(57)【要約】  本明細書中に開示されるのは、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニン又は脂質ラフトとのシス相互作用を調節する剤である。該剤による調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊することを含み得る。ひいては、このことが、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進する。また、本明細書中に開示されるのは、これらを必要とする被験体において疾患を治療する方法である。該方法は、被験体に該剤を投与することを含み得る。本明細書中に更に開示するのは、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法である。【選択図】図３−３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤。
【請求項２】
脂質ラフトを破壊する、請求項1に記載の剤。
【請求項３】
反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、請求項1に記載の剤。
【請求項４】
ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項1に記載の剤。
【請求項５】
ペプチド剤である、請求項4に記載の剤。
【請求項６】
前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の剤。
【請求項７】
前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含む前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項８】
前記ペプチド剤が、配列番号2に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項９】
前記ペプチド剤が、配列番号3に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１０】
前記ペプチド剤が、配列番号4に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１１】
前記ペプチド剤が、配列番号7に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１２】
前記ペプチド剤が、配列番号8に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１３】
前記ペプチド剤が、配列番号9に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１４】
前記ペプチド剤が、配列番号10に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項１５】
前記ペプチド剤が、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止する、請求項6に記載の剤。
【請求項１６】
抗体である、請求項4に記載の剤。
【請求項１７】
抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合する、請求項16に記載の剤。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号1のアミノ酸の1〜383を含む前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項１９】
前記抗体が、配列番号2に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号3に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２１】
前記抗体が、配列番号4に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２２】
前記抗体が、配列番号7に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２３】
前記抗体が、配列番号8に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２４】
前記抗体が、配列番号9に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２５】
前記抗体が、配列番号10に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合させる、請求項17に記載の剤。
【請求項２６】
前記抗体が、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止する、請求項17に記載の剤。
【請求項２７】
コレステロール降下剤である、請求項4に記載の剤。
【請求項２８】
前記コレステロール降下剤が、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)、コレステロール酸化酵素(CO)、AY-9944、スタチン、サブチリシン/ケキシン9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン、フィリピン、前駆タンパク質転換酵素、BM15.766、アルキルリン脂質類似体、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項27に記載の剤。
【請求項２９】
前記コレステロール降下剤が、脂質ラフトを破壊し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を妨げる、請求項28に記載の剤。
【請求項３０】
疾患の治療を、それ必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、前記被験体に請求項1に記載の剤を投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記虚血が脳卒中である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
剤が、前記ペプチド剤であり、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
剤が、前記コレステロール降下剤であり、前記コレステロール降下剤が、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)、コレステロール酸化酵素(CO)、AY-9944、スタチン、サブチリシン/ケキシン9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン、フィリピン、前駆タンパク質転換酵素、BM15.766、アルキルリン脂質類似体、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
剤が、前記抗体であり、前記抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、及び配列番号7に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合する、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
RGMaとネオジェニンとの前記シス相互作用を妨害することを更に含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３８】
脂質ラフトを破壊することを更に含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患が脊髄損傷であり、前記方法が、前記被験体において運動機能を回復させることを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が網膜色素変性症であり、前記方法が、前記被験体において視細胞の生存を促進することを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、前記被験体において梗塞体積、脳浮腫、又はこれらの組み合わせのうちの少なくとも1を減少させることを更に含む、請求項32に記載の方法。
【請求項４２】
反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、
(a)  RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)
(b)  剤の存在下で前記混合物をインキュベートすること、及び、
(c)  工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)
を含む、方法。
【請求項４３】
剤が抗体又は抗体断片である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記RGMペプチドが、RGMaペプチドであり、かつ、配列番号2に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり、かつ、配列番号3に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり、配列番号4に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項４７】
前記RGMペプチドが、RGMaペプチドであり、かつ、配列番号7に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項４８】
前記RGMペプチドがRGMcペプチドであり、かつ、配列番号9に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項４９】
前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり、かつ、配列番号10に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項５０】
前記ネオジェニンペプチドが、配列番号1のアミノ酸1〜383である、請求項42に記載の方法。
【請求項５１】
前記ネオジェニンペプチドが、配列番号8に示される前記アミノ酸配列である、請求項42に記載の方法。
【請求項５２】
調節が、RGMaとネオジェニンとの前記シス相互作用を妨害することを含む、請求項42に記載の方法。
【請求項５３】
剤の存在下において検出されたレベルの、前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合が、剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルよりも低い場合に、剤が前記シス相互作用を妨害するとする、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項５５】
配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項５６】
配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項５７】
配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項５８】
配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項５９】
配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項６０】
配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項６１】
配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチド剤が、配列番号11のアミノ酸1〜417を含む前記アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の剤。
【請求項６３】
前記抗体が、配列番号11のアミノ酸1〜417を含む前記アミノ酸配列を特異的に結合する、請求項17に記載の剤。
【請求項６４】
前記ネオジェニンペプチドが、配列番号11のアミノ酸1〜417である、請求項42に記載の方法。
【請求項６５】
配列番号11のアミノ酸1〜417位を含むアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、2013年9月17日に提出された米国仮特許出願第61/878,827号の優先権を主張し、該出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、反発性ガイダンス分子A(Repulsive Guidance Molecule A, RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を阻止し、又は脂質ラフトを破壊する剤、このシス相互作用又は脂質ラフトを調節して、細胞の生存及び軸索成長並びに/あるいは再生を促進するための方法、及びシス相互作用又は脂質ラフトが被験体に対して有害な疾患、例えば、網膜色素変性症、多発性硬化症、虚血(例えば、脳卒中)、視神経損傷、及び脊髄損傷を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
中枢神経系(CNS)への損傷は、成体神経細胞が軸索を再生する能力が乏しいことから、永続的な機能喪失をもたらし得る。更に、成体神経細胞は、損傷時にアポトーシスを起こしやすい。損傷への応答において、反発性ガイダンス分子A (RGMa)のレベルは、CNSにおいて増加する。RGMaのレベルの増加は、軸索成長及び/又は再生を抑制し、神経細胞の生存を促進する。このように、RGMaは、損傷したCNSにおいて肯定的(positive)及び否定的(negative)な効果を発揮する。これらの効果は、CNSの発生中にも起こる。
【０００３】
RGMaは、ネオジェニンとのトランス相互作用を介して、軸索成長及び/又は再生の、こういった抑制、並びに細胞生存の促進に影響する。このトランス相互作用は、神経細胞の表面に配置された細胞外RGMa及びネオジェニンの間で生じる。
【０００４】
それゆえに、CNSに対する損傷又はCNSの疾患の存在下において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生の両方を促進する治療の同定及び開発の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を目的とする。
【０００６】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が脂質ラフトを破壊し得る、剤も目的とする。
【０００７】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用(cis interaction)を妨害し得る、剤も目的とする。
【０００８】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤(cholesterol-lowering agent)、又はこれらの任意の組み合わせであり得る、剤も目的とする。
【０００９】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得る、剤も目的とする。
【００１０】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１１】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含む前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１２】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号2に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１３】
本発明は、(i)神経細胞の生存及び(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号3に示される前記 アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１４】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号4に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１５】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号7に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１６】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号8に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１７】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号9に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１８】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号10に示される前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００１９】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止し得る、剤も目的とする。
【００２０】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得る、剤も目的とする。
【００２１】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２２】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含む前記アミノ酸配列を特異的に結合する、剤も目的とする。
【００２３】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号2に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２４】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号3に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２５】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号4に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２６】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号7に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２７】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号8に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２８】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号9に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００２９】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号10に示される前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００３０】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止し得る、剤も目的とする。
【００３１】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記コレステロール降下剤であり得る、剤も目的とする。
【００３２】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記コレステロール降下剤であり得、前記コレステロール降下剤が、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)、コレステロール酸化酵素(CO)、AY-9944、スタチン、サブチリシン(subtisilin)/ケキシン9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン、フィリピン、前駆タンパク質転換酵素、BM15.766、アルキルリン脂質類似体(analog)、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る、剤も目的とする。
【００３３】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記コレステロール降下剤であり得、前記コレステロール降下剤が、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)、コレステロール酸化酵素(CO)、AY-9944、スタチン、サブチリシン/ケキシン9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン、フィリピン、前駆タンパク質転換酵素、BM15.766、アルキルリン脂質類似体、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得、前記コレステロール降下剤が、脂質ラフトを破壊し、これによって脂質ラフトへのネオジェニンの動員を妨げ得る、剤も目的とする。
【００３４】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含む、方法も目的とする。
【００３５】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択され得る、方法も目的とする。
【００３６】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択され得、前記虚血が脳卒中であり得る、方法も目的とする。
【００３７】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得る、方法も目的とする。
【００３８】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る、方法も目的とする。
【００３９】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記コレステロール降下剤であり得、前記コレステロール降下剤が、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)、コレステロール酸化酵素(CO)、AY-9944、スタチン、サブチリシン/ケキシン9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン、フィリピン、前駆タンパク質転換酵素、BM15.766、アルキルリン脂質類似体、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る、方法も目的とする。
【００４０】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が、前記抗体であり得、前記抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、及び配列番号7に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得る、方法も目的とする。
【００４１】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、RGMaとネオジェニンとの前記シス相互作用を妨害することを更に含む、方法も目的とする。
【００４２】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、脂質ラフトを破壊することを更に含む、方法も目的とする。
【００４３】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択され得、前記疾患が脊髄損傷であり得、前記方法が、前記被験体において運動機能を回復させることを更に含み得る、方法も目的とする。
【００４４】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択され得、前記疾患が網膜色素変性症であり得、前記方法が、前記被験体において視細胞の生存を促進することを更に含み得る、方法も目的とする。
【００４５】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法であって、前記方法が、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤を前記被験体に投与することを含み、前記疾患が、網膜色素変性症、虚血、多発性硬化症、脊髄損傷、及び視神経損傷からなる群から選択され得、前記虚血が脳卒中であり得、前記方法が、前記被験体において梗塞体積、脳浮腫、又はこれらの組み合わせのうちの少なくとも1を減少させることを更に含み得る、方法も目的とする。
【００４６】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含む、方法も目的とする。
【００４７】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、剤が抗体又は抗体断片であり得る、方法も目的とする。
【００４８】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドが、RGMaペプチドであり得、かつ、配列番号2に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００４９】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり得、かつ、配列番号3に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００５０】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり得、配列番号4に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００５１】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドが、RGMaペプチドであり得、かつ、配列番号7に示される前記アミノ酸配列であり得る(maybe)、方法も目的とする。
【００５２】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドがRGMcペプチドであり得、かつ、配列番号9に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００５３】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記RGMペプチドがRGMaペプチドであり得、かつ、配列番号10に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００５４】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記ネオジェニンペプチドが、配列番号1のアミノ酸1〜383であり得る、方法も目的とする。
【００５５】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記ネオジェニンペプチドが、配列番号8に示される前記アミノ酸配列であり得る、方法も目的とする。
【００５６】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸の1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、調節が、RGMaとネオジェニンとの前記シス相互作用を妨害することを含み得る、方法も目的とする。
【００５７】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において、前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、調節が、RGMaとネオジェニンとの前記シス相互作用を妨害することを含み得、剤の存在下において検出されたレベルの前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合が、剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルよりも低い場合に、剤が前記シス相互作用を妨害するとする、方法も目的とする。
【００５８】
本発明は、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００５９】
本発明は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６０】
本発明は、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６１】
本発明は、配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６２】
本発明は、配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６３】
本発明は、配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６４】
本発明は、配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６５】
本発明は、配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【００６６】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記ペプチド剤であり得、前記ペプチド剤が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、配列番号10に示されるアミノ酸配列、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得、前記ペプチド剤が、配列番号11のアミノ酸1〜417を含む前記アミノ酸配列を含み得る、剤も目的とする。
【００６７】
本発明は、(i)神経細胞の生存並びに(ii)軸索成長及び/又は軸索再生の両方を促進する剤であって、剤が、ペプチド剤、抗体、コレステロール降下剤、又はこれらの任意の組み合わせであり得、剤が前記抗体であり得、抗体が、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号8に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特異的に結合し得、前記抗体が、配列番号11のアミノ酸1〜417を含む前記アミノ酸配列を特異的に結合し得る、剤も目的とする。
【００６８】
本発明は、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法であって、前記方法が、(a)RGMペプチド及びネオジェニンペプチドを含む混合物を形成すること(前記RGMペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ネオジェニンペプチドが、配列番号1のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む)、(b)剤の存在下において前記混合物をインキュベートすること、及び、(c)工程(b)の前記インキュベートされた混合物において前記RGMペプチドと前記ネオジェニンペプチドとの特異的結合のレベルを検出すること(剤の非存在下における前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルと比較した、剤の存在下において検出された前記ネオジェニンペプチドへの前記RGMペプチドの特異的結合のレベルの違いにより、剤が前記シス相互作用を調節することが示される)を含み、前記ネオジェニンペプチドが、配列番号11のアミノ酸1〜417であり得る、方法も目的とする。
【００６９】
本発明は、配列番号11のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列と少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが、反発性ガイダンス分子A(RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を妨害する、ペプチドも目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図1は、ネオジェニンが脂質ラフトに存在したことを示す。(A)ネオジェニンに対するN-20抗体及びAF1079抗体を作製するために使用された配列の模式図である。(B) N-20は、1の180 kDaバンドを検出したが、AF1079は180 kDaバンド及び約150kDaにおけるネオジェニンのN-末端欠失物を認識したことを示す、脳溶解物のウエスタンブロット解析。(C)F-アクチン(Alexaファロイジン)及び(D)ネオジェニンの網膜成長円錐(retinal growth cone)の免疫蛍光画像。バーは、30 μm。(E)ネオジェニン染色、ラフトマーカーのコレラ毒素サブユニットB (CTB)及びマージされた画像の複合画像であり、破線の輪郭において示された(かつ拡大された)表示された領域が、色の変化を示し(色は図示せず)、このことは、ネオジェニン及びCTBの共局在化を示した。ネオジェニンとCTBとの共局在を定量化するための強度相関率(Intensity correlation quotient, ICQ)を12の成長円錐について計算した。ICQは、全ピクセル数に対する正又は負の(Ai - a)(Bi - b)の値の数の比率引く(minus)0.5を反映して、-0.5〜+0.5の範囲を得た。ここでは、算出された平均ICQは0.27であり、該ICQは、ネオジェニンとCTBとの強い共局在を示した。バーは、30 μmである。(F)ネオジェニン (AF1079)、RGMa及びマージされた画像の複合画像であり、カラーで示された(色は示さず)、表示された領域は、ネオジェニン及びRGMaの表示された共局在を示した。算出された平均ICQは0.32であり、このことは、ネオジェニンとRGMaとの強い共局在を示した。バーは、30 μmである。(G)ネオジェニン(矢印)がRGMa及びラフトマーカーである、フロチリン(Flotillin)とともに局在することを示すニワトリ(Chick)脳の勾配分画(gradient fractionation)。トランスフェリン受容体(TfR)を重い画分のマーカー(heavy fraction marker)として使用した。
【図２】図2は、ネオジェニン中の4IgドメインとRGMaのN-末端部分とのシス相互作用が、脂質ラフトへネオジェニンを動員することを示す。(A) RGMaタンパク質を、4Ig-又は6FNIII-APでコーティングされたプレートにおいてインキュベートした。(結合: -、ベースライン(base line); ++ > 5 xベースライン;本実験のための定量分析を図9に提示する)。1のC-RGMaドメイン及び1のN-RGMaドメイン(N-RGMa77-113)が6FNIIIと相互作用した。1のN-RGMaドメイン(N-Raft)が、4Igと相互作用した。(B)His-6FNIII又はHis-4Igを発現する細胞からの上清(Supernatants, Sup)を、N-Raft、N-RGMa50-99、及びN-inhで被覆されたビーズでプルダウンした(pulled down)(IP)。次いで抗-His抗体を用いてウエスタンブロットを行って、His-6FNIII又はHis-4Igが、コーティングされたビーズと相互作用するか否かを明らかにした。このことは、His-6FNIIIがN-inhによってプルダウンされるが、His-4Igは、N-Raftによってプルダウンされることを示した。細胞上清に対してウエスタンブロットを行って、同じ量のHis-FNIII及びHis-4Igが、プルダウンを行うために使用されたことを示した。ラミニン(laminin, lam.) 及びN-RGMa又はN-RGMaタンパク質ドメインを加えたラミニン上の網膜外植片生成物(retinal-explant outgrowth)の(C)画像及び(D)定量化は、N-RGMa及びN-in.のみが、軸索の成長を阻害することを示した。データは、平均 ± SEM (n=3の独立の実験)、*p<0.0001である。スケールバーは、100μmである。(E)ニワトリ(chick)脳に、膜分画(membrane fractionations)を調製する1日前にコントロールペプチド(Ctrl; N-RGMa50-99)、4Ig、N-Raft、又はノギン(Noggin)を注入した。コントロール実験では、ネオジェニンがフロチリン/RGMaを含有する脂質ラフト画分(実線の四角に示す)に局在した。4Ig、N-Raft、又はノギンは、ネオジェニンを重い画分へシフトさせた。
【図３−１】図3は、ネオジェニンと脂質ラフトとの関連性が、RGMa阻害に必要であることを示す。(A) N-RGMa上で培養し、4Ig (1 μg/ml)、N-Raft (1 μg/ml)、RGMa ShRNA (shRNA21及びshRNA37)、MβCD (10 mM)、CO (2U/ml)、及びノギン(100 nM)で処理した側頭外植片(Temporal explants)。(B-F)外植片を、ラミニン(Ctrl)、N-RGMa、C-RGMa、又はRGMaΔを加えたラミニン上で生育させ、(B) RGMa shRNA21及びshRNA37、(C) 4Ig、(D) N-Raft、(E) MβCD及びCO、並びに(F)ノギン(Nog.)で処理した。データは、平均± SEM (n=3の独立実験)、*p<0.005である。
【図３−２】図3は、ネオジェニンと脂質ラフトとの関連性が、RGMa阻害に必要であることを示す。(G)ニワトリ視覚伝導路(visual pathway)におけるインビボ実験の模式図である。右目に、E2にRGMa/ネオジェニンコンストラクトを発現するプラスミドをエレクトロポレーション(electroporated)し、E17に目から視蓋へトレーシング(tracing)を行った。差し込み(inset)は、パネルh-kに示される領域を示す。(H)ネオジェニンと相互作用しないN-RGMa50-99を用いたコントロール実験。軸索経路は無傷であり、全ての線維が、末端域(terminal zone, TZ)への終末分枝(terminal arbor)を確立した。(I) RGMa-shRNA、(J) N-Raft又は(K) 4Igのエレクトロポレーションは、軸索経路を無秩序にし(perturbed)多数の線維が、予測されたTZ (矢頭)の外側に終末分枝を確立した。スケールバーは、100 μmである。
【図３−３】図3は、ネオジェニンと脂質ラフトとの関連性が、RGMa阻害に必要であることを示す。(L)上述の処理の作用の模式図。ネオジェニンにおける4Igドメインが、RGMa (N-Raft)におけるN-末端部分に相互作用して、BMP-依存性の脂質ラフトへのネオジェニンの動員を可能にする。脂質ラフトに入ると、ネオジェニンは、軸索阻害(axonal inhibition)を形質導入(transduced)した。脂質ラフトとのネオジェニンの会合(association)を阻害する処置により、軸索阻害を無効にした(abolished)。これらの処理は、(1)BMPをノギンでキレートすること(Chelating); (2) N-Raftペプチドを付加してネオジェニンにおける4Ig部位を遮蔽すること; (3) 4Igペプチドを付加してRGMaにおけるN-Raft部位を遮蔽すること; (4) shRNA (shRNA21及びShRNA37)を用いたRGMaのサイレンシング(Silencing)、及び(5)コレステロール枯渇(cholesterol depletion)(MβCD及びCO)を用いて脂質ラフトを破壊する(Disrupting)ことであった。
【図４−１】図4は、ネオジェニンが、細胞死を誘導するために脂質ラフトを必要としたことを示す。(A) RGMa (図11)を安定的に発現するHEK293細胞に、空のプラスミド(empty plasmid)(Ctrl)又はネオジェニン(Neo)をトランスフェクト(transfected)した。コントロールと比較した場合、ネオジェニンは、細胞死を誘導した(矢印)。(B)ネオジェニンをトランスフェクトし、BSA (Neo+Ctrl)、4Ig (1 μg/ml)、N-Raft (1 μg/ml)、ノギン(100 nM)、又はMβCD (10 mM)においてインキュベートした細胞における細胞死の定量化。脂質ラフトとのネオジェニンの結合を抑制する処理により、ネオジェニン誘導性細胞死が有意にレスキューされた(rescued)。データは、平均± SEM (n=3の独立の実験)、*p<0.0001であった。GFP及びネオジェニン発現プラスミドでエレクトロポレーションし、かつ、その後、N-RGMa50-99 (Ctrl; 1 μg/ml)、4Ig (1 μg/ml)、又はN-Raft (1 μg/ml)を注入し(injected)、TUNELアッセイに供したニワトリE5蓋(tecta)における細胞死の(C)代表的画像及び(D)定量化。4Ig又はN-Raftは、ネオジェニンによって惹起されたTUNEL陽性細胞の数を有意に減少させた。データは、3の異なる蓋/条件(*p<0.001)からの平均 ± SEMであった。バーは、100 μmである。コントロールペプチド(1 μg/ml)、4Ig (1 μg/ml)、N-Raft (1 μg/ml)、又はMβCD (10 mM)と4日間、インキュベートした網膜ホールマウント(retinal whole mounts)の(E)代表的画像及び(F)定量化。死細胞を、プロピジウムヨウ化物(Propidium Iodide, PI)で染色した。3の独立の実験の条件ごと(per condition)に9のホールマウント画像を同じ明度(intensities)で取得し、蛍光を、ImageJを用いて測定した。4Ig、N-Raft、又はMβCDは、網膜ホールマウントにおいて細胞死を有意に減少させた。バーは、500 μmである。
【図４−２】図4は、ネオジェニンが、細胞死を誘導するために脂質ラフトを必要としたことを示す。(G)軸索切断(axotomy)後14日目の損傷網膜におけるFluorogold標識された網膜神経節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)を図示する平坦な標本の(flat-mounted)網膜の蛍光顕微鏡写真。コントロール網膜(Ctrl)は、生存RGCをほとんど有していなかった。4Ig、N-Raft又はMβCDが細胞の生存を増加させた。バーは、200μmである。(H)本発明者らの解析において選択された網膜領域の描写。軸索切断(post-axotomy)後14日目の生存RGCの密度の定量化( (I) 4Ig又はN-Raft並びに(j) MβCDは、RGC生存を有意に増加させたことを示す)。データは、平均 ± SEM (n=6、目)、*p<0.01であった。
【図５−１】図5は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無(presence)を変更することにより、脊髄損傷後の機能的回復及び神経細胞の生存(neuronal survival)が促進されたことを示す。BBB (A、D)、運動サブスコア(motor subscore) (B、E)、及び足音(footfalls)の平均数(C、F)を用いた行動評価(Behavioral assessment)により、4Ig (IV)又はMβCD (IP)を用いた全身的治療(systemic treatment)が、コントロールと比較して、脊髄を損傷したラットにおいて著しい機能的改善をもたらしたことが示された。データは、平均 ± SEM (コントロール: n=7; 4Ig: n=8; MβCD: n=8) (* p<0.005)であった。
【図５−２】図5は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無(presence)を変更することにより、脊髄損傷後の機能的回復及び神経細胞の生存(neuronal survival)が促進されたことを示す。BBB (A、D)、運動サブスコア(motor subscore) (B、E)、及び足音(footfalls)の平均数(C、F)を用いた行動評価(Behavioral assessment)により、4Ig (IV)又はMβCD (IP)を用いた全身的治療(systemic treatment)が、コントロールと比較して、脊髄を損傷したラットにおいて著しい機能的改善をもたらしたことが示された。データは、平均 ± SEM (コントロール: n=7; 4Ig: n=8; MβCD: n=8) (* p<0.005)であった。(G、H) BBB (G)、及び足音の平均数(H)を用いた行動評価により、4Igのくも膜下腔への投与(intrathecal application)が、コントロールと比較して脊髄損傷ラットにおいて顕著な機能的改善をもたらしたことが示された。データは、平均 ± SEM (コントロール: n=10; 4Ig: n=10) (* p<0.005)であった。(I-M)神経細胞マーカ−、NeuNで染色された損傷脊髄の縦断面図(Longitudinal sections)。差し込みは、(I)ビヒクル(vehicle)コントロール、(J) 4Ig、及び(K) MβCDを用いた全身的治療後のラットの損傷脊髄における病変部近傍(peri-lesional)の神経細胞を表示する。矢印は、4Ig及びMβCD処理後の神経細胞を指す。点線は、白質(white matter)と灰白質(grey matter)との境界を示す。I-Kに提示された実験の定量化により、(L) 4Ig及び(M) MβCDを用いた処理が、SCI後に生存した(spared)神経細胞の数の有意な増加をもたらしたことを示す。各動物について、同等の(equivalent)灰白質組織を覆う各脊髄の厚みのすべてにわたって前後の距離が同等な5の切片から神経細胞の絶対数を定量した。
