(57)【要約】【課題】現在の方法はいずれも、無濾過の又は遠心分離していない全血において、溶血を決定するために機能しない。【解決手段】  本発明は、溶血センサ、溶血センサシステム、及び溶血センサ又は溶血センサシステムを利用して、試料、例えば、全血試料、血漿試料、血清試料、又は溶血した血液中の溶血をモニタリング又は検出する方法に関する。溶血センサは、全血中の溶血を検出するための方法として、細胞外ヘモグロビンレベル、例えば、全血試料中の細胞外ヘモグロビンに応答する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料中の溶血を検出するための電気化学センサシステムであって、
過酸化水素の流出を増大させるための０．１〜５０μｍの範囲の厚さを含む外膜、過酸化水素を発生させるオキシドレダクターゼ酵素を含む膜を有する電気化学センサと、
前記全血を前記センサと接触させるための無試薬チャンバと
を含む、電気化学センサシステム。
【請求項２】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項３】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、乳酸オキシダーゼを含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項４】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、酵素の混合物を含み、前記混合物が、クレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを少なくとも含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項５】
前記酵素の混合物が、前記クレアチニナーゼ及び前記サルコシンオキシダーゼを含む、請求項４に記載の電気化学センサシステム。
【請求項６】
前記酵素の混合物が、前記クレアチナーゼ及び前記サルコシンオキシダーゼを含む、請求項４に記載の電気化学センサシステム。
【請求項７】
全血試料中の溶血を検出するための方法であって、
（ｉ）オキシドレダクターゼ酵素と、過酸化水素に対して透過性の外膜とを含む電気化学センサに前記全血試料を導入し、続いて、
（ｉｉ）Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で過酸化水素によって発生する電気化学信号を検出することを含み、ここで、標準的な溶血していない全血試料と比較して４％〜５０％の範囲の検出可能な電流の減少が、前記全血試料中の溶血の指標である、方法。
【請求項８】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、乳酸オキシダーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、酵素の混合物を含み、前記混合物が、クレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを少なくとも含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記外膜が、０．１〜５０μｍの範囲の厚さを含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶血センサ、溶血センサシステム、及び溶血センサ又は溶血センサシステムを利用して、試料、例えば、全血試料、血漿試料、血清試料、又は溶血した血液試料中の溶血をモニタリング又は検出し、試料中の電解質、例えば、カリウムのレベルに対する溶血の関与を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の細胞部分及び流体部分を合わせたものを意味する、全血中の分析物の濃度は、赤血球中に見出される分析物の濃度とは、量に顕著な差があることがある。例えば、全血中では、カリウムレベルは通常約４．０ｍＭである一方で、赤血球中のカリウム濃度は通常約１５０ｍＭである。
【０００３】
患者から全血を収集し処理する過程で、一部の細胞、特に赤血球は、物理的に損傷を受けて、赤血球の破裂を引き起こすことがある。赤血球が破裂する現象は、「溶血」として知られている。全血試料中で溶血が起こると、赤血球の含有物が、血漿又は一部の場合血清と呼ばれる、全血の無細胞部分の含有物と入り混じる。通常は赤血球中に見出され血液の流体部分中には遊離していない全血の構成要素であるヘモグロビン、及び他の細胞内要素、例えば、カリウムが、赤血球の細胞内区画から血液の流体部分、即ち、血漿又は血清中に放出される。
【０００４】
赤血球中のカリウムの濃度は、正常血漿中のカリウムの濃度よりも２５〜７５倍高いことから、患者の溶血した血液試料の流体部分中のカリウムを測定することにより、人為的な結果、例えば、患者の実際の血漿カリウムレベルの人為的な測定値上昇が誘導される。溶血していない血液の流体部分中のカリウム濃度は、数多くの状態の重要な指標である。溶血した血液中でカリウムの濃度を過大評価することにより、患者が、その患者の溶血していない血液試料中で、実際には低濃度のカリウムを有し得る場合であっても、高カリウム血症（血中カリウムの増加）について処置されることがある。残念ながら、比較的少数の破裂した赤血球のみにより、血中カリウムレベルの人為的な上昇が生じ得る。
【０００５】
血液試料が溶血した場合の血漿カリウムの上昇に加えて、他の分析物、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、酸性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びアラニンアミノトランスフェラーゼなども、血液の流体部分中よりも赤血球中に高濃度で存在し、これらの分析物は、溶血した血液中で人為的に上昇することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
患者の血液試料中の溶血を検出するための現在の方法には、血液試料を遠心分離して血液細胞を取り除き、次いで、光学的方法によって、血漿部分におけるヘモグロビンの存在を決定することが含まれる。ヘモグロビンは、普通溶血していない血液試料の色が淡黄色である場合、ピンク又は赤色を血漿に付与する。現在の方法はいずれも、無濾過の又は遠心分離していない全血において、溶血を決定するために機能しない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、全血試料中の溶血を検出するための電気化学センサシステムであって、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の流出を増大させるための約０．１〜約５０μｍの範囲の厚さを含む外膜、過酸化水素を発生させるオキシドレダクターゼ酵素を含む別の膜を有する電気化学溶血センサと、全血試料をセンサの外膜と接触させるための外膜に隣接して配置された無試薬フローチャンバとを含む、電気化学センサシステムを提供する。外膜厚さは、過酸化水素の流出を増大させるように適合される。一実施形態では、外膜は、約０．１％〜約１００％の範囲の含水率を含むヒドロゲルを含む。一実施形態では、オキシドレダクターゼ酵素は、グルコースオキシダーゼ、又は乳酸オキシダーゼ、又はクレアチニナーゼ及び／若しくはクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを含む酵素の混合物を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、全血試料中の溶血を検出するための方法であって、電気化学センサに全血試料を導入することを含む、方法を提供する。電気化学センサは、複数の膜又は層を含む。電気化学センサの複数の膜において、複数の膜の１つは、過酸化水素を発生させることが可能なオキシドレダクターゼ酵素又はオキシドレダクターゼとして働く酵素の混合物を含む中間層を含む。複数の膜の別の１つは、血液試料と接触し、且つ過酸化水素に対して透過性でありその流出を増大させる、外膜を含む。複数の膜のさらに別の１つは、内膜を含む。電気化学溶血センサへの全血試料の導入に続いて、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で過酸化水素によって発生する電気化学信号を検出し、ここで、溶血していない全血試料と比較して４％〜５０％の範囲の検出可能な電流の減少が、全血試料中の溶血の指標である。