(57)【要約】本発明は、抗MIF抗体の効力に関する、ロバストで正確で使い易いアッセイに関する。特に本発明は、抗MIF抗体-細胞遊走アッセイとそれぞれの方法およびキットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗MIF抗体の効力を決定するためのアッセイ方法であって、細胞遊走が実施され、
・遊走能を有し、かつMIFを含む細胞を、デバイスの第1部分に供給するステップ、
・細胞の遊走と拡散が可能であるように前記デバイスの第1部分と接続される構成を有する前記デバイスの第2部分に、決定対象である抗(ox)MIF抗体を加えるステップ、および
・遊走の阻害を計算するステップ
を含む、前記アッセイ方法。
【請求項２】
抗MIF抗体が抗oxMIF抗体であり、好ましくは抗体が、RAB0、RAB4、RAB9、RAM0、RAM4および/またはRAM9からなる群より選択され、非常に好ましくはRAM9である、請求項1に記載のアッセイ方法。
【請求項３】
デバイスが、細孔を有する分離膜を介して接続された上部チャンバーと下部チャンバーとを備え、細胞は上部チャンバーに加えられ、抗体は下部チャンバーに加えられ、好ましくはデバイスが二チャンバー細胞遊走アッセイ（改変ボイデンチャンバーアッセイ）、より好ましくはTranswell細胞遊走アッセイデバイスである、請求項1または請求項2に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
細胞が(ox)MIFを好ましくはその細胞表面に発現する細胞であり、好ましくは細胞が疾患試料からの細胞であり、より好ましくは細胞が単核球細胞、好ましくはヒト単核球細胞、より好ましくはヒト不死化単核球細胞、最も好ましくはU937細胞、またはTHP-1ヒト単核球細胞であるか、一代替実施形態ではラットNR8383単核球細胞である、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
細胞が、遊走を可能にするための適切な遊走培地中の細胞懸濁液として供給される、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
遊走培地がタンパク質を含まない、請求項5に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
抗体が、適度に弱い酸とその共役塩基とによる無毒性の生物学的緩衝液、好ましくはグリシン緩衝液、N-置換タウリン緩衝液、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）緩衝液に入れて、例えばTranswell（登録商標）チャンバーなどの、第2部分、例えば下部チャンバーに加えられる、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
抗体を、アッセイにおける最終濃度が、好ましくは希釈系列として、0.01〜100nM、好ましくは0.02〜50nM、好ましくは0.04〜30nMになるように加える、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項９】
アッセイ、例えばTranswell（登録商標）チャンバーが、細胞と抗体の添加後、6〜20時間、好ましくは8〜12時間、好ましくは約37℃でインキュベートされ、細胞がU937細胞であり、膜が約5μmの孔径を有する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
遊走した細胞が、好ましくは上述のインキュベーションステップ後に、好ましくは下部チャンバーにおいて計数され、その結果として、試験された抗体の効力に関する情報を、好ましくは50％阻害抗体濃度（IC50値）を計算することによって得ることができる、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
細胞をアッセイに使用する前に、細胞を10〜48時間、好ましくは8〜16時間、好ましくは10〜12時間の血清飢餓に付す、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
細胞がワーキングバンクに由来する、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
(ox)MIFがデバイスに加えられない、上記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
上記請求項のいずれか一項またはそれ以上に記載のアッセイ方法を行うために必要な試薬の全て、好ましくは
・MIFを発現する細胞、
・抗体希釈緩衝液（例えばグリシン緩衝液）、
・遊走培地、および/または
・二チャンバー細胞遊走システム
を含む、抗(ox)MIF抗体の効力を決定するためのアッセイキット。
【請求項１５】
上記請求項のいずれか一項に記載の効力決定を受けたことを特徴とする抗(ox)MIF抗体を含む、医薬組成物または診断組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗MIF抗体の効力を試験するのに適したアッセイに関する。特に本発明は便利で使い易い細胞遊走アッセイを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
背景
マクロファージ遊走阻止因子（MIF）はサイトカインの一種であり、最初は、ツベルクリン過敏性モルモットからの腹腔滲出細胞（これはマクロファージを含有している）のin vitroでのランダムな遊走を阻害するその能力に基づいて単離された（Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2；David et al. PNAS 1966, 56, 72-7）。MIFは、現在では、多面的な活性スペクトルを発揮する自然免疫応答および獲得免疫応答の決定的上流調節因子として知られている。
【０００３】
ヒトMIF cDNAは1989年にクローニングされ（Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6）、そのゲノム局在は第22染色体にマッピングされた。ヒトMIF遺伝子の産物は、114アミノ酸（N末端メチオニンの切断後）のタンパク質であり、その見掛けの分子量は約12.5kDaである。MIFには他のどのタンパク質とも有意な配列相同性がない。このタンパク質は同一サブユニットの三量体として結晶化する。各単量体は、4本鎖βシートと相対するようにパッキングされた2本の逆平行αヘリックスを含んでいる。単量体はさらに2本のβストランドを有し、それらは隣接するサブユニットのβシートと相互作用して単量体間の界面を形成している。3つのサブユニットは、溶媒露出チャネルを含むバレルを形成するように配置され、そのチャネルは分子の3回回転軸に沿ってタンパク質の中心を貫通している（Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196）。
【０００４】
マクロファージからのMIFの分泌は極めて低濃度のグルココルチコイドで誘導されると報告されている（Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71）。しかしまた、MIFはグルココルチコイドの効果を対抗的に制御し、腫瘍壊死因子TNF-αやインターロイキンIL-1βなどといった他のサイトカインの分泌を刺激する（Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35）。MIFは、例えば血管新生促進性、増殖促進性および抗アポトーシス性を呈し、よって腫瘍細胞増殖を促進することも示されている（Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1):p.13-19；Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35):p.5046-59）。また、これは、例えばリンパ腫、黒色腫、および大腸がんの成長とも、直接的に関連付けられている（Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62）。
【０００５】
MIFは、多くの病理学的状態のメディエーターであり、したがってさまざまな疾患、例えば限定するわけではないが、とりわけ、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ（RA）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、喘息、糸球体腎炎、IgAネフロパシー、心筋梗塞（MI）、敗血症およびがんなどと関連付けられている。
【０００６】
組換えヒトMIFに対してポリクローナルおよびモノクローナルの抗MIF抗体が開発されている（Shimizu et al., FEBS Lett. 1996；381, 199-202；Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232、およびWeiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78）。
【０００７】
抗MIF抗体はその治療的使用が提案されている。Calandraら（J. Inflamm. (1995), 47, 39-51）は、実験的に誘発されるグラム陰性菌およびグラム陽性菌による敗血症性ショックから動物を防御するために、抗MIF抗体を使用したと報告している。抗MIF抗体は、敗血症性ショックおよび他の炎症性疾患状態におけるサイトカイン生産を調節するための治療手段として提案された。
