(57)【要約】  本明細書において、強力なアジュバント活性を有するワクチン組成物を提供する。そのような組成物は、抗原特異的抗体の応答を増加させることができ、および、Ｈｅｒ−２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を上昇させることができ、抗腫瘍効果を改善し、ならびに、癌を治療する方法において有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を含有する組成物。
【請求項２】
前記異種腫瘍関連抗原が、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記異種腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２抗原を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＥＲ−２抗原が、配列番号１を含有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物の投与が、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善を誘導し（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇を誘導する（ＥＬＩＳＡにより測定）、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体をさらに含有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者を特定すること；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の治療有効量、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質の治療有効量を前記患者に投与し、それにより、前記癌を治療すること、を含む、ヒト癌患者を治療する方法。
【請求項９】
前記異種腫瘍関連抗原が、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２抗原を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＥＲ−２抗原が、配列番号１を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えＭＶＡおよび前記組換えタンパク質を共に投与することにより、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善を誘導し（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇を誘導する（ＥＬＩＳＡにより測定）、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えＭＶＡおよび前記組換えタンパク質が、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト癌患者は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記乳癌は、転移性乳癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質；および、（ｃ）組換えＭＶＡの治療有効量および組換えタンパク質の治療有効量を、異種腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者に投与するための説明書、を含有する、ヒト癌患者を治療するためのキット。
【請求項２０】
前記異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記異種腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２抗原を含有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＨＥＲ−２抗原が、配列番号１を含有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記組換えＭＶＡおよび前記組換えタンパク質を共に投与することにより、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善を誘導し、（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇を誘導する（ＥＬＩＳＡにより測定）、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記組換えＭＶＡおよび前記組換えタンパク質が、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ヒト癌患者が、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌からなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記乳癌は、転移性乳癌である、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌関連抗原をコードするＭＶＡウイルスを、特に、同癌抗原の組換え体と組み合わせて用いる、癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ属のワクシニアウイルスに関連した、高度に弱毒化されたポックスウイルスである。ＭＶＡは、漿尿膜ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のＡｎｋａｒａ株をニワトリ胚線維芽細胞上で５１６回、継代培養することにより作製された（概略は、Ｍａｙｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，  ６−１４  （１９７５）を参照のこと）。この長期間の継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、およそゲノム配列が３１キロベース欠損し、それゆえ、複製のための宿主細胞は鳥類細胞に強く限定されることとなったと報告された（Ｍｅｙｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２，  １０３１−１０３８  （１９９１））。次いで、様々な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡはほぼ無毒であったことが示された（Ｍａｙｒ，  Ａ．  ＆  Ｄａｎｎｅｒ，  Ｋ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ４１：  ２２５−３４  （１９７８））。さらに、このＭＶＡ株は、ヒトの天然痘に対する免疫のためのワクチンとして、臨床試験で検証されている（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｂｌ．  Ｂａｋｔ．  Ｈｙｇ．  Ｉ，  Ａｂｔ．  Ｏｒｇ．  Ｂ  １６７，  ３７５−３９０  （１９８７）；  Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２  （１９７４））。これらの試験には１２０，０００を超える人々（高リスク患者を含む）が関与し、ＭＶＡは、ワクシニアをベースとしたワクチンと比較し、病原性または感染力を減弱させ、それでも良い特異的免疫応答を誘導したことが明らかとなっている。
【０００３】
その後の数十年、ＭＶＡは、組換え遺伝子発現のためのウイルスベクターとしての使用、または組換えワクチンとしての使用のために用いられていた（Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：  １０３２−４０  （１９９４））。
【０００４】
１９７０年代に、Ｍａｙｒらが、ＭＶＡは高度に減弱され、ヒトおよび哺乳類において無毒であることを示したが、ある調査において、ＭＶＡは、これらの細胞においてある程度の残存複製を行うことがあり、そのため、ヒトおよび哺乳類において完全に無毒化されてはいないと報告されている（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９，  １１５９−１１６７  （１９９８）；  Ｃａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｍｏｓｓ，  Ｖｉｒｏｌ．  ２３８，  １９８−２１１  （１９９７）；  Ａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、米国特許第５，１８５，１４６号；  Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ５５（５），  ５６９  （１９９９））。これらの文献で報告されている結果は、用いられたウイルスが、その特性（特に、様々な細胞株における増殖様式）において本質的に異なっているため、ＭＶＡの様々な公知の株から得られたと推測されている。そのような残存複製は様々な理由（ヒトにおける使用に関する安全性に関する懸念を含む）で好ましくないものである。
【０００５】
より安全な製品（たとえば、ワクチンまたは医薬品）の開発における使用のために、安全性を強化したＭＶＡの株が報告されている。たとえば、米国特許第６，７６１，８９３号、および、米国特許第６，１９３，７５２号を参照のこと。そのような株は、非ヒト細胞および細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において非常に良く増殖複製することができるが、公知のワクシニア株で複製が行われることが知られている、あるヒト細胞株においては、あまり増殖複製することはできない。そのような細胞株としては、ヒト角化細胞株であるＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０６（３）：  ７６１−７１  （１９８８））、ヒト子宮頸部腺癌細胞株である、ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、寄託番号は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ヒト胚腎細胞株である２９３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、アクセッション番号は、８５１２０６０２）、およびヒト骨肉腫細胞株である１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣに寄託されており、アクセッション番号は、９１１１２５０２）が挙げられる。そのような株はまた、たとえば、あるマウス系統（たとえば、重度の免疫不全状態にあり、ウイルス複製を良く受け入れる、トランスジェニックモデルのＡＧＲ．１２９等）においても、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖複製することができない。たとえば、米国特許第６，７６１，８９３号を参照のこと。そのようなＭＶＡ株の１つ、その派生物、および「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼称される組換え体が、報告されている。米国特許第６，７６１，８９３号、および米国特許第６，１９３，７５２号を参照のこと。
【０００６】
ＭＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮはそれぞれ、組換え遺伝子発現のためのウイルスベクターとしての使用のために遺伝子操作されており、または、組換えワクチンとしての使用のために遺伝子操作されている。Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：  １０３２−４０  （１９９４）；米国特許第６，７６１，８９３号；および、米国特許第６，１９３，７５２号を参照のこと。
【０００７】
癌免疫療法に対するある特定の方法には、癌関連抗原を用いてワクチン接種を行うことが含まれている。いくつかの例において、それら方法には、特定の癌関連抗原に対する宿主免疫応答を刺激するため、送達系を使用することが含まれる。それら送達系には組換えウイルスベクターが含まれ、それらの一部は、ワクシニアウイルス由来のものである。たとえば、Ｈａｒｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １１：８０４−８１７  （２００６）；  Ａｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３２：５４９−５５５  （２００５）；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１  （ｓｕｐｐｌ．  ２）：１４５６７−１４５７１  （２００４）、を参照のこと。たとえば、ＨＥＲ−２抗原を標的とする、能動免疫療法は、ＨＥＲ−２過剰発現乳癌の治療に対し試験が行われている。ＨＥＲ−２は、たとえば乳癌等、特殊な癌のタイプを有する一部の患者において、あるタイプの腫瘍細胞中で過剰発現されている腫瘍関連抗原である。様々なＨＥＲ−２ポリペプチドを用いた免疫化が、この抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起させるために用いられており、ＨＥＲ２タンパク質の改変形態を発現する、組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（すなわち、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２）ベクターを用いた免疫化も同様に用いられている。たとえば、Ｒｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：１５８８−１５９５  （２００３）；  Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  １０６：２３０９−２３１７  （２００６）；  Ｍａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６１（１）：１９−２９  （２０１２）を参照のこと。
【０００８】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた従前の研究によって、抗体および細胞性成分の両方を有する、それはＴＨ１に偏向した免疫応答を誘導することが示されている。たとえば、Ｍａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２を参照のこと。一部の研究者によって、液性および細胞性成分の両方を含む、バランスのとれた免疫応答が、感染性疾患での様々な病原体からの防御および病原体の排除に重要であることが示されている。たとえば、Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：５９９−６０６  （２００５）を参照のこと。癌においては、最新の定説では、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、抗腫瘍活性に対する初期エフェクターメカニズムであるとみなされている。しかしながら、本発明者らは、自然免疫応答および適応免疫応答の複数の攻撃手段の両方を含む、広範な腫瘍特異的免疫応答を高めることが、癌の予防および／または癌の治療に有益であると考えている。
【０００９】
いずれにしろ、本明細書に記述されるような、能動免疫療法および癌ワクチンを含む、さらなる癌治療のための、いまだ実質的には解決されていない医療上の必要性がはっきりと存在する。
【発明の概要】
【００１０】
１つの態様において、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を含有する組成物が本明細書において提供される。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ）である。ある特定の実施態様において、当該組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、当該組成物にはさらに、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体を含有する。
【００１１】
他の態様において、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を対象に投与し、それにより、抗原特異的免疫応答を誘導することを含む、ヒト対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法が本明細書において提供される。ある特定の実施態様において、当該異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、または、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原、および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質を共に投与することにより、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的な抗体の力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび、組換え体は、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される。ある特定の実施態様において、ヒト対象は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌からなる群から選択される。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。
【００１２】
他の態様において、（ａ）腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者を特定すること；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の治療有効量、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質の治療有効量を患者に投与し、それにより、当該癌を治療すること、を含む、ヒト癌患者を治療する方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、または、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原、および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質を共に投与することにより、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的な抗体の力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび、組換えタンパク質は、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される。ある特定の実施態様において、ヒト癌患者は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌からなる群から選択される。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。
【００１３】
他の態様において、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質；および、（ｃ）当該組換えＭＶＡの治療有効量および当該組換えタンパク質の治療有効量を、当該異種腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者に対して投与するための説明書、を含む、ヒト癌患者を治療するためのキットが、本明細書において提供される。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、または、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原、および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質を共に投与することにより、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗体の力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび、組換えタンパク質は、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される。ある特定の実施態様において、ヒト癌患者は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌からなる群から選択される。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。
