(57)【要約】  ３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物の、ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏへの変換を触媒する活性を向上させたアルケノールデヒドラターゼ変異体が記載されている。特に、例えばブタ−２−エン−１−オール（クロチルアルコール）の１，３ブタジエンへの変換において向上した活性を有し、かつ／またはブタ−３−エン−２−オールの１，３ブタジエンへの変換において向上した活性を有し、かつ／または３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）もしくは３−メチルブタ−３−エン−２−オール（イソプレノール）のイソプレンへの変換において向上した活性を有し、かつ／または２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オールのジメチルブタジエンへの変換において向上した活性を有するアルケノールデヒドラターゼ変異体が記載されている。2016523524.tif 000033
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルケノールデヒドラターゼ変異体であって、それが由来するアルケノールデヒドラターゼの活性よりも向上した活性で一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する少なくとも１つのアルケノール化合物を共役ジエンＣｎＨ２ｎ−２に変換することができ、３＜ｎ＜７であることを特徴とする、アルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項２】
（ｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールもしくはブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、１，３ブタジエンである；または
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、イソプレンである；または
（ｉｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、ジメチルブタジエンである、請求項１に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項３】
（ａ）クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができ、クロチルアルコールから１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも０．０３３×１０−３ｓ−１であることを特徴とする；または
（ｂ）ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができ、ブタ−３−エン−２−オールから１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも１．１×１０−４ｓ−１であることを特徴とする；または
（ｃ）プレノールをイソプレンに変換することができ、プレノールからイソプレンへの回転速度が少なくとも３．３×１０−４ｓ−１であることを特徴とする；または
（ｄ）イソプレノールをイソプレンに変換することができ、イソプレノールからイソプレンへの回転速度が少なくとも３．３×１０−５ｓ−１であることを特徴とする
アルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項４】
前記アルケノールデヒドラターゼ変異体が、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、請求項１から３のいずれか一項に記載のアルケノールデヒドラターゼの変異体。
【請求項５】
アルケノールデヒドラターゼの変異体であって、クロチルアルコールの１，３ブタジエンへの変換において、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも向上した活性を示し、前記アルケノールデヒドラターゼ変異体が、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、アルケノールデヒドラターゼの変異体。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼが、一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する少なくとも１つのアルケノール化合物の共役ジエンＣｎＨ２ｎ−２への変換において向上した活性を有する、請求項４または５に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項７】
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンもしくはトリプトファンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニン、アラニン、グリシン、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、チロシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニン、ロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、セリン、イソロイシン、グルタミン、バリン、アスパラギン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グリシンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジン、トリプトファン、アルギニン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、トレオニン、バリン、グルタミンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシン、メチオニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２２７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、バリンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、トレオニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、セリン、ロイシンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置５０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジン、アルギニンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはシステインで置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはフェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている、
請求項４または５または６に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項８】
前記アルケノールデヒドラターゼ変異体が、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、請求項１から３のいずれか一項に記載のアルケノールデヒドラターゼの変異体。
【請求項９】
アルケノールデヒドラターゼの変異体であって、ブタ−３−エン−２−オールの１，３ブタジエンへの変換において、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも向上した活性を示し、前記アルケノールデヒドラターゼ変異体が、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、アルケノールデヒドラターゼの変異体。
【請求項１０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼが、ブタ−３−エン−２−オールの１，３ブタジエンへの変換において向上した活性を有する、請求項８または９に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項１１】
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、セリン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、グリシンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンもしくはグリシンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２２７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン酸もしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリン、メチオニンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、アスパラギンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、システインで置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている、
請求項４または９または１０に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項１２】
アルケノールデヒドラターゼの変異体であって、イソプレノールおよび／またはプレノールのイソプレンへの変換において、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも向上した活性を示し、前記アルケノールデヒドラターゼ変異体が、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、アルケノールデヒドラターゼの変異体。
【請求項１３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼが、イソプレノールおよび／またはプレノールのイソプレンへの変換において向上した活性を有する、請求項１２に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項１４】
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、リジン、アルギニン、グルタミン、メチオニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニンもしくはグリシンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリン、イソロイシンもしくはシステインで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジン、グルタミン、アルギニンもしくはグリシンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミン酸で置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはグリシンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、グルタミンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンもしくはアスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンもしくはグルタミン酸で置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸もしくはトレオニンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、プロリンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、バリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニン、トリプトファン、トレオニンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アニリンもしくはアスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸もしくはフェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸もしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、ヒスチジンもしくはプロリンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている；かつ／または
（７１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（７２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（７３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸もしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（７４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（７５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている、
請求項１２または１３に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物の、ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏへの変換のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアルケノールデヒドラターゼ変異体または請求項１７に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１９】
３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物から一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物を産生する方法であって、
（ｉ）請求項１７に記載の宿主細胞を適切な培地中で培養するステップ；および
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する産生された前記化合物を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２０】
（ｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールもしくはブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、１，３ブタジエンである；または
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、イソプレンである；または
（ｉｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物が、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する前記化合物が、ジメチルブタジエンである、請求項１８に記載の使用または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する前記化合物を産生することができる細胞である、請求項１８もしくは２０に記載の使用、または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
【請求項２２】
酵素的変換がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される、請求項１８もしくは２０、または２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物の、ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏへの変換を触媒する活性を向上させたアルケノールデヒドラターゼ変異体に関する。特に、本発明は、例えばブタ−２−エン−１−オール（クロチルアルコール）の１，３ブタジエンへの変換における活性を向上させた、かつ／またはブタ−３−エン−２−オールの１，３ブタジエンへの変換における活性を向上させた、かつ／または３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）もしくは３−メチルブタ−３−エン−２−オール（イソプレノール）のイソプレンへの変換における活性を向上させた、かつ／または２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オールのジメチルブタジエンへの変換における活性を向上させたアルケノールデヒドラターゼ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタジエン（１，３ブタジエン）は、式Ｃ４Ｈ６の共役ジエンである。これは、合成ゴムの生産におけるモノマーとして用いられる重要な工業化学物質である。ブタジエンを生産する様々な可能性が存在する。ブタジエンは、例えば、エチレンおよび他のオレフィンを生産するのに用いられる蒸気クラッキングプロセスの副産物として生産される。このプロセスでは、ブタジエンは、Ｃ４ストリームにおいて生じ、通常は、アセトニトリル等の極性非プロトン溶媒中への抽出によって他の副産物から単離されて、次にそこから取り出される。ブタジエンはまた、標準的なブタンの触媒的脱水素によって生産されてもよいし、エタノールから生産されてもよい。後者の場合、２つの異なるプロセスが用いられる。単一ステッププロセスにおいて、エタノールは、金属酸化物触媒上で４００〜４５０℃にて、ブタジエン、水素および水に変換される（Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene. In M. Grayson (Ed.), Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 4, pp. 313-337. New York: John Wiley & Sons）。ツーステッププロセスにおいて、エタノールはアセトアルデヒドに酸化し、これがタンタル促進多孔質シリカ触媒上で３２５〜３５０℃にて付加的なエタノールと反応して、ブタジエンが生じる（Kirshenbaum, I. (1978)、先に引用）。ブタジエンはまた、標準的なブテンの触媒的脱水素によって生産されてもよい。
【０００３】
過去２０年間で、遺伝子工学技術により微生物の代謝の修飾が可能となったので、普通であれば低い収率で産生されるであろう重要な物質を産生するのに用いることが可能となった。天然に存在する代謝経路を増強することによって、この技術は、産業関連の多数の化合物を生物生産する新しい方法を切り開いている。動物飼料、生物分解性プラスチックまたはテクスタイル繊維用のアミノ酸等のいくつかの産業化合物は、今では、遺伝子修飾生物を用いてルーチン的に産生されている。しかしながら、石油化学的に誘導される主な分子、特にブタジエンの大規模生産用に微生物を適所に用いるバイオプロセスは存在しない。これは、ブタジエンの天然の生産者としての微生物が、少量ですら知られていないためである。世界中で生産されている大量のゴム、ならびに化学プロセスを用いるブタジエン生産についての環境懸念の増大および資源の制限を考えると、ブタジエンの生産のための代替の、環境に優しく持続可能なプロセスを提供する必要がある。イソプレンまたはジメチルブタジエン等の他の共役ジエンの生産についても同様である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近の研究により、デヒドラターゼ、特にリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼを利用する酵素的プロセスを介して、クロチルアルコールおよびブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することによってブタジエンを生成することが可能であることが示された。同酵素はまた、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する他の化合物をＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏに変換するのに用いられてもよい（図１）。
【０００５】
しかしながら、天然に存在する酵素の回転速度は、産業用途にまだ適していないので、改良の必要がある。即ち、そのような酵素の活性を増大させること、特に上記のプロセスの効率の更なる増大に関して、酵素を産業目的により適したものとすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特許請求の範囲に定義される実施形態を提供することによって、この必要に対処する。
【０００７】
ゆえに、本発明は、アルケノールデヒドラターゼ変異体であって、それが由来するアルケノールデヒドラターゼの活性よりも向上した活性で一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する少なくとも１つのアルケノール化合物を、共役ジエンＣｎＨ２ｎ−２に変換することができることを特徴とするアルケノールデヒドラターゼ変異体を提供する。
【０００８】
特に、本発明は、以下の対応するアルケノールデヒドラターゼ変異体を提供する
（ｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールもしくはブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、１，３ブタジエンである；または
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、イソプレンである；または
（ｉｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、ジメチルブタジエンである。
【０００９】
ゆえに、変換されることになる化合物は、特に、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールまたはブタ−３−エン−１−オール（１，３ブタジエンとなる）であってもよいし、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールまたは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オール（イソプレンとなる）であってもよいし、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールまたは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オール（ジメチルブタジエンとなる）であってもよい。向上した酵素変異体、または活性を増大させて反応を触媒することができる酵素変異体は、野生型酵素と異なっており、かつ、先に定義されるアルケノールの、共役ジエンへのそれぞれの変換を触媒することで、酵素変異体の比活性は、アルケノール基質の少なくとも１つの与えられた濃度について、野生型酵素の比活性よりも高い（好ましくは、０Ｍよりも高く最大１Ｍである任意のアルケノール濃度）酵素変異体として定義される。比活性は、時間のユニット単位および酵素のモル単位での産物モルに変換された基質モルの数と定義される。Ｋｃａｔ（回転数）は、基質の飽和濃度での比活性である。
【００１０】
特に、この第１の態様によれば、本発明は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができ、クロチルアルコールから１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも０．０３３×１０−３ｓ−１である酵素を提供する。そのような酵素は、アルケノールデヒドラターゼ内の特定位置に突然変異を生じさせることによって提供されてよく、そのような突然変異を生じさせることによって得られる変異体は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換を触媒することにおいて向上した活性を示す。好ましい実施形態において、当該酵素は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができ、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも０．０５×１０−３ｓ−１、少なくとも０．１×１０−３ｓ−１、少なくとも０．１５×１０−３ｓ−１または少なくとも０．２×１０−３ｓ−１、より好ましくは少なくとも０．５×１０−３ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１．０×１０−３ｓ−１である。特に好ましい実施形態において、当該酵素は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの回転速度が、少なくとも２×１０−３ｓ−１であり、特に好ましい実施形態において、少なくとも４×１０−３ｓ−１である。最も好ましい実施形態において、当該酵素は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの回転速度が、少なくとも１０×１０−３ｓ−１、少なくとも１ｓ−１、または少なくとも１０ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１００ｓ−１である。対応する野生型酵素は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの回転速度が、約０．０３×１０−３ｓ−１である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができ、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１．５倍高い酵素を提供する。好ましい実施形態において、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素は、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または実に少なくとも１０倍高い。さらにより好ましい実施形態において、回転速度は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１００倍、または実に少なくとも５００倍高い。
【００１２】
クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素の回転速度は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この回転速度は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この回転速度は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、回転速度が評価されることになる酵素は、以下で概説されるように判定されてよい：クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数が、以下のプロトコルを用いて判定されてよい：アルケノールデヒドラターゼ変異体が、市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ−２５ｂ＋またはｐＥＴ  ＤＥＳＴ細菌発現ベクター中にサブクローニングされて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換されて、適切な抗生物質が補われたＬＢアガープレート上にプレーティングされる。単離された形質転換体が用いられて、自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種され、培養物が、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートされる。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットは、−８０℃にて一晩保存されてから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁され、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）が補われる。細胞懸濁液は、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートされる。細胞溶解物が、遠心分離によって澄明にされ、上清は、濾過コンセントレータを用いて２倍濃縮される。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定される。酵素反応が、４５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のトランスクロチルアルコール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定される。バイアルは封をされて、３７℃にて１から６時間インキュベートされる。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止され、産生された１，３ブタジエンは、実施例７に記載されるガスクロマトグラフィーによって定量化される。反応によって産生される１，３ブタジエンの絶対量を定量化するために、ガスクロマトグラフは、純粋なブタジエン（１から１０，０００ｐｐｍ）の濃度範囲を用いて較正される。較正表は、この範囲のブタジエン濃度において線形である。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）は、トランスクロチルアルコールの濃度の関数としてプロットされ、曲線は、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめられて、ｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）が抽出される��
【００１３】
さらに、第１の態様によれば、本発明はまた、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができ、ブタ−３−エン−２−オールから１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも１．１×１０−４ｓ−１である酵素を提供する。そのような酵素は、アルケノールデヒドラターゼ内の特定位置に突然変異を生じさせることによって提供されてよく、そのような突然変異を生じさせることによって得られる変異体は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換を触媒することにおいて向上した活性を示す。好ましい実施形態において、当該酵素は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができ、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの回転速度が少なくとも５×１０−４ｓ−１、より好ましくは少なくとも１×１０−３ｓ−１または５×１０−３ｓ−１、特に好ましくは少なくとも１０．０×１０−３ｓ−１である。最も好ましい実施形態において、当該酵素は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの回転速度が、少なくとも１３×１０−３ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも２０×１０−３ｓ−１、少なくとも１ｓ−１、または少なくとも１０ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１００ｓ−１である。対応する野生型酵素は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの回転速度が、約１．０×１０−４ｓ−１である。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができ、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１．５倍高い酵素を提供する。好ましい実施形態において、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素は、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または実に少なくとも１０倍高い。さらにより好ましい実施形態において、回転速度は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１００倍、または実に少なくとも５００倍高い。
【００１５】
ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素の回転速度は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この回転速度は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この回転速度は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、回転速度が評価されることになる酵素は、以下で概説されるように判定されてよい：ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔ（ｓ−１）およびＫｍ値（ｍＭ）定常状態運動定数が、以下のプロトコルを用いて判定されてよい：アルケノールデヒドラターゼ変異体が、市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ−２５ｂ＋細菌発現ベクター中にサブクローニングされて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換されて、適切な抗生物質が補われたＬＢアガープレート上にプレーティングされる。単離された形質転換体が用いられて、自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種され、培養物が、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートされる。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットは、−８０℃にて一晩保存されてから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁され、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）が補われる。細胞懸濁液は、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートされる。細胞溶解物が、遠心分離によって澄明にされ、上清は、遠心コンセントレータを用いて２倍濃縮される。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定される。酵素反応が、４５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のブタ−３−エン−２−オール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定される。バイアルは封をされて、３７℃にて１から６時間インキュベートされる。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止され、産生された１，３ブタジエンは、先に記載されるガスクロマトグラフィーによって定量化される。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）は、ブタ−３−エン−２−オールの濃度の関数としてプロットされ、曲線は、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめられて、ｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）が抽出される。
