(57)【要約】  乾燥細胞重量の重量％としての測定で少なくとも２８パーセントのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含んでなる油を産生する組換え微生物細胞が、本明細書で開示される。これらの細胞は、膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる、活性アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなってもよい。さらに細胞は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御、および／またはリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＰＤＡＴ）、Δ１２デサチュラーゼ、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）シンターゼマルチザイム、Δ８デサチュラーゼ、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、またはアシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含んでなってもよい。組換え微生物細胞を使用して、ＥＰＡなどのω−３多価不飽和脂肪酸を含有する油を生産する方法もまた開示される。
2016502852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２８パーセントのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含んでなる油を産生する組換え微生物細胞であって、前記細胞が、膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記ＬＰＣＡＴが、ＬＰＣＡＴ活性を有し、前記ＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する、組換え微生物細胞。
【請求項２】
前記ＬＰＣＡＴが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴである、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項３】
前記ＬＰＣＡＴが、（ｉ）１３６位のアミノ酸をメチオニンから異なるアミノ酸に変化させ、（ｉｉ）３８９位のアミノ酸をスレオニンから異なるアミノ酸に変化させる変異を含んでなる、請求項２に記載の組換え微生物細胞。
【請求項４】
前記細胞が、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御をさらに含んでなる、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項５】
前記下方制御が、前記内在性ポリヌクレオチド配列の変異に起因して、前記変異が置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え微生物細胞。
【請求項６】
前記Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質が、配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の組換え微生物細胞。
【請求項７】
前記下方制御が、前記微生物細胞によって産生される糖アルコールの総量を低下させる、請求項４に記載の組換え微生物細胞。
【請求項８】
（ａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＰＤＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ１２デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および
（ｃ）ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）シンターゼマルチザイムをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列
をさらに含んでなり、ａ〜ｃ）の各ポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項９】
前記ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムが、Δ８デサチュラーゼと連結するΔ９エロンガーゼを含んでなる、請求項８に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１０】
（ａ）Δ８デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、
（ｂ）マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および
（ｃ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列
をさらに含んでなり、ａ〜ｃ）の各ポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１１】
前記油が、前記宿主細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも３０パーセントのＥＰＡを含んでなる、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、油性酵母細胞である、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１３】
前記油性酵母細胞が、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である、請求項１２に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１に記載の組換え微生物細胞を培養し、その中でエイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生成するステップと；
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の前記微生物油を回収するステップと
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、どちらもその内容全体を参照によって本明細書に援用する、それぞれ２０１２年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７４０，５０２号明細書および米国仮特許出願第６１／７４０，５０６号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、乾燥細胞重量として少なくとも２８％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生じ得る、組換え油性酵母細胞などの組換え微生物細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の商業的生産手段として、継続して研究されている。遺伝子工学は、天然ではリノール酸（ＬＡ、１８：２  ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３  ω−３）脂肪酸生成に制限されているものであっても、いくつかの宿主の天然能力を実質的に改変して、様々な長鎖ω−３／ω−６  ＰＵＦＡの高レベルの生成をもたらし得ることを実証している。
【０００４】
文献は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）産生に関与するω−３／ω−６  ＰＵＦＡ生合成経路の様々な部分が、植物および非油性酵母に導入されるいくつかの最近の例を報告しているが、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に、多大な努力が向けられている（特許文献１および２；特許文献３および４）。油性酵母は、天然に油を合成して蓄積する能力のある酵母と定義され、油の蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％であり、またはこれらの酵母は、油を合成して蓄積する能力を持つように遺伝子改変されて、油の蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％である。
【０００５】
重点は、増大した量のＥＰＡを産生し得る、トランスジェニック油性Ｙ．リポリティカ株の開発に置かれている。ＥＰＡ生産に対するこの注目は、認識されたＥＰＡの有益な効果にある程度起因する。例えば、ＥＰＡは、脳、網膜、および心臓血管の健康を維持する役割を果たすことが、示されている。ＥＰＡはまた、抗炎症特性を有することが知られており、炎症と関連づけられている心血管疾患および関節炎などの疾患を、治療または予防するのに有用である場合もある。したがってＥＰＡの臨床的および医薬的価値は、良く知られている（特許文献３）。同様に、天然微生物源からまたは魚油および海洋性プランクトンからの単離を通じたＥＰＡ生産とは対照的に、組換え手段を使用して微生物中でＥＰＡを生産する利点もまた、よく認識されている。酵母中におけるＥＰＡ生産に対する関心は、魚からＥＰＡを生産する代案として、ＥＰＡの持続可能な供給源の開発を進めると言う動機に起因し、これは魚の乱獲に伴う問題を軽減するのを助ける。
【０００６】
Ｙ．リポリティカ中におけるＥＰＡの生産増大は、２つの一般的な方法で標的とされてきた。最初に、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）によって産生される油中に存在するＥＰＡの量を増大させることが、試みられた。このような油は、必ずしもＹ．リポリティカバイオマスの乾燥細胞重量の大部分を構成しなくてもよく、バイオマスから精製され得て、次にＥＰＡ健康補助食品で使用され、および／または、医薬用途のためのさらなる濃縮のために使用される。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の乾燥細胞重量中で、ＥＰＡの量を増大させる試みがなされている。これは（ｉ）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の油のレベルを増大させながら、（ｉｉ）油中に存在するＥＰＡの量も増大させる試みを必然的に伴う。得られたバイオマスは、供給スキームで直接使用して、油の精製問題を回避しながら、食餌に大量のＥＰＡを送達し得る。もちろんこのようなバイオマスはまた、ＥＰＡ補給剤中で油供給源の役割を果たすことができ、油はまた、製薬用途においてさらなる濃縮のために使用することができ、より低い油量を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のバイオマスと比較して、生産されるＥＰＡの単位当たりより少量のバイオマスを要する。
【０００７】
特許文献４は、油の全脂肪酸の６１．８重量％のＥＰＡを含有する油を産生する、遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を開示する。しかしこの株は、乾燥細胞重量基準で２６．５％の油を含有する。したがって、油中のＥＰＡ含有量が高い（６１．８％）一方で、開示されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中のＥＰＡ含有量は、乾燥細胞重量基準で約１６．４％と、低い。
【０００８】
油の全脂肪酸の５８．７重量％のＥＰＡを含有する油を産生する、遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が、特許文献５で開示される。この株は、乾燥細胞重量基準で３８．３％の油を含有する。したがって、油中のＥＰＡ含有量が高い（５８．７％）一方で、開示されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中のＥＰＡ含有量は、乾燥細胞重量基準で約２２．５％と、低い。
【０００９】
特許文献５もまた、油の全脂肪酸の４８．３重量％のＥＰＡを含有する油を産生する、遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を開示する。この株は、乾燥細胞重量基準で５６．２％の油を含有し、ＥＰＡ含有量は約２７．１％である。
【００１０】
これらの開示された例は、ＥＰＡ生成量および／または産油量増大のための、遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発における進歩に伴って、生成する総油量と、全脂肪酸中に存在するＥＰＡの量との間に逆相関が生じることを示唆する。乾燥細胞基準でより大量の油を産生するように改変された株は、脂肪酸油中の百分率として、概してより少ない量のＥＰＡを有する。
【００１１】
乾燥細胞重量基準で、生成された全ＥＰＡ量の増大は、産油量と油中の全脂肪酸の百分率としてのＥＰＡ生成量の間に逆相関があったにもかかわらず、実現化された。この達成にもかかわらず、より大きな全ＥＰＡ量を生じ得るＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を開発する必要性がなおもある。この目的の達成は、株によって産生される油の総量を損なうことなく、油中の全脂肪酸の百分率としてのＥＰＡ量を高める、新しい株の改変の開発を必然的に伴う可能性が高い。
【００１２】
Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、他の研究者らによって同定されている。しかしこのタンパク質の機能に関する情報は、限定的であると思われる。例えば、非特許文献１は「推定」Ｓｏｕ２タンパク質が、糸状菌ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の細胞外画分中に存在することを開示した。Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質としてのオンラインデータベース中のいくつかのアミノ酸配列の特性解析は、機能検討の開示がなく、配列相同性のみに基づいていると思われる。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）中のＳｏｕ２タンパク質のアミノ酸配列は、非特許文献２および非特許文献３によって、Ｌ−ソルボース利用に必要なソルボース還元酵素として開示されている、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ１タンパク質のアミノ酸配列と、約７２％同一である。しかしＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ１タンパク質とＳｏｕ２タンパク質の間の相同性にもかかわらず、Ｊａｎｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｓｏｕ２タンパク質がソルボース利用に必要でないことを開示した。脂質代謝におけるＳｏｕ１およびＳｏｕ２タンパク質の役割は、もしあったとしても不明であると考えられる。
【００１３】
本明細書で開示される研究は、乾燥細胞重量として２８％を超えるＥＰＡを産生し得るＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を詳述する。このような株を作成するのに使用される改変には、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする遺伝子の下方制御が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，２３８，４８２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９３２，０７７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｊａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９：２７２９−２７４４）
【非特許文献２】Ｊａｎｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：５１５０−５１５５）
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｙｅａｓｔ  ２２：９５７−９６９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一実施形態では、本発明は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２８パーセントのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含んでなる油を産生する、組換え微生物細胞に関する。この細胞は、膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなり、ＬＰＣＡＴはＬＰＣＡＴ活性を有して、ＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチドは少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。
【００１７】
第２の実施形態では、ＬＰＣＡＴは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴである。第３の実施形態では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴは、（ｉ）アミノ酸１３６位に、メチオニンを異なるアミノ酸に変化させる変異、および（ｉｉ）アミノ酸３８９位に、スレオニンを異なるアミノ酸に変化させる変異を含んでなる。
【００１８】
第４の実施形態では、組換え微生物細胞は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御をさらに含んでなる。第５の実施形態では、この下方制御は、変異が、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の変異に起因する。
【００１９】
第６の実施形態では、配列番号１０と少なくとも９５％と同一である、内在性ポリヌクレオチド配列によってコードされるＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、アミノ酸配列を含んでなる。
【００２０】
第７の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、組換え微生物細胞によって産生される糖アルコールの総量を低下させる。
【００２１】
第８の実施形態では、組換え微生物細胞は、（ａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＰＤＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、（ｂ）Δ１２デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および（ｃ）ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）シンターゼマルチザイムをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含んでなり、（ａ〜ｃ）の各ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。第９の実施形態では、（ｃ）の配列のポリヌクレオチドによってコードされるＤＧＬＡシンターゼマルチザイムは、Δ８デサチュラーゼと連結するΔ９エロンガーゼを含んでなる。
【００２２】
第１０の実施形態では、組換え微生物細胞は、（ａ）Δ８デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、（ｂ）マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および（ｃ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ａ〜ｃ）の各ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。
【００２３】
第１１の実施形態では、組換え微生物細胞によって産生される油は、宿主細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも３０パーセントのＥＰＡを含んでなる。
【００２４】
第１２の実施形態では、組換え微生物細胞は、油性酵母細胞である。第１３の実施形態では、この油性酵母細胞は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００２５】
第１４の実施形態では、本発明は、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を生産する方法に関する。この方法は、ａ）本発明の組換え微生物細胞を培養し、その中でエイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生成するステップと；ｂ）ステップ（ａ）の微生物油を任意選択的に回収するステップとを含んでなる。
【００２６】
生物学的寄託
以下の生物学的材料が、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受入番号、および寄託日を有する。
【００２７】
【表１】
2016502852.tif 000003
【００２８】
上に列挙した生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙された寄託は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００２９】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２号明細書に記載されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２株から誘導された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５８５株は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書に記載されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株から誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で、ω−３およびω−６脂肪酸を生成する生合成経路が示される。
【図２Ａ】略図で示されるのは、（ａ）野性型ＡＴＣＣ＃２０３６２株からＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株を開発するステップである。特定の株の下に列挙されるパーセント脂肪酸（例えばＥＰＡ）値は、株によって産生される油の脂肪酸中の特定の脂肪酸の百分率を表す。特定の株の下に列挙されるパーセント油値は、株の乾燥細胞重量百分率としての油を表す。
【図２Ｂ】略図で示されるのは、（ｂ）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からＺ５６２７およびＺ５５８５株を開発するステップである。特定の株の下に列挙されるパーセント脂肪酸（例えばＥＰＡ）値は、株によって産生される油の脂肪酸中の特定の脂肪酸の百分率を表す。特定の株の下に列挙されるパーセント油値は、株の乾燥細胞重量百分率としての油を表す。
【図３】略図で示されるのは、（ａ）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５６２７株からＺ６１０９株を開発するステップ、および（ｂ）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５８５株からＺ９２７６株を開発するステップである。特定の株の下に列挙されるパーセントＥＰＡ値は、株によって産生される油の脂肪酸中のＥＰＡの百分率を表す。特定の株の下に列挙されるパーセント油値は、株の乾燥細胞重量百分率としての油を表す。
【図４】略図で示されるのは、プラスミドコンストラクト（ａ）ｐＹＲＨ５５および（ｂ）ｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗである。
【図５】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子座を含有するゲノムのＤＮＡ配列（配列番号８）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０３０１０、ＹＡＬＩ０Ｄ１８９６４ｇ）を示す。Ｓｏｕ２アミノ酸コード領域（配列番号９）は、太字の下線付きテキストで示される。染色体Ｄの２４００３４９および２４００３５０位に位置する２つの隣接するシトシン残基は、大型太字フォントで示され、明らかなＴＡＴＡボックス（太字）のすぐ下流にある。Ｓｏｕ２発現を損なうＺ３０４１株中で観察された変異的挿入は、これらの２つのシトシン残基の間で起きた。２つの対向する三角形間に示される配列は、プラスミドｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗの５’および３’相同性配列によって、除去対象とされる。
【図６】コンストラクトｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗを使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の内在性ＳＯＵ２遺伝子をノックアウトするのに使用された、遺伝子標的ストラテジーを略図で示す。特定の５’および３’相同性アーム配列間に示される「Ｘ」は、相同組換え部位を意味する。５’相同性アームにおける相同組換に起因するポップイン事象は、変異ＳＯＵ２アレルと野性型ＳＯＵ２アレルの並置をもたらす。２つの異なるポップアウト事象が示される。左側ポップアウト事象は、５’アームポップイン事象から形成される遺伝子構造の３’相同性アームにおける相同組換えの結果として起きる。このプロセスは、変異ＳＯＵ２アレルと、野性型アレル除去とをもたらす。右側のポップアウト事象は、５’相同性アームにおける相同組換えの結果として起こる。このポップアウト事象は、野性型ＳＯＵ２アレルをもたらす。
【図７】略図で示されるのは、プラスミドコンストラクト（ａ）ｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８Ｆ、および（ｂ）ｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８である。
【図８】略図で示されるのは、Ｚ１９７８Ｕ株からＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ３０４１株を開発するステップである。特定の株の下に列挙されるパーセントＥＰＡ値は、株によって産生される油の脂肪酸中のＥＰＡの百分率を表す。特定の株の下に列挙されるパーセント油値は、株の乾燥細胞重量百分率としての油を表す。
【図９】略図で示されるのは、プラスミドコンストラクト（ａ）ｐＺＫＴ２−ＭＬ９ＤＣＢ、および（ｂ）ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２ＹＡＰである。
【図１０】プラスミドコンストラクトｐＹ３０６−Ｎを略図で示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
【表２】
2016502852.tif 000004
【００３２】
【表３】
2016502852.tif 000005
【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
2016502852.tif 000007
【００３５】
【表６】
2016502852.tif 000008
【００３６】
【表７】
2016502852.tif 000009
【００３７】
引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【００３８】
本明細書の用法では「発明」または「本発明」という用語は、特許請求の範囲および本明細書に記載される、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いずれかの特定の実施形態または態様に限定されると理解すべきではない。
【００３９】
「ＳＯＵ２’」、「ＳＯＵ２遺伝子」、および「Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で同義的に使用される。「Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質」（Ｓｏｕ２ｐ）は、ＳＯＵ２遺伝子によってコードされる。
【００４０】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質（配列番号１０）は、（ＢＬＡＳＴアラインメントによると）カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質（配列番号３０）と約６６％のアミノ酸配列同一性を有する。したがってＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、特定の実施形態では、配列番号３０と、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。代案としてはＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、配列番号３０と、少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％のアミノ酸配列同一性を有してもよい。
【００４１】
本明細書の用法では、「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質の概説は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書で提供される（その中の表２を参照されたい）。
【００４２】
本明細書の用法では、「油」という用語は２５℃で液体の脂質物質を指し；油は疎水性で、有機溶媒に可溶性である。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主にトリアシルグリセロールからなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中の脂肪酸濃度の増大または減少は、油中の脂肪酸濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。「油」、「総脂質」、「総脂質含量」、「全脂肪酸」、および「全脂肪酸メチルエステル」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【００４３】
「トリアシルグリセロール」という用語は、（ＴＡＧまたはＴＡＧ（複数））は、本明細書の用法では、グリセロール分子とエステル化した３つの脂肪酸アシル残基から構成される、中性脂肪を指す。ＴＡＧは、長鎖多価不飽和および飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い不飽和および飽和脂肪酸を含有し得る。
【００４４】
「全脂肪酸」（ＴＦＡ）という用語は、本明細書の用法では、例えばバイオマスまたは油であってもよい、所与のサンプルの塩基エステル交換によって、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化し得る、全ての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって全脂肪酸は、中性脂肪（モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、ＴＡＧ）、および極性脂質（例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン）からの脂肪酸を含む。
【００４５】
細胞の「総脂質含量」という用語は、本明細書の用法では、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の百分率としてのＴＦＡの測定値を指し、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりのＴＦＡのミリグラムは、「ＴＦＡ％ＤＣＷ」として表し得る。例えば５０ＴＦＡ％ＤＣＷは、乾燥細胞重量の５０％が脂質または油であることを意味する。総脂質含量は、ＤＣＷの百分率としてのＦＡＭＥ（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）の測定値として近似し得る。
【００４６】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの重量％（％ＴＦＡ）として表される。本明細書中で特に断りのない限り、総脂質または油に対する特定脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質または油の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。例えば油の全脂肪酸中の５０重量％のＥＰＡは、５０ＥＰＡ％ＴＦＡとして表される。
【００４７】
