(57)【要約】  本開示は、Ｎ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）欠失を有するグリコシルトランスフェラーゼ変異体に関する。先の知見に反して、保存されたアミノ酸モチーフ（「ＱＶＷｘＫＤＳ」）を含む特定の一部切除は、特にヒトシアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）において、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性と適合することが見出された。したがって、開示するのは、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、該酵素をコードする核酸、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの変異体を組換え的に産生するための方法および手段、ならびに、特に、免疫グロブリンなどの糖タンパク質の部分であるグリカン部分の末端アクセプター基にシアル酸付加するための、その使用である。
2016523539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼであって、該変異体のポリペプチドが、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、該一部切除が配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含み、そして変異体がグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す、前記変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
前記グリコシルトランスフェラーゼ活性が、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸から、またはその機能的同等物から、アクセプターへの、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基のトランスファーを含む化学反応を触媒し、該アクセプターが、糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分における末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである、請求項１記載の変異体。
【請求項３】
グリコシルトランスフェラーゼ活性によって触媒される前記化学反応が、前記ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸由来、またはその機能的同等物由来の５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を、β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基との反応を含み、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンが形成される、請求項１および２のいずれか記載の変異体。
【請求項４】
前記野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれか記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体のポリペプチドが、配列番号１記載の野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、該一部切除が、（ｉ）配列番号１の１位〜１００位、（ｉｉ）配列番号１の１位〜１０１位、（ｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０２位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０３位、（ｖ）配列番号１の１位〜１０４位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０５位、（ｖｉｉ）配列番号１の１位〜１０６位、（ｖｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０７位、および（ｉｘ）配列番号１の１位〜１０８位からなる群より選択される、請求項４記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体のポリペプチドが、配列番号１の１０９位〜４０６位のアミノ酸配列からなる、請求項５記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端がアフィニティタグに融合している、請求項１〜６のいずれか記載の変異体。
【請求項８】
ペプチダーゼ切断部位が、前記アフィニティタグおよび前記変異体のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の間に位置する、請求項７記載の変異体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
発現ベクターで形質転換された宿主生物において、ターゲット遺伝子の発現を促進する配列に制御可能であるように連結されたターゲット遺伝子を含む発現ベクターであって、ターゲット遺伝子が請求項９記載のヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターで形質転換されている、形質転換宿主生物。
【請求項１２】
変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、形質転換宿主生物において、請求項１〜８のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させ、ここでポリペプチドが形成され、それによって、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記産生された変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが、前記宿主生物から分泌される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主生物が真核細胞である、請求項１２および１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが精製される、請求項１２〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか記載の方法によって得られる、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの変異体。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、あるいは請求項１２〜１５のいずれか記載の方法によって得られる、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの変異体の、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸から、またはその機能的同等物から、アクセプターへの、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基のトランスファーのための使用であって、アクセプターが、モノクローナル抗体のグリカン部分における末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｎ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）欠失を有するグリコシルトランスフェラーゼ変異体に関する。先の知見に反して、保存されたアミノ酸モチーフ（「ＱＶＷｘＫＤＳ」、配列番号２）を含む特定の一部切除は、特にヒトシアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）において、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性と適合することが見出された。したがって、開示するのは、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、該酵素をコードする核酸、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの変異体を組換え的に産生するための方法および手段、ならびに、特に免疫グロブリンなどの糖タンパク質の部分であるグリカン部分の末端アクセプター基にシアル酸付加するための、その使用である。
【発明の概要】
【０００２】
トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２）は、１つの物質から別の物質への官能基のトランスファーを触媒する。酵素のスーパーファミリーであるグリコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質、糖脂質およびグリコサミノグリカンの炭水化物部分を合成する際に関与する。特定のグリコシルトランスフェラーゼは、活性化された糖ドナーの単糖部分をアクセプター分子に連続してトランスファーすることによって、オリゴ糖を合成する。したがって、「グリコシルトランスフェラーゼ」は、ヌクレオチドドナーから、ポリペプチド、脂質、糖タンパク質または糖脂質のアクセプター部分への糖部分のトランスファーを触媒する。このプロセスはまた、「グリコシル化」としても知られる。例えば糖タンパク質の構造部分である炭水化物部分はまた、「グリカン」とも呼ばれる。グリカンは、すべての既知の翻訳後タンパク質修飾のうち、最も優勢な部分を構成する。グリカンは、接着、免疫反応、神経細胞遊走および軸索伸張のように多様な、広い範囲の生物学的認識プロセスに関与する。糖タンパク質の構造部分として、グリカンはまた、タンパク質フォールディング、ならびにタンパク質安定性および生物学的活性の補助においても役割を果たす。
【０００３】
グリコシルトランスフェラーゼ触媒において、単糖単位グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＵＡ）およびキシロースは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−α−Ｄ誘導体として活性化され；アラビノースは、ＵＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化され；マンノース（Ｍａｎ）およびフコースは、それぞれ、ＧＤＰ−α−ＤおよびＧＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化され；そしてシアル酸（＝Ｎｅｕ５Ａｃ；＝ＳＡ）は、β−Ｄ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ誘導体として活性化される。
【０００４】
多くの異なるグリコシルトランスフェラーゼがグリカン合成に寄与する。糖タンパク質の炭水化物部分の構造的多様性は特に大きく、そしてこれは、複雑な生合成経路によって決定される。真核生物において、糖タンパク質のグリカン部分の生合成は、小胞体（「ＥＲ」）およびゴルジ体の管腔で行われる。糖タンパク質の単一（分枝または直鎖）炭水化物鎖は、典型的には、ＮまたはＯ連結グリカンである。翻訳後プロセシング中、炭水化物は、典型的には、アスパラギンを通じて（「Ｎ連結グリコシル化」）、あるいはセリンまたはスレオニンを通じて（「Ｏ連結グリコシル化」）、ポリペプチドに連結される。グリカン合成は、ＮまたはＯ連結のいずれであっても（＝「Ｎ／Ｏ連結」）、いくつかの異なる膜係留グリコシルトランスフェラーゼの活性によって達成される。糖タンパク質は、１またはそれより多いグリカン連結アミノ酸（＝「グリコシル化部位」）を含むことも可能である。特定のグリカン構造は、直鎖または分枝いずれでもよい。分枝は、炭水化物の顕著な特徴であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびポリペプチドに典型的な直鎖性質とは対照的である。これらの基本的構築ブロック、単糖が非常に不均一であることと組み合わせて、グリカン構造は高い多様性を示す。さらに、特定の糖タンパク質種のメンバーでは、特定のグリコシル化部位に付着するグリカンの構造は多様であることも可能であり、したがって、それぞれの糖タンパク質種の微少不均一性を生じ、すなわちポリペプチド部分の同じアミノ酸配列を共有する種が生じる。
【０００５】
シアリルトランスフェラーゼ（＝「ＳＴ」）は、ドナー化合物から（ｉ）糖脂質またはガングリオシドの末端単糖アクセプター基への、あるいは（ｉｉ）糖タンパク質のＮ／Ｏ連結グリカンの末端単糖アクセプター基への、シアル酸（＝５−Ｎ−アセチルノイラミン酸＝Ｎｅｕ５Ａｃ＝ＮＡＮＡ）残基のトランスファーを触媒する、グリコシルトランスフェラーゼである。ヒトＳＴ種を含む哺乳動物シアリルトランスフェラーゼに関しては、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ＝ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）である共通のドナー化合物がある。シアル酸残基のトランスファーはまた、「シアル酸付加する」および「シアル酸付加」とも称される。
【０００６】
シアル酸付加糖タンパク質のグリカン構造において、（１またはそれより多い）シアリル部分は、通常、オリゴ糖の末端位に見られる。末端、すなわち曝露される位であるため、シアル酸は、多くの異なる生物学的認識現象に関与し、そして異なる種類の生物学的相互作用において働くことも可能である。糖タンパク質中に１より多いシアル酸付加部位が存在してもよく、すなわちシアリルトランスフェラーゼの基質として働くことが可能であり、そしてシアル酸残基のトランスファーに適したアクセプター基であることも可能な部位が存在してもよい。こうした１より多い部位は、原則的に、糖タンパク質の異なるグリコシル化部位に係留される、複数の直鎖グリカン部分の末端であることも可能である。さらに、分枝グリカンは、シアル酸付加が起こりうる複数の部位を有しうる。
【０００７】
