(57)【要約】JQ1を含むBET阻害剤を用いて心疾患を処置するための方法が提供される。心肥大を処置するための方法、炎症から生じたものではない心不全を処置するための方法、心筋梗塞を処置するための方法、心保護のための方法、および再狭窄を阻害するための方法が、本明細書において記載される。方法は、JQ1などのBET阻害剤の有効量の使用を含む。
2016520130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋症を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、心筋症を処置するために有効な量の本発明の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
対象は、心不全を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象は、閉塞性冠動脈疾患の症状を有さない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象は、アテローム動脈硬化症のための処置中ではない、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
対象は、閉塞性冠動脈疾患を有さないことが、血管造影図により明らかである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
対象は、心不全またはアテローム動脈硬化症を有さず、心筋梗塞からの回復中ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象は、血圧を低下させるための治療中である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
心筋症が、慢性高血圧、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症）、周産期心筋症、または遺伝子変異に起因する心筋症に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
本発明の化合物がJQ1である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
心筋症が心肥大である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
炎症から生じたものではない心不全を処置するための方法であって、かかる処置を必要とする対象に、心不全を処置するために有効な量の本発明の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
対象は、閉塞性冠動脈疾患を有さないことが、血管造影図により明らかである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象は、心筋梗塞からの回復中ではない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
対象は、心筋梗塞からの回復中ではない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
心不全は、以下：
（ｉ）閉塞性冠動脈疾患のエビデンスを伴わない、駆出率保持心不全（HFpEF）；
（ｉｉ）薬物（抗がん剤および依存性薬物を含む）の毒性に起因する心不全；
（ｉｉｉ）エタノール乱用により引き起こされる心不全；
（ｉｖ）慢性頻拍（速い心拍）に起因する心不全；
（ｖ）内分泌異常（過剰な甲状腺ホルモン、成長ホルモン、糖尿病、褐色細胞腫）に起因する心不全；
（ｖｉ）高拍出性心不全（貧血または末梢動静脈シャントにより引き起こされるものを含む）；
（ｖｉｉ）栄養障害（チアミン、セレニウム、カルシウムおよびマグネシウム欠乏を含む）により引き起こされる心不全；
（ｖｉｉｉ）ウイルス感染（HIVを含む）に起因する心不全、または
（ｉｘ）先天的な心奇形に起因する心不全
に起因する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象は、血圧を低下させるための治療中である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
本発明の化合物がJQ1である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心筋梗塞を処置するための方法であって、かかる処置を必要とする対象に、本発明の化合物を、心筋梗塞を処置するために有効な量で投与することを含み、ここで、本発明の化合物の投与は、心筋梗塞の５日後より前には開始されない、前記方法。
【請求項１９】
本発明の化合物の投与は、心筋梗塞の６日後より前には開始されない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
本発明の化合物の投与は、心筋梗塞の７日後より前には開始されない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象は、アテローム動脈硬化症を有さないことが、血管造影図により明らかである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象が心不全を有さない、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
本発明の化合物がJQ1である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
心保護のための方法であって、心毒性を伴う治療を受けている対象に、BET阻害剤を、かかる治療による心毒性を阻害するために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
治療が抗がん治療である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗がん治療が化学療法薬による治療である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化学療法薬が、アントラサイクリン、トラスツズマブ、５−フルオロウラシル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ビンカアルカロイド、タモキシフェン、シクロホスファミド、イマチニブ、トラスツズマブ、カペシタビン、シタラビン、ソラフェニブ、スニチニブおよびベバシズマブからなる群より選択される抗がん剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
BET阻害剤がJQ1である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
再狭窄を阻害するための方法であって、血管形成術を受けている、および／またはステントを受けている対象に、BET阻害剤を、再狭窄を阻害するために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
BET阻害剤は、狭窄の部位において局所的に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
BET阻害剤は、カテーテルを介して投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
BET阻害剤は、ステント上のコーティングの成分として投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
BET阻害剤がJQ1である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
狭窄または再狭窄を予防するためのステントにおいて、該ステントは、ステントが脈管系に配置されたときに薬剤を局所的に脈管系へ送達するためのコーティングを含み、改善は、コーティング中に含まれるBET阻害剤を含む、前記ステント。
【請求項３５】
BET阻害剤がJQ1である、請求項３４に記載のステント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2013年5月28日に出願された米国仮出願第61/828,166号、および2014年1月24日に出願された米国仮出願第61/931,062号の、35 U.S.C.§119(e)下における利益を主張し、当該仮出願の内容は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【０００２】
連邦により出資された研究
本発明は、国立衛生研究所の助成金R01 DK093821の下における政府の支援により行われた。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
心不全（HF）は、現代社会における死亡、入院加療および医療費の主要な原因である。この疾患は、心臓が、臓器の灌流を、組織の需要を満たすために十分なレベルに維持することができなくなった場合に起こり、疲労、息切れ、多臓器機能不全および早期の死亡をもたらす。ベータアドレナリン受容体アンタゴニストおよびレニン・アンギオテンシン系の阻害剤などの、HFを罹患する個体のための既存の薬物療法は、一般に、神経ホルモンシグナル伝達経路を標的とする。かかる治療は、HF患者において改善された生存率を有するが、一方で、残りの罹患率および死亡率は、受け入れ難いほど高いままである。この主要な未だ対処されていない臨床的必要性を考慮すると、HFの病因に関与する新規のシグナル伝達経路の解明により、この蔓延性が高く致死性の疾患のための新規の治療を同定することが期待できる。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、幾つかの側面において、BET（ブロモドメイン含有リーダータンパク質のブロモドメインおよびエキストラターミナル（bromodomain and extraterminal）ファミリー）が、それらの広汎であるが既定のストレス誘導型の転写プログラムを共活性化する能力を介した、病的な心臓のリモデリングの重要なエフェクターであるという知見に関する。さらに、本願の発明者らは、JQ1などのBET阻害剤が、驚くべきことに、心肥大および血管傷害に関して、筋細胞の増殖を阻害し得ることを発見した。したがって、本発明の幾つかの側面は、かかる処置を必要とする対象に、心筋症を処置するために有効な量の本発明の化合物、例えばJQ1を投与することにより心筋症を処置する方法を含む。
【０００５】
幾つかの態様において、対象は、心不全を有さない。幾つかの態様において、対象は、閉塞性冠動脈疾患の症状を有さない。幾つかの態様において、対象は、アテローム動脈硬化症のための処置中ではない。幾つかの態様において、対象は、閉塞性冠動脈疾患のための処置中ではないことが、血管造影図により明らかである。幾つかの態様において、対象は、心不全またはアテローム動脈硬化症を有さず、心筋梗塞からの回復中ではない。幾つかの態様において、対象は、血圧を低下させるための治療中である。幾つかの態様において、心筋症は、慢性高血圧、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症を含む）、周産期心筋症、または遺伝子変異に起因する心筋症（家族性肥大型心筋症および家族性拡張型心筋症を含む）に起因する。幾つかの態様において、本発明の化合物は、JQ1である。幾つかの態様において、心筋症は、心肥大である。
【０００６】
本発明の一側面により、炎症から生じたものではない心不全を処置するための方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、心不全を処置するために有効な量の本発明の化合物、例えばJQ1を投与することを含む。幾つかの態様において、対象は、閉塞性冠動脈疾患を有さないことが、血管造影図により明らかである。幾つかの態様において、対象は、心筋梗塞からの回復中ではない。幾つかの態様において、心不全は、以下：
（ｉ）閉塞性冠動脈疾患のエビデンスを伴わない、駆出率保持心不全（HFpEF）；
（ｉｉ）薬物（抗がん剤および依存性薬物を含む）の毒性に起因する心不全；
（ｉｉｉ）エタノール乱用により引き起こされる心不全；
（ｉｖ）慢性頻拍（速い心拍）に起因する心不全；
（ｖ）内分泌異常（過剰な甲状腺ホルモン、成長ホルモン、糖尿病、褐色細胞腫）に起因する心不全；
（ｖｉ）高拍出性心不全（貧血または末梢動静脈シャント）により引き起こされるものを含む）；
（ｖｉｉ）栄養障害（チアミン、セレニウム、カルシウムおよびマグネシウム欠乏を含む）により引き起こされる心不全；
（ｖｉｉｉ）ウイルス感染（HIVを含む）に起因する心不全、または
（ｉｘ）先天的な心奇形に起因する心不全
に起因する。
【０００７】
幾つかの態様において、対象は、血圧を低下させるための治療中である。幾つかの態様において、本発明の化合物は、JQ1である。
【０００８】
本発明の幾つかの側面により、心筋梗塞を処置するための方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、本発明の化合物、例えばJQ1を、心筋梗塞を処置するために有効な量で投与することを含み、ここで、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の５日後より前には開始されない。幾つかの態様において、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の６日後より前には開始されない。幾つかの態様において、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の７日後より前には開始されない。幾つかの態様において、対象は、アテローム動脈硬化症を有さないことが、血管造影図により明らかである。幾つかの態様において、対象は心不全を有さない。幾つかの態様において、本発明の化合物は、JQ1である。
【０００９】
本発明の幾つかの側面により、心保護のための方法が提供される。方法は、心毒性を伴う治療を受けている対象に、BET阻害剤を、かかる治療による心毒性を阻害するために有効な量で投与することを含む。幾つかの態様において、治療は、抗がん治療である。幾つかの態様において、抗がん治療は、化学療法薬による治療である。幾つかの態様において、化学療法薬は、アントラサイクリン、トラスツズマブ、５−フルオロウラシル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ビンカアルカロイド、タモキシフェン、シクロホスファミド、イマチニブ、トラスツズマブ、カペシタビン、シタラビン、ソラフェニブ、スニチニブおよびベバシズマブからなる群より選択される抗がん剤である。幾つかの態様において、BET阻害剤は、JQ1分子である。
【００１０】
本発明の幾つかの側面により、再狭窄を阻害するための方法が提供される。方法は、血管形成術を受けている、および／またはステントを受けている対象に、BET阻害剤を、再狭窄を阻害するために有効な量で投与することを含む。幾つかの態様において、BET阻害剤は、狭窄の部位において局所的に投与される。幾つかの態様において、BET阻害剤は、カテーテルを介して投与される。幾つかの態様において、BET阻害剤は、ステント上のコーティングの成分として投与される。幾つかの態様において、BET阻害剤は、JQ1分子である。
【００１１】
本発明の幾つかの側面は、狭窄または再狭窄を予防するためのステントを提供し、当該ステントは、ステントが脈管系に配置されたときに薬剤を局所的に脈管系へ送達するためのコーティングを含み、ここで、改善は、コーティング中に含まれるBET阻害剤を含む。幾つかの態様において、BET阻害剤は、JQ1分子である。
