(57)【要約】フェムト秒レーザーパルスを用いた、インビボでの化学物質の制御放出のための方法を提供する。この方法は、化学物質が充填されており、金属ナノ粒子に結合されているリポソームを被験者の身体中に注射する工程を含む。次に、レーザーパルス列を、一定のまたは変動するレーザー強度、露光時間、および露光間の時間を用いて、身体の外部からリポソームに適用し、それにより、神経シグナリングを再現するために十分に速いタイムスケールで、リポソームから、制御された量の化学物質を身体に放出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでの化学物質の制御放出のための方法であって、
被験者の身体中にリポソームを注射する工程であって、リポソームは、化学物質が充填されており、かつ、金属ナノ粒子に結合されている工程；および
一定のまたは変動するレーザー強度、露光時間、および露光間の時間を用いて、身体の外部からリポソームに、レーザーパルス列を適用する工程であって、これによって、制御されたタイムスケール下で、制御された量の化学物質がリポソームから身体に放出される工程
を含む、方法。
【請求項２】
リポソームが、５W/cm2までの強度を伴うレーザーパルスの露光時に破壊されない構造を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リポソームが、１０〜５００nm、好ましくは約２００nmの直径を有し、金ナノ粒子に繋留されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
金ナノ粒子が中空金ナノシェルである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
リポソームが、固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
レーザーパルス列が、５W/cm2未満、好ましくは２〜３W/cm2の強度を伴う近赤外フェムト秒パルスの列である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
パルス長が、１０フェムト秒から１ピコ秒、好ましくは５０〜１５０フェムト秒である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
化学物質が治療剤である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
化学物質が神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、又は抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
レーザーパルス列が、反復的に適用される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
インビボでの化学物質の制御放出のためのシステムであって、
化学物質を充填し、金属ナノ粒子に結合されたリポソーム、および
１０フェムト秒から１ピコ秒、好ましくは５０〜１５０フェムト秒のパルス長を伴う近赤外レーザーパルスの列を照射することが可能なレーザーパルス発生器
を含む、システム。
【請求項１２】
神経障害の処置が必要な被験者において神経障害を処置するための方法であって、
神経伝達物質または神経調節物質で充填され、金属ナノ粒子に結合された、リポソームを被験者に投与する工程であって、リポソームは、血液脳関門を通過して輸送されるようにさらに修飾されている工程、および
脳中に位置付けられるリポソームに、１０フェムト秒から１ピコ秒、好ましくは５０〜１５０フェムト秒のパルス長を伴う反復可能な様式において、レーザーパルス列を適用する工程
を含む、方法。
【請求項１３】
神経調節物質がドーパミンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ドーパミンが、１ミリ秒までの精度を伴うパルスの正確なタイミングで放出される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下を含む方法における使用のための、治療剤が充填され、金属ナノ粒子に結合された、リポソームを含む医薬組成物であって、
被験者の身体中にリポソームを注射する工程；および
一定のまたは変動するレーザー強度、露光時間、および露光間の時間を用いて、体の外部からのリポソームに、レーザーパルス列を適用する工程であって、これによって、制御されたタイムスケール下で、制御された量の化学物質がリポソームから身体に放出される工程
を含む方法における使用のための、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御放出用の薬物送達システムおよびそのための医薬組成物に関する。特に、本発明は、外部刺激としてフェムト秒レーザーを使用したオンデマンドのサブ秒反復薬物送達システムに関する。
【０００２】
背景技術
生体材料およびナノテクノロジーにおける進歩によって、生きた生物中にナノスケールデバイスを導入し、それらの固有の機構をターゲットとし、それを模倣し、最終的には制御する能力が約束される。この概念の最初の応用は、外部刺激により活性化される、標的化された部位特異的薬物送達システムの開発であった（非特許文献１を参照のこと）。例えば、ナノ癌処置（非特許文献２を参照のこと）において、投薬量は、身体における特定部位で、長期間にわたり、緩徐的に、持続的に送達される。空間的制御と等しく重要なのは、薬物送達システム上で時間的なパルス性制御を獲得することである（非特許文献３を参照のこと）。生きた生物学的システムの多数の重要な機能は、数時間（非特許文献４を参照のこと）からミリ秒（非特許文献５を参照のこと）の自然リズムを伴う、調節された反復可能な様式で生じる。これらのリズムは生命の化学に不可欠であり、これらを模倣することは、適当な時間的プロファイルを伴う、パルス性の反復放出する化学送達システムを要求する。以前の試みでは、パルスプロファイルの時間的制御が達成は数時間から数日のオーダーでにすぎなかったか（非特許文献６を参照のこと）、または、含有構造の不可逆的な破壊による、１回の破壊的な放出機構が用いられてきた。
【０００３】
リポソーム内に封入された治療剤または診断剤の送達用のリポソーム組成物は記載されている。例えば、リポソームは、中空金ナノシェル（ＨＧＮ）に繋留することができ、近赤外光を用いてこれらの構造を照射することによって、リポソーム内容物の放出を誘発することができる（非特許文献７および特許文献１を参照のこと）。しかし、この構造によって、ほぼ全体的な内容物の放出の１回の破壊的な誘発が可能になるだけである。それらの実施形態の１つにおいて、ＨＧＮはリポソームに直接的に繋留されていたが、照射によって、リポソーム内部に貯蔵された６−カルボキシフルオレセインの９６%の放出が誘導され、照射されたＨＧＮは恒久的に破壊され、パルス性の反復放出する化学送達を達成することが不可能になった。
【０００４】
記載されている別の組成物は、電磁輻射を吸収し、吸収されたエネルギーを使用して化学物質の送達を誘発する、熱感受性ポリマー粒子複合体である（特許文献２を参照のこと）。金属ナノシェルは、温度感受性材料と組み合わされ、近赤外光への外部露光を介した、調節された薬物送達のための移植可能な、または注射可能な材料を提供する。ウシ血清アルブミンの反復放出が、実施例４に開示されているが、放出間の時間は約２０分であり、それは、生物学的リズム（例えば、マイクロ秒のタイムスケールで生じるニューロの発火など）を模倣することができる時間的プロファイルについて要求されるよりも桁違いに遅い。これは、放出機構が、熱平衡にあるヒドロゲルマトリックスの膨張および崩壊という遅いプロセスに頼るという事実に起因する。
【０００５】
現在利用可能な方法、デバイス、または組成物のいずれも、生きた生物のパルス性の化学的活性を再現するために十分に速いタイムスケールでの化学物質の頑強な反復放出に達する満足な方法を提供しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ganta, S., Devalapally, H., Shahiwala, A. & Amiji, M. J Control Release, 126, 187-204 (2008).