現在の知識によれば、末端シアル酸残基は、（ｉ）ガラクトシル−Ｒにα２→３（α２，３）連結されて、（ｉｉ）ガラクトシル−Ｒにα２→６（α２，６）連結されて、（ｉｉｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミニジル−Ｒにα２→６（α２，６）連結されて、（ｉｖ）Ｎ−アセチルグルコサミニジル−Ｒにα２→６（α２，６）連結されて、そして（ｖ）シアリジル−Ｒにα２→８／９（α２，８／９）連結されて、見出されうる、式中、−Ｒはアクセプター基質部分の残りを示す。したがって、シアリルコンジュゲートの生合成（＝「シアル酸付加」）において活性であるシアリルトランスフェラーゼは、一般的に、それぞれの単糖アクセプター基質にしたがって、そして触媒するグリコシド結合の３、６または８／９位にしたがって命名され、そして分類される。したがって、当該技術分野に知られる文献において、例えばＰａｔｅｌ  ＲＹら，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（２００６）１０８−１１６において、真核生物シアリルトランスフェラーゼに対する言及は、グリコシド結合を形成する間に、Ｎｅｕ５Ａｃ残基がトランスファーされるアクセプター糖残基のヒドロキシル位に応じて、例えば（ｉ）ＳＴ３Ｇａｌ、（ｉｉ）ＳＴ６Ｇａｌ、（ｉｉｉ）ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ、または（ｖ）ＳＴ８Ｓｉａとされる。より一般的な方式において、シアリルトランスフェラーゼに対する言及はまた、例えばＳＴ３、ＳＴ６、ＳＴ８とされることも可能である；したがって、「ＳＴ６」は、具体的には、α２，６シアル酸付加を触媒するシアリルトランスフェラーゼを含む。
【０００８】
二糖部分β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）は、糖タンパク質のＮ連結グリカンのアンテナにしばしばある末端残基であるが、また、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質にも存在しうる。酵素、β−ガラクトシド−α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（＝「ＳＴ６Ｇａｌ」）は、グリカンの末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃまたはグリカンの分枝（＝「アンテナ」）のα２，６−シアル酸付加を触媒することが可能である。その一般的な側面に関しては、ＤａｌｌＯｌｉｏ  Ｆ．  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７（２０００）６６９−６７６の文書に言及される。ヒトおよび他の哺乳動物において、ＳＴ６Ｇａｌのいくつかの種があるようである。本開示は特に、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（＝ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；ＩＵＢＭＢ酵素命名法にしたがってＥＣ  ２．４．９９．１）を扱うが、これに限定されない。
【０００９】
シアリルトランスフェラーゼのＳＴ６群は、２つの下位群、ＳＴ６ＧａｌおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃを含む。ＳＴ６Ｇａｌ酵素の活性は、グリカン中の末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃまたはグリカンのアンテナの一部である未結合（ｆｒｅｅ）ガラクトシル残基のＣ６ヒドロキシル基への、Ｎｅｕ５Ａｃ残基のトランスファーを触媒し、それによって、グリカンにおいて、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ部分のガラクトシル残基にα２→６連結された末端シアル酸残基を形成する。グリカン中に生じる新規に形成される末端部分は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃである。
【００１０】
本文書提出時点で、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の野生型ポリペプチドは、公的にアクセス可能なＮＣＢＩデータベースにおいて「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５９０７．１」として開示された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１１５４４５）。コード配列を含むさらなる情報は、データベースエントリー「ＧｅｎｅＩＤ：６４８０」内にコンパイルされるハイパーリンクとして提供される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６４８０）。
【００１１】
哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、他の哺乳動物ゴルジ常在グリコシルトランスフェラーゼと、（ｉ）短い細胞質Ｎ末端テール、（ｉｉ）膜貫通断片、その後、（ｉｉｉ）可変長のステム領域および（ｉｖ）ゴルジ体の管腔に向いたＣ末端触媒ドメインを含む、いわゆる「ＩＩ型構造」を共有する（Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．ら  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８５（２００３）３１１−３２１中）。哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、その触媒ドメイン中に有意な配列相同性を示すようである。しかし、一般に多数の真核生物グリコシルトランスフェラーゼ（すなわちシアリルトランスフェラーゼおよび他のグリコシルトランスフェラーゼを含む酵素群）の中であっても、アミノ酸配列レベルの保存されたモチーフ、すなわち配列番号２のＱＶＷｘＫＤＳコンセンサスモチーフが観察される。配列番号１（野生型配列）として示されるヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（「ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ」）にも、このモチーフが含まれ、顕著には、例えば本文書の出願時点で、公的にアクセス可能なＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１１５４４５）において、「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５９０７．１」として開示されるｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ野生型ポリペプチドのアミノ酸配列の９４〜１００位上にある。
【００１２】
Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．ら（上記）の刊行物によれば、ＱＶＷｘＫＤＳコンセンサスモチーフのアミノ酸配列は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの触媒ドメインが生物学的活性コンホメーションを獲得するために必須である。Ｄｏａｎｄｉｏ  Ｓ．らは、ＣＨＯ細胞において、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのいくつかのＮ末端一部切除変異体を発現させ、そして最初の３５、４８、６０および８９アミノ酸を含むＮ末端欠失が、突然変異酵素を生じるが、それにもかかわらず、なおシアル酸を外因性アクセプターにトランスファーする活性を有することを発見した。しかし、最初の１００アミノ酸のＮ末端欠失を持つｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ突然変異体は、これに関して不活性であることが見出された。注目すべきことに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのこの「Δ１００」欠失突然変異体は、高度に保存されたＱＶＷｘＫＤＳモチーフを欠いた。したがって、このモチーフの存在は、Ｄｏｎａｄｉｏ  Ｓ．ら（上記）によって、シアリルトランスフェラーゼ活性を促進するために必須であると結論づけられた。
【００１３】
驚くべきことに、そしてＤｏｎａｄｉｏ  Ｓ．ら（上記）の知見および解説とは矛盾して、本開示の著者らは、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ酸配列中の保存されるＱＶＷｘＫＤＳモチーフ全体を含む配列部分の欠失が、実際に、グリコシルトランスフェラーゼ活性、特にシアリルトランスフェラーゼ活性と適合しうることを見出した。
【００１４】
発明の概要
第一の側面において、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼであって、変異体ポリペプチドが、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、一部切除が配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含み、そして変異体がグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す、前記変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを報告する。第二の側面において、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を報告する。第三の側面において、発現ベクターで形質転換された宿主生物において、ターゲット遺伝子の発現を促進する配列に制御可能であるように連結されたターゲット遺伝子を含む発現ベクターであって、ターゲット遺伝子が本明細書に開示するようなヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターを報告する。第四の側面において、本明細書に開示するような発現ベクターで形質転換された、形質転換宿主生物を報告する。第五の側面において、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、形質転換宿主生物において、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させ、ここでポリペプチドが形成され、それによって、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法を報告する。第六の側面において、本明細書に開示するような方法によって得られるグリコシルトランスフェラーゼを報告する。第七の側面において、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸から、またはその機能的同等物から、アクセプターへ、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基をトランスファーするための使用であって、アクセプターが、モノクローナル抗体のグリカン部分における末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンである、前記使用を報告する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチド、ならびにΔ２７、Δ４８、Δ６２、Δ８９、およびΔ１０８変異体において一部切除されているそのＮ末端部分のアミノ酸配列の提示。一部切除中の欠失位を「Ｘ」で示す。
【図２】ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現され、そしてそこから分泌されるｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の電気泳動および染色後のＳＤＳゲル。レーン１および９はサイズ標準を含有し、標準にしたがったｋＤａの分子量を左に示す。レーン２：Δ６２；レーン３：Δ４８；レーン４：Δ２７（「クローン１０３」）；レーン５：Δ２７（「クローン１５４」）；レーン６：Δ６２（「クローン３５６」）；レーン７：Δ４８（「クローン９」）；レーン８：Δ８９（「クローン１８７」）。
【図３】ＨＥＫ細胞において一過性に発現され、そしてそこから分泌されるΔ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の電気泳動および染色後のＳＤＳゲル。レーン１はサイズ標準を含有し、標準にしたがったｋＤａの分子量を左に示す。レーン２：Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ一部切除変異体（５μｇをゲル上に装填した）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が別に明白に示さない限り、一般的に複数の指示対象が含まれる。本明細書において、「複数」は、１より多いことを意味すると理解される。例えば、複数は、少なくとも２、３、４、５またはそれより多くを指す。具体的に言及されるかまたは文脈より明らかでない限り、本明細書において、用語「または」は包括的であると理解される。
【００１７】
具体的に言及されるかまたは文脈より明らかでない限り、本明細書において、用語「約」は、当該技術分野の通常の許容の範囲内と理解され、例えば平均の２標準偏差以内である。「約」は、言及する値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解されうる。文脈から別に明らかでない限り、本明細書に提供するすべての数値は、用語「約」によって修飾可能である。
【００１８】
