(57)【要約】  本発明は、脂質及びカロテノイド、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを、混合栄養モードで、特に変化する及び／又は不連続な照明、特にフラッシュを使用して、高収率で生産することを可能とする、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する原生生物の新規株に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する方法であって、以下の工程：
ａ）１つ以上のオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の株を混合栄養モードで培養する工程
を含み、当該工程ａ）における培養工程が、以下の工程：
−ｉ）混合栄養又は従属栄養条件下で増殖させる工程、及び
−ｉｉ）混合栄養条件下でＤＨＡ及び／又はカロテノイドを蓄積させる工程
を含む、生産方法。
【請求項２】
工程ｉ）が発酵槽中で連続モードで実施され、工程ｉｉ）が、混合栄養条件下での、半連続モードで操作されるｎ個の発酵槽への、工程ｉ）で得られた細胞及びそれらの培養物の連続及び逐次的供給を含み、ｎは２以上の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合栄養モードでの培養が、時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で実施され、当該照明の強度が変化し、その振幅が５  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が、一時間あたり２〜３６００回起こる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記強度の変化の振幅が７０〜３００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、好ましくは１００〜２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フラッシュの形態で光が供給される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記フラッシュの持続時間が１／１０秒〜１０分、好ましくは５秒〜１０分、より好ましくは１０秒〜２分、より好ましくは２０秒〜１分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フラッシュの持続時間が、１／１５００００秒〜１／１０００秒である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記フラッシュの回数が、１時間あたり５〜３，６００回、好ましくは１０〜１５０回、好ましくは１５〜１００回、より好ましくは２０〜５０回である、請求項５又は６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記フラッシュの回数が、１時間あたり３．６  ｘ１０５〜５．４  ｘ  １０９回である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養が、１００  ｍＭ〜１．５  Ｍ、好ましくは２００ ｍＭ〜１．２ Ｍ、より好ましくは２５０  ｍＭ〜１  Ｍ、尚もより好ましくは３００  ｍＭ〜６００  ｍＭの有機炭素含有基質の存在下で実施され、当該有機炭素含有基質が、サッカロース、グリセロール、グルコース及びセルロースの誘導体並びにこれらの分子の混合物から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ｂ）培養培地中の有機炭素含有基質の存在下で数世代に渡って培養を維持する工程、及び任意で
ｃ）培養された細胞を回収する工程、及び任意で
ｄ）疎水性物質を回収する工程、及び任意で
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）及びカロテノイドを抽出する工程、
も含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オーランチオキトリウム属の株が、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）にアクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株に対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オーランチオキトリウム属の株が、以下の：
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／２で寄託されたＦＣＣ３１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３で寄託されたＦＣＣ１３１１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４で寄託されたＦＣＣ１３１９株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５で寄託されたＦＣＣ１３２５株；及び
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６で寄託されたＦＣＣ１４７９株；
から選択される株に対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オーランチオキトリウム属の株が、以下の：
−ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／２で寄託されたＦＣＣ３１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３で寄託されたＦＣＣ１３１１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４で寄託されたＦＣＣ１３１９株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５で寄託されたＦＣＣ１３２５株；及び
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６で寄託されたＦＣＣ１４７９株；
から選択される株に対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養の照明が、発酵槽内部の、好ましくは発酵槽内部のバッフル上に配置された照明装置によって確保される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記照明の光源が発光ダイオードである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｉｉ）が１５〜２５℃で実施される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）にアクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株。
【請求項１９】
以下：
−ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３で寄託されたＦＣＣ１３１１株；
−ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４で寄託されたＦＣＣ１３１９株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５で寄託されたＦＣＣ１３２５株；及び
−ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６で寄託されたＦＣＣ１４７９株；
から選択される株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュロマイケテス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱、特にオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の原生生物を混合栄養モードで特に不連続な照明および／または変化する照明の存在下にて培養する方法に関する。この方法により、バイオマスを高収率にすることと、このようにして培養された原生生物の脂質及びカロテノイド、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを豊富にすることが可能になる。この方法により、混合栄養性であって、脂質および／またはカロテノイド、より具体的には高不飽和脂肪酸、及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの収率が高い、オーランチオキトリウム属の株を培養することができる。また、本発明は、オーランチオキトリウム属に属する原生生物のうちで特に脂質及びカロテノイドの産生に適した新規な株にも関する。オーランチオキトリウム属のこの新規な株は、混合栄養モードでのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの産生に有用である。
【背景技術】
【０００２】
高不飽和脂肪酸のうちで、オメガ−３シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）のいくつかの非常に不飽和な脂肪酸（ＨＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡまたはＣ２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはＣ２２：６  ω３）と、オメガ−６シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）からのいくつかの非常に不飽和な脂肪酸、特にアラキドン酸（ＡＲＡまたはＡＡ、またはエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４  ω６）が、栄養学的に重要であると認識されていて、治療の用途で大きな可能性がある。
【０００３】
必須栄養素の一つとして、ＤＨＡは、細胞の通常の機能的発達に必須であり、様々な生化学的プロセス及び機能において、重大な役割を果たす。斯かる多不飽和の特性は、植物及び動物の両方の細胞膜の特性に関して重要な役割を果たし、低温下での、特に魚の、例えば効率的な適応、あるいは生存を可能とする、流動性、柔軟性、及び選択的透過性をもたらし得る。
【０００４】
ＤＨＡは、ヒトの脳の主要な構成要素であり、その主要な脂肪酸である。ＤＨＡは、大脳皮質の１５〜２０％を占め（成人の脳は２０ｇ以上のＤＨＡを含有する）、網膜の３０〜６０％を占める。ＤＨＡは、細胞膜に組み込まれることにより、中枢神経系の発達及び網膜の機能にとって必須であり、映像及び記憶の機構を十分に維持し、適応において主要な役割を果たす。
【０００５】
現在のところ、水産業からの魚油が、市場においてこのようなタイプの脂肪酸の主な供給源になっている。しかしこれらの油には新たな用途（養殖における食品サプリメント、マーガリンへの組み込み）があるにもかかわらず、活発な漁獲活動が理由で海の漁獲資源が少なくなりつつある。
