(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物【化１】2016520641.tif 000007（式中、Ｒは、メチル基またはエチル基から選択される）、そのヒドロキシ酸形態、前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、ならびに前記化合物およびそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグおよび溶媒和物と、神経変性疾患および／または神経疾患、認知機能障害、ＡＰＰ代謝障害を伴う疾患、炎症もしくは炎症プロセス、または癲癇、癲癇発作および痙攣の予防または治療におけるそれらの用途とを説明する。
2016520641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2016520641.tif 000006
（式中、Ｒは、メチル基およびエチル基から選択される）、
そのヒドロキシ酸形態、前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、ならびに前記化合物およびそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグおよび溶媒和物。
【請求項２】
Ｒがメチルである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒがエチルである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、および／またはそのヒドロキシ酸形態、および／または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容され得るアジュバント、担体および／またはビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
医薬品として用いられる、請求項１〜３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物。
【請求項６】
ａ．神経変性疾患および／または神経系疾患、
ｂ．認知機能障害、
ｃ．炎症または炎症プロセス、ならびに
ｄ．癲癇、癲癇発作および痙攣
の予防および／または治療に用いられる、請求項１〜３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物。
【請求項７】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、フリードライヒ失調症、レビー小体型認知症、脊髄性筋萎縮症、海綿状脳症、デビック病、ギラン・バレー症候群、カナバン病、脊椎症、ラフォラ病、ダウン症候群およびコルサコフ症候群を含む群から選択される、請求項６に記載の用途の化合物。
【請求項８】
炎症または炎症プロセスが、関節炎、関節症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、アレルギー、喘息、湿疹、乾癬、アトピー性皮膚炎、癌、座瘡、膀胱炎、術後炎症、歯性炎症、炎症性眼疾患、移植片対宿主病、過敏症を含む群から選択される、請求項６に記載の用途の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患または神経系疾患、特に、アルツハイマー病および癲癇の予防および／または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経変性疾患および／または神経疾患の高い発生率は、解決が最優先の世界的な問題である。したがって、前記疾患を予防または緩和する神経保護化合物の探索が必要である。アルツハイマー病（ＡＤ）は、前記疾患の中で最も蔓延している。現在の薬物は患者にあまり効果がないため、この疾患を緩和するための神経保護化合物の探索が必要である。
【０００３】
これまでの薬物はほとんど成果がなかったため、新たな研究が始まっており、近年、治療剤として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）酵素の阻害剤（スタチンとして周知である）に関する研究が目立つ。実際、スタチンによって治療した患者において、アルツハイマー病リスクの有意な減少が示されている（Ｊｉｃｋ  Ｈ，Ｚｏｒｎｂｅｒｇ  ＧＬ，Ｊｉｃｋ  ＳＳ，Ｓｅｓｈａｄｒｉ  Ｓ，Ｄｒａｃｈｍａｎ  ＤＡ．Ｓｔａｔｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｌａｎｃｅｔ．２０００．３５６：１６２７−１６３１）。ＡＤの場合、アトルバスタチンおよびシンバスタチンを主に使用したいくつかの第ＩＩ相臨床試験が、最近数十年間に行われている。しかしながら、これまでに、前記研究において、アルツハイマー病におけるスタチンの治療有効性を実証することができなかった（Ｂｕｒｇｏｓ  ＪＳ，Ｂｅｎａｖｉｄｅｓ  Ｊ，Ｄｏｕｉｌｌｅｔ  Ｐ，Ｖｅｌａｓｃｏ  Ｊ，Ｖａｌｄｉｖｉｅｓｏ  Ｆ．Ｈｏｗ  ｓｔａｔｉｎｓ  ｃｏｕｌｄ  ｂｅ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ´ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ？  Ａｍ  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｄｅｍｅｎ．２０１２．２７（３）：１５１−１５３）。
【０００４】
最先端の技術（ＥＰ２２４１５６１）において、特定のスタチンのヘキサヒドロナフタレン環構造の改変が、高いコレステロール低下能力および神経保護能力を有するスタチン（ＮＳＴ００３７）をもたらすことが公知である。シムバスタチンのβ−ヒドロキシピラノン環のメチル化は、インビトロＨＭＧＣＲ阻害能力（これがインビボコレステロール低下作用を生み出す）を有する誘導体をもたらしたことが以前に判明しているが（米国特許第６５４１５１１号）、この文献においては、前記改変スタチンの神経保護能力について言及されていない。
【０００５】
現在、神経変性疾患の治療効果を有する、すなわち、高い神経保護活性を有する化合物であって、優れた血液脳関門通過性をさらに有する新たな化合物、特にスタチン、を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、スタチンＮＳＴ００３７の２つの新たな誘導体であって、メチル基またはエチル基の組み込みによって、分子のβ−ヒドロキシピラノン環が保護された誘導体を説明する。これらの新たな化合物は、（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−８−（２−（（２Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エチル）−３，７−ジメチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル２−エチルブタノエート（本特許出願においてはＮＳＴ００７６と特定されることもある）および（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−８−（２−（（２Ｒ，４Ｒ）−５−エチル−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エチル）−３，７−ジメチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル２−エチルブタノエート（本特許出願においてはＮＳＴ００７８と特定されることもある）である。本発明者らが実施したインビトロアッセイおよびインビボアッセイによれば、米国特許第６５４１５１１号に記載されているものと比較して、これらの改変は、驚くべきことに、この出発物質と同程度かまたはそれよりも大きなＨＭＧＣＲ阻害活性を有する分子をもたらさなかった。しかしながら、また驚くべきことに、本発明者らは、本発明の２つの分子ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の高い神経保護能力を見出した。実際、本発明の化合物は、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７のものを上回る優れたインビボ神経保護能を有し、さらに癲癇を防ぎ、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）酵素活性（これは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）プロセシングのアミロイド生成経路に関与するため、ＡＤ治療の治療標的である）を減少させ、神経炎症を軽減する。加えて、本発明者らは、誘導体ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門（ＢＢＢ）通過を研究することを決定し、驚くべきことに、両化合物の脳内レベルが、シンバスタチンについて検出されたものよりもはるかに高いこと（このことは、脳アクセスの改善も予測したインビトロアッセイによって確認された）を見出した。
【０００７】
市販のスタチン（シンバスタチン）（これは、前記酵素を阻害する）およびモナコリンＪ（これは、ＨＭＧＣＲ阻害能力がシンバスタチンのものよりもはるかに低い以外は、類似の構造を有する）と比較した、ＨＭＧＣＲに対する前記化合物の活性を決定することによって、前記化合物には脂質低下活性がないことが明確に示された（実施例２、図１）。脂質代謝に対する前記化合物の効果をより詳細に特性評価し、インビトロにおいて得られた結果を比較するために、本発明者らは、インビボモデルを使用し、家族性高脂血症モデルマウスにおける誘導体化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の急性効果を評価することによって、コレステロール低下活性をより詳細に分析することを決定した（実施例２、図２）。
【０００８】
癲癇モデルマウスにおける癲癇発作および痙攣に対する保護を決定することによって、前記化合物の抗癲癇活性および抗痙攣活性が実証された（実施例３、図３）。前記実施例は、癲癇および癲癇発作または痙攣の予防および／または治療におけるこれらの化合物の使用可能性を明確に示している。興奮毒性物質の作用によって引き起こされる海馬神経損傷に関して、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の神経保護効果を評価した（実施例３、図４および５）。本発明者らは、驚くべきことに、これらの化合物が、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７よりも優れた神経保護物質であり、神経細胞死および誘導性神経炎症を防ぐことを見出した。前記実施例は、興奮毒性症候群に関連する疾患、例えば神経変性疾患および／または神経疾患の予防および／または治療におけるこれらの化合物の使用可能性を明確に示している。
