(57)【要約】  開示されるのは、原核生物の１６ＳリボソームＲＮＡ(１６Ｓ  ｒＲＮＡ)における１個以上の一塩基多型(ＳＮＰ)および／または真核生物の５.８ＳリボソームＲＮＡ(５.８Ｓ  ｒＲＮＡ)における１個以上のＳＮＰを使用して、微生物を同定および／または分類する方法である。また開示されるのは、これらの方法に有用なプローブ、プライマーおよびキットである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣがあり、３９８位にＴ、ＡまたはＣがあるときは、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＡ、ＴまたはＧがあり、３９８位にＣがあるときは、細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法。
【請求項２】
細菌がアシネトバクター属(Acinetobacter spp.)；アクチノバチルス属(Actinobaccillus spp.)；アクチノマヅラ属(Actinomadura spp.)；アクチノマイセス属(Actinomyces spp.)；アクチノプラーネス属(Actinoplanes spp.)；エロモナス属(Aeromonas spp.)；アグロバクテリウム属(Agrobacterium spp.)；アリスティペス属(Alistipes spp.)；アナエロコッカス属(Anaerococcus spp.)；アルスロバクター属(Arthrobacter spp.)；バチルス属(Bacillus spp.)；ブルセラ属(Brucella spp.)；ブレイジア属(Bulleidia spp.)；バークホルデリア属(Burkholderia spp.)；カルジオバクテリウム属(Cardiobacterium spp.)；シトロバクター属(Citrobacter spp.)；クロストリジウム属(Clostridium spp.)；コリネバクテリウム属(Corynebacterium spp.)；デルマトフィルス属(Dermatophilus spp.)；ドレア属(Dorea spp.)；エドワージエラ属(Edwardsiella spp.)；エンテロバクター属(Enterobacter spp.)；エンテロコッカス属；エリシペロスリクス属(Erysipelothrix spp.)；エシェリキア属(Escherichia spp.)；ユーバクテリウム属(Eubacterium spp.)；フィーカリバクテリウム属(Faecalibacterium spp.)；フィリファクター属(Filifactor spp.)；フィネゴルディア属(Finegoldia spp.)；フラボバクテリウム属(Flavobacterium spp.)；ガリコラ属(Gallicola spp.)；ヘモフィルス属(Haemophilus spp.)；ヘルココッカス属(Helcococcus spp.)；ホールディマニア属(Holdemania spp.)；ハイフォミクロビウム属(Hyphomicrobium spp.)；クレブシエラ属；ラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)；レジオネラ属(Legionella spp.)；リステリア属(Listeria spp.)；メチロバクテリウム属(Methylobacterium spp.)；ミクロコッカス属(Micrococcus spp.)；ミクロモノスポラ属(Micromonospora spp.)；モビルンカス属(Mobiluncus spp.)；モラクセラ属(Moraxella spp.)；モルガネラ属(Morganella spp.)；マイコバクテリウム属(Mycobacterium spp.)；ナイセリア属(Neisseria spp.)；ノカルジア属(Nocardia spp.)；パエニバチルス属(Paenibacillus spp.)；パラバクテロイデス属(Parabacteroides spp.)；パスツレラ属(Pasteurella spp.)；ペプトニフィラス属(Peptoniphilus spp.)；ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus spp.)；プラノコッカス属(Planococcus spp.)；プラノミクロビウム属(Planomicrobium spp.)；プレジオモナス属(Plesiomonas spp.)；ポルフィロモナス属(Porphyromonas spp.)；プレボテラ属(Prevotella spp.)；プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)；プロテウス属(Proteus spp.)；プロビデンシア属(Providentia spp.)；シュードモナス属(Pseudomonas spp.)；ラルストニア属(Ralstonia spp.)；ロドコッカス属(Rhodococcus spp.)；ロゼブリア属(Roseburia spp.)；ルミノコッカス属(Ruminococcus spp.)；サルモネラ属(Salmonella spp.)；セディメンチバクター属(Sedimentibacter spp.)；セラチア属(Serratia spp.)；シゲラ属(Shigella spp.)；ソロバクテリウム属(Solobacterium spp.)；スフィンゴモナス属(Sphingomonas spp.)；スポラナエロバクター属(Sporanaerobacter spp.)；スダフィロコッカス属；ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas spp.)；ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)；ストレプトマイセス属(Streptomyces spp.)；ティシエレラ属(Tissierella spp.)；ビブリオ属(Vibrio spp.)；およびエルシニア属(Yersinia spp.)から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌が細菌番号１〜１４３０から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、
３９６位にＣが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＧが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法。
【請求項６】
細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ
があるとき、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＧ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、細菌はグラム陽性菌であると決定される、
方法。
【請求項８】
細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される、請求項���に記載の方法。
【請求項９】
細菌を同定するかまたは細菌を細菌群の一つであると同定することをさらに含み、
３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、
３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の数群の一つとして分類する方法であって、ここで、ＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ５病原体ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６病原体であると決定され、または
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ７病原体ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)であると決定される、方法。
【請求項１１】
細菌がグループ１細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、
９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細菌がグループ２細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
細菌がグループ３細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
細菌がグループ４細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
細菌がグループ６細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置および配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９９位、４００位および４０１位または２７８位、２８６位および６４８位に対応する位置の複数一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類する方法であって、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価するならば、細菌は哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の７群に分類され、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４病原体であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ５病原体ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６病原体であると決定され、または
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ７病原体ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)であると決定され、そして
２７８位、２８６  ３９６、３９８および６４８を評価するならば、細菌はグラム陽性またはグラム陰性として分類され、ここで、
３９６位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ
があるとき、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＧ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、細菌はグラム陽性菌であると決定される、
方法。
【請求項１７】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価し、細菌がグループ１細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、
９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価し、細菌がグループ２細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価し、細菌がグループ３細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価し、細菌がグループ４細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価し、細菌がグループ６細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位を評価したならば、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコ��クテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
さらに細菌を細菌群の一つとして同定することを含み、ここで、
３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、
３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは細菌がストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、１種以上の抗生物質に対して細菌が耐性であるか否かを決定することを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
さらに、サンプル中の真菌の存在または不在について決定するためにサンプルを分析することを含み、このさらなる分析は配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置での５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の一塩基多型(ＳＮＰ)について核酸の分析を含み、ここで、ＳＮＰはサンプル中の真菌の存在の指標であり、ここで、ＳＮＰは１４２位のＣ；１４４位のＡ；１４６位のＡ；１４７位のＡ；１４８位のＣ；１５４位のＴ；１５７位のＴ；１６４位のＣまたはＧ；１６７位のＡ；１８５位のＧ；１８７位のＡ；１８８位のＡ；１９４位のＴ；１９７位のＧ；２１３位のＡ；２１５位のＴ；２１６位のＴ；２１９位のＧ；２２３位のＡ；２３１位のＧまたはＡ；２３２位のＴ；２３６位のＴ；２４５位のＣまたはＡ；２５１位のＣ；および２５６位のＴから選択される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
さらに、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の存在および正体を決定するためにサンプルを分析することを含み、このさらなる分析は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の少なくとも４個のＳＮＰｓについての核酸の分析を含み、
少なくとも４個のＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置のもの、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置のものおよび配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置のいずれか２箇所のものを含み；
哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択され、そして
病原体の存在および正体は次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき決定する、
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【表１】
2016520314.tif 000135
【請求項２７】
少なくとも４個のＳＮＰｓが配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の１６４位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも４個のＳＮＰｓが配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の２２３位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２４位または２５９位に対応する位置である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
さらにサンプル中の細菌の数を決定することを含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
さらにサンプル中の真菌細胞数を決定することを含む、請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
サンプルが全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)を呈するまたは敗血症を有する疑いのある哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの生体サンプルである、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
生体サンプルが血液である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
核酸を分析前にサンプルから抽出する、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
分析が核酸の増幅を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける真菌の存在または不在を決定する方法であって、このＳＮＰはサンプル中の真菌の存在の指標であり、ここで、ＳＮＰは１４２位のＣ；１４４位のＡ；１４６位のＡ；１４７位のＡ；１４８位のＣ；１５４位のＴ；１５７位のＴ；１６４位のＣまたはＧ；１６７位のＡ；１８５位のＧ；１８７位のＡ；１８８位のＡ；１９４位のＴ；１９７位のＧ；２１３位のＡ；２１５位のＴ；２１６位のＴ；２１９位のＧ；２２３位のＡ；２３１位のＧまたはＡ；２３２位のＴ；２３６位のＴ；２４５位のＣまたはＡ；２５１位のＣ；および２５６位のＴから選択される、方法。
【請求項３７】
サンプルが土壌、食品、水、表面スワブおよび対象からの生体サンプルから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
生体サンプルが血液、組織、痰、洗浄液、糞便、尿および唾液から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらにサンプル中の真菌細胞数を決定することを含む、請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
核酸を分析前にサンプルから抽出する、請求項３６〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
分析が核酸の増幅を含む、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う、請求項２８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも４個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法であって、ここで、
少なくとも４個のＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置の任意の２箇所であり、
哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択され、そして
病原体の正体は次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき決定する、
方法。
【表２】
2016520314.tif 000136
【請求項４４】
少なくとも４個のＳＮＰｓが配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の１６４位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも４個のＳＮＰｓが配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の２２３位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２４位または２５９位に対応する位置である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色を決定することを含み、ここで、ＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＧが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される、
請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色の決定を含み、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ
があるとき、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして
３９６位にＧ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；
または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡ
があるとき、細菌はグラム陽性菌であると決定される、
請求項４３〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、細菌を同定するかまたは細菌を細菌群の一つであるとして同定することを含み、ここで、
３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、
３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す、
請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
さらに１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の７群の一つとしてサンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類することを含み、ここで、ＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１細菌であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２細菌であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３細菌であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣが存在するとき、細菌はグラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４細菌であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣが存在するとき、細菌はグループ５細菌ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)であると決定され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６細菌であると決定され、または
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ７細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)であると決定される、
請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
細菌がグループ１細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、
９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細菌がグループ２細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
細菌がグループ３細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
細菌がグループ４細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
細菌がグループ６細菌であると決定されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｄ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
さらにサンプル中の真菌細胞数を決定することを含む、請求項４３〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
さらにサンプル中の細菌の数を決定することを含む、請求項４６〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
サンプルが哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの生体サンプルである、請求項４３〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
生体サンプルが血液、組織、痰、洗浄液、糞便、尿および唾液から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
生体サンプルが血液である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
核酸を分析前にサンプルから抽出する、請求項４３〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
分析が核酸の増幅を含む、請求項４３〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う、請求項４３〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
対象の血液からの核酸を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて分析することを含む、対象(例えば、ヒト)における敗血症を診断する方法であって、ここで、ＳＮＰの存在が敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、そしてグラム陰性菌感染が原因の敗血症は、３９６位にＣがあるとき診断され、グラム陽性菌感染が原因の敗血症は３９６位にＧがあるとき診断され；そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される、方法。
【請求項６６】
細菌感染がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される細菌による感染である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象の血液からの核酸を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて分析することを含む、対象(例えば、ヒト)における敗血症を診断する方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ
があるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして
３９６位にＧ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡ
があるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される、方法。
【請求項６８】
細菌感染がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される細菌���よる感染である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
さらに、敗血症がグラム陽性菌またはグラム陰性菌が原因であると同定されたとき、細菌の同定または細菌の群の一つであるとしての細菌の同定を含み、ここで、
３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、
３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す、
請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰの存在が敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、そして３９６位にＣがあるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして３９６位にＧがあるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される、方法。
【表３】
2016520314.tif 000137
【請求項７１】
細菌感染がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される細菌による感染である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、
３９６位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ
があるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして
３９６位にＧ；
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡ
があるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される、方法。
【表４】
2016520314.tif 000138
【請求項７３】
細菌感染がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される細菌���よる感染である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
さらに、敗血症がグラム陽性菌またはグラム陰性菌が原因であると同定されたとき、細菌の同定または細菌の群の一つであるとしての細菌の同定を含み、ここで、
３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、
３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして
３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す、
請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣが存在するとき、グラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、ループ５細菌ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、グラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、グループ７細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される、方法。
【請求項７６】
グループ１細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、
９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され；そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される、
請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
グループ２細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される、
請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
グループ３細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される、
請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
グループ４細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される、
請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
グループ６細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される、
請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、ここで、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択異されるグループ１細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣが存在するとき、グラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、ループ５細菌ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、グラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６細菌が原因の敗血症と診断され、
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、グループ７細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される、方法。
【表５】
2016520314.tif 000139
【請求項８２】
グループ１細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、
９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される、
請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
グループ２細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される、
請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
グループ３細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され；
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され；
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される、
請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
グループ４細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして
４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される、
請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
グループ６細菌が原因の敗血症と診断されたならば、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析することを含み、ここで、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、
４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして
４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される、
請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を同定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＣの存在が、サンプル中の真菌病原体がカンジダ属である指標である、方法。
【請求項８８】
カンジダ属がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中のカンジダ属の存在または不在を決定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＴの存在がサンプル中のカンジダ属の存在の指標であり、１６３位のＴおよび１６４位のＣの不在が、サンプル中のカンジダ属の不在の指標である、方法。
【請求項９０】
カンジダ属がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
さらにサンプル中の細菌数および／または真菌数を決定することを含む、請求項６５〜９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
核酸を分析前にサンプルから抽出する、請求項６５〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
分析が核酸の増幅を含む、請求項６５〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う、請求項６５〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
治療剤を対象に投与することを含む、請求項６５〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
治療剤が抗真菌剤または抗生物質である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
さらに検出または同定された細菌または真菌病原体が治療剤に耐性であるか否かを決定することを含む、請求項１〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
さらに検出または同定された細菌または真菌病原体の毒性を決定することを含む、請求項１〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
対象が敗血症を有するか否かを請求項６５〜９４のいずれかの方法に従い決定し、敗血症が対象に存在することに基づき、敗血症の処置のための治療剤を対象に投与することを含む、敗血症を有する対象を処置する方法。
【請求項１００】
対象が敗血症を有するか否かを請求項６５〜９４のいずれかの方法に従い決定し、敗血症が対象に存在することに基づき、敗血症の処置のための治療剤を対象に投与するかまたは対象に敗血症が存在しないことに基づき、感染陰性全身性炎症反応症候群のための治療剤を対象に投与することを含む、全身性炎症性応答を有する対象を処置する方法。
【請求項１０１】
請求項１〜９４のいずれかに記載の方法に従い哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連病原体の存在、グラム呈色、正体または分類を決定または診断し、対象における哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連病原体の存在、グラム呈色、正体または分類に基づき対象に治療剤を投与することを含む、対象における感染の処置方法。
【請求項１０２】
さらに検出または同定された哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連病原体が治療剤に耐性であるか否かを決定し、ここで、対象に投与される治療剤は、病原体が耐性であるもの以外の治療剤である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１〜１０２のいずれかの方法において使用するための試薬を含む、キット。
【請求項１０４】
試薬がプライマーまたはプローブである、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
２個のプライマーを含み、その各々が請求項１〜９０のいずれかに定義するＳＮＰを含む１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはそのＤＮＡコピーの少なくとも一部とハイブリダイズする、請求項１０３または１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
請求項１〜９０のいずれかに定義するＳＮＰを含む１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはそのＤＮＡコピーの少なくとも一部とハイブリダイズするプローブを含む、請求項１０３〜１０５のいずれかに記載のキット。
【請求項１０７】
全てまたは一部をプロセシングシステムにより実施する、請求項１〜１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
サンプルが対象からの生体サンプル、空気、土壌、水、濾液、食品、工業製品およびスワブサンプルから選択される、請求項１〜１０２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年５月２８日出願の“微生物マーカーおよびその使用”なる名称のオーストラリア仮出願番号２０１３９０１９０７および２０１３年１０月１１日出願の“微生物マーカーおよびその使用”なる名称のオーストラリア仮出願番号２０１３９０３９１４に基づく優先権を主張し、この各々の対象を引用により本明細書にその全体を包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、原核生物の１６ＳリボソームＲＮＡ(１６Ｓ  ｒＲＮＡ)における１個以上の一塩基多型(ＳＮＰｓ)および／または真核生物の５.８ＳリボソームＲＮＡ(５.８Ｓ  ｒＲＮＡ)における１個以上のＳＮＰｓを使用して微生物を同定および／または分類する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法において有用なプローブ、プライマーおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
原核生物は、核またはあらゆる膜結合小器官を欠き、一般に単細胞である生物である。ほとんどの原核生物は、クリスタルバイオレットおよびサフラニン(またはカルボールフクシン)で染色するグラム陽性微生物の外部細胞壁のペプチドグリカンに基づき、大まかにグラム陽性またはグラム陰性に分類され得るが、グラム染色不定の原核生物も数種いる。原核生物は、原核生物リボソームの３０Ｓ(スベドベルグ単位)小サブユニットの要素である１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む。１６Ｓ  ｒＲＮＡは、一般に２３Ｓおよび５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子も含む共転写オペロンの一部である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(１６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれることもある)によりコードされる、約１５００ヌクレオチド長である。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列(およびゆえに１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子のＲＮＡ配列)は原核生物間で高度に保存されているが、変動性の領域がある(Weisburg WG, et al., (1991) J Bacteriol. 173 (2): 697-703)。
【０００４】
