(57)【要約】【課題】タガトースの製造方法の提供。【解決手段】本発明は、タガトースの製造方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）にエピマー化して、タガトースを含むエピマー化反応物を得るステップと、
ｂ）前記エピマー化反応物を精製するステップと、
ｃ）前記精製されたエピマー化反応物を結晶化するステップと、を含む、タガトースの製造方法。
【請求項２】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素が、サーモトガマリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモトガサーマラム（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）、またはその変異株来由酵素である、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項３】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素が、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株から生成される、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項４】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素の生産菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）である、請求項３に記載のタガトースの製造方法。
【請求項５】
前記エピマー化反応が、６０〜９０℃の温度およびｐＨ５〜８で、果糖とヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素とを反応させることを含む、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項６】
前記エピマー化反応が金属塩の存在下で行われる、請求項５に記載のタガトースの製造方法。
【請求項７】
前記金属塩が、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４の１種以上である、請求項６に記載のタガトースの製造方法。
【請求項８】
前記エピマー化反応物中に、タガトースが０．０５重量％以上で含まれる、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項９】
前記果糖が、砂糖の加水分解により製造されるか、ブドウ糖を異性化することで製造される、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１０】
前記精製ステップで、クロマトグラフィー、分別結晶、およびイオン精製の一つ以上を行う、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１１】
前記精製ステップの前または後に、脱色、脱塩または両方を行う、請求項１０に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１２】
前記結晶化する前に、前記精製されたエピマー化反応物を濃縮させることを含む、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１３】
前記ｂ）ステップの後に、未反応の果糖をａ）ステップで再使用するか、前記ｃ）ステップの後に結晶が分離された母液をｂ）ステップで再使用するか、または両方を行うことを特徴とする、請求項１乃至１２の何れか一項に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）菌株。
【請求項１５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）菌株。
【請求項１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）菌株。
【請求項１７】
配列表の配列番号４のヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、果糖からタガトースを製造する方法、より具体的に、果糖の４位の炭素位置をエピマー化してタガトースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タガトースは、砂糖と殆ど区別のつかない天然の甘味を有しており、物理的性質も砂糖に近似する。しかしながら、摂取したタガトースは小腸で吸収されにくいため血糖値に影響を与えず、また、そのカロリーが砂糖の約３０％である、低カロリーの甘味料である。また、タガトースは、腸内微生物により発酵されて有益な乳酸菌の増殖を促進させる前生物的効果（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を有している。
【０００３】
タガトースは、摂取量の２０％程度のみが小腸で吸収され、残りの８０％は、腸内微生物が棲息する大腸に移動して、選択的に乳酸菌の生成を促進することで短鎖脂肪酸を生成し、特に、大腸癌を予防する酪酸（ｂｕｔｙｒａｔｅ）を多量（全短鎖脂肪酸の５０％程度まで）生成するプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）の性質を有している。また、タガトースは、１．５ｋｃａｌ／ｇの低カロリーの天然糖であって、米国ＦＤＡのＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）として認められ、食品、飲料、健康食品、ダイエット添加物などに機能性甘味料として使用されている。
【０００４】
しかし、タガトースは、自然界に一般に存在するものではなく、乳製品や一部の植物に微量含有されている希少糖であるため、低カロリーの機能性甘味料として使用されるためには、安価の原料から大量に生産することが可能な技術が開発されなければならない。
【０００５】
従来は、ガラクトースの異性化反応によりタガトースを製造しており、ガラクトースを経済的に得るために、ガラクトースを含有する種々の基礎原料およびそれからガラクトースを得てタガトースを製造するための研究が先行されてきた。最も代表的な基礎原料としては乳糖を使用してきたが、乳糖あるいは乳糖を含有している製品の価格は、天気による原乳の生産量、粉乳の需要、第三国での乳糖消費量の変化などの様々な要因により上昇と下落を繰り返す固有の価格パターンを有する。そのため、市場における価格の不安定性が存在し、タガトースの生産原料の安定した需給が困難であるという問題があった。したがって、普遍化された一般原料（ブドウ糖、砂糖、果糖など）を使用してタガトースを製造する新しい工程の開発が必要である。