【０００９】
また、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性に対する前記化合物の効果を評価したところ、驚くべきことに、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、齧歯動物またはゼブラフィッシュの脳内ＢＡＣＥに対して阻害効果を有し、これがシンバスタチンおよびＮＳＴ００３７を上回ることを観察した（実施例４、図６および７）。前記実施例は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）代謝障害に関連する疾患、例えばＡＤの予防および／または治療におけるこの化合物の使用可能性を明確に示している。
【００１０】
実施例５に記載されているように、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門通過を規定するために、インシリコにおいて、またはＢＢＢ通過の割合およびその有効透過率（図８）を分析するインビトロアッセイによって、様々なパラメータ（例えば、化合物の親油性によって決定される理論関門通過）を分析したところ、両ＮＳＴ００３７誘導体は高い理論ＢＢＢ通過を有しており、驚くべきことに、このような通過はシンバスタチンのものよりも高いことが観察された。加えて、新たなＮＳＴ００３７誘導体の場合には、参照スタチン（すなわち、シンバスタチン）の通過と比較して、前記分子は、驚くべきことに、より大きな脳アクセスを有することがマウスにおいて証明された（実施例５、図９）。続いて、シンバスタチンに対するこれらの分子の血漿濃度を決定したところ（実施例５、図１０）、驚くべきことに、シンバスタチンに対して統計的に有意な非常に高濃度のＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が観察された。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、式（Ｉ）：
【化１】
2016520641.tif 000003
（式中、Ｒは、メチル基［本特許出願においてはＮＳＴ００７６と特定されることもある］およびエチル基［本特許出願においてはＮＳＴ００７８と特定されることもある］から選択される）の２つの化合物、そのヒドロキシ酸形態、前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、ならびに該化合物およびそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグおよび溶媒和物に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物、および／またはそのヒドロキシ酸形態、および／または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容され得るアジュバント、担体および／またはビヒクルとを含んでなる医薬組成物である。
【００１３】
本発明の別の態様は、医薬品として用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはそのヒドロキシ酸形態、または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物に関する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、神経保護剤とし用いられる、特に、
ａ．神経変性疾患および／または神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、フリードライヒ失調症、レビー小体型認知症、脊髄性筋萎縮症、海綿状脳症、デビック病、ギラン・バレー症候群、カナバン病、脊椎症、ラフォラ病、ダウン症候群、コルサコフ症候群など）、より具体的には、前記慢性神経変性疾患に関連するＡＰＰ代謝障害に対する神経保護剤として、
ｂ．認知機能障害、
ｃ．炎症または炎症プロセス、ならびに
ｄ．癲癇、癲癇重積状態、癲癇発作および痙攣
の予防および／または治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物に関する。
【００１５】
本発明の一態様は、医薬品の調製における、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物の用途に関する。特定の実施形態によれば、医薬品は、神経保護剤として用いられるものであり、特に、
ａ．神経変性疾患および／または神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、フリードライヒ失調症、レビー小体型認知症、脊髄性筋萎縮症、海綿状脳症、デビック病、ギラン・バレー症候群、カナバン病、脊椎症、ラフォラ病、ダウン症候群、コルサコフ症候群など）、より具体的には、前記慢性神経変性疾患に関連するＡＰＰ代謝障害に対する保護のため、
ｂ．認知機能障害、
ｃ．炎症または炎症プロセス、ならびに
ｄ．癲癇、癲癇重積状態、癲癇発作および痙攣
の予防および／または治療に用いられるものである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、治療を必要とする被験体における神経変性疾患もしくは神経系疾患、認知機能障害、癲癇、癲癇発作および痙攣、またはＡＰＰ代謝障害に関連する疾患を予防および／または治療するための方法であって、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、および／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒドロキシ酸形態の化合物ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８、モナコリンＪおよびシンバスタチンによる３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）の酵素活性の阻害を示すＸＹ散布図である。図は、様々な濃度の化合物によって処理した後のＨＭＧＣＲ酵素活性の割合を示す（２回反復の１回の実験による平均±ＳＤを示す）。４つの化合物のＩＣ５０（酵素活性の５０％を阻害する濃度）の結果を要約した表を示す。
【図２】５０ｍｇ／ｋｇの各分子の懸濁液を雄性ａｐｏＢ１００トランスジェニックマウス（ｎ＝４〜５／群）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した１２時間後のシンバスタチンならびにＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のコレステロール低下作用を示す棒グラフである。酵素技術および分光光度技術によって、齧歯動物の血漿中の総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロールを定量した。結果は、対照に対するコレステロールレベルの変化の平均±ＳＤである。＊スチューデントｔ検定による、対照群（ビヒクル）に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図３】図３、４および５は、興奮毒性損傷のインビボモデルマウスにおける化合物による保護の程度を示す。  図３は、ビヒクル＋ＫＡ群に対する癲癇レベルの曲線下面積の割合の平均±ＳＥＭを示す棒グラフであり、受けた前処理に応じて、カイニン酸（２３ｍｇ／ｋｇ）接種後１２０分間の観察中にマウスが示したものである。カイニン酸によって損傷を誘導する２４時間前および０．５時間前に、前処理（ｎ＝１２、シンバスタチン＋ＫＡ群）、ＮＳＴ００７６（ｎ＝１０、ＮＳＴ００７６＋ＫＡ群）およびＮＳＴ００７８（ｎ＝１０、ＮＳＴ００７８＋ＫＡ群）を３．１２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。対照マウスには、同じレジメンによって同量のビヒクル（０．５％メチルセルロース食塩溶液）を投与した（ｎ＝１０、ビヒクル＋ＫＡ群）。＊ビヒクル＋ＫＡ群に対して、ｐ値＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図４】死亡した動物の割合、海馬損傷を有する動物の割合、および処理実施により前記領域の損傷を有しない動物の割合を示す積み上げ棒グラフである。この実験は、６つの実験群から構成されていた：ビヒクル＋ＰＢＳ＋ビヒクル群（ｎ＝９）、ビヒクル＋ＫＡ＋ビヒクル群（ｎ＝２０）、シンバスタチン＋ＫＡ＋シンバスタチン群（ｎ＝１２）、ＮＳＴ００７６＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７６群（ｎ＝１０）、ＮＳＴ００７８＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７８群（ｎ＝１０）およびＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群（ｎ＝２２）。カイニン酸（２３ｍｇ／ｋｇ）を接種することによって損傷を誘導する０．５時間前および２４時間前に、用量３．１２５ｍｇ／ｋｇによってマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）前処理した。カイニン酸によって処理しなかったマウス群には、代わりにＰＢＳを投与した。カイニン酸の投与後、マウスを３日間処理（投与１回／日）し続けた。ビヒクル群のマウスには、同量の０．５％メチルセルロース食塩溶液を投与した。４日目に生存動物を屠殺し、その脳を摘出し、５μｍ冠状切片を調製するために加工し、次いで、これをヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。海馬において検出された損傷を記録して、脳を分析した。記録データの割合がシンバスタチン＋ＫＡ＋シンバスタチン群のものを上回る回数を各場合において示す。
