(57)【要約】本発明は、シリカ蒸着及び熱収縮によって誘導される自己皺形成（self-wrinkling）に基づいて、薄いポリマー膜上にシリカナノ構造体を作製する新規の方法を提供する。これらのマイクロスケール及びナノスケールの構造体によってシリカの特定の面積が大きく拡大されるため、シリカナノ膜を核酸の固相抽出に使用することができるようになった。発明的シリカナノ膜は核酸の精製及び単離に適しており、ＤＮＡの回収率及び完全性に関して、市販の粒子よりも優れた性能を示している。更に、シリカナノ膜は、その著しく拡大されたシリカの特定表面積のため、極めて高い核酸収容力を有している。使用方法及びシリカナノ膜を含むデバイスも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱収縮ポリマーコアを含み、二酸化ケイ素層によって被覆されるシリカナノ膜であって、前記二酸化ケイ素層は複数のマイクロスケールのシリカ皺及びナノスケールのシリカフレークを含むシリカナノ膜。
【請求項２】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、前記二酸化ケイ素層は約２ｎｍ〜約５００ｎｍの厚さを有するシリカナノ膜。
【請求項３】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、前記ポリマーコアは約５μｍ〜５ｍｍの収縮厚さを有するシリカナノ膜。
【請求項４】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、前記ポリマーコアは約５μｍ〜５００μｍの予め収縮した厚さを有するシリカナノ膜。
【請求項５】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、前記ポリマーコアは平面であるシリカナノ膜。
【請求項６】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、前記ポリマーコアは、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチル・メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、フッ素エチレンプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン及びフッ化ポリビニリデンから成る群より選択される熱可塑性材料であるシリカナノ膜。
【請求項７】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、該シリカナノ膜は正方形又は円形の形状であるシリカナノ膜。
【請求項８】
請求項１に記載のシリカナノ膜において、該シリカは誘導体化されるシリカナノ膜。
【請求項９】
請求項８に記載のシリカナノ膜において、該シリカは、アミノプロピル基、クロロプロピル基、オクタデシル基、オクチル基、第４級アンモニウム基、ジエチルアミノエチル基、スルホン酸基、フェニル基、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体又は酵素で誘導体化される、シリカナノ膜。
【請求項１０】
シリカナノ膜を生成する方法であって、
ａ） 元の大きさを有するポリマーフィルム又はコアに二酸化ケイ素層を蒸着するステップと、
ｂ）ａ）の組成物を十分な温度で十分な時間加熱し、前記ポリマーフィルム又はコアを収縮させるステップとを含み、
前記ポリマーフィルム又はコアの収縮により、シリカマイクロ構造体及び／又はナノ構造体が前記シリカナノ膜上の前記シリカ層の表面に生成される方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記ポリマーフィルム又はコアはその元の大きさの約０．１％〜約７５％に収縮する方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記ポリマーフィルム又はコアは平面である方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法において、前記ポリマーコアは約５μｍ〜５００μｍの予め収縮した厚さを有する方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、前記ポリマーコアは熱収縮性があり、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチル・メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素エチレンプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン及びフッ化ポリビニリデンから成る群より選択される熱可塑性材料である方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法において、前記二酸化ケイ素層は約２ｎｍ〜５００ｎｍの厚さを有する方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法において、前記二酸化ケイ素層を前記熱可塑性コア上に、化学蒸着、電気泳動析出、浸せきコーティング、物理的気相成長法、電子ビーム蒸着、スパッタリング、スピンコーティング、又は液相蒸着によって蒸着する方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、ステップｂ）において、前記組成物を華氏１００度〜５００度の温度で加熱する方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記温度は華氏２５０度である方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法において、ステップｂ）において、前記組成物を１０秒〜１０分間加熱する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記組成物を３分間加熱する方法。
【請求項２１】
請求項６に記載の方法において、シリカ構造体はマイクロスケールの皺及びナノスケールのフレークを含む方法。
【請求項２２】
試料から核酸を抽出する方法であって、
ａ）核酸を含む試料を取得するステップと、
ｂ）前記試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、
ｃ）前記試料内の前記核酸を前記シリカナノ膜に吸着させるステップと、
ｄ）前記シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、
ｅ）前記核酸を前記シリカナノ膜から脱着して、前記試料から単離、精製された核酸を取得するステップとを含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記試料は細胞又は組織からのものである方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、ステップａ）の前に、前記試料を溶解及び／又は消化溶液と接触させるステップを更に含み、続いて細胞デブリと溶解及び／又は消化成分を除去するための１回又は複数回の洗浄を行う方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法において、ステップａ）において、前記核酸をカオトロピック剤と接触させる方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法において、ステップｂ）において、前記試料を十分な量のシリカナノ膜と、水性アルコール溶液の存在下で接触させるステップを更に含む方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法において、ステップｄ）は２回以上の洗浄を含む方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法において、ステップｄ）は、続いて前記試料にデオキシリボヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼを添加して前記試料をＲＮＡ又はＤＮＡで濃縮するステップを更に含む方法。
【請求項２９】
請求項２２に記載の方法において、ステップｄ）の後に乾燥ステップを更に含む方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法において、ステップｅ）において、前記シリカナノ膜からの前記核酸の蒸着は、溶出溶液を適用して行う方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法において、前記核酸はＤＮＡである方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の方法において、前記核酸はＲＮＡである方法。
【請求項３３】
請求項２２に記載の方法において、前記核酸はプラスミド、ゲノム、ミトコンドリア、小胞又は無細胞源からのものである方法。
【請求項３４】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から核酸を抽出する方法であって、
ａ）核酸を含むＦＦＰＥ試料を取得するステップと、