【００１４】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記述において部分的に、説明され、および本記述から部分的に、明らかであり、または本発明の実施により理解されるであろう。本発明の目的および利点は、添付の請求項において特に挙げられている構成要素および組み合わせによって、理解され、および実現されるであろう。
【００１５】
前述の概説、および後述の詳述の両方が例示および解説のためのみであり、請求される、本発明の限定ではないことを理解されたい。
【００１６】
本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の１つの実施態様を図示するものであり、本記載と共に、本発明の主旨の説明のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２に記述される実験の結果を示す。図１Ａは、総抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧ抗体の力価、およびＩｇＧ２ａとＩｇＧ１アイソタイプの比率を示す。図１Ｂは、脾臓細胞における応答性Ｔ細胞の頻度（ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、および、ＴＨ１偏向（ＴＮＦα）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、またはＴＨ２偏向（ＩＬ−５）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特徴である、分泌型サイトカインの量（ＢＤ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  （ＣＢＡ）法により、上清で測定）を示す。
【図２】統計的に有意な抗腫瘍活性には、生ウイルスおよびＨＥＲ２タンパク質の両方の存在（ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２）、または、ＨＥＲ２導入遺伝子の発現（ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２）が必要であることを示す、実施例３に記述される実験の結果を示す。
【図３】ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた処置のみが、腫瘍におけるＨＥＲ−２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを示す、実施例３に記述される実験の結果を示す。図３はまた、ＨＥＲ−２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導には、ウイルスベクターからのＨＥＲ−２の発現が必要であることを示す。
【図４】アジュバントとしてＭＶＡ−ＢＮを使用して誘導された抗腫瘍有効性は、ＨＥＲ−２特異的抗体が介在していることを示す、実施例３に記述される実験の結果を示す。
【図５】ＨＥＲ−２特異的抗体の力価は、ＨＥＲ２タンパク質の添加で有意に増加したこと、および、アイソタイプＩｇＧ２ａの力価よりも、アイソタイプＩｇＧ１の力価が比例的に増加したことを示す、実施例４に記述される実験の結果を示す。
【図６】組換えＨＥＲ２タンパク質の添加により、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が増加した（ＨＥＲ２タンパク質およびＨＥＲ−２  ＥＣＤ  ＯＰＬ）が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は増加しなかった（ＨＥＲ−２  ｐ６３）ことを示す、実施例５に記述される実験の結果を示す。
【図７】乳癌に対するＴＵＢＯマウスモデルにおける、腫瘍体積に対する、組換えＨＥＲ２タンパク質の添加の有無での、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いたワクチン接種の効果を経時的に検証した、実施例６に記述される実験の結果を示す。
【図８】実施例６に記述される実験の結果を示す。図８Ａは、各群におけるそれぞれのマウスに対する、チャレンジ後３３日目、およびチャレンジ後３９日目における、腫瘍体積を示す。図８Ｂは、ボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡにより行われた、各群に対する統計解析の結果を示す。
【図９】実施例６に記述される実験の結果を示す。図９Ａは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による、ワクチン接種後に測定された様々な抗体価を示す。図９Ｂは、ワクチン接種後に測定されたＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比率を示す。
【図１０】実施例６に記述される実験の結果を示す。図１０Ａは、全長ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をカバーする、重複ペプチドライブラリ（ＯＰＬ）を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて活性な、ＨＥＲ２由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、ｐ６３を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１０Ｃは、破傷風毒素由来の２つのＴＨエピトープを組み込むように改変された、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である、１０４．１タンパク質を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。
【図１１】乳癌に対するＴＵＢＯマウスモデルにおける、腫瘍体積に対する、組換えＨＥＲ２タンパク質の添加の有無での、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いたワクチン接種の効果を経時的に検証した、実施例７に記述される実験の結果を示す。
【図１２】各群におけるそれぞれの全マウスに対する、チャレンジ後２９日目、およびチャレンジ後３３日目における、腫瘍体積を示す、実施例７に記述される実験の結果を示す。
【図１３】実施例７に記述される実験において検証された全ての群に対するカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図１４】ワクチン接種後、腫瘍実験の終了時での、ＥＬＩＳＡにより測定された様々な抗体価を示す、実施例７に記述される実験の結果を示す。
【図１５】乳癌に対するＴＵＢＯマウスモデルにおける、腫瘍体積に対する、組換えＨＥＲ２タンパク質の添加の有無での、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いたワクチン接種の効果を経時的に検証した、実施例８に記述される実験の結果を示す。
【図１６】ＥＬＩＳＡによりワクチン接種後に測定された、様々な抗体価、ならびに、ＩｇＧ２ａ価とＩｇＧ１価の比率を示す、実施例８に記述される実験の結果を示す。図１６Ａは、ワクチン接種後にＥＬＩＳＡにより測定された様々な抗体価を示す。図１６Ｂは、ワクチン接種後に測定されたＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比率を示す。
【図１７】実施例８に記述されるＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果を示す。図１７Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて活性な、ＨＥＲ２由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、ヒトｐ６３を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１７Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて活性な、ＨＥＲ２由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、ラットｐ６３を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１７Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて活性な、ＨＥＲ２由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、マウスｐ６３を用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１７Ｄは、全長ＨＥＲ２  ＥＣＤ  ＯＰＬをカバーする、ＯＰＬを用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。図１７Ｅは、全長前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をカバーするＯＰＬを用いた再刺激後のＴ細胞応答を示す。
【図１８】腫瘍チャレンジ後、２１／２２、２８／２９、３３／３４および３９／４０日目における、組換えＨＥＲ２タンパク質の添加の有無での、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いたワクチン接種の効果を示す、実施例６、７、および８に記述される実験の結果を組み合わせたものを示す。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、破傷風毒素由来の２つのＴＨ細胞エピトープを含む、ＨＥＲ２タンパク質細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１つの態様において、抗原特異的免疫応答の惹起における使用のための、または、癌治療のための、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質、を含有する組成物が本明細書において提供される。また、本明細書において、抗原特異的免疫応答の惹起における使用のための、または癌治療のための、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質と組み合わせて用いられる、非組み換えＭＶＡを含有する組成物も企図される。
【００２１】
核酸、ベクター、ポックスウイルス等に適用される場合、「組み換え体」という用語は、核酸配列の２以上の異種セグメントの人工的な組み合わせにより作製された核酸、ベクター、もしくはポックスウイルスを指し、または、核酸配列の２以上のそのような異種セグメントの人工的な組み合わせを含有する核酸、ベクターもしくはポックスウイルスを指す。人工的な組み合わせは、最も一般には、確立された遺伝子操作技術を用いて、単離された核酸セグメントの人工的な操作により行われる。タンパク質、ポリペプチド等に適用される場合、当該用語は、組換え核酸、ベクター、ポックスウイルス等から発現された（すなわち、転写および翻訳された）タンパク質またはポリペプチドを指す。たとえば、異種腫瘍関連抗原に対して適用された「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」という用語は、組換え核酸、ベクター、ポックスウイルス等から発現され、次いで、たとえばヒト癌患者等のヒト対象に投与するために精製された異種腫瘍関連抗原の組換えバージョンを指す。
【００２２】
組換えＭＶＡは、異種配列をＭＶＡウイルスへと挿入することにより作製される。ある特定の実施態様において、異種核酸配列は、ウイルスゲノムの非必須領域へと挿入される。ある特定の実施態様において、異種核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に記述される、自然発生したＭＶＡゲノムの欠損部位のうちの１つに挿入される。ポックスウイルスゲノムへの異種配列の挿入方法は、当分野の当業者に公知である。組換えタンパク質は、当該生物学的分野の当業者に公知の標準的な手順に従い、組換えＭＶＡまたは組換え発現ベクターで細胞を感染させることにより作製される。
【００２３】
ＭＶＡを含むワクシニアウイルスにおいて、ＴＫ領域に加え、たとえばＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片が、他の可能性のある有用な挿入領域として挙げられる。さらに、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域を、たとえばＨＥＲ２タンパク質等の外来性タンパク質のための挿入部位として用いることができる（たとえば、米国特許第７，９６４，３７４号（参照によりその全体で本明細書に援用される）を参照のこと）。
【００２４】
特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の要求に準拠し寄託された、本発明の実施に有用なＭＶＡウイルス系統の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍに、寄託番号ＥＣＡＣＣ  ９４０１２７０７で１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２であり、および、寄託番号ＥＣＡＣＣ  ００１２０７０７で２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５、寄託番号Ｖ０００８３００８で２０００年８月３０日に寄託された、ＭＶＡ−ＢＮ、およびその派生物がさらなる系統の例となる。
【００２５】
ＭＶＡ−ＢＮは、その高い安全性のために（複製能力が低いため）好ましいが、すべてのＭＶＡが、本明細書に記述される組成物および方法での使用に適している。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮおよびその派生物である。ＭＶＡ−ＢＮおよびその派生物の定義は、ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８（参照により本明細書にその全体が援用される）にある。
【００２６】
ある特定の実施態様において、１以上の外来性ＴＨエピトープを含有するために、腫瘍関連抗原が改変される。そのような癌免疫療法剤が、本明細書に非限定的な例で記述されており、「ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２」として呼称される。本明細書に記述されるように、そのような癌免疫療法剤（限定されないが、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を含む）は、癌の治療に有用である。本発明により、免疫不全状態にある患者を含む、ヒトおよび他の哺乳類の、抗原特異的免疫応答を惹起させ、癌を治療するための、プライム／ブーストワクチン接種療法における、そのような剤の使用が可能となる。ある特定の実施態様において、誘導される免疫応答には、たとえば、元より存在したＴＨ２環境におけるＴＨ１免疫応答等の、液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方が含まれる。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または改変ペプチド結合により互いに結合された２以上のアミノ酸のポリマーを指す。アミノ酸は天然型ならびに非天然型であってもよく、または、天然型アミノ酸の化学的類似体であっても良い。本明細書において、当該用語はまた、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含有する機能性生分子を指す。少なくとも２つのポリペプチドを含有する場合、ポリペプチドは、共有結合された、または非共有結合された、複合体を形成しても良い。タンパク質のペプチドおよびポリペプチドは、グリコシル化されていても良く、および／または、脂質付加されていてもよく、および／または、補欠分子群を含有してもよい。
【００２８】
ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、２０００年８月３０日にブダペスト条約に基づいてＥＣＡＣＣに寄託番号Ｖ０００８３００８で寄託され、米国特許第６，７６１，８９３号および米国特許第６，１９３，７５２号に記述される、ＭＶＡ−ＢＮである。
【００２９】
ワクシニアウイルスＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞上でワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株を５１６回継代培養することにより作製され、漿尿膜ウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ；Ａ．  Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，  ６−１４  （１９７５）を参照のこと）と呼称される。得られた弱毒化ＭＶＡのゲノムは、元のＣＶＡ株と比較して、ゲノムＤＮＡをおよそ３１キロベース対ほど欠損し、鳥類細胞に宿主細胞を強く限定されている（Ｈ．  Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２，  １０３１−１０３８  （１９９１））。得られたＭＶＡはかなり無毒化されていることが、様々な動物モデルにおいて示されている（Ａ．  Ｍａｙｒ  ＆  Ｋ．  Ｄａｎｎｅｒ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ４１：２２５−３４  （１９７８））。このＭＶＡ株は、天然痘に対する免疫のためのワクチンとして、ヒトにおいて臨床試験で試験されている（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｂｌ．  Ｂａｋｔ．  Ｈｙｇ．  Ｉ，  Ａｂｔ．  Ｏｒｇ．  Ｂ  １６７：３７５−３９０  （１９８７）；  Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｔｓｃｈ．  Ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９：２３８６−２３９２  （１９７４））。それらの試験には１２０，０００人を超える人々（高リスク患者を含む）が関与し、ワクシニアウイルスを基にしたワクチンと比較して、ＭＶＡは病原性または感染力が減弱しており、それでも良い特異的免疫応答を誘導したことが明らかとなっている。ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株よりも複製能力が低く、より高い安全性プロファイルを有しているため、好ましいが、ＭＶＡ−ＢＮおよびその派生物を含むすべてのＭＶＡが本発明に適している。
【００３０】
ＭＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮの両方が、無毒であるが、哺乳類細胞中において、それらのＤＮＡを効率的に複製することができる。その形質は、ニワトリ胚線維芽細胞での継代の間に発生する、少なくとも２５のさらなる変異および欠損のうちの、２つの重要な宿主範囲遺伝子から生じたものである（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：１０３１−１０３８  （１９９１）；  Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．  ２４４：３６５−３９６  （１９９８））。弱毒化Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（ＭＹＶＡＣ）および宿主範囲限定アビポックス（ＡＬＶＡＣ）とは対照的に、ＭＶＡにおける早期転写および後期転写の両方が損なわれておらず、ウイルスの生活環を通じて、連続的な遺伝子発現が可能である（Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０８４７−１０８５１  （１９９２））。さらに、ＭＶＡは、ポックスウイルス免疫が先在する状態下で、用いることができる（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：７６５１−７６５５  （２０００））。
【００３１】
ＭＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮは、原型となるＣＶＡと比較して、およそ１５％のゲノム（６つの領域からの３１ｋｂ）を欠損している。この欠損により、多くの毒性および宿主範囲の遺伝子、ならびに、Ａ型封入体に対する遺伝子が影響を受ける。ＭＶＡ−ＢＮはヒト細胞に付着し、侵入することができ、そこで、ウイルスによりコードされた遺伝子が非常に効率的に発現される。しかしながら、子孫細胞のアセンブリおよび放出は起きない。ＭＶＡ−ＢＮは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に高く適合されており、ヒト細胞において複製しない。ヒト細胞においては、ウイルス遺伝子は発現されるが、感染性のウイルスは産生されない。弱毒化および毒性の低下にも関わらず、前臨床試験において、ＭＶＡ−ＢＮは、ワクシニアおよび、ＭＶＡゲノムへとクローニングされた遺伝子によりコードされた異種遺伝子産物に対し、液性免疫応答等および細胞性免疫応答の両方を惹起することが示されている（Ｅ．  Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ａｎｔｉｖｉｒ．  Ｔｈｅｒ．  １０（２）：２８５−３００；  Ａ．  Ｃｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３），  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２（１）：２１−９；  Ｍ．  ＤｉＮｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３），  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １４（１４）：１３４７−１３６０；  Ｍ．  ＤｉＮｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １０（１６）：５３８１−５３９０）。
【００３２】
ある特定の実施態様において、弱毒化ワクシニアウイルス株は、免疫不全状態の動物（たとえば、ＳＩＶに感染したサル（ＣＤ４＜４００／μｌの血液）、または、免疫不全状態のヒト）における免疫応答の誘導に有用である。「免疫不全状態」という用語は、個々の免疫システムが不完全な免疫応答しか示さない状態、または、感染体に対する防御において、性能が落ちた状態を表す。
【００３３】
ウイルスの増幅複製は通常、増幅率により表される。「増幅率」という用語は、最初の場面で細胞に感染させるために用いられた元々の量（インプット）に対する、感染細胞から産生されたウイルス（アウトプット）の比率を指す。増幅率が「１」とは、感染細胞から産生されるウイルスの量が、細胞を感染させるために用いられた当初量と同じである増幅状態であり、感染細胞はウイルス感染および複製に対し許容的であることを意味する。増幅率が１未満である場合、感染細胞は、最初の場面で細胞を感染させるために用いられた量よりも少ない量のウイルスを産生することを意味し、ウイルスは、ウイルス弱毒化の基準である、増幅複製の能力を失っていることを示唆する。
【００３４】
ゆえに「増幅複製ができない」という用語は、ＭＶＡまたはＭＶＡ派生物が、ヒト細胞株（たとえば、ヒト胎児腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３、寄託番号８５１２０６０２にてＥＣＡＣＣに寄託されている）、ヒト骨肉腫細胞株である１４３Ｂ（１４３Ｂ、ＥＣＡＣＣに寄託されており、アクセッション番号は、９１１１２５０２）、ヒト子宮頸部腺癌細胞株である、ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、寄託番号は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、およびヒト角化細胞株であるＨａＣａｔ（ＨａＣａｔ、Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０６（３）：７６１−７１  （１９８８））等）の１以上において、１未満の増幅率を有するということを意味する。
【００３５】
米国特許第６，７６１，８９３号、米国特許第６，１９３，７５２号、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０１３６２８に記述されるように、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔにおいて増幅複製を行わない。たとえば、１つの例示的な実験において、ＭＶＡ−ＢＮは、ＨＥＫ２９３細胞において、０．０５〜０．２の増幅率を示し、１４３Ｂにおいて、０．０〜０．６の増幅率を示し、ＨｅＬａ細胞において、０．０４〜０．８の増幅率を示し、ＨａＣａｔ細胞において、０．０２〜０．８の増幅率を示し、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＶ１細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの寄託番号はＣＣＬ−７０）において、０．０１〜０．０６の増幅率を示した。ゆえに、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔのいずれにおいても、または、アフリカミドリサル腎細胞株ＣＶ．１において、増幅複製を行わない。対照的に、ＭＶＡ−ＢＮの増幅率は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代培養、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３２にて、ＡＴＣＣに寄託されている）においては１を超えている（米国特許第６，７６１，８９３号、米国特許第６，１９３，７５２号、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０１３６２８に記述される）。それゆえ、ＭＶＡ−ＢＮは、ＣＥＦ初代培養（増幅率は５００を超える）およびＢＨＫ細胞（増幅率は５０を超える）において、容易に増殖拡大させることができる。
【００３６】
上述のように、すべてのＭＶＡ（ＭＶＡ−ＢＮおよびその派生物を含む）が本発明に適している。「派生物」という用語は、２０００年８月３０日に寄託番号Ｖ０００８００３８でＥＣＡＣＣに寄託された株と基本的に同じ複製の特性を示すが、そのゲノムの１以上の部分が異なるウイルスを指す。寄託ウイルスと同じ「複製の特性」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔの寄託株を用いて類似した増幅率で複製し、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏで類似した複製の特性を示す（たとえば、ＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデルで測定される）、ウイルスである。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮの派生物である。そのような「派生物」には、寄託株（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｖ０００８００３８）と本質的に同じ複製の特性を示すが、そのゲノムの１以上の部分が異なるウイルスが含まれる。
【００３７】
ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ワクシニアウイルスに対して異種である、追加のヌクレオチド配列を含有する組換えワクシニアウイルスである。ある特定の実施態様において、異種ヌクレオチド配列は、免疫システムによる応答を誘導するエピトープをコードする。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、エピトープを含有するタンパク質または剤に対するワクチン化を行うために用いられる。
【００３８】
例示的な腫瘍関連抗原
ある特定の実施態様において、免疫応答は、細胞関連ポリペプチド抗原に対し、対象において発生する。ある特定の実施態様において、細胞関連ポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原である。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは少なくとも１つの腫瘍関連抗原を含有する。
【００３９】
多くの腫瘍関連抗原が当分野に公知である。例示的な腫瘍関連抗原としては、限定されないが、５−α−還元酵素、α−フェトプロテイン、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３  ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｏｘ−２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシル転移酵素、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−ファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎｓｅ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−ファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰｓ、ムチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポイエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸ−ファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、サイモシン−ベータ−１５、ＴＮＦα、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが挙げられる。
【００４０】
１つの例示的な腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２である。ＨＥＲ−２は、現在のところｃ−ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦｒ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２、ｃ−Ｎｅｕ）、ｃ−ｅｒｂＢ−３、および、ｃ−ｅｒｂＢ−４の４つの異なる受容体からなる、上皮細胞増殖因子受容体ファミリー（ｃ−ｅｒｂＢ）の一員である（Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １９：１８３−２３２  （１９９５））。ｃ−ｅｒｂＢ−３および、ｃ−ｅｒｂＢ−４は、ＥＧＦｒおよびＨＥＲ−２よりはあまり機能解析がなされていない。ＨＥＲ−２は、内在性膜糖タンパク質である。その成熟タンパク質は、ＥＧＦｒ受容体と極めて良く似た構造的特性を有し、分子量は１８５ｋＤである（Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．  ４（１）：１−２４  （１９９２））。ＥＧＦｒもまた、１つのサブユニットからなる内在性膜受容体である。見かけ上、１７０ｋＤの分子量を有し、６２１アミノ酸の表面リガンド結合ドメイン、２３アミノ酸の１つの疎水性膜貫通ドメイン、および５４２アミノ酸の高度に保存された細胞質チロシンキナーゼドメインからなる。当該タンパク質は、Ｎ−グリコシル化されている（Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３（１２）：２８３１−２８４１  （１９９４））。
【００４１】
このファミリーのすべてのタンパク質はチロシンキナーゼである。受容体リガンドで相互作用により、受容体の二量体化がもたらされ、それにより、チロシンキナーゼの触媒活性が増加する。ファミリー内のタンパク質は、ホモ二量体化、およびヘテロ二量体化することができ、このことは、その活性にとって重要である。ＥＧＦｒは、増殖促進効果を伝達し、細胞によるグルコースとアミノ酸の取り込みを刺激する（Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。ＨＥＲ−２もまた、増殖促進シグナルを伝達する。
【００４２】
上皮細胞増殖因子受容体は、正常組織に低量で発現するが、多くのタイプの癌で過剰発現する。ＥＧＦｒは、乳癌（Ｃｈｒｙｓｏｇｅｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ３１（２−３）：２２７−２３６  （１９９４））、膠芽細胞腫（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．  ２２（３）：２０１−２０７  （１９９４））、胃癌（Ｔｏｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ７５（６  Ｓｕｐｐｌ．）：１４７２−１４７７  （１９９５））、卵巣癌（ｖａｎ  Ｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ４７（１０）：９１４−９１９  （１９９４））等で過剰発現する。ＨＥＲ−２もまた、いくつかの正常ヒト組織において低量で発現され、最も特徴的なのは、分泌上皮である。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌、胃癌、膵癌、膀胱癌および卵巣癌の約３０％で発生する。
【００４３】
これらの受容体の発現は、腫瘍の分化度、および癌のタイプにより変化し、たとえば、乳癌では、原発腫瘍が両方の受容体を過剰発現するが、胃癌においては、過剰発現は転移性腫瘍において後期に発生する（Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。癌細胞上で過剰発現される受容体の数は、いくつかの頭頸部癌、ならびに患者から単離された外陰部癌、乳癌および卵巣癌の株に対しては１０６／細胞を超える（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：２５４５−２５５０  （１９９４））。
【００４４】
ＥＧＦｒ受容体ファミリーのメンバーが腫瘍免疫療法の適切な標的となる理由にはいくつかある。第一に、それらは多くのタイプの癌において過剰発現されており、腫瘍に対し、直接、免疫応答を向かわせ、様々な患者の治療に有用な免疫療法となりうる。第二に、腫瘍は多くの場合、このファミリーの受容体に対するリガンドを発現、または過剰発現し、当該リガンドが介在する増殖効果に対して感受性が高い。第三に、増殖因子受容体を過剰発現する腫瘍を有する患者は、多くの場合、予後が悪い。過剰発現は、特に乳癌、肺癌および膀胱癌において、予後の悪さと密接に関係しており、従来的な療法に対しては感受性が低い、侵襲的／転移性の表現型と関連する可能性がある（Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６（６）：４１３−４２８  （１９９４））。
【００４５】
改変腫瘍関連抗原
ある特定の実施態様において、細胞関連ポリペプチド抗原は、細胞表面上にポリペプチド抗原由来のエピトープを提示している細胞（すなわち、抗原提示細胞（ＡＰＣ））が、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩ分子に伴って提示される場合に、ＣＴＬが誘導されるように改変されている。ある特定の実施態様において、少なくとも１つの第一の外来性ＴＨエピトープが、提示された際、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する。ある特定の実施態様において、細胞関連抗原は、腫瘍関連抗原である。
【００４６】
エピトープを提示することができる例示的なＡＰＣとしては、樹状細胞およびマクロファージが挙げられる。さらなるＡＰＣの例としては、ピノサイトーシスＡＰＣまたはファゴサイトーシスＡＰＣが挙げられ、それらは、１）ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＣＴＬエピトープ、および２）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＴＨエピトープを同時に提示することができる。
【００４７】
ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２に対する改変は、対象への投与の後、ＨＥＲ−２と主に反応するポリクローナル抗体が惹起されるように行われる。そのような抗体は腫瘍細胞を攻撃および排除することができ、ならびに、転移性細胞が転移しないようにすることができる。この抗腫瘍効果のエフェクターメカニズムは、補体依存性および抗体依存性の細胞障害活性を介して調節される。さらに、誘導された抗体はまた、増殖因子依存性受容体のオリゴ二量体化および内在化を阻害することにより、癌細胞の増殖を阻害する。ある特定の実施態様において、そのような改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原は、腫瘍細胞により提示される公知のＨＥＲ−２エピトープおよび／または予測ＨＥＲ−２エピトープに対するＣＴＬ応答を誘導することができる。
【００４８】
ある特定の実施態様において、改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原は、細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープおよび変異型を含有し、ここで、当該変異は、外来性ＴＨエピトープの少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含有する。そのような、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含有する、ある特定の改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原、および、外来性ＴＨエピトープの少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含有する変異型、ならびに、それらを製造する方法は、米国特許第７，００５，４９８号および米国特許出願公開２００４／０１４１９５８号および２００６／０００８４６５に記述されている。
【００４９】
ある特定の実施態様において、外来性ＴＨエピトープは、天然型の「無差別」Ｔ細胞エピトープである。そのような無差別Ｔ細胞エピトープは、動物種または動物群の大部分の個体において活性である。ある特定の実施態様において、ワクチンは、そのような無差別Ｔ細胞エピトープを含有する。そのようなある特定の実施態様において、無差別Ｔ細胞エピトープを使用することにより、同じワクチン中に非常に多くの異なるＣＴＬエピトープを要する必要性が減少する。例示的な無差別Ｔ細胞エピトープとしては、限定されないが、破傷風毒素（限定されないが、Ｐ２およびＰ３０エピトープを含む）、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、および、Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＣＳ抗原由来のエピトープが挙げられる。
【００５０】
さらなる無差別Ｔ細胞エピトープとしては、異なるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子によりコードされるＨＬＡ−ＤＲ分子の大部分に結合することができるペプチドが挙げられる。たとえば、ＷＯ９８／２３６３５；  Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ  ｅｔ．  ａｌ．，  （１９９８），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：３３６３−３３７３；  Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：７７８−７８０；  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．  ４１（４）：１７８−２２８；  Ｃｈｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８：２７−４７；  Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７４：１９７−２０３；および、Ｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．  ３９：２３０−２４２を参照のこと。後者の参照文献はまた、ＨＬＡ−ＤＱおよびＤＰリガンドについても記述している。これらの参照文献に列挙される全てのエピトープが、本明細書に記述される天然エピトープの候補として適切であり、共通のモチーフをこれらと共有するエピトープである。