対照的に、真核生物は、細胞に膜、特にＤＮＡを含む核膜を含む生物であり、単細胞(例えば大部分の酵母)または多細胞であり得る。全ての真核生物は、真核リボソームの大６０Ｓ小サブユニットの要素である５.８Ｓ  ｒＲＮＡを含む。その長さは種間で多様であるが、通常１６０ヌクレオチド前後である。５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(しばしば５.８Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる)は、２種の内部転写スペーサーにより分離された１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子も含む、４５Ｓ  ｒＤＮＡの一部である。ヒトにおいて、４５Ｓ  ｒＤＮＡは、５個の異なる染色体上の５個のクラスターに存在し、各クラスターは３０〜４０反復配列を有する。４５Ｓ  ｒＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩにより単転写ユニット(４５Ｓ)として転写され、これが続いてプロセシングされて５.８Ｓ、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡ分子を産生する。５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列(およびそれゆえに５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子の配列)は真核生物間で高度に保存されているが、系統発生学的研究に使用できる変動領域がある(Field K. Get al., (1988) Science 239 (4841): 748-753)。
【０００５】
サンプル中の原核微生物および真核微生物を分類することがしばしば望まれる。例えば、溶液、物質または食品を汚染し、他の生物の健康に脅威を与える、または溶液または物質または食品の生産物の質を脅かす微生物の分類は、病原体の同定を、そしてこのような微生物の管理、調節、除菌、排除、制限または除去を助ける。微生物多様性、門(phylum)スペクトル、門間の相対的バランスの生態学的研究のため(Gehron, M. J. et al. (1984) J. Microbiol. Methods 2, 165-176; Claesson, M. J. et al. (2010) Nucl Acids Res 38(22), e200)、またはウイルス、真菌、寄生虫および細菌感染症を含む腸内(例えば胃腸炎、第一胃炎、大腸炎、盲腸炎；Bailey, S. R., et al. (2003). Appl. Environ. Microbiol. 69, 2087-2093)、呼吸器(例えば肺炎、気管支炎、粘膜炎)、泌尿器(例えば膀胱炎、腎炎、尿道炎)および皮膚(例えば創傷、掻痒症(pruritus)、皮膚炎、乾癬)障害のような病態における正常状態からのマイクロバイオームバランス逸脱の検定またはモニタリングのためのような、サンプルの天然微生物集団(“マイクロバイオーム”)の検定もまた望まれる。抗生物質、ステロイド類、免疫調節剤、プレおよびプロバイオティクス、土壌または水処理、濾過、殺菌処理、防腐剤の使用のような治療または処置または調節への応答としての、サンプル中のマイクロバイオームの検定もまた有用であり得る。
【０００６】
現在の微生物分類スキームは、表現型、化学型および遺伝子型を含むが、これらに限定されない。表現型分類に含まれるのは、グラム染色、成長要求性、生化学反応、抗生物質感受性、血清学的システム、環境的リザーバー(またはこのような微生物が優先的に生存および増殖する場所)の細分類法である。化学型分類に含まれるのは、糖類、脂肪、タンパク質または鉱物からなる微生物成分の分析を含み得る種々のテクノロジーを使用する細分類法である。遺伝子型分類に含まれるのは、制限酵素断片長分析およびリボソームＲＮＡ配列分析の細分類法であり、いずれも遺伝子材料の異なるレベルの解釈に依存する。
【０００７】
表現型分類法は、感受性および特異性の欠如に苦労することがあり、迅速または容易ではなく、自動化の可能性も限定される。化学型法もまた感受性および特異性を欠き、現時点では費用効率が悪い。遺伝子型はしばしばより感受性であり、迅速であり、実施が容易であり、費用効率がよく、自動化および多重化が可能である。
【０００８】
核酸分子法を使用して、グラム陽性原核生物およびグラム陰性原核生物を識別するための種々の試みがなされている(例えばBispo, P. J. M., et al., (2011) Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 873-881; Klaschik, S. et al. (2002) Journal of Clinical Microbiology 40, 4304-4307; Shigemura, K. et al. (2005) Clin Exp Med 4, 196-201 (2005); Carroll, N. M. et al. (2005) Journal of Clinical Microbiology 38, 1753-1757参照)。これらの試みは、大部分、限られた数の特定の病理学的検体(血液、尿、眼部検体)および病原体の種類に焦点を当てているため、検出し、識別する病原体の数により、範囲が限られる。これらの短所は、例えば、原核微生物感染を有する患者の検出が不可能であるとの、深刻な下流効果を暗示し得る。
【０００９】
このような報告されている方法は、一般に、重要とされる定量的方法ではない。サンプルが単一タイプの生物からなることは稀であり、病理サンプルについては、無関係かつ非病原性であり得る原核生物でしばしば汚染されている。さらに、溶液または物質または食品に微生物がいないことは極めて稀であり、汚染のレベル、品質不良または他の生物の健康への脅威を決定するのは、存在する微生物の数である。増殖培地へのプレーティングおよび微生物コロニーの計数、濁度を測定するための分光光度測定の使用およびナノ粒子の使用を含むが、これらに限定されない微生物を定量する多様な現存する方法がある(Zhao X et al., A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. PNAS, 101(42): 15027-15032. 2004)。
【００１０】
遺伝子型分類と定量化を組み合わせた方法はわずかしか存在しない。一つの例は、Spiro et al., 2000(A bead-based method for multiplexed identification and quantitation of DNA sequences using flow cytometry. App Env Micro 66(10): 4258-4265)である。しかしながら、この方法は微生物の遺伝子型分類を記載しない。むしろ、異質な混合物中の特定のＤＮＡ配列を同定するビーズテクノロジーの能力を示すものである。次世代シーケンシング(ＮＧＳ)のような最近の開発は、サンプルのマクロバイオーム上の大量のデータの作成を期待できる(Claesson, M. J. et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucl Acids Res 38 (22), e200 (2010))。しかしながら、これらのテクノロジーは、現在、感受性不良(サンプルは、配列決定にＰＣＲ増幅および、ある場合には、ライブラリー作成が必要となる)、費用、ＰＣＲバイアス、配列決定不正確さならびに作成された大量のデータを解釈するために必要な複雑なソフトウエアおよびアルゴリズムを含む、多くの制限、特に単純グラム呈色の決定に関して、苦労している。
【００１１】
それゆえに、微生物学の分野において、適切に識別力があり、感受性で、特異的で、迅速で、実施および解釈が容易で、安価で、それ自体自動化に役立ちかつ最小限の多重化を有し、優先的に現場で、遠隔的にまたは患者ベッドサイドでまたは少なくとも研究室で安価に実施できる、単一検査の形態である、広範な微生物分類および定量化の方法に対するニーズがある。このような検査は、このような微生物の迅速で情報に基づく管理、モニタリング、列挙、定量化、識別、調節、除菌、排除、制限または除去を可能にする。
【００１２】
特に、ヒトにおける敗血症の原因となるような、健康上重大な微生物の広範な微生物分類および定量化法に対するニーズがある。
【００１３】
全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)は、感染性病因または非感染性病因(すなわち感染陰性ＳＩＲＳまたはｉｎＳＩＲＳ)を有し得る抵抗しがたい全身性反応である。敗血症は、感染中に起こるＳＩＲＳである。この場合の敗血症は医師により(感染の疑いがあるとき)または生物サンプルの培養により診断される。ＳＩＲＳおよび敗血症のいずれも、心拍数および呼吸数、体温および白血球数の変化を含む、多くの非特異的宿主応答パラメータにより規定される(Levy et al., (2003) Critical Care Medicine 31: 1250-1256.; Reinhart et al., (2012) Clinical Microbiology Reviews 25(4): 609-634)。
【００１４】
敗血症およびＳＩＲＳは、世界的に医療制度に対して与える影響が増え続けている。１９９３年から２００９年までの間に米国での敗血症関連入院数は倍増以上であり、全体として１５３％増加し、平均年間６％増加している。２００９年には、院内で１日あたり４,６００名の新規患者が敗血症で処置され、院内で患者約２３名中１名が敗血症を有していた。院内敗血症死亡率は約１６％であり、２０００年以降変化しておらず、他の入院での死亡率より８倍を超えて高い。敗血症はまた米国で２００９年度の最も高価な入院理由であり、総額推定１５４億ドルが合算の入院費であった。
【００１５】
ＳＩＲＳは、局所または全身感染、外傷、熱傷、手術および無菌炎症を含む多くの侵襲により誘発され、４つの指定臨床指標(体温、心拍数、呼吸数および白血球)のうち少なくとも２つの異常を持つ。Rangel-Fausto et al.が実施した包括的な調査によると、９ヶ月を超える入院患者の６８％が、ＳＩＲＳの少なくとも２つの基準を満たし、異なる区にまたがって調査した病院におけるＳＩＲＳの発症密度は、１０００患者入院日数あたり３２０〜８５７発症例の範囲であった(Rangel-Frausto et al. (1995) JAMA 273(2): 117-123)。それゆえに、ＳＩＲＳは、病院で高い発症数を有する。
【００１６】
敗血症の確定診断は、通常血液サンプルからの生存病原体の培養を使用する単離および同定を必要とするが、この技術には制限がある。微生物培養は、通常陽性結果を得るのに数日かかり、陰性結果を確認するために５日間以上かかる。さらに、培養は、感受性、特異性および予測値に関して信頼性に問題がある(Jean-Louis Vincent et al., (2006) Critical Care Medicine 34: 344-353; Lamy et al., (2002) Clinical Infectious Diseases 35: 842-850)。敗血症が疑われる患者から採血した血液培養のかなりの割合が陰性または汚染である(Coburn et al. (2012) JAMA 308, 502-511)。患者から採血した総血液培養の９０％超が陰性である。少数(４〜７％)の陽性である血液培養の中で、最大半分が未熟なサンプリング技術の結果の、汚染(偽陽性)による。偽陽性血液培養は総入院費を増加させ、入院の中央値を増やし、かつ検査費を増加させ得る。それゆえに、サンプリングおよび試験を含む、敗血症の存在の決定のための未熟な診断手順は、医療制度に相当な経済的負担を強いる。敗血症を有することが疑われる患者における血液培養の診断上の限界の他の可能性のある結果は、広域スペクトル抗生物質の使用および誤使用、抗微生物剤耐性の発生およびクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)感染、有害反応および処置費用増加を含む。
【００１７】
ＳＩＲＳおよび敗血症の代替的診断法は幅広く研究されており、一般に病原体検出またはバイオマーカーを使用する宿主応答の決定の２つのカテゴリーの一つに入る。見込みのある迅速かつ感受性の病原体検出テクノロジーは、特に血液培養と併せて使用するとき、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、例えば、Roche's Lightcycler(登録商標)SeptiFastの使用を含む(Bauer and Reinhart (2010) International Journal of Medical Microbiology 300: 411-413; Uwe Lodes et al. (2012) Langenbeck's Archives of Surgery 397: 447-455; およびPasqualini et al., (2012) Journal of Clinical Microbiology 50: 1285-1288)。このテクノロジーを使用するときの現在の困難は、血液培養結果または関連臨床徴候の非存在下、どのように早期陽性ＰＣＲ結果を解釈するのが最良であるかである。このような試験は複雑であり、複数の多重反応が関与する。さらに、微生物の正確な定量が、感受性アッセイ法を使用するとき、病原体検出の妥当性の決定に重要である。特に末梢血液サンプルにおける、ＰＣＲベースの病原体検出と関係するさらなる技術的問題点は、宿主核酸のバックグラウンド中で、少量の病原体核酸を検出する能力の欠如である。
【００１８】
大手術後を含む種々の病因を持ち、三次医療ＩＣＵ環境に入れられた患者の大部分(＞８０％)がＳＩＲＳを有することを考えると、証拠に基づきかつ目標指向の医療を開始するために、感染の疑いのあるまたは感染の高いリスクのある患者を早期に同定し、等級付けし、モニターできることは、多大な臨床的重要性がある(Kumar, A. et al. (2006) Critical Care Medicine 34, 1589-1596)。ＳＩＲＳのための急性管理計画が、感染を伴うか伴わないかで非常に異なるため、これは重要である。経験的処置への依存は、患者の一部は過剰な抗生物質を受ける可能性があり、他の一部は、明確な感染部位が同定されていないために、免疫抑制性である処置(例えばコルチコステロイド)を受けることを意味する。それゆえに、医師が適切な患者管理およびこのような患者における処置決定を行う助けとなるために、広範な可能性のある病原体にわたって、感染陰性ＳＩＲＳ(ｉｎＳＩＲＳ)と感染陽性ＳＩＲＳ(例えば敗血症)を識別し、微生物ＤＮＡを定量し、原核生物ＤＮＡと真核生物ＤＮＡを識別し、グラム陽性ＤＮＡとグラム陰性ＤＮＡを識別することができる検査に対する要望が続いている。
【００１９】
医師が適切な治療方針を決定する助けとするために、細菌をグラム陽性およびグラム陰性以上にさらに分類する、迅速アッセイおよび検査に対する要望もある。従前の方法は、典型的に細菌を、細菌の種によって、典型的に２〜１０日(例えばマイコバクテリアのような成長が遅く、偏好性の生物は１０日を要し得る)培養することが必要である。この細菌の、特に嫌気性菌の培養は、労働集約的であり、厄介であり、特殊な装置および試薬を必要とする。培養したら、検査室で一般に実施される最初の手順は、グラム染色および形態学的評価であり、その結果は医師に速やかに報告される。グラム染色は、増殖した細菌の、増殖するならば、次のグラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性桿菌、グラム陰性球菌、嫌気性菌およびカンジダ属の群への分類を可能にする。このような情報を他のデータと組み合わせれば、適切な抗生物質の選択に十分であり得る。その後、さらなる検査が、抗生物質感受性決定および種属同定を助け得るが、これらの検査は費用および処置計画により実施されるとは限らない。
【００２０】
菌血症と関係する高い死亡率、ある感染症の処置下の危険性または不適切な抗生物質の使用に関する懸念のために、医師は血液培養を大量にオーダーし、血液培養を行った直後、患者に経験的抗生物質を処方する傾向にある。それゆえに、敗血症の疑いのある患者には、一般に血液培養が行われて間もなく、何らかの培養またはさらなる検査結果を受け取る前に、経験的抗生物質が処方される。使用する経験的抗生物質の選択は、感染部位(例えば呼吸器、皮膚、泌尿器、消化器など)、感染が院内か市中か、病原体の疫学、院内微生物耐性パターン、患者が抗生物質を服用したことがあるかまたは服用中か、患者アレルギーおよび患者併存症および既知抗生物質毒性のような因子による。経験的抗生物質の選択に対する医師へのガイダンスは、しばしば病院出版物、健康維持機構(ＨＭＯｓ)、専門家集団および科学論文を通して入手可能である(例としてhttp://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/antimicrobial-guidelines/; http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/; Huttner B, Jones M, Huttner A, Rubin M, Samore MH (2013) Antibiotic prescription practices for pneumonia, skin and soft tissue infections and urinary tract infections throughout the US Veterans Affairs system. J Antimicrob Chemother 68: 2393-2399. doi:10.1093/jac/dkt171; Snydman DR (2012) Empiric antibiotic selection strategies for healthcare-associated pneumonia, intra-abdominal infections, and catheter-associated bacteremia. J Hosp Med 7 Suppl 1: S2-S12. doi:10.1002/jhm.980; Maxwell DJ, Easton KL, Brien J-AE, Kaye KI (2005) Antibiotic guidelines in NSW hospitals. Aust Health Rev 29: 416-421参照)。しかしながら、微生物の抗生物質耐性獲得により、微生物学試験の目的および意図は、狭域性抗生物質の適切な使用に対する証拠およびガイダンスの提供と、続く経験的広域スペクトル抗生物質の使用の減少である。それゆえに、好ましくは、生物を増殖する必要性なしに、狭域性抗生物質の適切な使用に対するガイダンスを適時提供できる検査が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Weisburg WG, et al., (1991) J Bacteriol. 173 (2): 697-703
【非特許文献２】Field K. Get al., (1988) Science 239(4841): 748-753
【非特許文献３】Gehron, M. J. et al. (1984) J. Microbiol. Methods 2, 165-176
【非特許文献４】Claesson, M. J. et al. (2010) Nucl Acids Res 38(22), e200
【非特許文献５】Bailey, S. R., et al. (2003). Appl. Environ. Microbiol. 69, 2087-2093
【非特許文献６】Bispo, P. J. M., et al., (2011) Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 873-881
【非特許文献７】Klaschik, S. et al. (2002) Journal of Clinical Microbiology 40, 4304-4307
【非特許文献８】Shigemura, K. et al. (2005) Clin Exp Med 4, 196-201 (2005)
【非特許文献９】Carroll, N. M. et al. (2005) Journal of Clinical Microbiology 38, 1753-1757
【非特許文献１０】Zhao X et al., A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. PNAS, 101(42): 15027-15032. 2004
【非特許文献１１】Claesson, M. J. et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucl Acids Res 38(22), e200 (2010)
【非特許文献１２】Levy et al., (2003) Critical Care Medicine 31: 1250-1256
【非特許文献１３】Reinhart et al., (2012) Clinical Microbiology Reviews 25(4): 609-634
【非特許文献１４】Rangel-Frausto et al. (1995) JAMA 273(2): 117-123
【非特許文献１５】Jean-Louis Vincent et al., (2006) Critical Care Medicine 34: 344-353; Lamy et al., (2002) Clinical Infectious Diseases 35: 842-850
【非特許文献１６】Coburn et al. (2012) JAMA 308, 502-511
【非特許文献１７】Bauer and Reinhart (2010) International Journal of Medical Microbiology 300: 411-413
【非特許文献１８】Uwe Lodes et al. (2012) Langenbeck's Archives of Surgery 397: 447-455; and Pasqualini et al., (2012) Journal of Clinical Microbiology 50: 1285-1288
【非特許文献１９】Kumar, A. et al. (2006) Critical Care Medicine 34, 1589-1596
【非特許文献２０】http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/antimicrobial-guidelines/
【非特許文献２１】http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/
【非特許文献２２】Huttner B, Jones M, Huttner A, Rubin M, Samore MH (2013) Antibiotic prescription practices for pneumonia, skin and soft tissue infections and urinary tract infections throughout the US Veterans Affairs system. J Antimicrob Chemother 68: 2393-2399. doi:10.1093/jac/dkt171
【非特許文献２３】Snydman DR (2012) Empiric antibiotic selection strategies for healthcare-associated pneumonia, intra-abdominal infections, and catheter-associated bacteremia. J Hosp Med 7 Suppl 1: S2-S12. doi:10.1002/jhm.980
【非特許文献２４】Maxwell DJ, Easton KL, Brien J-AE, Kaye KI (2005) Antibiotic guidelines in NSW hospitals. Aust Health Rev 29: 416-421
【発明の概要】
【００２２】
発明の要約
本発明は、細菌および真菌のｒＲＮＡ遺伝子内の１個以上の一塩基多型がグラム陽性菌、グラム陰性菌または真菌に独特であり、ある場合特定の菌種または菌種群に独特であるとの決定に基づく。この決定に基づき、本発明者らは、サンプル中の細菌および／または真菌の存在または非存在の同定、細菌と真菌の識別、細菌のグラム陽性またはグラム陰性としての同定、細菌の特定の病原体群のメンバーとしての同定、細菌の菌種の同定または数種の可能性のある菌種の一つとしての細菌の同定および／または真菌の菌種の同定のために、これらの識別に役立つＳＮＰｓを利用した、種々の方法およびキットを開発している。特定の場合において、本方法およびキットはまた、サンプル中の微生物の定量化を促進する。
【００２３】
本発明の方法およびキットのいくつかは、あらゆるサンプル中の細菌または真菌の存在の決定、識別および／または同定のために使用できるが、ある態様において、本発明の方法およびキットは、哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの生体サンプルのような生体サンプル中の細菌または真菌の存在の決定、識別および／または同定のために特に有用である。さらに具体的に、本方法およびキットは、ＳＩＲＳを有する対象からの血液を分析し、ＳＩＲＳが感染性起源であるか否か、すなわち対象が敗血症を有するか否かまたはＳＩＲＳが感染陰性であるか否かを決定し、または対象が実際に敗血症を有するか否かを決定するために敗血症を有することが疑われる対象からの血液を分析するのに適する。対象が細菌または真菌感染が原因の敗血症を有するとき、本発明の方法およびキットは、血液に存在する細菌がグラム陽性またはグラム陰性かを決定し、細菌を、例えば好気性または嫌気性としてまたは主要抗生物質処置群のメンバーとして分類または大別し、細菌の菌種を同定しまたは数種の可能性のある菌種の一つとして細菌を同定し、そして／または対象の真菌の菌種を同定するために使用できる。さらに、感染の重症度を、血液中の細菌または真菌の数で測定して、また決定できる。その結果、本発明の方法およびキットは、対象を入院させるか否か、もしあれば、どのような治療方針が必要であるかに関して医師のガイドとして使用できる。本発明の方法およびキットはまた、抗生物質耐性、微生物病原性を決定するために、そして必要であれば、細菌菌種の特定のために、さらなる検査を実施すべきであるかに関しても医師のガイドとして使用できる。本発明の方法を実施できる速さのために、対象が初めて医師により診察されて、数日ではなく数時間以内に、これらの決定をなし得る。それゆえに、本発明の方法およびキットは、先行技術の方法と関連付けるための不要な入院、不要な抗生物質投与および／または無効なまたは不適切な抗生物質の投与を減らすことができ、適切かつ有効な処置レジメンの迅速な実行を促進する。
【００２４】
一つの面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の細菌のグラム呈色(Gram status)を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置であり、ここで、３９６位にＣがあり、３９８位にＴ、ＡまたはＣがあるときは、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＡ、ＴまたはＧがあり、３９８位にＣがあるときは、細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法を提供する。
【００２５】
ある態様において、細菌はアシネトバクター属(Acinetobacter spp.)；アクチノバチルス属(Actinobaccillus spp.)；アクチノマヅラ属(Actinomadura spp.)；アクチノマイセス属(Actinomyces spp.)；アクチノプラーネス属(Actinoplanes spp.)；エロモナス属(Aeromonas spp.)；アグロバクテリウム属(Agrobacterium spp.)；アリスティペス属(Alistipes spp.)；アナエロコッカス属(Anaerococcus spp.)；アルスロバクター属(Arthrobacter spp.)；バチルス属(Bacillus spp.)；ブルセラ属(Brucella spp.)；ブレイジア属(Bulleidia spp.)；バークホルデリア属(Burkholderia spp.)；カルジオバクテリウム属(Cardiobacterium spp.)；シトロバクター属(Citrobacter spp.)；クロストリジウム属(Clostridium spp.)；コリネバクテリウム属(Corynebacterium spp.)；デルマトフィルス属(Dermatophilus spp.)；ドレア属(Dorea spp.)；エドワージエラ属(Edwardsiella spp.)；エンテロバクター属(Enterobacter spp.)；エンテロコッカス属；エリシペロスリクス属(Erysipelothrix spp.)；エシェリキア属(Escherichia spp.)；ユーバクテリウム属(Eubacterium spp.)；フィーカリバクテリウム属(Faecalibacterium spp.)；フィリファクター属(Filifactor spp.)；フィネゴルディア属(Finegoldia spp.)；フラボバクテリウム属(Flavobacterium spp.)；ガリコラ属(Gallicola spp.)；ヘモフィルス属(Haemophilus spp.)；ヘルココッカス属(Helcococcus spp.)；ホールディマニア属(Holdemania spp.)；ハイフォミクロビウム属(Hyphomicrobium spp.)；クレブシエラ属；ラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)；レジオネラ属(Legionella spp.)；リステリア属(Listeria spp.)；メチロバクテリウム属(Methylobacterium spp.)；ミクロコッカス属(Micrococcus spp.)；ミクロモノスポラ属(Micromonospora spp.)；モビルンカス属(Mobiluncus spp.)；モラクセラ属(Moraxella spp.)；モルガネラ属(Morganella spp.)；マイコバクテリウム属(Mycobacterium spp.)；ナイセリア属(Neisseria spp.)；ノカルジア属(Nocardia spp.)；パエニバチルス属(Paenibacillus spp.)；パラバクテロイデス属(Parabacteroides spp.)；パスツレラ属(Pasteurella spp.)；ペプトニフィラス属(Peptoniphilus spp.)；ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus spp.)；プラノコッカス属(Planococcus spp.)；プラノミクロビウム属(Planomicrobium spp.)；プレジオモナス属(Plesiomonas spp.)；ポルフィロモナス属(Porphyromonas spp.)；プレボテラ属(Prevotella spp.)；プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)；プロテウス属(Proteus spp.)；プロビデンシア属(Providentia spp.)；シュードモナス属(Pseudomonas spp.)；ラルストニア属(Ralstonia spp.)；ロドコッカス属(Rhodococcus spp.)；ロゼブリア属(Roseburia spp.)；ルミノコッカス属(Ruminococcus spp.)；サルモネラ属(Salmonella spp.)；セディメンチバクター属(Sedimentibacter spp.)；セラチア属(Serratia spp.)；シゲラ属(Shigella spp.)；ソロバクテリウム属(Solobacterium spp.)；スフィンゴモナス属(Sphingomonas spp.)；スポラナエロバクター属(Sporanaerobacter spp.)；スダフィロコッカス属；ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas spp.)；ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)；ストレプトマイセス属(Streptomyces spp.)；ティシエレラ属(Tissierella spp.)；ビブリオ属(Vibrio spp.)；およびエルシニア属(Yersinia spp.)から選択される。他の態様において、細菌は細菌番号１〜１４３０から選択される。具体例において、細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択されるような、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌である。
【００２６】
本発明のさらなる面は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、３９６位にＣが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＧが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法に関する。ある態様において、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される。
【００２７】
他の面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、３９６位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＧ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法を提供する。ある態様において、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガ���ー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される。
【００２８】
本方法はまた細菌を同定するかまたは細菌を細菌群の一つであると同定することも含み得て、ここで、３９６位にＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobact jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示しまたは３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す。
【００２９】
一つの面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の数群の一つとして分類する方法であって、ここで、ＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、ここで、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき細菌はグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ５病原体ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６病原体であると決定されまたは３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ７病原体ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)であると決定される、方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置および配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９９位、４００位および４０１位または２７８位、２８６位および６４８位に対応する位置での複数一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類する方法であって、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を評価したとき、細菌を哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の７群に分類し、ここで、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４病原体であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ５病原体ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)であると決定され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６病原体であると決定されまたは３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ７病原体ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)であると決定され；そして
２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位を評価するとき、細菌はグラム陽性またはグラム陰性に分類され、ここで、３９６位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＧ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される、方法も提供する。
【００３１】
ある態様において、細菌がグループ１細菌であると決定されたならば、本発明の方法は、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析する方法を含んでよく、ここで、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されるグループ１ａ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)から選択されるグループ１ｂ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｃ細菌ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinali)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡがあるとき、細菌はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)から選択されるグループ１ｄ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｅ細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)およびスタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)から選択されるグループ１ｆ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴがあるとき、細菌はグループ１ｇ細菌ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であると決定され、９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ��ｈ細菌ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｉ細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｊ細菌エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグループ１ｋ細菌であると決定され、そして４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、細菌はグループ１ｌ細菌ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であると決定される。
【００３２】
細菌がグループ２細菌であると決定されたならば、本方法は、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析する方法を含んでよく、ここで、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ａ細菌コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diptheriae)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグループ２ｂ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)およびストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)から選択されるグループ２ｃ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ２ｄ細菌レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｅ細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)およびコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)から選択されるグループ２ｆ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ２ｇ細菌モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２ｈ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)およびノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)から選択されるグループ２ｉ細菌であると決定され、そして４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はグループ２ｊ細菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であると決定される。
【００３３】
細菌がグループ３細菌であると決定された場合、本方法は、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析する方法を含んでよく、ここで、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグループ３ａ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＡ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catharrallis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)から選択されるグループ３ｂ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)およびナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)から選択されるグループ３ｃ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＡがあるとき、細菌はエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択されるグループ３ｄ細菌であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｅ細菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、ＧおよびＣが存在するとき、細菌はグループ３ｆ細菌ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であると決定され、そして４９０位、４９１位、４９６位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、ＴおよびＡがあるとき、細菌はグループ３ｇ細菌フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)であると決定される。
【００３４】
