(57)【要約】  補因子およびオキシドレダクターゼを用いたキヌクリジン−３−オンの還元による（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法であって、該オキシドレダクターゼがアミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３のそれぞれは、アミノ酸残基Ａ（Ａｌａ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）またはＶ（Ｖａｌ）のいずれかである）を含んでなることを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補因子およびオキシドレダクターゼを用いたキヌクリジン−３−オンの還元による、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法であって、該オキシドレダクターゼがアミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡを含んでなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３のそれぞれが、アミノ酸残基Ａ（Ａｌａ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）もしくはＶ（Ｖａｌ）のいずれかであり、かつ該オキシドレダクターゼが下記から選択される、方法：
ａ）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９から、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個もしくは２７個〜４０個のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加により誘導された、キヌクリジン−３−オンを還元することができるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｃ）アミノ酸の少なくとも５１％が配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｄ）アミノ酸の少なくとも５５％が配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｅ）アミノ酸の少なくとも７０％が配列番号７のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
補因子およびオキシドレダクターゼを用いたキヌクリジン−３−オンの還元による（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法であって、該オキシドレダクターゼが、アミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡを含んでなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３のそれぞれが、アミノ酸残基Ａ（Ａｌａ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）もしくはＶ（Ｖａｌ）のいずれかであり、かつ該オキシドレダクターゼが下記から選択される、方法：
ａ）配列表の配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号８もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列の全長相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、ここで、該ストリンジェント条件は、０．７〜１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中６０℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１〜２倍ＳＳＣ溶液中６５℃での洗浄を含んでなり、１倍ＳＳＣ溶液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸ナトリウムとからなる混合物と理解される。
【請求項３】
補因子が補助基質で継続的に再生される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが補因子として使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘプタノールまたは２−オクタノールが、それぞれ補助基質として、または第２級アルコールとして使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
補助基質としての第２級アルコールが、水混和性第２級アルコールの場合には、５〜７０容量％、好ましくは５〜５０容量％、より好ましくは５〜４０容量％、最も好ましくは５〜２０容量％の量で使用され、一方メチル−２−ペンタノールなどの水不混和性第２級アルコールの場合には、好ましい濃度は反応バッチの総容量に対して５〜８０％、より好ましくは２０〜８０％、最も好ましくは４０〜８０％の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キヌクリジン−３−オンが総反応容量に対して５〜５０重量％、好ましくは８〜４０重量％、特に１０〜２５重量％の量で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
総ターンオーバー数ＴＴＮ（＝補因子１モル当たりの還元キヌクリジン−３−オンのモル）が＞１０３である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
水性有機性二相系において行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ジエチルエーテル、第３級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサンまたはシクロヘキサンなどの有機溶媒がさらに使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
補因子再生のための反応にオキシドレダクターゼがさらに添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＮＡＤＨを補因子として使用することにより、キヌクリジン−３−オンを新規なオキシドレダクターゼと反応させることを含んでなる、高い光学純度の（Ｒ）−３−キヌクリジノール（（３Ｒ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オール（ＣＡＳ＃：２５３３３−４２−０）またはその塩（ＣＡＳ＃：４２４３７−９６−７）の製造方法に関する。
【化１】
2016517690.tif 000002
（Ｒ）−３−キヌクリジノール［（３Ｒ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オール］
【０００２】
背景技術