【０００８】
US6,645,493には、MIFの生物学的活性を中和する、ハイブリドーマ細胞由来のモノクローナル抗MIF抗体が開示されている。これらのマウス由来抗MIF抗体がエンドトキシン誘発性ショックの処置において有益な効果を有することは、動物モデルで示すことができた。
【０００９】
US200310235584には、MIF遺伝子がホモ接合性にノックアウトされている動物において、MIFに対する高アフィニティ抗体を調製する方法が開示されている。
【００１０】
グリコシル化阻害因子（GIF）はGalatら（Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21）によって記載されたタンパク質である。MIFとGIFは現在では同一であると認識されている。Wataraiら（PNAS 2000, 97, 13251-6）は、Ts細胞におけるGIFの翻訳後修飾の生化学的性質を同定するために、異なるGIFエピトープに結合するポリクローナル抗体を記載した。Wataraiら（前掲書）は、GIFがin vitroでは異なるコンフォメーションアイソフォームで存在すると報告した。アイソマーの一タイプは、単一システイン残基の化学修飾によって生じる。この化学修飾がGIFタンパク質内でのコンフォメーション変化につながる。
【００１１】
抗MIF抗体の効力を試験するには、使い易くて信頼できるアッセイを用意する必要がある。所与の抗MIF抗体試料をその効力に関して規定することが可能であることは、診断のためにも、治療のためにも、極めて重要である。抗MIF抗体は、それぞれの効力が明示されなければ、診断にも治療にもそれを使用することができない。
【００１２】
MIF関連薬の効力を評価するための、特に抗MIF抗体の効力を評価するための、ロバストなバイオアッセイは、今のところ知られていない。
【００１３】
MIFタンパク質がケモカイン様の機能を呈することと、抗MIF抗体によってそれらの機能を遮断できることは、以前のアッセイフォーマットで示されたが（例えばBernhagen et al., Nature Medicine, 2007）、例えば単核球細胞などの自己分泌誘導性細胞遊走の阻害に基づくロバストなMIFバイオアッセイの確立と適格性評価は、今のところまだなされていない。
【００１４】
したがって本発明の目的は、抗MIF抗体の効力を決定することができるアッセイの提供である。好ましくは、このアッセイおよび各アッセイ方法は、感度と再現性の高い結果を与える能力を持つべきであり、それと同時に使い易いものであるべきである。
【００１５】
本発明者らは、この目標を達成する方法を研究することとし、よって本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の概要
本発明は、感度と再現性が高く、非常に使い易い、抗MIF抗体（特に抗oxMIF抗体）の効力を決定するためのアッセイを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のアッセイは、以下のように定義される細胞遊走アッセイである：
1．抗MIF抗体の効力を決定するためのアッセイ方法であって、細胞遊走が実施され、
・遊走能を有し、かつMIFを発現する細胞を、デバイスの第1部分に供給するステップ、
・細胞の遊走と拡散が可能であるように前記デバイスの第1部分と接続される構成を有する前記デバイスの第2部分に、決定対象である抗(ox)MIF抗体を加えるステップ、および
・遊走の阻害を計算するステップ
を含む、前記アッセイ方法。
【００１８】
この文脈において「効力」とは、所与の強度の効果を生じるのに必要な量によって表された薬物活性の尺度である。これは、好ましくは、IC50値（50％阻害（half maximal inhibition））として表される。
【００１９】
本発明のアッセイは、(ox)MIFの自己分泌型走化性作用を阻害し、よってMIF（特にoxMIF）を、好ましくはその表面に発現する細胞、例えばU937単核球細胞のような一定の単核球細胞の遊走を阻害するという原理に基づいている。本発明の細胞は、MIFを内因的に発現することができるか、またはMIFを組換え発現するように操作することができる。MIFは、oxMIFとして発現させるか、oxMIFに転化する必要がある。好ましい一実施形態では、oxMIFが細胞表面に発現するが、これは必ずしも本発明の重要な特徴ではない。
【００２０】
本アッセイは、化学誘引物質の勾配に対する細胞の指向性遊走に基づく（科学文献にいう）典型的走化性アッセイとは弁別されるべきである。先行技術によるこの化学誘引物質勾配は、細胞とは別にデバイスに添加された(ox)MIFであったであろう。驚くべきことに、本発明者らは、MIFを発現する細胞を使用するアッセイを提供することが可能であること、およびそうすることで、さらなる化学誘引物質の添加を伴わない、すなわち(ox)MIFの添加を伴わない、アッセイを提供することが可能であることを示すことができた。これらの発見はとりわけ有益であった。というのも、結果として得られるアッセイはox-MIF拡散に依存せず（すなわち経時的な拡散が結果に干渉せず）、したがって本アッセイは先行技術アッセイのように時間依存的ではないからである。抗(ox)MIF抗体は、(ox)MIFを発現する細胞における遊走促進性の(ox)MIF機能を阻害し、それによって（科学文献にいう細胞走化性を阻害するのではなく）ランダムな細胞遊走（「ケモキネシス」）を阻害する能力を有する。
【００２１】
添付の図面でも本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本アッセイ方法の一般的構成。
【図２】U937単核球細胞上のoxMIFのFACSデータ。
【図３】異なる濃度のRAM9（抗oxMIF抗体；対数目盛）に対するU937（ヒト単球）とNR8383（ラットマクロファージ）の2本の遊走阻害曲線を示す例示的な図である。FACSプロットはこれらの細胞の細胞表面へのRAM9の結合を示している（黒線；細線はアイソタイプ対照抗体）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の項目を特徴の一部とする：
1．抗MIF抗体の効力を決定するためのアッセイ方法であって、細胞遊走が実施され、
・遊走能を有し、かつMIFを発現する細胞を、デバイスの第1部分に供給するステップ、
・細胞の遊走と拡散が可能であるように前記デバイスの第1部分と接続される構成を有する前記デバイスの第2部分に、決定対象である抗(ox)MIF抗体を加えるステップ、および
・遊走の阻害を計算するステップ
を含む、前記アッセイ方法
【００２４】
2．抗MIF抗体が抗oxMIF抗体であり、好ましくは抗体が、RAB0、RAB4、RAB9、RAM0、RAM4および/またはRAM9からなる群より選択され、非常に好ましくはRAM9である、項目1に記載のアッセイ方法。
【００２５】
3．デバイスが、細孔を有する分離膜を介して接続された上部チャンバーと下部チャンバーとを備え、細胞は上部チャンバーに加えられ、抗体は下部チャンバーに加えられ、好ましくはデバイスが二チャンバー細胞遊走アッセイ（改変ボイデンチャンバーアッセイ）、より好ましくはTranswell細胞遊走アッセイデバイスである、項目1または項目2に記載のアッセイ方法。
【００２６】
異なる一実施形態では、デバイスが、細孔を有する分離膜を介して接続された上部チャンバーと下部チャンバーとを備え、細胞と抗体がどちらも上部チャンバーに加えられ、好ましくはデバイスが二チャンバー細胞遊走アッセイ（改変ボイデンチャンバーアッセイ）、より好ましくはTranswell細胞遊走アッセイデバイスである。
【００２７】
どちらの場合も、遊走した細胞の数は下部チャンバーにおいて測定されることになる。
【００２８】
4．細胞が(ox)MIFを好ましくはその細胞表面に発現する細胞であり、好ましくは細胞が疾患試料からの細胞であり、より好ましくは細胞が単核球細胞、好ましくはヒト単核球細胞、より好ましくはヒト不死化単核球細胞、最も好ましくはU937細胞、またはTHP-1ヒト単核球細胞であるか、一代替実施形態ではラットNR8383単核球細胞である、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００２９】
5．細胞が、遊走を可能にするための適切な遊走培地中の細胞懸濁液として供給される、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３０】
6．遊走培地がタンパク質を含まない、項目5に記載のアッセイ方法。
【００３１】
7．抗体が、適度に弱い酸とその共役塩基とによる無毒性の生物学的緩衝液、好ましくはグリシン緩衝液、N-置換タウリン緩衝液、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）緩衝液に入れて（例えばTranswell（登録商標）チャンバーの）第2部分に加えられる、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３２】
