(57)【要約】  本発明は、結腸癌の診断および処置のための新規な薬剤および方法を開示する。また、関連するアレイ、キットおよびスクリーニング方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において脳型クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）またはクレアチントランスポーターチャンネルＳＬＣ６ａ８（ＳＬＣ６ａ８）の発現レベルまたは活性を低下させることを有する、結腸癌の処置を必要とする患者の結腸癌の処置方法。
【請求項２】
前記低下段階が、患者にシクロクレアチンを投与することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者に別の治療剤を投与することをさらに有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記別の治療剤が、β−グアニジノプロピオン酸、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、カペシタビン、ゲムシタビン、セツキシマブ、タキソール、およびアバスチンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が転移性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
患者にβ−グアニジノプロピオン酸を投与することを有する癌を処置する必要のある患者の癌の処置方法であって、前記癌が、結腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、およびメラノーマからなる群より選択される一である、方法。
【請求項７】
患者においてｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを増加させることを有する、結腸癌の処置を必要とする患者の結腸癌の処置方法。
【請求項８】
前記癌が転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記増加段階が、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａをコードする核酸を患者に投与することによって行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが合成核酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がベクター内にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが、プラスミド、ウィルス、コスミド、および合成染色体(synthetic chromosome)からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウィルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはポックスウィルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者に別の治療剤を投与することをさらに有する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が、配列番号１〜１０のいずれか一の配列またはその補体(complement)を有する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
被検者からサンプルを得；
サンプルにおけるｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを測定し；さらに
前記発現レベルを所定の参考値と比較し、
前記発現レベルが前記所定値より低い場合には、前記被検者が転移性結腸癌を有する、または転移性結腸癌を有する危険性があると決定する、
ことを有する、被検者が転移性結腸癌を有する、または転移性結腸癌を有する危険性があることを決定する方法。
【請求項１８】
被検者からサンプルを得；
サンプルにおけるｍｉＲ＿４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを測定し；さらに
前記発現レベルを所定の参考値と比較し、前記発現レベルが前記所定値より低い場合には、前記被検者が転移性結腸癌を再発する、または転移性結腸癌を再発する危険性があると決定する、
ことを有する、被検者が転移性結腸癌を再発する、または転移性結腸癌を再発する危険性があることを決定する方法。
【請求項１９】
被検者からサンプルを得；
サンプルにおけるｍｉＲ＿４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを測定し；さらに
前記発現レベルを所定の参考値と比較し、
前記発現レベルが前記所定値より低い場合には、前記被検者が標的治療法の化学療法薬に対して耐性のある結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する、または前記結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する危険性があると決定する、
ことを有する、被検者が標的治療法の化学療法薬に対して耐性のある結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する、または前記結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する危険性があることを決定する方法。
【請求項２０】
前記所定の参考値は、転移性結腸癌を持たないコントロール被検者から得られる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルは、体液サンプルである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルは、腫瘍サンプルである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）複数の特有な位置を有する支持体ならびに（ｉｉ）各核酸は前記支持体の特有な位置に固定化される、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、またはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８をコードする遺伝子の発現産物に相補的な配列を有する少なくとも一の核酸のいずれかの組み合わせを含む、アレイ。
【請求項２４】
ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、またはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８をコードする遺伝子の発現産物に特異的に結合する試薬を含む、被検者の結腸癌の転移の可能性を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７２０，９１２号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８６，５００号の優先権を主張する。上記出願の内容は、全体を参考で本明細書中に引用される。
【０００２】
（連邦政府の利益）
本明細書に開示される発明は少なくとも一部が国立衛生研究所の認可番号１  ＤＰ２  ＯＤ００６５０６−０１に基づく政府の支援によりなされた。したがって、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、結腸癌の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
結腸癌は、一般的に結腸直腸癌(colorectal cancer)または大腸癌(bowel cancer)として知られているが、結腸もしくは直腸での、または虫垂での制御されない細胞増殖による癌である。例えば、Cancer Genome Atlas Network, "Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer," Nature 487: 330-337 (19 July 2012)を参照。米国では２番目に最も頻繁に診断される悪性腫瘍であり、２番目に最も一般的な癌による死亡原因である。例えば、初期の限局的な段階で検出された結腸直腸癌の患者の５年生存率は９２％であるが、癌が付近の器官やリンパ節に転移している場合には生存率が６４％まで低下し、さらに遠隔転移のある患者では７％にまで低下する。
【０００５】
結腸癌の予後は、腸壁を介した腫瘍の浸透度合いやリンパ節の転移のありなしに直接関連する。その結果、初期の検出および処置が重要である。現在、便の潜血、Ｓ状結腸鏡検査、結腸内視鏡検査、及び二重造影バリウム注腸(double contrast barium enemas)のスクリーニングアッセイを用いて診察が行われている。癌のタイプやステージによって決定される、治療計画としては、外科手術、放射線療法および／または化学療法がある。しかし、外科手術後（最も一般的な治療形態）の再発が主要な問題であり、しばしば最終的な死亡原因である。病気の治療が研究されているにもかかわらず、結腸癌は依然として診断及び処置が難しい。ゆえに、結腸癌を検出・処置するための新規な薬剤や方法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明は、結腸癌の診断および処置のための薬剤および方法を提供することによって上記必要性に対応する。
【０００７】
一つの態様では、本発明は、処置の必要な患者における結腸癌（例えば、転移性結腸癌）の処置方法を特徴とする。本方法は、患者においてｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを増加させることを有する。上記増加段階は、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａをコードする核酸を患者に投与することによって行われうる。上記核酸は、オリゴヌクレオチド、例えば、合成核酸であってもよい。上記核酸は、プラスミド、ウィルス、コスミド、人工染色体(artificial chromosome)、ならびに細菌および／またはウィルス源由来の他のベヒクルからなる群より選択されるものなどの、ベクター内にあってもよい。ウィルスの例としては、アデノ随伴ウイルス(Adeno-associated virus（ＡＡＶ）またはポックスウィルス(POX virs)がある。アデノ随伴ウイルス(Adeno-associated virus（ＡＡＶ）またはポックスウィルス(POX virs)は、活性、安定性、または特異性を向上させるように修飾されてもよい。例としては、核酸は、配列番号１〜１０のいずれか一の配列またはその補体(complement)を有する。本方法は、本明細書に開示されるような別の治療剤を患者に投与することをさらに有してもよい。
【０００８】
第二の態様では、本発明は、脳型クレアチンキナーゼ (Creatine Kinase Brain-type)（ＣＫＢ）またはクレアチントランスポーターチャンネル(creatine transporter channel)ＳＬＣ６ａ８（ＳＬＣ６ｓａ８）の発現を阻害できる単離されたＲＮＡ干渉(RNA interference)（ＲＮＡｉ）を提供する。上記薬剤は、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８タンパク質をコードする遺伝子の領域に相同的または相補的である第一の配列を有する。例としては、上記第一の配列としては、配列番号１１〜１８のいずれかの配列がある。
【０００９】
本発明はまた、上記ＲＮＡｉ剤をコードする配列を有する単離核酸および上記核酸を有するベクターを提供する。上記ベクターは、プラスミド、ウィルス、コスミド、人工染色体(artificial chromosome)、ならびに細菌および／またはウィルス源由来の他のベヒクルからなる群より選択されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは、ウィルスベクター、例えば、ＡＡＶウィルスベクターである。上記ＲＮＡｉ、核酸またはベクターを有する宿主細胞もまた提供される。（ａ）薬学的に許容される担体および（ｂ）上記ＲＮＡｉ、核酸またはベクターを含む薬剤組成物がさらに提供される。上記ＲＮＡｉ、核酸またはベクターは、効率的なデリバリーを目的として、他の薬剤、例えば、リポソーム化合物またはポリエチレンアミンと複合体を形成して(complexed with)いてもよい。一実施形態では、薬剤組成物は別の治療剤をさらに含む。
【００１０】
第三の態様では、本発明は、処置の必要な患者における結腸癌（例えば、転移性結腸癌）または膵臓癌などの、癌の処置方法を特徴とする。本方法は、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８）の発現レベルまたは活性を患者において低下させることを有する。上記低下段階は、患者に核酸、小分子化合物、または双方を投与することによって行われうる。一例では、上記低下段階は、患者にシクロクレアチン(cyclocreatine)またはβ−グアニジノプロピオン酸を投与することによって行われる。他の例では、上記低下は、患者に上記ＲＮＡｉ剤、核酸、およびベクターからなる群より選択される一の薬剤を投与することによって行われる。実施形態によっては、本方法は、β−グアニジノプロピオン酸などの、別の治療剤を患者に投与することをさらに有する。
【００１１】
本発明はまた、処置の必要な患者における結腸癌や膵臓癌などの癌の処置方法を特徴とする。本方法は、クレアチントランスポーターチャンネル(creatine transporter channel)ＳＬＣ６ａ８の阻害により患者においてクレアチンレベルを低下させることを有する。本方法は、患者にβ−グアニジノプロピオン酸、および必要であれば別の治療剤を投与することを有する。別の治療剤の例としては、上記シクロクレアチン、ＲＮＡｉ、核酸およびベクターからなる群より選択される一以上がある。別の治療剤のさらなる例としては、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、カペシタビン、ゲムシタビン、セツキシマブ、タキソール、アバスチン、ホリニン酸（ロイコボリン）、レゴラフェニブ(Regorafenib)、ザルトラップ(Zaltrap)、トポイソメラーゼＩインヒビター、ＮＫＴＲ−１０２、チバンチニブ(Tivantinib)、ＰＸ−８６６、ソラフェニブ(Sorafenib)、リニファニブ(Linifanib)、キナーゼインヒビター、テラチニブ(Telatinib)、ＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）、ロバツムマブ(Robatumumab)およびＩＧＦ１−Ｒインヒビターがある。
【００１２】
第四の態様では、本発明は、患者が転移性結腸癌を有する、または転移性結腸癌を有する危険性があることを決定する方法を提供する。本方法は、（ｉ）被検者からサンプルを得；（ｉｉ）サンプルにおけるｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを測定し；さらに（ｉｉ）前記発現レベルを所定の参考値と比較することを有する。前記発現レベルが前記所定の参考値より低い場合には、この被検者は、転移性結腸癌を有する、または転移性結腸癌を有する危険性があると決定される。上記所定の参考値は、転移性結腸癌を持たないコントロール被検者から得られてもよい。上記サンプルは、体液サンプルまたは生検腫瘍サンプルであってもよい。本方法はまた、被検者が転移性結腸癌を再発する、もしくは転移性結腸癌を再発する危険性があることを決定するために、または被検者が標的治療法の化学療法薬に対して耐性のある結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する、もしくは前記結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する危険性があることを決定するために使用されてもよい。より詳細には、発現レベルが所定の参考値より低い場合には、被検者は、転移性結腸癌の再発を、または標的治療法の化学療法薬に対して耐性のある結腸癌もしくは転移性結腸癌を有する、またはこのような危険性があると決定される。
【００１３】
第五の態様では、本発明は、（ｉ）複数の特有な位置を有する支持体ならびに（ｉｉ）ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、またはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８をコードする遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたは関連ｃＤＮＡ）に相補的な少なくとも一の核酸のいずれかの組み合わせを含む、アレイを提供する。例えば、核酸は、配列番号１〜１８の一つに相補的である、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするものであってもよい。各核酸は、上記支持体の特有な位置に固定化される。
【００１４】
本発明はまた、被検者の結腸癌の転移の可能性、転移性結腸癌の再発の可能性、転移性結腸癌が迅速に進行する可能性、または転移性結腸癌が化学療法薬に対して耐性を示す可能性を診断するためのキットを提供する。本キットは、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、またはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８をコードする遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチド）に特異的に結合する試薬を含む。上記薬剤は、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの配列に相補的な配列を有するプローブであってもよい。例えば、各プローブは、配列番号１〜１８の一つに相補的である、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするものであってもよい。本キットは、ハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイまたは上記アレイを実施するための試薬をさらに含んでいてもよい。
【００１５】
第六の態様では、本発明は、結腸癌を処置するのに、または癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するのに有用である化合物の同定方法を提供する。本方法は、（ｉ）ｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡを発現する試験細胞を得；（ｉｉ）前記試験細胞を試験化合物に接触させ；（ｉｉｉ）前記試験細胞における前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを測定し；（ｉｖ）前記発現レベルをコントロールレベルと比較し；さらに（ｖ）前記比較から発現レベルがコントロールレベルより高いことが示される場合には、前記化合物を、結腸癌を処置するのにまたは癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するのに有用である候補として選択することを有する。
【００１６】
本発明はまた、結腸癌を処置するのにまたは癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するのに有用である化合物の同定方法を提供する。本方法は、（ｉ）ＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８からなる群より選択される遺伝子のポリペプチドまたはｍＲＮＡを発現できる試験細胞を得；（ｉｉ）前記試験細胞を試験化合物に接触させ；（ｉｉｉ）前記試験細胞における前記遺伝子の発現レベルを測定し；（ｉｖ）前記発現レベルをコントロールレベルと比較し；さらに（ｖ）前記比較から発現レベルがコントロールレベルより低いことが示される場合には、前記化合物を、結腸癌を処置するのにまたは癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するのに有用である候補として選択することを有する。
【００１７】
上記方法において、コントロールレベルは、コントロール細胞を予め試験化合物に接触させなかった以外は試験細胞と同じであるコントロール細胞から得られてもよい。試験細胞は、結腸癌細胞系、例えば、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌系の細胞であってもよい。実施形態によっては、遺伝子の発現レベルは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、またはＬａｃＺをコードするもの)が上記ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、ＣＫＢ、またはＳＬＣ６ａ８をコードする遺伝子のプロモーターに操作により連結される(operably linked to)レポーター構築物を用いて測定されてもよい。
【００１８】
本発明はさらに、処置が必要な患者における乳癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、肝癌、胆嚢癌、前立腺癌、肉腫様癌、メラノーマ、または肺癌の処置方法を提供する。本方法は、特に、β−グアニジノプロピオン酸を患者に投与することを有する。
【００１９】
