む。1つの特に好ましい態様において、検出するための手段は、感覚受容体と選択的に結合する、1つまたは複数の抗体またはそれらの誘導体（例えば、Fab断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、フレキシボディ、タンダブ）であるかまたはそれを含む。
【００７９】
または、手段が、感覚受容体の天然または人工の特異的結合パートナー、例えば、嗅覚受容体の1つによって特異的に認識されるホルモンまたは嗅覚化合物であってもよい。
【００８０】
特にインビボ用途の場合には、そのような高分子量化合物が感覚受容体の分子構造と特異的に結合することが好ましく、ここで前記分子構造が細胞の外表面に存在することは把握されているであろう。典型的には、細胞の外表面に存在する前記分子構造は、感覚受容体の1つの細胞外ドメイン、または2つもしくはそれを上回る細胞外ドメインの組み合わせである。高分子量化合物が抗体またはその断片である場合、そのような分子構造はエピトープであり、例えば、線状または構造エピトープであってよい。
【００８１】
好ましくは、検出性を向上させる目的で、手段またはその部分は標識されており、特に蛍光性に標識されるか、造影剤によって標識されるか、スピン標識されるか、および／または放射性に標識されていて、特に前記化合物は抗体またはその感覚受容体結合性断片である。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「検出すること」という用語は、感覚受容体のあらゆる認識、決定、局在決定および／または定量として、最も広い意味で解釈されうる。本明細書で用いる場合、検出することは、当技術分野において公知のあらゆる手段によって行うことができる。
【００８３】
本発明のこの局面に関連して、好ましくは、検出はインビボで患者において行われる。代替的または追加的に、本発明のこの局面に関連して、検出をインビトロで試料において行ってもよく、好ましくは前記試料は患者から得られる。本明細書で用いる場合、検出は、当技術分野においてこの目的のために公知のあらゆる手段、例えば、X線ベースの手法によって（例えば、標準的なX線、コンピュータ断層撮影法（CT））、スピン検出（例えば、磁気共鳴映像法（MRI））、蛍光および／または他の発光を検出することによって（例えば、蛍光分子トモグラフィー（FMT）、蛍光分子映像法（FMI）、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法（SPECT）、光学顕微鏡法（明視野顕微鏡法）、蛍光顕微鏡法（例えば、蛍光光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法（例えば、レーザー走査型顕微鏡法（LSM）、単一光子型顕微鏡法）によって）、蛍光相関分光法（FCS）、蛍光相互相関分光法（FCCS）、蛍光偏光解消）、放射能を検出することによって（例えば、ポジトロン放出分光法（PET）、シンチグラフィー）、電子顕微鏡法、および／または超音波を検出することによって、行うことができる。上記のうち2つまたはそれを上回る方法を別のものと組み合わせてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【００８４】
当業者は、上記の検出手法の多くについて、その検出性を向上させるために、意図する検出方法に応じた手段を標識することが有益であると考えられることを把握しているであろう。例示的には、蛍光性に標識された手段は、蛍光ベースの方法のために用いることができ、一方、スピン標識された手段はスピン検出のために用いることができ、放射性に標識された手段は放射能の検出のために用いることができ、重原子標識された手段は、X線ベースの方法および電子顕微鏡法に用いることができる。
【００８５】
さらに、手段は、他の分子とコンジュゲートまたは結合されてもよく、それは融合タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）、1つもしくは複数の脂質もしくはリピドイド、1つもしくは複数の低分子色素（例えば、蛍光性色素もしくはUV／可視色素（例えば、p-ニトロフェニルモイエティー、クーマシーブリリアントブルーG-250）、1つもしくは複数の量子ドット、1つもしくは複数の結合モイエティー（例えば、ビオチン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、または例えば、1つもしくは複数の活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、グルタルアルデヒド誘導体、カルボジイミド誘導体またはそれらの組み合わせを含むモイエティー）、1つもしくは複数の不溶性および／もしくは可溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（HPMA）、ポリエチレンイミン（PEI））、1つもしくは複数の抗体／抗体もしくはそれらの誘導体（例えば、Fab断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、フレキシボディ、タンダブ（tandab））、1つもしくは複数のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド（CPP）、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）、シグナル伝達ペプチドなど）、1つもしくは複数のスピン標識、1つもしくは複数の酵素標識（例えば、ペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、マイクロビーズもしくはナノビーズ（例えば、官能化シリカビーズ、多糖ベースのビーズ）、ポリマーソームおよび／またはリポソームのことを指しうるが、これらには限定されない。
【００８６】
本方法をインビトロで行う場合には、試料を任意で固定および／または染色してもよく、それを「標本」または「顕微鏡標本」と呼んでもよい。標識された手段または標識されていない手段が前記患者に投与される場合には、任意の免疫学的方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法、FCSおよび／またはFCCS）によって、細胞または固形組織の試料を検査してもよい。
【００８７】
本発明はまた、本発明による診断のための手段を含み、任意でさらに（i）1つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または（ii）使用者マニュアルも含む、薬学的組成物およびキットに関することが理解されるであろう。
【００８８】
1つの好ましい態様において、手段は、感覚受容体と選択的に結合する少なくとも1種の化合物を含み、好ましくは前記化合物は標識されており、特に蛍光性に標識されるか、造影剤によって標識されるか、スピン標識されるか、および／または放射性に標識されていて、特に前記化合物は抗体またはその感覚受容体結合性断片である。
【００８９】
本発明に関連して、「標識された」という用語は、インビボおよび／またはインビトロでのその検出を可能にする、1つまたは複数のモイエティーを保有する手段として、最も広い意味で解釈されうる。本明細書で用いる場合、「標識」、「検出可能なモイエティー」および「マーカー」という用語は、互換的に解釈されうる。標識は、例えば、放射性標識、スピン標識、蛍光性標識または発光性標識であってよい。標識は、手段と直接的にコンジュゲートされてもよく、または機能的リンカー（例えば、ペプチドリンカー、ポリエチレングリコール（PEG）リンカー、糖類リンカー、脂肪酸リンカー、アルキルリンカーなど）を介してコンジュゲートされてもよい。または、1つまたは複数の標識抗体／抗体またはそれらの誘導体（例えば、Fab断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、フレキシボディ、タンダブ）を標識して、手段と結合させてもよい。手段との結合はインビトロまたはインビボのいずれで起こってもよい。前述の標識をインビトロで手段に追加してもよく、またはインビボで患者に直接的に添加してもよい。
【００９０】
本発明に関連して、放射性標識には、シンチレーションアッセイ、コンピュータ断層撮影法（CT）に適した3H、32P、35S、14C、99mTcもしくはランタノイド（例えば、64Gd）、またはポジトロン放出断層撮影法（PET）に適した標識が非限定的に含まれうる。手段を単独で直接的に放射性標識してもよく、または放射性標識分子のコンジュゲーションもしくは複合体化を介しててもよい。さらに、手段を、例えば核磁気共鳴（NMR）によって検出可能な1つまたは複数の重同位体、例えば、13C、Gdまたは2Hなどのスピン標識の手段によって標識してもよい。
【００９１】
標識が、蛍光性色素または発光性色素であってもよい。本明細書で用いる場合、「蛍光性色素」、「蛍光色素」および「蛍光団」という用語は、互換的に用いうる。蛍光性色素は、蛍光性ポリペプチド（例えば、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）または黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、mCherryなど）、低分子色素（例えば、Cy色素（例えば、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy 7）、Alexa色素（例えば、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750）、Visen色素（例えば、VivoTag680、VivoTag750）、S色素（例えば、S0387）、DyLight蛍光団（例えば、DyLight 750、DyLight 800）、IRDye（例えば、IRDye 680、IRDye 800）、フルオレセイン色素（例えば、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC））、ローダミン色素（例えば、ローダミン、テトラメチルローダミン（TAMRA））またはHOECHST色素）または量子ドットであってよい。1つまたは複数の色素を組み合わせてもよい。本明細書で用いる場合、「発光性色素」という用語は、化学反応または生化学反応が起こると光を発する、あらゆる分子のことを指しうる。
【００９２】
診断方法への言及に関連して、「感覚受容体」という用語は、上記に定義された通りの最も広い意味で解釈されうる。
【００９３】
したがって、1つの好ましい態様において、感覚受容体は細胞表面に局在する受容体であって、好ましくは前記感覚受容体は、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される。
【００９４】
これに関連して用いられる用語は、上記に定義された通りの最も広い意味で解釈されうる。
【００９５】
また、診断に関連して、1つの好ましい態様において、患者は新生物、自己免疫疾患、感染症および／または移植片対宿主病に罹患しており、特に前記患者は新生物に罹患しており、特に前記新生物は癌、特に乳癌である。
【００９６】
これに関連して用いられる用語は、上記に定義された通りの最も広い意味で解釈されうる。
【００９７】
