(57)【要約】  腫瘍がグリオーマではないという条件で腫瘍転移を防止する方法が提供される。この方法は、腫瘍転移の防止を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤を投与することによって、腫瘍転移を防止することを含む。また、がんを処置する方法も提供される。この方法は、がんの処置を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を投与することによって、がんを処置することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍がグリオーマではないという条件で腫瘍転移を防止する方法であって、
腫瘍転移の防止を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤を投与することによって、腫瘍転移を防止するステップを含む、方法。
【請求項２】
腫瘍がグリオーマではないという条件で腫瘍転移を防止するためのシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤。
【請求項３】
がんを処置する方法であって、がんの処置を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を投与することによって、がんを処置するステップを含む、方法。
【請求項４】
がんを処置するためのシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤。
【請求項５】
がんの前記発症または進行と関連する前記細胞表面受容体が受容体チロシンキナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記受容体チロシンキナーゼがＥｒｂＢ受容体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥｒｂＢ受容体が表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍転移の推定阻害剤を同定する方法であって、試験薬剤の存在下でのＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングを分析するステップを含み、
前記試験薬剤の前記存在下でのＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのプロセッシングの、前記試験薬剤の非存在下でのプロセッシングと比較した減少が、腫瘍転移の推定阻害剤を示す、方法。
【請求項９】
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングの前記分析が、競合アッセイにより実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記競合アッセイが、ＰＩ（３，４）Ｐ２に結合したＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインを含む複合体からの前記ＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインの置換をアッセイする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記競合アッセイが、蛍光偏光競合アッセイである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんの予後診断を必要とする対象においてがんを予後診断する方法であって、
前記対象のがん細胞中のＳＹＮＪ２のレベルまたは活性を決定するステップを含み、前記対象の前記がん細胞中の前記ＳＹＮＪ２の活性の前記レベルの、罹患していない対照試料の細胞中のＳＹＮＪ２の活性のレベルと比較した上方調節が、予後不良を示す、方法。
【請求項１３】
至適基準法を用いて前記予後診断を補強するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記至適基準法が、マーカーの検出を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーが、ＨＥＲ−２およびエストロゲン受容体（ＥＲ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記転移がＥＧＦ依存的である、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが乳がんである、請求項３または１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＹＮＪ２の阻害剤が、小分子、抗体、ペプチドおよび核酸サイレンシング剤からなる群から選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１９】
前記小分子が、表２に列挙される分子から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＹＮＪ２の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を包装する包装材料を含む、がんの処置またはがん転移の防止のための製品。
【請求項２１】
前記がんの発症または進行と関連する前記細胞表面受容体の前記阻害剤が、抗体である、請求項３に記載の方法または請求項２０に記載の製品。
【請求項２２】
前記がんの発症または進行と関連する前記細胞表面受容体の前記阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項３に記載の方法または請求項２０に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、腫瘍転移を防止し、がんを処置および予後診断し、推定転移阻害剤である薬剤を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞運動は、腫瘍転移などの様々な生理学的および病理学的プロセスを支援する（Ridley、2011）。移動の開始は、葉状仮足および糸状仮足の形成を引き起こすアクチン重合およびＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅにより誘導される。数多くの証拠が、マトリックス分解における、浸潤突起と呼ばれる、別の種類のアクチン誘導性突出を暗示する（Murphy and Courtneidge、2011）。転移を始めるために、移動性乳がん細胞は浸潤突起を形成し、近隣の血管中に浸潤する。乳がん細胞の肺（Minn et al.、2005）および脳（Bos et al.、2009）への転移と関連する遺伝子発現特性を特徴付けるための研究により、部位特異的転移の基礎となる遺伝子セットが同定された。興味深いことに、両セットは、表皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーを含み、これは共有された受容体、ＥＧＦＲによるシグナリングが転移播種を支援することを示唆している。
【０００３】
細胞内輸送は、細胞移動および腫瘍進行の重要な特徴として現れる（Mosesson et al.、2008）。例えば、ｐ５３変異体は、Ｒａｂカップリングタンパク質（ＲＣＰ）に依存する、インテグリンおよびＥＧＦＲ輸送の増強を介して転移を促進することが示された（Muller et al.、2010）。Ｒａｂタンパク質と共に、ホスホイノシチドが、小胞の同一性を決定することによって細胞区画化において中枢的な役割を果たしている（Yuan and Cantley、2008）。例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によるＰＩ（４，５）Ｐ２（ホスファチジル−イノシトール４，５−二リン酸）のＤ３位でのリン酸化は、浸潤突起形成にとって必要であるＰＩ（３，４，５）Ｐ３を生成する（Yamaguchi et al.、2011）。同様に、ＰＩ（４，５）Ｐ２は、エンドサイトーシスおよびアクチン動力学を制御する複数のタンパク質を調節する（Saarikangas et al.、2010）が、そのレベルは２つのさらなる型の酵素により厳密に制御される：ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣγ）は、コフィリン（アクチン切断タンパク質）を活性化し、乳腺細胞移動を誘導する、ＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解を促進する（van Rheenen et al.、2007）。同様に、イノシトールポリリン酸５−ホスファターゼ、例えば、シナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）は、イノシトール環のＤ５位を脱リン酸化し、グリオーマ細胞移動を制御する（Chuang et al.、2004；Malecz et al.、2000）。さらに、ホモ接合変異が、ある特定の前立腺がん試料中で同定された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，０３６，９４５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３３１，６４７号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９４６，７７８号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５４５，８０７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，５４５，８０６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，５６９，８２５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，６２５，１２６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，６３３，４２５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６６１，０１６号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３４８，１８５号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，３２６，１７４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，６６６，８２８号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１５】米国特許第４，８０１，５３１号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，１９２，６５９号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，２７２，０５７号明細書
【特許文献１８】米国特許第３，７９１，９３２号明細書
【特許文献１９】米国特許第３，８３９，１５３号明細書
【特許文献２０】米国特許第３，８５０，７５２号明細書
【特許文献２１】米国特許第３，８５０，５７８号明細書
【特許文献２２】米国特許第３，８５３，９８７号明細書
【特許文献２３】米国特許第３，８６７，５１７号明細書
【特許文献２４】米国特許第３，８７９，２６２号明細書
【特許文献２５】米国特許第３，９０１，６５４号明細書
【特許文献２６】米国特許第３，９３５，０７４号明細書
【特許文献２７】米国特許第３，９８４，５３３号明細書
【特許文献２８】米国特許第３，９９６，３４５号明細書
【特許文献２９】米国特許第４，０３４，０７４号明細書
【特許文献３０】米国特許第４，０９８，８７６号明細書
【特許文献３１】米国特許第４，８７９，２１９号明細書
【特許文献３２】米国特許第５，０１１，７７１号明細書
【特許文献３３】米国特許第５，２８１，５２１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Rossi et al. Cancer Genet Cytogenet. 2005 Sep;161(2): 97-103
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【非特許文献８】Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)
【非特許文献９】Larrick and Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]
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【非特許文献８３】「A Practical Guide to Molecular Cloning」Perbal, B., (1984)
【非特許文献８４】「Methods in Enzymology」Vol. 1-317, Academic Press
【非特許文献８５】「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」, Academic Press, San Diego, CA (1990)
【非特許文献８６】Marshak et al.,「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」, CSHL Press (1996)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、腫瘍がグリオーマではないという条件で腫瘍転移を防止する方法であって、腫瘍転移の防止を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤を投与することによって、腫瘍転移を防止するステップを含む、方法が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、がんを処置する方法であって、がんの処置を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を投与することによって、がんを処置することを含む、方法が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、前記腫瘍がグリオーマではないという条件で、腫瘍転移を防止するためのシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、がんを処置するための、シナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がんの発症または進行と関連する細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼである。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、受容体チロシンキナーゼは、ＥｒｂＢ受容体である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＥｒｂＢ受容体は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、腫瘍転移の推定阻害剤を同定する方法であって、試験薬剤の存在下でのＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングを分析するステップを含み、試験薬剤の存在下でのＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのプロセッシングの、試験薬剤の非存在下でのプロセッシングと比較した減少が、腫瘍転移の推定阻害剤を示す、方法が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングの分析は、競合アッセイにより実施される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、競合アッセイは、ＰＩ（３，４）Ｐ２に結合したＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインを含む複合体からのＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインの置換をアッセイする。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、競合アッセイは、蛍光偏光競合アッセイである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、がんの予後診断を必要とする対象においてがんを予後診断する方法であって、対象のがん細胞中のＳＹＮＪ２のレベルまたは活性を決定するステップを含み、対象のがん細胞中のＳＹＮＪ２の活性のレベルの、罹患していない対照試料の細胞中のＳＹＮＪ２の活性のレベルと比較した上方調節が、予後不良を示す、方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、至適基準法を用いて予後診断を補強することをさらに含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、至適基準法は、マーカーの検出を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マーカーは、ＨＥＲ−２およびエストロゲン受容体（ＥＲ）からなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、転移は、ＥＧＦ依存的である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がんは乳がんである。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＹＮＪ２の阻害剤は、小分子、抗体、ペプチドおよび核酸サイレンシング剤からなる群から選択される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、小分子は、表２に列挙される分子から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＳＹＮＪ２の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を包装する包装材料を含む、がんの処置またはがん転移の防止のための製品が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤は、抗体である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤は、小分子阻害剤である。
【００２８】
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において用いることができるが、例示的方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、ほんの一例として本明細書に記載される。ここで図面を詳細に特に参照すれば、示される項目は例であり、本発明の実施形態の例示的考察のためのものであることが強調される。これに関して、図面と共に記載される説明により、本発明の実施形態をどのように実施することができるかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＥＧＦが乳腺細胞の侵襲的増殖を促進し、特定の遺伝子セットを誘導することを示す図である。図１Ａ−ＭＣＦ１０Ａ細胞を増殖因子の非存在下で播種し、クラスターを形成させた。７２時間後、細胞を示された増殖因子（それぞれ、１０ｎｇ／ｍＬ）で処理し、位相差画像を２４時間後に撮影した（スケールバーは５０μｍである）。図１Ｂ−ＭＣＦ１０Ａ細胞を、示されたリガンド（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、示されたような移動または侵襲チャンバー中に播種し、１８時間後、下方の区画に移動した細胞をクリスタルバイオレットで染色した（左パネル）。ＥＧＦ処理の効果に対して正規化された、移動および侵襲シグナルの定量化が示される。データは、２回繰り返した代表実験からの生物学的トリプリケート（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）の平均±Ｓ．Ｄ．である（右パネル）。図１Ｃ−ＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＥＧＦを含有する培地中、トランスウェルインサート中に、阻害剤ＡＧ−１４７８（１μＭ）、Ｕ０１２６（５μＭ）、またはウォルトマンニン（２００ｎＭ）を入れずに、またはそれと共に播種し、１８時間移動させた。データは、トリプリケートの平均±Ｓ．Ｄ．である。実験を２回繰り返した。図１Ｄ−ＥＧＦにより（血清によってではない（Amit et al.、2007））ヒト乳腺ＭＣＦ１０Ａ細胞中で特異的に誘導された４２５個の遺伝子の一覧を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の転移の状況において上方調節された遺伝子（１，５９７個の遺伝子）と交差させた（Minn et al.、2005）。２３個の重複する遺伝子の１個が、５’−ホスファチジルイノシトール脂質ホスファターゼであるシナプトジャニン−２（ＳＹＮＪ２）をコードする。図１Ｅ−ＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＬａｃＺ（Ｃｔｒｌ）またはＳＹＮＪ２−ＧＦＰ（ＳＹＮＪ２−ＯＸ）をコードするレンチウイルス粒子に感染させた。内因性ＳＹＮＪ２およびＳＹＮＪ２−ＧＦＰ融合タンパク質の発現レベルを免疫ブロッティングにより決定し、等量のタンパク質をチューブリンの精査により確認した。図１Ｆ−ＭＣＦ１０Ａ細胞のＣｔｒｌおよびＳＹＮＪ２−ＯＸクローンを、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の非存在下（ＮＴ）または存在下で移動チャンバー中に播種し（５×１０４細胞／ウェル）、２２時間移動させた。フィルターの他方の側に到達した移動細胞をクリスタルバイオレットで染色し、画像を撮影した。図１Ｇ−ＭＣＦ１０Ａ細胞に、ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｔｒｌ）またはＳＹＮＪ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＹＮＪ２）をトランスフェクトし、ＳＹＮＪ２のタンパク質レベルを３６時間後に免疫ブロッティングにより決定した。等量のタンパク質を、Ｒａｓ−ＧＡＰに関する免疫ブロッティングにより確認した。図１Ｈ−Ｇで提示される細胞を、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の非存在下（ＮＴ）または存在下で移動チャンバー（５×１０４細胞／ウェル）中に播種し、２２時間移動させた。フィルターの下面に到達した移動細胞をクリスタルバイオレットで染色し、画像を捕捉した。図１Ｉ−ＭＣＦ１０Ａ細胞の集密培養物を、示されたｓｉＲＮＡで処理した。一度、単層が形成されたら、それらを、擦過傷閉鎖の速度をモニタリングする自動擦過システムにかけた。
【図２】ＥＧＦによるＳＹＮＪ２の転写誘導が侵襲的増殖を促進することを示す図である。図２Ａ−血清飢餓ＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）または血清（５％）で刺激し、ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡ発現をマイクロアレイまたはＲＴ−ｑＰＣＲを用いることによりアッセイした。図２Ｂ−ＭＣＦ１０Ａ細胞をＥＧＦで刺激し、抽出し、示されたように免疫ブロットした。図２Ｃ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２（ＳＹＮＪ２−ＯＸ）または対照としてのＬａｃＺ（Ｃｔｒｌ）をコードするウイルスに感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＥＧＦの非存在下または存在下で４日間培養した。ファロイジンおよびＤＡＰＩを用いて、位相差画像（上、バー：１００μｍ）および共焦点画像（下、バー：２０μｍ）を取得した。図２Ｄ〜Ｅ−ＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の非存在下（ＮＴ）または存在下で、移動または侵襲チャンバー（５〜６×１０４細胞／ウェル）中で２２時間培養した。フィルターの底に到達した細胞を染色し、フィルターの被覆を定量した（平均±Ｓ．Ｄ．）。
【図３】先端へのＳＹＮＪ２の誘導的転位が乳腺細胞の移動および侵襲に付随して起こることを示す図である。図３Ａ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）またはＳＹＮＪ２に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＹＮＪ２）と共に、ＬａｃＺ（Ｃｔｒｌ）またはＶ５タグ付ＳＹＮＪ２（ＳＹＮＪ２−Ｖ５）をコードするレンチウイルス粒子に感染させた。Ｖ５−ＳＹＮＪ２および内因性ＳＹＮＪ２のタンパク質レベルを、免疫ブロッティングにより決定した。等量のタンパク質を、ＡＫＴに関する免疫ブロッティングにより確認した。図３Ｂ−ＳＹＮＪ２、または対照としてのＬａｃＺを安定に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の位相画像（左パネル）および侵襲画像（右パネル）である。侵襲能力を、侵襲アッセイを用いて３回反復で決定し、侵襲細胞を定量し、対照（Ｃｔｒｌ）に対して正規化した。スケールバーは５０μｍである。図３Ｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＳＹＮＪ２に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（またはｓｉＣｔｒｌ）をトランスフェクトした。３６時間後、ＳＹＮＪ２のタンパク質レベルを、免疫ブロッティングにより決定した。等量のタンパク質を、Ｒａｓ−ＧＡＰに関する免疫ブロッティングにより確認した。図３Ｄ−Ｃからの細胞を移動または侵襲チャンバー中に播種し、１８時間インキュベートした。移動および侵襲シグナルを定量し、ＥＧＦ処理されたｓｉＣｔｒｌ細胞に対して正規化した。示されるデータは、トリプリケートの平均±Ｓ．Ｄ．である。図３Ｅ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を一過的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、ＴＧＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。低速度撮影顕微鏡写真を撮影した（１０秒毎）。示される画像は反転されており、黒色の点はＳＹＮＪ２および葉状仮足の基部でのその集合を表す。スケールバーは１０μｍである。図３Ｆ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いて内因性ＳＹＮＪ２およびＦ−アクチンについて免疫染色した。四角の領域は拡大されている。スケールバーは１０μｍである。図３Ｇ−ＭＣＦ１０Ａ細胞をＥＧＦで１８時間刺激した後、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いて内因性ＳＹＮＪ２について免疫染色し、Ｆ−アクチンについて対抗染色した。スケールバーは１０μｍである。