オキシドレダクターゼ酵素は、グルコースオキシダーゼ、又は乳酸オキシダーゼ、又はクレアチニナーゼ及び／若しくはクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを含む酵素の混合物を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、患者の全血試料中の分析物のレベルの上昇が、溶血に関連する人為的な結果であるかどうかを決定するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載された電気化学溶血センサに患者からの全血試料を導入することを含む。溶血センサは、過酸化水素を発生させることが可能なオキシドレダクターゼ酵素を含む。溶血センサはまた、約０．１μｍ〜約５０μｍの範囲の厚さを含む外膜を含む。外膜の厚さは、過酸化水素の流出を増大させるように適合される。電気化学センサに全血試料を導入した後、ヘモグロビン（Hb（Ｆｅ２＋））の存在下で過酸化水素によって発生する電気化学信号を検出する。標準的な溶血していない全血試料と比較して約４％〜約５０％の範囲の検出可能な電流の減少が、患者の全血試料中の分析物のレベルの上昇の原因としての溶血の指標である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態による（図２に示した）例示的なセンサカード及び溶血センサを含めたセンサアセンブリ中のセンサバンクを包含する例示的な電気化学センサシステムを示す図である。
【図２】本発明の一実施形態による図１に示したセンサアセンブリ中のセンサバンク中に溶血センサを備えた例示的なセンサカードの逆正面を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態による図２に示した例示的な溶血センサの断面を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態による図２に示した例示的な溶血センサの別の断面を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態による図２に示した例示的な溶血センサの複合層の断面を示す図である。
【図６】例示的なグルコースオキシダーゼ酵素層を有する溶血センサの別の実施形態を示す図である。
【図７】本発明による例示的なグルコースオキシダーゼ酵素層を含む溶血センサにおけるヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を示すグラフである。図７中、ｘ軸は時間を秒で表し、ｙ軸は電流をアンペアで表す。
【図８Ａ】本発明の一実施形態によるグルコースオキシダーゼ酵素層を有する例示的な溶血センサの溶解した（lysed）血漿に対する応答を示すグラフである。図８Ａ中、ｘ軸は時間を秒で表し、ｙ軸は電流をアンペアで表す。
【図８Ｂ】図８Ａに示した溶血センサの溶解した血漿に対する応答が線形であることを示すグラフである。図８Ｂ中、ｘ軸は血漿ヘモグロビン（g/dL）を表し、ｙ軸は電流をナノアンペアで表す。
【図９Ａ】全血及び溶血した血液試料についての本発明による例示的な溶血センサによって生成された実時間電流プロファイルを示すグラフである。図９Ａ中、ｘ軸は時間を秒で表し、ｙ軸は電流をアンペアで表す。
【図９Ｂ】図９Ａに示した例示的な溶血センサの異なる容量百分率の溶解した血液に対する応答を示すグラフである。図９Ｂ中、ｘ軸は溶解した血液（%vol/vol）を表し、ｙ軸は電流をナノアンペアで表す。
【図９Ｃ】例示的なグルコースオキシダーゼ酵素層を含む図９Ａ及び９Ｂの溶血センサによって生成された較正グラフの線形部を示すグラフである。図９Ｃ中、ｘ軸は溶解した血液（%vol/vol）を表し、ｙ軸は電流をナノアンペアで表す。
【図１０】本発明による例示的なグルコースオキシダーゼ酵素層を含む溶血センサ応答に対するｐＯ２の予想される影響を示すグラフである。図１０中、ｘ軸は酸素分圧（ｐＯ２）をｍｍＨｇで表し、ｙ軸は電流をアンペアで表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、溶血センサ、溶血センサシステム、及び溶血センサ又は溶血センサシステムを利用して、試料、例えば、全血試料、血漿試料、血清試料、又は溶血した血液中の溶血をモニタリング又は検出し、血液試料中の分析物、例えば、カリウムのレベルに対する溶血の関与を評価する方法に関する。
【００１２】
簡潔にいえば、本明細書に記載された溶血センサ及び溶血を検出するための方法は、Ｈ２Ｏ２に対する膜透過性を有効利用する。本明細書で使用される膜透過性は、下記でより詳細に説明するが、過酸化水素を膜の内外に容易に通過させる、溶血センサの膜（例えば、溶血センサの外膜）の性質を指す。本明細書で使用される膜透過性は、例えば、溶血センサの外膜の含水率によって調整することができる。高含水率を有する膜は、低含水率を有する膜と比較して、過酸化水素について、高い透過性を有する。本発明による溶血センサの膜含水率は、好ましくは、約３０〜１００％の範囲である。
【００１３】
本明細書で使用される膜透過性にはまた、選択的膜透過性が含まれる。例えば、溶血センサ中の妨害除去膜は、過酸化水素が膜を容易に通過することを選択的に許容する一方で、他の物質、例えば、妨害物質の透過性に対する障壁として作用する。本明細書で使用される選択的膜透過性にはまた、１つ又は複数の溶血センサ膜（例えば、外膜）が、一部の粒子に膜を自由に通過させる（例えば、過酸化水素）一方で、他の物質、例えば、全血試料に由来するタンパク質分子の通過を遅らせる又は完全に防止する能力が含まれる。
【００１４】
本発明の一実施形態によれば、溶血センサは、全血試料中の細胞外ヘモグロビン（以後、別段の明記がない限り「ヘモグロビン」と称される）のペルオキシダーゼ様活性を有効利用する。基質（例えば、血中グルコース）がガス（例えば、酸素）の存在下でオキシドレダクターゼ酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）と反応すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が基質（例えば、血中グルコース）から生成され、Ｈ２Ｏは、全血試料の流体部分中に存在する細胞外ヘモグロビンによって消去（scavenge）される。
【００１５】
本明細書で使用される「消去される」は、Ｈ２Ｏ２が溶血センサ中のヘモグロビンと接触すると、ヘモグロビンによってＨ２Ｏ２がより小さい成分へと分解又は破壊されることを指す。
【００１６】
ヘモグロビンに誘導される過酸化水素のより小さい成分への分解又は破壊は、溶血センサにおける過酸化水素拡散勾配を発生させて、過酸化水素を好ましくは、過酸化水素を発生させる溶血センサの膜、例えば、下記でより詳細に説明する中間酵素膜から、溶血センサ内に導入された血液試料中の細胞外ヘモグロビンと接触している外膜の外表面を通じて及び外膜の外表面へと拡散させる。
【００１７】
溶血センサ中のヘモグロビンの消去作用により、作用電極、例えば、白金電極における酸化に必要なＨ２Ｏ２利用率が、溶血センサ中にヘモグロビンが存在しない場合と比較して減少する。ゆえに、溶血センサ中のヘモグロビンの存在下では、作用電極によって発生する電流が、溶血していない血液試料と比較して少なくなる。
【００１８】
血漿又は血清中の細胞外ヘモグロビン（赤血球の外側の）のみが過酸化水素と反応し、溶血に関する信号を生成することに留意することは重要である。赤血球内部のヘモグロビンは、溶血センサに対して作用を及ぼさない。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、本発明による溶血センサは、全血の流体部分中の同じ分析物の濃度よりも高い細胞内濃度を有する、患者の血液試料中の様々な分析物、例えば、カリウム、クレアチニン、又はマグネシウムの濃度の増加が、血液試料中の溶血、即ち、赤血球の完全性の喪失に起因するかどうか、又は血液試料を採取した患者における何らかの生理学的異常に起因するかどうかを評価するのに有用である。下記の表１は、無傷赤血球中で高い細胞内濃度を有する分析物である、カリウムの細胞外濃度に対する溶解した赤血球の作用を例示している。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