本発明はまた、本発明による化合物および／または本発明による検出のための手段、ならびに任意でさらに（i）1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または（ii）使用者マニュアルを含む、薬学的組成物およびキットにも関することが理解されるであろう。
【００９８】
本発明に関連して、「キット」という用語は、診断を行うために用いうる種々の生成物の組成物として、最も広い意味で解釈されうる。キットが、上記の治療法に関連して記載された通りの内容物を含んでもよい。
【００９９】
本発明は、インビボでの患者における診断方法だけでなく、インビトロにおけるものにも関する。したがって、1つのさらなる局面において、本発明は、インビトロでCTL応答に対する細胞の抵抗性を判定するための方法であって、
（i）CTL応答に対する抵抗性に関して試験しようとする細胞を提供する段階、
（ii）前記細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する段階、および
（iii）感覚受容体の前記量を、感覚受容体をその表面に持たない同等の細胞、および／またはCTL応答に対する高度の抵抗性が生じるような量をその表面に有する同等の細胞の標準値と比較する段階、
を含む方法に関する。
【０１００】
本発明に関連して用いる場合、「インビトロ」および「エクスビボ」という用語は、多細胞生物、例えばヒト患者などの生体外で行われるあらゆる方法として、最も広い意味で互換的に解釈されうる。インビトロ法は、あらゆる生きた材料の外部で行われる方法であってよく、ならびに／または細胞培養、卵ベースの方法、もしくは当業者および／もしくは欧州特許条約（EPC）および／もしくは米国（U.S.A.）の1つもしくは複数の加盟国の1つもしくは複数の管轄区域の判例法においてインビトロ法と見なされているあらゆる他の方法で行われてよい。インビトロ法を、「アッセイ」、「スクリーニングアッセイ」、「スクリーニング」などと呼んでもよい。
【０１０１】
第1の段階では、CTL応答に対する抵抗性に関して試験しようとする細胞を提供する。本明細書において、「細胞を提供すること」という用語は、試験しようとする細胞を、そのために適した任意の供給源から得ることとして、最も広い意味で解釈されうる。好ましくは、細胞は患者から得られる。これには、細胞を患者から直接的に得ること、または患者から抽出した後に1回もしくは複数回の継代を行うことが含まれうる。または、細胞は、細胞培養物から得られた細胞であってもよい。いずれの場合であっても、細胞は好ましくは真核細胞、特に哺乳動物細胞である。最も好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【０１０２】
CTL応答は、最も好ましくは、その細胞を得たのと同じ生物によるCTL応答である。この方法に関連して同じく用いられるCTLについては、上記の治療法に関連して定義されている。
【０１０３】
1つのさらなる段階において、細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する。ここで、細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量の決定は、当技術分野において公知であって上記に定義されたあらゆる手段によって、特に上記に定義された通りの標識抗体の手段によって行うことができる。
【０１０４】
代替的または追加的に、検出を、遺伝子発現レベルで、例えば、qPCRプライマープローブを用いることによって行うこともできる。その場合は、例示的には、逆転写および定量的PCRを行うことができる。続いて、qPCRプライマープローブは診断ツールとしても役立てることができ、細胞の内部に関する情報を与えることもできる。
【０１０５】
最後に、細胞の表面にある感覚受容体の量を、標準的な試料と比較する。典型的には、この標準的な試料は、感覚受容体をその表面に持たない同等の細胞（CTL応答の陽性対照（Ctrl））、および／またはCTL応答に対する高度の抵抗性が生じるような量をその表面に有する同等の細胞（CTL応答の陰性対照（Ctrl））を含む。
【０１０６】
この方法の特に好ましい態様は、本発明の実施例において詳細に明示されている。
【０１０７】
同じくこれに関連して、1つの好ましい態様において、感覚受容体は、細胞表面に局在する受容体であって、好ましくは、前記感覚受容体は、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される。
【０１０８】
1つの好ましい態様において、患者は新生物、自己免疫疾患、感染症および／または移植片対宿主病に罹患しており、特に前記患者は新生物に罹患しており、特に前記新生物は癌、特に乳癌である。
【０１０９】
1つの好ましい態様において、前記細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する段階（方法の段階（ii））は、細胞を、少なくとも1種の感覚受容体と選択的に結合する少なくとも1種の化合物と接触させることを含み、ここで好ましくは前記化合物は標識されており、特に蛍光性に標識されるか、造影剤によって標識されるか、スピン標識されるか、および／または放射性に標識されていて、特に前記化合物は抗体またはその感覚受容体結合性断片である。
【０１１０】
本発明の全体を通じて用いられる、「細胞を接触させること」という用語は、細胞に対して影響を及ぼす可能性のある物質を細胞に添加することとして、最も広い意味で解釈されうる。化合物の薬理学的特性に応じて、かつ化合物がインビボまたはインビトロのいずれに用いられるかに応じて、細胞を接触させるのに適切な手段が選択されると考えられる。
【０１１１】
インビボでの患者における適用の場合には、化合物を局所性に投与してもよく、または全身性に投与してもよいことが理解されるであろう。優れた生物学的利用能および薬物動態を有する化合物は、好ましくは患者に対して全身性に与えられる（例えば、注射により、経口的に、または経鼻的に）。代替的または追加的に、それを局部的または皮下に投与してもよい。抗体および／またはsiRNAを含む薬学的組成物の場合には、注射が典型的には最も好ましい。その場合、化合物は、例示的には、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、動脈内（i.a.）、筋肉内（i.m.）、皮下（s.c.）に注射されるか、かつ／または局所性、例えば、腫瘍などの罹患組織中に直接注射される。または、化合物が、例えば、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、チュワブルカプセル、シロップ、ジュース、ゲル、液体またはペーストなどとして経口服用されてもよい。または、化合物を、経鼻的（鼻内）に（例えば、噴霧薬またはエアロゾルとして）、経皮的に（例えば、クリーム、噴霧薬もしくは軟膏として、および／またはコーティングされた硬膏として）、ならびに／または吸入（例えば、エアロゾルもしくは噴霧薬の吸入）によって取り込ませてもよい。
【０１１２】
インビトロでの適用、例えば、細胞培養物における場合には、化合物を1つのやり方で、または数多くのやり方の組み合わせで、細胞に投与しうることが理解されるであろう。感覚受容体の外面側と結合する抗体などのように、化合物を細胞の外表面で作用させようとする場合には、化合物を細胞に添加するだけでよい。対照的に、例えば、siRNA、発現に影響を及ぼす別の化合物、または細胞内シグナル伝達に影響を及ぼす化合物などのように、化合物を細胞の細胞質中で作用させようとする場合には、それを細胞内に入れる必要がある。その場合に、薬理学的特性が好都合である場合には、化合物を同じく細胞外に添加するだけでよい。対照的に、薬理学的特性があまり好都合でない場合には、化合物を、例示的には、エレクトロポレーションによって、トランスフェクション剤（例えば、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン（PEI）、正荷電脂肪酸）を使用する手段によって、化合物とコンジュゲートもしくは複合体化された細胞透過性ペプチド（CPP）もしくはタンパク質形質導入ドメイン（PTD）を使用する手順によって、マイクロビーズおよび／もしくはナノビーズの手段によって、ミセルの手段によって、リポソームの手段によって、ならびに／またはポリマーソームの手段によって、投与することができる。
【０１１３】
この方法に関連して用いられるさらなる用語については、本発明の化合物の治療的使用に関連して上記に説明した定義が同じく当てはまる。読み取りの前に、細胞を任意で緩衝液および／または培地によって洗浄してもよい。
【０１１４】
1つの代替的な好ましい態様において、前記細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する段階（方法の段階（ii））は、細胞を、少なくとも1種の感覚受容体の少なくとも1種のアンタゴニストであって特に前記感覚受容体に対して相補的な低分子干渉リボ核酸（siRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である前記アンタゴニストと接触させること、少なくとも1種のアンタゴニストと接触させた細胞を少なくとも1種のCTLとともにコインキュベートすること、およびその後にCTL活性を決定することを含む。
【０１１５】
siRNAを用いるこの方法の1つの特に好ましい態様は、本発明の実施例において詳細に明示されている。
【０１１６】
本発明の全体を通じて用いられる、コインキュベートすることとは、細胞を、それらの生存度を維持することを可能にする条件下で培養する手段のことを意味する。哺乳動物細胞の場合は、典型的には、約30℃〜約40℃の温度、特に約37℃の温度が適している。細胞を好ましくは、栄養分を含む培地中でインキュベートする。短期コインキュベーションに関しては、それらを適切な緩衝液中でインキュベートしてもよい。いずれの場合も、pHは典型的には極めて中性の範囲、すなわち、約pH 6〜pH 8、特に約pH 7.0〜pH 7.5であると考えられる。コインキュベーション時間は、好ましくは、CTL応答の発生が可能になるのに十分に長く続けられる。典型的にはそれは、30分間〜数日の間、特に数時間、例えば1時間、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24時間などにわたって、好ましくは約4時間〜24時間の範囲、さらにより好ましくは約12時間〜20時間の範囲にわたって続けられる。
【０１１７】
読み取りの前に、細胞を任意で緩衝液および／または培地によって洗浄してもよい。
【０１１８】
CTL活性は、当技術分野において公知のあらゆる手段によって決定することができる。
【０１１９】
1つの好ましい態様において、前記細胞の表面にある少なくとも1種の感覚受容体の量を決定する段階（方法の段階（ii））は、以下のうち1つによってCTL活性を決定する段階を含む：（i）少なくとも1種のCTLとともにコインキュベートした細胞の生存度を決定し、その生存度を、前記アンタゴニストによって処理していない同等の細胞およびCTLを含む試料のものと比較すること、または
（ii）CTL活性にとって典型的なポリペプチド、例えば1つもしくは複数のインターフェロン（IFN）、1つもしくは複数のインターロイキン（IL）および／または1つもしくは複数の腫瘍壊死因子（TNF）などの排出を決定し、その結果を該アンタゴニストによって処理していない同等の細胞およびCTLを含む試料のそれと比較すること。
