(57)【要約】  ＤＮＡポリメラーゼ内の共有結合的リジン修飾を検出する方法が提供される。これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の程度と位置を決定するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内の共有結合的リジン修飾の数を検出する方法であって、
（ｉ）修飾安定化ｐＨでリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を検出し；そして
（ｉｉ）リジン修飾のないポリメラーゼとリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を比較することによってリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を計算すること、
を含み、ここで、リジン修飾の数は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼとリジン修飾のないポリメラーゼの質量の差をリジン修飾の質量で割ったものであり、それによって、ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を検出する方法。
【請求項２】
前記共有結合的リジン修飾が、修飾剤とＤＮＡポリメラーゼとの反応によって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾剤が、ジカルボン酸無水物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジカルボン酸無水物が、マレイン酸無水物、シトラコン酸無水物、ｃｉｓ−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−ｃｉｓ−３、６−エンドキソ−Δ4−テトラヒドロフタル酸無水物及び３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記共有結合的リジン修飾が、シトラコニル修飾である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記共有結合的リジン修飾が、アコニチル化修飾である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記共有結合的リジン修飾が、２，３−ジメチルマレイン酸化修飾である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量が、コンピューターが読み取り可能な質量である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リジン修飾のないポリメラーゼの質量が、コンピューター上で構築され、それによって、コンピューターが読み取り可能な基準質量が形成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記計算が、コンピューターによっておこなわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾安定化ｐＨが、少なくとも８である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ステップ（ｉ）の検出直前及び検出中、非イオン性界面活性剤を実質的に含まない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）の検出前に、ポリメラーゼ内の既知の部位でそのポリメラーゼを断片化する酵素を用いてリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼを断片化することを更に含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、トリプシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ断片の質量対電荷比を検出し、そして、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の質量対リジン修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の質量とを比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定のリジンにおけるリジン修飾の位置を決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
１若しくは複数のリジン修飾が酵素を妨げ、それによって、１若しくは複数の断片の形成が妨げられる、及び／又は得られる断片のサイズが増大する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量を検出し、そして適宜、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量をリジン修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の予測される相対量と比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定のリジンにおけるリジン修飾の相対的レベルを決定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記リジン修飾の位置が、Ｔａｑ ＧＯＬＤポリメラーゼの５４０、６６３、又は７３８位のアミノ酸に相当する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記リジン修飾の位置が、Ｔａｑ Ｚ０５ポリメラーゼの５４２、６６５、又は７４０位のアミノ酸に相当する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸位置における修飾の相対量を検出することを含み、ここで、前記修飾の相対量が、前記位置の修飾リジン残基の量を、前記位置の修飾リジン残基と非修飾リジン残基の量で割ったものであり、それによって、前記位置での修飾の相対量を検出する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスは、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，６８３，１９５号；及び同第４，９６５，１８８号で開示されている。ＰＣＲ増幅の各サイクルでは、二本鎖の標的配列を変性させ、プライマーをその変性標的配列の各鎖にアニーリングさせ、そして、そのプライマーをＤＮＡポリメラーゼの作用によって延長（伸長）させる。これらのステップは、それぞれ変性、アニーリング、及び伸長ステップにまとめられる。典型的なＰＣＲに使用される高温下では、プライマーは対象とする標的配列だけにハイブリダイズする。しかしながら、増幅反応混合物は、プライマーのハイブリダイゼーション温度よりかなり低い、室温で一般的に混ぜ合わせられる。こうした低ストリンジェント条件下では、プライマーは、部分的にだけ相補的な配列又は他のプライマーに結合して、望ましくない伸長産物の合成を開始する可能性がある。これらの望ましくない伸長産物は標的配列と共に増幅され、そして、この増幅は所望の標的配列の増幅と競合し、そして、特異的増幅の効率を低下させる。ＰＣＲ反応中の効率を高め、且つ、非特異的増幅を減少させるためのいくつかの方法が、当該技術分野では既知の。例えば、ホットスタート法は、最初の高温インキュベーションステップ後に反応チューブを手で開け、そして、失われた試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を追加することによって初めに実施される。この方法は、化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼの開発によって更に改善された。化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼは可逆的な不活性ポリメラーゼであって、そしてそのポリメラーゼは、酵素の活性部位に位置しているか又は酵素を不活性な状態にする立体配座変化を引き起こす共有結合修飾によって不活性される。化学修飾は加熱によって無効にされ、その結果、酵素はその活性形態に形質転換する。そのため、最初の高温インキュベーション後に酵素を追加する余分なステップなしに、ＤＮＡポリメラーゼをその不活性型で含んでいる混ぜ合わせ済みの反応混合物が、増幅にそのまま使用できる。化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼとその修飾方法は、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号に記載されている。
【０００２】
高品質のＤＮＡポリメラーゼは、高い効率、且つ、高い特異性のＰＣＲ増幅が実施される必要のある非常に複雑な診断検査などのさまざまな適用に有用である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、とりわけ、質量分析法を使用してＤＮＡポリメラーゼを特徴づけする方法を提供する。特に、本明細書中に提供した方法は、ＤＮＡポリメラーゼ内の化学的リジン修飾を検出し、それによって、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性レベルを特徴づけるのに使用できる。
【０００４】
