(57)【要約】  本発明は、癌の処置における使用のためのサリチル酸塩に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の投与レジメン：
ａ）最初の処置日にアセチルサリチル酸または５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸のいずれかの初回用量を患者に投与すること、
ｂ）次の処置日にアセチルサリチル酸、４−アミノサリチル酸および５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸から選択される少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の２回目の用量を患者に投与すること
を含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項２】
前記２回目の用量を少なくとも連続３日の処置日の各々に患者に投与する、請求項１に記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項３】
段階ａ）におけるアセチルサリチル酸の前記初回用量が４０〜７０ｍｇ／ｋｇ患者体重である、請求項１または２のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項４】
段階ａ）における５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸の前記初回用量が２０〜６０ｍｇ／ｋｇ患者体重である、請求項１から３のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項５】
段階ｂ）におけるアセチルサリチル酸の前記用量が３０〜１２０ｍｇ／ｋｇ患者体重である、請求項１から４のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項６】
段階ｂ）における４−アミノサリチル酸の前記用量が１００〜３００ｍｇ／ｋｇ患者体重である、請求項１から５のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項７】
段階ｂ）における５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸の前記用量が２０〜６０ｍｇ／ｋｇ患者体重である、請求項１から６のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項８】
アセチルサリチル酸および５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸を一緒に投与する場合、段階ｂ）においてアセチルサリチル酸の前記用量が８０ｍｇ／ｋｇ患者体重を超えない、請求項１から７のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項９】
前記初回用量を最初の処置日全体にわたって分割して投与する、請求項１から８のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項１０】
段階ａ）における５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸の前記初回用量を、２０〜３５ｍｇ／ｋｇ患者体重の第１分割用量として、および次に４〜８時間後に１２〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の第２分割用量として、２つの別々の分割量で投与する、請求項９に記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項１１】
段階ｂ）における前記少なくとも２つの異なるサリチル酸塩を、分割量で、一緒に、別々におよび／または処置日全体にわたって分けて投与する、請求項１から１０のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項１２】
任意の処置日の用量の最後の投与と次の処置日の用量の最初の投与との間の時間間隔が少なくとも１２時間である、請求項１から１１のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項１３】
処置サイクルが、段階ａ）における５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸の投与が処置の連続４日間反復され、および段階ｂ）の前記少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の投与が処置の少なくとも連続２日間反復されることを特徴とする、請求項１、４から１２のいずれかに記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【請求項１４】
