(57)【要約】  本発明は、一般式（Ｉ）の化合物：2016523947.tif 000011［式中、可変部は種々の意味を持つ］、それらを含有する医薬組成物および薬剤におけるそれらの使用に関する。本化合物は、血管新生阻害剤として治療に有用であることが示される。本化合物は、真菌株パラコニオチリウム種（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｓｐ．）の発酵ブロスから単離されるか、またはその誘導体である。
2016523947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物：
【化１】
2016523947.tif 000009
［式中、Ｒ１は、−ＣＯＯＲａ、−ＣＯＮＨＲａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＸ、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＨ２ＯＲａ、−ＣＨ２Ｘからなる群から選択され；
ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、置換または無置換のアシル、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、置換または無置換のアルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換のベンジル、アルカリ金属および糖からなる群から選択され；
Ｘは、水素およびハロゲンからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、置換または無置換のアシル、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、置換または無置換のアルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換のベンジル、アルカリ金属および糖からなる群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、および置換または無置換のアルキニルからなる群から選択される］。
【請求項２】
Ｒ１が、−ＣＯＯＲａ、−ＣＯＮＨＲａ、−ＣＯＮＲａＲｂから選択され、より好ましくは−ＣＯＯＲａである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、−ＣＯＯＨまたはその塩である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、水素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、置換または無置換のアルケニルであり、好ましくは無置換のアルケニルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が、１−プロペニルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が、置換または無置換のアルケニルであり、好ましくは無置換のアルケニルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ４が、１−プロペニルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ＡＤ００１５７： 
【化２】
2016523947.tif 000010
またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に定義される一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の製造方法であって、微生物の培養ブロスから上記式（Ｉ）の化合物を単離する工程を含んでなる、方法。
【請求項１１】
微生物が、真菌株であり、より好ましくはパラコニオチリウム種（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｓｐ．）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
真菌株が、バレンシア大学（スペイン）のスペイン微生物株保護機関（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ  Ｅｓｐａｎｏｌａ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｉｖｏｓ  Ｔｉｐｏ）に寄託番号ＣＥＣＴ２０８４１で寄託されている、パラコニオチリウム種（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に定義される少なくとも１つの一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤として用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に定義される一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物。
【請求項１５】
薬剤が、病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防用である、請求項１４に記載の用途のための化合物。
【請求項１６】
ヒトの疾患が、癌、眼疾患、乾癬、血管腫、関節炎、子宮内膜症およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１５に記載の用途のための化合物。
【請求項１７】
眼疾患が、糖尿病性および非糖尿病性網膜症、未熟児網膜症ならびに黄斑変性症によって形成される群から選択される、請求項１６に記載の用途のための化合物。
【請求項１８】
関節炎が、変形性関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、痛風性関節炎、ループスに伴う関節炎、乾癬に伴う関節炎および関節リウマチによって形成される群から選択される、請求項１６に記載の用途のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、それを含有する医薬組成物および病的血管新生に起因するヒトの疾患の治療における用途のための薬剤中でのそれらの使用に関する。特に、当該発明は、微生物（真菌株パラコニオチリウム種（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｓｐ．））の発酵ブロスから単離された、ＡＤ０１５７などの新規な血管新生阻害剤化合物およびこれらの化合物の誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
他の既存のものから新しい血管を形成するプロセスである血管新生は、厳密には活性化剤と阻害剤とのバランスによって制御される。血管新生増殖因子が血管新生阻害剤を上回って産生される場合、バランスは血管増殖に有利に傾き、いわゆる「血管新生スイッチ」につながる。血管新生は、成人の生殖サイクル（黄体形成、子宮内膜の血管新生、胎盤発達）、創傷治癒および骨の修復に関連する幾つかの過程において減少する。これらすべての場合において、血管新生は、一過性の高度に制御されたプロセスとして生じる。逆に、持続的に調節解除された血管新生は、腫瘍の休眠状態から悪性の状態への移行における重要な工程である。
【０００３】
血管新生は、通常、制御されたプロセスであるが、（血管新生疾患として特徴づけられる）多くの疾患は、持続的な未制御の血管新生によって引き起こされる。眼の血管新生は、失明の最も一般的な原因に関係があるとされており、約２０の異なる眼疾患の原因である。関節炎のような特定の条件においては、新たに形成された毛細血管が、関節に侵入し、軟骨を破壊する。固形腫瘍の増殖および転移も血管新生に依存している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８６，４６，４６７−４７３およびＪ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９８９，８２，４−６）。
【０００４】
現在、血管新生は癌の特徴の１つとして考えられており、腫瘍の増殖、浸潤および転移に関連した役割を果たしている（Ｈａｎｎａｈａｎら，Ｃｅｌｌ  １４４（５）：６４６−７４，２０１１）。血管新生スイッチの役割は、腫瘍性疾患の原因に限定されず、他の非腫瘍性疾患（特に、滲出型黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病、乾癬および関節リウマチを含む）にも関連している。これら全ての事実は、血管新生阻害を、薬理学的研究の分野における魅力的な標的にしている。血管新生阻害治療の数の持続的な増加が、癌、失明および他の血管新生依存性疾患の治療のため認められており、これらの治療の可能性において期待を抱かせる（Ｑｕｅｓａｄａら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，１６（３５）：３９３２−５７，２０１０）。
【０００５】
ＪＰ２００８００１７２０は、血管新生阻害剤としての、微生物に由来するアンサマイシン抗生物質を開示する。
【０００６】
ＵＳ２００５１３１０６１は、血管新生阻害活性を有する、アスペルギルス属に属する微生物によって産生される化合物を記載している。
【０００７】