【００５１】
ある特定の実施態様において、無差別Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡハプロタイプの大部分に結合することができる、人工的なＴ細胞エピトープである。ある特定の実施態様において、人工的なＴ細胞エピトープは、汎ＤＲエピトープペプチド（ＰＡＤＲＥ）である（ＷＯ９５／０７７０７に記述される）。また、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−７６１、を参照のこと。
【００５２】
改変ＨＥＲ２ポリペプチド抗原
様々な改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原および、それらを製造する方法が、米国特許第７，００５，４９８号、米国特許公開２００４／０１４１９５８および米国特許公開２００６／０００８４６５に記述されており、それらはすべて、参照によりその全体で本明細書に援用される。これらの文献は、ＨＥＲ−２ポリペプチドの異なる位置で１以上の無差別Ｔ細胞エピトープを含有する、様々な改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原を記述している。
【００５３】
ヒトＨＥＲ−２配列は、もっぱらタンパク質の一次構造に基づき、多くのドメインに分けられることができる。それらのドメインは以下である。細胞外（受容体）ドメインは、アミノ酸１〜６５４にわたり、以下のいくつかのサブドメインを含有する：ドメインＩ（成熟型ポリペプチドのＮ末端ドメイン）はアミノ酸１〜１７３にわたる；ドメインＩＩ（システインリッチドメイン、２４システイン残基）はアミノ酸１７４〜３２３にわたる；ドメインＩＩＩ（同種ＥＧＦ受容体中のリガンド結合ドメイン）はアミノ酸３２４〜４８３にわたる；および、ドメインＩＶ（システインリッチドメイン、２０のシステイン残基）はアミノ酸４８４〜６２３にわたる。膜貫通残基はアミノ酸６５４〜６７５にわたる。細胞内（キナーゼ）ドメインは、アミノ酸６５５〜１２３５にわたり、アミノ酸６５５〜１０１０にわたるチロシンキナーゼドメイン（コアＴＫドメインは７２５〜９９２にわたる）、およびアミノ酸１０１１〜１２３５にわたるＣ末端ドメインを含有する。
【００５４】
Ｐ２ヒトＴヘルパーエピトープまたはＰ３０ヒトＴヘルパーエピトープのいずれかにより置換される、ＨＥＲ−２のアミノ酸配列中の選択部位は、米国特許第７，００５，４９８号、米国特許公開２００４／０１４１９５８および米国特許公開２００６／０００８４６５に記述されている。要約すると、以下のパラメーターが考慮された：１．既知のＣＴＬエピトープおよび予測ＣＴＬエピトープ；２．関連受容体（特にＥＧＦＲ）に対する相同性；３．システイン残基の保存状態；４．予測ループ、αヘリックスおよびβシート構造；５．潜在的なＮグリコシル化部位；６．露出アミノ酸残基および埋没アミノ酸残基の予測；および７．タンパク質のドメイン構造。
【００５５】
ＣＴＬエピトープは、ドメインＩ、ドメインＩＩＩ、ＴＭドメインおよび、ＴＫドメイン中の２または３の「ホットスポット」にクラスター化されると考えられる。米国特許第７，００５，４９８号、米国特許公開２００４／０１４１９５８および米国特許公開２００６／０００８４６５に記述されるように、これらは高度に保存されているはずである。
【００５６】
他の受容体と高度な相同性を有する領域は、ＨＥＲ−２の「全体的な」三次元構造、ゆえに、抗体の認識にとって構造的に重要である可能性があり、一方で、低い相同性でありそうな領域は、結果として、構造の局所的な変化のみで交換することができる。システイン残基は多くの場合、分子内ジスルフィド結合の形成に関与しており、ゆえに、三次元構造に関与しており、変更することはできない。αヘリックスまたはβシート構造を形成すると予測される領域は、タンパク質のフォールディングに関与していると想定されるため、外来性エピトープの挿入ポイントとしては避けなければならない。
【００５７】
潜在的なＮグリコシル化部位は、タンパク質のマンノシル化が望ましい場合には、保存されなければならない。（その疎水性の特性により）分子の内部にあると予測される領域は、フォールディングに関与する可能性があることから、好ましくは保存されるべきである。対照的に、溶媒露出領域は、モデルＴＨエピトープＰ２およびＰ３０の挿入部位の候補となりうる。最後に、タンパク質の構造および機能に対する関連性から、タンパク質のドメイン機構が考慮に入れられるべきである。
【００５８】
米国特許第７，００５，４９８号、米国特許公開２００４／０１４１９５８および米国特許公開２００６／０００８４６５に記述されるように、戦略の焦点は、可能な限り、中和抗体の標的として関連性のあるタンパク質の部分である、ＨＥＲ−２の細胞外部分の構造を保存することである。対照的に、癌細胞表面上のＨＥＲ−２に結合した天然型の膜の細胞内の部分は、液性免疫システムにとってアクセスできない部分である。
【００５９】
ＨＥＲ−２の様々なドメインに挿入された、破傷風毒素のＰ２およびＰ３０エピトープを用いた様々な例示的な構築物は、米国特許第７，００５，４９８号、米国特許公開２００４／０１４１９５８および米国特許公開２００６／０００８４６５に提供されている。改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原の１つの例は、「ｍＨＥＲ２」と呼ばれ、細胞外ドメインと９アミノ酸の膜貫通ドメイン；改変ＨＥＲ−２ポリペプチドのアミノ酸残基２７３〜２８７の間、ドメインＩＩに挿入されたＰ２エピトープ；および、改変ＨＥＲ−２ポリペプチドのアミノ酸残基６５５〜６７５の間、ドメインＩＶに挿入されたＰ３０エピトープ、を含有する。配列番号２は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、ｍＨＥＲ２をコードするヌクレオチド配列を開示する。
【００６０】
組換えＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２
ある特定の実施態様において、腫瘍関連抗原を含有する組換えＭＶＡ（たとえば、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２）は、以下のように構築されている。最初のウイルスのストックは、複製に許容的な細胞型（たとえば、ＣＥＦ細胞）を用いた細胞培養における組換えにより作製される。細胞は、弱毒化ワクシニアウイルス（たとえば、ＭＶＡ−ＢＮ）を接種され、腫瘍関連抗原（たとえば、ｍＨＥＲ２）配列および、ウイルスゲノムの隣接領域をコードする組換えプラスミド（たとえば、ｐＢＮ１４６）をトランスフェクトされる。ある特定の実施態様において、プラスミドｐＢＮ１４６は、ＭＶＡ−ＢＮにもまた存在する配列（たとえば、１４Ｌおよび１５Ｌオープンリーディングフレーム）を含有する。ｍＨＥＲ２配列は、ＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムへの組換えが可能となるように、ＭＶＡ−ＢＮ配列の間に挿入される。ある特定の実施態様において、プラスミドは、ＣＥＦ細胞における組換え構築物の選択が可能となるような、１以上の選択遺伝子を含有する選択カセットもまた含有する。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、配列番号１のポリペプチドをコードする、配列番号２のヌクレオチド配列を含有するＨＥＲ−２抗原を含有する。
【００６１】
培養物の感染とトランスフェクションを同時に行うことにより、ウイルスゲノムと組換えプラスミドの間に相同組み換えの発生が可能となる。次いで、挿入物を担持するウイルスを単離し、特性を解析し、そしてウイルスのストックを調製する。ある特定の実施態様において、ウイルスは、選択遺伝子（ｇｐｔおよびＥＧＦＲ）をコードする領域が欠損するように、選択を行わずに、ＣＥＦ細胞培養中で継代される。
【００６２】
野生型ＨＥＲ−２または改変ＨＥＲ−２をコードする核酸は、発現制御配列に操作可能に連結されていても良い。コード配列に連結された発現制御配列は、当該発現制御配列と合致する条件下でコード配列の発現が行われるように、結合される。発現制御配列としては、限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの始まりにある開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル、および、フレーム内の終止コドンが挙げられる。適切なプロモーターとしては、限定されないが、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ中間早期Ｉプロモーター、および、限定されないが、以下のワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来のプロモーターを含む様々なポックスウイルスプロモーターが挙げられる：３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、４０Ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、およびＰｒＬＥ１プロモーター。
【００６３】
さらなる発現制御配列としては、限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよび、所望される宿主系中で、所望される組換えタンパク質（たとえば、ＨＥＲ−２）をコードする核酸配列の適切な転写および、それに引き続く翻訳に必要な任意の他の配列が挙げられる。また、ポックスウイルスベクターは、所望される宿主系中で、核酸配列を含有する発現ベクターの移送および、それに引き続く複製に必要な、さらなる必須要素を含有しても良い。さらに、そのようなベクターは、標準的な方法を用いて容易に構築され（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  ｉｎ  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）、および市販されていることが、当業者には理解されるであろう。
【００６４】
組成物
１つの態様において、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡ、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を含有する組成物が本明細書において提供される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ５７２である。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ５７５である。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ−Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ）である。また、本明細書において、抗原特異的免疫応答の惹起に用いるための、または癌を治療するための、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質と組み合わせて用いられる、非組み換えＭＶＡを含有する組成物も企図される。
【００６５】
ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦｒ）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２、またはｃ−Ｎｅｕ）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原およびｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、腫瘍関連抗原は、本質的にＨＥＲ−２抗原からなる。ある特定の実施態様において、腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原からなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００６６】
ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１以上の異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１つの異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、２つの異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、１以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、１つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、２つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、２つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００６７】
ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００６８】
ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦｒ）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２、またはｃ−Ｎｅｕ）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原およびｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質は、本質的に、ＨＥＲ−２抗原からなる。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質は、ＨＥＲ−２抗原からなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００６９】
ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は１以上の異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は１つの異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は２つの異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープを含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、１以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、１つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、２つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、１つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、２つの異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種ＴＨ細胞エピトープからなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００７０】
ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、本質的に、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施態様において、組成物の投与により、異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡのみを含有する組成物の投与と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【００７１】
ある特定の実施態様において、組成物は、１以上の薬学的に受容可能な、および／もしくは、承認された、担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈物質、ならびに／または、安定化剤を含有する医薬組成物である。そのような添加剤としては、たとえば、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝物質が挙げられる。例示的な担体は、通常、たとえばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体等の、大きく、ゆっくりと代謝される分子である。
【００７２】
薬学的に受容可能な担体の使用は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）において、本明細書に記述される組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質の薬学的送達に適した組成物および処方が記述されている。
【００７３】
概して、担体の性質は、用いられる投与の特定の様式に依存する。たとえば、非経口の処方の場合には通常、たとえばビヒクルとして水、生理学的食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的に、および生理学的に受容可能な液体を含む、注射可能な液体を含有する。固形の組成物（たとえば、粉末、錠剤、タブレット、またはカプセルの形態）については、従来的な非毒性の固形担体は、たとえば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウム等を含んでも良い。生物学的に中性な担体に加え、投与される医薬組成物は、少量の非毒性の補助物質（たとえば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、および、たとえば酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステル等のｐＨ緩衝剤等）を含有しても良い。
【００７４】
たとえば、ＨＥＲ−２等の組換え腫瘍関連抗原、および、たとえばＨＥＲ−２等の腫瘍関連抗原をコードする組換えＭＶＡは、局所または全身投与のいずれかを含む、当業者公知の任意の手段により投与されても良く（たとえば、Ｂａｎｇａ，  Ａ．，  “Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ，  １９９５を参照のこと）、たとえば、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、ならびに経口投与、経鼻投与、経皮投与、経肛門投与が企図される。ある特定の実施態様において、投与は、皮下注射または筋肉内注射によるものである。ペプチドまたはタンパク質が応答刺激に利用される時間を延長させるために、当該ペプチドまたはタンパク質は、埋め込み、油性注射、または粒子状の系として導入されてもよい。粒子系は微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフィア、ナノカプセル、または類似の粒子であってもよい（たとえば、Ｂａｎｇａ  １９９５を参照のこと）。合成ポリマーをもとにした粒子状担体は、免疫応答を増強するアジュバントとして作用し、さらに、放出制御をもたらすことがしめされている。アルミニウム塩もまた、免疫応答をもたらすアジュバントとして用いられても良い。
【００７５】
