(57)【要約】  本発明は、タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）活性フラグメントとＣＤ１３７Ｌ細胞外領域とを有する二機能融合タンパク質を開示する。該タンパク質はヒト臍帯静脈内皮細胞増殖を抑制し、且つＴ細胞増殖の活性を共刺激し、血管生成抑制剤、各種腫瘍の関連疾患及び生物免疫調節薬物などの製造に用いることができる。
2016520053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とを有し、前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とが可撓性リンカーペプチドによって融合してなり、
前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８のうちから選択される１種であり、
前記リンカーペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６のうち選択される１種であり、
前記ＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０に示すアミノ酸配列のうちから選択される一種である、タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８のうちの１つのアミノ酸配列を有する、請求項１記載の二機能組換えタンパク質。
【請求項３】
タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子、リンカーペプチドをコードする遺伝子及びＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントをコードする遺伝子から構成され、
前記タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２のうち選択される一種であり、
前記リンカーペプチドをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０のうち選択される一種であり、
前記ＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４のうちから選択される一種である、請求項１記載の二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４のうちの１つのヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項３乃至４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列と比べて７０％以上の相同性を有する、タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質の遺伝子。
【請求項６】
（１）請求項３乃至５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を設計して得るステップと、
（２）発現ベクターを構築し、且つ発現ベクターを宿主細胞にトランスファーすることを含む、請求項３乃至５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含有する発現系を構築し、請求項１記載のタムスタチン活性とＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質を発現することができる組換え細胞を形成するステップと、
（３）ステップ（２）で形成された組換え細胞を培養するステップと、
（４）単離・精製して請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質を得るステップと、
を含む、請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の製造方法。
【請求項７】
前記発現系は原核発現系又は真核発現系であり、前記原核発現系は大腸菌発現系又はバチルス発現系から選択され、前記真核発現系は酵母発現系から選択される、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の、腫瘍微小環境における血管再生の抑制、腫瘍関連の各種疾患、機体免疫力の調節、Ｔ細胞増殖、並びに生物サイトカインの合成及び分泌薬物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体工学の技術分野に属する。本発明は腫瘍微小環境における血管再生の抑制及び適応免疫応答の活性化を有する二機能の融合タンパク質ＣＤ１３７Ｌ−タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）及びその遺伝子、並びに該遺伝子を含有する発現ベクター及び該ベクターによって形質転換された菌株に関し、更に該融合タンパク質の調製方法に関し、且つＣＤ１３７Ｌとタムスタチン二機能を有するタンパク質の、腫瘍微小血管再生及び腫瘍関連の疾患（例えば、黒色腫、直腸がん、肺がんなど）の抑制と適応免疫応答の活性化効果の薬物調製方面における適用に関し、更に投与方法方面の使用に関する（例えば、経口投与、噴霧投与方法などである。）。
【背景技術】
【０００２】
がんの生成は、多遺伝子が協力し、異なるシグナルが関わる過程である。本質的には、がんは分子疾患の一種である。従来、標的が単一である分子治療方法は多くの欠点が徐々に現れ、マルチ標的、マルチメカニズムで併用薬物療法はよい治療効果が示される。
【０００３】
１９７１年、ハーバード大学のＦｏｌｋｍａｎ教授は、「腫瘍の成長及び転移は微小環境における血管再生に依存する」という学説を提出した。該理論により、腫瘍微小環境における血管再生を抑制し、腫瘍の栄養と酸素供給を切断することで腫瘍細胞の成長及び転移を抑制することができる。該学説はその発表から世界範囲において大量の実験室及び臨床的データに支持されたため、近来の腫瘍治療分野における新しい方法になっている。タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）は血管基底膜ＩＶ型コラーゲンα３鎖カルボキシルＣ末端から由来する腫瘍血管再生抑制因子であり、２４４個のアミノ酸から構成する。
【０００４】
全ての血管基底膜において、ＩＶ型コラーゲンで形成された３次元網状骨格構造は、サポート作用を発揮する主成分であり、細胞の粘着、移動、分化及び成長を促進することができる。それは６つの独特の遺伝子によりそれぞれコードされて６本の鎖α１〜α６を産生し、且つ異なる或いは同じα鎖で三量体を形成し、更に網状構造を形成する。ＩＶ型コラーゲンの各本のα３鎖はいずれも３つの部分の機能ドメイン（７Ｓ構造ドメイン、三重螺旋ドメイン、非コラーゲンペプチドＮＣ１構造ドメイン）から構成され、糸球体、肺胞毛細血管、蝸牛、水晶体嚢、卵巣及び睾丸の基底膜に分布する。
【０００５】
新生血管の形成は腫瘍成長及び転移の決定的なステップであり、一連の複雑な過程を含む。腫瘍組織には低酸素であることから、血管に刺激因子を形成させて合成を増加し、従って腫瘍組織の微小環境における新生血管の生成を刺激する。近来、研究により、タムスタチンは腫瘍血管における内皮細胞タンパク質の合成を特異性に抑制することができ、内皮細胞のアポトーシスを引き起こし、血管生成を抑制するため、腫瘍の成長及び転移を抑制する。また、タムスタチンは腫瘍細胞に直接的に作用し、且つその増殖を抑制する特性を有する。その作用メカニズムはインテグリン受容体αｖβ３と結合することで、腫瘍微小環境における血管内皮細胞タンパク質の合成を特異的に抑制し、それにより血管再生を遮断し、腫瘍の成長及び転移を抑制する。
【０００６】
現在、学界において抗腫瘍免疫について認識の合意を達成している。即ち、ヒトと動物の体内には、悪性腫瘍に対してある程度の免疫反応がある。腫瘍患者の免疫系の細胞は腫瘍細胞発現の抗原、例えば、組織分化抗原、癌胎児性抗原及び突然変異遺伝子の生成物などを識別することができる。腫瘍抗原識別及び免疫応答メカニズムについての理解に伴い、研究により、アクセサリー分子が免疫共刺激シグナルを提供することで抗腫瘍免疫応答を向上させることができる。腫瘍抗原特異性Ｔ細胞は共刺激を必要として第１抗原シグナルがエフェクター細胞を刺激する機能を補助し、そのため、共刺激分子の補助治療は悪性腫瘍についての免疫反応を調節することに用いられる。
【０００７】
共刺激分子は免疫応答において極めて重要な役割を発揮する。一般的に、Ｔリンパ球を活性化するには２つのシグナルの参加が必要であり、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）が抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，ＡＰＣ）伝導を受ける主要組織適合性複合体−抗原ペプチドシグナル（第１シグナル）、及び細胞膜表面粘着分子が提供した共刺激信号（即ち、第２シグナル）である。Ｔ細胞媒介を強化した抗腫瘍免疫の重要な方法の１つは、Ｔリンパ球活性化に必要である共刺激シグナルを提供することである。ＣＤ１３７及びそのリガンドＣＤ１３７Ｌは、ＣＤ２８／Ｂ７以外の新たに発見されたもう一対の重要なＴ細胞共刺激シグナル分子である。
【０００８】
構成に応じて共刺激分子を二種に分けることができる。即ち、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＮＦＲ）と免疫グロブリンスーパーファミリーである。ＣＤ１３７は腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである。それは細胞増殖、分化、アポトーシスの調節において重要な作用を発揮する。そのリガンドＣＤ１３７ＬもＴＮＦファミリーのメンバーであり、細胞表面ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、その他のＴＦファミリーと類似するＣ端アミノ酸を有する。コーダＣＤ１３７Ｌの遺伝子は１９ｐ３．３に位置し、その生成物は２５４個アミノ酸であり、その内、細胞質ドメインが２８アミノ酸であり、膜貫通ドメインが２１アミノ酸であり、細胞外領域が２０５アミノ酸である。ＣＤ１３７Ｌは、まずＧｏｏｄｗｉｎらが発現スクリーニング技術を利用してマウス胸腺腫細胞から分離して抽出し、その後にヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンから分離して得られる。
【０００９】