【０００６】
したがって、これらのタイプの高不飽和脂肪酸に対する将来における要求の増大に対処するため、ＥＰＡ、ＤＨＡやＡＲＡといった脂肪酸の新たな供給源を探す必要がある。
【０００７】
原生生物は、単純な細胞組織を有する微小生物であり、即ちそれらは、一般に単細胞であり、多細胞の場合もあるが、分化した組織構造を有しない。それらは独立栄養性又は従属栄養性であってもよい。
【０００８】
微生物は、現在、様々な産業的計画の主体である。それらの幾つかの種は、顕著な量の脂質、特に高不飽和脂肪酸を蓄積又は分泌し得るからである。
【０００９】
原生生物は、脂肪酸を新たに合成できることに加え、魚油と比べていくつかの利点を有する。原生生物は、インビトロで制御された条件下において培養できるため、バイオマスを比較的一定の生化学的組成で産生することが可能であることに加え、魚油とは違って脂質にコレステロールがほとんど含まれないか、まったく含まれていない。
【００１０】
最後に、原生生物によって産生される脂質は、魚油よりも脂肪酸のプロファイルが簡単であるため、興味の対象である脂肪酸を分離する工程の数が限られる。
【００１１】
更に、カロテノイドも興味の対象となる分子である。これらは一般に色素として使用されるが、抗酸化剤としてヒトの健康に顕著な役割も有している。最後に、それらは免疫系を刺激する能力を有する。
【００１２】
トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｅｓ）、特にオーランチオキトリウムは、従属栄養モードで培養するとＤＨＡを生産することが知られている（Ｗ．Ｋ．  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）；  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏａｌｇａ，  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＲＳ１０１．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．：  １６４（８）：１４６８−８０）。オーランチオキトリウムは、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチン等のカロテノイドを生産することも知られている［Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｒ，  Ｈｏｎｄａ，  Ｄ．  （２００７）  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  ａｎｄ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  （Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ，  Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）：  ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｅｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｇｅｎ．  ｎｏｖ．；  Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ４８，  ｐｐ  １９９−２１１］。
【００１３】
原生生物による脂肪酸及び／又はカロテノイドの産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。
【００１４】
いずれにしても、より効率的かつより費用効果の優れた産業的利用のために、従来技術で記載されているよりも優れた収率でＤＨＡ及びカロテノイドを取得できることが望ましい。
【００１５】
したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば乾燥材料が８０ｇ／ｌを超えるバイオマスと、乾燥材料の全重量に対して３０重量％超の脂肪酸、そして乾燥材料の全重量に対して０．１重量％のカロテノイド）。
【００１６】
増殖に対する光の影響は、光合成生物（植物；シアノバクテリア、原生生物及び巨大藻類）に限られない。幾つかのクロロフィルを有しない生物は、それらの発生に必須である光エネルギーを捕捉することが出来る光受容体を有する。フィトクロム等の光受容体は、それを有する生物の発生を制御する光センサーの典型例を表す。現在までに、様々な光受容体が報告されており、中でも、補助色素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ）、クリプトクロム、フォトトロピンがよく知られている。
【００１７】
加えて、培養のモードに関して、バイオマス生産の分野で通常使用される、３種類の発酵プロセスが存在する。
【００１８】
−不連続（又は「バッチ」）モード：
タンクに滅菌した培養培地を充填し、ここに種菌を播種する。培地への顕著な添加物の添加を要さずに（主にｐＨ調整剤や脱泡剤）、発酵が起こる。体積は一定で、バイオマスの生産性は比較的低い。発酵の最後に、発酵槽が空にされ、その内容物は置き換えられる。
【００１９】
−半連続（又は「フェド−バッチ」）モード：
この生産方法は、培養中に漸進的に栄養物質を導入することに基づく。このモードは、一般に、発酵槽中に高い細胞密度を達成するために使用される。
【００２０】
−連続モード：
この方法において、通常「ケモスタット」と呼ばれる発酵槽が使用され、その中に新鮮な培地が連続的に添加され、一方培養液は連続的に抜き取られて、培養体積が一定に維持される。
【００２１】
細胞の増殖速度は、栄養物質の供給の速度を変化させ、一方細胞又は株の各種類の生理学的限界（特定のプロセス条件下でのその特定の最大増殖速度（μｍａｘ）に依存する）を順守することによりモニタリングできる。
【００２２】
連続モードは、バイオマスの増殖と所望の代謝物の生産との間の平衡に対応する所定の生理的平衡状態における微生物の培養を可能とする。
【００２３】
平衡状態において、定常速度での細胞増殖及び培養のパラメーターは、一定を維持する（ｐＨ、体積、溶存酸素濃度、栄養素及び産物の濃度、細胞密度等）。
【００２４】
連続モードは、特に、以下の利点を有する：
−バイオマスの全体の生産コストが低下する（洗浄、滅菌及び培養操作、発酵レベルでの装備の不動化の減少）；
−生産性（１時間あたりに生産されるバイオマスの量）が増大する；
−バイオマスの連続的な回収が、装備の寸法を最大化することにより下流の操作を促進することを可能とする。
【００２５】
しかしながら、前記連続プロセスは欠点も有り、特に、所望の分子の生産が細胞の増殖相から離れている、又は部分的に離れているときに不利となる。従って、所望の物質がこの最適の増殖相の外側に有る場合（例えば培養終期、培養の定常期の期間内）、経済的関心に適合した性能を得ることが困難である。
【００２６】
連続モードに関連した他の制約は：
−大量の廃液の管理（バイオマスの濃度の低下）、
−消費されなかった材料（残留物質）の損失も、下流のプロセス（抽出、乾燥等）に一定の影響を有することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
従って、産業スケールで費用効果に優れた所望のバイオマス及び分子のレベルを達成することが可能な培養モードに従ってＤＨＡ及び／又はカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産するための、オーランチオキトリウムの株の培養物を生産することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
ＤＨＡ及びカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの収量を改善するために、本発明の培養方法は、混合栄養モード、即ち照明、好ましくは変化する及び／又は不連続な強度の照明を用い、そして有機物質の供給の存在下で、実施される。
【００２９】
混合栄養という用語は、通常、葉緑体を有し、光の存在下、２つの炭素源（有機及び無機）を使用して増殖が可能な株に関して採用されると理解される。オーランチオキトリウム属の株の場合、そのような葉緑体は同定されていない。しかしながら、当該株は従属栄養性であり光に反応性もあるので、混合栄養は、本発明において、この株のカテゴリーにまで拡張される。「光従属栄養」という用語も、そのような株を示すのに使用され得る。
【００３０】
従って、高不飽和脂肪酸及びカロテノイド、特にＤＨＡ及びカロテノイド、特にカンタキサンチン及びアスタキサンチンを、混合栄養モードで、本発明の条件下で、高収率で生産することを可能とする、オーランチオキトリウム属の原生生物株を単離せしめるために、多数のスクリーニング試験が必要であった。
【００３１】
そのように単離及び選択されたオーランチオキトリウムの新規株の代表的な株は、ＣＣＡＰ  （Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，  Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｄｕｎｓｔａｆｆｎａｇｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｏｂａｎ，  Ａｒｇｙｌｌ  ＰＡ３７  １ＱＡ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に寄託された。
【００３２】
従って、株（ＦＣＣ１３２４）は、ブダペスト条約の規定に従い、２０１３年６月２１日に、アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で、ＣＣＡＰに寄託された。
【００３３】
株ＦＣＣ  ３１  （アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／２）；  ＦＣＣ １３１１  （アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３）；  ＦＣＣ １３１９  （アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４）；  ＦＣＣ １３２５  （アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５）及びＦＣＣ １４７９  （アクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６）は、ブダペスト条約の規定に従い、２０１４年７月８日に、ＣＣＡＰに寄託された。
【００３４】
