(57)【要約】  ＡＡＶ等のウイルスの本来のパッケージング許容限界に近い発現カセットを用いて設計された、ＡＡＶベクター等の組換えウイルスベクターを提供する。該組換えウイルスベクターは、残存プラスミドＤＮＡ不純物を減少させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリヌクレオチド配列とフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）またはスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が、前記異種ポリヌクレオチド配列と合わせた場合に約３．０ないし５．５Ｋｂ、約４．０ないし５．０Ｋｂ、または約４．３ないし４．８Ｋｂの全長となる長さを有する、組換えベクタープラスミド。
【請求項２】
異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し、前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを上回る長さ、約５．０ないし１０．０Ｋｂの長さ、または約６．０ないし８．０Ｋｂの長さを有する組換えベクタープラスミド。
【請求項３】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置する第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列をさらに含んでなり、該第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が最大約５．０Ｋｂの長さを有する、請求項２の組換えベクタープラスミド。
【請求項４】
前記ベクタープラスミドがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項５】
前記異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターゲノムが、ウイルス粒子またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子にパッケージまたはカプシド化されることが可能な、請求項１の組換えベクタープラスミド。
【請求項６】
前記異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムがウイルス粒子またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子にパッケージまたはカプシド化されることが可能で、前記完全長のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はウイルス粒子またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子にパッケージまたはカプシド化されない、請求項２の組換えベクタープラスミド。
【請求項７】
一つ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が前記異種ポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に隣接する、請求項１の組換えベクタープラスミド。
【請求項８】
前記異種ポリヌクレオチド配列および／またはフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が二つのＡＡＶのＩＴＲ配列の内側に存在する、請求項１の組換えベクタープラスミド。
【請求項９】
前記二つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の外側に第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を更に含んでなり、該第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が４．０Ｋｂを上回る長さ、約５．０ないし１０．０Ｋｂの長さ、または約６．０〜８．０Ｋｂの長さを有する、請求項８の組換えベクタープラスミド。
【請求項１０】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端それぞれに隣接するＡＡＶの５’側および／または３’側ＩＴＲの間に位置しないか、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端それぞれに隣接するＡＡＶの５’側および／または３’側ＩＴＲの間に位置するか、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端それぞれに隣接するＡＡＶの５’側および／または３’側ＩＴＲに隣接して位置するか、または異種ポリヌクレオチド配列の内側に位置する、請求項１の組換えベクタープラスミド。
【請求項１１】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が、異種ポリヌクレオチド配列に関係するまたは関係しないイントロンである、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１２】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が細菌のポリヌクレオチド配列ではない配列を含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１３】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がタンパク質またはペプチドをコードしない配列を含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１４】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が、前記異種ポリヌクレオチド配列、ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、発現調節要素、複製起点、選択マーカー、またはポリアデニン配列のいずれとも異なる配列を含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１５】
前記フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が、１ないし１０、１０ないし２０、２０ないし３０、３０ないし４０、４０ないし５０、５０ないし６０、６０ないし７５、７５ないし１００、１００ないし１５０、１５０ないし２００、２００ないし２５０、２５０ないし３００、３００ないし４００、４００ないし５００、５００ないし７５０、７５０ないし１，０００、１，０００ないし１，５００、１，５００ないし２，０００、２，０００ないし２，５００、２，５００ないし３，０００、３，０００ないし３，５００、３，５００ないし４，０００、４，０００ないし４，５００、４，５００ないし５，０００、５，５００ないし６，０００、６，０００ないし７，０００、７，０００ないし８，０００、または８，０００ないし９，０００ヌクレオチドの長さの配列を含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１６】
前記異種ポリヌクレオチド配列が治療的タンパク質をコードする、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項１７】
前記治療的タンパク質が血液凝固因子を含んでなる、請求項１６のベクター。
【請求項１８】
前記治療的タンパク質が、ＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（嚢胞性線維性膜貫通調節因子））、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子またはプロテインＣ、抗体、網膜色素上皮細胞特異的  ６５  ｋＤａタンパク質（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６５  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＲＰＥ６５））、エリスロポエチン（赤血球生成促進因子）、  ＬＤＬ  受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、βグロビン、αグロビン、スペクトリン、αアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、  スルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）、リソソーム蓄積症に関わる酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソーム・ヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、成長因子（例えばインスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３および４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子αおよびβ等）、サイトカイン（例えばαインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、自殺遺伝子産物（例えば  単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば癌治療に使われる薬剤に抵抗性を付与するタンパク質）、腫瘍抑制タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ））、大腸腺腫様性ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節機能を有するペプチド、寛容原性もしくは免疫原性のペプチドまたはタンパク質Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ（制御性Ｔ細胞エピトープ）、またはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（先天性脈絡膜欠如）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノ基転移酵素（脳回転状網膜脈絡膜萎縮）、レチノスキシン（Ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｎ）１（Ｘ染色体連鎖性の網膜分離症），ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ染色体連鎖性の網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型の網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３、および４（色覚異常）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝的欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質等）、ゲノムエディティングに用いられる一つまたは複数のジンク・フィンガーヌクレアーゼ、また��ゲノムエディティングで修復テンプレートとして用いられるドナー配列を含んでなる、請求項１６のベクター。
【請求項１９】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、転写される際には、ＲＮＡに転写されるポリヌクレオチドを含んでなる請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項２０】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、転写される際には、抑制性核酸（例えば抑制性ＲＮＡ）に転写されるポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項２１】
前記抑制性核酸が一本鎖配列を含んでなるか、または二本鎖または三本鎖配列を形成する、請求項２０の組換えベクタープラスミド。
【請求項２２】
前記抑制性核酸がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または三重鎖形成ＲＮＡを含んでなる、請求項２０の組換えベクタープラスミド。
【請求項２３】
前記抑制性核酸がハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症に関連する遺伝子（例えばアトロフィン１（ＡＴＮ１））、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン（Ａｔａｘｉｎ）１、２、３および７、ＣＡＣＮＡ１Ａにコードされる電位依存性カルシウムチャンネルＣａv２．１  Ｐ／Ｑ、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られるアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調におけるセリン・スレオニンタンパクホスファターゼ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（１，２，３，６，７，８，１２，１７型）、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連震戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２（ＡＦ４／ＦＭＲ２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２）、筋強直性ジストロフィー症におけるミオトニンタンパク質キナーゼ（Ｍｙｏｔｏｎｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＴ−ＰＫ）、フリートライヒ運動失調症におけるフラタキシン（Ｆｒａｔａｘｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症における変異型スーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子、パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の発症機序に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）および前駆タンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ  ９（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶ転写トランス活性化因子遺伝子、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶトランス活性化因子応答配列遺伝子、ＨＩＶ  ＴＡＲ、ＨＩＶ感染におけるＣ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染におけるヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）、ｐ５３、急性腎損傷または移植腎機能発現遅延または腎損傷急性腎不全、進行した再発性または転移性の固形悪性腫瘍におけるタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、転移性黒色腫におけるＬＭＰ２（ＬＭＰ２はプロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ  ９）としても知られる）、転移性黒色腫におけるＬＭＰ７（ＬＭＰ７はプロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ  ８）としても知られる）、転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ  １０）としても知られるＭＥＣＬ１、固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、固形腫瘍におけるキネシン紡錘タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）、固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）、固形腫瘍におけるフーリン（Ｆｕｒｉｎ）、肝臓がんにおけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン、緑内障におけるベータアドレナリン作動性受容体、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢に伴う黄斑変性症におけるＤＡＮ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴ���８０１／Ｒｅｄｄ１、加齢に伴う黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２、先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ  Ｎ１７Ｋ  変異型タンパク質、インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡ型ウイルスのゲノム／遺伝子配列、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるコロナウイルスのゲノム／遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスのゲノム／遺伝子配列、エボラ感染におけるエボラフィロウイルスのゲノム／遺伝子配列、Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム／遺伝子配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染におけるＨＳＶウイルスのゲノム／遺伝子配列、コクサッキー・ウイルスＢ３感染におけるコクサッキー・ウイルスＢ３のゲノム／遺伝子配列、原発性筋失調症におけるトルシンＡ  Ａ（ＴＯＲ１Ａ）の様な遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植手術における汎クラスＩおよびＨＬＡ対立遺伝子特異的（サイレンシング）、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異型ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）の発現を抑制するか、または抑制性核酸が前記遺伝子または配列のいずれかの転写物に結合する、請求項２０の組換えベクタープラスミド。
【請求項２４】
前記異種ポリヌクレオチド配列の転写を駆動する発現調節配列をさらに含む、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項２５】
前記発現調節配列が前記異種ポリヌクレオチド配列の転写に寄与するプロモーターまたはエンハンサーを含んでなる、請求項２４の組換えベクタープラスミド。
【請求項２６】
前記発現調節要素が構成的または制御可能な調節要素を含んでなる、請求項２４の組換えベクタープラスミド。
【請求項２７】
前記発現調節要素が組織特異的発現調節要素またはプロモーターを含んでなる、請求項２４の組換えベクタープラスミド。
【請求項２８】
前記異種ポリヌクレオチド配列の３’末端側にポリアデニン配列をさらに含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項２９】
選択マーカーおよび／または複製起点をさらに含んでなる、請求項１または２の組換えベクタープラスミド。
【請求項３０】
選択マーカーが抗生物質抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる、請求項２９の組換えベクタープラスミド。
【請求項３１】
請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドを含んでなる細胞。
【請求項３２】
請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるウイルス粒子。
【請求項３３】
請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子。
【請求項３４】
請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなる、複数のウイルス粒子またはＡＡＶ粒子。
【請求項３５】
前記ウイルス粒子またはＡＡＶ粒子が単離または精製されている、請求項３２ないし３４のいずれかのウイルス粒子またはＡＡＶ粒子。
【請求項３６】
請求項３２ないし３４のいずれかのウイルス粒子またはＡＡＶ粒子を含んでなる医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３２のウイルス粒子、請求項３３のＡＡＶ粒子、請求項３４または３５の複数のウイルス粒子またはＡＡＶ粒子、または請求項３６の医薬組成物を、哺乳動物または哺乳動物の細胞に投与することによって、該哺乳動物または該哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達または移入する工程を含んでなる、前記異種ポリヌクレオチド配列を哺乳動物または哺乳動物の細胞に送達または移入する方法。
【請求項３８】
タンパク質の発現または機能が欠損しているか、これらのいずれかを必要とするか、または内因性タンパク質の発現または機能の低減を必要とする哺乳動物を治療する方法であって、
ａ．請求項３２のウイルス粒子、請求項３３のＡＡＶ粒子、請求項３４または３５の複数のウイルス粒子またはＡＡＶ粒子、または請求項３６の医薬組成物を提供する工程と、
ｂ．請求項３２のウイルス粒子、請求項３３のＡＡＶ粒子、請求項３４または３５の複数のウイルス粒子またはＡＡＶ粒子、または請求項３６の医薬組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、
前記異種ポリヌクレオチド配列が前記哺乳動物で発現されるタンパク質をコードするか、または前記異種ポリヌクレオチド配列が前記哺乳動物内で内因性タンパク質の発現または機能を低減させる抑制性配列またはタンパク質をコードする、方法。
【請求項３９】
ウイルス粒子またはＡＡＶ粒子が静脈内に、動脈内に、筋肉内に、皮下に、経口で、挿管により、カテーテルを経て、経皮的に、頭蓋内に、吸入により、腔内に、または粘膜に送達される、請求項３７または３８の方法。
【請求項４０】
哺乳動物がヒトである、請求項３７または３８の方法。
【請求項４１】
組換えウイルス粒子またはＡＡＶ粒子を産生する方法であって、
ａ．生産的ウイルスまたはＡＡＶ感染を起こさせるために、請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドをパッケージングヘルパー細胞に導入する工程と、
ｂ．ベクターゲノムを有する組換えウイルスまたはＡＡＶ粒子を産生する条件下で前記ヘルパー細胞を培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項４２】
組換えベクターゲノムが夾雑核酸を含む組換えウイルスまたはＡＡＶ粒子の量が低下した組換えウイルス粒子またはＡＡＶ粒子を産生する方法であって、
ａ．請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドをパッケージングヘルパー細胞に導入する工程と、
ｂ．ベクターゲノムを有する組換えウイルスまたはＡＡＶ粒子を産生する条件下で前記ヘルパー細胞を培養する工程を含み、
前記産生した組換えウイルス粒子またはＡＡＶ粒子に含まれる夾雑核酸含有組換えベクターゲノムを有するウイルスまたはＡＡＶ粒子の数が、組換えベクタープラスミドにフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が存在しない条件下で産生される夾雑核酸含有ウイルスまたはＡＡＶ粒子の数よりも少ない、方法。
【請求項４３】
前記夾雑核酸が請求項１ないし３０のいずれかの組換えベクタープラスミドのバックボーンまたはプラスミド部分に由来する核酸を含んでなる、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記夾雑核酸が細菌の配列を含んでなる、または前記異種ポリヌクレオチド配列、ＩＴＲ、プロモーター、エンハンサー、複製起点、ポリアデニン配列、または選択マーカーのいずれとも異なる配列を含んでなる、請求項４２の方法。
【請求項４５】
哺乳動物細胞を含んでなる、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項４６】
前記ベクターをウイルス粒子内にパッケージするヘルパー機能を提供する、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項４７】
ＡＡＶのヘルパー機能を提供する、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項４８】
ＡＡＶのＲｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を提供する、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項４９】
Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドにより安定的にまたは一過的にトランスフェクションされる、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項５０】