用語「アミノ酸」は、一般的に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質内に取り込まれうる、任意の単量体単位を指す。本明細書において、用語「アミノ酸」には、以下の２０の天然または遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸が含まれる：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは、「任意のアミノ酸」と定義されるべきである。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えばＳｔｒｙｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  第５版，  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２００２）に示される。さらなるアミノ酸、例えばセレノシステインおよびピロールリジンもまた、遺伝的にコードされうる（Ｓｔａｄｔｍａｎ（１９９６）“Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎ，”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６５：８３−１００およびＩｂｂａら（２００２）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ，”  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １２（１３）：Ｒ４６４−Ｒ４６６）。用語「アミノ酸」にはまた、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば修飾側鎖および／または主鎖を有する）、およびアミノ酸類似体も含まれる。例えば、Ｚｈａｎｇら（２００４）“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１（２４）：８８８２−８８８７、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４）  “Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｃｏｄｏｎ”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１（２０）：７５６６−７５７１、Ｉｋｅｄａら（２００３）  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １６（９）：６９９−７０６、Ｃｈｉｎら（２００３）  “Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３５）：９６４−９６７、Ｊａｍｅｓら（２００１）  “Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ  ｐｈｅｎｙｌａ��ｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １４（１２）：９８３−９９１、Ｋｏｈｒｅｒら（２００１）  “Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８（２５）：１４３１０−１４３１５、Ｂａｃｈｅｒら（２００１）  “Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｎ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｔｏｘｉｃ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅ，”  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３（１８）：５４１４−５４２５、Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら（２０００）  “Ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（５１）：４０３２４−４０３２８、およびＢｕｄｉｓａら（２００１）  “Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｛ｂｅｔａ｝−（ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）ａｌａｎｉｎｅｓ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １０（７）：１２８１−１２９２を参照されたい。さらに例示するため、アミノ酸は、典型的には、置換または非置換アミノ基、置換または非置換カルボキシ基、および１またはそれより多い側鎖または基、あるいはこれらの基いずれかの類似体を含む有機酸である。例示的な側鎖には、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組み合わせが含まれる。他の代表的なアミノ酸には、限定されるわけではないが、光活性化可能架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有または非共有相互作用するアミノ酸、光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）および／または光異性体化可能（ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ）アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的切断可能および／または光切断可能アミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ��含有アミノ酸、および１またはそれより多い毒性部分を含むアミノ酸が含まれる。
【００１９】
用語「タンパク質」は、リボソーム翻訳プロセスの産物としてのポリペプチド鎖（アミノ酸配列）を指し、ここでポリペプチド鎖は翻訳後フォールディングプロセスを経て、三次元タンパク質構造を生じる。用語「タンパク質」はまた、１またはそれより多い翻訳後修飾、例えば（限定されるわけではないが）グリコシル化、リン酸化、アセチル化およびユビキチン化を含むポリペプチドもまた含む。
【００２０】
本明細書に開示するような任意のタンパク質、特に本明細書に開示するような組換え産生タンパク質は、特定の態様において、「タンパク質タグ」を含むことも可能であり、該タグは、組換えタンパク質上に遺伝的に移植されるペプチド配列である。タンパク質タグは、タンパク質分解によってタグの除去を促進する、特異的プロテアーゼ切断部位を持つリンカー配列を含むことも可能である。特定の態様として、ターゲットタンパク質に「アフィニティタグ」を付随させて、アフィニティ技術を用いてターゲットが未精製生物学的供給源から精製可能であるようにする。例えば、供給源は、ターゲットタンパク質を発現する、形質転換された宿主生物、または形質転換された宿主生物によってターゲットタンパク質が分泌される培養上清であってもよい。アフィニティタグの特定の態様には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、広く用いられるタンパク質タグであり、特定の金属キレートマトリックスへの結合を促進する。
【００２１】
用語「キメラタンパク質」、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、そのアミノ酸配列が少なくとも２つの別個のタンパク質由来のアミノ酸配列の下位配列の融合産物に相当するタンパク質を指す。融合タンパク質は、典型的には、アミノ酸配列の直接操作によっては産生されず、むしろ、キメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。
【００２２】
用語「組換え」は、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。用語「組換え核酸」によって、本明細書において、一般的に、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで元来形成され、天然に通常見られない形である核酸を意味する。したがって、直鎖型の単離された突然変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、または通常連結されていないＤＮＡ分子を連結することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、どちらも、本発明の目的のため、組換えと見なされる。ひとたび組換え核酸が作製され、そして宿主細胞内に再導入されると、非組換え的に、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作よりもむしろ、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて、複製するであろう；が、ひとたび組換え的に産生されたこうした核酸は、続いて非組換え的に複製されるが、なお、本発明の目的のため、組換えと見なされることが理解される。「組換えタンパク質」または「組換え的に産生されたタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち上述のような組換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。
【００２３】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置された際、「制御可能であるように連結され」ている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、該配列に制御可能であるように連結されており；あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に制御可能であるように連結されている。
【００２４】
用語「宿主細胞」は、単細胞原核生物および真核生物（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、および放線菌）、ならびに細胞培養中で増殖している場合のより高次の植物または動物由来の単細胞の両方を指す。
【００２５】
用語「ベクター」は、外来ＤＮＡ片を挿入することが可能な、典型的には二本鎖のＤＮＡ片を指す。ベクターは例えばプラスミド起源のものであってもよい。ベクターは、宿主細胞中のベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有する。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に天然には見られないＤＮＡであり、例えばベクター分子を複製するか、選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードするか、あるいは導入遺伝子をコードする、異種ＤＮＡと定義される。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞内に輸送するために用いられる。ひとたび宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立にまたはそれと同時に複製することも可能であり、そしてベクターおよびその挿入ＤＮＡの数コピーを生成することも可能である。さらに、ベクターはまた、挿入ＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、または別の方式で挿入ＤＮＡの複数コピーのＲＮＡへの複製を引き起こす、必要な要素も含有することも可能である。いくつかの発現ベクターは、さらに、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させ、そして／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接する配列要素を含有する。したがって、挿入ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多くの分子が迅速に合成可能である。
【００２６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用可能であり、そしてリボース核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー、あるいはその類似体に対応させうる、ポリマーを指す。これには、ＲＮＡおよびＤＮＡなどのヌクレオチドのポリマー、ならびにその合成型、修飾型（例えば化学的にまたは生化学的に修飾された型）、および混合ポリマー（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡサブユニット両方を含む）が含まれる。例示的な修飾には、メチル化、１またはそれより多い天然存在ヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、ペンデント（ｐｅｎｄｅｎｔ）部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレ−ター、アルキル化剤、および修飾連結（例えばアルファアノマー核酸等）が含まれる。やはり含まれるのは、水素結合および他の化学的相互作用を通じて、設計される配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する、合成分子である。典型的には、ヌクレオチド単量体は、ホスホジエステル結合を通じて連結されるが、核酸合成型は、他の連結を含んでもよい（例えばＮｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００，  １９９１）に記載されるようなペプチド核酸）。核酸は、例えば、染色体または染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ、およびプライマーであってもよいし、またはこれらを含んでもよい。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよいし、そして任意の特定の長さに限定されない。別に示されない限り、特定の核酸配列は、明確に示す任意の配列に加えて、相補配列を含むかまたはコードする。
【００２７】
用語「グリコシル化」は、アクセプター基にグリコシル残基を共有カップリングさせる化学反応を示す。１つの特定のアクセプター基は、ヒドロキシル基、例えば別の糖のヒドロキシル基である。「シアル酸付加」は、アクセプター基をシアル酸（＝Ｎ−アセチルノイラミン酸）残基と反応させる、グリコシル化の特定の型である。こうした反応は、典型的には、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をドナー化合物または補助基質として用いるシアリルトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。
【００２８】
用語「グリコシル化」は、アクセプター基にグリコシル残基を共有カップリングさせる化学反応を示す。１つの特定のアクセプター基は、ヒドロキシル基、例えば別の糖のヒドロキシル基である。「シアル酸付加」は、アクセプター基をシアル酸（＝Ｎ−アセチルノイラミン酸）残基と反応させる、グリコシル化の特定の型である。こうした反応は、典型的には、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をドナー化合物または補助基質として用いるシアリルトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。
【００２９】
