(57)【要約】  本発明は、インフルエンザ由来の核タンパク質抗原の細胞性の免疫原性を増強するための、Ａ、ＢまたはＣ型インフルエンザ株由来の核タンパク質抗原の変異体とＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体とを含んでなる融合タンパク質に関する。本発明はまた、インフルエンザ疾患の予防および治療用ワクチンまたは免疫療法としての使用のための核酸、ベクター、融合タンパク質および免疫原性組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＰ抗原の少なくとも１つの変異体とニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体とを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項２】
前記少なくとも１つの核タンパク質抗原が、Ａ、ＢまたはＣ型インフルエンザ株に由来する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記核タンパク質抗原が単量体抗原である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記単量体核タンパク質抗原が、Ａ型インフルエンザ株に由来し、以下の２つの点突然変異：Ｅ３３９ＡおよびＲ４１６Ａのうち少なくとも１つを示す、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記単量体核タンパク質抗原が、配列番号２の配列によりコードされている、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体がＩＭＸ３１３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＩＭＸ３１３が配列番号１の配列を示す、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体が、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（ここで、（ｉ）Ｚは任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、かつ、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である）を有する少なくとも１つの正電荷ペプチドのＣ末端置換を含んでなるＩＭＸ３１３担体タンパク質の変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＩＭＸ３１３担体タンパク質の変異体が、配列番号４または配列番号５の配列を示す、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＮＰ抗原がシグナルペプチドを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１２】
前記ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体が配列番号４または配列番号５の配列を有する融合タンパク質をコードする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
配列番号６または配列番号７の配列を示す、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずか一項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸または請求項１４に記載のベクター、および
細胞内ＴＬＲに対する核酸リガンド
を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記細胞内ＴＬＲに対する核酸リガンドがポリＩ：Ｃである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ワクチンアジュバントをさらに含んでなる、請求項１５または１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
インフルエンザ疾患の予防および治療用のワクチンまたは免疫療法としての使用のための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
配列番号２で示される配列を有する核タンパク質抗原を配列番号４または配列番号５で示される配列を有する担体タンパク質に融合させ、ヒトまたは動物の身体に投与することにより、インフルエンザの核タンパク質抗原に対する細胞性免疫応答を増強するための方法。
【請求項２０】
必要とするヒトまたは動物においてインフルエンザ疾患を予防または治療するための方法であって、請求項１５〜１７の一項に記載の免疫原性組成物を前記ヒトまたは動物の身体に投与することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
改良されたインフルエンザワクチンの必要がある。インフルエンザに対する現ワクチン戦略は、血球凝集素に対してロバストな抗体（体液性）応答を生成することに焦点が当てられている。１年のうちに起こる循環性インフルエンザ株間の高い程度の抗原ドリフトのために、ワクチン株はインフルエンザシーズンごとに具体的に再処方しなければならない。毎年の（または季節的な）インフルエンザワクチンは、種々の年齢カテゴリーで様々な程度に成功を収めているが、特に、若齢者および高齢者にはより効果的な防御が明らかに必要である。さらに、「抗原シフト」として知られるプロセスで極めて異なるＨＡ（血球凝集素）遺伝子を獲得した合併結合変異ウイルス(reassortant viruses)が発達する大きな永続的リスクが存在する。現インフルエンザワクチンは本質的にＨＡ抗原に頼るものであるので、前記のことは公衆衛生の緊急事態を生み出すことになる。
【０００２】
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)ウイルスの、エンベロープを有する、一本鎖、ネガティブセンスＲＮＡウイルスであり、Ａ、Ｂ、およびＣの３つの主要なタイプに分類される。Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒト、鳥類、ブタ、ウマ、コウモリおよび他の多くを含む多様な動物に感染するが、特定のインフルエンザウイルスの向性は一般に特定の宿主に対して適合性が高い。Ｂ型インフルエンザウイルスは、少数の種、すなわち、ヒトおよびアザラシにしか感染しないが、やはり周年的インフルエンザ流行の実質的な原因となっている。ほとんどのヒトインフルエンザ感染はＡ型またはＢ型インフルエンザにより引き起こされ、ヒトおよびブタに感染するＣ型インフルエンザウイルスは、まれにではあるが、重大なヒト感染または流行の原因となる(Lamb)。
【０００３】
現在の不活化インフルエンザウイルスワクチンは、近縁のウイルス株から防御する抗体を含む。現在の許諾ワクチンは主として、ウイルス表面にある、免疫原性の高い主要抗原決定基である血球凝集素（ＨＡ）に対する株特異的中和抗体を誘導し、マッチするウイルス株の感染により引き起こされる疾患を予防することができる。しかしながら、ＨＡには実質的な抗原変異があり、これにより、幅広い防御を提供するように設計されるワクチンにおいては単独では使用できない。このため、変異性の小さい標的に対する防御応答を生じる代替ワクチン戦略への注目が大きい。
【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスの自然感染は、体液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する。長時間持続する細胞性免疫は、主として、核タンパク質（ＮＰ）などの、保存されている内部ウイルスタンパク質に向けられる。ＮＰ抗原は、自然感染後のヒトにおいて免疫原性があるが、誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球は短命である(McMichael a、McMichael b)。
【０００５】
ＮＰに対する細胞性免疫は、ＮＰエピトープの種々の変異体に対して向けられるので有用であり、ＮＰを標的とするＤＮＡワクチンは、動物において交差感染防御免疫を誘導した(Schotsaert)。
【０００６】
核タンパク質（ＮＰ）抗原は、保存性の高い抗原として長年認識されており、最も発散性の高いインフルエンザＡ株であっても、それがコードするＮＰタンパク質に９０％の同一性を有する(Gorman、Xu)。ＮＰに対する抗原変化はまれであり、軽微な程度でしか起こらない(Stanekova)。
【０００７】
従来技術
ワクチンにおける抗原としての核タンパク質の使用