腫瘍関連抗原（たとえば、ＨＥＲ−２）をコードする組換えＭＶＡ、および、たとえばＨＥＲ−２等の組換え腫瘍関連抗原を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。当該組成物を用いて、たとえば免疫療法等のための免疫応答が誘導される。ある特定の実施態様において、組換え腫瘍関連抗原は、安定化界面活性剤、ミセル形成剤、および油のうちの２以上を含有するアジュバントと混合される。適切な安定化界面活性剤、ミセル形成剤および油は、米国特許第５，５８５，１０３号、米国特許第５，７０９，８６０号、米国特許第５，２７０，２０２号および、米国特許第５，６９５，７７０号に記述されている（それらすべては、参照によりその全体で本明細書に援用される）。安定化界面活性剤は、乳濁液の成分が、安定な乳濁液として留まるようにする、任意の界面活性剤である。そのような界面活性剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標））（ソルビタン−モノ−９−オクタデセノエート−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）；ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥにより製造）、ＴＷＥＥＮ４０（登録商標）、ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）、ＴＷＥＥＮ６０（登録商標）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１２、ＴＥＥＰＯＬ  ＨＢ７（登録商標）、およびＳＰＡＮ８５（登録商標）が挙げられる。これらの界面活性剤は、通常、およそ０．０５〜０．５％（ｖ／ｖ）（たとえば、約０．２％（ｖ／ｖ））の量で供給される。ミセル形成剤は、ミセル様の構造が形成されるよう、他の成分と形成された乳濁液を安定化することができる剤である。そのような剤は通常、細胞性応答を増強するマクロファージを動員するために、注射部位でいくらかの炎症を引き起こす。そのような剤の例としては、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに記述されており、たとえば、Ｓｃｈｍｏｌｋａ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｏｉｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ５４：１１０，  １９７７、および、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２９：１２４４，  １９８１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ６２ＬＦ、Ｌ１０１、および、Ｌ６４、ＰＥＧ１０００、ならびに、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）１５０１、１５０Ｒ１、７０１、９０１、１３０１、および１３０Ｒ１が挙げられる。そのような剤の化学的構造は当分野に公知である。ある特定の実施態様において、剤は、Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １３３：３１６７，  １９８４により定義される、０〜２の間の親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有するよう選択される。剤は、たとえば０．５〜１０％（ｖ／ｖ）の有効量で、または１．２５〜５％（ｖ／ｖ）の量で供給されてもよい。
【００７６】
組成物に含まれる油は、たとえば、所望される抗原のためのビヒクルを供給するために、水中油乳濁液中の抗原の保持が促進されるよう選択され、好ましくは、乳濁液が室温（約２０℃〜２５℃）のいずれかで形成されるよう、または、乳濁液の温度が室温より下回った時点で乳濁液が形成されるよう、６５℃未満の融点を有する。そのような油の例としては、スクワラン、Ｓｑｕａｌａｎｅ、ＥＩＣＯＳＡＮＥ（登録商標）、テトラテトラコンタン、グリセロール、およびピーナッツ油、または他の植物油が挙げられる。ある特定の実施態様において、油は、１〜１０％（ｖ／ｖ）、または２．５〜５％（ｖ／ｖ）の間の量で供給される。当該油は、身体が当該油を経時的に分解することができ、当該油の使用で副作用（たとえば、肉芽腫等）が現れないよう、生分解性および生体適合性の両方があるものでなければならない。
【００７７】
ある特定の実施態様において、アジュバントは、安定化界面活性剤、ミセル形成剤、および、ＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）の名称で市販されている油の混合物である。アジュバントはまた、免疫刺激性の核酸（たとえば、ＣｐＧモチーフを含有する核酸等）、または生物学的なアジュバント（上述を参照）であっても良い。
【００７８】
放出制御された非経口製剤は、埋め込み、油性注射、または粒子状の系として作製されても良い。タンパク質送達系の概説としては、Ｂａｎｇａ，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ，  １９９５を参照のこと。粒子系としては、マイクロスフィア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフィアおよびナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは、中心コアとして治療用タンパク質を含有する。マイクロスフィアにおいては、治療剤は、粒子全体に分散されている。約１μｍよりも小さい粒子、マイクロスフィア、およびマイクロカプセルは通常、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフィア、およびナノカプセルと呼称される。毛管は、ナノ粒子のみが静脈内投与されるよう、およそ５μｍの直径を有している。微粒子は一般的に、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される（Ｋｒｅｕｔｅｒ，  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．  Ｋｒｅｕｔｅｒ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ２１９−３４２，  １９９４；  Ｔｉｃｅ  ＆  Ｔａｂｉｂｉ，  Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ａ．  Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ３１５−３３９，  １９９２を参照のこと）。
【００７９】
ポリマーは、イオン制御放出に用いることができる。薬物送達制御における使用のための、様々な分解性、および非分解性のポリマー物質が、当分野に公知である（Ｌａｎｇｅｒ，  Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２６：５３７，  １９９３）。たとえば、ブロックコポリマーである、ポロクサマー４０７は、低温では粘性で可動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。組換えインターロイキン２およびウレアーゼの処方および徐放のための効果的なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：４２５，  １９９２；  ａｎｄ  Ｐｅｃ，  Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  ４４（２）：５８，  １９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の放出制御のためのマイクロ担体として用いられている（Ｉｊｎｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １１２：２１５，  １９９４）。さらに他の態様において、リポソームが、放出制御、ならびに、脂質内包化された薬物の薬物標的化のために用いられている（Ｂｅｔａｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ，  １９９３）。治療用タンパク質の送達制御のための多くのさらなるシステムが公知であり；任意の技術的に適切な製剤の使用が、本明細書において予期され、および、当分野公知の通常技術のレベルの範囲内である（たとえば、米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；および、米国特許第  ５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号；および、米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
【００８０】
ある特定の実施態様において、静脈内投与のための医薬組成物は、たとえばＨＥＲ−２等の組換え腫瘍関連抗原を約０．１μｇ〜１０ｍｇ／患者／日で含有する。特に、当該剤が隔離された部位に投与され、循環システムまたはリンパシステム内に入らない場合（たとえば、体腔または器官内腔に入らない場合）には、０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ／患者／日までの投与量が用いられてもよい。実際の投与可能な組成物の調製方法は、当業者に公知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １９ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  １９９５のような文献に詳述されている。
【００８１】
ワクチンの調製に関しては、ＭＶＡは、生理学的に受容可能な形態へと転換されてもよい。ある特定の実施態様において、そのような調製は、たとえば、Ｓｔｉｃｋｌ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２  （１９７４）に記述されるような、天然痘に対するワクチンに用いられた、ポックスウイルスワクチンの調製の知識に基づいている。
【００８２】
腫瘍関連抗原を発現する組換えＭＶＡの例示的な調製法は以下である。精製ウイルスは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、−８０℃に保存する。ワクチン注射の調製に関しては、たとえば、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、１０２〜１０８のウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に凍結乾燥させても良い。あるいは、ワクチン注射は、製剤中のウイルスの凍結乾燥を段階的に行うことで調製してもよい。ある特定の実施態様において、製剤は、たとえばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン、または他の添加剤（たとえば、限定されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適した抗酸化剤、不活化ガス、安定化剤または組換えタンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン））等の追加の賦形剤を含有する。次いで、アンプルを密封し、適切な温度（たとえば、４℃〜室温）で数か月の間、保存しても良い。しかしながら、必要がなければ、アンプルは、好ましくは、−２０℃以下の温度で保存する。
【００８３】
ワクチンまたは治療を含む、ある特定の実施態様において、凍結乾燥物は、０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理学的食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液で溶解され、全身または局所のいずれかで投与される（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の他の任意の投与経路により）。投与様式、投与量、および投与回数の最適化は、当業者公知の範囲内にある。
【００８４】
組成物の単回投与または複数回投与が、必要とされる投与量および頻度、ならびに対象の耐容に依存して行われてもよい。ある特定の実施態様において、用量は、ボーラスとして１度で投与される。ある特定の実施態様において、用量は、所望される治療結果が得られるまで、定期的に投与されてもよい。通常、投与量は、対象に受容不可能な毒性が発現することなく、疾患の症状もしくは兆候が治療または改善されるのに十分な量である。
【００８５】
免疫応答を惹起させる方法
他の態様において、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を含有する任意の組成物を対象に投与し、それにより、抗原特異的免疫応答を惹起させること、を含む、対象において抗原特異的免疫応答を惹起させる方法が本明細書において提供される。当該組成物は、本明細書に開示される任意の腫瘍関連ポリペプチドを発現するＭＶＡ、および本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質、を含有する。また、本明細書において、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質と組み合わせて用いられる、非組み換えＭＶＡを含有する組成物が企図される。
【００８６】
ある特定の実施態様において、対象において抗原特異的免疫応答を惹起させる方法は、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を対象に投与し、それにより、抗原特異的免疫応答を惹起させること、を含む。ある特定の実施態様において、当該異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、当該異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質を共に投与することにより、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が改善され（ＥＬＩＳＰＯＴにより測定）、または、抗原特異的抗体価が上昇する（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換え体は、本明細書に開示される様々な薬学的に受容可能な希釈剤、緩衝剤、賦形剤、または担体のうちの任意の１つ以上と共に製剤化される。ある特定の実施態様において、対象は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有している。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌または卵巣癌である。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。ある特定の実施態様において、対象は、哺乳類である。ある特定の実施態様において、哺乳類は、霊長類である。ある特定の実施態様において、霊長類は、ヒトである。
【００８７】
ＨＥＲ−２抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡは、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０５〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０７〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０８〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０８〜１０９  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。
【００８８】
ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原は、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１０μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１００μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の２５ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の５０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。
【００８９】
ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、順次に投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡが最初に投与され、次いで組換えタンパク質が投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えタンパク質が最初に投与され、次いで組換えＭＶＡが投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、同時に投与されても良い。
【００９０】
ある特定の実施態様において、組成物は、ヒト対象または、癌患者に対し、プライム−ブーストワクチン接種として投与される。「プライム−ブーストワクチン接種」という用語は、最初に特異抗原を標的とするワクチンのプライム（起爆）注射を行い、次いで、間隔を置いて、同じワクチンの１以上のブースト（追加）注射を行う、ワクチン接種戦略を指す。プライム−ブーストワクチン接種は、同種であっても、異種であっても良い。同種のプライム−ブーストワクチン接種は、プライム注射と１以上のブースト注射の両方に対して、同じ免疫原およびベクターを含有するワクチンを用いる。異種のプライム−ブーストワクチン接種は、プライム注射と１以上のブースト注射の両方に対して同じ免疫原を含有するが、プライム注射と１以上のブースト注射に対し、異なるベクターを含有するワクチンを用いる。たとえば、同種のプライム−ブーストワクチン接種は、プライム注射と１以上のブースト注射の両方に対して、Ｈｅｒ−２を発現する核酸を含有するＭＶＡベクターを用いても良い。対照的に、異種のプライム−ブーストワクチン接種は、プライム注射に対してはＨｅｒ−２を発現する核酸を含有するＭＶＡベクターを用いて、１以上のブースト注射に対してはＨＥＲ−２を発現する核酸を含有する鶏痘ベクターを用いてもよい。たとえば、プライム注射では免疫原をコードするプラスミドを使用し、１以上のブースト注射では同じ免疫原をコードするポックスウイルスベクターを使用する、または、プライム注射では組換えタンパク質免疫原を使用し、１以上のブースト注射では同じタンパク質免疫原をコードするポックスウイルスベクターまたはプラスミドを使用する等、異種のプライム−ブーストワクチン接種はまた、様々な組み合わせを包含する。
【００９１】
ある特定の実施態様において、組成物（すなわち、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質）は、プライム−ブーストワクチン接種としてヒト癌患者に投与される。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、同種のプライム−ブーストワクチン接種である。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、異種のプライム−ブーストワクチン接種である。
【００９２】
ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）が、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、間隔（日、週、月を含む）を置いて、投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の日の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の月の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、任意の組み合わせの間隔をおいて、投与される（たとえば、１、２、３、４、５、６、７もしくはそれ以上の日、１、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれ以上の週、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれ以上の月）。
【００９３】
癌を治療する方法
他の態様において、（ａ）腫瘍関連抗原を発現している癌を有しているヒト癌患者を特定すること；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の治療有効量、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組み換えタンパク質の治療有効量を患者に投与し、それによって、癌を治療すること、を含有する、ヒト癌患者を治療する方法が本明細書に提供される。当該組成物は、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を発現するＭＶＡ、および、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連高原を含有する組換えタンパク質を含有する。また、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を含有する組みかえタンパク質と組み合わせて用いられる、非組み換えＭＶＡを含有する組成物が本明細書において企図される。
【００９４】