全血中の分析物レベル、例えば、カリウムの増加が、全血試料の溶血に起因するか、又は他の治療を必要とし得る他の不特定の原因に起因するかを、本発明による溶血センサによって決定することができる。したがって、全血試料の溶血は、全血試料中の分析物、例えば、カリウム、クレアチニン、又はマグネシウムの濃度の変更、典型的には、増加と相関する可能性がある。したがって、一態様では、本発明は、全血試料の細胞要素の存在下で細胞外ヘモグロビンの存在を検出し、血液試料、好ましくは、全血試料中の分析物の細胞外レベルの増加を血液試料中の溶血と相関させるための溶血センサ又は溶血センサシステムを対象とする。
【００２２】
一般的に、本明細書に記載された溶血センサは、下記でより詳細に説明する図１に示した例示的な電気化学システム８の部品、例えば、交換部品である。
【００２３】
電気化学センサシステム
図１を参照して、本発明による一実施形態では、電気化学センサシステム８は、一般的に１０に示されるセンサアセンブリを採用しており、これは、センサアセンブリ１０に導入された試料、例えば、血液試料、例えば、全血試料に対して電気的測定を行うように適合された、図２に示した溶血センサ１１０を含めた複数の電極を組み込んでいる。複数の電極における他の電極には、グルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、ｐＣＯ２９３、ｐＨ９４、Ｋ＋９０、Ｃａ＋＋８６、Ｎａ＋７８、及びｐＯ２７０の１つ又は複数が含まれ得る。システム８によって分析される全血試料は、溶血センサ１１０の、下記でより詳細に論じる外膜５１の外表面２００に導かれる。本発明の一実施形態では、システム８によって分析される血液試料、例えば、全血は、試料注入口１３ａを通じて導入される。血液試料は、例えば、シリンジ、チューブ、真空管システム、静脈穿刺、瀉血によって入手されるか、又は定期的に、例えば心臓切開手術の間に患者に接続される体外血流回路から得られる。全血試料は、試料注入口１３ａを介して若しくは他の自動的手段によって、又は手動で、例えば、シリンジによって、外膜５１の外表面２００と接触したセンサチャネル５６内に導入される。或いは、図２に示したように、全血試料を、別個の試料として導入してもよい。全血試料は、溶血センサ１１０において全血試料を溶血について分析する前又は間に、遠心分離に全く供されない。
【００２４】
図２を参照して、本発明の一実施形態では、溶血センサ１１０は、無試薬チャンバ、例えば、センサチャネル５６を含む。無試薬チャンバ５６は有利であり、その理由は、溶血センサ１１０が、溶血センサ１１０において全血を溶血について分析する前又は間に、ヘモグロビンを測定するために全血試料に添加される比色試薬又は他の試薬を必要としないからである。
【００２５】
図１及び図２を引き続き参照して、本発明の一実施形態では、電気化学システム８は、使い捨てカートリッジ３７を備える（図１）。カートリッジ３７は、センサアセンブリ１０に導入された試料、例えば、血液試料、例えば、全血試料に対して電気的測定を行うように適合された、溶血センサ１１０を含めた（図２に示した）複数のセンサを備えたセンサアセンブリ１０を組み込んでいる。複数のセンサにおける他の電極には、グルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、ｐＣＯ２９３、ｐＨ９４、Ｋ＋９０、Ｃａ＋＋８６、Ｎａ＋７８、及びｐＯ２７０の１つ又は複数が含まれ得る。一実施形態では、カートリッジ３７はまた、センサアセンブリ１０を備えた電気化学センサカード５０を組み込んでいる。
【００２６】
図１を参照して、カートリッジ３７は、センサアセンブリ１０を備えた、例えば図１〜３に示したセンサカード５０（電極又はサポートカードとしても知られている）を含有し、これは、低容量の気密チャンバを提供し、ここで、試料、例えば、全血試料、内部標準溶液、又はモノマー含有溶液が、１つ又は複数の電気化学センサ、例えば、溶血センサ１１０、ｐＨ９４、ｐＣＯ２９３、ｐＯ２７０、Ｎａ＋７８、Ｃａ＋＋８６、グルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、及びヘマトクリットセンサに提示される。
【００２７】
図１を引き続き参照して、本発明の一実施形態では、電気化学センサシステム８は、カートリッジ３７中に少なくとも３つのパッケージング済み容器１４、１６、及び１７を組み込んでおり、これらはそれぞれ、システム８によって測定されるパラメータの既知の値を有する内部標準溶液を含有する。パッケージング済み容器１４、１６、及び１７はそれぞれ、パッケージング済み容器１４、１６、１７が空になる前に、システム８中のセンサアセンブリのセンサが相当な回数較正されることを可能にするのに十分な分量のその内部標準溶液を含有する。内部標準溶液を含有する容器１４、１６、及び１７の１つ又は複数が空になったら、パッケージング済み容器１４、１６、及び１７を含有するカートリッジを交換する。
【００２８】
図２を参照して、センサチャネル５６内に導入された血液試料、例えば、全血試料、又は内部標準溶液容量が、センサチャネル５６を通じて出力セクション３４へと通過する場合、これは、図２に示したように、多数のセンサ、例えば、溶血センサ１１０上を通過する。例えば、血液試料及び／又は内部標準溶液は、溶血センサ１１０、ｐＯ２センサ７０、Ｎａ＋センサ７８、Ｃａ＋＋センサ８６、Ｋ＋センサ９０、グルコースセンサ９１、乳酸センサ９２、ｐＣＯ２センサ９３、ｐＨセンサ９４、ヘマトクリットセンサ９８、１００、クレアチニンセンサ１１６、及びクレアチンセンサ１１８上を通過させることができる。
【００２９】
図１をなお参照して、カートリッジ３７はまた、参照電極を取り囲む溶液のための容器２８を備える。容器２８は、フローライン３０によってセンサアセンブリ１０に接続される。システムは、センサアセンブリ１０を通過した後に、血液試料、内部標準溶液、及び参照電極用溶液２８を受容する、廃液容器３２をさらに備える。一実施形態では、センサアセンブリ１０は、これらの試料（例えば、血液試料）を、可撓性導管３４を介して廃液容器３２に移送する。図１をなお参照して、電気化学センサシステム８は、溶血センサ１１０を備えたセンサアセンブリ１０を格納するカートリッジ３７を電気化学センサシステム８に挿入すると形成される。挿入すると、センサアセンブリ１０は、ヒータブロックアセンブリ３９にはまり込む。
【００３０】
センサアセンブリ１０は、バンク中に多数のエッジコネクタ３６を有していてもよく、これにより、電気インタフェース３８の適合するメスコネクタに差し込むことが可能になり、その結果、アセンブリ１０上に形成された電極を、アナログボード４５を通じてマイクロプロセッサ４０に接続することができる。マイクロプロセッサ４０は、バルブドライバ４３を介してライン４２によってマルチポートバルブ１８に、またポンプドライバ４５を介してライン４４によって蠕動ポンプ２６のモータに接続される。
【００３１】
図２を参照して、例として、センサアセンブリ１０中のセンサカード５０は、一実施形態では、構造的に剛性の長方形のカード、例えば、ポリ塩化ビニルからなり、例えば、長方形のアルミニウム（又は他の好適な材料）のカバープレート５２が、その表面の一方に接着されている。本発明の一実施形態では、カバープレート５２は、カード５０の一方の表面に形成された、センサの膜に血液試料を導入するセンサフローチャネル５６を封鎖し、また熱サイクルによるセンサの水和のための熱移動媒体として、並びに較正の間及び患者全血試料中の関連パラメータを測定する間、センサアセンブリ１０を通じて流れる流体及び電極自体を一定の温度で維持するように作用する。試料フローチャネルは、一実施形態では、試料中に導入される試薬を含まず、即ち、チャンバは無試薬である。これは、プレート５２の温度を測定し、好適な加熱又は冷却素子、例えば、ペルチェ効果デバイス及びサーミスタ４１（図１）を採用して、プレート５２の温度を所望の温度に維持することによって実現することができる。
【００３２】
図３は、本発明の一実施形態による図２に示した例示的な溶血センサ１１０を示す。図示された溶血センサ１１０は、本明細書に記載された３つの層を含む複合膜６０（層及び膜という用語は、膜を表すのに本明細書で互換的に使用される）を備え、３つの層とは、まず、血液試料と接触している層、即ち、外層５１（外膜とも称される）、続いて、中間層５３の片側で外層５１と接触し、且つ中間層の反対側で内層と接触した、中間層５３（酵素層又は酵素膜とも称される）、下記でより詳細に説明する内層５５（内膜又は妨害除去層とも称される）であり、内層は、内層の片側で中間層と、且つ内層の他方の側で作用電極５７と接触しており、電極５７は、金属、例えば、白金製である。
