(57)【要約】  本発明は、悪性黒色腫の処置における使用のための、第一の成分として、デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの複合体および／またはデルフィニジンまたはその塩を含み、第二の成分として、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性黒色腫の処置における使用のための、第一の成分として、デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの複合体および／またはデルフィニジンまたはその塩を含み、第二の成分として、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む、組成物。
【請求項２】
複合体におけるスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンがスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
複合体におけるシクロデキストリンのスルホアルキルエーテル基での置換度が、３から８、好ましくは４から８、より好ましくは５から８、より好ましくは６から７であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、デルフィニジンまたはその塩またはデルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの複合体の治療的有効量を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が、少なくとも１個のさらなる治療的活性物質を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
治療的活性物質が、
−細胞増殖抑制剤、
−インターフェロン、好ましくはα−および／またはβ−インターフェロン、より好ましくはインターフェロンα−２ａおよび／またはα−２ｂ、および
−腫瘍ワクチン
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
１個またはそれ以上の薬学的な助剤および／または添加剤、好ましくは薬学的に許容される担体、充填剤、付臭剤および安定化剤からなる群より選択される物質をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
投与のための製剤形態が、経口形態、経直腸形態ならびに腹腔内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、点眼、経肺および経鼻を含む非経腸形態からなる群より選択される形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
投与形態が、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エアロゾル、溶液、クリーム剤、ペースト、ローション剤、ジェルおよび軟膏からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
デルフィニジンまたはその塩および／またはデルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの複合体が、デルフィニジンの制御放出および／または遅延放出のためのガレヌス製剤に使用されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
悪性黒色腫の処置が、
−メラノーマ細胞または悪性黒色腫罹患組織の外科的除去、
−放射線療法、
−免疫療法、
−化学療法、および
−インターフェロン処置
からなる群より選択される処置を受けたか、該処置を受けようとしているか、または該処置を受ける準備をしている対象に行われることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
第一および第二の成分が医薬の構成成分であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
第一および第二の成分が同時に投与されることを意図されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性黒色腫の処置における使用のための、第一の成分として、デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンの複合体および／またはデルフィニジンまたはその塩を含み、さらなる成分として、好ましくは腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
“黒色調の皮膚癌”としても知られる悪性黒色腫は、色素細胞、いわゆるメラノサイトの悪性変性である。癌は、早期であっても循環系およびリンパ系を通して転移を拡大する傾向がある。悪性黒色腫は、少なくとも、早期に診断され、治療されれば、治療可能である。
【０００３】
最も重要な処置法は、放射線療法に加えて腫瘍の外科的除去であるが、インターフェロンでの単剤療法もまた、悪性黒色腫の処置に用いられる。ワクチン療法もまた公知であり、すなわち、癌細胞を特異的に排除するための身体の抵抗力を高めるために、腫瘍ワクチンを用いて腫瘍接種することによる能動免疫療法が知られている。この場合において、腫瘍の特徴（例えば、腫瘍細胞または腫瘍細胞の細胞断片により生産されるタンパク質分子）は、免疫細胞がこれらの特徴を異物として認識し、これらの特徴を有する自身の細胞を攻撃するように、投与されるワクチンによって免疫細胞に提示される。ワクチン療法に加えて、化学療法、すなわち、腫瘍細胞を損傷し、または阻止する（細胞増殖抑制）化学物質による治療は、実際に適用されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、従来技術から公知の悪性黒色腫のための治療の選択肢の代替または補足として効果的な治療を提供することにある。
【０００５】
この目的は、独立請求項に記載の組成物および使用によって達成され、一方、本発明の有利な態様は従属請求項に開示されている。この目的が実際に達成されることは、メラノーマ細胞と非癌性の細胞における本発明の組成物の効果、および実施例６から１２、特にＴＲＡＩＬがさらなる成分として使用される実施例９から１１に記載の細胞生存率における本発明の組成物の効果のインビトロでの実験結果によって証明されている。
【０００６】
初めに、本明細書の文脈において使用される用語を説明する。
【０００７】
本発明の組成物は、悪性黒色腫を有する対象または個体を処置するために使用される。用語“対象”は、生存動物およびヒトを含む。この処置の目的は、少なくとも部分的な腫瘍細胞の細胞死または中和である。“中和”または“細胞死”は、本明細書の文脈中、少なくとも部分的な腫瘍細胞の破壊または分解または増殖の不活化を意味する。
【０００８】
本発明はまた、悪性黒色腫の対象を処置するための方法であって、本発明の組成物の治療的有効量を対象に投与することを意味する。特に興味深いのは、非癌性細胞の生存性および増殖に可能な限り影響を与えずに、活性成分を用いてメラノーマ細胞を排除することである。
【０００９】
用語“処置”は、本明細書の文脈において、以下の特定の結果の完全または部分的な達成を意味する：臨床像の完全または部分的な軽減；疾患に関連する臨床的症状または指標の少なくとも１つの改善；疾患の進行の遅延、抑制または疾患進行からの保護の提供；または、疾患の発症または進行の完全または部分的な遅延、抑制またはそれらからの保護。治療される対象は、ヒトまたは動物、好ましくは哺乳動物である。獣医学的処置は、家畜または野生動物（例えば、ヒツジ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ）の処置の他に、実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、サル）の処置も含む。
【００１０】