優れた血管新生阻害特性を有する小分子の設計および開発は、新規治療剤の開発のための魅力的な手法であり、そのような分子の必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、血管新生阻害特性を有する新規化合物を開示し、従って、病的血管新生プロセスに起因する疾患の治療において有用である。実施例の結果は、本発明の化合物であるＡＤ０１５７がインビトロで、またインビボでも血管新生を阻害することを明確に示す。それは、腫瘍および内皮細胞における増殖を阻害し、アポトーシスを誘発し；マトリゲルの層上で内皮管の形成を阻害し、内皮のタンパク質分解能を低下させる。インビボでの当該化合物の血管新生阻害活性が、マトリゲルプラグにおけるニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）ならびにゼブラフィッシュ胚の血管新生およびゼブラフィッシュの尾びれの再生アッセイによって示された。これらに基づくと、これらのデータは本発明の化合物が血管新生プロセスの幾つかの重要な工程を阻害することを示す。
【０００９】
具体的には、本発明の目的は、一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物：
【化１】
2016523947.tif 000003
［式中、Ｒ１は、−ＣＯＯＲａ、−ＣＯＮＨＲａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＸ、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＨ２ＯＲａ、−ＣＨ２Ｘからなる群から選択され；
ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、置換または無置換のアシル、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、置換または無置換のアルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換のベンジル、アルカリ金属および糖からなる群から選択され；
Ｘは、水素およびハロゲンからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、置換または無置換のアシル、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、置換または無置換のアルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換のベンジル、アルカリ金属および糖からなる群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のアルケニル、および置換または無置換のアルキニルからなる群から選択される］、
またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物である。
【００１０】
本発明の別の目的は、上記定義の一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の製造のための種々の方法である。
【００１１】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの上記定義の一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、薬剤または医薬組成物である。
【００１２】
本発明の別の目的は、薬剤として用いられる、特に病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防用の、上記定義の一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物である。
【００１３】
本発明の別の目的は、病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防用の薬剤の製造における、上記定義の一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の使用である。
【００１４】
本発明の別の目的は、病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防方法であって、上記定義の一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の治療有効量を、治療または予防などを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法である。
【００１５】
１つの態様において、前記疾患または状態は、癌、眼疾患、乾癬、血管腫、関節炎、子宮内膜症およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【００１６】
特定の態様において、疾患または状態は癌である。
【００１７】
１つの態様において、眼疾患は、糖尿病性および非糖尿病性網膜症、未熟児網膜症ならびに黄斑変性症によって形成される群から選択される。
【００１８】
別の態様において、関節炎は、変形性関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、痛風性関節炎、ループスに伴う関節炎、乾癬に伴う関節炎および関節リウマチによって形成される群から選択される。
【００１９】
これらの特徴およびその好ましい態様は、特許請求の範囲と同様に、以下の本明細書の詳細な説明においても更に定義される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＤ０１５７は内皮細胞および腫瘍細胞の増殖を阻害する。（Ａ）ＢＡＥ（▲）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（×）、ＨＴ２９（◆）、ＨＴ１０８０（■）およびＵ２ＯＳ（●）のインビトロでの増殖に対するＡＤ０１５７の用量依存的な効果。細胞の生存率は、薬剤を含有しない培地における対照の細胞増殖に対する割合として表される。各ポイントは４回の平均を表し、ＳＤ値は、典型的には、平均値の１０％未満であり、明確さのために省略する。（Ｂ）対照の細胞生存率の５０％を示す化合物の濃度として用量応答曲線から計算された半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値。これらは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表される。（Ｃ）対照の細胞生存率の５０％を示す化合物の濃度として用量応答曲線から計算された半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値。これらは２回の独立した実験（最初は単一試料での実験、２回目は３試料での実験）の平均±ＳＤとして表される。  ＢＡＥＣのＩＣ５０値は単一試料の実験から得た。
【図２】内皮細胞および腫瘍細胞における、ヘキスト染色による細胞形態に対するＡＤ０１５７の効果（バー＝５０μｍ）。
【図３】ＡＤ０１５７は内皮細胞の管形成を阻害する。  マトリゲル上に播種されたＢＡＥＣが管を形成した。ＡＤ０１５７は、毒性を示さない用量で、用量依存的にインビトロで内皮細胞の管形成を阻害した。倒立顕微鏡下、播種後７時間で細胞を撮影した（バー＝１００μｍ）。
【図４】ＡＤ０１５７は、内皮細胞の潜在的な遊走を阻害する。（Ａ）コンフルエントなＢＡＥＣ単層を傷つけ、指示された濃度の化合物の不存在中または存在中で新鮮な培地を添加した。アッセイ開始時および２４時間培養後に写真を撮影した。破線は傷の輪郭を示す（バー＝１００μｍ）。（Ｂ）無細胞領域内でのＢＡＥＣの再増殖を７時間後に測定し、回復した領域の割合を平均±ＳＤ（＊  Ｐ＜０．０５  対  対照（ｎ＝３））として表す。
【図５】ＢＡＥ細胞（Ａ）またはＨＴ１０８０細胞（Ｂ）からの培養上清および細胞抽出物を指示された濃度のＡＤ０１５７で２４時間処理し、等しい細胞密度に正規化し、ゼラチン酵素電気泳動に使用した。グラフは、ＢＡＥＣのＭＭＰ−２活性またはＨＴ１０８０のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性に対する正規化した相対的阻害効果の定量化を示す。データは無処理の対照に対する割合として表し、これらは３回の実験値の平均±ＳＤである（＊  Ｐ＜０．０５  対  対照、および＊＊  Ｐ＜０．００５  対  対照）。
【図６】ＢＡＥ細胞に対するＡＤ０１５７によるアポトーシス誘導。（Ａ）ＤＮＡ断片化に対するＡＤ０１５７の効果（ＴＵＮＥＬアッセイ）（バー＝５０μｍ）。（Ｂ）サブＧ１細胞群に対するＡＤ０１５７の効果。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ｃ）内皮細胞のカスパーゼ−３−様活性に対するＡＤ０１５７の効果。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤである（＊  Ｐ＜０．００５  対  対照）。
【図７】ＡＤ０１５７は、絨毛尿膜アッセイを阻害する。  媒体物質のみを含有するメチルセルロースディスク、ならびに０．５、０．１および５ｎｍｏｌのＡＤ０１５７を含有するメチルセルロースディスク。円は、メチルセルロースディスクの位置を示す（バー＝１ｍｍ）
【図８】ＡＤ０１５７によるゼブラフィッシュの血管新生の阻害。  内皮細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す遺伝子導入ＴＧｆｌｉ１：ＥＧＦＰｙ１ゼブラフィッシュ胚を、ＡＤ０１５７なしでまたは５、１０および２５μＭのＡＤ０１５７と共に培養した（バーは５０μｍを表す）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の文脈において、次の用語は以下に詳述する意味を有する。
【００２２】