「シアル酸付加」は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する条件下での、該活性（特定の場合、シアリルトランスフェラーゼ酵素活性）の結果の特定の態様である。一般的に、当業者は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素反応を実行可能である（＝「グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する」）水性緩衝液が、特にｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲、より具体的にはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲に緩衝可能な、さらにより具体的には約ｐＨ６．５の溶液に緩衝可能な、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、または別の緩衝塩などの緩衝塩を用いて緩衝される必要があることを認識する。緩衝剤はさらに、限定されるわけではないがＮａＣｌなどの中性塩を含有することも可能である。さらに、特定の態様において、当業者は、二価イオン、例えばＭｇ２＋またはＭｎ２＋を含む塩、例えば限定されるわけではないがＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を水性緩衝液に添加することを考慮することも可能である。当該技術分野に知られるグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する条件には、周囲温度（室温）が含まれるが、より一般的には、０℃〜４０℃、特に１０℃〜３０℃、特に２０℃の範囲の温度が含まれる。
【００３０】
用語「グリカン」は、多糖またはオリゴ糖、すなわち、酸加水分解に際して、複数の単糖を生じる多量体化合物を指す。糖タンパク質は、典型的にはアスパラギンまたはアルギニンを通じて（「Ｎ連結グリコシル化」）あるいはセリンまたはスレオニンを通じて（「Ｏ連結グリコシル化」）、ポリペプチド鎖の側鎖に共有結合している、１またはそれより多くのグリカン部分を含む。
【００３１】
複雑なグリカン構造の酵素的合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、複雑な生理活性糖タンパク質を得るための魅力的なアプローチである。例えば、Ｂａｒｂら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８（２００９）９７０５−９７０７は、単離ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いて、免疫グロブリンＧのＦｃ断片の非常に強力なシアル酸付加型Ｆｃ断片を調製した。しかし、糖タンパク質の療法的適用に対する関心が大きくなるにつれて、シアリルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼへの要求は増加しつつある。糖タンパク質のシアル酸付加を増加させるかまたは修飾する様々な戦略は、Ｂｏｒｋ  Ｋ．ら  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９８（２００９）３４９９−３５０８に記載された。魅力的な戦略は、組換え産生タンパク質（例えば限定されるわけではないが、免疫グロブリンおよび増殖因子）、特に療法タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏシアル酸付加である。この目的に向けて、いくつかの研究グループが、形質転換生物におけるシアリルトランスフェラーゼの発現、および組換え産生シアリルトランスフェラーゼの精製を記載した。原核生物起源のグリコシルトランスフェラーゼは、通常、複雑な糖タンパク質（例えば抗体）に対しては作用しないため、哺乳動物起源由来のシアリルトランスフェラーゼが優先して研究された。
【００３２】
本開示、および本文書のすべての側面、ならびに本明細書の側面および態様の対象である特定の糖タンパク質は、限定なしに、細胞表面糖タンパク質および血清中に可溶性型で存在する糖タンパク質（「血清糖タンパク質」）、特に哺乳動物起源である糖タンパク質を含む。「細胞表面糖タンパク質」は、該糖タンパク質の部分が、表面糖タンパク質のポリペプチド鎖の膜係留部分によって、膜表面上に位置し、そして膜表面に結合しており、膜が生物学的細胞の一部である、糖タンパク質と理解される。用語「細胞表面糖タンパク質」はまた、細胞表面糖タンパク質の単離型、ならびに例えばタンパク質分解的切断によって、またはこうした可溶性断片の組換え産生によって、膜係留部分から分離されている、その可溶性断片も含む。「血清糖タンパク質」は、血清中に存在する糖タンパク質、すなわち全血の非細胞部分、例えば細胞性血液構成要素の沈降後の上清中に存在する血液タンパク質と理解される。限定なしに、具体的に考慮され、そして具体化される血清糖タンパク質は、免疫グロブリンである。本明細書に言及する特定の免疫グロブリンは、ＩｇＧ群（ガンマ重鎖によって特徴付けられる）、特に任意の４つのＩｇＧ下位群に属する。本明細書の開示、側面および態様に関して、用語「血清糖タンパク質」はまた、モノクローナル抗体を含み；人工的なモノクローナル抗体は、当該技術分野に周知であり、そして例えばハイブリドーマ細胞により、または形質転換宿主細胞を用いて組換え的に、産生可能である。さらなる血清特異的糖タンパク質は、キャリアータンパク質、例えば血清アルブミン、フェチュイン、またはフェチュインがメンバーであるヒスチジンリッチ糖タンパク質スーパーファミリーの別の糖タンパク質メンバーである。さらに、限定なしに、本明細書のすべての開示、側面および態様に関して、具体的に考慮され、そして具体化される血清糖タンパク質は、グリコシル化タンパク質シグナル伝達分子である。この群の特定の分子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。
【００３３】
糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作のため、グリコシルトランスフェラーゼを効率的なツールとして使用可能である（Ｗｅｉｊｅｒｓ  ２００８）。哺乳動物起源のグリコシルトランスフェラーゼは基質としての糖タンパク質と適合する一方、細菌グリコシルトランスフェラーゼは、通常、オリゴ糖のようなより単純な基質を修飾する。このため、糖タンパク質のグリカン部分における合成変化は、都合よくは、選択ツールとして哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを用いて行われる。しかし、糖鎖工学において、グリコシルトランスフェラーゼを大規模適用するためには、適切な酵素が多量に（すなわち産業量で）入手可能であることが必要である。本明細書に記載する本発明は、特に、一部切除欠失を含むいくつかの変異体を提供する。特に、そして驚くべきことに、Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、シアル酸付加ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素活性を示す。
【００３４】
本明細書記載の各一部切除変異体は、配列番号１記載の野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩポリペプチドのＮ末端から数えた、それぞれの一部切除欠失の最後のアミノ酸位の数字を示す「デルタ」（＝「Δ」）表示で示される。いくつかの異なるＮ末端一部切除変異体、特にΔ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（配列番号７に示すアミノ酸配列）をより詳細に研究した。
【００３５】
ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを含むいくつかのヒトグリコシルトランスフェラーゼは、メチロトローフ酵母、ピキア  パストリスにおいて、可溶性型で成功裡に発現された。しかし、わずかな量のタンパク質しか発現されず、例えばＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ：０．３単位/Ｌであった（Ｍａｌｉｓｓａｒｄら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６７（２０００）１６９−１７１）。何人かの著者らは、組換えＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現速度および可溶性を改善するための代替発現系の使用を記載する。例えば、ＦＬＡＧタグ化組換えＳＴ６Ｇａｌ−Ｉをカイコ（ｓｉｌｋｗｏｒｍ）幼虫において発現させたが、やはり収率は低かった（Ｏｇａｔａ  Ｍ．ら  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９（２００９）５４）。別のグループは、大腸菌において、細胞質ゾルおよび膜領域を欠く、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの可溶性型を発現させ、そしてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグに融合させた。しかし、ターゲット酵素の精製後、わずかな量しか得られなかった（Ｈｉｄａｒｉら  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２（２００５）１−１１）。ＵＳ  ５，０３２，５１９は、哺乳動物および昆虫細胞における、一部切除ラットＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現および単離を記載する。該酵素は、ステム領域の大部分を含む、天然存在（野生型）遺伝子のアミノ酸５８〜４０３を含有する。
【００３６】
本明細書に開示するような第一の側面は、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ変異体（突然変異体アレル）であって、変異体のポリペプチドは、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ（参照）のＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、一部切除は配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含み、そして変異体はグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す。したがって、新たに発見された変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ酵素の１つは、Ｎ末端からの欠失によって一部切除され、ここで、欠失は、配列番号２のモチーフ（「ＱＶＷｘＫＤＳ」）を含む。驚くべきことに、この変異体はグリコシルトランスフェラーゼ活性を保持する。本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、変異体は、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの欠失突然変異体であり、ここで欠失は、保存されたモチーフ「ＱＶＷｘＫＤＳ」を含むアミノ酸配列を含む隣接Ｎ末端部分（一部切除）を含み、式中、保存されたモチーフにおいて、「ｘ」は単一の可変アミノ酸を示し、そして欠失突然変異体はグリコシルトランスフェラーゼ活性を保持する。本明細書に報告するようなすべての側面の１つの特定の態様において、「ｘ」はアスパラギン（＝ＡｓｎまたはＮ）を示す。
【００３７】
本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわち本明細書に開示するような変異体グリコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、ドナー化合物からアクセプター基への５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝Ｎｅｕ５Ａｃ）残基のトランスファーを含む化学反応を触媒する。本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。本明細書に報告するようなすべての側面の特定の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃ残基のトランスファーのターゲットであるアクセプター基は、糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分における末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）のガラクトシル残基である。本明細書に報告するようなすべての側面の特定の態様において、ドナー化合物は、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃまたはＣＭＰ−ＮＡＮＡ）またはその機能的同等物である。これに関連して特定の機能的同等物はＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡである。より一般的には、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの機能的同等物は、活性化糖または糖誘導体を提供することによって、シアリルトランスフェラーゼの補助基質として働くことが可能であり、ここで糖または糖誘導体は、シアリルトランスフェラーゼの酵素触媒によって、アクセプター基にトランスファーされる。
【００３８】
ドナー化合物としてのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの特定の場合、そして本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性は、ドナー化合物ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ由来のＮｅｕ５Ａｃ残基と、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基を反応させる工程を含み、ここでＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）が形成される化学反応を触媒する。
【００３９】