【０１２０】
本発明はさらに、感覚受容体がCTL応答を抑制するのと同じ原理に基づいて、本発明による化合物を同定するための方法に関する。本明細書において、本発明者らは、CTLにより誘導される腫瘍細胞死を、スクリーニングのための好ましい選択基準として選択した。
【０１２１】
それに基づき、本発明はさらに、CTLに対する細胞の応答に影響を及ぼす作用物質を同定するための方法に言及する1つのさらなる局面に関し、前記方法は以下の段階を含む：
（i）CTL応答を妨げる少なくとも1種の表面ポリペプチドを発現し、さらに生物発光を可能にするポリペプチド、特にルシフェラーゼも発現する細胞を提供する段階、
（ii）段階（i）の細胞を、関心対象の少なくとも1種の作用物質と接触させる段階、
（iii）段階（ii）から得られた細胞を、CTL、およびCTLの抗原受容体を段階（ii）の細胞の細胞表面分子と架橋させる作用物質とともにコインキュベートする段階、
（iv）段階（iii）から得られた生細胞を回収する段階、
（v）段階（iv）から得られた細胞のサイトゾルの生物発光を決定する段階、ならびに
（vi）少なくとも1種の作用物質と接触させた細胞の生物発光を、作用物質と接触させていない細胞、かつ／または1種もしくは複数の他の薬剤と接触させた陰性対照の細胞と比較する段階。
【０１２２】
本明細書で用いる場合、「作用物質を同定すること」は、CTLに対する細胞の応答に影響を及ぼしうる作用物質を発見することとして、最も広い意味で解釈されうる。
【０１２３】
本発明に関連して、「作用物質」は、上記に定義された通りのあらゆる化合物、すなわち、感覚受容体と選択的に結合する、あらゆる分子、塩または分子複合体もしくは凝集体として、最も広い意味で解釈されうる。本明細書において、作用物質は、上記の化合物に関連して好ましい態様として明示された特性を有すると考えられる。したがって、最も好ましくは、作用物質は、siRNA、特に感覚受容体の発現を減少させるsiRNA、または感覚受容体もしくは感覚受容体の一群と結合する抗体であって、特に前記抗体はモノクローナル抗体である。本明細書において、siRNAおよび抗体という用語は、上記に定義された通りの最も広い意味で解釈されうる。当業者は、CTL応答を増強しようとする場合にはsiRNAならびに感覚受容体遮断抗体が特に好ましい作用物質であり、一方、CTL応答を弱めようとする場合にはT細胞-感覚受容体架橋抗体が特に好ましい作用物質であると考えられることを把握しているであろう。
【０１２４】
CTLに対する細胞の応答に影響を及ぼす作用物質を同定するためのこの方法を実施する場合に、前記方法を実施する当業者は、試験しようとする関心対象の単一の作用物質（候補作用物質）を試験してもよく、または種々の作用物質、もしくはさらには種々の作用物質のライブラリーを用いてもよい。種々の候補作用物質のそのようなライブラリーにおいて、前記方法を実施する当業者は、分子構造の類縁した分子（例えば、抗体ライブラリー、RNAライブラリー、DNAライブラリー、ポリペプチドライブラリー、低分子ライブラリーなど）を試験してもよく、または分子構造の異なる分子を試験してもよい。そのような試験を実施する場合には、単一の候補作用物質を試験してもよく、または2つもしくはそれを上回る候補化合物をそれぞれが含む1つもしくは複数の組成物を試験してもよい。siRNAライブラリーを用いる場合には、好ましくは、典型的には細胞表面に局在する、かつ／または細胞シグナル伝達に関与する、ポリペプチドの発現活性をコードするmRNAを標的とするsiRNAを選択する。好ましくは、siRNAライブラリーを用いる場合には、同じポリペプチドの発現活性を標的とする（すなわち、同じポリペプチドの発現を低下させる）、複数の、2種類を上回る、3種類を上回る、4種類を上回る、またはさらには5種類を上回るsiRNA分子を含む組成物を同時に用いる。
【０１２５】
最も好ましくは、作用物質を同定するための方法は、特に新生物、例えば癌、最も特定的には乳癌などの免疫拒絶を抑制する新規な免疫調節分子を同定するためのスクリーニング法、特にハイスループットスクリーニング、より好ましくはハイスループットsiRNAスクリーニング、特にハイスループットsiRNAスクリーニングである。したがって、本方法はまた、CTLに対する腫瘍抵抗性を媒介する免疫チェックポイント分子の検出のためのハイスループットRNAiスクリーニング（例えば、siRNAスクリーニング）にも関する。したがって、全体として、本発明者らは、ハイスループット共培養設定において細胞傷害性T細胞によって媒介される実際の腫瘍細胞溶解を測定することを可能にするアッセイを確立した。
【０１２６】
この方法に用いられる細胞は、CTL応答に関与しうるあらゆる細胞、すなわち、好ましくは哺乳動物起源の細胞、特にヒト起源の細胞であってよい。細胞は好ましくは、上記に定義された通りの特徴を有する。最も好ましくは、細胞は異常増殖細胞、例えば、新生物細胞、特に癌細胞などに関与する。上記に明示した通り、細胞は患者から直接的に得てもよく、そのような細胞の数世代後の子孫であってもよく、または細胞培養細胞であってもよい。
【０１２７】
作用物質を同定するための本方法の実施を可能にすることを目的として、細胞はCTL応答を妨げる少なくとも1種の表面ポリペプチドを発現する。これに関連して、細胞はそのようなポリペプチドを天然で発現しうるか、またはそのようなポリペプチドをコードする、前記細胞において活性のある遺伝子によってトランスフェクトされている。典型的には、細胞は、特にそれが癌細胞である場合には、CTL応答を妨げる少なくとも1種のポリペプチドを天然に発現すると考えられる。しかし、任意で、CTL応答を妨げる効果を高め、その結果として方法の読み取り値を向上させるために、より多量の各々のポリペプチドを得る目的で、細胞をさらにトランスフェクトさせることも有益であると考えられる。さらに、特定の場合には、CTL応答を妨げる1つまたは複数の特定のポリペプチドを天然には発現しない細胞に、そのためのものをコードする活性遺伝子をトランスフェクトさせて、CTL応答を妨げるそのようなポリペプチドの規定の組成物により、高度に規定された読み取り値を持たせることも有益であると考えられる。
【０１２８】
本発明による方法の読み取りを可能にすることを目的として、細胞は、生物発光を可能にするポリペプチド、特にルシフェラーゼもさらに発現する。このことにより、生細胞の容易な定量が可能になる。
【０１２９】
第2の段階では、細胞を、関心対象の少なくとも1種の作用物質（候補化合物）と接触させる。薬理学的特性に応じて、方法は選択されるであろう。これに関連しては、上記の細胞を接触させるための定義が同じく当てはまる。細胞を任意で緩衝液および／または培地によって洗浄してもよい。
【０１３０】
続いて、1つのさらなる段階において、細胞を、CTL、およびCTLの抗原受容体を細胞の細胞表面分子と架橋させる作用物質とともにコインキュベートするが、ここで細胞表面分子は典型的には、1種のポリペプチド、または少なくとも1種のポリペプチドを含む複合体であると考えられる。例示的には、架橋性のさらなる作用物質は、抗体、特に二重特異性抗体であってよい。好ましくは、そのような二重特異性抗体の結合特異性の一方は、T細胞の表面に発現されるポリペプチドを対象とし、一方、もう一方は、試験しようとする他の細胞の表面に発現される。1つの特に好ましい態様において、T細胞の表面に発現されるポリペプチドはCD3である。もう1つの特に好ましい態様において、試験しようとする細胞で発現されるポリペプチドはEpCAMである。1つの最も好ましい態様において、T細胞の表面に発現されるポリペプチドはCD3であり、試験しようとする細胞で発現されるポリペプチドはEpCAMである。この架橋は、CTL応答を、候補作用物質の効果の読み取り値を向上させるレベルまで増強する。最も典型的には、架橋性作用物質は、抗体、特に少なくとも2種類の結合特異性を有する抗体である：その一方はT細胞表面ポリペプチドに対し、もう一方は、候補作用物質と接触される細胞上および／または細胞内（好ましくは細胞上）に存在するポリペプチドである。
【０１３１】
生細胞を回収する次の段階は、当技術分野において公知のあらゆる手段によって行ってよい。例示的には、細胞が付着性に増殖している場合には、緩衝液および／または培地による（単純な）洗浄段階を用いて成長できない細胞を洗い流して、生細胞を固体担体上に回収することができる。代替的または追加的に、生細胞を、他の手段、例えば、蛍光結合細胞分取（fluorescence associated cell sorting）（FACS）などによって回収することもできる。
【０１３２】
続いて、細胞のサイトゾルの生物発光を決定する。生物発光性ポリペプチドを発現するのは生細胞のみであることから、これにより、生細胞の量の評価が可能になる。好ましくは、細胞を、任意の手段（例えば、1つもしくは複数の界面活性剤（例えば、Triton-X-100）の手段によって、機械的ホモジネート化の手段（例えば、PotterまたはDownsのホモジナイザーによる、フレンチプレスによる、スクラッチングによる）によって、および／または音波処理の手段によって、溶解させる。続いて、任意で、遠心分離によって細胞膜を高度に除去する。適切な生物発光前駆化合物および各々の補因子を添加して、生物発光を検出する。または、生物発光を生細胞において決定してもよい。
【０１３３】
最後に、少なくとも1種の候補作用物質と接触させた細胞の生物発光を、作用物質と接触させていない、かつ／または1つもしくは複数の他の薬剤と接触させた陰性対照の細胞と比較する。
【０１３４】
これらの試料の間の生物発光の違いは、CTL応答の差の逆数と高度に対応する。すなわち、特定の化合物とともにインキュベートした細胞から得られた試料における生物発光が、対照試料から得られた生物発光と比較して2分の1未満の低さであれば、化合物を伴う試料におけるCTL応答は2倍に増大している。
【０１３５】
本発明はまた、本発明による作用物質を同定するための方法を実行するための手段を含み、ならびに任意で使用者マニュアルをさらに含むキットにも関することは理解されるであろう。
【０１３６】
当業者は、本方法が、作用物質の同定を可能にするだけでなく、引き続いて、本方法が、総体として癌の「免疫モジュラトーム」である、多くの種類の腫瘍における免疫調節遺伝子の迅速かつ包括的な決定をも可能にすることを把握しているであろう。これらの遺伝子は、好ましくは、siRNAライブラリーを用いることによって同定される。同じポリペプチド（候補ポリペプチド）をコードするmRNAを標的とする1つの特定のsiRNAまたはいくつかのsiRNAの組み合わせは、本方法において正の効果を示しており、このことは発現が抑制されたポリペプチドがCTL応答を妨げるポリペプチドであることを示している。その場合、このポリペプチドは、本発明の意味において分子標的構造として役立つ可能性があり、本発明による化合物による標的となる可能性もある。
【０１３７】
CTL応答を妨げる表面ポリペプチドは、当技術分野において公知のこの特性を有するあらゆるポリペプチドであってよい。
【０１３８】
1つの好ましい態様において、表面ポリペプチドは感覚受容体であり、より好ましくは、前記感覚受容体は、
（a）好ましくは以下のものからなる群より選択される嗅覚受容体：
（i）味覚受容体、特に味覚受容体2型（TAS2R）、特に味覚受容体2型メンバー3（TAS2R3）、