ｂ）前記試料を脱パラフィンするステップと、
ｃ）前記試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、
ｄ）前記試料内の前記核酸を前記シリカナノ膜に吸着させるステップと、
ｅ）前記シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、
ｆ）前記核酸を前記シリカナノ膜から脱着して、前記試料から単離、精製された核酸を取得するステップとを含む方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記試料は細胞又は組織からのものである方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法において、前記脱パラフィンステップｂ）は前記試料を有機溶剤と接触させるステップを含む方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記有機溶剤は、キシレン、鉱油、ヘキサデカン、トルエン、５‐クロロ−２‐メチル−４‐イソチアゾリン−３オン、テルペン又はイソパラフィン系炭化水素及び２−ブトキシエタノールを含む方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法において、ステップｂ）は前記有機溶剤を除去し、前記試料を洗浄するステップを更に含む方法。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法において、ステップｃ）の前に、前記試料を溶解及び／又は消化溶液と接触させるステップを更に含み、続いて細胞デブリと溶解及び／又は消化成分を除去するために、１回又は複数回の洗浄を行う方法。
【請求項４０】
請求項３４に記載の方法において、ステップｃ）において、前記核酸をカオトロピック剤と接触させる方法。
【請求項４１】
請求項３４に記載の方法において、ステップｃ）において、前記試料を十分な量のシリカナノ膜と、水性アルコール溶液の存在下で接触させるステップを更に含む方法。
【請求項４２】
請求項３４に記載の方法において、ステップｅ）は２回以上の洗浄を含む方法。
【請求項４３】
請求項３４に記載の方法において、ステップｅ）は次に前記試料にデオキシリボヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼを添加して、前記試料をＲＮＡ又はＤＮＡで濃縮するステップを含む方法。
【請求項４４】
請求項３４に記載の方法において、ステップｅ）の後に乾燥ステップを更に含む方法。
【請求項４５】
請求項３４に記載の方法において、ステップｆ）において、前記シリカナノ膜からの前記核酸の蒸着は、溶出溶液を適用して行う方法。
【請求項４６】
請求項３４に記載の方法において、前記核酸はＤＮＡである方法。
【請求項４７】
請求項３４に記載の方法において、前記核酸はＲＮＡである方法。
【請求項４８】
請求項３４に記載の方法において、前記核酸はプラスミド、ゲノム、ミトコンドリア、小胞又は無細胞源からのものである方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの開口を有し、液体又は組織試料を保持することができる装置を有する、試料から核酸を抽出するためのデバイスであって、前記装置内に１つ又は複数のシリカナノ膜を更に含むデバイス。
【請求項５０】
請求項４９に記載のデバイスにおいて、前記装置は閉鎖部又は蓋を有する容器であるデバイス。
【請求項５１】
請求項４９に記載のデバイスにおいて、前記装置はチューブであるデバイス。
【請求項５２】
請求項４９に記載のデバイスにおいて、前記容器内の前記１つ又は複数のシリカナノ膜は前記装置の内部に固定されるデバイス。
【請求項５３】
１つ又は複数のシリカナノ膜と、試料からＤＮＡ又はＲＮＡの何れかの単離又は精製における前記シリカナノ膜の使用説明書とを含むキット。
【請求項５４】
請求項４９に記載の装置と、試料からＤＮＡ又はＲＮＡの何れかの単離又は精製における前記シリカナノ膜の使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は２０１３年８月５日に出願された、米国仮特許出願第61/862,319号の利益を主張するものであり、これを本明細書に明記する全ての目的のために、本明細書に参照として援用する。
【政府の利益に関する表明】
【０００２】
本発明は国立衛生研究所によって付与された助成金第CA155305号及び第CA151838号のもと、政府の支援によってなされた。政府は本発明の一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
核酸分析の根本的な問題は試料調製である。調査する試料は、大抵、その後の単離及び分析を妨げ、干渉する、部分的に不溶性の成分（デブリとして知られる）を有する細胞又は組織を含んでいる。このような不溶性成分は、具体的に、糞／便、血液、疣贅、石灰化構造体（骨）又はかなり壊死の進んだ組織試料から核酸を単離する場合に発生する。しかしながらデブリは、広い意味で、例えば、著しく過多に存在し、核酸の単離中に除去される、赤血球から放出されるヘモグロビンなどの可溶性成分も含み得る。
【背景技術】
【０００４】
細胞、組織、植物、細菌、ウイルス粒子、血液、血清又は血漿などの試料から核酸を単離することは、下流遺伝子解析にとって重要なステップである。従来、フェノール／クロロホルム沈殿などの液相抽出技術が広く用いられている。これらの手法によって高品質の核酸が生成されるが、これらの手法は多くの時間と労力を要し、技師に依存するところが大きい。固相抽出技術は人気のある代替法である。これは大抵、大量の試料を処理する場合に選択される方法である。一般的に用いられる固相基板には、核酸結合に大きな表面積を提供するシリカスピンカラムとシリカ磁性粒子がある。しかしながら、これらの多孔質母材及びマイクロ／ナノ粒子では、流れと粒子とが混合してＤＮＡのせん断を誘発し、ＤＮＡの完全性が低減される。
【０００５】
ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded（ＦＦＰＥ））試料の分子解析は、試料調製の進歩を必要とする別の領域である。高まる分子バイオマーカーの必要性及び実証された潜在的利点にもかかわらず、それらを患者の診断及び管理に日常的に用いるのは困難であることがわかっている。その１つの理由として、現場で急速冷凍された組織試料を入手し、迅速に処理、保存し、そして搬送する物流的な課題がある。標準的な病院の組織処理には、 ホルムアルデヒド固定と、その後のパラフィンブロックへの包埋、そしてその後のブロックの薄切り及び染色によるＦＦＰＥ試料の生成が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらのＦＦＰＥ試料を分子解析のために利用できるのであれば、現在の医療行為に革命を起こす可能性がある。そして病院の病理部門で入手されるＦＦＰＥブロックは、標準的な形態的解析及び組織学的分析に加えて、新しい分子法を用いて日常的に分析することができるようになるだろう。更に、ＦＦＰＥ試料は、大抵、病院の病理部門で何年もの間保存されるので、遡及的分子評価も行なわれるだろうし、研究者達は既知の臨床転帰を使用して、大規模コホートで分子疫学的研究を行なうことができるようになる。分子病理学的アッセイをこれらのＦＦＰＥ試料で使用できるように考案され、適合させた、新しい技術が必要である。
【０００７】
しかしながら、ＦＦＰＥ保存は、元来、分子情報を保存するというよりは、むしろ形態学的及び組織学的特徴を安定させるように構成されているので、その中に含まれるＤＮＡ／ＲＮＡはしばしばＦＦＰＥ保存プロセス、酸化、劣悪な保存条件（すなわち、室温での長期間の保存）によって断片化してしまう。更にＦＦＰＥ組織は汚染ホルマリン及びパラフィンろう、並びに下流分析を阻止し得る、重度に架橋されたＤＮＡ／ＲＮＲを含む。
【０００８】
このように、ＦＦＰＥ試料を含む臨床試料から核酸をより簡単に単離及び精製することを可能にする、新規の分離材料及び方法を開発するという、まだ満たされていない要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、「ナノバインド（Nanobind）」と命名した、新規に、且つ安価に作製される階層的シリカナノ膜に基づく、新しいＤＮＡ／ＲＮＡ抽出方法を開発した。ナノバインドはマイクロスケールの皺及びナノスケールのシリカフレークの階層的トポグラフィを含むポリマー基板である。ＤＮＡ／ＲＮＡを断片化するせん断力を与えるビーズ及びカラムと異なり、無孔のナノバインド基板は断片化せずにＤＮＡ／ＲＮＡを結合、解放し、ビーズやカラム（例えば磁石、高速遠心分離、又は管移送のない）よりも簡単なプロセスで、至適基準であるフェノール−クロロホルム抽出に匹敵するＤＮＡ／ＲＮＡ完全性（＞４８ｋｂｐ）を達成することができる。更にナノバインドはビーズ及び／又はカラムを用いる既知の方法よりも、少なくとも５〜３０倍大きな結合能力を有する。アッセイで使用する出発物質を増やすと、 損傷を受けたＦＦＰＥのＤＮＡ／ＲＮＡにおける有害作用を埋め合わせることが可能であると知られている。このように、ＤＮＡの高い完全性を達成するナノバインドの能力は、その高い抽出効率と、一度の抽出に非常に多くの組織を充填させる能力と相まって、分子のアッセイの感度及び再現性を大幅に高めることができる（すなわちよりＤＮＡ／ＲＮＡの品質が高まる）。