【図４】ＳＹＮＪ２の触媒活性が侵襲的増殖にとって必須であることを示す図である。図４Ａ〜Ｂ−ＳＹＮＪ２（ＳＹＮＪ２−ＯＸ）またはＳＹＮＪ２に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＹＮＪ２）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ならびに対照細胞を、５％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に播種した。６日後に画像を捕捉し、侵襲的スフェロイドを定量した（平均±Ｓ．Ｄ．）。スケールバーは５０μｍである。図４Ｃ〜Ｄ−ｓｈＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＷＴ  ＳＹＮＪ２（ｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＷＴ）または触媒によって機能しなくなった突然変異体（ｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＣＤ）に感染させた。細胞を、示されたように抽出し、免疫ブロットしたか、またはそれらを侵襲チャンバー中で１８時間侵襲させた。侵襲した細胞の画像およびその正規化された定量を示す（平均±Ｓ．Ｄ．）。図４Ｅ−フィブロネクチン上で増殖させたｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す。スケールバーは２μｍである。図４Ｆ−ファロイジンおよびＤＡＰＩで染色された示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中のＦ−アクチンの画像である。Ｚ軸切片（線）および拡大された領域を示す。矢頭は膨張した構造を示す。スケールバーは１０μｍである。
【図５】ＳＹＮＪ２の細胞内局在化を示す図である。図５Ａ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＲＦＰ−クラスリンをトランスフェクトし、フィブロネクチンで被覆されたプレート上に播種した。回転盤顕微鏡を用いて、細胞を５秒毎に画像化した。矢頭は新しく形成された先端を示す。スケールバーは５μｍである。図５Ｂ−先端（上２行）および細胞体の下部でのＳＹＮＪ２の集合および分解を示す代表的な時間枠である。下の行については、細胞にｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｉｆｅＡＣＴプラスミドをトランスフェクトし、コラーゲン上に播種した。その後、細胞を１分間隔で画像化した。矢頭を参照のために挿入した。時間尺度の差異に留意されたい。スケールバーは１μｍである。図５Ｃ−細胞をＴＩＲＦおよび落射蛍光顕微鏡により同時に画像化し、シグナルをキモグラフに変換した（Ｘ軸）。矢頭はシグナルの開始を示す。スケールバーは５μｍである。図５Ｄ−Ｄｙｎｇｏ−４ａ（３０μＭ；ダイナミン−２阻害剤）を用いる処理の５分前および５分後に回転盤共焦点顕微鏡を用いて、細胞を画像化した。スケールバーは５μｍである。図５Ｅ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｄｙｎｇｏ−４ａ（３０μＭ；３０ｍｉｎ）、または溶媒（ＤＭＳＯ）と共に予備インキュベートした。細胞溶解物を、抗ＧＦＰ抗体（または抗体なし；−Ａｂ）を用いる免疫沈降にかけた後、細胞溶解物の試料（５％）と共に、示された抗体で免疫ブロットした。図５Ｆ−細胞をフィブロネクチン上に播種し、固定し、内因性Ｒａｃ１について免疫染色した。スケールバーは１０μｍである。図５Ｇ−ＮＳＣ−２３７６６（５μＭ）を用いる３０ｍｉｎの長さの処理の５分前および５分後に共焦点顕微鏡を用いて、細胞を画像化した。スケールバーは５μｍである。図５Ｈ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、示されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで処理した。細胞抽出物をＳＹＮＪ２およびＲａｓ−ＧＡＰについてブロットした。ＧＴＰ−Ｒａｃ１レベルを、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（細胞骨格）を用いて決定した。
【図６】先端へのＳＹＮＪ２の局在化が、カベオリン分布と異なり、Ｆ−アクチン、コレステロールおよびＰＩ３Ｋに依存することを示す図である。図６Ａ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を発現し、ＲＦＰ−Ｃａｖ１を同時発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、経時的に同時に画像化し、シグナルをキモグラフに変換した（ＸおよびＹ軸）。ＳＹＮＪ２集合体の一過的性質およびカベオリン１の安定な出現に留意されたい。スケールバーは５μｍである。図６Ｂ−左パネルは、図５Ａにおけるように画像化された（５秒間隔、単一面、回転盤共焦点）、１５０の無作為に選択されたＳＹＮＪ２集合体の分布（ピット％対寿命）を示す。右パネルは、５５秒の寿命を示した集合体の平均（±ＳＥＭ）相対強度を示す。図６Ｃ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＭβＣＤ（１０ｍＭ、１５分）またはウォルトマンニン（５００ｎＭ、１５分）で処理した。同じ選択された細胞の画像を、処理の前または後に６秒毎に捕捉し、シグナルをキモグラフ（左パネル中の四角の差込み図である）に変換した。スケールバーは２０μｍである。図６Ｄ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２およびｌｉｆｅＡＣＴ−ｍＣｈｅｒｒｙを安定に同時発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ラトランクリンＢ（１μＭ、１５分）で処理した。処理の前または後に画像を獲得した。スケールバーは５μｍである。
【図７】ＳＹＮＪ２枯渇が細胞内小胞中のＥＧＦＲを停止させることを示す図である。図７Ａ−ｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣｔｒｌ）またはＳＹＮＪ２に特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＹＮＪ２）を安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞を、ＥＧＦ含有培地中に播種した３日後に抽出した。免疫ブロットを、ＳＹＮＪ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲのリン酸化チロシン１０６８（ｐＥＧＦＲ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、およびローディング対照としてのＲａｓ−ＧＡＰについて精査した。図７Ｂ−ＭＣＦ１０Ａ細胞に、ＥＧＦの存在下で、ｓｉＲＮＡ対照、またはＳＹＮＪ２に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＥＧＦＲおよびＳＹＮＪ２抗体を用いて、共焦点免疫蛍光分析を実施した。ＳＹＮＪ２枯渇細胞（星印）のみがＥＧＦＲ輸送の欠陥を示すことに留意されたい。スケールバーは１０μｍである。図７Ｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の３つの誘導体を、ＥＧＦＲについて免疫染色し、ＤＡＰＩおよびＦ−アクチンについて対抗染色した：（ｉ）ＳＹＮＪ２がノックダウンされた細胞（ｓｈＳＹＮＪ２；左列）、（ｉｉ）触媒により死んだ形態に対応するレンチウイルス遺伝子導入により感染した同じ細胞（ｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＣＤ；中央列）、および（ｉｉｉ）ＳＹＮＪ２がノックダウンされ、野生型形態が感染により導入された細胞（ｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＷＴ；右列）。スケールバーは２０μｍである。図７Ｄ−ユビキチン化されたＥＧＦＲのレベルである（密度測定）。図７Ｅ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体を、４８８−Ｔｆｎ（５分、１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。細胞を氷上で固定し、酸で洗浄し、シグナル強度について分析した。
【図８】ＳＹＮＪ２がＥＧＦＲの輸送および走化性を調節することを示す図である。図８Ａ−示されたｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全抽出物を、示されたように免疫ブロットした。図８Ｂ−示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１サブクローン中での表面ＥＧＦＲのＦＡＣＳ（左）および１２５Ｉ−ＥＧＦ結合（右；３回反復）分析。図８Ｃ−ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２細胞をフィブロネクチン上で増殖させ、ＥＧＦＲおよびＦ−アクチンについて免疫染色した。バーは２０μｍである。図８Ｄ−ＥＧＦ勾配への曝露時に走化性チャンバー中で移動したｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の軌跡のＲｏｓｅプロットである。赤色の軌跡は、ＥＧＦに向かって移動する細胞を示す。図８Ｅ−飢餓状態のＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体を、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理し、細胞溶解物を示されたように免疫沈降および免疫ブロッティングにかけた。図８Ｆ−細胞をＣに記載のように培養し、活性ＥＧＦＲ（ｐＹ１０４５）およびＦ−アクチンについて免疫染色した。バーは１０μｍである。図８Ｇ−示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体を、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間処理し、抽出物を示されたように免疫ブロットした。図８Ｈ−示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−Ｔｆｎ（２５μｇ／ｍｌ；５ｍｉｎ）に曝露し、酸で洗浄して表面結合したリガンドを除去し、示された間隔で画像を撮影した。正規化された蛍光シグナルを示す。バーは１０μｍである。図８Ｉ−ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＳＹＮＪ２で予備処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ；１０ｍｉｎ）で刺激し、酸で洗浄し、示された間隔で３７℃でインキュベートし、ＦＡＣＳにより分析した。
【図９】ＳＹＮＪ２が小胞輸送と接着斑形成の両方にとって必要であることを示す図である。図９Ａ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体（ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２）を固定し、ＥＥＡ１、Ｆ−アクチンおよび核（ＤＡＰＩ）について染色した。スケールバーは１０μｍである。図９Ｂ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体、すなわち、ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２細胞を、インテグリンベータ−１、Ｆ−アクチンおよびＤＡＰＩ（スケールバー、２０μｍ）について精査した。図９Ｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＳＹＮＪ２で４８時間処理した後、インテグリンベータ−１およびリン酸化ＥＧＦＲについて免疫染色した。図９Ｄ−パキシリン、核（ＤＡＰＩ）、およびＦ−アクチン（ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いる）に関するＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体の免疫蛍光分析である。パキシリンシグナルを、接着斑と比較した細胞質領域中で定量し、細胞あたりの接着斑の数も定量した。さらに、接着斑の形状を、完全な円からの逸脱（離心率）を決定することにより定量した。スケールバーは１０μｍである。
【図１０】ＳＹＮＪ２枯渇がホスホイノシチド恒常性を混乱させ、初期エンドソームに浸潤し、接着斑を分解することを示す図である。図１０Ａ−ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＧＦＰ−Ｒａｂ４プラスミドをトランスフェクトし、４８時間後、細胞を固定し、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いてＦ−アクチンについて対抗染色した。図１０Ｂ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体をＲａｂ５、Ｆ−アクチンおよび核（ＤＡＰＩ）について免疫染色した。画像を、Ｒａｂ５−陽性小胞のサイズおよび数について、ならびに平均細胞面積について定量した。スケールバーは１０μｍである。図１０Ｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の３Ｈ−ホスホイノシトール標識された誘導体から抽出されたホスホイノシチドをクロマトグラフィーにより分離し、そのレベルを３つの異なる実験において決定した（シグナルをｓｈＣｔｒｌ細胞に対して正規化した）。図１０Ｄ−ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ｐＹ１０６８−ＥＧＦＲ、パキシリンおよびＦ−アクチンについて精査した（同時局在化シグナルは白色である）。スケールバーは１０μｍである。図１０Ｅ−ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種した。付着しなかった細胞を２０ｍｉｎ後に除去し、付着した細胞を画像化し、表面積について定量した。図１０Ｆ−ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＲＴＣＡ  Ｅプレート上に播種し、リアルタイム電気抵抗測定を５ｓｅｃ間隔で８０ｍｉｎ記録した後、１０ｍｉｎ間隔でさらに８０ｍｉｎ記録した。２回反復の平均（±Ｓ．Ｄ．）を示す。
【図１１】ＳＹＮＪ２がプロテアーゼ分泌および浸潤突起集合を調節することを示す図である。図１１Ａ−ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間培養し、固定し、ＭＭＰ−９について免疫染色した。シグナル強度をヒートマップに変換し、コロニーコアからの距離に対してプロットした。矢頭はスフェロイドの境界を示す。バーは５０μｍである。図１１Ｂ−対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＳＹＮＪ２を安定に過剰発現する細胞からの上清を、ゼラチンザイモグラフィーを用いてＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性について３回反復で分析した。図１１Ｃ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、架橋蛍光ゼラチンで予め被覆されたカバースリップ上に播種した。３時間後、細胞をＧＦＰおよびＦ−アクチンについて精査し、浸潤突起構造を検出した（矢頭）。バーは１０μｍである。図１１Ｄ−ＳＹＮＪ２を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＳＹＮＪ２−ＯＸ）ならびにｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＳＹＮＪ２オリゴヌクレオチドで予備処理された細胞を、架橋蛍光ゼラチンで予め被覆されたカバースリップ上に播種し、浸潤突起構造を３回の独立した実験において定量した。図１１Ｅ−示されたｓｉＲＮＡで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤突起構造を、ゼラチン分解、ならびにＦ−アクチンまたはＴＫＳ５に関する染色によって検出した。矢頭（Ｚ軸画像）は浸潤突起を示す。バーは１０μｍである。図１１Ｆ−ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をゼラチン被覆カバースリップ上に播種し、ファロイジンおよびリン酸化型ＥＧＦＲ（チロシン１０６８）に対する抗体を用いてＣに記載のように加工した。スケールバーは１０μｍである。図１１Ｇ−示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１誘導体により３日間にわたって条件付けられた培地を、ＥＧＦ様リガンドに関するＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて検査した。
【図１２】ＳＹＪＮ２がマトリックス分解および浸潤突起集合を調節することを示す図である。図１２Ａ−示されたｓｉＲＮＡで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３回反復で播種し、３日間培養し、その条件化培地をゼラチン（０．１％）埋込みゲルを用いて電気泳動により分離した後、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９タンパク質分解活性を定量するためにタンパク質染色を行った。図１２Ｂ−ＧＦＰコンジュゲート化ビーズおよびＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の清澄化された抽出物を用いる同時免疫沈降分析。図１２Ｃ−ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＲＦＰ−コルタクチンプラスミドをトランスフェクトし、コラーゲンプレート上に播種した。生細胞画像分析を４８時間後に実施し、末梢および中枢細胞領域の両方の代表的なスナップショット画像を捕捉した。スケールバーは５μｍである。図１２Ｄ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の示された誘導体に、Ｔａｐｐ１（ＰＩ（３，４）Ｐ２結合剤）のＭｙｃタグ付ＰＨドメインをコードするプラスミドをトランスフェクトし、４８時間後、それらをゼラチン被覆表面上に播種した。Ｆ−アクチン、凝集したＴＫＳ５およびＰＩ（３，４）Ｐ２（Ｔａｐｐ１）の同時分布を可視化し、共焦点顕微鏡を用いて定量した。スケールバーは１０μｍである。図１２Ｅ−ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＦＩＴＣ−ゼラチン被覆ガラスカバースリップ上に播種し、３時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、ＣＤ４４について免疫染色し、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いてＦ−アクチンについて対抗染色した。細胞を蛍光顕微鏡を用いて可視化し、ＦＩＴＣ−ゼラチンマトリックス中の穴を観察することにより、浸潤突起を検出した。枠付の領域を拡大する。スケールバーは１０μｍである。図１２Ｆ−ＣＤ４４に対する抗体を、ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２細胞による表面発現のＦＡＣＳ分析のために用いた。示されるのは、枠付の領域に対応する細胞の画分である。図１２Ｇ−ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＳＹＮＪ２で予備処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＦＩＴＣ−ゼラチン被覆ガラスカバースリップ上に播種し、３時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、ＭＴ１−ＭＭＰについて免疫染色し、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いてＦ−アクチンについて対抗染色した。スケールバーは１０μｍである。
【図１３】ＳＹＮＪ２の酵素活性が乳腺腫瘍細胞の転移拡散を推進することを示す図である。図１３Ａ−ＲＦＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の示された誘導体（２×１０６個／マウス）を、雌のＳＣＩＤマウス（１０〜１１匹／群）の脂肪体中に埋込んだ。腫瘍サイズ（平均±Ｓ．Ｄ．）を、埋込みの２および６週間後に測定した。図１３Ｂ〜Ｃ−腋窩リンパ節および遠隔リンパ節（図１３Ｂ）、または肺（図１３Ｃ）への埋込みの６週間後に出現した転移を示す。星印はｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１および＊＊＊＜０．００１を示す。図１３Ｄ〜Ｆ−対照（ＬａｃＺ）およびＳＹＮＪ２を過剰発現する（ＳＹＮＪ２−ＯＸ）ＲＦＰ標識されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ａに記載のように動物中に埋込み、腫瘍サイズ（図１３Ｄ）、ならびにリンパ節（図１３Ｅ）および肺（図１３Ｆ）への転移を、埋込みの６および８週間後に定量した。図１３Ｇ〜Ｈ−示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ誘導体を、５週齢の雌のＳＣＩＤマウスの静脈内（１．５×１０５個／マウス；尾静脈）、または乳腺脂肪体（２．５×１０６個／マウス）中に注入した。４週間後、静脈中に注入されたマウスからの肺を、ＲＦＰシグナルについて検査した（左および中央パネル）。末梢血を、４週間後に脂肪体処理群から採取した。試料をフィコールの勾配上で精製し、１×１０６のＦＡＣＳ読取り値あたりのＲＦＰ陽性循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数をスコア化し、腫瘍重量に対して正規化した。
【図１４】局部および遠隔リンパ節転移のｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化の図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞を接種し、６週間後に分析したマウスにおける局部（同側）および遠隔（反対側）リンパ節転移の代表的な画像（図１３Ｂを参照されたい）。画像化の前に、マウスを麻酔し、リンパ節における転移の可視化および定量化のためにその毛皮を除去した。
【図１５】細胞移動および侵襲におけるＳＹＮＪ２の総合的な作用を描くワーキングモデルの図である。ＥＧＦＲを充填したリサイクルしているエンドソームは腹側膜に活性な受容体を位置させ、次いで、ＰＩ３Ｋの局部活性化を行う。ＰＩ３Ｋによる膜のＰＩ（４，５）Ｐ２のリン酸化はＰＩ（３，４，５）Ｐ３を生成し、ＳＹＮＪ２によりＰＩ（３，４）Ｐ２に脱リン酸化される。後者は、コルタクチンを固定し、アクチン重合の核となるＴＫＳ５を動員する。同時に、ＳＹＮＪ２はＣＤ４４などの接着分子、およびＭＴ１−ＭＭＰなどのプロテアーゼの送達を制御し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解し、新しい侵襲構造、浸潤突起を確立する。類似する方法で、細胞周辺へのＥＧＦＲの送達は、ＳＹＮＪ２（およびホスホリパーゼＣ）によるＰＩ（４，５）Ｐ２の破壊をもたらし、ダイナミンおよびコフィリンなどのアクチン切断酵素を局部的に活性化して、皮質アクチン繊維を溶解し、葉状仮足と呼ばれる、アクチンが充填され、インテグリンに富む突出を開始させる。水平の矢印は、細胞移動の方向を示す。形質膜の色分けされた部分は、特異的ＰＩリン脂質を示す。
【図１６】ＳＹＮＪ２が侵攻性乳腫瘍において高度に発現されることを示す図である。図１６Ａ−免疫組織化学および組織マイクロアレイを用いて、ＳＹＮＪ２存在量に従って３３１の侵襲性乳がん腫を階層化した（高い、中程度および低い）。腫瘍の相対画分を、臨床サブタイプに従って提示する。図１６Ｂ−内腔の場合（星印は対照としての内皮細胞による発現を示す）、および基底様とＨＥＲ２過剰発現乳腫瘍の両方において観察された強度およびパターンを示すＳＹＮＪ２染色の代表的画像である（右列は拡大画像）。図１６Ｃ−２８６人（左：ＧＳＥ２０３４）または９９人（右；ＧＳＥ１９７８３）の乳がん患者のコホートにおけるＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡ発現に従って階層化されたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【図１７】ＳＹＮＪ２の５’−ホスファターゼ活性を測定するのに用いられる蛍光偏光アッセイの原理を示す図である。図１７Ａは、未結合のＰＩ（３，４）Ｐ２蛍光プローブは低い偏光読取り値を生じさせるが、結合したＰＩ（３，４）Ｐ２蛍光プローブは偏光読取り値を増加させる一般原理を示すスキームである。図１７Ｂは、偏光値（ｍＰ）により測定されたＳＹＮＪ２  ５’−ホスファターゼ活性検出を示す代表的な棒グラフである。
【図１８】ｐＥＴ２８プラスミド中にクローニングされ、大腸菌中で発現されたＦｌａｇ−ＴＡＰＰ１  ＰＨドメイン−Ｈｉｓのアミノ酸および核酸配列（それぞれ、配列番号１３および１４）の図である。ＴＡＰＰ１  ＰＨドメインは黄色で示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、腫瘍転移を防止し、がんを処置および予後診断し、推定転移阻害剤である薬剤を同定する方法に関する。
【００３２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その出願において、以下の説明に記載されるか、または実施例により例示される詳細に限定されるとは限らないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態または様々な方法で実施もしくは実行されることを可能にする。
【００３３】
増殖因子は細胞移動および転移を推進するが、基礎となる機構は完全には理解されていない。
【００３４】
本発明者らは、ここで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで浸潤突起および葉状仮足を調節し、ｉｎ  ｖｉｖｏでがん転移を調節する優れたモジュールとしてシナプトジャニン−２（ＳＹＮＪ２）を同定した。
【００３５】
以下およびその後の実施例の節で例示されるように、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、動物、および患者標本においてその知見を実証した。特に、ＥＧＦで刺激した乳腺細胞を用いて、本発明者らは、脂質ホスファターゼシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）を、侵襲的表現型と関連付け、高いＳＹＮＪ２をがん患者の短い生存率と関係付けた。ＳＹＮＪ２のノックダウンは、動物モデルにおいて乳腺腫瘍細胞の転移を確実に悪化させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＳＹＮＪ２枯渇細胞は、ＥＧＦＲおよびインテグリンの逸脱した輸送を示し、接着斑の変形、葉状仮足の停止および浸潤突起の消失をもたらした。理論に束縛されるものではないが、能動的なＥＧＦＲのリサイクルが特定のホスホイノシトール脂質のＳＹＮＪ２媒介性脱リン酸化を局所的に促進することによって、浸潤突起と葉状仮足の両方の形成を引き起こし、腫瘍進行を容易にすることが示唆される（図１５を参照されたい）。
【００３６】