細胞中の特定脂肪酸含量をその乾燥細胞重量の重量％（％ＤＣＷ）として表すことが、有用な場合もあり得る。例えば全ＥＰＡ生成の測定値（ＥＰＡ％ＤＣＷ）は、次式を使用して判定し得る：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００例えば乾燥細胞重量で３０重量％のＥＰＡ測定値は、３０ＥＰＡ％ＤＣＷによって表される。乾燥細胞重量でのＥＰＡなどの脂肪酸の含有量は、次式を使用して近似し得る：（ＥＰＡ％ＦＡＭＥ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。
【００４８】
「脂質プロフィール」脂、「質組成」、および「脂肪酸プロファイル」という用語は、本明細書で同義的に使用され、総脂質または油に含有される個々の脂肪酸の量を指し、量はＴＦＡの重量％として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００４９】
本明細書の用法では、「油性」という用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で貯蔵する傾向がある生物を記述する（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。  油性微生物は、その乾燥細胞重量の約２５％以上を油として含んでなり得て、または蓄積し、または産生し得る（すなわち≧２５  ＴＦＡ％ＤＣＷ）。
【００５０】
「油性酵母」という用語は、本発明における用法では、多量の油を産生し得る、酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる好ましくは油性酵母は、乾燥細胞重量の約２５％を超えて油として蓄積し得る。
【００５１】
「脂肪酸」という用語は、本明細書の用法では、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の簡易表記体系によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合数である。「不飽和脂肪酸」に対する「飽和脂肪酸」、「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］に対する「一不飽和脂肪酸」、および「ω−３脂肪酸」（ｎ−３）に対する「ω−６脂肪酸」（ｎ−６）の区別に関する追加的な詳細は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供される。
【００５２】
本明細書でＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」欄では、ω基準系を使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素から数えてω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。
【００５３】
【表８】
2016502852.tif 000010
【００５４】
本明細書の用法では、「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝経路または過程を指す。この経路は、文献に記載されている（例えば米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）。簡単に述べると、ＰＵＦＡ生合成経路は、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特殊な伸長および不飽和化酵素による、炭素原子付加を通じた炭素鎖の伸長と、二重結合付加を通じた分子不飽和化とを伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼ。図１は、特定のＰＵＦＡ生合成経路を示す。
【００５５】
特定の実施形態では、ＰＵＦＡ生合成経路は、「改変」されていてもよい。このような経路は、１つまたは複数の外来性または異種ＰＵＦＡ生合成経路酵素を含んでなる。このような酵素は、酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子の導入を通じて、細胞内で発現され得る。
【００５６】
本明細書において「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼなどの特定の酵素が、その各基質を生成物に変換し得る効率を指す。変換効率は、次式に従って判定される：（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００「生成物」は、直接生成物、およびそれに由来する全ての生成物を指す。より具体的には、各ＰＵＦＡ生合成経路酵素が１００％の効率で機能して、基材を生成物に変換することはめったにないので、宿主細胞内で生成する未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に、所望のω−３／ω−６脂肪酸からなる様々なＰＵＦＡ、ならびに様々な上流の中間ＰＵＦＡの混合物であろう。
【００５７】
「Ｃ１８からＣ２０への伸長変換効率」という用語は、本明細書で、それによってＣ１８／２０エロンガーゼが、Ｃ１８基質（すなわちＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡなど）をＣ２０生成物（すなわちＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡなど）に変換し得る効率を指す。これらのＣ１８／２０エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼまたはΔ６エロンガーゼのいずれかであり得る。
【００５８】
「Δ９伸長変換効率」および「Δ９エロンガーゼ変換効率」という用語は、本明細書で、それによってΔ９エロンガーゼが、Ｃ１８基質（例えばＬＡ、ＡＬＡ）をＣ２０生成物（例えばＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ）に変換し得る効率を指す。Δ９エロンガーゼ変換効率は、本明細書で「％変換」または「ｄ９ｅＣＥ（％）」と称される。
【００５９】
「膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ」および「ＭＢＯＡＴモチーフ」という用語は、本明細書で同義的に使用される。ＭＢＯＡＴモチーフは、ＬＰＣＡＴなどのＬＰＬＡＴ中に含有されて、これらのタンパク質の酵素活性において役割を果たす（Ｓｈｉｎｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３８３：３２０−３２５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，７３２，１５５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏｓ．２００８−０１４５８６７  ａｎｄ  ２０１０−０３１７８８２）。
【００６０】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。
【００６１】
本明細書の用法では、「単離された」という用語は、特定の実施形態における用法では、その天然原料から完全にまたは部分的に精製されている、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指す。場合によっては、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、緩衝系または試薬混合物の一部である。例えば単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞または生物内に異種様式で含まれ得る。
【００６２】
「遺伝子」という用語は、本明細書の用法では、タンパク質を発現するポリヌクレオチド配列を指し、コード領域のみを指してもよく、またはコード領域上流および／または下流の制御配列を含んでもよい（例えばコード領域の転写開始部位上流の５’非翻訳領域）。「天然」または「内在性」の遺伝子は、それ自身の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指し；この遺伝子は、生物のゲノム内のその自然な位置に位置する。特定のタンパク質「をコードする内在性ポリヌクレオチド」は、内在性遺伝子の一例である。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。本明細書において「外来性」または「異種」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物内に挿入された天然遺伝子、天然宿主中の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。本明細書で開示される特定の実施形態のポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。
【００６３】
「コード配列」は、本明細書の用法では、特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」は、本明細書の用法では、コーディング配列の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列である５’非翻訳領域と、３’非コード領域とを指し、それは結合するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与えてもよい。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、および遺伝子発現調節に関与するその他の要素が挙げられる。
【００６４】
本明細書の用法では、「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の５’側上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡ断片を含んでなってよい。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００６５】
本明細書の用法では、「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、および「ターミネーター」という用語は、コード配列３’下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。
【００６６】
「発現」という用語は、本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＲＮＡを生じる、遺伝子からの転写を指す。この用語はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
【００６７】
「下方制御」、「妨害」、および「阻害」という用語は、遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現を記述するのに使用される場合、本明細書で同義的に使用されて、ポリヌクレオチド配列転写が、低下または排除される事例を指す。これはポリヌクレオチド配列からのＲＮＡ転写物の低下または排除をもたらし、それはポリヌクレオチド配列から誘導される、タンパク質発現の低下または排除をもたらす。代案としては、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって生成された転写物からのタンパク質翻訳が、低下または排除される事例を指し得る。さらに代案としては、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質が、活性低下を有する事例を指し得る。上の細胞内プロセス（転写、翻訳、タンパク質活性）のいずれかの低下は、適切な対照細胞の転写、翻訳、またはタンパク質活性と比較して、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る。下方制御は、例えば、本明細書で開示されるような変異（例えばノックアウト）の結果であり得て、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ技術の使用を介し得る。
【００６８】
「対照細胞」および「適切な対照細胞」という用語は、本明細書で同義的に使用され、特定の改変（例えばポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドの下方制御）が施された細胞（すなわち「試験細胞」）との比較で言及されてもよい。対照細胞は、試験細胞の特定の改変を有しない、またはそれを発現しない、あらゆる細胞であってもよい。したがって対照細胞は、非形質転野性型細胞であってもよく、または遺伝子的に形質転換されているが、遺伝的形質転換を発現しない細胞であってもよい。例えば対照細胞は、試験細胞の直接の親であってもよく、この直接の親細胞は、試験細胞にある特定の改変を有しない。代案としては、対照細胞は、１つまたは複数世代を隔てた試験細胞の親であってもよい。なおも代案としては、対照細胞は、試験細胞の同胞細胞であってもよく、この同胞細胞は、試験細胞にある特定の改変を含まない。対照細胞としての役割を果たし得る同胞細胞は、その中にタンパク質過剰発現のためのプラスミドが挿入されている細胞であり得るが、同胞細胞中ではプラスミドが発現しないのに対し、試験細胞中では発現する。細胞が対照細胞になり得るかどうかを判定することは、十分に当該技術分野の技術範囲内である。
【００６９】
本明細書の用法では、「増大」という用語は、例えば元の量よりわずかにより大きな量、または例えば元の量を大きく上回る量、およびその間の全ての量などのより大きな量を有することを意味する。代案としては、「増大」は、量または活性増大が比較される量または活性を、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％上回る量または活性を指してもよい。「増大」、「上回る」、および「改善」という用語は、本明細書で同義的に使用される。「増大」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現の特徴を描写するのに使用し得て、例えば「発現増大」は、「過剰発現」もまた意味し得る。
【００７０】
「作動可能に連結する」という用語は、本明細書の用法では、片方の機能が他方によって影響を受けるような、２つ以上の核酸配列の結合を指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはコード配列と作動的に連結する。すなわちコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【００７１】
「組み換え」という用語は、本明細書の用法では、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ分離している２つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組換え」、「遺伝子組換え」、「形質転換」、「遺伝子操作」または「外来性遺伝子発現のための改変」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【００７２】
本明細書の用法では、「形質転換」という用語は、核酸分子の宿主生物への転移を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。
【００７３】
「微生物細胞」および「微生物」という用語は本明細書で同義的に使用され、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、それらの遺伝子を発現できる微生物を指す。「組換え微生物細胞」とは、組換え遺伝子操作されている微生物細胞を指す。
【００７４】
「発現カセット」という用語は、本明細書の用法では、選択された遺伝子産物の発現に必要な、選択された遺伝子のプロモーターとコード配列、ならびにコード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）別の制御配列を含んでなる、ポリヌクレオチド配列を指す。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター；２）コード配列（すなわち読み取り枠［ＯＲＦ］）；および３）通常はポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。本明細書の用法では、「読み取り枠」は、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。読み取り枠は、翻訳開始開始コドン（ＡＴＧ）で開始して、翻訳終止コドン（停止コドン）のすぐ５’側のコドンで終結する。
【００７５】
核酸またはポリペプチド配列に関して本明細書で使用される、「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大対応関係で整列させると同一である、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって「配列同一性の百分率」または「％同一性」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列との比較で、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。
【００７６】
例えば国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトにおいてオンラインで利用できる、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、本明細書で開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間のパーセント同一性を測定してもよい。代案としては、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を使用して、遂行されてもよい。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を使用する多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当してもよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列のパーセント同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってもよい。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってもよい。
【００７７】
開示される発明の特定の実施形態の特徴として、様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、本明細書で開示される。本明細書で開示される配列と、少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、または９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変種を、特定の実施形態で使用し得る。代案としては、変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、特定の実施形態では、本明細書で開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し得る。変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示された配列と同一機能を有し、または開示された配列の機能の少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有する。
【００７８】
背景技術セクション（上記）で考察されるように、以前の研究は、ＥＰＡ生成量および／または産油量増大のための遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発における進歩に伴って、産油量と油の全脂肪酸中のＥＰＡの存在量との間に、概して逆相関が生じることを示した。乾燥細胞重量基準でより大量の油を産生するように改変されている株は、油中の脂肪酸百分率として、概してより少ない量のＥＰＡを有する。
【００７９】
本明細書で開示される実施例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中の特定の改変が、油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量を低下させない様式で、全含油量を維持しまたは増大させることを示す。興味深いことに、このような改変Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、各株の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも約２８パーセントのＥＰＡ（すなわち２８ＥＰＡ％ＤＣＷ）を含んでなる油を産生する能力がある。
【００８０】
したがって開示される発明の一態様は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも約２８パーセントのＥＰＡを含んでなる油を産生する、組換え微生物細胞に関する。組換え微生物細胞は、酵母、カビ、真菌、卵菌、細菌、藻類、ストラメノパイル、または原生生物（例えばユーグレナ属）細胞であり得る。特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、油性酵母細胞などの油性微生物細胞である。油性酵母の例としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）の種が挙げられるより具体的な油性酵母の例としては、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）およびＲ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）が挙げられる。特定の実施形態における真菌細胞の例としては、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（例えばフザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、モルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）（例えばモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ））およびケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）（例えばムコール・ルーキシ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）およびムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））の種が挙げられる。開示される発明の別の実施形態では、微生物細胞は、ハエカビ属（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）であり得る。
【００８１】
開示される発明の特定の実施形態では、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞が、油性酵母細胞であり得る。乾燥細胞重量の百分率として、少なくとも２８％のＥＰＡがある油を産生するように改変し得るヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の例としては、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる、以下の野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）単離株が挙げられる：株の名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３。
【００８２】
特定の実施形態の組換え微生物細胞は、増大した量のＰＵＦＡなどの総脂質および／または脂肪酸を産生するように、遺伝的に改変されたものであってもよい。例えば脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼなどの特定の経路酵素のためのコード配列を挿入することで、脂肪酸またはＰＵＦＡ生合成経路、またはその一部を生物に導入してもよい。本明細書で使用し得るＰＵＦＡ生合成経路の例は、図１に示される。以下の酵素の１つまたは組み合わせを油性酵母細胞に遺伝子的に導入し、その中にＰＵＦＡ生合成経路を提供してもよい：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ。これらの酵素の１つまたは複数が、異種起源に由来してもよい。ＰＵＦＡ生合成経路の例は、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼの双方（例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−００５５９７３号明細書を参照されたい）、またはΔ６デサチュラーゼおよびΔ６エロンガーゼの双方を含有してもよい。代案としては、脂肪酸生合成を調節するデサチュラーゼまたはエロンガーゼをコードするもの以外の遺伝子を導入し、または欠失させることで、組換え微生物細胞を改変し、総脂質および／またはＰＵＦＡレベルを増大させてもよい。
【００８３】
開示される発明の組換え微生物細胞によって発現されるＰＵＦＡ生合成経路によって生じるＰＵＦＡとしては、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡが挙げられ；このようなＰＵＦＡの例は、リノール酸（ＬＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω−６ドコサペンタエン酸（ＤＰＡｎ−６）、ω−３ドコサペンタエン酸（ＤＰＡｎ−３）、エイコサジエン酸（ＥＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）、ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。組換え微生物細胞中のこれらのＰＵＦＡの１つまたは複数は、組換え微生物細胞によって内因的に産生される基質、または外部から組換え微生物細胞に供給される基質から生成されてもよい。
【００８４】
開示される発明の組換え微生物細胞は、リノール酸に加えてＰＵＦＡを生じる、ＰＵＦＡ生合成経路を含有するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株であってもよい。例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞は、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、および／またはエイコサジエン酸を生成する酵素を含有してもよく、これらのＰＵＦＡのいずれも、野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内では生成されない。常態でヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で発現されて、リノール酸を生じる脂肪酸生合成経路酵素以外に、エイコサジエン酸、γ−リノレン酸、および／またはα−リノレン酸の生成のために、Δ９エロンガーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および／またはΔ１５デサチュラーゼが、それぞれ外因的に発現されてもよい。これらの３種のＰＵＦＡをさらに修飾して（不飽和化および／または伸長）、追加的なＰＵＦＡ経路酵素を発現することで、下流ＰＵＦＡを生成し得る。
【００８５】
開示される発明の特定の実施形態で使用される組換え微生物細胞は、その野性型形態と比較して、増大した量の脂質を産生するように、遺伝子的に改変されたものであってもよい。このような遺伝子改変細胞の例は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２号明細書、および米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書で開示される、特定のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株である。
【００８６】
開示される発明の特定の実施形態中の組換え微生物細胞は、微生物細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも約２８％ＥＰＡを含んでなる油を含んでなり、または産生する。代案としては、組換え微生物細胞は、微生物細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも約３０％のＥＰＡを含んでなる油を含んでなり、または産生する。さらに、開示される発明別の実施形態では、組換え微生物細胞は、微生物細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも約２８％、２８．５％、２９％、２９．５％、３０％、３０．５％、３１％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．５％、３４％、３４．５％、または３５％のＥＰＡを含んでなる油を産生する。
【００８７】
組換え微生物細胞の乾燥細胞重量の重量％としての測定（ＥＰＡ％ＤＣＷ）によるＥＰＡレベルの増大は、特定の実施形態では対照細胞のＥＰＡ％ＤＣＷを少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、または１８％上回ってもよい。特定の実施形態では、このＥＰＡ％ＤＣＷの増大は、対照細胞の含油量と比較した、含油量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の維持または増大と連動する。特定の実施形態では、含油量の維持は、対照細胞の含油量と比較した、組換え微生物細胞の含油量の約−３％、−２％、−１％、または０％未満の変化を指す。特定の実施形態では、含油量の増大は、対照細胞の含油量を約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％上回る増大を指す。
【００８８】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、微生物細胞の乾燥細胞重量の少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、または６５％の含油量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）を有する。
【００８９】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、または６５重量％である、油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）を有する。
【００９０】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）を欠いている油を産生する。欠いているとは、ＧＬＡが油中の検出閾値未満であることを意味し、または代案としては、それは油中のＧＬＡ量が油のＴＦＡの０．１重量％未満であることを意味する。
【００９１】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、油のＴＦＡの約２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、または１．０重量％未満である、油の全脂肪酸中のステアリン酸（Ｃ１８：０）含有量（１８：０％ＴＦＡ）を有する。
【００９２】
開示される発明の特定の実施形態では、培養物中で培養された組換え微生物細胞の乾燥細胞重量は、１リットルの培養物あたり少なくとも約５．５グラムである。代案としては、培養物中で培養された組換え微生物細胞の乾燥細胞重量は、１リットルの培養物あたり少なくとも５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、または７．２グラムである。特定の実施形態では微生物細胞の乾燥細胞重量は、窒素制限培養中で、約１２０時間にわたり微生物細胞を培養することで測定し得る。このような培養物は、唯一の炭素源として、または優勢な炭素源として、グルコースを含んでなってもよい（例えばその他の炭素源は培養物の５重量％未満である）。組換え微生物細胞の乾燥細胞重量を測定するための培養の出発種菌は、その中で細胞を約０．３のＯＤ６００に増殖させた培養物からのものであり得る。次に、特定の容積（例えば６ｍＬ）のこのＯＤ６００が約０．３の培養物の全ての細胞を使用して、一定容積（例えば２５ｍＬ）の窒素制限培地に接種する。この培養物を次に約１２０時間にわたり培養して、その後、培養物の乾燥細胞重量を測定する。
【００９３】
特定の実施形態では、組換え微生物細胞の乾燥細胞重量の増大は、対照細胞の乾燥細胞重量を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、または３８％上回ってもよい。乾燥細胞重量は、例えばこの比較を行う際に、上記のように測定し得る。