【００１０】
一実施形態によれば、本発明は、熱収縮ポリマーコアを含み、二酸化ケイ素層で被覆されたシリカナノ膜を提供し、二酸化ケイ素層は複数のマイクロスケールの皺とナノスケールのシリカフレークとを含む。
【００１１】
別の実施形態によれば、本発明はシリカナノ膜を生成する方法を提供し、この方法は以下のステップ、すなわち、ａ）元のサイズを有するポリマーフィルム又はコアに二酸化ケイ素層を蒸着するステップと、ｂ）ａ）の組成物を十分な温度で十分な時間加熱し、ポリマーフィルム又はコアを収縮させるステップとを含み、ポリマーフィルム又はコアの収縮によって、シリカナノ膜上のシリカ層の表面に、シリカマイクロ構造体及び／又はナノ構造体を生成する。
【００１２】
更なる実施形態によれば、本発明は試料から核酸を抽出する方法を提供し、この方法は以下のステップ、すなわち、ａ）核酸を含む試料を取得するステップと、ｂ）試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、ｃ）試料内の核酸をシリカナノ膜に吸着させるステップと、ｄ）シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、ｅ）核酸をシリカナノ膜から脱着し、試料から単離され、精製された核酸を取得するステップとを含む。
【００１３】
一実施形態によれば、本発明はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から核酸を抽出する方法を提供し、この方法は以下のステップ、すなわち、ａ）核酸を含むＦＦＰＥ試料を取得するステップと、ｂ）試料を脱パラフィンするステップと、ｃ）試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、ｄ）試料内の核酸をシリカナノ膜に吸着させるステップと、ｅ）シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、ｆ）核酸をシリカナノ膜から脱着し、試料から単離され、精製された核酸を取得するステップとを含む。
【００１４】
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも一つの開口を有する装置を含む、試料から核酸を抽出するデバイスを提供し、該装置は液体または組織試料を保持することができ、該デバイスは更に、該装置内に１つ又は複数のシリカナノ膜を備える。
【００１５】
一実施形態によれば、本発明は、１つ又は複数のシリカナノ膜と、ＤＮＡ又はＲＮＡの試料からの単離又は精製におけるシリカナノ膜の使用に関する指示とを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のシリカナノ膜の一実施形態による調製を示す概略図である。簡単かつ安価な熱可塑性プロセスを用いて、高収率、高純度、及び高完全性のＤＮＡを抽出するための、ナノスケールトポグラフィを有する、無孔で、硬質のシリカ膜を生成する。
【図２】種々のシリカナノ膜表面のＳＥＭ画像であり、ナノスケールフレークによって覆われたマイクロスケール皺の階層的な表面トポグラフィは、蒸着酸化物の厚さに依存することを示している。２ｍｍのシリカ層では、膜は表面から僅かに隆起するマイクロ皺を呈した（図２Ａｌ）。ナノ構造体に覆われずに滑らかである（図２Ａ２）。２０ｎｍでは、マイクロ皺が高く成長し、より密集している（図２Ｂ１）。綿密な観察により、ナノ皺がマイクロ皺上に現れ始め、第２の階層的構造体を形成することが明らかとなった（図２Ｂ２）。一方、５０ｎｍでは、マイクロ皺を覆うナノ皺に沿ったナノフレークが観察される（図２Ｃ１及び図２Ｃ２）。シリカ層厚が１００ｎｍになると、数十ナノメートルからマイクロメートルの大量のシリカフレークが出現する（図２Ｄ１及び図２Ｄ２）。これらのフレークは、シリカ層の厚さが増大するにつれてこれらのナノ皺に取って代わり始め、シリカ層の厚さが１５０ｎｍを超えると、完全にマイクロ皺に取って替わる（１５０ｎｍに関しては図２Ｅ１及び図２Ｅ２，２００ｎｍに関しては図２Ｆ１及び図２Ｆ２）。
【図３】本発明の一実施形態の略図である。シリカナノ膜基板（赤、キャップ）は、ＤＮＡの抽出の能率化と下流分析のために、ＰＣＲ（１．５ｍｌ）チューブに直接一体化させることができる。結合はチューブを反転及び回転させて行い、一方で溶離は、直立させ、低速スピンダウンによって行う。
【図４】２つの異なるベンダーの電磁ビーズ、２００ｎｍの酸化物のシリカナノ膜及び５ｎｍの酸化物のシリカナノ膜を用いて行なった、ＤＮＡ抽出の比較を示す。２００ｎｍの酸化物のナノ膜は、表面積が大きいため、一番高いＤＮＡ回収率を示している。市販の精製ヒトゲノムＤＮＡ４μｇを出発物質として使用した。
【図５】キアゲン（Qiagen）のカラム、キアゲンのビーズ及び本発明のシリカナノ膜を用いて行なった抽出の比較を示し、シリカナノ膜は高いＤＮＡ結合能力があることを示している。約３−４×１０６の細胞を出発物質として使用した。この数の細胞は約２０〜２５μｇのＤＮＡを含んでいる。
【図６】本発明によるシリカナノ膜のＤＮＡ結合の直線性を示している。一実施形態において、６ｍｍのナノバインド片を用いて、初期投入された１００万〜２５００万の大腸がん細胞からＤＮＡを単離した。抽出されたＤＮＡの量は、この範囲にわたる投入細胞に対して直線的に変化し、２５００万の細胞でも膜はＤＮＡで飽和されるにはまだ至っていないことを示している。これは標準カラムが収容することのできるものの５〜３０倍である。
【図７】他の市販のＤＮＡ単離法よりも、シリカナノ膜の方がＤＮＡのせん断の少ないことを示している。フェノール−クロロホルム法によって取得されたコントロールＤＮＡと比較すると、磁性粒子（Ｐ１及びＰ２）を使って単離されたＤＮＡは、より小さな断片にせん断された。最大のＤＮＡせん断は、Ｐ２（直径約１００ｎｍ）粒子を使って単離されたＤＮＡで発生した。一方で、ＤＮＡシリカナノ膜を使って単離されたＤＮＡはコントロールＤＮＡに匹敵する完全性を保った。
【図８】本発明のシリカナノ膜を使って単離されたＤＮＡの完全性をフェノール−クロロホルム抽出と比較したものである。ゲル電気泳動により、シリカナノ膜によって抽出されたものは、フェノール−クロロホルム法によって抽出されたものと同等の、２３ｋｂを超える高い分子量のＤＮＡとなることが証明された。
【図９】磁性微粒子法を使ってＤＮＡをどのようにせん断することができるかを、本発明のシリカナノ膜による場合と比較した略図である。
【図１０】１００万〜２５００万の投入細胞から単離した核酸を、PicoGreen（登録商標）（ｘ軸）及び吸光度（ｙ軸）を用いて数値化したものである。測定値間の違いはＲＮＡ及びＤＮＡがどちらも共抽出されたことを示している。抽出された核酸の約６０％は、ＲＮＡから成る。
【図１１】本発明のシリカナノ膜を使って抽出されたＤＮＡがＰＣＲでの使用に適することを示すゲルである。ＰＣＲを、市販のゲノムＤＮＡと、ナノバインド及びフェノール−クロロホルムを使って抽出されたＤＮＡとで行なった。３つの試料は全て予想される１４８ｂｐのＧＡＰＤＨ対象の増幅に成功し、抽出の成功とＰＣＲの適合性とを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一実施形態によれば、本発明は、ポリマーコアを含む、二酸化ケイ素層で被覆されたシリカナノ膜を提供し、ポリマーコアは熱収縮され、二酸化ケイ素層は複数のマイクロ構造体及びナノ構造体を含んでいる。
【００１８】
本明細書で用いる「シリカナノ構造体」という用語は、ポリマーコア上のシリカの３次元配座を意味し、数十ナノメートルからマイクロメートルの大きさのマイクロ皺、ナノ皺、シリカフレークなどの構造体を含み得る。この例を図２に示す。
【００１９】
本明細書で用いる「シリカ」という用語は、二酸化ケイ素及び二酸化ケイ素誘導体、具体的にはＳｉＯ２結晶及びＳｉＯ２のその他の形態、例えば、ＳｉＯ２からなる珪藻、ゼオライト、非結晶二酸化ケイ素、ガラス粉末、ケイ酸、水ガラス及び珪酸アルミニウム及び活性珪酸を意味する。
【００２０】
本発明におけるシリカナノ膜上の階層的パターンは、シリカの蒸着された熱収縮性ポリマーフィルムの熱的に誘導された表面の皺に基づいている。金属薄膜で被覆された、予め延伸された軟質ポリマー基板を収縮又は膨張させることによって生じる表面の皺の使用は、ナノ材料作製のための１つの簡単かつ低コストの方法である。ポリマー基板と堅いフィルムとの間の異なる収縮又は膨張係数により、応力がフィルム内に蓄積され、最終的には表面に皺が自発的に生成される（図１）。
【００２１】
本明細書で用いる「ポリマー」という用語は、熱収縮することのできる任意のポリマー基板を意味する。いくつかの実施形態において、ポリマーは熱可塑性ポリマーである。本明細書で用いる「熱可塑性」という用語は、特定の温度を上回ると曲げやすく、又は成形しやすくなり、冷却すると固体に戻るポリマーである。熱可塑性物質には、例えば、ポリメチル・メタクリレート（polymethyl methacrylate（ＰＭＭＡ））、ポリカーボネート、ポリスチレン（polystyrene（ＰＳ））及び環状ポリオレフィン（polyolefin（ＰＯ））ポリマーなどのポリマーがある。
【００２２】
