(57)【要約】  癌細胞特異的活性及び抗腫瘍免疫が充填された代謝阻害剤の構築のための標的分子スキャホールドが記載される。トリフェニルホスホニウムカチオンなどのミトコンドリア標的化部分の、生分解性リンカーによる組み込みは、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）などの特定の代謝阻害剤のミトコンドリア標的化を可能にする。
2016523926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを有する化合物：
【化１】
2016523926.tif 000016
（式中、
ＴＣは、ミトコンドリア標的化部分であり；
ＩＭは、阻害剤部分であり；
ｌは、１から１０であり；
ｍは、１から３であり；
ｎは、０から２０であり；
ｐは、１から６４であり；
Ｘ１は、−ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；
Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；
Ｘ３は、−ＣＯ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＲ３−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−１，２，３−トリアゾール−であり；且つ
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、互いに独立に、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｃ１〜６アルキル、又は−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキルである）
又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
ｍが、１、２、又は３であり、Ｘ１が、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり；Ｘ２が、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ３が、−ＣＯ２−であり；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ−Ｈであり；ｐが１であり；ｌが１から５であり；且つ、ｎが０から３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｐが、１、２、又は３であり、Ｘ１が、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり；Ｘ２が、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ３が、−ＣＯ２−であり；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ−Ｈであり；ｍが１であり；ｌが１から５であり；且つ、ｎが０から３である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４】
ＴＣが、カチオン性ローダミン部分又はＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ＴＣがトリフェニホスホニウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ＩＭが、ロニダミン、ジクロロアセタート、コハク酸α−トコフェリル、ジャスモン酸メチル、ベツリン酸、及びレスベラトロール、Ａ−３８５３５８、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、ＡＴ−１０１、２−アミノ−６−ブロモ−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈ−クロメン−３−カルボキシラート（ＨＡ１４−１）、ＬＤＨ−Ａ  ｓｈＲＮＡ、オルリスタット、ＳＢ−２０４９９０、ソラフェンＡ、４−（Ｎ−（ｓ−グルタチオニルアセタート）アミノフェニルアルセノキシド（ＧＳＡＯ）、クロドロネート、ＰＫ１１１９５、メナジオン、β−ラパコン、ＣＤ４３７、ｇａｍｉｔｒｉｎｉｂｓ、８−（２−クロロ−３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−フルオロ−９−（ペンタ−４−ニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵ２４Ｆｃｌ）、（８−（６−ブロモベンゾ［ｄ］［１，３，］ジオキシル−５−イルチオ）−９−（ペンタ−４−ニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵＨ５８）、８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３，］ジオキシル−５−イルチオ）−９−（３−イソプロピルアミノ）プロピル−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵＨ７１）、ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ、２−メトキシエストラジオール、テトラチオモリブデート、ブチオニンスルホキシイミン、ジメチルアミノ−パルテノリド、パルテノリド、イメキソン、マガホジピール、メナジオン、モテキサフィンガドリニウム、ＰＥＩＴＣ、エレスコモール（ＳＴＡ−４７８３）、オール・トランスレチノイン酸、６−［３−（１−アダマンチル）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ナフタレンカルボン酸、Ｅ−３−（４’−ヒドロキシ−３’−アダマンチルビフェニル−４イル）アクリル酸、３−ブロモピルビン酸、酪酸、２−デオキシＤ−グルコース、三酸化亜ヒ酸、又はベツリン酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ＩＭがＤＣＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
式ＩＩを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物：
【化２】
2016523926.tif 000017
（式中、
ｌは、１から１０であり；
ｍは、１から３であり；
ｎは、０から２０であり；
ｐは、１から６４であり；
Ｘ１は、−ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；
Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；且つ
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、互いに独立に、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｃ１〜６アルキル、又は−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキルである）。
【請求項９】
ｍが、１、２、又は３であり、Ｘ１が、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり、且つＸ２が、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ−Ｈであり；ｐが１であり；ｌが１から５であり；且つ、ｎが０から３である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ｐが、１、２、又は３であり、Ｘ１が、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり、且つＸ２が、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ−Ｈであり；ｍが１であり；ｌが１から５であり；且つ、ｎが０から３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ｍが、１、２、又は３であり、Ｘ１が−ＣＨ２−であり、且つＸ２が−ＣＯＮＨ−であり、且つ、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ−Ｈであり；ｐが１であり；ｌが１から３であり；且つ、ｎが０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
ｐが、１、２、又は３であり、Ｘ１が−ＣＨ２−であり、且つＸ２は−ＣＯＮＨ−であり、且つ、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ−Ｈであり；ｍが１であり；ｌが１から３であり；且つ、ｎが０である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
式ＩＶ又はＶを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物：
【化３】
2016523926.tif 000018
（式中、ｐは１から６４であり、且つＲ１はＣ１〜３アルキル又はＨである）。
【請求項１４】
前記化合物が
【化４】
2016523926.tif 000019
又はその薬学的に許容できる塩である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
４から６４のトリフェニルホスフェニル部分及び４から６４のジクロロアセチル部分を含む化合物。
【請求項１６】
以下の構造を有する請求項１５に記載の化合物。
【化５】
2016523926.tif 000020
【請求項１７】
以下の構造を有する請求項１５に記載の化合物。
【化６】
2016523926.tif 000021
【請求項１８】
以下の構造を有する請求項１５に記載の化合物。
【化７】
2016523926.tif 000022
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項の記載の化合物及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項２０】
疎水性コア、前記コアを取り囲む親水性外層、及び請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物を含むナノ粒子。
【請求項２１】
前記コアが、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）を含む、請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記親水性外層がポリエチレングリコールを含み、前記コアと結合している、請求項２０又は２１に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
対象の癌を治療又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物若しくは組成物又は請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のナノ粒子を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記癌が、前立腺癌、肺、乳房、脳、卵巣、リンパ腫、白血病、頭頚部、膵臓、及び子宮頚部、結腸及び直腸、子宮内膜、食道、肝臓、陰茎、皮膚−メラノーマ、皮膚−非メラノーマ、胃、精巣、膣、子宮、外陰部、副鼻腔癌、口腔咽頭、及び喉頭癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第二の化合物又は組成物を投与することをさらに含み、前記第二の化合物又は組成物が抗癌剤を含む、請求項２３又は２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
有効量の電離放射線を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象の腫瘍細胞を殺す方法であって、前記腫瘍細胞を、有効量の請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物若しくは組成物又は請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の承認
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成ＧＭ０９２３７８及び国防総省により与えられた助成Ｗ８１ＸＷＨ−１２−１−０４０６の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリア活性の刺激及び癌細胞に特徴的なアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）生成経路の変更は、抗癌のための戦略である（Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３：３０９−３１４，１９５６；Ｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：４５９−４６５，２００４；Ｓａｍｕｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：２１６３−２１６６，２００９；Ｇａｔｅｎｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：８９１−８９９，２００４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：８９２７−８９３０，２００６；Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：６７１−６７８，２０１２．）。ジクロロアセタート（ＤＣＡ）分子は、癌化学療法の分野で大きな役割を果たす可能性を有する（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１：３７−５１，２００７；Ｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：２２１９９−２２２０４，２００９；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１２０：２５３−２６０，２０１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４６：４７４−４７５，２００７．）。代謝スイッチを利用することにより、ＤＣＡは、ミトコンドリアのピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）の活性を低下させることにより、異常な癌細胞代謝を好気性解糖からグルコース酸化へと逆転させるが、ＰＤＫ１は、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換し酸化的リン酸化を促進するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）を負に調節する（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ＤＣＡは、癌細胞の高いミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を低下させ、正常細胞ではなく悪性細胞においてミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）を増加させる（同上）。しかし、ＤＣＡの腫瘍細胞への侵入及び標的とする細胞小器官、細胞のミトコンドリア内部での局在化のための効果的な機構がないため、治療上異常に高いＤＣＡ投与量が、腫瘍成長の抑制に必要となる。
【０００３】
ある研究は、正常細胞に毒性効果が全くない濃度で選択的な腫瘍細胞の死を誘起するには、非常に高濃度のＤＣＡが必要とされることを示した（Ｓｔｏｃｋｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２７：２５１０−２５１９，２０１０）。生理的条件において、経口投与又は静脈内投与されたＤＣＡはイオン化され、受動的拡散によっては細胞膜を通過できない。生理学的に適切な投与量のＤＣＡ並びに他の治療剤を癌細胞に導入できる方法及び組成物が必要とされている。アニオン形態のＤＣＡが、負に帯電した内部ミトコンドリア膜（ＩＭＭ）を横切り、ミトコンドリアマトリックス内のＰＤＫ１に接近できるような方法及び組成物も必要とされている。そのような方法及び組成物があれば、抗癌療法において非常に有用であろう。さらに、そのような方法及び組成物は、ＤＣＡ以外の他の治療剤にも適用可能であろうが、それらはやはりミトコンドリアへの標的化送達から利益を得るだろう。本明細書に開示される組成物及び方法は、これら及び他のニーズに対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で具体化され広く記載される開示された化合物、組成物、及び方法の目的により、開示される主題は、組成物並びに組成物を製造及び使用する方法に関する。他の態様において、式Ｉを有する化合物：
【化１】
2016523926.tif 000003
（式中、「ＴＣ」は、ミトコンドリア標的化部分であり；「ＩＭ」は阻害剤部分であり；ｌは１から１０であり；ｍは１から３であり；ｎは０から２０であり；ｐは１から６４であり；Ｘ１は、−ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ３は、対象とする特定の阻害剤の利用可能な部位に応じて好適なリンカー、例えば、−ＣＯ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＲ３−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−１，２，３−トリアゾール−であり；かつ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、互いに独立に、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｃ１〜６アルキル、又は−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキルである）又はその薬学的に許容できる塩が本明細書に開示される。式ＩＩ〜Ｖなど、式Ｉの特定の亜属が本明細書に開示される。標的化部分ＴＣ及び連結するアルキル及びＸ１がポリラクチドグリコリドポリマーにより置き換えられている、式ＶＩの化合物も開示される。開示された化合物を含む組成物及びナノ粒子も本明細書に開示される。開示された化合物、組成物、及びナノ粒子を使用して、癌などの種々の病態を治療する方法、又は癌細胞を阻害する方法も開示されている。
【０００５】
開示された主題の追加の利点は、一部は以下の説明に述べられ、一部は説明から明らかであるか、又は以下に記載される態様の実施により習得できる。以下に記載の利点は、添付される特許請求の範囲に特に指摘される要素及び組み合わせにより認識され、達成されるだろう。上記の全般的な説明及び以下の詳細な説明がどちらも例示と説明のために過ぎず、限定的でないことを理解されたい。
【０００６】