【非特許文献２】Arap, W., Pasqualini, R. & Ruoslahti, E. Science, 279, 377-380 (1998).
【非特許文献３】Kikuchi, A. & Okano, T. Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 53-77 (2002).
【非特許文献４】Welsh, D. K., Logothetis, D. E., Meister, M. & Reppert, S. M.  Neuron, 14, 697-706 (1995).
【非特許文献５】Buzsaki, G. & Draguhn, A.  Science, 304, 1926-1929 (2004).
【非特許文献６】LaVan, D. A., McGuire, T. & Langer, R.  Nat Biotechnol, 21, 1184-1191 (2003).
【非特許文献７】Wu, G. et al.  J. Am. Chem. Soc., 130, 8175-8177 (2008).
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ  ２０１１／００５２６７１
【特許文献２】ＷＯ  ０１／０５５８６
【０００８】
発明の目的
開発の重要な次の一歩は、より速い生物学的ライフサイクルを模倣するために、薬物送達プロファイルのサブ秒制御に向けたものである。特に重要なサブ秒の生物学的プロセスは、脳における神経伝達物質および神経調節物質のパルス放出である（Wickens, J. R., et al. Ann N Y Acad Sci, 1104, 192-212, 2007）。化学的シナプス伝達によって、ニューロン間で情報が迅速に伝達され、例えば知覚および運動制御、ならびに学習および記憶などの脳機能を実現させる。神経調節物質は、また、サブ秒のタイムスケールで作動し、神経組織の大きな領域の活性を調節する（Roitman, M. F., et al. J Neurosci, 24, 1265-1271, 2004）。脳における神経化学的シグナリングにおける欠損は、神経学的障害（例えばパーキンソン病など）をもたらす。補充療法が、そのような障害において用いられてきたが、薬物の吸収および拡散が遅いことから、それらの適用は、神経調節物質の定常バックグラウンドレベルを置き換えることだけに限定されてきた（Arbuthnott, G. W. & Wickens, J. R. Trends Neurosci, 30, 62-69, 2007）。適当な時間的構造を伴う神経化学的シグナルを人工的に模倣することができれば、より良い結果を期待することができる。
【０００９】
本発明の目的は、従って、特に脳において自然の神経伝達物質の動態を模倣することが可能であるほど十分に速く、頑強なナノスケールの薬物送達システムを使用し、化学物質のサブ秒のパルス性反復オンデマンド放出を可能にする方法を提供することである。
【００１０】
発明の概要
本発明の一態様は、インビボでの化学物質の制御放出のための方法を提供し、この方法は、以下を含む：被験者の身体中にリポソームを注射すること（リポソームは化学物質が充填されており、金属ナノ粒子に結合されている(attached)）；および、一定のまたは変動するレーザー強度、露光時間、および露光間の時間を用いて、身体の外部からのリポソームに、レーザーパルス列を適用すること（それにより、制御されたタイムスケール下で、リポソームから、化学物質の制御された量が身体において放出される）。
【００１１】
他の態様において、インビボでの化学物質の制御放出用のシステム、デバイス、および組成物、ならびに神経障害を処置するための方法が、本発明により提供される。
【００１２】
発明の効果
本発明に従い、化学物質で充填された頑強なリポソーム構造体を刺激することにより、化学物質をサブ秒のタイムスケールで反復送達することができ、送達時間および化学物質濃度は、フェムト秒レーザーパルス列の強度および露光時間を調整することにより、簡単に制御することができる。脳における神経伝達物質および神経調節物質のサブ秒での動的化学を模倣および再現する能力は、脳機構を制御し、脳の挙動を理解し、神経学的疾患に対処する際での有意な一歩となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リポソーム送達および測定システム。（Ａ）ドーパミンを、リポソームの脂質２分子膜内に封入した。中空金ナノシェル（ＨＧＮ）を膜に繋留した。フェムト秒レーザーパルス列によって、リポソーム構造体からのドーパミン放出が誘導される。（Ｂ）放出されたドーパミンは、高速スキャンサイクリックボルタンメトリーを使用して測定した。三角電圧パルスを、炭素繊維電極に１０Ｈｚで適用した。電圧パルスへの電流応答は、ドーパミンの酸化・還元ピークをそれぞれの電位で示した。
【図２】パルス性の反復可能なドーパミン放出。（Ａ）１秒レーザー露光により刺激されたドーパミン濃度における迅速な増加、それに続く、拡散に起因する減少。（挿入図）１００秒間にわたる、反復１秒レーザー露光によるパルス性放出。（Ｂ）本発明者らは、複数のレーザー露光後、１回の露光当たりに放出されるドーパミンの、最初は迅速な、次に緩徐な減少を観察する。この動態は、双指数関数曲線によりフィッティングすることができ、異なる送達機構を伴う、リポソームの２つの集団を仮定することにより説明される。
【図３】オンデマンドの反復可能なサブ秒薬物送達。本発明者らは、レーザー強度および露光時間によりそれぞれ制御された任意の濃度および時間的プロファイルを伴う反復ドーパミンパルスを実証する。挿入図は、レーザー露光の間でのドーパミン濃度の線形上昇を示し、より高いレーザー強度について、より速いドーパミン放出速度、および、より長いパルスを用いた、より延長された放出を伴う。
【図４】炭素繊維に結合された(attached)リポソームの電子顕微鏡画像。（Ａ）リポソーム構造体が、反復測定のために固定された炭素線維。長方形は、（Ｂ）リポソームが結合される前、（Ｃ）リポソームが結合された後、および（Ｄ）レーザー露光後での、領域におけるズームを表示する。結合したリポソームを示す、（Ｃ）における多数のスペックル、および、レーザー露光後での喪失に起因する、（Ｄ）におけるわずかに低下した数が観察される。数個の小さな円および四角は、目のためのガイドであり、円は、リポソームが結合し、レーザー露光後に結合したままの領域（頑強な集団）の例である。四角は、リポソームが結合するが、しかし、レーザー露光後に破壊された領域（脆弱な集団）の例である。
【００１４】
発明の詳細な説明
金属ナノ粒子を伴うリポソーム