【図５】処理に応じたカイニン酸によって影響を受けた様々な脳内領域において、アストログリオーシスが拡散した程度（またはスコア）を示す棒グラフであり、生存動物の脳において記録されたスコアの平均±ＳＥＭとして表されている。この実験は、５つの実験群から構成されていた：ビヒクル＋ＰＢＳ＋ビヒクル群（ｎ＝９）、ビヒクル＋ＫＡ＋ビヒクル群（ｎ＝２０）、シンバスタチン＋ＫＡ＋シンバスタチン群（ｎ＝１２）、ＮＳＴ００７６＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７６群（ｎ＝１０）およびＮＳＴ００７８＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７８群（ｎ＝１０）。カイニン酸（２３ｍｇ／ｋｇ）を接種することによって損傷を誘導する０．５時間前および２４時間前に、用量３．１２５ｍｇ／ｋｇによってマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）前処理した。カイニン酸によって処理しなかったマウス群には、代わりにＰＢＳを投与した。カイニン酸の投与後、マウスを３日間処理（投与１回／日）し続けた。ビヒクル群のマウスには、同量の０．５％メチルセルロース食塩溶液を投与した。４日目に生存動物を屠殺し、その脳を摘出し、５μｍ冠状切片を調製するために加工し、次いで、アストログリア中に存在するＧＦＡＰタンパク質について染色した。アストログリオーシスの拡散を記録することによって、脳を分析した（スコアにおいて、ゼロは、反応性アストログリアの欠如を示し、３は、最大反応性アストログリアを示す）。＊ビヒクル＋ＫＡ＋ビヒクル群に対して、ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図６】５０ｍｇ／ｋｇのシンバスタチン、ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８の懸濁液または同量のそのビヒクル（０．５％メチルセルロース食塩溶液）を雄性ＦＶＢマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した２４時間後のマウスの脳内のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）酵素活性の平均±ＳＥＭを示す棒グラフである。蛍光発生基質を使用することによって、脳ホモジネート中の酵素活性をインビトロにおいて決定し、タンパク質の量によって正規化した酵素の任意単位によって表した（ＢＣＡ法によって決定）。＊対照群に対して、ｐ＜０．０５；＊＊対照群に対して、ｐ＜０．０１；＃シンバスタチン群に対して、ｐ＜０．０５；＃＃シンバスタチン群に対して、ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。
【図７】１００ｍｇ／ｋｇのシンバスタチン、ＮＳＴ００３７、ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８の懸濁液または同量のそのビヒクル（０．５％メチルセルロース食塩溶液）を２４月齢の成体ゼブラフィッシュに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した２４時間後のゼブラフィッシュの脳内のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）酵素活性の平均±ＳＥＭを示す棒グラフである。蛍光発生基質を使用することによって、脳ホモジネート中の酵素活性をインビトロにおいて決定し、タンパク質の量によって正規化した酵素の任意単位によって表した（ＢＣＡ法によって決定）。＊＊対照群に対して、ｐ＜０．０１；＃シンバスタチン群に対して、ｐ＜０．０５；†ＮＳＴ００３７群に対して、ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図８】ヒドロキシ酸形態のシンバスタチン、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門（ＢＢＢ）通過（％）に関する有効透過率（Ｐｅ（ｃｍ／秒）として表す）を示すＸＹ散布図である。ＰＡＭＰＡ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）法によって、両パラメータをインビトロにおいて決定した。ベラパミルおよびテオフィリンをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
【図９】ビヒクルとして０．５％メチルセルロース食塩溶液を使用して、５０ｍｇ／ｋｇの化合物の懸濁液を雄性ＦＶＢマウス（ｎ＝４〜８／群／時）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した１時間後、２時間後、４時間後および６時間後のラクトン型のシンバスタチン、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の脳内濃度を示すＸＹ散布図である。ＵＰＬＣ−ＭＳによって、化合物の濃度を決定した。結果は、決定濃度の平均値±ＳＥＭである（脳の量当たりによって表す）。＊スチューデントｔ検定による、シンバスタチン群に対する有意差（ｐ＜０．０５）。各群の動物に基づいて、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘおよびＡＵＣ０−６（曲線下面積）の値を計算した。
【図１０】ビヒクルとして０．５％メチルセルロース生理食塩水を使用して、５０ｍｇ／ｋｇの化合物の懸濁液を雄性ＦＶＢマウス（ｎ＝４〜８／群／時）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した１時間後、２時間後、４時間後および６時間後のラクトン型のシンバスタチン、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血漿中濃度を示すＸＹ散布図である。ＵＰＬＣ−ＭＳによって、化合物の濃度を決定した。結果は、決定濃度の平均値±ＳＥＭである（μｇ／ｍＬによって表す）。＊スチューデントｔ検定による、シンバスタチン群に対する有意差（ｐ＜０．０５）。各群の動物に基づいて、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘおよびＡＵＣ０−６（曲線下面積）の値を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本特許出願の本発明の目的の理解を助けるために、本発明との関連において使用されるいくつかの用語および表現の意味を以下に説明する。
【００１９】
本明細書において使用される「神経保護」という用語は、公知であるかもしくは公知となる任意の機構、例えば壊死、アポトーシス、自己消耗、酸化的損傷、興奮毒性、小胞体損傷、副生成物の堆積、細胞骨格の崩壊、電子伝達系の阻害、細胞構造の喪失、タンパク質の過剰リン酸化もしくは脱リン酸化などによって神経変性もしくは死亡の効果の減衰消失を引き起こすことができる任意の物質、または副作用の軽減もしくは消失を指す。
【００２０】
本明細書において使用される「スタチン」という用語は、コレステロール生合成の律速段階を触媒する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）酵素の阻害剤を指し、任意の天然スタチン、合成スタチンまたは半合成スタチンを含む。しかしながら、構造が公知のスタチンに類似するが、ＨＭＧＣＲ酵素を阻害することができない化合物は、スタチンとみなされ得ない。
【００２１】
本明細書において使用される「コレステロール低下」という用語は、血中コレステロールレベルまたは他の組織中のコレステロールレベルを減少させる特性を有する任意の薬理学的に活性な物質を指す。
【００２２】
本明細書において使用される「神経系疾患または神経疾患」という用語は、中枢神経系（すなわち、脊髄（脊髄症）または脳（脳症））および末梢神経系（すなわち、神経）の両方の機能に影響を与え得る疾患であって、移動障害、言語障害、学習障害、記憶障害、嚥下障害または感覚もしくは情調の機能の変化を引き起こし得る疾患を含む。神経疾患群は、神経変性疾患および他の疾患、例えば癲癇、髄膜炎、脳卒中、二分脊椎症、多発神経障害、血管病状などを含む。
【００２３】
本明細書において使用される「神経変性疾患」という用語は、神経組織（特に、ニューロン）の変性または劣化に起因する疾患であって、時間と共に機能障害または能力障害を引き起こす疾患を含む；変性という用語は、細胞の生存能力の喪失、細胞機能の喪失および／または細胞（ニューロンまたは他のもの）数の減少を含む。神経変性疾患の例示的で非限定的な例としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、フリードライヒ失調症、レビー小体型認知症、脊髄性筋萎縮症、海綿状脳症、デビック病、ギラン・バレー症候群、カナバン病、脊椎症、ラフォラ病、ダウン症候群、コルサコフ症候群などが挙げられる。特定の実施形態において、前記神経変性疾患は、例えば、酸化ストレスまたは小胞体ストレスまたはアポトーシスまたは興奮毒性または細胞骨格の崩壊または電子伝達系の阻害またはタンパク質の過剰リン酸化もしくは脱リン酸化または一般的な神経細胞死を引き起こす物質によって引き起こされる神経細胞死に関係する疾患である。
【００２４】
本明細書において使用される「認知障害」という用語は、精神機能（例えば、記憶、定位、言語、視覚認識または行為）の喪失または変化であって、罹患者の社会活動および相互関係を長期にわたって持続的に妨げるものを指す。
【００２５】
本明細書において使用される「癲癇」という用語は、様々な原因による慢性脳症候群であって、脳ニューロンによる神経インパルスの過剰な高共時的放電による再発性発作を特徴とし、最終的には様々な臨床的およびパラクリニカルな兆候に関連するもの指す。癲癇発作は、痙攣性または非痙攣性であり得る。癲癇は、多くの原因を有し得る；いくつかの場合において、様々な種類の脳損傷（例えば、脳外傷、髄膜炎の後遺症、腫瘍など）によるものであり得る；他の場合において、損傷は存在しないが、発作に対する遺伝的素因が存在する；他の場合において、癲癇の病因は、環境的なもの、薬理学的治療によるもの、興奮毒性、外傷、ストレス過程、老化、発達障害、神経疾患、心理的危機、妊娠期間中の問題、出産中の問題などによるものであり得る。
【００２６】