本発明の一以上の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は当該説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａ〜Ｅは、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−５５１ａおよびＣＫＢが臨床的に意義があり、治療のために阻害できることを示す一連の図および写真である。ａ：３７個の原発腫瘍サンプルおよび３０個の肝転移サンプルにおけるｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ(quantitative real-time PCR)を用いて定量した。ｂ：３７個の原発腫瘍サンプルおよび３０個の肝転移サンプルにおけるＣＫＢ発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ(quantitative real-time PCR)によって測定した。ｃ：ＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、細胞を注射してから１日後にｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａを２種発現するＡＡＶを単回投与して処置したマウスにおける肝転移。ｄ：５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、２週間の間毎日シクロクレアチンで処置したマウスにおける肝転移の生物発光測定結果(Bioluminescent measurements)。処置終了時に、マウスを安楽死させ、肝臓をエクスビボイメージングのために摘出した。ｅ：５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、２週間の間毎日クレアチントランスポーターインヒビターβ−グアニジノプロピオン酸（Ｂ−ＧＰＡ）で処置したマウスにおける肝転移の生物発光測定結果(Bioluminescent measurements)。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ；すべてのＰ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づく。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２】図２は、Ｂ−ＧＰＡ処置が結腸直腸癌転移を抑制したことを示す一連の図および写真である。５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、３週間の間毎日Ｂ−ＧＰＡで処置したマウスにおける肝転移の生物発光測定結果(Bioluminescent measurements)。マウスを３週間目に安楽死させ、肝臓を生物発光イメージング(bioluminescent imaging)および肉眼による組織観察(gross histology)用に取り出した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す；すべてのＰ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づく。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、クレアチントランスポーター、ＳＬＣ６ａ８が結腸直腸および膵臓癌転移に必要であることを示す一連の図および写真である。ａ）クレアチントランスポーターチャンネル、ＳＬＣ６ａ８を標的とするショートヘアピン(short hairpins)を発現する侵襲性の高いＬｖＭ３ｂ細胞(highly aggressive LvM3b cells)による肝転移。肝転移は生物発光イメージング(bioluminescent imaging)によってモニターし、癌細胞を接種してから３週間後にマウスを安楽死させた。肝臓を肉眼による組織観察(gross histology)のために摘出した。ｂ）ＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡを導入した５×１０５個のＳＷ４８０細胞を注射したマウスにおける肝転移。転移性進行を生物発光イメージング(bioluminescent imaging)によってモニターした。注射してから２８日間後にマウスを安楽死させ、肝臓を生物発光イメージング(bioluminescent imaging)および肉眼による組織観察(gross histology)のために摘出した。ｃ）ＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡを導入した５×１０５個のＰＡＮＣ１膵臓癌細胞を注射したマウスにおける肝転移。転移性進行を生物発光イメージング(bioluminescent imaging)によってモニターし、上記と同様にしてマウスを安楽死させた。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表わす；すべてのＰ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づく。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図４】図４は、ＳＬＣ６ａ８が原発腫瘍に比べて肝転移でアップレギュレートされることを示す図である。３６個の原発腫瘍および３０個の肝転移におけるＳＬＣ６ａ８の発現を定量的リアルタイムＰＣＲ(quantitative real-time PCR)によって定量した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す；すべてのＰ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づく。＊Ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、Ｂ−ＢＰＡ処置がインビボで肝臓の播種性ＰＡＮＣ１膵臓癌細胞の生存を抑制することを示す一連の図および写真である。４８時間１０ｍＭ  Ｂ−ＧＰＡで予め処置したまたは処置しない５×１０５個のＰＡＮＣ１細胞を注射した免疫不全マウスの生物発光イメージング(bioluminescent imaging)。マウスの画像を注射してから１日目に撮影し、シグナルを０日に正規化した(normalized to day zero)。Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づく。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、Ｂ−ＧＰＡがＰＡＮＣ１膵臓癌細胞へのゲムシタビンの細胞毒性を促進することを示す図である。高投与量の(escalating doses of)ゲムシタビン単独または高投与量の(escalating doses of)ゲムシタビンと１０ｍＭ  Ｂ−ＧＰＡとの組み合わせにより処置した後のＰＡＮＣ１膵臓癌細胞の細胞生存率(Cell viability)。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬を用いてアッセイした。エラーバーは標準誤差(standard error of the mean)を表わす。
【図７】図７は、Ｂ−ＧＰＡがＬＳ−ＬｖＭ３ｂ結腸直腸癌細胞への５’−フルオロウラシルの細胞毒性を促進することを示す図である。高投与量の(escalating doses of)５’−フルオロウラシル単独または高投与量の(escalating doses of)５’−フルオロウラシルと１０ｍＭ  Ｂ−ＧＰＡとの組み合わせにより処置した後のＬＳ−ＬｖＭ３ｂ細胞の細胞生存率(Cell viability)。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬を用いてアッセイした。エラーバーは標準誤差(standard error of the mean)を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、共同的なｍｉＲＮＡ−タンパク質ネットワーク(cooperative miRNA-protein network)が転移性結腸癌による肝転移増殖(liver colonization)で無秩序になる(deregulated)というおよびｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａが脳型クレアチンキナーゼ依存性エネルギー(brain creatine kinase dependent energetics)を共同して標的にすることによって結腸癌転移性の生存(metastatic survival)を抑制するという予想できない知見に基づく。したがって、本発明は、結腸癌、特に転移性結腸癌の診断および処置のための新規な薬剤および方法を提供する。
【００２２】
播種性癌細胞による器官の転移増殖(colonization)は、癌の進行の最終的で、最も臨床上重要で、かつ最も理解しにくいステージを表わす。肝臓は、多くの癌のタイプによるこのような転移増殖(metastatic colonization)で最も一般的な器官である。肝転移増殖の分子基盤を理解するために、結腸癌による肝転移増殖のインビボでの選択モデルを確立した。競合的な器官内インビボ選択(competitive intra-organ in-vivo selection)を低分子ＲＮＡプロファイリング(small-RNA profiling)と結び付けて、肝転移増殖中の６１１個のｍｉｃｒｏＲＮＡのインビボでの役割を並行して機能的に評価するため、これは強力なシステムである。本明細書で開示されるように、内因性のｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａは、多様な変異バックグラウンド(diverse mutational backgrounds)の複数の結腸癌集団による肝転移増殖の強力なサプレッサーとして同定された。これらのｍｉＲＮＡは、転移性細胞でおよびヒト肝転移で後成的にサイレンスであり(epigenetically silenced)、クレアチンキナーゼ、脳型（ＣＫＢ）を標的にすることによって転移を抑制する。
【００２３】
本明細書に開示されるように、ＣＫＢは、肝臓の低酸素(hepatic hypoxia)に遭遇すると−肝臓での播種性癌細胞の生存を促進することによって転移を促進する。結腸癌の生存は、肝臓の低酸素に耐えるのに必要なＡＴＰを生成するためのエネルギー貯蔵(energetic store)として作用する、クレアチンリン酸のＣＫＢ生成に依存する。これと一致するが、クレアチントランスポーターノックダウンにより癌細胞のクレアチン摂取を阻害しても、転移を低減する。アデノ随伴ウィルスデリバリー(adeno-associated viral delivery)によりｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１を治療のために投与すると、結腸癌の転移を劇的に抑制する。さらに、小分子インヒビターと共にＣＫＢを治療のために標的とすると、結腸癌の転移を有意に抑制する。これらの結果から、癌進行中の転移性の生存(metastatic survival)を維持する際の代謝エネルギー(metabolic energetics)の重要性が強調される。本明細書に開示される知見は、肝臓に選択的に転移増殖し、年間５００，０００人を超える人々の命を奪う、胃腸悪性腫瘍の処置に重要な意味を持つ。さらに、本明細書に開示されるインビボでのスクリーニング／選択方法は、いかなる癌のタイプによるいかなる器官の転移増殖を調節するコーディングおよび非コーディング遺伝子を包括的にかつ迅速に同定する可能性を有する。
【００２４】
本明細書に開示されるように、上記アプローチにより、ヒト転移系の結腸癌で無秩序である１セットのｍｉＲＮＡを同定した。本明細書に開示されるように、ｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａは、代謝関連遺伝子  脳型クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）の収束標的(convergent targeting)により結腸癌転移の強力な内因性のサプレッサーとして作用する。これらのｍｉＲＮＡは結腸癌転移性再発を発症する患者を同定する際の有意な予測能を発揮する一方で、これらのｍｉＲＮＡの治療のためのデリバリーにより結腸癌の転移を有意に抑制する。
【００２５】
本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ−タンパク質ネットワークのものは、転移性結腸癌を処置するためのターゲットとして使用できる。加えて、これらは、被検者が転移性結腸癌を有する、もしくは転移性結腸癌を有する危険性があるかどうかを決定するためのまた疾患を有する患者の予後もしくは監視を決定するためのバイオマーカーとして使用できる。したがって、本発明は、一以上の上記をターゲットとすることによる転移性結腸癌の処置方法、癌を阻害するための治療計画の有効性の決定方法、および抗癌剤の同定方法を包含する。また、被検者が転移性結腸癌を有する、または転移性結腸癌を有する危険性があるかどうかの診断方法、および疾患を発症する危険性があると考えられる被検者のスクリーニング方法が提供される。本発明はまた、上記方法を実施するのに適切な様々なキットを包含する。
【００２６】
処置方法
本明細書に開示されるように、ｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａは、結腸癌や他のタイプの癌で癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、または転移増殖(metastatic colonization)の内因性の転移サプレッサー(metastasis suppressors)として同定された一方で、ＣＫＢやクレアチントランスポーターチャンネルＳＬＣ６ａ８が同じプロセスの転移プロモーター(metastasis promoter)として機能する。これらのｍｉＲＮＡまたはタンパク質は、ヒトの転移による結果(metastatic outcome)を強力に予想するだけでなく、結腸癌や他のタイプの癌等の癌を処理するためのターゲットを提供する。
【００２７】
したがって、本発明は、１以上の転移サプレッサーの発現レベルまたは活性レベルを患者において増加することにより結腸癌や他のタイプの癌などの癌を処置するのにｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＣＫＢを標的とするＲＮＡｉ剤、ＳＬＣ６ａ８を標的とするＲＮＡｉ剤、このようなＲＮＡｉ剤をコードするベクター（例えば、ＡＡＶ）、シクロクレアチン、およびグアニジノプロピオン酸などの、関連薬剤を使用する方法を提供する。上記増加は、特に、１以上の転移サプレッサーを強制発現させることによって達成できる。加えて、上記処置は、１以上の転移プロモーター(metastasis promoter)の発現レベルまたは活性レベルを減少することによって達成できる。他のタイプの癌の例としては、固形腫瘍、特に上皮性悪性腫瘍(carcinomas)がある。固形腫瘍の例としては、以下に制限されないが、肺、胸部、骨、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、中皮メラノーマ(mesotheleoma melanomas)、骨髄腫、リンパ腫(lymphoma gliomas)、グリア芽腫、神経芽細胞腫、カポジ肉腫、および肉腫がある。特に、本発明の方法は、胃癌、食道癌、膵臓癌、肝臓癌、胆道癌、及び乳癌の処置に使用できる。
【００２８】
転移サプレッサーの強制発現(Forced Expression)
ｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａの双方ならびにこれらをコードする核酸を転移サプレッサーとして用いて、問題となる細胞または必要とする患者でのこれらの過剰発現により発明を実施してもよい。
【００２９】
「過剰発現」とは、ＲＮＡもしくはポリペプチドもしくはタンパク質が宿主細胞に正常に存在しない、またはＲＮＡもしくはポリペプチドが上記ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする内因性の遺伝子から正常に発現するのより高いレベルで当該宿主細胞に存在する、宿主細胞に導入される核酸によりコードされるＲＮＡまたはポリペプチドの発現を意味する。
【００３０】
すべての天然(naturally occurring)型の、遺伝子操作型のおよび化学合成された型の上記サプレッサーを用いて、本明細書に開示される発明を実施できる。上記サプレッサーを発現するために、本発明は、上記いずれかのサプレッサーをコードする核酸を提供する。好ましくは、ヌクレオチド配列を単離および／または精製する。核酸とは、ＤＮＡ分子（例えば、以下に制限されないが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子（例えば、以下に制限されないが、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成できる。上記核酸分子は、１本鎖であってもまたは２本鎖であってもよい。「単離された核酸」は、天然の核酸の構造とまたは天然のゲノム核酸のいずれかの断片の構造と同じでない構造を有する核酸である。したがって、このことばは、例えば、（ａ）天然のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが天然に存在する生物のゲノムの分子の上記部分に隣接する(flank)双方のコーディング配列には隣接しないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子が天然のベクターもしくはゲノムＤＮＡと同じでないようにベクターにまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに導入された核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造される断片、または制限断片などの別の分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、即ち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換ヌクレオチド配列を包含する。
【００３１】
「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」、及び「リボ核酸分子」ということばは、本明細書では同じ意味で使用され、リボヌクレオチドのポリマーを意味する。「ＤＮＡ」、または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」ということばは、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。ＤＮＡ及びＲＮＡは、（例えば、それぞれ、ＤＮＡの複製またはＤＮＡの転写によって）天然で合成されてもよい。ＲＮＡは、転写後に修飾されてもよい。また、ＤＮＡ及びＲＮＡは、化学的に合成されてもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡは、１本鎖（即ち、それぞれ、ｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）であってもまたはマルチストランド(multi-stranded)（例えば、２本鎖、即ち、それぞれ、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）であってもよい。
【００３２】
本発明はまた、本明細書に記載される１以上のヌクレオチド配列を有する組換構築物を提供する。当該構築物の例としては、本発明のヌクレオチド配列が順方向または逆方向に、予め挿入された、プラスミドまたはウィルスベクター等の、ベクターがある。好ましい実施形態では、上記構築物は、上記配列に操作により連結された(operably linked to)、プロモーター等の、調節配列をさらに有する。数多くの適当なベクター及びプロモーターが当業者には知られており、市販されている。また、原核生物や真核生物宿主と共に適当に使用されるクローニング及び発現ベクターは、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)に記載される。
【００３３】
発現ベクターの例としては、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、バクテリアプラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウィルス、フォールポックスウィルス、及び仮性狂犬病等のウィルスＤＮＡまたはこれらの誘導体がある。しかしながら、宿主で複製可能でありかつ生存可能である限り、他のベクターを使用してもよい。適当な核酸配列を様々な方法によってベクターに挿入してもよい。通常、上記サプレッサーの一つをコードする核酸配列を、当該分野において既知な方法によって適当な制限酵素部位に挿入してもよい。このような方法および関連するサブクローニング方法は当業者に知られている。
【００３４】
上記発現ベクターにおける核酸配列は、好ましくは、ＲＮＡ合成をおこなわせる(direct RNA synthesis)ように適当な転写制御配列（プロモーター）に操作により連結される。このようなプロモーターの例としては：レトロウィルスロングターミナル(retroviral long terminal)（ＬＴＲ）またはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(E. coli)ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、 ファージラムダＰＬプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞またはウィルスの遺伝子の発現を制御することが既知な他のプロモーターがある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを有していてもよい。上記ベクターは、発現を増幅するための適当な配列を有していてもよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核生物細胞の培養物ではジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性等の、または大腸菌(E. coli)ではテトラサイクリンもしくはアンピリシン耐性等の、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために１以上の選択マーカーを有する。