一実施形態において、本発明は、金属ナノ粒子に結合されたリポソームを使用した、化学物質の制御放出のための方法を提供し、それにおいて、化学物質は、リポソーム内に封入されている。任意の化学物質を、それらが、リポソーム内部の水性溶液、または、その膜中に溶解することができる限り使用することができ、それらは、栄養素、または治療用、予防用、診断用、もしくは化粧用の薬剤であることができる。薬剤は、抗精神病、抗増殖性、もしくは抗炎症性の特性を有することができる、または、神経調節物質もしくは神経伝達物質でありうる。適切な治療的および予防的な薬剤の例は、治療的、予防的、または診断的な活性を有する、合成無機および有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖類および他の糖類、脂質、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列を含む。一部の他の例は、生物活性薬剤、例えば抗体、受容体リガンド、酵素、接着ペプチド、血液凝固因子、阻害剤または血餅溶解剤、例えばストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子など、免疫化用の抗原、ホルモンおよび成長因子、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、ならびに遺伝子治療における使用のためのレトロウイルスベクターなどを含む。
【００１５】
神経調節物質および／または神経伝達物質の例は、アミン（例えばドーパミン、ノルアドレナリン、およびセロトニンなど）、アミノ酸（例えばＧＡＢＡ、ペプチド、および可溶性ガスなど）、ならびにそれらの誘導体を含む。他の例は、アセチルコリン、アデノシン、およびアナンダミドを含む。
【００１６】
前述の物質は、また、プロドラッグまたはそれらのコドラッグの形態において使用することができる。前述の物質は、また、それらの代謝物および／またはその代謝物のプロドラッグを含む。前述の物質は、例として列挙されており、決して網羅的と見なされるべきではない。現在入手可能である、または将来的に開発されうる他の活性薬剤が、等しく適用可能である。
【００１７】
リポソームは、典型的には、主にリン脂質で形成することができる。適切なリン脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。その充填率がリポソーム二重層構造の形成が可能とするもので、その構造が、本開示の方法を使用してレーザーパルスを用いて照射された場合、リポソーム内容物の放出を可能にするものである限り、他の脂質を用いることもできる。コレステロールおよび他の物質を加え、構造の安定性を調整することができる。リポソーム二重層の外表面は、身体の免疫系、特に細網内皮系による検出を回避するために、ポリエチレングリコールおよび類似の化合物を用いて修飾することができ、より長い循環寿命を可能にする。リポソームは、正もしくは負に荷電している、または正味で中性でありうる。
【００１８】
リポソームの組成および大きさは、安定性（即ち、複合体が、放出事象の間にその構造を維持し、貯蔵に耐え、血流および脳脊髄液からの排除で残存し、薬物が漏出しないように不浸透性のままである能力、またはクラスターを形成する傾向）、可塑性（即ち、リポソーム壁が一時的に透過性となり、その後、再び安定となる放出サイクルに耐える能力）、および感度（即ち、放出を起こすために要求されるレーザーパルスの強度）に影響を及ぼす因子を考慮することにより最適化することができる。組成は、物理的および化学的な特性に影響を及ぼす。安定性および可塑性に影響を及ぼす物理的特性は、リポソームの直径ならびに貯蔵および体温での脂質の相転移のプロファイルを含む。リポソーム壁の物理的および機械的な特性は、また、曲率に依存しており、機械的安定性のための最適なサイズを決定する。好ましい実施形態において、リポソームは、５W/cm3までの強度のレーザーパルスに露光された場合、一過的に透過性になる非破壊構造を含み、１０〜５００nm、より好ましくは約２００nmの直径を有する。一実施形態において、金中空ナノシェルに繋留されたリポソームは、６ヶ月間超にわたる貯蔵において安定であり、マウスの血流中に注射した場合、３日間超にわたり循環中に残った。
【００１９】
開示において用いる金属ナノ粒子は、近赤外スペクトル域への可視域において強く吸収する単分散でサイズが制御された中空コアナノシェルを含む。それらは、金、銀、または他の貴金属で作製することができる。従来のガルバニック置換方法は、安定で周波数調整可能で、スケーラブルなナノ構造体（中空ナノ構造を含む）を調製するための簡単で効果的な方法として使用することができ、それにおいて、テンプレート金属ナノ構造を、水性環境中で貴金属塩前駆体と接触させる。この場合において、貴金属塩前駆体は、テンプレート金属ナノ構造より大きな標準還元電位を有さなければならない。例えば、銀テンプレートが、金を用いて置換される、ガルバニック置換反応を使用し、２０〜１００nmの直径を伴う中空金ナノスフェア（ＨＧＮ）を作製することができる。金属テンプレートコアは、従来の方法を使用して合成され、銀粒子であることができ、それは、次に、金属塩の溶液と混合される。混合時、テンプレートコアは、酸化されて溶液中に溶解し、金シェルが還元の結果として形成される。
【００２０】
異なる金属試薬比（例、銀と金）によって、異なるサイズおよびシェルの厚さを伴う中空金属ナノ構造が作成され、そしてそれは、異なる波長での吸収ピークをもたらす。なぜなら、吸収は、表面プラズモン共鳴効果に起因して生じ、吸収波長は、サイズおよび形状（例、球体、キューブ、ロッド、ボウルなど）ならびに、使用される金属の種類により決定されるからである。中空ナノ構造は、従って、テンプレート金属と貴金属塩の比率を調整することにより、所望の波長で吸収するように微調整することができ、吸収波長は、組織を通過する際の光の減衰を最小限にするため、好ましくは、近赤外領域にある。
【００２１】
使用することができる貴金属塩の例は、金、白金、銀、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、およびイリジウムを含む。金は、特に効果的な種類の金属である。なぜなら、金についての表面プラズモン共鳴は、多くの他の貴金属よりも長い波長で生じるためで、および、それは、より少ない健康リスクを提起するためである。金属塩は、塩化物、酢酸塩、硝酸塩、または他の塩であることができる。
【００２２】
金属ナノ構造は、リガンド（例えば長鎖アルキルチオールなど）を用いてキャップすることができる。そのようなリガンドまたはキャップは、約１〜３０の炭素原子のアルキル鎖長を有するアルカンチオールならびにポリマー、例えばポリエチレングリコール、界面活性剤、洗浄剤、タンパク質複合体、ポリペプチド、および他の生体分子（例えば多糖類など）などを含む。デンドリマー材料、オリゴヌクレオチド、蛍光成分、および放射性基も使用することができる。
【００２３】
アルカンチオールは、化学的部分および官能基を用いて、種々の位置で修飾することができる。リガンドまたはキャップは、種々の方法（共有結合的結合および静電的結合を含むが、これらに限定されない）により金属ナノ構造に結合させることができる。
【００２４】
ナノ構造（例えばアルキルチオールでキャップされた金ナノ粒子など）は、広範囲の極性を伴う種々の有機溶媒中に溶解または分散させることができる。他のキャッピング剤（例えばアミン、カルボン酸、カルボキシレート、およびホスフィンなど）を使用し、実質的に任意の溶媒の使用を可能にすることができる。
