(57)【要約】  本発明は、グルカゴン受容体と結合する拮抗性抗体およびその使用方法を提供する。抗グルカゴン受容体抗体は、血中グルコースレベルを低下させるために治療的に使用することができ、また、糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、または代謝症候群を含めたグルコース関連障害の予防および／または処置中に存在することができる。【図１】2016520058.tif 000039
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴン受容体と特異的に結合し、
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、単離した拮抗抗体。
【請求項２】
配列番号２４、１６、または２５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８または２６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項３】
配列番号３、５、７、９、もしくは１１に示すアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＨを含む、請求項１または２に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、もしくは１０に示すアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＬを含む、請求項１から３のいずれかに記載の単離した拮抗抗体。
【請求項５】
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項６】
配列番号８７または８８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項５に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項７】
免疫学的に不活性な定常領域をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ΔｂＳ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項７に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項９】
定常領域が非グリコシル化Ｆｃである、請求項７に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項１０】
抗体のそれぞれのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義されている、請求項１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項１１】
グルカゴン受容体と特異的に結合し、請求項１に記載の抗体によって認識されるグルカゴン受容体上のエピトープと同じ、またはそれと重複するエピトープと結合する、単離した拮抗抗体。
【請求項１２】
配列番号１に示すグルカゴン受容体アミノ酸配列のアミノ酸残基３１、３３〜３８、４０〜４２、４４〜４５、４８、６２、および６４を含むヒトグルカゴン受容体上のエピトープを認識する、請求項１１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項１３】
配列番号１に示すグルカゴン受容体アミノ酸配列のアミノ酸残基３３、３６、３８、４１、４４、および４５を含むヒトグルカゴン受容体上の機能的エピトープを認識する、請求項１１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項１４】
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号９４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号９２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の単離した拮抗抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を産生する単離した細胞系。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体をコードしている単離した核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
【請求項２０】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体を産生する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体を組換え産生する細胞系を、抗体が産生される条件下で培養することと、抗体を回収することとを含む方法。
【請求項２１】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体を産生する方法であって、配列番号８７または８８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードしている核酸を含む細胞系を、抗体が産生される条件下で培養することと、抗体を回収することとを含む方法。
【請求項２２】
重鎖および軽鎖が別々のベクター上にコードされている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
重鎖および軽鎖が同じベクター上にコードされている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物を含む、異常な血糖値に関連する状態を処置するためのキット。
【請求項２６】
それを必要としている個体において、血中グルコースを低下させる、耐糖能を改善する、および／またはグルカゴン受容体によって媒介される状態を処置もしくは予防する方法であって、個体において、血糖値が低下する、耐糖能が改善される、および／または状態に関連する１つもしくは複数の症状が寛解されるように、有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載の拮抗抗体を個体に投与することを含む方法。
【請求項２７】
状態が、１型糖尿病、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、および代謝症候群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
有効量の第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
第２の治療剤が、インスリン、ｍＴｏｒ阻害剤、ビグアニド、スルホニル尿素、ＰＰＡＲガンマ作用剤、アルファグルコシダーゼ阻害剤、ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（登録商標）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）、グルカゴン拮抗剤、および第２のグルカゴン受容体拮抗剤からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ビグアニドがメトホルミンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｍＴｏｒ阻害剤が、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびＡＴＰ競合的ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＫＩが、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、ＫＵ００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＯＳＩ−０２７、ＡＺＤ−８０５５、ＫＵ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−１、Ｗｙｅｔｈ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−２、ＸＬ−３８８、ＩＮＫ−１２８、およびＡＺＤ−２０１４からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１型もしくは２型糖尿病を処置もしくは予防するため、またはヒトにおいて体重減少を達成するための医薬品の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３４】
グルカゴン受容体によって媒介される状態の処置において使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子出願されるものであり、．ｔｘｔ形式の電子提出された配列表を含む。この．ｔｘｔファイルは、表題「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＰＣ３３９９２＿０２」、２０１４年４月１６日作成の、７２ＫＢのサイズを有する配列表を包含する。この．ｔｘｔファイルに包含される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、抗体、たとえばグルカゴン受容体と結合する完全長抗体に関する。本発明はさらに、グルカゴン受容体に対する抗体を含む組成物、および抗グルカゴン受容体抗体を医薬品として使用する方法に関する。抗グルカゴン受容体抗体は、血中グルコースレベルを低下させるために治療的に使用することができ、また、糖尿病を含めたグルコース関連障害の予防および／または処置中に使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、その増加している有病率および関連する健康上のリスクが原因で、公衆衛生上の大きな懸念である。この疾患は、適切な血漿グルコースレベルの維持不全をもたらす、炭水化物の産生および利用の代謝欠損によって特徴づけられている。２つの主要な糖尿病の型が認められている。Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、すなわちインスリン依存性真性糖尿病は、インスリンの絶対的欠乏の結果である。ＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、すなわちインスリン非依存性真性糖尿病は、しばしば正常な、またはさらには上昇したレベルのインスリンで起こり、組織および細胞がインスリンに適切に応答できないことの結果であると考えられる。医薬を用いたＴ２Ｄの積極的な調節が不可欠であり、そうでなければ、これはβ細胞不全およびインスリン依存へと進行する場合がある。
【０００４】
グルカゴンとは、膵臓のα細胞から肝門静脈内に分泌される２９個のアミノ酸のペプチドであり、それにより、肝臓はこのホルモンに非肝臓組織よりも高いレベルで曝される。血漿グルカゴンレベルは、高血糖症、高インスリン血症、上昇した血漿非エステル化脂肪酸レベル、およびソマトスタチンに応答して減少する一方で、グルカゴン分泌は、低血糖症および上昇した血漿アミノ酸レベルに応答して増加する。グルカゴンは、その受容体の活性化を通じて、グリコーゲン分解および糖新生を活性化することによる肝臓のグルコース産生の強力な活性化剤である。Ｔ２Ｄ個体では、基底グルカゴンレベルが高く、高血糖症および高インスリン血症によって不適当に抑制されている。
【０００５】
グルカゴン受容体とは、グルカゴンによって活性化される６２ｋＤａのタンパク質であり、クラスＢのＧタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーである。グルカゴン受容体は、ヒトにおいてＧＣＧＲ遺伝子によってコードされており、これらの受容体は主に肝臓中で発現され、より少ない量が腎臓、心臓、脂肪組織、脾臓、胸腺、副腎、膵臓、大脳皮質、および胃腸管中で見つかる。グルカゴン受容体の刺激は、アデニル酸シクラーゼの活性化および細胞内ｃＡＭＰレベルの増加をもたらす。
【０００６】
マウスにおけるグルカゴン受容体発現の遺伝子破壊（Ｇｃｇｒ−／−）は、絶食および摂食グルコースレベルを低下させ、血糖コントロールを改善する。しかし、Ｇｃｇｒ−／−マウスは、高グルカゴン血症、膵臓α細胞過形成、および膵臓神経内分泌腫瘍を発生する（Ｇｅｌｌｉｎｇ，Ｒ．Ｗ．ら、２００３、「Ｌｏｗｅｒ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ｈｙｐｅｒｇｌｕｃａｇｏｎｅｍｉａ，  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｌｐｈａ  ｃｅｌｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００：１４３８〜１４４３、Ｙｕ，Ｒ．ら、２０１１、「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」、Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ、６（８）：ｅ２３３９７）。同様に、ホモ接合性不活性化ＧＣＧＲ突然変異（Ｐ８６Ｓ）を持って生まれたヒト患者は、膵臓神経内分泌腫瘍を発生し、高グルカゴン血症および膵臓α細胞過形成を示す（Ｙｕ，Ｒ．ら、２００８、「Ｎｅｓｉｄｉｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ｃｅｌｌｓ，ｍｉｃｒｏｇｌｕｃａｇｏｎｏｍａ，ａｎｄ  ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ」、Ｐａｎｃｒｅａｓ、３６：４２８〜４３１）。
【０００７】
それぞれが異なる機構によって作用する、５つの主要な分類のいくつかの薬物が、高血糖症、続いてＴ２Ｄを処置するために利用可能である（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．、２０１１、「Ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：８２１〜８２７）：（Ａ）スルホニル尿素（たとえば、グリピジド、グリメピリド、グリブリド）ならびにメグリチニド（たとえば、ナテグリニドおよびレパグリニド）を含めたインスリン分泌促進物質は、膵臓ベータ細胞に作用することによってインスリンの分泌を増強する。この療法は、血漿グルコースレベルを減少させることができる一方で、有効性および許容性が制限されており、体重増加を引き起こし、しばしば低血糖症を誘発する。（Ｂ）ビグアニド（たとえばメトホルミン）は、主に肝臓のグルコース産生を減少させることによって作用すると考えられている。ビグアニドはしばしば胃腸障害および乳酸アシドーシスを引き起こし、その使用がさらに制限される。（Ｃ）アルファグルコシダーゼの阻害剤（たとえばアカルボース）は腸管のグルコース吸収を減少させる。これらの薬剤はしばしば胃腸障害を引き起こす。（Ｄ）チアゾリジンジオン（たとえば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）は、肝臓、筋肉および脂肪組織中で特定の受容体（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）に作用する。これらは脂質代謝を調節し、続いて、インスリンの作用に対するこれらの組織の応答を増強させる。これらの薬物の頻繁な使用は、体重増加をもたらす場合があり、浮腫および貧血を誘発する場合がある。（Ｅ）インスリンは、より重篤な事例において、単独で、または上記薬剤と組み合わせて使用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当分野で入手可能な情報から、また、本発明の以前には、グルカゴン受容体を選択的に拮抗するために抗グルカゴン受容体拮抗抗体を血液循環内に導入することが、血漿グルコースレベルを低下させ、糖尿病を予防および／または処置するために安全かつ有効であるか、また、その場合は、そのようなｉｎ  ｖｉｖｏの安全性および有効性のためには抗グルカゴン受容体抗体のどのような特性が必要であるかが、不明確なままであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
グルカゴン受容体と選択的に相互作用する抗体を提供する。特定の抗グルカゴン受容体抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで糖尿病を予防および／または処置するために有効であることが実証されている。有利なことに、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体抗体は、肝機能または血漿脂質に有害な影響を与えない。やはり有利なことに、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血中Ｃ−ペプチドレベルを低下させるために有効である。
【００１０】
グルカゴン受容体と特異的に結合し、グルカゴン受容体の生物学的効果を妨げるまたは低下させる、単離した拮抗抗体を本明細書中で提供する。一部の実施形態では、拮抗抗体は、たとえば、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得る。
【００１１】
一部の実施形態では、単離した拮抗抗体は、たとえば、配列番号３、５、７、９、もしくは１１に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号２、４、６、８、もしくは１０に示すアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。抗体のそれぞれのＣＤＲは、たとえば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＡｂＭ定義、および／またはＣＤＲの接触定義に従って定義することができる。
【００１２】
一部の実施形態では、抗体は、たとえば、（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、（ｄ）配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに（ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨからなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ、（ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ、（ｈ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ、（ｉ）配列番号８に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ、ならびに（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＶＨのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬからなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み得る。
【００１３】
一部の実施形態では、抗体は、たとえば、配列番号２４、１６、もしくは２５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８もしくは２６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および／または配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含み得る。
【００１４】
一部の実施形態では、抗体は、たとえば、配列番号３、５、７、９、もしくは１１に示すアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にない残基中に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＨを含み得る。一部の実施形態では、抗体は、たとえば、配列番号２、４、６、８、もしくは１０に示すアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＶＬを含み得る。
【００１５】
一部の実施形態では、抗体は、たとえば、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび／または配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含み得る。一部の実施形態では、抗体は、たとえば、配列番号８７もしくは８８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および／または配列番号８９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
【００１６】
一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性な定常領域を含み得る。一部の実施形態では、定常領域は、たとえば非グリコシル化Ｆｃであり得る。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ΔｂＳ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを含み得る。
【００１７】
また、モノクローナル抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、またはｍＡｂ５によって認識される、グルカゴン受容体上のエピトープと同じ、またはそれと重複するエピトープと特異的に結合する、単離した抗グルカゴン受容体拮抗抗体も、本明細書中で提供する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号９４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および／または配列番号９２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含み得る。一部の実施形態では、エピトープは構造的エピトープである。一部の実施形態では、エピトープは、配列番号１に示すグルカゴン受容体アミノ酸配列のアミノ酸残基３１、３３〜３８、４０〜４２、４４〜４５、４８、６２、および６４を含む。一部の実施形態では、エピトープは機能的エピトープである。一部の実施形態では、機能的エピトープは、配列番号１に示すグルカゴン受容体アミノ酸配列のアミノ酸残基３３、３６、３８、４１、４４、および４５を含む。一部の実施形態では、機能的エピトープは、配列番号１に示すグルカゴン受容体アミノ酸配列のアミノ酸残基３３、３６、３８、４１、４４、４５、および６０を含む。
【００１８】
また、本明細書中で提供する１つまたは複数の抗体を産生する細胞系も提供する。
【００１９】
また、本明細書中で提供する抗体をコードしている単離した核酸も提供する。一部の実施形態では、単離した核酸は、制御配列に作動可能に連結させることができる。一部の実施形態では、単離した核酸は、本明細書中で提供する抗体の軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、または両方をコードしているポリヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２０】
また、本明細書中で提供する核酸を含む組換え発現ベクターも提供する。また、本明細書中で提供する発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。また、本明細書中で提供する抗体のいずれかを産生することができるハイブリドーマも提供する。
【００２１】
また、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を産生する方法も提供する。一部の実施形態では、この方法は、抗体を産生する細胞系を、抗体が産生される条件下で培養することと、抗体を回収することとを含む。一部の実施形態では、この方法は、配列番号８７または８８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードしている核酸を含む細胞系を、抗体が産生される条件下で培養することと、抗体を回収することとを含む。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖は別々のベクター上にコードされている。他の実施形態では、重鎖および軽鎖は同じベクター上にコードされている。
【００２２】
また、本明細書中で提供する１つまたは複数の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物も提供する。また、本明細書中で提供する１つまたは複数の抗体を含む医薬組成物を含む、グルカゴン受容体によって媒介される状態を処置するためのキットも提供する。
【００２３】
また、それを必要としている個体において、血中グルコースを低下させる、耐糖能を改善する、Ｃ−ペプチドレベルを低下させる、Ｃ−ペプチドの血中レベルの顕著な増加を防止する、および／またはグルカゴン受容体によって媒介される状態を処置もしくは予防する方法も提供する。一部の実施形態では、この方法は、個体において、血糖値が低下する、耐糖能が改善される、および／または状態に関連する１つもしくは複数の症状が寛解されるように、有効量の本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を個体に投与することを含む。他の実施形態では、この方法は、個体においてＣ−ペプチドレベルが低下するように、有効量の本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を個体に投与することを含む。他の実施形態では、この方法は、個体において、血糖値が低下する、耐糖能が改善される、および／または状態に関連する１つもしくは複数の症状が寛解されるように、有効量の本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体およびｍＴｏｒ阻害剤を個体に投与することを含む。個体は、たとえば、それだけには限定されないが哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、個体はヒトである。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、個体において体重増加を低下させる。
【００２４】
一部の実施形態では、状態は、たとえば、１型糖尿病、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病に関連する長期合併症、代謝症候群、または上昇した血糖値によって部分的に特徴づけられる他の代謝障害である。
【００２５】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体処置後の膵島のアルファ細胞の変化は、個体中の抗グルカゴン受容体拮抗抗体のレベルが最小有効閾値レベル未満より下に落ちた後に逆転する。
【００２６】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体処置後の肝細胞中のグリコーゲン蓄積の変化は、個体中の抗グルカゴン受容体拮抗抗体のレベルが最小有効閾値レベル未満より下に落ちた後に逆転する。
【００２７】
一部の実施形態では、この方法は、有効量の第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、第２の治療剤は、たとえば、インスリン、ｍＴｏｒ阻害剤、ビグアニド、スルホニル尿素、ＰＰＡＲガンマ作用剤、アルファグルコシダーゼ阻害剤、ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（登録商標）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）、グルカゴン拮抗剤、または第２のグルカゴン受容体拮抗剤である。一部の実施形態では、ビグアニドは、たとえばメトホルミンである。一部の実施形態では、ｍＴｏｒ阻害剤は、たとえば、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、またはＡＴＰ競合的ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。一部の実施形態では、ＴＫＩは、たとえば、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、ＫＵ００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＯＳＩ−０２７、ＡＺＤ−８０５５、ＫＵ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−１、Ｗｙｅｔｈ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−２、ＸＬ−３８８、ＩＮＫ−１２８、およびＡＺＤ−２０１４である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤を用いた組合せ処置は、グルカゴン受容体活性を遮断することによって誘発される肥厚および／または過形成を低下させる。
【００２８】
また、１型もしくは２型糖尿病を処置もしくは予防するため、またはヒトにおいて体重減少を達成するための医薬品の製造における、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体のいずれかの使用も提供する。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、個体において体重増加を低下させる。
【００２９】
また、グルカゴン受容体によって媒介される状態の処置において使用するための抗グルカゴン受容体拮抗抗体も提供する。一部の実施形態では、状態は、たとえば、１型糖尿病、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、または代謝症候群である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｃＡＭＰアッセイの結果を要約するグラフである。
【図２】図２Ａ：抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）試験の結果を要約するグラフである。図２Ｂ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）試験の結果を要約するグラフである。
【図３】図３Ａ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）試験の結果を要約するグラフである。図３Ｂ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）試験の結果を要約するグラフである。
【図４】図４Ａ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、総コレステロールレベルを要約するグラフである。図４Ｂ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、ＬＤＬ−Ｃレベルを要約するグラフである。
【図５】図５Ａ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、ＨＤＬ−Ｃレベルを要約するグラフである。図５Ｂ：ｍＡｂ５（白丸）またはＰＢＳ（黒丸）のどちらかを投与した動物における、トリグリセリドレベルを要約するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書中には、グルカゴン受容体と特異的に結合する抗体が開示されている。抗グルカゴン受容体抗体の作製方法、これらの抗体を含む組成物、およびこれらの抗体を医薬品として使用する方法を提供する。抗グルカゴン受容体抗体は、血漿グルコースレベルを低下させるために使用することができ、また、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、または、高血糖症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、肥満症、腎症、網膜症、白内障、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒障害、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖性高浸透圧性症候群、周術期高血糖症、集中治療室患者における高血糖症、インスリン耐性症候群、および代謝症候群を含めた関連障害の、予防および／または処置において使用することができる。
【００３２】
一般技法
別段に指定しない限りは、本発明の実施では、当分野の技術範囲内にある、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣用技術を用いる。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）、Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献中に十分に記述されている。
【００３３】
定義