シリカナノ膜は、例えば、ポリメチル・メタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン（ＰＳ）及び環状ポリオレフィン（ＰＯ）ポリマーなどの予め延伸された熱可塑性物質を含む、最も一般的に使用されるポリマー基板を使って製造することができる。シリカは収縮可能なＰＯフィルム上に蒸着される。高温で培養した後、上述のメカニズム（図２）により、ポリマーフィルムは収縮し、シリカはナノ構造体を形成する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、シリカナノ膜のポリマーコアを環状ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチル・メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、フッ素エチレンプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン及びフッ化ポリビニリデンからなる群より選択する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、シリカナノ膜の二酸化ケイ素層は約２ｎｍ〜約５００ｎｍの厚さを有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、シリカナノ膜のポリマーコアは約５μｍ〜５ｍｍの収縮厚さを有する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、シリカナノ膜のポリマーコアは約５μｍ〜５００μｍの予め収縮した厚さを有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、シリカナノ膜を含むシリカは当該技術分野で知られる他の組成物又は成分で誘導体化される。いくつかの実施形態において、シリカはアミノプロピル基、クロロプロピル基、オクタデシル基、オクチル基、第４級アンモニウム基、ジエチルアミノエチル基、スルホン酸基、フェニル基、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体又は酵素で誘導体化され得る。
【００２８】
シリカナノ膜を生成するプロセスで形成される正確なナノ構造体は、蒸着される二酸化ケイ素の被覆又は層の厚さに依存する。シリカ層が厚くなると、シリカナノ膜の特定の表面積が大幅に増大し、付随してＤＮＡ結合能力も増大する。このように、本発明によるシリカナノ膜は市販のシリカカラム及び磁性粒子と比較して高いＤＮＡ回収率を有する。発明によるシリカナノ膜は、培養ヒト細胞からＤＮＡを高収率で抽出することができ、かつ、至適基準であるフェノール−クロロホルム法と同等の品質のＤＮＡを抽出することができる。
【００２９】
本発明によるシリカナノ膜は特定の目的に合う任意の形状に作製することができる。シリカナノ膜は平面、又はビーズ配座とすることができる。シリカナノ膜は円形、正方形又は特定の形状とすることができる。一実施形態において、シリカナノ膜は円形で、試験管に圧入することができる。代替実施形態において、シリカナノ膜はフロースルー分析用カラム若しくはピペットチップ、又は試料を保持することのできる任意の他の装置に圧入するように構成することができる。
【００３０】
一実施形態において、本発明はシリカナノ膜を生成する方法を提供し、この方法は、以下のステップ、すなわち、ａ）オリジナルサイズを有するポリマーフィルム又はコアに二酸化ケイ素層を蒸着するステップと、ｂ）ａ）の組成物を十分な温度で十分な時間加熱し、ポリマーフィルム又はコアを収縮させるステップとを含み、ポリマーフィルム又はコアの収縮によって、シリカナノ膜上のシリカ層の表面に、シリカマイクロ構造体及び／又はナノ構造体を生成する。
【００３１】
シリカナノ膜は、簡単で安価な、発明的な熱可塑性プロセスを使って作製する。いくつかの実施形態において、任意の既知の蒸着方法により、約２ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の二酸化ケイ素を５μｍ〜約５００μｍの厚さのポリオレフィンフィルムに蒸着する。蒸着方法の例として、化学蒸着、電気泳動析出、浸せきコーティング、物理的気相成長法、電子ビーム蒸着、スパッタリング、スピンコーティング、又は液相蒸着があるが、これらに限定されない。
【００３２】
その後、シリカ被覆ポリオレフィンフィルムを、ポリマーを収縮させるのに十分な温度で、オーブン内で加熱して収縮させる。温度は使用するポリマーの種類及びポリマーの開始厚さに応じて変化させることができる。赤外線ヒーター、ヒートガン又は抵抗加熱要素などの任意の加熱手段を使用することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ポリマーを華氏１００度〜華氏５００度の温度で加熱する。一実施形態において、ポリマーを華氏２５０度で加熱する。
【００３４】
収縮プロセスの加熱時間も使用するポリマーの種類及びポリマーの開始厚さに応じて変化させることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ポリマーを１０秒〜１０分加熱する。一実施形態において、ポリマーを３分加熱する。
【００３６】
ポリマーの熱収縮によってフィルムの面積は９５％超収縮し、一方で厚さは増大し、ナノスケールのフレークによって覆われた、マイクロスケール襞の階層的な構造体が生成される。その後シリカナノ膜は種々の用途のため、必要に応じて、種々の形状又はサイズに作製することができる。
【００３７】
一実施形態において、シリカナノ膜は種々の直径の円に打ち抜くことができる。一実施形態において、６ｍｍ径の片を使用することができ、これは一般的な１．５ｍｌチューブに圧入させることができ、各々１５０μｇ超のＤＮＡに結合させることができる。予備実験では、シリカナノ膜は少なくとも１ヶ月にわたって安定していた（データは示さず）。
【００３８】
当業者であれば、本発明によるシリカナノ膜は、異なる用途に応じて種々の形状に鋳造又は作製することができると理解するであろう。一実施形態において、シリカナノ膜はパンチを使って任意の径の平面状の円形に作製することができる。いくつかの実施形態において、直径は種々の試験管、細胞培養管、プレート又は皿に合うような大きさにすることができる。図３に示す様に、一実施形態において、６ｍｍの円状のシリカナノ膜を１．５ｍｌチューブのキャップに圧入し、核酸の分離に使用することができる。これらのチューブは予め作製することができ、例えば、試料調製及び浄化用の試薬と共に、使用説明書を含むキットとして利用することができる。
【００３９】
当業者であれば、例えば、カラムフォーマットにおけるシリカナノ膜の他の使用を想像し得る。例えば、別の実施形態において、種々の径のガラス又はプラスチックの毛細管を、核酸抽出の連続的なフロー方法のために、その内面をシリカナノ膜で被覆してもよい。
【００４０】
別の実施形態によれば、シリカナノ膜で外面を被覆したビーズを製造することができる。これらのビーズは連続フロー法のために、円状又は柱状で管内に設置することができる。
【００４１】
更に別の実施形態によれば、シリカナノ膜はマイクロ流体デバイスで使用することができる。マイクロ流体デバイスは、特定の実施形態において、内部にシリカ膜の埋め込まれたマイクロ流体経路を備えた装置である。シリカナノ膜はデバイスの空間的に定義された場所に取り付けることができる。
【００４２】
更に別の実施形態によれば、シリカナノ膜をチップフォーマットで使用することができる。チップは、特定の実施形態において、複数の個別のシリカナノ膜領域を有する固体基板を含む装置である。シリカナノ膜は基板上の空間的に定義されたアドレスに取り付けることができる。
【００４３】
シリカナノ膜は当業者に明らかな種々のやり方でチップに取り付けることができる。シリカナノ膜は最初に合成して、次にチップへ接着するか、又はチップに直接合成することができる。
【００４４】
チップの固体基板はシリカナノ膜の接着又は会合のための個別の部位を含むように修飾することのできる材料であってもよく、少なくとも１つの検出法のために修正することができる。基板の代表的な例には、ガラス及び修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンなどを含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコン及び修飾シリコンを含む石英系材料、炭素、金属、無機ガラス並びにプラスチックがある。基板は感知できるほどの蛍光を発さない光検出を可能にする。
【００４５】
基板は平らであるが、他の形状の基板も使用することができる。又、基板は特定のプラスチックで生成された独立気泡発泡体を含む軟質発泡体のような、軟質なものであってもよい。
【００４６】
上述の様に、チップ及びシリカナノ膜は、次にこれらを接着するために、化学官能基によって誘導体化してもよい。 例えば、チップは、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基又はチオール基を含むが、これらに限定されない化学官能基で誘導体化してもよい。これらの官能基を使用して、シリカナノ膜をシリカナノ膜に直接、又はリンカーによって間接的に接着してもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ポリマーフィルム又はコアは、熱収縮されると、その元のサイズの約０．１％〜約７５％に収縮する。