【０００６】
そこで、特許文献１では、エピマー化によりブドウ糖からガラクトースを生産する方法が開示されているだけであり、特許文献２では、ケトヘキソースのＣ３‐エピマー化反応が開示されているが、上記文献のいずれにも、Ｃ４‐エピマー化反応を用いて果糖からタガトースを製造する方法は開示されていない。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第１０‐２００９‐０１２５００４号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０‐２００６‐０１２５９７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来は、乳糖または乳糖を含有する製品や、その他にガラクトースを含有する種々の生物資源から分解されるガラクトースを用いてタガトースを製造していた。しかし、原料の安定した需給および投資効率性などを考慮して現在商業化されているかまたはその水準に製造可能な原料は、乳糖あるいは乳糖を含有する製品（乳清など）と評価されている。しかしながら、乳糖または乳糖を含有する製品は価格の変動が激しく、最近、乳糖の消費量が増加するに伴って価格が上昇し、タガトースの安定した供給が困難であるという問題がある。
【０００９】
また、従来の乳糖をガラクトースに転換する化学転換法はエピマー化に限界があり、酵素転換法は依然としてガラクトースを用いるという限界があった。
【００１０】
したがって、本発明は、従来のタガトースの製造方法に比べ安定的かつ経済的でありながらも、生産効率の高い製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明は、果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）にエピマー化して、タガトースを含むエピマー化反応物を得るステップと、前記エピマー化反応物を精製するステップと、前記精製されたエピマー化反応物を結晶化するステップと、を含むタガトースの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、価格の変動が激しい乳糖でなく、普遍化された原料である果糖を使用して製造コストを低減することで、経済的でありながらも高い収率のタガトースの製造方法を提供することができる。
【００１３】
一般に、果糖がブドウ糖または砂糖から工業的に製造可能であることは公知のことである。したがって、本発明で提示する工程の原料は、果糖の他にも、より安価の生産のために果糖を全体にあるいは一部に含有する形態で使用する場合まで確張して含むことができる。すなわち、本発明は、澱粉質または原糖または砂糖から酵素的転換によりタガトースを生産することを含む。
【００１４】
また、本発明によれば、果糖を用いてタガトースを製造することで、現在重要な食品素材として脚光を浴びているタガトースを効率的に大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一様態によるタガトースの製造工程を示すフローチャートである。
【図２】他の様態によるタガトースの製造工程を示すフローチャートである。
【図３】さらに他の様態によるタガトースの製造工程を示すフローチャートである。
【図４】さらに他の様態によるタガトースの製造工程を示すフローチャートである。
【図５】さらに他の様態によるタガトースの製造工程を示すフローチャートである。
【図６】果糖を基質とした、Ｃ４‐エピマー化酵素の反応によるタガトースの生成を示すＨＰＬＣグラフである。
【図７】反応温度の変化によるＣ４‐エピマー化酵素の活性程度を示すグラフである。
【図８】ｐＨの変化によるＣ４‐エピマー化酵素の活性程度を示すグラフである。
【図９】金属塩の種類によるＣ４‐エピマー化酵素の活性程度を示すグラフである。
【図１０】基質である果糖の濃度変化によるタガトースへの転換率の程度を示すグラフである。
【図１１】果糖とタガトースの転換率と回収率との相関性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明についてより詳細に説明する。本明細書に記載されていない内容は、本発明の技術分野または類似分野において熟練された者であれば十分に認識して類推できるものであるため、その説明を省略する。
【００１７】
本願における前記用語「ｎ位の炭素位置」とは、ＩＵＰＡＣで規定する炭素番号を付ける規則に従って定められた炭素位置を意味し、これはＣｎで表現することができる。この際、ｎは１以上の整数を意味する。例えば、「４位の炭素位置でエピマー化」されることを、「Ｃ４‐エピマー化」で表現することができる。
【００１８】
本発明の一様態によれば、ａ）果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）にエピマー化して、タガトースを含むエピマー化反応物を得るステップと、ｂ）前記エピマー化反応物を精製するステップと、ｃ）前記精製されたエピマー化反応物を結晶化するステップと、を含むタガトースの製造方法が提供される。
【００１９】
一般に、単糖類は、アルドヘキソース（ａｌｄｏｈｅｘｏｓｅ）とケトヘキソース（ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅ）とに分類されることができる。アルドヘキソースとは、６個の炭素原子からなるアルドースであって、一端にアルデヒド基を有するものを意味する。その非制限的な例としては、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、アロース（ａｌｌｏｓｅ）、グロース（ｇｕｌｏｓｅ）、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、イドース（ｉｄｏｓｅ）が挙げられる。また、本願におけるケトヘキソースとは、６個の炭素原子からなり、ケトン基を有する単糖類を意味する。その非制限的な例としては、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、およびソルボース（ｓｏｒｂｏｓｅ）が挙げられ、好ましくは果糖であることができる。前記果糖および前記タガトースは、本願で特に言及しない限り、Ｄ‐型果糖またはＤ‐型タガトースを意味する。
【００２０】