よって、本発明の態様によれば、腫瘍がグリオーマではないという条件で腫瘍転移を防止する方法であって、腫瘍転移の防止を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤を投与することによって、腫瘍転移を防止するステップを含む、方法が提供される。
【００３７】
本明細書で用いられる語句「腫瘍転移」とは、その原発部位から身体の他の部分へ拡散する悪性腫瘍、例えば、肺に転移する乳がんを指す。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「がん」および「腫瘍」は、互換的に用いられる。この用語は、異常な、および未制御の細胞分裂により引き起こされる悪性増殖または腫瘍を指す。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「防止すること」とは、転移プロセスまたは進行およびその後の転移を停止させること、休止させること、阻害することを指す。
【００４０】
さらに別の態様によれば、がんを処置する方法であって、がんの処置を必要とする対象に治療上有効量のシナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤およびがんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤を投与することによって、がんを処置するステップを含む、方法が提供される。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「処置すること」は、ある状態の進行を無効化すること、実質的に阻害すること、遅延させること、もしくは逆転させること、ある状態の臨床もしくは美的症状を実質的に改善すること、またはある状態の臨床もしくは美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態に従って処置（または予後診断）することができるがんの非限定例としては、限定されるものではないが、消化管の腫瘍（結腸がん腫、直腸がん腫、結腸直腸がん腫、結腸直腸がん、結腸直腸腺腫、遺伝性非腺腫性１型、遺伝性非腺腫性２型、遺伝性非腺腫性３型、遺伝性非腺腫性６型；結腸直腸がん、遺伝性非腺腫性７型、小腸および／もしくは大腸がん腫、食道がん腫、食道がんを伴う胼胝症、胃がん腫、膵臓がん腫、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜がん腫、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢がん腫、胆管腫瘍、前立腺がん、前立腺腺がん、腎臓がん（例えば、ウィルムス腫瘍２型もしくは１型）、肝臓がん（例えば、肝芽腫、肝細胞がん腫、肝細胞がん）、膀胱がん、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣性胚細胞腫瘍、卵巣、子宮、上皮性卵巣の未熟型奇形腫、仙尾部腫瘍、絨毛がん腫、胎盤部位絨毛性腫瘍、上皮性成人腫瘍、卵巣がん腫、漿液性卵巣がん、卵巣性索腫瘍、子宮頸がん腫、子宮頸部がん腫、小細胞および非小細胞肺がん腫、鼻咽頭がん腫、乳がん腫（例えば、乳管がん、侵襲性管内乳がん、散発性；乳がん、乳がんに対する罹患性、４型乳がん、乳がん−１、乳がん−３；乳−卵巣がん）、扁平上皮がん腫（例えば、頭部および頸部における）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽腫、神経芽腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞、組織球性、リンパ芽球性、Ｔ細胞性、胸腺リンパ腫）、グリオーマ、腺がん、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質がん腫、脳の悪性腫瘍（腫瘍）、様々な他のがん腫（例えば、気管支大細胞、腺管、Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｒｅ腹水、類表皮、大細胞、Ｌｅｗｉｓ肺、髄様、粘膜表皮、燕麦細胞、小細胞、紡錘細胞、有棘細胞、移行細胞、未分化、がん肉腫、絨毛がん腫、嚢胞腺がん）、上衣芽細胞腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド、リンパ芽球）、線維肉腫、巨細胞種様、グリア腫瘍、グリア芽腫（例えば、多形成、星状細胞腫）、グリオーマ、肝がん、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞）、副腎腫、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化症、平滑筋芽腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄白血病、急性骨髄性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄性白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性白血病、Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性もしくは骨髄細胞性白血病、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球−マクロファージ白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞性白血病、前駆Ｂ細胞白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ球新生物、骨髄悪性腫瘍の素因、急性非リンパ球性白血病）、リンパ肉腫、黒色腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、髄芽細胞腫、中皮腫、転移腫瘍、単球性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽細胞腫、神経組織グリア腫瘍、神経組織ニューロン腫瘍、神経線維腫症、神経芽腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、オステオミエローマ、骨肉腫（例えば、ユーイング肉腫）、乳頭腫、移行細胞、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍（侵襲性）、形質細胞腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、イエンセン肉腫、骨原性肉腫、細網肉腫）、神経鞘腫、皮下腫瘍、奇形がん腫（例えば、多能性）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫および毛包上皮腫、胃がん、線維肉腫、多形成グリア芽細胞腫；多発性グロムス腫瘍、リー−フラウメニがん症候群、脂肪肉腫、ＩＩ型リンチ症候群、雄性胚細胞腫瘍、肥満細胞白血病、甲状腺髄様がん、多発性髄膜腫、内分泌新生物、粘液肉腫、非クロム親和性傍神経節腫、石灰化上皮腫、乳頭状、家族性および散発性、ラブドイド素因症候群、家族性、ラブドイド腫瘍、軟部肉腫、ならびにグリア芽腫を伴うターコット症候群などの、任意の固形または非固形のがんおよび／またはがん転移が挙げられる。
【００４３】
特定の実施形態によれば、がんは、乳がんである。
【００４４】
特定の実施形態によれば、がん（またはがん転移）は、ＥＧＦにより調節される。
【００４５】
別の好ましい実施形態によれば、がんは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２などのＥｒｂＢ受容体分子の過剰発現または上方調節を特徴とする。
【００４６】
ＥＧＦＲ過剰発現（上方調節として知られる）または過剰活性をもたらす突然変異は、肺がん、肛門がんおよび多形成グリア芽細胞腫などのいくつかのがんと関連している。この後者の場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩと呼ばれる、多かれ少なかれ特異的なＥＧＦＲの突然変異が観察されることが多い。ＥＧＦＲまたはファミリーメンバーの突然変異、増幅または誤調節は、全ての上皮がんの約３０％に関与している。
【００４７】
ＥＧＦＲを含む突然変異は、その定常的な活性化をもたらし、未制御の細胞分裂−がんの素因をもたらし得る。結果として、ＥＧＦＲの突然変異がいくつかの型のがんにおいて同定され、それは拡大するクラスの抗がん療法の標的である（非特許文献２）。
【００４８】
ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅または過剰発現は、約３０％の乳がんにおいて起こる。それは疾患の再発率の増加および予後の悪化と強く関係している。過剰発現はまた、卵巣がん、胃がん、および侵攻型の子宮がん、例えば、子宮内膜漿液性腺がんにおいても起こることが知られている。
【００４９】
以下は、ＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼのメンバーが関与するがんの一覧である。
【００５０】
ＥｒｂＢ−１  −  副腎皮質がん、胆道がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、グリア芽細胞腫、頭部および頸部がん、肺がん（非小細胞、扁平上皮がん腫、腺がん、および大細胞肺がん）、膵臓がん、唾液腺がん、下痢性良性新生物、侵襲性がん腫、皮膚疾患、非浸潤性乳管がん、爪周囲炎。
【００５１】
ＥｒｂＢ−２  −  胆道がん、膀胱がん、乳がん、胆管がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、グリア芽細胞腫、卵巣がん、膵臓がん、唾液腺がん。特定の実施形態によれば、がんは、乳がんまたは胃がんである。
【００５２】
ＥｒｂＢ−３  −  乳がん、肺がんおよびウイルス性白血病。
【００５３】
ＥｒｂＢ−４  −  乳がん、ウイルス性白血病、髄芽細胞腫、肺がんおよび乳腺腫瘍。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「対象」とは、がんと診断された哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、シナプトジャニン−２またはＳＹＮＪ２とは、シナプスのイノシトール−１，４，５−三リン酸５−ホスファターゼ２、ＥＣ３．１．３．３６を指す。シナプトジャニン−２は、遍在的に発現されるイノシトールポリリン酸５−ホスファターゼである（それぞれ、ポリヌクレオチドおよびコードされるポリペプチドを指す配列番号１および２）。
【００５６】
本明細書で用いられる語句「シナプトジャニン２（ＳＹＮＪ２）の阻害剤」とは、ＳＹＮＪ２の発現または活性を減少させるか、または下方調節する分子を指す。
【００５７】
下方調節は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を超えるものであるか、または完全な阻害（以下に記載のものなどの所与のアッセイによって決定された場合、活性または発現の１００％の喪失）であってもよい。
【００５８】
ＳＹＮＪ２の発現の下方調節を、以下に記載のようにＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで行うことができる。ＳＹＮＪ２活性とは、その触媒活性［ホスファターゼとして、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３をＰＩ（３，４）Ｐ２に変換する］、そのシグナリング活性（ダイナミン、コトラクチンと相互作用する、図５Ｅ〜Ｈを参照されたい）または細胞局在化を指す。後者の場合、ＳＹＮＪ２の阻害剤は、タンパク質の細胞局在化を変化させる。
【００５９】
かくして、ＳＹＮＪ２の下方調節を、遺伝子をノックインするか、またはその転写および／もしくは翻訳を阻害する様々な分子［例えば、核酸サイレンシング剤、例えば、核酸（ＲＮＡ）サイレンシング剤、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイムおよびＤＮＡザイム］を用いてゲノムおよび／もしくは転写物レベルで、または例えば、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素などを用いてタンパク質レベルで行うことができる。
【００６０】
以下は、ＳＹＮＪ２の発現レベルおよび／または活性を下方調節することができる薬剤の一覧である。
【００６１】
ＳＹＮＪ２を下方調節することができる薬剤の一例は、ＳＹＮＪ２に特異的に結合することができる抗体または抗体断片である。好ましくは、この抗体は、ＳＹＮＪ２の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。ＳＹＮＪ２は細胞タンパク質であるので、抗体を細胞中に導入するための手段が取られる。本明細書で用いられる用語「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。
【００６２】
エピトープ決定基は通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの、分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。
【００６３】
本発明で用いられる用語「抗体」は、マクロファージに結合することができる無傷の分子ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどのその機能的断片を含む。これらの機能的抗体断片は、以下のように定義される：（１）Ｆａｂ、この断片は抗体分子の一価抗原結合断片を含有し、パパイン酵素を用いた全抗体の消化により生成することができ、無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部が得られる；（２）Ｆａｂ’、この抗体分子の断片は、全抗体をペプシンで処理した後、還元することにより得ることができ、無傷の軽鎖および重鎖の一部が得られる；抗体１分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、この抗体の断片は、全抗体をペプシン酵素で処理した後、還元しないことにより得ることができる；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合により一緒に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体である；（４）Ｆｖ、２つの鎖により発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に操作された断片と定義される；ならびに（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子的に融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学的に操作された分子。
【００６４】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにその断片を生成する方法は、当業界で周知である（例えば、参照により本明細書に援用される非特許文献３を参照されたい）。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態による抗体断片を、抗体のタンパク質分解的加水分解によるか、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞中での発現（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物もしくは他のタンパク質発現系）により調製することができる。抗体断片を、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片を、ペプシンを用いた抗体の酵素的切断により生成して、Ｆ（ａｂ’）２と命名される５Ｓの断片を提供することができる。この断片を、チオール還元剤、場合により、ジスルフィド結合の切断から得られるスルフヒドリル基のための遮断基を用いてさらに切断して、３．５ＳのＦａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ’断片とＦｃ断片とを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの特許文献１および特許文献２、ならびにそこに含まれる参考文献により記載されており、これらの特許はその全体が参照により本明細書に援用される。また、非特許文献４も参照されたい。断片が無傷抗体により認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、一価重鎖−軽鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的技術を用いることもできる。
【００６６】
Ｆｖ断片は、ＶＨとＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、非特許文献５に記載のように、非共有的であってもよい。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合により連結するか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋することができる。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーにより接続されたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより接続されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクター中に挿入され、続いて、大腸菌などの宿主細胞中に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、および特許文献３（その全体が参照により本明細書に援用される）により記載されている。
【００６７】
別の形態の抗体断片は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製される。例えば、非特許文献９を参照されたい。
【００６８】
抗ＳＹＮＪ２は市販されている。抗ヒトＳＹＮＪ２モノクローナル抗体の供給業者の例としては、限定されるものではないが、Ａｍｓｂｉｏ、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ、Ｇｅｎｗａｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐなどが挙げられる。本発明の抗体は、治療適用のために非免疫原性になっている。
【００６９】
ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含有するその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲに由来する残基（ドナー抗体）により置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、輸入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む（非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２）。
【００７０】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当業界で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源に由来する１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、輸入残基を指すことが多く、典型的には、輸入可変ドメインから取られる。ヒト化は、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換することにより、本質的にはＷｉｎｔｅｒｓおよび共同研究者の方法（非特許文献１０、非特許文献１３、非特許文献１４）に従って実施することができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換された、キメラ抗体である（特許文献４）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の同様の部位に由来する残基により置換されたヒト抗体である。
【００７１】
ヒト抗体を、ファージディスプレーライブラリーなどの、当業界で公知の様々な技術を用いて生成することもできる（非特許文献１５、非特許文献１６）。Cole et al.およびBoerner et al.の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（非特許文献１７、非特許文献１８）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウスに導入することにより、ヒト抗体を作製することができる。チャレンジの際に、遺伝子再配置、集合、および抗体レパートリーなどのあらゆる点でヒトにおいて見られるものと密接に類似するヒト抗体生成が観察される。この手法は、例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、ならびに以下の科学出版物：非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３および非特許文献２４に記載されている。
【００７２】
ＳＹＮＪ２の下方調節を、ＲＮＡサイレンシングにより達成することもできる。本明細書で用いられる語句「ＲＮＡサイレンシング」とは、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子により媒介される調節機構群［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、同時抑制、および翻訳抑制］を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、および菌類などの多くの種類の生物において観察されている。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「ＲＮＡサイレンシング剤」とは、標的遺伝子の発現を特異的に阻害するか、または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。ある特定の実施形態においては、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構によりｍＲＮＡ分子の完全なプロセッシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を防止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤は、非コードＲＮＡ分子、例えば、対形成した鎖を含むＲＮＡ二本鎖、ならびにそのような非コードＲＮＡを生成することができるＲＮＡ前駆体を含む。ＲＮＡサイレンシング剤の例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが挙げられる。一実施形態においては、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態においては、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
【００７４】
本発明のある実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、標的ＲＮＡ（例えば、ＳＹＮＪ２）に特異的であり、標的遺伝子に対する９９％以下の全体的相同性、例えば、標的遺伝子に対する９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％未満の全体的相同性を発現する遺伝子またはスプライスバリアントを交叉阻害しないか、または沈黙させない。
【００７５】
ＲＮＡ干渉とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。植物における対応するプロセスは、一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、菌類においてはクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、一般に多様な植物相および動物門によって共有される。外来遺伝子発現からのそのような保護は、ウイルス感染から、または相同な一本鎖ＲＮＡもしくはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答によるトランスポゾンエレメントの宿主ゲノム中への無作為な組込みから誘導される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して進化してきたものであってもよい。
【００７６】
細胞中の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡから低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短片へのプロセッシングに関与する。ダイサー活性から誘導される低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、ＲＮＡにより誘導されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に呼ばれる、エンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。
【００７７】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を下方調節するためのｄｓＲＮＡの使用を企図する。
【００７８】
一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐより大きい。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐよりも大きいｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこれらのより長い領域がインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすという考えのため、非常に限定されてきた。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は、細胞が最適なサイレンシング配列を選択し、いくつかのｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減することができる；長いｄｓＲＮＡがｓｉＲＮＡに必要であるものよりも複雑度が低いサイレンシングライブラリーを可能にする；およびおそらく最も重要なことに、長いｄｓＲＮＡが治療剤として用いられた場合にウイルスのエスケープ変異を防止することができるという点でいくつかの利点を提供することができる。
【００７９】
様々な研究が、長いｄｓＲＮＡを用いて、ストレス応答を誘導するか、または有意なオフターゲット効果を引き起こすことなく遺伝子発現を沈黙化することができることを証明している。例えば、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９を参照されたい。
【００８０】