本アッセイの好ましい一実施形態では、被験抗体の濃度が通例の希釈実験に基づいて決定される。第1ステップでは予想IC50が決定されるであろう。ここではIC50値がKD値（親和定数）と同じ範囲にあるはずである。典型的には、0.01nMと100nMの間にある数点（例えば6〜10点）の濃度の抗体を含む希釈系列を設定することで、予想IC50値が決定されるであろう。実際のアッセイでは、次に、この予想IC50が、希釈系列の固定された中点として使用され、希釈系列には、典型的には、IC50値の下に最大5濃度ステップ、IC50値の上に最大5濃度ステップが設けられるであろう。濃度ステップは、典型的にはそれぞれ指数関数的に、例えば3の累乗倍、4の累乗倍または5の累乗倍ずつ、増加および減少する。
【００３３】
したがって、仮に予備実験において決定された予想IC50が1nMであったとすると、アッセイにおいて実際に使用される濃度は（5の累乗を使用し、3ステップであれば）0.008nM、0.04nM、0.2nM、1nM、5nM、25nMおよび125nMになるであろう。
【００３４】
8．抗体を、アッセイにおける最終濃度が、好ましくは希釈系列として、0.01〜100nM、好ましくは0.02〜50nM、好ましくは0.04〜30nMになるように加える、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３５】
本アッセイ方法の好ましい一実施形態では、アッセイを、当業者には決定することができるとおり、適切な用量応答が観察されるまで、ある期間にわたってインキュベートする。このインキュベーション期間は、アッセイに使用する細胞に応じて変動するであろう。また、インキュベーション期間は、アッセイチャンバー中の膜に使用される孔径によっても変動するであろう。孔径が大きいほど、細胞の分布は速くなるので、インキュベーション期間は短くなるが、非特異的な結果につながるかもしれない。インキュベーション期間の調整は予備実験で行うことができ、当業者の一般的技量で十分に可能であるだろう。
【００３６】
9．アッセイ、例えばTranswell（登録商標）チャンバーが、細胞と抗体の添加後に、6〜20時間、好ましくは8〜12時間、好ましくは約37℃でインキュベートされ、細胞がU937細胞であり、膜が約5μmの孔径を有する、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３７】
10．遊走した細胞が、好ましくは上述のインキュベーションステップ後に、好ましくは下部チャンバーにおいて計数され、その結果として、試験された抗体の効力に関する情報を、好ましくは50％阻害抗体濃度（half-maximal inhibiting antibody concentration）（IC50値）を計算することによって得ることができる、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３８】
11．細胞をアッセイに使用する前に、細胞を10〜48時間、好ましくは8〜16時間、好ましくは10〜12時間の血清飢餓に付す、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００３９】
この文脈における「血清飢餓」とは、血清を含まない培地中で、好ましくはウシ胎児血清を含まない培地中で、細胞が上記の時間にわたって培養されたことを意味するものとする。血清飢餓は、血清構成要素が実際のアッセイ方法に含まれないことを確実にするために行う必要がある。もしも血清構成要素が実際のアッセイ方法に含まれたとすると、血清構成要素は強力な化学誘引物質として作用することが知られているので（血清は下記の実施例では陽性対照としても使用される）、結果は非特異的になりうる。
【００４０】
12．細胞がワーキングバンク（working bank）に由来する、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００４１】
13．(ox)MIFがデバイスに加えられない、上記項目のいずれか一つに記載のアッセイ方法。
【００４２】
これは、組換えMIFタンパク質を調製する必要を取り除き、よって本アッセイの利点の一つとなる。
【００４３】
本アッセイ方法は、当業者がその一般知識に基づいて決定することのできる細胞数で行うことができる。
【００４４】
この細胞数は、それぞれのアッセイデバイスの各ウェル（好ましくは上部チャンバー）に加えられる細胞の数と定義される。
【００４５】
14．上記項目のいずれか一つまたはそれ以上に記載のアッセイ方法を行うために必要な試薬の全て、好ましくは
・MIFを発現する細胞、
・抗体希釈緩衝液（例えばグリシン緩衝液）、
・遊走培地、および/または
・二チャンバー細胞遊走システム
を含む、抗(ox)MIF抗体の効力を決定するためのアッセイキット。
【００４６】
このキットの好ましい構成要素についてはさらに詳しく後述する。
【００４７】
15．上記項目のいずれか一つに記載の効力決定を受けたことを特徴とする抗(ox)MIF抗体を含む、医薬組成物または診断組成物。
【００４８】
本発明によれば、抗(ox)MIF抗体、特にRAM0、RAM4、RAM0、RAB9、RAB0および/またはRAB4、最も好ましくはRAM9を含み、抗体がその効力に関して規定されている、医薬組成物および診断組成物を確実に提供することが、初めて可能になった。その結果得られる抗体製剤は、抗体の効力に関して一貫しているであろう。
【００４９】
さまざまな疾患の発症後は、とりわけがんの発症後は、MIFレベルの上昇、すなわちMIF全般のレベルの上昇が検出される。しかしMIFは健常被験者でも循環しており、そのことが、明確な弁別を困難にしている。これに反してoxMIFは、健常被験者には存在しないので、MIF関連疾患に関して、はるかに強い診断マーカーである。本発明者らの以前の研究で示されているように、oxMIFは疾患状態において増加し、例えば血漿、血液、血清および尿のような患者の試料中に検出することができる。
【００５０】
Baxterの抗体RAB9、RAB4およびRAB0ならびにRAM9、RAM4、およびRAM0は、それぞれ、oxMIFに特異的に結合する（しかも、redMIFには結合することができない）。
【００５１】
本発明者らが行った以前の実験では、シスチンによる酸化、GSSG（酸化型グルタチオン）による酸化、またはMIFとProClin300もしくはタンパク質架橋剤（例えばBMOE）とのインキュベーションのような酸化手順が、上述の抗体への結合を引き起こすことを示すことができた。
【００５２】
本発明者らが到達した驚くべき結論は、次のとおりである：
・組換えMIF（ヒト、マウス、ラット、CHO、サル）の酸化還元調節（Cys/Gluによる温和な酸化）またはProClin300またはタンパク質架橋剤による組換えMIFの処理は、Baxterの抗MIF抗体RAB9、RAB4およびRAB0の結合につながる、
・oxMIFの還元は、Ab結合の喪失につながる、
・oxMIFアイソフォームに対する特異性は（in vitro/in vivoでの）生物学的Ab有効性と相関する、
・oxMIFレベルだけが疾患状態と相関し、MIFレベルは必ずしもそうではない。
【００５３】
上述の抗体は、その配列によっても、またそれぞれが上述の抗体RAB0、RAB4およびRAB9ならびにRAM0、RAM4およびRAM9のそれぞれの軽鎖または重鎖のいずれかを含んでいる大腸菌（TG1株）中のプラスミドとしての寄託物によっても、特徴づけられ、裏付けられている。
【００５４】
前記プラスミドは、ブダペスト条約に基づくGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）（ドイツ、ブラウンシュヴァイク、マッシェローダー・ヴェーク1b）への寄託時に取得した公式番号であるそれぞれのDSM番号によって特徴づけられる。プラスミドはそれぞれ大腸菌株に入れて寄託された。
【００５５】
番号DSM25110のプラスミドは抗MIF抗体RAB4の軽鎖配列を含む。
【００５６】
番号DSM25112のプラスミドは抗MIF抗体RAB4の重鎖（IgG4）配列を含む。
【００５７】
適切な宿主細胞中でプラスミドDSM25110とDSM25112を同時発現させると、好ましい抗MIF抗体RAB4の生産が起こる。
【００５８】
番号DSM25111のプラスミドは抗MIF抗体RAB9の軽鎖配列を含む。
【００５９】
番号DSM25113のプラスミドは抗MIF抗体RAB9の重鎖（IgG4）配列を含む。
【００６０】
適切な宿主細胞中でプラスミドDSM25111とDSM25113を同時発現させると、好ましい抗MIF抗体RAB9の生産が起こる。
【００６１】
番号DSM25114のプラスミドは抗MIF抗体RAB0の軽鎖配列を含む。
【００６２】
番号DSM25115のプラスミドは抗MIF抗体RAB0の重鎖（IgG4）配列を含む。
【００６３】
適切な宿主細胞中でプラスミドDSM25114とDSM25115を同時発現させると、好ましい抗MIF抗体RAB0の生産が起こる。
【００６４】
抗体RAM0、RAM9およびRAM4も寄託されており、それらはいずれもブダペスト条約に従ってDSMZ（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）に2012年4月12日に寄託され、次のように指定されている：
RAM9−重鎖：大腸菌GA.662-01.pRAM9hc−DSM25860、
RAM4−軽鎖：大腸菌GA.906-04.pRAM4lc−DSM25861、
RAM9−軽鎖：大腸菌GA.661-01.pRAM9lc−DSM25859、
RAM4−重鎖：大腸菌GA.657-02.pRAM4hc−DSM25862、
RAM0−軽鎖：大腸菌GA.906-01.pRAM0lc−DSM25863、
RAM0−重鎖：大腸菌GA.784-01.pRAM0hc−DSM25864。