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、広範囲の医薬の合成に有用な中間体である。製薬工業では、それは、例えば、認知力改善薬タルサクリジン、尿失禁薬ソリフェナシンまたは喘息治療用のＭ３拮抗薬レバトロペートのためのキラルシントンとして使用される。光学的に活性なキヌクリジノールを得るために知られているものとして、金属触媒を用いた化学的還元反応（ＪＰＨ９−１９４４８０Ａ参照）、酵素的加水分解反応による（±）−３−キヌクリジノールエステルのラセミ混合物の分割（ＵＳ５２１５９１８Ｂ、ＪＰＨ１０−１３６９９５Ａ、ＪＰＨ１０−２１０９９７Ａ、ＪＰＨ９−１９４４８０Ａ）参照、および全細胞生体触媒または単離酵素を用いたキヌクリジン−３−オンの酵素的還元（ＪＰ１０２４３７９５、ＪＰ１１１９６８９０、ＪＰ２００２１５３２９３、ＪＰ２０００２４５４９５参照）などの様々な方法がある。
【０００３】
金属触媒を用いた還元による光学的に純粋な（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造は、その還元生成物の光学純度が低く、純粋な鏡像異性体を得るためにはさらなる精製工程が必要とされることから、工業適用には十分な有効性を提供するとは言えないことが報告されている。
【０００４】
プロテアーゼを用いた（±）−３−キヌクリジノールエステルのラセミ混合物の分割による光学的に純粋な（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造もまた、反応混合物に由来する残留エステルを除去する必要とそれに伴う高コストから、工業適用に適さない。
【０００５】
完全生体変換を介したキヌクリジン−３−オンの酵素的還元による光学的に純粋な（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造は、ナカザエワエア属(Nakazaewaea)、カンジダ属(Candida)、プロテウス属(Proteus)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、スポリジオロブス属(Sporidiolobus)、ロドスポリディウム属(Rhodosporidium)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichisporon)、ゴルドニア属(Gordonia)、ノカルジア属(Nocardia)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、アルスロバクター(Arthrobacter)、フィロバシディウム属(Filobasisdium)、オーレオバシディウム属(Aureobasidium)、ヤロウイア属（Yarrowia）、ゲオトリクム属(Geotrichum)、ツカムレラ属(Tsukamurella)、クルチア属(Kurthia)、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、アクレモニウム属(Acremonium)およびムコール属(Mucor)（ＪＰ１０２４３７９５、ＪＰ１１１９６８９０、ＪＰ２００２１５３２９３、ＪＰ２０００２４５４９５参照）の細胞に関して報告されている。微生物細胞に由来する不純物およびまたは微生物に含まれる他の酵素によって生じる副反応は、光学純度および生成物収量を引き下げる。
【０００６】
単離酵素を用いたオキシド還元による（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造も当技術分野で公知であり、ダチュラ属(Datura)およびヒヨス属(Hyoscyamus)の植物由来の酵素（特許ＪＰ２００３２３０３９８）、ならびにロドトルラ属（ＪＰ２００７１２４９２２）、バークホルデリア属(Burkholderia)（ＷＯ２０１０１２３０６２）およびミクロバクテリウム・ルテオラム(Microbacterium luteolum) (Int J Mol Sci. 2012 Oct 19、13(10):13542-53)由来の酵素に関して報告されている。最近、キヌクリジン−３−オンを還元するアルコールデヒドロゲナーゼが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumerfacience)から結晶化された(Acta crystallografica 10(2012) 68 (Pt 10): 1237-1239)。
【０００７】
植物起源であるために、ダチュラ属およびヒヨス属由来の酵素は、工業的に製造することが難しい。ロドトルラ属およびバークホルデリア属に由来する酵素は、補因子としてのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ再生のためのグルコースデヒドロゲナーゼを必要とし、従って、製造プロセスを極めてコストの高いものにする。
【０００８】
これまでに、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造のための最も効率的な方法は、ミクロバクテリウム・ルテオラム由来の酵素を用いた還元プロセスに関して、(Int J Mol Sci. 2012 Oct 19;13(10):13542-53)により報告されている。ミクロバクテリウム・ルテオラム由来の酵素は、補因子としてのＮＡＤＨと補因子再生のための第２級アルコールデヒドロゲナーゼを、補助基質としての２−プロパノールとともに必要とする。しかしながら、この酵素還元プロセスでは、おそらくは酵素活性に対するキヌクリジン−３−オンの阻害効果のために基質負荷率は限定される。反応バッチに基質を継続的に加え、従って、反応容器中のキヌクリジン−３−オン濃度と、付随する酵素阻害を適当なレベルに維持することによって、１０％（ｗ／ｖ）の最大基質負荷率を達成することができた。固定化酵素を用い、１５％（ｗ／ｖ）の基質負荷率で１００％の変換収率が達成された。しかしながら、酵素の固定化は精緻なものであり、コストがかかり、反応容量にも制限を課し、工業的製造プロセスの要件に見合わない。
【０００９】
キヌクリジン−３−オンの還元のための既知の酵素の数は限られている。さらに、これらの酵素は市販されておらず、対応する還元プロセスは大きな欠点を持つ。従って、還元反応において生体触媒として使用される新規な組換えオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）を用いて（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生産するための効率的かつ工業適用可能な方法の必要がある。
【００１０】
３−キヌクリジノンの工業的還元プロセスに好適なオキシドレダクターゼは、以下の要件を満たさなければならない：
１）組換え株（例えば、大腸菌(Escherichia coli)）における発現に見合うこと、
２）有機溶媒中、特に、２−プロパノールおよび２−ブタノールなどの水混和性有機溶媒中での高い安定性、
３）基質または生成物の阻害により悪影響を受けることなく、高濃度の基質３−キヌクリジノンにおいて酵素活性があること、
４）酵素結合型補因子再生、特に、補助基質として第２級アルコールを用いるアルコールデヒドロゲナーゼによる補因子再生に従うこと。
【００１１】
本発明は、補因子と、単離されたオキシドレダクーゼ、前記オキシドレダクターゼを発現する組換え生物、または前記オキシドレダクターゼを発現する生物の調製物、例えば、その透過処理細胞、溶解細胞または凍結乾燥細胞とを用いて、キヌクリジン−３−オンまたはその塩を還元することによって（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造するための方法を提供する目的を持つ。オキシドレダクターゼは、
