(57)【要約】  本発明は、とりわけ腸管神経系の機能を改善することができるビフィドバクテリウム・アニマリスssp.アニマリスの新規株、及び該新規株を含んでなる組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2012年３月６日に、番号I-4602で、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に寄託されたビフィドバクテリウム アニマリス亜種アニマリス株。
【請求項２】
請求項１に記載の株と、ビフィドバクテリウム・ブレーベCNCM I-4321、ビフィドバクテリウム・ブレーベCNCM I-2219、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.ラクティスCNCM I-2494、ラクトバチルス・プランタラムCNCM I-4318、ビフィドバクテリウム・ビフィダムCNCM I-4319及びラクトバチルス・ラムノサスCNCM I-4316からなる群より選択される少なくとも１つの他の菌株とを含んでなる組成物。
【請求項３】
乳製品、好ましくは発酵乳製品である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
乾燥重量１ｇあたり少なくとも105cfuの、好ましくは少なくとも106cfuのビフィドバクテリウム・アニマリスssp.アニマリスCNCM I-4602を含んでなる請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
胃腸不快又は胃腸障害の予防及び/又は低減に使用するための請求項１に記載の株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
対象者における腸管神経系の血管作動性腸管ペプチド(VIP)レベルの増加に使用するための請求項１に記載の株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
胃腸運動の改善、腸蠕動の改善及び/又は腸透過性の低減に使用するための請求項１に記載の株又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
腸運動障害、腸透過性障害、過敏性腸症候群(IBS)、炎症性腸疾患(IBD)、便秘及び腸感染からなる群より選択される疾患を有する対象者に投与される請求項５に記載の株又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)の新規株に関する。この株は、例えば消化管の運動性又はバリア完全性についての機能を促進するために、特にその血管作動性腸管ペプチド(VIP)レベルを増加させることによって、とりわけ腸管神経系(ENS)の機能を改善することができる。よって、この株は、胃腸不快又は胃腸障害の予防及び/又は低減に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腸管神経系(ENS)は、消化管に沿って、機能上特異的な役割を有する２つの主要な神経叢に組織化された統合神経系である(Furness，J. Auton. Nerv. Syst.，81(1-3):87-96，2000)。縦走筋と輪状筋との間に位置する筋層間神経叢は、胃腸(GI)運動の制御に主に関与するニューロンを含む。輪状筋と粘膜との間に位置する粘膜下神経叢は、腸上皮バリア(IEB)機能の制御に主に関与するニューロンを含む。腸ニューロンは、それらが支配する標的細胞に作用する神経媒介物質を遊離することによりGI機能を制御する。
消化器系に関しては、神経媒介物質VIPは、平滑筋弛緩を誘導し(下部食道括約筋、胃及び胆嚢)、膵液及び胆汁中への水の分泌を刺激し、胃酸分泌及び腸管腔からの吸収の阻害を引き起こす。腸での役割は、水及び電解質の分泌を大いに刺激すること、並びに腸平滑筋の拡張、末梢血管の拡張、膵臓の炭酸水素塩分泌の刺激及びガストリン刺激性胃酸分泌の阻害である。これら効果は運動性の増加に一緒に働く。よって、VIPの増加は、GI管の筋肉の弛緩を有益に改善する。
【０００３】
腸上皮バリアは、バリア透過性及び上皮細胞の極性を制御する密着接合関連タンパク質、例えば閉鎖帯-１(zonula occludens-1；ZO-1)によって結合した、分極した特化細胞の連続単層により構成される。インビトロ及びインビボの研究により、プロバイオティクスは、ZO-1をモジュレートすることにより、上皮抵抗性に影響し、透過性を低減できることが示されている(Eunら，APMIS，119(1):49-56，2011；Miyauchiら，J. Dairy Sci.，92(6):2400-8，2009)。ENSにより合成される神経媒介物質はまた、腸透過性の調節に関与する(Hallgrenら，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，275:G95-103，1998；Haydenら，Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.，278:R1589-94，2000；Neunlistら，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，285(5):G1028-36，2003)。