【００２５】
これらのリガンドまたはキャップを、例えば、チオール／ＰＥＧ脂質連結を使用して、リポソームの外部にナノ構造を繋留するために使用することができる。
【００２６】
本明細書において記載する平均粒径および粒径分布は、電子顕微鏡技術（例えばＳＥＭまたはＴＥＭなど）を使用して測定されうる。本明細書における粒径への参照は、一次粒子径を指す。
【００２７】
金属ナノ構造は、例えば、標準的な化学を使用した、チオール化ポリエチレングリコールを用いたコーティングにより、高イオン強度溶液中でさえ凝集に対して安定化させることができる。この方法で安定化されたナノ構造は、リポソームの脂質二重層内に封入することができる。任意の数の可能な治療剤または診断剤を、ナノ構造と共に脂質二重層内に封入することができる。別の実施形態において、ナノ構造体は、また、リガンド−受容体相互作用（例えばビオチンおよびストレプトアビジンを含むものなど）を通じて、またはチオール化ポリエチレングリコール脂質を用いて、リポソームの膜に繋留することができる。
【００２８】
リポソームは、固体支持体（例えば炭素繊維など）に結合させ、標的位置に埋め込んでもよい。そのような支持体を使用することの利点は、より簡単な投与および標的化、ならびに多量のリポソーム構造体およびナノシェルを貯蔵するための、支持体の能力を含む。あるいは、リポソームは、特定の部位、細胞、または分子に選択的に結合する抗体に結合させてもよく、それにより、リポソームを標的に結合させる。
【００２９】
レーザーパルス照射システム
ナノ構造体に繋留されたリポソームの懸濁液を、電磁波を用いて照射することができる。照射時、ナノ構造は、輻射からエネルギーを吸収し、リポソーム構造を乱す、または、そうでなければ、振動エネルギーもしくは熱エネルギーの形態において、周囲の環境中へエネルギーを散逸する。使用される電磁輻射は、例えば、８００nmでのフェムト秒パルスを送達するＴｉ：サファイアレーザーを用いて生成することができる。他の実施形態において、可視光域から近赤外領域における異なる波長でのパルスを生成するレーザーを使用することができ、典型的には、６５０〜１２００nmで使用することができる。以下の実施例は、そのような技術によって、リポソームからのドーパミンの放出が可能になることを実証する。ドーパミンは、レーザー照射の開始後１００ミリ秒以内に放出され、このシステムによって、各々のパルスの正確なタイミングを伴う、ドーパミンの反復放出が可能になった。ドーパミンは、中空金ナノシェルを伴わないリポソームを使用した対照実験において放出されず、ドーパミン放出は、照射前に生じなかった。
【００３０】
本開示の方法は、ナノ構造に、熱または音波もしくは圧力波を生成させるため、任意の波長の電磁波照射を用いて実施することができる。可視域または赤外域の輻射を使用することができる。レーザーを用いて、照射を生成することができるが、しかし、本開示は、任意の輻射源（レーザー以外の源を含む）の使用を包含する。代替的な輻射源は、フラッシュランプ、白熱光源、放射性物質、およびシンクロトロン放射を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
リポソーム内容物の放出を誘発するために近赤外光を使用することの１つの利点は、近赤外光が、組織、血液、他の体液などに浸透することができることであり、それにより、それが身体を通過する際に、光の減衰を最小限にし、１０cm以上の浸透長を可能にする。身体内の部位は、このようにアクセスすることができ、そこでは、薬物放出を、近赤外領域での照射により誘導することができる。金属ナノ構造（中空金ナノシェルを含む）は、近赤外光を強く吸収し、そのエネルギーを衝撃波、マイクロジェット、振動、または熱に変換する。
【００３２】
本開示は、近赤外領域におけるフェムト秒パルスの金属ナノ構造による吸収が、リポソーム中に封入された水溶性のモデル薬剤であるドーパミンの反復放出を誘導することを実証する。ナノ構造体により吸収されるエネルギーは、超音波により起こされるキャビテーション気泡と似ており、衝撃波または不安定な微小気泡の生成に導く。リポソーム構造は、ミリ秒以内の微小気泡の崩壊の機械的および熱的効果により乱され、例えば、リポソーム担体中に捕捉されたドーパミンの酸化電流における増加により示される通り、内容物を放出する。リポソームから放出されたドーパミンは、このプロセスにより影響されないように見え、リポソームも、恒久的に変化を受けるようには思われない。この輻射誘発放出の利点の一部は、（１）周囲の健康な組織を害することを伴わない、局在化した薬物送達、（２）光毒性または皮膚光線過敏症がないこと（なぜなら、近赤外光は、組織を害することなく、金ナノ粒子は不活性であるため）、（３）体の内部深くの組織を標的化すること（なぜなら、近赤外光は、組織中に深く浸透することができるため）、（４）空間的及び時間的制御を共に伴い、薬物の高い局在化濃度を生成すること、および（５）神経学的障害（例えばパーキンソン病およびアルツハイマー病など）の処置へ潜在的に道を開く、神経伝達物質および神経調節物質の迅速な反復放出などの生物学的現象の模倣を可能にするタイムスケールでのリポソーム内容物の反復放出を含む。リポソーム以外の多くの他の担体（ｃａｒｒｉｅｓ）および容器は、近赤外照射時に、封入された内容物のオンデマンドでの迅速な反復放出のためのシステムを実現するように、金属ナノ粒子をそれらに繋留することにより修飾することができる。このシステムは、また、他の分野（例えば反応速度論、膜化学、および神経科学など）を研究するために用いることができる。種々の賦形剤を、この開示において使用される製剤に加えることができる。賦形剤の例は、化学的安定化剤、緩衝剤、中性または荷電脂質、気体、液体、油、および生物活性薬剤を含む。
【００３３】
輻射の強度は、標的化組織の種類および組織の深さなどの因子により決定される、それが組織および他の媒質を通過する際の輻射の減衰の程度などの、多くの考慮事項に基づいて選択される。他の考慮事項は、ナノ構造体の機械的、熱的、および物理的な安定性、リポソーム、リポソームにナノ構造体を繋留する連結、およびリポソームの内部に封入された化学物質を含む。広範囲の強度が、その強度での輻射が、リポソーム内容物の放出を誘導するために十分であり、リポソームまたはナノ構造を瞬時に破壊しない限り使用することができる。好ましい実施形態において、減衰効果が考慮され、輻射の強度は、ナノ構造が、５W/cm2まで、より好ましくは２〜５W/cm2の強度を用いて照射されるように調整される。その強度は、本明細書において、ナノ構造体が位置付けられる、身体の内部でありうる標的部位での強度を指す。
【００３４】
