(57)【要約】本発明は、コア、水溶性ポリマー、及びＲＧＤペプチドを含んだナノ粒子及びポロキサマーを含む組成物を提供する。このナノ粒子は、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含み、水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーの第一の末端でコアに付着し、水溶性ポリマーの第二の末端でペプチドに付着する。ペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドをグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合させるのに十分な長さを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含み、前記水溶性ポリマーは、前記水溶性ポリマーの第一の末端で前記コアに付着され、前記水溶性ポリマーの第二の末端に前記ペプチドが付着され、前記ペプチドが、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、前記水溶性ポリマーが、前記ペプチドのグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）との結合を可能にするのに十分な長さを有し、前記組成物がさらにポロキサマーを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記ポロキサマーが、前記組成物の約０．１％から約６０％で存在する、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記ポロキサマーが、前記組成物の約０．１％から約４０％で存在する、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記組成物内の前記ポロキサマーが、最大でナノ粒子質量の５０倍で存在する、請求項１から３のいずれか一つの組成物。
【請求項５】
前記ポロキサマーが、−［親水性ポリマー−疎水性ポリマー−親水性ポリマー］ｎ−の構造を含む非イオン・トリブロック・コポリマーである、請求項１から４のいずれか一つの組成物。
【請求項６】
前記ポロキサマーが、−［ポリエチレングリコール−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリエチレングリコール］ｎ−である、請求項１から５のいずれか一つの組成物。
【請求項７】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７及びコリフォアＰ１８８からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一つの組成物。
【請求項８】
前記ポロキサマーが、プルロニック（登録商標）１０Ｒ５、プルロニック（登録商標）（商標）１７Ｒ２、プルロニック（登録商標）１７Ｒ、プルロニック（登録商標）２５Ｒ２、プルロニック（登録商標）２５Ｒ４、プルロニック（登録商標）３１Ｒ１、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８界面活性錠剤、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦプリル・ポロキサマー３３８、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ５００ＢＨＴプリル、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦプリル・ポロキサマー４０７、プルロニック（登録商標）Ｆ３８、プルロニック（登録商標）Ｆ３８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＬＦパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦプリル・ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ７７ミクロパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦプリル・ポロキサマー２３７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、プルロニック（登録商標）Ｆ８８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ９８、プルロニック（登録商標）Ｌ１０、プルロニック（登録商標）Ｌ１０１、プルロニック（登録商標）Ｌ１２１、プルロニック（登録商標）Ｌ３１、プルロニック（登録商標）Ｌ３５、プルロニック（登録商標）Ｌ４３、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、ポロキサマー１２４、プルロニック（登録商標）Ｌ６１、プルロニック（登録商標）Ｌ６２、プルロニック（登録商標）Ｌ６２ＬＦ、プルロニック（登録商標）Ｌ６２Ｄ、プルロニック（登録商標）Ｌ６４、プルロニック（登録商標）Ｌ８１、プルロニック（登録商標）Ｌ９２、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｎ３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０４、プルロニック（登録商標）Ｐ１０５、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３界面活性剤、プルロニック（登録商標）Ｐ６５、プルロニック（登録商標）Ｐ８４、及びプルロニック（登録商標）Ｐ８５からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一つの組成物。
【請求項９】
ナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が、コア、水溶性ポリマー及びペプチドからなり、前記水溶性ポリマーは、前記水溶性ポリマーの第一の末端で前記コアに付着され、前記水溶性ポリマーの第二の末端に前記ペプチドが付着され、前記ペプチドが、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、前記水溶性ポリマーが、前記ペプチドのグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）との結合を可能にするのに十分な長さを有し、前記組成物がさらにポリ（アクリル酸）からなる、前記組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、約−３．０ｍＶから約３ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１から９のいずれか一つの組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、回転楕円体形状、及び１ミクロン未満の直径を有する、請求項１から１０のいずれか一つの組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、０．１ミクロンと１ミクロンとの間の直径を有する、請求項１１の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、非回転楕円体形状を有する、請求項１から１０のいずれか一つのナノ粒子。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、ロッド、ファイバーまたはホイスカーである、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、少なくとも３の長さ対幅アスペクト比を有する、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
室温で少なくとも１４日間安定である、請求項１から１５のいずれか一つの組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子コアが結晶性ポリマーである、請求項１から１６のいずれか一つの組成物。
【請求項１８】
前記コアが、単一ポリマー、ブロック・コポリマー、トリブロック・コポリマーまたはクワドブロック・ポリマーである、請求項１から１７のいずれか一つの組成物。
【請求項１９】
前記ナノ粒子コアが、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ）、ＰＬＬまたは、それらの組合せを含む、請求項１から１８のいずれか一つの組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子コアが生物分解性である、請求項１から１９のいずれか一つの組成物。
【請求項２１】
前記ナノ粒子コアが固体である、請求項１から２０のいずれか一つの組成物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子コアが非生分解性である、請求項１から１９のいずれか一つの組成物。
【請求項２３】
前記ナノ粒子コアが、金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト・クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ及びＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロースまたはデンドリマー構造からなる群から選択される物質である、請求項１から２３のいずれか一つの組成物。
【請求項２４】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐型ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、澱粉、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマル）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダム・コポリマーのいずれか）、ポリ（ｎービニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセリン）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸または他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストラン及びそれらの組合せまたは混合物からなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか一つの組成物。
【請求項２５】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、請求項１から２３のいずれか一つの組成物。
【請求項２６】
前記ＰＥＧが、１００Ｄａと１０，０００Ｄａとの間の平均分子量を有する、請求項２５の組成物。
【請求項２７】
前記ＰＥＧが、少なくとも約１００の平均分子量を有する、請求項２５または２６の組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドが、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号４）、ＧＲＧＤＮ（配列番号５）、ＧＲＧＤＮＰ（配列番号６）、ＧＧＧＧＲＧＤＳ（配列番号７）、ＧＲＧＤＫ（配列番号８）、ＧＲＧＤＴＰ（配列番号９）、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ（配列番号１０）またはそれらの変異形からなる群から選択される配列を含む、請求項１から２７のいずれか一つの組成物。
【請求項２９】
前記ＲＧＤペプチドが、タンデム・リピートの構造である、請求項１から２８のいずれか一つの組成物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、前記ＲＧＤペプチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のコピーを含む、請求項１から２９のいずれか一つの組成物。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が、前記ＲＧＤペプチドの複数のコピーを含む、請求項３０の組成物。
【請求項３２】
前記ＲＧＤペプチドのすべてのコピーが同じである、請求項３１の組成物。
【請求項３３】
前記ＲＧＤペプチドの二つのコピーが、異なる配列を有する、請求項３１の組成物。
【請求項３４】
請求項１から８及び１１から２７のいずれかのナノ粒子を含み、前記水溶性ポリマーが、前記コアに０．１：１から１：１０以上のモル比で付着される、請求項１から３３のいずれか一つの組成物。
【請求項３５】
前記ナノ粒子が、さらに治療化合物を含む、請求項１から３４のいずれか一つの組成物。
【請求項３６】
前記治療化合物が疎水性である、請求項３５の組成物。
【請求項３７】
前記治療化合物が親水性である、請求項３５の組成物。
【請求項３８】
前記治療化合物が、共有結合によって前記ナノ粒子に付着される、非共有結合的に前記ナノ粒子に結合される、静電的相互作用を介して前記ナノ粒子に結合される、あるいは疎水性相互作用を介して前記ナノ粒子に結合される、請求項３５から３７のいずれか一つの組成物。
【請求項３９】
前記治療化合物が、増殖因子、サイトカイン、ステロイドまたは小分子である、請求項３５から３８のいずれか一つの組成物。
【請求項４０】
前記治療化合物が抗癌化合物である、請求項３５から３９のいずれか一つの組成物。
【請求項４１】
医薬組成物である、請求項１から４０のいずれか一つの組成物。
【請求項４２】
静脈内投与製剤である、請求項４１の医薬組成物。
【請求項４３】
凍結乾燥される、あるいは粉末である、請求項４１の医薬組成物。
【請求項４４】
個人の病状の治療方法であって、治療が必要な患者へ、前記病状を治療するのに効果的な量で、請求項１から４３のいずれか一つの組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項４５】
前記個人が出血障害を有する、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、無投与または食塩水の投与に比較して、出血時間を１５％超減少させるのに効果的な量で投与される、請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記出血障害が、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒障害、外傷、爆傷、脊髄損傷または大量出血の症状である、請求項４５または４６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本文に全文を援用する２０１３年４月１６日に出願の米国仮特許出願第６１／８１２，６４２号及び２０１３年８月１２日に出願の米国仮特許出願第６１／８６４，９６９号の優先権を主張する。
【０００２】
政府の利益に関する記述
本発明は、国立衛生研究所が授与した助成金番号１ＤＰ２ＯＤ００７３３８−０７、アメリカ合衆国国防総省が授与した助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１１−１−００１４及びアメリカ合衆国海軍が授与した助成金番号ＮＧ２６４５−１２−Ｃ４０５５を介した政府の支援で実施された。政府は、本発明に対してある特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、コア、水溶性ポリマー、及びＲＧＤペプチドを含むナノ粒子及びポロキサマーを含む組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
大量出血は、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）における損傷カスケードの第一ステップでもある。脊髄損傷及び外傷性脳損傷の両方において、傷害の機序に関係なく最初に観察可能な現象が、大量出血である。この出血を止めることができるならば、組織が維持され、転帰が改善される、と推測できる。多くの場合、一次的傷害は、損傷の小さな部分である。損傷後の数時間、数日間あるいは数週間に渡って生じる二次的損傷プロセスが、機能障害を進行させ、それを深刻なものとしてしまう。それら二次的損傷プロセスを停止させることは、より多くの組織を維持することを意味する。組織の維持はより良好な機能上の転帰を意味する。
【０００５】
損傷後、一連の凝固作用を介して止血が行われる。血小板の観点での重要なステップは、血小板の活性化、結合、及び一連の増殖因子、フィブリノゲン等の他の分子の放出を伴う。脈管損傷中、コラーゲンが露出されることで、血小板の活性化が起動する。血小板の形態構造が、円板状から星状へと移行し、血小板が露出コラーゲンに付着する。一旦血小板凝集が始まると、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む複数の炎症作用因子が、それらの貯留粒状体から放出される。このことによって、その近くを循環する血小板の表面は、付着性を帯びる。さらに、セロトニン、エピネフリン及びトロンボキサンＡ２が、極度な血管収縮を誘発する。最終ステップ、すなわちクロット形成は、肝臓で生成されて通常プラズマ中に存在する大きな溶性血漿タンパクであるフィブリノゲンの、不溶性糸状分子であるフィブリンへの転換である。
【０００６】
重傷の場合、これらの内因性プロセスだけでは不十分で、出血は抑制されない。これらのプロセスを強化し、外的方法を越えて止血を誘発する多数のアプローチがある。既存の血小板を置換あるいは増強する血小板代替物は、長年に渡り探求されている（Ｂｌａｊｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１：１６３７−４１（２００３））。同種異系血小板の投与は、止血を支援可能であるが、血小板の有効期間は短い。また、同種異系血小板の投与は、移植片対宿主疾患、同種異系免疫化及び輸血関連肺損傷を引き起こすこともある（Ｂｌａｊｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１：１６３７−４１（２００３））。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列で修正した赤血球、アルブミンに基づくフィブリノゲン被覆マイクロカプセル、及びリポソーム系などの非血小板選択肢も、凝固剤として研究されている（Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１００：３９７−４０４（２００８））。しかし、これらの製品の臨床応用には、毒性があること、血栓症を生じること、有効性が限られること等の、主要な問題がある（Ｆｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：９７９３８３（２０１１））。
【０００７】
現場及びクリニック内で止血を強化するための多数のアプローチは存在する。例えば、加圧包帯、クイッククロット（商標）等の吸収材、及び活性化組み換え型ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）の静脈内（ＩＶ）注入などがある。しかし、前者二つは、露出した傷に対してのみ適用可能であり、ｒＦＶＩＩａの効果は、不明確なものであり、また、冷蔵を必要とし、高価である。現場で投与、あるいは外傷の部位に投与するには問題がある。現場での投与が可能な、止血のための新しいアプローチが必要なことは、明らかである。