ＣＤ１３７とそのリガンドＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用（ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ）は、Ｔ細胞活性化への重要な役割を果たすことが既に十分に認識されている。マウスとヒトＴ細胞のいずれにおいても、ＣＤ３抗体（第１シグナル）の存在する場合に、ＣＤ１３７はＴ細胞増殖を誘導し、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α）の合成及び活性化細胞の生存期間の延長が観察される。共刺激シグナルは、抗原特異性とエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の数量を向上させることで効果機能を増強することができる。ＣＤ３抗体シグナルが欠如するときに、ＣＤ１３７分子の刺激はＴ細胞の機能を変更することができず、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの相互作用は、提供されたのが共刺激シグナルの一種のみであることが示される。
【００１０】
ＫｉｍなどのＴ細胞及びサイトカインの研究により、ＣＤ１３７モノクローナル抗体が媒介した抗腫瘍免疫は、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の共同参加に依存することが示される。ＣＤ１３７がＦ−ｋＢの活性化を媒介することで、ｂｃｌ−ｘＬとｂｆｌ−１分子との発現を上方制御し、ＣＤ８＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存期間を延長し、かつその増殖を促進する。Ｍｅｌｅｒｏらは活性化型マウス由来ＣＤ１３７モノクローナル抗体を使用してＣＤ１３７標的免疫治療を実行した。その結果、ＣＤ１３７モノクローナル抗体は、マウス体内における接種済みのＰ８１５固形腫瘍を除去することができることが示された。活性化型ＣＤ１３７モノクローナル抗体の抗腫瘍効果と一致し、ＣＤ１３７Ｌは細胞毒性Ｔリンパ球効果（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）及び抗腫瘍効果を同時活性化することができる。ＣＤ１３７Ｌ−／−マウスは、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ系がＴ細胞が媒介した、ウイルスと腫瘍免疫応答において発揮した重要な作用を説明する。ＣＤ１３７又はＣＤ１３７Ｌ欠陥型マウスの研究により、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌの共刺激作用は移植片対宿主病、Ｔ細胞の抗ウイルス細胞性応答にとって重要であることが示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌが提供した刺激シグナルは、ＣＤ２８／Ｂ７分子と協同してＴ細胞を更に活性化させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と生存を維持することができる。タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）は腫瘍血管の生成を効果的に抑制することができ、腫瘍細胞の生存、転移に対して遅延作用を発揮する。そのため、本発明における融合タンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌは、血管生成の抑制と抗腫瘍免疫応答の強化の２つの方面において腫瘍の成長及び転移を共同に抑制することができ、従って、単一治療による薬物に対する耐性を避け、腫瘍治療患者に新しい戦略を提供する。
【００１２】
本発明は、短い可撓性リンカーペプチドでタムスタチン抗血管新生活性フラグメントとＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質とを、Ｔ細胞免疫の強化と抗血管新生の二機能・二重標的を同時に有する分子に合成する。かつ本発明においてタムスタチンが異なる関連活性部位（タムスタチン１の第４５位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン２の第６０位乃至第１３２位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン３の第６０位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン７の第７４位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント）とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質アミノ酸配列（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ４の第５０位乃至第２４０位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位のアミノ酸の結合フラグメント、模式図は図２に示す）が選択され、リンカーペプチドで接続し、原核又は真核発現系によって調製され、この方法は調製が簡単であり、及び完全長タムスタチンと完全長ＣＤ１３７Ｌの副作用の問題を回避し、本発明は血管生成抑製剤、腫瘍関連の各種疾患（例えば、黒色腫、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎がん、膀胱がんなど）、網膜症、細胞増殖、生物サイトカイン合成及び分泌、機体免疫力の調製などの薬物の製造、及び経口或いは注射などの関連剤形薬物の調製においてよい適用の見通し及び市場価値を有する。
【００１３】
本発明の目的は、タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ機能を同時に有するタンパク質を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ機能を有するタンパク質の製造方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ機能を有するタンパク質及びその遺伝子の腫瘍学関連疾患（例えば、黒色腫、直腸がん、肺がんなど）の治療及び投与方法方面（例えば、経口投与、噴霧投与方法など）における使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の技術方案は、具体的には以下の通りである。
タムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質であって、タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列を有し、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とタムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とは可撓性リンカーペプチドで融合されてなり、前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８に示すアミノ酸配列のうちから選択される１種であり、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０に示すアミノ酸配列のうちから選択される１種である。
【００１８】
前記リンカーペプチドアミノ酸配列は、本分野の通常の技術手段を採用して設計され、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６のうちの１種が好ましい。
【００１９】
本発明に関わる二機能組換えタンパク質アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８のうちの１種が好ましく、前記組換えタンパク質の構成模式図は図１に示される。
【００２０】
本発明は、前記タムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子を更に提供し、ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントをコードする遺伝子、リンカーペプチドをコードする遺伝子、及びタムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子を含む。尚、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４のうちから選択される１種であり、前記タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２のうちから選択される１種である。
【００２１】
前記リンカーペプチドをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０のうちの１種が好ましい。
【００２２】
前記組換えタンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４のうちの１種のヌクレオチド配列を有することが好ましい。
【００２３】
本発明は、前記組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌをコードする遺伝子を更に提供し、前記ヌクレオチド配列と比べて７０％以上の配列同一性を有し、本発明に係る組換えタンパク質や、その保持性変異ポリペプチド、その活性フラグメント、その活性誘導体をコードすることができる。
【００２４】
本発明は、前記タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の調製方法を更に提供し、
（１）本発明に記載のタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質をコードする遺伝子配列を設計して得るステップと、
（２）前記の遺伝子配列の発現系を構築することで発現ベクターを構築し、かつ発現ベクターを宿主細胞にトランスファーすることを含む、本発明に記載のタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質を発現することができる組換え細胞を形成するステップと、
（３）ステップ（２）で形成された組換え細胞を培養するステップと、