抗原としてのインフルエンザ核タンパク質の使用は、１９８０年代に記載されている(Wraith)。マウスにおけるＮＰに対する細胞性免疫応答は免疫を誘導することができ、特に、発散性のＡ型ウイルスに対する交差防御を生じることができる。Ｈ３Ｎ２ウイルスから精製されたＮＰによるマウスの免疫誘導は致死的な異種（Ｈ１Ｎ１）抗原投与からの実質的防御（７５％）を与えることができたが、感染は回避できなかったことが示された。
【０００８】
ＮＰ遺伝子を用いたＤＮＡワクチンは２０年間知られており、前記ワクチンはＤＮＡワクチン接種自体の最初の「概念実証」試験に用いられた(Ulmer)。
【０００９】
ウイルスベクターからのＮＰの発現は１９８０年代に初めて実証され(Yewdell 1985)、このベクターによる免疫誘導が、ＤＮＡワクチンに比べて、発散性のＡ型インフルエンザ株に対する細胞傷害性Ｔリンパ球の生成の改善に関連付けられたが、Ｂ株についてはこの限りでなかった。
【００１０】
その後、ＰＲ８核タンパク質を発現するＭＶＡベクターによるマウスの免疫誘導が、亜型インフルエンザウイルスによる低用量抗原投与に対してそれらを防御したことが示された(Altstein)。もっと最近では、Ｍ１タンパク質に融合されたＮＰタンパク質をコードするウイルスベクターが、ヒトの免疫誘導に使用された(Lillie、Berthoud、Antrobus)。これらの研究は、特に、高齢者において、体液性応答が免疫老化によって低下している際に、ＮＰに対する細胞性免疫応答が実質的に追加増強可能であることを示した(Antrobus)。
【００１１】
核タンパク質の分泌
いくつかの研究では、ＮＰタンパク質は主として核内に位置し、このことがこのようなＤＮＡワクチンの免疫原性を低下させていることが示唆されている(Stanekova)。
【００１２】
ＮＰに対する細胞性免疫応答の改善は、例えば、ＮＰ遺伝子にｔＰＡシグナルペプチドを融合すること(Luo)、ＤＮＡの処方(Greenland、Sullivan)およびＤＮＡ送達を改善するためのエレクトロポレーションの使用(Laddy)によるなど、ＮＰの分泌を強制することによって得ることができる。
【００１３】
単量体インフルエンザ核タンパク質
Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインと融合した単量体抗原の好ましい使用が特許出願ＷＯ２００５／０１４６５４に記載されている。しかし、単量体化された抗原を使用することのリスクは、それらの免疫原性の低下である。このことは、Ｂａｃｈｍａｎｎおよび共同研究者らによって水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇを用いて実証され(Bachmann 1993)、インフルエンザ抗原ノイラミダーゼ、またはＮＡに関しては、Ｆｉｅｒｓおよび共同研究者らによって実証された(Fiers 2001)。インフルエンザ核タンパク質から高次構造を減らすまたは除去することはそれらの免疫原性を低下させると思われる。
【００１４】
いくつかの突然変異が、本来オリゴマー化するインフルエンザ核タンパク質を単量体型に変換することが示されている(Ye 2006)。この２００６の論文に記載されている単量体型のＮＰは、もっと最近の論文では単量体であることが確認されている(Tarus、Ye 2012)。これらの論文に記載されている、Ａ型インフルエンザの核タンパク質を単量体とする２つの点突然変異は、Ｂ型およびＣ型インフルエンザ株の核タンパク質でも保存されている（Ｎａｋａｄａの図３参照）。従って、同じ点突然変異を、これらの他のインフルエンザ核タンパク質を単量体とするために、Ｂ型およびＣ型インフルエンザ株の核タンパク質に導入することができた。しかしながら、単量体核タンパク質の免疫原性に関する研究は実施されなかった。
【００１５】
ＮＰ抗原を用いたインフルエンザワクチンを作製する上での主要な技術的問題は、強く、持続的な細胞性免疫応答を誘導することである。「細胞性免疫応答」は、抗体を含むのではなく、抗原特異的Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化と抗原に応答した種々のサイトカインの放出を含む免疫応答である。ＣＤ４細胞またはヘルパーＴ細胞は、免疫を活性化するサイトカインを分泌することによって種々の病原体からの防御を与える。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）は、サイトカインを用いずに、病原体のアポトーシスによる死滅を引き起こす。
【００１６】
ＮＰに対するＣＤ４応答かＣＤ８応答のどちらが防御に対してより重要なのかについては議論が残るが(Epstein)、この抗原が誘導し得る防御には、核タンパク質に対する体液性応答よりも細胞性応答が重要であるという共通認識が存在する(Thomas)。強い細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起することにより防御を与えるワクチンは、Ｔ細胞エピトープが、保存性の高いＮＰタンパク質に由来している場合に有用であり得る(Epstein; Roy)。Ｔリンパ球により媒介される細胞性免疫応答は、主として、インフルエンザウイルス感染細胞を認識すること、ウイルス複製を阻害することおよびウイルスクリアランスを加速化することによって働く。
【００１７】
免疫の付与に関与する特異的Ｔ細胞にはＣＤ４＋とＣＤ８＋の両Ｔ細胞が含まれ、多くの場合、それぞれ分泌されるサイトカインおよび細胞溶解活性の作用を介してそれらの機能を発揮する。インフルエンザＮＰ特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬは特に、マウスにおける致死的インフルエンザウイルス投与に対する亜型感染防御免疫に重要な役割を果たしている可能性があり(Gschoesser)、上部呼吸器系粘膜表面からのインフルエンザウイルスのクリアランス(Mbawuike)、抗原投与後の生存および回復の増進(Epstein)が含まれる。最適なＮＰベースワクチンは、ＣＤ４およびＣＤ８の両細胞性応答を改善するであろう。
【発明の概要】
【００１８】
本特許出願は、インフルエンザウイルス核タンパク質に対する細胞性免疫応答を改善するための方法を提供する。
【００１９】
発明の簡単な説明
本発明は、Ａ、ＢまたはＣ型インフルエンザ株由来のＮＰ抗原の少なくとも１つの変異体を担体タンパク質としてのニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体に融合させることにより、インフルエンザウイルス由来のＮＰ抗原の免疫原性、特に細胞性免疫原性を増強するための方法に関する。
【００２０】
本発明は特に、Ａ、ＢまたはＣ型インフルエンザ株由来のＮＰ抗原の少なくとも１つの単量体変異体と、特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９に記載されているような、配列番号１で示される配列を有する担体タンパク質ＩＭＸ３１３とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００２１】
本発明は特に、配列番号２で示される、Ｅ３３９ＡおよびＲ４１６Ａ点突然変異を示すＡ型インフルエンザ株由来のＮＰ抗原の単量体変異体と、配列番号３で示される、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されているような、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（ここで、（ｉ）Ｚは任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、かつ、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である）を有する少なくとも１つの正電荷ペプチドのＣ末端置換を有するＩＭＸ３１３担体タンパク質の変異体とを含んでなる、融合タンパク質に関する。ＩＭＸ３１３担体タンパク質の好ましい変異体は、プロタミンと交差反応する抗体を誘導しない。
【００２２】
本発明は特に、ＮＰ抗原の単量体変異体と、それぞれ配列番号４および配列番号５で示される改変型の担体タンパク質ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００２３】
本発明はまた、プラスミドまたはウイルスベクター中にＤＮＡ配列を含んでなり、さらに配列番号６で示されるｔＰＡのようなシグナルペプチドを含んでなる免疫原性組成物に関する。
【００２４】
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列に関する。
【００２５】
本発明はまた、プラスミドもしくはウイルスベクターによりコードされているＤＮＡ配列、または融合タンパク質を含んでなり、さらに２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されているようなワクチンアジュバントまたは細胞内ＴＬＲに対する核酸リガンドを含んでなる免疫原性組成物に関する。
【００２６】