例えば、ラットにおいて、新生仔母体分離により結腸で誘導されるニューロンによるアセチルコリン合成の上昇は、上皮傍細胞の透過性増大を導く(Gareauら，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，293:G198-203，2007)。対照的に、粘膜下ニューロンにより遊離された血管作動性腸管ペプチド(VIP)は、腸上皮細胞において、密着接合タンパク質ZO-1の発現を調節することによりIEB抵抗性を増大させた(Neunlistら，J. Intern. Med.，263(6):577-83，2008)。バリア機能の調節におけるVIPの役割は、VIPがマウスにおいてシトロバクター・ローデンチウム(Citrobacter rodentium)誘導結腸炎に対するバリア抵抗性を増大させたことを示す最近の研究により更に補強される(Conlinら，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，297(4):G735-50，2009)。
【０００４】
幾つかの研究で、VIPを含むENS神経媒介物質に対する幾つかのプロバイオティクスの効果が測定されている。Kammら(Neurogastrointest. Motil.，16:53-60，2004)は、カルビンジン-28k(CALB)の減少に対するサッカロミセス・ブラウディ(Saccharomyces boulardii)の効果を開示し、ブタ空腸の他のニューロンマーカー(ChAT、VIP、SP、NF-160など)に対しては何らの効果も得られなかったことを開示した。Metugriachukら(Rejuvenation Res.，9:342-345，2006)は、老齢ウィスターラットにおける小腸及び大腸の運動性に対するシンバイオティクス調製物が、小腸及び結腸の筋電活動を有意に増加させ、VIPのmRNA発現の増加を生じたが、VIP濃度に対しては何ら有意な効果を生じなかったことを開示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌株は、健康に関連する有益性を提供できることが知られている。このような株は、しばしば、プロバイオティクスと呼ばれ、食物に使用される。食物に導入でき、改変された健康に関連する有益性及び/又は他の有益性(例えば官能特性及び/又は加工性)を有する新たな株が必要とされている。
国際出願WO 2011/148219では、乳酸菌を含む組成物は、ENSにおけるVIPレベルを増加させ、よってENS機能を改善することが見出された。これら乳酸菌は、特には、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)CNCM I-4318、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)CNCM I-2219、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.ラクティスCNCM I-2494及びビフィドバクテリウム・ブレーベCNCM I-4321であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この点に関して、本発明者らは、特には消化管の運動性及びバリア完全性についての機能を促進するために、とりわけ腸管神経系をモジュレートすることができる新たな細菌株、特にWO 2011/148219に開示された株より大きくVIPレベルを増加させる新たな株を同定した。この株は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリスの株として分類され、ブダペスト条約に従って、国際寄託機関としてのCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に、番号I-4602で2012年３月６日に寄託された。
よって、本発明は、Ｂ.アニマリスssp.アニマリスCNCM I-4602株に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
この株の特徴は以下のとおりである：
− コロニー形態(固体MRS＋システイン上、37℃にて72時間、嫌気条件)：小さく、丸く、白色の、通常の、半透明コロニー；
− 微視的形態(液体MRS＋システイン上、37℃にて16時間、嫌気条件)：厚く、大きく、双極の、瓢箪型桿菌；
− 以下の基質の発酵(API 50 CHストリップ上、API MRS培地中37℃にて48時間)：L-アラビノース、D-キシロース、D-ガラクトース、D-グルコース、Dマルトース、D-メリビオース、D-サッカロース及びD-ラフィノース；
− 生化学的同定(API 20 Aストリップ上、API 20 A培地中36℃にて24時間)：胞子なし、グラム染色陽性、桿状、Dグルコース、D-サッカロース、D-マルトース、サリシン、D-キシロース、L-アラビノース及びD-ラフィノースの存在下での酸性化、ゼラチン及びエスクリン加水分解；
− 検出された酵素活性(API ZYMストリップ上、37℃にて４時間)：エステラーゼ(C4)、ロイシンアリルアミダーゼ、シスチンアリルアミダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びα-グルコシダーゼ。