【図５−３】図5は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無(presence)を変更することにより、脊髄損傷後の機能的回復及び神経細胞の生存(neuronal survival)が促進されたことを示す。(I-M)神経細胞マーカ−、NeuNで染色された損傷脊髄の縦断面図(Longitudinal sections)。差し込みは、(I)ビヒクル(vehicle)コントロール、(J) 4Ig、及び(K) MβCDを用いた全身的治療後のラットの損傷脊髄における病変部近傍(peri-lesional)の神経細胞を表示する。矢印は、4Ig及びMβCD処理後の神経細胞を指す。点線は、白質(white matter)と灰白質(grey matter)との境界を示す。I-Kに提示された実験の定量化により、(L) 4Ig及び(M) MβCDを用いた処理が、SCI後に生存した(spared)神経細胞の数の有意な増加をもたらしたことを示す。各動物について、同等の(equivalent)灰白質組織を覆う各脊髄の厚みのすべてにわたって前後の距離が同等な5の切片から神経細胞の絶対数を定量した。(N-O) 4Igを用いたくも膜下腔処理後の損傷脊髄の横断面(cross-sections)のNeu-N染色。差し込みは、(N)ビヒクル、及び(O) 4Igで処理されたラットからの脊髄を示す。矢頭は、神経細胞を指す。(P)N〜Oにおいて提示された実験の定量化により、4Igを用いたくも膜下腔の処理が、SCI後の神経細胞数の有意な増加をもたらしたことが示される。損傷部位への異なる距離における定量化を、図12Dに提示する。バーは、100 μmである。データは、平均 ± SEM (n=8 animals/condition)であり、*p<0.001であった。スケールバーは、100μmである。
【図６−１】図6は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無を変化させることが、有髄の(myelinated)脊髄における軸索再生を促進したことを示す。皮質脊髄路(cortico-spinal tract)からの軸索を可視化するため、ビオチンデキストランアミン(biotin dextran amine, BDA)を用いた順行性軸索トレーシング(anterograde axonal tracing)をSCI後6週間目に行った。(A)最上部のパネルは、損傷後のコントロールの脊髄を示す。差し込みは、より高倍率の拡大を示す。損傷空洞(lesion cavity)は、左に提示される。(B) 4Igで処理された損傷脊髄。BDAを用いたトレーシングは、4Ig実験において空洞の尾側(caudal)に線維があるが、コントロールにはないことを明らかにした。最も長い再生する軸索は、空洞の尾方端(caudal end)を超えて数mm伸長した。矢印は、線維を示す。差し込みにおける矢頭は、線維が曲がること(turning fibers)を示す。スケールバーは、100μmである。(C、 D) SCI後の平均的な最大長は、(C) 4Ig及び(D) MβCD処理後に増加した。データは、平均± SEM (n=4の独立のラット/条件; 3〜4切片/ラット) であった。*p<0.001。
【図６−２】図6は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無を変化させることが、有髄の(myelinated)脊髄における軸索再生を促進したことを示す。皮質脊髄路(cortico-spinal tract)からの軸索を可視化するため、ビオチンデキストランアミン(biotin dextran amine, BDA)を用いた順行性軸索トレーシング(anterograde axonal tracing)をSCI後6週間目に行った。再生する軸索/切片の数の平均を測定し、これにより、(E) 4Ig及び(F) MβCDで処理された損傷ラットにおける、再生する軸索の数はより大きいことが示された。データは、平均 ± SEM (n=4の独立のラット/条件; 3〜4切片/ラット) であった。*p<0.005。(G、H)動物を犠死させる(sacrificed)前に4又は6週間(w)、損傷脊髄を4Igで処理し軸索の長さを測定した。(G)平均の軸索の長さは、4週間目と比べた場合、6週間目が有意に大きかった。(H)再生する軸索/切片の平均数を測定し、このことにより、脊髄を6週間処理した場合に、4週間に比べて、3〜4 mmの軸索の数が有意に高いことが示された。データは、平均± SEM (n=5の独立のラット/条件; 3〜4の切片/ラット) であった。*p<0.005。
【図７−１】図7は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無を変化させることが視神経損傷後の軸索の再生を促進したことを示す。(A-D)視神経挫滅(optic nerve crush)及び様々な処理後、21日目の視神経の縦切片におけるGAP-43免疫染色。コントロール(A)と比べて、(B) 4Ig及び(C) N-Raftを用いて脂質ラフトにおいてネオジェニンの有無を変化させることにより、又は、(D) MβCDを用いて脂質ラフトを破壊することにより、挫滅部位(大部分が(C)における破線として容易に視認される)を過ぎて、かつ、末梢の有髄視神経へ、の軸索再生を増進(enhanced)した。矢印は、各神経切片におけるいくつかの再生する軸索の境界を定める。差し込み画像は、対応する切片の再生する軸索のより高倍率の図である。
【図７−２】図7は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無を変化させることが視神経損傷後の軸索の再生を促進したことを示す。(A-D)視神経挫滅(optic nerve crush)及び様々な処理後、21日目の視神経の縦切片におけるGAP-43免疫染色。コントロール(A)と比べて、(B) 4Ig及び(C) N-Raftを用いて脂質ラフトにおいてネオジェニンの有無を変化させることにより、又は、(D) MβCDを用いて脂質ラフトを破壊することにより、挫滅部位(大部分が(C)における破線として容易に視認される)を過ぎて、かつ、末梢の有髄視神経へ、の軸索再生を増進(enhanced)した。矢印は、各神経切片におけるいくつかの再生する軸索の境界を定める。差し込み画像は、対応する切片の再生する軸索のより高倍率の図である。(E) 4Ig、N-Raft、及びMβCDにより、視神経損傷後の軸索再生が有意に増進されたことを示す軸索長の定量化。データは、平均± SEM (n=7の視神経/条件)、*p< 0.001であった。スケールバーは、200μmである。
【図８】図8は、共局在実験のためのコントロールを示す。(A)網膜成長円錐のCTB及びF-アクチン染色。ラフトマーカーコレラ毒素サブユニットB(cholera toxin subunit B, CTB)、F-アクチンマーカーAlexa-ファロイジン及びマージされた画像の複合画像であり、図の細長い部分(stem)及び周囲におけるCTB及びF-アクチンの共局在の重複(色は図示せず)を示す。バーは、30 μmである。(B) CTB及びF-アクチンは、網膜の成長円錐におけるランダム染色(random staining)を示した。CTBとAlexa-ファロイジンとの共局在を定量化するための強度相関率(ICQ)を、10の成長円錐において、説明されたように計算した。ICQは、-0.5から+0.5までの範囲を導くための、全ピクセル数引く0.5に対する、正又は負の(Ai - a)(Bi - b)の値の数の割合を反映する。ここでは、ICQの平均0.05が算出され、このことは、CTBとF-アクチンとのランダム局在(random localization)を示す。(C)ニワトリ脳のMβCD処理が、ネオジェニン共局在を重い画分へシフトさせる。膜分画を調製する1日前に、ニワトリ脳に、MβCD (10mM)を注入して、コレステロールを枯渇(deplete)した。これらの実験では、ネオジェニンは、トランスフェリン受容体(transferrin receptor, TfR)と共局在した。従って、MβCDを用いた前処置がネオジェニン局在を変化させ、もはや脂質ラフト画分にはそれがなかったことを示す。
【図９−１】図9は、別個のネオジェニン領域と相互作用する異なるRGMaドメインの同定を示す。(A)異なるRGMa-APタンパク質を、4Ig 6FNIII又はBSAでコーティングしたウェルにおいてインキュベートした。結合を、APタグ(tag)の有無を明らかにする発色基質(colorimetric substrate)p-ニトロフェニルリン酸塩(p-Nitrophenyl Phosphate)を加えることによって明らかにし、405nmにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。データは、平均 ± SEM (n=3の独立の実験)であった。*p<0.005。(B)結合アッセイの定量化(4Ig-AP及び6FNIII-APタンパク質を異なるRGMa領域からのタンパク質でコーティングしたウェルにおいてアッセイした)。(a)において相互作用を示したフラグメント(fragments)は、本分析において確認した（where）。従って、ネオジェニンにおける4Ig及び6FNIIIドメインをそれぞれ結合させる2のN-RGMaフラグメント(N-Raft及びN-RGMa77-113)を、同定した。C-RGMaタンパク質及び完全長の(full length) RGMaのみが6FNIIIを結合させる。データは、平均 ± SEM (n=3の独立の実験)、*p<0.005であった。(C) DCCの4Igドメインは、N-Raft (N-RGMa28-73)と相互作用しない。結合分析の定量化(N-RGMa-APを、タンパク質DCC-4Ig及びネオジェニン-4Igでコーティングしたウェルにおいてアッセイした)。本実験では、ネオジェニン-4IgがN-Raft -APと相互作用したが、DCC-4Igは、N-Raft -APと相互作用しなかった。データは、平均± SEM (n=4の独立の実験)であった。*p<0.005。
【図９−２】図9は、別個のネオジェニン領域と相互作用する異なるRGMaドメインの同定を示す。 (D)ネオジェニンの4IgドメインとN-Raftとのシス-相互作用は、脂質ラフトにおけるネオジェニンの局在に必要である。HEK-293細胞に、ネオジェニン及びRGMaコンストラクトをトランスフェクトした。細胞を回収する1時間前に、BMP2 (100nM)を培地に加えた。脂質ラフト分画に続いて、ウエスタンブロッティングを行った。フロチリンを、脂質ラフト画分についてのマーカーとして使用したのに対し、トランスフェリン受容体(TfR)を重い膜画分についてのマーカーとして使用した。全ての実験を2度繰り返した。ネオジェニンについてのウエスタンブロットを、両方のアイソフォームを認識する抗体AF1079を用いて行った。実験の第1のセットでは、細胞を、単にネオジェニンでトランスフェクトした。当研究の細胞膜では、ネオジェニンは、重い膜(heavy membranes)についてのマーカーTfRと共局在し、脂質ラフトマーカーフロチリンとの共局在は見られなかった。第2セットでは、完全長のネオジェニン及びRGMaをトランスフェクトし、180 kDaのネオジェニンバンドが、フロチリンを含む脂質ラフトフラクションへ局在した。第3及び第4セットでは、ネオジェニンの4Ig欠失(truncation)(Neo (4Ig del))又はRGMa (RGMa (28-73 del))のN-RGMa28-73 (N-Raft)欠失のいずれかをトランスフェクトした場合、ネオジェニンは、フロチリンを有するラフトフラクションにもはや存在しなかった。このことは、4IgとN-RGMa28-73 (N-Raft)との相互作用が、脂質ラフトにネオジェニンが存在するために必要であることを示唆する。
【図１０−１】図10は、shRNAを用いたRGMaサイレンシングの評価を示す。(A)RGMa-shRNA (shRNA#21及びshRNA#37)を用いた、ニワトリ及びマウスRGMaサイレンシングのウエスタンブロット解析。HEK-293細胞に、ニワトリ又はマウスRGMa及びshRNAを共トランスフェクト(co-transfected)した。トランスフェクションの2日後、膜の調製(membrane preparations)を行い、抗RGMa抗体を用いるウエスタンブロットにおいてRGMa発現を解析した。HEK-293細胞にニワトリRGMaをトランスフェクトした場合、ウエスタンブロット解析は、RGMa-shRNAs (shRNA#21及びshRNA#37)がRGMa発現をサイレンシングしたが、コントロールShRNA (ShRNA-Crl)は、そうしなかったことを明らかにした。HEK-293細胞にマウスRGMaをトランスフェクトした場合、ウエスタンブロット解析により、RGMa-shRNA #21が、その発現をサイレンシングしたことが明らかになった。しかしながら、shRNA#37は、マウスRGMa発現をサイレンシングしなかった。従って、マウスRGMaは、ニワトリRGMaがRGMa shRNA#37でサイレンシングされたレスキュー実験において使用することができる。クマシー染色(Coomassie staining)は、同じ量のタンパク質ローディング(protein loading)を示す。(B)解離した(Dissociated)網膜神経節細胞を、様々なコンストラクトを用いてトランスフェクトし、N-RGMa上で培養した。赤色蛍光タンパク質を用いた共トランスフェクションを行って、トランスフェクトされた細胞を同定した。βIIIチューブリンに対する染色を行って、神経細胞を同定した。コントロール shRNAでトランスフェクトしたRGCの代表図は、N-RGMaでコーティングされたカバースリップ(coverslips)における軸索成長の阻害を示す。ニワトリRGMaをサイレンシングするshRNA37の存在下において、この阻害は、抑制された(suppressed)。shRNA37をマウスRGMaとともに共トランスフェクトした場合、N-RGMaの軸索成長阻害が回復した(restored)。
【図１０−２】図10は、shRNAを用いたRGMaサイレンシングの評価を示す。 (C)網膜神経節細胞に、様々なプラスミドをトランスフェクトし、ラミニン及び、N-RGMa、C-RGMa及びRGMaΔを加えたラミニン上で増殖させた実験の定量化。RGMaタンパク質上では、ラミニンと比べた場合、網膜軸索は、より短かった。これらの阻害は、shRNA37トランスフェクションによって抑制され、マウスRGMaを、shRNA37とともに共トランスフェクトした場合に、回復した。従って、shRNA37の効果は、RGMaの特異的なサイレンシングから生じる。全てのデータは、平均軸索長±SEM (n= 6の独立の実験)であった。データは、平均± SEM (n=6 の独立の実験)、*p<0.01であった。(D)網膜外植片のMβCD処理は、ネオジェニン共局在をより重い画分へ変化させた。ニワトリ外植片をMβCD (10mM)処理して、膜分画を調製する前に、コレステロールを1時間枯渇させた。これらの実験において、ネオジェニンは、トランスフェリン受容体(TfR)と共局在した。従って、MβCDを用いた前処置がネオジェニン局在を変化させ、もはやそれが脂質ラフト画分にないことを示した。
【図１１】図11は、細胞死の評価のコントロール実験を示す。(A)安定なHEK-293におけるRGMa発現。RGMaを安定的に発現する細胞株を、HEK-293細胞で作製した。コントロール及びRGMa-発現安定株からの膜を、解析のために調製した。ウエスタンブロット解析を、(ジスルフィド架橋を保つための)DTTの非存在下で載せた(loaded)サンプルについて行った。抗-RGMa抗体により、予期された55kDaバンドが安定な細胞株において存在することが明らかになる。このバンドは、コントロールには存在しなかった。(B)緑色蛍光タンパク質(Green fluorescent protein, GFP)のエレクトロポレーションは、ニワトリ蓋におけるアポトーシスを引き起こさない。E5の蓋に、GFPを発現するプラスミドをエレクトロポレーションし、1日後、蓋を取り去り、アポトーシス細胞死を、切片におけるTUNEL分析を用いて測定した。GFP染色は、蓋が首尾よくエレクトロポレーションされたことを示した。TUNEL染色は、GFPエレクトロポレーションがアポトーシスを誘導しなかったことを明らかにした。従って、GFPのエレクトロポレーションは、アポトーシス死を誘導しなかった。
【図１２】図12は、GFAP及びNeuN染色におけるMβCD及び4Igを用いた処置の効果を示す。(A) MβCD、4Ig、及びコントロールPBSで処置されたラットの、星状膠細胞(astrocyte)マーカーである、GFAPで染色された損傷部位の尾側の脊髄領域を示す代表的画像。差し込みは、陽性星状膠細胞の高倍率画像を示す。(B、C)各動物について、各脊髄の厚みの全てにわたって等しい前後の距離を有する3の切片において損傷の縁から吻側(rostrally)及び尾側の両方の0.45 mm及び1.8 mmにおいて3領域 (1.1 x 106 um2領域)の合計の免疫蛍光強度値(immunofluorescence intensity values)を測定した。損傷を受けていないコントロールの平均強度値に対し、1動物当たりの各領域の平均値を正規化し(normalized)、平均値を求めた。群間において有意な差はない。データは、平均 ± SEM (n= 5 動物/条件)であった。(D) MBCD又は4Ig処理は、損傷体積(lesion volume)に影響を与えなかった。側矢状切片(Parasagittal sections)をLFB/H&Eで染色し、損傷の体積を各脊髄において計算して平均化した。グループの間において損傷の体積に有意な差はなかった。(E)宿主神経総数(Host neuronal counts):損傷後、6週間にわたって4Igのくも膜下腔投与を行い、脊髄の横断面をNeuNで染色した。NeuN+細胞を、損傷部位を取り囲む脊髄の5mmの吻側-尾側切片(rostro-caudal segment)のいたるところで320umの距離だけ離れている横断面において数えた。上のグラフ(top graph)は、数えられ、グループごとに平均化された全ての神経細胞の総数を示し、下のグラフは、損傷部位を取り囲む吻側-尾側の間隔において数えられた神経細胞の平均#を示す。-3mm吻側から0(中心点(epicentre))へ、3mm尾側まで; 1way ANOVA、事後(post-hoc)ボンフェローニ。
【図１３】図13は、4Ig及びMβCDを用いた処理が脊髄損傷後の機能転帰(functional outcome)を改善したことを示す。損傷及び処理後の行動評価。(A、B)録音をスローモーションにおいて解析し、１後肢当たりの足音の数を記録し、1週間ごとに各ラットについて平均を計算した。後肢を引きずっている損傷ラットを、最大の、足音12と採点した。損傷を受けていないラットでは、交差路(crossing)ごとに0又は時々1の足音があった。テストにおける相対的な成功率を計算して、ここに提示する。4Ig又はMβCDを用いた処理は、コントロールと対比して、脊髄損傷ラットにおける顕著な機能改善をもたらした。データは、平均± SEM (コントロール: n=8; 4Ig: n=8; MβCD: n=8) (* p<0.005)であった。(C)吻側から尾側への断面における、切断された脊髄のH/E&LFB染色は、典型的な空洞(cavitation)及びラット(レベルT8(level T8)における20g 損傷)におけるクリップ圧迫(clip compression)脊髄損傷後の中心点における皮質-脊髄路(cortico-spinal tract)の完全切除を示す。皮質脊髄路(corticospinal tract, CST)を、損傷を受けていない第1の吻側(rostral)切片において、ボックスによってマークした。(D)パネルは、4週目においてBDAを注入した4Igラットにおける、損傷から約1000um尾側の、BDA標識された線維を示す。ボックスは、BDA標識された線維(矢印)の複雑な形態(tortuous morphology)の、より高倍率の拡大を示す。標識された線維は、4週目にBDAを注入した4Igラットにおいて、損傷部位から尾側の、更に遠い距離においては明らかではなかった。(E) 4Ig処理されたラットの損傷部位(T8)の2 mm吻側及び5mm尾側の脊髄の断面及び皮質脊髄路軸索を示す、損傷を受けていないコントロールのBDA染色。横断面では、BDA軸索の輪郭(axonal profiles)が、4Igにおける損傷部位の2 mm吻側及び損傷を受けていないコントロールに対するCST(丸く囲んだ)において明らかである。BDA標識されたCST軸索は、CSTの連続性(continuity)を示す、損傷を受けていないコントロールラットにおける損傷部位の5mm尾側においても存在する。これに対し、CSTの途絶(disruption)を示す損傷部位の5mm尾側の切片では、4Ig処理されたラットにおいて、BDA標識された軸索は、全く明らかではなく、軸索防御(axonal sparing)も全く明らかではない。 (F) MβCDで処理された高齢のラットの行動評価:高齢のラット(>7月)を損傷させ、4週間、MβCDで処理した。BBB評価は、MβCDを用いた処理が、コントロールと対比して、脊髄損傷ラットにおいて顕著な機能改善をもたらしたことを示した。効果は、早ければ(as soon as)損傷後7日で見られ、MβCD処理も生存を促進するという見解と整合した。データは、平均 ± SEM (コントロール: n=4; MβCD: n=4) (* p<0.05)であった。
【図１４】図14は、損傷視神経における4Ig、N-Raft及びMβCDを用いた処理を示す。視神経は、挫滅損傷(crush injury)を受け、損傷の21日後に犠死させるまで、DMSO (コントロール)、4Ig、N-Raft、及びMβCDで処置された。視神経を、その後固定し、切片にし(sectioned)、星状膠細胞(astroglia cells)を標識するための抗-GFAP抗体を用いて解析した。(A) DMSO (コントロール)、4Ig、N-Raft、及びMβCDで処理した視神経の代表的な図。パネルは、GFAP、DAPI及びマージ(merge)の染色を表示する。上端右パネルは、GFAP染色の定量化のために使用された領域を示す。(B)各動物について、(A)に提示された4領域において、イメージJプログラム(Image J program) (NIH)を使用して、免疫蛍光強度を測定した。各領域についての相対的平均強度が提示される。グループ間に有意な差はない。データは、平均 ± SEM (n= 8 動物/条件)である。(C)視神経挫滅(optic nerve crush)の21日後における平坦な標本の網膜のコレラ毒素B(Cholera Toxin B)(FITC結合(conjugated))順行性標識法を示す落射蛍光顕微鏡写真(Epifluorescence micrographs)。各図は、特定の処理後の中央-周辺(mid-periphery)からのものである。その軸索に沿ってCTB-FITCを活発に順行性に輸送する(transporting)RGCの細胞体(cell bodies)(矢印)及び軸索がみえる。MBCD、4Ig又はN-Raft処理は、i)コントロールと比較して、視神経挫滅後の神経線維層におけるRGCアクソンソーマ(axonsoma)の強度を保つ。これらの効果は、外側網膜への中央-周辺から、網膜の全表面にわたってみられる。
【図１５】図15は、ネオジェニンに対するRGMaの作用のモデルを示す。RGMa及びネオジェニンは、2種の相互作用を確立し、神経細胞の死及び軸索の成長/再生を制御する。A)ネオジェニンの脂質ラフトへの動員(recruit)における、RGMaのN-末端部分とネオジェニンの4Igドメインとのシス相互作用。脂質ラフトに動員された時点で、ネオジェニンは、環境からのRGMa分泌源(source)がないときは、細胞死を誘導するだろう。B)トランス相互作用は、RGMaのC-及びN-末端部分並びにネオジェニンのFNIIIドメインを有する、異なる2のドメインの間において起こり、RGMaとネオジェニンとの相互作用が、軸索の成長/再生阻害を調節する。トランスに相互作用するRGMaペプチドは、神経細胞の直接的周囲における細胞によって分泌される。軸索の成長/再生を阻止するためには、ネオジェニンは、脂質ラフトに存在する必要があった。C)ネオジェニンが、細胞死を引き起こし、軸索の成長/再生を阻止する(block)ために脂質ラフトの会合を必要とすることから、これらの区画(compartments)へのネオジェニンの動員を変化させることが、その機能を防止するために使用され得る。このことは、4Igペプチド(本明細書に示される)、N-Raftペプチドのようなペプチドを含む剤、又は脂質ラフト破壊を用いてなされ得る。ネオジェニンの脂質ラフトとの会合を防止することは、細胞の生存及び軸索成長/再生を促進する。
【図１６】図16は、ニワトリRGMaのアミノ酸28-73の配列を示す。ニワトリRGMa配列は、受入番号NP_989868.1 (配列番号6)であった。
【図１７】図17は、(A)ウエスタンブロット及びその対応するクマシー染色ゲル; (B) RGMaペプチドの模式図;及び(C) 450 nmの吸光度に対してプロットされた(plotted)ペプチドを示す。本研究に使用された全てのコンストラクトはGallus gallus種から作製した。ネオジェニンの4Igドメインに対するN-RGMaの結合部位を同定するため、N-RGMa (28-73アミノ酸)を、4の重複する断片: 1) N-RGMa (28〜54アミノ酸); 2) N-RGMa (40〜62アミノ酸); 3) N-RGMa (55〜73アミノ酸)、及び4) N-RGMa (54〜62アミノ酸)、に分割した。配列を、Psectag2B-APプラスミドにクローニング(cloned)した。このことは、アルカリフォスファターゼタグ(alkaline phosphatase tag)と融合した可溶性タンパク質として、ペプチドを分泌することを可能にする。96-ウェルマイクロタイタープレート(Corning Incorporated)を用いて、ウェルを、100 μl (10 μg/mL)のPoly-L-Lysineを用いて4℃で一晩コーティングした。ウェルを、その後、100 μlのPBST (+0.02% Tween)を用いて3回洗浄した。50 μl (2.5 μg/mL)の、His-タグを付けた、完全長ネオジェニン、4 Igネオジェニン、及びFNIIIネオジェニンを、各ウェル上に1時間、37℃でコーティングした。100 μl PBSTの3の洗浄後、次いで各ウェルを、300 μlのPBST中3% BSAを用いて、1 時間、37°Cでブロッキングした(blocked)。50 μl (1.0 μg/mL)のAP-タグを付けた、1% BSA + PBST中N-RGMa (28〜73)、N-RGMa (28〜54)、N-RGMa (40〜62)、N-RGMa (54〜73)、N-RGMa (54〜62)を、その後各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。各ウェルを、100 μl PBSTを用いて3回、十分に洗浄し、続いて次に、各ウェルをアルカリフォスファターゼ(AP)促進バッファー(developing buffer) (100 mM NaHCO3、1mM MgCl2)を用いて平衡化した。反応を、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)(Sigma-Aldrich)を添加したAP促進バッファーを使用して進展させ、発色(color development)まで進展させた。反応を、50 μl (0.1M) NaOHを添加して停止させた。各反応物の吸光度をマイクロプレートオートリーダー(microplate autoreader)(BIO-TEK Instruments Inc.)を用いて450ナノメートル(nanometers, nm)の波長で測定した。ネオジェニンの4Ig-ドメインに対するN-Raft内の結合部位を更に同定するため、N-Raftを4の重複する断片: N-RGMa (28〜54アミノ酸); N-RGMa (40〜62アミノ酸); N-RGMa (55〜73アミノ酸);及びN-RGMa (54〜62アミノ酸)に分割した。これらの4断片を、精製し、完全長ネオジェニン、ネオジェニンの4Ig-ドメイン、及びネオジェニンの6FNIII-ドメインに対する結合性について試験した(図17A-17C)。これらの研究は、N-RGMa (40〜62アミノ酸)及びN-RGMa (54〜73アミノ酸)がネオジェニンの4Ig-ドメインに特異的に結合したことを実例で示した(図17C)。
【図１８】図18は、ネオジェニンが成体マウス光受容体に発現することを示す。成体網膜は、抗-ネオジェニン抗体で染色された。このことは、このタンパク質が光受容体を含む外顆粒層(Outer Nuclear Layer, ONL)において発現されることを明らかにする。
【図１９】図19は、ネオジェニンの4Igドメインが、rd1マウスにおいて光受容体の死を防止することを示す。A) Rd1マウスに、P9で PBS (コントロール)又はネオジェニンの4Ig断片を注入した。P21に、動物を犠死させ、DAPI又はH&E染色を行って、光受容体を可視化した。4Igを注入した動物では、コントロールと比べた場合、外顆粒層(ONL)がより厚く見えた。B) (A)に提示された実験のための定量化。細胞数及びONLの厚さの平均は、コントロールと対比して、4Ig処理された動物において有意に増加した。
【図２０】図20は、コレステロール枯渇/阻害が、光受容体の生存を促進することを示す。(A) rd1マウスに、P9でPBS (コントロール)あるいはMBCD又はAY-9944を注入した。P21に動物を犠死させ、光受容体を可視化するためにDAPI染色を行った。MBCD及びAY-9944を注入した動物では、コントロールと比べた場合に、外顆粒層がより厚く見えた。B) (A)に提示された実験のための定量化。ONLにおける細胞数が、コントロールと対比して、MBCD及びAY-9944処理された動物において有意に増加した。
【図２１】図21は、コレステロール枯渇/阻害が桿体視細胞(rod)の生存を促進することを示す。rd1マウスに、P9にPBS (コントロール)あるいはMBCD又はAY-9944を注入した。P21に動物を、犠死させ、桿体視細胞を抗-ロドプシン(Rhodopsin)抗体で染色した。MBCD及びAY-9944を注入した動物では、発明者らは、外顆粒層内における桿体視細胞数の劇的な増加に気付き得た。
【図２２】図22は、RGMaが、脳卒中モデル(stroke model)においてネオジェニンによる細胞の生存を促進することを示す。(A)網膜ホールマウントは、脳卒中のモデルとして脱酸素・脱グルコース(oxygen glucose deprivation, OGD)を受け、プロピジウムヨウ化物染色(赤色、色は図示せず)を行って、細胞死を評価した。コントロール(OGDせず)では、大部分の細胞は生存する。OGD後、染色の増加が、死細胞数がより多いことを明らかにする。培地(medium)へのRGMaの添加(OGD+RGMa)は、細胞死を減少させる。抗体を阻止するネオジェニンの存在は、RGMaの生存促進性効果(pro-survival effect)を無効にし、細胞生存におけるRGMaの効果は、ネオジェニンを介することを示す(OGD+RGMa+ネオジェニン抗体)。(B)独立した4の、Aにおいて提示された実験の定量化。
【図２３】図23は、RGMa注入が、インビボの(in vivo)脳卒中モデルにおいて細胞の生存を促進することを示す。(A、B、C)目において行われた実験の模式図。A)大動脈を結紮して(ligated)、血流を15分間、停止させた。B)結紮直後に眼の硝子体(eye vitreous)にRGMaを注入した。C)結紮の2週間後、逆行性標識法(retrograde labeling)を行って、細胞の生存を評価した。D)定量化のために使用された網膜領域の表示。E)各条件についての8ラットにおいて行われた細胞の生存の定量化。このことは、RGMa注入が本インビボ脳卒中モデルにおいて、生存を2倍促進することを示す。
【図２４】図24は、4Igが、網膜ホールマウントにおけるOGD (脱酸素・脱グルコースGlucose deprivation)後の生存を増加させることを示す。A)細胞生存に対する4Igの効果を網膜ホールマウントにおいて評価した。2日培養した後、プロピジウムヨウ化物染色を行って、死細胞を可視化した。コントロール又は4Igの存在下においてOGDを行った(1h)。OGDの1日後、細胞生存をPI染色によって評価した。B) Aにおいて観察された行動の定量化。4Ig処理された培養では、細胞生存の有意な改善がある。
【図２５】図25は、ネオジェニンの脂質ラフト(4Ig)との結合を変化させることが、脳卒中後の脳の損傷を防止することを示す。血栓(blood clot)を中大脳動脈(middle Cerebral Artery)に注入して、脳卒中を引き起こし、動物を、4Ig (毎日)、又は(and animal or)コントロールペプチドの尾静脈注入で処理した。動物を1週間飼育し、脳を染色して(2% 2, 3, 5-塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液)、損傷を可視化した。次にコレラ毒素を、損傷を示す硝子体の白い領域(矢印)に注入した。4Ig処理された動物では、損傷は、コントロールと比較した場合、減少した。
【図２６】図26は、ネオジェニンの脂質ラフトとの結合を変化させること(4Ig)が、脳卒中後の脳の損傷を防止することを示す。血栓を、中大脳動脈に注入して、脳卒中を引き起こし、動物を4Ig(毎日)、又は(and animal or)コントロールペプチドの尾静脈注入で処理した。動物を1週間、飼育し、脳を染色して(2% 2, 3, 5-塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液)、損傷を可視化した。A) 4Ig及びコントロールの動物において梗塞体積(infarct volume )を測定した。このことは、4Ig処理された動物において梗塞サイズの有意な減少を示す。B)脳浮腫(brain edema)のサイズを4Ig及びコントロールの動物において測定した。このことは、4Ig処理された動物における、浮腫サイズの有意な減少を示す。(*p<0.05)
【図２７】図27は、ネオジェニンの脂質ラフト(4Ig)との会合を変化させることが、脳卒中後の脳機能の回復を促進することを示す。血栓を中大脳動脈に注入して、脳卒中を引き起こし、動物を、4Ig (毎日)又はコントロールペプチドの尾静脈注入で処理した。動物を1週間、飼育し、機能的行動(functional behavior)をBedersonテストを用いて評価した。4Ig処置された動物は、コントロールと比べた場合に、脳機能の有意な改善(p<0.05)を示した。
【図２８】図28は、実験計画の模式図を示す。マウスにおいて行われたEAE実験の模式図である。
【図２９】図29は、4IgペプチドがEAEにおける麻痺を緩和したことを示す。EAEは、10匹のマウス、処置グループごとに5匹のマウスにおいて誘導された。矢印で示された日に、マウスに、4Igペプチド(PBS中3μg)又は、コントロールとしてのPBSのいずれかを与えた。17日目に、コントロールマウスを重篤に麻痺させたが、4Igは、麻痺の重症度を強く低減させた。
【図３０】図30は、AY-9944及びBM 15. 766を用いてコレステロール生合成を阻害することにより、ミエリン(myelin)において網膜神経節細胞の神経炎(neuritis)を促進したことを示す。網膜外植片を、E7ニワトリ胚から調製して、ラミニン又はミエリンにより（with on）被覆されたカバースリップ上で培養し、コントロール(DMSO)又はAY-9944 (1μM)又はBM15.766 (4μM)で処理した。培養18時間後、外植片を4%PFAで固定し、Alexa488-ファロイジンで染色した。神経突起(Neurites)を、Cellsensソフトウェアを用いて測定した。網膜外植片をラミニン(コントロール)又はミエリン(CNSの阻害化合物(inhibitory compound))上で培養した。ミエリンは、伸長(outgrowth)を阻害したため、ラミニン上において、軸索成長は、ミエリンに比べて正常であった。コレステロール阻害剤を培地に加えた場合、それらは、ラミニン上における伸長に影響を与えなかった。しかしながら、ミエリン上における伸長を回復させた。このことは、これらがミエリンの阻害活性を抑制したことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
詳細な説明
本発明は、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用の調節を、それを必要とする被験体においてする方法、並びに脂質ラフト内のネオジェニンの動員を調節する(すなわち、動員及び/又は維持を妨害する)方法を目的とする。トランス相互作用は、神経細胞の表面において、細胞外のRGMaとネオジェニンとの間で起こるが、一方、シス相互作用は、意外にも、神経細胞の同じ細胞膜(plasma membrane)内に局在するRGMaとネオジェニンとの間で起こる。
【００７２】
シス相互作用を阻止すること及び脂質ラフトを破壊することの両方が、本明細書中に記載された発見であり、CNSの損傷又は疾患(disease)に応答して、(a)細胞の死及び(b)軸索阻害の2つの悪影響を弱める能力を有する。脂質ラフトへの動員の際、ネオジェニンは、RGMaとのトランス相互作用がない状態では、神経細胞の死(例えば、アポトーシス)を誘導するためのシグナルを送る。ネオジェニンの脂質ラフトへの動員を阻害することは、脂質ラフト自体を破壊すること、又はRGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止することのいずれかによって、神経細胞生存の増加、並びに軸索成長及び/又は再生の増加の両方をもたらす。
【００７３】
このシス相互作用は、ネオジェニンの4つの免疫グロブリン様ドメイン(immunoglobulin-like domains) (4Igドメイン)及びRGMaのN-末端部分(すなわち、N-Raft又はRGMaのアミノ酸28〜73として本明細書中に記載される)を介して行われる。より詳細に以下に記載され、かつ、図2A、9、及び17に示されるN-Raft内のマッピング実験は、RGMaのアミノ酸40〜73が、ネオジェニンの4Igドメインを結合させるために必要なアミノ酸及び/又は二次構造を含むことを示した。さらに、完全長RGMaは、4Igドメインを結合させることができず、これらの必要なアミノ酸及び/又は二次構造が、ネオジェニンとのシス相互作用を生じさせるために、RGMaにおいて(例えば、構造変化時に)露出される必要があるかもしれないことを示した。
【００７４】
より詳細に以下に説明する通り、調節する方法は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止すること(blocking)又は妨害すること(disrupting)並びに/あるいは脂質ラフトを破壊することを含む。かかる方法は、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を変化させ、これによって、ネオジェニンが、細胞の死を誘導し、軸索の成長及び/又は再生を阻害するシグナルを送ることを阻止する。
【００７５】
調節する方法は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止しもしくは妨害し、及び/又は脂質ラフトを破壊する剤を投与することも含む。この剤は、より詳細に以下に記載された、ペプチド剤、コレステロール降下剤、又は抗体であり得る。
【００７６】
本発明は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節する剤を同定する方法も目的とする。剤は、抗体又は抗体断片であり得る。抗体又は抗体断片は、RGMaとネオジェニンとの間に起こるシス相互作用のために必要なアミノ酸及び/又は二次構造を特異的に認識し、選択的に結合し得る。このように、抗体又は抗体断片は、シス相互作用を阻害し、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を調節し、かつ神経細胞の生存並びに軸索の成長及び/又は再生を促進し得る。
【００７７】
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする被験体においてする方法も目的とする。治療する方法は、被験体において神経細胞の生存並びに軸索の成長及び/又は再生の促進を調節する方法を適用し得る。疾患は、網膜色素変性症(retinitis pigmentosa)、虚血(ischemia)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、脊髄損傷(spinal cord injury)、又は視神経損傷であり得る。
【００７８】
定義
別途定義しない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が、統制するだろう。本明細書中に記載された方法及び材料と同様の又は対応する方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料は、以下に記載される。本明細書中において言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる。本明細書中に開示された材料、方法、及び例は、単に説明に役立つものであり、限定することを意図するものではない。
【００７９】
本明細書中に使用される用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「できる(can)」、「含む(contain(s))」、及びこれらの変形(variant)は、追加的な行動(act)又は構造(structures)の可能性を排除しないオープンエンド型(open-ended)の移行句(transitional phrase)、用語(terms)又は単語(words)であることが意図される。文脈で明確に別途制約がない限り、単数形「a」、「及び(and)」及び「the」は、複数の言及を含む。本開示は、明示的に説明されていようといまいと、本明細書中に提示された実施態様又は要素(elements)を「含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」、及び本明細書中に提示された実施態様又は要素(elements)で「実質的に構成される(consisting essentially of)」、他の実施態様も予期する。
【００８０】
「アクセプター(Acceptor)」及び「アクセプター抗体」は、1以上のフレームワーク領域(framework regions)の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%のアミノ酸配列をもたらし又はコードする抗体又は核酸配列に言及するために本明細書中において使用される。用語「アクセプター」は、定常領域(複数可)をもたらし又はコードする抗体のアミノ酸配列又は核酸配列を包含する。該用語は、1以上のフレームワーク領域及び定常領域(複数可)をもたらし又はコードする抗体アミノ酸配列又は核酸配列も包含する。例えば、用語「アクセプター」は、1以上のフレームワーク領域の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%のアミノ酸配列をもたらし又はコードするヒト抗体のアミノ酸配列又は核酸配列に言及し得る。かかるアクセプターは、ヒト抗体の1以上の特定の位置に存在しない、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、又は少なくとも10アミノ酸残基を含み得る。アクセプターフレームワーク領域及び/又はアクセプター定常領域(複数可)は、例えば、生殖細胞系列(germline)の抗体遺伝子、成熟した(mature)抗体遺伝子、又は機能的抗体(例えば、当分野において周知の抗体、開発中(in development)の抗体、又は市販の抗体)に由来し、又はこれらから得られ得る。
【００８１】
「親和性(Affinity)成熟抗体」は、1以上のCDRにおける1以上の改変を伴う抗体に言及するために本明細書中において使用され、該抗体は、改変(複数可)を有しない親(parent)抗体と比べて、標的抗原に対する、抗体の親和性(すなわち、KD、kd又はka)の改善をもたらす。典型的な親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル濃度(nanomolar)又はピコモル濃度(picomolar)の親和性さえ有するだろう。バイオディスプレイ(bio-display)を使用して作製されたコンビナトリー(combinatory)抗体ライブラリのスクリーニングを含めて、親和性成熟抗体を製造するための様々な手順が、当分野において知られている。例えば、Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)は、VH及びVLドメインシャッフリング(domain shuffling)による親和性成熟を記載する。CDR及び/又はフレームワーク残基のランダム変異導入法(Random mutagenesis)は、Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene. 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995);及びHawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)に記載される。活性を増進するアミノ酸残基を有する、選択的突然変異位置(selective mutagenesis positions)及び接触位置(at contact)あるいは高頻度変異位置(hypermutation positions)における選択的突然変異は、米国特許第6,914,128 B1号に記載される。
【００８２】
本明細書中に使用される場合、「抗体」及び「抗体(複数)」は、モノクローナル抗体(monoclonal antibodies)、多重特異性抗体(multispecific antibodies)、ヒト抗体、(完全に又は部分的にヒト化された)ヒト化抗体(humanized antibodies)、鳥類(例えば、アヒル又はガチョウ)、サメ、クジラ、及び非霊長類(non-primate) (例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、等。)又は非ヒト霊長類(例えば、サル、チンパンジー、等。)を含む哺乳類、組換え抗体(recombinant antibodies)等の、(ただし限定されなるものではない)動物抗体、キメラ抗体(chimeric antibodies)、一本鎖Fvs(single-chain Fvs, scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体(single domain antibodies)、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、F(ab')2フラグメント、ジスルフィド-結合(disulfide-linked)Fvs (「sdFv」)、及び抗イディオタイプ抗体(anti-idiotypic antibodies)(「anti-Id」)、二重ドメイン抗体(dual-domain antibodies)、(二重可変ドメイン(dual variable domain, DVD)又は三重可変ドメイン(triple variable domain, TVD)抗体(二重可変ドメイン免疫グロブリン及びこれらを製造する方法は、Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007)及びPCT国際出願公開第WO 2001/058956号に記載されており、それぞれの文献の内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる)、並びに上述されたいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメント(epitope-binding fragments)を指す。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある断片、すなわち、被験物質結合部位(analyte-binding site)を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスであり得る。簡単にするために、被験物質に対する抗体を、本明細書中においてしばしば「抗被験物質抗体」又は単に「被験物質抗体。」のいずれかと呼ぶ。