細菌がグループ４細菌であると決定されたならば、本方法は、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析する方法を含んでよく、ここで、４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＡ、Ｃ、ＧおよびＣがあるとき、細菌はグループ４ａ細菌レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であると決定され、４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ａ、ＴおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｂ細菌バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であると決定され、そして４９０位、４９１位、４９６位および４９９位にそれぞれＧ、Ｃ、ＧおよびＧがあるとき、細菌はグループ４ｃ細菌カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であると決定される。
【００３５】
細菌がグループ６細菌であると決定されたならば、本方法は、さらに、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９６位に対応する位置のＳＮＰｓについて核酸を分析する方法を含んでよく、ここで、４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＣ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ａ細菌プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であると決定され、４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＡおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であると決定され、４９０位、４９１位および４９６位にそれぞれＴ、ＡおよびＴがあるとき、細菌はグループ６ｃ細菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であると決定され、そして４９０位、４９１位および４９６位にＴ、ＴおよびＣがあるとき、細菌はグループ６ｂ細菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であると決定される。
【００３６】
ある態様において、本発明の方法は、さらに、１種以上の抗生物質に対して細菌が耐性であるか否かを決定することを含む。
【００３７】
一つの態様において、上におよびここに記載する方法は、さらに、サンプル中のw452w3aq34t5yghusの存在または不在について決定するためにサンプルを分析することを含み、このさらなる分析は配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置での５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の一塩基多型(ＳＮＰ)について核酸の分析を含み、ここで、ＳＮＰはサンプル中の真菌の存在の指標であり、ここで、ＳＮＰは１４２位のＣ；１４４位のＡ；１４６位のＡ；１４７位のＡ；１４８位のＣ；１５４位のＴ；１５７位のＴ；１６４位のＣまたはＧ；１６７位のＡ；１８５位のＧ；１８７位のＡ；１８８位のＡ；１９４位のＴ；１９７位のＧ；２１３位のＡ；２１５位のＴ；２１６位のＴ；２１９位のＧ；２２３位のＡ；２３１位のＧまたはＡ；２３２位のＴ；２３６位のＴ；２４５位のＣまたはＡ；２５１位のＣ；および２５６位のＴから選択される。
【００３８】
本方法は、さらに、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の存在および正体を決定するためにサンプルを分析することを含んでよく、このさらなる分析は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の少なくとも４個のＳＮＰｓについての核酸の分析を含み、ここで、少なくとも４個のＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置のもの、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置のものおよび配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置のいずれか２箇所のものを含み、哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択され、病原体の存在および正体は次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき決定する。
【表１】
2016520314.tif 000002
【００３９】
ある態様において、少なくとも４個のＳＮＰｓは、配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の１６４位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置である。他の態様において、少なくとも４個のＳＮＰｓは、配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の２２３位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２４位または２５９位に対応する位置である。
【００４０】
ある態様において、本発明の方法は、さらに、サンプル中の細菌数および／または真菌細胞数の決定を含む。具体例において、サンプルは、全身性炎症反応症候(ＳＩＲＳ)を呈するまたは敗血症を有する疑いのある哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの、血液サンプルのような生体サンプルである。本発明の方法のある態様において、核酸を分析前にサンプルから抽出する。さらなる態様において、分析は核酸の増幅を含む。ある例において、分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う。
【００４１】
本発明のさらなる面は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける真菌の存在または不在を決定する方法であって、このＳＮＰはサンプル中の真菌の存在の指標であり、ここで、ＳＮＰは１４２位のＣ；１４４位のＡ；１４６位のＡ；１４７位のＡ；１４８位のＣ；１５４位のＴ；１５７位のＴ；１６４位のＣまたはＧ；１６７位のＡ；１８５位のＧ；１８７位のＡ；１８８位のＡ；１９４位のＴ；１９７位のＧ；２１３位のＡ；２１５位のＴ；２１６位のＴ；２１９位のＧ；２２３位のＡ；２３１位のＧまたはＡ；２３２位のＴ；２３６位のＴ；２４５位のＣまたはＡ；２５１位のＣ；および２５６位のＴから選択される、方法にも関する。ある態様において、サンプルは土壌、食品、水、表面スワブおよび対象からの生体サンプルから選択される。特定の態様において、生体サンプルは血液、組織、痰、洗浄液(lavage fluid)、糞便、尿および唾液から選択される。
【００４２】
本方法は、さらにサンプル中の真菌細胞数の決定を含み得る。具体例において、核酸を分析前にサンプルから抽出する。ある態様において、分析は核酸の増幅を含む。さらなる態様において、分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う。
【００４３】
本発明はまた、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも４個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法であって、ここで、少なくとも４個のＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置の任意の２箇所であり、哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択され、病原体の正体は次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき決定する、方法も提供する。
【表２】
2016520314.tif 000003
【００４４】
具体例において、少なくとも４個のＳＮＰｓは、配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の１６４位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する位置である。他の例において、少なくとも４個のＳＮＰｓは、配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置、配列番号２の２２３位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２４位または２５９位に対応する位置である。
【００４５】
本発明はまた、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を同定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＣの存在が、サンプル中の真菌病原体がカンジダ属である指標である、方法も提供する。好適には、カンジダ属はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)から選択される。
【００４６】
本発明はまた、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中のカンジダ属の存在または不在を決定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＴの存在がサンプル中のカンジダ属の存在の指標であり、１６３位のＴおよび１６４位のＣの不在が、サンプル中のカンジダ属の不在の指標である、方法も提供する。好適には、カンジダ属はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)から選択される。
【００４７】
ある態様において、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法は、さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における一塩基多型(ＳＮＰ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色の決定を含み、ここで、ＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、ここで、３９６位にＣが存在するとき細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＧが存在するとき細菌はグラム陽性菌であると決定される。ある例において、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される。
【００４８】
さらなる態様において、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法は、さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することを含む、サンプルにおける哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色の決定を含み、ここで、ＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、３９６位のＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧがあるとき、細菌はグラム陰性菌であると決定され、そして３９６位にＧ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、細菌はグラム陽性菌であると決定される。ある例において、細菌はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される。
【００４９】
本方法は、さらに、細菌を同定するかまたは細菌を細菌群の一つであると同定することを含んでよく、ここで、３９６位のＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す。
【００５０】
本方法はまた、さらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における複数一塩基多型(ＳＮＰｓ)についてサンプルからの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の７群の一つとしてサンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類することを含んでよく、ここで、ＳＮＰｓが、上におよびここに記載するとおり、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置である。さらに、細菌のグループ１ａ〜ｌ、２ａ〜ｊ、３ａ〜ｇ、４ａ〜ｃおよび６ａ〜ｄへの細分を、上におよびここに記載するとおり実施できる。
【００５１】
ある例において、サンプル中の真菌細胞数および／または細菌数も決定する。サンプルは、例えば、例えば血液、組織、痰、洗浄液、糞便、尿または唾液のような哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの生体サンプルであり得る。具体的態様において、生体サンプルは血液である。ある態様において、核酸を分析前にサンプルから抽出する。さらなる態様において、分析は核酸の増幅を含む。ある例において、分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う。
【００５２】
本発明はまた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象における敗血症の診断方法も提供し、ここで、ＳＮＰの存在が敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、そしてグラム陰性菌感染が原因の敗血症は、３９６位にＣがあるとき診断され、グラム陽性菌感染が原因の敗血症は３９６位にＧがあるとき診断され、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される。本方法のある態様において、細菌感染は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される細菌による感染である。
【００５３】
他の面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、３９６位のＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧがあるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され；そして３９６位にＧ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され；そして、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される、方法を提供する。
【００５４】
一例において、細菌感染は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)か���選択される細菌による感染である。
【００５５】
ある態様において、本方法は、さらに、敗血症がグラム陽性菌またはグラム陰性菌が原因であると同定されたとき、細菌の同定または細菌の群の一つであるとしての細菌の同定を含み、ここで、３９６位のＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディ��ガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す。
【００５６】
他の面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰの存在が敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置であり、そして３９６位にＣがあるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして３９６位にＧがあるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され、そして５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される、方法を提供する。
【表３】
2016520314.tif 000004
【００５７】
ある態様において、細菌感染は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)から選択される細菌による感染である。
【００５８】
また提供されるのは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位に対応する位置であり、ここで、３９６位のＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧがあるとき、グラム陰性菌感染が原因の敗血症と診断され；そして３９６位にＧ；３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、グラム陽性菌感染が原因の敗血症と診断され；そして５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される。
【表４】
2016520314.tif 000005
【００５９】
具体的態様において、細菌感染は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択される細菌による感染である。
【００６０】
ある例において、本方法は、さらに、敗血症がグラム陽性菌またはグラム陰性菌が原因であると同定されたとき、細菌の同定または細菌の群の一つであるとしての細菌の同定を含み、ここで、３９６位のＣは、細菌がプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)およびバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴは、細菌がカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびクラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)から選択されるグラム陰性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧは、細菌がグラム陰性菌ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)およびベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)であることを示し、３９６位にＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣは、細菌がグラム陽性菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＴおよび６４８位にＴは、細菌がグラム陽性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡは、細菌がグラム陽性菌ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディス��ラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)およびストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)であることを示し、または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡは、細菌がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)から選択されるグラム陽性菌であることを示し、３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)またはスタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominus)であることを示し、そして３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡは、細菌がグラム陽性菌スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)であることを示す。
【００６１】
本発明はまた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、そして、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるときグラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１細菌が原因の敗血症であると診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)���ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣが存在するとき、グラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、ループ５細菌ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、グラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、グループ７細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)が原因の敗血症と診断され、そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰは配列番号２に示す５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位または２５６位に対応する位置であり、真菌感染が原因の敗血症は、１４２位にＣ；１４４位にＡ；１４６位にＡ；１４７位にＡ；１４８位にＣ；１５４位にＴ；１５７位にＴ；１６４位にＣまたはＧ；１６７位にＡ；１８５位にＧ；１８７位にＡ；１８８位にＡ；１９４位にＴ；１９７位にＧ；２１３位にＡ；２１５位にＴ；２１６位にＴ；２１９位にＧ；２２３位にＡ；２３１位にＧまたはＡ；２３２位にＴ；２３６位にＴ；２４５位にＣまたはＡ；２５１位にＣ；または２５６位にＴがあるときに診断される、方法を提供する。
【００６２】
他の面において、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓおよび５.８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰについて対象の血液からの核酸を分析することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)対象の診断方法における敗血症の診断方法であって、ここで、ＳＮＰ(ｓ)の存在は敗血症の指標であり、ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓが、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置であり、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはグラム陰性菌種ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグループ１細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、グラム陽性菌種コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)またはグラム陰性菌種レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)から選択されるグループ２細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣがあるとき、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)から選択されるグラム陰性好気性菌から選択されるグループ３細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣが存在するとき、グラム陰性好気性菌種レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)から選択されるグループ４細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣがあるとき、ループ５細菌ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡがあるとき、グラム陰性嫌気性菌種プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)から選択されるグループ６細菌が原因の敗血症と診断され、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位にそれぞれＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣがあるとき、グループ７細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)が原因の敗血症と診断され；そして
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓは配列番号２の２５４位に対応する位置、配列番号２の１６０位または２５５位に対応する位置および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する任意の二箇所であり、ここで、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から選択される真菌による感染が原因の敗血症は、次の表に示すＳＮＰｓの存在に基づき診断される、方法を提供する。
【表５】
2016520314.tif 000006
【００６３】
本方法のある態様において、敗血症がグループ１、２、３、４または６の細菌が原因であると決定されたならば、さらに細菌のグループ１ａ−ｌ、２ａ−ｊ、３ａ−ｇ、４ａ−ｃおよび６ａ−ｄへの細分を、上におよびここに記載するとおり実施できる。
【００６４】
ある態様において、サンプル中の細菌数および／または真菌数も決定する。一例において、核酸を分析前にサンプルから抽出する。さらなる例において、分析は核酸の増幅を含む。一つの態様において、分析を配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイまたはこれらの任意の組み合わせを使用して行う。さらなる態様において、診断方法は、さらに、抗真菌剤または抗生物質のような治療剤を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】グラム陰性、グラム陽性または真菌性の微生物を添加した全血の定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ(TaqMan(登録商標)アッセイ)の結果を示す。
【００６６】
【表６】
2016520314.tif 000007
【表７】
2016520314.tif 000008
【００６７】
【表８】
2016520314.tif 000009
【表９】
2016520314.tif 000010
【００６８】
【表１０】
2016520314.tif 000011
【表１１】
2016520314.tif 000012
【００６９】
【表１２】
2016520314.tif 000013
【００７０】
【表１３】
2016520314.tif 000014
【発明を実施するための形態】
【００７１】
発明の詳細な記載
１. 定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を有する。ここに記載しているものに類似したまたは同等なあらゆる方法および材料を、本発明の実施および試験に際して使用できるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的で、次の用語を下に定義する。
【００７２】
単数表現は、ここでは、１個または１個を超える(すなわち少なくとも１個)の文法上対象となるものをいうために使用する。一例として、“要素”は１個の要素または１個を超える要素を意味する。
【００７３】
“増幅産物”は、核酸増幅技術により産生された核酸産物をいう。
【００７４】
ここで使用する用語“生体サンプル”は、患者から抽出され、未処理であり、処理されており、希釈され、または濃縮されていてもよい試料をいう。好適には、生体サンプルは、毛髪、皮膚、爪、組織または唾液もしくは血液のような体液を含むが、これらに限定されず、患者の体のあらゆる部分から選択される。
【００７５】
本明細書をとおして、文脈上他の解釈が必要ではない限り、用語“含む”、“含み”および“包含”は、記載した工程もしくは要素または複数工程もしくは要素群の包含を意図するが、あらゆる他の工程もしくは要素または複数の工程もしくは要素群を除外しない。
【００７６】
ここで使用する“対応する”核酸位置またはヌクレオチドは、２個以上の核酸分子の整列させた座位で生じる位置またはヌクレオチドをいう。関連するまたは変異体ポリヌクレオチドを、当業者に知られるあらゆる方法により整列させ得る。このような方法は、典型的にマッチを最大にし、手動整列および利用可能な多数の整列プログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＮ)および当業者に知られるその他の整列方法の使用を含む。ポリヌクレオチド配列の整列により、当業者は、同一ヌクレオチドをガイドとして使用して、対応するヌクレオチドまたは位置を同定できる。例えば、エシェリキア・コリ(E. coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡ(配列番号１に示す)をコードする遺伝子と、他種の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の整列により、当業者は、保存ヌクレオチドをガイドとして使用して、対応する位置およびヌクレオチドを同定できる。
【００７７】
“遺伝子”は、ゲノム上の特定座位を占める遺伝単位を意味し、転写および／または翻訳制御配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列(すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列)からなる。
【００７８】
“相同性”は、同一であるまたは保存的置換を構成する、核酸またはアミノ酸のパーセンテージ数値をいう。相同性は、引用により本明細書に包含させるＧＡＰ(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)のような配列比較プログラムを使用して決定し得る。この方法で、ここに記載するものに類似するまたは実質的に異なる長さの配列を、整列化へのギャップの挿入により比較でき、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定される。
【００７９】
“ハイブリダイゼーション”は、ここでは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生じるための、相補的ヌクレオチド配列の対形成を言い表すために使用する。相補的塩基配列は、塩基対形成規則で繋がっている配列である。ＤＮＡにおいては、ＡはＴと対形成し、ＣはＧと対形成する。ＲＮＡにおいては、ＵはＡと対形成し、ＣはＧと対形成する。この点に関し、ここで使用する用語“マッチ”および“ミスマッチ”は、相補的核酸鎖における対ヌクレオチドのハイブリダイゼーション能をいう。マッチしたヌクレオチドは、上記古典的Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対のように、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしない、ヌクレオチドの他の組み合わせである。
【００８０】
“単離”は、通常その天然状態では付随している成分が実質的にまたは本質的に除かれた物質を意味する。
【００８１】
ここで使用する用語“オリゴヌクレオチド”は、ホスホジエステル結合(またはその関連する構造変異体または合成類似体)を介して結合した複数のヌクレオチド残基(デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその関連する構造変異体または合成類似体)からなるポリマーをいう。それゆえに、用語“オリゴヌクレオチド”は、典型的にヌクレオチド残基およびそれらの間の結合が天然に起こるヌクレオチドポリマーをいうが、本用語はまたその範囲内に、ペプチド核酸類(ＰＮＡｓ)、ホスホロアミデート類、ホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボ核酸類などを含み、これらに限定されない、多様な類似体を含むことが理解される。分子の正確なサイズは、特定の利用目的により変わり得る。オリゴヌクレオチドは、典型的に長さが短く、一般に約１０〜３０ヌクレオチド残基であるが、用語“ポリヌクレオチド”または“核酸”は大きなオリゴヌクレオチドについて典型的に使用されており、本用語はまたあらゆる長さの分子を意味し得る。
【００８２】
用語“患者”および“対象”は交換可能に使用され、ヒトまたは他の哺乳動物の患者および対象をいい、本発明の方法を使用した試験または処置が望まれる、任意の個体を含む。しかしながら、“患者”は、症状の存在を含意しないと解釈される。本発明の範囲内に入る適当な哺乳動物は、霊長類、家畜(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、実験動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、コンパニオンアニマル(例えば、ネコ、イヌ)および捕獲された野生動物(例えば、キツネ、シカ、ディンゴ)を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
ここで使用する用語“多型性”は、他の個体の相同領域におけるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、ある領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の差異、特に、同種の個体間で異なるある領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の差異の存在をいう。多型性は、一般には対照配列と比較して定義する。多型性は、単ヌクレオチド差異、配列中の１個を超えるヌクレオチドの差異または単一もしくは複数ヌクレオチドの挿入、逆位および欠失；ならびに1個のアミノ酸差異、配列中の１個を超えるアミノ酸の差異および単一または複数アミノ酸挿入、逆位および欠失を含む。“多型性部位”は、変化が生じる部位である。核酸配列中に多型性が存在し、多型性部位の特定の１個または複数の塩基の存在について論じるとき、本発明はその部位の相補鎖上の相補的１個または複数の塩基を包含することが理解されるべきである。
【００８４】
ここで使用する用語“ポリヌクレオチド”または“核酸”は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡをいう。本用語は、典型的に３０を超えるヌクレオチド残基長のオリゴヌクレオチドをいう。
【００８５】
“プライマー”は、ＤＮＡの鎖と対形成したとき、適当な重合剤の存在下で、プライマー伸長産物の合成を開始できる、オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは増幅の最大効率のために一本鎖であるが、代替的に二本鎖でもあり得る。プライマーは、重合剤存在下で、伸長産物の合成を誘発するのに十分長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いるべき温度、鋳型反応条件、他の試薬およびプライマーの起源を含む、多くの因子による。例えば、標的配列の複雑さによって、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に１５〜３５個またはそれ以上のヌクレオチド残基を含むが、より少ないヌクレオチド残基でもよい。プライマーは、約２００ヌクレオチド残基〜数キロベースまたはそれ以上のような大ポリヌクレオチドであり得る。プライマーは、ハイブリダイズすることが望まれ、合成開始部位として働く鋳型上の配列に“実質的に相補的”であるように選択し得る。“実質的に相補的”により、プライマーが、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのに十分相補的であることを意味する。ある態様において、プライマーは、ハイブリダイズをするように設計された鋳型とのミスマッチを含まないが、これは必須ではない。例えば、非相補的ヌクレオチド残基はプライマーの５’末端に結合でき、プライマー配列の残りは、鋳型と相補的である。あるいは、プライマー配列がハイブリダイズする鋳型の配列と十分に相補性であり、それゆえに、プライマーの伸長産物の合成のための鋳型を形成する限り、非相補的ヌクレオチド残基または非相補的ヌクレオチド残基の区間を、プライマーに分散させ得る。
【００８６】
“プローブ”は、他の分子の特異的配列または部分配列または他の部分に結合する分子をいう。特に断らない限り、用語“プローブ”は、典型的に、しばしば“標的ポリヌクレオチド”と呼ばれる他のポリヌクレオチドに、相補的塩基対形成を介して結合する、ポリヌクレオチドプローブをいう。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって、プローブと完全配列相補性を欠く標的ポリヌクレオチドと結合できる。プローブは直接的または間接的に標識できる。
【００８７】
用語“敗血症”は、臨床医学における通常の意味に従いここで使用し、例えば、細菌または真菌感染のような、全身性および／または血液媒介性感染を含む。
【００８８】
用語“敗血症関連細菌”は、対象における敗血症の原因となり得るとして同定されている、または敗血症を有する対象の血液において同定されている細菌をいう。“哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌”は、それゆえに、哺乳動物(例えば、ヒト)対象における敗血症の原因となり得るとして同定されている、または敗血症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)対象の血液において同定されている細菌をいう。哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌の例は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、クラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステ���イデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)を含む。
【００８９】
用語“敗血症関連真菌”は、対象における敗血症の原因となり得るとして同定されている、または敗血症を有する対象の血液において同定されている真菌(酵母を含む)をいう。“哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連真菌”は、それゆえに、哺乳動物(例えば、ヒト)対象における敗血症の原因となり得るとして同定されている、または敗血症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)対象の血液において同定されている真菌をいう。哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連真菌の例は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を含む。
【００９０】
ここで使用する“敗血症”は、推定感染過程または確認感染過程を伴うＳＩＲＳとして定義される。感染過程の確認は、微生物学的培養または感染病原体の単離により決定できる。免疫学的視点からは、敗血症は、微生物または全身的感染に対する全身的応答と理解し得る。
【００９１】
ここで使用する用語“配列同一性”は、比較領域全体で、ヌクレオチド毎基準でまたはアミノ酸毎基準で配列が同一である程度である。それゆえに、“配列同一性のパーセンテージ”は、２個の最適に整列した配列の、比較領域全体の比較により計算し、同一核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ)が両配列に存在する位置の数を決定して、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較領域中の位置の総数(すなわち、領域サイズ)で除し、結果に１００乗じて、配列同一性のパーセンテージを求める。
【００９２】
ここで使用する用語一塩基多型(ＳＮＰ)は、ゲノム配列中の一ヌクレオチド(Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ)が変わっている(例えば、置換、付加または欠失による)ときに生じる、ヌクレオチド配列多様性をいう。ＳＮＰｓは、原核微生物または真核微生物のゲノムのようなゲノムのコード(遺伝子)領域および非コード領域の両者で生じ得る。
【００９３】
ここで使用する“全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)”は、次の測定可能な臨床的特徴の２個以上を伴う、非特異的侵襲により生じる臨床的応答である。３８℃を超えるまたは３６℃未満の体温、９０回／分を超える心拍数、２０回／分を超える呼吸数、１２,０００／mm３を超えるまたは４,０００／mm３未満の白血球数(総白血球)または１０％を超える桿状核好中球パーセンテージ。免疫学的展望から、侵襲(例えば、大手術)または全身性炎症に対する全身性応答を表すものとしてみなし得る。それゆえに、ここで使用する“感染を伴わないＳＩＲＳ(ｉｎＳＩＲＳ)”は、同定可能な感染過程がない以外、上記の臨床的応答を含む。
【００９４】
ここで使用する用語“処置”、“処置する”などは、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることをいう。効果は、感染、異常またはその症状を完全にまたは一部予防する点で予防的であってよくおよび／または感染、異常および／または感染または状態に起因し得る悪影響を一部または完全に治癒させる点で治療的であってよい。ここで使用する“処置”は、哺乳動物(例えば、ヒト)における感染または異常のあらゆる処置を包含し、(ａ)感染または異常の素因があり得るが、またその診断がされていない対象において、感染または異常が生じるのを予防する；(ｂ)感染または異常を阻止する、すなわち、その進展を阻止する；および(ｃ)感染または異常を軽減する、すなわち、感染または状態の後退を生じさせる。
【００９５】
２. 本発明の多型性
本発明は、一部、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内(およびそれゆえに１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子内)のＳＮＰｓが、細菌をグラム陽性またはグラム陰性として分類するために使用できるとの決定に基づく。ＳＮＰｓの特定の組み合わせは、細菌のさらなる分類に、特に哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌病原体のさらなる分類または同定に使用できる。本発明はまた、一部、真核生物の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内(およびそれゆえに５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子内)の一ＳＮＰが、真菌細胞(酵母細胞を含む)を哺乳動物細胞と識別するために使用できるとの決定にも基づく。さらに、真核生物の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ内のＳＮＰｓの組み合わせが、最も一般的な哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の識別および同定に使用できることも決定されている。
