(57)【要約】ヒト血清と、約200IU/mLのIL-2と、治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な濃度の非照射NK-92細胞とを含む、NK-92細胞を輸送するための保存培地であって、培地の温度は、20℃〜40℃の間の選択された温度の±5℃以内で維持され、その結果、NK-92細胞は、保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するために生存可能なままである、保存培地が、本明細書において記載される。また、NK-92細胞が、保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するために生存可能なままであるように、NK-92細胞を輸送する方法も、記載される。2016533720.tif 000005
2016533720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)ヒト血清またはヒト血清アルブミン;
(ii)治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期細胞濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞;および
(iii)約200IU/mLのIL-2濃度
を含む、NK-92細胞を輸送および配達するための無菌等張性NK-92細胞保存培地であって、
該培地が、輸送のために選択される温度の±5℃以内で維持され、さらに、輸送のために選択される該温度が、該細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で約20℃〜約40℃の間であり、その結果、NK-92細胞が、該保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである、保存培地。
【請求項２】
NK-92細胞濃度が、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される、請求項1に記載の保存培地。
【請求項３】
NK-92細胞濃度が、輸送の間、約0.5×106細胞/mL〜約8×106細胞/mLの間で維持される、請求項3に記載の保存培地。
【請求項４】
初期細胞濃度が、約1×106細胞/ml〜6×106細胞/mlの間である、請求項1に記載の保存培地。
【請求項５】
輸送のために選択される温度の±2℃以内で維持される、請求項1に記載の保存培地。
【請求項６】
約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清アルブミンを含む、請求項1に記載の保存培地。
【請求項７】
輸送のために選択される温度が約25℃〜約38℃の間である、請求項1に記載の保存培地。
【請求項８】
保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するためにNK-92細胞の生存能力を維持するように、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を輸送するための方法であって、該方法が、
(a)滅菌済み保存容器を提供する段階;
(b)ヒト血清またはヒト血清アルブミンおよび約200IU/mLのIL-2を含む無菌保存培地を該容器に加える段階;
(c)治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を該容器に加える段階;
(d)該容器を密閉する段階;
(e)輸送のために選択される温度の±5℃以内で該培地を維持する段階であって、輸送のために選択される該温度が約20℃〜約40℃の間である、段階;ならびに
(f)NK-92細胞を、該細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で、該保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、輸送する段階
を含み、
その結果、NK-92細胞が、該保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するために生存可能なままである、方法。
【請求項９】
NK-92細胞濃度が、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
NK-92細胞濃度が、輸送の間、約0.5×106細胞/mL〜約8×106細胞/mLの間で維持される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
初期濃度が、約1×106細胞/ml〜6×106細胞/mlの間である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
培地が、輸送のために選択される温度の±2℃以内で維持される、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
温度制御装置が、輸送のために選択される温度の±5℃以内で保存培地を維持する、請求項8に記載の方法。
【請求項１４】
保存容器に、NK-92細胞が保存培地に加えられた日時のラベルが付けられる、請求項8に記載の方法。
【請求項１５】
培地が、約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清アルブミンを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１６】