一態様において、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内の共有結合的リジン修飾の数を検出する方法を提供する。前記方法は、（ｉ）修飾安定化ｐＨでリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を検出し；そして（ｉｉ）リジン修飾のないポリメラーゼとリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を比較することによってリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を計算すること、を含み、ここで、リジン修飾の数は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼとリジン修飾のないポリメラーゼの質量の差をリジン修飾の質量で割ったものであり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を検出する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾は、修飾剤とＤＮＡポリメラーゼとの反応によって形成される。他の実施形態において、修飾剤は、ジカルボン酸無水物である。いくつかの実施形態において、ジカルボン酸無水物は、マレイン酸無水物、シトラコン酸無水物、ｃｉｓ−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−ｃｉｓ−３、６−エンドキソ−Δ4−テトラヒドロフタル酸無水物及び３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾はシトラコニル修飾である。いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾はアコニチル化修飾である。いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾は、２，３−ジメチルマレイン酸化修飾である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量は、コンピューターが読み取り可能な質量である。いくつかの実施形態において、リジン修飾のないポリメラーゼの質量はコンピューターを用いて構築され、それによって、コンピューターが読み取り可能な基準質量が形成される。いくつかの実施形態において、計算がコンピューターによっておこなわれる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、修飾安定化ｐＨは少なくとも８である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）の検出直前及び検出中、ＤＮＡポリメラーゼは非イオン性界面活性剤を実質的に含まない。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記方法は、ステップ（ｉ）の検出前に、ポリメラーゼ内の既知の部位でそのポリメラーゼを断片化する酵素を用いてリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼを断片化することを更に含んでいる。いくつかの実施形態において、前記酵素はトリプシンである。いくつかの実施形態において、前記方法は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の質量対電荷比を検出し、そして、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の質量対リジン修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の質量とを比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定のリジンにおけるリジン修飾の位置を決定することを含んでいる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、１若しくは複数のリジン修飾が酵素を妨げ、それによって、１若しくは複数の断片の形成が妨げられる、及び／又は得られる断片のサイズが増大する。いくつかの実施形態において、前記方法は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量を検出し、そして適宜、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量をリジン修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の予測される相対量と比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定のリジンにおけるリジン修飾の相対的レベルを決定することを含んでいる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、リジン修飾の位置は、Ｔａｑ ＧＯＬＤポリメラーゼの５４０、６６３、又は７３８位のアミノ酸に相当する。いくつかの実施形態において、リジン修飾の位置は、Ｔａｑ Ｚ０５ポリメラーゼの５４２、６６５、又は７４０位のアミノ酸に相当する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供した方法は、前記アミノ酸の位置における修飾の相対量を検出することを含んでおり、ここで、前記修飾の相対量は、前記位置の修飾リジン残基の量を、前記位置の修飾リジン残基と非修飾リジン残基の量で割ったものであり、それによって、前記位置での修飾の相対量を検出する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】四重極飛行時間型質量分析計の概略図（Siuzdak, G, "The Expanding Role of Mass Spectrometry in Biotechnology"より）。
【図２】デルタＺ０５の完全分析：（Ａ）全イオンクロマトグラム；（Ｂ）質量スペクトル；（Ｃ）デコンボリュートした質量（deconvoluted mass）。デルタＺ０５の理論上の質量は６１，０７６．０４である。質量スペクトルのデコンボリューションによって得られた質量は、６０，８７４．９１であり、そしてそれは、１８ｐｐｍ（１．１ｌａｍｕ）以内でのＮ末端のメチオニンとアラニン残基の喪失と一致している。
【図３】高ｐＨ完全分析が、デルタＺ０５ ＧＯＬＤにおける１０〜１９のシトラコニル修飾の全体的な分布を測定するのに使用された。各ピークは、デルタＺ０５の質量に加え、示された数のシトラコニル修飾を表す。
【図４】ＬＣＭＳに適合できるように修飾されたＰＣＲマスターミックスの分析。酵素濃度が高められ、そして、塩、ｄＮＴＰｓ、ＵＮＧ及びＤＭＳＯが除かれた。加速保存条件下でのこのマスターミックスの分析は、高温でシトラコニル修飾の重大な喪失を示した。４℃での保存では、４カ月後に２つの修飾の純喪失を示した。
【図５（ａ）】シトラコニル修飾のパーセンテージを伴ったＴａｑ ＧＯＬＤ及びＺ０５ ＧＯＬＤのリジン残基のマップ。
【図５（ｂ）】シトラコニル修飾のパーセンテージを伴ったＴａｑ ＧＯＬＤ及びＺ０５ ＧＯＬＤのリジン残基のマップ。
【図６Ａ】Ｔａｑ ＧＯＬＤとＺ０５ ＧＯＬＤのＤＮＡポリメラーゼドメインのリジン残基の比較。Ｚ０５ ＧＯＬＤには、すべてがある程度修飾されている５つの追加リジンから成るネットがある。ＴａｑにおけるＫ５４０、Ｋ６６３、及びＫ７３８と、Ｚ０５におけるそれらの同等物は、すべて重度に修飾されている。エキソヌクレアーゼドメインを欠いているＴａｑの分子モデル（正面図）は、それらが重要な位置にあることを示している。
【図６Ｂ】Ｔａｑ ＧＯＬＤとＺ０５ ＧＯＬＤのＤＮＡポリメラーゼドメインのリジン残基の比較。Ｚ０５ ＧＯＬＤには、すべてがある程度修飾されている５つの追加リジンから成るネットがある。ＴａｑにおけるＫ５４０、Ｋ６６３、及びＫ７３８と、Ｚ０５におけるそれらの同等物は、すべて重度に修飾されている。エキソヌクレアーゼドメインを欠いているＴａｑの分子モデル（正面図）は、それらが重要な位置にあることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中に使用される略語は、化学的及び生物学的な技術分野内でのそれらの慣用の意味を有する。
【００１４】
「ポリメラーゼ」は、ポリヌクレオチドの鋳型指向性合成をおこなう酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成される鎖の３’末端だけに遊離ヌクレオチドを付加する。これが、５’−３’方向への新たに形成される鎖の延長をもたらす。どんな既知のＤＮＡポリメラーゼも新しい鎖を始めること（デノボ（de novo））ができない。ＤＮＡポリメラーゼは、既存の３’ＯＨ基にヌクレオチドを付加することしかできず、そのため、そこに最初のヌクレオチドを付加できるプライマーを必要とする。プライマーは、例えばＲＮＡ及び／又はＤＮＡ塩基、並びに非天然塩基を含んでいてもよい。新たに形成される鎖（娘鎖）の有向性は、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に沿って移動した方向と反対である。ポリメラーゼの制限されることのない例としては、原核生物のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ及びＰｏｌ Ｖ）、真核生物のＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼ、逆転写酵素、及びＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成するＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼである。逆転写酵素ファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼの機能性、及びＤＮＡと対合するＲＮＡ塩基対を分解するＲＮアーゼ Ｈの機能性の両方を含んでいる。ＲＮＡポリメラーゼは、遺伝子転写プロセス中に、鋳型としてＤＮＡを使用してＲＮＡを合成する酵素である。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ転写物の３’末端でリボヌクレオチドを重合させる。