【００４８】
一実施形態によれば、本発明は試料から核酸を抽出するステップを提供し、このステップは、以下、すなわち、ａ）核酸を含む試料を取得するステップと、ｂ）試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、ｃ）試料内の核酸をシリカナノ膜に吸着させるステップと、ｄ）シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、ｅ）核酸をシリカナノ膜から脱着し、試料から単離され、精製された核酸を取得するステップとを含む。
【００４９】
本明細書で用いる「試料」又は「生体試料」という用語は、細胞又は細胞物質、特に細胞、凍結細胞ペレット、固定細胞、糞／便、軟膜（すなわち、血液細胞分画）、腹水、スワブ、特に口腔粘膜、咽頭又は子宮頚部スワブ、唾液、臓器穿刺液、精液、組織試料、固定組織試料、固定又は非固定組織試料の組織切片、特に凍結切片及びパラフィン切片、特にホルマリン固定パラフィン切片、採取した腫瘍、生検標本、血液試料、特に全血又は血液分画、細胞懸濁液、及び広い意味で細胞成分要素を含む全ての試料を含む任意の試料を指し、無傷細胞及び細胞成分がどちらも含まれる。更に、この用語はまた、例えば、血清又は血漿、特にウイルスを含む血清又は血漿、ＨＩＶ及びＨＣＶに感染した血清試料、分泌物、ＣＳＦ、胆汁、リンパ液、尿などの、その他の核酸含有生体物質も含む。同様に、生化学又はバイオテクノロジープロセスから生じて精製される核酸含有物質でもあり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明によるシリカナノ膜を使って核酸を抽出する方法は、ステップａ）の前に試料を溶解液及び／又は消化液と接触させるステップを含み、次に細胞デブリと溶解及び／又は消化成分とを除去するための１つ又は複数の洗浄ステップがくる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明によるシリカナノ膜を使って核酸を抽出する方法は、ステップａ）において、核酸をカオトロピック剤と接触させるステップを含む。これによって核酸のナノ膜上のシリカマイクロ構造体及びナノ構造体への吸着又は結合が促進される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明によるシリカナノ膜を使って核酸を抽出する方法は、ステップｂ）において、アルコール水溶液の存在下において、試料を十分な量のシリカナノ膜に接触させるステップを更に含む。アルコール水溶液が試料内の別の細胞又は組織成分からの核酸の沈殿を促進させることは周知である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明によるシリカナノ膜を使って核酸を抽出する方法は、例えばステップｄ）において、２つ、３つ又はそれ以上の洗浄ステップを含む。これらの洗浄ステップには、核酸の単離及び精製に適することで知られる緩衝液、アルコール又はその他の試薬が含まれる。
【００５４】
ＤＮＡの精製に関して、好適には、生体学的に有効な量のリボヌクレアーゼを試料に添加し、そうすることによってＲＮＡを消化し、無傷のＤＮＡを試料から単離することができる。リボヌクレアーゼ消化は、一番早くて溶解後と、一番遅くて精製の最後の溶出後との、抽出中の異なる時間に行なうことができる。しかしながら好適には、ＤＮＡの検出は共精製されたＲＮＡの存在下で行なう、すなわち、リボヌクレアーゼのステップを削除し、又は緩衝液条件を用い、ＲＮＡを排除することによって、ＤＮＡの選択的な単離が可能になる。
【００５５】
ＲＮＡの単離に関しては、好適には、生物学的に有効な量のデオキシリボヌクレアーゼを試料に添加する。そうすることによってＤＮＡは「消化され」、溶液になり、一方で消化されないＲＮＡを溶液から単離することができる。デオキシリボヌクレアーゼ消化は一番早くて溶解後と、一番遅くて精製の最後の溶出後との、抽出中の異なる時間に行なうことができる。
【００５６】
本発明による方法は、試料を特定のタイプの核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡで濃縮するために用いることができる。例えば、ステップｄ）でデオキシリボヌクレアーゼを添加して試料内の核酸からＤＮＡを除去し、試料をＲＮＡで濃縮することができる。同様に、当業者はステップｄ）でリボヌクレアーゼを試料に添加して試料内の核酸からＲＮＡを取り除き、試料をＤＮＡで濃縮することができる。
【００５７】
本発明による方法は、試料を特定の種類の核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は長鎖核酸若しくは短鎖核酸で濃縮するために用いることができる。例えば、結合ステップｃ）及び洗浄ステップｄ）中、緩衝液内のアルコールの割合を、特定の種の好適な結合及び溶出がもたらされるよう、溶解性の調整に使用することができる。塩も、比溶解度を調整することにより、特定の種類の核酸を好適に抽出するために使用することができる
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明によるシリカナノ膜を使って核酸を抽出する方法は、ステップｄ）の後に乾燥ステップを含む。
【００５９】
当業者であれば、本発明によるシリカナノ膜に結合又は吸着される核酸が、当技術分野で知られる任意の溶出溶液を使用することにより、ナノ膜から脱着され得ることを理解するだろう。典型的な溶出溶液は、例えば、（０．５Ｍ）酢酸アンモニウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム及び１ｍＭのＥＤＴＡの混合物を含む緩衝液であり得る。別の典型的な溶出溶液は、例えば、１０ｍＭトリス系及び１ｍＭのＥＤＴＡの混合物を含む緩衝液であり得る。更に別の典型的な溶出溶液は水であり得る。
【００６０】
別の実施形態によれば、本発明はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から核酸を抽出する方法を提供し、この方法は以下のステップ、すなわち、ａ）核酸を含むＦＦＰＥ試料を取得するステップと、ｂ）試料を脱パラフィンするステップと、ｃ）試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、ｄ）試料内の核酸をシリカナノ膜に吸着させるステップと、ｅ）シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、ｆ）核酸をシリカナノ膜から脱着し、試料から単離され、精製された核酸を取得するステップとを含む。
【００６１】
ＦＦＰＥ試料から核酸を抽出する方法は、上述の非ＦＦＰＥ試料検出方法に記載したものと同じ基本原理を有すると理解されよう。基本的な違いは、脱パラフィンステップが加わることである。ＦＦＰＥ試料の脱パラフィンは当技術分野で知られている。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＦＦＰＥ試料の脱パラフィンは、試料を有機溶剤と接触させてパラフィンを溶解するステップを含む。有機溶剤の適切な例には、キシレン、ヘキサデカン、トルエン、５‐クロロ−２‐メチル−４‐イソチアゾリン−３オン、テルペン又はイソパラフィン系炭化水素及び２−ブトキシエタノールが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、パラフィンを溶解するために試料を加熱し、または加熱せずに、鉱油を使用してもよい。代替実施形態において、ＦＦＰＥ試料の脱パラフィンは有機溶剤を使用せず、試料のみを加熱して行なうこともできる。緩衝液を試料に添加して十分な時間試料を加熱してパラフィンを融解し、加熱しながら試料を遠心分離させてもよい。融解したパラフィンは上昇して固まる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、脱パラフィンステップ後、本方法は、有機溶剤を除去して試料を洗浄するステップを含む。本方法の残りの部分は、本明細書に記載する非ＦＦＰＥ試料の方法と同様に進めることができる。
【００６４】
本明細書で用いる「核酸」には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」が含まれ、一般にはＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これは単鎖又は二本鎖、合成また天然源から得られたもの（例えば単離及び／又は精製）であり、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含み得、又、天然、非天然又は、改変ヌクレオチド間結合があり、これは無修飾のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見つかるリン酸ジエステルではなく、例えば、ホスホロアミド酸結合又はホスホロチオエート結合である。一般に好適には、核酸は挿入、欠失、反転、及び／又は置換を含まない。しかしながら、場合によっては、本明細書に記載する様に、核酸は１つ又は複数の挿入、欠失、反転、及び／又は置換を含むのが適切であろう。