【００３３】
溶血センサは、センサカード５０内のチャネルであるセンサチャネル５６の床面に配置される（図２）。センサカード５０は、低容量の気密フロースルーチャンバを提供し、ここで、患者試料、例えば、全血（例えば、溶血した血液）、血漿、又は血清が、これらに限定されないが、溶血１１０（細胞外ヘモグロビン）、グルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、ｐＣＯ２９３、ｐＨ９４、Ｋ＋９０、Ｃａ＋＋８６、Ｎａ＋７８、ｐＯ２７０センサを含めた、カード５０上の１つ又は複数のセンサに提示される。一実施形態では、溶血センサ１１０は、参照電極及び対電極を備える。
【００３４】
ここで図３〜６を参照して、溶血センサ１１０の複合膜６０は、化学反応（例えば、酵素反応）によってＨ２Ｏ２を発生させる層５３を備える。複合膜６０は、２つ、３つ、又はそれ以上の膜（又は層）、例えば、センサチャネル５６と接触して配置された外膜（又は外層）５１と、オキシドレダクターゼ酵素、例えば、グルコースオキシダーゼを含む酵素膜（又は酵素層）５３と、作用電極と接触した妨害除去内膜（又は妨害除去内層、又は内層）５５とを含む（図４〜６）。
【００３５】
溶血センサの複合膜の外層又は外膜
図３を参照して、外膜５１は、一般的に、試料フローチャンバ５６内の患者全血試料と接触して溶血センサ１１０の表面に配置される。外膜５１は、ポリウレタン成分、例えば、これに限定されないが、約４５〜１００％の含水率を有する脂肪族ポリエーテルポリウレタンから構成され、これは、Ｈ２Ｏ２が外膜５１の外表面を通じて溶血センサ１１０中から血液フローチャンバ５６へと拡散することを容易に許容し、そこで、Ｈ２Ｏ２は、全血試料と混ざり合う。
【００３６】
本発明の一実施形態では、外膜５１の厚さは、中間層（例えば、酵素層５３、及び内層（例えば、妨害層５５）、又は作用電極５７からの外膜５１を通じたＨ２Ｏ２拡散の速度を制御し、したがって、一実施形態では、溶血センサ１１０の外膜５１の厚さは、高Ｈ２Ｏ２濃度の領域（例えば、酵素層５３、他の内層（例えば、妨害層５５）、又は作用電極５７から低Ｈ２Ｏ２濃度（例えば、外膜５１）への、外膜５１を介したＨ２Ｏ２の正味の移動に基づいて選択される。
【００３７】
従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサでは、これらのセンサにおいて使用される外膜の厚さは、溶血を測定するために不利であり且つ機能せず、その理由は、これらのセンサ中の外膜のＨ２Ｏ２に対する透過性が、本明細書に記載された本発明による溶血センサ１１０における外膜のＨ２Ｏ２に対する透過性と比較して、低いからである。結果として、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサの外膜は、膜を介した（即ち、内膜から外膜方向への又は外膜を通じて膜の表面への）Ｈ２Ｏ２拡散を許容せず、したがって、本明細書に記載された溶血センサにおいて機能しない。従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサでは内膜から外膜へのＨ２Ｏ２の拡散がほとんど又は全くないため、本発明による溶血センサの外膜の透過性を特徴付ける過酸化水素透過性の増加により作用電極における酸化に必要なＨ２Ｏ２利用率が減少する溶血センサ１１０と比較して、作用電極、例えば、白金電極における酸化に必要なＨ２Ｏ２利用率が減少しない。そのため、全血に由来する細胞外ヘモグロビンの存在下で電流の振幅の十分な減少をもたらす溶血センサ１１０と比較して、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサは、全血に由来する細胞外ヘモグロビンが存在するかどうかにかかわらず、電流の振幅の十分な減少をもたらさない。
【００３８】
加えて、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサでは、これらのセンサにおいて使用される外膜の厚さはまた、溶血センサ１１０において不利であり且つ機能せず、その理由は、従来の外膜（グルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサ中の）は、溶血センサ１１０中の外膜と比較して、溶血センサ１１０において過酸化水素を発生させるのに必要とされる基質（例えば、グルコース）に対する透過性が低いからである。溶血センサ１１０では、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサにおける過酸化水素発生と比較して、十分に多くの過酸化水素発生が、溶血センサ１１０による溶血の検出のために必要である。
【００３９】
さらに、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサの外膜を有する溶血センサ１１０は、溶血を測定するために機能せず、その理由は、従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサによって提供される外膜の厚さが、溶血センサ１１０において使用した場合、恐らくは従来のグルコース９１、乳酸９２、クレアチン１１８、クレアチニン１１６、又はｐＯ２７０センサの外膜のＨ２Ｏ２に対する低い透過性により、全血試料中の細胞外ヘモグロビンの存在下で電流の振幅の減少に関して誤った結果を発生させるからである。
【００４０】
本発明の一実施形態では、ヘモグロビンセンサ１１０の外膜５１の厚さは、約０．０１μｍ〜約１００μｍ、約０．０１μｍ〜約９０μｍ、約０．１μｍ〜約８０μｍ、約０．１μｍ〜約７０μｍ、約０．１μｍ〜約６０μｍ、約０．１μｍ〜約５０μｍ、約０．１μｍ〜約４０μｍ、約０．１μｍ〜約３０μｍ、約０．１μｍ〜約２０μｍ、好ましくは、約０．１〜約１５μｍ、より好ましくは、約０．１〜約１０μｍの範囲である。
【００４１】
本発明の代替的な実施形態では、外膜５１は必要でなく、患者の溶血した全血試料中の細胞外ヘモグロビンは、酵素中間層５３を透過し、外膜５１の非存在下で、溶血センサ１１０の酵素中間層５３中のＨ２Ｏ２と直接相互作用することが企図される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、外膜５１は、約０．１％〜約１００％  約０．５％〜約１００％、約１％〜約９０％、約５％〜約８０％、約１０％〜約７５％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、好ましくは、約４０％〜約７０％、より好ましくは、約６０％〜約７０％の範囲の含水率を有するヒドロゲルを含む。０〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、又は９０〜１００％の範囲の含水率を有する本発明による外膜５１もまた企図される。
【００４３】
本発明による一実施形態では、溶血センサ１１０の外膜５１の、水に浸したときのヒドロゲルの膨張として定義される線膨張は、約０．１％〜約１００％、約０．５％〜約１００％、約１％〜約１００％、約５％〜約１００％、約１０％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、又は約１００％、好ましくは、約１５％〜約６５％、より好ましくは、約２０％〜約４５％の範囲である。
【００４４】
本発明による一実施形態では、外膜層５１は、ポリウレタン成分から構成されるヒドロゲルを含む。例えば、外膜の組成は、４５〜１００％の含水率を有する脂肪族ポリエーテルポリウレタンである。
【００４５】
本発明による溶血センサ１１０の別の実施形態では、外膜５１の粘度は、外膜５１の厚さを調節する。膜の厚さは、外膜５１を介したＨ２Ｏ２拡散の速度を制御する。例えば、外膜５１の粘度は、約０センチポアズ（cps）〜約１０，０００ｃｐｓ、約０〜約９，０００ｃｐｓ、約０〜約８，０００ｃｐｓ、０〜約７０００ｃｐｓ、約０〜約６０００ｃｐｓ、約０〜約５０００ｃｐｓ、約０〜約４０００ｃｐｓ、約０〜約３，０００ｃｐｓ、約０〜約２０００ｃｐｓ、約０〜約１０００ｃｐｓ、約０〜約９００ｃｐｓ、約０〜約８００ｃｐｓ、約０〜約７００ｃｐｓ、約０〜約６００ｃｐｓ、約０〜約５００ｃｐｓ、約０〜約４００ｃｐｓ、約０〜約３００ｃｐｓ、約０〜約２００ｃｐｓ、約０〜約１００ｃｐｓ、約０〜約９０ｃｐｓ、約０〜約８０ｃｐｓ、約０〜約７０ｃｐｓ、約０〜約６０ｃｐｓ、約０〜約５０ｃｐｓ、約０〜約４０ｃｐｓ、約０〜約３０ｃｐｓ、約０〜約２０ｃｐｓ、約０〜約１０ｃｐｓ、約０〜約１ｃｐｓ、好ましくは、約１０ｃｐｓ〜約５０００ｃｐｓ、より好ましくは、約１０ｃｐｓ〜約２５００ｃｐｓの範囲である。