別段に指定しない限りは、以下の用語は以下の意味を有すると理解される。分子（ただし、分子は、たとえば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である）に言及する場合の用語「単離した分子」は、その起源または派生供給源のおかげで、（１）そのネイティブ状態においてそれに付随する、天然に会合している構成成分と会合していない、（２）同じ供給源、たとえば、種、それが発現される細胞、ライブラリなどからの他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない。したがって、化学合成である分子、またはそれが天然において由来する系とは異なる細胞系中で発現された分子は、その天然に会合している構成成分から「単離」されている。また、分子は、分野で周知の精製技法を使用して単離することによっても、天然に会合している構成成分を実質的に含まないようにし得る。分子の純度または均一性は、当分野で周知のいくつかの手段によってアッセイし得る。たとえば、ポリペプチド試料の純度は、当分野で周知の技法を使用して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイし得る。特定の目的には、ＨＰＬＣまたは当分野で周知の精製用の他の手段を使用して、より高い分解能をもたらし得る。
【００３４】
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用するこの用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみでなく、別段に指定しない限りは、特異的結合、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変立体配置についてインタクトな抗体と競合するその任意の抗原結合部分も包含される。抗原結合部分には、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、たとえばサメおよびラクダの抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ、ならびに、ポリペプチドに特異的抗原結合を与えるために十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。抗体にはＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２へとさらに分類し得る。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００３５】
抗体の「可変領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。当分野で知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域は、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からそれぞれなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。対象可変領域の変異体、特にＣＤＲ領域外（すなわちフレームワーク領域内）のアミノ酸残基中の置換を有するものが望まれる場合は、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカルクラス内のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。
【００３６】
特定の実施形態では、ＣＤＲの確定描写および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解析するおよび／または抗体−リガンドの複合体の構造を解析することによって達成される。特定の実施形態では、このことは、Ｘ線結晶構造解析などの当業者に知られている様々な技法のいずれかによって達成することができる。特定の実施形態では、様々な分析方法を用いてＣＤＲ領域を同定または概算することができる。そのような方法の例には、それだけには限定されないが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義、およびコンホメーション定義が含まれる。
【００３７】
Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基の付番の標準であり、ＣＤＲ領域を同定するために典型的に使用する。たとえばＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２１４〜８を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ定義はＫａｂａｔ定義に類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は特定の構造的ループ領域の位置を考慮に入れる。たとえばＣｈｏｔｈｉａら、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７；
Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３を参照されたい。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデリングする、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって作成されたコンピュータプログラムの統合スイートを使用する。たとえば、Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８〜９２７２、「ＡｂＭＴＭ，Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、英国Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照されたい。ＡｂＭ定義は、Ｓａｍｕｄｒａｌａら、１９９９、「Ａｂ  Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ補遺、３：１９４〜１９８によって記載されているものなどの、知識データベースおよび非経験的方法の組合せを使用して、抗体の三次構造を一次配列からモデリングする。接触定義は、入手可能な複合体の結晶構造の分析に基づく。たとえばＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２〜４５を参照されたい。本明細書中でＣＤＲの「コンホメーション定義」と呼ぶ別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー貢献を行う残基として同定し得る。たとえばＭａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記手法のうちの１つに厳密に従わないが、それでもＫａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部分と重複していてもよい。ただし、これらは、特定の残基または残基群が抗原結合に顕著な影響を与えないという予測または実験的発見に鑑みて短縮または伸長してもよい。本明細書中で使用するＣＤＲとは、手法の組合せを含めた、当分野で知られている任意の手法によって定義されるＣＤＲをいう場合がある。本明細書中で使用する方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。複数のＣＤＲを含有する任意の所定の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義し得る。
【００３８】
当分野で知られているように、抗体の「定常領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域をいう。
【００３９】
本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得た抗体をいう、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに、様々な決定要因（エピトープ）に対して向けられている様々な抗体が典型的に含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して向けられている。修飾語句「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られたという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきでない。たとえば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記載されているハイブリドーマ方法によって作製し得るか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているものなどの組換えＤＮＡ方法によって作製し得る。また、モノクローナル抗体は、たとえばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載されている技法を使用して作製されたファージライブラリからも単離し得る。本明細書中で使用する「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（たとえばネズミ）抗体の形態をいう。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントのＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性、および結合能を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲからの残基（ドナー抗体）によって置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中のどちらにも見つからないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含められる残基を含み得る。
【００４０】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を保有する抗体、および／または本明細書中に開示するヒト抗体を作製する技法のいずれかを使用して作製された抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【００４１】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、たとえば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体をいうことを意図する。
【００４２】
用語「エピトープ」とは、抗体の抗原結合領域のうちの１つまたは複数において、抗体によって認識および結合されることができる分子の一部分をいう。エピトープは多くの場合アミノ酸または糖側鎖などの表面分子群からなっており、特定の三次元構造的特徴および特定の電荷特徴を有する。一部の実施形態では、エピトープはタンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは直鎖状またはコンホメーションであり得る。直線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線状に存在する。「非線形エピトープ」または「コンホメーションエピトープ」は、抗原タンパク質内の非連続的なポリペプチド（またはアミノ酸）を含み、これに、エピトープに特異的な抗体が結合する。本明細書中で使用する用語「抗原エピトープ」とは、当分野で周知の任意の方法、たとえば慣例の免疫アッセイによって決定される、抗体が特異的に結合することができる抗原の一部分として定義される。抗原上の所望のエピトープが決定された後、たとえば本明細書中に記載の技法を使用して、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能である。あるいは、発見の過程中に、抗体の作製および特徴づけにより望ましいエピトープに関する情報が解明され得る。その後、この情報から、同じエピトープとの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するための一手法は、グルカゴン受容体との結合について互いに競合または交差競合する抗体、たとえば抗原との結合について競合する抗体を見つけるために競合および交差競合研究を実施することである。「機能的エピトープ」は含む
【００４３】
本明細書中で使用する用語「グルカゴン受容体」とは、グルカゴン受容体の任意の形態、およびグルカゴン受容体の活性の少なくとも一部を保持しているその変異体をいう。ヒトグルカゴン受容体への具体的な言及など、そうではないと別段に示さない限りは、グルカゴン受容体には、ネイティブ配列グルカゴン受容体のすべての哺乳動物種、たとえば、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、およびウシ科動物が含まれる。１つの例示的なヒトグルカゴン受容体はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４７８７１（配列番号１）として見つかる。
【００４４】
用語「拮抗抗体」とは、標的と結合して、その標的の生物学的効果を妨げるまたは低下させる抗体をいう。一部の実施形態では、この用語は、それが結合している標的、たとえばグルカゴン受容体が、生物学的機能を行うことを妨げる抗体を意味することができる。
【００４５】
本明細書中で使用する「抗グルカゴン受容体拮抗抗体」とは、グルカゴン受容体によって媒介されるグルカゴン受容体の生物活性および／または下流事象（複数可）を阻害することができる抗体をいう。抗グルカゴン受容体拮抗抗体には、グルカゴン結合および下流のシグナル伝達、アデニル酸シクラーゼ活性化、細胞内ｃＡＭＰレベルの増加、グリコーゲン分解の刺激、糖新生の活性化、グリコーゲン生成の阻害、解糖の阻害、ならびに肝臓のグルコース産生など、グルカゴン受容体によって媒介される下流事象を含めたグルカゴン受容体の生物活性を（顕著なものを含めた任意の度合まで）遮断する、拮抗する、抑制する、または低下させる抗体が包含される。本発明の目的のために、用語「抗グルカゴン受容体拮抗抗体」（「拮抗性グルカゴン受容体抗体」、「拮抗性抗グルカゴン受容体抗体」または「グルカゴン受容体拮抗抗体」と互換的に呼ばれる）には、グルカゴン受容体自体、グルカゴン受容体の生物活性（それだけには限定されないが、グルカゴンと結合する、細胞内ｃＡＭＰを増加させる、グリコーゲン分解を刺激する、糖新生を活性化する、および肝臓グルコースの放出を促進するその能力を含む）、または生物活性の結果が、任意の有意義な度合で実質的に無効化、減少、または中和されている、以前に同定されたすべての用語、表題、ならびに機能的状態および特徴が包含されることを明確に理解されたい。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、グルカゴン受容体と結合して血漿グルコースレベルを低下させる。抗グルカゴン受容体拮抗抗体の例は本明細書中に提供されている。
【００４６】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、本明細書中で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の鎖をいう。鎖は直鎖状または分枝状であってよく、また、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。また、この用語には、天然または介入、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸鎖も包含される。また、この定義には、たとえば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（たとえば非天然アミノ酸などを含む）、および当分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として存在できることが理解されよう。
【００４７】
当分野で知られているように、本明細書中で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドの鎖をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖内に取り込ませることができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖が構築される前または後に与え得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションによってなど、重合後にさらに修飾し得る。他の種の修飾には、たとえば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数を類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、たとえば、無電荷連結（たとえば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および電荷連結（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント基、たとえばタンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）を含有するもの、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結（たとえばアルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態が含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、たとえば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換える、標準の保護基によって保護し得る、もしくは追加のヌクレオチドとのさらなる連結を調製するために活性化させ得る、または固体支持体とコンジュゲーションさせ得る。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。また、他のヒドロキシルも標準の保護基へと誘導体化し得る。また、ポリヌクレオチドは、たとえば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環状糖類似体、アルファまたはベータアノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、当分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似体を含有することもできる。１つまたは複数のリン酸ジエステル連結を代替連結基によって置き換え得る。これらの代替連結基には、それだけには限定されないが、リン酸基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態［式中、それぞれのＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、または、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有していてもよい置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０個のＣ）］が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書中で言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【００４８】
本明細書中で使用するように、本明細書中の実施例１に開示されている方法によって測定して平衡解離定数が２０ｎＭ以下、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．２ｎＭ未満である場合、抗体はグルカゴン受容体「と相互作用する」。
【００４９】
エピトープと「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書中で互換的に使用される）抗体とは、当分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定するための方法も当分野で周知である。分子は、別の細胞または物質とよりも、より高い頻度で、より迅速に、より長い期間、および／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質と結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い期間結合する場合に、標的と「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、グルカゴン受容体エピトープと特異的または優先的に結合する抗体は、他のグルカゴン受容体エピトープまたは非グルカゴン受容体エピトープと結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い期間、このエピトープと結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、たとえば、第１の標的と特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的と特異的または優先的に結合してもしなくてもよいことも理解されたい。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（ただし含まれることはできる）。一般に、必ずしもではないが、結合への言及は優先的結合を意味する。
【００５０】
本明細書中で使用する「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である材料をいう。
【００５１】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を取り込ませるためのベクター（複数可）のレシピエントとなることができる、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然、偶然、または意図的な突然変異が原因で、元の親細胞と必ずしも完全に（形態学的またはゲノムＤＮＡ相補体的に）同一でない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで形質移入した細胞が含まれる。
【００５２】
当分野で知られているように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。「Ｆｃ領域」はネイティブ配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端までのストレッチであると定義される。Ｆｃ領域中の残基の付番は、Ｋａｂａｔ中のものと同じＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２およびＣＨ３を含む。当分野で知られているように、Ｆｃ領域は二量体または単量体の形態で存在することができる。
【００５３】
当分野で使用する「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体と結合するものであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは類似のアミノ酸配列を有するが主にその細胞質ドメインが異なる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２、Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４、ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に総説されている。また、「ＦｃＲ」には新生児受容体ＦｃＲｎも含まれ、これは母性ＩｇＧを胎児に輸送することを司っている（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【００５４】
本明細書中で抗体に関して使用する用語「競合する」とは、第１の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体が存在しない場合の第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に減少するように、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に類似した様式でエピトープと結合することを意味する。その逆、すなわち、第２の抗体とそのエピトープとの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少することは、可能であるがそうである必要はない。言い換えると、第２の抗体が第１の抗体とその対応するエピトープとの結合を阻害することなく、第１の抗体は、第２の抗体とそのエピトープとの結合を阻害することができる。しかし、同じ、より高い、またはより低い程度にかかわらず、それぞれの抗体が他方の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合は、抗体は、そのそれぞれのエピトープの結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合抗体はどちらも本発明によって包含される。そのような競合または交差競合が起こる機構（たとえば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその一部分との結合）にかかわらず、当業者は、本明細書中で提供する教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が本明細書中に開示されている方法に包含され、それに有用な場合があることを理解されよう。
【００５５】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、貪食、細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（たとえば抗体可変ドメイン）と一緒になることを必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当分野で知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００５６】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によってネイティブ配列Ｆｃ領域とは異なるが、それでもネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持しているアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、たとえば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１個〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１個〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を保有する。
【００５７】
本明細書中で使用する「処置」とは、有益または所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果には、それだけには限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、高血糖症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、肥満症、腎症、網膜症、白内障、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒障害、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖性高浸透圧性症候群、周術期高血糖症、集中治療室患者における高血糖症、インスリン耐性症候群、および代謝症候群から生じる、血糖値の低下、グルコースクリアランスの改善（耐糖能の改善）、および異常な血漿グルコースレベルの発生率の低下または寛解。
【００５８】
「寛解」とは、抗グルカゴン受容体拮抗抗体を投与しない場合と比較した、１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。また、「寛解」には、症状の期間の短縮または縮小も含まれる。
【００５９】
本明細書中で使用する「有効用量」または「有効量」の薬物、化合物、または医薬組成物とは、任意の１つまたは複数の有益または所望の結果をもたらすために十分な量である。より具体的な態様では、有効量は、疾患の症状を予防する、緩和させる、もしくは寛解させる、および／または処置している対象の生存を延長する。予防的使用では、有益または所望の結果には、疾患、その合併症、および疾患の発生中に表れる中間病理表現型の生化学的、組織学的および／または行動性の症状を含めた、疾患の危険性の排除もしくは低下、重篤度の軽減、または発生の遅延が含まれる。治療的使用では、有益または所望の結果には、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、高血糖症、高インスリン血症、空腹時血糖異常、耐糖能異常、異常脂質血症、もしくは代謝症候群の１つもしくは複数の症状の低下、疾患を処置するために必要な他の医薬の用量の減少、別の医薬の効果の増強、および／または患者の疾患の進行の遅延などの臨床結果が含まれる。有効用量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物とは、予防的または治療処置を直接または間接的に達成するために十分な量である。臨床的な場面で理解されているように、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成してもしなくてもよい。したがって、「有効用量」は、１つまたは複数の治療剤の投与の場面で考慮してよく、１つまたは複数の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合は、単一の薬剤を有効量で投与することを検討し得る。
【００６０】
「個体」または「対象」とは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。また、哺乳動物には、それだけには限定されないが、家畜（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットも含まれる。
【００６１】
本明細書中で使用する「ベクター」とは、１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を宿主細胞内に送達し、好ましくは発現させることができる構築体を意味する。ベクターの例には、それだけには限定されないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などの特定の真核細胞が含まれる。
【００６２】
本明細書中で使用する「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写する核酸配列に作動可能に連結されている。
【００６３】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わせた場合に、成分が生物活性を保持することを許容し、対象の免疫系と反応しない、任意の材料が含まれる。例には、それだけには限定されないが、リン酸緩衝溶液、水、油／水乳濁液などの乳濁液、および様々な種類の湿潤剤等の標準の製薬担体のいずれかが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与のために好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または正常（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の慣用方法によって配合される（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ、１９９０およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。
【００６４】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｎ」とは、抗体と抗原との会合の速度定数をいう。具体的には、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数は、完全長抗体および／またはＦａｂ抗体断片（すなわち一価）ならびにグルカゴン受容体を使用して測定する。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｆｆ」とは、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数をいう。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、抗体−抗原の相互作用の平衡解離定数をいう。
【００６７】
本明細書中で「約」の値またはパラメータへの言及には、その値またはパラメータ自体に向けられた実施形態が含まれる（かつそれを記述する）。たとえば、「約Ｘ」に言及する記述には「Ｘ」の記述が含まれる。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。
【００６８】
本明細書中で「含む」という言葉を用いて実施形態を記述する場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的にある」に関して記述されている、そうでなければ類似の実施形態も提供されることを理解されたい。
【００６９】
マーカッシュ群または代替物の他の群分けに関して本発明の態様または実施形態が記述されている場合、本発明には、列挙されている群全体を総じてのみでなく、群のそれぞれのメンバーの個々および主群のすべての可能な部分群、ならびに主群から群のメンバーのうちの１つまたは複数が欠如しているものも包含される。また、本発明は、特許請求される発明中の群のメンバーのうちの任意の１つまたは複数の明確な排除も想定している。