輸送のために選択される温度が、約25℃〜約38℃の間である、請求項8に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、保存培地に入れた後、例えば少なくとも24時間の期間、患者に投与するために細胞が生存可能なままであるような、NK-92細胞の保存および輸送に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫系のある種の細胞は、特定の標的細胞に対する細胞傷害活性を有する。ナチュラルキラー(NK)細胞は、通常、循環血中リンパ球の約10〜15％に相当し、抗原に関して非特異的に、かつ事前の免疫感作なしで、ウイルス感染細胞および多くの悪性細胞を含む標的細胞に結合し、死滅させる。Herberman et al., Science 214:24 (1981) (非特許文献1)。標的細胞の死滅は、細胞溶解を誘導することによって起こる。NK細胞は、進行癌患者のエクスビボ治療法およびインビボ治療の両方において有効であることが示されている。しかし、内因性NK細胞(すなわち、ドナーまたは患者から採取されたもの)は、取り扱うことおよび免疫療法で応用することが依然として困難である。インビボでの腫瘍を標的とする能力、殺腫瘍能力、および殺ウイルス能力を維持するNK細胞をエクスビボで増殖させることは困難であり、養子細胞免疫療法においてそれらを臨床使用することへの大きな障害である。Melder, et al., Cancer Research 48:3461-3469 (1988) (非特許文献2); Stephen, et al., Leuk. Lymphoma 377-399 (1992) (非特許文献3); Rosenberg, et al., New Engl. J. Med. 316:889-897 (1987) (非特許文献4)。さらに、内因性NK細胞の調製物は、ドナーに無関係の患者を治療するためにNK細胞が使用される場合には除去されなければならないT細胞および/または他の免疫エフェクター細胞を含んでいる。
【０００３】
本明細書において記載する態様は、全体として、NK-92細胞を輸送および/または配達するための保存培地、ならびにNK-92細胞を輸送し、輸送されたNK-92細胞を使用する方法に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Herberman et al., Science 214:24 (1981)
【非特許文献２】Melder, et al., Cancer Research 48:3461-3469 (1988)
【非特許文献３】Stephen, et al., Leuk. Lymphoma 377-399 (1992)
【非特許文献４】Rosenberg, et al., New Engl. J. Med. 316:889-897 (1987)
【発明の概要】
【０００５】
NK-92細胞株は、インターロイキン2(IL-2)の存在下で増殖することが発見された独特な細胞株である。Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994)。これらの細胞は、様々な癌に対して高い細胞溶解活性を有している。NK-92細胞株とは、増殖後の収量が予測可能である、広範な抗腫瘍細胞傷害性を有する均一なNK細胞集団である。第一相臨床試験により、その安全性プロファイルが確認され、一定の進行癌患者において抗腫瘍応答が観察された。
【０００６】
NK-92細胞による患者治療の1つの制約は、長期間にわたって細胞を保存および/または輸送する能力である。患者の治療法で使用されるNK細胞は、現行の優良な製造工程(current good manufacturing process)(cGMP)のもとで維持されなければならず、その結果、NK-92細胞株を培養し調製できる施設の数が限られる。これまで、患者の治療法でNK-92細胞を使用することは、治療が行われることになっている病院に非常に近い培養施設および生産施設を利用できるかということによって制限されてきた;NK-92細胞は、現在、病院に隣接した施設で調製され、次いで、患者の治療に使用するために、医療チームに手渡されている。一般に、凍結されたNK-92細胞は、劇的に低下した細胞傷害性を解凍後に示す。数日間の培養による回復期間の後でさえ、NK-92細胞の数および細胞傷害性は、最適以下のままである。
【０００７】
これまで、内因性NK細胞に関する研究により、IL-2(1000IU/mL)が、配送中のNK細胞活性化に不可欠であるが、これらの細胞を37℃および5％二酸化炭素で維持する必要はないことが示されている。Koepsell, et al., Transfusion 53:398-403 (2013)。しかし、内因性NK細胞はNK-92細胞とは顕著に異なり、これは主に、それらの起源が異なることに起因する:NK-92は癌由来の細胞株であるのに対し、内因性NK細胞は、ドナー(または患者)から採取され、患者に注入するために処理される。内因性NK細胞調製物は、不均一な細胞集団であり、一方、NK-92細胞は、均一なクローン細胞株である。NK-92細胞は、細胞傷害性を維持しつつ、培養下で容易に増殖するが、内因性NK細胞はそうではない。さらに、NK細胞の不均一な内因性集団は、高密度で凝集しない。したがって、これら2種の細胞型の保存および/または輸送後の生存能力および細胞傷害性を最大にするために必要となる考慮すべき事柄は、大きく異なる。
【０００８】
NK-92細胞は、他の問題も呈する。例えば、NK-92は、生存可能なままであるため、かつ増殖するために、IL-2の存在を必要とし、わずか1IU/mLのIL-2のもとで増殖すると考えられる。Gong, et al. 前記。さらに、細胞の形態および/または表現型は、培地中で使用されるIL-2の量によって変化する。Gong, et al. 前記。例えば、IL-2受容体(CD-25)発現は、IL-2濃度に反比例する。Gong, et al. 前記。