【００６５】
一実施形態において、本発明の核酸は組み換え体である。本明細書で用いる「組み換え体」という用語は、（ｉ）天然又は合成核酸セグメントを生体細胞内で複製できる核酸分子に結合させることによって生体細胞外に構成することのできる分子、又は、（ｉｉ）上述の（ｉ）に記載されるものの複製から生じる分子である。本明細書の目的において、複製は生体外複製又は生体内複製である。
【００６６】
本発明の実施形態において単離された核酸は、当技術分野で知られる手順を用いて、化学合成及び／又は酵素連結反応手順に基づいて構成することができる。例えば、Sambrook氏等による（eds.）、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York （２００１）及びAusubel氏等による、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY（１９９４）を参照されたい。例えば、核酸は自然発生したヌクレオチド、又は分子の生体安定性の増大、又は交雑（例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）によって形成された二重鎖の物理的安定性の増大のために構成された、種々に修飾されたヌクレオチドを使って化学合成することができる。核酸を生成するために使用することのできる修飾されたヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−イオドウラシル、ヒポキサチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２‐チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明による１つ又は複数の核酸は、Macromolecular Resources（コロラド州フォートコリンズ）及びSynthegen（テキサス州ヒューストン）などの会社から購入することができる。
【００６７】
本明細書で用いる「単離された、精製された」という用語は、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば、本発明によるシリカナノ膜を用いて細胞及びその他の汚染物質から分離された自然発生タンパク質と本質的に会合のない核酸を意味する。
【００６８】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して本明細書で用いる「同一な」又は「同一性」という用語は、配列が特定の領域に亘って同じ特定の割合の残基を有することを意味する。この割合は、２つの配列を最適に整列させ、これら２つの配列を特定の領域に亘って比較し、両方の配列で同一の残基が発生した場所の数を測定して一致した場所の数を出し、この一致した場所の数を特定の領域における場所の全数で割り、それを１００倍して同一性の割合を求める。２つの配列の長さが異なる場合や、又は整列によって１つ又は複数のすれた端部（staggered ends）が生じ、比較する特定の領域に単一の配列しか含まれない場合、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は等価と考えてもよい。同一性は手作業で行ってもよいし、又はＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使って行なってもよい。
【００６９】
本明細書で用いる「細胞」という用語は、原核細胞及び真核細胞の両方を指す。
【００７０】
本明細書で用いる「試料を溶解する」という用語は、試料中で細胞又は細胞構造体を割る（break open）ことを含む。これは具体的に機械的な溶解法（例えば超音波）、熱溶解（例えば凍結融解サイクル、試料の加熱）、及び化学溶解（例えば界面活性剤を用いた）を含んでいる。しかしながら、「試料を溶解する」という表現は細胞に限られず、非細胞生体構造体又は複合体から記載する方法によって核酸を放出することも指している。
【００７１】
「カオトロピック条件」という用語は、カオトロピック剤又は化合物の存在下における溶剤条件を指す。カオトロピック剤又は化合物は、１次構造を損なわずに、タンパク質、核酸、及びタンパク質と核酸の複合体の２次構造、３次構造、及び４次構造を変化させる、又は破壊する化合物である。溶液内では、カオトロピック条件において、生体分子、特にタンパク質、タンパク質と核酸の複合体及び核酸の分子内相互作用が破壊される、というのも、カオトロピック化合物は、例えば、水素結合、ファン・デル・ワールス力、及び疎水性効果などの生体分子内の分子内相互作用の安定性を阻害するからである。カオトロピック化合物は大抵大量のイオンを有し、これはその大きさのため、分子内相互作用を阻害し、その結果溶剤の極性が低減され、分子内及び分子間の水素結合が妨げられる。その結果、多くのタンパク質が沈殿する。しかしながら、二重鎖の核酸セグメントのらせん構造は維持される。カオトロピック化合物を細胞溶解物又は細胞浮遊液に添加することにより、タンパク質を沈殿させ、核酸を溶液中に残すことができる。カオトロピック条件下における、核酸の二酸化ケイ素系母材への結合は非常に好ましい。カオトロピック化合物は、例えば、高分子量の尿素溶液（例えば６〜８モル／Ｌ尿）、グアニジウム塩溶液（例えば６モル／Ｌ塩化グアニジウム）、高分子重量リチウム塩（例えば４．５モル／Ｌ過塩素酸リチウム）を含む。カオトロピックアニオンは、アニオンＦ−、ＰＯ４３−、ＳＯ４２−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｃｌ−、 特にＢｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＳＣＮ−及びＣｌ３ＣＣＯＯ−を含む。カオトロピックカチオンは、カチオンＬｉ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋及び特にグアニジウムカチオン［ＣＨ６Ｎ３］＋を含む。核酸単離に好適なカオトロピック化合物はグアニジウムイソチオシアン酸（［ＣＨ６Ｎ３］＋ＳＣＮ−）及び塩化グアニジウムである。
【００７２】
本明細書で用いる「分離」という用語は、単離の実際の対象ではない、すなわち実質的に核酸ではない生体又は化学物質あるいは成分をできる限り取り除くことを意味している。具体的には、これらの物質を分離することによって実際の結合、濃縮、精製、及びその後の対象分子検出中の干渉又は妨害を防ぐことができる。
【００７３】
本明細書で用いる「細胞デブリ」という用語は、核酸単離の主要な対象ではなく、精製又は負の選択ステップによって実際の対象分子から分離される全ての生体成分を意味している。細胞試料の溶解後、これには、具体的には、水溶液に溶けない、かつ溶解しにくい細胞成分が含まれ、例えば、壊死組織成分、骨又は石灰構造体、具体的には微小石灰化構造体、又、バースト赤血球若しくは形態的に変化した赤血球、いぼ様及びパピローマ様組織構造体、並びに複雑な溶解しにくい糖衣を有する特定のバクテリア（例えばマイコバクテリア）が含まれる。更に、タンパク質、膜成分、具体的には固定によって架橋される構造体が含まれる。個々の場合において、これは、しかしながら、上述の溶解プロセスによって放出され、分離される水溶性成分でもあり得る。例としてヘモグロビンがあり、これは、赤血球の（例えば低緊張緩衝液条件による）溶解後、大量に、そして核酸に対してモル過剰に放出され、体液試料を更に処理する前に単離される。
【００７４】
本明細書で用いる「磁性粒子」という用語は、有機及び無機の両方の磁性粒子を意味する。
【００７５】
「溶解緩衝液」という用語には、細胞、細胞系、細胞成分又はその他の生体複合体又は構造体に破壊を生じさせることのできる、少なくとも１つの物質を含む緩衝液が含まれる。これらの物質は、界面活性剤（Triton X-100, SDSなど）と、具体的にはプロテイナーゼＫなどの酵素試薬との群からとりわけよく選択される。また、水溶液、緩衝液又は非緩衝液（最も単純なケースとして水）の群から選択した試薬の使用も含まれる。溶解緩衝液において、１つ又は複数の成分を片方若しくは両方の群から組み合わせてもよいし、又は相互に組み合わせてもよい。
【００７６】
更なる実施形態によれば、本発明は試料から核酸を抽出するステップを提供し、このステップ以下のステップ、すなわち、ａ）核酸を含む試料を取得するステップと、ｂ）試料を十分な量のシリカナノ膜と接触させるステップと、ｃ）試料内の核酸をシリカナノ膜に吸着させるステップと、ｄ）シリカナノ膜を洗浄して非核酸成分を除去するステップと、ｅ）核酸をシリカナノ膜から脱着し、試料から単離され、精製された核酸を取得するステップとを含む。
【００７７】
シリカナノ膜によるＤＮＡの抽出
【００７８】