【００１６】
さらに、第１の態様によれば、本発明はまた、プレノールをイソプレンに変換することができ、プレノールからイソプレンへの回転速度が少なくとも３．３×１０−４ｓ−１、好ましくは少なくとも５×１０−４ｓ−１、より好ましくは少なくとも１×１０−３ｓ−１、少なくとも１×１０−２ｓ−１、または少なくとも１×１０−１ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも５×１０−１ｓ−１、少なくとも９×１０−１ｓ−１、少なくとも１ｓ−１、または少なくとも１０ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１００ｓ−１である酵素を提供する。対応する野生型酵素は、プレノールの、イソプレンへの回転速度が、約３．０×１０−４ｓ−１である。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、プレノールをイソプレンに変換することができ、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１．５倍高い酵素を提供する。より好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することができる酵素は、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または実に少なくとも１０倍高い。さらにより好ましい実施形態において、回転速度は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１００倍、または実に少なくとも５００倍高い。
【００１８】
そのような酵素は、アルケノールデヒドラターゼ内の特定位置に突然変異を生じさせることによって提供されてよく、そのような突然変異を生じさせることによって得られる変異体は、プレノールの、イソプレンへの変換を触媒することにおいて向上した活性を示す。プレノールをイソプレンに変換することができる酵素の回転速度は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この回転速度は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この回転速度は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、回転速度が評価されることになる酵素は、以下で概説されるように判定されてよい：プレノールの、イソプレンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数が、以下のプロトコルを用いて判定されてよい：試験されることになるアルケノールデヒドラターゼ変異体が、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングされて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換されて、適切な抗生物質が補われたＬＢアガープレート上にプレーティングされる。単離された形質転換体が用いられて、自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種され、培養物が、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートされる。２００ｍｌの培養物から得られ、かつ過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットは、−８０℃にて一晩保存されてから、３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルタチオン）中に再懸濁され、１０μｌ  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅが補われる。細胞懸濁液は、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートされる。細胞溶解物が、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）によって澄明にされ、上清は、濾過コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、１ｍｌの最終容量に３倍濃縮される。５００μｌの酵素反応物が、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（変異体）、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（空のベクターで形質転換した細胞）、および２０、４０、８０、１２０ｍＭの範囲のプレノール濃縮物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する２ｍｌのガラスバイアル内に設定される。バイアルは封をされて、３７℃にて２０、４０、６０、９０、１２０および１８０分間インキュベートされる。酵素変異体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＢＳＡ較正曲線に対して定量化される。酵素反応は、８０℃にて５分間のインキュベーションによって停止され、産生されたイソプレンは、ガスクロマトグラフィーによって定量化される。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスが注入される。イソプレンを検出するのに用いられるＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：１０である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素がキャリアガスとして用いられ（１．５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２５ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物が用いられて、ＦＩＤ検出系が供給される。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。イソプレンの産生速度（イソプレンモル／酵素モル／秒）は、プレノールの濃度の関数としてプロットされ、曲線は、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめられて、ｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）が抽出される。
【００１９】
さらに、第１の態様によれば、本発明はまた、イソプレノールをイソプレンに変換することができ、イソプレノールからイソプレンへの回転速度が少なくとも３．３×１０−５ｓ−１、好ましくは少なくとも５×１０−５ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−４ｓ−１、特に好ましくは少なくとも３×１０−４ｓ−１、少なくとも１ｓ−１、または少なくとも１０ｓ−１、さらにより好ましくは少なくとも１００ｓ−１である酵素を提供する。対応する野生型酵素は、イソプレノールの、イソプレンへの回転速度が、約３．０×１０−５ｓ−１である。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、イソプレノールをイソプレンに変換することができ、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１．５倍高い酵素を提供する。より好ましい実施形態において、イソプレノールをイソプレンに変換することができる酵素は、回転速度（即ち、Ｋｃａｔ値）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または実に少なくとも１０倍高い。さらにより好ましい実施形態において、回転速度は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する対応する野生型酵素の回転速度と比較して、少なくとも１００倍、または実に少なくとも５００倍高い。
【００２１】
そのような酵素は、アルケノールデヒドラターゼ内の特定位置に突然変異を生じさせることによって提供されてよく、そのような突然変異を生じさせることによって得られる変異体は、イソプレノールの、イソプレンへの変換を触媒することにおいて向上した活性を示す。イソプレノールをイソプレンに変換することができる酵素の回転速度は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この回転速度は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この回転速度は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、回転速度が評価されることになる酵素は、先のプレノールの、イソプレンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数の判定について既に概説されたように判定されてよいが、イソプレノールがプレノールの代わりに基質として用いられることを例外とする。
【００２２】
そのような酵素を提供することによって、本発明は、クロチルアルコール、３−メチル−ブタ−２−エン−１−オール（プレノール）もしくはイソプレノールまたは２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１オールからの、それぞれブタジエン、イソプレンまたはジメチルブタジエン等の３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する共役ジエンの産生効率を劇的に増大させることができる。
【００２３】
用語「アルケノールデヒドラターゼ」は、アルケノールを脱水し得る酵素、好ましくは、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する少なくとも１つの化合物を脱水し得、かつ反応産物がＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏである酵素を指す。この活性は、本明細書中において以下でさらに記載されるアッセイにおいて、かつ添えられた実施例において、測定され得る。好ましい一実施形態において、アルケノールデヒドラターゼは、クロチルアルコールデヒドラターゼまたはブタ−３−エン−２−オールデヒドラターゼである。本発明の文脈における用語「クロチルアルコールデヒドラターゼ」は、クロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素を指す。本発明の文脈における用語「ブタ−３−エン−２−オールデヒドラターゼ」は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素を指す。これらの活性は、さらに以下で記載されるアッセイ、特に実施例の部におけるアッセイによって、測定されてよい。リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼ（ＥＣ  ４．２．１．１２７）として分類される酵素が、適切なアルケノールデヒドラターゼであり、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する種々の化合物の、ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏへの変換、例えば、クロチルアルコールまたはブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンまたは本明細書に記載される他の化合物への変換等を触媒することができることが示され得た。リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、異性化を介してゲラニオールをリナロールに変換する能力、および脱水反応を介してリナロールをミルセンに変換する能力を有する酵素である。ゆえに、好ましい実施形態において、用語「アルケノールデヒドラターゼ」は、本発明の文脈において用いられる場合、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼを指す。別の好ましい実施形態において、用語「アルケノールデヒドラターゼ」は、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに由来し、かつクロチルアルコールまたはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を有する酵素を指す。指定された酵素リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）（以前はアルカリゲネス・デフラグランス（Alcaligenes defragrans））系統６５Ｐｈｅｎにおいて同定された（Brodkorb et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 30436-30442）。リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、モノテルペンの嫌気性分解に関与する二官能性酵素である。本来の酵素は、１６０ｋＤａの分子量を有することが見出されており、かつ４０ｋＤａのサブユニットのホモテトラマーであると想定されている。当該酵素は、２つの反応を、熱力学的駆動力に応じて両方向にｉｎ  ｖｉｔｒｏで触媒する。一方では、当該酵素は、第一級アリルアルコールゲラニオールの、第三級アリルアルコールモチーフを有する立体異性体リナロールへの異性化を触媒する。他方では、当該酵素は、第三級アルコールリナロールから、対応する非環式モノテルペンベータミルセン（共役ジエンモチーフを有する分子）への水分離（脱水）を触媒する。カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）において、当該タンパク質は、前駆体タンパク質として発現され、周辺質（periplasmatic）位置特定のためのシグナルペプチドが、膜を通った輸送後に切断される。当該酵素は、ＥＣ  ４．２．１．１２７として分類される。リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、嫌気性条件下で以下の反応を触媒する能力を有する：
リナロール＜＝＞ミルセン＋Ｈ２Ｏ
【００２４】
この活性は、例えば、Brodkorb et al.（先に引用）に記載されるアッセイにより測定されてよい。そのようなアッセイにおいて、バイアルが３５℃に予め温められ、無酸素性タンパク質溶液がバイアル中に移され、そしてＤＴＴが２ｍＭになるまで加えられる。反応混合物はブチルセプタムで封をされ、ヘッドスペースはＣＯ２／Ｎ２（１０／９０（ｖ／ｖ））でフラッシュされる。反応は、明確な濃度のリナロールを加えることによって開始され、３５℃にてインキュベートされる。リナロールの、ミルセンへの変換は、例えばガスクロマトグラフィーによって、ミルセンの産生を調査することによって評価される。
【００２５】
好ましい実施形態において、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼはまた、嫌気性条件下で、ゲラニオールの、リナロールへの異性化を触媒する能力を有する：
ゲラニオール＜＝＞リナロール
【００２６】
この活性は、例えば、Brodkorb et al.（先に引用）に記載されるアッセイにより測定されてよい。そのようなアッセイにおいて、バイアルが３５℃に予め温められ、無酸素性タンパク質溶液がバイアル中に移され、そしてＤＴＴが２ｍＭになるまで加えられる。反応混合物はブチルセプタムで封をされ、ヘッドスペースはＣＯ２／Ｎ２（１０／９０（ｖ／ｖ））でフラッシュされる。反応は、明確な濃度のゲラニオールを加えることによって開始され、３５℃にてインキュベートされる。ゲラニオールの、リナロールへの変換は、例えばガスクロマトグラフィーによって、ミルセン、即ち、酵素によって触媒される第２の反応の産物、の産生を調査することによって評価される。
【００２７】
ゲラニオール、リナロールおよびミルセンは、植物によって産生される非環式C10テルペノイドであり、それぞれアリルアルコールおよび炭化水素のクラスに属する。Luddecke and Harder （Z. Naturforsch. 66c (2011), 409-412）は、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼの高い基質特異性について報告した。
【００２８】
先に述べたように、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、１，３ブタジエンに変換するようにクロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールに作用し得ることが見出された。本発明はここで、クロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができる酵素の改善された変異体を提供する。発明者らは、モデル酵素として、配列番号１に示されるカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼを用いて、クロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換に関する活性の増大を示すこの酵素の変異体を提供することが可能であることを示すことができた。
【００２９】
好ましい一実施形態において、本発明の変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または非常に関連した配列（少なくとも６０％同一である）を有し、かつ突然変異が、示される位置の１つまたは複数で生じているアルケノールデヒドラターゼ、より好ましくはリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに由来するという特徴によって、そしてクロチルアルコールおよびブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力、または両反応を触媒する能力を示し、かつ向上した活性でこれを行うことができるという特徴によって、特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつ本明細書中で以下に示される位置で１つまたは複数の置換および／または欠失および／または挿入が生じている配列に由来する。
【００３０】
しかしながら、本発明の教示は、モデル酵素として用いられている配列番号１に示されるカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼ酵素に制限されず、他の生物由来のアルケノールデヒドラターゼに、特に他のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに、または、例えば酵素のトランケート変異体等の配列番号１と構造的に関連する酵素にまで拡張されてよい。ゆえに、本発明はまた、アルケノールデヒドラターゼの変異体に、特に、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragran）配列（配列番号１）と構造的に関連し、かつ以下に示される位置のいずれかに対応する位置で１つまたは複数の置換および／または欠失および／または挿入を示す他のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに関する。用語「構造的に関連する」は、配列番号１に示される配列と少なくともｎ％の配列同一性を示し、ｎが６０から１００の間の整数、好ましくは６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９であるアルケノールデヒドラターゼ、特にリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼを指す。好ましい実施形態において、構造的に関連するアルケノールデヒドラターゼは、原核生物起源、さらにより好ましくは細菌由来、最も好ましくはカステラニエラ（Castellaniella）属の細菌由来である。
【００３１】
ゆえに、一実施形態において、本発明に従うアルケノールデヒドラターゼ、特にリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼの変異体は、配列番号１と少なくともｎ％同一である配列であって、ｎが６０から１００の間の整数、好ましくは６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９であり、かつ、以下に示される位置に置換および／または欠失および／または挿入を有する配列を有する、好ましくはこの配列から由来する。比較される配列が同じ長さを有していない場合、同一性の程度は、より長い配列におけるアミノ酸残基と同一であるより短い配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを、または、より短い配列におけるアミノ酸残基と同一であるより長い配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを指す。好ましくは、より長い配列におけるアミノ酸残基と同一であるより短い配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを指す。配列同一性の程度は、ＣＬＵＳＴＡＬ等の好ましくは適切なコンピュータアルゴリズムを用いる、当該技術において周知である方法に従って判定されてよい。
【００３２】
Ｃｌｕｓｔａｌ分析法を用いて、特定の配列が、例えば、参照配列と少なくとも６０％同一であるか否かを判定する場合、デフォルトのセッティングが用いられてよく、またはセッティングは好ましくは以下の通りである：アミノ酸配列の比較について、マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ  ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；拡張ギャップペナルティ：０．０５；遅延分岐：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列の比較について、拡張ギャップペナルティは、好ましくは５．０に設定される。
【００３３】
好ましい実施形態において、ＣｌｕｓｔａｌＷ２が、アミノ酸配列の比較のために用いられる。ペアワイズ比較／アラインメントの場合、以下のセッティングが好ましくは選択される：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．１。多重比較／アラインメントの場合、以下のセッティングが好ましくは選択される：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．２；ギャップ距離：５；末端ギャップなし。
【００３４】
好ましくは、同一性の程度は、配列の完全長の全体にわたって算出される。
【００３５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において以下に示される位置に対応する位置に位置決めされたアミノ酸残基が、当該技術において知られている方法によって、当業者によって同定され得る。例えば、そのようなアミノ酸残基は、問題の配列を、配列番号１に示される配列とアラインすることによって、かつ配列番号１の先に示された位置に対応する位置を同定することによって、同定され得る。アラインメントは、当業者に知られている手段および方法でなされてよく、例えばリップマン−ピアソン法（Science 227 (1985), 1435）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム等の既知のコンピュータアルゴリズムを用いることによる。そのようなアラインメントにおいて、最大相同性が、アミノ酸配列内に存在する保存アミノ酸残基に割り当てられることが好ましい。
【００３６】
好ましい実施形態において、ＣｌｕｓｔａｌＷ２がアミノ酸配列の比較のために用いられる。ペアワイズ比較／アラインメントの場合、以下のセッティングが好ましくは選択される：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．１。多重比較／アラインメントの場合、以下のセッティングが好ましくは選択される：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．２；ギャップ距離：５；末端ギャップなし。
【００３７】
アルケノールデヒドラターゼのアミノ酸配列がそのような方法によってアラインされる場合、アミノ酸配列内に生じる挿入にも欠失にも関係なく、対応するアミノ酸残基の位置は各アルケノールデヒドラターゼにおいて判定され得る。
【００３８】
本発明の文脈において、「別のアミノ酸残基で置換される」は、示される位置の各アミノ酸残基が、任意の他の可能なアミノ酸残基、例えば天然に存在するアミノ酸または非天然由来のアミノ酸（Brustad and Arnold, Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (2011), 201-210）で、好ましくは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されてよいことを意味する。ある位置について好ましい置換が、以下でさらに示される。さらに、用語「置換される」または「置換」はまた、示される位置の各アミノ酸残基が修飾されていることを意味する。
【００３９】
そのような修飾として、天然に存在する修飾および非天然由来の修飾が挙げられる。天然に存在する修飾として、限定されないが、官能基（例えばアセテート（acetate）、ホスフェート（phosphate）、ヒドロキシル、脂質（グリシン残基のミリストイル化）および炭水化物（例えばアルギニン、アスパラギンその他のグリコシル化））の付着等の真核生物の翻訳後修飾が挙げられる。天然に存在する修飾はまた、シトルリン化、カルバミル化およびシステイン残基間のジスルフィド結合形成；補因子（共有結合的に付着され得るＦＭＮまたはＦＡＤ）の付着またはペプチドの付着（例えばユビキチン結合またはスモイレーション）による化学構造の変化を包含する。
【００４０】
非天然由来の修飾として、例えば、リジン残基のビオチン化または非カノニカルアミノ酸（non-canonical amino acids）の包含等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾が挙げられる（Liu and Schultz, Annu. Rev. Biochem. 79 (2010), 413-44 and Wang et al., Chem. Bio. 2009 March 27; 16 (3), 323-336; doi: 101016/jchembiol.2009.03.001参照）。
【００４１】
本発明の文脈において、「欠失した」または「欠失」は、対応する位置のアミノ酸が欠失していることを意味する。
【００４２】
本発明の文脈において、「挿入された」または「挿入」は、各位置で１つまたは２つ、好ましくは１つのアミノ酸残基が、好ましくは示された位置の前に、挿入されていることを意味する。
【００４３】
本発明はまた、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換のための、先に記載されたアルケノールデヒドラターゼの、またはそのようなアルケノールデヒドラターゼを含む宿主細胞の使用に関する。
【００４４】
Ａ．クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性が向上した変異体
第２の態様において、本発明は、アルケノールデヒドラターゼの変異体であって、先に定義されたアルケノール、好ましくはクロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することにおいてそれが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも向上した活性を示し、当該アルケノールデヒドラターゼ変異体は、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、アルケノールデヒドラターゼの変異体に関する。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１７３に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１８１に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３２４に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１１９に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３２４、１３２、１１６、８０、１０６、３５７、７５、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９９に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１１９、３２４、１３２、１１６、８０、１０６、３５７、７５、７３、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０  ３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３１０に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９９、１９５、１１９、３２４、１１６、８０、１０６、３５７、７５、７３、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１４０に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９９、１９５、１１９、３２４、１１６、８０、１０６、３５７、７５、７３、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【００５２】
さらにより好ましい実施形態において、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、複数の突然変異を有することを特徴とする。実施例において以下でさらに例示されるように、変異体が、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有すると見出された。複数の突然変異を有するこれらの変異体は、以下に要約される：
【００５３】
したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、７３、１３２、１７０、１８１、１９９、２６９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＷ２６９ＡＬ３６７Ｆ。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１７０、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３６７および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＬ３６７ＦＧ３８２Ｄ。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１７０、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＧ７３ＳＲ１７０ＫＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、１３２、１７０、１８１、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＤ３９ＡＧ１３２ＶＲ１７０ＫＩ１８１ＬＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１８１、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＩ１８１ＬＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、７３、１４４、１７０、１８１、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＦ２０ＬＤ３９ＡＧ７３ＳＩ１４４ＴＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１２３、１３２、１７０、１８１、１９９および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＳ１２３ＥＧ１３２ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＷ２６９Ａ。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、１７０、１８１、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１３２、１７０、１８１および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＧ１３２ＱＲ１７０ＫＩ１８１ＳＷ２６９Ａ。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、１３２、１７０、１８１および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＦ２０ＬＤ３９ＡＧ１３２ＫＲ１７０ＫＩ１８１ＬＷ２６９Ａ。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、１３２および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ１３２ＭＷ２６９Ａ。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１７０、１７３、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＲ１７０ＫＡ１７３ＲＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｌ。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１７０、１７３および３８９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＲ１７０ＫＡ１７３ＲＰ３８９Ｌ。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１６８、１７０、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１６８ＮＲ１７０ＫＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【００７０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、７７、１３２、１７０、１９９、３６７および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ１３２ＱＲ１７０ＫＤ１９９ＮＬ３６７ＦＧ３８２Ｄ。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、７７および３８６に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＥ７７ＩＲ３８６Ｓ。