【００１２】
前述の態様のいずれにおいても、本発明の化合物は、本明細書において、および本明細書において参考として援用されるWO 2011/143669において記載される式Ｉ〜ＸＸＩＩの化合物である。幾つかの重要な態様において、本発明の化合物は、式Ｉ〜ＩＶの化合物である。好ましい態様において、本発明の化合物はJQ1である。
【００１３】
本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含することができる。したがって、任意の一要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各々の側面において含まれ得ることが見込まれる。本発明は、その適用において、以下の説明において記載される、または図面において説明される構造および成分の配置の詳細に限定されない、本発明は、他の態様を可能とし、多様な方法において実施されることまたは実行されることが可能である。また、本明細書において用いられる表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびこれらのバリエーションの本明細書における使用は、その後に列記される項目およびそれらの均等物、ならびにさらなる項目を包含することを意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、心臓におけるBET発現を示す。（Ａ）qRT-PCRによる、示されたBET遺伝子の、（Ａ）NRVMおよび（Ｂ）成体マウス心臓組織（Ｎ＝４）における相対的発現。Brd2およびBrd3に対してＰ＜０．０５。（Ｃ）NRVMホールセル抽出物における（左）、ならびに成体マウスおよびヒトの心臓組織の核タンパク質抽出物における（右）BRD4の存在を示すウェスタンブロット。チューブリンおよびPOL2をローディングのために示す。（Ｄ）BRD4、α−アクチニン、DAPIについてのNRVMにおける免疫蛍光染色。マージされた画像は、核に局在するBRD4シグナルを示す。白色のバー＝１０μＭ。（Ｅ）NRVMにおけるBRD4タンパク質の有効なノックダウンを示す、濃度測定による定量を伴うウェスタンブロット（Ｎ＝３）。*sham−対照（sh-cntrl）に対してＰ＜０．０５。（Ｆ）図２Ｆにおいて用いられたBET阻害剤の化学構造。
【００１５】
【図２】図２は、BETブロモドメイン阻害が、心筋細胞肥大をin vitroでブロックすることを示す。（Ａ）（＋）−JQ1の化学構造。（Ｂ）JQ1（２５０ｎＭ）およびPE（１００μＭ）を用いて、またはこれらを用いずに、４８時間にわたり処置されたNRVMの代表的な画像、および心筋細胞面積の定量。α−アクチニン免疫蛍光染色が緑色、DAPIが青色である。*DMSO−PEに対してＰ＜０．０５。**JQ1−PEに対してＰ＜０．０５。#DMSO＋PEに対してＰ＜０．０５。（Ｃ）JQ1（５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で４８時間にわたり処置されたNRVMにおける肥大マーカー遺伝子のqRT-PCR（Ｎ＝４）。#ビヒクル（veh）に対してＰ＜０．０５、*PEに対してＰ＜０．０５。（Ｄ）sham−Brd4またはsham−対照（スクランブルshRNA）を含むアデノウイルスに感染したNRVMを、PE（１００μＭ）を用いて、またはこれらを用いずに、４８時間にわたり処置したものの代表的な画像、および心筋細胞面積の定量。*sham−対照−PEに対してＰ＜０．０５。**sham−Brd4−PEに対してＰ＜０．０５。#sham−対照＋PEに対してＰ＜０．０５。（Ｅ）JQ1（５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で４８時間にわたり処置されたNRVMにおける肥大マーカー遺伝子のqRT-PCR（Ｎ＝４）。#sham−対照に対してＰ＜０．０５、*sham−対照＋PEに対してＰ＜０．０５。（Ｆ）構造的に異なるBET阻害剤のパネル（JQ1、iBET、iBET-151、RVX-208、PF-1；５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で４８時間にわたり処置されたNRVMの細胞面積の測定。*示される化合物について、‐PE対照に対してＰ＜０．０５。#ビヒクル＋PEに対してＰ＜０．０５。白色のバー＝３０μＭ。群ごとに３回の独立した実験からプールしたＮ＝１５０〜２００の心筋細胞からのNRVM面積の定量を行った。
【００１６】
【図３】図３は、遺伝子発現プロファイリングが、in vitroでの心筋細胞肥大の間のBETにより調節される転写プログラムを定義することを示す。（Ａ）発現が異なる転写物の選択されたヒートマップ。５００ｎＭのJQ1および１００μＭのPEで処置されたNRVM。（Ｂ）発現が異なる転写物の網羅的分析は、経時的なPEによる遺伝子の誘導、およびPEにより媒介される遺伝子誘導のJQ1による漸進的逆転を示す。（Ｃ）PEにより誘導される個々の転写物、および同じ転写物のJQ1による抑制を示すVolcanoプロット。Il6の位置を注解する。（Ｄ）PEにより誘導され、JQ1により逆転される遺伝子のパネルの機能的経路分析（DAVID）。＜５％の偽陽性率（FDR）を、統計学的に有意であるものと考える。（Ｅ）JQ1（５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で、示された時点にわたり処置されたNRVMからのIl6のqRT-PCR（Ｎ＝４）。*ビヒクルに対してＰ＜０．０５、#PEに対してＰ＜０．０５。（Ｆ）JQ1（５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で９０分間にわたり処置されたNRVMにおける、Pol IIおよびBRD4に対するChIP-qPCR。Il6転写開始部位（TSS）の近傍においてPCRを行った。−４ｋｂの遺伝子座を、非標的領域として用いた（上記のPCRプライマーの位置、Ｎ＝３）。*ビヒクルに対してＰ＜０．０５、#PEに対してＰ＜０．０５。（Ｇ）JQ1（５００ｎＭ）およびPE（１００μＭ）で、示された時点にわたり処置されたNRVMからのc-mycのqRT-PCR（Ｎ＝４）。JQ1はIl6の誘導を抑制するが、一方で、c-mycの誘導は抑制しない。*ビヒクルに対してＰ＜０．０５、#PEに対してＰ＜０．０５。
【００１７】
【図４】図４は、NRVMにおけるBET発現が、PE刺激によっては不変であることを示す。（Ａ）qRT-PCRによる、PE（１００μＭ）で、示された時点にわたり処置されたNRVMにおけるBrd2-4遺伝子の相対的発現（Ｎ＝４）。
【００１８】
【図５】図５は、JQ1によるBETブロモドメイン阻害が病的な心肥大および心不全をin vivoで強力に減弱することを示す。（Ａ）マウスにおけるTACおよびJQ1の投与のための実験プロトコル。（Ｂ）TACの間のマウスにおける心エコーのパラメーター（Ｎ＝７；図６において示されるsham群）。LVIDdは左心室拡張終期面積であり、（IVS＋PW）dは、拡張終期における心室中隔およびLV後壁の合計厚である。*ビヒクルTACに対してＰ＜０．０５。（Ｃ）代表的なＭモードトレーシングおよび（Ｄ）４週間のTACの対象となったマウスの拡張終期の２Ｄ画像。白色のバー＝２ｍｍ。（Ｅ）マウスにおける４週間のTACの後での心臓重量／体重（HW／BW）および（Ｆ）肺重量／体重（LW／BW）の比（TAC：Ｎ＝７、sham：Ｎ＝５）。*sham−ビヒクルに対してＰ＜０．０５。#TACビヒクルに対してＰ＜０．０５。**shamJQ1に対してＰ＜０．０５。（Ｇ）マウスからフレッシュに切除された全心臓の代表的な写真。黒色のバー＝３ｍｍ。（Ｈ）マウスの心臓からの示された遺伝子のqRT-PCR（Ｎ＝５〜７）。*sham−ビヒクルに対してＰ＜０．０５。#TACビヒクルに対してＰ＜０．０５。（Ｉ）JQ1は、in vivoで、LVの収縮機能を損なうことなくPEにより誘導される心肥大をブロックする。マウスにおけるPE注入（皮下浸透圧ミニポンプを介して７５ｍｇ／ｋｇ／日）およびJQ1投与のための実験プロトコル（PE：Ｎ＝７、生理食塩水：Ｎ＝５）。また、図６を参照。
【００１９】
【図６】図６は、JQ1がマウスにおいて良好に耐容され、血圧または大動脈較差（trans-aortic gradient）に影響を及ぼさないことを示す。（Ａ）マウスに、JQ1（５０ｍｇ／ｋｇ／日ＩＰ）を、ビヒクルを対照として、１７日間にわたり投与する。マウスをトレッドミル運動（１５ｍ／分、無傾斜）に供し、消耗までの時間を測定した（Ｎ＝６）。NSは、統計学的に非有意であったことを表す。（Ｂ）shamされたマウスにおける心エコーのパラメーター（Ｎ＝５）。（Ｃ）ビヒクルを対照として、JQ1（５０ｍｇ／ｋｇ／日ＩＰ）で１７日間にわたり処置されたマウスにおける収縮期血圧（Ｎ＝５）。（Ｄ）マウスにおけるTACの７日後の外科的に狭窄された大動脈弓のセグメント間の圧較差（Ｎ＝４）。
【００２０】
【図７】図７は、in vivoでのBETブロモドメイン阻害が、心不全の主要な病理組織学的な特徴の発生をブロックすることを示す。（Ａ）心臓切片のコムギ胚芽アグルチニン染色、および心筋細胞面積の定量。バー＝３０μｍ。（Ｂ）心臓切片のMassonのトリクローム染色、および線維化面積の定量。バーは、低倍率画像については４００μｍ（上）、高倍率画像については４０μｍ（下）。（Ｃ）心臓切片のTUNEL染色、および下にTUNEL陽性核の定量。バー＝２０μｍ。（Ｄ）心臓切片のPECAM-1免疫蛍光染色、および心筋毛細管密度の定量。バー＝３０μｍ。パネルＡ〜Ｄについて：Ｎ＝３〜４、マウスから４週の時点において得た組織、*shamビヒクルに対してＰ＜０．０５、#TACビヒクルに対してＰ＜０．０５。
【００２１】
【図８】図８は、BETが、心臓においてTACの間に、広範であるが特異的な転写プログラムを共活性化することを示す。（Ａ）マイクロアレイGEP実験のためのプロトコル。（Ｂ）遺伝子発現プロファイルの無監督階層式クラスタリング。（Ｃ）選択された遺伝子のヒートマップ。（Ｄ）遺伝子クラスターの時間的発展を示すGEDIプロット。（Ｅ）個々の転写物のVolcanoプロット。TACにより誘導される遺伝子は、JQ1により抑制される。（Ｆ）TACにより誘導され、JQ1により逆転される遺伝子のパネルの機能的経路分析（DAVID）。＜５％の偽陽性率（FDR）を、統計学的に有意であるものと考える。（Ｇ）以下の結節性の肥大促進性（pro-hypertrophic）転写エフェクターの心筋細胞特異的な活性化により駆動されるTAC−ビヒクルおよびTAC−JQ1についての、３回の独立したGEPに対するGSEA：カルシニューリン−NFAT（構成的活性型カルシニューリンＡ導入遺伝子により駆動される（Bousette et al., 2010））、IKK2導入遺伝子により駆動されるNFκB（Maier et al., 2012）、およびトランスジェニックなGATA4の過剰発現（Heineke et al., 2007）。FWER  Ｐ＜０．２５０を、統計学的に有意な濃縮（enrichment）を表すと考えた。３つの時点すべてについての代表的なデータ、および２８日の時点について示された代表的なプロット。また、図９を参照。
【００２２】
【図９】図９は、TACの間のマウス心臓の遺伝子発現プロファイルを示す。（Ａ）sham／TACの後での示された時点におけるマウス心臓におけるBrd2-4のqRT-PCRによる相対的発現（Ｎ＝５〜７）。（Ｂ）Volcanoプロット。（Ｃ）TAC−ビヒクルを用いるc-myc標的の上方調節を示すが、JQ1の効果とは重複しないGSEA。（Ｄ）示された時点におけるマウスの心臓からのqRT-PCR（Ｎ＝５〜７）は、JQ1がc-mycの誘導を抑制しないことを示す。*shamビヒクルに対してＰ＜０．０５。#JQ1に対してＰ＜０．０５。
【００２３】
【図１０】図１０は、TACモデルにおいてBETにより調節される遺伝子は、ヒト心不全に関連することを示す。（Ａ）TACにより誘導される遺伝子であってJQ1により抑制されるものの、ヒトにおける進行期の非虚血性および虚血性の心不全において上方調節される遺伝子の発現プロファイルプロファイルに対する交差（intersection）を示すベン図（Hannenhalli et al., 2006）。ヒト心不全において誘導される遺伝子のセットと統計学的に有意な様式において重複する、マウスTACモデルにおけるBETの標的（χ２＜２×１０−１４）。（Ｂ）３つすべてのセットの交差に存在する遺伝子名を列記する。
【００２４】
【図１１】図１１Ａは、研究デザインを示す。成体マウスに、大動脈縮窄術（TAC）を用いて圧負荷をかけた。JQ1またはビヒクルを、著しい病態が既に発症している時点であるTAC後第１８日に開始した。JQ1は、著しい心臓の病態が既に発症した後に投与された場合ですら、（Ｂ）LV収縮不全、（Ｃ）LV腔の拡大、（Ｄ）LV壁肥厚、および（Ｅ）心拡大の進行を著しく減弱する（Ｎ＝群あたり６〜１２）。このデータは、予め確立されたヒトにおける心疾患に高度に関連する実験的セッティングにおいて、BETブロモドメイン阻害の効力を実証する。
【００２５】
【図１２】図１２Ａは、研究デザインを示す。広範囲前壁心筋梗塞（MI）を起こさせるために、マウスに、近位左前下行枝（left anterior descending artery：LAD）永久結紮を行った。JQ1またはビヒクルは、示された用量で（２５ｍｇ／ｋｇ／日または５０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内注射）、術後第５日に開始した。この投与レジメンにより、ビヒクル対照に対して、JQ1により、過剰な死亡率、心筋破裂およびLV動脈瘤形成は観察されなかった。JQ1は、（Ｂ）LV収縮不全、（Ｃ）LV腔の拡大、（Ｄ）LV壁肥厚、および（Ｅ）広範囲前壁心筋梗塞後の心拡大の発生を減弱する（群あたりＮ＝５）。このデータは、ヒトの疾患に高度に関連する実験的セッティングにおいて、BETブロモドメイン阻害の効力を実証する。
【００２６】
【図１３】図１３は、JQ1によるBETブロモドメイン阻害が、培養心筋細胞において、Doxoにより誘導される心毒性をブロックすることを示す。新生仔ラット心室心筋細胞（NRVM）を、JQ1（２５０ｎＭ）を用いてまたはこれを用いずに、３時間にわたり処置し、その後、±Doxo（１μＭ）で、さらに２４時間にわたり処置した。細胞を、TUNEL染色によりアポトーシスについてアッセイし、核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡で画像を取得し、TUNEL陽性核を定量した（ｎ＝５；*ビヒクル、（−）Doxoに対してＰ＜０．０５。；#ビヒクル、（＋）Doxoに対してＰ＜０．０５。これらのデータは、JQ1によるBETブロモドメイン阻害は、アントラサイクリンなどの心毒性化学物質から心臓を保護することができることを支持する。これらのデータは、がん治療の間の心保護剤としてのJQ1の有用性を、JQ1はまた抗がん特性をも有するというさらなる利益と共に、支持する。
【００２７】
【図１４】図１４は、JQ1が、病的な平滑筋細胞の活性化の主要な特徴を阻害することを示す。全ての実験は、初代ラット大動脈平滑筋細胞（RASMC）、PDGF-bb（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびJQ1（５００ｎＭ）を用いて行った。JQ1は、アゴニストPDGF-bbに対する応答における病的な平滑筋活性化の顕著な特徴（（Ａ）増殖（放射標識チミジンの取り込みにより定量される）、（Ｂ）遊走（Transwell遊走アッセイを用いて定量される）、および（Ｃ）病的な遺伝子誘導（Ptgs2／Cox2について示されるqRT-PCR）など）をブロックする。これらの知見は、病的な平滑筋の増殖に対するBETブロモドメイン阻害の効力を支持する（群あたりｎ＝３〜６；*ビヒクルに対してＰ＜０．０５；**PDGF-bbに対してＰ＜０．０５）。