止血剤が複雑な外傷に対して効果的となるためには、その系が無毒性であること、室温（すなわち、医療部隊のバッグ）での保存に安定であること、即時のＩ．Ｖ．投与が可能であること、及び非特異的血栓症を回避するよう損傷部位特定集合性を有することが必要である。この系が臨床利用可能であるためには、理想的に、既にＦＤＡの承認を得た物質から生成される必要がある。実用的に、また、安価でなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｌａｊｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１：１６３７−４１（２００３）
【非特許文献２】Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１００：３９７−４０４（２００８）
【非特許文献３】Ｆｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：９７９３８３（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、合成血小板、すなわち、出血を減少させて外傷の転帰を改善する静注投与可能な止血性ナノ粒子を提供する。
【００１０】
本文で説明のナノ粒子は、上に述べたような、大腿動脈損傷モデルにおける出血時間を半減させる。これらナノ粒子は、本質的に、合成血小板として作用し、室温で安定であり、また、静注投与可能である。
【００１１】
本発明は、ナノ粒子を含む組成物を提供する。このナノ粒子は、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含み、水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーの第一の末端でコアに付着し、水溶性ポリマーの第二の末端でペプチドに付着する。ペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドをグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合させるのに十分な長さを有する。組成物は、さらに、ポロキサマーを含む。本発明の組成物のナノ粒子は、約−３．０ｍＶから約３ｍＶのゼータ電位を有するナノ粒子などであり、電荷的に中性である。
【００１２】
本発明の組成物は、ポロキサマーが組成物の約０．１％から約６０％で存在するものを含む。本発明は、また、ポロキサマーが組成物の約０．１％から約４０％で存在する組成物を提供する。
【００１３】
加えて、本発明の組成物は、組成物内のポロキサマーが、ナノ粒子質量の５０倍まで存在するものを含む。
【００１４】
本発明の組成物のいずれにおいても、ポロキサマーは、構造−［親水性ポリマー−疎水性ポリマー−親水性ポリマー］ｎ−を含む非イオン・トリブロック・コポリマーである。
【００１５】
本発明の組成物のいずれにおいても、ポロキサマーは、−［ポリエチレングリコール−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリエチレングリコール］ｎ−である。例えば、ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７及びコリフォア（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ）Ｐ１８８からなる群から選択してもよい。加えて、ポロキサマーは、プルロニック（登録商標）１０Ｒ５、プルロニック（登録商標）１７Ｒ２、プルロニック（登録商標）１７Ｒ、プルロニック（登録商標）２５Ｒ２、プルロニック（登録商標）２５Ｒ４、プルロニック（登録商標）３１Ｒ１、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８界面活性錠剤、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦプリル・ポロキサマー３３８、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ５００ＢＨＴプリル、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦプリル・ポロキサマー４０７、プルロニック（登録商標）Ｆ３８、プルロニック（登録商標）Ｆ３８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＬＦパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦプリル・ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ７７ミクロパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦプリル・ポロキサマー２３７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、プルロニック（登録商標）Ｆ８８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ９８、プルロニック（登録商標）Ｌ１０、プルロニック（登録商標）Ｌ１０１、プルロニック（登録商標）Ｌ１２１、プルロニック（登録商標）Ｌ３１、プルロニック（登録商標）Ｌ３５、プルロニック（登録商標）Ｌ４３、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、ポロキサマー１２４、プルロニック（登録商標）Ｌ６１、プルロニック（登録商標）Ｌ６２、プルロニック（登録商標）Ｌ６２ＬＦ、プルロニック（登録商標）Ｌ６２Ｄ、プルロニック（登録商標）Ｌ６４、プルロニック（登録商標）Ｌ８１、プルロニック（登録商標）Ｌ９２、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｎ３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０４、プルロニック（登録商標）Ｐ１０５、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３界面活性剤、プルロニック（登録商標）Ｐ６５、プルロニック（登録商標）Ｐ８４及びプルロニック（登録商標）Ｐ８５からなる群から選択してもよい。
【００１６】
具体的には、本発明は、ナノ粒子を含む組成物を提供する。このナノ粒子は、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含み、水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーの第一の末端でコアに付着し、水溶性ポリマーの第二の末端でペプチドに付着する。ペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドをグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合させるのに十分な長さを有する。組成物は、さらに、ポリ（アクリル酸）を含む。組成物のナノ粒子は、電荷的に中性であってよく、すなわち約−３．０ｍＶから約３．０ｍＶのゼータ電位を有し得る。
【００１７】
本発明の組成物のいずれにおいても、組成物は、回転楕円体形状及び１ミクロン未満の直径を有するナノ粒子を含む。例えば、ナノ粒子は、０．１ミクロンから１ミクロンの直径を有する。
【００１８】
代替的に、本発明の組成物のいずれにおいても、組成物は、非回転楕円体形状を有するナノ粒子を含む。例えば、ナノ粒子は、ロッド、ファイバーまたはホイスカーである。ナノ粒子は、少なくとも３の長さ対幅アスペクト比を有し得る。
【００１９】
本発明は、室温で少なくとも１４日間安定である前述の組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、また、結晶性ポリマーであるコアを有するナノ粒子を含む前述の組成物を提供する。加えて、前述の組成物は、単一ポリマー、ブロック・コポリマー、トリブロック・コポリマーまたはクワドブロック・ポリマーであるコアを有するナノ粒子を含む。例えば、本発明の組成物は、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ＰＬＬ、または、それらの組合せを含んだコアを有するナノ粒子を含む。
【００２１】
本発明は、生物分解可能なコアを有するナノ粒子、または代替的に、非生物分解性コア・スコアを有するナノ粒子を含む組成物を提供する。本発明の組成物のいずれにおいても、ナノ粒子は、固体コアを有し得る。例えば、本発明は、コアが、金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト・クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ及びＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロースまたはデンドリマー構造からなる群から選択される物質であるナノ粒子を含む組成物を提供する。
【００２２】
加えて、本発明の組成物のいずれにおいても、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐型ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、澱粉、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマル）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダム・コポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセリン）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸または他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストラン、及びそれらの組合せまたは混合物からなる群から選択される水溶性ポリマーを含む。
【００２３】
例えば、本発明は、１００Ｄａから１０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧ等の、水溶性ポリマーＰＥＧのナノ粒子を含む組成物を提供する。
【００２４】
本発明の組成物のいずれにおいても、ナノ粒子は、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号４）、ＧＲＧＤＮ（配列番号５）、ＧＲＧＤＮＰ（配列番号６）、ＧＧＧＧＲＧＤＳ（配列番号７）、ＧＲＧＤＫ（配列番号８）、ＧＲＧＤＴＰ（配列番号９）、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ（配列番号１０）、または、それらの変異形からなる群から選択される配列を含んだペプチドを含む。本発明の組成物は、タンデム・リピートの状態にあるＲＧＤペプチドを含んだナノ粒子含み得る。本発明の組成物は、ＲＧＤペプチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のコピーを含むナノ粒子、またはＲＧＤペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を含み得る。例えば、組成物は、ＲＧＤペプチドの複数のコピーを含んだナノ粒子を含み、ＲＧＤペプチドのすべてのコピーが同じである、あるいは組成物は、ＲＧＤペプチドの複数のコピーかナノ粒子を含み、ＲＧＤペプチドの二つのコピーが、異なる配列を有する。
【００２５】
本発明の組成物のいずれにおいても、組成物は、０．１：１から１：１０またはそれ以上のモル比で水溶性ポリマーをコアに付着して含むナノ粒子を含む。
【００２６】
本発明の組成物のいずれにおいても、組成物は、治療化合物を更に含んだナノ粒子を含む。例えば、その治療化合物は疎水性である。代替的に、治療化合物は親水性である。治療化合物は、共有結合でナノ粒子に付着されても、非共有結合でナノ粒子に結合されても、静電的相互作用を介してナノ粒子に結合されても、あるいは疎水的相互作用を介してナノ粒子に結合されてもよい。治療化合物は、成長因子、サイトカイン、ステロイドまたは小分子、あるいは抗癌化合物でもよい。
【００２７】
本発明は、医薬組成物である組成物を提供する。この場合の組成物は、医薬的に許容可能な担体、希釈液または調合物をさらに含む。例えば、本発明の組成物は、静脈内投与製剤であってもよい。本発明の組成物は、凍結乾燥されてもよいし、粉末であってもよい。
【００２８】
本発明は、病状を治療するのに効果的な量で、前述の組成物のいずれかを、それを必要とする患者へ投与するステップを含む、個人における病状の治療方法を提供する。例えば、本発明は、出血障害がある個人に対して、出血を減少させるのに効果的な量での組成物の投与方法を提供する。具体的には、本発明は、無投与または食塩水の投与に比較して出血時間を１５％超減少させるのに効果的な量で、前述の組成物のいずれかを投与するステップを含む出血障害の治療方法を提供する。本発明のこれらの方法における出血障害は、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒疾患、外傷、ブラスト外傷、脊髄損傷または大量出血の症状であり得る。
【００２９】
本発明は、また、病状治療薬剤を調製するための、本発明の組成物の使用を提供する。この場合の薬剤は、病状を治療するのに効果的な量で組成物を含む。例えば、本発明は、出血障害治療薬剤を調製するための、本発明の前述の組成物の使用を提供する。この場合の薬剤は、出血を減少させるのに効果的な量で組成物を含む。本発明は、出血障害治療薬剤を調製するための、前述の組成物の使用を提供する。この場合の薬剤は、無投与または食塩水の投与に比較して出血時間を１５％超減少させるのに効果的な量の組成物を含む。本発明の使用のいずれにおいても、薬剤は、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒疾患、外傷、爆傷、脊髄損傷または大量出血の症状である出血障害を治療するために投与されてもよい。
【００３０】
本発明は、また、出血障害等の病状を治療するための、本発明の組成物を提供する。本発明は、出血障害を治療するための組成物を提供する。この場合の出血障害は、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒疾患、外傷、爆傷、脊髄損傷または大量出血の症状である。本発明は、出血障害の治療のための組成物を提供する。この場合の組成物は、無投与または食塩水の投与に比較して出血時間を１５％超減少させるのに効果的な量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のＰＬＧＡ−ＰＬＬナノ粒子の概略図である。
【図２Ａ】試験管内での出血時間に対するナノ粒子の効果を表す。
【図２Ｂ】試験管内での出血時間に対するナノ粒子の効果を表す。
【図３】乳酸リンゲル対照に対する累積血液損失を表す。時間０で肝臓に損傷を与え、自由に出血させる。血液は、吸引を介して採集する。この曲線は、４件の実験からの平均値による累積血液損失を表す。血液損失の大部分は、最初の５分間で発生する。点線は、標準誤差を表す。
【図４】四つの時間範囲に分けた血液損失を表す。投与前（０から５分、３８０＋／−５９ｍｌ）、投与後（５から１５分、１７４＋／−１０６ｍｌ）、注入後１（１５から３０分、１５０＋／−１１１ｍｌ）及び注入後２（３０から６０分、７０＋／−９５ｍｌ）。＋／−は、標準偏差を表す。
【図５】（損傷後５分の時点における０．１ｍｇ／ｋｇ用量の）ＮＰ１投与後の血液損失速度を表す。＋／−は、標準偏差を表す。
【図６】（損傷後５分の時点における０．１ｍｇ／ｋｇ用量の）ＮＰ１００投与後の血液損失速度を表す。＋／−は、標準偏差を表す。
【図７】ブタ１：２ｍｇ／ｋｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ’ｓ−ＰＡＡ（ゼータ＝−３０ｍＶ）の第一の投与。ＣＡＲＰＡは、ｔ＝０分での最初の注入後の、ｔ＝１から２分、８から１２分及び６１から６５分での注入直後に存在している。
【図８】ブタ１：最初の粒子注入後８５分でのＰＬＡ−ＰＥＧｎＰ＋ＰＡＡ（ゼータ＝−３０ｍＶ）の第二の投与。
【図９】単純な粒子投与中の凝固時間を表す。凝血異常が、生来存在するようには見えない。
【図１０】６０ｍｇのＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ｐＡＡ（ゼータ＝−１．２９ｍＶ）の第一の投与。ローテム（ＮＡＴＥＭ）及びヘモクロン（ＡＰＴＴ）によって測定した凝固プロフィールを含んで、副作用は全く観察されなかった。
【図１１】２ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＮＰ＝ｐＡＡ（ゼータ＝＋２２．９７ｍＶ）の第二の投与を表す。
【図１２】肝臓損傷誘発ＣＡＲＰＡ後エピソード後の血液損失に対する、標的部分を欠くナノ粒子の効果を表す。これは、対照系である。
【図１３】非ＣＡＲＰＡ反応系において上方制御されるサイトカインに対する、ＣＡＲＰＡにおいて上方制御されるサイトカインの比率を表す。これは、補体活性化のための典型的な炎症マーカーが上方制御されたことを示す。
【図１４】動物が新規物体において費やした時間のパーセントを表す。統計的有意差は全く検出されなかった。活性（５匹の動物）、対照（５匹の動物）及びＬＲ（６匹の動物）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
複数の用途を有する官能化ナノ粒子を含む組成物が、ＦＤＡ承認物質に基づき提供される。種々の態様において、ナノ粒子は、損傷部位での出血時間を減少させる、中枢神経系（ＣＮＳ）への外傷後の止血に効力を発揮する、及び局所的薬剤送達手段を提供する。
【００３３】
活性化血小板を標的とする止血性ナノ粒子の静脈内投与が、いくつかのグループによって研究されており、ある程度の期待及び様々な挑戦を伴っている。血栓赤血球と呼ばれるＲＧＤ抱合赤血球（ＲＢＣ）は、試験管内では有望に見えたが、血小板減少性霊長類において長引く出血時間を有意に減少させることはなかった。フィブリノゲンγ鎖ドデカペプチド（ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（配列番号１３））を保持する他のものによって使用されたフィブリノゲン被覆アルブミン微小粒子、「Ｓｙｎｔｈｏｃｙｔｅ」及びリポソームは、血小板減少性ウサギの出血モデルにおいて成功を収めた。しかし、Ｓｙｎｔｈｏｃｙｔｅは、正常のウサギにおける出血治療には効果がなかった。また、リポソームは、この目的では未だに研究されていないようである。
【００３４】
この研究から、複数の事項が明白である。第一に、粒子が、大き過ぎる、あるいは免疫原性物質を保持する場合、非特異的血栓症を誘発する可能性がある。血小板代替物のための一組の公開ガイドラインにおいてＦＤＡが認識しているように、凝固系は非常に複雑であるため、生体外研究に協調させて、機能的に有向な結果を有する複数の出血モデル（及び種属）が、潜在的療法を完全に評価するのに用いられる。血栓形成促進可能性、免疫抗原性、及び添加剤からの毒性などが、安全基準であり、有効基準は、一連の生体内及び生体外試験に基づく。
【００３５】