特に、本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明は、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いｄｓＲＮＡ（３０塩基を超える転写物）の導入を企図する。例えば、非特許文献３０、非特許文献３１を参照されたい。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明はまた、遺伝子発現を下方調節するためにインターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないように特異的に設計された長いｄｓＲＮＡの誘導を企図する。例えば、非特許文献３２は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターから長い二本鎖ＲＮＡを発現する、ｐＤＥＣＡＰと命名されたベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓＲＮＡの輸出を容易にする５’−キャップ構造と３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠くため、ｐＤＥＣＡＰに由来する長いｄｓＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。
【００８２】
哺乳動物系においてインターフェロンおよびＰＫＲ経路を回避する別の方法は、トランスフェクションまたは内因性発現を介する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の誘導によるものである。
【００８３】
用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子干渉ＲＮＡ二本鎖（一般的には１８〜３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐの二本鎖領域と、末端に対称的な２塩基の３’突出とを含む２１ｍｅｒとして化学的に合成されるが、２５〜３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二本鎖は同じ位置の２１ｍｅｒと比較して、効力が１００倍も増加し得ることが最近記載された。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを用いて得られた観察された効力の増加は、生成物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）を含むダイサーの提供から生じ、これはｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＩＳＣ中への進入の速度または効率を改善すると理論付けられる。
【００８４】
３’突出の位置はｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖上に３’突出を有する非対称性二本鎖は、センス鎖上に３’突出を有するものよりも一般に強力であることが見出された（Rose et al.、2005）。アンチセンス転写物を標的化する場合、反対の有効性パターンが観察されるため、これはＲＩＳＣ中への非対称性鎖充填に起因し得る。
【００８５】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を接続して、ヘアピンまたはステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。かくして、記載のように、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
【００８６】
低分子干渉ＲＮＡ分子の例を、Chuang et al.（上掲）におけるＳＪ２−１（コード領域１６１２〜１６３３；５’ＡＡＣＧＴＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧ、配列番号３）、ＳＪ２−２（３’非翻訳領域中の領域５４１９〜５４４０；５’ＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＡＣＧＣＧＡＴＡＴＴ、配列番号４）；またはＳＹＮＪ２のコード領域１６１２〜１６３３もしくは４９２５〜４９４６に対するｓｉＲＮＡを教示する非特許文献３３、非特許文献３４に見出すことができる。
【００８７】
ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルを上手く下方調節するｓｉＲＮＡ配列の他の例としては、限定されるものではないが、ＧＡＡＧＡＡＡＣＡＵＣＣＣＵＵＵＧＡＵ（配列番号５）およびＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＧＣＡＧＧＵＧＵＵ（配列番号６）が挙げられる。
【００８８】
本明細書で用いられる用語「ｓｈＲＮＡ」とは、相補的配列の第１および第２の領域を含み、相補性の程度および領域の方向が、その領域の間で塩基対形成が起こるような十分なものであり、第１および第２の領域がループ領域によって連結され、ループが、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如の結果得られる、ステムループ構造を有するＲＮＡ剤を指す。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１の間およびそれを含む数である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成させるために用いることができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（非特許文献３５）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（非特許文献３６）が挙げられる。当業者であれば、得られる一本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループまたはヘアピン構造を形成することを認識できる。
【００８９】
ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルを上手く下方調節するｓｈＲＮＡ配列の例としては、限定されるものではないが、ＣＣＧＧＣＣＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＧＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）：ＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号８）；ＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号９）が挙げられる。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態と共に使用するのに好適なＲＮＡサイレンシング剤の合成を、以下のように行うことができる。第１に、ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンの下流で走査する。それぞれのＡＡおよび３’に隣接する１９ヌクレオチドの出現を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位中により多いため、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位を、オープンリーディングフレームから選択する。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を阻害することができる（非特許文献３７）。しかし、５’ＵＴＲを指向するｓｉＲＮＡが細胞内ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に無効化したＧＡＰＤＨについて証明されたように（非特許文献３８）、非翻訳領域を指向するｓｉＲＮＡも有効であることが理解される。
【００９１】
第２に、潜在的な標的部位を、ＮＣＢＩサーバー（非特許文献３９）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどの任意の配列アラインメントソフトウェアを用いて、好適なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列に対する有意な相同性を示す推定標的部位をフィルタリングする。
【００９２】
適格な標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択する。低いＧ／Ｃ含量を含むものは５５％より高いＧ／Ｃ含量を含むものと比較して遺伝子サイレンシングの媒介においてより有効であることが証明されているため、好ましい配列は低いＧ／Ｃ含量を含むものである。いくつかの標的部位を、好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択する。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、好ましくは陰性対照を一緒に用いる。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠く。かくして、好ましくはｓｉＲＮＡのスクランブルされたヌクレオチド配列を用いるが、但し、それは任意の他の遺伝子に対する任意の有意な相同性を示さない。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、化学的に改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解される。
【００９４】
いくつかの実施形態においては、本明細書で提供されるＲＮＡサイレンシング剤は、「細胞透過性ペプチド」と機能的に関連していてもよい。本明細書で用いられる場合、「細胞透過性ペプチド」は、短い（約１２〜３０残基）アミノ酸配列または細胞の形質膜および／もしくは核膜を横断する膜透過性複合体の輸送と関連するエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシス）転位特性を付与する機能的モチーフを含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態の膜透過性複合体において用いられる細胞透過性ペプチドは、好ましくは、ジスルフィド結合のために改変された二本鎖リボ核酸とのそのような結合を含まないか、またはそれを形成するように誘導体化される、少なくとも１つの非機能的システイン残基を含む。そのような特性を付与する代表的なアミノ酸モチーフは、その内容が参照により本明細書に明示的に援用される特許文献１１に列挙される。本発明のいくつかの実施形態の細胞透過性ペプチドとしては、好ましくは、限定されるものではないが、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが挙げられる。
【００９５】
ＲＮＡサイレンシング剤を用いて標的化されるｍＲＮＡとしては、限定されるものではないが、その発現が望ましくない表現型形質と相関するものが挙げられる。標的化することができるｍＲＮＡの例は、トランケートされたタンパク質をコードする、すなわち、欠失を含むものである。したがって、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤を、いずれかの側の欠失上の架橋領域に標的化させることができる。そのようなＲＮＡサイレンシング剤の細胞中への導入は、非突然変異タンパク質に影響しないようにしながら、突然変異タンパク質の下方調節を引き起こす。
【００９６】
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡであってもよい。
【００９７】
用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ」は同義語であり、遺伝子発現を調節する約１９〜２８ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合を指す。ｍｉＲＮＡは様々な生物中に見出され（非特許文献４０）、発生、恒常性、および病因において役割を果たすことが示されている。
【００９８】
以下は、ｍｉＲＮＡ活性の機構の簡単な説明である。
【００９９】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は転写され、プリ−ｍｉＲＮＡとして知られるｍｉＲＮＡ前駆体の生成をもたらす。プリ−ｍｉＲＮＡは、典型的には、複数のプリ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部である。プリ−ｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを含むヘアピンを形成することができる。ステムは、不一致の塩基を含んでもよい。
【０１００】
プリ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは、典型的には、プリ−ｍｉＲＮＡ中の末端ループを認識し、約２つのヘリックスターンをステムに切断して、プレ−ｍｉＲＮＡとして知られる６０〜７０ヌクレオチドの前駆体を生成する。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切断でプリ−ｍｉＲＮＡを切断し、５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’突出を有するプレ−ｍｉＲＮＡステムループを得る。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を超えて伸長するステムのおよそ１つのヘリックスターン（約１０ヌクレオチド）が効率的なプロセッシングにとって必須であると見積もられる。次いで、プレ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸送受容体Ｅｘ−ポーチン−５によって核から細胞質へ能動的に輸送される。
【０１０１】
次いで、プレ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼでもあるダイサーによって認識される。ダイサーもまた、ステムループの基部にある５’リン酸および３’突出を認識することができる。次いで、ダイサーはステムループの基部から末端ループの２つのヘリックスターンを切断し、さらなる５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’突出を脱離する。不一致を含んでもよい、得られるｓｉＲＮＡ様二本鎖は、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊として知られる同様のサイズの断片を含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊は、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡの反対側のアームから誘導することができる。ｍｉＲＮＡ＊配列はクローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリー中に見出されるが、典型的には、ｍｉＲＮＡよりも低い頻度で見出される。
【０１０２】
初めはｍｉＲＮＡ＊を含む二本鎖種として提供されるが、ｍｉＲＮＡは最終的には一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡにより誘導されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボ核タンパク質複合体に組込まれるようになる。様々なタンパク質が、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二本鎖に対する特異性の可変性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制するか、または活性化する）を誘導することができ、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二本鎖の鎖がＲＩＳＣ中に充填されるＲＩＳＣを形成することができる。
【０１０３】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣ中に充填される時、ｍｉＲＮＡ＊は除去、分解される。ＲＩＳＣ中に充填されるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖の鎖は、５’末端があまり緊密ではなく対形成した鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両方の末端が大まかに等価な５’対を有する場合、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊は遺伝子サイレンシング活性を有し得る。
【０１０４】
ＲＩＳＣは、特に、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７により、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの高レベルの相補性に基づいて標的核酸を同定する。
【０１０５】
いくつかの研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との塩基対形成要件に目を向けてきた（非特許文献４１により概説される）。哺乳動物細胞において、ｍｉＲＮＡの最初の８個のヌクレオチドが重要であり得る（非特許文献４２）。しかしながら、マイクロＲＮＡの他の部分も、ｍＲＮＡ結合に参画し得る。さらに、３’での十分な塩基対形成は、５’での不十分な対形成を相殺することができる（非特許文献４３）。全ゲノムに関するｍｉＲＮＡ結合を分析するコンピュータ研究により、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’での塩基２〜７の特異的役割が示唆されたが、通常は「Ａ」であるとわかっている最初のヌクレオチドの役割も認識されている（非特許文献４４）。同様に、非特許文献４５により、標的を同定および検証するためにヌクレオチド１〜７または２〜８が用いられた。
【０１０６】
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはコード領域中にあってもよい。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが、同じか、または複数の部位を認識することにより、同じｍＲＮＡ標的を調節することができる。多くの遺伝子的に同定された標的における複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの共同作用が多くの効率的な翻訳阻害を提供することを示してもよい。
【０１０７】
ｍｉＲＮＡは２つの機構、すなわちｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のいずれかによって、遺伝子発現を下方調節するようにＲＩＳＣに指令することができる。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対するある特定の程度の相補性を有する場合、ｍＲＮＡの切断を特定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、切断は典型的にはｍｉＲＮＡの残基１０〜１１とのヌクレオチド対の間で行われる。あるいは、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する必要な程度の相補性を有さない場合、翻訳を抑制することができる。動物はｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度が低いため、翻訳抑制は動物においてより一般的である。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’および３’末端に可変性があってもよいことに留意すべきである。この可変性は、切断部位に関してＤｒｏｓｈａおよびダイサーの酵素的プロセッシングにおける可変性に起因するものであってもよい。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’および３’末端での可変性もまた、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡのステム構造の不一致に起因するものであってもよい。ステム鎖の不一致は、異なるヘアピン構造の集団をもたらし得る。ステム構造における可変性は、Ｄｒｏｓｈａおよびダイサーによる切断の生成物における可変性ももたらし得る。
【０１０９】
用語「マイクロＲＮＡ模倣体」とは、ＲＮＡｉ経路に進入し、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣し、成熟二本鎖分子または模倣前駆体（例えば、またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、改変または非改変ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、または代替核酸化学物質（例えば、ＬＮＡもしくは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ））を含んでもよい。成熟二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体について、二本鎖領域の長さは、１３〜３３、１８〜２４または２１〜２３ヌクレオチドの間で変化してもよい。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドを含んでもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３個のヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列はまた、プレ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３個のヌクレオチドであってもよい。
【０１１０】
上記に提供された説明から、がん細胞とｍｉＲＮＡとの接触を、いくつかの方法で行うことができることが理解される：
１．  がん細胞に、成熟二本鎖ｍｉＲＮＡを一過的にトランスフェクトすること。
２．  がん細胞に、成熟ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを安定に、または一過的にトランスフェクトすること。
３．  がん細胞に、プレ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを安定に、または一過的にトランスフェクトすること。プレ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０、または６０〜７０個のヌクレオチドを含んでもよい。プレ−ｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊を含んでもよい。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はまた、プリ−ｍｉＲＮＡの５’および３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを除くプリ−ｍｉＲＮＡのものであってもよい。
４．  がん細胞に、プリ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを安定に、または一過的にトランスフェクトすること。プリ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３０，０００、５０〜２５，０００、１００〜２０，０００、１，０００〜１，５００または８０〜１００個のヌクレオチドを含んでもよい。プリ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に記載のプレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊、ならびにその変異体を含んでもよい。
【０１１１】
ＳＹＮＪ２を下方調節することができる別の薬剤は、ＳＹＮＪ２のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖と二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（非特許文献４６、非特許文献４７）。ＤＮＡザイムの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提唱されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれ７〜９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接した、１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。この型のＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン結合部でその基質ＲＮＡを効率的に切断することができる（非特許文献４８；ＤＮＡザイムの概説については、非特許文献４９を参照されたい）。
【０１１２】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する合成の操作されたＤＮＡザイムの構築および増幅の例は、Joyce et al.の特許文献１２に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に対する類似する設計のＤＮＡザイムが、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏで結腸がん細胞転移を上手く阻害することが最近観察された（非特許文献５０）。別の適用においては、ｂｃｒ−ａｂ１がん遺伝子と相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞中でのがん遺伝子発現の阻害、ならびにＣＭＬおよびＡＬＬの場合、自己骨髄移植における再発率の低下に成功した。
【０１１３】
ＳＹＮＪ２の下方調節を、ＳＹＮＪ２をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いることによって行うこともできる。
【０１１４】
ＳＹＮＪ２を効率的に下方調節するために用いることができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンス手法にとって重要な２つの態様を考慮しながら行わなければならない。第１の態様は、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であるが、第２の態様は、その翻訳を阻害する方法で細胞内の指定のｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１１５】
先行技術は、オリゴヌクレオチドを様々な細胞型に効率的に送達するために用いることができるいくつかの送達戦略を教示している（例えば、非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３、非特許文献５４および非特許文献５５を参照されたい）。
【０１１６】
さらに、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギーを構成する熱力学サイクルに基づいて、標的ｍＲＮＡに対する最も高い予測された結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（例えば、非特許文献５６を参照されたい）。
【０１１７】