【００９６】
２.１ １６Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを使用した細菌の分類
本発明は、サンプルにおける細菌のグラム呈色を決定する、すなわち細菌がグラム陽性またはグラム陰性であるかを決定する方法を提供する。ここに示すとおり、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子(およびそれゆえに１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子それ自体)の配列番号１に示すエシェリキア・コリ(E. coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応するヌクレオチド位置の多型性を、ほとんどの哺乳動物(例えば、ヒト)病原体(汚染赤血球および血小板製剤で見られる一般的な細菌、哺乳動物(例えば、ヒト)糞便サンプルに見られる最も一般的な細菌および敗血症の原因となる多くの病原体を含む)、最も一般的な土壌細菌および労働環境に見られる一般的な細菌を含む、細菌の大部分のグラム呈色の決定に使用できる。ある原核１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)における配列番号１の３９６位および３９８位に対応する位置は、配列番号１に示すエシェリキア・コリ(Escherichia coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子との整列により容易に同定可能である。ある例において、配列番号１のヌクレオチド５１８〜５３７に対応し、ほぼ７０００細菌種で全長にわたって一般的な高度に保存された配列を、整列を助けるために使用できる。これらの２個のＳＮＰｓを用いて大部分のグラム陽性原核生物およびグラム陰性原核生物を識別する一般的規則を表１に示す。
【表１４】
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【００９７】
それゆえに、本発明は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置での１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはそのＤＮＡコピー)についてサンプルからの核酸を分析することによる、サンプル中の細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、３９６位のＣおよび３９８位のＴ、ＡまたはＣは、サンプル中の細菌がグラム陰性菌であることを示し、そして３９６位にＡ、ＴまたはＧおよび３９８位にＣは細菌がグラム陽性菌であることを示す、方法を提供する。配列番号１に示すエシェリキア・コリ(E. coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置のＳＮＰｓを使用してグラム陽性またはグラム陰性として分類できる細菌は、例えば、アシネトバクター属；アクチノバチルス属；アクチノマヅラ属；アクチノマイセス属；アクチノプラーネス属；エロモナス属；アグロバクテリウム属；アリスティペス属；アナエロコッカス属；アルスロバクター属；バチルス属；ブルセラ属；ブレイジア属；バークホルデリア属；カルジオバクテリウム属；シトロバクター属；クロストリジウム属；コリネバクテリウム属；デルマトフィルス属；ドレア属；エドワージエラ属；エンテロバクター属；エンテロコッカス属；エリシペロスリクス属；エシェリキア属；ユーバクテリウム属；フィーカリバクテリウム属；フィリファクター属；フィネゴルディア属；フラボバクテリウム属；ガリコラ属；ヘモフィルス属；ヘルココッカス属；ホールディマニア属；ハイフォミクロビウム属；クレブシエラ属；ラクトバチルス属；レジオネラ属；リステリア属；メチロバクテリウム属；ミクロコッカス属；ミクロモノスポラ属；モビルンカス属；モラクセラ属；モルガネラ属；マイコバクテリウム属；ナイセリア属；ノカルジア属；パエニバチルス属；パラバクテロイデス属；パスツレラ属；ペプトニフィラス属；ペプトストレプトコッカス属；プラノコッカス属；プラノミクロビウム属；プレジオモナス属；ポルフィロモナス属；プレボテラ属；プロピオニバクテリウム属；プロテウス属；プロビデンシア属；シュードモナス属；ラルストニア属；ロドコッカス属；ロゼブリア属；ルミノコッカス属；サルモネラ属；セディメンチバクター属；セラチア属；シゲラ属；ソロバクテリウム属；スフィンゴモナス属；スポラナエロバクター属；スダフィロコッカス属；ステノトロホモナス属；ストレプトコッカス属；ストレプトマイセス属；ティシエレラ属；ビブリオ属；およびエルシニア属を含む。
【００９８】
３９６位および３９８位のＳＮＰｓを使用してグラム陽性またはグラム陰性として分類できる病原体の具体例は、表２に示すものを含むが、これらに限定されない。
【表１５】
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【表１６】
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【００９９】
【表１７】
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【表１８】
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【０１００】
【表１９】
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【表２０】
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【０１０１】
【表２１】
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【表２２】
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【０１０２】
【表２３】
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【表２４】
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【０１０３】
【表２５】
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【表２６】
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【０１０４】
【表２７】
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【表２８】
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【０１０５】
【表２９】
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【表３０】
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【０１０６】
【表３１】
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【表３２】
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【０１０７】
【表３３】
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【表３４】
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【０１０８】
【表３５】
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【表３６】
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【０１０９】
【表３７】
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【表３８】
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【０１１０】
【表３９】
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【表４０】
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【０１１１】
【表４１】
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【表４２】
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【０１１２】
【表４３】
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【表４４】
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【０１１３】
【表４５】
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【表４６】
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【０１１４】
【表４７】
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【表４８】
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【０１１５】
【表４９】
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【表５０】
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【０１１６】
【表５１】
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【０１１７】
２.２ １６Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを使用する哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症原因菌のさらなる分類
一般に哺乳動物(例えば、ヒト)における敗血症の原因となる細菌病原体は、グラム陽性菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)、バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)、ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびグラム陰性菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、フラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)を含む。これらの病原体を、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位に対応する位置での、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分析し、表３に示す規則を適用して、７群に分類できる。
【表５２】
2016520314.tif 000053
【０１１８】
それゆえに、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌がグループ１病原体、典型的にグラム陽性菌、例えばバチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニゥモニエ(Streptococcus pneumonia)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)またはペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)またはヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)およびベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)から選択されるグラム陰性菌であることを示す。
【０１１９】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＧ、Ｃ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌がグループ２病原体、例えばコリネバクテリウム・ジフセリエ(Corynebacterium diphtheria)、デルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、コリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)およびアクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)から選択されるグラム陽性菌またはレプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumonia)から選択されるグラム陰性菌であることを示す。
【０１２０】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＣ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌が、アクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)およびフラボバクテリウム・セティ(Flavobacterium ceti)を含む好気性グラム陰性菌であるグループ３病原体であることを示す。
【０１２１】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌が、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)およびカルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)を含む好気性グラム陰性菌であるグループ４病原体であることを示す。
【０１２２】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＣ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＣは、細菌が、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)のような好気性グラム陰性菌であるグループ５病原体であることを示す。
【０１２３】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＡは、細菌がプレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)またはプレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)のような嫌気性グラム陰性菌であるグループ６病原体であることを示す。
【０１２４】
３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位それぞれのＣ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣは、細菌がポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)のような嫌気性グラム陰性菌であるグループ７病原体であることを示す。
【０１２５】
グループ１に分類された病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分類し、表４に示す規則を適用して、さらに１２の下位群に分類でき、ここで、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位それぞれのＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＡは、細菌がグラム陽性菌であり、好気性かつ潜在的バンコマイシン耐性であり、病原体バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)を含むことを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧがあるとき、細菌がストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptoococcus pyogenes)を含むグラム陽性、好気性、β溶血性連鎖球菌種であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＡ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃは、細菌がグラム陽性好気性菌、ラクトバチルス・インテスティナリス(Lactobacillus intestinalis)であることを示し、Ａ、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＡは、細菌がヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)またはカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)のいずれかであるグラム陰性螺旋状好気性菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＡ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌がグラム陽性、嫌気性桿菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＡ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣは、細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)を含むオキサシリン耐性能を有するグラム陽性スタフィロコッカスであることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＧ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＴは、細菌がグラム陽性嫌気性桿菌、ユウバクテリウム・デスモランス(Eubacterium desmolans)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位���４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれにＧ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣは、細菌がグラム陰性嫌気性球菌、ベイヨネラ・ディスパー(Veillonella dispar)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌がグラム陽性嫌気性桿菌、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＣは、細菌がグラム陽性桿菌、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＧは、細菌がストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)から選択されるグラム陽性α溶血性球菌であることを示し、そして４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位それぞれにＴ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＣおよびＣは、細菌がグラム陽性、嫌気性球菌、ペプトストレプトコッカス・ストマティス(Peptostreptococcus stomatis)であることを示す。
【０１２６】
【表５３】
2016520314.tif 000054
【表５４】
2016520314.tif 000055
【０１２７】
グループ２に分類された病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９６位、４９９位および５０１位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分析し、表５に示す規則を提供することによりさらに９個の下位群に分類でき、ここで、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれのＡ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌がグラム陽性、抗酸桿菌、コリネバクテリウム・ジフセリエ(Cornebacterium diptheriae)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれにＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌がデルマトフィルス・コンゴレンシス(Dermatophilus congolensis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)およびロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)から選択されるグラム陽性球菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧは、細菌がストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)またはストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)のいずれかであるグラム陽性、抗酸桿菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、ＡおよびＣは、細菌がグラム陰性螺旋状細菌、レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interrogans)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌がグラム陽性、抗酸桿菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌がコリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)またはコリネバクテリウム・ウレアリティクム(Corynebacterium urealyticum)のいずれかであるグラム陽性、抗酸桿菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＧは、細菌がグラム陽性、嫌気性桿菌、モビルンカス・クルティシイ(Mobiluncus curtisii)であることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌はグラム陰性であり、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)またはクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)のいずれかであることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌はグラム陽性桿菌、一部抗酸であり、好気性ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroids)、ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasilensis)のいずれかであることを示し、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５０���位および５０１位にそれぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、ＧおよびＡは、細菌はグラム陽性桿菌、一部抗酸かつ好気性菌アクチノマイセス・マシリエンシス(Actinomyces massiliensis)であることを示す。
【０１２８】
【表５５】
2016520314.tif 000056
【０１２９】
グループ３に分類された病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および５０１位に対応する位置での１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分析し、表６に示す規則を提供することによりさらに７個の下位群に分類でき、ここで、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＡ、Ｃ、ＧおよびＡは、細菌がアクチノバチルス・ホミニス(Actinobacillus hominis)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、ヘモフィルス・デュクレイ(Hemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリチカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providentia alcalifaciens)およびビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)から選択されるグラム陰性球菌または球桿菌であること意味し、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位のＡ、Ｃ、ＧおよびＡは、細菌がモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)およびシュードモナス・エルジノーサ(Psuedomona aeruginosa)を含む拡張型ベータラクタマーゼ耐性能を有するグラム陰性菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＧ、Ａ、ＴおよびＡは、細菌がナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)またはナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)のいずれかであるグラム陰性双球菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＧ、Ｃ、ＧおよびＡは、細菌がエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)およびエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)から選択される拡張型ベータラクタマーゼ耐性能を有するグラム陰性菌であることを示し、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＧ、Ｃ、ＴおよびＡは、細菌が、拡張型ベータラクタマーゼ耐性能を有するグラム陰性球菌アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)であることを示し、４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＧ、Ｇ、ＧおよびＣは、細菌がブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)であることを示し、そして４９０位、４９１位、４９６位および５０１位それぞれのＴ、Ａ、ＴおよびＡは、細菌がフラボバクテリウム・セティ(Flavibacterium ceti)であることを示す。
【０１３０】
【表５６】
2016520314.tif 000057
【０１３１】
グループ４に分類された病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位、４９６位および４９９位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分析し、表７に示す規則を提供することによりさらに３個の下位群に分類でき、ここで、４９０位、４９１位、４９６位および４９９位それぞれのＡ、Ｃ、ＧおよびＣは、細菌がグラム陰性多形性細菌、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)であることを示し、４９０位、４９１位、４９６位および４９９位それぞれのＧ、Ａ、ＴおよびＧは、細菌がグラム陰性桿菌、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)であることを示し、そして４９０位、４９１位、４９６位および４９９位それぞれのＧ、Ｃ、ＧおよびＧは、細菌がグラム陰性桿菌、カルディオバクテリウム・バルバリューム(Cardiobacterium valvarum)であることを示す。
【表５７】
2016520314.tif 000058
【０１３２】
グループ５における病原体、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotropomonas maltophila)は、表３のもの以外のさらなるＳＮＰｓを用いずとも同定できる。
【０１３３】
グループ６に分類された病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４９０位、４９１位および４９２位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分類し、表８に示す規則を適用して、さらに４個の下位群に分類でき、ここで、４９０位、４９１位および４９２位それぞれのＣ、ＡおよびＴは、細菌がグラム陰性、嫌気性、桿菌、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)であることを示し、４９０位、４９１位および４９２位それぞれのＴ、ＡおよびＣは、細菌がグラム陰性、嫌気性、桿菌、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)であることを示し、４９０位、４９１位および４９２位のＴ、ＡおよびＴは、細菌がグラム陰性、嫌気性、桿菌バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)であることを示し、そして４９０位、４９１位および４９２位それぞれにおけるＴ、ＡおよびＣは、細菌がグラム陰性、嫌気性、桿菌プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であることを示す。
【表５８】
2016520314.tif 000059
【０１３４】
グループ７における病原体、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)は、表３のもの以外のさらなるＳＮＰｓを用いずとも同定できる。
【０１３５】
それゆえに、敗血症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)対象または敗血症を有することが疑われる哺乳動物(例えば、ヒト)対象、例えばＳＩＲＳを呈しているヒト対象からの血液サンプルのようなサンプルを、本発明の方法を使用して分析して、細菌が原因物質であるか否か(すなわちサンプル中の存在する細菌がいるかいないか)および細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるか、抗酸であるか抗酸でないか、好気性であるか、嫌気性であるかおよび／または主要な潜在的抗生物質耐性群の一部であるか否かを正確かつ迅速に決定できる。表３〜８の情報を使用して、細菌種の正体もまた、絞ることができるか、ある場合、確認できる。
【０１３６】
２.３ １６Ｓ  ｒＲＮＡにおける１個以上のＳＮＰｓを使用した一般に敗血症を起こす哺乳動物(例えば、ヒト)病原体の同定
哺乳動物(例えば、ヒト)において一般に敗血症を起こす細菌病原体は、グラム陽性菌スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、緑色連鎖球菌群(ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)およびグラム陰性菌エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)およびプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)を含む。これらの病原体は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)について核酸を分析し、表１に示す規則を適用することによりグラム陽性またはグラム陰性として分類でき、ここで、３９６位のＣおよび３９８位のＴ、ＡまたはＣは細菌がグラム陰性菌であることを示し、そして３９６位にＡ、ＴまたはＧおよび３９８位にＣは細菌がグラム陽性菌であることを示す。
【０１３７】
実際、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色は、配列番号１に示すエシェリキア・コリ(Escherichia coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(または１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)におけるわずか一ＳＮＰに基づき、決定できる。具体的に、配列番号１の３９６位に対応する位置のＣは、細菌がグラム陰性菌であることを示し、そしてＡ、ＴまたはＧは細菌がグラム陽性菌であることを示す。それゆえに、本発明は、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位に対応する位置の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(または１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはそのＤＮＡコピー)における一ＳＮＰについてサンプルからの核酸を分析することによる、サンプル中の細菌のグラム呈色を決定する方法であって、ここで、３９６位のＣは、サンプル中の細菌がグラム陰性菌であることを示し、そして３９６位にＡ、ＴまたはＧは細菌がグラム陽性菌であることを示す、方法を提供する。サンプル中の細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、緑色連鎖球菌群(ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテ��・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)またはプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)のような哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌であり得る。したがって、本発明は、敗血症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)対象または敗血症を有することが疑われる哺乳動物(例えば、ヒト)対象、例えばＳＩＲＳを呈する哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの血液サンプルのようなサンプル中の細菌を検出し、検出されれば、細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを決定する方法を提供する。
【０１３８】
哺乳動物(例えば、ヒト)において敗血症を起こし得る他の細菌は、上記のものより一般的ではないが、例えばグラム陰性菌サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)およびベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)；およびグラム陽性菌ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)を含む。これらの中で、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)およびベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)は上記規則に従わず、それゆえに、３９６位の一ＳＮＰまたは３９６位および３９８位のＳＮＰｓのみを使用してグラム陽性またはグラム陰性として分類できない。敗血症を同様に起こし得るこれらの細菌病原体をグラム陽性またはグラム陰性として正確に分類するために、さらに２７８位、２８６位および６４８位の３個のＳＮＰｓ(番号付けは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応する)を使用できる。それゆえに、３９６位、３９８位、２７８位、２８６位および６４８位の計５個のＳＮＰｓを使用して、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌病原体スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、緑色連鎖球菌群(ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコ���カス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・ソマリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)のグラム呈色を分類できる。
【０１３９】
上記５個のＳＮＰｓを使用した哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症を起こし得るこれらのグラム陽性菌およびグラム陰性菌を分類するための一般的規則は次のとおりである。
【０１４０】
３９６位がＣであるならば、細菌はグラム陰性であり、表９の種を含み、３９６位がＡまたはＧであるならば、細菌はグラム陽性であり、表１０の種を含む。
【表５９】
2016520314.tif 000060
【０１４１】
【表６０】
2016520314.tif 000061
【０１４２】
３９６位、３９８位および２７８位がＡ、ＣおよびＴ(それぞれ)であるならば、細菌はグラム陰性であり、表１１の種を含む。
３９６位、３９８位および２７８位がＡ、ＣおよびＣ(それぞれ)であるならば、細菌はグラム陽性であり、表１２の種を含む。
【表６１】
2016520314.tif 000062
【０１４３】
【表６２】
2016520314.tif 000063
【０１４４】
３９６位、３９８位および２７８位がＡ、Ｃ、Ｇであり、２８６位がＡであるならば、細菌はグラム陽性であり、表１３の種を含む。
【表６３】
2016520314.tif 000064
【０１４５】
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ａであるならば、細菌はグラム陽性であり、表１４の種を含む。
【表６４】
2016520314.tif 000065
【０１４６】
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ｇであり、６４８位がＧであるならば、細菌はグラム陰性であり、表１５の種を含む。
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ｇであり、６４８位がＡであるならば、細菌はグラム陽性であり、表１６の種を含む。
【表６５】
2016520314.tif 000066
【０１４７】
【表６６】
2016520314.tif 000067
【０１４８】
３９６位、３９８位、２７８位および２８６位がＡ、Ｃ、ＧおよびＧ(それぞれ)であり、６４８位がＧであるならば、細菌はグラム陰性であり、表１７の種を含む。
３９６位、３９８位、２７８位および２８６位がＡ、Ｃ、ＧおよびＧであり、６４８位がＡまたはＴであるならば、細菌はグラム陽性であり、表１８の種を含む。
【表６７】
2016520314.tif 000068
【０１４９】
【表６８】
2016520314.tif 000069
【０１５０】
それゆえに、大部分の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌のグラム呈色は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ(または１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはそのＤＮＡコピー)の３９６位、３９８位、３７８位、３８６位および６４８位のＳＮＰｓについて核酸を分析することにより決定でき、ここで、３９６位にＣ；または３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＴ；３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＧがあるとき、細菌病原体はグラム陰性菌であると決定され、そして、３９６位にＧ；または３９６位にＡ、３９８位にＣおよび２７８位にＣ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧおよび２８６位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡおよび２８６位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＡ、２８６位にＧおよび６４８位にＡ；または３９６位にＡ、３９８位にＣ、２７８位にＧ、２８６位にＧおよび６４８位にＴまたはＡがあるとき、細菌病原体はグラム陽性菌であると決定される。
【０１５１】
それゆえに、敗血症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)対象または敗血症を有することが疑われる哺乳動物(例えば、ヒト)対象、例えばＳＩＲＳを呈する哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの血液サンプルのようなサンプルを、本発明の方法を使用して分析し、細菌が原因物質であるか否か(すなわちサンプル中の存在する細菌がいるかいないか)およびまた細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを正確かつ迅速に決定できる。表９〜１８の情報を使用して、細菌種の正体もまた、絞ることができるか、ある場合、確認できる。
【０１５２】
２.４ ５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを使用する哺乳動物細胞および原核生物からの真菌細胞の識別
５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子は真核生物に固有である。ここで決定されるように、多くの５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内(およびそれゆえに５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子内)のＳＮＰｓは、真菌真核生物(酵母を含む)、例えば哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)に固有であり、それゆえに、このような真菌細胞を哺乳動物細胞から識別できる。５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子が原核生物に存在しないため、同じＳＮＰｓを、真菌細胞を細菌のような原核生物と識別するために使用できる。そのようなものとして、これらのＳＮＰｓを使用して、サンプル中の真菌細胞の存在を決定できる。
【０１５３】