【００３５】
上記適当な核酸配列、さらには適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて、適当な宿主に形質転換して、宿主に上記サプレッサーを発現させてもよい。このようなベクターは、遺伝子療法に使用できる。適当な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、E. coli、Streptomyces、Salmonella typhimurium）、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSpodoptera frugiperda（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びＨＥＫ  ２９３）、アデノウィルス、ならびに植物細胞がある。適当な宿主の選択は当業者には知られている。実施形態によっては、本発明は、サプレッサーの一つをコードする核酸配列を有する発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって上記サプレッサーを製造する方法を提供する。
【００３６】
転移プロモーターの発現または活性レベルの減少
上述したように、結腸癌の処置にＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８の発現または活性レベルを減少する阻害物質を使用できる。阻害物質（即ち、インヒビター）は、核酸、ポリペプチド、抗体、または小分子化合物であってもよい。一例では、インヒビターは、転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性／分解、タンパク質修飾、およびタンパク質結合のレベルで機能する。
【００３７】
核酸インヒビターは、上記遺伝子、例えば、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８の１以上を標的とし、その発現または活性を阻害する低分子干渉ＲＮＡ(small interference RNA)（例えば、ＲＮＡｉ剤）をコードしてもよい。「ＲＮＡｉ剤」ということばは、ＲＮＡ干渉をおこなわせる(direct RNA interference)標的ＲＮＡに対して十分な配列相補性を有する、ＲＮＡ、またはそのアナログを意味する。例としては、ＲＮＡを作製するのに使用できるＤＮＡがある。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的分子（例えば、標的遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）がダウンレギュレーションされる配列特異的または選択的なプロセスを意味する。通常、干渉ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ」）は、特定のｍＲＮＡを触媒分解(catalytic degradation)させ、また遺伝子の発現を低下させるまたは阻害するのに使用できる２本鎖のショート干渉ＲＮＡ(double stranded short-interfering RNA)（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)（ｓｈＲＮＡ）、または１本鎖ｍｉｃｒｏＲＮＡ(single-stranded micro-RNA)（ｍｉＲＮＡ）である。
【００３８】
「ショート干渉ＲＮＡ(short interfering RNA)」または「ｓｉＲＮＡ」（また、「スモール干渉ＲＮＡ(small interfering RNA)としても知られている）は、約１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長の、ＲＮＡ剤、好ましくは２本鎖剤を意味し、この際、上記鎖は、必要であれば、ＲＮＡ干渉をおこなわせるまたは仲介することができる、例えば、１、２または３個のオーバーハンギングヌクレオチド(overhanging nucleotides)（またはヌクレオチドアナログ）を有するオーバーハンギング末端(overhanging ends)を有する。天然のｓｉＲＮＡは、細胞のＲＮＡｉ機構(cell's RNAi machinery)（例えば、そのダイサー(Dicer)またはホモログ(homolog)）によりより長いｄｓＤＮＡ分子（例えば、＞２５ヌクレオチド長）から得られる。
【００３９】
「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」ということばは、ＲＮＡ干渉をおこなわせるまたは仲介することができる、約１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長の、ＲＮＡ剤、好ましくは１本鎖剤を意味する。天然のｍｉＲＮＡは、ダイサー(Dicer)によってステム−ループプレカーサーＲＮＡ（即ち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）から得られる。本明細書で使用される「ダイサー(Dicer)」ということばは、ダイサー(Dicer)さらにはｄｓＲＮＡ構造物をｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様もしくはｍｉＲＮＡ様分子にプロセッシングできるダイサーオルソログ(orthologue)またはホモログ(homolog)がある。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）ということばは、天然のｍｉｃｒｏＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）が一時的に（例えば、発達中に）発現することが分かっているという事実に基づいて、「スモールテンポラルＲＮＡ(small temporal RNA)」（または「ｓｔＲＮＡ」）ということばと同義に使用される。
【００４０】
本明細書において使用される、「ｓｈＲＮＡ」ということばは、相補的配列の第一および第二領域を含むステム−ループ構造を有するＲＮＡ剤を意味し、上記領域の相補性および配向の度合いが、領域間で塩基対合が生じるのに十分であり、第一および第二領域がループ領域によって結合しており、ループがループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）間の塩基対合の欠損から生ずる。
【００４１】
ＲＮＡ分子の（例えば、細胞内での）分解を特徴とするＲＮＡｉの利用は、本発明の範囲内に含まれる。分解は、酵素により、ＲＮＡで誘導されるサイレンシング複合体(enzymatic, RNA-induced silencing complex)（ＲＩＳＣ）によって触媒される。ＲＮＡｉに命令するのに標的ＲＮＡ配列（例えば、上記ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８遺伝子）に対して十分相補的である配列を有するＲＮＡ剤は、ＲＮＡ剤が、それら２つが互いに十分ハイブリダイズして、ＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またはプロセスにより標的ＲＮＡの分解を開始させるように、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％の相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相同性）を有することを意味する。また、「ＲＮＡｉに命令するのに標的ＲＮＡ配列に対して十分に相補的な配列」を有するＲＮＡ剤は、ＲＮＡ剤が、ＲＮＡｉ機構またはプロセスにより標的ＲＮＡの翻訳阻害を開始させるのに十分な配列を有することを意味する。また、ＲＮＡ剤は、標的ＤＮＡ配列が染色体的にサイレンスである(chromatically silenced)ように標的ＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡに対して十分相補的な配列を有していてもよい。換言すると、ＲＮＡ剤は、転写遺伝子サイレンシング(transcriptional gene silencing)を誘導する、例えば、標的ＤＮＡ配列でのまたは付近でのクロマチン構造変化を誘導することにより、例えば、標的ＤＮＡ配列でのまたは付近での遺伝子発現をダウンレギュレーションする、のに十分な配列を有する。
【００４２】
上記ポリヌクレオチドは、当該分野において既知の高分子、生体分解性微粒子またはマイクロカプセルデリバリーデバイスを用いてデリバリーされうる。ポリヌクレオチドの摂取を達成する他の方法としては、標準的な方法によって調製された、リポソームの使用がある。ポリヌクレオチドは、これらのデリバリービヒクルに単独で組み込みされても、または組織特異的抗体と一緒に同時組み込みされてもよい。あるいは、静電力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リシンに結合したプラスミドまたは他のベクターから構成される分子コンジュゲートを調製してもよい。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する(Cristiano, et al., 1995, J. Mol. Med. 73:479)。あるいは、当該分野において既知の組織特異的転写調節要素を用いて、組織特異的ターゲティングを行ってもよい。筋肉内、皮内、または皮下部位への裸のＤＮＡのデリバリー（すなわち、デリバリービヒクルなし）は、インビボ発現を果たすための別の手段である。
【００４３】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）分子は、当該分野において周知の方法によって設計されてもよい。ＲＮＡを特有に分解するのに必要な配列特異性をもたらすのに十分な相同性を有するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ分子を、以下に制限されないが、ＡＭＢＩＯＮ，Ｉｎｃ．およびＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，Ｉｎｃ．のウェブサイト上で管理されているものなどの当該分野において既知のプログラムを用いて設計してもよい。当業者は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびａｓＲＮＡ配列の最適化のために幾つかの設計された薬剤の系統的な試験を定常的に行ってもよい。ショート干渉核酸分子を設計する際の考慮としては、以下に制限されないが、生物物理的、熱力学的、および構造的な考慮、センス鎖内の特定の位置での塩基優先性、および相同性がある。これらの考慮事項は、当該分野において周知であり、上記ＲＮＡ分子を設計するための指針となる。
【００４４】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）は、上記ネットワークの成分をコードする遺伝子の塩基配列に相補的であるまたは実質的に相補的である塩基配列を有する限り、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。塩基配列は、ポリペプチドをコードする遺伝子の補体と少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％相同でありうる。これらのアンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ合成器を用いて合成できる。
【００４５】
本発明のアンチセンスＤＮＡは、変更または修飾された糖、塩基または結合を有していてもよい。また、アンチセンスＤＮＡ、さらには上記ＲＮＡｉ剤は、リポソーム、マイクロスフェア等の特定の形態で提供されてもよく、または遺伝子療法に適用されてもよく、または結合部分と組み合わせて提供されてもよい。このような結合部分としては、ホスフェート骨格を有する電荷中和剤として作用するポリリシン等のポリカチオン、または細胞膜との相互作用を促進するもしくは核酸の摂取を向上する脂質（例えば、リン脂質、コレステロール等）等の疎水性部分がある。結合する脂質の好ましい例としては、コレステロールまたはその誘導体（例えば、クロロギ酸コレステロール(cholesteryl chloroformate)、コール酸等）がある。これらの部分は、３’または５’末端の核酸に結合してもよく、また、塩基、糖、または分子間ヌクレオシド結合を介して核酸に結合してもよい。他の部分が、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼによる分解を防ぐために核酸の３’または５’末端に特異的に配置されたキャッピング基であってもよい。このようなキャッピング基としては、以下に制限されないが、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等のグリコール類などの、当該分野において既知のヒドロキシル保護基がある。アンチセンスＤＮＡの阻害作用は、インビボ及びインビトロで本発明の細胞系または動物を用いた遺伝子発現システムを用いて試験できる。
【００４６】
１以上の上記ＲＮＡｉ剤またはポリペプチドサプレッサー（下記に記載される）をコードする核酸は、インビトロまたはインビボで細胞へのデリバリーするためのベクターにクローニングされてもよい。インビボ用途では、デリバリーは、特定の組織または器官（例えば、肝臓または結腸）を標的としうる。標的とされたデリバリーは、全身投与後に特定の器官または組織に標的とされるベクター（例えば、器官−ホーミングペプチド(organ-homing peptides)）の使用を含む。例えば、ベクターは、アビジンおよび肝臓に特異的なタンパク質に対するモノクローナル抗体の共有結合性共役体(covalent conjugate)を有していてもよい。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、上記転移サプレッサーのインビボでの発現方法を提供する。このような方法では、癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害する必要のあるヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織にいずれかの因子をコードする核酸配列を導入することにより、その治療効果を達成するであろう。上記核酸配列のデリバリーは、キメラウィルス等の組換発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成できる。核酸配列の好ましい治療用デリバリーは、標的リポソーム(targeted liposomes)の使用がある。
【００４８】
本明細書に開示される遺伝子療法に使用できる様々なウィルスベクターとしては、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス(adeno-associated virus)（ＡＡＶ）、ヘルペスウィルス、ワクチニア、または好ましくは、レトロウィルスやレンチウィルス等のＲＮＡウィルスがある。好ましくは、レトロウィルスベクターは、レンチウィルスまたはマウスもしくは鳥類のレトロウィルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウィルスベクターの例としては、以下に制限されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(Moloney murine leukemia virus)（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス(Harvey murine sarcoma virus)（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス(murine mammary tumor virus)（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma Virus)（ＲＳＶ）がある。多数のさらなるレトロウィルスベクターは複数の遺伝子を組み込まれうる。
【００４９】
これらのベクターはすべて、形質導入細胞を同定し、得られるように、選択マーカー用の遺伝子を伝達(transfer)または組み込まれて(incorporate)もよい。レトロウィルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を結合することによって標的特異的にされてもよい。好ましいターゲッティングは、標的中でレセプターを有する標的特異的な抗体またはホルモンを用いることによって達成される。当業者は、レトロウィルスベクターの標的特異的デリバリーができるように特定のポリヌクレオチド配列をレトロウィルスゲノム中に挿入できるまたはウィルスエンベロープに結合できると認識するであろう。
【００５０】
核酸のデリバリーのための他の標的系として、コロイド分散系(colloidal dispersion system)がある。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム等の脂質を用いた系がある。本発明の好ましいコロイド分散系は、リポソームである。リポソームは、インビトロ及びインビボでのデリバリーベヒクルとして有用である人工膜ベヒクルである。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び完全ウィルス粒子(intact virion)を水性内部(aqueous interior)に封入し、生物学的に活性な形態で細胞にデリバリーできる。リポソームベヒクルを用いた効率的な遺伝子導入方法は既知である。リポソームの組成は、一般的に、ステロイド、特にコレステロールと組み合わされる、リン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質を使用してもよい。リポソームの物性は、ｐＨ、イオン強度、及び２価のカチオンの存在に依存する。
【００５１】
リポソームの製造に使用できる脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジル化合物、スフィンゴリピド、セレブロシド、及びガングリオシドがある。具体的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン(egg phosphatidylcholine)、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンがある。また、リポソームのターゲティングは、例えば、器官特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当該分野において既知である。
【００５２】
インビボで使用する際には、可逆的なデリバリー−発現系を使用することが望ましい。そのためには、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰまたはＦＬＰ／ＦＲＴ系および他の同様の系が上記核酸の１以上の可逆的なデリバリー−発現系に使用できる。ＷＯ  ２００５／１１２６２０号、ＷＯ  ２００５／０３９６４３号、米国特許出願公開第２００５／０１３０９１９号、第２００３／００２２３７５号、第２００２／００２２０１８号、第２００３／００２７３３５号、及び第２００４／０２１６１７８号を参照。特に、米国特許出願公開第２０１０／０２８４９９０号に記載される可逆的なデリバリー−発現系が選択的または緊急遮断(emergency shut-off)を提供するために使用できる。
【００５３】
他の例では、上記阻害物質またはサプレッサーは、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８の活性を阻害または干渉する、抗体またはその抗原結合部分等の、ポリペプチドまたはタンパク質複合体であってもよい。
【００５４】
「抗体」ということばは、免疫グロブリン分子またはその免疫グロブリン活性部分、すなわち抗原結合部位を意味する。例としては、以下に制限されないが、少なくとも１つまたは２つの重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）、及び少なくとも１つまたは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）を有する部分がある。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より高度に保存される領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、高可変性のある領域にさらに細分することができる。本明細書に使用される、「免疫グロブリン」ということばは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている１以上のポリペプチドから構成されるタンパク質を指す。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、さらには無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。
