(57)【要約】  本発明は、β−カテニンに関し、骨粗鬆症、癌または糖尿病などのβ−カテニン／Ｗｎｔ−シグナル伝達関連疾患の治療に使用するための、細胞中のβ−カテニンの移行に影響しうる化合物の使用に関する。本発明は、このような化合物を含む製剤処方および薬剤組成物に及ぶ。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のβ−カテニンの移行を調整する、β−カテニン関連疾患の治療における使用のための細胞膜電位調節剤。
【請求項２】
ドフェチリド、エタモン（Ｅｔａｍｏｎ）、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、グリベンクラミド、トルブタミド、トラジミド（Ｔｏｌａｚｉｍｉｄｅ）、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン（Ｎｉｆｉｄｉｐｉｎｅ）、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム（Ｉｓａｔｒｏｘｉｍｅ）、ジゴキシンおよびフロセミドからなる化合物の群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項３】
β−カテニンの細胞核への移行を減少させるように準備され、癌または糖尿病を治療するために用いられる、請求項１または２に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項４】
治療される癌は、結腸、前立腺、乳房、下垂体、膵臓、食道、陰茎もしくは肝臓の癌、または糖尿病誘発性の癌を含む、請求項３に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項５】
癌を治療するために用いられ、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、グリベンクラミド、トルブタミド、トラジミド、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム、イスラジピン、ジゴキシンおよびフロセミドからなる化合物の群から選択される化合物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項６】
糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するために用いられ、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム、イスラジピンおよびジゴキシンからなる化合物の群から選択される化合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項７】
ＡＴＰアーゼまたはイオン輸送体もしくはチャネルを遮断でき、これによって細胞膜電位を調節し、β−カテニンの核への移行を減少させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項８】
遮断されるイオンチャネルまたは輸送体は、Ｎａ＋チャネル、Ｋ＋チャネル、Ｃｌ−チャネルまたはＣａ２＋チャネルである、請求項７に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項９】
抗体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１０】
前記細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤は、既にβ遮断薬で治療を受けている患者を治療するためのものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１１】
β−カテニンの細胞核への移行を増加させるように準備され、骨粗鬆症を治療するために用いられる、請求項１に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１２】
前記β−カテニンの核への移行を増加させる化合物は、ニコランジル、ベラトリジン、トシル酸ブレチリウム（ＢＴＬ）およびロキサピンからなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１３】
ＡＴＰアーゼまたはイオン輸送体もしくはチャネルを遮断解除することができ、これによって細胞膜電位を調節し、β−カテニンの核への移行を増加させる、請求項１１または１２に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１４】
前記遮断解除されるイオン輸送体またはチャネルは、Ｎａ＋チャネルまたはＣａ２＋チャネルである、請求項１３に記載の細胞膜電位調節剤。
【請求項１５】
細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤、および製薬上許容されるビヒクルを含む、β−カテニン関連疾患治療用組成物。
【請求項１６】
前記細胞膜電位調節剤が請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞膜電位調節剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
治療上有効な量の細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤、および製薬上許容されるビヒクルを接触させることを含む、請求項１５または１６に記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達／ベータ−カテニン（β−カテニン）に関し、特に、限定されないが、β−カテニン／Ｗｎｔ−シグナル伝達関連疾患の治療に使用するための、細胞中のβ−カテニンの移行に影響しうる化合物の使用に関する。本発明は、このような化合物を含む製剤処方および薬剤組成物に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
その原形質膜受容体（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＦＺＤおよび低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質；ＬＲＰ）に結合しているＷｎｔは、２つの主要なトランスデューサーであるβ−カテニン（強い転写因子）およびＣａ２＋を含む複数の細胞内トランスデューサーを、それぞれ古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）または非古典的（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）シグナル伝達経路を介して活性化させうる。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を介した遺伝子転写の活性化は、最も研究されたＷｎｔ経路であり、発達および疾患において極めて重要な役割を果たすことが知られている。古典的シグナル伝達経路は、β−カテニンの多タンパク質複合体からの脱隔絶（ｄｅｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（安定化と呼ばれる）およびその後のＬＥＦ／ＴＣＦ応答遺伝子の転写の活性化をもたらす。しかしながら、受容体活性化の下流の事象は、安定化された、負に荷電した９２ｋＤａのタンパク質である細胞質β−カテニンの、核膜（ＮＥ）を横切って核質に入る移行に依存する。非古典的な、β−カテニンに依存しない、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路の活性化は、細胞骨格を含む多くの細胞過程および前立腺癌細胞の細胞運動性を調節する遊離細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす。いわゆる古典的（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達）および非古典的（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達）経路は、現在は、独立して、または拮抗して動作すると考えられている。
【０００３】
ＮＥは、イオンおよび高分子の核質への交換を制限する障壁として働く。ＮＥは、核ラミナに面する核の内膜からなり、小胞体に隣接する外膜から槽によって分離される。超分子核膜孔複合体（ＮＰＣ）の陥入は、細胞の細胞質と核質との間の物質の交換（上限〜９０〜１００ｋＤａで）のための唯一の経路を提供する。ＮＥを横切る高分子輸送は、取り込まれたタンパク質上の特定のアミノ酸モチーフ（例えば、核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）またはアルマジロドメイン反復配列）によるタンパク質認識を必要とする複雑な過程（はじめにＮＥの外膜に結合し、次いでＧＴＰアーゼＲａｎ／輸送受容体経路などのエネルギー消費のメカニズムによってＮＰＣを通って横切る）である。９２ｋＤａのβ−カテニンは、小さな高分子（＜１０ｋＤａ）と異なって、高分子がＮＰＣを通って核質に入る上限にあり、単純な拡散もＲａｎＧＴＰアーゼ経路も含まず、β−カテニンはＮＥを横切るためにはかなりのハードルに遭遇しうることを示唆する。
【０００４】
ＮＥはまた、特にＣａ２＋およびＫ＋濃度、およびさらに他のイオン（例えばＮａ＋）の変化に応答する、動的なトランス（ｔｒａｎｓ）−ＮＥ電位を有する、イオン選択性膜である。細胞質［Ｃａ２＋］ｉは核のＣａ２＋濃度を調節する。核質のＣａ２＋の増加は、ＮＥを越える大きい高分子（＞１０ｋＤａ）の輸送を促進し、核質のＣａ２＋の減少はトランス−ＮＥ高分子輸送を阻害する。核は、主に負に荷電したＤＮＡおよびヌクレオソームのコアタンパク質の領域からなる、「負に荷電したシンク（ｓｉｎｋ）」と呼ばれている。ＨｅＬａ細胞では、トランス−ＮＥ電位は、電気的細孔径を１１μｍ−２と見積もると、−４３ｍＶと測定された。そのバルクに加えて、β−カテニンタンパク質は全体として負電荷を有する（ｐＨ７．０で−２０．８）。したがって、ＮＥはβ−カテニンが核質へ入るときの物理的および電気的障壁を与え、ＮＥを横切るβ−カテニン移行の物理電気化学的なメカニズムを示す。
【０００５】
現在まで、正確にはどのようにβ−カテニンがＮＥを横切るのかわかっていなかった。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に応答したβ−カテニンの安定化およびその後の核への移行は、癌、骨粗鬆症および糖尿病などのさまざまなβ−カテニン関連疾患において調節不全である極めて重要な段階である。β−カテニン関連疾患は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に応答したβ−カテニンの核への移行の調節不全（増加または減少）がある疾患の種類である。核に移行すると、β−カテニンは癌および糖尿病などの疾患における遺伝子転写を増加させるように働くが、骨粗鬆症などの疾患では、β−カテニンの核への移行が減少し、その後遺伝子転写が減少する。
【０００６】
主要な発生過程（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を支配する少数のシグナル伝達経路もまた原因として癌などの深刻な疾患に関与することは一般に認められた知識である。これらの少数の経路のうち、Ｗｎｔシグナル伝達は、動物の細胞運命をその生存期間を通して、例えば、その幹細胞の自己再生の調整を通して調節する極めて重要な分子カスケードを示す。その結果、その調節不全は、変異を通して、または機能の時間的欠陥および運動欠陥を通して、癌を含むさまざまな疾患の原因となる、または関連する。Ｗｎｔシグナル伝達は前立腺癌でアップレギュレートされることは知られており、Ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達の増加は結腸癌、乳癌および他の癌の発癌における重要な段階であることには多くの根拠がある。しかしながら、Ｗｎｔシグナル伝達に含まれる下流の細胞内キナーゼを標的とすることは難しいことがわかった。また、機能のかなりのオーバーラップを可能にするが、治療上有効な阻害剤の設計に大きな課題をも与える、複数の（＞２０）Ｗｎｔ受容体および共受容体ならびに１９のＷｎｔリガンドがある。
【０００７】
Ｗｎｔシグナル伝達、特にβ−カテニンの核転写パートナーであるＴＣＦ７転写因子はまた、糖尿病のリスクの増加と関連づけられていた。いくつかの研究は、素因となるＴＣＦ７Ｌ２変異体が膵臓のβ−細胞のインシュリン分泌の減少を引き起こすことを示唆している。糖尿病の治療手段は、膵臓のβ−細胞を標的にして膜電位およびカルシウムの両方に依存する過程であるインシュリン放出を調節することである。高グルコースは、癌に関連するＷｎｔ／β−カテニン経路を通してシグナル伝達を向上させ、肥満および糖尿病を伴う癌の頻度の増加を説明しうる。
【０００８】
最後に、骨粗鬆症は、骨折のリスクの増加につながる病気であり、骨のホメオスタシス、すなわち骨形成および骨吸収の不均衡である。後者は破骨細胞の固有の機能であり、前者は骨芽細胞およびその前駆細胞である骨細胞の複合機能である。骨粗鬆症は、年間８９０万を超える骨折の原因であり、世界中で２億人の女性に影響を与えていると見積もられている−近似的に６０歳の女性の１／１０、７０歳の女性の１／５、８０歳の女性の２／５、および９０歳の女性の２／３（国際骨粗鬆症財団ウェブサイト）。骨粗鬆症は、ヨーロッパ、アメリカ合衆国および日本で推定７５００万人に影響を及ぼしている。加えて、続発性骨粗鬆症は、甲状腺機能亢進症、糖尿病およびセリアック病を含む複数の病変によって引き起こされる。骨のホメオスタシスは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の複数の点で調節される。しかしながら、多くの研究の主要な結論は、骨芽細胞系列におけるＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達は破骨細胞骨吸収を阻害するということである。遺伝子導入マウスを用いた研究から、骨のホメオスタシスの調節におけるＷｎｔシグナル伝達、特にβ−カテニンの核への移行による転写の活性化の決定的に重要な役割、すなわちＷｎｔ−β−カテニン経路の活性化は骨の質量および強度を増加させるのに対して、Ｗｎｔ−β−カテニン経路の阻害は骨の質量および強度を減少させることが確認された。骨のホメオスタシスとＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達との関係のために、この経路は骨折のリスクのある患者の骨の強度を回復するための治療的介入のための極めて重要な標的である。
【０００９】
したがって、上記の観点から、Ｗｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達経路の基本的なメカニズムをよりよく理解することが、癌、糖尿病および骨粗鬆症を含む広範なβ−カテニン関連疾患の治療に有用であることは明らかである。したがって、本発明者らは、これらの経路の関係をより詳細に調べることを試みた。
【００１０】
