(57)【要約】  本発明は、クロマトグラフィー材料の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）材料の製造方法であって、多孔質炭水化物粒子上に不飽和基を導入する工程及び不飽和基を含む粒子にスチレンモノマーをグラフトする工程を含む方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）材料の製造方法であって、多孔質炭水化物粒子上に不飽和基を導入する工程及び不飽和基を含む粒子にスチレンモノマーをグラフトする工程を含む方法。
【請求項２】
多孔質炭水化物粒子が多糖類材料からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
多孔質炭水化物粒子がアガロースからなる、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
不飽和基がアリル基である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アリル化がアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）により実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
スチレンモノマーがスチレン、ｔｅｒｔブチルスチレン又はペンタフルオロスチレンから選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
スチレンモノマーＩのグラフト溶液ｖ／ｖが５〜９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５〜７５％である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
アリル化がＡＧＥによるものであり、スチレンモノマーがスチレン又はｔｅｒｔブチルスチレンであり、グラフト溶液中に５０％ｖ／ｖで存在する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で製造されたＲＰＣ材料。
【請求項１０】
請求項８記載の方法で製造されたＲＰＣ材料。
【請求項１１】
逆相クロマトグラフィーを実施するための請求項９又は請求項１０記載のＲＰＣ材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー材料の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、クロマトグラフィー粒子の表面修飾による逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
吸着クロマトグラフィーは、溶質分子と、クロマトグラフィーマトリックスに化学的にグラフトされた、特異的にデザインされたリガンドとの間の化学的相互作用に依存する。数年にわたって、電子電荷から生体親和性にわたるさまざまな生化学的特性を利用する、多数の異なるタイプのリガンドが生体分子の精製のためにクロマトグラフィー担体に固定されてきた。生体分子の分取クロマトグラフィーに関するのためのさまざまな吸着技術に対する重要な追加は、移動相の溶質と、固定されたｎ−アルキル炭化水素又は芳香族リガンドとの結合が疎水性相互作用により起こる逆相クロマトグラフィーとなってきている。逆相クロマトグラフィーは生化学的分離及び精製の領域で分析及び分取の両方の応用が見出されている。ある程度の疎水性を特徴とする分子、例えばタンパク質、ペプチド及び核酸は、極めて優れた回収率及び分離能で逆相クロマトグラフィーにより分離され得る。加えて、移動相におけるイオンペアリング調整剤の使用により、荷電溶質、例えば完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド及び親水性ペプチドの逆相クロマトグラフィーが可能になる。分取逆相クロマトグラフィーは、シーケンシングのためのタンパク質断片のマイクロ精製から組換えタンパク質製品の処理規模の精製に及ぶ応用が見出されている。
【０００３】
逆相クロマトグラフィーにおける分離機構は、移動相中の溶質分子と固定された疎水性リガンド、すなわち固定相との間の疎水性結合相互作用に依存する。疎水性結合相互作用の実際の性質は、それ自体が白熱する議論の主題であるが、社会通念としては、結合相互作用が有益なエントロピー効果の結果であると想定されている。逆相クロマトグラフィーに使用される初期移動相の結合条件は主に水性であり、溶質分子と固定化リガンド両方を取り巻く高度に組織化された水構造を示す。溶質は固定化疎水性リガンドと結合するので、溶媒に曝露される疎水性領域は最小化される。したがって、組織化された水構造の程度は、対応する系のエントロピーの有利な増加により縮小される。このようにして、会合する疎水性部分、すなわち溶質及びリガンドのエネルギーの観点から有利である。
【０００４】
逆相クロマトグラフィーは、実験計画による吸着過程であり、これは分離をもたらす分割機構に頼っている。溶質分子は、移動相と固定相との間で分割される（すなわち、平衡が確立される）。２つの相の間の溶質の分配は、媒体の結合特性、溶質の疎水性及び移動相の組成物に依存する。当初は、実験条件は、移動相由来の溶質の固定相への吸着に都合がよいように計画される。その後、移動相の組成物は、固定相から移動相へ戻る脱離に都合がよいように改変される。この場合、吸着は、基本的に溶質分子が固定相に１００％分配されている、極度の平衡状態であると考えられる。逆に、脱離は、基本的に溶質が移動相に１００％分配されている、極度の平衡状態である。
【０００５】
