(57)【要約】  がんの処置を必要とする対象の処置に有用であるリポソーム組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含む。内表面は中心リポソーム腔を画定している。多重膜リポソームは、第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。多重膜リポソーム内には少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。前記対象を処置する方法も提供される。【選択図】図１Ａ
2016522213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外表面および内表面を有する、架橋多重膜リポソームであって、前記内表面は中心リポソーム腔を画定し、前記多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含み、前記第１の脂質二重層は前記第２の脂質二重層に共有結合している、架橋多重膜リポソームと、
前記リポソーム内の少なくとも１種の抗がん性化合物と
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記多重膜リポソームは、隣接する脂質二重層に共有結合している少なくとも１層の追加の脂質二重層を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、脂質二重層中に配置されている疎水性抗がん性化合物と、前記中心リポソーム腔内に配置されている親水性抗がん性化合物とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はチオエーテル結合により共有結合されていることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記脂質二重層はそれぞれ独立して、マレイミド頭部基を有する脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立してマレイミド含有ジアシルグリセロール脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立して、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物のナトリウム塩を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立して、前記マレイミド頭部基を有する脂質とは異なるリン脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項５に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立して、ホスファチジルコリンの、エチルホスファチジルコリンの、ホスファチジルグリセロールの、ホスファチジン酸の、ホスファチジルエタノールアミンの、ホスファチジルセリンのまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルであるリン脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、ＤＮＡアルキル化剤、酸化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、メチルメタンスルホネート、シクロホスファミド、エトポシド、ドキソルビシン、タキソール（パクリタキセル）、メナジオン、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、ドキソルビシンおよびタキソールからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物において、前記少なくとも１種のｓｉＲＮＡはアンドロゲン受容体を対象とすることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物において、前記リポソームの前記外表面にポリ（エチレングリコール）基が共有結合していることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームであって、前記内表面は中心リポソーム腔を画定し、前記多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含み、前記第１の脂質二重層は前記第２の脂質二重層に共有結合している、架橋多重膜リポソームと、
前記多重膜リポソームの前記外表面に共有結合しているターゲティングペプチドと、
前記リポソーム内に配置されている少なくとも１種の抗がん性化合物と
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物において、前記多重膜リポソームは少なくとも１種の追加の脂質二重層を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はチオエーテル結合により共有結合していることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立して、マレイミド頭部基を有する脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および前記第２の脂質二重層はそれぞれ独立してマレイミド含有ジアシルグリセロール脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１６に記載の組成物において、前記ターゲティングペプチドは環状であることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項１６に記載の組成物において、前記ターゲティングペプチドは、ＲＲＬ、ＲＧＤ、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣおよびＣＲＧＤＫＧＰＤＣからなる群から選択されるペプチド配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項１６に記載の組成物において、前記第１の脂質二重層および第２の脂質二重層はそれぞれ独立して、ホスファチジルコリンの、エチルホスファチジルコリンの、ホスファチジルグリセロールの、ホスファチジン酸の、ホスファチジルエタノールアミンの、ホスファチジルセリンのまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルであるリン脂質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項１６に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、ＤＮＡアルキル化剤、酸化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項１６に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、メチルメタンスルホネート、シクロホスファミド、エトポシド、ドキソルビシン、タキソール（パクリタキセル）、メナジオン、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項１６に記載の組成物において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、ドキソルビシンおよびタキソールからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２７】
がんを処置する方法であって、
がんを有する対象を同定することと、
治療上有効な量の、下記：
外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームであり、前記内表面は中心リポソーム腔を画定し、前記多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含み、前記第１の脂質二重層は前記第２の脂質二重層に共有結合している、架橋多重膜リポソーム、ならびに
前記リポソーム内に配置されている少なくとも１種の抗がん性化合物、
を含む組成物を投与することと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、前記多重膜リポソームの前記外表面に共有結合しているターゲティングペプチドを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは環構造内に存在していることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは、ＲＲＬ、ＲＧＤ、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣおよびＣＲＧＤＫＧＰＤＣからなる群から選択されるペプチド配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは、下記式１：
2016522213.tif 000010
（式１において、Ｃ０およびＣ１０はそれぞれ独立してシステインであり、波線はジスルフィド結合であり、Ｘ１〜Ｘ９は存在せず、またはアミノ酸残基であり、但し、Ｘ１〜Ｘ９中の少なくとも１個の配列はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＧＧＲＲＬＧＧもしくはＲＧＤＫＧＰＤである）
を有するペプチド配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは、下記式２：
2016522213.tif 000011
（式２において、ＣＬは、チオエーテル結合を介して上記に記載の前記リポソームに結合しているシステインであり、Ｃ０およびＣ１０はそれぞれ独立してシステインであり、ＰＰ１およびＰＰ２はそれぞれ独立して、存在せず、または１〜１０個のアミノ酸残基を有する任意のポリペプチドであり、Ｘ１〜Ｘ９はそれぞれ独立して、存在せず、またはアミノ酸残基であり、但し、Ｘ１〜Ｘ９中の少なくとも１個の配列はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＧＧＲＲＬＧＧもしくはＲＧＤＫＧＰＤである）
を有するペプチド配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法において、前記少なくとも１種のがん化合物は、メチルメタンスルホネート、シクロホスファミド、エトポシド、ドキソルビシン、タキソール（パクリタキセル）、メナジオン、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせからからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法において、少なくとも１種のがん化合物は親水性化合物および疎水性化合物を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２７に記載の方法において、前記親水性化合物対前記疎水性化合物の重量比は約１：５〜５：１であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項２７に記載の方法において、前記親水性化合物対前記疎水性化合物の重量比は３：３〜５：１であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項２７に記載の方法において、前記親水性化合物はドキソルビシンであり、前記疎水性化合物はパクリタキセルであることを特徴とする方法。
【請求項３８】
がんを処置する方法であって、
多剤耐性がんを有する対象を同定することと、
治療上有効な量の、下記：
外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームであり、前記内表面は中心リポソーム腔を画定し、前記多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含み、前記第１の脂質二重層は前記第２の脂質二重層に共有結合している、架橋多重膜リポソーム、ならびに
前記リポソーム内に配置されている少なくとも１種の抗がん性化合物、
を含む組成物を投与することと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、がん細胞におけるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現を測定することにより多剤耐性がんを同定することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法において、前記多重膜リポソームの前記外表面に共有結合しているターゲティングペプチドを更に含むことを特徴する方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは環構造内に存在していることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記ターゲティングペプチドは、ＲＲＬ、ＲＧＤ、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣおよびＣＲＧＤＫＧＰＤＣからなる群から選択されるペプチド配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は、メチルメタンスルホネート、シクロホスファミド、エトポシド、ドキソルビシン、タキソール（パクリタキセル）、メナジオン、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項３８に記載の方法において、前記少なくとも１種の抗がん性化合物は親水性化合物および疎水性化合物を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項３８に記載の方法において、前記親水性化合物対前記疎水性化合物の重量比は約１：５〜５：１であることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項３８に記載の方法において、前記親水性化合物対前記疎水性化合物の重量比は約３：３〜５：１であることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法において、前記親水性化合物はドキソルビシンであり、前記疎水性化合物はパクリタキセルであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月３日に出願された米国仮出願第６１／８３０，６３６号明細書および２０１３年６月３日に出願された米国仮出願第６１／８３０，６０８号明細書の利益を主張するものであり、これら仮出願の開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、保健社会福祉省により与えられた契約番号Ｒ０１ＡＩ０６８９７８、Ｒ０１ＣＡ１７０８２０およびＰ０１ＣＡ１３２６８１の下での連邦政府の支援によりなされた。連邦政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
テキストファイルは、本明細書と共に提出した２０１４年６月３日作成で４ＫＢのサイズのＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、参照により本明細書に援用される。
【０００４】
技術分野
少なくとも１つの態様において、本発明は、抗がん性化合物等の治療用化合物の送達用のリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
細胞毒性薬による最適な抗がん処置のためには、重度の全身毒性を誘導することなく有効な薬剤濃度で長期間にわたり抗腫瘍効果を持続させる必要がある。従って、がん治療用の従来の薬剤の代替として、ナノ粒子をベースとする薬剤送達システムが広く評価されており、抗がん剤の毒性プロファイルを調節するためにおよび薬剤循環時間を改善するために利用されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆リポソーム等の長期循環リポソームは、治療の送達用の最も一般的なナノ担体の内の一つとなっており、透過性および滞留性の増強（ＥＰＲ）効果の結果として、腫瘍中に受動的に蓄積する能力を示している。しかしながら、最終的には、ナノ担体上での腫瘍ターゲティング分子の包含による腫瘍細胞への能動的なターゲティングにより、より効果的ながん治療が提供されると予想される。いくつかのターゲティング分子はナノ粒子の腫瘍内皮への結合を促進し、この腫瘍内皮からナノ粒子は腫瘍環境中に浸出することができる。腫瘍環境中に浸出すると、その他のターゲティング分子がおそらく、抗腫瘍活性の上昇のために、特定の受容体を発現している腫瘍細胞へのナノ粒子の能動的な付着を促進することができる。
【発明の概要】
【０００６】
科学的調査により、腫瘍中において固有の表現型を有するがん細胞特異的マーカーを能動的に標的とするためにナノ粒子により利用され得る多様な腫瘍ターゲティング分子が同定されている。例えば、抗Ｈｅｒ２抗体、葉酸またはトランスフェリン（Ｔｆ）等のターゲティングリガンドが接合された薬剤担体は、ヒト上皮受容体（ＨＥＲ）、葉酸受容体およびトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）（これらは全て腫瘍細胞上で過剰発現されている）をそれぞれ標的とすることに成功することにより、治療効果を実現していることが報告されている。細胞特異的なまたは組織特異的なリガンド−受容体相互作用は、受容体媒介性エンドサイトーシスによる腫瘍細胞中への複合体の取り込みの増加の結果として有効性の増強に寄与する。しかしながら、このターゲティング戦略の臨床応用に対する主要な障害物は、血管壁を通るおよび間質圧が高い腫瘍実質中への、特に固体腫瘍中での目標のペイロードの浸透の低さである。
【０００７】
従って、リポソーム組成物を改善する必要がある。
【０００８】
本発明は、がんの処置を必要とする対象の処置に有用であるリポソーム組成物を少なくとも１つの実施形態で提供することにより、先行技術の１つまたは複数の問題を解決する。この組成物は、外表面および内容面を有する架橋多重膜リポソームを含む。内表面は中心リポソーム腔を画定している。多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。多重膜リポソーム内には少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。
【０００９】
別の実施形態では、がんの処置を必要とする対象の処置に有用であるリポソーム組成物が提供される。この組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含む。内表面は中心リポソーム腔を画定している。多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に特徴的に共有結合している。多重膜リポソームの外表面にはターゲティングペプチドが共有結合している。多重膜リポソーム内には少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。
【００１０】
別の実施形態では、がんの処置を必要とする対象を処置する方法が提供される。この方法は、がんを有する対象を同定する工程を含む。対象に治療上有効な量の組成物を投与する。この組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含む。内表面は中心リポソーム腔を画定している。多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。リポソーム内には少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。
【００１１】
更に別の実施形態では、がんの処置を必要とする対象を処置する方法が提供される。この方法は、薬剤耐性がんを、特に多剤耐性がんを有する対象を同定する工程を含む。対象に治療上有効な量の組成物を投与する。この組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含む。内表面は中心リポソーム腔を画定している。多重膜リポソームは第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。リポソーム内には少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、架橋多重膜リポソームを概略的に示す図である。図１Ｂは、図１Ａの架橋多重膜リポソームの調製を概略的に示すフローチャートである。
【図２】図２Ａは、ターゲティングペプチドを有する架橋多重膜リポソームを概略的に示す図である。図２Ｂは、図２Ａの架橋多重膜リポソームの調製を概略的に示すフローチャートである。
【図３】図３は、去勢抵抗性前立腺がんに関与する分子の複数の部位のターゲティングを概略的に示すフローチャートである。
【図４】図４は、去勢抵抗性前立腺がんに関与する複数の経路のターゲティングを概略的に示すフローチャートである。
【図５】図５は、アンドロゲン受容体ｓｉＲＮＡ標的の例を概略的に示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、動的光散乱により測定した、ＰＥＧ化したＵＬ（図６Ａ）、ＤＬＬ（図６Ｂ）およびＣＭＬ（図６Ｃ）の流体力学的サイズ分布を示すグラフである。図６Ｄは、ＵＬ、ＤＬＬおよびＣＭＬの平均直径および多分散性を示す表である。図６Ｅおよび図６Ｆは、小胞の単膜構造および多重膜構造を可視化している写真である。ＵＬ（図６Ｅ）およびＣＭＬ（図６Ｆ）のクライオ電子顕微鏡画像。図６Ｇは、積み重なった脂質二重層を示すＣＭＬのクライオ電子顕微鏡画像である。囲んだ領域が右側のパネルに拡大されている。
【図７】図７Ａ〜図７Ｅは、小胞安定性の増強およびＣＭＬの持続可能な放出動態を示すグラフである。（図７Ａ）ドキソルビシン（Ｄｏｘ）のＵＬ中への、ＤＬＬ中へのまたはＣＭＬ中へのカプセル化効率。（図７Ｂ）リン脂質当たりの全Ｄｏｘ装荷（μｇ／ｍｇ）。（図７Ｃ）ＵＬ、ＤＬＬおよびＣＭＬからのドキソルビシンのインビトロでの放出動態。（図７Ｄ）Ｂ１６メラノーマ腫瘍における遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−Ｄｏｘ、ＤＬＬ−ＤｏｘおよびＣＭＬ−Ｄｏｘのインビトロでの細胞毒性。細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。（図７Ｅ）ＨｅＬａ細胞における遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−ＤｏｘおよびＣＭＬ−Ｄｏｘのインビトロでの細胞毒性。細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＣＭＬのカベオリン媒介性内在化およびその後の細胞内処理を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞を、ＤｉＤで標識したＣＭＬ粒子と共に４℃で３０分にわたりインキュベートして、同時に内在化させた。次いで、細胞を１５分にわたり３７℃に移し、固定し、透過処理し、抗カベオリン−１抗体または抗クラスリン抗体により免疫染色した。囲んだ領域が下側のパネルに拡大されている。（図８Ａ）１５分間のインキュベーション分後での、カベオリン−１シグナルまたはクラスリンシグナルと共局在化したＣＭＬ粒子の定量化。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して各試料の５０個超の細胞を観測することにより、Ｍａｎｄｅｒのオーバーラップ係数（ＭＯＣ）によりオーバーラップ係数を算出した。エラーバーは、複数の画像の解析からの平均の標準偏差を表す。（図８Ｂ）４℃でのインキュベーションによるエネルギー依存性内在化の阻害、クロルプロマジン（ＣＰＺ、２５μｇ／ｍｌ）によるクラスリン依存性内在化の阻害、ならびにナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ）およびメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ、１５ｎＭ）によるカベオリン依存性内在化の阻害。ＤｉＤで標識したＣＭＬ粒子の取り込みをＤｉＤ蛍光の測定により確認した。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、インビボでの毒性および耐容性を示す図である。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、ＣＭＬ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘを単回静脈内注射で投与した。（図９Ａ）経時的な平均マウス体重減少。データを、注射することなく処置したマウスに関する（黒線）、ＣＭＬ−Ｄｏｘ（２０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量、赤線；４０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量、青線）で処置したマウスに関する、または遊離Ｄｏｘ（２０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量、緑線；４０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量、オレンジ線）で処置したマウスに関する初期体重のパーセンテージで表す。エラーバーは平均の標準偏差を表し、各処置群に関してｎ＝２である（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５）。（図９Ｂ）薬剤処置なしのまたは２０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量で遊離ＤｏｘもしくはＣＭＬーＤｏｘを単回静脈内注射にて投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから得た心臓組織の組織学的所見。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、Ｂ１６メラノーマ腫瘍モデルにおける、Ｄｏｘが装荷されたＣＭＬ、ＵＬおよびＤＬＬの抗腫瘍効果を示す図である。（図１０Ａ）注射することなく処置した（黒線）後に、ＣＭＬ−Ｄｏｘ（１ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、青色の点線；４ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、青色の実線）による処置後に、ＵＬ−Ｄｏｘ（１ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、緑色の点線；４ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、緑色の実線）による処置後に、またはＤＬＬ−Ｄｏｘ（１ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、赤色の点線；４ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ当量、赤色の実線）による処置後に、腫瘍増殖を測定した。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各処置群に関してｎ＝６である（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（図１０Ｂ）腫瘍接種の１６日後に各処置群から摘出した腫瘍。（図１０Ｃ）実験の持続時間全体にわたる平均マウス体重減少。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、薬剤担体の生体内分布および腫瘍中におけるＤｏｘの蓄積を示す図である。（図１１Ａ）６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒで標識したリポソームの調製。（図１１Ｂ）組織ｇ当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す、６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒで標識したＵＬ、ＤＬＬまたはＣＭＬの注射から２４時間後の様々な組織におけるリポソームの生体内分布。（図１１Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量で遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−Ｄｏｘ、ＤＬＬ−ＤｏｘまたはＣＭＬ−Ｄｏｘを注射した、Ｂ１６腫瘍を保持するＣ５７／ＢＬ６マウスの血漿中におけるＤｏｘの薬物動態。所定の時間間隔で、後眼窩採血により血液を採取した。（図１１Ｄ）腫瘍中におけるＤｏｘの蓄積。Ｂ１６腫瘍を保持するＣ５７／ＢＬ６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量で遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−Ｄｏｘ、ＤＬＬ−ＤｏｘまたはＣＭＬ−Ｄｏｘを静脈内注射した。腫瘍中における平均Ｄｏｘ濃度を示した。エラーバーは平均の標準偏差を表し、各処置群に関してｎ＝３である。