【００４６】
図４及び５を参照して、本発明のさらに別の実施形態では、外膜５１の透過性は、溶血センサ１１０における異なる膜層を介した分子のランダムな動きによるＨ２Ｏ２の拡散を許容し、又は溶血センサ１１０における高濃度の領域、例えば、内膜（例えば、酵素膜５３）から外膜５１への或いは外膜５１から外膜５１の表面２００への、Ｈ２Ｏ２の正味の動きを許容する。例えば、過酸化水素の拡散は、酵素層５３若しくは妨害除去層５５から又は作用電極５７中及びその付近、即ち、そのごく近傍からチャネル５６内の全血試料へと起こる。別の実施形態では、外膜５１の透過性は、Ｈ２Ｏ２濃度又は勾配が変化するために飽和されない、即ち、外膜５１は、Ｈ２Ｏ２濃度又は勾配が、酵素層５３若しくは妨害除去層５５又は作用電極５７中及びその付近、即ち、そのごく近傍から外層５１の外表面２００へと変化する（即ち、増加又は減少する）ためにＨ２Ｏ２で飽和されない。別の実施形態では、外膜５１は、全血又は血漿中の異なる構成要素、例えば、これらに限定されないが、電解質、酸素、ヘモグロビン、二酸化炭素、重炭酸塩、メタン、タンパク質の拡散が、内膜（例えば、酵素膜５３）から外膜５１方向へのＨ２Ｏ２の拡散を妨害しないような材料（例えば、脂肪族ポリエーテルポリウレタン）から構成される。
【００４７】
全血中の溶血をモニタリング又は検出するための溶血センサの電気信号出力は、個々の患者の全血試料、例えば、溶血した全血試料中で起こり得る、酸素分圧（ｐＯ２）の変動によって影響される。その理由は、このセンサは酸素に対して透過性のヒドロゲル外膜を採用しており、過酸化物形成はｐＯ２レベルに依存するからである。酸素分圧は、患者の全血に由来する酸素がどの程度溶血センサ１１０の酵素中間層５３における酵素反応に利用可能であるかを示す。
【００４８】
溶血センサ応答に対するｐＯ２の影響を決定するための例示的な研究において、高ｐＯ２では、低ｐＯ２と比較して、同じレベルの基質、即ち、グルコースについて、より高い応答が確保されることが見出された。例えば、図１０中、１％の溶解した血液における２０３ｍｍＨｇのｐＯ２圧力は、１％の溶解した血液における１９．８ｍｍＨｇのｐＯ２圧力と比較して、高い酸素利用率を示す。ゆえに、全血中の溶血を検出する溶血センサ１１０の感度は、患者の全血中のｐＯ２の増加とともに増加する。したがって、本発明の一実施形態によれば、全血中の溶血に対する溶血センサの応答は、溶血センサ１１０の外膜５１を通じた酸素の流入を変更することによって変動させることができる。
【００４９】
図１０は、溶血センサ１１０の応答の感度に対する全血ｐＯ２の影響を例示しているが、一定の酸素分圧では、溶血センサ１１０の作用電極５７において発生する電流は、ヘモグロビンの非存在下で作用電極５７において発生する電流と比較して、ヘモグロビンの存在下では常に低いことに留意されたい（図９Ａの２００ｍｍＨｇのｐＯ２における１％の溶解した血液及び全血についての電流出力を比較されたい）。
【００５０】
本発明の別の非限定的な例示的な実施形態では、外膜５１は、複合膜６０の酵素層５３に、テトラヒドロフラン溶媒２０．０ｍＬ、５９％吸水ポリウレタン０．２ｇの溶液を分注することによって生成される。
【００５１】
別の実施形態では、外膜５１が本発明の実施形態に従って包含される場合、１つ又は複数の市販の膜、例えば、ＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Wilmington、MA）から入手可能なＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ６、Ｄ６４０、Ｄ７、及びＨＹＤＲＯＳＬＩＰが使用される。市販の外膜の特性を下記の表２に示す。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
酵素層５３の上に直接積層され、それと接触している外膜５１は、酵素層５３に包埋された酵素４９、例えば、グルコースオキシダーゼ及び酵素４９が包埋されている安定化マトリックスが、チャネル５６内の試料に由来する分解タンパク質又は化合物に曝されるのを防止することによって、酵素層５３を保存する働きをすることもできる。同様に、外膜５１は、酵素層５３からの酵素４９の拡散を防止することができる。外膜５１は、上記で論じたように、試料から酵素層５３への、基質（例えば、グルコース、乳酸、クレアチン、及びクレアチニン）及び酸素の拡散の速度を制御する働きをすることもできる。図３及び４をなお参照して、一実施形態では、溶血センサ１１０の外膜５１は、一般的に、酵素層５３からのＨ２Ｏ２の拡散を制御又は調節する働きをする。外膜５１は、溶血センサ１１０の他の成分をチャネル５６内の試料の構成要素との直接的な接触から保護することもできる。一実施形態では、外膜５１は、１つ又は複数のポリウレタン系化合物を含むポリマー膜である。膜の親水性又は疎水性は、ポリマー化合物の種の混合によって決定される。例えば、膜の親水性を増加させると、Ｈ２Ｏ２がより急速に膜を通じて拡散する能力を助長又は促進することができる。外膜５１の最適な組成は、Ｈ２Ｏ２の拡散速度の最適なバランスが典型的な条件下で存在する濃度である。
【００５４】
図４を参照して、外膜５１は、溶血した試料（例えば、全血）が、一般的に酵素層から拡散するＨ２Ｏ２と接触するための手段を提供する。例示的な実施形態では、溶血した試料が外層５１の外表面２００に置かれると、溶血した試料から放出されたヘモグロビン含有物が、酵素層５３から外層５１へと拡散するＨ２Ｏ２を消去する。
【００５５】
一実施形態では、酵素層５３の上に直接積層され、それと接触している外膜５１は、酵素層５３に包埋された酵素４９及び酵素４９が包埋されている安定化マトリックスが、チャネル５６内の患者血液試料中に存在する分解タンパク質又は化合物に曝されるのを防止することによって、酵素層５３を保存する働きをすることもできる。同様に、外膜５１は、酵素層５３からの酵素４９の拡散を防止することができる。外膜５１は、試料から酵素層５３への、基質（例えば、グルコース、乳酸、クレアチン、及びクレアチニン）及び酸素の拡散の速度を制御する働きもする。
【００５６】
一実施形態では、外膜が存在しない場合、下記でより詳細に論じる酵素層５１は、試料がセンサチャネル５６に沿って溶血センサ１１０上を流れるときに、試料と接触する。作用電極５７における過酸化水素の酸化によって発生する電気信号は、作用電極５７中の白金線によって運ばれ、図１に示した電気インタフェース３８及び接点３６と電気的に連通している導体６１に伝達される。
【００５７】
溶血センサの中間層又は中間膜（酵素層）
図４をなお参照して、溶血センサ１１０の酵素層５３は、酵素層５３のマトリックス中に安定化されている少なくとも１つの酵素４９を備える。酵素４９は、特定の基質が関わる酵素反応に必要とされる。一実施形態では、酵素４９には、酵素活性を有する少なくとも１つのタンパク質が含まれる。他の実施形態では、酵素４９には、例えば、いくつかの酵素、タンパク質、及び安定剤の混合物が含まれる。
【００５８】
本発明の例示的な実施形態では、タンパク質酵素４９は、溶血センサ１１０の酵素層５３に包埋されている、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、又は酵素の混合物（例えば、クレアチニナーゼ及び/又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼ）である。溶血センサ１１０は、Ｈ２Ｏ２発生器であり、即ち、溶血センサ１１０は、酵素層５３中の酵素４９が酵素基質と接触すると、Ｈ２Ｏ２を発生させる。例示的な実施形態では、溶血センサ１１０は、酵素層５３中にグルタルアルデヒド及びグルコースオキシダーゼを備える。一実施形態では、溶血センサ１１０は、グルコースオキシダーゼ１グラム当たりグルタルアルデヒド０．１０ｇを備える。別の例示的な実施形態では、溶血センサ１１０は、酵素層５３中にグルタルアルデヒド、ウシ血清アルブミン、及び酵素安定剤、例えば、ポリエチレンイミンなど、及び乳酸オキシダーゼを少なくとも備える。一実施形態では、溶血センサ１１０は、例えば、４５重量％の乳酸オキシダーゼ、４５重量％のウシ血清アルブミン、５重量％のポリエチレンイミン（酵素安定剤）、及び５重量％のグルタルアルデヒドを備える。乳酸オキシダーゼ及びウシ血清アルブミンの重量分率は変動してもよい。酵素層中のポリエチレンイミンの重量パーセントは変動してもよく、グルタルアルデヒドの重量パーセントは変動してもよい。他の酵素安定剤には、これらに限定されないが、ポリイオン化合物、例えば、ポリプロピレンイミン、ポリ（N-ビニルイミダゾール）、ポリアリルアミン、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリリジン、プロタミン、及びそれらの誘導体が含まれる。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態では、溶血センサ１１０の酵素層５３は、グルコースオキシダーゼ又は乳酸オキシダーゼのみの溶血センサ１１０を使用したＨ２Ｏ２の特異的生成の代わりに、酵素層５３のマトリックスに包埋された、いくつかの酵素、タンパク質、及び安定剤の混合物を備える。