本発明はまた、インフルエンザの予防または治療方法としてのワクチンまたは免疫療法としての使用のための、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター、融合物または免疫原性組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【００２７】
本発明を詳しく記載する前に、本発明は特に例示される方法に限定されず、当然のことながら変更可能であると理解されるべきである。特に、本発明は、インフルエンザ由来の少なくとも１つの核タンパク質抗原を含んでなる融合タンパク質に関し、特定のインフルエンザ核タンパク質に限定されない。
【００２８】
本明細書に引用されている総ての刊行物、特許および特許出願は、前掲であれ後掲であれ、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。しかしながら、本明細書に述べられる刊行物は、それらの刊行物で報告されている、また、本発明に関して使用され得るプロトコール、試薬およびベクターを記載および開示する目的で引用される。
【００２９】
さらに、本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の技能の範囲内の従来のタンパク質精製および分子生物学的技術を使用する。このような技術は当業者には周知であり、文献で十分に説明されている。後述する特許請求の範囲および本発明の続いての記載では、言葉または必要な含意を説明するために文脈がそうではないことを必要としない限り、「含んでなる(comprise)」、「含有する(contain)」、「伴う(involve)」、もしくは「含む(include)」、または「含んでなる(comprises)」、「含んでなる(comprising)」、「含有する(containing)」、「伴った(involved)」、「含む(includes)」、「含む(including)」などの変形形態は、包含の意味で、すなわち、記載の特徴の存在を明示するが、本発明の種々の実施形態においてさらなる特徴の存在または追加を排除しないために使用される。
【００３０】
本発明のより良い理解のために以下の用語を定義する。
【００３１】
インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型およびＣ型の３タイプである。この分類は、まず、血清学的なものであり、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質に対する抗血清は他のＡクラスのウイルスの核タンパク質と交差反応するが、ＢクラスまたはＣクラスのウイルスの核タンパク質とは交差反応しない。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらの血球凝集素（Ｈ）およびノイラミダーゼ（Ｎ）糖タンパク質の血清学的交差反応に基づいてさらに亜型に分類される。
【００３２】
「インフルエンザ核タンパク質」とは、インフルエンザウイルスの３タイプ（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）総ての核タンパク質を意味する。
【００３３】
「担体タンパク質」は、抗原がコンジュゲートまたは融合され、それにより、より高い免疫原性となったタンパク質を一般に表す。本明細書では、この用語は、特に抗原を運ぶタンパク質の意味で使用される。タンパク質の機能は、それがコンジュゲートまたは融合されている前記抗原の免疫原性を増強することである。
【００３４】
「ＮＰの変異体」とは、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ株由来の野生型インフルエンザ核タンパク質と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する総てのタンパク質を表す。
【００３５】
「ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体」とは、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９およびＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９（両参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている配列番号１のＣ４ｂｐドメインの変異体、特に、少なくとも４８の連続するアミノ酸の、および／または特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９に記載の前記配列番号１と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する断片である。
【００３６】
「ＩＭＸ３１３担体タンパク質の変異体」とは、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されている。
【００３７】
プロタミンは、魚類から得られる、平均分子量４５００ダルトンを有する一群のヘテロなペプチドからなる。プロタミンのアミノ酸組成のおよそ６７％はアルギニンである。プロタミンは、インスリンの処方（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ中）またはヘパリンの中和に長年使用されてきた。
【００３８】
用語「融合タンパク質」は、融合されている起源の異なる２つのドメインを含んでなる、非天然型組換えタンパク質を表す。より詳しくは、本発明では、融合タンパク質は、ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメイン、特に、「ＩＭＸ３１３Ｔ」または「ＩＭＸ３１３Ｐ」の担体ドメイン変異体に融合されたインフルエンザ核タンパク質抗原を含んでなる。融合は同質の生成物を作出できるという利点を有する。より形式的には、「コンジュゲーション」は、遺伝学的には、向免疫原性担体タンパク質をコードするＤＮＡがスプライシングされて抗原をコードするＤＮＡとなると記載することができる。抗原は、担体タンパク質のＮ末端またはＣ末端と融合させることができる。
【００３９】
本発明は、インフルエンザ核タンパク質抗原の少なくとも１つの変異体とＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体とを含んでなり、かつ、インフルエンザ核タンパク質抗原に対して増強された細胞性免疫応答を惹起する免疫原性組成物に関する。
【００４０】
本発明によれば、ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの担体タンパク質変異体、特にＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐに融合される核タンパク質は、インフルエンザウイルスのいずれのタイプ（Ａ、ＢまたはＣ型）に由来する核タンパク質であってもよい。
【００４１】
核タンパク質抗原は、担体タンパク質、特に、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３ＰのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。
【００４２】
本発明によれば、少なくとも１つの核タンパク質が、担体タンパク質、特に、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐに融合されるが、同じまたは異なる２つ以上の核タンパク質を同じ担体タンパク質に融合させることもできる。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、ニワトリＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインの変異体、特に、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐに融合される核タンパク質抗原は、単量体抗原である。実際に、単量体化がそれらの免疫原性を減少させない限り、特許出願ＷＯ２００５／０１４６５４に記載されるように、単量体抗原を使用することが有利である。さらに、ＮＰは、結晶中で三量体を形成し(Ye 2006)、ｉｎ  ｖｉｖｏでは他のオリゴマーを形成する(Arranz、Moeller)。三量体またはオリゴマータンパク質とＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐなどのヘプタマータンパク質との融合は、立体衝突が作り出されるリスクがある。他方、単量体型の天然オリゴマータンパク質は、免疫原性が低下している(Fiers)。
【００４４】
単量体核タンパク質抗原を得るために、当業者は、単量体化を誘導するためにＮＰ抗原のタンパク質配列に導入できる種々の点突然変異を知っている。特に、ＮＰ抗原は、以下の２つの点突然変異：Ｅ３３９ＡおよびＲ４１６Ａのうち少なくとも１つを示す。
