(57)【要約】  本発明は、１つには、ヒアルロナン（ＨＡ）に結合するペプチドタグを使用する組成物及び方法に関連する。前記ＨＡタグは、眼に投与された際に、分子、例えば、タンパク質又は核酸に結合することができ、眼における半減期及び／又は平均滞留時間の増大、及び又は、前記タンパク質又は核酸の眼におけるクリアランスの低下をもたらす。本発明は、眼の疾患、例えば、網膜性血管疾患を、ＨＡペプチドタグに結合したタンパク質又は核酸を投与することにより処置するための方法も包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナン（ＨＡ）と結合するペプチドタグであって、前記ペプチドタグが、
ａ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６；又は、
ｂ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列の９５個の連続するアミノ酸、
からなる群から選択される配列を含む、ペプチドタグ。
【請求項２】
タンパク質又は核酸に結合している請求項１記載のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子。
【請求項３】
前記ペプチドタグが、Ｎ末端及び／又はＣ末端で前記タンパク質に結合しているか、あるいは、前記核酸の５’及び／又は３’末端に結合している、請求項２記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項４】
前記ペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に直接結合している、請求項２又は３記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項５】
前記ペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に、リンカーを介して間接的に結合している、請求項２又は３記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項６】
前記タンパク質が、
ａ）単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント；
ｂ）治療用タンパク質、
ｃ）タンパク質受容体、又は、
ｄ）設計アンキリン反復タンパク質（ｄａｒｐｉｎ）
である、請求項２から５のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項７】
前記核酸が、アプタマーである、請求項２又は３記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項８】
前記分子が、ＶＥＧＦ、Ｃ５、因子Ｐ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、Ｉｌ−１０、ＴＮＦα又はＦＧＦＲ２と結合するタンパク質である、請求項２から５のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項９】
前記分子が、ＰＤＧＦ−ＢＢと結合する核酸である、請求項２、３、４、５又は７のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項１０】
前記分子が、
ａ）ＶＥＧＦと結合し、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むか；又は、
ｂ）Ｃ５と結合し、それぞれ配列番号３７、３８及び３９の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号４６、４７及び４８の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むか；又は、
ｃ）因子Ｐと結合し、それぞれ配列番号５３、５４及び５５の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号６５、６６及び６７の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むか；又は、
ｄ）ＥＰＯと結合し、それぞれ配列番号７５、７６及び７７の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号８６、８７及び８８の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むか、又は、
ｅ）ＴＮＦαと結合し、それぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１７、１１８及び１１９の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むか、又は、
ｆ）ＩＬ−１βと結合し、それぞれ配列番号１８９、１９０及び１９１の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１９８、１９９及び２００の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、
単離された抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項６記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項１１】
前記分子が、
ａ）それぞれ配列番号７及び配列番号１７；又は、
ｂ）それぞれ配列番号４０及び配列番号４９；又は、
ｃ）それぞれ配列番号５９及び配列番号７１；又は、
ｄ）それぞれ配列番号８１及び配列番号９２；又は、
ｅ）それぞれ配列番号１１１及び配列番号１２０；又は、
ｆ）それぞれ配列番号１９３及び配列番号２０１
の配列を有する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１０記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項１２】
前記分子が、
ａ）それぞれ配列番号９及び配列番号１９；又は、
ｂ）それぞれ配列番号４２及び配列番号５１；又は、
ｃ）それぞれ配列番号６１及び配列番号７３；又は、
ｄ）それぞれ配列番号８３及び配列番号９５；又は、
ｅ）それぞれ配列番号１１３及び配列番号１２２；又は、
ｆ）それぞれ配列番号１９４及び配列番号２０２
の、重鎖及び軽鎖の配列を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１０又は１１記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項１３】
ａ）配列番号２１及び１９；又は、
ｂ）配列番号２３及び１９；又は、
ｃ）配列番号２５及び１９；又は、
ｄ）配列番号２７及び１９；又は、
ｅ）配列番号２９及び１９；又は、
ｆ）配列番号４４及び５１；又は、
ｇ）配列番号６３及び７３；又は、
ｈ）配列番号８５及び９５；又は、
ｉ）配列番号１１５及び１２２；又は、
ｊ）配列番号１９６及び２０２
の配列を含む、請求項１０記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項１４】
請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子と、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアとを含む、組成物。
【請求項１５】
眼内送達用に配合された、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
１２ｍｇ／眼の前記ペプチドタグ付き分子を含む、請求項１４又は１５記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１記載のペプチドタグをコードする核酸。
【請求項１８】
請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子をコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、哺乳類の細胞株である、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２０又は２１記載の宿主細胞を、前記ペプチドタグ又は前記ペプチドタグ付き分子を産生するのに適切な条件下において培養することと、前記ペプチドタグ又は前記ペプチドタグ付き分子を単離することとを含む、
請求項１記載のペプチドタグ又は請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子を製造するための方法。
【請求項２３】
医薬として使用するための、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項２４】
眼用の医薬として使用するための、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項２５】
対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項２６】
血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症からなる群から選択される状態又は障害の処置において使用するための、請求項２５記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項２７】
医薬として使用するための、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
眼用の医薬として使用するための、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項２７又は２８記載の組成物。
【請求項３０】
対象において、眼の状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、
方法。
【請求項３１】
対象において、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記網膜血管疾患に関連する状態又は障害が、血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である、請求項２９記載の組成物又は請求項３０もしくは３１記載の方法。
【請求項３３】
対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
【請求項３４】
対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
対象において、黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
対象において、黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である、請求項３３もしくは３４記載の組成物又は請求項３５もしくは３６記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害の処置において使用するための、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合している請求項１記載のペプチドタグを含む組成物。
【請求項３９】
対象において、ＶＥＧＦ媒介性障害を処置する方法であって、
前記対象に、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合している請求項１記載のペプチドタグを含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、請求項３８記載の組成物又は請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害が、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４２】
ペプチドタグ付き分子を製造する方法であって、該方法は、請求項１記載のペプチドタグを、タンパク質又は核酸に結合させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
網膜疾患、例えば、血管新生（ｗｅｔ）ＡＭＤ、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症は、視力喪失をもたらす血管新生成分を有する。臨床試験では、これらの疾患は、抗ＶＥＧＦ治療剤、例えば、ラニビズマブ又はベバシズマブの毎月の硝子体内注入又はアフリベルセプトによる隔月の処置により、効果的に処置され得ることが示されてきた。これらの治療剤の有効性にもかかわらず、毎月又は隔月での処置は、患者及び医師にとっての明らかな健康管理の負担である（Oishi et al. (2011) Eur J Ophthalmol. Nov-Dec;21 (6):777-82）。このため、より低い頻度でも送達されることができ、これらの薬剤による毎月又は隔月での処置により見られるのと同じ治療利益をも提供する、眼の治療に対する必要性が存在する。
【０００２】
眼は、複数の別個の区画、例えば、角膜、眼房水、レンズ、硝子体液、網膜、網膜色素上皮及び脈絡膜を有する複雑な組織である。これらの区画の組成は変動するが、それらは、一般的には、細胞からなることが、文献に記載されており、細胞外巨大分子、例えば、ヒアルロン酸を含む。本発明は、硝子体におけるヒアルロン酸と結合するペプチドタグについて述べており、それが結合した分子が、より長い眼における半減期、より長い眼における保持及び眼の疾患における作用のより長い持続時間を有することを可能にする。
【０００３】
本発明は、眼からの治療用分子のクリアランスを低下させることにより、その眼における半減期を増大させるために、治療用分子に結合し得るペプチドタグを提供する。例えば、ペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子に対して、眼における有効性の増大した持続期間を有し、より低い頻度の眼内注入及び改善した患者処置を、臨床的にもたらすであろうことが本願明細書に記載されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、本願明細書に記載されたように、眼におけるヒアルロナン（ＨＡ）と結合するペプチドタグに関する。特定の態様では、本発明は、本願明細書に記載されたように、９．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるヒアルロナン（ＨＡ）と結合するペプチドタグに関する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。本発明は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含む、ＨＡと結合するか、又は、結合可能な、単離されたペプチドタグにも関する。
【０００５】
本発明は、タンパク質又は核酸に結合した１つ以上のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子にも関する。この場合、前記ペプチドタグは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含む。ペプチドタグがタンパク質に結合する場合、前記タグは、このようなタンパク質のアミノ酸に結合し得る。前記ペプチドタグが核酸に結合する場合、前記タグは、このような核酸のヌクレオチドに結合し得る。特定の態様では、前記ペプチドタグは、タンパク質分子のＮ−末端及び／もしくはＣ−末端に結合し、又は、核酸の５’及び／もしくは３’端に結合すると考えられる。さらに、前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸に直接結合してもよいし、又は、前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸に、リンカーを介して間接的に結合してもよい。本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子は、医薬として有用であり得ると考えられる。
【０００６】
本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、タンパク質、例えば、抗体もしくは抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体又は設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）に結合したペプチドタグを含む。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、アプタマーに結合したペプチドタグを含む。前記ペプチドタグ付き分子は、ＶＥＧＦ、Ｃ５、因子Ｐ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２及び／又はＰＤＧＦ−ＢＢと結合すると考えられる。
【０００７】
本発明は、ＶＥＧＦと結合し、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、Ｃ５と結合し、それぞれ配列番号３７、３８及び３９の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号４６、４７及び４８の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、因子Ｐと結合し、それぞれ配列番号５３、５４及び５５の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号６５、６６及び６７の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、ＥＰＯと結合し、それぞれ配列番号７５、７６及び７７の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号８６、８７及び８８の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、ＴＮＦαと結合し、それぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１７、１１８及び１１９の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、ＩＬ−１βと結合し、それぞれ配列番号１８９、１９０及び１９１の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１９８、１９９及び２００の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。
【０００８】
本発明は、それぞれ配列番号７及び配列番号１７；それぞれ配列番号４０及び配列番号４９；それぞれ配列番号５９及び配列番号７１；それぞれ配列番号８１及び配列番号９２；それぞれ配列番号１１１及び配列番号１２０；又は、それぞれ配列番号１９３及び配列番号２０１の配列を有する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインをさらに含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。特定の態様では、本発明は、それぞれ配列番号９及び配列番号１９；それぞれ配列番号４２及び配列番号５１；それぞれ配列番号６１及び配列番号７３；それぞれ配列番号８３及び配列番号８５；それぞれ配列番号１１３及び配列番号１２２；それぞれ配列番号１９４及び配列番号２０２の、重鎖及び軽鎖の配列を有する、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子に関する。より具体的には、前記ペプチドタグ付き分子は、それぞれ、配列番号２１及び１９；配列番号２３及び１９；配列番号２５及び１９；配列番号２７及び１９；配列番号２９及び１９；配列番号４４及び５１；配列番号６３及び７３；配列番号８５及び９５；配列番号１１５及び１２２；又は、配列番号１９６及び２０２の、タグ付き重鎖配列及び軽鎖配列を含む。
【０００９】
本発明は、表１、２、８、８ｂ、９又は９ｂに記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子にも関する。より具体的には、特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６、ＮＶＳ３７、ＮＶＳ７０Ｔ、ＮＶＳ７１Ｔ、ＮＶＳ７２Ｔ、ＮＶＳ７３Ｔ、ＮＶＳ７４Ｔ、ＮＶＳ７５Ｔ、ＮＶＳ７６Ｔ、ＮＶＳ７７Ｔ、ＮＶＳ７８Ｔ、ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２Ｔ、ＮＶＳ８３Ｔ、ＮＶＳ８４Ｔ、ＮＶＳ１ｂ、ＮＶＳ１ｃ、ＮＶＳ１ｄ、ＮＶＳ１ｅ、ＮＶＳ１ｆ、ＮＶＳ１ｇ、ＮＶＳ１ｈ又はＮＶＳ１ｊである。
【００１０】
本発明は、前記ペプチドタグ、例えば、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を有するペプチドタグを含む組成物にも関する。本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子、特に、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列の配列を有するペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子に関する。特定の態様では、本願明細書に記載された組成物は、さらに、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアを含む。前記組成物は、眼送達（例えば、眼内）用に配合されてもよいと考えられる。特定の態様では、前記眼送達用組成物は、９．０μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグを含んでもよい。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の態様では、前記組成物は、１２ｍｇ以下の前記ペプチドタグ付き分子を含む。更なる態様では、前記組成物は、投与あたりに、１２ｍｇ／眼以下のペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。特定の態様では、本願明細書に記載された組成物は、６ｍｇ／５０μｌ以下のペプチドタグ付き分子を含む。本発明の特定の態様では、前記組成物は、１２ｍｇ以下の前記ペプチドタグを含むと考えられる。
【００１１】
本発明の別の態様は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含むペプチドタグをコードする核酸分子を提供する。より具体的には、前記核酸分子は、ペプチドタグＨＡ１０．１、ＨＡ１０．２、ＨＡ１１又はＨＡ１１．１をコードしてもよい。本発明の更なる態様は、表１、２、８、８ｂ、９又は９ｂに記載されたペプチドタグ付き分子をコードする核酸分子を提供する。特定の態様では、前記核酸分子は、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６、ＮＶＳ３７、ＮＶＳ７０Ｔ、ＮＶＳ７１Ｔ、ＮＶＳ７２Ｔ、ＮＶＳ７３Ｔ、ＮＶＳ７４Ｔ、ＮＶＳ７５Ｔ、ＮＶＳ７６Ｔ、ＮＶＳ７７Ｔ、ＮＶＳ７８Ｔ、ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２Ｔ、ＮＶＳ８３Ｔ、ＮＶＳ８４Ｔ、ＮＶＳ１ｂ、ＮＶＳ１ｃ、ＮＶＳ１ｄ、ＮＶＳ１ｅ、ＮＶＳ１ｆ、ＮＶＳ１ｇ、ＮＶＳ１ｈ又はＮＶＳ１ｊをコードしてもよい。特定の具体的な態様では、前記核酸分子は、配列番号１０、２０、２２、２４、２６、２８及び／又は３０の配列を含む。
【００１２】
本発明は、本願明細書に記載された核酸を含む発現ベクターに関する。より具体的には、例えば、前記発現ベクターは、表１及び２に記載された核酸を含んでもよい。特定の態様では、本発明は、さらに、本願明細書に記載された１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。この場合、前記宿主細胞は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を有するペプチドタグの産生に使用されてもよい。あるいは、本願明細書に記載された１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞は、表１、２、８、８ｂ、９又は９ｂに記載されたペプチドタグ付き分子の産生に使用されてもよい。特定の態様では、前記宿主細胞は、哺乳類の細胞であると考えられる。
【００１３】
本願明細書に記載された宿主細胞は、本発明のペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子を産生するために有用であると考えられる。このため、本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子、例えば、表１、２、８、８ｂ、９又は９ｂに記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を製造するための方法に関する。前記方法は、さらに、前記宿主細胞を、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を産生するのに適切な条件下において培養する工程と、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子をさらに単離する工程とを含むと考えられる。
【００１４】
本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子を含む組成物に関する。前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び／又は組成物は、治療用、より具体的には、眼の治療用に有用であり得ると考えられる。さらに、前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び／又は組成物は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記網膜血管疾患は、血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症であり得る。あるいは、前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び／又は組成物は、対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
【００１５】
本発明の特定の具体的な態様では、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子を含む組成物は、対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記ＶＥＧＦ媒介性障害は、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症であり得る。特定の具体的な態様では、ＶＥＧＦ媒介性障害を処置するために有用な組成物は、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
【００１６】
本発明は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法であって、前記対象に、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含む方法にも関する。特定の具体的な態様では、前記方法は、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。
【００１７】
特定の態様では、前記網膜血管疾患に関連する状態又は障害は、血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
【００１８】
本発明は、さらに、対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、前記対象に、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。特定の具体的な態様では、前記方法は、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の態様では、前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
【００１９】
本発明は、さらに、対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害を処置する方法であって、前記対象に、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグを含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の態様では、前記方法は、対象の眼におけるＶＥＧＦ媒介性障害を処置することに関する。本発明は、さらに、対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害を処置する方法であって、前記対象に、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含むペプチドタグを含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列、ならびに、それぞれ配列番号１２、１３及び１４の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３の配列を含むと考えられる。特定の具体的な態様では、前記ＶＥＧＦ媒介性障害は、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症である。
【００２０】
本発明は、眼における分子の半減期、平均滞留時間もしくは最終濃度を増大させ、又は、眼からの分子のクリアランスを低下させる方法であって、対象の眼に、ペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する方法にも関する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫｄで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。
【００２１】
本発明は、分子の眼における半減期を増大させる方法であって、前記分子を、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法にも関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼における平均滞留時間を増大させる方法であって、前記分子を、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼における最終濃度を増大させる方法であって、前記分子を、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼におけるクリアランスを低下させる方法であって、前記分子を、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。前述の方法それぞれにおいて、前記ペプチドタグは、９．０μＭ、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含む。
【００２２】
本発明は、さらに、眼送達用の組成物を製造する方法であって、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグを、前記眼におけるターゲットと結合する分子に結合させる工程を含む方法に関する。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。本発明は、さらに、分子、例えば、タンパク質又は核酸に結合した、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６の配列を含むペプチドタグ付き分子を製造する方法に関する。特定の態様では、前記ペプチドタグを分子に結合させることにより、眼に投与された場合、前記タグを含まない分子と比較して、低下した眼におけるクリアランス、増大した眼における平均滞留時間及び／又は増大した眼における最終濃度を有する、ペプチドタグ付き分子が形成されると考えられる。
【００２３】
定義
特に断らない限り、本願明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野において通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２４】
本願明細書で使用する場合、「抗体」の用語は、全長抗体を意味する。全長抗体は、ジスルフィド結合により相互に結合した、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖には、重鎖可変領域（本願明細書において、ＶＨと省略される）及び重鎖定常領域が含まれる。前記重鎖定常領域には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。各軽鎖には、軽鎖可変領域（本願明細書において、ＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域が含まれる。前記軽鎖定常領域には、１つのドメイン、ＣＬが含まれる。前記ＶＨ及びＶＬの領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている散在領域に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬには、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが含まれ、下記順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ−末端からカルボキシ−末端に配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。前記抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介する場合がある。
【００２５】
本願明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合フラグメント」の用語は、所定の抗原（例えば、血管内皮細胞増殖因子：ＶＥＧＦ）に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合能は、完全な抗体のフラグメントにより発揮され得る。前記抗体の抗原結合フラグメントの用語内に包含される結合フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；１つのドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341 :544-546）があげられる。前記ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる。
【００２６】
さらに、前記Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、前記ＶＬ及びＶＨ領域対が一価の分子を形成する１つのタンパク質鎖を形成するのを可能にする、人工的なペプチドリンカーにより結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；及び、Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照のこと。）。このような一本鎖抗体は、抗体の１つ以上の抗原結合フラグメントを含んでもよい。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。前記フラグメントは、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
【００２７】
抗原結合フラグメントは、単一のドメイン抗体、ｍａｘｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖにも包含され得る（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照のこと。）。抗体の抗原結合部分は、ポリペプチド、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）に基づく足場に移植され得る（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照のこと。同特許には、フィブロネクチンポリペプチドのｍｏｎｏｂｏｄｙが記載されている。）。
【００２８】
抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に包含され得る。前記セグメントは、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００２９】
「アミノ酸」の用語は、天然由来及び合成のアミノ酸、ならびに、天然由来のアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を意味する。天然由来のアミノ酸は、遺伝情報によりコードされているもの、及び、後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の全体的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然由来のアミノ酸に類似する様式で機能する化合物を意味する。
【００３０】
「補体Ｃ５タンパク質」又は「Ｃ５」の用語は、互換的に使用され、種々の種における補体成分５タンパク質を意味する。例えば、ヒトＣ５は、配列番号９９（表２ｂを参照のこと。）に示された配列を有する。ヒトＣ５は、当分野において公知であり、Ｑｕｉｄｅｌから得ることができる（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ  Ａ４０３）。
【００３１】
「網膜性疾患に関連する状態又は障害」の用語は、網膜が変性し、又は、不全になる多数の状態又は疾患を意味する。これには、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ、血管新生性ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症が含まれる。ＶＥＧＦ阻害により処置され得る網膜血管疾患の解剖学的特徴としては、フルオレセイン血管造影により測定される、黄斑浮腫、静脈拡張、血管のねじれ、血管漏出、網膜出血及び微小血管異常（例えば、小動脈瘤、綿花状白斑、ＩＲＭＡ）、毛細管脱落、白血球接着、網膜虚血、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩の血管新生、網膜内出血、硝子体出血、斑点状瘢痕、網膜下線維症及び網膜線維症があげられる。
【００３２】
「網膜血管疾患に関連する状態又は障害」の用語は、網膜の異常な血管新生（例えば、増大又は低下）が存在する状態を意味する。網膜血管疾患に関連する状態又は障害としては、血管新生性加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び未熟児網膜症があげられる。
【００３３】
「糖尿病性網膜症に関連する状態又は障害」の用語は、網膜の血管系、網膜の代謝、網膜色素上皮、血液−網膜関門又は、最終糖化産物（ＡＧＥ）、アルドース還元酵素活性、グリコシル化ヘモグロビン及びプロテインキナーゼＣの眼におけるレベルにおける、糖尿病（１型又は２型）の影響の結果として、網膜が変性し、又は、不全になる、数多くの状態のいくつかを意味する。糖尿病性網膜症の患者における視力低下は、網膜虚血、黄斑浮腫、血管漏出、硝子体出血の結果であるか、又は、網膜神経における上昇したグルコースレベルの直接的な影響であり得る。ＶＥＧＦ阻害により処置され得る糖尿病性網膜症の解剖学的特徴としては、小動脈瘤、綿花状白斑、静脈拡張、黄斑浮腫、網膜内の微小血管異常（ＩＲＭＡ）、網膜内出血、血管増殖、視神経乳頭の血管新生、皮膚紅潮及び網膜虚血があげられる。「糖尿病性黄斑浮腫」は、糖尿病性網膜症の対象において起こり、前記疾患のいずれかの段階において起こり得る。
【００３４】
「黄斑浮腫に関連する状態又は障害」の用語は、斑点の膨張又は濃厚化が、網膜血管漏出液の結果である「黄斑浮腫」として生じる、多数の状態又は障害を意味する。黄斑浮腫は、網膜血管疾患の合併症において生じ、又は、多くの場合、同合併症である。黄斑浮腫に関連する具体的な状態又は障害としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症があげられる。ＶＥＧＦ阻害による黄斑浮腫の処置は、眼底検査、光干渉断層撮影及び改善した視力により決定され得る。
【００３５】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を除外するものではなく、これらに追加されるものである。下記８つのグループ：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び、８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと。）。一部の実施形態では、「保存的配列修飾」又は「保存的修飾」の用語は、前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に明らかに影響を及ぼさない、又は、変更しない、アミノ酸修飾を意味するのに使用される。
【００３６】
本願明細書で使用する場合、「ＤＡＲＰｉｎ」（設計アンキリン反復タンパク質についての頭字語）の用語は、典型的に高い特異性及び高い親和性のターゲットタンパク質結合を示す、抗体模倣物タンパク質を意味する。それらは、典型的には、天然のアンキリンタンパク質から、遺伝子操作及び誘導され、少なくとも３つの、通常、４つ又は５つの、これらのタンパク質の繰り返しモチーフからなる。その分子量は、４又は５つの反復ＤＡＲＰｉｎそれぞれについて、約１４又は１８ｋＤａ（キロダルトン）である。ＤＡＲＰｉｎの例は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号明細書に見出され得る。
【００３７】
「用量」の用語は、対象に、一時に全て（単位用量）を投与される、又は、所定の時間間隔にわたって２回以上投与される、ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子、タンパク質又は核酸の量を意味する。例えば、用量は、３週間又は１、２、３ヶ月又はそれ以上の経過にわたって、（例えば、１回の投与により、又は、２回又はそれ以上の投与により）対象に投与されたタンパク質（例えば、ペプチドタグ付き分子、例えば、抗ＶＥＧＦ抗原結合フラグメント及びＨＡと結合しているペプチドタグを含むペプチドタグ付きタンパク質）の量を意味し得る。投与の間隔は、任意の所望の時間であってよく、「投与間隔」と呼ばれる。用量に言及する場合に、「薬学的に有効な」の用語は、所望の効果を提供するのに十分な量の、前記タンパク質（例えば、抗体又は抗原結合フラグメント）、ペプチドタグ又は薬学的に活性な薬剤を意味する。「有効」である量は、年齢及び個体の全体的な状態、具体的な薬剤又は薬学的に活性な薬剤等に応じて、対象間で変動するであろう。このため、全ての患者に適した、正確な「有効」量を特定するのは、常に可能なわけではない。ただし、任意の個体の場合における適切な「有効」用量は、通常の検査を使用して、当業者により決定され得る。
【００３８】
「Ｅｐｏタンパク質」もしくは「Ｅｐｏ抗原」又は「ＥＰＯ」もしくは「Ｅｐｏ」の用語は、互換的に使用され、種々の種におけるエリスロポエチンタンパク質を意味する。例えば、ヒトＥＰＯは、表２ｂ：配列番号９８に示された配列を有する。ヒト、カニクイザル、マウス、ラット及びウサギのＥｐｏについてのタンパク質配列は、公衆に利用可能である。ヒトＥＰＯも、過剰グリコシル化され得る。
【００３９】
「Ｅｐｏ受容体」又は「ＥＰＯＲ」の用語は、互換的に使用され、エリスロポエチン受容体タンパク質を意味し、種々の種におけるエリスロポエチン受容体タンパク質を意味する。ＥＰＯＲは、Winkelmann J.C., Penny L.A., Deaven L.L., Forget B.G., Jenkins R.B.BIood 76:24-30(1990)に記載されている。
【００４０】
「因子Ｄタンパク質」又は「因子Ｄ抗原」又は「因子Ｄ」の用語は、互換的に使用され、種々の種における因子Ｄタンパク質を意味する。ヒト因子Ｄの配列は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（FEBS Lett. 1984 Jan 30;166(2):347- 51）により記載されている。因子Ｄの抗体は、当分野において公知であり、米国特許第８２７３３５２号明細書に記載されている。
【００４１】
「因子Ｐタンパク質」又は「因子Ｐ抗原」又は「因子Ｐ」の用語は、互換的に使用され、種々の種における因子Ｐタンパク質を意味する。例えば、ヒト因子Ｐは、表２ｂ：配列番号１００に示された配列を有する。ヒト因子Ｐは、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸから得ることができる。カニクイザルの因子Ｐは、カニクイザルの血清から精製され得る（Nakano et al., (1986) J Immunol Methods 90:77- 83から改良したプロトコル）。因子Ｐは、「プロパージン」としても当分野において公知である。
【００４２】
「ＦＧＦＲ２」の用語は、種々の種における繊維芽細胞増殖因子受容体２を意味する。ＦＧＦＲ２は、Dionne C.A., Crumley G.R., Bellot F., Kaplow J.M., Searfoss G., Ruta M., Burgess W.H., Jaye M., Schlessinger J.EMBO J. 9:2685-2692(1990)に記載されている。
【００４３】
「ヒアルロナン」又は「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」の用語は、細胞外マトリクス中又は細胞表面上に生じる、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との繰り返し二糖類単位を含む大型のポリマー性グリコサミンを意味する。さらに、ヒアルロナンは、J. Necas, L. Bartosikova, P. Brauner, J. Kolar, Veterinarni Medicina, 53, 2008 (8):397- 411に記載されている。
【００４４】
「ヒアルアドへリン」又は「ヒアルロナン結合タンパク質」又は「ＨＡ結合タンパク質」の用語は、ヒアルロナンと結合するタンパク質又はタンパク質ファミリーを意味する。ＨＡ結合タンパク質の例は、当分野において公知である（Day, et al. 2002 J Bio.Chem 277:7, 4585及びYang, et al. 1994, EMBO J 13:2, 286-296）（例えば：Ｌｉｎｋ、ＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ、アグリカン、ベルシカン、細菌のＨＡ合成酵素、コラーゲンＶＩ及びＴＳＧ−６）。多くのＨＡ結合タンパク質及びペプチドフラグメントは、ＨＡ結合に関与する長さ約１００個のアミノ酸の共通構造ドメインを含む。前記構造ドメインは、「ＬＩＮＫドメイン」と呼ばれる（Yang, et al. 1994, EMBO J 13:2, 286-296及びMahoney, et al. 2001 , J Bio.Chem 276:25, 22764-22771）。例えば、ＨＡ結合タンパク質である、ＴＳＧ−６のＬＩＮＫドメインは、ヒトＴＳＧ−６配列（配列番号３０）のアミノ酸残基３６−１２８を含む。
【００４５】
本願明細書で使用する場合、「ヒト抗体」の用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列から得られる可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、前記抗体が定常領域を含む場合、前記定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系配列又はヒト生殖系配列の変異型から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発により、又は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導かれる変異）を含んでもよい。
【００４６】
「ヒトモノクローナル抗体」の用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト配列に由来する可変領域を有する、１つの結合特異性を示す抗体を意味する。一実施形態では、前記ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００４７】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持するが、ヒトにおける免疫原性がほとんどない抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残り部分をそのヒトカウンターパート（すなわち、定常領域及び可変領域のフレームワーク部分）により置き換えることにより達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 -6855, 1984；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；及びPadlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照のこと。ヒト遺伝子操作技術の他の例としては、限定されるものではないが、米国特許第５，７６５，８８６号明細書に開示されたＸｏｍａ技術があげられる。