【００６０】
酵素混合物は、溶血センサ１１０において使用されてＨ２Ｏ２を発生させ、これは、溶血した全血に由来するヘモグロビンによって消去される。本発明の例示的な実施形態では、溶血センサ１１０は、例えば、５重量％のクレアチニナーゼ、５５重量％のクレアチナーゼ、３０重量％のサルコシンオキシダーゼ、５重量％のポリ（N-ビニルイミダゾール）（酵素安定剤）、及び５重量％のグルタルアルデヒドの混合物を備える。
【００６１】
溶血センサ１１０中のクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、及びサルコシンオキシダーゼの重量分率、並びに溶血センサ１１０中のクレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼの重量分率は変動してもよい。溶血センサ１１０中のポリ（N-ビニルイミダゾール）の重量パーセントは変動してもよく、例えば、１％〜２０％であり、クレアチニン及びクレアチン電極中のグルタルアルデヒドの重量パーセントもまた変動してもよく、例えば、１％〜１０％である。ポリ（N-ビニルイミダゾール）以外のポリイオン安定剤を、酵素混合物を安定化するために使用することもできる。ポリイオン化合物の例には、これらに限定されないが、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリリジン、プロタミン、及びそれらの誘導体が含まれる。
【００６２】
一実施形態では、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、酵素の混合物（例えば、クレアチニナーゼ及び/又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼ）を含む溶血センサの酵素層５３は、酵素、安定剤、例えば、ポリエチレンイミン又はポリ（N-ビニルイミダゾール）、及び他のタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンの架橋マトリックスからなる。酵素、安定剤、及び他のタンパク質分子の架橋は、例えば、グルタルアルデヒド及びジアルデヒドを用いて達成される。他の架橋試薬、例えば、１，４−ジイソシアナトブタン、ジイソシアナト（diisocyanato）、１，２，７，８−ジエポキシオクタン及び１，２，９，１０−ジエポキシデカン、両方のジエポキシドを使用することもできる。酵素マトリックスにおける酵素分子の架橋並びにポリイオン安定剤及び不活性タンパク質の使用により、酵素電極の貯蔵寿命及び使用寿命を顕著に延長することができる。
【００６３】
内層又は内膜（妨害除去膜）
図３及び４を参照して、溶血センサ１１０はまた、白金導線を有する作用電極５７と緊密に接触した復元可能なポリマー膜である、妨害除去内膜又は層５５を備える。妨害除去内膜５５は、電解重合性モノマーが溶血センサ１１０上のポリマー内膜へと重合することによって形成される。好適な電解重合性モノマーには、ベンゾチオフェン、フェニレンジアミン（例えば、m-フェニレンジアミン（PDA）、及び例えば、フェノール）が含まれる。妨害除去内膜５５は、作用電極５７中の線を、溶血センサ１１０が適切に働くのを妨害する試料中の化合物、具体的には被酸化性化合物から絶縁又は保護する。一実施形態では、妨害除去膜は、Ｈ２Ｏ２のみに対して透過性であり、より大きい分子が作用電極５７において酸化を起こすのを阻止し、それによって、電流応答がＨ２Ｏ２のみから生じることを確実にする。
【００６４】
他の金属、例えば、金、炭素、銀、銅、パラジウム、及びイリジウムを、作用電極５７において白金の代わりに使用することができる。
【００６５】
本発明による一実施形態では、妨害除去内膜５５を含むポリマー膜は、電解重合性モノマーの存在下で導電線（例えば、白金線）を含む作用電極５７に電位を印加することによって形成される。モノマーは、電位の存在下で、作用電極５７上で重合して、図３及び４に示した作用電極５７上の電気的に絶縁性の妨害除去ポリマー内膜５５を形成する。溶血センサ１１０の酵素層５３中の酵素の特定の基質に対する活性により発生する過酸化水素は、妨害除去内膜５５の細孔を通過し、作用電極５７と接触して、作用電極５７における電気信号の発生を引き起こす。妨害除去内膜５５における、より小さいサイズの細孔により、過酸化水素よりも大きい試料中に見出される化合物、例えば、アセトアミノフェン、アスコルビン酸、尿酸、システイン、及びＨ２Ｏ２よりも大きい他の電気活性化合物（一般的に、妨害物質と称される）が偽信号を生成し、溶血センサの精度を低減させることを制限する。
【実施例】
【００６６】
上記の溶血センサ１１０は、市販の電気化学センサシステム、例えば、ＧＥＭ４０００（Instrumentation Laboratory Company、Bedford、MA）における使用に適合させることができる。一例として、溶血センサを以下のように調製した；酵素グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中で、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲のＧＯｘ濃度で調製した。ＧＯｘを、グルタルアルデヒド溶液（０．０６〜６％）と架橋させた。架橋酵素溶液を白金電極表面にドロップキャストし、３０分間風乾した。同様に、テトラヒドロフラン（THF）中の外膜ヒドロゲルＤ２（AdvanSource Biomaterials、Wilmington、MA）（１％）を酵素層にドロップキャストし、３０分間風乾した。乾燥の後、修飾白金電極を、ＧＥＭ４０００臨床分析装置（Instrumentation Laboratory Company、Bedford、MA）における使用のため、室温で９０分間ＧＥＭ４０００  Ｃａｌ  Ｂ緩衝溶液（Instrumentation Laboratory Company、Bedford、MA）、ｐＨ７．４溶液中で水和した。
【００６７】
別の態様では、本発明は、全血の溶血を検出又はモニタリングするための方法を対象とする。本方法の一実施形態では、酵素層５３中の少なくとも１つのオキシドレダクターゼ酵素と、過酸化水素に対して高度に透過性である外膜５１とを有する本発明による溶血センサ１１０に全血試料を導入し、続いて、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で過酸化水素によって発生する電気化学信号を検出する。作用電極５７における全血ベースラインから４％〜５０％の範囲の検出可能な電流の減少が、全血試料中の溶血の存在の指標である。
【００６８】
上記で論じたように、全血中の溶血により、全血試料の流体（例えば、血漿）の非細胞部分への細胞内分析物（例えば、カリウム、マグネシウム、又はクレアチニンなど）の増加が生じ、その理由は、これらの分析物（カリウム、マグネシウム、又はクレアチニン）は、破裂した又は異常に透過性の赤血球の細胞内含有物から放出されるからである。試料の収集及び処理の間の赤血球の崩壊によって生じる溶血は、臨床現場における溶血の一般的な原因である。例えば、全血中の溶血は、カリウムの分析の場合に特に問題となり、その理由は、赤血球内部のＫ＋レベルは、血漿中のカリウム濃度と比較して、約２０倍上昇するからである（Ｋ＋-赤血球中１０５ｍｍｏｌ／Ｌ対血漿中４．０ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【００６９】
