(57)【要約】本開示は、ナノ粒子およびビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物（例えば、ＶＤＲアゴニスト）を含む組成物、ならびに上皮細胞または星細胞などの細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の保持または貯蔵を増加させるためにそのような化合物を使用する方法を提供する。このような方法は線維症を処置または予防するために使用できる。ナノ粒子であって、その表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−６−リン酸修飾アルブミン、脂肪酸エステル、レチニルエステルまたは直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーのうちの１つまたは複数を含むナノ粒子、および該ナノ粒子にあるまたは該ナノ粒子に結合するビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物を含む、組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子であって、その表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−６−リン酸修飾アルブミン、脂肪酸エステル、レチニルエステルまたは直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーのうちの１つまたは複数を含むナノ粒子、および
該ナノ粒子にあるまたは該ナノ粒子に結合するビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＶＤＲの生物活性が、細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵のうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が、前記ＶＤＲの生物活性を、該化合物の非存在下での該生物活性と比較して、少なくとも２５％増加させる、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記化合物が、細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵を、該化合物の非存在下での該貯蔵と比較して、少なくとも２５％増加させる、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が、星細胞、上皮細胞または両方における前記ＶＤＲの生物活性を増加させる、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記化合物が、膵臓星細胞、心臓星細胞、肺星細胞、腎臓星細胞または肝星細胞における前記ＶＤＲの生物活性を増加させる、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記化合物が、星細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵を、該化合物の非存在下での該貯蔵と比較して、少なくとも２５％増加させる、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
化学療法剤、生物製剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記化学療法剤がゲムシタビンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＶＤＲアゴニストが、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せである、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＶＤＲアゴニストが、カルシポトリオール、２５−ヒドロキシ−Ｄ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）またはそれらの組合せである、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するための方法であって、
請求項１から１２のいずれかに記載の治療有効量の組成物を該上皮細胞または星細胞と接触させ、それにより該上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
前記上皮細胞または星細胞が被験体に存在し、接触させるステップが、治療有効量の前記組成物を該被験体へ投与し、それにより該上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が、肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記肝臓疾患が、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症／肝硬変、胆管線維症／胆汁性肝硬変、肝臓がん、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシスまたはウィルソン病のうちの１つまたは複数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記肝臓がんが、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記膵臓疾患が、膵臓線維症または膵管腺癌（ＰＤＡ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記腎臓疾患が腎臓の線維症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法であって、
星細胞を１種または複数の試験作用物質と接触させるステップ、
該星細胞を、ＴＧＦ−β１の非存在下での発現と比べて該星細胞におけるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）発現を少なくとも２倍増加させるのに十分な量の該ＴＧＦ−β１と接触させるステップ、
該星細胞によるＶＤＲアゴニストの産生、該星細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生、該星細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾もしくは発現、またはそれらの組合せを検出するステップ、および
１種または複数の該試験作用物質の非存在下と比べて該星細胞による該ＶＤＲアゴニストの産生を少なくとも５倍増加させる、１種または複数の該試験作用物質の非存在下と比べて該星細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生を少なくとも５倍増加させる、前記１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて前記星細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾もしくは発現を少なくとも５倍減少させる、またはそれらの組合せである試験作用物質を選択するステップであって、選択した該試験作用物質が線維症を処置できる作用物質である、ステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