【００６５】
本願に関して、生物学的試料は、好ましくは、診断の実施対象である被験者の体液試料、または組織試料もしくは細胞試料である。体液試料は、当業者に知られている任意の体液試料である。そのような試料の例として、血液、血漿、血清、唾液、尿、鼻水、腹水、眼液、羊水、房水、硝子体液、涙液、カウパー液、精液、間質液、リンパ液、母乳、粘液（鼻汁および痰を含む）、胸水、膿、月経、膣潤滑液、皮脂、脳脊髄液および滑液を挙げることができるが、これらに限るわけではない。本願に関して、他の生物学的試料としては、(中空）体器官の洗浄液（洗い出し液）（例えば気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液および腸洗浄液）を挙げることができる。組織試料は好ましくは組織生検、例えば針コア生検である。
【００６６】
本願に関して、生物学的試料は、一代替実施形態では、診断の実施対象である被験者の細胞試料、最も好ましくは循環または患部組織からの、より好ましくは単細胞懸濁液試料としての、細胞試料である。
【００６７】
「予防的」処置または「治療的」処置という用語は、当技術分野において認識されている用語であり、患者への薬物の投与を指す。望ましくない状態（例えば宿主、例えばヒトまたは動物の、疾患または他の望ましくない状況）の臨床症状が発現する前の投与であれば、その処置は予防的である。すなわち、その処置は、前記望ましくない状態の発達から宿主を保護する。一方、望ましくない状態の症状発現後に投与されるのであれば、その処置は治療的である（すなわち、それは既存の望ましくない状態またはその副作用を減じ、改善し、または維持することを目的としている）。
【００６８】
本明細書にいう抗(ox)MIF化合物とは、(ox)MIFの生物学的活性を減弱し、阻害し、抵抗し、対抗し、または減少させる任意の薬剤を指す。抗(ox)MIF化合物は、(ox)MIF活性を阻害しまたは中和する薬剤、特に好ましくは本明細書に記載する抗体、さらに好ましくは、それぞれ抗体RAB9、RAB4および/もしくはRAB0、またはRAM9、RAM4および/もしくはRAM0でありうる。
【００６９】
定義および一般技法
本明細書に別段の定義がある場合を除き、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者に通例理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載する細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学に関連して使用される術語、およびそれらの技法は、当技術分野において周知の、よく使用されるものである。本発明の方法および技法は、別段の表示がある場合を除き、一般に、当技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、本明細書を通じて言及し論述するさまざまな一般的文献および専門的文献に記載されているように実施される。例えば、引用により本明細書に組み込まれるSambrook et al.「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、およびAusubel et al.「Current Protocols in Molecular Biology」Greene Publishing Associates (1992)、およびHarlow and Lane「Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたい。
【００７０】
「MIF」または「マクロファージ遊走阻止因子」とは、免疫応答および炎症応答における決定的メディエーターとして知られ、またグルココルチコイドの対抗制御因子（counterregulator）としても知られているタンパク質を指す。MIFには、哺乳動物MIF、特にヒトMIF（Swiss-Protプライマリアクセッション番号:P14174）が含まれ、ヒトMIFの場合、単量体型は115アミノ酸タンパク質としてコードされているが、開始メチオニンが除去されるので114アミノ酸タンパク質として生産される。「MIF」には、「GIF」（グリコシル化阻害因子）および他の形態のMIF、例えばMIFの融合タンパク質も含まれる。MIFのアミノ酸のナンバリングは、N末端メチオニン（アミノ酸1）から始まり、C末端アラニン（アミノ酸115）で終わる。
【００７１】
「酸化型MIF」またはoxMIFは、本発明においては、MIFをシスチンなどの温和な酸化試薬で処理することによって生じるMIFのアイソフォームと定義される。本発明者らが以前の研究で示したとおり、こうして処理された組換えoxMIFは、（例えば）動物が細菌にばく露された後にin vivoで生じるoxMIFと共通する構造再構成を起こしたMIFのアイソフォームを含む。
【００７２】
redMIFは、本発明においては、還元型MIFと定義され、RAB0、RAB9および/またはRAB4に結合しないMIFである。
【００７３】
本発明において記述する抗oxMIF抗体は、温和な酸化または還元によってそれぞれ生じるoxMIFとredMIFとを区別することができ、oxMIFを特異的に検出するのに役立つ。これらのコンフォーマー間の区別は、当技術分野ではよく知られているように、ELISAまたは表面プラズモン共鳴によって評価される。
【００７４】
Biacoreによる抗体の弁別的結合の評価
抗体RAB9およびRAB0へのoxMIFおよびredMIFの結合キネティクスを、Biacore 3000システムを使った表面プラズモン共鳴分析によって調べた。抗体をCM5（＝カルボキシメチル化デキストラン）チップ上にコーティングし、0.2％ProClin300と共にプレインキュベートした組換えMIFタンパク質を注入した（ProClin300は、oxMIFからredMIFへの転化を回避することによってoxMIF構造を安定化する、酸化的イソチアゾロンからなる）。ProClin300を添加していないネイティブHBS-EP緩衝液（＝Biacoreランニング緩衝液）では、組換えMIFタンパク質はいずれもRAB9、RAB0には結合せず、陰性（バックグラウンド）結合対照として使用した参照抗体（無関係なアイソタイプ対照抗体）にも結合しなかった。
【００７５】
好ましい一実施形態では、oxMIFが、抗体RAB9、RAB4および/もしくはRAB0またはその抗原結合性フラグメントによって弁別的に結合されるMIFである。これは、これらの抗体がoxMIFには結合するが、redMIFはこれらの抗体のいずれとも結合しないことを意味している。
【００７６】
別の実施形態では、抗oxMIF抗体、例えば上述の抗体、またはその抗原結合性部分が、100nM未満のKD、好ましくは50nM未満のKD、さらに好ましくは10nM未満のKDで、oxMIFに結合する。特に好ましくは、本発明の抗体は、5nM未満のKDでoxMIFに結合する。
【００７７】
（oxMIFまたはredMIFへの）抗体、例えばRAB9、RAB4またはRAB0の（非）結合は、当業者に広く知られているようにして決定することができる。例えば以下の方法のいずれかである：組換えMIFによる弁別的結合ELISA（Differential Binding ELISA）、または上述した周知のBiacoreアッセイのように組換えMIFをその還元状態または酸化状態で使用する表面プラズモン共鳴。
【００７８】
結合を決定するための好ましい方法は、例えば組換え(ox)MIFへの抗体の表面プラズモン共鳴であり、ここでは、「結合」とは、100nM未満、好ましくは50nM未満、さらに好ましくは10nM未満のKDによって表されるものとし、一方、redMIFへの非結合は、400nMを上回るKDによって特徴づけられる。「結合」および「特異的結合」は、本明細書では、上記のことを表すために可換的に使用される。本願に関して「弁別的結合」とは、ある化合物、特に本明細書に記載する抗体が、oxMIFに（例えば上述のKD値で）結合すると共に、それらがredMIFには結合しない（非結合とは、ここでも、上に定義したとおりである）ことを意味する。
【００７９】
「抗体」とは、無傷の抗体または（特異的）結合に関して無傷の抗体と競合する抗原結合性部分を指す。一般論については「Fundamental Immunology」第7章（Paul, W., ed. Raven Press, N.Y. (1989)）（引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体という用語には、ヒト抗体、哺乳動物抗体、単離された抗体および遺伝子工学による形態、例えばキメラ抗体、ラクダ化抗体またはヒト化抗体が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００８０】