【００２８】
【図１５】図１５は、心筋梗塞（MI）のマウスモデルにおける病的な心臓のリモデリングにおける、BETブロモドメイン阻害（JQ1を用いての）の効力を示す。（Ａ）研究デザイン。広範囲前壁心筋梗塞（MI）を起こさせるために、マウスに近位LAD永久結紮を行った。JQ1またはビヒクルは、示された用量で（２５ｍｇ／ｋｇ／日または５０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内注射）、術後第５日に開始した。JQ1を用いて、ビヒクル対照に対して、この投与レジメンにより、過剰な死亡率、心筋破裂およびLV動脈瘤形成は観察されなかった。JQ1は、（Ｂ）LV収縮不全、（Ｃ）LV腔の拡大、（Ｄ）LV壁肥厚、および（Ｅ）広範囲前壁心筋梗塞後の心拡大の発生を減弱する（sham群においてＮ＝５、MI群においてＮ＝１０）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ブロモドメイン含有タンパク質のブロモドメインおよびエキストラターミナル（BET）ファミリー（BRD2、BRD3、BRD4およびBRDT）が、心臓において広範であるが規定されるストレス誘導性の転写プログラムを共活性化するそれらの能力を介して、病的な心臓のリモデリングの重要なエフェクターであるという驚くべき知見に基づく。本願の発明者らは、in vivoでの低分子プローブJQ1によるBETブロモドメイン阻害が、血行動態ストレスおよび神経ホルモンによるストレスの両方への暴露の間に、病的な心臓のリモデリングを強力に抑制し、収縮機能を保つことを示した。したがって、本発明の側面は、心肥大を処置する方法を含む。方法は、心肥大を処置するために、かかる処置を必要とする対象に、本発明の化合物、例えばJQ1の有効量を投与することを含む。
【００３０】
心筋症（文字どおり「心臓の筋肉の疾患」）とは、任意の原因による測定可能な心筋（心臓の筋肉）の機能の悪化であり、通常、心不全をもたらす；一般的な症状は、呼吸困難（息切れ）および末梢性浮腫（下肢の腫脹）である。炎症またはアテローム動脈硬化症と無関係な心筋症の例は、慢性高血圧、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、僧房弁閉鎖不全症）、周産期心筋症、または遺伝子変異に起因する心筋症（家族性肥大型心筋症および家族性拡張型心筋症を含む）に起因するものである。幾つかの態様において、心筋症は、心肥大である。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「心肥大」とは、機械的刺激またはホルモンによる刺激などのストレス要因により活性化され、心臓を、心拍出量の需要の増大に対して、または傷害に対して適応することができるようにする、心臓の拡張を指す（Morgan and Baker, Circulation 83, 13-25（1991））。それは、増大した心臓の質量の存在である。それは、典型的には、心電図検査、または胸部Ｘ線、心臓超音波検査（心エコー）、心臓ＣＴスキャンもしくは心臓ＭＲＩスキャンなどのイメージングモダリティーなどの、非侵襲的な方法により検出される。これらのイメージングモダリティーに基づく、厳密な臨床的に定義される測定値が存在する。それは、しばしば、冠動脈疾患または炎症とは無関係に起こる。無徴候性の状態において存在する場合ですら、その存在は、有害な将来のイベントと強く関連する。無徴候性心肥大に対して現在処方される治療は、もし存在するとしても標準的な高血圧の処置の他には存在しない。心肥大は、多くの患者において、生理学的に明白であり、概して炎症とは無関係である。
【００３２】
幾つかの態様において、心肥大はまた、心不全、閉塞性冠動脈疾患、および／またはアテローム動脈硬化症とは無関係であることが明らかであり得る。本明細書において用いられる場合、「心不全」とは、心臓が、筋肉の需要を満たすために十分なレベルにおいて臓器の灌流を維持することができない場合に起こる疾患であり、疲労、息切れ、多臓器不全、および早期の死亡をもたらす。心不全は、鬱血性心不全、心筋梗塞、頻脈性不整脈、家族性肥大型心筋症、虚血性心臓疾患、特発性拡張型心筋症、心筋炎などの広範な疾患状態を含む。心不全は、限定することなく、虚血性、鬱血性、リウマチ性、ウイルス性、中毒性または特発性の形態を含む、任意の数の要因により引き起こされ得る。慢性心肥大は、鬱血性心不全および心停止の前兆である、顕著に病的な状態である。
【００３３】
「閉塞性冠動脈疾患」とは、冠動脈の１または２以上の閉塞から生じる動脈性の心脈管系の疾患を指す。かかる疾患として、限定することなく、冠動脈の脈管系のアテローム動脈硬化症、血栓症、再狭窄、心筋梗塞、および／または虚血（再発性虚血を含む）が挙げられる。これらの疾患の１または２以上の症状として、労作性狭心症、異型狭心症、安定狭心症および不安定狭心症などの狭心症を挙げることができる。
【００３４】
「アテローム動脈硬化症」とは、大および中サイズの動脈の壁の最内層における、コレステロールおよび脂質を含む粥腫の沈着により特徴づけられる障害を指す。アテローム動脈硬化症はまた、慢性炎症性疾患としても特徴づけることができ、ここで、血管壁におけるLDL粒子の存在が、血液からの単球の動員、それらのマクロファージへの変換、および、食作用によりLDL粒子を除去しようとする、動力学的であるが最終的には失敗する試みをもたらす。自然免疫系および獲得免疫系の両方が、病変の発達に寄与していると考えられ、多くの他の炎症性疾患におけるものと同じく、補体の活性化が、少なくとも部分的に、組織損傷を媒介していると考えられる。
【００３５】
「アテローム硬化性冠動脈疾患」とは、冠動脈造影において検出される、血流を制限する狭窄の存在（管腔の直径の＞７０％の閉塞）であって、心筋血流減少の臨床的エビデンス（狭心症の症状または心臓負荷試験陽性）を伴うものを指す。
【００３６】
対象は、動物、典型的には哺乳動物である。一側面において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはげっ歯類である。重要な態様において、対象は、ヒトである。
【００３７】
幾つかの態様において、対象は心不全を有さない。幾つかの態様において、対象は、限定されないが、労作性狭心症、異型狭心症、安定狭心症および不安定狭心症などの狭心症を含む、閉塞性冠動脈疾患の症状を有さない。幾つかの態様において、対象は、アテローム動脈硬化症のための処置中ではない。例えば、対象は、スタチン、抗血小板薬、ベータ遮断薬、アンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤およびカルシウムチャネル遮断薬で処置されていない。幾つかの態様において、対象は、アテローム動脈硬化症のための処置中ではないことが、血管造影図により明らかである。
【００３８】
幾つかの態様において、対象は心不全またはアテローム動脈硬化症を有さず、心筋梗塞からの回復中ではない。急性心筋梗塞（AMI）とは、心臓への血液の供給の中断により引き起こされる、心筋細胞の死または壊死である。用語「心筋梗塞」および「心臓発作」は、本明細書において、非常に類似した意味、すなわち、一般的な医学および心臓病学の分野における当業者により用いられる同じ意味を有するものとして用いられる。
【００３９】
幾つかの態様において、対象は、６０歳を超えており、肥大を発症する危険があるが、現在は無症状である。かかる対象は、血管造影図に基づいて、処置のために同定することができる。
【００４０】
幾つかの態様において、対象は、降圧剤などの血圧を低下させるための治療中である。異なる手段により血圧を低下させる、多くのクラスの降圧剤が存在する；最も重要であり、最も広く用いられているものの中には、チアジド系利尿薬、ACE阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、およびアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストまたはARBがある。降圧剤の例として、限定されないが、インダパミド、クロルタリドン、メトラゾン、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、アムロジピン、シルニジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタンおよびバルサルタンが挙げられる。
【００４１】
本発明の幾つかの側面は、炎症から生じたものではない心不全を処置する方法を含む。方法は、かかる処置を必要とする対象に、心不全を処置するために有効な量の本発明の化合物、例えばJQ1を投与することを含む。
【００４２】
炎症から生じたものではない心不全は、抗炎症性薬物の適応ではない心不全である。したがって、炎症から生じたものではない心不全を有する対象は、限定されないがステロイド性および非ステロイド性の抗炎症薬などの抗炎症薬を投与されない。炎症から生じたものではない心不全とは、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、および閉塞性冠動脈疾患により引き起こされるものではない。
【００４３】
典型的には、対象は、閉塞性冠動脈疾患を有さないことが、血管造影図により明らかである。幾つかの態様において、対象は、心筋梗塞からの回復中ではない。幾つかの態様において、心不全は、以下に起因する：
（ｉ）閉塞性冠動脈疾患のエビデンスを伴わない、駆出率保持心不全（HFpEF）；
（ｉｉ）薬物（抗がん剤および依存性薬物を含む）の毒性に起因する心不全；
（ｉｉｉ）エタノール乱用により引き起こされる心不全；
（ｉｖ）慢性頻拍（速い心拍）に起因する心不全；
（ｖ）内分泌異常（過剰な甲状腺ホルモン、成長ホルモン、糖尿病、褐色細胞腫）に起因する心不全；
（ｖｉ）高拍出性心不全（貧血または末梢動静脈シャントにより引き起こされるものを含む）；
（ｖｉｉ）栄養障害（チアミン、セレニウム、カルシウムおよびマグネシウム欠乏を含む）により引き起こされる心不全；
（ｖｉｉｉ）ウイルス感染（HIVを含む）に起因する心不全、または
（ｉｘ）先天的な心奇形に起因する心不全。
【００４４】
幾つかの態様において、対象は、降圧剤などの血圧を低下させるための治療中である。異なる手段により血圧を低下させる、多くのクラスの降圧剤が存在する；最も重要であり、最も広く用いられているものの中には、チアジド系利尿薬、ACE阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、およびアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストまたはARBがある。降圧剤の例として、限定されないが、インダパミド、クロルタリドン、メトラゾン、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、アムロジピン、シルニジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタンおよびバルサルタンが挙げられる。
【００４５】
対象は、動物、典型的には哺乳動物である。一側面において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはげっ歯類である。重要な態様において、対象は、ヒトである。
【００４６】
本発明の幾つかの側面は、心筋梗塞を処置するための方法を含む。方法は、かかる処置を必要とする対象に、本発明の化合物、例えばJQ1を、心筋梗塞を処置するために有効な量で投与することを含む。本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の５日後より前には開始されない。幾つかの態様において、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の６日後より前には開始されない。幾つかの態様において、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の７日後より前には開始されない。幾つかの態様において、本発明の化合物、例えばJQ1の投与は、心筋梗塞の８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後より前には開始されない。
【００４７】
典型的には、対象は、ベータ遮断薬およびACE阻害剤処置を投与されている。ベータ遮断薬の例として、限定されないが、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、およびチモロールが挙げられる。ACE阻害剤の例として、限定されないが、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、およびベナゼプリルが挙げられる。幾つかの態様において、対象は、アテローム動脈硬化症を有さないことが、血管造影図により明らかである。幾つかの態様において、対象は心不全を有さない。
【００４８】
本発明の別の側面により、心保護のための方法が提供される。方法は、心毒性を伴う治療を受けている対象に、BET阻害剤を、かかる治療による心毒性を阻害するために有効な量で投与することを含む。
【００４９】
多くの抗がん剤が心毒性作用を有することは、当該分野において知られている。がんを処置するために用いられる多くの治療剤、例えば、限定されないが、古典的な化学療法剤、チロシンキナーゼ受容体を標的とするモノクローナル抗体、低分子チロシンキナーゼ阻害剤、ならびに抗血管新生薬およびシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤などの化学予防剤ですら、全て、心血管系に影響を及ぼす。心毒性を有する化学療法薬の周知の例として、限定されないが、ドキソルビシンおよびダウノルビシンなどのアントラサイクリン、モノクローナル抗体、トラスツズマブ、５−フルオロウラシル、ミトキサントロン、パクリタキセルまたはビンカアルカロイド、タモキシフェン、シクロホスファミド、イマチニブ、トラスツズマブ、カペシタビンまたはシタラビンなどの抗代謝剤、チロシンキナーゼ阻害剤（TKI）ソラフェニブおよびスニチニブ、ならびに血管内皮増殖因子阻害抗体であるベバシズマブが挙げられる。
【００５０】
BET（ブロモドメイン含有リーダータンパク質のブロモドメインおよびエキストラターミナルファミリー）（BRD2、BRD3、BRD4およびBRDT））阻害剤が、筋細胞ストレスの保護剤であることを、予想外に見出した。幾つかの態様において、BET阻害剤は、平滑筋細胞ストレスの保護剤である。したがって、BET阻害剤は、一般的に、かかる抗がん分子の心毒性作用に対して対象を保護することにおいて有用であろう。
【００５１】
BET阻害剤は、アセチル化されたリジン残基へのBETファミリーブロモドメインの結合を阻害する。「BETファミリーブロモドメイン」とは、２つのブロモドメイン、および１つのエキストラターミナル（ET）ドメインまたは、転写調節活性もしくはアセチル化されたリジンに結合する活性を有するそのフラグメントを含むポリペプチドを意味する。例示的なBETファミリーメンバーとして、BRD2、BRD3、BRD4およびBRDTが挙げられる（WO 2011/143669を参照；これは本明細書において参考として援用される）。BET阻害剤の例として、限定されないが、本発明の化合物が挙げられる。BET阻害剤の他の例は、例えばWO 2011/054843、WO 2009/084693、およびJP2008-156311（これらの各々は、本明細書において参考として援用される）において見出すことができる。
【００５２】
本発明の幾つかの側面により、再狭窄を阻害するための方法が提供される。方法は、血管形成術を受けている、および／またはステントを受けている対象に、BET阻害剤を、再狭窄を阻害するために有効な量で投与することを含む。