本発明の他の一例によれば、前記果糖は、砂糖またはブドウ糖から得られることができる。これにより、ブドウ糖、果糖、砂糖のように、普遍化されて安価な原料を使用して高い収率でタガトースを製造する方法を提供することで、タガトースの大量生産を可能とする。
【００２１】
したがって、前記ａ）ステップの前に、砂糖を加水分解して果糖を得るステップをさらに行うことができる。前記加水分解に使用される酵素は、β‐フルクトフラノシダーゼ、インベルターゼ、サッカラーゼなどを含むβ‐Ｄ‐フルクトシダーゼ；スクラーゼ、α‐グルコシダーゼ、およびα‐Ｄ‐グルコヒドロラーゼからなる群から選択される１種以上であることができるが、これに制限されない。
【００２２】
また、前記ａ）ステップの前に、ブドウ糖を異性化して果糖を得るステップをさらに行うことができる。前記異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼまたはホスホグルコイソメラーゼであることができるが、これに制限されない。
【００２３】
本願で使用できるヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）は、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）来由酵素またはその変異体であることができ、具体的には、サーモトガマリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、またはサーモトガサーマラム（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）来由酵素またはその変異体であることができる。
【００２４】
また、前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素は、例えば、配列表の配列番号１〜３記載のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）でＥ．ｃｏｌｉなどの菌株に形質転換させ、これを培養して培養物を得て、前記培養物を破砕し、カラムなどにより精製したものであることができる。前記形質転換用菌株としては、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられ、前記Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換された菌株としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）菌株（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）などが挙げられる。前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）菌株は、それぞれ韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ソウル市西大門區弘濟一洞３６１‐２２１ユリムビル）に２０１４年５月２３日付で寄託され、寄託番号はそれぞれＫＣＣＭ１１５４２Ｐ、ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ、およびＫＣＣＭ１１５４４Ｐである。
【００２５】
したがって、本発明の他の様態は、前記寄託菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）菌株（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）それぞれに関する。
【００２６】
前記果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素にエピマー化させる反応は、ｐＨ５〜８、温度６０〜９０℃の条件下で行われ、好ましくは、ｐＨ６〜８および７０〜９０℃または７５〜９０℃の高温条件下で行われることができる。前記ｐＨおよび温度の範囲内で酵素反応を行うと、相対的に高温で反応を進行させることができるため、製造工程中における微生物の汚染を最小化することができ、基質として使用されるケトヘキソースの溶解度を増加させることができるとともに、酵素の反応速度および転換率を極大化することができる効果がある。図７を参照して、反応温度が酵素活性に与える影響を説明すれば、温度が上昇するに伴ってＣ４‐エピマー化酵素の活性が増加するが、９０℃を境界として酵素活性が急激に低下し得る。
【００２７】
また、図８を参照して、ｐＨが酵素活性に与える影響を説明すれば、一般に、ｐＨが増加するに伴って酵素活性が増加する傾向を示す。特に、緩衝液の種類によって、適正ｐＨ領域が変わり得る。例えば、リン酸塩緩衝液の場合にはｐＨ５〜９が適正ｐＨであり、トリス緩衝液の場合にはｐＨ８．０〜８．５が適正ｐＨであることができる。但し、後続工程のために、ｐＨを８以下にすることが好適である。
【００２８】
一例において、前記Ｃ４‐エピマー化酵素にエピマー化させる反応は、金属塩の存在下で施すことができる。前記金属塩は、前記エピマー化反応において触媒の役割をすることができ、例えば、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、またはＺｎＳＯ４が挙げられる。具体的に、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２またはＣｏＣｌ２の１種以上が使用できる。図９を参照すれば、金属塩の種類によってエピマー化酵素活性が変わり得て、活性度の高い金属塩から低い金属塩の順に配列すれば、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４の順であることが分かる。前記金属塩の濃度は、０．００１ｍＭ〜５０ｍＭであることができる。より具体的に、金属塩の濃度は０．０１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲であることができる。
【００２９】
前記エピマー化反応物中に、タガトースが０．０５重量％以上、例えば、０．０７重量％以上、より具体的には０．１重量％以上で含まれることができ、タガトースの転換率は５％以上、例えば、７％以上であることができる。
【００３０】
前記精製方法は、特に制限されず、本願発明の技術分野において通常的に利用する方法を用いることができる。非制限的な例として、イオン精製、クロマトグラフィー、または分別結晶などが挙げられる。前記クロマトグラフィーによる糖の分離は、分離しようとする糖とイオン樹脂に付着された金属イオンとの弱い結合力の差を用いて行われることができる。一例において、イオン樹脂は、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ残基が付着された強酸性カチオン交換樹脂であることができる。