【００７２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、１７０、１８１、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【００７３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ３２４Ｓ。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＧ７３Ｓ−Ｅ７７Ｌ。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＦ３２４Ｓ。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１７０、１７３および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＲ１７０ＫＡ１７３ＲＦ３２４Ｓ。
【００７８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＭＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＦ３２４Ｓ。
【００８０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＭＦ３２４Ｓ。
【００８１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＬＦ３２４Ｓ。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１２３および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３ＥＬ３６７Ｆ。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および１２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１２Ｌ。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ１９９Ｎ。
【００８５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｅ。
【００８６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ａ。
【００８７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および１７０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＲ１７０Ｋ。
【００８８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＲＦ３２４Ｓ。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＴＤ１９９Ｎ。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【００９１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１７３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＡ１７３Ｒ。
【００９２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１７０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＲ１７０Ｋ。
【００９３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＥＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【００９４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および２０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＦ２０Ｌ。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＷ２６９Ａ。
【００９６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＳＤ１９９Ｎ。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＮＤ１９９Ｎ。
【００９８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＷ２６９Ａ。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＤ１９９Ｎ。
【０１０１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および３９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＤ３９Ａ。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＡ１８Ｉ。
【０１０３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＤ１１９Ｇ。
【０１０４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および１７３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＡ１７３Ｒ。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１８１および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＩ１８１ＳＤ１９９Ｎ。
【０１０６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＲＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０１０７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１８１および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＩ１８１ＬＤ１９９Ｎ。
【０１０８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＲＦ３２４Ｓ。
【０１０９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ｋ。
【０１１０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＦ２０Ｌ。
【０１１１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＶ１２２Ｌ。
【０１１２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＴＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１２３および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３ＥＦ３２４Ｓ。
【０１１４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＹ１５１Ｍ。
【０１１５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および２３０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ２３０Ｑ。
【０１１６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９５および１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＶ１９５ＦＡ１８Ｖ。
【０１１７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＡ１８Ｉ。
【０１１８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２２および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＶ１２２ＬＧ１３２Ｑ。
【０１１９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＦ３２４Ｓ。
【０１２０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＹ２５１Ｍ。
【０１２１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＡ１８Ｖ。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０１２３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＬＤ１９９Ｎ。
【０１２４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＭＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２６、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＫ１２６ＡＧ１３２ＡＤ１９９Ｎ。
【０１２６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ｔ。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ３９Ａ。
【０１２８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ１１９Ｇ。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、１９４および２０７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ１３２ＡＩ１９４ＲＳ２０７Ａ。
【０１３０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２８５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＹ２８５Ｌ。
【０１３１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＲＤ１９９Ｎ。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３８９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＰ３８９Ｓ。
【０１３３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＶ３１８Ａ。
【０１３４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１５９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＹ１５９Ｍ。
【０１３５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＮＤ１９９Ｎ。
【０１３６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｑ。
【０１３７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＤ１９９Ｎ。
【０１３８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１１４および１２２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＡ１１４ＳＶ１２２Ｉ。
【０１３９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１９９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１９９ＮＬ３６７Ｆ。
【０１４０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ｓ。
【０１４１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＬ３６７Ｆ。
【０１４２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｈ。
【０１４３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１６９および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＲ１６９ＮＤ１９９Ｎ。
【０１４４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＤＤ１９９Ｎ。
【０１４５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＴＤ１９９Ｎ／Ｄ１１９Ｇ。
【０１４６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２２および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＶ１２２ＩＧ１３２Ｌ。
【０１４７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１９９および３１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１９９ＮＶ３１８Ａ。
【０１４８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ｎ。
【０１４９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１２３および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３ＥＬ３６７Ｆ。
【０１５０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＤ１１９Ｇ。
【０１５１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＬＤ１１９ＧＧＦ３２４Ｓ。
【０１５２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、１２３および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１０６ＮＤ１１９ＧＳ１２３ＥＧ１３２Ｍ。
【０１５３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＨＤ１９９Ｎ。
【０１５４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１８１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＩ１８１Ｌ。
【０１５５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１５８および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＭ１５８ＩＦ３２４Ｓ。
【０１５６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２３および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１２３ＴＦ３２４Ｓ。
【０１５７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２２および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＶ１２２ＬＧ１３２Ｖ。
【０１５８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１９９および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１９９Ｎ／Ｙ２５１Ｌ。
【０１５９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｒ。
【０１６０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｄ。
【０１６１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２および１９５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２Ｔ。
【０１６２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２２７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＡ２２７Ｉ。
【０１６３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＫＹ２５１Ｍ。
【０１６４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１５８および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＭ１５８ＩＤ１９９Ｎ。
【０１６５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２３および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１２３ＥＤ１９９Ｎ。
【０１６６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１６９および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＲ１６９ＴＤ１９９Ｎ。
【０１６７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＥＹ２５１Ｍ。
【０１６８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＡＹ２５１Ｍ。
【０１６９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１５および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１１５ＡＤ１１９Ｇ。
【０１７０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２３および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１２３ＲＧ１３２Ｋ。
【０１７１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｋ。
【０１７２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＬ３６７Ｆ。
【０１７３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１０６ＮＤ１１９ＧＳ１２３Ｅ。
【０１７４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、１２３および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１０６ＮＤ１１９ＧＳ１２３ＥＧ１３２Ｑ。
【０１７５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＴＲ１６９Ｔ。
【０１７６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＫＤ１９９Ｎ。
【０１７７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ１１９Ｌ。
【０１７８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１４０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２Ｔ。
【０１７９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３５７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＴＳ３５７Ｎ。
【０１８０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＳＹ２５１Ｍ。
【０１８１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２３および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ１２３ＱＧ１３２Ｓ。
【０１８２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７６および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ７６ＬＤ１９９Ｎ。
【０１８３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１０６ＮＤ１１９ＧＳ１２３Ｅ。
【０１８４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および１７５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＨ１７５Ｎ。
【０１８５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、８４および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４ＩＧ１３２Ｒ。
【０１８６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１６９および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＤ１１９Ｇ。
【０１８７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２０７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＳ２０７Ｃ。
【０１８８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および８４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４Ｉ。
【０１８９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および２２７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ２２７Ｓ。
【０１９０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および７５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＳ７５Ｎ。
【０１９１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＥ７７Ｌ。
【０１９２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および７６に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ７６Ｌ。
【０１９３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および１０８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＰ１０８Ｉ。
【０１９４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２１０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＹ２１０Ｌ。
【０１９５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および７０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＹ７０Ａ。
【０１９６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、７０、７３、１３２、１７０、１８１、１９９、３２４、３６４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＹ７０ＦＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＧ３６４ＳＬ３６７Ｆ。
【０１９７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、７３、１３２、１７０、１８１、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０１９８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、７７、１３２および３６４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＥ７７ＩＧ１３２ＡＧ３６４Ｓ。
【０１９９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、２０、１３２、１７０、１７３、１８１、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ２０ＬＧ１３２ＶＲ１７０ＫＡ１７３ＲＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０２００】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３６７および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＬ３６７ＦＧ３８２Ｄ。
【０２０１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０、１３２、１７０、１７３、１８１、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１０ＡＧ１３２ＶＲ１７０ＫＡ１７３ＲＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０２０２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、７７、８４および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＥ７７ＩＴ８４ＩＧ１３２Ａ。
【０２０３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、２０、７３、１３２、１７０、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ２０ＬＧ７３ＳＧ１３２ＧＲ１７０ＫＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【０２０４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１７０、１７３、１８１、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＲ１７０ＫＡ１７３ＲＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０２０５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、７０、７７および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＹ７０ＦＥ７７ＩＧ１３２Ａ。
【０２０６】
好ましい実施形態において、変異体が由来するアルケノールデヒドラターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を示すアルケノールデヒドラターゼ、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【０２０７】
したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアルケノールデヒドラターゼ変異体に関し、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、７７、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼは、先に定義されるアルケノール、好ましくはクロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することにおいて、向上した活性を有する。
【０２０８】
本発明者らは、アルケノール、例えばクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換を触媒するアルケノールデヒドラターゼの活性が、ある位置でアルケノールデヒドラターゼ酵素を変異させることによって劇的に向上し得ることを見出した。本発明者らは、モデル酵素として、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）の酵素「リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼ」を用いた。その配列は配列番号１に示される。突然変異は、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）酵素の非変異型配列（配列番号１によって表される）と比較して、最大２４倍を超える活性の増大の原因となる。
【０２０９】
本発明の第２の態様に従うアルケノールデヒドラターゼの変異体は、好ましくは、それが由来するアルケノールデヒドラターゼと比較して、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示すことを特徴とする。ゆえに、変異体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに由来する場合、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。変異体が、本明細書中で先に定義されたカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと構造的に関連があるアルケノールデヒドラターゼに由来する場合、変異体は、対応する突然変異が導入された対応する出発配列と比較して、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。特に好ましい実施形態において、そのような変異体はまた、配列番号１に示されるリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この活性は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この活性は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、活性が評価されることになる酵素は、以下で概説されるように産生されてよい：アルケノールデヒドラターゼの野生型バージョンまたは変異体をコードする配列は、標準的な分子生物学技術を用いて、ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐｅＴ３００／ＮＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングされる。発現構築体は、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換される。単離されたクローンが用いられて、１ｍｌから５００ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種され、かつ７００ｒｐｍに設定された振盪インキュベータ内で３０℃にて一晩２０〜２２時間増殖される（１ｍｌの容量について、８５％の湿度）。細胞はペレット化し、−８０℃にて少なくとも一晩保存される。
【０２１０】
一実施形態において、酵素アッセイは、粗細胞溶解物を用いて設定される：凍結細胞ペレットは、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび０〜１００ｍＭクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒのトランス異性体またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈのシス−トランス混合物）を含有する反応混合物中に直接的に再懸濁される。
【０２１１】
別の実施形態において、酵素アッセイは、澄明な細胞溶解物を用いて設定される：この場合、過剰発現組換え酵素を含有する凍結細胞ペレットは、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁され、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）が補われる。細胞懸濁液は、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートされる。細胞溶解物が、遠心分離によって澄明にされ、上清は、遠心コンセントレータを用いて２〜３倍濃縮される。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定される。アッセイは、０〜１００ｍＭクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒのトランス異性体またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈのシス−トランス混合物）を、４ｍＭグルタチオンが補われた濃縮可溶性画分に加えることによって開始される。