【００５３】
主幹動脈が急性に閉塞した場合、結果は、例えば心筋の梗塞などの重大なものとなり得る。多くの場合、血管形成術、ステント留置、粥腫切除および移植を含む血管的介入は、しばしば、内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を併発し、これは、動脈の再狭窄または再閉塞（re-clogging）をもたらす。このことは、処置そのものにより引き起こされた内皮細胞の傷害に起因し得る。ステント留置などの経皮経管的介入（PTI）は、不安定粥腫からの液体および／または固体の血流中への放出を急性に引き起こし得、それにより、潜在的に、冠動脈の血栓による閉塞を引き起こす。したがって、不安定粥腫および再狭窄の処置についての必要性が存在する。
【００５４】
再狭窄を処置または予防するために、多様な治療が試みられてきた。例えば、再狭窄の可能性を最小化することを補助するために、治療剤で被覆されたステントの使用が提案されている。パクリタキセルで被覆されたステントは、被覆されていないステントと比較した場合に、再狭窄率を低下させることが示されている。本願の発明者らは、JQ1などのBET阻害剤が、驚くべきことに、心室肥大および血管傷害と関連する筋細胞の増殖（例えば平滑筋細胞の増殖）を阻害することができることを見出した。したがって、BET阻害剤を用いて再狭窄を阻害する方法が提供される。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「再狭窄」とは、狭小化を軽減するための手段が行われた後の、血管（または他の構造）の再狭小化を指す。本発明は、幾つかの例において、対象における再狭窄の発生（もしくは発生率）を減少させること、および／または再狭窄の重篤度もしくは程度を軽減すること、および／または再狭窄に付随する症状を軽減もしくは改善させることを目的とする。再狭窄の重篤度もしくは程度の軽減は、直接的または間接的に測定することができる。例えば、再狭窄の重篤度もしくは程度の軽減は、例えば血管直径の測定を通して、直接的に測定することができる。間接的測定として、機能的測定が挙げられる。機能的測定の性質は、損傷を受けた血管の性質および正常な機能に依存するであろう。機能的測定の一例は、血管を通しての流速および血流の質である。これらの測定は、好ましくは、比較可能であるが未処置の対象からの病歴データに基づいて、再狭窄が起こる可能性が高い場合に行う。かかるタイミングは、処置の数日後、数週間後、数か月後または数年後であり得る。再狭窄に関連する症状の分析もまた、再狭窄し得る血管の性質に依存するであろう。再狭窄が脈管系において起こり得る場合、症状は、血流障害に関連する任意の心血管症状を含み、これは、限定されないが、心臓および脳の症状を含む。これらは、特に労作の後での胸痛（狭心症）、異常な疲労、息切れ、および胸部圧迫感を含み得る。生物学的マーカーもまた、再狭窄の指標として測定することができる。生物学的マーカーの一例はトロポニンであり、これは、再狭窄の存在下で上昇する。再狭窄を検出するために多様な試験が利用可能であり、これらは、イメージング試験（例えばＣＴ、磁気共鳴画像法、放射性核種イメージング、血管造影図、ドップラー超音波、MRAなど）、および運動ストレス試験などの機能的試験を含む。
【００５６】
典型的には、対象は、血管形成術を受けているところである。用語「血管形成術」は、管腔内部のバルーンを用いて血管を拡張することによる、または他の外科的手順による、血管の構造の変更を含む。用語「血管形成術」は、経皮経管的な冠状動脈血管形成術を含む。幾つかの態様において、対象は、ステントを受けているところである。ステントは、血管および他の身体の管腔を支えて開くために用いられる、管状の足場構造である。最も広まっているステントの使用は、詰まった冠動脈を開いて、再狭窄を予防するためのものである。
【００５７】
幾つかの態様において、BET阻害剤は、狭窄の部位において局所的に投与される。狭窄は、血管および他の管状の臓器または構造における異常な狭小化である。幾つかの態様において、BET阻害剤は、カテーテルを介して投与される。幾つかの態様において、BET阻害剤は、ステント上のコーティングの成分として投与される。
【００５８】
BET阻害剤は、アセチル化されたリジン残基へのBETファミリーブロモドメインの結合を阻害する。「BETファミリーブロモドメイン」とは、２つのブロモドメイン、および１つのエキストラターミナル（ET）ドメインまたは、転写調節活性もしくはアセチル化されたリジンに結合する活性を有するそのフラグメントを含むポリペプチドを意味する。例示的なBETファミリーメンバーとして、BRD2、BRD3、BRD4およびBRDTが挙げられる（WO 2011/143669を参照；これは本明細書において参考として援用される）。BET阻害剤の例として、限定されないが、本発明の化合物が挙げられる。BET阻害剤の他の例は、例えばWO 2011/054843、WO 2009/084693、およびJP2008-156311（これらの各々は、本明細書において参考として援用される）において見出すことができる。
【００５９】
本発明の化合物
本発明は、BETファミリーメンバー（例えば、BRD4）の第１のブロモドメインのapo結晶構造の結合ポケットに結合する化合物（例えば、JQ1、ならびに、本明細書、および本明細書において参考として援用されるWO 2011/143669に記述される式の化合物）を提供する。ある態様において、本発明の化合物は、BETファミリーメンバーに結合して、BETファミリーメンバーの生物学的活性を低下させる（例えば、伸長を減少させる）、および／またはBETファミリーメンバーの細胞内局在を妨害する（例えば、クロマチン結合を減少させる）ことができる。
【００６０】
ある態様において、本発明の化合物は、例えばブロモドメインのapo結合ポケットにおける結合部位に結合することにより、BETファミリーメンバー（例えば、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT）の生物学的活性を、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％、防止するか、阻害するか、または妨害するか、または低下させる、および／またはかかるタンパク質の細胞内局在を妨害することができる。
【００６１】
ある態様において、本発明の化合物は、約１０００ダルトン未満、８００ダルトン未満、６００ダルトン未満、５００ダルトン未満、４００ダルトン未満、または約３００ダルトン未満の分子量を有する低分子である。本発明の化合物の例は、JQ1、およびBETファミリーメンバー（例えば、BRD4（本明細書において以下BRD4(1）；PDB ID 20SSとして言及される）の第１のブロモドメインのapo結晶構造の結合ポケットに結合する他の化合物を含む。JQ1は、新規のチエノ−トリアゾロ−１，４−ジアゼピンである。本発明はさらに、かかる化合物の薬学的に受容可能な塩を提供する。
【００６２】
一側面において、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2016520130.tif 000003
式中、
ＸはＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
ＲＢは、Ｈ、アルキル、ヒロドキシルアルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であって、これらの各々は、任意に置換されており；
環Ａは、アリールまたはヘテロアリールであって；
各々のＲＡは、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、縮合したアリールまたはヘテロアリール基を形成してもよく；
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって；これらの各々は、任意に置換されており；
【００６３】
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであって、ここでｎは０〜３であり、Ｌは、Ｈ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｄ（デューテリウム）、ハロゲンまたは任意に置換されたアルキルであり；
各々のＲ３は、独立して、以下：
（ｉ）Ｈ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換されたヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）各々が、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含む、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルまたは置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、これらの各々は、任意に置換されていてもよい；ならびに
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６；
からなる群より選択され、
各々のＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
あるいは、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
Ｒ６は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；あるいはＲ４およびＲ６は、それらが結合している炭素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
ｍは、０、１、２または３であり；
【００６４】
ただし、
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒがフェニルまたは置換されたフェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが１であり、Ｌが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である場合、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、モルホリノ環を形成し；
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換されたフェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが１であり、Ｌが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）であり、Ｒ３およびＲ４のうちの一方がＨである場合、Ｒ３およびＲ４のうちの他方は、メチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換されたフェニル、ピリジルまたは置換されたピリジルではなく；ならびに
（ｃ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換されたフェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが１であり、Ｌが−ＣＯＯ−Ｒ３である場合、Ｒ３は、メチルまたはエチルではない；
の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
【００６５】
ある態様において、Ｒは、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されている。
ある態様において、Ｌは、Ｈ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３または任意に置換されたアリールである。
ある態様において、各々のＲ３は、独立して、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、これは任意に置換され、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含む；またはＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６からなる群より選択される。
ある態様において、Ｒ２は、Ｈ、Ｄ、ハロゲンまたはメチルである。
ある態様において、ＲＢは、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキルまたはアルコキシであって；これらの各々は、任意に置換されている。
ある態様において、ＲＢは、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、またはＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００６６】
ある態様において、環Ａは、５または６員のアリールまたはヘテロアリールである。
ある態様において、環Ａは、チオフラニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリニルである。
ある態様において、環Ａは、フェニルまたはチエニルである。
ある態様において、ｍは、１または２であって、ＲＡの少なくとも１回の出現は、メチルである。
ある態様において、各々のＲＡは、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキルであるか、または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、アリールを形成してもよい。
【００６７】
別の側面において、本発明は、式ＩＩ：
【化２】
2016520130.tif 000004
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
ＲＢは、Ｈ、アルキル、ヒロドキシルアルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であって、これらの各々は、任意に置換されており；
各々のＲＡは、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、縮合したアリールまたはヘテロアリール基を形成してもよく；
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
【００６８】
Ｒ’１は、Ｈ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；
各々のＲ３は、独立して、以下：
（ｉ）Ｈ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換されたヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）各々がＯ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含む、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、；−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル；−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルまたは置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル；これらの各々は、任意に置換されていてもよい；
からなる群より選択され、
ｍは、０、１、２または３であり；