【００３１】
果糖とタガトースのように同じケトヘキソース糖である場合、その構造が類似するため、Ｋ、Ｎａなどのような残基を有する別の樹脂を使用しなければならない。これは、基本的に、２つの個別的なクロマトグラフィーを順に行うことでタガトースを単離することができるということを意味する。前記クロマトグラフィー分離に使用できる金属イオン残基の例としては、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇなどが挙げられるが、これに制限されない。
【００３２】
前記クロマトグラフィーは、具体的にＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｂｅｄ）クロマトグラフィーであることができる。
【００３３】
一様態において、前記精製ステップの前または後に、脱色、脱塩、または両方をさらに施すことができる。具体的には、前記精製ステップの前に、脱色、脱塩、または両方を施すことができる。前記脱色は、活性炭をエピマー化反応物の重量を基準として０．０５〜５．０重量％添加し、撹拌することを含むことができる。前記撹拌は、１０〜１０００ｒｐｍ、具体的には１０〜１００ｒｐｍの撹拌速度で３０分〜３時間行われることができる。
【００３４】
前記脱塩は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、または両方を使用して行うことができる。上記のような脱色およびイオン精製過程を経て、エピマー化反応物中の色素物質およびイオン性物質などの不純物が除去されることができる。
【００３５】
前記カチオン交換樹脂は、酸基を有する重合体であって、水素イオンや金属イオンなどのカチオンを交換させることができる。また、前記アニオン交換樹脂は、塩基性基を有する重合体であって、アンモニウム基を主にヒドロキシイオンやハロゲン化イオンなどのアニオンを交換させることができる。本願発明において、前記カチオン交換樹脂や前記アニオン交換樹脂を１種以上使用することができ、イオン性物質を効果的に除去するために、カチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂の両方を使用することができる。この場合、カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂の割合は、１：１〜１：３、具体的には１：１．５〜１：２であることができる。前記イオン精製後におけるエピマー化反応物中のイオン性物質の含量は、電気伝導計で測定した時に、単位ｃｍ当り１０マイクロジーメンス以下であることができる。
【００３６】
前記精製、脱色および／または脱塩工程を経ることでタガトースの分離、色素物質およびイオン性物質などの不純物の除去がなされたエピマー化反応物は、任意に、次の反応のためにさらに濃縮されることができる。例えば、タガトースの濃度が４０Ｂｘ以上となるように濃縮することができる。または、タガトースの濃度が５０Ｂｘ以上となるように濃縮することができる。
【００３７】
前記精製されたエピマー化反応物の結晶化ステップでは、エピマー化反応物の温度を徐々に冷却させて結晶を成長させることができる。前記結晶化は、例えば、４０〜９０℃の温度で、毎時間当り０．１〜５℃ずつ徐々に冷却させて結晶化させることが挙げられる。前記得られたタガトース結晶は、さらに脱水および乾燥されることができる。
【００３８】
図２を参照すれば、本発明の他の様態によるタガトースの製造方法は、果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）にエピマー化してタガトースを含むエピマー化反応物を得て、前記エピマー化反応物を精製し、前記精製されたエピマー化反応物を濃縮し、これを結晶化してタガトース結晶を得て、これを脱水および乾燥することを含むことができる。
【００３９】
本発明の一様態或いは他の様態による製造方法により製造されたタガトースは、８０％以上の純度、例えば、９０％以上の純度、具体的には９５％以上の純度、より具体的には９８％以上の純度を有することができる。前記純度は、ｂ）ステップの後、ｃ）ステップの前に測定された純度であることができる。他の例において、前記純度は、ｃ）ステップの後に測定された純度であることができる。
【００４０】
本発明のさらに他の一例によれば、前記ｂ）ステップの後に、未反応の果糖をａ）ステップで再使用してもよく、前記ｃ）ステップの後に結晶が分離された母液をｂ）ステップで再使用してもよく、またはその両方をさらに施してもよい。
【００４１】
前記例を図４を参照して説明すれば、前記精製ステップによりエピマー化反応物中のタガトースと果糖が分離され、分離された果糖は、ａ）ステップのエピマー化反応の基質として再使用されることができる。また、図３を参照すれば、前記結晶化ステップで結晶形態のタガトースと結晶が分離された母液とに分離され、前記結晶が分離された母液は所定量のタガトースを含み得るため、精製ステップで再使用されることができる。図５は、分離された果糖のａ）ステップでの再使用、および結晶が分離された母液のｂ）ステップでの再使用が同時に行われる本発明の一様態を図示する。
【００４２】
本発明の一例による砂糖の加水分解、ブドウ糖の異性化および／またはヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化により得られた糖液は、砂糖、ブドウ糖、果糖、およびタガトースからなる群から選択される１種以上を含有する混合糖からなる糖液であることができ、前記糖液は、クロマトグラフィー分離法により分離することができる。
【００４３】
一般に、前記アルドヘキソースと前記ケトヘキソースで構成された混合糖の分離は、カチオン残基を有する樹脂を用いたクロマトグラフィーにより経済的に分離することができる。しかし、同一型の糖である場合には、その構造が類似するため、Ｋ、Ｎａなどの残基を有する別の樹脂を使用しなければならない。これは、基本的に、２つの個別的なクロマトグラフィーを順に行うことでタガトースを単離することができるということを意味する。前記クロマトグラフィー分離に使用できる金属イオン残基の例としては、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇなどが挙げられるが、これに制限されない。
【００４４】
前記クロマトグラフィーは、好ましくはＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｂｅｄ）クロマトグラフィーであることができる。この際、前記クロマトグラフィー分離ステップにおける未反応物の再循環は、糖液の種類に応じて次のように任意選択することができる。