本明細書において使用される「癲癇または痙攣」という用語は、任意の病因、例えば遺伝的なもの、環境的なもの、薬理学的治療によるもの、興奮毒性によるもの、外傷によるもの、ストレス過程によるもの、老化によるもの、発達障害によるもの、神経疾患によるもの、心理的危機によるもの、妊娠期間中の問題によるもの、出産中の問題によるものなどの任意の癲癇発作または痙攣を指す。脳内の異常な電気活動が身体の運動または機能、感覚の不随意変化を引き起こすと、癲癇発作が警戒能力または行動として起こり、部分性または全般性（痙攣性または非痙攣性）であり得る。
【００２７】
本明細書において使用される「炎症」または「炎症性のプロセス」という用語は、環境の攻撃に対する非特異的応答、または炎症性作用物質（細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、細胞死プロセス、例えばアポトーシスまたは壊死、炎症応答を活性化する分子、外傷、異物、物理的因子、血管障害、変性プロセス、免疫および自己免疫障害、過敏症など）によって引き起こされる応答を指す。この用語は、とりわけ、関節炎、関節症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、アレルギー、喘息、湿疹、乾癬、アトピー性皮膚炎、様々な種類の癌、座瘡、膀胱炎、術後炎症、歯性炎症、炎症性眼疾患、移植片対宿主病、過敏症を含む。
【００２８】
本明細書において使用される「被験体」という用語は、哺乳動物種の一員を指し、限定されないが、家畜、霊長類およびヒトが挙げられる；好ましくは、被験体は、任意の年齢または人種のヒトの男性または女性である。特定の実施形態において、前記被験体は、加齢に関連する病理過程、例えば老化または神経変性疾患、例えば慢性神経変性疾患を患っているか、またはこれらを患っていると疑われる哺乳動物である。
【００２９】
本明細書において使用される「薬学的に許容され得る」という用語は、化合物が生理学的に認容され得るものであり、被験体への投与時にアレルギー反応および望ましくない類似反応（例えば、胃障害、めまいなど）を一般に引き起こさないという事実を指す；前記「薬学的に許容され得る」という用語は、好ましくは、政府の規制官庁によって承認されていること、または米国薬局方もしくは別の一般に認められている動物用薬局方（例えば、欧州薬局方など）に記載されていることを意味する。
【００３０】
本明細書において使用される「薬学的に許容され得る塩」という用語は、「薬学的に許容され得る金属塩」および「薬学的に許容され得るアミン塩」を含む。「薬学的に許容され得る金属塩」という用語は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、アルミニウムイオン、鉄イオンまたは亜鉛イオンと形成された塩を意図する。「薬学的に許容され得るアミン塩」という用語は、カルボン酸と塩を形成するのに十分に強いアンモニア塩基および有機窒素塩基との塩を意図する。前記薬学的に許容され得る塩は、当業者に公知の通常の方法によって得られ得る。
【００３１】
本発明の化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の性質により、および分子のβ−ヒドロキシピラノン環の構造改変によって得られるシンバスタチンのメチル類似体であって、並外れたＨＭＧＣＲ阻害能力を有するメチル類似体が米国特許第６５４１５１１号に記載されていることを考慮すると、新たな化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、高いＨＭＧＣＲ阻害能力を示すと予想される。驚くべきことに、実施例２の図１に示されているように、結果は、いずれの化合物もＨＭＧＣＲを効率的に阻害することができなかったことを示している。実際、ＮＳＴ００７６が示した酵素阻害は、モナコリンＪと同程度であり、シンバスタチンのものよりもはるかに低く（約２８倍低い）、ＮＳＴ００７８は、前記酵素に対する阻害効果を示さなかった（シンバスタチンよりも約１，９００倍低い）。
【００３２】
コレステロール代謝に対する化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の効果を研究するために、本発明者らは、家族性高脂血症齧歯動物モデルを使用してインビボにおいて、コレステロールおよびコレステロール画分のレベルを減少させるそれらの能力を評価することを決定した。実施例２の図２に示されているように、主にＬＤＬ画分レベルにおいて血漿コレステロールレベルを減少させたシンバスタチンとは異なり、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、いかなるコレステロール低下作用も示さなかった。
【００３３】
続いて、前記化合物がコレステロール低下特性を有していなかった場合であっても、本発明者らは、インビボにおけるＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の神経保護効果を評価することを決定した。このために、本発明者らは、興奮毒性物質の投与を使用して神経損傷を誘導し、動物において痙攣発作および癲癇を引き起こした。このため、本発明者らは、本発明の化合物が、興奮毒性物質によって引き起こされる損傷に対する抗癲癇効果および抗痙攣効果を示したかを分析することを決定し（実施例３、図３）、それらが、興奮毒性物質によって引き起こされる神経細胞死および神経炎症を防いだかをさらに決定したところ（図４および５）、驚くべきことに、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の投与が、痙攣発作、神経細胞死および関連の神経炎症を軽減し、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７よりも高い活性をさらに示したことを見出した。
【００３４】
前記化合物がＡＰＰ代謝に対して効果を及ぼしたかを実証するために、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、インビボにおいてＢＡＣＥ活性を改変することができたか否かを決定した。実施例４の図６および７は、マウスの脳内およびゼブラフィッシュの脳内の両方において、両化合物が、その投与２４時間後において、シンバスタチンまたはＮＳＴ００３７よりも高いＢＡＣＥ活性減少能力を有することを示しているため、ＡＰＰ代謝障害を伴う疾患、例えばＡＤにおいてそれらを使用し得る。
【００３５】
実施例５に記載されているように、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門（ＢＢＢ）通過を研究するために、様々なパラメータ（例えば、理論ＢＢＢ通過、通過の割合および有効透過率（図８））を分析した。受動拡散（ＰＡＭＰＡ法）によってＢＢＢ通過を決定するためのインビトロアッセイにおいて、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、シンバスタチンよりも驚くほど高いＢＢＢ通過を示した（シンバスタチンよりもそれぞれ１．５倍および１．７倍）。したがって、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のＬｏｇＢＢ（血漿と脳組織との間の化合物の分配係数）の値（それぞれ０．１９および０．２７）は、シンバスタチンのもの（０．１７）よりも大きく、これは、先のアッセイの結果を裏付けている。次いで、本発明者らは、図９、実施例５に示されているように、５０ｍｇ／ｋｇの化合物を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した１時間後、２時間後、４時間後および６時間後のマウスの脳内濃度を決定することによって、インビボにおける化合物の浸透度を研究することを決定した。化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、シンバスタチンよりも驚くほど高いＢＢＢ通過を示し、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のＡＵＣ値は、それぞれ３７および１７μｇ  ｈ／ｇであったのに対して、シンバスタチンについては１２μｇ  ｈ／ｇであった。加えて、本発明者らは、図１０、実施例５に示されているように、これら３つの化合物の血漿濃度を評価することを決定したところ、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、様々な時点において、シンバスタチンのものよりもはるかに高い血漿レベルを示すことを観察し、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のＡＵＣ値は、それぞれ１２および１７μｇ  ｈ／ｍＬであったのに対して、シンバスタチンについては０．７μｇ  ｈ／ｍＬであった。
【００３６】
特定の実施形態において、Ｒは、メチルである。
【００３７】
特定の実施形態において、Ｒは、エチルである。
【００３８】
一実施形態において、Ｒ基が結合している炭素（ヒドロキシ−テトラヒドロピラノン環の５位）の立体配置は、Ｓである。
【００３９】
別の実施形態において、Ｒ基が結合している炭素（ヒドロキシ−テトラヒドロピラノン環の５位）の立体配置は、Ｒである。
【００４０】
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸形態、前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、該化合物またはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグまたは溶媒和物は、Ｒ基が結合している炭素原子（ヒドロキシ−テトラヒドロピラノン環の５位）におけるＲエピマーとＳエピマーとの混合物である。
【００４１】
一実施形態において、Ｒ基は、メチルであり、Ｒ基が結合している炭素の立体配置は、Ｓである。
【００４２】
一実施形態において、Ｒ基は、エチルであり、Ｒ基が結合している炭素の立体配置は、Ｓである。
【００４３】
一実施形態において、Ｒ基は、メチルであり、Ｒ基が結合している炭素の立体配置は、Ｒである。
【００４４】
一実施形態において、Ｒ基は、エチルであり、Ｒ基が結合している炭素の立体配置は、Ｒである。
【００４５】
本発明によって提供される医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得るアジュバント、ビヒクルまたは賦形剤と一緒に、本発明の化合物ＮＳＴ００７６および／もしくはＮＳＴ００７８、ならびに／またはそのヒドロキシ酸形態、ならびに／または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩、ならびに／または該化合物もしくはそのヒドロキシ酸形態の薬学的に許容され得るプロドラッグもしくは溶媒和物を含有し得る。