（４）単離・精製して本発明に記載のタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質を得るステップと、を含む。
【００２５】
前記発現系は、原核発現系又は真核発現系を選択することが可能であり、原核発現系が大腸菌発現系又は枯草菌発現系であることが好ましく、この２つの発現系は普遍的に本発明に関わる組換えタンパク質の発現に適応される。尚、大腸菌系における発現ベクターがｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２２ｂであることが好ましく、枯草菌発現系における発現ベクターがｐＰ４３であることが好ましく、真核発現系が酵母発現系であることが好ましく、発現ベクターがｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺａＡであることが好ましく、酵母宿主細胞がＧＳ１１５又はＳＭＤ１１６８であることが好ましい。
【００２６】
前記製造方法の好ましい技術案の１つは、前記タムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌをコードする遺伝子をＮｄｅＩ及びＮｈｅＩで二重消化し、その後、発現ベクターｐＥＴ−１１ａの相応消化部位に接続し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、液体培養エンジニアリング細菌によってインクルージョン（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）形式の目標タンパク質を獲得する。インクルージョンに対して希釈リフォールディングする方法によって、即ち、低濃度尿素を含有する溶液でインクルージョンタンパク質を複数回洗浄し、その後、８Ｍ尿素を含有する変性溶液で５０℃にてインクルージョンを溶解し、最後に０．４ＭＬ−Ａｒｇを含有するリフォールディング溶液でインクルージョン（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を希釈リフォールディングし（目標生成物の純度が８０％以上に達する)、本発明に記載の組換えタンパク質を得ることである。
【００２７】
前記製造方法の好ましい技術案の１つは、前記タムスタチン活性とＣＤ１３７Ｌ活性とを有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌをコードする遺伝子をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、その後、発現ベクターｐＰ４３の対応する消化部位で接続し、更に枯草菌ＷＢ８００へエレクトロポレーションし、液体培養エンジニアリング細菌によって細胞外まで分泌し、溶解可能な形式の目標タンパク質を獲得する。ＤＥＡＥ陰イオン交換の方法を利用して精製を行い、純度が８０％以上に達し、本発明に記載の組換えタンパク質が得られることである。
【００２８】
前記調製方法の好ましい技術案の１つは、前記タムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌをコードする遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで二重消化し、その後、発現ベクターｐＰＩＣＺａＡの相応消化部位で接続し、ピキア酵母ＧＳ１１５をエレクトロポレーションし、液体培養エンジニアリング細菌によって細胞外に分泌し、溶解可能な形式の目標タンパク質を獲得する。ＤＥＡＥ陰イオン交換の方法によって精製を行い、純度が９０％以上に達し、本発明に記載の組換えタンパク質が得られることである。
【００２９】
本発明は、前記タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の、腫瘍微小環境における血管再生及び腫瘍関連疾患（例えば、黒色腫、直腸がん、肺がんなど）の抑制、有機体免疫力の調節、Ｔ細胞増殖、並びに生物サイトカインの合成及び分泌のための薬物の調製における使用を更に提供する。
【００３０】
本発明は、前記タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の遺伝子の、腫瘍微小環境における血管再生及び腫瘍関連疾患（例えば、、黒色腫、直腸がん、肺がんなど）の抑制、機体免疫力の調節、Ｔ細胞増殖、並びに生物サイトカインの合成及び分泌の薬物製造における使用を更に提供する。
【００３１】
前記使用において、本発明に記載の組換えタンパク質は単独に使用してもよく、或いは薬物組合せ物の形式で使用してもよい。薬物組合せ物は、活性成分である本発明に記載の組換えタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む。薬物組合せ物は、０．１〜９９．９％重量パーセントの、活性成分である本発明の組換えタンパク質を有することが好ましい。「薬学的に許容される担体」は、本発明の組換えタンパク質の薬学活性を破壊せず、かつその有効用量、即ち、薬学的に許容される担体の作用を発揮することができる時の用量は人体に対して毒性を有しない。
【００３２】
「薬学的に許容される担体」は、イオン交換材料、酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ)（例えば、ｄ−ビタミンＥポリエチレン・グリコール１０００コハク酸エステル）、トゥイーン又はその他の類似ポリマー媒体などの薬物製造用の界面活性剤、血清タンパク質（例えば、ヒト血清タンパク質）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、アミノ酢酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸部分グリセリド混合物、水、塩、電解質（例えば、硫酸塩プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、シリカゲル、ケイ酸マグネシウムなどを含むが、それに限定されない。ポリビニルピロリドン、セルロース系材料、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸エステル、エチレン−ポリオキシエチレン−ブロック重合体及びラノリン、シクロデキストリン（例えば、α−、β−、γ−シクロデキストリン）若しくはその他の化学修飾された誘導体（例えば、２−及び３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのヒドロキシアルキルシクロデキストリン）、又はその他の可溶性誘導体は、いずれも本発明の組換えタンパク質の薬物送達を促進することに用いられる。
【００３３】
その他の薬用可能な補助材料、例えば、充填剤（例えば、無水ラクトース、澱粉、乳糖粒子及びグルコース）、接着剤（例えば、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチル澱粉ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース及び架橋ＰＶＰ)、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、吸収促進剤、香味剤、甘味剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、溶媒、ソリュタイザー及び着色剤なども本発明の薬物組合せ物に加えることができる。
【００３４】
前記薬物組合せ物は限定されず、使用した何らかの剤形を選択することができる。例えば、経口投与形式（例えば、錠剤、カプセル、顆粒剤、粉末剤又は液体製剤）又は非経口投与形式（例えば、注射、局所製品又は坐剤）が挙げられ、それらは通常の方法又は非通常の方法（例えば、リポソームなど）で調製することもできる。
【００３５】
本発明に記載される組換えタンパク質を治療剤として使用する場合、その使用量は成人に対して約０．０１ｍｇ乃至１ｇ／毎日の範囲内であり、それはそれぞれの患者の年齢、性別、体重及び症状程度に基づいて決められ、かつ日用量は複数個の用量に分けられる。
【００３６】
本発明に記載の組換えタンパク質には、既存の技術分野の通常の方法により、本発明に記載の組換えタンパク質を修飾した修飾タンパク質が更に含まれる。
【００３７】
タンパク質及びペプチド系薬物に対して、有機体内のアミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼは、一般的な直鎖ペプチドの両端から段階的な切断分解を容易に行うことができ、直鎖ペプチドが分解されることが多い。ポリペプチド修飾はペプチド鎖の主鎖構造と側鎖遺伝子を変更する重要な手段であり、大量の文献により、修飾されたポリペプチド薬物によって免疫原性を明らかに低下させ、副作用を低減させることができ、水溶性を増加させ、体内の作用時間を延長し、その生物分布状況などを変更し、明らかに薬物の治療効果を改善することが示される。
【００３８】
本発明に記載の組換えタンパク質の慣用修飾方法は、中間残基の修飾、アミノ酸置換、グリコシル化修飾及びＰＥＧ修飾を含み、基本原理は、ポリペプチド分子の相対分子量と立体障害を増加することで、ポリペプチド加水分解酵素への安定性を向上させ、糸球体の濾過作用を低下させる。ペプチド鎖におけるいくつかのアミノ酸を置換することは、酵素分解を低減してポリペプチド薬物の半減期を延長するもう１つの方式であり、置換対象は、通常、ペプチド鎖における酵素分解し易いアミノ酸である。具体的には、組換えタンパク質の中間残基に対してグリコシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、ニトロ化、スルホン化を行い、或いはＰＥＧ修飾又は結合タンパク質を接続することができる。
【００３９】
グリコシル化修飾の中で最も慣用されるのがＮ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化である。グリコシル化修飾ペプチドでは、本発明の組換えタンパク質中のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＴｙｒ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ残基における酸素と糖とが接続し、或いは本発明に記載の組換えタンパク質のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のアスパラギン側鎖のアミド窒素と糖とが接続することが好ましい。
【００４０】