Ｒｅｐ７８または／およびＲｅｐ６８タンパク質を提供する、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項５１】
Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質のポリヌクレオチドをコードする配列により安定的にまたは一過的にトランスフェクションされる、請求項３１または４１ないし４４のいずれかの細胞。
【請求項５２】
前記ＡＡＶがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４、もしくはＲｈ１０の血清型、または前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッドまたはキメラを含んでなる、請求項１ないし３０のいずれかのベクター、請求項３１の細胞、請求項３２ないし３６のいずれかのＡＡＶ粒子、または請求項３７ないし４４のいずれかの方法。
【請求項５３】
前記ＡＡＶ粒子がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４、もしくはＲｈ１０の血清型の、または前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッドまたはキメラの、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質を含んでなる、請求項１ないし３０のいずれかのベクター、請求項３１の細胞、請求項３２ないし３６のいずれかのＡＡＶ粒子、または請求項３７ないし４４のいずれかの方法。
【請求項５４】
前記Ｃａｐ、Ｒｅｐ、またはＩＴＲの配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４、もしくはＲｈ１０の血清型、または前記ＡＡＶ血清型のいずれかのハイブリッドまたはキメラに由来する、請求項２、３、７ないし１０、１４、もしくは４４のいずれかのベクター、または請求項４８ないし５１のいずれかの細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９９，３４２号に基づく優先権を主張し、この内容は参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる。
序論
【０００２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、今日までにいくつかの初期臨床試験において治療用途に極めて有望であることが複数のグループによる報告で示されている。この新規なクラスの生物学的製品を後期臨床試験に進め、最終的に医薬品としての認可を得るためにはベクターの特性解析および品質管理手法を更に改善する必要がある。例えば、臨床等級の精製ベクターにおける不純物プロファイルに、ベクター設計と製造工程パラメータがどのように影響するかについての更なる理解が必要である。ＡＡＶベクター中に存在するＤＮＡ不純物の除去は、ベクター精製中に処理可能な核酸を効率良く取り除くことが出来るヌクレアーゼ処理を行っても、ＤＮＡ断片がパッケージされ、ベクター粒子の完全性を保ち得るような様式で行われるヌクレアーゼ処理に対しては抵抗性になる可能性があるという事実によって複雑なものとなる。
【０００３】
ｒＡＡＶ作製システムの設計における重要な目的は、野生型・偽野生型ＡＡＶ種（ｗｔＡＡＶ）、ＡＡＶ内でカプシド化された残存ＤＮＡ不純物および空のカプシドを含む、ベクター関連不純物の特性を分析し、それらの生成を極小化・管理し得る戦略を遂行することである。このような生成物関連不純物はベクターそのものと酷似しており、精製過程中に真正のベクターから容易に分離できない。ベクター以外のＤＮＡ不純物はベクター粒子精製物の総ＤＮＡ量の１〜８％を占めると報告されている（Ｓｍｉｔｈ  ＰＨ  Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＦ．  Ｑｕ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｍｏ．  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ７：８３４８；  Ｃｈａｄｅｕｆ  Ｇ．  Ｃｉｒｏｎ  Ｃ．  Ｍｏｕｌｌｉｅｒ  Ｐ．  Ｓａｌｖｅｔｔｉ  Ａ．，  Ｍｏ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００５，  １２：７４４．  ヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）遺伝子治療  専門家会合による報告．  欧州医薬品庁  ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ  ２００５，  １８３９８９／２００４）。カプシド化した残存ＤＮＡの多くは、逆方向末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，  ＩＴＲ）を含むベクタープラスミドテンプレートに由来する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、組換えベクタープラスミドおよびベクターゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス粒子を提供する。一実施形態では、組換えベクタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）ポリヌクレオチド配列またはスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ポリヌクレオチド配列を含む。
【０００５】
本発明はまた、ＡＡＶベクタープラスミドおよびＡＡＶベクターゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ＡＡＶ粒子を提供する。一実施形態では、組換えＡＡＶベクタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラーポリヌクレオチド配列またはスタッファーポリヌクレオチド配列を含む。
【０００６】
種々の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列の長さは約４．７Ｋｂ未満とする。特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列は。長さが約４．７Ｋｂ未満で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の内側に位置するものとする。特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を合わせた全体の長さは、約３．０〜５．５Ｋｂ、または約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂとする。
【０００７】
フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクターの機能または活性を損なわない限り、ベクター内の任意の所望の位置に配置することができる。ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’ 末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列の間には配置されないものとする。別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列の間に配置されるものとする。さらに別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列に隣接して配置されるものとする。またさらに別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、例えばゲノム核酸中のイントロンのように異種ポリヌクレオチド配列内に配置されるものとする。
【０００８】
従って、種々の実施形態では、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の内側に位置する、または、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置する、または、２つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列があり、第１のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の内側に位置し、第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置することになる。
【０００９】
さらにまた種々の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、その長さが１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００または８，０００〜９，０００ヌクレオチドの配列とする。
【００１０】
さらに特定の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の間に位置する場合には、異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を合わせた全体の長さは、約３．０〜５．５Ｋｂ、または約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂとする。また別の特定の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の外側に位置する場合には、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列の長さは４．７Ｋｂを超えるものとし、約５．０〜１０．０Ｋｂまたは約６．０〜８．０Ｋｂとする。
【００１１】
本発明はさらに、第二（第三、第四等）のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含む組換えベクタープラスミドを提供する。一実施形態では、第一のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の内側に位置し、第二のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の外側に位置する。
【００１２】
ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は不活性または無害であり、機能や活性を有しない。種々の特定の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は細菌のポリヌクレオチド配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はタンパク質やペプチドをコードする配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は異種ポリヌクレオチド配列、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、発現制御要素、複製起点、選択マーカーまたはポリアデニン（ｐｏｌｙ−Ａ）配列のいずれとも異なる配列である。
【００１３】
また他の種々の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列に関連する、または関連しないイントロン配列とする。特定の実施形態では、イントロン配列は異種ポリヌクレオチド配列の内部に位置する。また別の実施形態では、イントロン配列は、イントロンがタンパク質をコードし、そのタンパク質が異種ポリヌクレオチド配列によってもコードされるようなゲノムＤＮＡ内にあるため、異種ポリヌクレオチド配列と関連する。
【００１４】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子において、異種ポリヌクレオチド配列は転写され引き続きタンパクに翻訳されるか、またはそれ自体で機能や活性を有する転写物に転写され得る。ある実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は治療効果を有するタンパク質をコードする。特定の実施形態では、当該タンパク質は、血液凝固因子（例えば第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子またはプロテインＣ）、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ；  ＣＦＴＲ  ）、抗体、網膜色素上皮特異的  ６５  ｋＤａタンパク質（  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６５  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ；    ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン（赤血球生成促進因子）、  ＬＤＬ  受容体、リポタンパク質リパーゼ、  オルニチン・トランスカルバミラーゼ、βグロビン、αグロビン、スペクトリン、αアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）、リソソーム蓄積症に関わる酵素（ＡＲＳＡ）、  ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソーム・ヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、成長因子（例えば、インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３および４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子α  、β等）、サイトカイン（例えばαインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば癌治療に使われる薬剤に抵抗性を付与するタンパク質）、腫瘍抑制タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ；  ＶＨＬ）、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節機能を有するペプチド、寛容原性もしくは免疫原性のペプチドまたはタンパク質Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ（制御性Ｔ細胞エピトープ）、またはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グラニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（先天性脈絡膜欠如）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノ基転移酵素（脳回転状網膜脈絡膜萎縮）、レチノスキシン（Ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｎ）１（Ｘ染色体連鎖性の網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ染色体連鎖性の網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型の網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ��（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ  ２、３および４（色覚異常）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝的欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク等）、ゲノムエディティングに用いられる一つまたは複数のジンク・フィンガーヌクレアーゼ、またはゲノムエディティングで修復テンプレートとして用いられるドナー配列である。
【００１５】
他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードし、その結果として、患者に存在する望ましくないまたは異常な（機能不全）タンパク質（内因性タンパク質）の発現または機能を阻害する。さらに他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、転写されると抑制性核酸（例えば抑制性ＲＮＡ）に転写されるポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、抑制性核酸は一本鎖配列であるか、または二本鎖配列または三本鎖配列を形成する。さらに他の実施形態では、抑制性核酸はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または三重鎖形成ＲＮＡである。
【００１６】
さらに他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、例えばＨＩＶ感染のような感染を阻害したり、感染に対する抵抗性や防御力を付与したりするタンパク質をコードする。特定の実施形態では、このタンパク質はケモカイン受容体ＣＣＲ５である。
【００１７】
さらに他の実施形態では、抑制性核酸は、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症に関連する遺伝子（例えばアトロフィン１（ＡＴＮ１））、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン（Ａｔａｘｉｎ）１，２，３および７、ＣＡＣＮＡ１Ａにコードされる電位依存性カルシウムチャンネルＣａv２．１  Ｐ／Ｑ  、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られるアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調におけるセリン・スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａの５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（１，２，３，６，７，８，１２，１７型）、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１  （脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連震戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１），脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２（ＡＦ４／ＦＭＲ２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２）、筋強直性ジストロフィー症におけるミオトニンタンパク質キナーゼ（Ｍｙｏｔｏｎｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＴ−ＰＫ）、フリートライヒ運動失調症におけるフラタキシン（Ｆｒａｔａｘｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症における変異型スーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子、パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の発症機序に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）  および前駆タンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶ転写トランス活性化因子遺伝子、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶトランス活性化因子応答配列遺伝子、ＨＩＶ  ＴＡＲ、ＨＩＶ感染におけるＣ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染におけるＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）、ｐ５３、急性腎損傷または移植腎機能発現遅延または腎損傷急性腎不全、進行した再発性または転移性の固形悪性腫瘍におけるタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、転移性黒色腫におけるＬＭＰ２、ＬＭＰ２はプロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ  ９）としても知られる、転移性黒色腫におけるＬＭＰ７、プロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ  ８）としても知られる、転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ  １０）としても知られるＭＥＣＬ１、固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、固形腫瘍におけるキネシン紡錘タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）、固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）、固形腫瘍におけるフーリン（Ｆｕｒｉｎ）、肝臓がんにおけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン、緑内障におけるベータアドレナリン受容体、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢に伴う黄斑変性症におけるＤＡＮ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、加齢に伴う黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２、先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ  Ｎ１７Ｋ  変異型タンパク質、インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡ型ウイルスのゲノム・遺伝子配列、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるコロナウイルのゲノム・遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスのゲノム・遺伝子配列、エボラ感染におけるエボラフィロウイルスのゲノム・遺伝子配列、Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム・遺伝子配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染におけるＨＳＶウイルスのゲノム・遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３のゲノム・遺伝子配列、原発性筋失調症におけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）の様な遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植における汎クラスＩおよびＨＬＡ対立遺伝子特異的（サイレンシング）、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異型ロドプシン遺伝子、または前記の遺伝子または配列のいずれかの転写物に結合する抑制性核酸の発現を阻害する。
【００１８】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、シスまたはトランスで機能する追加の要素を含む。特定の実施形態では、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび／または組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子はまた、異種ポリヌクレオチド配列の’５末端または３’末端に隣接する一つ以上の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種ポリヌクレオチド配列の転写を駆動する発現調節配列（例えば構成的または制御可能な調節配列の様に異種ポリヌクレオチド配列の転写に寄与するプロモーターまたはエンハンサー、または組織特異的発現調節要素）、異種ポリヌクレオチド配列の３‘に位置するポリアデニン配列、選択マーカー（例えばカナマイシン抵抗性の様な抗生物質抵抗性を付与するタンパク質）、および／または複製の起点を含む。
【００１９】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、細胞に含まれてよい。そのような実施形態においては、細胞は、溶解されてウイルス粒子を産生するヘルパー細胞、または異種ポリヌクレオチド配列がその内部で発現することを所望する標的細胞を含んでいる。
【００２０】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、医薬組成物に含まれてよい。そのような医薬組成物は、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を被験体に投与する際に有用である。