【００４６】
薬学的に許容され得る「塩、プロドラッグまたは溶媒和物」という用語は、レシピエントへの投与において、本発明に記載されている化合物を（直接的または間接的に）提供することができる任意の薬学的に許容され得る塩、溶媒和物または任意の他の化合物を指す。それにもかかわらず、薬学的に許容され得ない塩もまた、薬学的に許容され得る塩の調製に有用であり得るため、本発明の範囲内に含まれる。塩およびプロドラッグは、当技術分野において公知の方法によって調製され得る。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物またはそのヒドロキシ酸形態のプロドラッグである任意の化合物は、本発明の範囲内である。「プロドラッグ」という用語は、その最も広い意味において使用され、インビボにおいて本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。このような誘導体は当業者に明らかであり、本化合物の以下の誘導体：エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属スルホン酸塩エステル、カルバメートおよびアミドを含み得る。本発明の化合物は、結晶形態または遊離化合物または溶媒和物（例えば、水和物）であり得、いずれの形態も本発明の範囲内であることを意図する。溶媒化方法は、一般に当業者に公知である。特定の実施形態において、溶媒和物は、水和物である。
【００４８】
化合物ＮＳＴ００７６またはＮＳＴ００７８、またはそのヒドロキシ酸形態または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩を含有する医薬組成物は、選択された投与経路、例えば、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、局所、直腸経路などによる投与に適切な任意の医薬剤形に製剤化され得る。非限定的な例示として、本発明によって提供される医薬組成物は、経口経路によって投与される固体医薬剤形（例えば、顆粒剤、錠剤、カプセル剤など）、経口経路によって投与される液体医薬剤形（例えば、液剤、懸濁液、エマルションなど）、非経口経路によって投与される医薬剤形（例えば、液剤、懸濁液、エマルションなど）に製剤化され得る。このため、各場合において、選択された医薬剤形および投与経路に適切な薬学的に許容され得るビヒクルおよび賦形剤、例えば、固体医薬剤形の製剤化の場合には結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤などおよび液体医薬剤形の製剤化の場合には緩衝剤、界面活性剤などが選択されるであろう。前記ビヒクルおよび賦形剤は、薬学的に許容され得るおよび薬理学的に認容され得るものでなければならず、治療される被験体に対していかなる悪影響も発揮せずに製剤の他の成分と組み合わせることができるものでなければならない。前記ビヒクルおよび賦形剤ならびに前記有効成分の前記医薬剤形に関する情報は、Ｇａｌｅｎｉｃ  ｐｈａｒｍａｃｙ  ｔｒｅａｔｉｓｅｓに見られ得る。一般的な薬物の様々な医薬剤形の総説およびそれらの調製方法は、書籍“Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”（“ｂｙ  Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓに見られ得る。
【００４９】
本発明によって提供される医薬組成物は、治療有効量の化合物ＮＳＴ００７６および／もしくはＮＳＴ００７８、ならびに／またはそのヒドロキシ酸形態、ならびに／または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩を含んでなる。本明細書において使用される意味において、「治療有効量」という表現は、所望の効果をもたらすように計算された化合物量に関する。被験体に投与すべき化合物ＮＳＴ００７６および／もしくはＮＳＴ００７８、ならびに／またはそのヒドロキシ酸形態、ならびに／または前記ヒドロキシ酸の薬学的に許容され得る塩の用量は、多数の要因に応じて広範囲内に変化し得、その中でも、使用される化合物の特性、例えば、その生物学的半減期および活性、医薬組成物中の化合物の濃度、被験体の臨床像、病態の重症度、選択された医薬剤形などが挙げられる。本発明によって提供される医薬組成物は、予防目的もしくは治療目的により１日１回以上投与され得るか、またはあるいは他の投与レジメンが、必ずしも毎日ではないが、毎週にわたって正確な回数継続され得る。
【００５０】
所望により、本発明によって提供される医薬組成物の有効性を増加させるために、本発明によって提供される医薬組成物は、他の薬物、例えば、神経変性疾患もしくは神経疾患、認知障害、癲癇、癲癇発作もしくは痙攣、またはＡＰＰ代謝障害を伴う疾患の治療に有用な薬物と一緒に使用され得、それにより併用療法を行い得る。前記のさらなる薬物は、同じ医薬組成物の一部であり得るか、またはあるいは本発明によって提供される医薬組成物と同じ時点（同時投与）において、もしくは本発明によって提供される医薬組成物の投与に対して異なる時点（逐次投与）において投与するための別個の医薬組成物として提供され得る。
【００５１】
以下の実施例は本発明を例証するためのものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−８−（２−（（２Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エチル）−３，７−ジメチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−ナフタレン−１−イル２−エチルブタノエート（ＮＳＴ００７６）および（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−８−（２−（（２Ｒ，４Ｒ）−５−エチル−４−ヒドロキシ−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エチル）−３，７−ジメチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル２−エチルブタノエート（ＮＳＴ００７８）の合成
対応するハロゲン化アルキルを用いて、ロバスタチン誘導体（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−８−（２−（（２Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−テトラヒドロ−ピラン−２−イル）エチル）−３，７−ジメチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル２−エチルブタノエート（欧州特許出願公開第２２４１５６１号においてＮＳＴ００３７として特定されている）を直接アルキル化することによって、本発明の化合物（ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８として特定される）を調製した。
【００５３】
化合物ＮＳＴ００７６の調製
塩基としてＬｉＨＭＤＳのＴＨＦ溶液を使用して、ＭｅＩを用いてＮＳＴ００３７をアルキル化することにより、所望の生成物を収率２９％で生産した。
【化２】
2016520641.tif 000004
【００５４】
具体的には、実験段階を以下のように行った：無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に出発物質（０．４１０ｇ、０．９８０ｍｍｏｌ）を含有する溶液を−４０℃において冷却し、ＬｉＨＭＤＳ・ＴＨＦ（３．００ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を滴下する。反応混合物をこの温度において３０分間撹拌し、次いで、ＭｅＩ（０．０９０ｍＬ、１．４４ｍｍｏｌ）を追加する。得られたオレンジ色の溶液を−４０℃において２時間撹拌する。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）を追加し、相分離する。ＡｃＯＥｔ（２×１０ｍＬ）によって、水相を再抽出する。合わせた有機相を１０％ＨＣｌ溶液（１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）によって洗浄する。得られた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥し、ろ過し、濃縮する。得られた油状物質をシリカゲルクロマトグラフィー（４０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）によって精製して、クリーム状の固体を得、これを粉砕し、ヘキサン（２×１ｍＬ）によって洗浄し、０．０７７ｇの所望の生成物を得る（Ｒｆ＝０．６（５０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）、白色の固体、収率２９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：６．００（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９２−５．７２（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｄ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６０−４．３７（ｍ，１Ｈ），４．００−３．７７（ｍ，１Ｈ），２．７２−１．４３（ｍ，２２Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．０２−０．８１（ｍ，６Ｈ）．
【００５５】
化合物ＮＳＴ００７８の調製
塩基としてＬｉＨＭＤＳの無水ＴＨＦ溶液を使用して、ＥｔＩを用いてＮＳＴ００３７をアルキル化することにより、所望の生成物を収率１４％で生産した。
【化３】
2016520641.tif 000005
【００５６】