例えば、溶血していない全血試料と比較して約１％の溶血は、全血Ｋ＋を約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ誤って上昇させ、これは、溶血の非存在下で臨床的に意義があると考えるのに十分である。そのため、一態様では、本発明は、患者の全血試料中の分析物、例えば、カリウムの上昇の起源が、全血試料の人工的溶血によって導入された人為的な結果に起因するか、又は患者における生理学的異常に起因するかを評価するための方法を対象とする。
【００７０】
本発明の別の態様は、本発明の溶血センサ１１０を利用して、溶血を起こしている全血試料中の少なくとも１つの成分のレベルを検出又はモニタリングする方法に関連する。全血中の溶血を検出するためにモニタリングすることができる、全血中の少なくとも１つのそのような成分は、ヘモグロビンである。しかしながら、本発明の方法を利用して、全血中の他の血液成分、例えば、電解質、ミネラル、ガスなどを、ヘモグロビンと併せて検出又はモニタリングすることもでき、又はヘモグロビンとは独立に検出又はモニタリングすることもできる。ある特定の態様では、少なくとも１つの血液成分は、ヘモグロビンであり、これは、ヘム基によりペルオキシダーゼ様の化学的挙動を示す。したがって、一態様では、本発明の方法は、過酸化物又は全血中の血液成分のペルオキシダーゼ様活性を活用して、溶血を検出又はモニタリングする。
【００７１】
一態様では、電気化学システム８（図１）は、溶血センサ１１０の電気出力の変化を測定することによって、全血中の溶血を検出又はモニタリングするように構成される。この態様では、電気化学センサシステム８の溶血センサ１１０は、溶血センサ１１０においてヘモグロビン（ペルオキシダーゼ）が過酸化水素と反応するときにヘモグロビンによって誘導される溶血センサ１１０中の電流の上下変動を測定することによって、試料（例えば、全血）中の溶血を検出する。溶血センサ１１０におけるヘモグロビン及び過酸化水素間の相互作用の結果として、過酸化水素は、ヒドロキシル基又は水及び酸素に分解される。結果として、溶血センサ１１０の作用電極５７（例えば、白金電極）における酸化に利用可能な過酸化水素が、溶血センサ１１０中のヘモグロビンの非存在下での過酸化水素の利用率と比較して少なくなる。溶血センサ１１０の作用電極５７における過酸化水素の酸化は、溶血センサ１１０中の電流を発生させる。血漿又は血清中の細胞外ヘモグロビン（赤血球の外側の）のみが過酸化水素と反応し、溶血に関する信号を生成することに留意することは重要である。細胞内ヘモグロビンは、溶血センサに対して作用を及ぼさない。
【００７２】
電気化学システム８中の溶血センサ１１０によって溶血をモニタリング又は検出する方法において、本発明の溶血センサ１１０は、試料及び酸化剤の存在下で過酸化水素を生成する、１つ又は複数のオキシドレダクターゼ酵素を含む。
【００７３】
グルコースオキシダーゼを有する溶血センサ
図２及び６を参照して、酵素層５３中にグルコースオキシダーゼを有する溶血センサ１１０は、酵素層５３における酵素反応によって生成される過酸化水素を消去することによって働く。酵素、グルコースオキシダーゼは、酸化剤、酸素の存在下でグルコースを特異的に酸化し、ヘモグロビンによって消去される化合物である過酸化水素を生成する。溶血センサ１１０において、過酸化水素によって発生する電気化学信号は、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で低下する。
【００７４】
クレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを有する溶血センサ
図２を参照して、酵素層中にクレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼをサルコシンオキシダーゼとともに有する溶血センサは、そのそれぞれの酵素層における酵素反応によって生成される過酸化水素を検出することによって働く。クレアチニナーゼを有する実施形態では、溶血センサ１１０中の酵素層５３は、３つの酵素：クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、及びサルコシンオキシダーゼの混合物を備える。この酵素混合物は、クレアチニン及びクレアチンを特異的に酸化し、サルコシンオキシダーゼの存在下で、過酸化水素を生成する。過酸化水素は、ヘモグロビンによって消去される。溶血センサ１１０において、過酸化水素によって発生する電気化学信号は、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で低下する。
【００７５】
クレアチナーゼを有する実施形態では、溶血センサ１１０中の酵素層５３は、２つの酵素：クレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼの混合物を備える。この酵素混合物は、クレアチンのみを特異的に酸化し、過酸化水素を生成する。過酸化水素は、ヘモグロビンによって消去される。溶血センサ１１０において、過酸化水素によって発生する電気化学信号は、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で低下する。
【００７６】
乳酸オキシダーゼを有する溶血センサ
図２を参照して、酵素層５３中に乳酸オキシダーゼを有する溶血センサは、酵素層５３における乳酸に対する乳酸オキシダーゼの酵素反応によって生成される過酸化水素を消去することによって働く。酵素層５３中に存在する乳酸オキシダーゼは、乳酸を酸化して過酸化水素を生成し、これは、ヘモグロビンによって消去される。溶血センサ１１０において、電気化学信号は、Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で過酸化水素によって発生する。
【００７７】
ヘモグロビンによるＨ２Ｏ２消去
図７は、ヘモグロビンによるＨ２Ｏ２消去の原理を対象とした研究の結果を示す。簡潔にいえば、白金作用電極、金対電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ参照電極からなる３電極電気化学セルを、緩衝溶液（ｐＨ７．４）に浸漬した。作用電極を、＋５００ｍＶ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ）で分極させ、その電流応答を撹拌条件下で連続的にモニタリングした。１８０秒付近で、Ｈ２Ｏ２（最終濃度  −  ９０μＭ）を細胞に注入し、これは、電流応答の上昇を生じさせ、次いで、即座に安定化した（注:１８０秒時点で観察されたスパイクは、溶液注入による人為的な結果であった）。この電流応答は、白金電極におけるＨ２Ｏ２の直接酸化から生じた。
【００７８】
図７を引き続き参照して、３２０秒時点でヘモグロビン（最終濃度  −  ７．３５μＭ）を上記の溶液に添加すると、初期バックグラウンド電流への急速な減少に続く緩やかな減少が観察された。これは、溶液に添加されたヘモグロビンが、溶液中の過酸化水素の分解を原因とすると思われる電流の即座の減衰を引き起こしたことを実証する。溶液中のＨ２Ｏ２の濃度が減少するにつれ、白金電極における対応する電流応答もまた減少する。５５０秒時点のＨ２Ｏ２（最終濃度  −  ８１μＭ）の２回目の添加は、電流スパイクに続く電流プロファイルの同様の減衰を示す。そのような挙動は、溶液中のヘモグロビン及びＨ２Ｏ２の相互作用が、白金電極における電気化学的酸化を使用して検出可能であることを証明する。
【００７９】
溶血した血漿に対するＧＯｘ／Ｄ２（１％）応答
図８Ａ及びＢは、溶血した血漿に対するＧＯｘ／Ｄ２（１％）応答を対象とした研究の結果を示す。この研究では、溶血センサを以下のように構築した。簡潔にいえば、酵素ＧＯｘ溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中で調製した。ＧＯｘの濃度は、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲とすることができる。グルタルアルデヒド溶液（０．０６〜６％）を上記の酵素溶液に添加し、３０分間架橋させた。架橋酵素溶液を白金電極表面にドロップキャストし、３０分間風乾した。同様に、ＴＨＦ中の外膜ヒドロゲルＤ２（AdvanSource Biomaterials）（１％）を酵素層にドロップキャストし、３０分間風乾した。乾燥の後、修飾白金電極を、室温で９０分間ＧＥＭ４０００  Ｃａｌ  Ｂ緩衝溶液（Instrumentation Laboratory Company、Bedford、MA）、ｐＨ７．４溶液中で水和した。