「アルキル」は、不飽和（二重または三重結合）を含有しない、直鎖状または分枝鎖状の炭化水素鎖ラジカルを意味し、これは、一重結合によって分子の残部に結合する。典型的なアルキル基は、１〜約１２個、１〜約８個または１〜約６個の炭素原子を有する（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなど）。シクロアルキルによって置換された場合、シクロプロピルメチルなどの「シクロアルキルアルキル」ラジカルに相当する。アリールによって置換された場合、ベンジル、ベンズヒドリルまたはフェネチルなどの「アリールアルキル」ラジカルに相当する。ヘテロシクリルによって置換された場合、「ヘテロシクリルアルキル」ラジカルに相当する。
【００２３】
「アルケニル」は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１つの不飽和を含有する、直鎖状または分枝鎖状の炭化水素鎖ラジカルを意味し、これは、一重結合によって分子の残部に結合する。典型的なアルケニルラジカルは、２〜約１２個、２〜約８個または２〜約６個の炭素原子を有する。特定の態様において、アルケニル基は、ビニル、１−メチル−エテニル、１−プロペニル、２−プロペニルまたはブテニルである。
【００２４】
「アルキニル」は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖状または分枝鎖状の炭化水素鎖ラジカルを意味し、これは、一重結合によって分子の残部に結合する。典型的なアルキニルラジカルは、２〜約１２個、２〜約８個または２〜約６個の炭素原子を有する。特定の態様において、アルケニル基は、エチニル、プロピニル（例えば、１−プロピニル、２−プロピニル）またはブチニル（例えば、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル）である。
【００２５】
「シクロアルキル」は、脂環式の炭化水素を意味する。典型的なシクロアルキルラジカルは、１〜４個の別個の環および／または縮合環と、３〜約１８個の炭素原子、好ましくは３〜１０個の炭素原子を含有する（例えば、シクロプロピル、シクロヘキシルまたはアダマンチル）。特定の態様において、シクロアルキルラジカルは、３〜約６個の炭素原子を含有する。
【００２６】
「アリール」は、単環および複数の環のラジカルを意味し、別個のアリール基および／または縮合アリール基を含有する複数の環ラジカルを含む。典型的なアリール基は、１〜３個の別個の環および／または縮合環と、６〜約１８個の炭素環原子、好ましくは６〜約１４個の炭素環原子を含有する（例えば、フェニル、１−もしくは２−ナフチル、ビフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラシルラジカル）。
【００２７】
「ヘテロシクリル」としては、１〜３個の別個の環および／または縮合環と、３〜約１８個の炭素環原子を含有する芳香族複素環基および脂肪族複素環基が挙げられる。好ましくは、芳香族複素環基および脂肪族複素環基は、５〜約１０個の環原子を含有する。本発明の化合物における適切な芳香族複素環基は、Ｎ、ＯまたはＳ原子から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含有し、例えば、クマリニル（８−クマリニルを含む）、キノリル（８−キノリルを含む）、イソキノリル、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリミジニル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ピリダジニル、トリアジニル、シンノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニルおよびフロピリジニルが挙げられる。本発明の化合物における適切な脂肪族複素環基は、Ｎ、ＯまたはＳ原子から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含有し、例えば、ピロリジニル、テトラヒドロフリル、ジヒドロフリル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジル、モルホリニル、チオモルホリニル、チオキサニル、ピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、アゼピニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキシル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプチル、３Ｈ−インドリルおよびキノリジニルが挙げられる。
【００２８】
上述の基は、１以上の適切な基（例えば、ＯＲ’、＝Ｏ、ＳＲ’、ＳＯＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＯＳＯ２Ｒ’、ＯＳＯ３Ｒ’、ＮＯ２、ＮＨＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、＝Ｎ−Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）ＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）２、Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（＝ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）Ｒ’、Ｎ３、ＣＮ、ハロゲン、ＣＯＲ’、ＣＯＯＲ’、ＯＣＯＲ’、ＯＣＯＯＲ’、ＯＣＯＮＨＲ’、ＯＣＯＮ（Ｒ’）２、ＣＯＮＨＲ’、ＣＯＮ（Ｒ’）２、ＣＯＮ（Ｒ’）ＯＲ’、ＣＯＮ（Ｒ’）ＳＯ２Ｒ’、ＰＯ（ＯＲ’）２、ＰＯ（ＯＲ’）Ｒ’、ＰＯ（ＯＲ’）（Ｎ（Ｒ’）Ｒ’）、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、アリールおよび複素環基（各Ｒ’基は、独立して、水素、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＮ、ハロゲン、ＣＯＨ、ＣＯアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、アリールおよび複素環基からなる群から選択される））によって、１以上の可能な位置で置換されてよい。このような基それ自身が置換されている場合、置換基は前述のリストから選択してよい。
【００２９】
「ハロゲン」、「ハロ（ｈａｌｏ）」または「ハロ（ｈａｌ）」は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを意味する。
【００３０】
用語「塩」は、前記化合物が、イオン形態であるか、または荷電して対イオン（カチオンまたはアニオン）に結合しているか、または溶液中にある、本発明に従って使用される化合物の任意の形態として理解されなければならない。この定義は、４級アンモニウム塩、および他の分子とイオンとの分子の錯体（特に、イオン相互作用を介して形成される錯体）も包含する。本定義は、特に、生理学的に許容可能な塩を包含し、当該用語は、「薬理学的に許容可能な塩」または「薬学的に許容可能な塩」に対する等価物として理解されなければならない。
【００３１】
本発明の文脈における用語「薬学的に許容可能な塩」は、特に、ヒトおよび／または哺乳動物において、治療のために適切な方法で使用されるか、適用されるかまたは使用される場合、生理学的に許容される（特に対イオンの結果として、通常、毒性がないことを意味する）、任意の塩を意味する。これらの生理学的に許容可能な塩は、カチオンまたは塩基と共に形成されてよく、本発明の文脈において、アニオンなどの本発明に従って使用される少なくとも１つの化合物（通常、（脱プロトン化された）酸）と、好ましくは無機の、特にヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合に、生理学的に許容される少なくとも１つのカチオンとによって形成される塩であると理解される。アルカリ金属およびアルカリ土類金属との塩は、アンモニウムカチオン（ＮＨ４＋）と形成されたものと同様に、特に好ましい。好ましい塩は、（モノ）もしくは（ジ）ナトリウム、（モノ）もしくは（ジ）カリウム、マグネシウムまたはカルシウムと形成されたものである。これらの生理学的に許容可能な塩は、アニオンまたは酸と形成されてもよく、本発明の文脈において、カチオンなどの、例えば、窒素において、通常プロトン化された本発明に従って使用される少なくとも１つの化合物と、特にヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合に、生理学的に許容される少なくとも１つのアニオンとによって形成される塩であると理解される。本発明の文脈において、当該定義としては、特にヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合に、生理学的に許容される酸によって形成される塩（即ち、生理学的に許容される有機酸もしくは無機酸との特定の活性化合物の塩）が具体的に挙げられる。当該タイプの塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、マンデル酸、フマル酸、乳酸またはクエン酸と形成されるものである。
【００３２】
本発明の用語「溶媒和物」は、前記化合物が、別の分子（通常、極性溶媒）と非共有結合によって結合する本発明の化合物の任意の形態を意味するものと理解されるべきであり、特に、水和物およびアルコラート（例えば、メタノラートなど）を包含する。好ましい溶媒和物は水和物である。
【００３３】