具体的には、実験段階を以下のように行った：無水ＴＨＦ（３４ｍＬ）中に出発物質（１．４０ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）を含有する溶液を−４０℃において冷却し、ＬｉＨＭＤＳ・ＴＨＦ（１０．１０ｍＬ、１０．１０ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を滴下する。反応混合物をこの温度において４０分間撹拌し、次いで、ＥｔＩ（０．３９７ｍＬ、５．０１ｍｍｏｌ）を追加する。得られたオレンジ色の溶液を−４０℃において２１時間撹拌する。Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を追加し、相分離する。ＡｃＯＥｔ（２×３０ｍＬ）によって、水相を再抽出する。合わせた有機相を１０％ＨＣｌ溶液（５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）によって洗浄する。得られた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥し、ろ過し、濃縮する。得られた油状物質を２回のシリカゲルクロマトグラフィー（１０〜６０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）および（７０％Ｅｔ２Ｏ／ヘキサン）によって精製して、０．１２５ｇの所望の生成物を得る（Ｒｆ＝０．６（５０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）、白色の固体、収率１４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）δ  ｐｐｍ：６．００（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８６−５．７３（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｄ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５５−４．４１（ｍ，１Ｈ），４．０６−３．９４（ｍ，１Ｈ），２．５４−１．１５（ｍ，２０Ｈ），１．１４−１．０１（ｍ，６Ｈ），０．９４−０．８０（ｍ，１０Ｈ）．
【００５７】
実施例２
化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のコレステロール低下作用の研究
２．１．シンバスタチンおよびモナコリンＪと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８によるインビトロにおける３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）の酵素活性の阻害
ヒドロキシ酸形態のＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８によるインビトロにおけるＨＭＧＣＲ酵素の阻害程度を研究した。これらの化合物の効果を参照スタチン（すなわち、同様にヒドロキシ酸形態のシンバスタチンおよびモナコリンＪ）のものと比較した。
【００５８】
反応中、ＨＭＧＣＲは、還元剤としてＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）、および基質として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を使用する。反応生成物として得られるメバロン酸は、コレステロール合成を継続する次の反応の基質として働く。研究対象の酵素反応は、以下のように図式化される：
ＨＭＧ−ＣｏＡ＋２・ＮＡＤＰＨ＋２・Ｈ＋→メバロン酸＋２・ＮＡＤＰ＋＋ＣｏＡＳＨ
【００５９】
このインビトロアッセイは、３４０ｎｍの吸光度の減少（これは、基質の存在下におけるＨＭＧＣＲの触媒サブユニットによるＮＡＤＰＨの酸化に相当する）の分光光度測定に基づく。このアッセイは、（ｉ）ブランク（酵素なし）；（ｉｉ）対照（試験化合物なし）；ならびに（ｉｉｉ）試験化合物：濃度４、１０、４０、１００、４００、８００、１０００、４０００、１００００、４００００および８００００ｎＭのシンバスタチン、モナコリンＪ、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８を含み、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中において活性化後に２回反復でアッセイする。簡潔に言えば、反応緩衝液（５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＫＣｌ、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ＝７．３）を含む９６ウェルプレート中において、アッセイを実施し、反応混合物中の試薬濃度は、０．２ｍＭ  ＨＭＧ−ＣｏＡ、３μＵ／ポイントＨＭＧＣＲおよび０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨである。分光光度計によって、３４０ｎｍおよび３７℃において、プレートを読む。反応開始２０分後に３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することによって、対照に対するＨＭＧＣＲ酵素活性の割合を計算し、Ｔｒｉｍｍｅｄ  Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（バージョン１．５）によって、ＩＣ５０（酵素活性の５０％を阻害する濃度）値を計算する。
【００６０】
驚くべきことに、図１に示されているように、結果は、ＩＣ５０＝２１±３ｎＭを示したシンバスタチンとは異なり、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８がＨＭＧＣＲ酵素を有意に阻害しないことを示しており［ＮＳＴ００７６はＩＣ５０＝６０３±１７７であるのに対して、ＮＳＴ００７８は、酵素を阻害することができなかった（ＩＣ５０約４０μＭ）］、したがって、ＮＳＴ００７６は、効力がシンバスタチンよりも約２８倍低く、モナコリンＪによって生じる効力と同程度であるのに対して、ＮＳＴ００７８は、いかなる阻害能力もほとんど示さない。
【００６１】
２．２．内因性（家族性）高コレステロール血症モデルにおけるＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のコレステロール低下作用
前述の点に関する結果に基づいて、本発明者らは、インビボにおける前記化合物のコレステロール低下能力を評価することを決定した。
【００６２】
このために、血液からのコレステロール排除障害（これは、血漿コレステロールの異常に高い増加を引き起こす）を示す成体雄性トランスジェニックＡｐｏＢ１００マウス（ｎ＝４〜５／群）（Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ  Ｌ，Ｖｅｎｉａｎｔ  Ｍ，Ｌａｔｖａｌａ  ＲＤ，Ｈｉｒａｎｏ  ＫＩ，Ｗｏｎ  ＷＢ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ：ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｎ  ａ  ｌｏｗ−ｆａｔ  ｃｈｏｗ  ｄｉｅｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８．４：９３４−９３８）を使用した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ａｃｔ．１９８６）のガイドラインに厳密にしたがって、実験を行った。各検疫期間の後、最大限の予防措置によって動物を処理して、接種および操作中の汚染可能性を最小限に抑えた。
【００６３】
化合物ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８およびシンバスタチンを１２．５ｍｇ／ｍＬで調製し、その懸濁液を得た。５０ｍｇ／ｋｇの化合物をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した。対照マウスには、同量のビヒクルを接種した。動物の処理前および処理１２時間後の空腹状態時に、血液を採取した。両方の場合において、血漿を得た後に、これを凍結した。酵素的方法および分光光度法によって、血漿総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロール濃度を定量した。コレステロールレベルおよびコレステロール画分レベル（ベースラインレベルおよび処理１２時間後）を決定した後、ベースラインレベルに対するその変化を計算し、結果を対照群に対する割合として示した。図２は、様々な処理群における様々なコレステロール画分の変化を示す。結果は、シンバスタチンのみが、基本的にはＬＤＬの減少によって媒介されるコレステロールの統計的に有意な減少をもたらすことを示している。一方、このモデルにおいて、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、いかなるコレステロール低下作用も示さなかった。
【００６４】
実施例３
マウスにおける興奮毒性物質の作用に対するＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の抗癲癇効果および神経保護効果
３．１．マウスにおける興奮毒性物質の急性投与によって引き起こされる癲癇に対するＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の保護効果
先の結果に基づいて、本発明者らは、カイニン酸などの興奮毒性物質の動物への投与（これは、一部の場合において、癲癇発作および痙攣を誘導する）によって誘導される神経細胞死モデルにおける様々な化合物の神経保護効果を研究することを決定した。さらに、カイニン酸の投与前におけるシンバスタチンによる前処理は、前記癲癇発作および痙攣の発生を予防することが実証されている（Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｃ，Ｔｅｒｃｅｒｏ  Ｉ，Ｐｉｎｅｄａ  Ａ，Ｂｕｒｇｏｓ  ＪＳ．Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｏｓｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｋａｉｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．２００１．２４：１６１−１７４）。その結果、本発明者らは、分子ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、シンバスタチンの場合に観察された抗癲癇特性を示したかを調査することを決定したが、それらは、インビボにおけるコレステロール低下作用、およびインビトロにおけるＨＭＧＣＲ阻害効果を示さなかった。