添付される図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するが、本発明のいくつかの態様を説明し、説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、化合物ＭＩＴＯ−ＤＣＡ及びその作用機序を示す絵（ｃａｒｔｏｏｎ）である。
【図２】図２は、２つのミトコンドリア標的ＤＣＡアナログ、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ及びＴＰＰ−ＤＣＡの化学合成を示すスキームである。
【図３】図３は、ＪＣ−１アッセイによるΔΨｍの変化を示す画像を集めたものである。図は、５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡによるＰＣ３細胞の処理が、Ｎａ−ＤＣＡ又はＴＰＰ−ＤＣＡに比べてこれらの細胞においてΔΨｍの崩壊を劇的に起こしたことを示す。細胞は、１５分間ＪＣ−１により染色された。緑色蛍光、脱分極された（Ｊ−モノマー）ミトコンドリア；赤色蛍光、過分極された（Ｊ−集合体）。ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる、赤橙色に染められたミトコンドリア（大きな負のΔΨｍ）の消失及び蛍光の緑に染められたミトコンドリア（ΔΨｍの喪失）の増加により観察される膜電位のシフトは、ＴＰＰ−ＤＣＡ又はＮａ−ＤＣＡにより観察されるものに比べて大きい。全４群中のミトコンドリアからのＪＣ−１緑／赤の比率の結果は右側に示される。
【図４】図４は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる癌細胞中のアポトーシスの効率的で選択的な誘導を示すグラフを集めたものである。パネルＡは、解糖性の高いＰＣａＰＣ３及びＤＵ１４５細胞が、解糖性の低いＰＣａＬＮＣａＰ細胞に比べて、ＭＩＴＯ−ＤＣＡに異なるように応答することを示す；ＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、及びＮａ−ＤＣＡは、ｈＭＳＣ細胞において毒性を全く有さない。９６ウェルプレート上の細胞は、異なる濃度のＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、及びＮａ−ＤＣＡに１２時間、生存率がＭＴＴアッセイにより評価された。代表的な実験データが図に示され、ＩＣ５０値が３つの独立した実験から計算された。パネルＢは、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（５０μＭ）、ＴＰＰ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、及びＮａ−ＤＣＡ（１５０μＭ）により１６時間処理した時の、ＭＳＣ及びＰＣ３細胞におけるアポトーシス検出のためにアネキシンＶ−ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ／ＰＩ染色を利用したＦＡＣＳ分析のデータを示す。右下の四半分中の細胞は、アネキシン陽性／ＰＩ陰性の、早期アポトーシス細胞を示す。右上の四半分中の細胞は、アネキシン陽性／ＰＩ陽性の、後期アポトーシス又は壊死細胞を示す。
【図５】図５は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡがＰＣａ細胞代謝の変更を誘発したことを示すグラフを集めたものである。パネルＡは、１５０μＭのＮａ−ＤＣＡ、１５０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡにより３７℃で６時間処理した後のＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞中の細胞内乳酸レベルを示す。パネルＢは、６０μＭのＮａ−ＤＣＡ、６０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び２０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡにより３７℃で３時間処理した後の、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞中の乳酸の変動に関連した細胞内ＡＴＰ含量の変化を示す。
【図６】図６は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる乳酸減少が抗腫瘍免疫を刺激することを示すグラフを集めたものである。パネルＡは、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（５０μＭ）、ＴＰＰ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、及びＮａ−ＤＣＡ（１５０μＭ）による２４時間の処理時の、ＰＣ３細胞（０．５×１０６細胞／ｍＬ）によるサイトカイン産生を示す。パネルＢは、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、及びＮａ−ＤＣＡにより処理されたＰＣ３細胞からの上清により活性化されたＢＭＤＣが、癌細胞上清とは異なるサイトカイン分泌プロファイルを示すことを示す。ＢＭＤＣは、異なるコンストラクトにより処理された１００μＬのＰＣ３癌細胞上清の存在下で、０．５×１０６細胞／ｍＬで培養された。対照として、ＢＭＤＣは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）により刺激された。２４時間後、ＢＭＤＣ培養物上清は収集され、ＥＬＩＳＡにより試験されて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γの濃度が決定された。全データは平均±Ｓ．Ｄ（標準偏差）で示される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．００を利用して実施された。テューキーの事後検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを利用して、群の間の有意差を特定した。
【図７】図７は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により測定されたＭＩＴＯ−ＤＣＡ（上）及びＴＰＰ−ＤＣＡ（下）の一対の質量スペクトルである。
【図８】図８は、より高濃度の開示されたＤＣＡ化合物（ＭＩＴＯ−ＤＣＡ：５０μＭ；ＴＰＰ−ＤＣＡ；１５０μＭ；及びＮａ−ＤＣＡ：１５０μＭ）で、より長いインキュベーション時間６時間により、ＰＣ３細胞がＡＴＰ減少及び細胞成長阻害を示したことを示すグラフである。
【図９】図９は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡをカプセル化するナノ粒子を形成するＰＳＭＡ標的化ポリマーを示す絵である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載される化合物、組成物、物品、装置、及び方法は、開示される主題の具体的な態様の以下の詳細な説明並びに実施例及び図面を参照してより容易に理解できる。
【０００９】
本化合物、組成物、及び方法が開示及び記載される前に、具体的な合成方法又は具体的な試薬は当然様々になり得るので、以下に記載される態様が、そのようなものに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される術語が特定の態様を説明する目的のみであり、限定的であると意図されないことも理解されたい。
【００１０】
また、本明細書全体にわたって、種々の刊行物が言及される。これらの刊行物全体の開示は、開示される事柄が属する技術水準をより完全に説明するために、引用により本願に組み込まれる。開示される引用文献は、引用文献が依拠する文中で議論される、それらに含まれる題材について、個別且つ具体的に引用により本明細書に組み込まれる。
【００１１】
定義
本明細書及び以下の特許請求の範囲において、いくつかの術語が言及されるが、それらは以下の意味を持つように定義されるものとする：
【００１２】
本明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される通り、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「組成物」への言及は、２種以上のそのような組成物の混合物を含み、「化合物」への言及は、２種以上のそのような化合物の混合物を含む、などである。
【００１３】
値の範囲が開示され、表記「ｎ１から．．．ｎ２まで（ｎ１及びｎ２は数である）」が使用される場合、特記されない限り、この表記は、その数自体及びそれらの間の範囲を含むものとする。この範囲は、整数でも、終値を含みその間の連続的なものでもよい。例としては、範囲「２から６つの炭素」は、炭素は整数単位であるので、２、３、４、５、及び６つの炭素を含むものとする。例として、１μＭ、３μＭ、及び任意の有効桁数でその間の全てを含む（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）ことが意図される範囲「１から３μＭ」と比較されたい。
【００１４】
本明細書での用語「約」は、それが修飾する数値を限定するものであり、そのような値が許容誤差内の変数であることを意味する。データのチャート又は表に与えられた平均値に標準偏差などの特定の許容誤差が全く示されていない場合、用語「約」は、列挙された値自体を包含する範囲及び有効数字を考慮してその桁への切り上げ又は切り下げにより含められる範囲も意味すると理解されるべきである。
【００１５】
「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」又は「減少させること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」若しくは「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」などのその言葉の他の形態は、事象又は特性（例えば、腫瘍成長）の低下を意味するものとする。これが、典型的には何らかの標準又は期待値に対するものであり、言い換えると相対的であるが、標準値又は相対値が常に言及される必要はないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を減少させる」は、標準又は対照に対する腫瘍の成長速度の減少を意味する。
【００１６】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」若しくは「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」などのその言葉の他の形態は、特定の事象若しくは特性を停止すること、特定の事象若しくは特性の発展若しくは進行の安定化若しくは遅延させること、又は特定の事象若しくは特性が起こる機会を最小限にすることを意味する。予防は、例えば減少よりも典型的に絶対的なものなので、対照との比較を要さない。本明細書では、あるものは減少させることができるが予防はできないのに対して、減少されるものは予防も可能である。同様に、あるものは予防できるが減少させることができず、予防されるものは減少させることもできる。減少又は予防が使用される場合、具体的に特記されない限り、もう一方の言葉の使用も明白に開示されることが理解される。
【００１７】
本明細書では、用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、その用語が適用される疾病又は病態か、そのような疾病又は病態の１つ以上の症状のいずれかの始まりを遅延させ、その進行を抑制若しくは逆転させ、又はそれを緩和若しくは予防することを指す。
【００１８】
用語「個体」（及び同様に「対象」又は「患者」）は、ヒトを含む全哺乳動物を意味する。個体の例には、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びウサギがある。好ましくは、個体はヒトである。
【００１９】
本明細書の用語「疾病」は、用語「疾患」、「症候群」、及び「病態」（病状における）と全般的に同義であると意図され、全てが個体の異常な状態を反映する点で（例えば、正常な機能を損なうヒト若しくは動物の体又は１つ以上のその一部）それらと互換的に使用され、典型的には顕著な徴候又は症状により明らかになるか、且つ／又は個体の人生又は生活の質を減少させる。
【００２０】
用語「併用療法」は、２種以上の治療剤を投与して、本開示に記載される治療上の状態又は疾患を治療することを意味する。そのような投与は、例えば、一定比率の有効成分を有する単一のカプセル又は各有効成分用の複数の別なカプセルにおける、これらの治療剤の実質的に同時の共投与を包含する。さらに、そのような投与は、各種類の治療剤の連続的な使用も包含する。いずれにしても、治療レジメンは、本明細書に記載される病態又は疾患の治療において薬物組み合わせの有益な効果を与えるだろう。
【００２１】
本明細書では、用語「投与すること」は、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、鼻腔内、若しくは皮下投与、又は徐放性装置、例えばミニ浸透圧ポンプの対象への埋め込みを意味する。投与は、非経口、及び経粘膜（例えば、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、又は経皮）を含む任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、小動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内がある。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどがあるが、これらに限定されない。
【００２２】
用語「治療上許容できる」は、過度な毒性、刺激、及びアレルギー反応無しに患者の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に釣り合い、その意図される用途に効果的である化合物（又は塩、互変異性体、双極性イオン形態など）を指す。
【００２３】
反対に述べられない限り、くさび形又は破線としてではなく実線としてのみ示される化学結合を有する式は、可能性のある各異性体、例えば、各エナンチオマー、ジアステレオマー、及びメソ化合物、並びにラセミ体又はスカレミック混合物などの異性体の混合物を企図する。
【００２４】
開示される物質、化合物、組成物、物品、及び方法の具体的な態様がここで詳細に言及されるが、その例は添付される実施例及び図面に示されている。以下の例は、本明細書に記載される方法及び化合物の特定の態様をさらに説明することが意図され、請求項の範囲を限定するものではない。
【００２５】
方法及び組成物
リンカー部分により連結されているミトコンドリア標的化部分と治療剤部分を含む化合物が本明細書に開示される。本明細書に開示される治療剤部分は、阻害剤部分（ＩＭ）である。一態様において、開示される化合物は式Ｉにより表すことができる：
【化２】
2016523926.tif 000004
（式中、「ＴＣ」はミトコンドリア標的化部分であり、「ＩＭ」は阻害剤部分である）。式Ｉにおいて、ｌは、１から１０であり；ｍは、１から３であり；ｎは、０から２０であり；ｐは、１から６４、好ましくは１〜３であり；Ｘ１は、−ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ３は、対象とする特定の阻害剤の利用可能な部位に応じて好適なリンカーであり、例えば、Ｘ３は、−ＣＯ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＲ３−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−１，２，３−トリアゾール−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、互いに独立に、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｃ１〜６アルキル、又は−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキルである。式Ｉを有する化合物の薬学的に許容できる塩も開示される。
【００２６】
式Ｉの特定の例において、ｍは、１、２、又は３であり、Ｘ１は、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり；Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−、好ましくは、−ＣＯＮＲ３−であり；Ｘ３は、−ＣＯ２−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ−Ｈであり；ｐは１であり；ｌは１から５であり；且つｎは０から３である。他の例において、ｐは、１、２、又は３であり、Ｘ１は、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり；Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−、好ましくは、−ＣＯＮＲ３−であり；Ｘ３は−ＣＯ２−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ−Ｈであり；ｍは１であり；ｌは１から５であり；且つｎは０から３である。
【００２７】
上述の通り、Ｘ３は１，２，３−トリアゾールでよく、阻害剤のアジドとアルキン部分の間の１，３−双極子付加環化反応により形成される。
【００２８】
さらに別の例において、本明細書に開示される化合物は式ＶＩを有し得る：
【化３】
2016523926.tif 000005
（式中、ｎ、ｐ、ＩＭ  Ｒ２は、本明細書に定義される通りであり、Ｘ５はポリラクチドグリコリドポリマーである）。
【００２９】
ミトコンドリア標的化部分（「ＴＣ」）
本明細書に開示される式中の「ＴＣ」は、化合物をミトコンドリアに選択的に送達し、又は化合物をミトコンドリアに蓄積することにより、ミトコンドリアを標的とする部分である。開示される化合物に組み込むことができる例示的なミトコンドリア標的化部分（「ＴＣ」）は、非局在化親油性カチオンであり、それは、疎水性膜を横切り、ミトコンドリア中に蓄積するのに効果的である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ又は（Ｐｈ）３Ｐ＋と称される）含有化合物は、ミトコンドリアマトリックス内で１０倍以上蓄積できる。治療上許容できるあらゆるＴＰＰ含有化合物を、開示される化合物中でミトコンドリア標的化部分ＴＣとして使用できる。開示される化合物中でＴＣとして使用できる別な非局在化親油性カチオンは、デカリニウムである。
【００３０】
他の例において、ミトコンドリア標的化部分は、以下に示されるローダミン１２３などのローダミンカチオンでよい：
【化４】
2016523926.tif 000006
（ここで、二級アミン（図示される通り）は式Ｉに示される化合物の残りに結合できる）。ローダミン６Ｇも使用できる。
【００３１】
非カチオン性化合物は、ミトコンドリアマトリックス中で、開示される化合物を標的化し蓄積するのに役立ち得る。例えば、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ミトコンドリアマトリックス中で阻害剤を標的化し蓄積するための、開示される化合物における好適なミトコンドリア標的化部分として役立ち得る。あらゆる好適なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、開示される化合物中で使用できる。非限定的な例には、ＳＳ−０２  ＳＳ−２０、及びＳＳ−３１がある。
