(57)【要約】  本発明は、多能性細胞（ＰＳＣ）の前腸幹細胞（ＦＳＣ）への分化であって、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む胚体胚葉誘導培地を使用して該多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させ、ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地を使用して該胚体内胚葉細胞を前腸幹細胞（ＦＳＣ）に分化させることに関する。分化方法、前腸幹細胞集団、培地及びキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団の製造方法であって、
（ｉ）胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）集団を準備する工程、
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中において該ＤＥＣを培養して前腸幹細胞（ＦＳＣ）の集団を生成する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＥＣ集団を、
ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害因子を含む胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地中において、多能性細胞（ＰＳＣ）集団を培養する工程、
そして該ＰＳＣをＤＥＣに分化させる工程、
を含む方法によって生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性細胞がヒト多能性細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性細胞がＩＰＳＣである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｉＰＳＣが個体から得られた前駆細胞に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞が次の多能性関連マーカー：
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４及びｃ−ｍｙｃ
の一つ以上を発現する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＥ誘導培地がＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害因子を含む、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＥ誘導培地がＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害因子を補充した化学特定栄養培地からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＧＦβリガンドがアクチビンであり及び／又は前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＥＣ集団が均質な集団又は不均質な集団である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＥＣが次の内胚葉関連マーカー：
Ｓｏｘ１７、ｆｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、Ｍｉｘｌ１、ＨＮＦ−３ベータ、ケルベロス、ＯＴＸ４、グースコイド、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９９及びＨｅｘ
の一つ以上を発現する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記前腸誘導培地が、ＴＧＦβリガンドを補充した化学特定栄養培地からなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＴＧＦβリガンドがアクチビンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＳＣが次のマーカー：
ＳＯＸ２、ＨＨＥＸ、ＨＯＸＡ３、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１β、ＧＡＴＡ４、Ｃｅｒ、ＨＮＦ６及びＨＮＦ１ｂｅｔ
の一つ以上を発現する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＦＳＣ集団を、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びヘパリンの有効量を含むＦＳＣ維持培地中で培養することを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＦＳＣ維持培地が、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びヘパリンを補充した化学特定培地からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＧＦβリガンドがアクチビンである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＳＣがインビトロで多能性かつ自己再生性である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＳＣを内胚葉細胞に分化させる、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＳＣを肝内胚葉細胞又は肝前駆細胞に分化させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦＳＣを膵臓前駆細胞又は膵臓内胚葉細胞に分化させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＳＣを肺前駆細胞又は肺内胚葉細胞に分化させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）ＲＡ及びＦＧＦを含む第１肺誘導培地中で前記ＦＳＣ集団を培養する工程；
（ｉｉ）ＦＧＦ及びＨＧＦを含む第２肺誘導培地中において工程（ｉ）からの細胞を培養する工程；
それによって肺前駆細胞集団を生成すること
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
肺前駆細胞の生成方法であって、次の工程：
（ｉ）ＦＳＣ集団を準備する工程；
（ｉｉ）ＲＡ及びＦＧＦを含む第１肺誘導培地中において該ＦＳＣ集団を培養する工程；
（ｉｉｉ）ＦＧＦ及びＨＧＦを含む第２肺誘導培地中において工程（ｉ）からの細胞を培養する工程；
それにより肺前駆細胞集団を生成すること
を含む方法。
【請求項２５】
前記第１肺誘導培地が、レチノイン酸及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を補充した化学特定栄養培地からなる、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２肺誘導培地が、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を補充した化学特定栄養培地からなる、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法により製造された単離ＦＳＣの集団。
【請求項２８】
前記単離ＦＳＣが疾患関連遺伝子型を有する、請求項２７に記載の集団。
【請求項２９】
前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を維持するための方法であって、
（ｉ）前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を準備する工程；及び
（ｉｉ）該ＦＳＣ集団を、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンを含むＦＳＣ維持培地中で培養する工程
を含む方法。
【請求項３０】
前記ＦＳＣが請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって製造された、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７又は２８に記載の単離ＦＳＣの集団の、内胚葉細胞のインビトロ製造のための使用。
【請求項３２】
ヒト又は動物の身体の治療の方法に使用するための、請求項２７に記載の集団。
【請求項３３】
肺、肝臓及び膵臓の状態の治療に使用するための、請求項２７に記載の集団。
【請求項３４】
請求項２７又は２８に記載の単離ＦＳＣの集団と試験化合物とを接触させる工程；及び
前記前腸幹細胞に及ぼす該試験化合物の影響及び／又は該試験化合物に及ぼす該前腸幹細胞の影響を測定する工程
を含む、化合物のスクリーニング方法。
【請求項３５】
ＴＧＦβリガンドが補充された化学特定栄養培地からなる前腸誘導培地を含む、ＦＳＣの製造用キット。
【請求項３６】
ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤が補充された化学特定栄養培地からなるＤＥ誘導培地をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンが補充された化学特定栄養培地からなるＦＳＣ維持培地をさらに含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
前腸誘導培地の、ＦＳＣ集団の製造のための使用であって、
該前腸誘導培地がＴＧＦβリガンドを補充した化学特定栄養培地からなる使用。
【請求項３９】
第１肺誘導培地及び第２肺誘導培地の、肺前駆細胞の集団を製造するための使用であって、
該第１肺誘導培地がレチノイン酸及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を補充した化学特定栄養培地からなり、該第２肺誘導培地が肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を補充した化学特定栄養培地からなる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、例えば内胚葉系統の細胞の生成において使用するための前腸幹細胞のインビトロ生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
任意のｈＰＳＣ系統を特定の細胞型の均質な（ホモジニアスな）集団に分化させるための普遍的なプロトコールの開発は、系統間に存在する固有の変異性により困難になっている。後生的記憶、一貫性のない再プログラミング及び遺伝的背景がこの変異性の主な原因である可能性が高く、この変異性は個別化医療を開発するため［１（非特許文献１）、２１（非特許文献４）］及び浸透率の低い表現型を有する疾患をモデル化するための大きな課題となっている。分化の中間段階の拡大は、特にこれらの細胞型が不均質な（ヘテロジニアスな）集団から単離できれば、この問題に対処するための魅力的な代替手段となり得るだろう。例えば、神経幹細胞は、神経外胚葉系統に分化し、その後様々なニューロンに分化するｈＩＰＳＣ系統から容易に拡大し、それにより多能性細胞を連続的に成長させる必要性を回避することができる［２（非特許文献２）］。しかし、内胚葉分化と同じアプローチには、より多くの問題があった。というのは、この胚葉の特異化及びパターン形成を制御する誘導性シグナルの複雑な組み合わせは、インビトロで模倣するのが困難な場合があるからである［３（非特許文献３）］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】1.  Lund, R.J. 外、 Nat Rev Genet. 13(10): p. 732-44.
【非特許文献２】2.  Falk, A., 外、 PLoS One. 7(1): p. e29597.
【非特許文献３】3.  Sneddon, J.B. 外、 Nature.
【非特許文献４】21.  Kim 外、 Nature 2010 467 285-290.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
本発明者は、ヒト前腸幹細胞（ｈＦＳＣ）をｈＰＳＣから誘導するための所定の培養系を開発した。これらの幹細胞は、インビトロで自己再生でき、かつ、それらの膵臓、肝臓及び肺の内胚葉細胞への分能力によって前方原腸管の多能性細胞に似ることができる。さらに、ｈＦＳＣは、内胚葉分化に耐性のあるｈＩＰＳＣ系統から誘導でき、それによって多数のｈＰＳＣ系統からの内胚葉誘導体の生成を可能にする。これは、研究及び治療用途のための内胚葉細胞のインビトロ生成に有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団の生成方法であって、
（ｉ）多能性細胞（ＰＳＣ）集団を準備し、
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害因子を含む胚体内胚葉誘導培地中においてＰＳＣを培養して、細胞の第１集団を生成し；
（ｉｉｉ）ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中において該細胞の第１集団を培養して前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を生成すること
を含む方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を生成するための方法であって、
（ｉ）胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）の集団を準備し；
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビンを含む前腸誘導培地で該ＤＥＣ集団を培養して前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を生成すること
を含む方法を提供する。
【０００７】
胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）集団は、均質又は不均質であってよい。
【０００８】
ＦＳＣ集団は、ＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びヘパリンを含むＦＳＣ維持培地で培養又は継代できる。
【０００９】
本発明の別の態様は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を維持するための方法であって、
（ｉ）前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を準備し；
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンを含むＦＳＣ維持培地でＦＳＣ集団を培養すること
を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を肺前駆細胞に分化させるための方法であって、次の工程：
（ｉ）前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を準備し；
（ｉｉ）ＲＡ及びＦＧＦを含む第１肺誘導培地でＦＳＣ集団を培養し；
（ｉｉｉ）ＦＧＦ及びＨＧＦを含む第２肺誘導培地で工程（ｉｉ）からの細胞を培養し；
それにより肺前駆細胞集団を生成すること
を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様は、ここで記載された方法により生成されたＦＳＣの単離集団、及びここで記載された方法により生成されたＦＳＣの単離集団の、より分化した内胚葉細胞へのインビトロ分化のための使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１は、ｈＰＳＣ由来前腸がインビトロで自己再生できることを示す。図１Ａは、ｈＰＳＣから誘導される前腸内胚葉幹細胞を分化させ増殖させるための方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｈＥＳＣ細胞（Ｈ９）及びｈＩＰＳＣ（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ−１）由来ｈＦＳＣを、前腸マーカー（ＣＥＲＢ、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ６、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７）の発現を維持しつつ１０継代まで成長させることができることを示すＱ−ＰＣＲを示す。多能性（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）、膵臓（ＰＤＸ１）、肝臓（ＡＦＰ）及び肺（ＮＫＸ２．１）、腸（ＣＤＸ２）の発現は増殖中には認められなかった。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｈＥＳＣ細胞（Ｈ９）及びｈＩＰＳＣ（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ−１）由来ｈＦＳＣを、前腸マーカー（ＣＥＲＢ、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ６、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７）の発現を維持しつつ１０継代まで成長させることができることを示す免疫染色分析を示す。多能性（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）、膵臓（ＰＤＸ１）、肝臓（ＡＦＰ）及び肺（ＮＫＸ２．１）、腸（ＣＤＸ２）の発現は増殖中には認められなかった。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４を共発現するｈＦＳＣのほぼ均質な集団が、ＦＡＣＳ分析によって示されるように継代３の後に明らかであり、かつ、継代６を超えても培養中に安定であったことを示す。グレーの集団は、二次抗体のみのコントロールを表す。