ここに提供する実験は、本発明の止血性ナノ粒子は、齧歯動物における、大腿動脈損傷、肝臓損傷及び爆傷を含むいくつかの外傷モデルで、出血を減少させたことを示す。加えて、これらの止血性ナノ粒子は、ブタにおける鈍的外傷肝臓損傷後に用いた。
【００３６】
ブタ肝臓損傷モデルは、軍人が経験する非圧縮性損傷を模倣するために開発されたもので、他の止血性介入の研究との直接的な比較を可能にする。手短に言うと、肝の左葉を単離させ半分割し、その後、腔を閉じ、経時的に血液損失を治療法の関数として定量化すると共に、連続的なモニタリングと血液分析も一緒に行うものである。
【００３７】
最初は、低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）のナノ粒子でも、過度の出血に至った。無傷のブタでの粒子試験は、ナノ粒子上の電荷と相関する強い補体関連反応を示した。本発明のナノ粒子は、電荷的に中性であるよう設計されたものであり、この変化は、これらの粒子によって誘発された補体反応における緩和であった。
【００３８】
本発明は、ナノ粒子を含む組成物を提供する。このナノ粒子は、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含み、水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーの第一の末端でコアに付着され、水溶性ポリマーの第二の末端にペプチドが付着される。ペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドをグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）へ結合させるのに十分な長さを有する。組成物は、さらに、ポロキサマーを含む。
【００３９】
図１は、本発明の例示的なナノ粒子を示す。これは、ＰＬＧＡ−ＰＬＬナノ球コア（約２００ｎｍ）を含み、ＰＥＧアームは、第一の末端でコアに接合され、ＰＥＧアームの第二の末端でＲＧＤペプチドに接合されている。このナノ粒子は、活性化血小板と結合する。本発明のナノ粒子の特質は、脈管損傷部位に対する特異性、生物学的適合性及び生物分解性であることを含む。加えて、ナノ粒子は、室温で乾燥状態で保存されてもよく、また、迅速で簡単な投与が可能である。
ナノ粒子
【００４０】
本開示は、コア、水溶性ポリマー及びペプチドを含むナノ粒子を提供する。水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーの第一の末端でコアに付着され、水溶性ポリマーの第二の末端にペプチドが付着される。ペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドをグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）へ結合させるのに十分な長さを有する。種々の態様において、ペプチドは、線形または環状である。本開示の複数のナノ粒子を含む組成物において、組成物は、すべてのペプチドが線形である、すべてのペプチドが環状である、あるいは線形及び環状ペプチドが混在するナノ粒子を含むことを企図する。
【００４１】
開示のナノ粒子は、それらが広範囲の温度に渡って、本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持するという点で、温度安定性がある。「本質的に同じ構造」及び「本質的に同じ機能」は、本開示では、「本質的に同じ」が、当初の投与のプラスマイナス１０％、当初の投与のプラスマイナス９％、当初の投与のプラスマイナス８％、当初の投与のプラスマイナス７％、当初の投与のプラスマイナス６％、当初の投与のプラスマイナス５％、あるいは当初の投与のプラスマイナス５％から１０％の適用量で使用するのに、ナノ粒子の効力に影響を及ぼすような変化がないことを意味する、ことを企図する。種々の実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子が生成される温度に関係なく、生理的温度において、本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持する。生理的温度を大きく超える温度で本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子も企図される。高温でも本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持する能力は、限定せずに例えば、滅菌プロセス等の多くの理由で、重要である。他方、低温で本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子も企図される。例えば、凍結温度以下で本質的に同じ構造及び／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子は、長期貯蔵が必要な、あるいは長期貯蔵が利益を生む製剤に対して企図される。種々の態様において、本開示のナノ粒子は、３５℃を超える、４０℃を超える、４５℃を超える、５０℃を超える、５５℃を超える、６０℃を超える、６５℃を超える、７０℃を超える、７１℃を超える、７２℃を超える、７３℃を超える、７４℃を超える、７５℃を超える、７６℃を超える、７７℃を超える、７８℃を超える、７９℃を超えるあるいは８０℃を超える融解温度を有する。
【００４２】
本開示のすべての態様において、ナノ粒子は、室温で、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、あるいは少なくとも１４日、またはそれ以上、安定である。
【００４３】
本開示のナノ粒子は、多数の異なる形状のいずれであってもよいよう企図される。ナノ粒子の形状は、特定な態様において、その生成方法に依存する。他の態様において、ナノ粒子は、その生成プロセスの以前に、その間に、あるいはその後に形成された形状を得る。種々の実施形態においては、回転楕円体形状を有するナノ粒子が提供される。回転楕円体ナノ粒子（本文ではナノ球と称する）は、種々のサイズを有するように企図される。例えば、０．１ミクロンと０．５ミクロンの間、０．２ミクロンと０．４ミクロンの間、０．２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１３ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１４ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１５ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１６ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１７ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１８ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１９ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．２０ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．２１ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２１ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２０ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１９ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１８ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１７ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１６ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１５ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１４ミクロンの間、あるいは０．１２ミクロンと０．１３ミクロンの間の直径を有するナノ粒子を企図する。種々の態様においては、ナノ粒子が、０．０１ミクロンから１．０ミクロン、０．０５ミクロンから１．０ミクロン、０．０５ミクロンから０．９５ミクロン、０．０５ミクロンから０．９ミクロン、０．０５ミクロンから０．８５ミクロン、０．０５ミクロンから０．８ミクロン、０．０５ミクロンから０．７５ミクロン、０．０５ミクロンから０．７ミクロン、０．０５ミクロンから０．６５ミクロン、０．０５ミクロンから０．６ミクロン、０．０５ミクロンから０．５５ミクロン、０．０５ミクロンから０．５ミクロン、０．１ミクロンから１ミクロン、０．１５ミクロンから１．０ミクロン、０．２ミクロンから１ミクロン、０．２５ミクロンから１．０ミクロン、０．３ミクロンから１ミクロン、０．３５ミクロンから１．０ミクロン、０．４ミクロンから１ミクロン、０．４５ミクロンから１．０ミクロン、あるいは０．５ミクロンから１ミクロンの直径を有することを企図する。本開示により提供されるナノ粒子の組成物において、球状ナノ粒子は、すべてが同じ直径を有するという点で均質なものである、あるいは組成物中の少なくとも二つのナノ粒子が異なる直径を有するという点で不均質なものである。
【００４４】
非回転楕円体であるナノ粒子も提供される。他のナノ粒子は、ロッド、ファイバーまたはホイスカー形状を有するものを含む。ロッド、ファイバーまたはホイスカー実施形態において、ナノ粒子は、循環からの除去を回避する、減速させる、あるいは減少させるのに十分に高いアスペクト比を有する。
【００４５】
アスペクト比は、本技術において理解されている用語であり、高アスペクト比は、長くて狭い形状を指し、低アスペクト比は、短くて厚い形状を指す。
【００４６】
本開示のナノ粒子には、少なくとも３の、少なくとも３．５の、少なくとも４．０の、少なくとも４．５の、少なくとも５．０の、少なくとも５．５の、少なくとも６．０の、少なくとも６．５の、少なくとも７．０の、少なくとも７．５の、少なくとも８．０の、少なくとも８．５の、少なくとも９．０の、少なくとも９．５の、少なくとも１０．０、または以上の長さ対幅アスペクト比を企図する。企図されるナノ粒子の組成物において、ナノ粒子は、一つの実施形態において、同一のアスペクト比を有し、代替実施形態において、組成物中の少なくとも二つのナノ粒子が、異なるアスペクト比を有する。ナノ粒子の組成物は、また、平均で、本質的に同じアスペクト比を有することを特徴とする。この例で用いる「本質的に同じ」は、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％あるいは最高約５％の、アスペクト比の変動が受け入れられることを指す。さらに他の態様においては、ナノ粒子が、約１％と２００％の間、約１％と１５０％の間、約１％と１００％の間、約１％と約５０％の間、約５０％と２００％の間、約１００％と２００％の間、及び約１５０％と２００％の間のアスペクト比を有する、ナノ粒子の組成物が提供される。代替的に、組成物のナノ粒子は、Ｘ％からＹ％のアスペクト比を有する。この場合、Ｘが１から１００であり、Ｙが１００から２００である。
【００４７】
本開示は、また、複数のナノ粒子を提供する。開示により提供される複数の球状ナノ粒子を含む組成物においては、その複数のナノ粒子が、０．１ミクロンと０．５ミクロンの間、０．２ミクロンと０．４ミクロンの間、０．２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間の平均直径を有する。また、約０．１２ミクロン、約０．１３ミクロン、約０．１４ミクロン、約０．１５ミクロン、約０．１６ミクロン、約０．１７ミクロン、約０．１８ミクロン、約０．１９ミクロン、約０．２０ミクロン、約０．２１ミクロン、約０．２２ミクロン、約０．２３ミクロン、約０．２４ミクロン、約０．２５ミクロン、約０．２６ミクロン、約０．２７ミクロン、約０．２８ミクロン、約０．２９ミクロン、約０．３０ミクロン、約０．３１ミクロン、約０．３２ミクロン、約０．３３ミクロン、約０．３４ミクロン、約０．３５ミクロン、約０．３６ミクロン、約０．３７ミクロン、約０．３８ミクロン、約０．３９ミクロン、約０．４０ミクロン、約０．４１ミクロン、約０．４２ミクロン、約０．４３ミクロン、約０．４４ミクロン、約０．４５ミクロン、約０．４６ミクロン、約０．４７ミクロン、約０．４８ミクロン、約０．４９ミクロン、約０．５０ミクロン、約０．４１ミクロン、約０．５２ミクロン、約０．５３ミクロン、約０．５４ミクロン、約０．５５ミクロン、約０．５６ミクロン、約０．５７ミクロン、約０．５８ミクロン、約０．５９ミクロン、約０．６０ミクロン、約０．６１ミクロン、約０．６２ミクロン、約０．６３ミクロン、約０．６４ミクロン、約０．６５ミクロン、約０．６６ミクロン、約０．６７ミクロン、約０．６８ミクロン、約０．６９ミクロン、約０．７０ミクロン、約０．７１ミクロン、約０．７２ミクロン、約０．７３ミクロン、約０．７４ミクロン、約０．７５ミクロン、約０．７６ミクロン、約０．７７ミクロン、約０．７８ミクロン、約０．７９ミクロン、約０．８０ミクロン、約０．８１ミクロン、約０．８２ミクロン、約０．８３ミクロン、約０．８４ミクロン、約０．８５ミクロン、約０．８６ミクロン、約０．８７ミクロン、約０．８８ミクロン、約０．８９ミクロン、約０．９０ミクロン、約０．９１ミクロン、約０．９２ミクロン、約０．９３ミクロン、約０．９４ミクロン、約０．９５ミクロン、約０．９６ミクロン、約０．９７ミクロン、約０．９８ミクロン、約０．９９ミクロン、約１．０ミクロンまたはそれ以上の平均直径を有する。
【００４８】
種々の態様において、複数の球状ナノ粒子は、すべてのナノ粒子の７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、あるいは９９％を超える割合が、０．１ミクロンと０．５ミクロンの間、０．２ミクロンと０．４ミクロンの間、０．２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロンと０．３７５ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１３ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１４ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１５ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１６ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１７ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１８ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１９ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．２０ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．２１ミクロンと０．２２ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２１ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．２０ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１９ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１８ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１７ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１６ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１５ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１４ミクロンの間、０．１２ミクロンと０．１３ミクロンの間の直径を有する、また、０．０１ミクロンから１．０ミクロン、０．０５ミクロンから１．０ミクロン、０．０５ミクロンから０．９５ミクロン、０．０５ミクロンから０．９ミクロン、０．０５ミクロンから０．８５ミクロン、０．０５ミクロンから０．８ミクロン、０．０５ミクロンから０．７５ミクロン、０．０５ミクロンから０．７ミクロン、０．０５ミクロンから０．６５ミクロン、０．０５ミクロンから０．６ミクロン、０．０５ミクロンから０．５５ミクロン、０．０５ミクロンから０．５ミクロン、０．１ミクロンから１ミクロン、０．１５ミクロンから１．０ミクロン、０．２ミクロンから１ミクロン、０．２５ミクロンから１．０ミクロン、０．３ミクロンから１ミクロン、０．３５ミクロンから１．０ミクロン、０．４ミクロンから１ミクロン、０．４５ミクロンから１．０ミクロン、あるいは０．５ミクロンから１ミクロンの直径を有するということにおいて特徴づけられる。
【００４９】