【図１２】図１２Ａは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定したｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの流体力学的サイズ分布を示すグラフである。データは、ｎ＝３である少なくとも３回の実験の平均±ＳＤを表す。図１２Ｂは、ｉＲＧＤーｃＭＬＶからのドキソルビシン（Ｄｏｘ）のインビトロでの放出動態を示すグラフである。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各製剤に関してｎ＝３である。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｄは、腫瘍細胞におけるｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶのインビトロでの細胞毒性、結合および内在化を示すグラフである。（図１３Ａ、図１３Ｂ）４Ｔ１腫瘍（図１３Ａ）および多剤耐性ＪＣ細胞（図１３Ｂ）におけるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）のインビトロでの細胞毒性。細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。（図１３Ｃ、図１３Ｄ）４Ｔ１細胞へのｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）の結合および内在化。４Ｔ１細胞を４℃で３０分にわたり（図１３Ｃ）または３７℃で２時間にわたり（図１３Ｄ）、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）と共にインキュベートした。ナノ粒子の結合および細胞取り込みの両方を、フローサイトメトリーを使用するドキソルビシン蛍光の測定により確認した。統計解析をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により実施した。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、１５分間のインキュベーション後にクラスリンシグナル（図１４Ａ）またはカベオリン−１シグナル（図１４Ｂ）と共局在化したｃＭＬＶ粒子およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子の定量化を示すグラフである。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して各試料の３０個超の細胞を観測することにより、Ｍａｎｄｅｒのオーバーラップ係数を使用してオーバーラップ係数を算出した。エラーバーは、複数の画像の解析からの平均の標準偏差を表す（＊＊＊：Ｐ＜０．００５）。図１４Ｃは、クロルプロマジン（ＣＰＺ、２５μｇ／ｍｌ）によるクラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害およびフィリピン（１０μｇ／ｍｌ）によるカベオリン依存性内在化の阻害を示すグラフである。フローサイトメトリーでＤｉＤ蛍光を測定することにより、ＤｉＤで標識されたｃＭＬＶナノ粒子およびＤｉＤで標識されたｉＲＧＤ−ｃＭＬＶナノ粒子の取り込みを確認した。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｄは、４Ｔ１乳房腫瘍モデルにおけるｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶの抗腫瘍効果を示す図である。（図１５Ａ）インビボでの腫瘍研究のための実験プロトコルの概略的に示す図である。（図１５Ｂ）注射することなく処置した後に（コントロール）、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量）で処置した後におよびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量）で処置した後に、腫瘍増殖を測定した。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各処置群に関しｎ＝５である（＊Ｐ＜０．０５）。（図１５Ｃ）実験の継続時間全体にわたる平均マウス体重減少。（図１５Ｄ）腫瘍接種後２５日での各処置群から摘出した腫瘍の腫瘍重量。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各処置群に関してｎ＝５である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｈは、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の特性を示すグラフである。（図１６Ａ〜図１６Ｃ）動的光散乱により測定したｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の流体力学的サイズ分布。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の平均流体力学的直径（ＨＤ）および多分散性指数（ＰＩ）をグラフ上に示す。（図１６Ｄ、図１６Ｅ）ｃＭＬＶの装荷能力および薬剤放出動態プロファイルに対するＤｏｘおよびＰＴＸの共カプセル化の効果。ｃＭＬＶ（組み合わされた薬剤）およびｃＭＬＶ（単一の薬剤）における薬剤のカプセル化効率（図１６Ｄ）および装荷効果（図１６Ｅ）。（図１６Ｆ〜図１６Ｈ）２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶからのドキソルビシンおよびパクリタキセルのインビトロでの放出動態。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｈは、相乗作用を誘導するための薬剤の組み合わせの比率の決定を示す図ある。（図１７Ａ、図１７Ｂ）Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞株または４Ｔ１乳房腫瘍細胞株におけるｃＭＬＶ製剤での（図１７Ａ）または溶液での（図１７Ｂ）ＤｏｘならびにＰＴＸの３種の重量比（５：１、３：３および１：５）のインビトロでの細胞毒性。細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。（図１７Ｃ）培養したＢ１６腫瘍細胞および４Ｔ１腫瘍細胞に曝露したｃＭＬＶ（様々な薬剤の組み合わせ）に関する組み合わせ指数（ＣＩ）ヒストグラム。（図１７Ｄ）培養Ｂ１６腫瘍細胞および培養４Ｔ１腫瘍細胞に曝露した溶液での薬剤の組み合わせの様々な比率に関する組み合わせ指数ヒストグラム。３回の反復からの生存細胞の割合を平均化し、非線形回帰により解析した。このヒストグラムは、０．５の割合で得たＣＩ値を表す。エラーバーは、３重の実験からの平均の標準偏差を表す。（図１７Ｅ）下記の３種の用量比：５：１、３：３および１：５のｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）で処置したＢ１６細胞におけるリン酸化ＥＲＫの免疫ブロット解析。βアクチンをコントロールとして使用した。（図１７Ｆ）図１７Ｅに示すリン酸化ＥＲＫの定量化。免疫ブロットの濃度測定によりタンパク質量を推定した。エラーバーはＳＤを表す。（図１７Ｇ、図１７Ｈ）Ｂ１６メラノーマ細胞および４Ｔ１乳がん細胞に関するｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでの個々の薬剤のＩＣ５０値をそれぞれ図１７Ｇおよび図１７Ｈに示す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｃは、腫瘍処置におけるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の薬剤の比率に依存する有効性を示すグラフである。（図１８Ａ）３日毎にｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでのＰＢＳ、３．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋０．６７ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、０．６７ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋３．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸで処置した後に腫瘍増殖を測定した。実験終了まで腫瘍増殖および体重をモニタリングした。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各処置群に関してｎ＝６である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。（図１８Ｂ）実験の持続時間全体にわたる平均マウス体重減少。（図１８Ｃ）３日毎にｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでのＰＢＳ、３．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋０．６７ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、０．６７ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋３．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸで処置した４Ｔ１保持マウスに関する生存曲線。生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表す。個々の群の生存曲線をログランク検定により比較した。
【図１９】図１９は、腫瘍細胞アポト−シスに対する共カプセル化Ｄｏｘ：ＰＴＸの薬剤の比率に依存する有効性を示すグラフである。４Ｔ１腫瘍保持マウスを、ｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでのＰＢＳ、８．３３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋１．６６７ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、１．６６７ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋８．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸで処置した。注射から３日後に腫瘍を摘出した。アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬアッセイにより検出し（緑色）、核染色ＤＡＰＩにより共染色した（青色）。スケールバーは５０μｍを表す。（Ａ）４Ｔ１腫瘍におけるアポトーシス陽性細胞の定量化。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化するために、×２の倍率での画像当たり４つの目的領域（ＲＯＩ）をランダムに選択した。１つの領域内において、ＴＵＮＥＬ陽性核の領域および核染色の領域をソフトウェアにより計数した。データを、領域においてＴＵＮＥＬにより染色された核領域の合計％で表す。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
【図２０】図２０は、インビボでの毒性を示す写真である。薬剤処置なしのまたは１０ｍｇ／ｋｇの全薬剤当量で溶液でのもしくはｃＭＬＶ製剤での３種の用量比のＤｏｘならびにＰＴＸ（５：１、３：３および１：５）の単回静脈内注射を投与したＣ５７／ＢＬ６マウスから得た心臓組織の組織学的所見。スケールバーは１００μｍを表す。
【図２１】図２１Ａは、ｃＭＬＶ製剤でのＤｏｘ：ＰＴＸ比のインビボでの維持を示す図である。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、腫瘍保持マウスを、ｃＭＬＶ（図２１Ｂ）または溶液（図２１Ｃ）のどちらかでのＰＢＳ、８．３３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋１．６６７ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、１．６６７ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋８．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸで処置したことを示すグラフである。注射から２４時間後に腫瘍を摘出し、ＤｏｘおよびＰＴＸの薬剤濃度をＨＰＬＣにより測定した。全データを３重の実験の平均で示す。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｅは、ｃＭＬＶによるＤｏｘおよびＰＴＸの共送達による薬剤耐性の克服を示すグラフである（Ｄ：Ｄｏｘ、Ｔ：ＰＴＸ）。（図２２Ａ、図２２Ｂ）Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞（図２２Ａ）および４Ｔ１乳房腫瘍細胞（図２２Ｂ）におけるｃＭＬＶ（単一の薬剤）およびｃＭＬＶ（薬剤の組み合わせ）のインビトロでの細胞毒性。（図２２Ｃ、図２２Ｄ、図２２Ｅ）薬剤耐性ＪＣ細胞（図２２Ｃ）、Ｂ１６−Ｒ細胞（図２２Ｄ）および４Ｔ１−Ｒ細胞（図２２Ｅ）におけるｃＭＬＶ（単一の薬剤）およびｃＭＬＶ（薬剤の組み合わせ）のインビトロでの細胞毒性。メジアン効果モデル（ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｍｏｄｅｌ）における３つのパラメータ（ＩＣ５０、Ｄおよびｍ）を下記の方程式に組み込むことにより、ＩＩＰＣｍａｘを決定した：ＩＩＰＣｍａｘ＝ｌｏｇ（１＋（Ｃｍａｘ／ＩＣ５０）ｍ）。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。アスタリスクは、２つの群の間での統計的有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｄは、ＤｏｘおよびＰＴＸの細胞取り込みを示すグラフである（Ｄ：ＤＯＸ、Ｔ：ＰＴＸ）。（図２３Ａ、図２３Ｂ）Ｄｏｘ（図２３Ａ）およびＰＴＸ（図２３Ｂ）の４Ｔ１細胞中への全細胞取り込み。４Ｔ１細胞を、ｃＭＬＶ（Ｄ）、ｃＭＬＶ（Ｔ）、ｃＭＬＶ（Ｄ＋Ｔ）および溶液でのＤ＋Ｔに曝露した。ＤｏｘおよびＰＴＸの最終濃度は各群に関して１μｇ／ｍｌであった。（図２３Ｃ、図２３Ｄ）ＪＣ細胞におけるＤｏｘ（図２３Ｃ）およびＰＴＸ（図２３Ｄ）の全細胞取り込み。ＪＣ細胞を、ｃＭＬＶ（Ｄ）、ｃＭＬＶ（Ｔ）、ｃＭＬＶ（Ｄ＋Ｔ）およびＤ＋Ｔに曝露した。ＤｏｘおよびＰＴＸの最終濃度は各群に関して５μｇ／ｍｌであった。ＤｏｘおよびＰＴＸの取り込みを、ＢＣＡアッセイにより測定したタンパク質含有量に対して正規化した。全てのデータを、３種の異なるナノ粒子調製物からの３重の実験の平均で示す。アスタリスクは、２つの群の間の統計的有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、共送達されたナノ粒子のＰ−ｇｐ発現に対する効果を示すグラフである（Ｄ：Ｄｏｘ、Ｔ：ＰＴＸ）。（図２４Ａ）４Ｔ１細胞を、ＤｏｘおよびＰＴＸが同じ濃度（１μｇ／ｍｌ）であるｃＭＬＶ（Ｄ）、ｃＭＬＶ（Ｔ）、ｃＭＬＶ（Ｄ＋Ｔ）およびＤ＋Ｔに曝露した。（図２４Ｂ）ＪＣ細胞を、ＤｏｘおよびＰＴＸが同じ濃度（５μｇ／ｍｌ）であるｃＭＬＶ（Ｄ）、ｃＭＬＶ（Ｔ）、ｃＭＬＶ（Ｄ＋Ｔ）およびＤ＋Ｔに曝露した。フローサイトメトリーを用いて、Ｐ−ｇｐ特異的抗体によりＰ−ｇｐ発現を検出した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。アスタリスクは、２つの群の間の統計的有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、４Ｔ１腫瘍モデルにおける、ｃＭＬＶによる薬剤の組み合わせのインビボでの有効性を示す図である。（図２５Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボでの４Ｔ１腫瘍研究のための実験プロトコルの概略図。（図２５Ｂ）ＰＢＳｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）またはｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）での処置後に、腫瘍増殖を測定した。エラーバーは平均の標準誤差を表し、各処置群に関してｎ＝６である（＊＊ｐ＜０．０１）。（図２５Ｃ）実験の継続時間全体にわたる平均マウス体重減少。（図２５Ｄ）ＰＢＳ、ｃＭＬＶ２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）またはｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）で処置した４Ｔ１保持マウスの生存曲線。腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達した場合に生存エンドポイントを設定した。生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表した。個々の群の生存曲線をログランク検定により比較した。
【図２６】図２６Ａおよび図２６Ｂは、共送達されたｃＭＬＶの腫瘍アポトーシスに対する効果を示すグラフである（Ｄ：Ｄｏｘ、Ｔ：ＰＴＸ）。（図２６Ａ、図２６Ｂ）４Ｔ１腫瘍または多剤耐性ＪＣ細胞のどちらかを保持するマウスに、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸまたはｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）を尾静脈から静脈内注射した。注射から３日後に腫瘍を摘出した。ＴＵＮＥＬアッセイ、続いてＤＡＰＩによる核共染色により、アポトーシス細胞を検出した。（図２６Ａ、図２６Ｂ）４Ｔ１（図２６Ａ）腫瘍およびＪＣ（図２６Ｂ）腫瘍におけるアポトーシス細胞の定量化。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化するために、×２の倍率での画像当たり４つの目的領域（ＲＯＩ）をランダムに選択した。１つの領域内において、ＴＵＮＥＬ陽性核の領域および核染色の領域を計数した。データを、領域においてＴＵＮＥＬにより染色した核領域の合計％で表す。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
【図２７】図２７Ａおよび図２７Ｂは、共送達されたｃＭＬＶの腫瘍におけるＰ−ｇｐ発現に対する効果を示すグラフである。４Ｔ１腫瘍を保持するマウスおよび多剤耐性腫瘍ＪＣを保持するマウスに、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸまたはｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）を尾静脈から静脈内注射した。注射から３日後に腫瘍を摘出し、Ｐ−ｇｐ特異的抗体で染色し、続いてＤＡＰＩで核共染色した。（図２７Ａ、図２７Ｂ）４Ｔ１（図２７Ａ）腫瘍およびＪＣ（図２７Ｂ）腫瘍におけるＰ−ｇｐ陽性細胞の定量化。Ｐ−ｇｐ陽性細胞を定量化するために、×２の倍率での画像当たり４つの目的領域（ＲＯＩ）をランダムに選択した。１つの領域内において、Ｐ−ｇｐ陽性核の領域および核染色の領域を計数した。データを、領域内においてＰ−ｇｐ陽性である核領域の合計％で表す。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
【図２８】図２８は、ＰＢＳ（左側）、溶液での５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ（中央）およびｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）（右側）の単回静脈内注射から３日後に単離した、光学顕微鏡による心臓組織の組織学的所見（ヘマトキシリン染色およびエオシン染色）を示す写真である。
【図２９】図２９は、アンドロゲン受容体を標的とするｓｉＲＮＡをカプセル化しているＲＲＬ−ＣＭＬ［ｓｉＲＮＡ］ナノ粒子がヒト前立腺がん細胞においてアンドロゲン受容体の発現をノックダウンすることができることを示すグラフである。一般的な陰性コントロ−ルｓｉＲＮＡ（ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＮＣ１］）、ＡＲに対する４種の異なるｓｉＲＮＡ（ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡ１〜４］の内の１種、またはＡＲに対するｓｉＲＡの全４種のプール（ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡプール］のいずれかをカプセル化したＲＲＬ−ＣＭＬ［ｓｉＲＮＡ］ナノ粒子を含む標準培地中で４８時間にわたり、ＬＮＣａＰ細胞を培養した。処置後、細胞を回収して全ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡを生成するためのテンプレートとして使用した。処置群のそれぞれにおける相対的なＡＲ発現を、リアルタイムＱＰＣＲを使用して評価した。未処置ＬＮＣａＰ細胞のＡＲ発現を、１の値を有すると任意に割り当てた。バーは、平均の相対的なＡＲ発現＋／−ＳＥＭを表す。各処置群における相対的なＡＲ発現を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により未処置ＬＮＣａＰ細胞の場合と比較した。＊＊はｐ＜０．０１を示す。＊＊＊はｐ＜０．００を示す。「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＮＣ１］」は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの専売のスクランブルされた陰性コントロールｓｉＲＮＡ対を含むＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子を意味する。「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡ１］」は、（カプセル化前に互いにヘテロ二量体化されている）配列番号３および配列番号４を含むＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子を意味しており、「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡ２］」は、（カプセル化前に互いにヘテロ二量体化されている）配列番号５および配列番号６を含むＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子を意味しており、「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡ３］」は、（カプセル化前に互いにヘテロ二量体化されている）配列番号７および配列番号８を含むＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子を意味しており、「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＡＲ  ｓｉＲＮＡ４］」は、（カプセル化前に互いにヘテロ二量体化されている）配列番号９および配列番号１０を含むＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
必要に応じて、本発明の詳細な実施形態を本明細書に開示しているが、開示された実施形態は、様々なおよび代替の形態で具現化され得る本発明の単なる例示であることを理解しなければならない。図面は必ずしも縮尺通りではなく、いくつかの特徴は、特定の構成要素の詳細を示すために誇張され得る、または最小化され得る。従って、本明細書に開示する特定の構造および機能の詳細は、限定するものであると解釈してはならず、本発明を様々に採用するように当業者に教示するための代表的な基準にすぎないと解釈しなくてはならない。
【００１４】
略語：
「℃」は摂氏度を意味する。
「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味する。
「ＡＤＴ」はアンドロゲン欠乏療法を意味する。
「ＡＮＯＶＡ」は分散分析を意味する。
「ＡＲ」はアンドロゲン受容体を意味する。
「ＡＴＣＣ」はアメリカンタイプカルチャーコレクションを意味する。
「ＣＩ」は組み合わせ指数を意味する。
「ＣＭＬ」は架橋多重膜リポソームを意味する。
「ＣＭＬ（Ｄ）」は、ドキソルビシンを含むＣＭＬを意味する。
「ＣＭＬ（Ｄ＋Ｔ）」は、ドキソルビシンおよびタキソールを含むＣＭＬを意味する。
「ＣＭＬ（Ｄｏｘ）」は、ドキソルビシンを含むＣＭＬを意味する。
「ＣＭＬ−Ｄｏｘ」は、ドキソルビシンを含むＣＭＬを意味する。
「ＣＭＬ（ＰＴＸ）」は、タキソールを含むＣＭＬを意味する。
［ＣＭＬ（Ｔ）」は、タキソールを含むＣＭＬを意味する。
「ｃＭＬＶ」は、本発明に関しては架橋多重膜リポソームと同じである架橋多重膜小胞を意味する。
「ｃＭＬＶ（Ｄ）」は、ドキソルビシンを含むｃＭＬＶを意味する。
「ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）」は、ドキソルビシンを含むｃＭＬＶを意味する。
「ｃＭＬＶ（Ｄ＋Ｔ）」は、ドキソルビシンおよびタキソールを含むｃＭＬＶを意味する。
「ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）」は、ドキソルビシンおよびタキソールを含むｃＭＬＶを意味する。
「ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）」は、タキソールを含むｃＭＬＶを意味する。
「ｃＭＬＶ（Ｔ）」は、タキソールを含むｃＭＬＶを意味する。
「ＣＰＺ」はシクロプロマジンを意味する。
「ＣＲＰＣ」は去勢抵抗性前立腺がんを意味する。
「ＣＴｘＢ」はコレラ毒素結合サブユニットを意味する。
「ＤＡＰＩ」は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを意味する。
「ＤＢＤ」はＤＮＡ結合ドメインを意味する。
「ＤＬＬ」はドキシル様リポソームを意味する。
「ＤＬＬ−Ｄｏｘ」は、ドキソルビシンを含むＤＬＬを意味する。
「ＤＬＳ」は動的光散乱を意味する。
「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を意味する。
「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を意味する。
「ＤＯＰＣ」は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを意味する。
「ＤＯＰＧ」は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）を意味する。
「Ｄｏｘ」はドキソルビシンを意味する。
「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味する。
「ＥＤＣ」は１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリドを意味する。
「ＥＥＡ１」は初期エンドソーム抗原１を意味する。
「ＥＰＲ」は、増強された透過性および滞留性の効果を意味する。
「ＥＲ」は小胞体を意味する。
「ＥＲＫ」は細胞外シグナル調節キナーゼを意味する。
「ｆａ」は、影響を受けた細胞の割合を意味する。
「ＦＢＳ］はウシ胎仔血清を意味する。
「ｇ」は重力を意味する。
「ｇ／分」は分当たりのグラムを意味する。
「ｈ」は時間を意味する。
「Ｈ」はヒンジ領域を意味する。
「ＨＢＳ」はＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を意味する。
「ＨＤ」は流体力学的直径を意味する。
「ＨＥＲ」はヒト上皮受容体を意味する。
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味する。
「ＨＰＶ３１」はヒトパピローマウイルス３１型を意味する。
「ＩｇＧ」は免疫グロブリンガンマを意味する。
「ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ」は、ｉＲＧＤに接合されたｃＭＬＶを意味する。
「ｋＤａ」はキロダルトンを意味する。
「ＬＢＤ」はリガンド結合ドメインを意味する。
「ＭβＣＤ」はメチル−β−シクロデキストリンを意味する。
「ＭＡＰＫ」はマイトジェン活性化プロテインキナーゼを意味する。
「ＭＤＲ」は多剤耐性を意味する。
「ＭＦＩ」は平均蛍光強度を意味する。
「ＭｇＣｌ２」は塩化マグネシウムを意味する。
「ｍｌ／分」は分当たりのミリリットルを意味する。
「ｍＭ」はミリモル濃度を意味する。
「ＭＰＢ−ＰＥ」は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミドを意味する。
「ｎｍ］はナノメートルを意味する。
「ＮＲＰ−１」はニューロピリン−１を意味する。
「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を意味する。
「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールを意味する。
「ＰＥＴ」はポジトロン放射断層撮影法を意味する。
「Ｐ−ｇｐ」はＰ−糖タンパク質である。
「ＰＩ」は多分散性指数を意味する。
「ＰＴＸ」はパクリタキセルを意味する。
「ＱＰＣＲ」は定量ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
「ＲＮＡ」はリボ核酸を意味する。
「ＲＯＩ」は目的領域を意味する。
「ＲＰＭ」は分当たりの回転数を意味する。
「ＲＲＬ−ＣＭＬ」は、ＲＲＬに接合されたＣＭＬを意味する。
「ＲＲＬ−ＣＭＬ［ｓｉＲＮＡ］」は、ｓｉＲＮＡを含むＲＲＬ−ＣＭＬを意味する。
「ｓ」は秒を意味する。
「ＳＮＨＳ」はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを意味する。
「ｓｉＲＮＡ」は低分子干渉ＲＮＡを意味する。
「ＳＶ４０」はシミアンウイルス４０を意味する。
「ＴＡＣ」は時間活性曲線を意味する。
「ＴＡＤ」はトランス活性化ドメインを意味する。
「ＴＤＥＣ」は腫瘍由来内皮細胞を意味する。
「Ｔｆ」はトランスフェリンを意味する。
「ＴｆＲ」はトランスフェリン受容体を意味する。
「ＴＧＮ３８」はトランス−ゴルジネットワークタンパク質２を意味する。
「ＴＵＮＥＬ」は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を意味する。
「ＵＬ」は単膜リポソームを意味する。
「ＵＬ−Ｄｏｘ」は、ドキソルビシンを含むＵＬを意味する。
「ＰＥＧ」はポリ（エチレングリコール）である。
【００１５】
用語「対象」は、ヒトまたは動物、例えば霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギおよびウシ（ｃｏｗ）等の全ての動物を意味する。
【００１６】
図１Ａを参照すると、がんの処置を必要とする対象の処置に有用であるリポソーム組成物が示されている。組成物１０は、外表面１４および内表面１６を有する架橋多重膜リポソーム１２を含む。内表面１６は中心リポソーム腔１８を画定している。多重膜リポソーム１２は、第１の脂質二重層２０および第２の脂質二重層２２を少なくとも含む。第１の脂質二重層２０は、共有結合２４により第２の脂質二重層２２に共有結合している。一改良では、これら脂質二重層は、エーテル結合および／またはチオエーテル結合により共有結合している。典型的には、多重膜リポソーム１２は、少なくとも１層の追加の脂質二重層、例えば第２の脂質二重層２２に共有結合している第３の脂質二重層２６を含む。一改良では、多重膜リポソーム１２は平均して２〜１０層の脂質二重層を含む。別の改良では、多重膜リポソーム１２は平均して３〜９層の脂質二重層を含む。更に別の改良では、多重膜リポソーム１２は平均して３〜６層の脂質二重層を含む。多重膜リポソーム１２内には、少なくとも１種の抗がん性化合物２８が配置されている。一改良では、がん性化合物２８はリポソーム腔１８内に配置されている。別の改良では、がん性化合物２８は脂質二重層内に配置されており、例えば、脂質二重層２０、２２内におよび任意の追加の脂質層内に配置されている。更にその他の改良では、がん性化合物２８は、リポソーム腔１８内におよび脂質二重層内に配置されている。いくつかの変形では、リポソームの外表面にはポリ（エチレングリコール）基３０が共有結合しており、水溶性が改善されている。ある改良では、ポリ（エチレングリコール）基の重量平均分子量は約４００〜２５００ダルトンである。別の改良では、ポリ（エチレングリコール）基は−ＯＣＨ２ＣＨ２−の繰り返し単位を９〜４５個含む。