【図２Ａ】図２は、ｈＦＳＣが多数の前腸誘導体に分化する能力を有することを示す。図２Ａは、ｈＦＳＣを肺細胞に分化させるための方法の一例を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｑ−ＰＣＲの結果を示し、これは、Ｑ−ＰＣＲによって示されるように、これらの条件の下で、ｈＦＳＣが早期肺内胚葉マーカー（ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＰ２、ＩＲＸ１）だけでなく、成熟マーカー（ＭＵＣ１）も上方調節することを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、３Ｄ培養で増殖させて得られた細胞が遠位気道マーカー（ＳＦＴＰＣ、ＭＵＣ１、ＣＫ１８）を発現する分岐及び嚢胞性構造細胞凝集物を生成することを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ｈＦＳＣを膵臓細胞に分化させるための方法の一例を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、これらの培養条件下で増殖させたｈＦＳＣが膵臓芽マーカー（ＰＤＸ１、ＨＬＸＢ９）、その後内分泌マーカー（ＩＮＳ、ＮＧＮ３）を連続的に発現することを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、Ｃペプチド及びＰＤＸ１が２５日間にわたって分化した細胞によって発現されることを確認する免疫染色の結果を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ｈＦＳＣを肝細胞に分化させるための方法の一例を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、分化の２５日後に、細胞が肝臓マーカー（ＡＬＢ、ＡＦＰ、Ａ１ＡＴ）を発現し、誘導性チトクロームＰ４５０活性を示した（Ｃ＝ＨＥＳＣ、ＵＳ＝非刺激、Ｓ＝非刺激）ことを示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、細胞が成熟肝細胞マーカー（ＡＬＢ、Ａ１ＡＴ、ＣＫ１８、ＨＮＦ４α）を発現することを確認する免疫染色の結果を示す。
【図３Ａ】図３は、ｈＦＳＣの生成がｈＩＰＳＣ系統間の変異性を解消することを示す。図３ＡはＦＡＣＳ分析を示し、これは、高い（ＢＢＨＸ８）及び低い（ＣＳ８、ＣＶ３及びＣＬ４）内胚葉分化能を有するｈＩＰＳＣ系統から生成されたｈＦＳＣの単離前（色付きのプロット）及び増殖後（継代５、黒のプロット）における内胚葉／前腸マーカーＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４を共発現する細胞画分を示す。ゲートを二次抗体のみのコントロール、グレーの集団に設定した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、低い内胚葉分化能を有するｈＩＰＳＣが肝臓又は膵臓細胞に分化することができない（ＣＯＸＳ８（Ｂ）、ＣＯＸＶ３（Ｂ）、４（Ｂ））のに対し、同じ細胞系統から生じかつ５回分裂したｈＦＳＣが肝細胞マーカー（Ａ１ＡＴ、ＡＦＰ、ＡＬＢ  ＨＮＦ４ａ）及び膵臓細胞マーカー（ＧＣＧ、ＰＤＸ１、ＩＮＳ、ＮＧＮ３）をポジティブコントロール（ＢＢＨＸ８）に匹敵するレベルで発現する細胞に分化できることを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、低い内胚葉分化能を有するｈＩＰＳＣが肝臓又は膵臓細胞に分化することができない（ＣＯＸＳ８（Ｂ）、ＣＯＸＶ３（Ｂ）、４（Ｂ））のに対し、同じ細胞系統から生じかつ５回分裂したｈＦＳＣが肝細胞マーカー（Ａ１ＡＴ、ＡＦＰ、ＡＬＢ  ＨＮＦ４ａ）及び膵臓細胞マーカー（ＧＣＧ、ＰＤＸ１、ＩＮＳ、ＮＧＮ３）をポジティブコントロール（ＢＢＨＸ８）に匹敵するレベルで発現する細胞に分化できることを示す。
【図４】図４は、インビトロでの内胚葉パターン形成及び分化の概略を示す。ここに記載された培養系は、同一の元のｈＰＳＣ株から多様な内胚葉細胞を生成するためのユニークなプラットフォームを表す。実際に、ｈＰＳＣから生成されたＤＥは、後腸内胚葉にパターン形成でき、該後腸内胚葉細胞は、簡単な継代によって容易に単離できる腸上皮内又は自己再生可能な前腸内胚葉細胞にさらに分化することができる。これらの前腸幹細胞は、肺、肝臓及び膵臓細胞に分化する能力を保持しつつ長期の継代を受けることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明は、多能性細胞の集団から前腸幹細胞（ＦＳＣ）をインビトロ生成することに関する。ＦＳＣは、異なる多能性細胞系統から一貫して生成でき、かつ、ここで自己再生性及び多能性であることが示される。したがって、ＦＳＣは、内胚葉系統の細胞、例えば肺細胞、肝細胞及び膵臓細胞のインビトロ生成に有用な多能性細胞源であることができる。
【００１４】
前腸幹細胞（ＦＳＣ）（Foregut stem cells）は、本明細書に記載されるように、ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中で胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）（definitive endoderm cells）集団を培養し、そしてＤＥＣをＦＳＣに分化させることによって生成できる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前腸幹細胞（ＦＳＣ）は、ここに記載されるように、胚体内胚葉誘導培地中で多能性細胞（ＰＳＣ）（pluripotent cells）集団を培養してＤＥＣを含む細胞集団を生成し、その後ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中で該細胞集団を培養し、そしてＤＥＣをＦＳＣに分化させることによって生成できる。
【００１６】
多能性細胞は、未分化表現型を示し、かつ、三胚葉（内胚葉、中胚葉及び内胚葉）のいずれかの任意の胎児又は成体細胞型に分化する潜在能力がある細胞である。多能性細胞は、全能性細胞とは区別され、胚体外細胞系統を生じさせることができない。多能性細胞集団はクローン性、すなわち単一の共通の祖先細胞の子孫である遺伝的に同一の細胞であることができる。
【００１７】
多能性細胞は、次の多能性関連マーカーの一つ以上を発現することができる：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４、及びｃ−ｍｙｃ、好ましくはＰＯＵ５ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２の一つ以上。多能性細胞は、Ｂｒａ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１及びＣＤＸ２などの、特定の分化フェイトに関連するマーカーを欠失することができる。特に、多能性細胞は、内胚葉フェイトに関連するマーカーを欠失することができる。
【００１８】
好ましくは、多能性細胞は、ヒト多能性細胞である。
【００１９】
多能性細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）（embryonic stem cells）及び非胚性幹細胞、例えば、胎児及び成体幹細胞並びに誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）（induced pluripotent stem cells）を含むことができる。いくつかの実施形態では、多能性細胞はｈＥＳＣではない。
【００２０】
胚性幹細胞は、従来技術を使用して得ることができる。例えば、ＥＳＣ細胞は、培養ＥＳＣ細胞系統、例えばｈＥＳＣ系統から得ることができる。ＣＨＢ−１〜ＣＨＢ−１２、ＲＵＥＳ１〜ＲＵＥＳ３、ＨＵＥＳ１〜ＨＵＥＳ２８、ＨＵＥＳ４５、ＨＵＥＳ４８、ＨＵＥＳ４９、ＨＵＥＳ５３、ＨＵＥＳ６２〜ＨＵＥＳ６６、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＮＹＵＥＳ１〜ＮＹＵＥＳ７、ＭＦＳ５及びＵＣＬＡ１〜ＵＣＬＡ３といった多数の培養ｈＥＳＣ系統がリポジトリから公的に入手可能である（例えば、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ）。好適なヒト胚性幹細胞系統のさらなる例がＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ  外、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７（１９９８）；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  外、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：３９９−４０４（２０００）；Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．外、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３−１３５６（２００４），Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，外、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８  １５９-１９２(１９９５）；及びＧｏｔｌｉｅｂ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５  ３８１−４０７）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  外、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．５（１）：７９−８８（２００３）に記載されている。潜在的に臨床グレードのｈＥＳＣがＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．外、Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，１６３６−１６４１（２００５）及びＬｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．外、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１８５−１８７（２００６）に記載されている。好適なｈＥＳＣは、産業若しくは商業目的でヒト胚を破壊することなく又はヒト胚のいずれかを使用することなく、本発明で使用するために得ることができる。例えば、ｈＥＳＣは、割球生検技術によって得ることができる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ（２０１３）Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ．３１（１）：４９−５５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  外、Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４４（７１１８）４８１−５）。
【００２１】
ｉＰＳＣは、非多能性の完全分化祖先又は前駆細胞から誘導される多能性細胞である。好適な祖先細胞は、成体線維芽細胞及び末梢血細胞などの体細胞を含む。祖先細胞は、典型的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＳｏｘ１などの多能性遺伝子又はタンパク質を細胞に導入することによって再プログラミングされる。遺伝子又はタンパク質を、プラスミド又はより好ましくはウイルストランスフェクション若しくは直接タンパク質送達を含めた任意の好適な技術によって分化細胞に導入できる。また、他の遺伝子、例えばＫｉｆ−１、−２、−４及び−５などのＫｉｆ遺伝子；Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃなどのｍｙｃ遺伝子；ｎａｎｏｇ；及びＬｉｎ２８を細胞に導入して誘導効率を増加させることもできる。多能性遺伝子又はタンパク質の導入後に、祖先細胞を培養することができる。多能性マーカーを発現する細胞を単離及び／又は精製してｉＰＳＣ集団を生成することができる。ｉＰＳＣの生成のための技術は当該技術分野において周知である（Ｙａｍａｎａｋａ  外、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４８：３１３−７；Ｙａｍａｎａｋａ  ６  ２００７  Ｊｕｎ  ７；１（１）：３９−４９；Ｋｉｍ  外、Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｎｏｖ  ３０；１３１（５）：８６１−７２．  Ｐａｒｋ  外、Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊａｎ  １０；４５１（７１７５）：１４１−６；Ｋｉｍｅｔ  外、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｊｕｎ  ５；４（６）：４７２−６；Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．，外、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９．９９９９（９９９Ａ）：ｐ．Ｎ／Ａ）。
【００２２】
好ましくは、多能性細胞は、ＩＰＳＣ、より好ましくはヒトＩＰＳＣ（ｈＩＰＳＣ）である。
【００２３】
ｉＰＳＣは、正常の（すなわち非疾患関連）遺伝子型を有する線維芽細胞などの体細胞、例えば遺伝性疾患のない個体から得られた細胞から誘導できる。ｉＰＳＣをここに記載されるように使用して、正常な（すなわち非疾患関連）遺伝子型を有するＦＳＣを生成することができる。図４に示すように、これらのＦＳＣは、肺、膵臓、肝臓又は他の内胚葉系統にさらに分化できるところ、これは、治療、モデリング又は他の用途に有用な場合がある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、多能性細胞は、後成的効果のため、例えば内胚葉に分化しにくい又は耐性のあるＩＰＳＣであることができる（Ｋｉｍ  外、Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６７  ２８５−２９０）。ＤＥ誘導培地での分化では、内胚葉耐性ｈＩＰＳＣは、ＤＥＣの割合が低い細胞集団（すなわち、不均質な細胞集団）を生成する場合がある。少数のＤＥＣ（ＤＥＣｓ）を有する細胞集団であっても、本明細書に記載の方法を使用して均質ＦＳＣ集団を生成することができる。
【００２５】
ＩＰＳＣを個体から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＩＰＳＣの複数の集団を個体集団から得、そしてここに記載されるようにＦＳＣ集団のパネルを生成するために使用することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞又は異なる遺伝的背景を有する個体から得られた他の祖先細胞から誘導できる。例えば、ｉＰＳＣは、疾患状態を有する個体、高い疾患状態リスクを有する個体及び／又は低い疾患状態リスクを有する個体からの細胞から生成できる。疾患状態は、内胚葉組織に関連する障害、例えば肺、肝臓又は膵臓の状態を含むことができる。異なる遺伝的背景を有する個体又はインビトロでそれから分化した細胞から、ここに記載されるように生成されたＦＳＣは、糖尿病及び肝疾患といった疾患状態の機序を研究し、そして治療標的を同定する際に有用な場合がある。
【００２７】
ｉＰＳＣは、疾患関連遺伝子型を有する線維芽細胞などの体細胞、例えば遺伝性疾患を有する個体から得られた細胞から誘導できる。遺伝性疾患は、肺、膵臓及び肝臓障害などの内胚葉組織の疾患を含むことができ、かつ、単成的疾患であることができる。疾患遺伝子型、例えば、遺伝的変異又は欠損を有する任意の細胞を使用してｉＰＳＣを生成することができるが、線維芽細胞、例えば真皮線維芽細胞のサンプルを簡便に得ることができる。
【００２８】