本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの野生型参照分子は天然起源のものであり、すなわち、天然存在哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、特に天然存在シアリルトランスフェラーゼである。その特定の態様は、ヒト起源の酵素、特にヒトシアリルトランスフェラーゼであり、そしてより具体的には、α２，６シアル酸付加を触媒可能なシアリルトランスフェラーゼである。さらにより具体的には、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの野生型参照分子は、ヒトβ−ガラクトシド−α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ６Ｇａｌ）である。本明細書に報告するようなすべての側面の１つの態様において、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１の野生型参照分子に由来する。その特定の態様において、変異体は、Ｎ末端からの欠失によって一部切除された、配列番号１記載の野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含み、そして欠失は、配列番号２のモチーフを含み、式中、Ｘはアスパラギン（Ｎ）である。
【００４０】
（ｉ）短いＮ末端細胞質テール、（ｉｉ）膜貫通ドメインまたは（ｉｉｉ）ステム領域の欠失が、シアリルトランスフェラーゼ活性と適合することが以前見出されている一方、触媒ドメインに影響を及ぼす一部切除は、酵素活性を完全に消失させる。本開示と対照的に、従来技術は、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＮ末端アミノ酸の特定のより広範囲でない一部切除が、酵素反応に必須であるようであることを解説する。先の報告は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉアミノ酸配列において、ステムドメインおよび触媒ドメインの間の境界が、８６位のアミノ酸および１０４位のアミノ酸の間に位置することを開示する（Ｃｈｅｎ  Ｃ  ＆  Ｃｏｌｌｅｙ  Ｋ．Ｊ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（２０００）５３１−５３８）。進行性Ｎ末端一部切除によって実験を行って、触媒的に活性であるｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの最小サイズを決定した。予期されうるように、最初の８０アミノ酸を含む欠失を持つ変異体は、酵素的に活性であった。しかし、１００アミノ酸の一部切除は、酵素活性を消失させた（Ｌｅｇａｉｇｎｅｕｒら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（２００１）２１６０８−２１６１７）。別の刊行物において、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのアミノ酸配列において、残基９４〜１００を含む一部切除によって生じる不活性酵素が見出され；結果から、９４〜１００位のアミノ酸残基が、欠失された際、酵素活性に必須であることが結論づけられた。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドのアミノ酸配列中の残基９４〜１００は、ＱＶＷｘＫＤＳモチーフに対応する（Ｄｏｎａｄｉｏら、上記）。
【００４１】
本明細書に報告するようなすべての側面の特定の態様には、野生型参照ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列である変異体ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉが含まれ、そして変異体ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、（ｉ）配列番号１の１位〜１００位、（ｉｉ）配列番号１の１位〜１０１位、（ｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０２位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０３位、（ｖ）配列番号１の１位〜１０４位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０５位、（ｖｉｉ）配列番号１の１位〜１０６位、（ｖｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０７位、および（ｉｘ）配列番号１の１位〜１０８位からなる群より選択される一部切除によって特徴付けられる。
【００４２】
したがって、本明細書に報告するようなすべての側面のさらなる特定の態様には、（ｉ）配列番号１の１０１位〜４０６位、（ｉｉ）配列番号１の１０２位〜４０６位、（ｉｉｉ）配列番号１の１０３位〜４０６位、（ｖｉ）配列番号１の１０４位〜４０６位、（ｖ）配列番号１の１０５位〜４０６位、（ｖｉ）配列番号１の１０６〜４０６位、（ｖｉｉ）配列番号１の１０７位〜４０６位、（ｖｉｉｉ）配列番号１の１０８位〜４０６位、および（ｉｘ）配列番号１の１０９位〜４０６位からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００４３】
糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作のため、グリコシルトランスフェラーゼを効率的なツールとして使用可能である（Ｗｅｉｊｅｒｓ  ２００８）。哺乳動物起源のグリコシルトランスフェラーゼは基質としての糖タンパク質に適合する一方、細菌グリコシルトランスフェラーゼは、通常、オリゴ糖のようなより単純な基質を修飾する。このため、糖タンパク質のグリカン部分における合成変化は、都合よくは、選択したツールとして、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを用いて行われる。しかし、糖エンジニアリングにおいて、グリコシルトランスフェラーゼを大規模適用するためには、適切な酵素が多量に（すなわち産業量で）入手可能であることが必要である。本明細書に記載する本発明は、特に、１またはそれより多いアクセス可能なガラクトシル基質部分を含むターゲット糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏシアル酸付加に使用可能なｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素活性を持つタンパク質を提供する。適切なターゲットには、アシアロ糖タンパク質、すなわちシアリダーゼの作用によってシアル酸残基が除去されている糖タンパク質が含まれる。
【００４４】
メチロトローフ酵母、ピキア  パストリスにおいて、野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを発現させ、そして宿主生物の分泌経路に向けて、発現されるポリペプチドをターゲティングする一方、組換え産生ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの様々な、一部切除変異体を観察した。一般的に、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ由来タンパク質をクロマトグラフィ精製し、そして特に質量分析によって、そしてＮ末端からのアミノ酸配列を決定する（エドマン分解）することによって分析した。これらの手段によって、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除、特にＮ末端一部切除を詳細に性質決定した。
【００４５】
いくつかの顕著な一部切除変異体が、形質転換ピキア属株の上清中で同定された。変異体は、おそらく、酵母細胞からの分泌経過中の部位特異的タンパク質分解的切断から生じうるか、あるいは培養ピキア属株の上清中に存在する１またはそれより多い細胞外プロテアーゼによるタンパク質内分解的（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断から生じうる。
【００４６】
同定される一部切除変異体各々は、「デルタ」（＝「Δ」）表示を与えられ、これは、配列番号１に記載する野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩポリペプチドのＮ末端から数えたそれぞれの一部切除欠失の最後のアミノ酸位の数字を示す。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの５つの異なるＮ末端一部切除変異体、Δ２７（配列番号３）、Δ４８（配列番号４）、Δ６２（配列番号５）、Δ８９（配列番号６）、およびΔ１０８（配列番号７）をより詳細に研究した。
【００４７】
驚くべきことに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除変異体Δ１０８（すなわち対応する野生型ポリペプチドに存在する１〜１０８位のアミノ酸を欠くポリペプチドを含む変異体ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質）は、酵素的に活性であることが見出され；すなわち、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８一部切除変異体が、グリカンまたはグリカンのアンテナ中の末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃの一部である未結合ガラクトシル残基のＣ６ヒドロキシル基への、Ｎｅｕ５Ａｃ残基のトランスファーを触媒することが可能であり、それによって、グリカンにおいて、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ部分のガラクトシル残基にα２→６連結された末端シアル酸残基を形成する。さらに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８一部切除変異体は、糖タンパク質のグリカン部分の組成を合成的に変化させる糖エンジニアリング適用に適している。さらに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８一部切除変異体は、様々な宿主生物における組換え発現によく適しており、それによって多量で、そしてリーゾナブルなコストでのこの酵素の産生を可能にする。
【００４８】
さらに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８  Ｎ末端一部切除変異体（実施例１４の表１の「バッチ５」、「バッチ７」を参照されたい）がより活性であり、すなわち、Δ１１４一部切除変異体（実施例１４の表１中の「バッチ３」を参照されたい）を含有する調製物に比較すると、約２０倍、より活性であることが、注目に値する。したがって、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのそれぞれのＮ末端部分の除去にもかかわらず、シアル酸付加反応を触媒することが可能な酵素部分は残った。しかし、Δ１１４一部切除変異体が検出された調製物が、観察された残余活性の原因でありうる、微量のΔ１０８またはｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの別の酵素的活性変異体をさらに含有する可能性は完全には排除できなかった。これが当てはまるのであれば、Δ１１４変異体は、不活性である可能性もあった。
【００４９】
原核生物、例えば大腸菌およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、酵母、例えばサッカロミセス  セレビシエおよびピキア  パストリス、ならびに哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞を含む、多様な宿主生物における、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ野生型タンパク質の、ならびに選択された一部切除変異体の発現のために、発現ベクターを構築した。ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８一部切除変異体に関してだけでなく、他の４つの同定されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除型（Δ２７ＳＴ６、Δ４８ＳＴ６、Δ６２ＳＴ６およびΔ８９ＳＴ６）に関しても、発現構築物を含むベクターを作製した。組換え的に発現されたターゲットタンパク質の精製を容易にするため、構築物にコードされる一部切除変異体ポリペプチドには、通常、Ｎ末端Ｈｉｓタグが含まれた。
【００５０】
特定の一連の実験において、ピキア  パストリス株ＫＭ７１Ｈにおける増殖のため、発現構築物をベクター内に挿入した。発現は、典型的には、ＡＯＸ１プロモーターなどの誘導性プロモーターによって調節された。発現された一次翻訳産物を形質転換宿主の分泌経路にターゲティングすることが可能なリーダーペプチドに、Ｈｉｓタグ化一部切除変異体をさらに融合させた。翻訳後プロセシングには、したがって、それぞれのＨｉｓタグ化一部切除変異体の周囲培地内への分泌が含まれ、一方、リーダーペプチドは、分泌機構のエンドプロテアーゼによって切断された。
【００５１】
形質転換ピキア属細胞を典型的には液体培地中で培養した。発現誘導後、形質転換細胞を特定の時間、培養して、それぞれのターゲットタンパク質を産生した。培養工程の終結後、細胞および培養中に存在する他の不溶性物質を、上清から分離した。透明な上清中のｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除変異体を分析した。
【００５２】
ピキア属における最初の実験を、ターゲットタンパク質として、Ｎ末端Ｈｉｓタグ化野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉで行った。しかし、Ｎｉ−キレートアフィニティマトリックスを装填したクロマトグラフィカラムを用いた場合、活性酵素がカラム上に保持されず、フロースルー中に見られたため、上清から酵素を精製しようとする試みは失敗した。続いて、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＮ末端Ｈｉｓタグ化一部切除変異体でも類似の結果が得られた。陽イオン交換樹脂を用いた酵素（野生型および変異体）の精製は、にもかかわらず、非常に濃縮された酵素調製物を生じた。しかしこの精製法は、一般的に、酵素活性に負の影響を及ぼすようであった。
【００５３】
驚くべきことに、ＳＤＳゲル電気泳動によって性質決定した際、陽イオン交換クロマトグラフィによって精製されたすべてのｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質が、約３６ｋＤａの見かけの分子量を示した。精製のためＮｉ−キレートアフィニティマトリックスを用いる試みの負の結果と一致して、Ｎ末端配列決定および質量分析によって、Ｎ末端Ｈｉｓタグが存在しないことが確認された。形質転換ピキア属から分泌された様々な一部切除ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質の精製試料のため、いくつかのＮ末端配列は、Δ１０８、Δ１１２、およびΔ１１４一部切除を持つ変異体に対応することが見出された。広範囲のタンパク質分解産物があるのは、いくつかの一部切除機構を示すようであり、１より多いタイプのプロテアーゼによるタンパク質分解消化の結果である可能性がもっとも高い。