「治療有効量」は、治療される対称において、所望される治療効果、または臨床効果を得るために十分な組成物の量である。たとえば、発現制御配列に操作可能に連結されたヒトＨＥＲ２タンパク質をコードする核酸を含有するポックスウイルスベクターの治療有効量は、ＨＥＲ−２特異的免疫応答を惹起させる、腫瘍サイズまたは腫瘍量を減少させる、腫瘍転移の数を減少させる、癌の進行を遅延させる、または、癌を有する患者もしくは患者群の全生存率を上昇させるために十分な量である。ポックスウイルスベクターの治療有効量、および本明細書に開示されるポックスウイルスベクターを含有する組成物の治療有効量は、ＨＥＲ−２過剰発現細胞およびＨＥＲ−２を過剰発現する可能性を有する細胞に対する免疫応答を上昇させるために十分な量である。免疫応答は、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍の兆候または症状を減少させる、腫瘍に関連した１以上の症状の自覚的な軽減をもたらす、または、主治医に留意されている１以上の症状の客観的で識別可能な改善（たとえば、腫瘍サイズの減少、転移病変数の減少、疾患進行の遅延、または全生存率の上昇等）をもたらすために、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞およびＨＥＲ−２を過剰発現する可能性を有する細胞の増殖を遅延させるために十分な程度のものでなければならない。
【００９５】
ある特定の実施態様において、ヒト癌患者を治療する方法は、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の治療有効量、および、異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質の治療有効量、を患者に投与すること、を含む。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、当該組換えＭＶＡおよび当該組換えタンパク質を共に投与することにより、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、当該組換えＭＶＡおよび当該組換えタンパク質は、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される。ある特定の実施態様において、ヒト癌患者は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌である。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。
【００９６】
ＨＥＲ−２抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡは、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０５〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０７〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０８〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡの１０８〜１０９  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与される。
【００９７】
ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原は、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１０μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１００μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の１０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の２５ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。ある特定の実施態様において、組換えＨＥＲ−２抗原の５０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される。
【００９８】
ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、順次に投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡが最初に投与され、次いで組換えタンパク質が投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えタンパク質が最初に投与され、次いで組換えＭＶＡが投与されても良い。ある特定の実施態様において、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、同時に投与されても良い。
【００９９】
ある特定の実施態様において、組成物（すなわち、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質）は、プライム−ブーストワクチン接種としてヒト癌患者に投与される。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、同種のプライム−ブーストワクチン接種である。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、異種のプライム−ブーストワクチン接種である。
【０１００】
ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）が、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、間隔（日、週、月を含む）を置いて、投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の日の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の月の間隔を置いて投与される。ある特定の実施態様において、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、任意の組み合わせの間隔をおいて、投与される（たとえば、１、２、３、４、５、６、７もしくはそれ以上の日、１、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれ以上の週、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれ以上の月）。
【０１０１】
キット
他の態様において、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質；および、（ｃ）組換えＭＶＡの治療有効量および組換えタンパク質の治療有効量を、異種腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者に投与するための説明書、を含有する、ヒト癌患者を治療するためのキットが本明細書において提供される。当該組成物は、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を発現するＭＶＡ、および、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連高原を含有する組換えタンパク質を含有する。また、本明細書に開示される任意の異種腫瘍関連抗原を含有する組みかえタンパク質と組み合わせて用いられる、非組み換えＭＶＡを含有する組成物が本明細書において企図される。
【０１０２】
ある特定の実施態様において、ヒト癌患者を治療するためのキットは、（ａ）異種腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドを発現する組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含有する組成物；（ｂ）異種腫瘍関連抗原を含有する組換えタンパク質を含有する組成物；および、（ｃ）組換えＭＶＡを含有する組成物の治療有効量および組換えタンパク質を含有する組成物の治療有効量を、異種腫瘍関連抗原を発現する癌を有するヒト癌患者に投与するための説明書、を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ｃ−ｅｒｂＢ−１（“ＥＧＦｒ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−２（“ＨＥＲ−２”または“ｃ−Ｎｅｕ”）抗原、ｃ−ｅｒｂＢ−３抗原および、ｃ−ｅｒｂＢ−４抗原からなる群から選択される抗原を含有する。ある特定の実施態様において、異種腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ−２抗原を含有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２抗原は、配列番号１を含有する。ある特定の実施態様において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施態様において、当該組換えＭＶＡおよび当該組換えタンパク質を共に投与することにより、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善が誘導され（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定）、または、抗原特異的抗体の抗体力価の上昇が誘導される（ＥＬＩＳＡにより測定）。ある特定の実施態様において、当該組換えＭＶＡおよび当該組換えタンパク質は、１以上の薬学的に受容可能な希釈物質、緩衝剤、賦形剤、または担体と共に処方される。ある特定の実施態様において、ヒト癌患者は、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌を有する。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌、子宮頸癌および卵巣癌である。ある特定の実施態様において、ＨＥＲ−２を過剰発現する癌は、乳癌である。ある特定の実施態様において、乳癌は、転移性乳癌である。
【０１０３】
ある特定の実施態様において、当該説明書は、ＨＥＲ−２抗原を含有するポリペプチドを発現する組換えＭＶＡは、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）と、示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡの１０５〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与されると示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡの１０７〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与されると示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡの１０８〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与されると示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡの１０８〜１０９  ＴＣＩＤ５０の用量が対象に投与されると、示す。
【０１０４】
ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原は、全身または局所のいずれかで投与されても良い（すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者公知の任意の他の経路により）、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の０．１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の１μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の１０μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の１００μｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の１ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の１０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の２５ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＨＥＲ−２抗原の５０ｍｇ〜１００ｍｇの用量が対象に投与される、と示す。
【０１０５】
ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、順次に投与されても良い、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡが最初に投与され、次いで組換えタンパク質が投与されても良い、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えタンパク質が最初に投与され、次いで組換えＭＶＡが投与されても良い、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質は、同時に投与されても良い、と示す。
【０１０６】
ある特定の実施態様において、当該説明書は、組成物（すなわち、組換えＭＶＡおよび組換えタンパク質）は、プライム−ブーストワクチン接種としてヒト癌患者に投与される、と示す。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、同種のプライム−ブーストワクチン接種である。ある特定の実施態様において、プライム−ブーストワクチン接種は、異種のプライム−ブーストワクチン接種である。
【０１０７】
ある特定の実施態様において、当該説明書は、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）が、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、間隔（日、週、月を含む）を置いて、投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の日の間隔を置いて投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週の間隔を置いて投与される、とす。ある特定の実施態様において、当該説明書は本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の月の間隔を置いて投与される、と示す。ある特定の実施態様において、当該説明書は、本明細書に開示される組成物の１以上の追加の治療有効量（すなわち、１以上のブーストワクチン接種）は、本明細書に開示される組成物の最初の治療有効量（すなわち、プライムワクチン接種）の投与後、任意の組み合わせの間隔をおいて、投与される（たとえば、１、２、３、４、５、６、７もしくはそれ以上の日、１、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれ以上の週、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれ以上の月）、と示す。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：材料と方法
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＭＶＡ  ＥＬＩＳＡについては、凍結したウイルスストックを室温で解凍し、使用の前に良く混合した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＭＶＡ−ＢＮ（６×１０７  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を円錐管に加え、５０μＬのウイルスストックを、適切なサイズのマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。プレートをパラフィルム（登録商標）で包み、４℃で一晩インキュベートした。ＨＥＲ−２および他のタンパク質のＥＬＩＳＡについては、炭酸緩衝液（２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３）中、１μｇ／ｍＬの濃度の、所望されるタンパク質を５０μＬ、適切なサイズのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。プレートをパラフィルム（登録商標）で包み、室温で１時間、または４℃で一晩のいずれかでインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを空にして、１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
【０１０９】
コートされたプレートをブロッキングする前に、すべてのウェルをＰＢＳで再度、４回洗浄した。ＰＢＳで最後に洗浄した後、洗浄緩衝液を除去し、プレートをペーパータオル上でパッティングして乾かし、２００μＬの希釈していないＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ、カタログ番号ＰＩ３７５１６）を、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルに添加した。プレートを、室温で少なくとも５分間、ブロッキング溶液と共にインキュベートした。
【０１１０】
血清試料は、分析の前に−８０℃で保存した。試料を氷上で溶かし、標準的な方法に従い、希釈緩衝液（ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０）に溶解した１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）で希釈した。陽性対照および陰性対照の希釈も、同じ手順で調製した：陽性対照は抗体であり、陰性対照は感作されていない（ナイーブな）血清であった。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡを行う前に、ブロッキング緩衝液をプレートから除去した。次に、５０μｌの希釈緩衝液を、最初の列を除くすべての列（すなわち、Ｂ〜Ｈの行）に添加した。試料および対照を、最初の列（すなわち、Ａの列）に以下の様に添加した：Ａ１：１００μＬの希釈陽性対照抗体；Ａ２：１００μＬの希釈陰性対照血清；第一の行の残りのウェルは、１００μＬの希釈血清試料を２重に入れた。試料を列Ａから列Ｈへと、マイクロチャンネルピペットを用いて連続希釈した。次いで、プレートを、空のマイクロタイタープレートで覆い、室温で１時間インキュベートした。
【０１１２】
一次抗体とのインキュベートの後、ウェルを５０μＬの洗浄緩衝液でそれぞれ４回洗浄し、次いで、二次抗体とインキュベートした。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体混合物を、希釈緩衝液で１：５０００に希釈するか、または抗ウサギＩｇＧ抗体を希釈緩衝液で１：２０００に希釈するかのいずれかで調製した。ＩｇＧ比率を測定するＥＬＩＳＡに関しては、以下の系統特異的な二次抗体を用いた：ＢＡＬＢ／ｃに対してはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１、Ｃ５７ＢＬ／６に対してはＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１。二次抗体の５０μＬ分注物を、マルチチャンネルピペットを用いてウェルごとに添加した。プレートを積み重ね、空のマイクロタイタープレートで覆い、正確に１時間の間、室温でインキュベートした。
【０１１３】
インキュベーションの最後に、プレートを再度ＰＢＳで４回洗浄し、１００μＬの３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加えた。次いで、プレートを、溶液が青に変わるまで（通常は３〜５分）、室温で暗所にてインキュベートした。１００μＬのＨ２ＳＯ４をすべてのウェルに添加することにより反応を停止させた。次いで、プレートを、４５０ｎｍの波長に設定したＭｕｌｔｉｓｋａｎプレートリーダー上で読み取った。
【０１１４】
酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）
アッセイを行う前のすべてのステップは滅菌条件下、好ましくは層流フード中で行われた。
【０１１５】