【００４５】
本発明の実施形態において、ＮＰ抗原はインフルエンザＡ株由来のものである。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、ＮＰ抗原は、点突然変異Ｅ３３９ＡおよびＲ４１６Ａの両方を含んでなり、従って、単量体である。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、ＮＰ抗原は、配列番号２で示されるポリペプチド配列を示す。
【００４８】
ＤＮＡワクチンから発現された抗原に対する細胞性免疫応答の増強は、これまでに、ＩＭＸ３１３をコードする遺伝子に抗原の遺伝子を融合させることによって得られている(Spencer)。有利には、このドメインの変異体は、配列番号３で示される、配列ＺＸＢＢＢＢＺ（ここで、（ｉ）Ｚは任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、（ｉｉ）Ｘは任意のアミノ酸であり、かつ、（ｉｉｉ）Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である）を有する少なくとも１つの正電荷ペプチドのＣ末端置換を示し、これにより、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載のように、前記抗原に融合した場合に抗原に対する免疫応答の増強が可能となる。ＩＭＸ３１３担体タンパク質の好ましい変異体は、プロタミンと交差反応する抗体を誘導しない。
【００４９】
ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐと呼ばれる特定の改良型変異体が最近、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載された。これらのペプチド配列は下記の通りである。
【化１】
2016520534.tif 000002
【００５０】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドを含んでなるＮＰ抗原を含んでなる。いくつかの研究が、ＮＰタンパク質は主として核に位置し、このことがこのようなＤＮＡワクチンの免疫原性を低下させる可能性があることを示唆した。従って、シグナルペプチドを添加することによってＮＰ抗原の分泌を可能とすることが望ましい。特に、前記シグナルペプチドは、(Luo)に記載されているようなｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）分泌シグナルペプチドである。
【００５１】
本発明の特定の実施形態では、ＮＰ抗原は単量体であり、シグナルペプチドを含んでなる。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、ＮＰ抗原は、突然変異Ｅ３３９ＡおよびＲ４１６Ａの両方とシグナルペプチドｔＰＡとを含んでなる。例に示されるように、ＩＭＸ３１３Ｔと、シグナルペプチドを含んでなる単量体ＮＰ抗原とを含んでなる融合タンパク質は、マウスにおいてＤＮＡワクチンとして注射されると、Ｔｈ２応答よりも強いＴｈ１応答（ＩｇＧ２ａ）を誘導する（図１３）。免疫学者間の共通認識は、Ｔｈ２応答よりもＴｈ１応答の方が望ましいということである。しかしながら、抗原に対するＴｈ１応答を優先的に高めるための方法は、この目的のために開発されたアジュバントの使用なしでは、当技術分野で知られていない。以下の例では、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐの、インフルエンザ核タンパク質抗原との融合がＴｈ１応答を優先的に高めることが示される。
【００５３】
本発明はまた、コイルドコイルドメインを含んでなる任意の担体タンパク質と、インフルエンザ由来の少なくとも１つの核タンパク質（ＮＰ）抗原とを含んでなる融合タンパク質に関する。特に、前記核タンパク質抗原は単量体である。
【００５４】
本発明はまた、上記のような融合タンパク質をコードする、特に、
・ＮＰ抗原とＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとを含んでなる融合タンパク質をコードする；
・単量体ＮＰ抗原とＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとを含んでなる融合タンパク質をコードする；
・シグナルペプチドを含んでなるＮＰ抗原と、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとを含んでなる融合タンパク質をコードする；
・シグナルペプチドを含んでなる単量体ＮＰ抗原と、ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとを含んでなる融合タンパク質をコードする
核酸に関する。
【００５５】
好ましい実施形態として、前記核酸は、Ａ型インフルエンザ由来の単量体ＮＰ抗原を含んでなる融合タンパク質をコードする。好ましい実施形態として、前記核酸は、プロタミンと交差反応する抗体を誘導しない融合タンパク質をコードする。特に、前記核酸は、配列番号６および配列番号７で示される配列を示す。
【００５６】
本発明はまた、宿主細胞においてＤＮＡカセットの発現を確保するための、上記に示した核酸と、プロモーターおよびエンハンサーなどの遺伝子エレメントとを含んでなるベクターに関する。
【００５７】
本発明はまた、
・上記に示される融合タンパク質または核酸またはベクターと、
・細胞内ＴＬＲに対する核酸リガンド、および／または任意の他のワクチンアジュバントと
を含んでなる免疫原性組成物に関する。
【００５８】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）
自然免疫系の細胞は、生殖細胞系にコードされている限定されたセットの受容体によって病原体を検出する。これらの自然免疫受容体は、病原体によって発現される一連の保存された分子構造、すなわち、ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）を認識する。
【００５９】
これらの病原体由来分子は一般に、ある病原体セットに極めて特異的な複合分子を呈する。ＴＬＲは、病原体による感染後すぐに免疫系に警報を発することができる免疫パターン認識受容体セットに相当する。ＴＬＲは、自然免疫と適応免疫の間の中枢的成分として重要な役割を果たし、ウイルスから寄生虫までに及ぶ多くの病原体を嗅ぎ分けることができる。Ｔｏｌｌと呼ばれる第１の特徴的なＴＬＲは、成体ショウジョウバエにおいて抗真菌応答を担うことが示されており、病原体認識に関わる１０のヒト等価物がこれまでに同定されている。ＴＬＲは、それらの局在およびそれらが認識するＰＡＭＰのタイプに基づいて異なる群に分類することができる。ＴＬＲ１、２、４、５および６は、主として細胞表面で発現され、そこでそれらは主として細菌生成物を認識し、一方、ＴＬＲ３、７、８および９は、細胞内コンパートメントに局在し、主としてウイルス生成物および核酸を認識する。
【００６０】
細胞内Ｔｏｌｌ様受容体
加えて、免疫誘導法を改良するためには、ＴＬＲ受容体を介したシグナル伝達を制限することも極めて重要である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫系において重要な役割を果たすタンパク質種である。微生物がひと度、生物の物理的バリアを破ると、それらはＴＬＲにより認識される。認識される微生物由来の特徴には、ウイルスの二本鎖ＲＮＡ、細菌およびウイルスの非メチル化ＣｐＧ部位アイランド、ならびに特定のＲＮＡおよびＤＮＡ分子が含まれる。
【００６１】
このような核酸は、それらがＴｏｌｌ様受容体（以下、ＴＬＲ）種、特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１３のリガンドであるので、大いに注目される（Ｂｌａｓｉｕｓおよびその中の参照文献）。これらは「細胞内Ｔｏｌｌ様受容体」として分類されることがあるが、少なくともＴＬＲ３は一部の細胞表面にも存在する。ＴＬＲ３は、気道、子宮、角膜、膣、子宮頸、胆管および腸管上皮細を含む様々な上皮細胞上にも発現され、これらの細胞は、それらの細胞表面にＴＬＲ３を発現すると思われる(Akira)。
【００６２】
これらの受容体、特にＴＬＲ３受容体を介したシグナル伝達を制限することの重要性は、用量依存的である。従って、抗原の不在下で核酸リガンドのＴＬＲへの結合を妨げるためには、核酸リガンドが抗原に強く結合することが不可欠である。よって、強く結合した細胞内ＴＬＲリガンドは、結合が弱い処方物よりも極めて好ましい。従って、当業者は、リガンドが他のどこかでＴＬＲ受容体と結合することにより媒介される潜在的有害作用を減らす目的で、ＴＬＲリガンドと効率的に結合でき、これにより、それらは抗原が細胞内に到達するまで抗原から分離せず、そこで免疫応答を惹起するような抗原組成物を探している。
【００６３】
本出願において、特に、実施例では、以下の細胞内ＴＬＲリガンドが使用された：