前記処置サイクルを少なくとも３回反復する、請求項１３に記載の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の投与レジメンを含む癌の処置における使用のためのサリチル酸塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
サリチル酸塩のアセチルサリチル酸（ＩＮＮ：ＡＳＡ）、４−アミノサリチル酸（一般にｐ−アミノサリチル酸として知られる、ＰＡＳ）および５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸（ＩＮＮ：ジフルニサル（Ｄｉｆｌｕｎｉｓａｌ））は当分野で周知であり、本明細書中以下では、それぞれＡＳＡ、ＰＡＳおよびジフルニサル（時としてＤｉｆｌｕと略す）と称する。
【０００３】
国際公開第９６／３０００３号は、サリチル酸塩およびサリチル酸誘導体を腫瘍組織の抑制のために使用することを提案しており、サリチル酸塩およびサリチル酸誘導体は７未満のｐＨでプロトン化するかまたは物質を放出し、プロトン化した化合物または放出された物質は、非プロトン化化合物または物質を放出する前の化合物よりも細胞に対してより強力な破壊作用を及ぼす。国際公開第９６／３０００３号はまた、２つ以上の化合物の混合物も一般的に開示する。
【０００４】
国際公開第９８／５８６３９号は、ジフルニサル−ＡＳＡ、ジフルニサル−ＰＡＳまたはＡＳＡ−ＰＡＳなどのサリチル酸塩の相乗的に作用する組合せによる、酸性細胞外環境に存在する癌細胞の選択的攻撃に関する。しかし、患者において卓越した抗腫瘍作用を示す改善された投与レジメンが依然として必要である。
【０００５】
国際公開第２００５／０１６３５４号は、ジフルニサルを単独で適用することによって与えられる、塩基性腫瘍画分への標的化攻撃の可能性を提供する。しかしジフルニサル単独の攻撃は、低アルブミンレベルの状況で存在する酸性および塩基性腫瘍画分に限定される。約０．４〜０．５ｍＭの高アルブミンレベルを有する器官、例えば肝臓では、アルブミンへのジフルニサルの低い負荷に起因してジフルニサル単独の活性は機能しない。
【０００６】
さらなる問題は、腫瘍および転移が生理的条件下では免疫系によって攻撃されないこと、すなわちそれらが正常組織と共存することである。
【０００７】
腫瘍画分が酸性環境に存在する限り、免疫攻撃に対する抵抗性は、細胞外環境の酸性化によって実現されるという古めかしい原理で説明することができる。免疫死滅作用のｐＨ依存性が検討されたので、免疫系の４つの公知の死滅作用すべてがｐＨ依存性であることおよびそれらがｐＨ＜６．９で起こらなくなることが判明した。そのため免疫系の遮断を作り出す簡単な方法は、癌細胞の細胞環境の酸性化を生じさせることである。（Ｋｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８０；２１０：１２５３−１２５５．Ｋｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．，１９９４；１５：３０４−３１０．Ｋｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００；９９：３７５−３８４．Ｋｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０００；２３（２）：１９６−２０７．およびＫｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００；９６（３）：２５２−２６３．）
【０００８】
これらの事実は、塩基性環境に存在する腫瘍画分が免疫系によって攻撃されるはずであることを示唆する。しかし、そのような活性は観察されていない。それゆえ、癌細胞に組み込まれたさらなる防御システム（保護因子）が存在するに違いない。
【０００９】
それゆえ、癌細胞におけるこの「保護因子」を除去することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえ、上記問題を解決すること、特に癌のより有効な処置を提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
今や驚くべきことに、上記問題は特定の投与レジメンを用いたＡＳＡ、ＰＡＳおよびジフルニサルの投与によって解決できることが見出された。
【００１２】
本発明は、したがって、以下の投与レジメン：
ａ）最初の処置日にアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）または５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸（ジフルニサル）のいずれかの初回用量を患者に投与すること、
ｂ）次の処置日にアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、４−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）および５−［２，４−ジフルオロフェニル］−サリチル酸（ジフルニサル）から選択される少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の２回目の用量を患者に投与すること