図３に示す様に、本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＡＬ（キアゲン、塩酸グアニジン溶液）などのカオトロピック緩衝液又は同様の緩衝液と、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼとを細胞に添加して、約５０〜６０℃で約１〜２時間培養する。グアニジン及びプロテイナーゼＫ緩衝液は細胞を溶解し、ＤＮＡは結合できるようになる。そしてエタノール又はイソプロパノールなどのアルコール溶液及びシリカナノ膜を添加してＤＮＡを沈殿させ、結合させる。この溶液を室温で１０分〜約１時間回転、培養して、ナノ膜の結合を生じさせる。液をピペットで取り出し、膜を洗浄緩衝液ＷＢ１及びＷＢ２（キアゲン、エタノールストリンジェンシー洗浄）、又はその他の任意の洗浄剤で２回洗浄する。次に膜を空気乾燥させ、残っているエタノールを除去する。最後に（キアゲン、ＴＥ緩衝液）などの溶出緩衝液を添加して７０℃で３０分〜約１時間培養し、シリカナノ膜からＤＮＡを溶出及び脱着する。こうすることによって完全性の高い、高収率、高純度のＤＮＡ抽出物の取得が可能となり、多くのＲＮＡがＤＮＡと共精製される。代替実施形態において、細胞を熱、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ及びＳＤＳなどの界面活性剤並びに塩酸グアニジンなどのカオトロープを使って溶解することができる。洗浄緩衝液を塩やタンパク質などの可溶汚染物質を洗い流すために使用することができる。洗浄緩衝液は、典型的には、エタノールを７０％含み、塩酸グアニジンなどのカオトロープ及び／又はＴｗｅｅｎなどの界面活性剤を含み、タンパク質を変性し、かつ洗い流すことができる。あるいはイソプロパノール洗浄液を使用してもよい。溶出緩衝液は、典型的には、ＴＥ緩衝液又はＤＩ水より成る。より高温でより長く溶出すると、抽出収率が高まる。
【００７９】
当業者であれば、明細書全体に亘って開示する、本発明によるシリカナノ膜を用いて核酸を単離する方法が、細胞デブリ及び溶解及び／又は消化成分を除去するために、ステップとステップとの間に更なる洗浄ステップを含むと理解されよう。
【００８０】
シリカナノ膜によるＦＦＰＥ ＤＮＡの抽出。
【００８１】
本発明によるＦＦＰＥ抽出方法の最初のステップは、脱パラフィン（すなわちパラフィンワックスの可溶化）を含む。いくつかの実施形態において、厚さ５〜１０μｍの厚いＦＦＰＥ組織のスライスを１．５ｍＬチューブに載置し、キシレンなどの有機溶剤を１ｍＬ添加する（Pathol. Res. Pract., 204, 633（２００８）; Methods Mol Biol 724, 161（２０１１））。そしてキシレンを除去し、試料ペレットを段階的エタノール溶液で洗浄してキシレンを完全に除去し、ＤＮＡを再水和する。別の実施形態において、脱パラフィン法は、キシレン濃度、培養回数及び洗浄プロトコルを変えることによって変化をもたせ、確実に全てのパラフィンが除去され、最後まで残るキシレンが最小限になるようにする。
【００８２】
そして細胞溶解は、プロテイナーゼＫ（New England Biolabs）及び６ＭグアニジンＨＣｌを含むｐＨ７．５のＴＥ緩衝液を脱パラフィンペレットに添加し、５５℃で約１時間培養することによって行なうことができる。プロテイナーゼＫは細胞を溶解して核酸を放出させ、一方でカオトロピック塩グアニジンＨＣｌはＤＮＡのシリカナノ膜基板への結合を可能にする。このステップ中に加熱することにより、ホルマリンによる架橋を逆転させることもできる。培養後、エタノールを試料に添加してＤＮＡを沈殿させ、膜への結合を容易にする。そして試料を７０％のエタノールで２回洗浄し、空気乾燥して残っているエタノールを取り除く。そして溶出緩衝液又は同様の手段を用いて核酸をシリカナノ膜から脱着する。
【００８３】
予備実験において、ＤＮＡとＲＮＡの共精製が得られた。ＲＮＡ汚染物質を取り除くために、溶解ステップの直後にリボヌクレアーゼＨ（New England Biolabs）を試料に添加してＲＮＡを消化させることができる。消化されたＲＮＡはナノバインド基板に結合せず、洗い流される。エタノールの割合は、大きな断片と小さな断片との異なる溶解性により、シリカと結合するＤＮＡ／ＲＮＡ断片のサイズに大きく影響する。結合及び洗浄緩衝液のエタノールの含有量を消化プロトコルにおいて変化させ、ＲＮＡが全て確実に除去されるようにする。
【００８４】
ＲＮＡ ＦＦＰＥ抽出方法
【００８５】
ＲＮＡの分解はＤＮＡの分解よりもかなり早く起こるので、アーカイブされたＦＦＰＥ試料はｍＲＮＡ発現プロファイリングに使用することのできる長いＲＮＡ分子を含む可能性は低いが、抽出してプロファイルすることのできるｍｉＲＮＡなどの無傷の小さなＲＮＡを含み得る。更に、診断用途のための新鮮冷凍試料の実行可能で安価な代替として、新鮮なＦＦＰＥ試料が考えられる。脱パラフィン、細胞溶解、及びＲＮＡ結合は、上述のＦＦＰＥ ＤＮＡ試料と同様に行なわれるが、基板リボヌクレアーゼ消化を行なうのではなく、デオキシリボヌクレアーゼＩ（New England Biolabs）消化をプロテイナーゼＫ消化の後に行なう。消化されたＤＮＡはエタノール系洗浄緩衝液によって運び去られる。エタノールの割合は、大きな断片と小さな断片とでは溶解性が異なるため、シリカと結合するＤＮＡ／ＲＮＡ断片のサイズに大きく影響する。デオキシリボヌクレアーゼ消化プロトコル（時間、温度など）及び結合、洗浄緩衝液のエタノールの含有量を変更して、消化されたＤＮＡが全部洗い流されるようにする。
【００８６】
ＦＦＰＥ組織におけるＤＮＡ及びＲＮＡのプロファイリング
【００８７】
ＰＣＲは分子解析手法のバックボーンを形成する。これらの方法は典型的に高い検出感度を有するが、ＰＣＲはバックグラウンド汚染に極めて敏感であり、高純度の出発物質を必要とする。シリカナノ膜を使ってＦＦＰＥ組織から単離されたＤＮＡ及びＲＮＡは、プロトタイプのエピジェネティック（後成的）アッセイと、例えば、メチル化特異的ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、及びＲＴ−ｑＰＣＲを含む、遺伝子プロファイリングアッセイとで使用することができる。
【００８８】
また、当業者は、本発明によるシリカナノ膜を用いた構成物、デバイス及び方法を、当技術分野で知られている核酸の単離、精製及び解析に役立つ他の解析技術と組み合わせることができると理解されよう。
【００８９】
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの開口を有し、液体又は組織試料を保持することができる装置を備える、試料から核酸を抽出するデバイスを提供し、デバイスは更に、装置内に１つ又は複数のシリカナノ膜を備える。 いくつかの実施形態において、デバイスは閉鎖部又は蓋を有する容器である。いくつかの実施形態において、デバイスは試験管又は１．５ｍｌの遠心分離管などのチューブである。本発明によるシリカナノ膜を含むチューブのサイズに制限はない。当業者であれば、シリカナノ膜をカラムなどの装置の内部に入れ、例えば内面に固定すると理解されよう。
【００９０】
一実施形態によれば、本発明は１つ又は複数のシリカナノ膜と、ＤＮＡ又はＲＮＡの試料からの単離又は精製におけるシリカナノ膜の使用説明書とを含むキットも提供する。このようなキットは、核酸単離及び精製を行なうのに必要なその他の試薬又は材料と共に容器内に設けてもよい。本発明によるキットはシリカナノ膜を含むデバイスや装置も含み得る。
【実施例】
【００９１】
シリカナノ膜の作製。本発明による実施形態におけるシリカナノ膜の作製手順の例を図１に示す。電子ビーム（Ｅビーム）物理蒸着を用い、シリカをＰＯフィルムの両側に、蒸着速度２Å／ｓで蒸着する。上述の様に、シリカは、スパッタリング、低圧化学蒸着、プラズマ化学気相成長法、電気化学法、ガラス上のスピンによるスピンコーティング及び液相蒸着によっても蒸着することができる。そしてシリカで被覆されたＰＯフィルムを華氏２５０度のオーブンで３分間ベーキングし、収縮、すなわち表面の皺を誘導する。熱誘導収縮によって、結果として生じたフィルムはその元のサイズの１０％以下に縮退し、その表面は階層的マイクロ及びナノ構造体を呈し、これを走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で検証する。
【００９２】
これらの表面を覆うシリカ階層的構造体は、図２に示す様に、蒸着されたシリカの厚さに応じてナノスケールからマイクロスケールへと変化する。２ｎｍのシリカ層では、膜は表面から僅かに隆起するマイクロ突起のみを呈する（図２Ａ１）。これらは表面を覆うナノ構造体なく、滑らかである（図２Ａ２）。厚さ２０ｎｍでは、シリカのマイクロ突起はより高く成長して高密度になる（図２Ｂ１）。綿密な観察により、シリカナノ皺が突起に出現し始め、第２の階層構造体を形成することが明らかとなった（図２Ｂ２）。５０ｎｍのシリカ層では、ナノチップがマイクロ突起を覆うナノ皺に沿って観察される（図２Ｃ１及び図２Ｃ２）。シリカ層が１００ｎｍになると、数十ナノメートルからマイクロメートルに亘る大量のシリカフレークが現れる（図２Ｄ１及び図２Ｄ２）。これらのフレークはシリカ層の厚さが増大するにつれてナノ皺に取って代わり始め、シリカの蒸着が１５０ｎｍを超えると完全にマイクロ突起に取って代わる（１５０ｎｍに関しては図２Ｅ１及び図２Ｅ２，２００ｎｍに関しては図２Ｆ１及び図２Ｆ２）。これらのナノフレークは相互に織り交ざってマイクロスケールの第２構造体を形成し、階層的パターンが残る。シリカ層が増大すると、より多くのナノフレークが現れ、そのマイクロスケールの第２構造体はどんどん良好に組織化され、全体的なシリカ表面積が大きくなる。
【００９３】
本発明によるナノ膜上の、ナノスケールからマイクロスケールの階層的シリカパターンは、シリカの特定表面積を大幅に拡大し、固相抽出用の新規の基板として、そのＤＮＡ吸収能力を高める。ＤＮＡ単離用固体基板としてのシリカナノ膜の効率を評価するために、ナノ膜を使って再単離したコントロールＤＮＡの回収率を市販の磁性シリカビーズによるものと比較した。