生体分子の逆相クロマトグラフィーは、一般に定組成溶出ではなく勾配溶出を使用する。生体分子は水性条件下で逆相マトリックスの表面に強力に吸着するが、これらの生体分子は非常に狭い範囲の有機調整剤濃度でマトリックスから脱離する。特有の吸着特性を有するこれらの高分子量生体分子と併せて、通常の生体試料は通常、対応して多様な吸着親和性を有する生体分子の広範囲の混合物を含有する。したがって、複合生体試料の逆相分離のための唯一の実用的方法は勾配溶出である。
【０００６】
要約すると、逆相クロマトグラフィーでの分離は、さまざまな度合いの疎水性を有する溶質分子の疎水性固定相への可逆的吸着／脱離に依存する。
【０００７】
クロマトグラフィー過程の第１工程は、逆相媒体を充填したカラムを、ｐＨ、イオン強度及び極性（移動相の疎水性）の適切な初期移動相条件下で平衡化することである。移動相の極性は、アセトニトリル等の有機調製剤の添加により調節される。トリフルオロ酢酸などのイオンペアリング剤もまた適切である。初期移動相（通常、移動相Ａと称される）の極性は、部分的に疎水性の溶質を溶解する程度に十分低いが、溶質と逆相クロマトグラフィーマトリックスとが確実に結合する程度に十分高くなければならない。第２の工程において、分離されるべき溶質を含有する試料が適用される。理想的には、試料はクロマトグラフィー床を平衡化するために使用される同じ移動相に溶解される。試料は最適な結合が起こる流速でカラムに適用される。ひとたび試料が適用されたら、クロマトグラフィー床は、すべての未結合及び望ましくない溶質分子を除去するために、移動相Ａでさらに洗浄される。
【０００８】
結合された溶質は次に、結合された溶質分子が段階的に脱離してカラムから溶出されるように移動相の極性を調整することによって、逆相媒体から脱離される。逆相クロマトグラフィーにおいて、これは通常、移動相中の有機調整剤の百分率を上げることによって、移動相の極性を低下させる工程を伴う。これは、最終移動相（移動相Ｂ）中に高濃度の有機調整剤を維持することによって達成される。概して、初期及び最終の移動相溶液のｐＨは同じままである。移動相の極性の漸減（移動相の疎水性の漸増）は、有機調整剤を殆ど又は全く含有しない初期移動相Ａが１００％から、高濃度の有機調整剤を含有する移動相Ｂが１００％（又はそれ以下）への漸増線形勾配により達成される。結合された溶質は、これらの個別の疎水性に従って逆相媒体から脱離する。
【０００９】
この過程の第４の工程は、これまでに脱離されなかった物質を除去する工程を伴う。これは一般に、カラムの再使用の前にすべての結合物質を確実に完全に除去するために、移動相Ｂをほぼ１００％の有機調整剤に変化させることによって達成される。
【００１０】
第５の工程は、移動相Ｂ１００％から初期移動相条件に戻す、クロマトグラフィー媒体の再平衡化である。
【００１１】
逆相クロマトグラフィーにおける分離は、試料の疎水性の違いの結果である、試料中に存在する溶質の結合特性の違いによるものである。逆相媒体に結合する溶質分子の程度は、初期移動相の疎水性を操作することによって調節可能である。溶質分子の疎水性を定量することは困難であるが、疎水性がごくわずかに変動する溶質の分離は容易に達成される。その極めて優れた分離能のため、逆相クロマトグラフィーは、複合生体分子の高性能の分離には不可欠な技術である。
【００１２】
通常逆相分離は、当初は移動相Ａ１００％から移動相Ｂ１００％への広範囲の勾配を使用して達成される。初期及び最終両方の移動相中の有機調整剤の量もまた、大きく変動し得る。
【００１３】
しかし、有機調整剤の日常的な百分率は移動相Ａにおいて５％以下であり、移動相Ｂにおいて９５％以上である。
【００１４】
逆相クロマトグラフィーの技術は、目的の溶質を結合して、混入物質を停滞せずにカラムを通過させる、又は混入物質を結合して、所望の溶質を自由に通過させるために研究者が選択可能なように、分離条件の大幅な柔軟性を可能にする。概して、脱離した溶質は濃縮状態でクロマトグラフィー媒体から溶出するので、目的の溶質を結合することはより適切である。さらに、初期移動相条件下における結合が完了すると、試料溶液中の所望の溶質の出発濃度は重要ではないので、希薄試料のカラムへの適用が可能になる。
【００１５】
逆相クロマトグラフィー媒体は、多孔質の不溶性ビーズマトリックスに化学的にグラフトされた疎水性リガンドからなる。このマトリックスは化学的及び機械的の両方で安定でなければならない。市販の逆相媒体のベースマトリックスは、一般にシリカ又は合成有機ポリマー、例えばポリスチレンから構成される。
【００１６】
逆相分離のための緩衝液条件を選択する場合、ｐＨが、分離プロファイルに非常に影響を与えると思われるパラメーターの１つである。さらに標的分子の安定性も考慮しなければならない。したがって、最適なｐＨの選択において最大の自由をユーザーにもたらすために、広いｐＨ域、例えばｐＨ３〜１２で使用可能な逆相クロマトグラフィー媒体の必要性が存在する。
【００１７】
シリカ及びポリスチレンで作られているＲＰＣ媒体は多くの場合十分に機能するが、これらは広いｐＨ域で使用することはできない。先に、細孔構造に変化をもたらす、ポリマー性（例えば、架橋ポリスチレン）担体へのスチレンのグラフトが、インスリンの分離においていくらかの改善をもたらしたことが示されており、米国特許第７，０４８，８５８号を参照されたい。ポリスチレンは広いｐＨ域で化学的に安定であるが、多くのｐＨ値においてシリカと比較して選択性が劣ることが問題である。
【００１８】
他方でシリカは約８を超えるｐＨにおいて長期使用すると安定ではない。
【００１９】
したがって、広いｐＨ域で優れた選択性を示す、改善されたＲＰＣ媒体の必要が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１１０４６４９４号
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、機械的強度に対する要求に耐え、広いｐＨ域内において高い選択性をもたらす、多孔質炭水化物粒子に基づくＲＰＣ材料の製造方法を提供する。
【００２２】