そのようなアルゴリズムは、細胞中でアンチセンス手法を実施するために上手く用いられてきた。例えば、Walton et al.により開発されたアルゴリズムにより、科学者はウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）転写物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを上手く設計できるようになった。同じ研究グループは、細胞培養物中の３モデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、動的ＰＣＲ技術により評価されたように、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学物質を含む２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験などの、ほぼ全ての事例において有効であることがわかったとより最近報告した。
【０１１８】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いる特定のオリゴヌクレオチドの効率を設計および予測するためのいくつかの手法も公開された（非特許文献５７）。
【０１１９】
例えば、ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡ（ＳＹＮＪ２タンパク質をコードする）に対して標的化された好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：ＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴ（配列番号１０）、ＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣ（配列番号１１）およびＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣ（配列番号１２）のものである。
【０１２０】
いくつかの臨床試験が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性を証明してきた。例えば、がんの処置にとって好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが上手く用いられてきたが（非特許文献５８）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液悪性腫瘍の処置が臨床試験に入っており、患者によって許容されることが示されている（非特許文献５９）。
【０１２１】
より最近では、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介性抑制は、マウスモデルにおいてヒトがん細胞の胸膜への播種を阻害することが報告されている（非特許文献６０）。
【０１２２】
かくして、現在のコンセンサスは、上記のように、正確度が高いアンチセンス設計アルゴリズムおよび様々なオリゴヌクレオチド送達系の作成をもたらしてきたアンチセンス技術の分野における最近の発達により、当業者が過度の試行錯誤実験に頼る必要なく、既知の配列の発現を下方調節するのに好適なアンチセンス手法を設計および実施することができるようになったということである。
【０１２３】
ＳＹＮＪ２を下方調節することができる別の薬剤は、ＳＹＮＪ２をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のために益々用いられている（非特許文献６１）。任意の特異的標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計する可能性により、基礎研究と治療適用の両方においてそれらは価値ある道具になっている。治療剤の領域では、リボザイムは、感染症におけるウイルスＲＮＡ、がんにおける優性がん遺伝子および遺伝子障害における体細胞変異を標的化するために活用されてきた（非特許文献６２）。最も注目すべきことに、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコールが既に第１相試験に入っている。より最近では、リボザイムはトランスジェニック動物研究、遺伝子標的検証および経路解明のために用いられてきた。いくつかのリボザイムが、臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験において試験される初めて化学的に合成されたリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ならびに他の会社は、動物モデルにおける抗血管形成治療剤の重要性を証明した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを減少させるのに有効であることがわかった（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
【０１２４】
ＳＹＮＪ２を下方調節することができる別の薬剤は、ＳＹＮＪ２に結合する、および／またはそれを切断する任意の分子である。
【０１２５】
本発明の教示は、細胞運動性におけるＳＹＮＪ２の役割の基礎となる一般的機構を明らかにした。
【０１２６】
その原理は図１５に概略される。したがって、重要な事象は、ＥＧＦにより誘導されるＳＹＮＪ２の上方調節、および３つのホスホイノシチド：ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３およびＰＩ（３，５）Ｐ２の結果として生じる枯渇を伴う。ＳＹＮＪ２に媒介されるＰＩ（４，５）Ｐ２の脱リン酸化は、ホスホリパーゼＣ−ガンマによるＰＩ（４，５）Ｐ２の分解、およびＰＩ（３，４，５）Ｐ３を生成するＰＩ３Ｋによるリン酸化と平行する。集合的に、ＥＧＦによる３つの酵素の刺激は、形質膜からＰＩ（４，５）Ｐ２結合剤の群を解離させ、また、ＰＩ（４，５）Ｐ２を含まないエンドサイトーシス小胞を生成する。同時に、ＳＹＮＪ２は、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を、浸潤突起形成にとって必須であるＰＩ（３，４）Ｐ２に変換する。一度、環境が整えば、ＰＩ（３，４）Ｐ２はＴＫＳ５に結合し、コフィリンが浸潤突起内でアクチン反矢尻端を生成することができるダイナミンとコルタクチン中心複合体を核とする。本発明の結果によれば、ＳＹＮＪ２は次の浸潤突起成熟ステップ、すなわち、ＭＭＰの分泌ならびにＭＴ１−ＭＭＰおよび他の表面分子、例えば、ＣＤ４４の送達にも関与する。同様の方法で、ＳＹＮＪ２は、先端へのＥＧＦＲおよびインテグリンの送達を制御し、コフィリンを活性化する可能性があり、これは葉状仮足突出の形成を指令する中枢的な事象である。
【０１２７】
これらの知見は、腫瘍転移の推定阻害剤であるＳＹＮＪ２阻害剤を同定するのに利用することができる。
【０１２８】
かくして、本発明の態様によれば、腫瘍転移の推定阻害剤を同定する方法であって、試験薬剤の存在下でＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングを分析するステップを含み、前記試験薬剤の前記存在下でのＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのプロセッシングの、前記試験薬剤の非存在下でのプロセッシングと比較した減少が、腫瘍転移の推定阻害剤を示す、方法が提供される。
【０１２９】
試験薬剤は、生体分子（タンパク質、例えば、ペプチドもしくは抗体、核酸分子、例えば、サイレンシング剤、炭水化物、脂質もしくはその組合せ）または小分子（例えば、化学物質）であってもよい。
【０１３０】
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。後者は、細胞系中で、または無細胞系を用いて実施することができる。
【０１３１】
例示的なアッセイは、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２へのＳＹＮＪ２媒介性プロセッシングを競合アッセイにより分析することを含む。
【０１３２】
したがって、競合アッセイは、ＰＩ（３，４）Ｐ２に結合したＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインを含む複合体からのＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメインの置換を試験するものである。
【０１３３】
例示的な実施形態によれば、蛍光偏光競合アッセイが用いられる。このアッセイは、分子が隔離するより大きいエレメント（例えば、タンパク質）に結合すると、空間中でのその移動は著しく減少するという原理に依拠する。この現象を、試料の平行面および垂直面からの測定後に蛍光偏光をアッセイすることを可能にする蛍光プローブを用いて検出および測定することができる。したがって、溶液中の未結合の蛍光分子は、非常に低い偏光読取り値を生じるが、これらの分子に結合する（隔離する）検出剤（例えば、結合タンパク質）を溶液に添加した場合、蛍光分子は溶液中での偏光読取り値を増加させる閉じ込められた組成物中で安定化される。
【０１３４】
例えば、前記アッセイは、組換えＳＹＮＪ２およびその非蛍光基質、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３と共に、ＰＩ（３，４）Ｐ２結合ドメイン（例えば、ＰＨ−ドメイン、例えば、Ｔａｐｐ１  ＰＨドメイン、配列番号１５〜１６）および蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２を含んでもよい。ＳＹＮＪ２の触媒活性の生成物は、蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２を置換し、かくして、蛍光偏光を減少させる。
【０１３５】
特定の実施形態によれば、市販の５’ＰＩ（３，４，５）Ｐ３ホスファターゼ活性蛍光偏光アッセイが用いられる（例えば、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号Ｋ−１４００）。
【０１３６】
特定の実施形態によれば、ＳＹＮＪ２と、基質としてのＰＩ（３，４，５）Ｐ３とを含む反応混合物を、ＳＹＮＪ２の触媒活性（脱リン酸化）を可能にする条件下で、調製された試験薬剤と共に、またはそれを用いずにインキュベートする。試験薬剤は、例えば、小分子、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物またはその組合せであってもよい。インキュベーション後、ＰＩ（３，４）Ｐ２生成物を含有する溶液を、ＰＩ（３，４）Ｐ２結合タンパク質（例えば、Ｔａｐｐ１のＰＨ−ドメイン、配列番号１５）と、蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２との混合物と混合し、蛍光偏光を測定する。結合した蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２分子は、ＳＹＮＪ２の酵素活性により生成された未標識のＰＩ（３，４）Ｐ２により置換され、溶液中の未結合の蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２分子の量が増加するため、このアッセイで測定される偏光値は減少する。試験薬剤の存在下での蛍光偏光の値が試験薬剤の非存在下での値と比較して増加する場合、試験薬剤は推定ＳＹＮＪ２阻害剤である。
【０１３７】
同定されると、抗転移剤としての試験薬剤の機能を、以下にさらに例示されるゼラチン−ザイモグラフィーアッセイ、トランスウェルアッセイおよび試験動物などの、関連アッセイを用いてさらに実証する。
【０１３８】
この方法を用いて、本発明者らは、本発明のいくつかの実施形態によるＳＹＮＪ２阻害剤として用いることができるいくつかの小分子を同定した。これらの分子は、図１９に記載され、以下の実施例１０の表２に示される。
【０１３９】
記載のように、ＳＹＮＪ２の阻害剤は、がんの発症または進行と関連する細胞表面受容体の阻害剤に加えて投与される。本発明の実施形態によれば、受容体はがん遺伝子である。
【０１４０】
本発明の教示に従って標的化することができる受容体の例は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＥｒｂＢ−２のものなどの受容体チロシンキナーゼである。
【０１４１】
標的化することができる他の表面分子としては、インテグリンマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ダイナミン、ＴＫＳ５およびＣＤ４４が挙げられる。
【０１４２】
細胞表面分子の阻害剤は、当業界で周知である。そのような阻害剤の非限定的一覧は、以下に提供される。
【０１４３】
かくして、例えば、がん遺伝子としてのＥＧＦＲの同定は、ＥＧＦＲに対する抗がん治療剤の開発をもたらした。
【０１４４】
セツキシマブおよびパニツムマブは、モノクローナル抗体阻害剤の例である。臨床開発中の他のモノクローナルは、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブである。モノクローナル抗体は、細胞外リガンド結合ドメインを遮断する。結合部位が遮断された場合、シグナル分子は最早そこに結合することができず、チロシンキナーゼを活性化することができない。
【０１４５】
別の方法は、受容体の細胞質側にあるＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害するための小分子を用いることである。キナーゼ活性がない場合、ＥＧＦＲはそれ自体を活性化することができず、これは下流のアダプタータンパク質の結合のための必要条件である。表面上、増殖のためにこの経路に依拠する細胞中のシグナリングカスケードを停止させることにより、腫瘍増殖および移動は減少する。ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびラパチニブ（ＥＧＦＲとＥＲＢＢ２阻害剤との混合物）は、小分子キナーゼ阻害剤の例である。他の例としては、ＥＧＦＲを直接標的とするイレッサおよびタルセバが挙げられる。
【０１４６】
ＨＥＲ２は、モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチンとして販売されている）の標的である。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現されるがんにおいてのみ有効である。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体の二量体化を阻害する、別のモノクローナル抗体、ペルツズマブが、２０１２年６月にトラスツズマブと一緒の使用についてＦＤＡによって認可された。
【０１４７】
さらに、ＮｅｕＶａｘ（Ｇａｌｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）は、ＨＥＲ２を発現するがん細胞を標的とし、破壊するように「キラー」Ｔ細胞に指令するペプチドに基づく免疫療法である。
【０１４８】
ＨＥＲ２の発現は、エストロゲン受容体を介するシグナリングによって調節される。エストロゲン受容体を介して作用するエストラジオールおよびタモキシフェンは、ＨＥＲ２の発現を下方調節する。
【０１４９】
本発明の教示に従って用いることができる抗体の例が以下に列挙されるが、限定を意味するものではない。
【０１５０】
【表１】
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ＳＹＮＪ２の阻害剤および場合により、本明細書に記載の細胞表面受容体の阻害剤を、対象自身に投与するか、またはそれを好適な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物中で投与することができる。
【０１５１】
本明細書で用いられる「医薬組成物」とは、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の１つまたは複数の有効成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【０１５２】
ここで、用語「有効成分」とは、生物学的効果の原因となり得るＳＹＮＪ２の阻害剤（および場合により、細胞表面受容体の阻害剤）を指す。
【０１５３】
以後、互換的に用いることができる語句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効化しない担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
【０１５４】
ここで、用語「賦形剤」とは、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５５】
薬剤の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に援用される非特許文献６３に見出すことができる。
【０１５６】
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸または非経口送達、例えば、筋肉内、皮下および髄内注射ならびにくも膜下、直接脳室内、例えば、右もしくは左心室腔への心臓内、一般的な冠動脈中、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射が挙げられる。
【０１５７】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬剤送達のための従来の手法としては、神経外科的戦略（例えば、大脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用する試みにおける薬剤の分子操作（例えば、それ自体ではＢＢＢを横断することができない薬剤と共に、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の生成）；薬剤の脂質溶解性を増加させるように設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲーション）；ならびに高浸透圧性崩壊によるＢＢＢの完全性の一時的な崩壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入またはアンギオテンシンペプチドなどの生物活性剤の使用の結果生じる）が挙げられる。しかしながら、これらの戦略はそれぞれ、それを送達方法として最適ではないものにする、侵襲的外科手術と関連する固有のリスク、内因性輸送系において固有の制限により課されるサイズ制限、ＣＮＳの外部で活性であり得る担体モチーフを含むキメラ分子の全身投与と関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが破壊された脳の領域内での脳損傷のリスクの可能性などの制限を有する。
【０１５８】
交互に、例えば、患者の組織領域中への医薬組成物の直接的注入により、全身様式よりもむしろ局部様式で医薬組成物を投与することができる。
【０１５９】
用語「組織」とは、機能または複数の機能を実行するように設計された細胞からなる生物の部分を指す。例としては、限定されるものではないが、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎臓組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられる。
【０１６０】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、当業界で周知のプロセスにより、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。
【０１６１】
かくして、本発明のいくつかの実施形態に従う使用のための医薬組成物を、薬学的に用いることができる、有効成分の調製物への加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いる従来の様式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１６２】
注射のために、医薬組成物の有効成分を、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理的塩バッファーなどの生理的に適合するバッファー中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、障壁を透過させるのに適切な浸透剤が製剤中で用いられる。そのような浸透剤は当業界で一般的に知られている。
【０１６３】
経口投与のために、活性化合物を当業界で周知の薬学的に許容される担体と混合することにより、医薬組成物を容易に製剤化することができる。そのような担体により、患者による経口摂取のための、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして医薬組成物を製剤化することができる。経口使用のための薬理学的調製物を、固体賦形剤を用いて作製し、場合により、得られる混合物を粉砕し、必要に応じて、好適な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを取得することができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１６４】
糖衣錠コアは、好適なコーティングと共に提供される。このために、場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい濃縮された糖溶液を用いることができる。同定のため、または異なる組合せの活性化合物用量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を添加してもよい。
【０１６５】
経口的に用いることができる医薬組成物としては、ゼラチンから作られる押し込み式カプセルならびにゼラチンと可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールから作られる軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により、安定剤と混合した有効成分を含有してもよい。軟質カプセルにおいては、有効成分を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択される投与経路にとって好適な用量にあるべきである。
【０１６６】
口腔投与のために、組成物は従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ってもよい。
【０１６７】
経鼻吸入による投与のために、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用と共に加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提供物の形態で都合良く送達される。加圧されたエアロゾルの場合、用量単位は一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えば、ディスペンサーにおける使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０１６８】
本明細書に記載の医薬組成物を、例えば、ボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤を、場合により、添加された保存剤を含む、単位剤形、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液であってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。
【０１６９】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水性溶液を含む。さらに、有効成分の懸濁液を、好適な油または水に基づく注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含有してもよい。
【０１７０】
あるいは、有効成分は、使用前の、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱源を含まない水に基づく溶液を用いる構成のための粉末形態にあってもよい。
【０１７１】
また、本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物中で製剤化することもできる。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態の文脈における使用にとって好適な医薬組成物は、意図される目的を達成するのに有効な量の有効成分が含有される組成物を含む。特に、治療上有効量は、障害（例えば、がんもしくは転移がん）の症状を防止する、軽減するもしくは改善するか、または処置される対象の生存を延長するのに有効な有効成分（ＳＹＮＪ２阻害剤）の量を意味する。
【０１７３】
治療上有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内にある。
【０１７４】
本発明の方法において用いられる任意の調製物について、治療上有効量または用量は、最初はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、用量を動物モデル中で処方して、所望の濃度または力価を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１７５】
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療有効性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞培養物中で、または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方するのに用いることができる。用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて変化してもよい。正確な処方、投与経路および用量を、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、非特許文献６４を参照されたい）。
【０１７６】
投薬量および間隔を個別に調整して、生物学的効果を誘導するか、または抑制するのに十分なものである有効成分のＳＹＮＪ２阻害剤レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【０１７７】
処置しようとする状態の重症度および応答性に応じて、用量は単回または複数回の投与のものであってよく、処置の経過は数日から数週間、または治癒が行われるか、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１７８】
投与される組成物の量は、勿論、処置される対象、苦痛の重症度、投与の様式、処方する医師の判断などに依存する。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態の組成物を、必要に応じて、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有してもよい、ＦＤＡに認可されたキットなどのパックまたはディスペンサー装置中に提供することができる。ブリスターパックなどのパックは、例えば、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置に、投与のための説明書を添付してもよい。また、パックまたはディスペンサー装置に、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の容器と関連する通知書を添付してもよく、この通知書は組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による認可を反映するものである。そのような通知書は、例えば、処方薬に関する米国食品医薬品局により認可されたラベル、または認可された製品挿入物のものであってもよい。適合性薬学的担体中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器中に入れ、上記でさらに詳述されたように、示された状態の処置のために標識することもできる。