【００１７】
図１Ｂを参照すると、図１Ａの多重膜リポソームの調製を概略的に示すフローチャートが記載されている。この方法は、Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｉｎｔｅｒｂｉｌａｙｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ；Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．１０，２４３−２５１を出典としており、この刊行物の開示全体が参照により援用される。この調製は、従来の脱水−再水和法をベースとする。一般に、隣接した脂質二重層の官能化した頭部基の共有結合的な架橋により、特にチオール反応性マレイミド頭部基脂質（例えば、Ｎ−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、ＭＰＢ−ＰＥ）の単膜リポソーム３２の表面上への組み込みにより、リポソームを形成する。工程ａ）では、二価陽イオン誘発性小胞融合により多重膜構造３４が生じる。工程ｂ）では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による、反応性頭部基を介した脂質二重層の対向する部位にわたる二重層間の架橋により、架橋多重膜リポソーム３６が生じる。工程ｃでは、チオール末端化ＰＥＧにより架橋多重膜リポソーム３６の表面にＰＥＧ基３８を付加して、ペグ化された架橋多重膜リポソーム４０を形成し、これにより、小胞の安定性および血液循環半減期が更に改善される。
【００１８】
図２Ａを参照すると、ターゲティングペプチドを有するリポソーム組成物が概略的に示されている。本実施形態は、架橋多重膜リポソーム（ＣＭＬ）に連結されているターゲティングペプチドを有するナノ粒子薬剤送達システムを提供する。ターゲティングペプチドは、ＣＭＬが装荷された薬剤の送達のために、治療を必要とする特定の組織、器官または部位を能動的にＣＭＬの標的にするための手段である。例えば、ターゲティングペプチドは、ＣＭＬ中に装荷された抗がん剤の送達のために、特定の腫瘍を能動的にＣＭＬの標的にするための手段である。換言すると、ターゲティングペプチドは、少なくとも１種の腫瘍細胞上のおよび／または腫瘍関連組織上のリガンドに対する特異的親和性を有し、それにより、薬剤送達のために、対応する腫瘍を能動的にＣＭＬの標的にする。このようにして、ターゲティングペプチドが連結されたＣＭＬにより、装荷された抗がん剤の腫瘍、腫瘍細胞または腫瘍組織への送達は、ターゲティングペプチドなしに装荷されたＣＭＬの受動的な送達と比較して増加する。具体的には、リポソーム組成物１０’は、外表面１４および内表面１６を有する架橋多重膜リポソーム１２を含む。内表面１６は中心リポソーム腔１８を画定している。多重膜リポソーム１２は、第１の脂質二重層２０および第２の脂質二重層２２を少なくとも含む。第１の脂質二重層２０は、共有結合２４により第２の脂質二重層２２に共有結合している。一改良では、これら脂質二重層は、エーテル結合およびチオエーテル結合により共有結合している。典型的には、多重膜リポソーム１２は、少なくとも１層の追加の脂質二重層、例えば第２の脂質二重層２２に共有結合している第３の脂質二重層１６を含む。一改良では、多重膜リポソーム１２は平均して２〜１０層の脂質二重層を含む。別の改良では、多重膜リポソーム１２は平均して３〜９層の脂質二重層を含む。更に別の改良では、多重膜リポソーム１２は平均して３〜６層の脂質二重層を含む。多重膜リポソームの外表面には、ターゲティングペプチド４２が共有結合している。本実施形態は、マレイミド頭部基へのチオエーテル結合によるまたはリポソームの外表面に取り付けられている（例えばマレイミド頭部基に取り付けられている）ＤＴＴ基への結合による結合を含むことができる共有結合の性質により制限されない。多重膜リポソーム１２内には、少なくとも１種の抗がん性化合物２８が配置されている。一改良では、がん性化合物２８はリポソーム腔１８内に配置されている。別の改良では、がん性化合物２８は脂質二重層内に配置されており、例えば、脂質二重層２０、２２内におよび任意の追加の脂質層内に配置されている。更にその他の改良では、がん性化合物２８は、リポソーム腔１８内におよび脂質二重層内に配置されている。いくつかの変形では、リポソームの外表面にはポリ（エチレングリコール）基３０が共有結合しており、水溶性が改善されている。ある改良では、ポリ（エチレングリコール）基の重量平均分子量は約４００〜２５００ダルトンである。別の改良では、ポリ（エチレングリコール）基は−ＯＣＨ２ＣＨ２−の繰り返し単位を９〜４５個含む。
【００１９】
図２Ａを参照すると、ターゲティングペプチドは、抗がん性化合物のがん細胞への送達に有利に使用される。いくつかの変形では、ターゲティングペプチドは、腫瘍部位上に見出されるまたはこの腫瘍部位に関連している、対応する同種リガンドを有する任意のペプチドである。本明細書で使用する場合、「腫瘍部位」は、腫瘍、腫瘍細胞、腫瘍組織および／または腫瘍血管系を意味する。ターゲティングペプチドは、腫瘍部位での少なくとも１種の対応する受容体の標的化およびこの受容体との関連付けを阻害しない任意の長さまたはサイズであることができる。一改良では、ターゲットペプチド４２は下記の配列を含む：
配列番号１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
（配列番号１において、Ｘ１〜Ｘ９は存在せず、またはアミノ酸残基であり、但し、Ｘ１〜Ｘ９中の少なくとも１個の配列はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣもしくはＣＲＧＤＫＧＰＤＣである）。従って、ターゲティングペプチドは、少なくとも３個のアミノの酸配列−ＲＲＬまたはＲＧＤを含む。一改良では、ターゲティングペプチドは、下記式１で描くようにジスルフィド結合により環構造を形成する配列番号２を含む：
配列番号２：Ｃ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃ
2016522213.tif 000003
（式１および配列番号２において、Ｃ０およびＣ１０はそれぞれ独立してシステインであり、波線はジスルフィド結合であり、Ｘ１〜Ｘ９は存在せず、またはアミノ酸残基であり、但し、Ｘ１〜Ｘ９中の少なくとも１個の配列はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＧＧＲＲＬＧＧもしくはＲＧＤＫＧＰＤである）。別の改良では、ターゲティングペプチドは、下記式２を有する環化ポリペプチドを含む：
2016522213.tif 000004
（式２において、ＣＬは、チオエーテル結合を介して上記に記載のリポソームに結合しているシステインであり、Ｃ０およびＣ１０はそれぞれ独立してシステインであり、ＰＰ１およびＰＰ２はそれぞれ独立して、存在せず、または１〜１０個のアミノ酸残基を有する任意のポリペプチドであり、Ｘ１〜Ｘ９はそれぞれ独立して、存在せず、またはアミノ酸残基であり、但し、Ｘ１〜Ｘ９中の少なくとも１個の配列はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＧＧＲＲＬＧＧもしくはＲＧＤＫＧＰＤである）。ある改良では、Ｘ１〜Ｘ９はＲＲＬ、ＲＧＤ、ＧＧＲＲＬＧＧまたはＲＧＤＫＧＰＤである。別の改良では、ＰＰ１およびＰＰ２はそれぞれ独立して、存在しない、または１〜５個のアミノ酸残基を有する任意のポリペプチドである。別の改良では、ＰＰ１およびＰＰ２はそれぞれ独立して、存在しない、または１〜３個のアミノ酸残基を有する任意のポリペプチドである。ターゲティングペプチドの環状化を、あらゆる適切な方法を使用して実行することができる。環状化方法は、例えばＤａｖｉｅｓ，２００３，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９：４７１−５０１に記載されているように当分野で既知であり、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００２０】
いくつかの変形では、ターゲティングペプチドは、腫瘍上の同種部分（ｃｏｇｎａｔｅ  ｍｏｉｅｔｙ）を標的としてこの同種部分に結合する。同種部分は、ターゲティングペプチドに対する親和性を有するおよびターゲティングペプチドと相互作用する生体分子である。本明細書で使用する場合、同種部分は、（例えば結合により）ターゲティングペプチドを受け入れてこのターゲティングペプチドに作用するという点で受容体と呼ばれ得るが、同種部分は、ターゲティングペプチドの不在下では腫瘍部位で受容体として必ずしも機能しない。加えて、同種部分を単離するまたは同定する必要がない。換言すると、同種部分は特定のターゲティングペプチドと相互作用することができ、またはこのターゲティングペプチドに結合することができ、同種部分を特定の腫瘍部位に関連付けることができるが、同種部分の分子詳細（例えばアミノ酸配列）は必ずしも既知である必要はない。
【００２１】
さらに、同種部分は腫瘍部位に対して特異的であることができるが、（正常な細胞上での発現は低レベルであるがまたは正常な細胞上では発現されないが）腫瘍部位で過剰発現される同種部分と関連するまたはこの同種部分に結合するターゲティングペプチドは、治療用の装荷を運ぶＣＭＬのターゲティングに有用である可能性もある。例えば、Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６：５１０−５２０、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０２：１９１−２０１およびＭｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＮＡＳ，１０５：９３４３−９３４８に記載されているように、ＲＯＤペプチドは、腫瘍内皮で高度に発現されるαυβ３インテグリンおよびαυβ５インテグリンへの結合により腫瘍部位を標的としており、これら文献全ての内容全体が参照により本明細書に援用される。別の例では、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ，７：７４３−７４９、Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：５３３−５３９およびＷｏｎｇらへの米国特許第６，９７４，７９１号明細書に記載されているように、ＲＲＬペプチドは腫瘍由来内皮（ＴＤＥＣ）上の腫瘍血管系を標的としており、これら全ての内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００２２】
図２Ｂを参照すると、図２Ａの多重膜リポソームの調製を概略的に示すフローチャートが記載されている。この方法は、Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｉｎｔｅｒｂｉｌａｙｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ；Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．１０，２４３−２５１を出典としており、この刊行物の開示全体が参照により援用される。この調製は、従来の脱水−再水和法をベースとする。一般に、隣接した脂質二重層の官能化した頭部基の共有結合的な架橋により、特にチオール反応性マレイミド頭部基脂質（例えば、Ｎ−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、ＭＰＢ−ＰＥ）の単膜リポソーム３２の表面上への組み込みにより、リポソームを形成する。工程ａ）では、二価陽イオン誘発性小胞融合により多重膜構造３４が生じる。工程ｂ）では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による、反応性頭部基を介した脂質二重層の対向する部位にわたる二重層間の架橋により、頑強で安定した架橋多重膜リポソーム３６が生じる。工程ｃ）では、ターゲティングペプチド４８を、マレイミド頭部基脂質（例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ−アノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド（ＭＰＢ−ＰＥ））の官能性のチオール反応性マレイミド頭部基を介してリポソーム３６の表面に接合させて、目標の多重膜リポソーム５０を形成する。工程ｄでは、チオール末端化ＰＥＧにより架橋多重膜リポソーム３６の表面にＰＥＧ基３８を付加して、架橋多重膜リポソーム５２を形成する。
【００２３】
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、脂質二重層、例えば第１の脂質二重層２０および第２の脂質二重層２２および追加の脂質二重層はそれぞれ独立して、共有結合基２４により互いに結合しているマレイミド頭部基Ｍを有する脂質を含む。具体的には、脂質二重層はそれぞれ独立して、マレイミドを含有するジアシルグリセロール脂質を含む。マレイミドを含有するジアシルグリセロールの例として、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物のナトリウム塩が挙げられるがこれらに限定されない。図１Ａおよび図１Ｂに示すように、脂質二重層に隣接するマレイミド頭部基Ｍは、連結基Ｌにより互いに共有結合している。ある改良では、Ｌは、任意選択的に置換された−（ＣＨ２）ｎ−、任意選択的に置換された−Ｓ（ＣＨ２）ｎＳ−、任意選択的に置換された−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯ−等である。特に、Ｌがジチオスレイトールである場合にはＬは−Ｓ（ＣＨＯＨ）（ＣＨＯＨ）Ｓ−である。
【００２４】
典型的には、脂質二重層、例えば第１の脂質二重層２０および第２の脂質二重層および任意の追加の脂質二重層は、追加の脂質、特に、マレイミド頭部基を有する脂質とは異なるリン脂質。例えば、脂質二重層はそれぞれ独立して、ホスファチジルコリンの、エチルホスファチジルコリンの、ホスファチジルグリセロールの、ホスファチジン酸の、ホスファチジルエタノールアミンの、ホスファチジルセリンのまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルであるリン脂質を含む。ある改良では、マレイミド頭部基を有する脂質対そのような頭部基を含まない脂質の重量比は３：５〜５：３である。別の改良では、マレイミド頭部基を有する脂質対そのような頭部基を含まない脂質の重量比は４：５〜５：４である。
【００２５】
上記に記載したように、本発明の組成物は少なくとも１種の抗がん性化合物を含む。抗がん性化合物の例として、ＤＮＡアルキル化剤、酸化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分が挙げられるがこれらに限定されない。具体的な抗がん性化合物として、メチルメタンスルホネート、シクロホスファミド、エトポシド、ドキソルビシン、タキソール（パクリタキセル）、メナジオン、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。特に、抗がん性化合物の例として、ドキソルビシンおよびタキソールからなる群から選択される成分が挙げられるがこれに限定されない。
【００２６】
抗がん性化合物の量は広い範囲で可変である。例えば、架橋多重膜リポソームは、１グラムの脂質に対して１００〜３００ｍｇの抗がん性化合物を含むことができる。ある改良では、架橋多重膜リポソームは、１グラムの脂質に対して２００〜３００ｍｇの抗がん性化合物を含む。別の改良では、架橋多重膜リポソームは、１グラムの脂質に対して２５０〜３００ｍｇの抗がん性化合物を含む。
【００２７】
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ｂおよび図２Ｂの実施形態の変形では、ある改良として、多重膜リポソーム１０または１０’内に、第１の抗がん性化合物および第２の抗がん性化合物が配置されている。一改良では、第１の化合物は疎水性であり、脂質二重層内に配置されている。別の改良では、第２の化合物は親水性であり、中心リポソーム腔１８内に配置されている。疎水性の化学療法用化合物の例として、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン等およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。親水性の化学療法用化合物の例として、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ｓｉＲＮＡ等およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。リポソームに組み込む組み合わせの例として、タキソールおよびカルボ白金、タキソールおよびシス白金、タキソテールおよびゲムシタビン、ならびにタキソールおよびゲムシタビンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
別の変形では、抗がん性化合物として少なくも１種のｓｉＲＮＡが挙げられる。ある改良では、抗がん性化合物として少なくも２種のｓｉＲＮＡ（即ち、２種、３種、４種、５種またはそれ以上のｓｉＲＮＡ）が挙げられる。特に有用な改良では、ｓｉＲＮＡはアンドロゲン受容体を対象とする。アンドロゲン受容体を対象とするｓｉＲＮＡの具体例は、
2016522213.tif 000005
である。
【００２９】
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂの実施形態のその他の変形では、リポソーム組成物は、薬学的に許容される水性担体、例えば水性緩衝液を更に含む。
【００３０】
架橋多重膜リポソーム組成物の変形がナノ粒子送達システムであることを認識しなければならない。これに関して、架橋多重膜リポソームの平均直径は典型的には、優先度の低い方から順に約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満および約２５０ｎｍ未満である。更にその他の改良では、架橋多重膜リポソームの平均直径は、優先度の低い方から順に約６０ｎｍ超、約７０ｎｍ超、約８０ｎｍ超、約９０ｎｍ超および約１００ｎｍ超である。典型的には、架橋多重膜リポソームの平均直径は２２０＋／−１４．９９ｎｍである。
【００３１】
別の実施形態では、がんの症状を処置するまたは緩和する方法が提供される。この方法は、がんを有するまたはがんの症状を呈する対象を同定する工程を含む。この対象に、治療上有効な量のリポソーム組成物を投与する。このリポソーム組成物は、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂの記載に関して上記に記載したリポソーム組成物である。具体的には、この組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含み、内表面は中心リポソーム腔を画定している。この多重膜リポソームは、第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。架橋多重膜リポソーム内には、少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。特に有用な組成物では、図２Ａおよび図２Ｂの記載に関連して上記に記載したように、多重膜リポソームの外表面にターゲティングペプチドが共有結合している。本実施形態の方法は、乳がん、前立腺がん、子宮頸がんおよびメラノーマの処置に特に有用である。
【００３２】
本実施形態の変形では、リポソーム組成物は、所定の比率で化学療法用化合物の組み合わせを含む。有利なことに、架橋多重膜リポソームは、このリポソームが目的の部位、即ちがん細胞または腫瘍細胞に送達された場合に、この架橋多重膜リポソーム内に配置された化学療法用化合物の比例的な制御を提供することができる。特に、本明細書に開示する組成物は、薬剤循環時間を延ばすことができる、全身毒性を低減することができる、ならびに増強された透過性および滞留性（ＥＰＲ）の効果により腫瘍部位での薬剤蓄積を高めることができる。さらに、リポソーム組成物は血漿の排出および複数の薬剤の生体内分布を調整し、薬剤耐性が生じる機会を最小化しつつ細胞毒性を最大化することができるように投薬量を最適化することができる。その他のナノ粒子送達システムと比べて、架橋リポソームは、先行技術のリポソーム製剤と比較して優れた安定性を保持しつつ、疎水性が大きく異なる複数の薬剤を同じ作用部位に共送達する優れた能力を発揮する。架橋多重膜リポソームは、インビボにおいて組み合わされた薬剤の相乗的比率の維持を延ばすことができ、同様に、遊離した薬剤のカクテル投与と比較して抗腫瘍効果の著しい増強をもたらす。
【００３３】
一改良では、化学療法用化合物の組み合わせは、所定の比率で少なくとも１種の疎水性化合物と少なくとも１種の親水性化合物とを含む。更なる改良では、リポソームは、２種以上の疎水性化合物および／または２種以上の親水性化合物を含む。疎水性の化学療法用化合物の例として、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、ラパマイシン等およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。親水性の化学療法用化合物の例として、カルボ白金、シス白金、ゲムシタビン、ドキソルビン、ｓｉＲＮＡ等およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。リポソームに組み込む組み合わせの例として、タキソールおよびカルボ白金、タキソールおよびシス白金、タキソテールおよびゲムシタビン、ならびにタキソールおよびゲムシタビンが挙げられるがこれらに限定されない。特に有用な組み合わせはドキソルビシンおよびパクリタキセルである。ある改良では、親水性化合物対疎水性化合物の重量比は約１：５〜５：１である。別の改良では、親水性化合物対疎水性化合物の重量比は約３：３〜５：１である。より具体的な改良では、ドキソルビシン対パクリタキセルの重量比は約１：５〜５；１である。特に有用な改良では、ドキソルビシン対パクリタキセルの重量比は約３：３〜５：１である。ドキソルビシンとパクリタキセルとの組み合わせは、転移性乳がんおよびメラノーマの処置に有用である。架橋多重膜リポソーム中におけるドキソルビシンとパクリタキセルとの組み合わせは、重度の心毒性をもたらすことなく乳房腫瘍モデルにおいて約３：３〜５：１のドキソルビシン対パクリタキセルの重量比で相乗効果を示す。
【００３４】
本実施形態の変形では、対象は去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を有する。従って、そのような対象を、アンドロゲン受容体機能に欠かせない複数の部位を標的とする少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む多重膜リポソームで処置する。図３および図４には、先行技術の処置モデルと本実施形態の方法との比較が概略的に示されている。本変形では、複数種のｓｉＲＮＡは、アンドロゲン受容体の重大な機能ドメインをコードするｍＲＮＡ配列と相補的である。従って、エスケープ変異体のコード配列は、野生型から多岐にわたるために機能性アンドロゲン受容体をもはやコードしないおそれがある。図５には、ｓｉＲＮＡへのアンドロゲン受容体の潜在的標的が記載されている。具体例として、
2016522213.tif 000006
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
更に別の実施形態では、がんの症状を処置するまたは緩和する方法が提供される。この方法は、抗がん剤耐性がんの、特に多剤耐性がんの症状を有するまたは示す対象を同定する工程を含む。改良では、多剤耐性の存在を、がん細胞中でのＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現を確認することにより評価する。この確認を、Ｐ−ｇｐ特異的抗体株により組織学的に実現することができる。この対象に、治療上有効な量のリポソーム組成物を投与する。このリポソーム組成物は、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂの記載に関連して上記に記載したリポソーム組成物である。具体的には、この組成物は、外表面および内表面を有する架橋多重膜リポソームを含み、内表面は中心リポソーム腔を画定している。この多重膜リポソームは、第１の脂質二重層および第２の脂質二重層を少なくとも含む。第１の脂質二重層は第２の脂質二重層に共有結合している。架橋多重膜リポソーム内には、少なくとも１種の抗がん性化合物が配置されている。特に有用な組成物では、図２Ａおよび図２Ｂの記載に関連して上記に記載したように、多重膜リポソームの外表面にはターゲティングペプチドが共有結合している。本実施形態の方法は、乳がん、前立腺がん、子宮頸がんおよびメラノーマの処置に特に有用である。本実施形態のある改良では、化学療法用化合物の組み合わせ、特に上記に記載した比率での疎水性化合物と親水性化合物との組み合わせがリポソーム中に配置されている。前と同じように、ドキソルビシン対パクリタキセルの重量比が約１：５〜５：１であり、特に３：３〜５：１である、架橋多重膜リポソーム中におけるドキソルビシンとパクリタキセルとの組み合わせは、乳がんモデルにより実証されているように有用であることが発見されている。
【００３６】
上記に記載した方法では、治療上有効な量のリポソーム組成物が普通であり、その結果、対象に、標準的なプロトコルにより特定のがんに一般的に利用される抗がん性化合物の治療上有効な量が投与される。例えば、架橋リポソームにより送達される抗がん性化合物の治療上有効な量は、従来の治療で使用される表１の投薬レジメンに一致するように設定される。
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2016522213.tif 000009
【００３７】
下記の実施例は本発明の様々な実施形態を説明する。当業者は、本発明の趣旨内および特許請求の範囲内である多くの変形を認識することができる。
【実施例】
【００３８】
１．抗がん剤の制御された送達用の架橋多重膜リポソーム
材料および方法
細胞株、抗体、試薬およびマウス。Ｂ１６腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｆ１０、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−６４７５）およびＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ネブラスカ州、オマハ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、バージニア州、マナサス）により５％ＣＯ２環境中で維持した。クラスリンに対するマウスモノクローナル抗体、カベオリン−１に対するマウスモノクローナル抗体、ＥＥＡ１に対するマウスモノクローナル抗体およびトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ３８）に特異的なウサギポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンタクルーズ）から購入した。Ｌａｍｐ−１に対するマウスモノクローナル抗体をＡｂｃａｍ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。Ａｌｅｘａ４８８−ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体およびＡｌｅｘａ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールスバッド）から購入した。クロロプロマジン、ナイスタチンおよびＭβＣＤをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００３９】
下記の全ての脂質を日油株式会社（日本）から得た：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラミド（マレイミド頭部基脂質、ＭＰＢ−ＰＥ）。６４Ｃｕをワシントン大学（ミズーリ州、セントルイス）およびウィスコンシン大学（ウイスコンシン州、マディソン）から得た。１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＳＮＨＳ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（イリノイ州、ロックフォード）から購入した。
【００４０】
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜１０週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入した。全てのマウスを、南カリフォルニア大学（米国）の動物施設において特定の病原体を低減した条件下で保持した。全ての実験を、動物の管理および使用に関して国立衛生研究所および南カリフォルニア大学により規定されたガイドラインに従って実施した。
【００４１】