【００４８】
２つ以上の核酸又はポリペプチドの配列についての、「同一」又はパーセント「同一性」の用語は、２つ以上の配列又はサブ配列が同じであることを意味する。比較ウインドウにわたって最大の一致を比較及び整列させるか、又は、下記配列比較アルゴリズムの１つを使用するか、もしくは、手動のアライメント及び目視検査によって測定される領域を指定した際、２つの配列が、特定の割合の、同じ（すなわち、特定の領域にわたって、又は、特定しない場合には配列全体にわたって、６０％同一性、場合により、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一性の）アミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意に、前記同一性は、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド（又は１０個のアミノ酸）の領域にわたって、又はより好ましくは、長さが１００から５００個又は１０００個又はそれ以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００個又はそれ以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００４９】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要に応じて、配列座標が指定される。配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は、別のパラメータが指定され得る。ついで、前記配列比較アルゴリズムは、前記プログラムパラメータに基づいて、前記参照配列に対する前記試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、２０から６００、一般的には、約５０から約２００、より一般的には、約１００から約１５０からなる群から選択される数の連続的な位置のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。そして、前記２つの配列が最適に整列された後に、配列は、同じ数の連続的な位置の参照配列に対して比較されてもよい。比較のための配列のアライメント方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman(1970)Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似法用検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wlにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は、手動アライメント及び目視検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)を参照のこと。）により行われ得る。
【００５１】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０のアルゴリズムである。前記２つのアルゴリズムは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；及び、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990それぞれに記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、照会配列において長さＷのショートワードを特定することにより、高いスコアリングの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。前記特定は、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合、いくつかの正の値を有する閾値スコアＴにマッチするか、又は、同スコアＴを満たすかのいずれかである。Ｔは、近接ワードスコア閾値（Altschul et al、上記）と呼ばれる。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチする残基についての報酬スコア；通常＞０）及びＮ（マッチしない残基についてのペナルティスコア；通常＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスが、前記累積スコアを算出するために使用される。各方向における前記ワードヒットの伸長は、前記累積アライメントスコアが、その最大達成値からの量Ｘにより減少し；前記累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積によりゼロ以下になり；又は、いずれかの配列の端部に達した時点で停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、前記アライメントの感受性及びスピードを決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長及び１０の予測（Ｅ）ならびに、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照のこと。）アライメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する
【００５２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間における類似性の統計学的分析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照のこと。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））である。前記最少合計確率は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における前記最少合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは、約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【００５３】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:1 1-17, 1988）を使用しても決定され得る。前記アルゴリズムは、ＰＡＭ１２０重量残基表（PAM120 weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に包含されている。さらに、前記２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）のアルゴリズムを使用して決定され得る。前記アルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍのワールド・ワイド・ウェブにおいて利用可能）におけるＧＡＰプログラムに包含されている。前記ＧＡＰプログラムは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５又は６の長さ重みを使用する。
【００５４】
上記配列同一性の割合以外に、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と、免疫学的に交差反応性であることである。このため、ポリペプチドは、典型的には、例えば、前記２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドに対して実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、前記２つの分子又はその相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーが前記２つの核酸配列を増幅するために使用され得ることである。
【００５５】
「単離された抗体」の用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体又は他のタンパク質を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、ＶＥＧＦと特異的に結合する単離された抗体は、ＶＥＧＦ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。ただし、ＶＥＧＦと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質、例えば、細胞上清から単離された抗体を実質的に含まない場合がある。
【００５６】
「ＩＬ−１β」の用語は、ヒトにおいて、ＩＬ１Ｂ遺伝子によりコードされるサイトカインである、インターロイキン−１ベータタンパク質を意味する。例えば、ヒトＩＬ−１βは、表２ｂ：配列番号１０２に示された配列を有する。
【００５７】
「ＩＬ−１０」又は「ＩＬ１０」の用語は、互換的に使用され、インターロイキン−１０タンパク質を意味し、種々の種のインターロイキン−１０タンパク質を意味する。ＩＬ１０は、Vieira P., de Waal-Malefyt R., Dang M.-N., Johnson K.E., Kastelein R., Fiorentino D.F., Devries J.E., Roncarolo M.-G., Mosmann T.R., Moore K.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:1172-1176(1991)に記載されている。
【００５８】
「ＩＬ−１７Ａ」の用語は、インターロイキン１７Ａを意味し、３５ｋＤａの分子量を有する、ジスルフィド結合した、ホモ二量体の分泌型糖タンパク質である、１５５個のアミノ酸のタンパク質である（Kolls JK, Linden A 2004, Immunity 21 :467-76）。
【００５９】
「アイソタイプ」の用語は、重鎖定常領域の遺伝子により提供される、抗体分類（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）を意味する。アイソタイプは、これらの分類の１つの修飾型も含む。この場合、修飾は、Ｆｃ機能を変更する、例えば、Ｆｃ受容体に対するエフェクタ機能又は結合を増大又は低下させるようになされている。
【００６０】
「結合した」又は「結合する」の用語は、ペプチドタグ、例えば、表１及び２に列記された、ＨＡと結合するペプチドタグの、分子、例えば、タンパク質又は核酸への結合を意味する。前記ペプチドタグのタンパク質又は核酸分子への結合は、例えば、前記分子のアミノ又はカルボキシ末端において生じ得る。前記ペプチドタグは、前記分子のアミノ及びカルボキシ末端の両方にも結合し得る。前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸分子それぞれの中の、１つ以上のアミノ酸又は核酸にも結合し得る。さらに、「結合した」は、２つ以上のペプチドタグが互いに会合すること、及び／又は、２つ以上のペプチドタグが分子の異なる部位に会合することも意味し得る。前記ペプチドタグの分子への結合は、当分野において公知の複数の方法、例えば、限定されるものではないが、融合タンパク質としての前記ペプチドタグ及び分子の発現、２つ以上のペプチドタグのタグ及び／又は分子間の「ペプチドリンカー」を介した結合により、あるいは、互いに直接又はジスルフィド結合によるリンカーを介して、翻訳後にペプチドタグを分子に化学的に結合させることにより達成され得る。
【００６１】
「ペプチドリンカー」の用語は、前記ペプチドタグを分子に共有結合させるように機能するアミノ酸配列を意味する。前記ペプチドリンカーは、ペプチドタグ及び／もしくはタンパク質のアミノ又はカルボキシ末端の一方又は両方、又は、核酸分子に共有結合してもよい。前記ペプチドリンカーは、タンパク質又は核酸分子それぞれの配列内のアミノ酸又は核酸にコンジュゲートされてもよい。ペプチドリンカーは、例えば、長さが約２から２５個の残基でもよいと考えられる。
【００６２】
本願明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」の用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００６３】
本願明細書において、「核酸」の用語は、「ポリヌクレオチド」の用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態におけるそれらのポリマーを意味する。前記用語は、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。前記核酸は、合成、天然由来及び非天然由来であり、参照核酸と類似する結合特性を有し、前記参照ヌクレオチドに類似する態様で代謝される。このような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデータ、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）があげられる。
【００６４】
特に断らない限り、特定の核酸配列は、暗黙の内に、その保存的に修飾された変異体（例えば、変性コドン置換）及び相補配列ならびに明確に示された配列も包含する。具体的には、以下に詳述されるように、変性コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することにより達成されてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；及び、Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【００６５】
「クリアランス」の用語は、単位時間あたりに消失する物質（例えば、マトリクス、組織、血漿、又は、他の物質（例えば、薬剤又は、例えば、ペプチドタグ付き分子等））の容積であることを意味する（Shargel, L and Yu, ABC: Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, 4th Edition(1999)）。「眼におけるクリアランス」は、眼からの物質、例えば、ペプチドタグ付き分子のクリアランスを意味する。
【００６６】
「操作可能に結合した」の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、前記用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を意味する。例えば、プロモータ又はエンハンサ配列は、それが、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に操作可能に結合する。一般的には、転写される配列に操作可能に結合するプロモータ転写調節配列は、前記転写される配列に対して物理的に連続している。すなわち、それらは、シス作用性である。ただし、一部の転写調節配列、例えば、エンハンサは、物理的に連続している必要がないか、又は、それらにより転写が増大するコード配列に近接して配置される必要がない。
【００６７】
本願明細書で使用する場合、「最適化された」の用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞又は生物（一般的には、真核生物の細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞）において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、本来開始ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を完全に、又は、可能な限り高く維持するように操作される。前記開始ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知である。本願明細書において、前記最適化された配列は、哺乳類の細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。ただし、他の真核生物の細胞又は原核生物の細胞におけるこれらの配列の最適化された発現は、本願明細書においても想定されている。前記最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列は、最適化とも呼ばれる。
【００６８】
「ＰＤＧＦ−ＢＢ」の用語は、血小板由来の増殖因子サブユニットＢを意味する。このタンパク質は、Josephs S.F., Ratner L, Clarke M.F., Westin E.H., Reitz M.S., Wong-Staal F.Science 225:636-639(1984)に記載されている。
【００６９】
「ペプチドタグ」又は「タンパク質タグ」の用語は、種々の眼の区画、例えば、硝子体、網膜、ＲＰＥ、脈絡膜、眼房水、小柱網、角膜又は毛様体において見出された分子と結合する、短いタンパク質配列、ペプチドフラグメント又はペプチド模倣物を意味するように、互換的に使用される。例えば、前記ペプチドタグに結合する眼の分子は、構造的な硝子体、網膜及びＲＰＥのタンパク質、例えば、コラーゲン及びラミニン：細胞外タンパク質、例えば、エラスチン、フィブロネクチン及びビトロネクチン；可溶性タンパク質、例えば、アルブミン；膜貫通タンパク質、例えば、インテグリン；ならびに、炭水化物含有分子、例えば、ヒアルロン酸、グルコサミングリカン及び他の細胞外プロテオグリカンを含み得る。ペプチドタグの具体例としては、例えば、ＨＡと結合するペプチドタグ（すなわち、ＨＡ結合ペプチドタグ）があげられる。本発明のペプチドタグ、例えば、ＨＡと結合するペプチドタグは、ペプチドタグに結合していない同じ分子（すなわち、タグ付けされていない分子）と比較して、眼における半減期（Ｔ１／２又はｔ１／２）を増大させ、及び／又は、平均眼平均滞留時間を増大させ、及び／又は、眼におけるクリアランス速度を低下させ、及び／又は、ペプチドタグ付き分子（例えば、タンパク質又は核酸）の投与間隔を長くし得る。
【００７０】
ペプチドタグは、当分野において公知の複数の方法、例えば、限定されるものではないが、融合タンパク質としての前記タンパク質タグの発現、２つ以上のタンパク質タグのタグ間のペプチドリンカーを介した結合、又は、互いに直接又はジスルフィド結合によるリンカーを介して、翻訳後にペプチドタグを化学的に結合させることにより、多量体を形成するように結合し得る。「ペプチドタグ付き分子」の用語は、本発明の１つ以上のペプチドタグに結合している分子を意味する。前記分子は、限定されるものではないが、タンパク質又は核酸でもよい。「タグ付き抗体」又は「ペプチドタグ付き抗体」の用語は、本発明の１つ以上のタンパク質タグに結合している、抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。「ペプチドタグ付き抗原結合フラグメント」の用語は、本発明の１つ以上のタンパク質タグに結合している抗原結合フラグメントを意味する。
【００７１】
本願明細書で使用する場合、「半減期」の用語は、薬剤の濃度が１／２に低下するのに必要とされる時間を意味する（Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995)及び、Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004)）。
【００７２】
本願明細書で使用する場合、「平均滞留時間」又は「ＭＲＴ」の用語は、薬剤（例えば、ペプチドタグ付き分子）が、身体、例えば、特定の臓器又は組織（例えば、眼）に残存する平均時間である。
【００７３】
本願明細書で使用する場合、「Ｃｔｒｏｕｇｈ」の用語は、投与期間全体を通してマトリクス又は組織において測定された薬剤の最も低い濃度を意味する。前記濃度は、繰り返しの用量投与の直前に最も頻繁に生じる。
【００７４】
本願明細書で使用する場合、「タンパク質」の用語は、１つ以上の直鎖状に配置されたアミノ酸から構成され、球状の形態に折り畳まれている、いずれかの有機化合物を意味する。ポリマー鎖におけるアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル及びアミノ基間において、ペプチド結合により互いに結合されている。「タンパク質」の用語は、限定されるものではないが、さらに、ペプチド、一本鎖ポリペプチド又は、主にアミノ酸の２つ以上の鎖からなるいずれかの複合体分子を含む。それは、さらに、限定されるものではないが、糖タンパク質又は他の公知の翻訳後修飾を含む。それは、さらに、天然のタンパク質の公知の天然又は人工の化学修飾、例えば、限定されるものではないが、糖鎖操作、ペグ化、ヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）等、非天然アミノ酸の包含及び別の分子との化学結合のためのアミノ酸修飾を含む。
【００７５】
本願明細書で使用する場合、「組換えヒト抗体」の用語は、組換え法により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランスクロモゾーマルである動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、前記ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ならびに、他のＤＮＡ配列に対する配列であるヒト免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部のスプライシングを含むいずれかの他の手段により調製、発現、生成又は単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。ただし、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対する動物トランスジェニックが使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞性変異誘発）に供され得る。このため、前記組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、同配列に関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ヒト抗体の生殖系レパートリ内には天然には存在し得ない配列である。
【００７６】
「組換え宿主細胞」（又は、単に「宿主細胞」）の用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。このような用語は、特定の対象となる細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図すると理解されるべきである。特定の修飾が変異又は環境影響のいずれかにより続く世代において生じる場合があるため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本願明細書で使用する場合、前記「宿主細胞」の用語の範囲内に含まれる。
【００７７】
「対象」の用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物（例えば、哺乳類及び非哺乳類）、例えば、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。言及した場合を除いて、「患者」又は「対象」の用語は、本願明細書において互換的に使用される。本願明細書で使用する場合、「ｃｙｎｏ」又は「カニクイザル」の用語は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を意味する。
【００７８】
「最終濃度」の用語は、実験又は研究の最後において測定された前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子等の濃度を意味する。「最終薬剤濃度の増大」は、前記ペプチドタグ付き分子の最終濃度の少なくとも２５％の増大を意味する。
【００７９】
本願明細書で使用する場合、網膜血管疾患に関連するいずれかの状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連するいずれかの状態もしくは障害、及び／又は、黄班浮腫に関連するいずれかの状態もしくは障害の「処置すること」又は「処置」の用語は、一態様において、前記疾患又は障害を改善すること（すなわち、前記疾患の進行又はその臨床的兆候の少なくとも１つを遅延もしくは停止もしくは低下させること）を意味する。別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、患者により認識できない場合があるものを含む、少なくとも１つの肉体的パラメータを緩和又は改善することを意味する。さらに別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害を、肉体的（例えば、認識できる兆候の安定化）、生理学的（例えば、肉体的パラメータの安定化）のいずれか又は両方で調節することを意味する。さらに別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害の開始又は進行又は進展を予防又は遅延させることを意味する。それが本願明細書に記載された指標、例えば、網膜血管疾患に関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連する状態もしくは障害、及び／又は、黄班浮腫に関連する状態もしくは障害に関連する場合、「予防」は、以下に記載されたように、悪化に対するリスクがある患者における、視覚機能、網膜解剖学、網膜血管疾患パラメータ、尿病性網膜症の疾患パラメータ及び／又は黄班浮腫の疾患パラメータにおける悪化を予防又は遅延させるいずれかの作用を意味する。より具体的には、網膜血管疾患に関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連する状態もしくは障害、及び／又は、黄班浮腫に関連する状態もしくは障害の「処置」は、視覚機能及び／又は網膜解剖学の改善又は保存をもたらす、又は、もたらすと考えられるいずれかの作用を意味する。疾患の処置及び／又は予防を評価するための方法は、当分野において公知であり、本願明細書において以下に記載されている。
【００８０】
「ＴＮＦα」の用語は、内毒素又は他の刺激への応答において、多くの細胞種、例えば、単球及びマクロファージにより産生される天然由来の哺乳類のサイトカインである、腫瘍壊死因子アルファ（カケクチンとしても公知）を意味する。ＴＮＦαは、炎症、免疫及び病態生理学的反応の主要なメディエータである（Grell, M., et al.(1995)Cell, 83: 793-802）。可溶性のＴＮＦαは、前駆体膜貫通タンパク質の開裂により形成される（Kriegler, et al.(1988)Cell 53: 45-53）。分泌型の１７ｋＤａポリペプチドは、可溶性のホモ三量体複合体を構築する（Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954；ＴＮＦαのレビューについては、Butler, et al.(1986), Nature 320:584; Old(1986), Science 230: 630を参照のこと。）。ヒトＴＮＦαについての配列は、表２ｂに記載されており、配列番号１０１の配列を有する。
【００８１】
「ＴＳＧ−６」の用語は、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６を意味する。ＴＳＧ−６は、ＨＡ結合性タンパク質ファミリーのメンバーであり、ＬＩＮＫドメインを含む（Lee et al. J Cell Bio(1992)116:2, 545-57）。ＴＳＧ−６由来のＬＩＮＫドメインは、本願明細書において、「ＴＳＧ−６  ＬＩＮＫドメイン」とも呼ばれる。
【００８２】
「ベクター」の用語は、それに結合している別のポリヌクレオチドを輸送可能なポリヌクレオチド分子を意味することが意図される。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」である。前記プラスミドは、更なるＤＮＡセグメントがライゲートされていてもよい、環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の種類のベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ又はＡＡＶ２）である。この場合、更なるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム内にライゲートされてもよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的な複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、前記宿主細胞内への導入に基づいて、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得ることにより、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指揮可能である。このようなベクターは、本願明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）とも呼ばれる。一般的には、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、前記プラスミドが、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用される場合がある。ただし、本発明は、このような他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）を含むことを意図する。前記ベクターは、同等の機能を果たす。
【００８３】
「ＶＥＧＦ」の用語は、Leung et al., Science 246:1306 (1989)及びHouck et al., Mol. Endocrin. 5:1806(1991)に記載されたように、１６５個のアミノ酸の血管内皮細胞増殖因子ならびに、関連する１２１、１８９及び２０６個のアミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を意味し、それらの増殖因子の天然由来の対立形質及び処理形態を伴う。ヒトＶＥＧＦについての配列は、表２ｂに記載されており、配列番号９７の配列を有する。
【００８４】
「ＶＥＧＦ媒介性障害」の用語は、ＶＥＧＦの関与を必要とする、いずれかの障害、症状又は疾患の開始、進行もしくは持続を意味する。代表的なＶＥＧＦ媒介性障害としては、限定されるものではないが、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症があげられる。
【００８５】
本願明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」の用語は、疾患、状態又は障害の治療、予防又は改善をするのに有用なタンパク質を意味する。
【００８６】
本願明細書で使用する場合、「タンパク質受容体」の用語は、細胞受容体であり、リガンドと結合するタンパク質を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ウサギ硝子体におけるラニビズマブ及びＮＶＳ４についての、４点ＰＫ曲線を示す。
【図２】ウサギ漏出モデルにおけるｈＶＥＧＦの用量応答を示す。
【図３】タグ付けされていない抗体によるフルオレセイン漏出の阻害における時間経過を示す。
【図４】ウサギ漏出モデルにおけるタグ付き抗体の効果と最終硝子体濃度との間の相関関係を示す。
【図５】コラーゲン結合ペプチドタグについての、ウサギ漏出モデルにおける効果の持続期間を示す。
【図６】ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７のウサギ漏出モデルにおける効果の持続期間を示す。
【図７】ラニビズマブ、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２及びＮＶＳ３についての２点ＰＫプロットを示す。
【図８】ウサギ漏出モデルにおけるタグ付き抗体の効果の延長した持続期間を示す。
【図９】ウサギ漏出モデルにおけるタグ付き抗体の効果の延長した持続期間を示す。
【図１０】ＮＶＳ１についての２及び６点ＰＫプロットを示す。
【図１１】カニクイザルにおけるパイロット試験を示す。
【図１２】２８日カニクイザル忍容性試験において測定された最終薬剤レベルから得られた、眼の２点ＰＫプロットを示す。
【図１３】５９日カニクイザル効果試験において測定された最終薬剤レベルから得られた、眼の３点ＰＫプロットを示す。
【００８８】
【図１４−１】Ａ：ヒトにおけるラニビズマブについての、硝子体におけるペプチドタグ付き抗体の濃度のモデル予測を示す。用量範囲予測を示す。Ｂ：ヒトにおけるラニビズマブについての、硝子体におけるペプチドタグ付き抗体の濃度のモデル予測を示す。用量範囲予測を示す。Ｃ：ヒトにおけるラニビズマブについての、硝子体におけるペプチドタグ付き抗体の濃度のモデル予測を示す。効果の持続期間を示す。
【図１４−２】Ｄ：最初の投与後の時間にわたって、眼に残存する分子の割合における、ＨＡ結合ペプチドタグを用いた分子の半減期増大の効果を説明するモデルを示す。
【図１４−３】Ｅ：比較されるペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ２）ならびに、ラニビズマブ（０．５ｍｇ）、アフリベルセプト（２ｍｇ）及びベバシズマブ（１．２５ｍｇ）のＩＶＴ投与についての、眼における効果の持続期間を示す。Ｆ：図１４Ｅに示された投与間隔で１年間投与した後の予測された血清合計薬剤Ｃａｖｅ（ｎＭ）を示す。
【図１５】ＮＶＳ４でない抗ＶＥＧＦタンパク質による、ウサギでの効果の持続期間試験を示す。
【図１６】高い及び低い親和性変異体の、ＶＥＧＦ負荷されたウサギでの効果を示す。
【図１７】ＰＥＴ画像化によりペプチドタグ付き分子及びタグ付けされていない分子の生体分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本発明は、１つには、タンパク質又は核酸の眼における半減期及び／又は平均滞留時間を増大させるペプチドタグの発見に基づいている。特定の態様では、本発明のペプチドタグは、抗体及び抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体、ＤＡＲＰｉｎならびに／又はアプタマーの、眼における半減期及び／又は平均滞留時間を増大させる。本発明は、眼のタンパク質（例えば、ＨＡ及び／又はＶＥＧＦ）と特異的に結合し、眼における増大した半減期及び／又は平均滞留時間を示す、長く作用する抗体分子の発見にも関連する。本発明は、タンパク質タグに結合している、完全なＩｇＧ型抗体及び抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）の両方に関する。
【００９０】
ペプチドタグ
多くの要因が、タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓でのろ過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解及び免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびに、マクロファージ及び樹状細胞による取り込み）である。各種の戦略が、抗体、抗原結合フラグメント又は抗体模倣物の血清半減期を延長させるために使用され得る。例えば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンド及び炭水化物のシールドを結合させることにより；血清タンパク質、例えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ及びトランスフェリンに結合するタンパク質への遺伝子融合により；血清タンパク質、例えば、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、ａｖｉｍｅｒ、アフィボディ及びアンチカリンに結合する他の結合部分に（遺伝的又は化学的に）結合させることにより；アルブミンもしくはアルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質、抗体のＦｃ領域への遺伝子融合により；又は、ナノキャリア、遅効性製剤又は医療機器内への組み込みによる。
【００９１】
本発明は、眼におけるヒアルロナンと特異的に結合するペプチドタグを提供する。ヒアルロナンは、身体における多くの臓器、組織において、種々のサイズで存在する。例えば、ヒトの眼及び滑液はそれぞれ、０．１４〜０．３３８ｍｇ／ｍｌ及び１．４２〜３．６ｍｇ／ｍｌの最高濃度のヒアルロナン濃度を含む。一方、他の組織／体液は、非常に低い濃度のヒアルロナンを含む。例えば、血清では、ヒアルロナン濃度は、０．００００１〜０．０００１ｍｇ／ｍｌである（Laurent and Fraser, 1986 Ciba Found Symp. 1986;124:9-29）。眼以外におけるヒアルロナンは、急速に分解され、代謝回転される、主に低分子量のポリマーからなる。ヒトにおいて、ヒアルロナンは、血中で２．５〜５分の半減期を有する（Fraser JR, Laurent TC, Pertoft H, Baxter E. Biochem J. 1981 Nov 15;200(2):415-24）。対照的に、眼におけるヒアルロナンは、主に高分子量のポリマー（＞０．５×１０＾５ダルトン）からなり、数日又は数週間のより遅い代謝回転速度を有する（Laurent and Fraser, Exp. Eye Res. 1983; 36, 493-504）。眼におけるヒアルロナンのサイズ及び代謝回転のこれらの違いにより、前記眼におけるヒアルロナンは、ＨＡ結合性のペプチドタグに結合した硝子体内タンパク質及び核酸に対する持続性放出の足場として機能すると推定される。
【００９２】
推定のヒアルロナン結合タンパク質は、当分野において記載されており（J. Necas, L. Bartosikova, P. Brauner, J. Kolar. Veterinarni Medicina, 53, 2008 (8): 397-411）、例えば、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ６）、ヒアルロナン媒介性運動性受容体（ＲＨＡＭＭ）、ＣＤ４４抗原、ヒアルロナン及びプロテオグリカン結合タンパク質４、ニューロカンコアタンパク質、スタビリン−２及びヒトグリアヒアルロン酸結合タンパク質である。ただし、試験されたほとんどの推定のヒアルロナン結合タンパク質は、ＨＡと結合せず、前記推定のＨＡ結合タンパク質に結合したタンパク質又は核酸の眼における半減期を増大させなかった。本発明は、眼におけるＨＡと結合し、タンパク質又は核酸の眼における半減期を延長させ、タンパク質又は核酸の眼における最終濃度を増大させ、眼においてタンパク質又は核酸の眼におけるクリアランスを低下させ、及び／又は、タンパク質又は核酸の眼における平均滞留時間を増大させるのに適している、ペプチドタグの驚くべき発見に基づいている。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグは、９．０μＭ以下、８．５μＭ以下、８．０μＭ以下、７．５μＭ以下、７．０μＭ以下、６．５μＭ以下、６．０μＭ以下、５．５μＭ以下、５．０μＭ以下、４．５μＭ以下、４．０μＭ以下、３．５μＭ以下、３．０μＭ以下、２．５μＭ以下、２．０μＭ以下、１．５μＭ以下、１．０μＭ以下、０．５μＭ以下、又は１００ｎＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合する。より具体的な態様では、例えば、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下、７．２μＭ以下、６．０μＭ以下又は５．５μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合する。本発明の一部の態様では、ＨＡと結合する前記ペプチドタグは、ＬＩＮＫドメインを有する。本発明の特定の他の態様では、前記ＬＩＮＫドメインは、ＴＳＧ−６  ＬＩＮＫドメインである。本発明のさらに他の態様は、タンパク質分解的開裂及び／又はグリコシル化にも抵抗性を有する、前記ペプチドタグの修飾型の発見に基づいている。より具体的には、本発明は、ＨＡと結合するか、又は、結合可能な、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含むペプチドタグを含んでもよい。配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含む前記ペプチドタグは、対象の眼におけるＨＡと結合するか、又は、結合可能であると考えられる。前記ペプチドタグは、表１に列記されたペプチドタグのいずれか１つであり得ると考えられる。より具体的には、前記ペプチドタグは、ＨＡ１０、ＨＡ１０．１、ＨＡ１０．２、ＨＡ１１又はＨＡ１１．１であり得る。
【００９３】
特定の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８個の連続するアミノ酸を含む配列を有し得る。特定の他の態様では、ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含むペプチドタグのトランケート変異体であると考えられる。アミノ酸は、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含む前記ペプチドタグのＮ−末端、Ｃ−末端又は両方から開裂して、ペプチドタグＨＡ１０、ＨＡ１０．１、ＨＡ１０．２、ＨＡ１１又はＨＡ１１．１のトランケート変異体を産生してもよい。前記配列は、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６のＮ−末端から、最初のＮ−末端システイン（ただし、このＮ−末端システインは含まない）まで開裂してもよいとさらに考えられる。前記配列は、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６のＣ−末端から、最初のＣ−末端システイン（ただし含まない）まで開裂してもよいとさらに考えられる。前記配列は、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６のＮ−末端及びＣ−末端の両方から、最初のＮ−末端システイン（ただし、このＣ−末端システインは含まない）及び最初のＣ−末端システインまで（ただし、このＣ−末端システインは含まない）開裂してもよいとさらに考えられる。例えば、配列番号３２について、当業者は、Ｎ−末端から２２個までのアミノ酸（太字）、及び／又は、Ｃ−末端から６個までのアミノ酸（下線）を除去し得た。
ＧＶＹＨＲＥＡＲＳＧＫＹＫＬＴＹＡＥＡＫＡＶＣＥＦＥＧＧＨＬＡＴＹＫＱＬＥＡＡＲＫＩＧＦＨＶＣＡＡＧＷＭＡＫＧＲＶＧＹ  ＰＩＶＫＰＧＰＮＣＧＦＧＫＴＧＩＩＤＹＧＩＲＬＮＲＳＥＲＷＤＡＹＣＹＮＰＨＡＫ（配列番号３２）
【００９４】
本発明のペプチドタグは、分子に結合して、前記分子の眼における半減期を延長させることができ、例えば、前記分子は、タンパク質又は核酸でもよい。本願明細書に記載されたタンパク質タグにより修飾され得るタンパク質及び核酸の具体例としては、限定されるものではないが、抗体、抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体、ＤＡＲＰｉｎ及び／又はアプタマーならびに多価の組み合わせタンパク質及び核酸があげられる。特定の態様では、これらのタンパク質及び核酸は、眼におけるターゲットタンパク質、例えば、ＶＥＧＦ、Ｃ５、因子Ｐ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、Ｉｌ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０又はＦＧＦＲ２と結合する。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のペプチドタグは、眼におけるターゲットタンパク質と結合するタンパク質又は核酸に結合した場合、タグ付けされていない分子に対して、眼におけるクリアランスを低下させ、平均滞留時間を増大させ、半減期（Ｔ１／２）を増大させ、及び／又は、タグ付き分子（例えば、タンパク質又は核酸）の眼における最終薬剤濃度を増大させる。
【００９５】
本発明は、眼におけるＨＡと結合するか、又は、結合可能なペプチドタグを、分子（例えば、タンパク質又は核酸）に結合させることが、前記タグを含まない分子と比較して、ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性を明らかに改善するという驚くべき発見にも関する。前記ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性は、ペプチドタグを含まない分子と比較して、統計学的に有意な量（すなわち、ｐ＜０．０５）を改善すると考えられる。例えば、限定されるものではないが、タグ付けされていない型の前記分子に対して、改善された溶解性、改善された等電点（ｐＩ）及び／又はそのターゲットに対する前記ペプチドタグ付き分子の改善された結合親和性である。具体的な態様では、本発明は、分子の溶解性を増大させる方法であって、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。具体的な態様では、本発明は、分子のｐＩを増大させる方法であって、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、前記ペプチドタグの分子への結合は、タグ付けされていない分子と比較して、３倍までｐＩを増大させる。他の態様では、前記ペプチドタグ付き分子のｐＩは、タグ付けされていない分子と比較して、２．８、２．５、２．０、１．７５、１．５、１．０又は０．５倍まで増大する。
【００９６】
具体的な態様では、本発明は、そのターゲットへの分子の結合親和性を増大させる方法であって、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグの分子への結合は、１３５倍、１３０倍、１２０倍、１１０倍、１００倍、９０倍、８０倍、７５倍、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍  １０倍、７．５倍、５倍、４倍、２倍、１．７５倍、主なターゲットに対する前記分子の結合親和性を改善する。前記ぺプチドタグ付き分子は、９．０μＭ、８．０μＭ、６．０μＭ又は５．５μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合すると考えられる。配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含むペプチドタグは、前記タグを含まない分子と比較した場合、結合した分子の生物物理学的特性を統計学的に有意な程度に改善するとも考えられる。眼におけるＨＡに対する結合親和性を改善するために、複数のペプチドタグが、本願明細書に記載された方法のいずれかに使用されてもよいとさらに考えられる。より具体的には、例えば、１．０μＭ、０．９μＭ、０．８μＭ、０．７μＭ、０．６μＭ、０．５μＭ、０．４μＭ、０．３μＭ、０．２μＭ又は０．１μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する、２つ以上のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子である。
【００９７】
本発明の特定の態様では、１つのペプチドタグが、分子、例えば、タンパク質又は核酸分子に結合すると考えられる。本発明の他の態様では、２、３、４又はそれ以上のペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に結合してもよいと考えられる。前記ペプチドタグが、前記タンパク質のカルボキシ−末端又はアミノ−末端のいずれかに結合すると考えられる。前記ペプチドタグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの重鎖もしくは軽鎖に結合してもよく、あるいは、両鎖に結合してもよいとも考えられる。ペプチドタグは、前記核酸分子の５’及び／又は３’に結合してもよいと考えられる。複数のタグが鎖状につながれ、及び／又は、複数のタンパク質鎖に結合し（例えば、重鎖及び軽鎖に結合し）てもよい。前記タンパク質タグ及び／又はタンパク質及び／又は核酸は、翻訳後に、互いに直接又はジスルフィド結合、ペプチドリンカー等を介してのいずれかで化学的に結合してもよいとも考えられる。タンパク質タグをタンパク質（例えば、抗体及び抗原結合フラグメント）又は核酸に結合するペプチドリンカー及び方法は、当分野において公知であり、本願明細書に記載されている。
【００９８】
ペプチドタグ付き分子
本発明の別の態様は、ペプチドタグ付き分子を含む。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、ＨＡと結合するか、又は、結合可能なペプチドタグを含んでもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、９．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含んでもよい。前記ペプチドタグは、タンパク質である分子又は核酸である分子に結合するとも考えられる。タンパク質タグに結合し得る分子の例は、本願明細書に記載されている。
【００９９】
タンパク質分子