フェムト秒レーザーの使用によって、リポソーム構造の一過性の局所的乱れが生じ、内容物放出を誘導することが可能になる。照射は、典型的には、系が熱平衡に達するずっと前である、１０フェムト秒から１ピコ秒、好ましくは５０〜１５０フェムト秒持続し、長い休止（典型的には１ミリ秒）が続く。それによって、内容物が、即時に放出されることを可能にするだけでなく、それは、また、熱的エネルギーで破壊されるリポソームまたはＨＧＮがほとんどないことを確実にし、少量の内容物の迅速な反復放出を可能にする。レーザーパルスの時間および時間的プロファイルは、当業者に公知の標準的なエレクトロニクスおよび機械的シャッターを使用して制御することができる。プロファイルの時間的な側面は、一定であっても変動してもよい、強度、露光時間、および露光間の時間などの因子を含むが、しかし、制御システムは、パルスのプロファイルが、より複雑な挙動を包含するように、当技術分野における標準的な技術を使用してプログラムすることができる。このシステムは、また、照射が、電気または分子シグナリング、温度変動、生体分子の濃度、または疾患（例えば発作、虚血、および他の障害など）の発症などの生物学的または生理学的条件に応答して生じるように設定することができる。
【００３５】
サブ秒のパルス性およびオンデマンド制御放出
本開示は、電磁波によって誘発された、インビボでのリポソームからの化学物質の遠隔での標的化された反復放出のための方法および組成物を提供する。リポソームは、血流もしくは他の生理学的液体中に、または細胞、組織、または生物（ヒトを含む）内に位置付けられうる。リポソームは、また、生物学的または化学的な実験において使用することができる。一部の実施形態において、神経学的実験またはアッセイを、本開示を使用して設計することができ、そこでは、リポソームから放出された化学物質が、ニューロン、他の細胞、または生体分子と相互作用し、生物学的シグナリングを誘導または模倣することができる。電磁波は、例えば、フェムト秒パルス近赤外レーザーにより生成された赤外線輻射とすることができる。一態様において、金属ナノ粒子は、リガンド−受容体繋留によりリポソームに結合される、または、放出される薬物を封入するリポソームの脂質二重層内に埋め込まれる。ナノ構造は、典型的には、１０フェムト秒から１ピコ秒、好ましくは５０〜１５０フェムト秒である電磁輻射のフェムト秒パルスから、衝撃波または熱を生成し、または、リポソーム中もしくは周囲の媒質（例えば水、緩衝液、または生理学的液体）中に圧力変動もしくは振動を起こすのに十分なエネルギーを吸収する。これらの形態で放出されるエネルギーは、リポソームの膜を機械的に乱し、封入された化学物質、薬物、または薬剤の迅速な放出を誘発する。内容物の放出の空間的および時間的制御は、制御された輻射の適用により達成することができる。このプロセスは、必要に応じて反復することができ、リポソーム内容物の迅速な反復放出を可能にする。リポソームの膜の著しい乱れが、照射の開始後１ミリ秒以内に生じるので、これによって、１ミリ秒までの精度を伴う、リポソーム内容物の放出制御が可能になる。
【００３６】
ナノ構造（例えば中空金ナノシェルなど）は、光パルスからエネルギーを強く吸収し、このエネルギーは、ナノ構造体に結合されたリポソーム構造に伝導され、膜を乱す。エネルギーは、また、不安定な微小気泡を周囲の水または他の媒質中に形成する可能性が高い。これらの不安定な気泡は、迅速に成長し、激しく崩壊することで、衝撃波またはマイクロジェットを生成し、次にこれが小胞またはリポソーム担体を乱す。パルスの短さよって、全体的なエネルギー入力が限定され、環境のバルクサンプル温度が３℃未満だけしか上昇しないことが確実となり、その結果、照射により、環境の大部分が無傷で残される。ナノシェルは、それら自体が、照射後も大部分が無傷である。なぜなら、ナノシェルは、一回あたりは極めて短時間にわたり照射されるだけであるから、それにより、ナノシェル中に貯蔵されている余分なエネルギーが、ナノシェルが照射されない時に、環境中に散逸するからである。ナノシェルは、従って、反復的に照射され、リポソーム内容物の放出を誘導することができる。加えて、温度に著しい増加がないことは、リポソーム中に封入された化学物質の著しい分解は生じない可能性が高いことを意味する。
【００３７】
本開示は、生体分子（例、脳または神経系におけるドーパミンまたはアセチルコリン）、薬物（例、炎症または疾患の部位での、もしくはその近くの抗生物質、または腫瘍細胞中での、もしくはその近くの化学療法薬物）、または他の薬剤（例、栄養剤、化粧剤、診断剤、または造影剤）の局所の制御された誘発放出のための方法および組成物を提供する。制御された反復送達は、長期間にわたる小用量の緩徐な放出、特定の時間におけるまたは生理学的条件（例えば発作の発症など）に応答した反復放出、または生物学的シグナリングを模倣する生体分子のシミュレートされた放出（例えばニューロンによる神経伝達物質または神経調節物質の放出など）を可能にする。局所送達は、特定の部位を標的化することを可能にし、それにより、送達の有効性を改善させる、または処置の副作用を最小限にする。一実施形態において、そのようなナノ構造を用いて、腫瘍組織を加熱または除去することができ、その場合において、薬物放出を、場合により、同時に誘導することができる。それは、超音波キャビテーションを含む、一部の処置方法（例えば腎臓結石の破壊など）の代わりに使用してもよい。
【００３８】
処置方法および医薬組成物
本開示の組成物は、皮内、皮下、筋肉内、動脈内、静脈内、および関節内注射により被験者または組織に送達することができる。脳への送達のために、種々の技術（例えばトロイの木馬リポソームなど）を用いて、血液脳関門を通過して組成物を輸送してもよい。腫瘍への送達のために、組成物は、腫瘍中に直接的に注射することができる。
【００３９】
本開示は、さらに、例えば、特定の疾患部位または目的の他の部位に薬剤を送達することにより、身体の他の場所で、それらの濃度を最小限にしつつも、多くの薬剤の治療的または診断的な有効性を改善させるための方法および組成物を提供する。本開示の方法および組成物は、また、抗原−抗体結合相互作用またはリガンド標的化技術を用いて標的化送達を実現するために使用することができる。本開示のリポソームおよび他の脂質ベースの薬物担体は、脂質膜内に有毒な薬物を隔離し、標的化されていない部位での薬物の副作用を抑え、健康な器官および組織への損傷を最小限に抑えることにより、化学療法を含む全身薬物送達を上回る有意な利点を提供することができる。
【００４０】
本開示に従ったナノ構造は、医薬組成物として単独で投与することができる。それは、また、リポソーム構造と組み合わせて投与することができる、または他の医薬的に許容可能な担体と製剤化することができる。適切な医薬的担体および送達の方法は、当技術分野において公知であり、本明細書において記載されている通りである。
【００４１】
本開示の医薬組成物は、賦形剤、添加剤、保存剤、補助剤、担体、および誘発放出を促進する、または構造を安定化する成分を用いて組成物を調製することにより、適当に投与することができる。担体または補助剤の例は、糖球体、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコール、ならびに溶媒を含む。静脈内賦形剤は、液体（例えば無菌水および栄養補給剤など）を含む。保存剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスを含む。他の医薬的に許容可能な担体は、当技術分野において公知であり、水性溶液、非毒性賦形剤、塩、保存剤、および緩衝剤を含む。医薬組成物中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野において周知のパラメータに従って調整される。また、製剤は、所望の貯蔵条件について最適化されうる。