リン酸化修飾ペプチドでは、本発明に記載の組換えタンパク質中のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＴｙｒ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ部位にリン酸化を行うことが好ましい。
【００４１】
メチル化修飾ペプチドは、側鎖メチル化修飾ペプチド及びＮ末端メチル化修飾ペプチドを含み、側鎖メチル化は本発明に記載の組換えタンパク質アミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＬｙｓ、Ｔｙｒ又はＡｒｇ側鎖にメチル化を行うことが好ましく、例えば、Ｌｙｓ（Ｆｏｒ），Ｌｙｓ（Ｍｅ），Ｌｙｓ（Ｍｅ）２，Ｌｙｓ（Ｍｅ）３，Ａｒｇ（Ｍｅ）２ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ，Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ），Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）である。
【００４２】
アセチル化修飾ペプチドは、本発明に記載の組換えタンパク質中のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＬｙｓ又はＳｅｒ側鎖にアセチル化を行うことが好ましく、例えば、Ｓｅｒ（Ａｃ）又はＬｙｓ（Ａｃ）である。
【００４３】
ニトロ化又はスルホン化修飾ペプチドは、本発明に記載の組換えタンパク質中のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＴｙｒ側鎖にニトロ化又はスルホン化を行うことが好ましく、Ｔｙｒ（３−ＮＯ２）、Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ２）。
【００４４】
中間残基のＰＥＧ修飾は、本発明に記載の組換えタンパク質中のアミノ酸配列のうちの１個又は複数個のＬｙｓ側鎖のアミノ基にＰＥＧ修飾を行うことが好ましく、ＰＥＧ分子量が２０００〜１００００であることが好ましい。
【００４５】
或いは、本発明に記載の組換えタンパク質又はその前記修飾タンパク質のアミノ酸配列のうちの１種又は複数種のアミノ酸を、対応するアミノ酸誘導体又は特殊なアミノ酸に置換し、例えば、アラニンをβ−アラニン、ホモフェニルアラニン又はナフチルアラニンに置換し、プロリンをヒドロキシプロリンに置換し、ロイシンをノルロイシンに置換し、バリンをノルバリンに置換し、トレオニンをアロトレオニンに置換し、イソロイシンをアロイソロイシンに置換し、アスパラギンを２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノースアスパラギン（Ａｓｎ（ＧｌｃＮａｃ（Ａｃ）３−β−Ｄ））に置換し、リジン置をＬｙｓ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）に置換する。
【００４６】
或いは、本発明に記載の組換えタンパク質又はその前記修飾タンパク質中のアミノ酸配列のうちの１種又は複数種のアミノ酸を、対応するＤ型アミノ酸に置換する。
【００４７】
本発明において前記タムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ７２６３２．１及びＮＰ＿００３８０２．１）は、通常の方法を使用して全遺伝子合成、ＰＣＲ方法又は両者の結合した方法で獲得する。尚、ＣＤ１３７Ｌ完全長配列ベクターパターンは文献（Ｗａｎｇ  ｓｈｕｚｈｅｎ．Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｍａｒ;３９（３）：４７１−６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０２９５−０１１−１０４５−１．）に開示された方法を参照して調製して得られる。
【００４８】
本発明では、前記タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有するタンパク質の遺伝子をコードする発現ベクターを構築し、即ち、通常のＰＣＲ技術及び消化、接続によって、タムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌ細胞外領域遺伝子フラグメントをＮｄｅＩ及びＮｈｅＩで二重消化した後に、原核発現ベクターｐＥＴ１１ａの対応消化部位の間に接続し、配列決定によって検証して正確な発現ベクターが得られる。
【００４９】
本発明では、前記発現ベクターを含有する遺伝子エンジニアリング細菌を構築し、即ち、目標遺伝子でＢＬ２１を形質転換し、液体培地で発現目的タンパク質をスクリーニングする陽性エンジニアリング細菌を少量に培養する。
【００５０】
本発明は、タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有するタンパク質を獲得する方法を提供し、該方法は、陽性エンジニアリング細菌株を培養して発酵し、かつ常温にて誘導してそれがタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有するタンパク質を効果的に発現し、さらに菌体を収集し、高圧で細胞を破砕し、遠心分離して得られた菌体沈殿を変性溶解及び希釈リフォールディングすることにより、タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有する組換えタンパク質を獲得する。
【００５１】
本発明は、タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有する組換えタンパク質への活性測定が、ヒト臍帯静脈内皮細胞活性試験（ＨＵＶＥＣ  ａｓｓａｙ）及びマウスＴ細胞活性化試験を実行することで行われる。尚、ヒト臍帯静脈内皮細胞活性試験結果により、内皮細胞の増殖に対して、明らかな抑制作用を有することが示されている。マウスＴ細胞活性化試験により、前記組換えタンパク質はＣＤ１３７Ｌの生物活性を維持することができ、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体と協同してＴ細胞の増殖を刺激することができることが示されている。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の有益的な効果は以下の通りである。
本発明により、原核発現系を採用してタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ細胞外領域活性フラグメントで組換えタンパク質を発現し、タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌの両活性を同時に有するタンパク質を生成できることが示される。本発明を採用して生成したタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌ組換えタンパク質（タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を同時に有するタンパク質）は、発現効率が高く、発現量が大きく、発現周期が短く、精製し易いメリットを有する。それと同時に、本発明が提供した融合タンパク質は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖に対して明らかな抑制作用を有し、かつ用量依存性を有し、かつ抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体と協同してマウスＴ細胞の増殖を刺激することができる。そのため、本発明はタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ組換えタンパク質の量産に対して新規、安全である方法を提供し、新世代の抗腫瘍薬物の更なる研究及び開発に対して強固な基礎を構築し、製薬産業において広い適用の見通しを有する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明のタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有する組換えタンパク質の構成模式図である。可撓性リンカーペプチドアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．７６のうちから選択される１種である。
【図２】ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７）、ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８）、ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９）及びＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０）のＣＤ１３７Ｌアミノ酸完全長配列にある領域模式図である。
【図３】アミノ酸配列、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８に示すような組換えタンパク質タムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌの大腸菌における発現である。レーン１〜２４がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５〜４８にそれぞれ対応する。
【図４】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）の枯草菌における発現である。レーン１〜８がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８にそれぞれ対応する。
【図５】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６）の酵母菌における発現である。レーン１〜１６がタンパク質アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２にそれぞれ対応する。