実施例に記載されるように、本発明者らは、予想外に、現在の考えとは逆に、古典的（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達）および非古典的（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達）経路は独立して、および拮抗して動作しないことを示した。本発明者らは、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋およびＷｎｔ／β−カテニン経路は実際は協調して働くこと、および［Ｃａ２＋］ｉ放出は哺乳類の細胞においてβ−カテニンが核へ入ることを促進することを見出し、非常に驚いた。実際、本発明者らは、カルシウム色素を用いたライブアッセイにおいて、ＰＣ３前立腺癌細胞において６つのＷｎｔペプチド（３Ａ、４、５Ａ、７Ａ、９Ｂおよび１０Ｂ）は［Ｃａ２＋］ｉを動員することを示した（乳房および膀胱の細胞においても同様の結果である）。ＰＣ３細胞におけるカルシウム波形の滞留時間（ＤＴ、範囲＝１５〜３０ｓ）に基づいて、これらのＷｎｔは、３つのクラスに分類された：短い、３Ａおよび５Ａ；長い、７Ａおよび１０Ｂ；非常に長い、４および９Ｂ。Ｗｎｔ−活性化［Ｃａ２＋］ｉ放出の後、核内カルシウムの増加ならびにＦＭ４−６４色素を用いて決定される核膜および細胞膜の両方の脱分極（膜貫通電位（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の変化）が生じた。それぞれのＷｎｔクラスのパラダイム基質であるＷｎｔ５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂで処理された細胞において、ＰＣ３、ＭＣＦ７および２５３Ｊ（前立腺癌細胞株、乳癌細胞株および膀胱癌細胞株）において、［Ｃａ２＋］ｉの増加の後、β−カテニンの核への移行が生じた。驚くことに、ＰＣ３細胞株において、Ｗｎｔ５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂ誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ放出の増加ならびにβ−カテニン移行の増加の両方が、タプシガルギンによって抑制される。
【００１１】
真核生物では、細胞膜電位は、主に、細胞膜を挟んだＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋の分布の関数である。ＡＴＰアーゼはまた、細胞膜の電位に影響を与えることが知られている。ストアからの［Ｃａ２＋］ｉの放出はまた、イオンチャネルを介して膜電位変化と密接に協調しており、それ自体が広がっている（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）膜電位によって調節されうる。本発明者らは、細胞株における［Ｃａ２＋］ｉ放出および免疫細胞化学の技術を用いてこの仮説を試験した。本発明者らは、細胞膜電位の調整またはイオンチャネルの遮断は、Ｗｎｔ−媒介性の［Ｃａ２＋］ｉ放出およびβ−カテニンの核への移行を阻害し、これによって細胞増殖を減少させることを示した。
【００１２】
これらの予測できなかった発見を考慮して、本発明者らは、Ｃａ２＋およびβ−カテニン経路が、これまで考えられていたように独立してではなく、協調して、相互依存して働きうるというＷｎｔシグナル伝達ネットワークの収束モデルを初めて提案した。この新しい収束モデルに基づいて、本発明者らは、癌、糖尿病および骨粗鬆症を含むさまざまなβ−カテニン関連疾患は、今では、細胞膜の電位を調節する化合物を用いて有効に治療されうると考える。このように、これらの結果は、β−カテニン関連疾患の治療のための大胆な新しい治療手段を提供する。
【００１３】
したがって、第１の形態において、細胞中のβ−カテニンの移行を調整する、β−カテニン関連疾患の治療における使用のための細胞膜電位調節剤が提供される。
【００１４】
第２の形態において、β−カテニン関連疾患を治療、予防、または改善する方法であって、治療上有効な量の細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００１５】
本発明者らは、予想外に、Ｗｎｔシグナル伝達誘導性のβ−カテニンの核への移行は、例えば、チャネルもしくは輸送体の活性または遊離の細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）の利用率を介してトランス−細胞カリウム勾配を調整することによって、細胞膜の電気的活性を標的にし、その結果、核膜の電気的活性を変化させることによって、制御されうることを見出した。このように、細胞膜を横切るイオン輸送を変化させ、すでに他の指示薬として治療上用いられている小分子化学遮断薬は、癌などの増殖性疾患を駆動することが知られているβ−カテニンの核への移行を調節するために用いられうる。したがって、イオンチャネルまたは輸送体を遮断する化合物を用いることで、β−カテニンの核への移行が制限され、細胞増殖の減少がもたらされ、したがって癌の治療に用いられうる。逆に、特定のイオンチャネルを活性化する化合物の使用は、β−カテニンの核への移行の増加をもたらし、骨粗鬆症の治療に利用されうる。
【００１６】
β−カテニンおよび（［Ｃａ２＋］ｉ）の放出は、Ｗｎｔシグナル伝達の極めて重要なトランスデューサーである。実施例１において、本発明者らは、［Ｃａ２＋］ｉ放出がβ−カテニンが核に入ることを促進する、Ｗｎｔシグナル伝達の新しい収束モデルを提供した。β−カテニンは強い転写因子であり、その核への移行は、β−カテニンの移行および遺伝子転写の増加がある癌および糖尿病を含む多くの疾患における、またはβ−カテニンの移行および遺伝子転写が少なすぎる骨粗鬆症における極めて重要な段階である。１９までのＷｎｔリガンドに２０を超える受容体および共受容体があり、これは受容体拮抗薬の設計の従来の薬理学的アプローチを困難にする。安定化された細胞質β−カテニンの利用率を調節する重要な酵素であり分解複合体の一部であるＧＳＫ３βキナーゼのような下流標的は、細胞質内酵素であり、大抵は薬剤が入ることおよびアクセスしやすさの問題に遭遇する。しかしながら、本発明者らは、実施例において、複数のＷｎｔリガンドが細胞内カルシウムストア［Ｃａ２＋］ｉを活性化させ、また、β−カテニンの核（ここで転写因子として働く）への移行を増加させることを示した。本発明者らはまた、［Ｃａ２＋］ｉの増加は、細胞および核の膜電位の脱分極をもたらし、これはＷｎｔシグナル伝達の活性化を通して安定化されたβ−カテニンが核に入ることを促進することを示した。本発明者らは、さらに、タプシガルギン（Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ阻害剤）による細胞内カルシウムストアの阻害または枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、Ｗｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出およびβ−カテニンの核への移行を停止させることを示した。Ｃａ２＋および膜電位の両方が、β−カテニンが核に入ることにおいて中心的な役割を果たすことは明らかであり、この新しい見解により本発明者らはＷｎｔシグナル伝達の全く新しいモデルを構築した。
【００１７】
好都合なことに、Ｗｎｔシグナル伝達経路に直接または明らかには関連していない細胞過程または細胞膜タンパク質の調整によってβ−カテニンの核への移行を標的にすることは、魅力的な提案である。本発明者らは、膜電位の調節がβ−カテニンが核に入ることを調整できるかどうか調べ、その結果は、イオン輸送体またはチャネル（例えばＮａ＋、Ｋ＋またはＣａ２＋）を遮断することを介して、またはチャネルを遮断することが知られている薬剤によって（例えばトルブタミドおよびＣｓＣｌによって）Ｗｎｔリガンドのその受容体への結合を直接阻害することを介して、細胞および核の膜電位を調節することによって、β−カテニンの移行を調整することができることを明らかに示す。したがって、これらの結果は、β−カテニン関連疾患の治療のための大胆な新しい治療手段を提供する。
【００１８】
核に移行すると、β−カテニンは癌および糖尿病における遺伝子転写を増加させる。したがって、本発明の好ましい一実施形態において、前記細胞膜電位調節剤は、β−カテニンの細胞核への移行を減少させるように準備され、癌および糖尿病を治療するために用いられる。前記薬剤は、好ましくは２型糖尿病の治療に用いられる。例えば、このように治療されうる癌は、結腸、前立腺、乳房、下垂体、膵臓、食道、陰茎もしくはまたは肝臓の癌を含む。前記癌はまた、糖尿病誘発性の癌でありうる。好ましくは、前記癌は、慢性の胃食道逆流症に反応して起こる食道下部の内膜における治癒の特異型であり、患者の腫瘍性成長を生じやすくするバレット食道でありうる。
【００１９】
好ましくは、前記細胞膜電位調節剤は、小分子などの化合物を含む。β−カテニンの核への移行を減少させる好ましい化合物は、ドフェチリド、エタモン（Ｅｔａｍｏｎ）、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、グリベンクラミド、トルブタミド、トラジミド（Ｔｏｌａｚｉｍｉｄｅ）、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン（Ｎｉｆｉｄｉｐｉｎｅ）、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム（Ｉｓａｔｒｏｘｉｍｅ）、イスラジピン、ジゴキシンおよびフロセミドからなる化合物の群から選択されうる（詳細は表１参照）。
【００２０】
好都合なことに、これらの化合物の多くは既に治療に用いられており、癌または糖尿病の治療のための治療法に容易な経路を与える。表１に興味のある化合物の推定投与量を示す（すべて現在の臨床ガイドラインの範囲内である）。
【００２１】
したがって、他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ドフェチリドが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、エタモンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ＣｓＣｌが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ソタロールが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、アミオダロンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、４−アミノピリジンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ピナシジルが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ニコランジルが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ミノキシジルが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、キニジンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、リドカインが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ニフィジピンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ジヒドロピリジンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、Ｂａｙ  Ｋ８６４４が提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ＦＰＬ  ６４１７６が提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、イサトロキシムが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、ジゴキシンが提供される。他の形態において、癌または糖尿病の治療における使用のために、イスラジピンが提供される。
【００２２】
好ましい一実施形態において、前記細胞膜電位調節剤は、好ましくは、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、グリベンクラミド、トルブタミド、トラジミド、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム、ジゴキシンおよびフロセミドからなる化合物の群から選択され、好ましくは癌の治療に用いられる。より好ましくは、グリベンクラミド、トルブタミド、またはトラジミドが癌の治療に用いられる。したがって、他の形態において、癌の治療における使用のために、グリベンクラミドが提供される。他の形態において、癌の治療における使用のために、トルブタミドが提供される。他の形態において、癌の治療における使用のために、トラジミドが提供される。他の形態において、癌の治療における使用のために、フロセミドが提供される。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、前記細胞膜電位調節剤は、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム、イスラジピンおよびジゴキシンからなる化合物の群から選択され、好ましくは糖尿病を治療するために用いられる。より好ましくは、アミオダロンまたはソタロールが糖尿病を治療するために用いられる。
【００２４】
他の実施形態において、前記薬剤はＡＴＰアーゼまたはイオン輸送体もしくはチャネルを遮断することができ、これは細胞膜電位の調節をもたらし、β−カテニンの核への移行を減少させる。遮断されうるイオンチャネルは、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＣａ２＋チャネルでありうる。Ｎａ＋チャネルを遮断できる好ましい薬剤としては、キニジンおよびリドカインが挙げられる。Ｋ＋チャネルを遮断できる好ましい薬剤としては、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、グリベンクラミド、トルブタミド、およびトラジミドが挙げられる。Ｃａ２＋チャネルを遮断できる好ましい薬剤としては、ニフィジピンおよびジヒドロピリジン類似体が挙げられる。細胞膜ＡＴＰアーゼまたは他のイオン輸送体を遮断するための好ましい薬剤としては、イサトロキシム（ＰＳＴ２７４４）、イスラジピン、ジゴキシンおよびフロセミドが挙げられる（詳細は表１参照）。このように、これらのイオンチャネルまたはＡＴＰアーゼの任意の遮断薬はβ−カテニンの核への移行を低減させるために効果的に用いることができ、これによって癌および糖尿病の有効な治療に用いられうる。
【００２５】
他の実施形態において、標的化免疫学的治療は、癌および糖尿病の治療に用いられうる。例えば、前記薬剤は治療用の抗体を含みうる。したがって、好ましくは、ＡＴＰアーゼ、またはイオン輸送体もしくはチャネルを遮断でき、細胞膜および核膜の電位の調節をもたらす前記薬剤は、抗体である。
【００２６】
β遮断薬は、高血圧の標準的な治療であり、サイクリックＡＭＰの増加を介して働き、カルシウム依存性カルモジュリンキナーゼ（Ｗｎｔおよび他のカルシウムシグナル伝達経路の下流標的）の活性を増加させる。β遮断薬を用いて血圧を低下させる治療は、遊離細胞内カルシウムの減少を伴うことも知られている。遊離細胞内カルシウムの減少は、Ｗｎｔシグナル伝達に反応したカルシウムの利用率を減少させ、また、細胞および核の膜電位の相対的な過分極をもたらす。したがって、好ましい実施形態において、細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤で治療される患者は、既にβ遮断薬で治療を受けている患者である。