【００１５】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、熱耐性であり、そして続くポリヌクレオチド伸長反応を達成するのに十分な活性を保持し、且つ、二本鎖核酸の変性を達成するのに必要な時間、高温に晒されても、不可逆的に変性しない（不活性化されない）酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号及び同第４，９６５，１８８号に例示されている。本明細書において、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクリング反応において使用するのに適している。本明細書の目的のため、不可逆的変性は、酵素活性の永続的で、そして完全な喪失を指す。熱安定性ポリメラーゼに関しては、酵素活性は、適切な方式でヌクレオチドを組み合わせて、鋳型核酸鎖に相補的なポリヌクレオチド伸長産物を形成する触媒作用を指す。増幅目的のため、好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス属種Ｓｐｓ１７、サーマス属種Ｚ０５、サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）が挙げられる。
【００１６】
本明細書中で規定される「化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡポリメラーゼを実質的に少なくとも不活性の状態にする少なくとも１つの共有結合により結合された修飾を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。いくつかの実施形態において、共有結合修飾は、ＤＮＡポリメラーゼの特定の種類のアミノ酸だけ（例えばリジンだけ、又はアルギニンだけなど）に取り付けられる。いくつかの実施形態において、前記修飾は、既知のセットのアミノ酸に生じるだけである（例えば、リジンやアルギニンにだけなど）。いくつかの実施形態において、前記修飾は、ポリメラーゼ内の特定の部位（例えば、特定の部分配列）で生じるだけであってもよい。いくつかの実施形態において、前記修飾は、ＤＮＡポリメラーゼのリジンに取り付けられる。前記修飾がリジンに取り付けられる場合、ＤＮＡポリメラーゼは「リジン修飾」ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる。
【００１７】
「化学的に修飾された」及び「可逆的に不活性化された」という用語は、それらの用語の明白な普通の語法を踏まえて互換的に終始使用される。これにより、本明細書中で規定される「可逆的に不活性」又は「可逆的に不活性化された」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のすべて又はほとんどすべての可逆的な喪失を指す。前記修飾は、その修飾が条件（例えば、熱）下で取り外されて、実質的に活性な酵素をもたらすので、「可逆的である」。
【００１８】
本明細書中で規定される「修飾剤」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸と反応でき、それによって、共有結合的アミノ酸（例えば、リジン修飾）を形成する化学物質を指す。
【００１９】
「修飾を安定させるｐＨ」は、ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾（例えば、共有結合的リジン修飾）が（ポリメラーゼに結合した）実質的に安定した状態を保つｐＨである。例えば、修飾を安定させるｐＨは、修飾ポリメラーゼの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離と、それに続く四重極飛行時間型質量分析（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ）分析のプロセス中、その修飾がポリメラーゼ上に留まれるようにする。場合によっては、本明細書中に記載したジカルボン酸無水物修飾は、あるいは、低いｐＨで不安定である。これにより、８以上のｐＨが、そのようなジカルボン酸無水物修飾の修飾を安定させるｐＨである。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼ内の位置を参照するとき、別の配列内の位置に「相当する」アミノ酸は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号による番号付けの慣例に基づき、そして、配列同一性のパーセンテージを最大にする様式でそれらの配列を整列させる。「［特定の配列］の位置［Ｘ］に相当する」アミノ酸とは、指定された配列の同等なアミノ酸と整列している着目のポリペプチド内のアミノ酸を指す。一般に、本明細書中に記載するように、ポリメラーゼのある位置に相当するアミノ酸は、以下で記載するＢＬＡＳＴなどの整列アルゴリズムを使用することで決定できる。所定の「対応部分」内のすべての位置が同一である必要はないので、対応部分内の非マッチング位置が「対応位置」と見なされてもよい。従って、本明細書中に使用されるとき、指定されたＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に相当するアミノ酸位置」とは、他のＤＮＡポリメラーゼ及び構造ホモログ、並びにファミリーにおける整列に基づいた同等の位置を指す。
【００２１】
配列比較については、典型的には1つの配列が参照配列として機能し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験及び参照配列はコンピューターに入力され、部分配列の同等なものが指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが一般的に用られるか、又は代替パラメーターを指定し得る。配列比較アルゴリズムは、次いで、プログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性パーセントを計算する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、２つの配列が任意にアラインメントされた後に同じ数の連続した位置の参照配列と配列が比較され得る、２０から６００まで、通常は約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される連続した位置の数のうちいずれか１つのセグメントについていうことを含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith及びWaterman（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）によって、又は手作業のアラインメント及び目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（1995年 別冊）を参照）によって、おこなわれ得る。
【００２３】
配列同一性パーセント及び配列類似性の測定に適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschulら（Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977）及びAltschulら（J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さの単語とアラインメントしたときにいくらかの正の値の閾値スコアＴに符合するか又は満たすかのいずれかである、問い合わせ配列における長さＷの短い単語を同定することによって、ハイスコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、近隣の単語のスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、前掲）。これらの最初の近隣の単語のヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種として作用する。単語のヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（適合する残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスを用いて累積スコアが計算される。各方向への単語のヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大の得られた値から量Ｘだけ減少した場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントが蓄積したために累積スコアがゼロ以下になった場合；又はいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１の単語の長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３の単語の長さ、及び１０の期待値（Ｅ）、ならびに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、ならびに両方の鎖の比較を用いる。いずれのプログラムも、低複雑性フィルター「オフ」でおこなわれる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計的解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される、類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の合計確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
【００２５】
ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾を検出する方法
ＤＮＡポリメラーゼ内の化学修飾（例えば、リジン修飾）の数量、及び／又は位置と数量を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、修飾の特質と数量は、酵素の産生、保存、及び使用中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの特質を観察及び制御するために有用である。更に、前記方法は、ＤＮＡポリメラーゼを不活化する新たに設計された化学修飾を特徴づけするのに有効である。
【００２６】