【０００９】
さらにまた、高濃度でのNK-92細胞凝集は、患者を治療するにあたっての使用に悪い影響を与える。IL-2の非存在下でNK-92細胞は生存能力を失うが、IL-2の存在下ではこれらの細胞が増殖するという点で、これは難問をもたらす。実際、通常の細胞培養条件下で、NK-92細胞の数は、約26〜32時間で2倍になる。この難問は、NK-92細胞を保存培地に入れてから少なくとも24時間までの間、病院への輸送を可能にする能力を保存培地が有していなければならないということによって、さらに複雑になる。任意の所与のIL-2濃度でのNK-92細胞増殖の速度が、輸送時の凝集を防止するために考慮に入れられなければならない。
【００１０】
例えば、少なくとも約24時間という期限は、保存培地に細胞を入れ、病院に輸送し、次いで患者にNK-92細胞を注入するための適切な手順を遂行する余地を与える。NK-92細胞が病院(または他の治療施設)に到着すると、それらは洗浄され、患者に注入するのに適した溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に移される。NK-92細胞はまた、インビボでの増殖を防止するために放射線照射される。放射線量は、細胞傷害性を維持するように設計されているが、細胞の生存能力に不利な影響をあたえる。したがって、治療のために有用な形態に変換する間に細胞集団が劣化するのを最小限に抑えるために、輸送用に使用される保存培地が、NK-92細胞の生存能力を可能な限り維持することが重要である。
【００１１】
したがって、細胞を中央施設で培養および調製し、受け取り後すぐに患者を治療するための遠方の病院または他の治療施設に配達できるように、NK-92細胞株を輸送するための保存培地に対するニーズが依然としてある。このニーズは、保存および/または輸送の間、実質的な凝集が起こる程度まで細胞の増殖を最小限に抑えつつ、NK-92細胞の生存能力および細胞傷害性を維持する方法も包含する。本発明は、これらのニーズに取り組む、非照射NK-92細胞を保存および/または輸送する保存培地および方法を提供する。
【００１２】
本発明は、いくつかの態様において、NK-92細胞の生産元の施設から離れた施設で患者を治療するために細胞の生存能力および細胞傷害性を維持するために、NK-92細胞株を保存および/または輸送するための保存培地および方法を提供する。本発明は、低レベルのIL-2の存在下で、かつ最小限に変化する温度でNK-92細胞を保存することにより、増殖を制限し、さらに細胞濃度の上昇に起因する実質的凝集を防止し、また同時に細胞の生存能力および細胞傷害性も維持できるという驚くべき発見に基づいている。中央施設は、治療法のためのNK-92細胞を調製し、次いで、遠隔の治療施設で患者に治療的に使用するために本発明が提供する条件下でそれらの細胞を輸送することができ、治療施設において特殊なcGMP遵守施設は必要とされない。したがって、本発明は、治療施設での細胞操作がごくわずかである増殖可能で「即出荷可能な」NK-92製品を実現する。本発明はさらに、安定した細胞生存率で、均一なNK-92細胞製品を目的地に配達する方法も提供する。
【００１３】
1つの局面において、本明細書において記載する本発明は、全体として、細胞を輸送および/または配達するための細胞保存培地、例えば、NK-92細胞を輸送および配達するための無菌等張性NK-92細胞保存培地に関し、この保存培地は、ヒト血清またはヒト血清アルブミン;治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞;および約200IU/mLのIL-2濃度を含み、前記培地は、輸送のために選択される温度の±5℃以内で維持され、さらに、輸送のために選択される前記温度は、前記細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で約20℃〜約40℃の間であり、その結果、NK-92細胞は、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。好ましい態様において、培地中のNK-92細胞の治療量は、治療施設への受け渡し時に約2.5×106細胞/ml以下である。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約0.5×106細胞/mL〜約8×106細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、前記培地は、輸送のために選択される温度の±2℃以内で維持される。いくつかの態様において、この培地は、約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、約25℃〜約38℃の間である。いくつかの態様において、初期細胞濃度は、約1×106細胞/ml〜6×106細胞/mlの間である。
【００１４】
別の局面において、本明細書において記載する本発明は、保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するためにNK-92細胞の生存能力を維持するように、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を輸送するための方法に関し、この方法は、
(a)滅菌済み保存容器を提供する段階;
(b)ヒト血清またはヒト血清アルブミンおよび約200IU/mLのIL-2を含む無菌保存培地を前記容器に加える段階;
(c)治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を前記容器に加える段階;
(d)前記容器を密閉する段階;
(e)輸送のために選択される温度の±5℃以内で培地を維持する段階であって、輸送のために選択される該温度が約20℃〜約40℃の間である、段階;ならびに