【００７０】
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が支配する。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述した整数または整数群の包含を暗示するが、任意の他の整数または整数群の排除を暗示するものではないと理解されたい。文脈によってそうでないと要求されない限りは、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。用語「たとえば（ｅ．ｇ．）」または「たとえば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の例（複数可）は、網羅的または限定であることを意図しない。
【００７１】
例示的な方法および材料を本明細書中に記述したが、本明細書中に記載のものに類似または均等である方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および例は例示的のみであり、限定することを意図しない。
【００７２】
グルカゴン受容体によって媒介される状態を予防または処置する方法
本明細書中では、治療上有効な量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体を個体に投与することを含む、それを必要としている個体において血中グルコースを低下させる方法を提供する。
【００７３】
また、治療上有効な量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体を個体に投与することを含む、それを必要としている個体において耐糖能を改善する方法も提供する。
【００７４】
また、それを必要としている個体に、有効量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体を投与することを含む、個体においてグルカゴン受容体によって媒介される状態を処置もしくは予防する方法も提供する。一部の実施形態では、状態はＴ１Ｄである。他の実施形態では、状態はＴ２Ｄである。他の実施形態では、状態は高血糖症である。他の実施形態では、状態は高インスリン血症である。他の実施形態では、状態は空腹時血糖異常である。他の実施形態では、状態は耐糖能異常である。他の実施形態では、状態は異常脂質血症である。他の実施形態では、状態は代謝症候群である。
【００７５】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の治療的投与は、より低い血清グルコースを有利にもたらす。好ましくは、血清グルコースは、投与前よりも少なくとも約１０％または１５％低い。より好ましくは、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも約２０％低い。さらにより好ましくは、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも３０％低い。有利なことに、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも４０％低い。より有利なことに、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも５０％低い。非常に好ましくは、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも６０％低い。最も好ましくは、血清グルコースは、抗体を投与する前よりも少なくとも７０％低い。
【００７６】
Ｔ２Ｄを患っている、またはその危険性にある個体を、抗グルカゴン受容体拮抗抗体で処置することができる。抗グルカゴン受容体拮抗抗体治療に適した個体は、当分野で周知のＴ２Ｄの臨床基準および予後的指標を使用して選択される。Ｔ２Ｄの重篤度の評価は、たとえば、絶食血漿グルコース試験、偶発血漿グルコース試験、経口糖負荷試験、食後２時間試験、ランダム血糖、糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）試験、尿試験、散瞳検査、および足の検査を含めた、当分野で知られている試験に基づいて行い得る。一部の実施形態では、Ｔ２Ｄおよび／またはＴ２Ｄの症状の寛解、調節、発生率の低下、または発生もしくは進行の遅延は、絶食血漿グルコース試験によって測定する。
【００７７】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の治療的投与は、たとえば、高血糖症、口渇の増加、空腹感の増加、口渇、頻尿、原因不明の体重減少、疲労、かすみ目、頭痛、意識喪失、網膜症、腎臓損傷、血液循環不良、神経損傷、感染症の増加、潰瘍、嘔気、嘔吐、および下痢を含めた、Ｔ２Ｄの１つまたは複数の症状の発生率の低下および／または寛解を有利にもたらす。
【００７８】
Ｔ１Ｄを患っている、またはその危険性にある個体を、抗グルカゴン受容体拮抗抗体で処置することができる。抗グルカゴン受容体拮抗抗体治療に適した個体は、当分野で周知のＴ１Ｄの臨床基準および予後的指標を使用して選択される。Ｔ１Ｄの重篤度の評価は、たとえば、Ａ１Ｃ試験、絶食血漿グルコース試験、経口糖負荷試験、ランダム血漿グルコース試験、フルクトサミン試験、ケトンの試験、および尿試験を含めた、当分野で知られている試験に基づいて行い得る。一部の実施形態では、Ｔ１Ｄおよび／またはＴ１Ｄの症状の寛解、調節、発生率の低下、または発生もしくは進行の遅延は、絶食血漿グルコース試験によって測定する。
【００７９】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の治療的投与は、たとえば、高血糖症、口渇の増加、空腹感の増加、口渇、頻尿、原因不明の体重減少、疲労、かすみ目、頭痛、意識喪失、網膜症、腎臓損傷、血液循環不良、神経損傷、感染症の増加、潰瘍、嘔気、嘔吐、下痢、刺痛、知覚麻痺、手または足の疼痛、皮膚の乾燥、皮膚の痒み、および治癒が遅い痛みを含めた、Ｔ１Ｄの１つまたは複数の症状の発生率の低下および／または寛解を有利にもたらす。
【００８０】
本明細書中に記載のすべての方法に関して、抗グルカゴン受容体拮抗抗体への言及には、１つまたは複数の追加の薬剤を含む組成物も含まれる。これらの組成物は、当分野で周知である緩衝剤を含めた薬学的に許容できる賦形剤などの適切な賦形剤をさらに含み得る。本発明は、単独で、または他の処置方法と組み合わせて使用することができる。
【００８１】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、任意の適切な経路を介して個体に投与することができる。当業者には、本明細書中に記載の例は限定することを意図せず、利用可能な技法を例示するものであることが明らかであろう。したがって、一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、静脈内投与などの既知の方法に従って、たとえば、ボーラスとしてもしくは一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液内、ガス注入を介して、くも膜下腔内、経口、吸入、または外用の経路によって、個体に投与する。投与は、全身性、たとえば静脈内投与であるか、または局所的であり得る。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた、液体配合物用の市販の噴霧器が投与に有用である。液体配合物は直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧することができる。あるいは、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、炭化フッ素配合物および定量吸入器を使用してエアロゾル化するか、または凍結乾燥および粉砕した粉末として吸入することができる。
【００８２】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、部位特異的または標的化された局所送達技法を介して投与する。部位特異的または標的化された局所送達技法の例には、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の様々な埋め込み型デポー源、または輸液カテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテルなどの局所送達カテーテル、人工血管移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み型装置、部位特異的担体、直接注入、あるいは直接塗布が含まれる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【００８３】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体の様々な配合物を投与に使用し得る。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体はニートで投与し得る。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体および薬学的に許容できる賦形剤が様々な配合物中にあり得る。薬学的に許容できる賦形剤は当分野で知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。たとえば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与える、または希釈剤として役割を果たすことができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、容積モル浸透圧濃度を変化させるための塩、カプセル封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透促進剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤および配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に記載されている。
【００８４】
一部の実施形態では、これらの薬剤は、注入による投与（たとえば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）のために配合されている。したがって、これらの薬剤を生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できるビヒクルと組み合わせることができる。具体的な投薬レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、具体的な個体およびその個体の病歴に依存する。
【００８５】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、注入（たとえば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によるものを含めた任意の適切な方法を使用して投与することができる。また、抗グルカゴン受容体抗体は、本明細書中に記載のように外用または吸入を介して投与することもできる。一般に、抗グルカゴン受容体抗体の投与には、初期候補用量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的のために、典型的な１日用量は、上述した要因に応じて、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇから３００μｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれより多くのいずれかの範囲であり得る。たとえば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの用量を使用し得る。数日間またはそれより長くにわたる繰り返し投与には、状態に応じて、症状の所望の抑制が起こるまで、またはたとえばグルカゴン関連障害に関連する症状を低下させるために十分な治療的レベルが達成されるまで、処置を持続させる。この治療の進行は、慣用技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を含む）は時間とともに変化することができる。
【００８６】
本発明の目的のために、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の適切な用量は、用いる抗グルカゴン受容体拮抗抗体（またはその組成物）、処置する症状の種類および重篤度、薬剤を予防的または治療的目的のどちらで投与するか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する応答、患者の血糖値、患者のグルコースの合成およびクリアランス速度、患者の投与した薬剤のクリアランス速度、ならびに担当医の裁量に依存する。典型的には、臨床家は、所望の結果をもたらす用量に達するまで抗グルカゴン受容体拮抗抗体を投与する。用量および／または頻度は処置の間に変化する場合がある。一般に、半減期などの経験的検討事項が用量の決定に貢献する。たとえば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系に適合性のある抗体を使用して、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを予防し得る。投与の頻度は治療の間に決定および調節してよく、必ずしもではないが、一般には症状の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の持続的な連続放出配合物が適切であり得る。持続放出をもたらすための様々な配合物および装置が当分野で知られている。
【００８７】
一実施形態では、拮抗抗体の用量は、拮抗抗体の１回または複数回の投与を与えられた個体において経験的に決定し得る。個体に漸増用量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体を与える。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。
【００８８】
本発明の方法に従った抗グルカゴン受容体拮抗抗体の投与は、たとえば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に知られている他の要因に応じて、連続的または断続的であり得る。抗グルカゴン受容体拮抗抗体の投与は、事前に選択した期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔を空けた投薬であり得る。
【００８９】
一部の実施形態では、複数の抗グルカゴン受容体拮抗抗体が存在し得る。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる拮抗抗体、またはそれより多くの拮抗抗体が存在することができる。一般に、これらの抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、互いに有害な影響を与えない相補的活性を有し得る。また、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、他の抗体および／または他の治療と併せて使用することもできる。また、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。
【００９０】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、１つまたは複数の追加の治療剤の投与と組み合わせて投与し得る。これらには、それだけには限定されないが、ｍＴＯＲ阻害剤、メグリチニド（たとえば、レパグリニド、ナテグリニドなど）、スルホニル尿素（たとえば、グリピジド、グリメピリド、グリブリドなど）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤（たとえば、サキサグリプチン、シタグリプチン、リナグリプチンなど）、ビグアニド（たとえば、メトホルミンなど）、チアゾリジンジオン（たとえば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）、アルファグルコシダーゼ阻害剤（たとえば、アカルボース、ボグリボース、ミグリトールなど）、アミリン模倣体（たとえばｓｙｍｌｉｎ）、および内分泌物模倣体（たとえば、ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（登録商標）、リラグルチドなど）の投与が含まれる。追加の処置には、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（プラムリンチド）などの注射可能な処置が含まれる。
【００９１】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、たとえば、それだけには限定されないが、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、および／またはＡＴＰ競合的ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）などの１つまたは複数のｍＴＯＲ阻害剤と併せて使用する。一部の実施形態では、ＴＫＩは、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、ＫＵ００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＯＳＩ−０２７、ＡＺＤ−８０５５、ＫＵ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−１、Ｗｙｅｔｈ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−２、ＸＬ−３８８、ＩＮＫ−１２８、および／またはＡＺＤ−２０１４である。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、および／または二糖阻害剤と併せて使用する。あるいは、治療は、数分間から数週間の範囲の間隔によって他の薬剤処置の前または後であり得る。他の薬剤および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドを別々に投与する実施形態では、一般に、薬剤および本発明の組成物が対象に対して依然として有利に組み合わさった効果を発揮することができるように、それぞれの送達の間に著しい期間があかないことを確実にするであろう。そのような事例では、どちらの様式も互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に投与し得ることが企図される。しかし、一部の状況では、それぞれの投与に間に数日間（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過してしまう場合は、投与の期間を顕著に延長することが望ましい場合がある。
【００９２】
一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体組成物は、非スルホニル尿素分泌促進物質、インスリン、インスリン類似体、エキセンディン−４ポリペプチド、ベータ３アドレナリン受容体作用剤、ＰＰＡＲ作用剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、スタチンおよびスタチン含有物の組合せ、コレステロール取り込みおよび／または胆汁酸再吸収の阻害剤、ＬＤＬ−コレステロール拮抗剤、コレステリルエステル転送タンパク質拮抗剤、エンドセリン受容体拮抗剤、成長ホルモン拮抗剤、インスリン増感剤、アミリン模倣体または作用剤、カンナビノイド受容体拮抗剤、グルカゴン様ペプチド−１作用剤、メラノコルチン、ならびにメラニン凝集ホルモン受容体作用剤からなる群から選択される第２の薬剤を含む。
【００９３】
本発明に従って使用する抗グルカゴン受容体拮抗抗体の治療用配合物は、所望の度合の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）と混合することによって、凍結乾燥した配合物または水溶液の形態で貯蔵用に調製する。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、塩化ナトリウムなどの塩、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
【００９４】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの、当分野で知られている方法によって調製する。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号中に開示されている。特に有用なリポソームは、逆相蒸発方法によって、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて作製することができる。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【００９５】
また、活性成分は、たとえば、コアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロ乳濁液にて捕捉させてもよい。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
【００９６】
持続放出調製物を調製し得る。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、造形品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７  エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、酢酸スクロースイソブチレート、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する配合物は無菌的でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。治療用抗グルカゴン受容体拮抗抗体組成物は、一般に、無菌的なアクセス口を備えた容器、たとえば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを備えた静脈内溶液のバッグまたはバイアル内に入れる。
【００９８】
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入による投与のために、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐薬などの単位剤形であり得る。
【００９９】
錠剤などの固体組成物の調製には、主活性成分を、製薬担体、たとえば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの慣用の錠剤化成分、および他の製薬希釈剤、たとえば水と混合して、本発明の化合物、または無毒性の薬学的に許容できるその塩の均質な混合物を含有している固体プレフォーミュレーション組成物を形成する。これらのプレフォーミュレーション組成物を均質と言及する場合は、組成物を錠剤、丸薬、およびカプセルなどの等しく有効な単位剤形へと容易に細分割し得るように、活性成分が組成物全体にわたって均等に分散されていることを意味する。その後、この固体プレフォーミュレーション組成物を、約０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上述の種類の単位剤形へと細分割する。新規組成物の錠剤または丸薬は、長期作用の利点をもたらす剤形を提供するために、コーティングまたは他の様式で配合することができる。たとえば、錠剤または丸薬は、内部用量および外部用量の構成成分を含むことができ、後者が前者を覆うエンベロープの形態である。２つの構成成分は、胃内での分解に耐え、内部構成成分が無傷で十二指腸内まで通る、またはその放出が遅延されることを可能にする役割を果たす腸溶層によって隔てることができる。様々な材料をそのような腸溶層またはコーティングに使用することができ、そのような材料には、いくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
【０１００】
適切な界面活性剤には、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（たとえばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）および他のソルビタン（たとえばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）などの非イオン性薬剤が含まれる。界面活性剤を有する組成物は０．０５〜５％の界面活性剤を好都合に含み、０．１〜２．５％であり得る。必要に応じて、たとえばマンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルなどの他の成分を加え得ることが理解されよう。
【０１０１】
適切な乳濁液は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳濁液を使用して調製し得る。活性成分は、事前に混合した乳濁組成物に溶かし得るか、または、油（たとえば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、もしくはアーモンド油）中に溶かし、リン脂質（たとえば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、もしくはダイズレシチン）および水と混合した際に乳濁液を形成し得る。乳濁液の等張性を調節するために他の成分、たとえばグリセロールまたはグルコースを加え得ることを理解されたい。適切な乳濁液は、典型的には２０％まで、たとえば５〜２０％の油を含有する。脂肪乳濁液は、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含み、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。
【０１０２】
乳濁組成物は、抗グルカゴン受容体拮抗抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものであり得る。
【０１０３】
吸入またはガス注入のための組成物には、薬学的に許容できる水性溶媒もしくは有機溶媒またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が含まれる。液体または固体組成物は、上述の適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所または全身性の効果のために経口または経鼻の呼吸器経路によって投与する。好ましくは無菌的な薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、ガスを使用することによって噴霧化し得る。噴霧化した溶液は、噴霧化装置から直接呼吸し得る、または噴霧化装置をフェイスマスク、テント、もしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付け得る。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、好ましくは経口または経鼻で、配合物を適切な様式で送達する装置から投与し得る。
【０１０４】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体
本発明の方法は、グルカゴン受容体によって媒介される下流事象を含めたグルカゴン受容体の生物活性を遮断する、抑制する、または低下させる（顕著に低下させることを含む）抗グルカゴン受容体拮抗抗体を使用する。抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、任意の以下のうちの１つまたは複数の特徴を示すべきである：（ａ）グルカゴン受容体との結合および下流のシグナル伝達事象の遮断、（ｂ）グルカゴン受容体とのグルカゴン結合の遮断、（ｃ）アデニル酸シクラーゼ活性化の遮断、（ｄ）細胞内ｃＡＭＰの増加の遮断、（ｅ）グリコーゲン分解の遮断、（ｆ）糖新生の遮断、ならびに（ｇ）肝臓のグルコース産生の遮断。
【０１０５】
本発明の目的のために、抗体は、好ましくは、グルカゴン受容体のシグナル伝達機能を阻害する様式で、グルカゴン受容体と反応する。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は霊長類のグルカゴン受容体を特異的に認識する。
【０１０６】
本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（たとえばドメイン抗体）、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含めた、所要の特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変立体配置を包含することができる。抗体は、ネズミ、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラもしくはヒト化抗体を含む）であり得る。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０１０７】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、当分野で知られている任意の方法によって作製し得る。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的技法は当分野で知られているおよび／または本明細書中に記載されている。
【０１０８】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、グルカゴン受容体の生物活性の低下、寛解、または中和が検出および／または測定される、当分野で知られている方法を使用して同定または特徴づけることができる。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、候補薬剤をグルカゴン受容体と共にインキュベートし、結合および／または付随するグルカゴン受容体の生物活性の低下もしくは中和をモニタリングすることによって同定する。結合アッセイは、たとえば、精製したグルカゴン受容体ポリペプチド（複数可）、またはグルカゴン受容体ポリペプチド（複数可）を天然に発現する細胞（たとえば様々な株）、もしくは発現するように形質移入した細胞を用いて行い得る。一実施形態では、結合アッセイは競合的結合アッセイであり、グルカゴン受容体結合について既知の抗グルカゴン受容体拮抗抗体と競合する候補抗体の能力を評価する。アッセイは、ＥＬＩＳＡ様式を含めた様々な様式で行い得る。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、候補抗体をグルカゴン受容体と共にインキュベートし、結合をモニタリングすることによって同定する。
【０１０９】
初期同定後、候補抗グルカゴン受容体拮抗抗体の活性は、標的の生物活性を試験することで知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞または細胞毒性アッセイを使用して候補抗グルカゴン受容体拮抗抗体をさらに特徴づける。たとえば、候補抗体を、グルカゴン受容体を発現するＣＨＯ細胞と共にインキュベーションし、グルカゴンを加え、細胞内ｃＡＭＰレベルをモニタリングする。あるいは、バイオアッセイを使用して候補を直接スクリーニングすることができる。
【０１１０】
本発明の抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、以下のうちの１つまたは複数の特徴を示す：（ａ）グルカゴン受容体との結合および下流のシグナル伝達事象の遮断、（ｂ）グルカゴン受容体とのグルカゴン結合の遮断、（ｃ）アデニル酸シクラーゼ活性化の遮断、（ｄ）細胞内ｃＡＭＰの増加の遮断、（ｅ）グリコーゲン分解の遮断、（ｆ）糖新生の遮断、ならびに（ｇ）肝臓のグルコース産生の遮断。好ましくは、抗グルカゴン受容体抗体はこれらの特徴のうちの２つ以上を有する。より好ましくは、抗体は特徴のうちの３つ以上を有する。より好ましくは、抗体は特徴のうちの４つ以上を有する。より好ましくは、抗体は特徴のうちの５つ以上を有する。より好ましくは、抗体は特徴のうちの６つ以上を有する。最も好ましくは、抗体は７つの特徴をすべて有する。