ただし、Ｒ’１が−ＣＯＯ−Ｒ３であり、ＸがＮであり、Ｒが置換されたフェニルであり、およびＲＢがメチルである場合、Ｒ３は、メチルまたはエチルではない；
化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
【００６９】
ある態様において、Ｒは、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されている。ある態様において、Ｒは、フェニルまたはピリジルであって、これらの各々は、任意に置換されている。ある態様において、Ｒは、ｐ−Ｃｌ−フェニル、ｏ−Ｃｌ−フェニル、ｍ−Ｃｌ−フェニル、ｐ−Ｆ−フェニル、ｏ−Ｆ−フェニル、ｍ−Ｆ−フェニルまたはピリジニルである。
ある態様において、Ｒ’１は、−ＣＯＯ−Ｒ３、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；および、Ｒ３は−Ｃ１〜Ｃ８アルキルであって、これは、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含み、およびこれは任意に置換されていてもよい。ある態様において、Ｒ’１は−ＣＯＯ−Ｒ３であり、およびＲ３は、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、sec−ブチルまたはｔ−ブチルであるか；またはＲ’１は、Ｈまたは任意に置換されたフェニルである。
【００７０】
ある態様において、ＲＢは、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
ある態様において、ＲＢは、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、またはＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
ある態様において、各々のＲＡは、独立して、任意に置換されたアルキルであるか、または任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、縮合したアリールを形成してもよい。
ある態様において、各々のＲＡはメチルである。
【００７１】
別の側面において、本発明は、式ＩＩＩ：
【化３】
2016520130.tif 000005
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
【００７２】
ＲＢは、Ｈ、アルキル、ヒロドキシルアルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であって、これらの各々は、任意に置換されており；
環Ａは、アリールまたはヘテロアリールであって；
各々のＲＡは、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、縮合したアリールまたはヘテロアリール基を形成してもよく；
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
【００７３】
各々のＲ３は、独立して、以下：
（ｉ）Ｈ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換されたヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）各々が、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含む、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、；−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルまたは置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、これらの各々は、任意に置換されていてもよい；ならびに
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６；
からなる群より選択され、
【００７４】
各々のＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
あるいは、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
Ｒ６は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；あるいはＲ４およびＲ６は、それらが結合している炭素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
ｍは、０、１、２または３であり；
【００７５】
ただし：
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒがフェニルまたは置換されたフェニルであり、ＲＢがメチルである場合、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、モルホリノ環を形成し；ならびに
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換されたフェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ３およびＲ４のうちの一方がＨである場合、Ｒ３およびＲ４のうちの他方は、メチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換されたフェニル、ピリジルまたは置換されたピリジルではない；
の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
【００７６】
ある態様において、Ｒは、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されている。ある態様において、Ｒは、フェニルまたはピリジルであって、これらの各々は、任意に置換されている。
ある態様において、Ｒは、ｐ−Ｃｌ−フェニル、ｏ−Ｃｌ−フェニル、ｍ−Ｃｌ−フェニル、ｐ−Ｆ−フェニル、ｏ−Ｆ−フェニル、ｍ−Ｆ−フェニルまたはピリジニルである。ある態様において、Ｒ３は、Ｈ、ＮＨ２、またはＮ＝ＣＲ４Ｒ６である。
ある態様において、各々のＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであって；これらの各々は、任意に置換されている。
ある態様において、Ｒ６は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されている。
【００７７】
別の側面において、本発明は、式ＩＶ：
【化４】
2016520130.tif 000006
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
ＲＢは、Ｈ、アルキル、ヒロドキシルアルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であって、これらの各々は、任意に置換されており；
【００７８】
環Ａは、アリールまたはヘテロアリールであって；
各々のＲＡは、独立して、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、縮合したアリールまたはヘテロアリール基を形成してもよく；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであって、ここでｎは０〜３であり、Ｌは、Ｈ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、または任意に置換されたアルキルであり；
【００７９】
各々のＲ３は、独立して、以下：
（ｉ）Ｈ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換されたヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）各々が、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含む、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルまたは置換された−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、これらの各々は、任意に置換されていてもよい；ならびに
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６；
からなる群より選択され、
【００８０】
各々のＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；
あるいは、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
Ｒ６は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって、これらの各々は、任意に置換されており；あるいはＲ４およびＲ６は、それらが結合している炭素原子と一緒に、４〜１０員の環を形成し；
ｍは、０、１、２または３であり；
【００８１】
ただし、
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが０であり、Ｌが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である場合、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒に、モルホリノ環を形成し；
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが０であり、Ｌが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）であり、Ｒ３およびＲ４のうちの一方がＨである場合、Ｒ３およびＲ４のうちの他方は、メチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換されたフェニル、ピリジルまたは置換されたピリジルではなく；ならびに
（ｃ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、およびＲ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであり、ここでｎが０であり、Ｌが−ＣＯＯ−Ｒ３である場合、Ｒ３は、メチルまたはエチルではない；
の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
【００８２】
ある態様において、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌであって、ここで、ｎは０〜３であり、Ｌは、−ＣＯＯ−Ｒ３、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；ならびにＲ３は−Ｃ１〜Ｃ８アルキルであって、これは、Ｏ、ＳまたはＮから選択される０、１、２または３個のヘテロ原子を含み、およびこれは任意に置換されていてもよい。ある態様において、ｎは１または２であり、Ｌは、アルキルまたは−ＣＯＯ−Ｒ３であり、およびＲ３は、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、sec−ブチルまたはｔ−ブチルであるか；あるいは、ｎは１または２であり、Ｌは、Ｈまたは任意に置換されたフェニルである。
ある態様において、Ｒ２は、Ｈまたはメチルである。
ある態様において、ＲＢは、メチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
ある態様において、環Ａは、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリニルである。
ある態様において、各々のＲＡは、独立して、任意に置換されたアルキルであるか、または、任意の２つのＲＡは、各々が結合している原子と一緒に、アリールを形成してもよい。
【００８３】
本発明はまた、式Ｖ〜ＸＸＩＩの化合物、およびWO 2011/143669において記載され、本明細書において参考として援用される全ての化合物を提供する。
ある態様において、化合物は、（＋）−JQ1：
【化５】
2016520130.tif 000007
、その塩、溶媒和物または水和物である。
【００８４】
本発明の化合物は、有効量で投与される。有効量とは、医学的に望ましい結果を提供するために十分な用量であって、当業者は、慣用的な方法を用いてこれを決定することができる。幾つかの態様において、有効量とは、処置されている状態における任意の改善をもたらす量である。幾つかの態様において、有効量は、処置されている疾患もしくは状態の型および程度、ならびに／または１または２以上のさらなる治療剤の使用に依存し得る。しかし当業者は、例えばin vitroおよび／もしくはin vivoの試験、ならびに／または化合物の投与量の他の知識に基づいて、適切な用量および用いるべき治療剤の範囲を決定することができる。
【００８５】
有効量は、典型的には、１日または数日間にわたる１または２以上の用量の投与において、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇで変化するであろう（投与の様式および上で議論された要因に依存する）。
【００８６】
幾つかの態様において、有効量とは、心筋症および／または心肥大の進行を停止させるかまたは阻害するであろう量である。幾つかの態様において、有効量とは、心筋症および／または肥大についてのリスクファクターを有する対象において心筋症および／または肥大の発症すら遅延させる量である。
幾つかの態様において、有効量とは、心不全の進行を停止させるかまたは阻害するであろう量である。幾つかの態様において、有効量とは、心不全についてのリスクファクターを有する対象において心不全の発症すら遅延させる量である。
【００８７】
幾つかの態様において、有効量とは、心臓の傷害を予防および／または軽減するであろうBET阻害剤の量である。任意の特定の患者のための具体的な治療有効用量レベルは、状態の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物、および対象の年齢を含む多様な要因に依存するであろう。投与の責任を有する者が、いかなる場合においても、個々の対象のために適切な用量を決定する。
【００８８】
幾つかの態様において、有効量とは、血管形成術後の血管傷害の部位における冠状動脈平滑筋細胞の増殖を阻害する化合物または停止させるために十分であるBET阻害剤の量である。「有効量」を構成するBET阻害剤の量は、用いられるBET阻害剤、再狭窄の重篤度、ならびに処置されるべきヒトの年齢および体重に依存して変化するであろうが、当業者はこれを、自身の知識および本開示を考慮して、慣用的に決定することができる。
【００８９】
本発明は、以下の例によりさらに説明される。例は、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本願を通して引用される参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含む）の全ての全内容は、本明細書により参考として明示的に援用される。
【００９０】
例
方法：