【０１８０】
細胞移動へのＳＹＮＪ２の寄与と一致して、本発明者らは、侵攻性サブタイプのがんにおけるＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの有意な上方調節を観察したが、これはＳＹＮＪ２が予後診断マーカーとして用いることができることを示唆している。
【０１８１】
かくして、本発明の態様によれば、がんの予後診断を必要とする対象においてがんを予後診断する方法であって、対象のがん細胞中のＳＹＮＪ２のレベルまたは活性を決定するステップを含み、対象の前記がん細胞中の前記ＳＹＮＪ２の前記活性のレベルの、罹患していない対照試料の細胞中のＳＹＮＪ２の活性のレベルと比較した上方調節が、予後不良を示す、方法が提供される。
【０１８２】
本明細書で用いられる用語「予後診断」とは、疾患（がん）の転帰を決定することを指す。
【０１８３】
本明細書で用いられる場合、「予後不良」とは、疾患の再発の危険性が高いこと、および／または疾患に起因する死亡の危険性が高いことを指す。
【０１８４】
本明細書で用いられる用語「レベル」とは、ＤＮＡ（遺伝子増幅）、ＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを指す。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合、「ＳＹＮＪ２活性」とは、主にそのホスファターゼ活性、すなわち、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３をＰＩ（３，４）Ｐ２に変換する活性を指す。
【０１８６】
特定の実施形態によれば、前記活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイを用いてアッセイされる。
【０１８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイ：これらの方法においては、特定の酵素（この場合、ホスファターゼ）の活性が、細胞から抽出されたタンパク質混合物中で測定される。活性は、比色分析方法を良好に用いる分光光度計中で測定するか、または非変性アクリルアミドゲル（すなわち、活性ゲル）中で測定することができる。電気泳動後、ゲルを、基質および比色分析試薬を含有する溶液中に浸す。得られる染色されたバンドは、対象のタンパク質の酵素活性に対応する。良好に較正され、直線的な応答範囲にある場合、試料中に存在する酵素の量は、生成された色の量に比例する。定量精度を改善するために、一般には酵素標準が用いられる。
【０１８８】
ＳＹＮＪ２のための特異的アッセイは上記に記載されており、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３からＰＩ（３，４）Ｐ２への変換活性が試験される。
【０１８９】
タンパク質の発現および／または活性を検出する方法
ＳＹＮＪ２のタンパク質発現は、当業界で公知の方法を用いて決定することができる。
【０１９０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、マイクロタイタープレートのウェルなどの表面への、タンパク質基質を含有する試料（例えば、固定された細胞またはタンパク質性溶液）の固定を含む。酵素と共役した基質特異的抗体を印加し、基質に結合させる。次いで、抗体の存在を検出し、抗体に共役した酵素を用いる比色分析方法により定量する。この方法で一般的に用いられる酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。良好に較正され、直線的な応答範囲にある場合、試料中に存在する基質の量は、生成された色の量に比例する。定量精度を改善するために、一般には基質標準が用いられる。
【０１９１】
ウェスタンブロット：この方法は、アクリルアミドゲルを用いた他のタンパク質からの基質の分離、次いで、膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）への基質の移転を含む。次いで、基質の存在を、基質に特異的な抗体により検出し、次いで、抗体結合試薬により検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡ、または他の抗体であってもよい。抗体結合試薬を、上記のように放射標識するか、または酵素に結合することができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によるものであってもよい。この方法は、電気泳動中のアクリルアミドゲル中での移動距離を示す膜上での相対的位置による、基質量の定量と、その同一性の決定との両方を可能にする。
【０１９２】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）：１つのバージョンにおいては、この方法は、アガロースビーズなどの沈降性担体上に固定された特異的抗体または放射標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）を用いる所望のタンパク質（すなわち、基質）の沈降を含む。沈降した沈殿中の計数は、基質の量に比例する。
【０１９３】
ＲＩＡの代替バージョンにおいては、標識された基質と、未標識の抗体結合タンパク質とが用いられる。未知の量の基質を含有する試料を、様々な量で添加する。標識された基質からの沈降した計数の減少は、添加された試料中の基質の量に比例する。
【０１９４】
蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的抗体による細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出を含む。基質特異的抗体は、フルオロフォアに結合される。検出は、細胞が光線を通過する時にそれぞれの細胞から放出される光の波長を読取る細胞選別装置による。この方法は、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１９５】
免疫組織化学分析：この方法は、基質特異的抗体による固定された細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出を含む。基質特異的抗体は、酵素に結合したものであるか、またはフルオロフォアに結合したものであってもよい。検出は、顕微鏡および主観的または自動的評価による。酵素に結合した抗体を用いる場合、比色反応が必要であり得る。免疫組織化学分析を行った後、例えば、ヘマトキシリンまたはギムサ染色を用いて細胞核を対抗染色することが多いことが理解される。
【０１９６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ活性アッセイ：この方法によれば、発色基質は、活性酵素を含有する細胞上に適用され、酵素は、基質が分解されて、光学または蛍光顕微鏡により見える発色生成物を生成する反応を触媒する。
【０１９７】
あるいは、またはさらに、ＳＹＮＪ２のレベルは、当業界で周知である方法を用いてＲＮＡレベルで検出され、そのいくつかを以下に記載する。
【０１９８】
ＲＮＡの発現レベルを検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の細胞中のＲＮＡの発現レベルを、当業界で公知の方法を用いて決定することができる。
【０１９９】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物中の特定のＲＮＡの検出を含む。ＲＮＡ試料を、塩基対間の水素結合を防止する薬剤（例えば、ホルムアミド）を用いる処理により変性させ、全てのＲＮＡ分子がアンフォールディングされた、直線状のコンフォメーションを有することを確保する。次いで、個々のＲＮＡ分子を、ゲル電気泳動によってサイズに従って分離し、変性したＲＮＡが付着するニトロセルロースまたはナイロンに基づく膜に移転させる。次いで、膜を標識されたＤＮＡプローブに曝露する。放射性同位体または酵素結合ヌクレオチドを用いて、プローブを標識することができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光を用いることであってもよい。この方法は、電気泳動中のゲル中での移動距離を示す膜上での相対的位置による、特定のＲＮＡ分子の量の定量と、その同一性の決定との両方を可能にする。
【０２００】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法は、比較的稀なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を用いる。第１に、ＲＮＡ分子を細胞から精製し、逆転写酵素（例えばＭＭＬＶ−ＲＴ）およびオリゴｄＴ、ランダムヘキサマーまたは遺伝子特異的プライマーなどのプライマーを用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。次いで、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを適用することにより、ＰＣＲ増幅反応をＰＣＲ装置中で実行する。当業者であれば、特異的ＲＮＡ分子を検出するのに好適である遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列ならびにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数など）を選択することができる。ＰＣＲのサイクル数を調整し、増幅生成物を既知の対照と比較することにより、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いることができることが理解される。
【０２０１】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色：この方法においては、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、細胞中に存在するＲＮＡ分子に結合させる。一般に、細胞を最初に顕微鏡スライドに固定して、細胞構造を保存し、ＲＮＡ分子が分解されるのを防いだ後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーションバッファーにかける。ハイブリダイゼーションバッファーは、プローブの非特異的結合を回避しながら、ｉｎ  ｓｉｔｕでＤＮＡまたはＲＮＡプローブの、その標的ｍＲＮＡ分子との特異的ハイブリダイゼーションを可能にするホルムアミドおよび塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬を含む。当業者であれば、特異的プローブおよび細胞の型に対してハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度など）を調整することができる。ハイブリダイゼーション後、未結合のプローブを洗浄除去し、結合したプローブを公知の方法を用いて検出する。例えば、放射性標識されたプローブを用いる場合、スライドを、放射性標識されたプローブを用いて生成されたシグナルを示す写真乳剤にかける；プローブを酵素で標識した場合、比色反応の形成のために酵素特異的基質を添加する；プローブを蛍光標識を用いて標識する場合、結合したプローブを蛍光顕微鏡を用いて見る；プローブをタグ（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチンなど）を用いて標識する場合、結合したプローブを、公知の方法を用いて検出することができるタグ特異的抗体との相互作用後に検出することができる。
【０２０２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ染色：この方法は、非特許文献６５および非特許文献６６に記載されている。簡単に述べると、標識されたヌクレオチドをＰＣＲ反応に組込むことにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応を固定された細胞上で実施する。Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）から入手可能なレーザーキャプチャーマイクロダイセクションＰｉｘＣｅｌｌ  Ｉ  ＬＣＭシステムなどの特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ装置を用いて、反応を実行する。
【０２０３】
ＤＮＡマイクロアレイ／ＤＮＡチップ：
特定の発達プロセスまたは生理学的応答の間の生物の完全な転写プログラムの分析を可能にするＤＮＡマイクロアレイを用いて、数千個の遺伝子の発現を同時に分析することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス顕微鏡スライドなどの支持体の表面上の密接に包装された領域に結合した数千個の個々の遺伝子配列からなる。ＤＮＡマイクロアレイを調製するための様々な方法が開発されてきた。１つの方法においては、分析のためのそれぞれの遺伝子のコード領域の約１キロベースのセグメントを、個別にＰＣＲ増幅する。ロボット装置を用いてそれぞれの増幅されたＤＮＡ試料を、ガラス顕微鏡スライドの表面上の密集した領域に印加した後、熱および化学処理によって加工して、ＤＮＡ配列を支持体の表面に結合させ、それらを変性させる。典型的には、そのようなアレイは約２ｘ２ｃｍであり、個々の核酸の約６０００個のスポットを含有する。この技術の変法においては、何万もの同一のオリゴヌクレオチドが支持体の表面上の小さい四角の領域中で合成されるように、通常は２０ヌクレオチド長の複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを、支持体の表面に共有結合した初期ヌクレオチドから合成する。単一の遺伝子に由来する複数のオリゴヌクレオチド配列を、その遺伝子の発現の分析のためにスライドの近隣領域中で合成する。したがって、数千個の遺伝子を１つのガラススライド上に表示することができる。上記の「ＤＮＡマイクロアレイ」と反対に、合成オリゴヌクレオチドのそのようなアレイを、当業界では「ＤＮＡチップ」と呼ぶことができる（非特許文献６７）。
【０２０４】
至適基準法、例えば、画像化方法、生検サンプリング、マーカー発現、免疫組織化学分析などを用いて、予後診断を実証することができる。
【０２０５】
以下は、乳がんの特定例であるが、いかなる意味でも限定を意味するものではない。乳がんの予後診断は、通常、腫瘍のサイズ（Ｔ）、近隣リンパ節への転移の状態（Ｎ）、および他の臓器への遠隔転移の存在または非存在（Ｍ）を評価する、外科手術後の疾患状態（ＴＮＭステージ）によって決定される。ＴＮＭステージに従って分類された患者の予後診断は、同じステージにおいてさえ異なる。換言すれば、同じステージの乳がんにおいては、エストロゲンもしくはプロゲステロン受容体（ＥＲもしくはＰＲ）の発現およびＨＥＲタンパク質の過剰発現またはその遺伝子の増幅によって、予後診断を決定することができる。
【０２０６】
ＳＹＮＪ２を検出するために上記で説明された本発明のいくつかの実施形態の薬剤を、好ましくは、がんのステージおよび／または予後を診断および／または評価するのに使用するための適切な説明書およびＦＤＡ認可を示すラベルと共に、診断キット／製品中に含有させることができる。
【０２０７】
そのようなキットは、例えば、少なくとも１つの上記診断剤（例えば、抗ＨＥＲ２および／もしくは抗ＥＲまたはこれらの標的のためのオリゴヌクレオチドプローブ／プライマーと共に、例えば、抗ＳＹＮＪ２抗体）を含む少なくとも１つの容器、および別の容器中に包装された画像化試薬（例えば、酵素、二次抗体、バッファー、発色基質、蛍光材料）を含んでもよい。キットはまた、キットの貯蔵期間を改善するための適切なバッファーおよび保存剤を含んでもよい。
【０２０８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「含むが限定されるものではい（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０２０９】
用語「からなる」は、「含み、かつ限定する」を意味する。
【０２１０】
用語「本質的にからなる」は、組成物、方法または構造が、さらなる成分、ステップおよび／または部分が特許請求された組成物、方法または構造の基本的特徴および新規特徴を実質的に変化させない場合に限り、さらなる成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいことを意味する。
【０２１１】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、その混合物を含む、複数の化合物を含んでもよい。本出願を通じて、本発明の様々な実施形態を、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は単に便宜上かつ簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に関する柔軟性のない限定と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、特に開示された全ての可能なサブ範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの特に開示されたサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２１２】
本明細書において数値範囲が示される場合はいつでも、それは示された範囲内の任意の記載の数字（分数または整数）を含むことを意味する。語句「第１の示された数と第２の示された数の間の範囲」と、「第１の示された数から第２の示された数までの範囲」は、本明細書では互換的に用いられ、第１および第２の示された数と、その間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０２１３】
本明細書で用いられる用語「方法」とは、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学業界の実務者に公知であるか、または彼らによって既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含む、所与の任務を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【０２１４】
本明細書で用いられる用語「処置すること」は、状態の進行を無効化すること、実質的に阻害すること、遅延させること、もしくは逆転させること、状態の臨床症状もしくは美的症状を実質的に改善すること、または状態の臨床症状もしくは美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【０２１５】
明確性のために、別々の実施形態の文脈で記載される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適なサブの組合せで、または本発明の任意の他の記載された実施形態において好適なものとして提供することもできる。様々な実施形態の文脈で記載されるある特定の特徴は、その実施形態がこれらの要素なしでは実施不可能でない限り、これらの実施形態の本質的な特徴と考えられるべきではない。
【０２１６】
上記で説明され、以下の特許請求の範囲で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に支持される。
【実施例】
【０２１７】
ここで、上記説明と一緒に、非限定的様式で本発明のいくつかの実施形態を例示する以下の実施例を参照する。
【０２１８】
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で用いられる実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、非特許文献６８、非特許文献６９、非特許文献７０、非特許文献７１、非特許文献７２、非特許文献７３、；特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６および特許文献１７に記載の方法；非特許文献７４、非特許文献７５、非特許文献７６、非特許文献７７を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許文献および科学文献に広く記載されており、例えば、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、特許文献３１、特許文献３２および特許文献３３；非特許文献７８、非特許文献７９、非特許文献８０、非特許文献８１、非特許文献８２、非特許文献８３、非特許文献８４、非特許文献８５、非特許文献８６を参照されたい；これらは全て、あたかも完全に本明細書に記載されたかのように参照により援用される。他の一般的な参考文献は、本文献を通して提供される。その中の手順は、当業界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。その中に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に援用される。
【０２１９】
（実施例１）
材料および方法
細胞移動、侵襲および走化性アッセイ
細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌトレー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の上側区分に３回反復で播種し、１８時間、介在膜を通して移動させた。その後、細胞をパラホルムアルデヒド（３％）中で固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．０５％）中で透過処理し、メチルバイオレット（０．０２％）で染色した。フィルターの上側で増殖している非移動細胞を除去し、移動した細胞を写真撮影した。ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｃｈａｍｂｅｒｓを用いて、侵襲アッセイを実施した。走化性については、ｉｂｉｄｉ（Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのチャンバーおよび低速度撮影画像化を用いた。細胞核の位置を、ＩｍａｇｅＪを用いて追跡した。
【０２２０】
ホスホイノシチド分析
細胞をイノシトールを含まない培地中で３０分間インキュベートし、［３Ｈ］−イノシトールと透析血清（１０％）の両方を添加した培地に交換した。細胞を３日間培養し、洗浄し、１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、１Ｍメタノール中に抽出した。次いで、細胞を擦り取り、クロロホルム中に抽出した後、メタノール：０．１Ｍ  ＥＤＴＡｐＨ８．０中に抽出し、有機相を蒸発させた。その後、抽出物を脱アセチル化し、２つのパーティスフェアＳＡＸカラム（Ｗｈａｔｍａｎ）を縦一列に、および４段階勾配のリン酸アンモニウムｐＨ６．０を用いる陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００）により分離した。放射性標識された溶出液を、オンラインフローシンチレーション分析装置により検出し、ＰｒｏＦＳＡソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量した。
【０２２１】
ゼラチンザイモグラフィー
ＭＭＰ−２活性を検出するために、生物試料を１０％ポリアクリルアミド／０．１％ゼラチン埋込みゲル上で電気泳動分離した。次いで、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄し、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１μＭ  ＺｎＣｌ２、０．０２％Ｂｒｉｊ３５、および１ｍＭ  ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、３７℃で３６時間インキュベートした。
【０２２２】
動物における転移試験
雌のＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈａｓｌｅｔｔ、ＭＩ；１群あたり１５匹）の脂肪体にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１．４×１０６細胞／マウス）を埋込んだ。埋込みの２および６週間後、マウスを麻酔し、腫瘍サイズを測定し、リンパ節中の転移を蛍光双眼鏡を用いて可視化した。肺転移については、マウスを犠牲にし、肺を取り出し、洗浄し、蛍光双眼鏡を用いて画像を獲得した。両側Ｆｉｓｃｈｅｒの直接確率検定を、リンパ節転移の分析のために用いた。腫瘍増殖測定には、Ｅｘａｃｔ−ｓｉｇ［２ｘ１−ｔａｉｌｅｄ］Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた。
【０２２３】
試薬
指摘しない限り、ヒト組換え増殖因子および他の材料を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。免疫ブロッティングのための放射性材料および化学発光キットを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から取得した。ＥＧＦＲ−キナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６およびＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのものとした。創傷治癒アッセイのためのプレートは、ｉｂｉｄｉ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものであった。低速度撮影画像化のための３５ｍｍガラス底皿は、ＭａＴｅｋ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）から購入した。ＥＧＦ受容体に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１１１．６は、本発明者らの実験室で作成されたものである。ウェスタンブロット分析のための抗ＥＧＦＲは、Ａｌｅｘｉｓ（Ｌａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものとした。抗Ｒａｓ−ＧＡＰおよび抗ＡＫＴ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）からのものとした。抗ＥＥＡ１、抗Ｒａｂ５、抗Ｒａｂ４、および抗Ｒａｃ１は、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）からのものとした。抗ＳＹＮＪ２  ｍＡｂは、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）からのものであった。以下の二次抗体を用いた：西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入した。テキサスレッドトランスフェリン、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５５５およびＡｌｅｘａ−６４７二次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのものとした。
【０２２４】