【００２１】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、種々の方法と用途に使用され得る。ある実施形態では、その方法は、異種ポリヌクレオチド配列を被験体（例えば哺乳類）または被験体（例えば哺乳類）の細胞に送達または輸送するためのものであり、一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、または一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を被験体（例えば哺乳類）または被験体（例えば哺乳類）の細胞に投与することを含む。これによって、異種ポリヌクレオチド配列を被験体（例えば哺乳類）または被験体（例えば哺乳類）の細胞に送達または輸送するものである。別の実施形態では、その方法は、タンパク質の発現または機能に不足のある、またはタンパク質の発現または機能を必要とする、または内因性タンパク質（例えば望ましくない、異常な、または機能不全のタンパク質）の発現または機能を低下させる必要のある被験体（例えば哺乳類）を治療するためのものであり、一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、または一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を提供すること、および一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子、または一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物を被験体（例えば哺乳類）に投与することを含む。ここで、異種ポリヌクレオチド配列は哺乳類で発現される。または、ここで、異種ポリヌクレオチド配列は、被験体（例えば哺乳類）において内因性タンパク質（例えば望ましくない、異常な、または機能不全のタンパク質）の発現または機能を低下させるような抑制性配列またはタンパク質をコードするものとする。
【００２２】
投与または送達の方法と用途は、被験体に適合するいかなる様式であってよい。特定の実施形態では、一つのウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、皮下に、口腔内に、挿管により、カテーテルを経て、皮膚に，頭蓋内に、吸入により、腔内に、または粘膜に投与または送達される。
【００２３】
被験体には、ヒトやヒト以外（例えば霊長目）の哺乳類が含まれる。ある特定の実施形態では、被験体は異種ポリヌクレオチド配列の発現により恩恵を受けるかまたはその発現を必要とする。
【００２４】
本発明において、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を生産する方法が提供される。ある実施形態では、組換えウイルスまたはＡＡＶ粒子を生産する方法は、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドをパッケージングヘルパー細胞に導入してウイルス（例えばＡＡＶ）を増殖感染させること、および組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を産生できるような環境下でヘルパー細胞を培養することを含む。他の実施形態では、夾雑核酸の存在する組換えウイルスベクターを含む組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の量を減少させた組換えウイルスまたはＡＡＶ粒子を生産する方法は、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドをパッケージングヘルパー細胞に導入してウイルス（例えばＡＡＶ）を増殖感染させること、および組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を産生できるような環境下でヘルパー細胞を培養することを含む。ここで、生産された組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、夾雑核酸の存在する組換えウイルスベクターゲノムを含むウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の数が、組換えウイルスベクター内にフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列の無い条件で生産された場合の夾雑核酸の存在するウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の数と比べて減少している。ある実施形態では、夾雑核酸は、細菌核酸、または異種ポリヌクレオチド配列、ＩＴＲ、プロモーター、エンハンサー、複製の起点、ポリＡ配列または選択マーカー以外の配列とする。
【００２５】
ヘルパー細胞は、哺乳類の細胞を含む。ヘルパー細胞はまた、Ｆ９細胞のような昆虫の細胞を含む。ある実施形態では、ヘルパー細胞は、異種ポリヌクレオチド配列をウイルス粒子にパッケージするヘルパー（例えばＡＡＶ）機能を提供する。ある実施形態では、ヘルパー細胞はＡＡＶのＲｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質（例えばＲｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質）を提供する。ヘルパー細胞は、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質の配列をコードするポリヌクレオチドによって、安定的にまたは一時的にトランスフェクトされる。ヘルパー細胞は、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質の配列をコードするポリヌクレオチドによって、安定的にまたは一時的にトランスフェクトされる。
【００２６】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、いかなる株、または異なる血清型からなるハイブリッドまたはキメラを含めいかなる血清型に基づくものであってよい。本発明の組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子も、いかなる株、または異なる血清型からなるハイブリッドまたはキメラを含めいかなる血清型に基づくものであってよい。代表的なＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４およびＲｈ１０を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、任意の単一の血清型、血清型の混合物、または異なる血清型からなるハイブリッドまたはキメラに由来する要素を含んでよい。種々の実施形態において、組換えＡＡＶベクタープラスミドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４またはＲｈ１０の血清型、または前記のＡＡＶ血清型のうち任意のものを含んでなるハイブリッドまたはキメラに由来するＣａｐ、Ｒｅｐおよび／またはＩＴＲを含む。さらに、ベクターゲノムを含む本発明の組換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４またはＲｈ１０血清型のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質のように、任意の単一の血清型、血清型の混合物、または異なる血清型からなるハイブリッドまたはキメラに由来する一つ以上のカプシドタンパク質を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】精製されたＡＡＶベクター調製物に含まれるプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが導入遺伝子カセットの大きさに依存することを示す。
【００２８】
【図２】ＰＣＲおよび導入遺伝子カセットと上流側のプラスミドバックボーン配列にわたる領域をカバーする一連のプライマーを用いて行ったベクターゲノムの５’末端のマッピングを、ＤＮａｓｅ１処理の前後で示す。導入遺伝子カセット内部に位置する単独のプライマー（円で囲む）を、導入遺伝子カセットと抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲおよびＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片の配列にわたるプライマーと組み合わせて使用した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル電気泳動法で解析された。
【００２９】
図２Ａ〜２Ｄは、ＤＮａｓｅ処理の前後のショートまたはロング導入遺伝子カセットを含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ａ】ＤＮａｓｅ処理前のショート導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ｂ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のショート導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ｃ】ＤＮａｓｅ処理前のロング導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ｄ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のロング導入遺伝子カセット（４．２ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【００３０】
図３Ａ〜３Ｂは、導入遺伝子カセットを含む生産プラスミドＤＮＡに対して前述の一連のプライマーセットを用いて行ったプラスミドコントロール（対照）ＰＣＲを、ＤＮａｓｅ  １処理の前後で示す。
【図３Ａ】導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むプラスミドを示す。
【図３Ｂ】導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むプラスミドを示す。
【図３Ｃ】ＤＮａｓｅ処理後のプラスミドサンプルを示す。
【００３１】
【図４】ショート導入遺伝子カセットを含むベクター内へのプラスミドＤＮＡのカプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の略図を示す。
【００３２】
【図５】トランス（ｔｒａｎｓ）に存在するＡＡＶのパッケージング許容限界サイズを超えるサイズ超過プラスミドバックボーン（７．１Ｋｂ）が、ベクター以外のＤＮＡのパッケージングを著しく低下させることを示す。
【００３３】
【図６】通常サイズ（円）対サイズ超過（三角）のバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作成されたＡＡＶベクターの精製物中に含まれる残存プラスミドＤＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ここに開示される研究は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズ（約４．７ｋｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒＡＡＶベクタープラスミドでは、残留プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが上昇したこと、および配列がｒＡＡＶの本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど不純物のレベルが上昇したことを示す。具体的な例を示すと、ｒＡＡＶのＡ（２．７ｋｂサイズ）は１６４ｐｇ／１０9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝９）。ｒＡＡＶのＢ（３．７ｋｂサイズ）は４２．７ｐｇ／１０9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝３２）。ｒＡＡＶのＣ（４．３ｋｂサイズ）は１４．０ｐｇ／１０9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝２９）。よって、これらの研究は、ベクターの設計時に発現カセットの長さをウイルス（ＡＡＶ）のカプシドの（本来の）パッケージング許容限界サイズと同じかそれに近くなるように調整することで、夾雑核酸のカプシド化を低減または阻止でき、よってカプシド化した核酸不純物を含むウイルス（ＡＡＶ）粒子が減少することを示す。
【００３５】
従って本発明は、ウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、および該組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを、例えば、残存ＤＮＡ不純物量を少なくしたかまたはこれを含まない組換えウイルス粒子を作成するために用いる方法を提供する。例えば、ベクターゲノム配列のサイズを最適化することで、抗生物質抵抗性を生じる細菌遺伝子の様な望ましくない核酸配列のベクターを介した導入に関わる潜在的危険性を軽減できる。
【００３６】
パッケージされた（カプシド化された）領域（「ベクター」または「ベクターゲノム」と称される）がウイルス（例えばＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズを有する本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、望ましいまたは治療的効果を提供するタンパク質をコードする配列（遺伝子）の様な異種ポリヌクレオチド配列、ならびに望ましくないまたは欠陥のある（たとえば病原性の）遺伝子の発現を低下または阻害する抑制性（例えばアンチセンス）核酸の導入・送達に用いることができ、従って種々の疾病を治療し得る。例えば、パッケージされた（カプシド化された）領域（ベクターゲノム）がウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、Ａ型またはＢ型血友病の様な遺伝的欠損疾患、他の代謝または血漿タンパク質の欠陥の治療、および他の治療目的のために治療的遺伝子を導入・送達するために用いることができる。
【００３７】
本明細書記載の通り、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、ポリヌクレオチド配列（例えば異種ポリヌクレオチド配列）をｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外で）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生体外の培養条件下で）、  ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内で）で細胞に送達するために用いることができる。該ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列が送達された細胞がこれによってコードされたタンパク質を発現するよう、タンパク質をコードできる。例えば、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、望ましい（例えば治療的な）タンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列を含むことができる。また、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、転写されると遺伝子（または遺伝子の転写物）を標的としてその発現を阻害するような抑制的配列（例えばＲＮＡ）を含む異種ポリヌクレオチド配列を含むことができる。従って、被験体（例えば哺乳類）へのベクターの送達または投与は、被験体にタンパク質およびペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するだけでなく、遺伝子を標的とし、その発現または機能を被験体内で阻害する抑制的核酸も提供する。
【００３８】
従って、本発明により、ペプチドまたはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列、および直接的にまたは転写されて標的とする遺伝子の発現または機能を阻害する抑制的核酸を含んでなる異種ポリヌクレオチド配列を含み、パッケージされた（カプシド化された）領域（ベクターゲノム）がウイルス（例えばＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズを有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドが提供される。さらに、該ベクターゲノムは、アデノ随伴ウイルス（例えばＡＡＶ）のようなウイルスの内部に含まれ得る（パッケージされ得る）。従って、ベクターゲノムがウイルスの本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズを有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで感染（形質転換）させるためにウイルス（ここでは“粒子”または“ビリオン”とも称される）内にパッケージされ得る。
【００３９】
該ウイルス粒子またはビリオンは、通常、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージするタンパク質を含む。例として、エンベロープタンパク質と、ＡＡＶの場合にはカプシドタンパク質が挙げられる。
【００４０】
組換え「ベクタープラスミド」および「ＡＡＶベクタープラスミド」は、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来し、分子学的手法を用いてウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを取り除き、異種ポリヌクレオチド配列（例えば治療的遺伝子発現カセット）の様な外来の核酸で置換している。通常は、ＡＡＶの場合には、野生型ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の片方または両方がＡＡＶベクタープラスミドに残される。ウイルスゲノムの全体または一部が異種ポリヌクレオチド配列によって置換されており、該異種ポリヌクレオチド配列は通常はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム核酸に対しては外来の核酸であるので、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムとは区別される。
【００４１】
従って、異種ポリヌクレオチド配列が組み入れられている場合に、そのウイルスベクター（例えばＡＡＶ）は「組換え」ベクターであると定義され、ＡＡＶの場合には該組換え」ベクターを「ｒＡＡＶベクター」と称することがある。組み替えベクターゲノムがＡＡＶ粒子内にカプシド化またはパッケージされている場合、その粒子を「ｒＡＡＶ」と称することがある。
【００４２】
特定の実施形態では、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドはパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ベクターである。パルボウイルスは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小型のウイルスである。「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」はパルボウイルス科に属する。
【００４３】
ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞内に進入し核酸・遺伝物質を導入できるので、遺伝子治療用ベクターとして有用なウイルスである。これらのウイルスは、核酸・遺伝物質が細胞内で安定に維持されるよう、細胞内に進入し核酸・遺伝物質を導入できるので、遺伝子治療用ベクターとして有用なウイルスである。さらに、これらのウイルスは、核酸・遺伝物質を特異的な部位、例えば第１９染色体上の特定の部位に導入できる。ＡＡＶはヒトの病原性疾患に関与しないので、ＡＡＶベクターは実質的なＡＡＶ関連の病原性または疾患を引き起こすことなく、患者に異種ポリヌクレオチド配列（例えば治療的タンパク質および薬剤）を送達できる。
【００４４】
該ベクタープラスミド（例えばＡＡＶ）、および該ベクターゲノムを含む粒子（例えばＡＡＶ）は、いかなる株または血清型のウイルス、またはそれらの亜群および変種を含む。本明細書中で使用する通り、「血清型」という用語は、他のウイルス（例えばＡＡＶ）血清型と血清学的に異なるカプシドを有するウイルス（例えばＡＡＶ）を区別して指すために用いられる。「血清型」は従来、あるウイルスに対する抗体を別のウイルスと比較して交差反応性がないことに基づいて定義される。そのような交差反応性の差異は、通常、カプシドタンパク質の配列・抗原決定基の差異（例えばＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３配列の違い）に起因する。従来の定義では、血清型とは、興味の対象となるウイルスを性質が既知のすべての既存血清型に特異的な血清に対して中和活性試験を行い、対象ウイルスを中和する抗体が存在しないことを意味する。自然界に存在するウイルスのより多くの単離株が発見され、カプシドの突然変異体が作出されるにつれて、現存する血清型との間の差異は必ずしも存在しない可能性がある。従って、新しいウイルス（例えばＡＡＶ）に血清学的な差異が認められない場合、この新しいウイルス（例えばＡＡＶ）は、対応する血清型の亜群または変種となる。多くの場合、カプシド配列が改変された突然変異ウイルスについては、血清型の従来の定義に基づいてそれらが他の血清型に属するか否かを決定するための、中和活性の血清学試験は行われていない。従って、便宜上、また重複を避けるため、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えばＡＡＶ）および血清学的には差異が無くある血清型の亜群または変種に属するウイルス（例えばＡＡＶ）の両者を幅広く指す。
【００４５】
本発明の範囲を限定しない（非限定的な）例として、ＡＡＶは、種々の天然または非天然の血清型を含む。そのような非限定的な血清型としては、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８が挙げられる。また、便宜上、血清型には、独立した血清型であると定義されるための十分な特性解析がなされておらず、実際には既存の血清型の亜群または変種であるかもしれない様な、カプシド配列が改変されたＡＡＶを含む。
【００４６】
従って、本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、およびパッケージまたはカプシド化されたベクターゲノムを含む粒子、ならびにそれらの方法と用途は、いかなるウイルス株または血清型を含む。非限定的な例としては、組換えベクター（例えばＡＡＶ）は、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８の様な、いかなるＡＡＶゲノムにも依拠することができる。組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムをパッケージ（カプシド化とも称される）する粒子（ウイルス）は、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８の様な、いかなるＡＡＶゲノムにも依拠することができる。該ベクターおよび粒子は、同一または互いに異なる株または血清型（または亜群または変種）に依拠してよい。非限定的な例としては、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、ＡＡＶ２血清型ゲノムに依拠することができ、該ゲノムはベクターをパッケージする一つ以上のカプシドタンパク質と同一であってよい。この場合、三つのカプシドタンパク質のうち少なくとも一つはＡＡＶ２である。さらに、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、ＡＡＶ２血清型ゲノムに依拠することができ、該ゲノムはベクターをパッケージする一つ以上のカプシドタンパク質と異なっていてよい。この場合、三つのカプシドタンパク質のうち少なくとも一つは、例えばＡＡＶ−１、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８のカプシドの様な、ＡＡＶ２以外のカプシドである。
【００４７】