【００２７】
骨粗鬆症において、β−カテニンの核への移行が減少し、その後遺伝子転写が減少することが知られている。したがって、他の好ましい実施形態において、前記細胞膜電位調節剤は、β−カテニンの細胞核への移行を増加させるように準備され、骨粗鬆症を治療するために用いられる。β−カテニンの核への移行を増加させる好ましい化合物は、ベラトリジン、トシル酸ブレチリウム（ＢＴＬ）、ニコランジルおよびロキサピンからなる群から選択されうる。したがって、他の形態において、骨粗鬆症の治療における使用のために、ベラトリジンが提供される。他の形態において、骨粗鬆症の治療における使用のために、ニコランジルが提供される。他の形態において、骨粗鬆症の治療における使用のために、トシル酸ブレチリウム（ＢＴＬ）が提供される。他の形態において、骨粗鬆症の治療における使用のために、ロキサピンが提供される。好都合なことに、これらの化合物のいくつかは既に治療に用いられており、骨粗鬆症の治療のための治療法に容易な経路を与える。
【００２８】
他の実施形態において、前記薬剤はＡＴＰアーゼまたはイオンチャネルを遮断解除（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）することができ、これは細胞膜電位の調節をもたらし、β−カテニンの核への移行を増加させる。遮断解除されうるイオンチャネルは、Ｎａ＋またはＣａ２＋チャネルでありうる。Ｎａ＋チャネルを遮断解除できる好ましい薬剤としては、ＢＴＬおよびロキサピンが挙げられる。Ｃａ２＋チャネルを遮断解除できる好ましい薬剤としては、Ｂａｙ  Ｋ８６４４およびＦＰＬ  ６４１７６が挙げられる。このように、これらのイオンチャネルの任意の遮断解除薬はβ−カテニンの核への移行を増加させるために効果的に用いることができ、これによって骨粗鬆症の治療に用いられうる。好都合なことに、いくつかのＮａ＋チャネルのブロック解除化合物は既に治療に用いられており、骨粗鬆症の治療のための治療法に容易な経路を与える。
【００２９】
本発明に係る薬剤は、癌、糖尿病または骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患の治療、改善、または予防のための単剤療法（すなわち、細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤のみの使用）で使用されうる医薬品において用いられうることが理解されるであろう。または、本発明に係る薬剤は、癌、糖尿病または骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患の治療、改善、または予防のための既知の治療の補助として、またはこれと組み合わせて用いられうる。
【００３０】
本発明に係る薬剤は、多くの異なる形態を有する組成物に、特に前記組成物が使用される方法に応じて、組み込まれうる。したがって、例えば、前記組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とする人もしくは動物に投与されうる任意の他の適当な形態でありうる。本発明に係る医薬品のビヒクルは、投与される患者がよく耐えられるものである必要があることが理解されるであろう。
【００３１】
本発明に係る薬剤を含む医薬品は、多くの方法で用いられうる。例えば、前記薬剤が、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形態で経口で摂取されうる組成物中に含まれうる場合、経口投与が求められうる。本発明の薬剤を含む組成物は、吸入によって（例えば鼻腔内に）投与されてもよい。組成物はまた、局所使用のために処方されてもよい。例えば、クリームまたは軟膏は皮膚に塗布されうる。
【００３２】
本発明に係る薬剤はまた、持続放出デバイスまたは遅延放出デバイスに組み込まれうる。これらのデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入され、前記医薬品は数週間または数か月にまでわたって放出されうる。前記デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して設置されうる。このようなデバイスは、本発明に係る使用される薬剤での長期間の治療が必要であり、通常頻繁な投与（例えば少なくとも毎日の注射）が必要である場合に特に有利でありうる。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明に係る薬剤および組成物は、血流に、または治療を必要としている部位に直接注射することによって患者に投与されうる。注射は、静脈内  （ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）でありうる。
【００３４】
必要とされる薬剤の量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、投与形態、薬剤（例えば抗体）の生理化学的性質、および、単剤療法として用いられるかまたは併用療法で用いられるか、に依存することが理解されるであろう。投与の頻度もまた、治療を受ける患者の体内での薬剤の半減期に影響される。投与される最適な投与量は、当業者によって決定されてよく、使用する特定の薬剤、薬剤組成物の強度、投与形態、ならびに癌、糖尿病または骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患の進行によって変化する。患者の年齢、体重、性別、食事および投与の時間を含む、治療を受ける特定の患者に依存するさらなる因子によって、投与量の調節が必要になるであろう。
【００３５】
本発明にしたがって使用される化合物の例示的な投与量を表１に示す。通常、本発明に係る薬剤の１日の投与量が０．０１μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重で、どの薬剤が用いられるかに依存して、癌、糖尿病または骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患の治療、改善、または予防に用いられうる。より好ましくは、１日の投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３６】
前記薬剤は、治療される疾患の発症の前、間、または後に投与されうる。１日の投与量は１回の投与（例えば１日１回の注射）として与えられうる。または、前記薬剤は、１日の間に２回以上の投与が必要とされうる。例として、薬剤は、２５ｍｇ〜７０００ｍｇ（すなわち、体重７０ｋｇと仮定して）の１日の投与量を２回で（または治療されるβ−カテニン関連疾患の重症度に依存して、それ以上で）投与されうる。治療を受ける患者は、起きると第１投与量を摂取し、次いで夕方に（２回の投与の形態の場合）、または３時間もしくは４時間の間隔をおいて第２投与量を摂取しうる。または、本発明に係る薬剤の最適な投与量を繰り返しの投与を必要とすることなく患者に提供するために、持続放出デバイスが用いられうる。
【００３７】
製薬工業（例えば、生体内実験、臨床試験など）によって従来採用されている手法などの既知の手法が、本発明に係る薬剤および正確な治療計画（薬剤の１日の投与量および投与の頻度など）を含む具体的な処方を形成するために用いられうる。本発明者らは、細胞膜電位を調節し、これによって細胞内カルシウムイオンの利用率、または細胞および核の膜電位に影響を与えることができるカルシウム、カリウムもしくはナトリウムイオンの組み合わせに影響を与え、β−カテニンの核への移行の量を調整する（すなわち増加または減少させる）ように設計された本発明の薬剤の使用に基づく、癌、糖尿病または骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患を治療するための薬剤組成物を初めて報告したものと考える。
【００３８】
したがって、本発明の第３の形態において、細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤、および製薬上許容されるビヒクルを含む、β−カテニン関連疾患治療組成物が提供される。
【００３９】
前記薬剤組成物は、β−カテニンの核への移行が多すぎる、または少なすぎることに起因する患者の任意のβ−カテニン関連疾患の治療上の改善、予防、または治療に用いられうる。例えば、前記疾患は、癌、糖尿病、または骨粗鬆症でありうる。
【００４０】
β−カテニンの核への移行を減少させる好ましい化合物は、ドフェチリド、エタモン、ＣｓＣｌ、ソタロール、アミオダロン、４−アミノピリジン、ピナシジル、ニコランジル、グリベンクラミド、トルブタミド、トラジミド、ミノキシジル、キニジン、リドカイン、ニフィジピン、ジヒドロピリジン、Ｂａｙ  Ｋ８６４４、ＦＰＬ  ６４１７６、イサトロキシム、イスラジピン、ジゴキシンおよびフロセミドからなる化合物の群から選択されうる。このような化合物は癌または糖尿病の治療に有用である。
【００４１】
β−カテニンの核への移行を増加させる好ましい化合物は、ベラトリジン、ニコランジル、トシル酸ブレチリウム（ＢＴＬ）およびロキサピンからなる群から選択されうる。このような化合物は骨粗鬆症の治療に有用である。
【００４２】
本発明はまた、第４の形態において、治療上有効な量の細胞中のβ−カテニンの移行を調整する細胞膜電位調節剤、および製薬上許容されるビヒクルを接触させることを含む、上記第３の形態に係る組成物の製造方法を提供する。
【００４３】
「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、脊椎動物、哺乳類、または飼育動物でありうる。したがって、本発明に係る薬剤、組成物および医薬品は、例えば家畜（例えば馬）、ペットなどの任意の哺乳類の治療に用いることができ、または他の獣医学的な用途に用いることができる。しかしながら、最も好ましくは、患者は人である。
【００４４】
薬剤の「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、患者に投与されたとき、標的の疾患を治療する、または、所望の効果、すなわち、β−カテニンの核への移行の量を調整するために細胞膜の電位を調整する効果を生じるために必要な薬剤の量である、任意の量である。
【００４５】
例えば、使用される薬剤の治療上有効な量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇであってよく、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇである。薬剤の量は、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇであることが好ましく、最も好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。
【００４６】
本明細書中、「製薬上許容されるビヒクル（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、当業者に薬剤組成物の製剤に有用であることが知られている任意の公知の化合物または公知の化合物の組み合わせである。
【００４７】
一実施形態において、製薬上許容されるビヒクルは固体であってよく、前記組成物は、粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の製薬上許容されるビヒクルは、着香料、滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、フィラー、流動促進剤、圧縮助剤、不活性バインダ、甘味料、防腐剤、色素、コーティング、または錠剤崩壊剤として働きうる１以上の物質を含みうる。前記ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末において、前記ビヒクルは、微粉化した本発明に係る活性薬剤と混合された微粉化した固体である。錠剤において、前記活性薬剤は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適当な比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮されてもよい。前記粉末および錠剤は、好ましくは、９９％までの活性薬剤を含む。適当な固体のビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。他の実施形態において、製薬ビヒクルはゲルであってよく、前記組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【００４８】
しかしながら、前記製薬ビヒクルは液体であってよく、前記薬剤組成物は溶液の形態である。液体のビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤および加圧組成物の調製に用いられる。本発明に係る活性薬剤は、水、有機溶媒、これらの混合物または製薬上許容されるオイルもしくは脂質などの製薬上許容される液体のビヒクルに溶解または懸濁されうる。液体のビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、着香料、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適当な製薬上の添加剤を含んでもよい。経口投与および非経口投与のための液体のビヒクルの好適な例としては、水（上記の添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシルメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール（例えばグリコール）を含む）およびこれらの誘導体、ならびにオイル（例えば分画したココナッツオイルおよびピーナッツオイル）が挙げられる。非経口投与のために、ビヒクルはまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油状のエステルであってもよい。滅菌液のビヒクルは非経口投与のための滅菌液の形態の組成物に有用である。加圧組成物のための液体のビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の製薬上許容される推進剤でありうる。
【００４９】
滅菌溶液または懸濁液である液体の薬剤組成物は、例えば、筋肉内、くも膜下、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下に注射することによって用いられうる。前記薬剤は、滅菌した水、生理食塩水、または他の適当な滅菌した注射可能な媒体を用いて投与時に溶解または分散されうる滅菌した固体の組成物として調製されてもよい。
【００５０】
本発明の薬剤および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張性にするために十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合したソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与されてもよい。使用される本発明に係る薬剤はまた、液体または固体の組成物の形態で経口投与されうる。経口投与に適した組成物としては、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤および粉末などの固体の形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁液などの液体の形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルションおよび懸濁液が挙げられる。