【００８３】
本明細書中において使用する場合、「抗体断片」は、抗原-結合部位又は可変領域を含む完全な抗体の一部を指す。該一部は、完全な抗体のFc領域の定常重鎖(constant heavy chain)ドメイン(すなわち、抗体アイソタイプ(isotype)に応じて、CH2、CH3、又はCH4)を含まない。抗体断片の例としては、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、ダイアボディ(diabody)、一本鎖Fv (single-chain Fv) (scFv)分子、1の軽鎖可変ドメイン(light chain variable domain)のみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの3のCDRを含有する一本鎖ポリペプチド、1の重鎖可変領域(heavy chain variable region)のみを含有する一本鎖ポリペプチド、及び重鎖可変領域の3のCDRを有する一本鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「二重特異性抗体(Bispecific antibody)」は、クアドローマ(quadroma)技術(Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)参照)、2の異なるモノクローナル抗体の化学的結合(Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)参照)、あるいはノブ・イントゥ―・ホール(knob-into-hole)、又は同様のアプローチ(Fc領域に変異を導入し、このうちの1のみが機能的な二重特異性抗体である、多数の異なる免疫グロブリン種(species)をもたらす)(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)参照)によって作製される完全長抗体に言及するために本明細書中において使用される。二重特異性抗体は、その2の結合アーム(binding arms)(1対の HC/LC)のうちの1において、1の抗原(又はエピトープ)を結合させ、その第2アーム(別の1対のHC/LC)において異なる抗原(又はエピトープ)を結合させる。この定義によって、二重特異性抗体は、2の(特異性及びCDR配列の両方において)異なる抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して一価(monovalent)である。
【００８４】
「CDR」は、抗体可変配列内の「相補性決定領域(complementarity determining region)」に言及するために本明細書中において使用される。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域には、3のCDRがあり、それぞれの可変領域に対し、「CDR1」、「CDR2」、及び「CDR3」と命名される。本明細書中において使用される場合、用語「CDRセット(CDR set)」は、抗原を結合させる単一の可変領域に存在する3のCDRのグループを指す。これらのCDRの正確な境界は、異なるシステムに従って、異なって規定されている。Kabatにより記載されるシステム(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))は、抗体の任意の可変領域に適用される一義的に残基を番号付けするシステムをもたらすだけでなく、3のCDRを規定する正確な残基の境界ももたらす。これらのCDRは、「Kabat CDR」として呼ばれ得る。Chothia及び共同研究者ら(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987);及び Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989))は、アミノ酸配列のレベル(level)で非常に多様であるにもかかわらず、Kabat CDR内のいくつかの小部分(sub-portions)は、ほぼ同一のペプチド骨格構造(backbone conformations)をとることを見出した。これらの小部分は、「L1」、「L2」、及び「L3」、あるいは「H1」、「H2」、及び「H3」と命名され、「L」及び「H」は、軽鎖及び重鎖の領域をそれぞれ命名する。これらの領域は、「Chothia CDR」と呼ばれ得、Kabat CDRと重なり合う境界を有する。Kabat CDRと重なり合うCDRを規定する他の境界は、Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995)及びMacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996)によって記載されている。更に他のCDR境界の規定(definition)が、本明細書中の1のシステムに厳密には従わないが、それでもなおKabat CDRと重なり合うであろう。ただし、特定の残基又は残基のグループあるいはCDR全体さえ、抗原の結合に有意な影響を与えないという予想又は実験的発見を考慮すると、これらは短くされ、又は長くされ得る。いくつかの実施態様は、Kabat又はChothiaで規定されたCDRを使用するが、本明細書中に使用される方法は、任意のこれらのシステムに従って規定されたCDRを利用し得る。
【００８５】
「CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)」は、1の種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、1以上のマウスCDR (例えば、CDR3)がヒトCDR配列と置き換えられたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体等、VH及び/又はVLの1以上のCDR領域の配列が、別の種のCDR配列と置き換えられる抗体に言及するために、本明細書において使用される。
【００８６】
「キメラ抗体」は、ヒト、イヌ、ウマ、又はネコ定常領域に結合されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体等、1の種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列と、別の種からの定常領域配列とを含む抗体に言及するために本明細書において使用される。キメラ抗体は、特定の種に由来し、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、抗体からの対応する配列と同一又は相同(homologous)の重鎖及び/又は軽鎖の一部を含み、一方、該鎖(複数可)のうちの残りが、別の種からの抗体もしくは別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びに望ましい生物活性を示すかかる抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である(例えば、米国特許第4,816,567号及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)参照)。
【００８７】
ダイアボディは、2の抗原-結合部位を有する小さい抗体断片であって、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン(VL)に結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む断片(VH-VL)に言及するために、本明細書中において使用される。同じ鎖における2のドメインの間における対合(pairing)を可能にするには、短いリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性(complementary)ドメインと対を形成することを強いられ、2の抗原結合部位を作り出す。
【００８８】
「ドナー(Donor)」及び「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する抗体に言及するために、本明細書中において使用される。ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られる又は由来する抗体とは異なる種からの抗体であり得る。ヒト化抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非ヒト抗体を指す。ウシ化(bovinized)抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非-ウシ抗体を指す。ブタ化抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非-ブタ抗体を指す。イヌ化抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非-イヌ抗体を指す。ネコ化抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非-ネコ抗体を指す。ウマ化抗体との関連では、用語「ドナー抗体」は、1以上のCDRを提供する非-ウマ抗体を指す。
【００８９】
「二重特異性(Dual-specific)抗体」は、それぞれのその2の結合アーム(1対のHC/LC) において2の異なる抗原(又はエピトープ)を結合することができる完全長抗体に言及するために本明細書において使用される(PCT公開第WO 02/02773号参照)。それゆえに、二重特異性結合タンパク質は、同一の特異性及び同一のCDR配列を有する、2の同一抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して二価(bivalent)である。
【００９０】
「二重可変ドメイン(Dual variable domain)」は、結合タンパク質(binding protein)における2以上の抗原結合部位に言及するために本明細書中において使用され、該結合タンパク質は、二価(divalent)(2の抗原結合部位)、四価(tetravalent) (4の抗原結合部位)、又は多価(multivalent)結合タンパク質であり得る。DVDは、単一特異的(monospecific)、すなわち、1の抗原(又は1の特異的エピトープ)を結合させることが可能であってもよく、又は多重特異的、すなわち、2以上の抗原(すなわち、同じ標的抗原分子の2以上のエピトープ又は異なる標的抗原の2以上のエピトープ)を結合させることが可能であってもよい。好ましいDVD結合タンパク質は、2の重鎖DVDポリペプチド及び2の軽鎖DVDポリペプチドを含み、「DVD免疫グロブリン」又は「DVD-Ig」と呼ばれる。かかるDVD-Ig結合タンパク質は、それゆえに、四量体(tetrameric)であり、IgG分子を連想させるが、IgG分子よりもより多くの抗原結合部位を提供する。従って、四量体DVD-Ig分子の各半分は、IgG分子の半分を連想させ、重鎖DVDポリペプチド及び軽鎖DVDポリペプチドを含むが、単一の抗原結合ドメインを提供するIgG分子の1対の重鎖及び軽鎖と異なり、DVD-Igの1対の重鎖及び軽鎖は、2以上の抗原結合部位を提供する。
【００９１】
DVD-Ig結合タンパク質の各抗原結合部位は、ドナーの(「親の」)モノクローナル抗体に由来し得、従って、抗原結合部位ごとに抗原結合に関与する合計6のCDRを有する重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。それゆえに、2の異なるエピトープ(すなわち、2の異なる抗原分子の2の異なるエピトープ又は同じ抗原分子の2の異なるエピトープ)を結合させるDVD-Ig結合タンパク質は、第1の親モノクローナル抗体に由来する抗原結合部位及び第2の親モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む。
【００９２】
DVD-Ig結合分子の設計、発現、及び特性評価(characterization)の記載は、PCT公開第WO 2007/024715号、米国特許第7,612,181号、及びWu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007)において提供される。かかるDVD-Ig分子の好ましい例は、構造式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(式中VD1は、第1の重鎖可変ドメインであり、VD2は、第2の重鎖可変ドメインであり、Cは、重鎖定常ドメインであり、X1は、CH1ではないという条件でリンカーであり、X2は、Fc領域であり、かつ、nは0又は1であるが、好ましくは1である)を含む重鎖を含み；構造式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(式中、VD1は、第1の軽鎖可変ドメインであり、VD2は、第2の軽鎖可変ドメインであり、Cは、軽鎖定常ドメインであり、X1は、CH1ではないという条件でリンカーであり、X2は、Fc領域を含まず、nは、0又は1であるが、好ましくは1である)を含む軽鎖を含む。かかるDVD-Igは、2のかかる重鎖及び2のかかる軽鎖を含み、各鎖は、可変領域の間に定常領域を挟むことなく、タンデム(tandem)に結合された可変ドメインを含み、重鎖及び軽鎖は、結合して、タンデムな機能的抗原結合部位を形成し得、1対の重鎖及び軽鎖は、もう一対の重鎖及び軽鎖と結合して、4の機能的抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。別の例では、DVD-Ig分子は、重鎖及び軽鎖を含み得、それぞれの重鎖及び軽鎖は、可変ドメインの間に定常領域を挟むことなく、タンデムに連結された3の可変ドメイン(VD1、VD2、VD3)を含み、1対の重鎖及び軽鎖は、結合して、3の抗原結合部位を形成し得、1対の重鎖及び軽鎖は、もう1対の重鎖及び軽鎖と結合して、6の抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。
【００９３】
好ましい実施態様では、本発明によるDVD-Ig結合タンパク質は、この親モノクローナル抗体が結合する同じ標的分子を結合させるだけでなく、1以上のこの親モノクローナル抗体の1以上の望ましい特性も有する。望ましくは、かかる追加的な特性は、1以上の親モノクローナル抗体の抗体パラメータである。1以上のこの親モノクローナル抗体からのDVD-Ig結合タンパク質に寄与し得る抗体パラメータとしては、抗原特異性、抗原親和性、有効性(potency)、生物学的機能(biological function)、エピトープ認識(epitope recognition)、タンパク質安定性、タンパク質溶解性、生産効率、免疫原性(immunogenicity)、薬物動態(pharmacokinetics)、バイオアベイラビリティ(bioavailability)、組織交差反応性(tissue cross reactivity)、及びオーソロガスな抗原の結合(thologous antigen binding)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
DVD-Ig結合タンパク質は、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドのうちの少なくとも1のエピトープを結合させる。DVD-Ig結合タンパク質の限定的でない例としては、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドのうちの1以上のエピトープを結合させるDVD-Ig結合タンパク質、ヒトRGMaペプチド又はネオジェニンペプチドのエピトープ、及び別の種(例えば、マウス)のRGMaペプチド又はネオジェニンペプチドのエピトープを結合させるDVD-Ig結合タンパク質、並びにRGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチドのエピトープ、及び別の標的分子のエピトープを結合させるDVD-Ig結合タンパク質が挙げられる。
【００９５】
「エピトープ(Epitope)、」又は「複数のエピトープ(epitopes)、」又は「対象のエピトープ(epitopes of interest)」は、認識され、かつ、その特異的結合パートナー(specific binding partner)における相補的部位(complementary site)(複数可)に結合し得る任意の分子における部位(複数可)のことを指す。分子及び特異的結合パートナーは、特異的な結合の対(binding pair)の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン(hapten)、糖鎖抗原(carbohydrate antigen) (糖脂質(glycolipids)、糖タンパク質(glycoproteins)又はリボ多糖(lipopolysaccharides)等であるが、これらに限定されない)、又は多糖にあり得る。その特異的結合パートナーは、抗体であり得るが、これに限定されない。
【００９６】
「Fab」は、抗体断片に言及するために、本明細書中において使用される。抗体のパパイン分解(Papain digestion)は、「Fab」フラグメントと呼ばれる、それぞれが、単一の抗原結合部位を有する、2の同一の抗原結合フラグメント、及び残余の(residual)「Fc」フラグメントを生じさせ、「Fc」フラグメントの名称は、容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処置は、結合架橋抗原(binding cross-linking antigen)を生じさせる。Fabフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1ドメイン(CH1)も含む。Fab′フラグメントは、抗体ヒンジ領域(hinge region)からの1以上のシステイン(複数可)を含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に少数の残基を付加することがFabフラグメントと異なる。Fab′-SHは、定常ドメインのシステイン(複数可)が、遊離チオール基(free thiol group)を有するFab′を本明細書中において意味する。F(ab′)2抗体断片は、これらの間にヒンジシステイン(hinge cysteines)を有する、一対のFab′フラグメントとして当初製造された。抗体断片の他の化学的結合(chemical couplings)も知られている。
【００９７】
本明細書中において使用される場合、「F(ab')2フラグメント」は、Fc領域の大部分を除去し、一部のヒンジ領域を完全なまま残すためのIgG抗体全体のペプシン消化(pepsin digestion)によって作製された抗体を指す。F(ab')2フラグメントは、ジスルフィド結合によって連結された(linked together)2の抗原-結合F(ab)部分を有し、それゆえ二価であり、分子量は約110 kDaである。二価抗体断片(F(ab')2フラグメント)は、全IgG分子よりも小さく、組織へのよりよい浸透を可能にし、ひいては免疫組織化学(immunohistochemistry)においてより良い抗原認識を促進する。F(ab')2フラグメントの使用は、生細胞のFc受容体又はタンパク質A/Gへの非特異的結合も回避する。F(ab')2フラグメントは、抗原を結合させることも沈殿させることも両方できる。
【００９８】
本明細書中に使用される場合、「フレームワーク(Framework)」(FR)又は「フレームワーク配列」は、CDRのない可変領域の残りの配列を意味し得る。CDR配列の正確な規定は、異なるシステムによって決定され得るので(例えば、上記参照)、フレームワーク配列の意味は、それに応じて、異なる解釈を受ける。6のCDR (軽鎖のCDR-L1、-L2、及びL3並びに重鎖のCDR-H1、-H2、及び-H3)も、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を、各鎖において4のサブ領域(FR1、FR2、FR3、及びFR4)に分割し、CDR1は、FR1及びFR2の間に位置し、CDR2は、FR2及びFR3の間に位置し、並びにCDR3は、FR3及びFR4の間に位置する。FR1、FR2、FR3、又はFR4として具体的なサブ領域を特定するものではないが、他によって言及されるように、フレームワーク領域は、単一の、天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたFR(combined FR)を示す。本明細書中に使用される場合、FR(単数)は、4のサブ領域のうちの1を意味し、FR(複数)は、フレームワーク領域を構成する4のサブ領域のうちの2以上を意味する。
【００９９】
ヒト重鎖及び軽鎖FR配列は、当分野において知られた技術を用いて、非ヒト抗体をヒト化するための重鎖及び軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列(又は単に、「アクセプター」配列)として使用され得ると、当分野において知られている。1の実施態様では、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列はV-ベース(V-base) (hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等の公に(publicly)利用可能なデータベースにおいて、又は国際ImMunoGeneTics(登録商標)(IMGT(登録商標))情報システム(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)において列挙されたフレームワーク配列から選択される。
【０１００】
「Fv」は、完全な抗原-認識部位及び結合部位を含む最小抗体断片に言及するために、本明細書中において使用される。この領域は、1の重鎖可変ドメイン及び1の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。
【０１０１】
「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン(germline immunoglobulin)配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体に言及するために、本明細書中において使用される。開示のヒト抗体は、例えば、CDRにおける、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロ(in vitro)でランダムもしくは部位特異的な突然変異によって導入された突然変異、又はインビボで体細胞突然変異により導入された突然変異)を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、マウス等の別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図されていない。
【０１０２】
「ヒト化抗体」は、非-ヒト種(例えば、マウス)からの重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含むが、VH及び/又はVL配列のうちの少なくとも一部が、より「ヒトのような(human-like)、」すなわち、ヒト生殖細胞可変配列により類似するように改変されている抗体を記載するために、本明細書において使用される。「ヒト化抗体」は、抗体もしくはこの変異体(variant)、誘導体(derivative)、類似体(analog)、又は断片であり、該抗体もしくはその変異体、誘導体、類似体、又は断片は、免疫特異的に(immunospecifically)対象の抗原に結合し、該抗体もしくはこの変異体、誘導体、類似体、又は断片は、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク(FR)領域、並びに非-ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域(complementary determining region, CDR)を含む。明細書中に使用される場合、CDRとの関連において、用語「実質的に(substantially)」は、非-ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一のアミノ酸配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、少なくとも1の、及び通常2の可変ドメイン(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)の実質的に全てを含み、該可変ドメインにおいて、全て又は実質的に全てのCDR領域は、非-ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のそれらに相当し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列(consensus sequence)のそれらのものである。１つの実施態様では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、軽鎖も、重鎖の、少なくとも可変ドメインも含む。抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びCH4領域も含み得る。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び/又はヒト化重鎖のみを含む。
【０１０３】
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、及びIgEを含むいかなるクラスの免疫グロブリン、並びに限定するものではないが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含むいかなるアイソタイプからも選択され得る。ヒト化抗体は、1を超えるクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、また、特定の定常ドメインは、当分野において周知の技術を用いて、望ましいエフェクター機能を最適化するために選択され得る。
【０１０４】
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びCDRは、親配列に正確に一致する必要はなく、例えば、その部位におけるCDR又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかに一致しないように、ドナー抗体CDR又はコンセンサスフレームワークが、少なくとも1のアミノ酸残基の置換、挿入、及び/又は欠失(deletion)によって突然変異させられ得る。好ましい実施態様では、かかる変異は、しかしながら、広範囲なものではないだろう(extensive)。通例、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のヒト化抗体残基が、親FR及びCDR配列のそれに一致するだろう。本明細書中で使用される場合、用語「コンセンサスフレームワーク(consensus framework)」は、免疫グロブリンコンセンサス配列におけるフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリンコンセンサス配列(consensus immunoglobulin sequence)」は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー(例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987参照))において最も頻繁に現れるアミノ酸(又はヌクレオチド)から形成された配列を指す。「免疫グロブリンコンセンサス配列」は、それゆえ、「コンセンサスフレームワーク領域(consensus framework region)(複数可)」及び/又は「コンセンサスCDR(複数可)」を含み得る。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置は、該ファミリーにおいてその位置に最も頻繁に現れるアミノ酸によって占められる。2のアミノ酸が同じ様に頻繁に現れる場合、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。
【０１０５】
「超可変領域(Hypervariable region)」は、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基に言及するために、本明細書において使用される。Kabat et al., 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に規定されたように、及び/又はChothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に規定されたように、並びに/あるいはMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)に「AbMループ(AbM loop)」として規定されたように、及び/又は国際ImMunoGeneTics情報システムデータベースにおけるLefranc et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)に規定されたように、超可変領域は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインにおける「相補性決定領域」あるいは「CDR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「FR」の残基は、本明細書中に規定されるように、超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。
【０１０６】
2以上のポリペプチド又はポリヌクレオチド(polynucleotide)配列の関連で本明細書中に使用される場合、「同一の(Identical)」又は「同一性(identity)、」は、配列が、特定の領域にわたって同じである特定のパーセンテージの残基を有することを意味し得る。パーセンテージは、2の配列を最適にアライメントする(aligning)こと、特定の領域にわたって該2の配列を比較すること、一致した位置の数を算出するために、両方の配列において現れる同一の残基の位置の数を決定すること、特定の領域における位置の合計数で一致した位置の数を除すること、並びに結果に100をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。2の配列が、異なる長さである場合、又はアライメントが1以上の付着端(staggered ends)を作り出し、かつ、比較の特定の領域が、単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。
【０１０７】
「Kabatナンバリング(numbering)、」「Kabat規定(definitions)、」及び「Kabat標識(labeling)」は、本明細書中において区別しないで使用される。当分野において識別されるこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域において他のアミノ酸残基より可変の(すなわち、超可変の(hypervariable))アミノ酸残基、又はその抗原結合部分をナンバリングするシステムを指す(Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190:382-391 (1971) 及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))。重鎖可変領域に関して、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置31から35まで、CDR2についてアミノ酸位置50から65まで、CDR3についてアミノ酸位置95〜102までに及ぶ。軽鎖可変領域に関して、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置24から34まで、CDR2についてアミノ酸位置50〜56まで、CDR3についてアミノ酸位置89から97までに及ぶ。
【０１０８】
本明細書中に使用される場合、「脂質ラフト」は、(例えば、膜の他の領域と比較して)濃縮された量のコレステロールを有する細胞の膜のミクロドメイン(microdomain)を指す。いくつかの実施態様では、濃縮(enrichment)は、2倍超である。他の実施態様では、濃縮は、3倍超である。なお他の実施態様では、濃縮は、4倍超である。更に他の実施態様では、濃縮は、膜の他の領域と比べて、5倍多いコレステロールを上回る。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル(Monoclonal)抗体」は、実質的に均一な(homogeneous)抗体の集団から得られた抗体(すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る、天然に生じる可能性がある変異を除いて、同一である)を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原が標的であり、高度に特異的である。更に、異なる決定因子(determinant) (エピトープ)を標的とする異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体標品と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原において単一の決定因子を標的とする。本明細書中におけるモノクローナル抗体としては、具体的には「キメラ(chimeric)」抗体が挙げられ、該キメラ抗体では、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であり、一方、該鎖(複数可)の残りは、別の種に由来する抗体、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びに、生物学的に(biological)望ましいものを示す限りにおいて、かかる抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である。
【０１１０】
本明細書中に使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」としては、任意かつ全ての、溶媒(solvents)、分散媒(dispersion media)、被覆剤(coating)、抗菌剤(antibacterial agent)及び抗真菌剤(antifungal agent)、等張剤(isotonic agent)及び吸収遅延剤(absorption delaying agents)、並びに生理学的に適合可能な同様のものが挙げられる。医薬的に許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水(saline)、リン酸緩衝(phosphate buffered)生理食塩水、ブドウ糖(dextrose)、グリセロール、エタノール等並びにこれらの組み合わせのうちの1以上が挙げられる。多くの場合、組成物(composition)において等張剤、例えば、砂糖、マンニトール(mannitol)、ソルビトール(sorbitol)等の多価アルコール(polyalcohol)、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。医薬的に許容な可能な担体は、保存可能期間あるいは抗体もしくは抗体の部分の有効性を増進する、浸潤剤(wetting agents)又は乳化剤(emulsifying agent)、防腐剤(preservatives)あるいは緩衝剤(buffers)等の少量の補助物質(auxiliary substances)を更に含み得る。
【０１１１】
本明細書中に使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、2以上のヌクレオチドの多量体型(polymeric form)を指し、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型(modified form)を指す。該用語は、DNAの1本鎖形態及び2本鎖形態を含む。用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」と自然において一緒に発見される全て又は一部のポリヌクレオチドと結合しておらず、自然においては連結されないポリヌクレオチドに機能可能に連結され(operably linked)、あるいは、より大きな配列の一部として自然において存在するものではない、ポリヌクレオチド(例えば、ゲノムの、cDNAの、もしくは合成起源(synthetic origin)のポリヌクレオチド、又はこれらのいくつかの組み合わせ)を意味するものとする。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意の重合鎖(polymeric chain)を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、用語ポリペプチドと区別しないで使用され、アミノ酸の重合鎖も指す。用語「ポリペプチド」は、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片、及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体又は重合体(polymeric)であり得る。
【０１１３】
「組換え(Recombinant)抗体」、「複数の組換え抗体」は、1以上のモノクローナル抗体をコードする核酸配列の全て又は一部を、適切な発現ベクターに組換え技術(recombinant techniques)によってクローニングし、かつ、その後に適切な宿主細胞において抗体を発現することを含む、1以上の工程によって調整された抗体を指す。該用語は、組換えによって製造されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体(完全な又は部分的なヒト化)を含み、抗体断片から形成された多重特異的な又は多価の構造、二価抗体(bifunctional antibodies)、ヘテロ共役(heteroconjugate) Ab、DVD-Ig(登録商標)、及び本明細書中(i)に記載された他の抗体を含むが、これらに限定されない。(二重可変(Dual-variable)ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作製する方法は、Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)に記載される)。本明細書中で使用される場合、用語「二価(bifunctional)抗体、」は、1の抗原部位に対する特異性を有する第1アームと、異なる抗原部位に対する特異性を有する第2アームとを含む抗体を指す。すなわち、二価抗体は、二重特異性を有する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、「一本鎖Fv又は「scFv」は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する抗体断片を指す。一般に、Fvポリペプチドは、VH及びVLドメインの間のポリペプチドリンカーを更に含み、該ポリペプチドリンカーは、scFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にする。scFvの総説については、Pluckthun in the The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、「被験体(Subject)」及び「患者(patient)」は、区別することなく、哺乳類(例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット(guinea pig)、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル(cynomolgous)又はアカゲザル(rhesus monkey)、チンパンジー(chimpanzee)、等のサル)及びヒト)を含むが、これらに限定されない、任意の脊椎動物を意味する。いくつかの実施態様では、被験体は、ヒト又は非ヒトであり得る。被験体又は患者は、他の種類の治療を受けていてもよい。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」は、望ましい治療的結果を達成するための、必要な用量及び期間の有効量を意味する。治療有効量は、疾病(disorder)もしくは1以上のその症状の重症度(severity)及び/又は継続期間を低減させ又は改善し(ameliorate)、疾病の進行を阻止し、疾病の退縮(regression)を引き起こし、疾病に関連する1以上の症状の再発(recurrence)、発達(development)、発症又は進行(progression)を阻止し、疾病を検出し、あるいは別の治療(例えば、予防又は治療剤)の予防(prophylactic)もしくは治療効果(複数可)を促進又は改善するのに十分な治療の量及び/又は継続期間(duration)であり得る。抗体又は抗体の部分の治療有効量は、当業者によって決定され得、個体の疾患の状態、年齢、性別、及び体重等の要因、並びに個体における望ましい応答を引き出す抗体又は抗体の部分の能力に従って、様々であり得る。治療有効量は、また、該有効量において、抗体、又は抗体の部分のいかなる毒性作用もしくは有害作用(detrimental effects)よりも、治療上の有益な効果が上回るものである。
【０１１７】
「治療する(Treat)」、「治療すること(treating)」又は「治療(treatment)」は、疾患の発症又は進行を後退させ(reversing)、軽減し(alleviating)、又は抑制し、あるいは当該用語が適用されるかかる疾患の1以上の症状を後退させ、軽減し、又は抑制することを記載するために、本明細書中において区別することなくそれぞれ使用される。被験体の状態(condition)に応じて、用語は、疾患を予防することも指し、疾患の発症を予防すること、又は疾患に関連する1以上の症状を予防することを含む。治療は、急性(acute)又は慢性的(chronic)な方法においていずれかが実行され得る。該用語は、疾患又は疾患の症状に伴う苦痛(affliction)より前に、疾患の重症度又はかかる疾患に関連する症状を低減させることも指す。かかる予防すなわち苦痛に先立つ疾患又はその症状の重症度の低減は、疾患又はその症状に苦しめられる投与時期にない被験体に、本発明の剤又は医薬組成物を投与することを指す。「予防」は、疾患又はかかる疾患に関連する1以上の症状の再発(recurrence)を予防することも指す。「治療すること」は、上述の通りであるため、「治療」及び「治療的に(therapeutically)、」は、治療行為を指す。
【０１１８】
「変異体(Variant)」は、挿入、欠失、又はアミノ酸の保存的置換(conservative substitution)によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも1の生物学的活性を保っているペプチド又はポリペプチドを記載するために本明細書中において使用される。「生物学的活性」の代表例としては、特定の抗体によって結合される能力、又は免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体は、少なくとも1の生物学的活性を保っているアミノ酸配列を有する標準(referenced)タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を記載するためにも、本明細書において使用される。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性の異なるアミノ酸(例えば、親水性(hydrophilicity)、荷電領域(charged regions)の程度及び分布)で置換することは、通常、若干の変更を含むものとして当分野において認識されている。これらの若干の変更は、当分野において理解される通り、アミノ酸のハイドロパシーインデックス(hydropathic index)を考慮することによって部分的に確認され得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性及び電荷の考慮に基づくものである。同様のハイドロパシーインデックスのアミノ酸が置換され、それでもタンパク質機能を保つことができることが当分野において知られている。1の態様では、±2のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保っているタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするためにも使用され得る。ペプチドの文脈でのアミノ酸の親水性の考慮が、ペプチドの最大の親水性局所平均の計算、つまり、抗原性(antigenicity)及び免疫原性とよく相関すると報告されている有用な評価を可能にする。米国特許第4,554,101号は、参照することによって本明細書中に全体が組み込まれる。同様の親水性値(hydrophilicity values)を有するアミノ酸の置換が、当分野において理解されているように、生物学的活性、例えば免疫原性を保っているペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±2以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸のハイドロパシーインデックス及び親水性値の両方が、アミノ酸の特定の側鎖によって影響される。観察結果と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかにされる、アミノ酸、特に、これらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性によって決まると理解されている。「変異体」は、タンパク質(proteolysis)、リン酸化反応(phosphorylation)、又は他の翻訳後修飾(other post-translational modification)等により、異なって処理されており、それでもその抗原反応性を保っているポリペプチド又はその断片を記載するためにも使用され得る。
【０１１９】
本明細書中において使用される場合、「バーニアゾーン(Vernier zone)」は、Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499、参照することによって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように、CDR構造を調節し、抗原に対する適合性(fit)を微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、CDRの基礎になる層を形成し、CDRの構造及び抗体の親和性に影響を与え得る。
【０１２０】
本明細書中の各数字の範囲の記述に関しては、その間の、同程度の精度をともなう、介在する各数値は、明確に予期されている。例えば、6-9の範囲について、数7及び8は、6及び9に加えて予期されており、並びに6.0-7.0の範囲について、数6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0は、明確に予期されている。