一つの態様において、前記混合栄養モードでの培養は、時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で実施され、当該照明の強度が変化し、その振幅は５  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が、一時間あたり２〜３６００回起こる。斯かる強度の変化の振幅は、７０〜３００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、好ましくは１００〜２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一つの態様に係る方法である「不連結方法」の模式図を示す。
【００３６】
【図２】株ＦＣＣ  １３２４  （ＣＣＡＰ  ４０６２／１）と、オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株ＦＣＣ  １１０４（寄託番号ＣＣＡＰ４０８７／１）との間の増殖の比較を示す。（Ａ）は窒素源としてＮＨ４＋の存在下の増殖、（Ｂ）は、は窒素源としてＮＯ３−の存在下の増殖を示す。
【００３７】
【図３】窒素源としてＮＨ４＋を含有する培地中で増殖させた細胞の光学顕微鏡画像を示す。（Ａ）はＦＣＣ  １３２４  （ＣＣＡＰ  ４０６２／１）の画像、（Ｂ）はオーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株ＦＣＣ  １１０４（寄託番号ＣＣＡＰ４０８７／１）の画像である。これらの２つの画像はいずれも×１０００の倍率で撮像された。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
従って、本発明は、ラビリンチュロマイケテス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱、特にトラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）科、特にオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の原生生物を、混合栄養モードで、特に時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で、培養する方法に関する。
【００３９】
また、本発明は、ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する方法にも関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）１つ以上のオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の株を混合栄養モードで培養する工程
を含む。
【００４０】
前記照明は、好ましくは強度が変化し、その振幅は、一般に５  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、好ましくは、３０  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１〜４００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。本発明の態様において、これらの変化は、一般に一時間あたり２〜３６００回、好ましくは２〜２００回起こる。この照明は、不連続及び／又は変化する照明の相を含んでもよく、強度の変化が、同一又は異なる振幅を有してもよい。
【００４１】
一つの態様において、前記照明は、フラッシュの形態で実施される、一つの態様において、フラッシュの持続時間は１／１０秒〜１０分、好ましくは５秒〜１０分、より好ましくは１０秒〜２分、より好ましくは２０秒〜１分である。
【００４２】
一つの態様において、前記フラッシュの回数は、１時間あたり５〜３，６００回、好ましくは１０〜１５０回、好ましくは１５〜１００回、より好ましくは２０〜５０回である。
【００４３】
一つの態様において、前記培養における照明は、発酵槽内部の、好ましくは発酵槽内部のバッフル上に配置された照明装置によって確保される。好ましい態様において、前記照明の光源は発光ダイオードである。
【００４４】
本発明の態様において、混合栄養モードでの培養方法は、１００  ｍＭ〜１．５  Ｍ、好ましくは２００ ｍＭ〜１．２ Ｍ、より好ましくは２５０  ｍＭ〜１  Ｍ、尚もより好ましくは３００  ｍＭ〜６００  ｍＭの有機炭素含有基質の存在下で実施される。当該基質は、細胞が高濃度で脂質及びカロテノイドを蓄積するように、培養中に連続的に供給される。十分な濃度を維持するように、当該培養方法の間中、追加の基質が培養培地に添加される。
【００４５】
本発明の他の態様において、前記培養方法は、発酵槽中で混合栄養又は従属栄養条件下で連続モードで細胞を培養する工程（「増殖」工程）、当該発酵槽中の、当該生産された細胞及びそれらの培養物を、半連続モードで操作する発酵槽に注ぎ込む工程（「熟成」工程）を含む（図１）。
【００４６】
本発明の方法は、培養物から取得されるバイオマスの収率が増大するという利点を有する。また、そのように培養された原生生物が、高不飽和脂肪酸、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びカロテノイドに富むという利点も有する。本発明の態様においてオーランチオキトリウムによって生産され得るカロテノイドは、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチンである。本発明の態様において、優勢なカロテノイドは、カンタキサンチン及びアスタキサンチンである。
【００４７】
この原生生物の混合栄養モードでの培養は、好ましくは、１００ｍＭ〜１．５Ｍ、好ましくは２００ｍＭ〜１．２Ｍ、より好ましくは２５０ｍＭ〜１Ｍ、なおもより好ましくは６００ｍＭ〜９００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質及びカロテノイドを蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、セルロース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはラクトース、および／またはスクロース、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。
【００４８】
培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って原生生物を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。
【００４９】
一つの態様において、前記有機炭素基質は、培養培地中に、３００ｍＭ以上のグルコース及び／又はグリセロールとして含有される。
【００５０】
この方法は、より具体的には、ラビリンチュロマイケテス綱、特にオーランチオキトリウム属の原生生物（界：  Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ、目：  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ、科：  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、高収量の高不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ、及びカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを有し、特に、例えば改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３  ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４  ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０  ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５  ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ、消泡剤０．１  ｍＬ／Ｌ）に有機炭素含有基質を添加した有機成分に富む培地中で、１０μＥを超えて光を供給して培養出来る、新規株の使用を想定する。有機炭素含有基質は、グルコースまたはグリセロールを３００ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。
【００５１】
「株」とは、オーランチオキトリウム属の天然の株に加えて、天然の株の突然変異をも意味する。
【００５２】
「変異体」とは、元の株に由来する生物であって、その遺伝子プールが、自然の方法により、又はランダム突然変異を発生させる当業者に公知の生化学的方法（例えばＵＶ）により、又は遺伝子操作方法により、改変されているものを意味する。
【００５３】
「混合栄養条件」とは、光の供給及び有機炭素基質の供給が有る培養を意味する。
【００５４】
「従属栄養条件」は、暗黒下で有機炭素含有基質を供給することを意味する。
【００５５】
本発明の（オーランチオキトリウム属の）株の代表的な株は、以下の株である。
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／２で寄託されたＦＣＣ３１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／３で寄託されたＦＣＣ１３１１株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／４で寄託されたＦＣＣ１３１９株；
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／５で寄託されたＦＣＣ１３２５株；及び
−出願人によって単離され、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に番号ＣＣＡＰ  ４０６２／６で寄託されたＦＣＣ１４７９株；
【００５６】
これらの株は、それらが、本発明の好ましい態様に従い、混合栄養モードで、特に変化する又は不連続な光の供給条件下で培養されたときに、顕著な量のバイオマス及び脂質及びカロテノイド、より好ましくはＤＨＡ及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産できる。
【００５７】
分類解析によると、ＦＣＣ  １３２４  （ＣＣＡＰ  ４０６２／１），  ＦＣＣ  ３１  （ＣＣＡＰ  ４０６２／２），  ＦＣＣ １３１１  （ＣＣＡＰ  ４０６２／３），  ＦＣＣ １３１９  （ＣＣＡＰ  ４０６２／４），  ＦＣＣ １３２５  （ＣＣＡＰ  ４０６２／５）及びＦＣＣ １４７９  （ＣＣＡＰ  ４０６２／６）は、オーランチオキトリウム属に属する。
【００５８】
本発明は、これらの新規株ＦＣＣ  １３２４  （ＣＣＡＰ  ４０６２／１），  ＦＣＣ  ３１  （ＣＣＡＰ  ４０６２／２），  ＦＣＣ １３１１  （ＣＣＡＰ  ４０６２／１），  ＦＣＣ １３１９  （ＣＣＡＰ  ４０６２／４），  ＦＣＣ １３２５  （ＣＣＡＰ  ４０６２／５）及びＦＣＣ １４７９  （ＣＣＡＰ  ４０６２／６）に関する。
【００５９】