(f)NK-92細胞を、該細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、輸送する段階
を含み、その結果、NK-92細胞は、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するために生存可能なままである。
【００１５】
好ましい態様において、培地中のNK-92細胞の治療量は、治療施設への受け渡し時に約2.5×106細胞/ml以下である。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約0.5×106細胞/mL〜約8×106細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、前記培地は、輸送のために選択される温度の±2℃以内で維持される。いくつかの態様において、温度制御装置は、輸送のために選択される温度の±5℃以内で保存培地を維持する。いくつかの態様において、保存容器には、非照射NK-92細胞が培地に加えられた日時のラベルが付けられる。いくつかの態様において、この培地は、約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、約25℃〜約38℃の間である。いくつかの態様において、初期細胞濃度は、約1×106細胞/ml〜6×106細胞/mlの間である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】増殖培養物中のNK-92細胞の倍加時間を示す。
【図２】図2Aは、1×106細胞/mL(赤色の丸)もしくは6×106細胞/mL(青色の四角形)の濃度で一晩配送されたNK-92細胞または4×105細胞/mL(緑色の三角形)の濃度でインキュベーターにおいて一晩保存されたNK-92細胞の細胞傷害性を示す。図2Bは、希釈し静置した後の細胞の細胞傷害性を示す。
【図３】1×106細胞/mLまたは6×106細胞/mLの濃度で一晩配送されたNK-92細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法を開示し説明する前に、後述する局面は特定の組成物にも方法にも使用にも限定されず、したがって、当然、変わり得ることを理解すべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の局面を説明することだけを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるものとするいくつかの用語に言及する。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含むことに留意しなければならない。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、ある値が±15％変動してよく、かつ依然として本発明の範囲内であり得ることを意味する。例えば、「約200IU/mLのIL-2濃度」とは、170IU/mL〜230IU/mLの間のIL-2濃度を包含する。
【００２１】
本発明を記載するのに使用される場合、「ナチュラルキラー(NK)細胞」とは、特異的な抗原刺激の非存在下で、かつMHCクラスに基づく拘束を受けずに、標的細胞を死滅させる免疫系細胞である。標的細胞は、腫瘍細胞またはウイルスを含む細胞であり得る。NK細胞は、CD56表面マーカーが存在することおよびCD3表面マーカーが存在しないことを特徴とする。
【００２２】
「内因性NK細胞」という用語は、NK-92細胞株と区別して、ドナー(または患者)に由来するNK細胞を意味するのに使用される。通常、内因性NK細胞は、その中でNK細胞が濃縮された不均一な細胞集団である。内因性NK細胞は、患者の自家治療または同種治療を目的としてよい。
【００２３】
不死NK細胞株であるNK-92は、もともとは非ホジキンリンパ腫患者から得られた。本発明の目的において、かつ別段の定めが無い限り、「NK-92」という用語は、元のNK-92細胞株ならびに(例えば、外来遺伝子の導入によって)改変されたNK-92細胞株を指すと意図される。NK-92細胞およびそれらの例示的かつ非限定的な改変物は、米国特許第7,618,817号;同第8,034,332号;および同第8,313,943号において記載されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「非照射NK-92細胞」とは、放射線照射されていないNK-92細胞である。放射線照射すると、細胞は成長および増殖する能力を失う。最適な活性を維持するためには放射と注入の間の時間が4時間以下であることが望ましいため、NK-92細胞は、患者の治療前に治療施設または他の何らかの場所で放射線照射されると想定される。あるいは、NK-92細胞は、別の手法によって不活性化されてもよい。
【００２５】
本発明を記載するのに使用される場合、NK-92細胞の「不活性化」とは、NK-92細胞から、成長および/またはそれらの通常の機能、特にそれらの細胞傷害活性の能力を失わせるものである。不活性化はまた、NK-92細胞の死に関係する場合もある。NK-92細胞は、それらが治療的適用において病理に関係する細胞をエクスビボ試料から効果的に一掃した後に、または体内に存在する多くもしくはすべての標的細胞を効果的に死滅させるのに十分な期間、それらが哺乳動物の体内に存在した後に、不活性化してよいと想定される。不活性化は、非限定的な例として、NK-92細胞が感受性である不活性化剤を投与することによって誘導することができる。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「実質的に凝集していない」という用語は、NK-92細胞濃度が、凝集に悪影響を与えると思われる濃度より低いことを意味する。すなわち、NK-92細胞の濃度は、凝集があってもインビボの有効性を実質的に変えない程度の濃度である。約1×107細胞/mLという細胞濃度が、適切な生存能力および非凝集を維持しながらの、NK-92細胞濃度の上限であると予想される。