【０１２１】
2.神経細胞の生存及び軸索成長及び/又は再生の調節方法
本明細書中に提供されるのは、神経細胞の生存及び軸索成長の両方及び/又は再生を調節する方法である。調節することは、反発性ガイダンス分子A (RGMa)とネオジェニンとのシス相互作用を変化させること(例えば、阻止すること又は妨害すること)、及び/又は脂質ラフトの完全性(integrity)を破壊することを含み得る。
【０１２２】
1の実施態様では、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用が、それを必要とする被験体において調節されるものである。RGMaとネオジェニンとのシス相互作用は、より詳細に後述される。調節する方法は、このシス相互作用を妨害し得る。調節する方法は、このシス相互作用を阻止し得る。
【０１２３】
シス相互作用を妨害又は阻止することは、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。シス相互作用を妨害又は阻止することは、ネオジェニン受容体の動員を調節することにより、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。神経細胞は、網膜神経節細胞(RGC)、運動ニューロン、海馬細胞(hippocampal cell)、皮質細胞(cortical cell)、視細胞、及び脊髄神経細胞であり得るが、これらに限定されない。
【０１２４】
調節する方法は、被験体に剤を投与することを含み得る。この剤は、シス相互作用を妨害し得る。この剤は、シス相互作用を阻止し得る。それゆえに、シス相互作用を妨害又は阻止することによって、剤は、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１２５】
別の実施態様では、調節されるものは、脂質ラフトの完全性である。調節する方法は、脂質ラフトを破壊し得る。調節する方法は、脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させ得、このことが脂質ラフトを破壊し得る。脂質ラフトを破壊すること又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、動員に影響を与え得、このことが、今度は、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１２６】
脂質ラフトの完全性を調節する方法は、被験体に剤を投与することを含み得る。この剤は、脂質ラフトを破壊し及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を減少させ得る。それゆえに、脂質ラフトを破壊すること及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用の能力に影響を与え得る。加えて、脂質ラフトを破壊すること及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、RGMaとネオジェニンとのトランス相互作用(trans interaction)の能力に影響も与え、並びに/あるいはRGMとネオジェニンとのトランス相互作用が軸索成長を抑制する能力に影響を与え得る。かかる剤によって脂質ラフトを破壊すること及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１２７】
これらの調節する方法は、より詳細に後述されるように、それを必要とする被験体を治療する方法において使用され得る。
【０１２８】
a. RGMaとネオジェニンとのシス相互作用及び脂質ラフトの破壊
方法は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用、及び/又は脂質ラフトを調節し得る。
【０１２９】
RGMaは、33 kDaグリコシルホスファチジルイノシトール(glycosylphosphatidylinositol, GPI)-結合(linked)膜糖タンパク質である。完全長のRGMaタンパク質は、N-末端シグナルペプチド、RGDモチーフ、部分的なフォン・ヴィレブランド因子(von Willebrand factor, vWF)タイプDドメイン(type D domain)、疎水性領域、及びC-末端GPI-アンカー(anchor)を含む。RGMaは、切断されて(cleaved)、様々なRGMaペプチドを生じ、いくつかの該ペプチドは、膜に結合し、いくつかの該ペプチドは可溶性であり、いくつかの該ペプチドは、ジスルフィド結合によって連結される。例えば、切断としては、自己切断(autoproteolysis)が挙げられ得、該自己切断において結果として生じるN-末端(N-RGMa)及びC-末端(C-RGMa)ドメインは、ジスルフィド架橋によって連結され得る。切断としては、RGMaから可溶性N-末端ペプチドを放出する酵素Furin-1及びシェディング切断部位も挙げられ得る。
【０１３０】
RGMaは、ネオジェニンを結合させる網膜軸索のための化学反発性(chemorepulsive)分子として当初同定された。ネオジェニンは、膜貫通(transmembrane)受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、4のN-末端免疫グロブリン-様ドメイン、6のフィブロネクチン(fibronection)ドメイン、膜貫通ドメイン、及びC-末端ドメインを含む。
【０１３１】
全体で、RGMa及びネオジェニンは、発生中の視覚系(visual system)における軸索誘導、及び発生中の脳における軸索路誘導(axon tract guidance)を調節する。特に、RGMaとネオジェニンとのトランス相互作用は、発生中の中枢神経系(central nervous system, CNS)及び損傷CNSにおける軸索成長及び/又は再生を阻害する。このトランス相互作用では、RGMaペプチドは、神経細胞を取り囲んでいる細胞によって分泌され(secreted)、分泌されたRGMaペプチドが、神経細胞の表面(surface neurons)に位置するネオジェニンと相互作用する。RGMaとネオジェニンとのこのトランス相互作用が、細胞の生存も促進する。このトランス相互作用の非存在下では、ネオジェニンは、細胞死、すなわちアポトーシスを誘導する。それゆえに、ネオジェニンは、トランス相互作用の存在下では細胞の生存を促進するためのシグナルを送るが、トランス相互作用の非存在下では細胞死を誘導するためのシグナルを送る依存性の受容体(dependence-receptor)である。
【０１３２】
本明細書中に実例で示すように、細胞死を誘導するためのネオジェニンシグナリングは、RGMaとネオジェニンとの間に起こるシス相互作用によって調節される。このシス相互作用は、神経細胞の同じ細胞膜(plasma membrane)と会合するRGMaとネオジェニンとの間において起こる。特に、このシス相互作用は、神経細胞の膜における脂質ラフトへのネオジェニンの動員を促進する。脂質ラフトは、コレステロールが濃縮されている膜内のミクロドメインである。脂質ラフトを破壊すること及び/又はシス相互作用を阻止し又は妨害することは、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を調節し、これによってネオジェニンシグナリングに起因する細胞死を妨害又は減少させる。
【０１３３】
また、本明細書中に実例で示されたように、軸索成長及び/又は再生を阻害するために、RGMaとネオジェニンとのこのシス相互作用は、RGMaとネオジェニンとのトランス相互作用に加えて必要である。それゆえに、シス相互作用を阻止すること又は妨害することは、トランス相互作用が起きたとしても、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止及び/又は脂質ラフトからネオジェニンを除去し、これによってネオジェニンシグナリングに起因する軸索成長及び/又は再生の阻害を防止又は減少させる。
【０１３４】
本明細書中に更に実例で示されるように、より詳細に後述されるコレステロール降下剤を用いてコレステロールを枯渇させることにより、脂質ラフトを破壊することが、(1)細胞死及び(2)ネオジェニンシグナリングに起因する軸索成長及び/又は再生の阻害を防止し、又は減少させる。ネオジェニンが、シグナルを送るために脂質ラフトに存在することが必要であるため、この防止または減少が起こると仮定されている。
【０１３５】
このように、ネオジェニンシグナリングが、(1)コレステロール降下剤で脂質ラフトを破壊すること及び/又は(2) RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止し又は妨害することによって、阻害又は阻止され得ることが、本明細書中において実例で示される。
【０１３６】
やはり本明細書中に実例で示されるように、トランス及びシス相互作用は、RGMa及びネオジェニンの異なる部分によって調節される。RGMaとネオジェニンとのトランス相互作用は、ネオジェニンの6のフィブロネクチン(fibronection)ドメイン(本明細書中では、「ネオジェニンの6FNIIIドメイン」又は「6FNIIIドメイン」しても知られる)によって調節される。RGMaとネオジェニンとのシス相互作用は、RGMaのアミノ酸28〜73(本明細書中では、「N-Raft」としても知られる)及びネオジェニンの4の免疫グロブリン-様ドメイン(本明細書中では、「ネオジェニンの4Igドメイン」又は「4Ig」としても知られる)によって調節される。RGMaとネオジェニンとのシス相互作用は、骨形成タンパク質(Bone Morphogenetic Protein, BMP)によっても促進され、従って、BMPも脂質ラフトへのネオジェニンの動員にも必要である。
【０１３７】
やはり本明細書中に実例で示されるように、N-Raftの一部は、シス相互作用には十分である。これらの部分は、RGMaのアミノ酸54〜73及び40〜62であるが、RGMaのアミノ酸28〜54又は54〜62ではない。このマッピングは、RGMaのアミノ酸40〜73が、シス相互作用には十分であり得ることを示した。対照的に、完全長のRGMaは、ネオジェニンの6FNIIIドメインと相互作用することができない。総合すると、このことは、シス相互作用がRGMaの構造又は折り畳み(folding)に依存し得ることを示した。完全長のRGMaは、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を起こすためには、RGMaに対して4Ig結合部位(すなわち、RGMaのアミノ酸28〜73、54〜73、40〜62、及び40〜73のによって包含される)を露出させるための、BMP等の付加的因子が必要であり得る。
【０１３８】
b.剤
上述のように、方法は、被験体に剤を投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し得る。剤は、シス相互作用を妨害又は阻止し得、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進する。剤は、脂質ラフトを破壊し、脂質ラフト内からコレステロールを減少させることを含み、このことは、今度は神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進する。剤は、抗体、ペプチド剤、コレステロール降下剤、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。抗体、ペプチド剤、及びコレステロール降下剤は、より詳しく後述される。
【０１３９】
(1)ペプチド剤
方法は、被験体へペプチド剤を投与することによって、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。ペプチド剤は、シス相互作用を妨害又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。ペプチド剤は、RGMaペプチド、ネオジェニンペプチド、ノギンペプチド、それらの断片、それらの変異体、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。RGMaペプチド、ネオジェニンペプチド、及びノギンペプチドは、より詳しく後述される。
【０１４０】
(a)ネオジェニンペプチド
方法は、被験体へネオジェニンペプチドを投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。ネオジェニンペプチドは、シス相互作用を妨害又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１４１】
ネオジェニンペプチドとしては、ネオジェニンの断片、ネオジェニンの変異体、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ネオジェニンペプチドとしては、ネオジェニンの2の免疫グロブリン-様ドメイン、それらの断片、それらの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ネオジェニンペプチドとしては、ネオジェニンの3の免疫グロブリン-様ドメイン、それらの断片、それらの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ネオジェニンペプチドとしては、ネオジェニンの4の免疫グロブリン-様ドメイン、それらの断片、それらの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ネオジェニンの4の免疫グロブリン-様ドメインは、本明細書中においてネオジェニンの4Igドメインも指し得る。それゆえに、ネオジェニンペプチドとしては、4Igドメイン、それらの断片、それらの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。
【０１４２】
ネオジェニンペプチドとしては、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列が挙げられ得る。ネオジェニンペプチドとしては、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383を含むアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、 81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、又は99%を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。ネオジェニンペプチドは、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１４３】
ネオジェニンペプチドとしては、受入番号AAI43272 (配列番号11)のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列が挙げられ得る。ネオジェニンペプチドは、受入番号AAI43272 (配列番号11)のアミノ酸1〜417を含むアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。ネオジェニンペプチドは、受入番号AAI43272 (配列番号11)のアミノ酸1〜417、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１４４】
ネオジェニンペプチドとしては、配列番号8に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ネオジェニンペプチドとしては、配列番号8に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。ネオジェニンペプチドは、配列番号8に示されるアミノ酸配列であり得る。
【０１４５】
(b)RGMaペプチド
方法は、被験体へRGMaペプチドを投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。RGMaペプチドは、シス相互作用を妨害し又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１４６】
RGMaペプチドとしては、RGMaの断片、RGMaの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。RGMaペプチドは、ネオジェニンの4Igドメインと相互作用するRGMaのいかなる断片であってもよい。RGMaペプチドは、RGMaとネオジェニンとの間にシス相互作用を生じさせるために必要であり得るいかなる二次構造を含んでもよい。
【０１４７】
RGMaペプチドとしては、配列番号2に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。RGMaペプチドとしては、配列番号2に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMaペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列であり得る。配列番号2に示されるアミノ酸配列は、本明細書中において「N-Raft」とも呼ばれ得る。配列番号2に示されるアミノ酸配列は、図16に示され、RGMaのアミノ酸28〜73である。
【０１４８】
RGMaペプチドとしては、配列番号3に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。RGMaペプチドとしては、配列番号3に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMaペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列であり得る。配列番号3に示されるアミノ酸配列は、RGMaのアミノ酸54〜73であり得る。
【０１４９】
RGMaペプチドとしては、配列番号4に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。RGMaペプチドとしては、配列番号4に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMaペプチドは、配列番号4に示されるアミノ酸配列であり得る。配列番号4に示されるアミノ酸配列は、RGMaのアミノ酸40〜62であり得る。
【０１５０】
RGMaペプチドとしては、配列番号7に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。RGMaペプチドとしては、配列番号7に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMaペプチドは、配列番号4に示されるアミノ酸配列であり得る。配列番号7に示されるアミノ酸配列は、RGMaのアミノ酸40〜73であり得る。
【０１５１】
RGMaペプチドとしては、配列番号10に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。RGMaペプチドとしては、配列番号10に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMaペプチドは、配列番号10に示されるアミノ酸配列であり得る。
【０１５２】
RGMaペプチドと同じように作用するペプチド、すなわち、RGMaとネオジェニンとの間のシス相互作用を阻止又は妨害するペプチドとしては、RGMcからのペプチドが挙げられ得る。このRGMcペプチドとしては、配列番号9に示されるアミノ酸配列、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。RGMcペプチドとしては、配列番号9に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。RGMcペプチドは、配列番号9に示されるアミノ酸配列であり得る。
【０１５３】
(c)ノギン
方法は、被験体へノギンペプチドを投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。ノギンペプチドは、シス相互作用を妨害又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１５４】
ノギンペプチドとしては、ノギンの断片、ノギンの変異体、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。ノギンペプチドとしては、受入番号AAA83259 (配列番号5)のアミノ酸配列が挙げられ得る。ノギンペプチドは、受入番号AAA83259 (配列番号5)のアミノ酸配列に対し、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ得る。ノギンペプチドは、受入番号AAA83259 (配列番号5)のアミノ酸配列であってもよい。
【０１５５】
(2)コレステロール降下剤
方法は、コレステロール降下剤を被験体へ投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。コレステロール降下剤は、脂質ラフトを破壊し、及び/又はシス相互作用を妨害又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１５６】
コレステロール降下剤は、メチル-β-シクロデキストリン(methyl-β-cyclodextrin, MβCD)、コレステロール酸化酵素(cholesterol oxidase, CO)、 AY-9944、スタチン(statin)、サブチリシン/ケキシン(kexin)9型(PCK9)阻害剤、ナイスタチン(nystatin)、フィリピン(filipin)、前駆タンパク質転換酵素(proprotein convertase)、BM15.766、アルキルリン脂質類似体(alkylphospholipid analog) (例えば、ミルテホシン(miltefosine)、エデルホシン(edelfosine)、及びペリホシン(perifosine))、又はそれらの任意の組み合わせであってもよいが、これらに限定されない。
【０１５７】
(3)抗体
方法は、抗体を被験体へ投与することにより、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し得る。抗体は、シス相互作用を妨害又は阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０１５８】
抗体は、上述されたRGMaペプチドに対するものであってもよい。このRGMaペプチドは、シス相互作用をRGMaとネオジェニンとの間に起こすために必須であり得る任意の二次構造を含む。それゆえに、RGMaペプチドに対する抗体は、この二次構造を特異的に認識し、選択的に結合させ得る。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号2に示されるアミノ酸配列、配列番号3に示されるアミノ酸配列、配列番号4に示されるアミノ酸配列、配列番号7に示されるアミノ酸配列、配列番号9に示されるアミノ酸配列、及び/又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を特異的に認識し、選択的に結合させ得る。抗体は、RGMaのアミノ酸28〜73、40〜62、54〜73、及び/又は40〜73を特異的に認識し、選択的に結合し得る。
【０１６０】
他の実施態様では、抗体は、上述したネオジェニンペプチド、例えば、ネオジェニンの4Igドメイン又はネオジェニンの細胞外部分に対するものであってもよい。抗体は、ネオジェニンの4Igドメインを特異的に認識し、選択的に結合させ得る。抗体は、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383、受入番号AAI43272 (配列番号11)のアミノ酸1〜417、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を特異的に認識し、選択的に結合させ得る。
【０１６１】
(a)抗体調製/製造
抗体は、任意の様々な技術によって調製され得る。一般に、抗体は、従来技術を用いて、あるいは、抗体の製造を可能にするための、適切な細菌の又は哺乳類の細胞宿主への抗体遺伝子、重鎖、及び/又は軽鎖のトランスフェクションを用いて、モノクローナル抗体を作製することを含む細胞培養技術によって製造され得、抗体は組み換え体(recombinant)であり得る。用語「トランスフェクション(transfection)」の様々な形は、外来DNAを原核又は真核の宿主細胞へ導入するために一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション(electroporation)、リン酸カルシウム沈殿(calcium-phosphate precipitation)、DEAE-デキストラン(dextran)トランスフェクション等を包含することを意図される。かかる真核細胞(及び特に哺乳類細胞)は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれた、免疫学的に活性のある(immunologically active)抗体を構築し、分泌する可能性が高いため、原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることができるが、真核細胞内で抗体を発現させることが好ましく、哺乳類の宿主細胞内が最も好ましい。
【０１６２】
本発明の組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳類宿主細胞としては、例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)に記載されたようなDHFR選択的マーカー、NS0骨髄腫細胞(myeloma cell)、COS細胞、及びSP2細胞とともに使用されるチャイニーズハムスター卵巣(Chinese Hamster Ovary, CHO cells) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)に記載されたdhfr-CHO細胞等を含む)が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞へ導入される場合、抗体は、宿主細胞において抗体を発現すること、あるいは、より好ましくは、ホスト細胞が生育される培養培地(culture medium)へ抗体を分泌することを可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって製造される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。
【０１６３】
宿主細胞は、また、Fabフラグメント又はscFv分子等の機能的な抗体断片を製造するために使用され得る。上記手順の変化形は、本発明の範囲内であると理解されるだろう。例えば、本発明の抗体の、軽鎖及び重鎖/軽鎖又は重鎖のいずれかの、機能的な断片をコードするDNAを宿主細胞にトランスフェクションすることが好ましい場合があり得る。組み換えDNA技術は、また、対象の抗原に結合するためには必要でない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするDNAの一部又は全てを除去するために使用され得る。かかる切断(truncated)DNA分子から発現した分子も、本発明の抗体により包含される。加えて、二価抗体であって、標準的な化学的架橋方法によって本発明の抗体を第2抗体に架橋すること(crosslinking)により、一方の重鎖及び一方の軽鎖が本発明の抗体(すなわち、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを結合させる)であり、他方の重鎖及び軽鎖がRGMaペプチド又はネオジェニンペプチド以外の抗原に特異的である、二価抗体が製造され得る。
【０１６４】
本発明の抗体、又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましいシステムでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウムを介するトランスフェクションにより、dhfr-CHO細胞に導入される。組み換え発現ベクター内では、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が、高レベルの遺伝子の転写を促進するため、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメント(regulatory elements)にそれぞれ機能可能に連結される。組み換え発現ベクターは、DHFR遺伝子も有し、該DHFR遺伝子は、メトトレキサート(methotrexate)セレクション/増幅(amplification)を用いて、ベクターをトランスフェクションされているCHO細胞をセレクションすることを可能にする。セレクションされた形質転換体(transformant)宿主細胞を、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために培養し、完全な抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を使用して、組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクションし、形質転換体をセレクションし、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。さらになお、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、適切な培養培地において本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。該方法は、培養培地から組換え抗体を単離することを更に含み得る。
【０１６５】
モノクローナル抗体を調製する方法は、望ましい特異性を有する抗体を製造することができる不死の(immortal)細胞株を調製することを含む。かかる細胞株は、免疫動物(immunized animal)から得られた脾臓細胞(spleen cell)から製造され得る。動物は、RGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチドあるいはそれらの断片及び/又はそれらの変異体で免疫され得る(immunized)。動物を免疫するために使用されるペプチドは、ヒトFc、例えばヒト抗体のフラグメント結晶化可能領域(fragment crystallizable region)又はテール領域をコードするアミノ酸を含み得る。脾臓細胞は、、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー(fusion partner)を用いた融合により、その後、不死化され得る。様々な融合技術が採用され得る。例えば、脾臓細胞及び骨髄腫細胞は、非イオン界面活性剤(nonionic detergent)で数分間、混合され、その後、ハイブリッド細胞のその増殖をサポートするが、骨髄腫細胞の増殖をサポートしない選択的培地に低密度でまかれ得る。1のかかる技術は、ヒポキサンチン(hypoxanthine)、アミノプテリン(aminopterin)、チミジン(thymidine) (HAT)セレクションを用いる。別の技術としては、電気融合(eletrofusion)が挙げられる。十分な時間の後、通常、約1から2週間、ハイブリッド(hybrid)のコロニーを観察する。単一のコロニーを、セレクションし、その培養上清(culture supernatants)をポリペプチドに対する結合活性について試験した。高い反応性及び特異性を有するハイブリドーマ(Hybridoma)が使用され得る。
【０１６６】
モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。加えて、マウス等の適切な脊椎動物宿主の腹膜腔(peritoneal cavity)へのハイブリドーマ細胞株の注入等、様々な技術が、生産量を増進するために採用されうる。モノクローナル抗体は、その後、腹水(ascites fluid)又は血液から採取され得る。混入物質(Contaminant)は、クロマトグラフィー(chromatography)、ゲル濾過(gel filtration)、沈殿(precipitation)、及び抽出(extraction)等の従来技術により、抗体から除去され得る。アフィニティクロマトグラフィー(Affinity chromatography)は、抗体を精製するための処理において使用され得る方法の例である。
【０１６７】
タンパク質分解酵素(proteolytic enzyme)パパインは、選択的にIgG分子を切断して、いくつかの断片を生み出し、該断片(F(ab)フラグメント)のうちの2が、それぞれ完全な抗原結合部位を含む共有結合性(covalent)ヘテロダイマー(heterodimer)を含む。酵素ペプシンは、IgG分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むF(ab’)2フラグメントを含む、いくつかの断片をもたらすことができる。
【０１６８】
Fvフラグメントは、選択的なIgM、及びまれにIgG又はIgA免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によってもたらされ得る。Fvフラグメントは、組換え技術を用いて得られ得る。Fvフラグメントは、天然の抗体分子の抗原認識能力及び結合能力(binding capabilities)の大半を保っている抗原結合部位を含む非共有結合性のVH::VLヘテロダイマーを含む。
【０１６９】
抗体、抗体断片、又は誘導体は、重鎖及び軽鎖フレームワーク(「FR」)セットの間にそれぞれ入る重鎖及び軽鎖相補性決定領域(「CDR」)セットを含み得、該重鎖及び軽鎖フレームワーク(「FR」)セットが、CDRへの支えを提供し、かつ、互いに関してCDRの空間的関係を決定付ける。DRセットは、重鎖又は軽鎖V領域の3の超可変領域を含み得る。重鎖又は軽鎖のN-末端から進んで、これらの領域は、「CDR1」、「CDR2」、及び「CDR3」、としてそれぞれ表示される。抗原結合部位は、、それゆえ、それぞれの重鎖及び軽鎖V領域からのCDRセットを含む、6のCDRを含み得る。単一のCDRを含むポリペプチド(例えば、CDR1、CDR2、又はCDR3)は、「分子認識ユニット(molecular recognition unit)」と呼ばれ得る。抗原-抗体複合体の結晶学的解析(Crystallographic analyses)は、CDRのアミノ酸残基が結合抗原と広範な接触(extensive contact)を形成し、最も広範な抗原接触は、重鎖CDR3とのものであることを示した。従って、分子認識ユニットは、抗原結合部位の特異性に主に関与し得る。一般に、CDR残基(CDR residue)は、抗原結合に影響を与えることに直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１７０】
必要な特異性を有する抗体を製造又は単離する他の適切な方法が、使用され得、該方法は、当分野において知られている方法を用いるペプチド又はタンパク質ライブラリ (例えば、バクテリオファージ(bacteriophage)、リボソーム、オリゴヌクレオチド、RNA、 cDNA、酵母等、ディスプレイライブラリであるが、これらに限定されるものではない)から組換え抗体をセレクションする方法を含み、例えば、Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)、 MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.)、Biovation (Aberdeen, Scotland, UK) BioInvent (Lund, Sweden)等の様々な商用のベンダーから利用可能であるが、これに限定されない。米国特許第4,704,692号;第5,723,323号;第5,763,192号;第5,814,476号;第5,817,483号;第5,824,514号;第5,976,862号参照。当分野において知られているように及び/又は本明細書中に記載されているように、代替的な方法は、ヒト抗体のレパートリーを製造することが可能なトランスジェニック動物の免疫(immunization)に依存している(例えば、SCID mice, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161)。かかる技術としては、リボソームディスプレイ(Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135);単一細胞抗体製造技術(例えば、選択リンパ球(lymphocyte)抗体法("SLAM") (米国特許第5,627,052号, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848);ゲルマイクロドロップ(gel microdroplet)及びフローサイトメトリー(Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337;一細胞システム, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790); B-細胞セレクション(B-cell selection) (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994))が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
親和性成熟抗体は、当分野において知られる多数の手順のうちのいずれか1によって製造され得る。例えば、VH及びVLドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載するMarks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)を参照。CDR及び/又はフレームワーク残基のランダム変異導入法(Random mutagenesis)は、Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)により記載される。活性を増進するアミノ酸残基を有する選択的突然変異生成(selective mutagenesis)位置並びに接触位置又は超変異位置(hypermutation positions)における選択的突然変異(Selective mutation)は、米国特許第6,914,128 B1号に記載される。
【０１７２】
また、トランスジェニック動物、又はその乳においてかかる抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等のトランスジェニック哺乳類をもたらすように、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主へ送達することを用いて、本発明の抗体変異体が調製され得る。これらの方法は、当分野において知られており、例えば、米国特許第5,827,690号;第5,849,992号;第4,873,316号;第5,849,992号;第5,994,616号;第5,565,362号;及び第5,304,489号に記載されている。
【０１７３】
本発明のポリヌクレオチドを送達して、植物の部分又はそれから培養された細胞においてかかる抗体、特定の部分又は変異体を製造するトランスジェニック植物及びトランスジェニック培養植物細胞(cultured plant cells)(例えば、タバコ、トウモロコシ、及びウキクサであるが、これらに限定されない)をもたらすことによっても、抗体変異体が調製され得る。例えば、Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118及び該文献において引用された参考文献は、例えば、誘導プロモーターを用いて、多量の組み換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコの葉を製造することを記載する。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換えシステムにおいて製造され、もしくは、天然のソース(natural source)から精製されたものと同等の生物活性を有する哺乳類タンパク質を商業生産レベルで発現させるために使用されている。例えば、Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147及び該文献において引用された参考文献参照。抗体変異体は、また、タバコ種子及びジャガイモ塊茎(potato tubers)を含む、一本鎖抗体(scFv's)等の抗体断片を含むトランスジェニック植物の種子で大量に製造されている。例えば、Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109及び該文献において引用された参考文献参照。従って、本発明の抗体は、既知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いても製造され得る。
【０１７４】
例えば、外来性配列を加えて、免疫原性を改善し、あるいは結合性(binding)、親和性、結合速度(on-rate)、解離速度(off-rate)、結合活性(avidity)、特異性、半減期(half-life)、又は任意の他の適切な特徴を低減させ、増進し、又は改善することにより、抗体誘導体(derivative)が製造され得る。通常、一部又は全ての非ヒト又はヒトCDR配列が維持されるが、一方、可変及び定常領域の非ヒト配列が、ヒトもしくは他のアミノ酸で置き換えられる。
【０１７５】
小さな抗体断片は、2の抗原-結合部位を有するダイアボディであり得、断片は、同じポリペプチド鎖(VH VL)における軽鎖可変ドメイン(VL)に結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。例えば、欧州特許404,097号;国際WO93/11161号;及びHollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448参照。同じ鎖における2のドメインの間に対を形成することを可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインが、別の鎖の相補的ドメイン(complementary domain)と対を形成し、2の抗原結合部位を作り出さざるを得なくなる。Chen et alに対する米国特許第6,632,926号も参照、該文献は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれ、親抗体の超可変領域に挿入された1以上のアミノ酸、及び抗原に対する親抗体の結合親和性より少なくとも約2倍強い標的抗原に対する結合親和性を有する抗体変異体を開示する。
【０１７６】
抗体は、直鎖状(linear)抗体であり得る。直鎖状抗体を作製するための手順は、当分野において知られており、Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されている。簡潔には、これらの抗体は、1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。
【０１７７】
限定されるものではないが、プロテインA精製(protein A purification)、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出(acid extraction)、陰イオン(anion)又は陽イオン交換クロマトグラフィー(cation exchange chromatography)、リン酸セルロール(phosphocellulose)クロマトグラフィー、疎水性相互作用(hydrophobic interaction)クロマトグラフィー、アフィニティ―クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト(hydroxylapatite)クロマトグラフィー及びレクチン(lectin)クロマトグラフィーを含む、既知の方法により、抗体は、回収され、組み換え細胞培養物から精製され得る。高速液体クロマトグラフィー(High performance liquid chromatography, "HPLC")も精製のために使用され得る。
【０１７８】
検出可能又は治療的に抗体を標識することが有用であり得る。これらの剤に抗体を結合する(conjugate)方法は、当分野において知られている。単に図示するためだけに、抗体を、放射性原子(radioactive atom)、発色団(chromophore)、蛍光色素分子(fluorophore)等の検出可能な部分で標識し得る。かかる標識された抗体は、インビボ、もしくは単離された試験試料のいずれかにおいて診断技術のために使用され得る。抗体は、例えば、化学療法薬(chemotherapeutic drug)又は毒素等の医薬品にも結合させられ得る。これらは、サイトカイン、リガンド、別の抗体に結合させられ得る。抗体に結合して抗腫瘍効果を得るための適切な剤としては、インターロイキン(interleukin) 2 (IL-2)及び腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)等のサイトカイン;アルミニウム(III)フタロシアニンテトラスルホナート(aluminum (III) phthalocyanine tetrasulfonate)、ヘマトポルフィリン(hematoporphyrin)、及びフタロシアニン(phthalocyanine)を含む、光力学治療(photodynamic therapy)における使用のための光増感剤(photosensitizer);ヨウ素-131 (131I)、イットリウム-90 (90Y)、ビスマス-212 (212Bi)、ビスマス-213 (213Bi)、テクネチウム-99m (99mTc)、レニウム-186 (186Re)、及びレニウム-188 (188Re)等の放射性核種(radionuclide);ドキソルビシン(doxorubicin)、アドリアマイシン(adriamycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、メトトレキサート(methotrexate)、ダウノマイシン(daunomycin)、ネオカルチノスタチン(neocarzinostatin)、及びカルボプラチン(carboplatin)等の抗生物質;ジフテリア(diphtheria)毒素、緑膿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)A、ブドウ球菌エンテロトキシン(staphylococcal enterotoxin) A、アブリン(abrin)-A毒素、リシン(ricin) A (脱グリコシルリシンA(deglycosylated ricin A)及び天然リシンA)、TGF-アルファ毒素、タイワンコブラ(chinese cobra)(naja naja atra)からの細胞毒素(cytotoxin)、及びゲロニン(gelonin) (植物毒素)等の、細菌性、植物性、及び他の毒素;レストリクトシン(restrictocin) (Aspergillus restrictusによって産生されるリボソーム不活性化タンパク質)、サポリン(saporin) (Saponaria officinalisからのリボソーム不活性化タンパク質)、及びRNase等の、植物、細菌及び真菌からのリボソーム不活性化タンパク質(ribosome inactivating proteins);チロシンキナーゼ(tyrosine kinase)阻害剤; ly207702 (ジフルオロ化プリンヌクレオシド(difluorinated purine nucleoside));抗嚢胞剤を含むリポソーム(liposomes containing anti cystic agents)(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサート等);及び他の抗体又はF(ab)等の抗体断片が挙げられる。