【００５１】
本明細書中に記載されたすべての特徴（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）、および／またはそのように開示された任意の方法または工程のすべての段階は、少なくともこれらの特徴および／または段階のいくつかが相互排他的である組み合わせを除いて、上記の任意の形態と任意の組み合わせで組み合わせられうる。
【００５２】
本発明のよりよい理解のために、およびその実施形態がどのように実施されて効果を生じるのかを示すために、以下の図面とともに実施例を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、１００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔリガンドペプチド（Ｗｎｔ３Ａ、灰色；Ｗｎｔ４、赤；Ｗｎｔ５Ａ、緑；Ｗｎｔ７Ａ、ピンク；Ｗｎｔ９Ｂ、青；Ｗｎｔ１０Ｂ、茶色；Ｗｎｔ１１、紫；ビヒクル対照、黄）の添加に応答したＰＣ３細胞における細胞内カルシウム放出の代表的なトレースである。Ｗｎｔ１１以外のすべての試験したＷｎｔは、ＰＣ３前立腺癌細胞株における細胞内カルシウム動員を誘起する。Ｘ軸は時間（ｓ）であり、Ｙ軸はＦｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比である。各リガンドの波形をカルシウム放出の時定数（立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間）の計算に用いた。
【図２】図２は、Ｆｌｕｏ４およびＦｕｒａＲｅｄ色素を用いて実験手順で記載したように行った［Ｃａ２＋］ｉ測定を反映する。タプシガルギン（５μＭの最終濃度で）を表示した時間（矢印）に添加した。タプシガルギンの添加後に引き起こされたカルシウムトランジェント（シアン）の代表的なトレースを示す。カルシウム信号（Ｆｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比）は、初期の立ち上がりの後、低下して、１２０秒以内にベースラインに達した。タプシガルギン（５μＭ）を用いて１５分間インキュベートしたＰＣ３細胞において、Ｗｎｔ５Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、緑）、Ｗｎｔ９Ｂ（２００ｎｇ／ｍｌ、青）およびＷｎｔ１０Ｂ（２００ｎｇ／ｍｌ、茶色）の添加は、未処理のＰＣ３細胞（図１）においてみられるような［Ｃａ２＋］ｉの増加を引き起こさなかった。
【図３】図３は、Ｗｎｔ誘導性カルシウム波形の時定数のボックスプロットである：時定数（Ａ、立ち上がり、Ｂ、滞留、およびＣ、立ち下がり時間）は、各Ｗｎｔリガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）のＰＣ３細胞への添加によって生じたカルシウム波形から計算した。差の有意性は、マン−ホイットニーＵ検定を用いて計算した。すべての時定数は、はじめにＷｎｔ３Ａと比較した；次の比較（例えば、Ｗｎｔ４からＷｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ４からＷｎｔ７Ａなど）は、それぞれ、後のＷｎｔのボックスプロットの上に降順で記載した。ｎ．ｓ．＝差は統計的に有意ではなかった。
【図４】図４は、［Ｃａ２＋］ｉ放出を活性化するＷｎｔは、負の協同性（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ）を示すことを示す。Ｗｎｔ３Ａ（灰色）、４（赤）、９Ｂ（青）および１０Ｂ（ダークブルー）は、［Ｃａ２＋］ｉ放出の滞留時間について、増加する濃度の少なくとも２つの増加分の間に、減少する有意な差を示した。増加するＷｎｔ濃度での滞留時間定数は、一次反応式（ｙ０＋Ａ１ｅ（−ｘ／ｔ１））にフィットした。ここでｙ０＝Ｙ  オフセット、Ａ１＝大きさ、およびｔ１＝減衰定数である。反応の速度定数（ｋ）はそれぞれのＷｎｔリガンドについて括弧内に与えられる。Ｗｎｔ７Ａの異なる濃度で滞留時間に有意な差がみられなかったため、データはこの解析に考慮しなかった。Ｗｎｔ５Ａ（緑）は、見積もりのＫ１／２が６７ｎｇ／ｍｌの古典的なミカエリス−メンテン速度論を示した。
【図５】図５は、［Ｃａ２＋］ｉ放出が核内Ｃａ２＋濃度の増加をもたらすことを示す。Ｆｌｕｏ４（緑）およびＦＭ４（赤）を有するＰＣ３細胞における、ｔ＝２０、１１０および２５０ｓ（Ａ〜Ｃ）の３つの時点（Ａ〜Ｃ）でのスナップショットを示し、これはＷｎｔ５Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理された。細胞質（［Ｃａ２＋］ｉ、赤の線）および核内Ｃａ２＋（紫の線）の増加の定量的表現を（Ｄ）に示す。（Ａ）ｔ＝２０（定常状態）で、Ｆｌｕｏ４強度の関数としてベースライン［Ｃａ２＋］ｉが示され、これはＷｎｔ５Ａの添加（黒の矢印）の後、（Ｂ）ｔ＝１１０ｓで増加を示し、［Ｃａ２＋］ｉの増加が開始され（赤の矢印）、少し（〜３３ｓ）後（紫の矢印）に核内Ｃａ２＋が増加する。ｔ＝２５０ｓ（Ｃ）で、細胞膜および核膜においてＦＭ４信号の増加がある（茶色の矢印）。３つの独立した測定からの代表的なものを示す。イメージングは、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点およびＤＭＲＢ顕微鏡上で、２０倍、０．８ＮＡの水浸対物レンズを用い、１２ビットグレー深さで、ＦＶ１０００と同様の条件を用いて行った。
【図６】図６は、ＰＣ３前立腺癌細胞株におけるＷｎｔリガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）による活性化に応答したβ−カテニン（赤）の核（ＤＡＰＩで対比染色、青）への移行を示す。対照（Ａ）またはＷｎ５Ａ（Ｂ）、Ｗｎｔ９Ｂ（Ｃ）およびＷｎｔ１０Ｂ（Ｄ）を用いた活性化の後。材料および方法に記載されたプロトコルを用いて、細胞を８ウェルチャンバスライドで成長させ、Ｗｎｔリガンドで処理し、β−カテニンを固定して染色した。オリンパス共焦点システムを用いて得られたＺ−スタックを示す。３つの個別の実験の代表的なイメージを示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図７】図７は、β−カテニンの核への移行の計算されたピアソン共局在化係数（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）のボックスプロットを示す。免疫組織化学および画像解析は、実験手順に記載したとおりに行った。２〜３の独立した実験からの２０〜９７の細胞を分析した。円は各条件のピアソン共局在化係数の平均値を示す。Ｃｙ３（β−カテニンのラベル）は、対照細胞に対して、Ｗｎｔ（１００ｎｇ／ｍｌ）処理した細胞の共局在化係数の有意な（ｐ＜０．００１、マン−ホイットニー検定）増加を示す。
【図８】図８は、哺乳類の細胞株における古典的（Ｗｎｔ／β−カテニン）および非古典的（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）Ｗｎｔシグナル伝達の収束モデルを示す（明確にするために細胞膜および核のみを図に示す）。
【図９】図９は、変化する外部カリウム［Ｋ＋］ｏの存在下で、ＷｎｔリガンドペプチドであるＷｎｔ５Ａ（緑）；Ｗｎｔ９Ｂ（青）；Ｗｎｔ１０Ｂ（茶色）の添加に応答した、ＰＣ３細胞における細胞内カルシウム放出の代表的なトレースである。この図は、トランス−細胞（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）Ｋ＋濃度勾配が、Ｗｎｔシグナル伝達に応答して細胞内Ｃａ２＋の活性化を調節することを示す。
【図１０】図１０−上：Ｗｎｔシグナル伝達がＷｎｔ９Ｂによって活性化されたときの、変化する外部カリウムＫ＋の存在下でのＰＣ３細胞におけるβ−カテニン染色（赤）の代表的な共焦点顕微鏡像である；核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。下：β−カテニンの核への移行の定量。外部Ｋ＋の増加およびこれによる細胞膜電位の脱分極は、Ｗｎｔ９Ｂに応答したβ−カテニンの移行を増加させる。この図は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化の後の、ＰＣ３細胞における外部Ｋ＋およびβ−カテニンの核への移行を示す。
【図１１】図１１は、Ｗｎｔ媒介性細胞内カルシウム放出（Ａ）が膜電位調節剤（Ｂ、例えばテトラエチルアンモニウム、ＴＥＡ、Ｋ＋チャネル阻害剤）で細胞を処理することによって停止されることを示す。（Ｃ）Ｋ＋チャネル阻害剤（１〜１５ｍＭ）もまたＷｎｔ媒介性のβ−カテニンの核への移行を減少させる。Ｋ＋チャネル阻害剤およびＷｎｔ５Ａ（赤の囲み）および９Ｂ（青の囲み）で処理したＰＣ３細胞におけるβ−カテニン染色（緑）の代表的な共焦点顕微鏡像を対応するボックスプロットの上に示す。この図は、膜電位の調節剤は、Ｗｎｔ媒介性の細胞内カルシウム放出およびβ−カテニンの移行を調整することを示す。
【図１２】図１２は、細胞膜電位の調節剤（Ｋ＋およびＣａ２＋チャネル阻害剤）はＰＣ３細胞の細胞増殖速度を減少させることを示す。Ｘ軸は（ｈ）であり、ｙ軸はライブイメージングを用いて測定された細胞成長のコンフルエンスである。この図は、ＣｓＣｌ、ニフェジピン、ＴＥＡおよびトルブタミドはＰＣ３細胞の増殖を阻害することを示す。
【図１３】図１３は、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質は前立腺癌組織でアップレギュレートされることを示す。４つのＷｎｔシグナル伝達抗体で染色した前立腺組織の代表的なマルチラベルイメージ。（Ａ）：３人の患者からの正常（腫瘍に隣接、上）および腫瘍（下）のサンプルを示す。４つのフルオロフォア（ＭＭＰ７（緑）、β−カテニン（シアン）、サイクリンＤ１（赤）およびｃ−ＭＹＣ（青）をそれぞれＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４０５、Ｃｙ３およびＣｙ５で擬似着色した）の合成した重ね合わせを示す。前立腺癌のサンプルと比較して、正常なサンプルではＷｎｔシグナル伝達標的の発現に目に見える定量的な差があった（図示せず）。組織サンプルは、共同（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）の部分である中心からのものである。（Ｂ）は、（Ａ）に示したコアの高倍率イメージである。
【図１４】図１４は、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質はヒト陰茎扁平上皮細胞癌でアップレギュレートされることを示す：Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＳｃａｎ  Ｚ１スライドスキャナで得られた代表的な画像。４つのフルオロフォア（ＭＭＰ７、Ｗｎｔ４、サイクリンＤ１およびｃ−ＭＹＣに、それぞれ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４０５、Ｃｙ３およびＣｙ５）の、（Ａ）ＰｅＣａ組織のコア（ＰＥ２４１のコアＢ２）および（Ｂ）対照（ＰＥ２４１のコアＤ５、方法を参照）における合成した重ね合わせ。Ｃ〜Ｆは、ＰｅＣａ組織のコアの合成画像を構成するために用いたＭＭＰ７（Ｃ、緑）、Ｗｎｔ４（Ｄ、青）、サイクリンＤ１（Ｅ、橙）およびｃ−ＭＹＣ（Ｆ、赤）の各画像である。Ｇ〜Ｊは、対照組織のコアの合成画像を構成するために用いたＭＭＰ７（Ｇ、緑）、Ｗｎｔ４（Ｈ、青）、サイクリンＤ１（Ｉ、橙）およびｃ−ＭＹＣ（Ｊ、赤）の各画像である。定量分析は、増強していない、オリジナルのグレー画像を用いて行い、そのすべての設定は分析したすべての組織のコアの画像で同一であった。スケールバー＝２５０μｍ。
【図１５】図１５は、病理学的グレードに従って分類された、ＰｅＣａ組織におけるＷＮＴ４、ＭＭＰ７、ＣＤ１およびｃ−ＭＹＣの発現の定量のボックスプロットである。この研究で使用したサンプルの９７％はグレードＩまたはＩＩに分類された。表１に示したデータを、病理学的グレードに従って発現に分離し、ボックスプロットとしてプロットした。塗りつぶした円は９９％値であり、ボックス中の水平の線は中央値である。対照サンプル（緑、ｎ＝３７）；病理医によってグレードＩ（青、ｎ＝８２）またはグレードＩＩ（紫、ｎ＝１８）に分類された悪性腫瘍サンプル；におけるタンパク質発現（コアあたりの平均グレー値）。すべてのタンパク質は対照と悪性腫瘍サンプルとの間で発現に有意な差を示した。差の有意性はマン−ホイットニーＵ検定を用いて測定した：対照と悪性のグレードＩまたはグレードＩＩのサンプルとの間で、または、グレードＩおよびグレードＩＩの中で、＊＝ｐ＜０．００１であり、§＝ｐ＜０．０１である。グレードＩおよびグレードＩＩのサンプルの間で、どのマーカーにもタンパク質発現に有意な差はなかった。
【図１６】図１６は、膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）は、Ｗｎｔ誘導性カルシウム放出（Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９）によって測定されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。Ｗｎｔ誘導性カルシウム放出の代表的なトレース（Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ（０．１μｇ／ｍｌ）を例として示す）。Ｗｎｔリガンド誘導性カルシウム放出は、ＭＰＲＣ（ＣｓＣｌ、５ｍＭ；ＣｄＣｌ２  １ｍＭ（Ｃａ−チャネル阻害剤）；テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１０ｍＭ；アミオダロン、７５μＭ；トルブタミド、１ｍＭ；イスラジピン１００μＭ；ニフェジピン、１ｍＭ；ミノキシジル、２５μＭ；アテノロール、３７．５μＭ；プロパノロール（Ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、５０μＭ；フロセミド、１５０μＭ）を用いた５分間のプレインキュベーションの後、阻害された。Ｘ軸は時間（ｓ）であり、Ｙ軸はＦｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比である。詳細な方法はＴｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９に記載されている。
【図１７】図１７は、膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）は、ＰＣ３前立腺癌細胞株において、Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行（Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９）によって測定されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。ＣＯ２インキュベータで３７℃で、ＭＰＲＣを用いたプレインキュベーション（５分間）をして、またはせずに、細胞をＷｎｔで処理した。Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９．に記載されるプロトコルに従って、Ｗｎｔを添加して、細胞をさらに２０〜３０分間インキュベートし、洗浄し、固定して染色した。β−カテニンは赤であり；細胞核は青であり、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。他のＭＰＲＣのデータを図１１に示す。