【０２１２】
対照反応が、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定される。この反応混合物は、３７℃にて最低でも１時間、最大１６時間インキュベートされ、反応は８０℃にて５分のインキュベーションによって停止される。
【０２１３】
１，３ブタジエン定量化：産生された１，３−ブタジエンの量は、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化される。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、３００μｌのヘッドスペースガスが注入される。１，３ブタジエンを検出するのに用いられるＧＣ分析法は、１４０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素がキャリアガスとして用いられ（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物が用いられて、ＦＩＤ検出系が供給される。
【０２１４】
本発明の文脈において、「活性の増大」は、問題のアルケノールデヒドラターゼ変異体の活性が、それが由来する酵素と比較して、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも２４倍、または少なくとも１００、１０００、１００００もしくは１００００倍増大することを意味する。
【０２１５】
一実施形態によれば、本発明の第２の態様のアルケノールデヒドラターゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンもしくはトリプトファンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニン、アラニン、グリシン、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、チロシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニン、ロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、セリン、イソロイシン、グルタミン、バリン、アスパラギン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、アラニン、システイン、グルタミン酸もしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジン、トリプトファン、アルギニン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、トレオニン、バリン、グルタミン、グリシンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシン、メチオニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２２７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、バリンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、トレオニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、セリン、ロイシンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置５０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジン、アルギニン、イソロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはシステインで置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはフェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている。
【０２１６】
本発明はまた、先の（１）から（７０）に定義された変異体に関し、配列番号１内の位置のアミノ酸残基を置換すると示されたアミノ酸残基は、特定のアミノ酸残基ではなく、示される置換アミノ酸に関して保存的であるアミノ酸残基である。
【０２１７】
アミノ酸が別のアミノ酸に対して保存的であるか否かは、当該技術において知られている手段および方法に従って判断され得る。１つの可能性は、ＰＡＭ  ２５０マトリックスである；代わりに、Ｂｌｏｓｕｍ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍａｔｒｉｃｅｓが用いられてもよい。
【０２１８】
好ましい実施形態において、本発明の第２の態様に従う酵素は、クロチルアルコールまたはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができるだけでなく、構造的に関連する基質に、特に３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏに向けてＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物に作用することもできる、即ち、好ましくは、１，３ブタジエンに変換するようにブタ−３−エン−１−オールに、またはイソプレンに変換するように３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）、３−メチルブタ−３−エン−１−オール（イソプレノール）、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールに、またはジメチルブタジエンに変換するように２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールに作用することもできる。
【０２１９】
特に好ましい実施形態において、本発明の第２の態様に従う変異体は、それが由来する酵素と比較して、これらの反応をいずれも活性を増大させて触媒し得る。増大の程度は好ましくは、先に定義された通りである。
【０２２０】
本発明はまた、アルケノールデヒドラターゼの変異体を提供する方法に関し、前記変異体は、先に定義されるアルケノール、好ましくはクロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示し、前記方法は、アルケノールデヒドラターゼの配列内に１つまたは複数の変化を生じさせるステップを含み、前記変化は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０、１４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置で生じる。
【０２２１】
そのような方法に従って変異することになるアルケノールデヒドラターゼの好ましい実施形態は、先に説明されたのと同様である。好ましい一実施形態において、変異体が由来するアルケノールデヒドラターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性もしくは先に指定されるいずれかの好ましい程度の配列同一性を有するアミノ酸配列を示すアルケノールデヒドラターゼである。
【０２２２】
さらに、生じることになる活性および変化の向上の程度の好ましい実施形態は、先に記載されたのと同様である。
【０２２３】
特に、本発明は、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１６、８０、１０６、１１９、３５７、７５、１３２、７３、１９９、１２３、６８、１２６、１５９、２２７、３６７、２３４、１９２、１５７、１６９、１８１、１５６、１２２、８４、３１８、３８９、１１５、７６、３９０、２５５、２４７、５０、２５１、１５８、３２４、２８１、２８５、９８、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１７３、３１０  １４０、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、７７、１４４、１６８、３８６、１２、１５１、２３０、１９４、２０７、１１４、１０８、２１０、７０、３６４および１０に対応する位置に対応する１つまたは複数の位置でアルケノールデヒドラターゼに生じる変化が、本発明の第２の態様の文脈において、項目（Ａ）の下で記載される項目（１）から（７０）に同定される変化からなる群から選択されるような方法に関する。
【０２２４】
本発明はまた、先に記載されたアルケノール、好ましくはクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換のための、先に記載された本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体、またはそのようなアルケノールデヒドラターゼを含む宿主細胞の使用に関する。
【０２２５】
Ｂ．ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性が向上した変異体
第３の態様において、本発明は、アルケノールデヒドラターゼの変異体であって、アルケノール、好ましくはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することにおいて、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼと比較して向上した活性を示し、当該アルケノールデヒドラターゼ変異体は、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる、アルケノールデヒドラターゼの変異体に関する。
【０２２６】
好ましい実施形態において、変異体が由来するアルケノールデヒドラターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を示すアルケノールデヒドラターゼである。
【０２２７】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３１０に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２２８】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１０６、１１９、３５７、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２２９】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３２４に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２３０】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９９に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２３１】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１４０に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、３１０、２５４、３７３、１０２  １６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２３２】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１０２に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１６６に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２３３】
好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１１９に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１０６、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２３４】
さらにより好ましい実施形態において、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、複数の突然変異を有することを特徴とする。実施例において以下でさらに例示されるように、変異体が、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有すると見出された。ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有するこれらの変異体は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有する変異体に対応する。したがって、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有する変異体の好ましい実施形態は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有する変異体について先に説明された突然変異と同様である。
【０２３５】
さらに、一実施形態において、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアルケノールデヒドラターゼ変異体に関し、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼは、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を有する。
【０２３６】
本発明者らは、先に定義されたアルケノールの、好ましくはブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換を触媒するアルケノールデヒドラターゼの活性が、アルケノールデヒドラターゼ酵素をある位置で変異させることによって劇的に向上し得ることを見出した。本発明者らは、モデル酵素として、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）の酵素「リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼ」を用いた。その配列は配列番号１に示される。突然変異は、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）酵素の非変異型配列（配列番号１によって表される）と比較して、最大３．０倍を超える活性の増大の原因となる。
【０２３７】
本発明の第３の態様に従うアルケノールデヒドラターゼの変異体は、それが由来するアルケノールデヒドラターゼと比較して、先に定義されたアルケノール、好ましくはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示すことを特徴とする。ゆえに、変異体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼに由来する場合、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。変異体が、本明細書中で先に定義されたカステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと構造的に関連があるアルケノールデヒドラターゼに由来する場合、変異体は、対応する突然変異が導入された対応する出発配列と比較して、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。特に好ましい実施形態において、そのような変異体はまた、配列番号１に示されるリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す。ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性は、当業者に知られている方法によって判定されてよい。一実施形態において、この活性は、本明細書に添えられる実施例に記載されるようにして判定される。特定の実施形態において、この活性は、酵素、好ましくは過剰発現組換えタンパク質を含有する細胞溶解物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることによって測定されてよい。代わりに、精製酵素が用いられてよい。より詳細には、活性が評価されることになる酵素は、以下で概説されるように産生されてよい：アルケノールデヒドラターゼの野生型バージョンまたは変異体をコードする配列は、標準的な分子生物学技術を用いて、ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐｅＴ３００／ＮＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングされる。発現構築体は、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換される。単離されたクローンが用いられて、１ｍｌから５００ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種され、かつ７００ｒｐｍに設定された振盪インキュベータ内で３０℃にて一晩２０〜２２時間増殖される（１ｍｌの容量について、８５％の湿度）。細胞はペレット化し、−８０℃にて少なくとも一晩保存される。
【０２３８】
一実施形態において、酵素アッセイは、粗細胞溶解物を用いて設定される：凍結細胞ペレットは、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび０〜１００ｍＭブタ−３−エン−２−オール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する反応混合物中に直接的に再懸濁される。
【０２３９】
別の実施形態において、酵素アッセイは、澄明な細胞溶解物を用いて設定される：この場合、過剰発現組換え酵素を含有する凍結細胞ペレットは、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁され、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）が補われる。細胞懸濁液は、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートされる。細胞溶解物が、遠心分離によって澄明にされ、上清は、遠心コンセントレータを用いて２〜３倍濃縮される。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定される。アッセイは、０〜１００ｍＭブタ−３−エン−２−オール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、４ｍＭグルタチオンが補われた濃縮可溶性画分に加えることによって開始される。
【０２４０】
対照反応が、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定される。この反応混合物は、３７℃にて最低でも１時間、最大１６時間インキュベートされ、反応は８０℃にて５分のインキュベーションによって停止される。
【０２４１】
１，３ブタジエン定量化：その後、産生された１，３−ブタジエンの量は、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化される。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、３００μｌのヘッドスペースガスが注入される。１，３ブタジエンを検出するのに用いられるＧＣ分析法は、１４０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素がキャリアガスとして用いられ（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物が用いられて、ＦＩＤ検出系が供給される。
【０２４２】
本発明の文脈において、「活性の増大」は、問題のアルケノールデヒドラターゼ変異体の活性が、それが由来する酵素と比較して、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼと比較して、少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．５倍、さらにより好ましくは少なくとも３．０倍、または少なくとも１００、１０００、１００００もしくは１００００倍増大することを意味する。
【０２４３】
一実施形態によれば、本発明の第３の態様のアルケノールデヒドラターゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、セリン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２２７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン酸もしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリン、メチオニンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、アスパラギンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トリプトファンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、システインで置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２８５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている。
【０２４４】
本発明はまた、先の（１）から（７０）に定義された変異体に関し、配列番号１内の位置のアミノ酸残基を置換すると示されたアミノ酸残基は、特定のアミノ酸残基ではなく、示される置換アミノ酸に関して保存的であるアミノ酸残基である。
【０２４５】
アミノ酸が別のアミノ酸に対して保存的であるか否かは、当該技術において知られている手段および方法に従って判断され得る。１つの可能性は、ＰＡＭ  ２５０マトリックスである；代わりに、Ｂｌｏｓｕｍ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍａｔｒｉｃｅｓが用いられてもよい。
【０２４６】
好ましい実施形態において、本発明の第３の態様に従う酵素は、クロチルアルコールまたはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができるだけでなく、構造的に関連する基質に、特に３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏに向けＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物に作用することもできる、即ち、好ましくは、１，３ブタジエンに変換するようにブタ−３−エン−１−オールに、またはイソプレンに変換するように３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）、３−メチルブタ−３−エン−１−オール（イソプレノール）、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールに、またはジメチルブタジエンに変換するように２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールに作用することもできる。特に好ましい実施形態において、本発明の第３の態様に従う変異体は、それが由来する酵素と比較して、これらの反応をいずれも活性を増大させて触媒し得る。増大の程度は好ましくは、先に定義された通りである。
【０２４７】
本発明はまた、アルケノールデヒドラターゼの変異体を提供する方法に関し、前記変異体は、先に定義されるアルケノール、好ましくはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示し、前記方法は、アルケノールデヒドラターゼの配列内に１つまたは複数の変化を生じさせるステップを含み、前記変化は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置で生じる。
【０２４８】
そのような方法に従って変異することになるアルケノールデヒドラターゼの好ましい実施形態は、先に説明されたのと同様である。好ましい一実施形態において、変異体が由来するアルケノールデヒドラターゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性もしくは先に指定されるいずれかの好ましい程度の配列同一性を有するアミノ酸配列を示すアルケノールデヒドラターゼである。
【０２４９】
特に、生じることになる活性および変化の向上の程度の好ましい実施形態は、先に記載されたのと同様である。
【０２５０】
より好ましくは、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の位置１９５、１０６、１１９、３５７、１３２、１２３、１５９、２２７、２３４、１５７、１６９、３２４、７５、１２６、１８１、１５６、１２２、８４、１１５、７６、３９０、２５５、２５１、２４７、２８１、７７、２８５、９５、１８６、２４８、７２、１７５、２４５、１９９、１４０、３１０、２５４、３７３、１０２、１６６、１８、２０、１７０、２６９、３８２、３９、１４４、１７３、１６８、３９、３８６、１２、１５１、２３０、２０７、１１４、７３、１８１、３６７、３８９、２８５、３１８、１５８、７０、１９９、３６４および１０に対応する位置に対応する１つまたは複数の位置でアルケノールデヒドラターゼに生じる変化が、本発明の第３の態様の文脈において、項目（Ｂ）の下で記載される項目（１）から（７０）に同定される変化からなる群から選択される方法に関する。
【０２５１】
本発明はまた、先に定義されたアルケノール、好ましくはブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換のための、先に記載された本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体、またはそのようなアルケノールデヒドラターゼを含む宿主細胞の使用に関する。
【０２５２】
本発明はまた、アルケノールデヒドラターゼの変異体に関し、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも、イソプレノールおよび／またはプレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示し、当該アルケノールデヒドラターゼ変異体は、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２５３】
好ましい実施形態において、そのようなアルケノールデヒドラターゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼは、イソプレノールおよび／もしくはプレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を有する。
【０２５４】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、アルケノールデヒドラターゼの変異体に関し、それが由来する対応するアルケノールデヒドラターゼよりも、イソプレノールおよび／またはプレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示し、当該アルケノールデヒドラターゼ変異体は、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を示すことを特徴とし、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置２０、７１、７２、７３、７５、７６、７８、７９、８４、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３５、１４３、１４５、１４８、１５１、１５２、１５５、１９２、１９３、１９５、１９９、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、３１８、３１９、３６１、３６６、３６７、３８３、３８４、３８７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２５５】
好ましい実施形態において、そのようなアルケノールデヒドラターゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置２０、７１、７２、７３、７５、７６、７８、７９、８４、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３５、１４３、１４５、１４８、１５１、１５２、１５５、１９２、１９３、１９５、１９９、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、３１８、３１９、３６１、３６６、３６７、３８３、３８４、３８７および３９０からなる群から選択される位置、もしくはこれらの位置のいずれかに対応する位置の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失しており、または挿入が、これらの位置の１つもしくは複数で生じており、前記アルケノールデヒドラターゼは、イソプレノールおよび／もしくはプレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を有する。
【０２５６】
一実施形態によれば、そのようなアルケノールデヒドラターゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、
（１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、リジン、アルギニン、グルタミン、メチオニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニンもしくはグリシンで置換されている；かつ／または
（３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはヒスチジンで置換されている；かつ／または
（４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリン、イソロイシンもしくはシステインで置換されている；かつ／または
（５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンもしくはアラニンで置換されている；かつ／または
（６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、ヒスチジン、グルタミンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（１０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（１２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（１３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンもしくはメチオニンで置換されている；かつ／または
（１４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミン酸で置換されている；かつ／または
（１５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンもしくはグリシンで置換されている；かつ／または
（１６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１６８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（１７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（１８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（１９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（２０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンで置換されている；かつ／または
（２２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１８１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはセリンで置換されている；かつ／または
（２３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（２４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２６９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（２５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（２６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、セリンで置換されている；かつ／または
（２７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンもしくはイソロイシンで置換されている；かつ／または
（２８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１７３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（２９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（３１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（３２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（３３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（３４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンもしくはグルタミン酸で置換されている；かつ／または
（３５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（３６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはロイシンで置換されている；かつ／または
（３７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸もしくはトレオニンで置換されている；かつ／または