さらに、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、およびパッケージ（カプシド化）された領域（ベクターゲノム）を含む粒子は、ハイブリッドまたはキメラを含む。従って、非限定的な例としては、ハイブリッドベクターゲノムは、例えばＡＡＶ２由来の隣接（５‘または３’）ＩＴＲと非ＡＡＶ２由来の隣接（５‘または３’）ＩＴＲのように、ＡＡＶ２血清型と非ＡＡＶ２血清型とを含んでなるような単一のウイルスゲノム血清型であってよい。更に具体的に、非限定的な例としては、ハイブリッドＡＡＶ血清型のベクターゲノムは、ＡＡＶ２由来の隣接（５‘または３’）ＩＴＲとＡＡＶ−１、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８に由来する隣接（５‘または３’）ＩＴＲとを含み得る。別の非限定的な例としては、ウイルスは、ＡＡＶ２由来のカプシドとＡＡＶ２以外のカプシド、例えばＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３とＡＡＶ２以外のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３の様な、ハイブリッドＡＡＶ血清型であってよい。更に具体的には、ＡＡＶ血清型のハイブリッドまたはキメラウイルスは、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２  またはＶＰ３とＡＡＶ−１、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３とを含み得る。
【００４８】
本明細書記載の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド（例えば一つ以上のＡＡＶのＩＴＲを含むＡＡＶ）および粒子（例えばＡＡＶのカプシドタンパク質を含むもの）は、参照配列との配列同一性が１００％を下回るポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそれらの部分配列をもつものを含む。種々の実施形態において、参照配列との配列同一性が１００％を下回る配列は、参照配列に対して８０％以上（例えば８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）の同一性を有し、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４の５‘または３’ＩＴＲ、またはＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシド配列のいずれかと８０％以上（例えば８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）の同一性を有する。そのようなＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４およびＡＡＶ−２ｉ８の５‘および３’ＩＴＲ、ならびにカプシドの配列は、当技術分野で既知である。
【００４９】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８、および関連するハイブリッドおよびキメラ配列を含む組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、当業者に既知の組換え技術を用いて、一つ以上の機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接した一つ以上の異種ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含むよう構築することができる。
【００５０】
該ベクタープラスミドは、全体またはその一部が欠失した野生型ＡＡＶの遺伝子、例えばｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を一つ以上含むことができるが、ＡＡＶベクター粒子の救済（ｒｅｓｃｕｅ）、複製およびパッケージングに必要となるので機能的なＩＴＲ配列を少なくとも一つ保持する。従って、ＡＡＶベクターゲノムは、複製およびパッケージングのために同一分子上（ｉｎ  ｃｉｓ）に必要な配列（例えばＩＴＲ配列）を含む。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、ここでは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ拡散（ＲＮＡ）を含め、あらゆる形の核酸およびオリゴヌクレオチドを指す際に交換可能に使われる。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、スプライスされたまたはスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび抑制性ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば低分子または短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子または短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成された、および恣意的に改変または修飾されたポリヌクレオチド、類似体および誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または三本鎖、直鎖または環状であってよく、いかなる長さでもあり得る。ポリヌクレオチドを論じる際には、特定のポリヌクレオチドの配列または構造を記載することがあり、ここでは慣例に従い、その配列は５‘から３’の方向に記載される。
【００５２】
「異種」ポリヌクレオチドは、ベクター（例えばＡＡＶ）を介して細胞内に導入・送達することを目的として、ベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種ポリヌクレオチドは、通常、ウイルス（例えばＡＡＶ）の核酸とは異なる。すなわち、ウイルス（例えばＡＡＶ）の核酸に対して「外来」である。一旦細胞内に導入・送達されると、ビリオン（例えばＡＡＶ）内に保持された異種ポリヌクレオチドは発現され得る（例えば転写され、適切な条件下では翻訳される）。または、細胞内に導入・送達された、ビリオン（例えばＡＡＶ）内に保持された異種ポリヌクレオチドは、発現される必要は無い。「異種」という用語はここではポリヌクレオチドを参照する際に常に使われるわけではないが、ポリヌクレオチドを参照する際は、「異種」という修飾語を欠く場合でも、省略にもかかわらず  異種ポリヌクレオチドを含むことを意図する。
【００５３】
「ポリヌクレオチド配列」にコードされる「ポリペプチド」、「タンパク」および「ペプチド」には、天然に存在するタンパク質と同様の完全長の天然配列、ならびに機能的な部分配列、修飾型、または配列変異体も、該配列、修飾型、または変異体が天然の完全長タンパク質の機能をある程度保持する限りにおいて含まれる。この発明の方法および使用においては、ポリヌクレオチド配列にコードされる前記ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、治療を受ける哺乳動物で機能不全、発現不足、または欠損している内在タンパク質と同一であり得るが、必ずしもそうである必要は無い。
【００５４】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、ポリヌクレオチドを細胞内およびその後代細胞内に安定的にまたは一過的に導入・送達するために使用されえる。「導入遺伝子」という用語は、ここでは便宜上、細胞または生物内に導入された異種ポリヌクレオチドを指す。導入遺伝子は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子、抑制性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、または転写されないポリヌクレオチド（例えば転写を駆動するプロモーター等の発現調節因子を欠く）の様な、いかなるポリヌクレオチドをも含む。
【００５５】
例えば、導入遺伝子を含む細胞には、導入遺伝子は、ベクター（例えばＡＡＶ）を介した細胞の「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」または「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」によって導入・移入される。「形質転換する（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」または「トランスフェクトする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）」という用語は、ポリヌクレオチドの様な分子を細胞または宿主生物内に導入することを指す。その内部に導入遺伝子が導入された細胞は、「形質転換された細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ）」または「形質転換体」と称される。従って、「形質転換された」または「トランスフェクトされた」細胞（例えば哺乳類における細胞、組織または器官）とは、外来分子、例えばポリヌクレオチドまたはタンパク質（例えば導入遺伝子）の細胞内への取り込みに続く細胞における変化を意味する。従って、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞とは、例えば、その内部に外来分子が導入された細胞、またはその後代の細胞である。該細胞を増殖させ、導入されたタンパク質を発現させる、または核酸を転写させることができる。遺伝子治療のための使用及び方法として、形質転換された細胞は、被験体内に存在し得る。
【００５６】
導入されたポリヌクレオチドは、受容細胞または生物の核酸中に組み込まれるかもしれないし、組み込まれないかもしれない。もし導入されたポリヌクレオチドが受容細胞または生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）中に組み込まれると、該細胞または生物内部で安定に維持され、受容細胞または生物の後代（子孫）に継承される、または遺伝する可能性がある。最後に、導入された核酸は、受容細胞または宿主生物の内部に一時的にのみ存在する可能性がある。
【００５７】
形質転換される細胞は、どのような起源（例えば中胚葉、外胚葉または内胚葉）のどのような組織または器官タイプの細胞であってもよい。細胞の非限定的な例としては、肝臓（例えば肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば膵島β細胞）、肺、脳（例えば神経、グリアまたは上衣細胞）または脊髄の様な中枢または末梢神経系、腎臓、眼（例えば網膜細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、睾丸、肺、横隔膜、心臓（心臓細胞）、筋肉または腰筋、または腸（例えば内分泌細胞）、脂肪組織（白色、褐色またはベージュ脂肪細胞）、筋肉（例えば繊維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳の神経細胞、または造血細胞（例えば、血液細胞またはリンパ球）が挙げられる。更なる例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、膵島β細胞）、肺、脳（例えば、神経、グリアまたは上衣細胞）または脊髄の様な中枢または末梢神経系、腎臓、眼（例えば、網膜細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、睾丸、肺、横隔膜、心臓（心臓細胞）、筋肉または腰筋、または腸（例えば内分泌細胞）、脂肪組織（白色、褐色またはベージュ脂肪細胞）、筋肉（例えば、繊維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳の神経細胞、または造血細胞（例えば血液細胞またはリンパ球）へと発達または分化する万能性または多能性前駆細胞の様な幹細胞が挙げられる。
【００５８】
ある実施形態における「治療的分子」は、細胞または被験体内のタンパク質の不在または機能不全の結果生じる症状を緩和または軽減する可能性のあるペプチドまたはタンパク質である。または、導入遺伝子によってコードされる「治療的」ペプチドまたはタンパクは、被験体に恩恵を与えるものであり、例えば遺伝的欠陥を修復したり、遺伝子（発現または機能）の不足を修復したり、抗がん作用を付与するものである。
【００５９】
本発明における有用な遺伝子産物（例えば治療的タンパク）をコードする異種ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  、  ＣＦＴＲ  ）、機能性血液凝固因子の獲得を含む血液凝固因子（例えば第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子またはプロテインＣ）、抗体、網膜色素上皮細胞特異的  ６５  ｋＤａタンパク質（  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６５  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、  ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン（赤血球生成促進因子）、ＬＤＬ  受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、βグロビン、αグロビン、スペクトリン、αアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、  スルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）、リソソーム蓄積症に関わる酵素（ＡＲＳＡ）、  ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５  グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソーム・  ヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子（例えば  インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３および４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子α  、β等）、サイトカイン（例えばαインターフェロン、βインターフェロン、  インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、自殺遺伝子産物（例えば  単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば癌治療に使われる薬剤に抵抗性を付与するタンパク質）、腫瘍抑制タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ、  ＶＨＬ）、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節機能を有するペプチド、寛容原性または免疫原性のペプチドまたはタンパク質Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ（制御性Ｔ細胞エピトープ）［ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、  Ｂｌｏｏｄ  ２００８  Ｏｃｔ  １５；１１２（８）：３３０３］、またはｈＣＤＲ１［Ｓｈａｒａｂｉら、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；１０３（２３）：８８１０−５］、インスリン、グルコキナーゼ、グラニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（先天性脈絡膜欠如）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノ基転移酵素（脳回転状網膜脈絡膜萎縮）、レチノスキシン（Ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｎ）  １（Ｘ染色体連鎖性の網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ染色体連鎖性の網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型の網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ  ２、３  および４（色覚異常）、Ｐ���Ｄ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝的欠損（例えば  スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク等）、ゲノムエディティングに用いられる一つまたは複数のジンク・フィンガーヌクレアーゼ、またはゲノムエディティングで修復テンプレートとして用いられるドナー配列を含む、またはコードする遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明における有用な遺伝子産物（例えば治療的タンパク質）をコードする異種ポリヌクレオチドのまた別の非限定的な例としては、嚢胞性線維症（または肺の他の病気）、血友病Ａ、血友病Ｂ、地中海貧血、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかんおよび他の神経障害、癌、（真性）糖尿病、筋ジストロフィー（例えばデュシェンヌ型（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）、ベッカー型（Ｂｅｃｋｅｒ））、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハーラー病（Ｈｕｒｌ
ｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、グリコーゲン蓄積症および他の代謝障害、網膜変性疾患（眼の他の疾患）、および固形臓器（脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患を含む疾患や障害の治療に用いられる可能性のあるものを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
遺伝子産物をコードするあらゆる哺乳類または哺乳類以外の形態のポリヌクレオチドには、ここに開示された非限定的な遺伝子とタンパク質を含めて、既知であれ未知であれ、明示的に含まれる。従って、本発明は、哺乳類以外、ヒト以外の哺乳類、およびヒトの遺伝子とタンパク質を含み、これらの遺伝子とタンパク質は、ここに記載されるヒトの遺伝子およびタンパクと実質的に同様の様式で機能する。哺乳類以外の遺伝子の非限定的な例としては、細菌に由来するＦｏｋヌクレアーゼドメインが挙げられる。ヒト以外の哺乳類のＦＩＸ配列の非限定的な例は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、１９８５，  上記参照；  Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５，  上記参照；  Ｊａｌｌａｔら、１９９０，  上記参照；  Ｋｕｒａｃｈｉら、１９８２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：６４６１−６４６４；  Ｊａｙｅら、１９８３，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１：２３２５−２３３５；  Ａｎｓｏｎら、１９８４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：  １０５３−１０６０；  Ｗｕら、１９９０，  Ｇｅｎｅ  ８６：２７５−２７８；  Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ    ８６：１００９５  （１９８９），  Ｂｌｏｏｄ  ７４：２０７−２１２；  Ｐｅｎｄｕｒｔｈｉら、１９９２，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  ６５：１７７−１８６；  Ｓａｋａｒら、１９９０，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９０，  ６：１３３−１４３；  および  Ｋａｔａｙａｍａら、１９７９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：４９９０−４９９４  に記載されている。
【００６２】
本明細書記載の通り、異種ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子）は、抑制性およびアンチセンス核酸配列を含む。抑制性、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を調節できる。そのような分子には、疾病経過の媒介に関与する標的遺伝子の発現を阻害し、よって疾病の一つ以上の症状を低減、阻害または緩和する分子が含まれる。
【００６３】
アンチセンスは、ＲＮＡ転写物またはＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）に結合する一本鎖、二本鎖または三本鎖ポリヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含む。標的遺伝子の転写開始部位、例えば開始部位の−１０から＋１０の間に由来するオリゴヌクレオチドは、もうひとつの特定例である。三本鎖を形成するアンチセンスは、二本鎖ＤＮＡに結合し、よって遺伝子の転写を阻害出来る。「ＲＮＡｉ」とは、遺伝子の発現を阻害するために一本鎖または二本鎖ＲＮＡ配列を使用することである（例えばＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７  （１９９８）；およびＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：８０６  （１９９８）を参照）。従って、本発明の方法および使用によって、標的遺伝子コーディング領域に由来する二本鎖ＲＮＡ配列は、遺伝子の発現・転写を阻害または予防するために使われ得る。アンチセンスおよびＲＮＡｉは、標的遺伝子配列（例えばハンチンチンまたはＨＴＴ）をコードする核酸、例えば哺乳類およびヒトのＨＴＴをコードする核酸に基づいて作成できる。例えば、一本鎖または二本鎖の核酸（例えばＲＮＡ）は、ＨＴＴ転写物（例えばｍＲＮＡ）を標的にできる。
【００６４】
「ｓｉＲＮＡ」は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックダウンのためのＲＮＡ干渉過程に関与する治療的分子を指す。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の同源（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの配列と相同性を有する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することにより、またはより長鎖のｄｓＲＮＡをリボヌクレアーゼＩＩＩで切断することにより作成でき、配列特異的ｍＲＮＡ分解の媒介物である。本発明のｓｉＲＮＡまたは他のそのような核酸は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することができる。ｓｉＲＮＡは、別々の二つの相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を有する一つのＲＮＡ分子として合成できる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の販売業者には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  Ｃｏｌｏ．，  ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．，  ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  Ｖａ．，  ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．，  ＵＳＡ）、  および  Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，  ＵＫ）がある。標的遺伝子のｍＲＮＡを阻害するための特異的ｓｉＲＮＡ構成物は、１５〜５０ヌクレオチドの長さであってよく、より典型的には約２０〜３０ヌクレオチドの長さであってよい。そのような核酸分子は、当業者に既知の従来法によって、本明細書に開示したウイルスベクター内に容易に組み込むことができる。
【００６５】