【００２７】
凝集の実体は、約1×107細胞/mLを超える細胞濃度に基づいて判定される。配送中のNK-92細胞濃度は、約1×107細胞/mL未満である場合、それらのインビボの有効性を実質的に変えないと考えられる。NK-92細胞は保存培地中で増殖すると考えられるため、保存培地に最初に加えられる細胞の量は、成長の程度および保存が維持される時間の長さを反映しなければならない。このような計算は、当業者の技能で十分に対応できる範囲内である。
【００２８】
本発明を記載するのに使用されるように、「細胞傷害性」および「細胞溶解性」という用語は、NK細胞のようなエフェクター細胞の活性を記載するのに使用される場合、同義であると意図される。通常、細胞傷害活性は、様々な生物学的、生化学的、または生物物理学的なメカニズムのいずれかによって標的細胞を死滅させることに関する。細胞溶解は、より具体的に、エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによって、その物理的完全性を破壊する活性を意味する。この結果、標的細胞は死滅する。理論に拘束されることを望むものではないが、NK細胞の細胞傷害作用は細胞溶解に起因すると考えられている。
【００２９】
本発明を記載するのに使用される場合、「標的細胞」とは、本発明のNK細胞の細胞傷害活性によって死滅させられる細胞である。具体的には、これらには、悪性であるか、またはそうでなければ癌に由来する細胞、およびHIV、EBV、CMV、またはヘルペスなどの病原性ウイルスに感染した細胞が含まれる。
【００３０】
本発明を記載するのに使用される場合、「一掃」とは、エクスビボでNK細胞のようなエフェクター細胞によって標的細胞を死滅させることを意味する。標的細胞は、試料中の標的細胞の存在に関連する病状を患っていると考えられている哺乳動物から得られた生物試料中に含まれ得る。この病状は、試料中の腫瘍細胞に起因する癌または悪性腫瘍であり得、試料からそれらの腫瘍細胞を一掃し、哺乳動物の身体にその試料を戻すことによって治療され得る。
【００３１】
本発明を記載するのに使用される場合、「癌」、「腫瘍」、および「悪性腫瘍」はすべて、組織または器官の過形成に同等に関係している。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環血中細胞からなる非固形腫瘍を含み得る。他の組織または器官の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生じ得る。一般に、本発明の方法は、リンパ細胞、循環血中免疫細胞、および固形腫瘍の治療において使用され得る。
【００３２】
本発明を記載するのに使用される場合、「病原性ウイルス」とは、宿主において疾患を引き起こすウイルスである。病原性ウイルスは、宿主動物の細胞に感染し、そのような感染の結果は、宿主の健康状態の悪化である。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「10^y」という用語は、10yに等しい。したがって、2.5×10^6は、2.5×106または2,500,000に等しい。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「治療施設」という用語は、細胞が配送される予定である任意の施設、病院、診療所、または他の機関を意味する。好ましい態様において、細胞は、患者を治療する施設に配送される。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「輸送のための方法」は、道路輸送、航空輸送、鉄道輸送、および適切な場合には歩行者輸送(例えば徒歩)を非限定的に含む、NK-92細胞の生産元である研究室または他の施設から治療施設までの輸送の任意の手段を含む。
【００３６】
表題または副題が、読者の便宜のために本明細書において使用される場合があり、これらは本発明の範囲に影響するものではない。さらに、本明細書で使用されるいくつかの用語を下記により詳細に定義する。
【００３７】
NK-92細胞株
NK-92細胞株は、Gong et al. (1994)によって記載された。これは、CD56bright、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、およびCD54表面マーカーを提示することが判明している。さらにこれは、CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、およびCD34マーカーを提示しない。培養下でのNK-92細胞の成長は、組換えインターロイキン2(rIL-2)の存在に依存しており、1IU/mLという少ない量が、増殖を維持するのに十分である。IL-7およびIL-12は、長期の成長を支援せず、IL-1α、IL-6、腫瘍壊死因子α、インターフェロンα、およびインターフェロンγを含む試験した他のサイトカインも、支援しない。NK-92は、1:1という低いエフェクター:標的(E:T)比でさえ高い細胞傷害性を有するので、K562細胞(赤白血病)およびDaudi細胞(バーキットリンパ腫)などの特定の腫瘍細胞を死滅させるのに極めて有効である。Gong, et al., 前記。さらに、NK-92細胞は、HIVに感染しHIVビリオンを生じる8E5細胞に対して高い細胞傷害活性を有する。NK-92細胞は、CRL-2407という呼称でAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されている。