【００５４】
一部切除ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質試料のさらなる分析によって、該ポリペプチドから１１２を超えるアミノ酸を含む連続Ｎ末端部分を除去すると、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの酵素活性が有意に減少することが明らかになった。この知見は、活性ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素であるようである、Ｎ末端からの１０８アミノ酸の一部切除とは非常に対照的であった。しかし、Δ８９一部切除変異体に比較して、Δ１０８酵素は、約５０％の相対活性を示す。
【００５５】
Ｎ末端Ｈｉｓタグ化Δ６２  ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物を発現しそして分泌するように設計された１つのピキア  パストリス  クローンから、高活性であり、そして相同なサイズを持つｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素が単離され、そしてさらに詳細に分析された。再び、上清中の酵素はＨｉｓタグを欠いていた。Ｎ末端配列は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８変異体に対応する「ＬＱＫＩＷＫＮＹＬＳ」であることが決定された。元来の一次翻訳産物は、Ｎ末端シグナルペプチド部分に続き、Ｈｉｓタグ、その後、Δ６２  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのアミノ酸配列が続くポリペプチドであった。Δ１０８一部切除変異体が上清中に見られるため、分泌プロセスが完了した後初めて、Δ６２からΔ１０８へのさらなる一部切除が起きたと結論づけられた。この一部切除が分泌前に起きていれば、シグナルペプチド部分が未成熟に失われるために、Δ１０８ポリペプチドは分泌されなかったであろう。したがって、この知見は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＨｉｓタグ化Δ６２変異体が、細胞内区画外で、タンパク質分解消化によって一部切除されたと解釈された。
【００５６】
本明細書の開示の特定の側面は、ドナー化合物から、アクセプター基を持つ、ターゲット糖タンパク質のグリカン部分の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基への５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基のトランスファーのための、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、特にｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８変異体の使用である。その例は、免疫グロブリンＧクラスのモノクローナル抗体である。本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様において、ターゲット分子は、α２，６シアル酸付加末端アンテナ（アクセプター）残基を含まない。こうしたターゲット分子に到着するいくつかの方法のうちの１つは、グリコシダーゼ、そして特にシアリダーゼ活性を有する酵素を用いて、いかなる末端シアリル残基も除去することである。したがって、しかしシアル酸付加のためのアクセプター部位を保持する、こうした「アシアロ」ターゲットタンパク質を利用して、本開示、特に上記使用および方法によって、当業者が糖タンパク質および糖脂質から選択されるシアル酸付加ターゲット分子を調製することが可能になる。
【００５７】
本明細書に例示するように、Δ１０８変異体は、複雑なターゲット（基質）として、組換え的に産生されたヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体を用いたシアル酸付加実験において活性であり；ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体をシアル酸付加ターゲットとして用いた際も同様の知見が得られた。Δ１０８変異体をコードする発現構築物を作製し、ピキア  パストリスＫＭ７１Ｈ中にクローニングし、そして多量に発現させた。組換え的に発現されるタンパク質は、液体増殖培地内に分泌され、そしてそこから精製された。さらに、Δ１０８変異体の発現構築物をＨＥＫ２９３細胞内に導入し、一過性に発現させ、分泌させ、そして精製した。分析によって、ＨＥＫ細胞において発現されたこの変異体もまた酵素的に活性であり、すなわちモノクローナル抗体にシアル酸付加することが可能であることが確認された。
【００５８】
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの、一部切除されているが酵素的に活性である変異体（Δ１０８  ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の検出は、新規であり、そして驚くべき発見であり、そして１００を超えるアミノ酸の欠失が、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの酵素活性を完全に消失させることを示唆する現在の知識（Ｃｈｅｎ  ＆  Ｃｏｌｌｅｙ，  ２０００；  Ｌｅｇａｉｇｎｅｕｒら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ２１６０８−１７；  Ｄｏｎａｄｉｏら  ２００３）に対する貢献であった。
【００５９】
本明細書に開示するような別の側面は、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
さらに、本明細書に開示するような別の側面は、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【００６０】
さらに、本明細書に開示するような別の側面は、ターゲット遺伝子、および発現ベクターで形質転換された宿主生物におけるターゲット遺伝子の発現を促進する配列を含む、発現ベクターであり、ここで、ターゲット遺伝子は、本明細書に開示するようなヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
さらに、本明細書に開示するような別の側面は、形質転換された宿主生物であり、ここで、宿主生物は、本明細書に開示するような発現ベクターで形質転換されている。特に都合よくは、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞を用いて、本明細書に開示するような解説を実施することも可能である。これらの細胞の特定の利点は、これらが、トランスフェクションに続く培養に非常に適したターゲットであることである。したがって、ＨＥＫ細胞を効率的に用いて、組換え発現および分泌によって、ターゲットタンパク質を産生することも可能である。にもかかわらず、ＨｅＬａ、ＣＯＳおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、周知の代替物であり、そして本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様として本明細書に含まれる。
【００６２】
さらに、本明細書に開示するような別の側面は、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターで形質転換された宿主生物において発現し、ここでポリペプチドが形成され、それによって変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法である。
【００６３】
以下の項目はさらに、本明細書に提供する解説を実施するための、開示の特定の側面、および特定の態様を提供する。
１．  変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼであって、変異体ポリペプチドが、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、一部切除が配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含み、そして変異体がグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す、前記変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
【００６４】
２．  グリコシルトランスフェラーゼ活性が、ドナー化合物からアクセプター基への、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮＡＮＡ）残基のトランスファーを含む化学反応を触媒する、項目１記載の変異体。
【００６５】
３．  アクセプター基が、糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分における末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）のガラクトシル残基である、項目２記載の変異体。
【００６６】
４．  ドナー化合物が、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）またはその機能的同等物である、項目２および３のいずれか記載の変異体。
【００６７】
５．  グリコシルトランスフェラーゼ活性によって触媒される化学反応が、ドナー化合物ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ由来のＮｅｕ５Ａｃ残基を、β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基と反応させる工程を含み、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）が形成される、項目４記載の変異体。
【００６８】
６．  野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが天然起源である、項目１〜５のいずれか記載の変異体。
７．  野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼがヒト起源である、項目６記載の変異体。
【００６９】
８．  野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼがヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼである、項目７記載の変異体。
９．  変異体のポリペプチドが、配列番号１記載の野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、一部切除が配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含む、式中、Ｘがアスパラギン（Ｎ）である、項目８記載の変異体。
【００７０】
１０．  一部切除が、（ｉ）配列番号１の１位〜１００位、（ｉｉ）配列番号１の１位〜１０１位、（ｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０２位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０３位、（ｖ）配列番号１の１位〜１０４位、（ｖｉ）配列番号１の１位〜１０５位、（ｖｉｉ）配列番号１の１位〜１０６位、（ｖｉｉｉ）配列番号１の１位〜１０７位、および（ｉｘ）配列番号１の１位〜１０８位からなる群より選択される配列である、項目９記載の変異体。
【００７１】
１１．  Ｎ末端からの欠失が、配列番号１の１位から１０８位までの配列である、項目９記載の変異体。
１２．  変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、アフィニティタグに融合している、項目１〜１１のいずれか記載の変異体。
【００７２】
１３．  アフィニティタグが、４つ、５つ、６つまたはそれより多い連続ヒスチジン残基を含む、項目１２記載の変異体。
１４．  ペプチダーゼ切断部位が、アフィニティタグ、および変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の間に位置する、項目１２および１３のいずれか記載の変異体。
【００７３】
１５．  変異体のポリペプチドが、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む、項目１〜１４のいずれか記載の変異体。
１６．  項目１〜１５のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【００７４】
１７．  項目１〜１５のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
１８．  項目１〜１５のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合ポリペプチドのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００７５】
１９．  発現ベクターで形質転換された宿主生物において、ターゲット遺伝子の発現を促進する配列に制御可能であるように連結されたターゲット遺伝子を含む発現ベクターであって、ターゲット遺伝子が項目１７または項目１８記載のヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクター。
【００７６】
２０．  項目１９記載の発現ベクターで形質転換されている、形質転換宿主生物。
２１．  変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、形質転換宿主生物において、項目１〜１５のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させ、ここでポリペプチドが形成され、それによって、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法。
【００７７】