オーランチオキトリウム・マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）種に属する幾つかの株は互いに異なる。ＣＣＡＰ  ４０６２／１，  ＣＣＡＰ  ４０６２／２，  ＣＣＡＰ  ４０６２／３，  ＣＣＡＰ  ４０６２／４，  ＣＣＡＰ  ４０６２／５，  ＣＣＡＰ  ４０６２／６株は、類似の特性を有する。例えば、ＣＣＡＰ  ４０６２／１株と、従来技術のオーランチオキトリウム・マングロベイＦＣＣ  １１０４  （寄託番号ＣＣＡＰ  ４０８７／１）株は、それらの形態的特徴及び増殖プロフィールが異なる。
【００６０】
発明者らは、増殖試験及び形態解析により、その差異を見出すことができた。同一の培養条件下で、これらの２つの株の増殖は、増殖速度及び飽和相で到達した光学密度の両方の観点で相違していた（図２Ａ及び２Ｂ）。効果的なことに、ＣＣＡＰ  ４０８７／１株は、ＣＣＡＰ  ４０６２／１株よりも、ＮＨ４＋を含有する培地中でより増殖し、一方、窒素源としてＮＯ３−を含有する培地では、その逆が観察される。
【００６１】
加えて、ＣＣＡＰ  ４０８７／１株は、より小さい（図３Ａ及び３Ｂ）。
【００６２】
本発明は、混合栄養条件、例えば本願で記載される条件下で増殖可能で、ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、例えばアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ベータカロテン及びフェニコキサンチンを生産できる、ラビリンチュロマイケテス綱、特にオーランチオキトリウム属の、いずれかの株に関する。
【００６３】
本発明は、本願に記載したような混合栄養培養条件で増殖できて脂肪酸、例えばＤＨＡ、及びカロテノイド、例えばカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの産生が可能なオーランチオキトリウム属の原生生物のあらゆる種にも関する。
【００６４】
本発明によって単離されたオーランチオキトリウム株により、混合栄養条件下で、大量のバイオマスと、脂質及びカロテノイドを産生させることができ、当該脂質は、ＤＨＡに富む。実際に、本発明の方法は、取得されるオーランチオキトリウムのバイオマスが、乾燥物の重量に対して５０〜６０％の脂質を含有することを可能とする。なおそのＤＨＡは、原生生物に含まれる全脂肪酸の１５％超、または２０％超、または３０％超を占めることができる。前記カロテノイドはカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンに富み、当該カンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンは、乾燥物の全重量の０．０１％超、又は０．１％超、又は０．２％超を占めてもよい。当該株は、カンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産性（１時間あたりの１リットルの培養物あたりの所望の産物の量）が、０．０５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は１  ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は１．５ｍｇ／Ｌ／ｈのレベルに達してもよい。
【００６５】
本発明において、混合栄養条件下、可変および／または不連続な照明、特にフラッシュの存在下で培養されたオーランチオキトリウムの株（例えば発明者らにより単離されたＦＣＣ  １３２４，  ＦＣＣ  ３１，  ＦＣＣ １３１１，  ＦＣＣ １３１９，  ＦＣＣ １３２５およびＦＣＣ １４７９株）は、カンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産が可能である。一方、従属栄養条件下では、アスタキサンチンは検出されない。更に、本発明の幾つかの態様に係る混合栄養モードで取得されるバイオマスの量は、従属栄養条件下で取得される量と同等又は上回る（例えば約１０〜１８％）。「従属栄養条件」とは、照明を点灯しない以外は同一の培養条件であることを意味する。
【００６６】
一方、従属栄養条件下では、カンタキサンチンは検出されない。更に、本発明の幾つかの態様に係る混合栄養モードで取得されるバイオマスの量は、従属栄養条件下で取得される量と同等又は上回る（例えば約１０〜１８％）。「従属栄養条件」とは、照明を点灯しない以外は同一の培養条件であることを意味する。
【００６７】
従って、本発明は、ラビリンチュロマイケテス綱、スラウストキトリド科、特にオーランチオキトリウム属、特にオーランチオキトリウム種の原生生物を、混合栄養モード下、時間中に変動し、又は不連続、例えばフラッシュの形態である照明の存在下で培養することにより、脂肪酸及びカロテノイド、例えばＤＨＡ及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する方法に関する。
【００６８】
従って、本発明は、ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを、オーランチオキトリウム属の１つ以上の株によって生産する方法に関する。
【００６９】
従って、本発明は、混合栄養的特徴を有し、混合栄養モードで、特に時間中に変動し、又は不連続、例えばフラッシュの形態である照明の存在下で、高収量の高不飽和脂肪酸及びカロテノイド、例えばＤＨＡ及びカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する、ビリンツロマイケテス綱、スラウストキトリド科、特にオーランチオキトリウム属、特にオーランチオキトリウム種の原生生物の株を選択する方法に関する。
【００７０】
本発明の態様において、ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する方法は、オーランチオキトリウム属の１つ以上の株の、混合栄養モードでの培養を含む。
【００７１】
本発明の態様において、工程ａ）は、以下の工程
ｉ）混合栄養又は従属栄養条件下で増殖させる工程、及び
ｉｉ）混合栄養条件下でＤＨＡ及び／又はカロテノイドを蓄積させる工程
を含み得る。
【００７２】
本発明の態様において、産業スケールでＤＨＡ及び／又はカロテノイドを生産するのに特にふさわしい場合、工程ｉ）は発酵槽中で連続モードで実施され、工程ｉｉ）は、混合栄養条件下での、半連続モードで操作されるｎ個の発酵槽への、工程ｉ）で得られた細胞及びそれらの培養物の連続及び逐次的供給を含み、ｎは２以上の整数である。
【００７３】
工程ｉ）は、顕著な集団数を達成出来る細胞の増殖相である。一般に、オーランチオキトリウム属の株の培養にふさわしい培養培地が使用される。
【００７４】
工程ｉｉ）は、ＤＨＡ及び／又はカロテノイドの蓄積の相である。好ましくは、この相は、代謝をこれらの所望の分子の蓄積に好ましく向かわせることを可能とする第二の供給手段を用いる。例えば、ＤＨＡの製造の場合、この方向付けは、炭素の濃度と容易に吸収される炭素の濃度との比率（Ｃ／Ｎ比）を増大させることによりなされる。
【００７５】
実際に、連続モードを実行する第一の発酵槽は、細胞の増殖（工程ｉ））を可能とし、この増殖発酵槽からの送出の流れ（又は排出）は、熟成タンクを供給し、そこでのバイオマスは、所望の分子が蓄積している（工程ｉｉ））。
【００７６】
本発明のこの態様において、前記方法は、「不連結」と呼ばれる方法として記載され得て、工程ｉ）の増殖相と工程ｉｉ）の熟成相は、物理的及び時間的に分離される。
【００７７】
本発明のバイオマスの生産方法の連続モードでの細胞の培養の工程ｉ）、又は「増殖工程」は、当業者に知られる発酵槽、例えば「ケモスタット」中で実施されてもよい。
【００７８】
工程ｉ）の培養の開始は、通常の方法で実施される（図１）。上流で前培養工程が実施され、連続的なバイオマスの生産を開始するのに望ましい細胞濃度、即ち２〜５０  ｇ／Ｌ、好ましくは５〜４０  ｇ／Ｌを得てもよい。
【００７９】
一般に、クライオチューブからのスケールの増大は、幾つかの前培養工程を経て実施される。例えば、それは、エルレンマイヤー中での２つの工程（前培養１及び前培養２）、並びに発酵槽中での１つの工程（前発酵槽）の３つの工程で行われてもよい。エルレンマイヤー中での増殖は、不連続（バッチ）モードで起こる。一般に、前発酵槽も、不連続モードで起こる。
【００８０】
例えば、前記培養は、２０ｍｌ  エルレンマイヤーでの培養から２ｌ  エルレンマイヤーでの培養に、そして不連続（バッチ）モードでの発酵槽での培養に（前発酵槽）、そして連続（トップ発酵槽）モードでの発酵槽での培養に漸進的に進み得る。例えば、不連続モードでの発酵槽の容積は４０Ｌで、トップ発酵槽の容積は４０００Ｌである。
【００８１】
トップ発酵槽での培養の開始は、その間に連続的な体制が達成されない、即ち細胞の増殖が安定しない、又は相内で新鮮な培地を供給する速度に同調しない、構築相を有する。それは、「平衡を達成する」相であり、「定常状態を達成する相」ともいえる。この「定常状態を達成する相」は、培養される微生物の増殖速度に、より正確には特定の増殖速度又はμｍａｘに依存する期間を有する。例えば、この期間は５〜２００時間、好ましくは１０〜１００時間であってもよい。
【００８２】
一般に、一旦定常状態に達すると、トップ発酵槽から熟成発酵槽への排出速度は、新鮮な培養培地を供給する速度に相当する流速で構築される。この排出は、所望の体積が移動するまで第一の熟成発酵槽に供給し、そして当該排出は、他の熟成タンクに方向転換される。当業者は、培養される細胞の種類、生産される所望の分子、及びその態様に係る熟成タンクの容量に従い、必要な播種物の体積をどうやって決定するかを知っている。この播種物の体積は、培養される細胞に依存して、熟成発酵槽の容積の１０〜９０％であってもよく、例えば熟成発酵槽の体積の約２０％，  ３０％，  ４０％，  ５０％，  ６０％，  ７０％、又は８０％である。
【００８３】
熟成発酵槽への排出は、公知の装備を使用して標準的な様式で実施される。
【００８４】
一般に、工程ｉ）で使用されるのと異なる培養培地が、熟成相で採用される。異なる態様において、培養培地は、トップ発酵槽からの排出を起源とする播種と同時に、又はその前に、又はその後に、熟成発酵槽に供給される。
【００８５】
工程ｉ）の発酵槽における培養の体積は、熟成発酵槽中の培養に必要な培養の最終体積の関数として決定される。一般に、トップ発酵槽の体積は、それを供給する熟成発酵槽の体積の約５〜１００％、好ましくは１０％〜５０％、より好ましくは約２０％である。例えば、体積４０００Ｌのトップ発酵槽は、２００００Ｌの熟成発酵槽に供給できる。ｎ個の熟成発酵槽の体積が異なる場合、最大の発酵槽の体積がトップ発酵槽の体積を決定し得る。
【００８６】