・ＴＬＲ３に対して：  ポリＩ：Ｃ、すなわち、二本鎖ＲＮＡの類似体である、ポリシチジル酸とハイブリダイズされたポリイノシン酸のポリヌクレオチドの二重鎖。鎖長は、各鎖、２０ヌクレオチドであった；
・ＴＬＲ７に対して：  配列5’ GsCsCsCsGsUsCsUsGsUsUsGsUsGsUsGsAsCsUsC 3’（ ここで、「ｓ」はホスホチオエート結合を表す）（配列番号８）を有する、ｓｓＲＮＡ４０と呼ばれるオリゴヌクレオチド；
・ＴＬＲ９に対して：  配列：5’ tccatgacgttcctgacgtt 3’（配列番号９）を有する、ＯＤＮ１８２６と呼ばれるオリゴヌクレオチド。
【００６４】
本発明の特定の態様では、免疫原性組成物は、
・上記で示された融合タンパク質または核酸またはベクターと、
・ポリＩ：Ｃと
を含んでなる。
【００６５】
本発明はまた、インフルエンザ疾患の予防および治療用のワクチンとしての使用のための上記のような融合タンパク質に関する。前記インフルエンザワクチンは、複数の適用：
・季節性インフルエンザの予防；
・パンデミック状況での予防；
・「ユニバーサル」予防、すなわち、総てのタイプのインフルエンザウイルスに対して免疫するワクチン；
・総てのタイプのインフルエンザの免疫療法
に使用可能である。
【００６６】
インフルエンザの予防または治療方法は、ヒトまたは動物の身体において本発明による特定のワクチンを用いて実施することができる。当業者ならば、特定の適用および特定の患者それぞれについてワクチンの組成をどのように適合させればよいかを知っている。
【００６７】
本発明はまた、インフルエンザ疾患の予防用のＤＮＡワクチンとしての使用のための上記のような核酸に関する。
【００６８】
本発明はまた、インフルエンザ疾患の予防用のウイルスワクチンとしての使用のための上記のようなベクターに関する。
【００６９】
本発明はまた、インフルエンザ疾患の予防用のワクチンとしての使用のための上記のような免疫原性組成物に関する。
【００７０】
本発明はまた、インフルエンザの核タンパク質抗原に対する細胞性免疫応答を増強するための方法であって、この抗原の、配列番号４および配列番号５に示される配列を有する担体タンパク質ＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐとの融合を含んでなる方法に関する。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、従前に記載されたような融合タンパク質または核酸またはベクターまたは免疫原性組成物がインフルエンザ疾患の免疫療法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】親プラスミドｐｃＤＮＡ３  ＮＰのマップ−実施例に記載の通りに構築したこのプラスミドおよびその誘導体をＤＮＡワクチン接種に用いた。
【図２】ＮＰ、またはＩＭＸ３１３と融合したＮＰをコードするプラスミドを用いた免疫誘導に応答してＩＦＮ−γを分泌する全Ｔ細胞の比較。
【図３】ＮＰをコードするプラスミドまたはＩＭＸ３１３と融合したＮＰをコードするプラスミドを用いた免疫誘導に応答してＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の比較。
【図４】ＮＰまたはＩＭＸ３１３と融合したＮＰをコードするＤＮＡプラスミドによって誘導された組換えＮＰに対するＩｇＧ抗体応答の比較。
【図５】ＮＰまたはＩＭＸ３１３と融合したＮＰをコードするＤＮＡプラスミドにより誘導された組換えＮＰに対するＩｇＧ抗体サブクラス応答の比較。
【図６】ＮＰ、単量体ＮＰ（ＮＰｍ）、ＩＭＸ３１３と融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔと融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対する全Ｔ細胞応答の比較。
【図７】ＮＰ、単量体ＮＰ（ＮＰｍ）、ＩＭＸ３１３と融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔと融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の比較。
【図８】ＮＰ、単量体  ＮＰ（ＮＰｍ）、ＩＭＸ３１３に融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔに融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対する、組換えＮＰを用いてＥＬＩＳＡにより測定した場合の、ＩｇＧ抗体応答の比較。
【図９】ＮＰ、単量体ＮＰ  （ＮＰｍ）、ＩＭＸ３１３と融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔと融合した単量体ＮＰ（ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対する、組換えＮＰを用いて測定した場合の、ＩｇＧ抗体サブクラス応答の比較。
【図１０】種々のＮＰ融合タンパク質に及ぼす、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の影響。全Ｔ細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔｓにより測定し、ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）を比較した。
【図１１】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔｓにより測定した、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答に及ぼす、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の影響における、ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）の比較。
【図１２】ＥＬＩＳＡにより測定した、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＩｇＧ応答に及ぼすｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の影響における、ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）の比較。
【図１３】ＥＬＩＳＡにより測定した、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＩｇＧサブクラス応答に及ぼすｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の影響における、ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型単量体ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合単量体ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）の比較。
【図１４】核タンパク質のＩＭＸ３１３Ｔとの融合は、ＮＰの水中油型アジュバントＡｄｄａＶａｘ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）処方と同程度にＮＰの免疫原性を増強し、ＡｄｄａＶａｘとＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ融合タンパク質の併用は相乗作用を示す。
【図１５】ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の分離後の図１４で示される結果の分析。ＡｄｄａＶａｘとＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質の相乗作用は、ＣＤ４応答とＣＤ８応答の両方で見られる。
【図１６】核タンパク質に対するＩｇＧ応答。アジュバントＡｄｄａＶａｘの不在下、核タンパク質とＩＭＸ３１３Ｔを融合しても、ＮＰに比べてＩｇＧ力価に有意な変化を示さなかった。しかしながら、ＡｄｄａＶａｘの存在下では、この融合タンパク質は核タンパク質よりも有意に高い免疫原性を示した。
【図１７】ＡｄｄａＶａｘを伴ってまたは伴わずに、ＮＰまたはＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔで免疫誘導した後の、組換えＮＰを用いて測定したＩｇＧ抗体サブクラス応答の比較。表４に示されるように、ＮＰはＡｄｄａｖａｘを伴う場合にも伴わない場合にも、Ｔｈ１応答を誘導した。しかしながら、融合タンパク質ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔは、ＡｄｄａＶａｘを伴う場合にも伴わない場合にも、ＩｇＧ応答をＴｈ１側にさらに分極した。