【０１７９】
抗体は、配列決定され、組換え又は合成方法により複製され得る。それらは、また、それらをコードするヌクレオチドの直線配列を下って、更に配列決定され得る。従って、本発明は、本発明の抗体配列をコードするこれらのポリヌクレオチドを、単独で又は上述された担体、ベクター又は宿主細胞との組み合わせて提供する。
【０１８０】
ハイブリドーマ技術を使用することによる抗体の製造、選択リンパ球抗体法(selected lymphocyte antibody method, SLAM)、トランスジェニック動物、及び組換え抗体ライブラリーは、より詳しく後述される。
【０１８１】
(a)ハイブリドーマ技術を用いる抗-RGMaペプチド又はネオジェニンペプチド抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ(phage display)技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当分野において既知の多種多様の技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当分野において既知であり、かつ、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, second edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981)において教示されたハイブリドーマ技術を含むハイブリドーマ技術を用いて製造され得る。本明細書中において使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造される抗体に限定されないことも留意される。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核細胞、原核細胞、又はファージのクローン等の、単一クローンに由来する抗体を指し、これを製造する方法を指していない。
【０１８２】
1の実施態様では、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法、及び該方法によって製造される抗体を提供する。該方法は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含み得、好ましくは、ハイブリドーマは、骨髄腫細胞とRGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで免疫した動物、例えば、ラット又はマウスから単離された脾細胞(splenocyte)とを融合し、その後、本発明のポリペプチドを結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、該融合から生じたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、作製される。簡潔に、ラットは、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで免疫することができる。好ましい実施態様では、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドは、免疫応答を刺激するアジュバント(adjuvant)とともに投与される。かかるアジュバントとしては、完全又は不完全フロイントアジュバント(Freund's adjuvant)、RIBI (ムラミルジペプチド(muramyl dipeptide))又はISCOM (免疫刺激複合体(immunostimulating complexes))が挙げられる。かかるアジュバントは、限局性沈着(local deposit)においてポリペプチドを隔離することにより、迅速な分散(dispersal)からこれを保護し得、または、マクロファージ(macrophage)及び免疫システムの他の構成要素にとっての走化性(chemotactic)因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含み得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫スケジュールは、ポリペプチドの2以上の投与を含み、数週間にわたって広がるであろうが、ポリペプチドの単回投与も使用され得る。
【０１８３】
RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで動物を免疫した後、抗体及び/又は抗体-生産細胞は、動物から得ることができる。抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチド抗体を含む血清は、動物を出血させ(bleeding)又は犠死させることにより、動物から得られる。血清は、動物から得られたままを使用することができ、免疫グロブリン画分は、血清から取得することができ、あるいは、抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチド抗体を、血清から精製することができる。この方法において取得された血清又は免疫グロブリンは、ポリクローナルであり、それゆえに数々の不均一な特性を有する。
【０１８４】
免疫応答が検出されると、例えば、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに特異的な抗体がラット血清において検出されると、ラット脾臓が採取され、脾細胞が単離される。その後、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, Va., US)から利用可能な細胞株SP20からの細胞に、周知技術によって、脾細胞が融合され得る。ハイブリドーマを、限界希釈法(limited dilution)によってセレクション及びクローニングする。ハイブリドーマクローンを、その後、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを結合させることができる抗体を分泌する細胞に関する当分野において知られた方法によって分析する。通常、高濃度の抗体を含む腹水(Ascites fluid)を、陽性(positive)ハイブリドーマクローンでラットを免疫することにより、作り出すことができる。
【０１８５】
別の実施態様では、抗体産生不死化ハイブリドーマが、免疫動物から調製され得る。免疫付与後、当分野において周知のように、動物を犠死させ、脾臓B細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、上記Harlow及びLane参照。好ましい実施態様では、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。融合及び抗生物質セレクション後、ハイブリドーマを、RGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチド、またはそれらの一部、あるいはRGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチドを発現する細胞を用いてスクリーニングする。好ましい実施態様では、初期スクリーニングが、酵素結合免疫吸着検査法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)又はラジオイムノアッセイ(radioimmunoassay, RIA)、好ましくはELISAを用いて行われる。ELISAスクリーニングの例は、PCT公開第WO 00/37504号において提供される。
【０１８６】
抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチド抗体を産生するハイブリドーマは、セレクションされ、クローニングされ、ロバストな(robust)ハイブリドーマ増殖、高い抗体産生、及び望ましい抗体特性を含む、望ましい特徴について更にスクリーニングされる。ハイブリドーマは、インビボにおいて同系(syngeneic)動物、免疫システムを欠いている動物、例えば、ヌードマウス(nude mice)、又はインビトロでの細胞培養において培養及び増殖され得る。ハイブリドーマのセレクション、クローニング、増殖の方法は、当業者に周知である。
【０１８７】
好ましい実施態様では、ハイブリドーマは、ラットハイブリドーマである。別の実施態様では、ハイブリドーマが、マウス、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマ等の非ヒト、非ラット種において製造される。更にもう1つの好ましい実施態様では、ハイブリドーマがヒトハイブリドーマであり、該ヒトハイブリドーマにおいてヒト非分泌性骨髄種が、抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチド抗体を発現するヒト細胞と融合される。
【０１８８】
特定のエピトープを認識する抗体断片が、既知の技術によって作製され得る。例えば、本発明のFab及びF(ab')2フラグメントは、(2の同一のFabフラグメントを製造するための)パパイン又は(F(ab')2フラグメントを製造するための)ペプシン等の酵素を用いる、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断(proteolytic cleavage)によって製造され得る。IgG分子のF(ab')2フラグメントは、両方の軽鎖(可変軽鎖及び定常軽鎖領域を含む)、重鎖のCH1ドメイン、及びジスルフィドを形成する親IgG分子のヒンジ領域を含む、より大きな(「親」) IgG分子の2の抗原結合部位を保っている。それゆえに、F(ab')2フラグメントは、親IgG分子のように、抗原分子を依然として架橋することができる。
【０１８９】
(b) SLAMを用いる抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチドモノクローナル抗体 
本発明の別の態様では、米国特許第5,627,052号; PCT公開第WO 92/02551号;及びBabcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996)に記載されているように、選択リンパ球抗体法(SLAM)として当分野において言及された手順を用いて、組換え抗体が、単一の、単離されたリンパ球から作製される。この方法では、対象の抗体を分泌する単一の細胞、例えば、免疫動物のいずれか1に由来するリンパ球が、抗原特異的溶血プラークアッセイ(hemolytic plaque assay)を用いてスクリーニングされ、RGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチド、又はそれらの断片が、ビオチン等のリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞に結合させられ、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対して特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために、使用される。対象の、抗体を分泌する細胞を同定した後、重鎖及び軽鎖可変領域cDNAは、逆転写酵素(reverse transcriptase)-PCR (RT-PCR)によって細胞からレスキューされ、これらの可変領域が、その後、適切な免疫グロブリン定常領域(例えば、ヒト、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、又はブタ定常領域)との関連において、COS又はCHO細胞等の哺乳類宿主細胞において発現され得る。インビボでセレクションされたリンパ球に由来する増幅された免疫グロブリン配列でトランスフェクトされた宿主細胞は、例えば、トランスフェクト細胞(transfected cell)をパニング(panning)して、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対する抗体を発現する細胞を単離することにより、その後、インビトロで更に解析及びセレクションを受け得る。増幅された免疫グロブリン配列は、インビトロの親和性成熟方法等により、更にインビトロで操作され得る。例えば、PCT公開第WO 97/29131号及びPCT公開第WO 00/56772号参照。
【０１９０】
(c)トランスジェニック動物を用いる抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチドモノクローナル抗体 
本発明の別の実施態様では、抗体は、一部、又は全ての、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非-ヒト動物に、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで免疫することによって製造される。1の実施態様では、非-ヒト動物は、XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウス、すなわち、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、かつ、マウス抗体産生に欠損がある改変(engineered)マウス系統である。例えば、Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994)及び米国特許第5,916,771号;第5,939,598号;第5,985,615号;第5,998,209号;第6,075,181号;第6,091,001号;第6,114,598号;及び第6,130,364号参照。また、PCT公開第WO 91/10741号;第WO 94/02602号;第WO 96/34096号;第WO 96/33735号;第WO 98/16654号;第WO 98/24893号;第WO 98/50433号;第WO 99/45031号;第WO 99/53049号;第WO 00/09560号;及び第WO 00/37504号参照。XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成体のような(adult-like)ヒトのレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生する。XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及び(and x)軽鎖遺伝子座の、メガ塩基対サイズの(megabase sized)生殖系列配置(germline configuration)YACフラグメントを導入することによって、約80%のヒト抗体レパートリーを含む。Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998)参照、該文献の開示は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
(d)組換え抗体ライブラリを用いる抗-RGMaペプチド又は抗-ネオジェニンペプチドモノクローナル抗体
インビトロの方法は、また、本発明の抗体を作製するために使用され得、抗体ライブラリは、望ましいRGMaペプチド又はネオジェニンペプチド結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリのかかるスクリーニング方法は、当分野において周知であり、例えば、米国特許第5,223,409号(Ladner et al.); PCT公開第WO 92/18619号(Kang et al.); PCT公開第WO 91/17271号(Dower et al.); PCT 公開第WO 92/20791号(Winter et al.); PCT公開第WO 92/15679号(Markland et al.); PCT公開第WO 93/01288号(Breitling et al.); PCT公開第WO 92/01047号(McCafferty et al.); PCT公開第WO 92/09690号(Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science,246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al.,EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et a., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991);米国特許出願公開第2003/0186374号;及びPCT公開第WO 97/29131号に記載された方法を含み、それぞれの該文献の内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【０１９２】
組換え抗体ライブラリは、RGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチド、又はRGMaペプチドもしくはネオジェニンペプチドの一部で免疫された被験体からのものであり得る。別の方法としては、組換え抗体ライブラリは、実験に使われていない(naive)被験体、すなわち、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで免疫されていないヒト被験体からのヒト抗体ライブラリ等、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドで免疫されていない被験体からのものであり得る。RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを含むペプチドで組換え抗体ライブラリをスクリーニングして、これによってRGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを認識するこれらの抗体をセレクションすることにより、本発明の抗体がセレクションされる。かかるスクリーニング及びセレクションを行う方法は、例えば、前段落における参考文献において記載されている方法等、当分野において周知である。特定のKoff速度定数でRGMaペプチド又はネオジェニンペプチドから解離する抗体等、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体をセレクションするため、表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)の既知の方法が、望ましいKoff速度定数を有する抗体をセレクションするために使用され得る。RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対して特定の中和活性(neutralizing activity)を有する本発明の抗体をセレクションするため、特定のIC50を有する抗体等、RGMa又はネオジェニン活性の阻害を評価するために当分野において知られた標準的方法が使用され得る。
【０１９３】
1の態様では、本発明は、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを結合させる単離された抗体、又はその抗原結合部分に関連する。好ましくは、抗体は中和抗体である。様々な実施態様では、抗体は、組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。
【０１９４】
例えば、本発明の抗体は、また、当分野において既知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、これらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示される(displayed)。かかるファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ(combinatorial antibody library) (例えば、ヒト又はマウス又はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、又はブタ)から発現した抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。抗原を用いて、例えば、標識された抗原、あるいは固体表面又はビーズに結合され又は捕捉された(captured)抗原を用いて、対象の抗原を結合させる抗原結合ドメインを発現するファージが、セレクション又は同定され得る。これらの方法において使用したファージは、通常、ファージ遺伝子III(phage gene III)又は遺伝子VIIIタンパク質(gene VIII protein)のいずれかと組み換え技術によって融合されたFab、Fv、又はジスルフィド安定化(disulfide stabilized)Fv抗体ドメインを有するファージから発現したfd及びM13結合ドメインを含む、糸状ファージ(filamentous phage)である。本発明の抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods,184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); PCT公開第WO 92/01047号; PCT公開第WO 90/02809号;第WO 91/10737号;第WO 92/01047号;第WO 92/18619号;第 WO 93/11236号; 第WO 95/15982号;第WO 95/20401号;並びに米国特許第5,698,426号;第5,223,409号;第5,403,484号;第5,580,717号;第5,427,908号;第5,750,753号;第5,821,047号;第5,571,698号;第5,427,908号;第5,516,637号;第5,780,225号;第5,658,727号;第5,733,743号;及び第5,969,108号に記載されたものが挙げられる。
【０１９５】
上述の参考文献に記載されたように、ファージセレクション(phage selection)後、ファージからの抗体コーディング領域が、単離され得、ヒト抗体又は任意の他の望ましい抗原結合性フラグメントを含む抗体全体を作製するために使用され得、例えば、より詳細に後述されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の望ましい宿主において発現させられ得る。例えば、PCT公開第WO 92/22324号; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995);及び Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988)に記載された方法等の、当分野において既知の方法を用いる、組換えによってFab、Fab'、及びF(ab')2フラグメントを製造する技術も、採用され得る。一本鎖Fv及び抗体を製造するために使用され得る技術の例としては、米国特許第4,946,778号及び第5,258,498号; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993);及び Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988)に記載された技術が挙げられる。
【０１９６】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリのスクリーニングの代わりに、大規模なコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための、当分野において既知の他の方法論が、本発明の抗体の同定(identification)に適用され得る。１種類の別の発現システムは、PCT公開第WO 98/31700号(Szostak and Roberts)、及びRoberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997) に記載されているように、組換え抗体ライブラリがRNA-タンパク質融合物として発現させられるものである。このシステムでは、共有結合的融合(covalent fusion)が、mRNAと、それがコードするタンパク質ペプチド又はタンパク質との間に、その3'末端においてペプチジルアクセプタ抗生物質(peptidyl acceptor antibiotic)であるピューロマイシンを有する合成mRNAのインビトロでの翻訳によって作り出される。従って、二重特異性抗原(dual specificity antigen)に対する抗体又はその一部の結合等、コードされたペプチド又はタンパク質、例えば、抗体又はその一部の特性に基づいて、mRNAの複雑な混合物(complex mixture)(例えば、コンビナトリアルライブラリ)から、特定のmRNAが濃縮(enrich)され得る。かかるライブラリのスクリーニングから回収された、抗体又はその一部をコードする核酸配列は、上述された組換え方法によって(例えば、哺乳類宿主細胞において)発現させられ得、そのうえ、当初セレクションされた配列(複数可)へ変異が導入されているmRNA-ペプチド融合物の追加的なラウンドのスクリーニング、あるいは組換え抗体のインビトロでの親和性成熟のための上述された他の方法のいずれかにより、更なる親和性成熟に供され得る。この方法論の好ましい例は、プロフュージョンディスプレイ(PROfusion display)技術である。
【０１９７】
別のアプローチでは、本発明の抗体は、また、当分野において既知の酵母ディスプレイ法(yeast display method)を用いて作製され得る。酵母ディスプレイ法では、酵母細胞壁に抗体ドメインを係留(tether)し、酵母の表面にこれらを提示するために、遺伝学的手法(genetic methods)が用いられる。特に、かかる酵母は、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ(例えば、ヒトもしくはマウス又はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、あるいはブタ)から発現させられた抗原-結合ドメインを提示するために利用され得る。本発明の抗体を作製するために使用され得る酵母ディスプレイ法の例としては、米国特許第6,699,658 (Wittrup et al.)に記載されたものが挙げられ、該文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１９８】
(b)組換えRGMaペプチド又はネオジェニンペプチド抗体の製造
本発明の抗体は、当分野において既知の多数の技術のいずれかによって製造され得る。例えば、宿主細胞からの発現であり、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター(複数可)が、標準的な技術によって宿主細胞へトランスフェクトされる。様々な形の用語「トランスフェクション」は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション等、外来性DNAを原核又は真核の宿主細胞へ導入するために、通例、使用される多種多様の技術を包含することが意図される。原核又は真核の宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることが可能であるが、かかる真核細胞(及び特に哺乳類細胞)は、適切に折り畳まれて、免疫学的に活性のある抗体を構築し、分泌することに原核細胞よりも適しているため、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳類の宿主細胞における発現が最も好ましい。
【０１９９】
本発明の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞) (例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982) に記載されたDHFRセレクション可能なマーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)に記載されたdhfr-CHO細胞を含む)、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、及びSP2細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞へ導入される場合、宿主細胞において抗体を発現させるのに十分な期間、又は、より好ましくは、宿主細胞が生育させられる培養培地へ抗体を分泌させるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体が製造される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培養培地から回収され得る。
【０２００】
宿主細胞は、Fabフラグメント又はscFv分子等の機能的抗体断片を製造するためにも使用され得る。上記手順の変形は、本発明の範囲内であると理解されるだろう。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び/又は重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするDNAで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えDNA技術は、対象の抗原に結合するために必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードする一部、又は全てのDNAを除去するためにも使用され得る。かかる切断されたDNA分子から発現する分子も、本発明の抗体により包含される。加えて、標準的な化学的架橋方法により本発明の抗体を別の抗体に架橋することによって、一方の重鎖及び一方の軽鎖が本発明の抗体であり(すなわち、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドを結合させる)、かつ他方の重鎖及び軽鎖がRGMaペプチド又はネオジェニンペプチド以外の抗原に特異的である二価抗体が製造され得る。
【０２０１】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましいシステムでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウムを介するトランスフェクションにより、dhfr-CHO細胞に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が、遺伝子の高レベルの転写を促進するために、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメントにそれぞれ機能可能に連結される。組み換え発現ベクターは、DHFR遺伝子も有し、該DHFR遺伝子は、メトトレキサートセレクション/増幅を用いて、ベクターをトランスフェクトされているCHO細胞をセレクションすることを可能にする。セレクションされた形質転換(transformant)宿主細胞は、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために培養され、完全な抗体が培養培地から回収される。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換細胞をセレクションし、宿主細胞を培養し、かつ、培養培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技術が用いられる。なお、さらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培養培地において培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。方法は、培養培地から組換え抗体を単離することを更に含み得る。
【０２０２】
(a)ヒト化抗体
ヒト化抗体は、対象の抗原に免疫特異的に(immunospecifically)結合し、かつ、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク(FR)領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)とを含む抗体又はその変異体、誘導体、類似体あるいは一部であり得る。ヒト化抗体は、望ましい抗原を結合させる、非ヒト種からの1以上の相補性決定領域(CDR)と、ヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有する、非ヒト種抗体由来のものであり得る。
【０２０３】
本明細書中に使用される場合、CDRとの関連で、用語「実質的に(substantially)」は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するCDRのことをいう。ヒト化抗体は、少なくとも1、通常2の、可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)の実質的に全てを含み、該可変ドメインの実質的に全てにおいて、CDR領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のCDR領域に相当し、かつ、フレームワーク領域のすべて又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。1の態様によれば、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのそれも含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体が、軽鎖及び、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。抗体としては、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びCH4領域も挙げられ得る。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、単にヒト化軽鎖だけを含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、単にヒト化重鎖だけを含む。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、単に、軽鎖及び/又は重鎖のヒト化可変ドメインだけを含む。
【０２０４】
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む任意のクラス、及び限定するものではないが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む任意のアイソタイプの免疫グロブリンから選択され得る。ヒト化抗体は、1を超えるクラス又はアイソタイプの配列を含み得、特定の定常ドメインは、当分野において周知の技術を用いて、望ましいエフェクター機能を最適化するために選択され得る。
【０２０５】
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びCDR領域は、親配列、例えば、ドナー抗体CDRに厳密に一致する必要はなく、あるいは、コンセンサスフレームワークは、少なくとも1のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失により、この部位におけるCDR又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれにも一致しないように、突然変異させられ得る。1の実施態様では、しかしながら、かかる変異は広範なものではないだろう。通例、ヒト化抗体残基の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%が、親FR及びCDR配列のそれらと一致するだろう。本明細書中に使用される場合、用語「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域のことをいう。本明細書中に使用される場合、用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいてに最も頻繁に現れるアミノ酸(又ヌクレオチド)から作り上げられた配列のことをいう(例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)参照)。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列における各位置が、ファミリーにおいてその位置に最も頻繁に現れるアミノ酸によって占められる。2のアミノ酸が同じくらい高頻度に現れる場合、いずれかが、コンセンサス配列に含まれ得る。
【０２０６】
ヒト化抗体は、ヒト受容者(recipients)において齧歯類(rodent)抗-ヒト抗体の部分の治療的適用の継続期間及び有効性を制限する、これらに対する望まれない免疫応答を最小にするように設計され得る。ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからそれに導入された1以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒト残基は、しばしば「インポート(import)」残基と呼ばれ、該「インポート(import)」残基は、通常、可変ドメインから取られたものである。ヒト化は、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって行われ得る。それゆえに、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない配列が、非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。例えば、米国特許第4,816,567参照(該文献の内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる)。ヒト化抗体は、いくつかの超可変領域残基、及び恐らくいくつかのFR残基が齧歯類抗体における類似の(analogous)部位からの残基によって置換されているヒト抗体であり得る。本発明の抗体のヒト化又は改変は、限定されるものではないが、米国特許第5,723,323号;第5,976,862号;第5,824,514号;第5,817,483号;第5,814,476号;第5,763,192号;第5,723,323号;第5,766,886号;第5,714,352;第6,204,023号;第6,180,370号;第5,693,762号; 第5,530,101号;第5,585,089号;5,225,539号;及び第4,816,567号に記載されている任意の既知の方法を用いて行われ得る。
【０２０７】
ヒト化抗体は、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保ち得る。ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念のヒト化産物の解析の過程によって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調査することが、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の解析、すなわち、その抗原を結合させる候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の解析を可能にする。このようにして、FR残基は、選択され、受容配列から結合され(combined)、RGMaペプチド又はネオジェニンペプチドに対する親和性を増大させる等の望ましい抗体特性を成し遂げるように、配列を取り込み得る。通例、超可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関係する。
【０２０８】
ヒト化の代わりとして、ヒト抗体 (本明細書中において「完全なヒト抗体」とも呼ばれる)が作製され得る。例えば、PROfusion及び/又は酵母関連技術を用いるライブラリからヒト抗体を単離することができる。トランスジェニック動物を製造することも可能である(例えば、内在性(endogenous)免疫グロブリンの産生動物なしで免疫時にヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なマウス。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(joining region)(JH)遺伝子のホモ接合性欠失(homozygous deletion)は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらす。かかる生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイ(gene array)の移入(Transfer)は、抗原投与(antigen challenge)時のヒト抗体の生産をもたらすだろう。ヒト化抗体又は完全なヒト抗体は、米国特許第5,770,429号;第5,833,985号;第5,837,243号;第5,922,845号;第6,017,517号;第6,096,311号;第6,111,166号;第6,270,765号;第6,303,755号;第6,365,116号;第6,410,690号;第6,682,928号;及び6,984,720号に記載された方法に従って調製され得、それぞれの該文献の内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。 
【０２０９】
神経細胞の生存
上述のように、調節する方法は、被験体において神経細胞の生存を促進し得る。神経細胞の生存は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロールの濃度を低減させることによって促進され得る。上述された剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロールの濃度を低減させ得る。
【０２１０】
調節する方法は、視神経損傷、脊髄損傷、又はそれらの組み合わせの後の神経細胞の生存を促進し得る。調節する方法は、網膜色素変性症、虚血(例えば、脳卒中)、又は多発性硬化症を患う被験体において神経細胞の生存を促進し得る。視神経損傷、脊髄損傷、 網膜色素変性症、虚血(例えば、脳卒中)、又は多発性硬化症を治療する方法は、より詳細に後述される。
【０２１１】
調節する方法は、少なくとも約1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、又は約10.0倍だけ、被験体において神経細胞の生存を促進することを含み得る。調節する方法は、少なくとも約2.0倍又は3.0倍だけ、被験体において神経細胞の生存を促進することを含み得る。
【０２１２】
調節する方法は、剤を投与されていない被験体における神経細胞の生存と比べて、被験体において神経細胞の生存を増加させることを含み得る。調節する方法は、剤を投与されていない被験体における神経細胞の生存と比較して、少なくとも約1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、又は約10.0倍だけ、被験体における神経細胞の生存を増加させることを含み得る。調節する方法は、剤を投与されていない被験体における神経細胞の生存と比べて、少なくとも約2.0倍又は3.0倍だけ、被験体における神経細胞の生存を増加させることを含み得る。
【０２１３】
d.軸索成長及び/又は再生の促進
調節する方法は、被験体における軸索成長及び/又は再生を促進し得る。軸索成長及び/又は再生は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減することによって促進され得る。上述された剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させ得る。
【０２１４】
調節する方法は、視神経損傷、脊髄損傷、又はそれらの組み合わせの後に、軸索成長及び/又は再生を促進し得る。調節する方法は、網膜色素変性症、虚血(例えば、脳卒中)、又は多発性硬化症を患う被験体における軸索成長及び/又は再生を促進し得る。視神経損傷、脊髄損傷、網膜色素変性症、虚血(例えば、脳卒中)、又は多発性硬化症を治療する方法は、より詳細に後述される。
【０２１５】
3.治療方法
また、本明細書中に提供されるのは、疾患の治療をそれを必要とする被験体においてする方法である。治療する方法は、上述のように、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節する方法、及び/又は脂質ラフトを破壊する方法、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減する方法を適用し得る。治療する方法は、被験体へ上述の剤を投与することを含み得る。
【０２１６】
RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、疾患に対して有益であり得る。疾患としては、限定されるものではないが、網膜色素変性症、虚血(例えば、脳卒中)、多発性硬化症、脊髄損傷及び視神経損傷が挙げられ得、それぞれの該疾患が、より詳細に後述される。
【０２１７】
a.網膜色素変性症
治療方法は、被験体において網膜色素変性症を治療することを含み得る。網膜色素変性症を治療する方法は、被験体に剤を投与することを含み得る。剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、(.)及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させ得る。調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減することを含み得る。シス相互作用を妨害すること又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、被験体における神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。それゆえに、治療方法は、網膜色素変性症を患う被験体における神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０２１８】
神経細胞は、視細胞であり得る。それゆえに、網膜色素変性症を治療する方法は、剤を投与された被験体において視細胞の生存を促進し得る。
【０２１９】
治療方法は、剤を投与されていない被験体における外顆粒層に比べて、少なくとも約1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、又は6.0倍だけ、被験体における外顆粒層を増加させ得る。
【０２２０】
b.虚血
治療方法は、被験体において虚血を治療することを含み得る。虚血を治療する方法は、被験体へ剤を投与することを含み得る。剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させ得る。調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることを含み得る。シス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、被験体において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。それゆえに、治療方法は、被験体における虚血性傷害(ischemic injury)の後に、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０２２１】