一態様において、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内の共有結合的リジン修飾の数を検出する方法を提供する。しかしながら、本明細書中に記載した方法が、そのポリメラーゼ又は他のタンパク質における修飾の可能な場所、並びに修飾のｍａｓが予測できる場合に限り、ポリメラーゼ又は他のタンパク質の他の化学修飾を評価するのに適用できることに注意しなければならない。いくつかの実施形態において、前記方法は、（ｉ）修飾安定化ｐＨでリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を検出し；そして（ｉｉ）リジン修飾のないポリメラーゼとリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を比較することによってリジン修飾ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を計算すること、を含み、ここで、リジン修飾の数は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼとリジン修飾のないポリメラーゼの質量の差をリジン修飾の質量で割ったものであり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼ内のリジン修飾の数を検出する。
【００２７】
先に記載したとおり、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼなどの化学的に修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、高い特異性（非特異的産物増幅の削減）、並びに高い感度及び収率（低濃度の鋳型ＤＮＡ）が求められるＰＣＲ適用（例えば、Hot Start PCR）に使用される。化学的に修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーアニーリング温度以下又はそれと同じ温度では実質的に不活性である。これにより、化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼは、非ストリンジェント条件下で活性ではないので、意図しない故意でないプライマーによって引き起こされた望ましくない伸長産物の合成は、予防されるか又はわずかなレベルに削減される。熱活性化ステップ中、化学修飾がポリメラーゼから取り外され、それによって、活性酵素が再構成され、そして、ＰＣＲが増幅が開始する。一般に、熱活性化ステップは、プライマーアニーリング温度より十分に高い温度で起こる。市販の化学的に修飾された又は可逆的に不活性化された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの制限されることのない例としては、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦａｓｔＳｔａｒｔ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｈｅｅｔａｈ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＭａｘｉｍａ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（登録商標）Ｔａｑが挙げられる。
【００２８】
可逆的に不活性ＤＮＡポリメラーゼでは、リジン残基が、リジン残基のε−アミノ基の化学修飾によって可逆的にブロックされ得る。そして、タンパク質の活性領域内のリジンの修飾が、タンパク質の不活性化をもたらす。更に、活性領域外のリジンの修飾が、立体相互作用又は立体配座変化によるタンパク質の不活性化に貢献することもある。タンパク質のアミノ基と反応し、それによって、そのアミノ基を可逆的に修飾する数多くの化合物を記載した。例えば、アミノ基は、トリフルオロアセチル化（Goldberger and Anfmsen, 1962, Biochemistry 1 :410を参照）、アミジノ化（Hunter and Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc. 84:3491を参照）、マレイル化（Butler et al, 1967, Biochem. J. 103:78を参照）、アセトアセチル化、（Marzotto et al, 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26:517; 及びMarzotto et al, 1968, Biochim. Biophys. Acta 154:450を参照）、テトラフルオロスクシニル化（Braunitzer et al, 1968, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349:265を参照）、及びシトラコニル化（Dixon and Perham, 1968, Biochem. J. 109:312-314; 及びHabeeb and Atassi, 1970, Biochemistry 9(25):4939-4944を参照）によって可逆的に修飾された。
【００２９】
更に、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号では、ポリメラーゼのリジンアミノ基と修飾剤（例えば、ジカルボン酸無水物）との反応によって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを可逆的に不活性化する方法が開示している。これにより、いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾は、修飾剤とＤＮＡポリメラーゼとの反応によって形成される。更なるいくつか実施形態において、修飾剤はジカルボン酸無水物である。ＤＮＡポリメラーゼを可逆的に不活化するのに有用なジカルボン酸無水物に関する制限されることのない例としては、マレイン酸無水物；例えば、シトラコン酸無水物、ｃｉｓ−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物などの置換されたマレイン酸無水物；エキソ−ｃｉｓ−３、６−エンドキソ−Δ4−テトラヒドロフタル酸無水物、及び３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられる。これにより、いくつかの実施形態において、ジカルボン酸無水物は、マレイン酸無水物、シトラコン酸無水物、ｃｉｓ−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−ｃｉｓ−３、６−エンドキソ−Δ4−テトラヒドロフタル酸無水物、及び３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾は、シトラコニル修飾である。他の実施形態において、共有結合的リジン修飾は、アコニチル化修飾である。いくつかの実施形態において、共有結合的リジン修飾は、２，３−ジメチルマレイン酸化修飾である。本発明の方法は、例示された無水物に制限されないが、任意の化学アミノ酸修飾に適用されてもよく、そしてそれは、ＤＮＡポリメラーゼを可逆的に不活化することができ、且つ、質量分析法で検出できる。本明細書中に規定される方法は、ＤＮＡポリメラーゼ内の化学修飾（例えば、リジン修飾）の位置、及びＤＮＡポリメラーゼの化学修飾（リジン修飾）の程度を検出するのに使用されてもよい。ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾が、その実施形態を含めた本明細書中に規定された方法を使用して検出される場合、化学修飾は、検出されたそれぞれの修飾残基に関して同じである。例えば、ＤＮＡポリメラーゼがアコニチル化されているとき、本明細書中に規定された方法は、ＤＮＡポリメラーゼ内に存在しているアコニチル化残基を検出するのに対して、ＤＮＡポリメラーゼがシトラコニル化されているとき、前記方法はシトラコニル化残基を検出する。
【００３０】
その実施形態を含めた本明細書中に規定される方法では、ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾は、質量分析法を使用して検出される。いくつかの実施形態において、前記質量検出法は、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を含むことができる。Ｑ−ＴＯＦ／ＬＣＭＳでは、液体クロマトグラフィーの物理的分離能力を質量分析法の質量分析能力に組み合わせている。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用することで、化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼを含んでいるサンプル成分は、それらの極性によってカラムで分離される。一般に、極性が低いほど、そして、成分が大きいほど、それらはカラム内で移動するのが遅くなる。これらの分離技法は、オフライン様式でおこなわれても、オンライン様式でおこなわれてもよい。分離技法がオンライン様式でおこなわれることで、サンプルは、カラムを通過した後に直接質量分析計に移動し、そして、サンプルの異なった成分が、時間的にばらけてカラムから溶出されると同時に分析される。オフライン様式で分離技法がおこなわれることで、サンプルは初めにカラムによって分離され、そして、異なった画分は、後の分析のために別々に保存される。
【００３１】