一般に、ＤＨＡの生産のためのオーランチオキトリウム属の原生生物の株の工程ｉ）の培養は、グルコース濃度５〜２００  ｇ／Ｌ、好ましくは３０〜１００  ｇ／Ｌ、より好ましくは３０〜６０  ｇ／Ｌの、生理食塩水培養培地（海水塩１０〜２０Ｌ、好ましくは１５ｇ／Ｌ）中で実施され得る。一つの態様において、前記培養培地は、濃度１〜５０  ｇ／Ｌ、好ましくは２〜２５  ｇ／Ｌのマグネシウム塩やカリウム塩等の主要栄養素も含有する。また、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン、及び銅、ニッケル及び鉄の塩等、原生生物の培養における通常の様式で使用される微量元素も含有する。これらの微量元素の濃度の典型的な値は、各微量元素において０．０２〜１５ｍｇ／Ｌである。例えば、マグネシウム及び亜鉛塩は２〜４ｍｇ／Ｌで存在し、コバルト及びモリブデン塩は少量存在し、例えば０．０１〜０．０４ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．０３ｍｇ／Ｌである。銅及びニッケル塩は１〜４ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌで存在する。一般に、鉄塩は他の塩より顕著なレベルで存在し、例えば８〜１５ｍｇ／Ｌのレベルである。
【００８７】
非常に高い細胞密度（１〜３ｘ１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を達成するのに適した本発明の態様において、下記表１の「初期培地」という培養培地が、連続培養の開始において使用され、表１の供給溶液が、発酵槽に連続的に供給するために使用される。
【００８８】
【表１】
2016523553.tif 000002
【００８９】
「初期培地」は、連続培養を開始するのに使用され得る培地に対応する。そして「供給溶液」は、発酵槽に連続的に供給するのに使用され得る。
【００９０】
同一の態様において、工程ｉｉ）の熟成工程で使用される栄養溶液は、炭素源（例えばグルコース又はグリセロール）、窒素源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）、リン酸源（例えばＫＨ２ＰＯ４）を含有する。好ましくは、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）及びＰ（リン酸塩）の比率（Ｃ／Ｎ／Ｐ）は、５３０：１１：１であるが、常に窒素が数倍前後、リン酸塩（Ｐ）が２倍前後あってもよく、例えば５３０：２２：１．５３０：５．５：１；  ５３０：２２：０．５；  ５３０：１１：２；  ５３０：２２：２；  ５３０：５．５：０．５；  ５３０：１１：０．５；  ５３０：５．５：２の比率も使用される。
【００９１】
前培養、不連続培養に使用される培地、及び連続培養用の供給培地における濃度範囲は、特に、オーランチオキトリウム・マングロベイ、特にＦＣＣ  １３２４株に適合されている。推奨範囲外の濃度も、前記種及び株に使用される。基礎として下記の範囲を使用することにより、当業者は、障害及び阻害を避けるよう留意して、使用される株に適合した組成を決定できる。
【００９２】
一般に、トップ発酵槽中のバイオマス濃度が平衡に達したとき、約５〜１００  ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜７０  ｇ／Ｌのバイオマス濃度で、トップ発酵槽からの排出は連続的かつ持続的に、半連続モードを実行する異なる熟成発酵槽に供給すると見做される。細胞の培養は、前記発酵槽中で混合栄養条件下で維持され（「熟成」工程）、ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンが生産される。
【００９３】
従って、一般に、工程ｉｉ）における熟成発酵槽への供給は、トップ発酵槽が定常状態で細胞密度が一定となったときに開始される。一般に、オーランチオキトリウムにおいて、この細胞密度は、１ｍＬあたり１０７〜１０９細胞であり得る。
【００９４】
工程ｉｉ）における熟成発酵槽への供給は、（一般に）連続で実施され、即ち、ｎ番目の熟成発酵槽に、トップ発酵槽からの排出物が供給され、その後、ｎ＋１番目の熟成発酵槽に順番が回る。
【００９５】
熟成発酵槽に播種するのに使用される種菌の体積は、熟成発酵槽中の細胞懸濁物の大衆体積の１０〜７０％、好ましくは２０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％である。
【００９６】
一般に、所望の播種物の体積が熟成発酵槽ｎにおいて達成されたら、次の（ｎ＋１）熟成発酵槽（又は「熟成容器」）に供給され、そして次の（ｎ＋２）熟成発酵槽に供給される。
【００９７】
一つの態様において、熟成発酵槽中の培養は停止され、そして当該発酵槽は、ＤＨＡ及び／又はカロテノイドの生産が所望のレベルに達したとき、例えばＤＨＡのタイターが５〜３０ｇ／Ｌ、及び／又はカロテノイドのタイターが乾燥バイオマス１ｇあたり０．１〜１０ｍｇとなったときに排出される。
【００９８】
排出は、所望の分子の抽出に関するバイオマスの処理を可能とする装置における標準的な方法で実施される。排出後、熟成発酵槽は、一般に、発酵槽のタンク内に備わっている装備の特定の部品で洗浄され、そしてそれは滅菌される。
【００９９】
例えば（表２及び図１の表を参照）、７２ｈの熟成発酵槽中での培養時間において、最初の日（Ｄ）に、熟成発酵槽１は充填され、他の熟成発酵槽は待機し；Ｄ＋１日に、熟成発酵槽２は充填され（培養物Ｎ＋２）、熟成発酵槽１は培養途中であり；Ｄ＋２日に、熟成発酵槽３が充填され、熟成発酵槽１及び２は培養途中であり；Ｄ＋３日に、熟成発酵槽１は洗浄され、熟成発酵槽４は充填され、熟成発酵槽２及び３は培養途中である。
【０１００】
【表２】
2016523553.tif 000003
【０１０１】
トップ発酵槽により供給される熟成発酵槽の数は２つより多く、一般に、この数は、当該発酵槽及びそれらに関連する装備を保存するのに利用できるスペースによってのみ限定される。一般に、この熟成発酵槽の数は２〜１０、好ましくは２〜６個である。
【０１０２】
オーランチオキトリウムの培養において、半連続モードでの培養工程は、一般に、各発酵槽において２４〜２００ｈ、好ましくは４８〜９６ｈ、より好ましくは７２〜９６ｈで実施される。
【０１０３】
工程ｉｉ）における培養培地の組成は、維持されるべき残留の増殖を可能としつつ、ＤＨＡ及び／又はカロテノイドの、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの蓄積を促進することを可能とする。「残留の増殖」とは、工程１の増殖速度の１〜９０％であるが、所望のバイオマス及び分子の生産性の改善を可能とする増殖を意味する。
【０１０４】
例えばオーランチオキトリウムＦＣＣ１３２４によるＤＨＡの生産において、連続培養における増殖速度は０．０５〜０．２０  ｈ−１、好ましくは０．１０  ｈ−１である。
【０１０５】
前記増殖速度は、時間中の集団数の増大を特徴付ける。斯かる増殖速度（μ）は、以下の式によって求められる。
μ＝  （ｌｎ  Ｎ２-  ｌｎ  Ｎ１）  ／  （ｔ２-  ｔ１）
Ｎ１は、時間ｔ１でのバイオマスの量、Ｎ２は、時間ｔ２におけるバイオマスの量である。バイオマスの量は、光学密度、細胞密度又は乾燥重量で表現され得る。時間ｔ１及びｔ２は、時間（ｈｏｕｒｓ）で表され得る。μの値はｈ−１  （１／ｈｏｕｒ）で表される。
【０１０６】
半連続培養の工程ｉｉ）における発酵に使用される培養培地は、培養される細胞の代謝をＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産に好ましく方向付けるために選択される。これは、窒素の制限を通じて実施される。窒素の制限とは、細胞の正常な増殖を確保するのに不十分な培地中の窒素の濃度を意味し、これは、炭素を脂質の形態で蓄積することを促進する代謝の変化をもたらす。斯かる代謝の変化は、Ｃ／Ｎ比（炭素濃度と容易に吸収される窒素の濃度との比率）を増大させることによっても達成される。
【０１０７】
しかしながら、前記培養培地は、有機炭素含有基質を含有しており、混合栄養又は従属栄養増殖が可能である。典型的には、原生生物培養において、有機炭素は、１０〜９０  ｇ／ｌ（５５  ｍＭ〜５００  ｍＭ）の濃度で存在する。
【０１０８】
一般に、オーランチオキトリウム株によるＤＨＡ（及び任意でカロテノイド）の生産のための熟成の工程ｉｉ）における培養において、培養培地（トップ発酵槽由来の細胞懸濁物の体積から、及び濃縮供給溶液の体積から再構築される）は、１００〜２００  ｇ／Ｌのグルコース、約５〜１０ｇ／Ｌのアンモニウム、及び１〜２ｇ／Ｌのリン酸塩を含有する。
【０１０９】
本発明の態様における培養方法は、混合栄養条件下、及び／又は従属栄養条件下で実施され、即ち工程ｉ）は、混合栄養又は従属栄養条件下で独立して実施され得る。一般に、工程ｉｉ）は、混合栄養条件下で実施される。一つの態様において、工程ｉ）は従属栄養条件下で実施され、工程ｉｉ）は、混合栄養条件下で実施される。他の態様において、工程ｉ）及びｉｉ）は、混合栄養条件下で実施される。
【０１１０】
一つの態様において、工程ｉｉ）は、工程ｉ）よりも低温で実施される。発明者らは、この態様において、工程ｉｉ）が工程ｉ）と同一の温度で実施された場合と比較して、脂質、特にＤＨＡの生産される量が増大すること見出した。実際に、本発明の方法において、増殖に最適の温度は、ＤＨＡの生産の最適温度よりも高い。一般に、工程ｉｉ）は、工程ｉ）が実施される温度よりも１〜８℃低い温度で実施される。例えば、培養の工程ｉ）は２５℃で実施され、工程ｉｉ）は、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、又は２３℃で実施され得る。例えば培養の工程ｉ）は２２℃で実施され、工程ｉｉ）は、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃で実施され得る。例えば培養の工程ｉ）は２７℃で実施され、工程ｉｉ）は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃又は２６℃で実施され得る。低い温度も、色素の蓄積を促進する。
【０１１１】
本発明の他の態様において、照明条件は、バイオマス、脂肪酸、特にＤＨＡ及びカロテノイドの収率を最大化するように調整される。特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、原生生物の増殖に好ましい影響があり、特に脂質及び／又はカロテノイドの産生に関する限り、原生生物生産性を増大させうることがわかった。発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を原生生物に照射すると、増殖と脂質及び／又はカロテノイド合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において原生生物は環境の制約に対抗するため予備の脂質及び／又はカロテノイドを蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。
【０１１２】
不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。
【０１１３】
本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。これらのフラッシュの持続時間は、「低頻度」での光の供給に適している。この最後の態様において、照明条件（光の供給）は、「低頻度」である。
【０１１４】
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。
【０１１５】