ｓｉＲＮＡ対照は、「Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ」のカタログ番号Ｄ−００１８１０−１０−０５であった；ＳＹＮＪ２に対するｓｉＲＮＡ配列は、配列番号６に記載の通りであり、ＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＧＣＡＧＧＵＧＵＵである；全てのｓｈＲＮＡはＳＩＧＭＡ  Ｉｓｒａｅｌからのものであった；ｓｈＲＮＡ対照はカタログ番号ＳＨＣ００２である；用いたＳＹＮＪ２に対するｓｈＲＮＡ配列は、ＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号９）である。
【０２２５】
細胞系およびトランスフェクション
ＭＣＦ１０Ａ細胞を、抗生物質、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍＬ）、熱不活化ウマ血清（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、およびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地中で増殖させた。ヒト乳腺ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン−ストレプトマイシン混合物（１００単位／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ安定細胞系は、Ｈａｄａｓａ  Ｄｅｇａｎｉ教授（Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｓｒａｅｌ）からの贈り物であった。プラスミドのトランスフェクションを、製造業者の指針（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってＦｕｇｅｎ−ＨＤを用いて実施した。あるいは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いる一過的ｍＲＮＡノックダウン実験のために、細胞にＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。
【０２２６】
レンチウイルスベクターおよびウイルス生成
非標的化ｓｈＲＮＡヘアピン（対照）およびヒトＳＹＮＪ２に対するヘアピンを、製造業者の指針（Ｓｉｇｍａ）に従ってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で生成した。標的細胞に、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を添加した、ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを感染させ、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下で４日間培養した。ヒトＳＹＮＪ２の安定な遺伝子特異的送達を、製造業者の指針に従って、ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。
【０２２７】
免疫蛍光および画像処理
細胞を、フィブロネクチン被覆カバースリップ上で４８時間増殖させた。処理後、細胞を洗浄し、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および３％パラホルムアルデヒドを用いて透過処理し、２０分間固定した。Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ（商標）のコマンドの下で、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０顕微鏡、または回転盤顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  １００ｘ、ＮＡ１．４５；Ｙｏｋｏｇａｗａ  ＣＳＵ−２２；Ｚｅｉｓｓ全自動倒立型２００Ｍ；Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＨＱ−ＣＣＤカメラ）および固体状態レーザー（４７３、５６１および６６０ｎｍ、露出時間：０．２５〜１ｓｅｃ）を用いて、共焦点顕微鏡観察を実施した。圧電制御ステージ（ステップサイズ：０．１〜０．４μｍ）の位置を変えることにより、３Ｄ画像スタックをＺ軸に沿って７０〜３００ｍｓ毎に獲得した。あるいは、生細胞蛍光顕微鏡観察を、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｉｓｓａｑｕａ、ＷＡ）を用いて実行し、画像をプリズムソフトウェアを用いて処理した。
【０２２８】
ＥＧＦの放射標識
ヒト組換えＥＧＦを、以下のようにＩＯＤＯＧＥＮで標識した：ＥＧＦ（５μｇ）をＩｏｄｏｇｅｎ被覆チューブ（１ｍｇの試薬）中でＮａ１２５Ｉ（１ｍＣｉ）と混合した。２３℃で１５分間インキュベートした後、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるようにアルブミンを添加し、混合物をＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＧＦ−５カラム上で分離した。
【０２２９】
受容体下方調節アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２４ウェルプレート中に、それぞれの時点で３回反復で播種し、対照のために追加のウェルに播種した。４８時間後、細胞を４時間飢餓状態にし、示された時間間隔で３７℃でＥＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。続いて、それらを氷上に置き、結合バッファー（ＤＭＥ培地、アルブミン１％、Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で１回洗浄し、弱酸／塩洗浄（０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）にかけて、表面に結合したＥＧＦを除去した。その後、細胞を放射標識されたＥＧＦと共に４℃で１．５時間インキュベートし、結合バッファーで洗浄した。対照ウェルを、放射標識されたＥＧＦおよび過剰の未標識のＥＧＦと共にインキュベートした。最後に、細胞を１Ｍ  ＮａＯＨで溶解し、γ−カウンターを用いて放射活性を決定した。データは、時間０に対する細胞表面上の受容体の割合を表す。
【０２３０】
表面ＥＧＦ受容体の決定
細胞（２×１０４個／ウェル）を、２４ウェルプレート中に３回反復で播種し、対照のために追加のウェルに播種した。その後、細胞を、放射標識されたＥＧＦと共に４℃で１．５時間インキュベートし、結合バッファーで洗浄した。対照ウェルを、放射標識されたＥＧＦおよび過剰の未標識のＥＧＦと共にインキュベートした。最後に、細胞を１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で溶解し、放射活性を決定した。データは、対照細胞に対する細胞表面上の受容体の割合を表す。
【０２３１】
免疫ブロッティング分析
細胞を、氷冷塩水で簡単に洗浄し、緩衝化界面活性剤溶液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｎａ−デオキシコレート、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および１：１０００に希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に擦り取った。等量のゲルのために、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）試薬を用いることによりタンパク質濃度を決定した。ゲル電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移転する。膜を、１０％低脂肪ミルクを含有するＴＢＳＴバッファー（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で遮断し、一次抗体で１時間ブロットし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体と共に３０分間インキュベートした。
【０２３２】
創傷治癒（スクラッチ）アッセイ
創傷治癒アッセイを、製造業者のプロトコール（ｉＢｉｄｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って実施した。簡単に述べると、ＭＣＦ１０Ａ細胞をトリプシン処理し、ＥＧＦ枯渇培地中に再懸濁（７．０×１０５細胞／ｍＬ）し、７０μｌを各ウェルに播種し、２４時間以内に集密層を得た。その後、滅菌ピンセットを用いることにより培養物−挿入物を除去し、細胞を２時間移動させた。
【０２３３】
走査型および透過型電子顕微鏡観察
細胞を、４％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロースを添加した塩水中で固定した。試料を洗浄し、２回目の固定（１％スクロースおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４を添加した０．１Ｍカコジレートバッファー中の３％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド）にかけた。細胞を０．１Ｍカコジレートバッファー中で洗浄し、カコジレートバッファー中の１％四酸化オスミウムで１時間後固定した。走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）のために、後固定した試料を２回洗浄し、１％タンニン酸で５分間処理した後、もう１回洗浄し、１％酢酸ウラニルで３０分間処理した。試料を段階的エタノール中で脱水し、金−パラジウムフィルムをスパッタすることにより伝導性にした。走査型電子顕微鏡（Ｌｅｏ  Ｓｕｐｒａ  ５５／Ｖｐ  Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｏｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて、試料を写真撮影した。
【０２３４】
受容体リサイクルアッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−トランスフェリン（無血清培地中の２５μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）と共に１０分間予備インキュベートした。表面に結合したリガンドを、酸性バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍグリシン）中、４℃で３０分間のインキュベーションにより分離させた後、示された時間間隔で３７℃に移し、内在化されたリガンドのリサイクルを可能にした。細胞を、画像化またはＦＡＣＳにより分析した。
【０２３５】
リアルタイム細胞電気抵抗分析
ＲＴＣＡ−Ｘｃｅｌｌｉｎｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより、細胞拡散および接着の測定を記録した。金微小電極Ｅ−プレート−１６を、塩水中で１回洗浄した。細胞（２，５００個／ウェル）を最初に播種した後、電気抵抗データ（細胞指数；測定された電気抵抗の相対変化として誘導される）を、示された間隔で記録した。製造業者により提供されたソフトウェアパッケージ１．２を用いて、データを分析した。
【０２３６】
ＴＡＰＰ１−ＰＨドメインの発現および精製
ＴＡＰＰ１−ＰＨドメインおよびＮ末端ＦｌａｇタグおよびＣ末端６ｘＨｉｓタグをコードする構築物（配列番号１３、図１８）を、ｐＥＴ２８プラスミド中にクローニングし、２００μＭのＩＰＴＧで誘導した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。細菌を１５℃で増殖させた後、細胞破壊機で溶解した。細胞破片を遠心分離により除去し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化させたＮｉカラム（ＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ１６／１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でタンパク質を捕捉した。タンパク質を、０．５Ｍイミダゾールを含有する同じバッファー中で溶出させた。ＴＡＰＰ１−ＰＨドメインを含有する画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーで平衡化させたサイズ排除カラム（Ｈｉｌｏａｄ＿２６／６０＿Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に注入した。ＴＡＰＰ１−ＰＨドメインを含有するプールされたピークを、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２で３倍に希釈し、同じリン酸バッファーで平衡化させた陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ＿ＳＰ＿ＦＦ＿５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。１Ｍ  ＮａＣｌを含有するリン酸バッファーの線形勾配を用いてカラムから純粋なタンパク質を溶出させた（ＴＡＰＰ１−ＰＨドメインは２００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価された純粋なＴＡＰＰ１−ＰＨドメインを含有する画分を一緒にプールし、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬およびＯＤ２８０（２０，５２０の吸光係数）量子化によりタンパク質濃度を決定した。タンパク質をアリコートに分割し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０２３７】
ＳＹＮＪ２の５’ホスファターゼ活性
ＳＹＮＪ２がＰＩ（３，４，５）Ｐ３に由来する５−リン酸を加水分解してＰＩ（３，４）Ｐ２を生成する能力の測定値を、読出し値として蛍光偏光に基づいて、競合アッセイにより記録した。１００μｌのＳＯＰＳ（Ａｖａｎｔｉ  Ｉｎｃ．、クロロホルム中の５０ｍｇ／ｍｌ）および５０μｌのコレステロール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、クロロホルム中の１０ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより、安定化ＳＯＰ脂質混合物（ｘ５０）をガラス管中で調製した。混合物を、穏やかな窒素流を用いて空気乾燥して、クロロホルムを蒸発させた。次いで、蒸発させた脂質混合物を、室温で１分間のボルテックスにより、１０ｍｌの０．２５ｍｇ／ｍｌのＣ１２Ｅ８（Ａｖａｎｔｉ  Ｉｎｃ．）中に再懸濁した。反応混合物は、ＰＢＳ、ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２（全てＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから）、ＳＯＰ脂質混合物（ｘ５０）、完全長精製ＳＹＮＪ２（ＯｒｉＧｅｎｅ、カタログ番号ＴＰ３１５１６０）およびＰＩ（３，４，５）Ｐ３（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号Ｐ−３９０８）と共に、試験化合物を含む、または試験化合物を含まない。一度、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３が添加されたら、反応混合物を３３℃で８分間インキュベートして、ＳＹＮＪ２の５’−ホスファターゼ活性によりＰＩ（３，４）Ｐ２を生成させた。インキュベーション後、ＰＢＳ、ＤＴＴ、検出タンパク質（ＴＡＰＰ１のＰＨドメイン）、ＳＯＰ脂質混合物（ｘ５０）、蛍光標識されたＰＩ（３，４）Ｐ２（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号Ｃ３４Ｍ６）およびＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む検出混合物を添加することにより、反応を停止させた。適切なプレートリーダーおよびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ染料と適合するフィルターセット（５５０ｎｍ励起／５８０ｍｍ偏光放出フィルター）を用いて、蛍光偏光を測定した。未標識のＰＩ（３，４）Ｐ２対照はＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した（カタログ番号Ｐ−３４０８）。
【０２３８】
（実施例２）
ＥＧＦに誘導されるＳＹＮＪ２の発現の上昇は乳腺細胞侵襲を促進する
ヒト乳腺上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）は、ＥＧＦファミリーリガンドと共に培養した場合、強い移動および侵襲表現型を示す（図１Ａおよび図１Ｂ）が、血清による処理は細胞運動を推進するには不十分である。ＥＧＦと、ＥＧＦＲ（ＡＧ１４７８）、ＭＥＫ（Ｕ０１２６）またはＰＩ３Ｋ（ウォルトマンニン）の阻害剤との同時インキュベーションは運動性を低下させた（図１Ｃ）が、これは、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ活性の両方がＥＧＦに誘導される移動にとって必須であることを示唆している。重要なことに、ＥＧＦＲに誘導される運動表現型は、４２５個の遺伝子の転写上方調節と関連する（Amit et al.、2007）。転移を推進する遺伝子を同定するために、この遺伝子セットを、乳がん細胞の転移性サブクローンのｉｎ  ｖｉｖｏでの選択の間に上方調節を受けるより大きい遺伝子セットと交差させた（Minn et al.、2005）。２３個の重複する遺伝子の群（図１Ｄ）は、グリオーマ細胞侵襲に関与する脂質ホスファターゼであるシナプトジャニン−２（ＳＹＮＪ２）をコードする遺伝子を含んでいた（Chuang et al.、2004）。ＥＧＦに誘導されるＳＹＮＪ２の上方調節を、ＰＣＲおよび免疫ブロッティングにより検証した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０２３９】
次に、ＭＣＦ１０Ａ細胞を形質転換し、サブクローニングして、ＳＹＮＪ２を安定に過剰発現させた（ＧＦＰ融合物として；ＳＹＮＪ２−ＯＸ、図１Ｅ）。ＥＧＦ枯渇培地中に播種した場合、ＳＹＮＪ２−ＯＸ細胞は、増強された基本的およびＥＧＦ誘導性の移動および侵襲能力（図２Ｄおよび図２Ｃ）と共に、膜ラッフリングを特徴とする前移動表現型を示した（図２Ｃ）。逆に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；図１Ｇ）を用いるＳＹＮＪ２のノックダウンは、細胞侵襲、ならびに個々のおよび集合的な移動を有意に減少させた（図２Ｅ、１Ｈおよび１Ｊ）。結論として、ＥＧＦに誘導されるＳＹＮＪ２の上方調節は、乳腺細胞の強固な侵襲表現型を誘導する。
【０２４０】
（実施例３）
ＳＹＮＪ２のホスファターゼ活性は乳腺細胞の侵襲性にとって必須である
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験を可能にするために、高転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現細胞を用いて、ＳＹＮＪ２またはＬａｃＺ（対照）を過剰発現するサブクローン、ならびにｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはＳＹＮＪ２特異的ヘアピン（ｓｈＳＹＮＪ２；図３Ａ）を発現するサブクローンを作成した。ＳＹＮＪ２発現の増強は２Ｄ培養物中で伸長した形態を付与し（図３Ｂ）、３Ｄ培養物中で細胞を増殖させた場合は、広い侵襲アームを付与した（図４Ａ）。逆に、ＳＹＮＪ２ノックダウンは侵襲パターンを無効化した（図４Ｂ）。同様に、過剰発現は侵襲能力を約３．２倍増強し（図３Ｂ）、ノックダウン（図３Ｃ）は移動および侵襲を阻害した（図３Ｄ）。触媒ホスファターゼ活性の役割を検査するために、ＷＴ  ＳＹＮＪ２またはホスファターゼ／ヌクレアーゼドメイン（Ｐｆａｍ：ＰＦ０３３７２）内の保存されたＷＸＧＤＸＮ（Ｆ／Ｙ）Ｒモチーフ（Jefferson and Majerus、1996）のそれぞれに点突然変異を担持する触媒により死んだ形態（Ｄ３８８ＡおよびＤ７２６Ａ；図４Ｃ）をコードするレンチウイルス粒子を含むｓｈＳＹＮＪ２細胞。ＷＴ  ＳＹＮＪ２と違って、突然変異体の再発現は、侵襲能力を回復することができなかった（図４Ｄ）が、これは、ＳＹＮＪ２のホスファターゼ活性が侵襲表現型にとって必須であることを示している。
【０２４１】
ｓｈＳＹＮＪ２細胞が移動できないことは、走査型電子顕微鏡観察（図４Ｅ）およびＦ−アクチン染色の両方によってさらに支持され、大幅なアクチン組織化の欠陥および細胞の高さの増加を示した（図４Ｆ）。重要なことに、円形部分の周囲にクラスター化したアクチンパッチも注目すべきであった（図４Ｆ；矢頭）。したがって、ｓｈＳＹＮＪ２細胞の低速度撮影顕微鏡観察により、異常な細胞内小胞の存在が確認されたが、これは、ＳＹＮＪ２ノックダウンが小胞輸送を逸脱したことを示唆している。次に、ＳＹＮＪ２の細胞内局在化を検査した。ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の低速度撮影画像（図３Ｅ）、ならびに抗ＳＹＮＪ２抗体を用いる免疫蛍光（図３Ｆ）は、ＳＹＮＪ２分布の２つの主要なパターンを反映していた：先端に局在化した小さい末梢集合体（図３Ｅ中の黒色の矢頭）、および細胞の中心に近いところに位置するより大きい集合体の第２集団（青色の矢頭）。注目すべきことに、ＥＧＦＲリガンド（ＴＧＦ−アルファ）でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を刺激した直後に、ＳＹＮＪ２は、形成中の先端の下に新たに発生した葉状仮足の基部に急速に集合した（図３Ｅ、図３Ｆ）。興味深いことに、ＭＣＦ１０Ａ細胞を用いて実施した同様の分析は、ＳＹＮＪ２は最初は細胞間結合においてＦ−アクチンと共に局在化するが、ＥＧＦで刺激すると、先端、典型的には、葉状仮足の基部に移行することを示した（図３Ｇ）。結論として、これらの観察は、増殖因子がＳＹＮＪ２発現のレベルだけではなく、先端へのその動的な動員をも調節することを示している。
【０２４２】
（実施例４）
腹側膜へのＳＹＮＪ２の動員はダイナミンおよびＲａｃ１に依存する
ＳＹＮＪ２の局在化部位の動力学を調査するために、安定に発現するＧＦＰ−ＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１サブクローン（ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２細胞）を作成し、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２点の形成および消費について分析した。これらのものを動的に異なるサブ集団に分類した：ラッフリング膜に局在化した力学点および細胞中心に近い別の領域に局在化した点（図５Ａ）。注目すべきことに、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２点は、ＲＦＰ−クラスリン軽鎖Ａ（図５Ａ）またはＲＦＰ−カベオリン１（図６Ａ）により印を付けた集合体との最小の重複を示したが、これは、クラスリン被覆ピットまたはカベオラへの局在化が少ないことを示唆している。重要なことに、新しく形成された末梢点は、それらの外見が葉状仮足の局部形成に先行したため、新生葉状仮足の前触れであった。対照的に、アクチンと共に局在化した、より中心的で安定な点のクラスターは、約３０分間持続した（図５Ｂ）。したがって、個々の集合体の軌跡（図６Ｂ；左）は、顕著に広い分布の寿命を示した：短命（約２０〜４０ｓ、集合体の６０％）、中間の寿命、および長寿命の集合体（集合体の約１０％）。中間群の開始後、蛍光強度は連続的に増大したが、集合体は移動に関しては依然として静的であった（図６Ｂ；右）。この力学的パターンは、クラスリン被覆ピットのものと類似し（Ehrlich et al.、2004）、輸送中の中間体の形成および消費を示唆している。
【０２４３】
腹側膜でのＧＦＰ−ＳＹＮＪ２の主に二峰性の区画化は、落射蛍光顕微鏡（赤色；Ｚ次元における変化に対して相対的に非感受性である）と全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ、緑色；約２００ｎｍの深さに限定される）の両方を用いる実験における蛍光シグナルの同期的出現および消失によって強化された。点はその寿命を通して黄色で出現したため（図５Ｃ）、本発明者らは、ＳＹＮＪ２が腹側形質膜の平面内に集合すると結論付けた。阻害剤のパネルを用いることにより、集合はコレステロール枯渇によって劇的に阻害されることが見出され（図６Ｃ；左）、コレステロールに富む膜のマイクロドメインが腹側膜へのＳＹＮＪ２動員にとって必要であることを示唆している。同様の阻害効果は、ウォルトマンニンによっても誘導されたが（図６Ｃ；右）、これはＰＩ３Ｋの役割を示唆している。別の要件は、ダイナミンの阻害剤であり、クラスリン依存的およびクラスリン非依存的担体の切断ステップを媒介し、その阻害がＵ型陥入中間体の蓄積をもたらす大きなＧＴＰａｓｅである（Macia et al.、2006）、Ｄｙｎｇｏ−４ａを用いることによって示された。Ｄｙｎｇｏ−４ａは形質膜でのＳＹＮＪ２の動的集合を強く停止させたため（図５Ｄ）、本発明者らは、ＳＹＮＪ２がダイナミンにより調節される新生輸送中間体に動員されると結論付けた。ダイナミンは細胞の移動および侵襲の促進因子として関与していたため（Kruchten and McNiven、2006）、ＳＹＮＪ２とのその物理的相互作用を試験した。この実験により、活性なダイナミンとＳＹＮＪ２との複合体形成が確認され（図５Ｅ）、エンドサイトーシスとアクチンに基づく移動の両方におけるダイナミンの拡張された役割と一致していた。
【０２４４】
ＳＹＮＪ２はＧＴＰを充填したＲａｃ１と物理的に相互作用することができ（Malecz et al.、2000）、Ｒａｃ１の誘導的活性化には、内在化とその後のリサイクルが必要である（Palamidessi et al.、2008）。したがって、Ｒａｃ１と一致するＳＹＮＪ２の末梢点の一致を試験した。実際、内因性Ｒａｃ１の免疫染色により、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２の末梢点との同時局在化が示された（図５Ｆ）。さらに、Ｒａｃ１上のＧＲＰ充填の阻害（ＮＳＣ−２３７６６を用いる）は、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２点の数を劇的に減少させた（図５Ｇ）。相補的に、ＳＹＮＪ２ノックダウンは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でのＧＴＰを充填したＲａｃ１のレベルを低下させた（図５Ｈ）。膜へのＳＹＮＪ２の動員におけるＲａｃ１およびアクチン細胞骨格の調節的役割と一致して、ラトランクリンを用いるアクチン動力学の阻害は、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２動力学を無効化した（図６Ｄ）。総合すると、これらの結果は、末梢ＳＹＮＪ２集合を、コレステロール、３’−ホスホイノシチド、アクチンおよび活性Ｒａｃ１に依存するダイナミン媒介性エンドサイトーシス経路と関連付ける。注目すべきことに、この経路は、移動する線維芽細胞の先端での急速な膜および接着代謝回転を可能にするクラスリン非依存的担体といくつかの属性を共有する（Howes et al.、2010）。
【０２４５】
（実施例５）
ＳＹＮＪ２は細胞表面受容体の小胞輸送を制御する