選択した前記試験作用物質が、ＶＤＲの前記ＶＤＲアゴニストへの結合を少なくとも１０倍増強する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１種または複数の選択した前記試験作用物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
選択した前記試験作用物質のうちの１種または複数を、線維症を有する哺乳動物に投与するステップ、および
１種または複数の該試験作用物質が該線維症を処置するかどうかを決定するステップ
をさらに含む、請求項２０から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記線維症を処置した試験作用物質を選択するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記線維症が肝臓線維症である、請求項２０から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
星細胞によるＶＤＲの発現を増加させる方法であって、
該星細胞を、ＶＤＲアゴニストの該ＶＤＲへの結合を少なくとも１０倍増強するのに十分な量のＶＤＲアゴニストおよび十分な量のＴＧＦ−β１と接触させるステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年４月２４日に出願した米国仮出願第６１／８１５，５７５号に対する優先権を主張する。米国仮出願第６１／８１５，５７５号は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、ナノ粒子およびビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物（例えば、ＶＤＲアゴニスト）を含む組成物、ならびに例えば線維症を処置または予防するために例えば細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵を保持するまたは増加させるためにこのような化合物を使用する方法を提供する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＤＫ０５７９７８、ＨＬ１０５２７８、ＤＫ０９０９６２、ＨＬ０８８０９３、ＥＳ０１０３３７およびＣＡ０１４１９５下で政府支援によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な蓄積ならびにその結果として起こる柔軟性および肝機能の損失によって定義される肝線維症は、急性または慢性のいずれかの肝臓傷害によって引き起こされる創傷治癒反応の結果である（BatallerおよびBrenner、２００５年；Hernandez-GeaおよびFriedman、２０１１年；LeeおよびFriedman、２０１１年）。先進国において線維症をもたらす肝臓傷害の主原因には、慢性肝炎ウイルス（ＨＢＶ／ＨＣＶ）感染、アルコール乱用および次第に増えてきている非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる（Friedman、１９９９年、２００３年；FriedmanおよびBansal、２００６年；Siegmundら、２００５年）。持続性の傷害と共に、線維状コラーゲンの進行性の沈着が存在し、最終的に、肝硬変の組織学的特徴である、コラーゲンバンドによって囲まれる実質小結節をもたらす（BatallerおよびBrenner、２００５年；Friedman、２００３年）。
【０００５】
慢性肝臓疾患および肝硬変は主要な世界の健康上の懸念を代表する（BatallerおよびBrenner、２００５年）。豪州およびＵＫにおいて、慢性肝臓疾患は、心臓疾患、がん、脳卒中および胸部疾患に続いて５番目に多い死因である（Williams、２００６年）。ＵＳにおいて、それらは８番目に多い死亡原因としてランク付けされている（Kimら、２００２年）。現在、慢性肝臓疾患に対する抗線維化治療でＦＤＡに承認されているものはなく（Cohen-NaftalyおよびFriedman、２０１１年）、肝臓疾患の基礎をなす原因が改善できない場合、治療選択肢は、門脈圧亢進症、肝細胞癌および肝不全などの、結果として生じる合併症に対処することに限られる。したがって、肝臓における肝臓線維形成反応を調節する分子機構のより深い理解が、成功する抗線維化治療のための新規標的を同定するために必要とされる。
【０００６】
肝臓線維症における中心的なプレーヤーは肝星細胞（ＨＳＣ）などの非実質細胞（ＮＰＣ）であり（BatallerおよびBrenner、２００５年；Bouwensら、１９９２年）、これはＥＣＭの主要な生産者である（Friedman、２００８年；Friedmanら、１９８５年；Reynaertら、２００２年）。健康な肝臓において、ＨＳＣは、類洞内皮と肝細胞との間のディッセ腔に位置するレチノイド（ビタミンＡ）貯蔵細胞である（Friedman、２００８年）。傷害後、パラクリン刺激により、ＨＳＣは（活性化と呼ばれるプロセスにおいて）劇的な表現型変化を受け、それによりそれらは、ケモカイン、サイトカインおよび病理学的細胞外マトリックス構成成分の分泌を伴う、増殖、収縮性およびレチノイド貯蔵の損失を示す（Friedman、２００８年；Geerts、２００１年）。このプロセスを調節する正確な機構はまだ解明されていないが、形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）シグナル伝達が、ＥＣＭ合成の原因となる最も効力のある線維化促進（pro-fibrotic）経路のうちの１つとして認識されている（Breitkopfら、２００６年；InagakiおよびOkazaki、２００７年）。
【０００７】
ＴＧＦβは、細胞分裂、分化、移動、接着、組織化および死に対して大きな効果を有する多機能サイトカインである。ＴＧＦβの３つの主要なアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）が存在し、ＴＧＦβ１は肝臓線維症に関与する主なアイソフォームである（InagakiおよびOkazaki、２００７年）。肝臓傷害後、パラクリンおよびオートクリン源の両方に由来するＴＧＦβ１はＨＳＣの細胞表面上のＩ型およびＩＩ型セリン／トレオニン受容体キナーゼと結合する（InagakiおよびOkazaki、２００７年）。その後、その下流エフェクターであるＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３がリン酸化され、サイトゾル内に放出され、それらがＳＭＡＤ４と複合体を形成する。このＳＭＡＤ複合体は次いで、核内に移行し、ゲノム上のＳＭＡＤ結合エレメント（ＳＢＥ）を認識し、標的遺伝子を直接調節する（FengおよびDerynck、２００５年；Massagueら、２００５年）。したがって、ＨＳＣにおけるＴＧＦβ−ＳＭＡＤ転写ネットワークを解明し、それが細胞外および細胞内因子によりどのように制御され得るかを理解することは、効果的な抗線維化戦略の開発にとって重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bataller,  R.,およびBrenner,  D.A.  (2005).  Liver  fibrosis.  J  Clin  Invest  115,  209-218
【非特許文献２】Hernandez-Gea,  V.,およびFriedman,  S.L.  (2011).  Pathogenesis  of  liver  fibrosis.  Annu  Rev  Pathol  6,  425-456.