動物モデル。動物の使用に関する全てのプロトコルは、ケースウェスタンリザーブ大学における研究動物の保護および使用の委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）により承認され、NIHの実験動物の保護および使用のための指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従って行われた。全てのモデルは、C57Bl/6Jマウス（Jackson Laboratories）において行われ、これらは、病原体フリーの施設において、標準的な明暗周期、ならびに食餌および水への自由なアクセスを用いて維持した。
【００９１】
ヒト試料。健康なヒト心臓からのLV試料は、記載されるように（Hannenhalli et al., 2006；Margulies et al., 2005）、ペンシルベニア大学病院（Philadelphia, PA）における研究審査委員会（Investigation Review Committee）に従って得た。核タンパク質は、NE-Perキット（Thermo Scientific＃78833）を用いて、製造者の説明に従って抽出した。不全ヒト心臓に対する非不全ヒト心臓からの左心室からの遺伝子発現プロファイルは、公開されたデータセットからキュレーションした（Hannenhalli et al., 2006）。
【００９２】
JQ1の調製。JQ1は、先に公開されているように（Filippakopoulos et al., 2010）、Dr. James Bradner（DFCI）の研究室において合成および精製した。in vivo実験のために、ストック溶液（DMSO中５０ｍｇ／ｍＬ）を、水性キャリア（１０％ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン；Sigma C0926）中で、５ｍｇ／ｍＬの使用濃度まで、激しい撹拌を用いながら希釈した。マウスに、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回、腹腔内に注射した。ビヒクル対照には、キャリア溶液中の等量のDMSOを投与した。全ての溶液は、無菌技術を用いて調製し、投与した。in vitro実験のために、JQ1および他のBET阻害剤を、対照として等容積のDMSOを用いて、示された濃度においてDMSO中に溶解し、細胞に投与した。用いられたBET阻害剤は、以下のとおりである：iBET、iBET-151、RVX-208およびPF-1。
【００９３】
マウスにおける大動脈縮窄術および慢性PE注入。全てのマウスは、１０〜１２週齢のC57Bl/6Jの同腹仔のオスであった。TACのために、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、機械的人工呼吸を行い（Harvard apparatus）、開胸術に供した。先に記載されているように（Hu et al., 2003）、左右の頸動脈の間で、７．０絹糸および２７ゲージ針を用いて、大動脈弓を狭窄した。本発明者らの元においては、このプロトコルは、大動脈の狭窄された部分にわたって約５０ｍｍＨｇの一貫したピーク圧較差をもたらす。PE注入のために、マウスを、持続的な１％の吸入性イソフルランを用いて麻酔した。ミニ浸透圧ポンプ（Alzet 2004, Durect Corp.）を、塩酸フェニレフリン（PE、Sigma）またはビヒクル（生理食塩水）で満たし、マウスの背側に皮下移植した。PEは、７５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で１７日間にわたり注入した。JQ1またはビヒクルの注射は、手術の１．５日後に開始した。
【００９４】
心エコー、血圧および耐久運動能力測定。経胸壁心エコーのために、マウスを、１％の吸入性イソフルランで麻酔し、Vevo 770 High Resolution Imaging System（Visual Sonics, Inc.）およびRMV-707B 30 MHzプローブを用いてイメージングした。Ｍモードサンプリングから測定値を得、乳頭筋中央部（mid-papillary level）において（Haldar et al., 2010）LV短軸において取得されたEKV画像を統合した。先に記載されているように（Liu et al., 2012）、高周波ドップラーにより、動脈の狭窄された部分の圧較差の測定値を得た。BP2000血圧分析システム（Visitech Systems, Inc.）を、製造者により推奨されるように用いて、覚醒下の尾静脈の収縮期血圧を測定した。マウスを装置に適応させるために、本発明者らは、実験を開始する前に１週間にわたって毎日の血圧測定を行った。先に記載されているように（Haldar et al., 2012）、電動マウストレッドミル（Columbus Instruments）において、トレッドミル耐久運動試験を行った。
【００９５】
NRVM培養。NRVMは、２日齢のSprague-Dawley仔ラット（Charles River）の心臓から単離し、先に記載されているように（Haldar et al., 2010）、標準的条件下において維持した。混入している非筋細胞を取り除くために、細胞培養ディッシュにおいて、１．５時間にわたり細胞を差次的に（differentially）播種した。他に記述されない限り、NRVMは、１０５細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞を、最初に、増殖培地（５％のFBS、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したDMEM）中に、２４〜３６時間にわたり播種し、その後、無血清培地（０．１％のBSA、１％のインスリン−トランスフェリン−セレニウム液体培地補充物（Sigma I3146）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したDMEM）中で維持した。培地は、２〜３日ごとに交換した。アゴニストによる刺激の前に、NRVMを無血清培地中で４８〜７２時間維持した。肥大刺激のために、NRVMを、JQ1と共に、DMSOを対照として、示された濃度において６時間にわたりインキュベートし、その後、PE（１００μＭ）で示された時点にわたり刺激した。
【００９６】
NRVM BRD4免疫蛍光。NRVMを、６ウェルディッシュ中でガラスのカバースリップ上で増殖させた。細胞を３％のPFAを含むPBS中で固定し（１５分間）、PBST／０．２５％のTriton X-100中で透過処理し（１０分間）、PBST／５％のウマ血清中で１時間にわたりブロッキングした。一次抗体（抗サルコメアα−アクチニン、Sigma A7811、１：８００；抗BRD4、Bethyl A301-985A、１：２５０）を、PBST／５％のウマ血清中で１時間にわたり共インキュベートした。二次抗体（ロバα−マウスAlexa 594レッド；ロバα−ウサギAlexa 488グリーン；Jackson Immuno-research）を、PBST／５％のウマ血清中で各１：１０００で１時間にわたり共インキュベートした。カバースリップを、DAPIを含むマウントメディアを用いてスライドガラス上にマウントした。蛍光顕微鏡上で画像を取得した。
【００９７】
細胞面積の測定。NRVMを、６ウェルディッシュ中でガラスカバースリップ上に１０５細胞／ｍＬの密度で播種した。処置の後で、細胞を、２％のPFAを含むPBS中で短時間固定し、PBST／０．１％のTriton X-100で透過処理し、PBST／５％のウマ血清中でブロッキングした。一次抗体は、１：８００における抗サルコメアα−アクチニン（Sigma A7811）であった。フルオロフォアでタグ付けされた抗マウス二次抗体（α−マウスAlexa 488グリーン）を、１：１０００希釈で用いた。カバースリップを、DAPIを含むマウントメディアを用いてスライドガラス上にマウントした。心筋細胞の細胞表面面積の定量は、先に記載されているように（Liang et al., 2001）α−アクチニン染色された心筋細胞において、蛍光顕微鏡およびNIH Image Jソフトウェアを用いて行った。分析は、４００×の倍率において、２０〜３０個の視野における、少なくとも１００個の心筋細胞からなった。このプロセスを、少なくとも３回の独立した実験において繰り返し、データを組み合わせた。
【００９８】
RNAの精製およびqRT-PCR。組織RNAのために、１ピースあたり１０〜２０ｍｇのマウス心臓組織を、RNA Later安定化試薬（Qiagen）中で保存し、その後、PureZOL（BioRad）中で、TissueLyser（Qiagen）において、ステンレススチールビーズ（Qiagen）を用いて機械的破壊／ホモジナイズした。クロロホルムで水相を抽出した。Aurum精製キット（BioRad＃732-6830）を製造者の指示に従って用いて、水相からRNAを精製した。細胞試料のために、High Pure RNA単離キット（Roche＃11828665001）を、製造者の指示に従って、オンカラムでのDNAase処置と共に用いて、NRVMからの全RNAを単離した。iScriptTM RT Supermix（Biorad＃170-8841）を製造者のプロトコルに従って用いて、精製されたRNAを相補的DNAへと逆転写した。定量リアルタイムPCRは、TaqMan化学（Fast Start Universal Probe Master（Rocheカタログ＃4914058001）およびRoche製の標識プローブUniversal Probe Library System）を用いて、Roche LightCycler上でを行った。示されたとおり、ΔΔＣｔ法を構成遺伝子に対する正規化と共に用いて、相対的発現を計算した。
【００９９】
ウェスタンブロット。総細胞タンパク質のために、プロテアーゼ阻害剤タブレット（Rocheカタログ＃4693132001）を補充したRIPAバッファー（Sigma R0278）中で、細胞を溶解した。NE-Perキット（Thermo Scientific＃78833）を製造者の指示に従って用いて、核タンパク質を単離した。ホールセルタンパク質抽出物のうちの２０〜４０μｇ、または核タンパク質抽出物のうちの２０μｇを、SDS PAGE、ニトロセルロース膜へのトランスファー、および以下の抗体を用いたウェスタンブロットに供した：BRD4（Bethyl＃A301-985A）、チューブリン（Sigma T9026）、RNAポリメラーゼII（Santa Cruz N-20、sc-899）。
【０１００】
Brd4ノックダウン。マウス／ラットBrd4に対するshRNAのために、ヘアピン配列５’−GCGGTAAGATGTACATCAA ACGTGTGCTGTCCGT TTGGTGTACATCTTGCTGC−３’（ループ配列に下線を付した）を、pEQアデノウイルス−shRNAベクター（Welgen, Inc.）中にサブクローニングした。sham−Brd4およびsham−対照（スクランブルshRNA）のための組み換えアデノウイルスは、Welgen, Inc.により増幅および精製された。NRVMは、アデノウイルス（５〜１０MOI）と共に２４時間にわたりインキュベートし、その後、さらなる２４時間にわたりフレッシュな無血清培地の交換を行った。最初の感染の４８時間後に、細胞をPEで刺激した。
【０１０１】
クロマチン免疫沈降。NRVMを、１５ｃｍディッシュに、５×１０６細胞／ディッシュで播種した。約１５×１０６のNRVMからプールしたクロマチンを、各々の免疫沈降のために用いた。示された処置の後で、NRVMを、直接ディッシュ上において１％のホルムアルデヒドで１０分間にわたり固定し、その後、０．１２５Ｍのグリシンで５分間にわたりクエンチした。クロマチンを抽出し、その後、BioRuptor（Diagenode；合計１６サイクル、ハイパワー、３０秒オン／オフ）で剪断した。超音波処理されたクロマチンを、Dynabeads（Invitrogen）に結合した５μｇの抗体で免疫沈降し、その後、しっかりと洗浄し、溶離させた。次いで、免疫沈降物とインプット（input）クロマチン試料とを、逆架橋（reverse cross-link）し、その後、ゲノムDNAの精製を行った。免疫沈降物およびインプット試料の両方において、Sybrgreen化学を用いて、ゲノムDNAの標的および非標的領域をqRT-PCRにより増幅した。先に記載されているように（Ott et al., 2012）、各々の試料について、インプットDNAのうちの免疫沈降したDNAのパーセンテージを計算することにより、濃縮データを分析した。ChIPにおいて用いられた抗体は、BRD4（Bethyl＃A301-985A）およびRNAポリメラーゼII（Santa Cruz N-20, sc-899）であった。
【０１０２】
組織学的分析。心室中部（mid-ventricle）からの短軸心臓切片を、PBS／４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。心筋細胞の断面積は、先に記載されているように定量されたとおりに（Froese et al., 2011）ローダミン共役されたコムギ胚芽アグルチニン（Vector Laboratories RL-1022）による染色により決定した。先に記載されているように（Song et al., 2010）、Massonのトリクローム染色キット（Biocare medical）を用いて線維化を可視化し、線維化面積を定量した。先に記載されているように（Song et al., 2010）、ApopTag Plus kit（Millipore）を製造者の指示に従って用いて、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）染色および定量を行った。先に記載されているように（Haldar et al., 2010）、凍結LV切片において、抗PECAM-1抗体（EMD Millipore カタログ＃ CBL-1337）を用いて、心筋毛細血管染色を行った。
【０１０３】
統計学的分析。データは、平均値±標準誤差として記録されている。マイクロアレイデータの分析において用いられる統計学的方法は、別に上で詳細に記載する。２群間の平均値の比較は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いる両側スチューデントｔ検定を用いて分析した。全ての分析のために、Ｐ値＜０．０５を有意と考えた。
【０１０４】
結果：
BETブロモドメインは、in vitroでの病的な心筋細胞肥大の細胞自律的な調節因子である。
心臓におけるBETの発現パターンを評価した。新生仔ラット心室心筋細胞（NRVM）および成体マウス心室組織の分析により、Brd2、Brd3およびBrd4は、検出可能であり、Brd4が最も発現量が高い転写物であったことが明らかになった（図１Ａ〜Ｂ）。NRVM、マウス心臓組織およびヒト心臓組織におけるウェスタンブロットは、豊富なBRD4の発現を確認し（図１Ｃ）、NRVMの免疫蛍光染色は、BRD4が核に局在することを示した（図１Ｄ）。BETは、刺激に特異的な遺伝子発現プログラムと細胞の状態に特異的な遺伝子発現プログラムとを転写により共活性化するそれらの能力を介する、細胞変換の重要な調節因子であることが知られている（Filippakopoulos et al., 2010；Lockwood et al., 2012）ため、心筋細胞肥大において役割を果たし得ると仮定した。このプロセスにおけるBETの役割を研究するために、低分子プローブJQ1の特性を利用した（図２Ａ）。これは、第２のブロモドメインの競合的結合、およびその結果としてのアセチル化クロマチンからのこれらのエピジェネティックなリーダータンパク質の解離を介して、BETの機能を特異的かつ強力に阻害する（Filippakopoulos et al., 2010）。広く用いられているNRVMモデル（Simpson et al., 1982；Starksen et al., 1986）において、ナノモル濃度の用量のJQ1は、フェニレフリン（PE）により媒介される細胞の肥大（図２Ｂ）および病的な遺伝子誘導（図２Ｃ）を著しくブロックした。類似の様式において、NRVMにおけるBrd4のノックダウン（図１Ｅ）もまた、PEにより媒介される肥大性増殖（図２Ｄ）および病的な遺伝子誘導（図２Ｅ）を減弱した。次に、複数の構造的に多様なBET阻害剤（iBET、iBET-151、RVX-208、PF-1；図１Ｆ）を、心筋細胞肥大を阻害するそれらの能力について評価した。等モル用量において、アゴニストにより誘導される心筋細胞肥大の阻害は、実際に、BET阻害剤のクラスの効果であり、これらの化合物の相対的効力は、それらのBRD4に対する既知のIC50と相関することを見出した。（Filippakopoulos et al., 2010）。まとめると、これらのデータは、BETブロモドメインタンパク質が、病的心筋細胞肥大の細胞自律的な調節因子であること、および低分子BET阻害剤JQ1が、in vitroで強力な抗肥大効果を有することを示す。