ａ）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９から、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個もしくはそれを超えるアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加により誘導された、補因子とともにキヌクリジン−３−オンを還元することができるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｃ）アミノ酸の少なくとも５１％が、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、好ましくは、アミノ酸の少なくとも５５％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、またはアミノ酸の少なくとも６０％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、またはアミノ酸の少なくとも６５％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、またはアミノ酸の少なくとも７０％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、または好ましくは、アミノ酸の少なくとも７５％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、より好ましくは、アミノ酸の少なくとも８５％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一である、最も好ましくは、アミノ酸の少なくとも９０％が配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一であり、かつ、補因子とともにキヌクリジン−３−オンを還元することができるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｄ）アミノ酸の少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％が配列番号７のアミノ酸と同一であり、かつ、補因子とともにキヌクリジン−３−オンを還元することができるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｅ）配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、または
ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列の全長相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ補因子とともにキヌクリジン−３−オンを還元することができるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、または
ｇ）アミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３のそれぞれは、アミノ酸残基Ａ（Ａｌａ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）もしくはＶ（Ｖａｌ）のいずれかである）をさらに含んでなる、ａ）もしくはｂ）もしくはｃ）もしくはｄ）もしくはｅ）もしくはｆ）に従うポリペプチド
から選択される。
【００１２】
好ましくは、オキシドレダクターゼは、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとともに使用される。
【００１３】
ａ）またはｂ）またはｃ）またはｄ）またはｅ）またはｆ）またはｇ）に従う本発明のポリペプチドは、キヌクリジン−３−オンをその対応する（Ｒ）−アルコールへと効率的に還元し得ることが見出された。驚くことに、本発明のポリペプチド間の配列相同性（同一性）（表１参照）は、４８％〜７２％まで異なっている。しかしながら、本発明のポリペプチドは、キヌクリジン−３−オンの還元におけるこれらのタンパク質の酵素活性に特徴的な特定のアミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡを共通に持つ。
【００１４】
【表１】
2016517690.tif 000003
【００１５】
配列モチーフＭＱＸ１ＲｅＸ２Ｘ３ＷＥＡは、タンパク質のＣ末端近傍に位置する。この知見は結晶構造およびそれに基づく既知の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼの相同性モデリングにふさわしく、このモチーフがデヒドロゲナーゼの基質結合ポケットのテールを形成し、そこでアミノ残基Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｗ、Ｅ、およびＡが基質と相互作用することを明らかに示す。よって、前記モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡを含んでなる短鎖アルコールデヒドロゲナーゼはキヌクリジン−３−オンの還元に好適であると仮定される。
【００１６】
キヌクリジン−３−オンの、好ましくは、対応するＲ−アルコールへの還元に好適なオキシドレダクターゼは、最適化された反応条件下で少なくとも５０％のＲ−アルコール鏡像体過剰率をもたらすポリペプチドであると理解される。ここで、最適化された反応条件は、ポリペプチドがＲ−アルコールの最大鏡像体過剰率をもたらす反応条件であると理解される。
【００１７】
本発明のポリペプチドは十分なオキシドレダクターゼ活性を提供し、キヌクリジン−３−オンを、好ましくは（Ｒ）−３−キヌクリジノールへ還元するために使用可能であることが判明した。Ｒ−アルコールの達成可能な鏡像体過剰率は５０％以上、好ましくは８０％以上、特に好ましくは９５％以上となる。配列番号１を使用すると、９９％以上の鏡像体過剰率が達成できる。
【００１８】
キヌクリジン−３−オンを対応する（Ｒ）−３−キヌクリジノールに還元することができるオキシドレダクターゼは、マイコバクテリウム属の細菌、特に、マイコバクテリウム・バンバアレニイ(Mycobacterium vanbaalenii)またはマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)、カルディリネア属の細菌、特に、カルディリネア・アエロフィラ(Caldilinea aerophila)、スタルケヤ属の細菌、特に、スタルケヤ・ノベラ(Starkeya novella)、オセアニセルムス属の細菌、特に、オセアニセルムス・プロフンドゥス(Oceanithermus profundus)から単離することができる。
【００１９】
本発明のオキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、細菌マイコバクテリウム・バンバアレニイＰＹＲ−１株またはマイコバクテリウム・スメグマティスＡＴＣＣ  ７０００８４株、カルディリネア属の細菌、特に、カルディリネア・アエロフィラＤＳＭ１４５３５株、スタルケヤ属の細菌、特に、スタルケヤ・ノベラＤＳＭ５０６株、オセアニセルムス属の細菌、特に、オセアニセルムス・プロフンドゥスのゲノムＤＮＡから、既知の分子生物学的技術を使用することによって得ることができる。
【００２０】