【００３２】
本明細書で使用できるミトコンドリア標的化部分のなおさらなる例は、ＭＫＴ−１２３などのシアニン染料、ＰＫ１１１９５、及びアントラサイクリンである。
【００３３】
阻害剤部分（「ＩＭ」）
本明細書に開示される式中の「ＩＭ」は、開示される化合物に結合している場合又は遊離の場合（すなわち開示される化合物から切断された場合）に、阻害剤又は治療剤である部分である。開示される化合物に組み込むことができる例示的な阻害剤には、ミトコンドリア作用性（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｃｔｉｎｇ）抗癌剤がある。例えば、阻害剤ＩＭは、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−１、ＭＣＬ１などに作用する化合物など、ＢＣＬ−３タンパク質ファミリーの調節物質；ＨＫに影響を与える化合物、ＨＫ２−ＶＤＡＣ相互作用に影響を与える化合物、ＰＤＫ阻害剤、ＬＤＨ−Ａに影響を与える化合物、脂肪酸シンターゼに影響を与える化合物、ＡＴＰクエン酸リアーゼに影響を与える化合物、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤など；ＶＤＡＣ−標的化剤又はＡＮＴ−標的化剤；ＳＯＤ阻害剤、ＧＳＨ阻害剤、ＧＰＸ阻害剤などのＲＯＳ制御因子；ＨＳＰ９０阻害剤などでよい。開示される化合物中に存在してよい具体的な阻害剤ＩＭの例には、ロニダミン、ジクロロアセタート、コハク酸α−トコフェリル、ジャスモン酸メチル、ベツリン酸、及びレスベラトロール、Ａ−３８５３５８、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、ＡＴ−１０１、２−アミノ−６−ブロモ−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈ−クロメン−３−カルボキシラート（ＨＡ１４−１）、ＬＤＨ−Ａ  ｓｈＲＮＡ、オルリスタット、ＳＢ−２０４９９０、ソラフェンＡ、４−（Ｎ−（ｓ−グルタチオニルアセタート）アミノフェニルアルセノキシド（ＧＳＡＯ）、クロドロネート、ＰＫ１１１９５、メナジオン、β−ラパコン、ＣＤ４３７、ｇａｍｉｔｒｉｎｉｂｓ、８−（２−クロロ−３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−フルオロ−９−（ペンタ−４−ニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵ２４Ｆｃｌ）、（８−（６−ブロモベンゾ［ｄ］［１，３，］ジオキシル−５−イルチオ）−９−（ペンタ−４−ニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵＨ５８）、８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３，］ジオキシル−５−イルチオ）−９−（３−イソプロピルアミノ）プロピル−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵＨ７１）、ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ、２−メトキシエストラジオール、テトラチオモリブデート、ブチオニンスルホキシイミン、ジメチルアミノ−パルテノリド、パルテノリド、イメキソン、マガホジピール（ｍａｇａｆｏｄｉｐｉｒ）、メナジオン、モテキサフィンガドリニウム、ＰＥＩＴＣ、エレスコモール（ｅｌｅｓｃｏｍｏｌ）（ＳＴＡ−４７８３）、オール・トランスレチノイン酸、６−［３−（１−アダマンチル）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ナフタレンカルボン酸、Ｅ−３−（４’−ヒドロキシ−３’−アダマンチルビフェニル−４イル）アクリル酸、３−ブロモピルビン酸、酪酸、２−デオキシＤ−グルコース、三酸化亜ヒ酸（ａｒｓｅｎｉｔｅ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、ベツリン酸などがある。
【００３４】
特定の例において、阻害剤部分ＩＭは、オブリメルセンナトリウム、ＡＴ−１０１、ＡＢＴ−２６３、ＧＸ１５−０７０、ゴシポール、ＴＷ−３７、ＡｐｏＧ２、ＡＢＴ７３７、及びオバトクラックスなどのＢｃｌ−２阻害剤である。
【００３５】
ＤＣＡ
一態様において、開示される化合物は、抗癌活性を誘起するために、効率的なＤＣＡの細胞及びミトコンドリア取り込みをするように設計されている。開示される化合物は、薬理学的に適切な投与量で、抗腫瘍免疫の効果も増大できる。ＤＣＡにとって、開示される化合物は特に有利になり得る。
【００３６】
ＤＣＡは、ミトコンドリアに侵入するその航行においておびただしいバリアに遭遇する。ＤＣＡ細胞侵入に関連したモノカルボン酸輸送体は、腫瘍を含むほとんどの細胞中で電気的中性である（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：８６１−８６８，１９９６）。乳酸、ピルビン酸、及びケトン体は、この輸送体系の天然の基質である。そのため、ＤＣＡは、その取り込みをめぐりこれらの基質との強い競合に直面する。さらに、ミトコンドリア取り込みのために、ＤＣＡは、ミトコンドリアピルビン酸輸送体によるその侵入をめぐってピルビン酸と競合する。研究により、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、ピルビン酸、３−ブロモピルビン酸、ニコチン酸の輸送において関連している新しいナトリウム結合モノカルボン酸輸送体（ＳＭＣＴ１）又は溶質キャリアファミリー−５メンバー−８（ＳＬＣ５Ａ８）が特定され、この高エネルギー共役輸送体がＤＣＡを基質として受け入れることが明示された（Ｃｏａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５７：７１９−７３１，２００４；Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１３２９３−１３２９６，２００４．）。しかし、この輸送体は正常な細胞中に発現されるが、腫瘍細胞中では発現が抑制されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：８４１２−８４１７，２００３；Ｂａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：４０２６−４０３７，２０１１．）。そのため、ＳＬＣ５Ａ８の欠乏により、腫瘍細胞はＤＣＡの抗腫瘍活性に対して耐性を持つようになる。乳酸は高解糖性の腫瘍の最も豊富な生成物であり、高レベルの細胞外乳酸の作用のいくつかには、下記がある：樹状細胞（ＤＣ）への単球の分化の遮断、ＤＣ及び細胞傷害性Ｔリンパ球からのサイトカイン放出の著しい阻害、単球移動の阻害、及び細胞傷害性Ｔ細胞機能の低下（Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７：２０１３−２０２１，２００６）。ＤＣＡを使用する解糖の阻害は、解糖性の腫瘍の免疫抑制性を克服できる。しかし、それには非常に高いＤＣＡ投与量が必要である。
【００３７】
癌細胞が、より負に帯電したミトコンドリアを有することが多いという事実を利用して、親油性ミトコンドリア標的化部分、例えば、トリフェニルポスホニウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｏｈｓｐｈｏｎｉｕｍ）（ＴＰＰ）カチオンを利用するＤＣＡの標的化送達により、低い有効性を回避する方法が本明細書に開示されるが、それはネルンストの方式で膜を越えて平衡に達し、ΔΨｍに反比例してミトコンドリアマトリックス空間に蓄積する（図１）（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５４０７−５４１２，２００３；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４１１：６３３−６４５，２００８；Ｍａｒｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１６２８８−１６２９３，２０１２；Ｍａｒｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１３．）。そのため、一態様において、標的化部分（例えば、ＴＰＰ部分）（例えば、図１）を組み込むことによる、ミトコンドリア標的ＤＣＡアナログ、例えば、ＭＩＴＯ−ＤＣＡを構築する技術、癌細胞代謝を変更して乳酸により調節される免疫状態を改善し、抗腫瘍免疫の有効性を高めるその能力が開示される。
【００３８】
式Ｉを参照すると、化合物ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（図１に示される）は、ＴＣ＝トリフェニルホスホニウム、ＩＭ＝ＤＣＡ、ｌが３であり、Ｘ１が−ＣＨＲ１−であり、ｍが１であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が全てＨであり、Ｘ２が−ＣＯＮＲ１−であり、ｎが０であり、且つｐが３である場合である。トリフェニルホスホニウム標的化部分及びＤＣＡ阻害剤を含むさらなるアナログが本明細書に開示され、式ＩＩに示される：
【化５】
2016523926.tif 000007
（式中、ｌは１から１０であり；ｍは１から３であり；ｎは０から２０であり；ｐは、１から６４、好ましくは１〜３であり；Ｘ１は、−ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；Ｘ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−であり；且つＲ１、Ｒ２、及びＲ３は、互いに独立に、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｃ１〜６アルキル、又は−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキルである）。式ＩＩを有する化合物の薬学的に許容できる塩も開示される。
【００３９】
式ＩＩの特定の例において、ｍは、１、２、又は３であり、Ｘ１は、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり、且つＸ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−、好ましくは、−ＣＯＮＲ３−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ−Ｈであり；ｐは１であり；ｌは１から５であり；且つｎは０から３である。他の例において、ｐは、１、２、又は３であり、Ｘ１は、−ＣＯ２−又は−ＣＨＲ３−であり、且つＸ２は、−ＣＯＮＲ３−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＣＨＲ３−、−ＮＨＲ３−、−ＣＯ−、又は−Ｏ−、好ましくは、−ＣＯＮＲ３−であり；且つ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ−Ｈであり；ｍは１であり；ｌは１から５であり；且つ、ｎは０から３である。なおさらなる例において、ｍは、１、２、又は３であり、Ｘ１は−ＣＨ２−であり、且つＸ２は−ＣＯＮＨ−であり、且つ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ−Ｈであり；ｐは１であり；ｌは１から３であり；且つ、ｎは０である。なおさらなる例において、ｐは、１、２、又は３であり、Ｘ１は−ＣＨ２−であり、且つＸ２は−ＣＯＮＨ−であり、且つ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ−Ｈであり；ｍは１であり；ｌは１から３であり；且つ、ｎは０である。
【００４０】
別な例において、本明細書に開示される化合物は式ＩＩＩを有する。
【化６】
2016523926.tif 000008
【００４１】
なお他の例において、開示される化合物は、式ＩＶ又はＶを有し得る。
【化７】
2016523926.tif 000009
（式中、ｐは、１から６４、好ましくは１〜３であり、且つＲ１は、Ｃ１〜３アルキル又はＨである）。
【００４２】
さらなる例において、化合物は、
【化８】
2016523926.tif 000010
又はその薬学的に許容できる塩である。
【００４３】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡ
ＰＤＫ１キナーゼ活性のＤＣＡに媒介される不活性化には、ＤＣＡが、ＰＤＫのＮ末端へリックスバンドルと結合することが必要である（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：９９２−１００４，２００７）。そのような結合は、ＰＤＫ１に局所的コンフォメーション変化を起こし、それがヌクレオチド結合ポケットとリポイル結合ポケットの両方に伝わり、キナーゼ活性の阻害につながる。ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、ミトコンドリアに存在するエステラーゼにより活性化されて、活性薬剤を、ＰＤＫ１結合ポケット中の蓄積のために放出することができる。ＭＩＴＯ−ＤＣＡにおいて、ミトコンドリア標的化ＴＰＰカチオンはアミド連結により導入され、多数のＤＣＡ分子がエステラーゼに対して不安定なエステル結合を利用して、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）により組み込まれた（Ｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：８７０２−８７０３，２００７）。このデザインは、嵩高いＴＰＰ部分からの立体障害を全く有さずに、効果的なＰＤＫ１結合のために、生理的条件下でエステラーゼ依存的にＤＣＡ分子の放出を可能にし、ＴＰＰ結合のために比較的安定なアミド連結を使用するので、発明者らは、細胞のミトコンドリアに到達する前のＤＣＡからの標的化部分の早期の分離を避けながら、ＭＩＴＯ−ＤＣＡをミトコンドリアに向けることができるだろう（図１）。ＭＩＴＯ−ＤＣＡを構築するには、ヒドロキシル基の存在下でアミンとカルボキシルのカップリングを可能とする特異性の高い試薬であるＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を使用して、（５−カルボキシペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミドをトリスと反応させることにより、ＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３が最初に合成される（図２）。ＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３のヒドロキシル基はＤＣＡ−無水物とカップリングされてＭＩＴＯ−ＤＣＡが生じる。他の阻害剤ＩＭとＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３中間体とのカップリングは同様に達成できる。
【００４４】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、ＴＰＰの分子あたり３つのＤＣＡ部分を含むので、１つの標的化リガンドを使用してより高いＤＣＡ投与量を送達できる。これは、治療効果の増大にもつながり得る。そのため、ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、単一のＴＰＰ標的化部分を使用してより高い薬物投与量を送達する可能性を有する。類似の送達効率が、本明細書に開示される他の阻害剤ＩＭでも期待され得る。
【００４５】
ＴＰＰの分子あたり１つのＤＣＡを含むＴＰＰ−ＤＣＡも開示される。図２に示されるように、（３−ヒドロキシプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミドをＤＣＡ−無水物と反応させて、ＴＰＰ−ＤＣＡは合成される。他の阻害剤ＩＭも同様に結合できる。
【００４６】
ミトコンドリア膜電位及びＭＩＴＯ−ＤＣＡ
細胞アポトーシスの開始の早期の表れは、ΔΨｍの変化により測定されるミトコンドリア膜を挟んだ電気化学的勾配の崩壊である（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５０：９８−１１５，２０１１）。ミトコンドリアのΔΨｍの喪失は、緑（５２５ｎｍ）から赤（５９０ｎｍ）への蛍光発光シフトを伴ってミトコンドリアへの電位依存性の蓄積を示す、独特なカチオン性染料、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージドすなわちＪＣ−１を使用して試験できる。電位に敏感な色のシフトは、赤色蛍光「Ｊ集合体」の濃度依存性の形成による。ミトコンドリアの脱分極は、緑色／赤色蛍光強度比の増加により示される。Ｎａ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、ＴＰＰ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、又はＭＩＴＯ−ＤＣＡ（５０μＭ）により処理され、それに続いてＪＣ−１で染色された前立腺癌（ＰＣａ）ＰＣ３細胞のライブセルイメージング並びにこれら３つのＤＣＡアナログに反応したＰＣ３細胞からのＪＣ−１緑色／赤色蛍光比の比較分析が図３に表される。ＰＣ３細胞のＭＩＴＯ−ＤＣＡへの曝露は、ほとんどの細胞での赤色蛍光の消失及び緑色蛍光の増加から明らかであるように、ΔΨｍの著しい変化を引き起こした。対照的に、Ｎａ−ＤＣＡ又はＴＰＰ−ＤＣＡによる細胞処理は、ほとんどの細胞で赤色蛍光を示した。蛍光強度の定量化は、ＩｍａｇｅＪを使用して実施され、補正された総細胞蛍光（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＴＣＦ）値はヒストグラムとして表される（図３）。ＪＣ−１−染色ＰＣ３細胞の定量的な分析は、対照細胞（緑：赤；０．２４±０．０３）、又は等価なＤＣＡ濃度でＮａ−ＤＣＡにより処理された細胞（緑：赤；０．２４±０．０２）に比べて、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（緑：赤；３．９６±０．９６）処理細胞における赤色（高いΔΨｍ）と緑色（低いΔΨｍ）比の著しい低下を明らかにした。ＴＰＰ−ＤＣＡは、０．４９±０．０９の緑：赤比を示し、ＭＩＴＯ−ＤＣＡにより示される比よりも著しく低かった。ＭＩＴＯ−ＤＣＡが５０μＭなどの濃度で高解糖性のＰＣ３細胞においてΔΨｍの低下を起こす能力は、ミトコンドリア標的化部分の組み込み及び単一分子中への多数のＤＣＡ単位の充填が、Ｎａ−ＤＣＡがその効能を示すのに要する高用量に関連する問題を克服するのに役立ち得ることを示す。
【００４７】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、高解糖性の癌細胞においてより効果的である