を含む、癌の処置における使用のためのサリチル酸塩に関する。
【００１３】
本明細書で使用する「最初の処置日」という用語は、段階ａ）で述べたＡＳＡまたはジフルニサルのいずれかの初回用量の投与から成る、１２〜２４時間、好ましくは２４時間の処置を表す。本発明の投与レジメンは最初の処置日から始まることが理解されるべきである。しかし、最初の処置日より前に同じまたは他の有効成分のさらなる投与が存在し得る。
【００１４】
本明細書で使用する「次の処置日」という用語は、最初の処置日またはその後の任意の処置日の後に続く２４時間の処置を表す。次の処置日は、最初の処置日またはその後の任意の処置日から連続していることが好ましい。本発明によれば、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の２回目の用量は、少なくとも連続３日の処置日、例えば少なくとも連続６日の処置日の各々に患者に投与することが好ましい。最も好ましくは、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の２回目の用量は、連続４日の処置日の各々に患者に投与する。
【００１５】
好ましい実施形態では、段階ａ）におけるＡＳＡの初回用量は、患者の体重に基づき４０〜７０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５０〜７０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは５０〜６０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。本明細書で使用する場合、ｍｇ／ｋｇはｍｇ／ｋｇ患者体重を意味する。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、ジフルニサルの初回用量は、２０〜６０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは３５〜４５ｍｇ／ｋｇ患者体重であることが好ましい。
【００１７】
最初の処置日にＡＳＡまたはジフルニサルのいずれかの初回用量を患者に投与した後、段階ｂ）におけるＡＳＡの用量は、３０〜１２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４０〜１２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは６０〜１１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であることが好ましい。
【００１８】
最初の処置日にＡＳＡまたはジフルニサルのいずれかの初回用量を患者に投与した後、段階ｂ）におけるＰＡＳの用量は、１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ患者体重であることが好ましい。
【００１９】
最初の処置日にＡＳＡまたはジフルニサルのいずれかの初回用量を患者に投与した後、段階ｂ）におけるジフルニサルの用量は、２０〜６０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは３０〜４５ｍｇ／ｋｇ患者体重であることが好ましい。
【００２０】
癌細胞の増殖は、ミトコンドリア呼吸鎖のエネルギー産生に加えて付加的なエネルギー供給を必要とするはずである。この付加的な供給エネルギーは解糖作用によって保証されるはずである。結果として癌細胞の乳酸輸送が認められるはずである。
【００２１】
この相関関係は、固形腫瘍の単離された癌細胞に関する乳酸輸送の測定によっておよび並行して、誘導される増殖の測定によって明らかにすることができる。膀胱細胞株ＲＴ１１２の場合のそのような実験の結果を図１および２に示す。乳酸輸送および増殖の誘導をジフルニサル、ＡＳＡおよびそれらの組合せの投与によって実施する。最初の処置日のジフルニサルまたはＡＳＡ単独の投与はすべてのｐＨ範囲にわたって乳酸輸送の刺激を生じさせるが、それらの組合せは塩基性ｐＨでのみ刺激する。この異なる挙動は孔形成、すなわち前記組合せによる酸性ｐＨでの細胞死滅に起因する。これらの乳酸輸送測定は増殖の刺激と相関するはずである。乳酸輸送測定で実施したのと同じ条件下で行った増殖試験は、想定された概念を確認する（図２）。刺激された癌細胞の増殖は、乳酸輸送の場合に認められたのと同じ増強作用を示す。
【００２２】
本発明によれば、増殖細胞は、最初の処置日のＡＳＡまたはジフルニサルの初回用量での刺激後、免疫系によって攻撃されるようになることが示されている。そのような試験は、免疫欠損であるヌードマウスでは実施することができず、患者試験によってしか実施できない。
【００２３】
最初の処置日にジフルニサルまたはＡＳＡのいずれかを投与し、その次の少なくとも連続３日の処置日に段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはジフルニサル−ＡＳＡまたはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せを酸性増殖癌細胞の除去のために投与するように患者試験を考案した。