一般に、質量分析計は、荷電した検体を生じる検体のイオン化（ＤＮＡポリメラーゼ又はその断片）により、そして、その検体の質量を計測する。手順の間、検体（ＤＮＡポリメラーゼ）を含むサンプル（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ溶出バッファー又は揮発性バッファー）は、ＭＳ装置内に入れられ、そして、気化を受ける。そして、サンプルの成分は、さまざまな方法のうちの１つでイオン化される。例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ＭＳ（ＥＳＩ）中、検体は、初め液体エアゾールの液滴中に溶解される。高い電磁場及び高温、及び／又は乾燥ガスの適用の影響下で、液滴が荷電を得、そして、液体マトリックスが気化する。すべての液体マトリックスが気化した後に、検体分子に限局して残った荷電が質量分析計に移される。マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）では、検体とマトリックスの混合物にレーザビームが照射される。これが、マトリックス基質の限局的なイオン化、そして、検体とマトリックスとの脱離をもたらす。検体のイオン化は、気相における基質からの電荷移動によって生じると考えられる。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）とマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）の詳述に関しては、例えば、Mano N et al. Anal. Sciences 19 (1) (2003) 3- 14を参照のこと。脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）の説明に関しては、Takats Z et al. Science 306 (5695) (2004) 471-473を参照のこと。例えば、Karas, M.; Hillencamp, F. Anal. Chem. 60:2301 1988); Beavis, R. C. Org. Mass Spec. 27:653 (1992); Creel, H. S. Trends Poly. Sci. 1(11):336 (1993)を参照のこと。
【００３２】
そして、イオン化サンプル成分は、質量分析計におけるそれらの質量対電荷比により分離される。ＬＣ／ＭＳに使用される別の質量分析計の例としては、これだけに限定されるものではないが、一連四重極、三連四重極、イオントラップ、ＴＯＦ（飛行時間）、及び四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）が挙げられる。ＭＳ技術の詳述に関しては、Mano N et al. Anal. Sciences 19 (1) (2003) 3-14を参照のこと。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ジカルボン酸無水物とＤＮＡポリメラーゼ内のリジン残基との反応によって形成された共有結合的リジン修飾のＬＣ−ＭＳ検出がおこなわれる。化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼの保存と反応バッファーは、８〜９の塩基性ｐＨを有し、その塩基性ｐＨは、リジン修飾を安定させ、且つ、可逆的に不活性されたＤＮＡポリメラーゼが、伸長温度以下の温度で不活性を維持することを確実にする。リジン修飾は、熱と酸に不安定であるので、そのため、標準的なＬＣ手順中に通常使用される移動相の酸性条件下で分離できない。発明者らは、修飾安定化ｐＨでＬＣプロセスをおこなうことによって、当該技術分野におけるこの問題とその他の問題も解決した。いくつかの実施形態において、修飾安定化ｐＨは、少なくとも８である。他の実施形態において、修飾安定化ｐＨは、約８である。他の実施形態において、修飾安定化ｐＨは、約８．２、約８．４、約８．６、約８．８、約９、約９．２、約９．４、約９．６、約９．８、約１０、又は約８〜９、８〜１０又は９〜１０である。いくつかの実施形態において、修飾安定化ｐＨは、ポリメラーゼ保存バッファーのｐＨである。ポリメラーゼ保存バッファーのｐＨは、ポリメラーゼが保存されるバッファーのｐＨを指す。保存バッファーは、酵素の長期間保存に備えたポリメラーゼ安定化成分と保存料（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＤＴＴ、グリセロール、ＥＤＴＡ）を含んでもよい。他の実施形態において、修飾安定化ｐＨは、ポリメラーゼ反応バッファーのｐＨである。ポリメラーゼ反応バッファーのｐＨは、ＰＣＲ反応がおこなわれるバッファーのｐＨを指す。反応バッファー（又は反応混合物）は、ＤＮＡ増幅に有用であることが知られている安定化成分及び保存成分と共に、プライマー、ヌクレオチド、塩を含んでもよい。
【００３４】
ＤＮＡポリメラーゼの保存及び反応バッファーで使用される安定化成分と保存料は、ＤＮＡポリメラーゼの安定性と能力に有益であると同時に、それらは質量分析法に不適合である可能性もある。例えば、非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０は、強疎水性ＤＮＡポリメラーゼを安定させる助けとなるが、妨害イオンを含んでいるので、イオン抑制を引き起こし、その結果、マススペクトル検出プロセスの妨げとなる。これにより、いくつかの実施形態において、前記方法は、質量分析前にＤＮＡポリメラーゼから非イオン性界面活性剤を分離することを含む。他の実施形態において、修飾ポリメラーゼは、任意の量の又は大量の非イオン性バッファーの存在下で保存しない。これにより、いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）の検出直前及び検出中には、ＤＮＡポリメラーゼは、非イオン性界面活性剤を実質的に含んでいない。
【００３５】
その実施形態を含めた本明細書中に規定した方法は、ＬＣ／Ｑ−ＴＯＦ質量分析法を使用することで修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量を検出するのに使用できる。いくつかの実施形態において、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量は、コンピューターが読み取り可能な質量である。コンピューターが読み取り可能な質量とは、マススペクトル検出装置がコンピューターに実装されているシステムに接続されているところ、及びコンピューターに実装されているシステムが検出装置からの電子信号を質量スペクトルに変換するところで形作られ、それによって、コンピューターが読み取り可能な質量が形作られる。コンピューターに実装されているシステムは、コンピューターが読み取り可能な標準質量を形作るために、リジン修飾のないＤＮＡポリメラーゼの質量を計算するために本明細書中に規定する方法で使用されてもよい。これにより、いくつかの実施形態において、リジン修飾のないポリメラーゼの質量はコンピューターを用いて構築され、それによって、コンピューターが読み取り可能な基準質量が形作られる。
【００３６】
修飾ＤＮＡポリメラーゼ内の（これだけに限定されるものではないが、リジン修飾を含めた）修飾の数を計算するために、修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量（例えば、コンピューターが読み取り可能な質量）が、修飾のないポリメラーゼの質量（例えば、コンピューターが読み取り可能な標準質量）と比較される。修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量と修飾のないポリメラーゼの質量の差を計算し、そして、その差点を修飾自体の質量で割ることによって、ポリメラーゼに取り付けられた修飾の数が決定される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、計算がコンピューター上でおこなわれる。従って、いくつかの実施形態において、「計算」とは、コンピューターに実装されたアルゴリズムを使用して、ＤＮＡポリメラーゼ内の化学（リジン）修飾の数を計算することを指す。計算は、正確な分子量に関連していることがわかっている一連のイオン（関連ｍ／ｚ値）に基づいて分子実体又は「化合物」の場所を見つけるために、精密質量アルゴリズムによっておこなわれ得る。コンピューターに実装されたアルゴリズムは、修飾ＤＮＡポリメラーゼの質量と修飾されていないポリメラーゼの質量の差を計算し、そして、その差を修飾の質量で割ることによって、と修飾の数を決定することができる。いくつかの実施形態において、コンピューターに実装されているアルゴリズムは、精密質量アルゴリズムである。精密質量アルゴリズムは、正確な分子量に関連していることがわかっている一連のイオン（関連ｍ／ｚ値）に基づいて分子実体又は「化合物」の場所を見つける。
【００３８】
先に記載したとおり、本明細書中に規定した方法は、ＤＮＡポリメラーゼ内の化学修飾（リジン修飾）の程度を検出するのに使用されてもよい。更に、本明細書中に規定した方法はまた、ＤＮＡポリメラーゼの中に化学修飾の位（例えば、リジン修飾）を検出するのに使用されてもよい。本明細書中に規定した方法は、先に記載の非断片化ＤＮＡポリメラーゼ内又は断片化ＤＮＡポリメラーゼ内に存在しているリジン修飾の検出に使用されてもよい。本明細書中に規定した断片化ＤＮＡポリメラーゼは、そのポリメラーゼ内の既知の（単数若しくは複数の）部位でタンパク質を加水分解することができる酵素（プロテアーゼ）によって消化されたポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、前記酵素はトリプシンである。
【００３９】
前記方法が、断片化ＤＮＡポリメラーゼを検出することを含んでいる場合、プロテアーゼ消化は、化学的に修飾された（リジン修飾）ＤＮＡポリメラーゼの質量の検出前におこなわれる。これにより、いくつかの実施形態において、前記方法は、検出ステップの前に、ポリメラーゼ内の既知の部位でポリメラーゼを断片化する酵素で修飾（例えば、リジン修飾）ＤＮＡポリメラーゼを断片化することを更に含んでいる。次に、修飾ＤＮＡポリメラーゼ断片の質量は、検出され、そして、リジン修飾のある又はリジン修飾のないポリメラーゼの潜在的（予測される）断片の質量と比較される。これにより、いくつかの実施形態において、前記方法は、修飾ＤＮＡポリメラーゼ断片の質量対電荷比を検出し、そして、修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の質量を修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の質量と比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定の部位（例えば、リジン）における修飾の位置を決定することを更に含んでいる。いくつかの実施形態において、リジン修飾の位置は、Ｔａｑ ＧＯＬＤポリメラーゼの５４０、６６３、及び／又は７３８位のアミノ酸に相当している。他の実施形態において、リジン修飾の位置は、Ｚ０５ ＧＯＬＤポリメラーゼの５４２、６６５、及び／又は７４０位のアミノ酸に相当している。「ＧＯＬＤ」という用語は、基本的なポリメラーゼ（例えば、実施例のＴａｑ又はＺ０５）が、ジカルボン酸無水物によりリジン残基で化学的に修飾されていることを示す。Ｔａｑ及びＺ０５ポリメラーゼのアミノ酸配列は、既知であり、例えば、米国特許公開第２０１２／０２５８５０１号に記載されている。