【００９４】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、膜結合Ｏ−アシル基転移酵素（ＭＢＯＡＴ）モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなり、ＬＰＣＡＴはＬＰＣＡＴ活性を有する。ＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。したがって特定の実施形態は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２８パーセントのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含んでなる油を産生する、組換え微生物細胞に関し、細胞は、ＭＢＯＡＴモチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなるＬＰＣＡＴをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなり、ＬＰＣＡＴはＬＰＣＡＴ活性を有する。
【００９５】
「アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素」（ＬＰＣＡＴ、ＥＣ２．３．１．２３）という用語は、本明細書の用法では、以下の酵素反応を触媒する酵素を指す：
アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン＝ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン。ＬＰＣＡＴ活性は、２つの構造的に異なったタンパク質ファミリー、すなわちＬＰＡＡＴタンパク質ファミリー（Ｈｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：２８３０−２８３５；国際公開第  ２００４／０７６６１７号パンフレット）と、Ａｌｅ１タンパク質ファミリー（Ｔａｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｅｋｈｏｆ  ｅｔ
ａｌ．）で記載される。
【００９６】
（参照によって本明細書に援用する）米国特許第６１／６６１，６２３号明細書で開示されるような変異ＬＰＣＡＴ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書で開示される特定の実施形態で使用してもよい。変異ＬＰＣＡＴは、天然に存在しない。
【００９７】
ＭＢＯＡＴモチーフは、ＬＰＣＡＴなどのＬＰＬＡＴ中に含有されて、これらのタンパク質の酵素活性において役割を果たす。開示される発明の特定の実施形態において変異させ得るＭＢＯＡＴモチーフの例は、参照によって本明細書に援用する、Ｓｈｉｎｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３８３：３２０−３２５）、米国特許第７，７３２，１５５号明細書、および米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７号明細書、および米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２号明細書で開示される。特定の実施形態では、ＬＰＣＡＴ酵素のＭＢＯＡＴモチーフのどちらか１つ、または２つが変異される。変異ＬＰＣＡＴはＬＰＣＡＴ活性を有するので、ＭＢＯＡＴモチーフ中の変異は、酵素活性を有意に低下させてはならない。
【００９８】
開示される発明の特定の実施形態では、変異ＬＰＣＡＴは、変異されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴ（ＹｌＬＰＣＡＴ、配列番号４０）である。「モチーフＩ」および「モチーフＩＩ」という用語は、本明細書では、特定の実施形態で変異させ得る、ＹｌＬＰＣＡＴの２つの異なるＭＢＯＡＴモチーフを指すために使用される。モチーフＩが、配列番号４０の１３２〜１４８位に位置するアミノ酸配列ＭＶＬＣＭＫＬＳＳＦＧＷＮＶＹＤＧ（配列番号８２）によって表わされる一方で、モチーフＩＩは、配列番号４０の３７６〜３９０位に位置するアミノ酸配列ＳＡＦＷＨＧＴＲＰＧＹＹＬＴＦ（配列番号８３）によって表わされ；これらの配列はどちらも野性型ＹｌＬＰＣＡＴに含有される。
【００９９】
特定の実施形態では、ＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号４０）のモチーフＩおよび／またはモチーフＩＩを変異させ得る。代案としては、モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩを変異させて、配列番号４０と少なくとも９０％、または９５％同一でＬＰＣＡＴ活性を有するアミノ酸配列内に含め得る。変異は、例えば、モチーフＩ（配列番号４０の残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８）および／またはモチーフＩＩ（配列番号４０の残基３７６、３７７、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０）中の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入であってもよい。置換変異は、例えば本明細書に記載されるもののいずれかであってもよい。代案の実施形態では、モチーフＩＩ中の変異は、配列番号４０の残基３７６〜３７８および３８２〜３９０であり得る。好ましくは、特定の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの活性は、野性型ＹｌＬＰＣＡＴ（例えば配列番号４０）の活性以上である。このような活性は、変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え微生物細胞中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび／またはｄ９ｅＣＥ（％）と、対照細胞中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび／またはｄ９ｅＣＥ（％）とを比較することで判定し得る。
【０１００】
下の例では、モチーフＩ中のアミノ酸残基１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７または１４８を変異させることで、同等のまたは増大した活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ変異株が作成され、それによって、配列番号４０の１３２位のメチオニン残基のみが、変更に耐え得ないこともあることが実証される。同様、モチーフＩＩ内のアミノ酸残基３７８、３８２、３８３、３８５、３８８、３８９または３９０を変異させることで、同等のまたは増大した活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ変異体が作成され、それによって、配列番号８３のセリン、アラニン、プロリン、および双方のチロシンが、変更に耐え得ないこともあることが実証される。ＹｌＬＰＣＡＴのＨ３８０に対応するその他のＬＰＣＡＴのヒスチジンは、活性部位残基である可能性が高いと報告されているので（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：１１７４−１１８４）、配列番号４０のアミノ酸残基３７９〜３８１（すなわちＷＨＧ）は、変異対象にしなかった。
【０１０１】
したがって開示される発明の特定の実施形態では、変異ＬＰＣＡＴは、配列番号８４に記載されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号８４は配列番号４０（ＹｌＬＰＣＡＴ）と、少なくとも１つのアミノ酸変異によって異なり、
（ｉ）アミノ酸変異は、残基１３３、残基１３４、残基１３５、残基１３６、残基１３７、残基１３８、残基１３９、残基１４０、残基１４１、残基１４２、残基１４３、残基１４４、残基１４５、残基１４６、残基１４７および残基１４８からなる群から選択される、残基におけるアミノ酸置換であり；
（ｉｉ）アミノ酸変異は、残基３７８、残基３８２、残基３８３、残基３８５、残基３８８、残基３８９、および残基３９０からなる群から選択される、残基におけるアミノ酸置換中にであり；または
（ｉｉｉ）少なくとも２つのアミノ酸変異があり、第１のアミノ酸変異は（ｉ）に記載される群から選択されるアミノ酸置換であり、第２のアミノ酸変異は（ｉｉ）に記載される群から選択されるアミノ酸置換である。
【０１０２】
変異ＹｌＬＰＣＡＴは、特定の実施形態では、配列番号７３に記載されるアミノ酸配列を含んでなり得て、配列番号７３は、Ｖ１３３Ｃ、Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｃ、Ｌ１３４Ｇ、Ｃ１３５Ｆ、Ｃ１３５Ｄ、Ｃ１３５Ｉ、Ｍ１３６Ｔ、Ｍ１３６Ｎ、Ｍ１３６Ｇ、Ｍ１３６Ｐ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｎ、Ｋ１３７Ｇ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｙ、Ｌ１３８Ｇ、Ｌ１３８Ｉ、Ｌ１３８Ｎ、Ｌ１３８Ａ、Ｌ１３８Ｈ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１３９Ｇ、Ｓ１３９Ｎ、Ｓ１３９Ｌ、Ｓ１３９Ｗ、Ｓ１４０Ｙ、Ｓ１４０Ｉ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｐ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ｖ、Ｆ１４１Ａ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｇ１４２Ｉ、Ｇ１４２Ｖ、Ｇ１４２Ｈ、Ｗ１４３Ｈ、Ｗ１４３Ｌ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｋ、Ｎ１４４Ｆ、Ｎ１４４Ｔ、Ｎ１４４Ｖ、Ｖ１４５Ａ、Ｖ１４５Ｇ、Ｖ１４５Ｅ、Ｖ１４５Ｍ、Ｖ１４５Ｆ、Ｖ１４５Ｗ、Ｙ１４６Ｇ、Ｙ１４６Ｌ、Ｙ１４６Ｍ、Ｄ１４７Ｅ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｈ、Ｇ１４８Ｖ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１４８Ｎ、Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｙ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｒ３８３Ａ、Ｒ３８３Ｍ、Ｌ３８８Ｈ、Ｌ３８８Ｔ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９Ｓ、Ｆ３９０Ｃ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０Ｎ、Ｆ３９０Ｔ、およびＦ３９０Ｓからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸変異によって配列番号４０と異なる。
【０１０３】
変異ＹｌＬＰＣＡＴは、特定の実施形態では、変異ＭＢＯＡＴモチーフを含んでなり得る。変異ＭＢＯＡＴモチーフの例は、モチーフＩ（配列番号８２）およびＩＩ（配列番号８３）の変異種である。特定の実施形態では、ＹｌＬＰＣＡＴは、Ｖ２Ｃ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｇ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｇ、Ｋ６Ｎ、Ｋ６Ｙ、Ｌ７Ａ、Ｌ７Ｎ、Ｌ７Ｇ、Ｌ７Ｈ、Ｌ７Ｉ、Ｌ７Ｍ、Ｄ１６Ｑ、Ｄ１６Ｎ、Ｄ１６Ｈ、Ｇ１７Ａ、Ｇ１７Ｖ、およびＧ１７Ｎのアミノ酸置換の１つまたは複数を有するモチーフＩを含んでなり；および／またはＦ１５Ｎ、Ｆ１５Ｃ、Ｆ１５Ｇ、およびＦ１５Ｔのアミノ酸置換の１つまたは複数を有するモチーフＩＩを含んでなる。
【０１０４】
開示される発明の特定の実施形態では、変異ＹｌＬＰＣＡＴは、（ｉ）メチオニンを異なるアミノ酸に変化させる１３６位のアミノ酸の変異、および（ｉｉ）スレオニンを異なるアミノ酸に変化させる３８９位のアミノ酸の変異を含んでなる。このような変異ＹｌＬＰＣＡＴの一例は、１３６位のメチオニンがセリンに変更され、３８９位のスレオニンがアラニンに変更されるものである（配列番号２６）。代案としては、変異ＹｌＬＰＣＡＴは、モチーフＩおよびＩＩ双方のその他の変異の組み合わせを含有する、配列番号７５〜８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなってもよい。代案としては、変異ＹｌＬＰＣＡＴは、特定の実施形態では、配列番号２６、７５〜８１のいずれか１つと、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなって（または本明細書で開示されるあらゆるその他の変異ＬＰＣＡＴ）、ＬＰＣＡＴ機能（上記）を有してもよい。さらに代案としては、変異ＹｌＬＰＣＡＴは、（ｉ）配列番号２６、７５〜８１のいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり；（ｉｉ）（ｉ）の変異ＹｌＬＰＣＡＴについて表１で列挙される双方の変異を含有し；（ｉｉｉ）ＬＰＣＡＴ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。例えば変異ＹｌＬＰＣＡＴは、配列番号２６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、１３６位にセリンを有し、３８９位にアラニンを有する、アミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１０５】
さらにモチーフＩおよびＩＩの双方の変異について、変異ＹｌＬＰＣＡＴは、特定の実施形態では、配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含んでなり得て、配列番号７４は、表３に記載されるペアの少なくとも１つの変異によって配列番号４０と異なる（例えばモチーフＩ中のＬ１３４Ａ変異は、モチーフＩＩ中のＴ３８２Ｉ変異、Ｌ３８８Ｇ変異、Ｆ３９０Ｇ変異またはＦ３９０Ｔ変異のいずれかと組み合わされてもよく、それによってＬ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｌ１３４Ａ＿Ｆ３９０Ｇ、およびＬ１３４Ａ＿Ｆ３９０Ｔ変異体がそれぞれ作成される）。
【０１０６】
【表９】
2016502852.tif 000011
【０１０７】
本明細書では、特定のＬＰＣＡＴアミノ酸変異の組み合わせが開示されるが、当業者は、本明細書で開示されるモチーフＩおよびモチーフＩＩ変異のその他の組み合わせも同様に、組み合わされてもよいことを容易に認識するであろう。したがって変異ＬＰＣＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作成する上で、開示されたモチーフＩＩ変異の１つまたは複数と組み合わせて、開示されたモチーフＩ変異の１つまたは複数を使用してもよい。
【０１０８】
開示される発明の特定の実施形態では、ＭＢＯＡＴモチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異がある活性ＬＰＣＡＴ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え微生物細胞は、
（ａ）総脂肪酸の重量％としての測定で、対照細胞によって産生される量と少なくとも同一またはより大きな量の少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸および／または
（ｂ）対照細胞の変換効率と少なくとも同一またはより大きなＣ１８からＣ２０への伸長変換効率（例えばΔ９エロンガーゼ変換効率またはΔ６エロンガーゼ変換効率）もまた含んでなる。
【０１０９】
（モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ中に変異を含有する）変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え細胞の総脂肪酸の重量％としての測定で、少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の量の増大は、対照細胞の重量％としての測定で、少なくとも１つの長鎖ＰＵＦＡ総脂肪酸量を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％上回ってもよい。
【０１１０】
（モチーフＩおよび／またはモチーフＩＩ中に変異を含有する）変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率、および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率の増大は、対照細胞のＣ１８からＣ２０への伸長変換効率、Δ９エロンガーゼ変換効率、および／またはΔ６エロンガーゼ変換効率をそれぞれ、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％上回ってもよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、対照細胞は、組換え細胞に対応するが、変異ＭＢＯＡＴモチーフを含んでなる活性ＬＰＣＡＴ酵素をコードするポリヌクレオチドを含まず、または過剰発現しない、野性型または組換え細胞であってもよい。例えば対照細胞は、変異ＬＰＣＡＴをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含まないために、変異ＬＰＣＡＴを過剰発現しない。また例えば対照細胞は、変異ＬＰＣＡＴをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるが、それを発現しないために、変異ＬＰＣＡＴを過剰発現しない。対照細胞は、変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現するように改変される前に存在した組換え細胞（すなわち親細胞）であってもよく、または変異ＬＰＣＡＴをコードする組換えポリヌクレオチドを含有するように改変されているが、変異ＬＰＣＡＴポリペプチドを過剰発現しない組換え細胞（例えば変異ＬＰＣＡＴを過剰発現する組換え細胞と並行して作成された細胞）であってもよい。
【０１１２】
開示される発明の特定の実施形態の組換え微生物細胞は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御を含んでなる。別の実施形態では、組換え微生物細胞は、（ｉ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御、および（ｉｉ）ＰＵＦＡ生合成経路を含んでなる。特定の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御が、組換え微生物細胞の脂質含量を増大させ、および／または細胞によって生産される糖アルコールの総量を低下させる。
【０１１３】
「Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質」は、ＳＯＵ２遺伝子によってコードされる。「ＳＯＵ２’」、「ＳＯＵ２遺伝子」、および「Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【０１１４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質（Ｓｏｕ２ｐ）（配列番号１０）は、（ＢＬＡＳＴアラインメントによると）カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質（配列番号３０）と約６６％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、Ｊａｎｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：５１５０−５１５５）によって、Ｓｏｕ１ソルビトール利用タンパク質（Ｓｏｕ１ｐ）に類似しているが、ソルボース利用には必要ないと記載される。Ｓｏｕ１ソルビトール利用タンパク質は、Ｊａｎｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｙｅａｓｔ  ２２：９５７−９６９）によって、Ｌ−ソルボース利用に必要なソルボース還元酵素として記載される。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｓｏｕ１およびＳｏｕ２タンパク質のアミノ酸配列は、互いに約７２％の同一性を有する。この類似性の程度を考慮して、Ｓｏｕ２タンパク質「は、おそらく補因子としてＮＡＤＰ（Ｈ）を利用して、基質特異性がＳｏｕ１ｐと重複する酸化還元酵素であることが、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．によって提案された。
【０１１５】
特定の実施形態で下方制御され得る、微生物細胞Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質配列の例としては、以下のＧｅｎＢａｎｋ受入番号で開示される配列が挙げられる：Ｐ８７２１８（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ＥＡＺ６３２６２（シェフェールミセス・スチピチス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ））、ＣＡＸ４２４５３（カンジダ・ズブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ））、ＥＨＫ９７９３４（グラレア・ロゾイエンシス（Ｇｌａｒｅａ  ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ））、ＺＰ＿０８４９９２６７（エンテロバクター・ホルメシェイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、ＣＣＧ２１８５２（カンジダ・オルトプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ））、ＹＰ＿８８７９０７（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ＥＪＴ７４９００（ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ））、ＥＧＺ７４８７８（ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ））、ＥＦＹ９６１１０（メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ））、ＥＧＸ８８９６０（コルジセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ））、ＥＦＹ８５０２０（メタリジウム・アクリズム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｃｒｉｄｕｍ））、ＥＧＹ１６１７９（ベルチシリウム・ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ））、ＥＥＨ４２６１５（パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ＥＨＡ５１５４６（マグナポルト・オリザ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ））、ＥＥＰ７８９３０（ウンシノカルプス・レエシ（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ  ｒｅｅｓｉｉ））、ＸＰ＿９６１１９２（ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、ＸＰ＿００１５２３１８１（ロデロミセス・エロンギスポルス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ））、ＣＡＫ３９３７１（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、ＸＰ＿００２５５６９８４（ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ＣＡＧ８１２０２（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ＣＡＧ８４８４４（デバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ））、ＣＣＥ４３８９１（カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）およびＺＰ＿０２９１７９７９（ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）。
【０１１６】
開示される発明の特定の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、ポリヌクレオチド配列の変異に起因する。この変異は、特定の実施形態では、置換、欠失または挿入である。欠失は、特定の実施形態では、（ｉ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする読み取り枠から１つまたは複数のヌクレオチド、および／または（ｉｉ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする読み取り枠の５’末端の５００塩基対内に位置する、非タンパク質コード配列の１つまたは複数のヌクレオチドを除去する。
【０１１７】
ＳＯＵ２読み取り枠中の欠失の例は、１つまたは２つのヌクレオチドを除去して、それによってフレームシフト変異をもたらすものであり；このような欠失の下流でコードされるアミノ酸配列は、内在性アミノ酸配列と異なる。当業者は、フレームシフト変異を作り出すために、その他の欠失を作成し得ることを理解するであろう（例えば３で整除できない数の塩基対を除去するあらゆる欠失）。その他の欠失の例としては、ＳＯＵ２読み取り枠の全体またはその一部を除去するものが挙げられる（例えばＳＯＵ２の「ノックアウト」）。フレームシフトの導入のために、ＳＯＵ２読み取り枠の一部が欠失し、または除去されている場合、欠失アミノ酸が、適切なＳｏｕ２タンパク質機能および／または局在化に必要であれば、下方制御が起きてもよい。代案としては、ＳＯＵ２読み取り枠中の欠失が、ＳＯＵ２の適切な転写および／または翻訳に影響を及ぼしてもよい。特定の実施形態では、ＳＯＵ２読み取り枠中の欠失は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００塩基対にある。欠失は、第１コドンまたはあらゆる下流コドンから開始してもよい（例えば２５０塩基対の欠失は、第１０コドンから開始し得る）。
【０１１８】
開示される発明の特定の実施形態では、欠失は、ＳＯＵ２の５’および／または３’調節非翻訳配列の一部を除去する。特定の欠失は、これらの制御配列の双方から配列を除去してもよく；このような欠失は、ほとんどの場合、ＳＯＵ２読み取り枠全体を除去する。その他の欠失は、１つのＳＯＵ２調節領域および読み取り枠（例えば特定の５’制御配列および読み取り枠の５’末端の欠失）に影響を及ぼしてもよい。５’制御配列に影響を及ぼす欠失は、適切なプロモーター活性を妨害することでＳＯＵ２を下方制御し、それによってＳＯＵ２転写を低下させまたは排除してもよい。３’制御配列に影響を及ぼす欠失は、適切な転写終結および／または転写物安定性を妨害することで、ＳＯＵ２を下方制御してもよい。
【０１１９】
欠失は、特定の実施形態では、ＳＯＵ２読み取り枠の５’末端の５００塩基対内に位置する、非タンパク質コード配列の１つまたは複数のヌクレオチドを除去する。このような欠失は、ＳＯＵ２転写配列の５’非翻訳領域および／またはＳＯＵ２プロモーターからの配列を除去し、転写および／または翻訳を低下させることで、ＳＯＵ２を下方制御してもよい。特定の実施形態では、欠失は、ＳＯＵ２読み取り枠上流の非タンパク質コード配列の−１０〜−１、−２０〜−１、−３０〜−１、−４０〜−１、−５０〜−１、−６０〜−１、−７０〜−１、−８０〜−１、−９０〜−１、−１００〜−１、−１５０〜−１、−２００〜−１、−２５０〜−１、−３００〜−１、−３５０〜−１、−４００〜１、−４５０〜−１、または−５００〜−１塩基対を除去し、−１位はＳＯＵ２開始コドン（ＡＴＧ）の５’に隣接するヌクレオチドである。別の実施形態では、欠失は、これらの前述の領域のいずれか１つから、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０個の連続塩基対を除去する（例えば−５００〜−１領域内で３００個の連続塩基対が欠失している）。
【０１２０】
別の実施形態では、欠失は、ＴＡＴＡボックス共通配列またはＴＡＴＡ様配列などの、ＳＯＵ２プロモーター中の１つまたは複数の調節因子を除去する（参照によって援用する、Ｂａｓｅｈｏａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｅｌｌ  １１６：６９９−７０９）。この種のプロモーター共通配列は、通常はＳＯＵ２読み取り枠の上流の非タンパク質コード配列の１００塩基対内に位置する。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞のＳＯＵ２遺伝子プロモーターにこのような欠失を作成する場合、例えばＳＯＵ２開始コドンに対して７９〜７２領域の塩基対の１つまたは複数を欠失させることで、ＴＡＴＡボックスコンセンサスを除去し得る（図５）。
【０１２１】
組換え微生物細胞がヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である実施形態では、下方制御される内在性ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードしてもよい。代案の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号１０を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる。別の実施形態では、下方制御される内在性ポリヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９５％と同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする。ポリヌクレオチド配列は、代案としては、配列番号９と少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号９を含んでなるポリヌクレオチド配列を含んでなってもよい。
【０１２２】
下の実施例では、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は遺伝子改変されて、内在性ＳＯＵ２読み取り枠の最初の２８７塩基対、ならびにＳＯＵ２開始コドンのすぐ上流の非タンパク質コード配列の２３５塩基対が除去される欠失を有した（すなわち位置−２３５〜−１が欠失していた）。配列番号８（図５）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡ配列の一例である。この配列は、ＳＯＵ２開始コドン上流の非タンパク質コード配列の１０００塩基対、ＳＯＵ２読み取り枠の７７１塩基対（配列番号９に対応する）、およびＳＯＵ２停止コドン下流の非タンパク質コード配列の３００塩基対を含有する。
【０１２３】
したがって、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でＳＯＵ２を下方制御するのに使用し得る、本明細書で開示されるあらゆる欠失は、配列番号８または９、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド配列部位に関して特徴付けられてもよい（異なるヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株に存在し得る、天然配列の変動性を考慮する）。このような欠失は、同様に、配列番号１０、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列中のアミノ酸位置に関して特徴付けられてもよい。例えば欠失は、少なくともヌクレオチド配列部位１〜７６８（ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２読み取り枠全体が除去される）、または配列番号９の１〜２８７（すなわちヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２読み取り枠の塩基対１〜２８７）を除去し得て、または代案としては欠失は、少なくともヌクレオチド配列部位１００１〜１７６８（ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２読み取り枠が全体除去される）または配列番号８の１００１〜１２８７（すなわちヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２読み取り枠の塩基対１〜２８７）を除去し得る。別の実施例として、欠失は、配列番号８の少なくともヌクレオチド配列部位５０１〜１０００（すなわちヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２開始コドンに関して５００〜１）、または７６６〜１０００（すなわちヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２開始コドンに関して−２３５〜−１）を除去し得る。さらに別の実施例としては、欠失は、配列番号８の少なくともヌクレオチド配列部位７６６〜１２８７（すなわち−２３５〜＋２８７、図５に記述される欠失に対応する）を除去し得る。
【０１２４】