抗体の「抗原結合性部分」という用語は、抗原（例えば(ox)MIF）に特異的に結合する能力を保持している、抗体の1つ以上のフラグメントを指す。抗原結合性部分は、組換えDNA技法によって生産するか、無傷の抗体の酵素的切断または化学的切断によって生産することができる。抗原結合性部分には、例えば−限定するわけではないが−次に挙げるものが含まれる：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および相補性決定領域（CDR）フラグメント、単鎖抗体（scFv）、キメラ抗体、ならびにポリペプチド（すなわちoxMIFまたはredMIF）への特異的抗原結合を付与するのに十分であるような抗体の少なくとも一部分を含有する抗体およびポリペプチド。N末端からC末端に向かって、成熟軽鎖可変ドメインと成熟重鎖可変ドメインはどちらも、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat「Sequences of Proteins of Immunological Interest」（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)）、Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、またはChothia et al., Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。抗体またはその抗原結合性部分は誘導体化するか、もう一つの機能的分子（例えばもう一つのペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。例えば抗体またはその抗原結合性部分は、1つ以上の他の分子実体、例えばもう一つの抗体（例えば二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能物質、細胞毒性物質、医薬物質および/または連結分子に、機能的に連結することができる。
【００８１】
「KD」という用語は、本明細書では、当業者の一般的知識のとおり、特定の抗体とそれぞれの抗原との平衡解離定数を指す。この平衡解離定数は、大きな物体（ここではoxMIFまたはredMIF/抗体複合体）が分離する傾向、すなわち小さな構成要素（ここではoxMIFまたはredMIFと抗体と）に解離する傾向の尺度となる。
【００８２】
「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインと定常ドメインとがヒト配列である任意の抗体を指す。この用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を持つが、例えば考えうる免疫原性が減少し、アフィニティが増加し、または望ましくないフォールディングを引き起こすかもしれないシステインが排除されるように配列が改変されている抗体を包含する。この用語は、例えばヒト細胞の典型ではないグリコシル化を付加するかもしれない非ヒト細胞において組換え生産された上述の抗体を包含する。
【００８３】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト配列を含み、かつ非ヒト配列も含有する抗体を指す。
【００８４】
「ラクダ化抗体」という用語は、抗体の構造または配列が、ラクダからの抗体（ラクダ科動物抗体ともいう）に、より近くなるように改変されている抗体である。ラクダ化抗体を設計し生産するための方法は、当業者の一般的知識の一部である。
【００８５】
「キメラ抗体」という用語は、2つ以上の異なる種からの領域を含む抗体を指す。
【００８６】
「単離された抗体」または「その単離された抗原結合性部分」とは、ファージディスプレイライブラリーまたはB細胞レパートリーなどの抗体供給源から同定され選択された抗体またはその抗原結合性部分を指す。
【００８７】
本発明の抗(ox)MIF抗体の生産には、遺伝子工学により、例えばRNAの逆転写および/またはDNAの増幅などによって、組換えDNAを生成させ、発現ベクターにクローニングするための任意の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターがウイルスベクターであり、その場合は、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、それが導入された宿主細胞内で自立的に複製する能力を有する（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。別の実施形態において、ベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製されうる。さらにまた、一定のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。
【００８８】
抗(ox)MIF抗体は、とりわけ従来の発現ベクターを利用して、例えば細菌ベクター（例えばpBR322およびその誘導体）、または真核細胞用ベクターを利用して、生産することができる。抗体をコードするこれらの配列には、複製、発現および/または宿主細胞からの分泌を制御する制御配列を設けることができる。これらの制御配列は、例えばプロモーター（例えばCMVまたはSV40）およびシグナル配列を含む。発現ベクターは、選択および増幅マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（DHFR）、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、およびチミジン-キナーゼも含むことができる。使用するベクターの構成要素、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、市販されているか、または従来の方法を利用して調製することができる。さまざまな細胞培養、例えば、CHO、COS、HEK293、NSO、線維芽細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または大腸菌などの細菌における発現のためのベクターを構築することができる。いくつかの例では、発現されるタンパク質の最適なグリコシル化を可能にする細胞が使用される。
【００８９】
抗(ox)MIF抗体軽鎖遺伝子および抗(ox)MIF抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、あるいはこれらの遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的方法によって、例えば抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位のライゲーションによって、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーションによって、発現ベクターに挿入される。
【００９０】
抗(ox)MIF抗体またはその抗原結合性フラグメントの生産は、トランスフェクションによって、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって、組換えDNAを真核細胞に導入するための、当技術分野において知られる任意の方法を含みうる。例えば、抗(ox)MIF抗体の組換え発現は、抗(ox)MIF抗体をコードするDNA配列を1つ以上の制御配列（例えば強力なプロモーター）の支配下に含有する発現プラスミドを、適切な宿主細胞株に、適当なトランスフェクション方法で導入することで、導入された配列がゲノムに安定に組み込まれている細胞を得ることによって、達成することができる。リポフェクション法は、本発明に従って使用しうるトランスフェクション法の一例である。
【００９１】
抗(ox)MIF抗体の生産は、前記形質転換細胞を、例えば連続法でまたはバッチ法で培養し、抗(ox)MIF抗体を構成的にまたは誘導時に発現させるための、当技術分野において知られている任意の方法も含みうる。抗(ox)MIF抗体の生産に関するさらなる文献として、特にWO2009/086920が挙げられる。好ましい一実施形態では、本発明に従って生産される抗(ox)MIF抗体が、oxMIFまたはそのエピトープに結合する。特に好ましい本発明の抗体は、抗体RAB9、RAB4および/またはRAB0ならびにRAM9、RAM4および/またはRAM0である。
【００９２】
これらの抗体の配列のうち,一部は、WO2009/086920に開示されているが、それらに加えて、本願の配列表および以下の配列も参照されたい。
【００９３】
RAB9の軽鎖のアミノ酸配列に関する配列番号1：
【化１】
2016502669.tif 000002
【００９４】
RAB4の軽鎖のアミノ酸配列に関する配列番号2：
【化２】
2016502669.tif 000003
【００９５】
RAB0の軽鎖のアミノ酸配列に関する配列番号3：
【化３】
2016502669.tif 000004
【００９６】
RAB2の軽鎖のアミノ酸配列に関する配列番号4：
【化４】
2016502669.tif 000005
【００９７】
RAB9の重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号5：
【化５】
2016502669.tif 000006
【００９８】
RAB4の重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号6：
【化６】
2016502669.tif 000007
【００９９】
RAB0の重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号7：
【化７】
2016502669.tif 000008
【０１００】
RAB2の重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号8：
【化８】
2016502669.tif 000009
【０１０１】
RAM0hcのアミノ酸配列に関する配列番号9：
【化９】
2016502669.tif 000010
【０１０２】
RAM0lcのアミノ酸配列に関する配列番号10：
