(57)【要約】  本発明は、神経毒活性を決定するための手段及び方法に関する。具体的には、神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられた(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、並びに本発明のポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドに関する。同様に検討されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は融合ポリペプチドを含む宿主細胞である。さらに想定されるのは、試料中の神経毒活性を決定するための方法である。付加的に本発明は、試料中の神経毒活性を決定するための本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞の使用に関係する。最終的に本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞を含む神経毒活性を決定するためのキットに関する。【選択図】  図２
2016502405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられた(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記細胞質保持ドメインが膜貫通タンパク質又は膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記膜貫通タンパク質が、原形質膜神経伝達トランスポーター、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体及び膜受容体からなる群から選択される、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記細胞質保持ドメインが膜アンカータンパク質又は膜アンカータンパク質の膜アンカードメインである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記膜アンカータンパク質が、SNAP-25、シンタキシン、シナプトブレビン、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質(VAMP)、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)、高親和性コリントランスポーター、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネルアセチルコリンエステラーゼ及びNOTCHからなる群から選択される、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記細胞質保持ドメインが、球状タンパク質及び細胞骨格アンカータンパク質からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記転写因子ドメインがDNA結合ドメイン及びトランス活性化因子又はサイレンサードメインを含む転写因子を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記転写因子が、テトラサイクリン依存性トランス活性化因子(tet-リプレッサー-VP16)、ステロイドホルモン受容体、NOTCH、NFκB、p53、NFAT、MLL、E2A、HSF1、NF-IL6、STAT、R-SMAD、GAL4及びSP1からなる群から選択される、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項9に記載のベクター又は請求項10に記載の融合ポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項１２】
初代神経細胞、神経芽細胞種細胞株、細胞株N1E-115、細胞株Neuro2a、細胞株SH-SY5Y、細胞株PC12、細胞株SiMa、細胞株MHH-NB-11、細胞株SK-N-BE(2)及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
融合ポリペプチドの切断に基づいて転写因子ドメインによって発現が調節されるレポーター遺伝子を含む、請求項11又は12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
(a)請求項10に記載の融合ポリペプチドと、前記融合ポリペプチドの切断に基づいて転写因子ドメインによって発現が調節されるレポーター遺伝子とを含む宿主細胞を、神経毒活性を含むと推測される試料と接触させるステップ、並びに
(b)レポーター遺伝子活性を測定し、それにより試料中の神経毒活性を決定するステップ、
を含む、試料中の神経毒活性を決定する方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が請求項11から13のいずれか一項に記載の宿主細胞である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の神経毒活性を決定するための請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項9に記載のベクター、請求項10に記載の融合ポリペプチド又は請求項11若しくは13に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１７】
請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項9に記載のベクター、請求項10に記載の融合ポリペプチド又は請求項11若しくは13に記載の宿主細胞及び好ましくはレポーター遺伝子活性を検出するための検出剤を含む神経毒活性を決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒活性を決定するための手段及び方法に関する。具体的には、神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられた(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、並びに本発明のポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドに関する。同様に検討されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は融合ポリペプチドを含む宿主細胞である。さらに想定されるのは、試料中の神経毒活性を決定するための方法である。付加的に本発明は、試料中の神経毒活性を決定するための本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞の使用に関係する。最終的に本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞を含む神経毒活性を決定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及び破傷風菌(Clostridium tetani)は、強力な神経毒、すなわちボツリヌス毒素(BoNT)及び破傷風毒素(TeNT)をそれぞれ産生する。これらのクロストリジウム神経毒は、神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質放出を妨害する。各毒素は、不活性な非プロセス型のおよそ150kDa 1本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成及び細菌性プロテアーゼ(複数可)によるタンパク質限定加水分解(ニッキング)に関与する。活性二鎖(dichain)神経毒は、ジスルフィド結合によって連結された二本鎖、およそ50kDaのN末端軽鎖及びおよそ100kDaの重鎖からなる。神経毒は、構造的にはドメイン3個、すなわち触媒軽鎖、移行ドメイン(N末端半分)及び受容体結合ドメイン(C末端半分)を包含する重鎖からなる。Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39、Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41、Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49を参照されたい。
【０００３】
ボツリヌス菌は、BoNTのAからGと指定される7種の抗原性が異なる血清型を分泌する。すべての血清型は、破傷風菌によって分泌される関連TeNTと共に、SNAREタンパク質、具体的にはSNAP-25を切断することによってシナプス開口放出を遮断する亜鉛(Zn2+)依存性エンドプロテアーゼである。BoNTは、とりわけ、ボツリヌス症及び破傷風において見られる弛緩性筋麻痺を生じる、Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照されたい。
【０００４】
その毒性効果にもかかわらず、BoNTは多数の疾患において治療剤として使用されている。BoNT血清型A(BoNT/A)は、斜視、眼瞼痙攣及び他の障害の処置のために1989年に合衆国においてヒトでの使用について認可された。それは、例えば商標BOTOX(Allergan Inc)、商標DYSPORT(Ipsen Ltd)でタンパク質調製物として商業的に入手できる。治療適用のために複合体は、処置される筋肉に直接注射される。生理的pHで毒素は、タンパク質複合体から放出され、所望の薬理学的効果が生じる。複合体化タンパク質を含まない改善されたBoNT/A調製物は、商標XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)で入手できる。
【０００５】
BoNTは、原理的には随意筋強度を弱くし、したがって、斜視、頸部ジストニアを含む限局性ジストニア及び良性本態性眼瞼痙攣などの疾患の治療のための有効な治療剤である。それらは、片側顔面痙攣及び限局性痙攣(focal spasticity)を軽減し、さらに胃腸疾患、多汗症及び美容用しわ取り(cosmetic wrinkle correction)などの幅広い他の適応において有効であることが示されている、Jost 2007, Drugs 67, 669を参照されたい。
【０００６】
生物学的活性の決定は、安全対策として、品質管理のため及び定量目的のために重要である。WO 95/33850は、非競合的アッセイに基づいて神経毒の生物学的活性を定量するための方法を記載している。これらの方法では、神経毒についての切断部位を含む基質が固相にカップルされている。神経毒の添加は、基質の切断を生じる。切断産生物は、次に例えば酵素にコンジュゲートされた特異的抗体によって検出される。そのような非競合的アッセイの1つの欠点は、得られた検査結果が不均一でありそれにより信頼できない場合があることである。
【０００７】