したがって、第１の態様において、本発明は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）材料の製造方法であって、多孔質炭水化物粒子上に不飽和基を導入する工程及び不飽和基を含む粒子にスチレンモノマーをグラフトする工程を含む方法を提供する。
【００２３】
多孔質炭水化物粒子は、好ましくは多糖類材料、最も好ましくはアガロースからなる。
【００２４】
アガロースは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に使用されすでに成功しており、多数の市販の製品、例えばＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が利用可能である。ＨＩＣのための製品は穏やかな疎水性なだけであり、アガロースは、その固有の親水性及び十分に疎水性にすることの難しさのため、高度に疎水性担体が必要とされる逆相クロマトグラフィー用には考えられてこなかった。
【００２５】
本発明者らは、架橋アガロース粒子にスチレンをグラフトすると、全ｐＨ域での良好な選択性と併せて、十分な疎水性を呈するという、シリカ又はポリスチレン担体のいずれでも見出すことのできない性状を呈するという予想外の知見を得た。
【００２６】
好ましくは、不飽和基は本製造方法においてアリル基である。
【００２７】
本方法の一実施形態では、アリル化はアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）により実施される。
【００２８】
スチレンモノマーは、例えば、スチレン、ｔｅｒｔブチルスチレン又はペンタフルオロスチレンから選択することができる。
【００２９】
グラフト溶液中のスチレンモノマーｖ／ｖは、５〜９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５〜７５％の量で存在することが好ましい。
【００３０】
好ましい実施形態では、アリル化はＡＧＥによるものであり、スチレンモノマーはスチレン又はｔｅｒｔブチルスチレンであり、グラフト溶液中に５０％  ｖ／ｖで存在する。
【００３１】
第２の態様において、本発明は、上記の方法に従って製造されるＲＰＣ材料に関する。
【００３２】
第３の態様において、本発明は、逆相クロマトグラフィーを実施するための、上で製造されたＲＰＣ材料の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図２】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図３】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図４】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図５】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図６】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図７】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図８】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図９】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図１０】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図１１】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）に対する、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図１２】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。
【図１３】ｐＨ７におけるシリカカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。
【図１４】ｐＨ３におけるシリカカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。
【図１５】ｐＨ７におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。
【図１６】ｐＨ３におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。
【図１７】ｐＨ１２におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明を、いくつかの限定されない実施例及び添付の図面と関連させて、これ以下により詳細に記載する。
【実施例】
【００３５】
材料
平均粒径８．３５μｍの多孔質架橋アガロース粒子を、すべての実験に使用した。
【００３６】
カップリング剤を表１に列挙する。
【００３７】
【表１】
2016535669.tif 000003
実施例１：ＬＳ００２５９７；アガロース粒子のアリル化及びポリスチレンのグラフト
アリル化
５０ｍＬのアガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で５００ｍＬの蒸留水で洗浄した。蒸留水中５０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム溶液を調製し、粒子を、３００ｍＬの該５０％水酸化ナトリウム溶液で洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。４０ｍＬの５０％水酸化ナトリウムを加え、温度を５０℃に上げた。撹拌速度を２５０ｒｐｍに設定した。温度が安定したら、５０ｍＬのアリルグリシジルエーテルを加えた。反応を一晩進行させた。