虚血としては、脳卒中が挙げられ得るが、これに限定されない。虚血は、脳卒中であり得る。それゆえに、方法は、被験体へ剤を投与することにより、脳卒中を治療することを含み得る。
【０２２２】
脳卒中を治療する方法は、脳卒中を患い、かつ、剤を投与されていない被験体の脳浮腫に比べて、被験体における脳浮腫を低減させ得る。脳卒中を治療する方法は、脳卒中を患い、かつ、剤を投与されていない被験体の梗塞体積に比べて、被験体における梗塞体積(infarct volume)を減少させ得る。脳卒中を治療する方法は、脳卒中を患い、かつ、剤を投与されない被験体における行動の欠陥に比べて、被験体において、脳卒中から生じる行動の欠陥(behavioral deficit)を減少させ得る。
【０２２３】
c.多発性硬化症
治療方法は、被験体において多発性硬化症を治療することを含み得る。多発性硬化症を治療する方法は、被験体へ剤を投与することを含み得る。剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を減少させ得る。調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること及び/又は、脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることを含み得る。シス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を減少させることは、被験体において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。それゆえに、治療方法は、多発性硬化症を患う被験体において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０２２４】
治療方法は、多発性硬化症を患い、かつ、剤を投与されていない被験体における神経変性(neurodegeneration)と比較して、被験体において、神経変性(neurodegeneration)を減少させ得る。
【０２２５】
d.脊髄損傷
治療方法は、被験体において脊髄損傷を治療することを含み得る。脊髄損傷を治療する方法は、被験体へ剤を投与することを含み得る。剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を減少させ得る。調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を減少させることを含み得る。シス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、被験体において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。それゆえに、治療方法は、被験体における脊髄損傷の後に、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。被験体において軸索成長及び/又は再生を促進することにより、治療方法は、被験体において自発運動(locomoter activity)を回復させ得る。治療方法は、脊髄損傷後の被験体における自発運動を部分的に又は完全に回復させ得る。
【０２２６】
e.視神経損傷
治療方法としては、被験体における視神経損傷を治療することが挙げられ得る。視神経損傷を治療する方法は、被験体へ剤を投与することを含み得る。剤は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節し、及び/又は脂質ラフトを破壊し、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させ得る。調節は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることを含み得る。シス相互作用を妨害又は阻止すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフト内のコレステロール濃度を低減させることは、被験体において神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。それゆえに、治療方法は、被験体における視神経損傷後の神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０２２７】
本発明は、以下の非限定的な例によって説明される多面的態様を有する。
【０２２８】
4.医薬組成物
上述の剤は、医薬組成物における成分であり得る。医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体も含み得る。本発明の剤を含む医薬組成物は、限定されるものではないが、疾病の診断、検出、又は経過観察(monitoring)、疾病又はその1以上の症状の予防、治療、管理、又は改善、並びに/あるいは研究、において用いるためのものである。特定の実施態様では、組成物は、本発明の1以上の剤を含む。別の実施態様では、医薬組成物は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を調節すること、及び/又は脂質ラフトを破壊すること、及び/又は脂質ラフトにおけるコレステロール濃度を減少させることが有益であり得る疾病の治療のための、本発明の1以上の剤並びに本発明の剤以外の1以上の予防剤又は治療剤を含む。更なる実施態様では、予防剤又は治療剤は、疾病、又はその1以上の症状の予防、治療、管理、もしくは改善のために有用であり、あるいは疾病、又はこの1以上の症状の予防、治療、管理、もしくは改善において使用されており、又は現在使用中であることが知られている。これらの実施態様に従って、組成物は、更に担体、希釈剤(diluent)、又は賦形剤(excipient)を含み得る。
【０２２９】
本発明の剤は、被験体への投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、本発明の剤及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中において使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」としては、生理的に適合する、任意かつ全ての溶剤(solvent)、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。医薬的に許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等のうちの1以上、並びに、それらの組み合わせが挙げられる。多くの場合には、組成物において等張剤、例えば、砂糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが望ましいだろう。医薬的に許容可能な担体は、剤の保存可能期間(shelf life)又は有効性を増進する、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、あるいは緩衝剤等の少量の補助物質を更に含み得る。
【０２３０】
様々な送達システム、例えば、リポソームにおけるカプセル化(encapsulation)、微小粒子(microparticle)、マイクロカプセル(microcapsule)、剤を発現できる組換え細胞、受容体を介した飲食作用(endocytosis) (例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)参照)、レトロウイルスベクター又は他のベクター等の一部としての核酸の構築(construction)等が知られており、本発明の1以上の剤又は本発明の1以上の剤の組み合わせ並びに疾病又は1以上のその症状を予防し、管理し、治療し、又は改善するために有用な予防剤又は治療剤を投与するために、該様々な送達システムが使用され得る。本発明の予防剤又は治療剤を投与する方法としては、限定されるものではないが、非経口投与(parenteral administration) (例えば、皮内(intradermal)、筋肉内(intramuscular)、腹腔内(intraperitoneal)、静脈内(intravenous)及び皮下(subcutaneous))、硬膜外(epidurala)投与、腫瘍内(intratumoral)投与、及び粘膜(mucosal)投与(例えば、鼻腔内(intranasal)及び経口経路(oral route))が挙げられる。加えて、経肺(pulmonary)投与が、例えば、吸入器(inhaler)又は噴霧器(nebulizer)、並びにエアロゾル化剤(aerosolizing agent)を用いた剤形の使用によって採用され得る。例えば、米国特許第6,019,968号;第5,985,320号;第5,985,309号;第5,934,272号;第5,874,064号;第5,855,913号;第5,290,540号;及び第4,880,078号;及びPCT公開第WO 92/19244号;第WO97/32572号;第WO97/44013号;第WO98/31346号;及び第WO99/66903号を参照(それぞれの文献は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる)。1の実施態様では、本発明の剤又は本発明の組成物は、Alkermes AIR(登録商標)肺疾患薬送達技術(pulmonary drug delivery technology)(Alkermes. Inc., Cambridge, Mass.)を使用して投与される。特定の実施態様では、本発明の予防剤又は治療剤は、筋肉注射で(intramuscularly)、静脈内に(intravenously)、腫瘍内に(intratumorally)、経口で(orally)、鼻腔内に(intranasally)、肺内に(pulmonary)、又は皮下に(subcutaneously)投与される。予防剤又は治療剤は、いかなる利便性のある経路で投与されてもよく、例えば、点滴(infusion)又は大量注射(bolus injection)によって、上皮(epithelial)又は皮膚粘膜(mucocutaneous)の内膜(lining) (例えば、口腔粘膜(oral mucosa)、直腸(rectal)及び腸粘膜(intestinal mucosa)、等)を通した吸収によって投与され、並びに他の生物活性剤(biologically active agent)とともに投与され得る。投与は、全身性又は局所性であり得る。
【０２３１】
特定の実施態様では、治療を必要とする領域に本発明の剤を局所的に投与することが望ましい場合がある;このことは、例えば、限定する目的ではないが、局所注入(local infusion)によって、注射(injection)によって、あるいは、シアラスト膜(sialastic membrane)、高分子化合物(polymer)、繊維性基質(fibrous matrices) (例えば、Tissuel(登録商標))、又はコラーゲン基質(collagen matrix)等の膜(membrane)及び基質(matrix)を含む多孔質(porous)又は無孔の物質であるインプラント(implant)を用いて、成し遂げられ得る。1の実施態様では、本発明の1以上の剤の有効量は、疾病又はその症状を予防し、治療し、管理し、及び/又は改善するために、被験体に対して患部(affected area)へ局所的に投与される。
【０２３２】
別の実施態様では、剤は、放出制御(controlled release)製剤又は持続放出製剤(sustained release system)において送達され得る。1の実施態様では、ポンプ(pump)が、放出制御又は持続放出を成し遂げるために使用され得る(Langer,上記; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。別の実施態様では、高分子材料(polymeric material)は、本発明の治療の放出制御又は持続放出を成し遂げるために使用され得る(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61参照; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照);米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号; PCT公開第WO99/15154号;及び PCT公開第WO99/20253号。持続放出性製剤において使用された高分子化合物の例としては、限定されるものではないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、エチレン-酢酸ビニル共重合体(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコール酸(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ラクチド・グリコリド共重合体(poly(lactide-co-glycolide) )(PLGA)、及びポリオルトエステルが挙げられる。特定の実施態様では、持続放出性製剤に使用される高分子化合物は、不活性であり(inert)、浸出し得る(leachable)不純物がなく、保管において安定であり、無菌であり(sterile)、かつ生分解性である(biodegradable)。更に別の実施態様では、放出制御製剤又は持続放出製剤は、予防又は治療標的に近接して設置され、従って、わずかな全身用量だけを必要とする(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,上記, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照)。
【０２３３】
放出制御製剤は、Langerによる総説(1990, Science 249:1527-1533)において説明される。当業者に知られた任意の技術が、本発明の1以上の剤を含む持続性製剤を製造するために使用し得る。例えば、米国特許第4,526, 938号, PCT公開WO91/05548, PCT公開WO96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 及び Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760参照(それぞれの該文献は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる)。
【０２３４】
特定の実施態様では、本発明の組成物が、上述の剤をコードする核酸である場合、例えば、レトロウイルスベクター(米国特許第4,980,286参照)を使用することによって、直接的な注入によって、又は微粒子銃(microparticle bombardment) (例えば、遺伝子銃(gene gun); Biolistic, Dupont)の使用、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト用剤で被覆すること、あるいは核にはいることが知られているホメオボックス様(homeobox-like)ペプチドと結合して投与すること(例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照) によって、細胞内のものとなるように、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、かつ、それを投与することにより、核酸は、そのコードされた抗体の発現を促進するためにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され、相同組換えにより、発現のために、宿主細胞DNA内に組み込まれ得る。
【０２３５】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される(formulated)。投与経路の例としては、限定されるものではないが、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内 (例えば、吸入)、経皮(例えば、局所の)、経粘膜(transmucosal)、及び直腸投与が挙げられる。吸入は、いくつかの実施態様では、被験体へ医薬組成物を投与するための吸入器の使用を含む。特定の実施態様では、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内、又は局所投与に適合させた医薬組成物として、所定の手順に従って、製剤化され得る。通常、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液(isotonic aqueous buffer)の溶液である。必要に応じ、組成物は、可溶化剤(solubilizing agent)、並びに注入部位の痛みを軽減するリグノカイン(lignocaine)等の局所麻酔薬(anesthetic)も含み得る。
【０２３６】
本発明の組成物を局所的に投与するつもりであれば、組成物は、軟膏(ointment)、クリーム(cream)、経皮パッチ(transdermal patch)、ローション(lotion)、ジェル(gel)、シャンプー(shampoo)、スプレー(spray)、エアロゾル(aerosol)、溶液(solution)、乳濁液(emulsion)の剤型、又は当業者に周知の他の剤型に製剤化され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)参照。噴霧できない(non-sprayable)局所的用量剤形のため、局所適用に適合性があり、かつ、水よりも大きな動的粘度(dynamic viscosity)を有する担体又は1以上の賦形剤を含み、粘性のある(viscous to)半固体状(semi-solid)又は固体状(solid)形態が、通常採用される。適切な剤形としては、限定するものではないが、必要に応じて、滅菌され、又は例えば、浸透圧(osmotic pressure)等の様々な特性に影響を与えるための助剤(auxiliary agent)(例えば、防腐剤、安定化剤(stabilizer)、湿潤剤、緩衝剤、又は塩)と混合された、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、クリーム剤、軟膏剤、粉末剤、塗布薬(liniment)、膏薬(salve)、等のものが挙げられる。他の適切な局所投与剤形としては、噴霧可能なエアロゾル調合液(preparation)(例えば、固体又は液体の不活性担体と組み合わせられた活性成分が、加圧された揮発性物質(pressurized volatile) (例えば、フレオン(freon)等の高圧ガス(gaseous propellant))との混合物で、又はスクイーズボトル(squeeze bottle)でパッケージ化される)が挙げられる。保湿剤(Moisturizer)又は保湿剤(humectant)が、また、医薬組成物及び必要に応じた剤形に加えられ得る。かかる付加成分(additional ingredient)の例は、当分野において周知である。
【０２３７】
本発明の方法が、組成物の経鼻投与を含む場合には、組成物は、エアロゾル剤形、スプレー、ミスト状(mist)又は点滴剤(drop)の剤形に製剤化され得る。特に、本発明による用途のための予防剤又は治療剤が、適切な高圧ガス(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の適切なガス)を使用することを伴う、加圧されたパック又は噴霧器からのエアロゾルスプレーの提示の剤形において簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合には、用量単位(dosage unit)は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器(inhaler)又は注入器(insufflator)における使用のためのカプセル及び薬包(cartridge) (例えば、ゼラチン(gelatin)で構成される)が、化合物の混合粉体(powder mix)並びにラクトース又はデンプン等の適切な適切な粉末基剤を含んで製剤化され得る。
【０２３８】
本発明の方法が、経口投与を含む場合には、組成物は、錠剤(tablet)、カプセル、カシェ剤(cachet)、ジェルキャップ(gelcap)、溶液剤、懸濁剤等の剤形において経口で製剤化され得る。錠剤又はカプセルは、結合剤(binding agent)(例えば、アルファ化(pregelatinised)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(filler) (例えば、ラクトース、微結晶性セルロース(microcrystalline cellulose)、又はリン酸水素カルシウム(calcium hydrogen phosphate));滑沢剤(lubricant) (例えば、ステアリン酸マグネシウム(magnesium stearate)、タルク(talc)、又はシリカ(silica));崩壊剤(disintegrant) (例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム);又は湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)等の医薬的に許容可能な賦形剤を用いて、常法によって調製され得る。錠剤は、当分野において周知の方法によって被覆され得る。経口投与のための液体製剤は、限定されるものではないが、溶液剤、シロップ剤(syrup)もしくは懸濁剤の剤形をとり得、又はこれらは、使用前に水又は他の適切なビヒクルとともに構成するための乾燥製品(dry product)として提示され得る。かかる液体製剤は、懸濁化剤(suspending agent) (例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素添加された食用脂(hydrogenated edible fat);乳化剤(例えば、レシチン(lecithin)又はアカシア(acacia));非水性ビヒクル(non-aqueous vehicle) (例えば、扁桃油(almond oil)、油性エステル(oily ester)、エチルアルコール、又は分画された植物油);及び防腐剤(例えば、メチルもしくはp-ヒドロキシ安息香酸プロピルあるいはソルビン酸)等の医薬的に許容可能な添加剤(additive)を用いて、常法によって調製され得る。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味料(flavoring)、着色料(coloring)、及び甘味剤(sweetening agent)も含み得る。経口投与のための製剤は、予防剤又は治療剤(複数可)の徐放性(slow release)、放出制御、又は持続放出(sustained release)のために適切に製剤化され得る。
【０２３９】
本発明の方法は、例えば、エアロゾル化剤(aerosolizing agent)を用いて製剤化された組成物の吸入器又は噴霧器の使用による、経肺投与(pulmonary administration)を含み得る。例えば、米国特許第6,019, 968号;第5,985, 320号;第5, 985,309号;第5,934,272号;第5,874,064号;第5,855,913号;第5,290,540号;及び第4,880,078号;並びにPCT公開第WO 92/19244号;第WO 97/32572号;第WO 97/44013号;第WO 98/31346号;及び第WO 99/66903号参照、それぞれの該文献は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる。特定の実施態様では、本発明の抗体及び/又は本発明の組成物は、Alkermes AIR肺疾患薬送達技術(pulmonary drug delivery technology)を用いて投与される(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)。
【０２４０】
本発明の方法は、注射(例えば、大量注射又は持続性点滴により)による非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含み得る。注射のための剤形は、追加された防腐剤とともに、単位用量剤形(unit dosage form)で(例えば、アンプルで、又は複数回投与容器(multi-dose container)で)提示され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクルにおいて懸濁液、溶液剤又は乳濁剤等の剤形をとり得、懸濁化剤、安定化剤及び/又は分散剤等の製剤化剤(formulatory agent)を含み得る。別の方法として、活性成分は、適切なビヒクル(例えば、無菌の、ピロゲンが含まれていない(pyrogen-free water)水)とともに使用前に構成するための粉体形状(powder form)であり得る。本発明の方法は、デポー製剤(depot preparation)として製剤化された組成物の投与を追加的に構成し得る。かかる長時間作用する製剤が、埋め込み(implantation)によって(例えば、皮下に又は筋肉内に)又は筋肉注射によって投与され得る。それゆえ、例えば、組成物は、適切な高分子又は疎水性材料 (例えば、許容可能な油における乳濁剤として)又はイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体として(例えば、やや溶けにくい塩として)製剤化され得る。
【０２４１】
本発明の方法は、中性又は塩の剤形として製剤化された組成物の投与を包含する。医薬的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、等に由来するもの等の陰イオン(anion)とともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄(ferric hydroxide)、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等に由来するもの等の陽イオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２４２】
通例、組成物の成分(ingredient)は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又はサシェット(sachette)等の密閉された密封容器において凍結乾燥された粉末又は水のない濃縮物として、単位用量剤形において別々か又は混ざり合って(mixed together)かのいずれかで提供される。投与の様式は、点滴(infusion)であり、組成物は、無菌製薬等級純水(pharmaceutical grade water)又は生理食塩水を有する点滴ボトルで調剤され得る。投与の様式が注射による場合、成分が投与より前に混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のためののアンプルが、提供され得る。
【０２４３】
具体的には、本発明は、本発明の1以上の剤、又は医薬組成物が、抗体の量を示すアンプル又はサシェット等の密閉された密封容器においてパッケージされることももたらす。1の実施態様では、本発明の1以上の剤、又は医薬組成物が、乾燥滅菌の凍結乾燥(lyophilized)粉末又は水が含まれていない濃縮物として、密閉された密封容器において提供され、被験体への投与のための適切な濃度に(例えば、水又は生理食塩水を用いて)再構成され得る。1の実施態様では、本発明の1以上の剤又は医薬組成物は、少なくとも5 mg、例えば少なくとも10 mg、少なくとも15 mg、少なくとも25 mg、少なくとも35 mg、少なくとも45 mg、少なくとも50 mg、少なくとも75 mg、又は少なくとも100 mgの単位用量において密閉された密封容器において乾燥滅菌の凍結乾燥粉末として提供される。本発明の凍結乾燥剤又は医薬組成物は、2℃及び8℃の間においてその元の容器に保管される必要がある。本発明の剤及び医薬組成物は、再構成された後、1週間以内、例えば、5日以内、72時間以内、48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、5時間以内、3時間以内、又は1時間以内に投与される必要がある。別の実施態様では、本発明の1以上の剤又は医薬組成物は、抗体の量及び濃度を示す密閉された密封容器において液体剤形で提供される。更なる実施態様では、投与された組成物の液体剤形は、少なくとも0.25 mg/ml、例えば少なくとも0.5 mg/ml、少なくとも1 mg/ml、少なくとも2.5 mg/ml、少なくとも5 mg/ml、少なくとも8 mg/ml、少なくとも10 mg/ml、少なくとも15 mg/ml、少なくとも25 mg/mlの、少なくとも50 mg/ml、少なくとも75 mg/ml又は少なくとも100 mg/mlで、密閉された密封容器において供給される。液体剤形は、2℃及び8℃の間においてその元の容器に保存される必要がある。
【０２４４】
本発明の剤は、非経口投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。1の態様では、剤は、0.1〜250 mg/ml抗体を含む注射溶液として調製されるだろう。注射溶液は、フリント(flint)又はアンバーバイアル(amber vial)、アンプル又はプレフィルドシリンジ(pre-filled syringe)において液体又は凍結乾燥された剤形のいずれかで構成され得る。緩衝剤は、L-ヒスチジン(1〜50 mM)、最適には5〜10 mM、pH 5.0〜7.0 (最適にはpH 6.0)であり得る。他の適切な緩衝剤としては、限定されるものではないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、0〜300 mM (液体剤形のためには、最適には150 mM)の濃度で溶液剤の張性(tonicity)を修正するために使用され得る。抗凍結剤(Cryoprotectant)は、主に0〜10%スクロース(最適には0.5〜1.0%)で凍結乾燥された剤形のために含められ得る。他の適切な抗凍結剤としては、トレハロース及びラクトースが挙げられる。充填剤(Bulking agent)は、主に1〜10%マンニトール(最適には2〜4%)で、凍結乾燥された剤形に含められ得る。安定化剤は、主に1〜50 mM  (最適には5〜10 mM)L-メチオニンで、液体及び凍結乾燥された剤形の両方において使用され得る。他の適切な充填剤としては、グリシン、アルギニンが挙げられ、0〜0.05%(最適には0.005〜0.01%)ポリソルベート-80として含められ得る。追加的な界面活性剤としては、ポリソルベート20及びBRIJ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与のために注射溶液として調整された本発明の抗体を含む医薬組成物は、抗体の吸収(absorption)、又は分散(dispersion)を増加させるために使用されるもの等、アジュバントとして有用な剤を更に含み得る。特に有用なアジュバントは、Hylenex(登録商標) (組換えヒトヒアルロニダーゼ)等のヒアルロニダーゼである。注射溶液におけるヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に皮下投与を受けたヒトバイオアベイラビリティ(bioavailability)を向上させる。より少ない痛み及び不快症状、並びに注射部位反応の最少の発生率で、注射部位体積(すなわち、1 mlより大きい)をより大きくすることも可能である。(国際出願公開第WO 04/078140号及び米国特許出願公開第US2006104968号参照(参照することによって本明細書中に組み込まれる。))
【０２４５】
該本発明の組成物は、様々な剤形におけるものであり得る。これらとしては、例えば、溶液(liquid solution) (例えば、注射可能及び点滴可能な(infusible)溶液剤)、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸薬(pill)、粉末(powder)、リポソーム(liposome)及び座剤(suppository)等の液体、半固体及び固体剤形である。好ましい形態は、意図された投与の様式及び治療的適用に依存する。組成物は、他の抗体とともに、ヒト又は哺乳類(例えば、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、及びブタ)の受動免疫法(passive immunization)のために使用されるものと同様の組成物等、注射又は点滴可能な溶液剤の剤形であり得る。1の実施態様では、抗体は、静脈内点滴又は注射によって投与され得る。別の実施態様では、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０２４６】
治療組成物は、製造及び保存条件下では、通常、無菌かつ安定である必要がある。組成物は、高い薬物濃度に適した、溶液剤、マイクロエマルション(microemulsion)、分散剤、リポソーム、又は他の規則正しい構造体として製剤され得る。活性化合物(すなわち、結合タンパク質、例えば、本発明の剤)を必要な量において、上に列挙された1の成分又は該成分の組み合わせとともに、適切な溶媒に包含させ、必要に応じて、続いてろ過滅菌(filtered sterilization)を行うことにより、無菌注射剤が、調製され得る。通例、分散剤は、基本分散媒、及び上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を包含させることにより、調製される。無菌の、無菌注射溶液の調製のために凍結乾燥された粉末の場合には、調製の方法は、任意の追加的な望ましい成分を以前に無菌ろ過(sterile-filtered)されたその溶液から加えた、活性成分の粉末を生産する真空乾燥及び噴霧乾燥(spray-drying)を含む。溶液剤の適切な流動性は、例えば、レシチン(lecithin)等のコーティングの使用により、分散剤の場合には、必要の粒子サイズを維持することにより、並びに、界面活性剤の使用により、維持され得る。
【０２４７】
注射可能な組成物の持続的吸収(Prolonged absorption)は、組成物に、吸収を遅延する剤、例えば、モノステアレート塩(monostearate salt)及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。本発明の剤は、当分野において知られた様々な方法によって投与され得る。多くの治療的適用のために、投与の経路/様式は、皮下注射、静脈注射、吸入、又は点滴であり得る。当業者によって理解されるであろうが、投与の経路及び/又は様式は、望ましい結果に応じて様々であろう。特定の実施態様では、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化した送達製剤を含む放出制御製剤等の、急速な放出に対して化合物を保護するであろう担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物(polyanhydride)、ポリグリコール酸(polyglycolic acid)、コラーゲン、ポリオルトエステル(polyorthoester)、及びポリ乳酸(polylactic acid)等の、生分解性の生体適合性のある高分子化合物が使用され得る。かかる剤形の製剤のための多くの方法が、特許されており、又は通例、当業者に既知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０２４８】
特定の実施態様では、本発明の剤が、例えば、不活性希釈剤又は吸収可能な(assimilable)可食(edible)担体を用いて、経口投与され得る。剤(及び、必要に応じて、他の成分)が、また、硬殻又は軟殻のゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され(compressed)、又は被験体の規定食(diet)に直接組み込まれ得る。経口治療的投与のために、剤は、賦形剤に包含され、摂取可能な(ingestible)錠剤、口腔錠(buccal tablet)、トローチ(troche)、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース(wafer)、等の剤形で使用され得る。非経口投与以外によって本発明の剤を投与するためには、その不活性化を防止するための物質で剤を被覆し、又は該物質と剤を同時投与することが必要であり得る。
【０２４９】
特定の実施態様では、本発明の剤は、当分野において知られた半減期延長(half-life extending)ビヒクルに結合される。かかるビヒクルとしては、限定されるものではないが、Fcドメイン、ポリエチレングリコール、及びデキストランが挙げられる。かかるビヒクルは、例えば、米国出願シリアル番号第09/428,082号及び公開されたPCT出願第WO 99/25044号に記載されている(該文献は、任意の目的のために参照することにより、本明細書中に組み込まれる)。
【０２５０】
具体的な実施態様では、本発明の剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子治療を手段として、疾病又はその1以上の症状を治療、予防、管理、又は改善するために投与される。遺伝子治療は、発現した又は発現され得る核酸の被験体への投与によって行われる治療のことをいう。本発明の実施態様では、核酸は、それらのコードする、予防又は治療効果を調節する本発明の剤をもたらす。
【０２５１】
当分野において利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って、使用可能である。遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); 及び Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215参照。使用され得る、組換えDNA 技術の分野における公知の方法は、 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 及びKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) に記載されている。  遺伝子治療の様々な方法の詳細な説明は、米国特許出願公開20050042664 A1号に記載されている(該文献は、参照することによって本明細書中に組み込まれる)。
【０２５２】
本発明の剤は、痛みに関連する疾患又は状態、あるいは、RGMa又はネオジェニンに関連する他の任意の疾患又は状態を治療するために、単独で又は併用で使用され得る。併用は、その本来の目的のために有用な併用であることが更に理解されよう。
【０２５３】
医薬組成物は、「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明の剤を含み得る。「治療有効量」は、望ましい治療結果を達成するための、必要な用量及び期間の有効量のことをいう。剤の治療有効量は、当業者によって決定され、個体の病状(disease state)、年齢、性別、及び体重、並びに個体において望ましい応答を引き出す抗体の能力等の因子により様々であり得る。治療有効量は、また、剤の有毒作用又は有害作用がもしあれば、それを、治療上の有益な効果が上回るものである。「予防有効量」は、望ましい予防結果を達成するために、用量及び必要な期間の有効量のことをいう。通常、予防的用量が、疾患の初期段階より前又は疾患の初期段階に被験体において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ないであろう。
【０２５４】
投薬計画が、最適な望ましい応答(例えば、治療又は予防応答)をもたらすために調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得、いくつかの分割された用量が経時的に投与され得、又は治療状況の要求によって示される場合、用量が、比例的に減少又は増加し得る。投与の容易さ及び用量の画一性(uniformity)のために、用量単位剤形において非経口の組成物を製剤化することは、特に有益である。本明細書中で使用された用量単位剤形は、治療すべき哺乳類の被験体のための単一用量として適した物理的な不連続単位(discrete unit)のことをいい、各単位は、必要な医薬担体との関連において望ましい治療効果を生じさせるために計算された、予め決められた量の活性化合物を含む。用量単位剤形の詳述は、(a)活性化合物の固有の特徴及び達成すべき特定の治療的又は予防的効果、並びに(b)個体における感受性の治療のための活性化合物等の配合の分野において固有の制約によって決定され、これらに直接的に依存する。
【０２５５】
剤の治療又は予防有効量のための典型的な、非限定的な範囲は、0.1及び200 mg/kgの間、例えば、0.1及び10 mg/kgの間の用量である。剤の治療又は予防有効量は、1及び200 mg/kgの間、10及び200 mg/kgの間、20及び200 mg/kgの間、50及び200 mg/kgの間、75及び200 mg/kgの間、100及び200 mg/kgの間、150及び200 mg/kgの間、50及び100 mg/kgの間、5及び10 mg/kgの間、あるいは1及び10 mg/kgの間であり得る。用量の値は、軽減すべき状態の種類及び重症度によって様々であり得ることは留意すべきである。更に、剤の用量は、当業者によって決定され得、個体の病状、年齢、性別、及び体重等の因子、並びに剤の、個体における望ましい応答を引き出す能力に従って様々であり得る。用量は、また、剤の有毒又は有害な効果がもしあれば、それを、治療上の有益な効果が上回るものである。任意の個々の被験体のために、特定の投薬計画は、個体の需要(individual need)及び投与し又は組成物の投与を管理する専門家の判断によって、時間をかけて調製されるべきであり、かつ、本明細書中に示される投与量範囲は、単なる例示であり、クレームされた組成物の範囲及び実施を制限することを意図するものではないことは、更に理解されるべきである。
【実施例】
【０２５６】
5.実施例
実施例1
実施例2-11のための材料及び方法
実施例1において本明細書中に提供されるのは、実施例2-11において後述される実験で使用された材料及び方法である。
【０２５７】
網膜外植片伸長アッセイ及び免疫共局在(immunocolocalization)。ポリ-L-リジン (SIGMA; 10μg/ml)で被覆されたガラスのカバースリップを、ラミニン(Invitrogen; 10μg/ml)及びRGMaタンパク質(5μg/ml)で処理して、3時間、室温でインキュベートした。側頭網膜外植片を、タンパク質で被覆された表面において18時間、培養した。脂質ラフトを破壊するために、外植片を、10mMメチル-β-シクロデキストリン(MβCD)で12分間、又は2 U/mlコレステロールオキシダーゼ(CO)で1時間、37℃で前処理した。外植片は、その後、4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde, PFA)で固定し、Alexa488-ファロイジンで染色した。線維長は、Image Pro 5.0を用いて定量化した。免疫学的局在決定のため、外植片を、コレラ毒素B-FITC (C1655; Sigma; 10mg/mL)で処理し、斑点状にし(patched)、固定し、及びネオジェニン抗体で染色した。網膜神経節細胞 (RGCs)を、RGMa-Hisでエレクトロポレーションし、18時間培養した。細胞を、固定し、ネオジェニン及びHis-タグ抗体で染色した。
【０２５８】
細胞の脂質ラフト分画及び蓋。注入されたニワトリE8蓋(4Ig、2mg/mL; N-Raft、 1mg/mL;メチル-β-シクロデキストリン(10mM))又はトランスフェクトされた細胞(ネオジェニン及びRGMa)を、24時間後に回収し、溶解し、ショ糖密度勾配の底部に配置し(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2 M)、38,000 rpmで16 時間、SW 60ローター(Beckman Instruments Inc.)において遠心分離した。
【０２５９】
脊髄損傷(SCI)。脊髄損傷を、脊髄レベルT8において20 gの力でクリップ圧迫により損傷させた。4Ig又はビヒクルは、SCIの直後に髄腔内に(intraspinally)注入した。2の注入(それぞれ250ng/μL、3 μL)を、損傷部位の1 mm吻側及び1mm尾側で、かつ、正中の静脈(midline vein)に隣接させて行った。SCIの直後に、4Ig処理ラットに、頸静脈(intrajugular vein)を通して、4Igの1 mg/kg用量も静脈内に(intravenously, i.v.)受けさせ、続いて、もう2週間、静脈内注入を毎週受けさせた。MβCD群におけるラットに、MβCDの腹腔内(intraperitoneal, i.p.)注入を1000 mg/kg/週でSCI直後に受けさせ、その後、犠死まで毎日腹腔内注入を受けた。コントロールラットは、上述の通り、同体積のビヒクルを受けさせた。
【０２６０】
髄腔内注入(Intrathecal infusion)。4Igの局所送達を評価するため、19の成体雌ウィスター(Wistar)ラットを、損傷させ、損傷部位の吻側及び尾側に4Ig又はPBSを注入した。髄腔内注入直後に、4Ig又はPBSを髄腔内(intrathecally)に送達し、その後、カテーテル及びポンプシステムによって14日間(0.5μL/時間)継続的に送達した。
【０２６１】
機能解析。機能試験を損傷1日前に行い、その後、SCI後6週間、毎週行った。運動機能をBBBロコモーター評価スケール(locomotor rating scale)を用いて評価した。0というスコアは、後肢運動が全くないことを示し、21というスコアは、コントロールにおいて観察されたように、損なわれていない運動を示す。運動サブスコア(Motor subscore)を、つま先クリアランス(toe clearance)、支配的な足の位置(predominant paw position)及び不安定性がないことを評価するように決定した。7という最大の運動サブスコアは、正常な運動を意味する。
【０２６２】
細やかな運動機能を評価するために、梯子歩行(Ladder-walk)解析を行った。SCIの1週間後及びその後毎週、10を超えるBBBスコアを有するラットを、水平梯子歩行器具(horizontal ladder-walk apparatus)上に配置し、3のテストランを記録した。記録をスローモーションにおいて解析し、後肢ごとの足跡の数を記録し、平均を、各ラットについて1週間ごとに計算した。
【０２６３】
タンパク質のクローニング及び精製。ネオジェニン(4Ig)のIgドメイン及び、DCC (4Ig)のIgドメインを、N-末端に6-Hisタグを有するpSectag 2Bベクター(Invitrogen)と、C-末端に、ベクターのmyc及び6-Hisタグとインフレームにクローニングした。N-RGMaコンストラクト、N-RGMa28-73 (N-Raft)、 N-RGMa50-99、及びN-RGMa77-113 (N-inh.)は、N-RGMa77-113を除いて、全て、N-末端の6-Hisタグとともにクローニングした、該RGMaコンストラクトは、C-末端にmycタグ及び6-Hisタグも有した。細胞にトランスフェクトし、培地を、48時間後に回収し、製造者のプロトコル(Qiagen)に従って、Ni-NTAビーズで精製した。全てのアッセイにおいて、使用する前に、タンパク質を、PBSにおいて透析した(dialyzed)。