所望されるサイズのマイクロタイタープレートを用いて、各ウェルの膜を、調製したばかりの５０％（ｖ／ｖ）エタノール（３５μＬ）で、マルチチャンネルピペットを用いて前もって湿らせた。１分後、エタノールをプレートから除去し、ウェルを２００μＬの滅菌ＰＢＳで洗浄した。所望される抗体を滅菌ＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、短時間混合した。次いで、各プレートのウェルを、マイクロチャンネルピペットを用いて５０μＬ／ウェルで適切な抗体でコートした。次いで、プレートを、添付のフタを用いて覆い、適切な場合には積み重ね、パラフィルム（登録商標）で包んで乾燥から防ぎ、４℃で一晩、インキュベートした。
【０１１６】
翌日、コートした抗体を各プレートのウェルから除去し、プレートを、滅菌ＰＢＳ（２００μＬ）を用いて２回洗浄した；２回目の洗浄液は、ブロッキングのための準備がすべて整うまで、プレート上に置かれた。次いで、プレートは、ろ過ＲＰＭＩ−１０培地を１００μＬ／ウェルで添加することによりブロッキングされ（ＲＰＭＩ−１０は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン、および０．５ｍＭのβメルカプトエタノールを補充された、ろ過滅菌されたＲＰＭＩ−１６４０である；ＶＷＲ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｂｒｉｓｂａｎｅ，  ＣＡ、カタログ番号１６７７７−１８０）、フタで覆われ、３７℃＋５％  ＣＯ２に設定されたインキュベーターに少なくとも１時間置かれた。
【０１１７】
再刺激のために用いられたタンパク質、ペプチド、ＣｏｎＡ（陽性対照として用いたレクチン）およびウイルス溶液は、ＲＰＭＩ−１０で希釈された。各再刺激溶液は、プレートマップに従い、深ウェルの９６ウェルマイクロタイタープレートに添加された。次いで、プレートをプレートシーラーを用いて覆い、使用するまで４℃に置かれた。脾臓細胞は、標準的な方法に従い調製された。
【０１１８】
ブロッキングＲＰＭＩ−１０溶液はウェルから除去され、次いで、プレートをパッティングして乾かした。次いで、プレートを、実験番号、日付、群、プールまたは枯渇を特定するために適切に標識し、およびＲ＆Ｄ実験として特定するために赤いステッカーで標識した。マルチチャンネルピペットを用いて、５０μＬの再刺激培地を、深ウェルの９６ウェルプレートの適切な列から、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの対応するウェルの列へと、各再刺激物質を低濃度から高濃度へと動かしながら、移した。各ＥＬＩＳＰＯＴプレートに添加される脾臓細胞は、細胞の円錐管を穏やかに数回、転倒混和させることにより混合させ、次いで、滅菌ｖ底ボートに移して、細胞が等しく分散するようにした。次に、５０μＬの脾臓細胞を各ウェルに添加し（５×１０５細胞／ウェル）、プレートを、３７℃＋５％  ＣＯ２に設定したインキュベーター中で、約４０時間、攪乱させないようにしてインキュベートした。
【０１１９】
スポットを、Ｌａｍｉｎａｒ  Ａｉｒ  Ｆｌｏｗフード中で検出した。最初に、細胞をウェルから除去し、プレートをパッティングして乾かした。次いで、ウェルを２００μＬのＰＢＳで２度洗浄し、次いで、ＰＢＳＴで２度洗浄した。後半の２回の洗浄は、各マイクロタイタープレートを、ＰＢＳＴを含有するバケツに単純に浸漬することにより行われた。このステップは、Ｌａｍｉｎａｒ  Ａｉｒ  Ｆｌｏｗフードの外で行われた。最後の洗浄液は、検出プロセスにおける次のステップが開始されるまでウェル内に留めて置いた。
【０１２０】
適切な検出抗体（すなわち、ビオチニル化抗マウスＩＦＮγ抗体）を、所望の濃度までＰＢＳＴＢ（ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で希釈した。所望検出抗体の希釈後、抗体溶液を混合し、０．２μｍの孔のフィルターを通してろ過した。次いで洗浄緩衝液を各プレートから除去し、５０μＬの希釈検出抗体を各ウェルに添加した。次いでプレートをフタで覆い、室温で１時間インキュベートした。次いで検出抗体溶液をプレートから除去し、次いで、ＰＢＳＴを含有するバケツへとプレートを浸漬させることにより洗浄した。再度、最後の洗浄液を、検出プロセスにおける次のステップが開始されるまでウェル内に留めて置いた。
【０１２１】
アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＡＰ）を適切な濃度までＰＢＳＴＢで希釈し、０．２μｍのステリフリップフィルターを通してろ過した。次いで洗浄緩衝液を各プレートから除去し、５０μＬの希釈ストレプトアビジン‐ＡＰ溶液を各ウェルに添加した。次いでプレートを覆い、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン‐ＡＰ溶液をプレートから除去し、次いで、ＰＢＳＴを含有するバケツへとプレートを浸漬することにより６回洗浄した。最後の洗浄液は、検出プロセスにおける次のステップが開始されるまで、ウェル内に留めて置いた。
【０１２２】
Ｔｈｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  ＡＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅミックス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ、カタログ番号ＳＫ−５３００）を、メーカーの説明書に従い調製し、０．２μｍのフィルターを通してろ過した。次に、５０μＬのＶｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  ＡＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅミックスを各ウェルに添加した。次いで、プレートをホイルで覆った。検出反応を２０〜３０分間進行させ、各プレートを水道水で完全にすすぐことにより、反応を停止させた。次いで、プレートの裏打ちを取り除き、ウェルの底をすすぎ、プレートを４℃で空気乾燥させた。最後に、乾いた後、プレートをスキャンして、スポット数を数えた。
【０１２３】
実施例２：ＭＶＡ−ＢＮは、組換えＨＥＲ２タンパク質でのワクチン接種に対する強力なＴＨ１アジュバントとして作用する
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの群（ｎ＝５）を、２週ごとに４サイクルの間、以下により、皮下注射によりワクチン接種を行った（すなわち、総計８週の処置時間）：（１）ＴＢＳ；（２）５μｇ  ＨＥＲ２（ＴＢＳで処方）（ＨＥＲ２）；（３）５×１０７感染単位（ＩＵ）ＭＶＡ−ＢＮ＋５μｇ  ＨＥＲ２（ＴＢＳで処方）；または、（４）５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２。
【０１２４】
総イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価またはＩｇＧアイソタイプの比率（ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１）が、実施例１に記述される標準的なプロトコールに従い行われたＥＬＩＳＡにより、プールされた血清試料において測定された。図１Ａを参照のこと。細胞性応答は、最後のワクチン接種の７日後に、実施例１に記述される標準的なプロトコールに従い行われたＥＬＩＳＰＯＴにより評価された。脾臓細胞中の応答性Ｔ細胞の頻度は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定された。さらに、ＴＨ１偏向（ＴＮＦα）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、またはＴＨ２偏向（ＩＬ−５）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特徴である、選択サイトカインの量が、ＢＤ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）により同じウェルの上清で測定された。図１Ｂを参照のこと。
【０１２５】
図１Ａで示されるように、ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２タンパク質またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２のいずれかでのワクチン接種により、組換えＨＥＲ２タンパク質単独でのワクチン接種と比較して、非常に高い力価のＨＥＲ２特異的抗体が産生された。同様に、ＴＨ１偏向ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比率が、ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２タンパク質またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２のいずれかでのワクチン接種の後に観察されたが、組換えＨＥＲ２タンパク質単独でのワクチン接種では観察されなかった。図１Ａを参照のこと。ＥＬＩＳＰＯＴおよびサイトカイン分析により、これらの結果が確認された：ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２タンパク質またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２のいずれかでのワクチン接種により、より多くのＩＦＮγ分泌スポット、および高レベルのＴＮＦα（ＴＨ１偏向ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特徴であるサイトカイン）が産生されたが、組換えＨＥＲ２タンパク質単独でのワクチン接種では、少ないＩＦＮγ分泌スポット、および高レベルのＩＬ−５（ＴＨ２偏向ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特徴であるサイトカイン）が産生された。図１Ｂを参照のこと。
【０１２６】
実施例３：組換えＨＥＲ２タンパク質と組み合わせて、アジュバントとしてＭＶＡ−ＢＮを使用することにより、ＣＴ２６−ＨＥＲ−２発現腫瘍細胞でチャレンジされたマウスにおいて、抗腫瘍効果が現れる
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝９）に、５×１０５のＣＴ２６−ＨＥＲ−２細胞を１日目に静脈内投与（ｉ．ｖ．）でチャレンジし、４日目に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で、（１）ＴＢＳ；（２）５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２；（３）生ＭＶＡ−ＢＮ＋７．５μｇ  ＨＥＲ２タンパク質；（４）不活化ＭＶＡ−ＢＮ＋７．５μｇ  ＨＥＲ２タンパク質；（５）生ＭＶＡ−ＢＮ；または、（６）不活化ＭＶＡ−ＢＮが処置された。ウイルスは熱不活化により不活化された。肺重量を１５日目に測定した。統計は、ボンフェローニ補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。
【０１２７】
図２において、統計的に有意な抗腫瘍活性には、生ウイルスと、ＨＥＲ２タンパク質（すなわち、ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２）、またはＨＥＲ２導入遺伝子を発現するウイルス（すなわち、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２）の両方の存在が必要であることが示されている。
【０１２８】
ワクチン接種が行われたマウスの肺から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により分析し、メーカーの説明書および標準的な手順（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ）に従い、ＨＥＲ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｐ６３ペプチド  ＮＨ２−ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ−ＣＯＯＨでロードされたＨ−２Ｋｄペンタマーを用いて検出した。図３において、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２での処置のみが、腫瘍においてＨＥＲ−２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが示されている。図３において、ＨＥＲ−２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導には、ウイルスベクターからのＨＥＲ−２の発現が必要であり；組換えＨＥＲ２タンパク質の添加では不十分であることも示されている。
【０１２９】
最後に、ＨＥＲ−２特異的、またはＭＶＡ−ＢＮ特異的なＩｇＧ抗体価が、ＣＴ２６−ＨＥＲ−２でチャレンジされ、上述のように処置されたマウス由来のプール血清で、ＥＬＩＳＡにより測定された。図４において、アジュバントとしてＭＶＡ−ＢＮを用いることにより誘導された抗腫瘍効果は、ＨＥＲ−２特異的抗体に介在されうることが示されている。
【０１３０】
実施例４：ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ−２へのＨＥＲ２タンパク質の添加により、抗ＨＥＲ−２抗体価が有意に上昇する
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、２週ごとに４サイクルの間、以下と共に、皮下注射によりワクチン接種を行った（すなわち、総計８週の処置時間）：（１）ＴＢＳ；（２）１×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２；または、（３）１×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋５μｇ組換えＨＥＲ２タンパク質。総ＩｇＧ抗体価またはアイソタイプ特異的な力価（たとえば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１）は、実施例１に記述される標準的な方法に従い、ＥＬＩＳＡによりプールされた血清で測定された。
【０１３１】
図５において、ＨＥＲ−２特異的抗体価は、ＨＥＲ２タンパク質の添加により有意に上昇したこと、および、ＩｇＧ１アイソタイプの力価は、アイソタイプＩｇＧ２ａの力価よりも比例的に増加したことが示されている。これにより、組換えＭＶＡベクターにより惹起された免疫応答に対して、ＨＥＲ２タンパク質は、異なる性質を加えることが示唆される。この応答は全体的にはまだＴＨ１偏向であるが、癌の処置に有益でありうる一部のＴＨ２の性質も含んでいる。
【０１３２】
実施例５：ＨＥＲ２タンパク質の添加により、ＨＥＲ−２特異的ＣＤ４＋が増加するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は増加しない
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、２週ごとに４サイクルの間、以下と共に、皮下注射によりワクチン接種を行った（すなわち、総計８週の処置時間）：（１）ＴＢＳ；（２）１×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２；または、（３）１×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋５μｇ組換えＨＥＲ２タンパク質。最後の処置の２週後、脾臓細胞中の応答性Ｔ細胞の頻度を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。脾臓細胞は、ＨＥＲ−２タンパク質、ＨＥＲ−２重複ペプチドライブラリ（ＯＰＬ）、または、Ｋｄ拘束性ＣＤ８＋ペプチド（ＨＥＲ−２  ｐ６３）で再刺激された。図６において、組換えＨＥＲ２タンパク質の添加により、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が増加したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は増加しなかったことが示されている。さらに、欠損実験により、ＨＥＲ−２タンパク質への応答、またはＨＥＲ−２  ＯＰＬへの応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的であることが示された（データは示さず）。
【０１３３】
実施例６：マウスモデルにおける、乳癌治療のための能動免疫療法の改善
ＴＵＢＯ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ−ＮｅｕＴマウスにおいて自然発生した小葉癌からｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹立されたクローン化細胞株である（Ｒｏｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：５１３３−５１４２  （２０００））。他の多くの腫瘍モデルとは対照的に、このＥｒｂ−２−発現腫瘍に対する防御メカニズムは、主に抗体介在性であることが知られている（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８（６）：１９７９−１９８７  （２００８））。Ｃｕｒｃｉｏ  Ｃ．ら  （Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１１（８）：１１６１−１１７０  （２００３））は、野生型（ＷＴ）またはノックアウト（ＫＯ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴＵＢＯ細胞の免疫療法を行った。免疫療法の背景において、腫瘍増殖動態および腫瘍逃避メカニズムを超える効果的な抗腫瘍攻撃を生み出す能力は、抗体がＴＵＢＯ腫瘍の増殖を効率的に制御することができる、複数のメカニズムの組み合わせに起因すると考えられている。さらなるエフェクターメカニズムとしては、ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ介在性の抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、パーフォリン、ＩＦＮγ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびマクロファージが挙げられる。
【０１３４】
この実験は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いたワクチン接種にＨＥＲ２タンパク質を加えることにより、ＴＵＢＯ腫瘍モデルにおける有効性が改善されるか否かを測定するために行われた。
【０１３５】
ワクチン接種プロトコール
４０匹のＢＡＬＢ／ｃオスマウス（７〜８週齢）（ＤＯＢ  ２０１０年１月５日）をランダムに４群に分けた（ｎ＝１０）。１群は、組換えＨＥＲタンパク質無しで、トリス緩衝生理食塩水（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．７；ＴＢＳ）でワクチン接種を行った；２群は、組換えＨＥＲ２タンパク質無しで、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２の５×１０７の感染単位（ＩＵ）でのワクチン接種を行った；３群は、５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質と共に、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を５×１０７でワクチン接種を行った；および、４群は、１日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質と共に、１５日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質と共に、ワクチン接種を行った。ワクチンは、実験の１日目と１５日目に投与された；ワクチンは、２つの部位に皮下注射で投与され、各注射は、２００μｌの量で行われた（１００μｌの量で１つの部位に行われた、ＣＦＡまたはＩＦＡで処方されたＨＥＲ２を除く）。マウスは、１×１０５ＴＵＢＯ腫瘍細胞を皮内投与で単回注射を行うことでチャレンジされた。
【０１３６】
結果：抗腫瘍効果