ボツリヌス神経毒の生物学的活性を決定するために開発されているさらなるアッセイは、例えば中毒症後の動物の生存時間の決定、例えば「死までの時間」(Lamanna C, Spero L, Schantz EJ: Dependence of time to death on molecular size of botulinum toxin. Infect. Immun. 1970, 1:423〜4、Kondo H, Shimizu T, Kubonoya M, Izumi N, Takahashi M, Sakaguchi G: Titration of botulinum toxins for lethal toxicity by intravenous injection into mice. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1984, 37:131〜5、Boroff DA, Fleck U: Statistical analysis of a rapid in vivo method for the titration of the toxin of Clostridium botulinum. J. Bacteriol. 1966, 92:1580〜1)、生存している生物の臓器機能の阻害、汗腺の麻痺など(Ellies M: Experimental and clinical investigations on the inhibition of secretion of the major salivary glands with botulinum toxin A. Laryngorhinootologie 2003, 82:713〜4、Monnier G, Tatu L, Parratte B, Cosson A, Michel F, Metton G: Sialorrhea, hyperhidrosis and botulinum toxin. Ann. Readapt. Med. Phys. 2003, 46:338〜45)、HDAなどの単離された器官の麻痺の決定(Goschel H, Wohlfarth K, Frevert J, Dengler R, Bigalke H: Botulinum A toxin therapy: neutralizing and nonneutralizing antibodies - therapeutic consequences. Exp. Neurol. 1997, 147:96〜102、HUGHES R, WHALER BC. Influence of nerve-ending activity and of drugs on the rate of paralysis of rat diaphragm preparations by Cl. botulinum type A toxin. J. Physiol. 1962, 160:221〜33)、細胞に基づくアッセイ、初代ニューロンを使用するSNAP-25切断ウエスタンブロットアッセイなど(Pellett S, Tepp WH, Toth SI, Johnson EA: Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A potency determination. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2010, 61:304〜10)及びin vitro検査に関係するが、それらは結合アッセイ又はSNAP-25切断アッセイなどの神経毒の、生物学的活性の一態様だけを決定する(Evans ER, Skipper PJ, Shone CC: An assay for botulinum toxin types A, B and F that requires both functional binding and catalytic activities within the neurotoxin. J. Appl. Microbiol. 2009, 107:1384-91、Habermann E: 125I-labeled neurotoxin from Clostridium botulinum A: preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1974, 281:47〜56、Ekong TA, Feavers IM, Sesardic D: Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology 1997, 143:3337〜47)。
【０００８】
したがってマウスLD50アッセイは、神経毒の生物学的活性を定量するため並びにそれらの治療可能性及び/又はそれらの毒性を評価するためのこれまでのところただ1つの信頼できるアッセイである。前記アッセイは、神経毒の製造の際の品質管理目的のためにも認められている。マウスLD50バイオアッセイでは、神経毒ポリペプチドを含有する試料の致死性及び亜致死性濃度が少なくとも動物120匹に注射されなければならない。72時間の観察期間に殺される動物の数が試料中の神経毒ポリペプチド濃度の決定を可能にする。このアッセイの明らかな欠点は、検査の際に犠牲になる動物の数の多さ及び前記動物へのストレス及び苦痛のレベルの高さである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでに提案されているin vitroアッセイは、無細胞系におけるSNAP-25切断の決定又は初代ニューロンへの神経毒曝露に基づいている。しかしこれらのアッセイは、あまり信頼できない及び/又は所望の神経毒機能のすべてを考慮していない。したがって現在は欧州薬局方(European pharmacopeia)のBoNT/Aについての研究書に記載されている上に記載のLD50バイオアッセイがただ1つの信頼できるアッセイである。しかし、当技術分野において記載のアッセイの欠点を回避して神経毒活性を測定するための信頼できるアッセイが必要である。
【００１０】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前述の必要性に応じるための手段及び方法の提供において見ることができる。技術的課題は、特許請求の範囲において特徴付けられ、本明細書下に記載される実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられた(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】A)活性化因子構築物の構築のための基礎として使用された、Clontechによって提供された元の制御プラスミド、B)ルシフェラーゼコードレポーター構築物、C)ルシフェラーゼレポーター構築物(すべてClontech)に関する系対照プラスミドを示す図である。
【図２】骨格としてpCMV-Tet3Gベクター(図1A)を有する活性化因子プラスミドmST01(配列番号9)の構築物の一例を示す図である。シナプトタグミン(アミノ酸87個)のN末端膜アンカードメイン及びSNAP25のC末端アミノ酸112個を含む特許請求されるポリヌクレオチドは、記入したEcoRI及びXbaI制限部位を介してクローニングされる。ベクターの鍵となる特質は、矢印として強調され、それらの位置を(bpで)示す右表に記載される。
【図３】活性化因子及びレポーター構築物の安定な組み込みについての対照としてのゲノムPCRの結果を示す図である。ルシフェラーゼに対して設計されたプライマーは約1kbの産生物、Tetエレメントに対するものは約0.5kbをもたらす。強調されたレーンは、両方のプラスミドを安定に組み込まれたクローンを表す。合計で、生成されたクローン24個の内10個がゲノムPCRの結果に基づいてルシフェラーゼ及びTetエレメントに対して陽性であった。
【図４】シナプトタグミン-SNAP25融合タンパク質の膜アンカー構築物を示して描かれた例の作用のモードの絵である。略号及び記号:SYT:シナプトタグミン、tetR:テトラサイクリンリプレッサー、VP16:単純ヘルペスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン、CMV:サイトメガロウイルスプロモーター、黒四角:ドキシサイクリン。融合タンパク質は、構成的に発現され、好ましくは神経分化細胞の終分枝の膜に連結される。それぞれのリンカードメイン内のBoNTの切断に基づいて、TetRエレメント及びVP16からなる複合体は、核に輸送される。抗生物質ドキシサイクリンの存在下でコンホメーション変化が誘導され、TetRエレメント/VP16のTetプロモーターへの結合及びそれによるレポーター遺伝子ルシフェラーゼの制御を可能にする。誘導されたルシフェラーゼ発現において、商業的に入手できるアッセイキットを使用するその酵素活性の検出及び定量は、機能的読み出し(functional readout)である。それは、すべての膜アンカー構築物にも適用可能である。サイトゾル活性化因子構築物について、局在化は細胞内の好ましいドメインに限定されない。TetRエレメントの核への輸送及び続くレポーターの発現/検出カスケードの活性化の基本的機構は一致している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」は、1本鎖又は2本鎖DNA分子及びRNA分子を指す。前記用語によって包含されるのは、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNA及び、そのような分子種の天然に存在する又は人工的に修飾されるすべての誘導体である。ポリヌクレオチドは、一態様では直鎖状又は環状分子である場合がある。さらに、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて本発明のポリヌクレオチドは、5'-若しくは3'-UTR配列などの適切な転写及び/又は翻訳のために必要な追加的配列を含む場合がある。遺伝暗号の縮重を考慮して、最適化されたコドンが本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列において使用されてよい。それにより例えば本発明の宿主細胞における、最適な発現は達成できる。別の態様では前記ポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27又は29に示す核酸配列を含む。さらに、包含されるのは一態様では、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30又は31に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【００１４】