【００２４】
図３ａおよび図３ｂにおいてそのような患者試験の２つの結果を提示する。図３ａでは卵巣癌の症例および図３ｂでは前立腺癌の症例で試験を実施した。そのような増殖試験の典型的な特徴は、刺激後（すなわち最初の処置日後）３日目に増殖が起こり始めることである。増殖後５日目および６日目（すなわち最初の処置日後、連続５日および６日の処置日）に免疫系の刺激が増殖細胞を攻撃する。これは免疫学において周知のｃＴリンパ球活性の典型的挙動である。この攻撃は、しかし、塩基性環境で増殖した癌細胞に限定されるはずである。既に言及したように酸性増殖癌細胞は免疫系によって妨げられない。これが、癌治療戦略において、実証した治療例で行ったように、既に最初の刺激日（すなわち最初の処置日）後、２日目、３日目および４日目の処置日に、形成された酸性癌細胞画分を破壊するために段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩を投与しなければならない理由である。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、ＡＳＡの用量は、酸性環境で活性になるために、ＡＳＡおよびジフルニサルを段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩として投与する場合、８０ｍｇ／ｋｇを超えない。高いＡＳＡ用量は、ジフルニサルが癌細胞膜に結合するのを妨げる。
【００２６】
最初の処置日に投与するＡＳＡまたはジフルニサルの初回用量は、最初の処置日全体にわたって分割して投与できることが理解されるべきであり、この場合ＡＳＡまたはジフルニサルの総量を単一ボーラス用量として投与するか、または例えば最初の処置日全体を通して初回用量の２、３、４または５分割量として投与することができる。最初の処置日のＡＳＡまたはジフルニサルの各々別々の分割用量の投与の時間間隔は１〜８時間、より好ましくは１〜６時間に変化させることができ、最も好ましくは約６時間である。
【００２７】
１つの実施形態では、ジフルニサルを段階ａ）の初回用量として投与する場合、ジフルニサルを２０〜３５ｍｇ／ｋｇ患者体重の第１分割用量として、および次に４〜８時間後に１２〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の第２分割用量として、より好ましくは２５〜３５ｍｇ／ｋｇ患者体重の第１分割用量として、および次に約６時間後に約１５ｍｇ／ｋｇ患者体重の第２分割用量として、２つの別々の分割量で投与することが好ましい。
【００２８】
段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩は、分割量で、一緒に、別々におよび／または処置日全体にわたって分けて投与することができる。ジフルニサル、ＡＳＡおよびＰＡＳの組合せを１回の特定の時間に全体で１つの総用量として一緒に投与することができるか、または前記組合せを、処置日全体を通して個別にまたは組み合わせて分割投与することができる。これらの用量は、分割用量に、例えば組み合わせてまたは個別にジフルニサル、ＡＳＡおよびＰＡＳの２、３、４、５または６分割用量に分けることもできる。本発明によれば、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の投与の用量、用量の分割および用量の時間間隔の無限量の異なる組合せが存在する。
【００２９】
別の実施形態では、任意の処置日の用量の最後の投与と次の処置日の用量の最初の投与との間の時間間隔は少なくとも１２時間であり、好ましくは２４時間以内である。
【００３０】
別の実施形態では、処置サイクルは、段階ａ）におけるジフルニサルの投与が処置の連続４日間反復され、および段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩の投与が処置の少なくとも連続２日間反復されることを特徴とし得る。処置サイクルは少なくとも３回、例えば５回反復することが好ましい。最も好ましくは、処置サイクルを４回反復する。
【００３１】
制御された条件下で活性化免疫系によって除去される塩基性腫瘍画分を得るこの可能性は、腫瘍を攻撃して完全寛解に至らせる機会を広げる。実際には免疫系の活性化は、免疫の攻撃に対して癌細胞中で確立された「保護因子」が除去されることを意味し、これは塩基性環境における増殖によって癌細胞がその保護因子を喪失することを指し示す。
【００３２】
しかし試験の途中で、どのようにして免疫系を人工的に活性化し、塩基性環境で癌細胞を死滅させるように条件づけるかが明らかになった。「保護因子」はまた、９０〜１２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の高いＡＳＡ用量の投与によっても除去することができる。さらに、保護因子が除去されただけでなく、増殖も停止した。
【００３３】