ＣＭＬ、ＵＬおよびＤＬＬの合成。従来の脱水−再水和法に基づいてリポソームを調製した。ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＢ−ＰＥ＝４０：１０：５０の脂質組成のモル比で、１．５μｍｏｌの脂質であるＤＯＰＣ、ＤＯＰＧおよびＭＰＢ−ＰＥをクロロホルム中で混合し、脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させ、一晩真空下で乾燥させて、乾燥した薄い脂質膜を形成した。結果として生じた乾燥膜を、０．５：１（薬剤：脂質）のモル比でドキソルビシンを含むｐＨ７．０での１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン中で１ｈにわたり１０分毎に激しくボルテックスしつつ水和させ、次いで、この乾燥膜に、サイクル毎に１分間のインターバルにて氷上で４サイクルの１５ｓ超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００、ニューヨーク州、ファーミングデール）を適用した。二価誘発性小胞融合を誘導するために、ＭｇＣｌ２を添加して最終濃度を１０ｍＭにした。結果として生じた多重膜小胞を、３７℃で１ｈにわたり１．５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することにより更に架橋させた。結果として生じた小胞を４分にわたる１４，０００ｇ（１２，３００ＲＰＭ）での遠心分離により回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ＣＭＬのペグ化のために、リポソームを、３７℃で１ｈにわたり２ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＨ（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、アラバマ州、アラブ）１μｍｏｌと共に更にインキュベートした。次いで粒子を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。カプセル化されていないドキソルビシンをＰＤ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘゲルろ過カラムで除去し、次いで最終生成物を４℃でＰＢＳ中にて保存した。同様に、二価誘導性小胞融合およびＤＴＴ架橋処理を除いて上記に記載したように、再水和、ボルテックスおよび超音波処理により、単膜リポソーム（ＵＬ）を同じ脂質組成で調製した。ＵＬを９０分にわたる２５０，０００ｇでの遠心分離により回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。２ｋＤａのＰＥＧ−ＳＨ  １μｍｏｌとのインキュベーションにより、ＵＬのペグ化を実行した。Ｈａｒａｎ  Ｇ、Ｃｏｈｅｎ  Ｒ、Ｂａｒ  Ｌ、Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙに記載された硫酸アンモニウムｐＨ勾配法を使用して、ドキシル様リポソーム（ＤＬＬ）を調製した。リポソーム中の膜貫通硫酸アンモニウム勾配により、両親媒性弱塩基が効率的におよび安定的に封入される。Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９３；１１５１：２０１−１５。簡潔に言うと、激しくボルテックスしつつ２４０ｍＭの硫酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．４で脂質膜（ＨＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００＝５６：３８：６）を再水和した。超音波処理と、ミニ押し出し機（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ州、アラバスター）を使用する１００ｎｍのポリカーボネートフィルタを通した６０℃での押し出し２０回とを使用して、小型の単膜小胞を調製した。ＤＬＬを９０分にわたる２５０，０００ｇ（４５，４００ＲＰＭ）での遠心分離により回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで塩酸ドキソルビシンを含むＨＢＳ  ｐＨ７．４（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で再懸濁した。次いで、��子を遠心分離してＰＢＳで２回洗浄した。カプセル化されていないドキソルビシンをＰＤ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘゲルろ過カラムで除去し、次いで最終生成物を４℃でＰＢＳ中にて保存した。
【００４２】
物理的特性のキャラクタリゼーション。ＣＭＬ、ＵＬおよびＤＬＬの流体力学的サイズおよびサイズ分布を動的光散乱（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、サンタバーバラ）により測定した。クライオ電子顕微鏡による撮像のために、リポソーム試料にグリッド（ｇｒｉｄ）とＦＥＩ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ  Ｖｉｔｒｏｂｏｔを使用する液体エタン中での急落凍結とを適用した。Ｇａｔａｎ  Ｕｌｔｒａｓｃａｎ  ２ｋ  ｂｙ  ２ｋ  ＣＣＤカメラを備えたＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２電子顕微鏡（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、クライオＥＭ画像を収集した。
【００４３】
インビトロでの薬剤のカプセル化、放出動態および細胞毒性。Ｄｏｘの装荷能力を研究するために、Ｄｏｘが装荷されたＣＭＬ、ＵＬまたはＤＬＬを回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理により小胞から脂質を抽出した。リポソーム懸濁液の脂質濃度を、リン酸塩アッセイ（Ｉｔａｙａ  Ｋ，Ｕｉ  Ｍ．Ａ  ｎｅｗ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．１９６６；１４：３６１−６）により測定した。次いで、Ｄｏｘ蛍光（励起４８０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ−５３０１ＰＣ分光蛍光光度計（日本）により測定した。封入したＤｏｘの５０％がリポソームから放出される半減期ｔ１／２を測定するために、ＣＭＬまたはＵＬを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地中において３７℃でインキュベートし、一定時間毎に遊離培地を回収してＤｏｘ蛍光を測定した。リポソームからのＤｏｘの放出動態を得るために、Ｄｏｘが装荷されたＣＭＬ、ＵＬまたはＤＬＬを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地中において３７℃でインキュベートし、毎日、３７℃でインキュベートしたＣＭＬ、ＵＬまたはＤＬＬから遊離培地を取り出してＤｏｘ蛍光を定量化し、新鮮な培地に置き換えて薬剤放出を継続的にモニタリングした。
【００４４】
Ｂ１６細胞またはＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中のＤ１０培地中にウェル当たり５×１０３個の細胞の密度で蒔いて、６ｈにわたり増殖させた。次いで、細胞を、一連の濃度の、Ｄｏｘが装荷されたＣＭＬ、ＵＬまたはＤＬＬに４８ｈにわたり曝露し、Ｄｏｘ−リポソームの細胞毒性を、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴアッセイ）を製造業者の指示に従って使用して評価した。
【００４５】
共焦点撮像。リポソーム粒子をＤｉＤ親油性色素で標識するために、クロロホルム中の脂質混合物に０．０１：１（ＤｉＤ：脂質）の比率でＤｉＤ色素を添加し、脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させてＤｉＤ色素を小胞の脂質二重層中に組み込ませた。エンドサイトーシスマーカーによる共局在化の研究のために、ＨｅＬａ細胞をガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州、アッシュランド）上に播種し、一晩３７℃で増殖させた。次いで、細胞をＤｉＤ標識ＣＭＬ粒子と共に４℃で３０分にわたりインキュベートして、同時に内在化させた。ＰＢＳでの洗浄後、処置した細胞を３７℃まで暖めて、指定した期間にわたり粒子の内在化を開始させた。細胞を固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、次いで、クラスリン、カベオリン−１、ＥＥＡ１、ＴＧＮ３８またはＬａｍ−１に対して特異的な、対応する抗体で免疫染色し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。
【００４６】
６０×／１．４９Ａｐｏ  ＴＩＲＦ油対物レンズおよびＣａｓｃａｄｅ  ＩＩ：５１２ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ、米国、アリゾナ州、ツーソン）を備えたＮｉｋｏｎエクリプスＴｉ−Ｅ顕微鏡を使用して、Ｙｏｋｏｇａｗａスピニングディスク共焦点スキャナシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ、ユタ州、ソルトレイクシティ）上で蛍光画像を得た。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して画像処理およびデータ解析を実行した。共局在化の程度を定量化するために、各時点で５０個超の細胞を観測することにより、Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用してＭａｎｄｅｒのオーバーラップ係数（ＭＯＣ）を生成した。
【００４７】
取り込み阻害アッセイ。ＨｅＬａ細胞（１×１０５個の細胞）をクロルプロマジン（ＣＰＺ、２５μｇ／ｍｌ）、ナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ）またはメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ、１５ｍＭ）で前処置し、クラスリン媒介性侵入経路またはカベオリン媒介性侵入経路を破壊した。次いで、ＣＰＺおよびナイスタチンの存在下でまたはＭβＣＤの不在下で、細胞をＤｉＤ標識ＣＭＬと共に３７℃で１ｈにわたりインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＣＭＬのエネルギー依存性内在化を妨害するために、ＨｅＬａ細胞をＤｉＤ標識ＣＭＬと共に１ｈにわたり４℃でインキュベートし、次いで冷ＰＢＳで２回洗浄した。分光蛍光光度計を使用してＤｉＤ蛍光を測定することにより粒子の細胞取り込みを確認し、１ｈにわたる３７℃でのインキュベーション時に得られる蛍光強度に基づいて正規化した。
【００４８】
最大耐性用量の研究。尾静脈からの単回静脈内注射により、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜１０週齢）に、０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量でＣＭＬ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘを投与した。注射後８日にわたり毎日、マウスを秤量した、およびモニタリングした。
【００４９】
インビボでの腫瘍チャレンジ。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜１０週齢）に、１×１０６個のＢ１６メラノーマ腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に、５０〜１００ｍｍ３の体積まで６日にわたり腫瘍を増殖させた。６日目に、１日毎に１ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量でＣＭＬ−Ｄｏｘ、ＵＬ−ＤｏｘまたはＤＬＬ−Ｄｏｘを尾静脈からマウスに静脈内注射し（群当たり６匹のマウス）、次いで、実験終了まで更なる１０日にわたり腫瘍増殖および体重をモニタリングした。Ｄｏｘ−リポソーム注射後に１日毎にファインキャリパーで腫瘤の長さおよび幅を測定した。腫瘍体積を１／２×（長さ×幅２）で表した。
【００５０】
インビボでのＰＥＴ撮像および生体内分布。リポソームを放射性同位体で標識するために、アミン末端化ＰＥＧ−ＳＨを使用してＵＬおよびＣＭＬをＰＥＧ化し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２を使用してＤＬＬをＰＥＧ化して、更なる反応のためにアミン基をリポソーム上に導入した。別途記載しない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）からの分析グレードであった。６４Ｎｉ（ｐ，ｎ）６４Ｃｕ核反応を使用して６４Ｃｕを製造し、０．１ＮのＨＣｌ中において６４ＣｕＣｌ２として高比放射能で供給した。二官能性キレート剤ＡｍＢａＳａｒを、報告されているようにして合成した（Ｃａｉ  Ｈ，Ｌｉ  Ｚ，Ｈｕａｎｇ  ＣＷ，Ｐａｒｋ  Ｒ，Ｓｈａｈｉｎｉａｎ  ＡＨ，Ｃｏｎｔｉ  ＰＳ．Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃａｇｅ−ｌｉｋｅ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒ，４−（（８−ａｍｉｎｏ−３，６，１０，１３，１６，１９−ｈｅｘａａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［６．６．６］ｉｃｏｓａｎｅ−ｌ−ｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｆｏｒ  ６４Ｃｕ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１０；３７：５７−６５）。ＡｍＢａＳａｒをＥＤＣおよびＳＮＨＳにより活性化した。典型的には、１００μＬの水中の５ｍｇのＡｍＢａＳａｒ（１１．１μｍｏｌ）と１００μＬの水中の１．９ｍｇのＥＤＣ（１０μｍｏｌ）とを一緒に混合し、０．１ＮのＮａＯＨ（１５０μＬ）を添加してｐＨを４．０に調整した。次いで、氷浴上で混合物を撹拌しつつＳＮＨＳ（１．９ｍｇ、８．８μｍｏｌ）を添加し、０．１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを４．０にした。反応を３０分にわたり４℃で保持した。活性なエステルＡｍＢａＳａｒ−ＯＳＳｕの理論濃度は８．８μｍｏｌであると算出した。次いで、５〜２０倍のＡｍＢａＳａｒ−ＯＳＳｕ（モル比に基づく）を目的のリポソームに装荷させた。ホウ酸塩緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．５）を使用してｐＨを８．５に調整した。サイズ排除ＰＤ−１０カラムを利用してＰＢＳ緩衝液中のＡｍＢａＳａｒ接合リポソームを産出させた後に、反応を一晩４℃で保持した。０．１Ｎ中のリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中の１〜５ｍＣｉの６４Ｃｕ（ｍＣｉ６４Ｃｕ当たり５０〜１００μｇのＡｍＢａＳａｒ−リポソーム）の添加により、ＡｍＢａＳａｒ−リポソームを６４Ｃｕで標識し、続いて４０℃で４５分間インキュベートした。６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒ−リポソームを、溶出溶媒としてＰＢＳを使用するサイズ排除ＰＤ−１０カラムで精製した。マイクロＰＥＴ  Ｒ４げっ歯類モデルスキャナ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、テネシー州、ノックビル）を使用して、マウスのポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）による撮像を実施した。マイクロＰＥＴスキャナ中において腹臥位でＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持Ｃ５７／ＢＬ６マウスを撮像した。マウスに、約１００μＣｉの６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒ−リポソームを尾静脈から注射した。撮像のために、マウスを２％のイソフルランで麻酔し、高解像度および高感度が得られる視野（ＦＯＶ）の中心近くに置いた。注射から１ｈ後、３ｈ後および２４ｈ後に静的走査を得た。２次元オーダーサブセット期待値最大化（２Ｄ−ＯＳＥＭ）アルゴリズムにより画像を再構築した。組織領域全体にわたる目的領域（ＲＯＩ）の描画により、選択した組織の時間活性曲線（ＴＡＣ）を得た。マイクロＰＥＴスキャナ中において円筒ファントムの走査から得た較正定数を使用することにより、ＲＯＩから得たピクセル／分当たりの数をｍｌ／分当たりの数に変換した。１ｇ／ｍｌの組織密度を仮定してｍｌ／分当たりのＲＯＩの数をｇ／分当たりの数に変換し、注射した用量で割ることにより、グラム当たりの保持された６４Ｃｕトレーサーの注射した用量のＲＯＩ由来の割合（％ＩＤ／ｇ）に基づく画像を得た。生体内分布に関しては、動物を注射から２４ｈ後に屠殺し、目的の組織および器官を回収して秤量した。ガンマ計数器を使用して各器官における放射能を測定し、放射能の取り込みをグラム当たりの注射した用量の割合（％ＩＤ／ｇ）で表した。動物の各群に関する平均取り込み（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
【００５１】
腫瘍におけるＤｏｘの薬物動態および定量化。Ｂ１６腫瘍（直径０．５〜１ｃｍ）を保持するＣ５７／Ｂｌ６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量で遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−Ｄｏｘ、ＤＬＬ−ＤｏｘまたはＣＭＬ−Ｄｏｘを注射した。薬物動態を調べるために、指定の時点で後眼窩採血により血液を採取し、次いで１０分にわたり１４，０００ｇで試料を遠心分離することにより血漿を得た。腫瘍中のＤｏｘを検出するために、注射から２４ｈ後に腫瘍を回収してホモジナイズした。ホモジナイズした試料にメタノールを添加することによりＤｏｘを抽出し、続いてボルテックスし、凍結／解凍サイクルを行った。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１０，０００ＭＷＣＯ遠心分離フィルタを使用する更なる精製によるＤｏｘの抽出後に、Ｃ１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによりＤｏｘ濃度を定量化した。
【００５２】
結果
架橋多重膜リポソームドキソルビシンの調製およびキャラクタリゼーション。発明者らの目標は、リポソーム薬剤の生物学的利用能が改善されているおよび小胞安定性が向上しているリポソーム製剤を生成することであった。この目標を達成するために、図１に示すように、隣接する脂質二重層の官能化頭部基を共有結合的に架橋させることにより、多重膜小胞を形成した。この設計は、最近報告された、従来の脱水−再水和法をベースとする下記の多段階手順を出典とした（Ｍｏｏｎ  ＪＪ，Ｓｕｈ  Ｈ，Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ  Ａ，Ｓｔｅｐｈａｎ  ＭＴ，Ｌｉｕ  ＨＰ，Ｈｕａｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｂｉｌａｙｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２０１１；１０：２４３−５１）：（１）チオール反応性マレイミド頭部基脂質（Ｎ−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、ＭＰＢ−ＰＥ）の単膜リポソーム（ＵＬ）の表面上への組み込み、（２）多重膜構造を生じる二価陽イオン誘発性小胞融合、および（３）頑強で安定した小胞を生成するための、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による、反応性頭部基を介した脂質二重層の対向する部位にわたる二重層間の架橋。最終工程として、架橋多重膜リポソーム（ＣＭＬ）の表面をチオール末端化ＰＥＧでＰＥＧ化し、これにより、小胞の安定性および血液循環半減期を更に改善することができた。加えて、比較のために、ドキシルとほぼ同じサイズおよび組成のリポソーム（命名ドキシル様リポソーム（ＤＬＬ））も調製した（図６Ｄ）。最初に、発明者らは、ＣＭＬの物理的特性を、同じ脂質組成の非架橋ＵＬまたは従来のリポソーム製剤であるＤＬＬの物理的特性と比較してキャラクタライズした。粒子の流体力学的サイズを動的光散乱（ＤＬＳ）により測定し、結果はＵＬの平均直径（〜２００ｎｍ）と比較してＣＭＬの平均直径（〜２２０ｎｍ）のわずかな増加を示したが（図６Ａおよび図６Ｂ）、ＤＬＬのサイズは予想したように更に小さかった（〜１２９ｎｍ）。また、ＣＭＬ粒子は狭いサイズ分布（多分散度：０．１０１±０．００８２、図６Ｃ）を提示することも示されており、このことは、架橋処理中に粒子の目立った凝集がないことを示唆する。加えて、ＣＭＬ粒子は著しく安定であり、ＣＭＬ粒子を、サイズまたはサイズ分布が大幅に変化することなく４℃で２週にわたりＰＢＳ中にて保存することができる（データを示さない）。
【００５３】
リポソームの多重膜構造を更に確認するために、クライオ電子顕微鏡によりＣＭＬ粒子を撮像した。ＵＬをコントロールとして用いた。画像から、ＣＭＬは厚い壁の多重膜化小胞構造を示す（図６Ｆおよび補足で図６Ｇ）が、ＵＬでは脂質膜の単一の薄層のみが見られる（図６Ｅ）ことが明らかとなり、このことは、隣接する二重層間の共有連結により、小胞の安定した多重膜構造をもたらすことができたことを示唆する。加えて、クライオ電子顕微鏡により推定されたＣＭＬの平均直径は〜１６０ｎｍであった。
【００５４】
インビトロでの薬剤のカプセル化、放出動態および細胞毒性。次に、発明者らは、ＣＭＬの多重膜構造が単膜リポソーム製剤の場合と比較して小胞中への抗がん剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の装荷能力を改善することができるかどうかを調べた（図７Ａ）。薬剤をカプセル化する能力を試験するために、脂質膜をＤｏｘ含有緩衝液中で再水和させて、Ｄｏｘが装荷されたＵＬまたはＣＭＬを形成した。結果は、ＣＭＬ製剤がＵＬのＤｏｘカプセル化効率（〜３９．７％）よりも高いＤｏｘカプセル化効率（〜８５％）を達成することができること、およびＣＭＬ中に装荷されたＤｏｘの量（脂質ｍｇ当たり〜２５０μｇ）がＵＬと比較して〜４倍に増加し（図７Ｂ）、ＤＬＬの装荷効率（脂質ｍｇ当たり〜１６０μｇ）よりも高い装荷効率でもあることも示した。まとめると、これらの結果は、小胞融合による多重膜構造の形成によりリポソーム中への追加の薬剤ペイロード（ｄｒｕｇ  ｐａｙｌｏａｄ）の封入が明らかに促進されることを示唆する。
【００５５】
脂質小胞は血清の存在下では非常に不安定であり、そのため、脂質小胞の薬剤担体としての利用が制限されることがよく知られている。血清成分はリポソーム膜を破壊し、これによりリポソーム膜の水性内容物の漏出が起きる。抗がん剤担体のように、リポソーム製剤の安定性は、薬剤ペイロードの毒性レベルと治療活性との両方に本質的に関連している。従って、発明者らは、ＣＭＬの内容物の放出の制御に関連して血清環境への曝露時のインビトロでのＣＭＬの小胞安定性を調べた。Ｄｏｘが装荷されたＵＬ、ＤＬＬおよびＣＭＬを１０％ＦＢＳ含有培地中において３７℃で保存し、インビトロでの薬剤放出率を測定した。図７Ｃに示すように、ＵＬは、予測されたバースト放出（２日以内にほとんど放出される）を有したが、ＣＭＬでは、より遅いおよび直線的に持続した放出動態（最大で２週間）が見られ、このことは、架橋多重膜構造の形成によりＣＭＬ製剤が血清成分の存在下で小胞安定性を改善することができたことを示す。ＤＬＬにおいて有意に遅い放出動態も観測したが、カプセル化されたＤｏｘの４０％未満が３７℃において２週間でＤＬＬから放出され、ＣＭＬは、カプセル化されたＤｏｘの〜８０％を２週間で放出することでき、このことは、ＣＭＬ製剤はＤＬＬと比較して薬剤放出を著しく改善することができたことを示唆する。
【００５６】
次に、発明者らは、このことが持続するかどうか、およびＣＭＬの薬剤放出プロファイルの改善がＵＬおよびＤＬＬの場合と比較して細胞中における細胞毒性に影響を及ぼすことができるかどうかを確認した。遊離ＤｏｘまたはＤｏｘが装荷されたＵＬ、ＤＬＬもしくはＣＭＬをＢ１６細胞と共に４８ｈにわたりインキュベートし、次いで、Ｄｏｘ−リポソームの細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。インビトロでの細胞毒性データから、ＣＭＬに関する最大半量応答（ＥＣ５０）は遊離ＤＯＸおよびＵＬの最大半量応答（ＥＣ５０）と同様にＢ１６細胞の場合に〜０．０５μｇ／ｍｌであることが明らかとなり（図７Ｄ）、このことは、ＣＭＬ製剤の薬剤放出が持続したにもかかわらずＣＭＬが細胞中においてＤｏｘ細胞毒性を維持することができたことを示唆する。ＨｅＬａ細胞でも同様の結果を観測した（図７Ｅ）。さらに、ＤＬＬは、より高いＥＣ５０である２．３μｇ／ｍｌを示し（図７Ｄ）、このことは、ドキシルが遊離Ｄｏｘよりもほぼ２桁高いＥＣ５０（より低い細胞毒性活性）を有することを示す過去の報告と一致し、ＣＭＬ製剤の薬剤放出の改善によりリポソーム薬剤の細胞毒性を増大させることができたことを示唆しており、このことはおそらく、細胞に対するＤｏｘの取り込みおよび細胞内送達の向上の結果である。
【００５７】
ＣＭＬの細胞取り込み、内在化経路および細胞内輸送。エンドサイトーシスは、様々な薬剤ナノ担体用の主な侵入機序の内の一つであると一般に考えられている。いくつかのエンドサイトーシス経路、例えばクラスリンン媒介性エンドサイトーシスおよびカベオリン媒介性エンドサイトーシスが、細胞内在化のための主要経路と見なされている。ナノ担体の細胞内運命は、このナノ担体の細胞への侵入時に用いられるエンドサイトーシス経路によって決定されることから、薬剤担体の細胞内処理の基本的原理を解明することにより、薬剤送達の効率の改善および薬剤担体の設計の開発に極めて重要な洞察をもたらすことができる。従って、このことを実現するために、発明者らは、３７℃での１５分間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞において、蛍光１，１−ジオクタデシル−３，３，３，３−テトラメチルインドジカルボシアニン(Ｄｉｄ）標識ＣＭＬ粒子と、エンドサイトーシス構造、即ちクラスリンおよびカベオリンとを可視化することにより、ＣＭＬの侵入機序およびその後の細胞内輸送を解明することに重点を置いた。不連続のカベオリン−１シグナルとのＣＭＬ粒子の著しい共局在化を観測したが、いくつかの粒子はクラスリン構造と重なり合ったものの１５分間のインキュベーション後ではＣＭＬとクラスリンとの間に顕著な共局在化を検出しなかった。５０個超の細胞を分析することによる、カベオリン−１構造またはクラスリン構造と共局在化したＣＭＬ粒子の定量化から、カベオリン媒介性経路がＣＭＬの侵入に関与し得ることができることが示唆された（図８Ｂ）。カベオリン経路の関与を薬剤阻害アッセイにより更に確認した（図８Ｃ）。ナイスタチンまたはメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）（これらはいずれもカベオリン依存性内在化を妨害することが知られている）による細胞の前処置により、ＨｅＬａ細胞中におけるＣＭＬ粒子の取り込みが有意に低下した。しかしながら、細胞を、クラスリン重合をブロックすることによりクラスリン依存性内在化を阻害することが知られている薬剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）で前処置した場合には、この取り込みに対する阻害効果を観測しなかった。阻害アッセイからの結果から、ＣＭＬの侵入がカベオリン依存性エンドサイトーシスにより媒介されることが更に実証された。１ｈにわたる４℃での細胞とのＣＭＬのインキュベーションでは、１ｈにわたる３７℃でのインキュベーション時の内在化と比較してＣＭＬの細胞取り込みが有意に減少する（〜６６．７％）ことも明らかであり、このことから、ＣＭＬがエネルギー依存性エンドサイトーシスにより細胞に侵入することが実証された。
【００５８】
カベオリン媒介性侵入およびその後の細胞内処理が十分に理解されていないままではあるが、カベオラを介して取り込まれたカーゴは、「カベオソーム」と呼ばれる細胞小器官に運ばれると考えられる。カベオソームを通過するカーゴは、ゴルジ装置および／または小胞体（ＥＲ）に更に運ばれると考えられる。カベオソームは、ＧＴＰアーゼＲｂ５依存的に初期エンドソームと直接融合することができること、および従来のエンドサイトーシス経路（エンドソーム／リソソーム）を通過することができることも提示されている。ＣＭＬのその後の細胞内運命を更に明らかにするために、ＤｉＤ標識ＣＭＬ粒子を、初期エンドソーム（ＥＥＡ−１）マーカー、リソソーム（Ｌａｍｐ−１）マーカーおよびトランス−ゴルジ（ＴＧＮ−３８）マーカーとの３７℃での様々なインキュベーション時間での共局在化に関して評価した。４５分間のインキュベーション後に、ほとんどのＣＭＬ粒子をＥＥＡ１＋初期エンドソーム中で発見したが、２ｈのインキュベーション後にＣＭＬとＥＥＡ１との間で検出した共局在化は、はるかに少なかった。より正確に言うと、２ｈでのインキュベーションでは、ＣＭＬ粒子をリソソーム中で主に発見し、ＣＭＬとトランス−ゴルジとのある程度の共局在化も観測した。これらの画像結果から、ＣＭＬ粒子はカベオソームから初期エンドソーム−リソソーム区画へと主に輸送され得ること、およびおそらく初期エンドソームを通ってトランス−ゴルジネットワークへと輸送されることもできることが明らかとなった。
【００５９】
加えて、Ｄｏｘが装荷されたＣＭＬによる薬剤放出の画像は、ＨｅＬａ細胞において４５分間のインキュベーション後の細胞質中で大量のドット形状のＤｏｘ蛍光を観測することができることを示しており、このことは、Ｄｏｘが著しく放出されることなくＤｏｘ−リポソーム複合体がエンドソーム中に依然として位置したことを示唆する。２ｈのインキュベーション後に、Ｄｏｘ蛍光シグナルがリポソームから細胞質中へと拡散したが、ある程度のドット形状のＤｏｘ蛍光を依然として観測することができた。３ｈのインキュベーションでは、Ｄｏｘ蛍光を細胞核中で主に検出し、細胞質中でのドット形状のＤｏｘの観測が不明瞭となり、このことは、ＣＭＬ−Ｄｏｘ粒子が、カプセル化されたＤｏｘがリソソーム分解前に細胞質中に放出されるリソソームまで運ばれる可能性が最も高かったことを示す。
【００６０】
インビボでの毒性、心毒性および耐容性。がん用の化学療法剤の最近の進歩にもかかわらず、この化学療法剤の臨床的応用は全身毒性により制限されることが多い。したがって、この薬剤の様々な製剤は、全身毒性の低下を達成することが評価されている。ＣＭＬ−Ｄｏｘの毒性および耐容性を確認するために、発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの単回静脈内投与により最大許容用量を推定した。マウスの体重および全体的な健康を、０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量でのＣＭＬ−Ｄｏｘまたは遊離Ｄｏｘの注射後８日にわたりモニタリングした（図９Ａ）。予測したように、遊離Ｄｏｘの２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇの両方で体重の有意の減少を観測した。特に、４０ｍｇ／ｋｇの遊離Ｄｏｘを投与したマウスは毒性の明らかな兆候を示した。しかしながら、ＣＭＬ−Ｄｏｘを投与した群のマウスは健康に見えた。２０ｍｇ／ｋｇのＣＭＬ−Ｄｏｘを投与したマウスは実験の間中、体重の減少を示さなかった。４０ｍｇ／ｋｇのＣＭＬ−Ｄｏｘを投与したマウスでは体重のある程度の減少を観測したが、体重は注射後４日で回復した。この結果は、ＣＭＬ−Ｄｏｘが、遊離Ｄｏｘ（最大許容用量＜２０ｍｇ／ｋｇ）よりもマウスに対する毒性が大幅に低い（最大許容用量＞４０ｍｇ／ｋｇ）ことを示した。さらに、病理組織学的分析により、遊離Ｄｏｘ（２０ｍｇ／ｋｇ）により心臓組織の重度の損傷、例えば筋原線維の減少および錯綜配列が生じるが、ＣＭＬ−Ｄｏｘ（２０ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量）で処置したマウスまたは薬剤処置なしのマウスからの心臓組織では有意な病理組織学的変化はないことが示された（図９Ｂ）。