【００５５】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）ということばは、抗原（例えば、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８）への特異的結合能を保持する抗体の１以上の断片を意味する。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実施できることが示された。抗体の「抗原結合部分」ということばに包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される１価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインから構成される、ｄＡｂ断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によってコードされているが、組換方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して１価の分子を形成する単一タンパク質鎖（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）として作製できる合成リンカーによりそれらを連結させてもよい。また、このような１本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」ということばに包含されると解される。これらの抗体断片は当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片を完全抗体であるのと同様の手法で有用性についてスクリーニングされる。
【００５６】
上記標的タンパク質（ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８）の１つに特異的に結合する抗体は、当該分野において既知の方法を用いて作製できる。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。一実施形態では、抗体は、組換えにより製造することができ、例えば、ファージディスプレイによってまたはコンビナトリアル法によって製造できる。他の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を製造するように遺伝子操作されたマウスで作製された抗体）、ヒト化抗体、または非ヒト抗体、例えば、以下に制限されないが、齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、以下に制限されないが、サル）、ウサギ、またはラクダ抗体である。ヒト化形態の抗体を得る方法の例としては、以下に制限されないが、ＣＤＲグラフティング(CDR grafting) (Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988))、チェインシャフリング(chain shuffling)（米国特許第５，５６５，３３２号）；およびベニアリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号）；Padlan, Molecular Immunology 28(415):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994))がある。完全ヒト抗体を得る方法の例としては、以下に制限されないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるマウスからの抗体の生成ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを作製、スクリーニングするファージ−ディスプレイ技術の使用がある。
【００５７】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味すると解される（例えば、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８に特異的に結合する単離された抗体がこのような抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体には、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５８】
本明細書に使用される、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」ということばは、単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５９】
本明細書に使用される、「ヒト抗体」ということばは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域が双方ともヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むと解される。さらに、抗体が定常領域を含む際には、定常領域もまたヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を包含してもよい。しかしながら、本明細書で使用される、「ヒト抗体」ということばは、マウス等の、他の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に予めグラフトされた抗体を包含しないと解される。
【００６０】
「ヒトモノクローナル抗体」ということばは、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域が双方ともヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を意味する。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムが不死化細胞に融合してなる、形質転換非ヒト動物、例えば、形質転換マウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって生産される。
【００６１】
本明細書に使用される、「組換ヒト抗体」ということばは、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはこれから調製されたハイブリドーマに対して形質転換された(transgenic)または染色体交換された(transchromosomal)動物（例えば、マウス）からから単離された抗体（以下にさらに記載する）、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の手段によって調製、発現、生成または単離された抗体などの、組換手段によって調製、発現、生成または単離されるすべてのヒト抗体を包含する。このような組換ヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換ヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列が形質転換された動物を使用する際には、インビボ体細胞突然変異誘発）されてもよく、ゆえに組換抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来、関連する一方で、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー中に天然では存在しない可能性がある配列である。
【００６２】
本明細書で使用される、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」というフレーズは、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と同義で使用される。本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」ということばは、標的抗原に対して、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対しては異なっていてもよい。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。
【００６３】
一例では、組成物は、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａを中和するモノクローナル抗体を含む。一実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、または非ヒト抗体、例えば、以下に制限されないが、齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、以下に制限されないが、サル）、ウサギ、またはラクダ抗体であってもよい。一実施形態では、このモノクローナルモノクローナル抗体の１以上のアミノ酸を、物性を変更するために置換してもよい。これらの物性としては、以下に制限されないが、結合特異性、結合親和性、免疫原性、および抗体アイソタイプがある。完全ヒトまたはヒト化形態の上記抗体を含む薬剤組成物は、結腸癌を処置するためにまたは癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するために使用できる。
【００６４】
本明細書で使用される、「被検者」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。非ヒト動物の例としては、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、イヌ、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ネコ、およびウサギ等の、哺乳動物、ならびに鳥類、両生類、爬虫類等の、非哺乳動物がある。一実施形態では、被検者はヒトである。他の実施形態では、被検者は、実験動物または疾患モデルとして適する動物である。ある疾患に関して処置すべき被検者は、当該疾患についての標準的な診断技術によって同定されうる。必要であれば、被検者は、処置前に当該分野において既知のまたは上記したような方法によって上記ＣＫＢ、ＳＬＣ６ａ８、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの１以上の突然変異、発現レベル、または活性レベルについて試験されてもよい。被検者が遺伝子の特定の突然変異を有する場合には、または遺伝子発現もしくは活性レベルが、例えば、正常な人からのサンプルにおけるのより被検者からのサンプルにおける方が高い場合には、その被検者は本発明の処置の候補である。
【００６５】
阻害または処置を確認するために、投与段階の前および／または後に当該分野において既知の技術を用いて癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、または転移増殖(metastatic colonization)の阻害を評価および／または確認してもよい。具体的な技術としては、体の器官のＣＴ−スキャンまたはＰＥＴ−スキャンがある。
【００６６】
本明細書で使用される、「処置する(treating)」または「処置(treatment)」とは、ある疾患を有する被検者に、上記疾患、上記疾患の症状、上記疾患の二次的な病状、または上記疾患に対する素因を治癒する(cure)、緩和する(alleviate)、軽減する(relieve)、治療する(remedy)、これらの発症を遅延させる、これらを予防する(prevent)、または改善する(ameliorate)ことを目的として、化合物または薬剤を投与することを意味する。「有効量」または「治療有効量」は、処置した被検者に医学的に望ましい結果を生じさせることができる化合物または薬剤の量を指す。処置方法は、インビボでまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬物もしくは療法と共に行うことができる。治療有効量は、１回以上の投与、適用または投薬で施すことができ、特定の処方または投与経路に限定されないと解釈される。
【００６７】
治療剤は、インビボでまたはエクスビボで、単独で投与されてもまたは他の薬もしくは療法と組み合わせて、すなわちカクテル療法で、共投与されても(co-administered)よい。本明細書で使用される、「共投与(co-administration)」または「共投与される(co-administered)」とは、少なくとも２種の薬剤または療法を被検者に施すことを意味する。例えば、腫瘍、特に悪性腫瘍の処置では、薬剤を、単独でまたは例えば、化学療法剤、放射線療法剤、アポトーシス(apoptopic)剤、抗血管新生剤、および／または免疫毒素もしくはコアグリガンド(coaguligand)と組み合わせて使用してもよい。実施形態によっては、２以上の薬剤／療法の共投与は同時に行われる。他の実施形態では、第一の薬剤／療法を、第二の薬剤／療法の前に投与する。使用される様々な薬剤／療法の処方および／または投与経路は様々であり得ることは、当業者には理解される。
【００６８】
インビボアプローチでは、化合物または薬剤を被検者に投与する。通常、化合物を製薬上許容される担体（例えば、以下に制限されないが、生理食塩水など）に懸濁し、経口でもしくは静脈内輸注により投与する、または皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、もしくは肺内に注射するまたは埋め込む。
【００６９】
必要な投与量は、投与経路の選択；処方の性質；患者の病気の性質；被検者の大きさ、体重、表面積、年齢および性別；他の薬が投与されている；ならびに主治医の判断によって異なる。適切な投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。使用される化合物の種類および様々な投与経路の異なる有効性を考慮して、必要な投与量の変動を予想することができる。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与より高い投与量を必要とすることが予想されうる。当該分野において十分理解されているように、最適化のための標準的経験的常套手順を用いて、これらの投与量レベルの変動を調節することができる。適当なデリバリービヒクル（例えば、ポリマー微粒子または埋め込み可能なデバイス）への化合物の封入は、デリバリー、特に経口デリバリーの有効性を向上できる。
【００７０】
組成物
適当な担体および上記治療剤の１つ以上を含む組成物は、本発明の範囲に含まれる。本組成物は、製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物、飲食に許容できる適当な担体を含む飲食用組成物、または化粧品として許容できる担体を含む化粧品組成物であり得る。
【００７１】
「薬剤組成物」ということばは、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適している組成物を作製する、不活性なまたは活性のある、担体と活性薬剤との組み合わせを指す。「製薬上許容できる担体」は、被検者にまたは被検者上に投与した後、望ましくない生理的な効果を生じない。薬剤組成物における担体は、活性成分と相溶性であり、安定化することが可能であるという意味でも「許容でき」なければならない。１以上の可溶化剤を活性化合物のデリバリーのための薬剤用担体として用いることができる。製薬上許容できる担体の例としては、以下に制限されないが、剤形として使用可能な組成物を得るための生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃイエロー＃１０が挙げられる。
【００７２】
上記いずれかの形態の、上記組成物は、結腸癌を処置するのに使用できる。有効量とは、処置される被検者に治療効果を付与するのに必要である活性化合物／薬剤の量を意味する。有効な投与量は、当業者に認識されているように、処置される病気のタイプ、投与経路、賦形剤使用量、および他の治療のための処置との併用(co-usage)の可能性によって、異なるであろう。
【００７３】
本発明の薬剤組成物は、非経口で、経口で、経鼻に、直腸内に、局所的に、または頬側に(buccally)投与されうる。本明細書において使用される、「非経口」ということばは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、さらにはいずれかの輸注技術を意味する。
【００７４】
滅菌注射用組成物は、非毒性で非経口で許容できる希釈剤または溶媒における溶液または懸濁液でありうる。このような溶液としては、以下に制限されないが、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられるが。加えて、固定油が、溶媒または懸濁化媒体（例えば、合成モノまたはジグリセリド）として従来使用される。以下に制限されないが、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体等の、脂肪酸は注射剤の調製に使用でき、同様に、以下に制限されないが、オリーブ油またはヒマシ油、それらのポリオキシエチレン化形態等の、天然の製薬上許容できる油も使用できる。これらの油性溶液または懸濁液はまた、以下に制限されないが、カルボキシメチルセルロース等の、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、または同様の分散剤を含んでもよい。製薬上許容できる固体、液体または他の剤形の製造に一般的に使用される、以下に制限されないが、ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎまたは他の同様の乳化剤または生物学的に利用可能な促進剤等の、他の一般的に使用される界面活性剤も、調合を目的として使用してもよい。
【００７５】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンならびに水性懸濁液、分散液および溶液などの、いずれかの経口で許容できる剤形であってもよい。錠剤の場合には、一般的に使用される担体としては、以下に制限されないが、ラクトースおよびコーンスターチがある。以下に制限されないが、ステアリン酸マグネシウム等の、滑沢剤が具体的に添加される。カプセル形態での経口投与には、使用できる希釈剤としては、以下に制限されないが、ラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液またはエマルジョンを経口投与する場合には、活性成分を乳化または懸濁化剤と組み合わせて油相に懸濁または溶解してもよい。必要に応じて、一定の甘味剤、着香剤または着色剤を添加してもよい。
【００７６】
上記本発明に係る局所投与用の薬剤組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、またはオイルとして処方されうる。あるいは、局所製剤は、必要であれば１つ以上の賦形剤または希釈剤を含んでもよい、活性成分を含浸させたパッチまたはドレッシングの形態であってもよい。好ましい実施形態によっては、局所製剤は、皮膚または他の罹患領域への活性薬剤の吸収または浸透を促進する材料を含む。
【００７７】
局所組成物は、安全かつ有効な量の、皮膚への塗布に適する皮膚科学的に許容できる担体を含有する。「化粧品的に許容できる(cosmetically acceptable)」または「皮膚科学的に許容できる(dermatologically-acceptable)」組成物または成分とは、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応など伴わずにヒト皮膚と接触しての使用に適している組成物または成分を意味する。担体により、活性薬剤および必要であれば使用される成分を適切な濃度で皮膚にデリバリーすることが可能になる。ゆえに、担体は、確実に活性材料を適切な濃度で所定の標的に均一に適用、分布させるための希釈剤、分散剤、溶媒などとして作用できる。担体は、固体、半固体、または液体であってもよい。担体は、ローション、クリーム、またはゲルの形態であってもよく、特に、活性材料が沈殿しないようにするのに十分な濃さおよび降伏点を有するものであってもよい。担体は、不活性である、または皮膚科学的利点を有しうる。担体は、本明細書に記載される活性成分と物理的および化学的に相溶性でなければならず、さらに安定性、有効性または組成物に関連した他の使用上の利点を過度に損ってはならない。
【００７８】
診断および予後診断(prognosis)方法
上記遺伝子は、被検者が転移性結腸癌を有するまたは有する危険性があるか否かを決定するのに使用できる。または、上記遺伝子は、被検者のこのような疾患の予後を決定するのに使用できる。
【００７９】
診断方法
一態様では、本発明は、被検者が、転移性結腸癌を有するもしくは転移性結腸癌にかかりやすい素因を有する、転移性結腸癌が再発しやすい素因を有する、化学療法に耐性のある結腸癌、もしくは癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)の特徴を有する他の病気にかかりやすい素因を有するか否かを決定するための定性的及び定量的な情報を提供する。このような疾患を有するまたはこのような疾患にかかりやすい被検者を、被検者の試験サンプルにおける上記遺伝子またはこれらの産物（ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはポリペプチド）の発現レベル、パターン、またはプロフィールに基づいて決定できる。換言すると、産物をマーカーとして用いて、疾患が存在するか存在しないかを示すことができる。本発明の診断および予後診断アッセイは、産物の発現レベルを評価する方法を包含する。本方法によって、疾患を検出できる。例えば、一以上のプロモーター（即ち、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８）の発現レベルが相対的に増加することは疾患が存在することを示す。これに対して、発現レベルが低くなるまたは発現レベルがないことは疾患が存在しないことを示す。同様にして、１以上のサプレッサー（ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａ）の発現レベルが低くなるまたは発現レベルがないことは疾患が存在することを示し、その一方、発現レベルが相対的に増加することは疾患が存在しないことを示す。
【００８０】