特定の実施形態における挿入は、（ｉ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする読み取り枠内、または（ｉｉ）非タンパク質コード配列の５’末端の５００塩基対内に位置する読み取り枠内で起きる。本明細書の用法では、「挿入」および「組み込み」という用語は、遺伝子配列中に挿入された１つまたは複数の連続ヌクレオチドを指すために、本明細書で同義的に使用される。挿入が読み取り枠内にある場合、それは転写および／または翻訳中に妨害される。これは、アミノ酸配列の改変、鎖中の追加的アミノ酸、または早期終結をもたらしてもよい。このような変異読み取り枠から生成される、新たに合成されたタンパク質は、異常に短くても異常に長くてもよく、および／または誤ったアミノ酸を含有してもよく、機能性でない見込みが高い。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＳＯＵ２読み取り枠内の挿入は、１つまたは２つのヌクレオチドを付加し、それによってフレームシフト変異をもたらし；このような挿入の下流でコードされるアミノ酸配列は、内在性アミノ酸配列と異なるであろう。当業者は、フレームシフト変異を作り出すために、その他の挿入を作成し得ることを理解するであろう（例えば３で整除できない数の塩基対を除去するあらゆる挿入）。ＳＯＵ２の下方制御は、挿入によって影響を受けるアミノ酸が、適切なＳｏｕ２タンパク質機能および／または局在化に必要な場合に起きてもよい。代案としては、ＳＯＵ２読み取り枠中の挿入が、ＳＯＵ２の適切な転写および／または翻訳に影響を及ぼしてもよい。特定の実施形態では、ＳＯＵ２読み取り枠への挿入は、ＳＯＵ２遺伝子の下方制御をもたらすあらゆる長さであり得る。代案としては、挿入の長さは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００塩基対であり得る。挿入は、第１のコドンまたはあらゆる下流コドンのすぐ後ろで起きもよい（例えば第１０のコドン直後の２５０塩基対の挿入）。
【０１２６】
挿入は、特定の実施形態では、ＳＯＵ２読み取り枠の５’末端の５００塩基対内に位置する、非タンパク質コード配列に、１つまたは複数のヌクレオチドを付加する。このような挿入は、ＳＯＵ２転写配列の５’非翻訳領域および／またはＳＯＵ２プロモーターに影響を及ぼし、転写および／または翻訳を低下させることで、ＳＯＵ２を下方制御してもよい。特定の実施形態では、挿入は、ＳＯＵ２読み取り枠上流の非タンパク質−コード配列の−１０〜１、−２０〜−１、−３０〜−１、−４０〜−１、−５０〜−１、−６０〜−１、−７０〜−１、−８０〜−１、−９０〜−１、−１００〜−１、−１５０〜−１、−２００〜−１、−２５０〜−１、−３００〜−１、−３５０〜−１、−４００〜−１、−４５０〜−１、または−５００〜−１領域内にあり、−１位は、ＳＯＵ２開始コドン（ＡＴＧ）の５’に隣接するヌクレオチドである。これらの前述の領域のいずれかへの挿入は、例えば、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００塩基対であり得る（例えば−１００〜−１領域内への３００塩基対の挿入）。代案としては、挿入は、ＳＯＵ２遺伝子の下方制御をもたらすあらゆる長さであり得る。
【０１２７】
下の実施例中のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、ＳＯＵ２遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して、−７１と−７０位の間に挿入を有するように遺伝子改変される。この特定の挿入、ならびにヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＳＯＵ２を下方制御するのに使用し得る本明細書で開示されるあらゆる挿入は、配列番号８または９、またはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列部位に関して特徴付けられてもよい（異なるヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株に存在し得る、天然配列の変動性を考慮する）。例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して、−７１と−７０位間の挿入は、配列番号８のヌクレオチド配列部位９３０と９３１間の挿入として説明され得る。別の例として、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＳＯＵ２読み取り枠の塩基対１０と１１間の挿入は、配列番号８のヌクレオチド配列部位１０１０および１０１１間の挿入として。または代案しては、配列番号９のヌクレオチド配列部位１０と１１の間の挿入として説明され得る。
【０１２８】
前述の欠失および挿入の他に、その他の各種変異を使用して、開示される発明の代案の実施形態中で、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列を下方制御し得る。例えば単一ヌクレオチドを別のもので交換する１つまたは複数の点変異（すなわちヌクレオチド置換）を使用してもよい。点変異は、塩基転位型点変異（すなわち別のプリンの代わりのプリン、または別のピリミジンの代わりのピリミジン）、または塩基転換型点変異（すなわちピリミジンの代わりのプリン、またはプリンの代わりのピリミジン）であってもよい。塩基転位型変異の例は、グアニンの代わりのアデニンである。例証的な塩基転換型変異は、シトシンの代わりのアデニンである。例えばこれらの変異のいずれもが、Ｓｏｕ２タンパク質の機能を下方制御するアミノ酸置換をもたらしてもよい。
【０１２９】
特定の実施形態では、変異は、ＳＯＵ２読み取り枠内のナンセンス変異であってもよく；このような変異は、アミノ酸コドンをナンセンスコドンに変化させる。ＳＯＵ２読み取り枠内のナンセンス変異の位置次第で、コードされたＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質は、そのカルボキシ末端でもう１つのアミノ酸がトランケートされていてもよい。このようなトランケーションは、例えばカルボキシ末端から、少なくとも１、５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２７５個のアミノ酸を除去してもよい。
【０１３０】
特定の実施形態では、変異は、コドンが異なるアミノ酸をコードするように変異される、ＳＯＵ２読み取り枠内のミスセンス変異であってもよい。このような変異は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質の野性型機能を低下させまたは排除するため、ＳＯＵ２を下方制御してもよい。例えばＳｏｕ２タンパク質の適切な局在化および／または酵素的活性が、損なわれてもよい。
【０１３１】
コドンによってコードされるアミノ酸を変化させない、ＳＯＵ２読み取り枠のコドン中の変異（すなわちサイレント変異）は、本明細書に記載される、ＳＯＵ２を下方制御する変異ではない。コドンによってコードされるアミノ酸を、Ｓｏｕ２タンパク質の野性型機能を変化させない関連アミノ酸に変化させる変異もまた、本明細書に記載される変異ではない。特定の実施形態では、関連アミノ酸は、構造および／または電荷を共有して、次のようにグループ分けされ得る、側鎖基を有する：脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、ヒドロキシル基含有（セリン、スレオニン）、イオウ族含有（システイン、メチオニン）、カルボン酸基含有（アスパラギン酸、グルタミン酸）、アミド基含有（アスパラギン、グルタミン）、およびアミノ基含有（ヒスチジン、リジン、アルギニン）。
【０１３２】
開示される内在性ＳＯＵ２配列に対する変異のいずれでも、内在性ＳＯＵ２配列を変異させるように改変されていない微生物細胞中の内在性ＳＯＵ２配列に関して、変異を構成すると判定し得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば改変Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中のＳＯＵ２配列は、改変株がそれから誘導された対応する野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の内在性ＳＯＵ２配列と、比較し得る。
【０１３３】
上の欠失および挿入のいずれか、ならびに本明細書に記載されるあらゆるその他の変異は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して、組換え微生物細胞の内在性ＳＯＵ２配列に導入されてもよい。例えば、酵母（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：９５３−９６１）、真菌（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２８：７７０−７７５）、藻類（Ｚｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４３２：９１−９６），および細菌（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：１６５６−１６６４）の改変について記載されるものなどの遺伝子標的化技術を使用してもよい。代案としては、ランダム変異誘発技術使用してもよい。
【０１３４】
特定の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、対照細胞における内在性ポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と比較した、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の、転写および／または翻訳の低下である。別の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、対照細胞中のＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質機能と比較した、コードされたＳｏｕ２タンパク質の（例えばタンパク質局在化および／または酵素活性）機能における、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の低下に反映される。
【０１３５】
開示される発明の特定の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、組換え微生物細胞の脂質含量を増大させる。この脂質含量の増大（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、対照細胞の脂質含量を少なくとも約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％上回り得る。
【０１３６】
開示される発明の特定の実施形態では、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御は、微生物細胞によって産生される糖アルコールの総量を低下させる。糖アルコールは、例えばアラビトールおよび／またはマンニトールを含んでなってもよい。糖アルコール総量の低下は、対照細胞の糖アルコール総量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を下回り得る。アラビトールおよび／またはマンニトールの低下は、対照細胞のアラビトールおよび／またはマンニトールの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％下回り得る。特定の実施形態における１００％低下は、検出閾値未満のアラビトールおよび／またはマンニトールに相当する。
【０１３７】
特定の実施形態では対照細胞は、本明細書で開示される変異のいずれをも有しない、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする、内在性ポリヌクレオチド配列を有する。対照細胞中のこのような非変異は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードするそのポリヌクレオチド配列を、対応する野性型細胞のものと比較することで判定し得る。例えば対照細胞が、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列に変異を有するように改変されていない、特定の組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であれば、対照細胞中のこのポリヌクレオチド配列は、対照がそれから誘導された対応する野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞中のポリヌクレオチド配列と同一であり、またはそれと非常に類似しているべきである（例えばサイレント変異を含有する）。特定の実施形態で使用し得る対照細胞その他の態様は、上で説明した。
【０１３８】
Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列を含まない組換え微生物細胞は、組換え微生物細胞がそれから誘導された対応する野性型細胞も同様に、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列を含まない場合、このポリヌクレオチドの下方制御を含んでなると見なされるべきではない。
【０１３９】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、（ａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＰＤＡＴ）をコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列、（ｂ）Δ１２デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列、および（ｃ）ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）シンターゼマルチザイムをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでなる。これらの各ポリヌクレオチド配列（ａ〜ｃ）は、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。
【０１４０】
「リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素」（ＰＤＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５８）という用語は、本明細書の用法では、アシル基をホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などのリン脂質のｓｎ−２位から、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位に転移する能力のある酵素を指す。この反応は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）などのリゾリン脂質をもたらす。ＰＤＡＴおよびアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＤＧＡＴ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０）のどちらもＴＡＧ生合成の最終段階に関与するが、ＰＤＡＴのみがアシルＣｏＡ−非依存性機序を介してＴＡＧを合成してもよい。
【０１４１】
Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６４８７−６４９２）およびＯｅｌｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５６０９−１５６１２）は、アシルＣｏＡ非依存性ＰＤＡＴ酵素（構造的にタンパク質のレシチン：コレステロールアシル基転移酵素ファミリーに関連する）によって、アシルＣｏＡ不在下でＴＡＧ合成が起こり得ることを最初に認識した。この研究に続いて、米国特許第７，２６７，９７６号明細書（参照によって本明細書に援用する）は、ＳｃＰＤＡＴと４７．１％のアミノ酸配列同一性共有すると判定された、ＰＤＡＴをコードするＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２遺伝子（本明細書の配列番号３１）のクローニング、過剰発現およびノックアウトを記載した。このＹｌＰＤＡＴの単一アミノ酸挿入変種（本明細書の配列番号１５）は、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書で開示された。
【０１４２】
開示される発明の特定の実施形態では、ＰＤＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド配列は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＰＤＡＴを含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい。このようなＰＤＡＴは、例えば配列番号１５または３１のアミノ酸配列を含んでなってもよい。代案としては、ＰＤＡＴは、特定の実施形態では、配列番号１５または３１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、ＰＤＡＴ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１４３】
「Δ１２デサチュラーゼ」（Ｄ１２；ＥＣ１．１４．１９．６）という用語は、本明細書の用法では、脂肪酸のカルボキシル末端からの番号付で１２番目と１３番目の炭素間に炭素−炭素二重結合を導入する能力のある酵素を指す。
【０１４４】
開示される発明の特定の実施形態では、Δ１２デサチュラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド配列は、そのどちらも参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２１４，４９１号明細書および米国特許出願公開第２００７−０２５４２９９号明細書で開示されるような、Δ１２デサチュラーゼを含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい。代案としては、アミノ酸配列は、全て米国特許第７，５０４，２５９号明細書（参照によって本明細書に援用する）で開示される、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）（例えば配列番号１３）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（例えば配列番号３２）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）またはアスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）からのΔ１２デサチュラーゼを含んでなってもよい。代案としては、Δ１２デサチュラーゼは、特定の実施形態では、配列番号１３または３２と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、Δ１２デサチュラーゼ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１４５】
「マルチザイム」および「融合タンパク質」という用語は、本明細書の実施形態では同義的に使用され、少なくとも２つの独立して分離可能な酵素機能を有して、第１の酵素活性が好ましくは第２の酵素活性に連結する、単一ポリペプチドを指す（参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書）。マルチザイムは、特定の実施形態では、２つの独立した別個の酵素を含んでなる。少なくとも２つの独立して分離可能な酵素機能間の「リンカー」は、単一ペプチド結合からなってもよいが、リンカーはまた、プロリンなどの１つのアミノ酸残基から、または少なくとも１つのプロリンを含んでなるポリペプチドからなってもよい。特定の実施形態で使用し得るリンカーの例は、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書で、配列番号４〜１０として開示される。
【０１４６】
開示される発明の特定の実施形態では、「ＤＧＬＡシンターゼマルチザイム」は、Δ８デサチュラーゼと連結するΔ９エロンガーゼを含んでなる。ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムは、Δ９エロンガーゼ活性（ＬＡからＥＤＡへの変換）とΔ８デサチュラーゼ活性（ＥＤＡからＤＧＬＡへの変換）の双方を含有するために、ＬＡをＤＧＬＡに変換し得る。ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムはまた、そのΔ９エロンガーゼ活性がＡＬＡをＥＴｒＡに変換し得て、そのΔ８デサチュラーゼ活性がＥＴｒＡをＥＴＡに変換し得ることから、ＡＬＡをＥＴＡに変換し得る。
【０１４７】
ＤＧＬＡシンターゼマルチザイム内に含まれ得るΔ９エロンガーゼアミノ酸配列の例は、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書で、配列番号２５４（ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Ｄ９ｅ、ＥａＤ９ｅ）、３１９（ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｄ９ｅ、ＥｇＤ９ｅ）、および３５９（ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９  Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ）として開示される。ＤＧＬＡシンターゼマルチザイム内に含まれ得るΔ８デサチュラーゼアミノ酸配列の例は、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書で、配列番号３２８（変異ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｄ８、ＥｇＤ８Ｍ）、４３０（ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Ｄ８、ＥａＤ８）、および５１４（テトルエトレプチア・ポムクテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ  ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１Ｄ８、ＴｐｏｍＤ８）として開示される例えば、これらのΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼのそれぞれ、またはそれと、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有して、Δ９エロンガーゼまたはΔ８デサチュラーゼ機能のどちらかを有するその変種は、ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムに含まれてもよい。
【０１４８】
特定の実施形態では、ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムは、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ（本明細書の配列番号１７）を含んでなる。このマルチザイムは、ＥｇＤ８Ｍのアミノ酸配列（本明細書の配列番号１９）の大部分に結合する、Ｅ３８９Ｄ９ｅ（本明細書の配列番号３３）を含んでなる。具体的には、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、配列番号３３−リンカーＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ（配列番号３４）−配列番号１９の２〜４２２位を含んでなる。ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムは、別の実施形態では、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書で開示されるもののいずれかであってもよい（例えば、ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ、本明細書の配列番号３５；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ；ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ、本明細書の配列番号３６；ＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８；ＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８）。代案としては、ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムは、特定の実施形態では、配列番号１７、３５、または３６（または別の上記ＤＧＬＡシンターゼのいずれか）と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、ＤＧＬＡシンターゼ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。Δ９エロンガーゼは、特定の実施形態では、マルチザイムポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）に位置する。
【０１４９】
開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、（ａ）Δ８デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列、（ｂ）マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）をコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列、および（ｃ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）をコードする、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列を含んでなる。これらの各ポリヌクレオチド配列（ａ〜ｃ）は、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。
【０１５０】
「Δ８デサチュラーゼ」（Ｄ８；ＥＣ１．１４．１９．４）という用語は、本明細書の用法では、脂肪酸のカルボキシル末端からの番号付で８番目と９番目の炭素間に炭素−炭素二重結合を導入する能力のある酵素を指す。
【０１５１】
開示される発明の特定の実施形態では、Δ８デサチュラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド配列は、全て参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００５−０２７３８８５号明細書または米国特許第７，５５０，６５１号明細書；米国特許第７，２５６，０３３号明細書；米国特許第７，７９０，１５６号明細書；米国特許第７，９４３，８２３号明細書；米国特許第７，８６３，５０２号明細書；または米国特許第６，８２５，０１７号明細書で開示されるような、Δ８デサチュラーゼ配列を含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい。代案としては、アミノ酸配列は、例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（例えば配列番号１９）、またはユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）（例えば配列番号３７）からのΔ８デサチュラーゼを含んでなってもよい。代案としては、Δ８デサチュラーゼは、特定の実施形態では、配列番号１９または３７と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、Δ８デサチュラーゼ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１５２】
「マロニルＣｏＡシンセターゼ」（ＭＣＳ、ＥＣ６．２．１．１４）という用語は、本明細書の用法では、以下の酵素反応を触媒する酵素を指す：
マロン酸＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ→マロニルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸
酵素は、最初、マロン酸で培養したシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から精製されたが（１９８５，Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｂａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：５０９８−５１０４）、それ以降、様々な根粒菌ホモログが、マメ類根粒内のバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）から単離されている（例えば、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｅ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３：５１１−５１６；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋａｎｇ，１９９４  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９７：３２７−３３３）。マロン酸をマロニルＣｏＡに変換することで、ＭＣＳは、脂肪酸合成で使用されるマロニルＣｏＡ基質を提供し得る。したがって、細胞内のマロン酸副産物の生成を低下させることに加えて、ＭＣＳ発現はまた、細胞内の炭素およびエネルギー浪費の回避も助け、発酵工程において最適ｐＨ範囲を維持するのに必要な塩基量を低下させ、発酵廃液内で中和が必要な副産物有機酸量を低下させる。
【０１５３】
開示される発明の特定の実施形態では、ＭＣＳをコードする異種ポリヌクレオチド配列は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８号明細書で開示されるような、ＭＣＳ配列を含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい。例えばアミノ酸配列は、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）からのＭＣＳを含んでなってもよい（例えば配列番号２１）。代案としては、ＭＣＳは、特定の実施形態では、配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％と同一であり、ＭＣＳ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１５４】
「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシル基転移酵素」または「リゾリン脂質アシル基転移酵素」［「ＬＰＬＡＴ」］という用語は、本明細書では、ｓｎ−２位で多様なリゾリン脂質基質をアシル化し得る、アシル基転移酵素の広範なクラスを指す。より具体的には、ＬＰＬＡＴとしては、ＬＰＡからＰＡへの変換を触媒し得る、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）；ＬＰＣからＰＣへの変換を触媒し得る、ＬＰＣアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）；ＬＰＥからＰＥへの変換を触媒し得る、アシル基転移酵素（ＬＰＥＡＴ）；ＬＰＳからＰＳへの変換を触媒し得る、ＬＰＳアシル基転移酵素（ＬＰＳＡＴ）；およびＬＰＧからＰＧへの変換を触媒し得る、ＬＰＧアシル基転移酵素（ＬＰＧＡＴ）が挙げられる。ＬＰＬＡＴのための様々なその他の名称が、当該技術分野で使用される。例えばＬＰＡＡＴは、アシルＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール‐３‐リン酸２−Ｏ−アシル基転移酵素、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素、または１−アシルグリセリンリン酸アシル基転移酵素と称されている。ＬＰＣＡＴは、アシルＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素と称されている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１などの特定のＬＰＬＡＴは、広範な特異性を有し、したがって単一酵素が、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、およびＬＰＥＡＴ反応をはじめとする、いくつかのＬＰＬＡＴ反応を触媒できてもよい（Ｔａｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３４２８８−３４２９８；Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８２：３０５−３０９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１：５５１１−５５１６；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３０８４５−３０８５５；Ｒｉｅｋｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２８３４４−２８３５２）。