【００６１】
インビボでの治療的抗腫瘍効果。次に、マウス腫瘍モデルを使用し、ＵＬ−ＤｏｘまたはＤＬＬ−Ｄｏｘの治療効果と比較してＣＭＬ−Ｄｏｘ製剤の治療効果を確認した。０日目では、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＢ１６メラノーマ腫瘍細胞を皮下接種した。６日目に、マウスに、１日毎に１ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量でＵＬ−Ｄｏｘ、ＤＬＬ−ＤｏｘまたはＣＭＬ−Ｄｏｘを静脈内注射し、次いで、更に１０日にわたり腫瘍増殖および体重をモニタリングした。１ｍｇ／ｋｇのＣＭＬ−Ｄｏｘを投与した群のマウスでは有意な腫瘍抑制が示されたが、同等のＤｏｘ濃度のＵＬ−Ｄｏｘによるマウスの処置では抑制が全く示されなかった（図１０Ａ）。ＣＭＬ−Ｄｏｘのより高い用量（４ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）では、この群において腫瘍増殖の劇的な抑制を観測し（図１０Ａおよび図１０Ｂ）、ＵＬ−Ｄｏｘの場合と比較して有意に増大した治療効果を表した。ＣＭＬ−Ｄｏｘが従来のリポソーム製剤であるＤＬＬ−Ｄｏｘと比較してわずかに良い抗腫瘍効果を示すことも分かった。４ｍｇ／ｋｇの高用量であっても実験の持続時間にわたり体重の減少は見られず（図１０Ｃ）、このことは、このＣＭＬ製剤からの全身毒性がないことを示す。
【００６２】
ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）による撮像、薬物動態および生体内分布。ＵＬ−ＤｏｘまたはＤＬＬ−Ｄｏｘの場合と比較したＣＭＬ−Ｄｏｘの治療効果の増強の根拠を更に調べるために、インビボでのＰＥＴ撮像により、Ｂ１６腫瘍を保持するマウスにおいてリポソームの生体内分布パターンを評価した。放射性標識リポソームを調製する方法を図１１Ａに示す。その他の６４Ｃｕキレート剤、例えば６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）よりも優れた６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒのインビボでの安定性に起因して、二官能性キレート剤ＡｍＢａＳａｒを６４Ｃｕ標識で使用した。６４Ｃｕ−ＡｍＢａＳａｒで標識したＵＬ、ＤＬＬまたはＣＭＬの静脈内注射後に、いくつかの時点（１ｈ、３ｈ、２４ｈ）でＰＥＴ画像を得た。投与の１ｈ後に、放射線は、よく灌流された器官に主に存在し、ＵＬと比較してＤＬＬおよびＣＭＬでは腫瘍中での蓄積を検出した。さらに、腫瘍中でのＤＬＬおよびＣＭＬの蓄積は注射の３ｈ後および２４ｈ後に有意に増加したが、投与の３ｈ後には、急速分解の結果として膀胱中でのＵＬの蓄積を観測した。
【００６３】
加えて、次いで、注射から２４ｈ後に目的の腫瘍および組織を摘出して秤量し、放射線を測定することにより腫瘍中におけるおよび組織中における粒子の蓄積レベルを測定した（図１１Ｂ）。この生体体内分布アッセイから、同じ脂質組成を有するＵＬの蓄積に比べて腫瘍中におけるＣＭＬの有意に高い蓄積が明らかとなり、このことは、小胞安定性が改善されているＣＭＬは腫瘍部位での薬剤担体の蓄積を実際に高めることができたことを示唆する。腫瘍中におけるリポソームの蓄積に関してＣＭＬとＤＬＬとの間には有意な差異を観測しなかったが、血液、心臓および脾臓においてＣＭＬの蓄積と比較して著しく高いＤＬＬの蓄積を検出したことは注目に値する。この結果は、ＤＬＬは、ＣＭＬの場合と比較してより長い血液循環を示すことができるが、心臓および脾臓への不必要な薬剤分布をもたらす可能性もあり、この薬剤分布は心毒性等の重度の毒性副作用を誘導する可能性があることを示した。
【００６４】
薬物動態分析は、血清中のＣＭＬ−ＤｏｘのＤｏｘレベルは遊離ＤｏｘおよびＵＬ−ＤｏｘのＤｏｘレベルよりも高く、興味深いことに、注射からの早期の時点（１５分以内）での血清中のＤＬＬ−ＤｏｘのＤｏｘレベルよりも更に高いことを示した（図１１Ｃ）。この観測は、ＤＬＬ粒子は投与後速やかに組織、例えば脾臓および心臓に優先的に吸収されたことを示唆することができる。しかしながら、組織中に蓄積した後、いくつかの粒子は血液循環に緩やかに戻され、これにより、その後のＣＭＬの血液滞留と比較してＤＬＬのより長い血液滞留が説明される。加えて、投与から２４ｈ後に採取した腫瘍中におけるＤｏｘ濃度を測定することにより、腫瘍に蓄積したＤｏｘレベル更に調べた。図１１Ｄに示すように、遊離Ｄｏｘ、ＵＬ−ＤｏｘまたはＤＬＬ−Ｄｏｘの場合と比較して、ＣＭＬ−Ｄｏｘで処置した腫瘍において有意に高いＤｏｘレベルを検出した。この結果は、ＣＭＬ製剤が腫瘍中へのＤｏｘの浸透を増加させることができることを裏付けた。さらに、ＣＭＬおよびＤＬＬの両方が腫瘍中においてリポソーム蓄積の同じようなレベルを示したが、ＣＭＬは、このＣＭＬの薬剤放出の改善（即ち、薬剤生物学的利用能の増強）に基づいて腫瘍中においてより高いＤｏｘ濃度を達成することができ、このことは、マウス腫瘍モデルにおけるＣＭＬ−Ｄｏｘの抗腫瘍活性の改善とよく対応した。
【００６５】
考察
本研究の包括的目標は、がん治療用の抗がん剤ドキソルビシンの架橋多重膜リポソーム製剤を評価することであった。発明者らは、ＣＭＬの架橋多重膜構造は、小胞安定性が向上した制御可能で持続可能な薬剤放出動態を提供するだけでなく、従来の単膜リポソームと比較して薬剤生物学的利用能の増強ももたらすことを明らかにした。ＣＭＬは小胞中にＤｏｘを安定的に捕捉し、ＣＭＬの優れた安定性により、このＣＭＬのサイズ特性が有意に変化することなく長期貯蔵を可能にすることも明らかにした。いくつかの研究から、様々な細胞株での、ＤＴＴを含むいくつかのチオール含有化合物の毒性が報告されているが、この毒性は、チオール誘導性アポトーシスにより主に引き起こされており、ＣＭＬの合成中に架橋剤として使用したＤＴＴの全てのチオール基は脂質のマレイミド頭部基と定量的に反応しており、さらに、架橋後に未反応ＤＴＴをＣＭＬから除去した。そのため、チオールに誘導される毒性は、このＣＭＬ製剤では最小化されているはずである。
【００６６】
本研究では、発明者らは、同じ脂質組成を有する非架橋単膜リポソーム（ＵＬ）またはドキシル様リポソーム（ＤＬＬ）の抗腫瘍活性と比較した場合に、ＣＭＬ−Ｄｏｘの腫瘍細胞へのインビトロおよびインビボでの送達の増加により、抗がん活性が改善され、良好な腫瘍減少および腫瘍増悪の抑制がもたらされることを明らかにした。一般に、リポソームの小胞安定性および薬剤放出速度は、リポソームのサイズ、構造および脂質組成により決定される。より高い薬剤放出速度により腫瘍における薬剤生物学的利用能を増大させることができたが、リポソームからの薬剤の急速放出は通常、血漿中における同様に急速な薬剤クリアランスを引き起こし、その結果、腫瘍に対する治療効果はより低くなる。しかしながら、ＣＭＬの架橋多重膜構造は、たとえＣＭＬが低Ｔｍ（遷移温度）リン脂質で構成されていても、制御されたおよび持続的な薬剤放出プロファイルを実現することができ、そのため、薬剤放出動態が増強された、および持続された。その結果として、ＣＭＬ−Ｄｏｘの生物学的利用能の増加は小胞安定性の改善と共に、インビトロおよびインビボの両方で、より高い治療活性を可能にした。
【００６７】
さらに、ＣＭＬと細胞エンドサイトーシス構造との間の相互作用の直接可視化により、ＣＭＬの侵入機序およびその後の細胞内輸送を決定した。発明者らの撮像研究から、ＣＭＬ粒子がカベオリン依存性エンドサイトーシスにより細胞に侵入することが示唆された。いくつかの研究から、カベオリン媒介性経路はリポソームの取り込みの主要経路であることを明らかになっている。さらに、近年では、カベオラ媒介性エンドサイトーシスおよびその後のカーゴの細胞内運命の基礎をなす詳細な分子機序を解明することに努力が払われている。例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）は、このシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の侵入にカベオラ媒介性経路を用いること、および感染を媒介するためにカベオソームから小胞体（ＥＲ）に運ばれることが知られている。コレラ毒素結合サブユニット（ＣＴｘＢ）も、カベオリン依存的に細胞に侵入し、おそらく初期エンドソームを介してゴルジ複合体に向かうと考えられる。別の最近の研究から、ヒトパピローマウイルス３１型（ＨＰＶ３１）のカベオリン依存性の感染性侵入により、エンドリソソーム区画に進んでうまく感染にすることができることが明らかになった。これら過去の研究は、カベオリン媒介性エンドサイトーシスを用いるカーゴは多数の別々の細胞内目的地に向かうことができることを示す。同様に、発明者らの細胞内オルガネラの撮像結果から、カベオラを介して内在化したＣＭＬ粒子は、従来のエンドサイトーシス経路（即ち、初期エンドソームからリソソーム）を更に介して主に運ばれ得ること、および初期エンドソームからトランス−ゴルジネットワークへ向かうこともできることが示唆されており、このことは、ＣＭＬの細胞内輸送は多数の別々の細胞内経路を必要とする場合があることを示す。加えて、カプセル化されたＤｏｘはリソソーム分解前に細胞の細胞質に放出されることも明らかであった。リポソームから薬剤を放出する方法は、ホスホリパーゼの存在下での、即ち、リン脂質を脂肪酸およびエンドリソソーム区画内に存在するその他の親油性物質に加水分解する酵素の存在下での、リポソーム二重層の完全性の崩壊をおそらく含む。
【００６８】
コレステロールはリポソーム膜を強固にするおよび安定化させることがよく知られており、現在のリポソーム製剤に広く使用されている。コレステロールのＣＭＬ製剤への添加により強固な二重層を生成することもでき、薬剤滞留性を促進させる。しかしながら、脂質二重層中でのコレステロールの組み込みは脂質二重層間の架橋の進行を妨げる可能性もあり、これにより、ＣＭＬ製剤中における小胞が不安定になる。加えて、リポソーム膜中におけるコレステロールの存在がホスホリパーゼ活性を劇的に阻害することがこれまで報告されており、このことは、コレステロールがエンドリソソーム区画からの細胞薬剤放出を妨害し、次いで、腫瘍細胞中における細胞毒性活性を低下させる場合があることを示唆する。
【００６９】
これまでの報告は、タンパク質抗原およびアジュバントを保有する、二重層間が架橋された多重膜小胞は、ワクチン送達の場合には強力な体液性のおよび細胞の免疫応答を着実に生じさせることができることを示した。発明者らの研究では、発明者らは、このリポソーム製剤を抗がん治療まで拡張し、化学療法薬送達用途のための新規のナノ担体プラットフォームとしてのＣＭＬの多くの有望な特徴を明らかにした。ＤｏｘのＣＭＬ製剤は、大概は薬剤放出の制御により全身毒性を低減することができた。さらに、より高いＤｏｘ生物学的利用能を有する小胞安定性の増強は、腫瘍に対するインビボでの治療活性の改善を可能にした。最も侵攻型の腫瘍の内の１つとして知られているＢ１６腫瘍のＣＭＬ−Ｄｏｘ処置は、従来のリポソームＵＬ−ＤｏｘおよびＤＬＬ−Ｄｏｘで処置した場合と比較して腫瘍増殖の有意な阻害を示したことは注目に値する。発明者らの生体内分布研究は、ＣＭＬの治療効果の増大は腫瘍部位での薬剤の蓄積の増大に起因することを明らかにし、ＤＬＬの場合と比較して心臓および脾臓におけるＣＭＬの低い蓄積も示し、これらにより、不必要な副作用を最小化して薬剤の有効性および安全性を改善することができた。
【００７０】
２．薬剤送達用の、ｉＲＧＤが接合された架橋多重膜リポソームの治療効果の増強
材料および方法
材料
マウス。雌の６〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入した。全てのマウスを、南カリフォルニア大学（米国）の動物施設において特定の病原体を低減した条件下で保持した。全ての実験を、動物の管理および使用に関して国立衛生研究所および南カリフォルニア大学により規定されたガイドラインに従って実施した。
【００７１】
細胞株、抗体および試薬。４Ｔ１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２５３９）およびＪＣ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２１１６）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ネブラスカ州、オマハ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、バージニア州、マナサス）により５％ＣＯ２環境中で維持した。クラスリンに対するマウスモノクローナル抗体、カベオリン−１に対するマウスモノクローナル抗体およびＥＥＡ１に対するマウスモノクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンタクルーズ）から購入した。Ｌａｍｐ−１に対するマウスモノクローナル抗体をＡｂｅａｍ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。Ａｌｅｘａ４８８−ＴＦＰエステル（Ａｌｅｘａ４８８−ＴＦＰ  ｅｓｔｅｒ）抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびＡｌｅｘａ４８８−ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールスバッド）から得た。クロロプロマジン（ＣＰＺ）およびフィリピンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）からから得て、製造者のプロコトル従って適切な濃度で使用した。
【００７２】
ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの合成。従来の脱水−再水和法に基づいてリポソームを調製した。全ての脂質を日油株式会社（日本）から得た。１．５μｍｏｌの脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）およびマレイミド頭部基脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ−アノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラミド（ＭＰＢ−ＰＥ）をクロロホルム中で混合してＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＢ＝４：１：５のモル比で脂質組成物を形成し、脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させ、続いて真空下で一晩更に乾燥させて、乾燥した薄い脂質膜を形成した。結果として生じた乾燥膜を、０．２：１（薬剤：脂質）のモル比でドキソルビシンを含むｐＨ７．０での１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン中で、１ｈにわたり１０分毎に激しくボルテックスしつつ水和させ、次いで、この乾燥膜に、サイクル毎に１分間のインターバルにて氷上で４サイクルの１５ｓ超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００、ニューヨーク州、ファーミングデール）を適用した。二価誘発性小胞融合を誘導するために、ＭｇＣｌ２を添加して最終濃度を１０ｍＭにした。結果として生じた多重膜小胞を、３７℃で１ｈにわたり１．５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することにより更に架橋させた。結果として生じた小胞を４分にわたる１４，０００ｇでの遠心分離により回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ｃＭＬＶへのｉＲＧＤ接合のために、粒子を、３７℃で１ｈにわたり０．５μｍｏｌのｉＲＧＤペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）と共にインキュベートした。ｃＭＬＶのペグ化のために、接合していない粒子およびｉＲＧＤが接合した粒子の両方を、３７℃で１ｈにわたり２ｋＤａのＰＥＧ−ＳＨ（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、アラバマ州、アラブ）０．５μｍｏｌと共に更にインキュベートした。次いで、粒子を遠心分離してＰＢＳで２回洗浄した。最終生成物を４℃でＰＢＳ中にて保存した。
【００７３】
物理的特性のキャラクタリゼーション。ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの流体力学的サイズおよびサイズ分布を、動的光散乱（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、サンタバーバラ）により測定した。
【００７４】
インビトロでの薬剤のカプセル化および放出。Ｄｏｘの装荷能力を研究するために、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）ナノ粒子を回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理により小胞から脂質を抽出した。次いで、Ｄｏｘ蛍光（励起４８０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ−５３０１ＰＣ分光蛍光光度計（日本）により測定した。リポソームからのＤｏｘの放出動態を得るために、Ｄｏｘが装荷されたｉＲＧＤ−ｃＭＬＶを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地中において３７℃でインキュベートし、毎日、３７℃でインキュベートしたｉＲＧＤ−ｃＭＬＶから遊離培地を取り出してＤｏｘ蛍光を定量化し、新鮮な培地に置き換えて薬剤放出を継続的にモニタリングした。
【００７５】
インビトロでの細胞毒性。４Ｔ１細胞およびＪＣ細胞を９６ウェルプレート中のＤ１０培地中にウェル当たり５×１０３個の細胞の密度で蒔いて、６ｈにわたり増殖させた。次いで、細胞を、一連の濃度のｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）に４８ｈにわたり曝露し、細胞の生存性を、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナ州、インディアナポリス）からのＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴアッセイ）を製造業者の指示に従って使用して評価した。薬剤処置ウェルから培地のみのウェルから得た吸光度値を引くことにより細胞の生存率を測定し、次いで薬剤を含まないコントロール細胞に対して正規化した。データを非線形回帰により解析してＩＣ５０値を得た。
【００７６】
インビトロでの結合および内在化の研究。４Ｔ１細胞を２４ウェルプレート中のＤ１０培地中にウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で蒔いて、一晩増殖させた。細胞を、２種の濃度（０．２μｇ／ｍｌおよび０．０４μｇ／ｍｌ）のｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）と共に、３０分にわたり４℃（結合アッセイ用）でまたは２ｈにわたり３７℃（内在化アッセイ用）でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して未結合のナノ粒子を除去した。フローサイトメトリーを使用してドキソルビシン蛍光を測定することにより、粒子の結合および細胞取り込みを測定した。
【００７７】
共焦点撮像。６０×／１．４９Ａｐｏ  ＴＩＲＦ油対物レンズおよびＣａｓｃａｄｅ  ＩＩ：５１２ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ、米国、アリゾナ州、ツーソン）を備えたＮｉｋｏｎエクリプスＴｉ−Ｅ顕微鏡を使用して、Ｙｏｋｏｇａｗａスピニングディスク共焦点スキャナシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ、ユタ州、ソルトレイクシティ）上で蛍光画像を得た。ＡＯＴＦ（音響光学的可変フィルタ）制御レーザーマージシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）を使用して、下記のレーザー線：４９１ｎｍ、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍの固体レーザー（各レーザーに関して５０ｍＷ）それぞれで照射パワーを供給した。
【００７８】
リポソーム粒子を標識するために、クロロホルム中の脂質混合物に０．０１：１（ＤｉＤ：脂質）の比率でＤｉＤ親油性色素を添加し、脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させてＤｉＤ色素を小胞の脂質二重層中に組み込ませた。ｉＲＧＤペプチドを検出するために、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子と未接合ｃＭＬＶ粒子との両方を、５０ｎｍｏｌのＡｌｅｘａ４８８−ＴＦＰエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２ｈにわたり０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．３）中でインキュベートした。２ｈのインキュベーション後に反応を停止させ、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）への緩衝液交換により未結合の色素分子を除去した。細胞内ナノ粒子を検出するために、ＤｉＤで標識したｉＲＧＤ−ｃＭＬＶまたはＤｉＤで標識した未接合ｃＭＬＶを、ポリリシンで被覆したガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州、アッシュランド）上に一晩播種したＨｅＬａ細胞と共に４℃で３０分にわたりインキュベートした。次いで、試料を３７℃でインキュベートして、指定した時点で粒子内在化を開始させた。次いで、培養皿をすすぎ、４％のホルムアルデヒドで固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、次いで、クラスリン、カベオリン−１、ＥＥＡ１またはＬａｍ−１に対して特異的な、対応する抗体で免疫染色し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）で対比染色した。
【００７９】
取り込み阻害アッセイ。ＨｅＬａ細胞（１×１０５個の細胞）をクロルプロマジン（ＣＰＺ、２５μｇ／ｍｌ）またはフィリピン（１０μｇ／ｍｌ）と共に３０分にわたりプレインキュベートし、クラスリン媒介性侵入経路またはカベオリン媒介性侵入経路を破壊した。次いで、ＣＰＺおよびフィリピンの存在下で、細胞をＤｉＤ標識ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶまたは未接合ｃＭＬＶと共に１ｈにわたり３７℃でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。フローサイトメトリーを使用してＤｉＤ蛍光を測定することにより粒子の細胞取り込みを測定し、未処置細胞から得られる蛍光強度に基づいて正規化した。
【００８０】
インビボでの抗腫瘍活性の研究。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１乳房腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に、腫瘍を〜５０ｍｍ３の体積まで増殖させた。１０日目に、３日毎にＰＢＳ（コントロール群）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）を尾静脈からマウスに静脈内注射した（群当たり５匹のマウス）。次いで、実験終了まで腫瘍増殖および体重をモニタリングした。注射後に、３日毎にファインキャリパーで腫瘤の長さおよび幅を測定した。腫瘍体積を１／２×（長さ×幅２）で表した。
【００８１】
結果
ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶナノ粒子の調製。架橋多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）の調製方法は、最近報告された、図２Ａおよび図２Ｂに示すように隣接する脂質二重層間の共有結合性の架橋物を形成するための従来の脱水−再水和法をベースとする多段階手順（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を出典とした。この方法は、二価陽イオン誘発性小胞融合を用いて多重膜構造を得ており、二重層間の架橋物が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による反応性頭部基を介した脂質二重層の対向する部位にわたり形成される。マレイミド頭部基脂質である１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ−アノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド（ＭＰＢ−ＰＥ）の官能性のチオール反応性マレイミド頭部基を介して、ｉＲＧＤペプチド（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ）をｃＭＬＶの表面に接合させた。最終工程として、ｉＲＧＤが接合したｃＭＬＶ（ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ）の表面をチオール末端化ＰＥＧでペグ化して、小胞の血液循環時間を更に改善した。
【００８２】
合成したｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの物理的特性を明らかにした。これら目標のナノ粒子の流体力学的サイズを動的光散乱（ＤＬＣ）により測定し、結果は、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの平均直径が〜２３０±１１．２３ｎｍであることを示し（図１２Ａ）、このｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの平均直径は、未接合ｃＭＬＶの平均直径（〜２２０±６．９８ｎｍ）と類似していた。さらに、この調製手順により、〜８５％のドキソルビシン（Ｄｏｘ）カプセル化効率を達成することができることを確認した。インビトロでの薬剤放出アッセイから、血清環境中においてｉＲＧＤ−ｃＭＬＶが遅くて持続的な放出動態（最高で２週間）を示すことも分かった（図１２Ｂ）。
【００８３】
次に、発明者らは、ｉＲＧＤペプチドがマレイミド頭部基によりｃＭＬＶの表面に接合されるどうかを調べた。この目的を達成するために、蛍光１，１−ジオクタデシル−３，３，３，３−テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉＤ）標識ｃＭＬＶ粒子を使用して、未接合粒子と接合粒子との両方を可視化した。加えて、Ａｌｅｘａ４８８色素を用いて、ｉＲＧＤペプチド（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ）上のリシン残基のアミン基を介してｉＲＧＤペプチドを標識した。結果は、ＤｉＤ標識ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子とＡｌｅｘａ４８８標識ｉＲＧＤ粒子との著しい共局在化を観測したが、未接合ｃＭＬＶ粒子ではＡｌｅｘａ４８８シグナルを検出しないことを示し、このことは、ｉＲＧＤペプチドがｃＭＬＶ粒子にうまく接合されなかったことを示唆する。
【００８４】
ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）の細胞毒性および細胞取り込み。次に、発明者らは、細胞中における細胞毒性レベルに対するｉＲＧＤ接合ｃＭＬＶナノ粒子の効果を未接合ｃＭＬＶナノ粒子と比較して確認した。Ｄｏｘが装荷されたｃＭＬＶ（ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ））およびＤｏｘが装荷されたｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ））を４Ｔ１細胞またはＪＣ細胞と共にインキュベートした。ＪＣ細胞はＰ−糖タンパク質を過剰発現するモデル薬剤耐性腫瘍細胞株に相当し、インビトロおよびインビボの両方で薬剤耐性表現型を示す。４８ｈのインキュベーション後に、Ｄｏｘ−リポソームの細胞毒性を標準ＸＴＴアッセイにより測定した。インビトロでの細胞毒性データから、ｃＭＬＶ（０．０１８±０．００２５μｇ／ｍｌ）と比較してｉＲＧＤ−ｃＭＬＶが４Ｔ１細胞中においてわずかに小さいＩＣ５０（０．０１１±０．００３７μｇ／ｍｌ）を示すことが明らかとなった（図１３Ａ）。ＪＣ細胞ではｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）とｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）との間で有意の差異の細胞毒性を観測しており、ＪＣ細胞では、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）は、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）のＩＣ５０（３．１９±０．３２μｇ／ｍｌ）値よりも低いＩＣ５０（２．０１±０．２２μｇ／ｍｌ）値を示した（Ｐ＜０．０５、図１３Ｂ）。ＸＴＴ結果は、ｉＲＧＤ接合ｃＭＬＶによるＤｏｘの送達により腫瘍細胞増殖がより強力に阻害されることを示した。
【００８５】
ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの細胞毒性の増強がナノ粒子の細胞取り込みの増加に起因したかどかを調べるために、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶの細胞結合および取り込みを調べた。結合アッセイの場合、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）を、３０分にわたり４℃で４Ｔ１腫瘍と共にインキュベートした。次いで、未結合ナノ粒子の除去後にフローサイトメトリーによりドキソルビシンシグナルを検出することにより、細胞表面上の結合ナノ粒子を測定した。図１３Ｃに示すように、両方の濃度で、細胞をｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）とインキュベートした場合に有意に高い統合平均蛍光強度（ＭＦＩ）を観測し、このことは、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶが、腫瘍細胞の表面上で発現されたインテグリン受容体を介した細胞へのナノ粒子の付着を促進することができることを示す（Ｐ＜０．０１）。加えて、４Ｔ１細胞におけるドキソルビシンの細胞蓄積を、この細胞を２ｈにわたり３７℃でｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）と共にインキュベートした後に統合ＭＦＩにより測定した。結果は、細胞をｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）と共にインキュベートした場合にドキソルビシンの細胞取り込みの著しい増加を観測した（Ｐ＜０．０１、図１３Ｄ）ことを示し、このことは、ドキソルビシンの細胞蓄積の増加がｉＲＧＤペプチドにより促進されたことを示唆する。まとめると、ｉＲＧＤペプチドは、腫瘍細胞において薬剤が装荷されたナノ粒子の結合と取り込みとの両方を促進し、これにより、細胞中での薬剤濃度を高めて薬剤の細胞毒性を改善した。