本明細書で言及する任意の化合物は、このような特定の化合物ならびに特定の変形物および形態を表すことを意図する。特に、本明細書で言及する化合物は、不斉中心を有していてよく、従って、種々のエナンチオマー形態またはジアステレオマー形態で存在してよい。従って、本明細書で言及する任意に提供される化合物は、ラセミ体の任意の一方、１以上のエナンチオマー形態、１以上のジアステレオマー形態およびそれらの混合物を表すことを意図する。同様に、二重結合に関する立体異性または幾何異性も可能であり、従って、ある場合において、分子は（Ｅ）異性体または（Ｚ）異性体（トランスおよびシス異性体）として存在することができる。分子が幾つかの二重結合を含有する場合、各二重結合はそれぞれ立体異性を有し、これは分子の他の二重結合の立体異性と同じまたは異なっていてよい。更に、本明細書で言及する化合物はアトロプ異性体として存在してよい。本明細書で言及する化合物の、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体およびアトロプ異性体を含む全ての立体異性体ならびにそれらの混合物が、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００３４】
更に、本明細書で言及する任意の化合物は互変異性体として存在してよい。具体的には、互変異性体という用語は、平衡状態で存在し、ある異性体の形態から別の形態にすぐに変換される化合物の２以上の構造異性体の１つを言う。一般的な互変異性のペアは、エナミン−イミン、アミド−イミド酸、ケト−エノール、ラクタム−ラクチムなどである。
【００３５】
特に明記しない限り、本発明の化合物は、同位体で標識された形態（即ち、１以上の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物）を包含することも意味する。例えば、少なくとも１つの水素原子が重水素もしくはトリチウムによって置換されたか、または少なくとも１つの炭素が１３Ｃもしくは１４Ｃが濃縮された炭素によって置換されたか、または少なくとも１つの窒素が１５Ｎが濃縮された窒素によって置換された以外は、現構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物は、好ましくは薬学的に許容可能な形態であるか、または実質的に純粋な形態である。薬学的に許容可能な形態としては、とりわけ希釈剤および担体のような通常の薬学的添加剤を除いて、薬学的に許容可能なレベルの純度を有し、通常の投与量で毒性を示す物質を含まないことを意味する。薬剤物質の純度レベルは、好ましくは５０％超、より好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超である。好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物、またはその塩、立体異性体もしくは溶媒和物は９５％超である。
【００３７】
本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、その発症後の疾患または状態の、根絶、除去、復帰、軽減、修飾または制御を含む。
【００３８】
本明細書で使用される用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、その発症前に、疾患または状態の発症もしくは発生を、回避する、最小化するもしくは困難にする治療能力を意味する。
【００３９】
従って、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」もしくは「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および／または「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」もしくは「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、全体として、対象を苦しめる状態に関連する症状の少なくとも抑制または回復を意味し、抑制および回復は、パラメータ（例えば、治療される状態に関連する症状）の大きさが少なくとも低減することを示す幅広い意味で使用される。このように、本発明の方法は、対象がもはやその状態を経験しなくなるような、状態を完全に阻害する（例えば、発生から予防する）または停止する（例えば、終結する）状況も包含する。
【００４０】
本発明の化合物は、血管新生に関連する障害または疾患の予防および／または治療のための薬剤における薬理学的に活性な剤として適切である。
【００４１】
特定の態様において、Ｒ１は、−ＣＯＯＲａ、−ＣＯＮＨＲａ、−ＣＯＮＲａＲｂ（ＲａおよびＲｂは上記定義の通り）から選択される。
【００４２】
より具体的な態様において、Ｒ１は、−ＣＯＯＲａであり、より好ましくは−ＣＯＯＨまたはその塩である。
【００４３】
別の特定の態様において、Ｒ２は水素である。
【００４４】
別の特定の態様において、Ｒ３は、置換または無置換のアルケニルであり、好ましくは無置換のアルケニルである。特定の好ましい態様において、Ｒ３は１−プロペニルである。
【００４５】
別の特定の態様において、Ｒ４は、置換または無置換のアルケニルであり、好ましくは無置換のアルケニルである。特定の好ましい態様において、Ｒ４は１−プロペニルである。
【００４６】
より好ましい態様において、Ｒ３およびＲ４の両方が１−プロペニルである。
【００４７】
別の特定の態様において、Ｒ５は、置換または無置換のアルキルであり、好ましくは無置換のアルキルである。より好ましい態様において、Ｒ５は、直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ１２アルキルであり、好ましくはＣ１−Ｃ７アルキルであり、より好ましくはＣ３−Ｃ６アルキルである。特定の態様において、無置換の直鎖状アルキルが好ましく、特にヘキシルが好ましい。
【００４８】
別の特定の態様において、Ｘはハロゲンである。
【００４９】
別の特定の態様において、Ｘはハロゲンであり、好ましくはＣｌである。
【００５０】
更に好ましい態様において、異なる置換基についての２以上の上述の好ましいものが組み合わされる。本発明は上記式（Ｉ）における好ましい置換基のそのような組み合わせにも対する。
【００５１】
式（Ｉ）に包含される特定の個々の本発明の化合物としては、化合物ＡＤ０１５７
【化２】
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またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物が挙げられる。
【００５２】
一般式（Ｉ）の化合物は、微生物（真菌株パラコニオチリウム種ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５）の発酵ブロスから単離することができ、その培養物は、バレンシア大学（スペイン）のスペイン微生物株保護機関（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ  Ｅｓｐａｎｏｌａ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｉｖｏｓ  Ｔｉｐｏ）に寄託番号ＣＥＣＴ２０８４１で寄託されている。当該寄託は、ブダペスト条約の規定の下で行われ、本出願に対する特許の認可の際に、公衆に対してこれを利用可能にする全ての条件が変更不可能に維持されるだろう。
【００５３】
微生物は、グアテマラで採取された海洋脊索動物の試料から単離された。
【００５４】
更なる面において、本発明は、微生物の培養ブロスから上記式（Ｉ）の化合物を単離する工程を含んでなる、上記定義の式（Ｉ）の化合物の製造方法に関する。
【００５５】
好ましい態様において、微生物は、真菌株であり、より好ましくはパラコニオチリウム種である。特定の態様において、真菌株は、バレンシア大学（スペイン）のスペイン微生物株保護機関に寄託番号ＣＥＣＴ２０８４１で寄託されている、パラコニオチリウム種ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５である。
【００５６】
寄託された株は明確に好ましいが、本発明は任意の特定の株または微生物に制限または限定されない。ＡＤ０１５７を産生する他の微生物、株または変異株は本発明の範囲内である。
【００５７】
適切な培地中、制御された条件下で培養されたパラコニオチリウム種は、血管新生阻害剤化合物であるＡＤ０１５７を産生する。当該株は、好ましくは、好気性および中温性条件下で、水性栄養培地中で増殖する。
【００５８】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、微生物または上記の株に由来する遺伝子改変微生物によって製造できる。
【００５９】
或いは、式（Ｉ）の化合物は、ＡＤ０１５７のような同じ基本構造を有する他の化合物から誘導できる。従って、本発明の化合物は、天然源から既に得られたものを修飾することによって、または各種の化学反応を使用することによって既に修飾されたものを更に修飾することによって得ることができる。従って、ヒドロキシル基は、標準的なカップリング法またはアシル化法によって（例えば、ピリジンなどの中で、酢酸、塩化アセチルまたは無水酢酸を使用することによって）アシル化できる。ホルメート基は、ギ酸中で、ヒドロキシル前駆体を加熱することによって得ることができる。カルバメートは、イソシアネートと共にヒドロキシル前駆体を加熱することによって得ることができる。ヒドロキシル基は、ヨウ素、臭素もしくは塩素については、スルホン酸中間体を経て、またはフッ素については三フッ化硫黄を使用して直接、ハロゲン基に変換でき、或いは、これらはスルホン酸中間体の還元によって水素に還元できる。ヒドロキシル基は、臭化アルキル、ヨウ化アルキルもしくはスルホン酸アルキルを使用するアルキル化によってアルコキシ基にも変換でき、または、例えば保護された２−ブロモエチルアミンを使用することによってアミノ低級アルコキシ基にも変換できる。アミド基は、標準的なアルキル化法またはアシル化法によって（例えば、ピリジンなどの中で、ＫＨおよびヨウ化メチル、または塩化アセチルをそれぞれ使用することによって）アルキル化またはアシル化できる。エステル基は、カルボン酸に加水分解でき、またはアルデヒドもしくはアルコールに還元できる。カルボン酸は、標準的なカップリング法またはアシル化法により、アミンとカップリングでき、アミドが得られる。必要に応じて、置換基に対して適切な保護基を使用でき、反応性基に影響を与えないことを確実にできる。これらの誘導体を得るために必要な手順および試薬は当業者に公知であり、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第６版、２００７、ワイリー・インターサイエンス）のような一般的な教科書中に見いだされ得る。