増大されたグルコース消費及び解糖からのエネルギー産生は、ほとんどの悪性細胞の基本的特徴である。しかし、ＰＣａには、ゆっくりとした解糖という特徴がある。ＰＣａ細胞の独特な代謝に関する特徴にもかかわらず、アンドロゲン依存性及びアンドロゲン非依存性ステージにおける解糖性プロファイルは充分に理解されていない（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１４：１９５−２０１，２００８）。異なるＰＣａ細胞型に対するＭＩＴＯ−ＤＣＡの代謝切替え能力が調査された。アンドロゲン応答性ＬＮＣａＰ及びアンドロゲン不応性ＰＣ３並びにＤＵ１４５ＰＣａ細胞が使用された。ＬＮＣａＰ細胞の代謝表現型は、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞とは異なっていた。ＬＮＣａＰ細胞は、著しく高い酸素消費速度並びに著しく低い乳酸産生速度を有した（同上；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７８７：１４３３−１４４３，２００９．）。間葉系前駆細胞は、様々な種類の肉腫の源であると考えられており、これらの幹細胞の変換が、ほとんどのヒト悪性腫瘍の発生にあらかじめ必要である（Ｈｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３：６８５−６９４，２００３）。さらに、未分化ＭＳＣ細胞は、初代ヒト線維芽細胞及び分化細胞よりも解糖性が高い。したがって、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、正常細胞に対するＭＩＴＯ−ＤＣＡの毒性プロファイルを調べる対照として使用された。ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞におけるＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、及びＮａ−ＤＣＡの代表的な生存率アッセイが図４Ａに示される。細胞のミトコンドリアへのＤＣＡの標的化送達のためのキャリアであるＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３の細胞傷害性プロファイルは、キャリアがＰＣａ又はＭＳＣ細胞のいずれにおいても毒性作用を全く示さなかったことを明らかにした。結果は、７２時間のインキュベーション後、Ｎａ−ＤＣＡが３つのＰＣａ細胞系の全てにおいて、その解糖状態にかかわらず比較的不活性で、高解糖性のＰＣ３及びＤＵ１４５細胞での２０〜４０ｍＭから、解糖性の低いＬＮＣａＰ細胞での５０ｍＭ超まで（ＩＣ５０（ＰＣ３）：２３±６ｍＭ；ＩＣ５０（ＤＵ１４５）：４１±９ｍＭ；ＩＣ５０（ＬＮＣａＰ）：５１±１７ｍＭ）のＩＣ５０値を有することを示し、ＭＳＣ細胞において毒性は全く観察されなかった。対照的に、ＭＩＴＯ−ＤＣＡの形態で単一のＴＰＰ分子を使用して、多数のＤＣＡ分子が直接ミトコンドリアに送達されると、３つのＰＣａ細胞系の全てにおいて顕著な細胞傷害性の増加が観察された。１７±１μＭのＩＣ５０値を有するＭＩＴＯ−ＤＣＡは、高解糖性のＰＣ３細胞において活性が３桁高いことが見出された。類似の傾向が、ＤＵ１４５（ＩＣ５０：４２±２μＭ）及びＬＮＣａＰ（ＩＣ５０：３０±６μＭ）細胞においても観察され、ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、Ｎａ−ＤＣＡよりも３桁高い活性を示した。ＴＰＰ−ＤＣＡは［ＩＣ５０（ＰＣ３）：６８±１１μＭ；ＩＣ５０（ＤＵ１４５）：４６８±４９μＭ；ＩＣ５０（ＬＮＣａＰ）：３０２±３７μＭ］、ＭＩＴＯ−ＤＣＡよりも、ＰＣ３細胞において約４分の１、ＬＮＣａＰ及びＤＵ１��５において約１０分の１の活性であった。ＭＳＣ細胞において、ＭＩＴＯ−ＤＣＡとＴＰＰ−ＤＣＡはどちらも、癌細胞に対するその独特な選択性を示すこれらの濃度では、毒性作用を全く示さなかった。
【００４８】
細胞のミトコンドリアへのこの化合物の標的化時のＭＩＴＯ−ＤＣＡの活性増大が、壊死よりもアポトーシスによるものであったか否かを決定するために、ＰＣ３及びＭＳＣ細胞でのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８−アネキシン−Ｖ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞染色を実施し、フローサイトメトリーを使用してデータを分析した（図４Ｂ）。対照として、エトポシド処理細胞を早期アポトーシス集団として使用し、Ｈ２Ｏ２処理細胞を後期アポトーシス集団又は壊死集団として特徴づけた。ＭＳＣ細胞は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（５０μＭ）又はＴＰＰ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、又はＮａ−ＤＣＡ（１５０μＭ）処理でアポトーシスを起こさなかった。しかし、５０μＭの低濃度のＭＩＴＯ−ＤＣＡで、完全な早期アポトーシスがＰＣ３細胞で観察された。ＴＰＰ−ＤＣＡは１５０μＭで類似の挙動を示し、１５０μＭの濃度のＮａ−ＤＣＡではアポトーシスは全く観察されなかった。これらの化合物で観察された後期アポトーシス細胞又は壊死細胞は全くなかった。
【００４９】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる癌細胞選択的グルコース代謝変更
グルコースのピルビン酸へのサイトゾル代謝は、酸化的リン酸化のためのミトコンドリアへの侵入前に起こる。しかし、癌に見られるように酸化的リン酸化により代謝されない場合、ピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼにより解糖されて乳酸に転化される。癌における酸化的リン酸化のない状態での解糖は、乳酸濃度を上昇させる。癌細胞においてグルコース代謝を解糖から酸化的リン酸化に切り替えるＭＩＴＯ−ＤＣＡの能力を試験するために、解糖性のＰＣ３細胞中の細胞内乳酸レベルを測定し、解糖性のより低いＬＮＣａＰ及び正常なＭＳＣ細胞に見られる値と比較した（図５Ａ）。ミトコンドリア標的化リガンドの重要性を理解し、標的化リガンドあたりのＤＣＡ分子の数を増やすトリスプラットフォームの重要性を調査するために、親薬物Ｎａ−ＤＣＡ及びＴＰＰ−ＤＣＡを対照として使用した。ＰＣ３細胞の５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡによる６時間の処理は、細胞内乳酸レベルを５８±５％低下させた。対照送達スキャホールドＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３により処理された細胞は、効果を全く示さなかった。１５０μＭのＮａ−ＤＣＡにより処理されたＰＣ３細胞は、およそ５％の乳酸レベルの低下を示した。ＴＰＰ−ＤＣＡは、細胞乳酸レベルの低下においてより低い効率を示し、低下はわずか３０±２％であった（図５Ａ）。予想された通り、より解糖性の低いＬＮＣａＰ細胞における乳酸レベルは、ＰＣ３細胞に観察されるものより著しく低かった。顕著な乳酸濃度の差が、健康な解糖性ＰＣ３細胞と健康なＭＳＣ細胞の間に観察された（図５Ａ）。ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる処理の後の解糖活性の相対的低下の程度は、ＰＣ３細胞とＬＮＣａＰ細胞で類似であり、低下は、ＴＰＰ−ＤＣＡ又はＮａ−ＤＣＡにより処理された細胞に比べてはるかに顕著であった（図５Ａ）。ＤＣＡ化合物のいずれも、ＭＳＣ細胞中の乳酸レベルに何も効果を有さない（図５Ａ）。これらの観察は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡが癌細胞中のグルコース代謝の変更にはるかに効率的であり、正常細胞には何も効果を示さないことを示唆する。
【００５０】
癌細胞乳酸レベルの低下は、ＡＴＰ産生の増加と関連することが期待される。ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（２０μＭ）、ＴＰＰ−ＤＣＡ（６０μＭ）、及びＮａ−ＤＣＡ（６０μＭ）により処理されたＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞中の細胞内ＡＴＰレベルが測定された。図５Ｂに示されるように、ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる３時間の処理の後、細胞内ＡＴＰレベルのおよそ４４％の増加が観察された。３倍の濃度のＴＰＰ−ＤＣＡ又はＮａ−ＤＣＡによる処理は、細胞内ＡＴＰレベルに有意な増加を全く示さなかった。類似のＡＴＰレベルが、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、及びＮａ−ＤＣＡによる処理時にＬＮＣａＰ細胞に観察された。対照的に、正常ＭＳＣ細胞は、比較的高レベルのＡＴＰを示し、３つのＤＣＡ化合物の全てによる処理時に、ＡＴＰレベルのわずかな増加があった。高濃度のＤＣＡ化合物（ＭＩＴＯ−ＤＣＡ：５０μＭ；ＴＰＰ−ＤＣＡ；１５０μＭ；及びＮａ−ＤＣＡ：１５０μＭ）で、６時間のより長いインキュベーション時間により、ＰＣ３細胞は、ＡＴＰ低下及び細胞成長阻害を示した（図８）。
【００５１】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡによる乳酸減少は抗腫瘍免疫を生み出す
癌細胞は、免疫系による排除から逃れるためにいくつかの経路を採用する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２１：１−１４，２００７）。腫瘍細胞が免疫を逃れるいくつかの機構には、阻害性分子の上向き調節、免疫抑制サイトカインの産生、及び共刺激分子の下向き調節がある（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２６７−２９６，２００７）。樹状細胞（ＤＣ）は、特異的な抗腫瘍Ｔ細胞応答の開始の主役であり、腫瘍媒介性免疫抑制の潜在的な標的である（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０９６−１１０３，１９９６；Ｒａｄｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：６２７−６３２，１９９５；Ｏｒｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４４９７−４５０６，２００３．）。増殖性の高い解糖性の腫瘍中の乳酸分泌は、ＤＣの抗原表現型及び機能活性の変更を誘起する能力を有し、局所免疫の抑制の一因である（Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。腫瘍により誘導される乳酸は、単球のＤＣへの分化を阻害し、ＤＣ活性化及び抗原発現を損ない、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、及び細胞毒性活性を抑制する（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０９：３８１２−３８１９，２００７）。ＭＩＴＯ−ＤＣＡによるＰＣａ細胞中の乳酸レベルの有意な非常に選択的な低下を観察した後、低下した乳酸産生ＰＣ３細胞上清のＤＣに対する影響が調査された。癌細胞上清は、ＰＣ３細胞を、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（５０μＭ）、Ｎａ−ＤＣＡ（１５０μＭ）、及びＴＰＰ−ＤＣＡ（１５０μＭ）により２４時間処理して生成させた。第一に、異なるＤＣＡ化合物による処理時のＰＣ３上清からの免疫応答が、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用して、炎症促進性及び抗炎症性サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を測定することにより調査された（図６Ａ）（Ｍａｒｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．５：２１５−２２３，２０１３）。ＤＣＡ化合物によるＰＣ３細胞の処理は、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−αの上向き調節をもたらした。これら３つのサイトカイン全てのレベルは、ＴＰＰ−ＤＣＡ又はＮａ−ＤＣＡにより処理されたものに比べて、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ処理細胞で高かった。ＤＣが適切に活性化されると、ＤＣは腫瘍抗原及びアポトーシス小体を吸収し、リンパ節のＴ細胞に富む領域に移動し、抗原特異的Ｔ細胞の選択のための一連の行動並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２などのＤＣサイトカインの放出を開始する。腫瘍抗原を含むＰＣ３上清が、マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）に加えられ、３７℃でインキュベートされた（Ｍａｒｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。２４時間のインキュベーション後、癌細胞上清によるＢＭＤＣの活性化がＥＬＩＳＡを利用して試験された。ＭＩＴＯ−ＤＣＡから生じた癌細胞上清により活性化されたＢＭＤＣは、ＩＬ−１２の分泌の著しい増加を示した（図６Ｂ）。ＴＰＰ−ＤＣＡにより媒介されるＢＭＤＣからのＩＬ−１２の増加は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡに比べて少なかった。Ｎａ−ＤＣＡ処理により生じた上清は、ＢＭＤＣからのＩＬ−１２レベルの増加を全く示さなかった。このように、ＭＩＴＯ−ＤＣＡは、ＩＬ−１２を増強し（Ｌａｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：２１４−２１７，１９９６）ＩＬ−１０産生を減少させることにより、１型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）を促進するＢＭＤＣの誘導を促進する能力を有する。ＭＩＴＯ−ＤＣＡにより処理された腫瘍上清によるＩＬ−１２分泌増強は、ナチュラルキラー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球活性を増強する能力を増加させる。乳酸による酸性化は、ヒト単球及びマウスマクロファージによるＴＮＦ−α分泌の抑制をもたらす（Ｄｉｅｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１２００−１２０９，２０１０）。発明者らのデータは、ＤＣＡ化合物処理から生じた癌細胞上清がＢＭＤＣを刺激してＴＮＦ−αを分泌させたことを示し、最高レベルのこのサイトカインが上清から観察されたが、これは、解糖からグルコース酸化へのグルコース代謝の効率よい変更によりＭＩＴＯ−ＤＣＡから生じた。これらの結果は、ＭＩＴＯ−ＤＣＡが、親薬物ＤＣＡに比べて、抗腫瘍免疫の向上のためのより良い薬剤になるだろうこと、ＭＩＴＯ−ＤＣＡの低濃度での効果的な乳酸減少の結果としての癌細胞中の変更されたサイトカインパターンが、抗腫瘍免疫に寄与し得るＤＣ表現型を調節する能力を有することを支持する。
【００５２】
ＭＩＴＯ−ＤＣＡが独特な代謝表現型を持つＰＣａの代謝を逆転させる能力は、それが選択的にミトコンドリアに向けられる場合のＤＣＡのけた外れの可能性及びさらなる調査の根拠を示唆する。ＴＰＰ系リガンドは、非ペプチド性ミトコンドリア標的化薬剤の重要なクラスを表すが、この研究の前に、この手法がＤＣＡ細胞内隔離（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）に使用されたことはなかった。ＭＩＴＯ−ＤＣＡに使用される分子スキャホールドは、ＴＰＰ関連ミトコンドリア毒性に影響を与えずに単一のＴＰＰ標的化部分を保ちながら、ＤＣＡのより多くのコピーを組み込む機会を与える。臨床的に重要な濃度のＭＩＴＯ−ＤＣＡに対する非癌性ＭＳＣ細胞の感受性の欠如は、このプラットフォームが正常組織において非毒性である可能性を有することを示唆する。ＭＩＴＯ−ＤＣＡの形態での、細胞のミトコンドリアへのＤＣＡの正確な標的化による腫瘍細胞中の効果的な乳酸減少は、腫瘍細胞の解糖を変えただけでなく、乳酸により調節される免疫状態も変更し、抗腫瘍免疫を増加させた。これらのデータは、ミトコンドリアへのＤＣＡの標的化が、独特な方法で癌細胞の代謝を刺激でき、それが免疫原性ＤＣＡ療法の新しい戦略を作り出し得ることを示唆する。本明細書に示されたＭＩＴＯ−ＤＣＡの形態での、細胞のミトコンドリアへのＤＣＡの正確な標的化は、高い効能を持つこの驚異の分子ＤＣＡの新規製剤を与える新しい道筋を明らかにでき、既存の医薬品に対する毒性の潜在的な源を排除できる。
【００５３】
デンドリマー化合物
正確な構造、高い充填能力（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）、調整可能な溶解度、及び生体共役能力のため、本明細書に開示される化合物は、デンドリマー又はハイパーブランチポリマーを、多数の標的化部分及び阻害剤ＩＭと共に含み得る。デンドリマー及びハイパーブランチポリマーの独特な性質と、標的化部分及び阻害剤部分との組合せは、高い効率を有する化合物のより効率よい合成、例えば、大量生産につながり得る。
【００５４】
本明細書で使用できる好適なデンドリマースキャホールドには、ＰＡＭＡＭ、又はＳＴＡＲＢＵＲＳＴ（商標）デンドリマーとしても知られるポリ（アミドアミン）；ポリリジンデンドリマー；及びポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーがある。これらのデンドリマーの製造プロセスは、中心の開始剤コア（例えば、エチレンジアミン−コア）で始まる一連の反復工程である。その後の各成長工程は、より大きい分子の直径を有し、反応性表面部位が２倍であり、先の世代のおよそ２倍の分子量を有する新しい「世代」のポリマーを表す。本明細書での使用に好適なデンドリマースキャホールドは、様々な世代で市販されている。好ましくは、開示される本明細書のデンドリマー化合物は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０世代のデンドリマースキャホールドに基づいている。そのようなスキャホールドは、それぞれ、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０４８、及び４０９６の反応性部位を有する。そのため、これらのスキャホールドに基づく開示されるデンドリマー化合物は、対応する数の組み合わされたＴＣ及びＩＭ部分を有する。
【００５５】
ポリエーテルアミンも好適であり、ポリエーテル骨格の末端に結合した一級アミノ基を含む。ポリエーテル骨格は、典型的には、プロピレンオキシド（ＰＯ）、エチレンオキシド（ＥＯ）、又は混合ＥＯ／ＰＯ／ＢＯのいずれかに基づいている。一態様において、ポリエーテルアミンは、ポリオキシアルキレンアミンであり得る。そのようなポリエーテルアミンは、Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）から名称ＪＥＦＦＡＭＩＮＥ（商標）（例えばＪＥＦＦＡＭＩＮＥ  Ｄ２３０）で商業的に入手できる。ＪＥＦＦＡＭＩＮＥは、モノアミン、ジアミン、及びトリアミンを有し得るが、５，０００までの範囲の種々の分子量で市販されている。
【００５６】
好適なデンドリマーのさらなる例は、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（ＭＰＡ）に基づいている。これらのハイパーブランチポリマーは、２、３、又は４世代で市販されており、それぞれ、開示されるＴＣ及びＩＭ部分を連結するための１６、３２、及び６４の反応性部位を有する。