本発明の組成物のナノ粒子は、約−３．０ｍＶから約３．０ｍＶのゼータ電位を有するナノ粒子のように、中立的にに帯電している。例えば、ナノ粒子は、−３．０ｍＶから約２．９ｍＶ、約−３．０ｍＶから約２．７ｍＶ、−３．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約２．３ｍＶ、約−３．０ｍＶから約２．０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約１．７ｍＶ、約−３．０ｍＶから約１．５ｍＶ、−３．０ｍＶから約１．３ｍＶ、約−３．０ｍＶから約１．０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．１ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−０．２５ｍＶ、約−３．０から約−０．５０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−０．７５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−１．０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−１．３ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−１．５ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−１．７ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−２．０ｍＶ、約−３．０ｍＶから約−２．３ｍＶ、−３．０ｍＶから約−２．７ｍＶ、−３．０ｍＶから約３ｍＶ、−２．５から約３．０ｍＶ、−２．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約−２．５ｍＶから約２．７ｍＶ、−２．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−２．５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約２．０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約１．７ｍＶ、約−２．５ｍＶから約１．５ｍＶ、−２．５ｍＶから約１．３ｍＶ、約−２．５ｍＶから約１．０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．１ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−０．２５ｍＶ、約−２．５から約−０．５０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−０．７５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−１．０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−１．３ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−１．５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−１．７ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−２．０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約−２．３ｍＶ、−２．０ｍＶから約３．０ｍＶ、−２．０ｍＶから約２．９ｍＶ、約−２．０ｍＶから約２．７ｍＶ、−２．０ｍＶから約２．０ｍＶ、約−２．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約２．０ｍＶ、約−２．０ｍＶから約１．７ｍＶ、約−２．０ｍＶから約１．５ｍＶ、−２．０ｍＶから約１．３ｍＶ、約−２．０ｍＶから約１．０ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．１ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約０ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−０．２５ｍＶ、約−２．０から約−０．５０ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−０．７５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−１．０ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−１．３ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−１．５ｍＶ、約−２．０ｍＶから約−１．７ｍＶ、約−１．５から約３．０ｍＶ、−１．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約−１．５ｍＶから約２．７ｍＶ、−１．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約２．０ｍＶ、約−１．５ｍＶから約１．７ｍＶ、約−１．５ｍＶから約１．５ｍＶ、−１．５ｍＶから約１．３ｍＶ、約−１．５ｍＶから約１．０ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０．５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０．１ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−２．５ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約０ｍＶ、約−１．５ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−１．５ｍＶから約−０．２５ｍＶ、約−１．５から約−０．５０ｍＶ、約−１．５ｍＶから約−０．７５ｍＶ、約−．５ｍＶから約−１．０ｍＶ、約−１．５ｍＶから約−１．３ｍＶ、−１．０から約３．０ｍＶ、−１．０ｍＶから約２．９ｍＶ、約−１．０ｍＶから約２．７ｍＶ、−１．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約２．０ｍＶ、約−１．０ｍＶから約１．７ｍＶ、約−１．０ｍＶから約１．５ｍＶ、−１．０ｍＶから約１．３ｍＶ、約−１．０ｍＶから約１．０ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．１ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約０ｍＶ、約−１．０ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約−０．２５ｍＶ、約−１．０から約−０．５０ｍＶ、約−１．０ｍＶから約−０．７５ｍＶ、約−１．０ｍＶから約−１．０ｍＶ、−０．５ｍＶから約３．０ｍＶ、−０．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約−０．５ｍＶから約２．７ｍＶ、−０．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約２．０ｍＶ、約−０．５ｍＶから約１．７ｍＶ、約−０．５ｍＶから約１．５ｍＶ、−０．５ｍＶから約１．３ｍＶ、約−０．５ｍＶから約１．０ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．７５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．２５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．１ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．０５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０．１２５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約０ｍＶ、約−０．５ｍＶから約−０．１２５ｍＶ、約−０．５ｍＶから約−０．２５ｍＶ、０ｍＶから約３．０ｍＶ、０ｍＶから約２．９ｍＶ、約０ｍＶから約２．７ｍＶ、０ｍＶから約２．５ｍＶ、約０ｍＶから約２．５ｍＶ、約０ｍＶから約２．０ｍＶ、約０ｍＶから約１．７ｍＶ、約０ｍＶから約１．５ｍＶ、０ｍＶから約１．３ｍＶ、約０ｍＶから約１．０ｍＶ、約０ｍＶから約０．７５ｍＶ、約０ｍＶから約０．５ｍＶ、約０ｍＶから約０．２５ｍＶ、約０ｍＶから約０．１ｍＶ、約０ｍＶから約０．０５ｍＶ、約０ｍＶから約０．１２５ｍＶ、０．２５ｍＶから約３．０ｍＶ、０．２５ｍＶから約２．９ｍＶ、約０．２５ｍＶから約２．７ｍＶ、０．２５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．２５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．２５ｍＶから約２．０ｍＶ、約０．２５ｍＶから約１．７ｍＶ、約０．２５ｍＶから約１．５ｍＶ、０．２５ｍＶから約１．３ｍＶ、約０．２５ｍＶから約１．０ｍＶ、約０．２５ｍＶから約０．７５ｍＶ、約０．２５ｍＶから約０．５ｍＶ、０．５ｍＶから約３．０ｍＶ、０．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約０．５ｍＶから約２．７ｍＶ、０．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．５ｍＶから約２．０ｍＶ、約０．５ｍＶから約１．７ｍＶ、約０．５ｍＶから約１．５ｍＶ、０．５ｍＶから約１．３ｍＶ、約０．５ｍＶから約１．０ｍＶ、約０．５ｍＶから約０．７５ｍＶ、０．７５ｍＶから約３．０ｍＶ、０．７５ｍＶから約２．９ｍＶ、約０．７５ｍＶから約２．７ｍＶ、０．７５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．７５ｍＶから約２．５ｍＶ、約０．７５ｍＶから約２．０ｍＶ、約０．７５ｍＶから約１．７ｍＶ、約０．７５ｍＶから約１．５ｍＶ、０．７５ｍＶから約１．３ｍＶ、約０．７５ｍＶから約１．０ｍＶ、１．０ｍＶから約３．０ｍＶ、１．０ｍＶから約２．９ｍＶ、約１．０ｍＶから約２．７ｍＶ、１．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．０ｍＶから約２．０ｍＶ、約１．０ｍＶから約１．７ｍＶ、約１．０ｍＶから約１．５ｍＶ、１．０ｍＶから約１．３ｍＶ、１．５ｍＶから約３．０ｍＶ、１．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約１．５ｍＶから約２．７ｍＶ、１．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．５ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．５ｍＶから約２．０ｍＶ、約１．５ｍＶから約１．７ｍＶ、１．７ｍＶから約３．０ｍＶ、１．７ｍＶから約２．９ｍＶ、約１．７ｍＶから約２．７ｍＶ、１．７ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．７ｍＶから約２．５ｍＶ、約１．７ｍＶから約２．０ｍＶ、２．０ｍＶから約３．０ｍＶ、２．０ｍＶから約２．９ｍＶ、約２．０ｍＶから約２．７ｍＶ、２．０ｍＶから約２．５ｍＶ、約２．０ｍＶから約２．５ｍＶ、２．５ｍＶから約３．０ｍＶ、２．５ｍＶから約２．９ｍＶ、約２．５ｍＶから約２．７ｍＶ、２．７ｍＶから約３．０ｍＶ、あるいは２．７ｍＶから約２．９ｍＶの範囲に及ぶゼータ電位を有する。
【００５０】
本開示は、さらに、本技術において周知で日常的に行われる微細加工プロセスを使用して形成される本質的にいかなる形状のナノ粒子をも提供する。微細加工法においては、ナノ粒子のサイズ及び形状は、予め設計される。
コア
【００５１】
上記のナノ粒子は、コアがポリマーとして提供される。種々の態様において、コアは、結晶性ポリマーである。本文中で用いる、また本技術分野で通じる「結晶性」は、規則的な三次元配列に分子が配置されることを意味する、と定義する。他の態様において、ポリマーは、すべての分子が規則的な三次元配列に配置されずに、結晶性領域とアモルファス領域との両方を含む半結晶である。種々の態様において、コアは、単一ポリマー、ブロック・コポリマーまたはトリブロック・コポリマーである。特定な態様において、コアは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ＰＬＬ、セルロース、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、デンドリマーに基づくポリマー、あるいはそれらの組合せを含む。
【００５２】
種々の態様において、コアは、生分解性または非生分解性であり、あるいは複数のナノ粒子であり、生分解性及び非生分解性コアの組合せを企図して調製される。種々の態様において、コアは、固体、多孔性、または中空である。複数のナノ粒子においては、固体、多孔性及び／または中空コアの混合物が含まれることを想定する。
【００５３】
本開示のいずれの態様のナノ粒子も、コアが、代替的に、金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト・クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、そして、ＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロースまたはデンドリマー構造からなる群から選択される物質であるものを含む。
【００５４】
ヒドロゲル・コアも提供される。一つの態様において、ヒドロゲル・コアは、高度の温度安定性を提供し、血管を傷つけにくく、また、非特異的血栓症を誘発しにくい。さらに、より大きなナノ粒子の形成も可能である。
水溶性ポリマー
【００５５】
本開示のナノ粒子は、水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐型ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、澱粉、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマル）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダム・コポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセリン）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸または他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストラン、及びそれらの組合せまたは混合物からなる群から選択される。本開示によって企図される複数のナノ粒子においては、各ナノ粒子が、種々の態様において、同じ水溶性ポリマーを有するよう、あるいは代替的に、各々が、それに付着される異なる水溶性ポリマーを有する複数の、少なくとも二つのナノ粒子からなるように企図される。
【００５６】
特定の態様において、開示のナノ粒子は、水溶性ポリマーがＰＥＧであるものである。この態様におけるナノ粒子について、ＰＥＧは、１００Ｄａと１０，０００Ｄａ、５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、１０００Ｄａと１０，０００Ｄａ、１５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、２０００Ｄａと１０，０００Ｄａ、２５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、３０００Ｄａと１０，０００Ｄａ、３５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、４０００Ｄａと１０，０００Ｄａ、４５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、５０００Ｄａと１０，０００Ｄａ、５５００Ｄａと１０，０００Ｄａ、１０００Ｄａと９５００Ｄａ、１０００Ｄａと９０００Ｄａ、１０００Ｄａと８５００Ｄａ、１０００Ｄａと８０００Ｄａ、１０００Ｄａと７５００Ｄａ、１０００Ｄａと７０００Ｄａ、１０００Ｄａと６５００Ｄａ、または１０００Ｄａと６０００Ｄａの間の平均分子量を有する。代替的に、ナノ粒子は、ＰＥＧが、約１００Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、４００Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３３５０Ｄａ、４０００Ｄａ、４６００Ｄａ、５，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａの平均分子量を有するものである。複数のナノ粒子においては、各ナノ粒子が、同じ分子量のＰＥＧ水溶性ポリマーに付着されることを企図する。または代替的に、複数の、少なくとも二つのナノ粒子の各々が、同じ分子量を持たないＰＥＧ水溶性ポリマーに付着される。
【００５７】
本開示のナノ粒子は、水溶性ポリマーが、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、またはそれ以上のモル比で、コアに付着されたものを含む。種々の態様においては、複数のものが、水溶性ポリマー対コアの比率が、その複数のもの内の各ナノ粒子に対して同一である。また、代替的態様においては、複数内の少なくとも二つのナノ粒子が、異なる水溶性ポリマー対コア比を有する。
【００５８】
ナノ粒子が水溶性ポリマーに結合する度合いは、種々の態様において、選択された投与経路によって決定される。
ペプチド
【００５９】
本開示のナノ粒子は、それに結合しているペプチドを有するという特徴がある。開示の種々の態様において、ペプチドは、線形または環状である。特定の実施形態において、ペプチドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号４）、ＧＲＧＤＮ（配列番号５）、ＧＲＧＤＮＰ（配列番号６）、ＧＧＧＧＲＧＤＳ（配列番号７）、ＧＲＧＤＫ（配列番号８）、ＧＲＧＤＴＰ（配列番号９）、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ（配列番号１０）、あるいはそれらの変異形からなる群から選択されるコア配列を含む。本文中で用いる変異形は、本文に定義するコア配列を有し、そのコア配列の一端または両端に、一つ以上の追加のアミノ酸残基が付着されるペプチド、本文に定義するコア配列を有するが、そのコア配列内の一つ以上のアミノ酸残基が代替アミノ酸残基で置換されるペプチドであって、その代替アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であるペプチド、本文に定義するコア配列を有するが、そのコア配列の一つ以上のアミノ酸残基またはそれらの組合せが削除されるペプチドである。この場合、アミノ酸残基の追加、アミノ酸の置換、アミノ酸の削除、あるいはこれら変更の組合せは、ナノ粒子の活性を本質的に変化させることはない。この態様で用いる「本質的に」は、本開示の他の箇所で説明した意味と同じである。
【００６０】
種々の態様において、ＲＧＤペプチドは、タンデム・リピート構成であり、この態様の実施形態においては、ＲＧＤペプチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のコピーを企図する。もう一つの態様においては、ＲＧＤペプチドの複数のコピーが、同じナノ粒子に付着されるが、ランダムな繰り返し構成ではない。
【００６１】
ナノ粒子が複数のＲＧＤペプチドに結合する種々の態様において、本開示は、ＲＧＤペプチドのすべてのコピーが同一であり、アスペクトも同一のナノ粒子、ならびにＲＧＤペプチドの二つが、異なる配列を有するナノ粒子を提供する。
【００６２】
企図する複数のナノ粒子においては、複数内の各ナノ粒子上で、ＲＧＤペプチド（またはＲＧＤペプチドの複数のコピー）が同一である実施形態が提供される。代替的態様においては、複数内の少なくとも二つのナノ粒子が、各々、一つ以上の特異なＲＧＤペプチドに結合される。
【００６３】
種々の態様においては、ナノ粒子のペプチドの数、すなわち、ペプチド密度は、血小板凝集に影響を及ぼす。
【００６４】
ポロキサマー
本発明のナノ粒子組成物は、安定剤であるポロキサマーを含む。ポロキサマーは、電荷的に中性なナノ粒子の凝集を減少させる、あるいは解消する。ポロキサマーは、中央に疎水性ブロック（ポリ（プロピレンオキサイド））及び両端に二つのＰＥＧ基を有する非イオン・トリブロック・コポリマーである。ポロキサマーは、本分野ではプルロニックとしても知られている。どのポロキサマーまたはプルロニックを、本発明の組成物に使用してもよい。
【００６５】