【００４２】
本開示に従った医薬組成物の投与は、局所または全身でありうる。「効果的な用量」とは、十分な程度まで望ましい、または有益な結果を生み出すための、開示に従ったリポソームまたはリポソーム内容物の量を意味する。この使用のために効果的な量は、組織および組織の深さ、送達のために使用される方法、波長、パルス長、使用される輻射の強度などに依存するであろう。
【００４３】
典型的には、投与量および効果に関するインビトロ試験からのデータは、ヒト被験者への投与のために適当である医薬組成物の量における有用な指針を提供しうる。動物モデルを使用し、特定のインビボ技術のための効果的な投与量を決定してもよい。種々の考慮事項が、例えば、Langer, Science, 249, 1527, (1990)に記載されている。
【００４４】
医薬組成物は、多数の方法、例えば皮下または静脈内注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸、非経口もしくは腹腔内投与などにより投与することができる。投与経路によっては、医薬組成物は、マクロファージ、酵素、酸、および医薬組成物を不活性化する、または、その他の点で開示の方法の信頼性または効果を低くしうる他の自然条件の作用から、医薬組成物、ナノ構造、またはリポソーム担体を保護するための材料を用いて被覆することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために、保存剤を含んでもよい。
【００４５】
注射可能な使用のために適切な医薬組成物は、無菌の注射溶液もしくは分散剤の即時調製用の、無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散剤、および無菌粉末を含んでもよい。典型的には、組成物は、無菌で液体であり、簡単な注射可能性を提供する。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒質であることができる。適当な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒径の維持により（分散剤の場合において）、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）により達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えばマンニトール）ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中で使用する。注射用組成物の持続性吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【００４６】
無菌の注射用溶液は、上に列挙する成分の１つ、または組み合わせを用いて、適当な溶媒中で、要求される量で、医薬組成物を組み入れることにより調製することができ、適宜、濾過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、基礎分散媒質および上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に医薬組成物を組み入れることにより調製される。
【００４７】
医薬組成物は、経口的に、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を用いて投与することができる。医薬組成物および他の成分は、また、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入する、圧縮して錠剤にする、または被験者の食事中に直接的に組み入れることができる。経口投与のために、医薬組成物は、賦形剤と組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態において使用することができる。そのような組成物および調製物は、リポソームの少なくとも１重量%を含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん、変動させることができ、便利には、単位重量の約５%から約８０%の間であることができる。
【００４８】
このように、「医薬的に許容可能な担体」は、溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬的に活性な物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。補助活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【００４９】
神経科学および神経学的障害のための処置への適用
サブ秒の生物学的プロセスの１つの例は、脳における神経伝達物質および神経調節物質（例えばドーパミンおよびアセチルコリンなど）のパルス放出である（Wickens, J. R. et al. Ann N Y Acad Sci, 1104, 192-212 (200)）。化学的シナプス伝達は、これらの化学物質の正確なタイミングのパルスを伴い、ニューロン間で情報を迅速に伝達し、例えば知覚および運動制御、ならびに学習および記憶などの脳機能を実現する（Katz, B. Nerve, muscle, and synapse. Mcgraw-Hill Book Co, New York (1966)）。神経調節物質は、また、サブ秒のタイムスケールで作動し、神経組織の大きな領域の活性を調節する（Roitman, M. F. et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci, 24, 1265-1271 (2004)）。脳中での神経化学的シグナリングにおける欠損は、神経学的障害（例えばパーキンソン病など）をもたらす。そのような障害のための補充療法が記載されているが、薬物の吸収および拡散が遅いことから、それらの適用は、神経調節物質の定常バックグラウンドレベルを置き換えることだけに限定されてきた。
【００５０】
本発明の方法を、神経学的障害の処置に適用する際での１つの潜在的な障害は、血液脳関門（循環系から脳を隔離する高度に選択的な透過障壁）の存在である。これによって、脳細胞中に化学物質を送達するための多くの努力が妨げられてきた。しかし、リポソームは、血液脳関門を横切って化学物質を移すための担体として使用することができる（トロイの木馬リポソーム）（Preparation of Trojan Horse Liposomes (THLs) for Gene Transfer across the blood-Brain Barrier, Cold Spring Harb Protoc (2010)）。
【００５１】