【非特許文献３】Lee,  U.E.,およびFriedman,  S.L.  (2011).  Mechanisms  of  hepatic  fibrogenesis.  Best  Pract  Res  Clin  Gastroenterol  25,  195-206.
【非特許文献４】Friedman,  S.L.  (1999).  Evaluation  of  fibrosis  and  hepatitis  C.  Am  J  Med  107,  27S-30S.
【非特許文献５】Friedman,  S.L.  (2003).  Liver  fibrosis  --  from  bench  to  bedside.  J  Hepatol  38  Suppl  1,  S38-53.
【非特許文献６】Friedman,  S.L.,およびBansal,  M.B.  (2006).  Reversal  of  hepatic  fibrosis  --  fact  or  fantasy?  Hepatology  43,  S82-88.
【非特許文献７】Siegmundら(2005).  Molecular  mechanisms  of  alcohol-induced  hepatic  fibrosis.  Dig  Dis  23,  264-274.
【非特許文献８】Williams,  R.  (2006).  Global  challenges  in  liver  disease.  Hepatology  44,  521-526.
【非特許文献９】Kimら(2002).  Burden  of  liver  disease  in  the  United  States:  summary  of  a  workshop.  Hepatology  36,  227-242.
【非特許文献１０】Cohen-NaftalyおよびFriedman  (2011).  Current  status  of  novel  antifibrotic  therapies  in  patients  with  chronic  liver  disease.  Therap  Adv  Gastroenterol  4,  391-417.
【非特許文献１１】Bouwensら(1992).  Liver  cell  heterogeneity:  functions  of  non-parenchymal  cells.  Enzyme  46,  155-168.
【非特許文献１２】Friedman,  S.L.  (2008).  Hepatic  stellate  cells:  protean,  multifunctional,  and  enigmatic  cells  of  the  liver.  Physiol  Rev  88,  125-172.
【非特許文献１３】Friedman,  S.L.,  Roll,  F.J.,  Boyles,  J.,およびBissell,  D.M.  (1985).  Hepatic  lipocytes:  the  principal  collagen-producing  cells  of  normal  rat  liver.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  82,  8681-8685.
【非特許文献１４】Reynaertら(2002).  Hepatic  stellate  cells:  role  in  microcirculation  and  pathophysiology  of  portal  hypertension.  Gut  50,  571-581.
【非特許文献１５】Geerts,  A.  (2001).  History,  heterogeneity,  developmental  biology,  and  functions  of  quiescent  hepatic  stellate  cells.  Semin  Liver  Dis  21,  311-335.
【非特許文献１６】Breitkopf,  K.,  Godoy,  P.,  Ciuclan,  L.,  Singer,  M.V.,およびDooley,  S.  (2006).  TGF-beta/Smad  signaling  in  the  injured  liver.  Z  Gastroenterol  44,  57-66.
【非特許文献１７】Inagaki,  Y.,およびOkazaki,  I.  (2007).  Emerging  insights  into  Transforming  growth  factor  beta  Smad  signal  in  hepatic  fibrogenesis.  Gut  56,  284-292.
【非特許文献１８】FengおよびDerynck  (2005).  Specificity  and  versatility  in  tgf-beta  signaling  through  Smads.  Annu  Rev  Cell  Dev  Biol  21,  659-693.