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得るタンパク質を提供する。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｃトラップ等）、治療用タンパク質（ＥＰＯ、インスリン、サイトカイン等）、タンパク質受容体（例えば、ＥＰＯ受容体、ＦＧＦＲ２等）であるタンパク質又はＤＡＲＰｉｎでもよい。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、ＶＥＧＦ、Ｃ５、因子Ｐ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０又はＦＧＦＲ２と結合するか、又は、結合可能である。さらに、前記タンパク質の結合は、眼において起こると考えられる。
【０１００】
本発明の一態様は、ＶＥＧＦと結合するタンパク質を含む。数多くのＶＥＧＦ結合タンパク質が、当分野において公知であり、本願明細書に記載されている。例えば、表１、９及び９ｂを参照のこと。特定の態様では、抗ＶＥＧＦ結合タンパク質は、ＮＶＳ４、ＮＶＳ８０、ＮＶＳ８１、ＮＶＳ８２、ＮＶＳ８３、ＮＶＳ８４又はＮＶＳ８５の配列を有してもよい。特定の具体的な態様では、例えば、本発明は、ＶＥＧＦと特異的に結合する抗体及び抗原結合フラグメントも提供する。本発明のＶＥＧＦ抗体及び抗原結合フラグメントとしては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書又は国際公開第１９９８０４５３３１号パンフレットにおいて単離され、記載された抗体及びフラグメント、ならびに、本願明細書、例えば、表１及び実施例に記載された抗体及び抗原結合フラグメントがあげられる。本願明細書に記載されたタンパク質タグに結合することができ、本願明細書に記載された方法に使用することができる、他の抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとしては、例えば、ラニビズマブ（Ferrara N, Damico L, Shams N, Lowman H, Kim R. Retina. 2006 Oct;26(8):859-70）、ベバシズマブ（Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W. Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400）、アフリベルセプト（Stewart MW, Grippon S, Kirkpatrick P. Nat Rev Drug Discov. 2012 Mar 30; 11 (4):269-70）、ＫＨ９０２（Zhang M, Zhang J, Yan M, Li H, Yang C, Yu D. Mol Vis. 2008 Jan 10; 14:37-49）、ＭＰ０１１２（Campochiaro PA, Channa R, Berger BB, Heier JS, Brown DM, Fiedler U, Hepp J, Stumpp MT. Am J Ophthalmol. 2013 Apr; 155(4):697-704）、ペガプタニブ（Gragoudas ES, Adamis AP, Cunningham ET Jr, Feinsod M, Guyer DR. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351 (27):2805-16）、ＣＴ−３２２（Dineen SP, Sullivan LA, Beck AW, Miller AF, Carbon JG, Mamluk R, Wong H, Brekken RA. BMC Cancer. 2008 Nov 27;8:352. doi: 10.1186/1471 -2407-8-352）ならびに、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載された抗ＶＥＧＦ抗体及びフラグメントがあげられる。
【０１０１】
本発明の具体的な態様は、ＶＥＧＦタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体も提供する。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号２１、２３、２５、２７又は２９のアミノ酸配列を含むペプチドタグ付き重鎖を有する抗体も提供する。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラット及び／又はマウスのＶＥＧＦ）に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表１に列記されたＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表１に列記されたＶＨ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１、２、３又はそれ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（あるいは、表１に列記されたＶＨ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１、２、３又はそれ以上のＶＨ  ＣＤＲからなる）抗体を提供する。
【０１０２】
本発明は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体も提供する。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表１に列記されたＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表１に列記されたＶＬ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１、２、３又はそれ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（あるいは、表１に列記されたＶＬ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する、１、２、３又はそれ以上のＶＬ  ＣＤＲからなる）抗体を提供する。
【０１０３】
本発明の別の態様は、本願明細書に記載されたペプチドタグに結合し得る更なるタンパク質を提供する。特定の態様では、前記タンパク質は、因子Ｐ、因子Ｄ、Ｅｐｏ、Ｃ５、ＴＮＦα、Ｉｌ−１β、Ｉｌ−１７ａ及び／又はＦＧＦＲ２と結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。特定の態様では、前記タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチン、インスリン、ヒト成長因子、インターロイキン−１０、補体因子Ｈ、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、補体因子Ｉ、補体受容体１−関連（ＣＲＲＹ）、神経成長因子、アンギオスタチン、色素上皮誘導因子、エンドスタチン、毛様体神経栄養因子、補体因子１阻害剤、補体因子様−１、補体因子Ｉ等でもよい。他の態様では、前記タンパク質は、受容体、例えば、ＥＰＯＲでもよい。ペプチドタグに結合し得るタンパク質の更なる例は、表２、８及び８ｂに提供される。より具体的には、前記タンパク質は、ＮＶＳ７０、ＮＶＳ７１、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７３、ＮＶＳ７４、ＮＶＳ７５、ＮＶＳ７６、ＮＶＳ７７、ＮＶＳ７８又はＮＶＳ９０でもよい。
【０１０４】
本発明の他のタンパク質は、変異しており、さらに、表１、２、８ｂ又は９ｂに記載された配列に対して、少なくとも６０、７０、８０．８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、それは、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸が表１、２、８ｂ又は９ｂに記載された配列において変異している、変異アミノ酸配列を含む。
【０１０５】
本発明は、本願明細書に記載されたタンパク質分子をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳類の細胞中での発現に最適化され得る。
【０１０６】
核酸分子
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得る核酸を提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する核酸は、ｍＲＮＡ又はＲＮＡｉ剤、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド、アプタマー等でもよい。特定の具体的な態様では、前記核酸分子は、アプタマーでもよい。特に、前記アプタマーは、ＰＤＧＦ−ＢＢと結合し得る。より具体的には、前記核酸は、ＮＶＳ７９でもよい。
【表１−１】
2016502850.tif 000002
【表１−２】
2016502850.tif 000003
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
2016502850.tif 000010
【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表２ａ−１】
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【表２ａ−２】
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【表２ａ−３】
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【表２ａ−４】
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【表２ａ−５】
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【表２ａ−６】
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【表２ａ−７】
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【表２ａ−８】
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【表２ａ−９】
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【表２ａ−１０】
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【表２ａ−１１】
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【表２ａ−１２】
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【表２ａ−１３】
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【表２ａ−１４】
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【表２ａ−１５】
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【表２ａ−１６】
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【表２ａ−１７】
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【表２ｂ−１】
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【表２ｂ−２】
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【０１０７】
ペプチドリンカー
本発明の特定の態様では、前記タンパク質タグは、リンカーにより分子に結合させてもよい。より具体的には、前記タンパク質タグは、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有するペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙｎ−Ｓｅｒｎ）ｎ又は（Ｓｅｒｎ−Ｇｌｙｎ）ｎリンカー）により、タンパク質又は核酸に結合させてもよい。ペプチドリンカー長は、結合したタンパク質の折り畳み及び相互作用の態様にかなりの影響を及ぼし得ることが公知である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号明細書ならびに国際公開第２００６／０２０２５８号及び同第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照のこと。これらの文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１０８】
前記ペプチドリンカーの配列は、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個又はそれ以上のアミノ酸残基でもよい。前記ペプチドリンカーの配列には、天然由来又は非天然由来のアミノ酸が含まれてもよい。一部の態様では、前記リンカーは、グリシンポリマーである。一部の態様では、アミノ酸であるグリシン及びセリンは、前記リンカー配列内のアミノ酸を構成する。特定の態様では、前記リンカー領域は、グリシン繰り返し（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ３）ｎのセットを含み、ｎは、１以上の正の整数である。より具体的には、前記リンカー配列は、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号３１）でもよい。あるいは、前記リンカー配列は、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ（配列番号１２４）でもよい。特定の他の態様では、前記リンカー領域の配向は、グリシン繰り返し（ＳｅｒＧｌｙ３）ｎのセットを含み、ｎは、１以上の正の整数である。
【０１０９】
前記ペプチドリンカーは、限定されるものではないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３も含み得る。アミノ酸残基であるＧｌｕ及びＬｙｓが、より良好な溶解性のために、前記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー内に散在し得る。特定の態様では、前記ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）又は（ＧｌｙＳｅｒ）の複数の繰り返しを含んでもよい。特定の態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＳｅｒＧｌｙ３）、（ＳｅｒＧｌｙ２）又は（ＳｅｒＧｌｙ）の複数の繰り返しを含んでもよい。他の態様では、前記ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）の組み合わせ及び複合体を含んでもよい。さらに他の態様では、Ｓｅｒは、Ａｌａにより置き換えられ、例えば、（Ｇｌｙ４Ａｌａ）又は（Ｇｌｙ３Ａｌａ）であり得る。さらに他の態様では、前記リンカーは、モチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）ｎを含み、ｎは、１以上の正の整数である。特定の態様では、ペプチドリンカーは、開裂性リンカーも含み得る。
【０１１０】
ペプチドリンカーは、可変性の長さのものであり得る。特に、ペプチドリンカーは、長さが約５から約５０個のアミノ酸；長さが約１０から約４０個のアミノ酸；長さが約１５から約３０個のアミノ酸；又は、長さが約１５から約２０個のアミノ酸である。ペプチドリンカーの長さの変化は、活性を保持又は増大させて、活性試験において優れた効果を生じさせ得る。ペプチドリンカーは、当分野において公知の技術を使用して、ポリペプチド及びタンパク質の配列内に導入され得る。例えば、ＰＣＲ変異誘発が使用され得る。修飾は、ＤＮＡ配列分析により確認され得る。プラスミドＤＮＡは、産生されるポリペプチドの適切な産生のために、宿主細胞を形質転換するのに使用され得る。
【０１１１】
ペプチドリンカー、ペプチドタグ及びタンパク質（例えば、抗体もしくは抗原結合フラグメント）又は核酸、又は、それらの組み合わせは、同じベクター中でコードされ、同じ宿主細胞中で発現及び構築され得る。あるいは、各ペプチドリンカー、タンパク質タグ及びタンパク質又は核酸は、別々に生成され、ついで、互いにコンジュゲートされ得る。ペプチドリンカー、ペプチドタグ及びタンパク質又は核酸は、当分野において公知の方法を使用して、前記構成成分をコンジュゲートすることにより調製され得る。部位特異的コンジュゲートは、ソルターゼ媒介性酵素的コンジュゲートを使用して達成され得る（Mao H, Hart SA, Schink A, Pollok BA. J Am Chem Soc. 2004 Mar 10; 126(9):2670-1）。各種の結合剤又は架橋剤が、共有的コンジュゲートに使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）があげられる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと。）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)及びGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されたものがあげられる。コンジュゲート剤は、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手できる、ＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣである。
【０１１２】
延長した半減期を有する操作及び修飾された分子
ペプチドタグ付き分子の産生
本発明は、他の分子、例えば、他のタンパク質又は核酸と、組換え的に融合（すなわち、結合）し得るか、又は、化学的にコンジュゲート（例えば、共有的コンジュゲート及び非共有的コンジュゲートの両方）し得る、ペプチドタグを提供する。特定の態様では、１、２、３、４又はそれ以上のペプチドタグが、タンパク質又は核酸と、組換え的に融合し、結合し、又は、化学的にコンジュゲートしてもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグは、ＨＡと結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、ＨＡと結合し、ＬＩＮＫドメインを含む。他の多様では、前記ペプチドタグは、ＨＡと結合し、ＴＳＧ−６  ＬＩＮＫドメインを含む。より具体的には、前記ペプチドタグは、ＨＡ１０（配列番号３２）、ＨＡ１０．１（配列番号３３）、ＨＡ１０．２（配列番号３４）、ＨＡ１１（配列番号３５）又はＨＡ１１．１（配列番号３６）でもよいと考えられる。さらに、前記タンパク質は、本願明細書に記載されたタンパク質、抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか、例えば、限定されるものではないが、上記及び表１、２、２ｂ、８ｂ及び９ｂ、ならびに、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書、国際公開第２０１２０１５６０８号、同第２０１２１４９２４６号パンフレット、米国特許第８２７３３５２号明細書、国際公開第１９９８０４５３３１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２１００１５３号明細書及び国際公開第２００２０１６４３６号パンフレットに記載されたタンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントでもよい。
【０１１３】
特定の具体的な態様では、本発明は、抗体又は抗原結合フラグメントと、ペプチドタグとを含むペプチドタグ付き分子を提供する。特に、本発明は、本願明細書に記載された抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン又はＶＬ  ＣＤＲ）と、ペプチドタグとを含むペプチドタグ付き分子を提供する。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを、抗体又は抗原結合フラグメントと結合、融合又はコンジュゲートするための方法は、当分野において公知であり、当業者に公知の標準的な分子生物学的技術を使用して行われてもよい。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号及び同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号及び同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；及び、Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1 1337- 11341；Hermanson (2008) Bioconjugate Techniques (2nd edition). Elsevier, Incを参照のこと。
【０１１４】
更なる融合タンパク質が、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング及び／又はコドンシャッフリング（まとめて、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術により生成されてもよい。ＤＮＡシャッフリングは、本発明の抗体もしくはそのフラグメントの活性を変化させるために使用されてもよいし（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体もしくはそのフラグメント）、及び／又は、ペプチドタグもしくはタンパク質の活性を変化させるために使用されてもよい（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有するペプチドタグ及び／もしくはタンパク質）。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号及び同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；及び、Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313, (Pluckthun, 2012), (Wittrup, 2001), (Levin and Weiss, 2006)を参照のこと。抗体もしくはそのフラグメント又は前記コードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム変異誘発に供されることにより変化させてもよい。眼における治療ターゲット（例えば、タンパク質であるＶＥＧＦ）に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の異種分子及び／又はＨＡと結合するペプチドタグの、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメント等により組み換えられてもよい。
【０１１５】
さらに、前記抗体もしくは抗原結合フラグメント及び／又はペプチドタグは、マーカー配列、例えば、精製を容易にするペプチドに融合され得る。例えば、前記マーカーのアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、中でも、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標），Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されるマーカーである。それらの多くは市販されている。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821 -824に記載されたように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、前記融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製に有用な他のタグとしては、限定されるものではないが、ヘマグルチニンタグ及び「フラッグ」タグがあげられる。前記ヘマグルチニンタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）。
【０１１６】
他の実施形態では、抗体もしくは抗原結合フラグメント及び／又はペプチドタグは、診断剤又は検出剤にコンジュゲートされてもよい。このような抗体及び／又はペプチドタグは、臨床試験法の一部として、疾患又は障害の開始、進行、進展及び／又は重症度をモニター又は診断する、例えば、具体的な治療の効果を決定するのに有用であり得る。このような診断及び検出は、前記抗体を、検出物質、例えば、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリン；発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルミノール；生体発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン；放射性物質、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎ；ならびに、種々の陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、ならびに、非放射性常磁性金属イオンに結合させることにより達成され得る。
【０１１７】
抗体又は抗原結合フラグメント及びペプチドタグは、固体支持体にも結合し得る。前記固体支持体は、ターゲット抗原の免疫アッセイ又は精製に特に有用である。このような固体支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンがあげられる。
【０１１８】
前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子のその特異的ターゲットへの結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）又はウェスタンブロットアッセイにより確認され得る。これらのアッセイはそれぞれ、一般的に、特定の所望のタンパク質−リガンド複合体の存在を、所望の前記複合体に特異的な標識化試薬（例えば、抗体）を使用することにより検出する。
【０１１９】
ペプチドタグに結合した抗ＶＥＧＦ抗体及び抗原結合フラグメント
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、ペプチドタグも提供する。
【０１２０】
特定の態様では、前記ペプチドタグは、ＨＡと結合するペプチドタグであり、抗ＶＥＧＦ抗体に結合する。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、９．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、８．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、７．２μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、５．５μＭ以下のＫＤでＨＡと結合する。ＨＡと結合する前記ペプチドタグは、ＬＩＮＫドメイン、ＴＳＧ−６  ＬＩＮＫドメイン又は、配列番号３２、３３、３４、３５もしくは３６の配列を有する特定のペプチドタグであり得る。特定の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１、２及び３の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、ペプチドタグは、それぞれ配列番号１、２及び３の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号７の配列を有する可変重鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号１７の配列を有する可変軽鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又はその抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号７及び１７の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号９の配列を有する重鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号１９の配列を有する軽鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号９及び２９の配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号９及び２９の配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号２１、２３、２５、２７又は２９の配列を有してもよい。他の具体的な態様では、前記ペプチドタグに結合するＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号２１及び１９；それぞれ配列番号２３及び１９；それぞれ配列番号２５及び１９；それぞれ配列番号２７及び１９；それぞれ配列番号２９及び１９；それぞれ配列番号１６３及び１６４の配列を有するペプチドタグ付���重鎖及び軽鎖を有する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグに結合するＶＥＧＦ結合抗原結合フラグメントは、配列番号１６６の配列を有するｓｃＦＶである。
【０１２１】
特定の態様では、それぞれ配列番号１、２及び３の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号１１、１２及び１３の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントは、前記軽鎖、前記重鎖に結合したペプチドタグを有してもよく、及び／又は、一方の鎖もしくは両方の鎖に複数のタグを有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグ付きＶＥＧＦ結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１７３及び１７４；それぞれ１７５及び１７６；それぞれ１７７及び１７８；それぞれ１７９及び１８０；それぞれ１８１及び１８２の配列を有する重鎖及び軽鎖を有していてもよい。
【０１２２】
配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、ラニビズマブ（Ferrara et al., 2006)、ベバシズマブ（Ferrara et al., 2004）、ＭＰ０１１２（Campochiaro et al, 2013）、ＫＨ９０２（Zhang et al., 2008）又は、アフリベルセプト（Stewart et al., 2012）に結合してもよい。
【０１２３】
ペプチドタグに結合する他の抗体又は抗原結合フラグメント
本発明は、Ｃ５、因子Ｐ、ＥＰＯ、因子Ｄ、ＴＮＦα又はＩｌ−１βと結合する抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含むペプチドタグも提供する。特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号３７、３８及び３９の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号４６、４７及び４８の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号３７、３８及び３９の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号４６、４７及び４８の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号４０の配列を有する可変重鎖を含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号４９の配列を有する可変軽鎖を含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号４０及び４９の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、Ｃ５結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号４４の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するＣ５結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号４４及び５１の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
【０１２４】
特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号７５、７６及び７７の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号８６、８７及び８８の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号７５、７６及び７７の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号８６、８７及び８８の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号８１の配列を有する可変重鎖を含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号９２の配列を有する可変軽鎖を含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号８１及び９２の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、Ｅｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号８５の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するＥｐｏ結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号８５及び９５の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
【０１２５】
特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号５３、５４及び５５の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号６５、６６及び６７の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号５３、５４及び５５の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号６５、６６及び６７の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号５９の配列を有する可変重鎖を含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号７１の配列を有する可変軽鎖を含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号５９及び７１の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号６３の配列を有していてもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合する因子Ｐ結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号６３及び７３の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
【０１２６】
特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１１７、１１８及び１１９の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号１１７、１１８及び１１９の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号１１１の配列を有する可変重鎖を含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号１２０の配列を有する可変軽鎖を含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１１１及び１２０の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号１１３の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１５および１２２の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
【０１２７】
特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号１８９、１９０及び１９１の配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ等）に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１９８、１９９及び２００の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１８９、１９０及び１９１の配列を有する重鎖ＣＤＲ、ならびに、それぞれ配列番号１９８、１９９及び２００の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号１９３の配列を有する可変重鎖を含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号２０１の配列を有する可変軽鎖を含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号１９３及び２０１の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＩＬ−１β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号１９４の配列を有していてもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するＴＮＦα結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１９６及び２０２の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
【０１２８】
特定の態様では、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグは、国際公開第２０１０／０１５６０８号又は同第２０１２／１４９２４６号パンフレットに記載されたＣ５、Ｅｐｏ又は因子Ｐと結合する抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１２９】
相同タンパク質
本発明は、本願明細書に記載された配列に相同なタンパク質及びペプチドタグも提供する。より具体的には、本発明は、表１、２、８、８ｂ、９及び９ｂに記載された配列に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。前記タンパク質又はペプチドタグは、眼における各ターゲットに結合し、表１、２、８、８ｂ、９、９ｂ及び実施例に記載された、それらのタンパク質及びペプチドタグの所望の機能的特性を保持している。
【０１３０】
例えば、本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントと、本願明細書に記載された配列に相同なペプチドタグとを提供する。より具体的には、本発明は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含み；前記抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の特定の態様では、前記重鎖及び軽鎖の配列は、さらに、Ｋａｂａｔにより定義された、例えば、それぞれ配列番号１、２、３、１１、１２及び１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む。本発明の特定の他の態様では、前記重鎖及び軽鎖の配列は、さらに、ｃｈｏｔｈｉａにより定義された、例えば、それぞれ配列番号４、５、６、１４、１５及び１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む。
【０１３１】
他の実施形態では、前記ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、表１及び２において説明された前記配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一でもよい。他の実施形態では、前記ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除いて同一でもよい。表１及び２に記載されたもののＶＨ及びＶＬ領域に対して、＜１００％の配列同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する抗体は、表１及び２に記載された核酸分子（例えば、それぞれ配列番号７及び配列番号１７をコードする核酸分子等）の変異誘発（例えば、部位直接的又はＰＣＲ媒介性変異誘発）によって得られ、続けて、本願明細書及び米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載された機能性アッセイを使用して、コードされた変異抗体の保持された機能を試験する。
【０１３２】
他の実施形態では、全長の重鎖及び／又は全長の軽鎖のアミノ酸配列は、表１及び２において説明された前記配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一でもよい。表１及び２に記載された前記重鎖及び軽鎖（例えば、配列番号９、２１、２３、２５、１７又は２９のいずれかの重鎖及び配列番号１９の軽鎖）に対して、高い（すなわち、８０％以上）同一性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗体が、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の変異誘発（例えば、部位直接的又はＰＣＲ媒介性変異誘発）によって得られ、続けて、本願明細書に記載された機能性アッセイを使用して、コードされた変異抗体の保持された機能を試験する。
【０１３３】
他の実施形態では、前記全長の重鎖及び／又は全長の軽鎖のヌクレオチド配列は、表１及び２において説明された前記配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一でもよい。
他の実施形態では、前記重鎖の可変領域及び／又は前記軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、表１及び２において説明された前記配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一でもよい。前記可変性は、ＣＤＲ又はフレームワーク領域にあってもよいと考えられる。
【０１３４】
さらに、本発明は、表１に記載された前記配列に相同なアミノ酸配列を含むペプチドタグであり、前記ペプチドタグが、ＨＡに結合し、本願明細書に記載されたそれらのペプチドタグの所望の機能的特性を保持する、ペプチドタグも提供する。より具体的には、前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、表１に説明された配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一でもよく、本願明細書に記載されたそれらのペプチドタグの所望の機能的特性を保持する。
【０１３５】
本願明細書で使用する場合、２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、前記配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性は、同一の位置数／位置の総数×１００に等しい。）。前記ギャップは、前記２つの配列の最適なアライメントに導入される必要がある。２つの配列間の、配列比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例示に記載される数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１３６】
さらに又はあるいは、本発明のタンパク質の配列は、さらに、例えば、関連する配列を特定するために、公衆データベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として使用され得る。例えば、このような検索は、Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。
【０１３７】
保存的修飾を有するタンパク質
本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離されたペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子がさらに含まれる。より具体的には、本発明は、表１のペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に対して保存的修飾を有する、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に関する。本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離された抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。特定の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのＣＤＲ配列の１つ以上が、本願明細書に記載された抗体、又は、その保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、本発明の抗体の所望の機能的特性を保持している。例えば、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域からなる、ＶＥＧＦ結合単離抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し、前記重鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１及びその保存的修飾配列であり；前記重鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２及びその保存的修飾配列であり；前記重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３及びその保存的修飾配列であり；前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１１及びその保存的修飾配列であり；前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１２及びその保存的修飾配列であり；前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１３及びその保存的修飾配列であり；及び、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＶＥＧＦに特異的に結合する、ペプチドタグを提供する。
【０１３８】