例えば、本発明は、そのポロキサマーが、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７及びコリフォアＰ１８８、プルロニック（登録商標）（商標）１０Ｒ５、プルロニック（登録商標）１７Ｒ２、プルロニック（登録商標）１７Ｒ、プルロニック（登録商標）２５Ｒ２、プルロニック（登録商標）２５Ｒ４、プルロニック（登録商標）３１Ｒ１、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８界面活性錠剤、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８ＮＦプリル・ポロキサマー３３８、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦ５００ＢＨＴプリル、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ＮＦプリル・ポロキサマー４０７、プルロニック（登録商標）Ｆ３８、プルロニック（登録商標）Ｆ３８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＬＦパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８ＮＦプリル・ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ７７ミクロパステル、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ８７ＮＦプリル・ポロキサマー２３７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、プルロニック（登録商標）Ｆ８８パステル、プルロニック（登録商標）Ｆ９８、プルロニック（登録商標）Ｌ１０、プルロニック（登録商標）Ｌ１０１、プルロニック（登録商標）Ｌ１２１、プルロニック（登録商標）Ｌ３１、プルロニック（登録商標）Ｌ３５、プルロニック（登録商標）Ｌ４３、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、ポロキサマー１２４、プルロニック（登録商標）Ｌ６１、プルロニック（登録商標）Ｌ６２、プルロニック（登録商標）Ｌ６２ＬＦ、プルロニック（登録商標）Ｌ６２Ｄ、プルロニック（登録商標）Ｌ６４、プルロニック（登録商標）Ｌ８１、プルロニック（登録商標）Ｌ９２、プルロニック（登録商標）Ｌ４４ＮＦ、プルロニック（登録商標）Ｎ３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０３、プルロニック（登録商標）Ｐ１０４、プルロニック（登録商標）Ｐ１０５、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３界面活性剤、プルロニック（登録商標）Ｐ６５、プルロニック（登録商標）Ｐ８４、及びプルロニック（登録商標）Ｐ８５からなる群から選択される組成物を提供する。
【００６６】
加えて、ポリマーが水溶性である限り、ＰＥＧを両端に、及びより高疎水性の基を中央に有する他のトリブロック・コポリマーを、組成物の安定剤として用いてもよい。例示的なトリブロック・コポリマーは、ＡＢＡ構造を有するポリマーを含む。この場合の実施例として、Ａは、ＰＥＧまたはＰＶＡ、あるいはもう一つの水溶性ポリマーであり、Ｂは、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリプロピレン、ポリ（プロピレンオキサイド）、ポリアミド、ポリスチレン、ポリブタジエンである。代替的に、トリブロック・コポリマーは、ＢがＰＥＧあるいは水溶性ポリマーであり、Ａが疎水性、すなわち水不溶性ポリマーであるＡＢＡ構造を有する。
【００６７】
本発明の組成物は、約０．１％のポロキサマー、約０．２％のポロキサマー、約０．３％のポロキサマー、約０．４％のポロキサマー、約０．５％のポロキサマー、約０．６％のポロキサマー、約０．７％のポロキサマー、約０．８％のポロキサマー、約０．９％のポロキサマー、約１％のポロキサマー、約２％のポロキサマー、約３％のポロキサマー、約４％のポロキサマー、約５％のポロキサマー、約６％のポロキサマー、約７％のポロキサマー、約８％のポロキサマー、約９％のポロキサマー、約１０％のポロキサマー、約１１％のポロキサマー、約１２％のポロキサマー、約１３％のポロキサマー、約１４％のポロキサマー、約１５％のポロキサマー、約１６％のポロキサマー、約１７％のポロキサマー、約１８％のポロキサマー、約１９％のポロキサマー、約２０％のポロキサマー、約２１％のポロキサマー、約２２％のポロキサマー、約２３％のポロキサマー、約２４％のポロキサマー、約２５％のポロキサマー、約２６％のポロキサマー、約２７％のポロキサマー、約２８％のポロキサマー、約２９％のポロキサマー、約３０％のポロキサマー、約３１％のポロキサマー、約３２％のポロキサマー、約３３％のポロキサマー、約３４％のポロキサマー、約３５％のポロキサマー、約３６％のポロキサマー、約３７％のポロキサマー、約３８％のポロキサマー、約３９％のポロキサマー、約４０％のポロキサマー、約４１％のポロキサマー、約４２％のポロキサマー、約４３％のポロキサマー、約４４％のポロキサマー、約４５％のポロキサマー、約４６％のポロキサマー、約４７％のポロキサマー、約４８％のポロキサマー、約４９％のポロキサマー、約５０％のポロキサマー、約５１％のポロキサマー、約５２％のポロキサマー、約５３％のポロキサマー、約５４％のポロキサマー、約５５％のポロキサマー、約５６％のポロキサマー、約５７％のポロキサマー、約５８％のポロキサマー、約５９％のポロキサマー、または約６０％のポロキサマーを含んでもよい。
【００６８】
本発明は、ポロキサマーが、組成物の約０．１％から約６０％で、または組成物の約０．１％から約５５％で、または組成物の約０．１％から約５０％で、または組成物の約０．１％から約４５％で、または組成物の約０．１％から約４０％で、または組成物の約０．１％から約３５％で、または組成物の約０．１％から約３０％で、または組成物の約０．１％から約２５％で、または組成物の約０．１％から約２０％で、または組成物の約０．１％から約１５％で、または組成物の約０．１％から約１２％で、または組成物の約０．１％から約１０％で、または組成物の約０．１％から約５％で、または組成物の約０．１％から約１％で、または組成物の約０．１％から約０．５％で、または組成物の約０．５％から約６０％で、または組成物の約０．５％から約５５％で、または組成物の約０．５％から約５０％で、または組成物の約０．５％から約４５％で、または組成物の約０．１％から約４０％で、または組成物の約０．５％から約３５％で、または組成物の約０．５％から約３０％で、または組成物の約０．５％から約２５％で、または組成物の約０．５％から約２０％で、または組成物の約０．５％から約１５％で、または組成物の約０．５％から約１２％で、または組成物の約０．５％から約１０％で、または組成物の約０．５％から約５％で、または組成物の約０．５％から約１％で、または組成物の約１％から約６０％で、または組成物の約１％から約５５％で、または組成物の約１％から約５０％で、または組成物の約１％から約４５％で、または組成物の約１％から約４０％で、または組成物の約１％から約３５％で、または組成物の約１％から約３０％で、または組成物の約１％から約２５％で、または組成物の約１％から約２０％で、または組成物の約１％から約１５％で、または組成物の約１％から約１２％で、または組成物の約１％から約１０％で、または組成物の約１％から約５％で、または組成物の約５％から約６０％で、または組成物の約５％から約５５％で、または組成物の約５％から約５０％で、または組成物の約５％から約４５％で、または組成物の約５％から約４０％で、または組成物の約５％から約３５％で、または組成物の約５％から約３０％で、または組成物の約５％から約２５％で、または組成物の約５％から約２０％で、または組成物の約５％から約１５％で、または組成物の約５％から約１２％で、または組成物の約５％から約１０％で、または約１０％から約６０％で、または組成物の約１０％から約５０％で、または組成物の約１０％から約４５％で、または組成物の約１０％から約４０％で、または組成物の約１０％から約３５％で、または組成物の約１０％から約３０％で、または組成物の約１０％から約２５％で、または組成物の約１０％から約２０％で、または組成物の約１０％から約１５％で、または組成物の約１０％から約１２％で、または組成物の約２０％から約６０％で、または組成物の約２０％から約５０％で、または組成物の約２０％から約４５％で、または組成物の約２０％から約４０％で、または組成物の約２０％から約３５％で、または組成物の約２０％から約３０％で、または組成物の約２０％から約２５％で、または約３０％から約６０％で、または組成物の約３０％から約５０％で、または組成物の約３０％から約４５％で、または組成物の約３０％から約４０％で、または組成物の約３０％から約３５％で、または約４０％から約６０％で、または組成物の約４０％から約５０％で、または組成物の約４０％から約４５％で、または約４５％から約６０％で、または組成物の約４５％から約５０％で、または組成物の約５０％から約６０％で存在する組成物を提供する。
【００６９】
本発明は、ポロキサマーが、最大でナノ粒子質量の５０倍、または最大でナノ粒子質量の４０倍、または最大でナノ粒子質量の３５倍、または最大でナノ粒子質量の３０倍、または最大でナノ粒子質量の２５倍、または最大でナノ粒子質量の２０倍、または最大でナノ粒子質量の１５倍、または最大でナノ粒子質量の１０倍、または最大でナノ粒子質量の９倍、または最大でナノ粒子質量の８倍、または最大でナノ粒子質量の７倍、または最大でナノ粒子質量の６倍、または最大でナノ粒子質量の５倍で存在する組成物を提供する。
【００７０】
組成物に負の電荷を与えない他の安定剤を、本発明の組成物に使用してもよい。例えば、ポリ（アクリル酸）、ポロキサマー１８８またはＰＥＧ等のポロキサマーである。
【００７１】
ナノ粒子に付随する他の化合物
また、開示のナノ粒子は、さらに治療化合物を含むことが企図される。種々の態様において、治療化合物は、疎水性である。さらに他の態様において、治療化合物は、親水性である。開示のナノ粒子は、治療化合物が、共有結合によってナノ粒子に付着され、非共有結合的にナノ粒子に結合され、静電的相互作用を介してナノ粒子に結合され、あるいは疎水性相互作用を介してナノ粒子に結合されて提供される。種々の実施形態において、治療化合物は、増殖因子、サイトカイン、ステロイドまたは小分子である。複数の治療化合物がナノ粒子に結合される実施形態が企図される。この態様においては、ナノ粒子に結合された治療化合物の各々は同じ、あるいはナノ粒子に結合された治療化合物の各々は異なる。開示により提供される複数のナノ粒子においては、その複数内の各ナノ粒子は、同じ治療化合物または同じ複数の治療化合物に結合される。あるいは代替的に、その複数内の少なくとも二つのナノ粒子の各々が、一つ以上の異なる治療化合物に結合される。
【００７２】
種々の態様において、治療化合物は、抗癌化合物であり、特定の実施形態において、治療化合物は、以下のものからなる群から選択される。限定せずに、メクロレタミン等のナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルを含むアルキル化剤。限定せずに、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（メチルーＣＣＮＵ）等のニトロソウレア。トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチルエン、チオリンアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン。限定せずに、ブスルファン等のアルキルスルホネート。ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等のトリアジン。メトトレキサート及びトリメトレキサート等の葉酸類似物を含むアンチメタボライト。限定せずに、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（アラック、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデキシシチジン等のピリミジン類似物。限定せずに、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンホスフェート及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）等のプリン類似物。限定せずに、パクリタキセル等の細胞分裂阻害剤を含む天然生成物。限定せずに、ビンブラスチン（ＶＬＢ）ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソテール、エストラムスチン及びリン酸エストラムスチンを含むビンカアルカロイド。限定せずに、エトポシド及びテニポシド等のエピポドフィロトキシン。限定せずに、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシン等の抗生物質。限定せずに、エルアスパラギナーゼ等の酵素。限定せずに、インターフェロンα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等の生体応答調節剤。限定せずに、シスプラチン及びカルボプラチン等のプラチナ配位化合物を含む種々雑多な薬剤。限定せずに、ミトキサントロン等のアントラセンジオン。限定せずに、ヒドロキシウレア等の置換尿素。限定せずに、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体。限定せずに、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤。限定せずに、プレドニソン及び相当物などの副腎皮質ステロイド拮抗剤、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及び拮抗剤。限定せずに、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロンアセテート及びメゲストロールアセテート等のプロゲスチン。限定せずに、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール相当物などのエストロゲン。限定せずに、タモキシフェン等の抗エストロゲン剤。テストステロンプロピオネート及びフルオキシメステロン／相当物を含むアンドロゲン。限定せずに、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似物及びロイプロリド等の抗アンドロゲン物質。限定せずに、フルタミ���等の非ステロイド性抗アンドロゲン剤。葉酸阻害剤。限定せずに、ＡＧ１４７８及び放射線増感化合物等のチロシンキナーゼ阻害剤。
【００７３】
種々の態様において、治療化合物は、ＡＧ１４７８、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン、ビスナフィド・ジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ブレキナル、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルマスティン、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトール・メシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニン・メシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロキシウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（ＩＬ−２、組換インターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンγーＩｂ、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レトロゾール、ロイプロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサート、メトプリン、メタウレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトジリン、マイトマルシン、マイトマイシン、ニトスパー、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ネララビン、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルムナプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、タモキシフェン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トレルニフェン、トレストロン、トリシリビン、トリエチレンメラミン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシル・マスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルリン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシナート、ビンロイロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾレドロネート及びゾルビシンからなる群から選択される。これらの、及び他の抗新生物性治療薬は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ&Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１０ｔｈｅｄ．，２００１に説明されている。
【００７４】
種々の態様において、治療化合物は、グルココルチコイド、カリクレイン阻害剤、コルチコステロイド（例えば限定せずに、プレドニソン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンまたはトリアムシノロンアセトニド）、（限定せずに、非コルチコステロイド抗炎症化合物（例えば限定せずに、イブプロフェンまたはフルルビプロフェン）等の）抗炎症剤、ビタミン及びミネラル（例えば限定せずに、亜鉛）、抗酸化剤（例えば、（限定せずに、ゼアキサンチンまたはルテインのようなキサントフィルカロチノイド等の）カロチノイド）、及び、限定せずに、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、セルトリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））及びエタナーセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を阻止する薬剤からなる群から選択される抗炎症薬である。
【００７５】