【０００８】
本発明はまた、本発明の株に由来し、依然としてVIPに対する活性を有する変異株又は形質転換株を包含する。これら変異株又は形質転換株は、親株の１以上の内因性遺伝子が変異した株、例えば幾つかの代謝特性(例えば、糖発酵能力、酸耐性、胃腸管輸送のための生存能力、後酸性化又は代謝物産生)を改変するように変異した株であることができる。それらはまた、例えば当該株に追加の生理学的特徴を付与するため又は当該株を介して投与されることが望まれる治療用若しくはワクチン用の興味対象のタンパク質の発現を可能にするために、１以上の興味対象の遺伝子による親株の形質転換から生じた株であることができる。
【０００９】
本発明の株及び上記変異体は、プロバイオティクスとして使用することができる。これは、胃腸不快又は胃腸障害の予防及び/又は低減に使用することができる。この株は、対象者における腸管神経系の血管作動性腸管ペプチド(VIP)レベルを増加させる。この株は、投与後の対象者及び/又は食品における病原体の増殖を阻害することができる。この株は、例えば腸上皮細胞の経上皮電気抵抗(TEER)を増大させることにより、腸バリア特性の改善を提供することができる。この株は、発酵及び/又は消化に際して、興味深い単鎖脂肪酸産生、例えば、産生増大又は脂肪酸組成の改変を提供することができる。この株は、発酵及び/又は消化に際して、気体発生を減少させることができる。この株は、胃ストレスに対して興味深い抵抗性を有することができる。この株は、例えば新生哺乳動物に対して、特にヒト新生児に対して、良好な胃腸運動特性を提供することができる。この株は、特に新生哺乳動物、例えばヒト新生児において、腸管神経系の成熟並びに消化管機能及び胃腸運動性の成熟を促進することができ、よって胃腸輸送時間を減少させ、胃腸筋収縮性を増大させ、胃腸蠕動を改善し、胃内容排出遅延を防止し、胃腸管系の協調収縮を増大させ、胎便排出時間を減少させ、生後に胃腸運動が始まる時間を短縮させ、生後早期の経腸栄養摂取を可能にさせる。この株は、発酵乳製品中、例えばビタミンＫの存在下に、良好な生育及び/又は生存を提供することができる。
【００１０】
本発明はまた、１以上の他の菌株(プロバイオティクスであってもなくても)、例えば、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属及びビフィドバクテリウム属から選択される１以上の菌株を含んでなる組成物に関する。具体的には、この(これら)他の株は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)の１以上の株及び/又はラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)の１以上の菌株を含むことができる。
本発明によるこの組成物は、有利には、ビフィドバクテリウム・ブレーベCNCM I-4321、ビフィドバクテリウム・ブレーベCNCM I-2219、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.ラクティスCNCM I-2494、ラクトバチルス・プランタラムCNCM I-4318、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)CNCM I4319及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CNCM I-4316からなる群より選択される少なくとも１つの株を含んでなることができる。Ｂ.ビフィダムCNCM I-4319及びＬ.ラムノサスCNCM I-4316は、国際出願WO 2011/148220に開示されている。
【００１１】
本発明の組成物は、投与に、特には経口投与に適切な任意の形態であることができる。この形態には、例えば、固体、半固体、液体及び粉体が含まれる。一般に、より容易な投与には液体組成物(例えば、飲料)が好ましい。
本発明の組成物の例は、食品を含む栄養組成物である。組成物は、例えば、乳製品であることができ、好ましくは発酵乳製品であることができる。随意に、他の乳酸菌株が存在してもよい。１つの好適な実施形態では、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・ブルガリカスの株が存在する。発酵品は、液体の形態又は発酵液の乾燥により得られる乾燥粉体の形態であることができる。好ましくは、発酵品は生鮮品である。激しい熱処理工程を経ていない生鮮品は、存在する細菌株が生存形態であるという利点を有する。発酵品は、特には乳製品であることができ、より好ましくは発酵乳及び/又は発酵ホエーであることができる。例えば、栄養組成物は、ヨーグルト又は固化形態、撹拌形態若しくは飲用形態の発酵乳である。発酵品はまた、チーズ、又は発酵野菜、例えば固化形態、撹拌形態若しくは飲用形態の発酵したダイズ、穀類及び/若しくは果実であることができる。本栄養組成物は、ベビーフード、乳児用調製乳(infant milk formula)又は乳児用調製品(infant follow-on formula)であることができる。
【００１２】
本発明の組成物はまた、栄養補給薬(nutraceutical)又は医薬品、栄養サプリメント(nutritional supplement)若しくは医療用食品であることができる。