本開示の方法は、従って、リポソーム内部に神経伝達物質または神経調節物質を貯蔵するために用いることができ、照射時に、内容物を、オンデマンドの反復パルス性様式で放出し、生物学的に正常なプロセスを模倣することができる。これによって、神経学的障害（パーキンソン病およびアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない）のための処置を提供することができる。他の実施形態において、この方法は、神経科学に関する研究のために使用することができ、それにおいて、迅速な反復の生物学的シグナリングを、照射のタイミングを調整することによりエミュレートすることができる。
【００５２】
以下の非限定的な例は、本明細書において提供する種々の実施形態を例証する。当業者は、本明細書において提供する主題の精神および特許請求の範囲内にある多くのバリエーションを認識するであろう。
【００５３】
本開示を、実施例として以下でより詳細に記載する前に、本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことを理解すべきである。なぜなら、これらは変動しうるからである。本明細書において使用する用語は、特定の実施態様だけを記載する目的のためであり、添付の請求項だけにより限定される、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解すべきである。別に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書において引用する全ての参考文献が、その全体において参照により組み入れられる。
【００５４】
実施例
ナノスケールの生体適合性薬物送達システムを開発するために、本発明者らは、中空金ナノシェル（ＨＧＮ）に繋留された、ドーパミンで充填したリポソーム構造体を調製した（Paasonen, L. et al. Journal of Controlled Release, 122, 86-93, 2007）（図１ａ）。リポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−  ２０００］（ＤＳＰＣ−ＰＥＧ２０００）、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＳＨを、モル比１００：５：５：４：３．５で混合することにより調製した。溶媒（クロロホルム）の除去時、ドーパミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。混合物を、全ての脂質材料が懸濁するまで、５０℃の水浴中で旋回させ、リポソームを、次に、２００nmポリカーボネート膜を通して押出し、本発明者らが、それらのサイズを調節することを可能にする。ＨＧＮ懸濁液を、次に、１２０：１の金−脂質比率（mg/mmol）でリポソームに定期的に加えた。この調製方法は、ドーパミンが充填された、金ナノ粒子に繋留された、安定なリポソーム構造体をもたらした。最後に、１０μm直径の炭素繊維を、リポソーム構造体を含むＰＢＳ溶液中に５分間にわたり浸漬し、ある程度の数の構造体が、繊維に結合することを可能にした。リポソーム構造体の結合およびその結果としての固定化によって、それらの反復可能な測定が可能になった。
【００５５】
リポソーム構造体からのドーパミンの放出を達成するために、リポソームを伴う炭素繊維を、水中に浸漬し、近赤外（８００nm）フェムト秒パルスの列により照射した。炭素繊維の電子顕微鏡画像によって、リポソームが、水道水中に浸漬された際に外れず、また、以下で考察する通り、反復レーザー露光後、大部分が無傷のままであることが確認された。フェムト秒パルス列は、パルスあたり７０ｆｓの時間幅、５W/cm2までの調節可能な強度、およびパルス間の１msの時間間隔を有していた（図１ａ）。電子的に操作される機械式シャッターによって、リポソーム構造体の照射時間が制御され、典型的な時間は数百ミリ秒から１秒であった。光への露光時に金繋留リポソーム構造体内に封入された化学物質の放出を起こす潜在的な機構が、以前に考察されている（Paasonen, L. et al. Journal of Controlled Release, 122, 86-93, 2007, and Wu, G. et al. J. Am. Chem. Soc., 130, 8175-8177, 2008）。
このように、変動するレーザー露光時間、および照明間の時間を伴う同じリポソーム構造体の反復照射により、本発明者らは、任意の時間的プロファイルのドーパミン送達を刺激した。
【００５６】
光刺激されたリポソーム構造体からのドーパミンの放出動態を測定するために、本発明者らは、高速スキャンサイクリックボルタンメトリー（ＦＳＣＶ）を使用した（Robinson, D. L. et al. Clin Chem, 49, 1763-1773, 2003）。この技術において、三角の電圧波形（−０．４V〜１．３Vおよび３００V/sで−０．４Vに戻す）を、周波数１０Hzで導電性電極に適用する。電極は、三角スイープ間、−０．４Vに保持する（図１ｂ）。本発明者らは、＋０．６V（−０．２V）でのドーパミン分子の酸化（還元）の間の電流の流れを記録することにより、溶液中のドーパミン濃度を測定する（Robinson, D. L. et al. Clin Chem, 49, 1763-1773, 2003）。本発明者らのリポソーム構造体からのドーパミンの放出を高感度で測定するために、本発明者らは、リポソーム構造体が結合されたのと同じ炭素繊維を導電性電極として使用する。ＦＳＣＶ技術に対するこの即興措置によって、このように、本発明者らは、高い感度で、ソースにおいて直接的にドーパミン放出を測定することができる。増加した感度を、炭素繊維上のリポソーム構造体の固定化と組み合わせることによって、本発明者らは、リポソーム構造体の反復するオンデマンドでのパルス性放出動態を測定することができる。
【００５７】
図２ａは、一度の１秒間、３W/cm2のフェムト秒パルス列による照度に起因する、溶液中に放出されたドーパミン濃度の時間的プロファイルを示す。固定リポソーム構造体を伴う炭素繊維が照射されている間の、放出されたドーパミンの濃度の迅速で直線的な上昇が明らかに見える。レーザー照明のシャッターが閉められると直ぐに、溶液中への炭素繊維ソースから離れるような拡散に起因して、ドーパミン濃度が指数関数的に減衰する。溶液中へのこの遅い拡散プロファイルは、溶液、隣接細胞によるドーパミン取り込み、および他の実世界のプロセス次第で変動することが予測されるが（Cragg, S. J. & Rice, M. E. Trends Neurosci, 27, 270-277, 2004）、それらは、本論文の焦点ではない。本明細書において、本発明者らは、レーザー照射の間のドーパミン濃度にのサブ秒の制御された上昇（即ち、ドーパミン送達の時間プロファイル）に焦点を当てる。図２ａ中の挿入図は、４０秒離した間隔を置いた、反復１秒レーザー露光を用いて達成されたパルス性ドーパミン送達を実証する。ドーパミン放出プロファイルの各々において、レーザー露光中のドーパミン濃度の線形および迅速な上昇、そして続くドーパミンのソースから離れるように拡散することが観察される。
【００５８】