【００６０】
例えば、Ｒ１は、以下に記載するような、標準的な有機化学反応を使用して変換できる。
【化３】
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【００６１】
カルボン酸と塩化チオニルとの反応は、対応する酸塩化物を生成し、これは対応するアミンとの反応によってアミドに変換できる。ピリジン存在中、酸塩化物とアルコールとの反応は対応するエステルを与え、これは種々の還元方法によって対応するアルコールに容易に変換できる。アルコールのスワン酸化は対応するアルデヒドを与える。アルコールとＮａＣＮとの反応は対応するニトリルを与え、最後に、対応するハロゲン化物は、アルコールとＰＸ３との反応によって得ることができる。
【００６２】
別の態様において、分子中へのＲ２の導入は、任意の古典的なヒドロキシル基の保護方法（エーテル、エステルなどの形成を経由する）によって達成できる。
【００６３】
Ｒ３およびＲ４のアルケニル基の修飾は、二重結合の水素化、エポキシ化、または種々の二重結合への付加反応および更なる修飾によって達成できる。
【００６４】
本発明の目的は、少なくとも１つの上記定義の一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、薬剤または医薬組成物を提供することでもある。
【００６５】
用語「賦形剤」は、活性成分以外の薬剤化合物の成分をいう（欧州医薬品庁（ＥＭＡ）から得られる定義）。それらとして、好ましくは「担体、補助剤および／または媒体」が挙げられる。担体は、薬剤の送達および有効性を改善するために組み込まれている物質の形態である。薬剤担体は、インビボでの薬剤の作用を延長するため、薬剤代謝を減少させるため、および薬剤の毒性を低減するために、放出制御技術のような薬物送達システムにおいて使用される。担体はまた、薬理作用の標的部位への薬剤の送達の有効性を高めるための設計において使用される（米国国立医学図書館、米国国立衛生研究所）。補助剤は、予測可能な方法で活性成分の作用に影響を与える薬剤製品製剤に添加される物質である。媒体は、好ましくは治療作用を有さず、薬剤の投与のためのバルクを与える媒質として使用される、賦形剤または物質である（Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｐｅｌｌｃｈｅｃｋｅｒ（ｃ）２００６  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。このような薬学的な担体、補助剤または媒体は、水および油などの無菌の液体（石油、動物、植物または合成起源のものを含む（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など））、賦形剤、崩壊剤（ｄｉｓｇｒｅｇａｎｔｓ）、湿潤剤または希釈剤であり得る。適切な薬学的な担体は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）に記載されている。これら賦形剤およびその使用量の選択は、医薬組成物の適用形態に依存するだろう。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口（例えば、肺内、経鼻、直腸内および／または静脈内）の任意の投与経路により投与するために適合し得る。従って、本発明の製剤は、特に、皮膚、皮下、筋肉内、関節内、腹腔内、肺、頬側、舌下、経鼻、経皮、膣、経口または非経口適用のために、局所または全身適用に適合し得る。
【００６７】
経口適用のための適切な製剤は、錠剤、丸剤、チューインガム、カプセル剤、顆粒剤、ドロップまたはシロップである。非経口適用のための適切な製剤は、液剤、懸濁剤、再構成可能な乾燥製剤またはスプレーである。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、経皮適用のために、溶解した形態中またはパッチ中に存在するように製剤化されてよい。皮膚適用としては、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、懸濁剤またはエマルジョンが挙げられる。
【００６９】
本発明の別の面は、上記定義の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の治療有効量を、治療または予防などを必要とする対象に投与することを含んでなる、病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防方法である。
【００７０】
本発明の文脈における病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患は、好ましくは、癌、眼疾患、乾癬、血管腫、関節炎、子宮内膜症およびアテローム性動脈硬化症から選択される。
【００７１】
用語「癌」としては、原発性および転移性の固形腫瘍および細胞癌（例えば、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、小腸、泌尿器（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む）、女性生殖器官（子宮頚部、子宮、卵巣、絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖器官（前立腺、精嚢、精巣および生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎および下垂体を含む）、皮膚（血管腫、黒色腫、骨または軟組織から生じる肉腫（カポジ肉腫を含む）、脳、神経および眼の腫瘍を含む）、髄膜（星細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽腫、シュワン細胞腫および髄膜腫を含む）、造血器腫瘍（白血病および緑色種を含む）に起因する固形腫瘍、形質細胞腫、プラーク、菌状息肉症の腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む））が挙げられる。用語「眼疾患」とは、本明細書において、角膜または網膜の血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）／血管新生（ａｎｇｉｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連する疾患（糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植後拒絶反応、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性症、低酸素、眼の異常な血管新生条件を介した網膜血管新生を含む）を意味する。
【００７２】
本発明の好ましい態様において、治療される眼疾患は、糖尿病性および非糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障ならびに黄斑変性症から選択される。
【００７３】
用語「角膜または網膜の血管新生」は、角膜に侵入するかまたは網膜に生じる新たな血管の形成に関し、これは、例えば、網膜症または黄斑変性症などの視覚的な変化と失明を引き起こし得る。用語「網膜症」とは、目の網膜の非炎症性損傷を意味し、網膜症としては、糖尿病性および非糖尿病性網膜症ならびに未熟児網膜症が挙げられる。特に、「糖尿病性網膜症」とは、糖尿病の合併症に起因する網膜症を意味する。用語「未熟児網膜症」は、未熟で生まれた新生児に影響を与える眼疾患に関する。用語「黄斑変性症」は、視野の中央（即ち、黄斑）における視力喪失に関する。
【００７４】
用語「乾癬」は、皮膚および関節に影響を与える免疫系によって媒介される疾患に関連かつ包含する。皮膚に影響を与える場合、制御できない血管新生、上皮細胞の増殖および局在性の慢性炎症の結果として、プラークと呼ばれる隆起した鱗状の赤いパッチの形態が、通常、生じる。用語「血管腫」は、幼年期の間に発生する血管腫瘍に関する。血管腫形成の原因は血管新生の増加が関与している。
【００７５】
用語「関節炎」は、硬直、痛みおよび時には関節の腫脹を引き起こす頻繁な慢性疾患に関連し、変形性関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、痛風性関節炎、ループスに伴う関節炎、乾癬に伴う関節炎などが挙げられる。好ましい実施形態において、治療される関節炎は関節リウマチである。
【００７６】
用語「子宮内膜症」は、骨盤痛、付属器腫瘤、月経困難症、排尿障害および不妊症などの症状を引き起こす、骨盤全体または腹壁内の様々な部位における、子宮外の子宮内膜の増殖に関する。
【００７７】
用語「アテローム性動脈硬化症」は、血管壁の収縮および変則性が生じ、血液循環を妨げて、臓器および組織の適切な灌流を困難にする、動脈に影響を与える疾患に関する。
【００７８】