【図１８】免疫誘導に使用した組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；レーン２：組換えＮＰ（Ｉｍｇｅｎｅｘ）；レーン３：精製ＮＰ；レーン４：精製ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ。
【図１９】組換えＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｐタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：精製ＮＰ；レーン２：精製ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ；レーン３：精製ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｐ；レーン４：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【図２０】ＩＭＸ３１３Ｐタンパク質を用いたマウスの免疫誘導後の、プロタミンまたはＩＭＸ３１３Ｐに対するＩｇＧ応答。これは、マウスがＩＭＸ３１３Ｐに対するＩｇＧ抗体を産生する（ＩＭＸ３１３と若干交差反応する）が、プロタミンと交差反応する抗体は見られなかったことを示す。
【実施例】
【００７３】
ＤＮＡワクチン接種のため、図１に示される親プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＰを以下の実施例に記載のように改変した。プラスミドｐＩＭＸ４９４およびｐＩＭＸ４９７は、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されている。
【００７４】
実施例１−ＮＰコードプラスミドへのＩＭＸ３１３の挿入
ＩＭＸ３１３コード配列を、オリゴヌクレオチドプライマーＩＭＸ１２８９
【化２】
2016520534.tif 000003
およびＩＭＸ１２９０
【化３】
2016520534.tif 000004
を用いてプラスミドｐＩＭＸ４９４から増幅し、Ｇｅｉｓｅｒにより記載されているようにプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＰに挿入した。
【００７５】
実施例２−ｔＰＡシグナルペプチドの挿入
ｔＰＡシグナルペプチドを、オリゴヌクレオチドＩＭＸ１３０５
【化４】
2016520534.tif 000005
およびＩＭＸ１３０６
【化５】
2016520534.tif 000006
を用いてベクターｐＳＧ２−８５Ａ(Spencer)から増幅し、Ｇｅｉｓｅｒにより記載されているように複数のプラスミドのＮＰコード配列のＮ末端とインフレームで挿入した。
【００７６】
実施例３−単量体とするためのＮＰの２つの点突然変異の作出
オリゴヌクレオチドプライマーＩＭＸ１２８７
【化６】
2016520534.tif 000007
およびＩＭＸ１２８８
【化７】
2016520534.tif 000008
を用いてＮＰ遺伝子の内部断片を増幅し、得られたＰＣＲ産物をＧｅｉｓｅｒにより記載されているようにＮＰコードプラスミドに挿入した。両オリゴヌクレオチドはＮＰ遺伝子と完全にはマッチしなかったので、このＰＣＲ産物は２つの点突然変異を生成した。ＩＭＸ１２８７プライマーはＮＰ遺伝子に突然変異Ｅ３３９Ａ（ＧＡＡからＧＣＡへ）を作り出し、ＭＸ１２８８プライマーは突然変異Ｒ４１６Ａ（ＡＧＡからＧＣＡへ）を作り出した。
【００７７】
実施例４−ＩＭＸ３１３Ｔの挿入
ＩＭＸ３１３Ｔコード配列を、オリゴヌクレオチドプライマーＩＭＸ１２８９（配列番号１０）およびＩＭＸ０５１（5’ GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3’−配列番号１６）を用いてプラスミドｐＩＭＸ４９７から増幅し、Ｇｅｉｓｅｒにより記載されているように種々のｐｃＤＮＡ３−ＮＰ由来プラスミドに挿入した。
【００７８】
実施例５−本発明による核酸を用いたＤＮＡ免疫誘導
５．１．プロトコール
５個体の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス群に、種々のプラスミドＤＮＡを用い、注射１回当たり２０μｇの各プラスミドで、１４日あけて２回、筋肉内に免疫誘導を行った。免疫応答を２８日目に測定し、種々の修飾物：＋／−ＩＭＸ３１３またはＩＭＸ３１３Ｔ；＋／−ｔＰＡシグナルペプチド；＋／−単量体化突然変異の効果を決定した。
【００７９】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、２８日目に脾細胞を用いてＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。免疫マウスから単離した精製脾臓ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および全Ｔ細胞を、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃから購入したＮＰ  Ａインフルエンザペプチド（アミノ酸３６６〜３７４）とともに共培養した。
【００８０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：  平底９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを１０％ウシ胎児血清で３７℃にて１時間でブロッキングした。２×１０６細胞／ウェルを１５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮ−γでコーティングしたＩＰＶＨ膜上、終濃度２μｇ／ｍｌの関連ペプチド（ＮＰ  Ａインフルエンザペプチド）で刺激し、２０時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートをＰＢＳで十分に洗浄して細胞を除去し、ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌのビオチン、ＭＡＢＴＥＣＨ）を各ウェルに加えた。３７℃にて２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ）を用い、室温で１時間現像した。洗浄後、基質（３−アミノ−９−エチカルバゾール（Ｓｉｇｍａ））を加え、１５分間インキュベートした。さらなる洗浄の後、赤いスポットを顕微鏡下で数えた。
【００８１】
体液性免疫応答を調べるために、本発明者らは、全ＩｇＧと、個別にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに特異的なＥＬＩＳＡにより抗体レベルを評価し、Ｔｈ１およびＴｈ２の各割合を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは一般に、ＩｇＧ１抗体の刺激に関連するＴｈ２型の免疫応答でインフルエンザワクチンに応答する。しかしながら、ウイルス感染から生き残ったマウスの血清中に存在する主要な抗体アイソタイプはＩｇＧ２ａであり、これはＴｈ−１型免疫応答の際に刺激される(Huber)。ＩｇＧ２ａ抗体の刺激は、インフルエンザワクチン接種の有効性の増強に関連付けられている。
【００８２】
ＥＬＩＳＡのために、抗原を０．１Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸（ｐＨ９．６）中で５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した後、これを用いてＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｌｏｎ、デンマーク）のウェルをコーティングした。試験血清の２倍連続希釈液をこれらのウェルに加え、洗浄後、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ、または抗マウスＩｇＧ１または抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）およびＨ２Ｏ２を加えた後に４９０ｎｍでの吸光度を測定し、反応を１Ｍ硫酸で停止させた。
【００８３】
結果を図２〜５に示す。
【００８４】
５．２．
予備実験において、本発明者らは、ＮＰまたはＩＭＸ３１３と融合したＮＰのいずれかをコードするＤＮＡワクチンにより誘導されたＮＰに対する全Ｔ細胞応答を試験した。ＮＰ−ＩＭＸ３１３免疫マウスから単離された全Ｔ細胞は、ＮＰ免疫マウスの場合に比べて有意に高いＩＦＮγ応答を示し、ＩＭＸ３１３のＴ細胞応答を増強する能力が確認された。
【００８５】
図２は、親ＮＰ抗原遺伝子をＩＭＸ３１３遺伝子と融合すると、その融合タンパク質がサイトゾルで発現された場合であっても、ＮＰに対するＴ細胞応答を向上させることを示す。
【００８６】
５．３．