【００５７】
なおさらに、好適なデンドリマーは、２つ以上のデンドロンを合わせて調製できる。デンドロンは、反応性焦点部位官能基を有するデンドリマーのくさび形の区画である。多くのデンドロンスキャホールドが市販されている。それらは、１、２、３、４、５、及び６世代であり、それぞれ、２、４、８、１６、３２、及び６４の反応性基を有する。特定の例において、ＴＣ部分は、ある種類のデンドロンに連結しており、阻害剤部分は別の種類のデンドロンに連結している。次いで、２つのデンドロンが接続されて、デンドリマーを形成する。これらの化合物の具体的な例は以下に示されるが、４つの反応性部位を有する第２世代ＭＰＡデンドロンがトリフェニルホスフィニル含有ＴＣ部分に結合された。３２の反応性部位を有する別な第５世代ＭＰＡデンドロンがＤＣＡに結合された。次いで、２つのデンドロンは、クリックケミストリー（すなわち、一方のデンドロンのアジド部分と他方のアルキン部分の間の１，３−双極子付加環化反応）により連結されて、トリアゾールリンカーを形成する。
【化９】
2016523926.tif 000011
【００５８】
この構造の種々の並べ替えが本明細書において企図される。例えば、好適なデンドリマーは、２、４、８、１６、３２、又は６４の阻害剤部分（例えば、ＤＣＡ）あたり２、４、８、１６、３２、又は６４のＴＣ部分（例えば、ＴＰＰ）を含み得る。当業者は、これらの種々の組み合わせを構築するための適切な世代のデンドロンを選択する方法を理解し、Ｍｅｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００９，１０９，３１４１−３１５７及びＴｅｋａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００９，１０９，４９−８７（デンドリマー、ハイパーブランチポリマー、及びデンドロンの教示のために引用により本明細書に全体として組み込まれる）に開示されているものなど、その製造のために公知の合成方法に従うことができる。
【００５９】
さらに、２つのデンドロンの間の連結基も、例えば、トリアゾール、アミド、チオエステル、エステル、エーテル、ジスルフィドなど様々でよい。本明細書で企図されるデンドリマーのさらなる例は以下に示されるが、ＴＣ部分と阻害剤部分のいずれかに結合されたそれぞれ３２の反応性基を有するＭＰＡに基づく２つの第４世代デンドロンが連結された。
【化１０】
2016523926.tif 000012
【００６０】
開示される化合物は、ハイパーブランチポリグリコール構造に基づいてもよい。これらのハイパーブランチポリマーは、エチレンオキシドとグリシドールのランダム共重合により１工程で合成できる（Ｓｈｅｎｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４  ６０６８−６０８１，２０１３，及びＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，４：３４８０−３４９０，２０１３、デンドリマー、ハイパーブランチポリマー、及びデンドロンの教示のために、引用により本明細書に全体として組み込まれる）。これらの化合物の具体例は以下に示される。
【化１１】
2016523926.tif 000013
【００６１】
具体例において、４から６４のトリフェニルホスフェニル（ｐｈｏｓｐｈｅｎｙｌ）部分及び４から６４のジクロロアセチル部分を含む化合物が開示される。
【００６２】
ナノ粒子
特定の態様において、開示される化合物はナノ粒子中に組み込まれ得る。好適なナノ粒子は、コア及び１種以上の本明細書に開示される化合物を含む。開示される化合物は、コア内に収容されても、埋め込まれてもよい。開示される化合物は、好ましくは、所望の速度でコアから放出される。コアは生分解性であり、コアが劣化又は浸食されるにつれて、開示される化合物を放出する。標的化部分は、それらが細胞成分との相互作用に利用可能であるように、好ましくは、コアから外側に延びているが、その相互作用は、ナノ粒子を、アポトーシス細胞などの適切な細胞；ミトコンドリアなどの細胞小器官；などに標的化するだろう。
【００６３】
ナノ粒子のコアは、任意の好適な成分又は複数の成分からも形成できる。好ましくは、コアは、疎水性ポリマー又は疎水性部分若しくはポリマー若しくは脂質などの疎水性成分から形成される。特定の例において、コアは、疎水性コア及び親水性外表面を有するミセルを形成できるリン脂質を含む。コアは、また、又は代りに、水性環境中で自己集合して疎水性コア及び親水性外表面を有する粒子になることができる疎水性部分及び親水性部分を有するブロックコポリマーを含んでよい。特定の例において、コアは、１種以上の生分解性ポリマー又は生分解性部分を有するポリマーを含む。
【００６４】
任意の好適な合成又は天然生分解性ポリマーを使用できる。そのようなポリマーは、当業者により認識可能であり、特定可能である。合成の生分解性ポリマーの非限定的な例には下記がある：ポリ（アミノ酸）及びポリ（ペプチド）などのポリ（アミド）；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、及びポリ（カプロラクトン）などのポリ（エステル）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（カーボナート）；並びにこれらの化学的誘導体（置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、当業者により型通りに実施される他の修飾）、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、スターチ、コラーゲン、及びヒアルロン酸、コポリマー、並びにこれらの混合物。これらのポリマー及び他の好適なポリマーの性質及び放出プロファイルは、公知であるか、容易に特定可能である。
【００６５】
種々の例において、ＰＬＧＡを含むコアが本明細書に記載される。ＰＬＧＡは周知であり、所望の速度での治療剤の送達及び放出に使用される充分に研究された疎水性の生分解性ポリマーである。
【００６６】
好ましくは、コアの形成に使用されるポリマーの少なくとも一部は、疎水性部分及び親水性部分を有する両親媒性である。疎水性部分はコアを形成でき、親水性領域は、ナノ粒子が免疫系による認識から逃れるのを助け、循環半減期を増大させるシェルを形成できる。両親媒性ポリマーの例には、疎水性ブロック及び親水性ブロックを有するブロックコポリマーがある。種々の例において、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマー、又はこれらの組み合わせから形成される。
【００６７】
任意の好適な親水性ポリマーが、ブロックコポリマーの親水性ブロックを形成できる。好適な親水性ポリマーの例には、多糖類、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸などがある。実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、ブロックコポリマーの親水性部分として作用するのに使用される親水性ポリマーである。
【００６８】
本明細書に記載されるナノ粒子は、どのような好適なサイズでもよい。一般的に、ナノ粒子は、約７５０ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、又は約２００ｎｍ未満などの約９９９ナノメートル未満の直径寸法である。さらに、或いは代りに、ナノ粒子は、約５ｎｍを超える直径寸法でよい。実施形態において、ナノ粒子は、直径が約３０ｎｍから約３００ｎｍである。実施形態において、ナノ粒子は、サイズに応じて、例えば、約２０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約１００ｎｍ、又は約１００ｎｍから約１５０ｎｍに分けられる。
【００６９】
本明細書に記載されるナノ粒子は、任意の好適なプロセスにより合成又は組立てできる。好ましくは、ナノ粒子は、プロセス変動を最小限にするために一工程で組み立てられる。一工程プロセスは、ナノ沈殿及び自己集合を含み得る。ナノ粒子は、有機溶媒に、好ましくは、沈殿に使用される水性溶媒に混和性である溶媒に疎水性成分を溶解又は懸濁させて、合成又は組立てできる。特定の例において、アセトニトリルが有機溶媒として使用されるが、任意の好適な溶媒を使用できる。親水性成分が、水、４ｗｔ％エタノールなどの好適な水性溶媒に溶解される。有機相溶液が水相溶液に滴加されて、疎水性成分をナノ沈殿させ、水性溶媒中でナノ粒子の自己集合を可能にすることができる。
【００７０】
ナノ粒子を形成する適切な条件を決定するプロセスは以下の通りになり得る。簡単に述べると、官能化ポリマー及びリン脂質を、有機溶媒混合物に同時溶解させることができる（実施形態において、リン脂質又は官能化リン脂質は水性溶媒に溶解される）。この溶液を、熱い（例えば、６５℃）水性溶媒（例えば、水、４ｗｔ−％エタノールなど）に滴加することができ、その結果溶媒が蒸発し、リン脂質に被覆された疎水性コアを有するナノ粒子が製造される。この段階で使用されるリン脂質は、ＰＥＧなどの親水性ポリマー成分も含んでよい、非官能化リン脂質と官能化リン脂質（例えば、標的化部分にコンジュゲートされている）の混合物でよい。高い（例えば、７５％超）レベルの化合物充填が得られる一連の条件が達成されると、造影剤又は追加の治療剤を、ナノ沈殿及びナノ粒子の自己集合において含めることができる。
【００７１】
製造されるナノ粒子のサイズは、疎水性コア成分と両親媒性シェル成分の比率を変更することにより変えることができる。ペグ化された脂質及び二層形成性リン脂質（ｐｈｏｓｈｐｈｏｌｉｐｄｓ）の選択は、生じるナノ粒子サイズに影響を与え得る。ペグ化された脂質は、ＰＥＧ鎖によりかけられる表面張力のため小さいミセル構造を形成することが知られている。ＮＰサイズは、ポリマーの長さを変えることによっても、混合時間を変えることによっても、有機と相（ｏｒｇａｎｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ）の比率を調整することによっても制御できる。異なる長さのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧから得たＮＰに関する先の経験は、ＮＰサイズが、短いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ３０００−ＰＥＧ７５０）での約２０ｎｍの最小から、長いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ１０００，０００−ＰＥＧ１０，０００）での約１５０ｎｍの最大まで増加することを示唆する。このように、ポリマーの分子量はサイズの調整に役立つだろう。
【００７２】
ＮＰ表面電荷は、適切に荷電した末端基を有する複数のポリマーを混合することにより制御できる。さらに、組成及び表面化学は、異なる親水性ポリマー長さを有するポリマー、枝分かれ状親水性ポリマーを混合することによっても、疎水性ポリマーを加えることによっても制御できる。
【００７３】
形成されると、ナノ粒子を回収し、遠心分離、遠心限外濾過などによって洗浄できる。凝集が起こる場合、ＮＰを、透析により精製し、より低速で長い遠心分離により精製し、界面活性剤などの使用により精製することができる。
【００７４】
回収されると、残存している溶媒を除去でき、粒子を乾燥させることができるが、それは早期の成分の崩壊又は放出を最低限にすることの助けになるはずである。ＮＰを、マンニトールなどの増量剤の使用と共に凍結乾燥しても、使用前の保存に他の方法で備えてもよい。
【００７５】
医薬組成物
本明細書に記載される化合物は、医薬組成物で提供できる。意図される投与様式に従って、医薬組成物は、好ましくは正確な用量の単一投与に好適な単位剤形で、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、又は懸濁剤などの固体、半固体、又は液体剤形の形態でよい。組成物は、治療上有効な量の本明細書に記載される化合物又はその誘導体を、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含み、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、又は希釈剤を含んでよい。薬学的に許容できるとは、生物学的又は他の点で有害でない物質であって、許容できない生物学的作用を起こさず、それが含まれる医薬組成物の他の成分と有害な方法で相互作用せずに、選択される化合物と共に個体に投与できる物質を意味する。
【００７６】
本明細書では、担体という用語は、医薬製剤に使用するためのあらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、又は当技術分野に周知である他の物質を包含する。組成物に使用する担体の選択は、組成物の意図される投与経路によるだろう。薬学的に許容できる担体の調製及びそれらの物質を含む製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．，２００５に記載されている。生理的に許容できる担体の例には、食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液、及び他の有機酸との緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール類；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）などの非イオン性界面活性剤がある。所望の治療的処置のためにそのような用量の投与を準備するために、本明細書に開示される組成物は、好都合には、担体又は希釈剤を含む組成物全体の重量に基づいて、約０．１％から９９％、及び特には１から１５重量％の１種以上の対象化合物の合計を含み得る。
【００７７】
非経口注射に好適な本明細書に記載される化合物又はその誘導体を含む組成物は、生理的に許容できる滅菌された水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液、又は乳液、及び滅菌された注射溶液又は分散液への再構成のための滅菌粉末を含んでよい。好適な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。
【００７８】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散化剤などの補助剤も含み得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより促進できる。等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなども含まれてよい。注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【００７９】
本明細書に記載される化合物又はその誘導体の経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤がある。そのような固体剤形において、本明細書に記載される化合物又はその誘導体は、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１種の不活性な通常の賦形剤（又は担体）、又は（ａ）充填剤若しくは増量剤、例えば、スターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴム、（ｃ）保水剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ポテトスターチ若しくはタピオカスターチ、アルギン酸、特定の複合シリケート、及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、及びグリセロールモノステアラート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイト、並びに（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、若しくはこれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含み得る。
【００８０】
類似の種類の固体組成物も、ラクトース又は乳糖などの賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、ソフト及びハードゼラチンカプセルに充填剤として使用され得る。
【００８１】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤などの固体剤形は、腸溶性コーティング及び当技術分野に公知である他のものなど、コーティング及びシェルにより調製できる。固体剤形は乳白剤を含んでよく、活性化合物又は複数の化合物を腸管の特定の部分で遅延した方式で放出するような組成であり得る。利用できる埋め込み組成物の例は、ポリマー性物質及びワックスである。活性化合物は、適切な場合、１種以上の上述の賦形剤と共にマイクロカプセル化された形態でもよい。開示される化合物はポリマー中に組み込まれてもよく、その例には、脳内腫瘍用のポリ（Ｄ−Ｌラクチド−コ−グリコリド）ポリマー；２０：８０モル比のポリ［ビス（ｐカルボキシフェノキシ）プロパン：セバシン酸］（グリアデルに使用される通り）；コンドロイチン；キチン；及びキトサンがある。
【００８２】
本明細書に記載される化合物又はその誘導体の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容できる乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ、及びエリキシルがある。活性化合物に加えて、液体剤形は、当技術分野で通常使用される不活性な希釈剤、例えば水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、とりわけ、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、又はこれらの物質の混合物などを含んでよい。
【００８３】
そのような不活性な希釈剤の他に、組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、着香剤、又は芳香剤などの追加の作用物質も含んでよい。
【００８４】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、追加の作用物質、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、及びトラガカント、又はこれらの物質の混合物などを含んでよい。
【００８５】
直腸投与用の本明細書に記載される化合物又はその誘導体の組成物は、任意選択で坐剤であり、通常の温度では固体だが体温では液体であり、そのため直腸又は膣内で融けて活性成分を放出するココアバター、ポリエチレングリコール、又は坐剤ワックスなどの好適な非刺激性の賦形剤又は担体と化合物を混合して調製できる。
【００８６】
本明細書に記載される化合物又はその誘導体の局所投与用の剤形には、軟膏、散剤、スプレー剤、及び吸入剤がある。本明細書に記載される化合物又はその誘導体は、滅菌条件下で、生理的に許容できる担体及び保存剤、緩衝液、又は要求され得る噴射剤と混合される。眼科用の製剤、軟膏、散剤、及び液剤も、組成物の範囲内にあると企図される。
【００８７】