配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位、２５６位に対応する位置のいずれか一箇所のＳＮＰｓを使用して、サンプル中のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)のような真菌細胞の存在の同定に使用でき、それらを哺乳動物細胞と識別できる。真菌および哺乳動物細胞の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子におけるこれらの位置のＳＮＰｓを表１９に示す。
【表６９】
2016520314.tif 000070
【０１５４】
それゆえに、本発明は、配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位、２５６位に対応する位置のいずれか一箇所のＳＮＰｓについてサンプルの核酸を分析することによる、サンプル中の真菌細胞の存在を迅速に検出する方法であって、ここで、１４２位のＣ；１４４位のＡ；１４６位のＡ；１４７位のＡ；１４８位のＣ；１５４位のＴ；１５７位のＴ；１６４位のＣまたはＧ；１６７位のＡ；１８５位のＧ；１８７位のＡ；１８８位のＡ；１９４位のＴ；１９７位のＧ；２１３位のＡ；２１５位のＴ；２１６位のＴ；２１９位のＧ；２２３位のＡ；２３１位のＧまたはＡ；２３２位のＴ；２３６位のＴ；２４５位のＣまたはＡ；２５１位のＣ；または２５６位のＴは、真菌細胞の存在を示す、方法を提供する。対照的に、哺乳動物細胞の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、１４２位にＴ；１４４位にＧ；１４６位にＧ；１４７位にＧ；１４８位にＴ；１５４位にＡ；１５７位にＣ；１６４位にＴ；１６７位にＧ；１８５位にＴ；１８７位にＧ；１８８位にＣ；１９４位にＧ；１９７位にＴ；２１３位にＧ；２１５位にＣ；２１６位にＡ；２１９位にＴ；２２３位は不在；２３１位にＣ；２３２位にＡ；２３６位にＣ；２４５位は不在；２５１位にＧ；または２５６位にＧを含む。この方法により同定される真菌細胞は、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を含み得る。
【０１５５】
２.５ ５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを使用する哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の同定
数真菌種が哺乳動物(例えば、ヒト)病原体として知られる。これらはカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を含む。５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における４個のＳＮＰｓの組み合わせ(およびそれゆえに５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピーにおける４個のＳＮＰｓの組み合わせ)を使用して、正確にこれらの種の各々を同定し、識別できる。
【０１５６】
１１種の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の同定および識別に使用できる４個のＳＮＰｓの組み合わせは、２５４位のもの；１６０位または２５５位のいずれか一箇所；および１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位および２５９位のいずれか二箇所を含み、番号付けは配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応する。表２０は、各病原体について各位置のＳＮＰｓを示す。それゆえに、本発明は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも４個のＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することによる、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは２５４位；１６０位または２５５位のいずれか一箇所；および１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位および２５９位のいずれか二箇所である、方法を提供する。
【表７０】
2016520314.tif 000071
【０１５７】
１６４位および２２３位のＳＮＰｓもまた真菌と哺乳動物細胞を識別するのに使用できるため、１６４位または２２３位のＳＮＰｓも使用する組み合わせは、哺乳動物バックグラウンドにおいて１１種の病原性真菌種を完全に識別できる。それゆえに、一例において、本発明は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも４個のＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することによる、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を決定する方法であって、ここで、ＳＮＰｓは２５４位；１６０位または２５５位のいずれか一箇所；１６４位および１６３位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位および２５９位の一箇所のものを含む、方法を提供する。他の例において、本方法は、少なくとも４個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸の分析を含み、ここで、ＳＮＰｓは２５４位；１６０位または２５５位のいずれか一箇所；２２３位および１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２４位および２５９位の一箇所のものを含む。このような方法を使用して、病原性真菌種は、ヒト対象を含む哺乳動物からの生体サンプルを含む、サンプルにおいて正確に同定され得る。
【０１５８】
さらに、１６３位および１６４位のＳＮＰｓは、カンジダ属を他の真菌病原体から識別できる。それゆえに他の例において、本発明は、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することによるサンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の正体を同定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＣの存在が、サンプル中の真菌病原体がカンジダ属である指標である、方法を提供する。関連する例において、本発明はまた５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも２個のＳＮＰｓについてサンプルからの核酸を分析することによりカンジダ属の存在または不在を決定する方法であって、ここで、少なくとも２個のＳＮＰｓは配列番号２の１６３位に対応する位置および配列番号２の１６４位に対応する位置であり、ここで、１６３位のＴおよび１６４位のＴの存在がサンプル中のカンジダ属の存在の指標であり、１６３位のＴおよび１６４位のＣの不在が、サンプル中のカンジダ属の不在の指標である、方法を提供する。上記例の具体的態様において、カンジダ属はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)から選択される。
【０１５９】
３. 本発明に従い微生物を分類するための、特異的多型性についてのスクリーニング
１個以上のＳＮＰｓを検出するための当分野で知られる任意の方法をここに記載する方法で使用して、サンプル中の微生物を分類および／または同定できる。具体的態様において、本方法はまたサンプル中の微生物の定量を促進し、すなわちサンプル中の細菌数および／または真菌数が決定または概算される。サンプル中の一ヌクレオチド多型性に対応する特定の位置のヌクレオチドを決定するための多くの方法が当分野で知られる。多型性の検出のための多様なツールは、ＤＮＡ配列決定、スキャニング法、ハイブリダイゼーションに基づく方法、伸長に基づく分析、取り込みに基づく方法、制限酵素に基づく分析およびライゲーションに基づく方法を含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
本発明の方法は、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子内またはそのＤＮＡコピー内およびいずれかの鎖についてここに記載する多型性を同定できる。ある例において、多型性を検出する方法は増幅の第一段階を利用し、増幅は１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子または１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子のＤＮＡコピーからであり得る。
【０１６１】
核酸は対象からの生体サンプルまたは環境サンプル、例えば空気、土壌または水サンプル、濾液、食品または工業製品または医療器具表面または作業場表面のような表面からのスワブ由来であり得る。対象はヒト対象または哺乳動物対象、例えば霊長類、家畜(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヤギ)、実験動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、コンパニオンアニマル(例えば、ネコ、イヌ)および捕獲された野生動物(例えば、キツネ、シカ、ディンゴ)のような非ヒト対象であり得る。対象からの生体サンプルは、血液、唾液または痰のような体液または尿、糞便、細胞、組織または生検サンプルを含むが、これらに限定されない対象の体の任意の部分由来であり得る。他の例において、核酸は、培養細胞から得る。具体例において、分析する核酸は、ＳＩＲＳを呈する哺乳動物(例えば、ヒト)対象からの生体サンプル由来である。このような対象は敗血症を有し得るおよび／または敗血症を有することが疑われ得る。
【０１６２】
本発明の方法に従い分析する核酸はサンプル内のまま分析してよくまたは最初にサンプルから抽出して、例えば、分析前にサンプルから単離してよい。サンプルから核酸を単離する任意の方法を本発明の方法において使用でき、このような方法は当業者に周知である。抽出核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ(ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡを含む)であり得る。ある例において、逆転写のさらなる工程を分析前に本方法に含ませ得る。それゆえに、分析する核酸は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＤＮＡコピー、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ、５.８Ｓ  ｒＲＮＡのＤＮＡコピーまたはこれらの任意の組み合わせを含み得る。核酸はまた、包含される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＤＮＡコピー、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５.８Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡのＤＮＡコピーの一部も含み得るが、当該一部はＳＮＰｓについて分析する核酸位置を含むことを条件とする
【０１６３】
ある例において、本方法は核酸の増幅を含む。このような例において、適当な核酸増幅法は当業者に周知であり、例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、例えば米国特許５,４２２,２５２に記載されているような鎖置換増幅法(ＳＤＡ)、例えばLiu et al.(1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594および国際出願ＷＯ９２／０１８１３)およびLizardi et al.(国際出願ＷＯ９７／１９１９３)に記載されているようなローリングサークル複製(ＲＣＲ)、例えばSooknanan et al.(1994, Biotechniques 17: 1077-1080)に記載されているような核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、単純反復配列分析(ＳＳＲ)、分枝ＤＮＡ増幅アッセイ(ｂ−ＤＮＡ)、転写増幅および自立配列複製および例えばTyagi et al.(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395-5400)により記載されているようなＱ−βレプリカーゼ増幅を含む。
【０１６４】
このような方法は、例えば、１個以上のＳＮＰｓを含む標的ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を含む、１個以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用できる。本発明の方法の実施に際して有用なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、多型性部位(すなわち、ＳＮＰ)での特異的ヌクレオチドがプローブの選択的ハイブリダイゼーションの存在または不在により検出される、標的ポリヌクレオチドに相補的であり、かつＳＮＰの位置を含む標的ポリヌクレオチドの部分にわたるオリゴヌクレオチドを含み得る。このような方法は、さらに、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとエンドヌクレアーゼを接触させ、多型性部位でのヌクレオチドがプローブの対応するヌクレオチドに相補的であるか否かによって、プローブの開裂産物の存在または不在を検出することを含み得る。
【０１６５】
プライマーは、任意の慣用の合成法を使用して製造してよい。このような方法の例は、“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties”, Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993に見ることができる。プライマーを検出を容易にするために標識してもよい。
【０１６６】
ＳＮＰｓの検出に有用な任意の方法を本発明で使用でき、ＳＮＰ遺伝子型判定のための多くの多様な方法が当分野で知られる(レビューのためにSyvaenen, A. C. (2001) Nat. Rev. Genet. 2, 930-942 (2001); Kwok, P. Y. (2001) Ann Rev Genomics Hum Genet 2, 235-258 ; Kim S, Misra A. (2007) Ann Rev Biomed Eng. 9:289-320参照)。このような方法は、“反応”(例えばハイブリダイゼーション、ライゲーション、伸長および開裂)、続く“分離”(例えば固相マイクロタイタープレート、微粒子またはアレイ、ゲル電気泳動、溶液相相同または半相同)、続く“検出”(例えば間接的比色分析、マススペクトロメトリー、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光および化学発光)を含む、３工程の連続での使用からなり得る。全ての適用についての単独の理想的ＳＮＰ遺伝子型判定法は存在せず、分析するサンプルサイズおよびＳＮＰｓの数のような多様なパラメータを考慮し、最適な方法を決定するのは十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６７】
特に臨床用途に役立つものとし、少数のＳＮＰｓのクエリーに頼り、速く、感受性であり(サンプル中の核酸増幅を経て)、一工程で、リアルタイム測定出力され、多重化および自動化可能であり、比較的安価でありかつ正確な方法の例は、TaqMan(登録商標)アッセイ(５’ヌクレアーゼアッセイ、Applied Biosystems)、ＬＵＸ(登録商標)(Invitrogen)またはScorpion(登録商標)プローブ(Sigma Aldrich)のような分子ビーコンプローブおよび鋳型指向色素取り込み(ＴＤＩ、Perkin Elmer)を含むが、これらに限定されない。例えば、TaqMan(登録商標)(Applied Biosystems)は、アレル特異的プローブを用いるハイブリダイゼーション、溶液相相同および蛍光共鳴エネルギー移動の組み合わせを使用する。TaqMan(登録商標)アッセイは、ＳＮＰ部位全体に結合するように設計した標識プローブを分解するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性と組み合わせて、核酸を増幅するために順方向および逆方向プライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに頼る。反応、分離および検出は、全て同時に実施でき、結果は反応が進むに連れてリアルタイムで読まれる。このような方法は、それ自体、多数のＳＮＰｓの同時の分析には役立たないが、少数のＳＮＰｓを迅速に、高感度かつ正確に、合理的な費用でクエリーするのに特に適する。
【０１６８】
いくつかの方法が他の方法より適当である可能性はあるが、１個以上のＳＮＰｓを検出するための当分野で知られる任意の方法をここに記載する方法で使用して、サンプル中の微生物を分類および／または同定できる。このような方法の非限定的例を下に記載する。
【０１６９】
３.１ 核酸配列決定法
ある態様において、多型性を核酸配列決定法により同定する。具体的に、ＳＮＰ座に及ぶ増幅産物を、古典的配列法を使用して配列させ得る(例えば、“ジデオキシ介在鎖停止法”、“サンガー法”としても知られる(Sanger, F., et al., (1975) J. Molecular, Biol. 94: 441; Prober et al., 1987, Science, 238: 336-340)および“化学分解法”、“マキサム・ギルバート法”としても知られる(Maxam, A. M., et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74: 560)、両文献とも、引用によりＳＮＰ座のヌクレオチドの決定にのために本明細書に包含させる)。
【０１７０】
Boyce-Jacino, et al.、米国特許６,２９４,３３６は、ＳＮＰが標的に選択的に結合する最も３’ヌクレオチドである部位でポリヌクレオチド標的に選択的に結合する、プライマーを使用することによる、核酸分子(ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか)の配列を決定するための固相配列決定法を提供する。変性高速液体クロマトグラフィーまたは質量分析のような他の配列決定技術も使用し得る。
【０１７１】
他の説明例において、配列決定法は、PyrosequencingTMとして知られる方法を含む。方法は、ＤＮＡの重合化の間にデオキシヌクレオチドが取り込まれるときは常に産生される、ピロホスフェートに基づく。ピロホスフェートの産生はルシフェラーゼ触媒反応と連結し、添加された特定のデオキシヌクレオチドが取り込まれたならば発光を生じ、定量的かつ示差的ピログラムを生じる。サンプルプロセシングは、ビオチニル化プライマーを用いるＰＣＲ増幅、ストレプトアビジン被覆ビーズ(または他の固相)上のビオチニル化一本鎖アンプリコンの単離および配列決定プライマーのアニーリングを含む。その後、サンプルをPyrosequenceTMにより分析し、これは、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含むインジケーター反応に必要な多数の酵素および基質ならびに組み込まれていないヌクレオチドを分解するためのピラーゼを添加する。次いで、サンプルを、４個のデオキシヌクレオチドの付加によりインテロゲートする。発光を、電荷結合素子カメラ(ＣＣＤ)により検出でき、これは取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。結果を、パターン認識により自動的に割り当てる。
【０１７２】
あるいは、本発明の方法は、“マイクロ配列決定”法を使用して、核酸配列内の多型性部位のヌクレオチドを同定できる。マイクロ配列決定法は、“予定”部位の一ヌクレオチドのみの正体を決定する。このような方法は、標的ポリヌクレオチドの多型性の存在および正体の決定に特定の有用性を有する。このようなマイクロ配列決定法、ならびに多型性部位のヌクレオチドを決定するための他の方法は、本明細書に引用により包含させるBoyce-Jacino et al.、米国特許番号６２９４３３６に記載されている。
【０１７３】
マイクロ配列決定法は、Goelet, P. et al. ＷＯ９２／１５７１２により開示されたGenetic Bit AnalysisTM法を含む。ＤＮＡの多型性部位をアッセイするためのさらなる、プライマー誘導、ヌクレオチド取り込み法も記載されている(Komher, J. S. et al, (1989) Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784; Sokolov, B. P., (1990) Nucl. Acids Res. 18: 3671; Syvanen, A. C, et al., (1990) Genomics, 8: 684-692; Kuppuswamy, M. N. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147; Prezant, T. R. et al, (1992) Hum. Mutat. 1: 159-164; Ugozzoli, L. et al., 1992, GATA, 9: 107-112; Nyren, P. et al., (1993) Anal. Biochem. 208: 171-175；およびWallace、ＷＯ８９／１０４１４)。これらの方法は、多型性部位の複数塩基を識別するために、標識デオキシヌクレオチドの取り込みに依存する点で、Genetic Bit AnalysisTMと異なる。このような形式において、シグナルが取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例的であるため、同一ヌクレオチドの複数ランにおいて生じる多型性が、ランの長さに比例するシグナルをもたらすことができる(Syvanen, A. C., et al., (1993) Amer. J. Hum. Genet. 52: 46-59)。
【０１７４】
さらにマイクロ配列決定法はMundy, C. R.(米国特許４,６５６,１２７)およびCohen, D. et al(仏国特許２,６５０,８４０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０２０８７)により提供されており、これは、多型性部位のヌクレオチドの正体を決定するための溶液ベースの方法を含む。米国特許４,６５６,１２７のMundy法におけるように、多型性部位に対してすぐ３’の対立形質配列に対して相補的であるプライマーを用いる。
【０１７５】
他の説明例において、Macevicz(米国特許５,００２,８６７)は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの複数混合物を用いるハイブリダイゼーションを経て核酸配列を決定する方法を記載する。このような方法に従い、標的ポリヌクレオチドの配列は、標的を一箇所に不変ヌクレオチドおよび他の位置に変異体ヌクレオチドを有するプローブセットをと連続的にハイブリダイズさせることにより決定する。Macevicz法は、標的のヌクレオチド配列を、標的とプローブセットをハイブリダイズさせ、続いてセットの少なくとも１個のメンバーが標的にハイブリダイズできる部位の数(すなわち、“マッチ”の数)を決定することにより、決定する。この方法を、プローブセットの各メンバーが試験されるまで反復する。
【０１７６】
あるいは、蛍光偏光検出を伴う鋳型指向色素ターミネーター取り込み(ＦＰ−ＴＤＩ)アッセイ(Chen et al., 1999)は、ミニ配列決定または一塩基伸長アッセイ(Syvanen, 1994)とも呼ばれるプライマー伸長アッセイの一変法である。プライマー伸長アッセイはＳＮＰｓを検出できる。ＤＮＡ配列決定プロトコールは、多型性部位からすぐ上流の標的ＤＮＡとアニールするＳＮＰ特異的配列決定プライマーのすぐ３’の一塩基の性質を確認する。ＤＮＡポリメラーゼおよび適切なジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート(ｄｄＮＴＰ)の存在下、プライマーは、多型性部位の標的ＤＮＡ配列により決定される一塩基により特異的に伸長する。どのｄｄＮＴＰが取り込まれたかを決定することにより、標的ＤＮＡに存在するアレルを推測できる。
【０１７７】
３.２ 多型性ハイブリダイゼーションに基づく方法
ヌクレオチド配列内の多型性を検出するためのハイブリダイゼーション法は、TaqMan(登録商標)アッセイ(Applied Biosystems)、ドットブロット、リバースドットブロット、多重アレル特異的診断アッセイ(ＭＡＳＤＡ)、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション(ＤＡＳＨ)(Jobs et al., (Genome Res (2003) 13: 916-924))、分子ビーコンおよびサザンブロットを含み得るが、これらに限定されない。
【０１７８】
ヌクレオチド配列内のＳＮＰｓを同定するためのTaqMan(登録商標)アッセイ(５’ヌクレアーゼアッセイまたは５’消化アッセイとしても知られる)は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを置き換え、開裂し、蛍光シグナルを生じさせるＴａｑポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に基づく。特定のＳＮＰに特異的なTaqMan(登録商標)プローブが必要であり、各プローブは、５’末端に結合した異なる蛍光色素および３’末端に結合したクエンチャーを有する。プローブが無傷であるとき、クエンチャーは蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)によりフルオロフォアと相互作用し、蛍光を消光させる。ＰＣＲアニーリング工程中、TaqMan(登録商標)プローブは標的ＤＮＡとハイブリダイズする。伸長工程中、蛍光色素はＴａｑポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により開裂され、レポーター色素の蛍光の増加に至る。ミスマッチプローブは断片化なしに置換される。サンプルの遺伝子型を、２種の異なる色素のシグナル強度の測定により決定する。
【０１７９】
他の有用なＳＮＰ同定法は、ＤＡＳＨ(動的アレル特異的ハイブリダイゼーション)を含み、これは、多型性を同定するために反応温度を一定に上昇させながらの、プローブ(オリゴヌクレオチド)の標的(ＰＣＲ産物)ハイブリダイゼーションの動的トラッキングを含む(Prince, J. et al., (2001) Genome Res, 11(1): 152-162)。
【０１８０】
ある態様において、多重アレル特異的診断アッセイ(ＭＡＳＤＡ)を、多数のサンプル(＞５００)の分析に使用できる。ＭＡＳＤＡは、ＤＮＡ配列をインテロゲートするためにオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを利用する。多重ＤＮＡサンプルを固体支持体上に固定し、一ハイブリダイゼーションをアレル特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)プローブのプールを用いて行う。あるサンプルに存在する特異的多型性と相補的なあらゆるプローブが、事実上、標的ＤＮＡによりプールから親和性精製される。結合ＡＳＯの化学配列決定または酵素配列決定により産生された配列特異的バンドパターン(フィンガープリント)は、特異的変異を容易に同定する。
【０１８１】
とりわけ、分子ビーコンおよびScorpion(登録商標)プローブ(Tyagi, S and Kramer, F. R., (1996) Nat. Biotechnol, 14: 303-308; Thelwell et al., (2000) Nucleic Acid Res. 28(19): 3752-3761)を含む、数種の別のハイブリダイゼーションに基づく方法がある。分子ビーコンは、５’末端および３’末端に蛍光レポーターおよびクエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドの中枢部分は標的配列全体とハイブリダイズするが、５’および３’フランキング領域は互いに相補的である。標的配列とハイブリダイズしないとき、５’および３’フランキング領域がハイブリダイズしてステムループ構造を形成し、レポーターとクエンチャー色素の近接によりほとんど蛍光を発光しない。しかしながら、標的配列とのハイブリダイゼーションにより、色素が離れ、蛍光が大きく上昇する。ミスマッチプローブ標的ハイブリッドは、まさに相補的であるハイブリッドより実質的に低い温度で解離する。“ビーコン”アプローチには多くの変法がある。Scorpion(登録商標)プローブは類似しているが、プローブの一部としてＰＣＲプライマー配列を取り込む。より最近、“二本鎖”形式も開発されている。
【０１８２】
ある態様において、ＳＮＰを同定するためのさらなる方法は、SNP-ITTM法を含む(Orchid BioSciences, Inc., Princeton, N.J.)。一般に、SNP-ITTMは、３工程プライマー伸長反応である。第一工程で、標的ポリヌクレオチドをキャプチャープライマーへのハイブリダイゼーションによりサンプルから単離し、これは、第一レベルの特異性を提供する。第二工程で、キャプチャープライマーを標的ＳＮＰ部位での停止ヌクレオチドトリスホスフェートから伸長し、これは第二レベルの特異性を提供する。第三工程で、伸長ヌクレオチドトリスホスフェートを、直接的蛍光、間接的蛍光、間接的比色分析アッセイ、マススペクトロメトリー、蛍光偏光などを含む、多様な既知形式を使用して検出できる。反応を、３８４ウェル形式で、SNPstreamTM装置を使用して自動化形式で処理できる(Orchid BioSciences, Inc., Princeton, N.J.)。
【０１８３】
これらの態様において、増幅産物を、放射性プローブを使用するまたは使用しないサザンブロット分析により検出できる。一つのこのような方法において、例えば、極小レベルの多型座の核酸配列を含む、ＤＮＡの小サンプルを増幅し、サザンブロッティング法を使用してまたは同様にドットブロット分析を使用して、分析する。非放射性プローブまたはラベルの使用は、高レベルの増幅シグナルにより促進される。あるいは、増幅産物を検出するために使用するプローブは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で、直接的または間接的に検出可能なように標識できる。
【０１８４】
塩濃度および温度のようなハイブリダイゼーション条件を、スクリーニングするヌクレオチド配列のために調節できる。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience), pages 2.9.1-2.9.10に記載されている。プローブを、ランダムオリゴマーおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でハイブリダイゼーションのために標識できる。極高特異的活性プローブを、製造業者のプロトコールに従い、Ready-To-Go DNA Labeling Beads(Pharmacia Biotech)のような市販のキットを使用して得ることができる。反復配列を高度に含有するプローブの可能性のある競合およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄度は、使用する各プローブについて個々に決定する。あるいは、候補配列のフラグメントをＰＣＲにより産生でき、特異性を齧歯類−ヒト体細胞ハイブリッドパネルを使用して検証し、フラグメントをサブクローニングする。これは、配列決定のためのラージプレップおよびプローブとしての使用を可能とする。ある遺伝子フラグメントが特徴づけされたら、小プローブ調製品をＰＣＲ産物のゲルまたはカラム精製により達成する。
【０１８５】
ドットブロット、リバースドットブロット、多重およびＭＡＳＤＡ形式で使用できる適当な物質は当分野で周知であり、ナイロンおよびニトロセルロース膜を含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
３.３ 多型性スキャニング法
ヌクレオチド配列内の多型性の検出のために本発明により意図されるスキャニング法は、化学ミスマッチ開裂(ＣＭＣ)(Saleeba, J. et al., (1992) Huma. Mutat, 1: 63-69)、ミスマッチ修復酵素開裂(ＭＲＥＣ)(Lu, A. LおよびHsu, I. C., (1992) Genomics, 14(2): 249-255)、化学開裂法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(ＤＧＧＥ)(Wartell et al., (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2699-2705 and; Sheffield et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232-236)、温度勾配ゲル電気泳動(ＴＧＧＥ)(Salimullah, et al., (2005) Cellular and Mol. Biol. Letts, 10: 237-245)、一定変性剤ゲル電気泳動(ＣＤＧＥ)、一本鎖高次構造多型(ＳＳＣＰ)分析(Kumar, D et al., (2006) Genet. Mol. Biol, 29(2): 287-289)、ヘテロ二本鎖分析(ＨＡ)(Nagamine, C. M et al., (1989) Am. J. Hum. Genet, 45: 337-339)、マイクロサテライトマーカー分析および一本鎖多型性アッセイ(ＳＳＰＡ)を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
ある態様において、本発明のＳＮＰｓは、放射標識ＤＮＡ野生型配列(プローブ)が推定変更を含む増幅配列にハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成するＣＭＣにより分析する。化学修飾、続くピペリジン開裂を、ヘテロ二本鎖のミスマッチバブルの除去のために使用できる。変性ヘテロ二本鎖のゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより開裂産物の可視化が可能となる。四酸化オスミウムを誤対合チミジンの修飾に、ヒドロキシルアミンをミスマッチシトシンのために使用する。さらに、プローブＤＮＡのアンチセンス鎖のラベルにより、アデノシンおよびグアノシンミスマッチの検出が可能となる。ミスマッチの化学開裂を使用して、長ＤＮＡフラグメントの変異のほぼ１００％を検出できる。さらに、本方法は、試験フラグメント内の変異の正確な特徴付けおよび正確な位置を提供する。最近、本方法が改良され、ＣＭＣが蛍光プライマーを使用することによる自動化により適するようになり、また多重化が可能になり、操作の数が少なくなった。あるいは、ＰＣＲにより取り込まれる蛍光標識ｄＵＴＰｓは、標的およびプローブ両者のＤＮＡ鎖の内部標識、それゆえに、各可能なハイブリッドの標識を可能にし、変異検出の機会を倍増させ、実質的に１００％検出を保証する。
【０１８８】
他の態様において、ミスマッチ修復酵素開裂(ＭＲＥＣ)アッセイを本発明のＳＮＰｓの同定に使用する。ＭＲＥＣは、ミスマッチ含有ＤＮＡに特異的な切断酵素系に依存する。目的の配列をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲの最後に、増幅産物を変性し、再アニーリングさせることによりホモおよびヘテロ二本鎖種が産生され得る。これらのハイブリッドをミスマッチ修復酵素で処理し、変性ゲル電気泳動により分析する。ＭＲＥＣアッセイは、３種のミスマッチ修復酵素を使用する。ＭｕｔＹエンドヌクレアーゼは、ミスマッチからアデニンを除去し、Ａ／ＴおよびＣ／ＧトランスバージョンおよびＧ／ＣおよびＴ／Ａ遷移の両者の検出に有用である。哺乳動物チミングリコシラーゼはＴ／Ｇ、Ｔ／ＣおよびＴ／Ｔミスマッチからチミンを除去し、Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ遷移ならびにＡ／ＴおよびＧ／ＣおよびＴ／ＡおよびＡ／Ｔトランスバージョンの検出に有用である。ヒトまたは仔ウシ胸腺由来の全タイプのエンドヌクレアーゼまたはトポイソメラーゼＩは全８種のミスマッチを認識でき、あらゆるヌクレオチド置換の走査に使用できる。ＭＲＥＣは、両ＤＮＡ鎖に取り込まれ得る特異的ラベルを使用でき、それゆえに、ある部位における全４種の可能なヌクレオチド置換が同定されることを可能にする。
【０１８９】
ある態様において、米国特許５,２１７,８６３(R. G. H. Cottonによる)に記載されるような化学開裂分析を、ヌクレオチド配列内のＳＮＰｓの同定に使用できる。ヘテロ二本鎖分析と同様、化学開裂は、ミスマッチした対立形質配列が互いにハイブリダイズした結果生じる、異なる特性を検出する。この差異をゲル上の移動速度変化として検出する代わりに、差異は、例えば、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、続くピペリジンの使用による化学開裂に対するハイブリッドの感受性の変化で検出される。
【０１９０】
本発明により意図される開裂法の中で、ＲＮＡｓｅ  Ａは、ヘテロ二本鎖ミスマッチ分析の原則に依存する。ＲＮＡｓｅ  Ａ開裂法において、放射標識リボプローブと、ＰＣＲ増幅により得たＤＮＡの間のＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖は、ＲＮＡｓｅ  ＡがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにおけるミスマッチの点で一本鎖ＲＮＡを開裂する能力を利用することにより、ＲＮＡｓｅ  Ａにより酵素開裂される。この後、電気泳動およびオートラジオグラフィーを行う。あるサイズの開裂産物により、変異の存在および位置が示される(Meyers, R. M et al., (1985) Science, 230: 1242-1246 and; Gibbs, R. A and Caskey, T, 1987, Science, 236: 303-305)。
【０１９１】
ＤＮＡプローブもまた、酵素または化学開裂を介するミスマッチの検出に使用できる。例えば、Cotton, et al., (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397;Shenk et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 989; およびNovack et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 586参照。
【０１９２】
ある態様において、Invader(登録商標)アッセイ(Third WaveTM Technology)を、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の多型性の走査に用いる。例えば、Invader(登録商標)アッセイは、２個の重複オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡに完全にハイブリダイズしたときに掲載される三次元構造の、Flapエンドヌクレアーゼによる認識および開裂の特異性に基づく(Lyamichev, V et al., (1999) Nat Biotechnol, 17: 292-296)。
【０１９３】
あるいは、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(ＤＧＧＥ)は、配列変異体の分離および同定に有用な方法である。ＤＧＧＥは、典型的に、存在する変性剤(通常ホルムアミドおよび尿素、陰極から陽極)の量を直線状に増加させながら鋳造した一定濃度ポリアクリルアミドゲル平板で実施する。ＤＧＧＥの変異体は、移動経路に沿って温度勾配を用い、ＴＧＧＥとして知られる。ＤＧＧＥまたはＴＧＧＥによる分離は、部分的に融解したＤＮＡ分子のゲルにおける電気泳動移動度が、非融解分子と比較して大きく減少するとの事実に基づく。
【０１９４】
ある態様において、一定変性剤ゲル電気泳動(ＣＤＧＥ)は、Smith-Sorenson et al., (1993) Human Mutation 2: 274-285(Anderson & Borreson, (1995) Diagnostic Molecular Pathology 4: 203-211もまた参照)に詳述されるように、ヌクレオチド配列内のＳＮＰｓの検出に有用である。あるＤＮＡ二本鎖は、一定変性剤のゲル中、予定された、特徴的な形式で融解する。変異はこの移動を変える。異常に移動するフラグメントを単離および配列決定して、特異的変異を決定する。
【０１９５】
他の態様において、一本鎖高次構造多型(ＳＳＣＰ)分析は、本発明のＳＮＰｓを検出する方法を提供する。ＳＳＣＰは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分離した一本鎖ＤＮＡ分子の移動度の変化に基づく方法である。電気泳動移動度は、分子のサイズおよび形のいずれにも依存し、一本鎖ＤＮＡ分子はそれら自体折り畳まれ、配列依存的方法で分子内相互作用により決定される二次構造を作る。一ヌクレオチド置換は二次構造を、結果的に、一本鎖の電気泳動移動度を変え、オートラジオグラフにおけるバンドシフトをもたらすことができる。あるヌクレオチド多様性が一本鎖の配座を変更させる能力は、適切な理論的モデルに基づいても予測不可能であり、二次構造のループまたは長い安定な基部で生じる塩基変化はＳＳＣＰにより検出されない。標準的ＳＳＣＰは、１５０〜２００bpのフラグメントにおける配列変化の検出で最大信頼性に到達する。放射活性ベースのＳＳＣＰ分析に等しい感受性で変異の検出が可能である、より進歩したプロトコールが開発されている。これらの方法は、ＰＣＲにおいて蛍光標識プライマーを使用し、産物を蛍光ベースの自動化配列決定機器を使用して分析する。多色蛍光ＳＳＣＰはまた、各レーンからのデータを互いに比較するために使用できる内部標準を全レーンに含むことを可能とする。検出率を上げるための他の変法は、ジデオキシフィンガープリンティング(ｄｄＦ)および制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(ＲＥＦ)に基づくジデオキシ配列決定法を含む。
【０１９６】
ｄｄＦ法は、ＳＳＣＰとSangerジデオキシ配列決定の組み合わせであり、一ジデオキシヌクレオチドを用いるSanger配列決定反応の非変性ゲル電気泳動を含む。この方法で、例えば、２５０bpフラグメントをスクリーニングして一ＳＮＰを同定できる。ＲＥＦは、１kbを超えるフラグメントのスクリーニングを可能にするＳＳＣＰのより複雑な修飾である。ＲＥＦに関して、標的配列をＰＣＲで増幅し、５〜６種の異なる制限エンドヌクレアーゼで消化させ、非変性ゲル上のＳＳＣＰにより分析する。６種の制限酵素を使用する場合、配列多様性は６種の異なる制限フラグメントで現れ、それゆえに、１２種の異なる一本鎖セグメントを産生する。これらのフラグメントのいずれか一つの移動度シフトが、本発明の一ＳＮＰの存在を特定するのに十分である。得られた制限パターンは、試験領域における変更の局在化を可能にする。
【０１９７】
ある態様において、ヘテロ二本鎖分析(ＨＡ)は、ＰＣＲ産物またはヌクレオチド配列における一塩基置換を検出する。ＨＡは放射性同位体または特殊な設備無しで、迅速に実施できる。ＨＡ法は、ＰＣＲ産物の加熱および復元により、一箇所以上で異なるヌクレオチドを有する配列の間のヘテロ二本鎖の形成を利用する。ミスマッチ塩基の周囲の二本鎖配置がより開放されているため、ヘテロ二本鎖は、対応するホモ二本鎖よりゆっくり移動し、その後移動度が減少したバンドとして検出される。特定の一塩基置換がＨＡ法により検出される能力は、隣接ヌクレオチドがミスマッチ領域の配置に相当な影響を有し、長さベースの分離が明らかにヌクレオチド置換を見逃すため、単にミスマッチ塩基を知るだけでは予測できない。使用するアクリルアミドの温度、ゲル架橋結合および濃度の最適化ならびにグリセロールおよびスクロースが突然変異サンプルの分離を増進する。ＨＡ法は放射性同位体または特殊な設備がなくとも、迅速に実施でき、配列決定された遺伝子における既知変異および多型性について大量のサンプルをスクリーニングする。ＨＡをＳＳＣＰと組み合わせて使用するとき、ＤＮＡフラグメントの全変更の最大１００％が容易に検出できる。