【０１１１】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体は、当分野で周知の方法を使用して特徴づけ得る。たとえば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。たとえばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌの第１１章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９９９に記載されているように、抗体−抗原複合体の結晶構造の分析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含めて、タンパク質上のエピトープの位置のマッピングおよび特徴づけを行うために数多くの方法が当分野で知られている。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗グルカゴン受容体拮抗抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給者、たとえば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から販売されている。エピトープは、直線状エピトープ、すなわち単一のアミノ酸ストレッチ中に含有されるもの、または必ずしも単一のストレッチ中に含有されていない場合があるアミノ酸の三次元の相互作用によって形成されるコンホメーションエピトープであり得る。様々な長さのペプチド（たとえば少なくとも４〜６個のアミノ酸の長さ）を単離または合成して（たとえば組換えによる）、抗グルカゴン受容体拮抗抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体が結合するエピトープは、グルカゴン受容体配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗グルカゴン受容体拮抗抗体による結合を決定することによる系統的なスクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、グルカゴン受容体をコードしているオープンリーディングフレームをランダムにまたは特定の遺伝子構築物によって断片化し、発現されたグルカゴン受容体断片の、試験する抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、たとえば、ＰＣＲによって生成し、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、放射性アミノ酸の存在下で転写してタンパク質へと翻訳し得る。その後、抗体と放射標識したグルカゴン受容体断片との結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定する。また、特定のエピトープは、ファージ粒子（ファージライブラリ）または酵母（酵母ディスプレイ）の表面上に提示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリを使用して同定することもできる。あるいは、簡単な結合アッセイにおいて、重複ペプチド断片の定義されたライブラリを、試験抗体との結合について試験することができる。さらなる例では、抗原の突然変異誘発、ドメインスワッピング実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発を行って、エピトープ結合に要求される、十分および／または必要な残基を同定することができる。たとえば、アラニンスキャニング突然変異誘発実験は、グルカゴン受容体ポリペプチドの様々な残基がアラニンで置き換えられている突然変異グルカゴン受容体を使用して行うことができる。抗体と突然変異グルカゴン受容体との結合��評価することによって、抗体結合に対する特定のグルカゴン受容体残基の重要性を評価することができる。
【０１１２】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体を特徴づけるために使用できるさらに別の方法は、同じ抗原と結合することが知られている他の抗体、すなわちグルカゴン受容体の様々な断片を用いた競合アッセイを使用して、抗グルカゴン受容体拮抗抗体が他の抗体と同じエピトープと結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは当業者に周知である。
【０１１３】
グルカゴン受容体に対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体の結合親和性（ＫＤ）は約０．００１〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。
【０１１４】
したがって、本発明は、以下のいずれか、あるいは、表１Ａもしくは１Ｂ中に見つかる部分的な軽鎖配列および部分的な重鎖配列を有する抗体、またはその変異体を含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する。表１Ａおよび１Ｂ中、下線を引いた配列はＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太字の配列はＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ配列である。
【０１１５】
【表１−１】
2016520058.tif 000003
【０１１６】
【表１−２】
2016520058.tif 000004
【０１１７】
【表１−３】
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【０１１８】
【表１−４】
2016520058.tif 000006
【０１１９】
【表１−５】
2016520058.tif 000007
【０１２０】
【表１−６】
2016520058.tif 000008
【０１２１】
【表１−７】
2016520058.tif 000009
【０１２２】
【表１−８】
2016520058.tif 000010
【０１２３】
また、本発明は、グルカゴン受容体に対する抗体のＣＤＲ部分も提供する。ＣＤＲ領域の決定は十分に当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの組合せであり得ることが理解されよう（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）。本明細書中でＣＤＲの「コンホメーション定義」と呼ぶ別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー貢献を行う残基として同定し得る。たとえばＭａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。一般に、「コンホメーションＣＤＲ」には、抗体が特定の抗原と結合するために正しいループ構造を維持するために束縛されている、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲおよびバーニアゾーン中の残基位置が含まれる。コンホメーションＣＤＲの決定は十分に当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、または接触ＣＤＲである。言い換えれば、複数のＣＤＲを有する実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、接触ＣＤＲのいずれか、またはその組合せであり得る。
【０１２４】
一部の実施形態では、抗体は、表１Ａまたは１Ｂ中に示す重鎖可変領域のうちの任意の１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１Ａまたは１Ｂ中に示す軽鎖可変領域のうちの任意の１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１Ａまたは１Ｂ中に示す重鎖可変領域のうちの任意の１つの３つのＣＤＲ、および表１Ａまたは１Ｂ中に示す軽鎖可変領域のうちの任意の１つの３つのＣＤＲを含む。
【０１２５】
表２Ａおよび２Ｂは、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体拮抗抗体のＣＤＲ配列の例を提供する。
【０１２６】
【表２−１】
2016520058.tif 000011
【０１２７】
【表２−２】
2016520058.tif 000012
【０１２８】
【表２−３】
2016520058.tif 000013
【０１２９】
一部の実施形態では、抗体は、表２Ｂからの３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲを含む。表２Ｂに示す変異体からのコンセンサス配列は以下の通りである：軽鎖可変領域ＣＤＲ１：Ｘ１ＡＳＱＮＸ２ＲＸ３  ＡＸ４Ｘ５［式中、Ｘ１はＫまたはＲであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、Ｘ４はＶまたはＬであり、Ｘ５はＶまたはＮである（配列番号９０）］。軽鎖可変領域ＣＤＲ２：ＬＡＸ１ＮＲＨ  Ｘ２［式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＳまたはＧである（配列番号９１）］。軽鎖可変領域ＣＤＲ３：Ｘ１ＱＨＷＸ２ＹＰＦＸ３［式中、Ｘ１はＬまたはＱであり、Ｘ２はＴまたはＳであり、Ｘ３はＴまたはＳである（配列番号９２）］。重鎖可変領域ＣＤＲ２：ＷＩＮＸ１ＥＸ２ＤＥＸ３Ｘ４ＹＡＸ５Ｘ６ＦＸ７Ｇ［式中、Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＴまたはＳであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、Ｘ５はＤまたはＱであり、Ｘ６はＤまたはＮであり、Ｘ７はＫまたはＱである（配列番号９３）］。重鎖可変領域ＣＤＲ３：ＳＲＧＷＸ１ＹＧＰＰＤＸ２［式中、Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＶである（配列番号９４）］。
【０１３０】
一部の実施形態では、抗体は、Ｃ末端リシンを有するもしくは有さない完全長重鎖、および／または抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５の完全長軽鎖を含む。ｍＡｂ５完全長重鎖のアミノ酸配列（配列番号８７）を以下に示す。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＦＳＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＥＴＤＥＴＳＹＡＤＤＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＳＲＹＷＳＹＧＰＰＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８７）
【０１３１】
Ｃ末端リシンを有さないｍＡｂ５完全長重鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＦＳＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＥＴＤＥＴＳＹＡＤＤＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＳＲＹＷＳＹＧＰＰＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８８）
【０１３２】
ｍＡｂ５完全長軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８９）を以下に示す。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＩＲＴＡＶＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＲＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＨＷＴＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８９）
【０１３３】
また、本発明は、抗グルカゴン受容体拮抗抗体を生成、選択、および作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当分野で知られている手順によって作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、当分野で知られている任意の方法を使用して、組換えによって作製し、発現させ得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって調製および選択し得る。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５、１９９４を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３、１９９０）を使用して、ヒト抗体および抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子をＭ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードしている遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な様式で行うことができ、総説には、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４〜５７１、１９９３を参照されたい。Ｓｅｖｅｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８、１９９１は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから単離した。ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原の多様なアレイ（自己抗原を含む）に対する抗体を、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７、１９９１またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２：７２５〜７３４、１９９３に記載の技術に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化の一部は高い親和性を与え、続く抗原チャレンジ中に高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製および分化される。この天然のプロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技法を用いることによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３、１９９２）。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、続いて、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化していないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）で置き換えることによって改善することができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能となる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「究極のライブラリ」としても知られる）を作製するための戦略が、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。また、遺伝子シャフリングを使用してげっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもでき、ヒト抗体は開始げっ歯類抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリント」としても呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えて、げっ歯類−ヒトのキメラを創製する。抗原に対する選択は、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域の単離をもたらす、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配（インプリント）する。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスを繰り返した場合に、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。従来のＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体のヒト化とは異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有さない、完全にヒトである抗体を提供する。
【０１３５】
一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して作製し得る。ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞を操作して、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を生成するための基礎として役割を果たすことができることが企図される。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、本明細書中にさらに記述されているように、抗体の刺激および生成における確立された慣用技術を順守する。典型的には、宿主動物は、本明細書中に記載のものを含めた一定量の免疫原を用いて、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内で接種する。
【０１３６】
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１、１９８２によって改変されたものを使用して調製することができる。それだけには限定されないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏからのものを含めた、利用可能な骨髄腫系をハイブリダイゼーションに使用し得る。一般に、この技法は、ポリエチレングリコールなどの融合誘導剤を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞をリンパ球細胞と融合させることを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的成長培地中で成長させてハイブリダイズしていない親細胞を排除する。血清を補充したまたは含まない、本明細書中に記載の培地のいずれかを使用して、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養することができる。細胞融合技法の別の代替法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本発明のグルカゴン受容体モノクローナル抗体を生成し得る。所望する場合は、ハイブリドーマまたは他の不死化Ｂ細胞を拡大およびサブクローニングし、上清を、慣用の免疫アッセイ手順（たとえば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイする。
【０１３７】
抗体の供給源として使用し得るハイブリドーマには、グルカゴン受容体に特異的なモノクローナル抗体、またはその一部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞が包含される。
【０１３８】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、既知の手順を使用して成長させ得る。モノクローナル抗体は、培養培地または体液から、所望する場合は硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの慣例の免疫グロブリン精製手順によって、単離し得る。望ましくない活性が存在する場合は、たとえば、調製物を固相に付着させた免疫原から構成される吸着剤上に流し、所望の抗体を免疫原から外して溶出または放出させることによって除去することができる。免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ科動物サイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤とコンジュゲーションさせたグルカゴン受容体ポリペプチド、または標的アミノ酸配列を含有する断片を用いた、二官能性剤または誘導体化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である］を使用した、宿主動物の免疫化により、抗体集団（たとえばモノクローナル抗体）を得ることができる。
【０１３９】
所望する場合は、目的の抗グルカゴン受容体拮抗抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定し、その後、発現または増殖のためにポリヌクレオチド配列をベクター内にクローニングし得る。目的の抗体をコードしている配列は宿主細胞中のベクター内に維持されていてよく、その後、宿主細胞を拡大し、将来使用するために凍結することができる。細胞培養物中での組換えモノクローナル抗体の産生は、当分野で知られている手段による、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングによって実施することができる。たとえば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９、１１２、米国特許第７，３１４，６２２号を参照されたい。
【０１４０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列を、抗体を「ヒト化する」ため、抗体の親和性もしくは他の特徴を改善するための遺伝子操作に使用し得る。また、抗体を、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおいて使用するためにカスタマイズしてもよい。
【０１４１】
一部の実施形態では、完全にヒトの抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販のマウスを使用することによって得られ得る。また、より望ましい（たとえば完全にヒトの抗体）またはより頑強な免疫応答を生じるように設計されているトランスジェニック動物も、ヒト化またはヒト抗体の作製に使用し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｆｒｅｍｏｎｔ）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）からのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０１４２】
抗体は、最初に抗体および抗体産生細胞を宿主動物から単離し、遺伝子配列を得て、遺伝子配列を使用して抗体を宿主細胞（たとえばＣＨＯ細胞）中で組換え発現させることによって組換え作製し得る。用い得る別の方法は、抗体配列を植物（たとえばタバコ）またはトランスジェニック乳中に発現させることである。植物または乳で抗体を組換え発現させる方法は開示されている。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６、２００１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：６５、１９９５、ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７、１９９９を参照されたい。抗体の誘導体、たとえば、ドメイン、単鎖などを作製する方法は当分野で知られている。
【０１４３】
また、免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー分別技法も、グルカゴン受容体に特異的な抗体を単離するために用いることができる。
【０１４４】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、慣用の手順を使用して（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役割を果たす。単離した後、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターなど）内に入れてよく、その後、これを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞内に形質移入させて、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。たとえばＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号を参照されたい。また、ＤＮＡは、たとえば、相同的なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１、１９８４、または、免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体または一部を共有結合させることによっても改変し得る。このようにして、本明細書中に記載のグルカゴン受容体モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製し得る。
【０１４５】
抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、上述のような組換え方法（すなわち、単一または融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０個までのアミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって便利に作製される。化学合成方法は当分野で知られており、商業的に利用可能である。たとえば、抗体を、固相方法を用いた自動ポリペプチド合成機によって生成することができる。米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第６，３３１，４１５号も参照されたい。
【０１４６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ＬＭ１、ＬＭ２、ＬＭ３、ＬＭ４、ＬＭ６、ＬＭ７、ＬＭ８、ＬＭ９、ＬＭ１１、ＨＭ４、ＨＭ６、ＨＭ７、ＨＭ８、ＨＭ１１、またはＨＭ１２の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードしている配列を含む。目的の抗体をコードしている配列を宿主細胞内のベクター中に維持してよく、その後、宿主細胞を拡大して将来使用するために凍結することができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書中にさらに記載されている。
【０１４７】
本発明には親和性成熟された実施形態が含まれる。たとえば、親和性成熟された抗体は、当分野で知られている手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５８１８４号）。
【０１４８】
以下の方法を、抗体の親和性の調節およびＣＤＲの特徴づけに使用し得る。抗体のＣＤＲを特徴づけるおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更する（たとえば改善する）１つの方法は、「ライブラリスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリスキャニング突然変異誘発は以下のように機能する。当分野で認識されている方法を使用して、ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置を２個以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個など）のアミノ酸で置き換える。これにより小さなクローンライブラリが生じ（一部の実施形態では、分析したそれぞれのアミノ酸位置について１つ）、そのそれぞれが２つ以上のメンバーの複雑度を有する（それぞれの位置で２個以上のアミノ酸を置換した場合）。一般に、ライブラリにはネイティブ（未置換の）アミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリからの少数のクローン、たとえば約２０〜８０個のクローン（ライブラリの複雑度に応じる）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、結合が増加した、同じ、減少した、または結合なしの候補を同定する。結合親和性を決定する方法は当分野で周知である。結合親和性は、たとえば、約２倍以上の結合親和性の差を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）バイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）免疫アッセイ、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して決定し得る。また、結合親和性は、適切なバイオアッセイを使用してもスクリーニングし得る。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、開始抗体が既に比較的高い親和性、たとえば約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合に特に有用である。
【０１４９】
一部の実施形態では、当分野で認識されている突然変異誘発方法（その一部は本明細書中に記載されている）を使用して、ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置（一部の実施形態では１個ずつ）を２０個すべての天然アミノ酸で置き換える。これにより小さなクローンライブラリが生じ（一部の実施形態では、分析したそれぞれのアミノ酸位置について１つ）、そのそれぞれが２０個のメンバーの複雑度を有する（それぞれの位置で２０個すべてのアミノ酸を置換した場合）。
【０１５０】
一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリは、同じＣＤＲまたは２つ以上のＣＤＲ中であり得る２つ以上の位置に置換を含む。したがって、ライブラリは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリは、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ中に見つかる３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの位置に置換を含み得る。置換は、冗長性の低いコドンを使用して調製し得る。たとえばＢａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８の表２を参照されたい。
【０１５１】
ＣＤＲは重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３であり得る。ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、拡張ＣＤＲ、ＡｂＭ  ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、またはコンホメーションＣＤＲであり得る。
【０１５２】
改善された結合を有する候補を配列決定してもよく、それによりＣＤＲ置換突然変異体が同定され、これにより改善された親和性（「改善された」置換とも呼ばれる）がもたらされる。結合する候補も配列決定してよく、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換が同定される。
【０１５３】
複数回のスクリーニングを実施し得る。たとえば、改善された結合を有する候補（それぞれが、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む）は、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示した、ＣＤＲ中のアミノ酸位置）に少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリの設計にも有用である。このライブラリの調製およびスクリーニングまたは選択は、以下にさらに記載されている。
【０１５４】
また、改善された結合、同じ結合、減少した結合、または結合なしのクローンの頻度が、抗体−抗原の複合体の安定性におけるそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供することに限って言えば、ライブラリスキャニング突然変異誘発は、ＣＤＲを特徴づけるための手段も提供する。たとえば、ＣＤＲの位置が、２０個のアミノ酸すべてに変えた場合に結合を保持する場合、その位置は抗原結合に必要である可能性が低い位置として同定される。逆に、ＣＤＲの位置が数パーセントの置換でのみ結合を保持する場合、その位置はＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリスキャニング突然変異誘発方法は、数多くのアミノ酸（２０個すべてのアミノ酸を含む）に変えることができるＣＤＲ中の位置、および変えることができないまたは数個のアミノ酸にしか変えることができないＣＤＲ中の位置に関する情報を生成する。
【０１５５】
改善された親和性を有する候補を第２のライブラリ中で組み合わせてよく、これには、改善されたアミノ酸、その位置での元のアミノ酸が含まれ、また、所望されるライブラリの複雑度、または所望のスクリーニングもしくは選択方法を使用して許容されるライブラリの複雑度に応じて、その位置での追加の置換がさらに含まれ得る。さらに、所望する場合は、隣接するアミノ酸位置を少なくとも２個以上のアミノ酸へとランダム化することができる。隣接アミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲ中に追加のコンホメーションの柔軟性を許容する場合があり、立ち代ってこれは、より多数の改善突然変異の導入を容易にするまたは促進し得る。また、ライブラリは、１回目のスクリーニングにおいて改善された親和性を示さなかった位置での置換も含み得る。
【０１５６】
Ｋｉｎｅｘａ（商標）バイオセンサー分析を使用したスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた当分野で知られている任意の選択方法を使用した選択を含めた、当分野で知られている任意の方法を使用して、第２のライブラリを、改善および／または変更された結合親和性を有するライブラリメンバーについてスクリーニングまたは選択する。
【０１５７】