（ii）ファミリー1、2または51の嗅覚受容体、特にファミリー1サブファミリーFの嗅覚受容体（OR1F）、特にファミリー1サブファミリーFメンバー1の嗅覚受容体（OR1F1）、ファミリー2サブファミリーJの嗅覚受容体（OR2J）、特にファミリー2サブファミリーJメンバー2の嗅覚受容体（OR2J2）、またはファミリー51サブファミリーEの嗅覚受容体（OR51E）、特にファミリー51サブファミリーEメンバー2の嗅覚受容体（OR51E2）、および
（iii）鋤鼻受容体、好ましくは鋤鼻1、特に鋤鼻1受容体4（VN1R4）；
（iv）フェロモン受容体；ならびに
（b）オプシン、特にオプシン3（OPN3）
からなる群より選択される。
【０１３９】
この方法に関連して用いられる用語については、本発明の化合物の治療的使用に関連して上記に説明した定義が同じく当てはまる。
【０１４０】
1つの好ましい態様において、CTLは、予備活性化CD8+ T細胞、特にCD3特異的抗体および／またはCD28特異的抗体を通じてのT細胞受容体（TCR）刺激によって予備活性化されたCD8+ T細胞である。
【０１４１】
CD3またはCD28に対して特異的なそのような抗体は、T細胞応答を刺激するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。好ましくは、それはモノクローナル抗体である。
【０１４２】
または、CTLは、抗原特異的なT細胞クローン、例えば、さまざまな妥当性検証試験において示されているもののようなサバイビン特異的T細胞であってもよい。その場合、抗原特異的T細胞クローンの性質および親和性は、用いる腫瘍細胞の種類に依存する。例えば、黒色腫抗原特異的T細胞クローン（例えば、MART-1、gp-100特異的T細胞クローン）を、黒色腫細胞上に発現される免疫調節因子（immune modulator）を検出するために用いることができる。任意で、患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）も、CTLとして用いることができる。
【０１４３】
1つの好ましい態様において、作用物質は、siRNA、特に、典型的には細胞表面に局在し、かつ／または細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをコードするメッセンジャーリボ核酸（mRNA）に対して相補的なsiRNAである。
【０１４４】
この方法では、感覚受容体とT細胞との間の相互作用に影響を及ぼす可能性のある作用物質が同定されうる。したがって、本発明の1つのさらなる局面は、本発明による方法によって同定された作用物質に関する。
【０１４５】
本発明の1つのさらに別の局面は、病的な細胞性CTL応答と関連のある疾患、特に新生物、特に癌、自己免疫疾患、感染症および移植片対宿主病疾患からなる群より選択される疾患を治療または予防するための方法に用いるための、本発明による方法によって同定された作用物質、またはそれをコードする遺伝物質に関する。
【０１４６】
本発明のこの局面に関連して用いられる用語については、本発明の化合物の治療的使用に関連して上記に説明した定義が同じく当てはまる。これはまた、以下のその好ましい態様にも当てはまる。
【０１４７】
1つの好ましい態様において、本発明による作用物質は、特に新生物、特に癌に罹患した患者における活性化CTLに対する免疫応答を増強し、ここで好ましくは、CTL応答を妨げる表面受容体の局所表面濃度および／またはT細胞結合活性が低下する。
【０１４８】
本発明はまた、本発明による作用物質を含み、ならびに任意でさらに（i）1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または（ii）使用者マニュアルを含む、薬学的組成物およびキットにも関する。
【０１４９】
もう1つの好ましい態様において、作用物質は、
（i）感覚受容体の発現を低下させる作用物質、特に前記感覚受容体をコードするmRNAに対して相補的なsiRNA、および
（ii）前記感覚受容体に対するT細胞結合活性を妨げる作用物質、特に抗体または感覚受容体結合性断片である前記作用物質、
からなる群より選択される。
【０１５０】
1つの代替的な好ましい態様において、本発明による作用物質は、特に自己免疫疾患および／または移植片対宿主病に罹患した患者における活性化CTLに対する免疫応答を抑制し、ここで好ましくは、CTL応答を妨げる表面受容体の量および／またはT細胞結合活性が増強される。
【０１５１】
1つの好ましい態様において、作用物質は、
（i）感覚受容体をコードする遺伝物質、
（ii）前記感覚受容体の発現を増強する作用物質、および
（iii）CTLを妨げる表面ポリペプチドをT細胞と架橋させる作用物質、特に架橋性抗体または抗体断片、
からなる群より選択される。
【０１５２】
1つの好ましい態様において、作用物質は、1つまたは複数のさらなる免疫調節物質と組み合わせて用いられる。
【０１５３】
本発明はさらに、対象における病的な細胞性細胞傷害性T細胞と関連のある疾患を予防する方法であって、前記対象に対して、感覚受容体と選択的に結合するかまたは感覚受容体の発現を選択的に変化させる十分な量の化合物を投与することによる方法にも関する。
【０１５４】
本発明はさらに、対象におけるCTL応答に対する細胞抵抗性を診断する方法であって、前記対象に対して、感覚受容体を検出するために十分な量の手段を投与することによる方法にも関する。
【０１５５】
以下の図面および実施例は、本発明を例示することを意図しており、特許請求の範囲によって付与される保護の範囲を限定することは意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図1は、免疫チェックポイント分子の同定のために用いたLuc-CTLアッセイのデザインを示している。（A）CTLおよび二重特異性抗体（bsAb）に曝露されたかまたは曝露されなかったルシフェラーゼ発現細胞を用いてRNAiを行う。読み取りの前に、細胞上清を除去し、残ったインタクト細胞を溶解させて、残留性の細胞結合ルシフェラーゼを測定する。免疫チェックポイントの調節因子を同定するには、CTLを伴う条件およびCTLを伴わない条件について、正規化したルシフェラーゼ測定値の間の差を算出する。CTL細胞傷害作用を増強するsiRNAは、CTLを伴う条件下で正規化ルシフェラーゼレベルのみを低下させると考えられ、それ故に、ルシフェラーゼ測定値の間の差は0を上回ると考えられる。（B）PBMC由来CD8+ T細胞および抗CD3×抗EpCAM二重特異性抗体（○）を用いて、異なるT細胞-MCF7細胞比で行ったLuc-CTLアッセイ。抗CD3×抗CD19二重特異性Ab（■）を特異性対照として用いたが、これはCD19がBリンパ球特異的抗原であり、それ故にこのbsAbは腫瘍をT細胞と架橋させることができないためである。ルシフェラーゼ強度が低いほど溶解が高度であることを指し示している。（C）対照siRNAまたはPD-L1特異的siRNAをトランスフェクトさせた上で、CTLおよびbsAbとの共培養を行うかまたは行わなかったたMCF7細胞を用いて、Luc-CTLアッセイを行った。各条件について、PD-L1-siRNA処理細胞のルシフェラーゼ活性を対照処理のものに対して正規化し、ここに示している；n＝8。（D）MCF7を標的細胞とし、サバイビン特異的T細胞をエフェクター細胞としてさまざまなE：T比で用いた、Luc-CTLアッセイ（■）と古典的クロム放出アッセイ（○）との比較。エラーバーは+/-SEMを表している。
【図２】免疫調節性腫瘍遺伝子を同定するために用いたRNAiスクリーニングのレイアウトおよび分析を示している。（A）RNAiスクリーニングの作業の流れおよび実験レイアウト。これは2回ずつ、そのたびに二重反復試験として行い、それとともに、最終的なヒットのリストから致死遺伝子を除外するためにさらなるCTGベースの生存度スクリーニングも行った。ヒットは、cellHTS2パッケージを用いるデータ正規化の後に分析した。（B）T細胞媒介性腫瘍溶解および細胞生存度の改変に関係する遺伝子機能の図式的概要。正のスコア＝癌細胞生存度の低下、負のスコア＝生存度の増大。X軸：T細胞の添加を伴わない場合の細胞生存度に対する影響。Y軸：T細胞の添加を伴う場合の細胞生存度に対する影響。適切な免疫抑制性対照（PD-L1、RCAS-1、GAL-3）および致死性対照（UBC、PLK-1）ならびに少数のヒット（2つの例示的な候補化合物）をここでは強調表示している。（C、D）スクリーニング-1（C）およびスクリーニング-2（D）の両方に関して、生存度セットと毒性セットとの間のスコアの差を、この検討において試験した遺伝子に対してプロットした。PD-L1試料のウェルにはスクリーニング-2が混入していたため、分析から除外した。（E）両方のスクリーニングによる上位150件のヒットを重複ヒットに関して分析し、両方のスクリーニングに関して、生存度セットによる高スコア物をこれらのヒットから除外した。CTGアッセイに基づいてそのほかの遺伝子も除外し、その結果、MCF7細胞に対するCTL活性を負の方向に調節する上位遺伝子42件のコンセンサスプールを得た。
【図３】（A）スペアマン順位相関検定によって判定した、毒性セット（T細胞を伴う）および生存度セット（T細胞を伴わない）に関するスクリーニング-1の反復試験の成績を示している。（B）ノックダウンに応じてMCF7細胞生存度に直接的に影響を及ぼす致死遺伝子を決定するためのCTGアッセイ。
【図４】致死性スコア（A）および示差スコア（B）として提示した、いくつかの候補ポリペプチド、すなわち感覚受容体を対象とするsiRNAに関する効果を示している。
【図５】腫瘍抗原特異的な細胞傷害性T細胞（サバイビン特異的CTLクローン）との共培養（A）またはT細胞を伴わない共培養（B）後にルシフェラーゼ活性（RLU）によって測定した、種々の遺伝子特異的siRNAをトランスフェクトさせたルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳房腫瘍細胞の生存度を示している。ルシフェラーゼ活性の低下は腫瘍細胞死を指し示している。非特異的なスクランブルsiRNA（sc RNA）を陰性対照として用いた；ルシフェラーゼ特異的siRNA（fluc）を陽性対照とした。
【図６】TAS2R3遺伝子ノックダウン後のMCF7乳癌細胞におけるT細胞媒介性の腫瘍細胞溶解の程度を評価するためのクロム放出アッセイを示している。非特異的スクランブルsiRNA（sc RNA）によるトランスフェクションを陰性対照として利用した。
【図７】IFN-γ分泌により、TAS2R3が能力を持つもの（sc siRNA）または欠損性のもの（TAS2R3 siRNA）と遭遇するように反応させた、サバイビン特異的T細胞の数を評価するためのIFN-γ Elispotアッセイを示している。非特異的スクランブルsiRNA（sc RNA）によるトランスフェクションを陰性対照として利用した。
【図８】Luminex分析によって分析した、TAS2R3が能力を持つもの（ctrl）または欠損性のもの（TAS2R3 siRNA_s3）のいずれかであるサバイビン発現性MCF7乳癌細胞と共培養したサバイビン特異的T細胞の上清におけるサイトカイン内容物を、PDL-1欠損物（PDL1 siRNAプール）と比較して示している。各ドットは、実験の反復試験の1回を表している。