この結果は、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはＡＳＡ−ジフルニサルまたはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せを投与することにより、ＡＳＡの用量を９０〜１２０ｍｇ／ｋｇ患者体重に増加した場合、増殖が停止し、５日目および６日目（最初の処置日にＡＳＡの初回用量を投与した後）以後に、免疫系が、保護因子を取り除かれた癌細胞を死滅させ始めることを意味する。卵巣癌および前立腺癌の症例におけるそのような試験例の２つの結果を図４ａおよび４ｂに提示する。この作用を与える投与用量は、ＡＳＡの９０〜１２０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【００３４】
酸性および塩基性環境におけるすべての種類の腫瘍および癌細胞は、したがって、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはジフルニサル−ＡＳＡまたはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せで死滅させることができる。
【００３５】
所定のプロトコルを確立するために、腫瘍および転移における増殖を誘導する２つの方法がある：好ましくは４０〜６０ｍｇ／ｋｇ患者体重のＡＳＡの初回用量を投与することによる方法、またはジフルニサルの初回用量を１回でまたは２回の分割用量で投与することによる方法、ここで１回目の分割用量は２５〜３０ｍｇ／ｋｇ患者体重の低濃度であり、約６時間後に約１５ｍｇ／ｋｇ患者体重の２回目の分割用量を投与する。最初の処置日のこの初回用量後、連続３日の治療日に続いて、酸性腫瘍画分を除去するために段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはＡＳＡ−ジフルニサルの組合せの投与を実施すべきである。１つの実施形態では、最初の処置日の初回用量はＡＳＡであり得、続いて連続２日間の処置日、より好ましくは少なくとも連続３日間の処置日に、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せの投与を実施し得る。
【００３６】
ＡＳＡ単独の投与は一般に癌細胞に対抗するのに有効でないと考えられる。既に概説したように、最初の処置日のＡＳＡの初回用量の投与は酸性ならびに塩基性環境において癌細胞の増殖を刺激する。生じた酸性癌細胞をその後免疫系が攻撃することはできず、すなわち結果として腫瘍は酸性環境で成長し始める。それゆえ本発明の別の実施形態として、最初の処置日にＡＳＡの初回用量を投与した場合（刺激剤として）、その後に、酸性腫瘍画分の除去のために投与する、段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはＡＳＡ−ジフルニサル、ジフルニサル−ＰＡＳまたはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せの処置を連続３日実施する。
【００３７】
特殊な条件下での免疫系活性化の使用を含む、先に概説した基準によれば、最初の処置日にＡＳＡの初回用量を、好ましくは単一ボーラス用量として投与し、続いて段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはＡＳＡ−ＰＡＳの組合せを投与することによって；または最初の治療日にジフルニサルの初回用量を、好ましくは単一ボーラス用量として投与し、続いて段階ｂ）の少なくとも２つの異なるサリチル酸塩、好ましくはジフルニサル−ＡＳＡの組合せを投与することによって、腫瘍を攻撃して完全寛解に至らせる可能性が開かれた。
【００３８】
本発明を図面および実施例においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ａ】０．２ｍＭアルブミンの存在下での膀胱癌細胞株ＲＴ１１２に関する乳酸輸送の測定（「実験材料および方法」参照）。乳酸排出がｐＨ依存性であることを示す、対照測定をプロットしている。ＡＳＡ、ＰＡＳ、ジフルニサル（１ａ）ならびにＰＡＳおよびＡＳＡとジフルニサルの組合せ（１ｂ）を添加した場合、乳酸排出が変化する。単独で投与したＡＳＡ、ＰＡＳおよびジフルニサルは、ｐＨ６．５〜７．４のｐＨ範囲全体にわたって乳酸排出を加速する。ジフルニサル−ＡＳＡまたはジフルニサル−ＰＡＳの組合せも対照と比較して加速を生じさせるが、ｐＨ＞７．０においてのみである。
【図１ｂ】０．２ｍＭアルブミンの存在下での膀胱癌細胞株ＲＴ１１２に関する乳酸輸送の測定（「実験材料および方法」参照）。乳酸排出がｐＨ依存性であることを示す、対照測定をプロットしている。ＡＳＡ、ＰＡＳ、ジフルニサル（１ａ）ならびにＰＡＳおよびＡＳＡとジフルニサルの組合せ（１ｂ）を添加した場合、乳酸排出が変化する。単独で投与したＡＳＡ、ＰＡＳおよびジフルニサルは、ｐＨ６．５〜７．４のｐＨ範囲全体にわたって乳酸排出を加速する。ジフルニサル−ＡＳＡまたはジフルニサル−ＰＡＳの組合せも対照と比較して加速を生じさせるが、ｐＨ＞７．０においてのみである。