用語“デルフィニジンおよびスルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンの複合体、および／またはデルフィニジンまたはその塩を含む組成物”は、単剤療法剤としての組成物、すなわち、さらなる治療的活性成分を含まない組成物を含む。あるいは、組成物は、少なくとも１種のさらなる治療的活性物質を含んでいてよい。本発明の組成物は、悪性黒色腫の１またはそれ以上の症状を軽減するために、単独で、または少なくとも１種の他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物は、同じ組成物の１成分であり得るか、または別の組成物中に提供される他の治療剤と同時に投与され得る。あるいは、本発明の組成物は、他の治療剤の投与前または投与後に投与され得る。本発明の組成物は、他の治療剤と同じ投与経路で、または異なる投与経路で投与され得る。
【００１１】
さらなる治療的活性物質は、好ましくは腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）である。本発明のさらに好ましい態様により、さらなる治療的活性物質は、細胞増殖抑制、インターフェロン、好ましくはアルファ−および／またはベータ−インターフェロン、より好ましくはインターフェロン アルファ−２ａおよびアルファ−２ｂ、および腫瘍ワクチンからなる群より選択される。後者はまた、ＴＲＡＩＬと併用および組み合わせて使用され得る。
【００１２】
特に、転移が既に他の臓器内に形成されているとき、個々の転移の化学療法、免疫療法、および放射線治療の組み合わせは、緩解を達成するために適当であり得る。
【００１３】
インターフェロン、特に白血球細胞（白血球）中に形成されるＩＦＮ−αおよび結合組織細胞（線維芽細胞）中に形成されるＩＦＮ−βは、典型的に、化学療法において使用され、それは健常細胞ならびに悪性細胞の増殖を阻止し、免疫系を刺激する。癌治療は、通常、遺伝子工学によって得られた純粋なインターフェロン、例えば、ドイツで癌治療のために承認されたインターフェロン アルファ−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標））およびインターフェロン アルファ−２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））に頼っている。
【００１４】
ほとんど使用されなくなってきている免疫療法では、自身の腫瘍細胞を放射線照射により分割不可能にし、免疫系の刺激を増加させる目的で、免疫細胞を誘引し、当該腫瘍細胞に対して選択的に標的化するために、皮膚に、好ましくはウイルスと混合して注射するという従前の考え方がある。全腫瘍細胞または細胞断片を用いる代わりに、インビトロで造血前駆細胞から培養された細胞に、腫瘍細胞が生産したタンパク質分子を加える方法が利用されており、そのようにして調整された培養物を患者に戻して、それらを免疫細胞が攻撃すべきものとして提示することが実施されている。あるいは、同様の結果が、免疫細胞に対する誘引物質または活性化物質のための遺伝子が腫瘍細胞中に挿入されたとき達成される。
【００１５】
実用的に関連する方法はまた、異なる態様で腫瘍増殖を阻害する種々の薬物を用いた癌細胞に対する上記の化学療法であり、これらの化学療法剤は、通常、“細胞増殖抑制剤”である。細胞増殖抑制剤は、合成されるか、または腫瘍細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘発する天然に存在する細胞毒素から誘導される。本発明の文脈において使用され得る化学療法剤の例には、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、Millennium）、メルファラン、プレドニゾン、ビンクリスチン、カルムスチン、シクロホスファミド、デキサメサゾン、サリドマイド、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシドおよびシタラビンが含まれる。
【００１６】
本発明の薬物投与に加えて、放射線療法を併用することが可能である。放射性薬物、いわゆる“放射性医薬品”の使用とは別に、放射線療法は、好ましくは、限定的方法で局在的に使用されている。このことは、好ましくは、電磁放射ならびに粒子ビームが、この場合、照射領域に限定されて局所的に作用し、腫瘍細胞を損傷する、特にイオン化し、フリーラジカルを形成し、そして腫瘍細胞のＤＮＡを切断することにより、細胞核中のＤＮＡを損傷することを意味する。腫瘍の周囲の健常な組織を保護するために、スクリーンを使用することができる。
【００１７】
本発明の活性成分の単剤療法またはＴＲＡＩＬもしくは他のもしくはさらなる治療的活性成分、例えば細胞増殖抑制、インターフェロンおよび腫瘍ワクチンからなる群より選択される物質との併用療法はまた、いわゆる局所的療法として、例えば身体の領域、体腔内または腫瘍領域もしくは腫瘍がその中に位置する臓器の血管中への標的化注射により（例えば、カテーテルを用いることにより）行われ得る。患部または臓器の浸透はまた、医薬が患部（例えば、腕または脚）または臓器を通して流れ、残りの循環の完了時に別の場所に達することなく、再び患部を直接通過する、局所かん流によっても可能である。
【００１８】
本発明の組成物は、好ましくは、医薬組成物として提供され、投与される。用語“医薬組成物”は、１またはそれ以上の活性成分および活性成分（複数可）のための担体として作用する１またはそれ以上の不活性成分を含む。医薬組成物は、本発明の複合体または本発明の組成物を、経口投与、経直腸投与、腹腔内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、点眼、経肺または経鼻経路を含む非経腸投与で投与するのを可能にする。非経腸投与形態は、例えば、錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁液または分散液であってよい。点眼、経肺または経鼻投与形態は、例えば、エアロゾル、溶液、クリーム剤、ペースト、ローション剤、ジェル、軟膏、懸濁液または分散液であってよい。製剤または投与のための適当な技術は、先行技術から公知であり、例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co., Easton Pa.)を参照のこと。例えば、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、生理的食塩溶液）を用いて対象に静脈内投与され得る。水溶液、好ましくは生理的に許容される緩衝液（例えば、ハンク溶液、リンゲル溶液または生理的に緩衝生理食塩溶液）の製剤は、注射に好適である。静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内投与を含む非経腸投与の場合、水性もしくは油性溶液または固形製剤もまた有用である。組成物中の活性成分の割合は変更でき、典型的に、用量単位の２〜６０重量％である。従って、活性成分の割合は、有効用量が達成されるように選択される。本発明の好ましい態様により、デルフィニジンまたはその塩および／またはデルフィニジンとスルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの複合体は、デルフィニジンの制御放出および／または遅延放出のためのガレヌス製剤に使用される。
【００１９】
“塩”または“薬学的に許容される塩”は、医薬的観点から許容される本発明の化合物の任意の塩であり、投与後に薬学的に有効な活性成分またはその活性代謝物を放出し得る。本発明の組成物および複合体の塩は、無機酸または有機酸および無機塩基または有機塩基から誘導され得る。
【００２０】
アントシアニジンであるデルフィニジンは、望ましくない成分が除去されたことを意味する、“純粋な形態”または“精製された形態”で使用され得る。
【００２１】
“アントシアニジン”は、以下に示す基本構造を有する。
【化１】
2016502985.tif 000002
【００２２】
この式における置換基は、水素、ヒドロキシル基、およびメトキシ基からなる群より選択される。
【００２３】