【図９】Luminex分析によって検出した、TAS2R3が能力を持つもの（wt MCF7、iso Ab）または欠損性のもの（TAS2R3Ab）のいずれかであるサバイビン発現性MCF7乳癌細胞と共培養したサバイビン特異的T細胞の上清におけるサイトカイン内容物を示している。各ドットは、実験の反復試験の1回を表している。TAS2R3阻害は特異的抗体（抗TAS2R3抗体ab65488；abcam）によって実施し、各々のアイソタイプ対照と比較した。
【図１０】腫瘍抗原特異的な細胞傷害性T細胞（サバイビン特異的CTLクローン）との共培養（A）またはT細胞を伴わない共培養（B）の後にルシフェラーゼ活性（RLU）によって測定した、種々の遺伝子特異的siRNAをトランスフェクトさせたルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳房腫瘍細胞の生存度を示している。ルシフェラーゼ活性の低下は腫瘍細胞死を指し示している。非特異的なスクランブルsiRNA（sc RNA）を陰性対照として用いた；ルシフェラーゼ特異的siRNA（fluc）を陽性対照とした。
【図１１】OR51E2遺伝子ノックダウン後のMCF7乳癌細胞におけるT細胞媒介性の腫瘍細胞溶解の程度を評価するためのクロム放出アッセイを示している。非特異的スクランブルsiRNA（sc RNA）によるトランスフェクションを陰性対照として利用した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１５７】
実施例1
材料および方法
細胞培養および試薬
MCF7、MDA-MB-231およびKS乳癌細胞はAmerican Type Cell Culture（Wesel, Germany）から取得し、10％ FCSを含有するDMEM（Sigma, Germany）中で、5％ CO2および37℃にて培養した。候補ポリペプチドが高度であるMCF7-C6乳癌細胞株は、FACS分取、および特異的mAb（Axxora, Lorrach, Germany）を用いる陽性MCF-7細胞の増大によって作製した。MCF7-Luc細胞株は、親細胞株にpEGFP-Lucプラスミド（Dr. Rudolph Hasse, LMU, Munichに寄贈いただいた）のエレクトロポレーションを行った上で、FACSで分取したGFP+クローンを550μg／mlの選択用抗生物質G418（Gibco, UK）を含有する培地中で培養することによって作製した。
【０１５８】
RNAiスクリーニングのためには、CD8 Flow Compキットを製造元（Dynal, Invitrogen；Karlsruhe, Germany）による推奨に従って用いるフィコール分離の後に、健常ドナーのPBMCからCD8+ T細胞を単離した。精製されたT細胞を、100U／mLのインターロイキン2（IL-2）および抗CD3／CD28活性化ビーズの存在下で、製造元のプロトコール（Dynal, Invitrogen）に詳述されている通りに、X-vivo培地（Lonza, Belgium）中で3日間培養した。ポリクローナルT細胞は、Dr. Gerhard Moldenhauer（DKFZ, Heidelberg, Germany）に寄贈いただいた抗CD3×抗EpCAM二重特異性抗体を用いて腫瘍に架橋させた。乳房腫瘍関連抗原サバイビン95-104（クローンSK-1）およびHER2369-377（クローンKU-1）のHLA-A0201拘束性エピトープに対して特異的なCTLクローンは、以前の記載の通りに（Conrad et al., 2008、およびBracketz et al., 2011）、健常ドナーの末梢血T細胞から作製した。場合によっては、HLA-A0201を発現するTAP欠損細胞株T2を、HLA-0201拘束性ペプチドの添加のために用いた。
【０１５９】
RNAiスクリーニング
ほとんどのGPCRを標的とするゲノムワイドsiRNAライブラリーsiGENOME（Dharmacon, Thermo）のサブライブラリーを、RNAiスクリーニングのために用いた。このライブラリーは516個のsiRNAプールを含み、そのそれぞれが4種の合成siRNA二重鎖からなり、以前に記載された通りに調製されている（Gilbert et al., 2011）。公知の表現型を有する陽性siRNA対照および陰性siRNA対照、例えば、非標的指向性siRNA（Ambion）、細胞生存度に影響を及ぼす遺伝子を標的とするsiRNA（例えば、UBC、PLK-1）、またはCTL細胞傷害作用に影響を及ぼすことが公知であるもの（例えば、PD-L1）、ならびに免疫チェックポイント調節に関与する可能性のある遺伝子を標的とするさらなるsiRNA、例えばRCAS1（Han et al., 2007）およびGal-3（Peng et al., 2008）（すべてDharmaconによる）などを、スクリーニングの前に空のウェルに分配した。
【０１６０】
そのほかに、表Aに描写された以下のsiRNA配列も本明細書に用いられている：
（表Ａ）siRNA配列
2016535060.tif 000002
【０１６１】
免疫チェックポイント調節因子をバイアスのない様式で包括的に同定することを目的として、本発明者らは、Luc発現性癌細胞をCTLに曝露させた後に残留性の細胞結合ルシフェラーゼ発現を定量することに基づく、腫瘍特異的T細胞の細胞傷害作用を測定するための以前に記載されたアプローチを利用した（Brown et al., 2005）。本発明者らは、前述のアプローチを、ハイスループットRNAiスクリーニングの目的に適合させるとともに拡張し、それを「Luc-CTL」アッセイと名づけた。手短に述べると、このスクリーニング実験は以下のように設定した：合計3回のRNAiスクリーニングを二重反復試験として行い、siRNAプールによる細胞の逆トランスフェクションを、0.05μlのRNAiMAX（Invitrogen）を含有する15μlのRPMI（Invitrogen）を送達することによって行った。室温での30分間のインキュベーション後に、10％ FBS（Invitrogen）を加えた30μlのDMEM培地（Invitrogen）中にある3000個のMCF7細胞（スクリーニング1：ルシフェラーゼを安定して発現するMCF7、スクリーニング2および3：野生型MCF7細胞）を、siRNAトランスフェクション混合物に添加した。続いてプレートを37℃、5％ CO2にてインキュベートした。24時間後に、細胞をTransIT-LT1トランスフェクション試薬（Mirius Bio LLC, Madison, USA）を製造元の指示に従って用いてルシフェラーゼ発現プラスミド（スクリーニング2）にトランスフェクトさせるか、またはトランスフェクションを行わないか（スクリーニング1およびスクリーニング3）のいずれかとした。siRNAトランスフェクションの72時間後に、癌細胞にCTLおよび抗CD3×抗EpCAM二重特異性抗体による曝露されたか（スクリーニング1およびスクリーニング2；CTLを添加する条件）または曝露されなかったか（スクリーニング1およびスクリーニング2；CTLの添加を伴わない条件、ならびにスクリーニング3）。スクリーニング1に関しては、単一の1例のドナーに由来するCTLの1つのバッチを使用した。スクリーニング2に関しては、2例の異なるドナーに由来するCTLの2つのバッチを使用した。18時間後に上清を除去し、細胞を溶解させて、ルシフェラーゼ測定値（スクリーニング1および2）またはCellTiter-Glo（Promega）を用いる生存度測定（スクリーニング3）を、以前に記載された通りに行った（Gilbert et al., 2011、およびMuller et al., 2005）。分配の段階はすべて、Multidrop Combi分配装置（Thermo）を用いて行った。
【０１６２】
データ分析
RNAiスクリーニングによるプレートリーダーのデータは、R／BioconductorのcellHTS2パッケージ（Boutros et al., 2006）を用いて統計学的に分析した。手短に述べると、プレートベースの正規化を行い、cellHTS2に組み込まれた堅牢なz-スコア法を使用した。プレート内部での明らかな行効果（row effect）を補正するために、b-スコア正規化を必要に応じて使用した。スクリーニング1およびスクリーニング2に関しては、両方の条件、すなわちCTLの添加下およびCTLの非添加下によるスコアを、Rにおけるaroma.lightパッケージを用いて、互いに対してさらに分位正規化した。示差スコアは、CTLの非添加下の分位正規化スコアを、CTLの添加下で導き出されたスコアから差し引くことによって算出した。CTL媒介性細胞傷害作用を正の方向にモジュレートする遺伝子を堅牢に同定するため、かつ、異なる複数のドナー由来のCTLを使用すること、ならびに遺伝的に操作されたMCF7細胞ならびに非改変MCF7細胞を使用することによって導入される可能性のあるバイアスを回避するために、示差スコアによって評価したうちの上位150件の遺伝子を独立したスクリーニング1および2のために抽出し、候補リスト間で重なり合うものを決定した。siRNAによって明らかとなる生存度への影響ならびにルシフェラーゼ発現に対する影響を補正するための候補リストのフィルタリングは、重なり合う候補リストから、CTLの非添加下での残留性ルシフェラーゼ測定値から導き出されたスコアに基づく最下位の10遺伝子および最上位の25遺伝子を除外することによって行った。最後に、CellTiterGloに基づく生存度スクリーニング（スクリーニング3）においてスコア付けされた遺伝子を、候補リストから除外した（スコアが-1.5未満のもの、および1.5を上回るもの）。それにより、細胞内ATPレベルによって判定される、細胞生存度に全般的に影響を及ぼすsiRNAを除外できたと考えられる。
【０１６３】
ネットワーク分析
同定された候補遺伝子に関して、Ingenuity Pathways Analysis（IPA）ウェブアプリケーション（www.ingenuity.com）を用いて相互作用ネットワークを作成した。遺伝子記号の識別子をIPAにアップロードして、これらの遺伝子対象物間の直接的または間接的な相互作用に対するクエリーを、以下のパラメーターを用いて行った：「種＝ヒト」および「信頼性＝実験的に観察された」。遺伝子または遺伝子産物はノードとして表され、2つのノード間の生物学的関係は辺（線）として表される。辺はすべて、少なくとも1件の参考文献によって文献的に裏づけられているか、またはIngenuity Pathways Knowledge Baseに記録されている公式に認められた情報である。
【０１６４】
ウエスタンブロット法およびRT-PCR
ウエスタンブロット分析のための全細胞タンパク質抽出物は、以前に記載された通りに調製した。ウエスタンブロット用に用いた抗体は、抗候補ポリペプチドヒト抗体、抗ヒトPD-L1（R&D systems）、抗ヒトβ-アクチン（Abeam）であった。細胞ペレットからRNeasy Microキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて全RNAを抽出し、QuantiTect逆転写キット（Qiagen）を製造元による指示の通りに用いて逆転写させた。PCR施行のためのプライマー配列：
2016535060.tif 000003
【０１６５】
細胞傷害性アッセイ