別の態様では前記ポリヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチド置換、欠失及び/又は付加を含む前述のポリヌクレオチドの変種であり、さらに別の態様では1つ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を有する融合ポリペプチドを生じる場合がある。さらに、本発明の変種ポリヌクレオチドは、別の態様では配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27若しくは29のいずれか1つに示す核酸配列に少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一である核酸配列変種、又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30若しくは31のいずれか1つに示すアミノ酸配列に少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変種を含む。本明細書において使用される用語「同一」は、2つの核酸配列又はアミノ酸配列間で同一のアミノ酸の数を決定することによって特徴付けられる配列同一性を指し、配列は最も高いマッチが得られるように配列比較される。それは、コンピュータープログラム化された、例えばBLASTP、BLASTN又はFASTAなどの公表された技術又は方法を使用して算出できる(Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215, 403)。配列同一性百分率値は、一態様ではヌクレオチド又はアミノ酸配列全体にわたって算出される。種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムは、異なる配列を比較するために当業者が容易に入手できる。この内容においてNeedleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムは、特に信頼できる結果をもたらす。配列の配列比較を実行するために、プログラムPileUp(Higgins 1989, CABIOS 5, 151)又はプログラムGap及びBestFit(Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48、443、Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482)、これはGCGソフトウェアパケットの一部である(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)、を使用できる。本発明の別の態様において、先に百分率(%)で記述した配列同一性値は、他に明記しなければ配列の配列比較のための標準的設定として常に使用される次の設定:ギャップウエイト:50、長さウエイト:3、平均マッチ:10.000及び平均ミスマッチ:0.000でプログラムGAPを配列領域全体にわたって使用して決定されよう。一態様では、前述の各変種ポリヌクレオチドは、本発明のそれぞれの融合ポリペプチドの1つ以上の、別の態様ではすべての生物学的特質を保持している融合ポリペプチドをコードする。好ましくは、変種ポリヌクレオチドは、神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられた(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする。
【００１５】
本明細書において使用される用語「転写因子」は、真核生物において転写を開始する又は制御するために必要なタンパク質を意味する。転写因子は、特異的DNA配列に結合するタンパク質であり、それによりDNAからmRNAへの遺伝情報の流れ、すなわち転写を調節する。転写因子が結合するDNA配列は、転写因子結合部位又は応答配列と称される。本明細書において使用される「エンハンサー」は遺伝子の転写を増大させることができるDNAの短い領域であり、一方「サイレンサー」はリプレッサーと称される転写制御因子に結合できるDNA配列である。転写因子は、RNAポリメラーゼの特異的遺伝子への動員を活性化因子として促進する又はリプレッサーとして遮断することによって、この機能を単独で又は複合体中の他のタンパク質と共に実施する。本明細書において使用される用語「ドメイン」は、タンパク質鎖の他所から独立して発達、機能及び存在できるタンパク質配列及び構造の一部であるタンパク質ドメインを意味する。各ドメインは、小型の三次元構造を形成し、しばしば独立に安定である及びフォールドしている場合がある。転写因子を含む多数のタンパク質は、いくつかの構造ドメインからなる。本明細書において使用される用語「転写因子ドメイン」は、転写因子のタンパク質ドメインの転写因子を含む。転写因子は、構造においてモジュラーであり、これだけに限らないが、DNA結合ドメイン、トランス活性化因子ドメイン又はサイレンサードメイン及び任意選択のシグナル検知ドメイン、例えばリガンド結合ドメインを含むいくつかのドメインを含有する。DNAに結合する転写因子の部分は、DNA結合ドメインと称される。DNA結合ドメインはエンハンサー又はプロモーターなどのDNAの特異的配列に付着する。転写因子は、静電力とファンデルワールス力との組合せを使用してそれらの結合部位と相互作用する。これらの化学的相互作用の性質により、大部分の転写因子は配列特異的やり方でDNAに結合する。しかし、転写因子結合部位のすべての塩基が実際に転写因子と相互作用するのではない。付加的に、これらの相互作用のいくつかは他よりも弱い場合がある。したがって転写因子は1つの配列だけに結合するのではなく、密接に関連する配列のサブセットにそれぞれ異なる相互作用の強さで結合できる。トランス活性化ドメイン、すなわちトランス活性化因子又はサイレンサードメインは、転写共制御因子(transcription co-regulator)などの他のタンパク質に対する結合部位を含有する。トランス活性化因子又はサイレンサードメインは、それらのアミノ酸組成から名付けられる。これらのアミノ酸は、活性に不可欠である、又はトランス活性化因子若しくはサイレンサードメインにおいて単に最も豊富である、のいずれかである。転写因子は、遺伝子転写の速度を調節すること、例えばRNAポリメラーゼのDNAへの結合を活性化又は阻害することによって転写を制御する。トランス活性化ドメインは、遺伝子転写の速度を増大させる又は遺伝子転写の速度を減少させる場合がある。前者の場合、トランス活性化ドメインはトランス活性化因子ドメインと称され、後者の場合、トランス活性化ドメインはサイレンサードメインと称される。シグナル検知ドメインは、外部シグナルを検知し、応答としてこれらのシグナルを残りの転写複合体に伝達し、遺伝子発現の上方又は下方制御をもたらす。本明細書において使用される転写因子は、例えばテトラサイクリン依存性トランス活性化因子(tet-リプレッサー-VP16)、ステロイドホルモン受容体、NOTCH、NFκB、p53、NFAT、MLL、E2A、HSF1、NF-IL6、STAT、R-SMAD、GAL4又はSP1であってよい。本明細書において使用される転写因子がいくつかの態様では核局在化配列を含む場合があることが想定される。核局在化配列又はシグナルは、シグナル配列又はシグナルパッチのいずれかであってよい。核局在化シグナルはタンパク質を細胞の核に方向付ける。
【００１６】
本明細書において使用される用語「細胞質保持ドメイン」は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドの、神経毒による融合タンパク質の切断に先立つ細胞質局所化を調節するタンパク質ドメインを意味する。本明細書において使用される細胞質保持ドメインは、例えば、膜貫通タンパク質又は膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインであってよい。例えば膜貫通タンパク質は、原形質膜神経伝達トランスポーター、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体又は膜受容体であってよい。細胞質保持ドメインは、膜アンカータンパク質又は膜アンカータンパク質の膜アンカードメインあってもよい。そのような膜アンカータンパク質は、例えば、SNAP-25、シンタキシン、シナプトプレビン、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質(vesicle associated membrane protein)(VAMP)、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)、高親和性コリントランスポーター、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ又はNOTCHであってよい。本明細書において使用される細胞質保持ドメインは、核のポアを通るためには大きすぎる球状タンパク質又は細胞骨格アンカータンパク質であってもよい。本発明の融合ポリペプチドの発現後、転写因子ドメインは、例えば細胞膜又は小胞膜に細胞質保持ドメインを介して固定され、それにより核に移動できない。このように転写因子による核でのレポーターの発現は回避される。ボツリヌス神経毒の神経毒軽鎖による本発明の融合タンパク質のリンカー内での切断だけが転写因子を放出させ、それは次に細胞核に移動し、それによりレポーター遺伝子の発現を開始させる。
【００１７】
本明細書において使用される用語「リンカー」は、神経毒切断部位を含むアミノ酸配列の短いセグメントであるポリリンカーを意味する。対応するDNA配列によってコードされる好適なリンカー配列は、例えばSchiavo G, Matteoli M, Montecucco C: Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000, 80:717〜66に記載されている。
【００１８】
本明細書において使用される用語「神経毒切断部位」は、神経毒ポリペプチドの内在性プロテアーゼによって認識及び切断される切断部位を指す。神経毒プロテアーゼによって認識される切断部位は、当技術分野において十分周知であり、例えばEP 1 926 744 B1を参照されたい。原理的に神経毒切断部位は、神経毒ポリペプチドプロテアーゼによって認識及び切断される、基質中に天然に存在する切断部位又は人工的に設計される切断部位であってよい。神経毒切断部位の特質が、本発明の融合ポリペプチドを活性化できる神経毒の種類を決定することは理解される。本明細書において参照する神経毒ポリペプチドは、一態様ではBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/G、BoNT/F又はTeNTを包含し、そのすべては当技術分野において十分周知である。例えば、BoNT/Aによって特異的に認識及び切断される神経毒切断部位が使用される場合、BoNT/Aプロテアーゼだけが本発明の融合ポリペプチドを活性化できる、一方でBoNT/Eによって特異的に認識及び切断される神経毒切断部位が使用される場合、BoNT/Eプロテアーゼだけが本発明の融合ポリペプチドを活性化できる。本発明の融合ポリペプチドの一態様では、神経毒切断部位は成熟BoNTによって切断される。さらに別の態様ではそれは、BoNTのムテインによって、一態様ではBoNTプロテアーゼ活性を示すBoNT軽鎖を含む又はからなるムテインによって切断される。
【００１９】
BoNT/Aプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Aによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、ヒトSNAP25A若しくはSNAP25B又はラット、マウス、ウシ、ダニオ(Danio)、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、オオバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイ若しくはアメフラシ由来のそのホモログ、パラログ若しくはオルソログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２０】
BoNT/Bプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Bによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD若しくはsyn、ヒルド(Hirudo)VAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP若しくは線虫SNB1様又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２１】