【化１０】
2016502669.tif 000011
【０１０３】
RAM9hcのアミノ酸配列に関する配列番号11：
【化１１】
2016502669.tif 000012
【０１０４】
RAM9lcのアミノ酸配列に関する配列番号12：
【化１２】
2016502669.tif 000013
【０１０５】
RAM4hcのアミノ酸配列に関する配列番号13：
【化１３】
2016502669.tif 000014
【０１０６】
RAM4lcのアミノ酸配列に関する配列番号14：
【化１４】
2016502669.tif 000015
【０１０７】
本発明の抗MIF抗体は、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体である。抗MIF抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgD分子であることができる。別の実施形態では、抗MIF抗体がIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスである。別の実施形態では、抗体がサブクラスIgG1またはIgG4のいずれかである。別の実施形態では、抗体がサブクラスIgG4である。いくつかの実施形態では、IgG4抗体が、セリン（Kabatナンバリング方式でセリン228）をプロリンに変える単一変異を有する。したがって、IgG4のFc領域中のCPSC部分配列が、IgG1中の部分配列であるCPPCになる（Angalet al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108）。
【０１０８】
加えて、抗(ox)MIF抗体の生産は、抗体を、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製するための、当技術分野において知られている任意の方法を含みうる。一実施形態では、抗(ox)MIF抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製することができる。
【０１０９】
MIFの「中央領域」および「C末端領域」という用語は、ヒトMIFのそれぞれアミノ酸35〜68およびaa86〜115、好ましくはヒトMIFのそれぞれaa50〜68およびaa86〜102を含む、ヒトMIFの領域を指す。本発明によってアッセイすることができる特に好ましい抗体は、ヒトMIFの領域aa50〜68または領域aa86〜102のいずれかに結合する。これは、次のように結合する好ましい抗体RAB0、RAB4、RAB2およびRAB9ならびにRAM4、RAM9およびRAM0の結合にも反映されている：
RAB4およびRAM4：aa86〜102
RAB9およびRAM9：aa50〜68
RAB0およびRAM0：aa86〜102
RAB2：aa86〜102
【０１１０】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたは抗体フラグメントに特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基が包含される。エピトープ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面基、例えば露出したアミノ酸、アミノ糖、または他の糖質側鎖からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と特異的な電荷特徴を有する。
【０１１１】
「ベクター」という用語は、もう一つの核酸に連結されてその核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミド、すなわち環状の二本鎖DNAループであって、その中に追加のDNAセグメントをライゲートすることができるものである。
【０１１２】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターの導入後に組換えタンパク質を生産する能力を有する細胞株を指す。「組換え細胞株」という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞株を指す。「組換え細胞株」は特定の対象細胞株だけでなく、そのような細胞株の子孫も意味することを理解すべきである。変異または環境の影響によって後続の世代では一定の修飾が起こりうるので、上述の子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお、本明細書において使用する用語「組換え細胞株」の範囲に包含される。
【０１１３】
本発明の宿主細胞タイプは、例えばCOS細胞、CHO細胞、または例えばHEK293細胞であるか、あるいは当業者に知られている他の任意の宿主細胞であり、したがって、例えば大腸菌細胞のような細菌細胞も含まれる。一実施形態では、DHFR欠損CHO細胞株、例えばDXB11において抗MIF抗体を発現させ、この場合は、選択マーカーとしてG418を添加する。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをCHO宿主細胞に導入した場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を可能にするのに十分な期間、または宿主細胞を成長させる培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって生産される。
【０１１４】
抗(ox)MIF抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使って、培養培地から回収することができる。
【０１１５】
生産される抗(ox)MIF抗体はいずれも所与の効力を有することになる。この抗体を診断用製剤または医薬製剤に処方しようとする場合は、その効力が既知であることを保証することが、とりわけ重要である。したがって、例えばIC50値で表されるこの効力を、明確にかつ信頼性をもって測定し計算するアッセイ方法を持っておく必要がある。
【０１１６】
本発明の好ましいアッセイフォーマットは、細胞の遊走を許し、アッセイの終了後に、好ましくは下部チャンバーにおいて、遊走した細胞を計数することができるようになっている、2つのチャンバーを備えた改変ボイデンチャンバー（Transwell（登録商標））アッセイである。ボイデンチャンバーアッセイとTranswell（登録商標）チャンバーアッセイはどちらも当業者にはよく知られている。当技術分野において細胞遊走アッセイに使用されている周知のデバイスはいずれも、基本的には、本アッセイ方法に使用することができるが、唯一の前提条件は（少なくとも）2つのチャンバーを備えていて、細胞が一方のチャンバー（例えば上部チャンバー）に供給され、抗体が他方のチャンバー（例えば下部チャンバー）に供給されることである。しかし、抗体を細胞と一緒に上部チャンバーに加えることも可能である。ボイデンチャンバーの他にも、例えばマルチウェルチャンバーやダン（Dunn）チャンバー（これは同心円状のリングがスライド上に配置されているものである）などといった、他の周知のアッセイフォーマットを使用することができる。チャンバーは、問題の細胞の拡散と特に遊走とが可能であるように、相互に連結されている必要がある。これは、それぞれの細孔を有する連結膜を設けることによって達成される。孔径は、アッセイにおいて使用する細胞タイプに応じて、当技術分野ではよく知られているように選択される。決して限定するわけではないが、一例として、本発明のアッセイ（例えばボイデンチャンバーアッセイ）には、典型的に、以下の孔径が選択される:
アストロサイト:12μm
リンパ球：5μm
がん細胞株： 8μm
マクロファージ： 5μm
内皮細胞： 8μm
単球：5μm
上皮細胞：8μm
好中球： 3μm
線維芽細胞： 8μm
白血球：3μm
速度の遅い細胞：12μm。
【０１１７】
本発明に使用するための好ましい遊走培地は特に限定されることはなく、遊走培地は当技術分野ではよく知られている。好ましい一実施形態では、培地が無タンパク質かつ無血清である。一例は、無血清RPMI培地、すなわち10mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、4.5g/Lグルコースを含むRPMI1640（Gibco、カタログ番号11835）であるだろう。
【０１１８】
例示的対照として、細胞遊走を誘導するために10％FBSを含む培地（RPMI培地：10％不活化FBS、10mM Hepes、1mM ピルビン酸Na、4.5g/Lグルコース、0.05mMβ-メルカプトエタノールを含むRPMI1640（Gibco、カタログ番号11835））が使用される。
【０１１９】
本発明のアッセイにとって好ましい細胞は、遊走能を有する細胞である。細胞が(ox)MIFを発現する細胞であることは、本発明にとってはとりわけ重要である。細胞を内因性(ox)MIFを発現するか、または遺伝子工学でこれらの細胞に(ox)MIFを導入してこれらの細胞が(ox)MIFを発現するようにすることができる。これにより、特に、細胞の遊走が達成される。言い換えると、細胞は、(ox)MIFを好ましくはその表面に発現することにより、自らの遊走を刺激する。これらの細胞はその遊走がとりわけ活発であり、抗(ox)MIF抗体がこれらの細胞の(ox)MIFと接触していると、その遊走作用が阻害（すなわち減速）されることが、明らかになった。この接触は、主として、2つのチャンバーを分かつ隔壁、例えば細孔を有する膜上で起こるであろう。問題の抗体の効力が高ければ、それらは、効力が低い場合よりもはるかに強く、細胞の遊走作用を減速するであろう。したがって、上部チャンバーから下部チャンバーへと隔壁（例えば細孔）を通って実際に遊走した細胞の数は、抗体がどのくらい強力であるかの指標である。下部チャンバーに遊走した細胞の数が多いことは、効力が低い（すなわち遊走の阻害が弱い）ことに等しく、下部チャンバーに遊走した細胞の数が少ないことは、効力が高い（すなわち遊走の阻害が強い）ことに等しい。