一つの態様において、フラッシュの持続時間は１／１５００００〜１／１０００秒である。これらのフラッシュの持続時間は「高頻度」の照明条件がふさわしい；即ちフラッシュの頻度がそれぞれ１５０ｋＨｚ〜１ｋＨｚである。
【０１１６】
照明条件（光の供給）が「高頻度」である場合のこの態様において、フラッシュは、１時間あたり３．６  ｘ  １０５〜５．４  ｘ  １０９回発生する。この態様において、光の変化は、１ｋＨｚ〜１５０ｋＨｚ、即ち１秒あたり１，０００〜１５０，０００フラッシュの頻度を有すると言われる。ほんはつめいのこの最後の態様における光の供給は、「高頻度と呼ばれる。
【０１１７】
１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。
【０１１８】
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。
【０１１９】
本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１，０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。
【０１２０】
光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１，０００マイクロモル／ｍ２秒にすることもできる。
【０１２１】
本発明の一実施態様によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。
【０１２２】
培養の初期段階において細胞密度が約１０６〜５×１０６細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０７〜１０８細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０８〜１０９細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜７００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０６〜５×１０６細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０７〜１０８細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０８〜１０９細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１，０００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【０１２４】
本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２である。この量は、１時間あたり４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２にすることができる。
【０１２５】
本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１２６】
本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１２７】
本発明の他の態様において、前記培養物に、５０ｋＨｚの頻度で、即ち１時間あたり１．８  ｘ１０８回フラッシュを照射し、当該フラッシュの持続時間は１／１０００００秒、強度は２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３６，０００  μｍｏｌ．ｍ−２であることを意味する。
【０１２８】
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。
【０１２９】
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１３０】
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【０１３１】
培養物への光の供給は、発酵槽の外壁の周囲に配置された光源によってなされ得る。時計が、光源所定の照明時間においてこれらの光源の発光を引き起こす。好ましい態様において、培養物の照明は、発酵槽の内部の発光装置によって確保される。従って、照明の有効性は、外側に配置された光源からの窓を介して光が透過する設計と比較して、良好である。前記照明装置は、ブレードに、又は処理される体積中に浸漬したチューブ部分上に、またはタンクの下部又は上部に、組み込まれて装着された回転部分に配置され得る。本発明の好ましい態様において、前記照明装置は、発酵槽の内部のバッフルに位置する。そのような装置は、フランス特許出願Ｎｏ．１３５３６４１に記載されている。前記発酵槽は、従って、バッフルにより担持される複数の光源を備え、当該バッフルは、回転混合部品の動作の下でバイオマス内の撹拌を妨げる機能を有する。これらの光源は、好ましくは、これらのバッフルの少なくとも一部の中に、バイオマスに適合し、タンク内の光を散乱させられる厚さを有する材料中に、部分的に又は完全に被包される。
【０１３２】
好ましい適切な材料は、食品基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）を含む）に対する良好な適合性、良好な熱伝導係数を併せ持つ、ポリスルホンである。ポリスルホンは、微生物の体積に対する熱の除去を可能とし、半透明の特性は、当該材料の厚さが１ｍｍ〜５ｃｍである場合、光の良好な透過を可能とする。更に、この材料は、洗剤又は酸による洗浄又は滅菌のための熱処理後にも、その特性を維持する。この望ましい特性の組み合わせは変化してもよく、他の材料、例えばポリウレタン、ポリプロピレン、アクリル材料又はポリカーボネート等が選択されてもよい。
【０１３３】
好ましくは、前記光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であり、それらは、実走及び応用の両方において、調整が容易である。そのような光源の発光スペクトルは非常に多様で、白色ＬＥＤ（日光を再現する）が有り、またスペクトル範囲が限定された（例えば赤色、青色又は緑色中心の）ＬＥＤも有る。そのような光源は、電球やランプよりも熱の発生が少なく、更にそれらの寸法は、バッフルのプレートの主要な機能に影響を与える厚みの増大をもたらさずにバッフルの表面に配置できる程十分に小さい。
【０１３４】
光源のスペクトルは、有利な場合、可視範囲であるが、必要に応じ、可視光範囲外、例えばＵＶ（滅菌も含んで実施する場合等）、又は赤外線（処理する体積内に熱を発生させることを目的として実施する場合等）を含み得る。
【０１３５】
光源は、非常に多様な調整体制（モニタリング又は管理体制ともいう）を有し得る。
【０１３６】
出願人が確認したように、そのように培養された株が、不連続及び／又は変化する光の存在下、混合栄養モードで良好な増殖性を有することは、斯かる株が、多不飽和脂肪酸及びカロテノイド、特にＤＨＡ並びにカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを高度に生産させる。
【０１３７】
本発明の培養方法は、脂質及びカロテノイドを生産できるようにする。
【０１３８】
この場合、本発明の幾つかの態様に係る方法は、以下の工程：
ａ）１つ以上のラビリンチュロマイケテス綱、特にオーランチオキトリウム属の株を混合栄養条件下、特に照明時間中不連続及び／又は変化する照明の存在下で培養する工程、ここで当該照明の強度の変化が、その振幅で、５〜１，０００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１、好ましくは５〜４００μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が１時間あたり２〜３，６００回、好ましくは５〜４００回起こる；
ｂ）培養培地中に有機炭素含有基質が存在する条件下、当該培養を数世代に渡り維持する工程；及び任意で
ｃ）そのように培養された原生生物を回収する工程；
を含む。
【０１３９】
「回収する工程」は、より具体的には、前記生産の過程で細胞数が最大に増大した株の単離である。
ｄ）前記原生生物から疎水性物質を回収する工程、及び任意で
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）及びカロテノイドを抽出する工程。
【０１４０】
実際に、前記疎水性物質は、脂質及びカロテノイドを含有する。
【０１４１】
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件下で増殖可能で、ＤＨＡ及びカロテノイドを生産できる、オーランチオキトリウム属のいずれの種にも適用され得る。
【０１４２】
従って、本発明は、好ましくは上記の方法で培養又は選択された、混合栄養特性を有するオーランチオキトリウム属の原生生物を培養することによる、バイオマスの生産、並びに脂質及びカロテノイド、特にＤＨＡ及び／又はカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産、そして、そのように培養された原生生物の回収、それらからの疎水性成分、特にＤＨＡを含む脂質、並びにカロテノイド、例えばアスタキサンチン及びカンタキサンチンの抽出、を最適化することにも関する。
【０１４３】
従来記載されたＤＨＡ及び／又はカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産方法において、取得されるバイオマスの量は、１００  ｇ／Ｌ超、好ましくは１１０  ｇ／Ｌ超、又はより好ましくは１４０  ｇ／Ｌ超である。前記脂質は、このバイオマス中に、４０％超、又は５０％のレベルで存在する。一般に、ＤＨＡは、脂肪酸の１５％、２０％、３０％又は３５％を占める。カンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンは、乾燥物質の合計重量の０．０１〜０．２重量％を占める。
【０１４４】
ＤＨＡを含む脂質を選択的に抽出する方法は当業者に周知で、例えば［Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，  Ｗ．Ｄ．  （１９５９）；  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３７：  ９１１−９１７］に記載されている。
【０１４５】
ルテインを含むカロテノイドを抽出及び解析する方法は当業者に周知であり、例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  （Ｓ．Ｗ．  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｓ．Ｗ．  Ｊｅｆｆｒｅｙ，  Ｒ．Ｆ．Ｃ．  Ｍａｎｔｏｕｒａ，  Ｃ．Ａ．  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，  Ｔ．  Ｂｊｏｒｎｌａｎｄ，  Ｄ．  Ｒｅｐｅｔａ，  Ｎ．  Ｗｅｌｓｃｈｍｅｙｅｒ：  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＨＰＬＣ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ．  Ｍａｒｉｎｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ：  Ｖｏｌ．  ７７：  １８３−１９６，  １９９１）に記載されている。