【０１５５】
「リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素」（ＬＰＡＡＴ、ＥＣ２．３．１．５１）という用語は、本明細書の用法では、以下の反応を触媒する酵素を指す：
アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸＝ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸
【０１５６】
開示される発明の特定の実施形態では、ＬＰＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド配列は、全て参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２号明細書または米国特許第７，１８９，５５９号明細書および米国特許第７，８７９，５９１号明細書で開示されるようなＬＰＡＡＴ配列を含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい。例えばアミノ酸配列は、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（例えば配列番号３８）またはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（例えば配列番号２３）からのＬＰＡＡＴを含んでなってもよい。代案としては、ＬＰＡＡＴは、特定の実施形態では、配列番号３８または２３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で、ＬＰＡＡＴ機能（上記）を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【０１５７】
したがって開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、上述したように、
（ｉ）膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる、活性ＬＰＣＡＴをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御、
（ｉｉｉ）ＰＤＡＴをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）Δ１２デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；（ｖ）ＤＧＬＡシンターゼマルチザイムをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；
（ｖｉ）Δ８デサチュラーゼをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）ＭＣＳをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；
（ｖｉｉｉ）ＬＰＡＡＴをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列
の特性の１つまたは複数を含んでなり、
（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する。（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各ポリヌクレオチドは、異種であってもよい。各実施形態中の組換え微生物細胞は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２８パーセントのＥＰＡを含んでなる油を含んでなってもよく、または産生してもよい。組換え微生物細胞の特定の実施形態は、
−  （ｉ）；
−  （ｉｉ）；
−  （ｉ）および（ｉｉ）；
−  （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）；
−  （ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）；または
−  （ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなる。
【０１５８】
例えば、特性（ｉ）および（ｉｉ）の双方を有する本発明の特定の実施形態は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２８パーセントのＥＰＡを含んでなる油を産生し、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列の下方制御と、膜結合Ｏ−アシル基転移酵素モチーフ中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなる活性ＬＰＣＡＴ酵素をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とを含んでなる、組換え微生物細胞（例えば組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞）に言及する。
【０１５９】
（参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２号明細書に記載されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株はＹ８４１２株から誘導され、Ｙ８４１２株は野性型株ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５８５株は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書に記載されるように、Ｙ９５０２株から誘導された。下の実施例で開示される組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株のいくつかは、表１３に列挙される株などのＺ５５８５から誘導される（例えばＺ９２７６）。したがって開示される発明の特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、以下の異種特性の１つ、その組み合わせ、または全てを含んでなる、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である：Ｐｅｘタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばＰｅｘ３）の下方制御、Ｓｏｕ２ｐをコードするポリヌクレオチドの下方制御、Ｃ１６／１８エロンガーゼ（例えばＭＥ３）をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド、Δ９エロンガーゼ（例えばＥｇＤ９ｅ）をコードする少なくとも５つのポリヌクレオチド、Δ８デサチュラーゼ（例えば、ＥｇＤ８、ＥｇＤ８Ｍ、またはＥａＤ８）をコードする少なくとも６つのポリヌクレオチド、ＤＧＬＡシンターゼ（例えば、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ、ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ、ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ）をコードする少なくとも４つのポリヌクレオチド、Δ９デサチュラーゼ（例えばＹｌＤ９）をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド、Δ１２デサチュラーゼ（例えばＦｍＤ１２）をコードする少なくとも５ポリヌクレオチド、Δ５デサチュラーゼ（例えばＥｇＤ５Ｍ）をコードする少なくとも４つのポリヌクレオチド、Δ１７デサチュラーゼ（例えばＰａＤ１７）をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（例えばＹｌＣＰＴ１）をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド、マロニルＣｏＡシンセターゼ（例えばＭＣＳ）をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド、コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ（例えばＹｌＰＣＴ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（例えばＭａＬＰＡＡＴ１またはＹｌＬＰＡＡＴ１）をコードする少なくとも５つのポリヌクレオチド、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（例えばＹｌＰＤＡＴ）をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド、変異アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（例えばＹｌＬＰＣＡＴ（Ｍ１３６Ｘ／Ｔ３８９Ｘ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド。代案としては、細胞は、これらのポリヌクレオチドのいくつかのまたは全ての１つのコピーを含んでなってもよい。
【０１６０】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含んでなるコンストラクトまたはベクターは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入されてもよい。これらの技術としては、例えば、変換（例えば酢酸リチウム変換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］））、遺伝子銃衝撃、電気穿孔、およびマイクロインジェクションが挙げられる。一例として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８：２３２−２３５（１９９７））は、直線化ＤＮＡ断片に基づくＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための組み込み技術を記載する。
【０１６１】
本明細書で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。代案の実施形態では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ−変異株（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書）の選択のために使用され、またはスルホニル尿素除草剤耐性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）が、形質転換体選択のために利用される。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数の逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」固有の方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書で教示される。
【０１６２】
開示される実施形態における転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性、およびタンパク質位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の側面を制御する、いくつかの異なる遺伝要素を操作することが望ましいことがある。より具体的には、遺伝子発現は、以下を変更することで制御されてもよい：関連するプロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミド由来であるか、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中における翻訳効率；宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の固有の安定性；およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子内のコドン使用頻度。
【０１６３】
微生物宿主細胞中における異種遺伝子発現を駆動する有用なプロモーターは多数あり、当業者に知られている。発現は、誘導性または構成的様式で達成され得る。誘導性発現が、対象の遺伝子と作動可能に結合する調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成され得る一方、構成的発現は、対象の遺伝子と作動可能に結合する構成的プロモーターの使用によって達成され得る。実質的に、遺伝子発現を誘導する能力のあるあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が適切であるが、宿主種からの転写および翻訳調節領域が、特に有用なこともある。
【０１６４】
一般に、ターミネーターは、それからプロモーターが得られた遺伝子の３’領域、または異なる遺伝子に由来し得る。多数のターミネーターが知られており、それらが由来するのと同じおよび異なる属および種のどちらで使用した場合も、多様な宿主中で満足に機能する。ターミネーターは、通常いかなる特性のためでもなく、便宜のために選択される。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子に由来する。当業者は、入手できる情報を利用してターミネーターをデザインおよび合成し得るので、ターミネーターはまた合成もされ得る。ターミネーターは不要なこともあるが、それは好ましい。
【０１６５】
制限を意図するものではないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の組換え微生物宿主細胞で使用される好ましいプロモーターおよびターミネーターは、全て参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書、米国特許出願公開第２０１０−００６８７８９号明細書、米国特許出願公開第２０１１−００５９４９６号明細書、米国特許出願公開第２０１２−０２５２０７９号明細書、米国特許出願公開第２０１２−０２５２０９３号明細書、米国特許出願公開第２０１３−００８９９１０号明細書、および米国特許出願公開第２０１３−００８９９１１号明細書で教示されるものである。
【０１６６】
ＰＵＦＡ生合成経路デサチュラーゼ、エロンガーゼなどの遺伝子の追加的なコピー（すなわち２つ以上のコピー）を組換え微生物宿主細胞に導入して、ＥＰＡの生成と蓄積を増大させてもよい。具体的には、遺伝子の追加的なコピーを単一発現コンストラクト内でクローン化してもよく；および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはクローン遺伝子のゲノム中への複数組み込みによって、クローン遺伝子の追加的なコピーを宿主細胞に導入してもよい。
【０１６７】
一般に、ひとたび組換え微生物宿主細胞中における発現に適したＤＮＡカセット（例えばプロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる）が得られたら、それを宿主細胞中の自律複製能力のあるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞ゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的化し得る。本明細書では、依存はしないが、転写および翻訳調節領域の全部または一部は内在性遺伝子座によって提供され得て、コンストラクトは内在性遺伝子座を標的とする。
【０１６８】
遺伝子改変組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞に関しては、この微生物宿主中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡ断片の組み込みによる。ゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が所望される場合に、特に有用である。好ましい遺伝子座としては、例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書で教示されるものが挙げられる。
【０１６９】
開示される発明別の態様は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含んでなる微生物油を生産する方法に関する。この方法は、
ａ）本発明に記載されるような組換え微生物細胞を培養し、その中でＰＵＦＡを含んでなる微生物油が生成するステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物油を任意選択的に回収するステップと
を含んでなる。
【０１７０】
特定の実施形態では、方法によって産生される微生物油は、ＥＰＡを含んでなる。方法で使用される微生物細胞種次第で、油は、例えば真菌油または酵母油であってもよい。油は、特定の実施形態では、微生物細胞を約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、または２００時間培養した後に、組換え微生物細胞から回収または入手されてもよい。
【０１７１】
本開示の組換え微生物細胞は、開示されたポリヌクレオチドの発現を最適化して、１つまたは複数のＰＵＦＡの最大かつ最も経済的収率を生じる条件下で培養し得る。一般に培地条件は、炭素源のタイプと量、窒素源のタイプと量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産期の長さ、油の蓄積期の長さ、および細胞収穫の時間と方法を変更することで、最適化されてもよい。
【０１７２】
本明細書に記載される組換え微生物細胞を培養するための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４号明細書に記載されるような、適切な炭素源を含有しなくてはならない。好ましい成長培地としては、例えば、酵母窒素原礎、コーンスティープリカー、またはコーンスティープソリッドなどの一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。その他の規定または合成成長培地もまた、使用してもよい。発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期成長条件範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１７３】
典型的に、代謝状態は、増殖と脂肪合成／貯蔵の間で「平衡状態」でなくてはならないので、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡ蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＥＰＡ生産のために、二段階発酵工程を使用し得る。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および増殖中の配慮についても同様である。二段階アプローチでは、発酵の第１段階は、細胞量蓄積のためであり、迅速な細胞増殖および分裂で特徴付けられ；発酵のこの段階には、標準的量の窒素が含まれる。発酵の第２段階では、培養物中の窒素欠乏が、高レベルの脂質生成と蓄積を促進する。第１段階は、約１２、２４、３６、４８、または６０時間にわたり実施してもよい一方で、第２段階（油性）は、所望の産油レベル次第で、約１２〜１５０時間にわたり実施してもよい。
【０１７４】
開示された組換え微生物細胞を培養する条件は、油性であってもよく；例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のための油性成長条件は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書に記載される。油性成長条件は、豊富なまたは多量の発酵性炭素源をなおも提供しながら、主に窒素が不在であり、または非常に限定的である（窒素制限）ことで、標準的な成長条件と異なる。例証的な発酵性炭素源は、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばスクロース）、転化糖、オリゴ糖、多糖類、アルカン、脂肪酸（例えば１０〜２２個の炭素）、脂肪酸のエステル、グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドである。窒素を欠く油性増殖培地の一例は、約８０ｇ／Ｌのグルコース、２．５８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４を有する。別の例は、培地を調製する際に、窒素含有塩が直接添加されない培地である。油性培地は、窒素限定的であるので、それは、最大で約０．０５０、０．１００、０．１２５、０．１５０、０．１７５、０．２００、０．２２５、０．２５０、０．２７５、または０．３００ｇ／Ｌの窒素を含有する塩（例えば（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＳＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、またはＮＨ４Ｃｌなどのアンモニウム含有塩；ＫＮＯ３またはＮａＮＯ３などの硝酸塩含有塩）、アミノ酸、または尿素を有してもよい。油性増殖培地中のグルコースの量は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｇ／Ｌであってもよい。
【実施例】
【０１７５】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１７６】
一般方法
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；ａｎｄ  ｂｙ  Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ａｎｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載される。特に断りのない限り、本明細書の遺伝子配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。
【０１７７】
微生物培養の維持および増殖に適した材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒ．Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；ｏｒ  ｉｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｈ．Ｂａｌｔｚ，Ｊ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ，ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ，Ｅｄｓ．），ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１０に記載される。
【０１７８】
微生物細胞の増殖および保守のために使用された、全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、、  ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、  ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られた。
【０１７９】
本明細書で開示される各遺伝子発現カセットの構造は、簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」によって表わされる。具体的には、Ｘはプロモーターを記述し、Ｙはタンパク質コード配列を記述し、Ｚはターミネーターを記述する。ＸはＹと作動可能に連結し、ＹはＺと作動可能に連結する。
【０１８０】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、慣例的に下に示すレシピに従った、いくつかの培地中で３０℃で培養した。
【０１８１】
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１リットルあたり）：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調節不要）。
【０１８２】
合成デキストロース培地（ＳＤ）（１リットルあたり）：６．７ｇの硫酸アンモニウム添加アミノ酸無添加の酵母窒素原礎培地、および２０ｇのグルコース。
【０１８３】
発酵培地（ＦＭ）（１リットルあたり）：６．７ｇの硫酸アンモニウム添加アミノ酸無添加の酵母窒素原礎培地、６．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇのグルコース、および５．０ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ，ＢＤ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）。
【０１８４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書に記載されるようにして実施した。一般に、Ｕｒａ３−細胞を形質転換するために、ＵＲＡ３遺伝子を保有するプラスミドまたはその断片で細胞を形質移入し、次にウラシル欠損プレート上で形質転換について選択した。
【０１８５】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析：
脂肪酸分析のために、細胞を遠心分離によって収集し、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載されるようにして、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドで脂質抽出物をエステル交換して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、引き続いて、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｏｍｅｇａｗａｘ３２０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カラムを装着した、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフを用いて分析した。オーブン温度を３０℃／分で１６０℃から２４０℃に上昇させ、次に２４０℃で３．８分間保持した。
【０１８６】
直接塩基エステル交換のために、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）培養物（１ｍＬ）を１分間の遠心分離（１３，０００×ｇ）によって収集した。サンプルにナトリウムメトキシド（５００μＬの１％溶液）を添加して、次にサンプルを４５分間ボルテックスして振盪した。次に、１００μＬの１．０Ｍ  ＮａＣｌおよび５００μＬのヘキサンを添加して、サンプルをボルテックスし遠心沈殿させた。上層を除去し、上述のようにガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１８７】
一般に、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の新規形質転換体の最初の脂肪酸スクリーニングは、以下のように実施した。最少培地（ＭＭ）プレート上で３０℃で５〜６日間増殖させた単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、３０℃で２日間増殖させ、次にマルチウェルプレート（例えば２４ウェル、３ｍＬＭＭ）内の液体ＭＭに接種して、３０℃で２日間２５０ｒｐｍで振盪した。各ウェルからの細胞を遠心分離によって収集し、ＨＧＭに再懸濁して、次に２５０ｒｐｍで５日間振盪した。次に細胞を脂肪酸分析のために、上述したように処理した。所望の脂肪酸形質を示す形質転換体を下述するような「フラスコアッセイ」によってさらに分析した。
【０１８８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の総脂質含量および組成の分析（フラスコアッセイ）
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の特定株の総脂質含量および組成の詳細な分析のために、フラスコアッセイを次のように行った。具体的には、培養物を１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＳＤ培地中で４８時間、約０．３の出発ＯＤ６００に増殖させた。６ｍＬの培養物を５０ｍＬ円錐管内で、４３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を廃棄して、細胞を別の１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのｆＨＧＭに再懸濁し；この培養物を２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪インキュベーター内で（特に断りのない限り）１２０時間培養した。次に（上述したような）脂肪酸分析のために、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離に続いて、培養物の１ｍＬのアリコートを使用した乾燥細胞重量測定のために、培養物の５ｍＬのアリコートを乾燥させた。「一段階フラスコアッセイ」を使用して実施したものを除いて、本明細書で言及される全てのフラスコアッセイは、この手順に従って実施した。
【０１８９】
ＤＣＷ測定のために、１０ｍＬの培養物を４３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。ペレットを１０ｍＬの滅菌水に再懸濁して、上のように再収集した。洗浄ペレットを１ｍＬの水に再懸濁し（３回）、あらかじめ秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を８０℃の真空オーブン内で一晩乾燥させた。細胞重量を測定した（ｇ／Ｌ）。
【０１９０】
細胞の総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）を計算してデータと併せて考察し、各脂肪酸濃度をＴＦＡの重量％（％ＴＦＡ）として、ＥＰＡ含有量を乾燥細胞重量の百分率（ＥＰＡ％ＤＣＷ）として表にした。フラスコアッセイからのデータは、細胞の総ＤＣＷ、細胞の総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）、ＴＦＡの重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸濃度、および乾燥細胞重量の百分率（ＥＰＡ％ＤＣＷ）としてのＥＰＡ含有量を要約する表形態で提示される。
【０１９１】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５６２７およびＺ５５８５株
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５６２７およびＺ５５８５株の作成は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書に記載される。実施例１〜４に記載されるようにして、Ｚ５６２７およびＺ５５８５を使用して、開示される発明の特定の株を誘導した。
【０１９２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５６２７およびＺ５５８５株は、Ｙ９５０２株の複数遺伝子修飾から誘導され、Ｙ９５０２株は野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２の複数遺伝子修飾後に誘導された。Ｚ５６２７およびＺ５５８５株を作成するために使用された、遺伝子修飾ステップおよび間性株は、図２Ａ（ＡＴＣＣ＃２０３６２からＹ９５０２）および２Ｂ（Ｙ９５０２からＺ５６２７およびＺ５５８５）に示される。
【０１９３】
野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ５６２７およびＺ５５８５株双方の遺伝子型は、次のとおりである：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知の１−、未知の２−、未知の３−、未知の４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知の６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知の８−、未知の１０−、未知の１１−、未知の１２−、未知の１３−、未知の１４−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
【０１９４】