【００８６】
ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの内在化経路および細胞内経路。次に、発明者らは、ｉＲＧＤペプチドが、ナノ粒子が取り込まれる経路を変更することができるかどうかを確認するために、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの腫瘍細胞中への侵入機序および細胞内過程を調べた。エンドサイトーシスは、様々なナノスケール薬剤担体のための主な侵入機序の内の一つとして知られている。いくつかの研究から、ナノ粒子媒介性エンドサイトーシスにおけるクラスリン依存性経路およびカベオリン依存性経路の関与が報告されている。従って、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶのクラスリン依存性エンドサイトーシスまたはカベオリン依存性エンドサイトーシスの役割を調べるために、発明者らは、３７℃での１５分間のインキュベーション後に、個々の蛍光ＤｉＤで標識したｃＭＬＶまたはｉＲＧＤ−ｃＭＬＶとエンドサーサイトーシス構造（クラスリンまたはカベオリン）とを可視化した。未接合ｃＭＬＶ粒子のカベオリン−１シグナルとの著しい共局在化を観測したが、接合ｃＭＬＶ粒子とクラスリン構造との間には共局在化を観測せず、このことは、カベオリン経路がｃＭＬＶのエンドサイトーシスに関与することができることを示す。しかしながら、１５分間のインキュベーション後に、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子はクラスリン構造と共局在化したが、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子とカベオリン−１シグナルとの間に目立った共局在化を観測せず、このことは、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶのエンドサイトーシスがクラスリン依存的でることができたことを示唆する。３０個超の細胞を分析することによるｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶのカベオリン−１構造またはクラスリン構造との共局在化の定量化により、クラスリン媒介性経路はｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの侵入に関与することができたが、ｃＭＬＶのエンドサイトーシスはカベオリン−１依存的であることができたことを確認した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。図１４Ｃに示す薬剤阻害アッセイにより、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶのクラスリン依存性エンドサイトーシスの役割を更に調べた。クロルプロマジン（ＣＰＺ）は、クラスリン重合を阻害することによりクラスリン媒介性内在化をブロックすることが知られており、フィリピンは、カベオリン依存性内在化を妨害することができるコレステロール結合試薬である。図１４Ｄに示すように、ＣＰＺ（１０μｇ／ｍｌ）はＨｅＬａ細胞においてｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子の取り込みを有意に低下させたが、細胞をフィリピン（１０μｇ／ｍｌ）で前処置した場合にはｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子の取り込みへの有意な阻害効果を観測しなかった。しかしながら、フィリピンによる細胞の前処置により、未接合ｃＭＬＶ粒子の取り込みが著しく低下した（Ｐ＜０．０１）が、ＣＰＺ前処置細胞では、未接合ｃＭＬＶ粒子の取り込みへの阻害効果を観測しなかった。阻害アッセイからの結果は、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶエンドサイトーシスはクラスリン依存性経路により媒介され、未接合ｃＭＬＶ粒子はカベオリン依存性エンドサイトーシスにより細胞に侵入することを更に裏付けた。
【００８７】
細胞内に入ると、エンドソームの内容物の細胞内運命は、薬剤送達の成功の重要な決定因子と見なされている。ナノ粒子はＧＴＰアーゼＲｂ５依存的に初期エンドソームに運ばれて従来のエンドサイトーシス経路（エンドソーム／リソソーム）も通る可能性があり、おそらくリソソーム中での薬剤放出のための脂質膜の酵素的破壊がもたらされることも提案された。ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶナノ粒子のその後の細胞内運命を更に調べるために、Ｄｉｄで標識されたｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子を、この粒子の、３７℃における様々なインキュベーション時間での初期エンドソーム（ＥＥＡ−１）マーカーおよびリソソーム（Ｌａｍｐ−１）マーカーとの共局在化に関して評価した。ほとんどのｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子を３０分間のインキュベーション後のＥＥＡ１＋初期エンドソーム中で発見し、標的ｃＭＬＶ粒子の細胞内運命での初期エンドソームの関与を裏付けた。加えて、２ｈのインキュベーション後に、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶとリソソームとの著しい共局在化を観察し、このことは、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶを初期エンドソームに運ぶことができ、リポソーム区画およびエンドサイトーシス区画からサイトゾルへの薬剤の可能な放出のために、リソソームに更に移動させることができることを示唆する。まとめると、結果は、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶがクラスリン依存性エンドサイトーシスおよび受容体媒介性エンドサイトーシスを介して腫瘍細胞に侵入し、続いて初期エンドソームおよびリソソームを通って輸送されることを示した。
【００８８】
乳房腫瘍動物モデルにおけるｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）の治療効果。発明者らは、ｉＲＧＤ接合ｃＭＬＶはナノ粒子の細胞中への取り込みを増加させることができ、結果としてドキソルビシンの濃度およびインビトロでの細胞毒性が増加することを明らかにしている。ここで、乳房腫瘍動物モデルを使用して、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）の場合と比較したｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）のインビボでの治療効果を評価した。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに４Ｔ１乳房腫瘍細胞を皮下接種した。１０日目に、３日毎に２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ当量の用量でｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）をマウスに静脈内注射した。次いで、実験終了まで腫瘍増殖および体重をモニタリングした（図１５Ａ）。図１５Ｂに示すように、２ｍｇ／ｋｇのｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）を投与した群のマウスは、未処置群のマウスと比較して有意な腫瘍抑制を示した（Ｐ＜０．０１）。加えて、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）により処置した群において腫瘍増殖の著しい抑制を観測し、このことは、ｉＲＧＤペプチドが、インビボでの薬剤が装荷されたナノ粒子の治療効果を更に高めることができたことを示唆する。全実験を通して全てのマウスで体重減少は見られず（図１５Ｃ）、このことは、ｃＭＬＶ製剤およびｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ製剤からの全身毒性がないことを示す。ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）の抗腫瘍活性の増加を、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）で処置したマウスの腫瘍重量と比較した、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）で処置したマウスの腫瘍重量の有意な減少により更に確認した（図１５Ｄ）。
【００８９】
考察
目標ではない長循環リポソーム、例えばドキシル／カエリクスは、透過性および滞留性機序の増強により、がんを処置するために化学療法剤を送達すると広く評価されている。長循環リポソームの治療活性を高めるために大変な努力が払われているが、結果として迅速な薬剤放出プロファイルが生じる、血清成分の存在下での従来のリポソームの比較的特有の不安定さは、がん処置のための開発での障害物とみなされている。持続可能な放出動態および改善された安定性を有するリポソーム製剤を開発するために、結果としてインビボでの治療効率が改善される、小胞安定性の改善および全身毒性の低減という特徴が約束されているＤｏｘのｃＭＬＶ製剤が新規のナノ担体プラットフォームとして調査されている。ｃＭＬＶは抗腫瘍活性の改善を示すが、受容体を標的とするこの粒子の直接送達により、効果を潜在的に更に高め、毒性を最小化する可能性がある。
【００９０】
最も現在研究されているターゲティング戦略は、腫瘍細胞上で過剰発現されている特定の受容体／リガンドを利用することによりナノ粒子を腫瘍細胞に指向させることに集中している。例えば、インテグリン受容体を標的とするために、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩）ペプチドが、薬剤が装荷されたナノ粒子に接合されており、インテグリン受容体は新生血管内皮細胞上で過剰発現されている。抗がん剤送達のために標的とするペイロードの開発は治療効果の潜在的な向上を示しているが、ナノ粒子の腫瘍細胞への不十分な透過が固体腫瘍の臨床的処置を依然として妨害する。従って、新規のｉＲＧＤペプチドが最近同定されており、腫瘍特異的におよびニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）依存的に血管透過および組織透過を増加させることが報告されている。ｉＲＧＤペプチドのＣ末端モチーフＣｅｎｄＲが、血管透過の制御に関与する細胞表面受容体であるニューロピリン−１受容体との相互作用による細胞透過および組織透過の媒介物として同定されている。例えば、ＣｅｎｄＲモチーフをニューロピリン−１受容体に曝露するためのカプシドタンパク質のタンパク分解性の開裂に必要な多くのウイルスの感染の成功が報告されており、ニューロピリン−１受容体は、細胞中へのウイルス粒子のエンドサイトーシスを誘発させる可能性がある。更に、いくつかの研究から、ＣｅｎｄＲモチーフを含むペプチドがＮＲＰ−１受容体に結合することができ、細胞内在化および血管浸出を引き起こすことが報告されており、このことは、ｉＲＧＤペプチドは、薬剤送達ナノ担体に共有結合的に連結された場合に同様の効果を有する可能性があることを示唆する。これまで、発明者らは、単膜リポソームまたはドキシル様リポソームの治療能力と比較して全身毒性が低減されているｃＭＬＶ製剤の治療能力の増強を明らかにした。従って、本研究では、発明者らはｉＲＧＤペプチドをこの比較的安定したｃＭＬＶ粒子に接合させ、インビトロおよびインビボの両方において、この目標のナノ粒子の効果を評価した。ｃＭＬＶ製剤と比較して、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ製剤において、これら２種の製剤の同様のサイズ分布および脂質組成に起因して、類似の累積薬剤放出プロファイルを観測した。結果は、ｉＲＧＤ−ｃＭＶＬが、細胞における目標のナノ粒子の結合および取り込みの増加に起因する優れた細胞毒性を提示することを示した。さらに、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ小胞によるＤｏｘの取り込みおよび透過の増加により、腫瘍におけるインビボでの治療活性の改善が可能となった。４Ｔ１腫瘍のｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ処置は、ｃＭＬＶによる処置と比較して腫瘍増殖の有意な抑制を示し、このことは、ナノ粒子による薬剤送達のためのｉＲＧＤの潜在的用途を更に示唆する。
【００９１】
さらに、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶの侵入機序に関する発明者らの画像研究から、この粒子の細胞内運命についてのいくつかの教訓的な詳細がもたらされた。具体的には、結果は、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶ粒子がクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞に入るが、未接合のｃＭＬＶ粒子の内在化はカベオリンに媒介されることを示した。ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶに利用される様々なエンドサイトーシス経路は、ｉＲＧＤ−インテグリン結合によるナノ粒子と細胞との相互作用から生じる場合がある。結果は、受容体媒介性相互作用が細胞接着を促進した可能性があり、結果として細胞取り込みが増加したことも示唆した。複数の経路がエンドソーム輸送に関与したと仮定されているが、発明者らのデータは、ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶの両方が初期エンドソームに向かい、リソソームへと更に輸送されることを示した。ｉＲＧＤ−ｃＭＬＶおよびｃＭＬＶの両方の細胞内輸送経路におけるリソソームの関与により、薬剤放出動態が促進される場合がある。なぜならば、ホスホリパーゼ等の酵素は、エンドリソソーム区画において、リポソーム二重層の破壊を促進することができるからである。
【００９２】
３．架橋多重膜リポソームによるドキソルビシンおよびパクリタキセルの共送達により、相乗的な抗腫瘍活性が可能となる
材料および方法
細胞株、抗体、試薬およびマウス。Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−６４７５）および４Ｔ１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２５３９）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ネブラスカ州、オマハ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、バージニア州、マナサス）により５％ＣＯ２環境中で維持した。マウス抗βアクチンとリン酸化型特異的タンパク質ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）に対するウサギ抗体とを、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、ダンバース）から購入した。ヤギ抗ウサギＩＲ色素（登録商標）６８０ＲＤおよびヤギ抗マウスＩＲ色素（登録商標）８００ＣＷをＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ネブラスカ州、リンカーン）から得た。ドキソルビシン、パクリタキセル、ダウノルビシンおよびドセタキセル（Ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
【００９３】
下記の全ての脂質を日油株式会社（日本）から得た：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１０−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ−ラミド（マレイミド頭部基脂質、ＭＰＢ−ＰＥ）。
【００９４】
雌で６〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入した。全てのマウスを、南カリフォルニア大学（米国、カリフォルニア州、ロサンゼルス）の動物施設において特定の病原体を低減した条件下で保持した。全ての実験を、動物の管理および使用に関して国立衛生研究所および南カリフォルニア大学により規定されたガイドラインに従って実施した。
【００９５】
ｃＭＬＶの合成。従来の脱水−再水和法に基づいてリポソームを調製した。全ての脂質を日油株式会社（日本）から得た。ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＢ＝４：１：５のモル脂質比でＤＯＰＣ、ＤＯＰＧおよびＭＰＢ−ＰＥをクロロホルム中で組み合わせ、この脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させた。脂質混合物を一晩真空下で更に乾燥させ、乾燥した薄い脂質膜を形成した。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）を調製するために、有機溶媒中のパクリタキセルを脂質混合物と混合させた後、乾燥した薄い脂質膜を形成した。結果として生じた乾燥膜を、ドキソルビシンを含むｐＨ７．０での１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ７．０）中で１ｈにわたり１０分毎に激しくボルテックスすることにより水和させ、次いで、この乾燥膜に、サイクル毎に１分間のインターバルにて氷上で４サイクルの１５ｓ超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００、ニューヨーク州、ファーミングデール）を適用した。二価誘発性小胞融合を誘導するために、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭの最終濃度で添加した。結果として生じた多重膜小胞を、３７℃で１ｈにわたり１．５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することにより更に架橋させた。結果として生じた小胞を４分にわたる１４，０００ｇでの遠心分離により回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ｃＭＬＶのペグ化のために、粒子を、３７℃で１ｈにわたり２ｋＤａのＰＥＧ−ＳＨ（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、アラバマ州、アラブ）１μｍｏｌと共に更にインキュベートした。次いで粒子を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。最終生成物を４℃でＰＢＳにて保存した。
【００９６】
物理的特性のキャラクタリゼーション。ｃＭＬＶの流体力学的サイズおよびサイズ分布を、動的光散乱（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、サンタバーバラ）により測定した。
【００９７】
インビトロでの薬剤のカプセル化および放出。Ｄｏｘの装荷能力を研究するために、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）を回収してＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理により小胞から脂質を抽出した。次いで、ＤＯＸ蛍光（励起４８０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ−５３０１ＰＣ分光蛍光光度計（日本により測定した。ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）に取り込まれたパクリタキセルの量を、Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州、ブレア）により測定した。０．５ｍｌの全体積まで水およびアセトニトリルを添加することにより、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）懸濁液およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＳ）懸濁液を希釈した。５ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルの添加および１分にわたる試料のボルテックス混合（ｖｏｔｅｘ−ｍｉｘｉｎｇ）により、パクリタキセルの抽出を達成した。混合物を遠心分離し、有機層をガラス管に移してアルゴン下で蒸発乾固させた。緩衝液Ａ（９５％の水、５％のアセトニトリル）を使用して、ガラス管を再水和させた。ＰＴＸ濃度を検査するために、１ｍｌの溶液をＣ１８カラムに注入し、２２７ｎｍでパクリタキセルを検出した（流量１ｍｌ／分）。リポソームからのＤｏｘおよびＰＴＸの放出動態を得るために、毎日、３７℃にて１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地中でインキュベートしたｃＭＬＶから遊離培地を取り出して新鮮な培地に置き換えた。取り出した培地の（分光蛍光光度計による）Ｄｏｘ蛍光および（ＨＰＬＣによる）ＰＴＸ蛍光を毎日定量化した。
【００９８】
インビトロでの薬剤装荷効率。全リン脂質の質量に対するカプセル化された薬剤の比率により装荷効率を決定した。リン酸リン脂質アッセイを実行して、リン脂質の質量を算出した。ｃＭＬＶを遠心分離し、１００μｌのクロロホルムをペレットに添加して脂質二重層を破壊した。試料をガラス管に移して蒸発乾固させた。１００μｌの過塩素酸の添加後、試料を２５分にわたり１９０℃で沸騰させた。次いで、脂質が消化されているので試料は褐色透明を呈するだろう。試料を室温まで冷却し、蒸留水で１ｍｌまで希釈した。リン酸リン脂質の量を、マラカイトグリーンリン酸塩検出キット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、ミネアポリス）により測定した。
【００９９】
インビトロでの細胞毒性およびデータ解析。Ｂ１６−Ｆ１０細胞および４Ｔ１細胞を、９６ウェルプレート中の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地中にウェル当たり５×１０３個の細胞の密度で蒔き、６ｈにわたり増殖させた。次いで、細胞を、４８ｈにわたり、組み合わせた薬剤の様々な重量比で、一連の濃度のｃＭＬＶ（単一の薬剤）またはｃＭＬＶ（薬剤の組み合わせ）に曝露した。Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅのＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴアッセイ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞生存性を評価した。薬剤処置ウェルから培地のみのウェルから得た吸光度値を引くことにより、細胞の生存性の割合を決定し、次いで薬剤を含まないコントロール細胞に対して正規化した。続いて、各薬剤濃度で影響を受けた細胞の割合（ｆａ）を各ウェルに関して決定した。データを非線形回帰により解析してＩＣ５０値を得た。組み合わせ指数（ＣＩ）値を、方程式：ＣＩ＝ＣＡ，Ｘ／ＩＣＸ，Ａ＋ＣＢ，Ｘ／ＩＣＸ，Ｂにより算出した２８。この解析方法を使用すると、ＣＩ＝０．９〜１．１は付加的な活性を反映し、ＣＩ＞１．１は拮抗作用を示し、ＣＩ＜０．９は相乗作用を示唆する。
【０１００】
ウェスタンブロット解析。処置から２４ｈ後に細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤を補充した溶解緩衝液中で溶解させ、１５分にわたり氷上でインキュベートし、次いで１０分にわたる４℃における１００００×ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を測定した。１２％ポリアクリルアミドゲルを還元させることにより溶解物（２０μｇ）を分離し、次いで二フッ化ポリビニリデン膜に移した。ウサギリン酸化型特異的タンパク質ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）に特異的な抗体およびヤギ抗ウサギＩＲ色素（登録商標）６８０ＲＤにより、ＥＲＫの免疫検出を実行した。β−アクチンに対する抗体およびヤギ抗マウスＩＲ色素（登録商標）８００ＣＷにより、β−アクチンの免疫検出を実行した。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州、リンカーン）を使用して膜を現像した。
【０１０１】
腫瘍におけるドキソルビシンレベルおよびパクリタキセルレベルの測定。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１腫瘍細胞に皮下接種した。腫瘍を、処置前に〜５００ｍｍ３の体積まで２０日にわたり増殖させた。２０日目に、マウスに、溶液またはｃＭＬＶのどちらかで８．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋１．６６ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、１．６６ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋８．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを尾静脈から静脈内注射した。注射から３日後、腫瘍を摘出して−２０℃で凍結した。パクリタキセルに関する内部標準（ＩＳ）としてのドセタキセル（１０μｌ、１００μｇ／ｍｌ）またはドキソルビシンに関する内部標準としての１０μｌのダウノルビシン（１００μｇ／ｍｌ）を、秤量した腫瘍組織に添加した。パクリタキセルおよび内部標準（ドセタキセル）を抽出するために、腫瘍組織を１ｍｌの酢酸エチル中でホモジナイズし、次いで１０分にわたり５０００ｒｐｍで遠心分離した。ドキソルビシンおよびこの内部標準（ダウノルビシン）を抽出するために、腫瘍組織を１ｍｌのメタノール中でホモジナイズし、次いで１０分にわたり５０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、有機層を透明なガラス管に移し、アルゴンの蒸気下で蒸発乾固させた。緩衝液Ａ（９５％の水、５％のアセトニトリル）を使用して、ガラス管中の試料を再水和させた。１ｍｌの溶液をＣ１８カラムに注入し、２２７ｎｍでパクリタキセルを検出し（流量１ｍｌ／分）、４８２ｎｍでドキソルビシンを検出した（流量１ｍｌ／分）。ＤｏｘならびにＰＴＸ（１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）ならびにＩＳのストック溶液を較正試料として調製した。次いで、５００μｌの腫瘍ホモジネートに、１μｇ／ｍｌの一定濃度で内部標準を含む５００μｌの較正試料を添加した。重み付き線形回帰解析によるドキソルビシンまたはパクリタキセルと内部標準とのピーク高さの比率を使用することにより、ドキソルビシンおよびパクリタキセルの較正曲線を作成した。
【０１０２】
インビボでの抗腫瘍活性研究。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１乳房腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に〜５０ｍｍ３の体積まで８日にわたり腫瘍を増殖させた。８日目に、マウスに、３日毎にｃＭＬＶまたは溶液のどちらかで３．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋０．６７ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、０．６７ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋３．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを尾静脈から静脈内注射した（群当たり６匹のマウス）。実験終了まで腫瘍増殖および体重をモニタリングした。注射後に３日毎にファインキャリパーで腫瘤の長さおよび幅を測定した。腫瘍体積を１／２×（長さ×幅２）で表した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した場合に生存エンドポイントを設定した。生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表す。個々の群の生存曲線をログランク検定により比較した。
【０１０３】