BoNT/C1プロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様ではBoNT/C1による切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、ヒト及びマウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン2-1、シンタキシン2-2、シンタキシン2-3、シンタキシン3A若しくはシンタキシン1B2、ウシ若しくはラットシンタキシン1A、シンタキシン1B1若しくはシンタキシン1B2、ラットシンタキシン2若しくはラットシンタキシン3、マウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン1B2、シンタキシン2、シンタキシン3A、シンタキシン3B若しくはシンタキシン3C、ニワトリシンタキシン1A若しくはシンタキシン2、アフリカツメガエルシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ダニオシンタキシン1A、シンタキシン1B若しくはシンタキシン3、シビレエイシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、オオバフンウニシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ショウジョウバエシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ヒルドシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ヤリイカシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、モノアラガイシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２２】
BoNT/Dプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Dによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD若しくはsyn、ヒルドVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP若しくは線虫SNB1様又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２３】
BoNT/Eプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Eによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、そのようなタンパク質はヒトSNAP-25A若しくはB又はラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、オオバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイ若しくはアメフラシ由来のそのホモログ、パラログ若しくはオルソログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２４】
BoNT/Fプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Fによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、そのようなタンパク質はヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD若しくはsyn、ヒルドVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP若しくは線虫SNB1様又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２５】
BoNT/Gプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、BoNT/Gによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、そのようなタンパク質はヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD若しくはsyn、ヒルドVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP若しくは線虫SNB1様又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２６】
TeNTプロテアーゼによって認識及び切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様では、TeNTによる切断に感受性であるタンパク質由来である。一態様ではそのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、オオバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD若しくはsyn、ヒルドVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP若しくは線虫SNB1様又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質由来の好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド又は融合ポリペプチドの内容において用語「リンカーによって隔てられた」は、下により詳細に記載するとおり、神経毒切断部位を含むリンカーが転写因子ドメインと細胞質保持ドメインとの間に位置付けられていることを意味する。
【００２８】
神経毒を含む内容において本明細書で使用される用語「生物学的に活性」は、本明細書で明記する生物学的特質を本質的に表す、すなわち(a)受容体結合、(b)内部移行、(c)エンドソーム膜を超えるサイトゾルへの移行、及び/又は(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解切断が可能である、成熟神経毒ポリペプチドを指す。好ましくは、生物学的活性は神経毒のタンパク質分解活性である。
【００２９】
上に記載の用語の定義及び説明が、他に示す場合を除いて次の明細書に記載されるすべての態様に対して、変更すべき箇所は変更して適用されることは理解される。
【００３０】
本発明の手段及び方法は、細胞中、好ましくは本明細書他所にさらに定義の神経細胞中のボツリヌス神経毒による融合ポリペプチドからの転写因子ドメインのタンパク質分解性放出に基づく。転写因子ドメインは、本発明のポリヌクレオチド又は融合ポリペプチドの一態様では、神経毒切断部位を含むリンカーを介して細胞質保持ドメインに融合される場合がある。前記融合ポリペプチドの発現後、転写因子ドメインは最初に細胞質に固定される。これは、膜貫通タンパク質若しくは膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、膜アンカータンパク質若しくは膜アンカータンパク質の膜アンカードメイン又は球状タンパク質又は細胞骨格アンカータンパク質などの本発明のポリヌクレオチド又は融合ポリペプチド中の好適な細胞質保持シグナルを使用することによって達成できる。細胞質保持シグナルは、転写因子ドメインが細胞核へ移動することを妨げる。ボツリヌス神経毒のタンパク質分解活性だけが神経毒切断部位を含むリンカー内での融合タンパク質の切断に基づいて、融合ポリペプチドから転写因子ドメインを放出させる。これが、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどのレポータータンパク質の発現を開始できる核への転写因子ドメインの移行を生じる。発現されたレポータータンパク質の存在及び/又は量は、当技術分野において十分記載のアッセイによって、例えば酵素検査によって分析できる(Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R: Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Comb. Chem. High Throughput Screen 2011, 14:648〜57、Fan F, Wood KV: Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 2007, 5:127〜36)。発現されたレポーターの量は、細胞質中の神経毒軽鎖のタンパク質分解活性に正比例し、それによりボツリヌス神経毒の生物学的活性にも比例する。規定の生物学的活性を有する基準ボツリヌス神経毒でのそのようなアッセイの結果の比較により、試料中の未知のボツリヌス神経毒の生物学的活性を決定できる。
【００３１】
有利には本発明のポリヌクレオチド及び融合ポリペプチドは、細胞培養系での所与の神経毒ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定することを可能にする。したがって本発明の結果、高価で倫理的に無益な動物試験は回避又は低減できる。さらに本発明のポリヌクレオチド及び融合ポリペプチドは、自動化ハイスループットスクリーニングアッセイに適用できる。本発明のポリヌクレオチド及び融合ポリペプチドは、例えば神経芽細胞種細胞株などの細胞株におけるアッセイの確立も可能にする。したがって、他の細胞に基づく神経毒アッセイにおいて必要である初代ニューロンの使用は回避できる。このことは、初代ニューロンの調製が煩雑で非効率的であることから本発明の方法及び手段の別の有利点である。付加的に本明細書に記載の手段及び方法を使用して、ボツリヌス神経毒の生物学的活性を決定するための細胞に基づくアッセイの感度及び流速は、顕著に増大できる。したがって本発明は、ボツリヌス神経毒の生物学的活性を検査するためのアッセイの改善を提供する。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドの一態様では、細胞質保持ドメインは膜貫通タンパク質又は膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインである。好適な細胞質保持ドメインを使用することによって本発明の融合タンパク質は、神経毒軽鎖が生物学的に活性である細胞のコンパートメント、すなわち細胞質に輸送又は保持される。言い換えると、前記融合ポリペプチドの発現後、転写因子ドメインは、神経毒切断による活性化より先に、細胞質に固定される。そのような細胞質保持ドメインは、この態様では本発明の融合ポリペプチド、膜貫通タンパク質又は膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドである。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドの別の態様では膜貫通タンパク質は、原形質膜神経伝達トランスポーター、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体及び膜受容体からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドのさらなる態様では細胞質保持ドメインは、膜アンカータンパク質又は膜アンカータンパク質の膜アンカードメインである。