本発明のアントシアニジンであるデルフィニジンと複合体を形成し得るシクロデキストリンは、α−１，４−グリコシド結合により結合したグルコース分子の環状オリゴ糖である。β−シクロデキストリンは、７つのグルコース単位を有する。スルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンにおいて、グルコース単位のヒドロキシル基がスルホアルキルアルコールでエーテル化されている。本発明においては、一般的に、β−シクロデキストリンの２１個のヒドロキシル基の一部のみがエーテル化されている。スルホアルキルエーテル シクロデキストリンの製造は、当業者に周知であり、例えば、ＵＳ５，１３４，１２７またはＷＯ２００９／１３４３４７Ａ２に記載されている。
【００２４】
スルホアルキルエーテル基は、その親水性または水溶性を増加させるために、先行技術においてシクロデキストリン中で用いられている。スルホアルキルエーテル基は、アントシアニジンおよび対応する置換β−シクロデキストリンの複合体の安定性を増大するのに特に寄与し、従って、アントシアニジンの貯蔵安定性および製剤性（formulatability）、特にその酸化に対する感受性を実質的に改善する。本発明の複合体は、以下により詳述される通り、貯蔵時安定な水溶液または固体として製剤され得る。
【００２５】
本発明により、活性成分デルフィニジンを、驚くべきことに、活性成分の溶解性および安定性を増大させるスルホアルキルエーテル β−シクロデキストリン、好ましくはスルホブチルエーテル β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−β−ＣＤ）またはスルホエチルエーテル β−シクロデキストリンと複合体形成することが特に好ましい。保護を要求する範囲を制限することなく、このことについての考えられる説明は、負に帯電したスルホブチル単位またはスルホエチル単位が、正に帯電したアントシアニジンであるデルフィニジンと静電的に相互作用し、アルキル基のうち、ブチル基またはエチル基が好適な立体相互作用を可能にするために最適な長さを有することである。ここで、デルフィニジンのような活性成分とスルホアルキルエーテル β−シクロデキストリンとの複合体が、改善された溶解性および安定性をもたらすとの一般的に妥当な説明はできないことが注意されるべきである。現時点で、例えば、Ueda et al., “Evaluation of a スルホbutyl Ether β Cyclodextrin as a Solubilizing/Stabilizing Agent for Several Drugs”, Drug Development and Industrial Pharmacy, 24 (9), 863−867 (1998)の表１を引用することができ、そこに、種々の活性成分のみ、スルホブチルエーテル β−シクロデキストリンとの複合体ならびにβ−シクロデキストリンとの複合体の溶解度が対比されている。そこに示される溶解度の値（ＳＢＥ７−β−ＣＤ  対  β−ＣＤ）から、試験した活性成分とスルホブチルエーテル β−シクロデキストリンの複合体の３分の１に、正反対の結果が見られ、すなわち、活性成分およびスルホブチルエーテル β−シクロデキストリンの複合体が、β−シクロデキストリンとの複合体と比較して顕著に低い溶解度となる。
【００２６】
スルホアルキルエーテル基によるシクロデキストリンの置換度は、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜８、より好ましくは５〜８、より好ましくは６〜７である。６〜７の平均置換度を有する好適なスルホブチルエーテル β−シクロデキストリンは、例えば、ＷＯ２００９／１３４３４７Ａ２に記載されており、商品名Ｃａｐｔｉｓｏｌ(登録商標)として市販されている。４〜５、例えば４．２の置換度を有する対応するシクロデキストリンは、同様に使用することができる。
【００２７】
本発明においてそれ自体、塩または複合体形態で用いるアントシアニジンはデルフィニジンである。化学構造は、以下の置換基パターンを有する上記の式に対応している。
【表１】
2016502985.tif 000003
【００２８】
本発明はまた、悪性黒色腫の処置のための医薬としての使用のための本発明の組成物の水溶液に関する。
【００２９】
本発明の複合体、およびまた対応する水溶液の製造は、
ａ）スルホアルキルエーテル−β−シクロデキストリンの水溶液を調製し、
ｂ）アントシアニジンであるデルフィニジンを添加し、混合して複合体を製造する
各工程を含む。
【００３０】
工程ａ）において、５〜１０重量％の使用されるシクロデキストリンを含む水溶液を製造することが好ましい。本発明の文脈において、水溶液のｐＨが、デルフィニジンの添加中または添加後、好ましくは添加前に、ｐＨ７以下、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４〜５に調整されているとき、特に好ましい。このｐＨで、より高い濃度の複合体水溶液を製造することが可能であることが示された。
【００３１】
塩化物として計算されるデルフィニジンの濃度は、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌである。好ましい態様において、少なくとも２．０ｍｇ／ｍｌの特に好ましい濃度範囲は、特に、４〜５の間のｐＨを有する水溶液で達成され得る。
【００３２】
製造の文脈上、水溶液の成分の混合は、２〜２０時間の混合のための好ましい時間の撹拌により達成され得る。混合は、好ましくは、光により誘発される酸化を避けるために暗所で行われる。
【００３３】
本発明はさらに、上記の本発明の水溶液から溶媒を除去することにより、本発明により得られ得る、悪性黒色腫の処置における医薬としての使用のための固体に関する。該除去は、好ましくは凍結乾燥によって達成され得る。本発明の水溶液医薬および薬用固体の両方は、良好な貯蔵安定性を有する。
【００３４】
本発明は、限定されることなく、添付の図面を参照して、以下の実施例でさらに説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ処理（ｂ）および未処理（ａ）のヒト  メラノーマ細胞株Ａ−３７５細胞のヒストグラムを示す。
【図２】図２ａは、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法により決定される、対照のＳＢＥ−β−ＣＤ、ＤＭＳＯおよび未処理の低細胞密度でのＡ−３７５細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤおよびデルフィニジン Ｃｌによるアポトーシスの用量依存的誘導を示す。図２ｂは、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法により決定される、デルフィニジン Ｃｌならびに対照のＳＢＥ−β−ＣＤ、ＤＭＳＯおよび未処理の高細胞密度でのＡ−３７５細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤによるアポトーシスの用量依存的誘導を示す。
【図３】図３ａは、ＷＳＴ−１アッセイにより決定される、対照のＳＢＥ−β−ＣＤ、ＤＭＳＯおよび未処理の低細胞密度でのＡ−３７５細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤおよびデルフィニジン Ｃｌの細胞生存率に対する用量依存的効果を示す。図３ｂは、ＷＳＴ−１アッセイにより決定される、デルフィニジン Ｃｌならびに対照のＳＢＥ−β−ＣＤ、ＤＭＳＯおよび未処理の高細胞密度でのＡ−３７５細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤの細胞生存率に対する用量依存的効果を示す。