腫瘍の免疫組織化学、心毒性および共焦点撮像。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に〜５００ｍｍ３の体積まで２０日にわたり腫瘍を増殖させた。２０日目に、マウスに、溶液またはｃＭＬＶのどちらかで８．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋１．６６ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、１．６６ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋８．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを尾静脈から静脈内注射した。注射から３日後、腫瘍を摘出し、固定し、凍結させ、凍結切片し、ガラススライド上にマウントした。凍結した切片を固定し、冷ＰＢＳですすいだ。ブロッキングおよび透過処理の後、スライドをＰＢＳで洗浄し、１時間にわたりＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス）と共にインキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）で対比染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡を使用して、Ｙｏｋｏｇａｗａスピニングディスク共焦点スキャナシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ、ユタ州、ソルトレイクシティ）により蛍光画像を得た。各レーザーに関して５０ｍＷであるＡＯＴＦ（音響光学的可変フィルタ）制御レーザーマージシステムにより、４０５ｎｍ、４９１ｎｍ、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍの固体レーザー線で照射パワーを供給した。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して全ての画像を解析した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化するために、×２の倍率での画像当たり４つの目的領域（ＲＯＩ）をランダムに選択した。１つの領域内において、ＴＵＮＥＬ陽性核の領域および核染色の領域をＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアで計数し、データを領域においてＴＵＮＥＬにより染色された核領域の合計％で表す。
【０１０４】
心毒性の場合、注射から３日後に心臓組織を採取し、４％ホルムアルデヒド中で固定した。組織を凍結し、次いで切片に切断してガラススライド上にマウントした。凍結切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。病理組織標本を光学顕微鏡で調べた。
【０１０５】
統計。２つの群間の差異をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で決定した。３つ以上の群の差異を一方向ＡＮＯＶＡで決定した。
【０１０６】
結果および考察
ｃＭＬＶによる組み合わせ薬剤送達の特性。架橋多重膜リポソーム小胞による組み合わせ薬剤送達の発明者らの戦略は、疎水性薬剤パクリタキセル（ＰＴＸ）を脂質膜中に組み込み、親水性薬剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）をリポソーム小胞の水性コア中にカプセル化することである（図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい）。ＭｇＣｌ２を添加して小胞融合を誘発し、次いでジチオスレイトール（ＤＴＴ）により安定化させて隣接するリポソーム小胞間に架橋を形成することにより、架橋多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）を形成した。架橋多重膜リポソームの表面をチオール末端化ＰＥＧにより更にＰＥＧ化し、チオール末端化ＰＥＧは、小胞安定性を高め、血液循環半減期を延ばすことが知られている。最初に、発明者らは、薬剤の組み合わせがリポソーム製剤の物理的特性を変更する可能性があるかどうかを確認するために、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶと比較して、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの物理的特性をキャラクタライズした。動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、結果として生じる２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶは単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶと同様の平均流体力学的直径を有することを示した（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの両方において観測した狭いサイズ分布および同様の多分散性により明らかなように、発明者らは、３種全てのリポソーム製剤において架橋処理中に粒子の目立った凝集がないことを発見した。このことは、単一のナノ粒子におけるＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせがｃＭＬＶ粒子の形成に与える影響は無視できることを示唆する。
【０１０７】
次に、発明者らは、ｃＭＬＶのカプセル化効率または装荷収率は複数の治療を装荷することにより影響を受けるかどうかを確認した。単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶを有機溶媒に溶解させて、カプセル化された薬剤（Ｄｏｘおよび／またはＰＴＸ）全てを遊離させた。Ｄｏｘ濃度およびＰＴＸ濃度をそれぞれ分光蛍光光度計および／またはＨＰＬＣにより定量化した。図１６Ｄに示すように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）におけるＤｏｘおよびＰＴＸの薬剤カプセル化効率は、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｃＭＬＶ（ＰＴＸ）のどちらかにおけるＤｏｘおよびＰＴＸの薬剤カプセル化効率と有意な差異はなかった。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）は単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶと比較して同等の薬剤装荷収率（リン脂質ｇ当たり〜２７０ｍｇの薬剤）を有することも示された（図１６Ｅ）。２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶにおいてＤｏｘおよびＰＴＸの薬剤放出プロファイルも評価し、ｃＭＬＶが制御された様式で個々の薬剤を放出することができるかどうかを調べた。インビトロでの薬剤放出アッセイの結果は、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）は、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの放出動態と同様に、ＤｏｘおよびＰＴＸの両方の遅いおよび直線的に持続される放出動態（最大２週間）を有することを示した（図１６Ｆ〜図１６Ｈ）。これらの結果は、このアプローチにより、効率的な薬剤装荷収率および持続的な薬剤放出プロファイルで、異なる疎水性を有する薬剤の同じナノ粒子中への装荷が可能になることを裏付ける。
【０１０８】
薬剤の比率に依存する相乗作用に関するドキソルビシン：パクリタキセルのインビトロでの分析。組み合わせ薬剤送達のいくつかの場合は相乗効果を誘導することができ、組み合わせ効果、相乗作用、加算性または拮抗作用が用量比率の影響を受ける可能性があることが報告されている。この仮説を検証するために、３種の異なる薬剤重量比（５：１、３：３および１：５）をカプセル化しているｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の細胞毒性をＢ１６細胞株および４Ｔ１細胞株で調べた。ｃＭＬＶの細胞毒性を、カクテル溶液での同じ３種の比率の組み合わせの細胞毒性と比較した。図１７Ａには、Ｂ１６細胞および４Ｔ１細胞との４８ｈのインキュベーション後の３種の異なる用量比での、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶのＩＣ５０測定の結果がまとめられている。３：３および５：１のＤｏｘ：ＰＴＸ比でのｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）のＩＣ５０値は、研究した細胞株における１：５の比率のＩＣ５０値よりも有意に小さかった。遊離したＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせに関しても、様々な用量比でＩＣ５０値の同様の傾向を観測した（図１７Ｂ）。
【０１０９】
さらに、組み合わせの効果を評価するために、ｃＭＬＶまたはカクテル溶液のどちらかでのＤｏｘとＰＴＸとの組み合わせに関するインビトロでの細胞毒性曲線から、組み合わせ指数（ＣＩ）値を解析した。ｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでの個々の薬剤のＩＣ５０値を図１７Ｇ〜図１７Ｈに示す。１未満のＣＩ、１と等しいＣＩおよび１よりも高いＣＩはそれぞれ、相乗作用、加算性および拮抗作用を示すことが知られている。図１７では、組み合わせ指数を、影響を受けた細胞の０．５の割合（ｆａ）（コントロール細胞に対する５０％細胞増殖抑制）に関してのみ示すが、相乗作用／拮抗作用のプロファイルはその他のｆａ値に関しても同様であった。図１７Ｃに示すように、ｆａ＝０．５では、５：１および３：３（Ｄｏｘ：ＰＴＸ）のＤｏｘ：ＰＴＸ比での共装荷ｃＭＬＶに関してＢ１６腫瘍細胞および４Ｔ１腫瘍細胞の両方で相乗効果を観測したが、１：５での組み合わせはＢ１６細胞および４Ｔ１細胞で加算性または拮抗性であった。これに対して、図１７Ｄに示すように、カクテルでの３種の比率のＤｏｘおよびＰＴＸで処置したＢ１６細胞または４Ｔ１細胞では相乗効果を観測せず、このことは、用量比を制御することにより相乗作用を誘導するｃＭＬＶの可能性を更に裏付ける。
【０１１０】
発明者らのデータは、ＰＴＸの比率が高いｃＭＬＶによる組み合わせ送達が加算性または拮抗作用を誘導することを示した。実際には、いくつかの研究から、低濃度のＰＴＸは高濃度よりも効率的に細胞アポトーシスを誘導することができるが、機序は分かり難いままでることが示されている。更なる研究から、ＰＴＸは細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化することができ、これにより細胞が増殖し、薬剤耐性が確立されることが示唆された。ＥＲＫ経路の阻害により、ＰＴＸにより誘導される細胞アポトーシスが劇的に増加することも示されている。これらの研究は、高ＰＴＸ濃度は、１：５の用量比でＤｏｘとＰＴＸとの間に見られる拮抗作用の原因となる可能性があることを示す。３種の異なる用量比にてｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）で処置したメラノーマ細胞においてＥＲＫの活性化に差異があるかかどうかと調べるために、リン酸化ＥＲＫの発現をウエスタブロットにより検出した。図１７Ｅに示すように、１：５の比率でのＤｏｘとＰＴＸとの組み合わせは、３：３の比率および５：１の比率と比較して、リン酸化ＥＲＫの有意に増加した発現を示した。ＥＲＫリン酸化の定量化（図１７Ｆ）は、１：５の比率のｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）で処置した細胞におけるリン酸化ＥＲＫの３０倍の増加を示した。このデータは、比率に依存する組み合わせ効果は、高濃度のＰＴＸにより引き起こされるＥＲＫ活性化とおそらく関連があることを示唆する。
【０１１１】
Ｂ１６メラノーマ細胞および４Ｔ１乳がん細胞に関するｃＭＬＶまたは溶液のどちらかでの個々の薬剤のＩＣ５０値をそれぞれ、図１７Ｇおよび図１７Ｈに示す。
【０１１２】
腫瘍処置におけるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の薬剤の比率に依存する有効性。薬剤の比率に依存するインビトロでの細胞毒性がインビボでも顕在化するかどうかを評価するために、ドキソルビシンおよびパクリタキセルを、５：１〜１：５の範囲の重量比でｃＭＬＶ粒子中に共カプセル化し、ｃＭＬＶ中にカプセル化された全薬剤質量を一定に保持した。一定比率のｃＭＬＶ製剤およびカクテル溶液での同じ一定比率の組み合わせのこのパネルを、インビボでの４Ｔ１乳房腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果に関して評価した。図１８Ａに示すように、溶液での薬剤組み合わせで処置した群における腫瘍体積は、コントロール群における腫瘍体積と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０１）。溶液での様々な比率の薬剤組み合わせで処置した群の間での腫瘍体積は有意な差異を示さず（Ｐ＞０．０５）、このことは、遊離した薬剤の組み合わせが相乗効果を示さなかったインビトロでの発見と一致する。比較すると、ｃＭＬＶでのＤｏｘ対ＰＴＸの５：１重量比および３：３重量比を投与した結果、１：５の比率と比較して抗腫瘍活性が有意に増加し、このことは、インビボでの比率に依存する相乗効果を誘導するｃＭＬＶの能力を示す。さらに、実験中において全ての処置した群に関して体重減少を観測せず（図１８Ｂ）、このことは、これらの用量の組み合わせから目立った毒性がなかったことを示す。
【０１１３】
図１８Ｃに示す生存試験により、用量に依存する抗腫瘍活性を更に確認した。カクテル溶液での３種の比率の薬剤組み合わせでの処置により、ＰＢＳ処置（２８日）と比較して生存時間が増加した（３５日、ｐ＜０．０５）。ｃＭＬＶ製剤での５：１のおよび３：３の重量比の投与により、ｃＭＬＶでの１：５の比率と比較して寿命が有意に増加した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ｃＭＬＶ製剤での薬剤組み合わせの用量に依存する相乗作用を裏付け、インビトロでの組み合わせ効果をインビボでの抗腫瘍効果の程度に関連付ける正の相関関係を提供する。
【０１１４】
腫瘍アポトーシスに対する共カプセル化Ｄｏｘ：ＰＴＸの薬剤の比率に依存する有効性。インビボでの比率に依存する抗腫瘍機序を調べるために、ＴＵＮＥＬアッセイを実施して、３日にわたりカクテルでのおよびｃＭＬＶ製剤での様々な比率のＤｏｘおよびＰＴＸで処置した４Ｔ１腫瘍におけるアポトーシス細胞を検出した。溶液での３種の異なる比率（５：１、３：３および１：５）のＤｏｘおよびＰＴＸで処置した４Ｔ１腫瘍は、コントロールと比較して有意な量で細胞アポトーシスを誘導した。アポトーシス指数は薬剤組み合わせカクテルの様々な比率間で著しく異なってはおらず（ｐ＞０．０５）、このことは、カクテル処置間の腫瘍増殖に対する同様の効果と一致する。さらに、ｃＭＬＶでの５：１および３：３の比率のＤｏｘおよびＰＴＸは、拮抗する比率（１：５）と比較して腫瘍細胞アポトーシスを促進した。定量化データ（図１９）は、ｃＭＬＶによる薬剤の比率に依存する抗腫瘍効果は様々なレベルの腫瘍アポトーシスの一因となる可能性があることを更に裏付ける。
【０１１５】
ｃＭＬＶ製剤での薬剤組み合わせのインビボでの心毒性評価。ＤｏｘとＰＴＸとの組み合わせ処置後の心毒性の増加という予想外の臨調転帰が報告されており、そのため、ＤｏｘとＰＴＸとの組み合わせ処置の臨床応用が制限されている。相乗的な治療により相乗的な心毒性が誘導され得たかどうかを調べるために、ｃＭＬＶ製剤およびカクテル溶液の両方での３種の重量比のＤｏｘおよびＰＴＸを心臓への影響に関して評価した。４Ｔ１腫瘍を保持するマウスに、溶液でのまたはｃＭＬＶでの８．３３ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋１．６６ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ、１．６６ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋８．３３ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを尾静脈から静脈内注射した。各処置群からの心臓組織部分のヘマトキシリン染色およびエオシン染色を調べた。図２０に示すように、カクテル溶液でのＤｏｘおよびＰＴＸの３種全ての用量比により、筋原繊維減少、錯綜配列および細胞質空胞化で示される心臓組織への損傷が引き起こされた。ｃＭＬＶ製剤でのＤｏｘおよびＰＴＸの３種の用量比では、コントロール群と比較して心臓組織における有意な病理組織学的変化を観測せず、このことは、薬剤をｃＭＬＶ中で共カプセル化した場合に全身毒性の低下を達成することができることを示す。さらに、ｃＭＬＶでのＤｏｘおよびＰＴＸの相乗的な比率（５：１および３：３）では、相乗的な毒性を観測しなかった。
【０１１６】
ｃＭＬＶ製剤での薬剤比率のインビボでの維持。ｃＭＬＶにより送達される薬剤の用量比がインビボで十分に維持されるかどうかを確認するために、およびインビボでの効果をインビトロでの組み合わせ効果に関連付けるために、腫瘍組成における薬剤濃度を測定した。ＤｏｘおよびＰＴＸを、ｃＭＬＶ内で５：１、３：３および１：５の重量比で共カプセル化し、マウスに静脈内注射で投与し、カクテル溶液での同じ比率の薬剤の組み合わせをコントロールとして投与した。図２１Ａに示すように、注射から２４時間後に、腫瘍を摘出してホモジナイズし、ＤｏｘおよびＰＴＸを抽出してＨＰＬＣ分析により検出した。ＨＰＬＣ結果は、ｃＭＬＶは、２４ｈ超にわたり腫瘍中においてＤｏｘ：ＰＴＸの重量比をそれぞれ５：１、３：３および１：５で維持すること示す（図２１Ｂ）。対照的に、遊離薬剤カクテルでのＤｏｘ：ＰＴＸの重量比は、図２１Ｃに示すように投与後に劇的に変化した。加えて、ｃＭＬＶ製剤により投与した場合での腫瘍中におけるＤｏｘおよびＰＴＸの蓄積は、ＤｏｘおよびＰＴＸが同量の遊離薬剤カクテルと比較して顕著に多く、そのため、これらの組み合わせ効果が最大化された。これらの結果は、ｃＭＬＶがインビボで用量比を効率的に維持することができ、そのため、組み合わせ効果（相乗作用、加算性および拮抗作用）がインビトロからインビボに変換されることを示す。
【０１１７】
まとめと、組み合わせ化学療法のための頑強なアプローチは、薬剤装荷に対する比例的な制御により、２種の異なるタイプの抗腫瘍治療を架橋多重膜リポソーム製剤中にカプセル化することにより示された。以前に、発明者らは、小胞安定性が増加しているＤｏｘの制御可能で持続可能な薬剤放出プロファイルを提供し、抗腫瘍活性の改善を可能にする、薬剤担体としてのｃＭＬＶの優れた能力を明らかにしている。本研究では、発明者らは、相乗的な抗腫瘍活性を実現するためにＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせ送達におけるｃＭＬＶの可能性を調査し、ＤｏｘおよびＰＴＸは、転移性乳がんにおけるアントラサイクリン−タキサンの併用レジメンとして広く使用されている。多くの研究は、カクテル溶液で投与した場合でのこの組み合わせの非協調的な生体内分布プロファイルが組み合わせの有効性を制限することを示唆する。しかしながら、多用途の架橋多重膜リポソームは、単一小胞によるＤｏｘおよびＰＴＸのがん部位への共送達を可能にし、そのため、血漿排出と組み合わせ薬剤の組織分布とが調和される。
【０１１８】
最近の研究から、抗腫瘍薬剤の組み合わせの活性は、細胞に曝露される組み合わせ薬剤の比率により決定されることが明らかになった。従って、組み合わせた薬剤の相乗的な比率をインビボで維持することが非常に望ましい。ここで、発明者らは、ｃＭＬＶの安定性により発明者らは所定の比率でＤｏｘおよびＰＴＸを共装荷させることができ、腫瘍細胞において比率に依存する相乗作用を誘導することができることを明らかにする。多くの研究により、ＰＴＸ含有リポソームは３％〜４％の薬剤対脂質のモル比にわたり安定性を維持することができないことが既に報告された。例えば、一研究は、８％超のＰＴＸ対脂質の製剤（ＰＧ：ＰＣ  ３：７のモル比）は１日にわたり安定でないことを示した２４。ｃＭＬＶは、最大３０％のＰＴＸ対脂質のモル比で高い安定性を維持することができる。このことはｃＭＬＶの架橋多重膜構造に起因する可能性が最も高く、ｃＭＬＶの架橋多重膜構造により、高装荷効率でＤｏｘおよびＰＴＸを共送達することができる。加えて、ｃＭＬＶの小胞安定性の増加により、このナノ粒子が腫瘍部位でＤｏｘおよびＰＴＸの用量比を維持することができ、比率に依存する相乗作用がインビトロからインビボに変換される。このことは、臨床試験における処置の効率およびインビトロでの細胞実験に基づく組み合わせ治療の最適設計を予測するのに有用であるだろう。発明者らのインビボでの結果から、カクテル組み合わせと比較したｃＭＬＶの組み合わせ効果の増強は、腫瘍部位での薬剤の蓄積の増大に起因することも明らかである。
【０１１９】
臨床研究では、ＤｏｘおよびＰＴＸはカクテルで組み合わされた場合に心毒性の増加を示し４０，４１、重大な副作用は相乗的な治療効果と関連する可能性があるという懸念を生じさせる。しかしながら、発明者らは、大概はＤｏｘの持続的な薬剤放出プロファイルに起因して、頑強なｃＭＬＶ製剤がＤｏｘの全身毒性を大きく低減することを既に明らかにした。ここで、発明者らは、ｃＭＬＶが心毒性を生じさせることなく腫瘍増殖への相乗効果を誘導することを示し、組み合わせ薬剤送達におけるｃＭＬＶの可能性を更に明らかにする。これらの結果は、まとめると、組み合わせ治療におけるｃＭＬＶの優れた能力は、腫瘍細胞への薬剤の持続的な曝露に起因するだけでなく、目立った全身毒性がない状態での作用部位での相乗的な薬剤の比率の維持にも起因することを示した。
【０１２０】
４．腫瘍における多剤耐性を克服するための架橋リポソーム製剤によるドキソルビシンおよびパクリタキセルの共送達
材料および方法
マウス。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入した。全てのマウスを、南カリフォルニア大学（米国）の動物施設において特定の病原体を低減した条件下で保持した。全ての実験を、動物の管理および使用に関して国立衛生研究所および南カリフォルニア大学により規定されたガイドラインに従って実施した。
【０１２１】
細胞培養。Ｂ１６腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｆ１０、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−６４７５）および４Ｔ１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２５３９）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ネブラスカ州、オマハ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、バージニア州、マナサス）により５％ＣＯ２環境中で維持した。４日にわたり５μｇ／ｍｌのＰＴＸでＢ１６細胞および４Ｔ１細胞を連続的に処置することにより、Ｂ１６−Ｒ細胞および４Ｔ１−Ｒ細胞を生成した。次いで、７日にわたり薬剤を含まない新鮮な培地で培地を置き換えることにより、細胞を回収した。残留する細胞は、ＰＴＸに関する薬剤耐性を形成した。ＪＣ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２１１６）をモデル薬剤耐性腫瘍細胞株として使用した。なぜならば、ＪＣ細胞はＰ−ｇｐを過剰発現し、インビトロおよびインビボの両方において薬剤耐性表現型を示すことが分かっているからである。
【０１２２】
ｃＭＬＶの合成。従来の脱水−再水和法に基づいてリポソームを調製した。全ての脂質を日油株式会社（日本）から得た。１．５μｍｏｌの脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）およびマレイミド頭部基脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ−アノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラミド（ＭＰＢ−ＰＥ）をＤＯＰＣ：ＣＯＰＧ：ＭＰＢ＝４：１：５のモル脂質比にてクロロホルム中で組み合わせ、脂質混合物中の有機溶媒をアルゴンガス下で蒸発させた。脂質混合物を一晩真空下で更に乾燥させ、乾燥した薄い脂質膜を形成した。ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）およびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）を０．２：１（薬剤：脂質）のモル比で調製するために、有機溶媒中のパクリタキセルを脂質混合物と混合させ、乾燥した薄い脂質膜を形成した。結果として生じた乾燥膜を、０．２：１（薬剤：脂質）のモル比でドキソルビシンを含む（ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）もしくはｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ））またはドキソルビシンを含まない（ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））ｐＨ７．０での１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン中で１ｈにわたり１０分毎に激しくボルテックスしつつ水和させ、続いて、この乾燥膜に、サイクル毎に１分間のインターバルにて氷上で４サイクルの１５ｓ超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００、ニューヨーク州、ファーミングデール）を適用した。二価誘発性小胞融合を誘導するために、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭの最終濃度で添加した。結果として生じた多重膜小胞を、３７℃で１ｈにわたり１．５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することにより更に架橋させた。結果として生じた小胞を４分にわたる１４，０００ｇでの遠心分離により回収し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ｃＭＬＶのペグ化のために、粒子を、３７℃で１ｈにわたり２ｋＤａのＰＥＧ−ＳＨ（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、アラバマ州、アラブ）１μｍｏｌと共にインキュベートした。次いで粒子を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。最終生成物を４℃でＰＢＳ中にて保存した。
【０１２３】
インビトロでの細胞毒性およびデータ分析。Ｂ１６−Ｆ１０細胞、４Ｔ１細胞、Ｂ１６−Ｒ細胞、４Ｔ１−Ｒ細胞およびＪＣ細胞を９６ウェルプレート中のＤ１０培地中にウェル当たり５×１０３個の細胞の密度で蒔いて、６ｈにわたり増殖させた。次いで、細胞を、一連の濃度のｃＭＬＶ（単一薬剤）またはｃＭＬＶ（薬剤の組み合わせ）に４８ｈにわたり曝露した。Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴアッセイ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞生存性を評価した。スロープｍおよびＩＣ５０をメジアン効果モデルから得て、ＩＩＰＣｍａｘを下記の方程式により算出した：ＩＩＰＣｍａｘ＝ｌｏｇ（１＋（Ｃｍａｘ／ＩＣ５０）ｍ）。Ｃｍａｘは、各薬剤に関して一般に推奨される用量に関する最大血漿薬剤濃度である。
【０１２４】
細胞におけるドキソルビシンおよびパクリタキセルの細胞取り込み。４Ｔ１細胞をウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で２４ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。次いで、細胞をｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）およびＤｏｘ＋ＰＴＸに曝露した。ＤｏｘおよびＰＴＸの最終濃度は各群に関して１μｇ／ｍｌであった。ＪＣ細胞を、９６ウェルプレート中のＤ１０培地中にウェル当たり１０５個の細胞の密度で播種した。細胞をｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）およびＤｏｘ＋ＰＴＸに曝露した。ＤｏｘおよびＰＴＸの最終濃度は、各群に関して５μｇ／ｍｌであった。処置から４８ｈ後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで溶解させた。細胞溶解物中のドキソルビシンおよびパクリタキセルをそれぞれ、１：１（体積／体積）クロロホルム／イソプロピルアルコールまたは酢酸エチルにより抽出した。細胞溶解物中のパクリタキセル濃度をＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムにより測定して２２７ｎｍで検出し（流量１ｍｌ／分）、ドキソルビシンを４８０／５５０ｎｍの励起／発光の蛍光により検出した。ＤｏｘおよびＰＴＸの濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定したタンパク質含有量に関して正規化した。
【０１２５】
インビボでの抗腫瘍活性研究。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１乳房腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に、腫瘍を〜５０ｍｍ３の体積まで８日にわたり増殖させた。８日後に、３日毎にｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）およびｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）を尾静脈からマウスに静脈内注射した（群当たり６匹のマウス）。４０日にわたりまたは実験終了まで、腫瘍増殖および体重をモニタリングした。注射後に、３日毎にファインキャリパーで腫瘤の長さおよび幅を測定した。腫瘍体積を１／２×（長さ×幅２）で表した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達した場合に生存エンドポイントを設定した。生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表す。個々の群の生存曲線をログランク検定により比較した。
【０１２６】