【００４０】
更なるいくつかの実施形態において、１若しくは複数の修飾が酵素をブロックし、それによって、１若しくは複数の断片の形成を妨げ、そして、得られる断片のサイズを大きくする。例えば、酵素がトリプシンであり、且つ、リジン修飾がシトラコニル修飾である場合、シトラコニル修飾は、シトラコニル化リジンにおける加水分解を妨げる可能性がある。そのため、シトラコニル化リジンに切断が起こらず、非修飾ＤＮＡポリメラーゼから得られた同じペプチド（断片）と比較して、より大きいサイズのペプチド（断片）をもたらす。いくつかの実施形態において、修飾ＤＮＡポリメラーゼは、そのうちの１つに修飾を担持している２つの分割部位を含んでいる。そのため、酵素が非修飾部位で切断する一方で、第二の部位は修飾のため切断されないまま残る。前記酵素切断は、断片ＡＢと断片Ｃの形成をもたらす。非修飾ＤＮＡポリメラーゼの同じ切断は、断片Ａ、断片Ｂ、及び断片Ｃの形成をもたらす。修飾ＤＮＡポリメラーゼ内の断片の総数の質量は、非修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片Ａ、Ｂ及びＣの質量と比較することによって計算される。そのため、質量は、断片ＡＢの質量、ＡＢ内の修飾の質量、及び断片Ｃの質量の合計として計算される。いくつかの実施形態において、前記計算は、コンピューターに実装されているアルゴリズムによっておこなわれる。
【００４１】
本明細書中に規定した方法は、特定の残基（例えば、Ｔａｑ ＧＯＬＤポリメラーゼの残基５４０、６６３、又は７３８）における修飾の相対量を検出するのに更に使用できる。「相対量」とは、修飾されている酵素内の特定の位置における特定のアミノ酸残基の割合を指す。例として、ポリメラーゼのサンプルは、サンプル中のポリメラーゼの６０％で特定の位置に修飾残基を含み、他の４０％が非修飾状態であることがある（例えば、ポリメラーゼのサンプルは不完全に修飾されていて、これにより、ポリメラーゼの他のコピーの修飾にもかかわらず、活性である可能性があることを示している）。ＰＣＲ反応バッファーは、特定の残基における修飾の相対量がそのバッファー中に存在している個々のＤＮＡポリメラーゼ分子の間で異なる場合、ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。これらのＤＮＡポリメラーゼ分子の間で特定の残基における修飾の相対量は、個々の分子の化学的不活性化のレベルに関連するので、そのため、バッファー中のＤＮＡポリメラーゼ活性に関する情報を提供する。これにより、いくつかの実施形態において、前記方法は、アミノ酸位置における修飾の相対量を検出することを含んでおり、ここで、前記修飾の相対量は、前記位置における修飾リジン残基の量を、前記位置における修飾リジン残基と非修飾リジン残基の量の合計で割ったものであり、それによって、前記位置における修飾の相対量を検出する。かかる情報は、続いて予想されるポリメラーゼ活性（又は不活性）に関連し、そして、例えば、不活性化酵素が生じたとき、品質管理に使用できる。
【００４２】
本明細書中に規定した方法はまた、ＤＮＡポリメラーゼ内の特定の残基（例えば、リジン）における化学修飾の相対的レベルを測定するのに使用されてもよい。これにより、いくつかの実施形態において、前記方法は、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量を検出し、そして、適宜、リジン修飾ＤＮＡポリメラーゼの断片の相対量と、リジン修飾のないポリメラーゼの潜在的断片の予測される相対量とを比較し、それによって、ポリメラーゼ内の特定のリジンにおけるリジン修飾の相対的レベルを決定することを含んでいる。
【実施例】
【００４３】
すべての配合物（すなわち、製造リテイン（manufacturing retains）、ストック、バルク及びマスターミックス）に適合できるすべてのＤＮＡポリメラーゼの分析のための方法を、本明細書中に提供する。これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ産物のライフサイクルの全分野をサポートすることを意図する。質量分析の追加は、ＤＮＡポリメラーゼの基本的理解を潜在的に広げることができる分子レベルでの特徴づけを提供する。研究ツールとして、質量分析から生み出される新規データは、化学的に修飾された（ＧＯＬＤ）ＤＮＡポリメラーゼの産生、保存、及び使用に関する重要な新情報を解明するのに使用できる。これらの結果は、プロセス及び／又は能力を改善に潜在的につながり得る情報を提供する。別の研究応用は、マスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼの分析である。このタイプの試験は、ＤＮＡポリメラーゼの構造保全に対する環境効果（すなわち、温度、保存、及びＰＣＲサイクル）を評価する際に洞察を示し得る。これらのタイプの分析はまた、ＤＮＡポリメラーゼ産生、及びＤＮＡポリメラーゼの能力の問題対策において役割を果たす。質量分析によるＤＮＡポリメラーゼの分析は、製造、開発、及び製品のケアを促進するために新たな様相を加えるであろう。このタイプの分子的特徴づけの潜在的応用としては、すべての配合物における同一性の検定と定量、タンパク質分解の識別及び／又はモニタリング、意図した修飾と意図しない修飾の特徴づけ、及び保存条件の最適化が挙げられる。
【００４４】
本明細書中に規定した方法は、これまで達成不能であった情報、すなわち一次配列決定、構造的特徴づけ、点突然変異の識別及び微小不均一性を提供した。分子ツールボックスへのこの技術の追加は、同一性の確認、修飾、突然変異、及び／又は切断の同定、分子レベルでの安定性の観察、並びに新規ＤＮＡポリメラーゼの開発の補助を可能にする。
【００４５】
質量分析は、そのすばらしく高い感度と精度のため、タンパク質試験において有用で広く採用されるツールになった。タンパク質分析への適用としては、分子量測定、識別、定量、及び配列決定法（１−８）が挙げられる。それはまた、翻訳後修飾、タンパク質構造及び非共有相互作用（９−１３）を試験するのにも使用される。これらの適用は、すべてＱＴＯＦ ＬＣＭＳ装置の能力の範囲内にある。質量分析から得られたデータは、ＤＮＡポリメラーゼの特徴づけに新たな道を提供する。実現可能性研究では、切断型ＤＮＡポリメラーゼの完全分析の方法を開発した。これは、密接に関連した分子、すなわち、Stoffel FragmentとデルタＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ、を迅速に同定し、そして、差別化するための新しい手法を提供する。加えて、これらの方法はまた、分解、修飾及び／又は切断を同定するのに使用されてもよい。このタイプの方法は、ＤＮＡポリメラーゼの製造及び使用に関する関心事の問題解決の際に役割を果たす。
【００４６】
最近まで、ＤＮＡポリメラーゼ、特に化学的に修飾された（ＧＯＬＤ）酵素における不均一性を調べる能力は、非常に制限されていた。最近、（１）これらの分子に対して化学修飾が可能な位置を特徴づけすること、及び（２）分子レベルでタンパク質に対する変更を評価することを可能にしたＬＣＭＳ法が開発された。このツールは、分子レベルでの化学修飾、安定性、再活性化の局所的変動、及びＴａｑ ＧｏｌｄとＺ０５ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼとの再活性化の相違を含めたＧＯＬＤ酵素に対する基本的研究の開始を可能にする。
【００４７】
ほとんどのＤＮＡポリメラーゼの最終的な行き先は、突き詰めるとキット内のＰＣＲマスターミックスである。典型的な濃度は、多くの標準的な生化学的特徴づけ技術の能力を著しく超える２５〜１００ｎＭであってもよい。現在利用可能な特徴づけ方法は、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイと銀染色ＰＡＧＥである。両方法とも、非常に感度か高いが、ある程度の変法が多く、日常的におこなわれない。ＱＴＯＦ ＬＣＭＳは、高ｆｍｏｌｅｓでのタンパク質定量に制限があると報告されたが、これは化合物に高度に依存する。マスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼの分析のための、且つ、定性及び定量分析の両方に関するそれらの有用性を評価する方法を、本明細書中に提供する。これらの方法は、酵素濃度を正確に定量する能力、及びマスターミックス中でのその構造保全を評価する能力の両方を可能にする。このツールは、酵素の識別と濃度を確認するのに有用である。それはまた、ＤＮＡポリメラーゼの構造保全に対する温度、保存、及びＰＣＲの影響を試験するのに使用されてもよい。
【００４８】
ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼは、シトラコン酸無水物での共有結合的誘導体化リジン残基によって可逆的に不活性されている。最近まで、多数のリジン残基のうちのいくつ又はどれが実際に誘導体化されているか測定することができる方法がなかった。本実施例では、ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼ中の誘導体化リジン残基を同定できるＬＣＭＳ ＱＴＯＦ法を使用する。この技術は、他のいかなる方法でも達成できない分子レベルでのＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼの完全特徴づけを可能にする。この実現技術は、これだけに限定されるものではないが、誘導体化残基のマッピング；残基レベルでの誘導体化の機能としての再活性化動態の研究；ホットスタート機構の分子的理解の獲得；ロット間の変動の測定；可能なＱＣ方法の提供；ギルディングプロセスの最適化；改善されたＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼの潜在的操作；安定性の研究及び／又は問題調査；並びに部分的に再活性化されたＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼの能力の評価、を含めたこれらの分子に関する基礎知識のギャップを埋めるのに役立つ。