【００６５】
実験的プロセスに含まれるすべての動物は、１２週齢の雄性ＦＶＢ／ＮＲｊ系統マウスであった。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ａｃｔ．１９８６）のガイドラインに厳密にしたがって、実験を行った。各検疫期間の後、最大限の予防措置によって動物を処理して、接種および操作中の汚染可能性を最小限に抑えた。
【００６６】
動物を５つの群に分けた：ビヒクル群（ｎ＝９）、ビヒクル＋ＫＡ群（ｎ＝動物１０匹）；シンバスタチン＋ＫＡ群（ｎ＝動物１２匹）；ＮＳＴ００７６＋ＫＡ群（ｎ＝動物１０匹）；ＮＳＴ００７８＋ＫＡ群（ｎ＝動物１０匹）。すべての処理は、ビヒクル（すなわち、０．５％メチルセルロース食塩溶液）中において調製した。カイニン酸を投与する２４時間前および０．５時間前に、ビヒクルのみによって処理した対照群を除いて、用量３．１２５ｍｇ／ｋｇの各処理を異なる群のマウスに腹腔内接種した。ＰＢＳに溶解したカイニン酸１００μＬを用量２３ｍｇ／ｋｇで腹腔内接種した後、追跡調査のために、動物をエンクロージャ内において個別に飼育した。観察中、Ｒａｃｉｎｅスケールにしたがって、動物における最大癲癇レベルを接種後１２０分間（ｍ．ｐ．ｉ．）にわたって１０分ごとに記録した。観察の１２０分間を分割した異なる時間間隔において、各マウスの最大癲癇レベルを示し、得られた曲線下面積（ＡＵＣ）を各マウスについて決定した。結果は、ビヒクル＋ＫＡ群に対するＡＵＣの割合の平均±ＳＥＭである。
【００６７】
図３は、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８によるマウスの前処理が、シンバスタチンと比較して、癲癇レベルの大きな減少をもたらしたことを示しており、さらに、それは統計的に有意であり（＊ｐ値＜０．０５；スチューデントｔ検定）、前記化合物の抗癲癇能力を示している。
【００６８】
３．２．マウスの海馬における興奮毒性物質の急性投与によって引き起こされる神経細胞死に対するＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の保護効果
ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、興奮毒性物質によって引き起こされる癲癇症候群および痙攣に対して示した保護の結果に基づいて、本発明者らは、前記保護効果が、マウスの海馬におけるカイニン酸によって引き起こされる神経細胞死の減少に関連していたかを調査することを決定した。動物を６つの群に分けた：ビヒクル＋ＰＢＳ＋ＫＡ群（ｎ＝９）、ビヒクル＋ＫＡ＋ビヒクル群（ｎ＝動物２０匹）；シンバスタチン＋ＫＡ＋シンバスタチン群（ｎ＝動物１２匹）；ＮＳＴ００７６＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７６群（ｎ＝動物１０匹）；ＮＳＴ００７８＋ＫＡ＋ＮＳＴ００７８群（ｎ＝動物１０匹）；ＮＳＴ００３７＋ＫＡ＋ＮＳＴ００３７群。すべての処理は、ビヒクル（すなわち、０．５％メチルセルロース生理食塩水）中において調製した。カイニン酸を投与する２４時間前および０．５時間前に、ビヒクルのみによって処理した対照群を除いて、用量３．１２５ｍｇ／ｋｇの各処理を異なる群のマウスに腹腔内接種した。ＰＢＳに溶解したカイニン酸を用量２３ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射することによって、損傷を誘導した。ビヒクル＋ＰＢＳ＋ビヒクル群には、同量のＰＢＳを投与した。カイニン酸（投与１回／日）接種後３日間にわたって、処理を投与し続けた。すべての場合において、最終処理の翌日にマウスを屠殺し、その脳を摘出し、固定し、パラフィン包埋した。厚さ５μｍの冠状脳切片を調製し、海馬のニューロンを分析するためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。
【００６９】
ＫＡの投与を生き残らなかった動物（死亡した動物）の割合、アポトーシスニューロンまたは死ニューロンを示した動物（損傷動物）の割合、およびいかなる種類の損傷も有しない動物（損傷を有しない動物）の割合を、各群について決定した。図４に見られるように、カイニン酸の投与およびビヒクルによる処理は、動物の５０％の死亡、およびマウスの３５％において海馬ニューロン（基本的には、ＣＡ１領域、ＣＡ３領域および歯状回領域）の損傷をもたらし、動物の１５％は、いかなる損傷も有していなかった。対照的に、ビヒクルおよびＰＢＳによって処理したマウスは、いかなる損傷も示さなかった。一方、シンバスタチンによる処理は、ＫＡに関連する損傷をわずかに減少させ（マウスの２５％は、いかなる損傷も受けなかった）、ＮＳＴ００３７による処理は、前記損傷をさらにより減少させた（マウスの４１％は、いかなる損傷も示さなかった）。しかしながら、驚くべきことに、ＮＳＴ００７６による処理は、いかなる損傷も検出されないマウスの割合を並外れて増加させ（５０％）、特に、ＮＳＴ００７８による処理は、損傷を有しない動物の割合を６０％まで増加させた。これらの結果は、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７と比較した、分子ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のディファレンシャルな神経保護特性を実証している。
【００７０】
３．３．興奮毒性物質によって誘導される脳炎症に対するＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の保護効果
化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、カイニン酸によって引き起こされる神経細胞死に対して示した保護の結果に基づいて、本発明者らは、前記保護効果が反応性アストログリオーシスの減少に関連していたか、したがって、それらが誘導性神経炎症において役割を果たしていたかを調査することを決定した。
【００７１】
上記実験において得られた冠状脳切片に基づいて、生存動物におけるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の明視野免疫組織化学によって、アストログリオーシスを分析した。
【００７２】
各群について、０〜３の強度スケール（ゼロは、反応性アストログリアの欠如を示し、３は、最大反応性アストログリアを示す）によって、アストログリオーシスが拡散した程度（またはスコア）を決定した。図５に見られるように、ＫＡに対して最も感受性の脳領域（海馬、運動皮質、外側皮質および扁桃領域）において、カイニン酸の投与は、（ＫＡを投与しなかった）対照マウスと比較して統計的に有意に、反応性アストログリアの発生をもたらした。前記図はまた、投与した用量のシンバスタチンによる処理が、カイニン酸によって誘導されるアストログリオーシスの程度を軽減しなかったことを示している。しかしながら、すべての研究領域において、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は両方とも、カイニン酸によって誘導されるアストログリオーシスを防ぎ、ＮＳＴ００７８による処理の場合には、前記軽減は、運動皮質および外側皮質ならびに扁桃領域において統計的に有意であった。これらの結果は、神経保護特性を裏付けており、分子ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の抗炎症特性も示している。
【００７３】
実施例４
インビボにおけるβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性に対する阻害効果
４．１．５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した２４時間後における、シンバスタチンと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８による、マウスの脳内のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）酵素活性の阻害
神経細胞死に対する前記化合物の効果が実証されたので、本発明者らは、ＡＤに密接に関係する機構に対する前記分子の効果の可能性を評価することを決定し、具体的には、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）代謝障害のそれらによる調節を研究した。このため、野生型マウスの脳において、シンバスタチンと比較した、ＢＡＣＥに対するＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の効果を評価した。ＢＡＣＥは、ＡＰＰをプロセシングすることによって、脳内Ａβプラーク（ＡＤに特徴的な組織病理学的マーカー）を生成するので、ＡＤにおける重要な酵素である。
【００７４】
反応中、ＢＡＣＥ特異的な蛍光発生基質を、前記酵素が存在する脳ホモジネートと接触させることにより、放出される蛍光の測定によって酵素活性を定量することが可能になる。
【００７５】
０．５％メチルセルロース生理食塩水中において、研究対象の化合物を１２．５ｍｇ／ｍＬで調製し、それらの均一な懸濁液を得た。５０ｍｇ／ｋｇの化合物によって、または同量のビヒクルによって、４月齢の雌性ＦＶＢマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した（ｎ＝マウス６匹／群）。２４時間後に動物を屠殺し、脳を摘出し、−２０℃において凍結し、小脳を初回処置した。脳を２４時間凍結した後、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）により１／１００希釈することによって、それらをホモジナイズした。冷条件下において、サンプルを１０分間インキュベートして溶解し、１０，０００ｇにおいて１０分間遠心分離した後に抽出物を得た。次いで、酵素反応を行った。ブランク（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４）、陽性対照（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞抽出物）、および前記酵素の特異的阻害剤（１０μＭ）を含む対照（これらもすべて２回反復）に加えて、５０μＬのサンプルを平底９６ウェルプレートに２回反復でロードした。２０μＭ蛍光発生ＢＡＣＥ基質（Ｍｃａ−ＲＰＰＧＦＳＡＦＫ）５０μＬをサンプルおよび対照に追加した（ウェルの最終濃度は１０μＭであり、総反応容量は１００μＬである）。３７℃の暗所においてプレートを３時間インキュベートした後、励起波長３２０ｎｍおよび発光波長４０５ｎｍの蛍光を記録した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により測定したタンパク質の量によって、得られた任意単位の結果を正規化した。