【００４５】
タガトースを主成分（９０％以上）として含有する糖液の場合には、前記タガトースを濃縮した後、必要に応じて結晶化するステップからなることができる。
【００４６】
果糖を主成分として含有する糖液の場合には、前記糖液を濃縮し、エピマー化ステップの前のステップへ再循環させることができる。
【００４７】
ブドウ糖を主成分として含有する糖液の場合には、前記糖液を濃縮し、異性化ステップの前のステップへ再循環させることができる。
【００４８】
砂糖を主成分として含有する糖液の場合には、前記糖液を濃縮または結晶化した後、加工処理して砂糖液として使用するか、他の生産原料として使用することができる。
【００４９】
以下、実施例を述べることで本願発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は本願発明の一例に過ぎず、本願発明の内容がこれに限定されると解釈されてはならない。
【００５０】
実施例１
酵素転換率によるクロマトグラフィー分離特性の評価
混合糖（果糖およびタガトース）から目的物質（タガトース）を高純度分離および結晶化するためには、クロマトグラフィー分離を用いた単離ステップが非常に重要である。一般に、結晶製品化を目的とする糖液の単離は、目的物質（タガトース）の含量がどのくらいであるかによって、異なる回収率（％）が得られる。一般に、目的物質（タガトース）の含量が高くなるほど、これに比例して高い回収率（％）が得られ、これにより、相対的に少ない製造加工コストで最終製品が製造できる。一般に、結晶糖を効率的（高純度、高収率）に製造するためには、母液（Ｆｅｅｄ）に含有されている目的物質（タガトース）の純度が９０％以上、より好ましくは９５％に至ることが非常に重要である。
【００５１】
クロマトグラフィーの運転条件は、使用する母液（Ｆｅｅｄ）の組成比、分離樹脂の種類、分離液中の目的物質（タガトース）の目標収率あるいは目標純度によって、様々な結果が得られる。したがって、果糖のタガトースへの酵素的転換工程で得られる反応液の組成、すなわち、果糖のタガトースへの転換率（％）は、クロマトグラフィーでの収率結果に影響を与える。結晶工程に使用するための好ましい結果である分離液中のタガトースの純度を９５％水準に固定したときに、母液（Ｆｅｅｄ）中の果糖およびタガトースの組成比（％）によるクロマトグラフィー分離収率（％）値の変化を観察した。
【００５２】
糖のクロマトグラフィー分離の効率を極大化するためには、クロマトグラフィー分離に使用される樹脂の大きさ、修飾化された金属イオン残基の種類（例えば、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇなど）を変更することで、一部改善した結果値を得ることができるが、本発明では、果糖とタガトースの一般的な分離特性を考慮して、Ｃａ残基を修飾している分離樹脂を使用した。評価に使用された条件は、次の表１のとおりである。
【００５３】
【表１】
2016523526.tif 000003
【００５４】
前記条件を適用したときに、果糖とタガトースの組成比（％）によるＳＭＢクロマトグラフィー分離のテスト結果は、下記の表のとおりである。結晶化工程に使用するに非常に好ましい条件である、タガトースの純度９５％水準を維持したときに、果糖とタガトースの組成比によるタガトースおよび果糖の回収率（％）を測定した結果、下記の表２のような結果が得られた。
【００５５】
【表２】
2016523526.tif 000004
【００５６】
前記表２の結果および図１１を参照すれば、特に、果糖に比べタガトースの回収率（％）が酵素転換率（％）に敏感に影響を受けることが分かった。タガトースを９０％以上の回収率および純度９５％水準で製造するためには、最小限１５％以上の酵素転換率（％）が得られるように酵素力価および工程条件を確立するべきであり、同様に、タガトースを８５％以上の回収率および純度９５％で製造するためには、最小限１０％以上の酵素転換率（％）を確保するべきであることを意味する。したがって、酵素転換率（％）は、本特許で構成しようとする製造工程の効率性において非常に重要な要素であることを、さらに確認することができる。
【００５７】
実施例２
ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素の製造
耐熱性微生物のサーモトガマリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ  ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ  ３１０９／ＪＣＭ  １００９９）のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）（配列番号１）を鋳型として、正方向（５´‐ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧ‐３´）および逆方向（５´‐ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧ‐３´）のプライマーを添加してＰＣＲ反応を行った。
【００５８】
耐熱性微生物のサーモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（ＤＳＭ  ４３５９）のゲノムＤＮＡ（配列番号２）を鋳型として、正方向（５´‐ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧ‐３´）および逆方向（５´‐ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＴＣＴＡＣＧＴＧ‐３´）のプライマーを添加してＰＣＲ反応を行った。
【００５９】