オキシドレダクターゼを産生する生物は、好ましくは、オキシドレダクターゼを過剰発現する組換え生物である。好ましくは、限定されるものではないが、このような組換え生物は大腸菌である。組換え生物により発現されたオキシドレダクターゼは、完全に生成された状態、部分的に精製された状態、または前記ポリペプチドを含有する細胞のいずれかで使用することができる。前記ポリペプチドを発現する細胞は、天然状態、透過処理状態、溶解状態または凍結乾燥状態で使用することができる。
【００２１】
よって、本発明のもう１つの側面は、補因子を用いてキヌクリジン−３−オンをその対応するアルコールへ鏡像異性体選択的に還元することができる、オキシドレダクターゼ、このオキシドレダクターゼを産生する生物、または前記オキシドレダクターゼを発現する生物の調製物、例えば、その透過処理細胞、溶解細胞もしくは凍結乾燥細胞である。このようなオキシドレダクターゼは、
ａ）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９から、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個もしくはそれを超えるアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加により誘導されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｃ）アミノ酸の少なくとも５１％が配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｄ）アミノ酸の少なくとも５５％が配列番号５もしくは配列番号９のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｅ）アミノ酸の少なくとも７０％が配列番号７のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
ｆ）配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、または
ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの全長相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、または
ｈ）アミノ酸配列モチーフＭＱＸ１ＲＥＸ２Ｘ３ＷＥＡ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３のそれぞれは、アミノ酸残基Ａ（Ａｌａ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）もしくはＶ（Ｖａｌ）のいずれかである）をさらに含んでなる、ａ）もしくはｂ）もしくはｃ）もしくはｄ）もしくはｅ）もしくはｆ）に従うポリペプチド
から選択される。
【００２２】
好ましくは、オキシドレダクターゼは、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとともに使用される。
【００２３】
本発明において、用語「アミノ酸の（Ｐ）％が配列番号（Ｎ）のアミノ酸配列のアミノ酸と同一であるアミノ酸配列（Ａ）」とは、それらの全長にわたってアラインされたアミノ酸配列（Ａ）および配列番号（Ｎ）を意味し、この場合、アラインされたアミノ酸配列（Ａ）およびアラインされた配列番号（Ｎ）はいずれも、アラインされていない個々の配列に対してギャップ挿入を含んでなってもよい。同一性のパーセンテージは、アラインされたアミノ酸配列（Ａ）とアラインされた配列番号（Ｎ）の両方に同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を求め、このマッチした位置の数を参照配列の残基の総数で割ることによって計算される。その商に１００を掛けたものが同一性パーセンテージとなる。配列のアラインメントは、Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402 and Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用することによって行うことができる。
【００２４】
本発明において、ｂ）またはｃ）またはｄ）またはｆ）またはｇ）に従うポリペプチド、すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列と相同なもしくは由来するアミノ酸配列を有する人工もしくは天然ポリペプチド、または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１０の全長相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９に対して「欠失したアミノ酸」（欠失）、「置換されたアミノ酸」（置換）または「挿入されたアミノ酸」（挿入）を含んでなるポリペプチドである。
【００２５】
用語「欠失したアミノ酸」または「欠失」は、１以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を意味する。欠失は、酵素活性を保持する限り、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の内部および／または末端部分の両方における、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個またはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸総数の１０％までの除去を含んでなり得る。
【００２６】
用語「挿入」は、１以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を意味する。挿入は、ポリペプチドに対する配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の内部および／または末端部分のいずれかの種々の位置への１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個またはそれを超えるアミノ酸の付加を含んでなり得る。
【００２７】
置換は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個またはそれを超えるアミノ酸の置き換えを意味し、保存的および／または非保存的であり得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、類似の側鎖を有するか、または同じクラスのアミノ酸に属するアミノ酸残基での置き換え、例えば、親水性から親水性へ、疎水性から疎水性へ、非極性から非極性へ、極性から極性へ、酸性から酸性へ、塩基性からへ、芳香族から芳香族への置き換えを意味する。保存的置換の例は、下記表に挙げられる。
【００２８】
【表２】
2016517690.tif 000004
【００２９】
非保存的置換は、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖および／または物理化学的特性を有するアミノ酸での置き換えを意味する。非保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの構造、その疎水性および／またはその正味電荷に影響を及ぼし得る。
【００３０】