ＥＬＩＳＰＯＴで検出されたＩＦＮ−γがＣＤ４  Ｔ細胞により産生されたかＣＤ８  Ｔ細胞により産生されたかを決定するために、本発明者らは免疫マウスから脾臓ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を精製し、これらをインフルエンザＡ  ＮＰペプチドとともに共培養した。ＮＰ−ＩＭＸ３１３で免疫した群で、ＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ生産の有意な増大が検出された。ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ８＋細胞のパーセンテージは、対応するＣＤ４＋  Ｔ集団よりも高かった（図３）。
【００８７】
図３は、ＮＰ抗原遺伝子とＩＭＸ３１３遺伝子との融合が、ＮＰ抗原に対するＣＤ４＋応答とＣＤ８＋応答を向上させることを示す。
【００８８】
５．４．
本発明者らは次に、免疫誘導後のＮＰに対する抗体応答を調べ、最後の免疫誘導から１４日後に血清中のＮＰ特異的ＩｇＧ  Ａｂ応答を測定した。ＮＰ対照マウスおよびＮＰ−ＩＭＸ３１３を投与したマウスは中程度のＮＰ特異的ＩｇＧ  Ａｂを示し（図４）、これはＮＰ−ＩＭＸ３１３で免疫した群でより高かった。
【００８９】
図４は、ＮＰ遺伝子とＩＭＸ３１３遺伝子との融合が、ＮＰ抗原に対するＩｇＧ抗体応答を向上させることを示す。
【００９０】
５．５．
血清をＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体（それぞれＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＴｈ２型およびＴｈ１型の応答を代表する）の存在に関しても調べた。ＮＰ−ＩＭＸ３１３免疫マウスの血清ではＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体アイソタイプが検出されたが、ＮＰ単独を投与したマウス由来の血清サンプルは、低レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ  Ａｂを示したに過ぎなかった（図５）。
【００９１】
図５は、ＮＰ抗原に対して誘導された抗体のサブクラス分布を示す。ＩＭＸ３１３遺伝子との融合は、ＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２Ａ応答を向上させ、ＮＰに対するＴｈ２型の応答をＮＰ−ＩＭＸ３１３に対するＴｈ１型の応答に変換した。
【００９２】
結果を以下の表にまとめる。
【００９３】
【表１】
2016520534.tif 000009
【００９４】
図６は、ＮＰの単量体化（ＮＰｍ）がその免疫原性を若干向上させること（ただし、この向上は統計学的に有意でない：ＮＳ）；ＮＰｍの免疫原性はＩＭＸ３１３遺伝子との融合によってさらに向上すること；および最後に、単量体ＮＰとＩＭＸ３１３Ｔ遺伝子との融合はＮＰの免疫原性をさらに高めることを示す。驚くべきことに、ＮＰの単量体化はその免疫原性を低下させない。
【００９５】
図７は、ＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答の分析では、図６の場合と同様のランク付けが見られ、ＮＰの単量体化はＮＰの免疫原性を若干向上させるが有意ではない（ＮＳ）こと；ＮＰの免疫原性はＩＭＸ３１３遺伝子との融合によりさらに向上すること、しかしながら、ＮＰ免疫原性の最大の向上は単量体ＮＰとＩＭＸ３１３Ｔ遺伝子との融合によって得られることを示す。
【００９６】
図８は、Ｂ細胞応答についても、図６および７でＴ細胞応答（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）に関して見られたものと同様のランク付けが見られることを示す。ＮＰに対する全ＩｇＧ応答は、ＩＭＸ３１３によるよりもＩＭＸ３１３Ｔによる方が高かった。
【００９７】
図９は、単量体ＮＰ抗原によって誘導された抗体のサブクラス分布を示す。ＮＰの場合と同様に、ＩＭＸ３１３遺伝子との融合は、ＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２Ａ応答を増強し、ＮＰに対するＴｈ２型の応答（０．８）からＮＰ−ＩＭＸ３１３に対するＴｈ１型の応答（１．５１）に変換した。このＴｈ２型からＴｈ１型への逆転は、ＩＭＸ３１３（１．５）との融合よりもＩＭＸ３１３Ｔとの融合によって維持された。インフルエンザワクチンにおけるＩｇＧ２ａ抗体の発現はウイルスのクリアランスに相関し、致死的なインフルエンザ投与に対する防御を高める。ＥＬＩＳＡにより測定した場合、両抗体アイソタイプの誘導の増大は、中和だけの場合よりもワクチンの有効性により良く相関していた(Huber)。
【００９８】
【表２】
2016520534.tif 000010
【００９９】
実施例６−ＮＰ抗原の分泌はその免疫原性を向上させた
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）分泌シグナル配列を含有する一連のＮＰ  ＤＮＡワクチン構築物：ｔＰＡ−ＮＰ、ｔＰＡ−ＮＰｍ、ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３、およびｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを作製した。免疫動物由来の体液性免疫応答および細胞性免疫応答に及ぼすｔＰＡとＮＰとの融合の効果を分析した。
【０１００】
ｔＰＡ含有構築物   で免疫したマウスは、ＮＰ免疫マウスに比べて有意に高いＩＦＮγ応答を示し、ＩＭＸ３１３Ｔおよび単量体化突然変異のＴ細胞応答を増強する能力が確認された。
【０１０１】
図１０は、単量体であってもなくても（ｔＰＡ−ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰｍ）、ＮＰ抗原の分泌の強制がその免疫原性を向上させたことを示す（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）。しかしながら、ＩＭＸ３１３との融合は、単量体型のＮＰを使用する場合は、非改変抗原を使用する場合よりも免疫原性が高かったことを示した（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）。また、ＩＭＸ３１３をＩＭＸ３１３Ｔで置換すると、ＮＰの免疫原性がさらに向上した（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）。
【０１０２】
図１１は、種々の分泌型のＮＰに対するＣＤ８＋応答およびＣＤ４＋応答を示す。図１０の場合と同じランク付けが見られ、抗原の単量体化の有用性は、この場合にもまた、ＩＭＸ３１３が加えられる場合に顕著となる。前記の図面と同様に、最大の免疫応答は、ＩＭＸ３１３よりもむしろＩＭＸ３１３Ｔを用いる場合に見られる。
【０１０３】
図１２は、抗原ＮＰに対する全ＩｇＧ応答を示し、Ｔ細胞応答に関して図１１と同じ結論を招き、最大応答はＩＭＸ３１３Ｔを使用する場合に見られるが、分泌（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）および単量体化（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）も重要な寄与である。
【０１０４】
ＮＰ単独（ＮＰ、ｔＰＡ−ＮＰまたはｔＰＡ−ＮＰｍとして）で免疫したマウスでは、それらの血清中に抗ＮＰ  ＩｇＧ抗体は存在しないかまたは極めて低レベルであった（図１２）。他方、ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３、ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３またはｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔで免疫したマウスは、高レベルの全身性のＮＰ特異的ＩｇＧ抗体応答を示し、この場合にもまた、ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ免疫マウスは、他の総ての群の免疫マウスに比べてＩｇＧ抗体応答が有意に高かった（ｐ＜０．００１）。このことは、総ての改変の組合せ（単量体化突然変異、ｔＰＡおよびＩＭＸ３１３Ｔ）が、親配列または他の組合せに比べて有意に向上した抗原に対する免疫原性を与えることを示す。
【０１０５】
図１３は、ＮＰに対するＢ細胞応答のサブクラス分析を示し、初期のＮＰ単独によるＴｈ２型がＩＭＸ３１３により、また、ＩＭＸ３１３Ｔにより逆転されることを実証する。分泌はそれ自体ではほとんど効果がないが（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）、単量体化（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３）、次いで、ＩＭＸ３１３のＩＭＸ３１３Ｔでの置換（ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）は総て、Ｔｈ２（ＩｇＧ１）応答よりもＴｈ１（ＩｇＧ２ａ）応答の向上に寄与する。