（３８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシン、プロリンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（３９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、バリンもしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（４０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシンで置換されている；かつ／または
（４２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（４３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置７０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（４４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置８３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニン、トリプトファン、トレオニンで置換されている；かつ／または
（４５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アニリンもしくはアスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（４６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１１６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、リジンもしくはアルギニンで置換されている；かつ／または
（４７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンもしくはバリンで置換されている；かつ／または
（４８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（４９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニン、アスパラギン酸もしくはフェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸もしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（５１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１２９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（５２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（５３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、フェニルアラニンで置換されている；かつ／または
（５４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、プロリンで置換されている；かつ／または
（５５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１３８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グルタミンで置換されている；かつ／または
（５６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（５７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１４８、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（５８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（５９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、イソロイシンで置換されている；かつ／または
（６０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ロイシンで置換されている；かつ／または
（６１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置１９３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アラニンで置換されている；かつ／または
（６２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２３９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンで置換されている；かつ／または
（６３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５２、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（６４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、ヒスチジンで置換されている；かつ／または
（６５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、ヒスチジンもしくはプロリンで置換されている；かつ／または
（６６）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２５５、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（６７）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（６８）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３１９、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アルギニンで置換されている；かつ／または
（６９）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６１、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、トレオニンで置換されている；かつ／または
（７０）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３６６、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている；かつ／または
（７１）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８３、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、チロシンで置換されている；かつ／または
（７２）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８４、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、メチオニンもしくはチロシンで置換されている；かつ／または
（７３）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３８７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸もしくはアスパラギンで置換されている；かつ／または
（７４）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置３９０、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、アスパラギン酸で置換されている；かつ／または
（７５）配列番号１に示される前記アミノ酸配列内の位置２４７、もしくはこの位置に対応する位置のアミノ酸残基が、欠失しているか、バリンで置換されている。
【０２５７】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置８３に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２５８】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１２９に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３６７に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２５９】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置８３に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６０】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３８に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６１】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７７に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６２】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置８４に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６３】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換する活性の向上を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３１４に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６４】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１２６に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３６４に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６５】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置８３に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６６】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置２３９に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置２４７に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、３１４、および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６７】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３１９に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３８２に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６８】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、３２４、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２６９】
好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、少なくとも２つの欠失、置換および／または挿入を含有することを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５に、またはこの位置に対応する位置にあり、別の欠失／挿入／置換が、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３２４に、またはこの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体はさらに、それが由来する対応する配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を有し、これらの置換、欠失および／または挿入は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１３２、８４、１８、７３、７７、３８６、１１９、２５１、１４１、１２３、３６４、１５１、３１２、３１８、１６８、１９、８、２０、３９、１７０、１８１、１９９、２６９、３６７、１３、１２２、１７３、３８９、１１８、１４４、１２、３８２、１４５、７１、７２、７５、７６、７８、７９、１１５、１１６、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３５、１４３、１４８、１５２、１５５、１９２、１９３、２５２、２５３、２５４、２５５、３１９、３６１、３６６、３８３、３８４、３８７、７０、７７、８３、１２９、１３８、２３９、３１４、２４７および３９０に対応する位置の１つまたは複数で起こる。
【０２７０】
さらにより好ましい実施形態において、プレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、複数の突然変異を有することを特徴とする。実施例において以下でさらに例示されるように、変異体が、プレノールの、イソプレンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有すると見出された。複数の突然変異を有するこれらの変異体は、以下に要約される：
【０２７１】
したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、８４および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４ＩＧ１３２Ｒ。
【０２７２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、７７および３８６に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＥ７７ＩＲ３８６Ｓ。
【０２７３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＫＹ２５１Ｍ。
【０２７４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および８４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ８４Ｉ。
【０２７５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｌ。
【０２７６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１４１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ１４１Ｓ。
【０２７７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１４１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ１４１Ｓ。
【０２７８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および８４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４Ｉ。
【０２７９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｅ。
【０２８０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ。
【０２８１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および３６４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ３６４Ｓ。
【０２８２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ。
【０２８３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＡＥ７７Ｌ。
【０２８４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＹ１５１Ｍ。
【０２８５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および３１２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＤ３１２Ｅ。
【０２８６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＹ２５１Ｍ。
【０２８７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＶ３１８Ａ。
【０２８８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２Ｑ。
【０２８９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１６８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＳ１６８Ｄ。
【０２９０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ１９Ｔ。
【０２９１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ８Ｌ。
【０２９２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５および８３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｓ７５ＶＨ８３Ｍ。
【０２９３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１２９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｒ１２９ＬＬ３６７Ｆ。
【０２９４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５および８３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｓ７５ＡＨ８３Ｗ。
【０２９５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５および１３８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｓ７５ＮＧ１３８Ｑ。
【０２９６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｆ７６ＶＥ７７Ｌ。
【０２９７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６および８４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｆ７６ＬＴ８４Ｉ。
【０２９８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７６および３１４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｆ７６ＬＡ３１４Ｔ。
【０２９９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１２６および３６４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｋ１２６ＦＧ３６４Ｍ。
【０３００】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７５および８３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｓ７５ＭＨ８３Ｔ。
【０３０１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置２３９および２４７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｌ２３９ＭＦ２４７Ｖ。
【０３０２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置３１９および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ３１９ＲＧ３８２Ｑ。
【０３０３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２Ａ。
【０３０４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７３、７７、１３２および１９５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ７３ＳＥ７７ＩＧ１３２ＡＶ１９５Ｆ。
【０３０５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置７３、１３２、１７０、１８１、１９５および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｇ７３ＳＧ１３２ＧＲ１７０ＫＩ１８１ＬＶ１９５ＦＦ３２４Ｓ。
【０３０６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ３２４Ｓ。
【０３０７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１７０、１３２、１７３、１８１、１９５、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｒ１７０ＫＧ１３２ＶＡ１７３ＲＩ１８１ＬＶ１９５ＦＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０３０８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１８、２０、７３、１３２、１７０、１８１、１９５、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ａ１８ＩＦ２０ＬＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＶ１９５ＦＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３０９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１８、２０、７０、７３、１３２、１７０、１８１、１９５、１９９、３２４、３６４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ａ１８ＩＦ２０ＬＹ７０ＦＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＶ１９５ＦＤ１９９ＮＦ３２４ＳＧ３６４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３１０】
他のより好ましい実施形態において、イソプレノールをイソプレンに変換することにおいて向上した活性を示す本発明に従う変異体は、複数の突然変異を有することを特徴とする。実施例において以下でさらに例示されるように、変異体が、イソプレノールの、イソプレンへの変換の反応速度の増大を示す複数の突然変異を有すると見出された。複数の突然変異を有するこれらの変異体は、以下に要約される：
【０３１１】
したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、７３、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＤ３９ＡＧ７３ＳＤ１１９ＧＧ１３２Ｒ。
【０３１２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、７３、１３２、１７０、１８１、１９９、２６９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＧ７３ＳＧ１３２ＭＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＷ２６９ＡＬ３６７Ｆ。
【０３１３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および３６４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ３６４Ｓ。
【０３１４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、１１９、１７０および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＤ１１９ＧＲ１７０ＫＦ３２４Ｓ。
【０３１５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２Ｓ。
【０３１６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、８４および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４ＩＧ１３２Ｒ。
【０３１７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＶＦ３２４Ｓ。
【０３１８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＬ３６７Ｆ。
【０３１９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＡ１３Ｉ。
【０３２０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２２および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＶ１２２ＬＧ１３２Ｖ。
【０３２１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＡ１８Ｃ。
【０３２２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、１７０、１８１、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３２３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１７０、１７３および３８９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＲ１７０ＫＡ１７３ＲＰ３８９Ｌ。
【０３２４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【０３２５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、７７、１７０、１７３、１９９、２６９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＥ７７ＩＲ１７０ＫＡ１７３ＲＤ１９９ＮＷ２６９ＡＦ３２４Ｓ。
【０３２６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１７０、１７３および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＲ１７０ＫＡ１７３ＲＦ３２４Ｓ。
【０３２７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、７３および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＤ３９ＡＧ７３ＳＷ２６９Ａ。
【０３２８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１１９、１２３、１８１および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＤ１１９ＧＳ１２３ＥＩ１８１ＬＤ１９９Ｎ。
【０３２９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１７０、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＧ７３ＳＲ１７０ＫＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３３０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、７３、１１８、１４４、１７０、１８１、１９９、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＦ２０ＬＤ３９ＡＧ７３ＳＬ１１８ＬＩ１４４ＴＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３３１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９、１３２および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＧ１３２ＫＹ２５１Ｍ。
【０３３２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１２２および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＶ１２２ＬＧ１３２Ｑ。
【０３３３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＳ１２Ａ。
【０３３４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ８Ｌ。
【０３３５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、１１９および１８１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＤ１１９ＧＩ１８１Ｌ。
【０３３６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および２５１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＹ２５１Ｍ。
【０３３７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、１７０、１８１および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＤ３９ＡＲ１７０ＫＩ１８１ＳＷ２６９Ａ。
【０３３８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、７７、１３２、１７０、１９９、３６７および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ１３２ＱＲ１７０ＫＤ１９９ＮＬ３６７ＦＧ３８２Ｄ。
【０３３９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＲＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０３４０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＧ１９Ｔ。
【０３４１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および１３２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２Ｑ。
【０３４２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、１３２、１７０、１８１、３２４および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＦ２０ＬＤ３９ＡＧ１３２ＶＲ１７０ＫＩ１８１ＬＦ３２４ＳＬ３６７Ｆ。
【０３４３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３６７および３８２に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＬ３６７ＦＧ３８２Ｄ。
【０３４４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、１７０、１８１、１９９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＦ３２４Ｓ。
【０３４５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、３９、７３、７７、１１９および１７０に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ３９ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＤ１１９ＧＲ１７０Ｋ。
【０３４６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、１１９、１３２、１７０、１７３、１８１、１９９および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＤ１１９ＧＧ１３２ＳＲ１７０ＫＡ１７３ＲＩ１８１ＬＤ１９９ＮＷ２６９Ａ。
【０３４７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および３１８に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＱＶ３１８Ａ。
【０３４８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１４５に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＥ１４５Ｅ。
【０３４９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ３２４Ｓ。
【０３５０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１３２、１７０、１８１および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＧ１３２ＧＲ１７０ＫＩ１８１ＬＦ３２４Ｓ。
【０３５１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、１３２、１７０、１９９および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ１３２ＡＲ１７０ＫＤ１９９ＮＷ２６９Ａ。