本発明による抑制性核酸配列の標的となる可能性のある遺伝子（例えばゲノムＤＮＡ）または病原性遺伝子の転写物（例えばＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の非限定的な例としては、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の様なポリヌクレオチド反復疾患に関連する遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症に関連する遺伝子（例えばアトロフィン１、ＡＴＮ１）、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン（Ａｔａｘｉｎ）１，２，３および７、ＣＡＣＮＡ１Ａにコードされる電位依存性カルシウムチャンネルＣａv２．１  Ｐ／Ｑ  、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られるアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調におけるセリン・スレオニンタンパク質ホスファターゼ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（１，２，３，６，７，８，１２，１７型）、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１  （脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連震戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１  （脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１  （脆弱性Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２（ＡＦ４／ＦＭＲ２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２）、筋強直性ジストロフィー症におけるミオトニンタンパク質キナーゼ（Ｍｙｏｔｏｎｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＴ−ＰＫ）、フリートライヒ運動失調症におけるフラタキシン（Ｆｒａｔａｘｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症における変異型スーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子、パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の発症機序に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）および前駆タンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶ転写トランス活性化因子遺伝子、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶトランス活性化因子応答配列遺伝子、ＨＩＶ  ＴＡＲ、ＨＩＶ感染におけるＣ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染におけるヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）、ｐ５３、急性腎損傷または移植腎機能発現遅延または腎損傷急性腎不全、進行した再発性または転移性の固形悪性腫瘍におけるタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、転移性黒色腫におけるＬＭＰ２、ＬＭＰ２はプロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ  ９）としても知られる、転移性黒色腫におけるＬＭＰ７、プロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ  ８）としても知られる、転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ  １０）としても知られるＭＥＣＬ１、固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、固形腫瘍におけるキネシン紡錘タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）、固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）、固形腫瘍におけるフーリン（Ｆｕｒｉｎ）、肝臓がんにおけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけ���ベータカテニン、緑内障におけるベータアドレナリン作動性受容体、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢に伴う黄斑変性症におけるＤＡＮ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、加齢に伴う黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２、先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ  Ｎ１７Ｋ  変異型タンパク質、インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡ型ウイルスのゲノム・遺伝子配列、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるコロナウイルのゲノム・遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスのゲノム・遺伝子配列、エボラ感染におけるエボラフィロウイルスのゲノム・遺伝子配列、Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム・遺伝子配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染におけるＨＳＶウイルスのゲノム・遺伝子配列、コクサッキー・ウイルスＢ３感染におけるコクサッキー・ウイルスＢ３のゲノム・遺伝子配列、原発性筋失調症におけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）の様な遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植手術における汎クラスＩおよびＨＬＡ対立遺伝子特異的（サイレンシング）、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異型ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）を含むが、これらに限定されるのもではない。
【００６６】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびこれらの部分配列は、修飾型や変異型を含む。ここで使用されるように、「修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）」または「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語、およびこれらの文法的に変化したものは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびこれらの部分配列が参照配列から逸脱することを意味する。よって修飾型および変異型の配列は、参照配列と比べて実質的に同等、高いまたは低い活性または機能を有することがあり得るが、少なくとも参照配列の活性または機能の一部を保持するものとする。
【００６７】
よって、本発明は、天然および非天然に存在する変異体も含む。そのような変異体は、機能を獲得または喪失した変異体を含む。例えば、本発明の方法と使用において、ヒトの野生型ＦＩＸ  ＤＮＡ配列であって、そのタンパク質の変異体または突現変異体が活性を維持しているもの、または治療学的に有効なもの、またはヒトの不変ＦＩＸと比較して治療活性が同程度、またはより活性が高いものである。ある特定の例では、コラーゲンＩＶはＦＩＸを捕捉する作用があり、すなわち哺乳類の筋肉組織に導入された際、ＦＩＸの一部は筋肉組織の間質腔内に保持されるので血液凝固に関与できない。コラーゲンＩＶとの結合が低下したタンパク質を生じるようなＦＩＸ配列の突然変異（例えば機能の喪失）は、本発明の方法において、例えば血友病の治療に有用な突然変異体である。そのようなヒトＦＩＸ遺伝子の突然変異体は、例えば、成熟タンパク質の開始点から５番目のアミノ酸であるリジンがアラニンに置換されたヒトＦＩＸタンパク質をコードする。
【００６８】
非限定的な修飾の例としては、参照配列の一つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換（例えば１〜３、３〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、またはさらに多くのヌクレオチドまたは残基）、付加（例えば挿入または１〜３、３〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、またはさらに多くのヌクレオチドまたは残基）、および欠失（例えば部分配列または断片）を含む。特定の実施形態では、修飾型または変異型の配列は、非修飾型配列の機能または活性の少なくとも一部を保持する。そのような修飾型または変異体は、例えばここに記載されるように、参照配列の機能または活性より低い、同等または高い機能または活性を有し得るが、参照配列の機能または活性の少なくとも一部を保持する。
【００６９】
変異体は、一つ以上の非保存的または保存的なアミノ酸配列の変異または修飾、またはその両者を有し得る。「保存的置換」とは、一つのアミノ酸が生物学的、化学的または構造的に類似の残基によって置換されることである。生物学的類似とは、置換によって生物学的活性が損なわれないことを意味する。構造的類似とは、例えばアラニン、グリシン、セリンの様にアミノ酸が類似した長さの側鎖を有する、または類似したサイズを有することを意味する。化学的類似とは、残基が同一の電荷を有すること、または両者ともに親水性または疎水性であることを意味する。特定の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの様な疎水性残基を互いに置換する、またはリジンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、アスパラギンをグルタミンで、スレオニンをセリンで置換するように極性残基を互いに置換することなどが挙げられる。保存的置換の特定の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような疎水性残基を互いに置換する、またはリジンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、アスパラギンをグルタミンで、スレオニンをセリンで置換するように極性残基を互いに置換することなどが挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は通常、以下のグループ内での置換を含み、それらは、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、および、フェニルアラニン、チロシンである。「保存的置換」はまた、置換されない本来の（ｐａｒｅｎｔ）アミノ酸の位置に、置換したアミノ酸を用いることも含める。
【００７０】
従って、本発明は、一つ以上の生物学的活性（例えば血液凝固における機能等）を保持する遺伝子およびタンパク質の変異体（例えばここに記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含む。そのようなタンパク質またはポリペプチドの変異体は、例えば血漿中でのタンパク質の安定性が向上させる、タンパク質の活性を向上させるなど、タンパク質が改変されたまたは付加的な特性を有するように組換えＤＮＡ技術によって修飾された、または修飾され得るタンパク質またはポリペプチドを含む。変異体は、天然に存在するポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドの様な参照配列とは異なり得る。
【００７１】
ヌクレオチド配列のレベルにおいて、天然または非天然に存在する変異型遺伝子は、一般的には少なくとも約５０％、より一般的には約７０％、さらにより一般的には約８０％、参照遺伝子と同一（９０％以上の同一性）である。アミノ酸配列のレベルにおいて、天然または非天然に存在する変異型タンパクは、一般的には少なくとも約７０％、より一般的には約８０％、さらにより一般的には約９０％以上、参照タンパクと同一であるが、非保存的領域においては実質的に非同一な領域の存在が許容される（例えば同一性が６０％を下回る、５０％を下回る、さらには４０％にも満たないなど、７０％を下回る）。他の実施形態では、配列は参照配列に対して６０％、７０％、７５％またはそれを超える同一性を有する（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性）。ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドに核酸およびアミノ酸の変異を導入する手順は、熟練技術者には既知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２００７）を参照）。
【００７２】
「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」および「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語、ならびにそれらの文法的に変化したものは、二つまたはそれ以上の参照される対象（ｅｎｔｉｔｙ）が、それらが「整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）」配列である場合に、同一であることを意味する。よって、例としては、二つのポリペプチド配列が同一である時、それらは少なくとも参照される領域または部分内では同じアミノ酸配列を有する。二つのポリヌクレオチド配列が同一である時、それらは少なくとも参照される領域または部分内では同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列中の定義された範囲（ａｒｅａ）（領域（ｒｅｇｉｏｎ）またはドメイン（ｄｏｍａｉｎ））を対象とする場合がある。よって、二つのタンパク質または核酸の配列が一つ以上の配列範囲または領域にわたって同一である時、それらはその領域内において同一性を有する。「整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）」配列は、複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質（アミノ酸）の配列であって、多くの場合参照配列と比較して欠落している、または追加されている塩基またはアミノ酸（ギャップ（ｇａｐｓ））に関する補正を含む。
【００７３】
同一性は、配列の全長または配列の一部分にわたってよい。特定の形態では、同一率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を共有する配列の長さは、２、３、４、５またはそれ以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸であり、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等の連続したアミノ酸である。さらに別の特定の形態では、同一性を共有する配列の長さは、２０以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸であり、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５，２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５等の連続したアミノ酸である。さらにまた別の特定の形態では、同一性を共有する配列の長さは、３５以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸であり、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、２０等の連続したアミノ酸である。さらにまた別の特定の形態では、同一性を共有する配列の長さは５０以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸であり、例えば５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１１０等の連続したアミノ酸である。
【００７４】
「相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、二つ以上の参照される対象が、ある一定の領域または部分にわたって少なくとも部分的に同一であることを意味する。相同なまたは同一な「範囲、領域またはドメイン」は、二つ以上の参照される対象の一部分が、相同性を有するか同一であることを意味する。よって、二つの配列が一つ以上の配列領域にわたって同一である時、これらの配列はそれらの領域において同一性を共有する。「実質的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）相同性」は、分子が構造的または機能的に保存されており、参照分子、または該分子が相同性を有する参照分子中の関連する／対応する領域の、一つ以上の構造または機能（例えば生物学的機能または活性）のうち少なくとも部分的な構造または機能を該分子が有する、または有することが予測されることを意味する。
【００７５】
二つの配列の間の同一性（相同性）の程度は、コンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズムを用いて解明することができる。配列同一性（相同性）のパーセンテージを算出するそのようなアルゴリズムは、一般的に比較領域または範囲にある配列のギャップとミスマッチを考慮に入れる。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えばＢＬＡＳＴ  ２．０）の検索アルゴリズム（  例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３  （１９９０）参照、ＮＣＢＩにより公的に入手可能）は、以下のような典型的な検索パラメターを有する：ミスマッチ‐２、ギャップ間隔（ｇａｐ  ｏｐｅｎ）５、ギャップ延長（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）２。ポリペプチド配列の比較には、一般的にＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ  ２５０、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  または  ＢＬＯＳＵＭ  ５０の様なスコアマトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）と組み合わせて用いる。配列比較プログラムであるＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）およびＳＳＥＡＲＣＨも、同一性の度合いを定量するのに用いられる（Ｐｅａｒｓｏｎら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）；  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５  （２０００）；  および  Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：１９５  （１９８１））。ドロネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）法による位相幾何学マッピングを用いてタンパク質構造の類似性を定量化するプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０４：３２０  （２００３））。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、例えば異種ドメインの様な、付加物および挿入物を含む。付加物（例えば異種ドメイン）は、組成物に対して共有結合的にまたは非共有結合的に結合するどのような種類の分子でもあり得る。一般的に、付加物および挿入物（例えば異種ドメイン）は、補完的または異なる機能または活性を付与する。
【００７７】
付加物および挿入物は、キメラおよび融合配列を含み、これは天然の参照配列（野生型）内には通常存在しない、該配列に共有結合した一つ以上の分子を有するポリヌクレオチドまたはタンパク質である。「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」または「キメラ状」という用語、およびこれらが文法的に変化したものは、分子を指して使用される場合には、分子の一部が、自然状態では通常共存しない異なる分子に由来する部分を含むことを意味する。すなわち、例えば、融合またはキメラの一部は、自然状態では共存せず構造的に異なる部分から成るか、またはこれを含む。
【００７８】
「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作することができるプラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、コスミドまたは他の輸送媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入・移入し、細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを転写または翻訳するための遺伝子操作（すなわち「クローニングベクター」）に用いることができる。ベクタープラスミドは一般に、細胞内で増殖するための複製起点を少なくとも一つ含み、随意に、異種ポリヌクレオチド配列、発現調節因子（例えばプロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性）、ポリアデニン配列のような追加因子を含む。
【００７９】
ここで用いられるように、ＡＡＶベクターの様なウイルスベクターの修飾語としての、ならびに組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドの様な配列の修飾語としての「組換え」という用語は、組成物が自然界では通常起らない様式で操作されている（すなわち改変されている）ことを意味する。ＡＡＶベクターの様な組換えベクターの一例としては、野性型ウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノムには通常存在しないポリヌクレオチドが、ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子および／またはウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム内に存在する場合が挙げられる。例えば、組換えポリヌクレオチドの一例としては、タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば遺伝子）が、ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム内では通常遺伝子に付随する５‘、３’および／またはイントロン領域を伴い、または伴わずにベクター内にクローニングされる場合が挙げられる。ここでは「組換え」という用語はＡＡＶベクターの様なウイルスベクター、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチドの様な配列、ハイブリッドおよびキメラを常に指して用いられるものではないが、ウイルス（例えばＡＡＶ）、ベクター、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ハイブリッドおよびキメラを含む配列の組換え型は、たとえ省略されていても明示的に含まれるものとする。
【００８０】
組換えベクタープラスミドについては、ベクターゲノムは、ウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージまたはカプシド化され、異種ポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドの一部を指す。組換えベクタープラスミドのプラスミド部位は、ヘルパー細胞のトランスフェクションおよび細胞によるベクターゲノムをパッケージ／カプシド化するウイルスの産生に用いられるバックボーン配列を含むが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージ／カプシド化されない。
【００８１】
ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを構成する一つ以上の核酸要素に由来するか、またはそれらに基づいて作成される。特定のウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの様なパルボウイルスベクターが含まれる。
【００８２】
ここで定義される組換えベクタープラスミドは、パッケージまたはカプシド化されて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、またはそれに近いサイズに長さを変更または調節する、追加的なフィラー／スタッファー核酸配列を含む。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパクをコードしない）断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）である。ＡＡＶベクターの特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、その長さが４．７Ｋｂ未満であり、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列と合わせた（例えばベクター内に挿入された）時の全長が約３．０〜５．５Ｋｂ、または４．０〜５．０ｋｂ、または４．３〜４．８ｋｂである。例えば、ＡＡＶ粒子パッケージングのためのベクターの長さは、最大で約５．２ｋｂである。さらに具体的には、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，０００〜５，５００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００または８，０００〜９，０００ヌクレオチドの配列長を有する。
【００８３】