遺伝的障害を有する個体から得られた細胞から生成されるｉＰＳＣをここに記載されるように使用して遺伝的疾患の遺伝子型を有するＦＳＣを生成することができる。これらのＦＳＣを、疾患遺伝子型を有する肺、膵臓、肝臓又は他の内胚葉系統にさらに分化させることができる。これらの内胚葉細胞は、例えば遺伝的疾患をモデル化する際に有用であり得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、多能性細胞の集団を培養多能性細胞系統から得ることができる。従来技術をヒト多能性細胞の培養及び維持のために使用することができる（Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．外、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７５，４０３−４２１（２００４），Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．外、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３−１３５６（２００４），Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ，Ａ．外、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，２３０−２３５（２００６）Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．外、Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，１６３６−１６４１（２００５），Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．外、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１８５−１８７（２００６））。本発明の方法において使用するための多能性細胞は、決められた条件で又はフィーダー細胞上で増殖できる。例えば、多能性細胞は、適切な密度（例えば、１０5〜１０6細胞／６０ｍｍディシュ）で、照射したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞の層上又はフィーダー条件培地若しくは規定培地を有する適切な基質上の培養皿内で従来どおり培養できる。本発明の方法において使用するための多能性細胞は、酵素的又は機械的手段によって継代できる。
【００３０】
多能性細胞に適した培地は、当該技術分野においてよく知られており、次のものが挙げられる：２０％の血清交換、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が補充されたノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）；又は４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が補充されたノックアウト（ＫＳ）培地；又は２０％血清交換、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβメルカプトエタノール及び４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ２が補充されたＫＯ−ＤＭＥＭ；又は２０％ノックアウト血清交換（ＫＳＲ）、６ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、１００μｍの非必須アミノ酸、１００μＭの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するための多能性細胞集団は、化学特定培地（ＣＤＭ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（既知組成培地）（合成培地）中で培養できる。
【００３２】
化学特定培地（ＣＤＭ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（既知組成培地）（合成培地）は、特定の成分、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する、細胞を培養するための栄養溶液である。ＣＤＭは、規定されていない成分又は規定されていない成分を含む構成要素、例えばフィーダー細胞、間質細胞、血清、マトリゲル、血清アルブミン及び複合体細胞外マトリックスを欠いている。いくつかの実施形態では、化学特定培地はヒト化される。ヒト化された化学特定培地は、非ヒト動物から誘導された又は単離された成分又は補充物、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びにマウスフィーダー細胞等を含まない。条件培地は、培養細胞からの未規定成分を含み、かつ、化学的に規定されていない。
【００３３】
アドバンストダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ  外、Ｆｏｃｕｓ（２００３）２５  ３−６）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）及びＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．及びＷｏｏｄｓ  Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ．３，５０３−５０８；表１参照）などの好適な化学特定基本培地は、当該技術分野において知られており、商業的供給源から入手可能である（例えば、米国ミシガン州Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社；米国Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するための多能性細胞集団は、無血清培地補充物及び／又は１種以上の追加の成分、例えばトランスフェリン、１−チオグリセロール及び規定の脂質並びに任意にポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール及びインスリン；血清アルブミン；又は血清アルブミン及びインスリンが補充された合成基本培地を含むＣＤＭ中で培養できる。
【００３５】
好適な無血清培地補充物としては、Ｂ２７（Ｂｒｅｗｅｒ  外、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ（１９８９）４９４  ６５−７４；Ｂｒｅｗｅｒ  外、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３５  ５６７−５７６（１９９３）；Ｂｒｅｗｅｒ  外、Ｆｏｃｕｓ  １６  １  ６−９；Ｂｒｅｗｅｒ  外、（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４２：６７４−６８３；Ｒｏｔｈ  外、Ｊ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ（２０１０）２４  １３０−１３７）及びＮＳ２１（Ｃｈｅｎ  外、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｓ（２００８）１７１  ２３９−２４７）が挙げられる。Ｂ２７及びＮ２１などの無血清培地補充物は、当該技術分野において知られており、広く市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）。
【００３６】
好適な化学特定培地としては、ポリビニルアルコール、インスリン、トランスフェリン及び規定脂質が補充された基本培地を含むＣＤＭ−ＰＶＡ（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＷｉｌｅｓ（１９９５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１５，１４１−１５１）が挙げられる。例えば、ＣＤＭ−ＰＶＡ培地は、５０％イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）＋５０％ハムＦ１２と共に、ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）又は５０％のＦ１２  ＮＵＴ−ＭＩＸ（１％の化学的に規定された脂質濃縮物、４５０μＭの１−チオグリセロール、１５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール、７μｇ／ｍｌのインスリンが補充されたギブコ）からなることができる。他の好適な化学特定栄養培地としては、上記ＣＤＭ−ＰＶＡと同様であるがただしＰＶＡを５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで置換したｈＥＳＣ維持培地（ＣＤＭＡ）並びにＢ２７及びアクチビン（例えば、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ基本培地が挙げられる。
【００３７】
ＣＤＭ−ＰＶＡ培地は、Ｖａｌｌｉｅｒ外、２００９  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：ｅ６０８２．ｄｏｉ：１０．１３７１；Ｖａｌｌｉｅｒ外、２００９  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：２６５５-２６６６，Ｔｏｕｂｏｕｌ  ２０１０  ５１：１７５４-１７６５．Ｔｅｏ外、２０１１  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（２０１１）２５：２３８−２５０及びＰｅｔｅｒｓｏｎ  ＆  Ｌｏｒｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｕａｌ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（２０１２）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００３８】
多能性を維持するために、多能性細胞を、分化前にアクチビン及びＦＧＦが補充されたＣＤＭ中で保持することができる。例えば、ＣＤＭは、ＦＧＦ２（例えば、１０〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば１２ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）をさらに含むことができる（Ｖａｌｌｉｅｒ外、２００５  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８：４４９５−４５０９；Ｂｒｏｎｓ外、Ｎａｔｕｒｅ．（２００７）Ｊｕｌ  １２；４４８（７１５０）：１９１−５）。
【００３９】
細胞培養に好適な技術は当該技術分野において周知である（例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５  Ｏｃｔ  ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１；Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９  Ｄｅｃ  ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ（２  Ａｕｇ  ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３，Ｈｏ  ＷＹ外、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０−５２，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｌａｎｚａ著）ＩＳＢＮ：０１２４３６６４３０）Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ及びＪ．Ｍ．ＷａｌｋｅｒよるＢａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （１９９７）、Ａ．Ｄｏｙｌｅ及びＪ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）  による‘Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’、Ａ．Ｃｈｉｕ及びＭ．Ｒａｏによる‘Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ’（２００３）、Ａ．ＢｏｎｇｓｏによるＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｂｅｄｓｉｄｅ（２００５）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＆  Ｌｏｒｉｎｇ（２０１２）Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｕａｌ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ    Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ及びＫ．Ｔｕｒｋｓｅｎ  による‘Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’（２００６）を参照されたい）。
【００４０】
培地及びその成分は、商業的供給源から得ることができる（例えばＧｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。標準的な哺乳動物細胞の培養条件、例えば３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素を上記培養工程に採用することができる。培地を、好ましくは２日ごとに交換し、細胞を重力によって沈降させる。
【００４１】
本発明の方法で使用するのに適した多能性細胞集団は、不均質（ヘテロジニアス）であってもよいし、１種以上の他の細胞型を実質的に含まなくてもよい（すなわち、均質（ホモジニアス））。多能性細胞は、例えば、ＳＳＥＡ４などの幹細胞上に見られる分子の細胞外領域に対する抗体の使用を含む抗体及び磁気ビーズ又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）による細胞外エピトープの認識に基づくものを含めた当業者に知られている任意の技術を使用して、他の細胞型から分離できる。
【００４２】
多能性細胞集団を胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地中で培養して、ＤＥＣを含む細胞集団を生成させる。
【００４３】
ＤＥ誘導培地は、好ましくは化学特定培地（ＣＤＭ）(既知組成培地)（合成培地）である。
【００４４】
好適なＤＥ誘導培地は、化学特定栄養培地及び１種以上の分化因子を含むことができる。
【００４５】
化学特定栄養培地は、ポリビニルアルコール、１−チオグリセロール、インスリン、トランスフェリン及び規定の脂質といった１種以上の追加の特定された成分が補充（添加）された基本培地を含む又はそれからなることができる。
【００４６】
好適な化学特定基本培地は、上に記載されており、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、アドバンストダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ外、Ｆｏｃｕｓ  （２００３），２５  ３−６）、及びＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．及びＷｏｏｄｓ  Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ．３，５０３−５０８）が挙げられる。
【００４７】
基本培地は、ＤＥ誘導培地中において無血清培地補充物及び／又は追加の成分が補充できる。好適な補充物及び追加の成分は上述されており、Ｌ−グルタミン又は代替物、例えばＧｌｕｔａＭＡＸ−１（商標）、化学的に特定された脂質、アルブミン、１−チオールグリセロール、ポリビニルアルコール、インスリン及びトランスフェリンを含むことができる。
【００４８】
ＤＥ誘導培地に使用するのに適した化学特定栄養培地は、上記のようなＣＤＭ−ＰＶＡ及びＣＤＭ−ＢＡを含む。
【００４９】
分化因子は、哺乳動物細胞において分化を仲介するシグナル伝達経路を調節、例えば促進又は阻害する因子である。分化因子としては、アクチビン／ノーダル、ＦＧＦ、Ｗｎｔ又はＢＭＰシグナル伝達経路の１以上を調節する成長因子、サイトカイン及び阻害因子が挙げられる。分化因子の例としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ、レチノイン酸、ＴＧＦβリガンド、例えばアクチビン、ＴＧＦβ又はノーダル、ＧＤＦ、ＬＩＦ、ＩＬ、アクチビン及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤が挙げられる。
【００５０】
分化因子は、培地中で培養した細胞においてシグナル伝達経路を調節するのに有効な量で、上記培地中に存在することができる。
【００５１】
ＤＥ誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、及びＰＩ３Ｋ阻害剤をさらに含むことができる。ＤＥ誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤以外の分化因子を欠いていてよい［４、６、７、９、２０］。
【００５２】
ＤＥ誘導培地は、有効量のＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤が補充された化学特定栄養培地からなることができる。例えば、ＤＥ誘導培地は、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＬＹ２９４００２が補充されたＣＤＭ−ＰＶＡなどの化学特定栄養培地からなることができる。
【００５３】
好ましいＤＥの誘導培地は、アクチビン−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（２〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ）及びＬＹ２９４００２（１〜１００μＭ、好ましくは１０μＭ）が補充された上記のようなＣＤＭ−ＰＶＡからなることができる。