【０１２０】
これらの基準を満たす細胞は当業者に広く知られているが、本フォーマットでは、単核球細胞、例えば（ヒト）U937細胞（ATCCカタログ番号：CRL-1593.2）を使用することがとりわけ好ましい。抗oxMIF抗体の効力を決定しようとするなら、細胞は(ox)MIFを例えばその細胞表面に発現する必要があるが、それは、当業者にはよく知られているとおり、例えばFACS（蛍光活性化細胞選別）によって決定することができる。細胞は、MIFを組換え発現するかもしれないし、あるいは、本発明者らはoxMIFが疾患状態にある細胞によってのみ発現されることを以前に明らかにしているので、疾患試料（例えばがん試料）から採取した細胞のように、MIFを内因性に発現するかもしれない。上記の好ましい細胞はこの基準を満たす。
【０１２１】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、抗体が、緩衝液系に入れて供給される。緩衝液系は好ましくは無毒性であり、抗体に対して良好な溶解度を示す。より好ましくは、緩衝液系は、例えばPBS（リン酸緩衝食塩水）またはN-置換タウリン緩衝液など、当業者にはよく知られているとおり、適度に弱い酸とその共役塩基とを含む。特に好ましい実施形態では、グリシン緩衝液（例えばpH4.5〜5.5、好ましくはおよそpH5.0の、100〜350mM、より好ましくは200〜300mM、最も好ましくは約250mMグリシン緩衝液）を使用する。
【０１２２】
好ましいアッセイ温度は37℃前後である。
【０１２３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、決して、これらの実施例が、、本願特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。
【実施例１】
【０１２４】
抗MIF抗体RAM9ケモキネシスアッセイ；細胞ベースアッセイ
意図した目的：
この試験は、単核球細胞のランダムな遊走（＝ケモキネシス）を阻害するグリシン緩衝抗MIF RAM9調製物（＝試験品目）の機能性を試験するために設定された。このアッセイとそれぞれの方法は、最終製剤（FDP）のための工程ステップにおける品質管理試験として使用できることを、本発明者らは明らかにした。
【０１２５】
1）理論的根拠：
U397（および他のがん性）単球ではMIFが構成的に発現しており、これらの細胞の細胞表面にはoxMIFが存在して（FACSデータ、図2参照）、それが遊走機能を支えている。疾患試料からの細胞のような、(ox)MIFを内因性または外因性に発現する細胞を使用することは、本発明の重要な特徴である。この原理は、oxMIFが健常な細胞または組織には存在しないという、本発明者らの以前の発見に基づいている。U397細胞株は本発明を実施するための好ましい一例である。これは、がん性組織からの不死化細胞株であり、初代細胞株ではない。
【０１２６】
試験方法の原理：
ヒト単球のランダムな遊走（ケモキネシス）を阻害する抗MIF抗体の能力をTranswell（登録商標）アッセイ（ボイデンチャンバーアッセイに相当する）で試験する。この試験方法の一般的構成を図1に示す。そのために、血清飢餓単核球細胞（細胞株：U937）を多孔性（5μm）Transwell（登録商標）インサート（すなわち「上部チャンバー」）に播種し、異なる濃度の抗MIF抗体RAM9（下部チャンバー中の試験品目）に向かう細胞遊走を測定した。IC50は、RAM9の濃度（対数目盛）に対する遊走した細胞の数の非線形回帰式（4パラメータロジスティック）：
Y−（Ymax−Ymin）/（1+(X/IC50）Expslope＋Ymin
によって決定した。
【０１２７】
試験方法の詳細：
材料と装置
Transwell（登録商標）プレート：HTS 96ウェルTranswell（登録商標）プレート、孔径5μmのポリカーボネート膜、滅菌、ポリスチレン、組織培養処理（Corning、カタログ番号：3387）。
遊走培地：無血清0％RPMI培地：10mM Hepes、1mMピルビン酸Na、PenStrep、4.5g/Lグルコースを含むRPMI1640（Gibco、カタログ番号11835）。
10％HG完全培地：10％RPMI培地：10％不活化ウシ胎児血清（FBS）、10mM Hepes、1mMピルビン酸Na、PenStrep、4.5g/Lグルコース、0.05mMβ-メルカプトエタノールを含むRPMI1640（Gibco、カタログ番号11835）（細胞を無血清培地に入れるまでの通常培養では、本発明者らは、この培地を使用する。また、本発明のアッセイでは、この培地を陽性対照として使用することで、10％FBSによる細胞遊走を誘導することができる）。
試料希釈緩衝液：250mMグリシン緩衝液、pH5.0、滅菌ろ過。
細胞：細胞密度が約1×106細胞/mlのU937細胞（www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-1593.2&Template=cellBiology、カタログ番号：CRL-1593.2（元のATCCバイアルからの総継代数＜25）。
試料希釈プレート：滅菌96Uウェルプレート、例えばBrand、カタログ番号：701316。
装置：
37℃インキュベーター、5％CO2、相対湿度（rH）＞80％、例えばHeraeus（CB_IN_17）。
CASY細胞計数システム、Innovatis（CB_SG_38）。
Cellavista（商標）システム、Roche。
50mlチューブ用遠心機：例えばHeraeus Megafuge 1.0R（CB_ZF_05）。800rpmが133gに相当する（ローター：#2704）。
抗体：RAM9（GMPグレード）
対照抗体（陰性対照）：Synagis（登録商標）、100mg/ml（チャージ：1006/1 0996）（アイソタイプ対照抗体）。
陽性対照（p.c.）：抗体を含まない10％HG完全培地（上記）、抗体希釈緩衝液だけをTranswell（登録商標）プレートの下部ウェルに適用する；遊走培地中の細胞をTranswell（登録商標）インサートに適用する。
緩衝液対照（b.c.）：抗体を含まない遊走培地、試料希釈緩衝液だけをTranswell（登録商標）プレートの下部ウェルに適用する；遊走培地中の細胞をTranswell（登録商標）インサートに適用する。
【０１２８】
2）追加情報：
試料適用：
各抗体希釈液を6回適用した（n＝6）。以後の計算には平均値を使用した。5μlの最小ピペット容積を使用した。
対照：各プレート上の陰性対照および陽性対照
アッセイは二つ一組のプレート（1ロット試験あたり2枚のプレート）で実施した。
【０１２９】
3）レイアウト（以下の図に示すとおり）：
（96ウェルELISAプレートの）端のウェルは信頼性を高めるためにRAM9試料および対照抗体試料には使用しない（緩衝液対照および陽性対照にのみ使用する）。
【化１５】
2016502669.tif 000016
p.c.＝陽性対照（血清）
b.c.＝バックグラウンド対照（緩衝液）
【０１３０】
4）手順：
1日目：
a．U937細胞を計数した。
b．適量の細胞懸濁液を室温にて800rpmで5分間遠心分離した。
c．上清を捨て、細胞を予温した遊走培地に再懸濁した（洗浄）。
d．800rpmの遠心分離ステップをもう一度、室温で5分間行った。
e．上清を捨てた。
f．その後、細胞を、1×106細胞/mlになるように、予温した遊走培地に再懸濁した。
g．その細胞懸濁液をインキュベーターで24時間インキュベートした。
【０１３１】
2日目：
a．Transwell（登録商標）プレートを次のように平衡化した：
235μlの予温した遊走培地をプレートの全てのウェルに適用する。
Transwell（登録商標）インサートをプレートに入れて、100μlの予温した遊走培地をインサートに加える。細胞培養インキュベーター中で少なくとも1時間はインキュベートする。
【０１３２】
b．抗体調製は次のように行った：
下部ウェル中のRAM9の最終濃度：
30nM、10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.04nM（1μg/mlのIgGを6.7nMと計算する）。
下部ウェル中のSynagis（登録商標）の最終濃度：
30nM、10nM、3.33nM（1μg/mlのIgGを6.7nMと計算する）。
同じ体積の抗体希釈緩衝液を加えることによって試料体積を調整した。試料の混合を改善するために希釈プレートとマルチチャンネルピペットとを使った予備希釈ステップを行うことが強く推奨されるので、当業者には知られているように予備希釈ステップも行った。
【０１３３】
c．細胞調製は次のように実施した：
細胞を計数し、室温にて800rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、予温した遊走培地で細胞を1回洗浄した。遠心分離ステップをもう一度、800rpmで5分間実施した。
上清を捨て、細胞数が1×106細胞/mlになるようにペレットを再懸濁した。
【０１３４】