【図１８】図１８は、膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）は、ＭＣＦ７乳癌細胞株において、Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行（Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９）によって測定されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。β−カテニンは赤であり；細胞核は青であり、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。
【図１９Ａ】図１９は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＰＣ３前立腺癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。成長曲線は、６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で、１ウェルあたり２５〜１００ｋ細胞の濃度で細胞播種（ｔ＝０）後、１５０時間までＩｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンセス）を用いたタイムラプスイメージングを用いることによって、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃でモニターした。ＭＰＲＣは、細胞播種の２４時間後に定められた濃度で添加した。
【図１９Ｂ】図１９は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＰＣ３前立腺癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。成長曲線は、６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で、１ウェルあたり２５〜１００ｋ細胞の濃度で細胞播種（ｔ＝０）後、１５０時間までＩｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンセス）を用いたタイムラプスイメージングを用いることによって、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃でモニターした。ＭＰＲＣは、細胞播種の２４時間後に定められた濃度で添加した。
【図１９Ｃ】図１９は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＰＣ３前立腺癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。成長曲線は、６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で、１ウェルあたり２５〜１００ｋ細胞の濃度で細胞播種（ｔ＝０）後、１５０時間までＩｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンセス）を用いたタイムラプスイメージングを用いることによって、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃でモニターした。ＭＰＲＣは、細胞播種の２４時間後に定められた濃度で添加した。
【図２０】図２０は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＭＣＦ７乳癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。成長曲線は、６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で、１ウェルあたり２５〜１００ｋ細胞の濃度で細胞播種（ｔ＝０）後、１５０時間までＩｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンセス）を用いたタイムラプスイメージングを用いることによって、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃でモニターした。ＭＰＲＣは、細胞播種の２４時間後に定められた濃度で添加した。他のＭＰＲＣのデータを図１２に示す。
【図２１】図２１は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であるウアバインがβ−カテニンの核への移行を増加させることを示す。別に記載されるように（Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９）、ＰＣ３前立腺癌細胞をウアバインで処理し、β−カテニンを染色した。（Ａ）Ｗｎｔ５Ａで処理された細胞はβ−カテニン（赤）の核への移行を示す；（Ｂ）ウアバインで前処理された細胞はβ−カテニン（赤）の移行の増加を示す；細胞核はＤＡＰＩで対比染色した。（Ｃ）Ｗｎｔ５Ａ（表示した例）の添加に応答したＰＣ３細胞におけるＷｎｔ誘導性カルシウム放出；（Ｂ）ウアバインでの前処理の後のＷｎｔ５Ａ誘導性カルシウム応答。
【図２２】図２２は、ニコランジルおよびベラトラジン（Ｖｅｒａｔｒａｄｉｎｅ）のような化合物は、細胞内カルシウム放出（ＡおよびＢ）または細胞増殖（ＣおよびＤ−例としてニコランジルを示す）を用いて測定されたＷｎｔシグナル伝達を阻害しないことを示す。Ｗｎｔシグナル伝達カルシウム測定は、（Ｔｈｒａｓｉｖｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：３５６５１−３５６５９）に記載される方法で行った。ＰＣ３（Ｃ）およびＭＣＦ７（Ｄ）における細胞成長はＩｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンス）を用いて測定した。
【実施例】
【００５４】
実施例
材料および方法
細胞株
すべての細胞株（ＰＣ３、前立腺癌；ＭＣＦ７、乳癌；２５３Ｊ  膀胱癌；およびＣｏｓ７  サルの腎臓）は、Ｊｏｈｎ  Ｒ  Ｗ  Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ＬｏｎｄｏｎによってＡＴＣＣから入手し、５ｍＭのＬ−グルタミンおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（インビトロジェン、ペーズリー、英国）培地中で培養した。
【００５５】
Ｗｎｔペプチド
組み換えＷｎｔ（３Ａ、４、５Ａ、７Ａ、９Ｂ、１０Ｂおよび１１）ペプチドは、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。Ｗｎｔ−ペプチドストック溶液をＰＢＳで調製した。
【００５６】
［Ｃａ２＋］ｉおよび膜電位イメージング
イメージングプロトコルは本発明者らの研究室で開発され、別に詳細に記載されている（Ｗａｎｇ  ａｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）。簡潔には、１０００００〜２０００００のＰＣ３、ＭＣＦ７、２５３ＪまたはＣｏｓ７細胞を３５ｍｍのＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ（ＷＰＩ）に入れ、４８時間成長させ；カルシウム指示薬であるＦｌｕｏ−４（インビトロジェン）およびＦｕｒａＲｅｄ（インビトロジェン）を１ｎｇ／ｍｌで、１ｍｌの培地のみを含むＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈに添加し、１５〜２０分間、３７℃でインキュベートした。培地を除去し、洗浄し（×２）、１ｍｌのＰＢＳで置換した。ライブセルカルシウムイメージングは、２０倍の乾燥対物レンズ（開口数＝０．７５）を備えたオリンパスＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ  １０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＫｅｙＭｅｄ）上で行った。ビヒクル対照（ＰＢＳ）またはＷｎｔ  Ｘ（３０〜６００ｎｇ／ｍｌ）の添加後、カルシウム指示薬をアルゴンレーザー線（４８８ｎｍ）で励起し、Ｆｌｕｏ−４の発光を緑色のチャンネル（５００〜５６０ｎｍ）で、ＦｕｒａＲｅｄの発光を赤色のチャンネル（６００〜７００ｎｍ）で記録した。１．１秒または２．２秒ごとに、６００〜８００秒までイメージを取得した；イメージおよびデータの取得は、ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、英国）を用いて行った。蛍光強度を測定し、データは、スプレッドシートを用いたさらなる解析のためにタブで区切られたファイルとしてエクスポートした。すべてのイメージング実験を２回行った；１００ｎｇ／ｍｌでの細胞内カルシウムを各Ｗｎｔリガンドの細胞株の少なくとも３〜１２の異なる継代（継代数２５〜３７）で測定した。Ｗｎｔ１１は、３つの異なる濃度で少なくとも５つの異なる継代で試験した。Ｗｎｔ活性化カルシウム放出が［Ｃａ２＋］ｉストアからかどうかを試験するために、場合によっては、Ｗｎｔリガンドの添加およびライブカルシウムイメージング（上述の通り）の前に、カルシウム色素を有するＰＣ３細胞を１〜５μＭのタプシガルギン（シグマ、英国）とともにインキュベートし、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で、２０分間、３７℃で再懸濁した。
【００５７】
膜電位感受性色素であるＦＭ４−６４（インビトロジェン）およびＦｌｕｏ４を用いた実験は、ＦＭ４−６４指示薬の異なる発光スペクトルの検出を行ったこと以外は、Ｆｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄと全く同様に行った；すなわち、両方の指示薬を４８８ｎｍで励起し、Ｆｌｕｏ４の発光を５００〜５６０ｎｍで検出し、ＦＭ４−６４の発光を６５０〜８００ｎｍで検出した。他のすべてのイメージング／データ取得の条件は上記と同様であった。
【００５８】
実験は、１ｍｌのＰＢＳを含む、３５ｍｍのガラス底のＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈを用いて３７℃で行い、ここに所望の濃度でリガンドを添加した。静的非灌流（ｎｏｎ−ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｎｇ）アッセイシステムでは、応答、この場合は遊離カルシウムの放出によるＦｌｕｏ４信号強度の増加、の開始前に時間差がある。これらの条件下での拡散定数を測定するために、４８８ｎｍでの励起で赤色のスペクトルの蛍光を発光するポンタミンスカイブルー（シグマアルドリッチ）を用い、標準的な方法を用いてリガンドを添加した；拡散定数を測定したところ２３．３±２．１μｍ・ｓ−１（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ＝８）であった。カルシウム波は、Ｗｎｔリガンドに応答して、ＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈを越えて伝播した。
【００５９】
外部Ｋ＋調整およびＫ＋チャネル阻害剤の使用
上述のプロトコルを用いて、［Ｃａ２＋］ｉ放出に対する膜電位の変化の影響を測定するために、いくつかの実験で、外液（ＰＢＳ）をＫＣｌの濃度を変化させて置換した。他の実験では、ＴＥＡ、ＣｓＣｌまたはトルブタミド（シグマ−アルドリッチ）などの化学的なＫ＋チャネル阻害剤を、Ｗｎｔリガンドの添加の少なくとも５分前に、３７℃で、ＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ上で成長させた細胞に添加した。
【００６０】
データ解析
イメージ取得後、関心領域（ＲＯＩ）を単一のフレームの個々のＰＣ３細胞（２５まで）に近づけ、カルシウム強度測定をＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、英国）を用いて行った。測定結果は、さらなる解析のためにスプレッドシートにタブで区切られたファイルとしてエクスポートし、Ｆｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比を計算した。波形、測定時間にわたるＦｌｕｏ４およびＦｕｒａＲｅｄの比の積を、異なるＷｎｔリガンドに応答したＰＣ３細胞における［Ｃａ２＋］ｉ放出の活性化の速度論を測定するために用いた。時定数（立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間）は、はじめにＦｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比を単一のガウス関数（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｏｒｐ．，マサチューセッツ州）にフィッティングすることによって計算した；次いで、下部（１０％）および上部（９０％）振幅閾値法を用いて時定数（ｓ）を計算した。差の有意性はマン−ホイットニーＵ検定を用いて計算した。
【００６１】
哺乳類の細胞株の免疫細胞化学
免疫染色は、２つの異なる研究室で、処理の同一性を知らない実験者で独立して行った。ＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ、色素を用いたポスト［Ｃａ２＋］ｉ実験（上記を参照）に用いた細胞、または８ウェルチャンバガラススライド（Ｌａｂ  Ｔｅｋ  ＩＩ、Ｎｕｎｃ）で成長させた細胞のいずれかの細胞を用いた。Ｗｎｔリガンド処理のために、培地をＰＢＳ（カルシウムを含まない）で３７℃で置換した。実験は、［Ｃａ２＋］ｉ測定で記載したように、Ｗｎｔリガンドまたはビヒクル対照で再現された。簡潔には、Ｗｎｔリガンドを添加して、チャンバスライドを３７℃で２０分までインキュベートした。チャンバウェルを０．５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、細胞を０．５ｍｌの４％ホルマリンで３０分間、４℃で固定した。細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、免疫染色のために４℃で０．５ｍｌのＰＢＳ中に保存した。いくつかの実験において、ＰＣ３細胞は、上述のようにタプシガルギンで処理した。
【００６２】
免疫染色のために、細胞をＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．９％  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、シグマ）中で２回、５分間洗浄した。次いで、細胞を２０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）／ＴＢＳＴ中で３０分間、室温でインキュベートし、チャンバを空け、細胞をマウス抗β−カテニン（ａｂ２２６５６、Ａｂｃａｍ、英国）を用いて、ＮＧＳ／ＴＢＳＴ中で１：５００の希釈で、一晩、４℃でインキュベートした。ＴＢＳＴ中でさらに５分間の洗浄を２回行った後、切片を１：５００に希釈したヤギ抗マウスペルオキシダーゼｆａｂ（Ａｂｃａｍ、英国）中で３０分間室温でインキュベートした。ＴＢＳＴ中でさらに５分間の洗浄を２回行った後、細胞をチラミドＣｙ３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０分間室温でインキュベートした。ＤＡＰＩを用いた核の対比染色の前に、切片をＴＢＳＴ中で２回、５分間洗浄した。最後の５分間の洗浄の後、チャンバを除去し、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いてスライド上にカバーガラスを設置した。