【０１４６】
また、本発明は、ラビリンチュロマイケテス綱、特にラビリンチュラケアエ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）及びスラウストキトリド科、特にオーランチオキトリウム属、特にオーランチオキトリウム種の原生生物であって、上記本発明の方法に従って取得できるものに関する。これらの原生生物は、多不飽和脂肪酸及びカロテノイドを含有する。そのような原生生物の全脂質は、乾燥物質の４０％超、又は５０％超、又は６０％超を占める。一般に、それらはＤＨＡのタイターが１０ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌである。そのような原生生物が含有するカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンは、本発明の態様において、乾燥物質の０．１％超、又は０．１５％超、又は０．２％超を占めてもよい。本発明の態様における原生生物は、従って、０．０５  ｍｇ／Ｌ／ｈ、又は１ｍｇ／Ｌ／ｈ超、又は１．５  ｍｇ／Ｌ／ｈ超のカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンの生産性（培養物１リットルあたり、１時間あたりの所望の生産物の生産量）を有してもよい。また、それらは、０．１  ｇ／Ｌ／ｈ以上、好ましくは０．２  ｇ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは０．３  ｇ／Ｌ／ｈ以上のＤＨＡの生産性を有してもよい。
【実施例】
【０１４７】
実施例１
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、Ｒｕｓｈｔｏｎの設定（３刃インペラ下方排水）に従うシャフト上にマウントした３つの撹拌ローターを使用して実施された。溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。前記バイオリアクターは、透明なタンクを取り囲む外部照明システムを備える。光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。
【０１４８】
前記リアクターに、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で調製した前培養物を播種した。前培養及びバイオリアクター中の培養は、改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ ｇ／Ｌ，  （ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ／Ｌ，  ＫＨ２ＰＯ４  １ ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４ ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４ ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ ｍｇ／Ｌ，  パントテン酸３．２ ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５ ｍｇ／Ｌ）中で実施された。前記バイオリアクター中、公知の混合栄養条件下、従属栄養条件下、及びフラッシュ（変化する／不連続の照明）照射混合栄養条件下での培養に使用する炭素含有基質は、３００ｍＭ〜１Ｍの濃度のグルコースである。
【０１４９】
培養のモニタリング
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０１５０】
全脂質の定量に関し、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。脂質抽出方法は、当業者に周知である。
【０１５１】
カロテノイド、特にカンタキサンチン及びアスタキサンチンの定量のため、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。カンタキサンチン及びアスタキサンチンを含むカロテノイドの解析及び抽出方法は、当業者に周知である。
【０１５２】
照明（混合栄養条件）
培養物に１時間あたり３０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は３０秒、強度は２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０１５３】
バイオリアクター中の培養物への光の供給は、培養槽の外壁の周囲に配置したＬＥＤランプによって行われた。時計が、光源所定の照明時間においてこれらのＬＥＤランプの発光を引き起こす（不連続香によるフラッシュ混合栄養条件下の培養において）。
【０１５４】
表３  実施例１の結果（ｎ＝３）：
【表３】
2016523553.tif 000004
【０１５５】
実施例２
オーランチオキトリウム属ＦＣＣ  １３２４株によるＤＨＡ及びカンタキサンチンに富む油の生産を下記に示す。
【０１５６】
工程ｉ）：
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、Ｒｕｓｈｔｏｎの設定（３刃インペラ下方排水）に従うシャフト上にマウントした３つの撹拌ローターを使用して実施された。溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。前記バイオリアクターは、透明なタンクを取り囲む外部照明システムを備える。光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり６０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０１５７】
前記リアクターに、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で調製した前培養物を播種した。前培養及びバイオリアクター中の培養は、改変Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（海水塩１５ ｇ／Ｌ，  （ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ／Ｌ，  ＫＨ２ＰＯ４  １ ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４ ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３ ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４ ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ ｍｇ／Ｌ，  パントテン酸３．２ ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５ ｍｇ／Ｌ）中で実施された。使用する炭素含有基質は、３００ｍＭ〜１Ｍの濃度のグルコースである。
【０１５８】
新鮮な培地の連続的供給は、０．０８〜０．１５  ｈ−１の希釈レベルで、各成分の初期濃度の１０〜１５倍の濃縮培地を用いて実施される。当業者は、どのようにして連続的培養を実施し、供給流速を計算するかを決定し、また定常状態に達した時間を決定することが出来る。
【０１５９】
一旦定常状態に達すると、この培養槽からの連続的排出が、工程ｂ）の熟成発酵槽に供給される。
【０１６０】
工程ｉｉ）：
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１０〜２０Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。後者の制御システム及びパラメーター化は、あらゆる点で、工程ｉ）のものと類似している。
【０１６１】
前記リアクターに、工程ｉ）から排出された培養体積の約５０％が播種され；同時に、タンクに、２倍に濃縮された培地が同一の流速で供給されることにより、以下の最終的な組成が得られる：海水塩１５  ｇ／Ｌ；グルコース６０〜１２０  ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．８  ｇＬ；  ＫＨ２ＰＯ４  １  ｇ／Ｌ；  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，  ０．５  ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２４  ｍｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０４  ｍｇ／Ｌ，  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩３．２  ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン９．５ ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１５  ｍｇ／Ｌ。
【０１６２】
前記培養において、１時間あたり６０回のフラッシュが照射され、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は５００μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である。
【０１６３】
培養のモニタリング
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０１６４】
全脂質の定量に関し、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。脂質抽出方法は、当業者に周知である。
【０１６５】
カロテノイド、特にカンタキサンチンの定量のため、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。カンタキサンチンを含むカロテノイドの解析及び抽出方法は、当業者に周知である。
【０１６６】
表４：実施例２の結果（ｎ＝３）
【表４】
2016523553.tif 000005
【０１６７】
実施例３
高細胞密度、低脂質（５〜１０％）でバイオマスを連続的に生産し、その後、このバイオマスの熟成によって、脂肪酸を蓄積させる。
【０１６８】
工程ｉ）：バイオマスの生産のための連続的培養
オーランチオキトリウムの培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、１〜２Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。当該系のｐＨは、塩基（２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を添加して調整された。培養温度は、２６℃に設定された。撹拌は、３つの撹拌ローター：スパージャーの上方の撹拌シャフトの下端に配置された６枚の真っ直ぐな刃を有する１つのＲｕｓｈｔｏｎタービン、及び撹拌シャフト上に配置された３枚の刃の２つのプロペラを用いて実施された（撹拌ローター間の距離＝プロペラの直径×１．５）。