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳類の細胞中での発現に最適化されており、全長の重鎖配列及び／又は全長の軽鎖配列を有し、これらの配列の１つ以上が、本願明細書に記載された抗体又はその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、本発明のＶＥＧＦ結合抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含み、前記可変重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記可変軽鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。本発明は、ペプチドタグに結合しており、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖と、ペプチドタグとを含み、前記可変重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記可変軽鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記ペプチドタグが、配列番号３２、３３、３４、３５及び３６から選択されるアミノ酸配列を含み、前記抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、ＨＡに特異的に結合する、単離された抗体をさらに提供する。本発明は、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、重鎖及び軽鎖と、ペプチドリンカーと、ペプチドタグとからなり、前記重鎖が、配列番号９のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記軽鎖が、配列番号１９のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み；前記ペプチドタグが、配列番号３２、３３、３４、３５及び３６から選択されるアミノ酸配列を含み；前記抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、ＨＡに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。より具体的には、本発明は、ペプチドタグに結合している単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記結合している抗体又はフラグメントが、哺乳類の細胞中での発現に最適化されており、配列番号２１、２３、２５、２７及び２９ならびにその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなり、前記単離された抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、ＨＡに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１３９】
本発明の抗体及びタグを製造する方法
抗体及びペプチドタグをコードする核酸
本発明は、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。特定の態様では、本発明は、ペプチドタグ付きタンパク質、例えば、表１、２、２ｂ、８ｂ及び９ｂに記載された前記ペプチドタグ付きタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。より具体的には、本発明は、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ４、ＮＶＳ３６、ＮＶＳ３７、ＮＶＳ７０、ＮＶＳ７０Ｔ、ＮＶＳ７１、ＮＶＳ７１Ｔ、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７２Ｔ、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７３Ｔ、ＮＶＳ７４、ＮＶＳ７４Ｔ、ＮＶＳ７５、ＮＶＳ７５Ｔ、ＮＶＳ７６、ＮＶＳ７６Ｔ、ＮＶＳ７７、ＮＶＳ７７Ｔ、ＮＶＳ７８、ＮＶＳ７８Ｔ、ＮＶＳ７９、ＮＶＳ７９Ｔ、ＮＶＳ８０、ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２、ＮＶＳ８２Ｔ、ＮＶＳ８３、ＮＶＳ８３Ｔ、ＮＶＳ８４、ＮＶＳ８４Ｔ、ＮＶＳ１ｂ、ＮＶＳ１ｃ、ＮＶＳ１ｄ、ＮＶＳ１ｅ、ＮＶＳ１ｆ、ＮＶＳ１ｇ、ＮＶＳ１ｈ又はＮＶＳ１ｊをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明において、配列番号３２、３３、３４、３５及び／又は３６のペプチド配列を有する、少なくとも１つのペプチドタグをコードする核酸分子も提供される。より具体的には、例えば、前記ペプチドタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０２、１０３、１０４、１０５及び／又は１０６のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１４０】
本発明は、本願明細書に記載されたタンパク質、例えば、抗ＶＥＧＦ、抗ＥＰＯ、抗Ｃ５、抗因子Ｐ、抗ＴＮＦα又は抗ＩＬ−１βの抗体又は抗原結合フラグメントを含むタンパク質、上記ペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。より具体的には、本発明の核酸の一部は、配列番号７に示された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及び／又は、配列番号１７に示された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の具体的な実施形態では、前記核酸分子は、表１又は表２において特定されたものである。本発明の一部の他の核酸分子は、表１又は表２において特定されたもののヌクレオチド配列に対して、実質的に同一（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％又は９９％）であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現された場合、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ターゲット抗原結合能、例えば、抗ＶＥＧＦ、抗ＥＰＯ、抗Ｃ５、抗因子Ｐ、抗ＴＮＦα又は抗ＩＬ−１βの標的抗原結合能を示し得る。
【０１４１】
本発明では、上記で説明した抗体の重鎖又は軽鎖由来の、少なくとも１つのＣＤＲ領域及び、通常３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。一部の他のポリヌクレオチドは、上記で説明した抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域配列の全て又は実質的に全てをコードする。前記コードの縮重のために、各種の核酸配列が、免疫グロブリンのアミノ酸配列それぞれをコードしてもよい。
【０１４２】
本発明の核酸分子は、前記抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードし得る。本発明の核酸の一部は、（例えば、ＮＶＳ４の重鎖に対して実質的に同一の）元の重鎖配列に対して、実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、９０％又は９９％）である、修飾された重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。一部の他の核酸配列は、（例えば、ＮＶＳ４の軽鎖に対して実質的に同一の）元の軽鎖配列に対して、実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、９０％又は９９％）である、修飾された軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０１４３】
前記ポリヌクレオチド配列は、新たに固相ＤＮＡ合成により、又は、ＶＥＧＦ抗体又はその結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載された配列）のＰＣＲ変異誘発により産生され得る。核酸の直接的な化学合成は、当分野において公知の方法、例えば、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト法；及び、米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持体法により達成され得る。ＰＣＲによりポリヌクレオチド配列に変異を誘導することは、例えば、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；及び、Eckert et al., PCR Methods and Applications 1 :17, 1991に記載されたように行われ得る。
【０１４４】
本発明では、上記ペプチドタグ、タンパク質、抗体もしくは抗原結合フラグメント又はペプチドタグ付き分子、例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントを産生するための、発現ベクター及び宿主細胞も提供される。より具体的には、本発明は、配列番号３２、３３、３４、３５及び／もしくは３６の配列を有するペプチドタグをコードする核酸を含む発現ベクター、あるいは、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。特定の態様では、前記発現ベクターは、表１、２、８又は９に記載されたペプチドタグ付き分子、例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ４、ＮＶＳ３６、ＮＶＳ３７、ＮＶＳ７０、ＮＶＳ７０Ｔ、ＮＶＳ７１、ＮＶＳ７１Ｔ、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７２Ｔ、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７３Ｔ、ＮＶＳ７４、ＮＶＳ７４Ｔ、ＮＶＳ７５、ＮＶＳ７５Ｔ、ＮＶＳ７６、ＮＶＳ７６Ｔ、ＮＶＳ７７、ＮＶＳ７７Ｔ、ＮＶＳ７８、ＮＶＳ７８Ｔ、ＮＶＳ７９、ＮＶＳ７９Ｔ、ＮＶＳ８０、ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２、ＮＶＳ８２Ｔ、ＮＶＳ８３、ＮＶＳ８３Ｔ、ＮＶＳ８４、ＮＶＳ８４Ｔ、ＮＶＳ１ｂ、ＮＶＳ１ｃ、ＮＶＳ１ｄ、ＮＶＳ１ｅ、ＮＶＳ１ｆ、ＮＶＳ１ｇ、ＮＶＳ１ｈ又はＮＶＳ１ｊのいずれか１つをコードする核酸を含む。
【０１４５】
種々の発現ベクターが、前記ペプチドタグ、前記タンパク質、前記抗体鎖もしくは抗原結合フラグメント又はペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る。ウイルス系及び非ウイルス両方の発現ベクターが、哺乳類の宿主細胞中で前記抗体を産生するために使用され得る。非ウイルスベクター及び系としては、タンパク質又はＲＮＡを発現させるための発現カセットを典型的に含むプラスミド、エピソームベクター及びヒト人工染色体（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照のこと。）があげられる。例えば、哺乳類（例えば、ヒト）細胞において前記ペプチドタグ又はＶＥＧＦポリヌクレオチド及びポリペプチドを発現させるため有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ＆Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター及び、他のタンパク質を発現させるために当分野において公知の数多くの他のベクターがあげられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクター及びＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターがあげられる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；及び、Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照のこと。
【０１４６】
ウイルスベクターを生成するための方法は、当分野において周知であり、当業者であれば、本発明のウイルスベクターを生成し得る（例えば、米国特許第７，４６５，５８３号明細書を参照のこと。）。
【０１４７】
前記発現ベクターの選択は、ベクターが発現することが意図された宿主細胞に依存する。典型的には、前記発現ベクターは、抗体鎖もしくはフラグメント、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き抗体鎖もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合した、プロモータ及び他の調節配列（例えば、エンハンサ）を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモータが、誘導条件下以外での挿入された配列の発現を妨げるために使用される。誘導性プロモータとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインのプロモータ又はヒートショックプロモータがあげられる。形質転換された生物の培養は、その発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列の集合を不利に扱うことなく、非誘導条件下において展開され得る。プロモータに加えて、他の調節エレメントも、抗体鎖もしくはフラグメント、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き抗体鎖もしくはフラグメントの効率的な発現に必要とされ、又は、望まれる場合がある。これらのエレメントとしては、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接リボソーム結合部位又は他の配列があげられる。さらに、発現効率は、使用する細胞系に適したエンハンサの包含により増大され得る（例えば、Scharf et al, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；及び、Bittner et al, Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照のこと。）。例えば、ＳＶ４０エンハンサ又はＣＭＶエンハンサが、哺乳類の宿主細胞中での発現を増大させるために使用されてもよい。
【０１４８】
前記発現ベクターは、挿入されたペプチドタグ、抗体又はペプチドタグ付き抗体の配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように配置された分泌シグナル配列も提供し得る。より頻繁に、このような挿入された配列は、前記ベクターに包含させる前に、シグナル配列に結合させる。抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメイン又はペプチドタグ付き抗体ドメインをコードする配列を受容するように使用されるベクターは、場合により、定常領域又はその一部もコードする。このようなベクターは、前記定常領域を含む融合タンパク質として可変領域の発現を可能にすることにより、完全な抗体又は抗原結合フラグメントの産生をもたらす。典型的には、このような定常領域は、ヒトである。
【０１４９】
前記ペプチドタグ、抗体鎖又はペプチドタグ付き分子（例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント）を保有及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のポリヌクレオチドをクローニング及び発現させるために有用な１つの原核生物の宿主である。使用するのに適した他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及び他の腸内細菌科、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ及び種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種があげられる。これらの原核生物宿主においては、それが、発現ベクターも作ることができる。前記発現ベクターは、典型的には、前記宿主細胞に適した発現制御配列（例えば、複製起点）を含む。さらに、任意の数の各種の周知のプロモータ、例えば、ラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、ベータ−ラクタマーゼプロモータ系又はファージラムダ由来のプロモータ系が存在するであろう。前記プロモータは、典型的には、任意にオペレータ配列により発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するための、リボソーム結合部位配列等を有する。他の微生物、例えば、酵母も、本発明の抗体又はペプチドタグ付き分子（例えば、ペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメント）又はペプチドタグを発現させるために使用され得る。バキュロウイルスベクターとの組み合わせにおいて、昆虫細胞も使用され得る。
【０１５０】
一部の好ましい実施形態では、哺乳類の宿主細胞が、本発明のペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び／又は本願明細書に記載されたタグ付けされていない分子（例えば、ペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメント）を発現及び産生するために使用される。例えば、それらは、内在性の免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、実施例に記載される１Ｄ６．Ｃ９メラノーマハイブリドーマクローン）又は、外来性の発現ベクターを有する哺乳類の細胞株（例えば、以下に例示されるＳＰ２／０メラノーマ細胞）のいずれかであり得る。これらは、任意の正常な致死又は正常もしくは異常な不死の動物又はヒト細胞を含む。例えば、完全な免疫グロブリンを分泌可能な数多くの適切な宿主細胞株が開発されており、当業者に公知であり、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、Ｈｅｌａ細胞、メラノーマ細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマを含む。ポリペプチドを発現するための哺乳類の組織細胞培養の使用は、一般的に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において検討されている。哺乳類の宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモータ及びエンハンサ（例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照のこと。）ならびに、必須の処理情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類の遺伝子又は哺乳類のウイルス由来のプロモータを含む。適切なプロモータは、構成型、細胞種特異型、段階特異型及び／又は変調型もしくは調節型でもよい。有用なプロモータとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモータ、構成型アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導型ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモータ、構成型ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導型ＣＭＶプロモータ（例えば、ヒト媒介初期ＣＭＶプロモータ）、構成型ＣＭＶプロモータ及び、当分野において公知のプロモータ−エンハンサの組み合わせがあげられる。
【０１５１】
所望のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の種類に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物の細胞に一般的に使用される。一方、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用されてもよい（一般的には、上記Sambrook,et al.,を参照のこと。）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、バリスティック法、ウイロゾーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤による増大した取り込み及びｅｘ  ｖｉｖｏにおける形質導入があげられる。組換えタンパク質の長期で、高収量の産生のために、安定した発現が、多くの場合望まれるであろう。例えば、前記ペプチドタグ、前記抗体鎖もしくは抗原結合フラグメント又は前記ペプチドタグ付き抗体鎖もしくは抗原結合フラグメントを安定して発現する細胞株は、ウイルスの複製起点又は内在性の発現エレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を含む、本発明の発現ベクターを使用して調製され得る。前記ベクターの導入後、細胞を、濃縮された培地中で、１〜２日間増殖させてもよく、その後、それらは、選択培地に移される。前記選択可能なマーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在により、選択培地中で、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖が可能となる。抵抗性を有する安定的に形質導入された細胞は、細胞種に適した組織培養技術を使用して増殖され得る。本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子を産生するための方法を提供する。この場合、本願明細書に記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を産生可能な宿主細胞が、１つ以上のペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子の産生に適した条件下で培養される。前記方法は、さらに、本発明のペプチドタグ及び／又はペプチドタグ付き分子を単離する工程を含んでもよい。
【０１５２】
本発明のペプチドタグ、タンパク質及び／又は抗体もしくは抗原結合フラグメントペプチドタグをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、眼に対して遺伝子を送達するために使用され得る。本発明の特定の態様では、前記発現ベクターは、本発明の１つ以上のペプチドタグに結合している抗体をコードし、眼に対する送達に適している。本発明の他の態様では、前記抗体又は抗原結合フラグメント及びペプチドタグは、眼に対する送達に適した１つ以上の発現ベクターにおいてコードされる。眼に対して遺伝子産物を送達するための方法は、当分野において公知である（例えば、米国特許出願公開第０５／０２２０７６８号明細書を参照のこと。）。
【０１５３】
モノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、各種の技術（例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼ―ション技術のような従来のモノクローナル抗体の方法論を含む）により産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための多くの技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又はガン遺伝子の形質転換が使用され得る。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法は、本願明細書、実施例及び国際公開第２０１２００１４９５８号パンフレットに記載されている。
【０１５４】
ハイブリドーマを調製するための動物系としては、マウス、ラット及びウサギの系があげられる。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、確立された手法である。融合用の免疫化脾臓細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は、当分野において公知である。融合パートナー（例えば、マウスのメラノーマ細胞）及び融合手法も公知である。
【０１５５】
本発明のキメラ又はヒト化抗体は、上述したように、調製されたマウスのモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、所望のマウスハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学的技術を使用して、非マウス（例えば、ヒト）の免疫グロブリン配列を含むように操作される。例えば、キメラ抗体を形成するために、マウスの可変領域を、当分野において公知の方法を使用して、ヒト定常領域に結合させ得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと。）。ヒト化抗体を形成するために、マウスのＣＤＲ領域が、当分野において公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク内に挿入され得る。例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５２２５５３９号明細書ならびに、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５６９３７６２号及び同第６１８０３７０号明細書を参照のこと。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＶＥＧＦに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろ、ヒト免疫系の一部を有するトランスジェニック又はトランスクロモゾームマウスを使用して生成され得る。これらのトランスジェニック及びトランスクロモゾームマウスは、本願明細書において、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと呼ばれ、まとめて、本願明細書において、「ヒトＩｇマウス」と呼ばれるマウスを含む。
【０１５７】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、非再編成のヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座、ならびに内在性のμ及びκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的変異を含む（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照のこと。）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ又はκの低下した発現を示し、免疫応答において、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、クラス転換及び体細胞変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する（上記Lonberg, N. et al., 1994；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 1 13:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93及び、Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546においてレビューされる）。ＨｕＭＡｂマウスの調製及び使用ならびに、このようなマウスが有するゲノム修飾は、さらに、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:1 17-123; Chen, J. et al, 1993 EMBO J. 12: 821 -830；Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；及び、Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている。それら全ての内容は、その全体が参照により具体的に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；及び同第５，７７０，４２９号明細書（全て、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙ）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書（Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ）；国際公開第９２１０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７１１３８５２号、同第９８／２４８８４号及び同第９９／４５９６２号パンフレット（全て、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙ）、ならびに、国際公開第０１／１４４２４号パンフレット（Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）を参照のこと。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子及びトランスクロモゾームにヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランスクロモゾームを有するマウスを使用して産生され得る。本願明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、国際公開第０２／４３４７８号パンフレット（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ）に詳細に記載されている。
【０１５９】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が、当分野において利用可能であり、本発明の抗体を産生するために使用され得る。例えば、ゼノマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる別のトランスジェニック系が使用され得る。このようなマウスは、米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号及び同第６，１６２，９６３号明細書（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ）に記載されている。
【０１６０】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモゾーム動物系が、当分野において利用可能であり、本発明のＶＥＧＦ抗体を産生するために使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖トランスクロモゾーム及びヒト軽鎖トランスクロモゾームの両方を有するマウスが使用され得る。このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖のトランスクロモゾームを有するウシが、当分野において記載されており（Kuroiwa et al, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＶＥＧＦ抗体を産生するために使用され得る。
【０１６１】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするための、ファージディスプレイ法を使用しても調製され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当分野において確立されており、又は、以下の例に記載されている。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；及び同第５，５７１，６９８号明細書（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）；米国特許第５，４２７，９０８号及び同第５，５８０，７１７号明細書（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ）；米国特許第５，９６９，１０８号及び同第６，１７２，１９７号明細書（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ）；ならびに、米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号明細書（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ）を参照のこと。
【０１６２】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化に基づいて生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても調製され得る。このようなマウスは、例えば、米国特許第５，４７６，９９６号及び同第５，６９８，７６７号明細書に記載されている（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）。
【０１６３】
変化したタンパク質およびペプチドタグを操作する方法
上述したように、本願明細書に示されたペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントは、記載されたアミノ酸配列を修飾することにより、新たなペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントを形成するために使用され得る。このため、本発明の別の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体の構造的特徴が、本発明のペプチドタグ付き抗体の少なくとも１つの機能的特性、例えば、ヒトＶＥＧＦへの結合性を保持し、及び、ＶＥＧＦの１つ以上の機能的特性の阻害性（例えば、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合阻害）も保持する、構造的に関連するペプチドタグ付き抗体を形成するために使用される。
【０１６４】
例えば、本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲ領域又はその変異は、上述したように、公知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと、組換えによって組み合わされ、更に組換え操作された本発明の抗体を形成する。他の種類の修飾は、先のセクションに記載されたものを含む。操作法のための開始材料は、本願明細書において提供されたＶＨ及び／もしくはＶＬ配列の１つ以上、又は、それらの１つ以上のＣＤＲ領域である。前記操作された抗体を形成するために、本願明細書において提供されるＶＨ及び／もしくはＶＬ配列の１つ以上、又は、それらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を、実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、前記配列に含まれる情報が開始材料として使用されて、元の配列に由来する「第２世代」配列を形成し、ついで、前記「第２世代」配列は、タンパク質として調製及び発現される。
【０１６５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号２のＣＤＲ２及び／又は配列番号３のＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに、配列番号１１のＣＤＲ１配列、配列番号１２のＣＤＲ２配列及び／又は配列番号１３のＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなり；前記重鎖可変領域抗体配列及び／又は前記軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基が変更されていることにより、少なくとも１つの変更された抗体配列を形成し；変更された抗体配列をタンパク質として発現する、ペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントを調製するための方法を提供する。
【０１６６】
前記変更された抗体配列は、米国特許出願公開第２００５０２５５５５２号明細書に記載された、固定されたＣＤＲ３配列又は最少必須結合決定因子、ならびに、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列上の多様性を有する、抗体ライブラリをスクリーニングすることによっても調製され得る。前記スクリーニングは、抗体ライブラリから抗体をスクリーニングするのに適したいずれかのスクリーニング技術、例えば、ファージディスプレイ技術に基づいて行われ得る。
【０１６７】
標準的な分子生物学的技術は、変更されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の配列を調製し、及び発現させるために使用され得る。前記変更された配列によりコードされる前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子は、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子、例えば、本願明細書に記載されたタンパク質又はペプチドタグ付き抗体、例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ４、ＮＶＳ３６又はＮＶＳ３７の機能的特性の１つ、いくつか又は全てを保持するものである。
【０１６８】
本発明の抗体又はペプチドタグを操作する方法の特定の実施形態では、変異は、ＶＥＧＦ抗体コード配列又はペプチドタグの全部又は一部に沿ってランダム又は選択的に導入することができ、得られた修飾ＶＥＧＦ抗体又はペプチドタグは、本願明細書に記載された結合活性及び／又は他の機能的特性についてスクリーニングされ得る。変異法は、当分野において記載されている。例えば、Ｓｈｏｒｔによる国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットには、飽和変異誘発、合成ライゲーションアッセンブリ又はそれらの組み合わせを使用して抗体変異を形成及びスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌによる国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットには、抗体の物理化学的特性を最適化するためのコンピュータスクリーニング法を使用する方法が記載されている。
【０１６９】
本発明の特定の実施形態では、抗体及びペプチドタグは、アミド分解部位を除去するように操作されてもよい。アミド分解は、ペプチド又はタンパク質における構造的及び機能的変化を引き起こすことが公知である。アミド分解は、低下した生体活性ならびに、タンパク質医薬品の薬物動態及び抗原性における変化をもたらし得る（Anal Chem. 2005 Mar 1 ;77(5):1432-9）。本発明の特定の他の態様では、抗体及びペプチドタグは、プロテアーゼ開裂部位を付加又は除去をするように操作され得る。ペプチドタグ修飾の例は、表４及び実施例に記載される。
【０１７０】
前記変更された抗体の機能的特性は、当分野において利用可能な、及び／又は、本願明細書に記載された、標準的なアッセイ、例えば、実施例において説明されたものを使用して評価され得る。
【０１７１】
他の抗体型
ラクダ抗体
ラクダ及びヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ及びＣａｌｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ）族のメンバー、例えば、アメリカ大陸メンバー、例えば、ラマ種（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ及びＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）から得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性及びヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられてきた。天然に見出された哺乳類のこの族由来の特定のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠いているため、他の動物由来の抗体についての２つ重鎖及び２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の４つの要素からなる構造とは構造的に異なる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日に公開された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照のこと。
【０１７２】
ＶＨＨとして特定される小さい単一の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、ターゲットに対して高い親和性を有する小さなタンパク質を産生し、「ラクダ抗体」として公知の低分子量抗体由来タンパク質をもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に発行された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照のこと。Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788；Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448；Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62；及び、Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照のこと。ラクダ抗体及び抗原結合フラグメントの操作されたライブラリは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手できる。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により厳密に類似する配列を得るために、組換え的に変更され得る。すなわち、ナノボディは、「ヒト化」され得る。
【０１７３】
前記ラクダナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１／１０の分子量を有し、前記タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルにすぎない。サイズが小さいことによる１つの結果は、より大きい抗体タンパク質に対しては機能的に反応しない抗原部位に結合するラクダ抗体の能力である。すなわち、ラクダのナノボディは、古典的な免疫学的技術を使用した別の方法では陰性の抗原を検出する試薬として、及び、有望な治療剤として有用である。このため、小さいサイズのさらに別の結果は、ラクダのナノボディが、ターゲットタンパク質の溝又は狭い窪みにおける特異的な部位への結合の結果として阻害することができ、このため、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量薬物の機能により厳密に類似する能力を有し得ることである。
【０１７４】
前記低分子量及びコンパクトなサイズは、さらに、ラクダのナノボディが、非常に熱安定性であり、極端なｐＨ及びタンパク質分解に対して安定であり、抗原性に乏しいことをもたらす。別の結果は、ラクダのナノボディが組織内の循環系から速やかに移動することである。ナノボディは、さらに、血液脳関門を横切る薬剤輸送を促進し得る。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照のこと。さらに、これらの分子は、原核生物の細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて完全に発現され、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。
【０１７５】
したがって、本発明の特徴は、例えば、ＶＥＧＦに対して高い親和性を有する、ラクダ抗体又はナノボディである。本願明細書における特定の実施形態では、前記ラクダ抗体又はナノボディは、ラクダ科動物において天然に産生される、すなわち、他の抗体について本願明細書に記載された技術を使用して、ＶＥＧＦ又はそのペプチドフラグメントで免疫化されたラクダ科により産生される。あるいは、ラクダのナノボディは、適切なターゲットによるパニング手法を使用して、適切に変異したラクダのナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリから得られる（すなわち、例えば、選択により産生）。得られたナノボディは、さらに、遺伝子操作によりカスタマイズされ得る。前記ラクダのナノボディは、タグ付けされていないラクダのナノボディに対して、平均滞留時間、最終薬剤濃度を増大させ、及び／又は、投与間隔を伸ばすために、本願明細書に記載されたペプチドタグに結合し得る。特定の態様では、前記ラクダの抗体又はナノボディは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号に記載されているように、本発明のヒト抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディ又は単一ドメイン抗体のフレームワーク配列内にグラフト化することにより得られる。
【０１７６】
二重特異性分子及び多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドタグを含む二重特異性又は多重特異性分子を特徴とする。より具体的には、本発明は、ペプチドタグと、２つ以上のタンパク質及び／又は核酸分子とを含む二重特異性又は多重特異性の分子を特徴とすると考えられる。例えば、多重特異性分子は、本発明のペプチドタグ、抗体又はその抗原結合フラグメント及び核酸分子を含んでもよい。
【０１７７】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に誘導体化され、又は、そのような分子と結合して、少なくとも２つの異なる結合部位又はターゲット分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。本発明の抗体は、実際に、２つ以上の他の機能性分子に誘導体化され、又は、そのような分子に結合することによって、３つ以上の異なる結合部位及び／又はターゲット分子に結合する多重特異性分子を生成し得る。このような多重特異性分子は、本願明細書で使用する場合、「二重特異性分子」の用語に包含されることも意図する。本発明の抗体は、二重特異性分子がもたらされるように、１つ以上の他の結合分子、例えば、別の抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド又は結合模倣体に、（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有会合又は別の方法により）機能的に結合して、本発明の二重特異性分子を形成し得る。
【０１７８】
したがって、本発明は、ＶＥＧＦに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２のターゲットエピトープに対する第２の結合特異性とを含む、二重特異性分子を含む。例えば、前記第２のターゲットエピトープは、前記第１のターゲットエピトープとは異なる、ＶＥＧＦの別のエピトープである。あるいは、前記第２のターゲットエピトープは、眼における別の分子のエピトープである。あるいは、前記第２のターゲットエピトープは、ＨＡのエピトープである。
【０１７９】
さらに、前記二重特異性分子が多重特異性である発明について、前記分子は、さらに、前記第１及び第２のターゲットエピトープに加えて、第３の結合特異性を含み得る。あるいは、前記第２のターゲットエピトープは、眼における別の分子のエピトープである。
【０１８０】
一実施形態では、二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ等を含み得る。前記抗体は、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌの米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載された、軽鎖もしくは重鎖の二量体又は任意のその最小フラグメント、例えば、Ｆｖもしくは一本鎖構築物でもあり得る。
【０１８１】
二重特異性抗体（ディアボディ）は、ＶＨ及びＶＬドメインが一本のペプチド鎖上に発現しており、同じ鎖上の前記２つのドメイン間で対合させるのに十分短いリンカーにより結合されている、二価の二重特異性分子である。前記ＶＨ及びＶＬドメインは、別の鎖の相補ドメインとペアとなることにより、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照のこと。）。ディアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ型）又はＶＬＡ−ＶＨＢ及びＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ型）のいずれかを有する、２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより産生され得る。それらの大部分は、細菌において可溶型で発現され得る。一本鎖のディアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのディアボディ形成するポリペプチド鎖を約１５個のアミノ酸残基のリンカーにより結合させることにより産生される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照のこと。）。ｓｃＤｂは、細菌において、可溶性の活性な単量体型で発現され得る（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1 ):21-36；Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105；Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照のこと。）。ディアボディは、Ｆｃに融合して、「ジ−ディアボディ」を作ることができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照のこと。）。