【００４９】
Agilent製ＱＴＯＦ ＬＣＭＳによってもたらされる高分解性と質量精度が、これらのタイプの分析を可能にしている。ＱＴＯＦは、ＣＩＴ部における一連四重極やイオントラップ質量分析計と比較して、３００倍良好な質量精度と分解能の２０倍の改善が可能である。高質量精度と高分解性の組み合わせは、賦形剤分子からのスペクトル妨害を最小にし、そして、小数第４位の桁の質量決定を可能にする。
【００５０】
Agilent製質量分析計は、ＵＰＬＣ、恒温自動サンプラー及びカラムコンパートメント、ダイオードアレイＵＶ検出器、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）線源、及び四重極飛行時間（ＱＴＯＦ）質量分析計で構成される。ＥＳＩ ＱＴＯＦの組み合わせは、化合物の元素組成を明確に推定するのに使用される、非常に高い感度、分解能、及び精度を提供する。四重極は、簡単な走査アナライザーとして使用されるか、又は前駆イオンを選択的に単離し、そして、断片化のための衝突セルにそのイオンを向かわせるために使用される。ＴＯＦ素子は、１０，０００を超える上限質量対電荷比（ｍ／ｚ）と高い分解力（１０，０００〜１５，０００）を有する。四重極ＴＯＦ装置は、単独の四重極又はタンデムＭＳ実験のどちらかとして使用できる。その高精度と感度のため、ＥＳＩ ＱＴＯＦ質量分析計は、プロテオミクスや薬物動力学の分野でのタンパク質の分析に使用されている（１４）。本明細書中に記載した方法は、ＤＮＡポリメラーゼの分析のためのこの強力なツールの利用に向けられる。
【００５１】
デルタＺ０５、Stoffel Fragment、及びこれらのＧＯＬＤ（化学的に修飾された）バージョンの完全分析のための方法を開発した。これらの方法は、精密質量と何らかの構造データを迅速に測定する能力を提供する。デルタＺ０５の分析では、データは、同一性を確認し、そしてまた、Ｎ末端のメチオニンとアラニン残基が切断されていることを示している（図２）。ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼの分析は、これまで入手不可能であった構造知見を提供する（図３）。ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼを、シトラコン酸無水物でのリジン残基の可逆的修飾によって作製する。この研究以前には、これらの修飾リジンに関して程度又は位置に関する知識が全くなかった。熱及び酸に不安定なシトラコニル修飾を保存するために開発された新規方法を使用することで、デルタＺ０５ ＧＯＬＤにおけるそれらの全体的な分布を測定することが、現在可能である（図３）。この技術は、これらの分子をより完全に特徴づけ、そして、その製造、安定性、及び保存の研究を開始するためのツールを提供する。
【００５２】
Ｚ０５ ＧＯＬＤ及びＴａｑ ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼのペプチド配列決定のための方法もまた、開発した。このデータは、これらの分子に対して作成された化学修飾の最初の精密なマップを提供した。前記分析は、個々のリジン残基の修飾の程度が０〜１００％に及んでいること、及び２つのＤＮＡポリメラーゼ内の相同のリジンが、同様の修飾程度を有する傾向があることを明らかにした（図５）。ＤＮＡポリメラーゼドメイン内の修飾を比較することで、Ｔａｑ ＧＯＬＤとＺ０５ ＧＯＬＤの両方で３つの位置（ＴａｑのＫ５４０、Ｋ６６３、及びＫ７３８）が高度に修飾されていることを明らかにした。分子モデルにおけるこれらの位置を分析することで、３つの位置すべてが活発に複製プロセスにかかわることを示した（図６）。これらの研究で明らかにされた詳細情報は、解析ツールとしての質量分析法の力を実証した。いくつかの実施形態において、質量分析は、それらの天然バッファー及び濃度でのＤＮＡポリメラーゼの分析に使用される。
【００５３】
材料と方法
ＤＮＡポリメラーゼについて分析する能力は、干渉成分を取り除くためのサンプル調製法の開発に関連する。例えば、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０は、それが妨害イオンを有していて、さらに、イオン抑制を引き起こす可能性もあるので、質量分析に不適合である。この界面活性剤は、すべての酵素保存バッファー及びＰＣＲマスターミックス中に存在して、強疎水性ＤＮＡポリメラーゼを安定させる助けとなっている。理想的には、サンプル調製法は、バッファーｐＨ、ＤＮＡポリメラーゼ濃度、及びＤＮＡポリメラーゼサイズ（すなわち、完全又は消化）から独立しているであろう。前記方法は、サンプルを濃縮し、優先的なタンパク質結合を用いることなく高い回収率を有し、そして、Ｔｗｅｅｎ２０の大部分を取り除くであろう。そのような方法は、一般にすべての配合物（ストック、バルク、マスターミックス）及び完全なタンパク質又はトリプシン分解物のどちらかで、すべてのＤＮＡポリメラーゼに適用される場合がある。
【００５４】
トリプシン分解物のためのサンプル調製法を開発
トリプシン反応は、酸性のｐＨを用いて一般的に非常に低濃度である。（１）Pierce製スピンカラム及び（２）ピペットチップに詰めた強力なカチオン交換（ＳＣＸ）樹脂の２つの方法が推奨された。１つ目の方法では、Ｔｗｅｅｎ２０が支持体に結合し、ペプチドは通り抜ける。２つ目の方法では、ペプチドを保持し、続いて、洗浄して、Ｔｗｅｅｎ２０を取り除き、次に、ペプチドを溶出する。溶出ペプチド中の残留Ｔｗｅｅｎ２０を、ＥＬＳＤによって定量する。タンパク質回収率は、未処理の対照消化産物との比較によって決定される。
【００５５】
ペプチドマッピングのためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を開発
ペプチドマッピングは、タンパク質の一晩のトリプシン分解と、それに続くＱＴＯＦ ＬＣＭＳによる分析によって達成される。方法は、１）ペプチドを分離するためのクロマトグラフィー法、そして、２）質量分析計のための線源条件の特定を含んでいる。これは、高度な配列適用範囲をもたらした。タンデムＭＳの追加は、ペプチド配列を確認するのに役立ち、これにより、全体的な配列データの信頼性が改善するであろう。タンデムＭＳのプロセスは、断片化のためのイオン（前駆体）の選択、及びそれを効率的に断片化するパラメーター（衝突エネルギー）の特定を伴う。
【００５６】
ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼのためのサンプル調製法を開発
ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼは、酸性及び熱に不安定なシトラコニル修飾を保護するために高ｐＨ条件バッファー中に保存される。高ｐＨ条件バッファーでこれらの修飾を保全することが不可欠である。このｐＨは、ＤＮＡポリメラーゼのｐＩを大きく超えているので、これにより、そのＤＮＡポリメラーゼは、それらを陰イオン交換固相抽出に好適にしている陰性の正味電荷を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、ｐＨ８にて強陰イオン交換（ＳＡＸ）により保持されないことが知られている。完全ＤＮＡポリメラーゼ及び消化ＤＮＡポリメラーゼの両方の保持は、１０〜１１の範囲内のｐＨにて評価される。残留Ｔｗｅｅｎ２０を、ＥＬＳＤによって定量する。タンパク質回収率は、完全ＤＮＡポリメラーゼに関してＰＡＧＥによって評価され、そして、消化産物に関して無処置対照のＬＣＭＳプロフィールを比較することによって評価される。あるいは、高濃度ストックの沈殿の使用が評価される。これは、非沈殿対照のＬＣＭＳプロフィールとの比較によって決定される。消化は、再懸濁したタンパク質に対しておこなわれるであろう。
【００５７】
化学的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼのトリプシン分解に適合できるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を開発
トリプシン分解物の分離の方法は、一般的に、酸性バッファーと周囲より高い温度を用いる。これらの分子のための、塩基性バッファーを使用して２０℃で実施する方法は、以前に開発された。これらの方法は、高ｐＨ条件におけるイオン化効率の低下のため、酸性方法に比べて感度が低い。これらの問題にもかかわらず、配列適用範囲マップは９０％超であった。タンデムＭＳの追加は、相反する結果をはっきりさせ、ペプチド配列を確認して、全体的な配列データの信頼性を改善するのに役立つであろう。
【００５８】
再活性化中のシトラコニル修飾の加水分解の研究
先に触れた方法の開発は、分子レベルでの再活性化プロセスの研究を可能にする。これらの研究は、ＰＣＲバッファー中でＧＯＬＤＤＮＡポリメラーゼの部分的な再活性化をおこない、得られた活性を測定し、そして、ペプチド配列決定によって修飾をマッピングすることによって達成される。
【００５９】
ＰＣＲマスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼの識別と特徴づけ
これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼの同一性と数量を迅速に確認するための支援手段として役立つことを意図している。加えて、それらは、切断又は酸化損傷などの構造的問題を検出するのに使用できる。
【００６０】
ＰＣＲマスターミックスのためのサンプル調製法を開発
ＰＣＲマスターミックスは、回収率及び／又は本明細書中で開発した方法の効率に悪影響を及ぼす数多くの構成要素を含んでいる。ＰＣＲマスターミックスのサンプル調製には、サンプル濃度を≧４０ｎＭに維持するか又は高める追加要件がある。前記アプローチは、必要に応じて、代表的なＰＣＲマスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼを用いて先に概説された方法開発プロセスを繰り返すことである。