クロム放出細胞傷害性アッセイのためには、腫瘍細胞をまず、上記のように、RNAiMaxトランスフェクション試薬を用いて、25m2培養フラスコ内で、記載のsiRNAによってトランスフェクトさせた。いくつかの実験では、候補ポリペプチドの過剰発現のために、TransIT-LT1トランスフェクション試薬（Mirus, Madison, USA）を製造元のプロトコールに従って用いて、MCF7細胞を、pCMV6-AC-His-候補ポリペプチドをコードするベクター（OriGene, Rockville, US）またはpCMV6-AC-His対照ベクターのいずれかによってトランスフェクトさせた。72時間後に、siRNAまたはプラスミドをトランスフェクトさせた細胞を採取し、洗浄した上で、200μlの51Cr／標的細胞106個（Perkins-Elmer, Germany）により、37℃で45分間かけて標識した。別の候補ポリペプチドの抗体遮断のためには、まず1×106個のMCF7-C6細胞を30ug／mlの遮断抗体とともに氷上で30分間インキュベートし、続いて洗浄した上で、クロムによって標識した。標識の後に、無細胞クロムを除去するために細胞を注意深く3回洗浄し、96ウェルプレート内で、3000個／ウェルの標的細胞を、T細胞とともに、T細胞-標的細胞比が1：1〜100：1となるように37℃で4時間共培養した。4時間後にプレートを遠心分離し、死細胞によって放出された放射能をγ線カウンター（Cobra counter Packard, Perkin Elmer, Rodgau, Germany）を用いて測定するために上清を採取した。本発明者らはまた、健常ドナー由来のポリクローナルCD8 T細胞も、乳癌細胞溶解の誘導のためのエフェクター細胞として用いた。この目的に向けて、健常ドナーのPBMCからCD8+ T細胞を単離し、上記の通りに抗CD3／抗CD28活性化ビーズを用いて活性化した。その後に、続いて、これらの活性化CD8 T細胞を、3000個／ウェルの放射標識標的細胞と、T細胞-標的細胞比が1：1〜100：1となるように、5μg／mlの抗CD3×抗EpCAM二重特異性抗体または抗CD3×抗CD19対照二重特異性抗体の存在下で4時間共培養した。自然放出に関する対照としては、標識細胞を培地のみとコインキュベートした；最大放出に関しては、細胞を、T細胞の代わりに10％ Triton X-100とともにインキュベートした。続いて、比溶解率（％）を以下に提示した式によって算出した：
比溶解率（％）＝（実験的放出-自然放出）／（最大放出-自然放出）×100
【０１６６】
ELISpotアッセイ
Tリンパ球からのIFN-γ、パーフォリンおよびグランザイムBの分泌を、ELISpotアッセイを製造元（Mabtech, Nacka Strand, Sweden）によって詳述されている通りに用いて決定した。手短に述べると、免疫抑制遺伝子の候補を、腫瘍細胞株において、特異的siRNAを用いて対照ノックダウンとともに阻害させた。siRNAトランスフェクションから48時間後に、ノックダウンさせた細胞を採取し、洗浄した上で、ELISpotウェル内で、サバイビン特異的T細胞とともに、エフェクターと標的の比が5：1となるようにして24時間共培養した。さらに、場合によっては、細胞を、さまざまな濃度のポリペプチド遮断抗体（Axxora）候補の存在下においても共培養した。IFN-γ、パーフォリンまたはグランザイムBのスポットを、酵素結合型イムノスポット（ELISPOT）ソフトウェア（Zeiss, Jena, GermanyまたはCTL Europe, Bonn, Germany）を用いて測定した。統計学的比較は、1群当たり3つの試験ウェルを用いて行った。いくつかの実験では、免疫応答の陽性対照として、腫瘍細胞株の代わりに、T2細胞に対して20μg／mlのHLA-A2拘束性ペプチドによるパルス刺激を用いた。
【０１６７】
サイトカイン測定
腫瘍とT細胞とのコインキュベーション実験による細胞培養上清中のサイトカインレベルは、2レーザー式フローサイトメーターを用いる分析物定量のために抗体とカップリングさせた蛍光性ビーズを使用する、Bio-plexサイトカインアッセイを用いて決定した。手短に述べると、MCF7細胞を、ポリペプチド候補特異的siRNAまたは対照siRNAによって48時間トランスフェクトさせた上で採取し、96ウェルプレート内で、104個のサバイビン特異的T細胞とともに、1：5の比で、37℃でさらに24時間共培養した。1群当たり3つの試験ウェルをこの検討に用いた。インキュベーション後にプレートを遠心分離し、培養上清100μlを各試験ウェルから収集して、1000×g、4℃で15分間遠心分離した。清澄な上清を収集し、Bio-Plex Proアッセイキットを製造元（Biorad, Germany）による記載の通りに用いて、そのままサイトカイン測定に用いた。データは、Bio-Plex Managerソフトウェア・バージョン6.0を用いて分析した。
【０１６８】
リンタンパク質分析
MCF7細胞を、上記の通りの対照siRNAまたは特異的siRNAのいずれかによってトランスフェクトさせた。72時間後に細胞を採取し、96ウェルプレートの1ウェル当たりに、100μlのサイトカイン非含有X-vivo 20培地中にある8×104個の細胞をプレーティングした。これに対して、100μlのX-vivo培地中に懸濁させた2×106個のサバイビン特異的T細胞を添加した。ポリペプチド遮断のためには、siRNAトランスフェクションの代わりに、KS細胞を非処理のままとするか、または30μg／mlの抗候補ポリペプチドmAbによって氷上で30分間前処理した後に、注意深く洗浄した。T細胞受容体複合体分析のためには腫瘍とT細胞を5分間共培養し、ホスホ-STAT分析のためには2時間共培養した。コインキュベーション後に細胞を採取し、洗浄した上で溶解させた。総タンパク質濃度を測定し、BSAタンパク質アッセイキット（Thermo scientific, Rockford、U.S.）を用いて測定し、これをリンタンパク質検出の前に、7-plex T細胞受容体シグナル伝達リンタンパク質キットまたはホスホ-STAT 5-plexキット（Millipore, Billerica、U.S.）のいずれかを製造元による指示の通りに用いて、すべての試料に対して正規化した。測定はLuminex100 Bio-Plex System（Luminex, Austin, U.S.）を用いて行い、データのすべてをBio-Rad Bio-Plex Managerソフトウェア・バージョン4.1.1（BioRad Life Science Research, Hercules, U.S.）を用いて分析した。
【０１６９】
養子T細胞移入実験
6〜8週齡の雌性NOD／SCIDマウス（系統NOD／NCrCrl-Prkdcscid）をCharles River（Sulzfeld, Germany）から入手し、SPF条件下で飼育した。マウスに対して、50μLのマトリゲル基底膜マトリックス（BD Biosciences）中にある2×106個のKS乳癌細胞を、右側腹部の皮下に移植した。腫瘍が直径6〜8mm（腫瘍移植からおよそ18日間後）に達した時点で、マウスに対して、5×106個のサバイビン特異的CTL（クローン：SK-1）／PBS 100μlを静脈内に2回移入した。加えて、マウスには、50μg〜200μgの抗候補ポリペプチドまたはアイソタイプmAbの腹腔内注射を週2回毎に4回〜7回行った。腫瘍増殖は、式  体積＝（長さ×幅2×π／6）に従って週2回ずつ評価した。
【０１７０】
統計学的評価
試験群と対照群との差は、両側スチューデントt検定を用いて分析した。いずれの統計学的検定においても、P値が0.05以下であれば、影響は統計学的に有意と見なした。
【０１７１】
ハイスループットRNAiスクリーニングの設計
細胞傷害性Tリンパ球（CTL）による細胞死滅を阻害する腫瘍関連遺伝子を同定する目的で、本発明者らは、以下ではLuc-CTLアッセイと称するルシフェラーゼベースの読み取りアッセイを適合化させた（図1A）。このアッセイのために、本発明者らは、安定なトランスフェクションによってルシフェラーゼ発現性MCF7乳癌細胞株（MCF7luc）を樹立したほか、さまざまな腫瘍細胞株の迅速スクリーニングが将来可能になるように、MCF7細胞の一過性ルシフェラーゼトランスフェクションも行った。
【０１７２】
CTLによる腫瘍細胞の溶解を誘導するために、本発明者らは、健常ドナー由来の精製されて予備活性化されたCD8+ 細胞傷害性T細胞の抗原受容体を、T細胞受容体結合分子CD3を1つのアームで認識し、ほとんどの上皮腫瘍上で高発現されるが白血球上ではそうでない細胞表面分子EpCAMをもう一方のアームで認識する二重特異性抗体を用いて、腫瘍細胞の細胞表面と架橋させた（Strauss et al., 1999）。これにより、T細胞活性化および腫瘍溶解が、種々の量のT細胞と共培養した後の残りの腫瘍細胞集団のルシフェラーゼ活性が大きく低下したことから判断されるように、用量依存的な様式で効率的に誘導された（図1B）。CTLにより誘導される破壊から腫瘍細胞を保護した遺伝子を同定するために、MCF7luc細胞に対して、384ウェルプレート内（腫瘍細胞3000個／ウェル）で、1つの標的当たり4種類のsiRNA配列を含有するプールsiRNAによって逆トランスフェクトさせた上で、3×104個の予備活性化したドナー由来CD8+ T細胞とともに18時間共培養した。ノックダウンがそれ自体で細胞生存度に影響を及ぼす遺伝子を除外する目的で、Luc-CTLアッセイには遺伝子ノックダウン毎に生存度対照を含め、それにはCTLを添加しなかった。本発明者らは、試験ウェル（CTL含有する）と対照ウェル（CTLを伴わない）との間のルシフェラーゼ活性の差を算出し、正の値が明らかになった遺伝子のみを、さらなる分析用に選択した（図1A）。Luc-CTLアッセイの妥当性を調べるために、本発明者らは、乳癌において強い免疫抑制を媒介するPD-L1を用いる概念実証妥当性検証実験を行った（Dong et al., 2002）。PD-L1ノックダウンは単独ではMCF7luc生存度に影響を及ぼさなかったが、CTLにより誘導される腫瘍細胞死を大きく増加させた（図1C）。本発明者らはこのため、PD-L1を、本発明者らの以後のハイスループットスクリーニングにおける陽性対照として用いた。重要なこととして、Luc-CTLアッセイによって検出された腫瘍細胞死滅の程度は、T細胞媒介性細胞傷害作用の一般的な試験である51クロム放出アッセイで得られたものと同等であった（Brunner et al., 1968）（図1D）。
【０１７３】
Luc-CTLアッセイをハイスループットスクリーニングアプローチに適用するために、本発明者らは、膜貫通タンパク質および細胞表面結合タンパク質をコードする520種の遺伝子のライブラリーに目を向けたが、これはそのような分子は治療用機能遮断抗体の適した標的であり、それ故に特に臨床的意義があるためである。
【０１７４】
候補同定手順の概要は図2Aに示されている。本発明者らはスクリーニングを、CD3およびCD28特異的抗体（mAb）によるポリクローナルTCR刺激によって予備活性化させた健常ドナー由来の精製CD8+ T細胞をCTLとして用いて、MCF7luc細胞および一過性にトランスフェクトさせたMCF7細胞と同時並行的に実施した。各スクリーニングは4件の反復試験を1セットとして実施し、そのうち2つをCTLおよび二重特異性抗体と共培養し（毒性セット）、他方の2つはCTLおよび二重特異性抗体を伴わずにインキュベートした（生存度セット）。本発明者らはまず、両方のスクリーニングにおいて、Luc-CTLアッセイにおけるノックダウンによって最も高度な細胞傷害作用が明らかになった150種の遺伝子を同定した。本発明者らは、これらの群から、両方のスクリーニングで同時に検出された遺伝子を選択した。それらの生存度セットスコアに基づき、本発明者らは続いて、細胞生存度に強い影響を及ぼす遺伝子を除外した。最後に本発明者らは、細胞内ATPレベルを測定することによってMCF7細胞の生存度に対する遺伝子ノックダウンの影響をルシフェラーゼ活性とは独立に判定した、別のスクリーニング（CTGアッセイに基づく）からのデータを使用した（図3）。このアッセイによって細胞生存度を低下させた遺伝子も除外した。