一般に、本発明で使用される化合物の有効投与量は、選択された化合物の相対的な有効性、治療される疾患の重症度、年齢、体重または投与方法に依存するだろう。しかしながら、活性化合物は、典型的には、１日当たり１回以上、例えば、１日１、２、３または４回、典型的な一日量の合計が０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内で投与されるだろう。
【００７９】
特定の態様において、本発明の式（Ｉ）の化合物および医薬組成物は、併用療法を行うために、他の薬剤と組み合わせて使用してよい。他の薬剤は、同一組成物の一部を形成してよく、または同時もしくは異なる時点で投与するための別個の組成物として提供されてよい。
【００８０】
１つの態様において、併用療法を行うための追加の薬剤は、別の医薬品の血管新生阻害剤である。前記他の血管新生阻害剤は、抗ＶＥＧＦ剤（モノクローナル抗体（ベバシズマブ（アバスチン）など）、抗体の誘導体（ラニビズマブ（ルセンティス）など）、もしくは抗体の断片（ＦａｂＩＭＣ１１２１またはＦ２００Ｆａｂなど）、またはＶＥＧＦによって刺激されたチロシンキナーゼを阻害する経口投与可能な小分子（ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブおよびパゾパニブなど）など）；抗ＦＧＦ剤（スラミンおよびその誘導体、ペントサンポリサルフェート、セジラニブ、パゾパニブまたはＢＩＢＦ１１２０など）；抗ＥＧＦ剤（セツキシマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブなど）；抗ＨＧＦ剤（ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＮＫ４またはＡＭＧ１０２など）；ならびに、血管新生阻害ポリペプチド（アンジオスタチン、エンドスタチン、血管新生阻害アンチトロンビンＩＩＩまたはＳＦＲＰ４など）から選択されてよい。
【００８１】
「併用投与」または「併用療法」としては、本発明の式（Ｉ）の化合物が、病的血管新生プロセスに起因するヒトの疾患の治療および／または予防に有用な別の活性薬剤と、同時にまたは連続して、一緒にまたは別々に、同時に投与されることが理解される。
【００８２】
本発明の意味における「同時に」とは、同じ経路によって、同時にまたは実質的に同時に、少なくとも２つの活性薬剤を投与することを意味する。
【００８３】
本発明の意味における「別々に」とは、異なる経路によって、同時にまたは実質的に同時に、少なくとも２つの活性薬剤を投与することを特に意味する。
【００８４】
「連続して」とは、同一または異なる投与経路で、少なくとも２つの活性薬剤を異なる時点で投与することを意味する。より具体的には、投与方法は、一方の活性成分の全体の投与が、他方の投与または他方の開始の前に行われることを意味する。従って、それは、活性成分の一方を、他方の活性成分または成分を投与する前の数ヶ月以上にわたって投与することが可能である。この場合には同時治療は存在しない。数週間にわたって各活性成分の交互の投与も想定し得る。
【００８５】
本発明について一般的な用語で記述してきたが、例証として提供し、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００８６】
実施例１：産生する生物の同定：
ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５株の分類学的検討を以下にまとめる。
【００８７】
培養物の特徴
コロニーは、湿度４２％を維持した培養室でポテトデキストロース寒天培地上、２５℃１０日間で、直径７ｃｍに達する。
【００８８】
コロニーの特徴
コロニー成長は早く、白〜淡褐色、テクスチャが感じられ、水浸した菌糸（ｈｉｐｈａｅ）の同心円領域では暗褐色になる。
【００８９】
顕微鏡観察
約１００μｍのサイズの褐色の分生子殻（ｐｉｃｎｉｄｉａ）を、コロニーの外側部分の幾つかの領域の周囲で分類した。単純な分生子形成細胞で、褐色の、中隔を有し、円柱状〜円形状の末端の、８×４μｍの分生子を生じる。
【００９０】
ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２のリボソームＤＮＡ領域の配列解析後、分類学的決定を確認した。配列は、パラコニオチリウム・バリアビレ（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）の配列と９５％の割合の類似性を示す。分生子の特徴および低い類似性値は種レベルを確認できないが、単離物をパラコニオチリウム種として同定させる。
【００９１】
固体培地上での増殖の最適温度は２４〜２８℃である。増殖のためのｐＨ範囲は５〜７である。増殖はグルコースおよびデンプンが最も良好であった。小麦粉、グリセリンおよびデキストロースなどの他の炭素源を使用することもできる。
【００９２】
前記した特徴に基づき、培養物をパラコニオチリウム種と決定した。真菌株パラコニオチリウム種ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５を、バレンシア大学（スペイン）のスペイン微生物株保護機関に寄託番号ＣＥＣＴ２０８４１で寄託した。
【００９３】
実施例２：産生段階
適切な培地中、制御された条件下で培養されたパラコニオチリウム種ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５は、血管新生阻害剤の化合物ＡＤ０１５７を産生する。この株は、好ましくはｐＨ５．０〜７．０で２４〜２８℃の、好気性および中温性条件下、水性栄養培地中で増殖する。
【００９４】
方法の記載は以下の通りである。
保存培養
純粋なパラコニオチリウム種ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５の培養物を２０％グリセリン中、−７０℃で凍結保管した。
【００９５】
種菌の調整
よく成長した寒天培地を使用し、２５０ｍｌの振とうフラスコ中、２％オートミール、２％麦芽エキス、０．０１％ＫＨ２ＰＯ４、０．００５％ＭｇＳＯ４および生水を含有する４０ｍｌの種培地を接種し、ロータリーシェーカー上、２００ｒｐｍで、２４℃で培養した。フラスコを暗所で４８時間培養し、第１段階の種菌として使用した。
【００９６】
発酵
２Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中、２５０ｍｌの同じ培地を１０％の第１段階の種菌と共に培養した。発酵は、暗所で、ロータリーシェーカー上、２００ｒｐｍで、２４℃、７日間行った。
【００９７】
当該化合物の産生は、ＨＰＬＣまたは十分な感度を持つ任意の他の方法によって追跡できる。
【００９８】
実施例３：単離
真菌ＨＬ−７８−ｇＣＨＳＰ３−Ｂ００５の発酵ブロス（４．５Ｌ）をセライトを通じてろ過し、菌糸体のケーキをＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（３：１）の混合物２Ｌで２回抽出した。得られた懸濁液をろ過し、ＥｔＯＡｃおよび水の間で分配した。有機層を乾燥し、粗抽出物（９．３１ｇ）をシリカゲルのＶＦＣ（真空フラッシュクロマトグラフィー）によって分画し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨの段階的なグラジエントで溶出した。化合物Ｉを含有する分画（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝９：１で溶出、２２５ｍｇ）を、シリカゲルカラムに適用し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨグラジエントで溶出するフラッシュクロマトグラフィーを行った。化合物Ｉを含有する分画（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝９３：７で溶出、８３ｍｇ）を最終的にセミ分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、２３ｍｇの純粋な化合物Ｉを得た。
【００９９】
分析用のＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム（５μｍ、３．９×１５０ｍｍ）および移動相として５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１％ギ酸）から１００％ＭｅＯＨにグラジエント（２０分）し、１００％ＭｅＯＨ（１０分以上）、流速０．７ｍＬ／分、検出２２０ｎｍを使用して、室温で、ＨＰＬＣ分析を行った（本条件において、化合物Ｉの保持時間は１７．９０分である）。
【０１００】
実施例４：構造決定
化合物Ｉは、ＡＰＣＩおよびＡＰＩ−ＥＳ質量スペクトル（擬分子イオンがｍ／ｚ６４２［Ｍ＋Ｈ］＋、および同位体ピークがｍ／ｚ６４４、比率は３：１）、１３Ｃ  ＮＭＲおよびＤＥＰＴデータによって確立した分子式Ｃ３４Ｈ４０ＣｌＮＯ９を有する。化合物Ｉの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの完全な帰属は、２次元ＮＭＲの実験（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ）によって最終的に確立した。その分光学データを第１表に示す。
【０１０１】
【表１】
2016523947.tif 000006
【０１０２】
生物活性
細胞の培地はバイオウィッタカー（ウォーカースビル、ＭＤ、米国）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ハーラン・セララボ（ベルトン、英国）の製品であった。マトリゲルは、ベクトン・ディッキンソン（ベッドフォード、ＭＡ、米国）から購入した。本セクションで列挙しない補助剤および他の化学薬品はシグマ・ケミカルズ（セントルイス、ＭＯ，米国）から入手した。細胞培養用のプラスチックはＮＵＮＣ（ロスキレ、デンマーク）によって供給された。受精鶏卵はグランハ  サンタ  イサベル（Ｇｒａｎｊａ  Ｓａｎｔａ  Ｉｓａｂｅｌ）（コルドバ、スペイン）から入手した。