【００８０】
図８Ａ及びＢを参照して、溶血した分析物試料は以下のように調製した。ドナーからの５ｍＬの血液試料４つをプールし、３ｍＬのアリコート６つをプラスチックチューブ中で調製した。第１のアリコートを遠心分離し、血漿を分離した。他の５つのアリコートにおける溶血は、全血を２１−Ｇ針に通らせて、実際の臨床状況の収集プロセスを綿密に模倣することによって引き起こした。各往復操作（back and forth draws）が、１回のシリンジ操作（syringe draw）を構成する。試料を針に通過させる回数を、後続のアリコートごとに増加させて、溶血量の増加を生じさせた。溶血の後、５つのアリコートを全て遠心分離し、血漿を分離した。血漿（１．２ｍＬ）のグルコース濃度は、５００ｍｇ／ｄＬに調整した。
【００８１】
図８Ａ及びＢを引き続き参照して、測定は、図７について記載したように、３電極セル設定において行った。ここでは、ＧＯｘ酵素及びヒドロゲル膜で修飾された白金電極は、作用電極として作用した。Ｃａｌ  Ｂ緩衝溶液２４００μＬを含有する細胞を連続的に撹拌し、血漿試料の個々のアリコート（６００μＬ）を１２０秒時点で注入した。図８Ａは、各アリコートについての対応する実時間電流応答を示す。各注入の直後に、血漿アリコートのヘモグロビン及びＫ＋値を取得し、それらを下記の表３に示す。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
溶血応答較正グラフ、図８Ｂは、溶血なしの血漿応答（即ち、０回のシリンジ操作、上記の表３を参照）から溶血した試料（１〜５）の電流応答を引くことによって構築した。この目的のために、注入の３０秒後の電流応答を使用して、溶血した試料と溶血していない試料との差を算出した。図８Ａ及びＢは、上記のセンサが血漿中の細胞外ヘモグロビンに即座に応答し、且つ応答がヘモグロビン濃度に対して線形であることを明確に実証する。
【００８４】
溶血した血液に対するＧＯｘ／Ｄ２（１％）応答
その結果を図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃに示した研究の実験計画は、試験された試料が血漿試料ではなく全血及び溶血した血液であったことを除いて、図８に反映された研究について上記したものと同じであった。ここでは、部分的に溶血した血液を、完全に溶血した血液のアリコートからの％（v/v）溶液として調製した。例えば、溶解した血液１０μＬを全血９９０μＬに添加することによって、１％の溶解した血液（LB）を調製した。全試料中のグルコースレベルは、前述のように、５００ｍｇ／ｄＬの一定値に調整した。
【００８５】
図９Ａは、全血及び溶血した血液試料についての実時間電流プロファイルを示す一方、９Ｂは、算出された較正グラフに対応する。図９Ｃは、較正グラフの線形部を示す。これらの結果は、本発明による溶血センサが、１％の溶解した血液又はさらに低い濃度の溶解した血液に対して感受性であり応答することを示す。マトリックスが全血であり、溶血センサが細胞外ヘモグロビンのみに応答することに留意することは重要である。そのような急速（３０秒以内）で感受性の応答は、この溶血センサの目的の１つが、臨床分析装置において誤って上昇したＫ＋値があればフラグを立てることであるために、必要である。
【００８６】
１％の溶解した血液の検出に対する酸素分圧（ｐＯ２）の作用
図１０を参照して、酸素分圧（ｐＯ２）が溶血センサ応答に及ぼす影響を理解するためにｐＯ２研究を実施した。この技術は、患者全血中の溶血を測定することに焦点を合わせているため、試料ｐＯ２は、患者の病歴に応じて大きく変動し得る。他方で、溶血センサは、主に、グルコースオキシダーゼの存在下でグルコース及び酸素からＨ２Ｏ２を生成することによって作動する。酸素分圧は、酸素がどの程度この反応に利用可能であるかを示す。高ｐＯ２では、低ｐＯ２と比較して、同じレベルのグルコースについて、より高い応答が確保される。
【００８７】
図１０は、溶血センサ応答に対するｐＯ２の予想される影響をグラフで示す。溶血センサ応答に対するｐＯ２の影響の理由は、センサは酸素に対して透過性のヒドロゲル外膜を採用しており、過酸化物形成はｐＯ２レベルに依存するからである。溶血センサは、このガスに対する膜透過性により、患者血液試料中のｐＯ２変動の影響を受けやすい。この研究によって実証されるように、本発明による溶血センサは、ｐＯ２による線形の負バイアスを有する。例えば、２００〜２０ｍｍＨｇのｐＯ２は、１％の溶解した血液について線形の負バイアスを有し、ゆえに、そのような挙動を説明するための補正が必要とされる。補正は、ｐＯ２変動を説明する応答アルゴリズムによって行われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月8日(2014.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料中の溶血を検出するための電気化学センサシステムであって、
過酸化水素の流出を増大させるための０．１〜５０μｍの範囲の厚さを含む外膜、過酸化水素を発生させるオキシドレダクターゼ酵素を含む膜を有する電気化学センサと、
前記全血を前記センサと接触させるための無試薬チャンバと
を含む、電気化学センサシステム。
【請求項２】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項３】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、乳酸オキシダーゼを含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項４】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、酵素の混合物を含み、前記混合物が、クレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを少なくとも含む、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項５】
前記酵素の混合物が、前記クレアチニナーゼ及び前記サルコシンオキシダーゼを含む、請求項４に記載の電気化学センサシステム。
【請求項６】
前記酵素の混合物が、前記クレアチナーゼ及び前記サルコシンオキシダーゼを含む、請求項４に記載の電気化学センサシステム。
【請求項７】
全血試料中の溶血を検出するための方法であって、
（ｉ）オキシドレダクターゼ酵素と、過酸化水素に対して透過性の外膜とを含む電気化学センサに前記全血試料を導入し、続いて、
（ｉｉ）Ｈｂ（Ｆｅ２＋）の存在下で過酸化水素によって発生する電気化学信号を検出することを含み、ここで、標準的な溶血していない全血試料と比較して４％〜５０％の範囲の検出可能な電流の減少が、前記全血試料中の溶血の指標である、方法。
【請求項８】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、グルコースオキシダーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、乳酸オキシダーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記オキシドレダクターゼ酵素が、酵素の混合物を含み、前記混合物が、クレアチニナーゼ及び／又はクレアチナーゼ並びにサルコシンオキシダーゼを少なくとも含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記外膜が、０．１〜５０μｍの範囲の厚さを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記外膜が、ヒドロゲルである、請求項１に記載の電気化学センサシステム。
【請求項１３】
前記ヒドロゲルが、約０．１％〜約１００％の範囲の含水率を含む、請求項１２に記載の電気化学センサシステム。
【請求項１４】
前記外膜が、ヒドロゲルである、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒドロゲルが、約０．１％〜約１００％の範囲の含水率を含む、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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