d．プレートを調製するために、以下のステップを実行した：
平衡化ステップからの培地を（ウェルおよびインサートから）捨てた。
インサートの膜には触れないようにして、インサートを上下逆さまにして層流フードに置いた（膜の空気乾燥を避けること）。
【０１３５】
e．220μlの予温した遊走培地（または10％HG完全培地＝陽性対照）を加えた。235μlの遊走培地を未使用のウェルに加えた。
抗体の添加は次のように行った：
15μlの予備希釈済み抗体をマルチチャンネルピペットでTranswell（登録商標）プレートのウェルに適用した。ウェル中に気泡が生じないようにした。
【０１３６】
f．細胞の添加は次のように実施した：
インサートをTranswell（登録商標）プレートに注意深く取り付け、100μlの調製済み細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットで全てのインサートに加えた（1×106細胞/ml）。
→インサート中の最終細胞数：1×105細胞/ウェル。
ピペットチップがインサートの膜に触れないようにした。
【０１３７】
g．プレートを細胞培養インキュベーター中で終夜（約16時間）インキュベートした。
【０１３８】
3日目：
a．インサートを捨て、Transwell（登録商標）プレートを細胞計数に使用した。
b．マルチチャンネルピペットで数回上下にピペッティングすることにより、細胞を分離させた。
c．気泡を除去した。
d．細胞をウェル中で少なくとも30分間は沈降させてから測定した。
e．Cellavistaシステム（パラメータ設定THP-1 AK、オペレータ設定はCell Confluence用）を使って細胞を計数した。
【０１３９】
評価（IC50値の計算）は、当業者によく知られているように、例えば4パラメータフィットの非線形回帰モデルで、以下の式を使って行われる：
Y＝（Ymax−Ymin）/（1+（X/IC50）Expslope＋Ymin。
【０１４０】
RAM9に関して許容できるIC50値の例示的範囲は≧0.1nMかつ≦4nMである。
【０１４１】
この点において「許容できる」とは、各プレートのIC50計算値がこの範囲内にない場合は、その試験を繰り返す必要があることを意味するものとする。繰り返した試験のIC50がこの範囲内になければ、そのRAM9抗体はこの試験に不合格とした。
【０１４２】
注：
RAM9のIC50を計算するには、例えば少なくとも5つの一連の濃度（およびフィット値）をカーブフィットに含めるべきである。（ここに示した例では、6つの濃度（0.04nM〜10nMの抗体）を計算に使用した）。
【０１４３】
正確度：
この方法に利用することができる国内標準物質や国際標準物質はない。そこで、IC50曲線の決定には、社内標準（抗MIF常用標準バルク原薬（ロットORMFUFD09003 REF）；17.44mg/ml）を使用した。アッセイの一貫性は、全ての試験にこの標準化合物を使用することによって確認した。列挙した25回の実験（＝38プレート）から、0.8という平均IC50が計算された。
【０１４４】
精度：
上述の標準化合物のIC50を決定するために、上記の例では、2人のオペレータが約7ヶ月にわたってケモキネシスアッセイを38回繰り返した（1濃度および1アッセイあたりn＝6ウェル）。列挙した25の実験（38プレート）からの標準偏差は0.7である（IC50：0.8±0.7nM）。二つ一組のプレート（13の実験からの26プレート）を評価に使用すると、0.8という平均IC50と0.5という標準偏差を計算することができる（IC50：0.8±0.5nM）。
【０１４５】
特異度：
RAM9（ロットORMFUFD09003 REF）によるU937細胞の用量依存的遊走阻害は、いくつかの実験で、繰り返して示すことができた。陰性対照として、もう一つの完全ヒトIgG原薬（抗体パリビズマブ、商品名Synagis（登録商標））を3つの濃度でアッセイに使用した。
この好ましい実施形態の適格性評価中に変化させなかった一般パラメータ：
・RAM9はグリシン緩衝液に希釈し、5μlの最小ピペット容積を使用した。
・U937単球の24時間血清飢餓。
・遊走培地におけるTranswell（登録商標）プレートの平衡化。
・96ウェルプレートにおけるグリシン緩衝液での抗体の予備希釈（等体積混合物）。
・新鮮遊走培地における1×106細胞/mlの調製。
・96ウェルプレートの下部チャンバーへの遊走培地および希釈抗体の添加。
・上部チャンバー（Transwell（登録商標）インサート）への細胞懸濁液の添加（遊走培地中の懸濁液）。
・プレートの終夜インキュベーション（16時間、細胞培養インキュベーター）。
・Transwell（登録商標）インサートの除去、および下部チャンバー中の細胞の計数（読出し＝細胞数）。
・エクセルのソルバー機能（excel solver function）（非線形回帰、4パラメータフィット）を利用するIC50の計算。
【０１４６】
範囲：
IC50範囲：≧0.1nMかつ≦4nM。
【０１４７】
ロバスト性：
本発明の好ましい一実施形態では、試験品目（抗MIF抗体RAM9のグリシン緩衝調製物）の凍結融解サイクルを避ける。細胞のロット変更後は、許容される抗MIF常用標準（例えばRAM9 BDS（バルク原薬）材料）を利用して、遊走アッセイを再評価することが好ましい。緩衝液対照ウェル中の遊走した細胞の数（n）は、好ましい一実施形態では、n＞60かつn＜3000であるべきである。遊走した細胞の数がこれらの限界値より少ないか多い場合は、試験を繰り返すべきである（そのIC50値は採用すべきでない）。そうすることにより、意味のある統計解析を行うには細胞の数が少なすぎること、または十分な細胞間コミュニケーションがないことを避けることができ、また、数が多すぎること（この場合は細胞間コミュニケーションが顕著すぎる状況での実施になりうる）が避けられる。
【０１４８】
装置適格性評価：
以下のデバイスで試験を実施した：
・37℃インキュベーター（5％CO2、＞80％rH）、Heraeus
・CASY細胞計数システム、Innovatis
・Cellavista、Innovatis
・遠心機Heraeus Megafuge 1.0R
この装置は、試験の設計上、許容できると評価される。
【０１４９】
5）結論：本方法はその意図した目的に適格である。すなわち、本方法は、抗(ox)MIF抗体の効力を試験するために、問題なく使用することができる。特に、臨床試験第I/II相材料の試験には、非常に適している。
【実施例２】
【０１５０】
基本的に同じアッセイ方法を使って、抗体を細胞と一緒に上部チャンバーに供給することができるかどうかを決定した。
【０１５１】
概略：
細胞遊走アッセイ：HTS Transwellプレート（Corning）：5μm。
・細胞：U937（継代第10代）、終夜飢餓。
・RAM9抗体：30nM〜0.04nM、ピペットでインサートに移す。
・Synagis（登録商標）グリシン中： 30nM；10nM；3.3nM、ピペットでインサートに移す。
・陰性対照：グリシン；陽性対照：FBS（ウシ胎児血清）。
・インキュベーション：2プレート、16時間。
・結果の計算にはCellavista（登録商標）を使用。
【０１５２】
結果：
プレート1
【表１】
2016502669.tif 000017
フィット：I％＝（A-D）/（1+（X/C）ExpB＋D（＝シグモイド曲線）
【０１５３】
プレート2
【表２】
2016502669.tif 000018
フィット：I％＝（A-D）/（1+（X/C）ExpB＋D（＝シグモイド曲線）
【０１５４】
結論：
このアッセイ方法もその意図した目的に適している。
【０１５５】
本発明は、FDAバイオアッセイガイドラインに従ってMIF特異的抗体/薬物をその効力について試験することを可能にするであろうアッセイのロバスト性および精度に関して、新しい（工業的）基準を設定する。実際のアッセイは臨床試験第III相まで抗MIF最終製剤ロットを試験するのに十分である適格な試験である。他の種から（例えばラットから）の単核球細胞を応用することにより、このアッセイは、MIF阻害抗体/分子の種同等性研究を裏付けるために使用することもできる。
【０１５６】
本アッセイは使い易く、組換えMIFタンパク質の使用を必要としない。その作用機序に基づいて、本バイオアッセイは、炎症性疾患との関連において、抗MIF抗体効力の評価について、FDAによって承認された。他の適応症（例えばがん）における抗MIF抗体/薬のin vitro効力を評価するには、規制当局によって他のアッセイ原理/フォーマットが要求されるかも知れない。
2016502669.tif 000019
2016502669.tif 000020
2016502669.tif 000021
2016502669.tif 000022
2016502669.tif 000023
2016502669.tif 000024
2016502669.tif 000025
2016502669.tif 000026
2016502669.tif 000027
2016502669.tif 000028
2016502669.tif 000029
2016502669.tif 000030
【図１】
2016502669.tif 000031
【図２】
2016502669.tif 000032
【図３】
2016502669.tif 000033
【配列表】
2016502669000001.app
【国際調査報告】
2016502669.tif 000034
2016502669.tif 000035
2016502669.tif 000036