本発明の抗グルカゴン受容体抗体を発現させるために、上述の方法のいずれかを使用して、ＶＨおよびＶＬ領域をコードしているＤＮＡ断片を最初に得ることができる。また、当業者に知られている標準の方法を使用して、様々な改変、たとえば、突然変異、欠失、および／または付加をＤＮＡ配列内に導入することもできる。たとえば、ＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有するように突然変異させたヌクレオチドをＰＣＲプライマー内に取り込ませるＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの標準の方法を使用して、突然変異誘発を実施することができる。
【０１５８】
本発明には、表１に示す可変領域への改変および表２Ａまたは２Ｂに示すＣＤＲへの改変が包含される。たとえば、本発明には、その特性に顕著な影響を与えない機能的に等価な可変領域およびＣＤＲを含む抗体、ならびに増強もしくは減少した活性および／または親和性を有する変異体が含まれる。たとえば、アミノ酸配列を突然変異させて、グルカゴン受容体に対して所望の結合親和性を有する抗体が得られ得る。ポリペプチドの改変は当分野において日常的な実施であり、本明細書中に詳述する必要はない。改変ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性に顕著に有害な変化を与えないアミノ酸またはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟（増強）させるアミノ酸の１つまたは複数の欠失または付加、あるいは化学的類似体の使用が含まれる。
【０１５９】
アミノ酸配列の挿入には、１個の残基から数百個またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１個または複数のアミノ酸残基配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合された抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮまたはＣ末端と血液循環中の抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドとの融合が含まれる。
【０１６０】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されている。置換突然変異誘発において最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、フレームワークの変更も企図される。保存的置換は、表３中に「保存的置換」の見出しの下示されている。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、表３中に「例示的な置換」と命名する、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載するより実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
【０１６１】
【表３】
2016520058.tif 000014
【０１６２】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）たとえばβシートもしくはヘリックスコンホメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされる。
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負電荷）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正電荷）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１６３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスで交換することによって行われる。
【０１６４】
たとえば、行い得る１つの種類の置換は、抗体中の化学的に反応性があり得る１つまたは複数のシステインを、それだけには限定されないがアラニンまたはセリンなどの別の残基に変えることである。たとえば、カノニカルでないシステインの置換が存在することができる。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中、または抗体の定常領域中で行うことができる。一部の実施形態では、システインはカノニカルである。また、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋結合を防止するために、抗体の正しいコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、一般にセリンで置換し得る。逆に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を改善するためにシステイン結合（複数可）を抗体に加え得る。
【０１６５】
また、たとえば抗体の結合特性を変更するために、抗体をたとえば重および／または軽鎖の可変ドメイン中で改変してもよい。可変領域中の変化は、結合親和性および／または特異性を変更する場合がある。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲドメイン内で行う。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲドメイン内で行う。たとえば、グルカゴン受容体に対する抗体のＫＤを増加もしくは減少させるため、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を変更するために、突然変異をＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数中で行い得る。部位特異的突然変異誘発の技法は当分野で周知である。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。
【０１６６】
また、抗グルカゴン受容体抗体の半減期を増加させるために、改変または突然変異をフレームワーク領域または定常領域中に行ってもよい。たとえばＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０号を参照されたい。また、フレームワーク領域または定常領域中の突然変異は、抗体の免疫原性を変更するため、別の分子との共有もしくは非共有結合の部位を提供するため、または補体結合、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの特性を変更するために行うこともできる。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換をフレームワーク領域または定常領域中で行う。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換をフレームワーク領域または定常領域中で行う。本発明によれば、単一の抗体が、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のうちの任意の１つもしくは複数中、または定常領域中に突然変異を有し得る。
【０１６７】
また、修飾体には、グリコシル化されたポリペプチドおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびにたとえば様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。抗体は、その定常領域中の保存的位置でグリコシル化されている（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）ならびに糖タンパク質部分間の分子内相互作用に影響を与え、これは、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示された三次元表面に影響を与える場合がある（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）。また、オリゴ糖は、特定の認識構造に基づいて所定の糖タンパク質を特定の分子に標的化させる役割を果たし得る。また、抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。具体的には、分岐ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を用いてＣＨＯ細胞によって産生させた抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
【０１６８】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のどちらかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に付着することをいう。トリペプチド配列はアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システインであり、式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素的付着するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの糖のうちの１つがヒドロキシアミノ酸に付着することをいい、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０１６９】
グリコシル化部位を抗体に付加することは、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加すること、またはそれによって置換することによっても行い得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０１７０】
また、抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を変更せずに変更してもよい。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。組換え糖タンパク質、たとえば抗体を潜在的な治療剤として発現させるために使用する細胞種がネイティブ細胞であることは稀なため、抗体のグリコシル化パターンの変動は予測できる（たとえばＨｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０１７１】
宿主細胞の選択肢に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を与える要因には、成長モード、培地配合、培養密度、酸素付加、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するために、オリゴ糖産生に関与している特定の酵素の導入または過剰発現を含めた様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号、および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、たとえばエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種類の多糖のプロセッシングに欠陥があるように遺伝子操作することができる。これらおよび同様の技法は当分野で周知である。
【０１７２】
他の改変方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含めた、当分野で知られているカップリング技法の使用が含まれる。改変は、たとえば、免疫アッセイのために標識を付着させるために使用することができる。改変ポリペプチドは当分野における確立された手順を使用して作製され、また、その一部が以下および実施例中に記述されている当分野で知られている標準のアッセイを使用してスクリーニングすることができる。
【０１７３】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体に対して増加もしくは減少した結合親和性を有する改変定常領域を含み、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性であり、たとえば、補体媒介性溶解を始動させない、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない、または、補体媒介性溶解の指導、ＡＤＣＣの刺激、またはミクログリアの活性化のうちの任意の１つまたは複数において活性が低下している（未改変の抗体と比較して）。定常領域の様々な改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成し得る。たとえば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４、１９９５、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜４９６９、１９９６、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４、２０００、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、１９８９、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、および／またはＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように改変する。
【０１７４】
一部の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体と補体および免疫系との相互作用を回避するために、抗体定常領域を改変することができる。そのような抗体を調製するための技法はＷＯ９９／５８５７２号に記載されている。たとえば、臨床治験および処置において使用する抗体がヒトである場合は、免疫応答を回避するために、定常領域をヒト定常領域により似せるために操作し得る。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＦｃはヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４であり得る。Ｆｃは、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１の突然変異を含有するヒトＩｇＧ２であり得（ＩｇＧ２Δａ）、アミノ酸残基は野生型ＩｇＧ２配列を参照して付番されている。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。一部の実施形態では、抗体はＥ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５の突然変異を含むＩｇＧ４（ＩｇＧ４Δｃ）の定常領域を含み（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０、５８５〜５９３）、付番は野生型ＩｇＧ４を参照している。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、Ｇ２３６の欠失を有するヒトＩｇＧ４  Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５である（ＩｇＧ４Δｂ）。別の実施形態では、Ｆｃは、ヒンジ安定化突然変異であるＳ２２８からＰ２２８を含有する任意のヒトＩｇＧ４  Ｆｃである（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、またはＩｇＧ４Δｃ）（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０５、９〜１９）。
【０１７６】
さらに他の実施形態では、定常領域はＮ結合型グリコシル化について非グリコシル化である。一部の実施形態では、定常領域は、定常領域中のオリゴ糖付着残基および／またはＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化である。たとえば、Ｎ−グリコシル化部位であるＮ２９７を、たとえばＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨへと突然変異させ得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、１９８９、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域はＮ結合型グリコシル化について非グリコシル化である。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去するなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞中で発現させることによって、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化であってよい。
【０１７７】
他の抗体の改変には、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域の全体または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、顕著な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を始動させずに標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインはＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で改変された抗体は、慣用の抗体治療に対する炎症性および他の有害な反応を回避して、慢性抗体治療で使用するために特に適している。
【０１７８】
一部の実施形態では、抗体は、未改変の抗体と比較してＦｃＲｎに対する増加した結合親和性および／または増加した血清半減期を有する改変定常領域を含む。
【０１７９】
「生殖系列化」として知られるプロセスでは、ＶＨおよびＶＬ配列中の特定のアミノ酸を、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中に天然に見つかるものに一致するように突然変異させることができる。具体的には、抗体を投与した際の免疫原性の危険性を低下させるために、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を、生殖系列配列と一致するように突然変異させることができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当分野で知られている（たとえば「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照。また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８、およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６を参照）。
【０１８０】
行い得る別の種類のアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または定常領域中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体産物における不均一性の危険性を減少させ、したがってその均一性を増加させ得る。別の種類のアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン−グリシンの対を排除することであり、これは、一方または両方の残基を変更することによって行う。別の例では、本発明の抗グルカゴン受容体抗体の重鎖のＣ末端リシンを切断することができる。本発明の様々な実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体の重鎖および軽鎖には、シグナル配列が任意選択で含まれていてもよい。
【０１８１】
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片を、たとえば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと変換するために、標準の組換えＤＮＡ技法によってさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードしている別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用する用語「作動可能に連結している」とは、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームに保たれるように結合されていることを意味することを意図する。
【０１８２】
ＶＨ領域をコードしている単離したＤＮＡは、ＶＨをコードしているＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、完全長重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られており（たとえばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などの、様々な個体の間で生じることが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプのいずれかであり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を表す。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子には、ＶＨをコードしているＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０１８３】
ＶＬ領域をコードしている単離したＤＮＡは、ＶＬをコードしているＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）へと変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られており（たとえばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。カッパ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）などの、様々な個体の間で生じることが知られている様々な対立遺伝子のいずれかであり得る。ラムダ定常領域は、３つのラムダ遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０１８４】
ｓｃＦｖ遺伝子を創製するためには、ＶＨおよびＶＬ配列を、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟なリンカーによって結合された連続した単鎖タンパク質として発現させることができるように、ＶＨおよびＶＬをコードしているＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードしている別の断片に作動可能に連結させる（たとえば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４を参照されたい）。連結ペプチドの一例は（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１８）であり、これは一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計かつ使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記）。立ち代って、リンカーは薬物の付着または固体支持体への付着などの追加の機能について改変することができる。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみを使用した場合は一価であり、２つのＶＨおよびＶＬを使用した場合は二価であり、または、２つより多くのＶＨおよびＶＬを使用した場合は多価であり得る。グルカゴン受容体および別の分子と特異的に結合する二重特異性または多価抗体を作製し得る。単鎖変異体は、組換えまたは合成のいずれかによって生成することができる。ｓｃＦｖの合成生成には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などの真核、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核のいずれかの適切な宿主細胞内に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの日常的な操作によって作製することができる。生じるｓｃＦｖは、当分野で知られている標準のタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
【０１８５】
また、ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディとは二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを使用することで、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合することを強制して２つの抗原結合部位を創製する（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。
【０１８６】
また、２つの共有結合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染症を処置するために使用されている（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００３６０号およびＷＯ９２／２００３７３号、ＥＰ０３０８９号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合方法を使用して作製し得る。適切な架橋結合剤およびその技法は当分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１８７】
また、キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋結合剤を含むものを含めた、合成タンパク質化学の既知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製し得る。たとえば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【０１８８】
また、本発明には、本明細書中に開示した抗体からの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含される。一部の実施形態では、別のポリペプチドと連結した本発明の抗グルカゴン受容体抗体の全体または一部分を含む融合抗体を作製し得る。別の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体の可変ドメインのみがポリペプチドと連結している。別の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体のＶＨドメインは第１のポリペプチドと連結している一方で、抗グルカゴン受容体抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるような様式で第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドと連結している。別の好ましい実施形態では、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによってＶＬドメインから隔てられている。その後、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を目的のポリペプチドと連結させる。さらに、２つ（以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を創製することができる。これは、単一のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価の抗体を創製したい場合、または二重特異性抗体を創製したい場合に有用である。
【０１８９】
一部の実施形態では、配列番号２、４、６、８、１０、もしくは４２に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、および／または配列番号３、５、７、９、１１、もしくは４３に示す可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２と３、４と５、６と７、８と９、１０と１１、および４２と４３から選択される配列対のいずれかに示される、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドはＶＨ  ＣＤＲ３および／またはＶＬ  ＣＤＲ３を含む。本発明の目的のために、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体と、ネイティブ分子中ではそれが付着していない別のアミノ酸配列、たとえば異種配列または別の領域からの相同配列とを含有する。例示的な異種配列には、それだけには限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。タグは当分野で周知である。
【０１９０】
融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば合成または組換えによって創製することができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書中に記載の組換え方法を使用して、それらをコードしているポリヌクレオチドを調製および発現させることによって作製されるが、たとえば化学合成を含めた当分野で知られている他の手段によっても調製し得る。
【０１９１】
他の実施形態では、核酸分子をコードしている抗グルカゴン受容体抗体を使用して、他の改変抗体を調製し得る。たとえば、標準の分子生物学的技法を使用し、明細書の教示に従って、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上記）、または「ヤヌシン」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）、７：５１〜５２）を調製し得る。
【０１９２】
たとえば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である二重特異性抗体を、本明細書中に開示されている抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を作製する方法は当分野で知られている（たとえばＳｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０を参照）。たとえば、二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生成することができる。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。従来は、二重特異性抗体の組換え産生は、２本の重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５３９）。さらに、二重特異性抗体を「ダイアボディ」または「ヤヌシン」として形成し得る。一部の実施形態では、二重特異性抗体はグルカゴン受容体の２つの異なるエピトープと結合する。一部の実施形態では、上述の改変抗体は、本明細書中で提供する抗グルカゴン受容体抗体からの可変ドメインまたはＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数を使用して調製する。
【０１９３】
二重特異性抗体を作製するための一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常領域配列と融合させる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とのものである。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合体のうちの少なくとも１つ中に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望する場合は免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主生物内に同時形質移入させる。これにより、構築に使用する３つのポリペプチド鎖の不均等な比が最適な収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチド断片の共通の割合の調節において大幅な柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現がより高い収率をもたらす場合、または比は特に重要でない場合は、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０１９４】
一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアーム中にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第２の結合特異性を提供する）とから構成されている。免疫グロブリン軽鎖を二重特異性分子の半分のみにしか有さないこの不斉構造が、所望の二重特異性化合物を望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にする。この手法はＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０号に記載されている。