試験サンプルにおけるｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはポリペプチドの存在、レベル、または不存在は、試験被検者からの試験サンプルを得、この試験サンプルを核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡプローブ）またはポリペプチドを検出できる化合物または物質と接触させることによって評価できる。「試験サンプル」としては、被検者から単離された組織、細胞及び体液、さらには被検者内に存在する組織、細胞及び体液がある。目的とする遺伝子の発現のレベルは、遺伝子によってコードされるＲＮＡを測定するなど、多数の方法で測定できる。
【００８１】
発現したＲＮＡサンプルは、数多くの既知の方法を用いて生体サンプルから単離できる。例えば、生体サンプルを、必要であればＲＮＡを安定化させる別の成分を含む、グアニジン系の溶解バッファー中で溶解してもよい。実施形態によっては、溶解バッファーは、細胞培養物のＲＮＡの回収及び安定性をモニターするためのコントロールとして精製ＲＮＡを含んでもよい。このような精製ＲＮＡ鋳型の例としては、PROMEGA (Madison, WI)製のカナマイシン陽性コントロールＲＮＡ(Kanamycin Positive Control RNA)、およびLIFE TECHNOLOGIES (Rockville, MD)製の7.5 kb Poly(A)-Tailed RNAがある。分解物は、即座にまたは例えば、−８０℃で凍結して貯蔵してもよい、
必要であれば、全ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ精製プラットフォーム(RNEASY purification platform)(QIAGEN, Inc., Valencia, CA)等の、自動適合(automation-compatible)９６ウェルフォーマットでシリカを用いた単離を用いて細胞溶解物（または他のタイプのサンプル）から精製してもよい。シリカ被覆ビーズまたはグアニジンを用いた抽出等の、他のＲＮＡ単離方法が考えられる。ＲＮＡ単離及び調製のためのさらなる方法は、当業者によって考案されうる。
【００８２】
本発明の方法は、ＲＮＡを単離する必要を除いて、未精製なサンプル（例えば、血液、血清、血漿、または細胞溶解物）を用いて行ってもよい。必要であれば、ＲＮＡａｓｅインヒビターを未精製サンプルに添加する。未精製な細胞溶解物を用いる場合には、ゲノムＤＮＡから、サンプルによっては、標的となる配列、例えば、遺伝子の１以上のコピーを得てもよいことは留意すべきである。標的配列が１以上の高発現した遺伝子由来である場合には、ゲノムＤＮＡから生じるシグナルは重要ではない場合がある。しかし、低レベルで発現する遺伝子では、サンプルをＤＮＡａｓｅで処理することによって、またはｃＤＮＡまたは増幅産物を次にプライミング(priming)するためのスプライシングジャンクション(splice junctions)を標的とするプライマーを用いることによって、バックグラウンドを排除してもよい。
【００８３】
細胞における遺伝子に対応するＲＮＡのレベルは、in situおよびin vitroの双方で測定できる。試験サンプルから単離されたＲＮＡは、サザンまたはノーザン分析、ＰＣＲ分析、およびプローブアレイなどのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用できる。ＲＮＡレベルの検出のための好ましい診断方法は、単離されたＲＮＡを遺伝子によってコードされたＲＮＡにハイブリダイズできる核酸プローブと接触させることを有する。プローブは、完全長核酸または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有しかつストリンジェントな条件下でＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド等の、その一部分であってもよい。
【００８４】
１つの形式では、例えば、単離されたＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ゲルからＲＮＡをニトロセルロース膜等の膜に移すことによって、ＲＮＡ（またはそれから調製したｃＤＮＡ）を表面に固定化し、プローブと接触させる。他の形式では、プローブを表面に固定化し、例えば、遺伝子チップアレイで、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）をプローブと接触させる。当業者は、ＲＮＡレベルを検出するために既知のＲＮＡ検出方法を採用できる。
【００８５】
試験すべき遺伝子によってコードされるサンプル中のＲＮＡ（またはそれから調製したｃＤＮＡ）のレベルは、核酸増幅、例えば、標準的なＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、ＲＴ−ＰＣＲ(Bustin S. J Mol Endocrinol. 25:169-93, 2000)、定量的ＰＣＲ(Ong Y. et al., Hematology. 7:59-67, 2002)、リアルタイムＰＣＲ(Ginzinger D.  Exp Hematol. 30:503-12, 2002)、およびｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ(Thaker V.  Methods Mol Biol. 115:379-402, 1999)、または他の核酸増幅法による核酸増幅、続いて当該分野において既知の技術を用いた増幅分子の検出によって、核酸増幅を用いて評価することができる。他の実施形態では、本発明の方法は、コントロールサンプルを遺伝子のＲＮＡを検出できる化合物または物質と接触させ、コントロールサンプルにおけるＲＮＡの存在を試験サンプルにおけるＲＮＡの存在と比較することをさらに含む。
【００８６】
上記方法およびマーカーは、被検者が結腸癌を発症する危険性を評価するのに使用できる。特に、本発明は、初期検出を臨界的に見抜くために既に特定の危険性のあるハイリスクな群にいる人々に適用できる。結腸癌に関連した上記遺伝子産物のレベルの変化は、被検者細胞の形質転換または悪性表現型の発生の前に、またはそのような発生の初期段階で検出できる。したがって、本発明はまた、被検者から得られた生体サンプルにおける疾患に関連した、少なくとも一の遺伝子産物、または複数の遺伝子産物の組み合わせのレベルを評価することを有する、結腸癌または結腸癌の転移性再発を発症する危険性を有する被検者をスクリーニングする方法を提供する。したがって、コントロールサンプルの相当する遺伝子産物のレベルと比較した際の生体サンプルにおける遺伝子産物、または複数の遺伝子産物の組み合わせのレベルの変化は、被検者が疾患を発症するリスクを有することを示す。このようなスクリーニングに使用される生体サンプルとしては、正常または癌であることが疑われる組織サンプルがありうる。結腸癌に関連した１以上の遺伝子産物のレベルが変化した被検者は、さらにモニターまたは試験するための候補である。このようなさらなる試験としては、組織サンプルの組織学的試験、または当業者に知られる他の技術がある。
【００８７】
本明細書で使用される、「診断」ということばは、病気もしくは疾患を検出するまたは病気もしくは疾患の段階もしくは程度を測定することを意味する。一般的に、病気または疾患の診断は、病気であることを示す１以上の因子および／または症状の評価に基づく。すなわち、診断は、病気または状態の存在または不存在を示す因子の存在、不存在または量に基づいてなされうる。特定の病気の診断を示すと考えられる各因子または症状は、特定の病気に排他的に関連する必要はない；すなわち、診断因子または症状から推論できる特異的な診断(differential diagnoses)が存在してもよい。同様にして、特定の病気を示す因子または症状が特定の病気をもたない個人に存在する場合もある。診断方法は、それぞれ、または特定の病気もしくは疾患、例えば、結腸癌について医学の分野において既知の他の診断(diagnosing)および／またはステージング(staging)方法と組み合わせて使用してもよい。
【００８８】
予後診断方法
上記診断方法は、結腸癌または転移性結腸癌の再発を有するまたはこれらを発症する危険性のある被検者を同定できる。加えて、生体サンプル、例えば、末梢血サンプルにおける上記遺伝子の発現レベルおよび／または傾向の変化は、回復または回復していないことの初期の指標を提供できる。例えば、プロモーター遺伝子（もしくはインヒビター遺伝子）のさらなる増加（もしくは減少）または永続的に変化した遺伝子発現レベルは、予後診断が乏しい、即ち、改善しないないまたは健康が減退している（もしくは予後が悪い）ことを示す。したがって、これらの遺伝子によって、結腸癌の処置後の回復を評価できる。この所定の遺伝子群またはそのサブセットの分析は状態の経過を示す。
【００８９】
本明細書に記載される予後診断アッセイを用いて、被検者に、結腸癌または癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)に関連する他の疾患を処置するために薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬候補）を投与するのが適するか否かを決定できる。例えば、このようなアッセイを用いて、被検者に化学療法薬を投与できるか否かを決定できる。
【００９０】
ゆえに、被検者の細胞増殖性疾患に関する処置のモニター方法もまた本発明によって提供される。これを目的として、本明細書で開示される遺伝子の遺伝子発現レベルは、処置を受ける前、処置を受けている最中、または処置を受けた後の被検者の試験サンプルで測定できる。次に、基準レベルと比較した際のレベルの変化の程度を評価する。処置後に上記プロモーター遺伝子（例えば、ＣＫＢまたはＳＬＣ６ａ８）の発現が減少したら、被検者はさらに同じ処置によって処置できることを示す。同様にして、インヒビター（例えば、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａ）が増加したら、被検者はさらに同じ処置によって処置できることを示す。逆に。１以上のプロモーター遺伝子の発現レベルがさらに増加するもしくは永続的に高い（または１以上のインヒビター遺伝子の発現レベルがさらに減少するもしくは永続的に低いもしくはない）と、改善していないまたは健康が減退していることを示す。
【００９１】
上記アッセイの実施から得られる情報は、病気または個々の被検者の健康状態に影響を及ぼす他の有害な状態の進行や臨床上の管理を予想、同定するのに有用である。好ましい実施形態では、前記診断アッセイは、結腸癌、転移性結腸癌および癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)の特徴を有する他の状態の進行や管理を予想、同定するのに有用である。情報は、より詳しくは、医師が、病人、ヒトの体からこのような状態を根絶する化学療法または他の処置レジメを設計するのを助ける。
【００９２】
本明細書で使用される「予後診断(prognosis)」ということばは、臨床的な状態または病気の起こりそうな経過及び結果の予想を意味する。予後診断は、一般的に、病気の好ましいもしくは好ましくない経過または結果を示す病気の因子または症状を評価することによってなされる。本明細書で使用される「予後診断を決定する(determining the prognosis)」というフレーズは、当業者が患者の状態の経過または結果を予想できるプロセスを意味する。「予後診断」ということばは、代わりに１００％正確に状態の経過または結果を予想できることを意味するものではなく、当業者は「予後診断」ということばは特定の経過または結果が起こるであろう可能性が増すことを意味する、すなわち、経過または結果が、そのような状態が現れないヒトに比べた場合に、患者に所定の状態が現れる可能性がより高いことを意味する。
【００９３】
本明細書で使用される「好ましい予後診断」および「陽性の予後診断」、または「好ましくない予後診断」および「陰性の予後診断」ということばは、状態または病気の起こりうる経過および／または起こりうる結果の予想に関する相対的なことばである。好ましいまたは陽性の予後診断は、好ましくないまたは陰性の予後診断に比べて状態の結果が良好であることを予想するものである。一般的な意味で、「好ましい予後診断」は特定の状態に関連する他の可能性のある予後診断に比べて相対的に良好な結果であり、これに対して、好ましくない予後診断は特定の状態に関連する他の可能性のある予後診断に比べて相対的に悪い結果を予想するものである。好ましいまたは陽性の予後診断の具体的な例としては、平均的な治癒率より良いこと、転移傾向がより低いこと、予想される平均余命より長いこと、癌の経過からの良性の経過に区別されること(differentiation of a benign process from a cancerous process)などがある。例えば、陽性の予後診断は、同じ癌の平均的な患者が２５％の可能性で治癒する際に、患者が処置後に特定の癌が治癒する可能性が５０％である場合である。
【００９４】
「決定する(determining)」、「測定する(measuring)」、「評価する(assessing)」、および「アッセイする(assaying)」ということばは、同義に使用され、定量的及び定性的な測定双方を包含し、特性(characteristic)、特質(trait)、特徴(feature)が存在するかどうかを決定することを含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。標的「の存在を評価する」ことは、標的の存在量を測定すること、さらにはそれが存在するか存在しないかを決定することを含む。
【００９５】
アレイ
バイオチップまたはアレイもまた本発明で提供される。バイオチップ／アレイは、本明細書に記載される結合プローブまたは複数のプローブを有する固体または半固体基材を含んでもよい。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできてもよい。プローブは、基材上の空間的に規定された場所で結合してもよい。１つの標的配列あたり１超のプローブを使用してもよく、この際、重複プローブであってもまたは特定の標的配列とは異なる部分に対するプローブであってもよい。プローブは、当業者に認識される単一の疾患に関連する標的配列とハイブリダイズできるものであってもよい。プローブは、まず合成された後バイオチップに結合されても、またはバイオチップ上に直接合成されてもよい。
【００９６】
本明細書で使用される「結合」または「固定化」は、核酸（例えば、プローブ）及び固体支持体が、プローブと固体支持体との結合が結合、洗浄、分析、及び除去の条件下で十分安定であることを意味してもよいことを指す。結合は、共有結合であってもまたは非共有結合であってもよい。共有結合は、プローブ及び固体支持体間に直接形成されてもまたはクロスリンカーによってもしくは固体支持体もしくはプローブもしくは双方の分子のいずれかに特定の反応基を含ませることによって形成されてもよい。非共有結合は、静電気的、親水性、及び疎水性の相互作用の一以上であってもよい。非共有結合には、ストレプトアビジン等の分子の支持体への共有結合、ビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合などがある。また、固定化は、共有及び非共有相互作用を包含する。
【００９７】
固体基材は、プローブの結合または会合に適する別々の個々の部位を含むように修飾されてもよい材料であってもよく、少なくとも一の検出方法に従う(is amenable to)。このような基材の例としては、ガラス及び修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＪ(TeflonJ)などを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコン及び修飾シリコン等のシリカ系材料、カーボン、金属、無機ガラスおよびプラスチックがある。上記基材によって、感知される程度の蛍光発光を伴わずに光学的に検出できる。
【００９８】
他の構造の基材を同様にして使用できるものの、基材は平面状であってもよい。例えば、プローブを、サンプル容積を最小限にしたフロースルーサンプル分析(slow-through sample analysis)用の、チューブの内面に配置してもよい。同様にして、基材は、特定のプラスチックで作製された独立セル発泡体(closed cell foam)等の、柔軟性のある発泡体などの、柔軟性を有するものであってもよい。
【００９９】
アレイ／バイオチップおよびプローブは、次にこれら２つを結合するために化学的な官能基で誘導化してもよい。例えば、バイオチップを、以下に制限されないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基等の、化学的な官能基で誘導化してもよい。これらの官能基を用いることにより、プローブは、直接的にまたはリンカーを用いて間接的にプローブに官能基を用いて結合されうる。プローブは、５’末端、３’末端、または内部ヌクレオチドを介して固体支持体に結合されうる。また、プローブは、非共有結合的に固体支持体に結合されてもよい。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作製して、ストレプトアビジンで共有結合的に被覆された表面に結合して付着させてもよい。または、プローブを、光重合及びフォトリソグラフィー等の技術を用いて表面上に合成してもよい。核酸の支持基材への結合方法の詳細は、例えば、米国特許第５８３７８３２号、第６０８７１１２号、第５２１５８８２号、第５７０７８０７号、第５８０７５２２号、第５９５８３４２号、第５９９４０７６号、第６００４７５５号、第６０４８６９５号、第６０６０２４０号、第６０９０５５６号、及び第６０４０１３８号に記載されている。
【０１００】
実施形態によっては、発現転写物（例えば、本明細書に記載されるｍｉｃｒｏＲＮＡまたはポリペプチド遺伝子の転写物）を核酸アレイに提示させる。このような実施形態では、１セットの結合部位が発現転写物の異なる配列セグメントに相補的である異なる核酸を有するプローブを含んでもよい。このような核酸の例としては、１５〜２００塩基、２０〜１００塩基、２５〜５０塩基、４０〜６０塩基の長さを含みうる。また、各プローブ配列は、標的配列に相補的である配列に加えて１以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、標的配列に相補的である配列と支持体の表面との間の配列である。例えば、本発明の核酸アレイは、各標的ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子に特異的な１つのプローブを有する。しかしながら、必要であれば、核酸アレイは、ある発現転写物（例えば、本明細書に記載されるｍｉｃｒｏＲＮＡの転写物）に特異的な少なくとも２、５、１０、１００、２００、３００、４００、５００以上のプローブを含んでもよい。
【０１０１】
キット
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド及びｍｉｃｒｏＲＮＡの発現の分析のための方法、組成物、およびシステムを具現化するキットを提供する。このようなキットは、本明細書に記載される核酸および下記のいずれかまたは全てを含んでもよい：アッセイ試薬、バッファー、プローブおよび／またはプライマー、ならびに滅菌生理食塩水もしくは他の製薬上許容できるエマルジョンおよび懸濁液ベース。加えて、キットは、本明細書に記載される方法を実施することを目的として指示書（例えば、プロトコル）を含む指示材料を有していてもよい。例えば、キットは、標的ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ配列の増幅、検出、同定または定量化用のキットであってもよい。これを目的として、キットは、適当なプライマー（例えば、ヘアピンプライマー）、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを有していてもよい。
【０１０２】
一例としては、本発明のキットは、複数の異なる核酸（それぞれが上記遺伝子の１つに対応する）が予め配置された１以上のマイクロアレイスライド（または代替となるマイクロアレイフォーマット）を有している。また、キットは、複数の標識プローブを有していてもよい。または、キットは、プローブとして適切である複数のポリヌクレオチド配列および医師の裁量で含まれているポリヌクレオチド配列、または他のポリヌクレオチド配列をカスタマイズするのに適する標識の選択を含んでもよい。一般的に、少なくとも１つの含まれているポリヌクレオチド配列がコントロール配列、例えば、標準化遺伝子などに相当する。具体的な標識としては、以下に制限されないが、核酸プライマーに連結する、蛍光体、染料、放射線標識、酵素タグがある。
【０１０３】
一実施形態では、発現したＲＮＡサンプルに対応する核酸を増幅するのに適するキットが提供される。このようなキットは、上記増幅方法に使用するのに適する試薬およびプライマーを含む。または、もしくは加えて、キットは、プローブおよび標的核酸サンプル（例えば、マイクロアレイ上に配置された）のハイブリッド形成に相当するシグナルを増幅するのに適する。
【０１０４】
加えて、遺伝子発現分析のために生体サンプルを調製するのに必要な１以上の材料および／または試薬が、必要であれば、キットに含まれる。さらに、様々なポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑ等）などの、核酸を増幅するのに適する１以上の酵素、１以上のデオキシヌクレオチド、及び増幅するのに必要な反応混合物を用意するためのバッファーが、必要であればキットに含まれる。
【０１０５】
具体的には、キットは、出発鋳型としてｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡを用いて遺伝子発現パターンを分析するために使用される。ＲＮＡ鋳型は、全細胞ＲＮＡまたは単離ＲＮＡのいずれとして提示されてもよい；双方のタイプのサンプルにより匹敵した結果が得られる。他の実施形態では、本発明に記載される方法およびキットによって、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、または他の転写産物などの、遺伝子発現の他の産物を定量できる。