【００６１】
ＬＣＭＳによる定性分析
マスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼの濃度は比較的低く、そしてそれが、多い体積中の少ないサンプルの注入につながる。本明細書中で開発した方法は、１）検出限界（ＬＯＤ）決定し、そして、２）サンプル体積を増やす影響を検討することによって評価される。
【００６２】
ＬＣＭＳによる定量
ＤＮＡポリメラーゼの定量に関する実現可能性は、参照標準の開発によって評価された。そのアプローチは、トリプシン分解物から完全なタンパク質を定量する方法を記載するSilvaらによって報告された方法（１５）を評価することであった。彼らは、ＭＳシグナル応答とタンパク質濃度とに相関があることを発見した。特に、タンパク質１ｍｏｌｅあたりの、最も強い３つのトリプシンペプチドからのＭＳシグナル応答の平均は、±１０％未満の変動係数の範囲内で一定である。
【００６３】
ＬＣＭＳ ＱＴＯＦは、リジン残基のうち２つを除いたすべてに関して誘導体化レベルを特徴づけることによって、モデルであるＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを完全に特徴づけるためにうまく使用された。この作業は、Ｔｗｅｅｎ２０の不在化で誘導体化されたポリメラーゼを使用しておこなわれた。Ｚ０５ ＧＯＬＤ及びＴａｑ ＦＳ Ｅ６８１Ｋ ＧＯＬＤの両方のリジン残基の大部分が、２〜１００％の範囲にわたり、ある程度誘導体化されていることがわかった。ほんのわずかな残基で、１００％誘導体化されていることがわかった。ポリメラーゼドメイン内の３つの残基が、Ｔａｑ及びＺ０５の両方（それぞれ、Ｋ５４０／５４２、Ｋ６６３／６６５、及びＫ７３８／７４０）で高度に修飾されていることがわかったのが特に興味深いことであった。モデリング結果は、Ｋ６６３／６６５及びＫ５４０／５４２が触媒部位内にあって、Ｋ７３８／７４０が鋳型ＤＮＡと相互作用することを示した。これは、これらの残基の誘導体化が、おそらくポリメラーゼの不活性化に関与していることを示唆している。特に、Ｋ６６３／６６５残基は、１００％誘導体化されていることがわかっており、文献中に不変であると報告されている。これらのタイプの比較は、分子レベルでＧｏｌｄポリメラーゼを理解するために新しいツールを提供する。
【００６４】
【表１】
2016507221.tif 000002
【００６５】
化学薬品
シトラコン酸無水物、ジメチルホルムアミド、及び重炭酸アンモニウムを、Sigmaから購入した。配列決定グレードのトリプシンを、Promegaから購入した。水酸化アンモニウムとアセトニトリルを、VWRから購入した。
【００６６】
Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの調製
前記ＤＮＡポリメラーゼを、４℃で一晩、シトラコン酸無水物と反応させた。誘導体化ＤＮＡポリメラーゼを、標準タンパク質保存バッファーにバッファー交換する。
【００６７】
Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの消化
Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを、プロテアーゼ添付文書で概説された標準手続きを使用して、トリプシンを用いて３７℃で一晩、消化する。消化したポリメラーゼを、水酸化アンモニウムでの希釈によって１μΜに希釈する。
【００６８】
ＬＣ／ＭＳ条件
５ｐｍｏｌｅのアリコートを、Agilent製の１２００ ＬＣに装着したＺｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ Ｃ−１８ ２．１×１００ｍｍ、３．５μｍカラムにより分析した。カラム温度は３５℃であった。Ａ移動相は２０ｍＭの水酸化アンモニウムであり、及びＢ移動相はアセトニトリル中の２０ｍＭの水酸化アンモニウムであった。４５分間をかけた５−５０％Ｂの線形勾配を、０．２ｍｌ／分の流量で実施した。カラムを、５分間１００％のＢで洗浄し、次に、１５分間再平衡化した。標準的な二元的なエレクトロスプレー線源を、Agilent製の６５３０ＱＴＯＦに装着した。乾燥ガスの温度は３５０℃であり、１２ｌ／分の流量を有していた。ネブライザーは３０ｐｓｉｇであり、フラグメンターの電圧は１８０Ｖであり、そして、キャピラリーの電圧は４０００Ｖであった。陽イオンにおける走査モード（ｍ／ｚ １４００〜３２００）でデータを取得した。
【００６９】
データ分析
Agilent製のＭａｓｓ ＨｕｎｔｅｒソフトウェアのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＦｅａｔｕｒｅツールによるＦｉｎｄを使用することで、化合物を同定した。親タンパク質配列をコンピューター上で消化し、そして、理論上のペプチドを、同定された化合物に当てはめた。シトラコニル群を、予測された修飾として付加し、且つ、２つの誤った切断を許容した。そのデータを、以下のとおり解釈した：
【００７０】
１．あらゆるリジン残基に関して、修飾種と非修飾種で存在する傾向がある。シトラコニル修飾の存在は、通常トリプシン切断を阻害する。よって、非修飾リジンが、ペプチドのＣ末端に通常存在する。
２．各リジンの修飾率（％）を、修飾リジン及び非修飾リジンの体積の合計で修飾リジンの体積を割ることによって計算する（表２を参照）。
３．いくつかのペプチドが、複数のリジンを有しているので、何らかのユーザ解釈を必要とする。各リジン残基に関連しているすべてのペプチドを分類して、複数のリジンを用いて線を再現する。群内の各ペプチドの異なったコドンでの修飾を決定する。それぞれの特定のコドンに関して修飾及び非修飾の体積を合計し、そして、％修飾率を計算する（表３を参照）。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
【表３】
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【００７３】
消化ＧＯＬＤポリメラーゼのための高ｐＨ条件法
シトラコニル修飾は熱及び酸に不安定であるので、高ｐＨ条件法を使用して、シトラコニル修飾の保全を確実なものにした。この方法は、特殊な保存バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、ＫＣ１又はＴｗｅｅｎ２０不含）中のＴａｑ ＧＯＬＤ及びＺ０５ ＧＯＬＤの分析のために開発された。標準的なＧＯＬＤ保存バッファーは：２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．２％のＴｗｅｅｎ２０である。
【００７４】
トリプシン分解を、ＮＨ4ＣＯ3バッファー（〜ｐＨ８）中、３７℃で一晩実施した。試験前に分析したサンプルの量は、約５ｐｍｏｌｅであった。消化中、ポリメラーゼ濃度は約１５μΜであった。完了後に、消化サンプルを、ｐＨを高く保つために、Ｔｒｉｓ ｐＨ９の添加によって約１μΜに希釈した。５μｌの消化サンプルをＬＣＭＳによって分析した。
【００７５】
サンプル処理法：ＧＯＬＤポリメラーゼ消化産物のｐＨを、消化完了時にｐＨ９に調整した。ＬＣＭＳ分析のために、サンプルをＮＨ4ＯＨ（バッファーＡ）により１μΜに希釈し、濾過し、そして、５μｌ（５ｐｍｏｌｅｓ）を分析した。
【００７６】
ｄＺ０５ ＧｏｌｄのＬＣＭＳ法
方法名：ＥＳＩ＿ＰｒｏｔｅｉｎＤｉｇｅｓｔ＿５＿５０。バッファーＡ１：２０ｍＭのＮＨ4ＯＨ；バッファーＢ１：ＣＨ3ＣＮ中の２０ｍＭのＮＨ4ＯＨ；流速：０．２ｍｌ／分；捕捉：ＵＶ Ａ２１５ｎｍ；カラム：Ｚｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）ｐ／ｎ ７６１７５３−９０２；温度：３５℃；グラジエント：分 ％Ｂ：０ ５；４５ ５０；４６ ９５；５０ ９５；ポストタイム：１５分；線源：Ｄｕａｌ ＥＳＩ；モード：陽性；範囲：１００〜１７００；ガス：３５０℃；１２Ｌ／分；ネブライザー：３０ｐｓｉｇ；Ｖ Ｃａｐ：４０００Ｖ；Ｖ Ｆｒａｇ：１８０Ｖ。
【００７７】
データ分析
ＭＦＥ（Molecular Feature Extraction）アルゴリズムを実施し、配列を配列エディタにロードし；そして、シトラコニル（１１２．０１６０４５）を化学辞書（Ｃ5Ｏ3Ｈ5）に追加した。全質量は、（単数若しくは複数の）シトラコニル群の付加とペプチドからの１Ｈの喪失を反映し、そして、２つの誤った切断を許容していた。シトラコニルは、予測した修飾を加えた。配列の当てはめを、コンピューター上で消化した配列に対して実施した。
【００７８】
あらゆるリジン残基に関して、修飾種と非修飾種で存在する傾向がある。シトラコニル修飾の存在は、通常トリプシン切断を阻害する。よって、非修飾リジンが、ペプチドのＣ末端に通常位置している。修飾率（％）を、下記のとおり各リジンについて計算した：修飾リジンの体積／修飾及び非修飾リジンの全体積（１１８９６９８／（１１８９６９８＋４８２０７５８）＝１９．８％（表２）。
【００７９】
いくつかのペプチドが、複数のリジンを有しているので、何らかのユーザ解釈を必要とする。各リジン残基に関連しているすべてのペプチドを分類して、複数のリジンを用いて線を再現する。群内の各ペプチドの異なったコドンでの修飾を決定する。それぞれの特定のコドンに関して修飾及び非修飾の体積を合計し、そして、％修飾率を計算する。
【００８０】
本明細書に記載した実施例および実施形態は、例示の目的だけのために存在し、これに鑑みた種々の変更または変形が当業者に示唆されるべきであることが理解される。
【図１】
2016507221.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
2016507221.tif 000009
【図５（ｂ）】
2016507221.tif 000010
【図６Ａ】
2016507221.tif 000011
【図６Ｂ】
2016507221.tif 000012
【配列表】
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【国際調査報告】
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