【０１９５】
また、本発明は、固体支持体へのカップリングを促進する薬剤（ビオチンまたはアビジンなど）とコンジュゲーション（たとえば連結）させた抗体を含む組成物も提供する。平易にするために、一般に、これらの方法は本明細書中に記載のグルカゴン受容体結合および／または拮抗剤の実施形態のいずれかに適用されるという理解で抗体に言及する。一般に、コンジュゲーションとは、これらの構成成分を本明細書中に記載のように連結させることをいう。連結（一般に、少なくとも投与のためにこれらの構成成分を近位の会合に固定すること）は、多数の方法で達成することができる。たとえば、薬剤および抗体がそれぞれ互いと反応することができる置換基を有する場合は、それらの間の直接反応が可能である。たとえば、一方上にあるアミノまたはスルフヒドリル基などの求核基が、他方上にある酸無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基、または良好な脱離基（たとえばハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる場合がある。
【０１９６】
抗体は、多数の様々な担体と結合させることができる。担体は活性および／または不活性であり得る。周知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然セルロースおよび変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のどちらかであり得る。当業者は、抗体を結合するための他の適切な担体を知っている、または日常的な実験を使用してそれを確認することができるであろう。一部の実施形態では、担体は、肺、心臓、または心臓弁を標的とする部分を含む。
【０１９７】
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子、または当分野で知られている任意の他の標識などの標識剤と連結させ得る。（直接または間接的に）シグナルを一般にもたらす標識は、当分野で知られている。
【０１９８】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
また、本発明は、たとえばエフェクター機能が損なわれた抗体などの、本明細書中に記載の抗体断片および改変抗体を含めた抗体のいずれかをコードしているポリヌクレオチドも提供する。別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている手順によって作製および発現させることができる。したがって、本発明は、以下のいずれかをコードしているポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む、医薬組成物を含めた組成物を提供する：抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ＬＭ１、ＬＭ２、ＬＭ３、ＬＭ４、ＬＭ６、ＬＭ７、ＬＭ８、ＬＭ９、ＬＭ１１、ＨＭ４、ＨＭ６、ＨＭ７、ＨＭ８、ＨＭ１１、およびＨＭ１２、またはグルカゴン受容体を拮抗する能力を有する任意の断片もしくはその一部。
【０１９９】
また、任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子と一対一の様式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよいが、そうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料と連結していてもよいが、そうである必要はない。
【０２００】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体もしくはその断片をコードしている内在性配列）を含み得るか、またはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、コードされているポリペプチドの免疫反応性がネイティブの免疫反応性分子と比較して消失しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に本明細書中に記載のように評価し得る。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその断片をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％同一性を示す。
【０２０１】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大一致についてアラインメントした際に同じである場合に「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較し、配列類似の局所領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続した位置、通常は３０〜約７５個、または４０〜約５０個のセグメントをいい、配列と同じ数の連続した位置の参照配列とを最適にアラインメントした後にそれらを比較し得る。
【０２０２】
比較のために配列の最適アラインメントは、生物情報学ソフトウェアスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のＬａｚｅｒｇｅｎｅ（登録商標）中のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して、初期設定パラメータを使用して実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献中に記載のいくつかのアラインメントスキームを統合している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣ、第５巻、補遺３、ページ３４５〜３５８のＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、ページ６２６〜６４５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．、１１：１０５、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４：４０６〜４２５、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：７２６〜７３０。
【０２０３】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まないもの）と比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウサイズ）で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算する。
【０２０４】
また、またはその代わりに、変異体は、ネイティブ遺伝子、またはその一部分もしくは補体に実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。
【０２０５】
適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で前洗浄することと、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でハイブリダイズさせることと、次いで、６５℃で２０分間、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれで２回洗浄することとが含まれる。
【０２０６】
本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、
（１）洗浄に低イオン強度および高温を用いるもの、たとえば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド、たとえば５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、４２℃を用いるもの、または、（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン、４２℃を用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミドの洗浄、次いで、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものである。当業者には、プローブの長さなどの要因に順応するために必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調節するかが理解されるであろう。
【０２０７】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載の１つのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が数多く存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、どのネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列とも最小限の相同性しか有さない。それにもかかわらず、コドン使用頻度の相違が原因で変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中で提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果変更されている内在性遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、そうである必要はない。対立遺伝子は、標準の技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定し得る。
【０２０８】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成方法は当分野で周知であり、本明細書中に詳述する必要はない。当業者は、本明細書中で提供する配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【０２０９】
組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するためには、本明細書中にさらに記述されているように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、ベクターは、複製および増幅のための適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。細胞は、外来性ポリヌクレオチドを、直接取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、Ｆ接合、または電気穿孔によって導入することによって形質転換させる。導入後、外来性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されるか、宿主細胞ゲノム内に組み込ませることができる。このようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当分野において周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０２１０】
あるいは、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号、および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
【０２１１】
ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。その後、細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される際、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に記載の当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
【０２１２】
適切なクローニングベクターは、標準の技法に従って構築し得るか、または当分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択し得る。選択されるクローニングベクターは使用を意図する宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有しており、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有していてよく、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を保有していてよい。適切な例にはプラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多数の他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの市販の供給業者から入手可能である。
【０２１３】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターとは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡと一体化した部分として、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが含まれる。ベクターの構成成分には、一般に、それだけには限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれ得る：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドンなどの１つまたは複数の翻訳制御要素が通常必要である。
【０２１４】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえばベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入するための選択肢は、多くの場合は宿主細胞の特徴に依存する。
【０２１５】
また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的で使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）など）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、対応する内在性抗体または目的タンパク質が宿主細胞中に存在する場合は、それよりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。グルカゴン受容体またはグルカゴン受容体ドメインとの特異的結合について宿主細胞をスクリーニングすることは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって達成する。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０２１６】
発現ベクターは、抗グルカゴン受容体拮抗抗体の発現を指示するために使用することができる。当業者は、外来性タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を得るために発現ベクターを投与することに精通している。たとえば、米国特許第６，４３６，９０８号、第６，４１３，９４２号、および第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および外用投与を含めた、局所または全身投与が含まれる。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠状動脈、心房、心室、もしくは心膜内に直接投与する。
【０２１７】
また、発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、たとえば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２、Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。また、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡも、遺伝子治療プロトコル中に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルはウイルス起源または非ウイルス起源のものであり得る（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１、Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５、Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５、およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照）。そのようなコード配列の発現は、内在性哺乳動物または異種プロモーターを使用して導入することができる。コード配列の発現は、構成的または調節性のどちらかであり得る。
【０２１８】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞中での発現のためのウイルスに基づくベクターは当分野で周知である。例示的なウイルスに基づくビヒクルには、それだけには限定されないが、組換えレトロウイルス（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６号、ＷＯ９４／０３６２２号、ＷＯ９３／２５６９８号、ＷＯ９３／２５２３４号、ＷＯ９３／１１２３０号、ＷＯ９３／１０２１８号、ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５、２１９，７４０号、および第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１号、ならびにＥＰ特許第０  ３４５  ２４２号を参照）、アルファウイルスに基づくベクター（たとえば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号、ＷＯ９３／１９１９１号、ＷＯ９４／２８９３８号、ＷＯ９５／１１９８４号、およびＷＯ９５／００６５５号を参照）が含まれる。また、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載の、死滅させたアデノウイルスと連結したＤＮＡの投与も用いることができる。
【０２１９】
また、それだけには限定されないが、死滅させたアデノウイルス単独と連結したまたはしていないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（たとえばＣｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照）、リガンドと連結したＤＮＡ（たとえばＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（たとえば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４号、ＷＯ９６／１７０７２号、ＷＯ９５／３０７６３号、およびＷＯ９７／４２３３８号を参照）、および核電荷中和または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス送達ビヒクルおよびその方法も用いることができる。また、裸ＤＮＡも用いることができる。例示的な裸ＤＮＡの導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして役割を果たすことができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６号、ＷＯ９４／２３６９７号、ＷＯ９１／１４４４５号、およびＥＰ０５２４９６８号に記載されている。さらなる手法が、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
【０２２０】
組成物
また、本発明は、有効量の本明細書中に記載の抗グルカゴン受容体抗体を含む医薬組成物も提供する。また、そのような組成物の例、およびどのように配合するかも、本明細書中に記載されている。一部の実施形態では、組成物は１つまたは複数のグルカゴン受容体抗体を含む。他の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体はグルカゴン受容体を認識する。他の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体はヒト抗体である。他の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなどの所望の免疫応答を始動させることができる定常領域を含む。他の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなどの所望しないまたは望ましくない免疫応答を始動させない定常領域を含む。他の実施形態では、抗グルカゴン受容体抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または一部の実施形態では６つすべてのＣＤＲなど）を含む。
【０２２１】
組成物は、複数の抗グルカゴン受容体抗体（たとえば、グルカゴン受容体の様々なエピトープを認識するグルカゴン受容体抗体の混合物）を含むことができることが理解されよう。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する複数の抗グルカゴン受容体抗体、またはグルカゴン受容体の様々なエピトープと結合する様々な種類の抗グルカゴン受容体抗体を含む。一部の実施形態では、組成物は、グルカゴン受容体の様々な変異体を認識する抗グルカゴン受容体抗体の混合物を含む。
【０２２２】
本発明において使用する組成物は、凍結乾燥した配合物または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含むことができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、用量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容できる賦形剤を本明細書中にさらに記載する。
【０２２３】
また、抗グルカゴン受容体抗体およびその組成物は、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。
【０２２４】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む、医薬組成物を含めた組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体のいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【０２２５】
キット
また、本発明は、本明細書中に記載の抗体のいずれかまたはすべてを含むキットも提供する。本発明のキットには、本明細書中に記載の抗グルカゴン受容体拮抗抗体を含む１つまたは複数の容器と、本明細書中に記載の本発明の方法のいずれかに従った使用説明書とが含まれる。一般に、これらの説明書は、上述した治療処置のための抗グルカゴン受容体拮抗抗体の投与の説明を含む。一部の実施形態では、単一用量の投与単位を生成するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を含む第１の容器および水性配合物を含む第２の容器をどちらも含有することができる。特定の実施形態では、単一および複数チャンバの事前に満たされたシリンジ（たとえば液体シリンジおよび分散シリンジ）を含有するキットが含まれる。
【０２２６】
一部の実施形態では、抗体はヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。抗グルカゴン受容体抗体の使用に関する説明書には、意図する処置のための用量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルク包装（たとえば複数用量の包装）または副単位用量であり得る。本発明のキット中に供給される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（たとえばキットに含まれる紙シート）上の書面の説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（たとえば磁気または光学記憶ディスク上に保持される説明書）も許容される。
【０２２７】
本発明のキットは適切に包装されている。適切な包装には、それだけには限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（たとえば密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれる。また、吸入器、経鼻投与装置（たとえば噴霧器）、またはミニポンプなどの輸液装置等の特定の装置と組み合わせて使用するための包装も企図される。キットは無菌的なアクセス口を備えていてよい（たとえば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを備えた静脈内溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。また、容器も、無菌的なアクセス口を備えていてよい（たとえば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを備えた静脈内溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は抗グルカゴン受容体抗体である。容器は第２の製薬的な活性薬剤をさらに含み得る。
【０２２８】
キットは、緩衝液および解釈用の情報などの追加の構成成分を任意選択で提供し得る。通常、キットは容器および容器に付随させたラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０２２９】
生物学的受託
本発明の代表的な材料は、２０１３年１月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  １０８０１、２０１１０−２２０９に受託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１６４を有するベクターｍＡｂ５−ＬＣはｍＡｂ５の軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１６５を有するベクターｍＡｂ５−ＨＣはｍＡｂ５の重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドである。特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約およびその下位規定（ブダペスト条約）の規定の下に受託を行った。これにより、受託から３０年間の間、受託物の生きた培養物の維持が保証される。受託物はブダペスト条約の条件の下にＡＴＣＣによって利用可能となり、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意に従う。これにより、関連する米国特許が発行された際、または任意の米国もしくは外国特許出願が公開された際のいずれか早い方において、受託物の培養物の子孫の公衆への永久的かつ無制限の利用可能性が確実となり、また、米国特許第１２２条およびそれに準ずる長官の規定（米国特許法施行規則第１．１４条が含まれ、８８６  ＯＧ  ６３８を具体的に参照）に従ってその権利を有すると米国特許商標庁長官に判断された者に、子孫の利用可能性が確実となる。
【０２３０】
本出願の譲受人は、受託されている材料の培養物が、適切な条件下で培養した場合に死滅または喪失または損なわれた場合は、通知された際に材料を即座に同じものと交換することに同意している。受託した材料の利用可能性は、任意の政府の権力の下、その特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施するための認可であるとして解釈されるべきでない。
【０２３１】
以下の実施例は例示目的でのみ提供し、いかなる様式でも本発明の範囲限定することを意図しない。実際に、前述の説明から、本明細書中に示し記載したものに加えて、本発明の様々な改変が当業者に明らかとなり、これらは添付の特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【０２３２】
（実施例１）
抗体動力学および結合親和性の決定
本実施例では、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）グルカゴン受容体に対する、抗グルカゴン受容体抗体の抗体動力学および結合親和性の決定を例示する。
【０２３３】
抗ヒトＦｃセンサーチップは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップのすべてのフローセルを、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）の混合物を用いて７分間、１０μＬ／分の流速で活性化することによって調製した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で５０μｇ／ｍＬまで希釈し、すべてのフローセル上に７分間、２０μＬ／分で注入した。すべてのフローセルを、１５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５中の１００ｍＭのエチレンジアミンを用いて７分間、１０μＬ／分で遮断した。この固定手順用のランニング緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ｐＨ７．４であった。
【０２３４】
以下の動力学実験を、２５℃および３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのランニング緩衝液を使用して行った。
【０２３５】
すべての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）上で行った。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）グルカゴン受容体細胞外ドメインヒトＦｃ融合タンパク質を、下流フローセル（それぞれフローセル２、３）上に、２μｇ／ｍＬ、１０μＬ／分の流速で３分間捕捉した。フローセル１はブランク参照表面として使用した。グルカゴン受容体Ｆｃ融合タンパク質の捕捉後、分析物（緩衝液またはｍＡｂ５  Ｆａｂ）を３０μＬ／分ですべてのフローセル上に２分間注入した。複数のｍＡｂ５  Ｆａｂ分析物の濃度を試験した。ｍＡｂ５  Ｆａｂ分析物の濃度は０．１６、０．８、４、２０、および１００ｎＭであった。分析物の注入後、解離を１０分間（２０ｎＭおよび１００ｎＭのｍＡｂ５  Ｆａｂ分析物試料）または３０秒間（０．１６、０．８、および４ｎＭのｍＡｂ５  Ｆａｂ分析物試料）の間モニタリングした。緩衝液分析物サイクルについて、解離を３０秒間および１０分間の間モニタリングした。分析物の結合および解離の後、４回の１分間の７５ｍＭのリン酸の注入を用いてすべてのフローセルを再生した。センサーグラムのデータは曲線の当てはめの前に二重参照した（二重参照はＭｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、１２：２７９〜２８４に記載のとおりである）。二重参照したセンサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、物質移行結合モデルを用いた単純な１：１のラングミュアーに全体的に当てはめた。抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５とヒトおよびｃｙｎｏのグルカゴン受容体との結合の結合親和性データを、以下の表４に示す。
【０２３６】
【表４】
2016520058.tif 000015
【０２３７】
（実施例２）
細胞に基づく機能的アッセイ
本実施例では、ヒトグルカゴン受容体を発現する細胞における、グルカゴンシグナル伝達に対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５の効果を例示する。
【０２３８】
本研究では、ヒトグルカゴン受容体を用いて安定に形質移入したＣＨＯ細胞系におけるｃＡＭＰシグナル伝達を、ＬＡＮＣＥ（登録商標）ｃＡＭＰキット（カタログ＃ＡＤ０２６２Ｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して測定した。細胞を９６ウェルプレートに加え、段階希釈したｍＡｂ５と共にインキュベーションした。その後、細胞を２００ｐＭのグルカゴン（カタログ＃２２４５６、ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．）で３０分間、室温（ＲＴ）で刺激した。その後、検出抗体を加え、１０分間ＲＴでインキュベーションした。その後、供給されている検出緩衝液を用いて細胞を溶解し、暗所で３時間、ＲＴでインキュベーションした。その後、プレートをＶＩＣＴＯＲ３（商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ）で読み取った。結果を図１に示す。このアッセイの読み取りは標識した外来性ｃＡＭＰ（６６５ｎｍで測定）と標識していない内在的に産生されたｃＡＭＰとの間の競合に基づいているため、より高いシグナルは、細胞によって産生されたｃＡＭＰがより少ないことを示す。ｍＡｂ５は用量依存的な様式でｃＡＭＰの産生を阻害する（図１）。
【０２３９】