ＰＣＲ反応条件は、下記の表３および表４のとおりである。ＰＣＲ反応により増幅された遺伝子をｐＥＴ‐２１ａベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株に形質転換した。これからプラスミドを分離して挿入された遺伝子の塩基配列を確認した後、タンパク質発現用菌株のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）にさらに形質転換して、ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素の生産に用いた。前記ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素を生産するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（サーモトガマリティマ来由の酵素発現遺伝子を含む）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（サーモトガネアポリタナ来由の酵素発現遺伝子を含む）を、１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地で２時間程度培養した。この際、培養温図３７℃、撹拌速度１８０ｒｐｍで前記培養過程を行った。培養後、６００ｎｍで微生物の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定し、その値が０．４〜０．８の範囲になると、０．２５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β‐Ｄ‐１‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、同条件で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養して、タンパク質発現を誘導した。
【００６０】
【表３】
2016523526.tif 000005
【００６１】
【表４】
2016523526.tif 000006
【００６２】
実施例３
ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素の精製
微生物内に発現されたケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素の活性を測定するために、下記のような方法を用いてタンパク質精製を行った。タンパク質発現が完了した培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、１０ｍＭのイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）および３００ｍＭのＮａＣｌが含有されている５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝液に再懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕器（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、これを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を回収した。前記回収された上清を、充填剤としてＮｉ‐ＮＴＡ樹脂が充填されているカラムに通液し、２０ｍＭのイミダゾールおよび３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝液を、カラム中の充填剤が占める体積の１０倍の体積で流して、非特異的に結合され得るタンパク質を除去した。最終の２５０ｍＭのイミダゾールおよび３００ｍＭのＮａＣｌが含有されている５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝液を流して、ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素を溶出精製した。また、精製酵素中のイミダゾールを除去するために、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝液を数回流して、その濃度が０．０１ｍＭ以下となるようにした。精製された酵素は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）を用いてタンパク質を定量した。
【００６３】
実施例４
果糖からタガトースへの転換
前記実施例２および３で得られた酵素の活性を測定するために、前記精製された酵素を、１重量％の果糖、０．０１ｍＭのＺｎＳＯ４、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に入れ、反応温度６０℃で３時間反応を行った。ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素により転換されたタガトースの濃度、および果糖からタガトースに転換された転換率を下記の表５に示した。
【００６４】
また、反応後に残っている果糖および生成物のタガトースは、ＨＰＬＣを用いて定量した。使用したカラムはＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０であり、カラム温度を８０℃とし、移動相に水を０．５ｍｌ／分で流した。図６に示すように、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて、果糖を基質とする前記酵素の反応によって現われるピークを検出して定量した。
【００６５】
【表５】
2016523526.tif 000007
【００６６】
前記表５および図６を参照すれば、果糖を添加せず、前記酵素のみをリン酸塩緩衝液に入れて転換反応させた場合（破線；の場合）、果糖およびタガトースを示すピークが全く観察されないことを確認することができる。
【００６７】
しかし、果糖と前記酵素をともに添加してエピマー化反応させた場合（実線；の場合）には、酵素反応が開始して３０分経過する前には果糖を示すピークのみが観察されたのに対し、時間の経過に伴って、約３０分経過後からはタガトースを示すピークが観察された。
【００６８】
したがって、前記表５および図６の結果をまとめると、実施例２および３で製造された前記酵素を用いて、果糖をタガトースへエピマー化転換できることを確認することができる。
【００６９】
実施例５
改良株の製作および選別
Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ来由の遺伝子を鋳型として、ランダム突然変異を行った。具体的に、ＣｌｏｎＴｅｃｈ社のＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔを用いてＴ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａについてランダム突然変異を誘導し、下記表６および７に記載の条件のＰＣＲ反応により増幅された遺伝子をｐＥＴ‐２８ａベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。その後のステップは、実施例２と同様に実施した。
【００７０】
【表６】
2016523526.tif 000008