種々の態様において、治療化合物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦy、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、メグ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子及びエリスロポイエチンである。ここで使用可能な追加の増殖因子は、アンギオゲニン、骨形成タンパク質−１、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−３、骨形成タンパク質−４、骨形成タンパク質−５、骨形成タンパク質−６、骨形成タンパク質−７、骨形成タンパク質−８、骨形成タンパク質−９、骨形成タンパク質−１０、骨形成タンパク質−１１、骨形成タンパク質−１２、骨形成タンパク質−１３、骨形成タンパク質−１４、骨形成タンパク質−１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体y、サイトカイン誘導性好中球化学走性因子１、サイトカイン誘導性好中球、化学走性因子２、サイトカイン誘導性好中球化学走性因子２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引剤、グリア細胞系由来ニュートロフィックファクター受容体１、グリア細胞系由来ニュートロフィックファクター受容体２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インシュリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチン細胞増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、形質転換増殖因子、形質転換増殖因子、形質転換増殖因子、形質転換増殖因子２、形質転換増殖因子γ、形質転換増殖因子β、潜在型形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体型Ｉ、腫瘍壊死因子受容体型ＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター受容体、細胞内シグマペプチド（ＩＳＰ）及びキメラタンパク質と、それらの生物学的に、あるいは免疫学的に活性なフラグメントを含む。
【００７６】
また、限定せずに例えば、プラビックス、アスピリン、ワルファリン、ヘパリン、チクロピジン、エノキサパリン、クマジン、ジクマロール、アセノクマロール、クエン酸、レピルジン、それらの組合せを含む抗凝血薬剤と一緒に使用する方法が提供される。
【００７７】
この態様における方法は、これらの抗凝固薬の影響を克服するもので、手術では非常に役に立つであろう。
【００７８】
医薬組成物
本開示は、開示のナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。種々の態様において、医薬組成物は、単位用量製剤である。種々の態様において、医薬組成物は、静脈内投与製剤である。種々の態様において、医薬組成物は、凍結乾燥される、あるいは粉末である。種々の態様において、医薬組成物は、さらに、ポリアクリル酸、ポロキサマー１８８またはＰＥＧを含む。
【００７９】
本発明の組成物は、静脈内投与のために調製されてもよい。組成物は、静脈内に注入または注射を介して、カテーテル、中央ライン、トンネル・ラインを通してあるいは埋込ポートを通して送達されてもよい。
【００８０】
種々の態様においては、局所製剤が提供される。この場合、内用及び外用のものが提供される。局所投与のための医薬組成物は、任意に担体を含み、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤として調製される。基剤は、例えば任意に、以下の一つ以上のものを含む。ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水及びアルコール等の希釈液、乳化剤及び安定剤。局所投与のための医薬組成物内には、任意に増粘剤が存在する。ある特定の態様において、製剤は、溶媒を含む。溶媒は、限定せずに例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）または類似化合物を含む。
【００８１】
本発明の組成物は、スプレー系を用いる投与のために調製されてもよい。一つの例示的なスプレー系では、組成物内のナノ粒子は、水等の担体中に懸濁または溶解されてもよいし、されなくてもよい。もう一つのスプレー系では、組成物内のナノ粒子が、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の、水混和性を有するものに、種々の比率で懸濁または溶解される。組成物は、それから、損傷部位の内部または外部へ、スプレー系、ブラシ系または注射器タイプ系を用いて直接投与される。スプレー系は、湿性または乾性エアロゾル・スプレー、あるいは湿性または乾性静電スプレーでもよい。代替的に、これらの組成物は、内視鏡、あるいは他の腹腔鏡機器を用いて、損傷へ導入されてもよい。
【００８２】
他の態様において、組成物は、経口、皮下、筋肉内、経皮、経頬側、非経口、あるいは舌下経路に対して調製されてもよい。
【００８３】
本開示は、１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから９００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから８００ｍ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから７００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから６００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから４００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから７５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇから９００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇから８００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇから７００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇから６００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上でナノ粒子を送達するよう調製された医薬組成物を提供する。
【００８４】
単一用量投与及び複数用量投与が提供される。複数用量投与は、最初の投与後の、数分、数時間、数日、数週または数ヶ月内に、第二の用量が投与されるものを含む。
組成物の使用
【００８５】
治療が必要な患者へ、開示のナノ粒子を、病状を治療するのに効果的な量で投与するステップを含む、個人における病状の治療方法が提供される。種々の態様において、個人は、出血障害を有する。無投与または食塩水の投与に比較して、ナノ粒子が、出血時間を１５％超、２０％超、２５％超、あるいは３０％超減少させるのに効果的な量で投与される方法が提供される。種々の態様において、方法は、出血障害が、凝固障害、後天性血小板機能異常、先天性血小板機能異常、先天性プロテインＣまたはＳ欠乏症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、第ＩＩ因子欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、血友病Ｂ、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、フォンビルブラント病（タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）、巨核球／血小板欠乏症である症状に対して使用される。種々の態様において、病状は、化学療法及び種々の薬剤による他の治療、放射線療法、手術、事故による血液損失、及び他の特定疾患の病状から生じる血小板減少症であり、これに対して方法が提供される。種々の態様において、病状は、無形成性貧血、乳癌転移性腫瘍に関連して血小板減少症で至る原因不明の血小板減少性紫斑病を含む原因不明の、あるいは免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、新生児ループス症候群、血小板減少症で至る転移性腫瘍を含む全身性エリテマトーデス、脾腫、ファンコニ症候群、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、メイ・ヘグリン異常、ウィスコット・アルドリッチ症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ＨＩＶ関連ＩＴＰ及びＨＩＶ関連血栓性血小板減少性紫斑病、慢性肝疾患、血小板減少症関連骨髄異形成症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｃ７Ｅ３Ｆａｂ（アブシキシマブ）治療後の急性重症血小板減少症、母体同種免疫血小板減少症を含む同種免疫血小板減少症、抗リン脂質抗体及び血栓症に関連する血小板減少症、自己免疫血小板減少症、カルボプラチン誘発血小板減少症及びヘパリン誘発血小板減少症を含む薬物誘発性免疫性血小板減少症、胎児血小板減少症、妊娠血小板減少症、ヒューズ症候群、ルポイド血小板減少症、偶発的及び／または大量血液損失、骨髄増殖性疾患、悪性腫瘍患者の血小板減少症、癌患者の血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症症候群として現れる血栓性微小血管障害を含む血栓性血小板減少紫斑病、自己免疫溶血性貧血、潜在性空腸分岐腸パーフォレーション、赤芽球癆、自己免疫血小板減少症、流行性腎症、リファンピシン関連急性腎不全、パリ・トルーソー血小板減少症、新生児同種免疫血小板減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、胃癌における血液学的変化、幼児期溶血性尿毒症症候群、Ａ型肝炎ウイルス等のウィルス感染関連血液学的徴候及びＣＭＶ関連血小板減少症であり、これらに対して治療方法が提供される。種々の態様において、病状は、血小板減少症に至るＡＩＤＳ治療から生じるもので、これに対して治療方法が提供される。種々の態様において、ＡＩＤＳの治療は、ＡＺＴの投与である。
【００８６】
種々の態様においては、治療を受ける個人は、創傷治癒疾患、外傷、爆傷、脊髄損傷、出血性卒中、ＴＰＡ投与後の大量出血、あるいは多くの病状で発症するが、早産で特に急性な心室内大量出血を患っている。
ブタ肝臓外傷モデル
【００８７】
静脈内止血剤の臨床への移行は、物質合成の規模を拡大することと、より大型の種で安全性及び有効性の治験を行うことの両方を必要とする。分子レベルでは、止血は一貫しているように見えるが、血流動態及び血液凝固パラメータにおいては、齧歯動物からヒトへと完全に維持することが不可能な有意差が存在する（Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１００：３９７−４０４（２００８））。血管外傷（大腿血管）（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄ．Ｄｅｐａｒｔ．Ｊ．３６−３９（２０１２），Ｇｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄ．Ｄｅｐａｒｔ．Ｊ．３１−３５（２０１２））、固形臓器損傷（肝臓、脾臓）（Ｖｅｌｍａｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｓｕｒｇ．７４：２９７−３０１（２００８），Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ，５７：７２６−３８（２００４））、胸部外傷（肺）（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．４０：２３７６−８４（２０１２））、及び多外傷（固形器官／大腿）に対して、ブタ出血損傷モデルが開発されている。血流動態性及びサイズがヒトに比較的よく類似しているため、１８から２０頭のブタが、しばしば、止血不能出血の前臨床モデルとして用いられる（Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１００：３９７−４０４（２００８）。
【００８８】
潜在的療法の生理的影響を調べる際、ブタは、止血不能出血性外傷の標準モデルである。心血管系がヒトのパラメータによく相関しており、また、サイズも類似しているので、臨床及び研究環境の両方に、修正なしでそのまま装置が使用可能である。さらに、ブタ及びヒトの皮膚が類似していることから、創傷治癒プロセスもヒトに類似しているようである。
【００８９】
静脈内止血剤の使用は、試験管内及び生体内（ネズミ）の両方で出血時間を減少させること、また、ネズミにおける致命的な肝臓外傷後の生存率を有意に上昇させることを示している（Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．１：１１ｒａ２２（２００９））。小さな動物及び大きな動物間での血流動態の違いに対処するため、大きな動物、ブタの出血モデルにおける止血性ナノ粒子の効力が研究された。実施例１において、血液損失を減少させるための、及び固形臓器損傷後の生存率を上昇させるための、静脈内止血性ナノ粒子の使用を試験した。
【００９０】
ナノ粒子の投与は、ブタがなりやすいようである最近研究され始めた疑似アレルギー、ＣＡＲＰＡを誘発する可能性があることが分かった。
【００９１】
無傷のブタ・モデルの実験では、電荷的に中性な粒子（＋ＰＡＡ）の注入それ自体が反応を誘発することはなかったので、賦形剤ポリ（アクリル酸）単独では、ＣＡＲＰＡ反応を発生させることはないことが分かった。しかし、実験のブタは、ＰＡＡを有する粒子に対しては、より重篤な反応を示した。ＰＡＡが、重症度を増加させる直接的役割を果たしている可能性はあるが、また、既に高められていた活性補体系によって反応が増強された可能性もある。それでも、ＰＡＡへの無症状反応の可能性は存在する。
【００９２】
Ｓｚｅｂｅｎｉらは、ゼータ電位が、静脈内ナノ粒子系によって誘発されるＣＡＲＰＡに対する一つの潜在的メディエータである、と仮定している（Ｓｚｅｂｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：１７６−８４（２０１２））。メカニズムは現在完全には理解されていないが、Ｓｚｅｂｅｎｉらが提示した結果、及び中性粒子の研究は、両方とも、電荷的に中性なナノ粒子が、ブタにおけるＣＡＲＰＡの発症を緩和する可能性を示唆している。このメカニズムを説明するためには、ＣＡＲＰＡを最小にするパラメータを識別できるよう、さらに研究が必要である。
【００９３】
ＣＡＲＰＡのメカニズムと、それの凝固カスケードに対する関係は、まだ詳細には説明されていない。しかし、血液に接触する生体適合物質が、補体活性化を誘発する潜在能力を有するということが以前に示されている。補体活性化は、ＦＸＩＩ活性化、及びそれのフラグメント（因子ＸＩ１）によって媒介される。帯電性、すなわち親水性物質は、タンパク質を吸着する傾向があり、ＦＸＩＩフラグメント及びカリクレインを生成する（これにより、強い血管拡張因子であるブラジキニン形成を引き起こす）。
【００９４】
ＣＡＲＰＡが、本当に、帯電ナノ粒子面への吸着による第ＸＩＩ因子活性化によって媒介されるのなら、それのフラグメントは、プラスミノーゲンを活性化することによって、凝血異常を誘発し、ブラジキニン（またはヒスタミン）血管拡張により、さらに追加の出血を引き起こす可能性が高い。凝固時間及びＡＰＴＴアッセイでは、長期の凝血異常は観察されていないが、この凝血異常は一時的なものであり、損傷と同時に発生したときにのみ、破滅的である可能性がある。
ＣＡＲＰＡ反応の緩和
【００９５】
ＣＡＲＰＡによって誘発されたアナフィラキシーを後退させるために、ジフェンヒドラミン、フェニルエフリン、エピネフリン及びステロイドを、一緒に用いてもよい（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１００：２６８５−９２（２０１１））。残念なことに、外傷中に投与すべき静脈内止血剤の適用に対しては、可能ならば、追加の医薬との共投与は回避すべきである。
【００９６】
ＣＡＲＰＡ発症を防ぐための一つの可能な方法は、ゆっくりと（または複数の小用量で）ナノ粒子を注入することである（タキフィラキシー）（Ｓｚｅｂｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：１７６−８４（２０１２））。これは、ＣＡＲＰＡ発症を阻止して、症状の重症度をも減少させるように見えた。それは、除感作メカニズムに依存する。しかし、現在の治療は、出血性損傷に対しては迅速な投与を基本としているので、タキフィラキシーは実行可能な選択肢とは思えない。
【００９７】
ＣＡＲＰＡを阻止するために最も実行可能な選択肢は、標的ナノ粒子のゼータ電位を中性近くに調整することのように思える。ＧＲＧＤＳ（配列番号２）標的リガンドは、Ａｒｇ（＋）、Ａｓｐ（−）及びカルボン酸末端（−）が存在するために、本質的に負に荷電する。この研究に関する一つの可能性のある緩和策は、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）標的ペプチドを電荷的に中性なもの、例えば、活性化血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するより高度な特異性と正味の中性電荷との両方を備える環状ＲＧＤ等で置換することである。
【００９８】
本文で説明の実験は、ナノ粒子投与によって誘発されるＣＡＲＰＡが、大規模な出血性損傷中に投与された場合、大量出血を生じることを示す。凝血異常は、（心肺機能障害を特徴とする）ＣＡＲＰＡエピソードが通過した後でさえも、まだ存在している可能性がある。しかし、この反応は、一時的なものであり、静脈内止血性ナノ粒子のパラメータを調整することによって、具体的には、それらの電荷（ゼータ電位）を中性にすることによって、調整できる。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ナノ粒子合成
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アームを結合させてポリ（ラクティック−コ−グリコール酸）−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ）ブロック・コポリマーから、ナノ粒子を合成した。本文で説明するナノ沈殿法を用いて、球状ナノ粒子を製造した。デキサメタゾンを溶媒中に溶解し、適切な量のポリマーも溶解し、薬剤と混合した。薬剤／ポリマー溶液は、回転する１ｘＰＢＳ内へ、ピペットで滴下させた。結果として得た溶液を、約２０分間室温で、蓋をせずに撹拌した。撹拌ナノ球が堅くなってから、凝集を誘発するために、ｐＨを３．０から２．７の範囲に調整した。このｐＨ範囲は、凝集を生じさせるのに有用であると発見された。ナノ球は、遠心分離（５００ｇ、３分、３ｘ）によって精製し、脱イオン水中に再懸濁させ、凍結乾燥器で凍結させて凍結乾燥した。１ｍｌの１ｘＰＢＳへ１０ｍｇのナノ球を溶解させることによって、放出試験を実行した。３回繰り返した。
【０１００】
ナノ球のサイズは、動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。サイズ及び形態構造のコンフォメーションは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した。薬剤の量は、ＤＭＳＯ内に球を溶解して、ＵＶ−可視光で測定することによって決定した。時間経過と共にナノ粒子からデキサメタゾンがどのように溶出するのかを調査するために、放出試験データを種々の時点で収集し、ＵＶ−可視光で測定した。
実施例２
ナノ粒子へのペプチドの付着
【０１０１】
中間処理ステップに必要な最短時間を決定することによって、生成物形成に対する時間が大幅に減少した。沈降後のＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧの採集に遠心分離を用いることにより、収量が大幅に増加する。収量は、ナノ沈降ナノ粒子形成法でも大幅に増加する。ナノ粒子収集のためにポリ（アクリル酸）コアセルベート沈降技術を使用するならば、さらに収量が増加する。