これらの結果は、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５が、グルカゴン刺激後にグルカゴン受容体媒介性のｃＡＭＰの増加を阻害することを実証している。
【０２４０】
（実施例３）
カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、カニクイザルにおける、グルカゴンチャレンジ後の血漿グルコースレベルに対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体の効果を例示する。
【０２４１】
動物へのグルカゴンの静脈内ボーラスの投与は、肝臓でのグルカゴンシグナル伝達の結果として血漿グルコースの上昇をもたらす。抗グルカゴン受容体拮抗抗体がこの血漿グルコースの上昇を阻害するかどうかを決定するために、抗グルカゴン受容体拮抗抗体またはＰＢＳのどちらかを与えたナイーブな雌のカニクイザルにおいてグルカゴンチャレンジを行った。グルカゴンチャレンジは、サルにおいて２回の別々の機会に行った。１回目のグルカゴンチャレンジは、サルに３ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内用量のｍＡｂ５または同体積のＰＢＳ（ベースライン）のどちらかを与える５日前に行い、２回目のグルカゴンチャレンジは、サルにｍＡｂ５の投薬またはＰＢＳを与えた１時間後に行った。
【０２４２】
それぞれのグルカゴンチャレンジについて、２０μｇ／ｋｇのグルカゴンの静脈内ボーラス（ＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標）Ｈｙｐｏｋｉｔｓ（登録商標））を０時点に投与した。以下の時点で血液試料をすべての動物から採取した：チャレンジ前、ならびにチャレンジの５、１５、３０、４５、６０、および１２０分後。臨床用化学分析器を使用して、血漿試料を血漿グルコース濃度について分析した。平均絶対的グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）＋／−ＳＥＭおよびＡＵＣ（経時的な血漿グルコース偏位を反映する曲線下面積）を表５に示す。
【０２４３】
【表５】
2016520058.tif 000016
【０２４４】
グルカゴンチャレンジの１時間前に３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した動物の平均血漿グルコース濃度は、チャレンジ前では７８．８３＋／−５．４４であり、チャレンジの５分後では９２．００＋／−４．８８ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの１５分後では８１．３３＋／−５．５４ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの３０分後では６９．００＋／−４．６６ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの４５分後では６３．８３＋／−２．３６ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの６０分後では６３．１７＋／−３．１５ｍｇ／ｄＬであった（表５）。対照的に、グルカゴンチャレンジの１時間前にＰＢＳを投与した動物の平均血漿グルコース濃度は、チャレンジ前では８４．５＋／−４．３６であり、チャレンジの５分後では１０９．０＋／−６．９８ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの１５分後では１１８．５＋／−９．７９ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの３０分後では１０７．１７＋／−１２．３０ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの４５分後では９８．３３＋／−１２．０８ｍｇ／ｄＬであり、チャレンジの６０分後では９２．６７＋／−１２．６４ｍｇ／ｄＬであった（表５）。したがって、グルカゴンチャレンジ後、血漿グルコースレベルは、ＰＢＳ対照と比較して抗グルカゴン受容体拮抗抗体Ｍａｂ５で処置した動物において実質的に低い。
【０２４５】
これらの結果は、グルカゴンチャレンジ後に抗グルカゴン受容体拮抗抗体がグルコース偏位を有効に遮断することを実証している。
【０２４６】
（実施例４）
処置後の肝機能の分析
本実施例では、高用量のｍＡｂ５グルカゴン受容体遮断ｍＡｂを用いた慢性処置の効果を例示する。
【０２４７】
ヒトにおける以前の臨床データにより、グルカゴン受容体低分子拮抗剤を用いた４週間の処置が、特定の肝機能検査（ＬＦＴ）、具体的にはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（ＬＹおよびＭＫ）の上昇をもたらす場合があることが実証されている。たとえばＥｎｇｅｌ，Ｓ．ら、２０１１、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＭＫ０８９３，ａ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ」、ＡＤＡ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍを参照されたい。そのような変化が、グルカゴン受容体を低分子の代わりにモノクローナル抗体で遮断した長期処置の後に明白であるかどうかに取り組むために、研究を実施して、カニクイザルにおいてこれらのＬＦＴパラメータに対する週に１回の静脈内ボーラス用量のｍＡｂ５の効果を４週間にわたって評価した。
【０２４８】
上記実施例３に示すように、カニクイザルにおいて、単一用量の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５がグルカゴンチャレンジ後にグルコース偏位を有効に阻害する。肝機能研究では、常に完全に遮断されていることを確実にするために１００ｍｇ／ｋｇの用量を選択した。３匹の細身のナイーブな雌サルに、１、８、１５、および２２日目に１００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を与えた。対照として、３匹の細身のナイーブな雌サルに、１、８、１５、および２２日目にＩＶボーラスのＰＢＳ対照を与えた。絶食血清試料を両群からのすべての動物から、７、１４、２１、および２９日目に採取し、ベースライン、すなわち研究の開始前（−６日目）に同じ動物から採取した処置前の試料に対して比較した。また、臨床用化学分析器を使用して、ＡＬＴおよびＡＳＴに加えてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）も測定した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、およびＧＧＴ試験の結果を図２および３に示し、以下の表６に要約する。
【０２４９】
【表６】
2016520058.tif 000017
【０２５０】
表６は、ベースライン（−６日目）および研究の終わり（２９日目）でのこれらのパラメータの平均（＋／−ＳＥＭ）値を示す。表６に見られるように、ＰＢＳ対照動物およびベースライン群の動物と比較して、ｍＡｂ５で処置した動物（最後の列）において測定されたＬＦＴパラメータのどれにも顕著な変化がなかった。
【０２５１】
これらの結果は、高用量のｍＡｂ５グルカゴン受容体遮断抗体を用いた慢性処置が肝機能に有害でないことを実証している。
【０２５２】
（実施例５）
処置後の循環脂質レベルの分析
本実施例では、高用量のＡｂ５グルカゴン受容体遮断ｍＡｂを用いた慢性処置が、カニクイザルにおいて血漿脂質の変化を誘発しないことを例示する。
【０２５３】
ヒトにおける以前の臨床データにより、グルカゴン受容体低分子拮抗剤を用いた４週間の処置が、ＬＤＬ−コレステロールレベル（ＭＫ）の用量依存的な１０〜１７％の上昇に関連していたことが実証されている。たとえばＲｕｄｄｙ，Ｍ．ら、２０１１、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ＭＫ０８９３，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ（Ｔ２ＤＭ）」、ＡＤＡ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍを参照されたい。そのような変化が、グルカゴン受容体を低分子の代わりにモノクローナル抗体で遮断した長期処置の後に明白であるかどうかに取り組むために、研究を実施して、カニクイザルにおいて、週に１回の静脈内ボーラス用量のｍＡｂ５の後の、ＬＤＬ−Ｃおよび他の循環脂質（総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、およびトリグリセリド）に対する効果を４週間にわたって評価した。
【０２５４】
３匹の細身のナイーブな雌サルに、１、８、１５、および２２日目に１００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を与えた。対照には、３匹の細身のナイーブな雌サルに、同じ時点でＩＶボーラスのＰＢＳ対照を与えた。絶食血清試料を両群からのすべての動物から、７、１４、２１、および２９日目に採取し、ベースライン、すなわち研究の開始前に同じ動物から採取した処置前の試料（−６日目）に対して比較し、臨床用化学分析器を使用して脂質を測定した。本研究からのデータを表７に要約し、図４および５に示す。
【０２５５】
【表７】
2016520058.tif 000018
【０２５６】
表７は、ベースライン（−６日目）および研究の終わり（２９日目）でのこれらのパラメータの平均（＋／−ＳＥＭ）値を示す。図４および５は、−６、７、１４、２１、および２９日目での、対照およびｍＡｂ５で処置した動物における血漿脂質レベルを示す。ＰＢＳ対照動物およびベースライン群の動物と比較した場合に、ｍＡｂ５で処置した動物において測定された循環脂質パラメータのどれにも変化が観察されなかった。
【０２５７】
これらの結果は、高用量のｍＡｂ５抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた慢性処置が上昇したＬＤＬ−コレステロールに関連していないことを実証している。
【０２５８】
（実施例６）
２型糖尿病のマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、２型糖尿病のマウスモデルにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた処置を例示する。
【０２５９】
絶食させたマウスにおけるグルコースの腹腔内ボーラスの投与（グルコースチャレンジ）は、血漿グルコースの著しい上昇、次いでクリアランス期間をもたらす。絶食血漿グルコースレベル、すなわちチャレンジの直前、および投与したグルコース負荷を処理する能力がどちらも、高脂肪食給餌のＤＩＯ（食餌性肥満）マウスでは損なわれていた。抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３を用いたこれらの動物の事前処置を、以下のように実施した：６週齢から開始して、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝５匹／群）に高脂肪食を給餌した（「ＨＦＤ」、４０ｋｃａｌ％の脂肪）。１２週齢から、マウスはＨＦＤを続け、第１の群には週に１回の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３の腹腔内注射を与えた一方で、第２の群には同様の体積のＰＢＳビヒクルを与えた。３週間の処置の後、かつ１８時間、終夜の絶食の後、グルコースの腹腔内ボーラス（２ｇ／ｋｇ）をすべての動物に投与した（時間＝０）。以下の時点で血液試料をすべての動物から採取した：チャレンジ前、ならびにチャレンジの１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分後。携帯用Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）グルコース計を使用して、全血試料を血漿グルコース濃度について分析した。平均絶対的グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）＋／−ＳＥＭおよびＡＵＣ（経時的な血漿グルコース偏位を反映する曲線下面積）を表８に示す。
【０２６０】
【表８】
2016520058.tif 000019
【０２６１】
抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３で処置した動物は１２８．８０＋／−１２．９２ｍｇ／ｄＬの絶食血糖値を有しており、これはＰＢＳを与えた対照動物における絶食血糖値である１５６．８０＋／−１１．４１ｍｇ／ｄＬよりも顕著に低かった（表８、２列目）。さらに、ＰＢＳを与えた動物と比較して、ｍＡｂ３で処置した動物はグルコースチャレンジ後により低い血糖値を有していた（表８、３〜９列目）。これらの結果は、２型糖尿病のマウスモデルにおいて、抗グルカゴン受容体拮抗抗体がグルコースチャレンジの際に誘発された絶食血中グルコースおよび血漿グルコース偏位を低下させることを実証している。
【０２６２】
（実施例７）
組合せ処置
本実施例では、マウスにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体およびｍＴＯＲ阻害剤を用いた組合せ処置を例示する。
【０２６３】
げっ歯類におけるグルカゴンシグナル伝達の遮断は、膵臓アルファ（すなわちグルカゴン産生）細胞の数および／または大きさの増加をもたらすことが以前に実証されている。たとえば、Ｇｅｌｌｉｎｇら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００（３）：１４３８〜１４４３（ＧＣＧＲヌルマウス）、Ｓｌｏｏｐら、２００４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１３（１１）：１５７１〜１５８１（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を参照されたい。マウスにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３の投与（週に１回、ｉ．ｐ．）も同様に島あたりのアルファ細胞の面積を増加させることが示されており、これは、アルファ細胞数の増加および平均のアルファ細胞の大きさの増加を反映している。
【０２６４】
本研究は、ｍＡｂ３との同時処置としてのｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの効果を評価するために実施した。本研究では、雄の１４週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝１０匹／群）に、週に１回の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３の腹腔内注射、または１日１回の１０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの腹腔内投薬（水中に５％のエタノール、５．２％のＴｗｅｅｎ−８０、５．２％のＰＥＧ４００で配合）のどちらかを、週に１回の３ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡｂ３と組み合わせて与えた。第３の群には対照としてビヒクルを与えた。３週間の処置の後、動物を屠殺してその膵臓を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、その後、パラフィンワックス中で加工し、標準の手順に従って包埋した。切片を４μｍに切断し、プラススライド上に載せ、終夜、３７℃で乾燥させた。Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ（商標）自動免疫染色器（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州）上の連続的な二重標識プロトコルを使用した免疫組織化学によって、グルカゴン（島アルファ細胞を同定するため）およびインスリン（島ベータ細胞を同定するため）を脾臓中で検出した。内在性タンパク質をＣｙｔｏ−Ｑ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州）で遮断した。熱誘導性エピトープ回収（ＨＩＥＲ）緩衝液をｐＨ６．０（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州）で２０分間使用して、抗グルカゴン免疫組織化学について抗原の回収を行った。抗インスリン（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州）はビオチン標識したヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州）を使用してＢｏｎｄ（商標）Ｉｎｔｅｎｓｅ  Ｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、抗グルカゴン（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州）はＢｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｋｉｔ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州）を使用して検出した。組織をヘマトキシリン（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州）で対比染色し、脱水し、キシレン中にマウントした後、微視的な評価を行った。抗グルカゴン（ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｄ）および抗インスリン（ＤＡＢ）について染色した膵臓ＩＨＣの切片を含有するスライドを、マルチスペクトルカメラを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｅｃｔｒａ  自動イメージングシステムを使用して低（４×）および高倍率（２０×）でイメージングした。低および高倍率の画像を、どちらもＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）のＩｎＦｏｒｍ（登録商標）画像分析ソフトウェアを使用して分析した。個々の島の詳細な分析は高倍率のマルチスペクトル画像を使用して実施した。膵臓切片内の各島の画像は自動の様式で獲得され、スペクトルの分解の後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）のＩｎＦｏｒｍ（登録商標）ソフトウェアで分析した。組織のすべての非関連領域を排除する一方で、それぞれ抗グルカゴンまたは抗インスリン染色を使用してアルファまたはベータ細胞の領域を定量および特徴づけるためのアルゴリズムを作成した。また、ヘマトキシリン対比染色を使用してそれぞれの領域内の核の数も決定し、これを使用して、それぞれの島の��域（アルファ／ベータ）に対する平均細胞数および平均の細胞の大きさを計算した。
【０２６５】
研究データを以下の表９に要約する。表中には、アルファ細胞の数（％アルファ細胞数／島＋／−ＳＥＭとして定量）、アルファ細胞によって占有される全体的な面積（％アルファ細胞の面積／島＋／−ＳＥＭとして定量）、および平均のアルファ細胞の大きさ（ピクセルとして測定）を提供する。
【０２６６】
【表９】
2016520058.tif 000020
【０２６７】
ビヒクルのみを投与したマウスと比較して、ｍＡｂ３で処置したマウスにおいてアルファ細胞数およびアルファ細胞の大きさの増加が観察された（表９）。これらの増加したアルファ細胞の数および大きさの測度は、ｍＡｂ３をラパマイシン処置と同時投与した場合には存在しなかった（表９）。これらのデータは、ｍＴＯＲシグナル伝達がアルファ細胞の過形成の媒介に役割を果たし得ることを実証している。また。これらのデータは、ｍＴＯＲ阻害剤を用いた同時処置は、グルカゴン受容体活性を遮断することによって誘発される肥厚および過形成を低下させることも実証している。
【０２６８】
（実施例８）
肝機能の分析
本実施例では、肝機能に対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた４週間の処置の効果を例示する。
【０２６９】
グルカゴン受容体低分子拮抗剤を用いた４週間の処置が、特定の肝機能検査（ＬＦＴ）、具体的にはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（ＬＹおよびＭＫ）の上昇をもたらす場合があることが以前に示されている。たとえばＥｎｇｅｌ，Ｓ．ら、２０１１、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＭＫ０８９３，ａ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ」、ＡＤＡ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍを参照されたい。そのような変化が、グルカゴン受容体を低分子の代わりにモノクローナル抗体で遮断した長期処置の後に明白であるかどうかに取り組むために、研究を実施して、野生型および高脂肪食給餌（ＨＦＤ）のＤＩＯ（食餌性肥満）マウスにおいて、これらのＬＦＴパラメータに対する週に１回の腹腔内用量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体の効果を４週間にわたって評価した。
【０２７０】
本研究では、野生型およびＨＦＤ−ＤＩＯマウスに、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３またはＰＢＳビヒクル（対照）のどちらかを、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．の用量で、週に１回の基準で投与した。使用した１０ｍｇ／ｋｇの用量は、少なくとも７日間（すなわち投薬間隔）の間に最大のグルコース低下効果を発揮することが示されており、これは、本研究においてグルカゴン受容体が完全に遮断されていることを示唆している。４週間のｍＡｂ３処置の後、絶食血清試料を採取し、以下の肝酵素のレベルを測定した：ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＰ。結果（群あたりの平均および標準誤差（ｎ＝１０匹／群／マウスモデル））を以下の表１０に要約する。
【０２７１】
【表１０】
2016520058.tif 000021
【０２７２】
ＰＢＳビヒクル対照動物において測定されたＬＦＴパラメータと比較して、ｍＡｂ３で処置した動物において測定されたＬＦＴパラメータ（すなわち、ＡＬＴ、ＡＬＰ、およびＡＳＴレベル）のどれにも顕著な変化がなかった（表１０）。
【０２７３】
これらの結果は、抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた４週間の処置が肝機能に有害でないことを実証している。
【０２７４】
（実施例９）
肝機能の分析
本実施例では、肝機能に対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた４３週間の処置の効果を例示する。
【０２７５】
本研究では、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウスを、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３を用いた長期処置に曝し、９週齢で開始し、４３週間の間、５２週齢まで続けた（ｎ＝９匹）。３ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡｂ３をｉ．ｐ．で週に１回投与した。ＰＢＳビヒクルを対照動物群に投与した（ｎ＝６匹）。研究の終了時に、絶食血清試料を採取し、以下の肝酵素のレベルを測定した：ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＰ。結果（群あたりの平均および標準誤差）を表１１に要約する。
【０２７６】
【表１１】
2016520058.tif 000022
【０２７７】
同じ期間にわたってＰＢＳを投薬した対照マウスにおいて測定されたＬＦＴパラメータと比較した場合に、ｍＡｂ３で処置したマウスにおいて測定されたＬＦＴパラメータ（すなわち、ＡＬＴ、ＡＬＰ、およびＡＳＴレベル）のどれにも顕著な変化がなかった（表１１）。したがって、この動物の全寿命のかなりの部分を表す約１１カ月の期間のｍＡｂ３グルカゴン受容体遮断抗体を用いた処置は、これらの肝機能の酵素マーカーに対するいかなる有害効果にも関連していなかった。
【０２７８】
これらの結果は、抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた長期処置が肝機能に有害でないことを実証している。
【０２７９】
（実施例１０）
肝機能の分析
本実施例では、抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた慢性処置の効果を例示する。
【０２８０】
肝機能に対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５を用いた１３週間の長さの処置の効果に取り組むための研究を実施した。本研究では、雄および雌のカニクイザルに、ｍＡｂ５を皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）のどちらかで、１３週間にわたって投与した。
【０２８１】
カニクイザルにおいて、単一用量の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５がグルカゴンチャレンジ後にグルコース偏位を有効に阻害する（上記実施例３を参照）。この慢性研究のために選択された用量は１０、５０、および２００ｍｇ／ｋｇであり、そのそれぞれがグルカゴンシグナルの完全な遮断を生じると予想される。
【０２８２】
細身のナイーブなサルの４つのコホート（それぞれｎ＝各性別が３匹ずつ）に、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルのさらに６つのコホートに、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶ注射によって、または２００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。対照として、各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルに、週に１回、ビヒクルの注射をＩＶまたはＳＣ注射のどちらかの経路によって１３週間の間与えた。
【０２８３】
２９、５７、および９３日目に絶食血清試料をすべての動物から採取し、２つのベースライン、すなわち研究の開始前（すなわち−４３および−８日目）に同じ動物から採取した処置前の試料と比較した。また、臨床用化学分析器を使用して、ＡＬＴおよびＡＳＴに加えてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）も測定した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、およびＧＧＴ試験の結果（平均＋／−ＳＥＭ）を以下の表１２に要約する。
【０２８４】
【表１２−１】
2016520058.tif 000023
【０２８５】
【表１２−２】
2016520058.tif 000024
【０２８６】
【表１２−３】
2016520058.tif 000025
【０２８７】
【表１２−４】
2016520058.tif 000026
【０２８８】
表１２は、ベースライン（−４３および−８日目）ならびに投薬スケジュール全体にわたる月に１回の間隔（２９、５７、および９３日目）での、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、およびＧＧＴレベルの平均（＋／−ＳＥＭ）値を示す。ビヒクルで処置した対照動物および各群の自身のベースライン値と比較して、ｍＡｂ５を用いて任意の用量レベル／投薬経路で処置した動物において測定されたＬＦＴパラメータのどれにも顕著な変化がなかった（表１２）。
【０２８９】
これらの結果は、高用量のｍＡｂ５グルカゴン受容体遮断抗体を用いた慢性処置が肝機能に有害でないことを実証している。
【０２９０】
（実施例１１）
循環脂質レベルの分析
本実施例では、ｍＡｂ５グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた慢性の長期処置の効果を例示する。
【０２９１】
グルカゴン受容体をモノクローナル抗体で遮断することの効果を評価するために、雄および雌のカニクイザルに、週に１回のｍＡｂ５の用量を１３週間の間投与し、循環脂質（総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、およびトリグリセリド）に対する効果について評価した。
【０２９２】
それぞれが各性別の動物を３匹ずつ含む、細身のナイーブなサルの４つのコホートに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルのさらに６つのコホートに、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶ注射によって、または２００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。対照として、各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルに、週に１回、ビヒクルの注射（ＩＶおよびＳＣ経路の両方によって）を１３週間の間与えた。
【０２９３】
２９、５７、および９３日目に絶食血清試料をすべての動物から採取し（約月に１回）、２つのベースライン、すなわち研究の開始前（−４３および−８日目）に同じ動物から採取した処置前の試料に対して比較した。また、臨床用化学分析器を使用して、ＡＬＴおよびＡＳＴに加えてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）も測定した。本研究からのデータ（平均＋／−ＳＥＭ）を表１３に要約する。
【０２９４】
【表１３−１】
2016520058.tif 000027
【０２９５】
【表１３−２】
2016520058.tif 000028
【０２９６】
【表１３−３】
2016520058.tif 000029
【０２９７】
【表１３−４】
2016520058.tif 000030
【０２９８】
表１３は、ベースライン（−４３および−８日目）ならびに投薬スケジュール全体にわたる月に１回の間隔（２９、５７、および９３日目）での、これらのパラメータの平均（＋／−ＳＥＭ）値を示す。ビヒクルで処置した対照動物および各群の自身のベースライン値と比較して、ｍＡｂ５を用いて任意の用量レベル／投薬経路で処置した動物において測定された循環脂質パラメータのどれにも顕著な変化がなかった（表１３）。
【０２９９】
これらの結果は、高用量のｍＡｂ５グルカゴン受容体遮断抗体を用いた慢性処置が、ＬＤＬ−Ｃまたはトリグリセリドの有害な上昇をもたらさないことを実証している。
【０３００】
（実施例１２）
アルファ細胞の過形成の逆転
本実施例では、高用量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体で処置した対象における、肥厚を伴ったまたは伴わない膵臓アルファ細胞の過形成の逆転を例示する。
【０３０１】
マウスおよび／またはラットにおけるグルカゴンシグナル伝達の遮断は、循環グルカゴンレベル（高グルカゴン血症）の代償性の上昇ならびに膵臓アルファ細胞の数および／または細胞の大きさの増加をもたらすことが示されている（たとえば、Ｇｅｌｌｉｎｇら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００（３）：１４３８〜１４４３（ＧＣＧＲヌルマウス）、Ｓｌｏｏｐら、２００４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１３（１１）：１５７１〜１５８１（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、Ｇｕら、２００９、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３３１（３）：８７１〜８８１（モノクローナル抗体）を参照）。上記実施例３に示すように、カニクイザルにおいて、単一用量の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５がグルカゴンチャレンジ後にグルコース偏位を有効に阻害するため、この慢性研究のために選択された用量（１０、５０、および２００ｍｇ／ｋｇ）は、グルカゴンシグナルの完全な遮断を生じると予想される。
【０３０２】
本研究では、それぞれが各性別の動物を３匹ずつ含む、細身のナイーブなサルの４つのコホートに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルのさらに６つのコホートに、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶ注射によって、または２００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。対照として、各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルに、週に１回、ビヒクルの注射（ＩＶおよびＳＣ経路の両方によって）を１３週間の間与えた。
【０３０３】