【図４】図４は、未処理のＡ−３７５細胞ならびにデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ、デルフィニジン ＣｌおよびＳＢＥ−β−ＣＤで処理したＡ−３７５細胞の顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図６】図６は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ処理した低細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図７】図７は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、デルフィニジン Ｃｌ処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図８】図８は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、デルフィニジン Ｃｌ処理した低細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図９】図９は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＳＢＥ−β−ＣＤ処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１０】図１０は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＳＢＥ−β−ＣＤ処理した低細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１１】図１１ａは、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法により決定される、低細胞密度での対照（未処理細胞またはＴＲＡＩＬのみで処理した細胞）と比較した、ＴＲＡＩＬの有無下におけるデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤによるアポトーシス誘導を示す。図１１ｂは、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法により決定される、高細胞密度での対照（未処理細胞またはＴＲＡＩＬのみで処理した細胞）と比較した、ＴＲＡＩＬの有無下におけるデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤによるアポトーシス誘導を示す。
【図１２】図１２ａは、ＷＳＴ−１アッセイにより決定される、低細胞密度でのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのみおよび対照（未処理細胞またはＴＲＡＩＬのみで処理した細胞）と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬ処理の細胞生存率に対する効果を示す。図１２ｂは、ＷＳＴ−１アッセイにより決定される、高細胞密度でのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのみおよび対照（未処理細胞またはＴＲＡＩＬのみで処理した細胞）と比較した、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬ処理の細胞生存率に対する効果を示す。
【図１３】図１３は、未処理のＡ−３７５細胞、ＴＲＡＩＬのみで処理したＡ−３７５細胞、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのみで処理したＡ−３７５細胞およびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬで処理したＡ−３７５細胞の顕微鏡写真を示す。
【図１４】図１４は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＴＲＡＩＬ処理、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ処理、ＴＲＡＩＬおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１５】図１５は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＴＲＡＩＬ処理、デルフィニジン Ｃｌ処理、ＴＲＡＩＬおよびデルフィニジン Ｃｌ処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１６】図１６は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＴＲＡＩＬ（０．０２μｇ／ｍｌ）処理、ＳＢＥ−β−ＣＤ（３０μｇ／ｍｌ）処理、ＴＲＡＩＬ（０．０２μｇ／ｍｌ）およびＳＢＥ−β−ＣＤ（３０μｇ／ｍｌ）処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１７】図１７は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いた、未処理細胞と比較した、ＴＲＡＩＬ（０．０２μｇ／ｍｌ）処理、ＳＢＥ−β−ＣＤ（１０００μｇ／ｍｌ）処理、ＴＲＡＩＬ（０．０２μｇ／ｍｌ）およびＳＢＥ−β−ＣＤ（１０００μｇ／ｍｌ）処理した高細胞密度のＡ−３７５細胞の細胞数および細胞増殖（リアルタイム細胞モニタリング）を示す。
【図１８】図１８は、ＡＴＰルミネッセンスアッセイを用いた、活性成分不含有対照培地と比較した、０．１μＭ、３．２μＭおよび１００μＭ濃度のデルフィニジン Ｃｌおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体の内皮細胞の細胞生存率に対する効果を示す。
【図１９】図１９は、ＡＴＰルミネッセンスアッセイを用いた、活性成分不含有対照培地と比較した、０．１μＭ、３．２μＭおよび１００μＭ濃度のデルフィニジン Ｃｌおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体のヒト線維芽細胞の細胞生存率に対する効果を示す。
【実施例】
【００３６】
実施例
Ｉ．デルフィニジンおよびシクロデキストリンの複合体の製造
１．用いた材料：
以下のシクロデキストリンを用いる：
【表２】
2016502985.tif 000004
塩化デルフィニジンは、Extrasynthese社から購入した。
【００３７】
２．デルフィニジン含量の決定
逆相ＨＰＬＣ法を用いて、デルフィニジン含有組成物中の塩化デルフィニジン含量を決定した。この目的のために、以下の試薬を用いた。
精製水
クロマトグラフィー用メタノール
分析用ギ酸
用量測定用溶液としての１Ｍ塩酸。
【００３８】
用いたカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ  Ｂｒｉｄｇｅ（商標）  Ｃ１８、３５μｌ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍであった。
【００３９】
移動相は以下の通りであった。
相Ａ：水  ９５０ｍｌ、メタノール  ５０ｍｌ、ギ酸  １０ｍｌ
相Ｂ：水  ５０ｍｌ、メタノール  ９５０ｍｌ、ギ酸  １０ｍｌ。
【００４０】
以下の勾配プログラムを用いた。
【表３】
2016502985.tif 000005
停止時間：３５分
アフターラン時間（ポストタイム）：８分
流速：１ｍｌ／分
注入量：２０μｌ
カラム温度：３０℃±２℃
ＵＶ／Ｖｉｓ検出器：アッセイについて５３０μｍ、不純物の検出について２７５μｍ
積分：面積。
【００４１】
溶液およびサンプル調製：
希釈溶液１：１００ｍｌのメタノールおよび２．６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合物
希釈溶液２：１００ｍｌの４０％メタノールおよび２．６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合物。
キャリブレーション溶液：デルフィニジンの標準溶液を、１０ｍｌフラスコに１０ｍｇの塩化デルフィニジンを秤量し、希釈溶液１に溶解した。溶解後、溶液を希釈溶液２で約１０倍に希釈し、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製した。
【００４２】