本発明の栄養組成物はまた、食物サプリメント(food supplement)及び機能性食品を含む。「食物サプリメント」とは、食料品に通常用いられる化合物から作られるものであって、錠剤、散剤、カプセル、頓服水剤(potion)の形態にあるか又は食べ物とは通常関連していない他の任意の形態にあり、健康に有益な効果を有するものを指称する。「機能性食品」とは、食べ物であって、健康に有益な効果を有するものである。特に、食物サプリメント及び機能性食品は、疾患に対する、例えば慢性疾患に対する生理学的(保護的又は治療的)効果を有することがある。
本発明による組成物は、例えば、乾燥重量１ｇあたり、少なくとも105コロニー形成単位(cfu)、好ましくは少なくとも106cfuの本発明の株、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.アニマリスCNCM I-4602を含んでなることができる。
【００１３】
本発明の組成物において、細菌株、特にＢ.アニマリスssp.アニマリスCNCM I-4602は、生存していてもよいし生存していなくてもよい細菌全体の形態で使用することができる。或いは、細菌株は、細菌溶解物の形態又は細菌画分の形態で使用することができる。この用途に適切な細菌画分は、例えば本願に記載した共培養モデルのVIPレベルに対する効果を緩和する特性を試験することにより、選択することができる。好ましくは、細菌細胞は、生存中であり継続して生存可能な細胞として存在する。
細菌が生存細菌の形態にあるとき、組成物は、代表的には、その乾燥重量１ｇあたり、105〜1013cfu、好ましくは少なくとも106cfu、より好ましくは少なくとも107cfu、より一層好ましくは少なくとも108cfu、最も好ましくは少なくとも109cfuを含んでいてもよい。液体組成物の場合、これは、一般には、104〜1012cfu/ml、好ましくは少なくとも105cfu/ml、より好ましくは少なくとも106cfu/ml、より一層好ましくは少なくとも107cfu/ml、最も好ましくは少なくとも109cfu/mlに相当する。
【００１４】
本発明の株又は組成物は、胃腸不快又は胃腸障害の予防及び/又は低減に使用するために特に適切である。本発明の株又は組成物は、腸の不快又は腸障害を患う対象者に投与することができる。よって、本発明の株又は組成物は、有利には、腸不快又は腸障害の予防又は処置に使用するためのものである。このような不快又は障害には、例えば、ガスに関連する不快又は障害、鼓脹(bloating)、腹部拡張、腹部疼痛、便秘、並びに幾つかの重篤な局面では、過敏性腸症候群(IBS)及び炎症性腸疾患(IBD)が含まれる。
１つの特定の観点に従えば、本発明によるCNCM I-4602株又は組成物は、対象者における腸管神経系の血管作動性腸管ペプチド(VIP)レベルの増加に使用するためのものである。より具体的には、このVIPレベル増加は、腸の運動性及び/若しくは透過性の障害、過敏性腸症候群(IBS)(例えばIBS-C、IBS-D及びIBS-PI)、炎症性腸疾患(IBD)、便秘並びに腸感染からなる群より選択される障害を有する対象者又は一般に腸機能を改善すべきである老人、乳児及び肥満の人からなる群より選択される対象者において特に、胃腸運動の改善、腸管蠕動の改善及び/又は腸透過性の低減に有用である。IBS又は痙攣性結腸は、検出可能な器質的原因がない慢性腹部疼痛、不快、鼓脹及び用便習慣変化により特徴付けられる機能的腸障害である。下痢若しくは便秘が頻繁に見られるか(そのためIBSはそれぞれIBS-D又はIBS-Cと分類される)、又はその両方が交互に起こることもあり得る。IBSは、感染後(これはIBS-PIと呼ばれる；PIは感染後(post-infectiousの略)、生活上のストレス性の出来事の後又は成熟後にその他の医学的指標を示さないで始まることもあり得る。
【００１５】
よって、本発明の組成物は、腸運動障害、腸透過性障害、IBS(IBS-D、IBS-C及びIBS-PIを含む)、IBD、便秘及び腸感染からなる群より選択される障害を、特に老人若しくは肥満の人又は幼児において、治療及び/又は予防するために使用することができる。
下記の限定されない実施例において本発明の詳細又は利点を見出すことができる。
【実施例】
【００１６】
実施例１：ENS初代培養物及びT84細胞の共培養モデルにおけるニューロンによるVIP産生に対する乳酸菌の効果
107のプロバイオティクス株(乳酸菌、特にビフィドバクテリウムを含む)の相互作用後の、VIP産生に対する初代腸ニューロンの示差応答を調べた。
【００１７】
細菌株及び生育条件
ラクトバチルスは、(マン、ロゴサ及びシャープ；Man，Rogosa and Sharpe；MRS)培地(Biokar Diagnostics，Beauvais，France)中37℃にて好気条件下で24時間生育させた。
ビフィドバクテリウムは、グルコース(Sigma，France)、酵母エキス(Becton Dickinson，USA)及びヘミン(Calbiochem，France)を補充し、トリプトンペプトン(Becton Dickinson，USA)ベースからなる規定培地中で培養し、37℃にて嫌気条件下で24時間生育させた。Ｂ.アニマリスssp.ラクティス株は、システイン(Sigma，France)を補充したMRS培地(Biokar Diagnostics)中で培養し、37℃にて嫌気条件下で24時間生育させた。