【０１８２】
本発明の二重特異性分子に使用され得る他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
【０１８３】
二重特異性分子は、当分野において公知の方法を使用して、結合特異性の構成をコンジュゲートすることにより調製され得る。例えば、前記二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、ついで、互いにコンジュゲートされ得る。前記結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、各種の結合剤又は架橋剤が、共有的コンジュゲートに使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと。）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan et al., 1985 Science 229:81-83及び、Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されたものがあげられる。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、共にＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手できる。
【０１８４】
前記結合特異性が抗体である場合、それらは、前記２つの重鎖のＣ−末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされ得る。具体的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、コンジュゲート前に、奇数、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０１８５】
あるいは、両結合特異性は、同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現及びアッセンブリされ得る。この方法は、前記二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、リガンド×Ｆａｂ、ペプチドタグ×ｍＡｂ、ペプチドタグ×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体及び結合決定因子を含む一本鎖分子、又は、２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；及び米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。
【０１８６】
その特異的ターゲットに対する前記二重特異性又は多価分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）又はウェスタンブロットアッセイにより確認され得る。これらのアッセイはそれぞれ、一般的に、特定の所望のタンパク質−抗体複合体の存在を、所望の前記複合体に特異的な標識化試薬（例えば、抗体）を使用することにより検出する。
【０１８７】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦに結合する、本発明の抗体の少なくとも２つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価分子を提供する。更なる態様では、本発明は、ＨＡに結合する、本発明のペプチドタグの少なくとも２つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。前記抗原結合部分は、タンパク質融合又は共有もしくは非共有結合により、互いに結合し得る。あるいは、結合方法は、前記多重特異性分子について記載されている。四価の化合物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域（例えば、Ｆｃ又はヒンジ領域）に結合する抗体と架橋することにより得ることができる。
【０１８８】
三量体化ドメインは、例えば、Ｂｏｒｅａｎの欧州特許第１０１２２８０号明細書に記載されている。五量体化分子は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７号に記載されている。
【０１８９】
予防的及び治療的使用
多くの眼の疾患、具体的には、例えば、網膜血管疾患は、毎週、隔週又は毎月での硝子体内注入を必要とする治療剤により処置される。前記処置の方法及び頻度は、医師及び患者に対する、明らかな健康管理上の負担を引き起こす。さらに、硝子体内注入による眼内炎及び眼内圧のリスクによる、頻繁な硝子体内注入に関連する患者に対する明らかなリスクも存在する。特定の場合、例えば、緑内障には、これらの治療剤の投与は困難であり、臨床において通常使用されない。このため、四半期又はより低い頻度で投与される治療剤を投与する能力が、目に見える結果における最良の改善を提供し、一方、頻繁な硝子体内注入に関連する処置の負担及びリスクを低下させるであろう。
【０１９０】
網膜性疾患、例えば、血管新生（ｗｅｔ）ＡＭＤ、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症は、視力喪失をもたらす血管新生成分を有する。臨床試験では、これらの疾患が、眼の生物学的治療剤（例えば、ラニビズマブもしくはベバシズマブのような抗ＶＥＧＦ治療剤）の毎月の硝子体内注入、又は、アフリベルセプトによる隔月の処置により、効果的に処置され得ることが示されてきた。これらの治療剤の効果にもかかわらず、毎月又は隔月の処置は、患者及び担当医にとって、明らかな健康管理上の負担となる（Oishi et al.(2011)）。このため、より低い頻度で送達することができ、毎月又は隔月での処置に見られるのと同じ処置利益も提供することができる眼の治療に対する必要性が頻繁に存在する。抗ＶＥＧＦ治療剤は、一般的には、ほとんどの患者に安全で、十分許容性であるが、硝子体内法による眼内炎のわずかなリスクが存在する（Day et al., 2011）。現在の臨床データは、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ）であるラニビズマブと比較して、全長ＩｇＧであるベバシズマブには、眼以外での有害事象を増大させる傾向があり得ることを示している。ラニビズマブと比較したベバシズマブの全身性有害事象の主な違いおよび潜在的な原因は、循環においてＶＥＧＦがより高度に抑制されることによるベバシズマブのより高い全身性暴露である（Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials (CATT) Research Group, Martin DF, Maguire MG, Fine SL, Ying GS, Jaffe GJ, Grunwald JE, Toth C, Redford M, Ferris FL 3rd. Ophthalmology. 2012 Jul; 119(7):1388-98）。このため、より低い頻度で投与され得る抗ＶＥＧＦ治療剤は、硝子体内法の回数の低下及びＶＥＧＦのより低い全身性抑制によって、安全性の利益を有し得る。
【０１９１】
重要なＭＡＲＩＮＡ臨床試験（Rosenfeld et al., 2006）では、ラニビズマブの毎月の注入は、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）において、１０〜１５ｌｅｔｔｅｒの得点をもたらす。一方、処置を受けなかった患者は、平均約１０ｌｅｔｔｅｒの視力を失った。ｗｅｔ  ＡＭＤ患者におけるその後の試験において、より少ない硝子体内処置によって視力得点を維持することができるかどうかを見るために、異なる投与パラダイムが評価された（ＰＩＥＲ、ＰＲＯＮＴＯ、ＥＸＣＩＴＥ、ＳＵＳＴＡＩＮ、ＨＯＲＩＺＯＮ、ＣＡＴＴ）。これらの臨床試験から、より低い頻度の投与計画と比較して、毎月の投与の方が優れた目に見える結果をもたらすことが示されてきた（Patel et al., 2011）。毎月又は隔月より低い頻度での注入を必要とする患者において、毎月又は隔月の投与計画により達成される効果も維持することをもたらす、より長い作用持続期間を有する抗ＶＥＧＦ治療剤に対する必要性が存在する。
【０１９２】
ＶＥＧＦに加えて、他の血管新生促進性、炎症性又は増殖因子メディエータが、網膜性疾患、例えば、血管新生（ｗｅｔ）ＡＭＤ、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症等に関与する。これらの血管新生促進性、炎症性又は増殖因子メディエータ分子の例としては、限定されるものではないが、ＰＤＧＦ（Boyer, 2013）、アンギオポエチン（Oliner et al., 2012）、Ｓ１Ｐ（Kaiser, 2013）、インテグリンανβ３、ανβ５、α５β１（Kaiser et al., 2013；Patel, 2009a；Patel, 2009b）、ベタセルリン（Anand-Apte et al., 2010）、アペリン／ＡＰＪ（Hara et al., 2013）、エリスロポエチン（Watanabe et al., 2005; Aiello, 2005）、補体因子Ｄ、ＴＮＦα及び、遺伝子関連試験によるＡＭＤリスクに結びつくタンパク質（例えば、補体経路のタンパク質、例えば、Ｃ２、因子Ｂ、因子Ｈ、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ及びＣ３ａならびにＨｔｒＡ１、ＡＲＭＳ２、ＴＩＭＰ３、ＨＬＡ、ＩＬ８、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＣＥＴＰ、ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（Nussenblatt et al., 2013）があげられる。これらの分子及び経路を効果的に標的とする治療剤が開発された場合、目に見える結果の改善を提供する一方、頻繁な硝子体内注入に伴う処置の負担及びリスクを低下させることに対する必要性が存在し得る。別の網膜疾患は、ドルーゼンの存在、網膜上の黄班として見られるデブリの堆積により特徴付けられる、最も一般的な型のＡＭＤであるＤｒｙ  ＡＭＤである。Ｄｒｙ  ＡＭＤは、より重篤な型、例えば、血管新生（ｗｅｔ）ＡＭＤ又は地図状萎縮に進展するおそれがある。Ｄｒｙ  ＡＭＤ及び地図状萎縮は、慢性疾患であるため、治療剤は、潜在的に長い年数投与されなければならないであろう。このため、目に見える結果を改善する一方、同時に頻繁な硝子体内注入に伴う処置の負担及びリスクを低下させる必要性が存在する。緑内障、ドライアイ又はブドウ膜炎を含むが、限定されるものではない他の眼の疾患も、硝子体内に送達される治療剤によって処置される可能性がある。
【０１９３】
本発明は、眼からの治療用分子のクリアランスを遅延させることにより、その眼における半減期を増大させるために、治療用分子に結合し得るペプチドタグを提供する。本発明は、タグ付けされてない分子に対して、効果の増大した持続期間を有し、臨床における、より低い頻度での眼内注入及び改善された患者の処置をもたらすであろう、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に関する。
【０１９４】
本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子は、医薬として使用され得る。特に、本発明のペプチドタグ付き分子は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置するために使用されてもよい。例えば、本願明細書に記載されたＶＥＧＦと結合するペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントは、有効量の本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することによる、増大したＶＥＧＦレベル及び／又は活性に関連する眼の疾患又は障害の処置のために、治療的に有用な濃度で使用され得る。
【０１９５】
本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、糖尿病性網膜症（ＤＲ）に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与する、黄班浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、糖尿病性黄班浮腫（ＤＭＥ）を処置する方法も提供する。本発明は、さらに、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を処置する方法を提供する。さらに、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、加齢黄班変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び／又は未熟児網膜症を処置する方法を提供する。さらに、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、ＶＥＧＦ媒介性障害を処置する方法に関する。前記ペプチドタグ付き分子は、９．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含むと考えられる。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。前記ペプチドタグ付き分子は、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントであると考えられる。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、８．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、７．２μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、６．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、５．５μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含んでもよい。更なる態様では、前述の方法は、前記投与工程前に、このような状態又は障害を有する対象を診断する工程をさらに含む。
【０１９６】
一態様では、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、抗ＶＥＧＦ治療剤に不応性の対象におけるＶＥＧＦ媒介性障害を処置する方法に関する。前記ペプチドタグ付き分子は、９．０μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含むと考えられる。例えば、前記ペプチドタグは、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合し得る。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含んでもよい。本願明細書で使用する場合、「抗ＶＥＧＦ治療剤に不応性」は、公知の抗ＶＥＧＦ治療剤、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤により、十分な生理学的応答を達成できないことを意味する。このような患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブもしくはアフリベルセプトの３回の硝子体内注入（又は、前述の治療剤のいずれかの組み合わせの３回の硝子体内注入）後に、異常な中心網膜厚み（斑点の中心１ｍｍ２の面積）において、２０％未満の低下を有する。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤の使用にもかかわらず、視力の連続的な悪化を経験する。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤の使用にもかかわらず、網膜の肥厚化を経験する。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤を受けたのにもかかわらず、ごくわずかな解剖学的改善しか示さない。
【０１９７】
本発明のペプチドタグ付き分子（例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント）は、特に、網膜血管疾患に関連する状態又は障害（例えば、ＤＲ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び／又は未熟児網膜症）の進展を予防し、網膜血管疾患に関連する黄斑浮腫を治療又は予防し、現在の抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト）に必要とされる頻繁な注入と比較して硝子体内注入の頻度を低下させ、網膜血管疾患の進展による視力損失を改善するために使用され得る。本発明のペプチドタグ付き分子（例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント）は、例えば、網膜血管疾患を有する患者の処置のための、他の抗ＶＥＧＦ治療剤、他の抗ＰＤＧＦ治療剤、他の抗補体治療剤又は他の抗ＥＰＯ治療剤又は他の抗炎症治療剤との組み合わせでも使用され得る。
【０１９８】
網膜血管疾患、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症及びＶＥＧＦ媒介性障害ならびに、網膜血管疾患に関連する他の状態又は障害の治療及び／又は予防は、眼科医又は医療専門家により、視覚機能及び／又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を使用して決定され得る。網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置は、視覚機能及び／又は網膜解剖学の改善又は保持をもたらす、又は、もたらすと考えられる、いずれかの行為（例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦ抗体の投与）を意味する。さらに、網膜血管疾患に関連する状態又は障害に関する場合、その予防は、悪化のリスクを有する患者において、視覚機能、網膜解剖学及び／又は本願明細書に記載された網膜血管疾患パラメータの悪化を予防又は遅延させる、いずれかの行為（例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦ抗体の投与）を意味する。
【０１９９】
視覚機能は、例えば、視力、低照度での視力、視野、中心視野、周辺視覚、対比感度、暗順応、光ストレス回復、色識別、読取り速度、補助機器への依存性（例えば、大きな活字、拡大装置、望遠鏡）、顔認識、自動車運転時の熟練度、日常生活の１つ以上の動作を行う能力、及び／又は、視覚機能に関連する患者報告満足度を含んでもよい。
【０２００】
視覚機能の例示となる測定としては、Ｓｎｅｌｌｅｎ視力、ＥＴＤＲＳ視力、低照度視力、Ａｍｓｌｅｒグリッド、Ｇｏｌｄｍａｎｎ視野、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ視野、マイクロ視野計、Ｐｅｌｌｉ−Ｒｏｂｓｏｎチャート、ＳＫＩＬＬカード、Ｉｓｈｉｈａｒａカラープレート、Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ  Ｄ１５又はＤ１００カラー試験、標準的な網膜電位図検査、多局所網膜電位図検査、読取り速度に対する検証試験、顔認識、運転刺激及び患者報告満足度があげられる。このため、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の処置は、ＥＴＤＲＳスケールにおいて、視覚の２以上のライン（又は１０文字）を得ること、又は、２以上のラインを失わないこと基づいて達成されるということができる。さらに、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の処置は、対象が、読取り速度（１分あたりのワード）において、少なくとも１０％の増大を示す場合又は１０％の低下を示さない場合に生じるということができる。さらに、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の処置は、対象が、ｉｓｈｉｈａｒａ試験において正確に特定されたプレートの割合、又は、Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ試験において正確に並べられたディスクの割合において、少なくとも２０％の増大を示す場合又は２０％の低下を示さない場合に生じるということができる。さらに、網膜血管疾患及び／又は黄斑浮腫の処置は、対象が、例えば、予め特定された程度の暗順応に対する時間において、少なくとも１０％の低下を示す場合又は１０％以上の増大を示さない場合に生じるということができる。さらに、網膜血管疾患及び／又は黄斑浮腫の処置は、対象が、例えば、資格を有する医療専門家（すなわち、眼科医）により決定される視野角として表現される視野の暗点の総面積の、少なくとも１０％の低下を示す場合又は１０％以上の増大を示さない場合に生じるということができる。
【０２０１】
治療又は予防され得る網膜組織の望ましくない態様としては、例えば、小動脈瘤、黄斑浮腫、綿花状白斑、網膜内微小血管異常（ＩＲＡＭ）、毛細血管脱落、白血球接着、網膜虚血、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩の血管新生、網膜内出血、硝子体出血、斑点状瘢痕、網膜下線維症及び網膜線維症、静脈拡張、血管のねじれ、血管漏出があげられる。このため、例えば、黄斑浮腫の処置は、光学干渉断層撮影法により測定された場合、中心網膜サブフィールドの厚みにおける２０％以上の低下により決定され得る。
【０２０２】
網膜解剖学を評価する例示となる手段としては、眼底検査、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影、インドシアニングリーン血管造影、光学干渉断層撮影法（ＯＣＴ）、スペクトルドメイン光学干渉断層撮影法、走査レーザ眼底検査、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生検、剖検及び免疫組織化学があげられる。このため、血管疾患及び／又は黄班浮腫は、フルオレセイン血管造影により決定される場合、対象において、漏出面積における１０％の低下時に処置されたと言うことができる。
【０２０３】
本発明の治療剤により処置される対象は、糖尿病に関連する状態を処置する公知の方法による他の治療剤、例えば、全ての形式のインスリン及び高血圧剤も投与され得る。
【０２０４】
眼の疾患、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び／又は未熟児網膜症の治療及び／又は予防は、眼科医又は医療専門家により、上記測定のいずれかによる視覚機能及び／又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を使用して決定され得る。本願明細書に記載された測定は、本願明細書における全ての眼の疾患に適用されるわけではないが、当業者は、所定の眼の疾患を処置するために使用され得る、視覚機能及び／又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を認識するであろう。
【０２０５】
本発明の治療剤が別の薬剤と共に投与される場合、その２つは、いずれかの順序で連続的に、又は、同時に投与され得る。一部の態様では、本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントは、第２の薬剤（例えば、ルセンティス）による治療も受けている対象に投与される。他の態様では、前記結合分子は、外科的処置と共に投与される。
【０２０６】
本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントとの組み合わせ処置に適した薬剤としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体の活性を調節することができる当該分野で既知の薬剤、他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤又はＨＩＦ−１媒介性経路を調節する他の実体があげられる。これらの経路を阻害することが報告されている他の薬剤としては、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、パゾパニブ、ソラフィニブ、スニチニブ及びラパマイシンがあげられる。抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤＳ及びＴＮＦ−α阻害剤との組み合わせ処置も、網膜血管疾患及び黄班浮腫、例えば、糖尿病性網膜症及びＤＭＥの処置に有益であり得る。
【０２０７】
組み合わせ治療の計画は、付加的でもよいし、又は、相乗的な結果（例えば、前記２つの薬剤の組み合わせ使用に対する予測よりも網膜症の重症度を低下させる）を生じさせてもよい。一部の実施形態では、本発明は、網膜血管疾患及び黄班浮腫、具体的には、上記ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症、例えば、ＤＭＥ及び／又はＰＤＲの予防及び／又は治療をするための、本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントと、抗血管新生剤（例えば、第２の抗ＶＥＧＦ剤）とを用いた組み合わせ治療剤を提供する。特定の他の実施形態では、本発明は、網膜血管疾患及び黄班浮腫、具体的には、上記血管新生ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症、例えば、ＤＭＥ及び／又はＰＤＲの予防及び／又は治療をするための、本発明のペプチドタグ付き抗体又はペプチドタグ付き抗原結合フラグメントと、眼における他のターゲット、例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、補体経路の成分（例えば、Ｃ５、因子Ｄ、因子Ｐ、Ｃ３）、ＳＤＦ１、アペリン、ベタセルリンを阻害する薬剤又は抗炎症剤（例えば、ステロイド）とを用いた組み合わせ治療剤を提供する。
【０２０８】
一態様では、本発明は、硝子体内投与された治療剤の効果の持続期間を延長する方法に関する。効果の持続期間を延長すること（例えば、投与間隔を広げること）は、治療剤の、眼における半減期を増大させ、眼におけるクリアランスを低下させ、又は、眼における平均滞留時間を増大させることにより達成され得る。半減期又は平均滞留時間は、ＨＡと結合するペプチドタグに前記治療剤（例えば、タンパク質又は核酸）を結合させることにより増大され得る（及び、クリアランスが低下し得る）。したがって、一態様では、本発明は、眼における分子の、半減期、平均滞留時間を増大させ、及び／又は、クリアランスを低下させる方法に関する。特に、本発明は、本願明細書に記載されたペプチドタグにタンパク質又は核酸を結合させることにより、眼における前記タンパク質又は核酸の、半減期及び／又は平均滞留時間を増大させ、又は、クリアランスを低下させる方法に関する。
【０２０９】
増大した半減期、増大した平均滞留時間、増大した最終濃度、及び／又は、眼からの分子の低下したクリアランス速度の結果として、投与間隔を広げることができる。本発明は、眼における分子の半減期を増大させるための方法であって、対象の眼に、９．０μＭ以下のＫＤでＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む方法も提供する。特定の具体的な態様では、前記方法は、８．０μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、７．２μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、５．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。本発明は、眼における平均滞留時間を増大させ、最終濃度を増大させ、及び／又は、眼からの分子のクリアランスを低下させるための方法であって、対象の眼に、９．０μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。特定の具体的な態様では、前記方法は、８．０μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、７．２μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、５．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号３２、３３、３４、３６又は３７の配列を含む。前記組成物は、タンパク質又は核酸、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、より具体的には、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントに結合した、９．０μＭ、８．０μＭ、７．２μＭ又は５．５μＭ以下のＫＤで、ＨＡと結合するペプチドタグを含む。
【０２１０】
本願明細書に記載された半減期は、薬剤濃度が１／２低下するために必要とされる時間を意味する（Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995) and Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004)）。詳細は、Kenneth, A et at Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)にも見出され得る。「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition (1982)も参照され得る。同文献には、薬物動態学的パラメータ、例えば、アルファ半減期及びベータ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）が記載されている。場合により、本願明細書において引用された全ての薬物動態学的パラメータ及び値は、ヒトにおける値であると読まれるべきである。場合により、本願明細書において引用された全ての薬物動態学的パラメータ及び値は、マウス又はラット又はカニクイザルにおける値であると読まれるべきである。
【０２１１】
一態様では、ＨＡに結合することによって、半減期が少なくとも２５％増大すること（例えば、５から６．２５日）が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも５０％の増大（例えば、５から７．５日）が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも７５％の増大（例えば、５から８．７５日）が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも１００％の増大（例えば、５から１０日）が考えられる。別の態様では、半減期における１００％より大きい増大（例えば、１５０％、２００％）が考えられる。一態様では、本願明細書に記載したように、分子へのペプチドタグの結合は、前記タグを含まない分子の眼における半減期に対して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍及び少なくとも４倍以上、眼における半減期を増大させ得る。タグ付けされていない分子と比較した、ＨＡ結合ペプチドタグ付き分子についての眼における半減期の相対的増大は、硝子体内注入により前記分子を投与し、当分野において公知の分析法、例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分光法、ウェスタンブロット、放射線免疫アッセイ又は蛍光標識を使用して、種々の時点において残留する濃度を測定することにより決定され得る。硝子体内に投与された生体分子の硝子体からのクリアランスは、一次指数崩壊関数（方程式１）に適合することが示されている（Krohne et al., 2008；Krohne et al., 2012；Bakri et al., 2007b；Bakri et al., 2007a；Gaudreault et al., 2007；Gaudreault et al., 2005）。
Ｃｔ＝Ｃｔ＝０＊ｅ−ｋｔ  （１）
速度定数ｋは、
【数１】
2016502850.tif 000035
である。
ｃｔは、硝子体内投与後の時間ｔにおける濃度である。
Ｃｔ＝０は、硝子体内投与後の時間０における濃度である。
Ｔ１／２は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
【０２１２】
硝子体内の半減期を増大させる効果は、方程式（１）及び（２）を使用してモデル化され得る。
【０２１３】
ペプチドタグ付き分子の平均滞留時間及び／又は半減期の薬物動態学的分析及び決定をするための方法は、当業者にありふれたものであろう。さらに、ペプチドタグ付き分子の平均滞留時間の薬物動態学的分析及び決定をするための方法に関連する詳細は、Shargel, L and Yu, ABC:Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, 4th Edition (1999)、Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995)及び、Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004)に見出され得る。前記文献には、薬物動態学的パラメータ、例えば、平均滞留時間が記載されている。平均滞留時間及びＡＵＣは、時間に対する、薬剤（例えば、治療用タンパク質、ペプチドタグ付きタンパク質、ペプチドタグ等）のマトリクス又は組織（例えば、血清）濃度の曲線から決定され得る。Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア、ｅｇ  バージョン６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡから入手）が、例えば、このようなデータを分析及び／又はモデル化するために使用され得る。前記平均滞留時間は、薬剤が身体に存在する平均時間であり、吸収、分布及び排出のプロセスを包含する。ＭＲＴは、用量の６３．２％が排出される時間を表す。
【０２１４】
一態様では、本発明は、分子（例えば、タンパク質又は核酸）の平均滞留時間を、本願明細書に記載されたペプチドタグに前記分子を結合させることにより増大させる方法に関する。一態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグの結合は、眼における前記分子の平均滞留時間を１０％以上増大させ得る。更なる態様では、ここに記載された分子へのペプチドタグの結合は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％以上、眼における前記分子の平均滞留時間を増大させ得る。
【０２１５】
更なる態様では、本発明は、分子（例えば、タンパク質又は核酸）の眼におけるクリアランスを、本願明細書に記載されたペプチドタグに前記分子を結合させることにより低下させる方法に関する。一態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグの結合は、前記分子の眼におけるクリアランスを１０％以上低下させ得る。更なる態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグを考慮することは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％以上、眼における前記分子の眼におけるクリアランスを低下させ得る。
【０２１６】
医薬組成物
ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の送達
本発明は、本発明のペプチドタグ、例えば、９．０μＭ、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む組成物を提供する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き分子（例えば、タンパク質又は核酸に結合したペプチドタグ）を含む組成物も提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、上述したように、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを含む。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き抗体もしくはペプチドタグ付き抗原結合フラグメントならびに／又はペプチドタグを含む組成物も提供する。特定の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合された、ペプチドタグに結合したＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。より具体的な態様では、本発明は、ペプチドタグ付き分子：ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６又はＮＶＳ３７を含む組成物を提供する。さらにより具体的な態様では、本発明は、表１、２、８、８ｂ、９又は９ｂのいずれかにおける前記ペプチドタグ付き分子を含む組成物を提供する。本願明細書に記載された組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合されてもよい。前記組成物は、さらに、例えば、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を治療又は予防するのに適した１つ以上の他の治療剤を含み得る。薬学的に許容され得るキャリアは、前記組成物を向上もしくは安定化させ、又は、前記組成物の調製を容易にするために使用され得る。薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理学的に適合性である、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等があげられる。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、当分野において公知の各種の方法により投与され得る。前記投与の経路及び／又は方式は、所望の結果に応じて変化する。前記組成物が、眼に対する投与に適しているのが好ましい。より具体的には、前記組成物は、硝子体内投与に適していてもよい。前記薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアは、眼に対する投与（例えば、注入、結膜下又は局所投与）に、より具体的には、硝子体内投与に適しているべきである。前記投与経路に応じて、前記活性な化合物（すなわち、抗体、二重特異性及び多重特異性分子）は、酸の作用及び前記化合物を不活性化する場合がある他の自然条件から、前記化合物を保護する材料でコートされてもよい。本発明は、眼への送達用の組成物を製造する方法であって、９．０μＭ、８．５μＭ、８．０μＭ、７．５μＭ、７．０μＭ、６．５μＭ、６．０μＭ、５．５μＭ、５．０μＭ、４．５μＭ、４．０μＭ、３．５μＭ、３．０μＭ、２．５μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグを、眼におけるターゲット（例えば、ＶＥＧＦ、因子Ｐ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＴＮＦα、Ｃ５、ＩＬ−１β等）と結合する、又は、結合可能な分子（例えば、タンパク質又は核酸）に結合させる工程を含む方法も提供する。
【０２１８】
前記組成物は、無菌及び流体であるべきである。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、前記組成物中に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール及び塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注入組成物の長期吸収は、前記組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アンモニウム又はゼラチンを含ませることにより、もたらされ得る。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、当分野において周知かつ通常に実用化されている方法に基づいて調製され得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；及び、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下において製造される。典型的には、治療的に有効な用量又は効果的な用量の分子が、本発明の医薬組成物に使用される。前記ペプチドタグ付き分子は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数の分割された用量が、長期間にわたって投与されてもよいし、又は、治療状態の緊急性により指示された場合、用量が比例的に減少又は増加されてもよい。投与の容易性及び用量の均質性のため、非経口組成物を単位剤形に製剤化するのが特に有益である。本願明細書で使用する場合、単位剤形は、処置される対象に対する単位用量として適切な、物理的に分離された単位を意味する。各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含む。
【０２２０】
本発明の医薬組成物中の前記活性成分の実際の用量レベルは、患者に対する毒性なしに、具体的な患者に対する所望の治療応答、組成物及び投与方式を達成するために有効な量の活性成分が得られるように変化し得る。前記選択された用量レベルは、各種の薬物動態学的要因、例えば、使用される本発明の具体的な組成物、又は、そのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与のタイミング、使用される具体的な化合物の排泄速度、処置の持続期間、使用される具体的な組成物との組み合わせで使用される他の薬剤、化合物及び／もしくは材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び既往歴等の要因により決まる。用量レベルは、本願明細書に記載された眼／視覚の評価の１つ以上を使用して決定される場合に治療的応答を達成するように選択及び／又は調節されてもよい。
【０２２１】
医師又は獣医師は、前記医薬組成物に使用される本発明のペプチドタグ付き分子の用量を、所望の治療的効果を達成するのに必要とされるより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、前記用量を徐々に増加させることができる。一般的には、本願明細書に記載された網膜血管疾患の処置用の本発明の組成物の有効な用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、ターゲット部位、患者の生理学的状態、前記患者がヒトもしくは動物であるかどうか、投与される他の薬剤及び、処置が予防的であるか、もしくは、治療的であるかどうかにより変化する。処置用量は、安全性及び効果を最適化するように用量設定される必要がある。ペプチドタグ付き分子による硝子体内投与のための用量は、注入あたりに、０．１ｍｇ／眼から６ｍｇ／眼の範囲でもよい。眼あたりの単回用量は、眼あたりに、２回の注入で行われてもよい。例えば、１２ｍｇ／眼の単回用量は、各６ｍｇの２回の注入で送達されて、合計１２ｍｇの用量をもたらしてもよい。特定の具体的な態様では、用量は、１２ｍｇ／眼、１１ｍｇ／眼、１０ｍｇ／眼、９ｍｇ／眼、８ｍｇ／眼、７ｍｇ／眼、６ｍｇ／眼、５ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４ｍｇ／眼、３．５ｍｇ／眼、３ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、２ｍｇ／眼、１．５ｍｇ／眼、１ｍｇ／眼、０．９ｍｇ／眼、０．８ｍｇ／眼、０．７ｍｇ／眼、０．６ｍｇ／眼、０．５ｍｇ／眼、０．４ｍｇ／眼、０．３ｍｇ／眼、０．２ｍｇ／眼、又は０．１ｍｇ／眼以下でもよい。各投与は、眼あたりに、１回以上の注入で行われてもよい。注入あたりの容量は、１０マイクロリットル〜５０マイクロリットルでもよいが、投与あたりの容量は、１０マイクロリットル〜１００マイクロリットルでもよい。例えば、用量としては、注入あたりの眼あたりに、０．１ｍｇ／５０μｌ、０．２ｍｇ／５０μｌ、０．３ｍｇ／５０μｌ、０．４ｍｇ／５０μｌ、０．５ｍｇ／５０μｌ、０．６ｍｇ／５０μｌ、０．７ｍｇ／５０μｌ、０．８ｍｇ／５０μｌ、０．９ｍｇ／５０μｌ、１．０ｍｇ／５０μｌ、１．１ｍｇ／５０μｌ、１．２ｍｇ／５０μｌ、１．３ｍｇ／５０μｌ、１．４ｍｇ／５０μｌ、１．５ｍｇ／５０μｌ、１．６ｍｇ／５０μｌ、１．７ｍｇ／５０μｌ、１．８ｍｇ／５０μｌ、１．９ｍｇ／５０μｌ、２．０ｍｇ／５０μｌ、２．１ｍｇ／５０μｌ、２．２ｍｇ／５０μｌ、２．３ｍｇ／５０μｌ、２．４ｍｇ／５０μｌ、２．５ｍｇ／５０μｌ、２．６ｍｇ／５０μｌ、２．７ｍｇ／５０μｌ、２．８ｍｇ／５０μｌ、２．９ｍｇ／５０μｌ、３．０ｍｇ／５０μｌ、３．１ｍｇ／５０μｌ、３．２ｍｇ／５０μｌ、３．３ｍｇ／５０μｌ、３．４ｍｇ／５０μｌ、３．５ｍｇ／５０μｌ、３．６ｍｇ／５０μｌ、３．７ｍｇ／５０μｌ、３．８ｍｇ／５０μｌ、３．９ｍｇ／５０μｌ、４．０ｍｇ／５０μｌ、４．１ｍｇ／５０μｌ、４．２ｍｇ／５０μｌ、４．３ｍｇ／５０μｌ、４．４ｍｇ／５０μｌ、４．５ｍｇ／５０μｌ、４．６ｍｇ／５０μｌ、４．７ｍｇ／５０μｌ、４．８ｍｇ／５０μｌ、４．９ｍｇ／５０μｌ、５．０ｍｇ／５０μｌ、５．１ｍｇ／５０μｌ、５．２ｍｇ／５０μｌ、５．３ｍｇ／５０μｌ、５．４ｍｇ／５０μｌ、５．５ｍｇ／５０μｌ、５．６ｍｇ／５０μｌ、５．７ｍｇ／５０μｌ、５．８ｍｇ／５０μｌ、５．９ｍｇ／５０μｌ又は６．０ｍｇ／５０μｌがあげられる。例示となる処置計画は、２週間毎に１回又は毎月１回又は２ヶ月毎に１回又は３から６ヶ月毎に１回又は、必要に応じて（ＰＲＮ）、ＩＶＴ投与を必要とする。前記ペプチドタグ付き分子は、現在の治療の処置計画を改善し、以下にさらに詳細に記載されている、投与間隔を広げることを可能にする。
【０２２２】
ルセンティスと共に使用するのに適したＦＤＡ承認用量及び投与計画が考慮される。抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合フラグメントと共に使用するのに適した他の用量及び投与計画は、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載されている。
【０２２３】
ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の組成物は、複数回投与されてもよい。単回用量間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。例えば、視力又は黄班浮腫に基づいて、患者における再処置の必要性により示された場合、間隔は不規則であってもよい。さらに、別の投与間隔は、医師により決定され、毎月又は効果的であるように必要に応じて投与され得る。効果は、光学干渉断層撮影法（ＯＣＴ）及び視力により決定される場合、病変の成長、抗ＶＥＧＦ救出速度、網膜の厚みに基づいている。用量及び頻度は、患者におけるペプチドタグ付き分子の半減期及び治療ターゲット（例えば、ＶＥＧＦ、Ｃ５、ＥＰＯ、因子Ｐ等）のレベルにより変化してもよい。ＩＶＴで投与された治療用分子の効果の持続期間を延長させることは、眼におけるＴ１／２を増大させること、及び／又は、その眼における平均滞留時間を増大させること、及び／又は、クリアランスを低下させることにより達成され得る。効果の持続期間を延長させることは、例えば、硝子体、網膜及び／又はＲＰＥ／脈絡膜からのそのクリアランスを遅延させて、前記ペプチドタグ付き分子の眼における増大した半減期をもたらすために、分子にＨＡ結合ペプチドタグを結合させることにより達成され得る。タグ付けされていない分子と比較して、ＨＡと結合するペプチドタグ付き分子についての眼における半減期の相対的増大は、硝子体内注入により前記分子を投与し、当分野において公知の分析法、例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分光法、ウェスタンブロット、放射線免疫アッセイ又は蛍光標識を使用して、種々の時点において残留する濃度を測定することにより決定され得る。血中濃度は、記載されたように、眼からのクリアランス速度を算出するためにも測定及び使用され得る（Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(3):1616-24 (2013)）。
【０２２４】
一般的に、本発明のペプチドタグに結合した分子（例えば、抗体又はフラグメント）は、タグ付けされていない分子よりも眼における長い半減期を示す。例えば、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグに結合し分子は、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における２５％の増大（例えば、５から６．２５日）、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における５０％の増大（例えば、５から７．５日）、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における７５％の増大（例えば、５から８．７５日）、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における１００％の増大（例えば、５から１０日）を有し得る。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子の半減期は、前記タグ付けされていない分子と比較して、１００％より高く（例えば、５から、１５、２０又は３０日；１週間から、３週間、４週間以上等）増大し得る。