対照のキャリブレーション溶液を同じ方法で調製した。塩化デルフィニジンが溶液中で不安定であるため、該キャリブレーション溶液を直ちにＨＰＬＣにより分析した。
【００４３】
試験溶液の製造：
本発明により製造された固体のデルフィニジン含量を決定するために（製造については、以下を参照のこと）、約５０ｍｇの本組成物を１０ｍｌフラスコに秤量した。次いで、これを希釈溶液２に溶解し、さらに、約０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のデルフィニジンが達成されるまで、同じく希釈溶液２で希釈した。
【００４４】
サンプル中のデルフィニジン含量の決定を、記載の外部標準を用いてキャリブレーションを用いて、Agilent ChemStationソフトウェアを用いて計算した。
【００４５】
実施例１：デルフィニジンとＳＢＥ−β−ＣＤの複合体形成
本実施例において、デルフィニジンと種々のシクロデキストリンの複合体形成および水溶液中の該複合体の溶解度を試験した。
【００４６】
中性水溶液を、それぞれ１０重量％のシクロデキストリンを含むように製造した。β−ＣＤの溶解度が不十分なために、２重量％濃度のみを選択した。
【００４７】
ガラス製フラスコに各５ｍｌのシクロデキストリン水溶液および純水を入れた。その後、過剰量の塩化デルフィニジンを添加した。必要とされる過剰量は、α−、β−およびγ−シクロデキストリン溶液に対して１０ｍｇ、ＨＰＢＣＤ（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）およびＳＢＥ−β−ＣＤの溶液に対して１５ｍｇであった。
【００４８】
懸濁液を暗所で３０℃にて２０時間撹拌した。次いで、該懸濁液を、０．２２μｍ孔径の膜フィルターを通して濾過した。
【００４９】
得られた溶解度を、以下の表に示す。
【表４】
2016502985.tif 000006
【００５０】
複合体形成およびそれによりもたらされる溶解度の増加が、他のシクロデキストリン類よりもＳＢＥ−β−ＣＤでより優れていることが明らかである。
【００５１】
実施例２：ｐＨの影響
本実施例において、水溶液へのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤの溶解度に対するｐＨの影響を試験した。ＳＥＢ−β−ＣＤの水溶液を実施例１の方法に従って製造し、これらの溶液を、表２に記載の酸性ｐＨ値に１Ｍ ＨＣｌで調整した。その後、塩化デルフィニジンを実施例１の方法に従って添加し、撹拌時間が２．５時間までに制限されることを除いて、さらに処理した。結果を以下の表に示す。
【表５】
2016502985.tif 000007
【００５２】
４から５の間のｐＨ値にて、複合体塩化デルフィニジンの溶解度が、中性ｐＨと比較して、約３倍増加することが見出された。
【００５３】
実施例３：本発明の固体の製造
本実施例において、本発明の複合体は、固体として製剤される。比較のため、デルフィニジン／ＨＰＢＣＤ複合体およびデルフィニジン／デンプン製剤を固体形態で製造する。
【００５４】
実施例３．１：デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ
５ｇのＳＥＢ−β−ＣＤを４０ｍｌの蒸留水に溶解し、透明な溶液を得た。該溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いて４．８に調整した。次いで、０．１１ｇの塩化デルフィニジンを添加し、混合物を暗所で２７℃にて２時間撹拌した。均一な液体を、孔径０．４５μｍの膜フィルターを通して真空下で濾過した。溶液を凍結し、その後、−４８℃および約１０．３Ｐａ（７７ｍＴｏｒｒ）の圧力下で凍結乾燥させた。凍結乾燥物を粉砕し、０．３ｍｍメッシュサイズの篩にかけた。
【００５５】
実施例３．２：デルフィニジン／ＨＰＢＣＤ
かなりの量の材料を濾過する以外、本実施例を実施例３．１と同様に行い、実施例３．１のＳＢＥ−β−ＣＤを用いるよりも溶解度が顕著に低かったことが示された。
【００５６】
実施例３．３：デルフィニジンデンプン製剤
５ｇのデンプンを４０ｍｌの蒸留水中に懸濁した。白色懸濁液を得た。該溶液のｐＨを、１Ｍ  ＨＣｌを用いて４．６に調整した。次いで、０．１１ｇの塩化デルフィニジンを添加し、混合物を暗所で２７℃にて２時間撹拌した。得られた均一な液体を、実施例３．１に記載の通り、凍結乾燥させて、固体を粉砕し、篩過した。
実施例３．１は本発明によるものであり、実施例３．２および３．３は比較例である。
【００５７】
実施例４：安定性試験
実施例３．１から３．３の固体を以下の条件下で貯蔵した。
−褐色のねじ式ガラス容器中、室温にて８日間、
−その後、酸素雰囲気下の暗所で、ガラス容器中、室温にて２２日間。
【００５８】
上記の貯蔵のうち後半の２２日間は、２０ｍｌ容量のガラスバイアル中で行った。各場合において、予め８日間貯蔵した２５０ｍｇのサンプルをそこに入れ、該バイアルをゴム栓で密封した。２本の注射針により、バイアルの上部空間に純粋な酸素を入れた。その後、サンプルを暗所で貯蔵した。
【００５９】
固体のデルフィニジン含有量（塩化デルフィニジンとして計算され、重量％で記載される）を、上記のＨＰＬＣ法により決定した。結果を以下の表に示す。
【表６】
2016502985.tif 000008
【００６０】
結果は、純粋な酸素雰囲気下でも高い安定性を有し、従って良好な貯蔵適正を有するデルフィニジン複合体が本発明により製造され得ることを示す。該複合体はまた、水溶液で、特にわずかに酸性の溶液で良好な溶解性を有し、デルフィニジンは、種々の方法で本発明により製剤され得る。本発明の固体の安定性は、デンプンを含む製剤（実施例３．３）と同程度に良好であるが、この比較例は、水溶液として製剤され得ない。
【００６１】
実施例５：水溶液における安定性試験
デルフィニジン含有溶液中の塩化デルフィニジン含量を決定するために、逆相ＨＰＬＣ法を上記のものと同様に用いた。以下の反応材をこの実施例において用いた。
精製水
クロマトグラフィー用メタノール
分析用ギ酸
用量測定用溶液としての１Ｍ塩酸。
【００６２】
用いたカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ  Ｂｒｉｄｇｅ（商標）  Ｃ１８、３５μｌ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍであった。
【００６３】
移動相は以下の通りであった。
相Ａ：水  ７７０ｍｌ、メタノール  ２３０ｍｌ、ギ酸  １０ｍｌ
相Ｂ：水  ５０ｍｌ、メタノール  ９５０ｍｌ、ギ酸  １０ｍｌ。
【００６４】
以下の勾配プログラムを用いた。
【表７】
2016502985.tif 000009
停止時間：２５分
アフターラン時間（ポストタイム）：８分
流速：１ｍｌ／分
注入量：２０μｌ
カラム温度：３０℃±２℃
ＵＶ／Ｖｉｓ検出器：アッセイについて５３０μｍ、不純物の検出について２７５μｍ
積分：面積。
【００６５】
溶液およびサンプル調製：
希釈溶液１：１００ｍｌのメタノールおよび２．６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合物
希釈溶液２：１００ｍｌの５０％メタノールおよび２．６ｍｌの１Ｍ ＨＣｌの混合物。
キャリブレーション溶液：デルフィニジンの標準溶液を、１０ｍｌフラスコに１０ｍｇの塩化デルフィニジンを秤量し、希釈溶液１に溶解した。溶解後、溶液を希釈溶液２で約１０倍に希釈し、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製した。
【００６６】
対照キャリブレーション溶液を同じ方法で調製した。塩化デルフィニジンが溶液中で不安定であるため、該キャリブレーション溶液を直ちにＨＰＬＣにより分析した。
【００６７】
試験溶液の製造：
本発明の水溶液のデルフィニジン含有量を決定するために、実施例３．１（本発明）のデルフィニジン／ＳＢＥ−β−ＣＤおよびデルフィニジン（比較例）を、１．５８４ｍｇ／ｍｌ（本発明実施例）または０．０２１６ｍｇ／ｍｌ（比較例）の開始濃度（デルフィニジンに基づく）が達成されるまで、０．９％ＮａＣｌ溶液中に溶解した。溶液を室温で製造し、その後、暗所で、３７℃にて密閉バイアル中に貯蔵した。