【０３５２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、１７０、１８１および１９９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９Ｎ。
【０３５３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１１９および１２３に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ１１９ＧＳ１２３Ｒ。
【０３５４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１３２、１７０および１８１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＧ１３２ＧＲ１７０ＫＩ１８１Ｌ。
【０３５５】
別に好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および８４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＴ８４Ｉ。
【０３５６】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、７７および３８６に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＧ７３ＳＥ７７ＩＲ３８６Ｓ。
【０３５７】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、７３、１２２、１２３、１３２、１９９および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ７３ＳＶ１２２ＩＳ１２３ＥＧ１３２ＡＤ１９９ＮＷ２６９Ａ。
【０３５８】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、７３、１７０、１８１および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＳＬ３６７Ｆ。
【０３５９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３、７７および１４１に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７ＩＴ１４１Ｓ。
【０３６０】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、３９、７３、１７０、１８１、１９９および３６７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＤ３９ＡＧ７３ＳＲ１７０ＫＩ１８１ＬＤ１９９ＮＬ３６７Ｆ。
【０３６１】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、２０、３９、１３２、１７０、１８１および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＶＦ２０ＬＤ３９ＡＧ１３２ＫＲ１７０ＫＩ１８１ＬＷ２６９Ａ。
【０３６２】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１８、１３２、１７０、２６９および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＡ１８ＩＧ１３２ＫＲ１７０ＫＷ２６９ＡＦ３２４Ｓ。
【０３６３】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２、７３および７７に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ。
【０３６４】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５および３２４に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＦ３２４Ｓ。
【０３６５】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う変異体は、欠失、置換および／または挿入を含むことを特徴とし、欠失／挿入／置換は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内の位置１９５、１３２および２６９に、またはこれらの位置に対応する位置にある。好ましくは、そのような変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列内に、またはこれらの位置に対応する位置に、以下の置換を有する：Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＷ２６９Ａ。
【０３６６】
本発明のアルケノールデヒドラターゼは、相同もしくは非相同のポリペプチドもしくはタンパク質、酵素、基質またはタグに融合されて、融合タンパク質が形成されてよい。本発明に従う融合タンパク質は、本発明のアルケノールデヒドラターゼと同じく向上した活性を有することとなる。別のタンパク質に加えられてよいポリペプチド、酵素、基質またはタグが、当該技術において知られている。それらは、本発明のタンパク質を精製または検出するのに有用であってよい。例えば、検出および／または精製に用いられてよいタグとして、例えばＦＬＡＧ−タグ、Ｈｉｓ６−タグまたはＳｔｒｅｐ−タグがある。代わりに、本発明のタンパク質は、例えばルシフェラーゼといった、前記タンパク質の検出または局在化用の酵素に融合されてよい。他の融合パートナーとして、限定されないが、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたは酵母アルファ接合因子が挙げられる。ポリペプチド、酵素、基質またはタグが、例えば精製後に本発明のタンパク質から取り除かれることも考えられ得る。融合タンパク質は典型的に、組換え核酸法によって製造されてもよいし、当該技術において知られている合成ポリペプチド法によって製造されてもよい。
【０３６７】
本発明はさらに、本発明のアルケノールデヒドラターゼをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含むベクターに関する。本発明に従って用いられ得るベクターが、当該技術において知られている。ベクターはさらに、ベクター中に含有される本発明の核酸分子に機能可能にリンクされる発現制御配列を含んでよい。この発現制御配列は、細菌または菌類における翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実とするのに適していてよい。発現制御配列は、例えば、プロモーターであってよい。本発明の核酸分子に関連して用いられるプロモーターは、その起源に関して、かつ／または発現されることとなる遺伝子に関して、相同であっても非相同であってもよい。適切なプロモーターとして、例えば、構成的発現に役立つプロモーターがある。しかしながら、外部の影響によって決定される時点でのみ活性化されるプロモーターが用いられてもよい。人工の、かつ／または化学的に誘導可能なプロモーターが、この文脈において用いられてよい。
【０３６８】
好ましくは、本発明のベクターは、発現ベクターである。発現ベクターが、文献において広く記載されてきた。概してそれは、選択マーカー遺伝子および選択された宿主における複製を確実にする複製起源だけでなく、細菌プロモーターまたはウィルスプロモーターをも、そしてほとんどの場合、転写用の終結シグナルをも含有する。プロモーターと終結シグナルとの間に、一般に、コードＤＮＡ配列の挿入を可能とする少なくとも１つの制限部位またはポリリンカーがある。対応する遺伝子の転写を本来制御しているＤＮＡ配列は、選択された宿主生物において活性であれば、プロモーター配列として用いられてよい。しかしながら、この配列は、他のプロモーター配列と交換されてもよい。遺伝子の構成的発現を確実とするプロモーター、および遺伝子の発現の意図的な制御を可能とする誘導可能なプロモーターを用いることができる。これらの特性を有する細菌およびウィルスのプロモーター配列が、文献において詳細に記載されている。微生物（例えば大腸菌（E. coli）、出芽酵母（S. cerevisiae））における発現用の調節配列が、文献において十分に記載されている。下流配列の特に高い発現を可能にするプロモーターとして、例えば、Ｔ７プロモーター（Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89）、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25）、ｌｐ１、ｒａｃ（Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100）がある。誘導可能なプロモーターが、好ましくは、ポリペプチドの合成に用いられる。これらのプロモーターは多くの場合、構成的プロモーターよりも高いポリペプチド収率をもたらす。ポリペプチドの最適な量を得るために、二段階プロセスが多くの場合用いられる。第１に、宿主細胞が、最適の条件下で比較的高い細胞密度にまで培養される。第２のステップにおいて、用いられるプロモーターのタイプに応じて転写が誘導される。この関連で、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）によって誘導され得るｔａｃプロモーターが特に適している（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写用の終結シグナルもまた、当該文献において記載されている。
【０３６９】
また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【０３７０】
好ましい実施形態において、本発明に従う宿主細胞は、微生物、特に細菌または菌類である。より好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、大腸菌（E. coli）、クロストリジウム（Clostridium）属の細菌または出芽酵母（S. cerevisiae）等の酵母の細胞である。別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、植物細胞またはヒト以外の動物細胞である。
【０３７１】
本発明に従うベクターによる宿主細胞のトランスフォーメーションは、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されているような標準的な方法によって実行されてよい。宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素その他に関する、用いられる具体的な宿主細胞の要件を満たす栄養培地において培養される。
【０３７２】
先に記載されたように、本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することができるだけでなく、好ましくは、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する少なくとも１つの他の化合物をＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏに変換することもできる。
【０３７３】
したがって、本発明はまた、３＜ｎ＜７である式ＣｎＨ２ｎＯの化合物から式ＣｎＨ２ｎ−２の化合物を産生する方法であって、本発明のアルケノールデヒドラターゼを前記出発化合物と共に、前記変換を可能とする条件下でインキュベートするステップを含む、または本発明の宿主細胞を適切な培地中で培養して、所望の化合物を回収するステップを含む方法に関する。好ましくは、そのような方法において、
（ｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールもしくはブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、１，３ブタジエンである；または
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、イソプレンである；または
（ｉｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、ジメチルブタジエンである。
【０３７４】
ゆえに、本発明はまた、クロチルアルコールから１，３ブタジエンを産生する方法であって、本発明に従うアルケノールデヒドラターゼをクロチルアルコールと共に、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換を可能とする条件下でインキュベートするステップ、および前記１，３ブタジエンを回収するステップを含む方法に関する。
【０３７５】
本発明はまた、クロチルアルコールから１，３ブタジエンを産生する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な培地において培養するステップ、および前記１，３ブタジエンを回収するステップを含む方法に関する。好ましい実施形態において、そのような方法において用いられる、または宿主細胞によって発現されるアルケノールデヒドラターゼは、本発明の第１の態様または第２の態様に従うアルケノールデヒドラターゼである。
【０３７６】
この文脈では、そのような方法において、本発明に従う１つの酵素だけでなく、２つ以上の酵素の組合せが用いられることも考えられ得る。
【０３７７】
本発明はまた、ブタ−３−エン−２−オールから１，３ブタジエンを産生する方法であって、本発明に従うアルケノールデヒドラターゼをブタ−３−エン−２−オールと共に、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換を可能とする条件下でインキュベートするステップ、および前記１，３ブタジエンを回収するステップを含む方法に関する。
【０３７８】
本発明はまた、ブタ−３−エン−２−オールから１，３ブタジエンを産生する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な培地において培養するステップ、および前記１，３ブタジエンを回収するステップを含む方法に関する。好ましい実施形態において、そのような方法において用いられる、または宿主細胞によって発現されるアルケノールデヒドラターゼは、本発明の第１の態様、第２の態様または第３の態様に従うアルケノールデヒドラターゼである。
【０３７９】
先に述べられたように、好ましい実施形態において、本発明のアルケノールデヒドラターゼは、クロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することができるだけでなく、一般に、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物をＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏに変換することもできる。好ましくは、そのような酵素はまた、３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）またはイソプレノールをイソプレンに変換することができ、または２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１オールをジメチル−ブタジエンに変換することもできる。
【０３８０】
したがって、本発明はまた、更なる実施形態において、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯの化合物の、ＣｎＨ２ｎ−２＋Ｈ２Ｏへの変換のための、先に記載された本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体または宿主細胞の使用に関する。好ましくは、そのような使用において、
（ｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オールもしくはブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、１，３ブタジエンである；または
（ｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、プレノール、イソプレノール、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２−メチル−ブタ−３−エン−２−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、イソプレンである；または
（ｉｉｉ）一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物は、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールもしくは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オールであり、一般式ＣｎＨ２ｎ−２に対応する化合物は、ジメチルブタジエンである。
【０３８１】
好ましくは、本発明は、３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）またはイソプレノールの、イソプレンへの変換のための、先に記載された本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体または宿主細胞の使用に関する。さらに、更なる実施形態において、本発明は、３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）から、またはイソプレノールからイソプレンを産生する方法であって、（ｉ）本発明の先に記載された宿主細胞を適切な培地中で培養するステップ；および（ｉｉ）産生されたイソプレンを回収するステップを含む方法に関する。
【０３８２】
最後に、また更なる実施形態において、本発明はまた、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１オールの、ジメチル−ブタジエンへの変換のための、先に定義された本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体または宿主細胞の使用に関する。さらに、更なる実施形態において、本発明はまた、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オールからジメチルブタジエンを産生する方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を適切な培地中で培養するステップ；および（ｉｉ）産生されたジメチル−ブタジエンを回収するステップを含む方法に関する。
【０３８３】
ゆえに、好ましい実施形態において、本発明は、本発明の宿主細胞を利用する方法および使用に関し、そのような宿主細胞は、先に記載されたアルケノールデヒドラターゼ変異体をコードする少なくとも１つの核酸分子の導入によって遺伝子組換えされているという点で、組換え生物である。好ましくは、そのような核酸分子は、生物に対して非相同であり、前記宿主細胞内で天然に存在しないことを意味する。
【０３８４】
別の好ましい実施形態において、そのような宿主細胞は、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する、クロチルアルコール、ブタ−３−エン−２−オール、ブタ−３−エン−１−オール、３−メチルブタ−２−エン−１−オール（プレノール）、３−メチルブタ−３−エン−１−オール（イソプレノール）、２−メチル−ブタ−３−エン−１−オール、２−メチル−ブタ−２−エン−１−オール、３−メチル−ブタ−３−エン−２−オール、２−メチル−ブタ−３−エン−２−オール、２，３−ジメチル−ブタ−２−エン−１−オール、２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−２−オールまたは２，３−ジメチル−ブタ−３−エン−１−オール等の化合物を産生することができる生物である。
【０３８５】
ゆえに、別の好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、培養において、本発明の酵素変異体を産生する生物、好ましくは微生物の存在下で実行される。ゆえに、本発明のそのような実施形態において、本発明の酵素を産生する生物、好ましくは微生物が用いられる。好ましい実施形態において、（微）生物は、宿主によって産生される酵素が、産生宿主に対して非相同であるという点で、組換え体である。ゆえに、本方法は、培地において直接的に実行されてよく、酵素を分離する必要も精製する必要もない。特に有利な方法において、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する化合物を内因的に産生する特性が天然である、または人工的である（微）生物が用いられて、培養液中に既に存在する基質から産物が直接的に産生される。
【０３８６】
先に記載された方法および使用に関連して、微生物は、本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体の酵素反応の発生を可能とする適切な培養条件下で培養される。具体的な培養条件は、用いられる具体的な微生物によって決まるが、当業者に周知である。培養条件は概して、本発明のアルケノールデヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を可能とするように選択される。化学的誘導因子による、または温度シフトによる遺伝子発現の誘導等の、培養のあるステージでのある遺伝子の発現を向上させ、かつ微調整する種々の方法が、当業者に知られている。
【０３８７】
本発明に従う方法はさらに、反応物から脱ガスして、例えば１，３ブタジエンまたはイソプレンといったガス状産物を収集する、即ち、例えば培養物から脱ガスして産物を回収するステップを含む。ゆえに、好ましい実施形態において、本方法は、反応中にガス状の形態の１，３ブタジエンまたはイソプレンを収集する系の存在下で実行される。
【０３８８】
実際、１，３ブタジエン等の短いアルケンは、室温および大気圧にて気体状態をとる。さらに、イソプレンもまた、３７℃の培養条件下で気体状態をとる。したがって、本発明に従う方法は、産業規模で実行される場合に常に非常に高コストであるステップとなる、液体培地からの産物の抽出を必要としない。ガス状の炭化水素の排気および貯蔵、ならびに以降の可能な物理的分離および化学的変換は、当業者に知られている任意の方法に従って実行されてよい。
【０３８９】
また更なる実施形態において、本発明に従う方法は、例えば、本発明のアルケノールデヒドラターゼ変異体を含む単離された酵素の、または酵素もしくは部分的に精製された酵素調製物を含む細胞溶解物の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏは好ましくは、細胞フリー系であることを意味する。
【０３９０】
一実施形態において、本方法で用いられる酵素は、精製された形態で用いられる。しかしながら、そのような方法は、酵素および基質の生産コストおよび精製コストが高いため、高コストとなり得る。
【０３９１】
ゆえに、別の好ましい実施形態において、本方法で用いられる酵素は、非精製抽出物としての反応物中に、または非溶解細菌の形態で存在して、タンパク質精製コストが節約される。しかしながら、そのような方法と関連するコストは、基質を生産し、かつ精製するコストのために、依然として非常に高い場合がある。
【０３９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応において、酵素は、天然であれ組換えであれ、精製されていようといまいと、酵素が活性になり得る物理化学的条件において基質の存在下でインキュベートされ、インキュベーションは、先に記載された所望の産物の生産を可能とするのに十分な期間、進められ得る。インキュベーション終了時に、任意で、所望の化合物の存在が、そのような化合物の形成を測定するガスクロマトグラフィーまたは比色試験等の、当業者に知られている任意の検出系を用いて測定される。
【０３９３】
本発明の特に好ましい実施形態において、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行され、酵素は固定される。様々な支持体上に酵素を固定する手段および方法が、当業者に周知である。
【図面の簡単な説明】
【０３９４】
【図１ａ】共役ジエン（ブタジエン、イソプレン、ジメチル−ブタジエン）への変換が、野生型アルケノールデヒドラターゼおよびアルケノールデヒドラターゼ変異体によって触媒される、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応するアルケノール基質の例である。図１ａは、概略的に、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する第一級アリルアルコール（ＰＲＡ）を示す。基質名、系統名、式、カテゴリーおよび産物が示される。
【図１ｂ】図１ｂは、概略的に、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する第二級および第三級アリルアルコール（ＳＴＡ）を示す。基質名、系統名、式、カテゴリーおよび産物が示される。
【図１ｃ】図１ｃは、概略的に、３＜ｎ＜７である一般式ＣｎＨ２ｎＯに対応する第一級ホモアリルアルコール（ＰＨＡ）を示す。基質名、系統名、式、カテゴリーおよび産物が示される。
【図２】誘導進化アプローチの概略図である。
【図３】クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異体の完全なコレクションであり、野生型酵素と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図４】ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異であり、野生型酵素と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図５】１，３ブタジエンの産生に及ぼす位置Ｓ７５の突然変異の影響である。
【図６】１，３ブタジエンの産生に及ぼす位置Ｓ１２３の突然変異の影響である。
【図７】１，３ブタジエンの産生に及ぼす位置Ｖ１９５の突然変異の影響である。
【図８】１，３ブタジエンの産生に及ぼす位置Ｇ１３２の突然変異の影響である。
【図９】ｔ−クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換についての、野生型酵素対Ｖ１９５Ｆの比活性である。
【図１０】ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換についての、野生型酵素対Ｖ１９５Ｆの比活性である。
【図１１】クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性が増大した二重残基突然変異を有する酵素変異体である。
【図１２】トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換についての、野生型酵素対酵素変異体のパネルの比活性である。
【図１３】３−ブテン−２−オールアルコールの、１，３ブタジエンへの変換についての、野生型酵素対変異体のパネルの比活性である。
【図１４】Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５ＦＧ１３２Ａ変異体であり、プレノールをイソプレンに変換するアルケノールデヒドラターゼ酵素の能力がそれぞれ１２倍および２０倍増大している。
【図１５】Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５ＦＧ１３２Ａ変異体であり、イソプレノールをイソプレンに変換するアルケノールデヒドラターゼ酵素の能力がそれぞれ４〜５倍および８〜９倍増大している。
【図１６】配列番号２および配列番号３の配列特徴の説明図である。下線を引かれた配列はＨｉｓ６タグを表し、太字のイタリック体文字は固有の配列のアミノ酸残基Ｍ１を示す。
【図１７】クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異であり、Ｇ１３２Ａ  Ｖ１９５Ｆアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図１８】ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異であり、Ｇ１３２Ａ  Ｖ１９５Ｆアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図１９】クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異であり、野生型酵素と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図２０】ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増強のためのスクリーニングにおいて同定された突然変異であり、野生型酵素と比較した相対活性に従って順序付けられている。
【図２１】アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａ  Ｇ７３Ｓ  Ｅ７７Ｉ変異体による、クロチルアルコールの、ブタジエンへの変換である。ブタジエン産生が、基質濃度の関数としてプロットされている。
【図２２】アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａ  Ｇ７３Ｓ  Ｅ７７ＩおよびＶ１９５Ｆ  Ｇ７３Ｓ  Ｒ１７０Ｋ  Ｉ１８１Ｌ  Ｆ３２４Ｓ変異体による、ブタ−３−エン−２−オールの、ブタジエンへの変換である。ブタジエン産生が、基質濃度の関数としてプロットされている。
【図２３】実施例１５において用いられるＶ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ａ変異体の配列番号４および配列番号５の配列特徴の説明図である。下線を引かれた配列はＨｉｓ６タグを表し、太字のイタリック体文字は固有の配列のアミノ酸残基Ｆ３を示す。修飾Ｖ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ａは、太字で強調されている。イタリック体文字の配列「ＩＴＳＬＹＫＫＡＧＣ」は、ｐｅＴ３００：ＮＴ−ＤＥＳＴベクターによってコードされる。
【図２４】実施例１６において用いられるＶ１９５Ｆ変異体の配列番号６および配列番号７の配列特徴の説明図である。下線を引かれた配列はＨｉｓ６タグを表し、太字のイタリック体文字は固有の配列のアミノ酸残基Ｆ３を示す。修飾Ｖ１９５Ｆは、太字で強調されている。イタリック体文字の配列「ＩＴＳＬＹＫＫＡＧＣ」は、ｐｅＴ３００：ＮＴ−ＤＥＳＴベクターによってコードされる。
【図２５】実施例６において用いられる配列番号８および配列番号９野生型配列の配列特徴の説明図である。下線を引かれた配列はＨｉｓ６タグを表し、太字のイタリック体文字は固有の配列のアミノ酸残基Ｆ３を示す。イタリック体文字の配列「ＩＴＳＬＹＫＫＡＧＣ」は、ｐｅＴ３００：ＮＴ−ＤＥＳＴベクターによってコードされる。
【図２６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いた一組の突然変異体の特徴付けである。表１６に記載される空のベクター、野生型ＬＤＩならびにクローンＩＤ４８、Ｃ１２４６、Ｃ３０２７およびＣ６２０７が、実施例１に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて試験された。５０ｍＭクロチルアルコールを加えた１６時間後に測定がなされた。
【図２７】ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いた一組の突然変異体の特徴付けである。表１６に記載される空のベクター、野生型ＬＤＩならびにクローンＩＤ４８、Ｃ１２４６、Ｃ３０２７およびＣ６２０７が、実施例２１に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて試験された。０、５、１０、２５、５０または１００ｍＭクロチルアルコールを加えた４時間後に測定がなされた。クロチルアルコールが０ｍＭの結果は、グラフ上で見えない。
【図２８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いた一組の突然変異体の特徴付けである。突然変異体が、実施例１に記載されるように試験された。
【発明を実施するための形態】
【０３９５】
本発明の他の態様および利点が、以下の実施例において記載されるが、それらは限定としてではなく説明のために与えられるものである。
【実施例】
【０３９６】
Ｉ．クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示し、かつ／またはクロチルアルコールをブタ−３−エン−２−オールに変換することにおいて向上した活性を示し、かつ／またはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換することにおいて向上した活性を示すアルケノールデヒドラターゼ変異体のスクリーニングの概略
【０３９７】
スクリーニングは、（１）アルケノールデヒドラターゼ酵素の単一点突然変異体をコードするＤＮＡライブラリの生成、（２）これらの酵素変異体の活性を試験するアッセイの設計かつ確認、（３）突然変異体のコレクションを、野生型アルケノールデヒドラターゼと比較して活性が向上した突然変異体を同定するようにスクリーニングするための活性アッセイの使用、からなる誘導進化アプローチに基づいた。このアプローチの概略図を図２に示す。スクリーニング法は概して、いくつかのステップ（最大４）からなり、偽陰性を除外する、または最初の陽性ヒットの内の人為結果をアッセイするので、真のリードのみを保持することができる。
【０３９８】
スクリーニングは、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の速度がより速い、かつ／またはブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の速度がより速い酵素変異体を同定することを意図した。そうするために、スクリーニングアッセイを、類似のプロトコルを用いて実行したが、クロチルアルコール（トランス−シス異性体混合物）またはブタ−３−エン−２−オール（Ｒ、Ｓエナンチオマー混合物）を基質として用いたことを例外とする。両方のスクリーニングから得た変異体を、更なる試験にかけて、基質の範囲についての相対活性を評価した：（１）クロチルアルコール（トランス−シス異性体混合物）についてのスクリーニングから得た変異体を、ブタ−３−エン−２−オールについて試験し、（２）ブタ−３−エン−２−オール（Ｒ、Ｓエナンチオマー混合物）についてのスクリーニングから得た変異体を、クロチルアルコール（トランス−シス異性体混合物および純粋なトランス異性体）について試験し、（３）両スクリーニングから得た全変異体も、純粋なトランス異性体（＞９６％）について試験した。
【０３９９】
この一連のスクリーニング実験から得た変異体を、表１〜表４に記載しており、活性の範囲に従ってまとめた。また、向上した活性をもたらす突然変異を、分子生物学における古典的な方法を用いて規則的に組み合わせて、生じた複数の突然変異体を、単純な突然変異体と同じアッセイで試験した。表５は、複数の突然変異体を一覧にしている。
【０４００】
表１は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を与える突然変異の一覧を示している。
【０４０１】