【０１９８】
ある態様において、エシェリキア・コリ(E. coli)ｍｕｔＳタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質を、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ内の多型性の検出に使用できる(Modrich, (1991) Ann. Rev. Genet. 25: 229-253)。ｍｕｔＳアッセイにおいて、タンパク質は、２個の配列間のヘテロ二本鎖にヌクレオチドミスマッチを含む配列とのみ結合する。
【０１９９】
さらなる態様において、マイクロサテライトマーカー分析を使用して多型性検出を実施できる。例えば約１０センチモルガン(cM)の平均的ゲノムスペーシングを有するマイクロサテライトマーカーを、当分野で知られる標準的ＤＮＡ単離法を使用して用いることができる。
【０２００】
上記ＳＳＰＡ分析および密接に関連するヘテロ二本鎖分析法は、一塩基多型性のスクリーニングに使用し得る(Orita, M. et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2766)。
【０２０１】
３.４ 多型性分析のためのヌクレオチドアレイおよび遺伝子チップ
本発明は、さらに、オリゴヌクレオチド、例えば少なくとも１２nt、少なくとも約１５nt、少なくとも約１８nt、少なくとも約２０ntまたは少なくとも約２５ntまたはそれより長く、多型位置にフランキングな配列を含むオリゴヌクレオチドのアレイの使用によりＳＮＰｓを同定する方法を意図し、ここで、アレイ上の別々の位置が本発明のＳＮＰｓを含む配列の１個以上に相補的である。このようなアレイは一連のオリゴヌクレオチドを含んでよく、その各々は、異なる多型性と特異的にハイブリダイズし得る。アレイの例については、Hacia et al. (1996, Nat. Genet. 14: 441-447 and De Risi et al., (1996, Nat. Genet. 14: 457-460)を参照のこと。
【０２０２】
ヌクレオチドアレイは、必要に応じて、本発明の多型性の全てまたはサブセットを含み得る。１個以上の多型体がアレイに存在し得る。アレイ上のオリゴヌクレオチド配列は、一般に少なくとも約１２nt長、少なくとも約１５nt長、少なくとも約１８nt長、少なくとも約２０nt長または少なくとも約２５nt長またはそれ以上、例えば１００〜２００nt長である。アレイの例については、Ramsay (1998, Nature Biotech. 16: 40-44; Hacia et al., (1996, Nature Genetics 14: 441-447; Lockhart et al., (1996, Nature Biotechnol. 14:1675-1680; and De Risi et al., (1996, Nature Genetics 14: 457-460)を参照のこと。
【０２０３】
多数の方法が、生体サンプルのマイクロアレイ、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイに使用するＤＮＡサンプルのアレイの製造に利用可能である。このようなアレイの例は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５(１９９５)；米国特許出願番号５,４４５,９３４、(１９９５)；およびDrmanac et al., (1993, Science 260:1649-1652)に詳細に記載されている。Yershov et al., (1996, Genetics 93: 4913-4918)は、オリゴヌクレオチドアレイの別の構成を記載する。オリゴヌクレオチドアレイの構成および使用は、Ramsay(1998) supraに概説されている。
【０２０４】
ヌクレオチド配列内の多型性の同定のために高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用する方法は当分野で知られる。例えば、Milosavljevic et al., (1996, Genomics 37: 77-86)は、短オリゴマーへのハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列認識を記載する。また、Drmanac et al., (1998, Nature Biotech. 16: 54-58; and Drmanac and Drmanac, 1999, Methods Enzymol. 303: 165-178)も参照のこと。未知変異の同定のためのアレイの使用は、Ginot, (1997, Human Mutation 10: 1-10)により提案されている。
【０２０５】
既知変異の検出は、Hacia et al. (1996, Nat. Genet. 14: 441-447; Cronin et al., (1996) Human Mut. 7: 244-255)およびその他に記載されている。遺伝子マッピングにおけるアレイの使用は、Chee et al., (1996, Science 274: 610-613; Sapolsky and Lishutz, 1996, Genomics 33: 445-456)に記載され;そして、Shoemaker et al., 1996, Nat. Genet. 14: 450-456は、平行バーコーディング戦略を使用する酵母欠失変異体の定量的表現型分析を実施する。
【０２０６】
相補的ＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現パターンの定量的モニタリングはSchena et al., (1995, Science 270: 467)に記載られ；DeRisi et al., 1997, Science 270: 680-686)はゲノム規模で遺伝子発現を探索する。Wodicka et al., (1997, Nat. Biotech. 15: 1-15)は、出芽酵母でゲノム全域にわたる発現モニタリングを実施する。
【０２０７】
オリゴヌクレオチドの高密度マイクロアレイは当分野で知られ、商業的に入手可能である。アレイ上のオリゴヌクレオチドの配列は既知標的配列に対応する。アレイに存在するオリゴヌクレオチドの長さは、ミスマッチの存在に対してハイブリダイゼーションの感受性がどの程度かにおける重要な因子である。通常オリゴヌクレオチドは少なくとも約１２nt長、より一般には、少なくとも約１５nt長、好ましくは少なくとも約２０nt長、より好ましくは少なくとも約２５nt長であり、約３５nt長より長くなく、通常約３０nt長を超えない。
【０２０８】
オリゴヌクレオチドの大アレイを製造する方法は米国特許５,１３４,８５４(Pirrung et al.)および米国特許５,４４５,９３４(Fodor et al.)に記載され、光指向性合成法を使用している。コンピュータ制御システムを使用して、複数モノマーの不均一アレイを、多数の反応部位での同時カップリングにより、複数ポリマーの不均一アレイに変換する。あるいは、例えば国際公開ＷＯ９５／３５５０５に記載のように、マイクロアレイを、予め合成したオリゴヌクレオチドの固形基質への沈着により製造する。
【０２０９】
マイクロアレイを走査して、標識ゲノムサンプルのハイブリダイゼーションを検出できる。デバイス上の蛍光標識標的を検出する方法およびデバイスは当分野で知られる。一般にこのような検出デバイスは顕微鏡および基質に光を当てるための光源を含む。光子計数器は基質からの蛍光を検出し、一方ｘ−ｙ変換ステージは、基質の位置を変える。対象方法において使用し得る共焦点検出装置は米国特許５,６３１,７３４に記載されている。走査型レーザー顕微鏡はShalon et al. (1996, Genome Res. 6: 639)に記載されている。適切な励起線を使用する走査を、使用する各フルオロフォアについて実施する。走査から作成されたデジタル画像を、その後、引き続く分析のために合わせる。任意の特定のアレイ要素について、一つの核酸サンプルからの蛍光シグナルの比を他の核酸サンプルからの蛍光シグナルと比較し、相対的シグナル強度を決定する。
【０２１０】
蛍光検出により収集したデータを分析する方法は当分野で知られる。データ分析は、収集したデータからの基質位置の関数としての蛍光強度の決定、異常値、すなわち、予定統計分布から逸脱したデータの除去および残りのデータからの標的の相対的結合親和性の計算の工程を含む。得られたデータを、標的とプローブの間の結合親和性に従い変化する、各領域における強度を伴った画像として表示し得る。
【０２１１】
マイクロチップテクノロジーを介する核酸分析も本発明で適用可能である。本方法において、何千もの異なるオリゴヌクレオチドプローブを、シリコンチップに整列して適用できる。分析する核酸は蛍光標識され、チップ上のプローブとハイブリダイズする。これらの核酸マイクロチップを使用して核酸−タンパク質相互作用を研究することも可能である。この方法を使用して、変異の存在の決定、分析する核酸の配列決定または目的の遺伝子の発現レベルの測定ができる。本方法は、同時の、多数の、数千にさえのぼるプローブの平行プロセシングの一つであり、分析速度を非常に速めることができる。
【０２１２】
ｍＲＮＡ転写の変更は、当業者に知られる任意の方法により検出できる。これらは、ノーザン・ブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。ｍＲＮＡ転写の減少は、配列の変更を示す。
【０２１３】
アレイ／チップテクノロジーは多くの例で既に適応され、成功している。例えば、変異のスクリーニングが、ＢＲＣＡ  １遺伝子、出芽酵母変異体株およびＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子で行われている(Hacia et al., 1996;Shoemaker et al., 1996;Kozal et al., 1996)。ＳＮＰｓの検出に使用するための種々の形式のチップが、カスタマイズに基づいて製造できる。
【０２１４】
ＳＮＰｓの検出に有用なアレイベースのタイル張り戦略はＥＰ７８５２８０に記載されている。簡単にいうと、アレイを、一般に多数の特異的多型性について“タイル張り”し得る。“タイル張り”は、目的の標的配列に相補的な配列、ならびにその配列の前選択した変種、例えば、基本のモノマー、すなわち、ヌクレオチドの１個以上のメンバーでのある一箇所以上の置換からなる所定のオリゴヌクレオチドプローブの合成をいう。タイル張り戦略は、さらにＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１１９９５に記載されている。ある態様において、アレイは、多数の特異的ＳＮＰｓについてタイル張りされる。特に、アレイは多数の検出ブロックを含むようにタイル張りされ、各検出ブロックは特異的ＳＮＰまたは一連のＳＮＰｓに特異的である。例えば、検出ブロックを、特異的ＳＮＰを含む配列セグメントにまたがる多数のプローブを含むようにタイル張りする。各アレルに相補的なプローブを確実にするために、ＳＮＰ位置が異なる対でプローブを合成する。ＳＮＰ位置が異なるプローブに加えて、一置換プローブも一般に検出ブロック内でタイル張りされる。このような方法を、ここに開示するＳＮＰ情報に容易に適用できる。
【０２１５】
これらの一置換プローブは、多型性からのいずれかの方向にいくつかの塩基の場所でおよび最大いくらかの塩基で、残りのヌクレオチド(Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選択)で置換された塩基を有する。典型的に、タイル張り検出ブロック中のプローブは、ＳＮＰから５塩基離れたおよびそこを含む配列位置の置換を含む。一置換プローブは、実際のハイブリダイゼーションと人為現象的交差ハイブリダイゼーションを識別するために、タイル張りアレイのための内部管理を提供する。標的配列とのハイブリダイゼーションとアレイの洗浄完了後、アレイを走査して、標的配列がハイブリダイズしたアレイ上の位置を決定する。走査したアレイからのハイブリダイゼーションデータを、次いで、どのＳＮＰの１個または複数個のアレルがサンプルに存在するかを同定するために分析する。ハイブリダイゼーションおよび走査を、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９５／１１９９５および米国特許５,４２４,１８６に記載のように実施し得る。
【０２１６】
それゆえに、ある態様において、チップは、約１５ヌクレオチド長のフラグメントの核酸配列およびそれに相補的な配列またはそのフラグメントのアレイを含み得て、そのフラグメントは少なくとも約８連続ヌクレオチド、好ましくは１０、１５、２０、より好ましくは２５、３０、４０、４７または５０連続ヌクレオチドを含み、多型性塩基を含む。ある態様において、多型性塩基は、ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２または１ヌクレオチドであり、より好ましくはポリヌクレオチドの中心である。他の態様において、チップは、任意の数の本発明のポリヌクレオチドを含むアレイを含み得る。
【０２１７】
オリゴヌクレオチドを、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６(Baldeschwieler et al.)に記載のように、化学カップリング法およびインクジェット塗布装置を使用して、基質の表面上で合成し得る。他の面において、ドット(またはスロット)ブロットに類似する“格子付き”アレイを使用して、真空システム、熱的、ＵＶ、機械的または化学結合法を使用してｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを基質の表面に配置および結合させるのに使用し得る。上記のもののようなアレイを手製でまたは利用可能なデバイス(スロット、ブロットまたはドットブロット装置)、材料(任意の適当な固体支持体)および器械(ロボット機器を含む)を使用して製造でき、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４またはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは市販の器具類の効率的使用をさせる任意の他の数のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０２１８】
このようなアレイを使用して、本発明は、サンプル中の本発明のＳＮＰｓを同定する方法を提供する。このような方法は、試験サンプルと、本発明の少なくともの一箇所のＳＮＰに対応する１個以上のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイをインキュベートし、試験サンプルからの核酸とオリゴヌクレオチドプローブの１個以上との結合をアッセイすることを含む。このようなアッセイは、典型的に、少なくともそのうち一つは本発明のＳＮＰである多くのＳＮＰ位置および／またはこれらのＳＮＰ位置の対立形質変異体に対応するオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイを含む。
【０２１９】
核酸分子と試験サンプルをインキュベートする条件は様々である。インキュベーション条件はアッセイに用いる形式、用いる検出法およびアッセイで使用する核酸分子のタイプおよび性質による。当業者は、一般に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅またはアレイアッセイ形式の一つを、ここに開示する新規ＳＮＰｓを用いるために容易に応用できることを認識する。このようなアッセイの例は、Chard, T, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. Vol. 1 (I 982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)に見ることができる。
【０２２０】
多成分統合システムもＳＮＰｓの分析に使用し得る。このようなシステムは、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応のような工程を単一機能装置に小型化および区画化する。このような方法の例は、チップへのＰＣＲ増幅およびキャピラリー電気泳動の組込みを記載する米国特許５,５８９,１３６に開示されている。
【０２２１】
統合システムは、主に微小流体システムを使用するとき想定される。これらのシステムは、マイクロチップに含まれるガラス、シリコン、石英または可塑性ウェーハ上に設計されたあるパターンのマイクロチャネルを含む。サンプルの移動は、可動部がない機能的顕微鏡的バルブおよびポンプを作るためにマイクロチップの種々の領域にわたり適用された電気的、電気浸透的または静水学的力により制御される。電圧を変えることによりマイクロ機器加工チャネル間の交差部の液体流を制御し、マイクロチップの異なるセクションを越えるポンプ輸送のための液体流速を変化させる。
【０２２２】
遺伝子型判定ＳＮＰｓのために、微小流体システムを、例えば、核酸増幅、ミニ配列決定プライマー伸長、キャピラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出のような検出法と統合する。
【０２２３】
第一工程において、ＤＮＡサンプルを、好ましくはＰＣＲにより増幅する。次いで、増幅産物を、ｄｄＮＴＰｓ(各ｄｄＮＴＰについて特異的蛍光)および標的多型性塩基の丁度上流でハイブリダイズする適切なオリゴヌクレオチドミニ配列決定プライマーを使用する自動化ミニ配列決定反応に付す。３’末端での伸長が完了したら、プライマーを、キャピラリー電気泳動により組み込まれていない蛍光ｄｄＮＴＰｓと分離する。キャピラリー電気泳動に使用する分離媒体は、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランであり得る。一ヌクレオチドプライマー伸長産物中に取り込まれたｄｄＮＴＰｓをレーザー誘発蛍光検出により同定する。このマイクロチップを使用して、少なくとも９６〜３８４個またはそれ以上のサンプルを平行して処理できる。
【０２２４】
３.５ 多型性の検出のための伸長に基づく方法
ヌクレオチド配列内の多型性を検出するための伸長に基づく方法は、欧州特許出願公開番号０３３２４３５およびNewton et al., (1989, Nucl. Acids Res. 17: 2503-2516)に記載されている増幅抵抗性変異システム(ＡＲＭＳ)としても知られるアレル特異的増幅およびGibbs et al., (1989, Nucleic Acids Research, 17: 2347)により意図される多型性のクローニング(ＣＯＰＳ)を含むが、これらに限定されない。
【０２２５】
伸長に基づく方法、ＡＲＭＳは、遺伝子型判定のためにアレル特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)ＰＣＲプライマーを使用する。この方法において、ＰＣＲに使用する２個のオリゴヌクレオチドプライマーのうち１個を、多型性部位と、最も一般的には該部位を標的とするプライマーの３’末端と、結合するように設計する。注意深く制御された条件(アニーリング温度、マグネシウム濃度など)下、増幅は、ＰＣＲプライマーの３’末端のヌクレオチドが、多型性部位の塩基と相補的である場合にのみ起こり、ミスマッチは増幅“抵抗性”である。
【０２２６】
突然変異誘発的に分離したＰＣＲ(ＭＳ−ＰＣＲ)と呼ばれるＡＲＭＳの変法は、異なる長さの２個のＡＲＭＳプライマーを含み、各々、部位の異なる多型性に特異的である。本方法は、異なる多型性について異なる長さのＰＣＲ産物を生じる。
【０２２７】
３.６ 多型性を検出するためのライゲーションに基づくアッセイ
ＳＮＰ検出の他の典型的方法は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを含む。多くの方法により、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズした２個の隣接オリゴヌクレオチドを連結できる酵素であるＤＮＡリガーゼを使用する。本方法の特異性は、ライゲーション部位でのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとＤＮＡ鋳型の完全マッチが必要であることに基づく。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(ＯＬＡ)またはリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)アッセイにおいて、変異部位周囲の配列が最初に増幅され、一つの鎖が３個のライゲーションプローブの鋳型として働き、そのうち２個がアレル特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)であり、３個目が共通プローブである。ライゲート産物の検出のために多数の方法が使用できる。例えば、２個のＡＳＯｓを、蛍光またはハプテンラベルで別々に標識し、ライゲート産物を、それぞれ蛍光または比色酵素結合免疫吸着アッセイで検出できる。電気泳動に基づくシステムにおいて、蛍光検出と結合させた移動度修飾タグまたはプローブ長多様性が、単一チューブでの数個の一ヌクレオチド置換の多重遺伝子型判定を可能にする。アレイ上で使用するとき、ＡＳＯｓを特異的位置にスポットするかまたはチップ上にアドレスを割り当てる。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを次いで添加し、アレイ上の特異的アドレスにおける標識オリゴヌクレオチドのライゲーションを測定できる。
【０２２８】
３.７ シグナル発生多型性検出アッセイ
ある態様において、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)が、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の多型性を同定する方法として考慮される。ＦＲＥＴは、電子的励起状態の２個の色素分子間の相互作用により生じる。励起は、一方の(ドナー)色素分子から他方の(アクセプター)色素分子に、光子の放出なしに伝達される。これは距離依存性であり、すなわちドナーとアクセプター色素が近接していなければならない。ハイブリダイゼーションプローブシステムは、蛍光色素で標識された２個のオリゴヌクレオチドからなる。ハイブリダイゼーションプローブ対は、標的ＤＮＡ上の隣接領域にハイブリダイズするよう設計される。各プローブを異なるマーカー色素で標識する。２個の色素の相互作用は、両者がそれらの標的に結合したときのみ起こる。ドナープローブを、３’末端でフルオロフォアで標識し、アクセプタープローブを５’末端で標識する。ＰＣＲ中、２個の異なるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと結合したフルオロフォアが、ハイブリッド構造で近接するように、標的ＤＮＡの隣接領域とハイブリダイズする。ドナーフルオロフォア(Ｆ１)は外部光源により励起され、その後その励起エネルギーの一部を隣接アクセプターフルオロフォア(Ｆ２)に渡す。励起アクセプターフルオロフォア(Ｆ２)は、異なる波長の光を発し、これをその後分子近接について検出し、測定できる。
【０２２９】
他の態様において、一塩基伸長、磁気分離および化学発光に基づくＭａｇＳＮｉＰｅｒ法は、ヌクレオチド配列におけるＳＮＰ同定のさらなる方法を提供する。一塩基ヌクレオチド伸長反応を、３’末端がタグ標識ｄｄＮＴＰを有するＳＮＰ部位に隣接する、ビオチニル化プライマーを用いて実施する。次いで、プライマーをストレプトアビジンを伴う磁気被覆ビーズにより捕捉し、組み込まれていない標識ｄｄＮＴＰを磁気分離により除去する。磁気ビーズを、アルカリホスファターゼと結合した抗タグ抗体とインキュベートする。磁気分離により過剰のコンジュゲートを除去後、ＳＮＰ分類を化学発光の測定により行う。標識ｄｄＮＴＰの取り込みを、アルカリホスファターゼにより誘発される化学発光によりモニターする。
【０２３０】
ある態様において、蛍光偏光は、ヌクレオチド配列内の多型性の同定のための方法を提供する。例えば、多型性を含む増幅ＤＮＡをオリゴヌクレオチドプライマー(多型性部位に隣接するＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするように設計)と、アレル特異的色素標識ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸類および市販の修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下インキュベートする。プライマーを、鋳型上に存在するアレルに特異的な色素−ターミネーターにより伸長し、フルオロフォアの分子量を約１０倍増加させる。反応の最後に、反応混合物中の２個の色素−ターミネーターの蛍光偏光を分離または精製せずに直接分析する。この均一ＤＮＡ診断法は高度に感受性かつ特異的であることが示されており、多数のサンプルの自動化遺伝子型判定に適する。
【０２３１】
他の態様において、表面増感ラマン散乱を、二本鎖ＤＮＡフラグメントにおける一塩基差異の検出および同定のための方法として使用できる。Chumanov, G. “Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) for Discovering and Scoring Single Based Differences in DNA” Proc. Volume SPIE, 3608 (1999). SERS has also been used for single molecule detection. Kneipp, K, (1997, Physical Review Letters, 78(9): 1667-1670)。ＳＥＲＳは、ナノメートルサイズの金属構造に結合している分子からの強く増加したラマンシグナルを生じる。
【０２３２】
説明的例は、検出として蛍光消光を伴うプライマー伸長アッセイに基づく、Xiao and Kwok (2003, Genome Research, 13(5): 932-939)により記載された遺伝子型判定法を含む。蛍光消光検出を伴う鋳型指向色素ターミネーター取り込み(ＦＱ−ＴＤＩ)アッセイは、蛍光色素Ｒ１１０およびＲ６Ｇ標識アシクロターミネーターの強度が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー上に取り込まれたら普遍的に減少するとの観察に基づく。２個の対立形質色素の蛍光消光速度をリアルタイムで比較することにより、ＤＮＡサンプル中のＳＮＰｓの頻度を測定できる。動的ＦＱ−ＴＤＩアッセイは、遺伝子型判定およびアレル頻度概算の両者で極めて正確かつ再現性がある。
【０２３３】
４. プライマー、プローブ、キットおよびプロセシングシステム
本発明は、サンプル中の微生物を分類および／または同定することを目的として、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一箇所以上のＳＮＰｓを決定するためにここに記載する方法で使用し得るプローブおよびプライマーを提供する。ある例において、本発明の方法におけるプライマーおよびプローブの使用は、微生物の定量を容易にする。
【０２３４】
本発明のプライマーおよびプローブは、１箇所以上のＳＮＰを含む１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子(または１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ分子またはそのＤＮＡコピー)の少なくとも一部とハイブリダイズする。例えば、プライマーは１個以上のＳＮＰｓにフランキングな配列とハイブリダイズしてよく、プローブは１個以上のＳＮＰｓを含む配列とハイブリダイズしてよい。１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の既知配列に基づき、本発明の方法において使用するための適切なプライマーおよびプローブの設計は、十分に当業者の技術範囲内である。
【０２３５】
配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、２７８位、２８６位および／または６４８位に対応する位置での哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを分析する、本発明の方法において有用なプライマーおよびプローブの非限定的例は、実施例６に記載のものを含む。例えば、３９６位および３９８位のＳＮＰｓを検出するために、プローブ配列の例は、グラム陽性菌についてＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号４)およびＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号５)、グラム陰性菌についてＧＣＣＡＡＧＴＡＧＣＧＴ(配列番号６)およびＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号７)を含み、グラム陽性菌およびグラム陰性菌両者からの順方向プライマーの例はＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ(配列番号８)を含み、逆方向プライマーの例はグラム陰性についてＧＣＣＡＧＣＡＧＣＹＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ(配列番号９)およびグラム陽性菌についてＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ(配列番号１０)を含む。２７８位および２８６位のＳＮＰｓを検出するために、プローブ配列の例はグラム陰性菌についてＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号１１)、ＧＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＴＡＡ(配列番号１２)、ＧＣＴＴＴＧＡＣＧＣＡＴＡＡ(配列番号１３)、ＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＧＴＡＴ(配列番号１４)、ＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号１５)およびＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＣＴＡＧ(配列番号１６)およびグラム陽性菌についてＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＴＡＧ(配列番号１７)、ＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧ(配列番号１８)およびＧＣＣＡＣＧＡＴＡＣＡＴＡＧ(配列番号１９)を含み、順方向プライマー配列の例は、グラム陰性菌についてＴＧＷＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＣＧＴＣ(配列番号２０)、ＴＧＴＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＴＷ(配列番号２１)およびＴＡＡＲＲＧＡＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＣ(配列番号２２)およびグラム陽性菌についてＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴ(配列番号２４)を含み、逆方向プライマー配列の例は、グラム陰性菌についてＡＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧ(配列番号２５)、ＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧ(配列番号２６)およびＧＴＧＡＷＣＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧ(配列番号２７)およびグラム陽性菌についてＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＲＡＣＴ(配列番号２８)を含む。６４８位のＳＮＰｓを検出するために、プローブの例は、グラム陰性菌についてＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧ(配列番号２９)およびグラム陽性菌についてＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧ(配列番号３０)およびＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＧ(配列番号３１)を含み、順方向プライマー配列の例はＴグラム陰性菌についてＡＡＣＣＣＣＧＴＧＡＫＧＧＧＡＴＧＧＡ(配列番号３２)およびグラム陽性菌についてＣＡＡＣＣＧＫＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡ(配列番号３３)を含み、逆方向プライマー配列の例は、グラム陰性菌についてＴＣＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ(配列番号３４)およびグラム陽性菌についてＣＡＲＲＡＧＲＧＧＡＲＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ(配列番号３５)を含む。グラム陰性菌を識別するためのプライマーおよびプローブのさらなる非限定的例は表２１に記載のものを含み、グラム陽性菌を識別するためのプラ���マーおよびプローブのさらなる非限定的例は表２２に記載のものを含む。このようなプライマーおよびプローブは、TaqMan(登録商標)アッセイのようなアッセイに特に適する。
【０２３６】
【表７１】
2016520314.tif 000072
【表７２】
2016520314.tif 000073
【０２３７】
【表７３】
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【０２３８】
【表７４】
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【表７５】
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【０２３９】
配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位および４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９５位、４９６位、５００位および５０１位に対応する位置での哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを分析する、本発明の方法に有用なプライマーおよびプローブの非限定的例は実施例６に記載するものおよび表２３に示すものを含む。
【表７６】
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【表７７】
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【０２４０】
【表７８】
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【表７９】
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【０２４１】
【表８０】
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【表８１】
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【０２４２】
【表８２】
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【０２４３】
真菌の５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを分析する、本発明の方法に有用なプライマーおよびプローブの非限定的例は表２４に示すものを含む。
【表８３】
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【表８４】
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【０２４４】
【表８５】
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【０２４５】
本発明に従う１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における１個以上のＳＮＰｓの検出のために必要な全ての必須材料および試薬をキットにまとめてよい。キットはまた所望によりラベルの検出のための適切な試薬、陽性および陰性対照、洗浄液、ブロッティング膜、マイクロタイタープレート希釈緩衝液なども含んでよい。例えば、多型性の同定のための核酸ベースの検出キットは次の１個以上を含み得る。(ｉ)グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌および／または哺乳動物細胞からの核酸(これは陽性対照として使用し得る)；および(ii)分析すべきＳＮＰ位置を含む、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブおよび所望により疑わしいＳＮＰ部位のまたは周囲の１個以上の他のＡＳマーカー。増幅に必要な反応混合物を提供するための、種々のポリメラーゼ類(用いる核酸増幅法により逆転写酵素、Ｔａｑ、SequenaseTMＤＮＡリガーゼなど)を含む核酸類の増幅に適する酵素、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液もまた含み得る。このようなキットは、一般に、適当な手段で、各個々の試薬および酵素ならびに各プライマーまたはプローブのための異なる容器も含む。キットはまた、ここに記載するアッセイの一つを実施するための種々のデバイスおよび試薬および／またはここに定義するＳＮＰの存在を同定するためにキットを使用する指示書も特徴とし得る。
【０２４６】
ある態様において、ここに一般に記載する方法は、少なくとも一部、適当にプログラムされたコンピューターシステムのようなプロセシングシステムにより実施する。上記方法の実施を可能とするマイクロプロセッサ実行アプリケーションソフトウェアを伴う独立コンピューターを使用し得る。あるいは、本方法を、少なくとも一部、分散型アーキテクチャの一部として動作する１個以上のプロセシングシステムにより実施できる。例えば、プロセシングシステムを使用して、核酸分子に対するプローブのハイブリダイゼーションの検出により、ＳＮＰの存在を検出できる。プロセシングシステムを使用して、また、１個以上のＳＮＰｓの検出に基づき、細菌のグラム呈色、正体またはグループ分けまたは真菌の正体またはグループ分けの決定ができる。ある例において、使用者によりプロセシングシステムに入力されたコマンドは、プロセシングシステムがこれらの決定を為すことを助ける。
【０２４７】
一例において、プロセシングシステムは、バスにより相互接続された、少なくとも１個のマイクロプロセッサ、記憶、入力／出力装置、例えばキーボードおよび／またはディスプレイおよび外部インターフェースを含む。外部インターフェースを使用して、プロセシングシステムを末端デバイス、例えば通信ネットワーク、データベースまたは保存デバイスに接続できる。マイクロプロセッサは、実施すべきＳＮＰ検出および／または微生物同定または分類処理を可能にするためならびにコンピューターシステムとの接続のような、あらゆる他の必要な処理を実施するためにメモリに保存されたアプリケーションソフトウエアの形で指示を実行する。アプリケーションソフトウェアは１種以上のソフトウェアモジュールを含み、オペレーティングシステム環境などのような適当な実行環境で実行させ得る。
【０２４８】
５. 本発明の方法の適用
本発明の方法は、対象からのサンプルまたは土壌または水サンプルのような環境サンプルまたは機器または装置(例えば医療器具または手術器具)表面または作業場表面から採ったサンプルのようなサンプル中の微生物の分類および／または同定に有用である。このような分類または同定は、次いで、微生物を除去する、根絶するまたは数を減らすための種々の処理の決定に使用できる。本発明の方法の任意の２個以上を組み合わせてよい。例えば、サンプルからの核酸を、本発明の方法を使用して１６ＳｒＲＮＡ遺伝子におけるＳＮＰｓの存在および５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓの存在を分析できる。これは、グラム陽性菌、グラム陰性菌および／または真菌がサンプルに存在するか否かを決定するために実施できる。ある例において、真菌の正体もここに教示するとおり決定できる。細菌をさらに分類でき、または細菌の正体も決定できるかまたはいくつかの可能性のうちの一つに絞ることができる。例えば、上記の開示から明らかなとおり、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９６位および３９８位に対応する位置におけるＳＮＰｓと、配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３９９位、４００位および４０１位に対応する位置または２７８位、２８６位および６４８位に対応する位置のＳＮＰｓの組み合わせを評価して、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類または同定できる。例えば、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位のＳＮＰｓを評価するならば、サンプル中の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を、上記のとおり７病原体群の一つに分類さきる。次いで、さらなるＳＮＰｓを評価して、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌を分類または同定さえできる。２７８位、２８６位、３９６位、３９８位および６４８位のＳＮＰｓを評価するならば、哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌をグラム陽性またはグラム陰性として決定でき、上記のとおり、さらに同定できるかまたは種の群のひとつとして同定できる。ある例において、サンプル中の細菌または真菌の数が決定されまたは推定される。
【０２４９】
感染または感染が疑われる(例えばＳＩＲＳを有する対象)対象は、しばしば、診療所、救急処置室、一般病棟および集中治療室の医師が遭遇する。このような患者は、しばしば、異常体温、心拍数および呼吸数増加および異常白色細胞数のような非診断的臨床的症状を有する。医師は、患者が感染しているかしていないか、感染の重症度、患者を入院させてよいか否か(既に入院していなければ)、感染源、抗生物質を使用するか否か、そうであれば、抗生物質の種類、経路および用量を決定しなければならない。患者における感染の存在は、最も典型的に患者からサンプルを採取し、培養ブロスで生物を増殖させることにより評価している。生物が増殖したら、グラム染色し、同定し、その抗生物質耐性を決定する。しかしながら、多くの感染患者(＞５０％)で生物の培養が不可能である。生物を同定しなければ、医師は、臨床的判断に、および広域抗生物質のしばしば組み合わせでの使用に頼らなければならない。病原性生物の正体または感受性が分からないままの、見境のない広域抗生物質の使用は、患者に抗生物質耐性、抗生物質の過剰使用および恐らく毒性副作用を起こし得る。さらに、敗血症患者への抗生物質の不適切な使用は、高い死亡率および長期入院を招く(Garnacho-Montero, J. et al. (2008) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 61, 436-441)。血液培養は鋭敏な方法(１〜１００cfu／mL)であるが、それは採取した血液サンプルが生存生物を含んでいる場合に限られ、敗血症の患者で常に当てはまるわけではない(Coburn B, Morris AM, Tomlinson G, Detsky AS (2012) Does this adult patient with suspected bacteremia require blood cultures? JAMA 308: 502-511. doi:10.1001/jama.2012.8262.)