【０１０６】
必要であれば、本発明のキットは、データの取得、分析および／または貯蔵を促進するための、ならびにデータベースにアクセスしやすくするためのソフトウェアをさらに含む。ソフトウェアとしては、データの収集、貯蔵および／または分析に使用できる理論的なインストラクション、インストラクションセット、または適当なコンピュータープログラムがある。データの比較分析及び関連分析は、提供されるソフトウェアを用いて可能である。
【０１０７】
キットは、必要であれば、各個々の試薬および／または酵素成分用に別の容器を有していてもよい。各成分は、通常、それぞれの容器中にアリコートされる(aliquoted)のが好ましい。キットの容器は、必要であれば、少なくとも１個のバイアル瓶、アンプル、または試験管を含む。試薬を入れられるまたはアリコートされうるフラスコ、ボトル及び他の容器メカニズムもまた可能である。キットの個々の容器は、好ましくは、市販用に密閉(close confinement)されて維持される。適当なより大量の容器としては、所望のバイアルビンを保持する射出成型またはブロー成型されたプラスチック容器がある。本発明のキットの使用の詳細が記載された書面での指示書またはビデオテープに撮られたデモンストレーションなどの、指示書が必要であればキットと共に準備される。
【０１０８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物またはキットの使用を目的として、本明細書に記載される方法もしくはアッセイの実施を目的として、および／または本明細書に記載されるアッセイもしくは方法の実施のための装置もしくはキットを目的として提供する。
【０１０９】
本明細書で使用される「試験サンプル」または「生体サンプル」は、核酸を含む生体組織または液体のサンプルを意味してもよい。このようなサンプルとしては、以下に制限されないが、動物から単離された組織または体液がある。また、生体サンプルは、生検や剖検サンプル、組織学的な目的で採取された凍結断片、血液、血漿、血清、唾液、便、涙、粘液、尿、胸液、羊水、腹水、毛髪、及び皮膚などの組織断片がある。生体サンプルはまた、被検者組織由来の外植片ならびに初代および／または形質転換細胞培養物を包含する。生体サンプルは、動物から細胞のサンプルを除去することによって用意されてもよいが、また、予め単離された細胞（例えば、他のヒトによって、別の時期に、および／または他の目的で単離された）を用いることによって、またはインビボで本明細書に記載される方法を実施することによって、なされてもよい。処置歴または転帰歴(treatment or outcome history)のあるものなどの、保存組織(Archival tissues)を使用してもよい。
【０１１０】
「体液(body fluid)」または「身体液(bodily fluid)」ということばは、動物の体由来の液体を意味する。体液の例としては、以下に制限されないが、血漿、血清、血液、リンパ液、脳脊髄液、滑液、尿、唾液、粘液、痰唾(phlegm)及び痰(sputum)がある。体液サンプルは、適当な方法によって集められる。体液は、即座に使用されてもまたは貯蔵して後に使用してもよい。当該分野において既知の適当な貯蔵方法を使用して体液サンプルを貯蔵してもよい：例えば、サンプルを約−２０℃〜−７０℃で凍結してもよい。適当な体液として、無細胞液がある。「無細胞」液としては、細胞が存在しないまたは測定されたｍｉＲＮＡレベルが細胞部分ではなく、サンプルの液体部分のレベルを反映するような少量で存在する体液サンプルがある。このような無細胞体液は、通常、細胞を含む体液を、例えば、遠心または濾過による処理を行い、細胞を除くことによって製造される。具体的には、無細胞体液は、無傷細胞を含まないが、細胞断片または細胞残屑を含む場合がある。無細胞液の例としては、血漿もしくは血清、または細胞を予め除去した体液がある。
【０１１１】
本明細書で使用される「遺伝子」ということばは、転写および／または翻訳調節配列および／またはコーディング領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）を含む天然（例えば、ゲノム）または合成遺伝子を指す。遺伝子のコーディング配列は、アミノ酸配列またはｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等の、機能性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であってもよい。また、遺伝子は、必要であれば５’−または３’−非翻訳配列が連結してなるコーディング領域（例えば、エキソン及びｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。遺伝子はまた、コーディング領域の全部または一部および／または５’−もしくは３’−非翻訳配列が連結してなるインビトロで製造された増幅核酸分子であってもよい。また、上記ことばは、タンパク質コーディング能を欠損したまたはもはや細胞で発現しない既知の遺伝子の機能障害関連物である、偽遺伝子を包含する。
【０１１２】
本明細書で使用される「発現プロフィール」は、ゲノム発現プロフィール、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現プロフィールを指す。プロフィールは、核酸配列のレベルを測定する公知の手段、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｃＲＮＡ等の定量的ハイブリダイゼーション(quantitative hybridization)、定量的ＰＣＲ、定量を目的とするＥＬＩＳＡなどによって得てもよく、プロフィールにより２サンプル間の異なる遺伝子発現を分析できる。被検者または患者のサンプル、例えば、細胞またはこれの集合物、例えば、組織をアッセイする。サンプルを当該分野において既知の公知の方法によって集める。問題となる核酸配列は、本明細書に記載されるものの核酸配列を含む、予想できうることが分かる核酸配列であり、この際、発現プロフィールは、列挙される核酸配列の５、１０、２０、２５、５０、１００以上（すべてを含む）の発現データを含む。「発現プロフィール」ということばはまた、測定サンプルにおける核酸配列の存在量(abundance)を測定することを意味してもよい。
【０１１３】
「異なる発現(Differential expression)」とは、細胞や組織内のおよびうちの時間的なおよび／または細胞の遺伝子発現パターンが定性的におよび／または定量的に異なることを意味する。ゆえに、異なるように発現した遺伝子は、例えば、正常な組織に対する疾患組織における、活性化または不活性化などの、発現が定性的に変化したものであってもよい。遺伝子は、他の状態に対して、特定の状態で開始しても(turned on)または停止しても(turned off)よいため、２以上の状態を比較できる。性質が調節された遺伝子は、標準的な技術によって検出可能でありうる状態または細胞タイプ内での発現パターンを示すであろう。遺伝子によっては、双方ではなく、一方の状態または細胞タイプで発現するであろう。または、発現の相違が、例えば、発現が、調節される、アップレギュレートされて、転写物の量を増加させる、またはダウンレギュレートされて、転写物の量を減少させるという点で、量的なものであってもよい。発現が相違する程度は、発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、及びＲＮａｓｅ保護等の標準的な特性評価技術により定量するのに十分大きければよい。
【０１１４】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２個のヌクレオチドが一緒に共有結合したものを指す。また、１本鎖の記述は相補鎖の配列を規定する。ゆえに、核酸はまた、記載される１本鎖の相補鎖を包含する。多くの核酸の変異体が所定の核酸と同様の目的で使用されうる。ゆえに、核酸はまた、実質的に同じ核酸およびこれらの補体を包含する。１本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズしてもよいプローブを提供する。ゆえに、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするプローブを包含する。
【０１１５】
核酸は、１本鎖であっても若しくは２本鎖であってもよく、または２本鎖及び１本鎖の配列双方の一部を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ双方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、この際、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ハイポキサンチン、イソシトチン及びイソグアニンの組み合わせを含んでもよい。核酸は、化学合成法によってまたは組換法によって得てもよい。
【０１１６】
「プライマー」ということばは、相補的な核酸分子に３’末端でハイブリダイズ可能であり、核酸ポリメラーゼによって伸長できるフリーな３’ヒドロキシル末端を提供する核酸を指す。本明細書に使用される、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれ、ストランドを加える及び除く、または逆も同様である(vice-versa)）にアニールでき、これらの間に短い領域を有する１対の核酸分子である。適当な条件下でおよび適当な試薬を用いて、このようプライマーにより、ヌクレオチド配列にプライマーが隣接する(flanked by)核酸分子を増幅できる。in situ法では、細胞または組織サンプルを、ガラススライド等の、支持体上に調製、固定化した後、ＲＮＡとハイブリダイズできるプローブと接触させてよい。発現ＲＮＡサンプルに相当する核酸の別の増幅方法としては、例えば、米国特許第７，８９７，７５０号に記載される方法がある。
【０１１７】
本明細書で使用される「プローブ」ということばは、１以上のタイプの化学結合を介して、一般的には、相補的な塩基対合を介して、一般的に水素結合形成により、相補配列を有する標的核酸に結合できるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによってプローブ配列との完全な相補性を持たない標的配列に結合してもよい。本明細書に記載される標的配列と１本鎖の核酸とのハイブリダイゼーションを妨げるような塩基対ミスマッチがあってもよい。しかしながら、変異の数が最小のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件ではハイブリダイゼーションが起こらないくらい大きい場合には、配列は相補的な標的配列ではない。プライマーは、１本鎖であってもまたは一部が１本鎖でかつ一部が２本鎖であってもよい。プローブの鎖数(strandedness)は、標的配列の構造、組成、及び特性によって記載される。プローブは、直接標識されてもまたはストレプトアビジン複合体が後に結合するようなビオチンなどで間接的に標識されてもよい。
【０１１８】
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対(Hoogsteen base pairing)を意味する。完全補体または完全に相補性があるとは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間で１００％相補的な塩基対であることを意味する。
【０１１９】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合的な混合物においてなど、第一の核酸配列（例えば、プローブ）が第二の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズするような条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる環境によって異なり、当業者は適切に選択できる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで特定の配列の熱融点(thermal melting point)（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択されてもよい。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占める）温度（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）であってもよい。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ  ７．０〜８．３で約０．０１〜０．１Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）濃度等の、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、温度が、短い（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）プローブでは少なくとも約３０℃であり、長い（例えば、約５０を超えるヌクレオチド）プローブでは少なくとも約６０℃であるような条件である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアルデヒド等の不安定化剤を添加することによって得られてもよい。選択的なまたは特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性なシグナルがバックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であってもよい。具体的なストリンジェントな条件としては下記がある：５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートする、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、この際、６５℃で０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳで洗浄する。しかしながら、塩濃度等の、温度以外のいくつかの因子はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし、当業者は同様のストリンジェンシーを達成できるように因子を適切に選択できる。
【０１２０】
本明細書で使用される「参考値」ということばは、アッセイ結果と比較した際に特定の結果に統計学的に相関する値を指す。好ましい実施形態では、参考値は、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはタンパク質の発現を既知の臨床結果と比較する研究の統計学的な分析から決定される。参考値は、閾値スコア値(threshold score value)またはカットオフスコア値(cutoff score value)であってもよい。具体的には、参考値は、それ以上（またはそれ以下）ではある結果がより起こりそうであり、かつそれ以下では別の閾値がより起こりそうである閾値であろう。
【０１２１】
一実施形態では、参考値は、健常な（病気にかかっていない）被検者のコントロール集団から採取したサンプルのｍｉＲＮＡまたはポリペプチドのレベルの平均値として表される１以上のｍｉＲＮＡまたはポリペプチドのレベルであってもよい。他の実施形態では、参考値は、異なる時期の、例えば、被検者がその疾患を発症する前にまたは治療を開始する前に測定されたレベル等の、本アッセイ前の、同じ被検者のレベルであってもよい。通常、サンプルは、共通因子によって標準化される。例えば、無細胞体液サンプルを容積体液(volume body fluid)によって標準化し、細胞を含むサンプルをタンパク質含有量または細胞数によって標準化する。また、核酸サンプルは、内部コントロール核酸に対して標準化される。
【０１２２】
本明細書に開示されるように、１以上のポリペプチドまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ）のレベルの差は、疾患またはそのステージの指標である。「レベルの差」というフレーズは、コントロールまたは参照レベルと比較した際のサンプルの、核酸等の、特定のマーカーの量の差を指す。例えば、特定のバイオマーカーの量は、参照レベルと比較して腫瘍性疾患の患者のサンプルでより多い量またはより少ない量で存在してもよい。一実施形態では、「レベルの差」は、コントロール（例えば、参考値）に比べて少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上のサンプル中に存在する特定のバイオマーカーの量の差であってもよい。一実施形態では、「レベルの差」は、コントロールに比べてサンプル中に存在するバイオマーカーの量の差が統計学的に有意な差であってもよい。例えば、バイオマーカーの測定レベルがコントロールまたは参照群の平均の約１．０標準偏差、約１．５標準偏差、約２．０標準偏差、または約２．５標準偏差から外れる場合には、差が統計学的に有意であってもよい。ｍｉＲＮＡ測定に関しては、レベルは、下記実施例に記載されるΔＣｔ値に標準化されてもよい、Ｃｔ値としてリアルタイムＰＣＲから測定されてもよい。
【０１２３】
薬剤スクリーニング
本発明は、結腸癌を処置するのに、または癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害するのに有用である化合物の同定方法を提供する。
【０１２４】
スクリーニングされる候補化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド(peptoids)、抗体、小分子、または他の薬剤）は、当該分野において既知のコンビナトリアルライブラリー法(combinatorial library method)を用いて得られる。このようなライブラリーとしては：ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性は有するが、酵素分解に耐性のある新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリューションまたはアフィニティークロマトグラフィー選択によって得られる合成ライブラリー；および「１ビーズ１化合物」ライブラリー(“one-bead one-compound” libraries)」がある。例えば、Zuckermann et al. 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685; and Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145を参照。分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、DeWitt et al., 1993, PNAS USA 90:6909; Erb et al., 1994, PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al., 1994 J. Med. Chem. 37:1233に見出される。化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）中に、またはビーズ（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., 1992, PNAS USA 89:1865-1869)、もしくはファージ（Scott and Smith 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310；及び米国特許第5,223,409号)上に提示されてもよい。
【０１２５】
有用な化合物を同定するために、試験化合物を上記転移プロモーターまたはサプレッサーから選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに操作により連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を含むシステムと接触させてもよい。上記システムは、インビトロの細胞系モデルまたはインビボの動物モデルであってもよい。細胞は、天然に上記遺伝子を発現するものであっても、または組換核酸を発現するように修飾されているものであってもよい。組換核酸は、異種プロモーターにレポーターポリペプチドをコードする核酸を有していてもよい。次に、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、またはレポーターポリペプチドの発現レベルを測定する。
【０１２６】
ポリペプチドについては、発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルのいずれかで測定されてもよい。細胞、組織サンプル、または体液におけるｍＲＮＡレベルの測定方法は、当該分野において周知である。ｍＲＮＡレベルを測定するためには、細胞を溶解し、溶解物または当該溶解物から精製もしくは半精製されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡのレベルを、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ（検出可能な程度に標識された遺伝子特異的ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いた）および定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（適当な遺伝子特異的プライマーを用いた）によって測定できる。または、組織断片または未溶解細胞懸濁液、および検出可能なように（例えば、蛍光または酵素）標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて、定量的または半定量的in situハイブリダイゼーションアッセイを行ってもよい。別のｍＲＮＡの定量方法としては、ＲＮＡ保護アッセイ(RNA protection assay)（ＲＰＡ）およびＳＡＧＥがある。また、細胞または組織サンプルにおけるタンパク質レベルの測定方法は当該分野において既知である。