【０１０２】
一旦ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧが合成されたら、ポリマーにＧＲＧＤＳ（配列番号２）等の活性ペプチドを結合させる必要がある。
【０１０３】
クワド・ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ペプチド）が使用した場合、球の産出高は非常に低かった。ペプチドがポリマーで最も高価な部分であったため、まず、トリブロック（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ）から球を形成し、それから、球体へペプチドを付着させる方法を用いた。
【０１０４】
トリブロック・ナノ粒子へのペプチドの結合は、約５０％の結合効率に至った（リシンに対するアルギニンの比率として計算）。
【０１０５】
しかし、アミノ酸分析前のナノ球に対する余分なリンス・ステップは、深刻なペプチド損失につながり、１１％の結合効率に至ることが分かった。１ｇバッチのナノ球に対して、反応規模を拡大すると、結合効率は、本質的に０％へ降下した。したがって、クワドブロック・ポリマー全体を形成可能な方法であって、少なくとも同様な産出高で、厳重な粒度分布を有するナノ粒子を生成可能な方法を追求した。
【０１０６】
このアプローチは、ナノ粒子形成前にクワドブロック・ポリマーの製造に至った。クワドブロック結合効率は、約８０％であったが、ポリ（アクリル酸）の有無に関係なくナノ沈降技術を用いるナノ球形成後には、１３％へ降下した。最後に、ペプチドを付着させる直前にＤＭＳＯ中でＣＤＩによりポリマーを再活性化させることによってクワドブロックを形成した。このステップは、ペプチドの結合を、５０％以上へ増加させる（ｎ＝３）。
エマルジョン法
【０１０７】
エマルジョン法は、３２６から３６１ｎｍの直径範囲にある球を形成することを達成する。
【０１０８】
エマルジョン法は、脱イオン水中の５０ｍｌの５％ＰＶＡ内で、ナノ球を撹拌硬化させる。この方法を用いるナノ球生成の規模を拡大するには、撹拌硬化のために大量の溶液を必要とする。この観察は、先行方法では粒子形成後の結合ステップ中にペプチドを加えたという事実を加味すると、大量の溶液が相当な結合効率を達成するためには非常に大量のペプチドが必要であることを意味する。
【０１０９】
規模を縮小したナノ沈降法では、１０ｍｌのＰＢＳ内での撹拌硬化を、ペプチドの結合と同時に行った。このステップは、十分な量のペプチドを付加する。ナノ沈降法も、クワドブロック・ポリマーでのナノ粒子形成に使用でき、製造後の結合反応の必要を省く。
【０１１０】
ナノ粒子に関しては、多数の基本的な特定された問題が存在する。例えば、粒子の均一性、粒子の凝集、ナノ粒子の再懸濁の困難性、及び凍結乾燥後の再懸濁の困難性がある。
【０１１１】
これらの難問を扱うために、複数のグループが、いつかのアプローチを考案した。例えば、凍結乾燥後の小さなナノ粒子を再懸濁するために、凍結乾燥保護剤を利用できる。（Ｓａｕａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ３８：１８５（１９９５），Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ５４：Ｓ１３（２００３））。他の研究者は、粒子を凝集させるための、ポリ（アクリル酸）の使用と合わせたナノ沈降技術によって、冷凍乾燥保護剤を溶液へ加える必要性が回避できたことを発見している。
ナノ沈降
【０１１２】
ナノ沈降法は、一貫したサイズの球を形成するために、アセトニトリル等の水混和性溶媒中に溶解させたポリマーの滴状添加を利用する（Ｒｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ  １１０：７１（１９９７）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ９：４５７（２０００）；Ｂｌａｊｃｈｍａｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１７（１９９９）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１４：４９６（２００１））。
ポリ（アクリル酸）コアセルベート沈降
【０１１３】
この方法は、（Ｒｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆ．ＣｅｌｌｓＢｌｏｏｄＳｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：５３７（２００６））を修正したもので、ナノ粒子の収量を増加させるために、また、先に観察されたような、遠心分離及び凍結乾燥ステップ中の球体凝集を減少させるために利用した。この沈降は、５００ｇ未満の穏やかな遠心分離を許容する。
【０１１４】
サイズ再現性は、いまのところ、エマルジョン及びナノ沈降単独での方法に優る利点が示されており、これは、均質な粒度分布を得るのに音波処理状態に大いに依存している。ＳＥＭ画像は、ナノ粒子の形態構造とサイズの均一性を示す。ヒストグラム挿入図は、ナノ粒子直径の１００回の測定値から作成したもので、粒度分布が、２３６．１ｎｍ＋／−５６．６ｎｍに集中することを示している。
ＰＡＡ被覆ナノ沈降合成血小板の形成方法
【０１１５】
ＰＬＧＡ（レゾマー５０３Ｈ）は、Ｅｖｏｎｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入した。ポリ−ｌ−リシン及びＰＥＧ（約４６００ＤａＭＷ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。すべての試薬はＡＣＳグレードで、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧコブロック・ポリマーは、標準バイオ結合技術を用いて、以前の説明のように形成した（Ｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ）。
クワドブロック結合
【０１１６】
ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧを、無水ＤＭＳＯ中に、１００ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。ＰＥＧ基を再活性化するために２モル当量のＣＤＩを加え、１時間撹拌した。２５ｍｇのオリゴペプチド（ＧＲＧＤＳ（配列番号２）またはＧＲＡＤＳＰ（配列番号３））を１ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させて、撹拌中のポリマー溶液へ加えた。この混合液を３時間反応させてから、透析管（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ２ｋＤａＭＷＣＯ）へ移した。透析水は、タイプＩ脱イオン水で、４時間に渡って３０分毎に変えた。それから、生成物を液体窒素で瞬間凍結させ、２日間凍結乾燥させた。
ナノ沈降
【０１１７】
それから、その結果として生じたクワドブロック・コポリマーＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳ（配列番号１１）を、２０ｍｇ／ｍｌの濃度のアセトニトリルへ溶解させた。この溶液を、撹拌中のＰＢＳへ滴下させた。一般的なルールとしては、アセトニトリルの２倍の量のＰＢＳを用いることである。水混和性溶媒が消散するにつれ、沈降ナノ粒子が形成された。しかし、３００ｍｇの出発クワドブロック量を超える規模へ拡大する上で、沈降体積をアセトニトリルで処理することが、自然発生的な凝集体の形成を減少させることを発見した。沈降体積の終濃度が、ＰＢＳ：アセトニトリルで２：１になるよう、溶媒：水の比率を沈降プロセスに渡って調節した。それから、粒子を３時間撹拌硬化させた。それから、粒子を、１５０００ｇの遠心分離を用いて採集し、ＰＢＳで３回すすいだ。代替的に、粒子は、コアセルベート沈殿法を用いても採集した。
コアセルベート沈降
【０１１８】
乾性ポリ（アクリル酸）の１質量当量を、撹拌中の粒子懸濁液へ加えた。それから、凝集が発生するまで、１％ｗ／ｖのｐＡＡを撹拌中の懸濁液に加えた。ｐＡＡの各添加後、凝集を観察するために一時的に撹拌を中断した。５分後、凝集粒子を５００ｇでの遠心分離によって採集し、３回、１％のｐＡＡですすいだ（遠心分離＠５００ｇ、２ｍ、すすぎの間４Ｃ）。最終すすぎの後、粒子を脱イオン水で再懸濁し、瞬間凍結させ、水の最終体積に応じて、２から５日間凍結乾燥させた。
再懸濁
【０１１９】
粒子を集め、２０ｍｇ／ｍｌの濃度の１ｘＰＢＳで再懸濁した。粒子を、ボルテックスして再懸濁、あるいは代替的に、ボルテックスし、プローブ・ソニケーター（ＶＣＸ−１３０、ソニックス  ＆  マテリアルズ社）を用いて、全エネルギーが５０Ｊになるよう短時間４Ｗで超音波処理した。
実施例３
大腿動脈損傷モデルにおける生体内テスト
【０１２０】
予備の研究においては、大腿動脈損傷モデルを使用した。それは、出血に対する治療の影響に関しての単純な評価を可能にする非常に清浄なモデルである。雄のスプラーグ・ドーリー・ラットに、イソフルランで麻酔をかけた。動物の体温は、加熱パッドを用いて維持し、実験中、温度プローブを用いて監視した。血圧を測定することと採血のために動脈カテーテルを使用し、テストすべき薬剤の投与には、静脈カテーテルを使用した。腹腔を切開して、上大静脈から、肝臓の中葉を鋭く１．３ｃｍ切る。腔はすぐに閉じ、実験薬剤を送達した。
【０１２１】
血液試料は、損傷の直前に、損傷後５分に、及び損傷後３０分に採集した。動物は、６０分間、あるいは死ぬまで保持した。６０分の終わりに、血液損失を測定するために、予め計量したスポンジを用いて腹腔内の血液を採集した。組織学的な調査、及びナノ粒子生体分布の調査のために、すべての主要な器官を採集した。
【０１２２】
本発明のナノ粒子は、カニューレを挿入した大腿静脈内へ、損傷の直後に、５分の平衡化を挟む３分の注入による０．５ｍｌの注入量（２０ｍｇ．ｍｌ）で、静注投与した。投与ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＬＬナノ球コア（〜２００ｎｍ）、複数の４６００ｋＤのＰＥＧアーム、及びＰＥＧアームに接合された以下のＲＧＤペプチドの一つを有した。ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）及びＧＲＧＤＳ（配列番号２）。
【０１２３】
これらのナノ粒子による出血時間に対する効果を、食塩水対照、組み換え型因子ＶＩＩａ、及びＰＥＧのみを含むナノ粒子に対して比較した。ＲＧＤペプチドを含むナノ粒子のすべてが、出血時間を大幅に減少させた。ナノ粒子は、損傷の直前に（図２Ａを参照）、あるいは損傷後に（図２Ｂを参照）投与された。損傷後の投与の場合、４６００−ＧＲＧＤＳ（配列番号１２）ペプチドを含むナノ粒子は、ＰＥＧ（ＰＥＧ４６００）のみを含むナノ粒子に比較して、出血時間％をより大幅に減少させた（図２Ｂを参照）。
【０１２４】
実施例２
肝臓切除モデル
ブタ肝臓外傷モデル
動物プロトコルは、Ｇｕｒｎｅｙら１６に基づいて開発され、マサチューセッツ総合病院の外傷リサーチ実験室と協同して適応され、ケース・ウエスタン・リザーブ大学ＩＡＣＵＣで承認された。肝臓損傷試験の目標は、ナノ粒子治療の安全かつ有効な服用レベルを決定することであった。初期用量は、おおよそ２０ｍｇ／ｋｇで開始し、安全な投薬量に達するまで１０分の１倍で投薬量を減少させ、影響が観察されなくなるまで２分の１倍で減少させた（−０．０３ｍｇ／ｋｇ）。
【０１２５】
ヨークシャー・ブタ（３０から３５ｋｇ）を、テラゾール（６から８ｍｇ／ｋｇの筋注）で麻酔させ、挿管し、ベンチレータにつなぎ、イソフルラン（２から２．５％）で維持した。動脈での試料採集と侵襲的な血圧監視のために頸動脈内へ、ならびに薬剤投与及び食塩水注入のために内頸静脈内へカテーテルを入れた。開腹を実行し、肝の左葉を、基底にある解剖学的組織から柔順なリトラクタで単離した（図２９）。これは、損傷後の血液を吸引するための収集面を提供する。左葉は、（葉の最遠位部から測定した）頂点から２インチ、#１５メスの刃で切開した。治療は、損傷を与えた５分後、静注で行った。活性静脈内止血剤（ＧＲＧＤＳ−ＮＰ（配列番号６））、スクランブル粒子（スクランブルＮＰ）及び食塩水（乳酸リンゲル）から構成された。
【０１２６】
腹腔から直に血液を吸引することによって、しかし、損傷面からクロットを除去することがないよう約１ｃｍの掃引半径を維持することによって、血液損失を直接測定した。動脈の血液試料は、損傷後のベースライン、１５、３０、６０、１２０、１８０及び２４０分に採集した。その後すぐに、乳酸リンゲル注入を行った。ＭＡＰがベースライン未満である第一の時点（１５分）に対して４０ｍｌ／分で４００ｍｌ、以降のすべての時点に対して２０ｍｌ／分で２００ｍｌ。
【０１２７】
考慮した結果は、生理的パラメータ、心拍数（ＨＲ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、Ｓｐ０２及びＥＴＣＯ２を含む。血液試料は、血小板数、血液ガス及び診断凝固時間に関して分析する（ローテム及びヘモクロン）。動物は損傷または死の後の４時間監視し、その時点でブタは、過量のペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。
無傷の投与／反応モデル
【０１２８】
このブタ・モデルでの最初の結果は、実験ナノ粒子薬剤の、０．１５ｍｇ／ｋｇを超えて投薬した場合の悪影響を示した。この有害な反応は、誘発肝臓損傷からの急激な出血を特徴とした。無傷の投与モデルを、損傷を欠いた状態でのナノ粒子の影響を測定するために開発した。ここでは、以下の二つの要因の影響を見るためにナノ粒子製剤を変化させた。賦形剤（＋／−ポリアクリル酸）及びゼータ電位（−３０ｍＶ、中性及び＋２０ｍＶ）。
【０１２９】
侵襲的な血圧監視、動脈血試料採集及び静脈注入のためのカテーテルを導入するために、手術を上記の通りに実行した。ナノ粒子の２ｍｇ／ｋｇの用量を注入して、時間＝０とした。それから、ブタを生理学的パラメータ、すなわち心拍数（ＨＲ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、Ｓｐ０２及びＥＴＣＯ２に関して１時間モニターした。血液試料は、血小板数、血液ガス及び診断凝固時間に関して分析した（ローテム及びヘモクロン）。
【０１３０】
１時間後、ナノ粒子の第二の製剤を注入し、無傷投与モデル実験を繰り返した。この実験には、Ｎ＝２ブタを使用した。第一のブタは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ（ゼータ＝−３０ｍＶ）の、ＰＡＡ賦形剤あり（ｔ＝０分）と、ＰＡＡ賦形剤なし（ｔ＝８５分）の、二つの投薬を受けた。第二のブタは、（ＰＡＡと一緒に）ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＰの、−１．２９ｍＶ（ｔ＝０）と、＋２０ｍＶ（ｔ＝６５分）のゼータ電位を比較する、二つの投薬を受けた。
再現可能なモデルの形成
【０１３１】
一貫した損傷モデルを形成する上で、再現可能な肝臓損傷を与えることは重要であった。最初の実験中の第一の、及び唯一の基準は、肝の左葉を頂点から２インチの長さを切開することである。投与前の時間（０から５分）における血液損失を比較すると、ブタの間には非常に大きな変動があることが観察された。これは、説明のように肝臓損傷を標準化した後、安定的な３００から４００ｍｌまで減少した。これは、一貫した程度の損傷とカットの角度を確立することによって主に達成された。左葉頂点から２インチの長さで、その長さが同等であることを確実にした。その自然な元の位置に左葉を再配置することも、張力やねじれが、肝からの通常の血流に変化を与えないために重要だった。損傷を与える間、リング・クランプを近くの適所に保持し、以前確立された損傷プロトコルとの一貫性を維持した（Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ５７：７２６−３８（２００４））。
【０１３２】
我々の最初の研究では、投与前血液損失（０から５分）は変化が大きく、損傷モデルが再生不可能なことを示した。これは、損傷を厳しく標準化することによって、後に改善された。粒子投与の前後における累積血液損失（図３）あるいは関連実験時点での血液損失（図４）の比較は、これらの粒子の止血性効力を測定する、また、ブタ間の投与前血液損失における差異の影響を最小化するのに使用可能な、一つの測定基準であるように見える。
【０１３３】
実施例３
ナノ粒子投与による出血の悪化
ナノ粒子組成物ＮＰ１及びＮＰ１００を投与した。ＮＰ１００は、ＮＰ１製剤に比べ、表面に約１００倍多くのペプチドを有する製剤である。付着ペプチドに関係なく、ナノ粒子の投与は２ｍｇ／ｋｇ以上の用量において、予想外の、大量出血を引き起こした。これは、ＮＰ１００及びＮＰ１粒子（様々なペプチド密度）で発生し、付着ペプチドに関係なく発生した（ＧＲＧＤＳ（配列番号２）、ＧＲＡＤＳＰ（配列番号３）または皆無）。このことは、生存時間及びトータル血液損失からに容易に分かる。乳酸リンゲルを与えた対照群（ｎ＝４／４）は、平均７７５ｍｌの血液損失＋／−２２５の標準偏差で、２４０分の全実験時間を生き残ったが、粒子治療群は、かなり悪い結果となった（表１）。
【０１３４】
表１は、用量（ｍｇ／ｋｇ）によってグループ分けした生存時間及び血液損失を示す。全４／４の乳酸リンゲル対照・ブタは、７７５ｍｌ＋／−２２５標準偏差の平均血液損失で全２４０分間生き残った。最適投与は、悪影響が最小になりそうな、０．１から０．２ｍｇ／ｋｇの範囲にあるように思える。興味深いことに、０．０３ｍｇ／ｋｇへ減少させた投与は、また、用量２．０ｍｇ／ｋｇ超で観察されたほど大幅にではないが、損傷モデルを悪化させるように見える。動物は、むしろ、急激な出血の誘発ではなく、出血時間が長引く影響を受けやすい。
【表１】
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【０１３５】
この有害な反応のための最初の仮説は、遊離ＲＧＤペプチドの投与で見られるであろうような、粒子が血小板受容体の飽和を引き起こし、血小板抑制を引き起こしているのかもしれない、ということであった。したがって、我々は予定通りに投与試験を続行し、有害な反応を誘発しない「最適」用量である０．１から０．２ｍｇ／ｋｇを発見した。しかし、更なる分析を行うと、粒子は、まだ、ブタにおける出血時間を長くするようで、治療後の出血量の増加を示す（５から６０分）。このことは、ＮＰ１粒子（図５）及びＮＰ１００粒子（図６）の両方について真実であった。
【０１３６】
図５に示すように、投与前（０から５分）ウインドウにおける血液損失は群間で一貫しているが、投与後（５から６０分）血液損失は、食塩水対照（３９５＋００４ｍｌ）に比較し、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）（５６０＋０１８ｍｌ）及びスクランブル（５３３＋／−１４６ｍｌ）群の両方で大いに悪化した。平均生存時間は、食塩水対照の２４０分に対し、スクランブルが２６分、及びＧＲＧＤＳ（配列番号２）が１４４分であった。
【０１３７】
図６に示すように、投与前（０から５分）ウインドウの血液損失は群間で一貫しているが、投与後（５から６０分）血液損失は、食塩水対照（３９５＋００４ｍｌ）に比較して、ＧＲＧＤＳ（配列番号２）（７７７＋０７７ｍｌ）及びスクランブル（９６８＋０８３ｍｌ）群の両方で大いに悪化した。平均生存時間は、食塩水対照の２４０分に比較して、スクランブルが７３分、及びＧＲＧＤＳ（配列番号２）が１７２分であった。