【００６８】
デルフィニジン含量を、１、２、３および４時間後に決定した。以下の表は、上記の開始濃度に対する割合として決定された含量を示す。
【表８】
2016502985.tif 000010
【００６９】
サンプル中のデルフィニジン含量の決定を、記載の外部標準を用いてキャリブレーションを用いて、Agilent ChemStationソフトウェアを用いて計算した。
【００７０】
ＩＩ．メラノーマ細胞に対するデルフィニジンおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体の効果
試験細胞株
以下に記載のインビトロ実験において、デルフィニジンとスルホブチルエーテル β−シクロデキストリン複合体（以降、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ）およびデルフィニジンの効果を、ヒトメラノーマ細胞株Ａ−３７５モデルを用いて試験した[ATCC Catalog No. CRL-1619; Bruggen J., Sorg C. (1983) Detection of phenotypic differences on human malignant melanoma lines and their variant sublines with monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 15: 200−205]。
【００７１】
細胞株を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）および抗生物質を添加したＤＭＥＭ（ドイツ、カールスルーエ、Gibco社のダルベッコの修飾イーグル培地）中、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
【００７２】
実施例６
（ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法を用いる、アポトーシス誘導の測定）
実施例６の実験において、試験細胞株におけるアポトーシスの誘導について試験した物質の効果を、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法、通常、技術文献において“Nicoletti method”と呼ばれる方法を用いて試験した[Riccardi C. Nicoletti I. (2006) Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat. Protoc. 1: 1458−1461]。
【００７３】
この方法は、生存細胞と比較して、アポトーシス細胞のより低いＤＮＡ含量に基づく。アポトーシスの特徴は、エンドヌクレアーゼによる、短いＤＮＡフラグメントへのＤＮＡの切断であって、ここで、生存細胞と比較して、アポトーシス細胞において低分子量ＤＮＡ含量が増加し、高分子量ＤＮＡの割合が低下する。細胞膜の誘導された溶解（膜透過化）は、アポトーシス細胞から低分子量ＤＮＡフラグメントを漏出する。細胞をＤＮＡインターカレート色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色するとき、アポトーシス細胞は生存細胞よりも弱い蛍光強度を示し、アポトーシス細胞核内でのフローサイトメトリーによって決定されたＤＮＡ含量は、広範な、低二倍体の、より弱い蛍光ＤＮＡピーク（ｓｕｂ−Ｇ１ピーク）を明らかにし、それは、二倍体ＤＮＡ含量を有する健常な細胞の狭い２倍のＤＮＡのピークとは容易に区別することができる。この一例を図１のヒストグラムａおよびｂに示す。ヒストグラムａは、未処理のＰＩ染色した細胞を示す。ヨウ化プロピジウムはＤＮＡに組み込まれ、２つの狭いピーク、１倍のＤＮＡ含量を有するＧ１期の細胞（左ピーク）および二倍体ＤＮＡ含量を有するＧ２期の細胞（右ピーク）で蛍光を発する。左のピークの上流のｓｕｂ−Ｇ１ピークは、実質的には存在しない。対照的に、ヒストグラムｂは、広範なｓｕｂ−Ｇ１ピークを示す。これは、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤで処理した２４時間後のアポトーシス細胞核の割合を示す。
【００７４】
実施例６のｓｕｂ−Ｇ１ピーク法を実施するために、細胞を１ｍｌの細胞懸濁液当たり１０−３０００μｇのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤまたは１５−１２０μＭの精製した塩化デルフィニジン（以降、デルフィニジン Ｃｌ）と共に２４時間インキュベートし、そこで、複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤおよびまたＤＭＳＯで処理した細胞、ならびに未処理細胞を対照とした。それぞれの個々の試験のために（対照、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ、ＳＢＥ−β−ＣＤ、デルフィニジン Ｃｌ）、ウェルプレート上の３つの３ｍｌウェルに細胞を準備した。その後、細胞をトリプシン処理により回収し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００およびＰＩ（４０μｇ／ｍｌ； Sigma−Aldrich, Taufkirchen, Germany）を含む染色緩衝液を用いて１時間インキュベートし、その後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Becton Dickinson, Heidelberg）により細胞核のＤＮＡ含量を測定および評価した。平均値は、トリプリケートの測定値それぞれから計算され、ここで、対象細胞について測定された値をｔ検定のための基準として用いた。
【００７５】
低い自発的アポトーシス率（バックグランドアポトーシス）が、アポトーシス測定中に発生し得ることが知られており、この作用は、細胞が既に増殖停滞期に達し、栄養および酸素の欠乏に直面している場合に、特に発生する。これを考慮するために、指数増殖期の細胞を測定し、実験を、低い（低細胞密度）および高い細胞密度（高細胞密度）の両方で並行して行い、結果を図２ａ（低細胞密度）および図２ｂ（高細胞密度）に示す通り図示した。
【００７６】
実験結果
−精製したデルフィニジン Ｃｌは、アポトーシスの有意な用量依存的誘導を示す（図２ａ参照、１２０μＭ）。
−デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体は、アポトーシスの明らかに強力な誘導を示す（図２ａ参照、１０００μｇ／ｍｌ、および図２ｂ参照、３０００μｇ／ｍｌ）。
−一方、複合体パートナー  ＳＢＥ−β−ＣＤおよびまたＤＭＳＯは、未処理の対照細胞と同様に、何の効果も示さない。
【００７７】
実施例７
（細胞生存率テスト）
実施例７の実験において、試験細胞株の細胞生存率に対する試験した物質の効果を、Roche Diagnostics社からのＷＳＴ−１アッセイ（水溶性テトラゾリウム）を用いて定量した。ＷＳＴ−１アッセイは、細胞中の無傷の呼吸鎖（respiratory chain）を検出するように設計されており、無傷のミトコンドリアのコハク酸テトラゾリウムデヒドロゲナーゼシステムを有する生存細胞は、弱赤色のテトラゾリウム塩  ＷＳＴ−１（４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート）から暗赤色のホルマザンへの酵素的変換を生じる。この色の変化は、分光光度計で光度測定し、評価することができる。
【００７８】