【０２６４】
網膜外植片伸長解析。ポリ-L-リジン(PLL; SIGMA; 10μg/ml)で被覆されたガラスのカバースリップを、ラミニン(10μg/ml; Invitrogen)及びRGMaタンパク質(5μg)で処理し、3時間、室温でインキュベートした。PLL処置したカバースリップをミエリン(myelin)で一晩被覆し(6μ g/cm2)、続いてラミニンで被覆した。側頭網膜外植片を、DMEM F-12培地(2%ニワトリ血清、10% FBS)においてミエリン又はタンパク質で被覆した表面のいずれかにおいて18時間培養した。ラフトを破壊するために、外植片を、10mM MβCDで12分間、前処理し、又は2 U/ml COで1時間、37°Cで前処理し、洗浄し、タンパク質を被覆したカバースリップ上で培養した。外植片を、その後、4% PFAで固定し、Alexa488-fluor-ファロイジン(1:50; Molecular Probes)で染色した。線維長を、Image Pro 5.0を用いて定量した。
【０２６５】
プルダウンアッセイ(Pull-down assay)。サプライヤーの指示に従って、タンパク質を、活性化されたCNBrセファロースビーズ(Sepharose bead) (Pharmacia)に結合した。トランスフェクトされた細胞からの上清を、2時間、室温で(RT)連結されたビーズに加えた。ビーズを、その後、0.02% Tween 20を加えたPBSで6回洗浄し、SDSローディングバッファーを加えた。試料を煮沸し、ウエスタンブロットティングにかけた。
【０２６６】
HEK細胞及び蓋の脂質ラフト分画。タンパク質(4Ig、2mg/ml; N-Raft、 1mg/mL; RGMaΔ、 5mg/ml;メチル-β-シクロデキストリン(10mM))を、ニワトリE8視蓋に注入し、蓋を24時間後に回収した。HEK細胞をネオジェニン及び異なるRGMaコンストラクトでトランスフェクトし、48時間後に回収した。RGMaΔを用いた処置のため、ネオジェニンでトランスフェクトした細胞を、RGMaΔ (2mg/ml)及びBMP-2(100nM)で処置し、1時間、37℃で更にインキュベートした。蓋(実験の各セットについて3の蓋)及び/又は細胞を冷却した緩衝剤(chilled buffer) (25mM Tris-HCl、pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(cocktail))中で可溶化し(solubilized)、G25及びG30の針をそれぞれ通過させ、800gで10分間、4℃で遠心分離した。低温のTriton X-100を核除去後上清(post nuclear supernatant)に加えて、1%の最終濃度とし、1時間、氷上でインキュベートした。2X体積の2Mショ糖を加え、試料をショ糖密度勾配(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2 M)の底部に配置し、38,000 rpmで16時間、SW 60ローター(Beckman Instruments Inc.)において遠心分離した。400μlの画分を最上部(1と番号を付した最上部及び連続的に番号を付した8画分)から回収し、-80℃で保存した。
【０２６７】
卵内(In ovo)エレクトロポレーション及びDiIトレーシング(tracing)。卵(白色レグホン)を38℃で高湿度チャンバーにおいてインキュベートした。少量のウイルス溶液(1 x 108 IU/mlのウイルス力価)を1/10体積の0.25%ファストグリーン(fast green)溶液(Molecular Probes)で混合し、E1.5の蓋に注入した。小さなDiI結晶(crystal)(Molecular Probes)を右目の側頭背側部に配置した場合、卵をE15まで更にインキュベートした。E17に、胚を犠死させ、蓋を4% PFAで固定した。蓋を半分に切った後、DiIトレーシングを顕微鏡(Olympus BX61)下で観察した。蓋のデジタル画像を撮影し、Photoshop (Adobe)を用いて処理した。別の方法として、プラスミドコンストラクトを眼胞(optic vesicle)にエレクトロポレーションして、目への発現を制限し、トレーシングを上述のように行った。
【０２６８】
統計分析。Excel (Microsoft)を用いるスチューデントの両側T検定(Student’s two-tail t-test)を使用して、網膜伸長アッセイの統計解析を行った。結果を、平均± SEM (n=少なくとも3の独立実験;独立実験ごとの2のデュプリケート(duplicates)、デュプリケートごとの>10の外植片)として表した。
【０２６９】
免疫共局在プロトコル。網膜外植片を、ラミニン上において18時間、37℃で培養し、コレラ(Cholera)毒素B-FITC (C1655; Sigma; 10mg/mL)で処理し、続いて抗-コレラ毒素B抗体(ab35988; abcam; 1:1000)により斑点状にし、4% PFA中で固定した。ネオジェニンとの共局在染色のために、外植片を5% FBS/PBSでブロッキングし、ネオジェニン抗体(H-175; Santa Cruz; 1:200)とインキュベートし、続いて抗-ウサギAlexa 555二次抗体(molecular probes; 1:250)とインキュベートした。コレラ毒素とF-アクチンとの共局在に関しては、外植片をコレラ毒素で処理し、上述のとおり斑点状にし、Alexa 555-flour-ファロイジンで染色した。ネオジェニンとRGMa-Hisとの共局在に関しては、DRGニューロンを、ニワトリE8胚から調製し、Amaxa Nucleofectorキット(Lonza)を用いて、RGMa-Hisとともにエレクトロポレーションし、ラミニンを被覆されたカバースリップに設置し、18時間培養した。細胞を固定し、洗浄し、5% FBS中でブロッキングし、ネオジェニン(H-175; Santa Cruz; 1:200)及びHis抗体(abm; 1:1000)で共染色した。DRGを、抗-ウサギAlexa 555及び抗-マウスAlexa 488抗体(molecular probes; 1:250)でインキュベートした。
【０２７０】
画像分析。網膜神経節細胞及びDRGニューロンの成長円錐をOlympus BX61顕微鏡においてイメージングした。Zスタック画像(stack images)を、赤(ネオジェニン)及び緑(コレラ毒素B又はRGMa)のチャンネル(channel)の両方において撮影し、プログラムの「z上の最大射影(maximum projection)」特性を用いることにより、単一のレイヤーに組み合わせた。2色の共局在の度合いを、「強度相関解析プラグインを有するImage J」を用いて定量した。強度相関解析(Intensity correlation analysis, ICA)により、2のチャンネルの強度が、同調して(in synchrony) (依存性染色(dependent staining))又は非同調的に(asynchronously) (分離染色(segregated staining))変化するか否かを測定した。
【０２７１】
定量的共局在分析。強度相関解析(ICA)プラグインを有するImageJソフトウェア(WCIF ImageJ)を用いて、定量的共局在解析を行った。ICQ値は、-0.5及び+0.5の間の範囲である。ランダム染色ICQ約0;分離染色: 0> ICQ > -0.5;依存性染色: 0<ICQ <+0.5。有意性のテストは、符号検定(sign test)(P sign test)の正規近似(normal approximation)を用いて行った。
【０２７２】
細胞死解析。RGMaを安定に発現するHEK293細胞をこのアッセイにおいて使用した。ネオジェニンを発現させるプラスミド(1μg/μl)の一過的なトランスフェクションをlipofectamin 2000を用いて行った。トランスフェクション後、細胞を24時間、5% CO2中でインキュベートし、トリパンブルー(SIGMA)染色を行って、細胞死を評価した。
【０２７３】
解離網膜神経節細胞レスキュー解析。解離網膜神経節細胞を、E7ニワトリ胚から調製した。網膜を、HBSSにおいて切開し、トリプシン処理し(trypsinized)、10%子牛血清及びN2サプリメントを含むDMEM/F12培地中で培養した。細胞に、nuclefectorキット(Amaxa Chicken Neuron Nucleofector kit, Lonza)を用いて、pRFPコントロールshRNA、ニワトリRGMaに対するshRNA 37、shRNA 37及びマウスRGMaの両方をヌクレオフェクション(nucleofect)した。ラミニン(10μg/ml)、あるいはN-RGMa (10μg)、C-RGMa (10μg)又はRGMaΔ (20μg)タンパク質を伴うラミニンのいずれかで被覆したカバースリップに、細胞をまき(500,000細胞/ウェル)、18時間、生育させた。細胞を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、β-チューブリン抗体(Covance; 1:1000)で1時間、室温で染色し、続いて、Alexa fluor488ヤギ抗マウス二次抗体を、1時間、室温で使用した(1:500)。トランスフェクトされた細胞の画像を、Olympus蛍光顕微鏡(BX61)を用いて撮影した。トランスフェクトされた細胞の軸索長を、各条件(少なくとも40細胞/条件/実験)からcellSens (Olympus)を用いて測定した。
【０２７４】
解離網膜神経節細胞の成長円錐におけるRGMaの染色。成長円錐におけるRGMaサイレンシングを観察するため、上述のとおり、解離網膜神経節細胞を調製し、いずれもRFPを発現させる、shRNA 37及び21並びにコントロールshRNAでヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションされた細胞を、ラミニン(10μg/ml)で被覆されたカバースリップにまき、培養し、18時間後に4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、RGMa抗体(7A2: RGMaのC末端部分を標的とするハイブリドーマ細胞からの上清)を用いて一晩、4℃で染色した。細胞を、Alexa-fluor 488抗-マウス二次抗体と1時間、室温において更にインキュベートした。ヌクレオフェクションされた網膜神経節細胞からの成長円錐を、Olympus蛍光顕微鏡(BX61)を用いてイメージングした。
【０２７５】
RGMa下方抑制のウエスタンブロット解析。HEK細胞を、PEI (Polysciences Inc.)を用いて、HIS抗体でタグ付けされたニワトリRGMa又はマウスRGMaのいずれか及びコントロールshRNA、shRNA 37、shRNA 21で共トランスフェクトした。細胞を、72時間、インキュベートし、RIPA緩衝剤及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを用いて溶解した。細胞溶解物を、ウエスタンブロットにかけ、1時間、室温においてHIS抗体(abm 1:1000)でプローブした。Odysseyヤギ抗マウス二次抗体(1:4000; LI-COR)を、1時間、室温で使用した。クマシー染色を、各条件について、ロードしている総タンパク質が等しいことを確かめるために行った。
【０２７６】
視神経挫滅。全動物が、病原体のない環境で飼育された、250〜300gの重さがある雌Sprague-Dawleyラットであった。簡潔には、神経挫滅の7日前に、動物に、RGCの上丘標的(superior colliculus target)への2% Fluorogoldの定位注入(stereotaxic injection)を受けさせた。定位の腕(stereotaxic arm)に取り付けられたForedoom Micro Motorドリルを使用して、上丘上方の頭蓋骨に左右相称に穴を開けた。コンピュータ制御のPicopump (World Precision Instruments)によって作動された10-μl Hamilton注射器を用いて注射を行った。2の注射液は、それぞれ3μlのFluorogold溶液からなり、500 nl/分の注射速度で上丘内の異なる深さに送達された。針穿刺経路(needle tract)の上方への、注射された溶液の逆流を防止するため、針は、各注射後、10分間、所定の位置に残され、ゆっくりと引き抜かれた。
【０２７７】
加えて、挫滅させる神経手術手順のため、動物を、定位フレームに配置し、ガス麻酔マスク(anesthesia mask)を用いて、イソフルラン(isoflurane) (2%; 0.8 L/分 O2)で通気した。眼窩(orbit)の上縁(superior rim)における切開によって神経に到達し、続いて上に横たわる直筋(rectus muscle)を退縮させた(retraction)。視神経を、細かい自動閉鎖(self-closing)の鉗子(forceps)を用いて6秒間、挫滅させた。最終的には、眼窩内容(orbital content)を穏やかにその元の位置に戻し、最初の切開を閉じた(closed)。手術の後に太陽灯下で、動物を、常温条件において37℃に維持し、これらにKetoprofen (5 mg/mL、ラットのための用量: 0.1 mL/100 g体重)及び無菌の生理食塩水を与え、術後回復(postsurgical recovery)を容易にした。
【０２７８】
注射プロトコル及び投薬。視神経挫滅後のRGCの生存及び再生に対する4Ig、N-Raft、及びMβCDの効果を評価するため、4Ig (250ng/μl)及びN-Raft (150ng/μl)溶液の4 μl眼内注射液(intraocular injection)を、損傷後3日目及び10日目に送達した。加えて、これらの2群に、頸静脈(intrajugular vein)を経由して挫滅後3日目及び10日目に、1 mg/kgの用量において4Ig及びN-Raftを受けさせた。別個に、MβCD群の動物に、神経挫滅後、MβCDの腹腔内注射を1000 mg/kg/週、1日1回のスケジュールで3週間受けさせた。
【０２７９】
眼内注射。簡潔には、ラットを、O2の混合物中の2%イソフルランで最初に麻酔し、その後、眼内注射より前に、角膜を、Alcaine点眼薬(eye drop)(Alcon)を用いて麻酔した。PEEK管(tubing)による流体継ぎ手(hydraulic coupling)を用いて10 μlハミルトン注射器に取り付けられた、引いた(pulled)ガラスマイクロピペットを使用して、縁(limbus)の後方の目の硝子体腔(vitreous chamber)に4Ig、及びN-Raft溶液を送達した。ピペットは、逆流を防止するために、注入後5秒間、適所に保持され、目からゆっくり引き抜かれた。注入後に、角膜を、眼軟膏(ophthalmic ointment)で被覆して、乾燥を防止し、動物を、その通常の住居に戻した。
【０２８０】
損傷後のRGCの生存の定量化。動物を、神経挫滅21日後に安楽死させ(euthanized)、目を摘出し、角膜及びレンズを除去し、網膜を有する残る眼杯(eye cup)を1時間、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。網膜を、その後に除去し、平坦に標本化し、50:50グリセロール/ PBSを用いて封入処理した(coverslipped)。Leica DM LFSA顕微鏡に取り付けられたAndor iXon 885+ 電子増倍(electron-multiplying)電荷結合デバイスカメラを用いて、RGCにおけるFluorogold染色を可視化した。加えて、液体の光ガイド付きのSutter Lambda XL (Quorum Technologies, Guelph, Canada)を光源として使用した。RGCの密度を、平坦な標本(網膜の中心から定められた距離)の各四分円の内側(1/6網膜偏心度(retinal eccentricity))、中間周辺(midperiphery)(1/2網膜偏心度)、又は外側網膜(5/6網膜偏心度)において測定した。この細胞計数を、0.08という因子で除して、細胞/mm2という単位領域ごとの推定RGC密度を得る。
【０２８１】
RGC再生、網膜内の完全性(intraretinal integrity)の定量化及びGAP-43免疫組織化学。最初に、RGC軸索再生及び網膜内の完全性を、視神経挫滅21日後に調べた。RGCの順行性標識が神経除去及び固定の2日前に生じ、順行性トレーサー(tracer)FITC-結合コレラ毒素タイプB (CTB-FITC)は、軸索を能動的に(actively)トレースするために、目の硝子体腔(vitreous chamber)に注入される。CTB-FITCを、順行性(anterogradly)に軸索内において輸送して、シナプス膜(synaptic membrane)に到達した。
【０２８２】
RGC軸索再生を、視神経挫滅21日後に調べた。動物に、上行大動脈を経由して、4%パラホルムアルデヒドをかん流させ(perfused)、一方、下行大動脈を固定し、視神経を除去した。神経を、一晩、PBS中の30%ショ糖を7日間、40℃(C)において加えた同じ固定液中で後固定した(post-fixed)。Leica CM1950クリオスタットミクロトーム(cryostat microtome)を用いて、固定された神経を、14 μmの厚さで連続的に切片にした。新生児(neonatal)及び成体RGCの両方において、スライドを、再生する網膜神経節細胞軸索のマーカーの成長関連タンパク質-43(growth associated protein-43, GAP- 43)を標的とする一次抗血清(antisera)中で一晩、4℃で最初にインキュベートした。一次抗血清(ウサギポリクローナル、1:250、Cell Signaling Technology/NEB)を0.3% Triton X-100及び3%通常のヤギ血清を含むPBS中で希釈した。一次抗体インキュベーションの後に、切片をPBS中で15分間、3回リンスし、続いて、室温においてFITC標識二次抗体で3時間、インキュベーションした。
【０２８３】
その後、50:50グリセロール/PBSを用いてカバースリップを作製する前に、スライドを、PBS中で15分間、3回リンスした。視神経のビン(bins)内の、挫滅部位の前方に始まり、遠心的に進む、再生している軸索成長円錐の総数を定量化した。ビンは、以下: 0-250、250-500、及び>500 μmの通りである。EMゲイン(EMgain)が適用されたAndor iXon 885+カメラを有するLeica DM LFSA顕微鏡(20×対物レンズ)を用いて、各視神経の幅の全てにわたって均等に間隔を開けた合計4の切片を調べ、定量化した。
【０２８４】
統計分析。RGCの密度及び再生する軸索の数が平均 ± SEMとして提示され、一元配置分散分析(one-way analysis of variance)を用いて分析し、続いてテューキー検定(Tukey test)で分析した。RGCの密度は、網膜偏心度(内側、中間、外側)によってグループ化された。差は、p < 0.05の場合に有意であるとみなされた。
【０２８５】
脊髄損傷。手術前に、32成体雌ウィスターラット(Charles River, St. Constant, QC, 200-300g)を、慣れさせて、基準値(baseline)行動評価のために訓練した。ラットを、4群(n=8/群): 1) MBCD (腹腔内); 2)ビヒクルコントロール(腹腔内); 3) 4Ig (静脈内(i.v.)及び髄腔内); 4)ビヒクルコントロール(静脈内及び髄腔内)、に分割した。ラットを、亜酸化窒素及び酸素(1:2, v/v)の混合物との組み合わせた2%イソフルオラン(isofluorane)の吸入により、麻酔した。脊髄を、椎弓切除(laminectomy)によって露出させ、脊髄レベルT8に20 gの力でクリップ圧迫損傷にした。これは、SCIを反映する人体の病理(human pathology)の臨床的に関連のあるモデルであった。4Ig群及び同等の対照群では、SCI直後に、4Ig又はビヒクルを、髄腔内に注入した。合計2の注入(250ng/μL,それぞれ3 μL)を、損傷部位に対して1 mm吻側及び1mm尾側、並びに正中の静脈に近接して行った。10 μlハミルトン注射器及び特別注文による32 G針を有する1.5μl/分の速さの電導微量注入器(microinjector)を用いて、手術用顕微鏡を活用して、注入を、定位的に(stereotactically)行った。漏出(leakage)を防止するために、注入後、更に2分間、針を適所に残した。上を覆う筋肉及び皮膚を、3-0バイクリル(vicryl)縫合糸(Johnson and Johnson, Peterborough ON, Canada)を用いて、縫合した。
【０２８６】
SCI直後に、4Ig処理ラットに、頸静脈を経由して、1 mg/kg用量の4Ig静脈内注射も受けさせ、その後にもう2週間、毎週静脈内注射を行った。MβCD群におけるラットに、SCI直後に1000 mg/kg/週でMβCDの腹腔内注射を受けさせ、その後、毎日、犠死まで腹腔内注射を受けさせた。コントロールラットに、上述のように、等しい体積を受けさせた。自発的排尿(spontaneous voiding)が確立されるまで、膀胱(Bladder)を、手作業で毎日3回排泄させ、血尿(hematuria)又は尿路感染(urinary tract infection)をClavomax (7日間、62.5 mg PO BID)で処置した。ラットを、12時間の明暗サイクルで、1匹ずつ、温度制御された部屋に26℃で飼育した。水及び餌を自由に提供した。
【０２８７】
髄腔内注入。4Igの局所送達を評価するための別個の実験において、上述のように、19の成体雌ウィスターラットを、損傷させ、損傷部位の吻側及び尾側に、4Ig又はリン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline, PBS)を注入した。ミニ浸透圧ポンプ(Alzet Model No. 2002)に取り付けられたポリウレタン製カテーテル(Alzet Model No. 0007741; Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA)を用いて、髄腔内注入直後に、4Igを、髄腔内に送達した。233uLの4Ig (1ug/uL)を、ミニ浸透圧ポンプに注入した。等しい体積のPBSを、4Igを受けない動物においてコントロールとして使用した。ポンプに、無菌生理食塩水において37℃で一晩、呼び水を入れた(primed)。髄腔内の空間に挿入したカテーテルによって、小規模な正中硬膜切開術(midline durotomy)をT9に行った。カテーテルの先端を、T7レベルに吻側に向けた。(この位置は、吻側の4Ig注入部位の約1mm吻側であった)カテーテル及びポンプを広範囲に皮下組織(subcutaneous tissue)に縫合した。その後、カテーテル及びポンプシステムを経由して、14日間(0.5uL/時間)、4Ig又はPBSを、連続して髄腔内に送達した。
【０２８８】
機能解析。損傷前、SCI 1日後、次いでSCI後6週間、毎週機能試験を行った。運動機能を、BBB運動評価スケールを用いて評価した。ラットを、滑りにくい表面を有するオープンフィールドに個別に配置し、処理が見えない2の独立した試験官が、4分間、後肢運動を観察して、ビデオ録画し、関節運動、足踏み能力(stepping ability)、協調(coordination)、足位、及びつま先クリアランスを含む動物の機能を評価した。0というスコアは、全く後肢運動がないことを示し、21というスコアは、コントロールにおいて観察されたような、損なわれていない運動を示した。運動サブスコアを、つま先クリアランス、優勢な足位及び不安定性がないことを評価するために決定した。7という最大の運動サブスコアは、正常な運動を意味する。
【０２８９】
器具を用いた梯子歩行解析を、細かい運動機能を評価するために行った。水平な梯子をわたるように、SCIの1週間前にラットを訓練した。SCIの1週間後及びその後毎週、BBBスコア>10のラットを、水平な梯子歩行器具に配置し、3の試験走行(test run)を記録した。記録をスローモーションで解析した;1後肢当たりの足音の数を記録し、1週間ごとに各ラットについて平均を計算した。後肢を引きずっている損傷ラットを最大の足音12と採点した。損傷を受けていないラットは、1回渡るごとに、0又は時に1を有した。試験における相対的成功率を計算した。
【０２９０】
組織標本(Tissue Preparation)、免疫染色、及び定量分析。ラットを、SCIの後に毎週の行動評価を行い、SCIの6週間後に犠死させた。ラットを、腹腔内ペントバルビトールナトリウムで深く麻酔し、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline, PBS)、pH 7.4において4%パラホルムアルデヒドで経心腔的に(transcardially)かん流した。T8の損傷部位を取り囲む組織の1.5 cm切片を、摘出し、0.1 M PBS 中30%ショ糖において少なくとも24時間、凍結防止した(cryoprotected)。組織を、Shandon Cryomatrix (VWR Laboratories, Mississauga, ON, Canada)に包埋し、矢状面に平行に、20 μm連続切片に凍結切片化した(cryosectioned)。
【０２９１】
生存した宿主神経細胞を定量化するため、切片をNeuNと免疫反応させた。切片を、0.1 M PBS中10% (v/v)正常ヤギ血清で1時間、ブロッキングし、神経細胞についてマウス抗-NeuN (1:500; Chemicon)と一晩インキュベートし、PBS中で洗浄し、ビオチン化(biotinylated)抗-マウス二次抗体(Vector Laboratories)で1時間インキュベートし、洗浄し、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体(Vectastain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories)と1時間、インキュベートした。ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine, DAB) (Vectastain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories)を、色原体(chromogen)として適用した。各脊髄について、脊髄の厚みの全てにわたって前後の距離で同等に280〜420 um離れた5切片を、同等の灰白質領域を含み、かつ、細胞の二重計算(double-counting)を回避するように、標本にした。Nikon NIS Elements BR v.3.1ソフトウェアを用いて、全てのNeuN陽性神経細胞を、損傷中心から2.7 mm吻側及び尾側で計数した。データは、脊髄の厚み全体について正規化されていない総数の群平均(group means)として提示した。
【０２９２】
宿主星状膠細胞及び乏突起膠細胞(oligodendrocyte)を定量化するため、上述のように、切片を、ブロックキングし、以下の一次抗体と一晩インキュベートした:星状膠細胞のためのマウス抗-GFAP (1:200; Chemicon, Temecula, CA)及び乏突起膠細胞のためのマウス抗-CC1/APC (1:1000; Calbiochem, San Diego, CA)。組織切片を、0.1M PBSで洗浄し、蛍光結合二次抗体と1時間、室温でインキュベートし、PBSで洗浄し、その後、4’, 6-ジアミジノ-2-フェニル-インドール(DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, ON, Canada)核対比染料(nuclear counterstain)を有するVectashield封入剤(mounting medium)でカバースリップを作製した。種特異的非免疫のIgGと一次抗体を省略したものとを、ネガティブコントロールとして使用した。損傷部位に隣接する宿主乏突起膠細胞の生存を定量化するために、CC1で免疫染色された切片を、Nikon Eclipse TE 300顕微鏡及びNIS Elements BR v.3.1ソフトウェアを用いて同一の設定及び露出時間でイメージングした。最大キャビテーション(cavitation)及び同様の背側-腹側距離を有する3切片を動物ごとに調べた。領域(2.9 x 105 um2 の面積)におけるCC1+ 細胞の数を、各切片における損傷の縁から600 um以内の吻側及び尾側の両方で計数した。GFAP免疫反応性を定量化するため、免疫染色された切片を、Nikon Eclipse TE 300 顕微鏡及びNIS Elements BR v.3.1ソフトウェアを用いて、同一の設定及び露出時間でイメージングした。最大のキャビテーション及び同様の背側-腹側距離を有する3の切片を、ラットごとに調べた。各切片について、吻側及び背側の両方において、損傷の縁から0.45mm及び1.8mmにおいて3の領域の総和強度値(sum intensity values) (1.1 x 106 um2の面積)を測定した。各領域について、平均強度値を、群ごとに平均化した。
【０２９３】
損傷体積を定量化するため、組織形態について、8番目の側矢状(parasagittal)切片ごとに、ルクソールファストブルー(luxol fast blue)及びヘマトキシリン & エオシン(hemotoxylin & eosin) (LFB/H&E)のために加工した。切片を、Nikon Eclipse TE 300顕微鏡を用いてイメージングし、各切片のキャビテーションの領域を、Nikon NISエレメントv.3.1ソフトウェアを用いてトレースした。空洞(cavities)内のいかなる壊死組織も損傷の一部として計数した。各切片の測定された面積の総和を、切片間の距離(inter-section distance)で乗じることによって、合計の空洞体積をを計算した。
【０２９４】
ビオチン化デキストランアミン(biotin dextran amine, BDA)を用いた皮質脊髄路(corticospinal tract, CST)の順行性の軸索トレーシング。SCI後に機能評価を完了し、CSTからの軸索を可視化するため、SCIの6週間後に、BDAを用いた順行性の軸索トレーシングを行った。各群からの動物 (n=3〜4)を、BDA注入のために、無作為に選択した。1:2 NO: O2を有する2%イソフルオランを用いた深い麻酔下において、ラットを定位のフレームに配置し、開頭術(craniotomy)を左右相称に行って、感覚運動皮質(sensorimotor cortex)を露出させた。BDA (10%, 10,000 MW; Invitrogen (Life Technologies))を0.01M PBSに溶解させ、ブレグマ(bregma)に関して以下の座標を用いて、各感覚運動皮質における6部位に注入した: 1) 0.5 mm後方及び1 mm側方、2) 0.5 mm後方及び2 mm側方、3) 1 mm後方及び1 mm側方、4) 1 mm後方及び2 mm側方、5) 1.5 mm後方及び1 mm側方、6) 1.5 mm後方及び 2 mm側方。各部位において、1 μlのBDAを、該皮質の表面から1.2 mmに注入した。手術用顕微鏡を活用して、0.5 μl/分の速さの電導微量注入器を用いて、10 μlハミルトン注射器及び32-ゲージ針(gauge needle)で注入を、定位的に行った。漏れを防止するために、注入後更に2分間、針を適所に残し、皮膚を6-0バイクリルで閉じた。動物を、もう3週間生存させ、その後、0.1 M PBS中4%パラホルムアルデヒドを心臓内にかん流させた。損傷部位を取り囲む組織の1.5 cmセグメントを含むBDA組織を、摘出し、スライド上の20 μm凍結切片(cryosection)又は浮遊性の(free-floating)30 μm切片のいずれかとして加工した。浮遊性切片を、PBSを含む24-ウェルプレートに回収した。切片を、メタノール中1% H2O2で10分間、室温で前処置し、0.5%トリトンXを含むPBSで30分間リンスし、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体(Vectostain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories, Burlington, ON, Canada)中で1時間、室温でインキュベートした。スライドを、PBSで洗浄し、その後、蛍光Alexa-488ヤギ抗-マウス二次抗体(1:500; Invitrogen (Life Technologies))と1時間、室温でインキュベートし、DAPI (4′, 6-ジアミジノ-2-フェニル-インドール) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)核対比染料を有するVectashield封入剤でカバースリップを作製した。
【０２９５】
統計解析。グループと時点とを比較する二元配置反復測定分散分析(two-way repeated-measures ANOVA)、続いて、ボンフェローニの方法を用いる事後多重対比較(post-hoc pairwise multiple comparisons)を行うことにより、機能的試験を解析した。細胞計数の差を、一元配置分散分析(one-way ANOVA)を用いて分析し、続いてボンフェローニ検定を用いる対多重比較を行った。データは、平均 ± 標準偏差として提示される。p < 0.05の場合に、差を有意とみなした。
【０２９６】
脊髄切片のカスパーゼ-3及びNeuN染色。T8の損傷部位を取り囲む、コントロール(n=4)及び4Ig (n=4)処理ラットからの組織の1.5cmセグメントを、摘出し、30%ショ糖において凍結保護した。組織を、矢状面に平行に、20μmの連続切片に切った。生存神経細胞をカスパーゼ3で共標識するために、切片を、ブロッキングして、ウサギ抗カスパーゼ3 (1:750; Cell Signaling)と、4℃において一晩インキュベートした。次の日、切片を洗浄し、マウス抗-NeuN (1:500; Chemicon)と4時間、室温においてインキュベートし、続いてAlexa 488抗-マウス及びAlexa 555抗-ウサギ二次抗体(1:500; Molecular Probes)によって、DAPI/PBSとともに1時間、室温においてインキュベートした。各脊髄について、脊髄の厚みのすべてにわたって160um離れた5の切片を、細胞の二重計数を回避するように、標本化した。全てのNeuN陽性神経細胞及びNeuN/カスパーゼ-3二重標識細胞、並びに、カスパーゼ-3で標識された細胞とDAPI染色された細胞との合計数を、cellSensソフトウェア(Olympus)を用いて、損傷中心から1.5mm吻側及び尾側において計数した。
【０２９７】
実施例2
成長円錐の脂質ラフトにおけるネオジェニンの存在
発生中の中枢神経系(central nervous system, CNS)におけるネオジェニンの役割を研究するため、脳膜(E8)におけるネオジェニンの発現を、ウエスタンブロッティングによって調べた。以下の抗体:ネオジェニンの細胞外ドメイン全体を標的とする抗体であるAF1079、及びネオジェニンのN-末端を標的とする抗体であるN-20、を本研究において用いた。AF1079は、180-kDA及び150-kDaにおける2バンドを検出し、N-20は、180-kDaにおけるバンドを検出した(図1A及び1B)。この結果は、脳膜が、完全長ネオジェニン(すなわち、180-kDa)と、4Igリピートの一部を欠くネオジェニンのN-末端欠失体(例えば、150-kDa)とを含むことを示した。
【０２９８】
ネオジェニンの発現の更に研究するため、ネオジェニンの膜局在を、共焦点イメージングによって調べた。特に、染色を、ネオジェニンのN-末端部に対する抗体を用いて行った。この染色は、網膜神経節細胞の成長円錐(RGC、E8、図1A-1D)における点状染色パターンを示した。これらの点状構造は、それぞれ0.27及び0.32という計算された強度相関率を有するラフトマーカー、コレラ毒素(CTB)及びRGMa(図1E及び1F)とともに、共局在した。この結果は、ネオジェニンが有意にRGMa (Pサイン=0.005)及び脂質ラフト(Pサイン=0.0002)に会合することを示した。コントロールとして、軸索を、CTB及びF-アクチン(F-action)について染色した。このコントロール実験では、計算された相関率が、0.05であり、このことは、CTB及びF-アクション(F-action)についての染色が分離することを示した(図8)。
【０２９９】
脂質ラフトにおけるネオジェニンの局在を更に調べるため、ニワトリ脳膜から単離された脂質ラフトにおけるネオジェニンの存在度(abundance)を調べた。ネオジェニンを、脂質ラフトマーカーフロチリン及びRGMaが濃縮された画分2〜4において回収した(図1G)。ネオジェニンは、重質画分マーカーのトランスフェリン受容体を含む非-脂質ラフト画分において回収されなかった(図1G)。
【０３００】
加えて、胚を、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)で処置して、膜コレステロールを枯渇させ(このことは、脂質ラフトを破壊する)、脳試料を分画した。MβCDの存在下において、ネオジェニンを、非-脂質ラフト画分においてトランスフェリン受容体とともに回収した(図8C)。
【０３０１】
要約すれば、上記結果は、ネオジェニンが、発生中のCNSにおいて脳膜に局在し、より具体的には、ネオジェニンは、これらの脳膜内において脂質ラフトに局在することを実例によって示した。
【０３０２】
実施例3
脂質ラフトにおけるネオジェニンの存在は、N-Raft及びネオジェニン-4Igの間の相互作用によって調節された
上述のように、ネオジェニンは、脂質ラフト及びRGMaと会合した。ネオジェニン及びRGMaの間の相互作用が、脂質ラフトへのネオジェニンの動員に関与したか否かを決定するため、結合試験を行って、ネオジェニン及びRGMaの異なる領域の間の相互作用を調べた。
【０３０３】
具体的には、ネオジェニンの4Ig-ドメイン及び6FNIII-ドメインを、それぞれアルカリフォスファターゼ(AP)と融合させた。ネオジェニンの4Ig-ドメイン及び6FNIII-ドメインは、ネオジェニンの細胞外部分において発見された。受入番号AAC59662 (配列番号1)が、ネオジェニンのアミノ酸配列であった。4Ig-ドメインは、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383であった。6FNIII-ドメインは、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸429〜1036であった。
【０３０４】
様々なRGMaペプチドへのこれらの融合物の結合性を、ELISAアッセイ(図2A)において解析した。ネオジェニンの6FNIII-ドメインは、完全長のRGMaと相互作用したが、ネオジェニンの4Ig-ドメインは、完全長のRGMaと相互作用しなかった(図2A)。このデータは、RGMa及びネオジェニンのインビボでの結合には、より詳細に後述される、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を助長するために、追加的な因子(複数可)が必要であり得ることを示唆した。
【０３０５】
更に、ネオジェニンの4Ig-ドメインは、RGMaのN-末端部分と相互作用した(図2A)。ネオジェニンの6FNIII-ドメイン(本明細書中において「フィブロネクチンドメイン」とも呼ばれる)も、RGMaのN-末端部分と相互作用した。
【０３０６】
RGMaの別個のN-末端領域がネオジェニンの4Ig-及び6FNIII-ドメインに結合するか否かを確認するため、RGMaのN-末端領域に及ぶペプチドを作製した。RGMaのアミノ酸配列は、受入番号NP_989868.1 (配列番号6)であった。これらのペプチドは、RGMaのアミノ酸28〜73に及ぶペプチド(本明細書中において「N-Raft」とも呼ばれる)及びRGMaのアミノ酸77〜113に及ぶペプチド(本明細書中において「N-inh」ともいう)であった。N-Raftペプチドは、ネオジェニンの4Ig-ドメインと相互作用したが、Neogninの6FNIII-ドメインとは相互作用しなかった。N-inhペプチドは、ネオジェニンの6FNIII-ドメインと相互作用したが、ネオジェニンの4Ig-ドメインと相互作用しなかった。RGMaのN-Raft及びN-inhペプチドを、ネオジェニンの4Ig-及び6FNIII-ドメインの代わりにAPと融合させる補足実験では、N-Raftは、4Ig-ドメインと結合したが、6FNIII-ドメインとは結合せず、一方、N-inhは、6FNIII-ドメインと結合したが、4Ig-ドメインとは結合しなかった(図9)。加えて、N-inh及びN-Raftを被覆させたビーズは、それぞれ6FNIII-ドメイン及び4Ig-ドメインをプルダウンし、このことは、上述のELISAの結果と整合した(図2B)。
【０３０７】
ネオジェニンの4Ig-ドメインとN-Raftとの相互作用の特異性を評価するために、最も近いネオジェニンホモログDCCを調べて、DCCがN-Raftと相互作用するか否かを決定した。DCCの4Ig-ドメインとN-Raftとの有意な相互作用は見られなかった(図9C)。
【０３０８】
上述されたネオジェニン-RGMa相互作用が、生物学的に意味があったのか(biologically relevant)かを決定するために、基質としてRGMaペプチドを用いた成長実験を行った(図2C)。完全長のN-RGMa及びN-inhフラグメントは、軸索成長において、コントロールと比較して3〜4倍の減少を引き起こした(51.5.5±3.0μm及び88.1±13.3μmと238.1±9.3μmとの比較;図2C及び2D)。これらのデータは、ネオジェニンの6FNIII-ドメインとN-RGMa及びN-inhとの相互作用が、網膜軸索成長を阻害することを示した。N-Raftペプチドを、基質として使用した場合、軸索成長に対する効果は見られなかった(図2C〜D)。これらのデータは、RGMaのN-Raftとネオジェニンとの4Ig-ドメインとの相互作用は、軸索成長をトランスに阻害しないことを示した。それゆえに、軸索成長をトランスに阻害するために、RGMaは、ネオジェニンの6FNIII-ドメインと相互作用したが、ネオジェニンの4Ig-ドメインとは相互作用しなかった。
【０３０９】
N-Raftと4Igとの相互作用は、ネオジェニンを脂質ラフトへ動員するかを評価するために、N-Raft及び4IgドメインをそれぞれRGMa及びネオジェニンから欠失させ、ネオジェニンの脂質ラフトとの会合を、その後調べた(図9)。特に、HEK293細胞を、ネオジェニン及びRGMaで共トランスフェクトし、BMP2で処理した。BMP2は、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を促進した。これらのHEK293細胞では、ネオジェニンを脂質ラフト画分において発見した。
【０３１０】
対照的には、ネオジェニンの欠失変異(すなわち、4Ig-ドメインの欠失であり、本明細書中では「4Ig-del」という)及びRGMaの欠失変異(すなわち、N-Raftドメインの欠失であり、本明細書中では「N-Raft-del」ともいう)は、通常、細胞表面を標的としたが(データは示さず)、いずれの欠失変異も、脂質ラフト画分に動員されなかった(図9)。これらのデータは、N-Raftと4Igとの相互作用が、ネオジェニンが脂質ラフトに存在するために必要であることを示した。
【０３１１】
従って、組換え4Ig及びN-Raftを過剰発現することが、脂質ラフト画分から非-脂質ラフト画分へネオジェニンをどかすための内在性4Ig及びN-Raftドメインと競合するか否かを調べた。具体的には、N-Raft、4Ig-ドメイン、又はRGMaのアミノ酸残基50〜99 (本明細書中において「N-RGMa50-99」ともいう)であるコントロールペプチドを、E8に視蓋に注入した。蓋を分画解析の1日後に回収した。
【０３１２】
コントロール(N-RGMa50-99)では、完全長のネオジェニンは、もっぱらラフト画分に局在した。N-Raft又は4Igの存在下では、ネオジェニンは、脂質ラフト画分から、脂質ラフトタンパク質を含まない重画分に再局在化した(図2E)。
【０３１３】
脂質ラフトにおけるネオジェニンの存在は、また、BMPに依存する。それゆえに、BMP-キレート剤(chelator)ノギンの存在下で、ネオジェニンが、脂質ラフトフラクションから重質フラクションへ再局在化するか否かを調べた。具体的には、この研究のために、ノギンをニワトリ脳に注入し、ノギンの存在下では、ネオジェニンが脂質ラフトには存在しないことが観察された(図2E)。それゆえに、上記データは、脂質ラフトにネオジェニンが会合することを、ノギン、N-Raft、及び4Igが、それぞれ防止することを示した。
【０３１４】
要約すれば、上記インビトロ及びインビボの結果は、ネオジェニンにおける4Ig-ドメインとRGMaにおけるN-Raft-ドメインとの間の相互作用が、ネオジェニンを脂質ラフトへ動員するために必要であることを示した。
【０３１５】
実施例4
ノックダウン解析は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を明らかにした
CNSは、3のRGMaアイソフォーム、すなわち、N-RGMa、C-RGMa、及びRGMaΔを含む。N-RGMa及びC-RGMaを図2Aに示した。RGMaΔが、完全長RGMaであった。
【０３１６】
N-RGMa、C-RGMa及びRGMaΔは、それぞれ軸索成長をトランスに阻害し、従って、増殖基質(growth substrate)として提供された場合に、N-RGMa、C-RGMa、及びRGMaΔのそれぞれが軸索成長を阻止した。加えて、N-RGMa、C-RGMa、及びRGMaΔのそれぞれは、ネオジェニンのフィブロネクチン(fibronectrin)ドメインと相互作用することにより、軸索成長をトランスに阻止した(図2A-2D)。
【０３１７】
上述し、図2E及び9に示すように、ネオジェニンの4Ig-ドメインとN-RGMa23-73との間の相互作用が、脂質ラフトへネオジェニンを動員した。RGMaは、そのGPIアンカーによって、脂質ラフトに局在した。加えて、上述もされたように、ネオジェニン及びRGMaは、成長円錐に共局在し(図1F)、N-Raftが増殖基質として(すなわち、トランスに)提供された場合に、N-Raftは、軸索成長を阻止しなかった(図2D)。総合すると、これらの結果は、ネオジェニンが、RGMaとのシス相互作用によって脂質ラフトへ動員されることを示した。
【０３１８】
RGMaとネオジェニンとのシス相互作用が、脂質ラフトへネオジェニンを動員することを更に断定するために、ショートヘアピンRNA (shRNA)を用いて、成長円錐においてRGMaをサイレンシングした。具体的には、shRNAをE2ニワトリの目に送達し、それぞれのRGMaタンパク質(すなわち、N-RGMa、C-RGMa、及びRGMaΔ)上での成長を、トランスフェクトされたE7網膜からの外植片を用いて測定した。目におけるshRNAの形質導入は、網膜神経節細胞(RGC)におけるcis RGMaの、ネオジェニンとの相互作用を単に破壊し、成長円錐と外部から増殖基質として提供されたRGMaとの間のトランス相互作用には影響しなかった。
【０３１９】
内在性RGMaを抑制する2の異なるshRNA(shRNA-21及びshRNA-37; 図12)は、N-RGMa基質において網膜外植片の成長を、コントロールshRNAに対してそれぞれ3.1倍及び2.8倍増進した(図3A及び3B)。加えて、RGMaのサイレンシングは、C-RGMa及びRGMaΔ上での軸索成長において、2.8〜3.4倍の増加をもたらした(図3A及び3B)。
【０３２０】