【０１３８】
ＧＲＡＤＳＰ（配列番号３）ペプチドでさえも血小板受容体と相互作用するのでは、と疑いながら、全く標的ペプチドを含まない複数の粒子対照（２ｍｇ／ｋｇ）も試験した。しかし、ペプチドを含まないという事実に関係なく、ナノ粒子が出血反応を誘発することを観察した。したがって、有害な影響は、おそらくナノ粒子の物質それ自体の非特異的相互作用からのものであり、さらに現象を調査するための、無傷な投与モデルの開発に至った。
実施例４
無傷ブタにおけるナノ粒子投与は、ＣＡＲＰＡを誘発する
【０１３９】
損傷を受けていない（無傷の）ブタにおける止血性ナノ粒子（２ｍｇ／ｋｇ、無ペプチド対照ＮＰ）の投与１分内に心肺問題が存在し、この問題は、疑似アレルギー（ＣＡＲＰＡ）に関連する補体活性化について以前に報告されたものと一貫性がある。２６−２８ＣＡＲＰＡの症状は、以下のものを含む。心拍数の増加、低血圧、皮膚の紅潮（紅斑）、心拍出量の減少、肺動脈圧の降下、及び血液ガス・レベルの減少。驚くべきことに、これらの問題は数分内に自然に解消する。しかし、我々は、これらの急性症状エピソードの再発が、頸動脈からの動脈血採取と同時に生じることを観察した。このことは、以前には報告されていなかった。この第一の実験の目的で、コポリマー・ポリ（ｌ−乳酸）−ポリ（エチレングリコール）からなるブランク（ペプチドなし、クマリン−６なし）ペグ化ナノ粒子を利用した（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ）。ＣＡＲＰＡ反応に対するｐＡＡ賦形剤の影響をテストするために、我々は、２ｍｇ／ｋｇのナノ粒子（−ｐＡＡ）をｔ＝０分に、２ｍｇ／ｋｇのもう一つのナノ粒子（＋ｐＡＡ）をｔ＝８５分に注入した。我々は、肝臓損傷モデルの実験からこの用量が強い影響を生じると確信していたので、２ｍｇ／ｋｇを選択した。
【０１４０】
ブタ１：第一の投与、２ｍｇ／ｋｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ−ＰＡＡ（ゼータ＝−３０．０４ｍＶ）
症状は、ｔ＝０での第一の注入後の１．５分に存在し、非常に減少した動脈圧、終端潮ＣＯ２及びｐａＯ２を含んだ（図７）。パルス・オキシメーターは、おそらく、エピソード中、低血圧になり四肢への潅流が限られるため、エラーになったにちがいない。しかし、動脈血ガス試料は、ｐ０２の減少を確証させ、エピソード中に６８０から７００ｍｍＨｇのベースラインから２６９ｍｍＨｇへ変化した。
【０１４１】
これらの心肺エピソードからの回復直後に皮膚の紅潮があった（紅斑）。これは、（最初の注入後のｔ＝１から２分、８から１２分及び６１から６５分で発生するエピソードに対して）各々、約１分ほど続いた。以降のエピソードは、採血直後に発生したので、血液に関連するように見えた。
【０１４２】
ブタ１：第二の投与、２ｍｇ／ｋｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ＋ＰＡＡ（ゼータ＝−３１．６４ｍＶ）
ブタは、最初の注入後最高８８分まで安定させて、その時点で、２ｍｇ／ｋｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＰ＋ｐＡＡの第二の注入を行った。これは、もう１回のＣＡＲＰＡ反応を誘発した。ブタは回復しなかった（図８）。これは、ｐＡＡが、より強い反応を誘発することを示すのかも、あるいは単に連続投与の結果であるのかもしれない。
実施例５
ナノ粒子電荷（ゼータ電位）を変化させると、ＣＡＲＰＡを緩和する
【０１４３】
ナノ粒子電荷（ゼータ電位）を変化させると、ＣＡＲＰＡを緩和する。この試験は、ブタへ、ｔ＝０で中性粒子（ゼータ電位＝−１．２９ｍＶ）を注入し、第二の注入として、ｔ＝６５分で正電荷粒子を注入することから構成された。両粒子製剤は、ポリ（アクリル酸）を含んだ。表２に示すように、賦形剤ではなくゼータ電位が、ＣＡＲＰＡを媒介する。
【表２】
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【０１４４】
第一の投与、２ｍｇ／ｋｇのＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＮＰ＋ＰＡＡ（ゼータ＝−１．２９ｍＶ）
電荷的に中性な粒子の注入後に有害な影響はなかった（図１０）。生理学的パラメータ、心拍数（ＨＲ）、ＭＡＰ、ｐ０２、ｐＣＯ２、及びローテム（ＮＡＴＥＭ）及びヘモクロンＪｒ．（ＡＰＴＴ）によって測定した凝固プロフィールは、それらのベースライン値の範囲内に留まった。ブタは、１時間まで観察してから、第二の注入へ移った（ｔ＝６５分）。
【０１４５】
ナノ粒子誘発ＣＡＲＰＡ後の損傷
一旦ＨＲ、ＭＡＰ、ＣＯ２及び０２の基本的な生理的示度がベースラインに戻ってから、出血性外傷後の止血に対するＣＡＲＰＡの影響を調査するために、肝臓損傷モデルを実行した（ｔ＝８８分、すなわち＋２０ｍＶ粒子によって誘発されたＣＡＲＰＡから回復した後の１０分）。肝臓に損傷を与えた５分後にＣＡＲＰＡが誘発された以前の試験のような、即時の出血は観察されなかった。しかし、その代わりに、標的部分を欠くナノ粒子を投与した際、食塩水のみを受けた以前の対照群に比べ、長時間に渡る血液損失量の増加が見られた（図１２）。ＣＡＲＰＡが存在しない状態では、食塩水単独投与に類似して、ナノ粒子投与に対する反応として出血は減速する。
【０１４６】
食塩水処置のブタに比べ、凝血異常があることは明らかである。粒子は、時間＝０分で投与した。急性相（０から５分）の血液損失は、食塩水対照群で、３８０ｍ１＋／−５９ｍｌ（標準偏差）から５１９ｍｌへ悪化する。この凝血異常は、５から６０分の時間範囲で続き、食塩水対照群の３９５ｍｌに比べ、８１４ｍｌへと出血を悪化させる。ＣＡＲＰＡ（＋損傷）実験の生存は、食塩水で処置された（ｎ＝４／４）ブタに対する２４０分に比べ、８２分であった。
【０１４７】
この試験に対する全１時間血液損失は、対照群の平均７７５ｍｌに対し、１３３０ｍｌであった（すなわち対照を２．５標準偏差で超えることに相当）。全生存時間は、すべての（ｎ＝４）ブタが少なくとも２４０分（実験の完了）まで生き残った食塩水対照群に対し、８２分であった。
【０１４８】
この試験は、集団のサブセットのみが症状を経験するとしても、ブタがナノ粒子誘発ＣＡＲＰＡに過敏であることを示した。中性ナノ粒子は、ＣＡＲＰＡを緩和する。
実施例６
凝集を減少させるための安定剤の添加
【０１４９】
中性ナノ粒子は、出血を減少させ、ＣＡＲＰＡを誘発しないが、これらの粒子は、電荷を欠いているために凝集することが示された。したがって、ナノ粒子組成物への安定剤への、投与後のナノ粒子の凝集を減少させる添加剤を調査した。それらの試験は、実施例２に説明するブタ肝臓損傷モデルで実行した。
【０１５０】
この試験の結果は、以下に表３及び表４で示す。ナノ粒子は、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）またはポロキサマー内に含ませた。各々の処置群は、一頭のブタからなった。ポリアクリル酸（ＰＡＡ）の添加は、中性粒子ではなく、負帯電性ナノ粒子に至った。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１５１】
ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を測定するために、動的光散乱（ＤＬＡ）を使用した。ＣＡＲＰＡを誘発した粒子とＣＡＲＰＡを誘発しなかった粒子は、大きさが類似しているため、ゼータ電位の違いが、ＣＡＲＰＡ誘発ナノ粒子を決定するのに重要であった（表４を参照）。
【表４】
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ＥＬＩＳＡサイトカイン・アッセイの変形を、ＣＡＲＰＡ動物に対して実行し、ＣＡＲＰＡ動物対非ＣＡＲＰＡ反応系での上方制御されるサイトカインの比率を調べた。図１３に示すように、補体活性化に関わる以下の典型的な炎症性サイトカインが、ＣＡＲＰＡ動物では上昇していた。ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１７Ｅ、セルピンＥ１、Ｃ５／Ｃ５ａ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−２３、ＩＬ−１６、ＭＩＦ、ＣＤ４０リガンド。これらの動物でＣＡＲＰＡ（補体反応）を緩和した結果として、ナノ粒子の投与は、外出血を引き起こさなくなった。
実施例５
身体全体及び頭部のみの爆傷における合成血小板のステロイド送達
【０１５２】
爆風による外傷の動物モデルを用いて、送達系としてナノ粒子を使用し、薬剤の送達を調査するために、ナノ粒子（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）にデキサメタゾンを載せた。
爆風への生理学的反応と治療、体重損失
【０１５３】
爆風後の２日及び７日に、ネズミの体重損失（ｇ）を測定し、試験日に、それらの体重に比較した。予想通り、偽群（爆風なし）は、爆風群に比べ、顕著に少ない体重損失を経験する。処置群間には、有意差はなかった。しかし７日目に、活性群は、対照及びＬＲ群との有意差を示し始める。これは、爆風後の生理的回復を示す可能性がある。
【０１５４】
偽群は、２日目には、すべての他の群に比較して、統計的に有意であった。偽群は、対照及びＬＲ群とは有意に異なった。活性群（ステロイド送達合成血小板を受けるもの）は、対照群に比べ、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。また、乳酸リンゲル（ＬＲ）群に比べても、その傾向にあった（ｐ＝０．０８）。
神経行動学的認知査定、オープン・フィールド
【０１５５】
７日時点まで生き残った動物には、認知及び行動テストを受けさせた。ネズミの移動力及び探索行動を測定するために、「オープン・フィールドテスト」を行った（Ｓａｌｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０（４）：３９１−４０２（２００７））。手短に言うと、このタスクのために、８０ｘ８０ｘ３６ｃｍの寸法を有する不透明な黒いアクリルの箱を使用した。爆風曝露後の２日及び７日に、箱内に全く物体を入れないで、動物に箱の中を探検させた。ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎＸＴ（商標）ソフトウェア・トラッキングを用いて、活動変化を検出した。爆風損傷及び治療後の動物の活動変化を検知するために、５分間のタスク中の移動距離及び平均速度のデータを採取した。活性群は、ＬＲ群とは統計学的に異なった。
ＮＯＲ査定
【０１５６】
空間学習及び短期記憶を査定するために、動物に、新規物体認識（ＮＯＲ）テストを受けさせた。確立されているＮＯＲテストを、齧歯動物の記憶を測定するために用いた（Ｂｅｖｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（３）：１３０６−１１（２００６），Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８９（１）：８４−７（２０１０））。手短に言うと、動物は、爆風テストの２日前に、環境順化期間を経る。このプロセスは、ストレス及び取扱いを減少させ、テスト環境に慣らすために行われた（Ｂｅｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，５０（１）：１９−２９（２０００））。爆風曝露後７日に、動物は、２０分の遅延を挟んで２回、短期記憶評価試験を受けた。第一の試験（Ｔ１）は、動物を同一の「見慣れた」物体へ５分間触れさせることを伴った。第二の試験（Ｔ２）では、動物を５分間、「見慣れた」物体（第一のタスクに使用したものと同じ物体）と「新規な」物体に触れさせた。試験及び動物行動を、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎＸＴ（商標）トラッキング・ソフトウェアを用いて追跡した。試験の間にチャンバを清掃するよう注意し、実験中は、実験者が実験室を退室するようにした（Ｂｅｖｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（３）：１３０６−１１（２００６））。分析のために、試験ごとに差別指標（各試験中に、新規物体と比較して見慣れた物体を探検するのに費やされた時間を、両方の物体を探検した全時間で除したもの）を計算した。比率０．５は、試験中に両方の物体に対して等しい探検がなされたことを指す。嗅内皮質障害のネズミは、新規物体の識別力が弱い（Ａｇｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２４（１）：５５−６８（２０１０））ため、この試験は、嗅内皮質への損傷、及びその記憶形成における海馬処理への入口としての役割を示し得る。結果は、各査定の統計分析とともに示した。
【０１５７】
結果は、短期記憶欠損に対する、爆風後１週間における治療群の有意な改善を示さなかった（図１４）。全身的な回復が、脳の認知中枢に関連する機能的回復を遅らせた可能性もある。したがって、組織学的パラメータを査定した。
【０１５８】
オープン・フィールド・テスト・アリーナを用いて、動物は、不安的行動に関しても査定した（Ｓａｌｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０（４）：３９１−４０２（２００７））。オープン・フィールドは、空のアリーナから構成されている。オープン・フィールドを探検するのが、ネズミの生来の傾向である。この傾向は、開いた照明のあるスペースに対する自然な恐れによって拮抗されるものである。したがって、チャンバ壁に沿って費やされた時間は、不安のレベルが増加したことを反映すると考えた。ネズミは、５分間ビデオテープに録画し、オープン・フィールドの中央部分へのエントリの頻度及び時間を測定することによって、センター・スクエア活動の回避（すなわち不安関連行動）を測定した。
接触走性査定、齧歯動物の不安（第三週ステロイド・群）
【０１５９】
活性群は、爆風後７日に、対照とＬＲ群とは有意に異なった（*−ｐ＜０．０５）。壁を求める傾向は、対照及びＬＲ群でより多く見られた。この試験は、ステロイド載置合成血小板が、爆風誘発頭部外傷に関連する不安及び機能障害を減少させる可能性があることを示唆した。
爆風及び治療への組織学的反応
【０１６０】
１週生存時点及びその後の行動試験の後、動物を安楽死させ、すべての重要な器官を採集して固定液に入れた。肺及び脳に対する組織学的染色及び分析を完了した。
肺の損傷
【０１６１】
三つの組織学的技術を用いて、肺組織に対する損傷を分析した。固定液内に４８時間入れた後、肺は、組織区分の準備のために、３０％スクロース溶液に入れた。肺をカセット内へ分離させ、分析のために各肺葉を単離した。先の試験の後に最も損傷を受けていると判定された肺葉Ａからの試料を切断し、染色した。各肺組織切片の三つの関心部分（ＲＯＩ）の画像を採取した。これらの三つの画像を白黒へ変換し、肺組織内の損傷レベルを測定するために、イメージＪソフトウェアを用いて光学濃度示度を採集した。各葉におけるパーセント損傷領域を計算し、有意差を決定し、平均±標準誤差として報告した。組織学的統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡで行い、その後、事後ＬＳＤテストを実行し、有意差をｐ＜０．０５で達成した。
【０１６２】
最初、肺組織は、標準的なヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ&Ｅ）染色法で査定した。以下のように、活性群は、ＬＲ群に対して、有意な傾向を有する。他の葉からの結果は、１週時点までに血液細胞クリアランスがある疑いがあるため、確定的ではない。
脳の組織病理学
【０１６３】
爆風ＴＢＩ試験は、対照に比べ、爆風曝露後、アポトーシス及び神経膠活性が有意に上昇することを示す組織学的マーカーを見出した（Ｓａｊｊａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２５（１２）：１３３１−９（２０１２），Ｓａｊｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．９１（４）：５９３−６０１（２０１３）  ａｎｄ  ＶａｎｄｅＶｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．．Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇｉｎ．４０（１）：２２７−３６（２０１２））。したがって、それらのマーカーを、我々の実験的肺損傷モデルにおける爆風神経外傷に対する機構を確証するために用いた。中枢神経系損傷または疾患１のすべての形態への反応として、反応性星状細胞増加が顕著に生じるため、我々は、脳組織１内のＧＦＡＰレベルを調べた。アポトーシスの細胞死を、初期アポトーシスの指標であるカスパーゼ３（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）、及び、神経細胞変性に関する機密情報を提供するＦｌｕｏｒｏＪａｄｅＢ（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）を定量化することによって確証した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１０：１２３（２００９））。一括して、これらの染色法は、爆風神経障害の存在、規模及び性質の査定を可能とする。すべての測定は、染色、損傷及び回復間の相関関係を判定するために個々に記録した。定量的なスコアを、全群にわたってＡＮＯＶＡで比較した。
扁桃体におけるＧＦＡＰ発現
【０１６４】
緑色蛍光として検出されるＧＦＡＰ発現は、活性星状細胞数を示した。活性及び対照群において、活性星状細胞数の有意差が観察された。偽群は、すべての他の群に比べ、統計学的に異なった。積分密度は、ＧＦＡＰ発現を表す緑色蛍光量に従って画像面積に対して正規化させた。全体として、偽及び活性群は、頭部外傷に関連する反応性星状細胞がより少ないことは明らかである。
扁桃体におけるカスパーゼ−３発現
【０１６５】
断裂カスパーゼ−３発現は、細胞死のマーカーであり、扁桃体で測定された。活性及び偽群に比較して、カスパーゼ−３活性の有意差が対照群で観察された。明らかに、活性及び偽群よりも、対照群及びＬＲ群で、より細胞死が多い。
ＦＪＢ発現
【０１６６】
フロロジェイドＢは、脳内における細胞死に対するマーカーである。扁桃体内でそのマーカーを測定した。傾向は、対照よりも、活性及び偽群で死がより少ないことを示唆した。この結果は、試料サイズが小さいので、有意ではなかった。
【０１６７】
全体として、これまでの組織学的分析は、ステロイド送達合成血小板を受けている群（活性群）の脳内では、対照よりも、細胞死が少なく外傷の兆候も少ないことを示唆するが、調査対象群は小さかった。
実施例６
【０１６８】
ステロイド載置ナノ粒子を用いる試験は、本発明の組成物内のナノ粒子及びポロキサマーの好適濃度の精選を可能にした。これは、下記の表５にまとめる。ナノ粒子に対して２０％のポロキサマー（重量対重量）からなる組成物。ポロキサマーの添加は、凝集を減少させ、音波処理なしでの再懸濁を可能にした。
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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