【０１０５】
BETは、心筋細胞における病的な遺伝子発現プログラムの誘導のために必要とされる
肥大性の形質転換の間のBETブロモドメイン阻害の転写に対する効果を決定するために、培養NRVMにおいて、基線、およびPE刺激後（１．５、６、４８時間）に、JQ1の存在下または不在下で、遺伝子発現プロファイリング（GEP）研究を行った。c-Mycなどの初期応答遺伝子（Starksen et al., 1986）および最終的な肥大性遺伝子プログラムの誘導を捕捉するために、これらの３つ時点を評価した。発現が異なる転写物の評価により、３つの主要なクラスターが明らかとなった：PEにより誘導可能であってJQ1により抑制された遺伝子、PEにより誘導可能であってJQ1により影響を受けない遺伝子、およびPEにより抑制され、JQ1により影響を受けない遺伝子。PEにより媒介される変化の最大量に基づいて選択された遺伝子のヒートマップは、これらのクラスターの各々を説明する（図３Ａ）。これらのGEPの網羅的分析は、PE刺激が、４５０を超える遺伝子の累積的誘導をもたらしたこと、およびJQ1の優性な効果は、PEにより媒介される遺伝子誘導を減弱するか、またはこれを完全に抑止することであったことを明らかにした。これらの転写に対する効果は、１．５時間において明らかであり、経時的に増大した（図２Ｂ〜Ｃ）。この知見は、誘導性遺伝子発現プログラムの必須のコアクチベーターとしての、BETの既知の役割と一致する。PEにより誘導可能であってJQ1により抑制される転写物の機能的経路分析により、BETが、病的な心筋細胞の活性化に関与することが知られている宿主の生物学的プロセス（細胞骨格の再組織化、細胞外マトリックスの生成、細胞周期への再進入、細胞増殖のパラクリン／オートクリン刺激、および炎症促進性シグナル伝達（図３Ｄ）（Song et al., 2012；Zhao et al., 2004））において、必須の役割を果たすことが明らかとなった。肥大促進性サイトカインであるIL6を代表的な標的として用いて（del Vescovo et al., 2013）、本発明者らは、qRT-PCRにより、JQ1が、そのPEにより媒介される誘導を著しく減弱したことを確認した（図３Ｅ）。病理学的ストレスの間のBETの活性の増大は、PEにより媒介されるそれら自体の発現の増大に起因するものではない（図４Ａ）。クロマチン免疫沈降（ChIP）研究は、PEに応答して内因性のBRD4およびPol IIがIL6の近位のプロモーターに動員されるが、一方で、JQ1がこの動員をブロックすることを示した（図３Ｆ）。興味深いことに、BETブロモドメイン阻害は、c-MycのPEにより媒介される誘導に影響を及ぼさない（図３Ｇ）。c-Mycは、特定の骨髄腫瘍においてBETにより直接的に調節される重要な標的であり、病的心肥大の確立された転写ドライバーでもある（Starksen et al., 1986；Xiao et al., 2001；Zhong et al., 2006）。まとめると、これらのin vitroデータ（図２および３）は、BETブロモドメイン含有タンパク質は、細胞自律的な様式で、広範であるが特異的な転写プログラムの共活性化を介して、心筋細胞肥大を調節することを示す。
【０１０６】
BETブロモドメイン阻害は、in vivoで、病的な肥大および心不全を停止させる。
培養心筋細胞における本発明者らの所見を考慮して、BETは、インタクトな生体において、病的な心臓のリモデリングを調節し得ると仮定した。JQ1の有利な治療指数を利用した。これは、５０ｍｇ／ｋｇ／日において慢性に投与された場合において著しい毒性をもたらすことなく、成体マウスにおいてBETブロモドメインの機能を強力に阻害することが先に示されている（Delmore et al., 2011；Filippakopoulos et al., 2010；Matzuk et al., 2012）。独立したアッセイにおいて、この主要な毒性の不在は、この用量のJQ1で２〜３週間にわたり処置されたマウスが、世界的な心血管代謝の健康の計量手段である耐久運動能力を保持したことを示すことにより確認された（図６Ａ）。in vivoでの研究のために、よく特徴づけられたモデルである、大動脈縮窄術（TAC）を用いた。TACは、心臓に限局的な血行動態ストレスを提供し、ヒトにおける病的肥大およびHFの幾つかの主要な側面を再現する（Rockman et al., 1991）。TACを行った成体マウスは、７〜１０日までに、同心円状の左心室肥大（LVH）を生じ、３〜４週間後に進行性心不全に移行する。TACまたはsham手術を行い、その後、TACの開始の約１．５日後に、JQ1を投与した（５０ｍｇ／ｋｇ／日、等容積のビヒクルを対照とする）（図５Ａ）。連続的心エコーは、JQ1が、TACにより媒介されるLV収縮不全、腔の拡大および心壁肥厚に対して保護したことを示し、効果は４週間までも持続した（図５Ｂ〜Ｄ、図６Ｂ）。JQ1処置はまた、TACの後の、病的心拡大（図５Ｅ；代表的な写真を図５Ｇにおいて示す）、肺鬱血（図５Ｆ）、および心筋の古典的な肥大マーカー遺伝子の発現（図５Ｈ）を阻害した。JQ1は、ビヒクル処置マウスと比較した場合の、正常な活動、および著しい死亡率または体重減少の不在により証明されるように、TACの間に良好に耐容された（データは示さず）。さらに、JQ1は、shamマウスにおいて、LVの構造または機能に対して有害効果を有さなかった（図５Ｅ〜Ｇおよび図６Ａ）。重要なことに、JQ1は、全身の血圧に影響を及ぼさない（図６Ｃ）。さらに、TACモデルにおけるJQ1の保護効果は、大動脈狭窄における圧較差の差異を伴わなかった（図６Ｄ）。
【０１０７】
血行動態ストレスに加えて、過剰な神経ホルモンの活性化もまた、病的心肥大の中心的なドライバーである（Hill and Olson, 2008；van Berlo et al., 2013）。したがって、JQ1が、神経ホルモンにより媒介される心肥大のマウスモデルにおける病態を改善させることができるか否かを評価した。マウスに、フェニレフリン（PE、７５ｍｇ／ｋｇ／日、生理食塩水を対照とする）を送達する浸透圧ミニポンプを移植し、その後、ミニポンプの挿入の１．５日後にJQ1またはビヒクルの投与を開始した。この注入プロトコルは、典型的には、２〜３週間のうちに、強力な同心円状のLVHを生じるが、野生型マウスにおいて、著しいLV腔の拡大またはLVの収縮機能の低下を引き起こさない。上のTACの結果と一致して、JQ1は、LVの収縮機能を少しも損なうことなく、慢性PE注入の間の病的心肥大の発症を強力に抑制した（図５Ｉ）。
【０１０８】
心臓の機能に対するその有利な効果に加えて、JQ1がまた、in vivoで、HFの主要な病理組織学的特徴を改善させるか否かを評価した。心臓組織の分析は、JQ1が、典型的にはTACの４週間後に観察される（Sano et al., 2007；Song et al., 2010）、心筋細胞肥大（図７Ａ）、心筋線維症（図７Ｂ）、アポトーシスによる細胞死（図７Ｃ）、および毛細管希薄化（図７Ｄ）の発生を著しく減弱したことを示した。まとめると、図５および７における結果は、BETの機能は、血行動態ストレスおよび神経ホルモンにより媒介されるストレス下のいずれにおいても、in vivoでの病的な心臓のリモデリングの発生のために重要であることを示す。さらに、これらのデータは、低分子JQ1による選択的BETブロモドメイン阻害が、心不全の動物モデルにおいて、良好に耐容され、効果的であることを確立する。
【０１０９】
BET阻害は、in vivoで病的な心臓の遺伝子発現プログラムを抑制する。
BETがストレスにより誘導される病的リモデリングをin vivoで調節する機構をよりよく理解するために、マウス心筋組織の動力学的GEPを行った。TACモデルを用いて、３群（sham−ビヒクル、TAC−ビヒクル、およびTAC−JQ1）において、３つの時点：３日（肥大の発症に先立って起こる初期のイベントを反映させるため）、１１日（確立された肥大）、および２８日（HFの徴候を伴う進行性病的リモデリング）において（図２Ｂ）、マイクロアレイを行った。GEPの教師なし階層的クラスタリングにより、TAC−ビヒクル群が、sham−ビヒクル群と比較して、時間と共に生じる区別し得るトランススクリプトームのシグネチャを有したことが明らかとなった（図２Ｂ）。対照的に、TAC-JQ1 GEPは、sham群によりクラスター化し、TACへの持続的暴露にもかかわらず、著しい時間的変化を示さなかった（図２Ｂ）。したがって、JQ1処置は、心臓における広範な病的遺伝子発現プログラムの発生を抑制し、この効果はTACの３日後から明らかであった。本発明者らの単離心筋細胞におけるGEP（図３）と類似して、発現が異なる転写物の網羅的分析により、３つの主要なクラスターが明らかとなった：TACにより誘導可能であってJQ1により抑制された遺伝子、TACにより誘導可能であってJQ1により影響を受けないもの、およびTACにより抑制され、JQ1により影響を受けないもの。遺伝子代表的なヒートマップ（TACにより媒介される変化の量が最大であるために選択した）は、これら３つのクラスターの各々を強調する（図８Ｃ）。TACは、心筋のBrd2、Brd3またはBrd4の発現そのものを著しく改変しなかった（図９Ａ）。モデルにおける経時的なTACおよびBETブロモドメイン阻害の網羅的なトランススクリプトーム効果を可視化するために、Gene Expression Dynamics Inspector（GEDI）分析（Eichler et al., 2003）を行った。shamのモザイクが時間的に不変であり続ける一方で、TACは、経時的に遺伝子のクラスターの進行的な誘導をもたらした。これは、モザイク内の多数のタイルにおけるシグナルの増大により示される（図８Ｄ）。BETブロモドメイン阻害は、このTACにより誘導される病的な転写プログラムの時間的な発生を抑制し、モザイクシグネチャは、sham群により類似した（図８Ｄ）。TACにより誘導可能であってJQ1により抑制される転写物の機能的経路分析は、in vivoでの病的な心筋リモデリングおよび心不全の進行に関与する重要な生物学的プロセス（細胞外マトリックス合成、細胞周期への再進入、炎症促進性の活性化、およびケモカイン／サイトカインシグナル伝達（図８Ｇ）を含む）の濃縮を示した（Song et al., 2012；Zhao et al., 2004）。重要なことに、これらの機能的用語は、単離されたNRVMからのデータ（図３Ｄ）、および進行性ヒトHFにおいて普遍的に観察される代表的な病理学的プロセス（Hannenhalli et al., 2006；Lin et al., 2011）と一致した。
【０１１０】
刺激と共役した遺伝子誘導は、DNAに結合する転写因子と、より高次におけるクロマチン構造の変化との間の動力学的相互作用を介して起こる（Lee and Young, 2013；Schreiber and Bernstein, 2002）。JQ1を用いて観察される心筋遺伝子の発現に対する広範な効果を考慮して、BETは、in vivoで複数の転写因子経路を協調的に共活性化するそれらの能力を介して、病的な遺伝子誘導を可能にすると仮定した。遺伝子セット濃縮分析（GSEA）（Subramanian et al., 2005）を用いて、本発明者らのTACにより誘導可能であってBET阻害により抑制された遺伝子のセットを、転写因子シグネチャの一覧に対して比較した。具体的には、以下に対してGSEAを行った：（ａ）The Broad Institute Molecular Signatures DatabaseのＣ３モチーフ遺伝子セット（Xie et al., 2005）、ならびに（ｂ）結節性の肥大促進性転写エフェクターの心筋細胞特異的な活性化により駆動される、３つの独立したGEP−カルシニューリン−NFAT（Bousette et al., 2010）、NFκB（Maier et al., 2012）およびGATA4（Heineke et al., 2007）。これらの分析により、TACにより誘導される遺伝子発現プロファイルは、IRFおよびEtsモチーフ（ｑ＜０．０００１）、ならびにカルシニューリン、NFκBおよびGATA4の活性化からもたらされる心筋シグネチャについて、正に濃縮されたことが明らかとなった：（図８Ｇ）。逆に、JQ1の効果は、これらの同じTFシグネチャについて、強力な負の濃縮を示した（図５Ｇ）。対照的に、TACはc-MycおよびE2Fシグネチャの両方と強力に相関したが、一方で、c-Myc/E2FとJQ1の効果との間には、いかなる時点においても相関は存在しなかった（図９Ｂ；E2Fについてはデータは示さず）。本発明者らのNRVM研究と一致して、JQ1が、in vivoで、TACにより媒介されるc-Mycの発現の誘導に対して効果を有しなかったこともまた見出された（図９Ｃ）。したがって、これらのGSEAは、BETブロモドメインが、広範であるが特異的な心筋転写因子ネットワークの共活性化を介して、遺伝子誘導を促進するモデルを支持する。
【０１１１】
次に、TAC誘導性の遺伝子のセットであってJQ1により抑制されるものを、ヒトにおける進行期の非虚血性および虚血性の心不全の検証された遺伝子発現プロファイルに対して比較した（Hannenhalli et al., 2006）。この分析は、マウスTACモデルにおけるBETの標的が、ヒト心不全において誘導される遺伝子のセットと統計学的に有意な様式において重複することを示した（図１０Ａ；χ２＜２×１０−１４）。興味深いことに、これらの標的のうちの大多数（９０％）は、虚血性および非虚血性の両方のヒト心不全に共通した（図１０Ｂ）。したがって、TACを行ったマウスの遺伝子発現プロファイルが、ヒトコホートにおける進行性心不全の遺伝子発現プロファイルと重複する限りにおいては、マウスにおけるBETシグナル伝達の転写標的もまた、ヒト疾患において関連することが見出された。
【０１１２】
JQ1は、マウスTACモデルにおける予め確立された病的リモデリングを改善させる
成体マウスに、大動脈縮窄術（TAC）を用いて圧負荷をかけた。JQ1またはビヒクルを、著しい病態が既に発症している時点であるTAC後第１８日に開始した（図１１）。JQ1は、著しい心臓の病態が既に発症した後に投与された場合ですら、（図１１Ｂ）LV収縮不全、（図１１Ｃ）LV腔の拡大、（図１１Ｄ）LV壁肥厚、および（図１１Ｅ）心拡大の進行を著しく減弱する（Ｎ＝群あたり６〜１２）。このデータは、ヒトにおける予め確立された心疾患に高度に関連する実験セッティングにおいて、BETブロモドメイン阻害の効力を実証する。例えば、患者は、典型的には、既存のまたは確立された心肥大および／または心不全を呈する。このデータは、JQ1によるBETブロモドメイン阻害が、予め確立された心肥大および心不全のセッティングにおいてすら、有効であることを示す。
【０１１３】
JQ1は、マウスにおける広範囲前壁MI後の病的リモデリングを阻害する（ｎ＝５およびｎ＝５〜１０）