【００３８】
NK-92細胞は、幅広い悪性標的細胞に対して溶解活性を示す。これらには、急性および慢性のリンパ芽球性白血病および骨髄性白血病、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫などの循環血中標的細胞に由来する細胞株、ならびに前立腺癌、神経芽細胞腫、および乳癌の細胞株などの固形腫瘍に由来する細胞が含まれる。この効果は、非常に低いエフェクター:標的比でさえ、観察される。この溶解は、IL-2で4日間刺激された正常末梢血単核細胞から得られる細胞傷害性より優れている。放射線照射されたNK-92細胞を患者において利用する初期の臨床試験により、有益な効果の徴候と共に、良好な忍容性が示された。これらの試験は、様々な癌のタイプの患者において実施されており、例えば、腎細胞癌および骨髄腫(Arai et al., Cytotherapy 10:625-632, 2008)ならびに肺癌(Tonn et al., J. Hematother. & Stem Cell Res. 10:535-544, 2001)において有望な結果が出ている。
【００３９】
組成物および方法
いくつかの態様は、全体として、本明細書において記載するパラメーターの内の1つまたは複数を有する、NK92細胞を輸送および/または配達するための培地を含む、保存培地に関する。1つの局面において、本明細書において記載する本発明は、NK-92細胞を輸送および配達するための無菌等張性NK-92細胞保存培地に関し、この保存培地は、ヒト血清またはヒト血清アルブミン;治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞;および約200IU/mLのIL-2濃度を含み、前記培地は、輸送のために選択される温度の±5℃以内で維持され、さらに、輸送のために選択される前記温度は、前記細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で約20℃〜約40℃の間であり、その結果、NK-92細胞は、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。
【００４０】
別の局面において、本明細書において記載する本発明は、保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するためにNK-92細胞の生存能力を維持するように、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を輸送するための方法に関し、この方法は、
(a)滅菌済み保存容器を提供する段階;
(b)ヒト血清またはヒト血清アルブミンおよび約200IU/mLのIL-2を含む無菌保存培地を前記容器に加える段階;
(c)治療施設への受け渡し時に治療量のNK-92細胞を提供するのに十分な初期濃度の、非照射の実質的に凝集していないNK-92細胞を前記容器に加える段階;
(d)前記容器を密閉する段階;
(e)輸送のために選択される温度の±5℃以内で培地を維持する段階であって、輸送のために選択される該温度が約20℃〜約40℃の間である、段階;ならびに
(f)NK-92細胞を、該細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素の存在下で、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、輸送する段階
を含み、その結果、NK-92細胞は、前記保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間までの間、患者に投与するために生存可能なままである。
【００４１】
いくつかの態様において、NK-92細胞の濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約0.5×105細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×105細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×106細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約2×105細胞/mL〜約1×107細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約9×106細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約8×106細胞/mLの間で維持される。いくつかの態様において、NK-92細胞濃度は、輸送の間、約1×104細胞/mL〜約6×106細胞/mLの間で維持される。NK-92細胞は、両端の値を含む、これらの範囲のいずれかの範囲内の任意の濃度で維持されてよい。
【００４２】
いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約0.5×104細胞/ml〜約9×106細胞/mlの間である。いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約1×105細胞/ml〜約9×106細胞/mlの間である。いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約1×106細胞/ml〜約9×106細胞/mlの間である。いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約1×106細胞/ml〜約8×106細胞/mlの間である。いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約1×106細胞/ml〜約7×106細胞/mlの間である。いくつかの態様において、NK-92細胞の初期濃度は、約1×106細胞/ml〜約6×106細胞/mlの間である。NK-92細胞の初期濃度は、両端の値を含む、これらの範囲のいずれかの範囲内の任意の濃度であってよい。