上の遺伝子型に列挙される略称は、次のとおりである：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり、ＦｍＤ１２Ｓは、そのコドン最適化形態である（米国特許第号７，５０４，２５９明細書）；ＭＥ３Ｓは、コドン最適化モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子である（米国特許第７，４７０，５３２号明細書）；ＥｇＤ９ｅは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子であり、ＥｇＤ９ｅＳは、そのコドン最適化形態（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）である；ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇは、ＥｇＤ９ｅＳの変異形態である（米国特許出願公開第２０１２／０２２６０６２号明細書）；ＥｇＤ８Ｍは、合成変異ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ遺伝子である（米国特許第７，７０９，２３９号明細書）；ＥａＤ８Ｓは、コドン最適化ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ８デサチュラーゼ遺伝子である（米国特許第７，７９０，１５６号明細書）；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種からのコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）をＥｇＤ８Ｍ（米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細）に連結させて生成されたＤＧＬＡシンターゼである；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ＥｇＤ９ｅＳをＥｇＤ８Ｍ（米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書）に連結させて生成されたＤＧＬＡシンターゼである；ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓは、コドン最適化Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＥａＤ９ｅＳ）（米国特許第７，７９４，７０１号明細書）をＥａＤ８Ｓ（米国特許第７，７９０，１５６号明細書）に連結させて生成されたＤＧＬＡシンターゼである；ＹｌＤ９は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ９デサチュラーゼ遺伝子である（米国特許出願公開第２０１２／００５２５３７号明細書）；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、変異ＨＰＧＳモチーフ（米国特許出願公開第２０１０／００７５３８６号明細書）を含んでなる、合成変異ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子である；ＥａＤ５ＳＭは、変異ＨＡＧＧモチーフ（米国特許出願公開第２０１０／００７５３８６号明細書）を含んでなる、合成変異Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子である；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子であり、ＰａＤ１７Ｓは、そのコドン最適化形態である（米国特許第７，５５６，９４９号明細書）；ＹｌＣＰＴ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である（米国特許第７，９３２，０７７号明細書）；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシア（ｖｉｃｉａｅ）３８４１からのコドン最適化マロニルＣｏＡシンセターゼ遺伝子である（米国特許出願公開第２０１０／０１５９５５８号明細書）；ＹｌＰＣＴは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子である（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０２９７８）；ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、コドン最適化Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である（米国特許第７，８７９，５９１号明細書）；ＹｌＬＰＡＡＴ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書）；ＹｌＰＤＡＴは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子である（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書）；ＹＡＴ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＡＴ１遺伝子プロモーターである（米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９号明細書）；Ｐｅｘ１６は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１６遺伝子ターミネーターである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ７５４３３）；ＧＰＤは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターである（米国特許第７，４５９，５４６号明細書）；ＧＰＤＩＮは、イントロンが付加されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤ遺伝子プロモーターである（米国特許第７，４５９，５４６号明細書）；Ｐｅｘ２０は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ２０遺伝子ターミネーターである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０５４６１３）；Ｌｉｐ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｉｐ１遺伝子ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ５００２０）である；Ｌｉｐ２は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｉｐ２遺伝子ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ０１２６３２）である；ＦＢＡは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）フルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼプロモーター配列であり、ＦＢＡＩＮおよびＦＢＡＩＮｍは、イントロン配列が付加されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡプロモーターである（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）；ＤＧＡＴ２Ｍは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールアシル基転移酵素−２（ＤＧＡＴ２）プロモーター配列である（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書）；ＥＸＰ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）輸出タンパク質（ＥＸＰ１）遺伝子プロモーター配列である（国際公開第０６／０５２８７０号パンフレット）；ＧＰＡＴは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＡＴプロモーターである（国際公開第２００６／０３１９３７号パンフレット）；Ａｃｏは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｃｏ遺伝子ターミネーターである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ００１３００）；Ｏｃｔは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｏｃｔ遺伝子ターミネーターである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６９９８８）；ＡＬＫ２ＬＭ１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＬＫ２遺伝子のＮ末端６６−ｂｐコード領域が付加された、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ｎ−アルカン−ヒドロキシル化チトクロームＰ４５０遺伝子（ＡＬＫ２）プロモーター配列である（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書）。
【０１９５】
米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書でも開示される下の表４で示されるように、Ｚ５６２７株は、油の脂肪酸中に約４９．５％のＥＰＡを含有する油を生じ得る。この株はまた、ＤＣＷの百分率として、約５２％の油および２５．６％のＥＰＡを産生し得る。
【０１９６】
表４に示されるように、Ｚ５５８５株は、油の脂肪酸中に約４９．４％のＥＰＡを含有する油を生じ得る。この株はまた、ＤＣＷの百分率として約５６．６％の油および２８％のＥＰＡを産生し得る。
【０１９７】
【表１０】
2016502852.tif 000012
【０１９８】
【表１１】
2016502852.tif 000013
【０１９９】
表４は、野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２の複数遺伝子修飾を通じて誘導される、Ｚ５６２７およびＺ５５８５以外のその他の株
を列挙する。この表中の株は、ＤＣＷの百分率として、およそ２０％〜２８％のＥＰＡを生じ得る。表４に列挙される株のいくつか、特にＬ２５０からＺ５６２７までの株は、全て間性株Ｚ１９７８の子孫である。各株で起きたＺ１９７８に関する遺伝子修飾（「遺伝子型の付加」）は、表４に示される。表４中のＺ５５６５からＺ５６２７の株は、Ｌ２５８株のＵｒａ３−形質転換体であるＬ２５８Ｕ株の特定の一段階遺伝子修飾を通じて、直接誘導された（表の脚注を参照されたい）。
【０２００】
Ｚ１９７８株に異なる遺伝子修飾が起きて、Ｚ５５６５〜Ｚ５６２７の各子孫株をもたらし、全含油量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）を３８．３％から５１．７％〜５６．６％の範囲に上昇させたことが、表４から明らかである。この含油量上昇は、Ｚ１９７８中の５８．７％から、子孫株Ｚ５５６５〜Ｚ５６２７中の４７．２％〜５０．４％の範囲への、油の脂肪酸中のＥＰＡの百分率の全体的な低下に付随した。
【０２０１】
したがってＺ１９７８株（２２．５ＥＰＡ％ＤＣＷ、表４）の遺伝子修飾を通じて、Ｚ５５６５〜Ｚ５６２７株（２５．６〜２８ＥＰＡ％ＤＣＷ、表４）で得られた、乾燥細胞重量基準で起きた全ＥＰＡ量の増大は、産油量を実質的に増大させることを通じて達成された。この重要な達成にもかかわらず、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書で開示される研究からは、どのようにして乾燥細胞重量基準で全ＥＰＡ含有量をさらに増大させるかは、明らかでなかった。例えば、ＥＰＡ％ＤＣＷを増大させるであろう、油中の脂肪酸中のＥＰＡの量を増大させながら含油量を維持または増大させるステップは、知られていなかった。
【０２０２】
したがってＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）を増大させながら、産油量を増大させる必要性がなおもある。
【０２０３】
実施例１
少なくとも約５４．２％の総脂質含量で総脂肪酸の少なくとも約５１．７％のＥＰＡを産生するＺ６１０９株の作成
本実施例は、Ｚ５６２７株の遺伝子修飾を通じた、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ６１０９株の作成を記載する。遺伝子修飾は、Ｚ５６２７に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｃａｌｅｏｓｉｎ−１（ＡｔＣｌｏ１）コードする発現カセットを導入することを必然的に伴った。図３Ａは、Ｚ６１０９株を作成するために使用された、遺伝子修飾ステップおよび間性株を示す。
【０２０４】
ＡｔＣｌｏ１をＺ５６２７に導入するために、引き続く選択目的のために、最初にこの株をＵｒａ３−にすることが必要であった。Ｚ５６２７は、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＹｌＤ９、およびＹｌＣＰＴ１の発現を可能にする配列を導入するために先に使用された、組み込まれたプラスミドコンストラクトｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢ内に、無処理ＵＲＡ３コード配列を保有する（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書を参照されたい）。Ｚ５６２７のＵＲＡ３コード配列を妨害するために、コンストラクトｐＺＫＵＭを使用して、無処理ＵＲＡ３配列にＵｒａ３−変異配列組み込んだ。Ｕｒａ−Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を得るためのプラスミドｐＺＫＵＭの構築および使用については、前述した（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書、その中の表１５を参照されたい）。
【０２０５】
Ｕｒａ−表現型Ｚ５６２７  ｐＺＫＵＭ−形質転換体は、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含有する最少培地（ＭＭ）プレート上で選択された（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書）。合計８つの形質転換体が増殖して、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。これらの形質転換体は、上述したように、最初の脂肪酸スクリーニングプロセスの対象となった。
【０２０６】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析は、ＦＯＡ−プレートからのＺ５６２７ｐＺＫＵＭ−形質転換体＃２、＃３、＃４、および＃６細胞中で、それぞれＴＦＡの３３．５％、３５．７％、３５．９％、および３４％のＥＰＡの存在を示した。これらの４つの形質転換体は、それぞれＺ５６２７Ｕ１、Ｚ５６２７Ｕ２、Ｚ５６２７Ｕ３、およびＺ５６２７Ｕ５株と命名され、集合的にＺ５６２７Ｕ株と命名された。
【０２０７】
プラスミドｐＹＲＨ５５（図４Ａ、配列番号１）を作成して、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）リパーゼ７遺伝子座に１つの合成シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｃａｌｅｏｓｉｎ−１（ＡｔＣｌｏ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ５４９５１９）を組み込んだ。ｐＹＲＨ５５中のＡｔＣｌｏ１コード配列（配列番号２；配列番号３をコードする）は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥＥ８５２４７から誘導されて、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２−０３０１９３２号明細書を参照されたい）。このコドン最適化ＡｔＣｌｏ１は、本明細書でＡｔＣｌｏ１Ｓと称される。表５は、ｐＹＲＨ５５中に含有される成分を記載する。
【０２０８】
【表１２】
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【０２０９】
ｐＹＲＨ５５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化して、次にＺ５６２７Ｕ５株を形質転換するのに使用した。形質転換細胞をウラシル欠損プレート上に播種して、３０℃で５〜６日間保った。最初の脂肪酸スクリーニングのために、単一コロニーを上述したように増殖させた。
【０２１０】
ＧＣ分析は、ｐＹＲＨ５５で形質転換された選択された７２株のＬ５６２７Ｕ５のほぼ全てが、ＴＦＡの４９％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。１１の株（＃１、＃１１、＃１５、＃１６、＃２０、＃２１、＃３０、＃３４、＃５１、＃５３、および＃５４）は、ＴＦＡの約５５．３％、５０．１％、５０．９％、５１．７％、５０．８％、４９．７％、５３．４％、５４．８％、５０．３％、５３．９％、および５０．６％のＥＰＡを産生して、それぞれＺ６１０３、Ｚ６１０４、Ｚ６１０５、Ｚ６１０６、Ｚ６１０７、Ｚ６１０８、Ｚ６１０９、Ｚ６１１０、Ｚ６１１１、Ｚ６１１２、およびＺ６１１３と命名された。
【０２１１】
上記のＺ６１０３〜Ｚ６１１３株のＬｉｐ７遺伝子座のノックアウトは、確認しなかった。野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ６１０９株およびその１０個の同胞種の遺伝子型は、次のとおりであった：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知の１−、未知の２−、未知の３−、未知の４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知の６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知の８−、未知の１０−、未知の１１−、未知の１２−、未知の１３−、未知の１４−、未知の１５−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＦＢＡＩＮｍ：：ＡｔＣｌｏ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
【０２１２】
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
Ｚ６１０９株およびその同胞種の細胞を増殖させて、上述のフラスコアッセイによって、総脂質含量および脂肪酸組成について分析した。表６は、Ｚ６１０３〜Ｚ６１１３株のＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸量、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０２１３】
【表１３】
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【０２１４】
表６の結果は、一般的に、Ｚ５６２７株中のＡｔＣｌｏ１Ｓの異種性発現が、産油量（すなわちＴＦＡ％ＤＣＷ）と、油の全脂肪酸中のＥＰＡの百分率（すなわちＥＰＡ％ＴＦＡ）を上昇させたことを示唆する。具体的には、株Ｚ５６２７が、５２のＴＦＡ％ＤＣＷと４９．３のＥＰＡ％ＴＦＡ（表４）を産生した一方で、Ｚ６１０３〜Ｚ６１１３株は、５３．９の平均ＴＦＡ％ＤＣＷと５０．７のＥＰＡ％ＴＦＡ（表６）を有した。
【０２１５】
表６で分析された特定株は、Ｚ５６２７と比較して、有意により高い油およびＥＰＡレベルを有した。例えばＺ６１０９株は、５４．２のＴＦＡ％ＤＣＷおよび５１．７のＥＰＡ％ＴＦＡを有した。Ｚ６１０９は、総計で、Ｚ５６２７によって産生されるもの（２５．６のＥＰＡ％ＤＣＷ）と比較して、総ＥＰＡ産生量の９．４％の増大（２８のＥＰＡ％ＤＣＷ）を示した。
【０２１６】
実施例２
少なくとも約４９．１％の総脂質含量および低下した糖アルコール副産物で総脂肪酸の少なくとも約５１．４％のＥＰＡを産生するＺ６９０３株の作成
本実施例は、Ｚ５５８５株の遺伝子修飾を通じた、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ６９０３株の作成を記載する。遺伝子修飾は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子ＳＯＵ２のノックアウトを必然的に伴った。遺伝子修飾は、さらに、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＰＤＡＴ）、Δ１２デサチュラーゼ、およびＤＧＬＡシンターゼマルチザイム（Δ８デサチュラーゼに融合したΔ９エロンガーゼ）をコードする発現カセットの導入を必然的に伴った。下の実施例４に記載されるＺ９２７６株を開発するために、Ｚ６９０３株の開発が必要であった。
【０２１７】
図３Ｂは、Ｚ６９０３株を作成するのに使用された、遺伝子修飾ステップおよび間性株（Ｚ５５８５Ｕ２１およびＺ５５８５Ｋ２Ｕ）を示す。株Ｚ５５８５Ｕ２１およびＺ５５８５Ｋ２Ｕは、以下のように作成された。
【０２１８】
Ｚ５５８５Ｕ２１株の作成
コンストラクトｐＺＫＵＭ（上記）を使用して、Ｚ５５８５株中で、プラスミドｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢによってあらかじめ導入されて、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＹｌＤ９およびＹｌＣＰＴ１の発現を可能にする配列を保有する、ＵＲＡ３遺伝子を妨害した（米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書を参照されたい）。合計８つの５−ＦＯＡ−耐性形質転換体が増殖されて、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。最初の脂肪酸スクリーニングのために、これらの形質転換体を上述したように増殖させた。
【０２１９】
ＧＣ分析は、ＦＯＡプレートから選択されたｐＺＫＵＭ形質転換株＃６細胞のＴＦＡ中の３７．７％のＥＰＡの存在を示した。この形質転換体は、Ｚ５５８５Ｕ２１株と命名された。
【０２２０】
Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ株（Ｓｏｕ２−）の作成
Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ株は、Ｚ５５８５Ｕ２１株中でＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子のノックアウトによって作成された。
【０２２１】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で脂質生成を改変するための遺伝子標的としてのＳＯＵ２遺伝子の同定は、下の実施例５に記載される。簡単に述べると、Ｚ１９７８株の遺伝子修飾を伴うＺ３０４１株の構築中（図８）に、Ｚ３０４１株は、その親株Ｚ２６３６と比較して、より多くのＤＣＷ、より多くの油、およびより少量の副産物を産生することが観察された。ゲノム歩行および配列決定分析は、ＳＯＵ２のプロモーター領域内で起きた挿入によって、Ｚ３０４１株中で、ＳＯＵ２遺伝子のプロモーター領域（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ１８９６４ｇ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０３０１０、図５）が、妨害されたことを示した（図５）。ソルビトールは糖アルコールである；マンニトールおよびアラビトールなどのその他の糖アルコールは、本明細書で開示される脂質生成増大のために改変されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中で、副産物として生成した。
【０２２２】
プラスミドｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗ（図４Ｂ、配列番号４）を使用して、Ｚ５５８５Ｕ２１株中のＳＯＵ２遺伝子の大部分をノックアウトした。表７は、ｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗ中に含有される成分を記載する。このベクターは、内在性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子座から誘導される配列を含有する、５’および３’相同性アームを含有する（それぞれｙＳＯＵ２−５’およびｙＳＯＵ２−３’と表記される）。スタッファー配列（非ＳＯＵ２配列）が、これらの相同性アーム間に位置する。
【０２２３】
【表１４】
2016502852.tif 000016
【０２２４】
ノックアウトストラテジーは、図６の略図および説明文に記述される「ポップイン／ポップアウト」プロセスを必然的に伴った。簡単に述べると、ポップイン事象は、ｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗの５’−相同性アームと、内在性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子座の対応する配列間の相同組換えの結果として起きた。この特定の組み込み事象は、変異ＳＯＵ２アレルと野性型ＳＯＵ２アレの並置をもたらして、ｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗの組み込みが、Ｚ５５８５Ｕ２１株（Ｕｒａ−）の細胞をＵｒａ＋にすることに基づいて選択された。
【０２２５】
ポップアウト事象は、組み込まれた変異対立遺伝子の３’相同性アームと、内在性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子座隣接する対応する配列の間の相同組換えの結果として起きた（図６、左側ポップアウト事象）。このポップアウト事象は、ポップイン中に導入されたＵＲＡ３遺伝子の除去をもたらしたので、その中でポップアウト事象が起きて、変異ＳＯＵ２アレルが残った細胞は、ＦＯＡプレート上で選択し得た（すなわち細胞はＵｒａ−である）。
【０２２６】
プラスミドｐＺＫＳＯＵ２−Ｎｅｗは、Ｚ５５８５Ｕ２１を形質転換するのに使用した。合計６０個のＵｒａ＋形質転換体をウラシル欠如ＭＭプレート上で増殖させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅分析は、形質転換体＃２６および＃２８が、ｐＺＳＯＵ２−Ｎｅｗおよび内在性ＳＯＵ２遺伝子の５’−アーム相同配列間で組換えされたことを示した。
【０２２７】
株＃２６を選択して液体ＹＰＤ培地中で培養し、次にＦＯＡプレート上に播種して、ポップアウト事象のために引き続いてＵｒａ−になった細胞を選択した（図６）。ＰＣＲ増幅によって合計９６個のＵｒａ−株を分析し、どれが、ｐＺＫＯＳＯＵ２−Ｎｅｗ主鎖配列（ＡｍｐＲおよびＵＲＡ３）を除去し、その結果、変異ＳＯＵ２アレルを残す、３’アーム相同性配列における組換えに関与するポップアウト事象を起こしたかを判定した。５’アーム相同配列でポップアウト組換え事象が起きた場合、特定のＵｒａ−細胞は、代わりに野性型ＳＯＵ２アレルを有し得るので、このＰＣＲ分析が必要であった（図６）。９６株のＵｒａ−の内９株をＰＣＲ分析して、変異ＳＯＵ２アレルを示唆する３’アーム相同配列組換えを検出した。これらの９株の内２つをＺ５５８５Ｋ２Ｕ１およびＺ５５８５Ｋ２Ｕ２と命名した。
【０２２８】
野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ１およびＺ５５８５Ｋ２Ｕ２の双方の株最終遺伝子型は、次のとおりである：Ｕｒａ−、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知８−、未知１０−、未知１１−、未知１２−、未知１３−、未知１４−、Ｓｏｕ２−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
【０２２９】
株Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ１は、本明細書でＺ５５８５Ｋ２Ｕと称される。
【０２３０】
Ｚ６９０３株の作成
プラスミドｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８Ｆ（図７Ａ、配列番号５）を作成して、ＰＤＡＴ（配列番号１５，野性型ＹｌＰＤＡＴと比較して２位の追加的アラニンがあるＰＤＡＴ）、Δ１２デサチュラーゼ（配列番号１３）、およびＤＧＬＡシンターゼマルチザイム（配列番号１７、Δ８デサチュラーゼに融合したΔ９エロンガーゼ）を発現するための遺伝子カセットを、Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ株のアルコールデヒドロゲナーゼ３（ＡＤＨ３）遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１７５２７３）に組み込んだ。表８は、ｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８Ｆ中に含有される構成成分を記載する。
【０２３１】
【表１５】
2016502852.tif 000017
【０２３２】
ｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８ＦプラスミドをＡｓｃＩで消化して、次にＺ５５８５Ｋ２Ｕ株を形質転換するのに使用した。形質転換細胞をウラシル非含有プレート上に播種して、３０℃に５〜６日間保った。最初の脂肪酸スクリーニングのために、単一コロニーを上述したように増殖させた。
【０２３３】
ＧＣ分析は、ｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８Ｆで形質転換された９株のＺ５５８５Ｋ２Ｕが、ＴＦＡの５１．１％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。これらの株（＃１０、＃１４、＃１５、＃６１、＃７６、＃８０、＃８２、＃８３、＃９６）は、ＴＦＡの約５２．４％、５１．９％、５１．６％、５３．２％、５２．３％、５２．４％、５１．９％、５１．３％、および５１．１％のＥＰＡを産生して、それぞれＺ６８９７、Ｚ６８９８、Ｚ６８９９、Ｚ６９００、Ｚ６９０１、Ｚ６９０２、Ｚ６９０３、Ｚ６９０４、およびＺ６９０５と命名された。
【０２３４】
上記のＺ６８９７〜Ｚ６９０５ＡＤＨ３株の遺伝子座のノックアウトは、確認しなかった。野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ６９０３株およびその８つの同胞種の遺伝子型は、次のとおりであった：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知の１−、未知の２−、未知の３−、未知の４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知の６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知の８−、未知の１０−、未知の１１−、未知の１２−、未知の１３−、未知の１４−、Ｓｏｕ２−、未知の１５−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＳＰＳ１９ＬＭ：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：ＧｌｏＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｅｒｐ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＳＰＳ１９−Ｐ３：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１。
【０２３５】
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
Ｚ６９０３株およびその同胞種の細胞を増殖させて、上述のフラスコアッセイによって、総脂質含量および脂肪酸組成について分析した。表９は、Ｚ６１０３〜Ｚ６１１３株のＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸量、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０２３６】
【表１６】
2016502852.tif 000018
【０２３７】
表９は、Ｚ６９０３株中のＤＣＷが４．９ｇ／Ｌ、ＴＦＡ％ＤＣＷが４９．１、ＥＰＡ％ＴＦＡが５１．４、およびＥＰＡ％ＤＣＷが２５．２であったことを示し、これは分析した株中で３番目に高いＥＰＡ％ＤＣＷ測定値であった。Ｚ６９０５株中では、ＤＣＷが４．８ｇ／Ｌ、ＴＦＡ％ＤＣＷが５２．８、ＥＰＡ％ＴＦＡが５０．０、およびＥＰＡ％ＤＣＷが２６．４であり、これは分析した株中で最も高いＥＰＡ％ＤＣＷ測定値であった。
【０２３８】
Ｚ６９０３株をさらに分析して、糖アルコール副産物アラビトール、マンニトールおよびエリスリトールのレベルを測定した（表１０）。この分析はまた、Ｚ６１０９株でも実施した（実施例１）。
【０２３９】
【表１７】
2016502852.tif 000019
【０２４０】
表１０の結果は、Ｚ６９０３株が、マンニトールまたはアラビトール副産物を産生しなかったことを示し、Ｓｏｕ２タンパク質が、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のマンニトールおよびアラビトール生合成に必須であることが示唆された。また、Ｚ６１０９株と比較して、Ｚ６９０３株は、約６８％少ない全糖アルコール副産物を産生した。これらの結果は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＳＯＵ２発現の下方制御が、糖アルコール副産物生成レベルを有意に低下させることを示す。