【００５４】
他の実施形態では、ＤＥ誘導培地は、アクチビン及びＷｎｔが補充されたＲＰＭＩからなることができる（ＫＡ  Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００５  Ｄｅｃ；２３（１２）：１５３４−４１）。
【００５５】
また、ＤＥＣは、アクチビンを含む血清含有培地中での３次元細胞培養によって多能性細胞から生成できる（Ｏｇａｗａ，Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１３  Ａｕｇ；１４０（１５）：３２８５−９６））。
【００５６】
ＴＧＦβリガンドは、哺乳動物細胞内においてＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３仲介細胞内シグナル伝達経路を刺激するＴＧＦβスーパーファミリーのペプチドである。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは、特徴的な構造を有し、かつ、当該技術分野において周知である。
【００５７】
ＴＧＦβリガンドは、アクチビン、ＴＧＦβ、ノーダル、ＧＤＦ３、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１０又はＧＤＦ１１、好ましくはアクチビンとすることができる。
【００５８】
アクチビン（アクチビン−Ａ：ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３６２４核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２  ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１  ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／ノーダル経路の刺激を介して広範囲の細胞効果を発揮する二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒ  外、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１８：４４９５−４５０９（２００５））。アクチビンは、商業的供給源（例えば米国マサチューセッツ州Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）から容易に入手可能である。好都合には、本明細書に記載の培地中におけるアクチビンの濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌであることができる。
【００５９】
ＴＧＦβ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：７０４０核酸参照配列ＮＭ＿０００６６０．４  ＧＩ：２６０６５５６２１、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０００６５１．３  ＧＩ：６３０２５２２２）は、増殖及び分化を調節するホモ二量体ポリペプチドである（Ｗａｔａｂｅ，Ｔ．外、（２００９）．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９：１０３−１１５）。組換えヒトＴＧＦβは、商業的供給源（例えば米国マサチューセッツ州Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）から容易に入手可能である。好都合には、培地中におけるＴＧＦβの濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６０】
ノーダル（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ４８３８核酸参照配列ＮＭ＿０１８０５５．４  ＧＩ：２２２３５２０９７、アミノ酸配列参照ＮＰ＿０６０５２５．３  ＧＩ：２２２３５２０９８）は、分化を調節するＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである（Ｈａｍａｄａ  外、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３（２）：１０３−１３）。ノーダルは、商業的供給源（例えば英国アブカム社）から容易に入手可能である。好都合には、培地中におけるノーダル濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６１】
ＧＤＦ３（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：９５７３核酸参照配列ＮＭ＿０２０６３４．１  ＧＩ：１０１９０６６９、アミノ酸配列参照ＮＰ＿０６５６８５．１  ＧＩ：１０１９０６７０）は、７個の保存システイン残基を含む成熟ＧＤＦ３タンパク質を生成するように切断される多塩基性タンパク質分解プロセシング部位によって特徴付けられるＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。好都合には、培地中におけるＧＤＦ３の濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６２】
ＧＤＦ８（ＭＳＴＮとも呼ばれる；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ２６６０核酸配列参照ＮＭ＿００５２５９．２  ＧＩ：１４９４０８１５８、アミノ酸配列参照ＮＰ＿００５２５０．１  ＧＩ：４８８５２５９）は、７個の保存システイン残基を含む成熟ＧＤＦ８タンパク質を生成するように切断される多塩基性タンパク質分解プロセシング部位によって特徴付けられるＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーである。好都合には、培地中におけるＧＤＦ８濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる（Ｈａｎｎａｎ  外、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９  Ｓｅｐ；１１（３）：４２７−３５）。
【００６３】
ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３Ｂとも呼ばれる；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ２６６２核酸配列参照ＮＭ＿００５８１１．３  ＧＩ：２２３９４１８６７、アミノ酸配列参照ＮＰ＿００４９５３．１  ＧＩ：４８２６７４０）は、７個の保存されたシステイン残基を含む成熟ＧＤＦ８タンパク質を生成するように切断される多塩基性タンパク質分解プロセシング部位によって特徴付けられるＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーである。好都合には、培地中におけるＧＤＦ８の濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる（Ｈａｎｎａｎ  外、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００９  Ｓｅｐ；１１（３）：４２７−３５）。
【００６４】
ＧＤＦ１１（ＢＭＰ１１とも呼ばれる；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：１０２２０核酸配列参照ＮＭ＿００４９６２．３  ＧＩ：３２５６５２０８８、アミノ酸配列参照ＮＰ＿００５８０２．１  ＧＩ：５０３１６１３）は、７個の保存システイン残基を含む成熟ＧＤＦ８タンパク質を生成するように切断される多塩基性タンパク質分解プロセシング部位によって特徴付けられるＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーである。好都合には、培地中におけるＧＤＦ８濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌとすることができる（Ｈａｎｎａｎ  外、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９  Ｓｅｐ；１１（３）：４２７−３５）。
【００６５】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することにより細胞の成長、増殖及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。好適な線維芽細胞成長因子としては、ＦＧＦファミリーの任意のメンバー、例えばＦＧＦ１〜ＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５〜ＦＧＦ２３のいずれか一つが挙げられる。
【００６６】
好ましくは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られ、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）；ＦＧＦ７（ケラチノサイト成長因子（又はＫＧＦ）としても知られ、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）又はＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子はＦＧＦ２である。
【００６７】
ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子は、通常の組換え技術を使用して生成でき、又は商業的供給業者から入手できる（例えば、米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；米国Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）。
【００６８】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３０８２、核酸配列ＮＭ＿０００６０１．４  ＧＩ：５８５３３１６８、アミノ酸配列ＮＰ＿０００５９２．３  ＧＩ：３３８５９８３５）は、ｃ−Ｍｅｔ受容体への結合を介して細胞増殖、細胞運動性及び形態形成を調節するサイトカインである。好都合には、細胞培養培地中におけるＨＧＦ濃度は５〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６９】
肝細胞成長因子（ＦＧＦ）は、通常の組換え技術を使用して生成でき、又は商業的供給業者（例えば、米国ミネソタ州ミネアポリスＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；米国Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）から入手できる。
【００７０】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ；Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９によって仲介される経路を介して細胞内シグナル伝達を刺激する。好適な骨形成タンパク質としては、ＢＭＰファミリーの任意のメンバー、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６又はＢＭＰ７が挙げられる。好ましくは、第２のＴＧＦβリガンドはＢＭＰ２（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：６５０、核酸配列ＮＭ＿００１２００．２  ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１  ＧＩ：４５５７３６９）又はＢＭＰ４（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：６５２、核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３  ＧＩ：１５７２７６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２  ＧＩ：１５７２７６５９３）である。好適なＢＭＰとしてはＢＭＰ４が挙げられる。好都合には、ここに記載される培地中におけるＢＭＰ２又はＢＭＰ４などの骨形態形成タンパク質の濃度は、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００７１】
骨形成タンパク質は、通常の組換え技術を使用して生成でき、又は商業上の供給業者（例えば、米国ミネアポリスのＲ＆Ｄ社、米国のＳｔｅｍｇｅｎｔ社）から得ることができる。
【００７２】
レチノイン酸（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸）は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）への結合により転写を調節し、かつ、所定の範囲の細胞型の分化を調節するビタミンＡの代謝産物である。好ましくは、全トランス型レチノイン酸をここに記載の培地で使用する。
【００７３】
好都合には、培地中におけるレチノイン酸の濃度は、１〜１０μＭ、好ましくは約２μＭであることができる。
【００７４】
レチノイン酸は、商業的供給業者（例えば米国のＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社；米国のＳｔｅｍｇｅｎｔ社）から入手可能である。
【００７５】
ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５３）などのホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性を阻害する。
【００７６】
好適なＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ワートマニン；ＬＹ３０１４９７（１７−ｂ−ヒドロキシワートマニン）；ＬＹ２９４００２（２−モルホリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン：Ｍａｃｌｅａｎ外、（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５  ２９−３８）；ＣＬＢ１３０９（ＫＮ３０９：（±）−２−（｛１−［７−メチル−２−（モルホリン−４−イル）−４−オキソピリド［１，２−ａ］ピリミジン−９−イル］エチル｝アミノ）安息香酸）；ＰＸ−８６６（（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペン−１−イルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチルシクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン）；ＩＣ８７１１４（キノロンピロロピリミジン）；ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）−チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）；ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、ケルセチン；ＢＥＺ２３５；ＸＬ１４７；Ｘｌ７６５；ＰＸ−８６６；ＺＳＴＫ４７４（２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン）；及びＳＦ１１２６（２−［２−メトキシエチルアミノ］−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）が挙げられる。他のＰＩ３Ｋ阻害剤も当該技術分野で入手可能である。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２である。
【００７８】
好適なＰＩ３Ｋ阻害剤は、商業的供給業者（例えば米国カリフォルニア州Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）から入手できる。
【００７９】
例えば、培地は、１〜１００μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＬＹ２９４００２を好ましくは約１０μＭ含有することができる。
【００８０】
ヒト多能性細胞をＤＥ誘導培地で１〜６日間、好ましくは約３日間培養して胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）を含む細胞集団を生成することができる。
【００８１】
多能性細胞は、ＤＥ誘導培地中において胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）を含む又はそれからなる細胞集団に分化する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＤＥＣの均質な又は実質的に均質な集団であることができる。例えば、細胞集団中における細胞の８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は最も好ましくは全てがＤＥＣであることができる。
【００８３】
他の実施形態では、細胞集団は、ＤＥＣ及び１以上の他の細胞型を含む不均質な集団であることができる。例えば、細胞集団中における細胞の４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下がＤＥＣであることができる。
【００８４】
ＤＥＣの他に、集団は線維芽細胞、中胚葉、外胚葉、栄養外胚葉及び／又は多能性細胞を含むことができる。
【００８５】