【０２２５】
前記投与の用量及び頻度は、処置が予防的又は治療的であるかどうか、及び、処置が、投与された分子の半減期により直接影響を受けるかどうかにより変化し得る。本願明細書に記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の投与は、用量及び投与頻度における臨床的に意義のある改善をもたらす。例えば、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子と比較して、より低い頻度で投与され得る。用量及び投与頻度における臨床的に意義のある改善を達成することは、組成物の初期の開始用量に応じて変化し得る。例えば、毎日、毎週、隔週、毎月又は隔月で投与される分子について、ペプチドタグ付き分子により達成され得る投与頻度における臨床的に意義のある改善は、例えば、投与間隔の、少なくとも２５％、３０％、５０％、７５％又は１００％の広がりであり得る。特定の態様では、例えば、投与頻度における臨床的に意義のある改善は、それぞれ、毎日から隔日、毎週から２週間毎又は毎月から６週間毎もしくは隔月以上に、投与頻度を低くすることにより生じる。
【０２２６】
より具体的には、本発明のペプチドタグは、現在の眼の治療剤の投与間隔を改善するために使用されてもよい。特定の態様では、ペプチドタグは、前記分子の投与間隔を少なくとも２５％広げるのに有用であり得る。例えば、前記投与間隔は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％以上広げられ得る。前記分子の眼における投与間隔は、７．５μＭ以下、７．０μＭ以下、６．５μＭ以下、６．０μＭ以下、５．５μＭ以下、５．０μＭ以下、４．５μＭ以下、４．０μＭ以下、３．５μＭ以下、３．０μＭ以下、２．５μＭ以下、２．０μＭ以下、１．５μＭ以下、１．０μＭ以下、０．５μＭ以下又は１００ｎＭ以下のＫＤで、眼におけるＨＡと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させることにより広げられてもよい。例えば、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂであるラニビズマブ及び抗ＶＥＧＦ  ＩｇＧであるベバシズマブは、現在、Ｗｅｔ  ＡＭＤ及びＤＭＥの患者に対して、最大の眼に見える利益を達成するために、毎月投与される。ＨＡ結合ペプチドタグをラニビズマブ又はベバシズマブに結合させることは、隔月又は四半期の投与に投与頻度を低くすること（すなわち、投与間隔における少なくとも５０％の増大）が期待され得る。同様に、抗ＶＥＧＦアプタマーであるペガプタニブは、現在、Ｗｅｔ  ＡＭＤ患者において、６週間毎の投与が規定されている。ペガプタニブをＨＡ結合ペプチドタグに結合させることは、２ヶ月以上投与間隔を広げること（すなわち、投与間隔における少なくとも３０％の増大）が期待される。隔月以上の投与頻度を必要とする他の分子について、臨床的に意義のある改善は、もう１月以上投与間隔を増大させ得る（すなわち、投与間隔における少なくとも５０％の増大）。例えば、抗ＶＥＧＦ  Ｆｃトラップであるアフリベルセプトは、現在、Ｗｅｔ  ＡＭＤ患者において、隔月の投与が規定されている。アフリベルセプトをＨＡ結合ペプチドタグに結合させることは、３ヶ月毎以上の投与を可能にすることが予測され、投与間隔における少なくとも５０％の増大をもたらす。
【０２２７】
特定の具体的な態様では、前記組成物は、投与あたりに、１２ｍｇ、１１ｍｇ、１０ｍｇ、９ｍｇ、８ｍｇ、７ｍｇ、６ｍｇ、５ｍｇ、４．５ｍｇ、４ｍｇ、３．５ｍｇ、３ｍｇ、２．５ｍｇ、２ｍｇ、１．５ｍｇ、１ｍｇ、０．９ｍｇ、０．８ｍｇ、０．７ｍｇ、０．６ｍｇ、０．５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．３ｍｇ、０．２ｍｇ又は０．１ｍｇの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。特定の具体的な態様では、前記組成物は、注入あたりに、６ｍｇ、５ｍｇ、４．５ｍｇ、４ｍｇ、３．５ｍｇ、３ｍｇ、２．５ｍｇ、２ｍｇ、１．５ｍｇ、１ｍｇ、０．９ｍｇ、０．８ｍｇ、０．７ｍｇ、０．６ｍｇ、０．５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．３ｍｇ、０．２ｍｇ、０．１ｍｇ又は０．０５ｍｇの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。具体的な態様では、前記組成物は、投与あたりに、１２ｍｇの前記ペプチドタグ付き分子、及び／又は、注入あたりに、６ｍｇの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。予防的用途では、比較的低い用量が、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者は、残りの人生の間にわたって処置を受け続ける。治療的用途では、比較的短い間隔で比較的高い用量が、場合により、前記疾患の進行が低下又は終了するまで、及び好ましくは、前記患者が疾患の兆候の部分的又は完全な改善を示すまで必要とされる。その後、前記患者は、予防的投与計画で投与され得る。
【実施例】
【０２２８】
本願明細書における実施例では、眼における分子の半減期を延長するヒアルロナン（ＨＡ）結合ペプチドタグが記載される。例えば、前記分子は、タンパク質又は核酸でもよい。２つの動物モデル：ウサギＶＥＧＦ誘導性漏出モデル、網膜浮腫モデル、及び、カニクイザルのレーザ誘導性脈絡膜血管新生（レーザＣＮＶ）モデル、血管新生性（ｗｅｔ）ＡＭＤモデルを、ＨＡ結合タンパク質タグと結合したタンパク質と、そのままの修飾されていない（すなわち、タグ付けされていない）タンパク質又は核酸との間における効果の持続期間における差異を評価するために使用した。
【０２２９】
実施例１：ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（ＮＶＳ４）及びペプチドタグ付きＶＥＧＦ  Ｆａｂ（ＮＶＳ１）の生成
抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（ＮＶＳ４）への変換
前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（ＮＶＳ４）を生成するための開始点を、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（１００８ｓｃＦｖ）とした。１００８ｓｃＦｖは、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に先に開示されており、５７８ｍｉｎｉｍａｘＴ８４Ｎ＿Ｖ８９Ｌ又はタンパク質Ｎｏ：１００８として特定された。
【０２３０】
１００８ｓｃＦｖをそのＦａｂ型（ＮＶＳ４）に変換するために、１００８ｓｃＦｖのアミノ酸配列を、公開されているヒトＩｇＧフレームワーク配列と整列させ、カッパフレームワークと高い相同性を有することを決定した。結果として、１）ヒト免疫グロブリン・カッパ鎖の定常領域配列であるＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＷＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１２５）を、１００８ｓｃＦｖにおける軽鎖のＣ−末端に付加し、及び、ｉｉ）ヒト免疫グロブリンの重鎖の第１の定常Ｉｇドメイン（ＣＨ１ドメイン）の配列であるＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ（配列番号１２６）を、１００８ｓｃＦｖにおける重鎖のＣ−末端に付加することにより、１００８ｓｃＦｖをＮＶＳ４に変換した。さらに、アロタイプとして、重鎖のＧ１ｍ（ｆ）３及びカッパ軽鎖のＫｍ３と相関する、選択されたアロタイプが、我々の抗体治療に使用される。
【０２３１】
タグ付き及びタグ付けされていない組換え抗体及びタンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞中の哺乳類発現ベクターの一過性導入により発現させ、標準的な親和性樹脂、例えば、Ｋａｐｐａｓｅｌｅｃｔ（Ｃａｔ＃１７−５４５８−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。
【０２３２】
実施例２：修飾されていないＶＥＧＦ抗体（ＮＶＳ４）のラニビズマブに対する評価
ウサギの眼における従来のＰＫ決定
ウサギの硝子体における、ＮＶＳ４及びラニビズマブ（ＣＡＳ＃：３４７３９６−８２−１）の眼におけるＰＫプロファイルを、以下に記載され、図１に示された従来の方法を使用して比較した。
【０２３３】
１５０μｇ／眼のラニビズマブ又はＮＶＳ４を、ウサギの眼の硝子体内に注入した（抗体あたりに、Ｎ＝６の眼）。ウサギを、注入後１時間ならびに７、１４、２１、２８日で屠殺し、眼を摘出した。前記摘出した眼を解剖し、硝子体を、他の組織から分離し、さらに、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ４６４７１８）を、炭酸バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）２８３８２）中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）３１１１９）で、４℃において一晩コートした。インキュベートの合間に、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレート洗浄器を使用して、プレートをＴＢＳＴ（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）２８３６０）で３回洗浄した。翌日、前記プレートを、ＴＢＳ中のブロッキングバッファー（５％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９）により、室温で２時間（又は、４℃で一晩）ブロッキングした。サンプルを、希釈剤（ＴＢＳにおける、２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９））中に希釈した。サンプルを、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において１時間インキュベートした。検出抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２］（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ３１４１４）とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で３０分間添加した。Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢを、１５分間添加した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）３４０２８）。反応を、２Ｎ  硫酸（Ｒｉｃｃａ８３１０−３２）により停止させた。前記サンプルの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）（４５０−５７０ｎｍ）上で読み取った。眼の組織からのＦａｂ回収レベルを逆算するために、精製した標準を使用した。前記標準について、使用した上限濃度を、２倍希釈による２００ｎｇ／ｍＬとした。種々の抗体ペアを、ウサギ組織からのＦａｂ回収に使用し得る。
【０２３４】
ＮＶＳ４及びラニビズマブは、図１に示されるように、眼における同等のＰＫプロファイルを示した。ラニビズマブ及びＮＶＳ４についての半減期値は、それぞれ、２．５及び２．７日であり、共に関連しない抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＰＫの同等性を示す。その後、ペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂが、ラニビズマブ又はＮＶＳ４のいずれかと比較されてよい。
【０２３５】
ウサギのＶＥＧＦ負荷モデル
ウサギのＶＥＧＦ誘導性漏出モデルにおいて、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）を、硝子体内（ＩＶＴ）注入によりウサギの眼に投与した。ヒトＶＥＧＦは、血管直径、ねじれ及び透過性の増大を含む用量依存性の血管変化を誘導する。血管透過性は、定量的画像処理又はフルオレセイン漏出スコアリングのいずれかと組み合わせたフルオレセイン血管造影（以下に記載される方法）を使用して評価され得る。
【０２３６】
ウサギにおける硝子体内（ＩＶＴ）注入
ウサギの眼を、局所の１％ シクロペントレート及び２．５又は１０％ フェニルエフリンにより広げ、角膜を、局所の０．５％ プロパラカインにより麻酔した。ついで、前記ウサギを、ケタミン／キシラジン混合物（１７．５−３５及び２．５−５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔した。外科用顕微鏡の直接視覚化下において、５０μＬの処置液を、硝子体内に注入した。３０ゲージのニードルを、角膜輪郭から硝子体の中央に、上側頭に約２ｍｍ挿入した。前記ウサギの眼を、前記注入由来の合併症（例えば、出血、網膜剥離又はレンズ傷害）について検査した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。抗生物質の軟膏（試験の部分集合では、デキサメタゾンをさらに含む抗生物質の軟膏）を、全ての試験について両眼に塗布した。４００ｎｇの組換えｈＶＥＧＦを、約１．６−２ｋｇの体重の、オスのダッチベルテッドウサギの硝子体内に注入した。ヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；ｃａｔ  ＡＦ１００−２０、Ｌｏｔ０５０８ＡＦ１０）を、無菌の０．９％ 生理食塩水に希釈した。ＶＥＧＦ負荷モデルの硝子体内注入４８時間後に、ウサギの網膜血管を、以下に記載するように画像化した。
【０２３７】
画像取得
ヒトＶＥＧＦ誘導性網膜血管変化を、静脈内蛍光染料投与後に、網膜血管の画像の取得により定量化した。フルオレセイン
送達後に取得した画像を、全ての効果試験における血管透過性を決定するために使用した。定量的なフルオレセイン漏出を生成する試験も、血管を標識するために選択される蛍光染料（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートデキストラン）の画像化を必要とした。眼の画像を、ＶＥＧＦの４８時間後に取得した。画像は、視神経に隣接する鼻髄腔上の３０度のレンズで取得された、４０以下の登録された走査レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）画像の平均であった。６−モードＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ（登録商標）（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）からのフルオレセインチャネルを、全ての画像取得に使用した。画像化前に、拡張のために、局所的に、１−２滴の１％ シクロペントレート及び１−２滴のフェニルエフリン（２．５又は１０％）をウサギに投与した。０．５％ プロパラカインも、局所麻酔として塗布した。その後、ウサギを、前述のように麻酔した。耳の縁の血管内に、ＦＩＴＣにコンジュゲートした２０００ｋＤデキストラン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））溶液１ｍＬを静脈内注射することにより、画像取得前の約５分間、血管を標識した。使用したＦＩＴＣ−デキストランの濃度（３５〜７０ｍｇ／ｍＬ）は、高品質画像を得るために必須のフルオレセインシグナルに基づいて、各ロットについて経験的に選択した。その後、標識された網膜血管の画像を取得した。ついで、網膜血管の透過性を、耳の縁の血管内への０．３ｍＬの１０％ フルオレセイン溶液を注入することにより評価した。ついで、試験に応じて、一方の眼内のみにフルオレセインを注入した３分後、又は、一方の眼に注入した３分後に、続けて、もう片方の眼にフルオレセインを注入した約４〜６分後のいずれかに取得した。
【０２３８】
画像分析
血管透過性におけるＶＥＧＦの作用を、３〜６分のフルオレセイン画像に適用した２種類の技術を使用して評価した。使用したアプローチにかかわらず、データを作成及び取得するために使用した工程は、先に記載したＦＩＴＣ−デキストラン注入を除いて同じとした。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（登録商標））を使用してこの目的のために開発された専用のソフトウェアを用いるか、又は、定量的スコアリングシステムを使用して各画像におけるフルオレセイン漏出を評価するかのいずれかにより、定量的に分析を行った。質が不十分な画像の場合、炎症が見られた場合、又は、注入の問題がある場合には、アンマスキング前に排除した。両方のアプローチについて、前記データを、個々の試験のため、又は、複数の試験の組み合わせとして、報告する。両方法を、以下に説明する。
【０２３９】
定量的画像処理分析
一部の試験において、フルオレセイン漏出を、以下に記載された方法を使用する画像処理技術により定量化した。
【０２４０】
まず、ＶＥＧＦ  ＦＩＴＣ−デキストラン及びフルオレセイン後の画像を、両画像に共通する血管の特徴を使用して互いに整列させた。ついで：
１．ついで、髄腔の外側領域を、分析用には不十分な画像品質のいずれかの局部に沿って、前記共登録画像からトリミングした。
２．網膜血管における目的の複数の領域を、両画像において表示し、一方の画像の強度を、前記目的の領域におけるシグナルが両画像において等しくなるまで増加させた（正規化）。
３．前記整列させたＦＩＴＣ−デキストラン画像を、浸出フルオレセインを含む画像を生じるフルオレセイン漏出画像から差し引いた。
４．フルオレセイン漏出を、浸出染料画像における目的のトリミング領域に含まれる画素の平均強度として、各眼について報告した。
【０２４１】
各群におけるフルオレセイン漏出の阻害を、生理食塩水コントロール群に対して算出した。統計学的分析を、両側スチューデントｔ検定又はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ複数比較検定による分散の一方向分析のいずれかにより行った。
【０２４２】
定量的フルオレセイン画像漏出スコアリング
一部の試験において、フルオレセイン血管造影画像への適用のために開発された３工程スコアリングシステムを使用して、網膜血管透過性を評価した。リーダにより、各フルオレセイン漏出画像を、３つのカテゴリーの内の１つに割り当てた。スコア０は、網膜血管からの漏出サインがないことを示した。スコア１は、フルオレセイン漏出を示唆するヘイズを示した。認められた漏出が薄い場合、血管のねじれの増加を、スコア１を確認するために使用し得た。スコア２は、網膜血管領域のほとんど又は全てにわたる明確なフルオレセイン漏出を示した。マスクしたランダム化データについて、画像評価を行った。
【０２４３】
血管透過性を評価するために使用した方法にかかわらず、測定したフルオレセインシグナル又は血管外浸出染料の認められた増加は、血管漏出に比例する。効果は、生理食塩水注入を受けた動物において観察されたシグナルに対する、前記測定したフルオレセインシグナル強度又は認められた血管外浸出染料の低下として定義される。より低い値の平均蛍光シグナル又は画像スコアは、より高い漏出阻害に対応し、及びこのため、より高い効果に対応する。
【０２４４】
４００ｎｇ／眼のヒトＶＥＧＦの硝子体内投与は、処置後４８時間で、最大漏出をもたらした（図２）。この血管漏出を、抗ＶＥＧＦ分子、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はＮＶＳ４の事前ＩＶＴ投与により、完全に阻害し得る（図３）。抗ＶＥＧＦ分子の作用の持続期間を決定するために、前記抗ＶＥＧＦ分子を、ｈＶＥＧＦ負荷前の種々のタイミングで投与した。前記抗ＶＥＧＦ分子の投与と前記ｈＶＥＧＦ負荷との間の間隔は、前記抗ＶＥＧＦ分子の作用の持続期間を決定する。前記ｈＶＥＧＦ負荷の４から２８日前（画像化の６から３０日前）に、抗ＶＥＧＦ抗体を、硝子体内に注入した。各ウサギのコホートは、同じ抗体を同時に注入した３〜５匹の動物（６〜１０個の眼）からなった。
【０２４５】
前記ウサギ漏出モデルにおける効果の持続期間を決定するために、眼あたりに５μｇの修飾されていない抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ又はＮＶＳ４）を、ｈＶＥＧＦ負荷の４から１９日前（画像化の６から２１日前、図３）の種々のタイミングで、各眼に対して硝子体内に投与した。ラニビズマブ及びＮＶＳ４は両方とも、フルオレセイン漏出スコアにより決定されたように、類似する持続期間の効果プロファイルを有した。５μｇ／眼のラニビズマブ又はＮＶＳ４を、前記ｈＶＥＧＦ負荷の４及び７日前に投与した場合、フルオレセイン漏出の完全な阻害が観察された。前記ｈＶＥＧＦ負荷の１２日前に投与した場合、部分的な効果を示すフルオレセイン漏出の増加が観察された。ラニビズマブをｈＶＥＧＦ負荷の１８日前に投与した場合、明らかな有効性が達成されなかった。別の試験において、ＮＶＳ４は、ｈＶＥＧＦ負荷の１９日前に投与した場合、明らかな効果が示されなかった。
【０２４６】
ウサギの眼における従来のＰＫデータと共に、これらの結果は、ラニビズマブ及び、修飾されていない／タグ付けされていないＶＥＧＦ抗原結合フラグメントであるＮＶＳ４が、ウサギにおいて、眼における同様の保持時間及び効果の持続期間を有することを示す。下記試験において、ペプチドタグ付き抗体（例えば、ＨＡと結合するペプチドタグに結合したＮＶＳ４）を、ラニビズマブと比較した。
【０２４７】
実施例３：タグ付き抗体の生成
眼における各種ターゲットに結合する数多くのペプチドタグ、例えば、コラーゲンＩＩ、ヒアルロナン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、エラスチン、ビトロネクチンと結合するペプチドタグを生成した。これらのペプチドタグを、眼における抗体の半減期を増大させるその能力について試験した。以下の方法は、単一及び二重のタグ付き抗体の生成及び特徴付けについて述べる。
【０２４８】
単一タグ付き抗体又はＦａｂ
上記列記した眼におけるターゲットの１つと結合する単一ペプチドタグを含むＮＶＳ４融合タンパク質を調製した。ペプチドタグ配列（例えば、ＨＡ結合タグ配列）を、ＧＳＧＧＧ（配列番号３１）又はＧＳＧＧ（配列番号１２４、例えば、ＮＶＳ５及びＮＶＳ１１を参照のこと。）のリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＣ−末端に融合させた。対象の産生は、前記タグ配列に融合した軽鎖及び重鎖のＦａｂのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の合成を必要とする。ＣＨ１定常ドメインの最後のシステインまでの重鎖可変領域のアミノ酸、続けて、上記ＧＳＧＧＧ又はＧＳＧＧのリンカー、及び、前記タグ配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドを合成した。ただし、前記タグ配列の融合は、重鎖ｆａｂのＣ−末端に限定されない。前記タグを、前記軽鎖のＣ−末端ならびに前記重鎖もしくは軽鎖又は前記２つの鎖の組み合わせのＮ−末端に融合するように操作してもよい。
【０２４９】
二重タグ付き抗体又はＦａｂ
ＮＶＳ４の複数のタグ付き型を、２つ以上のペプチドタグをＮＶＳ４に融合させることにより調製した。前記ペプチドタグ配列を、以下のいずれかに結合させた：
１）ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＣ−末端、及び、ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の軽鎖のＣ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｄ）、
２）ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＣ−末端、及び、ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の軽鎖のＮ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｆ）、
３）ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＮ−末端、及び、ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の軽鎖のＮ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｃ）、又は、
４）ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＮ−末端、及び、ＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の軽鎖のＣ−末端、
５）タンデムにＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の軽鎖のＣ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｅ）、
６）タンデムにＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＣ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｈ）、
７）タンデムにＧＳＧＧＧリンカーを使用して、ＮＶＳ４の重鎖のＣ−末端（例えば、ＮＶＳ１ｇ）。
【０２５０】
前記ペプチドタグ配列に融合させた軽鎖及び重鎖のＦａｂのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを合成した。ＣＨ１定常ドメインの最後のシステインまでの重鎖可変領域及び軽鎖全体、先行して、又は、続けて、ＧＳＧＧＧ又はＧＳＧＧのリンカー、及び、記載されたペプチドタグ配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドを合成した。
【０２５１】
実施例４：ペプチドタグ選択
下記実施例は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＮＶＳ４）に融合させた場合、その眼におけるターゲットに対する前記ペプチドタグの結合性及び／又は親和性を測定するために使用されて得る方法を説明する。結合親和性を測定するこれら及び他の方法は、当分野において公知である。
【０２５２】
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）によるＨＡ結合ペプチドタグの結合性及び／又は親和性の決定
ビオチン化ＨＡに対する、ペプチドタグ及び／又はタグ付きＶＥＧＦ抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合評価を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））を使用して、製造メーカーの説明により行った。バイオセンサである繊維の先端を、特別な光学層でコートし、ついで、補捉分子を、前記先端に結合させる。前記先端を、前記補捉分子に結合するターゲット分子を含むサンプルに浸漬した。前記２つは、分子層を形成する。白色光を前記繊維に向けると、２つのビームが、後端に反射されるであろう。第１のビームは、参照として、前記先端から来る。第２の光は、前記分子層から来る。前記２つのビームの差異は、スペクトルカラーパターンを生じさせるであろう。位相は、前記分子層の厚みの関数であり、前記先端表面上の分子数に対応する。前記分子が前記センサに結合する際、内部参照における反射は一定のままであろう。前記繊維上の分子層と溶液との間の界面は、結合分子の追加により変化する。前記センサ内の生体層干渉計は、時間経過による波長シフトにおけるこの変化をモニターする。分子が結合する際、シグナルのスペクトルが、前記センサ上で増加した前記層の関数として変化するであろう。このリアルタイムな結合測定は、濃度に対して速度をプロットすることによって、相互作用の反応速度、オンレート及びオフレート、及び最終的な濃度を算出するために使用され得る。
【０２５３】
下記に記載する方法では、ストレプトアビジン・バイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−５０１９）を、１×Ｋｉｎｅｔｉｃバッファー（ＦｏｒｔＢｉｏ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−５０３２）中に１０分間予浸して、前記バイオセンサの先端上の保護スクロース層を除去した。ついで、それを、１×Ｋｉｎｅｔｉｃバッファーにより希釈した５μｇ／ｍｌのビオチン化１７ｋＤａヒアルロン酸（ＨＡ）２００μｌを含むウェル内に浸漬し、ビオチン化ＨＡを前記ストレプトアビジン・バイオセンサ上に、９００秒間負荷した。ついで、前記補捉されたＨＡバイオセンサを、２００μｌの１×Ｋｉｎｅｔｉｃバッファーのウェル内に３００秒間浸漬して、ストレプトアビジンにより補捉されなかった残留ビオチン化ＨＡを除去した。その後、前記結合したＨＡバイオセンサを、一点結合スクリーニング又は反応速度を決定するための連続滴定用に、２００ｎＭの濃度の操作された抗体を含むウェル内に浸漬した。前記対象となる修飾された抗体を、前記補捉されたＨＡと、前記バイオセンサ上で９００秒間会合させ、その後、２００μｌの１×Ｋｉｎｅｔｉｃバッファーを含むウェルに移し、同ウェル中に２１００秒間浸漬して、前記抗原であるＨＡから前記操作された抗体を解離させた。結合の反応速度を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ（登録商標）分析プログラムから決定した。
【０２５４】
ＥＬＩＳＡ結合による、眼におけるターゲットに対するペプチドタグの結合性及び／又は親和性の決定
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（ＮＶＳ４）に融合した種々のペプチドタグの、眼におけるターゲットタンパク質、例えば、コラーゲンＩＩ、ラミニン、インテグリン、フィブロネクチン及びエラスチンへの結合を、以下に記載するように、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０２５５】
２μｇ／ｍｌ タンパク質２５マイクロリットルを、３８４ウェルのＭＳＤプレート（Ｃａｔ．＃  Ｌ２１ＸＡ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））上に、４℃で一晩コートした。前記プレートを、ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）＃２８３６０）中で３回洗浄し、ＴＢＳ／５％ ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）Ｃａｔ＃ＩＣＮ１６００６９８０）／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファーで、室温で最短２時間又は４℃で一晩ブロッキングした。前記プレートを、１回洗浄した。ｆａｂの滴定を、ＴＢＳ／２％ ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファー中で希釈し、ウェルあたり２５μｌを、前記洗浄したプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、前記プレートを３回洗浄した。１：０００に希釈した抗ヒトＩｇＧスルホタグ標識化検出抗体（Ｃａｔ．＃  Ｒ３２ＡＪ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））を、ウェルあたり２５μｌ添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを３回洗浄し、１×ＭＳＤ（登録商標）Ｒｅａｄバッファー（Ｃａｔ．＃  Ｒ９２ＴＣ）を、ウェルあたり２５μｌ添加する。前記プレートを、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（登録商標）Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）機器上で直ちに読み取る。電気化学的発光シグナルデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用して分析する。
【０２５６】
結果
全てにおいて、９０個のペプチドタグが、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに結合し（実施例３を参照のこと。）、Ｏｃｔｅｔ又はＥＬＩＳＡの眼における各推定上のターゲットへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合について評価された。
【０２５７】
５０個の推定のＨＡ結合ペプチドタグ配列が、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＡ結合について評価された。前記５０個の推定のＨＡ結合ペプチドタグのうち２７個のみが、ＨＡに対する測定可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示した。
【０２５８】
２３個の推定のコラーゲン結合タグが、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに結合し、コラーゲンＩＩに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合について評価された。２３個の推定のコラーゲン結合ペプチドタグのうち３つのみが、コラーゲンＩＩに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示した。
【０２５９】
７個の推定のインテグリン結合ペプチドタグが、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに結合し、インテグリンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合について評価された。前記７個の推定のインテグリン結合ペプチドタグのうち１つのみが、インテグリンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示した。
【０２６０】
他のフィブロネクチン結合性、ラミニン結合性、エラスチン結合性又はビトロネクチン結合性の結合タグは、その各ターゲットへの明らかに測定可能な結合を示さなかった。
【０２６１】
その後、陽性のターゲット結合を有するペプチドタグを、ラットのＰＥＴ／ＣＴ系画像化ＰＫモデルにおいて評価した。
【０２６２】
実施例５：コラーゲンＩＩ、インテグリン又はＨＡに陽性の結合を有するペプチドタグのＰＫ評価
Ｉ−１２４標識化Ｆａｂタンパク質を用いた、ＩＶＴ注入されたラットのＰＥＴ／ＣＴ画像化
Ｏｃｔｅｔ及び／又はＥＬＩＳＡにより、ＨＡ又はコラーゲンＩＩ又はインテグリンに対する測定可能な結合が示された前記タグ付き抗体の眼におけるＰＫを、本願明細書に記載されたラットのＰＥＴ／ＣＴ画像化法を使用して測定した。
【０２６３】
ラットの眼に注入された前記タンパク質の放射線標識を、ヨードゲン法（１）を使用して行った。前記方法は、ヨードゲンコートチューブ（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の使用を採用する。典型的には、＞８５％の放射線標識効率及び約７ｍＣｉ／ｍｇの比放射能を達成した。硝子体内（ＩＶＴ）注入用ラットを準備するために、動物を、３％ イソフルランガスで麻酔した。ついで、眼を、２滴のシクロペントレート（１％の好ましい濃度）及び２．５〜１０％ フェニルエフリンにより拡張させた。１滴の局所麻酔剤も塗布した（０．５％ プロパラカイン）。解剖顕微鏡下において、３０ゲージのニードルで、角膜の輪郭の下約４ｍｍを、眼の中央に向かう角度で切開した。ついで、放射線標識したタンパク質を含む鈍端のハミルトンシリンジ（例えば、３３ゲージ）を、この開口から硝子体腔内に挿入し、約３．５μＬの放射線標識化タンパク質を注入した。前記眼を、出血又は白内障について試験した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。ラットの眼内に前記放射線標識化タンパク質を注入した直後に、麻酔した動物を、その腹部を上にして、予熱したＰＥＴ画像化ベッドに寝かせた。前記ベッドに、ノーズコーンによりガス麻酔を供給した。ついで、固定及び確保された動物を、動物の胸部下に置かれた呼吸センサを使用してモニターされる生体機能（例えば、呼吸）についてのスキャナに移動させた。静的な１０分のＰＥＴスキャン、続けて、１０分のＣＴスキャンを、ＧＥ  Ｔｒｉｕｍｐｈ  ＬａｂＰＥＴ−８三峰性小型動物スキャナ（Ｇａｍｍａ  Ｍｅｄｉｃａ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）において行った。前記ＣＴスキャンの完了後、前記動物を、前記ベッドから取り外し、温かいケージに入れ、正常な生理学的機能を完全に回復するまでモニターした。ＩＶＴ注入後のＰＥＴ／ＣＴ画像化の典型的な時点を、０、３、６、２１、２９、４６、５２、７２、９４、１６６、１９０及び２１４時間とした。より短い時点での画像化（例えば、０、６、２４、４８、７２及び９６時間）でのより短い試験も行った。最後の画像化時点後に、麻酔した動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により安楽死させた。眼及び他の臓器／組織（血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨）を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、組織／臓器のカウント（％  注入用量／グラム（％ＩＤ／ｇ））に変換した。
【０２６４】
ついで、全てのＰＥＴ画像を、ＭＬＥＬ再構築アルゴリズムを使用して再構築し、ついで、前記ＣＴ解剖スキャンと共に登録した。分析用に、頭の画像を、左右の半球に分離した。ＡＭＩＲＡ（登録商標）（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇｒｏｕｐ（登録商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）及びＡｍｉｄｅ（Ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）分析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＴで定義した眼の位置に基づくＰＥＴ画像における所望の３Ｄ領域（ＲＯＩ）を描いた。前記所望の領域におけるＰＥＴシグナルを、減衰補正した注入用量及び動物の眼の重量（死後に測定）を考慮し、前記ＲＯＩの体積について正規化して、標準的な取り込み値（ＳＵＶ）として表した。ついで、前記データをプロットして、前記ラットの眼に注入したタンパク質のクリアランス反応速度（例えば、半減期又は平均滞留時間）を算出した。
【０２６５】
修飾されていない（例えば、タグ付けされていない）抗体又は抗原フラグメント及び、タグ付き抗体の眼におけるクリアランスを評価するために、１２４Ｉ−標識抗体を、ラットの眼に注入した。相対的な抗体レベルを、ＰＥＴ／ＣＴ系画像化を使用して、長時間にわたって決定した。相対的抗体レベルの測定としてのシグナル強度を、硝子体内（ＩＶＴ）注入直後、ならびに、注入２４、４８及び９６時間後にも決定した。修飾されていない抗体（例えば、ラニビズマブ）についての前記シグナル強度は、注入４８時間後までに初期値の１％に減衰する。注入９６時間後に、修飾されていない抗体（例えば、ラニビズマブ）の前記シグナル強度は、検出限界を下回った。このため、前記ラットモデルは、眼において増大した保持時間を有する分子を特定するのに有用な短期のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングモデルである。
【０２６６】
２７個のペプチドタグ付き抗体を、前記ラットモデルにおいて、より長い保持時間について試験した。ＩＶＴの９６時間後に注入用量の＞１％が残存する場合に、保持時間がより長いと定義した。９個のペプチドタグ付き抗体が、９６時間後に注入用量の＜１％の残留を有していた。対照的に、１８／２７個のペプチドタグ付き抗体は、ＩＶＴの９６時間後に注入用量の＞１％が残存することによって定義した場合、ラットの眼におけるより長い保持を示した。その後、これらの１８個のタグ付き抗体について、前記ウサギ漏出モデルにおける効果を評価した。ウサギは、短期のラットモデルよりも長期のモデルであるため、より臨床的に関連する。
【０２６７】
実施例６：ウサギでの効果：１つのＨＡ結合ペプチドタグのみが有効
（実施例２において記載された）前記ウサギ漏出モデルを、コラーゲン又はＨＡのいずれかと結合するペプチドタグに結合した抗ＶＥＧＦ抗体又はＦａｂが、注入後２０日で血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために使用した（図４及び５）。ウサギは、より大きく、ヒトに近い大きさの眼を提供する。前記ウサギにおいて、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の長期効果を試験する。コラーゲン結合ペプチドタグ又はＨＡ結合ペプチドタグのいずれかに結合した２２個の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを、５μｇ／眼のラニビズマブと等モルの用量で投与した。ｈＶＥＧＦ負荷の４８時間後、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。コラーゲン結合ペプチドタグの付加は、試験したＶＥＧＦ  Ｆａｂのいずれについても、有意なフルオレセイン漏出阻害をもたらさなかった（図５：ＮＶＳ６７、ＮＶＳ６８及びＮＶＳ６９）。対照的に、ＨＡ結合ペプチドタグの付加は、同じ条件下において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を示した（ＮＶＳ１、図５）。前記結果は、コラーゲンと結合するペプチドタグを抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに結合させることは、タグ付けされていない抗ＶＥＧＦ  ＦａｂであるＮＶＳ４より長く、ｈＶＥＧＦを抑制し、血管漏出を妨げるのに十分でなかったことを示す。対照的に、ＨＡ結合ペプチドタグの付加は、有意な効果を示すことができた。このため、半減期を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効な効果を生じさせる前記ペプチドタグの能力は、本願明細書に記載されたように、本発明のＨＡと結合するペプチドタグに特有のものである。
【０２６８】
ＥＬＩＳＡによるウサギの最終ＰＫ定量化
血管漏出を測定する画像化分析の完了に基づいて、前記動物を、画像化の日又は画像化後の日のいずれかにおいて屠殺し、眼を摘出し、実施例２において上述したように処理して、硝子体中の抗体濃度を定量化した（図４及び図６）。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、約５ｎｇ／ｍＬであった。対照的に、有効なタグ付き抗体であるＮＶＳ１の最終硝子体濃度は、２３１ｎｇ／ｍＬであった。より高い最終薬剤レベルは、２０日目での漏出阻害と関連し、より低い最終薬剤レベルは、効果の欠如と関連した。２０日目において効果を示さなかった全分子の最終薬剤レベルは、１００ｎｇ／ｍＬ未満であった（図４）。一方、フルオレセイン漏出を阻害した分子（ＮＶＳ１）の最終薬剤レベルは、１００ｎｇ／ｍＬより高かった。ＨＡと結合する種々のペプチドタグに結合した３つのタグ付き抗体は、２０日目において、ラニビズマブより１０−２０倍高い薬剤レベルを有したが、効果を示さなかった（例えば、ＮＶＳ６、ＮＶＳ７、ＮＶＳ８）。有効な分子であるＮＶＳ１の２０日目での薬剤レベルは、タグ付けされていない抗体（例えば、ラニビズマブ）の薬剤レベルより４０倍を超えて高かった。このことは、タグ付けされていない抗体と比較して、前記ＨＡ結合ペプチドタグ付き抗体の眼におけるクリアランスの顕著に遅い速度を示す。
【０２６９】
ＮＶＳ１のみが、ｏｃｔｅｔによるＨＡに対する測定可能な結合、ＰＥＴ／ＣＴ画像化により測定した場合のラットの眼におけるより長い保持、及び、ＶＥＧＦ負荷の１８日前に投与した場合にフルオレセイン漏出の統計学的に有意な阻害により定義される、ウサギ漏出モデルにおける効果のより長い持続期間を示した。コラーゲンＩＩ結合ペプチドタグは有効ではなかった。このため、配列番号３２の配列を有するＨＡと結合する前記ペプチドフラグメントを、最適化のために選択した。
【表３−１】
2016502850.tif 000036
【表３−２】
2016502850.tif 000037
【表３−３】
2016502850.tif 000038
【０２７０】
前記ウサギ漏出モデルにおいて効果の持続期間の延長を示さなかったペプチドタグの親和性を改善する試みにおいて、８個の推定のＨＡ結合ペプチドを、２種類のＦａｂである、ＮＶＳ４（抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ）及びＮＶＳ００（抗ニワトリライソザイムＦａｂのネガティブコントロール）の重鎖及び軽鎖両方のＣ−末端上に結合させることにより、１６個の更なる二重タグ付きＦａｂを生成した。全てにおいて、８個の二重タグ付きＦａｂを、ＮＶＳ４について生成した。更なる８個の二重タグ付きＦａｂを、ＮＶＳ００について生成した。結合における差異は、それらが、ＮＶＳ４又はＮＶＳ００に結合した場合、これらのペプチドタグのいずれについても観察されず、ＨＡに対するこれら１６個のペプチドタグ付きＦａｂの結合に明らかな改善は存在しなかった。このため、単量体としてウサギにおける陽性の効果を達成しなかったペプチドタグの多量体化は、複数のタグを抗ＶＥＧＦ  ＦａｂであるＮＶＳ４に結合させた場合、これらのペプチドタグの活性を改善しなかった。
【０２７１】
選択したペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３６、ＮＶＳ３７、ＮＶＳ１ｂ及びＮＶＳ７）のＨＡ結合親和性を、製造メーカーのプロトコルのとおりに、等温熱量計により決定した（ＭｉｃｒｏＣａｌ（登録商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。単一のペプチドタグを有するペプチドタグ付き分子、例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７の親和性は、それぞれ、５．５±２μＭ、８．０±１μＭ、６．０±１．２μＭ及び７．２±１．５μＭであった。例えば、ＮＶＳ１ｄ（ＮＶＳ１ｄ：実施例１３に記載）において、複数のペプチドタグを付加することは、結合親和性を改善した。ＮＶＳ１ｄは、０．４８±０．０４μＭのＫＤを有した。対照的に、前記ウサギモデルにおいて有効でなかったＮＶＳ７に対する親和性は、４４±１９μＭの親和性でのみＨＡと結合する。このため、本発明の有効なペプチドタグは、９．０μＭ以下の結合親和性を示す。
【０２７２】
実施例７：グリコシル化及びプロテアーゼ感受性を除去するためのＮＶＳ１におけるＨＡ結合ペプチドタグの最適化
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける分析は、Ｎ−結合グリコシル化部位として、ＮＶＳ１（配列番号２１）のＮ３１１位を特定した。この部位におけるグリコシル化を妨げるために、ＮＶＳ１の６個の単一部位変異体（ＮＶＳ１２、ＮＶＳ１９、ＮＶＳ２０、ＮＶＳ２１、ＮＶＳ２２及びＮＶＳ２３）ならびに、１２個の二重部位変異体（ＮＶＳ２ａ、ＮＶＳ３ａ、ＮＶＳ２８、ＮＶＳ３１、ＮＶＳ４９、ＮＶＳ５０、ＮＶＳ５１、ＮＶＳ５２、ＮＶＳ５３、ＮＶＳ５４、ＮＶＳ５５及びＮＶＳ５６）を発現させ、ＨＡ結合について特徴付けた。
【０２７３】
さらに、プロテアーゼ感受性アッセイを、順化培地を使用して行い、プロテアーゼ部位として、ＮＶＳ１（配列番号２１）におけるＲ２３６、Ｋ２４１及びＲ２６８位を特定した。Ｒ２３６、Ｋ２４１及びＲ２６８位におけるプロテアーゼ切断を妨げるために、前記ペプチドタグの複数の単一、二重、三重、四重及び五重変異体を発現させ、ＨＡ結合について特徴付けた（表４）。さらに、更なるジスルフィド結合を、前記ペプチドタグ内に操作して、２つのタグ付き変異体であるＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７を産生した。ＮＶＳ３６又はＮＶＳ３７におけるペプチドタグ変異体の配列は、それぞれ、配列番号３５又は配列番号３６である。
【０２７４】
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性決定
ＨＡに対して最適化されたＨＡ結合ペプチドタグとヒトＶＥＣＦとの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した。ＨＡ反応速度を決定するために、ビオチン化ＨＡを、ＢＩＯＣＡＰ  Ｂｉａｃｏｒｅフォーマットに使用した。前記フォーマットでは、ビオチン化ＨＡが捕捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される。この方法は、以下に詳細に記載する。ターゲット反応速度を決定するために、２種類のフォーマットを使用した。第１のフォーマットは、補捉されるビオチン化ターゲットリガンドを使用し、タンパク質サンプルを種々の濃度で流す、ＢＩＯＣＡＰ法である。第２のフォーマットは、ｆａｂタンパク質サンプルを捕捉し、ターゲットタンパク質を種々の濃度で流す、抗ｆａｂ補捉法である。