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２での免疫療法により、腫瘍増殖の有意な遅延が生じた（ｐ＜０．０５）。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２での免疫療法でも、腫瘍増殖の有意な遅延が生じた（ｐ＜０．０１）。２匹のマウスは、処置後３９日目で、腫瘍が無かった。有意差が増加したことにより示されるように、ＴＢＳ群と比較して、ＨＥＲ２タンパク質の追加により、防御反応が改善される傾向が示された（ＭＶＡ−ＢＮ単独に対するｐ＜０．０５から、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２に対するｐ＜０．０１へと改善）。これにより、２群を互いに比較した際には統計的有意差は得られなかったが、ＨＥＲ２タンパク質の追加により、抗腫瘍効果が改善されたことが示唆される。ＣＦＡで処方されたＨＥＲ２タンパク質での処置は、１０匹のマウスのうち２匹がＴＵＢＯ腫瘍を排除したが、全体的に有意な抗腫瘍効果を示さなかった。図７および８を参照のこと
【０１３７】
結果：抗体応答
ＥＬＩＳＡを、実施例１に示される標準的なプロトコールに従い、行った。力価は、２つの別の測定で再現性があるものであった。腫瘍誘導性の力価は１６０００であった。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２での処置は力価を４倍の６４０００へと増加させたが、タンパク質の添加では、力価は、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２単独の２倍、１２８０００にまでしか増加させなかった。ＣＦＡ＋ＨＥＲ２により誘導された力価は、１０〜２０倍高かった（１〜２００００００）。通常のように、腫瘍誘導性ＡｂおよびＣＦＡ製剤誘導性のＡｂは、高度にＴＨ２偏向性である一方で、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２誘導性のＡｂは、ＴＨ１偏向性であり、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２へのタンパク質の添加でもアイソタイプの比率に変化は生じなかった。これは、高力価のＩｇＧ１抗体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗腫瘍効果を生じさせないことを示す第二の腫瘍モデルであり、もう一つはＣＴ２６−ＨＥＲ２  ＥＬＭモデルである。
【０１３８】
結果：Ｔ細胞応答
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２群のマウスを、腫瘍退縮および腫瘍非退縮マウスへと分けた。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２群のすべてのマウスの腫瘍は退縮していた；ＣＦＡ＋ＨＥＲ２群の腫瘍は退縮しなかった。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、腫瘍移植後４１日目に、実施例１に示される標準的なプロトコールに従い実施した。他の実施例にあるように、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２へのＨＥＲ２タンパク質の添加により、ＨＥＲ２タンパク質応答が増強された（破傷風毒素由来の２つのＴＨエピトープを組み込むために改変されたＨＥＲ２細胞外ドメインである１０４．１タンパク質を用いたＥＬＩＳＰＯＴにより測定）（図４Ｃを参照のこと）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて活性であるＨＥＲ−２由来のＣＤ８エピトープであるｐ６３を用いて測定した場合には、増強されなかった（図１０Ｂを参照のこと）。興味深いことに、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２で処置され、腫瘍を拒否されたマウスにおいては、強いｐ６３応答が顕著であった。ＨＥＲ２  ＥＣＤ重複ペプチドライブラリ（ＯＰＬ）応答は、全ての群において同様であったこと（図１０Ａを参照のこと）から、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２処置動物と比較して、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２からの腫瘍退縮の効果が得られたことは、異なるエフェクターメカニズムが起因する可能性が示唆される。図１０を参照のこと。
【０１３９】
実施例７：マウスモデルにおける乳癌治療のための能動免疫療法の改善
本実験は、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２でのワクチン接種にＨＥＲ２タンパク質を加えることにより、ＴＵＢＯ腫瘍モデルにおける有効性が改善されるかどうかを測定するために行われた。
【０１４０】
ワクチン接種プロトコール
６０匹のＢＡＬＢ／ｃのメスマウス（７〜８週齢）（ＤＯＢ  ２０１０年３月５日、および２０１０年３月１２日）をランダムに６群に分けた（ｎ＝１０）。第１群はＴＢＳでワクチン接種を行った；第２群は、組換えＨＥＲ２タンパク質無しの５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２でワクチン接種を行った；第３群は、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った；第４群は、組換えＨＥＲ２タンパク質無しで、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮでワクチン接種を行った；第５群は、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ＋５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った；および、第６群は、１日目にＣＦＡで処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質と、１５日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った。ワクチンは、実験の１日目および１５日目に投与された；ワクチンは、２つの部位に皮下注射で投与され、各注射は、２００μｌの量で行われた（１００μｌの量で行われた、ＣＦＡまたはＩＦＡで処方された組換えタンパク質を除く）。マウスは、１×１０５ＴＵＢＯ腫瘍細胞の単回注射を皮内投与することによりチャレンジされた。
【０１４１】
結果：抗腫瘍効果
本実験において、統計的に有意な抗腫瘍効果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２処置のみの後で、一時的に得られた（１２〜２２日目に、スチューデントｔ検定による。しかしボンフェローニ補正を伴うＡＮＯＶＡでは得られなかった）が、抗腫瘍効果は、実験前のレベルで、統計的に有意なレベルに達した（ボンフェローニ補正を伴うＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５）。しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２での処置は、２９日目には統計的に有意な防御をもたらした（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５、前実験におけるｐ＜０．０１と比較した）。統計的に有意な防御（スチューデントｔ検定による評価）は、ＴＢＳで処置された対照群が死亡し始めた、１２〜３６日目の本群において得られ、このことから、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２処置にＨＥＲ２タンパク質を添加することは、明らかに有益であることが示された。他のいかなる処置でも有意な防御を誘導せず（腫瘍サイズにより測定）、しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮまたはＣＦＡでの処方に対しＨＥＲ２タンパク質を添加することにより、おそらくはＡｂ介在性のメカニズムにより、後期の時点でいくらかの腫瘍退縮を示した。ＭＶＡ−ＢＮでの処置は、本実験においては有意に腫瘍体積を増加させた。この結果は、次の実験において再現されず、誤った結果であると考えられる。
【０１４２】
結果：生存分析
ＴＢＳを投与された対照群の中央生存期間は、４１日であった。ＭＶＡ−ＢＮ単独での処置は、中央生存期間を３３日にまで減少させた。上述のように、この結果は次の実験において再現されず、誤った結果であると考えられる。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２での処置、またはＣＦＡ＋ＨＥＲ−２での処置は、６８日目の本実験の終了までに、６０％の生存を示した。ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２での処置は、４１から５８日まで中央生存期間を増加させたが、ＴＢＳ群と比較して、生存率は増加させなかった。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２での処置により、６８日目までに９０％の生存をもたらした。１０匹のマウスのうち３匹が、その時点で腫瘍が無かった。これは対数順位検定  ｐ＝０．００８により統計的に有意である。対数順位検定は、カプランマイヤー曲線の作製において用いられた。図１３を参照のこと。
【０１４３】
結果：抗体応答
ＥＬＩＳＡを、実施例１に示される標準的なプロトコールに従って実施した。データは、実施例６に記述される実験ほどには明確ではなく、本実験において、血清は非常に遅くに採取され、それにより前の実験と「同期」されなかったためである可能性が高い。予測されたように、全ての群におけるＭＶＡの力価は非常に類似しており、８０００〜１６０００の間の範囲にあった。組換えＨＥＲ２タンパク質の添加は、抗ＭＶＡ抗体のＩｇＧアイソタイプの比率には効果が無かった。
【０１４４】
ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２、またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２での処置により、腫瘍誘導性ＨＥＲ−２力価よりも２〜４倍高い、類似したＨＥＲ−２力価を誘導した。図１４を参照のこと。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２で処置された群にはＩｇＧ２ａの比率が高い傾向があったが、ＩｇＧアイソタイプの比率には有意な変化が無かった。ＭＶＡ−ＢＮで処置されたマウスは、ＴＢＳ単独投与されたマウスまたはＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２で処置されたマウスよりも４倍低いＨＥＲ−２Ａｂ力価を有した。これは、他の群よりも早く、これらマウスが倒れたという事実によるものであろう。ＣＦＡで処置されたマウスは、非常に高いＨＥＲ−２力価を有した；実に、他の群よりも１００倍まで高い力価であり、応答は主にＴＨ２アイソタイプ（ＩｇＧ１）であった。
【０１４５】
実施例８：マウスモデルにおける乳癌治療のための能動免疫療法の改善
本実験は、ＭＶＡ−ＢＮまたは、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２でのワクチン接種に対しＨＥＲ２タンパク質を追加することにより、ＴＵＢＯ腫瘍モデルにおける効果が改善するかどうかを測定するために実施された。
【０１４６】
ワクチン接種プロトコール
６０匹のＢＡＬＢ／ｃのメスマウス（７〜８週齢）（ＤＯＢ  ２０１０年５月２０日）をランダムに６群に分けた（ｎ＝１０）。第１群はＴＢＳでワクチン接種を行った；第２群は、組換えＨＥＲ２タンパク質無しの５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２でワクチン接種を行った；第３群は、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った；第４群は、組換えＨＥＲ２タンパク質無しで、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮでワクチン接種を行った；第５群は、５×１０７  ＩＵ  ＭＶＡ−ＢＮ＋５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った；および、第６群は、１日目にＣＦＡで処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質と、１５日目にＩＦＡで処方した５μｇの組換えＨＥＲ２タンパク質でワクチン接種を行った。ワクチンは、実験の１日目および１５日目に投与された；ワクチンは、２つの部位に皮下注射で投与され、各注射は、２００μｌの量で行われた（１００μｌの量で行われた、ＣＦＡまたはＩＦＡで処方された組換えＨＥＲ２タンパク質を除く）。マウスは、１×１０５ＴＵＢＯ腫瘍細胞の単回注射で皮内投与によりチャレンジされた。免疫応答は、腫瘍チャレンジ後に行われたＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴによりモニターされた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、移植後５５日目に行われた。
【０１４７】
結果：抗腫瘍効果
本実験においてＴＢＳ対照群において、一部のＴＵＢＯ腫瘍が、移植後およそ２５日目に退縮を始めた。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２およびＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２で処置された群は両方とも、有意な抗腫瘍活性を示した。それら２群は、互いに有意差は無かったが、ＭＶＡ−ＢＮ単独、またはＣＦＡ−ＨＥＲ−２で処置された群からは有意差があった。ＭＶＡ−ＢＮ＋ＨＥＲ２は、いくらか有意な抗腫瘍効果を示した（スチューデントｔ検定により測定）が、ＴＢＳのみを投与された群と比較して有意差は無かった（ボンフェローニ補正を伴うＡＮＯＶＡにより測定）。後の時点で、腫瘍の退縮がすべての群に発生し、統計的有意差は消失した。ＣＦＡ＋ＨＥＲ−２処置群の１０匹のマウスのうち５匹において腫瘍が消失し、このことから、ＩｇＧ１抗体が、本モデルにおける、後の時点での抗腫瘍効果に貢献していることが示唆される。図１５を参照のこと。
【０１４８】
結果：Ｔ細胞応答
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、実施例６に提供される標準的なプロトコールに従い実施した。ＣｏｎＡ応答はＴＢＳ群以外の全ての群で類似しており、増殖する腫瘍の免疫抑制活性を反映している可能性がある。ＭＶＡで処置された全てのマウスは、有意な抗ＭＶＡ応答を有していた。しかしながら、応答の程度は２〜３倍にまで変動し、特に、Ｆ２Ｌペプチドでの再刺激後に顕著であった。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２およびＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２＋５μｇ組換えＨＥＲ２タンパク質は、有意なｐ６３応答を示した（６０〜８０スポット）。ＨＥＲ−２特異的応答は、ＭＶＡ＋ＨＥＲ２処置マウスおよびＣＦＡ＋ＨＥＲ２処置マウスにおいて低く、特に、ｐ６３応答に関して低かった。図１７を参照のこと。全体的に、ＨＥＲ２応答は、実施例６に記述される実験よりも低かった。これは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでの、正常な分析間誤差範囲内である。また、本分析では、ヒト、マウスおよびラットのｐ６３の間での交差反応性を検証した。ヒトＨＥＲ２で免疫化され、ラットＨＥＲ２発現腫瘍を担持するマウスは、ラットｐ６３特異的Ｔ細胞が有意なレベルとはならず、ＤＮＡ免疫により、腫瘍が無いＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて低レベルの交差反応性のＴ細胞が誘導されたという、Ｊａｃｏｂら（Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４０：９６−１０６  （２００６））の報告とは対照的な結果となった。本実験とは異なり、Ｊａｃｏｂｓらに報告されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、ペプチド単独ではなく、１００μｇ／ｍｌのペプチドをロードされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）で再刺激を行っており、Ｊａｃｏｂｓらの結果の意義は不明のままである。
【０１４９】
結果：抗体応答
実施例１に示される標準的なプロトコールに従い、ＥＬＩＳＡを行った。データは、実施例６に記述される実験ほどには明確ではなく、本実験において、血清は非常に遅くに採取され、それにより前の実験と、採取が「同期」されなかったためである可能性が高い。全ての処置群におけるＭＶＡの力価は同一であった。予想されたように、ＨＥＲ２タンパク質の添加は、ＭＶＡの力価またはＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比率には影響を与えなかった。増殖するＴＵＢＯ腫瘍は、約８０００のＨＥＲ−２力価を誘導し、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比率は、０．３７５となった。実施例６と同様に、ＨＥＲ２力価は、群間でやや異なっていた。しかしながら、ＣＦＡで処方されたＨＥＲ−２での処置はまた、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２での処置（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比率は０．０３９）と比較して、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比率を、１００倍近くさらにＴＨ２応答側に偏移させていた。図１６を参照のこと。
【０１５０】
結論
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２の作用機序をさらに解明するために、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ベクターのアジュバントとしての免疫機能を調査した。組換えＨＥＲ２タンパク質と混合した際の、アジュバントとしてのＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）またはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２の免疫応答および抗腫瘍効果を比較する前臨床実験により、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、強力なアジュバント活性を有し、および、生きたウイルスが必要であることが示された。ＨＥＲ−２特異的免疫応答および抗腫瘍効果が誘導された；しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２のような、ベクターからの直接的なＨＥＲ２タンパク質の発現のほうが優れていた。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２にタンパク質を添加すると、特にＣＤ４Ｔ細胞および抗体応答に関して、ＨＥＲ−２特異的免疫応答がさらに上昇した。これにより、ＴＵＢＯ乳癌モデルにおける、抗腫瘍効果の改善がもたらされた。このことから、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と組換えＨＥＲ２タンパク質を混合することにより、ＰＢＳまたはＣＦＡで処方された組換えＨＥＲ２タンパク質、またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２単独での免疫化と比較して、質的に異なる免疫応答がもたらされることが示唆される。これらのデータから、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２の抗腫瘍活性は、組換えベクターにＨＥＲ２タンパク質を添加することにより、上昇する可能性が示された。図１８を参照のこと。組換えＨＥＲ２タンパク質の存在下、または非存在下で、抗体応答に定量的な違いは無かったが、たとえば、ＡＤＣＣ活性の上昇、パーフォリンもしくはＩＦＮ−γの分泌上昇、または、ＮＫ細胞および／もしくはマクロファージ活性の上昇を含む、差異の要因となりうる、免疫応答の質が変化しうる、多くの経路がある。
【０１５１】
本明細書に開示される、本発明の実施および、本明細書を考察することにより、本発明の他の実施態様が当業者には明らかとなるであろう。明細書および実施例は例示のためのみであり、本発明の真の範囲および主旨は、以下の請求項により示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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