実施例７のＷＳＴ−１アッセイを行うために、細胞を、実施例６と同様に、１ｍｌの細胞懸濁液当たり１０−３０００μｇのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤまたは１５−１２０μＭの精製されたデルフィニジン Ｃｌと共に２４時間インキュベートし、ここで、複合体パートナーＳＢＥ−β−ＣＤおよびまたＤＭＳＯで処理された細胞、ならびに未処理細胞を対照とした。Ploetz et al. (2012), Mutual Regulation of Bcl-2 Proteins Independent of the BH3 Domain as Shown by the BH3-Lacking Protein Bcl-xAK, PLOS ONE, vol 7, issue 4, e34549に詳細に記載のようなＷＳＴ−１アッセイにおいて、例えば、カルセイン  ＡＭでの染色は、血清不含有増殖培地中、３７℃にて６０分間、カルセイン（４μΜ； e Bioscience, Frankfurt, Germany）と共にインキュベートして行い、ＰＢＳで洗浄し、その後、細胞生存率の測定を、カルセイン染色（生存）細胞と染色されていない（死）細胞を区別するために、フローサイトメトリーにより行った（実施例５参照）。
【００７９】
実施例６と同様に、実施例７における試験はまた、低い細胞密度（低細胞密度）およびより高い細胞密度（高細胞密度）の両方で行い、その結果を、図３ａ（低細胞密度）および３ｂ（高細胞密度）に示す通り図示する。
【００８０】
試験結果
−精製したデルフィニジン Ｃｌは、低細胞密度で用量の増加に伴い生存細胞の喪失を示す（図３ａ参照）。
−デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体は、細胞生存率の明らかに高度かつ顕著な喪失を引き起こす（１０００μｇ／ｍｌおよび２０００μｇ／ｍｌについて図３ａ、および３０００μｇ／ｍｌについて図３ｂ参照）。
−一方、複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤおよびまたＤＭＳＯは、何の効果も示さず、未処理の対照細胞と同様である。
【００８１】
アポトーシスの誘導を超える生存細胞の喪失の効果（実施例６）はまた、処理の２４時間後に顕微鏡分析下での細胞の形態にも反映されており、高濃度のデルフィニジン Ｃｌまたはデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤでの細胞は、図４の顕微鏡写真から明らかなように、球状および／または分離している。
【００８２】
実施例８
［リアルタイム細胞分析−ＲＴＣＡ］
実施例６および７と同様に、同じ活性成分の試験における細胞数および細胞増殖を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いてリアルタイムで記録した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムは、リアルタイムに動的な細胞データを提供する、細胞ベースの無標識分析のための超小型バイオセンサーシステムである。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムの培養プレートは、電気的インピーダンスの変化を測定するために、各ウェルの底に微小電極を備えている。インピーダンスの量的変化は、下層の電極を用いて細胞接触の数および強度と相関する。
【００８３】
デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤは、高率のアポトーシス（実施例６）および細胞生存率の低下（実施例７）による細胞増殖の完全な低下を示し（図５および６参照）、特に図５の濃度１０００μｇ／ｍｌから強い抗増殖作用が示され、図６の濃度５００μｇ／ｍｌから細胞増殖の完全な阻害が示される。
【００８４】
同様に強力な抗増殖作用が、６０−１２０μＭのデルフィニジン Ｃｌで見られ（図７および８参照）、予期される通り、未処理細胞およびＤＭＳＯ対照は、ほぼ中立的な挙動であり（図７−１０参照）、すなわち、上記の抗増殖作用は、試験された活性成分であるデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤおよびデルフィニジン Ｃｌに特異的に起因している。
【００８５】
ＩＩＩ．デルフィニジンおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体とＴＲＡＩＬの組み合わせ剤のメラノーマ細胞に対する効果
用いる試験細胞株および方法
同じ細胞株および方法を、上記セクションＩＩのとおりに実験に用いた。
【００８６】
実施例９
（ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法を用いるアポトーシスの誘導の測定）
実施例９に記載の実験において、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体とアポトーシス促進性細胞死リガンドであるＴＲＡＩＬの組み合わせの効果を、中程度のアポトーシス感受性のみを有する細胞株Ａ−３７５に対して、ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法を用いて試験した。ｓｕｂ−Ｇ１ピーク法を実施例９の通りに実施するために、細胞を、細胞懸濁液１ｍｌ当たり３０−１０００μｇのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤと共に、細胞懸濁液１ｍｌ当たり０．０２μｇのＴＲＡＩＬの有無下で２４時間インキュベートし、ここで複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤで処理した細胞および未処理細胞を対照として用いた。実験を、低い（低細胞密度）およびより高い細胞密度（高細胞密度）の両方で並行して行い、結果を図１１ａ（低細胞密度）および図１１ｂ（高細胞密度）に示す通り図示した。
【００８７】
実験結果
−デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬの組み合わせにおいて、アポトーシスの誘導は、試験した全てのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ濃度でデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのみに関して増加した。
−アポトーシス誘導の増加は、同様に、高濃度のデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤにて、ＴＲＡＩＬのみに対してデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬの組み合わせについて顕著に増加した。
−一方、複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤは、対照レベルである。
【００８８】
実施例１０
（細胞生存率試験）
実施例１０の実験において、試験細胞株の細胞生存率は実施例７と同様に試験し、相違点は、細胞がデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体およびＴＲＡＩＬの組み合わせに暴露されたことである。
【００８９】
実施例７と同様のアッセイを実施するために、細胞を、１ｍｌの細胞懸濁液当たり３０−１０００μｇのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤと共に、細胞懸濁液１ｍｌ当たり０．０２μｇのＴＲＡＩＬの有無下で２４時間インキュベートし、ここで複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤで処理した細胞および未処理細胞を対照として用いた。
【００９０】
実施例１０における実験はまた、実施例９と同様に、低い（低細胞密度）およびより高い細胞密度（高細胞密度）の両方で行い、結果を図１２ａ（低細胞密度）および図１２ｂ（高細胞密度）に示す通り図示した。
【００９１】
実験結果
−デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬの組み合わせにおいて、細胞生存率は、試験した全てのデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ濃度でデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのみに関して低下する。