【００３８】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を５００ｍＬの蒸留水、５００ｍＬのエタノール及び５００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。
【００３９】
結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、６２５μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。
【００４０】
ポリ（スチレン）のグラフト
上記のように調製された１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮ（トルエン及びスチレンがグラフト溶液を構成する）を加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。
【００４１】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。
【００４２】
実施例２：ＬＳ００２９８０；アリル化アガロース粒子のポリスチレンでのグラフト（ポリスチレンの増量）
実験１のように調製された１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１０ｍＬのトルエン、２０ｍＬのスチレン及び３６０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。
【００４３】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。
【００４４】
実施例３：ＬＳ００２５９７；アガロース粒子のアリル化及びポリ（ペンタフルオロスチレン）のグラフト
アリル化
２００ｍＬのアガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で２０００ｍＬの蒸留水で洗浄した。蒸留水中５０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム溶液を調製し、粒子を、１２００ｍＬの該５０％水酸化ナトリウム溶液で洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した１０００ｍＬの丸底フラスコに移した。１６０ｍＬの５０％水酸化ナトリウム及び１．２ｇの水酸化ホウ素ナトリウムを加え、温度を５０℃に上げた。撹拌速度を６００ｒｐｍに設定した。温度が安定したら、２００ｍＬのアリルグリシジルエーテルを加えた。反応を一晩進行させた。
【００４５】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を５００ｍＬの蒸留水、５００ｍＬのエタノール及び５００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。
【００４６】
結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、５０１μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。
【００４７】
ポリ（ペンタフルオロスチレン）のグラフト
１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのペンタフルオロスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。
【００４８】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのアセトン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。
【００４９】
実施例４：ＬＳ００３１４７Ａ；アガロース粒子のアリル化及びポリ（ｔｅｒｔ−ブチルスチレン）のグラフト
アリル化
２００ｍＬのアガロース粒子を、実験３のようにアリル化した。結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、５０１μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。
【００５０】
ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルスチレン）グラフト
１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させる。
【００５１】
粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％  エタノールで洗浄した。
【００５２】
実施例５：プロトタイプ及び参照製品に対するペプチドの分離
異なるｐＨ値において４種のペプチドを、クロマトグラフィー評価方法のための被験ペプチドとして使用した。ペプチドのいくつかの特性を表に列挙する。
【００５３】
【表２】
2016535669.tif 000004
プロトタイプ及びカラム
本発明に係るＲＰＣプロトタイプ材料（実験１〜４参照）をＴｒｉｃｏｒｎ５／５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）の０．９８ｍＬカラムに充填した。さらに比較のためで、ＳＯＵＲＣＥ１５  ＲＰＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）及びＫｒｏｍａｓｉｌ  １００−１３−Ｃ４（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ）を、Ｔｒｉｃｏｒｎ５／５０カラムＡＫＴＡ（商標）に充填した。Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用して、分離方法を行った。