【図６】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルが希釈リフォールディングされた後に行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果図である。尚、第１レーンサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５である。第２レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６である。第３レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７である。第４レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７である。第５レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８である。第６レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１である。第７と第１０レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３である。第８と第１１レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４である。第９と第１２レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８である。第１３と第１５レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５である。第１４と第１６レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６である。第１７と第１８レーンのサンプルアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７である。
【図７】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルのヒト臍帯静脈内皮細胞増殖への影響である。
【図８】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルのマウスＴリンパ球増殖への影響である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、図面及び実施例を結合して本発明を更に説明する。
【００５５】
本発明は、合計でタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する２４種の二機能組換えタンパク質を設計し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に示される配列であり、コードするアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８に示される配列である。該組のタンパク質はタムスタチン１の第４５位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン２の第６０位乃至第１３２位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン３の第６０位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、又はタムスタチン７の第７４位乃至第９８位のアミノ酸フラグメントと、ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質アミノ酸配列（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位のアミノ酸の結合フラグメント）のうちの１種と、を有し、両者が可撓性リンカーペプチドで接続・融合してなり、但し、リンカーペプチドアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９乃至ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６に示されている。本発明は、前記タムスタチン活性フラグメント遺伝子及びリンカーペプチド遺伝子を接続したヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９４に示す）の５’端と３’にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化部位を設計し、上海捷瑞生体工程有限会社で完全合成され、かつ相応消化部位を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続され、組換えベクターが上海捷瑞生体工程有限会社で提供される。
【００５６】
各種の発現ベクターはノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社から購入し、Ｔｏｐ１０及びＢＬ２１（ＤＥ３）菌株はインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から購入した。ｐＭＤ１８−Ｔベクター、溶液I（商品番号：Ｄ１０３Ａ）、逆転写酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＮｄｅＩ、ＮｈｅＩなどの制限エンドヌクレアーゼはいずれも、タカラ（ＴＡＫＡＲＡ）社から購入した。プライマーの合成及びヌクレオチド配列の配列決定は上海英駿生物技術有限公司で完了された。変性溶解及び希釈リフォールディングで用いた尿素（分析純度）は、南京試剤化学品有限公司から購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞株は南京凱基生物科技発展有限会社から購入した。マウスＴ細胞増殖試験で使用したＥａｓｙＳｅｐＴＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔは、ステムセル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）社から購入した。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体はサンタクルツ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社から購入した。その他の試剤はいずれも国産分析純度（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ）である。
【００５７】
実施例１：タムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌの大腸菌発現系における発現
【００５８】
１．発現系の構築
合計でタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する２４種の二機能組換えタンパク質を設計した。該タンパク質は、タムスタチン１／タムスタチン２／タムスタチン３／タムスタチン７と、ＣＤ１３７Ｌ１／ＣＤ１３７Ｌ４／ＣＤ１３７Ｌ５／ＣＤ１３７Ｌ６とを、リンカーペプチドで融合してなる（図１）。尚、ＣＤ１３７Ｌ１、ＣＤ１３７Ｌ４、ＣＤ１３７Ｌ５、ＣＤ１３７Ｌ６はそれぞれＣＤ１３７Ｌ完全長アミノ酸配列の４６−２５４位のアミノ酸、５０−２４０位のアミノ酸、８３−２５４位のアミノ酸、並びに４６−８５位のアミノ酸及び１６７−２５４位のアミノ酸から由来する（図２）。該タンパク質ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に示される配列であり、コードするアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８に示される配列であり、リンカーペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６に示される配列のうちから選択される１種である。
【００５９】
ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ４の第５０位乃至第２４０位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４に示すようになっており、ＰＣＲ方法を採用して増幅することにより得られる。尚、ＣＤ１３７Ｌ完全長配列パターンは文献（Ｗａｎｇ  ｓｈｕｚｈｅｎ．Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｍａｒ；３９(３)：４７１−６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０２９５−０１１−１０４５−１．）に開示された方法を参照して調製することにより得られる。
【００６０】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１の上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９５）とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１の下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９６）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１）遺伝子フラグメントを得て（この場合、該遺伝子の両端の消化部位はそれぞれ５’ＢａｍＨＩと３’ＮｏｔＩである）、該生成物をｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、消化接続などの通常の分子生物学的手段によって、ＣＤ１３７Ｌ１遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出し、捷瑞会社で完全合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９４）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップまで、完全な融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７、下流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９８を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子を増幅させ、生成物の５’消化部位がＮｈｅＩであり、生成物の３’消化部位がＮｄｅＩであり、最終に発