ＤＥＣは、内胚葉系列の初期段階細胞である。ＤＥＣは、多能性細胞と比較して減少した分化能を有し、かつ、部分的に分化した内胚葉表現型を示す。ＤＥＣは、内胚葉の一次胚葉における系統に関係づけられ、かつ、内胚葉胚葉の胎児又は成体細胞型にさらに分化する潜在能力がある。例えば、ＤＥＣは、適切な条件下で肝臓、膵臓、肺、腸、及び甲状腺における全ての細胞型に分化することができる。いくつかの実施形態では、ＤＥＣを「多分化能」ということができる。ＤＥＣは、胚体外、中胚葉又は神経外胚葉細胞系統を生じさせることはできない。
【００８６】
ＤＥＣは、Ｓｏｘ１７、ｆｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、Ｍｉｘｌ１、ＨＮＦ−３ベータ、ケルベロス、ＯＴＸ４、グースコイド、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９９及びＨｅｘを発現することができる。典型的には、ＤＥＣは、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ１７の発現によって特徴付けられる。
【００８７】
ＤＥＣは、特定の内胚葉系統、例えば腸、膵臓、肝臓又は肺マーカーに関連するマーカーを欠失していてよい。例えば、ＤＥＣは、ＳＯＸ２（前腸）、ＣＤＸ２（中−後腸）、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ａ（膵臓）、ＡＦＰ（肝臓）、Ｎｋｘ２．１又はＴＢＸ１（肺）を発現しなくてもよい。
【００８８】
また、ＤＥＣは、多能性に関連するマーカー、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４及びｃ−ｍｙｃ並びに胚体外、中胚葉又は神経外胚葉細胞系統に関連するマーカーを欠失していてもよい。
【００８９】
ＤＥＣＳを含む細胞集団は、ＤＥＣがＦＳＣに分化するように前腸誘導培地中で培養される。
【００９０】
前腸誘導培地は、好ましくは、化学特定培地（ＣＤＭ）である。
【００９１】
好適な前腸誘導培地は、化学特定栄養培地と１種以上の分化因子とを含むことができる。好適な化学特定栄養培地は、上でさらに詳細に記載されている。例えば、前腸誘導培地は、Ｂ２７などの無血清培地補充物が補充されたＲＰＭＩなどの基本培地を含むことができる。
【００９２】
前腸誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビンをさらに含むことができる。例えば、培地はアクチビン−Ａを含むことができる。
【００９３】
ＴＧＦβリガンドは、培地中に有効量、例えば５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬで存在することができる。
【００９４】
前腸誘導培地は、ＴＧＦβリガンド以外の分化因子がなくてもよい。例えば、前腸誘導培地は、ＴＧＦβリガンドが補充された化学特定栄養培地からなることができる。好ましくは、ＴＧＦβリガンドはアクチビンである。
【００９５】
好ましくは、前腸誘導培地は、細胞内においてＴＧＦβシグナル伝達経路を刺激するが、Ｗｎｔシグナル伝達などの他のシグナル伝達経路を刺激しないために好適な分化因子を含有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、前腸誘導培地は、ノギンなどのＢＭＰアンタゴニスト及びＳＢ４３１５４２などのアクチビン／ＴＧＦβアンタゴニストを欠いていてもよい。
【００９７】
ＤＥＣを含む細胞集団を２〜５日間、好ましくは３〜４日間にわたって前腸誘導培地中で培養してＤＥＣをＦＳＣに分化させることができる。
【００９８】
ＦＳＣは、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１β、ＧＡＴＡ４、Ｃｅｒ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１ベータ、ＳＯＸ２、ＨＨＥＸ及びＨＯＸＡ３の一つ以上、好ましくは全てを発現することができる。例えば、集団中の細胞の少なくとも５０％がＳＯＸ２、ＨＨＥＸ及びＨＯＸＡ３を発現することができる。
【００９９】
ＦＳＣは、ＣＤＸ２又はＨＯＸＣ５を発現しなくてもよい。また、ＦＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４及びＰＯＵ５ｆ１などの多能性マーカー並びに外胚葉又は中胚葉系統に関連するマーカーを発現しなくてもよい。
【０１００】
ＦＳＣ（ＦＳＣｓ）は、内胚葉組織マーカー、例えばＮＫＸ２．１などの肺マーカー、ＡＦＰなどの肝臓マーカー又はＰＤＸ１マーカーなどの膵臓マーカーを発現しなくてもよい。
【０１０１】
ＤＥＣを含む細胞集団の分化の程度は、細胞培養中に、分化細胞集団における１以上の細胞マーカーの発現を監視及び／又は検出することによって決定（測定）できる。例えば、ＦＳＣに特有のマーカーの発現の増加又はＤＥＣに特有のマーカーの発現の減少を測定（決定）することができる。
【０１０２】
細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学法、免疫蛍光法、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫ブロット法、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、及び酵素的分析を含めた任意の適切な技術によって決定（測定）できる。
【０１０３】
上記の方法は、細胞集団における１以上のＦＳＣのマーカーの存在及び／又は１以上のＤＥＣの不存在を監視及び／又は検出することをさらに含むことができる。
【０１０４】
上記の方法は、例えば１以上のＦＳＣマーカーの発現の存在から、集団における１以上の細胞をＦＳＣとして同定することをさらに含むことができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、例えば細胞集団が実質的に均質なＤＥＣ集団である場合に、ここで説明する細胞集団におけるＤＥＣの分化は、他の細胞型を実質的に含まないＦＳＣ集団を生成することができる。例えば、集団は、前腸誘導培地中で培養した後に、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上のＦＳＣを含むことができる。
【０１０６】
好ましくは、ＦＳＣ集団は、精製が必要とされない他の細胞型を実質的に含まない。
【０１０７】
他の実施形態では、例えば細胞集団が線維芽細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、多能性細胞及び栄養外胚葉細胞などの他の細胞型並びにＦＳＣを含む不均質な集団である場合には、集団は、前腸誘導培地中で培養した後に、６０％以下、５０％以下、４０％以下又は３０％以下のＦＳＣを含むことができる。
【０１０８】
必要に応じて、ＦＳＣは、上記の特徴的なマーカーの細胞外領域に対する抗体の使用を含め、抗体及び磁気ビーズ又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）による細胞外エピトープの認識に基づく技術含めた当業者に知られている任意の技術を使用して集団中における他の細胞型から分離できる。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＦＳＣは、本明細書に記載されるように、ＦＳＣ維持培地中で培養することにより、集団中における他の細胞型から分離できる。例えば、ＦＳＣの実質的に均質な又は純粋な集団は、ＦＳＣの維持培地中における５継代以上で生成できる。
【０１１０】
本発明の別の態様は、単離されたＦＳＣの集団、好ましくは上記方法により生成された単離ＦＳＣの集団を提供する。
【０１１１】
上記のように、単離集団における各ＦＳＣは、インビトロで自己再生することができる。また、各ＦＳＣは、多能性であり、かつ、肺、肝臓及び膵臓細胞系統のいずれか一つに分化することができる（すなわち、系統は限定されない）。ここに記載された方法によって生成されたＦＳＣは、前部前腸又は後部前腸同一性を有しておらず、かつ、前部前腸及び後部前腸系統の両方に分化することができる。このように、ＦＳＣは、前部又は後部前腸前駆細胞よりも高い分化能を有する。
【０１１２】
ここに記載されるＦＳＣは、培養可能であり、かつ、分化能力を保持しながら（すなわち、ＦＳＣは多分化能のままである）インビトロで連続的に増殖できる。インビトロで維持できる安定なＦＳＣ集団の単離はこれまで報告されたことがない。
【０１１３】
好ましくは、ｈＦＳＣの集団は、均質又は実質的に均質である。
【０１１４】
単離ＦＳＣは、個体由来のｉＰＳＣによって生成でき、かつ、該個体と同じ遺伝子型を有することができる。例えば、ＦＳＣは、疾患関連遺伝子型、例えば内胚葉疾患関連遺伝子型を有することができる。
【０１１５】
ここで記載されるように生成されたＦＳＣの集団は、自己再生及び多能であるのみならず、奇形腫アッセイにより示されるときに均質かつ非腫瘍形成性であり、しかも内胚葉細胞の生成に有用であり得る。特に、ＦＳＣは、再生医療その他の用途のために多数の臨床関連細胞の生成に有用であり得る。
【０１１６】
本発明の別の態様は、上記のように生成された単離ＦＳＣ集団の、内胚葉細胞のインビトロ生成のための使用を提供する。
【０１１７】
前腸誘導培地中で培養後に、ＦＳＣ集団を単離し、培養し、増殖させ又は維持することができる。
【０１１８】
いくつかの好ましい実施形態では、ＦＳＣ集団をＦＳＣ維持培地中で培養することができる。これは、ＦＳＣのための集団を富化させ、非ＦＳＣ集団を枯渇させる点で特に有用であり得る。
【０１１９】
ＦＳＣ維持培地は、化学特定培地である。
【０１２０】
好適なＦＳＣ維持培地は、化学特定栄養培地及び１種以上の分化因子を含むことができる。
【０１２１】
好適な化学的に定義された栄養培地は、上に記載されている。例えば、ＦＳＣ維持培地に使用するのに適した化学特定栄養培地は、Ｂ２７が補充されたＲＰＭＩなどの基本培地を含むことができる又はそれからなることができる。
【０１２２】
ＦＳＣ維持培地は、ＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンをさらに含むことができる。
【０１２３】
本発明の別の態様は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を維持するための方法であって、
（ｉ）前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を準備し；及び
（ｉｉ）該ＦＳＣ集団を、ＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンを含むＦＳＣ維持培地中で培養することを含む方法を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＦＳＣ維持培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びヘパリン以外の分化因子がなくてもよい。例えば、ＦＳＣ維持培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びヘパリンが補充された化学特定栄養培地からなることができる。好ましくは、ＴＧＦβリガンドはアクチビンである。
【０１２５】
ＦＳＣ維持培地は、Ｂ２７及び分化因子のアクチビン−Ａ（例えば、１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（例えば２〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ（例えば１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（例えば、２〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（例えば５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）及びヘパリン（０．１ｕｇ〜１０ｕｇ、好ましくは１ｕｇ）が補充されたＲＰＭＩ基本培地を含むことができる又はそれからなることができる。
【０１２６】
好ましくは、ＦＳＣ集団は、ＦＳＣ維持培地中で少なくとも５回継代される。
【０１２７】
ＦＳＣ維持培地中でのＦＳＣ集団の継代は、該集団のＦＳＣ含有量を高め、かつ、該集団の非ＦＳＣ含有量を枯渇させる。例えば、維持培地中での５継代後に、該集団は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は好ましくは１００％のＦＳＣを含むことができる。
【０１２８】
上記のように生成し、そして任意に維持した後に、ＦＳＣ集団を後の使用のために保存又は保持することができる。
【０１２９】
ＦＳＣ集団は、より多くの特定の内胚葉系統及び／又は分化内胚葉細胞にさらに分化できる。例えば、ＦＳＣは、膵臓内胚葉細胞（ＰＤＸ+、ＨＬＸＢ９+）若しくは膵臓前駆細胞（ＰＤＸ+、ＮＧＮ３+、ＩＮＳ+）などの膵臓系統の細胞、肝内胚葉細胞（ＡＦＰ+、ＨＥＸ+、ＨＮＦ４ａ+）若しくは肝前駆細胞（Ａｌｂ+、Ａ１ＡＴ+、ＨＮＦ４ａ+）などの肝臓系統の細胞又は肺内胚葉細胞（ＮＫＸ２．１+、ＦＯＸＰ２+）及び肺前駆細胞（ＮＫＸ２．１+、ＧＡＴＡ６+、ＳＦＴＰ−Ｃ+）などの肺系統の細胞に分化できる。
【０１３０】
分化基質としてＦＳＣを使用すると、内胚葉細胞を源にかかわらず多能性細胞集団から一貫して生成することが可能になる。特に、内胚葉細胞は、内胚葉分化し難いｉＰＳＣ系統から一貫して生成できる。
【０１３１】
ＰＳＣの分化によって生成される内胚葉細胞集団を単離し、培養し、増殖させ又は維持することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞集団は、肝臓系統の細胞、例えば肝細胞、肝前駆細胞又は肝内胚葉細胞に分化できる。肝分化に好適方法が当該分野で利用可能である
（例えばＷＯ２０１２／０２５７２５；Ｙｕｓａ外、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｏｃｔ  １２；４７８（７３６９）：３９１−４；Ｃｈｏ外、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２  Ｄｅｃ；５５（１２）：３２８４−９５；Ｈａｎｎａｎ外、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｊａｎ  ３１；８（２）：４３０−７；Ｔｏｕｂｏｕｌ外、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｍａｙ；５１（５）：１７５４−６５；Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ外、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｊａｎ；５１（１）：２９７−３０５；Ｓｏｎｇ外、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００９  Ｎｏｖ；１９（１１）：１２３３−４２；Ｚｈａｏ外、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９  Ｊｕｌ  ３１；４（７）：ｅ６４６８；Ｈａｙ外、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  Ａｕｇ  ２６；１０５（３４）：１２３０１−６；Ｂａｈａｒｖａｎｄ外、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．２００８  Ｍａｙ；７６（５）：４６５−７７；Ａｇａｒｗａｌ外、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００８  Ｍａｙ；２６（５）：１１１７−２７；Ｃａｉ外、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００７  Ｍａｙ；４５（５）：１２２９−３９；Ｃａｉ，Ｊ．外、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２（１）：５０−６０；  Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．外、（２００６），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４（１１）：１３９２−４０１；Ｊｉａｎｇ外、（２００７）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １７（４）：３３３−４４．参照）
【０１３３】
簡単に言うと、上記の方法のいずれか一つは、上記のように生成されたＦＳＣ集団を肝臓誘導培地中で培養して肝前駆細胞集団を生成し、その際、該肝誘導培地は、ＢＭＰ及びＦＧＦを含む化学特定培地である。
【０１３４】
好適な肝誘導培地は、ＦＳＣを肝前駆細胞に分化するように誘導する１種以上の追加の因子、好ましくは組換えヒト因子が補充された化学特定基本培地を含むことができる。
好適な化学特定基本培地は、好ましくはＢ２７補充物が補充された上記のＲＰＭＩ−１６４０を含む。ＣＤＭは、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４（例えば１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）が補充されていてよい。
【０１３５】
ＦＳＣ集団を３〜５日間、好ましくは約４日間培養して肝前駆細胞集団を生成することができる。
【０１３６】
任意に、肝前駆細胞は、さらに分化できる。例えば、方法は、肝成熟培地中において肝前駆細胞集団を培養して肝細胞集団を生成することをさらに含むことができる。
【０１３７】