【００９４】
シリカナノ膜によるＤＮＡの単離。図３に示すものと類似した実施形態により、４μｇの市販のゲノムＤＮＡ投入を用い、２００ｎｍのシリカ層（図４）を有するナノ膜を使って約３．２μｇ（８０％）のＤＮＡを回収した。一方で、市販のシリカ電磁ビーズではほんの約０．８μｇ（２０％）しか回収できなかった。しかしながら、全てのナノ膜が匹敵する性能を持っているわけではない。同じ条件において、ほんの５ｎｍのシリカ層を有するナノ膜は実質的にＤＮＡの回収を呈さず、これは図２に示す様に、異なるシリカ厚から得られたナノ膜の表面構造の違いによって説明することができる。シリカの蒸着が厚くなると表面が粗くなり、特定表面積が大きくなり、ナノ膜上のＤＮＡ吸着能力が増大する。
【００９５】
本発明によるシリカナノ膜を用いて培養細胞でＤＮＡの抽出を行なった。約２×１０６の細胞から１１±４μｇのゲノムＤＮＡを抽出することができた。この収率は至適基準であるフェノール−クロロホルム法に匹敵するものである。発明のナノ膜を用いた培養細胞からのＤＮＡ収率も、スピンカラムやシリカ電磁ビーズなどの市販のキットを用いる方法と比較した。約３〜４×１０６の細胞を使用すると、約２１．２±２．６μｇのゲノムＤＮＡが本発明のナノ膜を用いて回収された。一方で、同じ条件下で、スピンカラムを用いて約９．０±２．９μｇのゲノムＤＮＡが、電磁ビーズを用いて１１．９±３．１μｇのゲノムＤＮＡが回収された（図５）。スピンカラム及び磁性粒子を用いたＤＮＡ収率は、本発明によるナノ膜を用いた場合のそれぞれ４２％及び５６％だった。
【００９６】
膜上の階層的マイクロ−及びナノ構造体は、ＤＮＡ吸収のためのシリカの全表面積を著しく拡大し、よって、そのＤＮＡ結合能力を高める。シリカナノ膜のＤＮＡ結合能力を評価するために、膜を約６ｍｍ径の小さな丸い片に切断し、１片を１．５ｍＬチューブで使用して、０．５×１０６〜２．５×１０７の範囲の異なる量の培養細胞からＤＮＡを抽出した。図６に示す様に、本発明によるシリカナノ膜は、培養細胞からＤＮＡを抽出するための固相基板として、広範な試料の量において、安定したＤＮＡ収率を呈した。ほんの２８ｍｍ２の面積を持つ６ｍｍ片のナノ膜は、１つの１．５ｍＬチューブで、２５００万の細胞から効率的にゲノムＤＮＡを回収することができた。これは、本発明によるシリカナノ膜が、その大幅に拡大されたシリカの表面積により、平方ミリメートル当たり６μｇのゲノムＤＮＡを捕捉することができることを示している。一方で、スピンカラム又は電磁ビーズを用いるほとんどの市販キットは、１つのチューブあたり最大で２×１０６細胞しか処理できなかった。図４の能力曲線がこのように高い入力で安定状態に達していないことを考えると、シリカナノ膜は１つのチューブで大量のＤＮＡを処理できる大きな可能性を持っている。
【００９７】
シリカナノ膜によって単離されたＤＮＡと磁性粒子による場合との比較。磁性粒子によって単離されたＤＮＡは機械的な応力によってしばしば小さな断片にせん断される。この現象は再単離されたＤＮＡをゲル電気泳動内に流すことによって観察される（図７）。フェノール−クロロホルム法によって得られたコントロールＤＮＡと比較すると、磁性粒子（Ｐ１及びＰ２）によって単離されたＤＮＡはより小さな断片にせん断されていた。Ｐ２（径約１００ｎｍ）を用いて単離されたＤＮＡは最も小さく(most significantly)せん断された。対照的に、本発明によるシリカナノ膜を用いて単離されたＤＮＡは高い完全性を保持した。シリカナノ膜を使って培養細胞から抽出されたＤＮＡの完全性もフェノール−クロロホルム法を用いて抽出されたＤＮＡとも比較した。ゲル電気泳動によれば、シリカナノ膜抽出は２３ｋｂを上回る高い分子量のＤＮＡをもたらし、これはフェノール−クロロホルム法によって抽出されたものに匹敵することを示している（図８）。
【００９８】
特定の理論に束縛されず、どうしてシリカナノ膜で単離されたＤＮＡ分子が完全性を保持し、一方で粒子によって単離されたものがせん断されるのかを説明すると、複数の粒子が１つの長いＤＮＡに結合するからではないかと考えられる（図９）。これらの粒子は独立して移動し、伸張し、最終的に長いＤＮＡ鎖を短い断片に分割してしまう。粒子が小さくなるとより多くの粒子が同じＤＮＡ鎖に結合されるようになり、より多くの破断点が生じ、更に小さな断片をもたらす。一方で、ＤＮＡ分子がシリカナノ膜に吸着されると、活性表面構造体はナノスケールであっても、ナノ膜の物理的な寸法はミリメートルである。その結果、長いＤＮＡ鎖が同じ平面の膜に結合することができ、それらが伸張して破断されるのを防ぐことができる。従って、ナノ膜を使って単離されたＤＮＡは完全性を保つことができるのである。
【００９９】
ＦＦＰＥ抽出法。結腸ポリープから採取した７μｍ厚さのＦＦＰＥスライスを約２０ヶ、１．５ｍＬチューブに載置し、キシレン／段階的エタノールを使って脱パラフィン化し、プロテイナーゼＫで溶解し、６ｍｍ片のシリカナノ膜を１つ用いてＤＮＡ抽出した。そして抽出したＤＮＡを洗浄してＴＥ緩衝液で溶出した。実験は繰り返して行なった。PicoGreen（登録商標）測定では、シリカナノ膜が２０１±２ｎｇのＤＮＡの単離に成功したことを示した。これによってシリカナノ膜が容易かつ高性能のＦＦＰＥ核酸抽出に完全に対応し、大きな可能性を持つことが実証された。予備実験では大量のＤＮＡ及びＲＮＡを単離する抽出ケミストリーを用いた。これは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む吸着測定によって得られた抽出収率と、ＤＮＡのみを含むPicoGreen測定を用いて得られたものとを比較すると明らかである（図１０）。これらの結果は抽出された核酸の約６０％がＲＮＡであることを示している。
【０１００】
シリカナノ膜を用いて抽出したＤＮＡのＰＣＲ分析。予備実験を行なってシリカナノ膜を用いて抽出したＤＮＡが汚染物質を含まず、ＰＣＲに適していることを検証した。ＰＣＲはプライマーを用いてヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の１４８ｂｐ領域を増幅して行った。シリカナノ膜を用いて卵巣がん細胞から単離したＤＮＡを、フェノールクロロホルム及び市販のヒトゲノムＤＮＡを用いて抽出したＤＮＡと比較した。何れの場合も予想される生成物はきれいに増幅され、シリカナノ膜がＰＣＲ阻害物質を含まない純粋なＤＮＡの単離に成功したことを示している（図１１）。
【０１０１】
本明細書に引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参照文献は、各参考文献が参照により援用されるように個別に、かつ具体的に示される場合と同じ程度まで、又、その全体が本明細書に記載される場合と同じ程度まで、本明細書に参照によって援用する。
【０１０２】
本発明（特に以下の請求項）の記載において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の用語並びに同様の言及の使用は、本明細書において特に断りのない限り、又は明らかに内容に矛盾しない限り、単数複数の両方をカバーすると解釈されよう。特に断りのない限り、「備える」、「有する」、「含む」及び「包含する」という用語は開放型用語として解釈される（すなわち、「含まれるが、これに限定されない」を意味する）。本明細書における数値範囲の記述は、本明細書において特に断りのない限り、単にその範囲内に該当する各値を個々に言及するための略記法としての使用のみを意図したものであり、各値は、個々に列挙されるかのように、明細書に組み込まれる。本明細書で使用される全ての方法は、本明細書中において特に断りのない限り、又は明らかに文脈と矛盾しない限り、あらゆる適切な順番で行なうことができる。本明細書で使用するあらゆる例または例示的な言い回し（例えば、「など」）は、特に主張しない限り、単に本発明をより良く説明することのみを意図したものであり、本発明の範囲に対して制限を設けるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠な、請求項に記載のない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【０１０３】
発明者に既知の本発明を実施するための最良の形態を含め、本発明の好適な実施形態について本明細書で説明する。これらの好ましい実施形態の変形は、上記説明を読めば当業者には明らかとなるだろう。発明者は熟練者が適宜このような変形を適用することを期待しており、発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されている方法意外の方法で実施されることを予想している。従って、本発明は準拠法によって許されている様に、本明細書に添付する請求項に記載の内容の全ての修正及び均等物を含む。更に、本明細書において特に断りのない限り、又、文脈と明らかに矛盾しない限り、全ての変形における上述の要素の任意の組み合わせも本発明に含まれる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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