組成物は、１種以上の本明細書に記載される化合物及び薬学的に許容できる担体を含み得る。本明細書では、薬学的に許容できる塩という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応など無しに対象の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に釣り合い、及びその意図される用途に効果的である、本明細書に記載される化合物又はその誘導体の塩並びに、可能な場合、本明細書に記載される化合物の双極性イオン形態を指す。塩という用語は、本明細書に記載される化合物の、比較的非毒性の無機及び有機の酸付加塩を指す。これらの塩は、化合物の単離及び精製の間にインサイチュで調製しても、別に、遊離塩基形態の精製された化合物を、好適な有機酸又は無機酸と反応させ、そのように形成された塩を単離して調製してもよい。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｈｔｈｙｌａｔｅ）メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、メタンスルホン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などがある。これらは、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属及びアルカリ土類金属に基づくカチオン並びに非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、非限定的にアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含み得る（Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６，１参照、少なくとも本明細書に教示される組成物に関して引用によりその全体として本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩の対象への投与は、疾患を治療するのに効果的な期間、治療上有効な量の本明細書に記載される化合物及び組成物又は本明細書に記載されるその薬学的に許容できる塩を利用して実施できる。
【００８９】
本明細書に記載される化合物及び組成物又は本明細書に記載されるその薬学的に許容できる塩の有効量は当業者により決定され得るが、１日あたり約０．５から約２００ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物の哺乳動物に対する例示的な用量を含み、単一投与でも、１日あたり１から４回などの個別の分割された投与量でも投与できる。或いは、用量は、１日あたり約０．５から約１５０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約０．５から１００ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約０．５から約７５ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約０．５から約５０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約０．５から約２５ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約１から約２０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約１から約１０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約２０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、１日あたり約１０ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物、又は１日あたり約５ｍｇ／体重ｋｇの活性化合物であり得る。有効量という表現は、方法における化合物の量を記載するのに使用される場合、所望の薬理学的効果又は他の効果を達成する化合物の量を指し、例えば酵素阻害をもたらす量を指す。
【００９０】
当業者は、特定の対象に対する具体的な投与量レベル及び用量の頻度を変更でき、種々の因子、例えば、利用される具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、対象の人種、年齢、体重、全般的な健康、性別、及び食事、投与の様式及び時間、排泄速度、薬物組み合わせ、並びに特定の病態の重症度によることを理解するだろう。
【００９１】
活性アッセイ
本明細書に記載される化合物の抗癌剤としての活性は、標準的なアッセイ、例えば、ＨＰＬＣアッセイで測定できる。本明細書に記載されるアッセイを利用して決定される化合物の活性は、ＩＣ５０で報告できる。本明細書では、ＩＣ５０は、応答を測定するアッセイにおいて、最大応答の５０％阻害を達成する特定の試験化合物の量、濃度、又は用量を指す。
【００９２】
特定の態様において、開示される化合物及び組成物は実際に合成される必要はなく、その代わり、癌関連酵素との相互作用を予測し特性化する分子モデリング技法の標的として使用することができる。これは、構造情報及びコンピューターモデリングにより達成される。コンピューターモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造の可視化及び酵素と相互作用する新化合物の合理的な設計を可能にする。酵素の三次元構造は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶解析又はＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする（例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄ）。コンピューターグラフィックスシステムは、新化合物がどのように酵素に結合するかの予測を可能にし、完璧な結合特異性まで化合物の構造の実験的操作を可能にする。一方又は両方に小さな変化が加えられる場合に相互作用がどうなるかという予測には、分子力学ソフトウェア及び、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニュー方式インターフェースを接続した計算集約型コンピューターが必要である。
【００９３】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子のお互いの挙動のインタラクティブな構築、修飾、可視化、及び分析を可能にする。所望の方法で酵素と相互作用する化合物をインシリコで特定すると、実際の化合物を合成して、本明細書に開示される通りアッセイできる。
【００９４】
使用方法
対象の癌を治療、予防、又は改善する方法が本明細書に提供される。方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される１種以上の化合物若しくは組成物又はその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩は、ヒト、例えば、小児及び高齢者の集団の癌、並びに動物の癌を治療するのに、例えば獣医学的用途に有用である。開示される方法は、任意選択で、癌の治療を必要としている、又は癌の治療を必要とし得る患者を特定することを含み得る。本明細書に記載される化合物及び組成物により治療可能な癌の種類の例には、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、消化器癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、及び精巣癌がある。さらなる例には、肛門、胆管、骨、骨髄、腸（結腸及び直腸を含む）、眼、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、子宮頚部、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋、血液細胞（リンパ球及び他の免疫系細胞を含む）の癌及び／又は腫瘍がある。治療に企図される具体的な癌には、癌腫、カポジ肉腫、メラノーマ、中皮腫、軟部肉腫、膵臓癌、肺癌、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、及びその他）、及びリンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、並びに多発性骨髄腫がある。開示される化合物を投与することによる乳癌の治療が特に好ましい。
【００９５】
本明細書に開示される化合物を利用して開示される方法により治療されることが好ましい癌は、肺、乳房、脳、卵巣、リンパ腫、白血病、頭頚部、膵臓、及び子宮頚部、結腸及び直腸、子宮内膜（ｅｎｄｒｏｍｅｔｒｉａｌ）、食道（ｅｓｏｐｈａｇｏｕｓ）、肝臓、陰茎、皮膚−メラノーマ、皮膚−非メラノーマ、胃、精巣、膣、子宮、外陰部、副鼻腔癌、口腔咽頭、及び喉頭癌である。
【００９６】
本明細書に記載される治療又は予防の方法は、１つ以上の追加の薬剤（例えば、抗癌剤又は電離放射線）による治療をさらに含み得る。１つ以上の追加の薬剤と、本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩は、同時の投与、並びに数日まで離れた時間をあけた順序を含む、どのような順序でも投与できる。方法は、１つ以上の追加の薬剤及び／又は本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩の２つ以上の投与も含み得る。１つ以上の追加の薬剤及び本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩の投与は、同じ経路によっても、異なる経路によってもよい。１つ以上の追加の薬剤により治療する場合、本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩は、１つ以上の追加の薬剤を含む医薬組成物に合わせることができる。
【００９７】
例えば、本明細書に記載される化合物若しくは組成物又はその薬学的に許容できる塩は、１３−シス−レチノイン酸、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−フロオロウラシル、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アキュテイン、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン、アドルシル、アグリリン、Ａｌａ−Ｃｏｒｔ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ、アルケラン、オール・トランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラネスプ、アレディア、アリミデックス、アロマシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、キャンパス、カンプトサー、カンプトテシン−１１、カペシタビン、Ｃａｒａｃ、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチンウェハー、カソデックス、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボルム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン、シタラビン、リポソーマルシタラビン、サイトサール−Ｕ、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、リポソーマルダウノルビシン、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、デカドロン、Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ、デルタゾン、デニロイキンジフチトクス、デポサイト、デキサメタゾン、デキサメタゾン酢酸エステル、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、デキサゾン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Ｄｉｏｄｅｘ、ドセタキセル、ドキシル、ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシン、ドロキシア、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ、Ｄｕｒａｌｏｎｅ、エフデックス、エリガード、エレンス、エロキサンチン、エルスパー、Ｅｍｃｙｔ、エピルビシン、エポエチンα、エルビタックス、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、Ｅｔｈｙｏｌ、エトポフォス、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｕｌｅｘｉｎ、エビスタ、エキセメスタン、フェアストン、ファスロデックス、フェマーラ、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ、フルダラビン、フルオロプレックス、フロオロウラシル、フロオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール、グリーベック、リュープロン、リュープロンデポ、マチュレーン、マキシデックス、メクロレタミン、−メクロレタミンハイドロクロリン（Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｎｅ）、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ、メドロール、メゲース、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ、メトトレキサート、メトトレキサー��ナトリウム、メチルプレドニゾロン、Ｍｙｌｏｃｅｌ、レトロゾール、Ｎｅｏｓａｒ、ニューラスタ、Ｎｅｕｍｅｇａ、ニューポジェン、ニランドロン、ニルタミド、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス、ノバントロン、オクトレオチド、オクトレオチド酢酸塩、Ｏｎｃｏｓｐａｒ、オンコビン、オンタック、Ｏｎｘａｌ、オプレベルキン（Ｏｐｒｅｖｅｌｋｉｎ）、オラプレッド、オラソン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パンレチン、パラプラチン、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−イントロン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニンマスタード、プラチノール、プラチノール−ＡＱ、プロドニゾロン、プレドニゾン、プレロン、プロカルバジン、プロクリット、プロロイキン、カルムスチンインプラントの付いたプロリフェプロスパン２０、プリネトール、ラロキシフェン、リウマトレックス、リツキサン、リツキシマブ、Ｒｏｖｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス、ルビドマイシン塩酸塩、サンドスタチン、サンドスタチンＬＡＲ、サルグラモスチム、ソル・コーテフ、ソル・メドロール、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ターグレチン、タキソール、タキソテール、テモダール、テモゾロミド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド、ＴｈｅｒａＣｙｓ、チオグアニン、チオグアニンタブロイド、Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ、チオテパ、ＴＩＣＥ、Ｔｏｐｏｓａｒ、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、Ｔｒｅｘａｌｌ、トリセノックス、ＴＳＰＡ、ＶＣＲ、ベルバン、ベルケイド、ベペシド、ベサノイド、Ｖｉａｄｕｒ、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサーＰｆｓ、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＬＢ、ＶＰ−１６、Ｖｕｍｏｎ、ゼローダ、ザノサー、ゼヴァリン、ザインカード、ゾラデックス、ゾレドロン酸、ゾメタ、グリアデルウェハー、グリベック、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、ハロテスチン、ハーセプチン、ヘキサドロール、ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン、ハイドレア、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ酢酸エステル、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、ハイドロコートンリン酸エステル、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン、イダルビシン、Ｉｆｅｘ、ＩＦＮ−α、イホスファミド、ＩＬ２、ＩＬ−１１、イマチニブメシル酸塩、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（インターフェロンα−２ｂ）、ロイコボリン、リューケラン、リューカイン、ロイプロリド、リューロクリスチン、ロイスタチン、リポソーマルＡｒａ−Ｃ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、メチコルテン、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ、ＭＴＣ、ＭＴＸ、マスタージ��ン、ムスチン、ムタマイシン、マイレラン、イレッサ、イリノテカン、イソトレチノイン、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ、ラナコート、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びＬＣＲなどの追加の抗癌剤を有する医薬組成物中に合わせてよい。追加の抗癌剤には、例えば、抗体などの生物製剤があり得る。
【００９８】
多くの腫瘍及び癌では、腫瘍又は癌細胞中にウイルスゲノムが存在している。例えば、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）は、いくつかの哺乳類の悪性腫瘍と関連している。本明細書に開示される化合物は、単独でも、抗癌剤若しくは抗ウイルス剤、例えば、ガンシクロビル、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）などとの組み合わせでも使用でき、細胞形質転換を起こし得るウイルスに感染している患者を治療し、且つ／又は細胞中のウイルスゲノムの存在に関連している腫瘍若しくは癌を有する患者を治療できる。本明細書に開示される化合物は、腫瘍性疾患のウイルス系治療と組み合わせても利用できる。例えば、化合物は、非小細胞肺癌の治療において変異型単純ヘルペスウイルスと共に利用できる（Ｔｏｙｏｉｚｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＣＰ３４．５  ｍｕｔａｎｔ（ＨＳＶ−１７１６）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，１０（１８）：１７）。