【０１０３】
ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞を、１０％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）を追加した、グルコース（１ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびアムホテリシン（１．２５ｍｇ／Ｌ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ヒト繊維肉腫ＨＴ１０８０細胞を、１０％ＦＢＳを追加した、グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびアムホテリシン（１．２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＤＭＥＭ中で維持した。ヒト結腸腺癌ＨＴ２９細胞およびヒト骨肉腫Ｕ２−ＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳを追加した、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびアムホテリシン（１．２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地中で維持した。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを追加した、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびアムホテリシン（１．２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
【０１０４】
統計解析：
全データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。二組の平均の評価のためにスチューデントの片側ｔ検定を使用し、対照群と異なる群を確立した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意とみなした。
【０１０５】
実施例５：ＡＤ０１５７は内皮細胞および腫瘍細胞の増殖を阻害する
９６ウェルマイクロプレート中、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）色素減少アッセイを使用した。アッセイは、生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる青色のホルマザン産物へのＭＴＴの減少に依存し、これは分光光度法で測定できる。全体積１００μｌの完全培地中の３×１０３のＢＡＥ細胞を、上記説明の通り入手した化合物ＡＤ０１５７の段階希釈と共に各ウェルで培養した。暗所（湿性環境中、３７℃、５％ＣＯ２）で培養３日後、１０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートを更に４時間（３７℃）培養した。得られたホルマザンを１５０μｌの０．０４Ｎ  ＨＣｌ−２−プロパノールに溶解し、５５０ｎｍで読み取った。全ての定量は、３回の独立した実験で行った。ＩＣ５０値を５０％の細胞生存率を示すＡＤ０１５７の濃度のものとして計算した（対照の値は１００％をとる）。
【０１０６】
ヘキスト染色実験のために、細胞を８ウェルのチャンバースライドに播種し、サブコンフルエントまで増殖させた。完全培地中、指示された濃度の化合物と共に１４時間処理後、細胞を洗浄し（ＰＢＳ）、固定した（ホルマリン溶液、シグマ）。チャンバースライドをヘキストで染色し、乗せて（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、ダコ）、蛍光顕微鏡（ライカ、ＴＣＳ−ＮＴ）下、観察した。
【０１０７】
血管新生は内皮細胞の局所的な増殖に関与する。我々は、活発に増殖する内皮細胞および腫瘍細胞の増殖を阻害するＡＤ０１５７の能力を見出した。図１に示すように、ＡＤ０１５７は、１０％ＦＢＳで増殖が刺激されたサブコンフルエントのＢＡＥ細胞について、ＩＣ５０値１０．９μＭで、培養ＢＡＥ細胞の増殖を阻害した。ＨＴ１０８０線維肉腫、ＨＴ２９結腸腺癌、ＭＤＡＭＢ２３１乳癌およびＵ２ＯＳ骨肉腫細胞株を用いて得られたデータは、腫瘍細胞のＩＣ５０値がＢＡＥＣのものと同範囲の濃度であったので、ＡＤ０１５７が内皮細胞の増殖の特異的阻害剤ではないことを示す。
【０１０８】
更に、Ａ５４９肺癌、ＨＣＴ−１１６結腸癌、ＰＳＮ１膵臓腺癌およびＴ９８Ｇ神経膠芽腫細胞株を用いて得られたデータは、腫瘍細胞のＩＣ５０値がＢＡＥＣのものと同範囲の濃度であったので、ＡＤ０１５７が内皮細胞の増殖の特異的阻害剤ではないことを示す。  
【０１０９】
ＡＤ０１５７の増殖阻害活性が、少なくとも部分的に、アポトーシスの誘導が原因であるかどうかを決定する最初のアプローチとして、核の形態を、種々の濃度のこれら化合物での内皮細胞および腫瘍細胞の処理後に調査した。図２は、ＡＤ０１５７が、５μＭを超える濃度で、内皮細胞およびほとんどの種類の腫瘍細胞における染色体凝縮を引き起こしたことを示す。
【０１１０】
実施例６：ＡＤ０１５７は内皮細胞による毛細管形成を阻害する
４℃でマトリゲル（約１０．５ｍｇ／ｍＬを５０μＬ）を使用して、９６ウェルプレートの各ウェルをコートし、３７℃で最大３０分間重合させた。５×１０４のＢＡＥ細胞を２００μＬのＤＭＥＭと共に添加した。最後に、種々の量の化合物ＡＤ０１５７を添加し、５％ＣＯ２の加湿チャンバー内で、３７℃で培養した。７時間培養後、培養物を観察し（４０×および１００×の拡大率）、ニコン倒立顕微鏡ＤＩＡＰＨＯＴ−ＴＭＤ（ニコン、東京、日本）で撮影した。各濃度で２回試験し、２回の異なる観察により管形成の阻害を評価した。本アッセイにおける化合物での処理後の内皮細胞の生存率を確認するために、管形成アッセイで使用された同じ条件で、ＢＡＥ細胞を９６ウェルプレートで培養した。７時間後、対照の無処理細胞と比較した細胞の生存率を、細胞増殖アッセイで実質的に記載した通り、ＭＴＴの添加によって決定した。
【０１１１】
血管新生中の最後の現象は管の三次元ネットワークにおける内皮細胞の組織化である。図３に示す通り、インビトロで、内皮細胞をマトリゲル上に配置し、配置の数時間後、既に証拠となる索が形成される。ＢＡＥＣについて、マトリゲル上での内皮の形成形態の完全な阻害が５μＭのＡＤ０１５７で得られ、部分的な阻害が１μＭのＡＤ０１５７で得られた。ＢＡＥ細胞の分化を阻害するために使用される濃度のＡＤ０１５７での処理は、７時間後における内皮細胞の生存率に影響を与えなかった（結果は示さない）。
【０１１２】
３×１０４のＢＡＥ細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘビーズと共に培養し、そこに接着させた。予め以下のようにして調製した９６ウェルプレートに、ビーズをウェル当たり２００μＬのＤＭＥＭ中に添加した。種々の量の化合物ＡＤ０１５７を９６ウェルプレートに分注した。マトリゲル（５０μＬ）を４℃で使用して各ウェルをコートし、３７℃で最大３０分間重合させた。重合後、内皮細胞を有するビーズをウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ２の加湿チャンバー内で、３７℃で培養した。４８時間培養後、光学顕微鏡を使用して培養物を観察した。各濃度で３回試験した。管形成の阻害は９．３ｕＭで得られた。
【０１１３】
実施例７：ＡＤ０１５７は内皮細胞の遊走能を阻害する
ＢＡＥＣの遊走活性を、傷遊走アッセイを使用して評価した。６ウェルプレート中のコンフルエントな単層を、２つの垂直径に続くピペットチップで傷つけ、ウェル当たり２つの無細胞の１ｍｍ幅のレーンを設けた。洗浄後、細胞に、ＡＤ０１５７の不存在（対照）または種々の濃度のＡＤ０１５７の存在中、１．５ｍＬの完全培地を供給した。暗所で種々の時間培養し、プレートを顕微鏡下で観察し、傷の領域を撮影した。０時間で記録したものと同じ領域を写真撮影した。７時間および２４時間での遊走量を、対照および処理ウェルの両方の画像分析によって決定し、ＮＩＨイメージ１．６ソフトウェアを使用してゼロ時間に対するそれらの相対量に関して正規化した。
【０１１４】
血管新生は、内皮細胞による細胞外マトリックスを通じての遊走能の獲得に関与する。内皮細胞の遊走に対するＡＤ０１５７の効果を調査するために、ＢＡＥ細胞を用いる創傷治癒アッセイを使用した。我々のデータは、ＡＤ０１５７が、７時間および２４時間の遊走で、用量依存的に内皮細胞の遊走能の阻害をもたらすことを示す（図４）。
【０１１５】
実施例８：ＡＤ０１５７は内皮細胞のタンパク質分解能を阻害する
ＢＡＥまたはＨＴ１０８０細胞を、６ウェルプレート中、６ウェルプレートの７５％サブコンフルエントに増殖させ、培地を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、各ウェルに２００ＫＩＵのアプロチニン／ｍＬを含有するＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡを１．５ｍｌ入れた。更に、幾つかのウェルに指示された濃度のＡＤ０１５７を入れた。培養２４時間後、培養上清を回収した。細胞抽出物を得るために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００ＫＩＵのアプロチニン／ｍＬを含有する０．１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の０．５ｍＬに、擦過（ｓｃｒａｐｐｉｎｇ）によって回収した。培地を、４℃、２０分間、１０００×ｇで遠心分離し、酵素電気泳動に用いた。コールターカウンターを用いて細胞数を決定するために二度繰り返した。