【０１７５】
第1のスクリーニングによって導き出されたデータの概観を図2Bに示している。個々のスクリーニング内部での反復試験間の再現性は、毒性セット（スペアマン順位相関係数：0.7）および生存度セット（スペアマン順位相関係数：0.9）のいずれも高かった（図3A）。ルシフェラーゼ遺伝子（FLuc）に対するsiRNAは予想通り、どちらの条件下でもルシフェラーゼシグナルの消失をもたらし、ルシフェラーゼに基づく読み取りの内部対照としての役を果たした。予期された通り、細胞生存に不可欠な遺伝子（UBCおよびPLK-1）を標的とする対照siRNAは、どちらの条件下でも顕著な細胞死滅を誘導した（CTLの非存在下および存在下；それぞれx軸およびy軸）（図2B）。対照的に、スクランブル陰性対照siRNAは、いずれの条件下でもルシフェラーゼシグナルに影響を及ぼさなかった。このように、UBCおよびPLK-1を一方に置き、陰性対照siRNA1およびsiRNA2をもう一方の側に置くことは、CTL媒介性腫瘍細胞溶解に対する影響に応じて候補遺伝子を順位付ける細胞傷害作用の範囲を定めるのに適する。腫瘍細胞に対して免疫調節分子として機能することが報告されている3種の遺伝子、すなわちPD-L1、ガレクチン-3およびRCAS-1のノックダウンは細胞傷害作用設定においてのみルシフェラーゼ活性を強く低下させ、T細胞媒介性腫瘍細胞溶解に対して最も強い影響を示したのはPD-L1であり、相対的に影響が最も弱かったのはRCAS-1であった。このことから、スクリーニングの全体を通じて、これらを免疫調節の参照基準遺伝子として利用した（Blank et al., 2004, Han et al., 2007、およびPeng et al., 2008）。
【０１７６】
より優れた候補の可視化およびヒット分析のために、本発明者らは、両方のスクリーニングに関するそれらの毒性および生存度の値の間の示差スコアに基づいて、遺伝子を順位付けた（図2Cおよび2D）。両方のスクリーニングのそれぞれからの上位150件のヒットのうち、52種の遺伝子は重なり合うことが見いだされ（p＜0.001、超幾何検定）、そのうち10種は腫瘍細胞生存度に及ぼす固有の強い影響に基づいて除外した（図2Eおよび3B）。同定された残りの42種の化合物のうち、それらのCTL-毒性スコアに基づいて、21種の遺伝子はRCAS-1の下位に順位付けられ、19種の遺伝子はRCAS-1とGal-3との間、2種の遺伝子はGal-3とPD-L1との間に順位付けられたが、腫瘍細胞溶解に対してPD-L1よりも強い影響を及ぼすものは1つも見いだされず、このことから、抗腫瘍T細胞応答の免疫モジュレーションにおけるその相対的重要性が指し示された。そのほかに、いくつかの感覚受容体も同定された。
【０１７７】
Ingenuity Pathways Analysisツールを用いたネットワーク分析により、遺伝子ヒットのいくつかが結び付けられた。しかし、それらのシグナル伝達経路に関しても、味覚受容体（TAS2R、TAS2R3）、嗅覚受容体（OR1F1、OR2J2、OR51E2）および光受容体（OPN3）などの感覚受容体の免疫系における関与の可能性についても、まだほとんど明らかになっていない。
【０１７８】
以上を総合すると、Luc-CTLスクリーニングアプローチにより、既に公知である3種の免疫調節遺伝子、およびそれに加えて、癌、特に乳癌において免疫調節機能を有する可能性が示唆される、さまざまな感覚受容体のメンバーを含む42種のさらなる候補が、信頼性を伴って同定された。
【０１７９】
選択された候補遺伝子の免疫調節機能の妥当性検証試験
スクリーニングおよび候補同定の過程の妥当性を調べる目的で、本発明者らは次に、上記の方法によって同定され、選択された候補遺伝子の免疫調節能力を機能の点での妥当性に関して検討した。この目的に向けて、本発明者らは、本発明者らのスクリーニングにおいて相対的に下位から中間位までに順位付けられた2つの候補遺伝子を選択した（図2Cおよび2D）。
【０１８０】
腫瘍特異的CTLの活性化および細胞傷害能力に対する、上記の方法によって同定されたそのような候補ポリペプチドの影響について評価するために、本発明者らは、乳房腫瘍関連抗原サバイビンまたはHer-2／neu（Conrad et al., 2008）に対して特異的なCTLクローンを、その両方の腫瘍抗原を発現する、HLAを合致させた候補分子を発現する乳癌細胞株KSおよびMCF7-と共培養した。CTLはこれらの腫瘍抗原を、それらが抗原提示性T2細胞株によって提示された場合に認識したが、IFN-γおよびパーフォリンの分泌の少なさ、ならびに細胞傷害活性の低さによって示されるように、両方の腫瘍細胞株に対するCTL反応性は低かった。上記の方法によって同定された候補ポリペプチドの場合には、特異的抗体によるノックダウンまたは遮断により、T細胞活性および腫瘍細胞溶解の強く、かつ用量依存的な増加がもたらされた。本発明者らはまた、遮断またはノックダウン後のMCF7-C6乳癌細胞に対する、健常ドナー由来のCD8+ 細胞傷害性T細胞の細胞傷害活性の強い増加も検出し、それはPDL1のノックダウンによって達成されるものと同等であった。
【０１８１】
次に、本発明者らは、発現の遮断により、腫瘍特異的CTLがインビボでの乳房腫瘍増殖を抑制するか否かについても興味を抱いた。この目的に向けて、本発明者らは、NOD／ScidマウスへのKS腫瘍細胞の異種移植を行った。腫瘍がおよそ200mm3の体積に達した時点で、マウスに対して、上記の方法によって同定された候補ポリペプチドに対する遮断抗体、および5×106個のサバイビン特異的CTLを投与した。遮断またはCTL移入は単独では腫瘍発達に有意な影響を及ぼさなかったが、それらの組み合わせにより、さらなる腫瘍増生は用量依存的な様式で消失し、このことから、この状況での乳癌細胞に対する免疫療法の成功は上記の方法によって同定された候補ポリペプチドによって阻害されるが、同定されたポリペプチドの遮断によってそれを効率的に逆転させうることが指し示された。
【０１８２】
以上を総合すると、本発明者らのデータにより、T細胞機能の阻害を通じてCTL媒介性溶解に対する免疫保護を付与する、癌細胞上の免疫調節リガンドとしての、上記の方法によって同定された候補ポリペプチドの妥当性が示された。特異的mAbによる遮断によって、インビトロおよびインビボでの抗腫瘍T細胞活性が効率的に回復したこと、ならびに上記の方法によって同定された候補ポリペプチドは多くの上皮癌上で発現されることからみて、これは癌、特に上皮癌における治療的免疫チェックポイント制御の有望な標的である可能性がある。
【０１８３】
本発明者らはさらなる候補を機能的妥当性検証のために選択し、それらに関して本発明者らは、細胞によって発現される候補としてのポリペプチドだけでなく、両方のスクリーニングにおいて免疫調節遺伝子としてのそれらのリガンドも同定したが、このことはこのシグナル伝達軸が免疫調節において一定の役割を果たしている可能性を指し示している。
【０１８４】
上記の方法によってsiRNAのプールから同定されたポリペプチドに対する単一のsiRNAを用いて、本発明者らはまず、そのmRNAおよびタンパク質レベルをダウンレギュレートさせる能力に基づいて、最も成績の良いsiRNA配列を評価した。T細胞媒介性細胞傷害作用に対する個々のsiRNAの機能的影響についてもLuc-CTLアッセイを用いて評価したところ、それは個々のsiRNAに関するmRNAおよびタンパク質ノックダウン効率と良好に相関した。発現をダウンレギュレートさせること、ならびにT細胞により誘導される腫瘍溶解を増大させる点で最も有効であったsiRNA配列を、そのためさらなる機能的試験のために選択した。CTGアッセイによる測定で、いずれのsiRNAも単独では細胞生存度に対して強い影響は及ぼさなかった。ノックダウンは、サバイビン特異的T細胞による腫瘍溶解を顕著に増加させた。siRNAプールの腫瘍溶解はPD-L1ノックダウンを用いて観察されたものと同等であったが、一方、単一のsiRNAを用いた場合にはその効果ははるかに強かった。その反対に、上記の通りに同定されたポリペプチドのMCF7細胞における強制的過剰発現は腫瘍細胞溶解の減少をもたらし、このことからその高発現によって癌細胞の免疫回避が可能になることが実証された。上記の通りに同定されたポリペプチドのMCF7細胞におけるノックダウンも、ELISpotアッセイによる測定で、サバイビン特異的T細胞によるIFN-γおよび細胞溶解酵素グランザイムBの分泌を有意に増加させた。
【０１８５】
さらに、発現のノックダウンは、別の転移性乳房腫瘍細胞株MDA-MB-231におけるサバイビン-CTLによる腫瘍細胞溶解の著しい増加ももたらしたが、このことは、このポリペプチド媒介性免疫抵抗性は特定の細胞株に限定されないことを示唆する。
【０１８６】
以上を総合すると、これらのデータは、上記の方法によって同定されたポリペプチドの腫瘍特異的発現により、癌細胞、特に乳癌細胞におけるT細胞媒介性腫瘍認識および溶解が抑制されることを示唆している。
【０１８７】
上記の方法によって同定された候補ポリペプチドの腫瘍特異的ノックダウンによる抗腫瘍CTL応答の増大の理由を明らかにするために、本発明者らは、対照siRNAで処理するかまたは候補ポリペプチドを含まない（siRNAで処理した）MCF7細胞、およびサバイビン特異的T細胞の共培養物からの上清中のサイトカインレベルを評価した。IFN-γ、インターロイキン-2（IL-2）および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）ならびにIL-17などのT-ヘルパー-1（Th1）サイトカインは、ノックダウン細胞からの共培養上清において、対照ノックダウンと比較して有意に高値であることが見いだされた。さらに、候補ポリペプチドのノックダウンに応じて、免疫抑制サイトカインIL-10のレベルの有意な低下も認められた。このサイトカインレベルの低下が、候補ポリペプチドによって媒介されるT細胞活性化の減退に起因するか否かを評価するために、本発明者らは、対照-siRNAで処理した候補ポリペプチドを含まないMCF7細胞との直接的で短期的な接触後のサバイビン特異的CTLにおいて、TCRホスホ-plex分析を行った。腫瘍特異的ノックダウンはTCRシグナル伝達の構成要素の活性化に大きな影響を及ぼさず、このことは候補ポリペプチドに特異的な免疫抑制の媒介には代替的経路が関与することを指し示している。そのような代替的経路の1つはSTAT（シグナル伝達因子および転写活性化因子）ファミリーの転写因子であり、これはそれらがT細胞においてさまざまなサイトカインの発現を調節することが知られているためである(Yu et al., 2009）。このため、本発明者らは、ノックダウンMCF7細胞および対照MCF7細胞と共培養した場合のサバイビン特異的T細胞におけるSTATタンパク質の活性化を判定するためのホスホ-plex分析を行った。STAT2、STAT3およびSTAT6の活性化状態に関して認知しうる違いは観察されなかったが、T細胞をノックダウンMCF7細胞と共培養した場合には対照細胞と比較してSTAT1およびSTAT5a／bシグナル伝達の顕著な増加が観察され、このことはエフェクターTh1型免疫応答が腫瘍特異的候補ポリペプチドによって課せられたことを指し示している。MCF7細胞だけではノックダウン後にSTATシグナル伝達における認知しうる違いは認められず、このことはSTATシグナル伝達において観察された全体的影響がT細胞に特異的であることを指し示している。