【００９９】
ミトコンドリアへのＤＣＡ送達は、乳酸レベルの著しい低下をもたらし、ＭＩＴＯ−ＤＣＡ処理癌細胞からの腫瘍抗原による活性化時の樹状細胞（ＤＣ）からのインターロイキン−１２の分泌により立証されるＤＣ表現型の調節に重要な役割を果たした。ミトコンドリア代謝阻害剤（例えば、ＩＭ）のミトコンドリアへの標的化は、効率よい抗腫瘍免疫応答の誘導につながり、そのため解糖阻害を免疫系と合わせて腫瘍を破壊するコンセプトを導入できる。したがって、開示される化合物は、（同じ組成物中で、共投与され、又は治療レジメンの一部として投与される）ＣＰＧ−ＯＤＮなどの抗癌免疫療法と組み合わせることができる。さらなる例において、開示される化合物は、（同じ組成物中で、共投与され、又は治療レジメンの一部として投与される）シプリューセル−Ｔ（プロベンジ）、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、又はトラスツズマブと組み合わせることができる。さらなる例において、開示される化合物は、（同じ組成物中で、共投与され、又は治療レジメンの一部として投与される）インターロイキン−２及びインターフェロン−αと組み合わせることができる。
【０１００】
対象の腫瘍細胞を殺す方法も本明細書に記載される。方法は、腫瘍細胞を、有効量の本明細書に記載される化合物又は組成物と接触させることを含み、任意選択で腫瘍細胞に有効量の電離放射線を照射する工程を含む。さらに、腫瘍の放射線療法の方法が本明細書に提供される。方法は、腫瘍細胞を、有効量の本明細書に記載される化合物又は組成物と接触させること、及び腫瘍に有効量の電離放射線を照射することを含む。本明細書では、電離放射線という用語は、充分なエネルギーを有するか、又は核の相互作用によりイオン化を生み出すのに充分なエネルギーを生み出すことができる粒子又は光子を含む放射線を指す。電離放射線の例はＸ線である。有効量の電離放射線は、本明細書に記載される化合物と組み合わせて投与される場合に細胞の損傷又は死の増加を生み出す線量の電離放射線を指す。電離放射線は、放射線標識された抗体及び放射性同位元素の投与を含む、当技術分野に公知である方法に従って送達できる。
【０１０１】
本明細書に記載される方法及び化合物は、予防的処置と治療的処置の両方に有用である。本明細書では、治療すること又は治療という用語は、予防；発症の遅延；発症後の徴候又は症状の増悪の減少、根絶、又は遅延；及び再発の予防を含む。予防的な用途では、治療上有効な量の本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩は、対象に、発症前に（例えば、癌の明らかな徴候の前に）、早期発症の間に（例えば、癌の初期の徴候及び症状と同時に）、又は癌の確立された発達の後で投与される。予防的投与は、感染の症状の発現前に、数日から数年間起こり得る。予防的投与は、例えば、前癌病変を呈する対象、早いステージの悪性腫瘍と診断された人々の化学予防治療において、及び特定の癌へのかかりやすさ（例えば、家族、人種、及び／又は職業上）を有する下位集団のために利用できる。治療的処置は、対象に、治療上有効な量の本明細書に記載される化合物及び組成物又はその薬学的に許容できる塩を、癌が診断された後に投与することを含む。
【０１０２】
キット
対象の癌を治療又は予防するキットも本明細書に提供される。キットは、本明細書に記載される化合物又は組成物のいずれを含んでもよい。例えば、キットは、式Ｉの化合物を含んでよい。キットは、１種以上の抗癌剤（例えば、パクリタキセル）をさらに含んでよい。キットは、本明細書に記載される化合物又は組成物のいずれの経口製剤を含んでもよい。キットは、さらにキットを使用するための説明書を含んでよい（例えば、対象を治療するための説明書）。
【０１０３】
以下の実施例は、本明細書に記載される方法及び化合物の特定の態様をさらに説明するものであり、請求項の範囲を限定しないものとする。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、開示された主題による方法及び結果を説明するために以下に述べられる。これらの実施例は、本明細書に開示される主題の全態様を含まず、代表的な方法及び結果を表すものとする。これらの実施例は、当業者に明らかな本発明の等価物及び変形物を除外しないものとする。
【０１０５】
数（例えば、量、温度など）に関して正確度を保証するように努力したが、いくらかの誤差及び偏差は説明されなければならない。特記されない限り、部は重量部であり、温度は℃で表されるか、又は周囲温度であり、圧力は大気圧又はその付近である。反応条件、例えば、成分濃度、温度、圧力、並びに記載されるプロセスから得られる生成物の純度及び収率を最適にするために利用できる他の反応範囲及び条件の変形版及び組み合わせが数多くある。
【０１０６】
全ての化学薬品は、特記されない限り、受け取って、さらに精製せずに使用した。ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）無水物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）、６−ブロモヘキサン酸、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、３−ブロモプロパノール、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）二ナトリウム塩水和物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＪＣ−１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから調達した。ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８アネキシンＶ／Ｄｅａｄ  ｃｅｌｌアポトーシスキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。乳酸アッセイキットは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡから得た。ＰｒｏｍｅｇａのＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）ルミネセンス細胞生存率アッセイキットを使用して、細胞ＡＴＰ含量を定量化した。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αサイトカインは、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡマウス酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。超純粋リポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡから購入した。樹状細胞（ＤＣ）精製のためのＣＤ１１ｃマイクロビーズは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＡ  ＵＳＡから購入した。エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）及び高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）−ＥＳＩは、それぞれ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  １  ｐｌｕｓ及びＴｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ  ＥＬＩＴＥ装置で記録した。
【０１０７】
蒸留水は、０．２２μｍフィルターを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ水精製システム（１８．２ＭΩ）に通して精製した。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ分光計で記録し、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、５００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ分光計で記録した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、多波長ＵＶ−可視検出器及び蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ装置で実施した。フローサイトメトリー試験は、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ６を利用してデジタル取得を備えたＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで実施した。プレートリーダー分析は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーで実施した。共焦点像は、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１共焦点顕微鏡で記録した。Ｘ線強度データは、１００ＫでＢｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ  ＣＣＤ回折計で収集した。
【０１０８】
ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、及びＤＵ１４５は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から調達した。ヒト骨髄由来ＭＳＣ細胞は、Ｌｏｎｚａから購入した。ＤＵ１４５細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で成長させた。ＬＮＣａＰ及びＰＣ３細胞を、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で成長させた。ＭＳＣ細胞を、ＭＳＣ成長キット低血清成分及び２％ＦＢＳを補ったＭＳＣ基本培地中で成長させた。細胞を３から４日ごとに継代し、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５では２０、ＭＳＣでは１０の継代数に達すると、凍結されたストックから再開した。
【０１０９】
動物はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、米国実験動物飼育公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）の「実験動物の管理と使用に関する指針」、動物福祉法（ＡＷＡ）、並びに他の該当する連邦及び州の指針に従って扱った。本明細書に呈示される全ての動物研究は、ジョージア大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。
【０１１０】
実施例１：ＴＰＰ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨの合成
６−ブロモヘキサン酸（２．０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）とＴＰＰ（２．８ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、アセトニトリル中で２４時間還流に加熱した。溶媒を蒸発乾固させた。生じた残渣をヘキサン−ジエチルエーテル（３×３０ｍＬ）で洗浄し、それに続いて真空乾燥させると、白色固体を純粋な生成物として与えた。収率：９１％（４ｇ）。融点：２００〜２０５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ９．３（ｓ，１Ｈ），７．６−７．８（ｍ，１５Ｈ），３．５（ｔ，２Ｈ），２．３（ｔ，２Ｈ），１．６（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７５，１３５，１３３．６，１３０．６，１１８．５，３４．２，２９．３７，２３．９，２２．８，２２．２９，２１．９。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２４．３４．ｐｐｍ。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ２４Ｈ２６Ｏ２Ｐ＋の計算値、３７７．１６６５；実測値、３７７．１６２９。
【０１１１】
実施例２：ＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３の合成
ＴＰＰ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ（０．５０ｇ、１．１  ｍｍｏｌ）、トリス（０．１５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、及びＥＥＤＱ（０．３２ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、エタノールに溶かした。この混合物を５０℃で１２時間撹拌し、それに続いて真空下で乾燥させた。粗製の混合物を、エタノール／ＣＨ２Ｃｌ２／ジエチルエーテルを使用して３〜４回再結晶すると、ＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３の白色固体を、収率８６％（０．５２ｇ）で与えた。融点：１１５〜１２０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．７（ｍ，１５Ｈ），３．７（ｓ，６Ｈ），３．５（ｔ，２Ｈ），２．４（ｔ，２Ｈ），１．７（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７５．６，１３５．２，１３３．６，１３０．６，１１８．４，１１３．２，６４．１，６２．３，３６．２，２９．３，２４．９，２２．５，２１．５ｐｐｍ。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２４．２８ｐｐｍ。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ２８Ｈ３５ＮＯ４Ｐ＋の計算値、４８０．２２９８；実測値、４８０．２２４３。
【０１１２】
実施例３：ＭＩＴＯ−ＤＣＡの合成
ＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３（０．５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を、窒素流を備えた丸底フラスコ中で調製した。ＤＣＡ無水物（２．１３ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を、溶液に滴加した。反応物を室温で一晩撹拌し、反応の進行を、ＣＨ２Ｃｌ２とＣＨ３ＯＨの混合物を使用して薄層クロマトグラフィーによりモニターした。溶媒を蒸発乾固させ、ＭＩＴＯ−ＤＣＡを、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ、９５：５）を使用して精製した。収率、３５％（０．３ｇ）。融点：８０〜８５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．３（ブロードｓ，１Ｈ），７．８−７．７（ｍ，１５Ｈ），６．２２（ｓ，３Ｈ），４．７２（ｓ，６Ｈ），３．５０（ｔ，２Ｈ），２．３８（ｔ，２Ｈ），１．６９（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７５．２，１６３．８，１３５．２，１３３．６，１３０．６，１１８．５，６４．６，６４．５，５７．９，３６．３，２９．５，２４．４，２２．８，２０．９ｐｐｍ。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２４．５９ｐｐｍ。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ３４Ｈ３５Ｃｌ６ＮＯ７Ｐ＋の計算値、８１０．０２７７；実測値、８１０．０２５８。Ｘ線分析に好適な単結晶を、ＣＨ２Ｃｌ２とジエチルエーテルの混合物中で成長させた。
【０１１３】
実施例４：ＴＰＰ−（ＣＨ２）３−ＯＨの合成
３−ブロモプロパノール（１．０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）とＴＰＰ（２．１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）中の混合物を、２４時間還流に加熱した。生じた白色沈殿物を、フリットガラスに通して濾過し、それに続いてジエチルエーテル（３×３０ｍＬ）で洗浄した。白色固体を真空下で乾燥させると、ＴＰＰ−（ＣＨ２）３−ＯＨの純粋な生成物を得た。収率、６１％（１．７ｇ）。融点：２３５〜２４０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．６５−７．８０（ｍ，１５Ｈ），４．９４（ｔ，１Ｈ），３．７０−３．８３（ｍ，４Ｈ），１．８１（ｍ，２  Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １３５．０９，１３３．４７，１３０．５１，１１８．７２，６０．４０，２５．９２，２０．４３ｐｐｍ。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２４．７７ｐｐｍ。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ２１Ｈ２２ＯＰ＋の計算値、３２１．１４０３；実測値、３２１．１４０３。
【０１１４】
実施例５：ＴＰＰ−ＤＣＡの合成
ＴＰＰ−（ＣＨ２）３−ＯＨ（０．２５ｇ，０．６２３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液を、窒素流を備えた丸底フラスコ中で調製した。ＤＣＡ無水物（０．４５ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を溶液に滴加した。反応物を室温で一晩撹拌し、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、９０：１０）によりモニターした。溶媒を蒸発乾固させると糊状の塊を得て、それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、９０：１０）を利用してさらに精製した。収率、４８％（０．１５ｇ）。融点：７５〜８０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．６８−７．８９（ｍ，１５Ｈ），６．１７（ｓ，１Ｈ），４．６４（ブロードｔ，２Ｈ），４．１３（ブロードｔ，２Ｈ），２．０６（ブロード，２Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １６４．２７，１３５．１７，１３３．７６，１３０．４９，１１８．２７，６６．０５，６４．５４，３０．９０，２２．１６ｐｐｍ。３１Ｐ（ＣＤＣｌ３）ＮＭＲ：２５．０１ｐｐｍ。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ２３Ｈ２２Ｃｌ２Ｏ２Ｐ＋の計算値、４３１．０７２９；実測値、４３１．０６８７。