本発明のポリヌクレオチドの一態様では膜アンカータンパク質は、SNAP-25、シンタキシン、シナプトプレビン、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質(VAMP)、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)、高親和性コリントランスポーター、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ及びNOTCHからなる群から選択される。次にそれぞれのタンパク質の対応するアクセッション番号が示される:ヒトSNAP-25 P60880、ヒトシンタキシン-1A Q16623、シンタキシン-1B P61266、シンタキシン-2 P32856、シンタキシン-3 Q13277、シンタキシン-4 Q12846、シンタキシン-5 Q13190、シンタキシン-6 O43752、シンタキシン-7 O15400、シンタキシン-8 Q9UNK0、シンタキシン-10 O60499、シンタキシン-11 O75558、シンタキシン-12 Q86Y82、シンタキシン-16 O14662、シンタキシン-17 P56962、シンタキシン-18 Q9P2W9、シンタキシン-19 Q8N4C7、ヒトシナプトブレビン-1 P23763、シナプトブレビン-2 P63027、シナプトブレビン-3 Q15836、ヒトシナプトタグミン:シナプトタグミン-1 P21579、シナプトタグミン-2 Q8N9I0、シナプトタグミン-3 Q9BQG1、シナプトタグミン-4 Q9H2B2、シナプトタグミン-5 O00445、シナプトタグミン-6 Q5T7P8、シナプトタグミン-8 Q8NBV8、シナプトタグミン-9 Q86SS6、シナプトタグミン-10 Q6XYQ8、シナプトタグミン-11 Q9BT88、シナプトタグミン-12 Q8IV01、シナプトタグミン-13 Q7L8C5、シナプトタグミン-14 Q8NB59、シナプトタグミン-15 Q9BQS2、シナプトタグミン-16 Q17RD7、シナプトタグミン-17 Q9BSW7、ヒト小胞結合膜タンパク質(VAMP):小胞結合膜タンパク質1 P23763、小胞結合膜タンパク質2 P63027、小胞結合膜タンパク質3 Q15836、小胞結合膜タンパク質4 O75379、小胞結合膜タンパク質5 O95183、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)の小胞結合膜タンパク質7 P51809、小胞結合膜タンパク質8 Q9BV40:シナプス小胞糖タンパク質2A Q7L0J3、シナプス小胞糖タンパク質2B Q7L1I2、シナプス小胞糖タンパク質2C Q496J9、ヒト高親和性コリントランスポーターQ9GZV3、ヒトニューレキシン:ニューレキシン-1-アルファQ9ULB1、ニューレキシン-1-ベータP58400、ニューレキシン-2-アルファQ9P2S2、ニューレキシン-2-ベータP58401、ニューレキシン-3-アルファQ9Y4C0、ニューレキシン-3-ベータQ9HDB5、ヒト電位開口型カルシウムチャネル:電位依存性カルシウムチャネルサブユニットアルファ-2/デルタ-1 P54289、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットQ9NY47、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットQ8IZS8、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットQ7Z3S7、電位依存性P/Q型カルシウムチャネルサブユニットO00555、電位依存性N型カルシウムチャネルサブユニットQ00975、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットQ13936、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットQ01668、電位依存性R型カルシウムチャネルサブユニットQ15878、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットO60840、電位依存性T型カルシウムチャネルサブユニットO43497、電位依存性T型カルシウムチャネルサブユニットO95180、電位依存性T型カルシウムチャネルサブユニットQ9P0X4、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットQ13698、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットQ02641、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットQ08289、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットP54284、電位依存性L型カルシウムチャネルサブユニットO00305、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-1サブユニットQ06432、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-2サブユニットQ9Y698、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-3サブユニットO60359、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-4サブユニットQ9UBN1、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-5サブユニットQ9UF02、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-6サブユニットQ9BXT2、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-7サブユニットP62955、電位依存性カルシウムチャネルガンマ-8サブユニットQ8WXS5、電位依存性カルシウムチャネルガンマ様サブユニットQ8WXS4、電位開口型カルシウムチャネルアルファ1FサブユニットF5CIQ9、ナトリウムリークチャネル非選択的タンパク質Q8IZF0、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ5QJ99、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ5QJA0、電位開口型L型カルシウムチャネルCav1.2 Q5V9X8、電位開口型L型カルシウムチャネルCav1.2 Q5V9X9、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ6TME0、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ6TME1、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ6TME2、電位開口型カルシウムチャネルベータ2サブユニットQ6TME3、電位開口型カルシウムチャネルベータ1サブユニットQ6TME4、電位開口型カルシウムチャネルアルファ1サブユニットQ71UT1、電位開口型カルシウムチャネルアルファ1EサブユニットQ9UN68、ヒトアセチルコリンエステラーゼP22303、及びヒトNOTCH:神経原性遺伝子座(Neurogenic locus)notchホモログタンパク質1 P46531、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質2 Q04721、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質3 Q9UM47、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質4 Q99466。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドのこの態様では、シナプス前性膜へ又はシナプス前性膜に局在化されるタンパク質を選択することは有利である。膜アンカー又は膜タンパク質との相互作用によって膜、例えば細胞膜又は小胞膜に局在化される基本的にすべてのタンパク質を使用できることは理解される。そのようなタンパク質は、好ましくは、神経毒軽鎖がその生物学的活性を発揮するコンパートメント、すなわち細胞、例えば神経細胞の細胞質中に存在する。生物学的活性は、神経毒受容体への結合、神経毒軽鎖の標的細胞のサイトゾルへの移行及び神経毒の軽鎖によって調節される神経毒のタンパク質分解活性からなる
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドのさらなる態様では細胞質保持ドメインは、球状タンパク質又は細胞骨格アンカータンパク質から選択される。この態様では転写因子は、融合ポリペプチドが核のポアを通ることを妨げるために十分大きい、大きな球状タンパク質又は細胞骨格アンカータンパク質に融合される。このように融合タンパク質(転写活性化ドメインを含む)の核のポアを通る輸送は、回避できる。球状タンパク質又は細胞骨格アンカータンパク質が単独で又は、エキスポーチン結合ドメイン又はIκB結合ドメインなどの他のタンパク質若しくはタンパク質ドメインに融合されて使用できることは想定される。本発明は、ロイシンリッチ核輸送シグナル(NES)、(LxxxLxxLxL、配列番号32)「x」は任意の天然に存在するアミノ酸を表す、に関して例証される。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドの別の態様では転写因子ドメインは、DNA結合ドメイン及びトランス活性化因子又はサイレンサードメインを含む転写因子を含む。さらなる態様では転写因子は、DNA結合ドメイン及びトランス活性化因子又はサイレンサードメインに加えて核局在化配列を含む。例えばいくつかの態様ではサイレンサー又はリプレッサー(例えばREST)は、切断部位がサイレンサー/リプレッサー及びトランス活性化因子ドメインに介在するように、トランス活性化因子ドメインとは反対側に位置付けられる場合がある。このことは、レポーターの基本的発現における追加的減少を生じる。核局在化シグナルは、タンパク質を細胞の核に方向付ける。本明細書において使用される転写因子がレポーター遺伝子の発現を調節できる、すなわち転写因子がレポーター遺伝子の発現を増大又は減少させることができることは理解される。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドのさらなる態様では転写因子は、テトラサイクリン依存性トランス活性化因子(tet-リプレッサー-VP16)、ステロイドホルモン受容体、NOTCH、NFκB、p53、NFAT、MLL、E2A、HSF1、NF-IL6、STAT、R-SMAD、GAL4及びSP1からなる群から選択される。テトラサイクリン依存性トランス活性化因子についてのアミノ酸配列は、例えば配列番号33又は34に示される:
「SRLDKSKVINSALELLNGVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEMLDRHHTHSCPLEGESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEEQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLKQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG」(配列番号33)
「SRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSAYSRARTKNNYGSTIEGLLDLPDDDAPEEAGLAAPRLSFLPAGHTRRLSTAPPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG」(配列番号34)。
【００３９】
tetリプレッサーのアミノ酸配列はアクセッション番号P04483に示される。VP16のアミノ酸配列はアクセッション番号P06492に示される。ステロイドホルモン又は他の核受容体に対応するアクセッション番号は、アンドロゲン受容体P10275、エストロゲン受容体P03372、グルココルチコイド受容体P04150、ミネラルコルチコイド受容体P08235、プロゲステロン受容体P06401、プロラクチン受容体P16471、レチノイン酸受容体アルファP10276、レチノイン酸受容体ガンマP13631、レチノイン酸受容体RXRアルファP19793、ステロイドホルモン受容体ERR1 P11474、ステロイドホルモン受容体ERR2 O95718、甲状腺ホルモン受容体アルファP10827、甲状腺ホルモン受容体ベータP10828である。NOTCHタンパク質に対応するアクセッション番号は、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質1 P46531、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質2 Q04721、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質3 Q9UM47、神経原性遺伝子座notchホモログタンパク質4 Q99466である。NFκBに対応するアクセッション番号はQ04206、p53に対してP04637、NFATについて:活性化T細胞核内因子1 O95644、活性化T細胞核内因子2 Q13469、活性化T細胞核内因子3 Q12968、活性化T細胞核内因子4 Q14934、活性化T細胞核内因子5 O94916、E2A(転写因子E2-アルファ)についてP15923、HSF1についてQ00613、NF-IL6についてP17676、STATについて:STAT1_HUMAN P42224、STAT2_HUMAN P52630、STAT3_HUMAN P40763、STAT4_HUMAN Q14765、STA5A_HUMAN P42229、STA5B_HUMAN P51692、STAT6_HUMAN P42226、R-SMADについて: Smadホモログ(Mothers against decapentaplegic homolog)1についてQ15797、Smadホモログ2 Q15796、Smadホモログ3 P84022、Smadホモログ4 Q13485、Smadホモログ5 Q99717、Smadホモログ6 O43541、Smadホモログ7 O15105、Smadホモログ9 O15198、GAL4について、及びSP1についてP08047である。
【００４０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関係する。一態様では前記ベクターは発現ベクターである。
【００４１】
用語「ベクター」は、好ましくはファージ、プラスミド、ウイルス性又はレトロウイルス性ベクター及び細菌性又は酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。さらに用語は、標的化構築物のゲノムDNAへの無作為又は部位特異的組み込みを可能にする標的化構築物にも関する。そのような標的構築物は、下に詳細に記載する相同性又は異種性組換えのいずれかのために十分な長さのDNAを好ましくは含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様では宿主での増殖及び/又は選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野において十分周知の種々の技術によって宿主細胞に組み込まれ得る。例えばプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿若しくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿中において、又は荷電脂質との複合体において又はフラーレンなどの炭素ベースクラスターにおいて導入され得る。代替的にプラスミドベクターは、熱ショック又は電気穿孔法技術によって導入されてよい。ベクターがウイルスであれば、それは宿主細胞への適用の前に適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージされる場合がある。レトロウイルスベクターは、複製可能である又は複製欠損である場合がある。後者の場合、一般にウイルス増殖は補完する宿主/細胞においてだけ生じる。さらに本発明の一態様ではポリヌクレオチドは、原核若しくは真核宿主細胞又はその単離された画分における発現を可能にする前記ベクター中の発現調節配列に作動可能に連結される。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能mRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞における発現を確実にする制御エレメントは、当技術分野において十分周知である。一態様ではそれらは、転写の開始を確実にする制御配列並びに/又は転写の終了及び転写物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。追加的制御エレメントは、転写及び翻訳エンハンサーを含む場合がある。原核宿主細胞での発現を可能にする可能性のある制御エレメントは、例えば大腸菌(E. coli)でのlac-、trp-又はtac-プロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする制御エレメントについての例は、酵母におけるAOX1若しくはGAL1プロモーター又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるCMV、SV40、RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus))、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。本発明によって想定される他の発現系は、ポリヘドリンプロモーターに基づく系などの昆虫細胞における発現を可能にする。
【００４２】
さらに誘導可能な発現調節配列は、本発明によって包含される発現ベクターにおいて使用できる。誘導可能発現系及び好適な発現調節配列は、当技術分野において十分周知である。例えば転写のトランス活性化のためのテトラサイクリン応答性制御系は、Zhu Z, Zheng T, Lee CG, Homer RJ, Elias JA: Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin. Cell Dev. Biol. 2002, 13:121〜8又はShockett P, Schatz D: Inducible gene expression using an autoregulatory, tetracycline-controlled system. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2002, Chapter 16: Unit 16.14に記載されている。そのような誘導可能ベクターは、tet若しくはlacオペレーター配列又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含む場合があり、当技術分野において記載されている。例えば2つの一般に使用される誘導可能な発現系は、Tet-Off及びTet-Onである、Bujard and Gossen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547〜51を参照されたい。それらは、リプレッサーよりも転写活性化因子タンパク質(トランス活性化因子)を作出するためのTetリプレッサーとVP16活性化ドメインとの融合からなる。遺伝子発現は、Tet-Off又はTet-Onタンパク質の、誘導可能プロモーター内に位置するテトラサイクリン応答エレメント(TRE)への結合の結果として活性化される。差異は、ドキシサイクリン(Dox)へのそれぞれの応答に関し、さらに安定なテトラサイクリン類似物:Tet-OffはDoxの非存在下で発現を活性化し、一方Tet-OnはDoxの存在下で活性化する。好適なベクターは商業的に入手できる。例えばClontechによって提供されるTet-On 3Gベクターは、培養物培地へのドキシサイクリンの添加によって作動される、しっかり制御された高応答性のテトラサイクリン(Tet)誘導可能哺乳動物発現系を作出するために使用できる。pCMV-Tet3Gベクターは、Tet-On 3G、テトラサイクリン調節トランス活性化因子を発現し、それは誘導剤ドキシサイクリンの存在下で高い活性を、その不在で例外的に低い活性を表す。Tet-On 3Gは、変異体Tetリプレッサー(TetR)のアミノ酸1〜207の、単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質由来の3個の最小「F」型転写活性化ドメインを形成する39アミノ酸への融合から生じる。Tet-On 3Gの構成的発現は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター(PCMV IE)によって駆動される。さらにEF1アルファバージョンは、CMVプロモーターが発現停止にされている細胞株について利用可能である。さらに詳細な情報はClontechカタログ番号631163及びそれに引用されている参考文献を参照されたい。一方そのような制御エレメントの転写の開始に関与するエレメントは、SV40ポリA部位又はtkポリA部位などの転写終結シグナルもポリヌクレオチドの下流に含む場合がある。この内容において好適な発現ベクターは、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3、pcDNA3.1(Invitrogen)若しくはpSPORT1(Invitrogen)又はバキュロウイルス由来ベクターなど当技術分野において周知である。好ましくは、前記ベクターは発現ベクター及び遺伝子移行又は標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルス由来発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド又はベクターの標的細胞集団への送達のために使用され得る。当業者に十分周知である方法は、組換えウイルスベクターを構築するために使用できる、例えばSambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