【００７６】
図６は、シンバスタチンとは異なり、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８が、ＢＡＣＥ酵素活性を統計的に有意に減少させることができたことを示している。ＮＳＴ００７８による阻害は、インビトロにおいて特異的阻害剤が示したものと比較しても大きかった（対照に対して、ＢＡＣＥ活性の８５±４％）。
【００７７】
４．２．１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した２４時間後における、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７と比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８による、ゼブラフィッシュの脳内のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）酵素活性の阻害
マウスにおいて、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、ＢＡＣＥに対する阻害効果を示したので、本発明者らは、異なる動物種において前記効果を評価することを決定し、この目的のために、ゼブラフィッシュにおいて、アッセイを行った。このため、本発明者らは、野生型ゼブラフィッシュの脳において、シンバスタチンおよびＮＳＴ００３７と比較した、ＢＡＣＥに対する化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の効果を評価した。
【００７８】
０．５％メチルセルロース生理食塩水中において、動物の体重に応じて、研究対象の化合物を様々な濃度で調製し、それらの均一な懸濁液を得た。１００ｍｇ／ｋｇの化合物によって、または同量のビヒクルによって、２４月齢の雌性ゼブラフィッシュを腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した（ｎ＝フィッシュ８匹／群）。２４時間後に動物を屠殺し、脳を摘出し、−２０℃において凍結した。脳を２４時間凍結した後、５００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）によって、それらをホモジナイズした。冷条件下において、サンプルを１０分間インキュベートして溶解し、１０，０００ｇにおいて１０分間遠心分離した後に抽出物を得た。次いで、マウスの場合と同じように、酵素反応を行った。
【００７９】
図７は、化合物ＮＳＴ００７８が、対照に対して、ＢＡＣＥ酵素活性を統計的に有意に減少させることができたことを示している。しかしながら、シンバスタチンによって処理したフィッシュの脳において、この阻害効果は観察されなかった。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００７８が、ＢＡＣＥ酵素活性に対するシンバスタチンおよびＮＳＴ００３７の効果をどの程度改善するかを示している。
【００８０】
実施例５
シンバスタチンと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門通過の予測
５．１．インビトロアッセイにおける、シンバスタチンと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門通過
ヒトＢＢＢに存在するものに非常に類似する脳脂質の混合物を含むシステムによってＢＢＢを模倣するＰＡＭＰＡ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）アッセイ（Ｄｉ  Ｌ，Ｋｅｒｎｓ  ＥＨ，Ｆａｎ  Ｋ，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＯＪ，Ｃａｒｔｅｒ  ＧＴ．Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００３．３８（３）：２２３−２３２）によって、ヒドロキシ酸形態の化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８のインビトロにおける血液脳関門（ＢＢＢ）通過を研究した。これらの化合物の通過をシンバスタチンヒドロキシ酸のものと比較した。
【００８１】
化合物ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８およびシンバスタチンをアッセイし、ベラパミル（高い透過性を有する化合物）を陽性対照として使用し、テオフィリン（ＢＢＢを通過しない化合物）を陰性対照として使用した。
【００８２】
Ｐｅから得られた結果によれば、関門通過を以下のように分類し得る：
−Ｐｅ＞４×１０−６ｃｍ／秒：ＢＢＢ通過に関する透過性が高い
−Ｐｅ＜２×１０−６ｃｍ／秒：ＢＢＢ通過に関する透過性が低い
−Ｐｅ２−４×１０−６ｃｍ／秒：ＢＢＢ通過に関する透過性が不確定
【００８３】
図８に示されているように、得られた結果は、化合物ＮＳＴ００７６（Ｐｅ＝６．１２±０．９９×１０−６ｃｍ／秒およびＢＢＢ通過４７±６％）およびＮＳＴ００７８（Ｐｅ＝７．２８±２．２４×１０−６ｃｍ／秒およびＢＢＢ通過５３±１１％）が、驚くべきことに、インビトロにおいてシンバスタチン（Ｐｅ＝４．２±０．３×１０−６ｃｍ／秒およびＢＢＢ通過３５±２％）よりも大きなＢＢＢ透過性を示すことを示している。図８に示されているように、ＢＢＢを通過する対照（ベラパミル）、およびＢＢＢを通過しない対照（テオフィリン）の挙動は適切である。
【００８４】
５．２．インシリコ分析による、シンバスタチンと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の理論血液脳関門通過。
先の結果に基づいて、本発明者らは、Ｒｉｓｈｔｏｎ理論的アプローチ（Ｒｉｓｈｔｏｎ  ＧＭ，ＬａＢｏｎｔｅ  Ｋ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＪ，Ｋａｓｓａｍ  Ｋ，Ｋｏｌｏｖａｎｏｖ  Ｅ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｒｕｇｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．２００６：９（３）：３０３−３１３）を使用して、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門（ＢＢＢ）通過を研究することを決定した。
【００８５】
Ｒｉｓｈｔｏｎ式は、ｌｏｇＢＢ値（これは、血漿と脳組織との間の前記化合物の分配係数と定義される）を求めるために、ｃＬｏｇＰ（オクタノール／水分配係数）およびＰＳＡ（極性表面積）パラメータを考慮するので、理論関門通過を決定するためにこの式を使用した。化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の前記パラメータの計算は、それぞれ０．１９および０．２７であり、シンバスタチンのもの（０．１７）よりも驚くほど大きな値であったが、これは、３つの化合物が関門を理論上通過することを示しており（０〜０．５の値は、関門通過を示す）、化合物ＮＳＴ００７８は、最高の透過性を示している。
【００８６】
５．３．インビボにおける、シンバスタチンと比較した、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の血液脳関門通過
先の結果に基づいて、本発明者らは、マウスにおける投与後のＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８の脳内濃度を研究することを決定した。０．５％メチルセルロース生理食塩水中において、研究対象の化合物を１２．５ｍｇ／ｍＬで調製し、それらの均一な懸濁液を得た。５０ｍｇ／ｋｇの化合物によって、４月齢の雄性ＦＶＢマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した（ｎ＝マウス４〜８匹／群／時）。Ｅｕｔａｎａｘの注射によって処理した１時間後、２時間後、４時間後および６時間後に、動物を屠殺し、ＰＢＳによって灌流した後に、血液および脳を摘出した。血液から得られた血漿および脳全体を分析まで−２０℃において凍結した。酢酸エチルによって組織から前記化合物を抽出し、この後のＵＰＬＣ−ＭＳ定量のためにエタノールに再懸濁した。フルバスタチンを内部標準として使用した。
【００８７】
図９は、分析した様々な時点における様々なラクトン型化合物の脳内濃度を示しており、ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、シンバスタチンのものよりも驚くほど大きな（化合物ＮＳＴ００７６については、統計的に有意な）ＡＵＣおよびＣｍａｘ値を有している。加えて、同じマウス由来の血漿サンプルにおいて、ラクトン型の化合物ＮＳＴ００７６、ＮＳＴ００７８およびシンバスタチンの濃度を評価したところ、図１０に示されているように、化合物ＮＳＴ００７６およびＮＳＴ００７８は、シンバスタチンよりもかなり大きな血漿レベルを有することを観察した。
【図１】
2016520641.tif 000008
【図２】
2016520641.tif 000009
【図３】
2016520641.tif 000010
【図４】
2016520641.tif 000011
【図５】
2016520641.tif 000012
【図６】
2016520641.tif 000013
【図７】
2016520641.tif 000014
【図８】
2016520641.tif 000015
【図９】
2016520641.tif 000016
【図１０】
2016520641.tif 000017
【国際調査報告】
2016520641.tif 000018
2016520641.tif 000019
2016520641.tif 000020
2016520641.tif 000021
2016520641.tif 000022
2016520641.tif 000023