【０２７５】
ＨＡ結合反応速度及び親和性：
ＨＡ反応速度について、接触時間及び解離時間がＨＡ−ビオチン及びヒトＶＥＧＦに対する親和性によって異なる、２種類の方法を使用した。両方の方法において、サンプル区画を、１５℃に維持するが、分析区画を、２５℃又は３７℃のいずれかで実行した。この方法では、４つのフローセルを、前記実行に使用した。フローセル１（ｆｃ１）は、参照セルとして機能し（リガンドは捕捉されず）、コートされたチップ表面上の修飾されたストレプトアビジン−ＢＩＯＣＡＰ（登録商標）試薬に対する前記タグ付きタンパク質の非特異的結合について評価した。第２、第３及び第４のフローセルにおいて、ＢＩＯＣＡＰ（登録商標）試薬と、ビオチン化ＨＡリガンド又は他のビオチン化リガンドのいずれかとが共に捕捉される。ついで、前記タグ付きタンパク質及び親タンパク質を、異なる濃度で流した。
【０２７６】
工程１  ＢＩＯＣＡＰ捕捉工程：
前記ＢＩＯＣＡＰ（登録商標）試薬を、ビオチン  ＣＡＰｔｕｒｅ（登録商標）キット（ＧＥ（登録商標）２８９２０３４）に提供し、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー（ｔｅｋｎｏｖａ  Ｈ８０２２）中、１：３に希釈した。流速を２μｌ／分とし、６０秒間流した。補捉レベルは、約１５００ＲＵであった。
【０２７７】
工程２  ビオチン化リガンド捕捉工程：
前記リガンドを全て、１０μｌ／分の速度で、約２０秒間、又は、２０のＲｍａｘが得られるであろう補捉レベルを達成するために流した。この方法で試験した前記ビオチン化リガンドは、内部で生成されたビオチン化ＨＡ及びビオチン化ヒトＶＥＧＦを含む。Ｒｍａｘを算出する方法の例には、ＨＡについて以下のものが含まれるが、この場合には、我々は、より高い補捉レベルを使用し、約６０のＲｍａｘを使用した。下記方程式は、２０の相対的Ｒｍａｘを達成するための計算を表す。
ＨＡ−１７ｋＤａ：Ｒｍａｘ＝ＲＬ＊（ＭＷ検体／ＭＷリガンド）＊化学量論  ２０＝ＲＬ＊（５０／１７）＊１＝７ＲＬ
【０２７８】
工程３  タンパク質希釈（検体）：
より速いオフレートでより高い親和性を有するサンプルのＨＡ反応速度について、タンパク質検体を、６０μｌ／分の流速で、３０秒間の接触時間で流した。検体濃度は、２５ｎＭで開始し、１：２（１部のバッファーに対して、１部の希釈液）での４回の希釈を含んでいた。速いオフレートのため、８５秒の解離時間は、全ての希釈液に対して含まれた。ただし、タンパク質サンプルは、８５秒の前にベースラインに達したことに留意されたい。
【０２７９】
遅いオフレートでより低い親和性を有するサンプルのＨＡ反応速度について、タンパク質検体を、３０μｌ／分の流速で２４０秒間流した。前記タンパク質検体の濃度は、２５ｎＭで開始し、１：２（１部のバッファーに対して、１部の希釈液）での６回の希釈を含んでいた。遅いオフレートのため、１０００秒の解離時間は、全ての希釈液に対して含まれた。
【０２８０】
工程４  再生：
全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に再生を行った。ビオチンＣＡＰｔｕｒｅ（登録商標）キットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック１（８Ｍ グアニジン−ＨＣＬ、ＧＥ（登録商標）２８−９２０２−３３）３部を、再生ストック２（１Ｍ ＮａＯＨ、ＧＥ（登録商標）２８−９２０２−３３）１部に混合することにより、再生バッファーを調製した。これを、前記フローセルに、２０μｌ／分で１２０秒間流した。
【０２８１】
ビオチンＣＡＰｔｕｒｅ法を使用したターゲットタンパク質の反応速度及び親和性
ターゲット／リガンドの反応速度を決定するために、２つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル１は、参照セルとして機能し、ＢＩＯＣＡＰ（登録商標）試薬のみを含んだ。フローセル２は、結合セルとして機能し、ＢＩＯＣＡＰ（登録商標）試薬及び前記ビオチン化ターゲット（例えば、ヒトＶＥＧＦ−ビオチン）の両方を含んだ。前記方法は、４工程からなる。
【０２８２】
工程１  ビオチンＣＡＰｔｕｒｅ試薬：
この試薬を、キットで提供し、ランニングバッファー中、１：３に希釈した。流速を、２μｌ／分とし、６０秒間流した。補捉レベルを、約１５００ＲＵとした。
【０２８３】
工程２  ビオチン化リガンド捕捉工程：
ビオチン化ターゲット／リガンドを、１０μｌ／分の速度で、設定した接触時間流し、２０のＲｍａｘのための所望の共鳴単位に到達させた。
下記方程式は、２０の相対的Ｒｍａｘを達成する計算を表す。
ＶＥＧＦの例：Ｒｍａｘ＝ＲＬ＊（ＭＷ検体／ＭＷリガンド）＊化学量論  ２０＝ＲＬ＊（５０／５０）＊１＝２０ＲＬ
【０２８４】
工程３  抗体希釈（検体）：
前記タンパク質検体がそのターゲットに対して強力な親和性を有するため、開始濃度を、１０ｎＭとし、８回の連続希釈点を含み得る。例えば、一部のタンパク質検体のＶＥＧＦ反応速度について、前記開始濃度を、１．２５ｎＭとし、１：２での７回の希釈を含んだ。短時間での解離及びより長い時間での解離は、前記タンパク質検体により決まる。これらのより低い親和性のタンパク質検体についての全体的なターゲット反応速度については、前記タンパク質検体を、６０μｌ／分で２４０秒間流し、同検体は、１０００秒より長い解離時間を有した。
【０２８５】
工程４  再生：
再生を、全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に行った。ビオチンＣＡＰｔｕｒｅキットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック１（８Ｍ グアニジン−ＨＣＬ）３部を、再生ストック２（１Ｍ ＮａＯＨ）１部に混合することにより、再生バッファーを調製する。これを、前記フローセルに、２０μｌ／分で１２０秒間流した。前記検体、リガンド及び再生バッファーを含むサンプル区画を、１５℃に維持する。全ての他の実行条件を、１×ＨＢＳＥ＋Ｐバッファー中、２５℃又は３７℃のいずれかで行った。最終結果は、二重参照、参照フローセルからの両屈折率値の差し引き、及び、検体を含まないブランク結合工程を反映する。データを、１０Ｈｚで収集し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））を使用して分析した。このプログラムは、各相互作用についての速度及び親和性定数を決定するためのグローバル・フィッティング分析法を使用する。
【０２８６】
プロテアーゼ感受性アッセイ
ＨＡ結合ペプチドタグのタンパク質分解的切断について評価するために、ソルターゼ−Ａ媒介反応を使用して、以下の表４に列記したＨＡ結合ペプチドタグの種々の変異体と融合したＮＶＳ４の軽鎖のＮ−末端上を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で部位特異的に標識した。前記標識化タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ以上）を、ＣＨＯ  Ｋ１ＰＤ使用済み培地と混合した（０．０５％ アジ化ナトリウムを含む使用済み培地と標識化タンパク質との比＝１：１０）。前記反応混合物を、振とうしながら３７℃でインキュベートする。２０マイクロリットルを、０日目の開始から種々の日に取り出し、凍結させた。前記サンプルを培養の最終指定日において取得した後、１６μｌ（１２μｌのサンプル＋４μｌのＳＤＳ負荷染料）を、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１２〜１６％ １７ウェルＮｕＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲルに負荷した。前記ゲルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ２０００を使用して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８設定下においてスキャンする。前記タンパク質のタンパク質分解的切断を、より低い分子量へのバンドの質量シフトにより分析する。
【０２８７】
親ＮＶＳ１に類似する結合性を有する２つの変異体であるＮＶＳ２ａ及びＮＶＳ３ａを、（表４）、引き続き、前記ウサギ漏出モデルにおいて評価した。ＮＶＳ２ａ及びＮＶＳ３ａのどちらも、ウサギ漏出モデルにおいて何らの効果も示さず、このことは、Ｎ３１１位におけるグリコシル化が、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に重要であることを示す。親ＮＶＳ１に類似する結合性を有する４つの変異体（表４：ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７）を、前記ウサギ漏出モデルにおいて評価した。４つ分子ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７の全ては、前記ウサギモデルにおいて、親ＮＶＳ１に類似する効果を示した。ただし、ＮＶＳ１と比較して、前記４つの変異体であるＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７は、前記タグ付きタンパク質の開発可能性を改善する重要な要因である、増大したタンパク質安定性、低下又は除去されたタンパク質分解的切断及び増大した融点を示した。
【０２８８】
これらの結果は、タンパク質分解的切断を変化させるように修飾された下記配列ＮＶＳ２、ＮＶＳ３及びＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７のみが、より遅い眼におけるクリアランス、及び、延長した効果の持続期間を有する、固有のｉｎ  ｖｉｖｏ特性を保持したことを示した。
【表４−１】
2016502850.tif 000039
【表４−２】
2016502850.tif 000040
【表４−３】
2016502850.tif 000041
【表４−４】
2016502850.tif 000042
【０２８９】
生理学的特性、アミノ酸配列及びＨＡ結合性に関して、全体として最も好ましい寄与を有した選択された各プロテアーゼ抵抗性又は非グリコシル化変異体を、前記ウサギモデルにおいて評価した。より具体的には、ｐＩの低下、グリコシル化部位の除去による乏しい安定性を有した変異体、及び／又は、タンパク質分解的切断を示したそれらの変異体を評価しなかった。
配列番号１４１
ＧＳＧＧＧＴＣＲＹＡＧＶＹＨＲＥＡＱＳＧＫＹＫＬＴＹＡＥＡＫＡＶＣＥＦＥＧＧＨＬＡＴＹＫＱＬＥＡＡＲＫＩＧＦＨＶＣＡＡＧ  ＷＭＡＫＧＲＶＧＹＰＩＶＫＰＧＰＮＣＧＦＧＫＴＧＩＩＤＹＧＩＲＬＮＲＳＥＲＷＤＡＹＣＹＮＡＳＡＰＰＥＥＤＣＴ
【０２９０】
実施例８：最適化抗体：ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７の更なる特徴付け
８ａ：最適化ＶＥＧＦ抗体のＢｉａｃｏｒｅ決定
ＨＡに対して最適化されたＶＥＧＦ抗体とヒトＶＥＧＦとの親和性を、上記実施例７に記載したように、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した。表５は、複数の実験の対象である各分子についての平均オンレート（ｋａ）、オフレート（ｋｄ）及び全体的な親和性（ＫＤ）と共に、測定値又は算出値それぞれについての平均の範囲及び標準誤差を列記する。ＨＡに対するＮＳＶ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７の全体的な親和性は、２５℃で測定した場合、５．７５μＭから３１ｎＭの範囲であり、３７℃で測定した場合、３．０７μＭから２９ｎＭの範囲であった。５個全てのペプチドタグ付き融合分子の親和性は、タグ付けされていないＦａｂであるＮＶＳ４と比較して、ＶＥＧＦに対してより高い（表６）。
【表５】
2016502850.tif 000043
【表６】
2016502850.tif 000044
【０２９１】
８ｂ：最適化ＶＥＧＦ抗体のウサギにおける効果
（実施例２に記載した）前記ウサギ漏出モデルを使用して、最適化された抗ＶＥＧＦ抗体が、注入後２０日目において血管漏出を阻害するかどうかを評価した（図６）。前記ペプチドタグ付き抗体であるＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７は全て、フルオレセイン漏出を有意に阻害した。一方、等モルのラニビズマブは阻害しなかった（図６）。前記ＨＡ結合ペプチドタグ付き抗体は全て、前記タグ付けされていない抗体であるラニビズマブと比較して、２０日目における最終薬剤濃度がより高かった（図６）。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、５ｎｇ／ｍｌであった。一方、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７の最終硝子体濃度は、それぞれ、２３１、５３３、３４３、７２２及び６４６ｎｇ／ｍｌであった。ラニビズマブについて、これは、注入用量の０．２％を表した。一方、前記最適化された抗ＶＥＧＦ抗体の最終硝子体濃度は、前記注入用量の５．６〜１７．４％を表した。このため、前記ペプチドタグ付き抗体のパーセント注入用量は、２０日目において、ラニビズマブのパーセント注入用量より、約２８〜８７倍高かった。前記最終薬剤レベル及び開始用量を、２点ＰＫ曲線を算出するために使用した（図７）。前記結果は、ラニビズマブ、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７についての半減期値が、それぞれ、２、４．２、５．６、４．８、５．７及び６．８日であったことを示した。このため、抗体に結合したＨＡ結合ペプチドタグは、タグ付けされていない抗体（例えば、ラニビズマブ）と比較して、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６及びＮＶＳ３７について、約２〜３．５倍半減期を改善した。
【０２９２】
このことは、前記ペプチドタグ付き抗体のクリアランスが、タグ付けされていない抗体より遅いこと、及び、眼からのより遅いクリアランスが、効果の増大と相関するより後の時点でより高い薬剤レベルをもたらすことを示す。タグ付き抗体を、ヒアルロン酸に結合するように操作することにより、眼からの抗体のクリアランスを遅くする。より高い最終薬剤レベル、前記タグ付き抗体の２０日目でのより高いパーセント注入用量及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムと一致する。ＨＡと結合するペプチドフラグメントによりタグ付けされた抗体がより高いレベルで存在したため、タグ付けされた抗体の投与は、ＶＥＧＦレベルのより高い抑制をもたらした。より低いＶＥＧＦレベルは、血管漏出量の低下及び効果の持続期間の増大に関連する（図６及び７）。ヒトｗｅｔ  ＡＭＤ患者では、ＶＥＧＦレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。ＶＥＧＦレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する（Muether et al., 2012）。このため、ＨＡと結合するペプチドフラグメントによりタグ付けされている抗体による、網膜血管疾患（例えば、ｗｅｔ  ＡＭＤ）を有する患者の処置は、タグ付けされていない抗ＶＥＧＦ抗体と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。このため、効果を維持するが、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。
【０２９３】
実施例９：ＮＶＳ１及びＮＶＳ２についての、ウサギにおける２０日目から３０日目の長期効果及び最終ＰＫ
ＮＶＳ１及びＮＶＳ２の効果の持続期間の増大の程度を決定するために、前記ウサギ漏出モデルを、以下に記載するように、ＮＶＳ１及びＮＶＳ２の効果を評価するために修飾した（図８及び図９）。これらの試験では、６．２μｇ／眼のＮＶＳ１及びＮＶＳ２（５μｇ／眼のラニビズマブに等モル）を、前記ｈＶＥＧＦ負荷の１８、２１、２４、２６又は２８日前のいずれかで、ウサギの種々のコホートに硝子体内投与した。ｈＶＥＧＦ負荷後４８時間で、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。ＮＶＳ１は、１つの試験における全ての時点において、類似する効果（７６〜８６％）を達成した（図８）。ＮＶＳ１及びＮＶＳ２は両方とも、２０日目（８１〜８５％）及び３０日目（６４〜６７％）において類似する効果を達成した（図９）。対照的に、ｈＶＥＧＦ負荷の２０日前における等モル用量のラニビズマブは、血管漏出を阻害しなかった（図３）。
【０２９４】
血管漏出を測定する画像化の完了に基づいて、前記動物を屠殺し、眼を摘出し、上述したように、硝子体中の総抗体濃度を定量化するために処理した。ＩＶＴ投与後２０〜２１日目において、ラニビズマブの硝子体濃度は、約５ｎｇ／ｍｌであった（図６及び７）。対照的に、ＮＶＳ１の最終硝子体濃度は、２０、２３、２６、２８及び３０日目において、それぞれ、４５９、２６１、２０２、１４５及び１４２であった。このことは、眼における保持の明らかな改善を示す。これらの最終硝子体濃度を、ＮＶＳ１についての２点及び６点ＰＫ曲線を算出するために使用した（図１０）。前記結果は、ＮＶＳ１についての眼における半減期値が、それぞれ、４．２及び５．２日であり、ラニビズマブと比較して、ＮＶＳ１の約２〜２．５倍の半減期の改善を示す。前記結果は、図７における結果に類似する。
【０２９５】
ＨＡ結合ペプチドタグにより操作された抗体は、ＨＡ結合ペプチドタグを含まない抗体と比較して、眼からの抗体のクリアランスの低下を示した。より高い最終薬剤レベル及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムに一致する。より高いＮＶＳ１レベルが後の時点で存在するために、ペプチドタグ付き抗体による投与は、タグ付けされていない抗体と比較して、より長い期間、ＶＥＧＦレベルのより高い抑制をもたらす。ヒトｗｅｔ  ＡＭＤ患者では、ＶＥＧＦレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。ＶＥＧＦレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する（Muether et al., 2012）。このため、ＨＡ結合ペプチドタグに結合した抗ＶＥＧＦ抗体によるｗｅｔ  ＡＭＤ患者の処置は、修飾されていない抗ＶＥＧＦ抗体と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。これにより、効果を維持する一方で、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。
【０２９６】
実施例１０：カニクイザルにおけるＮＶＳ１及びＮＶＳ４の認容性、効果及び最終ＰＫの２８日の試験
熱レーザ誘導性脈絡管血管新生のカニクイザルモデル
カニクイザルの熱レーザ誘導性脈絡管血管新生モデルにおいて、レーザを、ＲＰＥと脈絡膜との間の膜障壁（ブルッフ膜）を破壊するために使用した。前記破壊は、レーザ火傷部位における血管新生をもたらす。病変における病変サイズ及び漏出を、フルオレセイン血管造影を使用して測定し得る。作用の持続期間を決定するために、抗ＶＥＧＦ分子を、熱レーザ法前の種々のタイミングで投与し得る。前記抗ＶＥＧＦ分子投与とレーザ処置との間の間隔は、抗ＶＥＧＦ分子の作用の持続期間を決定する。
【０２９７】
網膜の黄班周囲に対する焦点熱レーザ除去は、加齢黄班変性（ＡＭＤ）に対する治療剤を評価するための脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）病変を形成するために一般的な方法である。先の評価試験に基づくと、臨床的に関連するグレードＩＶのＣＮＶ病変の形成においては、６５７ｎｍのクリプトン赤色レーザの使用がアルゴン緑色レーザ（５３２ｎｍ）より効果的であった（Ｉ〜ＩＶのスケールを、病変重症度を評価するために使用した。）。６７５ｎｍのクリプトンレーザを用いると、レーザ後４週間を超える漏出の延長した持続期間を達成することができたため、数週間から数ヶ月の期間にわたる、抗ＶＥＧＦ剤の作用の持続期間を評価するのに適していると考えられた。
【０２９８】
サルにおける硝子体内（ＩＶＴ）注入
原始的な非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（Ｎ＝３、２．４−５．８ｋｇ）を、ケタミン（５−２０ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．０５−０．５ｍｇ／ｋｇ）及びグリコピロレート（０．００５ｍｇ／ｋｇ）のＩＭカクテルにより鎮静させた。必要に応じて、麻酔の深さを、プロポフォール（２〜５ｍｇ／ｋｇ）の少量の追加ＩＶ投与（０．２５〜０．５ｍｌ）により維持した。前記サルを、手術顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ−Ｍｅｄｉｔｅｃ（登録商標））下において、加熱した手術台上に仰向けに寝かせた。瞼及び隣接する組織を、ベタジンスワブスティックで洗浄し、滅菌ドレープを、実験対象の眼上に置いた。１−２滴の０．５％ 眼科用ベタインを投与する前に、各眼に０．５％ プロパラカイン眼麻酔剤を滴下した。眼を、滅菌ＢＳＳで洗浄し、マイクロスポンジを使用して、過剰の流体を除去した。小児科用瞼検鏡を、前記瞼を収容するように配置した。ＧｅｎＴｅａｌ（登録商標）ゲル（Ｎａｖａｒｔｉｓ（登録商標））を、外科的拡大コンタクトレンズ（Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の角膜開口部に入れて、手術顕微鏡によって硝子体及びを通る網膜の視覚化を強めた。細い鉗子で結膜を掴み、眼をゆっくり回転させ、角膜輪部の後ろ３ｍｍの注入部位を曝した。ニードルを取り付けた２９Ｇの０．３ｃｃモノジェクトシリンジを、下方斜角で挿入し、網膜に向かって角度を付けた。前記斜角を可視化し、試験物質の硝子体内部送達用に配置した後、プランジャーをゆっくり押し下げて、５０μｌ容量の物質を送達した。前記ニードルをゆっくり引き、前記注入部位を細い鉗子で挟み、試験物質又は硝子体液の逆流を最少化又は防いだ。全ての眼に、感染を予防するために、１−２滴の局所眼科用ビガモックス（Ａｌｃｏｎ）を投与した。全ての注入観察を記録した。ケージに戻す前に、動物に麻酔回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
【０２９９】
熱レーザ法
前記サルを、ケタミン（５〜２０ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ）及びグリコピロレート（０．００５ｍｇ／ｋｇ）のＩＭカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール（２〜５ｍｇ／ｋｇ）の少量の追加ＩＶ投与（０．２５〜０．５ｍｌ）により維持した。ベースラインのカラー眼底写真を、レーザ前に取得し、レーザ火傷の事前配置のために使用して、網膜中心窩から及び互いから等間隔であることを確保し、局所網膜血管出血、ＣＮＶ病変癒合及び網膜中心窩の機能侵害のような影響を最少化した。前記鎮静させた動物を、その腹部側を上にして、専用の傾斜した携帯式画像化プラットホーム上に置き、各手術について、スリットランプ搭載レーザ又は画像化システムカメラレンズと整列させて頭を位置させた。アルカイン（０．５％ プロパラカイン、Ａｌｃｏｎ）の一滴の眼への局所滴を、各眼に滴下した後、開口部におけるＧｅｎＴｅａｌゲル（Ｎａｖａｒｔｉｓ（登録商標））を伴う１×Ｒｅｉｃｈｅｌ  Ｍａｉｎｓｔｅｒコンタクトレンズ（Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標））を配置した。６００ｍＷ、７５μｍスポットサイズ；０．０１−０．１秒の１パルス持続期間に設定されたクリプトン赤色レーザ（Ｎｏｖｕｓ  Ｖａｒｉａ  Ｔｈｒｅｅ  Ｍｏｄｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｕｍｅｎｉｓ（登録商標）を使用して、４か所のレーザ火傷を、両眼の角膜中心窩の外側に形成する。前記サルに、手術後２４時間、回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
【０３００】
画像取得
予想不可能なナトリウムフルオレセイン誘導性嘔吐の発生を最少化するために、前記サルに、ＩＭ  ゾフラン（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びベナドリル（２．２ｍｇ／ｋｇ）を、麻酔３０分前に与えた。前記サルを、ケタミン（５〜２０ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ）及びグリコピロレート（０．００５ｍｇ／ｋｇ）のＩＭカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール（２〜５ｍｇ／ｋｇ）の少量の追加ＩＶ投与（０．２５〜０．５ｍｌ）により維持した。全ての画像モダリティを、ベースライン、レーザ後及びレーザ後２週間に行い、ＣＮＶ病変の外観、厚み及び漏出を記録した。カラー眼底像撮影（Ｚｅｉｓｓ  ｆｆ４５０＋Ｎカメラ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｅｄｉｔｅｃ）を使用して、網膜の中央５０度の臨床的外観を記録した。赤外眼底像撮影、フルオレセイン血管造影及びＳＤ−ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒｉａｌｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）も行った。ＣＮＶ漏出を、遅延相フルオレセイン血管造影を使用して、０．１〜０．２ｍｌ／ｋｇの１０％ ＡＫ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ａｋｏｒｎ（登録商標））のＩＶボーラス後５分において評価した。ＣＮＶ病変厚みも、５°×１５°  ７−ライン  ＳＤ−ＯＣＴグリッド内の１ラインを使用して測定し、各レーザ火傷に占有されたおおよその面積をカバーした。ＲＰＥからＩＬＭの距離を、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（登録商標）ＨＥＹＥＸ（登録商標）ソフトウェアにより測定した。平均厚みを、群あたり及び更なる終点で算出して、薬剤処置群とコントロール群との効果を評価した。
【０３０１】
ＣＮＶ評価スキーム
フルオレセインのＩＶ注入の５分後に取得した遅延相フルオレセイン血管造影画像を、広く受け入れられた４点評価スケール（Covance and Krystolik ME, et al. Arch Ophthalmol 2002; 12:338）を使用して、前記ＣＮＶ病変を主観的に評価するために使用した。マスクされた熟練の採点者が、下記主観的評価スケールを使用して、各病変をスコアした（表７）。グレードＩ：過蛍光なし；グレードＩＩ：漏出なしに過蛍光を示した；グレードＩＩＩ：初期又は中期の画像における過蛍光および後期の漏出；グレードＩＶ：中期に鮮やかな過蛍光、後期に処置部位を超える漏出を示す。
【０３０２】
グレードＩＶの病変を、臨床的に有意と定義した。グレードＩＶ病変の平均数を、処置群あたりに計測し、処置群あたりに形成されたレーザ火傷の総数から、パーセント阻害を算出するために使用した。
【０３０３】
予めレーザ照射され、食塩水コントロールとして使用された非天然のカニクイザルを使用して、パイロット試験を、カニクイザルにおいて行った（図１１）。最重要の情報は、ＮＶＳ１の眼における認容性であった。さらに、これらの動物において、フルオレセイン血管造影により測定された持続性の血管漏出が存在した。したがって、薬理学的活性の予備的評価も行った。群あたりに合計２匹の動物（合計４つの眼）について、抗ＶＥＧＦ抗体である、２００μｇ／眼のＮＶＳ１又は２１４μｇ／眼のＮＶＳ２のいずれかを硝子体内に投与した。評価（スリットランプ、フルオレセイン血管造影）を、その日の薬剤投与前、ついで、２、７及び２８日目に行った。２８日目に、動物を屠殺し、眼を摘出し、記載したように最終薬剤レベルを決定するために硝子体を抽出した。
【０３０４】
ＥＬＩＳＡによるカニクイザルの最終的な眼におけるＰＫ定量
カニクイザルの硝子体におけるＮＶＳ１及びＮＶＳ４の眼におけるＰＫプロファイルを、以下に記載され、図１２に示された標準的な方法を使用して比較した。
【０３０５】
前記摘出した眼を解剖し、硝子体を他の組織から分離し、さらに、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ４６４７１８）を、炭酸バッファー（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標）２８３８２）中のＶＥＧＦ（ＮＯＶＡＲＴＩＳ（登録商標）０５／１０／２０１１）で、４℃で一晩コートした。インキュベートの合間に、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレート洗浄器を使用して、ＴＢＳＴ（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）２８３６０）でプレートを３回洗浄した。翌日、前記プレートを、ＴＢＳ中のブロッキングバッファー（５％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９）により、室温で２時間（又は、４℃で一晩）ブロッキングした。サンプルを、希釈剤（ＴＢＳ中の２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９））中に希釈し、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において１時間インキュベートした。ついで、ヤギ抗ヒト抗体（ｂｅｔｈｙｌ、Ａ８０−３１９Ａ）を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で１時間添加した。検出抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートしたウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（登録商標）３１４０２）とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で１時間添加した。Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢを、１５分間添加した（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（登録商標）３４０２８）。反応を、２Ｎ 硫酸（Ｒｉｃｃａ８３１０−３２）により停止させた。前記サンプルの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）（４５０〜５７０ｎｍ）上で読み取った。精製した標準を使用して、眼の組織からのＦａｂ回収レベルを逆算した。前記標準について、使用した最高濃度を、２倍希釈による２００ｎｇ／ｍＬとした。
【０３０６】
最終薬剤レベルを、硝子体抽出物において測定し、２点ＰＫ曲線を作成するために使用した（図１２）。タグ付けされていない抗体であるＮＶＳ４は、２．０９日の眼における半減期を有した。一方、ＮＶＳ１は、７．０３日の眼における半減期を有した。このため、前記ＨＡ結合ペプチドタグは、３倍より高く眼のＰＫを改善した。これらの結果は、１）ＨＡ結合ペプチドタグに結合したタンパク質が、非ヒト霊長類に安全に投与され得ること、２）ＨＡ結合ペプチドタグに結合したタンパク質が、ｗｅｔ  ＡＭＤモデルに有効であり得ること、及び、３）ＨＡ結合ペプチドタグにタンパク質を結合させることにより、高い薬剤レベルがより長い期間維持され得ることを示す。
【０３０７】
実施例１１：カニクイザルにおけるＮＶＳ１及びラニビズマブの５１日目の最終ＰＫ
２６３μｇ／眼のラニビズマブ又は３２４μｇ／眼のＮＶＳ１（ＮＶＳ１：ラニビズマブの用量に等モル）のいずれかを、カニクイザルの群（３匹の動物／群＝６個の眼／群）に対して、硝子体内に投与した。投与後２１又は５１日目に、動物を屠殺し、眼を摘出し、最終薬剤濃度を、Ｇｙｒｏｌａｂ  ＥＬＩＳＡにより測定した（図１３）。
【０３０８】
Ｇｙｒｏｌａｂ  ＥＬＩＳＡによるカニクイザルの最終ＰＫ定量
硝子体サンプルを、室温で１０分間解凍した。ＮＶＳ１サンプルを、９６ウェルＰＣＲプレート（ＴＨＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＡＢ−８００、０．２ｍＬ Ｓｋｉｒｔｅｄ  ９６ウェルＰＣＲプレート）において、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮバッファー（Ｇｙｒｏｓ（登録商標），Ｉｎｃ、Ｃａｔ  Ｐ０００４９９４）中、１：１０に希釈した。一方、ラニビズマブ（商標）サンプルを、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮバッファー中、１：４に希釈した。サンプルを密封し（ＧＹＲＯＳ（登録商標），Ｉｎｃ、マイクロプレートフォイル  Ｃａｔ  Ｐ０００３３１３）、プレートシェイカーにおいて、１分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションに入れた。３工程Ｃ−Ａ−Ｄ法を、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体（サンプル）を流す。ついで、検出器のＰＢＳ  ０．０１％ Ｔｗｅｎｎ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ６５５２０６）による洗浄を、各工程間に行った。遊離した（ＶＥＧＦに結合していない）ＮＶＳ１の測定についての検量線を、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮにおける１０％ ウサギの硝子体（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（登録商標），ＬＬＣ、Ｃａｔ  Ｃｙｎｏ−Ｖｉｔｒｅｏｕｓ）を含む希釈剤において作成する。前記標準を、６０００ｎｇ／ｍＬから０．１２９ｎｇ／ｍＬに、１：６の連続希釈をした。
【０３０９】
ラニビズマブ（商標）測定のための検量線を、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮにおける２５％ ウサギの硝子体（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（登録商標），ＬＬＣ、Ｃａｔ  Ｃｙｎｏ−Ｖｉｔｒｅｏｕｓ）を含む希釈剤において作成する。前記標準を、１：６で連続希釈して、６０００ｎｇ／ｍＬ〜０．１２９ｎｇ／ｍＬとした。
【０３１０】
５１日目に、ＮＶＳ１及びラニビズマブの平均濃度はそれぞれ、２０７０ｎｇ／ｍＬ及び＜０．１ｎｇ／ｍＬであった。前記データは、５１日目におけるＮＶＳ１の硝子体濃度が、２１日目におけるラニビズマブの硝子体濃度より高いことを示す。開始用量ならびに２１日目及び５１日目の眼における薬剤レベルを、３点ＰＫ曲線を算出するために使用した（図１３）。これらの曲線は、ラニビズマブ及びＮＶＳ１についての眼における半減期値がそれぞれ、２．６及び８．２日であったことを示し、ＨＡと結合するペプチドタグを抗体に結合させることが、サルにおいて、眼におけるＰＫを約３倍改善し得ることを示す。これらの結果は、前記ＨＡ結合ペプチドタグによりタグ付けされた抗体についての眼における半減期における明らかな増大を示す。前記ＮＶＳ１抗体を、ヒアルロン酸に結合するように操作したことにより、眼からの前記抗体のクリアランスが遅くなった。長期にわたるより高い薬剤レベル及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムと一致する。
【０３１１】
効果のこの延長した持続期間を、動物モデル、例えば、カニクイザルレーザＣＮＶにおいて試験し得た。前記モデルは、ｗｅｔ  ＡＭＤのモデルである。動物は、熱レーザ処置前の種々のタイミング（例えば、０〜８週間）で薬剤投与され得る。投与群は、例えば、ビヒクルコントロール群（例えば、生理食塩水）、コントロールのタグ付けされていない抗体（例えば、ラニビズマブ又はＮＶＳ４）で処置された群、及び、ＨＡ結合ペプチドでタグ付けされた抗体（例えば、ＮＶＳ２）により処置された群を含み得る。十分な数の動物（例えば、処置群あたりに１５〜２０匹の動物）の処置により、タグ付けされていない抗体とＨＡ結合ペプチドタグでタグ付けされた抗体との間の効果の持続期間における統計学的区別が可能であり得る。
【０３１２】
実施例１２：ヒト対象における抗ＶＥＧＦタンパク質の半減期、最終濃度、効果の持続期間を増大させるための、ＨＡ結合ペプチドに結合した抗ＶＥＧＦタンパク質の使用
１２ａ：ペプチドタグが、より高い最終濃度及び作用の持続期間を増大させる
ＨＡと結合するペプチドタグ（例えば、配列番号３２、３３、３４、３５又は３６の配列を有するペプチドタグ）に結合した抗ＶＥＧＦタンパク質（例えば、抗体又は抗原結合フラグメント）による処置は、タグ付けされていないタンパク質と比較して、より遅いタイミングにおいて、より高い薬剤レベルをもたらす。このため、遊離のＶＥＧＦレベルのより高い抑制が、より長い期間存在する。より低い遊離ＶＥＧＦレベルは、病因量の低下及び効果の持続期間の増大に関連する。ヒトｗｅｔ  ＡＭＤ患者では、ＶＥＧＦレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。ＶＥＧＦレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する（Muether et al., 2012）。このため、本願明細書に記載されたＨＡ結合ペプチドタグに結合した抗ＶＥＧＦタンパク質（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６又はＮＶＳ３７）によるｗｅｔ  ＡＭＤ患者の処置は、タグ付けされていない抗ＶＥＧＦタンパク質と比較して、作用のより長い持続期間を有し得る。これにより、効果を維持する一方、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。このような投与スキームの例は、図１４Ａ〜Ｃに示される。現在、５００μｇ／眼のラニビズマブが２８日毎にＩＶＴ投与されているヒトｗｅｔ  ＡＭＤにおいて、最大のＶＥＧＦ抑制及び最も高い視覚改善を達成している。等モル濃度のペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質（０．６２ｍｇ）を、ＩＶＴ投与される硝子体濃度が２８日目において前記ラニビズマブ濃度より高くなるようにする。図１４Ａにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、１．７μＭのＫＤで、ヒト硝子体ＨＡ（２５０μｇ／ｍＬ）の５〜１５％に結合するペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質に対する予測範囲を示す。図１４Ｂにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、０．４８から７．２μＭの範囲のＫＤで、硝子体ＨＡの１５％に結合するペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質に対する予測範囲を示す。効果の持続期間を、ヒト硝子体ＨＡの５％又は１５％に結合するペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質について、ＨＡについてのＫＤに対してプロットした（図１４Ｃ）。効果の持続期間を、２８日目におけるラニビズマブの硝子体濃度に達するのにかかる時間として定義した。全てのシミュレーションは、前記ペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質と硝子体ＨＡとの可逆的結合を仮定する。前記ペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質のクリアランスは、前記ペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質が解離して遊離のＨＡ及び遊離のペプチドタグ付き抗ＶＥＧＦタンパク質を形成することを除いて仮定しなかった。類似する作用の持続期間の延長及び低下した投与頻度が、ＨＡ結合ペプチドタグによりタグ付けされた眼に対する他の治療剤（例えば、他の抗ＶＥＧＦ抗体及び眼における他のターゲットと結合する抗体等）について期待される。
【０３１３】
４ヶ月毎に５００μｇ／眼で投与されるペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ３６又はＮＶＳ３７）は、ラニビズマブ又は他のタグ付けされていない抗ＶＥＧＦ分子の毎月又は隔月での投与と比較して、同程度のＶＥＧＦ抑制及び視覚の付随する改善を達成することが期待される。他の網膜血管疾患を有するヒト患者では、おそらく、遊離ＶＥＧＦレベルと疾患活動との同様の関係があるため、タグ付き抗ＶＥＧＦ抗体により同様の効果の延長した持続期間が、タグ付き抗ＶＥＧＦ抗体の同様の用量により期待される。
【０３１４】
１２ｂ：眼における薬剤濃度及び投与間隔における半減期増大の効果
眼内への送達用の分子に本発明のペプチドタグを結合させることは、ペプチドタグを含まない分子に対して、その眼における半減期を増大させ得る。ＨＡ結合ペプチドタグを含む分子の眼における半減期を増大させることは、タグ付けされていない分子と比較して、投与後の薬剤レベルを明らかに増大させ得る。ＨＡ結合ペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子と比較して、もはや治療的に有効でない、硝子体におけるトラフ濃度レベルに達するのにより長い時間がかかるであろう。
【０３１５】
硝子体内に投与された生体分子の硝子体からのクリアランスは、一次指数崩壊関数（方程式１）に当てはまることが示されている（Krohne et al., 2008；Krohne et al., 2012；Bakri et al., 2007b；Bakri et al., 2007a；Gaudreault et al., 2007；Gaudreault et al., 2005）。
Ｃｔ＝Ｃｔ＝０＊ｅ−ｋｔ
速度定数ｋは、
【数２】
2016502850.tif 000045
である。
ｃｔは、硝子体内投与後の時間ｔにおける濃度である。
Ｃｔ＝０は、硝子体内投与後の時間０における濃度である。
Ｔ１／２は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
【０３１６】
ＨＡ結合ペプチドタグを含む分子の硝子体内半減期を増大させる効果を、上記方程式を使用してモデル化し得る。この実施例の目的のために、タグ付けされていない分子の眼におけるＴ１／２を５日であると仮定する。図１４Ｄにおいて、曲線は、種々の時間において残留する薬剤の相対量（時間＝０において１００％の薬剤）ならびに、２５％、５０％、７５％及び１００％、眼におけるＴ１／２を増大させる効果を示す。図１４Ｄは、眼における半減期の増大が、最初の投与後の全てのタイミングにおいて、より高い濃度の硝子体内に投与された分子をもたらすことを示す。表７ａは、３０日間隔において、（最初の用量の割合としての）残留する分子の量を示す。表７ｂは、５日の半減期のタグ付けされていないモデルについて、残留する分子の量を示す。例えば、２５％半減期を増大させること（例えば、５．０から６．２５日）は、３０日目での薬剤レベルにおける２．３倍の増大、６０日目での薬剤レベルにおける５．２８倍の増大、９０日目での薬剤レベルにおける１２．１３倍の増大、１２０日目での薬剤レベルにおける２７．８６倍の増大及び１５０日目での薬剤レベルにおける６４倍の増大をもたらす。５０％半減期を増大させること（例えば、５．０から７．５日）は、３０日目での薬剤レベルにおける４倍の増大、６０日目での薬剤レベルにおける１６倍の増大、９０日目での薬剤レベルにおける６４倍の増大、１２０日目での薬剤レベルにおける＞２５０倍の増大及び１５０日目での薬剤レベルにおける＞１０００倍の増大をもたらす。７５％半減期を増大させること（例えば、５．０から７．５日）は、３０日目での薬剤レベルにおける４倍の増大、６０日目での薬剤レベルにおける１６倍の増大、９０日目での薬剤レベルにおける６４倍の増大、１２０日目での薬剤レベルにおける＞２５０倍の増大及び１５０日目での薬剤レベルにおける＞１０００倍の増大をもたらす。１００％半減期を増大させること（例えば、５．０から１０．０日）は、３０日目での薬剤レベルにおける８倍の増大、６０日目での薬剤レベルにおける６４倍の増大、９０日目での薬剤レベルにおける＞５００倍の増大、１２０日目での薬剤レベルにおける＞４０００倍の増大及び１５０日目での薬剤レベルにおける＞３２，０００倍の増大をもたらす。
【表７】
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【０３１７】
したがって、分子の眼における半減期を増大させるペプチドタグ（例えば、ＨＡ結合ペプチドタグ）は、眼における薬剤濃度（すなわち、最終薬剤濃度）を明らかに改善することができるため、効果の持続期間の増大及び延長した投与間隔をもたらすことができる。
【０３１８】
１２ｃ：ペプチドタグは、半減期、効果の持続期間を増大させ、血漿暴露を低下させる
眼に送達される分子（すなわち、ペプチドタグ付き分子又はタグ付けされていない分子）の眼におけるクリアランス又は薬物動態は、標識化分子及び非侵襲的画像化技術、例えば、ＰＥＴ又は蛍光顕微法を使用して眼において直接的に、又は、眼内流体、例えば、硝子体及び眼房水を抽出して、当分野において公知の標準的なＥＬＩＳＡ、ＭＳＤアッセイもしくは質量分光法を使用して濃度を測定することにより測定し得る。眼に送達された分子について、全身性循環における前記分子の出現は、眼からのクリアランス速度により決まる。全身性循環におけるこのような分子の出現速度及び濃度は、眼における前記分子の薬物動態を決定するために使用され得る（Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(3): 1616-24 (2013)）。
【０３１９】
ペプチドタグ付き分子の眼における薬物動態を、眼におけるＰＫ結合モデルを使用して、同様に評価及び予測し得る。このモデルにおいて、Ｆａｂは、特定のＫｏｎ及びＫｏｆｆレートで、少量の硝子体ＨＡに結合する。ＨＡに結合しなかった場合、前記Ｆａｂは、ラニビズマブと同じ速度（８．６日の半減期）で眼から出て、血清に入るであろう。カニクイザルのＩＶＴ試験からの最終硝子体濃度データに対するＨＡ結合モデルの当てはめに基づいて、サルの硝子体ＨＡの約１５％が、前記Ｆａｂに結合していたことが推測された。
【０３２０】
このモデルは、４．５ｍＬのヒト硝子体におけるペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ２）の眼及び血清における薬物動態を予測するために使用することができ、前記Ｆａｂが、４：１のＨＡとＦａｂの化学量論で、２×１０６Ｍ−１秒−１のＫｏｎ及び１．７μＭのＫＤで、ヒト硝子体ＨＡ（２５０μｇ／ｍＬ）の約５〜１５％に結合すると仮定する。血清において、前記ペプチドタグ付き分子は、ラニビズマブと同じ全身性の体内動態を有するであろう。この結合モデルを使用して、前記タグ付きペプチド分子についての眼及び血清モデル予測を、他の抗ＶＥＧＦ分子、例えば、ラニビズマブ、アフリベルセプト及びベバシズマブと比較した。
【０３２１】
ラニビズマブの眼−血清ＰＫモデルは、Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 2013に基づくものであった。ベバシズマブの眼−血清ＰＫモデルは、眼における９．８２日の半減期（Krohne TU et al., Am J Ophthalmol, 146(4): 508-12 (2008)）、生物学的利用能Ｆ＝０．６５〜０．９５及びベバシズマブの臨床的薬理学レビュー、ＳＴＮ−１２０８５／０に記載された全身性の体内動態に基づくものであった。アフリベルセプトモデルは、眼における約４日の半減期及び、Thai HT et al., Br J Clin Pharmacol, 72(3): 402-14 (2011)においてモデル化された全身性の体内動態を使用した。
【０３２２】
この予測での眼における効果の持続期間は、各分子が、０．５ｍｇのＩＶＴ投与後２８日目におけるラニビズマブの眼における濃度に到達するのにかかる時間として定義された。前記ペプチドタグ付き分子のシミュレーションのエラーバーは、ＮＶＳ２ぺプチドタグ付き分子についての予測範囲を示す。ペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ２）は、０．０８ｍｇの低ＩＶＴ投与で、１ヶ月間の効果を達成すると予測される。前記ペプチドタググ付き分子は、０．５ｍｇのラニビズマブより低い血清暴露も提供すると予測される。アフリベルセプトについての２ヶ月の持続期間を、アフリベルセプトのラベルに使用される投与間隔に基づいてプロットした。アフリベルセプトの血清予測は、前記アフリベルセプトのラベルに記載されているように、３ｑ４ｗ、続けて、ｑ８ｗの投与後の遊離ＰＫに対応する。
【０３２３】
ＨＡ結合ペプチドタグを用いて分子（例えば、抗ＶＥＧＦタンパク質）をタグ付けすることは、眼からのより遅いクリアランスをもたらす。より遅い眼におけるクリアランスは、全身性循環における前記ペプチドタグ付き分子の遅延した出現をもたらす。到達した最大血清濃度は、図１４Ｅに図示されたように、ペプチドタグを含まない分子のそれより低い。ペプチドタグ付き分子（例えば、ＮＶＳ２）の全身性暴露は、前記タグ付き及びタグ付けされていない分子が等モルの用量で投与された場合、タグ付けされていない分子（例えば、ラニビズマブ）より明らかに少ない。ＮＶＳ２の血清濃度は、全ての等モル用量において、ラニビズマブの血清濃度より明らかに低い。同様の結果は、アフリベルセプトのタグ付き型（例えば、ＮＶＳ８０Ｔ）及びベバシズマブのタグ付き型（例えば、ＮＶＳ８１Ｔ）について期待され得る。