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【００６１】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２の上流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９９）とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２の下流プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１００）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２）遺伝子フラグメントを得て（この場合、該遺伝子の両端の消化部位がそれぞれ５’ＢａｍＨＩ及び３’ＮｏｔＩである)、且つ該生成物をｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、消化接続などの通常の分子生物学手段によって、ＣＤ１３７Ｌ５遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出して捷瑞会社で完全合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップまで、完全な融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６上流プライマー１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６下流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０５を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子を増幅させ、生成物の５’消化部位がＮｈｅＩであり、生成物の３’消化部位がＮｄｅＩであり、最終に発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【００６２】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の上流プライマー１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０６）とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の下流プライマー１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０７）をプライマーとし、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の上流プライマー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０８）とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の下流プライマー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１０９）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３）の２つの遺伝子フラグメントを得て、アガロース電気泳動ゲル泳動により該２つのセクション遺伝子を回収した。その後、分子生物学ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ技術を使用して、回収された２つのセクションの遺伝子をパターンとし、ＣＤ１３７Ｌ６の上流プライマー１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０７）とＣＤ１３７Ｌ６の下流プライマー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０９）をプライマーとし、最終的なＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３）フラグメント（両端の消化部位が５’ＢａｍＨＩと３’ＮｏｔＩ) を増幅させ、且つｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３）遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出し、上海捷瑞会社で合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップで、完全的な融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７−１８）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８上流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８下流プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１１３を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）を増幅し、且つ最終的な発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【００６３】
前記実験操作過程は関したプライマーは、以下の通りである。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１の上流プライマー
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＣ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である。）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１の下流プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位である。）
融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２)の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＣＣＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２の上流プライマー
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２の下流プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩダイジェスト部位である)
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３−ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の上流プライマー１
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の下流プライマー１
５’−ＣＧＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の上流プライマー２
５’−ＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３の下流プライマー２
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
【００６４】
前記ＰＣＲ増幅条件はいずれも以下の通りである。
９４℃  ５分
９４℃  １分，６０℃  ３０秒，７２℃  ３０秒，３０サイクル
７２℃  ５分
４℃∞，ホールド
【００６５】
ＰＣＲ生成物を回収した後に、ｐＭＤ−１８Ｔベクターと接続し、体系がｐΜＤ−１８Ｔ１μＬであり、目標フラグメント４μＬ、溶液１５μＬ、接続反応条件が１６℃であり、反応時間が１６時間である。化学塩化カルシウム法で大腸菌Ｔｏｐ１０菌株を形質転換した。アンピシリンを含有するＬＢ固体培地で１２時間培養した後、単一クローンを選別し、プラスミドを抽出した後、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩとＮｈｅＩで二重消化検証を行った。消化検証が正確である細菌コロニーを上海英駿生物技術有限会社に移送して配列決定し、遺伝子配列の正確性を確定した。配列決定が正確である標的フラグメントと原核発現ベクターｐＥＴ１１ａとを接続し、反応系がＴ４リガーゼ１０×緩衝液１μＬ、ｐΕＴ１１ａ１μＬ、目標遺伝子７μＬ、Ｔ４リガーゼ１μＬであり、反応条件が１６℃、１６時間である。二重消化検証された後、大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
【００６６】
組換えタンパク質の発現
スーパークリーンベンチにおいて、１００ｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に１ｍＬの前記保存された、目標遺伝子プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を１００ｍＬ菌液に加入し、振動台に置いて、３７℃、２５０ｒｐｍの条件で終夜培養した。活性化された種培地を無菌ＬＢ培地に接種し、ＯＤ６０００値が０．９である時にＩＰＴＧを加え、誘導剤濃度が１００μＭであり、３７℃にて８時間培養した後、室温にて回転速度１２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して菌を回収した。菌体湿重量１ｇに１００ｍＬ  ＰＢＳを加えて吹いて懸濁し、高圧細胞破砕装置に加えて細胞を分解し、流出液を回収し、４℃、１２０００ｒｐｍで、３０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、残った沈殿についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の操作プロセスは、以下の通りである。
１）各管にそれぞれ適量な分解菌体を取ってＥＰ管に沈殿させ、ｄｄＨ２Ｏ１ｍＬで洗浄し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、さらにｄｄＨ２Ｏ１００μＬで再懸濁させた。