【０１０６】
ｔＰＡ−ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ自体は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答をほぼ等しく向上させるということが極めて重要である。ＮＰとＩＭＸ３１３との融合は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の両方を増強し、応答のタイプに有意なシフトはないことを示す。しかしながら、ＩＭＸ３１３Ｔおよび単量体化突然変異が合わさると、Ｔｈ１応答（ＩｇＧ２ａ）が優勢となり始める。免疫学者間の共通認識は、Ｔｈ２応答よりもＴｈ１応答の方が望ましいということである（図１３）。
【０１０７】
これらの結果を以下に表にまとめる。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
実施例７−組換えＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質の生産
Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有する、Ａ／ＷＳＮ／３３株（Ｔａｒｕｓ  ２０１２ｂ）の野生型Ｈ１Ｎ１  ＮＰタンパク質を発現するｐＥＴ２２由来プラスミドを、細菌株Ｃ４３Ｒで発現させた。この株は、Ｃ４３（ＤＥ３）をレアコドン発現プラスミドｐＲＡＲＥ２（Ｎｏｖａｇｅｎ）で形質転換することにより作製された。発現はＴＢ(terrific broth)培地中でＩＰＴＧを用いて誘導した。過剰発現したタンパク質をまず、清澄化およびイオン交換工程に関してはＹｅにより、またＴａｒｕｓにより記載されているように精製し、最終工程では、融合タンパク質を、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されているように、ヘパリンセファロース上での親和性により、また、ゲル濾過（Ｈｉ  Ｐｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）により精製した。
【０１１０】
ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質を発現させるために、ＮＰ発現プラスミドを２段階で改変した。第一に、単量体化突然変異を、オリゴヌクレオチドプライマーＩＭＸ１２８７（5’ ccattctgccgcatttgCagatctaagag 3’−配列番号１４）およびＩＭＸ１２８８（5’ CAAAAGGGAGATTTGCCTGTACTGAGAAC 3’−配列番号１５）を用い、実施例３のように導入した。第二の工程では、実施例４と同じオリゴヌクレオチドプライマー：ＩＭＸ１２８９（配列番号１０）およびＩＭＸ０５１（5’ GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3’−配列番号１６）を用い、６−ＨｉｓタグをＩＭＸ３１３Ｔコード配列で置換した。このＰＣＲ産物を次に、Ｇｅｉｓｅｒにより記載されているように６−Ｈｉｓタグの代わりに挿入した。
【０１１１】
ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ融合タンパク質も、ＮＰタンパク質と同じ様式および株で発現させ、同じクロマトグラフィー工程を用いて精製した。
【０１１２】
実施例８−免疫誘導
次に、ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔの免疫原性をＡｄｄａＶａｘアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）処方を用いる場合または用いない場合で比較するためにマウスを免疫した。ＡｄｄａＶａｘアジュバント処方を用いる場合または用いない場合のＮＰタンパク質を対照として用いた。
【０１１３】
この目的で、４群（５個体）の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、注射１回当たり２０μｇの各タンパク質を用い、１４日あけて２回、皮下免疫を行った。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導を、２８日目に脾細胞を用い、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。免疫マウスから単離した精製脾臓ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および全Ｔ細胞をＮＰタンパク質またはインフルエンザＡ  ＮＰ（３６６〜３７４）ペプチドとともに共培養した。免疫前と２８日目の抗体応答を、ＮＰを抗原として用い、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１４】
実施例９−ＩＭＸ３１３Ｔは分泌経路の通過中にプロテアーゼにより分解されない
ＩＭＸ３１３Ｔを含有するプラスミドでのＤＮＡ免疫誘導により得られた結果は、プロテアーが豊富な分泌経路を通過している際にその分子のテールがプロテアーゼにより切断されないことを強く示唆する。この疑問をより直接的に検討するために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現させるために使用されるｐｃＤＮＡ３プラスミドでＣＨＯ  Ｋ１細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは他所に記載の通りに行った(Krammer)。
【０１１５】
８〜２４時間後、トランスフェクト細胞の上清を遠心分離により回収し、濾過した後に、２０１３年１２月１１日出願の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７６２８９に記載されているようにヘパリンセファロースカラムにロードした。
【０１１６】
小さな「ピークＣ」が見られ、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットでタンパク質ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを含有することが分かった。
【０１１７】
実施例１０−組換えＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｐタンパク質の生産
ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｐタンパク質を発現させるために、ＮＰＭ−ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質をコードするプラスミドの対応する断片の代わりにＩＭＸ３１３Ｐをコードするプラスミド由来の制限断片（Ｐｍｌ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を用いることで、ＩＭＸ３１３Ｔ遺伝子の代わりにＩＭＸ３１３Ｐ遺伝子を使用することにより、ＮＰｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドを改変した。次に、この融合タンパク質を実施例７と同様に発現させ、精製した。図１９は、精製されたタンパク質を示し、主要なバンドはモノマーであるが、主要なバンドの上にオリゴマー形態も見られる（オーバーロードゲル上）。
【０１１８】
実施例１１−ＩＭＸ３１３Ｐに対する過免疫抗血清の生産
５個体の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群に、注射１回当たり５０μｇを用い、１４日あけて６回、ＩＭＸ３１３Ｐタンパク質で筋肉内に免疫誘導を行った。
【０１１９】
改変ＥＬＩＳＡ法を使用することにより、血清をＩｇＧ抗体に関して試験した。抗体を捕捉するために、硫酸プロタミングレードＸ（Ｓｉｇｍａ）、ＩＭＸ３１３またはＩＭＸ３１３Ｐ用いて、マイクロプレートのウェルをコーティングした。検出抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）であり、これを過酸化水素と反応させて、４０５ｎｍで吸光度の測定値を得た。
【０１２０】
ＩＭＸ３１３Ｐで免疫誘導しマウスの総ての血清は、ＩＭＸ３１３Ｐに対して高力価のＩｇＧ抗体を示し、ＩＭＸ３１３と交差反応した抗体は一部あったが、プロタミンと交差反応したものはなかった（図２０）。
【０１２１】
アルファベット順の参照文献
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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