【００７１】
【表７】
2016523526.tif 000009
【００７２】
前記ランダム突然変異により確保した変異株ライブラリーから高活性を有する候補変異株を選別し、塩基配列分析して変異部位を確認した。総５個のアミノ酸変異を確認した。（Ｓ１２５Ｄ／Ｖ１６３Ａ／Ｄ１８６Ｎ／Ｆ２６３Ｉ／Ｄ３１１Ｇ）
【００７３】
前記変異株は配列表の配列番号３記載のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）塩基配列を有し、前記変異株により生産される酵素をコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のとおりである。前記ケトヘキソースＣ４‐エピマー化酵素を生産する前記変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）である。前記変異株について前記実施例２および３と同様の方法で実施して、Ｃ４‐エピマー化酵素を製造した。
【００７４】
実施例６
改良株を用いた果糖からタガトースへの限界転換率の評価
前記改良株来由酵素を用いて、下記に記載の方法で、温度、ｐＨ、金属塩などによる転換率を評価した。
【００７５】
（１）反応温度毎の酵素活性の比較評価
反応温度の変化による酵素活性の変化を確認するために、前記実施例５で得られた精製された酵素を、１０重量％の果糖、０．３ｍＭのＺｎＳＯ４、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に入れ、３時間反応を行った。図７に図示されたように、３７℃から９６℃までのそれぞれ異なる反応温度で酵素活性を測定した。
【００７６】
温度が増加するに伴って酵素活性が増加する傾向が見られるが、９０℃以上反応時には活性の低下が見られた。
【００７７】
（２）反応ｐＨ毎の酵素活性の比較評価
反応ｐＨの変化による酵素活性の変化を確認するために、前記実施例５で得られた精製された酵素を、１０重量％の果糖、０．０１ｍＭのＮｉＳＯ４、リン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液に入れ、３時間反応を行った。具体的に、ｐＨ５〜ｐＨ８．０の範囲ではリン酸カリウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５の範囲ではトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。図８に図示されたように、それぞれ異なるｐＨで酵素活性を測定した。その結果、リン酸カリウム緩衝液を使用した時およびトリス緩衝液を使用した時の両方で、ｐＨが増加するに伴って活性が増加する傾向が見られ、同一のｐＨでは、トリス緩衝液を使用した場合に活性が低下した。
【００７８】
（３）金属塩の種類による酵素活性の比較評価
金属塩の種類による酵素活性の変化を確認するために、前記実施例５で得られた精製された酵素を、１０重量％の果糖、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液に入れ、３時間反応を行った。この際、前記反応には、それぞれ異なる１３種の金属塩が１ｍＭ添加された。
【００７９】
その結果、ＮｉＳＯ４＞ＮｉＣｌ２＞ＣｏＣｌ２＞ＭｎＣｌ２＝ＺｎＳＯ４の順に酵素活性において差が見られた（図９参照）。
【００８０】
（４）酵素反応による限界転換率の評価
基質の濃度による酵素活性の変化を確認するために、前記実施例５で得られた精製された酵素を、１０重量％の果糖、０．３ｍＭのＮｉＳＯ４、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液に入れ、６０℃で３時間反応を行った。前記酵素反応での限界転換率を評価するために、酵素反応を１８時間行った。図１０を参照すれば、この実験に使用した改良酵素を使用する時に、果糖からタガトースへの転換率が３０％であることが分かる。
【００８１】
実施例７
果糖とタガトースのクロマトグラフィー分離
前記実施例５で得られた精製された酵素を、１０重量％の果糖、０．０１ｍＭのＮｉＳＯ４、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液に入れ、６０℃で３時間反応を行った。前記得られたタガトースの混合液に粉末活性炭（ｐｏｗｄｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）０．１〜０．５％（ｗｔ／ｖ）を添加し、１０〜１００ｒｐｍで０．５〜１時間撹拌した後、これをフィルタプレスでろ過して有色物質を除去した。
【００８２】
前記有色物質が除去された果糖とタガトースとの混合物から、果糖とタガトースを効率的にクロマトグラフィー分離するために、水素基で置換されたカチオン交換樹脂および水酸基で置換されたアニオン交換樹脂が充填されたカラムに通過させて、前記溶液中のイオン成分を除去する工程を行った。
【００８３】
前記脱色および脱塩により有色物質およびイオン成分などの不純物が除去された果糖から生産されたタガトース混合液を６０％（ｇ／ｇ溶液）まで濃縮し、カルシウム基で置換させた強酸性カチオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＲ１３１０  Ｃａ）が充填された、改善された疑似移動床システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ‐ｂｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｒｇａｎｏ、Ｊａｐａｎ）装備を活用して溶液を分画、クロマトグラフィー分離して、成分の純度（ｐｕｒｉｔｙ）、回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｙｉｅｌｄ）、および果糖から転換されたタガトース混合供給液と移動相の水との割合（脱着剤／供給体積率）を測定した。
【００８４】
【表８】
2016523526.tif 000010
【００８５】
実施例８
タガトースの結晶化
前記実施例７のクロマトグラフィー分離により回収された溶液を使用してタガトースを結晶化した。タガトースの糖濃度が７０Ｂｘとなるように真空、加熱濃縮し、温度を６０℃から３０℃まで毎時間当り０．７〜１℃ずつ徐々に冷却して結晶化させた。
【００８６】
結晶化終了後、遠心脱水機を用いて結晶回収を行い、６０℃の流動層乾燥器を用いて１時間乾燥して、製品の純度および結晶回収率を測定した。
【００８７】
【表９】
2016523526.tif 000011
【００８８】
実施例９