好適な肝成熟培地は、Ｂ２７などの無血清培地補充物が補充され、任意に肝前駆細胞に成熟させるように肝前駆細胞を誘導するための追加の因子、好ましくは組換えヒト因子が補充された化学特定基本培地からなることができる。好適な化学特定基本培地としては、ＣＭＲＬ、ヘパトザイムＳＦＭ  （ＧＩＢＣＯ（商標）；インビトロジェン社）及び肝細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ社）が挙げられる。ＣＭＲＬ基本培地は、当該技術分野において周知であり、かつ、商業的供給源から容易に入手できる無血清基本培地である（例えばカタログ番号：１１５３００３７インビトロジェン社；製品番号Ｃ０４２２シグマ社）。ヘパトザイムＳＦＭは、商業的供給源（例えば、カタログ番号１７７０５；インビトロジェン社）から入手可能な無血清基本培地である。
【０１３８】
化学特定基本培地は、肝前駆細胞の肝細胞への分化及び成熟を誘導する１種以上の因子を補充することができる。例えば、基本培地は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）又は上皮成長因子（ＥＧＦ）を補充することができる（例えば５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）。また、化学特定基本培地は、オンコスタチンＭなどの肝細胞の分化及び成熟を誘導する１種以上の因子を補充することができる。
【０１３９】
好適な成熟培地は、Ｂ２７などの無血清培地補充物が補充され、さらにオンコスタチンＭ（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ）及びＨＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ）が補充された肝細胞基本培地又はヘパトザイムＳＦＭなどの化学特定基本培地を含むことができる。
【０１４０】
肝前駆細胞集団を１０〜４０日間、好ましくは約２５日間培養して肝細胞集団を生成することができる。
【０１４１】
肝前駆細胞及び肝細胞への分化のための好適な技術、培地及び試薬は、ＷＯ２０１２／０２５７２５；Ｙｕｓａ外、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｏｃｔ  １２；４７８（７３６９）：３９１−４及びＣｈｏ外、  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２  Ｄｅｃ；  ５５（１２）：３２８４−９５に記載されている。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＦＳＣ集団は、膵臓内胚葉細胞又は前駆細胞に分化できる。膵臓の分化に好適な方法が当該分野で利用可能である（例えばＣｈｏ外、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ２０１２  Ｄｅｃ；５５（１２）：３２８４−９５； Ｄ’Ａｍｏｕｒ外、，２００６），Ｊｉａｎｇ  外、２００７、Ｃａｉ  外、２０１０を参照）。
【０１４３】
簡単に言えば、上記の方法は、
アクチビンアンタゴニスト；ＦＧＦ；レチノイン酸；及びＢＭＰ阻害剤を含む第１膵臓誘導培地中でＦＳＣ集団を培養して背側前腸細胞集団を生成し；
ＦＧＦ、レチノイン酸、ＢＭＰ阻害剤及びヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を含む第２膵臓誘導培地中において該背側前腸細胞を培養し；
その後、分化因子ＦＧＦを含む第３膵臓誘導培地中において該細胞を培養し；
それによって膵臓前駆細胞集団を生成すること
を含む。
【０１４４】
好適な第１膵臓誘導培地は、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト；ＦＧＦ；レチノイン酸；及びＢＭＰアンタゴニストを含む化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。いくつかの実施形態では、これらは、培地中において唯一の分化因子であることができる。例えば、第１膵臓誘導培地は、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト、好ましくはＳＢ−４３１５４２（例えば、５〜２５μＭ、好ましくは約１０μＭ）、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（例えば０．５〜２０μＭ、好ましくは約２μＭ）及びＢＭＰアンタゴニスト、好ましくはノギン（例えば１００〜５００ｎｇ／ｍＬ）が補充されたアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定基本培地からなることができる。
【０１４５】
好ましくは、ＦＳＣ集団を２〜４日間、最も好ましくは３日間培養して背側前腸細胞集団を生成することができる。
【０１４６】
好適な第２膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、ＢＭＰ阻害剤、レチノイン酸及びヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を含む化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。いくつかの実施形態では、これらは、培地中において唯一の分化因子であることができる。例えば、第２膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）；レチノイン酸（例えば０．５〜２０μＭ、好ましくは約２μＭ）；ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、好ましくはＫＡＡＤ−シクロパミン（例えば０．１〜１μＭ、好ましくは０．２５μＭ）及びＢＭＰアンタゴニスト、好ましくはノギン（例えば５〜５００ｎｇ／ｍＬ又は１００〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定基本培地からなることができる。
【０１４７】
背側前腸細胞を２〜４日間、最も好ましくは３日間第２膵臓誘導培地中で培養することができる。
【０１４８】
好適な第３膵臓誘導培地は、ＦＧＦを含む化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、培地中の唯一の分化因子であることができる。例えば、第３膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定基本培地からなることができる。
【０１４９】
細胞を２〜４日間、最も好ましくは３日間第３膵臓誘導培地中で培養して膵臓前駆細胞集団を生成することができる。
【０１５０】
任意に、膵臓前駆細胞を膵臓内分泌細胞にさらに分化及び／又は成熟できる。例えば、膵臓細胞を、（ｉ）第１内分泌誘導培地中で培養し、そして（ｉｉ）第２内分泌誘導培地中で培養して膵臓内分泌細胞集団を生成させることによって成熟させることができ、その際、該第１内分泌誘導培地は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤及びレチノイン酸を含む化学特定培地であり；該第２内分泌誘導培地は、レチノイン酸以外の分化因子がない化学特定培地である。
【０１５１】
好適な第１内分泌誘導培地は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤及びレチノイン酸をさらに含むＢ２７などの無血清培地補充物が補充された化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤及びレチノイン酸は、培地中における唯一の分化因子であることができる。第１内分泌誘導培地は、Ｂ２７及びＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、好ましくはＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−１−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）（例えば０．１〜１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ）が補充されたアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定基本培地からなることができる。
【０１５２】
膵臓前駆細胞を２〜４日間、最も好ましくは３日間第１内分泌誘導培地中で培養することができる。
【０１５３】
好適な第２内分泌誘導培地は、Ｂ２７が補充され、さらなる分化因子のないアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。
【０１５４】
膵臓前駆細胞を２〜４日間、最も好ましくは３日間第２内分泌誘導培地中で培養することができる。この方法によって生成される膵臓細胞は、ＰＤＸ１、ＩＮＳ、ＮＧＮ２、ＮＧＮ３及びＳＳＴなどの膵臓マーカーを発現することができる。
【０１５５】
細胞の少なくとも８０％が第１内分泌誘導培地中でＰＤＸ１を発現することができる。該細胞は、最初に膵臓マーカー（ＨＬＸＢ９、ＰＤＸ１）、その後内分泌前駆細胞マーカー（Ｎｇｎ３）、そして最後にβ細胞マーカー（インスリン）を連続的に発現することができる。
【０１５６】
膵臓内分泌細胞の分化及び成熟のための好適なプロトコール、試薬及び培地が当該分野において利用できる（Ｋｒｏｏｎ  Ｅ  外、（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：４４３−４５２及びＣｈｏ  外、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２  Ｄｅｃ；５５（１２）：３２８４−９５参照）。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＦＳＣ集団は、肺系統の細胞、例えば肺前駆細胞又は肺内胚葉細胞に分化できる。
【０１５８】
ＦＳＣは、肺特異化のための誘導条件で培養することにより肺細胞に分化できる。例えば、ＦＳＣは、
（ｉｉｉ）ＲＡ及びＦＧＦを含む第１肺誘導培地中でＦＳＣ集団を培養し；
（ｉｖ）ＦＧＦ及びＨＧＦを含む第２肺誘導培地中で工程（ｉｉｉ）からの細胞を培養し；
それによって肺前駆細胞集団を生成すること
を含む方法により肺細胞に分化できる。
【０１５９】
好適な第１肺誘導培地は、ＦＧＦ及びＲＡを含む化学特定培地（ＣＤＭ）であることができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ及びＲＡは、培地中における唯一の分化因子であることができる。例えば、第１肺誘導培地は、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（例えば、０．３〜３０ｕＭ、好ましくは約３ｕＭ）が補充されたアドバンストＤＭＥＭなどの化学特定基本培地からなることができる。
【０１６０】
肺前駆細胞は、早期に肺マーカーＮｋｘ２．１、ＦＯＸＰ２及びＩＲＸ１を発現することができる。
【０１６１】
肺前駆細胞は、肺ＩＩ型肺胞細胞マーカーＮＫＸ２．１、ＡＢＣＡ３、ＭＵＣ１及び遠位気道マーカーＮＫＸ２．１、ＣＫ１８、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＣ、ＧＡＴＡ６を発現することができる。
【０１６２】
いくつかの好ましい実施形態では、肺前駆細胞は、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、ムチン１及びＮＫＸ２．１を発現するＩＩ型肺胞細胞であることができる。肺前駆細胞は、ＩＩ型肺細胞の１以上の活性、例えば嚢胞性線維症膜貫通型受容体を介したイオン移動及びＩ型肺細胞の分化能を示すことができる。
【０１６３】
本発明の他の態様は、ＩＩ型肺胞細胞の単離された集団及びＩＩ型肺胞細胞の集団を生成する方法、例えば上記の方法におけるＦＳＣの使用を提供する。
【０１６４】
本明細書で記載したとおりに生成された単離ＦＳＣの集団はスクリーニングに有用であり得る。
【０１６５】
本発明の別の態様は、上記の単離ＦＳＣと試験化合物とを接触させ、そして前腸幹細胞に及ぼす該試験化合物の影響及び／又は該試験化合物に及ぼす前腸幹細胞の影響を決定することを含む、化合物のスクリーニング方法を提供する。
【０１６６】
ＦＳＣの増殖、成長若しくは生存能力、分化能力又は１以上の細胞機能を実行する能力を、試験化合物の存在対非存在で決定できる。分化、増殖、成長、生存能力又は１以上の細胞機能を実行する能力の減少は、その化合物が毒性作用を有することを示し、増殖、生存能力又は１以上の細胞機能を実行する能力の増加は、その化合物が改善効果を有することを示す。
【０１６７】
また、単離されたＦＳＣから生成された細胞集団は、スクリーニングに有用な場合もある。例えば、化合物のスクリーニング方法は、上記のように生成された単離肝臓、膵臓又は肺前駆細胞と試験化合物とを接触させ；該前駆細胞に及ぼす該試験化合物の影響及び／又は該試験化合物に及ぼす該前駆細胞の影響を決定（測定）することを含むことができる。
【０１６８】
本発明の別の態様は、上記の前腸誘導培地、例えばＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビンが補充された化学特定栄養培地からなるＣＤＭ培地を含むＦＳＣの生成用キットを提供する。
【０１６９】
上記キットは、上記ＤＥ誘導培地、例えばＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤が補充された化学特定栄養培地からなる培地をさらに含むことができる。
【０１７０】
キットは、上記ＦＳＣ維持培地、例えばＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンが補充された化学特定栄養培地からなる培地をさらに含むことができる。
【０１７１】
キットは、肝臓誘導培地、肝臓成熟培地、第１膵臓誘導培地、第２膵臓誘導培地、第３膵臓誘導培地、第１内分泌誘導培地、第２内分泌誘導培地、第１肺誘導培地及び第２肺誘導培地の一つ以上をさらに含むことができる。好適な培地は、上記されている。
【０１７２】
本発明の別の態様は、ＴＧＦβリガンド、好ましくは、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びヘパリンの有効量が補充された化学特定栄養培地からなるＦＳＣ維持培地を含む、ＦＳＣを維持するためのキットを提供する。
【０１７３】
本明細書の他の箇所に記載されているように、培地は、上記分化因子の有効量を補充することができる。
【０１７４】
キット内における１種以上の培養培地は、脱イオン蒸留水で処方できる。１種以上の培地は、典型的には、汚染を防止するために、使用前に例えば紫外線、加熱、放射線照射又は濾過によって滅菌できる。１種以上の培地は、貯蔵又は輸送のために冷凍できる（例えば、−２０℃又は−８０℃）。１種以上の培地は、汚染を防止するために１種以上の抗生物質を含有することができる。
【０１７５】
１種以上の培地は、１倍配合物又はさらに濃縮された配合物、例えば２倍〜２５０倍濃縮培地配合物とすることができる。１倍配合物では、培地中の各成分は、細胞培養のために意図された濃度、例えば上記濃度である。濃縮配合物では、成分の１種以上は、細胞培養のために意図されるよりも高い濃度で存在する。濃縮培地は当該分野において周知である。培地は、既知の方法、例えば塩析沈殿又は選択的ろ過を使用して濃縮できる。濃縮培地は、水（好ましくは脱イオン及び蒸留）又は任意の適切な溶液、例えば食塩水、水性緩衝液又は培養培地により使用のために希釈できる。
【０１７６】
キット中の１種以上の培地は、密閉容器内に含まれていてもよい。密閉容器は、汚染を防止するために、培地の輸送又は保管にとって好ましい場合がある。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、ジャー、バイアル又はバッグなどの任意の好適な容器とすることができる。
【０１７７】
本発明の別の態様は、ここに記載される前腸誘導培地の、ＤＥＣからＦＳＣへのインビトロ分化における使用を提供する。
【０１７８】
本発明の別の態様は、ここに記載される前腸誘導培地及びＤＥ誘導培地の、多能性細胞からＦＳＣへのインビトロ分化における使用を提供する。
【０１７９】
本発明の別の態様は、ここに記載されるＦＳＣ維持培地の、ＦＳＣのインビトロ培養のための使用を提供する。
【０１８０】
本発明の他の態様及び実施形態は、用語「含む」を用語「からなる」に置き換えた上記態様及び実施形態を提供し、また、用語「含む」を用語「から本質的になる」に置き換えた上記及び態様及び実施形態を提供する。
【０１８１】
本願は、文脈が他に要求しない限り、上記態様及び実施形態のいずれかとそれら自体との全ての組合せを開示すると理解すべきである。同様に、本願は、文脈が他に要求しない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独又は他の態様のいずれかとの全ての組み合わせを開示する。
【０１８２】
上記実施形態の改変、さらなる実施形態及び改変は、当業者であればこの開示を読めば明らかであり、これらはそういうものとして本発明の範囲内にある。
【０１８３】
本明細書で言及される全ての文献及び配列データベースエントリは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書で援用される。
【０１８４】
ここで使用する「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は成分を他のものと共に又は他のものなしにそれぞれ具体的に開示するものとして解釈すべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈すべきであり、それぞれが個別的に記載される場合と同様である。