【０１１５】
実施例６：ＨＰＬＣ試験
ＨＰＬＣ試験を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ装置を利用して実施し、試料の純度を調べた。５ｍＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡのＤＭＳＯ溶液５μＬを、Ｚｏｅｂａｘ  Ｃ１８カラム及び５０：５０アセトニトリル：イソプロパノール−１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を移動相として使用して注入した。これらの実験に利用した波長は２６８ｎｍであった。ＨＰＬＣは、化合物の純度を確認する単一のピークを示した。
【０１１６】
実施例７：溶解度及び安定性試験
ＭＩＴＯ−ＤＣＡの水に対する溶解度を、２μＭから５ｍＭの異なる濃度のＭＩＴＯ−ＤＣＡをＤＭＳＯ（０．１〜２．５％）−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に調製して確認した。全濃度で、ＭＩＴＯ−ＤＣＡは透明であった。ＭＩＴＯ−ＤＣＡの溶解度は、有機溶媒中でＤＣＡの溶解度よりはるかに高く、ミトコンドリア取り込みのためのその親油性を示した。
【０１１７】
安定性試験には、５ｍＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡ又はＴＰＰ−ＤＣＡのＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ中の溶液を、室温で３６時間インキュベートした。この溶液をＥＳＩ−ＭＳ実験に使用して、ＴＰＰ化合物の劣化挙動を確認した。
【０１１８】
実施例８：単結晶Ｘ線回折
Ｘ線回折に好適なＭＩＴＯ−ＤＣＡの無色結晶を、ＭＩＴＯ−ＤＣＡの２５℃ジクロロメタン中の飽和溶液へのジエチルエーテルのゆっくりとした拡散により成長させた。単結晶を、ガラス繊維の上に載せた。強度データは、１００Ｋで、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ  ＣＣＤ回折計により、ＳＭＡＲＴソフトウェアを利用し、Ｍｏ−Ｋα線（λ＝０．７１０７３Å）により、ωスキャン技法を利用して収集した。データは、１４６４フレーム中で１０秒の曝露で収集した。ＳＡＩＮＴソフトウェアをデータ統合に使用した。構造を、ＳＨＥＬＸＴＬ  ６．１ソフトウェアパッケージを利用して直接法により解析した。非水素原子散乱因子を、文献の表から採用した。非水素原子を、逐次差分（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）フーリエマップ計算から配置した。経験的な吸収補正をＳＡＤＡＢＳにより適用した。分子のカチオン中の１つのＯ原子及び２つのＣｌ原子が、Ｏ（５）（１セット）及びＯ（５’）（別なセット）として標識されたＯ原子に対して、それぞれＣｌ（３），Ｃｌ（４）（１セット）及びＣｌ（３’），Ｃｌ（４’）（別なセット）として標識された２つのＣｌ原子の２つのセット中で乱れていることが分かった。これらの２つのセットのそれぞれを、適切な制約及び精密化された占有率によりＰＡＲＴコマンドを利用して分ける。Ｏ（５）のセットは７３．３７９％の占有率を有する一方で、他方の（Ｏ（５’））は２６．６２１％の占有率を有する。Ｃｌ（３），Ｃｌ（４）のセットは８１．９９７％の占有率を有する一方で、他方の（Ｃｌ（３’），Ｃｌ（４’））は１８．００３％の占有率を有する。各精密化の最終サイクルで、全非水素原子を、異方性変位パラメーターで精密化した。水素原子の位置を計算し、ｍÅのＣ−Ｈ結合長（ＣＨ基ではｍ＝１．００、ＣＨ２基ではｍ＝０．９９、ＣＨ３基ではｍ＝０．９８、Ｐｈ−Ｈ基ではｍ＝０．９５）を仮定してそれらが結合している炭素に載せた。水素原子温度因子を、それらが結合しているＣ原子の等方性温度因子のｎ倍（ＣＨ及びＣＨ２基でｎ＝１．２、ＣＨ３基でｎ＝１．５、Ｐｈ−Ｈ基でｎ＝１．２）で固定した。ＭＩＴＯ−ＤＣＡの透視図は、ＯＲＴＥＰにより得た。ＭＩＴＯ−ＤＣＡの結晶構造データは、ケンブリッジ結晶学データセンターから受入れ番号ＣＣＤＣ  ９４０３８３でアクセスできる。
【０１１９】
実施例９：ＪＣ１アッセイ
ＰＣ３細胞を、ライブセルイメージングガラスボトムディッシュ上で、１×１０６細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃で一晩成長させた。細胞を、１５０μＭのＮａ−ＤＣＡ、１５０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡにより、３７℃で６時間処理した。ＪＣ−１試薬の溶液（ＲＰＭＩ中１０μｇ／ｍＬ）を加え、インキュベーションを３７℃で２０分間実施した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ライブセルイメージングを、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地で実施した。
【０１２０】
実施例１０：ＭＴＴアッセイ
ＭＩＴＯ−ＤＣＡ、ＴＰＰ−ＤＣＡ、Ｎａ−ＤＣＡ、及びＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３の細胞傷害性挙動を、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞に対してＭＴＴアッセイを利用して評価した。細胞（ＰＣ３、ＤＵ１４５、及びＭＳＣ細胞では２０００細胞／ウェル；ＬＮＣａＰでは５０００細胞／ウェル）を、９６−ウェルプレート上で１００μＬの所望の培地に播種し、２４時間インキュベートした。細胞を、種々の濃度で異なるＤＣＡ化合物及びＴＰＰ−トリス−（ＯＨ）３により処理し、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、細胞を２０μＬのＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）により５時間処理した。培地を除去し、細胞を、１００μＬのＤＭＳＯで溶解させ、紫色のホルマザンの吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーを使用して５５０ｎｍで記録した。各ウェルを三連で実施した。全実験を３回繰り返した。細胞傷害性を、曝露されなかった対照に対する平均パーセンテージ増加±ＳＤで表した。対照値は、０％細胞傷害性又は１００％細胞生存率に設定した。細胞傷害性データ（適切な場合）をＳ字状曲線にフィッティングし、３パラメーターロジスティックモデルを使用してＩＣ５０を計算したが、それは、未処理の対照に比べて５０％阻害を起こす化学療法剤の濃度である。平均ＩＣ５０は、実験条件下で細胞成長を５０％減少させる薬剤の濃度であり、再現性があり統計的に有意な少なくとも３つの独立な測定値から得た平均である。ＩＣ５０値を、±９９％信頼区間で報告した。この分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）により実施した。
【０１２１】
実施例１１：アポトーシス検出
ＰＣ３及びＭＳＣ細胞を、１×１０６細胞／ｍＬの密度で６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩成長させた。細胞を、５０μＭのＮａ−ＤＣＡ、１５０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び１５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡにより３７℃で１２時間処理した。陽性対照として、アポトーシスにはエトポシド（１００μＭ、インキュベーション時間：１２時間）、及び壊死にはＨ２Ｏ２（１ｍＭ、インキュベーション時間：４５分）を使用した。細胞を、トリプシン処理し、繰り返し洗浄し、１，８００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞密度を測定し、細胞を、１×アネキシン結合緩衝液におよそ１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、アッセイあたり１００μＬを有するに十分な体積を準備した。１００μＬの細胞懸濁液、５μＬのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８アネキシンＶ、及び１μＬの１００μｇ／ｍＬのＰＩ標準溶液を加え、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション期間の後、４００μＬの１×アネキシン結合緩衝液を各試料に加え、試料を氷上に保ちながら穏やかに混合し、試料を直ちにフローサイトメーターで分析した。
【０１２２】
実施例１２：細胞の乳酸及びＡＴＰ測定
ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及びＭＳＣ細胞を、１２ウェルプレートの各ウェルに１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、５％ＣＯ２下３７℃で一晩成長させた。細胞を、１５０μＭのＮａ−ＤＣＡ、１５０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡにより３７℃で６時間処理した。６時間後、培地を除去し、細胞をホモジナイズした。溶解物を酵素と基質の標準試薬混合物に加え、３０分間インキュベートした。乳酸濃度を、４５０ｎｍでＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーを使用し、標準曲線と比べて測定した。
【０１２３】
実施例１３：ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）ルミネセンスＡＴＰ定量化
ＰＣ３又はＭＳＣ細胞を、１００μＬ培地中で使用する照度計に適合した９６−ウェルプレートに、ウェルあたり１０，０００細胞の密度で播種した。ＭＩＴＯ−ＤＣＡ（２０μＭ）、ＴＰＰ−ＤＣＡ（６０μＭ）、及びＮａ−ＤＣＡ（６０μＭ）を実験のウェルに加え、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で３時間インキュベートした。細胞無しで培地を含む対照ウェルを準備して、バックグラウンドルミネセンスの値を得た。次いで、プレートを室温でおよそ３０分間平衡化させた。各ウェルに存在する細胞培地の体積と等しい体積のＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）試薬を加え、この混合物を、振とう器を使用して２分間充分に混合し、細胞溶解を引き起こした。プレートを室温で１０分間インキュベートして、ルミネセンスシグナルを安定化した。プレートリーダーを使用して、ルミネセンスを記録した。ＡＴＰ定量化は、ＡＴＰ二ナトリウム塩水和物を使用した標準曲線から実施した。
【０１２４】
実施例１４：ＢＭＤＣの生成
ＢＭＤＣは、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。安楽死の後、骨髄を、マウスの大腿骨をＲＰＭＩ中で流して単離した。収集した細胞を１２５０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを２ｍＬの氷冷緩衝液に再懸濁させて、赤血球を溶解させた。細胞を計数し、再懸濁させて、１．５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度でペトリ皿に移した。この培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を加えて、ＢＭＤＣを生成させた。培地を、第２日及び第４日に交換した。第６日に、細胞をさらに処理して、製造者の説明に従って、抗ＣＤ１１ｃ抗体を使用して、細胞をＭＡＣＳビーズ精製に付すことにより、純粋なＤＣ集団を得た。ＢＭＤＣをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、ＣＤ１１ｃの表面発現を測定することによりＤＣ純度を試験した。
【０１２５】
実施例１５：ＥＬＩＳＡによる抗腫瘍免疫試験
ＰＣ３細胞を、０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で６ウェルプレートに播種し、１２時間成長させた。細胞を、１５０μＭのＮａ−ＤＣＡ、１５０μＭのＴＰＰ−ＤＣＡ、及び５０μＭのＭＩＴＯ−ＤＣＡと共に、３７℃で２４時間インキュベートした。ＰＣ３上清を、新たに調製したＢＭＤＣ（０．５×１０６細胞／ｍＬ）に加えた。ＢＭＤＣを、上清と共に、３７℃で２４時間インキュベートした。さらに、ＬＰＳのみ（１００ｎｇ／ｍＬ）をＤＣ培養物に加えた。ＤＣを１，８００ＲＰＭで３分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡを、製造者のプロトコルに従って、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γに対して上清で実施した。簡単に述べると、抗体がコートされたプレートをＰＢＳ中１０％ＦＢＳにより室温で１時間ブロックし、それに続いて洗浄した。ＢＭＤＣ上清を、プレート上で、１時間室温でインキュベートした。次いで、直ちに洗浄し、サイトカイン−ビオチンコンジュゲート及びストレプトアビジン標準溶液と共に連続してインキュベートした。最後に、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（１００μＬ）を含む基質試薬を各ウェルに加え、３０分間インキュベートし、０．１ＭのＨ２ＳＯ４を含む５０μＬ停止液を加えて反応を停止させた。ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴウェルプレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎｍで記録した。
【０１２６】
実施例１６：ＰＬＧＡ−トリス−ＤＣＡの合成
ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を、エステル結合により疎水性ＰＬＧＡポリマーに共有結合した。高い再現性及びポリマープラットフォームへの薬物のより良好な充填効率を達成するために、ＰＬＧＡを、薬物を共有結合する３つの部位を有するトリス分子により官能化した。個々の薬物は、単純なイーター（ｅａｔｅｒ）結合を利用してＰＬＧＡ−トリスプラットフォームに結合させた。ＰＬＧＡ−トリス−ＤＣＡの例の合成を以下に示した。
【化１２】
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【０１２７】
実施例１７：ＰＬＧＡ−トリスの合成
ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（固有粘度ｄ／Ｌ  ０．１５−０．２５）（５００ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）とＮＨＳ（１２．３７ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＤＣＣ（２０．３４ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を、反応混合物に滴加した。反応物を０℃から室温で１２時間撹拌した。沈殿したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）副生成物を濾去し、ロータバップを使用して溶液を蒸発させた。この残渣を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。トリエチルアミン（１８．１３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びトリス（２２．０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の１０ｍＬのＤＭＦ中の溶液を、ゆっくりと上記反応混合物に加えた。この反応混合物を、激しく撹拌しながら２４時間室温に保った。溶媒を蒸発乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、濾過し、ジエチルエーテル及びメタノール（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ジエチルエーテル：１：５：４）で沈殿させた。このプロセスを５回繰り返した。収率、１９０ｍｇ、３７％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ｐｐｍ  ５．２０（ｍ），４．８１（ｍ），４．２８（ｂｒ），３．６６（ｓ），１．５６（ｄ）。
【０１２８】
実施例１８：ＰＬＧＡ−トリス−（ＤＣＡ）３の合成
ＰＬＧＡ−トリス（１００ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１０．１４ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の混合物を、室温で３０分間撹拌した。ジクロロアセチルクロリド（４９．１３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を、反応混合物に滴加した。反応物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を蒸発乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ジエチルエーテル及びメタノール（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ジエチルエーテル：１：５：４）で沈殿させた。このプロセスを５回繰り返した。収率、４０ｍｇ、３８％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００  ＭＨｚ）：δ  ｐｐｍ  ６．０７（ｓ），６．０３（ｓ），５．２２（ｍ），４．８２（ｍ），１．５９（ｍ）。
【０１２９】
実施例１９：ＰＳＭＡ標的化ポリマーの合成
ＰＳＭＡ標的化ポリマーの合成を以下に示す。ＰＳＭＡは標的化部分（ＴＣ）である。本明細書に開示される化合物は、図９に示されるように、生じたＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＤＣＬのナノ粒子中にカプセル化することができる。
【化１３】
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【０１３０】
本明細書に記載される実施例及び実施形態が説明目的のみのものであり、それに照らして種々の改良形態又は変更形態が当業者に示唆され、本願及び添付される特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれるものとすることを理解されたい。さらに、本明細書に開示されるあらゆる発明又はその実施形態のあらゆる要素又は限定が、あらゆる及び／若しくは全ての他の要素若しくは限定（個別若しくは任意の組み合わせで）又は本明細書に開示されるあらゆる他の発明若しくはその実施形態と組み合わせることができ、そのような組み合わせ全てが、本発明の範囲と共にそれに限定されずに企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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