【０１２７】
候補化合物が結腸癌を処置する、または癌細胞の生存、低酸素での生存(hypoxic survival)、転移性の生存(metastatic survival)、もしくは転移増殖(metastatic colonization)を阻害する際の有効性を測定するためには、上記したようにして得られたレベルをコントロールレベル（例えば、候補化合物の不存在下で得られたレベル）と比較すればよい。（ｉ）転移サプレッサーのレベルがコントロールもしくは参考値より高いまたは（ｉｉ）転移プロモーターのレベルがコントロールもしくは参考値より低い場合には、その化合物は有効であると同定される。さらに、下記実施例に開示されるようにインビトロの細胞培養モデルまたはインビボの動物モデルを用いてこのように同定された化合物の有効性を確認してもよい。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
本実施例では、下記実施例２〜１５に使用される材料および方法を記載する。
【０１２９】
インビボ選択
ルシフェラーゼレポーターを発現する１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ細胞を、２０μｌ容の１：１のＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物中に懸濁し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの肝臓に肝臓内注射した。転移小塊(Metastatic nodules)を３〜４週間の期間発達させて、生物発光イメージングによってモニターした。形成した小塊を切除して、コラゲナーゼ及びヒアロニダーゼ消化によって解離させ、単細胞懸濁液を得た。細胞をインビトロで拡張した後、マウスに再注射した。インビボ選択を３回繰り返した後、転移性の高い(highly metastatic)ＬｖＭ３ａ及びＬｖＭ３ｂ誘導細胞系を確立した。
【０１３０】
Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲライブラリースクリーニング
各細胞が単一のｍｉＲＮＡを過剰に発現するように、低い感染の多重度（ＭＯＩ）で６１１個のｍｉＲＮＡのレンチウィルスＬｅｎｔｉ−ｍｉＲライブラリー(lentivirus Lenti-miR library of 611 miRNAs)(System Biosciences)を細胞に形質導入した。次に、過剰発現すると、肝転移増殖(metastatic liver colonization)を促進または抑制したｍｉＲＮＡをインビボで選択するために、形質導入した集団をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに肝臓内注射した。レンチウィルスのｍｉＲＮＡ挿入物のゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ増幅および回収を、製造社のプロトコルに従って注射前に肝臓小塊の細胞で行った。ｍｉＲＮＡアレイプロファイリングによって、インビボ選択の前後にｍｉＲＮＡ挿入物の定量を行った。
【０１３１】
器官型スライス培養系(Organotypic slice culture system)
注射する細胞を細胞トラッカー赤または緑(cell-tracker red or green)(Invitrogen)で標識し、脾臓内注射によりＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの肝臓に接種した。次に、肝臓を取り出し、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパー(McIlwain tissue chopper)(Ted Pella)を用いて１５０μｍスライスに切り、器官型組織培養インサート(organotypic tissue culture inserts)(Millipore)に播種し、肝細胞維持サプリメントパック(Hepatocyte Maintenance Supplement Pack)(Invitrogen)を添加したウィリアムＥ培地(William’s E Medium)中で培養した。所定の期間経過後、肝臓スライスをパラホルムアルデヒドで固定し、多光子顕微鏡を用いて画像を撮影した。
【０１３２】
インビボカスパーゼ活性アッセイ(In vivo caspase activation assay)
インビボでカスパーゼ活性を測定するために、ＶｉｖｏＧｌｏ  Ｃａｓｐａｓｅ  ３／７基質(VivoGlo Caspase 3/7 Substrate)(Z-DEVD-Aminoluciferin Sodium Salt, Promega)を使用した。ルシフェリンは、ＤＥＶＤペプチドがアポトーシスを起こした細胞で活性化したカスパーゼ−３から切断されるまで不活性である。ＤＥＶＤ−ルシフェリンを、ルシフェラーゼを発現する結腸直腸癌細胞を有するマウスに注射した。アポトーシスを起こした細胞によって活性化したら、生物発光イメージング(bioluminescence imaging)を行うことによってインビボでのカスパーゼ活性を測定できる。インビボでのカスパーゼ活性を測定してから５時間後に、マウスに標準化を目的として標準ルシフェリンを注射した。
【０１３３】
アデノ随伴ウィルス療法(Adeno-associated viral therapy)
ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａを、ｓｃＡＡＶ．ＧＦＰ(Plasmid 21893, Addgene)のＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ部位にタンデムにゲノム配列が隣接した双方のｍｉＲＮＡプレカーサーから構成されるポリシストロン(polycistron)としてクローニングした。ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａをコードするゲノム配列（配列番号：５及び６）、相当するプレカーサー配列（下線、配列番号：３及び４）、ならびに相当する成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列（下線および太字、配列番号：１及び２）を以下に示す。アデノ随伴ウィルスを、Cell Biolabs製のＡＡＶ−ＤＪヘルペスフリー発現系(AAV-DJ Helper Free expression system)を用いてパッケージ、精製し、さらに力価を測定した(titered)。
【０１３４】
【化１】
2016502514.tif 000002
【０１３５】
配列番号：１〜４の相当するＲＮＡ配列（配列番号：７〜１０）を以下に示す。
【０１３６】
【化２】
2016502514.tif 000003
【０１３７】
ＣＫＢ、ＳＬＣ６ａ８ノックダウン
ＣＫＢ及びＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡヘアピン(shRNA hairpins targeting CKB and SLC6a8)を発現するｐＬＫＯベクターを、Sigma-Aldrichで注文した。転写物レベルを最良にノックダウンした２個の独立したヘアピンをすべての実験に使用した。これらのヘアピンＤＮＡ及びＲＮＡ配列を以下に挙げる。
【０１３８】
【表１】
2016502514.tif 000004
【０１３９】
下記プライマーを、ＳＬＣ６ａ８の定量的ｑＲＴ−ＰＣＲに使用した：Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  Ａ−３’およびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  Ｇ−３’（それぞれ、配列番号：２１および２２）。
【０１４０】
シクロクレアチン及びβ−グアニジオプロピオン酸処置
マウスを、１０ｍｇのシクロクレアチンまたは生理食塩水ベヒクルで処置し、腹腔内注射により投与した。上記処置レジメを腫瘍細胞を接種してから１日後に開始し、マウスを安楽死させるまで続けた。β−グアニジノプロピオン酸を腹腔内注射により０．５Ｍ溶液  ２００μｌの投与量で投与した。シクロクレアチン処置についても同様の処置レジメを行った。
【０１４１】
実施例２
結腸癌の肝転移増殖(liver colonization)の分子調節剤を同定する最初の段階として、免疫不全マウスに癌細胞を繰り返し肝臓内注射した後肝臓コロニーを外科的に切除し細胞を解離させることにより、肝転移増殖の促進用のＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌系で、インビボ選択を行った。より詳細には、５×１０５個のＬＳ−Ｐａｒｅｎｔａｌ、ＬｖＭ３ａ及びＬｖＭ３ｂ細胞による肝転移増殖を、生物発光によって直接肝臓内注射後に試験した。注射してから２１日目にマウスの画像を撮影し、肝臓をエクスビボ撮影(ex vivo imaging)及び肉眼による形態学的試験(gross morphological examination)用に肝臓を摘出した。グループの光束子率(Photon flux ratios)を得て、比較した。３代目の肝臓コロナイザー(third-generation liver colonizers)  ＬＳ−ＬｖＭ３ａ及びＬＳ−ＬｖＭ３ｂはこれらの親系に対して肝臓内注射時に肝転移増殖能が劇的に（＞５０倍）促進したことが分かった。重要なことに、これらの誘導体はまた、転移増殖アッセイ(metastatic colonization assays)において門脈循環注射時に肝転移能が劇的に（＞１５０倍）促進したことから、肝転移増殖能が結腸癌の転移進行のカギとなる段階であることが示された。これらの生物発光アッセイでは、グループのそれぞれの光子束率のすべてのＰ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づき、０．０５、０．００１、または０．０００１未満であることが分かった。
【０１４２】
転移進行のｍｉｃｒｏＲＮＡ調節剤を体系的に同定するために、それぞれが６１１個のヒトｍｉｃｒｏＲＮＡの１つをコードする、レンチウィルス粒子のライブラリーを、ＬＳ−ＬｖＭ３ｂコロナイザー集団(LS-LvM3b colonizer population)、ＬＳ−１７４Ｔ親系(LS-174T parental line)、さらにはＳＷ６２０結腸癌集団(SW620 colon cancer population)に形質導入した。次に、肝臓に転移増殖できる(capable of colonizing the liver)細胞を選択するために、６６１個のｍｉｃｒｏＲＮＡのそれぞれを発現する癌細胞を含む、これらの癌集団をマウスの肝臓内に注射した。ｍｉＲＮＡ配列のゲノムＰＣＲ増幅、逆転写、及びｍｉＲＮＡ挿入物のｍｉＲＮＡプロファイリングによって、ｍｉＲＮＡ挿入物提示(miRNA insert representation)を定量化した。いくつかのｍｉＲＮＡが、双方の結腸癌細胞系での肝転移増殖の点でドロップアウト(drop-out)を示すことが同定され、これは結腸癌細胞による肝転移増殖を抑制するこれらのｍｉＲＮＡの過剰発現と一致する。
【０１４３】
実施例３
本実施例では、これらのｍｉＲＮＡの内因性レベルが同系の転移性の低い細胞に比べて転移性の高い細胞でサイレンシングを示す(exhibit silencing)か否かを試験するアッセイを行った。確かに、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａは、親系に対して転移性の高いＬＳ−ＬＶＭ３ａ及びＬＳ−ＬＶＭ３ｂ肝臓コロナイザー(liver colonizers)でならびに同系の親系に対して転移性ＳＷ６０２誘導体でサイレンシングされることが分かった。肝転移増殖(liver colonization)でのこれらのｍｉＲＮＡの抑制の役割と一致して、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａの過剰発現はＬＳ−ＬｖＭ３ｂ細胞による転移増殖を確実に抑制した一方、転移性の低い親系ＬＳ−１７４Ｔ及びＳＷ４８０での内因性のｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａの阻害は肝転移増殖を有意に促進した。
【０１４４】
実施例４
本実施例では、これらのｍｉＲＮＡが抗転移効果を発揮するメカニズムを調べるアッセイを行った。ｍｉＲ−５５１ａ阻害はインビトロでは増殖に効果を奏さない一方で、ｍｉＲ−４８３−５ｐ阻害は増殖を向上したため、転移進行へのこれらのｍｉＲＮＡの効果は増殖能の調節に二次的に起こるものではなかった。加えて、これらのｍｉＲＮＡの過剰発現は癌細胞の浸潤能またはアポトーシス速度を変化させなかった。これらのｍｉＲＮＡが転移に影響を及ぼすメカニズムを決定するために、これらのｍｉＲＮＡを過剰発現する細胞が進行しなくなる(display a defect in progression)転移プロセス中の時点を同定するアッセイを行った。驚くべきことに、肝転移増殖アッセイのために門脈循環に細胞を注射してから２４時間という初期の段階で、これらのｍｉＲＮＡを過剰発現する細胞がコントロールヘアピンを発現する細胞に対してこれらの提示(representation)において競合して負ける(out-competed)ことが分かった。
【０１４５】
実施例５
これらのｍｉＲＮＡが肝転移増殖を抑制するメカニズムを解明するために、インビトロの器官型スライス培養系を開発した。この系により、肝臓微小環境における結腸癌細胞の単細胞播種後の肝転移中の所期事象を研究することが可能になった。転移増殖中の細胞生存への有意な選択に関する従来の研究と一致するが、時間の関数として肝臓微小環境内で細胞数が大きく減少した。転移性の高いＬｖＭ３ｂコロナイザー細胞(colonizer cells)は、転移性の低い親系に比して肝臓微小環境での維持が有意に良好であった−この結果は転移進行での肝臓内持続に関する積極的な役割と一致する。
【０１４６】
次に、このｍｉＲＮＡ調節ネットワークの癌細胞持続への効果が転移進行中の癌細胞生存の減少によって起こるのか否かを調べるアッセイを行った。インビボでの細胞死を定量するために、カスパーゼ３／７(caspace-3/7)活性のルシフェリンレポーターを用いた生物発光を使用した。
【０１４７】
より詳細には、内因性ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａが阻害されるＳＷ４８０細胞を次に脾臓内注射によって免疫不全マウスの肝臓に導入した。次に、これらの細胞における相対的なインビボカスパーゼ活性を、カスパーゼ−３活性化ＤＥＶＤ−ルシフェリンを用いてモニターした。ｍｉＲＮＡ阻害が肝転移増殖の初期段階中に結腸癌細胞のインビボカスパーゼ活性を有意に減少することが分かったことから、癌生存がこれらのｍｉＲＮＡによって抑制される表現型であることが示される。
【０１４８】
これらのインビボでの知見は、器官型スライス培養系により裏付けられた。簡潔に言うと、内因性ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａがＬＮＡによる前処置により阻害される器官型培養物（ｎ＝８）のＳＷ４８０細胞生存を、細胞トラッカー(cell-tracker)緑(LS-Parental)または細胞トラッカー赤(LvM3b)で標識し、脾臓内注射により肝臓に導入した。注射直後、肝臓を摘出し、１５０μｍスライス培養物を組織チョッパーを用いて作製した。器官型培養物における細胞の生存を、多光子顕微鏡を用いて４日間までモニターした。ダイスワップ実験(Dye-swap experiment)を行い、ダイバイアスの効果を排除した。０日及び３日目の代表的な画像を示した。ＬＳ−ＬｖＭ３ｂ細胞での双方のｍｉｃｒｏＲＮＡの過剰発現が結腸癌持続を抑制する一方で、双方のｍｉｃｒｏＲＮＡの内因性レベルの阻害は転移性の低いＳＷ４８０細胞の持続を促進することが分かった。上記知見から、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａが肝転移増殖及び肝臓の転移細胞生存−転移性の高い結腸癌細胞によって示される表現型を抑制することが示される。
【０１４９】
実施例６
本実施例では、これらのｍｉＲＮＡの下流エフェクターを同定するアッセイを行った。転写プロファイリングにより、各ｍｉｃｒｏＲＮＡの過剰発現によってダウンレギュレーションされ、ｍｉＲＮＡに相補的である３’−ＵＴＲまたはコーディング配列（ＣＤＳ）要素を含む転写物を同定した。興味深いことに、脳型クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）が双方のｍｉＲＮＡの標的として可能性のあるものとして同定されたことから、これらのｍｉＲＮＡは、共通のインビボ及び器官型表現型を示すが、共通の標的遺伝子を介して効果を調節することが示唆された。確かに、定量的ＰＣＲ検証により、ｍｉｃｒｏＲＮＡの過剰発現時のＣＫＢ転写物レベルの抑制が示された。転写性の高いＬｖＭ３ｂ細胞におけるＣＫＢの発現レベルはｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの過剰発現によって抑制されることが分かった。さらに、内因性ｍｉＲ−４８３及びｍｉＲ−５５１ａは、内因性ＣＫＢタンパク質レベルを抑制することが分かった。例えば、ＣＫＢの発現は、内因性のｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａａがＬＮＡで阻害される転移性の低いＳＷ４８０細胞ではアップレギュレートされることが分かった。突然変異誘発およびルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイから、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａが３’ＵＴＲまたはＣＫＢのＣＤＳを直接標的とすることが示された。このため、ＣＫＢコーディング配列及び３’−ＵＴＲのルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａが、それぞれ、３’−ＵＴＲ及びＣＫＢコーディング配列の相補領域を標的とすることが分かった。これらのアッセイを、変異させた相補領域で同様にして行い、少なくとも３回行った。
【０１５０】
実施例７
本実施例では、ＣＫＢが結腸癌による肝転移増殖に十分かつ必要であるかどうかを調べるアッセイを行った。
【０１５１】
簡単にいうと、５×１０５個の転移性の低いＳＷ４８０細胞及びＣＫＢを過剰発現する細胞を脾臓内に注射したマウスで、肝転移を試験した。このマウスを注射してから２８日目に安楽死させ、肝臓を生物発光イメージングのために摘出した。同様にして、５×１０５個のコントロールヘアピンまたはＣＫＢを標的にするヘアピンを発現する非常に悪性なＬｖＭ３ｂを脾臓内に注射したマウスでも、肝転移を試験した。これらのマウスを上記と同様にして注射してから２１日目に安楽死させた。
【０１５２】
転移性の低いＳＷ４８０細胞でのＣＫＢの過剰発現は３倍以上肝転移を促進するのに十分である一方、転移性ＬＳ−ＬｖＭ３ｂ細胞及びＳＷ４８０細胞でのＣＫＢノックダウンは、各系での個々のヘアピンノックダウンにより、５倍以上肝転移を確実に抑制することが分かった。ｍｉＲＮＡの効果と一致して、ＣＫＢの過剰発現は、肝臓の微小環境での結腸癌の持続能を有意に促進するのに十分であり、肝臓での提示を促進した一方で、ＣＫＢのノックダウンは、肝臓内持続を有意に低減した。このため、器官型肝臓スライス（ｎ＝８）、およびコントロールヘアピンまたはＣＫＢを標的にするヘアピンを発現するＬｖＭ３ｂ細胞の器官型スライス培養物（ｎ＝８）におけるコントロールＳＷ４８０及びＣＫＢ過剰発現ＳＷ４８０細胞の生存を試験する研究を行った。０日及び２日目に撮影した画像から、ＣＫＢ過剰発現は癌細胞の能力を有意に促進するのに十分であることが示された。これらのアッセイにおいて、Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．００１または０．０００１未満であることが分かった。
【０１５３】
ＣＫＢがｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの下流で直接作用するか否かを調べるために、ＣＫＢのコーディング配列を、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａを過剰に発現する細胞中で過剰発現させた。簡単にいうと、ＣＫＢを過剰に発現するまたは過剰に発現しない、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａを過剰に発現する５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射したマウスで転移進行を調べるアッセイを行った。生物発光イメージングによって肝転移をモニターし、マウスを注射してから３５日目に安楽死させた。ＣＫＢの過剰発現はｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａを過剰発現する細胞の抑制された肝転移表現型を救出するのに十分であることが分かった。これに対して、内因性ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａ阻害を示す細胞におけるＣＫＢのノックダウンは、ｍｉＲ−４８３−５ｐまたはｍｉＲ−５５１ａでみられる促進された転移効果を防止した。このため、ＣＫＢをノックダウンしたまたはしない、内因性ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａがＬＮＡによって阻害されたＳＷ４８０細胞を５×１０５個注射したマウスの肝転移を調べるアッセイを行った。マウスを２８日目に安楽死させて、肝臓をエクスビボ生物発光イメージング用に摘出した。上記機能獲得型変異及び機能喪失型変異実験、ならびに上位分析の結果から、ＣＫＢがｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの直接の標的であり、結腸癌転移進行の調節においてこれらのｍｉＲＮＡの下流エフェクターとして作用することが示される。これらのアッセイにおいて、Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．０５または０．００１未満であることが分かった。