【０２５０】
それゆえに、本発明の方法は、医師が、ＳＩＲＳを呈する対象のような対象が感染(例えば敗血症)を有するか否か、そうであれば、感染の原因微生物の分類に基づく適切な処置過程の決定をすることを助けるのに特に有用である。実施例６に示されるように、本発明の例示方法において、検出限界は、微生物の培養より１０〜１００倍鋭敏である。さらに、本発明の方法は、対象からの全血サンプル(例えば敗血症が疑われる)採取後、３時間以内でのグラム陽性生物およびグラム陰性生物ならびに真菌の識別を容易にする。本発明の方法はまた、医師が結果を、数日ではなく数時間以内に利用できるような時間効率の良い方法で実施できる。このような特質により、医師は微生物の存在を感受性に検出かつ定量し、細菌のグラム呈色またはさらなるグループ分けまたは同定に特異的な抗生物質または真菌に特異的な抗真菌剤の使用に対して情報を得た上で決定することが可能となる。これらの改善は、不要な入院を強いられる患者の数を減らし、微生物の鋭敏に検出をし、負荷(および他の因子)で感染の重症度を評価し、広域抗生物質の使用を減らし、患者が広域抗生物質投与される時間を減らし、抗生物質からの毒性を減らし、抗生物質耐性の発生を減らすことを可能とする。表２５および２６は、先行技術の方法および本発明の方法(表中には“ＳＮＰアッセイ”と記す)を使用する、微生物感染の検出および識別に基づき、医師が決定をなすために利用可能となるタイムラインの例を示す。
【０２５１】
【表８６】
2016520314.tif 000087
【０２５２】
【表８７】
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【０２５３】
それゆえに、本発明はまた対象における敗血症の診断および陽性診断後の敗血症の管理にも拡張される。５.８Ｓ  ｒＲＮＡ内の１個以上のＳＮＰｓおよび／または１６Ｓ  ｒＲＮＡ内の１個以上のＳＮＰｓを分析するここに記載する方法を使用して、対象が血液中に真菌および／または細菌感染を有するかを決定し、さらに血液中の細菌をグラム陽性またはグラム陰性として分類しおよび／または細菌および／または真菌の群または種を同定できる。細菌および／または真菌負荷(すなわち細菌または真菌の数)も決定できる。
【０２５４】
対象がＳＩＲＳを呈し、ここに適用する方法を使用して敗血症の診断ができない場合、すなわち細菌または真菌細胞がここに適用する方法を使用して対象からのサンプルで同定されない場合、ｉｎＳＩＲＳの診断を消去法によりなし得る。ある例において、診断を確認するためのさらなる試験を実施できる。それゆえに、本発明はまた、対象におけるｉｎＳＩＲＳの診断および診断後のｉｎＳＩＲＳの管理に拡張される。
【０２５５】
５.１ さらなるアッセイおよび試験
ある例において、本発明の方法を、微生物の同定もしくは分類または微生物の特徴づけのための他の方法と組み合わせて実施する。例えば、細菌の抗生物質感受性または毒性因子の存在を、本発明の方法を使用してグループ分けまたは正体が決定した後に評価できる。
【０２５６】
抗生物質感受性アッセイを、培養方法または分子試験を使用して実施でき、このような方法は当業者に周知である。細菌の最初の培養を必要とする種々の商業的システムが利用可能であり、BiomerieuxのEtest(登録商標)を含む。このようなシステムは、広範な抗生物質の最小阻止濃度の決定を可能にする。
【０２５７】
分子試験はまた抗生物質耐性遺伝子の存在を同定するよう開発されている(例えばHuletsky, A. et al. (2004) Journal of Clinical Microbiology 42, 1875-1884; Wattersonet al. (1998) Journal of Clinical Microbiology 36, 1969-1973参照)。ＯＲＳＡについての分子試験は、ｍｅｃＲ１(またはｍｅｃＡまたはタンパク質ＰＢＰ２ａ)の存在を検出するよう設計されたＰＣＲアッセイを使用して達成できる。種々の方法は、Fang & Hedin (2006) Journal of Clinical Microbiology 44, 675; Huletsky, A. et al. (2004) Journal of Clinical Microbiology 42, 1875-1884および米国特許番号８,３６２,２２８に記載されたものを含む。ＶＲＥについての分子試験は、ＶａｎＡおよび／またはＶａｎＢの存在を検出するよう設計されたＰＣＲアッセイを使用して達成できる。特定の試験は、Cantarelli. et al. (2011) Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 44, 631-632; Fang et al. (2012) Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31, 261-265および米国特許公開番号２００５００５８９８５Ａ１に記載のものを含む。ＱＲＥＣ(フルオロキノロン耐性)についての分子試験は、ｇｙｒＡおよびｐａｒＣにおける変異を検出するよう設計されたＰＣＲアッセイを使用して達成できる。種々の方法は、Jurado et al. (2008) J. Vet. Diagn. Invest. 20, 342-345; Karczmarczyk et al. (2011) Appl. Environ. Microbiol. 77, 7113-7120；米国特許公開番号２０１００１３６５２３Ａ１；および国際特許公開番号ＷＯ２００００２４９３２に記載のものを含む。ＥＳＢＬ(セフタジジム耐性)についての分子試験は、ｂｌａ(ＳＨＶ)および変異を検出するよう設計されたＰＣＲアッセイを使用して実施できる(例えば、Alfaresi et al. (2010) Indian J Med Microbiol 28, 332; Randegger et al. (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45, 1730-1736および米国特許公開番号２０１３００６５７９０Ａ１参照)。
【０２５８】
多くの抗生物質耐性遺伝子および機序が当分野で周知である(Liu B, Pop M. ARDB-Antibiotic Resistance Genes Database. Nucleic Acids Res. 2009 Jan;37 (Database issue):D443-7; http://ardb.cbcb.umd.edu/参照)。多く見られる抗生物質耐性機序のいくつかを表２７に詳述する。
【表８８】
2016520314.tif 000089
【０２５９】
重要な既知耐性細菌属の各々における耐性の主要機序を表２８に記載し、主要機構に下線を付す。
【表８９】
2016520314.tif 000090
【表９０】
2016520314.tif 000091
【０２６０】
【表９１】
2016520314.tif 000092
【表９２】
2016520314.tif 000093
【０２６１】
【表９３】
2016520314.tif 000094
【０２６２】
微生物毒性遺伝子および機序も周知であり、既知病原体の毒性機序および因子、例えば病原菌の毒性因子のオンラインデータベース(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)およびＬＬＮＬ毒性データベース(http://mvirdb.llnl.gov/)がある。それゆえに、ここに記載する方法を使用して原因病原体が同定されたら、当業者は、毒性因子遺伝的決定因子についての特異的検出アッセイを容易に設計および／または実施できる。スダフィロコッカス属、エンテロコッカス属、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)およびクレブシエラ属における種々の毒性因子を決定するためのアッセイの例は、米国特許公開番号ＵＳ２００８０１２４７３およびＵＳ２００６０１９４２０６；国際特許公開番号ＷＯ２００３０５２１４３；欧州特許公開番号２２３１８５１；Pichon, B. et al. (2012) J. Antimicrob. Chemother. 67, 2338-2341; Lenz et al. (2010) Food Microbiol 27, 317-326 (2010); Margot et al. (2013) J Food Prot 76, 871-873; and Huang et al. (2012) BMC Microbiol. 12, 148に記載のものを含む。いくつかの重要な哺乳動物(例えば、ヒト)病原体の重要な毒性因子の非限定的例を表２９に挙げる。
【０２６３】
【表９４】
2016520314.tif 000095
【表９５】
2016520314.tif 000096
【０２６４】
５.２ 管理および治療
本発明の方法の結果に基づき、対象を適切に管理でき、必要に応じて治療剤を投与できる。例えば、ｉｎＳＩＲＳの管理は、例えば、血管作動性化合物、ステロイド類および抗腫瘍壊死因子剤のような治療剤の投与を含む。さらに、静脈内輸液および酸素および厳格な血糖管理のような、例えばCohen and Glauser(1991, Lancet 338: 736-739)に記載のような臓器機能回復および保護を目的とする対症的治療を使用できる。
【０２６５】
敗血症が診断され、さらに微生物の分類、グループ分けまたは同定が為されたら、施術者は、その後、感染を管理するための適切なレジメンを決定できる。これは、抗生物質、抗真菌剤またはエンドトキシンに対する抗体のような１種以上の治療剤の投与を含み得る。敗血症の適切な治療は当業者に周知であり、例えば、 Healy (2002, Ann. Pharmacother. 36(4): 648-54) and Brindley (2005, CJEM. 7(4): 227)およびJenkins (2006, J Hosp Med. 1(5): 285-295)にレビューされている。
【０２６６】
典型的に、治療剤は、医薬(または対象が非ヒト対象であるならば動物用医薬)組成物で、薬学的に許容される担体と共に、意図する目的を達成する有効量で投与される。対象に投与する活性化合物の投与量は、対象に時間と共に、敗血症またはｉｎＳＩＲＳの症状の軽減または症状からの解放および／または血液からの微生物の軽減または排除のような、有益な応答を達成するのに十分でなければならない。投与する薬学的活性化合物の量は、年齢、性別、体重および一般的健康状態を含む、処置する対象に依拠し得る。この点に関し、投与すべき活性化合物の厳密な量は、施術者の判断による。敗血症またはｉｎＳＩＲＳの処置または予防において投与すべき活性化合物の有効量の決定に際し、施術者は、敗血症の場合感染の重篤度ならびに炎症、血圧異常、頻脈、頻呼吸、発熱、悪寒、嘔吐、下痢、皮膚発疹、頭痛、錯乱、筋肉痛、発作を含む敗血症またはｉｎＳＩＲＳに伴う症状の重症度を評価し得る。いずれにしても、当業者は、過度の実験を行うことなく、治療剤の適当な投与量および適当な処置レジメンを決定できる。
【０２６７】
治療剤を、主要臓器への酸素供給を高め、主要臓器への血流を増加させおよび／または炎症性応答を軽減するための、補助的(対症的)治療剤と共に投与し得る。このような臍的治療剤の説明例は、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤｓ)、静脈内食塩水および酸素を含む。
【０２６８】
本発明が容易に理解され、実際的効果に換言され得るために、ここで、特定の好ましい態様を次の非限定的例の方法で述べる。
【実施例】
【０２６９】
実施例１
グラム陰性原核生物およびグラム陽性原核生物を識別するための１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓの同定
１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子をコードする代表的遺伝子をGenBankからダウンロードし、CLUSTALWを使用して整列して、保存配列領域を決定した。CLUSTALW整列化により決定した可変配列を除去し、配列をCLUSTALWを使用して再整列し、さらなる可変領域について確認した。この工程を数回繰り返した。続いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする全遺伝子の最終保存メガアラインメントを製造し、約７０２塩基対保存配列領域からなった。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)(GenBank accession NR_074891)からの例示的１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を配列番号１に示し、７０２塩基対保存領域は、配列番号１のヌクレオチド２５４〜９５５にわたる。
【０２７０】
整列配列を分析し、２個のＳＮＰｓが大部分のグラム陽性菌とグラム陰性菌を識別するのに十分であることが判明した。２個の同定したＳＮＰｓは配列番号１に示すエシェリキア・コリ(Escherichia coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡの３９６位および３９８位であり、ＳＮＰ  ３９６およびＳＮＰ  ３９８と呼ぶ。これら２個のＳＮＰｓを使用して大部分のグラム陽性とグラム陰性原核生物を識別する一般的規則を表３０に記載する。
【表９６】
2016520314.tif 000097
【０２７１】
実施例２
ＳＮＰ  ３９６およびＳＮＰ  ３９８を使用するグラム陰性原核生物とグラム陽性原核生物のインシリコ識別
インシリコ分析を使用して、ＳＮＰｓ  ３９６および３９８のみを使用してどの原核生物をグラム呈色に基づいて分類できるかを評価した。１２個の１２塩基対プローブ(ＧＣ(Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ)Ａ(Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ)Ｇ(ＣＣ／ＴＡ)ＧＣＧＴ；配列番号２)をＢＬＡＳＴ検索で使用し、３９６位および３９８位(番号付けは配列番号１に示すエシェリキア・コリ(Escherichia coli)１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応)にまたがる原核１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を同定し、結果を分析して、ＳＮＰｓに基づきどの種がグラム陽性またはグラム陰性として正確に分類できたかを決定した。
【０２７２】
表３１は、ＳＮＰ  ３９６位および３９８位のみに基づきグラム陰性またはグラム陽性に分類した最も一般的な哺乳動物病原体の一覧である。ＳＮＰ座３９６および３９８のそれぞれにＡおよびＣまたはＧおよびＣを有するいくつかのグラム陰性菌、例えばヘリコバクター属、ベイロネラ属、バクテロイデス属、カンピロバクター属、クラミドフィラ属を除き、ほとんどの病原体を、これら２個のＳＮＰｓに基づきグラム陰性またはグラム陽性に分類できた。
【表９７】
2016520314.tif 000098
【表９８】
2016520314.tif 000099
【０２７３】
表３２は、Janssen et al. (Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72, 1719-1728)において同定されている最も一般的な土壌細菌について３９６位および３９８位のＳＮＰｓを示す。
【表９９】
2016520314.tif 000100
【０２７４】
表３３は、Hewitt et al. (PLoS ONE(2012) 7, e37849)により同定された労働環境で見られる広範なグラム陽性原核生物およびグラム陰性原核生物の３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを示す。
【表１００】
2016520314.tif 000101
【０２７５】
表３４は、Brecher et al. (2005) Clinical Microbiology Reviews 18, 195-204)において同定された汚染赤血球および血小板製剤で見られる一般的な細菌についての３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを示す。
【表１０１】
2016520314.tif 000102
【０２７６】
表３５は、Son et al. (J Korean Med Sci (2010) 25, 992 (2010)およびGene website(www.seegene.com)およびSeptifast website(www.roche.com)において同定されるヒト血流感染(敗血症)で見られる一般的な細菌についての３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを示す。
【表１０２】
2016520314.tif 000103
【０２７７】
表３６は、Claesson et al. (Nucl Acids Res (2010) 38(22), e200)において同定される次世代配列決定技術を使用したときヒト糞便サンプルに見られる最も一般的な細菌について３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを示す。
【表１０３】
2016520314.tif 000104
【０２７８】
それゆえに、３９６位および３９８位でのＳＮＰｓは、土壌、職場環境、血液製剤汚染物、哺乳動物(例えば、ヒト)糞便物質、大部分の哺乳動物(例えば、ヒト)細菌病原体および哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症に一般に見られる大部分の病原体で見られる最も一般的な細菌生物を含むグラム陰性原核生物から、多数のグラム陽性原核生物を識別できる。
【０２７９】
実施例３
ＳＮＰｓを使用するグラム陰性およびグラム陽性敗血症関連細菌のインシリコ識別
実施例２(表３１)に示すとおり、３９６位および３９８位のＳＮＰｓを使用して哺乳動物(例えば、ヒト)病原体のグラム呈色が決定できない例が少数あった。これらの病原体は、ヘリコバクター属、ベイロネラ属、一部のバクテロイデス属、カンピロバクター属およびクラミドフィラ属のグラム陰性属を含む。最も一般的な哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌(例えばスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、緑色連鎖球菌群(ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)またはプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica))は、３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを使用してグラム陰性またはグラム陽性と分類され得るが、哺乳動物(例えば、ヒト)において敗血症の原因となり得る他の細菌、例えばカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)およびベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosa)は、３９６位および３９８位のＳＮＰｓを使用して分類できなかった。
【０２８０】
配列分析を実施して、どのＳＮＰｓが、一般的なおよびやや一般的ではない哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症関連細菌(スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、緑色連鎖球菌群(ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラータス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)およびストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis))、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、プレボテラ・ブカエ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クラミドフィラ・アボルタス(Chlamydophila abortus)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・デンティカリオシ(Veillonella denticariosi)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ストレプトマイセス・アヌラツス(Streptomyces anulatus)、ストレプトマイセス・��マリエンシス(Streptomyces somaliensis)およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis))を、グラム呈色に基づき分類できるかを決定した。２７８位、２８６位および６４８位(番号付けは配列番号１に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応する)の他の３個のＳＮＰｓが、３３種の哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の分類に使用できることが判明した。それゆえに、３９６位、３９８位、２７８位、２８６位および６４８位の計５個のＳＮＰｓを使用して、これらの哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体のグラム呈色を決定できる。
【０２８１】
５個のＳＮＰｓを使用して哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症の原因となる３３種のグラム陽性原核生物およびグラム陰性原核生物を分類する一般的規則は次のとおりである。
３９６位がＣであるならば、細菌はグラム陰性であり、表３７の種を含む；そして３９６位がＡまたはＧであるならば、細菌はグラム陽性であり、表３８の種を含む。
【表１０４】
2016520314.tif 000105
【０２８２】
【表１０５】
2016520314.tif 000106
【０２８３】
３９６位、３９８位および２７８位がＡ、ＣおよびＴ(それぞれ)であるならば、細菌はグラム陰性であり、表３９の種を含む；そして３９６位、３９８位および２７８位がＡ、ＣおよびＣ(それぞれ)であるならば、細菌はグラム陽性であり、表４０の種を含む。
【表１０６】
2016520314.tif 000107
【０２８４】
【表１０７】
2016520314.tif 000108
【０２８５】
３９６位、３９８位および２７８位がＡ、Ｃ、Ｇであり、２８６位がＡであるならば、細菌はグラム陽性であり、表４１の種を含む。
2016520314.tif 000109
【０２８６】
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ａであるならば、細菌はグラム陽性であり、表４２の種を含む。
【表１０８】
2016520314.tif 000110
【０２８７】
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ｇであり、６４８位がＧであるならば、細菌はグラム陰性であり、表４３の種を含む。
３９６位、３９８位、２７８位、２８６位がＡ、Ｃ、Ａ、Ｇであり、６４８位がＡであるならば、細菌はグラム陽性であり、表４４の種を含む。
【表１０９】
2016520314.tif 000111
【０２８８】
【表１１０】
2016520314.tif 000112
【０２８９】
３９６位、３９８位、２７８位および２８６位がＡ、Ｃ、ＧおよびＧ(それぞれ)であり、６４８位がＧであるならば、細菌はグラム陰性であり、表４５の種を含む。
３９６位、３９８位、２７８位および２８６位がＡ、Ｃ、ＧおよびＧおよび６４８位がＡまたはＴであるならば、細菌はグラム陽性であり、表４６の種を含む。
【表１１１】
2016520314.tif 000113
【０２９０】
【表１１２】
2016520314.tif 000114
【０２９１】
実施例４
真菌真核生物と原核生物および他の真核生物を識別する、５.８Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓの同定および位置
真菌(酵母を含む)真核生物と他の真核生物およびまた原核生物を識別できる５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを同定するために、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)からの代表的５.８Ｓ  ｒＲＮＡ配列をGenBankからダウンロードし、CLUSTALWを使用して整列して、保存配列領域を決定した。CLUSTALW整列化により決定した可変配列を除去しおよび配列をCLUSTALWを使用して再整列し、さらなる可変領域について確認した。この工程を数回繰り返した。真菌および４種の哺乳動物５.８Ｓ  ｒＲＮＡの最終保存メガアラインメントを製造し、これは約１２６塩基対保存配列からなった。この１２６塩基対配列は、配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド１３４〜２５９および配列番号３に示すヒト５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド１〜２２２に対応する。異なる真菌、酵母および哺乳動物種は、この領域全体にわたり長さおよび塩基対組成がわずかに異なる。
【０２９２】
配列の分析により、１４２位、１４４位、１４６位、１４７位、１４８位、１５４位、１５７位、１６４位、１６７位、１８５位、１８７位、１８８位、１９４位、１９７位、２１３位、２１５位、２１６位、２１９位、２２３位、２３１位、２３２位、２３６位、２４５位、２５１位、２５６位(番号付けは配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡに対応する)のいずれか一箇所のＳＮＰｓの決定が、一般的な真菌および酵母ヒト病原体核酸を、哺乳動物宿主核酸と識別することが判明した。これらの５.８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＳＮＰｓを使用して、真菌を、哺乳動物と識別する一般的規則を表４７に示す。
【表１１３】
2016520314.tif 000115
【０２９３】
実施例５
哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体の識別
７真菌種、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)は既知哺乳動物(例えば、ヒト)病原体である。これらの病原体の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ配列をGenBankからダウンロードし、上の実施例４に記載する〜１２６bp保存領域をCLUSTALWを使用して整列した。
【０２９４】
配列分析を実施し、最小４個のＳＮＰｓがこれらの病原体の識別および同定に使用できることを決定した。これらのＳＮＰｓは、配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２５４位に対応する位置；配列番号２の１６０位または２５５位に対応する一箇所；および配列番号２の１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位に対応する二箇所のものを含む。
【０２９５】
それゆえに、４個のＳＮＰｓの種々の組み合わせが、７種の哺乳動物(例えば、ヒト)真菌病原体を識別し、ここで、４個のＳＮＰｓは、２５４位；１６０位または２５５位のいずれか一箇所；および１６３位、１６４位、１６５位、１９６位、２０２位、２２３位、２２４位または２５９位のいずれか二箇所のものを含む。表４８は、各病原体の各位置のＳＮＰｓを示す。ＳＮＰｓ  １６４および２２３をまた酵母／真菌を哺乳動物と識別するために使用できるため、１６４または２２３の組み合わせ使用は、哺乳動物バックグラウンドでの７種の病原性真菌種の完全な識別を可能にする。
【表１１４】
2016520314.tif 000116
【０２９６】
実施例６
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症に一般に見られるグラム陰性原核生物およびグラム陽性原核生物および真菌真核生物の識別および定量
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症において一般に見られるグラム陰性原核生物およびグラム陽性原核生物および真菌真核生物を識別および定量するために、アッセイを実施した。
【０２９７】
Ａ. １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓ検出および細菌の定量のためのプライマー、プローブおよび標準
Primer Express 2.0(Applied Biosystems)ソフトウェアを使用して、原核生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの３９６位、３９８位、２７８位、２８６位および６４８位でのＳＮＰｓを決定するためのTaqMan(登録商標)ＭＧＢプローブおよびプライマーを設計した。合計、８対の順方向および逆方向プライマーおよび１６個のプローブをこれらのＳＮＰｓのために設計した。下記プライマーとプローブの組み合わせを使用して、実施例３に記載する哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体を、グラム呈色に基づき、分類できる。
【０２９８】
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡの３９６位および３９８位でのＳＮＰを検出するためのプライマーおよびプローブ：
プローブ配列：グラム陽性菌についてＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号４)およびＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号５)；およびグラム陰性菌についてＧＣＣＡＡＧＴＡＧＣＧＴ(配列番号６)およびＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号７)。
【０２９９】
順方向プライマー配列：グラム陰性菌およびグラム陽性菌についてＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ(配列番号８)。逆方向プライマー配列：グラム陰性菌についてＧＣＣＡＧＣＡＧＣＹＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ(配列番号９)およびグラム陽性菌についてＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ(配列番号１０)。
【０３００】
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡの２７８位および２８６位でのＳＮＰｓを検出するためのプライマーおよびプローブ
プローブ配列：グラム陰性菌についてＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号１１)、ＧＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＴＡＡ(配列番号１２)、ＧＣＴＴＴＧＡＣＧＣＡＴＡＡ(配列番号１３)、ＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＧＴＡＴ(配列番号１４)、ＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号１５)およびＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＣＴＡＧ(配列番号１６)；およびグラム陽性菌についてＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＴＡＧ(配列番号１７)、ＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧ(配列番号１８)およびＧＣＣＡＣＧＡＴＡＣＡＴＡＧ(配列番号１９)。