【００１８】
ENS初代培養物及びT84細胞の共培養モデルの取得
Moriezら(Biochem. Biophys. Res. Commun.，382(3):577-82，2009)により開発されたモデルから改作した、腸ニューロン細胞と腸上皮T84細胞との共培養モデルを細菌スクリーニングに使用した。
ラットENSの初代培養物は、以前に記載されたようにして得た(Chevalierら，J. Physiol.，586(7):1963-75，2008)。
T84細胞株は、10％熱不活化FBS及び50IU/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM-F12(1:1、GIBCO)中で培養した。細胞を12ウェルTranswell(登録商標)フィルター(Corning，NY USA)に２×105細胞/インサートの密度で播種して培養し、コンフルーエントな培養物を得た。共培養を設定する24時間前に、T84細胞の培養培地を初代ENS培地に置き換えた。
【００１９】
上皮細胞がコンフルーエントに達した１日後、Transwell(登録商標)フィルターを、底部に腸神経細胞を播種した12ウェルプレートに移した。上皮細胞及びニューロン細胞を上皮細胞用培地中で共培養した。
細菌培養物をPBS中で洗浄し、１％のN-2サプリメント(Life Technologies，Cergy-Pontoise，France)を含む、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)：栄養混合物F-12(ハム培地)(１:１)中に再懸濁した。分散分析を行うため、各細菌株を少なくとも３つ組で試験した。株は、40細菌/上皮細胞のMOIでフィルター区画に加えた。コントロールとして、細菌を加えないものを用意した。８時間のコインキュベーション後、上皮細胞及び細菌を含むフィルター区画を取り出し、初代ENS培養物をインキュベータ(95％空気、５％ CO2)中37℃にて22時間維持した。コントロールのウェルでは、VIP測定時にニューロン細胞を40mM KClで刺激した。
【００２０】
VIP測定
その後、ENS細胞を12ウェルプレートから採集し、血管作動性腸管ペプチド(VIP)定量用タンパク質抽出物の調製に使用した。細胞内VIPの測定のために、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics，Meylan，France)を含むRIPA溶解緩衝液(Millipore，Billerica，MA，USA)を用いて細胞内タンパク質を抽出した。購入した酵素イムノアッセイ分析(EIA)キット(Peninsula laboratories，Bachem，SA)を用いてVIPを定量した。
【００２１】
ENSモデル用の統計学的方法
式：(VIP株−VIPT84)/VIPT84  に従い、全ての株についてVIPマーカー値を陰性コントロール(T84)により規格化する。
固定効果としてその株を含む混合モデルから得られる推定の規格化値に従い、株をランク分けする。このモデルにより、各株についての推定の規格化値に関連するＰ値が得られた。Ｐ値が５％未満(＜0.05)であれば、その株の効果は有意である。
【００２２】
結果
結果を下記表１に示す。
【表１】
2016502842.tif 000002
【００２３】
陽性コントロールとして使用したKClは、VIPレベルを平均15.7％増加させた。
９株は、VIPレベルを有意に増加させることができた(0.18〜62.5％)。表１には、そのうち７株についての結果を示す。９株のうちＢ.アニマリスssp.アニマリスCNCM I-4602が最高レベルでのVIP増加を示した。細菌株なしでのレベルに対して、62.5％増加が見られた。
一方、15株はVIPレベルを有意に(Ｐ＜0.05)減少させることが観察された。これら15株のうちの10株についての結果を表１に示す。
【００２４】
試験した他の株は、VIPに対して有意な効果(Ｐ＞0.05)を示さなかった。このような株には、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)NCC 2705(CNCM I-2618)、ラクトバチルス・ラムノサスGG(ATCC 53103)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)UCC 3564、ビフィドバクテリウム・ロンガムBb536、ビフィドバクテリウム・アニマリスssp.ラクティスBi-07(ATCC SD 5220)、ラクトバチルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)La1(CNCM I-1225)、ラクトバチルス・プランタラム299v(DSM 9843)及びラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)SD 2112(ATCC 55730)が含まれる。
【国際調査報告】
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2016502842.tif 000004
2016502842.tif 000005