【００４３】
いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、約20℃〜約40℃の間である。好ましい態様において、輸送のために選択される温度は、約25℃〜約38℃の間である。いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、約20℃〜約25℃の間である。いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、ほぼ室温である。いくつかの態様において、輸送のために選択される温度は、約37℃である。
【００４４】
いくつかの態様において、培地は、輸送のために選択される温度の±5℃以内で維持される。いくつかの態様において、培地は、輸送のために選択される温度の±4℃以内で維持される。いくつかの態様において、培地は、輸送のために選択される温度の±3℃以内で維持される。いくつかの態様において、培地は、輸送のために選択される温度の±2℃以内で維持される。いくつかの態様において、培地は、輸送のために選択される温度の±1℃以内で維持される。
【００４５】
いくつかの態様において、温度制御装置は、輸送のために選択される温度の±5℃以内で保存培地を維持する。このような温度制御装置は、当技術分野において公知である。例示的な温度制御装置には、所望の温度まで加熱されるゲルパック、持ち運び可能な配送インキュベーター、バイオリアクター、または当技術分野において公知である他の任意の適切な装置が含まれる。
【００４６】
いくつかの態様において、NK-92細胞は、保存培地に入れた後少なくとも24時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。いくつかの態様において、NK-92細胞は、保存培地に入れた後約14時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。いくつかの態様において、NK-92細胞は、保存培地に入れた後、約20、16、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。いくつかの態様において、NK-92細胞は、保存培地に入れた後24時間を上回る期間、患者に投与するために生存可能なままである。いくつかの態様において、NK-92細胞は、保存培地に入れた後、約36、48、60、または72時間の期間まで、患者に投与するために生存可能なままである。
【００４７】
いくつかの態様において、NK-92細胞は、治療施設に到着した後に一定期間、保存される場合がある。例えば、NK-92細胞は、患者にNK-92細胞を注入するための手順を遂行する前に、施設で保存および/または培養される場合がある。1つの態様において、保存培地は、受け渡し後に、(例えば、より高濃度のIL-2を含む)増殖培地に交換される。1つの態様において、保存のために、追加の培地がNK-92細胞に加えられる;すなわち、NK-92細胞の濃度が下げられる。1つの態様において、NK-92細胞は、施設への受け渡し後、12時間、24時間、36時間、または48時間、保存される。1つの態様において、NK-92細胞の保存条件は、細胞濃度、細胞増殖、細胞の生存能、IL-2のレベル、またはそれらの任意の組合せに依存する。
【００４８】
いくつかの態様において、培地は、ヒト血清またはその等価物を含む。いくつかの態様において、培地は、ヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、培地は、ヒト血漿を含む。いくつかの態様において、培地は、約1％〜約15％のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。いくつかの態様において、培地は、約1％〜約10％のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。いくつかの態様において、培地は、約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。好ましい態様において、培地は、約2.5％のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。いくつかの態様において、血清は、ヒトAB型血清である。いくつかの態様において、ヒト治療物質中で使用するために許容されている血清代用物が、ヒト血清の代わりに使用される。このような血清代用物は、当技術分野において公知であり得るか、または今後に開発され得る。15％を超える濃度のヒト血清を使用することはできるが、約5％より高い濃度はコストが法外に高いと予想される。
【００４９】
本明細書において記載する本発明で使用される保存容器は、任意の細胞保存容器であってよい。いくつかの態様において、保存容器は、当技術分野において公知である任意の保存容器であってよい。いくつかの態様において、保存容器は、酸素透過性の袋である。いくつかの態様において、保存容器は、組織培養フラスコである。いくつかの態様において、保存容器は、酸素透過性のフラスコである。このようなフラスコの例は、Wilson Wolf Manufacturing製のG-Rexフラスコである。いくつかの態様において、保存容器は、輸送中に細胞の生存能力を維持するのに十分な酸素を上部の空間に含む酸素非透過性の袋である。