−細胞生存率の低下は、同様に、高濃度のデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤにて、ＴＲＡＩＬのみに対して、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤとＴＲＡＩＬの組み合わせについて明らかである。
−一方、複合体パートナーであるＳＢＥ−β−ＣＤは、対照レベルである。
【００９２】
アポトーシスの誘導を超える生存細胞の喪失の効果（実施例９）はまた、処理の２４時間後に顕微鏡分析下での細胞の形態にも反映されており、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤに加えてＴＲＡＩＬの使用は、図１３の顕微鏡写真から明らかなように、細胞のより球状および／または分離を引き起こす。
【００９３】
実施例１１
（リアルタイム細胞分析−ＲＴＣＡ）
実施例９および１０と同様に、同じ活性成分の試験における細胞数および細胞増殖を、ルフィニジン Ｃｌの組み合わせをＴＲＡＩＬの有無下でさらに添加して、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いてリアルタイムで記録した。
【００９４】
ＴＲＡＩＬと組み合わせたデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤは、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ単独と比較して、アポトーシスの増加率（実施例９）およびより大きな細胞生存率の低下（実施例１０）に従い、相乗的かつ強力な細胞増殖阻害を示す（図１４参照）。細胞増殖のより強力な阻害はまた、ＴＲＡＩＬ単独およびデルフィニジン単独と比較して、デルフィニジン ＣｌとＴＲＡＩＬの組み合わせでも観察され得る（図１５参照）。ＳＢＥ−β−ＣＤによるＴＲＡＩＬ感受性の強化は観察されず（図１６および１７参照）、すなわち、上記の抗増殖作用の強化は、デルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤのＴＲＡＩＬとの組み合わせにおいて試験された活性成分デルフィニジンに得意に起因するものである。
【００９５】
ＩＶ．細胞毒性の試験−細胞生存率に対するデルフィニジンおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体の効果
実施例１２
（ヒト線維芽細胞および内皮細胞の生存性に対するデルフィニジンおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体の効果）
【００９６】
用いた細胞
用いた細胞は、ヒトドナーの皮膚由来の単離された線維芽細胞および微小血管内皮細胞の初代細胞であった。
【００９７】
線維芽細胞を単離するために、組織の細胞構造を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液と共に１時間インキュベートすることにより溶解した。細胞剥離反応を停止するために、停止培地を皮膚に添加した。その後、皮膚片をＰＢＳ中で２回スワール（Swirl）して集め、線維芽細胞の懸濁液とする。得られた線維芽細胞を４℃にて５分間、１００回転／分で遠心分離し、定量化後に用いた。
【００９８】
ヒト皮膚微小血管内皮細胞は、Hewett and Murray (1993)の当業者に公知の標準的方法により得られた [Hewett P. W. and Murray J. C. (1993) Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated monoclonal antibodies to PECAM-1. Eur J Cell Biol 62: 451−454; Hewett P. W. ＆ Murray J. C. (1993) Human microvessel endothelial cells: Isolation, culture and characterization. In Vitro Cell Biol: 823−830]。
【００９９】
用いた測定方法
実施例１２の実験において、ヒト線維芽細胞および内皮細胞の生存性に対する試験した物質の効果は、当業者に公知のＡＴＰルミネッセンスアッセイを用いて試験され、それを、誤解をなくすために、以下に簡単にまとめる。
【０１００】
例えば、細胞毒性の活性成分の作用に起因する細胞死の後、細胞内ＡＴＰ含量は、ＡＴＰａｓｅによる分解のために大幅に減少する。従って、内生ＡＴＰａｓｅの阻害により、溶解により遊離されたＡＴＰ含量は、生存細胞数の１つの尺度として用いられ得る。定量化のために、遊離したＡＴＰは、酵素ルシフェラーゼにより触媒される反応に用いられ、ここで、基質ルシフェリンのオキシルシフェリン、二酸化炭素、ＡＭＰおよび無機リン酸へのＡＴＰ依存性の酸化が、Ｍｇ２＋の存在下で、光を放出しながら起こる。ＡＴＰ含量と相関した放出される光の量を測定し、試験した細胞の生存率についての直接定量可能な結果を提供する。これは、サンプル中のＡＴＰの量を反映する独立した単位であるＲＬＵ（相対光単位）で測定される。ＡＴＰ決定のためのキットおよび装置は、当業者に公知で有り、例えば、スウェーデン、ハニンゲ(Haning)のBiothema, AB社のＡＴＰ試験キット、およびドイツ、ビルケンフェルトのSTRATEC Biomedical Systems AG社の持ち場こび可能なルミノメーターであるＬｕｍｉｎｏ(登録商標)である。細胞内ＡＴＰを決定するために、試験すべき５０μｌのサンプルを、通常、ガラス管にピペットで移して、５０μｌの抽出試薬Ｂ／Ｓを細胞溶解のためにそこに添加し、４００μｌのＡＴＰ−ＨＳ試薬を添加し、混合した後、密封管を自動測定および発光の評価のためにルミノメーターに配置した。
【０１０１】
本実施例の場合、活性成分で処理し、ＡＴＰルミネッセンスアッセイに適用する前に、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中のヒト線維芽細胞または内皮細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し（５０００細胞／ウェル）、３日間培養した。インキュベーター内で細胞を接着および増殖させた後、物質での処理を、１日目〜４日目（内皮細胞）および４時間、２４時間、４８時間および９６時間の間隔（線維芽細胞）で行い、ここで、１００μｌのＤＭＥＭ培地中に溶解した活性成分デルフィニジン Ｃｌまたはデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤ複合体は、種々の濃度で３つのウェルに添加された（０．１μＭ；３．２μＭ；１００μＭ）。物質不含有培地で処理した細胞を参照対照として用いた。３時間後に物質の枯渇が生じ、その後、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。終点測定を、実施例７にて上記のＷＳＴ−１アッセイを用いて行った。
【０１０２】
ＡＴＰルミネッセンスアッセイの実験結果は、図１８（内皮細胞）および図１９（線維芽細胞）に図示され、以下の通りにまとめられる。
−デルフィニジン Ｃｌおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤは、ヒト線維芽細胞および内皮細胞に対して、試験した活性成分濃度（０．１−１００μＭ）で顕著な細胞毒性作用を示さない。
【０１０３】
これは、癌を処置するための完全に新規な、かつ特に好適な活性成分群を明らかにし、一方では、試験した活性成分デルフィニジン Ｃｌおよびデルフィニジン−ＳＢＥ−β−ＣＤが癌細胞（メラノーマ細胞）に対する所望の抗増殖作用を有し（実施例６−１１）、他方では、実施例１２に記載の通り、治療的に有効な濃度で一般的に予期される望ましくない非癌性細胞に対する細胞毒性作用（副作用）を回避する。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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