【図２ａ】ＲＴ１１２癌細胞のＤＮＡ内への３Ｈ−チミジンの取り込みによる増殖測定（「実験材料および方法」参照）。対照増殖は、毒性化合物の攻撃なしでの増殖を意味する。実験は０．２ｍＭアルブミンの存在下で実施した。１ｍＭおよび２ｍＭのＡＳＡは、ｐＨ６．５〜７．４の増殖範囲全体にわたって増殖のかなりの増強を示す(２ａ)。ジフルニサルは、弱い孔形成のためにｐＨ７．１までは増殖をわずかに阻害するが、ｐＨ７．１より上では、やはり増強を生じさせる(２ａ)。ＡＳＡまたはＰＡＳとジフルニサルの組合せは、ｐＨ７．０までは完全な増殖停止を示す(２ｂ)。ＡＳＡ−ＰＡＳの組合せは、ｐＨ６．８より上で増殖を増強する(２ｂ)。
【図２ｂ】ＲＴ１１２癌細胞のＤＮＡ内への３Ｈ−チミジンの取り込みによる増殖測定（「実験材料および方法」参照）。対照増殖は、毒性化合物の攻撃なしでの増殖を意味する。実験は０．２ｍＭアルブミンの存在下で実施した。１ｍＭおよび２ｍＭのＡＳＡは、ｐＨ６．５〜７．４の増殖範囲全体にわたって増殖のかなりの増強を示す(２ａ)。ジフルニサルは、弱い孔形成のためにｐＨ７．１までは増殖をわずかに阻害するが、ｐＨ７．１より上では、やはり増強を生じさせる(２ａ)。ＡＳＡまたはＰＡＳとジフルニサルの組合せは、ｐＨ７．０までは完全な増殖停止を示す(２ｂ)。ＡＳＡ−ＰＡＳの組合せは、ｐＨ６．８より上で増殖を増強する(２ｂ)。
【図３ａ】ジフルニサル−ＰＡＳの組合せでの処置の２日間の投与による、増殖刺激とそれに続く免疫応答を明らかにするための卵巣癌に関する個別患者試験。試験は、夜の３３ｍｇ／ｋｇのジフルニサルの経口投与から始まり、続いてその次の処置日に３００ｍｇ／ｋｇＰＡＳと並行してさらなる３３ｍｇ／ｋｇのジフルニサルの経口用量を投与した。主要な増殖は２日目の処置日にジフルニサル−ＰＡＳの組合せによって刺激される。５日目および６日目の処置日に増殖が起こり、続いて７日目および８日目の処置日に免疫応答が生じる。
【図３ｂ】前立腺癌を有する個別患者試験。最初の処置日に２５ｍｇ／ｋｇのジフルニサル投与によって増殖誘導を生じさせる。連続２日の処置日にそれぞれ２５ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇのジフルニサル−ＡＳＡの組合せを投与して酸性腫瘍画分を除去する。増殖は処置の３日目に始まる。ｃＴリンパ球による免疫攻撃は処置の５日目および６日目に起こる。患者のＰＳＡマーカーの経過を記録している。
【図４ａ】ＡＳＡ（単独でボーラスとして）の初回用量の投与および処置の連続２日間のＡＳＡ−ＰＡＳの組合せの投与による、卵巣癌を有する個別患者試験。この場合刺激作用は観察されないが、５日間の処置後に強力な免疫応答が認められる。このアッセイにおける増殖期は、＞９０ｍｇ／ｋｇの高いＡＳＡ用量によって取り消されると考えられる。ＣＡ  １２５マーカーの経過を活性の指標として記録した。
【図４ｂ】ジフルニサル−ＡＳＡ投与による卵巣癌を有する個別患者試験。最初の処置日に３０ｍｇ／ｋｇのジフルニサル経口投与の初回用量を投与する。２日目から５日目までの処置日に、ジフルニサル−ＡＳＡの組合せをそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与した。４日目日の処置日にＡＳＡの用量を毎日の蓄積によって＞９０ｍｇ／ｋｇに増加させ、５日目の処置日まで増加を続ける。５日目の処置日に、免疫系が活性になり始め、１２日目の処置日まで続く。５日間の処置の間、ジフルニサル−ＡＳＡによる弱い酸性作用が観察される。患者のＣＡ  １２５マーカーの経過を記録している。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４０】
実験材料および方法：
腫瘍細胞の培養：
３７℃および５％ＣＯ２で２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＢＩＯＣＨＲＯＭ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＦＲＧ）、１％ＮＥＡＥ（ＢＩＯＣＨＲＯＭ）、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＢＩＯＣＨＲＯＭ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＢＩＯＣＨＲＯＭ）を添加したヒト膀胱腫瘍細胞株ＲＴ１１２またはヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２をＤＫＦＺ  Ｔｕｍｏｒｚｅｌｌ−  ｕｎｄ  ｄａｔｅｎｂａｎｋ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）またはＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＦＲＧ）から購入した。マイコプラスマ非含有細胞培養物だけを使用した；これは、特異的検出キット（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）を使用して頻繁に試験した。
【００４１】
乳酸輸送：
３４０ｎｍでのＲＴ１１２細胞の上清中の乳酸の定性的酵素定量