ここで開示されるように、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列、調節因子、ＩＴＲ、複製起点、選択マーカー等の他の配列に対して、組換えベクタープラスミド内のベクター機能と両立できる任意の位置にあってよい。ある特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する３’ＩＴＲと５’ＩＴＲとの間に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルスのパッケージ／カプシド化に用いられる。別の特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する３’ＩＴＲと５’ＩＴＲの外側に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのバックボーンまたはプラスミド部分内に存在する。また別の特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の内部に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、異種ポリヌクレオチド配列の内部に位置するフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルスのパッケージ／カプシド化に用いられる。
【００８４】
本発明の組換えＡＡＶベクタープラスミドを含む組換えベクタープラスミドは、さらに追加の核酸因子を含むことができる。このような因子には、一コピー以上のＡＡＶのＩＴＲ配列、プロモーターまたはエンハンサー因子、転写終結シグナル、ポリヌクレオチド配列に隣接する５‘または３’非翻訳領域（例えばポリアデニレーション配列）、またはイントロンＩの全体または一部が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような因子はまた、随意に転写終結シグナルを含む。転写終結シグナルの非限定的な例としては、ＳＶ４０転写終結シグナルがある。
【００８５】
本発明の組換えベクタープラスミドは、一つ以上の「発現調節因子」を含むことができる。ここで定義されるように、発現調節因子を含む調節因子は、ベクター内に存在し、異種ポリヌクレオチドの適切な転写、および適切な条件下では翻訳（例えばイントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）翻訳を可能にする遺伝子の正しいフレーム読み取りの維持、および停止コドン等）を促進する。一般的には、発現調節因子は、作動可能な様に連結した異種ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーの様な核酸配列である。そのような因子は一般的にはシスに（ｉｎ  ｃｉｓ）作用するが、トランスに（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）作用することもある。
【００８６】
発現調節は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで効果を発揮し得る。一般的に、転写を調節する発現調節因子は、転写されるポリヌクレオチドの５‘末端の近傍（すなわち「上流側」）に並置される。発現調節因子はまた、転写されるポリヌクレオチドの３‘末端（すなわち「下流側」）、または転写物の内部（例えばイントロン内）に配置される場合もある。発現調節因子は、転写される配列から離れた位置（ポリヌクレオチドから１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜５０００、５０００〜１０，０００ヌクレオチド、またはさらに離れた位置）に、またかなり離れた位置にさえ配置され得る。とはいえ、ＡＡＶベクターの様なウイルスベクターのポリヌクレオチド長制限のために、そのような発現調節因子は、一般的にはポリヌクレオチドから１〜１０００ヌクレオチドの範囲に位置する。
【００８７】
機能的には、作動可能な様に連結された異種ポリヌクレオチドの発現は、調節因子（例えばプロモーター）によって少なくとも部分的には制御が可能であり、その結果調節因子は異種ポリヌクレオチドの転写を調節し、適切な条件下では転写物の翻訳も調節する。発現調節因子の具体的な例としては、プロモーターがあり、通常転写される配列の５’に位置する。発現調節因子の別の例としては、エンハンサーがあり、転写される配列の５’、３’または転写配列内部のいずれにも位置し得る。
【００８８】
ここで用いられる「プロモーター」という用語は、組換え産物をコードするポリヌクレオチド配列の近傍に位置するＤＮＡ配列を指す場合がある。プロモーターは、通常、例えば異種ポリヌクレオチドの様な近傍の配列と作動可能な様に連結されている。プロモーターは、通常、異種ポリヌクレオチドから発現される量を、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比べて増加させる。
【００８９】
ここで用いられる「エンハンサー」という用語は、異種ポリヌクレオチドの近傍に位置する配列を指す場合がある。エンハンサーは、通常、プロモーターの上流に位置するが、ＤＮＡ配列（例えば異種ポリヌクレオチド）の下流またはその内部にも位置することができ、機能する。従って、エンハンサーは異種ポリヌクレオチドの１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、またはさらに上流または下流に位置し得る。エンハンサーは、通常、異種ポリヌクレオチドの発現を、プロモーター配列によって増加された発現量以上に増加させる。
【００９０】
発現調節因子（例えばプロモーター）は、特定のタイプの組織または細胞で活性な因子を含み、ここでは「組織特異的発現調節因子／プロモーター」と称する。組織特異的発現調節因子は通常、特定の細胞または組織（例えば肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜、骨、筋肉、肺、すい臓、心臓、腎臓の細胞等で活性）で活性である。発現調節因子は通常、特定のタイプの細胞、組織または器官に固有の転写活性化因子タンパク質または他の転写調節因子によって認識されるので、特定の細胞、組織または器官で活性である。
【００９１】
例えば、骨格筋内での発現を所望する場合には、筋肉で活性なプロモーターを使用することができる。これらには、骨格αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子のプロモーター、および天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる。Ｌｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：２４１−２４５  （１９９９）を参照のこと。組織特異的プロモーターの例として、肝臓についてはアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１：５１２４−３２  （１９９７））、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ３：１００２−９  （１９９６））、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ．  Ｔｈｅｒ．，  ７：１５０３−１４  （１９９６））、骨についてはオステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．，  ２４：１８５−９６  （１９９７））、骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １１  ：６５４−６４  （１９９６））、リンパ球についてはＣＤ２（Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６１：１０６３−８  （１９９８））、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞受容体ａ鎖、神経については神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １３：５０３−１５  （１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：５６１１−５  （１９９１）、神経細胞特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １５：３７３−８４  （１９９５））が特に挙げられる。
【００９２】
発現調節因子はまた、多くの異なる細胞型でポリヌクレオチドの発現を駆動することができる偏在性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）または広域（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プロモーター／エンハンサーを含む。そのような因子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、および種々のタイプの哺乳類細胞で活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー配列、または自然界には存在しない合成因子（例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，  ４１：５２１−５３０  （１９８５）参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質性βアクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
発現調節因子はまた、制御可能、すなわち信号または刺激によって作動可能な様に連結された異種ポリヌクレオチドの発現を増加または低下させるような様式で発現させることもできる。信号または刺激に反応して異種ポリヌクレオチドの発現を増加させる制御因子は、「誘導因子」（すなわち信号によって誘導される）とも称される。特定の例としては、ホルモン（例えばステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。信号または刺激に反応して作動可能な様に連結された異種ポリヌクレオチドの発現を低下させる制御因子は、「抑制因子」（すなわち信号によって発現が低下し、信号が除去されるか存在しない場合には発現が増加する）とも称される。一般に、その様な因子によって増加または低下する量は、存在する信号または刺激の量に比例する。すなわち、信号または刺激の量が多いほど、発現の増加または低下の量が多くなる。特定の非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジ・メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、ステロイドホルモン誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ  ９８／１００８８）、テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：５５４７−５５５１  （１９９２））、テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２６８：１７６６−１７６９  （１９９５）；  Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５１２−５１８  （１９９８）も参照のこと）、ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：２３９−２４３  （１９９７）  およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４：４３２−４４１  （１９９７））、およびラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００：２８６５−２８７２  （１９９７）；  Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２：１０２８−１０３２  （１９９６））が挙げられる。このような背景において有用な可能性のある他のタイプの制御可能な調節因子は、例えば温度や急性期のような特定の生理的状態によって制御を受けるものである。
【００９４】
発現調節因子には、異種ポリヌクレオチドに対する天然の因子も含まれる。天然の調節因子（例えばプロモーター）は、異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣することが望まれる場合に用いることができる。天然の調節因子は、異種ポリヌクレオチドの発現を一時的または発生的に、組織特異的に、または特定の転写刺激に反応させて制御するときに用いられる可能性がある。イントロン、ポリアデニレーション部位またはコザックコンセンサス（共通）配列のような他の天然の調節因子も用いられる可能性がある。
【００９５】
ここで開示されるように、ＡＡＶベクターには通常、約４ｋｂから約５．２ｋｂまたはこれより若干大きい、定義されたサイズ範囲のＤＮＡを挿入することが可能である。従って、短い配列に対しては、ウイルス粒子にパッケージされるため許容されるＡＡＶベクターの長さに達させるために、スタッファーまたはフィラーを挿入断片に含める。ここで開示されるように、イントロンもまたＡＡＶベクターをウイルス粒子にパッケージされる長さに達成させるための、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能することができる。フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロンおよびイントロン断片（例えばＦＩＸのイントロンＩの一部）もまた、発現を向上させることができる。例えば、イントロンを含めることで、イントロンが不在の場合に比べて発現を向上させる可能性がある（Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、上記参照）。
【００９６】
イントロンの使用は、ＦＩＸのイントロンＩ配列の含有に限定されるものではなく、他のイントロンも含み、そのようなイントロンは同じ遺伝子（例えば異種ポリヌクレオチドがＦＩＸをコードする場合にイントロンがＦＩＸのゲノム配列内に存在するイントロンに由来する）、またはまったく異なる遺伝子または別のＤＮＡ配列に関連するものであってもよい。従って、本発明においては、同族（関連した）遺伝子（異種ポリヌクレオチド配列がゲノム配列によってコードされるタンパク質と同じタンパク質の全体または一部をコードする）、および非同族（関連しない）遺伝子（異種ポリヌクレオチド配列がゲノム配列によってコードされるタンパク質とは異なるタンパク質をコードする）に由来するゲノム配列内に存在するイントロンの様な、核酸内の他の非翻訳（タンパク質をコードしない）領域も、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能する。
【００９７】
ここで用いられる「イントロンＩの一部」とは、ヌクレオチド長が約０．１ｋｂから約１．７ｋｂのイントロンＩの領域を意味し、この領域はＦＩＸの発現を促進し、イントロンＩの一部が無いときのＦＩＸの発現に比べて、通常はプラスミドまたはウイルスベクターテンプレート上でのＦＩＸの発現を約１．５倍以上高める。より具体的な部分には、イントロンＩの１．３ｋｂの部分がある。
【００９８】
ここで使われる「オリゴヌクレオチド」という用語は、二以上の、通常は四以上のリボ核酸またはデオキシリボ核酸から構成される核酸分子として定義される配列、プライマーおよびプローブを指す。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の要因、オリゴヌクレオチドの具体的な用途および使用法に依存するが、通常、オリゴヌクレオチドは約５〜５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００９９】
ここで使われる「プライマー」という用語は、一本鎖または二本鎖の、生物学的システムに由来するか、制限酵素消化により生成されるか、または合成的に作成され、適切な環境下においてテンプレート（鋳型）依存的核酸合成の開始剤として機能することができるＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。適切な核酸テンプレート、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、および適切な温度およびｐＨの様な適切な環境条件の下では、ポリメラーゼの作用または類似の活性によってプライマーの３‘にヌクレオチドが添加されてプライマーが伸長され、プライマー伸長産物が得られる可能性がある。プライマーの長さは、特定の環境条件および応用要件に依存して変化してよい。例えば、診断的応用においては、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは通常、１５〜３０ヌクレオチドまたはこれを超える。所望の伸長産物の合成を始動する、すなわち、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成の開始に供するために、適切に並置されたプライマーの３’水酸基を与えるに十分な様態で所望のテンプレート鎖とアニールするためには、プライマーは、所望のテンプレートに対して十分な相補性を有しなければならない。プライマー配列が、所望のテンプレ−トと完全な相補性を有する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、他の領域は相補的なプライマーの５‘末端に連結されていてよい。または、プライマー配列が所望のテンプレートの配列と、伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供するに十分な相補性を有する限り、非相補的塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在してよい。
【０１００】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１９５号および４，９６５，１８８号に記載されている。
【０１０１】
「特異的にハイブリッド形成する」という表現は、通常当技術分野で用いられるあらかじめ規定された条件下で、十分な相補性を有する二本の一本鎖核酸分子が会合することを意味する（時には「十分に相補的」とも表現される）。特に、この用語は、十分に相補的な配列を有する二つのポリヌクレオチド配列のハイブリッド形成を意味し、非相補的な一本鎖核酸配列へのハイブリッド形成は実質的に除外される。
【０１０２】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらの修飾型を含めて、標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術、細胞による発現またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳、および化学合成技術によって作成することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動法などによって決定することができる。例えば、核酸はハイブリッド形成またはコンピュータに基づくデータベース検索技術を用いて単離することができる。そのような技術には、（１）ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーと、相同ヌクレオチド配列を検出するプローブとのハイブリッド形成、（２）発現ライブラリー等を用いた、共通の構造特性を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング、（３）目的核酸配列とアニーリング可能なプライマーを用いたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、（４）関連配列を検出するためのコンピュータによる配列データベースの検索、および（５）核酸サブトラクション・ライブラリーのディファレンシャル・スクリーニングが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
「選択マーカー遺伝子」は、発現されると、形質転換細胞に抗生物質（例えばカナマイシン）耐性の様な選択可能な表現型を付与する遺伝子を意味する。「レポーター」遺伝子は、検出可能な信号を提供する遺伝子である。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、ルシフェラーゼ遺伝子がある。
【０１０４】
ここで用いられるように、「作動可能な連結」または「作動可能な様に連結した」という表現は、記載された構成要素を、それらが意図されたように機能できるように物理的または機能的に並置することを意味する。異種ポリヌクレオチドと作動可能な様に連結した発現調節因子の例では、調節因子が異種ポリヌクレオチドの発現を調節するような関係にある。より具体的には、例えば、作動可能な様に連結された二つのＤＮＡ配列とは、少なくとも一方のＤＮＡ配列が他方の配列に生理的効果を発揮することができる関係でこれら二つのＤＮＡ配列が（シスまたはトランスに）配置されていることを意味する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらの修飾型を含めて、例えば自動合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡを参照）の様な熟練技術者には既知の方法を用いた化学的合成によって生産することができる。ペプチドは、化学的手法を用いて全体または部分的に合成することができる（例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．２１５；  Ｈｏｒｎ  （１９８０）；  およびＢａｎｇａ，  Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５）  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡを参照）。ペプチド合成は、種々の固相技術を用いて実施でき（例えばＲｏｂｅｒｇｅＳｃｉｅｎｃｅ２６９：２０２  （１９９５）；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３（１９９７）参照）、例えばＡＢＩの４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造会社の使用説明書に従って使用して自動合成することも可能である。
【０１０６】
組成物の修飾語として用いられる場合、「単離された」という用語は、組成物が人の手によって作出されたか、またはそれらが天然に存在する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）環境から、完全にまたは少なくとも部分的に、分離されていることを意味する。一般的に、単離された組成物は、通常自然界に随伴する一つ以上の物質、例えば一つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的には含まない。「単離された」という用語は、人の手によって作出された、例えば組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、またはベクターゲノムをパッケージまたはカプシド化するウイルス粒子と医薬製剤との混合物を除外するものではない。また、「単離された」という用語は、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えばリン酸化、糖鎖付加または脂質付加）、または誘導体の様な組成物の別の物理的形態、または人の手によって作出された宿主細胞で発現される形態を除外するものではない。
【０１０７】
本発明の方法と使用は、異種ポリヌクレオチド（導入遺伝子）を分裂細胞および非分裂細胞の両者を含む広範囲の宿主細胞に送達する（形質導入する）手段を提供する。本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、方法、使用、医薬製剤は、タンパク質、ペプチドまたは核酸を治療手段としてそれを必要とする被験体に投与する方法としても有用である。その結果として、タンパク質、ペプチドまたは核酸が被験体の体内で生成され得る。被験体は、該タンパク質、ペプチドまたは核酸が欠乏しているか、または被験体内での該タンパク質、ペプチドまたは核酸の生成が治療方法またはその他の方法として治療効果があるため、該タンパク質、ペプチドまたは核酸により恩恵を受けるか、またはこれらを必要としている可能性がある。または、例えば神経変性疾患、癌またはアテローム性動脈硬化症の治療の様に、治療効果を得るためには、疾患経過に関与する標的遺伝子の発現または生成を阻害または低減することが望ましい場合もある。
【０１０８】
一般に、本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、方法および使用は、不十分なまたは望ましくない遺伝子の発現に関係する任意の疾患に関わる一つ以上の症状を治療または緩和するために、生物学的効果を有する任意の異種ポリヌクレオチドを送達するために使用され得る。本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、方法および使用は、種々の病態に対する治療を提供するために用いられ得る。
【０１０９】