【０１１６】
培養上清および細胞抽出物に送達されたＭＭＰ−２のゼラチン分解活性をゼラチノグラムで決定した。ゼラチン（１ｍｇ／ｍＬ）を１０％の分解ゲルに添加した上記の非還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥに試料を付した。電気泳動後、ゲルを、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を追加した５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。各洗浄は１０分間連続振とうで行った。洗浄後、ゲルを基質緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０２％Ｎａ３Ｎを追加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中に浸漬して、３７℃で一晩培養した。その後、ゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色し、ゼラチナーゼ活性のバンドを、暗所で、染色されたバックグラウンドにおいて非染色バンドとして検出できた。
【０１１７】
酵素電気泳動像およびゼラチノグラムの定量分析をＳｃｉｏｎイメージ４．０．３．２プログラムで行った。
【０１１８】
基底膜の分解能、および、通常細胞外マトリックスの再構築能は、血管新生において重要である。ＡＤ０１５７−処理ＢＡＥＣ（図５Ａ）の培養上清および細胞抽出物のゼラチン酵素電気泳動は、ＡＤ０１５７が内皮細胞によるＭＭＰ−２分泌を阻害したことを示す。ＢＡＥ細胞はＭＭＰ−２のみを発現する一方で、ＨＴ１０８０細胞はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の両方のゼラチナーゼを発現する。我々の結果は、ＡＤ０１５７での処理後、ＨＴ１０８０腫瘍細胞の培養上清および細胞抽出物におけるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のレベルに対する効果がないことが観察されたことを示す（図５Ｂ）。
【０１１９】
実施例９：ＡＤ０１５７は、カスパーゼ依存メカニズムによる、内皮細胞および腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導する
ＤＮＡ断片化の検討において、８ウェルのＦａｌｃｏｎ  ８加湿チャンバースライドの７５％コンフルエントに細胞を増殖させ、指示された濃度のＡＤ０１５７の存在または非存在で、完全培地中１４時間培養した。ＴＵＮＥＬ（ｄＵＴＰ−ビオチンのニック末端標識を介した末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）アッセイを、製造者の説明書に従って、インサイチュの細胞死検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス、バルセロナ、スペイン）を使用して行った。
【０１２０】
細胞周期分析を以下のように行った。完全培地中で指示された濃度のＡＤ０１５７で処理（１４時間）後、接着または未接着の、処理したＢＡＥＣおよび対照のＢＡＥＣを回収し、洗浄し（ＰＢＳ）、固定した（７０％エタノール、氷上で１時間）。ペレット状の細胞を、ＲＮａｓｅ−Ａ（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（４０μｇ／ｍＬ）と共に１時間振とう培養し（１時間、光から保護した）、光から保護した。サブＧ１の集合の割合をＭｏＦｌｏ  Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎサイトメーターを使用して決定した。
【０１２１】
カスパーゼ３／７活性を決定するために、ＢＡＥＣを９６ウェルプレート（１３０００細胞／ウェル）に蒔き、種々の濃度のＡＤ０１５７の存在または非存在で、完全培地中で１４時間処理した。次いで、カスパーゼ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬（プロメガ・バイオテック・イベリカ、マドリード、スペイン）をウェルに添加し、製造者の説明書に従って、ＧＬＯＭＡＸ９６マイクロプレートルミノメーターで発光を３０分に記録した。アッセイは、カスパーゼ−３／７活性、ルシフェラーゼ活性および細胞溶解のために最適化された試薬中に、前発光のカスパーゼ−３／７ＤＥＶＤ−アミノルシフェリン基質、および所有権を持つ耐熱性のルシフェラーゼを与える。
【０１２２】
内皮のアポトーシス誘導は多くの血管新生阻害剤によって示された一般的なメカニズムである。ＡＤ０１５７が内皮細胞におけるアポトーシスを誘導し得るという我々の先の観察を確認するために、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、化合物によって誘導されたＤＮＡ断片化を検出した（図６Ａ）。種々の用量の化合物と共に培養した後の細胞周期のフローサイトメトリー分析を、ヨウ化プロピジウム染色後に行った。結果は、ＡＤ０１５７が種々の用量で細胞のアポトーシス性のサブＧ１細胞を著しく増加させたことを示した（図６Ｂ）。カスパーゼの活性化はアポトーシスの誘導において中心的な役割を果たす。化合物での処理の結果として、カスパーゼが活性化されたか否かを決定するために、我々はカスパーゼ−３／７基質ＤＥＶＤ−ＡＭＣを使用し、これは、カスパーゼ−３および同様の基質切断配列を有する他のカスパーゼによって蛍光産物に切断される。図６Ｃに示すように、「エフェクターカスパーゼ−３」は、ＡＤ０１５７での処理後、ＢＡＥ細胞における用量依存性パターンで著しく活性化された。カスパーゼ活性化の陽性対照として、１０μＭの２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ）を使用した。
【０１２３】
実施例１０：ＡＤ０１５７は、ニワトリ絨毛尿膜アッセイにおいて、インビボで血管新生を阻害する
受精鶏卵を、加湿培養器中３８℃で水平にして培養し、培養３日目までにウィンドウ化し、８日目までに処理した。試験化合物の保存液を、１．２％メチルセルロース水溶液に添加し、当該溶液の１０μＬ滴を層流フードのテフロン（登録商標）コートされた表面上で乾燥させた。次いで、メチルセルロースディスクをＣＡＭ上に移植し、卵を接着テープで封をして、４８時間、培養器に戻した。陰性対照はメチルセルロースと混合したＤＭＳＯで常に作られた。再培養後、ＣＡＭを実体顕微鏡下で調べた。アッセイは、２人の独立した観察者が処理領域内の血管の著しい減少を報告した場合、陽性としてスコア化した。
【０１２４】
ＣＡＭアッセイを使用し、インビボで血管新生を阻害する化合物の能力を決定した。対照において、血管は、高密度で形成され、空間指向性の葉様の分岐ネットワークは、それらが枝のように、徐々に小さな直径の血管構造によって構成された（図７）。第１表に、ＡＤ０１５７によるＣＡＭアッセイにおける血管新生のインビボでの阻害の評価をまとめる。当該表に示すように、ＡＤ０１５７での処理は用量依存的な血管新生阻害効果をもたらし、これは、ＣＡＭ当たり０．５ｎｍｏｌまでで維持され、８３％の卵で陽性スコアであった。ＡＤ０１５７は、ＣＡＭアッセイにおいて、１ｎｍｏｌ／ＣＡＭで１００％の総阻害という、より高い活性を奏した。この効果は、メチルセルロースディスクによって覆われた領域における新たな血管増殖の阻害および末梢血管の遠心性増殖（ディスクの位置に対して）が観察され、これは処理された領域を回避するように見え、減少した血管密度が観察された（図７）。
【表２】
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【０１２５】
実施例１１：ゼブラフィッシュの胚および尾のアッセイにおいてＡＤ０１５７はインビボで血管新生を阻害する
ゼブラフィッシュ胚を、自然ペアワイズ交配によって発生させ、胚を水中２８．５℃で維持した。遺伝子導入Ｆｌｉ−ＥＧＦＰ魚（ＴＧｆｌｉ１：ＥＧＦＰｙ１）は、緑色蛍光タンパク質を持つ標識脈管構造を有し、ゼブラフィッシュ国際リソースセンター（ＺＩＲＣ、ユージーン、ＯＲ）から購入した。胚を、受精後２４時間（ｈｐｆ）に、鉗子を用いて手作業で脱塩素化し、それを９６ウェルプレートにウェル当たり１つの胚に配置し、指示された濃度の処理化合物１００μｌと共に２８．５℃で２４時間培養した。ＤＭＳＯを薬剤の担体および対照の両方として使用した。培養後、魚胚をトリカイン（０．０２％）で麻酔し、スライド上に置き、ＤＳ−Ｌ１ニコンデジタルカメラを備えたニコン落射蛍光顕微鏡下で調べた。表現型の変化を２人の異なる観察者によって評価した。
【０１２６】
ＡＤ０１５７のインビボの血管新生阻害活性を更に評価するために、遺伝子導入（ＴＧ（ｆｌｉ１：ＥＧＦＰ）ｙ１）ゼブラフィッシュ系統に基づくアッセイを使用した。これらの動物において、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の増強は、転写因子のフレンド白血病ウイルス・インテグレーション−１（ｆｌｉ−１）の１５ｋｂのプロモーターの下、もたらされる。このプロモーターは、完全な胚、幼体および成体のゼブラフィッシュに沿って、内皮細胞内で遍在的に活性化される。この遍在性の発現は全ての内皮細胞内で、インビボで緑色の蛍光をもたらし、胚形成の全ての段階で、明るい血管の観察を可能にする。図８に示すように、２５μＭのＡＤ０１５７を水に添加し、Ｆｌｉ−ＥＧＦＰ遺伝子導入ゼブラフィッシュの尾の蕾状期の後期に、尾側のセグメント間の血管の数が減少した。この阻害効果は用量依存的であった（第２表）。
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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