【００６３】
β−カテニンの発現のイメージングおよび定量ならびに核共局在化分析
細胞株におけるβ−カテニンの発現の蛍光免疫細胞化学染色は、オリンパスＩＸ８１倒立顕微鏡に取り付けられたオリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＫｅｙＭｅｄ）を用いて、２０倍、０．７ＮＡまたは４０倍、１．０ＮＡの乾燥対物レンズを用いて、３倍の倍率でイメージングした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核の対比染色）は４０５ｎｍで励起し、発光は４１５〜５００ｎｍであった；Ｃｙ３（β−カテニンのラベル）信号は、５６１ｎｍで励起し、発光スペクトルは５７０〜６７０ｎｍであった。レーザーパワー、光電子増倍管（ＰＭＴ）のゲインおよびオフセット設定は、比較できるサンプルで同様に保った。１サンプルあたり少なくとも３視野のＺ−スタックをイメージングしてオリンパスＦＶ（ＯＩＦまたはＯＩＢ）ファイルフォーマットに保存した。
【００６４】
β−カテニンの核共局在化は、Ｃｙ３（β−カテニン）およびＤＡＰＩ（核）の信号について、未処理、対照、または処理した細胞のＦＶファイルをＦｉｊｉソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）の共局在化プラグインに取り込むことによって計算した。共局在化のピアソン相関を、ＲＯＩ解析を用いて、２５〜９０細胞（２〜５の異なる細胞の継代からの）について表にした。未処理の細胞と処理した細胞との間の統計的な有意性はマン−ホイットニーＵ検定を用いて計算した。
【００６５】
スクラッチ創傷アッセイ
ＰＣ３細胞を２４ウェルのＩｍａｇｅＬｏｃｋプレート（エッセンバイオサイエンス、ミシガン州）で高密集度まで成長させ、創傷メーカーデバイス（エッセンバイオサイエンス、ミシガン州）を用いて傷をつけた。創傷幅のイメージング（２時間間隔で）および定量は、以前に記載した方法（Ｗａｎｇ  ａｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）で、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（エッセンバイオサイエンス、ミシガン州）を用いて行った。創傷閉鎖（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）速度（±Ｗｎｔおよびタプシガルギン）は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｏｒｐ．，マサチューセッツ州）の線形回帰関数を用いて線をフィッティングすることによって計算した。未処理および処理したサンプルの傾きの間の差の統計的有意性は、Ｆ検定を用いて計算した。
【００６６】
細胞増殖アッセイ
ライブイメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ、エッセンバイオサイエンセス）を用いて細胞増殖速度に対するＫ＋チャネル阻害剤の影響を測定した。ＰＣ３細胞を３ｍｌの培地（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）中で６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に配置した；Ｋ＋チャネル阻害剤を０〜１５ｍＭでウェルに添加した。プレートを３７℃、ＣＯ２の標準細胞培養インキュベータ中のＩｎｃｕｃｙｔｅに設置した。各ウェルで４時間までの間隔でイメージを撮影し、これらのイメージからＩｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアを用いて細胞増殖速度を計算した。
【００６７】
化合物および材料
以下の化合物を用いた。
【００６８】
【表１】
2016535016.tif 000003
【００６９】
−陰茎組織アレイはＵＳ  Ｂｉｏｍａｘから購入した。前立腺組織アレイは研究室で特別注文した。
−抗体はサイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、米国から購入）およびＣ０ｍｙｃ（Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ、英国）以外はＡｂｃａｍ（英国）から購入した。
【００７０】
実施例１−複数のＷｎｔリガンドによる細胞内カルシウムの活性化およびβ−カテニンの核への移行：Ｗｎｔ／Ｃａ２＋およびＷｎｔ／β−カテニン経路の収束モデル
本発明者らは、Ｗｎｔ媒介性の［Ｃａ２＋］ｉの増加は、核質のカルシウムを増加させ、ＮＥの脱分極をもたらし、これはＮＥを横切るβ−カテニンの通過を促進する、という仮説を立てた。哺乳類細胞において［Ｃａ２＋］ｉ放出を活性化できるＷｎｔの識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は十分に特徴解析されていない。前立腺癌細胞において、Ｗｎｔ５Ａは、［Ｃａ２＋］ｉの大きな増加を誘導するが、これが核質のＣａ２＋の増加およびＮＥの脱分極をもたらすのか、さらに、その後のβ−カテニンの核質への移行があるのかはわかっていない。本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、はじめに、（ｉ）Ｗｎｔ５Ａ以外のＷｎｔもまた［Ｃａ２＋］ｉを増加させるのか、（ｉｉ）Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達の活性化による［Ｃａ２＋］ｉの増加は核膜の脱分極をもたらすこと、（ｉｉｉ）複数のＷｎｔリガンドによって活性化された細胞において、β−カテニンは核へ移行すること、を決定した。Ｗｎｔリガンドで活性化された哺乳類の癌細胞株（ＰＣ３：前立腺癌細胞株、ＭＣＦ７：乳癌細胞株および２５３Ｊ：膀胱癌細胞株）において、ライブ蛍光色素アッセイおよびその後のβ−カテニンの核質への移行の評価を用いることによって、本発明者らは、多くのＷｎｔリガンドは、異なる速度論で、細胞内および核内Ｃａ２＋、ＮＥの脱分極ならびにβ−カテニンの核への移行を増加させること；Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出の増加およびβ−カテニンの移行の増加の両方は、ミクロソームＣａ２＋−ＡＴＰアーゼの阻害剤であるタプシガルギンによって抑制されることを示した。Ｗｎｔ／Ｃａ２＋およびＷｎｔ／β−カテニン経路は、以前考えられていたように独立しておらず、連動しているというモデルもまた提案された。
【００７１】
結果
本発明者らは、以前、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達はＰＣ３細胞における細胞骨格および運動性の極めて重要な調節剤であり、［Ｃａ２＋］ｉを２．５倍増加させることを示した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）。前立腺および他の哺乳類の細胞において細胞内Ｃａ２＋放出を誘導するＷｎｔ５Ａ以外のＷｎｔの能力についてほとんど知られていない。本発明者らが答えようとした最初の疑問は、ＰＣ３細胞株において、他にどのＷｎｔが［Ｃａ２＋］ｉ放出を誘導するのか？であった。
【００７２】
Ｗｎｔリガンドに応答した［Ｃａ２＋］ｉ放出
試験したすべてのＷｎｔリガンドの添加は、Ｗｎｔ１１を除いて、ＰＣ３細胞におけるＦｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比の変化を引き起こした。Ｆｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比を時間の関数としてプロットし（図１、試験したすべてのＷｎｔの代表的なトレース）、波形を、異なるＷｎｔリガンドに応答した、ＰＣ３細胞における［Ｃａ２＋］ｉの活性化の速度論を測定するために用いた。大きさおよび時定数（立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間）などのパラメータは、はじめにＦｌｕｏ４／ＦｕｒａＲｅｄの比を単一のガウス関数にフィッティングすることによって計算した。次いで、本発明者らは、下部（１０％）および上部（９０％）振幅閾値法を用いてタイミングパラメータを計算した。Ｗｎｔリガンドに応答した［Ｃａ２＋］ｉ放出の大きさは、カルシウム波形のピークを表す。カルシウム放出の大きさは、Ｗｎｔリガンド濃度依存性であった。多くのＷｎｔリガンド（例えば、５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂ）もまたＭＣＦ７および２５３Ｊのヒトの乳癌および尿路癌の細胞株においてそれぞれ［Ｃａ２＋］ｉ放出を活性化し、この現象がＰＣ３細胞株に特異的ではないことを示した。さらに、Ｗｎｔ５ＡもまたＣｏｓ７サル腎臓細胞株において［Ｃａ２＋］ｉを活性化した。
【００７３】
タプシガルギンは、小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼの阻害剤であり、［Ｃａ２＋］ｉストアを枯渇させる（Ｔｈａｓｔｒｕｐ，Ｏ．  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８７，２４６６−２４７０）。リガンド誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を調べるために、以前はタプシガルギンを用いていた。試験したＷｎｔリガンド（５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂ）に応答した［Ｃａ２＋］ｉの増加は、タプシガルギン（５μＭ）を用いたＰＣ３細胞の処理の後、停止した（図２）。これらの結果は、［Ｃａ２＋］ｉの枯渇はＷｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を停止させることを示す。
【００７４】
［Ｃａ２＋］ｉ放出の立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間
Ｗｎｔペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）に応答した［Ｃａ２＋］ｉ放出の立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間の時定数を実験手順に記載したように計算し、図３に示した。Ｗｎｔ３ＡおよびＷｎｔ５Ａは最も短い立ち上がり時間および立ち下り時間を示したが、Ｗｎｔ９ＢおよびＷｎｔ４は最も遅い立ち上がり時間および立ち下り時間を示した（図３ＡおよびＣ）。ＤＴは、Ｗｎｔペプチドの適用後、［Ｃａ２＋］ｉ信号がピークの大きさで維持された時間を反映する。ＤＴ解析（図３Ｂ）から、［Ｃａ２＋］ｉ放出を活性化する６つのＷｎｔは、３つのクラスに分類されうることが示される：３Ａおよび５Ａは、短い（ＤＴ＜１５ｓ）、７Ａおよび１０Ｂは、長い（ＤＴ＞２５ｓ）、そして４および９Ｂは、非常に長い（ＤＴ＞３０ｓ）。
【００７５】
Ｗｎｔリガンドは負の協同的なメカニズムによってカルシウムを活性化する
［Ｃａ２＋］ｉ放出の速度論を、各Ｗｎｔリガンドについて、３つの異なる濃度を用いてさらに解析した。各Ｗｎｔリガンドの低い、中間の、および高い濃度の関数としての立ち上がり、滞留、および立ち下がり時間のボックス−ウィスカープロットを示す。時定数は、Ｗｎｔ３Ａ、４、５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂでは、少なくとも２つの異なる濃度の間で有意に異なったが、Ｗｎｔ７Ａでは、これらの時定数に差はみられなかった。本発明者らは、Ｗｎｔ３Ａ、４、５Ａ、９Ｂおよび１０ＢのＤＴ定数をより詳細に比較し、ＤＴデータをフィッティングすることによって［Ｃａ２＋］ｉ放出のメカニズムを解明し、一次反応の反応速度式を計算した（図４）。際立って、Ｗｎｔ３Ａ、４、９Ｂおよび１０Ｂは負の協同性を示すが、Ｗｎｔ５Ａは示さない。負の協同性は、リガンドの濃度が増加するにつれて関数（ＤＴ）が減少することを示す；負の協同性を示すＷｎｔの速度定数を図４に示す。Ｗｎｔ５Ａは、最大半量濃度がＫ１／２が６７ｎｇ／ｍｌの古典的なミカエリス−メンテン速度論に従う、唯一の［Ｃａ２＋］ｉを活性化するＷｎｔリガンドであった。これらの結果は、Ｗｎｔ（３Ａ、４、９Ｂおよび１０Ｂ）のこれらの受容体への結合の負の協同性の最初の証拠を提供し、受容体／リガンド相互作用を介した、異なるＷｎｔによる［Ｃａ２＋］ｉ放出の分子動力学は、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達の重要な調節メカニズムを提供しうることを、これも初めて示す。
【００７６】
［Ｃａ２＋］ｉ放出は核内Ｃａ２＋の増加をもたらし、核における電気的活性を変化させる
カルシウムは核における電気的活性の重要な調節剤である（Ｍａｚｚａｎｔｉ，Ｍ．  ａｔ  ａｌ（２００１）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８１，１−１９）。Ｃａ２＋の核内濃度は細胞質Ｃａ２＋の増加に従う（Ａｌｌｂｒｉｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９１，１２４５８−１２４６２）。したがって、本発明者らは、ＰＣ３およびＭＣＦ細胞において、Ｗｎｔを含む、または含まない、Ｆｌｕｏ４およびＦＭ４−６４を有する細胞を用いて核内カルシウムおよび膜電位の変化を調べた。これらの細胞にＷｎｔリガンドを添加すると、緑色のチャンネル（５００〜５６０ｎｍ）における［Ｃａ２＋］ｉ（Ｆｌｕｏ４）信号が増加した。〜３００秒後、赤色のチャンネル（６５０〜８００ｎｍ）におけるＦＭ４−６４信号の強度が増加した；予想されたように、細胞膜の脱分極が生じた（図５）。また、核の周辺のＦＭ４−６４の強度の増加があり、これはＰＣ３細胞におけるトランス核（ｔｒａｎｓｎｕｃｌｅａｒ）エンベロープ電位の脱分極を示す（図５）。
【００７７】
Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達および細胞運動性
下流のＷｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達の阻害の１つの機能的結果は、細胞運動性の減少である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）。Ｗｎｔ９Ｂおよび１０ＢなどのＷｎｔ／古典的シグナル伝達リガンドによってＷｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達が阻害されるかどうかを試験するために、本発明者らは、Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出がタプシガルギンによって阻害される、創傷スクラッチアッセイを用いた。Ｗｎｔ５Ａまたは９Ｂの存在下で、損傷を受けたＰＣ３細胞における創傷閉鎖速度は、対照の未処理細胞のものと同様であった。しかしながら、タプシガルギンで処理した細胞では、Ｗｎｔリガンドの存在下でも創傷閉鎖速度の有意な低下があった。これらの結果は、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達の下流のメカニズムは、古典的な、非古典的（Ｗｎｔ５Ａ）または古典的（Ｗｎｔ９Ｂ）Ｗｎｔリガンドと同様であることを示す。タプシガルギンを用いたインキュベーションによって［Ｃａ２＋］ｉが阻害された場合、同様の結果がＷｎｔ３Ａおよび１０Ｂで得られた。