投薬期間の終わりに、コホートあたり３匹の動物からの膵臓を採取し、切片にし、標準のＨ＆Ｅおよび抗グルカゴン／抗インスリンＩＨＣ技法を使用した染色した。膵臓を、島アルファ細胞の過形成および肥厚について検査およびスコアづけした。その後、選択されたコホートからの各性別２匹ずつの動物を（対照、５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ、２００ｍｇ／ｋｇのＩＶ、２００ｍｇ／ｋｇのＳＣ）、２４週間の回復期間（すなわちｍＡｂ５投薬の中断後）の間追跡して、抗体レベルを効果のある閾値未満まで落とさせた（「抗体ウォッシュアウト」）。この抗体ウォッシュアウト期間の終わりに、これらの動物からの膵臓を過形成および肥厚について同様に分析した。本研究からのデータを表１４に要約する。
【０３０４】
【表１４】
2016520058.tif 000031
【０３０５】
１３週間の時点で一部の動物においてアルファ細胞の過形成および／または肥厚の兆候が存在する（表１３、最初の８列）。しかし、２４週間の抗体ウォッシュアウト期間の終わりでは、どの用量群からのどの動物においても、アルファ細胞の過形成の兆候も肥厚の兆候も存在しなかった（表１３、最後の４列）。したがって、高用量のｍＡｂ５を用いた慢性の長期処置は肥厚を伴ったまたは伴わない膵臓アルファ細胞の過形成をもたらし得るが、これらの特徴は抗体ウォッシュアウトの後に完全に逆転可能である。
【０３０６】
これらの結果は、カニクイザルにおいて、ｍＡｂ５処置後の膵島のアルファ細胞の変化が、治療用抗体のレベルが最小の効果のある閾値未満に落ち、グルカゴンシグナル伝達の遮断が解放された後に完全に逆転可能であることを実証している。
【０３０７】
（実施例１３）
肝細胞グリコーゲン沈着の逆転
本実施例では、高用量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体で処置した対象における、肝細胞グリコーゲン沈着の逆転を例示する。
【０３０８】
カニクイザルにおいて、単一用量の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５がグルカゴンチャレンジ後にグルコース偏位を有効に阻害する（上記実施例３を参照）。この慢性研究のために選択された用量（１０、５０、および２００ｍｇ／ｋｇ）は、グルカゴンシグナルの完全な遮断を生じると予想される。それぞれが各性別の動物を３匹ずつ含む、細身のナイーブなサルの４つのコホートに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルのさらに６つのコホートに、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶ注射によって、または２００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５を週に１回、ＩＶまたはＳＣ注射によって、合計１３週間の間与えた。対照として、各性別５匹ずつの細身のナイーブなサルに、週に１回、ビヒクルの注射（ＩＶおよびＳＣ経路の両方によって）を１３週間の間与えた。
【０３０９】
投薬期間の終わりに、コホートあたり３匹の動物からの肝臓を採取し、固定し、切片にし、標準のＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色技法を使用して染色した。肝臓を、肝細胞グリコーゲン沈着の増加について検査およびスコアづけした。その後、選択されたコホートからの各性別２匹ずつの動物を（対照、５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ、２００ｍｇ／ｋｇのＩＶ、２００ｍｇ／ｋｇのＳＣ）、ｍＡｂ５投薬の中断後の２４週間の回復期間の間追跡して、抗体レベルを効果のある閾値未満まで落とさせた（「抗体ウォッシュアウト」）。この期間の終わりに、これらの動物からの肝臓を同様に分析した。本研究からのデータを表１５に要約する。
【０３１０】
【表１５】
2016520058.tif 000032
【０３１１】
１３週間のｍＡｂ５処置後に一部の動物において肝細胞グリコーゲンの増加が観察された（表１５）。たとえば、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣのｍＡｂ５を投薬した２匹の雄、５０ｍｇ／ｋｇのＩＶのｍＡｂ５を投薬した１匹の雌、２００ｍｇ／ｋｇのＩＶのｍＡｂを投薬した３匹の雄および２匹の雌、ならびに２００ｍｇ／ｋｇのＳＣのｍＡｂ５を投薬した２匹の雄が、肝細胞グリコーゲンの増加について陽性スコアとなった（表１５、最初の７列）。しかし、ｍＡｂ５ウォッシュアウト時間の後では、どの用量群からのどの動物においても肝細胞グリコーゲンの増加の兆候は観察されなかった（表１５、最後の４列）。したがって、高用量のｍＡｂ５を用いた慢性の長期処置は肝細胞グリコーゲン沈着の変化をもたらし得るが、この変化は抗体ウォッシュアウトの後に完全に逆転可能である。
【０３１２】
これらの結果は、カニクイザルにおいて、抗グルカゴン受容体拮抗抗体処置後の肝細胞中のグリコーゲン蓄積の変化が、治療用抗体のレベルが最小の効果のある閾値未満に落ち、グルカゴンシグナル伝達の遮断が解放された後に完全に逆転可能であることを実証している。
【０３１３】
（実施例１４）
２型糖尿病のマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、２型糖尿病のマウスモデルにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた処置を例示する。
【０３１４】
レプチン欠損の雄のｏｂ／ｏｂマウスは著しい食欲亢進を示し、高血糖症、高インスリン血症、および肥満症がもたらされる。本研究では、雄のｏｂ／ｏｂマウスに単一用量のｍＡｂ３を以下の用量で投与した：１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇ（各用量群でｎ＝５匹）。対照動物にはｍＡｂ３の代わりにＰＢＳを投与した。血液試料をすべての動物から（摂食状態で）以下の時点で採取した：投薬前、ならびに投薬後の１、２、５、６、７、９、１２、１３、および２０日目。携帯用Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）グルコース計を使用して、全血試料をグルコース濃度について分析した。平均絶対的グルコース値＋／−ＳＥＭを表１６に示す。
【０３１５】
【表１６】
2016520058.tif 000033
【０３１６】
表１６に示すように、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３の単一の腹腔内注射の投与は、その処置前のベースラインまたはビヒクルで処置した群と比較して、これらのマウスの著しいかつ持続的な摂食血糖値の低下を生じる。効果の持続期間は用量応答性を示し、１０ｍｇ／ｋｇの用量が最長の効果持続期間を有しており、１ｍｇ／ｋｇの用量が最短の効果持続期間を有していた（表１６）。１０、３、または１ｍｇ／ｋｇの抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３で処置した動物は、ｍＡｂ３投薬の１日および２日後に顕著に改善された摂食グルコースレベルを有していた（表１６、２および３段）。
【０３１７】
単一用量の１０または３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３は、グルコース低下において比較できるほどの最大効果を生じた。たとえば、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３を用いた処置の６日後では、マウスの摂食血糖値は７５．６０±７．７１ｍｇ／ｄＬであり、３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３を用いた処置の２日後では、マウスの摂食血糖値は７９．２０±３．６２ｍｇ／ｄＬであった。相対的に、ｍＡｂ３の代わりにＰＢＳを与えた対照動物では、摂食血糖値がはるかにより高かった、すなわち、投薬後の２日目に２６１．８０±２８．１３ｍｇ／ｄＬおよび投薬後の６日目に２４１．２０±４３．４０ｍｇ／ｄＬであった。１ｍｇ／ｋｇの用量はより低い効果を生じ、１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３を用いた処置の２日後では、マウスの摂食血糖値は１２４．００±８．７９ｍｇ／ｄＬであった。０．３ｍｇ／ｋｇの用量では測定可能な効果は観察されなかった。
【０３１８】
５日目までには、１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３で処置した動物におけるグルコースレベルは投薬前レベルに戻っていた。しかし、３または１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３のどちらかで処置した動物は、それぞれ投薬後の７日目および１２日目まで改善された摂食グルコースレベルを保持していた（表１６、４、６、および８段）。
【０３１９】
これらの結果は、２型糖尿病のマウスモデルにおいて、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３が摂食血糖値を有効に低下させることを実証している。
【０３２０】
（実施例１５）
２型糖尿病のマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、２型糖尿病のマウスモデルにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体を用いた処置を例示する。
【０３２１】
ＨＦＤ−ＤＩＯおよびｏｂ／ｏｂマウスは、２型糖尿病のすべてではなくても一部の要素の、一般に認められているモデルである。これらのモデルはどちらも明らかな肥満症を現す。両モデル種の３カ月齢の雄マウスに、抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３またはＰＢＳのどちらかを投与した（ｎ＝１０匹／群／マウスモデル）。ｍＡｂ３は、１０ｍｇ／ｋｇで、週に１回の腹腔内注射によって、４週間にわたって投与し、ＰＢＳは同様の様式で対照動物に投与した。１、２および３週間の処置の終わりに、それぞれのマウスの体重を測定した。それぞれの時点で、それぞれの個々のマウスの重量は、その投薬前の開始重量のパーセンテージとして表した。それぞれの群の平均重量±ＳＥＭを決定した。結果を表１７に要約する。
【０３２２】
【表１７】
2016520058.tif 000034
【０３２３】
１０ｍｇ／ｋｇの抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３で処置したＨＦＤ−ＤＩＯおよびｏｂ／ｏｂマウスはどちらも、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、４週間の研究期間にわたって体重増加が顕著により少なかった（表１７）。たとえば、ＨＦＤ−ＤＩＯマウスでは、平均体重がベースラインの１１９．４２±１．４１％であったＰＢＳを与えた動物と比較して、ｍＡｂ３で処置した動物の平均体重はベースラインの１１４．９９±１．２３％であった。要約すると、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、ｍＡｂ３を用いた処置はＨＦＤ−ＤＩＯマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスのどちらにおいても体重増加を顕著に低下させた。
【０３２４】
これらの結果は、２型糖尿病の２つの異なるマウスモデルにおいて、抗グルカゴン受容体拮抗抗体が体重増加させることができることを実証している。
【０３２５】
（実施例１６）
組合せ処置
本実施例では、マウスにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体およびｍＴＯＲ阻害剤を用いた組合せ処置を例示する。
【０３２６】
げっ歯類におけるグルカゴンシグナル伝達の遮断は、膵臓アルファ（すなわちグルカゴン産生）細胞の数および／または大きさの増加をもたらすことが以前に実証されている。たとえば、Ｇｅｌｌｉｎｇら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００（３）：１４３８〜１４４３（ＧＣＧＲヌルマウス）、Ｓｌｏｏｐら、２００４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１３（１１）：１５７１〜１５８１（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、Ｇｕら、２００９、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３３１（３）：８７１〜８８１（モノクローナル抗体）を参照されたい。マウスにおける抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３の投与（週に１回、ｉ．ｐ．）も同様に島あたりのアルファ細胞の数および合計面積を増加させることが示されており、これは、アルファ細胞数の増加および平均のアルファ細胞の大きさの増加を反映している。
【０３２７】
本研究では、１２週齢の雄のＨＦＤ−ＤＩＯマウス（ｎ＝５匹／群）に、週に１回の３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３の腹腔内注射、または１日１回の１０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの腹腔内投薬（水中に５％のエタノール、５．２％のＴｗｅｅｎ−８０、５．２％のＰＥＧ４００で配合）のどちらかを、週に１回の３ｍｇ／ｋｇの用量の抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ３と組み合わせて与えた。第３の群には対照としてＰＢＳを与えた。
【０３２８】
３週間の処置の後、動物を屠殺してその膵臓を採取し、固定し、切片にし、以前に記載のようにグルカゴン（島アルファ細胞を同定するため）およびインスリン（島ベータ細胞を同定するため）について染色した。組織のすべての非関連領域を排除する一方で、それぞれ抗グルカゴンまたは抗インスリン染色を使用してアルファまたはベータ細胞の領域を定量および特徴づけるためのアルゴリズムを作成した。また、ヘマトキシリン対比染色を使用してそれぞれの領域内の核の数も決定し、これを使用して、それぞれの島の領域（アルファ／ベータ）に対する平均細胞数および平均の細胞の大きさを計算した。
【０３２９】
研究データを以下の表１８に要約する。表１８は、（ａ）アルファ細胞の数、％アルファ細胞数／島＋／−ＳＥＭとして定量、（ｂ）アルファ細胞によって占有される全体的な面積、％アルファ細胞の面積／島＋／−ＳＥＭとして定量、および（ｃ）平均のアルファ細胞の大きさ、ピクセルとして測定を提供する。
【０３３０】
【表１８】
2016520058.tif 000035
【０３３１】
ビヒクルのみを投与したマウスと比較して、ｍＡｂ３で処置したＨＦＤ−ＤＩＯマウスにおいてアルファ細胞数（アルファ細胞の過形成）およびアルファ細胞の大きさ（アルファ細胞の肥厚）の増加が観察された（表１８）。しかし、これらの増加したアルファ細胞の数および大きさの測度は、ＨＦＤ−ＤＩＯマウスにおいてｍＡｂ３をラパマイシン処置と同時投与した場合には存在しなかった（表１８、最後の段）。
【０３３２】
これらのデータは、ｍＴＯＲシグナル伝達がアルファ細胞の過形成の媒介に役割を果たし得ることを実証している。また。これらのデータは、ｍＴＯＲ阻害剤を用いた同時処置は、グルカゴン受容体活性を遮断することによって誘発される肥厚および過形成を低下させることも実証している。
【０３３３】
（実施例１７）
カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、カニクイザルにおける、グルカゴンチャレンジ後の血漿グルコースレベルに対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体の効果を例示する。
【０３３４】
動物へのグルカゴンの静脈内ボーラスの投与は、肝臓でのグルカゴンシグナル伝達の結果として血漿グルコースの上昇をもたらす（グルカゴンチャレンジ）。急性グルカゴンシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断することに有効なｍＡｂ５の用量を決定するために、グルカゴンチャレンジを行う１時間前に１、３、または３０ｍｇ／ｋｇの抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５を与えた細身のナイーブな雌のカニクイザルにおいてグルカゴンチャレンジパラダイムを実施した。それぞれの動物コホートにおいて、グルカゴンチャレンジは２回の別々の機会に行った。１回目のチャレンジは、投薬後の応答を比較するための、それぞれの動物の投薬前ベースラインを確立するために、サルにｍＡｂ５を与える５日前であり、２回目のチャレンジは、サルにｍＡｂ５の投薬を与えた１時間後であった。
【０３３５】
それぞれのグルカゴンチャレンジについて、２０μｇ／ｋｇのグルカゴンのＩＶボーラス（ＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標）Ｈｙｐｏｋｉｔｓ（登録商標））を０時点に投与した。以下の時点で血液試料をすべての動物から採取した：チャレンジの直前、ならびにチャレンジの５、１５、３０、４５、６０、および１２０分後。臨床用化学分析器を使用して、血漿試料を血漿グルコース濃度について分析した。結果（グルコースレベルの平均変化＋／−ＳＥＭ、単位はｍｇ／ｄＬ）を表１９に要約する。動物間の開始血糖値のばらつきが理由で、データは、チャレンジ前の値からの絶対的グルコース値の変化として示す。
【０３３６】
【表１９】
2016520058.tif 000036
【０３３７】
それぞれの群において、−５日目に、事前のｍＡｂ５処置なしのグルカゴンチャレンジは血漿グルコースレベルの増加をもたらし、これは、肝臓がグルコース産生を増加する生理的応答およびグルカゴン刺激の結果としてのアウトプットを反映している（ベースライン）（表１９、「ベースラインでのＧＣ」と表示した段）。グルコースレベルはグルカゴンチャレンジの１５分後にピークとなり、一般に、チャレンジの６０〜１２０分後にチャレンジ前またはさらにより低いレベルまで戻った。
【０３３８】
グルカゴンチャレンジの１時間前にｍＡｂ５を用いた処置を行うことで、ベースライン応答と比較して、グルカゴンチャレンジに対するグルコース応答の著しい阻害がもたらされた（表１９、「ＭＡｂ５の１時間後でのＧＣ」と表示した段）。これらの群におけるピークグルコース偏位は最小限であり、一部の場合では負数であり、一般により早い時点で観察され、正常または実際にチャレンジ前よりも低いレベルまでより急速に戻った。たとえば、ＧＣの１５分後では（ベースラインチャレンジ中にグルコースレベルがピークとなった時点）、３０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した動物の血糖値はチャレンジ前よりも１６．６７±１４．１７ｍｇ／ｄＬ低かった。しかし、ＭＡｂ５処置なしのＧＣの１５分後では、これらの同じ動物の血糖値はチャレンジ前よりも４５．６７±６．８４ｍｇ／ｄＬ高かった。ＧＣの１５分後では、３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した動物の血糖値はチャレンジ前よりも１６．２５±２２．４５ｍｇ／ｄＬ高かった。対照的に、ＭＡｂ５処置なしのＧＣの１５分後では、これらの同じ動物の血糖値はチャレンジ前よりも５６．７５±２６．５２ｍｇ／ｄＬ高かった。ＧＣの１５分後では、１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した動物の血糖値はチャレンジ前よりも１．００±１４．７３ｍｇ／ｄＬ高かった。対照的に、ＭＡｂ５処置なしのＧＣの１５分後では、これらの同じ動物の血糖値はチャレンジ前よりも５２．００±１４．１９ｍｇ／ｄＬ高かった。３０、３、または１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５の用量は、このパラダイムにおいて用量応答のない同様の有効性を示した。
【０３３９】
これらの結果は、ｍＡｂ５がグルカゴンシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断することに有効であり、また、グルカゴンチャレンジ後に抗グルカゴン受容体拮抗抗体がグルコース偏位を有効に遮断することを実証している。
【０３４０】
（実施例１８）
カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
本実施例では、カニクイザルにおける、グルカゴンチャレンジ後の血漿グルコースレベルに対する抗グルカゴン受容体拮抗抗体の効果を例示する。
【０３４１】
動物へのグルカゴンの静脈内ボーラスの投与は、肝臓でのグルカゴンシグナル伝達の結果として血漿グルコースの上昇をもたらす（グルカゴンチャレンジ）。急性グルカゴンシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断することに有効であり得るｍＡｂ５の他の用量を決定するために、グルカゴンチャレンジを行う１時間前に１．７８、０．２４、または０．０２６ｍｇ／ｋｇの抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５を与えた細身のナイーブな雌のカニクイザルにおいてグルカゴンチャレンジパラダイムを実施した。動物の追加のコホートにＰＢＳビヒクルのみを与えた（ｎ＝４匹／群）。それぞれの動物コホートにおいて、グルカゴンチャレンジは３回の別々の機会に行った。１回目のチャレンジは、それぞれの動物の投薬前ベースラインを確立し、すべての動物がグルカゴン応答性であることを確実にするために、サルにｍＡｂ５を与える３日前であり、２回目のチャレンジは、サルにｍＡｂ５の投薬を与えた１時間後であり、３回目のチャレンジは、サルにｍＡｂ５の投薬を与えた１週間後であった。
【０３４２】
それぞれのグルカゴンチャレンジについて、２０μｇ／ｋｇのグルカゴンのＩＶボーラス（ＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標）Ｈｙｐｏｋｉｔｓ（登録商標））を０時点に投与した。以下の時点で血液試料をすべての動物から採取した：チャレンジ前、ならびにチャレンジの５、１５、３０、４５、６０、および１２０分後。臨床用化学分析器を使用して、血漿試料を血漿グルコース濃度について分析した。２回目および３回目のチャレンジからの結果（グルコースレベルの平均変化＋／−ＳＥＭ、単位はｍｇ／ｄＬ）を表２０に要約する。動物間の開始血糖値のばらつきが理由で、データは、その日に採取したチャレンジ前の値からの絶対的グルコース値の変化として示す。
【０３４３】
【表２０】
2016520058.tif 000037
【０３４４】
ｍＡｂ５で処置した動物におけるグルカゴンチャレンジ（ＧＣ）後の血糖値の変化は、同じ日にＧＣを受ける、ＰＢＳで事前処置した動物の血糖値の変化と比較することができる（表２０）。ピークグルコースレベルは、一般に５分の時点で観察された。０．０２６および０．２４ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５の投薬の１時間後のＧＣ中、グルコース応答の低下は、あったとしても非常にわずかしか見られなかった。たとえば、ｍＡｂ５の代わりにＰＢＳを与えた動物における３４．７５±５．５７ｍｇ／ｄＬの増加と比較して、０．０２６および０．２４ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した１時間後にチャレンジした動物では、それぞれ３０．２５±６．６５ｍｇ／ｄＬおよび４４．２５±６．２１ｍｇ／ｄＬの血糖値の増加がピークグルコースレベルで観察された（表２０）。８日目までには、０．０２６および０．２４ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５投薬群における応答は対照動物と同様であった。
【０３４５】
しかし、１．７８ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５処置群では、投薬の１時間後でのグルカゴン応答の中等度の阻害が観察された。１．７８ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５で処置した動物では、血漿グルコースレベルは他の群よりも低く、５分でピークとなり（２２．２５±１．４９ｍｇ／ｄＬ）、チャレンジの３０〜４５分後までにベースラインまたはそれ未満まで戻った（表２０）。このグルカゴン応答の阻害は、ｍＡｂ５投与の７日後に反復グルカゴンチャレンジを実施した場合にさえも観察された（表２０）。また、１．７８ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ５の顕著な処置効果は、ビヒクルで処置した群における血漿グルコースレベル（８５．５０±８．１７ｍｇ／ｄＬ）と比較して、チャレンジ前（すなわち絶食）血漿グルコースレベルを低下させる（６０．０±３．７９ｍｇ／ｄＬ）ことにおいても明白であった。
【０３４６】
これらの結果は、グルカゴンチャレンジ後に抗グルカゴン受容体拮抗抗体がグルコース偏位を有効に遮断することを実証している。
【０３４７】
（実施例１９）
エピトープマッピング
抗グルカゴン受容体拮抗抗体ｍＡｂ５の結晶構造およびｍＡｂ５：グルカゴン受容体複合体の結晶構造を使用して、ｍＡｂ５によって認識されるヒトグルカゴン受容体上のエピトープを特徴づけた。ｍＡｂ５：グルカゴン受容体の結晶構造とグルカゴン受容体構造単独との間の接近可能な表面積の相違を計算することによって、結合に関与しているグルカゴン受容体残基を同定した。ｍＡｂ５抗体との複合体形成の際に埋もれた表面積を示すグルカゴン受容体残基がエピトープの一部として含められた。溶媒が接近可能なタンパク質の表面は、タンパク質のファンデルワールス表面を転がっていく際のプローブ球（半径１．４Ａの溶媒分子を表す）の中心位置として定義した。溶媒が接近可能な表面積は、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ａ．ＳａｌｉおよびＴ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４、７７９〜８１５、１９９３）によって実装されているように、各原子の周りの拡張球上に表面点を作製し（原子およびプローブの半径の合計に等しい、原子中心からの距離で）、隣接原子と会合している等価な球内にあるものを排除することによって計算した。結晶構造の分析に基づいて、ｍＡｂ５によって認識されるグルカゴン受容体上の構造的エピトープは、ヒトグルカゴン受容体の位置３１、３３〜３８、４０〜４２、４４〜４５、４８、６２、および６４のアミノ酸残基を含む（配列番号１）。
【０３４８】
大きなタンパク質−タンパク質界面の結合エネルギーを支配する残基が何であるかは、「機能的エピトープ」と呼ばれている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４、５５４〜５６３）。その結果、相互作用の親和性（したがって生物学的特異性）はリガンドおよび受容体の機能的エピトープの構造的相補性によって定義される。詳細な突然変異誘発の研究により、サイトカインおよび受容体の機能的エピトープを作り上げる最も重要な残基は、トリプトファンなどの非極性側鎖、非極性側鎖の脂肪族構成成分、またはポリペプチド主鎖のいずれかに関与する疎水性接触であることが示されている。非極性の「コア」は、結合エネルギーにおいて重要性がより低い極性残基のハローによって取り囲まれている。動力学的研究により、機能的エピトープの主な役割は、複合体の解離速度を減少させることによってタンパク質−タンパク質の相互作用を安定化することであることが示されている。サイトカインと受容体との間の初期接触は、多くの不安定な接触を生じるランダム拡散またはタンパク質表面の「転がり」によって支配されていることが示唆されている。その後、複合体は、受容体の機能的エピトープとリガンドとが結合する際に安定化される（たとえばＢｒａｖｏおよびＨｅａｔｈ、２０００、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９：２３９９〜２４１１を参照）。
【０３４９】
酵母ディスプレイを使用して、ｍＡｂ５によって認識されるグルカゴン受容体上の機能的エピトープに関与しているアミノ酸残基を決定した。グルカゴン受容体細胞外ドメイン（ＧＣＧＲ−ＥＣＤ）の単一点突然変異体のライブラリを酵母細胞上に提示させた。その後、ＧＣＧＲ−ＥＣＤを発現する酵母細胞（「元のライブラリ」）を、蛍光標識したｍＡｂ５または蛍光標識した非ｍＡｂ５抗グルカゴン受容体抗体のプールのどちらかと共にインキュベーションした。野生型グルカゴン受容体を陽性対照として使用した。野生型ＧＣＧＲ−ＥＣＤと比較して抗体結合が減少したＧＣＧＲ−ＥＣＤ突然変異体を提示する酵母細胞を、ＦＡＣＳによって単離した。この細胞集団（「濃縮ライブラリ」）をディープシークエンシングし、データ分析して、それぞれの突然変異体の濃縮を決定した。濃縮とは、元のライブラリにおけるその発生率と比較した、濃縮されたライブラリ（ＦＡＣＳ単離後）中の特定の突然変異体の発生率として定義され、たとえば、濃縮４．０とは、突然変異体が、元のライブラリ中に見つかるよりも４倍の頻度で濃縮されたライブラリ中に存在することを意味する。より高い濃縮は、より低い結合親和性を有するＧＣＧＲ−ＥＣＤ突然変異体に対応する。３回のパニングを実施し、３回の異なる回の間に一貫性があった。表２１は酵母ディスプレイ分析の結果を要約している。
【０３５０】
【表２１】
2016520058.tif 000038
【０３５１】
いずれかの回において３より高い濃縮を有する突然変異位置は、ｍＡｂ５によって認識されるグルカゴン受容体上の機能的エピトープの一部であるとみなされる。酵母ディスプレイ分析に基づいて、ｍＡｂ５によって認識されるグルカゴン受容体上の機能的エピトープは、配列番号１の位置３３、３６、３８、４１、４４、４５、および６０のアミノ酸残基に関与している（表２１、太字の位置）。位置６０が、構造的エピトープ中には見つからない唯一の濃縮された残基であり、これは非ｍＡｂ５抗体のプール中でも濃縮されており、この位置の残基がタンパク質の折り畳みを乱すことを示している。
【０３５２】
突然変異体ライブラリおよび構造的エピトープ中のどの位置が濃縮されていないかを決定するための分析を実施した。構造的エピトープ中の１５個の位置のうち、１１個の位置は突然変異体ライブラリ中にも存在する。これらの１１個の位置のうち、６個の位置が濃縮されている。機能的エピトープ中の５個の濃縮されていない位置は、３１、３４、４２、４８、および６４である。すべての濃縮されていない位置は、構造的エピトープの周辺に位置する。
【０３５３】
開示されている教示は様々な応用、方法、キット、および組成物を参照して記載されているが、本明細書中および以下に特許請求される発明の教示から逸脱せずに様々な変化および改変が可能であることを理解されたい。前述の例は開示されている教示をより良好に例示するために提供するものであり、本明細書中に提示する教示の範囲を限定することを意図しない。本教示はこれらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者には、これらの例示的な実施形態の数々の変形および改変が必要以上の実験を行わずに可能であることを容易に理解されるであろう。すべてのそのような変形およい改変が本教示の範囲内にある。
【０３５４】
特許、特許出願、論文、教科書などを含めた本明細書中で引用したすべての参考文献、およびその中に引用されている参考文献は、既に組み込まれていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。それだけには限定されないが、定義された用語、用語の用法、記述された技法などを含めて、組み込まれている文献および同様の資料のうちの１つまたは複数が本出願と異なるまたは矛盾する場合は、本出願が支配する。
【０３５５】
前述の説明および実施例は、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良の形態を記載している。しかし、前述のものが文書上でいかに詳細であるように見えても、本発明は数多くの方法で実施してよく、本発明は添付の特許請求の範囲およびその均等物によって解釈されるべきであることを理解されたい。
【受託番号】
【０３５６】
Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４７８７１
ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７
ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７
ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３
ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６
ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３
ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０
ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９
ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１６４
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１６５
【図１】
2016520058.tif 000040
【図２】
2016520058.tif 000041
【図３】
2016520058.tif 000042
【図４】
2016520058.tif 000043
【図５】
2016520058.tif 000044
【配列表】
2016520058000001.app
【国際調査報告】
2016520058.tif 000045
2016520058.tif 000046
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