よって、本発明はまた、１〜２８２番のそれぞれの位置に、角括弧で囲まれた対応する選択群［…］（ここで、「−」はギャップを表す）から選択される１つのアミノ酸を含んでなる、以下に列挙されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００３１】
【表３】
2016517690.tif 000005
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【００３２】
ポリペプチド配列のアミノ酸改変の数は、そのポリペプチドの触媒活性を保持または改善する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個またはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％または２０％またはさらには３０％までを含んでなり得る。
【００３３】
例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの全長相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号２の相補的全長ＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして使用することによる、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションなどの多様なハイブリダイゼーション技術によって検出可能なポリヌクレオチドを含んでなる。好適なハイブリダイゼーション方法は、Molecular Cloning, A laboratory manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている。
【００３４】
ハイブリダイゼーションに関しては、検討下のポリヌクレオチドをフィルターに固定し、０．７〜１ＭのＮａＣｌ溶液中、６０℃で、例えば配列番号２のポリヌクレオチド相補物とハイブリダイズさせる。次に、このフィルターを６５℃にて０．１〜２倍ＳＳＣ溶液で洗浄する。ここで、１倍ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる混合物であると理解される。
【００３５】
例えば配列番号２の相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％が配列番号２のヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、そのプロセスに使用される補因子が第２級アルコールの存在下でのオキシドレダクターゼの作用によって継続的に再生されることを特徴とする。好ましくは、ＮＡＤＨが補因子として使用され、還元で形成されたＮＡＤは再び還元されてＮＡＤＨとなる。
【００３７】
ＮＡＤＨに対するオキシドレダクターゼの補因子選択性は、ＮＡＤＰＨ選択性に変更することができ、補因子結合部位を変位させることによる突然変異誘発技術を用いて復帰させることができる。
【００３８】
本発明による方法では、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼにより形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは好ましくは継続的に再生される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、アルコールの酸化により再生される。
【００４０】
好ましくは、一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨの第２級アルコールを補因子再生に使用するが、ここで、ＲＸおよびＲＹは水素、分岐または非分岐Ｃ１−Ｃ８−アルキル基から独立に選択され、炭素原子の総数Ｃｔｏｔａｌ≧３である。
【００４１】
２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールの第２級アルコールは補助基質として好ましく使用される。特に好ましい実施形態によれば、２−プロパノールまたは４−メチル−２−ペンタノールが補酵素再生に使用される。再生のための補助基質の量は、水混和性第２級アルコールの場合には、５〜７０容量％、好ましくは５〜５０容量％、より好ましくは５〜４０容量％、最も好ましくは５〜２０容量％の範囲であり得、一方、メチル−２−ペンタノールなどの水不混和性第２級アルコールの場合には、好ましい濃度は反応バッチの総容量に対して５〜８０％、より好ましくは２０〜８０％、最も好ましくは４０〜８０％の範囲である。
【００４２】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態によれば、補因子の再生のために付加的オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼが添加される。
【００４３】
さらに好ましい実施形態では、さらなるアルコールデヒドロゲナーゼを、補因子の再生のために付加的に添加することができる。好適なＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、パン酵母、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)（ＣＰＣＲ）（米国特許第５，５２３，２２３号および同第５，７６３，２３６号、Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8）、ピキア・カプスラータ(Pichia capsulata)（ＥＰ１６３３７７９Ｂ１）、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)(ＲＥＣＲ）（米国特許第５，５２３，２２３号）、ノルカルジア・フスカ(Norcardia fusca) (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729、 Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4):380-6、 Epub 2003, Apr. 26)またはロドコッカス・ルーバー(Rhodococcus ruber)(J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6)から得ることができる。それらのアルコールデヒドロゲナーゼの好適な補助基質は、例えば、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールなどの既に記載されている第２級アルコールである。
【００４４】
ＮＡＤＰＨの再生のための好適な第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、上記のようなもの、およびラクトバチルス目の生物、例えば、ラクトバチルス・ケフィア(Lactobacillus kefir)（米国特許第５，２００，３３５号）、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)（ＤＥ１９６１０９８４  Ａ１、Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 December、 56 Pt 12:1696-8）、ラクトバチルス・マイナー(Lactobacillus minor)（ＤＥ１０１１９２７４）、ラクトバチルス・カルノスム(Leuconostoc carnosum)（Ａ１２６１／２００５、Ｋｌ．Ｃ１２Ｎ）から、または記載のようにサーモアネロビウム・ブロッキー(Thermoanerobium brockii)、サーモアネロビウム・エタノリカス(Thermoanerobium ethanolicus)もしくはクロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)から単離されるものである。