【００５０】
いくつかの態様において、保存容器には、情報を記載したラベルが付けられる。好ましい態様において、保存容器には、NK-92細胞が保存培地に入れられた日時に関する情報を記載したラベルが付けられる。容器にラベルを付ける方法は、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、ラベルは、バーコードである。いくつかの態様において、ラベルは、無線自動識別(RFID)タグである。いくつかの態様において、ラベルは、2次元バーコードである。いくつかの態様において、ラベルは、クイックレスポンス(QR)コードである。いくつかの態様において、ラベルは、書かれるか、タイプされるか、またはスタンプで押される。いくつかの態様において、ラベルを付ける複数の方法が使用される。
【００５１】
以下の略語が本出願において使用される。
2016533720.tif 000003
【００５２】
NK-92細胞を輸送するための保存培地(SM)は、以下の表に示すようにして、適切な滅菌済み容器中で調製される。培地は、0.2ミクロンのPESフィルター装置を用いてろ過される。SMを作製するために、IL-2(200IU/mL)が培地に添加される。好ましい態様において、IL-2は、使用する直前に添加される。
2016533720.tif 000004
【００５３】
IL-2は、上記では約200IU/mLの濃度で添加されるが、本明細書の別の場所で記載するものを含む他の濃度を使用できることを理解すべきである。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例示するために含まれ、本発明を限定するためには含まれない。本明細書において引用される刊行物または参照文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５５】
実施例1:NK-92細胞の倍加時間
VueLife(登録商標)培養バッグ(American Fluoroseal Corp.)において、2.5％ヒトAB型血漿、500IU/mL IL-2、アスパラギン、グルタミン、およびセリンを補充したX-VIVO 10細胞培養培地(Lonza, Inc.)中で、NK-92細胞を2週間培養した。図1に示すように、補充した細胞培養培地を3日毎に加えた(2×:2倍体積量の培地を加えた;4×:4倍体積量の培地を加えた;3〜4×:3〜4倍体積量の培地を加えた)。細胞濃度(黒丸)および細胞総数(白丸)を細胞計数によって測定した。倍加時間は、26〜32時間の間であると測定された。
【００５６】
実施例2:NK-92細胞の細胞傷害性-保存/配送細胞濃度
NK-92細胞を、37℃に予熱しておいた温度制御パック上の450IU IL-2含有SMを入れたG-RexlOフラスコに入れて、様々な細胞濃度で配送した。K562細胞に対するNK-92細胞の細胞傷害活性を測定した。K562(赤白血病)細胞株は、ATCCから入手し、10％ウシ胎児血清(FCS)を補充したRPMI 1640培地中で連続的に懸濁培養して維持した。Gong, et al. (1994), 前記、Klingemann, et al. (Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991))、および米国特許出願第10/456,237号(これら3つはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)において記載されているように、様々なE:T比を用いる51Cr遊離アッセイ法によって、K562(標的、T)細胞に対するNK-92(エフェクター、E)の細胞傷害活性を評価した。細胞傷害性は、配送の直後、または細胞を1×106細胞/mLに希釈し一晩静置した後のいずれかに、測定した。
【００５７】
図2Aは、1×106細胞/mL(赤色の丸)もしくは6×106細胞/mL(青色の四角形)の濃度で一晩配送されたNK-92細胞または4×105細胞/mL(緑色の三角形)の濃度でインキュベーターにおいて一晩保存されたNK-92細胞の細胞傷害性を示す。図2Bは、希釈し静置した後の細胞の細胞傷害性を示す。高濃度(6×106細胞/mL)で配送された細胞の細胞傷害性は、配送直後に低下したが、細胞を1×106細胞/mLに希釈し一晩静置した場合、回復させることができた。
【００５８】
実施例3:NK-92細胞の培養
NK-92細胞を、予熱しておいた温度制御パック(例えば37℃)上の200IU IL-2含有SMを入れた容器に入れて、様々な細胞濃度で輸送する。例えば、実施例2で記載したアッセイ法によって、標的細胞に対するNK-92細胞の細胞傷害活性を評価する。細胞傷害性は、配送の直後、または細胞を1×106細胞/mLに希釈し一晩静置した後のいずれかに、測定する。
【００５９】
実施例4:NK-92細胞の配送
NK-92細胞をテキサス州からピッツバーグまで配送した。細胞は、1つのG-Rex10に入れたIL-2含有GM-1培地中に1×106細胞/mlで配合した(体積40ml中に合計40×106個の細胞)。37℃に予め温めた温度制御パックを用いて、細胞を配送した。配送時の細胞は、94.9％が生存可能であった。
【００６０】
フローサイトメトリー解析により、生存能力および表現型について、6×106細胞/mlで配送したNK-92細胞を1×106細胞/mlで配送したものと比較した。図3は、フローサイトメトリーアッセイ法の結果を示す。
【図１】
2016533720.tif 000006
【図２】
2016533720.tif 000007
【図３】
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【国際調査報告】
2016533720.tif 000009
2016533720.tif 000010