【０１６９】
溶存酸素圧は、撹拌速度（２５０〜６００ｒｐｍ）、通気速度（０．２５〜１ｖｖｍ）、又は酸素流速（０．１〜０．５ｖｖｍ）によって、培養の間中培地内で制御された。自動化管理システムに組み込まれたコントロールパラメーターは、定常ｐＯ２を１５％で維持することを可能にした。
【０１７０】
発酵層は、バッフルに固定された内部照明システムを備える。
【０１７１】
光の強度及びサイクルは、コンピューター管理の下、専用の自動装置にコントロールされた。培養物に１時間あたり６０回のフラッシュを照射し、各フラッシュの持続時間は２０秒、強度は１００  μｍｏｌ．  ｍ−２．  ｓ−１とした。
【０１７２】
前培養は、温度管理された（２６℃）チャンバー中、１００〜２００μＥで照明を照射し、混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で実施された。前記リアクターに、当該前培養物を１％播種し、不連続モードで培養した。
【０１７３】
最初の培地中に含有されていた基質が消費され、所望の細胞密度が達成されたら、一方からの培養培地の排出、及び他方からの供給溶液の供給が開始される。定常状態は、少なくとも５滞留時間後に達成される。当該定常状態が安定化すると、操作パラメーター（ベンチレーション流速、パワー消費、供給流速、ｐＨ、マッシュの体積）、当該マッシュ中の基質の残留濃度、並びに高分子濃度及び生産されたバイオマスの組成が、一定になる。
【０１７４】
ＦＣＣ１３２４株において、選択される供給溶液の組成及び選択される希釈レベルは、各日の培養槽の体積の２．４倍に相当する体積のマッシュを生産することを可能とする。
【０１７５】
前記体制は、５０時間の培養の終盤で安定と見なされる。当該体制が安定化したら、マッシュ中の残留グルコース濃度は約０ｇ／Ｌに安定化し、細胞密度は約３×１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに安定化し、これは、バイオマス約６５ｇ／Ｌに相当し、バイオマス中の脂質の量は、約５％（脂質ｇ／乾燥物質ｇ）に安定化する。連続モードにおける発酵は、合計で８９０時間継続され、その中で８１５時間は、安定化条件下でされた。
【０１７６】
この例において、供給溶液による希釈のレベルは、使用された培地及び使用された培養条件下での、その株の最大増殖速度の半分で設定された。
【０１７７】
前記培地の排出流速は、供給溶液の流速、及びｐＨを調整する液体の体積を考慮して調整される。
【０１７８】
バッチモードでの培養を開始するための培養培地の組成は、図１に詳述されている。
【０１７９】
連続培養の供給溶液は、１５ｇ／Ｌの市販の海水塩（例えばＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ  ｓａｌｔｓ）、１１０  ｇ／Ｌのグルコースを含有し、そして、前培養及び不連続培養で使用される培地が含有する量の約３倍に相当する濃度の、微量元素、主要栄養素及びビタミンを含有する。供給溶液に含有される他の成分については、表１に詳述されている。
【０１８０】
全バイオマスの濃度は、乾燥重量の測定によりモニタリングされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターでの濾過、２４時間以上、１０５℃でのオーブン乾燥後の計量）。
【０１８１】
全脂質の定量に関し、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。脂質抽出方法は、当業者に周知である。
【０１８２】
カロテノイド、特にカンタキサンチンの定量のため、１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍＬが抽出された。カンタキサンチンを含むカロテノイドの解析及び抽出方法は、当業者に周知である。
【０１８３】
表５．連続培養で取得された定常状態の特性
【表５】
2016523553.tif 000006
【０１８４】
工程ｉｉ）熟成
連続培養で生産されたマッシュは、高い細胞密度のバイオマスで、脂質含量は非常に低い（５〜１０％）。このバイオマスを培養条件下の熟成タンク中に写し、そこでバイオマスは、非常に迅速に脂肪酸を蓄積する（２４時間以内に６５Ｇ／Ｌ）。これは、生産すべき脂肪酸に富んだバイオマスの高度な蓄積を可能とする。
【０１８５】
この例において、幾つかの熟成試験が、ケモスタットモードで操作された発酵槽に由来するマッシュから出発して実施された。培養は、専用の自動コントローラーを用いてコンピューター管理の下、３〜５Ｌ容量の発酵槽（バイオリアクター）中で実施された。後者の制御システム及び設定は、あらゆる点で工程１におけるものと類似する。
【０１８６】
この例において記載された熟成試験において、連続培養から取り出した体積は、１回で取り出された。産業的な発酵において、この移動は、培養培地の排出によって漸進的に実施される。
【０１８７】
熟成タンク中で、Ｃ／Ｎ／Ｐ比が５３０：１１：１の栄養溶液が、取り出された体積に漸進的に添加される。
【０１８８】
当該栄養溶液は、炭素源（ここではグルコース）が枯渇した各時間で熟成タンクに添加される。
【０１８９】
熟成タンク中で実施された、供給される不連続培養物のモニタリングは、あらゆる点で、工程ｉ）のものと同一のプロトコールに従い実施された。その結果を表６に示す。
【０１９０】
表６：２５℃及びｐＨ６．５で２４時間及び４８時間生産した乾燥物質、脂肪酸及びＤＨＡ（５回反復）
【表６】
2016523553.tif 000007
【図１】
2016523553.tif 000008
【図２】
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【図３（Ａ）】
2016523553.tif 000010
【図３（Ｂ）】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＨＡ及び／又はカロテノイド、特にカンタキサンチン及び／又はアスタキサンチンを生産する方法であって、以下の工程：
ａ）１つ以上のオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の株を混合栄養モードで培養する工程
を含み、当該工程ａ）における培養工程が、以下の工程：
−ｉ）混合栄養又は従属栄養条件下で増殖させる工程、及び
−ｉｉ）混合栄養条件下でＤＨＡ及び／又はカロテノイドを蓄積させる工程
を含み、工程ｉｉ）が工程ｉ）よりも低い温度で実施される、生産方法。
【請求項２】
工程ｉ）が発酵槽中で連続モードで実施され、工程ｉｉ）が、混合栄養条件下での、半連続モードで操作されるｎ個の発酵槽への、工程ｉ）で得られた細胞及びそれらの培養物の連続及び逐次的供給を含み、ｎは２以上の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合栄養モードでの培養が、時間中に不連続及び／又は変化する照明条件下で実施され、当該照明の強度が変化し、その振幅が５  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１〜１，０００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１であり、これらの変化が、１時間あたり２〜３６００回起こる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記強度の変化の振幅が７０〜３００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１、好ましくは１００〜２００  μｍｏｌ．  ｍ−２．ｓ−１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フラッシュの形態で光が供給される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記フラッシュの持続時間が１／１０秒〜１０分、好ましくは５秒〜１０分、より好ましくは１０秒〜２分、より好ましくは２０秒〜１分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フラッシュの持続時間が、１／１５００００秒〜１／１０００秒である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記フラッシュの回数が、１時間あたり５〜３，６００回、好ましくは１０〜１５０回、好ましくは１５〜１００回、より好ましくは２０〜５０回である、請求項５又は６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記フラッシュの回数が、１時間あたり３．６  ｘ１０５〜５．４  ｘ  １０９回である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養が、１００  ｍＭ〜１．５  Ｍ、好ましくは２００ ｍＭ〜１．２ Ｍ、より好ましくは２５０  ｍＭ〜１  Ｍ、尚もより好ましくは３００  ｍＭ〜６００  ｍＭの有機炭素含有基質の存在下で実施され、当該有機炭素含有基質が、サッカロース、グリセロール、グルコース及びセルロースの誘導体並びにこれらの分子の混合物から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ｂ）培養培地中の有機炭素含有基質の存在下で数世代に渡って培養を維持する工程、及び任意で
ｃ）培養された細胞を回収する工程、及び任意で
ｄ）疎水性物質を回収する工程、及び任意で
ｅ）回収された疎水性物質からＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）及びカロテノイドを抽出する工程、
も含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オーランチオキトリウム属の株が、ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）にアクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株に対応する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養の照明が、発酵槽内部の、好ましくは発酵槽内部のバッフル上に配置された照明装置によって確保される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｉｉ）が１５〜２５℃で実施される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＣＡＰ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）にアクセッション番号ＣＣＡＰ  ４０６２／１で寄託されたＦＣＣ１３２４株。
【国際調査報告】
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