腫瘍の免疫組織化学および共焦点撮像。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に０．２×１０６個の４Ｔ１腫瘍細胞またはＪＣ腫瘍細胞を皮下接種した。処置前に、〜５００ｍｍ３の体積まで２０日にわたり腫瘍を増殖させた。２０日目に、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸまたはｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）を尾静脈からマウスに静脈内注射した。注射から３日後、腫瘍を摘出し、固定し、凍結させ、凍結切片し、ガラススライド上にマウントした。凍結した切片を固定し、冷ＰＢＳですすいだ。ブロッキングおよび透過処理の後、スライドをＰＢＳで洗浄し、次いで１ｈにわたりＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス）と共にインキュベートした。Ｐ−ｇｐ発現の場合、透過処理後にスライドをマウスモノクローナル抗Ｐ−ｇｐ抗体（Ａｂｅａｍ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で１ｈにわたり染色し、続いてＡｌｅｘａ４８８接合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）で染色し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）で対比染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡を使用して、Ｙｏｋｏｇａｗａスピニングディスク共焦点スキャナシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ、ユタ州、ソルトレイクシティ）により蛍光画像を得た。各レーザーに関して５０ｍＷであるＡＯＴＦ（音響光学的可変フィルタ）制御レーザーマージシステムにより、４０５ｎｍ、４９１ｎｍ、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍの固体レーザー線で照射パワーを供給した。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して全ての画像を解析した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞およびＰ−ｇｐ陽性細胞を定量化するために、×２の倍率での画像当たり４つの目的領域（ＲＯＩ）をランダムに選択した。１つの領域内において、ＴＵＮＥＬ陽性核またはＰ−ｇｐ陽性核の領域および核染色の領域をＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアにより計数した。データを、領域においてＴＵＮＥＬまたはＰ−ｇｐにより染色した核領域の合計％で表す。
【０１２７】
心臓部位のヘマトキシリン染色およびエオシン染色。４Ｔ１腫瘍を保持するマウスに、５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸまたはｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）を静脈内注射した。注射から３日後に、心臓組織を摘出して４％のホルムアルデヒド中で固定した。組織を凍結して切片に切断し、ガラススライド上にマウントした。凍結した切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。病理組織学的検体を光学顕微鏡で調べた。
【０１２８】
統計。２つの群間の差異をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で決定した。３つ以上の群の間の差異を一方向ＡＮＯＶＡで決定した。
【０１２９】
結果
ＸＴＴアッセイによるインビトでの有効性研究。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）とパクリタキセル（ＰＴＸ）との組み合わせ送達を実現するために、既に開発した架橋多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）を使用して、ＰＴＸを脂質膜中に組み込み、Ｄｏｘを１：１の比率で水性コア中にカプセル化してｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）を形成した。薬剤の組み合わせは、他の方法では様々な単剤治療の潜在的な用途を制限するであろう薬剤耐性を克服することができることが報告されている。ＤｏｘおよびＰＴＸの共送達が薬剤耐性を克服することができたかどうかを確認するために、インビトロでの細胞毒性アッセイを、単一の薬剤が装荷されたまたは２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの広範囲の濃度で実施した。図２２Ａおよび図２２Ｂ（左側のパネル）に示すように、Ｂ１６細胞および４Ｔ１細胞の両方において単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶに対する薬剤耐性が現われたが、この耐性は、組み合わせ製剤であるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の投与により抑制された。これら２種の腫瘍細胞で観測した、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの最大細胞毒性は６０％〜８０％であったが、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）で処置した細胞は有意な更なる増殖抑制を示した。
【０１３０】
薬剤耐性の克服における、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの有効性を更に確認するために、親Ｂ１６または親４Ｔ１を高濃度のパクリタキセル（５μｇ／ｍｌ）で継続的に処置することにより薬剤耐性細胞株Ｂ１６−Ｒおよび４Ｔ１−Ｒを生成した。様々な濃度の、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）を、これら２種の薬剤に対する耐性細胞株と共に４８ｈにわたりインキュベートし、標準ＸＴＴアッセイにより細胞毒性を測定した。図２２Ｄおよび図２２Ｅに示すように、Ｂ１６−Ｒ細胞および４Ｔ１−Ｒ細胞の両方が、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）またはｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）で処置した場合に高耐性を示し、このことは、これらの細胞中に多剤耐性が現われていることを示す。対照的に、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）は、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの場合と比較して有意な更なる細胞死（９０〜１００％）を誘発し、このことは、共送達システムは高濃度の単一の薬剤により誘導される薬剤耐性を克服することができたことを裏付ける。さらに、インビトロでの細胞毒性研究は、モデル薬剤耐性腫瘍細胞株であるＪＣ細胞におけるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の治療効果を明らかにしており、このことは、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶと比較した低い有効性を裏付ける。図２２Ｃ（左側のパネル）に示すように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）およびｃＭＬＶ（ＰＴＸ）の最大細胞毒性は６０〜７０％の範囲であったが、ＪＣ細胞におけるｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の最大細胞毒性は約９０％であった。
【０１３１】
細胞増殖の５０％＞抑制効果を生じる薬剤濃度を示すＩＣ５０は、薬剤の有効性に関する情報を提供することができる。しかしながら、Ｈｉｌｌ係数と数学的に類似するパラメータであるスロープｍも細胞毒性に対する有意な効果を有することができることも報告されている。従って、メジアン効果モデルからの３つのパラメータ（ＩＣ５０、薬剤濃度およびｍ）を直感的な意味で単一の値ＩＩＰ（潜在的抑制）、即ち抑制効果のｌｏｇ減少値に組み込むことにより薬剤活性を評価するための新規のモデルが開発されている。従って、発明者らの実験の信頼性を高めるために、ＩＩＰを使用して、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの細胞生存性に対する有効性を評価した。図２２Ａ〜図２２Ｃ（中央のおよび右側のパネル）に示すように、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶにおけるＤｏｘおよびＰＴＸは、研究した細胞株において、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの場合と比較して有意に大きいＩＩＰＣｍａｘ値を示し、このことは、組み合わせたｃＭＬＶが、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶよりもがんの処置において効果があったことを示す。
【０１３２】
ドキソルビシンおよびパクリタキセルの細胞取り込み研究。ｃＭＬＶ組み合わせ治療により観測した細胞毒性の増強の機序を調べるために、発明者らは、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの細胞における薬剤の流入／流出の速度への効果を評価した。ＨＰＬＣにより、単独または組み合わせの両方でのｃＭＬＶ中におけるＤｏｘ（１μｇ／ｍｌ）およびＰＴＸ（１μｇ／ｍｌ）への曝露の後の４Ｔ１細胞における、ならびにＤｏｘおよびＰＴＸのより高い用量（５μｇ／ｍｌ）でのＪＣ細胞における、ＤｏｘおよびＰＴＸの細胞内蓄積を調べた。３ｈのインキュベーション後に細胞外培地を廃棄し、細胞溶解物中の薬剤濃度により細胞内薬剤（ＤｏｘまたはＰＴＸ）蓄積を定量的に測定し、細胞の全細胞タンパク質含有量により正規化した。図２３Ａおよび図２３Ｂに示すように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）は、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの場合と比較して４Ｔ１細胞におけるＤｏｘおよびＰＴＸの両方の蓄積を有意に増加させ（ｐ＜０．０５）、このことは、組み合わせ処置が薬剤耐性を克服することができることを示唆する。加えて、溶液での薬剤の投与と比較して、ｃＭＬＶ組み合わせ処置により、エンドサイトーシスを介した細胞によるｃＭＬＶの内在化に起因する可能性が最も高い結果である（Ｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）ＤｏｘおよびＰＴＸのより高い細胞蓄積が生じ、その結果としてＰ−ｇｐ排出ポンプが効果的に迂回される。薬剤耐性ＪＣ細胞では、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび溶液での薬剤組み合わせと比較して、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶでの薬剤の細胞内蓄積の増加も観測した（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）。これらのデータは、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）は、組み合わせ処置およびナノ粒子送達の両方に関連する機序による抗がん剤の細胞内蓄積を有意に増加させたことを示唆する。
【０１３３】
共送達されたナノ粒子のＰ−ｇｐ発現への効果。２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶが薬剤の細胞蓄積を増加させることが分かったため、次に、発明者らは、このことが実際には膜ポンプの調節に起因したことを確認しようとし、この膜ポンプの調節は多剤耐性の原因である。発明者らは、４８ｈにわたり様々なナノ粒子製剤で処置した４Ｔ１細胞においてフローサイトメトリーによりＰ−ｇｐの発現を最初に測定し、これらのｃＭＬＶ製剤が、細胞において、薬剤蓄積の低下と共に多剤耐性におけるＰ−ｇｐの関与を変える原因となったかどうかを試験した。図２４Ａに示すように、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶによる処置によって、（統合平均蛍光強度という観点から）Ｐ−ｇｐの発現は４Ｔ１細胞において有意に増加し（Ｐ＜０．０１）、次に４Ｔ１細胞における薬剤耐性の発生につながる可能性がある。しかしながら、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶは、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび溶液での薬剤組み合わせの場合と比較した場合にＰ−ｇｐの発現を有意に抑制し（Ｐ＜０．０１）、このことは、ｃＭＬＶによるＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせ送達によってＰ−ｇｐ発現を効率的に抑えることができ、それによりＭＤＲを克服することを示唆する。次に、発明者らは、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）がＪＣ細胞において多剤耐性を抑制することができるかどうかを調べており、このＪＣ細胞は、Ｐ−ｇｐの過剰発現による薬剤耐性表現型を示す。図２４Ｂに示すように、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶで処置した場合にＰ−ｇｐの発現はＪＣ細胞との４８ｈのインキュベーション後に減少しており（Ｐ＜０．０５）、このことは、ナノ粒子送達システムが少なくとも部分的にＭＤＲを抑えることができたことを示す。しかしながら、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の共送達製剤は、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶおよび溶液での薬剤組み合わせの場合と比較して、Ｐ−ｇｐ発現を有意に抑制した（Ｐ＜０．０１）。まとめると、これらの結果は、ｃＭＬＶによるＤｏｘおよびＰＴＸの共送達によりＰ−ｇｐの発現を抑制することができ、および薬剤の細胞蓄積を高めることができ、これにより薬剤耐性細胞等の細胞における薬剤作用が増強することを示した。
【０１３４】
２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶのマウス乳がんモデルに対する有効性。ｃＭＬＶによるＤｏｘおよびＰＴＸの共送達により、インビトロでの薬剤耐性を克服することができることが明らかとなっている。しかしながら、インビボ環境は相当に複雑であるであることから、この効果を動物がんモデルに変換することが可能であるかどうかは不明のままである。従って、本実験では、マウス乳房腫瘍モデルを使用して、単一の薬剤のリポソーム製剤の場合と比較して２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの治療効果を評価した。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに４Ｔ１乳房腫瘍細胞を皮下接種した。８日目に、腫瘍を保持するマウスを６つの群にランダムに分類し、各群を３日毎に下記の内の１つで処置した：ＰＢＳ（コントロール）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）、ｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）またはｃＭＬＶ（２ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋２ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ）。実験終了まで、腫瘍増殖および体重をモニタリングした（図２５Ａ）。
【０１３５】
図２５Ｂに示すように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｃＭＬＶ（ＰＴＸ）を投与した群のマウスは、コントロール群のマウスと比較して腫瘍抑制を示した（Ｐ＜０．０１）。さらにより重要なことに、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）処置は、単一の薬剤をカプセル化しているｃＭＬＶの場合よりも高い抑制を誘導した（ｐ＜０．０１）。実験の継続時間を通して体重減少は見られず（図２５Ｃ）、このことは、この共送達システムからのあらゆる明らかな全身毒性がないことを示す。２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶの４Ｔ１腫瘍モデルに対するインビボでの有効性を、いくつかの試験で更に確認した。図２５Ｄに示すように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）またはｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置した群はコントロール群と比較して寿命が延びているが、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）で処置した群のマウスは、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶで処置した群と比較して寿命が有意に延びた（ｐ＜０．０１）。
【０１３６】
組織学的研究。インビボでの抗腫瘍機序を研究するために、ＴＵＮＥＬアッセイを実行して、３日にわたり様々な剤形でのＤｏｘ（５ｍｇ／ｋｇ）および／またはＰＴＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した腫瘍における腫瘍細胞のアポトーシスを検出した。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）で処置した４Ｔ１腫瘍、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置した４Ｔ１腫瘍および溶液でのＤｏｘ＋ＰＴＸで処置した４Ｔ１腫瘍細胞は、コントロールと比較して有意に多いアポトーシス細胞を示した（Ｐ＜０．０１）（図２６Ａ）。アポトーシス指数も、その他の群と比較してｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）処置群で有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。そのため、抗腫瘍処置としてのｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の有効性を、腫瘍細胞アポトーシスの増加を示唆するデータにより説明することができた。処置群における細胞アポトーシスの誘導を更に確認するために、３日にわたり様々な剤形で処置した薬剤耐性ＪＣ腫瘍でＴＵＮＥＬアッセイを実施した（図２６Ｂ）。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）およびＤｏｘ＋ＰＴＸは、コントロールのＪＣ腫瘍と比較して多くのアポトーシス細胞を誘導した（ｐ＜０．０１）。２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶで処置したＪＣ腫瘍は、その他の群と比較して非常に高いアポトーシス指数を示し（ｐ＜０．０１）、このことは、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の抗腫瘍活性の増強を再び裏付ける。
【０１３７】
処置した腫瘍の生来の特性を更に調べるために、各処置群からの４Ｔ１腫瘍切片およびＪＣ腫瘍切片を、Ｐ−ｇｐタンパク質の発現に関して分析した。図２７Ａに示すように、Ｐ−ｇｐの発現レベルはコントロール群で中程度であった。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）群およびｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群においてＰ−ｇｐ発現が有意に増加しており、コントロールと比較してＤｏｘ＋ＰＴＸ群において更により有意に増加しているように見えた。しかしながら、図２７Ａに示す定量化データにより更に裏付けられるように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）群、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群およびＤｏｘ＋ＰＴＸ群と比較した場合にｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）処置群において顕著な減少を観測した（Ｐ＜０．０１）。興味深いことに、Ｐ−ｇｐはＪＣ腫瘍コントロール群において非常に高かった。しかしながら、図２７Ｃにおける定量化データにより更に裏付けられるように、ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ）群、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群およびＤｏｘ＋ＰＴＸ群において有意な減少が見られた（Ｐ＜０．０５）。ｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）群ではＰ−ｇｐ発現の更により有意な減少が見られ（Ｐ＜０．０１）、このことは、２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶはＪＣ細胞等の多剤耐性腫瘍細胞の生来の特性を変えることができたことを示す。まとめると、これらのデータは、薬剤が装荷されたナノ粒子はＰ−ｇｐ排出ポンプを部分的に迂回してＤｏｘおよびＰＴＸの細胞取り込みを増加させることができ、がん細胞における細胞毒性を十分に誘導することを示す。
【０１３８】
Ｄｏｘ処置の結果として重度の不可逆的な心臓毒性が生じ、これにより筋細胞アポトーシスが引き起こされることが報告されている。加えて、組み合わせたＤｏｘおよびＰＴＸの処置の予期しない臨床転帰である心毒性が報告されている。従って、遊離Ｄｏｘ＋ＰＴＸおよびｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）の全身毒性を評価して、共送達されたｃＭＬＶが組み合わせ薬剤処置のこの副作用を低減することができるかどうかを確認した。このことを実現するために、溶液でのＤｏｘ＋ＰＴＸまたはｃＭＬＶ（Ｄｏｘ＋ＰＴＸ）のどちらかの単回静脈内用量を、４Ｔ１腫瘍を保持するマウスに投与した。次に、各処置群からの、ヘマトキシリン染色したおよびエオシン染色した心臓組織切片を調べた（図２８）。溶液での遊離Ｄｏｘ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＰＴＸ（５ｍｇ／ｋｇ）による処置により、筋原繊維減少、錯綜配列および細胞質空胞化で示される心毒性が生じた。しかしながら、ｃＭＬＶ（５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＰＴｘ）をｃＭＬＶにより同じ実験条件で投与した場合には、心筋組織の目に見える減少を観測しなかった。
【０１３９】
考察
化学療法剤は様々ながんとの戦いに極めて重要であるが、臨床的転帰がよくないことが常である。なぜならば、がん細胞は、化学療法剤への数回のラウンドの曝露後に多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を持つようになるからである。腫瘍部位に送達された全身薬の効率を高めるためにおよびアポトーシス閾値を下げるために組み合わされた治療の使用により腫瘍ＭＤＲを克服する治療戦略を開発することに多くの努力が払われている。本研究では、発明者らは、乳がん細胞および薬剤耐性ＪＣ細胞での、架橋多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）を使用したＤｏｘおよびＰＴＸの共投与時の治療効果の増大を調べた。発明者らは、ＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせ治療、特にｃＭＬＶ製剤で共送達された場合のＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせ治療が、細胞蓄積および薬剤の滞留の上昇により野生型細胞および薬剤耐性細胞の両方において細胞毒性の増加に有効であることを明らかにした。発明者らはまた、２重治療戦略はアポトーシス応答を増強することにより腫瘍増殖を効率的に抑えることも示した。
【０１４０】
膜に結合した活性な薬剤の排出ポンプであるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇＰ）は、ＭＤＲに関与する最も重要な機序の内の一つと考えられる。結果的に、ＭＤＲを克服するためのナノ粒子薬剤送達システムの開発への関心の高まりが見られる。ナノ粒子薬剤送達システムの独特の特性により、ナノ粒子は、透過性および滞留性の増強（ＥＰＲ）効果により腫瘤を受動的に標的とすることができ、標的部位での化学療法の蓄積を高める。加えて、ナノ粒子はエンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入することができ（このエンドサイトーシス経路はＰ−ｇｐ経路から独立していると考えられる）、そのため耐性のあるがん細胞における治療の細胞取り込みおよび滞留が増加する。これまでに、発明者らは、がん治療における従来のリポソーム製剤を上回るｃＭＬＶの利点は、このｃＭＬＶの持続的な薬剤放出、小胞安定性の増強および薬剤放出の改善、この結果として生じる全身毒性の低減を伴う治療活性の改善に基づくことを明らかにした。さらに、ｃＭＬＶはクラスリン媒介性エンドサイトーシスを介して腫瘍細胞により内在化され、このことは、ｃＭＬＶは、ＭＤＲを克服するのに有効な薬剤担体である可能性があることを示唆する。本研究において、発明者らのインビトロでのおよびインビボでの結果は、ｃＭＬＶによるＤｏｘおよびＰＴＸの共投与により、野生型がん細胞および薬剤耐性がん細胞の両方においてＰ−ｇｏ発現が効果的に抑えられることを明らかにした。
【０１４１】
ナノ送達に加えて、ＭＤＲを克服するための別の可能な戦略が複数の薬剤の組み合わせから生じている。例えば、カクテルでのＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせは標準的なアントラサイクリン−タキサン処置レジメンであり、別の方法では細胞毒性を実現するために必要である個々の薬剤濃度を低減し、このようにして薬剤耐性を克服することにより、様々な腫瘍の処置で有効であることが分かった。しかしながら、この臨床転帰は、組み合わせた薬剤のばらばらな生体内分布および心臓の細胞毒性の増加により制限された。本研究では、ＤｏｘおよびＰＴＸの薬物動態は両方の薬剤の単一のｃＭＬＶ粒子へのカプセル化により統一されており、その結果、Ｐ−ｇｐ発現の低減に成功している２種の薬剤が装荷されたｃＭＬＶが生じ、単一の薬剤が装荷されたｃＭＬＶと比較して、薬剤耐性細胞等のがん細胞における薬剤の細胞蓄積が増強される、および細胞毒性が増強される。さらに、ｃＭＬＶ製剤で投与されたＤｏｘおよびＰＴＸの組み合わせ治療は、インビボでアポトーシス応答を促進することにより、腫瘍増殖の抑制でｃＭＬＶ単剤治療を超える有効性の増加を示した。
【０１４２】
５．ｓｉＲＮＡをカプセル化している多重膜リポソーム
ＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子がｓｉＲＮＡカプセル化および送達基準を満たすことができることを最初に可視化するために、ＤｉＤで標識したｓｉＲＮＡをＣＭＬナノ粒子中にカプセル化し、ヒトがん細胞と共にインキュベートした。１時間以内に、カプセル化されたｓｉＲＮＡは腫瘍細胞の細胞質に送達されている。ＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子により複数種の機能性ｓｉＲＮＡを前立腺がんに特異的に送達することができることを明らかにするために、ＡＲを標的とする４種の異なるｓｉＲＮＡを設計した。これらｓｉＲＮＡをプールとして個々におよび一緒にの両方でＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子中にカプセル化し、次いで標準的な組織培養条件でヒトＬＮＣａＰ前立腺がん細胞と共にインキュベートした。ＮＣＩの場合では、ｓｉＲＮＡを２００マイクロリットルの全体積中に５マイクロモルでカプセル化した。その他の全ての場合では、ｓｉＲＮＡ（即ち１〜４およびプール）を２００マイクロリットルの全体積中に合計で１０マイクロモルにてカプセル化した。処置した細胞を４８時間後に回収し、リアルタイム定量ＰＣＲによりＡＲ発現を評価した（図２９）。陰性コントロールとして、未処置のＬＮＣａＰ細胞と、一般的な陰性コントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ１、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州、コーラルビル）をカプセル化しているＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞との両方を使用した。抗ＡＲ  ｓｉＲＮＡプールをカプセル化しているナノ粒子がしたように、個々の抗ＡＲ  ＲＲＬ−ＣＭＬ［ｓｉＲＮＡ］ナノ粒子の１種の除く全ては、統計的に有意なアンドロゲン受容体ノックダウンを強力に媒介した。未処置のＬＮＣａＰ細胞と比較して、ＲＲＬ−ＣＭＬ［ＮＣ１］陰性コントロールナノ粒子により有意なノックダウンが媒介されなかった。最適化により、発明者らは、この最初の試験で明らかになったＲＲＬ−ＣＭＬ［ｓｉＲＮＡ］ナノ粒子により効率的に媒介されたノックダウンを劇的に改善することができることを予想した。このデータは、ＲＲＬ−ＣＭＬナノ粒子が複数の治療用ｓｉＲＮＡをヒト前立腺がん細胞に実際にうまく送達することができることを明白に明らかにする。
【０１４３】
例示的な実施形態が上記に記載されているが、これらの実施形態が本発明の全ての可能な形態を説明することは意図されていない。より正確に言うと、本明細書で使用した単語は、限定よりはむしろ説明のための用語であり、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解される。さらに、様々な実施の実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１５Ａ−Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｃ】
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【図１６Ｄ−Ｅ】
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【図１６Ｆ−Ｈ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ−Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ−Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ−Ｅ】
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【図２３Ａ−Ｄ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２５Ａ−Ｄ】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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