２２．  産生された酵素が宿主生物から分泌される、項目２１記載の方法。
２３．  宿主生物が真核細胞である、項目２１および２２のいずれか記載の方法。
２４．  宿主生物が酵母細胞および哺乳動物細胞より選択される、項目２３記載の方法。
【００７８】
２５．  宿主生物が、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、項目２４記載の方法。
２６．  変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが精製される、項目２１〜２５のいずれか記載の方法。
【００７９】
２７．  項目２１〜２６のいずれか記載の方法によって得られる、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの変異体であって、宿主生物が、ピキア  パストリス細胞、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞より選択される、前記変異体。
【００８０】
２８．  項目１〜１５のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、あるいは項目２１〜２６のいずれか記載の方法によって得られるヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの変異体の、ドナー化合物から、モノクローナル抗体のグリカン部分の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基への、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基のトランスファーのための使用。
【００８１】
２９．  グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する条件下で、水溶液中、以下の化合物：（ｉ）グリカン部分において末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンアクセプター基を有する糖タンパク質、（ｉｉ）ドナー化合物、（ｉｉｉ）ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの変異体であって、変異体ポリペプチドが、野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除アミノ酸配列を含み、一部切除が配列番号２のアミノ酸配列モチーフを含み、そして変異体がグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す、を接触させ、それによって、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それによって糖タンパク質にシアル酸付加する工程を含む、糖タンパク質にシアル酸付加する方法。
【００８２】
３０．  糖タンパク質が免疫グロブリン、そして特にモノクローナル抗体である、項目２９記載の方法。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、開示の特定の態様、およびその多様な使用の例示である。これらは、例示目的のみのために示し、そして開示を限定するとは解釈されないものとする。
実施例１
ＱＶＷｘＫＤＳコンセンサスモチーフを共有する真核グリコシルトランスフェラーゼに関するデータベース検索
公的に利用可能なデータベース、特に「ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ」データベース、および検索アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（＝「基本局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」）を用いて、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１９９７）３３８９−３４０２の開示にしたがって、検索を行った。モチーフＱＶＷｘＫＤＳ（配列番号２）は、例として提示される、以下のポリペプチド配列各々に見られた：
（ａ）配列ＩＤ：ｓｐ｜Ｑ６４６８５．２｜ＳＩＡＴ１＿ＭＯＵＳＥ；ベータ−ガラクトシド  アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ
（ｂ）配列ＩＤ：ｓｐ｜Ｐ１３７２１．１｜ＳＩＡＴ１＿ＲＡＴ；ベータ−ガラクトシド  アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ
（ｃ）配列ＩＤ：ｓｐ｜Ｐ１５９０７．１｜ＳＩＡＴ１＿ＨＵＭＡＮ；ベータ−ガラクトシド  アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ
実施例２
ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのクローニングおよび発現
宿主生物としてピキア  パストリス用に、最初の一連の発現構築物を設計した。一般的に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎマニュアル「ピキア属発現キット」バージョンＭ  ０１１１０２  ２５−００４３および「ｐＰＩＣＺα  Ａ、Ｂ、およびＣ」バージョンＥ  ０１０３０２  ２５−０１５０に示唆されそして記載される方法を適用した。該文献に言及されるさらなるベクター、酵母株および培地もまた参照されたい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に記載されるような、分子生物学の基本的方法を適用した。
【００８４】
各場合で、それぞれのｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物の発現は、メタノールによって誘導可能なピキア  パストリスＡＯＸ１プロモーターの調節下であった。
ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩの制限部位を用いて、各構築物を、ｐＰＩＣＺαＢベクター内にカセットとして挿入した。この方式で、シグナルペプチドのコード配列（サッカロミセス  セレビシエ由来のα因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列）が、Ｈｉｓタグ化ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチド配列（すなわち全長ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドまたはその変異体）のコード配列とインフレームで融合された。
【００８５】
シグナルペプチドおよびＨｉｓタグの間の接合領域に、前駆体ポリペプチド配列中のＫＥＸ２様プロセシング部位があり、すなわちこれは、分泌経過中に前駆体タンパク質からシグナルペプチドを切り落とすために必要なシグナルペプチダーゼ切断部位であった。Ｎ末端シグナルペプチドは、酵母の分泌経路に一次翻訳産物各々を方向付けるために適していることが見出された。その結果、組換え的に発現されたｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドは、組換えピキア  パストリス株が培養された液体培地内に搬出された。
【００８６】
ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ  Δ２７、Δ４８、Δ６２、Δ８９、Δ１０８の一部切除変異体をコードするコドン最適化（ピキア  パストリスにおける発現のため）ヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号８、１０、１２、１４、および１６に示す。配列番号９、１１、１３、１５、および１７は、ピキア  パストリスにおける発現実験に供されるｈｉｓタグ化配列を示す。各変異体由来の培養上清を産生し、そしてそこに含まれるｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素変異体を精製し、そして性質決定した。
【００８７】
実施例３
ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除変異体
いくつかの一部切除変異体を、上記実施例２に技術的に記載するように、ピキア  パストリスにおいて発現させた。
【００８８】
図１は、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ、Ｅ．Ｃ  ２．４．９９．１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー「Ｐ１５９０７」）のアミノ酸配列、配列番号１を開示し、そしてより詳細に性質決定されるポリペプチドのＮ末端部分における欠失の模式図を提示する。
【００８９】
変異体各々に関して、Ｎ末端で欠失されるアミノ酸位は、「Ｘ」によって示される。配列番号２の９４〜１００位にしたがった「ＱＶＷＮＫＤＳ」モチーフ、式中Ｘはアスパラギンである、の残基を下線で示す。
【００９０】
実施例４
形質転換および形質転換ピキア  パストリスの発酵
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ遺伝子の変異体をピキア  パストリスＫＭ７１Ｈにおいて発現させた。細胞を複合グリセロール培地中、３０℃およびｐＨ５．２で、２００のＯＤ５７８（＝５７８ｎｍの波長で測定した光学密度）まで増殖させた。２０℃に温度を下げた後、メタノールを細胞に供給することによって、それぞれの発現カセット中のＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ遺伝子の発現を誘導した。４００の最終ＯＤ５７８で、培地を４℃に冷却し、そして遠心分離によって細胞を分離した。ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの酵素変異体を含有する上清を−２０℃で保存した。
【００９１】
実施例５
哺乳動物宿主細胞における一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）のためのｐＭ１ＭＴ発現構築物のクローニング
エリスロポエチンシグナルペプチド配列（Ｅｐｏ）および４アミノ酸（「ＡＰＰＲ」）のペプチドスペーサーを用いて、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除変異体Δ１０８を一過性発現のためにクローニングした。Ｅｐｏ−ＡＰＰＲ−Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物のため、コドン最適化ｃＤＮＡを合成した。天然ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ由来ｍＲＮＡリーダーおよびＮ末端タンパク質配列を、エリスロポエチン  シグナル配列および「ＡＰＰＲ」リンカー配列と交換し、ＨＥＫ宿主細胞株の分泌機構によるポリペプチドの正しいプロセシングを確実にした。さらに、発現カセットは、あらかじめ消化したｐＭ１ＭＴベクター断片（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）のマルチクローニングサイト内へのクローニングのため、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を特徴とする。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列の発現は、それによって、ヒト  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター領域の制御下に置かれ；発現ベクターはさらに、制御された発現およびＢＧＨポリアデニル化シグナルのため、「イントロンＡ」を特徴とした。
【００９２】
ＨＥＫ細胞におけるＥｐｏ−ＡＰＰＲ−Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物（配列番号１８）の発現、および細胞上清内へのΔ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質の分泌を、実施例６に記載するように行った。
【００９３】
実施例６
形質転換ＨＥＫ細胞ならびに一過性発現および分泌
プラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）は、哺乳動物細胞培養においてタンパク質を産生する迅速戦略である。組換えヒトタンパク質の高レベル発現のため、懸濁適応ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株に基づくＴＧＥプラットホームを用いた。細胞を、血清不含培地条件下、３７℃で振盪フラスコ中で培養した。細胞をおよそ２ｘ１０６ｖｃ／ｍｌで、製造者の指針にしたがって、２９３−ＦｒｅｅＴＭ（Ｍｅｒｃｋ）トランスフェクション試薬によって複合体化したｐＭ１ＭＴ発現プラスミド（０．５〜１ｍｇ／Ｌの細胞培養）でトランスフェクションした。トランスフェクション３時間後、発現をブーストするため、ＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸を添加した（最終濃度４ｍＭ）（Ｂａｃｋｌｉｗａｌら（２００８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，  ｅ９６）。各日、培養に、６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解産物に基づくフィードを補充した。トランスフェクション７日後、遠心分離によって培養上清を収集した。
【００９４】
実施例７
シアリルトランスフェラーゼ酵素活性に関する試験
シアル酸のアシアロフェチュインへのトランスファーを測定することによって、酵素活性を決定した。反応混合物（０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）は、５１μＬの総体積中、２．５μｇの酵素試料、５μＬアシアロフェチュイン（１０ｍｇ／ｍｌ）および４μＬ  ＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡ（０．２ｍＭ）を含有した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。１０μＬの阻害剤ＣＴＰ（１０ｍＭ）を添加することによって反応を停止した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５で平衡化したＰＤ１０脱塩カラム上に、反応混合物を装填した。平衡緩衝液を用いて、カラムからフェチュインを溶出させた。分画サイズは１ｍＬであった。蛍光分光計を用いて、形成されたフェチュイン濃度を決定した。励起波長は４９０ｎｍであり、発光を５２０ｎｍで測定した。酵素活性をＲＦＵ（相対蛍光単位）として表した。