【００４５】
しかしながら、原理的には他の酵素系も補因子再生に使用可能である。例えば、補因子再生は、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを用いて果たすことができる(Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase)。ギ酸デヒドロゲナーゼの好適な補助基質は、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウムまたはギ酸カルシウムなどのギ酸の塩である。
【００４６】
１ｋｇの基質キヌクリジン−３−オンの変換のためには、５０００〜１０Ｍｉｏ．単位のオキシドレダクターゼを適用すべきである。酵素活性単位（Ｕ）は、１分当たりに(pro minute)１μｍｏｌのキヌクリジン−３−オンの対応するアルコールへの変換に必要とされる酵素の量として定義される。
【００４７】
本発明による方法では、基質キヌクリジン−３−オンは反応バッチにおいて、総容量に対して好ましくは１０ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌ、好ましくは２５ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ、特に好ましくは５０ｇ／ｌ〜２００ｇ／ｌの量で使用される。
【００４８】
酵素的還元が進行する反応混合物の水性部分は、好ましくは、５〜１０のｐＨ値、好ましくは６〜９のｐＨ値を有するバッファー、例えば、リン酸カリウムバッファー、トリス／ＨＣｌバッファーまたはトリエタノールアミンバッファーを含有する。さらに、バッファーは、例えば、亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンなど、酵素の安定化または活性化のためのイオンを含有することができる。
【００４９】
本発明による方法を実施する際には、温度は好適には約１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜４５℃の範囲である。
【００５０】
水相中の補因子、特に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度はそれぞれ、０．００１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００５１】
本発明による方法で達成されるＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元された式Ｉの化合物のモル／使用した補因子のモル）は通常１０２〜１０５であるが、好ましくは≧１０３である。
【００５２】
本発明による方法では、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼの安定剤も使用可能である。好適な安定剤は例えば、グリセロール、ソルビトール、１，４−ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００５３】
本発明の別の可能性のある実施形態によれば、反応平衡を反応生成物側に傾かせるために、酸化された補助基質（例えば、アセトン）を継続的に除去することができ、かつ／または補助基質（例えば、２−プロパノール）を継続的に新たに添加することができる。
【００５４】
還元の完了後、反応混合物を処理する。この目的で、例えば、場合により水相を有機相から分離し、生成物を含有する有機相を濾過する。場合により、水相もまた抽出し、有機と同様にさらに処理することができる。その上に、有機相から溶媒を蒸発させ、一般式ＩＩまたはＩＩＩの生成物を粗生成物として得ることができる。次に、粗生成物をさらに精製することもできるし、または結果としての生成物の合成のためにそのまま使用することもできる。
【００５５】
以下、本発明を例によりさらに示す。
【実施例】
【００５６】
実施例１
マイコバクテリウム・バンバアレニイからのオキシドレダクターゼの単離
マイコバクテリウム・バンバアレニイからＮＡＤＨ依存性オキシドレダクターゼを単離するために、微生物を水１リットル当たりペプトン５．０ｇ、肉抽出物３．０ｇ、ｐＨ７．０中で培養した。
【００５７】
静止期に達した際に細胞を採取し、遠心分離により培地から分離した。５ｇのマイコバクテリウム・バンバアレニイ細胞を２０ｍｌのバッファー（１００ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．０）に懸濁させ、ホモジナイズした。遠心分離（７０００ｒｐｍ）後に得られた粗抽出物をその後さらに精製し、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）を介して再処理した。オキシドレダクターゼは、ブチル−セファロース（Ｍｅｓｓｒｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのイオン交換クロマトグラフィー、Ｑ−セファロース・ファースト・フロー（Ｍｅｓｓｒｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での２回の精製、続いてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による４連続工程で精製することができた。この目的で、遠心分離後に得られた溶解液を、５０ｍＭのＴＥＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ＝７．０で平衡化したブチル−セファロースカラムにそのまま適用し、漸減する線形塩勾配で溶出した。このような実施で、オキシドレダクターゼは０．２〜０．３Ｍ硫酸アンモニウムで溶出した。オキシドレダクターゼ含有画分を合わせ、限外濾過（排除限界１０ｋＤａ）により適当な容量まで濃縮した。次に、濃縮されたオキシドレダクターゼ画分を再処理し、Ｑ−セファロースにより、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファーを用いてさらに精製した。これにより、酵素が０．７〜０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
【００５８】
次に、活性画分を濃縮し、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭＭｇＣｌ２で平衡化し、ヒドロキシアパタイトカラムに適用し、２００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭＭｇＣｌ２で溶出した。下記表に得られた結果をまとめる。
【００５９】
【表４】
2016517690.tif 000012
【００６０】
タンパク質量の決定は、Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275またはPeterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220に従って行った。タンパク質量に対する酵素活性の比率として比活性を求め、この場合、１分当たり１μｍｏｌの変換は１単位（Ｕ）に相当する。