増大倍数は、５０ｍＭクロチルアルコール（トランス＋シス異性体混合物または純粋なトランス異性体）にて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、野生型酵素について得たガスクロマトグラフシグナルに対する、アルケノールデヒドラターゼ変異体について得たガスクロマトグラフシグナルの比率である。完全なプロトコルを、実施例１の材料および方法の部において詳述する。表１は、単一残基突然変異を有する全ての酵素変異体を一覧にしている。これらの突然変異は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応の触媒作用を増大させる。
【０４０２】
【表１】
2016523524.tif 000003
【０４０３】
表２は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を与える突然変異の一覧を示している。
【０４０４】
増大倍数は、５０ｍＭクロチルアルコール（トランス＋シス異性体混合物または純粋なトランス異性体）にて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、突然変異体について得たガスクロマトグラフシグナル／野生型酵素について得たガスクロマトグラフシグナルの比率である。完全なプロトコルを、実施例１の材料および方法の部において詳述する。表２は、２つの突然変異を有する全てのアルケノールデヒドラターゼ変異体を一覧にしている。これらの変異体は、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についての触媒作用の増大を示す。
【０４０５】
【表２】
2016523524.tif 000004
【０４０６】
表３は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を与える突然変異の一覧を示している。
【０４０７】
増大倍数は、５０ｍＭブタ−３−エン−２−オールにて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、突然変異体について得たガスクロマトグラフシグナル／野生型酵素について得たガスクロマトグラフシグナルの比率である。表３は、単一突然変異を有する全ての酵素変異体を一覧にしている。これらの突然変異は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度を上げる。これらは、ブタ−３−エン−２−オールについて、またはクロチルアルコールについて、酵素ライブラリをスクリーニングすることによって得た。クロチルアルコールについてのスクリーニングから得た変異体について、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を、独立したアッセイにおいて評価した。
【０４０８】
【表３】
2016523524.tif 000005
【０４０９】
表４は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を与える突然変異の一覧を示している（二重突然変異体）。
【０４１０】
増大倍数は、５０ｍＭブタ−３−エン−２−オールにて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、突然変異体について得たガスクロマトグラフシグナル／野生型酵素について得たガスクロマトグラフシグナルの比率である。表４は、二重突然変異を有する全ての酵素変異体を一覧にしている。これらの突然変異は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度を上げる。これらは、ブタ−３−エン−２−オールについて、またはクロチルアルコールについて、酵素ライブラリをスクリーニングすることによって得た。クロチルアルコールについてのスクリーニングから得た変異体について、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を、独立したアッセイにおいて評価した。
【０４１１】
【表４】
2016523524.tif 000006
【０４１２】
表５は、クロチルアルコールおよび／またはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性の増大を示す突然変異体の一覧を示している（複数の突然変異）。増大倍数は、５０ｍＭクロチルアルコール（トランス＋シス異性体混合物または純粋なトランス異性体）にて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、または５０ｍＭブタ−３−エン−２−オールにて、３７℃での１６時間のインキュベーション後に、突然変異体について得たガスクロマトグラフシグナル／野生型酵素について得たガスクロマトグラフシグナルの比率である。完全なプロトコルを、実施例１５の材料および方法の部において詳述する。表５は、複数の突然変異を有する全ての酵素変異体を一覧にしている。これらの突然変異は、ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応速度を上げる。これらは、ブタ−３−エン−２−オールについて、またはクロチルアルコールについて、酵素ライブラリをスクリーニングすることによって得た。クロチルアルコールについてのスクリーニングから得た変異体について、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を、独立したアッセイにおいて評価した。
【０４１３】
【表５】
2016523524.tif 000007
2016523524.tif 000008
2016523524.tif 000009
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2016523524.tif 000011
【実施例１】
【０４１４】
ＩＩ．クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性が増強されたアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の同定
ａ）ライブラリの構築
アルケノールデヒドラターゼの単一残基突然変異体をコードするＤＮＡライブラリを、標準的な突然変異誘導技術を用いて構築した。ＤＮＡライブラリは、Ｎ末端にＨｉｓ６タグがある（配列番号３に示される）、アルケノールデヒドラターゼ酵素、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する酵素の全長コード配列に基づいて開発した。対応するコードヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。配列を、市販のｐｅＴ−２５ｂ＋発現ベクター中にサブクローニングして、突然変異誘導ＰＣＲのテンプレートとして用いた。ライブラリ構築のための品質制御は、２つのステップからなった：（１）得られた増幅ＤＮＡ断片を、対照反応の範囲に対して分析かつ定量化し、（２）ＤＮＡ配列決定法を、２００のランダムに選択したクローンについて実行した。ＤＮＡ断片のプロフィールは予想通りであった。アルケノールデヒドラターゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列分析に関して、クローンの７３％は単一残基突然変異を示し、残りは野生型であると見出した。
【０４１５】
ｂ）スクリーニングアッセイ
注目する酵素変異体を同定するスクリーニングアッセイを特別に開発した。このアッセイは、以下のように設定した：ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター中アルケノールデヒドラターゼ単一点突然変異ＤＮＡライブラリを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単離したクローンを用いて１ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、７００ｒｐｍおよび８５％の湿度に設定した振盪インキュベータ内で一晩３０℃にて２０〜２２時間増殖した。細胞をペレット化して、−８０℃にて一晩保存した。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有するこれらの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭクロチルアルコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得たトランス−シス混合物）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。この反応混合物を、３７℃にて１６時間インキュベートし、反応を８０℃にて５分のインキュベーションによって停止した。その後、産生された１，３ブタジエンの量を、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、３００μｌのヘッドスペースガスを注入した。１，３ブタジエンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１４０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。
【０４１６】
ｃ）活性が増大した酵素変異体の同定
アルケノールデヒドラターゼの単一残基変異体のライブラリを、先に記載したスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。総数１６，３１８の変異体をアッセイした。アルケノールデヒドラターゼ変異体と一緒に、野生型アルケノールデヒドラターゼ酵素を用いた参照対照および陰性対照（アルケノールデヒドラターゼ酵素なし）を含む対照反応を設定した。全体で、１９，９００のクローンをスクリーニングした。分析した１６，３１８のアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の内、３５３の陽性ヒットを同定し、これらは、スクリーニングした集団の２．１８％を表す。一次スクリーニングにおいて単離した３５３の変異体の内、５２の変異体が、付加的な２ラウンドのスクリーニング後に残った。複数の反復において、そして活性の増大が再生可能であり、かつアッセイの人為結果によらないことを確実とする条件の範囲において、これらの変異体を試験した。最後に、各クローンをＤＮＡ配列決定法にかけて、酵素活性の変化の原因となる突然変異を同定した。図３は、同定した突然変異体の完全なコレクションを示しており、野生型酵素と比較した相対活性に従って順序付けた。
【実施例２】
【０４１７】
ＩＩＩ．ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性が増強されたアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の同定
実施例１に記載した単一残基突然変異体のライブラリを、実施例１に記載したプロトコルに従ってスクリーニングしたが、アッセイ反応混合物を以下のように修飾したことを例外とする：発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有する細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭブタ−３−エン−２−オール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。５０ｍＭブタ−３−エン−２−オールで活性の増大を示す変異体をさらに、１２．５および２５ｍＭブタ−３−エン−２−オールを用いてアッセイした。図４は、このスクリーニングによって同定した突然変異の完全な収集を示しており、野生型酵素と比較した相対的な活性に従って順序付けた。
【実施例３】
【０４１８】
ＩＶ．トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の活性の増大の原因となる、アルケノールデヒドラターゼの残基Ｓ７５の突然変異の同定
スクリーニングにより、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換を増大させることができる突然変異Ｓ７５Ｍを同定することができた。位置Ｓ７５の他の置換の範囲の影響を試験して、他の置換が、Ｓ７５Ｍと同様に、野生型酵素の活性を増強することができるか否かを評価した。Ｓ７５変異体をコードする発現ベクター用のプラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換し、単一形質転換体を用いて１ｍｌの自己誘導培地に播種し、組換え酵素を細菌内に産生させた。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有する凍結細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび２５ｍＭトランスクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。３７℃にて１６時間のインキュベーション後、産生された１，３ブタジエンの量を、実施例１に記載したＧＣ法に従うガスクロマトグラフィーによって定量化した。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。全ての変異体を８反復試験した。未処理のＧＣデータを図５に示す。Ｓ７５のＴ、Ａ、Ｎ、Ｖへの置換により、野生型酵素と比較して、産生される１，３ブタジエンの量がおよそ２倍増大した。Ｓ７５のＭ、Ｇ、Ｌへの置換により、産生される１，３ブタジエンの量が１．３〜１．５倍増大した。
【実施例４】
【０４１９】
Ｖ．トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の活性の増大の原因となる、アルケノールデヒドラターゼの残基Ｓ１２３の突然変異の同定
実施例１に記載したスクリーニングにより、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換のおよそ３倍の増大の原因となるアルケノールデヒドラターゼの位置Ｓ１２３での４つの置換を同定することができた（Ｓ１２３Ｒ、Ｓ１２３Ｈ、Ｓ１２３Ｅ、Ｓ１２３Ｄ）。位置Ｓ１２３の他の置換の範囲の影響を試験して、他の置換が、Ｓ１２３Ｒ、Ｓ１２３Ｈ、Ｓ１２３Ｅ、Ｓ１２３Ｄと同様に、野生型酵素の活性を増強することができるか否かを評価した。Ｓ１２３変異体をコードする発現ベクター用のプラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換し、単一形質転換体を用いて１ｍｌの自己誘導培地に播種し、組換え酵素を細菌内に産生させた。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有する凍結細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトランスクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。３７℃にて１６時間のインキュベーション後、産生された１，３ブタジエンの量を、実施例１に記載したＧＣ法に従うガスクロマトグラフィーによって定量化した。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。全ての変異体を８反復試験した。未処理のＧＣデータを図６に示す。Ｓ１２３Ｒ、Ｓ１２３Ｈ、Ｓ１２３Ｅ、Ｓ１２３Ｄに加えて、このアッセイは、活性の１．７〜２倍の増大を与える突然変異としてＳ１２３Ｗ、Ｓ１２３Ｙを、活性のおよそ１．５倍の増大を与える突然変異Ｓ１２３ＫおよびＳ１２３Ｉを、そして１．２〜１．３倍の増大の原因となる突然変異Ｓ１２３Ｍ／Ｑ／Ｖ／Ｔ／Ｌ／Ｆを同定した。
【実施例５】
【０４２０】
ＶＩ．トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の活性の増大の原因となる、アルケノールデヒドラターゼの残基Ｖ１９５の突然変異の同定
実施例１に記載したスクリーニングにより、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換を触媒する活性が、野生型酵素よりもおよそ８倍高いＶ１９５Ｆ変異体を同定することができた。Ｖ１９５Ｆは、最も良い性能の変異体として同定された。位置Ｖ１９５の他の置換の範囲の影響を試験して、他の置換が、Ｖ１９５Ｆと同様に、野生型酵素の活性を増強することができるか否かを評価した。Ｖ１９５変異体をコードする発現ベクター用のプラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換し、単一形質転換体を用いて１ｍｌの自己誘導培地に播種し、組換え酵素を細菌内に産生させた。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有する凍結細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトランスクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。３７℃にて１６時間のインキュベーション後、産生された１，３ブタジエンの量を、実施例１に記載したＧＣ法に従うガスクロマトグラフィーによって定量化した。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。全ての変異体を８反復試験した。未処理のＧＣデータを図７に示す。Ｖ１９５Ｆに加えて、Ｖ１９５Ｙの活性が、野生型酵素と比較して３．５倍増大したことが見出された。Ｖ１９５Ｌ、Ｖ１９５Ｍ、Ｖ１９５Ｃもまた、１．２〜１．３倍の活性の増大を示す。
【実施例６】
【０４２１】
ＶＩＩ．トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の活性の増大の原因となる、アルケノールデヒドラターゼの残基Ｇ１３２の突然変異の同定
実施例１に記載したスクリーニングにより、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の４倍の増大の原因となるＧ１３２Ｄアルケノールデヒドラターゼ変異体を同定することができた。位置Ｇ１３２の置換の範囲の影響を試験して、他の置換が、Ｇ１３２Ｄと同様に、野生型酵素の活性を増強することができるか否かを評価した。Ｇ１３２変異体をコードする発現ベクター用のプラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換し、単一形質転換体を用いて１ｍｌの自己誘導培地に播種し、組換え酵素を細菌内に産生させた。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有する凍結細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトランスクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。３７℃にて１６時間のインキュベーション後、産生された１，３ブタジエンの量を、実施例１に記載したＧＣ法に従うガスクロマトグラフィーによって定量化した。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。全ての変異体を８反復試験した。未処理のＧＣデータを図８に示す。これらの結果は、Ｇ１３２が、酵素活性に重要な位置であることを示している。というのも、Ｇ１３２Ｄ変異体に加えて、９つの他の置換により、酵素活性が上記の２倍増大する一方で（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ）、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｔへの置換により、１．２〜１．８倍増大するからである。
【実施例７】
【０４２２】
ＶＩＩＩ．アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ変異体の運動定数の判定−クロチルアルコールの、ブタジエンへの変換
クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ−２５ｂ＋細菌発現ベクター中にサブクローニングした野生型アルケノールデヒドラターゼおよびＶ１９５Ｆ変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁させ、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）を補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離によって澄明にし、上清を、濾過コンセントレータを用いて２倍濃縮した。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定した。酵素反応を、４５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のトランスクロチルアルコール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１から６時間インキュベートした。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生された１，３ブタジエンを、先に記載したガスクロマトグラフィーによって定量化した。反応によって産生された１，３ブタジエンの絶対量を定量化するために、ガスクロマトグラフを、純粋なブタジエン（１から１０，０００ｐｐｍ）の濃度範囲を用いて較正した。較正表は、この範囲のブタジエン濃度において線形であると見出された。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、トランスクロチルアルコールの濃度の関数としてプロットし（図９）、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表５に示されるｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４２３】
【表６】
2016523524.tif 000012
【実施例８】
【０４２４】
ＩＸ．アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ変異体の運動定数の判定−ブタ−３−エン−２−オールの、ブタジエンへの変換
ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔ（ｓ−１）およびＫｍ値（ｍＭ）定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ−２５ｂ＋細菌発現ベクター中にサブクローニングした野生型アルケノールデヒドラターゼおよびＶ１９５Ｆ変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁させ、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー）を補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離によって澄明にし、上清を、遠心コンセントレータを用いて２倍濃縮した。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定した。酵素反応を、４５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のブタ−３−エン−２−オール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１から６時間インキュベートした。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生された１，３ブタジエンを、先に記載したガスクロマトグラフィーによって定量化した。反応によって産生された１，３ブタジエンの絶対量を定量化するために、ガスクロマトグラフを、純粋なブタジエン（１から１０，０００ｐｐｍ）の濃度範囲を用いて較正した。較正表は、この範囲のブタジエン濃度において線形であると見出された。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、ブタ−３−エン−２−オールの濃度の関数としてプロットし（図１０）、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表６に要約するｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４２５】
【表７】
2016523524.tif 000013
【実施例９】
【０４２６】
Ｘ．クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性が増大した、二重残基突然変異を有する酵素変異体の同定
二重突然変異体のコレクションを、テンプレートとしてＶ１９５Ｆアルケノールデヒドラターゼ変異体（配列番号２）を用いて構築した。変異体の活性を評価するために、このコレクションをｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単離したクローンを用いて１ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、７００ｒｐｍおよび８５％の湿度に設定した振盪インキュベータ内で３０℃にて一晩２０〜２２時間増殖した。細胞をペレット化して、−８０℃にて一晩保存した。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有するこれらの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒから得たトランス異性体）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋またはＶ１９５Ｆ変異体を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。この反応混合物を、３７℃にて１６時間インキュベートし、反応を８０℃にて５分のインキュベーションによって停止した。その後、産生された１，３ブタジエンの量を、実施例１に記載した方法に従うガスクロマトグラフィー分析によって定量化した。データを図１１に示す。これらのデータは、１５の置換体（１２が位置Ｇ１３２上）がさらに、Ｖ１９５Ｆ変異体の活性をおよそ１．４〜３．４倍増大させることを示している。二重突然変異Ｖ１９５Ｆ−Ｇ１３２ＲおよびＶ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ｌを有する変異体はそれぞれ、最も良い性能の変異体の１つである。
【実施例１０】
【０４２７】
ＸＩ．アルケノールデヒドラターゼ変異体のコレクションの運動定数の判定−トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換
トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、実施例７に記載したプロトコルを用いて判定した。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、トランスクロチルアルコールの濃度の関数としてプロットし（図１２）、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表７に要約するｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４２８】
【表８】
2016523524.tif 000014
【実施例１１】
【０４２９】
ＸＩＩ．アルケノールデヒドラターゼ変異体のコレクションの運動定数の判定−ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換
ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、実施例１０に記載したプロトコルを用いて判定した。濃縮した可溶性の画分中に存在する組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ＢＳＡ標準曲線に対するゲルデンシトメトリーにより推定した。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、３−ブタ−エン−２−オールの濃度の関数としてプロットし、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表８に要約するｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した（図１３も参照）。
【０４３０】
【表９】
2016523524.tif 000015
【実施例１２】
【０４３１】
ＸＩＩＩ．アルケノールデヒドラターゼ変異体Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａは、プレノールをイソプレンに変換する活性が、野生型酵素と比較して増大している
アルケノールデヒドラターゼは、プレノールの、イソプレンへの変換を触媒する。プレノールの、イソプレンへの変換を触媒するアルケノールデヒドラターゼの能力に及ぼす、Ｖ１９５ＦおよびＶ１９７ＦＧ１３２Ａ突然変異（１，３ブタジエンの産生について、高性能の変異体）の影響を評価した。アッセイを、以下のように設定した：野生型アルケノールデヒドラターゼならびにＶ１９５ＦおよびＶ１９７ＦＧ１３２Ａ変異体を、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物を、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。２００ｍｌの培養物から得られ、かつ過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルタチオン）中に再懸濁させ、１０μｌ  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅを補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）によって澄明にし、上清を、濾過コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて３倍濃縮した。酵素反応物を、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（変異体）、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（空のベクターで形質転換した細胞）、および２０、４０、８０ｍＭの範囲のプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する２ｍｌのガラスバイアル内に設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１時間インキュベートした。酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＢＳＡ較正曲線に対して定量化した。酵素反応を、８０℃にて５分間のインキュベーションによって停止し、産生されたイソプレンを、ガスクロマトグラフィーによって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：１０である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（３０ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。ＧＣデータを、等量のタンパク質に対して正規化した。図１４に示されるデータは、Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５ＦＧ１３２Ａ変異体がそれぞれ、プレノールをイソプレンに変換するアルケノールデヒドラターゼ酵素の能力の１２倍および２０倍の増���をもたらすことを示している。
【実施例１３】
【０４３２】
ＸＩＶ．  アルケノールデヒドラターゼ変異体Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａは、イソプレノールをイソプレンに変換する活性が、野生型酵素と比較して増大している
アルケノールデヒドラターゼは、イソプレノールの、イソプレンへの変換を触媒する。イソプレノールの、イソプレンへの変換を触媒する最も良い性能の変異体Ｖ１９５ＦおよびＶ１９７ＦＧ１３２Ａの能力を評価し、かつ野生型酵素と比較した。アッセイを、以下のように設定した：野生型アルケノールデヒドラターゼならびにＶ１９５ＦおよびＶ１９７ＦＧ１３２Ａ変異体を、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物を、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。２００ｍｌの培養物から得られ、かつ過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルタチオン）中に再懸濁させ、１０μｌ  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅを補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）によって澄明にし、上清を、濾過コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて３倍濃縮した。酵素反応物を、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（変異体）、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（空のベクターで形質転換した細胞）、および２０、４０、８０ｍＭの範囲のイソプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する２ｍｌのガラスバイアル内に設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１時間インキュベートした。酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＢＳＡ較正曲線に対して定量化した。酵素反応を、８０℃にて５分間のインキュベーションによって停止し、イソプレンを、ガスクロマトグラフィーによって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２５ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。ＧＣデータを、等量のタンパク質に対して正規化した。図１５に示されるデータは、Ｖ１９５ＦおよびＶ１９５ＦＧ１３２Ａ変異体がそれぞれ、イソプレノールをイソプレンに変換するアルケノール酵素の能力の４〜５倍および８〜９倍の増大をもたらすことを示している。
【実施例１４】
【０４３３】
ＸＶ．アルケノールデヒドラターゼＶ１９５ＦおよびＶ１９５Ｇ１３２Ａ変異体の運動定数の判定−プレノールの、イソプレンへの変換