【０１８５】
本発明の所定の態様及び実施形態を例示として上記の図面を参照して説明する。
【実施例】
【０１８６】
例
方法
ヒトＥＳ及びＩＰＳ細胞の培養
ｈＥＳＣ（Ｈ９）及びｈＩＰＳＣ（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ−１、ＣＯＸＶ３、ＣＯＸＳ８、Ｌｉｎｅ４及びＩＰＳ４０）を、従来記載されたとおり化学的に特定されたフィーダーなしの培養系でアクチビン−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍＬ）を使用して培養した［５−７、１７、１８］。細胞を、コラゲナーゼＩＶの混合物又はコラゲナーゼとディスパーゼとの混合物（１：１比）を使用して７日ごとに継代した。
【０１８７】
ｈＰＳＣから内胚葉への分化
細胞を、ＣＤＭ−ＰＶＡ及びアクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＬＹ２９４００２（１０μＭ）を使用して３日間にわたり従来記載されたとおりに胚体内胚葉に分化させた［４、６、７、９］。
【０１８８】
胚体内胚葉のパターン形成
ＤＥ細胞を、３〜４日間にわたりアクチビン−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）を有するＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地中で培養して前腸細胞を生成した。ＤＥ細胞を、４日間にわたりＣＨＩＲ９９０２１（６μＭ）を有するＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地中で培養して後方内胚葉を生成した。
【０１８９】
後方内胚葉から３Ｄ腸オルガノイドへの分化
後天的内胚葉細胞を、Ｂ２７補充物（ＲＡ枯渇）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヒトＲ−スポンジン（５００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトノギン（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社）、Ｊａｇｇｅｄ−１ペプチド（１μＭ）（ＡｎａＳｐｅｃ社）を含有する成長因子減少マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中に包埋した。細胞／マトリゲルミックスに、Ｂ２７補充物（ＲＡ枯渇）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｙ−２７６３２（１０ｕＭ）（シグマ・アルドリッチ社）、ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＲ−スポンジン（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＷｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ社）を含有する、２ｍＭのグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０ｍＭヘペス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社）を重層した。
【０１９０】
ｈＦＳＣの継代及び維持
ｈＦＳＣを、Ｂ２７補充物、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、アクチビン−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びヘパリンを含有するＲＰＭＩ培地中でのｈＰＳＣの維持について記載したとおりに調製したゼラチン被覆プレート上で培養した。細胞を、４〜７日毎に細胞解離緩衝液（ＣＤＢ）を使用して継代した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後１０〜１５分間にわたり３７℃でＣＤＢ中においてインキュベートした。細胞を小塊として掻き取り、そして１５ｍＬ管に移し、その後２分間にわたって８００ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、次いで上記成長因子のカクテル及びＲｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁した。ＲｏｃＫ阻害剤は、その後の培養日の間には使用しなかった。培地は、翌日及び細胞がその後８０〜９０％コンフルエントになるまで日毎に取り替えた。
【０１９１】
ｈＦＳＣから肝内胚葉への分化
肝臓分化は以前に記載されている［４、７、９］。簡単に言うと、ｈＦＳＣを、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ１０（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋Ｂ２７中で４日間培養した。次いで、細胞を、ＯＳＭ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する肝細胞基本培地（ロンザ社）中で少なくともさらに２０日間にわたって培養した。
【０１９２】
ｈＦＳＣから膵臓内胚葉への分化
ｈＦＳＣを、以前に記載されたように５工程プロセスを使用して膵臓内胚葉に分化させた［４］。ｈＦＳＣ（段階１）を、ＳＢ−４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ社）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；ＡｕｔｏｇｅｎＢｉｏｃｌｅａｒ社）、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ社）及びノギン（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充したアドバンストＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で３日間にわたり培養した。第２段階について、細胞を、ヒトＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；ＡｕｔｏｇｅｎＢｉｏｃｌｅａｒ社）、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２ｕＭ；Ｓｉｇｍａ社）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）及びノギン（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充したアドバンストＤＭＥＭ中で３日間にわたって培養した。第３段階について、細胞を、ヒトＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で３日間培養した。膵臓前駆細胞の成熟（段階４）について、細胞を、アドバンストＤＭＥＭ＋１％体積／体積のＢ２７及びＤＡＰＴ（１ｍＭ）中で３日間にわたり増殖させ、そしてさらに３日間にわたってアドバンストＤＭＥＭ＋１％体積／体積のＢ２７中で増殖させた（段階５）。段階４及び分化の最終段階の段階５を、免疫蛍光及びＥＬＩＳＡアッセイを妨害しないようにインスリンのない培地を使用して達成した。インスリンの存在を実証するための抗体をＣ−ペプチドに対して産生して潜在的な偽陽性の結果を回避した。
【０１９３】
ｈＦＳＣから肺内胚葉への分化
肺前駆細胞を、レチノイン酸（３μＭ）及びＦＧＦ１０（１００ｎｇ／ｍＬ）中でｈＦＳＣを６日間にわたって増殖させることにより生成させた。細胞を、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを有する２Ｄ培養又はＦＧＦ１０及びＨＧＦ使用した３Ｄマトリゲル培養でさらに２０日間にわたって増殖させた。
【０１９４】
ＲＮＡ単離、ＲＴ及びＱ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）哺乳動物全ＲＮＡ単離キットを使用して単離した。接着細胞又は細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、次いで３５０μＬの全ＲＮＡ溶解緩衝液中で溶解させた。その後、ＲＮＡを製造業者の説明書に従って精製した。ＤＮＡ消化を、製造者の推奨に従ってＲＮＡアーゼフリーＤＮＡアーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を使用して実行した。５００ｎｇの全ＲＮＡを、反応あたり５００ｎｇの全ＲＮＡ、０．５μＬのランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及び１μＬのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して逆転写させた。サンプルを５分間にわたって６５℃に加熱し、次いでさらに５分間にわたって氷上に置いた。４μＬの第１ストランド緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋２μＬのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１μＬのＲＮＡｓｅ  ＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋０．５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をそれぞれのサンプルに添加し、その後１０分間室温でインキュベートし、その後５０分間にわたり４２℃、そして１５分間にわたり７０℃でインキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲからのｃＤＮＡを、ＲＮＡｓｅを含まない水の５００μＬの総容量に希釈した。反応当たり５μＬのｃＤＮＡを、Ｃｙｂｅｒ−Ｇｒｅｅｎ  Ｓｅｎｓｉ  ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）７．５μＬ、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各プライマー０．６μＬ及びＲＮＡｓｅを含まない水１．３μＬと混合した。ＰＣＲを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅサーモサイクラーを使用して、９５℃で１０分間の１サイクル、その後９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間の４０サイクル、その後９５℃で１分間の１サイクルを用いて実行した。５５℃〜９５℃の範囲の解離曲線を、各Ｑ−ＰＣＲ実施の終了時に作成して単一増幅産物の存在を確認した。全てのＱ−ＰＣＲデータは３回の実験の平均を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ｈＥＳＣ（Ｈ９）を全ての実験においてネガティブコントロールとして使用し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０１９５】
免疫染色
ｈＰＳＣ又はそれらの分化前駆細胞を、４％パラホルムアルデヒド中において４℃で２０分間固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、１０％ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）を含有するＰＢＳＴ（０．１％トリトンＸ１００；Ｓｉｇｍａ社；ＰＢＳ中）中において室温で２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳＴ中の１％ロバ血清で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした（表１１）。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ中１％ロバ血清中において室温で２時間にわたって二次抗体と共にインキュベートした。結合しなかった二次抗体をＰＢＳで５分間にわたって３回洗浄することによって除去した。ヘキスト３３２５８を最初の洗浄に添加した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社；１：１００００  ）。
【０１９６】
３Ｄオルガノイドをマトリゲルから除去し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして４％アガロース中に包埋してから、パラフィン切片のために処理加工した。抗原回復後に、サンプルを、０．５％トリトンＸ−１００で透過処理し、そして１０％ＦＢＳでブロックしてから、一次抗体中において一晩インキュベートした。サンプルをＰＢＳで洗浄し、そして室温で１時間にわたって二次抗体と共にインキュベートしてから、ＤＡＰＩを使用して対比染色した。サンプルを、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍと、ＭＲｃカメラと、画像キャプチャ用のＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ社製イメージャＭ．２を使用して画像化した。
【０１９７】
フローサイトメトリー
接着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に細胞解離緩衝液（米国カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）中において３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中において穏やかなピペッティングにより解離し、そして１ｍＬ当たり０．１〜１×１０5個の細胞で再懸濁した。細胞をペレット化し、４％パラホルムアルデヒド溶液中において細胞を２０分間にわたって４℃で再懸濁することによって固定した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．１％アジド（英国オックスフォードのＳｅｒｏｔｅｃ社）を含有するＰＢＳ＋１０％ロバ正常血清（ＮＤＳ）でブロックした。細胞を透過性にするために、ペレット化した細胞を２ｍＬのＳＡＰ緩衝液（ハンクス平衡塩溶液中０．１％（ｗ／ｖ）のサポニン）に再懸濁した。次いで、細胞を０．１％のＳＡＰ、１％のロバ血清＋一次抗体溶液中でインキュベートし、室温で少なくとも２時間又は一晩４℃でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋１％ＮＤＳで３回洗浄し、そして室温で２時間又は４℃で一晩ＳＡＰ緩衝液中において二次抗体と共にインキュベートした。結合しなかった二次抗体をＰＢＳで３回洗浄することによって除去した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳキャリバー機（米国カリフォルニア州サンノゼのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して分析した。陽性細胞の数を３回の別々の実験からの平均として記録した。
【０１９８】
ｈＩＰＳＣの生成
ｈＩＰＳＣ（ＢＢＨＸ８及びＡ１ＴＡＴＤ）を、記載されているとおりに山中因子を使用してヒト皮膚線維芽細胞のレトロウイルス仲介再プログラミングを用いて誘導した［７］。
【０１９９】
ＧＦＰ  ｈＰＳＣの生成及びクローン分析
Ｈ９、ＢＢＨＸ８及びＡ１ＡＴＤ−１を発現するＧＦＰを、以前に記載されたとおり、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した安定なトランスフェクションによって生成した［１９］。ＧＦＰ陽性細胞を前腸細胞に分化させ、その後単一細胞に解離させた。その後、個別に単離されたＧＦＰ細胞を、非ＧＦＰ陽性ｈＦＳＣを含有するウェルに移した。ウェルをプレーティング後１２時間目に視覚的に検査し、そして単一のＧＦＰ陽性ｈＦＳＣを含むウェルをクローン性増殖のために選択した。
【０２００】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