【００７８】
核膜の脱分極の後のβ−カテニンの核への移行
β−カテニンの発現を、Ｗｎｔリガンドの活性化および［Ｃａ２＋］ｉ放出の後、免疫蛍光を用いて決定した。ビヒクル対照と比較して、Ｗｎｔ５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂで処理したＰＣ３細胞において、β−カテニンの発現の増加があった（図６）。ビヒクル処理した細胞では、β−カテニンの発現はほとんどなかった（図６Ａ）；β−カテニンの発現は、Ｗｎｔ５Ａ（図６Ｂ）、Ｗｎｔ９Ｂ（図６Ｃ）およびＷｎｔ１０Ｂ（図６Ｄ）で処理したＰＣ３細胞において目に見えて増加し、核において可視である。同様の結果がＰＣ３細胞におけるＷｎｔ３ＡおよびＷｎｔ４で得られた。β−カテニンおよびＤＡＰＩ信号の共局在化をＦｉｊｉソフトウェア（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，６７６−６８２）を用いて、方法に記載したように定量化した。細胞がＷｎｔ３Ａ、４、５Ａ、９Ｂおよび１０Ｂにさらされたとき、β−カテニンの核の共局在化のピアソン係数が有意に増加した（図７）。さらに、細胞をタプシガルギンを用いてインキュベーションすることによるＷｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出の阻害は、β−カテニンの核への移行を減少させ、β−カテニンの移行と、ストア作動性のタプシガルギンで阻害可能な［Ｃａ２＋］ｉ放出と、おそらく核膜電位の変化との間の関連を示す。
【００７９】
本発明者らはまた、Ｗｎｔクラス（図３で分類される）のパラダイムリガンドを２つの他の細胞株に用いて、［Ｃａ２＋］ｉ放出の増加の後、β−カテニンの核への移行が起こることを見出した。この結果は、多くのＷｎｔリガンドに応答した［Ｃａ２＋］ｉの増加は、核膜の脱分極およびβ−カテニンの細胞質ゾルから核への移行をもたらすことを示す。
【００８０】
議論
Ｗｎｔシグナル伝達は、独立した古典的経路および非古典的経路に分類され、ここでβ−カテニンは前者の極めて重要なトランスデューサーであり、Ｃａ２＋は後者の主要なエフェクタ分子である（他の非古典的経路としては、平面内細胞極性（Ｇｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．６８，３７−５７；Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３，１４３−１５１）およびｃＧＭＰ／ＰＤＥ経路が挙げられる。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、古典的経路の同義語として用いられている。上記分類は、最近の例がいくつかのクロストークを示しているため絶対的ではないが、Ｗｎｔシグナル伝達を記述するための、β−カテニン依存性の経路と依存しない経路との区別は、解決されていないままであった。本発明者らは、哺乳類細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に関する２つの重要な疑問：（１）どの、およびいくつのＷｎｔリガンドが細胞内カルシウムを動員することができるのか？；および（２）β−カテニンが核に入るメカニズムは何か？に取り組んだ。データから、初めて、哺乳類細胞において、従来はβ−カテニン経路を介してのみ働くと考えられていたＷｎｔリガンド（例えばＷｎｔ９Ａ、１０Ｂ）を含めて、直接カルシウム測定アッセイにおいて試験した７つのＷｎｔのうち６つが［Ｃａ２＋］ｉを動員することが示された（図１）。タプシガルギンを用いた細胞のインキュベーションによる、小胞体からの［Ｃａ２＋］ｉの放出およびミクロソームＣａ２＋−ＡＴＰアーゼの阻害が、Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出の増加を停止させ（図２）、β−カテニンの核への移行を減少させた。タプシガルギンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁させた。ＤＭＳＯは多くの細胞でＣａ２＋スパイクを誘導する；ＰＣ３細胞での結果は以前の観察と一致した。タプシガルギンはまた、１２０秒以内に減少してベースラインに達するＣａ２＋トランジェントを誘導した（図２）。しかしながら、ＤＭＳＯを用いた１５分間のインキュベーションは、Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を停止させたタプシガルギン処理（図２）と異なって、Ｗｎｔ誘導性の［Ｃａ２＋］ｉの増加に影響せず、Ｗｎｔがストア作動性Ｃａ２＋放出を活性化することを示す。
【００８１】
この結果は、古典的および非古典的経路の極めて重要なトランスデューサーは、哺乳類細胞においてＷｎｔシグナル伝達を活性化することに収束することの初めての証拠を提供する。多様な哺乳類の細胞株における複数のＷｎｔリガンドが、遊離の細胞内および核質のＣａ２＋を増加させ、ＮＥを脱分極し、β−カテニンの核質への移行を増加させ、独立したものではなく、結合した（ｃｏｕｐｌｅｄ）Ｗｎｔ／Ｃａ２＋およびβ−カテニン経路を示唆する、Ｗｎｔシグナル伝達ネットワークの新しい収束モデルが提案された（図８）。哺乳類細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の提案された段階：［１］Ｗｎｔ（３Ａ、４、５Ａ、７、９Ｂおよび１０Ｂ）の結合は、［２］細胞内カルシウムストアの活性化をもたらし、これは［３］遊離のストア作動性カルシウムの細胞内濃度を増加させる（図１、２および３）。遊離カルシウムの増加は、細胞膜を脱分極させ、そして［４］カルシウムが核に入るにつれて、ＮＥが脱分極される（図５）；遊離細胞内カルシウムに結合した活性化のための計算された拡散定数は０．２１μｍ／ｓであり、段階１〜４の時定数はミリ秒の範囲であると考えられる。
【００８２】
本発明者らは、以前、Ｗｎｔ５ＡによるＷｎｔ／Ｃａ２＋経路の活性化は、［５］ＣａｍＫＩＩ活性を増加させ、前立腺癌細胞における細胞骨格の調整を誘導することを示した（Ｗａｎｇ  ａｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０４５６）。これまでの研究（レビューとして、Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．４，ｐｉｉ：ａ０１１１６３を参照）によって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、［６］細胞質ゾルにおいて、ケージド（ｃａｇｅｄ）β−カテニン（プロテアソームの分解の前にリン酸化（Ｐ）およびユビキチン化（ＵＵＵ）された、灰色の四角）を脱隔絶する（ｄｅｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ことが十分に確立されている。脱隔絶されたβ−カテニン［７］の移行が促進されてＮＥを越え（図５）、これは今度は［８］脱分極され、核質のカルシウムが増加する。［９］β−カテニンは、今や核に共局在化され（図６および７）、ここでＬＥＦ／ＴＣＦタンパク質に結合して遺伝子転写を開始することが知られている。単純化のために、図には、Ｗｎｔシグナル伝達に含まれる多くの他のタンパク質は示されておらず、Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路などの複数の他の経路も含まれていない。この証拠の段階を紫の斜線の矢印で示す。
【００８３】
Ｗｎｔリガンドの分類ならびに古典的および非古典的経路への区別
β−カテニンまたはカルシウム経路を介したＷｎｔリガンド媒介性シグナル伝達の分類は、そのアフリカツメガエル胚の二次軸を誘導する能力またはそのＣ５７ｍｇ細胞を形質転換する能力に主に基づく。Ｗｎｔ１、３Ａ、８および８ＢなどのＷｎｔの異所性発現は、アフリカツメガエル胚の二次軸を誘導し、β−カテニンを安定化させることがわかり、Ｗｎｔ５Ａおよび１１などの他のＷｎｔはそのようなことがなかった。Ｗｎｔ１クラスのメンバーとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ＢおよびＷｎｔ１０Ｂ（Ｗｎｔ１は、Ｗｎｔ１０Ｂとアミノ酸配列の９６％の同一性を共有し、機能がオーバーラップする）が挙げられ、これらはアフリカツメガエル胚の二次軸を誘導し、古典的Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化する。Ｗｎｔ５Ａクラスは、アフリカツメガエルの二次体軸の形成を誘導することはなく、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ＡおよびＷｎｔ１１を含む。ゼブラフィッシュ胚の研究は、Ｗｎｔ５ＡおよびＷｎｔ１１の過剰発現はカルシウム放出を誘導するが、Ｗｎｔ８の過剰発現はカルシウム放出を誘導しないことを示す。
【００８４】
しかしながら、いわゆる非古典的経路に関連するＷｎｔは培養下の細胞を形質転換できることが示されると、これらの区別は曖昧になった。加えて、Ｗｎｔファミリーのリガンドは、細胞膜受容体を共有しやすく、ほとんどの細胞は同時にさまざまなＷｎｔリガンドにさらされる。これらのシグナルおよびこれらが活性化しうる経路（例えばＷｎｔ／β−カテニンまたはＷｎｔ／Ｃａ２＋または両方）のバランスは、例えば、幹細胞の細胞運命または癌細胞が転移するかどうか（例えば運動性の能力が向上することによって）を決定しうる。前立腺または他の哺乳類の細胞において細胞内Ｃａ２＋放出を誘導する、Ｗｎｔ５Ａ以外のＷｎｔの能力について、ほとんど知られていない。Ｗｎｔ１１は、本発明者らの研究で試験された中で、［Ｃａ２＋］ｉを動員しなかった唯一のリガンドである。これについて考えられる説明は、ＲＷＮＣモチーフに近接した５ＡＡ残基における共通Ｗｎｔ配列から外れた一次アミノ酸（ＡＡ）に存在しうる。
【００８５】
核質のＣａ２＋の増加およびＮＥの脱分極の後のβ−カテニンの核への移行
ＮＥを横切る高分子輸送は、多くの独立した、および相互依存した、生化学的および電気化学的過程から構成される。これらは、核を他の細胞質タンパク質と結合させ、エネルギー依存性メカニズムまたは特定のタンパク質のリン酸化を必要とするその侵入を促進する、タンパク質のＮＬＳ結合を含みうる。β−カテニンはＮＬＳを含まないが、インビトロの生化学実験を用いることによって、Ｓｈａｒｍａらは、この認識は、β−カテニンのアームドメインのＮＰＣ成分タンパク質との相互作用によって生じうることを示した。これが外側ＮＥに到達しても、β−カテニンは核質に入るのにかなりの障壁に向き合い、これらの実験は、β−カテニンが外側ＮＥを標的とすることを示すが、９２ｋＤａの負に荷電したタンパク質（ｐＨ７．０で−２０．８）であるβ−カテニンが、どのように有意な生物物理学的ハードルを克服して、細胞中でＷｎｔ−シグナル伝達に応答してＮＥを横切ることができるのかを説明していない。
【００８６】
他のメカニズムは、中サイズの（〜４０ｋＤａ）転写因子（ＮＦκＢまたはＳＰ１など）の輸送のＮＰＣチャネル活性のサイレンシングを含む。Ｃａ２＋イオンはまた、高分子のトランス−ＮＥ輸送における役割を果たし、核内Ｃａ２＋の枯渇は、特に中間サイズ（７０ｋＤａ）の高分子の、しかしながら小さい（＜１０ｋＤａ）高分子についても、ＮＥを越える高分子輸送を阻害しうることが提案されている。９２ｋＤａの転写因子であるβ−カテニンの、細胞質ゾルから核への移行は、いわゆる古典的Ｗｎｔシグナル伝達における極めて重要な事象であるが、この移行のメカニズムはわかっていない。核内Ｃａ２＋の増加および核膜の脱分極の増加（図５）、ならびにタプシガルギンの存在下でのβ−カテニンの核への移行の減少は、膜電位調節イオンのＰＣ３細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の調節剤としての推定される役割を示唆する。
【００８７】
ここに提案される哺乳類の細胞のＷｎｔシグナル伝達の収束モデル（図８）では、さまざまなＷｎｔリガンドのその受容体への結合は、［Ｃａ２＋］ｉ放出を活性化させる（図１）。［Ｃａ２＋］ｉの鋭い過渡的な増加は、Ｗｎｔリガンドの活性化から３０秒以内に核内Ｃａ２＋の増加をもたらす（図５）。核内Ｃａ２＋の増加およびＮＥの脱分極の後、さらに、β−カテニンの核発現の明らかな増加がある（図６および７）。ここに示されるモデルは、β−カテニンをＮＥまたは下流の事象に向かわせる、上流に戻る事象、例えば、同様に最終的なβ−カテニンの核への移行を促進しうる、エネルギー消費または他の生化学的および高分子輸送のメカニズムの関与など、を排除しない。しかしながら、これは、β−カテニンの核への輸送において、その機能的活性が存在する、重要な、まだ考慮されていない電気化学的側面を含む。これはまた、少なくとも哺乳類の細胞株において、個々のリガンドによって活性化された複数のトランスデューサーの活性を促進し、増幅し、調節することができる総合的なシグナル伝達過程を示唆する（図８）。
【００８８】
実施例２−膜電位および細胞内カルシウムの調節のβ−カテニンの核への移行が調節不全である疾患を制御するための治療上の使用
実施例１に記載されるように、本発明者らは、［Ｃａ２＋］ｉ放出がβ−カテニンの核に入ることを促進するというＷｎｔシグナル伝達の新しい収束モデルを提供した。
【００８９】
結果
本発明者らは、先に実施例１において、［Ｃａ２＋］ｉの放出は、β−カテニンの安定化の前に、β−カテニンの核への移行を促進することを示した。細胞膜の脱分極に加えて、［Ｃａ２＋］ｉの放出（または細胞内Ｋ＋またはＮａ＋の増加）もまた、核膜を含む細胞内膜を脱分極させる（Ｍａｚｚａｎｔｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８１，１−１９）。細胞膜を横切るＫ＋濃度勾配は、Ｎａ＋濃度勾配とともに、膜電位の極めて重要な調節剤であり、細胞内Ｃａ２＋もまた役割を果たす。Ｋ＋濃度勾配の減少（例えば細胞外Ｋ＋濃度の小さな上昇による）は細胞膜を脱分極させ、広がっている（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）Ｋ＋勾配の増加は膜電位を過分極させる（脱分極および過分極の両方が相対的な用語である）。本発明者らがした最初の質問は、外部Ｋ＋濃度の変化はＷｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を変化させるのか？であった。
【００９０】
Ｗｎｔリガンドに応答した膜電位の変化および［Ｃａ２＋］ｉ放出
Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出の速度に対する変化した膜電位の影響を測定するために、３つの異なる濃度のＫ＋を細胞外溶液に用いた（図９）。細胞外Ｋ＋の増加およびこれによるトランス−細胞Ｋ＋勾配の減少は、Ｗｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を阻害し（図９）、Ｗｎｔシグナル伝達は起電性であることを示した。これは新しい見解である。Ｗｎｔシグナル伝達の第２のトランスデューサーであるβ−カテニンもまた、広がっている膜電位に依存する；Ｋ＋勾配が減少するにつれてＷｎｔ媒介性のβ−カテニンの核への移行が増加する（図１０）。後者は一見すると直観に反しているように思われるが、脱分極（細胞膜の内側が外側に比較して正である）は、特に核膜電位について、遊離のＷｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出の放出および輸送による細胞内正電荷の増加と同様の結果をもたらす。この見解は、膜電位色素を用いて確認された。