【０２４１】
実施例３
少なくとも約４９．３％の総脂質含量で総脂肪酸の少なくとも約４９．８％のＥＰＡを産生するＺ７４１８株の作成
本実施例は、Ｚ６９０３株の遺伝子修飾を通じた、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ７４１８株の作成を記載する。遺伝子修飾は、Δ８デサチュラーゼ、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、およびアシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＬＰＡＡＴ）をコードする発現カセットを導入することを必然的に伴った。下の実施例４に記載されるＺ９２７６株を開発するために、Ｚ７４１８株の開発が必要であった。
【０２４２】
図３Ｂは、Ｚ７４１８株を作成するために使用された、遺伝子修飾ステップおよび間性株（Ｚ６９０３Ｕ）を示す。Ｚ６９０３Ｕ株は、以下のようにして作成された。
【０２４３】
Ｚ６９０３Ｕ株の作成
コンストラクトｐＺＫＵＭ（上記）を使用して、Ｚ６９０３株中で、プラスミドｐＺＫＡＤｎ−ＳｙＰ２９８Ｆ（上記）によって導入されたＵＲＡ３遺伝子を妨害した。合計８つの５−ＦＯＡ−耐性形質転換体が増殖されて、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。最初の脂肪酸スクリーニングのために、個々の形質転換体を上述したように増殖させた。
【０２４４】
ＧＣ分析は、ＦＯＡプレートから選択されて、それぞれＺ６９０３Ｕ５、Ｚ６９０３Ｕ６、およびＺ６９０３Ｕ７と命名された、ｐＺＫＵＭ形質転換株＃５、＃６、および＃７のＴＦＡ中の３５．０％、３２．７％、および３７．７％のＥＰＡの存在を示した。これらの３つの形質転換体は、集合的にＺ６９０３Ｕ株と命名された。
【０２４５】
Ｚ７４１８株の作成
プラスミドｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎを使用して、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ（ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０；ＥｇＤ８Ｍは配列番号１９）、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシア（ｖｉｃｉａｅ）３８４１に由来するコドン最適化マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１；ＭＣＳは配列番号２１）、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１；ＹｌＬＰＡＡＴ１は配列番号２３）を発現するための遺伝子カセットを、Ｚ６９０３Ｕ株のＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）に組み込んだ。プラスミドｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎの構築が、記載されている（参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書、その中の表１１を参照されたい）。
【０２４６】
ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８ＮプラスミドをＡｓｃＩで消化して、次にＺ６９０３Ｕ５株を形質転換するのに使用した。形質転換細胞をウラシル非含有プレート上に播種して、３０℃で５〜６日間保った。最初の脂肪酸スクリーニングのために、単一コロニーを上述したように増殖させた。
【０２４７】
ＧＣ分析は、ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎで形質転換された選択された９６株のＺ６９０３Ｕ５のほぼ全てが、ＴＦＡの５０．０％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。１０株（＃８、＃９、＃３４、＃４０、＃４３、＃５８、＃５９、＃７０、＃７９、＃８０）は、ＴＦＡの約５２．１％、５０．３％、５１．５％、５１．１％、５３．５％、５１．４％、５０．８％、５２．２％、５１．２％、および５１．６％のＥＰＡ産生し、それぞれＺ７４１６、Ｚ７４１７、Ｚ７４１８、Ｚ７４１９、Ｚ７４２０、Ｚ７４２１、Ｚ７４２２、Ｚ７４２３、Ｚ７４２４、およびＺ７４２５と命名された。
【０２４８】
上記のＺ７４１６〜Ｚ７４２５株のＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座のノックアウトは、確認しなかった。野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ７４１８株およびその９つの同胞種の遺伝子型は、次のとおりであった：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知の１−、未知の２−、未知の３−、未知の４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知の６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知の８−、未知の１０−、未知の１１−、未知の１２−、未知の１３−、未知の１４−、Ｓｏｕ２−、未知の１５−、未知の１６−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＳＰＳ１９ＬＭ：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：ＧｌｏＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｅｒｐ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＳＰＳ１９−Ｐ３：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１。
【０２４９】
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
Ｚ７４１８株およびその同胞種の細胞を増殖させて、上述のフラスコアッセイによって、総脂質含量および脂肪酸組成について分析した。表１１は、Ｚ７４１６〜Ｚ７４２５株のＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸量、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０２５０】
【表１８】
2016502852.tif 000020
【０２５１】
表１１は、Ｚ７４１８株中で、ＤＣＷが５．９ｇ／Ｌ、ＴＦＡ％ＤＣＷが４９．８、Ｅ
ＰＡ％ＴＦＡが４９．３、およびＥＰＡ％ＤＣＷが２４．６であったことを示す。
【０２５２】
実施例４
少なくとも約５６．９％の総脂質含量で総脂肪酸の少なくとも約５７．５％のＥＰＡを産生するＺ９２７６株の作成
本実施例は、Ｚ７４１８株の遺伝子修飾を通じた、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ９２７６株の作成を記載する。遺伝子修飾は、変異アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）をコードする発現カセットを導入することを必然的に伴った。これとその他の変異ＬＰＣＡＴの構築および分析は、実施例６〜９に記載される。
【０２５３】
図３Ｂは、Ｚ９２７６株を作成するために使用された、遺伝子修飾ステップおよび間性株（Ｚ７４１８Ｕ）を示す。Ｚ７４１８Ｕ株は、以下のようにして作成された。
【０２５４】
Ｚ７４１８Ｕ株の作成
コンストラクトｐＺＫＵＭ（上記）を使用して、Ｚ７４１８株中で、プラスミドｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎ（上記）によって導入されたＵＲＡ３遺伝子を妨害した。合計２４の５−ＦＯＡ−耐性形質転換体が増殖されて、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。最初の脂肪酸スクリーニングのために、これらの形質転換体を上述したように増殖させた。
【０２５５】
ＧＣ分析は、ＦＯＡプレートから選択されて、それぞれＺ７４１８ＢＵ１、Ｚ７４１８ＢＵ２、Ｚ７４１８ＢＵ３、Ｚ７４１８ＢＵ４、およびＺ７４１８ＢＵ５と命名された、ＢグループｐＺＫＵＭ−形質転換株＃２、＃３、＃６、＃７、および＃８のＴＦＡ中の３５．７％、３６．１％、３２．３％３５．４、および３３．６％のＥＰＡの存在を示した。ＧＣ分析はまた、ＦＯＡプレートから選択されて、Ｚ７４１８ＣＵ１と命名された、ＣグループｐＺＫＵＭ−形質転換株＃６のＴＦＡ中の３５．９％のＥＰＡの存在も示した。ＧＣ分析はまた、ＦＯＡプレートから選択されて、それぞれＺ７４１８ＤＵ１、Ｚ７４１８ＤＵ２、およびＺ７４１８ＤＵ３と命名された、ＤグループｐＺＫＵＭ−形質転換株＃３、＃４、および＃７のＴＦＡ中の２４．２％、３４．９％、および３４．０％ＥＰＡの存在も示した。
【０２５６】
Ｚ９２７６株の作成
プラスミドｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８（図７Ｂ、配列番号２４）を作成して、二重変異Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＹｌＬＰＣＡＴ［Ｍ１３６Ｓ／Ｔ３８９Ａ］、配列番号２６）を発現するための遺伝子カセットを、Ｚ７４１８Ｕ株のＤ−アラビニトール２−デヒドロゲナーゼ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４８９５）に組み込んだ。表１２は、ｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８中に含有される構成成分を記載する。
【０２５７】
【表１９】
2016502852.tif 000021
【０２５８】
ｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８プラスミドをＡｓｃＩで消化して、次にＺ７４１８ＢＵ１株を形質転換するのに使用した。形質転換細胞をウラシル非含有プレート上に播種して、３０℃に５〜６日間保った。最初の脂肪酸スクリーニングのために、単一コロニーを上述したように増殖させた。
【０２５９】
ＧＣ分析は、選択された４８株のｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８で形質転換されたＺ７４１８ＢＵ１の内９株が、ＴＦＡの５５．０％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。これらの９株（＃１１、＃１３、＃１４、＃１５、＃２４、＃２５、＃３３、＃３７、＃４８）は、ＴＦＡの約５５．９％、５５．９％、５５．０％、５６．３％、５６．１％、５７．１％、５５．３％、５５．１％、および５６．１％のＥＰＡを産生し、それぞれＺ９２５６、Ｚ９２５７、Ｚ９２５８、Ｚ９２５９、Ｚ９２６０、Ｚ９２６１、Ｚ９２６２、Ｚ９２６３、およびＺ９２６４と命名された。
【０２６０】
ＧＣ分析は、選択された６０株のｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８で形質転換されたＺ７４１８ＢＵ２の内１１株が、ＴＦＡの５４．７％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。これらの１１株（＃１、＃５、＃８、＃１０、＃１８、＃２６、＃３０、＃３５、＃４２、＃４５、＃５４）は、約５６．５％、５４．８％、５７．９％、５６．１％、５７．３％、５８．８％、５４．９％。５４．７％。５５．４％および５５．５％のＥＰＡを産生し、それぞれ、Ｚ９２６５、Ｚ９２６６、Ｚ９２６７、Ｚ９２６８、Ｚ９２６９、Ｚ９２７０、Ｚ９２７１、Ｚ９２７２、Ｚ９２７３、Ｚ９２７４、およびＺ９２７５と命名された。
【０２６１】
ＧＣ分析は、選択された４４株のｐＺＫＭＰｎ−ＹＤ５８で形質転換されたＺ７４１８ＢＵ３の内４株が、ＴＦＡの５５．８％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。これらの４株（＃１０、＃１２、＃１５、＃１６）は、ＴＦＡの約５６．５％、５５．８％、５５．９％、および５６．２％のＥＰＡを産生し、それぞれＺ９２７６、Ｚ９２７７、Ｚ９２７８、およびＺ９２７９と命名された。
【０２６２】
上記のＺ９２５６〜Ｚ９２７９株のＤ−アラビニトール２−デヒドロゲナーゼ遺伝子座のノックアウトは、確認しなかった。野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ９２７６をはじめとするこれらの株の遺伝子型は、次のとおりであった：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知の１−、未知の２−、未知の３−、未知の４−、ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−、未知の６−、ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−、未知の８−、未知の１０−、未知の１１−、未知の１２−、未知の１３−、未知の１４−、Ｓｏｕ２−、未知の１５−、未知の１６−、未知の１７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＳＰＳ１９ＬＭ：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：ＧｌｏＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｅｒｐ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＳＰＳ１９−Ｐ３：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＣＡＴ（Ｍ１３６Ｓ／Ｔ３８９Ａ）：：Ｌｉｐ１。
【０２６３】
一段階フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
Ｚ９２７６をはじめとするＺ９２５６〜Ｚ９２７９株の細胞を増殖させて、以下のように説明される「一段階」フラスコアッセイによって総脂質含量および脂肪酸組成について分析した：
１白金耳の新鮮に画線塗抹された細胞を３ｍＬの一段階フラスコ培地に接種して（レシピ下述）、２５０ｒｐｍおよび３０℃で一晩培養した。培養物のＯＤ６００ｎｍを測定して、１２５ｍＬフラスコ内の１５ｍＬの一段階フラスコ培地に、培養物からの細胞のアリコートを０．２５の最終ＯＤ６００ｎｍに添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪インキュベーターに１日間入れた後に、１０ｍＬの高グルコース培地（８０ｇ／Ｌのグルコース、１．９ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、６．３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、８．４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．２）を同じフラスコに添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪インキュベーターに５日間入れた後に、脂肪酸分析のために１ｍＬのアリコートを使用し、乾燥細胞重量測定のために１０ｍＬを乾燥させた。脂肪酸およびＤＣＷ分析を上述したように実施した。
【０２６４】
一段階フラスコアッセイ培地：０．５ｇ／Ｌの尿素、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、３．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２０ｇ／ＬのＤ−グルコース、０．２ｍｌ／Ｌの微量金属溶液（１００×）、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ。
【０２６５】
微量金属溶液（１００×）：１０ｇ／Ｌのクエン酸、１．５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ。
【０２６６】
表１３は、Ｚ９２５６〜Ｚ９２７９株のＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸量、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
【０２６７】
【表２０】
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【０２６８】
表１３は、Ｚ９２６４を除く、試験した全ての株が、ＤＣＷとして３０．０％を超えるＥＰＡを産生したことを示す。Ｚ９２５６、Ｚ９２５９およびＺ９２７６株中のＥＰＡプロファイルは注目に値し、以下のように要約される。Ｚ９２５６株中では、ＴＦＡ％ＤＣＷが６１．３％、ＥＰＡ％ＴＦＡが５２．９％で、ＥＰＡ％ＤＣＷが３２．４％、およびＥＰＡ生産性が０．０１６５ｇ／Ｌ／ｈであった。Ｚ９２５９株中では、ＴＦＡ％ＤＣＷが６１．２％、ＥＰＡ％ＴＦＡが５３．９％で、ＥＰＡ％ＤＣＷが３３．０％、およびＥＰＡ生産性が０．０１６４ｇ／Ｌ／ｈであった。Ｚ９２７６株中では、ＴＦＡ％ＤＣＷが５６．９％、ＥＰＡ％ＴＦＡが５７．５％で、ＥＰＡ％ＤＣＷが３２．７％、およびＥＰＡ生産性が０．０１４３ｇ／Ｌ／ｈであった。
【０２６９】
表１３に列挙される株中の乾燥細胞重量基準の平均含油量は、５７．５％（ＴＦＡ％ＤＣＷ）であった。この平均含油量は、表１３中の株がそれから誘導されたＺ５５８５株（５６．６％、表４）の含油量よりも高い。特に、表１３の株中の油の全脂肪酸中の平均ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）は５４．６％でありこれは、Ｚ５５８５についての同じ測定よりも約１０．５％高かった（４９．４％、表４）。この油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量の増大は、Ｚ５５８５と比較して、表１３の株中で生成する総油量を保ちながら、乾燥細胞重量基準で、Ｚ５５８５（２８％、表４）と比較してより高い平均ＥＰＡ量（３１．４％）をもたらした。これは約１２．１％の増大に相当し、これは含油量について観察された約１０．５％の増大に一致する。
【０２７０】
表１３のいくつかの株は、Ｚ５５８５株と比較して、油およびＥＰＡ含有量に有意な増大を示した。例えばＺ９２５６およびＺ９２５９株の全含油量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、Ｚ５５８５株の全含油量と比較して、それぞれ約８．３％および８．１％増大した（表４）。Ｚ９２５６およびＺ９２５９株中の油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）は、Ｚ５５８５（表４）中の同じ測定と比較して、約７．１％および９．１％増大した。油含有量および油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量のこれらの堅調な増大は、Ｚ５５８５の全ＥＰＡ含有量（表４）と比較して、それぞれＺ９２５６およびＺ９２５９株の全ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）に、約１５．７％および１７．９％の増大をもたらした。
【０２７１】
表１３中の別の株、Ｚ９２７６は、Ｚ５５８５と比較して、含油量のわずかな増大を示したが、Ｚ５５８５中の同じ測定と比較して、油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）に１６．４％の増大を有した（表４）。このＥＰＡ％ＴＦＡのかなりの増大は、Ｚ５５８５の全ＥＰＡ含有量（表４）と比較して、Ｚ９２７６株の全ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）に約１６．８％の増大をもたらした。
【０２７２】
Ｚ５５８５株（表４）から表１３の株を作成するのに使用された遺伝子修飾は、このようにして、Ｚ５５８５の全含油量とほぼ同様のまたはより大きな全油含有量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）をもたらした。より顕著には、この全含油量の維持または増大は、全ＥＰＡ生成量を増大させる以前の努力における一般的問題であった、油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）低下と連動しなかった。この以前の問題は、例えば、その他の遺伝子修飾を通じた含油量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の増大が、一般に、油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＴＦＡ）の低下をもたらしたことを示す、表４のデータに反映される。したがって全ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）の以前の増大は、主に、総産油量の増大によって、ある程度促された。他方、表１３の株は、含油量全を保ちながらまたは増大させながら、主に油の全脂肪酸中のＥＰＡ含有量増大によって促された、全ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）の増大を示した。
【０２７３】
注目すべきことに、表１３のほぼ全ての株が、全油中の脂肪酸の百分率として、非常に低いレベルのステアリン酸を有した（１８：０％ＴＦＡ）。具体的には、株Ｚ９２６１を除く全ての株が、全脂肪酸の重量基準で２．０％以下のステアリン酸を有した。全ての株の平均レベルは、１．８％ステアリン酸であった。
【０２７４】
表１３の株の平均乾燥細胞重量（６．３ｇ／Ｌ）は、表４に列挙されるＺ５５８５株（４．６ｇ／Ｌ）および別の株の乾燥細胞重量と比較して、実質的に増大した。これは、Ｚ５５８５の乾燥細胞重量と比較して、約３７％の平均増大に相当する。Ｚ９２５６、Ｚ９２５９、およびＺ９２６３などの表１３中の特定の個々の株は、Ｚ５５８５と比較して、それぞれ約５４．３％、５２．２％、および５８．７％の乾燥細胞重量の増大を示した。
【０２７５】
フラスコアッセイでは、先のＺ５５６７株（表４）は、約０．４５ｇの有機酸／ｇ  ＤＣＷ、および約０．５０ｇの糖アルコール／ｇ  ＤＣＷ副産物を産生することが示された。他方、Ｚ９２７６株は、０．２７ｇの有機酸／ｇ  ＤＣＷ、および０．１８ｇの糖アルコール／ｇ  ＤＣＷを産生した。Ｚ５５６７株（表４）との対比で増大したＺ９２７６株中のＥＰＡ生成（表１３）と、Ｚ９２７６株による副産物生成の低下を考えると、Ｚ９２７６株がＥＰＡ生成に向かう炭素流の増大を有したことが、明らかである。
【０２７６】
要約すると、実施例２〜４でＺ５５８５株から表１３の株を開発するために用いられた遺伝子修飾は、次のとおりであった。実施例２では、Ｚ５５８５を最初に修飾して、Ｓｏｕ２タンパク質の発現を下方制御し、Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ株をもたらした。次にＰＤＡＴ、Δ１２デサチュラーゼ、およびＤＧＬＡシンターゼマルチザイムを過剰発現するための遺伝子カセットを導入して、Ｚ６９０３株をもたらした。実施例３では、Δ８デサチュラーゼ、ＭＣＳおよびＬＰＡＡＴを過剰発現するための遺伝子カセットが導入され、それによってＺ７４１８株をもたらした。最後に、本実施例では、変異ＬＰＣＡＴを過剰発現させるための遺伝子カセットを導入して、表１３の株をもたらした。１つを除いて、これらの株は全て、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも３０パーセントのＥＰＡを含有する油を産生し得る。
【０２７７】
実施例５
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で脂質生成および糖アルコール生成を改変するための遺伝子標的としてのＳＯＵ２遺伝子の同定
本実施例は、Ｓｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードするＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＯＵ２遺伝子が、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質および特定の糖アルコールのレベルを調節し得ることを記載する。具体的には、それは、ＳＯＵ２遺伝子が、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を妨害することが、株によって産生される油の量を増大させ、アラビトールおよびマンニトールの量を低下させることを示した。
【０２７８】
ＳＯＵ２遺伝子は、Ｚ１９７８株からのＺ３０４１株開発において、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質生成を改変する遺伝子標的と同定される。このプロセスに伴うステップは、間性株Ｚ１９７８Ｕ、Ｚ２６３６、およびＺ２６３６Ｕを伴う（図８）。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ株の開発は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書に記載される。
【０２７９】
Ｚ２６３６株は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＹｌＣＰＴ１；米国特許第７，９３２，０７７号明細書）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ９デサチュラーゼ（ＹｌＤ９；米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７号明細書）、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）アシルＣｏＡ：リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素ヌクレオチド配列（ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ；米国特許第号７，８７９，５９１明細書）を発現するためのカセットを含有する、プラスミドｐＺＫＴ２−ＭＬ９ＤＣＢ（配列番号２７、図９Ａ）で、Ｚ１９７８Ｕを形質転換して作成された。次にコンストラクトｐＺＫＵＭ（上記）を使用して、Ｚ２６３６株中で、プラスミドｐＺＫＴ２−ＭＬ９ＤＣＢによって導入されたＵＲＡ３遺伝子を妨害し、それによってＵｒａ−株Ｚ２６３６Ｕを生成する。
【０２８０】
Ｚ３０４１株は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙａｐ１（ＹｌＹＡＰ１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０４９４５）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ（Ｙｌ６ＰＧＬ、米国特許出願公開第２０１１−０２４４５１２号明細書）、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＹｌＧ６ＰＤＨ、４４０ｂｐのイントロンあり；米国特許出願公開第２０１１−０２４４５１２号明細書）を発現するためのカセットを含有する、ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ−消化プラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２ＹＡＰ（配列番号２８、図９Ｂ）で、Ｚ２６３６Ｕを形質転換することで、作成された。Ｚ３０４１は、同胞種Ｚ３０３０〜Ｚ３０４０およびＺ３０４２〜Ｚ３０５０株と共に作成した。
【０２８１】
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
Ｚ３０４１をはじめとするＺ３０２９〜Ｚ３０５０株の細胞を増殖させて、上述のフラスコアッセイによって、総脂質含量および脂肪酸組成について分析した。表１４は、Ｚ３０２９〜Ｚ３０５０株のＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡ重量％（％ＴＦＡ）としての各脂肪酸量、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。各値は、２つの測定値の平均に相当する。
【０２８２】
【表２１】
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【０２８３】
Ｚ３０４１株は、その全ての同胞種株と比較して、最大の含油量（約４２．１のＴＦＡ％ＤＣＷ）を有した（表１４）。またＺ３０４１の同胞種の大部分は４０％未満の油を有し、平均含油量は３８．３％であったので、Ｚ３０４１の含油量は注目に値する（表１４）。その同胞種と比較したＺ３０４１株の含油量の平均増大は、約１０．７％であった。これらの観察は、ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２ＹＡＰから組み込まれたＺ３０４１株中の配列が、表１４中の別の株の全てに提供される、追加的な効果を提供したことを示唆した。
【０２８４】
一つの可能性は、組み込みそれ自体が、合成に寄与する追加的な形質をＺ３０４１に提供したことであった。この見通しは、油レベル増大を与えるために、Ｚ３０４１株中でどの遺伝形質を改変してもよいかを判定するための、ゲノム歩行および配列決定分析に導いた。追加的な分析は、ＹｌＹＡＰ１、Ｙｌ６ＰＧＬ、およびＹｌ６ＰＤＨ発現カセットを含有する、ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２ＹＡＰの約１０．５ｋｂｐのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片が、ＳＯＵ２遺伝子のプロモーター（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ１８９６４ｇ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０３０１０、図５）に組み込まれたことを見出した。具体的には、ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩプラスミド断片は、ＳＯＵ２遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して−７０に組み込まれた；この位置は、推定ＴＡＴＡプロモーター共通配列のすぐ下流である。ＳＯＵ２プロモーターの組み込み位置を考えると、組み込みは、ＳＯＵ２遺伝子発現を下方制御する（転写の減少）ことが予測された。
【０２８５】
含油量増大を有する他に、Ｚ３０４１株は、Ｚ２６３６と比較して、特定の発酵副産物のより低いレベルもまた示した。具体的には、Ｚ３０４１中の糖アルコールアラビトールおよびマンニトールの生成を排除した。
【０２８６】
ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での油および糖アルコール生成量の調節における、ＳＯＵ２遺伝子の役割を理解するために、追加的な試験を実施した（実施例２を参照されたい）。簡単に述べると、ＳＯＵ２遺伝子がＺ５５８５株中でノックアウトされ、それによってＺ５５８５Ｋ２Ｕ株が生成する（図３）。ＳＯＵ２のノックアウトは、ＡＴＧ開始部位の約２３５塩基対上流から開始して、ＡＴＧ開始部位の約２８７塩基対下流に終わる約５２２塩基対の配列の標的化および欠失を必然的に伴った（図５、対向する三角形間の配列を参照されたい）。このようにしてＳＯＵ２遺伝子の転写およびＳｏｕ２タンパク質の発現は、Ｚ５５８５Ｋ２Ｕ株およびその子孫株中で完全に下方制御された。
【０２８７】
実施例６
変種ＹｌＬＰＣＡＴを含んでなるプラスミドｐＹ３０６−Ｎの合成
本実施例および実施例７〜９は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願第６１／６６１，６２３号明細書で開示される。
【０２８８】
野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＣＡＴ（ＹｌＬＰＣＡＴ）ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９および４０によって表わされる。
【０２８９】
本実施例は、変種ＹｌＬＰＣＡＴ配列を含んでなる、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製ベクターの構築を記載する（プラスミドｐＹ３０６−Ｎ、図１０、配列番号４２）。本明細書でＹｌＬＰＣＡＴ＊（配列番号４１）と称される変種ＹｌＬＰＣＡＴポリヌクレオチド配列は、野性型ＹｌＬＰＣＡＴコード領域内に存在する、２つのＮｃｏＩ制限酵素部位を欠く。これらの内部ＮｃｏＩ部位除去は、引き続くクローニング手順を容易にした。ＹｌＬＰＣＡＴ＊は、野性型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質（配列番号４０）をコードする。
【０２９０】