【００５４】
分離方法に使用した材料を、表３に列挙する。
【００５５】
【表３】
2016535669.tif 000005
緩衝液の調製
１５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ３．０緩衝液：
０．１７６ｍＬのリン酸及び１．７１ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物を、最終体積が１ＬになるようにＭｉｌｌｉ  Ｑ  ｗａｔｅｒに溶解した。
【００５６】
１５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０緩衝液：
１．０３２ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物及び１．０６８ｇのリン酸水素二ナトリウムを最終体積が１Ｌになるように溶解した。
【００５７】
１０ｍＭ  水酸化ナトリウムを、ｐＨ１２溶液として使用した。溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒで最終体積１Ｌに希釈したＴｉｔｒｉｓｏｌアンプルを使用して調整した。
【００５８】
ペプチド分離法
被験ペプチド：アンジオテンシンＩ、Ｉｌｅ７−アンジオテンシンＩＩＩ、Ｖａｌ４−アンジオテンシンＩＩＩ及びアンジオテンシンＩＩＩを、各ペプチドの最終濃度が０．１２５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒに溶解した。
【００５９】
分離は、ｐＨ３．０並びにｐＨ７．０及び１２．０において実施する。
【００６０】
Ａ  緩衝液は、１５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ３．０もしくはｐＨ７．０又は１０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１２である。Ｂ  緩衝液はアセトニトリルである。
【００６１】
本方法の概要を下記に示す。
【００６２】
【表４】
2016535669.tif 000006
検出波長としてＵＶ  ２１５ｎｍを使用した。
【００６３】
ｐＨに依存して、ペプチドは正に荷電（ｐＨ３）、ほぼ非荷電（ｐＨ７）又は負に荷電（ｐＨ１２）していると思われる。ペプチドの電荷は分離に影響を与え得る。例えば負に荷電した基が粒子上に存在する場合、正に荷電したペプチドがイオン性及び疎水性両方の相互作用により保持されるので、低ｐＨにおけるピークの広がりがもたらされ得る。
【００６４】
図１〜図３は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２５９７の分離のクロマトグラムを示す。
【００６５】
ＬＳ００２５９７はすべてのｐＨ値において全体に非常に優れた性能を有し、鋭いピークを有する。ペプチドのうちの１種は、ペプチドが強力に負に荷電するｐＨ１２において結合していない。
【００６６】
図４〜図６は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２９８０の分離のクロマトグラムを示す。ＬＳ００２９８０は全体に非常に優れた性能を有し、ｐＨ１２において４種すべてのペプチドを保持するために十分な疎水性を有し、極めて優れた分離が得られるいくつかのプロトタイプのうちの１つである。ｐＨ３における分離は、例えばＬＳ００２５９７よりわずかに広いピークをもたらすが、ｐＨ７における分離はＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ４・１００Åとの比較が十分可能である。
【００６７】
図７〜図９は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２８８９の分離のクロマトグラムを示す。
【００６８】
ポリ（ペンタフルオロスチレン）をグラフトしたプロトタイプ（ＬＳ００２８８９）はすべてのｐＨ値において優れた分離をもたらし、分離パターンはＬＳ００２５９７と似ている。
【００６９】
図１０〜図１２は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００３１４７Ａの分離のクロマトグラムを示す。Ｔｅｒｔブチルスチレン（ＬＳ００３１４７Ａ）は全体に優れた性能をもたらす。
【００７０】
図１３〜図１４は、それぞれｐＨ７及びｐＨ３におけるＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ４・１００Åのクロマトグラムを示す比較図である。
【００７１】
ＫｒｏｍａｓｉｌカラムはｐＨ７において優れた分離を示すが、ｐＨ３ではペプチドを分離できず、わずか３つのピークが観察されるだけである。すべてのペプチドの保持時間は、アガロース系プロトタイプより非常に長い。このことは、この事例においてペプチドの溶出に使用しなければならない有機溶媒がより多いことを意味する。シリカ系製品は約ｐＨ８を超えると安定ではないので、ＫｒｏｍａｓｉｌカラムにはｐＨ１２における分離は行わなかった。
【００７２】
図１５〜図１７は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるＳｏｕｒｃｅ１５  ＲＰＣのクロマトグラムを示す比較図面である。ＳＯＵＲＣＥ１５  ＲＰＣカラムはｐＨ３において優れた分離を示すが、ｐＨ７及び１２の両方では分離が劣り、広いピークを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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