【００９１】
Ｋ＋チャネル遮断薬およびＷｎｔ媒介性の［Ｃａ２＋］ｉ放出、β−カテニンの安定化および核への移行
Ｗｎｔシグナル伝達における膜電位、特にＣａ２＋イオンおよびＫ＋イオンの役割を確立して、本発明者らは、次に、Ｋ＋チャネルの遮断がＷｎｔシグナル伝達、特にβ−カテニンの核への移行を変化させるのかを試験した。これを行うために、ＰＣ３細胞をさまざまな既知のＫ＋チャネル遮断薬を用いてインキュベートした。ＴＥＡ（一般的なＫ＋チャネル遮断薬）を用いたＰＣ３細胞のプレインキュベーションはＷｎｔ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ放出を減少させた（図１１）。さらに、ＴＥＡおよびＣｓＣｌ（Ｋｉｒ  １型のチャネルの遮断薬）およびトルブタミド（Ｋｉｒ  ６型のチャネルを遮断する）などの他のＫ＋チャネル阻害剤を、すべて生理的濃度の範囲で用いたＰＣ３細胞のインキュベーションは、Ｗｎｔ媒介性のβ−カテニンの安定化および核への移行を減少させた（図１１Ｂ）；一般的なＫ＋チャネル阻害剤であるＴＥＡは、Ｗｎｔ媒介性のβ−カテニンの安定化および移行の最も大きな減少を示した。
【００９２】
Ｋ＋チャネル遮断薬および細胞増殖
癌などの増殖性疾患におけるβ−カテニンの役割は確立されている（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８，３２０−３２３）。Ｋ＋チャネル阻害剤がＷｎｔ媒介性のβ−カテニンの核への移行を減少させると、細胞がこれらの阻害剤を用いてインキュベートされた場合、細胞増殖の減少が起こる結果となる。本発明者らは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いた細胞成長曲線を用いて細胞増殖速度を測定した（材料および方法を参照）。いずれのＫ＋およびＣａ２＋チャネル阻害剤の添加によっても、細胞増殖速度の減少がもたらされた（図１２）。これらの結果は、ＰＣ３細胞株におけるＫ＋チャネルの阻害は、おそらくＷｎｔシグナル伝達を減少させる、または阻害することによって、細胞成長を阻害することを示す。
【００９３】
議論
ここに示したデータは：（ｉ）膜電位の調整、または、（ｉｉ）チャネルの遮断（例えばＴＥＡ、トルブタミドを用いて）は、Ｗｎｔ媒介性の［Ｃａ２＋］ｉ放出およびβ−カテニンの核への移行を阻害する、および、（ｉｉｉ）細胞増殖を減少させることを示す。Ｗｎｔ媒介性のβ−カテニンの細胞核への移行は、癌または骨粗鬆症などの疾患における重要な事象である。細胞膜タンパク質を標的にすることによって、β−カテニンの核への移行を調節することは、これらの疾患に対抗するための有用なアプローチでありうると長く考えられてきた。しかしながら、古典的な薬理学的アプローチは有用または有効な治療をもたらさず、通常は困難であることがわかった。
【００９４】
実施例１で議論したＷｎｔシグナル伝達の新しい収束モデルの構築によって発見された本発明者らのアプローチは、Ｃａ２＋および広がっている細胞および核の膜電位が、Ｗｎｔシグナル伝達の極めて重要な調節剤であることを示す。本発明者らはまた、これは異なる器官（例えば、前立線、乳房、膀胱、腎臓）からの細胞株で起こり、共通の細胞現象である可能性が高いことを示した。膜電位の調節は、膜におけるイオン輸送体の活性によって主に行われる極めて重要な細胞過程である。この結果は、明らかに、膜電位または細胞内Ｃａ２＋放出を変化させることは、β−カテニンの核への移行を調整することを示す。これは、何十年もの間にわたって科学研究および臨床用途にあった化合物および調節剤を用いた、Ｗｎｔシグナル伝達経路を標的とするための新しい手段を切り開く。下流と異なって、Ｗｎｔシグナル伝達の細胞質調節剤（例えば、ＧＳＫ３βなどのキナーゼ、阻害剤）、ほとんどの細胞膜電位調節剤は複合細胞膜タンパク質であり、薬剤のインビボの接近しやすさはハードルをもたらさない。
【００９５】
ここに示したデータから、トランス−細胞Ｋ＋勾配を消失させることによって、または既知の阻害剤を用いてＫ＋チャネルを阻害することによって、膜電位を変化させることは、Ｗｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出およびβ−カテニン移行の両方を変化させると考えられる。このＷｎｔシグナル伝達の減少のメカニズムは、［Ｃａ２＋］ｉの変化、細胞膜および核膜の電位の変化の両方によるものと考えられる（図９〜１１）。これは、多くの化合物、例えば、膜電位を脱分極して（例えば、ＢＴＬまたはロキサピンなどのＮａ＋チャネル開口薬）、Ｗｎｔ媒介性のβ−カテニン移行膜を増加させる化合物を、β−カテニンの核への移行の減少が存在する骨粗鬆症（Ｂａｒｏｎ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｋｎｅｉｓｓｅｌ，Ｍ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９，１７９−１９２）などの疾患に用いることができることを意味する。
【００９６】
逆に、癌のような疾患では、Ｗｎｔシグナル伝達の増加および結果として生じるβ−カテニンの核への移行の増加がある（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １４９，１１９２−１２０５；Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１７，４５−５１；Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．（２０１２）ＥＭＢＯ  Ｊ．３１，２７３７−２７４６）。この結果は、多くのチャネル阻害剤（図１０〜１２を参照）はＷｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出および細胞増殖の両方を減少させることを示し、これはＫ＋チャネルの阻害剤は独立して、またはＷｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出を減少させることによって、β−カテニンの核への移行を減少させることができることを示す。実際、電気生理学的研究もまた、Ｗｎｔシグナル伝達は起電性であり、広がっている膜電位およびＣａ２＋調節剤の両方によって調節されるというアイデアを支持する（Ａｈｍｅｄ，Ａ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｈ，未発表データ）。
【００９７】
ＣｓＣｌ、ＴＥＡ、トルブタミドなど（表１参照）などの薬剤の新規の用途が、Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行が発癌に含まれる、前立腺癌、乳癌、結腸癌（Ｂａｒｏｎ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｋｎｅｉｓｓｅｌ，Ｍ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９，１７９−１９２）、下垂体癌および他の癌の治療のために提案される。さらに、膜電位の脱分極（例えば、ＢＴＬまたはロキサピンなどのチャネル開口薬を用いてＮａ＋の内側への動きを増加させることによって）もまた、骨芽細胞の破骨細胞への分化においてβ−カテニンの明確な役割のある骨粗鬆症の有効な治療になることは明らかである。トルブタミド（薬剤名オリナーゼ）は、そのＫＡＴＰチャネルに対する作用によってインシュリン放出を刺激することが知られている。本発明者らは、トルブタミドの存在下でのβ−カテニン移行の阻害（図１１）および細胞増殖の阻害（図１２）を観察した。β−カテニン／ＴＣＦ／ＬＥＦ媒介性遺伝子転写の役割を考えると、他の分子または抗体によるβ−カテニン移行の阻害もまた糖尿病（特にＩＩ型）の治療に用いられうる。
【００９８】
Ｗｎｔ媒介性［Ｃａ２＋］ｉ放出の阻害と、β−カテニンの核への移行および転写の低減とが癌において起こりやすいことの根拠は、公表された疫学的研究によって間接的に支持されている：β遮断薬は、高血圧の標準的な治療法であり、サイクリックＡＭＰの増加を介して働き、カルシウム依存性カルモジュリンキナーゼ（Ｗｎｔおよび他のカルシウムシグナル伝達経路の下流標的）の活性を増加させる。β遮断薬を用いて血圧を低下させる治療は、遊離細胞内カルシウムの減少を伴うことも知られている（Ｂａｕｍｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８，５５９−５６１）。遊離細胞内カルシウムの減少は、細胞および核の膜電位の過分極をもたらす（Ｇｅｉｓｚｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２６４７１−２６４７８；Ｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４，２９４７−２９５３）。乳癌、皮膚癌および前立腺癌における３つの独立した疫学的研究において、β遮断薬の投与を受けた患者は癌の進行および死亡率の発生率が低いことが示唆されている（Ｂａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９，２６３５−２６４４；Ｍｅｌｈｅｍ−Ｂｅｒｔｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９，２６４５−２６５２；Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２０，２２７３−２２７９；Ｇｒｙｔｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．）。
【００９９】
以下の表１に、癌、糖尿病および骨粗鬆症などのβ−カテニン関連疾患を治療するために用いられうるいくつかの化合物を示す。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
イオンチャネルまたは輸送体の活性を調整する提案された化合物のほとんどは、現在は臨床で癌または骨粗鬆症以外の指標のために用いられている（第１の用途）。これらの薬剤および化合物は、癌、糖尿病、または骨粗鬆症の治療としての第２の用途のために提案される。
【０１０２】
癌の標的化免疫学的治療：
１）組織特異的チャネルを遮断する治療用抗体
実施例３−前立腺癌および陰茎癌
図１３、１４、および１５に示すように、本発明者らはＷｎｔシグナル伝達を調べ、これが前立腺癌および陰茎癌において増加していることを確認した。
【０１０３】
図１３は、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質は前立腺癌組織でアップレギュレートされることを示す。前立腺癌のサンプルと比較して、正常なサンプルではＷｎｔシグナル伝達標的の発現に目に見える定量的な差があった。図１４は、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質はヒト陰茎扁平上皮細胞癌でアップレギュレートされることを示す。定量分析は、増強していない、オリジナルのグレー画像を用いて行い、そのすべての設定は分析したすべての組織のコアのイメージで同一であった。図１５は、病理学的グレードに従って分類された、ＰｅＣａ組織におけるＷＮＴ４、ＭＭＰ７、ＣＤ１およびｃ−ＭＹＣの発現の定量のボックスプロットである。すべてのタンパク質は対照と悪性腫瘍サンプルとの間で発現に有意な差を示した。
【０１０４】
実施例４−Ｗｎｔシグナル伝達はカルシウム放出を誘発する
図１６を参照すると、Ｗｎｔ誘導性カルシウム放出によって測定された、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する一連の膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）の結果が示される。図１６ＡはＷｎｔ誘導性カルシウム放出の代表的なトレースを示す。Ｗｎｔリガンド誘導性カルシウム放出は、ＭＰＲＣ（ＣｓＣｌ、ＣｄＣｌ２、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、アミオダロン、トルブタミド、イスラジピン、ニフェジピン、ミノキシジル、アテノロール、プロパノロール（Ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）およびフロセミド）を用いた５分間のプレインキュベーションの後、阻害された。
【０１０５】
実施例５−Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行
図１７を参照すると、ＰＣ３前立腺癌細胞株において、Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行によって測定されるＷｎｔシグナル伝達を阻害する多くの膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）の結果が示される。ＣＯ２インキュベータで３７℃で、ＭＰＲＣを用いたプレインキュベーションをして、またはせずに、細胞をＷｎｔで処理した。Ｗｎｔを添加して、細胞をさらに２０〜３０分間インキュベートし、洗浄し、固定して染色した。
【０１０６】
図１８は、ＭＣＦ７乳癌細胞株において、膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）は、Ｗｎｔ媒介性β−カテニン移行によって測定されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。
【０１０７】
実施例６−前立腺癌細胞株および乳癌細胞株
図１９は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＰＣ３前立腺癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。図２０は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する膜電位調節化合物（ＭＰＲＣ）はまた、ＭＣＦ７乳癌細胞株の細胞成長を阻害することを示す。
【０１０８】
実施例７−ウアバインはＷｎｔ  β−カテニンの核への移行を増加させる
図２１を参照すると、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であるウアバインは、β−カテニンの核への移行を増加させることがわかる。ＰＣ３前立腺癌細胞をウアバインで処理し、β−カテニンを染色した。
【０１０９】
実施例８−ＭＰＲＣはＷｎｔシグナル伝達カルシウム測定を活性化する
図２２は、ニコランジルおよびベラトラジン（Ｖｅｒａｔｒａｄｉｎｅ）のような化合物は、細胞内カルシウム放出（ＡおよびＢ）または細胞増殖（ＣおよびＤ−例としてニコランジルを示す）を用いて測定されたＷｎｔシグナル伝達を阻害しないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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