ＥＧＦで処理されたｓｈＳＹＮＪ２−ＭＣＦ１０Ａ細胞は、対照細胞と比較してより高いレベルの全ＥＧＦＲおよびリン酸化ＥＧＦＲを示したが、これは、ＥＲＫのより高いというよりもむしろ低い活性化ということであった（図７Ａ）。この線に沿って、ＳＹＮＪ２ノックダウンが拡大した細胞内小胞中でＥＧＦＲを捕捉することは注目すべきことであった（図７Ｂ）。捕捉と一致して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の免疫ブロッティングも同様に、ＥＧＦＲレベルがｓｉＳＹＮＪ２細胞中で安定化されることを示したが（図８Ａ）、２つの方法を用いることによる表面ＥＧＦＲの定量化は有意により低い表面レベルを示した（図８Ｂ）。ＥＧＦＲの細胞内捕捉は、機能的結果を有する：そのよく特徴付けられた走化性機能（Mouneimne et al.、2006; van Rheenen et al.、2007）と一致して、ＥＧＦＲは乳腺細胞の先端に局在化したが、ｓｈＳＹＮＪ２細胞のＥＧＦＲはその偏向した分布を失い、大きい、アクチンに飾られた小胞中に蓄積した（図８Ｃ）。注目すべきことに、ｓｈＳＹＮＪ２細胞中で観察されたＥＧＦＲ輸送の欠陥はＷＴ  ＳＹＮＪ２によって救助することができたが、触媒的に死んだ形態によっては救助できず（図７Ｃ）、これはＳＹＮＪ２のホスファターゼ活性が先端からの、および先端へのＥＧＦＲの小胞輸送にとって必須であり、ＥＧＦの勾配に対する走化性応答を媒介することを示している。このモデルと一致して、ｓｈＳＹＮＪ２細胞はＥＧＦの勾配に沿って移動する能力を大幅に失った（図８Ｄ）。
【０２４６】
ＳＹＮＪ２枯渇細胞中のＥＧＦＲの異常な蓄積は、ＥＧＦＲ送達の欠陥、リサイクルの停止、またはユビキチン化により調節されるプロセスである分解のための選別の障害を反映し得る（Goh et al.、2010）。選別の障害と一致して、ＳＹＮＪ２枯渇細胞は有意により高い基本的ＥＧＦＲユビキチン化を示し、ＥＧＦに応答してわずかに弱く変化した（図８Ｅおよび図７Ｄ）。さらに、チロシン１０４５（ユビキチンリガーゼｃ−Ｃｂｌのためのドッキング部位；図８Ｆ）のリン酸化による分解のためにタグ付けられるにも拘らず、ＥＧＦ刺激実験により、正常な活性化（チロシン１０６８のリン酸化）が確認されたが、ｓｈＳＹＮＪ２細胞における分解の欠陥が確認された（図８Ｇ）。リサイクルの欠陥に対処するために、蛍光リガンドを用いて、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の大規模なリサイクル、ならびにより弱いＥＧＦＲのリサイクルを追跡した。ＴｆＲ内在化は影響されなかったが、リサイクルはｓｈＳＹＮＪ２細胞中では顕著に低下し、逆に、ＳＹＮＪ２−ＯＸ細胞中では顕著に加速した（図８Ｈおよび図７Ｅ）。同様に、フローサイトメトリー分析により、蛍光ＥＧＦのリサイクルの欠陥が示され（図８Ｉ）、生細胞画像化により、ＳＹＮＪ２枯渇細胞の大きい小胞内でのリガンド蓄積が確認された。結論として、これらの結果は、ＳＹＮＪ２がＥＧＦＲとＴｆＲの両方の適切なリサイクルにとって必須であることを示している。
【０２４７】
（実施例６）
ＳＹＮＪ２ノックダウンはホスホイノシトール脂質の恒常性をかく乱し、エンドサイトーシスと接着の両方を変化させる
エンドサイトーシス系は、特定のホスホイノシチド（ＰＩ）（Gruenberg and Stenmark、2004）により定義される、いくつかの異なる区画を維持し、現在の分析はＳＹＮＪ２に対する強い依存性を明らかにした。例えば、ＰＩ（３）Ｐ−結合剤であるＥＥＡ１のための初期エンドソームを精査することにより、その空間的組織化がＳＹＮＪ２枯渇細胞中で顕著に変化することが見出された（図９Ａ）。同様に、ＧＦＰタグ付Ｒａｂ４を用いてリサイクル区画を精査することにより、ｓｈＳＹＮＪ２細胞の円形アクチンパッチとの強い会合が明らかとなった（図１０Ａ）。初期エンドソームの別のマーカー、Ｒａｂ５の分布も、ＳＹＮＪ２に対する依存性を反映していた（図１０Ｂ）。Ｒａｂ５陽性小胞の数はｓｈＳＹＮＪ２枯渇細胞中では有意により低かったが、その平均サイズは増大し、それらは一部、円形アクチンパッチに局在化していた（図９Ａ）。ホスホイノシチドにおける基礎的な変化を明らかにするために、ｓｈＣｔｒｌと生合成的に標識されたｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を比較し、その後、そのリン脂質を抽出した（図１０Ｃ）。その結果は、主にＰＩ（３）Ｐだけでなく、ＰＩ（４，５）Ｐ２およびＰＩ（３，５）Ｐ２もｓｈＳＹＮＪ２細胞中でより高レベルで存在するが、ＰＩ（４）Ｐレベルは未変化のままであり、ＰＩ（３，４）Ｐ２およびＰＩ（３，４，５）Ｐ３の両方のレベルはこの方法によっては検出困難であることを示していた。これらの結果は、ＳＹＮＪ２がＰＩのＤ５位を主な標的とするという意見を確認するものであるが、本発明者らは、観察されたむしろ限られた全体的効果がより大きい局部的な相違であると推測する。結論として、これらの観察は、ＳＹＮＪ２が初期エンドソームにおける、ならびにその後のリサイクルステップにおけるカーゴ選別を制御することを再確認するものである。
【０２４８】
ＥＧＦＲのようなＲＴＫのリサイクルと共に、インテグリンの小胞輸送およびパキシリンなどの下流のパートナーとのその相互作用は、細胞移動および接着斑（ＦＡ）成熟において主要な役割を果たす（Guo and Giancotti、2004）。したがって、ベータ−１インテグリンおよびリン酸化されたＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＦＡに局在化した。対照的に、大きい小胞中での異常な蓄積のため、両タンパク質はＳＹＮＪ２枯渇細胞の末梢に局在化することができなかった（図１０Ｄ、Ｓ５ＢおよびＳ５Ｃ）。さらに、成熟ＦＡのマーカーとしてパキシリンを用いて、ＦＡがｓｈＳＹＮＪ２細胞中では丸く、比較的短い外見を取ることがわかった（図９Ｄ）。総合すると、これらの観察は、ＳＹＮＪ２が、２つの方法を用いて細胞拡散を測定することによって検査される状況である基質接着にとって必要であることを暗示するものである（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）。この結果は、インテグリンとＲＴＫの両方のＦＡへの送達の欠陥に起因する、ｓｈＳＹＮＪ２細胞の弱まった接着を証明していた。
【０２４９】
（実施例７）
ＳＹＮＪ２は浸潤突起の集合を調節する
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のマトリックスに基づく３Ｄ培養物は、通常、くさび形状の突出を示すが、ｓｈＳＹＮＪ２細胞は丸みのある伸長を示し（図１１Ａ）、これはマトリックス分解の欠陥を示唆している。これを試験するために、ＭＭＰ−９の共焦点免疫蛍光画像を取得したところ、ｓｈＳＹＮＪ２スフェロイドが、おそらく分泌の障害のため、その境界でＭＭＰ−９存在量の比較的鋭い減少を示すことがわかった（図１１Ａ）。実際、条件化培地に対して行ったザイモグラフィーアッセイにより、ｓｉＳＹＮＪ２オリゴヌクレオチドで処理した細胞によるＭＭＰ−９分泌の欠陥が確認されたが、ＭＭＰ−２分泌は未変化のままであった（図１２Ａ）。逆に、ＳＹＮＪ２を過剰発現する細胞により条件付けられた培地は、ＭＭＰ−９活性の実質的な増加を示し（図１１Ｂ）、これはＭＭＰ分泌におけるＳＹＮＪ２の関与と一致していた。
【０２５０】
限局性のタンパク質分解を可視化するために、細胞を架橋蛍光ゼラチン上に播種し、浸潤突起と呼ばれるアクチン中心のマトリックス分解オルガネラについて精査した（Murphy and Courtneidge、2011）。以前の報告と一致して、活性マトリックスタンパク質分解は、細胞体の下に局在化したアクチンドットと一致していた。重要なことに、ＳＹＮＪ２−ＧＦＰ点はこれらの構造と同時局在化し（図１１Ｃ、矢頭）、図５Ｂに提示されるアクチンと関連する長寿命の点と類似していた。ＳＹＮＪ２の発現レベルは、浸潤突起発生と明確に相関するが、ＳＹＮＪ２過剰発現は浸潤突起を含有する細胞の画分をほぼ倍加し、ｓｉＳＹＮＪ２は浸潤突起の発生を有意に減少させ（図１１Ｄ）、因果関係を暗示している。次に、ＳＹＮＪ２と、浸潤突起のよく特徴付けられたマーカーであるコルタクチンとの潜在的な物理的関係を検査したところ、ＳＹＮＪ２とコルタクチンが同時に免疫沈降し（図１２Ｂ）、ならびに浸潤突起と先端の両方に同時に局在化する（図１２Ｃ）ことがわかった。ＳＹＮＪ２の誘導的役割を確固たるものにするために、ＰＩ（３，４）Ｐ２であり、浸潤突起の道標として働くコルタクチンの結合剤であるＴＫＳ５を観察した（Courtneidge et al.、2005）。予想通り、内因性ＴＫＳ５は対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中のマトリックス分解の複数の腹側部位に局在化したが、ｓｉＳＹＮＪ２細胞中には活性部位はほとんど認められず、ＴＫＳ５はその腹側位置を失った（図６Ｅ；Ｘ−ＹおよびＺパネル）。さらに、ＰＩ（３，４）Ｐ２−結合ドメイン、すなわち、Ｔａｐｐ１のＰＨドメインであるＰＩ（３，４）Ｐ２（Oikawa et al.、2008）での浸潤突起ＴＫＳ５アンカーを、プローブとして用いた。以前の報告と一致して、ＰＨドメインの異所性発現は浸潤突起の数を減少させたが、それにも拘らず、残存するシグナルはＴＫＳ５およびアクチンコアと同時に局在化していた（図１２Ｄ）。結論として、ＳＹＮＪ２は、ＴＫＳ５の関与に先行するステップで必要であると考えられ、それぞれ、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３および次いで、ＰＩ（３，４）Ｐ２を生成して、ＰＩ３ＫのＥＧＦＲ誘導性活性化の部位にＴＫＳ５を固定する、ＰＩ３Ｋ（Yamaguchi et al.、2011）およびＳＹＮＪ２の連続的作用と一致する。
【０２５１】
ＥＧＦＲ−ＰＩ３Ｋ−ＳＹＮＪ２の状況と一致して、活性型のＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）がタンパク質分解的に活性な浸潤突起中で検出されたが、ＳＹＮＪ２枯渇細胞のＥＧＦＲは膨張した小胞に局在化した（図１１Ｆ）。局部受容体活性化を担う機構は依然として不明である。１つのモデルによれば、ＭＭＰ−７およびＣＤ４４を含む複合体による、ヘパリン−結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）などのプロ−リガンドの切断は、ＥＧＦＲを局部的に刺激し得る（Yu et al.、2002）。このモデルと一致して、ＳＹＮＪ２の存在量は、ＥＧＦＲリガンドの分泌と相関し（図１１Ｇ）、浸潤突起のアクチンコアとのＣＤ４４の同時局在化を検出した（図１２Ｅ）。同様に、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４４の表面発現は対照細胞と比較してｓｈＳＹＮＪ２細胞中で強く抑制されることがわかった（図１２Ｆ）。浸潤突起の成熟におけるさらに別の重要なステップは、可溶性ＭＭＰを活性化する、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）の動員である（Wang and McNiven、2012）。したがって、対照細胞において、ＭＴ１−ＭＭＰは浸潤突起突出の部位に一致するが、ｓｉＳＹＮＪ２細胞のＭＴ１−ＭＭＰ分子はマトリックス分解と関連しない大きい凝集体を形成することがわかった（図９Ｅ）。総合すると、これらの観察は、ＳＹＮＪ２が浸潤突起のプライミングにとって、ならびにプロテアーゼと、２つの以前には認識されていなかった居住物、ＣＤ４４および活性ＥＧＦＲとの両方をこのオルガネラに標的化するのに必須であることを暗示する。
【０２５２】
（実施例８）
ＳＹＮＪ２は哺乳動物モデルにおける腫瘍増殖および転移拡散を促進する
ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移性播種に対するＳＹＮＪ２の効果を評価するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞（および誘導体）を、雌マウスの乳腺脂肪体に埋込み、２または６週間後、腫瘍サイズ（図１３Ａ）と転移（図１３Ｂ）の両方を測定した。一次腫瘍増殖は、ｓｈＳＹＮＪ２および「不活性救助」（ｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＣＤ）群と比較して、ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＳＹＮＪ２＋ＳＹＮＪ２ＷＴ（「活性救助」）群において有意により速かった。転移挙動も同様にＳＹＮＪ２と相関した：ｓｈＳＹＮＪ２および「不活性救助」群は局部および遠隔リンパ節への転移拡散の有意な減少を示した（図１３Ｂおよび図１４）。遠隔転移を検査するために、マウスを犠牲にし、その肺を評価した。ｓｈＳＹＮＪ２細胞、または「不活性救助」細胞を埋込んだ動物の肺は、ｓｈＣｔｒｌまたは「活性救助」細胞を接種した動物と比較して、転移の数およびサイズの劇的な減少を示した（図１３Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＳＹＮＪ２を転移促進に関与させるものである。
【０２５３】
同様に、ＳＹＮＪ２を過剰発現する異種移植片をモニタリングした。予想通り、ＳＹＮＪ２−ＯＸ細胞は、より速く増殖する腫瘍を生じ（図１３Ｄ）、それらはまた、結節転移のより早い開始を示した（図１３Ｅ）。強固なリンパ節侵襲と一致して、ＳＹＮＪ２−ＯＸ細胞を埋込んだ動物の肺は、転移の数の増加を示した（図１３Ｆ）。次に、脈管内侵入または溢出に対するＳＹＮＪ２の効果を試験した。したがって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞のサブクローンを、雌マウスの循環（尾静脈）に直接注射し、肺定着（溢出）についてスコア化したか、またはそれらを脂肪体に埋込んで、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ；脈管内侵入）として血液中でスコア化した。これらの実験はそれぞれの原発腫瘍間のサイズの相違を考慮に入れたものであることに留意されたい。正規化された結果により、ＳＹＮＪ２が脈管内侵入（ｐ＝０．００３１）と溢出（ｐ＝０．００８２；図１３Ｇ）の両方にとって必要であることが示された。この結論を、ＧＦＰ−ＳＹＮＪ２を過剰発現する細胞を用いることによりさらに試験した（図１３Ｈ）。注目すべきことに、この実験で得られた脈管内侵入の結果は、統計的有意性を示したが、ＳＹＮＪ２−ＯＸ細胞がより良好に溢出し、遠隔臓器に定着する能力は有意性に達しなかったが、これは局部および遠隔転移に対するＳＹＮＪ２の観察された強力な効果が主にリンパ管および血管への脈管内侵入の増強に起因するものであることを示唆している。
【０２５４】
（実施例９）
ＳＹＮＪ２は侵攻性ヒト乳腫瘍と関連する
ヒトがんとのＳＹＮＪ２の関連性に取り組むために、ＳＹＮＪ２の転写物レベルを６０個のヒトがん細胞系のＮＣＩ−６０パネルにおいて分析した。移動表現型への寄与と一致して、ＳＹＮＪ２の高い転写物レベルは間葉表現型と関連することがわかった。次に、乳がん腫ＮＪ２の３３１のパラフィン包埋試料のセットを免疫染色した（図１６Ａ）。重要なことに、ＳＹＮＪ２の発現強度は、ＨＥＲ２過剰発現（ｐ＜０．００１）および／またはエストロゲン受容体の欠如（ｐ＜０．００１）により定義される予後的に好ましくないサブタイプと正の関連を示した。しかしながら、ＳＹＮＪ２存在量と、年齢、組織学的サブタイプ、腋窩リンパ節状態、および分化等級との間には有意な関連は認められなかった。興味深いことに、ＳＹＮＪ２の染色パターンも変化した；ＨＥＲ２＋腫瘍はほとんど膜染色を示したが、内腔腫瘍および三種陰性腫瘍は細胞質染色を示した（図１６Ｂ）。この知見を支持するために、ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルを、乳がん標本の２つのコホートにおいて分析したところ、より短い患者生存率との関連が見出された（図１６Ｃ）。要するに、これらの観察は、乳がんの進行におけるＳＹＮＪ２の関与を支持するが、それらは転写上方調節の背後にある機構を未解明のままにしておく。
【０２５５】
まとめると、臨床データおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験と共に、動物において行われた観察は、主に浸潤突起および先端への、およびそれからの細胞表面分子の輸送においてホスホイノシチドにより果たされる主要な役割のため、ＳＹＮＪ２によるイノシトール脂質の脱リン酸化が転移プロセスにとって重要であることを明確に示す。以下は、ワーキングモデル（図１５）であり、腫瘍進行の広い文脈におけるＳＹＮＪ２の複数の機能を考察するものである。
【０２５６】
（実施例１０）
ＳＹＮＪ２の５’ホスファターゼ活性の選択的阻害剤
ＳＹＮＪ２ホスファターゼ活性の選択的阻害剤を同定するために、本発明者らは、分子が空間中で定常的に回転および運動しているが、一度別のより大きいエレメント（例えば、タンパク質）に結合したら、それらの運動が劇的に制限されるという原理に依拠する蛍光偏光競合アッセイを用いた。これらの運動における変化は、未結合の状態では非常に低い偏光読取り値を生じる蛍光分子（すなわち、プローブ）を用いて検出および測定することができるが、これらの分子に結合する検出剤（例えば、結合タンパク質）を溶液に添加した場合、蛍光分子は溶液中での偏光読取り値を増加させる限定された組成物中で安定化される（図１７Ａを参照されたい）。
【０２５７】
予備形成されたスクリーニングにおいて、本発明者らは、異なる化合物の存在下で、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３の５’位を脱リン酸化してＰＩ（３，４）Ｐ２を生成するＳＹＮＪ２の酵素活性を測定した。一度、酵素反応が完了／停止したら、ＰＩ（３，４）Ｐ２生成物を含有する溶液を、ＰＩ（３，４）Ｐ２結合タンパク質（検出剤）と蛍光ＰＩ（３，４）Ｐ２（プローブ）との混合物と混合した。用いた検出タンパク質は、ＰＩ（３，４）Ｐ２（配列番号１５）に選択的に結合するＴａｐｐ１の精製されたＰＨ−ドメインであった。図１７Ｂに示されるように、結合したＰＩ（３，４）Ｐ２蛍光プローブがＳＹＮＪ２の酵素活性により生成された未標識のＰＩ（３，４）Ｐ２により置換され、溶液中の未結合の蛍光プローブの量が増加するにつれて、このアッセイで測定された偏光値は減少した。
【０２５８】
以下の表２は、ＳＹＮＪ２によるＰＩ（３，４）Ｐ２の生成を阻害することができるこの方法を用いて同定された様々な化合物を記載する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０２５９】
考察
おそらくセカンドメッセンジャーと、特異的膜サブドメインの同一性を決定する道標の両方として作用するＰＩリン脂質のレベルを制御するＳＹＮＪ２の能力のため、細胞移動および腫瘍転移の統合的な優れた調節因子としてのＳＹＮＪ２の機能が示される。ＳＹＮＪ２の作用の多様性の別の反映は、浸潤突起および葉状仮足への主に二峰性の腹側局在化である。したがって、ＳＹＮＪ２は、アクチン動力学の顕著な調節因子（例えば、ダイナミン、コルタクチンおよびＲａｃ１）との物理的複合体を形成する。ＳＹＮＪ２の作用を理解するための１つの鍵は、エンドサイトーシス輸送を制御する能力である。アクチンに基づく突出を定常的に供給する小胞中の形質膜の部分の頻繁なパッケージングは、細胞移動を推進する（Ridley、2011）。葉状仮足のＳＹＮＪ２は顕著なダイナミズムを示し（図３Ｂ）、生細胞画像化は、ＳＹＮＪ２動員が新しい葉状仮足形成の部位を示すことを暗示する。先端に位置するＳＹＮＪ２分子はダイナミン、Ｒａｃ１、アクチン重合およびコレステロールに依存するが、その分布はカベオリン−１およびクラスリンのものとは異なるため、本発明者らは、それが先端での膜の代謝回転を持続させるクラスリン非依存的担体（ＣＬＩＣ）のダイナミン依存的変異体であると推測する（Howes et al.、2010）。
【０２６０】
一連の素晴らしい研究によって、ＳＹＮＪ１がニューロンのシナプス小胞のリサイクルに関連づけられている（Cremona et al.、1999）。マウスにおいては、ＳＹＮＪ１の欠失は、安定状態のＰＩ（４，５）Ｐ２の上昇、クラスリン被覆小胞の蓄積、およびエンドサイトーシス後の小胞の再利用性の遅延を引き起こした（Mani et al.、2007）。これらの観察は、小胞外被脱落を可能にするＰＩ（４，５）Ｐ２の脱リン酸化が表現型の基礎にあることを示唆している。同様に、本発明のＳＹＮＪ２枯渇乳腺細胞は活性ＥＧＦＲの細胞内蓄積を示した。受容体ユビキチン化状態およびエンドサイトーシス経路のマーカーは、内在化された受容体が通常はリサイクルまたは分解に分岐する選別エンドソームで輸送が停止することを示した。考えられる限りでは、その欠陥は小胞の外被またはそのアクチンコメット尾部と会合したＰＩ（４，５）Ｐ２結合タンパク質を分解することができないことに起因する（Kaksonen et al.、2003）。かくして、ＳＹＮＪ１切断時に観察されるシナプス伝達における欠陥と同様、ＳＹＮＪ２の喪失は、運動にとって必須の表面分子の輸送停止のため細胞の移動および侵襲を大幅に損なう。
【０２６１】
ＳＹＮＪ２枯渇細胞における、それぞれ初期および後期エンドソームの調節因子であるＰＩ（３）ＰおよびＰＩ（３，５）Ｐ２の観察された上昇（図５Ｃ）は、さらなる輸送機構を提唱する。ＰＩ（３，５）Ｐ２の調節的役割は、インテグリンおよびいくつかのＲａｂタンパク質などの複数の結合剤の同定によって補強された（Catimel et al.、2008）。ＰＩ（３）Ｐは、ＭＴ１−ＭＭＰを浸潤突起に送達する経路である、エンドソームとｔｒａｎｓ−ゴルジ体ネットワークとの間の循環に関与する５−キナーゼであるＰＩＫｆｙｖｅによりリン酸化される（Poincloux et al.、2009）。したがって、ＰＩ（４，５）Ｐ２の脱リン酸化に加えて、ＳＹＮＪ２はＰＩ（３，５）Ｐ２を加工して、初期エンドソームのＰＩ（３）Ｐプールを微調整し、ＭＴ１−ＭＭＰのエキソサイトーシスと、インテグリン、ならびにＥＧＦＲのリサイクルとの両方を連係させる可能性がある。
【０２６２】
動物中に導入された場合、ｓｈＳＹＮＪ２  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、リンパ節および血管に到達する能力の低下のため、転移能力を大幅に失った（図１３Ａ〜Ｈ）。これらの結果およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの表現型を統合する試みにおいて、図１５に概略されるのは、細胞運動におけるＳＹＮＪ２の役割の基礎となる機構である。したがって、重要な事象は、ＳＹＮＪ２のＥＧＦにより誘導される上方調節、結果として、３つのホスホイノシチド：ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３およびＰＩ（３，５）Ｐ２の枯渇を必要とする。ＳＹＮＪ２により媒介されるＰＩ（４，５）Ｐ２脱リン酸化は、ホスホリパーゼＣ−ガンマによるＰＩ（４，５）Ｐ２の分解、およびＰＩ（３，４，５）Ｐ３を生成するＰＩ３Ｋによるリン酸化と平行する。集合的に、ＥＧＦによる３つの酵素の刺激は、形質膜からＰＩ（４，５）Ｐ２結合剤群を解離させ、また、ＰＩ（４，５）Ｐ２を含まないエンドサイトーシス小胞を生成する。同時に、ＳＹＮＪ２はＰＩ（３，４，５）Ｐ３を、浸潤突起形成にとって必須であるＰＩ（３，４）Ｐ２に変換する。このモデルと一致して、ＰＩ３Ｋが浸潤突起形成にとって必要であることが報告されている。一度、環境が整えば、ＰＩ（３，４）Ｐ２はＴＫＳ５に結合し、コフィリンが浸潤突起内でアクチン反矢尻端を生成することができるダイナミンとコルタクチン中心複合体を核とする。本発明の結果によれば、ＳＹＮＪ２は次の浸潤突起成熟ステップ、すなわち、ＭＭＰの分泌ならびにＭＴ１−ＭＭＰおよび他の表面分子、例えば、ＣＤ４４の送達にも関与する。同様の方法で、ＳＹＮＪ２は、先端へのＥＧＦＲおよびインテグリンの送達を制御し、コフィリンを活性化する可能性があり、これは葉状仮足突出の形成を指令する中枢的な事象である。
【０２６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞移動および動物における転移へのＳＹＮＪ２の寄与と一致して、乳がん標本の本発明における調査により、疾患の侵攻性サブタイプにおけるＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの有意な上方調節が観察された。さらに、２つのコホートからのデータを用いて、乳がん患者の高いＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡ発現と、より短い生存期間との関係が観察された。
【０２６４】
まとめると、本研究は、本質的な転移開始事象を、ＰＩ（４，５）Ｐ２に対する一連の作用が先端でアクチン動力学を調節し、ならびに浸潤突起の道標であるＰＩ（３，４）Ｐ２を生成する、ＰＩ３ＫのＥＧＦに誘導される局部活性化およびＳＹＮＪ２の全体的上方調節に帰する。さらに本研究によりＳＹＮＪ２によるＰＩ（３，４）Ｐ２の生成を選択的に阻害する様々な化合物が同定された。
【０２６５】
本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの代替物、改変および変更が当業者には明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内にあるそのような代替物、改変および変更を全て包含することが意図される。
【０２６６】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に援用されると示されるのと同程度に、その全体が参照により本明細書に援用される。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であるとの承認と解釈されるべきではない。セクションの見出しが用いられる程度で、それらは必ずしも限定と解釈されるべきではない。
【０２６７】
参考文献（他の参考文献は本文中に含まれる）
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【配列表フリーテキスト】
【０２６８】
配列番号３：コード領域１６１２〜１６３３（ＳＪ２−１）を標的とする、低分子干渉ＲＮＡ分子配列の例
配列番号４：３’非翻訳領域（ＳＪ２−２）を標的とする、低分子干渉ＲＮＡ分子配列の例
配列番号５：ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートに成功するｓｉＲＮＡ配列の例
配列番号６：ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートに成功するｓｉＲＮＡ配列の例
配列番号７：ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートに成功するｓｈＲＮＡ配列の例
配列番号８：ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートに成功するｓｈＲＮＡ配列の例
配列番号９：ＳＹＮＪ２  ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートに成功するｓｈＲＮＡ配列の例
配列番号１０：コード領域１４９４〜１４７５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの例；ホスホロチオエート骨格
配列番号１１：３’ＵＴＲ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの例；ホスホロチオエート骨格
配列番号１２：コード領域２４２８〜２４０９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの例；ホスホロチオエート骨格
配列番号１３：ヒト由来の組み換えＴＡＰＰ１  ＰＨドメイン
配列番号１４：ヒト由来の組み換えＴＡＰＰ１  ＰＨドメイン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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