膵臓特異化を誘導する培養条件下で２５日間にわたって成長させたｈＥＳＣを、グルコース刺激前に２４時間にわたってインスリンなしの分化培地中で培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２．２ｍＭのグルコースを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で３７℃で６０分間にわたってプレインキュベートした。プレインキュベートした細胞を、２２ｍＭのグルコース又は２．２ｍＭのグルコースを含むＤＭＥＭ中で１５又は６０分間にわたって増殖させた。上澄みを、Ｃ−ペプチド放出の決定のために集めた。ＥＬＩＳＡ分析を、Ｍｅｒｃｏｄｉａ超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を使用して実施した。アルブミン及びＡＴＴ分泌アッセイについて、高結合表面ＣＯＳＴＡＲ９６ウェルプレート（米国ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を、α1−アンチトリプシン（英国ケンブリッジＡｂｃａｍ３１６５７）及びアルブミン（英国ケンブリッジＡｂｃａｍ８７５６４）に対する親和性精製ウサギポリクローナル抗体により炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）中２μｇ／ｍｌで一晩被覆した。洗浄（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）後に、プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．２５％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）中で２時間ブロックした。培地をブロッキング緩衝液で希釈し、そして５０μＬを各ウェルに添加し、その後２時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを対応するモノクローナル抗体（ブロッキング緩衝液で希釈された１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、そして２時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体を、ウサギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（英国ヘイバリルのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、１：２０，０００）で１時間にわたって検出した。反応をＴＭＢ液体基質（英国ヘイバリルのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共に暗所で１０分間にわたって進行させ、そして反応を１ＭのＨ2ＳＯ4で停止させた。吸光度をＴｈｅｒｍｏ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（米国カリフォルニア州サニーベールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で４５０ｎｍで読み取った。
【０２０１】
シトクロムＰ４５０活性
Ｃｙｐ３Ａ４活性アッセイを、Ｐ４５０−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して製造業者の指示に従って３回測定した。その後、シトクロム活性をＰ４５０−ＧｌｏＭａｘ９６マイクロプレートルミノメーターを使用して分析した。
【０２０２】
過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色
ＰＡＳ染色を、キット（Ｓｉｇｍａ３９５Ｂ−１ＫＴ）を使用して製造業者の説明書のガイドに基づいて３回細胞について実施した。その後、ジアスターゼ消化を実施して、陽性染色がグリコーゲンの存在によるものであったことを確認した。
【０２０３】
ＬＤＬの取り込み
Ｄｉｌ−ＬＤＬ染色キットを（米国マサチューセッツ州Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）から購入し、そしてアッセイを製造業者の指示に従って行った。
【０２０４】
結果
本発明者は、以前に、ｈＰＳＣを、肝細胞及び膵臓前駆細胞への分化能を有する胚体内胚葉（ＤＥ）細胞のほぼ均質な集団への分化に向かわせるための特定された培養系を開発した［４−９］。
これらの培養条件で増殖させた細胞は、原始線条マーカー（Ｔ、Ｅｏｍｅｓ、Ｍｉｘｌ１）を連続的に発現し、多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＰＯＵ５Ｆ１）を下方調節し、そして胚体内胚葉マーカー（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢ及びＳＯＸ１７）を徐々に上方調節する。フローサイトメトリー分析から、得られたＤＥ集団の８０％がＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７を共発現することが示された。興味深いことに、得られたＤＥ細胞集団は、前腸（ＳＯＸ２）、中腸／後腸（ＣＤＸ２）、膵臓（ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ａ）、肝臓（ＡＦＰ）及び肺（Ｎｋｘ２．１、ＴＢＸ１）をマークする遺伝子に対して陰性である。このことから、インビトロで生成されたＤＥ細胞は、前後パターン形成又は器官形成の前の初期の内胚葉前駆細胞に相当することが確認される。
【０２０５】
次に、本発明者は、ＤＥ細胞が原腸管の前方ドメイン及び後方ドメインの代表物に分化する能力を試験した。本発明者は様々な成長因子をスクリーニングし、アクチビン−ＡがＣＤＸ２の発現をブロックする一方で、ＳＯＸ２、ＨＨＥＸ及びＨＯＸＡ３などの前方腸マーカーの発現を誘導することを見出した。一方、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で増殖させたＤＥ細胞は、ＣＤＸ２及びＨＯＸＣ５などの中腸／後腸マーカーを発現し、前方マーカーの発現を示さない。アクチビン−Ａ処理及びＣＨＩＲ処理の両方の間に、細胞は、高レベルの原腸マーカーＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ及びＨＯＸＡ２を発現するが、これは、これらの条件下で、細胞がそれらの内胚葉同一性を保持することを示す。注目すべきことに、フローサイトメトリー分析から、細胞の９０％がアクチビン−Ａ処理後にＳＯＸ２を発現する一方で、細胞の８５％がＣＨＩＲ９９０２１処理後にＣＤＸ２に対して陽性であったことが明らかになった。同様の結果が、２種のｈＩＰＳＣ系統（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ．１）を使用して得られた。まとめると、これらのデータは、アクチビン−Ａ及びＧＳＫ３ベータシグナル伝達がインビトロでヒトＤＥの前後方向パターン形成を指示することを示す。
【０２０６】
アクチビン−Ａ又はＣＨＩＲ９９０２１の存在下で生成された細胞の同一性をさらに検証するために、本発明者は、それらの腸細胞への分化能を試験することを決定した。ＳＯＸ２+細胞及びＣＤＸ２+細胞を、後方腸分化を促進することが知られている３次元オルガノイド培養条件で増殖させた［１０］。これらの条件下で増殖させたＳｏｘ２+細胞は増殖をやめ、拡大できなかったのに対し、ＣＤＸ２+細胞は、腸上皮に似た高度に折りたたまれた構造を有するスフェロイドを形成し、かつ、腸マーカー（ムチン、ビリン及びクロモグラニンＡ）を発現した。さらに、これらのオルガノイドは、少なくとも２ヶ月間にわたって拡大できると共に、成体腸上皮のマーカーの漸進的増加を示す。最後に、ＣＤＸ２+細胞誘導オルガノイドと初代マウス腸管オルガノイドとの比較免疫染色分析から、両方の種類のオルガノイドにおいて頂端ビリンを発現する偏光上皮が示された。これらのデータは、ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で生成されたＣＤＸ２+細胞が中腸／後腸前駆細胞を形成する分化能を有すると共に、アクチビン−Ａ誘導ＳＯＸ２+がこの能力を欠失したことを実証するものである。その結果、これらのＳＯＸ２+細胞は、前腸前駆細胞と同等である可能性がある。［１１］
【０２０７】
その後、本発明者は、前腸ＳＯＸ２+細胞がインビトロで自己再生する能力を試験した。ｈＥＳＣから誘導されるＤＥ細胞をアクチビン−Ａの存在下で４日間にわたり分化させ、その後成長因子の多様な組合せの存在下で培養した。このアプローチ後に、本発明者は、アクチビン−ＡとｂＦＧＦとＢＭＰ４とＨＧＦとＥＧＦとヘパリンとの組合せが１：４〜１：６の比率で１０継代を超えて前腸ＳＯＸ２+細胞を増殖させるのに十分であったことを確認した（図１Ａ）。前腸細胞の増殖に最適な培養条件は、細胞死又は前腸細胞自体への分化をほとんど生じさせなかったが、ニューロン様細胞及び線維芽細胞様細胞などの汚染細胞の有意な細胞死が観察されたところ、これは、前腸培養を経時的に増強させることのみに役立つ。これらの培養条件下で５継代後に、前腸ＳＯＸ２+細胞は、多能性（ＰＯＵ５ｆ１及びＮＡＮＯＧ）、肺（ＮＫＸ２．１）、肝臓（ＡＦＰ）又は膵臓（ＰＤＸ１）マーカーを発現しなかった一方で、前腸マーカー（ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１β、ＧＡＴＡ４、Ｃｅｒ、ＳＯＸ２  ＨＮＦ６及びＨＮＦ１ベータ；図１Ｂ〜Ｃ）の発現を維持した。フローサイトメトリー分析から、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４がほぼ均質に共発現したことが示された（図１Ｄ）。重要なことに、同様の結果が２種のｈＩＰＳＣ系統（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ．１）で得られた［５−７］。まとめると、これらのデータは、本発明の培養系が前腸細胞の均一な集団を獲得することを実証するものであり、該集団は、インビトロで自己再生できるため、新たなタイプの内胚葉幹細胞（以下、ヒト前腸幹細胞又はｈＦＳＣという）に相当することができるであろう。
【０２０８】
この仮説を確認するために、本発明者は、ｈＦＳＣの肺、肝臓及び膵臓細胞への分化能を試験した。肺分化誘導性の培養条件で成長させたｈＦＳＣ（図２Ａ）は、初期肺内胚葉マーカーを上方調節した（Ｎｋｘ２．１、ＦＯＸＰ２及びＩＲＸ１、図２Ｂ）。さらに、３Ｄ条件で分化した細胞は、遠位気道上皮に似た両方の分岐嚢胞構造を有する凝集体のみならず、ＩＩ型肺細胞により典型的な大型単一嚢胞凝集体を形成した。細胞の約７０％が初期肺内胚葉マーカーＮＫＸ２．１を発現したため、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫染色分析により、肺ＩＩ型肺胞細胞マーカー（ＮＫＸ２．１、ＡＢＣＡ３、ＭＵＣ１）及び遠位気道マーカー（ＮＫＸ２．１、ＣＫ１８、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＣ、ＧＡＴＡ６、図２Ｂ−Ｃ）の両方の発現を確認した。また、ｈＦＳＣを、膵臓特異化を誘導する培養条件下でも増殖させ［４］（図２Ｄ）、まず膵臓マーカー（ＨＬＸＢ９、ＰＤＸ１）、その後内分泌前駆細胞マーカー（Ｎｇｎ３）、そして最後にβ細胞マーカー（インスリン）を連続的に発現させた（図２Ｅ）。以前に報告されたように、細胞の約８０％以上が膵臓分化プロトコールの段階４でＰＤＸ１陽性であった［４］。分化の１８日後に、ｃ−ペプチド、ＰＤＸ１及びソマトスタチン発現細胞を免疫染色によって検出することができ、ｃ−ペプチドの放出をグルコース刺激時に検出した（図２Ｆ）。最後に、肝臓マーカー（ＡＦＰ、ＡＬＢ、Ａ１ＡＴ、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ａ４）を発現した、肝特異化を誘導する培養条件で増殖させたｈＦＳＣ［７、９］（図２Ｇ）は、誘導シトクロム活性（図２Ｈ及び２Ｉ）を示し、ＡＡＴ及びアルブミンを分泌し、そしてコレステロール及びＣａｒｉｏｇｒｅｅｎを取り込む。ｈＦＳＣから生成された肝細胞様細胞は、以前に報告されたように肝臓マーカーのアルブミン及びα−１アンチトリプシンに対して９０％を超えて二重陽性であった［７、９］。重要なことに、異なるｈＩＰＳＣ系統から誘導された複数のｈＦＳＣ系統が同様の分化効率を示した。まとめると、これらのデータは、ｈＦＳＣが肺、膵臓及び肝細胞を含めた前腸誘導体に分化する能力を有することを実証するものであり、そのためこれらの細胞が多能性であることが確認される。
【０２０９】
これらの結果をさらに補強するために、本発明者は、単一のｈＦＳＣが多能性であることを確認することを決定した。ｈＦＳＣは上皮として成長し、単一細胞の単離により系統的に細胞死が生じた。この制限をバイパスするために、本発明者は、ＧＦＰ発現ｈＦＳＣを生成し、これらを単一の細胞に分離し、そして非ＧＦＰ発現ｈＦＳＣを含む２４ウェルプレートのウェルに別々に配置した。次の日に、単一のＧＦＰ陽性ｈＦＳＣを含むウェルを増殖についてマークし、そして５継代後に、得られた細胞は肺、肝臓及び膵臓細胞に分化した。これらの各培養条件下で成長させたｈＦＳＣのＧＦＰ陽性細胞は、肺（プロＳＦＴＰＣ及びＭＵＣ１）、肝臓（ＡＬＢ、Ａ１ＡＴ、ＡＦＰ及びＨＮＦ４ａ及びＬＤＬ取り込み）及び膵臓（ＰＤＸ１、ＩＮＳ、ＮＧＮ２及びＳＳＴ）マーカーを発現したため、ｈＥＳＣ及びｈＩＰＳＣから生成されたｈＦＳＣが多能性幹細胞であるという必要な証拠が得られた。
【０２１０】
１６の個体由来の４８種のｈＩＰＳＣ系統のパネルから、本発明者は、ＤＥの均質集団に分化することのできない、少なくとも３種の系統を同定した。これらの内胚葉耐性ｈＩＰＳＣ系統（ＣＯＸＳ８、ＣＯＸＶ３及びＬｉｎｅ４）は、ＳＯＸ１７  ＤＥ細胞の３０％未満しか生成しなかった（図３Ａ）。それにもかかわらず、この不均質な集団は、アクチビン−Ａの存在下でさらに３日間にわたって増殖して前腸特異化を促進することができたので、得られた細胞をｈＦＳＣ増殖を支持する培養条件に移した。興味深いことに、非内胚葉起源の汚染細胞は、増殖を停止させ、かつ、継代時に漸進的に消失した。フローサイトメトリー分析から、５継代増殖させた細胞は、内胚葉生成能力のあるｈＩＰＳＣから生成されたｈＦＳＣと同様に、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４（９９％）を均一に発現したことが示される（図３Ａ）。したがって、本発明の培養系は、ＤＥ細胞の不均質集団に由来する場合であってもｈＦＳＣを選択的に増幅する。得られたｈＦＳＣ集団をさらに２継代増殖させ、その後膵臓及び肝臓分化誘導培養条件に移した。肝臓系統に向かって分化した細胞は、対照ｈＦＳＣから生成された肝細胞様細胞と同様のレベルで肝マーカー（ＡＡＴ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＨＮＦ４）を発現した（図３Ｂ）。同様に、膵臓系統の細胞に向かって分化した細胞は、ＰＤＸ１、ＩＮＳ及びＮＧＮ３を発現した（図３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ｈＦＳＣが肝臓及び膵臓細胞の生成について胚葉分化能の減少したｈＩＰＳＣから容易に生成できることを示す。したがって、ｈＦＳＣの誘導は、多数のｈＩＰＳＣ系統を容易に達成することができ、かつ、様々な患者のからの臨床的利益を有する細胞の生成を可能にする。
【０２１１】
本発明者の結果は、ｈＰＳＣを前腸幹細胞の多能性集団に分化させる段階的方法を説明する（図４）。
【０２１２】
重要なことに、前腸細胞の生成は以前に報告されている［１２］が、本発明者の研究は、多能性自己再生前腸幹細胞の単離、拡大及び分化を可能にする培養系を初めて提供するものである。同様に、最近の研究では、多能性ＤＥ細胞をインビトロで拡大させることができることを示している［３、１３］が、これらの細胞は、依然として多様なマーカーを発現し、それによってこれらの胚同一性を確立するのが困難になっている。さらに、これらのものは、フィーダー、マトリゲル、３次元培養条件及び血清を使用して生成することしかできず、これらの全ては、大規模又は臨床用途には適していない。本発明の培養系は、これらの制限のいくつかに対処すると共に、ｈＦＳＣはそれらのインビボ対応物と基本的な特徴を共有する。それにもかかわらず、ここで説明する前腸細胞の正確なタイプをなお完全に定義すべきである。というのは、系統追跡実験から、前腸は、肝臓及び膵臓系統に分化することができる唯一の二分化能前駆細胞を含有することができることが示されているからである［１４］。しかし、インビボ前駆細胞の特性は、前腸内でのそれらの局在化、すなわちそれらの周囲環境によって決定される可能性がある。さらに、腸管は、最初にかなりの柔軟性を有する。実際、初期の時点で採取された場合の後腸のドメインは、前腸噴門中胚葉に対して並置されたとき又はＢＭＰ及びＦＧＦを有する培養条件に置かれたときに肝臓及び膵臓芽構造を生成することが可能である［１５、１６］。これは、腸形成の初期段階の間に、腸上皮シート全体が多能性である可能性があることを示唆する。したがって、ここに記載の培養系は、制限が少なく、ｈＦＳＣがそれらの発生柔軟性の全範囲を示すのを可能にするであろう。
【０２１３】
最後に、多能性前腸前駆細胞集団の増殖は、臨床応用に関心が高い。実際に、本発明の培養系は、細胞ベース療法のための細胞生成を大きく簡素化することができる内胚葉細胞のほぼ均質な集団の大規模生成に対応している。さらに、ｈＦＳＣの誘導は、個々のプロトコールを確立する必要なしに、全ての試験ｈＩＰＳＣ系統の分化を可能にした。したがって、ｈＦＳＣは、ヒト発生のユニークなインビトロモデルを与えるだけでなく、オーダーメイド医療の分野におけるｈＩＰＳＣの臨床上の期待を与えるための重要なツールとなるいう意義がある。
【０２１４】
参考文献
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21.  Kim 外、 Nature 2010 467 285-290
【０２１５】
【表１】
2016540497.tif 000002
【図１Ｃ】
2016540497.tif 000003
【図２Ｃ】
2016540497.tif 000004
【図２Ｅ】
2016540497.tif 000005
【図２Ｉ】
2016540497.tif 000006
【図１Ａ】
2016540497.tif 000007
【図１Ｂ】
2016540497.tif 000008
【図１Ｄ】
2016540497.tif 000009
【図２Ａ】
2016540497.tif 000010
【図２Ｂ】
2016540497.tif 000011
【図２Ｄ】
2016540497.tif 000012
【図２Ｆ】
2016540497.tif 000013
【図２Ｇ】
2016540497.tif 000014
【図２Ｈ】
2016540497.tif 000015
【図３Ａ】
2016540497.tif 000016
【図３Ｂ】
2016540497.tif 000017
【図３Ｃ】
2016540497.tif 000018
【図４】
2016540497.tif 000019
【国際調査報告】
2016540497.tif 000020
2016540497.tif 000021
2016540497.tif 000022