【００９５】
実施例８
ＳＤＳゲル電気泳動
ＮｕＰＡＧＥゲル（４〜１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、分析ＳＤＳゲル電気泳動を行った。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、試料を染色した。すべての方法を、製造者の推奨にしたがって実行した。
【００９６】
実施例９
エドマン分解によるＮ末端配列決定
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た試薬およびデバイスを用いたエドマン分解によって、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現された変異体のＮ末端配列を分析した。ＰｒｏＳｏｒｂ試料調製カートリッジ（カタログ番号４０１９５０）およびＰｒｏＢｌｏｔｔ  Ｍｉｎｉ  ＰＫ／１０膜（カタログ番号０１１９４）の取扱説明書に記載されるように試料調製を行った。配列決定のため、Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク質配列決定プラットフォームを用いた。
【００９７】
実施例１０
質量分析
ピキアおよびＨＥＫ細胞中で発現させたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの変異体の分子マスを質量分析において分析した。したがって、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのグリコシル化および脱グリコシル化型を調製し、そしてＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｋｅｒｓ  英国）およびＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１ソフトウェアを用いて分析した。
【００９８】
実施例１１
グリコシル化ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
質量分析測定のため、試料をエレクトロスプレー培地（２０％アセトニトリル＋１％ギ酸）中で緩衝した。ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で緩衝液交換を行った。１ｍｇ／ｍｌ濃度の２０μｇシアリルトランスフェラーゼ変異体を、あらかじめ平衡化したカラムに適用し、そして遠心分離によって、溶出させた。生じた溶出液をエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。
【００９９】
実施例１２
脱グリコシル化ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
脱グリコシル化のため、シアリルトランスフェラーゼの試料を変性させ、そして還元した。１００μｇのシアリルトランスフェラーゼに、４５μＬ変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム）および１３μＬ  ＴＣＥＰ（０．１ｍＭ、変性緩衝液中に希釈）を添加した。さらに、適切な体積の超純水を添加し、塩化グアニジニウムの全体の濃度が約４Ｍになるようにした。次いで、試料を３７℃で１時間インキュベーションした。変性剤および還元剤を除去するため、再緩衝を行った。したがって、あらかじめ超純水で平衡化したＢｉｏ−ＳｐｉｎＲ  ６  Ｔｒｉｓカラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いた。全試料をカラム上に適用し、そして遠心分離によって溶出させた。生じた溶出液に、５．５μＬの０．１Ｕ／μｌ溶液のＰＮＧアーゼＦを添加し、そして３７℃で一晩インキュベーションした。その後、試料を３０％ＡＣＮおよび１％ＦＡに調節し、そしてエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。
【０１００】
実施例１３
形質転換ピキア  パストリスＫＭ７１Ｈにおいて組換え的に発現され、そして該株から分泌されるヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の精製
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの変異体を、ピキア  パストリスＫＭ７１Ｈの発酵上清から精製した。精製は、本質的に、２つのクロマトグラフィ法によって実行された。第一の工程において、２リットルの上清を遠心分離した（１５分間、８５００ｒｐｍ）。限外濾過工程（０．２μｍ）の後、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５）に対して溶液を透析し、そして濃縮した。緩衝液Ａで平衡化したＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ迅速流カラム（５．０ｃｍｘ５．１ｃｍ）上に、透析物を装填した。６００ｍＬ緩衝液Ａで洗浄した後、酵素を、１００ｍＬ緩衝液Ａおよび１００ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌの線形勾配で溶出させ、その後、３００ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いた洗浄工程が続いた。分析ＳＤＳゲル（４〜１２％）によって、分画（５０ｍＬ）を分析した。ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを含有する分画をプールし、そして緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）に対して透析した。透析物を、緩衝液Ｃで平衡化したＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラム（１．６ｃｍｘ３．０ｃｍ）上に装填した。１５０ｍＬ緩衝液Ｃでカラムを洗浄した後、６０ｍＬ緩衝液Ｃおよび６０ｍＬ緩衝液Ｄ（５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２Ｍ  ＮａＣｌ）の線形勾配で酵素を溶出させた。分析ＳＤＳゲル電気泳動（４〜１２％）によって、分画（６ｍＬ）を分析した。ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを含有する分画をプールし、そして緩衝液Ａ＋１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。
【０１０１】
溶液中、２８０ｎｍの波長での消光（Ｅ２８０ｎｍ）として、タンパク質濃度を決定し、１．８０２の消光値が１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に対応した。精製酵素に関して、比活性を決定した。
【０１０２】
調製物の純度をＳＤＳゲル電気泳動によってチェックした。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体Δ２７、Δ４８、Δ６２およびΔ８９の各試料上清に関して、約３６ｋＤａの見かけ上均質な分子量を含む主要なタンパク質バンドが得られた（図２を参照されたい）。このバンドに対応する観察された分子量は、上清中のｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の予測されたサイズからの逸脱を示す。しかし、Δ８９変異体を分泌するクローンの上清において、４０〜５０ｋＤａの間の分子量に対応する、さらなる（しかしより豊富でない）タンパク質バンドが観察された。約３６ｋＤａの均一に得られる主要なバンドから、分泌されるタンパク質が、分泌プロセス後にタンパク質分解的に切断され、これはおそらくピキア細胞によって上清中に放出されるプロテアーゼによるものであると結論づけられた。
【０１０３】
実施例１４
形質転換ピキア  パストリスＫＭ７１Ｈ由来のヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の酵素的性質決定
実施例１３に記載するように、そして図２によってさらに示すように、遺伝子構築物のいくつかのクローンをピキア  パストリスＫＭ７１Ｈにおいて発現し、そして上清から精製した。精製後、質量分析（ＭＳ）によって、分泌されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体を分析した。表１（以下）において、各酵素試料に関して、ＭＳデータで得られる相対ピークサイズに基づき、多様なタンパク質分解的一部切除種からなる組成物が得られる。したがって、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体の特定の種の相対存在量を表１に示す。さらに、ＭＳ分析の経過中に生成される断片の時間飛行データに基づいて、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体のＮ末端断片の組成に関するさらなる情報を収集した。さらに、比活性（ＲＦＵ／μｇ；実施例７を参照されたい）を決定した。
【０１０４】
Δ２７変異体に関しては、活性酵素は上清中に見られず；このため、この場合、さらなる分析を行わなかった。
構築物Δ６２：クローン３５６のいくつかの精製試料は、高い比活性を示すことが見出された。試料中に存在するｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体のＮ末端配列を決定した。Ｎ末端「ＬＱＫＩＷＫＮＹＬＳ」は、試料中に一貫して見出され；これは、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８  Ｎ末端一部切除変異体に対応する。
【０１０５】
別個の培養バッチ由来のΔ６２：クローン３５６の上清から、別の調製物が得られ；これは約７５％のΔ１１４  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉおよび約２５％のΔ１１２  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの混合物を含むことが見出された。これは、Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体に関して測定される比活性の約１０％である比活性を示した。この比較的低い比活性から、１１２アミノ酸残基またはそれより多い残基の欠失は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ一部切除変異体酵素の活性を有意に減少させると結論づけられた。主にΔ１１４  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉからなる酵素調製物は、測定可能ではあるが、非常に減少した活性を有することが見出された。しかし、測定可能な活性は、検出を逃れたにも関わらず、少量のより大きな一部切除変異体に起因する可能性もある。
【０１０６】
表１：
形質転換ピキア  パストリスＫＭ７１Ｈ上清から単離された、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの組換え的に発現された一部切除変異体Δ４８、Δ６２およびΔ１０８の分析データ
【０１０７】
【表１】
2016523539.tif 000003
ｎ．ｄ．＝未決定
【０１０８】
実施例１５
形質転換ＨＥＫ細胞の上清からのヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ１０８  Ｎ末端一部切除変異体の精製
実施例６に記載するように、ＨＥＫ細胞を形質転換した。実施例５に記載するように、発現構築物を調製した。特定のｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列は、Δ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ  Ｎ末端一部切除変異体をコードするヌクレオチド配列であり、したがって、発現される構築物はＥｐｏ−ＡＰＰＲ−Δ１０８−ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉであった。
【０１０９】
酵素変異体のＨＥＫ細胞発酵の上清から、単純化精製プロトコルを用いて精製した。第一の工程において、０．１リットルの培養上清を濾過し（０．２μｍ）、溶液を緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５）に対して透析した。緩衝液Ａで平衡化したＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  ｆｆ（迅速流）カラム（１．６ｃｍｘ２ｃｍ）上に、透析物を装填した。１００ｍＬ緩衝液Ａで洗浄した後、酵素を、１０ｍＬ緩衝液Ａおよび１０ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌの線形勾配で溶出させ、その後、４８ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いた洗浄工程が続いた。分析ＳＤＳゲル電気泳動によって、分画（４ｍＬ）を分析した。酵素を含有する分画をプールし、そして保存緩衝液（２０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）に対して透析した。１．８７１のモル濃度消光係数を用いて、２８０ｎｍの波長でタンパク質濃度を決定した。Ｅｐｏ−ＡＰＰＲ−Δ１０８−ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ発現構築物で形質転換したＨＥＫ細胞から分泌される組換えタンパク質の質量分析によって、Ｎ末端配列「ＡＰＰＲ」が確認され、したがって、シグナルペプチダーゼによるＥＰＯシグナル配列の予期される切断が示された。ＨＥＫ細胞由来の組換えヒトΔ１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体に関しては、＞６００ＲＦＵ／μｇの比活性が測定された。
【図１】
2016523539.tif 000004
【図２】
2016523539.tif 000005
【図３】
2016523539.tif 000006
【配列表】
2016523539000001.app
【国際調査報告】
2016523539.tif 000007
2016523539.tif 000008
2016523539.tif 000009