欠陥遺伝子が既知でクローニングされている遺伝疾患は、多数存在する。一般的に、上述の病態は二つのクラスに分けられる。一つは欠損状態で、通常欠損しているのは酵素であり、一般的に劣性遺伝する。もう一つは不均衡状態で、調節または構造タンパク質が関与することがあり、優性遺伝する。欠損状態の疾患では、遺伝子導入は、補充療法として罹患組織に正常遺伝子を運ぶため、ならびにアンチセンス突然変異を用いて疾患の動物モデルを作出するために用いることができる。不均衡状態の疾患では、遺伝子導入は、モデルシステムで病態を作出するために用いることができ、該モデルシステムはその病態を解消する取り組みに利用することができる。従って、本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、方法および使用は、遺伝疾患の治療を可能にする。ここで用いられる様に、病態は、その疾患の原因となる、または悪化させる欠損または不均衡を部分的または完全に改善することによって治療される。核酸配列の部位特異的組み込みを、突然変異を起こすため、または欠陥を矯正するために使用することも可能である。
【０１１０】
病態の実例としては、嚢胞性線維症（および肺の他の病気）、血友病Ａ、血友病Ｂ、地中海貧血、  貧血症および他の血液障害、ＡＩＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかんおよび他の神経障害、癌、（真性）糖尿病、筋ジストロフィー（例えばデュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型、ベッカー（  Ｂｅｃｋｅｒ）型），  ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハーラー病（Ｈｕｒｌｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）  、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、  グリコーゲン蓄積症および他の代謝障害、ポンペ病、鬱血性心不全、網膜変性疾患（先天性脈絡膜欠如、レーバー先天性黒内障および眼の他の疾患）、および固形臓器（脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明において、治療方法と使用が提供されており、それらには本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、およびベクターゲノムを含む本発明のウイルス粒子が含まれる。本発明の方法と使用は、タンパク質をコードする遺伝子の導入によって、または遺伝子の追加または置換など、遺伝子の発現または機能を増加または亢進させることによって、治療可能な疾患に広範に応用可能である。本発明の方法と使用はまた、例えば遺伝子ノックアウトまたは遺伝子発現の低減（遺伝子ノックダウン）など、遺伝子の発現または機能を低減または減少させることによって治療可能な疾患に広範に応用可能である。
【０１１２】
本発明によって治療可能な疾患の非限定的な特定の例としては、ここに示したもの、ならびに肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、血液凝固疾患または出血性疾患（例えば阻害剤の有無に関わらず血友病Ａ、血友病Ｂ）、地中海貧血、血液障害（例えば貧血症）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症、銅または鉄の蓄積症（例えばウィルソン病またはメンケス病）、リソソーム酸リパーゼ欠損症、神経障害または神経変性疾患、癌、  １型または２型糖尿病、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハーラー病  （Ｈｕｒｌｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）  、ア
デノシン・デアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えばグリコーゲン蓄積症）、網膜変性疾患（例えばＲＰＥ６５欠損症または不全、先天性脈絡膜欠如や他の眼の疾患）および固形臓器（脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
更に、本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子、方法および使用は、癌、感染病、および関節リウマチの様な自己免疫疾患に関連する症状を治療または緩和するために有益な生物学的効果を提供するモノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸を送達するために利用され得る。
【０１１４】
ある実施形態では、本発明の方法または使用は、（ａ）ベクターが異種ポリヌクレオチド配列およびフィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチド配列を転写させる発現調節因子と作動可能な様に連結されており、両者を合わせた長さが約３．０〜５．５Ｋｂ、約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂである、本発明のベクターゲノムを含んでなるウイルス粒子を提供すること、および（ｂ）前記異種ポリヌクレオチドが哺乳動物内で発現されるよう、ある量のウイルス粒子を哺乳動物に投与することを含む。特定の形態では、異種ポリヌクレオチドの発現は、哺乳動物（例えばヒト）に治療的効果を与えるタンパク質または抑制性核酸をコードする。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明の方法または使用は、異種ポリヌクレオチド配列を哺乳動物または哺乳動物の細胞内に送達または移入することを含み、これは、ベクターが前記異種ポリヌクレオチド配列およびフィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチド配列を転写させる発現調節因子と作動可能な様に連結されており、両者を合わせた長さが約３．０〜５．５Ｋｂ、約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂである、本発明のベクターゲノムを含んでなるウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を哺乳動物または哺乳動物の細胞に投与し、以て異種ポリヌクレオチド配列を哺乳動物または哺乳動物の細胞内に送達または移入することによる。
【０１１６】
さらに別の実施形態では、タンパク質の発現または機能を必要とする欠損哺乳動物を治療するための本発明の方法または使用は、ベクターが異種ポリヌクレオチド配列およびフィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなり、両者を合わせた長さが約３．０〜５．５Ｋｂ、約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂである、本発明のベクターゲノムを含んでなるウイルス（例えばＡＡＶ）粒子または複数のウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を提供すること、および該ウイルス粒子または複数のウイルス粒子を哺乳動物に投与することを含み、ここで異種ポリヌクレオチド配列は哺乳動物内で発現されるタンパク質をコードするか、または異種ポリヌクレオチド配列は哺乳動物の内因性タンパク質の発現を低下させる抑制性配列またはタンパク質をコードする。
【０１１７】
本発明の方法および使用は、いかなる治療的または有益な効果を及ぼす治療方法をも含む。種々の本発明の方法および使用にはさらに、例えば血液凝固時間の短縮、補充血液凝固因子の投与用量の低減等、疾患に起因するかこれに関連する一つ以上の有害な（例えば身体的な）症状、障害、不健康状態、疾病または合併症を阻害、低減または軽減することを含む。
【０１１８】
治療の治療的または有益な効果は、従って、特定の被験体に提供される客観的または主観的な測定、または検出が可能な改善、または効果を意味する。治療的または有益な効果は、疾病のすべてのまたは特定の有害な症状、障害、不健康状態、または合併症の完全な除去であり得るが、そうである必要はない。従って、満足のいく臨床的エンドポイントは、短期または長期間にわたって（時間、日、週または月等）、疾病に起因するかこれに関連する有害な症状、障害、不健康状態、または合併症に漸進的な改善または部分的低減が認められるか、または疾病に起因するかこれに関連する一つ以上の有害な症状、障害、不健康状態、または合併症の悪化または進行の阻害、減少、低減、抑制、予防、制限または制御が認められるときに達成される。
【０１１９】
本発明のベクターゲノム、ベクターゲノムを含む組換えウイルス粒子、方法および使用は、これらを必要とする被験体に十分量または有効量投与することができる。「有効量」または「十分量」とは、単回または複数回投与、単体または一つ以上の他の組成物（薬物のような治療的物質）、治療法、プロトコール、投薬計画との併用で、任意の期間（長期または短期）の検出可能な反応、または任意の測定可能または検出可能な程度の期待される、または望ましい結果、または有益な効果を任意の期間（例えば分、時、月、年または治癒まで）被験体に提供する量を意味する。
【０１２０】
治療的効果を発揮するベクターゲノムまたはウイルス粒子（例えばＡＡＶ）の用量、例えば体重１キログラム当たりのベクターゲノム量（ｖｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ／ｋｉｌｏｇｒａｍ、ｖｇ／ｋｇ）で表した用量は、投薬経路、治療的効果の発揮に要する異種ポリヌクレオチドの発現レベル、具体的な治療対象の疾患、ウイルスベクターに対する宿主免疫反応、異種ポリヌクレオチドまたは発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫反応、および発現されタンパク質の安定等のいくつかの要因に基づき変化するが、要因はこれらに限られるものではない。当業者は、上述の諸要因および他の要因に基づき、特定の疾患または障害を有する患者を治療するためのビリオンの用量範囲を容易に決定できる。一般的に、治療効果を発揮するには、用量は被験体の体重１キログラム当たりのベクターゲノム量（ｖｇ／ｋｇ）単位で、少なくとも１ｘ１０8以上、例えば１ｘ１０9、１ｘ１０10、１ｘ１０11、１ｘ１０12、１ｘ１０13または１ｘ１０14、またはそれを超える範囲になると考えられる。
【０１２１】
血友病を例にとると、治療効果を発揮するためには、一般的に言って、重度の疾患表現型を中程度に変えるためには、健常者でみられる血液凝固因子濃度の１％を超える血液凝固因子濃度が必要であるとされている。重度の表現型は、関節損傷および生死にかかわる出血を特徴とする。疾患の表現型を中程度から軽度に変えるためには、正常の５％を超える血液凝固因子濃度が必要であるとされている。そのような血友病被験体の治療については、所望の治療的効果を発揮するための典型的な用量は、被験体の体重１キログラム当たりのベクターゲノム量（ｖｇ／ｋｇ）単位で、少なくとも１ｘ１０10で、約１ｘ１０10から１ｘ１０101ｖｇ／ｋｇ、または約１ｘ１０11から１ｘ１０12ｖｇ／ｋｇである。
【０１２２】
治療（例えば緩和する、または治療的有用性または改善を提供する）のための「有効量」または「十分量」の用量は、通常、疾病の一つ、複数またはすべての有害な症状、悪影響または合併症、疾病に起因するかこれに関連する一つ以上の有害な症状、障害、不健康状態、病態、または合併症に対して、測定可能な程度の応答を提供するのに有効であるが、疾病の進行または悪化の減少、軽減、阻害、抑制、制限、または制御も満足のいく結果である。
【０１２３】
有効量または十分量は、単回投与で提供され得るが、そうである必要はなく、複数回投与を必要とするかもしれない。そして単独で、または別の組成物（例えば薬物）、治療、プロトコール、または投薬計画との併用で投与され得るが、そうである必要はない。例えば、投与量は、被験体の必要性、タイプ、状態、治療対象疾患の重症度、および（もしあれれば）治療の副作用に応じて比例的に増加されるかもしれない。さらに、二番目の組成物（例えば薬剤や薬物）、治療、プロトコール、または投薬計画と併用せずに単回または複数回で投与される場合には、有効量または十分量は有効または十分である必要はない。なぜなら、対象被験体において有効量または十分量と見なされるために、その様な用量に加えて追加的な用量、量または投与期間、または追加的な組成物（例えば薬剤や薬物）、治療、プロトコール、または投薬計画を含めることが可能であるからである。有効とみなされる量にはまた、血液凝固障害（例えば血友病ＡまたはＢ）の治療のための組換え凝固因子の投与の様に、別の治療、投薬計画、またはプロトコールの使用を減らすことにつながる量も含まれる。
【０１２４】
有効量または十分量は、個々のあらゆる治療を受けた被験体で、またはある特定の群または集団における大多数の治療を受けた被験体で有効である必要はない。有効量または十分量とは、群または一般集団ではなく、ある特定の被験体において有効であること、または十分であることを意味する。そのような方法では典型的であるが、一部の被験体が、ある特定の治療方法または使用に対して、より強い反応または弱い反応を示すこともあるし、まったく反応しないこともある。従って、適切な量は、治療される条件、所望の治療効果、および個々の被験体（例えば被験体内での生体利用効率、性別、年齢等）に依存する。
【０１２５】
「緩和する」という用語は、被験体の疾病またはその症状、またはその原因となる細胞の反応における検出可能または測定可能な改善を意味する。検出可能または測定可能な改善には、疾病、疾病に起因または随伴する合併症の発生、頻度、重症度、進行、または期間の主観的または客観的な軽少、低減、阻害、抑制、制限または制御、または疾病の症状または根底にある原因または影響の改善、または疾病の好転が含まれる。
【０１２６】
従って、成功した治療の結果は、「治療的効果」、または被験体における疾病の発生、頻度、重症度、進行、または期間、または疾病の一つ以上の有害な症状、根底にある原因、または影響を減少、低減、阻害、抑制、制限、制御または予防するという「有用性」に繋がる。疾患の一つ以上の原因または有害な症状に影響を与える治療方法または使用は、従って、有用であるとみなされる。例えば疾病またはその有害な症状の安定化など、悪化の減少または軽減もまた成功した治療の結果である。
【０１２７】
治療効果または改善は、従って、疾病、または疾病に関連する一つの、ほとんどの、もしくはすべての有害な症状、合併症、影響、または根底にある原因の完全な除去である必要はない。従って、満足のいくエンドポイントは、被験体の疾病に漸進的改善、または発生、頻度、重症度、進行、または期間の部分的な減少、低減、阻害、抑制、制限、制御または予防、または疾病の阻害または好転（例えば一つ以上の症状または合併症の安定化）が、短期または長期（時、日、週、月等）にわたって認められるときに達成される。治療効果または疾病の改善をもたらす可能性のある治療の様な方法または使用の有効性は、種々の方法によって確認することができる。
【０１２８】
本発明の方法および使用は、所望の治療的、有用、相加的、相乗的または相補的活性または効果を有する任意の化合物、作用物質、薬物、治療または他の治療計画またはプロトコールと併用することができる。併用組成物または治療の例としては、生物製剤（タンパク質）、作用物質および薬物の様な第二の活性物（ａｃｔｉｖｅｓ）が挙げられる。そのような生物製剤（タンパク質）、作用物質、薬物、治療および治療法は、本発明の他の方法または使用、例えば血液凝固障害を有する被験体を治療する治療方法の前、実質的に同時期、または後に投与または実行することができる。
【０１２９】
化合物、作用物質、薬物、治療または他の治療計画またはプロトコールは、複合組成物として、または別々に、例えば本発明のベクターゲノムまたはウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の送達または投与と同時に、連続してまたは順次に（前または後に）投与することができる。本発明は従って、本発明の方法または使用を、ここに記載または当業者に既知の任意の化合物、作用物質、薬物、治療計画、治療プロトコール、プロセス、療法、または組成物と併用する、組み合わせを提供する。化合物、作用物質、薬物、治療計画、治療プロトコール、プロセス、療法、または組成物は、本発明のベクターゲノムまたはウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の投与の前、実質的に同時に、または後に被験体に投与することができる。従って、非限定的な併用の実施形態としては、前記のまたは他の化合物、作用物質、薬物、治療計画、治療プロトコール、プロセス、療法または組成物が含まれる。
【０１３０】
本発明の方法および使用は、とりわけ、別の化合物、作用物質、薬物、治療計画、治療プロトコール、プロセスまたは療法の必要性または使用の減少に繋がる方法および使用を含む。例えば、血液凝固障害に対しては、本発明の方法または使用は、ある特定の被験体において、該被験者で不足または機能していない（異常または変異体）内因性凝固因子を補充するための組換え凝固因子タンパク質の投与の頻度低下または用量減少、または投与不要に繋がる場合、治療的有用性を有する。従って、本発明によれば、別の治療または治療法の必要性または使用を低減する方法および使用が提供される。
【０１３１】
本発明は、獣医学的適用を含み動物において有用である。従って適切な被験体としては、ヒトの様な哺乳動物およびヒト以外の哺乳動物が含まれる。「被験体」という用語は、動物、通常はヒト、ヒト以外の霊長目（サル、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカクザル）、ペット（犬や猫）、家畜（ニワトリやアヒルのような家禽、ウマ，ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）の様な哺乳動物を称する。ヒト被験体としては、胎児、新生児、幼児、年少者、および成人を含む。被験体には動物疾患モデルを含み、その例として、血液凝固疾患のマウスおよび他の動物のモデル、および当業者に既知の他のものがある。
【０１３２】
ここに記載の通り、本発明のベクターおよび該ベクターを含んでなるウイルス粒子は、タンパク質の量が不十分であるか機能的な遺伝子産物（タンパク質）が欠損している被験体にタンパク質を提供する、または疾病の原因となり得る異常な、機能が不完全な、または非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を生成する被験体に抑制性核酸またはタンパク質を提供するために用いることができる。従って、治療に適した被験体は、機能的な遺伝子産物（タンパク質）の量が不十分、または欠損している、または疾病の原因となり得る異常な、機能が不完全な、または非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生するか、その危険性を有する被験体である。本発明による治療に適した被験体はまた、疾病の原因となる異常または欠陥（突然変異）遺伝子産物（タンパク質）を産生するか、その危険のある被験体も含み、異常または欠陥（突然変異）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現、または機能の低下が疾病の治療、または一つ以上の症状の軽減または疾病の緩和に繋がると考えられる。従って、対象被験体には、疾病のタイプ、発症の時期または程度、進行、重症度、頻度、症状のタイプ、期間に関わらず、そのような欠損を有する被験体が含まれる。
【０１３３】
「予防（Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」およびその文法的に変化したものは、被験体への接触、投与または生体内送達が疾病の前に起こる方法を意味する。被験体への投与または生体内送達は、疾病に起因または関連する有害な症状、状態、合併症などが発生する前に実施することができる。例えば、スクリーニング（例えば遺伝子スクリーニング）を使用して、その被験体を本発明の方法および使用の候補として同定することができるが、被験体は疾病が現れていないかもしれない。従って、その様な被験体には、たとえ疾病の症状を示していなくても、機能的な遺伝子産物（タンパク質）が不十分な量であること、または欠損している、疾病の原因となり得る異常な、機能が不完全、または非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生する、および疾病の原因となり得る異常または欠陥（突然変異）遺伝子産物（タンパク質）のスクリーニングにより陽性と発見された被験体が含まれる。
【０１３４】
本発明の方法および使用は、全身、局部的（ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ）、または局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、または、例えば注射、点滴、経口（例えば経口摂取または吸入）または外用（例えば経皮）等の任意の経路による送達および投与を含む。そのような送達および投与には、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、頭蓋内、経皮（外用）、例えば経粘膜または経直腸などの非経口的送達および投与が含まれる。送達および投与経路の例としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹膜内（ｉ．ｐ．）、動脈内、筋肉内、非経口的、皮下、胸膜腔内、外用、皮膚（ｄｅｒｍａｌ）、皮内、経皮、および、例えば経粘膜、頭蓋内、脊椎内、経口（摂食）、粘膜、呼吸器官、鼻腔内、挿管、肺内、肺内点滴、頬部、舌下、血管内、クモ膜下腔内、腔内、イオン導入、眼内、点眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、光学的、腺内、臓器内、リンパ管内等の非経口的経路を含む。
【０１３５】
用量は、処置が予防的か治療的かどうか、処置の対象となる疾病の種類、発症、進行、重症度、頻度、期間または見込み、所望の臨床的エンドポイント、前処置または同時処置、被験体の全体的健康状態、年齢、性別、人種または免疫能、および当業者によって理解される他の要因によって変化し、左右される。投与の量、回数、頻度、または期間は、処置または治療の副作用、合併症、または他のリスク因子、および被験体の状態に応じて比例的に増加または減少させてよい。当業者は、治療的または予防的有用性を発揮するに十分な量の提供に要する用量およびタイミングに影響を及ぼす可能性のある因子を理解できる。
【０１３６】
ここに開示される本発明の方法および使用は、被験体が処置の対象となる疾患を有していると同定されるか、該疾患の一つ以上の症状を有するか、該疾患の一つ以上の症状を持たないがスクリーニングを受けここで規定されるように陽性であると同定されてから、１〜２、２〜４、４〜１２、１２〜２４または２４〜７２時間後に実施することができる。当然ながら、本発明の方法および使用は、被験体が処置の対象となる疾患を有していると同定されるか、該疾患の一つ以上の症状を示すか、またはスクリーニングを受けここで規定されるように陽性であると同定されてから、１〜７、７〜１４、１４〜２１、２１〜４８日後またはそれを超える日数、月数、年数を経た後にも実施することができる。
【０１３７】
組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子（例えばＡＡＶ）、および他の組成物、作用物質、薬物、生物製剤（タンパク質）は、医薬組成物、例えば医薬品として許容できる担体または賦形剤に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、とりわけ患者に生体内または生体外で投与および送達する際に有用である。
【０１３８】
ここで用いられるように「医薬品として許容できる」または「生理学的に許容できる」という用語は、投与、生体内送達や接触のための一つ以上の経路に適した生物学的に許容できる製剤、気体、液体、固体またはそれらの混合物を意味する。「医薬品として許容できる」または「生理学的に許容できる」成分は、生物学的または他の側面で有害でない物質で、例えば著しい望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく被験体に投与され得る物質である。従って、その様な医薬組成物は、例えばウイルスベクター、ウイルス粒子または形質転換細胞を被験体に投与する際に用いられ得る。
【０１３９】
前記組成物は、投薬または生体内での接触または送達に適した溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、乳剤（例えば油中水型または水中油型）、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、分散媒と懸濁媒、コーティング剤、等張剤、吸収促進剤、または吸収遅延剤等を含む。水性および非水性の溶媒、溶液および懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含むことがある。そのような医薬品として許容できる担体としては、錠剤（被覆錠や素錠）、カプセル（硬カプセル剤または軟カプセル剤）、微粒子、粉末、顆粒および結晶等がある。補助活性化合物（例えば保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。
【０１４０】
医薬組成物は、ここで規定される様に、または当業者に既知の様に、特定の投与または送達の経路に合わせて製剤することができる。従って、医薬組成物は、種々の経路による投与に適した担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【０１４１】
非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性および非水性の溶液、懸濁液または乳剤を含み、その調製物は通常無菌であり、対象被験体の血液と等張である場合がある。説明のための非限定的な例としては、水、生理食塩水、デキストロース、果糖、エタノール、動物性油、植物性油、または合成油が含まれる。