【０１８８】
以上の全体からみて、本発明者らの知見は、Th1型免疫応答を課すことによって癌、特に乳癌における免疫抑制を媒介するという、腫瘍特異的候補ポリペプチドの役割を示唆するものである。
【０１８９】
感覚受容体によるスクリーニング
候補ポリペプチドとしての感覚受容体を対象とするsiRNAを用いるスクリーニングを、上記の方法によって行った。
【０１９０】
それにより、結果は、致死性スコア（図4A）およびCTL毒性の示差スコア（図4B）として描写された。これらの結果は、感覚受容体が、CTL応答を改変させる上で効力のある標的であることを明らかに示している。特に、ファミリー2の嗅覚受容体（OR2J2）およびTAS2受容体（TAS2R3）は特に有望な結果を示した。
【０１９１】
用いられたsiRNAはCTL応答を媒介し、すなわちそれを抑制する。したがって、使用されたsiRNAは、本発明によるCTL応答を媒介するための化合物としての役を果たす。
【０１９２】
考察
以下に本発明者らは、腫瘍における免疫抵抗性を助長する新たな癌関連免疫チェックポイント分子を包括的に同定するためのハイスループットスクリーニング戦略について報告する。
【０１９３】
前記方法を通じて、本発明者らはいくつかの感覚受容体を、インビボおよびインビトロでの治療法および診断に用いうる治療および診断の標的として同定した。
【０１９４】
本発明者らの検討において選択された腫瘍細胞死のルシフェラーゼベースの判定は、古典的細胞傷害性試験と十分に相関し、ハイスループット形式での適用にも適していた。複数の異なる健常ドナー由来の新鮮な初代CD8+ T細胞はばらつきをもたらすため、本発明者らはスクリーニング全体を2回行い、その都度、二重反復試験を行った。それにより、本発明者らは、再現性があり、かつ重なり合う候補を得ることができた。乳癌細胞において既に確立されている3種の免疫調節リガンドが信頼性を伴って確認されたことにより、このスクリーニング手順が腫瘍細胞上の免疫調節リガンドを同定しうる能力が立証された。試験した合計520種の遺伝子のうち、CTLの腫瘍溶解能力に対して強い影響を及ぼす可能性のある42種の新たな候補が同定された。全ゲノムベースのスクリーニングと比較して、およそ8％というこの収率は高いと思われ、同定された標的の機能的妥当性検証を厳密に保証すると思われる。しかし、免疫応答に関連する遺伝子はゲノムの多くの割合を占めており、細胞表面結合分子のみを含む本発明者らのスクリーニングライブラリーは、免疫モジュレーションに役割を果たす可能性のある細胞表面シグナル伝達タンパク質を豊富に含む（Zhu et al., 2011）。さらに、Bellucci et al.によって報告された、NK細胞をモジュレートするリガンドに関する以前のスクリーニングでも、多数のNKモジュレート性遺伝子が明らかになっている（Bellucci et al., 2012）。このため、本発明者らの発見率の高さは、癌患者における免疫監視機構の制御を司る複雑な遺伝子ネットワークを真に表すものである可能性がある。今日までに、本発明者らは、そのほかの腫瘍細胞株および腫瘍抗原特異的CTLクローンを用いて、いくつかの同定された候補の実験的妥当性検証試験を行っており、いずれの場合にも、本発明者らはそれらの免疫調節機能を確認することができている。
【０１９５】
興味深いことに、同定された候補は感覚受容体およびペプチドも含んでいた‐これらは診断または治療薬開発の新たな標的となるものである。
【０１９６】
以上を総合すると、本発明者らは今回、癌における新たな免疫抑制性遺伝子の広範な一団を解明するためのハイスループットスクリーニングの有効なデザインを提出する。このスクリーニングはまた、病的なCTL応答を示す他の細胞において発現された場合に免疫攻撃に対する感受性を付与する遺伝子も同定することができた。これらの両方のサブセットの遺伝子の同定は、より優れた患者層別化のための、および癌免疫療法に対する臨床的応答を評価するための有望なバイオマーカーとして利用しうる可能性がある。加えて、本明細書に提示されたスクリーニングアプローチに幾分の変更を加えることにより、CTL媒介性細胞死滅を増強する化合物または生体化合物の同定も可能になると考えられる。以上の全体からみて、本発明者らの方法は、病的なCTL応答を有する細胞の「免疫モジュラトーム」全体の特性決定を可能にする可能性があり、それは遮断抗体または化合物を含む治療戦略を開発のための有望な標的分子の選択のための基盤として役立つであろう。
【０１９７】
さらに、本発明者らは、病的なCTL応答を治療するため、予防するため、または診断するための方法に用いるための治療用および診断用化合物としての、CTL応答をモジュレートするための分子標的構造としての感覚受容体、およびそれらのリガンドも同定した。
【０１９８】
実施例2
TAS2R3およびOR51E2が腫瘍細胞上の免疫調節リガンドであり、それらの阻害が腫瘍特異的T細胞の抗腫瘍活性を増大させると考えられ、かつそれ故にそれらが抗癌免疫療法の有望な標的であるという初期の知見を裏づけるために、そのほかの実験も実施した。実験の概要は以下に示す通りである。
【０１９９】
TAS2R3
HTPスクリーニングのために用いたTAS2R3 siRNAプールはデコンボルーションされ、このことからsiRNA s3およびs4が、十分に確立され、かつ臨床的意義のある免疫チェックポイント分子であるPDL1およびRCAS1のノックダウンによって達成されるものと同等なルシフェラーゼ活性の有意な低下によって示されるように、ルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳癌標的細胞のT細胞媒介性溶解を有意に増加させることが実証された（図5A）。対照的に、これらのsiRNAは、T細胞の非存在下ではルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳癌細胞の生存度に影響を及ぼさず（図5B）、一方、細胞生存のために必須であるユビキチン（ubc）のノックダウンは細胞生存度を強く低下させたことから、これをアッセイ系の内部陽性対照とした。もう1つの内部対照としては、MCF7細胞におけるルシフェラーゼ（fluc）のノックダウンを用いた。
【０２００】
MCF7腫瘍細胞におけるTAS2R3ノックダウンは、古典的細胞溶解実験における腫瘍特異的T細胞によるそれらの溶解を有意に増加させることがさらに示された（クロム放出アッセイ；図6）。
【０２０１】
本発明者らは続いて、MCF7乳房腫瘍細胞におけるTAS2R3ノックダウンが、共培養した腫瘍特異的T細胞の機能的活性を以下の点で増大させることを示した：i）活性化T細胞の数の増加（IFN-γ ElispotアッセイにおけるIFN-γ分泌性T細胞の数の増加によって指し示される）（図7）；およびii）T細胞によって共培養上清中に放出されるT細胞エフェクターサイトカイン、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4の量が増加し（図8A〜D）、一方、免疫抑制性サイトカインIL-10およびIL-17の放出は影響されなかったこと（図8Eおよび8F）。
【０２０２】
なお、本発明者らは、IFN-γの発現増大が、乳房腫瘍細胞の表面にあるTAS2R3のTAS2R3特異的抗体による遮断によっても達成されうることも実証している（図9）。
【０２０３】
OR51E2
TAS2R3を用いた妥当性検証実験と同様に、本発明者らはHTPスクリーニングのために用いるOR51E2 siRNAプールをデコンボルーションし、プール中のすべてのsiRNAが、十分に確立され、かつ臨床的意義のある免疫チェックポイント分子であるPDL1およびRCAS1のノックダウンによって達成されるものと同等なルシフェラーゼ活性の有意な低下によって示されるように、ルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳癌標的細胞のT細胞媒介性溶解を有意に増加させることを実証した（図10A）。対照的に、これらのsiRNAは、T細胞の非存在下ではルシフェラーゼトランスフェクトMCF7乳癌細胞の生存度に影響を及ぼさず（図10B）、一方、細胞生存のために必須であるユビキチン（ubc）のノックダウンは細胞生存度を強く低下させたことから、これをアッセイ系の内部陽性対照とした。もう1つの内部対照としては、MCF7細胞におけるルシフェラーゼ（fluc）のノックダウンを用いた。
【０２０４】
本発明者らはさらに、MCF7腫瘍細胞におけるOR51E2ノックダウンが、古典的細胞溶解実験において腫瘍特異的T細胞によるそれらの溶解を有意に増加させることも示している（クロム放出アッセイ；図11）。
【０２０５】
以上を総合すると、遺伝子ノックダウンまたは抗体遮断によって遮断することのできる、TAS2R3およびOR15E2の免疫抑制性の役割に関してさらなる証拠が提供された。
【０２０６】
参考文献
2016535060.tif 000004
2016535060.tif 000005
2016535060.tif 000006
【図１Ａ】
2016535060.tif 000007
【図１Ｂ】
2016535060.tif 000008
【図１Ｃ】
2016535060.tif 000009
【図１Ｄ】
2016535060.tif 000010
【図２Ａ】
2016535060.tif 000011
【図２Ｂ】
2016535060.tif 000012
【図２Ｃ】
2016535060.tif 000013
【図２Ｄ】
2016535060.tif 000014
【図２Ｅ】
2016535060.tif 000015
【図３】
2016535060.tif 000016
【図４】
2016535060.tif 000017
【図５】
2016535060.tif 000018
【図６】
2016535060.tif 000019
【図７】
2016535060.tif 000020
【図８】
2016535060.tif 000021
【図９】
2016535060.tif 000022
【図１０】
2016535060.tif 000023
【図１１】
2016535060.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月11日(2016.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016535060000001.app
【国際調査報告】
2016535060.tif 000025
2016535060.tif 000026
2016535060.tif 000027
2016535060.tif 000028
2016535060.tif 000029
2016535060.tif 000030
2016535060.tif 000031