【００４３】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドに関する。本明細書において使用される用語「融合ポリペプチド」は、(i)転写因子ドメイン及び(ii)細胞質保持ドメイン、を含む融合ポリペプチドを意味する。転写因子ドメイン及び細胞質保持ドメインは、神経毒切断部位を含むリンカーによって隔てられている。リンカー内のタンパク質分解性切断は、リンカーが(少なくとも)1度切断されるようなやり方で神経毒切断部位で生じる。リンカーは、1つ以上の神経毒切断部位(複数可)を含んでよい。融合ポリペプチド又は本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの内容において用語「リンカーによって隔てられた」は、神経毒切断部位を含むリンカーが転写因子ドメインと細胞質保持ドメインとの間に位置付けられていることを意味する。したがって融合ポリペプチドにおけるドメイン配置は、N末端転写因子ドメイン-リンカー-細胞質保持ドメインからC末端へ、又はN末端細胞質保持ドメイン-リンカー-転写因子ドメインからC末端へ、である場合がある。本明細書において使用される用語「融合ポリペプチド」は、他の宿主細胞ポリペプチドを本質的に含まない単離された又は本質的に精製されたポリペプチドを包含する。用語は、別の態様では本発明の融合ポリペプチド及び付加的に他のタンパク質を含むポリペプチド調製物を含む。さらに用語は、一態様では化学的に修飾されたポリペプチドを含む。そのような修飾は、人工的修飾又は天然に存在する修飾であってよい。本発明の融合ポリペプチドは、上に言及された生物学的特質を有する。さらに包含されるのは、一態様では配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30又は31に示すアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、一態様では当業者に十分周知の化学合成又は組換え分子生物学的技術によって製造されてよい。一態様では本発明の融合ポリペプチドを製造するそのような方法は(a)本明細書他所により詳細に記載される本発明の宿主細胞を培養すること、及び(b)本発明の融合ポリペプチドを前記宿主細胞から得ることを含む。この方法の一態様では、ポリペプチドは親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は調製用ゲル電気泳動を含む従来の精製技術によって宿主細胞可溶化液から得ることができる。本発明の融合ポリペプチドの一態様では融合ポリペプチドは精製タグを含む。
【００４４】
用語「精製タグ」は、それを含むポリペプチドの精製を可能にするアミノ酸配列を指す。これは、一態様では、精製マトリクスと物理的又は化学的に相互作用できる個々のアミノ酸、ペプチド配列又は三次元ペプチド構造の存在によって達成され得る。好適なタグは親和性タグ及びエピトープタグを含む。この内容では、セファロース又はアガロースなどの好適なマトリクス中に包埋されたニッケル又はコバルトなどの金属イオンと物理化学的に相互作用できるヒスチジンなどの特定のアミノ酸が、精製のために使用される規定のマトリクスと複合体を形成できることは十分周知である。さらなるペプチド配列又は三次元構造は、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)において見出すことができる。さらなる態様では、同様に当技術分野において十分周知であるストレプトアビジン/ビオチン系などのタンパク質-タンパク質相互作用に基づく精製マトリクス/精製タグ系が使用され得る。さらに別の態様ではタグは、それを含有するポリペプチドに蛍光などの精製を可能にする物理化学的特質を付与する場合がある。この内容では好適なタグは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)などの十分周知の蛍光タンパク質を含む。いくつかのマトリクスに固有の親和性を有するこれらのタグに加えて、別の態様ではエピトープタグも適用できる。そのようなエピトープタグは、抗体によって特異的に認識され得るペプチドエピトープを構成する短いアミノ酸ストレッチからなる。エピトープタグも当技術分野において十分周知であり、FLAGタグ、MYCタグ又はHAタグを含む。したがって一態様では精製タグは、Hisタグ、Mycタグ、FLAGタグ、strepタグ、MBPタグ、NusAタグ、GSTタグ、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される。
【００４５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は融合ポリペプチドを含む宿主細胞にさらに関係する。
【００４６】
本明細書において使用される用語「宿主細胞」は、原核及び真核宿主細胞、好ましくは単離された原核及び真核宿主細胞を包含する。好ましくは宿主細胞は真核宿主細胞である。本明細書において使用される真核宿主細胞は、本発明の融合ポリペプチドの産生のために好適な動物細胞株の細胞である。本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る又は宿主細胞によって一過的に発現され得る。本明細書で言及する宿主細胞は、それにより一態様では酵母細胞、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞を初代細胞として又は細胞株としてのいずれかで包含する。好ましくは宿主細胞は、神経細胞若しくは細胞株又は神経芽細胞種細胞若しくは細胞株である。
【００４７】
本発明の宿主細胞の一態様では宿主細胞は、初代神経細胞、神経芽細胞種細胞株、細胞株N1E-115、細胞株Neuro2a、細胞株SH-SY5Y、細胞株PC12、細胞株SiMa、細胞株MHH-NB-11、細胞株SK-N-BE(2)及び人工多能性幹細胞(iPS)、好ましくはヒト人工多能性幹細胞(hiPS)からなる群から選択される。神経芽細胞種細胞株は、ATCC又はDSMZから次のATCC又はDSMZ番号により得ることができる:細胞株N1E-115 CRL-2263、細胞株Neuro2a CCL-131、細胞株SH-SY5Y CRL-2266、細胞株PC12 CRL-1721、細胞株SiMa ACC 164 (DSMZ)、細胞株MHH-NB-11 ACC 157(DSMZ)及び細胞株SK-N-BE(2) CRL-2271。細胞株SiMaの特異的クローンはWO 2010/105234においてさらに開示されている。iPS細胞を生成する方法は、例えばYu et al., Science. 2009 May 8、324(5928): 797〜801. Epub 2009, WO 2011/056971及びWO 2011/025852に開示されている。いくつかの実施形態ではiPSは、好適な方法、例えばWO 2012/135621並びに米国特許出願第US 2010/0,279,403号及び第US 2010/0,216,181号に開示のものを使用してニューロンに分化される。
【００４８】
本発明の宿主細胞のさらなる態様では宿主細胞は、融合ポリペプチドの切断に基づいて転写因子ドメインによって発現が調節されるレポーター遺伝子を含む。この態様では宿主細胞は、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる又は宿主細胞によって一過的に発現される。レポーター遺伝子の発現は、リンカー内の本発明の融合ポリペプチドの神経毒による切断後にだけ転写因子ドメインによって調節される。レポーター遺伝子アッセイは当技術分野において十分記載されている(Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R: Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Comb. Chem. High Throughput Screen 2011, 14:648〜57、Fan F, Wood KV: Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 2007, 5:127〜36)。レポーター遺伝子として、例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は蛍光タンパク質(GFP、YFP、RFP、CFPなど)は使用できる。
【００４９】
本発明は:
(a)本発明の融合ポリペプチドと、前記融合ポリペプチドの切断に基づいて転写因子ドメインによって発現が調節されるレポーター遺伝子とを含む宿主細胞を、神経毒活性を含むことが推測される試料に接触させるステップ、並びに
(b)レポーター遺伝子活性を測定し、それにより試料中の神経毒活性を決定するステップ
を含む試料中の神経毒活性を決定するための方法に追加的に関係する。
【００５０】
本明細書に記載のレポーター遺伝子アッセイの作製は、BoNT/Aなどの神経毒ポリペプチドの、生物学的活性の決定を促進及び改善する。そのようなアッセイのために本発明のポリヌクレオチド、融合ポリペプチド、ベクター及び宿主細胞は利用できる。続いて活性化因子構築物及びレポーター遺伝子構築物は本明細書に記載の宿主細胞に安定に形質移入される。中毒及びSNAP-25などの神経毒ポリペプチド基質の切断後に、活性化因子構築物中に含まれるトランス活性化因子(tTA)がTet系から放出される。トランス活性化因子のレポーター遺伝子構築物中の制御エレメントへの結合は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現の活性化を生じる。コードされたルシフェラーゼ酵素の活性は、商業的に入手できるキットによって、数時間の内に検出できる。酸化還元反応においてルシフェラーゼによって調節される発光は、試料中の神経毒ポリペプチドの量に相当する。既知の神経毒ポリペプチド濃度での標準曲線が並行して基準として使用される。さらなる基準としてタンパク質測定をルシフェラーゼによるシグナルを場合により異なる試料中の細胞数に整合させるために実行できる。この方法は、当技術分野において周知の日常的方法であり、上に記載の本発明の活性アッセイに並行して実行できる。例えばSIMA細胞株(ヒト神経芽細胞種)などの本明細書に記載の細胞は宿主細胞として使用できる。本発明ではSIMA細胞株の種々のクローンが活性化因子構築物mST01(シナプトタグミン-SNAP-25-tTA)(配列番号9)及びレポーター遺伝子構築物pTRE-Luc(ルシフェラーゼレポーター)(Clontech)を含むサブクローンSIMA細胞株(SIMA no. 3B4)から次の実施例に示すとおり生成された。本明細書に記載のレポーター遺伝子アッセイのために使用できるレポーター遺伝子は、当技術分野において十分周知であり、例えばアクセッション番号P08659、Q27758、H1AD96、A3KC01、A3KC00、A3KBZ9、A3KBZ8、A3KBZ7、A3KBZ6、A3KBZ5、D5MS63、Q2TNU5、Q5UFR2、Q2VL10、Q6SVE0、B5A991、Q27688、A1Z0H9、Q207B1、Q5USC8、G9M6I8、Q6SVE2、Q9GPF9、又はQ6SVE1に示す配列を含む。
【００５１】
活性化因子構築物mST01(シナプトタグミン-SNAP-25-tTA)(配列番号9)及びレポーター遺伝子構築物pTRE-Luc(ルシフェラーゼレポーター)(Clontech)を含む前述のクローンは、ゲノム中に活性化因子及びレポーター構築物を安定に保有する。さらに、親SIMA細胞、すなわちサブクローンされていない、胚性組織由来ヒト多能性細胞又は商業的に入手できるP19細胞株(マウス胚性細胞腫)は、一過性形質移入として又は安定な形質移入としてのいずれかで本発明の前述の構築物での形質移入のためにも使用できる。好ましくは形質移入は安定な形質移入である。したがって、上に記載の生成された新規二重トランスジェニック細胞株は、神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定するためのアッセイの改善を可能にする。結果として神経毒ポリペプチド活性を決定するためのアッセイの感度は増大され得る。さらに本発明のアッセイは、当技術分野において記載のアッセイと比較して時間及び費用を節約する。本発明の前記アッセイは、当技術分野において記述されている神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するための、例えば、2人日を必要とする煩雑な方法であるウエスタンブロットなどの方法に代替法を提供する。