ＲＴ１１２細胞を採取し、２回洗浄して、培地に再懸濁し、２×１０５／ｍｌの密度を生じさせた。５００μｌ／ウェルのＲＴ１１２細胞懸濁液を２４ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤ）に接種し、３７℃および５％Ｃ〜で一晩インキュベートした。上清を、ｐＨ調整した培地（ｐＨ６．０〜７．４）４５０μｌおよび好ましい物質の溶液５００μｌ、または５００μｌ／ウェルのｐＨ調整した培地単独（対照）に置き換えた。再び、細胞を３７℃および５％Ｃ０２で２４時間インキュベートした。３４０ｎｍでの上清中の乳酸の測定（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ，Ｌａｍｂｄａ  １７．ＵＶ−ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｂｅｒｌｉｎｇｅｎ，ＦＲＧ）を製造者の指示に従って（ＳＩＧＭＡ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，ＦＲＧ；乳酸：３４０ｎｍでの全血中の乳酸の定量的酵素定量（手順番号８２６−ＵＶ））を実施した。
【００４２】
増殖：
［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みアッセイ
ＲＴ１１２腫瘍細胞の増殖への細胞傷害性分子の影響を、液体シンチレーション計数法（ＬＳＣ）による腫瘍細胞の細胞ＤＮＡ内に取り込まれたトリチウム化チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ）の測定によって定量化した。簡単に述べると、ＲＴ１１２細胞を採取し、２回洗浄して、培地に再懸濁した（２．５×１０５／ｍｌ）。１００μｌ／ウェルのＲＴ１１２細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）に接種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。上清を、ｐＨを調整した培地（ｐＨ６．０〜７．４）９０μｌおよび好ましい物質の溶液１０μｌ、または１０μｌ／ウェルのｐＨ調整培地単独（対照）に置き換えた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で様々な時間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、新鮮なｐＨ調整培地中で再インキュベートした。２３．１２５ｋＢｑ［３Ｈ］−ＴｄＲ／ウェル（９２５ｋＢｑ／ｍｌ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＦＲＧ）の添加によって２４時間パルスした。凍結および解凍後、培養物の放射性ＤＮＡを、自動セルハーベスタ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を用いてガラス繊維フィルタに移した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数器（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）で測定した。
【００４３】
アポトーシス：
誘導細胞死後の細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片（モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム）の定量
ＲＴ１１２腫瘍細胞におけるアポトーシスの定性的および定量的インビトロ定量を、測光酵素免疫測定法を用いて分析した。簡単に述べると、ＲＴ１１２細胞を採取し、２回洗浄して、培地に再懸濁し、２．５×１０５／ｍｌの密度を生じさせた。１００μｌ／ウェルのＲＴ１１２細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）に接種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。上清を、ｐＨを調整した培地（ｐＨ６．０〜７．４）９０μｌおよび好ましい物質１０μｌ、または１００μｌ／ウェルのｐＨ調整培地単独（対照）に置き換えた。再び、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で様々な時間インキュベートした。試験培養物の上清を廃棄し、ＲＴ１１２細胞を室温で３０分間溶解緩衝液に溶解した。細胞質画分をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに移し、ＥＬＩＳＡのための作業手順を製造者の指示に従って（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ）実施した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【国際調査報告】
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