レーザー強度、露光時間、および露光間の時間を調整することにより、本発明者らは、任意のパルス性ドーパミン放出をプログラムすることができる。図３は、そのような任意のパルス性放出プロファイルを実証しており、そこでは、リポソーム構造体が、２W/cm2と３W/cm2の間の強度、５００msと１秒の間の露光時間、および５秒から２０秒までの範囲の露光間の時間を使用したフェムト秒パルス列を用いて反復照射された。図３中の挿入図は、放出されたドーパミンが、照射の期間中に直線的に増加し、放出速度は、入力レーザー強度により決定されていることを示している。故に、放出されたドーパミンの時間的プロファイル（レーザーへの露光時間を介して）および放出されたドーパミンの量（レーザーパルスの強度を介して）を独立的に制御することが可能である。
【００５９】
このドーパミン送達システムの長期的挙動および安定性をさらに理解するために、本発明者らは、反復の１秒間の３W/cm2露光にわたり放出されるピークドーパミン濃度を測定した。露光は、４０秒間離れるように設定し、これにより、以前の放出からのドーパミンが、拡散してなくなることを可能にした。露光間のこの時間によって、実験の結果は変わらなかった。図２ｂにおいて、本発明者らは、露光回数に対して放出されたピークドーパミン濃度をプロットしている。データは、双指数関数的減衰に直接的に適合することができ、これはドーパミン送達機構に寄与する２つの異なるプロセス（最初の数回の露光だけ継続する高速プロセス、および何百秒もの露光にわたり継続するより長いプロセス）があることを示している。
本発明者らは、リポソーム構造体の２つの集団があることを仮定することにより、この挙動を数学的にモデル化する：（ｉ）高い確率-αｆで、一度のレーザー露光においてこれらのリポソーム構造体の任意の１つが破壊され、それにより、そのリポソーム構造内の全てのドーパミンが、一度に放出される「脆弱」集団（Mackanos, M. A. et al.  J Biomed Opt, 14, 044009, 2009）；および（ｉｉ）レーザー露光時に破壊されないリポソームの頑強な集団、しかし、レーザー露光によって、それらの脂質膜の透過性が増加し、溶液中へのドーパミン分子の部分的な放出をもたらす。透過性のそのような増加は、以前に提案されている通り、外部刺激からの熱的（Djanashvili, K. et al. Bioorg Med Chem, 19, 1123-1130, 2011）または機械的（Oerlemans, C. et al. J Control Release, 168, 327-333, 2013）効果に起因しているのかもしれない。これらの仮定を用いて、ｋ回目の露光後に残存する「脆弱」リポソーム（Ｎｆｋ）の数が、指数関数的減衰により与えられ、ここで、Ｎｆ０は「脆弱」リポソームの初期個体数である。これらのリポソームからのｋ回目の露光において放出されたドーパミンは、単純に、破壊回数とそれらの内部体積中に含まれるドーパミンを乗じたものであり、ここで、Ｃ０およびＶ０は、作製された初期のリポソーム構造体の各々の濃度および容積である。リポソームの頑強な集団については、リポソームの数は、経時的に変化しない。しかし、ドーパミンの内部濃度は、レーザー露光時での溶液中へのその部分拡散に起因して減少し続ける。この部分的な拡散が、内部および外部濃度の差に単に比例し（比例定数αｒ）、外部濃度が、次のレーザー露光の時間までには常にゼロに行くと仮定すると、ｋ回目の露光中に放出されるドーパミンは、単純に
【化１】
2016540012.tif 000002
であり、ここで、Ｃｒｋは、ｋ回目の露光の間での頑強なリポソーム中での内部ドーパミン濃度であり、Ｎｒ０は頑強なリポソームの数である。このように、ドーパミンの内部濃度は、
【化２】
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により与えられる指数関数的減衰に従い、Ｃ０は、作製された初期のドーパミン濃度である。放出された全ドーパミンは、２つの寄与の合計により与えられ、このように、定数αｆおよびαｒならびに大きさＮｆおよびＮｒをそれぞれ伴う双指数関数的減衰を示す。
【００６０】
実験から上記のパラメータを抽出するために、本発明者らは、図３ｂ中のデータを、予想される双指数関数的減衰とフィッティングさせた。これによって、本発明者らに、αｆおよびαｒについての値を、０．２９±０．０８（標準誤差；ｎ＝７）および０．０６±０．０３としてそれぞれ与え、ＮｒとＮｆの比率は、実験的誤差内において、４：１である。Ｎｒ：Ｎｆの比率が大きいことは、リポソームの小さなパーセンテージだけが「脆弱」であることを示す。また、αｆの値が大きいことは、この「脆弱」集団が、それらが基本的に全て破壊される前の、数回の初期露光だけにおいて放出に寄与することを示す。他方で、頑強なリポソームは、集団の大きな割合を構成し、小さなαｒ値は、長期間にわたるドーパミンの反復放出の可能性を実証する。これらの頑強な集団は、また、リポソーム内での将来のドーパミン「ナノ工場」への扉を開くが（Schroeder, A. et al. Nano Lett., 12, 2685-2689, 2012）、そこでは、内部のドーパミン濃度が維持され、したがって、遅い減衰成分が排除される。
【００６１】
図４は、レーザー露光前後でのリポソーム構造体の電子顕微鏡画像を示しており、このモデルの独立した確認を提供する。以前に考察した通り、図４ｃは、レーザー露光前の炭素繊維に結合した多数のリポソーム構造体を示し、図４ｄは、反復レーザー露光後での炭素繊維の同じ領域を画像化している。これらの２つの画像の比較は、破壊されたリポソーム構造体の個体数は少数にすぎず（約２０%−本発明者らの数学的モデルから抽出されたパラメータと一致する）、大きな割合が、レーザー照射後に残存していることを示す。
【００６２】
結論として、本発明者らは、外部刺激としてフェムト秒レーザーを使用し、オンデマンドのサブ秒パルス性ドーパミン送達システムを実証した。レーザー強度および露光時間を変動させることにより、本発明者らは、ドーパミン送達の濃度および時間的プロファイルを任意に制御することができる。神経シグナリングが作動するタイムスケールは高速であることを考慮すると、この前例のない時間的制御は、重要な神経化学的プロセスを模倣する能力を提供する。この技術は、迅速な生物学的シグナリングに関与する天然および合成の治療化合物の送達；刺激される体積のサイズおよび形状を制御するための最近開発されたフェムト秒技術（Papagiakoumou, E. et al., Nat Meth, 7, 848-854, 2010）を組み合わせることにより、複数の脳部位を同時に刺激すること；異なるレーザー波長への送達システムの応答を設計し、マルチチャネル操作を可能にすること；および「神経化学的プロテーゼ」により神経変性に起因する機能喪失を潜在的に置換すること、における将来の可能性を約束する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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