レスキュー実験では、shRNA37に抵抗性のマウスRGMaを用いた共トランスフェクションが、shRNA37で処理された解離RGCにおいてRGMaタンパク質の阻害活性を回復させた(図10)。それゆえに、RGMa shRNAを用いて得られた結果は、オフターゲット(off-target)効果ではなかった。総合すると、上述されたデータは、トランス相互作用に加えて、ネオジェニンを脂質ラフトへ動員する、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用が、軸索成長を抑制するために必要であることを示した。
【０３２１】
RGMaとネオジェニンとのシス相互作用が4Ig及びN-Raftの間に生じることを更に断定するため、研究を行って、4Ig及び/又はN-Raftが、阻止するペプチドとして作用し、RGMaタンパク質上で培養された網膜外植片における軸索成長を回復させるか否かを調べた。これらの研究では、5μg/mlの4Ig (図3A及び3C)又はN-Raft (図3A及び3D)のいずれかを培地へ添加することが、RGMaタンパク質の阻害効果を阻止し、成長を回復させた。総合すると、これらのデータは、ネオジェニンの4Ig-ドメインとN-Raftとのシス相互作用が、軸索の成長を抑制するために必須であることを示した。
【０３２２】
実施例5
RGMa抑制には、ネオジェニンの脂質ラフトとの会合とともにBMPが必要である
上述のように、4IgとN-Raftとの相互作用が、ネオジェニンの脂質ラフトとの会合を調節し(図2E)、軸索成長を阻害するために、ネオジェニンが脂質ラフトに存在する必要があることを示した。軸索成長を阻害するために、ネオジェニンが脂質ラフトに存在する必要があるか否かを更に研究するため、軸索をRGMaタンパク質上で培養する場合に、剤のメチル-β-シクロデキストリン(MβCD)及びコレステロール酸化酵素(CO)を用いて、脂質ラフトを破壊した。具体的には、10mM MβCD又は2U/mlのCOの存在下で軸索をRGMaタンパク質上で培養した場合、コントロールの値に軸索成長を回復させた(図3A、3E、S3D)。これらのデータは、トランスに供給されるRGMaに対する軸索応答は、脂質ラフトへのネオジェニンの輸送によって引き起こされることを示した。脂質ラフトへのこのネオジェニンの輸送は、ネオジェニンとRGMaとの(すなわち、ネオジェニンの4Ig-ドメインとRGMaのN-Raftとの)シス相互作用によって仲介された。
【０３２３】
図2Eにおけるデータは、発生中のCNSにおいて、脂質ラフトへのネオジェニンの動員が、BMPに依存することを示した。BMPと相互作用するタンパク質、ノギンが、RGMaタンパク質への軸索応答に影響を与えるか否かを決定するために、ノギンの存在下及び非存在下において軸索成長を測定した。これらの研究では、軸索成長がノギン単独によっては影響を受けなかったが、N-RGMa、C-RGMa又はRGMaΔによって著しく減少した(図3A及び3F)。ノギンは、それぞれ個別のRGMaに曝露した網膜外植片(E8)における成長をコントロールの値へ回復させた(図3A及び3F)。これらのデータは、BMPに依存する同様の機構が、3のRMGaタンパク質、すなわち、N-RGMa、C-RGMa又はRGMaΔの全てに対する、ネオジェニンを介する応答の基礎になることを示した。
【０３２４】
要約すると、上述の結果は、RGMaが、BMP(複数可)とともに、脂質ラフトへのネオジェニンの輸送を調節し、この輸送が、RGMaによる軸索成長抑制を調節するために必要であることを示した。
【０３２５】
実施例6
ネオジェニンは、正しい軸索経路探索のために脂質ラフトを必要とした
インビボでの、軸索経路に対する4Ig及びN-Raftの間の相互作用の効果を研究するため、4Ig、N-Raft、及びコントロールNRGMa50-99を異所的に(ectopically)発現させ、軸索経路探索(axonal pathfinding)を調べた。処理が、成長する軸索に影響を与え、その環境に影響を与えないことを確かめるため、エレクトロポレーションを行う場合に、電場の印加をE2の眼胞に狭め、これによって発現を目及び網膜軸索に制限した(図3G)。
【０３２６】
コントロール実験では、全ての網膜軸索が明確に定義された後外側束(terminal zone)内に樹枝状分岐(arborization)を確立した(図3H)。ポジティブコントロールとして、RGMaをサイレンシングし、ひいては、軸索経路をかき乱すshRNAをエレクトロポレーションした、(図3I)。100% (8のうちの8)の4Ig及び85.7% (7のうちの6)のN-Raftのエレクトロポレーションが、異常な経路の原因となった(図3J及び3K)。  
【０３２７】
それゆえに、脂質ラフトへのネオジェニンの局在に必要な、4IgとN-Raftとの相互作用は、インビボでの軸索経路探索にも必要であるというこれらのデータ。総合すると、成長実験(図3A〜3F)とともに、これらのデータは、BMPによって補助される、シスでのネオジェニンへのRGMaの結合が、ネオジェニンを脂質ラフトへ移行させ、この移行が、その後の、軸索成長を阻害するトランスRGMa-ネオジェニン相互作用に必要であることを示した(図3L)。前述のことを考慮すると、成長円錐におけるノギン、N-Raft、4Ig、又はRGMa-ノックダウン又はコレステロール枯渇を用いて脂質ラフトへのネオジェニンの移行を阻止することが、軸索成長を刺激する5つの戦略をもたらした(図3L)。
【０３２８】
実施例7
ネオジェニンは、細胞死を誘導するために脂質ラフトを必要とした
トランス相互作用を阻害するためにRGMaを無効にすることは、軸索成長を増加させるが、このことは、今度は、ネオジェニンの死促進(pro-death)機能を活性化する。アポトーシスを誘導するためにネオジェニンが脂質ラフトを必要とするか否かを決定するため、HEK293細胞にネオジェニンをトランスフェクトし、細胞死をトリパンブルー色素排除アッセイ(trypan blue exclusion assay)によって測定した。このアッセイでは、HEK293細胞が、安定的にRGMaを発現した(図11)。
【０３２９】
ネオジェニンは、細胞死を、モック細胞においてみられた上述のものの2倍だけ引き上げた(図4A)。ノギン、4Ig、N-Raft又はMβCDを、ネオジェニンがトランスフェクトされた細胞の培地へ加えた場合、細胞の生存率が、約2〜3倍だけ改善され、ネオジェニンによって誘導される死には、脂質ラフトが必要であることを示した(図4B)。
【０３３０】
それゆえ、これらのデータは、上述のデータとともに、RGMaとともに機能して軸索成長を阻害する場合、及び、RGMaを伴わずに機能してアポトーシスを誘導する場合に、ネオジェニンが脂質ラフトを必要とすることを示した。従って、脂質ラフトへのネオジェニン輸送を防止することは、同時に軸索成長及び細胞の生存を促進した。
【０３３１】
RGMaを、発生中のニワトリ神経管で発現させて、このようにして、ネオジェニンが、インビボでのその死促進機能のために、脂質ラフトを必要とするか否かを決定するため、アポトーシスを、ニワトリ胚(E2)の神経管において調べた。具体的には、GFP-コンストラクトを、モックまたはネオジェニンのいずれかを発現するプラスミドとともにエレクトロポレーションし、アポトーシスを、TUNEL染色によってアッセイした。
【０３３２】
アポトーシスを誘導しなかったMock発現と対照的に(図11)、多数のTUNEL+細胞が、GFP-ネオジェニンを トランスフェクトした細胞において観察された(図4C及び4D)。  4Ig又はN-Raftのいずれかを蓋に注入し、続いてネオジェニンのエレクトロポレーションを行った場合に、ネオジェニンのこのアポトーシス促進(pro-apoptotic)効果が無効になった。4Ig及びN-Raftは、それぞれ約18倍(432±23から23±4まで)及び約4倍(432±23から103±8まで)だけ、TUNEL+細胞の数を減少させた(図4D)。これらのデータは、発生中の脳において起こるアポトーシスのために、ネオジェニンが、脂質ラフトに存在することが必要であることを示した。更に、上述のデータは、アポトーシスを誘導するために、ネオジェニンが脂質ラフトを必要とし、それゆえに、4IgもしくはN-RaftまたはMβCDを用いたコレステロール枯渇により、脂質ラフトへのネオジェニンの動員又は局在を防止することが、アポトーシスの誘導を阻止することを実例で示した。
【０３３３】
実施例8
損傷網膜神経細胞においてアポトーシスを誘導するために、ネオジェニンが脂質ラフトを必要とした
上述のデータは、RGMa/ネオジェニン経路を脳発生の間に機能させるために、脂質ラフトが必要であることを示した。RGMa/ネオジェニン経路は、損傷中枢神経系(CNS)において神経細胞の死を仲介した。それゆえに、脂質ラフトへのネオジェニンの局在が、ネオジェニンの病態生理的役割のために必要であるか否かを調べた。
【０３３４】
この研究のために、網膜神経節細胞(RGC)の軸索切断(axotomy)により、細胞から栄養因子(tropic factor)を奪い、アポトーシスを誘導する網膜の器官型培養(organotypic culture)を用いた。細胞死を、プロピジウムイオディド(PI)を用いて検出し、全ての画像を、焦点が合ったRGC層と同じ強度(intensity)で撮影した。ホールマウントの相対的PI強度を測定することにより、細胞死を評価した。4Ig又はN-Raftのいずれかが培地に存在することにより、細胞死が(約40%だけ)有意に減少した(図4E及び4F)。MβCD又はCOのいずれかで脂質ラフトを攪乱することは、同様に細胞の生存を、コントロールに対して約50%だけ増進した(図4E及び4F)。
【０３３５】
それゆえに、これらのデータは、ネオジェニンが損傷神経細胞においてアポトーシスを誘導するために、ネオジェニンが脂質ラフトに局在することが必要であることを示した。RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止することにより、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を防止する4Ig又はN-Raftの存在下において、あるいは、コレステロールを枯渇させ、脂質ラフトを破壊するMβCDもしくはCOの存在下において、損傷神経細胞におけるこのアポトーシスが有意に減少した。このように、4Ig、N-Raft、又はMβCDもしくはCOを用いたコレステロールの枯渇が、ネオジェニンによるアポトーシスの誘導を阻止することにより、細胞の生存を促進した。
【０３３６】
損傷後、より高レベルのネオジェニン及びRGMaの両方が網膜において観察された。加えて、RGMa及びネオジェニンは、軸索切断後に、インビボで網膜神経節細胞(RGC)のアポトーシス死を引き起こした。損傷後にアポトーシスを誘導するために、ネオジェニンが、インビボで脂質ラフトを必要とするか否かを決定するため、4Ig又はN-Raftを、眼内(intra-ocularly)に注入し、細胞生存を、軸索切断後、14日間測定した。4Ig (682±21細胞/mm2)及びN-Raft (652±24細胞/mm2)の両方が、コントロール(361±19細胞/mm2)に対して約2倍、RGCの生存を増加させた(図4G及び4I)。MβCDの全身投与(Systemic application)(腹腔内、IP)が、また、RGCの生存を約2倍増加させた(図4G及び4J)。COは、インビボで不安定であり、それゆえに、試験しなかった。これらのデータは、損傷CNSにおいてネオジェニンで誘導されたアポトーシスには、脂質ラフトとのネオジェニンの会合が必要であることを更に示した。この会合は、ネオジェニンの4Ig-ドメインとRGMaのN-Raftとのシス相互作用に依存した。
【０３３７】
実施例9
脊髄損傷後の軸索再生を阻害するために、ネオジェニンが、脂質ラフトを必要とした
上述され、図3及び4に示すように、脂質ラフトからネオジェニンを分離することは、軸索成長をサポートし、発生中のCNSにおいて神経細胞の死を停止させた。加えて、図4G〜4Jに示すように、インビボでの軸索切断後のRGCの生存の改善が観察された。RGMaは、発生中に放射状グリア細胞によって発現させられ、ガイダンス分子として機能した。RGMaは、損傷CNSにおいて反応性(reactive)星状膠細胞及び乏突起膠細胞によって発現させられた。発生中及び再生中の両方のCNSで、RGMaは、軸索成長の阻害剤として機能した。
【０３３８】
上述のデータが、脂質ラフトとのネオジェニンの会合を防止することが、発生中のRGCにおけるRGMa/ネオジェニン経路の阻害機能を抑制することを実例で示したことから、RGMa/ネオジェニン経路によって損傷CNSの再生を妨げるには、ネオジェニンの、脂質ラフトとの結合が必要であるか否かを決定するため、RGMa/ネオジェニン経路が再生を妨げる損傷モデルにおいて研究を行った。
【０３３９】
ラット脊髄圧迫モデルにおける脊髄損傷(SCI)後の再生は、ヒトSCIを厳密に模倣した。具体的には、機能回復を、BBB運動機能評価スケール、運動サブスコア、及び梯子歩行試験を用いて、毎週測定した。
【０３４０】
4Ig (静脈内、IV)又はMβCD (IP)のいずれかを用いた処理は、コントロールと比較してより高いBBBスコア及び運動サブスコアにより証明されたように、早ければSCIの2-3週間後に、有意な機能的回復を示した(図5A、5B、5D、及び5E)。
【０３４１】
足音をエラーとみなし、それゆえ、高いスコアが、より不足した協調を反映する梯子歩行試験を用いて、後肢協調(Hindlimb coordination)を評価した。コントロールと比べて、4Igを注入されたラットでは、足音が少なかった(図5C)。機能改善の同様のパターンが、MβCDを注入されたラットにおいても観察された(図5D-5F)。
【０３４２】
加えて、星状膠細胞の染色により、4Ig及びMβCDを用いた処理が、これらの細胞集団に影響を与えることが示された。従って、観察された運動機能の改善は、神経細胞の生存又は軸索再生が改善されたことに起因した(図12)。
【０３４３】
4Igで観察された効果が、もっぱら損傷部位におけるこのペプチドの作用に起因すると断定するため、Alzetミニ浸透圧ポンプを用いた局所髄腔内投与を行った。自然回復(spontaneous recovery)を弱めるため、より強いクリップを使用して、圧迫を行った(26と20との比較)。上述の全身投与と同様に、4Igの局所投与は、より高いBBBスコアで証明されたように、早ければSCIの2〜3週間後に有意な機能的回復を示した(図5G)。ここでも、後肢協調が、有意に改善され、4Igを局所注入されたラットでは、足音がより少なかった(図6H)。
【０３４４】
運動機能の回復におけるMβCDの効果を、SCI後の、より高齢の動物(7月超、n=4)において試験した。若い動物の結果と同様に、MβCD-処理は、顕著な改善をもたらした(+6.8 BBBポイントとコントロールとの比較;図13C)。
【０３４５】
それゆえに、上述の結果は、4Ig又はMβCDによる、ネオジェニンの脂質ラフトとの会合の妨害が、SCI後の機能的運動の回復を刺激することを示した。
【０３４６】
実施例10
神経細胞の生存及び運動性軸索の再生
SCI後の神経細胞の欠損は、筋肉制御の欠失及び最終的な麻痺をもたらした。RGMa/ネオジェニン経路は、損傷CNSにおいて神経細胞の死をもたらした。それゆえに、研究を行って、ネオジェニンの脂質ラフトとの会合を阻止することが、神経細胞の欠損を停止させ、SCI後の軸索再生及び、続く機能回復を促進するか否かを調べた。
【０３４７】
本研究では、損傷ラットは、6週間、4Ig又はMβCDのいずれかの全身投与を受け、病変部近傍(peri-lesional)の神経細胞は、神経細胞マーカー、NeuNで定量化された。4Ig又はMβCD処理は、コントロールと比較して、約2倍だけ病変部近傍の神経細胞の数を増加させた(図5I-5M)。6週間の期間にわたる4Igの髄腔内投与は、脊髄断面のNeuN陽性細胞の同様の増加(約2倍)をもたらした(図5N-5P及び図12E)。測定により、4Ig及びMβCD処理された動物についての損傷体積は、コントロールと比較した場合、有意には変化しないことが明らかになった(図12D)。それゆえに、これらのデータは、ネオジェニンの、脂質ラフトとの会合を阻止することが、SCI後の神経細胞の欠損を軽減することを更に示した。
【０３４８】
CNS軸索が再生できないことは、主に、再生に貢献しないミエリンに存在する阻害因子に起因した。行動的治療成績(behavioral outcome)の改善が、軸索再生に起因するか否かを決定するために、ビオチンデキストランアミン(BDA)を運動皮質に注入することによる皮質脊髄路の順行性トレーシングを行った(図6)。
【０３４９】
1のコントロール動物のみにおいて、単一の再生線維が損傷部位(空洞)を超えて伸長することが示された。対照的に、全ての4Ig及びMβCD処理された動物では、空洞を超えて線維が突出し、いくつかは、この部位を超えて数ミリメートル伸張した(図6A及び6B)。最も長い軸索の平均長は、そのそれぞれのコントロール(18±7μm及び128±118μm)と比べて、4Ig (2875±228μm)又はMβCD (2195±335μm)で処理された動物において増加した(図6C、D)。コントロールでは、軸索は、まれにしか損傷部位を超えて見られないが、4Ig群又はMβCD群における多くの線維が、損傷部位の3000μmを超えて広がった(図6E及び6F)。 
【０３５０】
脊髄の背側及び腹側面の両方が同時に圧迫された衝撃/圧迫損傷のSCIモデルを、更なる研究に使用した。使用されたSCIの重症度が、灰白質の中心腔形成(central cavitation)と全てのCST軸索を切断した隣接した白質とをもたらし、軟膜下(subpial)の白質の生存した縁を残した(図13C)。4Ig及びMβCDの動物では、異常な経路を示した線維が観察され(図S6D)、軸索再生を示した。
【０３５１】
BDA-線維が、再生しつつある軸索であることを断定するため、4Ig (静脈注射(IV-injection))処置動物からの脊髄を、異なる時点において調べ(それぞれ、n=5)、線維が、損傷後4週目の場合と比べて、6週目において有意に長いことが観察された(図6G)。特に、6週目の動物では、4週目の動物と比べて損傷から2mm尾側と3 mm尾側との間の線維の数が有意に多いことが観察された(図6H)。
【０３５２】
損傷に対して、3mm吻側及び5mm尾側における脊髄の断面も調べた。シャム(sham)動物では、生存した線維は、両方の位置において明らかであり、このことは損傷を受けていない脊髄においてCSTが連続していることを示す。対照的に、4Ig (IV)処理動物では、線維は、損傷に対して吻側において観察されたが、損傷に対して5mm尾側では観察されず、生存した線維が欠失していることを示した。4IG (IV)又はMBCD (IP)処理されたラットでは、標識された繊維を、損傷部位に対して約4mm尾側の最大距離において検出し、これらの線維は再生しつつあり、生存しなかったことを示した。
【０３５３】
要約すれば、上述の結果は、4Ig又はMβCDによって脂質ラフトからネオジェニンを除くことが、SCI後の軸索再生及び付随する機能回復を促進することを示した。
【０３５４】
実施例11
ネオジェニンは、視神経挫滅後の軸索再生を妨げるために、脂質ラフトを必要とする
再生しつつある線維を更に調べるために、再生しつつある線維のみを染色するGAP-43とともに、視神経挫滅モデルを用いた。この研究は、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止することによって4Ig又はN-Raftで処理することは、上述の脊髄損傷後にも観察されたように、視神経損傷後の軸索再生を促進した。
【０３５５】
損傷後、動物に、4Ig又はN-Raftの静脈注射を受けさせ、軸索の再生を21日後に調べた(図7)。再生を、近位及び遠位神経断端(nerve stump)の再生しつつある成体RGC-軸索に局在するGAP-43免疫染色によって視覚化した。
【０３５６】
コントロールでは、ほとんどの軸索は、視神経内の損傷部位を横断せず、成長円錐は、挫滅部位において突然停止した(図7A)。コントロールにおいて再生しつつある軸索は、長さ250μm未満に制限され、視神経ごとに、平均約408の再生しつつある軸索が、損傷部位を越えて観察された(図7A及び7E; 250μm未満: 224±36; 250〜500μm: 108±12; 500μm超: 76±24)。
【０３５７】
対照的に、4Igで処理された動物は、損傷部位を越える再生の増加を示し、神経の近位切片においてより多くの明白な軸索発芽(axon sprouting)を示した(図7B及び7E)。軸索数の長さによる定量化は、4Igが、コントロールと比較して、再生しつつある軸索の数を有意に5.7倍だけ増加させたことを示した(図7B、E; 250μm未満: 1134±68; 250-500μm: 640±128及び500μm超: 410±64)。N-Raftを与えられた動物は、また、4Igと同程度に、損傷部位を越える再生を示した(図7C及び7E)。それゆえに、これらのデータは、4Ig及びN-Raftの両方が、有髄の成体CNSにおける軸索再生を改善させることを示した。
【０３５８】
コレステロール枯渇が視神経挫滅後の軸索再生を促進させるか否かも、これらの研究において調べた。28日間にわたってMβCDで処理されたラットにおいて軸索長を測定した(図7D及び7E)。測定された全ての距離について、MβCD (腹腔内注入)で処理された動物における切片ごとの軸索の平均数が、コントロールより7.1倍だけ有意に多かった(図7D及び7E; 250μm未満: 23.7±1.2; 250-500μm: 10.7±0.9;及び500μm超: 8.4±1.4)。
【０３５９】
視神経挫滅後の網膜内のRGC軸索の完全性(integrity)を、損傷4週間後の4Ig、N-Raft及びMβCD処理による軸索/細胞体(soma)保護の増加について調べた。無傷動物の生存RGCの細胞体を、CTB-FITCで見えるように標識した(図14C)。4Ig、N-Raft及びMβCDでの処理は、(1)網膜の至る所で軸索束(axon bundle)を厚くすること、及び(2) RGC細胞体標識の増加をもたらし、このことは、細胞の生存及び軸索再生の両方におけるこれらの処理の役割と整合した。
【０３６０】
要約すれば、これらのデータは、ネオジェニンが、軸索が視神経損傷後に再生することの失敗(failture)を仲介し、4Ig、N-Raft、又はMβCDによる、ネオジェニンの、脂質ラフトとの会合を防止することが、軸索再生をもたらすことを示した。
【０３６１】
星状膠細胞は、4Ig、N-Raft、又はMβCD処理によって影響を受けなかったことから、これらの処理の再生促進性(pro-regenerative)効果は、再生しつつある軸索における効果から生じた(図14)。それゆえに、これらのデータは、脂質ラフトにおけるネオジェニンの有無を変化させることにより、CNS-損傷後の軸索再生が促進されることを実例で示した。
【０３６２】
実施例12
実施例13に関しての材料及び方法
実施例12において本明細書中に提供されるのは、実施例13において後述される実験において使用された材料及び方法である。
【０３６３】
コンストラクト。本研究において使用された全てのコンストラクトは、別途指摘しない限り、Gallus gallus種から作製した。具体的には、N-RGMa (すなわち、アミノ酸28〜73;本明細書中「N-Raft」ともいう)は、4の重複するフラグメント: (1)アミノ酸28〜54、本明細書中「N-RGMa (28〜54アミノ酸)」ともいう; (2)アミノ酸40〜62、本明細書中「N-RGMa (40〜62アミノ酸)」ともいう; (3)アミノ酸55〜73、本明細書中「N-RGMa (55〜73アミノ酸)」ともいう;及び(4)アミノ酸64〜62、本明細書中「N-RGMa (54〜62アミノ酸)」ともいう  に分割された。これらの配列は、Psectag2B-APプラスミドにクローンされ、このことは、アルカリフォスファターゼタグに融合された可溶性タンパク質としてのペプチドの分泌を可能にした。
【０３６４】
結合アッセイ。アッセイを、96-ウェルマイクロタイタープレート(Corning Incoporated)において行った。ウェルを、4°Cで一晩、100 μl (10 μg/mL)のポリ-L-リジンで被覆した。ウェルを、その後、100 μlのPBST (+0.02% Tween)で3回洗浄した。  
【０３６５】
50 μl (2.5 μg/mL)のHisのタグを付けた:完全長のネオジェニン;ネオジェニンの4Ig-ドメイン;及びネオジェニンの6FNIII-ドメインを、1時間、37℃で各ウェルに被覆した。100 μl PBSTの3の洗浄後、各ウェルを、次いで、300 μlのPBST中3% BSAで1時間、37°Cでブロッキングした。 
【０３６６】
1% BSA + PBSTにおける50 μl (1.0 μg/mL)の、APタグを付けた: N-RGMa (28〜73); N-RGMa (28〜54); N-RGMa (40〜62); N-RGMa (54〜73); N-RGMa (54〜62)を、その後、各ウェルに加え、37℃で1時間、インキュベートした。各ウェルを、100 μl PBSTで、十分に、3回洗浄し、その後続けて、各ウェルにアルカリフォスファターゼ(AP)反応促進緩衝液(developing buffer) (100 mM NaHC03, 1mM MgCl2)を加えて平衡化した。p-ニトロフェニルフォスフェート(p- nitrophenyl phosphate, pNPP) (Sigma-Aldrich)を追加したAP反応促進緩衝液を用いて、反応を促進し、発色(color development)まで促進させた。反応を、50 μl (0.1M) NaOHを加えて停止させた。各反応の吸光度を、マイクロプレートオートリーダー(BIO-TEK Instruments Inc.)を用いて、405ナノメートル(nm)の波長において測定した。
【０３６７】
実施例13
上述のように、ネオジェニンの4Ig-ドメインに結合したRGMaのN-Raftは、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を仲介し、該シス相互作用は、脂質ラフトへのネオジェニンの局在に必要であった。N-Raftは、RGMaの残基28〜73であった。ネオジェニンの4Ig-ドメインについてN-Raft内の結合部位を更に同定するため、N-Raftを、4の重複するフラグメント: N-RGMa (28〜54アミノ酸); N-RGMa (40〜62アミノ酸); N-RGMa (55〜73アミノ酸);及びN-RGMa (54〜62アミノ酸)に分割した。これらの4のフラグメントを、精製し、完全長のネオジェニン、ネオジェニンの4Ig-ドメイン、及びネオジェニンの6FNIII-ドメインに対する結合性について試験した(図17A-17C)。
【０３６８】
これらの研究は、N-RGMa (40〜62アミノ酸)及びN-RGMa (54〜73アミノ酸)がネオジェニンの4Ig-ドメインに特異的に結合することを実例で示した(図17C)。上述もされたように、完全長のRGMaは、ネオジェニンの4Ig-ドメインに結合しなかった。加えて、N-RGMa (28〜54アミノ酸)は、ネオジェニンの4Ig-ドメインに結合しなかった。
【０３６９】
4Igに結合するフラグメント、すなわち、N-RGMa (40〜62アミノ酸)及びN-RGMa (55〜73アミノ酸)と重複するN-RGMa (54〜62アミノ酸)は、ネオジェニンの4Ig-ドメインに結合しなかった。この結果は、ネオジェニンの4Ig-ドメインに結合するために必要なアミノ酸及び/又は構造が、RGMaの残基40〜73の間に位置することを示した。
【０３７０】
結合性の研究は、2の重複するフラグメント: N-RGMa (40〜62アミノ酸)及びN-RGMa (55〜73アミノ酸)は、ネオジェニンの4Igドメインに特異的に結合するが、完全長のRGMaタンパク質及びN-RGMa (28-54アミノ酸)フラグメントは、結合しないことを明らかにした。マウスからのN-RGMa (配列番号10)及びN-RGMc (配列番号9)も試験し、ヒトネオジェニンのN-RGMa部分と同様に、ネオジェニンの4Igドメインに対する結合性を実例によって示した(データは示さず)。N-RGMaの結合性ドメインを更に単離するための取り組みにおいて、4番目(a fourth)の重複フラグメントN-RGMa (54〜62アミノ酸)(上述された結合性の研究において同定された重複する対象の特定の領域)を、ネオジェニンに対する結合特性について研究した。N-RGMa (54〜62アミノ酸)フラグメントは、ネオジェニンの4Igドメインに結合しなかった。このことは、決定的な折り畳み構成(folding composition)が、40〜73アミノ酸の領域における、ネオジェニンの4Igに対するN-RGMaの結合に必要であることを明らかにした。
【０３７１】
実施例14
網膜変性(Retinal Degeneration)
桿体視細胞の不可逆的欠失が、網膜色素変性症(RP)患者の進行性及び永久的な機能障害の重要な決定要因であった。桿体視細胞は、遺伝子変異から生じたアポトーシスに起因して失われた。RPでは、しかしながら、錐体視細胞(cone)の進行性欠失もあった。酸化的ストレス(oxidative stress)が存在する場合に、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止することは、インビボ及びインビトロで神経細胞の生存を促進した。酸化的ストレスは、RPにおいて錐体視細胞の死の一因となった。それゆえ、研究を行って、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止することが、網膜変性において視細胞の死を阻害し、錐体視細胞及び桿体視細胞の生存を促進するか否かを決定した。
【０３７２】
具体的には、これらの研究は、ネオジェニンが、成体桿体視細胞及び錐体視細胞に発現することを実例によって示した(図18)。rd1マウスを用いて、ネオジェニンが桿体視細胞の死に関与するか否かを決定した。rd1マウスモデルは、ヒトRPのためのモデルであり、桿体視細胞光受容体cGMPホスホジエステラーゼ-6.2のβ-サブユニット(subunt)をコードする遺伝子の機能喪失(loss-of-function)突然変異を有した。この機能喪失突然変異は、cGMPの蓄積(accumulation)につながり、このことが、視細胞の死を引き起こした。具体的には、rd1マウスは、生後9日目(P9)及びP21にアポトーシスを示し、90%を超える視細胞が死滅した。
【０３７３】
これらの研究では、P9及びP15における4Ig (2μg/μl)ペプチドの眼内注射(intraocular injection)を行い、動物をP21に犠死させて、細胞の生存を調べた。4Igペプチドを用いた処理を受けていないコントロール動物と比べて、4Igペプチドを用いた処置は、網膜内の視細胞の数を有意に改善した。加えて、4Igペプチドの代わりにPBSを注射したコントロール動物において、光受容体層(photoreceptor layer)は、平均約2細胞の厚みを有した。4Igの注射は、外顆粒層(ONL)の厚みを約6細胞に増大させた(図19)。この寸法は、ONLの平均的厚みであった。それゆえ、これらのデータは、上述のように脂質ラフトへのネオジェニンの局在を阻止する4Igペプチドを用いた処理が、コントロールマウスと比較して、3倍を超えてONLの厚みを増加させることを示した。
【０３７４】
脂質ラフトを破壊することが、rd1マウスにおいて細胞の生存を促進するか否かを決定するため、視細胞の生存に対するコレステロール枯渇の効果を調べた。上述のように、コレステロール枯渇は、脂質ラフトを除去する。具体的には、マウスを、毎日、P9からP21までMβCDの皮下(IP)注入で処理した。処理されたこれらのマウスでは、視細胞の生存が改善された(図21及び22)。MβCDは、細胞の生存を、4Ig処理で観察されたのと同程度、すなわち、ONLの平均的厚みの3倍の増加及び約6細胞の平均深度に促進した。それゆえ、これらのデータは、コレステロールを枯渇させることが、視細胞の生存を促進することを示した。
【０３７５】
コレステロール合成を減少させることの、細胞の生存に対する影響を調べるため、rd1マウスにおいてAY-9944を調べた(図20及び21)。rd1マウスを、P9及びP15に、AY-9944の2の腹腔内注入を用いて処理し、P21に犠死させた。MβCDと同様に、AY-9944は、rd1マウスの視細胞の生存を促進した。それゆえに、これらのデータは、コレステロール合成を減少させることが、rd1マウスにおいて視細胞の生存を促進することを示した。
【０３７６】
要約すれば、上述のデータは、脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止することが、ヒト網膜色素変性症のモデルであるrd1マウスにおいて視細胞の死を減少させ、視細胞の生存を促進することを示した。
【０３７７】
実施例15
AY-9944及びBM 15.766を用いたコレステロール生合成の阻害が、ミエリン上において網膜神経節細胞の神経突起(Neurite)の成長を促進した 
上記証明のように、コレステロール合成を減少させるAY-9944が、神経細胞の生存を促進した。コレステロール合成を減少させることの役割を更に調べるため、研究を行って、コレステロール合成を減少させることが、ミエリン上において網膜神経節細胞の神経突起の成長を促進するか否かを調べた。
【０３７８】
具体的に、網膜外植片を、E7ニワトリ胚から調製し、ラミニン又はミエリンで(with on)被覆されたカバースリップ上で培養し、コントロール(DMSO)、あるいはコレステロール生合成の2の阻害剤、AY-9944 (1μM)又はBM15.766 (4μM)で処理した。培養18時間後、外植片を4%PFAで固定し、Alexa488-ファロイジンで染色した。神経突起を、Cellsensソフトウェアを用いて測定した。網膜外植片をラミニン(コントロール)又はミエリン(CNSの阻害化合物)上で培養した。ミエリンは、成長を阻害するため、ラミニン上において、軸索成長は、ミエリンと比べると正常であった。コレステロール阻害剤を培地に加えた場合、それらは、ラミニン上において成長に影響を与えなかった。しかしながら、それらは、ミエリン上においては成長を回復させ、このことは、それらが、ミエリンの阻害活性を抑制することを示した。
【０３７９】
実施例16
実施例17のための材料及び方法
実施例15において本明細書中に提供されるのは、実施例16において後述される実験において使用された材料及び方法である。
【０３８０】
局所的脳虚血(Cerebral Focal Ischemia)モデル。全ての実験において、200〜250 gの体重の雌Sprague-Dawleyラットを使用した。簡潔には、前もって作られた凝血塊をMCAに注入することにより、局所的脳虚血を誘導した。ラットを、最初に3.0%イソフルランで麻酔し、その後、手術の間、フェイスマスクを用いて30:70 O2及びNO2の混合中1.5%イソフルランで維持した。手術の間、及び動物が麻酔から完全に回復するまでの、直後の術後期間において、体温を、加温パッド(heating pad)を用いて、正常体温のラットにおいて37℃に維持した。 
【０３８１】
腹側頸部の皮膚(cervical skin)の正中線において1.5-cmの縦切開(longitudinal incision)を行った。右総頸動脈(common carotid artery, CCA)、右内頸動脈(internal carotid artery, ICA)、及び右外頸動脈(external carotid artery, ECA)を露出させた。ECAの末梢部分を結紮し(ligated)、切断した。ウシトロンビン(Thrombostat, TM Warner-Lambert Co.)で充填された修正ポリエチレン-10カテーテルを、小さな穴を経由して右ECAの内腔に導入した。10マイクロリットルの血液を、カテーテルに引き出し、15分間保持して、凝血塊を形成させた。凝血塊が形成された時点で、その先端がMCAの起点(origin)から1〜2 mm離れた所になるまで、カテーテルを内頸動脈へ17 mm前進させた。カテーテルにおいて前もって作られた凝血塊を、その後、注入し、カテーテルを除去した。手術を、通常15分で終え、傷を閉じた。動物を、その後、そのケージに戻した。それらのケージに戻した後、動物を、正常な回復について、観察した。
【０３８２】
脳梗塞体積及び浮腫の定量化。梗塞体積を、同側半球(ipsilateral hemisphere)からの合計体積の百分率として表現した。脳浮腫を、2半球の間の体積差を計算し、左半球の体積で除することにより、決定した。 
【０３８３】
簡潔には、MCA閉塞7日後、麻酔したラットを致死させた。脳を、頭蓋骨から取り出し、氷冷の生理食塩水中で約5分間、冷却した。形態学的実験のため、2mm厚の冠状切片(coronal section)を、ラットブレインマトリックス(brain matrix)を用いて切断した。合計8の冠状切片を回収し、切片を、2% 2, 3, 5-塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液を用いて染色した。梗塞は、赤色の正常の脳の背景において青白く見えた。染色した脳切片を、Scan Jet (Hewlett Packard)フラットベッドスキャナを用いてスキャンした。画像を解析し、盲検(blinded)で、梗塞体積及び浮腫を測定した。梗塞体積を、以下の式:
【０３８４】
梗塞体積 = [左半球体積- (右半球体積 - 測定された梗塞体積)]/左半球体積
を用いて計算した。
【０３８５】
脳腫張(Brain swelling)を、以下の式:
【０３８６】
腫張(浮腫) = (右半球体積 -左半球体積)/左半球体積
を用いて決定した。
【０３８７】
梗塞体積 及び 脳腫張を、百分率において表現した。
【０３８８】
神経学的欠損及び発作活動(Seizure Activity)。各ラットの神経学的欠損及び発作活動を、虚血性損傷(ischemic injury)の2、8、24、48、72時間及び1週間後(各ラットについて6回)に、どちらの手順が行われたかを知らない観察者が、慎重に評価した。
【０３８９】
簡潔には、神経学的欠損を、改変したBedersonの評価システム(modified Bederson’s scoring system)を用いて決定した。改変システムでは、先の標準評点(0〜3のスケール)システムの代わりに、0〜4の評点スケール(grading scale)を、行動を評価するために用いた。改変評価システムは、臨床的に意義があり、改変されていない評価システムと比較して、行動を評価する能力がよりあった。発作活動を、Racineスケールを用いて分類した。死亡率(Mortality)も記録した。
【０３９０】
実施例17
脳卒中
RGMaを、ヒト成人神経系(ミエリン内の)及び脳卒中後のペナンブラ(penumbra)において高度に発現させた。ヒト脳における局所脳虚血(focal brain ischemia)後、RGMaを、損傷部位及び梗塞周囲領域(peri-infarct region)において上方制御した。損傷部位及び梗塞周囲領域は、再生を制限した。上述のように、RGMaは、軸索成長を阻害し、ひいては、損傷領域における再生を阻害する。それゆえ、更なる研究を行って、脳卒中等の虚血性傷害(ischemic insult)後のRGMa/ネオジェニン経路を調べた。
【０３９１】
RGMaは、虚血性傷害後の神経細胞の生存を促進した。脳卒中におけるRGMa/ネオジェニン経路の役割を評価するため、インビトロの脳卒中モデル(脱酸素・脱グルコース; OGD)を用いて、脳卒中誘導性細胞死を研究した。  
【０３９２】
具体的には、網膜ホールマウントを、1時間、OGDに供した。虚血後、ホールマウントを24時間、インキュベートし、死細胞を、プロピジウムイオディド(PI)染色を用いて、同定した。このアプローチを用いた場合、培地へのRGMaの添加が、細胞の生存を促進することが観察された(図22)。抗-ネオジェニン抗体が細胞死を元の状態に戻す(restored)ことから、このアプローチは、ネオジェニンが細胞の生存においてこの促進に介在することも示した。
【０３９３】
この研究を拡げるため、目へのRGMa注入が、主要な眼動脈(main optic artery)の結紮後の細胞の生存に影響を与えて、眼虚血(ocular ischemia)を誘導するか否かを試験した。この注入処理は、コントロールと比較して、生存を最大2倍増進し(図23)、更に、ネオジェニン/RGMa経路が、虚血性傷害後の細胞死に関与することを示した。
【０３９４】
ネオジェニンの、脂質ラフトとの会合を妨害することが、OGD後の細胞の生存を促進した。ネオジェニンが、細胞死を誘導するために脂質ラフトの会合を必要とするか否かを決定するため、上述のように、脂質ラフトへのネオジェニンの局在を防止する4Igの存在下で、OGDを網膜ホールマウントにおいて行った。これらの研究は、4Igペプチドが細胞の生存を増進し、コントロールと比較して、2倍だけ死滅神経細胞の数を減少させることを実例によって示した(図24)。
【０３９５】
ネオジェニンの、脂質ラフトとの会合を妨害することは、インビボでの脳の損傷を減少させた。ネオジェニンが、細胞死を誘導するために、脂質ラフトの会合を必要とするか否かを決定するため、血栓を用いて中大脳動脈閉塞を行った。動物を、ペプチドコントロール又は4Igの毎日に注入によって処理した。これらの研究では、動物の機能評価を行い、脳の損傷を調べた。これらの研究は、脳浮腫及び梗塞体積が、コントロールと比較して、4Igの存在下で有意に減少することを実例によって示した(図25及び26)。加えて、行動の欠陥も、コントロールと比較して、4Ig処理動物において有意に減少した(図27)。
【０３９６】
要約すれば、これらのデータは、脳卒中等の虚血イベントの後、ネオジェニンの、脂質ラフトとの会合を阻止することが、細胞の生存を促進し、脳浮腫、梗塞体積、及び行動の欠陥を減少させることを示した。
【０３９７】
実施例18
多発性硬化症
上述のデータは、多発性硬化症に関連のあるモデルである脊髄損傷及び視神経損傷モデルにおいて、4Igペプチドが、神経細胞の生存及び軸索再生を促進することを示した。  RGMa/ネオジェニン経路を調節することが、多発性硬化症を軽減するか否かを決定するため、上述のように、脂質ラフトへのNeogennの局在を阻止する4Igペプチドで、EAEマウスモデルを処理した。
【０３９８】
具体的には、4IgがEAEモデルにおいて麻痺を軽減するか否かを試験した。EAEを誘導するため、完全フロイントアジュバンド(complete Freund’s adjuvant, CFA)と混合したMOGp35-55ペプチドの乳濁液(50 μg、0日目)をC57BL6/Jマウスに注入した。2日目に、重篤かつ確かなEAEを引き起こすために、動物に、400 ngの百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)も腹腔内に受けさせ、その後、17日間に亘って、臨床兆候を調べた(図28)。 
【０３９９】
EAE誘導の3、6、及び9日後に、動物を、3 μgのPBS中4Ig (静脈注入)又はPBS (コントロール)のいずれかで処理した。17日後、コントロールマウスは、5にほぼ等しい臨床スコアを示し、これらが重度の麻痺状態であることを示した(図29)。対照的に、4Igを注入されたマウスは、1.4という有意に低いスコアを有し、上述のように、4Igが、脂質ラフトにネオジェニンが存在することを阻止するため、脂質ラフトにおけるネオジェニンの存在が、これらのマウスにおける免疫介在性の麻痺に必要であることを示した。
【０４００】
要約すれば、これらのデータは、4Igペプチドによる脂質ラフトへのネオジェニンの動員を阻止することが、EAEモデルにおける麻痺を減少させることを示した。
【０４０１】
実施例19
RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止する抗体の調製
上述のように、RGMaの以下の部分:アミノ酸28〜73 (すなわち、N-Raft及び配列番号2)、アミノ酸40〜62 (すなわち、配列番号4)、及びアミノ酸54〜73 (すなわち、配列番号3)が、ネオジェニンの4Igドメインを結合させた。上述のように、ネオジェニンの4Igドメインは、受入番号AAC59662 (配列番号1)のアミノ酸1〜383であった。他の断片としては、マウスネオジェニンの4Igドメイン(配列番号8)、マウスN-RGMc (配列番号9)、マウスN-RGMa (配列番号10)、又は受入番号AAI43272 (ヒトネオジェニン;配列番号11)のアミノ酸1〜417が挙げられ得る。
【０４０２】
これらのRGMaペプチドと異なり、図2Aに示すように、完全長のRGMaは、ネオジェニンの4Igドメインを結合させることができない。加えて、図17Cにおけるデータは、RGMaのアミノ酸40〜73は、また、ネオジェニンの4Igドメインを結合させ得ることを示した。RGMaのアミノ酸40〜73は、配列番号7に示される。総合すると、これらのデータは、RGMaのアミノ酸40〜73に含まれるRGMaの特定の構造が、4Igを結合させ、ひいてはRGMaとネオジェニンとのシス相互作用を仲介し、ネオジェニンを脂質ラフトへ動員するために、必要であり得ることを示唆した。この構造は、完全長のRGMaにおいて遮蔽され(occluded)、それゆえに、完全長のRGMaがネオジェニンの4Ig-ドメインを結合させることを防止し得る。この遮蔽は、他の因子(複数可)、例えば、上述のように、脂質ラフトへのネオジェニンの動員に必要であったBMPによって解除され得る。遮蔽の解除としては、RGMaの構造変化が挙げられ得る。
【０４０３】
それゆえに、4Igドメイン又はRGMaのアミノ酸40〜73の内に含まれる本構造を結合させる抗体は、RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止し得、ひいては、脂質ラフトへのネオジェニンの会合を阻止し、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進し得る。
【０４０４】
RGMaとネオジェニンとのシス相互作用を阻止し、ひいては、ネオジェニンの脂質ラフトへの動員を阻止する抗体を作製し、かつ同定するために、これらのRGMaペプチド及び4Igペプチドが使用されるだろう。これらの抗体が、ネオジェニンの、脂質ラフトへの動員を阻止することにより、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進するであろうことが予期される。
【０４０５】
具体的には、これらの抗体は、1以上のRGMaペプチド又は4Igペプチドで動物を免疫することにより、作製されるだろう。血清が、動物から回収され、N-Raftと4Igとの相互作用を妨害する、すなわち、血清の存在下において、N-Raftと4Igとの結合が減少させられ又は測定可能でないそれらの血清について、図2A、図9、及び図17に関連して説明された結合アッセイを使用して、血清がスクリーニングされるだろう。N-Raftと4Igとの相互作用を妨害するそれらの血清から、抗体が、その後精製されるだろう。これらの精製された抗体は、ネオジェニンの脂質ラフトへの動員を阻止し、ひいては、神経細胞の生存並びに軸索成長及び/又は再生を促進するであろうことが予期される。
【０４０６】
前述の詳細な説明及び付随の実施例は、単に例示であり、添付のクレーム及びその均等物によってもっぱら規定された本発明の範囲に関する限定と解釈されるべきでないと理解される。開示された実施例に対する様々な変形及び変更は、当業者にとって明白だろう。限定するものではないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成、剤形、又は使用の方法に関する変形及び変更を含む、かかる変形及び変更が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、なされ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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