【０３０１】
順方向プライマー配列：グラム陰性菌についてＴＧＷＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＣＧＴＣ(配列番号２０)、ＴＧＴＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＴＷ(配列番号２１)およびＴＡＡＲＲＧＡＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＣ(配列番号２２)；およびグラム陽性菌についてＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＹ(配列番号２３)およびＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴ(配列番号２４)。
【０３０２】
逆方向プライマー配列：グラム陰性についてＡＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧ(配列番号２５)、ＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧ(配列番号２６)およびＧＴＧＡＷＣＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧ(配列番号２７)；およびグラム陽性についてＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＲＡＣＴ(配列番号２８)。
【０３０３】
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡの６４８位でのＳＮＰｓを検出するためのプライマーおよびプローブ：
プローブ配列：グラム陰性についてＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧ(配列番号２９)；およびグラム陽性についてＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧ(配列番号３０)およびＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＧ(配列番号３１)。
【０３０４】
順方向プライマー配列：グラム陰性についてＴＡＡＣＣＣＣＧＴＧＡＫＧＧＧＡＴＧＧＡ(配列番号３２)；およびグラム陽性についてＣＡＡＣＣＧＫＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡ(配列番号３３)。
【０３０５】
逆方向プライマー配列：グラム陰性についてＴＣＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ(配列番号３４)；およびグラム陽性についてＣＡＲＲＡＧＲＧＧＡＲＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ(配列番号３５)。
【０３０６】
プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems(Life Technologies, USA)のCustom TaqMan登録商標)遺伝子発現アッセイとして合成した。全グラム陰性プローブをＶＩＣTM蛍光標識で標識し、全グラム陽性プローブをＦＡＭTM蛍光標識で標識し、一反応中でのグラム陰性菌種とグラム陽性菌種の識別を可能にした。
【０３０７】
定量的リアルタイムＰＣＲのために、各グラム陽性およびグラム陰性プローブおよびプライマーセットで反応を繰り返した。各主要細菌群の標準曲線を作成するために、表４９に示すＡＴＣＣ対照を製造した。
【表１１５】
2016520314.tif 000117
【０３０８】
各標準を２個作製し、典型的ＰＣＲラン形式を次のとおり調製した。チューブ１〜１６：１：１０に連続希釈したスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)ATCC25923  ＤＮＡを含む396398 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。これにより標準曲線が作成される。チューブ１７〜３２：連続希釈した血液添加細菌ＤＮＡを含む396398 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。チューブ３３〜４８：１：１０に連続希釈したスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)ATCC25923  ＤＮＡを含む396398 GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。これにより標準曲線が作成される。チューブ４９〜６４：連続希釈した血液添加細菌ＤＮＡを含む396398GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。チューブ６５〜６６：鋳型対照なしの396938 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。チューブ６７〜６８：鋳型対照なしの396398 GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。このプロトコールを全グラム陽性およびグラム陰性プローブについて適用した。
【０３０９】
ＰＣＲ反応物(デュプリケートで)を次のとおり製造した。１μL  ２０ｘ  TaqMan遺伝子発現アッセイ；１０μL  ２ｘ  TaqMan遺伝子発現Master Mix；４μL  ＤＮＡ鋳型(１〜１００ng)；５μL  ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含水。ＰＣＲ反応物をRotor-Gene Q Real-Time PCR装置(Qiagen, Australia)に移し、ＰＣＲを次の条件で実施した。５０℃で２分；９５℃で１０分；次いで４５サイクルの９５℃で１５秒および６０℃で１分。
【０３１０】
Rotor-Gene Q v.2.1.0.9ソフトウェアを使用して、各々連続希釈した次の対照について標準曲線を作成した。グラム陽性対照：スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ATCC25923；グラム陰性対照：エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＡＴＣＣ２５９２２。
【０３１１】
Ｂ. ５.８Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓを検出するためのプライマーおよびプローブ
カンジダ属およびアスペルギルス属について５.８Ｓ  ｒＤＮＡ配列をGenBankからダウンロードし、上記のとおり整列した。Primer Express 2.0(Applied Biosystems)を使用して、１６４位および１６５位のＳＮＰｓを使用する酵母および真菌種の同定に特異的なTaqMan(登録商標)ＭＧＢプローブおよびプライマーを設計した。
【０３１２】
TaqMan(登録商標)ＭＧＢ  ＦＡＭプローブ配列はＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡ(配列番号３６)であり、TaqMan(登録商標)ＭＧＢ  ＶＩＣプローブ配列はＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＡＴＣＧＡ(配列番号３７)であり、順方向プライマー配列はＴＡＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＡＴＴＡＴＣＧＴＡＡＴＣ(配列番号３８)およびＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＡＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴ(配列番号３９)であり；逆方向プライマー配列はＧＣＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣ(配列番号４０)であった。プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems (Life Technologies, USA)によるCustom TaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイとして合成した。
【０３１３】
実施例７
ＳＮＰｓを使用する一般的な哺乳動物(例えば、ヒト)病原菌の分類および定量
抗生物質選択、富化培地選択、どの抗生物質耐性試験を行うかおよびどの微生物毒性試験を行うかのような下流決定を可能にする、広い群への一般的な哺乳動物(例えば、ヒト)病原体の分類および定量は、最初にＤＮＡを生体サンプルから抽出し、細菌を上記グループ１〜７の一つに分類するためにプローブを使用して、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を包含する細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの１８１塩基対領域を増幅するために多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施することを含む。細菌ＤＮＡが検出されたら、第二反応を実施して、さらに細菌を下位群に分類でき、それにより、細菌の正体および／または特徴についてのさらなる情報を提供し、これは、医師が適切な処置過程の選択のために使用できる。正確な細菌の正体および／または抗生物質耐性および／または毒性を決定するためのさらなる調査は、文献に記載されているような標準的で周知の分子技法を使用して実施できる。
【０３１４】
第一工程において、何らかの細菌ＤＮＡを、Biomerieux(NucleSENS EasyMAG(登録商標))およびBecton Dickinson(BD MAX(登録商標))からの自動化システムの使用を含むが、これらに限定されない当分野で知られる任意の方法を使用して、生体サンプルから抽出する。Polaris(登録商標)(Biocartis)およびMolYsis(登録商標)(MolZym)を含む、特殊化キット／システムも、全血から細菌ＤＮＡを濃縮および抽出するのに利用可能である。多重ＲＴ−ＰＣＲ反応(反応１)を、次いで、細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡの同じ１８１塩基対領域を増幅する２対の順方向および逆方向プライマーを使用して実施する：順方向プライマーは配列ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ(配列番号８)を有し、逆方向プライマーは配列ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ(配列番号２７８)を有し、これは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の大部分からの配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド３３８〜５３６に対応する領域を増幅し、順方向プライマーは配列ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴ(配列番号２７９)を有し、逆方向プライマーは配列ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ(配列番号２８０)を有し、これは、クラミジア属およびクラミドフィラ属からの同じ領域を増幅する。反応１はまた７個の１２塩基対プローブも含み、各プローブは異なる色素を有し、３９６位、３９８位、３９９位、４００位および４０１位を包含する。プローブは次のとおりであり、５’から３’方向で、ＳＮＰｓは下線を付している。
プローブ１＝ＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴ  (配列番号２８１)
プローブ２＝ＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴ  (配列番号２８２)
プローブ３＝ＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴ  (配列番号２８３)
プローブ４＝ＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴ  (配列番号２８４)
プローブ５＝ＡＧＣＣＡＴＡＣＣＧＣＧＴ  (配列番号２８５)
プローブ６＝ＡＧＣＣＡＡＧＴＡＧＣＧＴ  (配列番号２８６)
プローブ７＝ＡＧＣＣＡＡＧＴＣＧＣＧＴ  (配列番号２８７)
【０３１５】
細菌ＤＮＡがサンプル中に十分な濃度で存在するならば、これらのプライマーは、クラミジア属ｌ種を含む、GenBankデータベースに存在する７０００を超える細菌種からの核酸を増幅する。７個のプローブは、細菌を大まかに７群に分類する。グループ１は大部分グラム陽性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の１８００を超える細菌種の存在を同定する；グループ２は大部分グラム陽性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の２２００を超える細菌種の存在を同定する；グループ３はグラム陰性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の２３００を超える細菌種の存在を同定する；グループ４はグラム陰性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の８００を超える細菌種の存在を同定する；グループ５はグラム陰性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の４６細菌種の存在を同定する(大部分ステノトロホモナス属)；グループ６はグラム陰性嫌気性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の８２細菌種の存在を同定する(大部分バクテロイデス属およびプレボテラ属)；グループ７はグラム陰性嫌気性生物を含み、１２塩基対プローブ、順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、この群の３３細菌種を同定する(大部分ポルフィロモナス属)。
【０３１６】
反応１で陽性結果となったら、第二工程を実施し、これは、反応１の産物の１：１００への希釈、反応１と同じ順方向および逆方向プライマーおよび各哺乳動物(例えば、ヒト)病原体群について表７に挙げるプローブを含む多重反応２に添加する。例えば、反応１がグループ１細菌について陽性であるならば、反応産物を１：１００に希釈し、配列番号８に示す順方向および逆方向プライマー対および２７８およびグラム陽性プローブ１ａ(配列番号２８８)、１ｂ(配列番号２８９)、１ｃ(配列番号２９０)、１ｄ(配列番号２９１)、１ｅ(配列番号２９２)、１ｆ(配列番号２９３)、１ｇ(配列番号２９４)、１ｈ(配列番号２９５)、１ｉ(配列番号２９６)、１ｊ(配列番号２９７)、１ｋ(配列番号２９８)、１ｌ(配列番号２９９)を含む反応に添加する。多重化および利用可能な色素数の限界から、各反応は適切な数のプローブに制限され得る。例えば、２個の反応を実施でき、一方はプローブ１ａ〜１ｇおよび他方はプローブ１ｈ〜１ｌを含む。プローブのいずれかでの陽性結果は、グループ分けおよびサンプル中の可能性のある細菌の正体を示す。例えば、プローブ１ａを使用して陽性結果が得られたならば、サンプルに存在する細菌は、バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択される、バンコマイシン耐性の可能性があるグラム陽性菌である。表５０は、上記方法を使用したサンプルにおける、細菌の分類およびグループ分けに使用できるプローブおよび各プローブを使用して同定された、同定細菌の特徴を示す。
【０３１７】
【表１１６】
2016520314.tif 000118
【表１１７】
2016520314.tif 000119
【０３１８】
【表１１８】
2016520314.tif 000120
【表１１９】
2016520314.tif 000121
Ｇｍ＋ｖｅ＝グラム陽性
Ｇｍ  −ｖｅ＝グラム陰性
ＶＲＥ＝バンコマイシン耐性エンテロコッカス
ＯＲＳＡ＝オキサシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)。
ＥＳＢＬ＝広域ベータ−ラクタマーゼ
【０３１９】
第三の工程を実施でき、これは、文献に記載されているような標準分子技法を使用して達成できる、細菌種および／または抗生物質耐性および／または毒性についての特異的試験を含む。
【０３２０】
工程１および２(および実施するならば工程３)の結果が判明したら、細菌定量を、既知量の適切な細菌種対照ＤＮＡおよび標準曲線の作成を使用して上記のように実施する。
【０３２１】
それゆえに、一連の反応の第三または第四工程は、元のサンプルの群への細菌の分類、細菌種決定、抗生物質耐性決定、細菌毒性決定および細菌ＤＮＡの定量を、最初に生物を富化または増殖させることなくできる。このような方法は、現在培養ブロスで生物を増殖するのにかかる時間より短い時間で達成できる。
【０３２２】
実施例８
易感染性、肺炎および嚢胞性線維症患者の気道および呼吸器体液に見られるグラム陰性原核生物およびグラム陽性原核生物および真菌真核生物の識別および定量
易感染性であり、敗血症合併症を伴う肺炎および嚢胞性線維症であるヒト患者の気道および呼吸器体液に一般に見られるグラム陰性原核生物およびグラム陽性原核生物および真菌真核生物の識別および定量をするためにアッセイを実施した。易感染性患者のＢＡＬから単離される一般的な微生物はスタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、アシネトバクター属、キャプノサイトファーガ属、腸内細菌科、ヘモフィルス属、レジオネラ属、シュードモナス属、マイコバクテリウム属、カンジダ属およびアスペルギルス属を含む(Table 2, p 118, Hohenadel IA, et al., (2001) Role of bronchoalveolar lavage in immunocompromised patients with pneumonia treated with a broad spectrum antibiotic and antifungal regimen. Thorax 56: 115-120参照)。急性気管支炎、市中感染肺炎および院内感染肺炎の患者の下部呼吸器に一般に見られる微生物の例は、ボルデテラ属、ストレプトコッカス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、クレブシエラ、腸内細菌科、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モラクセラ属、シュードモナス属、アシネトバクター属、カンジダ属およびアスペルギルス属を含む(Carroll KC (2002) Laboratory Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections: Controversy and Conundrums. Journal of Clinical Microbiology 40: 3115-3120)。嚢胞性線維症患者の気道に一般的に見られる微生物の例は、ヘモフィルス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ステノトロホモナス属、クレブシエラ属、カンジダ属およびアスペルギルス属を含む(Harrison F (2007) Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology (Reading, Engl) 153: 917-923)。
【０３２３】
Ａ. １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓの同定および細菌の定量のためのプライマー、プローブおよび標準
Primer Express 2.0(Applied Biosystems)ソフトウェアを使用して、原核生物の３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを決定するためのTaqMan(登録商標)ＭＧＢプローブおよびプライマーを設計した。合計、１対の順方向および逆方向プライマーおよび３個のプローブをこれらのＳＮＰｓのために設計した。下記プライマーとプローブの組み合わせを使用して、最も一般的なヒト呼吸器細菌病原体を分類できる。
【０３２４】
哺乳動物(例えば、ヒト)敗血症病原体の１６Ｓ  ｒＲＮＡの３９６位および３９８位でのＳＮＰｓを検出するためのプライマーおよびプローブ：
プローブ配列：グラム陽性菌についてＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号４)およびＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号５)；およびグラム陰性菌についてＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴ(配列番号７)。
【０３２５】
順方向プライマー配列：グラム陰性菌およびグラム陽性菌についてＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ(配列番号８)。逆方向プライマー配列：グラム陰性菌およびグラム陽性菌についてＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ(配列番号２７８)。
【０３２６】
プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems(Life Technologies, USA)のCustom TaqMan登録商標)遺伝子発現アッセイとして合成した。全グラム陰性プローブをＶＩＣTM蛍光標識で標識し、全グラム陽性プローブをＦＡＭTM蛍光標識で標識し、一反応中でのグラム陰性菌種とグラム陽性菌種の識別を可能にした。
【０３２７】
定量的リアルタイムＰＣＲのために、各グラム陽性およびグラム陰性プローブおよびプライマーセットで反応を繰り返した。各主要細菌群の標準曲線を作成するために、表５１に示すＡＴＣＣ対照を調製した。
【表１２０】
2016520314.tif 000122
【０３２８】
各標準を２個作製し、典型的ＰＣＲラン形式を次のとおり調製した。チューブ１〜１６：１：１０に連続希釈したスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)ATCC25923  ＤＮＡを含む396398 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。これにより標準曲線が作成される。チューブ１７〜３２：連続希釈した血液添加細菌ＤＮＡを含む396398 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。チューブ３３〜４８：１：１０に連続希釈したスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)ATCC25923  ＤＮＡを含む396398 GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。これにより標準曲線が作成される。チューブ４９〜６４：連続希釈した血液添加細菌ＤＮＡを含む396398GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。チューブ６５〜６６：鋳型対照なしの396938 GRPOS1、278286 GRPOS1および648GRPOS1 Mastermix。チューブ６７〜６８：鋳型対照なしの396398 GRPOS2、278286GRPOS2および648GRPOS2 Mastermix。このプロトコールを全グラム陽性およびグラム陰性プローブについて適用した。
【０３２９】
ＰＣＲ反応物(デュプリケートで)を次のとおり製造した。１μL  ２０ｘ  TaqMan遺伝子発現アッセイ；１０μL  ２ｘ  TaqMan遺伝子発現Master Mix；４μL  ＤＮＡ鋳型(１〜１００ng)；５μL  ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含水。ＰＣＲ反応物をRotor-Gene Q Real-Time PCR装置(Qiagen, Australia)に移し、ＰＣＲを次の条件で実施した。５０℃で２分；９５℃で１０分；次いで４５サイクルの９５℃で１５秒および６０℃で１分。
【０３３０】
Rotor-Gene Q v.2.1.0.9ソフトウェアを使用して、各々連続希釈した次の対照について標準曲線を作成した。グラム陽性対照：スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)ATCC25923；グラム陰性対照：エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＡＴＣＣ２５９２２。
【０３３１】
Ｂ. ５.８Ｓ  ｒＲＮＡ  ＳＮＰｓを検出するためのプライマーおよびプローブ
カンジダ属およびアスペルギルス属の５.８Ｓ  ｒＤＮＡ配列をGenBankからダウンロードし、上記のとおり整列した。Primer Express 2.0(Applied Biosystems)を使用して、１６３位および１６４位のＳＮＰｓを使用して酵母および真菌種を同定するための特異的なTaqMan(登録商標)ＭＧＢプローブおよびプライマーを設計した。
【０３３２】
TaqMan(登録商標)ＭＧＢ  ＦＡＭプローブ配列はＴＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡ(配列番号３２４)であり、TaqMan(登録商標)ＭＧＢ  ＶＩＣプローブ配列はＴＴＣＴＣＧＣＡＴＣＧＡ(配列番号３２５)であり、順方向プライマー配列はＣＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣ(配列番号３２６)およびＴＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣ(配列番号３２７)であり、そして逆方向プライマー配列はＧＡＣＧＣＴＣＧＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧ(配列番号３２８)およびＧＡＣＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＧ(配列番号３２９)であった。プライマーおよびプローブをApplied Biosystems (Life Technologies, USA)によるCustom TaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイとして合成した。
【表１２１】
2016520314.tif 000123
【０３３３】
【表１２２】
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【０３３４】
【表１２３】
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【０３３５】
【表１２４】
2016520314.tif 000126
【０３３６】
【表１２５】
2016520314.tif 000127
【０３３７】
【表１２６】
2016520314.tif 000128
【０３３８】
実施例９
哺乳動物バックグラウンドでの他の真菌病原体からの哺乳動物(例えば、ヒト)カンジダ属真菌病原体の識別
１１種の真菌種、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アジェロミセス・カプスラーツス(Ajellomyces capsulatus)、スタキボトリス属、スケドスポリウム・アピオスペルムム(Scedosporium apiospermum)、フサリウム属、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)は哺乳動物(例えば、ヒト)病原体として知られる。上の実施例４に記載のとおり、これらの病原体の５.８Ｓ  ｒＲＮＡ配列をGenBankからダウンロードし、〜１２６bp保存領域をCLUSTALWを使用して整列した。
【０３３９】
配列分析を実施して、最小２個のＳＮＰｓを使用して、哺乳動物ゲノムバックグラウンドにおいて一般的なカンジダ属病原体を他の真菌病原体と識別できることを決定した。このような識別は、適切な処置レジメンの決定および予後の決定に関して、臨床的に重要である。このような試験はあらゆる臨床サンプルで使用できるが、敗血症および肺炎の診断のために特に血液および気管支肺胞洗浄サンプルと関係する。２個のＳＮＰｓは、配列番号２に示すカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)５.８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１６３位、１６４位に対応する。
【０３４０】
表５８は、各病原体および多数の哺乳動物の各位置でのＳＮＰｓを示す。１６３位および１６４位のＳＮＰｓを酵母／真菌と哺乳動物の識別に使用できるため、これら２個のＳＮＰｓの組み合わせは、哺乳動物バックグラウンドでカンジダ属病原菌種を他の病原性真菌種と完全に識別できる。
【０３４１】
プライマーおよびプローブは、上の実施例８に記載するものである。
【表１２７】
2016520314.tif 000129
【０３４２】
実施例１０
微生物病原体の大まかな分類に基づく抗生物質選択
ここに詳述する本発および得られる微生物病原体の大まかな分類を使用して、下記表５９および６０(例示として)に提供されるような適切な経験的および標的抗生物質治療の選択に関して、より情報に基づく決定がなされ得る。原因病原体により直接的に向かう抗生物質の使用は、費用軽減(狭域抗生物質は広域抗生物質よりはるかに安価)、良好な患者転帰、有害作用発生の可能性低下(クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)感染を含む)および抗生物質耐性発生の可能性低下にいたる。
【表１２８】
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【０３４３】
【表１２９】
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【表１３０】
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【０３４４】
【表１３１】
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【表１３２】
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＊単なる例−抗生物質選択は、しばしば、感染の源(例えば呼吸器対皮膚対腹部対泌尿器)、院内耐性記録、患者併存症およびアレルギーのような他の因子に依存する。
【０３４５】
ここに引用する全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０３４６】
なんらかの文献のここでの引用は、このような文献が本出願に対する“先行技術”として利用可能であったことを認めるものであると解釈してはならない。
【０３４７】
本明細書をとおして、本発明を何らかの一つの態様または特性の特異的集合に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することが目的である。当業者には、それゆえに、本開示に鑑み、本発明の範囲から逸脱することなく、例示した特定の態様に種々の修飾および変更をなし得ることが認識される。全てのこのような修飾および変更は、添付する特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016520314.tif 000143
2016520314.tif 000144
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