【０１５４】
ＣＫＢの役割をさらに確認するために、相対的なインビボカスパーゼ活性をマウスの肝臓でコントロールＳＷ４８０及びＣＫＢ過剰発現細胞で試験した。カスパーゼ−３活性化ＤＥＶＤ−ルシフェリンを用いた生物発光によって活性を測定し、調節用ルシフェリンの生物発光シグナル（ｎ＝３）に標準化した。また、コントロールヘアピンまたはＣＫＢを標的にするヘアピンを発現し、脾臓内注射によりマウスの肝臓に導入されたＳＷ４８０細胞で、同様の相対的なインビボカスパーゼ−３活性を調べた。カスパーゼ活性を、注射してから、１日、４日、及び７日目に測定した。上記知見と一致することであるが、ＣＫＢ過剰発現は、肝転移増殖の初期段階で結腸癌細胞でのインビボのカスパーゼ−３／７を有意に減少させ、ＣＫＢノックダウンはこのカスパーゼ−３／７を有意に促進した。これらのアッセイにおいて、Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．０５または０．００１未満であることが分かった。これらの知見から、ＣＫＢは肝転移増殖中の結腸癌の生存のプロモーターであることが示される。
【０１５５】
実施例８
ＣＫＢは、ホスホクレアチンからＡＤＰへの高エネルギーリン酸基の移動を触媒してＡＴＰ及びクレアチンを生成することによって脳や腎臓等の組織の迅速に移動する高エネルギーリン酸塩のレザーバーを調節することが知られている。ホスホクレアチンからのＡＴＰのＣＫＢ生成は肝転移増殖中にエネルギー面での利点を結腸癌細胞に提供する可能性があるとの仮説があった。ＣＫＢ触媒反応の最終産物である、ＡＴＰがＣＫＢノックダウン時にみられる転移抑制を救出できるか否かを決定するために、実験転移アッセイで細胞を注射する前にＣＫＢノックダウン細胞にＡＴＰを充填した。簡単にいうと、ＣＫＢをノックダウンしたまたはしない５×１０５個のＬｖＭ３ｂを注射し、１００μＭ  ＡＴＰまたはベヒクルで予め処置したマウスで、肝転移を試験した。生物発光イメージングによって転移負荷(Metastatic burden)をモニターし、注射してから２１日目に安楽死させた。細胞のＡＴＰ充填がＣＫＢが枯渇した細胞で抑制された転移表現型を１０倍以上有意に促進するのに十分であることが分かった。ＡＴＰ充填がショートヘアピンコントロールを発現する細胞の転移活性を促進しなかったため、ＡＴＰによる救済は特異的であった。
【０１５６】
クレアチン及びホスホクレアチンがＣＫＢノックダウン時に見られる表現型を救出するか否かを決定するために、同様の研究を行った。より詳細には、ＣＫＢノックダウンの背景のある、１０μＭ  クレアチンで予め処置した５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射したマウスで肝転移を試験するアッセイを行った。次に、マウスを上記と同様にして安楽死させて、注射してから２１日目にエクスビボ生物発光イメージング用に肝臓を摘出した。また、ＣＫＢノックダウンし、１０μＭ  クレアチンリン酸で予め処置した５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射したマウスで結腸盲腸癌転移を試験した。生物発光イメージングによって肝転移をモニターし、上記と同様にしてマウスを安楽死させた。クレアチン及びクレアチンリン酸は双方とも転移抑制を救出することが分かった。
【０１５７】
結腸癌転移がクレアチンの結腸癌細胞への輸送を遮断することによって阻害できるか否かを調べるために、ＳＬＣ６ａ８を標的とするショートヘアピンを発現することによって、クレアチントランスポーターチャンネル  ＳＬＣ６ａ８がＬｖＭ３ｂ細胞で阻害された。次に、ＬｖＭ３ｂ細胞による肝転移を上記と同様にして調べた。クレアチントランスポーターチャンネル  ＳＬＣ６ａ８のノックダウンが結腸癌転移を阻害することが分かった。これらの知見から、結腸癌細胞が肝転移増殖中に生存するためのＣＫＢ生成ＡＴＰに依存することが示される。
【０１５８】
実施例９
結腸癌転移進行を制御するこの協力的ｍｉＲＮＡ調節ネットワームがヒト疾患と関連があるか否かを決定するために、１セットの６７個の原発性結腸癌およびＭＳＫＣＣで患者から得られた肝転移で、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａの発現レベルを分析した。より詳細には、３７個の原発性腫瘍サンプル及び３０個の肝転移サンプルにおけるｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって定量した。転移進行中のこれらのｍｉＲＮＡに関する転移抑制役割と一致するが、ｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａは双方とも、原発性結腸癌に対してヒト肝転移での発現レベルが有意に減少した（図１ａ；ｍｉＲ−４８３−５ｐでｐ＜０．０５及びｍｉＲ−５５１ａでｐ＜０．０５；Ｎ＝６７）。
【０１５９】
また、ＣＫＢ発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによって、３７個の原発性腫瘍サンプル及び３０個の肝転移サンプルで試験した。重要なことに、ＣＫＢ発現が、原発性結腸癌に対して肝転移で有意に上昇し（ｐ＜０．０５）、その発現がｍｉＲＮＡと有意に反対相間する(anti-correlated with)ことが分かった−これはヒト結腸癌でのこれらのｍｉＲＮＡによる直接標的と一致する（図１ｂ）。これらの知見は、従来の臨床的な組織学的分析結果と一致することから、ＣＫＢタンパク質の高レベルは癌ステージの進行にあることが示される。
【０１６０】
実施例１０
本実施例では、このｍｉＲＮＡ調節ネットワームを標的とすることの治療の可能性を調べるためのアッセイを行った。このために、多数（５００ｋ）の転移性の高いＬｖＭ３ａ細胞をマウスに注射し、２４時間後に、１本の転写物からｍｉＲ−４８３−５ｐ及びｍｉＲ−５５１ａを発現するアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を単回静脈内投与量マウスに注射した。単回治療量の双方のｍｉＲＮＡをデリバリーするアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）が５倍以上転移増殖を劇的にかつ有意に抑制することが分かった（図１ｃ）。
【０１６１】
最後に、結腸癌転移へのＣＫＢの小分子阻害およびクレアチン利用能の制限の効果を測定するアッセイを行った。クレアチンリン酸に類似する、シクロクレアチンは、クレアチンキナーゼの遷移状態アナログである。シクロクレアチンの効果を調べるために、５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、２週間シクロクレアチンで毎日処置したマウスで、肝転移の生物発光測定を行った。次に、処置が終了したら、マウスを安楽死させ、エクスビボイメージング用に肝臓を摘出した。ＣＫＢの低いインヒビター（５０００μＭ  ｋｉ）であるにもかかわらず、シクロクレアチンによるマウスの処置によって、転移増殖を有意に低減し、一般的な標準治療(standard-of-care)であるＦＯＬＦＯＸ化学療法より優れることが分かった（図１ｄ）。
【０１６２】
クレアチントランスポーターインヒビターであるβ−グアニジノプロピオン酸（Ｂ−ＧＰＡ）を用いて、同様のアッセイを行った。生物発光測定を用いて、５×１０５個のＬｖＭ３ｂ細胞を注射し、２週間Ｂ−ＧＰＡで毎日処置したマウスで、肝転移を試験した。クレアチントランスポーターチャンネルのこの拮抗阻害剤でマウスを処置することによっても転移増殖を有意に抑制することが示された（図１ｅ）。
【０１６３】
系統的なアプローチを用いて、２個のｍｉＲＮＡが、結腸癌細胞による肝転移増殖のサプレッサーとして作用することが同定された。これらのｍｉＲＮはＣＫＢを集中的に標的とする−肝臓が低酸素状態になった細胞にクレアチンリン酸からのＡＴＰ生成能を与える鍵となる遺伝子を備えることが分かった。一般的な標準治療(standard-of-care)より有効であり明白な毒性のない４種のそれぞれの治療剤を用いたこの経路の良好なターゲッティングは、ヒト結腸癌のこの経路の治療のためのターゲッティングであることが期待できる。上記インビボ選択／遺伝子スクリーニングアプローチの組み合わせは、MUlti-Gene Screening of Human genes through intra-Organ Tandem Selection（ＭＵＧＳＨＯＴＳ）と称されるが、これにより、肝転移増殖及び結腸癌による転移の強力で病気に有効な調節剤であることが効果的に同定され、癌タイプによる器官の転移増殖のコーディング及び非コーディング調節剤を発見する可能性を有する。
【０１６４】
実施例１１
本実施例では、ＳＬＣ６ａ８のインヒビターである、小分子Ｂ−ＧＰＡを投与することによるクレアチントランスポーターチャンネル  ＳＬＣ６ａ８を標的とする治療の可能性を確認するアッセイを行った。上記したように、ＬｖＭ３ｂ結腸癌細胞を注射したマウスにＢ−ＧＰＡを投与すると、処置してから２週間後に肝臓への結腸癌転移が阻害された（図１ｅ）。この治療効果を確認するために、ＬｖＭ３ｂ結腸癌細胞を注射したマウスを、３週間、毎日腹腔内注射によりＢ−ＧＰＡまたはコントロールベヒクル（ＰＢＳ）で処置した（図２）。３週間目にマウスを安楽死させ、生物発光イメージング及び肉眼による組織観察のために肝臓を摘出した。
【０１６５】
Ｂ−ＧＰＡで毎日処置することによって、インビボマウスのインビボ生物発光イメージング、摘出した肝臓の生物発光イメージングによって、および処置マウスの摘出した肝臓の肉眼による解剖学的な試験によって評価される際に、肝臓への結腸癌転移が有意に抑制されたことが分かった（図２）。より詳細には、コントロール群（Ｂ−ＧＰＡで処置せず）および処置群の生物発光イメージングによって測定される平均光子束率は、それぞれ、約８００および１００であった。Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．０５未満であることが分かった。
【０１６６】
実施例１２
本実施例では、ＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡノックダウン(shRNA knockdown targeting SLC6a8)を用いたクレアチントランスポーターチャンネル  ＳＬＣ６ａ８を標的とする治療上の有用性を評価するアッセイを行った。
【０１６７】
簡単にいうと、クレアチントランスポーターチャンネル  ＳＬＣ６ａ８を標的とする２つの別個のショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＳＬＣ６ａ８  ＃４またはｓｈＳＬＣ６ａ８  ＃５）の一方を発現するＬｖＭ３ｂ結腸癌細胞でまたはコントロールＲＮＡ（空のｐＬＫＯベクター、Sigma Aldrichで注文)をマウスに注射した（図３ａ）。再度、生物発光イメージングによって肝転移をモニターし、癌細胞を接種してから３週間でマウスを安楽死させた。肝臓を肉眼による組織観察のために摘出した。ＳＬＣ６ａ８を２個の別のｓｈＲＮＡでノックダウンすることによって結腸癌転移を阻害することが分かった（図３ａ）。
【０１６８】
ＳＬＣ６ａ８のノックダウンによる治療上の利点を確認するために、ＳＬＣ６ａ８を標的とするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＳＬＣ６ａ８  ＃２）を発現する別の結腸癌細胞系（ＳＷ４８０結腸癌細胞系）をマウスに注射した（図３ｂ）。ＳＬＣ６ａ８のノックダウンによって、ＳＷ４８０結腸癌細胞の転移を有意に阻害することが分かった（図３ｂ）。
【０１６９】
最後に、ＳＬＣ６ａ８を標的とする治療上の利点を膵臓癌細胞で調べた。これを達成するために、ＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＣ６ａ８  ＃５）またはコントロールＲＮＡ（空のｐＬＫＯベクター）のいずれかを発現するＰＡＮＣ１膵臓癌細胞をマウスに注射した。生物発光イメージングによって転移進行をモニターし、上記と同様にしてマウスを安楽死させた。２８日目に、ＳＬＣ６ａ８を標的とするｓｈＲＮＡで処置した細胞で膵臓癌転移が有意に抑制されたことが分かったことから、ＳＬＣ６ａ８は膵臓癌の治療上の標的であることが示された。
【０１７０】
実施例１３
本実施例では、ヒト結腸癌腫瘍のクレアチントランスポーターであるＳＬＣ６ａ８が転移進行と相関するか否かを調べた。
【０１７１】
これを達成するために、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、３６個の原発性結腸癌腫瘍及び３０個の転移結腸癌腫瘍でのＳＬＣ６ａ８の発現を定量した（図４）。確かに、ＳＬＣ６ａ８の発現は、原発性腫瘍（約０．５）に比べて転移性腫瘍（約１．３）で有意に高かったことから、転移におけるＳＬＣ６ａ８の中心的な役割がさらに確認された（図４）。Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．０５未満であることが分かった。
【０１７２】
実施例１４
上記したように、ｓｈＲＮＡが介在するノックダウンでクレアチントランスポーターであるＳＬＣ６ａ８を阻害することによって、結腸癌および膵臓癌双方の転移を抑制できることが示された。また、小分子インヒビターであるＢ−ＧＰＡでＳＬＣ６ａ８を阻害することによって、インビボでの結腸癌の転移について治療上の利点があることが示された。Ｂ−ＧＰＡ処置が膵臓癌で治療上の利点があるか否かを評価するために、Ｂ−ＧＰＡ処置のヒト膵臓癌細胞の生存の阻害能をマウスでインビボで評価した。
【０１７３】
簡単にいうと、ＰＡＮＣ１膵臓癌細胞を、１０ｍＭのＢ−ＧＰＡを存在させてまたは存在させずに、４８時間インキュベートした後、免疫不全マウスに注射した（各マウスで５×１０５個のＰＡＮＣ１細胞；処置及び未処置コホート(cohort)で４匹ずつのマウス）。これらのマウスについて、注射してから１日目に生物発光イメージングによって画像を撮影し、シグナルを０日に対して標準化した。治療上の利点は注射してから１日と初期に観察され、この際、生物発光イメージングで評価した際にインビボで膵臓癌細胞の腫瘍負荷(tumor burden)が有意に減少した（図４）ことから、膵臓癌についてＢ−ＧＰＡの治療上の利点が示された。より詳細には、コントロール群（Ｂ−ＧＰＡの処置なし）および処置群の生物発光イメージングによって測定される際の平均光子束率は、それぞれ、約２．７及び１．６であった。Ｐ値は、片側スチューデントｔ−検定(on one-sided Student’s t-tests)に基づいて、０．０５未満であることが分かった。
【０１７４】
実施例１５
上記実施例から、Ｂ−ＧＰＡ処置単独で、結腸癌及び脾臓癌について治療上の利点があることが示された。本実施例では、Ｂ−ＧＰＡ処置が化学療法剤である５’−フルオロウラシル及びゲムシタビンの治療活性を促進できるかを調べた。上記を達成するために、細胞生存率アッセイを行い、５’−フルオロウラシルまたはゲムシタビン単独の細胞毒性活性を、Ｂ−ＧＰＡと組み合わせた治療と比較した。
【０１７５】
簡単にいうと、１００００個のＰＡＮＣ１細胞を９６ウェルプレートに３連で播種し、４８時間、１０ｍＭのＢ−ＧＰＡと共にまたはＢ−ＧＰＡを使用せずに様々な濃度のゲムシタビン（１ｎｍ、１０ｎｍ、１００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、及び１００００００ｎｍ）で処理した。次に、細胞の生存率を、４４０ｎｍの吸光度で、生存細胞数を指標として、ＷＳＴ−１試薬(Roche Applied Science)を用いてアッセイした。図６に示されるように、治療濃度のＢ−ＧＰＡを添加することによって、ＷＳＴ−１試薬を用いた細胞生存率アッセイによって評価される際にＰＡＮＣ１膵臓癌細胞へのゲムシタビンの細胞毒性活性を促進することが分かった。
【０１７６】
同様にして、治療濃度のＢ−ＧＰＡを添加することによって、Ｌｓ−ＬｖＭ３ｂ結腸癌細胞への５’−フルオロウラシルの細胞毒性活性を促進した。このため、１０，０００個のＬｓ−ＬｖＭ３ｂ細胞を９６ウェルプレートに３連で播種し、４８時間、１０ｍＭのＢ−ＧＰＡと共にまたはＢ−ＧＰＡを使用せずに様々な濃度の５’−フルオロウラシルで処理した。次に、細胞の生存率を、４４０ｎｍの吸光度で、生存細胞数を指標として、上記と同様にしてアッセイした。図７に示されるように、これらの結果から、Ｂ−ＧＰＡが結腸直腸癌及び膵臓癌の処置を目的として一般的に使用される化学療法剤の治療活性を促進することが示される。
【０１７７】
好ましい実施形態の前記実施例および説明は、詳細に説明するものであると解されるべきであり、本発明の限定するものではなく、本請求項によって規定されると考えるべきである。容易に理解されるように、上記に記載される特徴の非常に多数の変形および組み合わせを、本請求項に記載される本発明から逸脱しない限り用いることができる。このような変形は、本発明の範囲から逸脱しないとみなされ、すべてのこのような変形は、以下の請求項の範囲内に含まれると解される。本明細書で引用されたすべての参考文献は全体を本明細書中に引用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月15日(2015.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置のためのβ−グアニジノプロピオン酸を含む薬剤。
【請求項２】
前記癌が転移性癌である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記癌が、結腸癌、転移性結腸癌または膵臓癌である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記癌が、乳癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、肝癌、胆嚢癌、前立腺癌、肉腫様癌、メラノーマ、または肺癌である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
肝臓での癌の転移増殖(metastatic colonization)を抑制するためのβ−グアニジノプロピオン酸を含む薬剤。
【請求項６】
クレアチントランスポーターチャンネル(creatine transporter channe
l)ＳＬＣ６ａ８（ＳＬＣ６ｓａ８）の発現レベルまたは活性を患者において低下させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
前記転移性癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、中皮メラノーマ(mesotheleoma melanomas)、結腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌または肝臓癌である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項８】
前記癌がｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルが所定の参考値より低いまたはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８の発現レベルが所定の参考値より高いことが決定された転移性結腸癌である、請求項２、５または７に記載の薬剤。
【請求項９】
シクロクレアチン、ＲＮＡｉ、核酸、ベクター、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、カペシタビン、ゲムシタビン、セツキシマブ、タキソール、アバスチン、ホリニン酸、レゴラフェニブ(Regorafenib)、ザルトラップ(Zaltrap)、トポイソメラーゼＩインヒビター、ＮＫＴＲ−１０２、チバンチニブ(Tivantinib)、ＰＸ−８６６、ソラフェニブ(Sorafenib)、リニファニブ(Linifanib)、キナーゼインヒビター、テラチニブ(Telatinib)、ＸＬ２８１、ロバツムマブ(Robatumumab)およびＩＧＦ１−Ｒインヒビターからなる群より選択される別の治療剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
ｍｉＲ−４８３−５ｐおよびｍｉＲ−５５１ａからなる群より選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルが所定の参考値より低いまたはＣＫＢもしくはＳＬＣ６ａ８の発現レベルが所定の参考値より高いことにより転移性結腸癌を有するまたは転移性結腸癌を有する危険性があると同定される患者の転移性結腸癌を処置するためである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
製薬上許容できる担体をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１２】
溶液形態であり、前記製薬上許容できる担体は、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、または等張塩化ナトリウム溶液を含む、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
滅菌注射用組成物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１４】
静脈内輸注により投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【国際調査報告】
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