【０３２４】
実施例１３：ＨＡ結合ペプチドタグに結合した更なるタンパク質及び核酸の生成
眼におけるタンパク質又は核酸の半減期を延長させるＨＡ結合ペプチドタグの能力を試験するために、本発明のペプチドタグを、各種の眼におけるタンパク質ターゲットと結合する、数多くの抗体、タンパク質及び核酸に結合させた。
【０３２５】
ペプチドタグ付き抗体及びタンパク質の生成
タグ付き及びタグ付けされていない組換え抗体及びタンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞中の哺乳類発現ベクターの一過性導入により発現させ、標準的な親和性樹脂、例えば、Ｋａｐｐａｓｅｌｅｃｔ（Ｃａｔ＃１７−５４５８−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））及びＨｉｓ  Ｔｒａｐ（Ｃａｔ＃１７−５２５５−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を使用して精製した。種々の型の抗体及びタンパク質、例えば、Ｆａｂ、ＩｇＧ、Ｆｃトラップ及びタンパク質を試験した。これらの抗体及びタンパク質は、眼における複数のターゲット、例えば、Ｃ５、因子Ｐ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＴＮＦα、因子Ｄ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＦＧＦＲ２又はＩＬ−１０をターゲットにする。
【０３２６】
上述したように、前記ＨＡ結合タグ配列を、ＧＳＧＧＧリンカー（例えば、配列番号３１）を使用して、Ｆａｂの重鎖のＣ−末端に結合させることにより、１つのペプチドタグに結合したＦａｂを生成した。ペプチドタグ付きＩｇＧ（例えば、ＨＡ結合タグ配列を含むＩｇＧ融合物）を生成するために、前記ＨＡ結合タグ配列を、ＧＳＧＧＧリンカー（例えば、配列番号３１）を使用して、ＩｇＧの重鎖又は軽鎖のＣ−末端に融合した。Ｆｃ部分を含むペプチドタグ付きタンパク質、例えば、ＨＡ結合タグに結合したＦｃトラップタンパク質を生成するために、前記ＨＡ結合タグを、ＧＳＧＧＧリンカー（例えば、配列番号３１）を使用して、前記タンパク質のＦｃ部分のＣ−末端に結合させた。更なるペプチドタグ付きタンパク質を生成するために、前記ＨＡ結合タグを、ＧＳＧＧＧリンカー（例えば、配列番号３１）を使用して、所望のタンパク質のＣ−末端に結合させた。上記された全ての場合において、候補の産生は、所望のタンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチドの合成、続けて、上記哺乳類の発現系を使用した発現及び精製を必要とする。
【０３２７】
本願明細書に例示されたペプチドタグ付き抗体及びペプチド抗原結合フラグメントも、別の抗体型に変換及び使用され得る。例えば、ペプチドタグ付きＩｇＧを、ペプチドタグ付きＦａｂ又はペプチドタグ付きｓｃＦｖに変換することができ、逆もまた同じである。
【０３２８】
ペプチドタグ付き核酸の生成
ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーを含む核酸は、以下に記載するように、ＨＡ結合ペプチドとコンジュゲートし得る。室温でのＡＣＮ（体積：１．７５ｍＬ）中のＢ−３−（２−カルボキシエチル）−１−（１−（２−ヒドラジニル−４−メチルペンタノイル）ピロリジン−２−イル）−６−（１−ヒドロキシエチル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザトリデカン−１３−オイック酸（１９８ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ）の溶液中に、ＤＩＰＥＡ（０．０９８ｍＬ、０．５５９ｍｍｏｌ）、及び、ＤＭＳＯ（体積：１．７５ｍＬ）中のＡ−（３Ｓ，６Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−アミノ−４−メチルペンタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−（２−カルボキシエチル）−６−（（Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザトリデカン−１３−オイック酸（３２ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。前記混合物を、室温で１時間攪拌し、ついで、Ｓｕｎｆｉｎｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８を使用して、１０から９０％ ＡＣＮ−水＋０．１％ ＴＦＡにより溶出して精製し、２７ｍｇの純粋な所望の生成物である、Ｃ−（３Ｓ，６Ｓ）−３−（２−カルボキシエチル）−１−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−イソブチル−４，３４−ジオキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−ノナオキサ−３−アザテトラトリアコンタン−１−オイル）ピロリジン−２−イル）−６−（（Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザトリデカン−１３−オイック酸を得た。Ｄ−ＡＲＣ１２６−ＮＨ２（ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５バッファー中の２５ｍｇ／ｍｌ）の溶液（１８．６３ｍｇ、２３０μｌ、１．８０７μｍｏｌ）に、Ｃ−（３Ｓ，６Ｓ）−３−（２−カルボキシエチル）−１−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−イソブチル−４，３４−ジオキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−ノナオキサ−３−アザテトラトリアコンタン−１−オイル）ピロリジン−２−イル）−６−（（Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザトリデカン−１３−オイック酸（ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍｌ）（５．２６ｍｇ、５２．６μｌ、４．５２μｍｏｌ）を添加した。反応系を、室温で１．５時間攪拌する。粗生成物を、３Ｋ  ＭＷ  ＣＯ  Ａｍｉｃｏｎフィルタカラム（３Ｋ  ＭＷカットオフ）に通過させ、同時に、ソルターゼバッファー  ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０＋ＣａＣｌ２  ０．０１Ｍ＋ＮａＣｌ  ０．１５Ｍにバッファー交換した。Ｔｒｉｓ  ０．２５Ｍ  ｐＨ７．４＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ及びＮａＣｌ  １５０ｍＭ（体積：３１３μＬ）中の、Ｆ−ＨＡペプチドタグの溶液に、Ｅ（５７．４μＬ、０．７０３μｍｏｌ）を添加し、続けて、ビーズ上にソルターゼＡ（８７μＬ、０．０１６μｍｏｌ）を固定化した。前記混合物を、２０℃で２日間振とうした。得られたアプタマー−ＨＡ結合ペプチドコンジュゲートを、ＮＶＳ７９Ｔとした。
【０３２９】
【表８ａ−１】
2016502850.tif 000047
【表８ａ−２】
2016502850.tif 000048
【表８ｂ−１】
2016502850.tif 000049
【表８ｂ−２】
2016502850.tif 000050
【表８ｂ−３】
2016502850.tif 000051
【表８ｂ−４】
2016502850.tif 000052
【表８ｂ−５】
2016502850.tif 000053
【表８ｂ−６】
2016502850.tif 000054
【０３３０】
下線の配列は、記載された、クローニングに使用された更なる任意の配列（すなわち、ＧＧＧＧＧ、配列番号１８７）、又は、精製法に使用された更なる任意の配列（例えば、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１８８）を示す。
【０３３１】
【表９ａ−１】
2016502850.tif 000055
【表９ａ−２】
2016502850.tif 000056
【表９ｂ−１】
2016502850.tif 000057
【表９ｂ−２】
2016502850.tif 000058
【表９ｂ−３】
2016502850.tif 000059
【表９ｂ−４】
2016502850.tif 000060
【表９ｂ−５】
2016502850.tif 000061
【表９ｂ−６】
2016502850.tif 000062
【表９ｂ−７】
2016502850.tif 000063
【表９ｂ−８】
2016502850.tif 000064
【表９ｂ−９】
2016502850.tif 000065
【０３３２】
実施例１４：実施例１３のペプチドタグ付きタンパク質及び核酸の更なる特徴付け
ＨＡ結合ペプチドタグと融合したタンパク質、Ｆｃトラップ、全長抗体、ＤＡＲＰｉｎ及びｓｃＦｖの結合親和性を、実施例７に記載したように、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した。
【０３３３】
１４ａ：Ｂｉａｃｏｒｅ親和性決定
ペプチドタグ付きタンパク質及びタグ付けされていない親タンパク質の親和性を、実施例７において上述したように、その主なターゲット（例えば、因子Ｐ、Ｃ５、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２、ＶＥＧＦ、因子Ｄ、ＥＰＯ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０Ｒ）に対する反応速度及びＨＡ結合性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて分析した。ＨＡ反応速度を決定するために、ビオチン化ＨＡを、ビオチン化ＨＡが補捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される、ＢＩＯＣＡＰ  Ｂｉａｃｏｒｅフォーマットにおいて使用した。ビオチン化ターゲットリガンド及びビオチン化ＨＡを、実施例７：Ｂｉａｃｏｒｅ親和性決定に記載された親和性測定に使用した。
【０３３４】
抗Ｆａｂ法を使用したターゲットの反応速度及び親和性：
抗Ｆａｂ補捉法に対して、ＧＥ（登録商標）からのヒトＦａｂ  Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）キットを使用した（ＧＥ  ２８９５８３２５）。より詳細な情報は、カタログ番号を参照のこと。この方法について、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー（ｔｅｋｎｏｖａ  Ｈ８０２２）を使用した。ＣＭ５チップ（ＧＥ（登録商標）、ＢＲ−１００５−３０）を使用して、これに、抗Ｆａｂポリクローナルを固定化し、ＧＥ（登録商標）のプロトコルに従って、約５，０００ＲＵを達成した。より詳細な情報を得るには、ＧＥ（登録商標）のウェブサイトにおいて、カタログ番号を参照のこと。２つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル１は、固定化された抗Ｆａｂ試薬のみを含んだ参照セルとして機能した。フローセル２は、抗ｆａｂ試薬及びタンパク質サンプルの両方を含んだ結合セルとして機能した。この方法において試験された前記タンパク質サンプルは、Ｃ５、因子Ｐ及びＥＰＯに対して特異的であった。前記タンパク質サンプルを、２０のＲｍａｘについてのＲＵシグナルを達成するために、１０μｌ／分の流速で、特定の接触時間補捉した。タンパク質検体は、そのターゲットに対して強力な親和性を有するため、前記ターゲット検体の開始濃度は、約１０ｎＭで開始し、８回の連続希釈点を含み得る。前記ターゲット検体を、６０μｌ／分で、サンプルに応じて、短くて２４０秒間〜長くて１０００秒より長い解離時間で流した。
【表１０】
2016502850.tif 000066
【０３３５】
ＨＡ結合ペプチドタグと結合した全てのＦａｂ及びタンパク質は、類似するＨＡ結合親和性を示し、その主なターゲットに対する結合性を保持した（表１０）。実際に、前記ペプチドタグの存在は、タグ付けされていない分子と比較して、分子の主なターゲット結合親和性を改善した（実施例１５ｂを参照のこと。）。
【表１１−１】
2016502850.tif 000067
【表１１−２】
2016502850.tif 000068
【０３３６】
ＨＡ結合ペプチドタグと結合した全てのＦａｂ及びタンパク質は、類似するＨＡ結合親和性を示し、その主なターゲットに対する結合性を保持した（表１０）。実際に、前記ペプチドタグの存在は、タグ付けされていない分子と比較して、分子の主なターゲット結合親和性を改善した（実施例１５ｂを参照のこと。）。
【０３３７】
１４ｂ：ウサギの従来の眼におけるＰＫの決定
ウサギの硝子体において、ＨＡ結合ペプチドタグに結合した抗体、Ｆｃトラップ及びタンパク質の眼における最終濃度を、以下に記載され、図１５及び表１２に示すように、標準的な方法を使用して、そのタグ付けされていない型と比較した。
【０３３８】
５μｇ／眼（約１０５ｐモル）のタグ付けされていない抗体及び６．２μｇ／眼（約１０５ｐモル）のタグ付き抗体を、ウサギの眼の硝子体内に注入した（抗体あたりにＮ＝６個の眼）。ウサギを、注入後２１日目に屠殺し、眼を摘出した。前記摘出した眼を解剖し、硝子体を、他の組織から分離し、さらに、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ＥＬＩＳＡ又は質量分光法により測定した。
【０３３９】
ＥＬＩＳＡ法
Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ４６４７１８）を、炭酸バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ２８３８２）中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ３１１１９）で、４℃で一晩コートした。インキュベートの合間に、ＢｉｏＴｅｋプレート洗浄器を使用して、ＴＢＳＴ（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）２８３６０）でプレートを３回洗浄した。翌日、前記プレートを、ＴＢＳ中のブロッキングバッファー（５％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９）により、室温で２時間ブロッキングした。サンプルを、希釈剤（ＴＢＳにおける、２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ａ４５０３）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ１３７９）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｐ２３４７２９））中に希釈した。サンプルを、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において１時間インキュベートした。検出抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２］（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ３１４１４）とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で３０分間添加した。Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢを、１５分間添加した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ３４０２８）。反応を、２Ｎ 硫酸（Ｒｉｃｃａ８３１０−３２）により停止させた。前記サンプルの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（４５０〜５７０ｎｍ）上で読み取った。眼の組織からのＦａｂ回収レベルを逆算するために、精製した標準を使用した。前記標準について、使用した上限濃度を、２倍希釈による２００ｎｇ／ｍＬとした。異なる抗体ペアを、ウサギ組織からのＦａｂ回収に使用し得る。
【０３４０】
ＮＶＳ９０及びＮＶＳ９０Ｔに対するＥＬＩＳＡ法
標準的な結合ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）、３８４ウェル：ＭＳＤ  Ｃａｔ．＃  Ｌ２１ＸＡ）を使用し、コーティングバッファー（ＰＢＳ）及びインキュベートバッファー（２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ  ＃Ａ４５０３）及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を使用して、アッセイを行った。捕捉抗体であるＥＰＯ２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ  ＃２６Ｇ９Ｃ１０）を、ＰＢＳ（２５μｌ）中の１μｇ／ｍｌでコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中で３回洗浄し、２５μｌのインキュベートバッファーにより、ＲＴで２時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。インキュベートバッファー中での硝子体希釈液を、前記プレートに添加し（２５μｌ）、室温で６０分間インキュベートした。ヒト組換えダルベポイエチンを、ダルベポイエチンサンプルについての標準（１１０９６−２６−７、Ａ０００１２３、５μｇ／ｍｌで開始）として使用した。ＮＶＳ９０Ｔを、ＮＶＳ９０Ｔサンプルについての標準（５μｇ／ｍｌで開始）として使用した。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。２５μｌの一次抗体を添加し（インキュベートバッファー中、１μｇ／ｍｌ）、室温で６０分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。２５μｌの抗種二次Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ抗体（ＭＳＤ  Ｃａｔ  ＃Ｒ３２ＡＪ−１）を添加し（インキュベートバッファーにおける１：１０００）、ＲＴで６０分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。２５μｌの１×ＭＳＤ  ＲｅａｄバッファーＴを添加した（界面活性剤を含む、ＭＳＤ  ｃａｔ  ＃Ｒ９２ＴＣ−１）。プレートを、ＭＳＤ  Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００（登録商標）上で読み取った。
【０３４１】
ＮＶＳ７８及びＮＶＳ７８Ｔに対するＥＬＩＳＡ法
３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４６４７１８）を使用し、炭酸−重炭酸コーティングバッファー（ＢｕＰＨの炭酸−重炭酸バッファーパックを使用して調製、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、２８３８２）、ブロッキングバッファー（５％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ４５０３）を含むＴＢＳＴ）及び希釈バッファー（２％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴ）を使用して、アッセイを行った。ストレプトアビジン（Ｒｏｃｋｌａｎｄ（登録商標）、Ｓ０００−０１）を、コーティングバッファー（２０μｌ／ウェル）中の１μｇ／ｍｌにおいてコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（５０μｌ／ウェル）により、ＲＴで２時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。希釈剤中１μｇ／ｍｌのｈｕＥｐｏ−ビオチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、プレートに添加し（２０μｌ／ウェル）、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。希釈剤中の硝子体希釈液を、前記プレートに添加した（２０μｌ／ウェル）。ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲ−ＨＡ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で開始する標準として使用した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートする。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。２０μｌの検出抗体（ヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、Ｃａｔ  ＃３１４１３）を、前記プレートに添加し（希釈液中で１：５０００）、ＲＴで＞３０分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で３回洗浄した。２０μｌの１工程  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）、３４０２８）を添加した。陽性のウェルにおいて溶液の色が暗青色に変わった場合、反応を停止させるために、１０μｌの２Ｎ 硫酸停止溶液（ＲＩＣＣＡ、８３１０−３２）を、各ウェル内に添加する。プレートを、分光計プレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  ＰＬＵＳ３８４）上で、ＯＤ４５０−５７０ｎｍにおいて直ちに読み取った。
【０３４２】
質量分光法
還元、アルキル化及び消化：
各ウェルにおける６０μＬの硝子体サンプルを、室温において１０分間解凍した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＢＰ１５３−５００）中の１５０μｌの８Ｍ 尿素（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｕ１５−５００）を、各サンプルのウェルに添加し、続けて、４０ｍＭ ＤＴＴの最終濃度に、４μＬの２Ｍ ＤＴＴ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｄ９７７９）を添加した。前記プレートを５８℃で４５分間加熱して、タンパク質を変性させた。その後、前記プレートを室温に冷却し、ついで、４０ｍＭの最終濃度にするために、８μＬの１Ｍ ヨードアセトアミド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ１１４９）を添加し、室温において暗所で４５分間インキュベートする。１．３ｍＬの５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ２４１３−５００）を添加することにより、尿素の最終濃度を２Ｍ未満に希釈する。１０μＬの０．１μｇ／μＬ トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１１）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３４３】
ＳＰＥ浄化及びろ過：
消化後、ギ酸（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５６３０２−５０ＭＬ−Ｆ）を各サンプルに添加して、１％（ｖ／ｖ）の最終濃度とし、トリプシン消化を停止させる。Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸプレート（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６０００２５９）を使用して、消化サンプルを浄化した。浄化から収集したサンプル溶液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓａｖａｎｔ）を使用して、完全に乾燥させた。前記サンプルを一旦乾燥させ、６０μＬのバッファー（０．１％ ギ酸、１％ ＡＣＮ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９９８−４Ｌ）及び２０ｐｇ／μＬの重鎖標識内部標準（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒにより特注）溶液を、各ウェルに添加した。前記プレートを、２０分間振とうした。再構成ペプチド溶液を、１０ＫＤａ  ＭＷＣＯを有する限外ろ過（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．８１６４）フィルタ用のＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）ａｄｖａｎｃｅｄ  ９６ウェルフィルタプレートを使用してろ過した。
【０３４４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
５μＬの各ろ過サンプルを、３００μｍ×１５０ｍｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６００３４９８）に負荷した。５μＬ／分の流速で、５％ Ｂ（０．１％ ギ酸におけるアセトニトリル）から２０％ Ｂの５分の勾配を適用することにより、分離を達成した。２つのペプチド（ＨＣ＿Ｔ３：ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ及びＤＤＡ２：ＴＧＩＩＤＹＧＩＲ）ならびに、各ペプチドについての２つの転移（ＨＣ＿Ｔ３：５９４．１９／６９９．８２及び５９４．１９／８４７；ＤＤＡ２：５０４．５８／６２３．６８及び５０４．５８／７３６．８４）を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱＳ質量分光計（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、各サンプルについてモニターした。アイリーア及び、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ由来の２つの転移（５６０．２８／６９７．７６及び５６０．２８／７０９．２８）である構築物を含むアイリーアを、同じＬＣカラム及び条件を使用して、同じ質量分光計においてモニターした。これらのペプチドを含む薬剤分子を、これらの転移から生じるＭＳシグナルを使用して定量した。
【０３４５】
Ｇｙｒｏｌａｂ法
サンプル調製
硝子体サンプルを、室温で１０分間解凍した。ついで、５μＬの硝子体サンプルを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）ＡＢ−８００、０．２ｍＬ Ｓｋｉｒｔｅｄ  ９６ウェルＰＣＲプレート）において、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮバッファー（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ（登録商標），Ｉｎｃ、Ｃａｔ  Ｐ０００４９９４）中に、１：２に希釈した。サンプルを密封し（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ（登録商標），Ｉｎｃ、マイクロプレートフォイル  Ｃａｔ  Ｐ０００３３１３）、プレートシェイカーにおいて、１分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションに入れた。３工程Ｃ−Ａ−Ｄ法を、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体（サンプル）、ついで、検出抗体を流す。Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションは、ＰＢＳ  ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），Ｉｎｃ、Ｃａｔ６５５２０６）の洗浄を、各工程間に行う。遊離したＦｃ薬剤測定用の検量線を、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ中の５０％  ウサギ硝子体（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（登録商標），ＬＬＣ、Ｃａｔ  Ｒａｂｂ−Ｖｉｔｒｅｏｕｓ）を含む希釈剤において作成した。前記標準を、６０００ｎｇ／ｍＬから０．１２９ｎｇ／ｍＬに、１：６で連続希釈した。Ｆａｂ薬剤測定用の検量線を、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ中の１０％  ウサギ硝子体（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（登録商標），ＬＬＣ、Ｃａｔ  Ｒａｂｂ−Ｖｉｔｒｅｏｕｓ）を含む希釈剤において作成した。前記標準を、６０００ｎｇ／ｍＬから０．１２９ｎｇ／ｍＬに、１：６の連続希釈をした。
【０３４６】
Ｆａｂの検出
合計及び遊離した精製薬剤構築物を、Ｂｉｏａｆｆｙ１０００  ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ  Ｐ０００４２５３）を使用して、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションにおいて分析した。Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ
【０３４７】
遊離した薬剤は、１００μｇ／ｍＬのビオチン−標識化ＶＥＧＦ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、２５ｎＭ ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）、Ｃａｔ  Ａ８０−３１９Ａ）による毛管作用により検出した。ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ標識を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの標識キット（Ｃａｔ  Ａ−２０１８６）を使用して行ったことに留意されたい。補捉試薬を、ＰＢＳ  ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中で調製し、検出試薬を、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ（登録商標），Ｉｎｃ、Ｐ０００４８２５）中で調製した。
【０３４８】
全ての薬剤を、１００μｇ／ｍＬのビオチン−標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）、Ｃａｔ  Ａ８０−３１９Ｂ）を適用することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、１０ｎＭ ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）、Ｃａｔ  Ａ８０−３１９Ａ）による毛管作用により検出した。
【０３４９】
Ｆｃタンパク質の検出
全ての遊離した精製薬剤構築物を、Ｂｉｏａｆｆｙ１０００  ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ  Ｐ０００４２５３）を使用して、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションにおいて分析した。１００μｇ／ｍＬのビオチン−標識化ＶＥＧＦ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより、遊離した薬剤を測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、２５ｎＭ ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７標識化抗ヒトＦｃ−特異的抗体（Ｒ１０、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）による毛管作用により検出した。全ての薬剤を、２５μｇ／ｍＬのビオチン−標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）、Ｃａｔ  Ａ８０−３１９Ｂ）を適用することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、１２．５ｎＭ ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ  Ａ８０−３１９Ａ）による毛管作用により検出した。
【０３５０】
ＤＡＲＰｉｎの検出
遊離した精製薬剤構築物を、Ｂｉｏａｆｆｙ１０００  ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ  Ｐ０００４２５３）を使用して、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰワークステーションにおいて分析した。遊離した薬剤を、２５μｇ／ｍＬのビオチン−標識化ＶＥＧＦ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、６．２５ｎＭ ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７標識化Ｐｅｎｔａ  ＨＩＳ抗体（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｔ３５３７０）による毛管作用により検出した。
【表１２】
2016502850.tif 000069
【０３５１】
ＨＡ結合ペプチドタグ（配列番号３３）を抗原結合フラグメント（例えば、ＮＶＳ７０、ＮＶＳ７１、ＮＶＳ７２、ＮＶＳ７３、ＮＶＳ７４、ＮＶＳ７５、ＮＶＳ７６及びＮＶＳ７７等）、Ｆｃトラップタンパク質（ＮＶＳ７８及びＮＶＳ８０等）、ならびに、タンパク質（ＮＶＳ８４及びＮＶＳ９０等）に融合させることは、タグ付けされていないＦａｂ及びタンパク質と比較して、これらの分子の眼におけるより高い最終濃度をもたらした。これらのデータは、前記ＨＡ結合ペプチドタグの融合が、それが融合される分子とは無関係に、眼における半減期（ｔ１／２）の改善を与えることを示す。その結果、ＨＡ結合ペプチドタグの融合は、硝子体内に投与された分子の、眼における保持及び眼における半減期を普遍的に増大させると考えられる。
【０３５２】
１４ｃ：ウサギにおける効果の持続期間
ＶＥＧＦ結合生物製剤をＨＡと結合するように操作することが、注入後２０日目での血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した（図１５）。この試験では、ＨＡ結合ペプチドタグによりタグ付けされた種々の抗ＶＥＧＦ分子を、前記ｈＶＥＧＦ負荷の１８日前に、その各親分子と等モル用量で投与した。ｈＶＥＧＦ負荷の４８時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。タグ付けされていないタンパク質であるＮＶＳ８０、ＮＶＳ８１、ＮＶＳ８２及びＮＶＳ８４をＨＡ結合ペプチドタグ（例えば、配列番号３３）と融合させた、ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２Ｔ及びＮＶＳ８４Ｔは、そのタグ付けされていない親分子と比較して、２０日目において有意な効果を有した。動物を画像化後のその日に屠殺し、眼を摘出し、処理し、（ＶＥＧＦに結合しなかった）遊離した薬剤のレベルを、上述したように、Ｇｙｒｏｌａｂにより測定した。ＮＶＳ８０Ｔ、ＮＶＳ８１Ｔ、ＮＶＳ８２Ｔ及びＮＶＳ８４Ｔの遊離した最終硝子体濃度は、２５ｎｇ／ｍｌから２４２２ｎｇ／ｍｌの範囲であり、そのタグ付けされていない親分子であるＮＶＳ８０、ＮＶＳ８１、ＮＶＳ８２及びＮＶＳ８４より、３１〜２２０倍高かった（図１５）。
【０３５３】
これらのデータは、前記ＨＡ結合タグの融合が、それに融合される分子とは無関係に、眼における保持及び効果の持続期間の改善を付与することを示す。ＨＡ結合部分の付加は、全ての各親分子に対して、フルオレセイン阻害を増大させた。このため、硝子体における前記ＨＡタグ付き構築物の量は、ｈＶＥＧＦを抑制し、血管漏出を妨げるのに十分であった。一方、タグ付けされていない分子の量は、そうではなかった。
【表１３】
2016502850.tif 000070
【０３５４】
効果の持続期間の増大は、眼においてヒアルロン酸に結合することが眼からのクリアランスを低下させ、後の時点における、より高いタンパク質レベル、及び、より長い持続期間のためのＶＥＧＦの抑制をもたらすことを示す。ヒトｗｅｔ  ＡＭＤ患者では、ＶＥＧＦレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。ＶＥＧＦレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する（Muether et al., 2012）。このため、ＨＡ結合抗ＶＥＧＦ抗体又はタンパク質によるｗｅｔ  ＡＭＤ患者の処置は、修飾されていない抗ＶＥＧＦ抗体又はタンパク質と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。このため、効果を維持するが、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。これらの実験は、本発明のＨＡ結合ペプチドタグが、硝子体における抗ＶＥＧＦタンパク質薬剤の、半減期を延長させ、最終濃度を増大させ、クリアランスを低下させ、平均滞留時間を増大させるために使用され得ることを示す。
【０３５５】
１４ｄ：ＮＶＳ１及びＮＶＳ１ｄについての、ウサギにおける２０日目における効果の持続及び最終ＰＫ
２つのＨＡ結合部分を有する分子（ＮＶＳ１ｄ）が、１つのタグ付き構築物（ＮＶＳ１）に対して効果を増大させ得るかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した（図１６）。ＶＥＧＦ量は、試験の期間を長くする必要なく、増大した半減期を有する分子を試験するために、試験群の半分において、４００ｎｇ／眼から１２００ｎｇ／眼に増加させた。等モル量のＮＶＳ１及びＮＶＳ１ｄ（両方とも、５μｇ／眼のラニビズマブに等モル）を、前記ｈＶＥＧＦ負荷の１８日前に硝子体内に投与した。群の半分に、１２００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦを投与した。一方、残りに、先に記載した実施例のように、４００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦを投与した。ｈＶＥＧＦ負荷の４８時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。ＮＶＳ１及びＮＶＳ１ｄは両方とも、４００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦ注入による２０日目において、同様の効果を達成した（８５〜９１％の漏出阻害）。１２００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦが負荷されたＮＶＳ１ｄ群において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を達成した（４９％）。対照的に、１２００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦが負荷されたＮＶＳ１群は、有効ではなかった（−２％）。
【０３５６】
一般的に、４００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦが負荷された、ＮＶＳ１が注入されたウサギの、投与後１８日目での最終硝子体濃度は、５９８〜９５３ｎｇ／ｍｌの範囲であった。一方、４００ｎｇ／眼のｈＶＥＧＦが負荷された、ＮＶＳ１ｄが注入されたウサギの、投与後１８日目での最終硝子体濃度は、１０４８〜３０５４ｎｇ／ｍＬの範囲であった。このため、硝子体におけるＮＶＳ１ｄ量は、ＮＶＳ１により達成された量と比較して、硝子体におけるｈＶＥＧＦ量の増加を抑制するのに十分であった。これらのデータは、ＨＡに対して高い親和性を有する２つのＨＡ結合ペプチドタグを含む抗体（ＮＶＳ１ｄ）は、１つのＨＡ結合ペプチドタグのみを有する抗体（ＮＶＳ１）と比較して、効果の有意に長い持続期間を有することを示す。
【０３５７】
実施例１５：ＨＡ結合ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性
１５ａ：等電点及び溶解性の改善
前記ＨＡ結合タグを種々の種類のタンパク質（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＩｇＧ及びＦｃトラップ）に結合させることは、全体的に、前記ＨＡ結合タグに結合した親タンパク質の等電点及び溶解性を増大させた。表１４に、そのままのタグ付けされていないタンパク質の等電点を、前記ＨＡ結合ペプチドタグと結合した同じタンパク質の等電点とあわせて示す。
【０３５８】
前記ＨＡ結合ペプチドタグは、その主なターゲット／リガンドに対する前記タンパク質の親和性も増大させる。表１５は、前記ＨＡ結合タグに結合したこれらの同じタンパク質の親和性と比較した、その主なターゲット／リガンドに対する種々のタンパク質の親和性を示す。驚くべきことに、前記ＨＡ結合タグに結合したタンパク質は、前記ＨＡ結合タグを含まない親タンパク質と比較して、主な眼のタンパク質ターゲット／リガンドに対する親和性において、１．２〜７５倍の増大を有した。
【表１４】
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１５ｂ：眼におけるターゲットとの結合
【表１５】
2016502850.tif 000072
【０３５９】
これらの結果は、ＨＡと結合するペプチドタグを抗原結合フラグメント、全長抗体、Ｆｃトラップ、ＤＡＲＰｉｎ、ｓｃＦｖ及びタンパク質に結合させることが、その主なターゲット、例えば、ＶＥＧＦに対する、そのタンパク質分子の親和性を増大させることを明らかに示す。これは、これらの抗ＶＥＧＦタンパク質のターゲット結合領域から空間的に完全に離れている前記ＨＡ結合ペプチドタグとしての予期しなかった特性である。
【０３６０】
実施例１６：Ｉ−１２４標識化ラニビズマブ及びＨＡタグ付き抗体のラットにおける生体分布
ラニビズマブ及び本発明のＨＡ結合ペプチドによりタグ付けされた抗体（ＮＶＳ１）の生体分布を、以下に記載するように、Ｉ−１２４標識化タンパク質を使用して測定した。その結果は、前記ＨＡ結合ペプチドタグが、眼球外の環境におけるクリアランスへの何らの明らかな影響も及ぼすことなく、眼における治療の作用の持続期間を延長させるのに有用であることを示す。
【０３６１】
ラットの眼に注入された前記タンパク質の放射線標識化を、ヨードゲン法（１）を使用して行った。前記方法は、ヨードゲンコートチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用する。典型的には、＞８５％の放射線標識効率及び約７ｍＣｉ／ｍｇの比放射能を達成した。硝子体内（ＩＶＴ）注入用ラットを準備するために、動物を、３％ イソフルランガスで麻酔した。ついで、眼を、２滴のシクロペントレート（１％の好ましい濃度）及び２．５〜１０％ フェニルエフリンにより拡張させた。１滴の局所麻酔剤も塗布した（０．５％ プロパラカイン）。解剖顕微鏡下において、３０ゲージのニードルで、角膜の輪郭の下４ｍｍを、眼の中央に向かう角度で切開した。ついで、放射線標識したタンパク質を含む鈍端のハミルトンシリンジ（例えば、３３ゲージ）を、この開口から硝子体腔内に挿入し、約３．５μＬの放射線標識化タンパク質を注入した。前記眼を、出血又は白内障について試験した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。ラットの眼内に前記放射線標識化タンパク質を注入した直後に、麻酔した動物を、その腹部を上にして、予熱したＰＥＴ画像化ベッドに寝かせた。前記ベッドに、ノーズコーンによりガス麻酔を供給した。ついで、固定及び確保された動物を、動物の胸部下に置かれた呼吸センサを使用してモニターされる生体機能（例えば、呼吸）についてのスキャナに移動させた。Ｉ−１２４標識化ラニビズマブを注入した動物について、動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により、ＩＶＴ注入後７２時間で安楽死させた。眼及び他の臓器／組織（血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨）を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、カウントした組織／臓器の％  注入用量／グラム（％  ＩＤ／ｇ）に変換した。Ｉ−１２４標識化ＨＡタグ付き抗体（ＮＶＳ１）を注入した動物について、動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により、ＩＶＴ注入後７２時間で安楽死させた。眼及び他の臓器／組織（血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨）を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、カウントした組織／臓器の％  注入用量／グラム（％  ＩＤ／ｇ）に変換した。
【０３６２】
最後のＰＥＴ／ＣＴ画像化時点直後に、ラットを安楽死させ、血液を、心臓穿刺により収集した。臓器及び組織に捕捉された血液関連放射能量を減らすために、血液を、前記動物から取り除いた。個々の臓器及び組織、例えば、左目、右目、血液、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、筋肉、胃、骨及び脳を解剖し、秤量し、Ｉ−１２４についての適切なエネルギーウインドウ（３５０〜７５０ｋｅＶ）に設定したガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。ガンマ線カウントについての２つの標準を、各眼及び両眼における注入用量の１／１００希釈液を調製することにより調製した。標準は、１分あたりのカウント数（ｃｐｍ）及び各眼に注入されたｃｐｍに関して、前記動物に注入された合計活性を算出するために使用した。２つの生理食塩水充填チューブを、ガンマカウンターにおいて計測して、バックグラウンド活性を取得した。バックグラウンドｃｐｍを、前記組織のｃｐｍから差し引いた。ついで、バックグラウンドを差し引いたｃｐｍを、注入のタイミングに対して減衰補正し、合計注入ｃｐｍで割り、１００を掛けて、％注入用量（％  ＩＤ）を算出した。前記減衰補正された各眼におけるｃｐｍを、その眼に注入されたｃｐｍで割り、１００を掛けて、その眼における％  ＩＤを算出した。％  ＩＤ／グラムを算出するために、各算出％  ＩＤを、対応する組織／臓器の重量で割った。以下の参照には、％  ＩＤ／ｇの算出がより詳細に記載されている：Yazaki PJ, et al. 2001。
【０３６３】
結果及びまとめ：
放射線標識化され、ＩＶＴ投与されたラニビズマブ及びＮＶＳ１の生体分布を、ガンマカウンターを使用して評価した（図１７）。Ｉ−１２４標識化ラニビズマブのＩＶＴ後７２時間において、前記注入用量の約１．４％が、眼において測定された。対照的に、Ｉ−１２４標識化ＨＡタグ付き抗体のＩＶＴ後１６６時間において、前記注入用量の約１１％が、眼において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、ＨＡ結合ペプチドタグ付き抗体の１０倍以上高い眼における保持を示す。分析した残りの眼以外の組織において、類似する量のラニビズマブ及び前記ＨＡ結合ペプチドタグ付き抗体の両方が、眼の外部において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、前記ＨＡ結合ペプチドタグ付き抗体の眼球外保持において、明らかな差がないことを示す。これらのデータは、Ｉ−１２４標識化ペプチドタグ付き分子が、タグ付けされていない分子と比較して、明らかにより高い眼における保持、より低い眼におけるクリアランス及び増大した最終的な眼における濃度を有するという、驚くべき発見を示す。ただし、前記ＨＡ結合ペプチドタグの半減期延長効果は、眼の外部では見られなかった。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１５】
2016502850.tif 000083
【図１６】
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【図１１】
2016502850.tif 000085
【図１２】
2016502850.tif 000086
【図１３】
2016502850.tif 000087
【図１４−１】
2016502850.tif 000088
【図１４−２】
2016502850.tif 000089
【図１４−３】
2016502850.tif 000090
【図１７】
2016502850.tif 000091
【国際調査報告】
2016502850.tif 000092
2016502850.tif 000093
2016502850.tif 000094