２）２０μＬ再懸濁菌液を取って５×ＳＰＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液５μＬを加え、５分間沸騰水浴させた。
３）マニュアル＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ＞を参照して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、５％濃縮ゲル、１２％分離ゲルを製造し、１×Ｔｒｉ−Ｇｌｙタンパク質電気泳動緩衝液を入れた。
４）それぞれ２０μＬ上澄みのローディングを取り、電気泳動を行い、パラメータが定電圧９０Ｖであり、３０分後に１３０Ｖ、１時間である。電気泳動が終了した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを取り除き、１−２時間クーマシーブリリアントブルー染色した。取り出した後に脱イオン水で３回洗い出し、脱色液に終夜浸漬した。
５）タンパク質電気泳動の結果は図面を参照する。陰性対照と比べて、誘導された後に、陽性菌株は明らかに発現される。具体的には、発現情況が図３に示されることを参照する。図に示すように、以上の前記タンパク質はいずれも大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現された。
【００６８】
３．組換えタンパク質の精製
インクルージョンのリフォールディング研究
前記方法を採用して高圧破砕された菌体沈殿を回収し、洗浄液Ａ及びＢで繰り返し２回洗浄し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄みを廃棄し、回収して準備した。洗浄液Ａの処方は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２Ｍ尿素、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。洗浄液Ｂの処方は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２Ｍ尿素、５ｍＭＥＤＴＡである。洗浄した後に、溶解液（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、８Ｍ尿素）で５０℃にて終夜変性した。完全に変性した後、４℃クロマトグラフカラムにて変性溶液を恒流装置によってリフォールディング溶液に加え、過程全体をゆっくり攪拌しながら１２時間持続した。リフォールディング溶液の処方は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、２Ｍ尿素、０．４−０．６Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ、１ｍＭＥＤＴＡである。得られた試料を含有するリフォールディング溶液を濃縮し、置換した。濃縮に使用した装置は、ミルポール（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）社のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮管であり、４５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃において行った。それと同時に濃縮液をｐＨ７．４、１００ｍＭＰＢＳ緩衝液に置換した。終体積が１ｍＬである。４℃にて保存して準備した（図６)。計算により、リフォールディング後の目標生成物の純度が８０％以上に達し、図により、以上のような変性インクルージョン（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）タンパク質リフォールディング情況が良好である。
【００６９】
実施例２：タムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌの枯草菌発現系における発現
【００７０】
１．発現系の構築
実施例１において構築された、完全な組換えタンパク質の遺伝子配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−２４）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターをパターンとし、異なるプライマー（５’ＰｓｔＩ、３’ＨｉｎｄＩＩＩ）を設計してＰＣＲを行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続された異なる融合タンパク質の遺伝子を増幅し、且つ完全なフラグメントを発現ベクターｐＰ４３に接続し（接続実験前にＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで該ベクターを二重消化する必要である）。ＰＣＲ及びダイジェスト接続などの操作ステップは、実施例１における融合タンパク質の遺伝子の構築部分と同じである。発現ベクターの構築が完了した後に、エレクトロポレーション操作を行い（具体的には、方法はＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーション装置の使用説明を参照する）、枯草菌発現系ＷＢ８００組換え菌株の構築を完了した。
【００７１】
２．組換えタンパク質の発現
種菌液の培養は、スーパークリーンベンチにおいて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地に、それぞれ１０μＬの前記保存された、目標遺伝子プラスミドを含有した枯草菌ＷＢ８００菌株を５ｍＬ試験管培地に加え、振動台において、３７℃、２５０ｒｐｍの条件で１２時間培養することにより行った。組換えＷＢ８００は発酵して、活性化された種菌液を１０％の接種量で５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する無菌２×ＹＴ培地に接種し、ｐＨ７．０、３７℃にて９６時間培養した後に、４℃にて低温で遠心分離して上澄みを収集し、かつサンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。
【００７２】
３．組換えタンパク質の精製
組換えタンパク質の精製は、ＧＥ会社のＤＥＡＥ陰イオン交換法を採用して該目標タンパク質を精製することにより行った。精製緩衝液がＰＢＳリン酸塩緩衝液であり、ｐＨ８．５である。
【００７３】
実施例３：タムスタチン活性とＣＤ１３７Ｌ活性とを有する組換えタンパク質タムスタチン−ＣＤ１３７Ｌの酵母発現系における発現
【００７４】
１．発現系の構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに取り込まれている異なる融合タンパク質の遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜２４）をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで二重消化し、且つｐＰＩＣ９Ｋに接続して、ベクターの構築作業を完了した。その後、エレクトロポレーション操作を行い（具体的な方法はＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーション装置の使用説明を参照する）、ピキア酵母ＧＳ１１５組換え菌株の構築を完了した。
【００７５】
２．組換えタンパク質の発現
ＢＭＧＹで菌体を集め、ＢＭＭＹで誘導発現する戦略によって発酵して目標生成物を獲得した。第１日目、前記方法に従って構築された発現菌株をＹＰＤ種培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。第２日目、適量の種子培養液をＢＭＧＹ培地に転移し、４８時間成長させ、ＯＤ６００が１０であるときに、培地をＢＭＭＹに変換し、９６時間誘導発現し、１２,０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して上澄みを収集し、かつサンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。
【００７６】
３．組換えタンパク質の精製
組換えタンパク質の精製は、ＧＥ会社のＤＥＡＥ陰イオンカラムを採用してイオン交換精製分析により行った。リン酸塩緩衝系でｐＨが８．５であり、生成物の純度が８０％以上に達することができる。
【００７７】
実施例４：タムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能の組換えタンパク質のヒト臍帯静脈内皮細胞増殖への影響。
【００７８】
１）細胞培養：１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ/ｍＬペニシリン及び１００Ｕ/ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度のインキュベーターでヒト臍帯静脈内皮細胞系（ＨＵＶＥＣ）を培養し、２〜３日、細胞が壁に蔓延った後に継代し、対数増殖期細胞を取って実験に用いた。
【００７９】
２）ＭＴＴ比色法測定：対数増殖期細胞を取り、孔ごとに５０００個の細胞を９６ウェル培養板に接種し、各孔に細胞懸濁液１００Ｌを加入し、細胞培養箱において１２時間培養し、細胞が壁に蔓延った後に１００μＬの異なる濃度のタンパク質サンプルを加入し、陽性対照がＴＰ−４７０であり、陰性対照組に同一体積のＰＢＳを加入し、各組に３個の複数孔を設置し、それぞれ４８ｈ処理した。培養終了４時間前に９６ウェル培養板における各孔に５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ液２０μＬを加入し、細胞インキュベーターにおいて続いて４時間培養した後に、ゆっくり培地を取り除き、その後に各孔にＤＭＳＯ１５０μＬを加入し、１０分間振動させ、青紫色沈殿を十分に溶解させた。マイクロプレートリーダーで吸光値（Ａ４９０)を測定した。
【００８０】