【００６１】
実施例２
本発明によるオキシドレダクターゼのＮ末端配列の決定
ヒドロキシアパタイトカラム精製工程の後、実施例１による酵素調製物を１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルで分画し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ−膜）に転写した。
【００６２】
約３０ｋＤａの明白なバンドに対して、エドマン分解（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によるＮ末端シーケンシングと顕著な内部ペプチドのシーケンシングを行った。以下のＮ末端配列が得られた。
TRTVVVTGAGSGIGR
【００６３】
内部ペプチドの配列：
LEQADDVAR
【００６４】
実施例３
ａ）マイコバクテリウム・バンバアレニイからのオキシドレダクターゼのクローニング
マイコバクテリウム・バンバアレニイＰＹＲ−１の細胞から単離されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型とし、エドマン分解からのタンパク質断片配列に基づいて設計した縮重プライマーとともに用いた。そうすることで、増幅をＰＣＲバッファー［１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３（２５℃）、１．５ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、各場合において３０ｐＭｏｌのプライマーおよび１．２５ＵのＢｉｏＴｈｅｒｍ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）］中で５０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行った。
【００６５】
サイクル１：  ９５℃、７分
サイクル２×２８：  ９４℃、４０秒
温度降下開始６３℃  −０．５℃／工程、３０秒
６８℃、６０秒
サイクル３×２０：  ９４℃、４０秒
５３℃、４０秒
７２℃、６０秒
サイクル４：  ７０℃、７分
４℃［無限大］
【００６６】
１％アガロースゲルで全ＰＣＲバッチを分画した後に、約６５０ｂｙのバンドを同定し、オーバーハングアデノシン部分を介して、ＤＮＡ配列の決定のためのＴｏｐｏ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００６７】
スクリーニング反応から得られたＤＮＡバンドは、２２７アミノ酸残基のオキシドレダクターゼ断片に対応するオープンリーディングフレームを示した。
【００６８】
オキシドレダクターゼをコードする全配列の決定は、逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）方法により行った。
【００６９】
オキシドレダクターゼをコードする遺伝子配列は、７７１塩基対を含んでおり、２５６アミノ酸残基長に相当した。
【００７０】
ｂ）マイコバクテリウム・バンバアレニイ由来短鎖ＡＤＨをコードする全長ＤＮＡ断片のＰＣＲによる合成
続いての、全長転写産物の適当な発現系へのクローニングのために特異的プライマーを構築した。そうすることで、Ｎｄｅ  Ｉの認識配列を有する５’−プライマーおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの認識配列を有する３’−プライマーを改変した。マイコバクテリウム・バンバアレニイ細胞から単離したゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。増幅は、ＰＣＲバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、各場合において２０ｐＭｍｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中、５０ｎｇの鋳型および以下の温度サイクルを用いて行った。
サイクル１：  ９４℃、２分
サイクル２×３０：  ９４℃、１５秒
５８℃、３０秒
６８℃、７５秒
サイクル３：  ６８℃、７分
４℃［無限大］
【００７１】
得られたＰＣＲ産物に、１％アガロースゲル上で精製した後、エンドヌクレアーゼＮｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて制限酵素処理を行い、同じエンドヌクレアーゼで処理しておいたｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の骨格に連結した。２μｌのライゲーションバッチを大腸菌Ｔｏｐ  １０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した後、アンピシリン（またはカナマイシン）耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを、エンドヌクレアーゼＮｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄを用いた制限酵素分析により、７５０のサイズを有する挿入配列の存在に関して試験した。発現構築物ｐＥＴ２１−Ｍｙｃのシーケンシングを行った。短鎖オキシドレダクターゼをコードするマイコバクテリウム・バンバアレニイ(mycobacterium vanbalenii)由来の遺伝子は、全７７１ｂｙのオープンリーディングフレーム（配列番号２）を有しており、これは２５６アミノ酸のタンパク質に対応していた（配列番号１）。
【００７２】
実施例４
大腸菌細胞における組換えオキシドレダクターゼの発現
コンピテント大腸菌Ｓｔａｒ  ＢＬ２１（Ｄｅ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、オキシドレダクターゼをコードする発現構築物ｐＥＴ２１−ＭＩＸで形質転換した。発現構築物で形質転換された大腸菌細胞を、次に、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２００ｍｌのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）中で、５５０ｎｍで測定した際に光学密度が０．５となるまで培養した。組換えタンパク質の発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度で加えることにより誘導した。２５℃および２２０ｒｐｍで誘導１６時間後に、細胞を採取し、−２０℃で冷凍した。活性試験のために、１０ｍｇの細胞を５００μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファーｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５００μｌガラスビーズと混合し、ガラスミルを用いて１０分間粉砕した。次に、得られた溶解液を希釈状態で各測定に使用した。
【００７３】
活性試験物は次のように作製した：８７０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファーｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６０μｇ  ＮＡＤＨ、１０μｌの希釈細胞溶解液。反応は、反応混合物に１００ｍＭの基質溶液１００μｌを加えることにより開始した。