対照として、野性型ＹｌＬＰＣＡＴポリヌクレオチド配列（配列番号３９）をヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製ベクターにクローン化して、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ｆ１複製起点およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ３０６４２１）を含んでなる、プラスミドｐＹ３０６（配列番号４３）をもたらした。
【０２９１】
変種ＹｌＬＰＣＡＴ＊配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。サイレント変異を作成することで、２つの内部ＮｃｏＩ制限酵素認識部位を除去した一方で、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位をそれぞれＹｌＬＰＣＡＴ読み取り枠の５’および３’末端に付加して、クローニングを容易にした。具体的には、Ａ１２Ｔ変異（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号３９）中の１２位のアデノシン［Ａ］から、ＹｌＬＰＣＡＴ＊変種のチミン［Ｔ］への変化）およびＴ９１８Ｃ変異（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ（配列番号３９）中の９１８位のチミン［Ｔ］から、ＹｌＬＰＣＡＴ＊変種のシトシン［Ｃ］への変化）をＹｌＬＰＣＡＴコード配列に導入した。これらの２つのヌクレオチド置換は、変異配列によってコードされるアミノ酸に関してサイレントであった。その内部ＮｃｏＩ部位が欠如している変種ＹｌＬＰＣＡＴ（すなわちＹｌＬＰＣＡＴ＊）をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４１によって表わされる一方、それによってコードされるアミノ酸配列は、野性型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質である配列番号４０によって表わされる。
【０２９２】
ＹｌＬＰＣＡＴ＊は、引き続いてプラスミドｐＹ３０６にクローン化され、それによってｐＹ３０６−Ｎ（配列番号４２；図１０）が生成する。コンストラクトｐＹ３０６−Ｎは、以下の成分を含有する。
【０２９３】
【表２２】
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【０２９４】
それぞれ下の実施例７および９に記載されるように、プラスミドｐＹ３０６−Ｎを使用して、ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質の単一および二重変異体を調製した。
【０２９５】
実施例７
修飾モチーフのある変異ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＰＣＡＴ酵素のデザインおよび合成
ＹｌＬＰＣＡＴ中の保存アミノ酸モチーフが、触媒作用に関与する可能性が高いという前提に基づいて、変種モチーフを有する変異体の作成が、改善された機能活性を有するＬＰＣＡＴ酵素の同定をもたらすと結論付けた。
【０２９６】
配列番号４０のアミノ酸残基１３２〜１４８に及ぶ保存配列（すなわちモチーフＩ）、および配列番号４０のアミノ酸残基３７６〜３９０に及ぶ保存配列（すなわちモチーフＩＩ）中の一連の単一アミノ酸置換がデザインされた。表１６に示されるように、モチーフ中の１７個のアミノ酸残基のそれぞれに様々な置換を作成することで、モチーフＩ中で、合計１９５個のアミノ酸置換がデザインされた。
【０２９７】
【表２３】
2016502852.tif 000025
【０２９８】
同様に、モチーフ中の１５アミノ酸残基の内１２個に様々な置換を作成することで、表１７に示されるように、モチーフＩＩ中に合計１３４個のアミノ酸置換をデザインした。ＹｌＬＰＣＡＴのＨ３８０に相当するその他のＬＰＣＡＴのヒスチジンは、活性部位残基である可能性が高いと報告されているため、Ｗ３７９、Ｈ３８０およびＧ３８１の置換は作成しなかった（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：１１７４−１１８４）。
【０２９９】
【表２４】
2016502852.tif 000026
【０３００】
上記表１６および１７に記載される３２９個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体のそれぞれは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、個別に合成され、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ｃｕｔ  ｐＹ３０６−Ｎベクターにクローン化された。
【０３０１】
実施例８
改善されたＬＰＣＡＴ活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ中の単一アミノ酸置換の同定
本実施例は、ＹｌＬＰＣＡＴ変異ポリヌクレオチド配列（実施例７）を含んでなる３２９個の各ｐＹ３０６−Ｎベクターの、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株への変換と、それに続く形質転換体の脂質プロファイル分析を記載する。
【０３０２】
改善されたＬＰＣＡＴ活性は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書に記載される観察に基づいて、間接的に評価した。具体的には、どちらかの要素を親野性型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質を発現するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株のＥＰＡ％ＴＦＡまたはΔ９エロンガーゼ変換効率と比較する場合、変異ＹｌＬＰＣＡＴを含んでなる、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株形質転換体中の改善されたＬＰＣＡＴ活性は、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ濃度（ＥＰＡ％ＴＦＡ）の増大および／またはΔ９エロンガーゼ変換効率の増大に基づいて結論付けられた。
【０３０３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株の形質転換
Ｙ８４０６Ｕ２株を形質転換して、実施例７で調製された変異ＹｌＬＰＣＡＴを含有する各ｐＹ３０６−Ｎベクターの１つを個別に発現させた。Ｙ８４０６Ｕ２は、Ｙ８４０６のＵｒａ−株である。Ｙ８４０６およびＹ８４０６Ｕ２株開発に関する詳細は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書で提供される。形質転換に続いて、上述したように、個々の形質転換体を最初の脂肪酸スクリーニングプロセスの対象とした。簡単に述べると、ＭＭプレート上で３０℃で５〜６日間増殖させた単一コロニーを再度画線塗抹して、ＭＭプレート上で３０℃で２日間増殖させた。次に単一コロニーを２４ウェルプレート内の３ｍＬのＭＭに接種して、３０℃で２日間、２５０ｒｐｍで振盪した。各ウェルからの細胞を遠心分離によって収集し、ＨＧＭに再懸濁して、次に２００ｒｐｍで５日間振盪した。次に細胞を脂肪酸分析のために、上述したように処理した。
【０３０４】
ＹｌＬＰＣＡＴの単一変異体の発現に関する形質転換ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の脂質プロファイルの分析
下の表１８（バッチ１）、１９（バッチ２）、２０（バッチ３）、２１（バッチ４）、および２２（バッチ５）は、特定の単一変異ＹｌＬＰＣＡＴ（モチーフＩまたはモチーフＩＩ中の単一アミノ酸置換）を発現するためのプラスミドを含んでなる、個々のＹ８４０６Ｕ２形質転換体の脂肪酸プロファイルおよびΔ９エロンガーゼ変換効率を示す。これらの測定はまた、以下の特定の対照についても実施した：空ベクター（ＥＶ）（すなわちＬＰＣＡＴ遺伝子のない複製型プラスミド［バッチ＃１のみ］）またはｐＹ３０６−Ｎ（野性型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質発現［ＷＴ］）を含んでなる形質転換体。
【０３０５】
より具体的には、各表は、それぞれ特定の形質転換体について分析された複製の数（＃）、ＴＦＡの重量％としての平均各脂肪酸濃度（％ＴＦＡ）、ＥＰＡ％ＴＦＡの標準偏差（ＥＰＡ  ＳＤ）、およびΔ９エロンガーゼ変換効率（％変換）を要約する。％変換は、次式に従って各形質転換体について計算された：（ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）／（Ｃ１８：２＋Ｃ１８：３＋ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ＋ＡＲＡ＋ＥＲＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ）＊１００
【０３０６】
野性型ＹｌＬＰＣＡＴ対照に対する各変異株の比較は、その中で各変異株が分析される特定バッチ内でのみ実行すべきである（すなわち例えばバッチ＃１およびバッチ＃２の間で比較してはならない）。太字で示され「＋」がそれに続く変異体を、下で考察されるようにさらなる試験のために選択した。
【０３０７】
【表２５】
2016502852.tif 000027
【０３０８】
【表２６】
2016502852.tif 000028
【０３０９】
【表２７】
2016502852.tif 000029
【０３１０】
【表２８】
2016502852.tif 000030
【０３１１】
【表２９】
2016502852.tif 000031
【０３１２】
【表３０】
2016502852.tif 000032
【０３１３】
【表３１】
2016502852.tif 000033
【０３１４】
【表３２】
2016502852.tif 000034
【０３１５】
【表３３】
2016502852.tif 000035
【０３１６】
【表３４】
2016502852.tif 000036
【０３１７】
【表３５】
2016502852.tif 000037
【０３１８】
【表３６】
2016502852.tif 000038
【０３１９】
【表３７】
2016502852.tif 000039
【０３２０】
【表３８】
2016502852.tif 000040
【０３２１】
【表３９】
2016502852.tif 000041
【０３２２】
上記データに基づいて、ＹｌＬＰＣＡＴ単一アミノ酸変異体のいくつかが、親野性型ＹｌＬＰＣＡＴ酵素（配列番号４０）と比較して、ほぼ同等のまたは改善された活性で機能したことが明らかであった。この結論は、ＬＰＣＡＴ活性をＥＰＡ％ＴＦＡおよび／また
は％変換の関数として測定することに基づいてなされた。事実上、全ての変異ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体は、対照中（野性型ＹｌＬＰＣＡＴを用いた形質転換体）で測定されたＥＰＡ％ＴＦＡの少なくとも７５％のＥＰＡ％ＴＦＡを有した。また全ての変異ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体は、対照中で測定された％変換の少なくとも８７．６％の％変換を有した。
【０３２３】
５６個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体（配列番号４０と比較して、以下の変異の１つを含んでなる：Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｃ、Ｌ１３４Ｇ、Ｃ１３５Ｄ、Ｃ１３５Ｉ、Ｍ１３６Ｇ、Ｍ１３６Ｐ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｎ、Ｋ１３７Ｇ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｙ、Ｌ１３８Ａ、Ｌ１３８Ｈ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１３９Ｌ、Ｓ１３９Ｗ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｐ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ａ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｇ１４２Ｈ、Ｗ１４３Ｌ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｋ、Ｎ１４４Ｆ、Ｎ１４４Ｔ、Ｎ１４４Ｖ、Ｖ１４５Ａ、Ｖ１４５Ｇ、Ｖ１４５Ｅ、Ｖ１４５Ｍ、Ｖ１４５Ｆ、Ｖ１４５Ｗ、Ｙ１４６Ｇ、Ｙ１４６Ｌ、Ｙ１４６Ｍ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｈ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１４８Ｎ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｒ３８３Ｍ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９Ｓ、およびＦ３９０Ｃ）が、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡ、および同等のまたは改善された％変換を提示することが分かった。変異体Ｖ１３３Ｃ、Ｍ１３６Ｎ、Ｌ１３８Ｇ、Ｌ１３８Ｉ、Ｌ１３８Ｎ、Ｓ１３９Ｇ、Ｓ１３９Ｎ、Ｗ１４３Ｈ、Ｇ１４８Ｖ、Ｌ３８８Ｈ、Ｌ３８８Ｔ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０Ｎ、およびＦ３９０Ｔをはじめとする、追加的な１４個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体が、対照と比較して、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有する（が、同等のまたは改善された％変換は有しない）と判定された。変異体Ｃ１３５Ｆ、Ｍ１３６Ｔ、Ｓ１４０Ｙ、Ｓ１４０Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｇ１４２Ｉ、Ｇ１４２Ｖ、Ｄ１４７Ｅ、Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｙ、Ｒ３８３Ａ、およびＦ３９０Ｓをはじめとする、追加的な１２個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体が、対照と比較して、同等のまたは改善された％変換を有する（が、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡは有しない）と判定された。
【０３２４】
それぞれモチーフＩまたはモチーフＩＩのどちらかの中の単一変異を含んでなり、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または同等のまたは改善された％変換を有する、合計２６のＹｌＬＰＣＡＴ変異体をさらなる評価のために選択した（下記の実施例９）：Ｌ１３４Ａ（１００．４％、１００．６％）、Ｌ１３４Ｇ（１０１．３％、１００．７％）、Ｍ１３６Ｓ（１０４．０％、１０４．０％）、Ｍ１３６Ｖ（１０２．２％、１０３．３％）、Ｋ１３７Ｈ（１０７．３％、１０４．４％）、Ｋ１３７Ｎ（１０１．８％、１０２．０％）、Ｓ１４０Ｈ（１０７．３％、１０４．３％）、Ｓ１４０Ｗ（１０３．２％、１０３．８％）、Ｆ１４１Ｍ（１０５．４％、１０６．７％）、Ｆ１４１Ｗ（１０１．２％、１０１．６％）、Ｎ１４４Ａ（１０５．３％、１０３．４％）、Ｎ１４４Ｔ（１０１．８％、１０１．６％）、Ｖ１４５Ｍ（１０２．０％、１０４．０％）、Ｖ１４５Ｗ（１００．４％、１００．５％）、Ｄ１４７Ｈ（１０５．３％、１０２．３％）、Ｄ１４７Ｑ（１０３．６％、１０１．２％）、Ｇ１４８Ａ（１０１．３％、１０１．８％）、Ｇ１４８Ｎ（１０２．２％、１０１．８％）、Ｔ３８２Ｉ（１０２．９％、１０２．５％）、Ｔ３８２Ｐ（１００．２％、１００．２％）、Ｒ３８３Ｍ（１０３．６％、１０４．０％）、Ｌ３８８Ｇ（１０１．６％、１００．２％）、Ｌ３８８Ｙ（１００．０％、９９．９％）、Ｔ３８９Ａ（１０２．２％、１０１．２％）、Ｔ３８９Ｃ（１０２．１％、１０１．５％）、Ｔ３８９Ｓ（１０１．９％、１０１．７％）。ここで各括弧内の組の１番目および２番目の百分率は、それぞれ野性型ＹｌＬＰＣＡＴ対照形質転換体中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換と比較した、変異ＹｌＬＰＣＡＴ形質転換体中のＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換の百分率比に相当する。それぞれモチーフＩまたはモチーフＩＩのどちらかの単一変異を含んでなる、追加的な８個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体を、さらなる評価のために選択した（下記の実施例９）：Ｆ３７８Ｙ（９９．６％、１０１．１％）、Ｔ３８２Ｙ（９９．８％、１００．８％）、Ｐ３８４Ａ（９８．７％、９９．０％）、Ｐ３８４Ｇ（９９．
２％、９８．６％）、Ｌ３８８Ｔ（１００．５％、９８．３％）、Ｆ３９０Ｇ（１０２．４％、９９．８％）、Ｆ３９０Ｓ（９９．４％、１００．５％）およびＦ３９０Ｔ（１０１．６％、９９．３％）、ここで括弧内の組は上記のとおりである。
【０３２５】
実施例９
改善されたＬＰＣＡＴ活性を有するＹｌＬＰＣＡＴ中の二重アミノ酸置換の同定
本実施例は、モチーフＩ中の単一変異とモチーフＩＩ中の単一変異の双方を含んでなる、ＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体の合成を記載する。これらの二重変異体をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株に形質転換して、形質転換体の脂質プロファイル分析がそれに続いた。実施例８と同様に、ＥＰＡ％ＴＦＡおよび％変換に基づいて、改善されたＬＰＣＡＴ活性を間接的に評価した。
【０３２６】
二重ＹｌＬＰＣＡＴ変異体の作成
モチーフＩ中の好ましい単一変異（Ｌ１３４Ａ、Ｌ１３４Ｇ、Ｍ１３６Ｓ、Ｍ１３６Ｖ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１３７Ｎ、Ｓ１４０Ｈ、Ｓ１４０Ｗ、Ｆ１４１Ｍ、Ｆ１４１Ｗ、Ｎ１４４Ａ、Ｎ１４４Ｔ、Ｖ１４５Ｗ、Ｖ１４５Ｍ、Ｄ１４７Ｈ、Ｄ１４７Ｑ、Ｇ１４８Ａ、およびＧ１４８Ｎ）を、モチーフＩＩ中の好ましい単一変異（Ｆ３７８Ｙ、Ｔ３８２Ｉ、Ｔ３８２Ｐ、Ｔ３８２Ｙ、Ｒ３８３Ｍ、Ｐ３８４Ａ、Ｐ３８４Ｇ、Ｌ３８８Ｇ、Ｌ３８８Ｔ、Ｌ３８８Ｙ、Ｔ３８９Ａ、Ｔ３８９Ｃ、Ｔ３８９Ｓ、Ｆ３９０Ｇ、Ｆ３９０Ｓ、Ｆ３９０Ｔ）と組み合わせて、様々な二重変異ＹｌＬＰＣＡＴ配列の組み合わせを作成した。したがって例えばモチーフＩ中のＳ１４０Ｗ変異と、モチーフＩＩ中のＴ３８２Ｉ変異を含んでなるＹｌＬＰＣＡＴ変異体は、本明細書でＹｌＬＰＣＡＴ変異株Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｉと称される。これらの二重変異体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって個別に合成され、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ  ｃｕｔ  ｐＹ３０６−Ｎベクターにクローン化された；配列番号７４は、クローン化配列によってコードされる変異ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質に相当する。
【０３２７】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株の形質転換およびｐＹ３０６−Ｎ形質転換体中の脂質プロファイル分析
実施例８に記載されるようにして、プラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ２株に形質転換し、引き続いて形質転換体を増殖させて脂質分析した。表２３（バッチ６）、２４（バッチ７）、２５（バッチ８）および２６（バッチ１０）は、Ｙ８４０６Ｕ２の個々の形質転換体の脂肪酸プロファイルおよびΔ９エロンガーゼ変換効率を示す。これらの測定はまた、ｐＹ３０６−Ｎ（野性型ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質発現［ＷＴ］）を含んでなる対照形質転換体についても実施した。表は、実施例８に記載されるようにフォーマットされている。
【０３２８】
野性型ＹｌＬＰＣＡＴ対照に対する各変異株の比較は、その中で各変異株が分析される特定バッチ内でのみ実行すべきである（すなわち例えばバッチ＃６およびバッチ＃７の間で比較してはならない）。太字で示され「＋」がそれに続く変異体を、下で考察されるようにフラスコアッセイをはじめとする、さらなる試験のために選択した。
【０３２９】
【表４０】
2016502852.tif 000042
【０３３０】
【表４１】
2016502852.tif 000043
【０３３１】
【表４２】
2016502852.tif 000044
【０３３２】
【表４３】
2016502852.tif 000045
【０３３３】
【表４４】
2016502852.tif 000046
【０３３４】
【表４５】
2016502852.tif 000047
【０３３５】
【表４６】
2016502852.tif 000048
【０３３６】
【表４７】
2016502852.tif 000049
【０３３７】
【表４８】
2016502852.tif 000050
【０３３８】
上記データに基づいて、上で分析された１６７個のＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体の大部分は、親野性型酵素（配列番号４０）と比較して、ほぼ同等または改善された活性で機能したことが明らかである。この結論は、ＬＰＣＡＴ活性をＥＰＡ％ＴＦＡおよび／または％変換の関数として測定することに基づいてなされた。
【０３３９】
より具体的には、モチーフＩ中の単一アミノ酸変異およびモチーフＩＩ中の単一アミノ酸変異を含んでなる、１０６個のＹｌＬＰＣＡＴ変異体は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡと、同等のまたは改善された％変換とを提示することが分かった。これらの変異体は、Ｌ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｌ１３４Ａ＿Ｆ３９０ＴＭ１３６Ｓ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｐ３８４Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｐ３８４Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ａ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｐ３８４Ａ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｐ３８４Ａ、Ｆ１４１Ｍ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｐ３８４Ａ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｎ１４４Ａ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｐ３８４Ａ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ａ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｎ１４４Ｔ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８９Ａ、Ｖ１４５Ｍ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｖ１４５Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｄ１４７Ｑ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｄ１４７Ｑ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３７８Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８２Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｒ３８３Ｍ、Ｇ１４８Ａ＿Ｐ３８４Ｇ、Ｇ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｇ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｙ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８９Ａ、Ｇ１４８Ａ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｔ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｇ、およびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓ）であった。
【０３４０】
（分析した１６７株の内）追加的な１５個のＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体が、対照と比較して同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡを有した一方で、（分析した１６７株の内）追加的な６個のＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体は、対照と比較して同等のまたは改善された％変換を有すると判定された。
【０３４１】
フラスコアッセイによって、ＬＰＣＡＴ活性の改善が確認された
それぞれモチーフＩ中の単一アミノ酸変異およびモチーフＩＩ中の単一アミノ酸変異を含んでなり、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡ、および／または同等のまたは改善された％変換を有する、合計２３のＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体をさらなる評価のために選択した（これらの変異体は、表２３〜２６で、太字および「＋」で表記される）。これらの変異体は、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ａ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｆ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｌ１３４Ａ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｋ１３７Ｎ＿Ｆ３９０Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｋ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｔ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｓ１４０Ｈ＿Ｌ３８８Ｇ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｄ１４７Ｈ＿Ｔ３８２Ｉ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２Ｉ、およびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓであった。さらに、対照と比較して、それぞれわずかに減少したＥＰＡ％ＴＦＡおよびわずかに減少した％変換を有する変異体Ｍ１３６Ｖ＿Ｆ３７８Ｙ、およびＧ１４８Ａ＿Ｌ３８８Ｔをさらなる評価のために選択した。
【０３４２】
これらの二重変異体ＹｌＬＰＣＡＴタンパク質を発現する形質転換体を、総脂質含量および組成の詳述な分析のために、フラスコアッセイした。具体的には、二重変異体株を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）試験管内の３ｍＬのＦＭ個別に接種し３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００ｎｍを測定し、最終ＯＤ６００ｎｍが０．３になるように、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬＦＭ培地に細胞のアリコートを添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃のＭｕｌｔｉｔｒｏｎ振盪インキュベーターに２日間入れた後に、６ｍＬの培養物を遠心分離によって収集し、元の１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁した。２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪培養器に５日間（１２０時間）入れた後、フラスコに水を添加して総容積を２５ｍＬに戻した（それによって蒸発を考慮した）。脂肪酸分析（上記）のためにアリコートを使用し、乾燥細胞重量測定（上記）のために１０ｍＬの培養物を乾燥させた。
【０３４３】
フラスコアッセイ結果は、下の表２７（グループＩ）および２８（グループＩＩ）に示される。表は、特定の形質転換体について分析された複製の数（＃）、細胞の平均総合乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、細胞平均総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）、ＴＦＡの重量％平均各脂肪酸濃度（「％ＴＦＡ）、Δ９エロンガーゼ変換効率（％変換）、および乾燥細胞重量の百分率としての平均ＥＰＡ含有量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）を要約する。
【０３４４】
【表４９】
2016502852.tif 000051
【０３４５】
【表５０】
2016502852.tif 000052
【０３４６】
それぞれモチーフＩ中の単一アミノ酸変異およびモチーフＩＩ中の単一アミノ酸を含んでなる、分析した変異２５個のＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体の内、１７個は、同等のまたは改善されたＥＰＡ％ＴＦＡと、同等のまたは改善された％変換の双方を有することが観察された一方で、残りの８個は同等のまたは改善された％変換を有した。
【０３４７】
上記データに基づいて、分析された２２個の２５ＹｌＬＰＣＡＴ二重変異体は、親野性型酵素（配列番号４０）と比較して、改善された活性で機能した。
【０３４８】
また、特定の二重変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの過剰発現は、組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）で総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の増大をもたらした。例えば、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８２Ｐ、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｓ、およびＦ１４１Ｗ＿Ｔ３８２Ｉ、またはＫ１３７Ｈ＿Ｌ３８８Ｇの変異ペアを含んでなる変異ＬＰＣＡＴポリペプチドの過剰発現は、対照の総脂質含量と比較して、８％以上増大された総脂質含量をもたらした（表２７および２８）。興味深いことに、特定の形質転換体は、総脂質含量およびＥＰＡ％ＴＦＡの双方の増大を有した。例えば、Ｓ１４０Ｗ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、またはＭ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓの変異ペアがある、ＬＰＣＡＴを過剰発現する形質転換体は、対象と比較して、少なくとも５％の総脂質含量の増大と、少なくとも約３％のＥＰＡ％ＴＦＡの増大を有した（表２７および２８）。総脂質含量およびＥＰＡ％ＴＦＡの双方の同時の増大を誘導することは、以前は困難であったので、これは重要な観察である。通常は、総脂質含量の増大が、ＥＰＡ％ＴＦＡの低下に対応して、逆もまた然りであった。
【０３４９】
表２７および２８において、太字および「＋」で列挙される、二重変異ＹｌＬＰＣＡＴポリペプチド、すなわちＭ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ａ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｍ１３６Ｓ＿Ｔ３８９Ｓ、Ｍ１３６Ｖ＿Ｔ３８９Ｃ、Ｎ１４４Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ａ＿Ｆ３９０Ｓ、Ｇ１４８Ｎ＿Ｔ３８２Ｉ、およびＧ１４８Ｎ＿Ｆ３９０Ｓは、本明細書で、それぞれ配列番号２６、７５、７６、７７、７８、７９、８０、および８１として開示される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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