広範囲前壁心筋梗塞（MI）を起こさせるために、マウスに、近位LAD永久結紮を行った。JQ1またはビヒクルは、示された用量で（２５ｍｇ／ｋｇ／日または５０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内注射）、術後第５日において開始した。この投与レジメンにより、ビヒクル対照に対して、JQ1を用いて、過剰な死亡率、心筋破裂およびLV動脈瘤形成は観察されなかった（図１２）。JQ1は、（図１２Ｂおよび１５Ｂ）LV収縮不全、（図１２Ｃおよび１５Ｃ）LV腔の拡大、（図１２Ｄおよび１５Ｄ）LV壁肥厚、および（図１２Ｅおよび１５Ｅ）広範囲前壁心筋梗塞後の心拡大の発生を減弱する（図１２−Ｎ＝群あたり５；図１５−sham群においてはＮ＝５、ＭＩ群においてはＮ＝１０）。このデータは、ヒト疾患に高度に関連する実験セッティングにおける、BETブロモドメイン阻害の効力を実証する。心筋梗塞の後で、梗塞を起こさなかった心筋の遠位領域において、心臓の異常なリモデリングが起こり、心臓の拡張、拡大および収縮不全をもたらす。これは非常に一般的な心不全の原因である。このデータは、BETブロモドメイン阻害は、心筋の梗塞を起こさなかった領域を病的リモデリングから保護し、したがって全体的な心臓の機能を保つことを示す。このモデルまたはTACモデルのいずれも、アテローム動脈硬化症を含まない。したがって、これらのセッティングにおいて心臓を保護する能力は、アテローム動脈硬化症に対するいかなる効果とも無関係である。これらのデータは、心筋梗塞（MI）のマウスモデルにおける病的な心臓のリモデリングにおけるBETブロモドメイン阻害（JQ1を用いての）の効力を実証する。MI後の病的リモデリングの幾つかの主要なパラメーターにおいて、統計学的に有意な効果が達成された。
【０１１４】
JQ1は、培養心筋細胞においてドキソルビシンにより媒介されるアポトーシスを阻害する。
ドキソルビシン（Doxo）は、がんのための細胞傷害性化学療法剤として一般的に用いられる、アントラサイクリン化合物である。Doxoは、心筋細胞に対して用量依存的な毒性を引き起こし、患者における心拡大、線維化および心不全を引き起こし得る。心毒性は、ドキソルビシンおよびダウノルビシンなどのアントラサイクリンについて、用量制限的である。図１３は、JQ1によるBETブロモドメイン阻害が、培養心筋細胞においてDoxoにより誘導される心毒性をブロックすることを示す。新生仔ラット心室心筋細胞（NRVM）を、JQ1（２５０ｎＭ）を用いてまたはこれを用いずに、３時間にわたり処置し、その後、±Doxo（１μＭ）で、さらに２４時間にわたり処置した。細胞を、TUNEL染色によりアポトーシスについてアッセイし、核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡で画像を取得し、TUNEL陽性核を定量した（ｎ＝５；*ビヒクル、（−）Doxoに対してＰ＜０．０５；#ビヒクル、（＋）Doxoに対してＰ＜０．０５）。これらのデータは、JQ1によるBETブロモドメイン阻害は、アントラサイクリンなどの心毒性化学物質から心臓を保護することができることを支持する。これらのデータは、がん治療の間の心保護剤としてのJQ1の有用性を、JQ1はまた抗がん特性をも有するというさらなる利益と共に、支持する。
【０１１５】
JQ1は、病的な平滑筋細胞の活性化の主要な特徴を阻害する
全ての実験は、初代ラット大動脈平滑筋細胞（RASMC）、PDGF-bb（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびJQ1（５００ｎＭ）を用いて行った。JQ1は、アゴニストPDGF-bbに対する応答における病的な平滑筋活性化の顕著な特徴（（図１４Ａ）増殖（放射標識チミジンの取り込みにより定量される）、（図１４Ｂ）遊走（Transwell遊走アッセイを用いて定量される）、および（図１４Ｃ）病的な遺伝子誘導（Ptgs2／Cox2について示されるqRT-PCR）など）をブロックする。これらの知見は、病的な平滑筋の増殖に対するBETブロモドメイン阻害の効力を支持する（群あたりｎ＝３〜６；*ビヒクルに対してＰ＜０．０５；** PDGF-bbに対してＰ＜０．０５）。
【０１１６】
考察
本研究は、BETブロモドメインリーダータンパク質を、病的な心臓のリモデリングおよび心不全の進行の必須の調節因子として意味づける。Brd4ノックダウンおよび低分子BET阻害剤を用いる培養心筋細胞における研究は、心筋細胞肥大におけるこれらのタンパク質についての細胞自律的な役割を確立する。さらに、BETブロモドメインとアセチル化クロマチンとの相互作用を特異的に妨害する低分子であるJQ1は、病的肥大およびHFの発生を強力に減弱することを、２つの独立したマウスモデルにおいて示した。遺伝子発現のプロファイリングおよびChIP研究により、BETは、重要な肥大促進性転写ネットワークを共活性化し、Pol IIをプロモーターへと動員する能力を介して、病理学的標的の広範なプログラムを調節することが明らかとなった。幾つかのがんにおける所見とは対照的に（Delmore et al., 2011；Ott et al., 2012；Toyoshima et al., 2012；Zuber et al., 2011）、BETは、心筋におけるc-Mycの発現または機能を直接的には調節せず、したがって、BETの転写的機能は、高度に状況特異的であることのさらなる証左を提供する。
【０１１７】
本発明者らの培養心筋細胞およびマウス心臓における遺伝子発現プロファイルは、BETが心筋において標的特異性を有することを、明らかに示す（図３および８）。発生、分化および疾患における細胞の状態の変遷の間に起こるヒストンアセチル化のゲノムワイドな変化（Lee and Young, 2013）を考慮すると、BET依存的なシグナル伝達に特性を付与する機構は、この急速に発展している分野において、重要な未解決の問題である。BETの翻訳後修飾と、他のタンパク質のBETとの相互作用との組み合わせが、ヒストンアセチル化における全体的な変化を超えて、それらの標的遺伝子特異性のさらなる決定要因として働く可能性がある。癌細胞における最近の研究は、カゼインキナーゼ２（CK2）による、BRD4の特定のセリン残基におけるリン酸化が、転写因子p53と機能的に相互作用してこれを共活性化するその能力に影響を及ぼすことを示している（Wu et al., 2013）。注目すべきことに、マウスにおける遺伝子研究は、CK2が心肥大の正の調節因子であることを示す（Eom et al., 2011）。CK2により媒介されるBRD4のリン酸化などの刺激と共役した翻訳後修飾がまた、心臓においてBETを活性化するか否かを研究することは重要であろう。さらに、BETの、特定の転写因子経路（例えばNFAT、GATA4、NFκB）を共活性化するが、他のもの（例えばc-Myc）は共活性化しない能力は、部分的に、心筋における刺激と共役した特異的タンパク質複合体の形成に由来し得る。
【０１１８】
タンパク質相互作用の研究に加えて、心臓における広いBETゲノムのクロマチン局在を、基底の状態下に対して病理学的状態（例えばsham／TAC）下において、定義することが重要であろう。ここで、BETは、心筋細胞において、ストレスにより誘導される標的遺伝子の近位プロモーターに動員されて、転写開始部位におけるPol IIの濃縮を促進することを示した（図３Ｆ）。BET、Pol II、および重要なアセチル−ヒストンマークについてのChIP-Seq分析は、本明細書において提供される遺伝子発現プロファイルと比較した場合に、病理学的ストレスの間に起こるクロマチンの状態の動力学的変化、およびこれらの変化がどのようにしてBETブロモドメイン阻害により影響を受けるかについての洞察を提供する。これらのクロマチンの状況は、BRD4などの心筋BETが、ストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域およびエンハンサー領域の両方に存在するか否かを明らかにするであろう。さらに、心臓ゲノムにわたるPol IIの濃縮パターンに対するJQ1の効果は、de novoでのPol IIの動員、用意された遺伝子座におけるPol IIの一時停止−遊離（pause-release）、および転写の伸長などのプロセスにおけるBETのための潜在的役割についての洞察を提供するであろう（Lee and Young, 2013）。最後に、転写因子結合と組み合わせたゲノム全体にわたるBETのクロマチン占有率のバイオインフォマティクス分析は、これらのエピジェネティックリーダーと、それらが共活性化するDNA結合因子の特定のサブセットとの間の相互作用についての我々の理解を、大きく改善するであろう。「スーパーエンハンサー（super-enhancer）」と称される、細胞特異的な主要調節的エンハンサー（master-regulatory enhancer）のサブセットにおけるBRD4の顕著な濃縮を示す最近の研究を考慮すると、推定の心筋スーパーエンハンサーに対するBETの優先的なローディングもまた、心不全の間のストレスにより誘導される転写プログラムの選択的誘導を駆動する可能性がある。成体マウス心臓組織におけるゲノムワイドなクロマチン状態マップの構築の実現可能性が得られつつあることから（Sayed et al., 2013）、心筋BETシグナル伝達の分野へのこの技術の応用は、刺激的な将来の研究の領域となるであろう。
【０１１９】
心不全の開始および進行は、心筋細胞、心臓線維芽細胞、およびストレスを受けた心筋に存在し得る他の細胞型の間の病理学的クロストークを介して起こることが知られている（van Berlo et al., 2013）。HFのTACモデルは、心臓に対して相対的に限局性のストレスを提供し、JQ1は、血圧または血行動態負荷に対する影響を伴うことなく、病的リモデリングを減弱する（図６Ｃ〜Ｄ）が、一方で、本発明者らはin vivoでのBETブロモドメイン阻害が、心筋細胞に対してのみではなく、また、心臓線維芽細胞および心筋の他の細胞成分に対しても作用し得ることを認識した。しかし、本発明者らのデータは、３つ全てのBETがげっ歯類の心筋細胞および心臓組織において発現する一方で、Brd4が最も高いレベルで発現することを確立する（図１Ａ〜Ｂ）。さらに、単離された培養心筋細胞におけるBETブロモドメイン阻害およびBrd4ノックダウンの両方が、in vitroで病的な心筋細胞肥大を減弱する（図２）。まとめると、これらのデータは、心筋細胞におけるBRD4の細胞自律的な役割を同定し、それがin vivoでのJQ1の重要な標的であることを示唆する。細胞型および時間的に限定された、Brd4および他のBETファミリーメンバーの、成体マウスにおけるターゲティングを用いる将来の研究は、心不全の実験モデルにおいて、それらの遺伝子特異的および組織特異的な機能を注解するために役立つであろう。
【０１２０】
過去１５年間にわたり、マウスにおける遺伝子ターゲティングアプローチは、実際に、心臓の肥大および不全を支配する分子機構についての重要な洞察を提供してきた（van Berlo et al., 2013）。BETについてのかかる戦略を企図して、本発明者らは、Brd4ヌルおよびBrd2ヌル接合体が生育不能であること、ならびに生殖系列Brd4のハプロ不全が、重篤な発達異常をもたらすことを認めた（Houzelstein et al., 2002）。したがって、HFの成体マウスモデルにおけるBET機能喪失の遺伝子研究は、組織特異的かつ誘導型である条件的なアプローチを必要とする可能性がある。現在まで、BET遺伝子のいずれについても、条件的にターゲティングされた対立遺伝子を保有するマウスは、首尾よく開発されていない。伝統的な遺伝子ターゲティングを用いて遭遇した概念的および技術的な障壁を考慮すると、心臓生物学におけるBETブロモドメインタンパク質の機能を探索するためにここで用いられた化学生物学的アプローチは、幾つかの利点を有する。第１に、このアプローチは、BETの機能を時間的な正確性をもって操作することを可能にする。これは、現在のCre-lox技術を用いて達成することは困難である。第２に、化学生物学的アプローチは、伝統的な遺伝子削除法を用いる遺伝子機能の永久的な喪失と比較した場合、BETブロモドメインのクロマチンとの相互作用を一過性に妨害する。第３に、エピジェネティックライター（epigenetic writer）（例えばHATs）またはイレーサー（例えばHDACs）の酵素活性を操作する戦略とは異なり、JQ1は、ヒストンそのものに対する翻訳後修飾に直接的に影響を及ぼすことなく、クロマチンベースのシグナル伝達を調節する。第４に、JQ1は、心臓において発現する３つ全てのBETファミリーメンバー（BRD2〜4）を阻害し、したがって、しばしば単遺伝子ターゲティングアプローチを混乱させる現象である、このファミリー内での機能的重複性をブロックする。最後に、化学生物学的アプローチは、JQ1などの低分子プローブの全身送達が、実験的心不全において有効であり、かつ良好に耐容されることを示し、この疾患における薬理学的なBETブロモドメイン阻害の有用性を示唆する。
【０１２１】
結論として、本研究は、BETエピジェネティックリーダータンパク質を、病的な心臓のリモデリングおよびHFを駆動する転写機構の必須の成分として決定的に意味づける。特に、本発明者らは、BETを心筋における新たな標的として、BETブロモドメイン阻害をHF治療のための有望なアプローチとして同定する。JQ1は心不全のマウスモデルにおいて良好に耐容されたので、本発明者らの研究は、薬物様のBETブロモドメイン阻害剤をこの疾患における薬理学的戦略として用いることについての論理的根拠を提供する。当該分野における転写的治療の開発における強い関心を考慮すると（McKinsey and Olson, 2005）、この化学生物学的アプローチは、より高次のクロマチンの状態およびクロマチン依存性シグナル伝達の調節を、心不全における治療上の利益のために利用し得ることについての原理証明を提供する。
【０１２２】
参考文献
【表１−１】
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【０１２３】
【表１−２】
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【０１２４】
【表１−３】
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【０１２５】
【表１−４】
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【０１２６】
【表１−５】
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【０１２７】
【表１−６】
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【０１２８】
【表１−７】
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【０１２９】
本明細書において示され、記載されるものに加えて、本発明の多様な改変が、前述の記載から当業者には明らかとなり、これは、添付の請求の範囲の範囲内に該当するであろう。本発明の利点および目的は、本発明の各々の態様により、必ずしも包含されない。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｆ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図５Ｅ−Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図８Ｃ−３】
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【図８Ｄ−Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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