実験結果を図７に示す。図中、「ＴＰ−４７０」が陽性対照、「１１５」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）、「１５５」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）、「１１６」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）、「２１５」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７）、「２５５」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）、「２５６」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１）、「７１１」がタムスタチン７−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９）、「７２１」がタムスタチン７−リンカーペプチド２−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０）、「７３１」がタムスタチン７−リンカーペプチド３−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１）、「７４１」がタムスタチン７−リンカーペプチド４−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２）、「７５１」がタムスタチン７−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）、「７６１」がタムスタチン７−リンカーペプチド６−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４）、「７７１」がタムスタチン７−リンカーペプチド７−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５）、「７８１」がタムスタチン７−リンカーペプチド８−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６）、「１１４」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３）、「２１４」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４）、「３１４」がタムスタチン３−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５）、「１５４」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６）、「２５４」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７）、「３５４」がタムスタチン３−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８）である。前記結果により、選択された代表的なタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、ヒト臍帯静脈内皮細胞に対して抑制効果を示し、なお、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４1、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１の抑制効果は、陽性対照より高いことが示される。
【００８１】
実施例５：タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ二機能を有する組換えタンパク質のマウス脾臓Ｔリンパ球増殖への影響。
【００８２】
ステムセル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）社の「ＥａｓｙＳｅｐ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ」のキット説明書に従って操作した。マウス脾臓から分離することにより、精製されたＴ細胞集団を得た。ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を７．５ｇ／ｍＬで９６ウェルプレートを被覆し、４℃にて終夜し、第２日目に分離したマウス脾臓Ｔ細胞１００ｕｌ／孔（１０５個）を加え、合計で４個の実験組、即ち、１）何らかの抗体刺激を添加しないＴ細胞ブランク組（培地＋Ｔ細胞)、２）抗ＣＤ３（７．５μｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍＬ）と結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８）、３）抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体と抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とが結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８／ａｎｔｉ−ＣＤ１３７ｍＡｂ）、４）融合タンパク質サンプルがそれぞれ抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８／タムスタチン１−ＣＤ１３７Ｌ）に分け、各組に３個の複数孔を設置した。９２時間培養した後、孔毎に「アラマーブルー」（ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ）１０μＬを加え、１２時間後に吸光度Ａ５７０値を測定し、Ａ６００を参照とした。実験結果を図８に示す。「１１５」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）、「１５５」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）、「１１６」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）、「２１５」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７）、「２５５」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）、「２５６」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１）、「７１１」がタムスタチン７−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９）、「７２１」がタムスタチン７−リンカーペプチド２−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０）、「７３１」がタムスタチン７−リンカーペプチド３−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１）、「７４１」がタムスタチン７−リンカーペプチド４−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２）、「７５１」がタムスタチン７−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）、「７６１」がタムスタチン７−リンカーペプチド６−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４）、「７７１」がタムスタチン７−リンカーペプチド７−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５）、「７８１」がタムスタチン７−リンカーペプチド８−ＣＤ１３７Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６）、「１１４」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３）、「２１４」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４）、「３１４」がタムスタチン３−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５）、「１５４」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６）、「２５４���がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７）、「３５４」がタムスタチン３−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８）である。結果により、選択した代表的なタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、終濃度が２μｇ／ｍＬである場合に、Ｔ細胞への増殖作用が「ＣＤ３＋ＣＤ２８」共刺激組より明らかに高く、ＣＤ１３７ＬとＣＤ２８とが協同効果を有することが証明される。それによって、本発明で獲得した代表的なタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、Ｔ細胞増殖を共刺激する良好な生物学活性を有することが示される。
【００８３】
以上に記述した実施例は、本発明の実施方法を説明するためのものであり、具体的な好ましい実施方法を合わせて本発明をより詳しく説明するものであり、本発明の具体的な実施はこれらの説明のみに限定されている、と理解することができない。かつ、実施例は異なる活性部位のタムスタチン遺伝子のみを選択してＣＤ１３７Ｌ細胞外領域と接続され、本発明におけるタムスタチン遺伝子がＣＤ１３７Ｌ細胞外領域のみに接続される、と理解することができず、それはその他のタンパク質又はポリペプチドと接続し、或いはその他のタンパク質の遺伝子と接続しない。当業者としては、本発明の技術思想を逸脱しない前提で、実施例に対し行われたいくつかの簡単な推定又は置換は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【図２】
2016520053.tif 000003
【図３】
2016520053.tif 000004
【図４】
2016520053.tif 000005
【図５】
2016520053.tif 000006
【図６】
2016520053.tif 000007
【図１】
2016520053.tif 000008
【図７】
2016520053.tif 000009
【図８】
2016520053.tif 000010
【配列表】
2016520053000001.app
【国際調査報告】
2016520053.tif 000011
2016520053.tif 000012
2016520053.tif 000013
2016520053.tif 000014
2016520053.tif 000015