【００５２】
本発明の方法は、自動化によって支援され得る。具体的に一態様では、ステップa)及び/又はb)は、化合物の混合及びレポーター遺伝子活性の測定についてロボットデバイス及び自動化リーダーシステムによって支援されてよい。好適なシステムは当技術分野において周知であり、決定される応答の種類に依存する。さらに方法は、試料調製又は本発明の融合ポリペプチドの生成に関係する追加的ステップを含む場合がある。
【００５３】
本明細書において使用される用語「接触させるステップ」は、少なくとも2つの異なる化合物を、前記化合物の物理的及び/又は化学的相互作用を可能にする物理的近接にすることを指す。前述の方法では、本発明の融合ポリペプチドと、前記融合ポリペプチドの切断に基づいて転写因子ドメインによって発現が調節されるレポーター遺伝子とを含む宿主細胞は、神経毒活性を含むと推測される試料と接触される。接触させるステップは、一時的であり、試料に含まれる神経毒ポリペプチドによる本発明の融合ポリペプチドのリンカー中の神経毒切断部位の切断を可能にするための十分な条件下においてである。本明細書において使用される接触させるステップは、一態様では、本発明の融合ポリペプチドを含有する本発明の宿主細胞において生じる。したがって一態様では前記ポリペプチドは宿主細胞、一態様では本発明の宿主細胞によって含まれる。前記時間及び条件は、試料に含まれる神経毒ポリペプチドの量及び宿主細胞による神経毒ポリペプチドの取り込みに依存する。当業者は、適用される必要がある条件が宿主細胞、試料の種類及び決定されるべき神経毒の種類に依存することを十分に認識する。この態様では接触させるステップは、本発明の融合ポリペプチドを含む細胞系において生じる。細胞系は系に試料を接触させるステップにおいて神経毒の活性を測定するステップを可能にし、それにより前記試料中の神経毒プロテアーゼ活性を決定することを可能にする。用語「試料」は、神経毒ポリペプチドを含むことが推測される試料を指す。試料は、一態様では水性溶液である。そのような試料は、生物学的試料であってよく、又は人工的に生成された水性溶液の試料であってよい。そのような溶液は、一態様では品質管理及び/若しくは活性決定/規格目的のため又は安全管理のために神経毒製造の際のさまざまな段階で得られる。前記試料中に存在する神経毒は、少なくとも神経毒プロテアーゼ活性を示すことが想定される。別の態様では神経毒は、完全に生物学的に活性である。一態様では前記完全に生物学的に活性な神経毒は、細胞に侵入するため及び本発明の融合ポリペプチドに基づいた読み取りを活性化するために必要である。したがってそのような完全に生物学的に活性な神経毒は、宿主細胞が本発明の方法によって分析される試料と接触される場合に適用される。別の態様では本発明の方法に適用される試料は、神経毒ポリペプチド又は、神経毒プロテアーゼ活性を示すだけのその断片を含む。そのような神経毒ポリペプチド又は断片は、一態様ではタンパク質分解性活性軽鎖を含む又は本質的にそれからなる神経毒ポリペプチドのムテインである。
【００５４】
一態様ではレポーター遺伝子活性は、レポーター遺伝子基質の酵素転換を測定するステップによって決定される。後者は一態様では、転換反応の際に発せられる光の強度を検出することによって測定できる。レポーター遺伝子によって触媒される転換反応の際に生じる発光を測定するステップのための好適な系は、当技術分野において十分周知であり、商業的に入手できる。さらに、レポーター遺伝子のために使用できる好適な基質も当技術分野において十分周知であり、商業的に入手できる。
【００５５】
試料中の神経毒ポリペプチドは、定量的に又は定性的に決定され得る。定性的決定のために本発明の一態様では、神経毒ポリペプチドの存在又は不在が決定される。定量的検出のために、一態様では神経毒ポリペプチドの量が決定される。一態様では定量的決定は、絶対量又は相対量、すなわち異なる試料中において見出された量が互いに比較できるように標準化された量の決定を包含する。一態様ではこれは、検査試料について測定されたレポーター遺伝子活性と、予め決定された量の神経毒ポリペプチドを含む校正試料を本発明の方法に供することによって確立された校正曲線との比較によって達成され得る。
【００５６】
本発明の方法の一態様では宿主細胞は、本明細書他所で定義の宿主細胞である。
【００５７】
本発明は、試料中の神経毒活性を決定するための本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞の使用にさらに関する。
【００５８】
最終的に本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、融合ポリペプチド又は宿主細胞並びに好ましくは、レポーター遺伝子活性を検出するための検出剤を含む神経毒活性を決定するためのキットに関係する。
【００５９】
本明細書において使用される用語「キット」は、本発明の融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は宿主細胞を含む手段の収集物を指し、本発明の方法を実行するためにすぐに使えるやり方で別々の又は共通のバイアル中で提供される。一態様ではキットは、本発明の方法を実行するための追加的手段、一態様では規定の生物学的活性を有する神経毒ポリペプチドを含む校正基準溶液及び/又はレポーター遺伝子についての検出剤又はレポーター遺伝子によって転換される基質などのレポーター遺伝子活性を測定するステップのための手段を含む。さらに一態様ではキットは、本発明の方法を実行するための説明書を含む。これらの説明書は、マニュアルとして提供されてよい、又は本発明の方法の1つ以上のステップを実行時に管理できる、データ保存媒体内のコンピューターが実行可能なアルゴリズムの形態であってもよい。一態様ではキットは、上に明記の本発明の方法を実行するために使用される。
【００６０】
本明細書に引用したすべての参考文献は、開示内容全体及び明細書において具体的に述べられた開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６１】
本発明は、本発明を単に例示し、その範囲を限定するとして解釈されるべきでない次の非限定的実施例によってここに記載される。
【００６２】
親SiMa細胞株(DSMZ、Acc.No.:ACC-164)から限界希釈を使用してサブクローニングした、サブクローンSiMa細胞株(SIMA no.3B4)を、Xfect形質移入試薬及び販売者によって提供された付属製品(Clontech Laboratories、Inc.、Cat.No.:631317)を使用して安定に形質移入した。形質移入は6ウエルプレートで実施し、形質移入時に細胞は90%コンフルエントを示した。それぞれのポリヌクレオチドDNAを1ウエルあたり2μgで使用した。ルシフェラーゼ-レポーター-構築物での形質移入の場合は、前記DNAにハイグロマイシンに対する直鎖状選択マーカー0.1μg(比20:1)を合わせた。4時間後、形質移入マトリクスを含有する培地を通常の増殖培地で置き換えた。
【００６３】
培地交換後の24時間、同じ調製物の2個の6ウエルをプールし、PDLコートペトリ皿(直径14.5cm)に蒔き、抗生物質選択(G418:400μg/ml、ハイグロマイシン:150μg/ml)が適用される前に単一コロニーが形成されるまで少なくとも48時間増殖させた(密度70〜80%コンフルエンスに達するまで)。これらの単一コロニーを採取し、増殖させ、目的のそれぞれの構築物の安定なゲノム組み込みについての検査に供した。選択期間後、抗生物質濃度をG418:200μg/ml及びハイグロマイシン:100μg/mlまで低下させた。
【００６４】
Tetエレメント(フォワード:AGCTGGGAGTTGAGCAGCCTAC(配列番号35)、リバース:GGTGCCGAGATGCACTTTAGCC(配列番号36))及びルシフェラーゼレポーター(フォワード:GAAGAGATACGCCCTGGTTC(配列番号37)、リバース:CGGGAGGTAGATGAGATGTG(配列番号38))に対する特異的プライマーを使用し、プロトコールに従ってPhusion High Fidelityキット(NEB)を適用するゲノムPCR(Lyse and Go PCR試薬、Thermo Scientificをプロトコールに従って使用して細胞を可溶化した)及び続くアガロースゲル電気泳動による分析。
【００６５】
両方の構築物の挿入について陽性と検査された後に、細胞は増殖され、細胞バンク貯蔵物を液体窒素タンクに生成した。貯蔵物の再融解後、実験に細胞を使用する前に安定挿入についての検査を実施した。
【００６６】
最初に構築物mST01(シナプトタグミン-SNAP-25-tTA)(配列番号9)を形質移入し、単一細胞サブクローニングを可能な限り少ない遺伝的変異を有するクローナルなバックグラウンドに達するために実施した。これらの安定クローンをレポーター遺伝子構築物pTRE-Luc(ルシフェラーゼレポーター)での第二ラウンドの形質移入及び続く反復単一細胞クローニング(図3)に供した。形質移入、生存率及び機能性対照をそれぞれのGOIを含まずに空ベクター(活性化因子対照プラスミドとしてpCMV-Tet3G、及びレポーター対照プラスミドとしてpTRE3G)を使用して作製し、上に述べた特質にいかなる障害も示さなかった(図1A、C)(Clontech)。
【００６７】
組み込みの安定性を示した後に、Tetエレメントの発現分析及び神経毒によるBoNTリンカードメインの切断を評価する。この実験について二重形質移入クローンをPDLコート96ウエルプレートに蒔き、WO 2010/105234に開示の手順に従ってニューロンの表現型に分化させる。BoNT/Aでの中毒は、細胞培養中最終濃度1x10-10Mから10x10-14Mの範囲の一連の濃度を使用して24〜72時間実施する。BoNTの一連の貯蔵希釈は0.2%ヒト血清アルブミンを補充したDPBS中で行い、対応する細胞培養培地に直接適用する。中毒後、Tetリプレッサータンパク質の放出は検出可能であり、元のポリペプチド配列から識別可能である。さらにルシフェラーゼレポーターの発現レベルをTet-on系を基本として使用して、同時に及びBoNTへの用量応答で、並びに同時に及びドキシサイクリンへの用量応答レベルで評価する。機能的読み出しを商業的に入手できるルシフェラーゼアッセイキットを使用して行う。この場合2つの異なるキットは、主に純粋な機能的読み出しのためにpure Luciferase Assay System(One-Glo、Promega)及び完全なアッセイ適用のために細胞生存率の判定との組合せでLuciferase Assay System(One-Glo+Tox、Promega)を適用できる。この多重化アプローチは、標準化及び同じ試料内での機能性データを可能にし、したがってアッセイの検証のための堅固な基礎を提供する。
【図１】
2016502405.tif 000003
【図２】
2016502405.tif 000004
【図３】
2016502405.tif 000005
【図４】
2016502405.tif 000006
【配列表】
2016502405000001.app
【国際調査報告】
2016502405.tif 000007
2016502405.tif 000008
2016502405.tif 000009
2016502405.tif 000010