クロマトグラフィー分離技術を用いた、改良株を用いた果糖からタガトースの連続再循環生産工程の設計
前記実施例５で得られた精製された酵素を使用した、タガトースの連続再循環生産工程を下記の方法で設計した。
【００８９】
このような連続再循環生産工程は、図２、図３、図４、図５で簡略な図式で説明した。当該図式において、精製ステップでは、必要に応じて、脱色、脱塩などのような製品の品質向上のための単位工程を別に追加実施または排除することができる。
【００９０】
前記連続再循環生産工程は、先ず、果糖を主成分として含有する液をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の反応器を通過してタガトースを生産し、果糖とタガトースの混合糖で構成されたエピマー化産出物をクロマトグラフィー分離し、精製されたエピマー化反応物中のタガトースの濃度に応じて、選択的に濃縮ステップを挿入または排除し、タガトースを主成分（９０％以上）として含有するクロマトグラフィー分離液を濃縮し（必要時）結晶化することでタガトースを製造することを含む。ここで、果糖を主成分として含有するクロマトグラフィーの残液をエピマー化反応器前に再循環させ／再循環させたり、タガトースの結晶化ステップで得られる非結晶母液をエピマー化後のステップに再循環させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月9日(2016.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）果糖をヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ  Ｃ４‐ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）にエピマー化して、タガトースを含むエピマー化反応物を得るステップ、及び、
ｂ）前記エピマー化反応物を精製するステップを含む、タガトースの製造方法。
【請求項２】
前記精製するステップの後に、前記精製されたエピマー化反応物を結晶化するステップをさらに含む、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項３】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素が、サーモトガマリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモトガサーマラム（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）、またはその変異株来由酵素である、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項４】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素が、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、またはバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株から生成される、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項５】
前記ヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素の生産菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）である、請求項４に記載のタガトースの製造方法。
【請求項６】
前記エピマー化反応が、６０〜９０℃の温度およびｐＨ５〜８で、果糖とヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素とを反応させることを含む、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項７】
前記エピマー化反応が金属塩の存在下で行われる、請求項６に記載のタガトースの製造方法。
【請求項８】
前記金属塩が、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４の１種以上である、請求項７に記載のタガトースの製造方法。
【請求項９】
前記エピマー化反応物中に、タガトースが０．０５重量％以上で含まれる、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１０】
前記果糖が、砂糖の加水分解により製造されるか、ブドウ糖を異性化することで製造される、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１１】
前記精製ステップで、クロマトグラフィー、分別結晶、およびイオン精製の一つ以上を行う、請求項１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１２】
前記精製ステップの前または後に、脱色、脱塩または両方を行う、請求項１１に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１３】
前記結晶化する前に、前記精製されたエピマー化反応物を濃縮させることを含む、請求項２に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１４】
前記ｂ）ステップの後に、未反応の果糖をａ）ステップで再使用するか、前記結晶化するステップの後に結晶が分離された母液をｂ）ステップで再使用するか、または両方を行うことを特徴とする、請求項１乃至１３の何れか一項に記載のタガトースの製造方法。
【請求項１５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４２Ｐ）菌株。
【請求項１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２１ａ‐ＴＮ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４３Ｐ）菌株。
【請求項１７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８ａ‐ＴＮ（ｍ）（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５４４Ｐ）菌株。
【請求項１８】
配列表の配列番号４のヘキスロン酸Ｃ４‐エピマー化酵素変異体。
【国際調査報告】
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