【００７４】
多量に酵素を回収するためには、３０ｇの細胞を１５０ｍｌのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）に再懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いて破砕した。次いで、この酵素溶液に１５０ｍｌのグリセロールを混合し、−２０℃で保存した。
【００７５】
実施例５
光度測定アッセイによるキヌクリジン−３−オンの還元に関するオキシドレダクターゼ活性の測定
実施例４に記載の通りに調製した酵素の活性は、１ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファー、ｐＨ７．０中、１０μｌの酵素溶液に、基質３−キヌクリジノン（１０ｍＭ）、補酵素ＮＡＤＨ（０．２５ｍＭ）を加えることにより、１分間の、１μｍｏｌのＮＡＤＨからＮＡＤへの酸化の活性として測定した。１分当たりの３４０ｎｍにおける吸光度の低下速度をＮＡＤＨの吸光度係数（６．２２Ｍ-１ｃｍ-１）で割った商は、キヌクリジン−３−オンの相当するアルコールへの還元に関する酵素活性（Ｕ）に比例する。
【００７６】
【表５】
2016517690.tif 000013
【００７７】
実施例６
キヌクリジン−３−オンの還元に関するオキシドレダクターゼの特徴
キヌクリジン−３−オンの対応するアルコールへの還元による鏡像異性体選択性および変換値の決定のために、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９のポリペプチド配列のオキシドレダクターゼを、以下の手順によって調べた：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９のオキシドレダクターゼの遺伝子を保持する組換え大腸菌を実施例４に記載の通りに培養した。誘導１８時間後に、２ｇの各組換え株細胞を、２ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１０ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミンバッファー、ｐＨ７．０に再懸濁させ、ガラスミルで１０分間粉砕した。得られた酵素溶液を遠心分離により明澄化し、等容量のグリセロールと混合した。反応の構成については、５６μｌの酵素溶液を用い、０．１５ｍｇのＮＡＤ、７５μｌ（１０％）のピキア・カプスラータ由来オキシドレダクターゼ、２５０μｌのメチル−２−ペンタノールおよび１１９μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ  ｐＨ６．５（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加）を加えることにより、７５ｍｇのキヌクリジン−３−オンを変換した。３０℃でサンプルをインキュベートして２４時間後に、１０μｌの反応物を１ｍｌのＭｅＯＨに加え、ＧＣ分析を行った。鏡像異性体の検出のために、Ｍａｓｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（ドイツ）Ｈｙｄｒｏ製のβ−６ＴＢＤＭカラム（２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用した。
【００７８】
【表６】
2016517690.tif 000014
【００７９】
実施例７
補助基質としてメチル−２−ペンタノールを用いる１０ｍｌスケールでのキヌクリジン−３−オンの対応する（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換
配列番号１のオキシドレダクターゼの遺伝子を保持する組換え大腸菌を実施例４に記載の通りに培養した。誘導１８時間後、３０ｇの採取細胞を、２ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１００ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）バッファー、ｐＨ７．０に再懸濁させ、フレンチプレスで粉砕した。得られた溶解液を４℃、６０００ｇで１０分の遠心分離により明澄化した。１．５ｇの３−キヌクリジノンの還元のために、２５０μｌの酵素溶液（１１２５Ｕ）を、２ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍｇのＮＡＤ、２２５Ｕのピキア・カプスラータ由来アルコールデヒドロゲナーゼおよび５ｍｌのメチル−２−ペンタノールを添加した４．０５ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファー、ｐＨ６．５に加えた。この反応物を、３０℃、撹拌下でインキュベートした。２１時間後、３ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨ、５ｍｌのメタノールを添加することによって反応を停止し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。測定された（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は９８％であり、生成物の光学純度は＞９９％であった。
【００８０】
実施例８
補助基質としてイソプロパノールを用いる１０ｍｌスケールでのキヌクリジン−３−オンの対応する（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換
配列番号１のオキシドレダクターゼの遺伝子を保持する組換え大腸菌を実施例４に記載の通りに培養した。誘導１８時間後、３０ｇの採取細胞を、２ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１００ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）バッファー、ｐＨ７．０に再懸濁させ、フレンチプレスで粉砕した。１．５ｇの３−キヌクリジノン−３−オンの還元のために、５２５Ｕの酵素を、１ｍＭのＺｎＣｌ２、１．５ｍｇのＮＡＤ、５２５Ｕのカンジダ・ネモデンドラ(Candida nemodendra)由来アルコールデヒドロゲナーゼ（ＷＯ２００７０１２４２８、配列番号８）および１ｍｌのイソプロパノールを添加した５．２５ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファー、ｐＨ７．０に加えた。この反応物を、３０℃、撹拌下でインキュベートした。インキュベーション２４時間後に、３ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨ、５ｍｌのメタノールを添加することによって反応を停止し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。測定された（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は１００％であり、生成物の光学純度は＞９９％であった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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