【０１４２】
経粘膜または経皮投与（例えば表面接触）のためには、浸透剤を医薬組成物内に含めることができる。浸透剤は当技術分野では既知であり、例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経皮投与のためには、当技術分野で一般に知られるように、活性成分はエアロゾル、スプレー、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ジェルまたはクリーム状に製剤することができる。皮膚に接触させるためには、医薬組成物は通常、軟膏、クリーム、ローション、錬り粉、ジェル、スプレー、エアロゾル、または油を含む。使用され得る担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮促進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４３】
共溶媒およびアジュバントを製剤に添加することがある。共溶媒の非限定的な例としては、水酸基または他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールの様なアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルの様なグリコール、グリセロール、ポリオキシエチレンアルコール、およびポリオキシエチレン脂肪酸エステルが挙げられる。アジュバントには例えば、ダイズレシチンおよびオレイン酸の様な界面活性剤、ソルビタン三オレイン酸の様なソルビタンエステル、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０１４４】
本発明のベクターゲノム、ウイルス粒子（例えばＡＡＶ）、および方法と使用に適した医薬組成物および送達システムは、当技術分野では既知である（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２００３）  第２０版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）  第１８版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  （１９９６）  第１２版，  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，  ＮＪ；  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （１９９３），  Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｐａ．；  Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  （２００１）  第１１版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ；  ａｎｄ  Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９８０），  Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  ２５３−３１５を参照）。
【０１４５】
ここで用いられる「単位投与量形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）」とは、処置の対象となる被験者への単位用量として適した物理的に個別化した単位を指し、個々の単位は、単回または複数回投与されると所望の効果が得られるように計算された、あらかじめ規定された量を含み、随意に医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビ−クルまたは増量剤）を含んでもよい。単位投与量形態は、例えば、アンプルおよびバイアルの内部に液体組成物または凍結乾燥状態の組成物として充填されてよい。例えば、投与または生体内送達の前に無菌の液体担体を加えることができる。個々の単位投与量形態は、多回投与キットまたは容器に含まれる場合がある。組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子（例えばＡＡＶ）、およびこれらの医薬組成物は、投与の簡便性と用量の均一性のために単一または複数の単位投与量形態でパッケージされ得る。
【０１４６】
本発明は、パッケージ材料および一つ以上のその構成要素を含むキットを提供する。キットは通常、これに含まれる構成要素の説明、またはそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での使用方法の説明を含むラベルまたは添付文書を含む。キットは、例えばベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムまたはウイルス粒子（例えばＡＡＶ）、および随意で別の化合物、作用物質、薬物または組成物等の第二の活性物の様な一群の構成要素を含む場合がある。
【０１４７】
キットは、キットの一つ以上の構成要素を収納する物理的構造物を指す。パッケージ材料は、構成要素を無菌状態に保つことができ、その様な目的に一般的に用いられる素材（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、アルミホイル、アンプル、バイアル、チューブ等）から成る。
【０１４８】
ラベルまたは添付文書は、キットに含まれる一つ以上の構成要素の識別情報、用量、および作用機序、薬物動態、薬物力学を含む活性成分の臨床薬理学を含む場合がある。ラベルまたは添付文書は、製造者、ロット番号、製造場所、製造日、および有効期限を特定する情報を含む場合がある。ラベルまたは添付文書は、製造者情報、ロット番号、製造場所と製造日を特定する情報を含む場合がある。ラベルまたは添付文書は、キットの構成要素の使用対象となる疾患に関する情報を含む場合がある。ラベルまたは添付文書は、一つ以上のキットの構成要素の使用について、臨床医または被験体向けの、方法、使用、治療プロトコールまたは治療計画の使用説明を含む。使用説明には、投与の量、頻度または期間、およびここに記載される方法、使用、治療プロトコール、または予防または治療計画を実行するための指示が含まれる場合がある。
【０１４９】
ラベルまたは添付文書は、予防または治療効果の様な、構成要素が提供し得る有用性に関する情報を含む場合がある。ラベルまたは添付文書は、特定の組成物の使用が適切でないと考えらえる状況に関する、被験体または臨床医に対する警告の様な潜在的に有害な副作用、合併症または反応に関する情報を含む場合がある。有害な副作用または合併症は、被験体が組成物と不適合な可能性のある一つ以上の他の薬物を摂取したか、将来摂取するか、または現在摂取している場合、または被験体が組成物と不適合と考えられる別の治療プロトコールまたは治療効果を受けたか、将来受けるか、または現在受けている場合にも起こり得るので、使用説明にはその様な不適合性に関する情報が含まれ得る。
【０１５０】
ラベルまたは添付文書は、「印刷物」を含み、それは例えば紙、厚紙、または構成要素、キットまたはパッケージ材料（例えば箱）とは別にまたはそれらに貼付され、またはキットの構成要素が入っているアンプル、チューブまたはバイアルに添付される。ラベルまたは添付文書は、バーコード印刷ラベル、ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープの様な光ディスク、ＲＡＭおよびＲＯＭの様な電気的記憶媒体、磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体、またはメモリーカードなどによるハイブリッドも含まれ得る。
【０１５１】
別途定義されない限り、ここで用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践および試験においては、ここで記載されるものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料はここで記載される。
【０１５２】
ここで引用されるすべての出願、出版物、特許および他の参照物、ＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用は、出典明記により全体に組み込まれる。相反する場合には、定義を含めて、明細書が優先する。
【０１５３】
ここで開示されるすべての特性は、どのような組み合わせにでも組み合わされるものとする。明細書で開示された個々の特性は、同じ、同等または類似の目的を果たす代替的特性で置換してよい。従って、別途明言されない限り、開示された特性（例えば組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、ベクターゲノムまたは組換えウイルス粒子（例えばＡＡＶ））は、同等または類似の特性の属の例である。
【０１５４】
ここで用いられる様に、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないと明らかでない限り、複数形の指示対象を含める。従って、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を参照する際には、複数のその様なポリヌクレオチドが含まれ、「ベクター（ａ  ｖｅｃｔｏｒ）」を参照する際には、複数のその様なベクターが含まれ、「ウイルス（ａ  ｖｉｒｕｓ）」または「粒子（ａ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」を参照する際には、複数のその様なビリオン／粒子が含まれる。
【０１５５】
ここで用いられる様に、すべての数値または数的範囲は、文脈からそうでないと明らかでない限り、その様な範囲内の整数および範囲内の小数値または整数値を含む。例えば、少なくとも８０％の同一性を参照する場合には、８１％、  ８２％、  ８３％、  ８４％、  ８５％、  ８６％、  ８７％、  ８８％、  ８９％、  ９０％、  ９１％等、  および  ８１．１％、  ８１．２％、  ８１．３％、  ８１．４％、  ８１．５％等、また  ８２．１％、  ８２．２％、  ８２．３％、  ８２．４％、  ８２．５％等を含む。
【０１５６】
ある数を上回るか下回る数を参照する際には、それぞれ参照される数を上回るか、下回る数はすべて含まれる。従って、例えば、１，０００を下回ると言及されるとき、９９９、９９８、９９７等、１に至るまでのすべての数が含まれ、１００を下回ると言及されるとき、９９、９８、９７等、１に至るまでのすべての数が含まれる。
【０１５７】
ここで用いられる様に、すべての数値または数的範囲は、文脈からそうでないと明らかでない限り、その様な範囲内の小数値と整数値、およびその様な範囲内の各整数の小数値を含む。従って、例えば、パーセンテージの範囲の様な数的範囲に言及する際、１〜１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。１〜５０の範囲に言及する際には、従って、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、５０を含めて５０に至るまで、および１．１、  １．２、  １．３、  １．４、  １．５等、２．１、  ２．２、  ２．３、  ２．４、  ２．５等を含む。
【０１５８】
連続した複数の範囲のシリーズに言及する際には、そのシリーズ内の異なる範囲の境界値を結合した範囲を含む。従って、例えば１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００または８，０００〜９，０００に言及する際は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００等を含む。
【０１５９】
本発明は、多くの実施形態および態様の記述に一般的に肯定的文体を用いて、ここに開示される。本発明は、物質または材料、方法のステップと条件、プロトコール、または手順等、特定の対象の全部または一部が除外された実施形態を特に含む。例えば本発明のある実施形態または態様では、材料および／または方法のステップが除外されている。従って、本発明はここでは一般的に本発明が含まないものは表示されないが、本発明で明示的に除外されていない態様は、前記にかかわらずここに開示されるものとする。
【０１６０】
本発明の多くの実施形態が記載されている。しかしながら、当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるために、本発明に種々の変更および修飾を行うことができる。従って、下記の例は説明を目的とするもので、請求する発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１
【０１６１】
この実施例は、種々の材料および方法の記述を含む。
【０１６２】
標準的ＰＣＲを、ＰＣＲ増幅の陽性対照としてＡＡＶベクターゲノム配列を含むプラスミッドＤＮＡ（図３、パネルＡとＢ）、精製ベクター調製物から抽出されたベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＡとＣ、それぞれベクターゲノムサイズが２．７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）、およびベクターをＤＮａｓｅ  Ｉで処理した後抽出されたベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＢとＤ、それぞれベクターゲノムサイズが２．７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）に対して実施した。導入遺伝子カセット内に位置するプライマー（図の赤丸）は、導入遺伝子カセット中の配列と、抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲまたはＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片中の配列とをカバーする一組のプライマーと対を構成し、それぞれのＰＣＲに用いられた。ＰＣＲ反応物は１％アガロース／ＥｔＢｒゲル電気泳動法によって解析された。
【０１６３】
図３のデータ、ＰＣＲ増幅の対照、プラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡがテンプレートとして用いられたとき、すべてのプライマー対（９プライマー対、パネルＡ  とＢ）についてＰＣＲ断片が生成し、本研究で使われたすべてのプライマー対がＰＣＲ産物を生成することが示唆された。すべてのＰＣＲ産物は、プラスミド配列とプライマーの位置に基づいて予測される期待されたサイズを示した。期待されたとおり、ＰＣＲ前にプラスミドサンプルがＤＮａｓｅ  Ｉで処理された場合には、ＰＣＲ増幅は認められなかった（パネルＣ）。
【０１６４】
図２のデータ。精製されたベクターから抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲが行われたときには、一組のプライマー対のみが実験でＰＣＲ産物を与えた（２．７Ｋｂの短いゲノムを有するベクターに６プライマー対（パネルＡとＢ）、４．２Ｋｂの長いゲノムを有するベクターに４プライマー対（パネルＣとＤ））。ＰＣＲ産物の最大のサイズ（ＰＣＲ増幅の外側のベクターゲノム配列と併せて）は、増幅されたＤＮＡの最大サイズがＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）と対応することを示した。
【０１６５】
ベクターからＤＮＡを抽出する前にベクター調製物を  ＤＮａｓｅ  Ｉで処理しても（図２、パネルＢとＤ）、ＰＣＲ増幅パターンに変化は認められなかった（図２、パネルＡとＣを、それぞれパネルＢとＤと比較）。すなわち、ＰＣＲ産物を生成するプライマー対の数とＰＣＲ産物のサイズに変化は無く、ＰＣＲによって増幅された配列（ベクターゲノムおよび隣接配列）は、ＤＮａｓｅから保護され、カプシド化されていることが示唆された。
【０１６６】
カプシド化されたＤＮＡのサイズ（例えばベクターゲノムサイズと併せたＤＮａｓｅ耐性プラスミドバックボーンＤＮＡ）は、短いゲノムを有するベクターと長いゲノムを有するベクターとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）にほぼ対応した。短いゲノムを有するベクター内にパッケージされたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含み、短いゲノムを有するベクターは、ＡＡＶウイルスの最大パッケージング許容限界までのサイズのプラスミド配列をパッケージすることが示された。
実施例２
【０１６７】
この実施例は、ＧＭＰ適合の製造工程を用いた組換えＡＡＶウイルスの生成および精製についての記述を含む。
【０１６８】
残存プラスミドＤＮＡのレベルは、以下のサイズ範囲の一本鎖標準導入遺伝子発現カセットを含む一連のＡＡＶ２ベクターにおいて評価された。すなわち、ｒＡＡＶ  Ａは２．  ７ｋｂ（野生型のサイズの５７％）、ｒＡＡＶ  Ｂは３．  ７ｋｂ（野生型の８３％）、およびｒＡＡＶ  Ｃは４．３ｋｂ（野生型の９１％）である。構築物毎に複数のロットを、同一のプロセスを用いて生成および精製した。ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスを必要としないトランスフェクションによって作出され、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｆｏｒｏｓ  ＳＯＨＳ）とｉｓＯＱＶＣｎｉｃ塩化セシウム超遠心の併用により精製された。
【０１６９】
残存プラスミドＤＮＡの濃度は、ベクター調製物１ｍｌ当たりのＫａｎＲ遺伝子コピー数として測定され、ＫａｎＲ（ＡｍｐＲ）のコピー数は完全長プラスミドのコピー数を示す（最悪の場合でも）と仮定して、ベクターゲノム（ｖｇ）の％、または１０＾９  ｖｇ当たりのｐｇとして表した。ベクターの力価および残存プラスミドＤＮＡの濃度は、導入遺伝子プラスミドのバックボーン内の導入遺伝子カセットの５’ＩＴＲの近傍に位置するＫａｎＲまたはＡｍｐＲ遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用い、ＴａｑＭａｎ技術を製造者のプロトコールに従って使用してリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ  ）により測定された。
【０１７０】
ＤＮａｓｅ実験では、１ｘ１０6コピーのベクターゲノムまたはプラスミドが、５ＵのＤＮａｓｅ  １によって消化された。増幅は、ＰＣＲ反応毎に５００コピー数のベクターゲノムまたはプラスミドを用いて標準的ＰＣＲによって行われた。短い導入遺伝子カセットを有するＡＡＶベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物は、ＤＮａｓｅに抵抗性であり、ベクタープラスミドのＩＴＲの近傍のプラスミドＤＮＡ断片がカプシド化されたことが示された。
【０１７１】
残存プラスミドＤＮＡは、ベクターサンプル中の標的ｑＰＣＲ増幅産物のコピー数の測定値に基づき、保守的方法により定量された。すなわち、コピー数にプラスミドのＭｒを乗じて算出された。導入遺伝子カセットサイズの関数としての不純物レベルを図１に要約した。評価により、ｒＡＡＶ  Ａ（サイズは２．７ｋｂ）は１６４  ｐｇ／１０9  ｖｇ（ｎ＝９）、ｒＡＡＶ  Ｂ（サイズは３．７ｋｂ）は４２．７  ｐｇ／１０9  ｖｇ（ｎ＝３２）、そして  ｒＡＡＶ  Ｃ（サイズは４．３  ｋｂ）は１４．０  ｐｇ／１０9  ｖｇ（ｎ＝２９）の残存プラスミドＤＮＡをそれぞれ含むことが示された。
【０１７２】
さらに、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲからの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、それはサイズ超過（＞４．７ｂｐ）のバックボーンを用いることで大幅に減少する（図５）。
実施例３
【０１７３】
この実施例は、サイズ超過バックボーンを用いずに調製されたベクターのＤＮＡ不純物を、サイズ超過バックボーンを用いて調製したベクターと比較した研究についての記述を含む。
【０１７４】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の一過性トランスフェクションによるベクター産生に基づき、以下に記述するベクター産生および精製方法に従い、一連の１２バッチの組換えＡＡＶベクターを同一の方法で調製した。
ＨＥＫ２９３細胞培養におけるベクター産生：
１．Ｔ７５フラスコ内でＨＥＫ２９３のマスター・セル・バンク細胞の培養を開始
２．細胞を約二個のＴ２２５フラスコに継代
３．細胞を約二個のローラーボトルに継代
４．細胞を約１０個のローラーボトルに継代
５．細胞を約１０２個のローラーボトルに継代
６．サイズ超過ベクターバックボーンを有するべクタープラスミド、またはサイズ超過ベクターバックボーンを有しないべクタープラスミドを含むプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクション
７．無血清培地に交換
ベクター精製（下流工程）：
８．ベクター含有細胞および培養液の回収
９．回収物のタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  （ＴＦＦ））（１００  ｋＤａ）による濃縮および透析ろ過
１０．濃縮された回収物の微細流動化
１１．微細流動化中間産物のろ過（０．６５  μｍ  ／  ０．２μｍ連続細孔径）
１２．イオン交換クロマトグラフィーによる精製
１３．塩化セシウム等密度勾配超遠心法による精製
１４．ＴＦＦ（１００  ｋＤａ）によるバッファー交換
１５．製剤化および０．２μｍろ過による精製バルクベクターの調製
１６．最終０．２μｍろ過、バイアルへの充填、仕上げによるバイアル充填された精製ベクターの調製
【０１７５】
サイズ超過バックボーンを含む生産プラスミドベクターを用いて調製された９バッチのベクター、およびサイズ超過バックボーンを含まない生産プラスミドベクターを用いて調製された３バッチのベクターの精製ベクターのサンプルを、精製されたベクター生産物の一部であることが意図されない（よって不純物である）アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子の残存レベルのｑＰＣＲ測定によって決定される残存宿主細胞プラスミドＤＮＡの測定に供した。この不純物の測定に用いた方法を以下に記す。
リアルタイムｑＰＣＲによる残存プラスミドＤＮＡ
【０１７６】
記述されたＴａｑＭａｎRリアルタイムｑＰＣＲ手法は、標的特異的Ｑ−ＰＣＲプライマーおよびプローブを用いて、ベクター生成に用いられた生産プラスミド内の特異的配列（ＡｍｐRまたはＫａｎR）を検出する。一つの標的がベクター製造で用いられたすべてのプラスミドに共通である場合には、総残存プラスミドは単回のｑＰＣＲ試験で決定された。ＡｍｐRおよびＫａｎRの両方がある特定のバッチの一つ以上の生産プラスミド内に存在する場合には、総残存プラスミドはそれぞれ別々の試験で決定されたＡｍｐRの残渣ＤＮＡとＫａｎRの残渣ＤＮＡの和として算出された。この例で報告される個々のバッチは、
１．被験物質および標準ベクターをＱ−ＰＣＲ希釈バッファーで希釈し、独立した３濃度の検体を調製した。
２．ウェル当たりのコピー数を検量線（Ｃｔ  ｖｓ．ＬＯＧ（各標準のコピー数）の傾きおよび縦軸切片に基づき算出する。検体（未知）＝１０  (Ct - 切片)/傾キ  。検量線の相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｒ2）は、各標準のＣｔ  ｖｓ．ＬＯＧ（各標準のコピー数）の平均値を反映する。
３．被験物質希釈物三検体と標準ベクター希釈物三検体のそれぞれのＰＣＲ増幅産物濃度、および平均濃度を算出した。
ＡｍｐRまたはＫａｎR  ［コピー数／ｍｌ］  ＝  平均  ［コピー数／ウェル  または５ｕｌ］  ｘ  ２００  ｘ  希釈率
４．想定される残存プラスミドＤＮＡコピーの平均サイズに基づき、コピー数濃度から質量（例えばｐｇ／ｍＬ）への変換を行ってもよい。
【０１７７】
図６に示される１２の定量結果で得られた残存プラスミドＤＮＡ不純物レベルにおいては、サイズ超過バックボーンを含まない（欠く）ベクタープラスミドを用いて調製されたベクター中の１０9ベクターゲノム当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均は３０１ｐｇで、これはサイズ超過バックボーンを用いて調製されたベクターで測定された１０9ｖｇ当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均である６０ｐｇと比較して、５倍高い値であった。従って、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンは、ウイルスベクターの調製において不純物の低減に使用することができる。
【図１】
2016517278.tif 000002
【図２Ａ】
2016517278.tif 000003
【図２Ｂ】
2016517278.tif 000004
【図２Ｃ】
2016517278.tif 000005
【図２Ｄ】
2016517278.tif 000006
【図３Ａ】
2016517278.tif 000007
【図３Ｂ】
2016517278.tif 000008
【図３Ｃ】
2016517278.tif 000009
【図４】
2016517278.tif 000010
【図５】
2016517278.tif 000011
【図６】
2016517278.tif 000012
【国際調査報告】
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2016517278.tif 000014
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