プレノールの、イソプレンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：野生型アルケノールデヒドラターゼ、Ｖ１９５ＦおよびＶ１９７ＦＧ１３２Ａ変異体を、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換し、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。２００ｍｌの培養物から得られ、かつ過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルタチオン）中に再懸濁させ、１０μｌ  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅを補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）によって澄明にし、上清を、濾過コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、１ｍｌの最終容量に３倍濃縮した。５００μｌの酵素反応物を、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（変異体）、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（空のベクターで形質転換した細胞）、および２０、４０、８０、１２０ｍＭの範囲のプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する２ｍｌのガラスバイアル内に設定した。バイアルは封をし、３７℃にて２０、４０、６０、９０、１２０および１８０分間インキュベートした。酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＢＳＡ較正曲線に対して定量化した。酵素反応を、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生されたイソプレンを、ガスクロマトグラフィーによって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：１０である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２５ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。イソプレンの産生速度（イソプレンモル／酵素モル／秒）を、プレノールの濃度の関数としてプロットし、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表９に示されるｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍ��）を抽出した。
【０４３４】
【表１０】
2016523524.tif 000016
【実施例１５】
【０４３５】
ＸＶＩ．クロチルアルコールおよびブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性が増強されたアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の同定
ａ）ライブラリの構築
アルケノールデヒドラターゼの単一残基突然変異体をコードするＤＮＡライブラリを、標準的な突然変異誘導技術を用いて構築した。ＤＮＡライブラリは、Ｎ末端にＨｉｓ６タグがある、配列番号５（図２３参照）に示されるアミノ酸配列によってコードされる、アルケノールデヒドラターゼ酵素変異体Ｖ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ａの全長コード配列に基づいた。配列を、市販のｐｅＴ３００：ＮＴ−ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）発現ベクター中にサブクローニングして、突然変異誘導ＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【０４３６】
ｂ）スクリーニングアッセイ
このアッセイは、以下のように設定した：ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター中アルケノールデヒドラターゼ点突然変異ＤＮＡライブラリを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単離したクローンを用いて０．３ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、７００ｒｐｍおよび８５％の湿度に設定した振盪インキュベータ内で一晩３０℃にて２０〜２２時間増殖した。細胞をペレット化して、−８０℃にて一晩保存した。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有するこれらの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭクロチルアルコール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒから得たトランス異性体）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋またはＶ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ａ酵素変異体を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。この反応混合物を、３７℃にて１６時間インキュベートし、反応を８０℃にて５分のインキュベーションによって停止した。その後、産生された１，３ブタジエンの量を、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。１，３ブタジエンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１４０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。
【０４３７】
ｃ）活性が増大した酵素変異体の同定
アルケノールデヒドラターゼの単一残基変異体のライブラリを、先に記載したスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。総数１６，３１８の変異体をアッセイした。アルケノールデヒドラターゼ変異体と一緒に、Ｖ１９５Ｆ−Ｇ１３２Ａ酵素変異体を用いた参照対照および陰性対照（アルケノールデヒドラターゼ酵素なし）を含む対照反応を設定した。これらの変異体を、全体で３ラウンドのスクリーニングにかけた。このスクリーニングプロセス中、複数の反復において、そして活性の増大が再生可能であり、かつアッセイの人為結果によらないことを確実とする条件の範囲において、変異体を試験した。スクリーニングの後者のステージにおいて、残ったヒットをアッセイして、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を評価した。最後に、各クローンをＤＮＡ配列決定法にかけて、酵素活性の変化の原因となる突然変異を同定した。図１７は、クロチルアルコールを１，３ブタジエンに変換する活性が増大した５つのアルケノールデヒドラターゼ変異体のコレクションを示す。図１８は、ブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性が増大した７つのアルケノールデヒドラターゼ変異体のコレクションを示す。
【実施例１６】
【０４３８】
ＸＶＩＩ．クロチルアルコールおよびブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性が増強されたアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の同定
ａ）ライブラリの構築
先のスクリーニングにおいて同定したアミノ酸突然変異のコレクションを再結合するためにコンビナトリアルライブラリを構築した。コンビナトリアルライブラリは、テンプレートとしてアルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ変異体配列（配列番号７、即ち、変異体Ｖ１９５Ｆの配列；図２４参照）を用いて構築した。この配列は、表１０に詳述するように、１５の位置で無作為化して２５の異なる突然変異を導入した。コンビナトリアルライブラリの構築は、標的遺伝子配列に合致するように設計したオーバーラップするセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのアセンブリに基づく遺伝子合成の標準的な技術を用いた（Czar et al, 2009 Trends in Biotechnology 27:63-72；Kodumal et al, 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15573-15578；Smith et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15440-15445；Xiong et al, 2008 FEMS Microbiol Rev 32:522-540）。簡潔に、Ｖ１９５Ｆアルケノールデヒドラターゼ変異体骨格を表す６９の３４〜３５マーオリゴヌクレオチドの混合物を、５０μＭの最終濃度で調製し、標的アミノ酸位置で変異したオリゴヌクレオチドを添加した（０．０５〜０．６μＭ）。ＤＮＡテンプレートのないＰＣＲ様反応を、３μｌのオリゴヌクレオチド混合物および０．５μｌのＰｆｘポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて設定して、遺伝子をオリゴヌクレオチドからアセンブルした。クローンあたりの突然変異率を、変異したオリゴヌクレオチドに対する骨格オリゴヌクレオチドの比率によって制御した。再アセンブルした遺伝子のＰＣＲ増幅の更なるサイクルを、遺伝子の５’末端および３’末端に位置するプライマーを用いて実行した。最後に、増幅したフラグメントを、市販のｐｅＴ−３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングした。
【０４３９】
ｂ）活性が増大した酵素変異体のスクリーニングアッセイおよび同定
アルケノールデヒドラターゼの複数残基変異体のコンビナトリアルライブラリを、実施例１５に記載したスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。およそ１３，５００の変異体を同時にアッセイして、クロチルアルコールおよびブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する能力を評価した。アルケノールデヒドラターゼ変異体と一緒に、野生型酵素（図２５に示す、配列番号９参照）、Ｖ１９５Ｆ酵素変異体を用いた参照対照および陰性対照（アルケノールデヒドラターゼ酵素なし）を含む対照反応を設定した。これらの変異体を、全体で３ラウンドのスクリーニングにかけた。このスクリーニングプロセス中、複数の反復において、そして活性の増大が再生可能であり、かつアッセイの人為結果によらないことを確実とする条件の範囲において、変異体を試験した。最後に、各クローンをＤＮＡ配列決定法にかけて、酵素活性の変化の原因となる突然変異を同定した。図１９および図２０は、クロチルアルコールまたはブタ−３−エン−２−オールを１，３ブタジエンに変換する活性（野生型酵素と比較した相対活性）が増大した５つのアルケノールデヒドラターゼ変異体のコレクションを示す。
【０４４０】
【表１１】
2016523524.tif 000017
【実施例１７】
【０４４１】
ＸＶＩＩＩ．アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａ  Ｇ７３Ｓ  Ｅ７７Ｉ変異体の運動定数の判定−クロチルアルコールの、ブタジエンへの変換
クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ−３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ細菌発現ベクター中にサブクローニングした野生型アルケノールデヒドラターゼおよびＶ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁させ、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー中１００μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ）を補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離によって澄明にし（１０，０００ｒｐｍで１５分）、上清を、濾過コンセントレータを用いて２倍濃縮した。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定した。酵素反応を、２５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のトランスクロチルアルコール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１から４時間インキュベートした。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生された１，３ブタジエンを、先に記載したガスクロマトグラフィーによって定量化した。反応によって産生された１，３ブタジエンの絶対量を定量化するために、ガスクロマトグラフを、純粋なブタジエン（１から１０，０００ｐｐｍ）の濃度範囲を用いて較正した。較正表は、この範囲のブタジエン濃度において線形であると見出された。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、トランスクロチルアルコールの濃度の関数としてプロットし（図２１）、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表１１に示されるｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４４２】
【表１２】
2016523524.tif 000018
【実施例１８】
【０４４３】
ＸＩＸ．アルケノールデヒドラターゼＶ１９５Ｆ  Ｇ１３２Ａ  Ｇ７３Ｓ  Ｅ７７ＩおよびＶ１９５Ｆ  Ｇ７３Ｓ  Ｒ１７０Ｋ  Ｉ１８１Ｌ  Ｆ３２４Ｓ変異体の運動定数の判定−ブタ−３−エン−２−オールの、ブタジエンへの変換
ブタ−３−エン−２−オールの、１，３ブタジエンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：市販のＮｏｖａｇｅｎ  ｐｅＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ細菌発現ベクター中にサブクローニングした野生型アルケノールデヒドラターゼ、Ｖ１９５ＦＧ１３２ＡＧ７３ＳＥ７７Ｉ変異体およびＶ１９５ＦＧ７３ＳＲ１７０Ｋ  Ｉ１８１ＬＦ３２４Ｓ変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換し、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁させ、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅ（１リットルの培養物から生産された細胞ペレットについて、１５ｍｌの溶解バッファー）を補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離によって澄明にし、上清を、遠心コンセントレータを用いて２倍濃縮した。濃縮した可溶性の画分中に存在する酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ゲルデンシトメトリーを用いたＢＳＡ較正曲線に対して推定した。酵素反応を、２５０μｌの細胞溶解物の上清、０から１００ｍＭの範囲のブタ−３−エン−２−オール、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５を有する２ｍｌのガラスバイアルで設定した。バイアルは封をし、３７℃にて１から４時間インキュベートした。酵素反応は、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生された１，３ブタジエンを、先に記載したガスクロマトグラフィーによって定量化した。反応によって産生された１，３ブタジエンの絶対量を定量化するために、ガスクロマトグラフを、純粋なブタジエン（１から１０，０００ｐｐｍ）の濃度範囲を用いて較正した。較正表は、この範囲のブタジエン濃度において線形であると見出された。ブタジエンの産生速度（ブタジエンモル／酵素モル／秒）を、ブタ−３−エン−２−オールの濃度の関数としてプロットし（図２２）、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表１２に要約されるｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４４４】
【表１３】
2016523524.tif 000019
【実施例１９】
【０４４５】
ＸＸ．プレノールおよびイソプレノールをイソプレンに変換する活性が、野生型酵素と比較して増大したアルケノールデヒドラターゼ変異体の同定
プレノールおよびイソプレノールの、イソプレンへの変換を触媒する、１，３ブタジエンの産生用の高性能のアルケノールデヒドラターゼ変異体の能力をアッセイするスクリーニングを設定した。アッセイを以下のように設定した：アルケノールデヒドラターゼ変異体および野生型酵素を、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換して、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物を、シェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。発現された発現組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有するこれらの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオンおよび５０ｍＭプレノールまたはイソプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋またはＶ１９５Ｆ酵素変異体を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。プレノールスクリーニングアッセイのために、この反応混合物を、３７℃にて４時間および２０℃にて１６時間インキュベートした。イソプレノールスクリーニングアッセイのために、この反応混合物を、３７℃にて１６時間および２０℃にて４時間インキュベートした。産生されたイソプレンの量を、ガスクロマトグラフィー分析によって直ちに定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１０５℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：１０である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２０ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。プレノールおよびイソプレノール基質についてのアッセイの結果を、それぞれ表１３および表１４に示す。
【０４４６】
【表１４】
2016523524.tif 000020
【０４４７】
【表１５】
2016523524.tif 000021
2016523524.tif 000022
【実施例２０】
【０４４８】
ＸＸＩ．
アルケノールデヒドラターゼの最も良い性能の変異体の運動定数の判定−イソプレノールの、イソプレンへの変換
イソプレノールの、イソプレンへの変換の反応についてのミハエリス−メンテンｋｃａｔおよびＫｍ定常状態運動定数を、以下のプロトコルを用いて判定した：野生型アルケノールデヒドラターゼ、アルケノールデヒドラターゼ変異体を、市販のｐＥＴ３００／ＮＴ−ＤＥＳＴ発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にサブクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換し、適切な抗生物質を補ったＬＢアガープレート上にプレーティングした。単離した形質転換体を用いて自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、培養物をシェーカーインキュベータ内で３０℃にて一晩インキュベートした。２００ｍｌの培養物から得られ、かつ過剰発現組換え酵素を含有する細胞ペレットを、−８０℃にて一晩保存してから、３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルタチオン）中に再懸濁させ、１０μｌ  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅを補った。細胞懸濁液を、室温で１０分間、その後氷上で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）によって澄明にし、上清を、濾過コンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、１ｍｌの最終容量に３倍濃縮した。５００μｌの酵素反応物を、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（変異体）、２００μｌの濃縮細胞溶解物の上清（空のベクターで形質転換した細胞）、および２０、４０、８０、１２０ｍＭの範囲のイソプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する２ｍｌのガラスバイアル内に設定した。バイアルは封をし、３７℃にて２０、４０、６０、９０、１２０および１８０分間インキュベートした。酵素変異体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＢＳＡ較正曲線に対して定量化した。酵素反応を、８０℃にて５分間インキュベートすることによって停止し、産生されたイソプレンを、ガスクロマトグラフィーによって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：１０である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２５ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。イソプレンの産生速度（イソプレンモル／酵素モル／秒）を、プレノールの濃度の関数としてプロットし、曲線を、ミハエリス−メンテン等式（Ｖ＝（Ｖｍａｘ＊（基質））／（Ｋｍ＋（基質）））を用いて当てはめて、表１５に示されるｋｃａｔ（ｓ−１）およびｋｍ値（ｍＭ）を抽出した。
【０４４９】
【表１６】
2016523524.tif 000023
【実施例２１】
【０４５０】
ＸＸＩＩ．ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイを用いた変異体の特徴付け
９６ウェルプレート内で野生型酵素とｉｎ  ｖｉｖｏ比較して活性がより高いクロチルアルコールデヒドラターゼ変異体を同定することで、高スループットスクリーニングアプローチと適合性があるアッセイを開発した。このｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、クロチルアルコールデヒドラターゼのコード配列を含有する発現ベクターで形質転換した細菌系統の使用に基づく。ゆえに、この細菌系統は、クロチルアルコールデヒドラターゼ組換え酵素を産生し、かつ培地中に補われたクロチルアルコールをブタジエンに変換することができる。
【０４５１】
ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター中にクローニングしたアルケノールデヒドラターゼ変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単離したクローンを用いて、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを有する、９６ウェルマイクロプレート内の１ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、７００ｒｐｍおよび８５％の湿度に設定した振盪インキュベータ内で一晩３０℃にて２０〜２２時間増殖した。その翌日、マイクロプレートを反復して、３０℃にて２０時間増殖した。その後、細胞をエッペンドルフ遠心分離機内で４０００ｒｐｍにて１０分遠心分離し、ペレットを、炭素源としてのグルコース（４５ｇ／Ｌ）、ｐＨ＝８．５の１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および種々の濃度（５から１００ｍＭ）のクロチルアルコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得たトランスシス混合物）を有する０．５ｍｌのＭＳ培地（Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. and Marliere P; The Journal of Biological Chemistry; 1993; Vol. 268; No. 36; pp. 26827-26835）中に再懸濁させた。対照反応は、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋または野生型酵素を発現する発現ベクターのいずれかを含有する細菌クローンを用いて設定した。この反応混合物を、Ｔｉｔｒａｍａｘマイクロプレートアジテータを用いて３７℃にて４時間インキュベートし、反応を、８０℃にて５分のインキュベーションによって停止した。その後、産生された１，３ブタジエンの量を、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、３００μｌのヘッドスペースガスを注入した。１，３ブタジエンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１４０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２８ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。
【０４５２】
このｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、表１６に記載される一組の突然変異体を特徴付けた。発明者らは特に、発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、野生型酵素と比較して、ブタジエン産生のおよそ２６０倍の増大を示すＣ６２０７という名の１つの変異体を同定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのデータをそれぞれ図２６および図２７に示す。
【０４５３】
【表１７】
2016523524.tif 000024
【実施例２２】
【０４５４】
ＸＸＩＩＩ．最も良い一部の変異体の比較
表５で一覧にされる最も良い変異体の内の一組の変異体を、実施例１に記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて比較した。変異体を表１７に記載する。結果を図２８に記載する。
【０４５５】
【表１８】
2016523524.tif 000025
【実施例２３】
【０４５６】
ＸＩＸ．プレノールを１，３イソプレンに変換する活性が増強されたアルケノールデヒドラターゼ酵素変異体の同定
ａ）原理
プレノールの、イソプレンへの変換について、アルケノールデヒドラターゼ（配列番号１に表される）の活性を向上させる残基を同定するために、突然変異体の新しいライブラリを設計し、構築し、かつスクリーニングした。３９７の内の１３２の残基を個々に変異させた。これらの残基は、表１８で一覧にする９つの異なるタンパク質セグメントに属する。
【０４５７】
【表１９】
2016523524.tif 000026
【０４５８】
ｂ）ライブラリの構築
アルケノールデヒドラターゼの単一残基突然変異体をコードするＤＮＡライブラリを、標準的な突然変異誘導技術を用いて構築した。ＤＮＡライブラリは、Ｎ末端にＨｉｓ６タグがある、配列番号１に示されるアミノ酸配列によってコードされる、アルケノールデヒドラターゼ酵素の全長コード配列に基づいた。配列を、市販のｐｅＴ３００：ＮＴ−ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）発現ベクター中にサブクローニングして、突然変異誘導ＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【０４５９】
ｃ）スクリーニングアッセイ
このアッセイは、以下のように設定した：ｐＥＴ２５ｂ＋発現ベクター中アルケノールデヒドラターゼ点突然変異ＤＮＡライブラリを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単離したクローンを用いてディープウェル９６ウェルマイクロプレート内の０．３ｍｌの自己誘導培地（Studier F.W, Protein Expr. Purif. 41 (2005), 207-234）に播種し、７００ｒｐｍおよび８５％の湿度に設定した振盪インキュベータ内で一晩３０℃にて２０〜２２時間増殖した。細胞をペレット化して、−８０℃にて一晩保存した。発現された組換えアルケノールデヒドラターゼ変異体を含有するこれらの細胞ペレットを、５０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭグルタチオン（０．２５％  Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｙｓｏｎａｓｅを補った）および５０ｍＭプレノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する反応混合物中に再懸濁させた。反応物を３７℃にて４時間、その後２０℃にて１６時間インキュベートし、最終的に８０℃にて５分のインキュベーションによって反応を停止した。
その後、産生されたイソプレンの量を、ガスクロマトグラフィー分析によって定量化した。ＧＣヘッドスペース分析のために、Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴ−アルミナカラム（５ｍ×０．３２ｍｍ）およびＦｌａｍｅイオン化検出系（ＦＩＤ）が装備されるＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０系内に、１００μｌのヘッドスペースガスを注入した。イソプレンを検出するのに用いたＧＣ分析法は、１８０℃の一定のオーブン温度、スプリット比率が１：４である２００℃のインジェクタポート温度、および２５０℃のＦＩＤディテクタ温度によって特徴付けられる。窒素をキャリアガスとして用い（１．２５ｍｌ／分の一定のフロー）、そして空気（エアフロー３００ｍｌ／分）、窒素（２５ｍｌ／分のフロー）および水素（３０ｍｌ／分のフロー）の混合物を用いて、ＦＩＤ検出系を供給した。これらのパラメータを用いて、イソプレンの保持時間は５．７５分である。
【０４６０】
ｄ）活性が増大した酵素変異体の同定
アルケノールデヒドラターゼの単一残基変異体のライブラリを、先に記載したスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。約７２のクローンを、１３２の無作為化した位置のそれぞれについて試験した。総数９，５０４の変異体をアッセイした。アルケノールデヒドラターゼ変異体と一緒に、空の発現ベクターｐｅＴ２５ｂ＋（陰性対照）または野生型酵素を発現する発現ベクター（陽性対照）のいずれかを含有する細菌クローンを用いて、対照反応を設定した。また、トランスクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換について、野生型酵素よりも活性が良好であると先に同定した一連の８つの突然変異体を、同実験において試験した。
【０４６１】
これらの変異体を、連続した３ラウンドのスクリーニングにかけた。一次スクリーニングの後、ｗｔタンパク質よりも高い活性を示す４３３の変異体を選択して、第２のスクリーニングラウンドにおいて１２反復試験した。二次スクリーニングの後、最も強い１０５の変異体（少なくとも２．５倍の活性の増大を示すが、２３の異なる位置しかカバーしない）、および、向上のより小さい倍率を示すが、できる限り多くの異なる位置をカバーする７１の付加的な変異体（例えば、１３２の内の合計５９の位置が突然変異誘導によって標的とされ、候補はこのステップによって同定された）を含む１７６の変異体を選択した。
【０４６２】
これらの１７６の変異体を第３のスクリーニングラウンドに１２反復かけ、かつ同時に、ＤＮＡ配列決定法にかけて、酵素活性の変化の原因となる突然変異を同定した。ほとんどの候補を、三次スクリーニングによって確かめたが、配列決定法により、それらのかなりの画分が同一であること、そして予想外の突然変異が時折観察されることが示された。最終的に、向上した活性を有する合計１００の異なる突然変異体を同定した。
【０４６３】
これらの１００の突然変異体の内の８９は、４６の異なる位置をカバーする単純な突然変異体であった。これらの突然変異体を表１９で、そして対応する変異位置を表２０で一覧にした。また、２つの突然変異を示し、かつ向上した活性を有する１１の変異体を同定した。これらの二重突然変異体を表２１で一覧にする。最後に、クロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換について向上した活性を有すると同定した一連の突然変異体を、同アッセイにおいても試験した。プレノールの、イソプレンへの変換（この実験で監視した）およびクロチルアルコールの、１，３ブタジエンへの変換（先の実験で監視した）について、これらの変異体の活性を表２２に示す。
【０４６４】
【表２０】
2016523524.tif 000027
2016523524.tif 000028
2016523524.tif 000029
【０４６５】
【表２１】
2016523524.tif 000030
【０４６６】
【表２２】
2016523524.tif 000031
【０４６７】
【表２３】
2016523524.tif 000032
【図１ａ】
2016523524.tif 000034
【図１ｂ】
2016523524.tif 000035
【図１ｃ】
2016523524.tif 000036
【図２】
2016523524.tif 000037
【図３】
2016523524.tif 000038
【図４】
2016523524.tif 000039
【図５】
2016523524.tif 000040
【図６】
2016523524.tif 000041
【図７】
2016523524.tif 000042
【図８】
2016523524.tif 000043
【図９】
2016523524.tif 000044
【図１０】
2016523524.tif 000045
【図１１】
2016523524.tif 000046
【図１２】
2016523524.tif 000047
【図１３】
2016523524.tif 000048
【図１４】
2016523524.tif 000049
【図１５】
2016523524.tif 000050
【図１６】
2016523524.tif 000051
【図１７】
2016523524.tif 000052
【図１８】
2016523524.tif 000053
【図１９】
2016523524.tif 000054
【図２０】
2016523524.tif 000055
【図２１】
2016523524.tif 000056
【図２２】
2016523524.tif 000057
【図２３】
2016523524.tif 000058
【図２４】
2016523524.tif 000059
【図２５】
2016523524.tif 000060
【図２６】
2016523524.tif 000061
【図２７】
2016523524.tif 000062
【図２８】
2016523524.tif 000063
【配列表】
2016523524000001.app
【国際調査報告】
2016523524.tif 000064
2016523524.tif 000065
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