【非特許文献１９】Massagueら(2005).  Smad  transcription  factors.  Genes  Dev  19,  2783-2810.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
肝臓機能におけるビタミンＤについての生理的役割は、肝臓における低レベルのＶＤＲ発現に起因して長い間、退けられていたが（Bookoutら、２００６年；Hanら、２０１０年）、本明細書においてＶＤＲは肝臓線維症のモジュレーターであることが示される。例えば、肝傷害の標準的なマウスモデルにおいて、合成ＶＤＲアゴニストカルシポトリオールの投与はコラーゲン沈着および線維化遺伝子発現の両方を減少させる。また、Ｖｄｒノックアウトマウスが、自然発生する肝臓線維症を発症することも示され、正常な肝臓恒常性におけるこの受容体の役割を証明している。機構研究により、ＶＤＲシグナル伝達の活性化が、肝星細胞（ＨＳＣ）における線維化促進遺伝子に対する広範囲のＴＧＦβ／ＳＭＡＤ依存性転写反応に拮抗することが明らかにされた。ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３のゲノム−ワイド結合部位のマッピングにより、線維化促進遺伝子のｃｉｓ−調節エレメント上のこれらの転写因子の重複するＤＮＡ占有率が明らかになった。加えて、ＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナル伝達は、これらのゲノム遺伝子座とのリガンドＶＤＲの接近性を向上させ、これは同様にＳＭＡＤ３の動員に拮抗した。この動的ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノムフィードバック回路は肝線維形成を調節するための以前に認識されていない機構を表す。
【００１０】
これらの観察に基づいて、ナノ粒子ならびに細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵のうちの１つまたは複数を増加させる化合物などの、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物を含む組成物が本明細書に提供される。ナノ粒子はビタミンＤアゴニストを肝臓、膵臓または腎臓に送達するために使用され得る。一例において、ナノ粒子には、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−６−リン酸修飾アルブミン（例えば、ナノ粒子を肝星細胞に対して標的化するために、例えば、Liら、J.  Pharm.  Pharmacol.  ２００９年、６１巻（９号）：１１５５〜６１頁を参照のこと）、脂肪酸エステルまたはレチニルエステルのうちの１つまたは複数が含まれる。このような作用物質は、（例えば、これらの作用物質の１つまたは複数で被覆された）ナノ粒子の表面に存在してもよい。いくつかの例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子である。ナノ粒子中またはナノ粒子上に存在してもよいＶＤＲアゴニストの例には、限定されないが、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆体およびそれらの組合せが含まれる。開示される組成物は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体）またはそれらの組合せなどの他の治療剤を含んでもよい。
【００１１】
上皮細胞または星細胞などの細胞においてビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するために治療有効量の開示される組成物を使用する方法もまた、提供される。このような方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてもよい。例えば、治療有効量の組成物は投与を必要とする被験体に投与されてもよく、それにより被験体における上皮細胞および／または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持することができる。いくつかの例において、被験体は、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症／肝硬変、胆管線維症／胆汁性肝硬変、肝臓がん、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、膵臓線維症、膵管腺癌（ＰＤＡ）または腎臓の線維症のうちの１つまたは複数などの肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患を有する。
【００１２】
星細胞（肝臓星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎臓星細胞など）によるＶＤＲの発現を増加させる方法もまた、提供される。このような方法は、星細胞（stellate）を、ＶＤＲアゴニストとＶＤＲとの結合を少なくとも１０倍向上させるのに十分な量のＶＤＲアゴニストと接触させるステップを含んでもよい。
【００１３】
本開示はまた、肝臓、膵臓または腎臓線維症などの線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、星細胞（肝臓星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎臓星細胞など）を、１種または複数の試験作用物質および必要に応じてＴＧＦ−β１と接触させるステップを含んでもよい。その後、星細胞によるＶＤＲアゴニストの産生、星細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生もしくは発現、星細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾（リン酸化）もしくは発現、ＶＤＲアゴニストのＶＤＲへの結合またはそれらの組合せが検出される。１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるＶＤＲアゴニストの産生を少なくとも５倍増加させる、１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生を少なくとも５倍増加させる、１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾（リン酸化）もしくは発現を少なくとも１．５倍減少させる、またはそれらの組合せとなる試験作用物質が選択される。選択される試験作用物質は線維症を処置できる作用物質である。いくつかの例において、方法はまた、１種または複数の試験作用物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップを含む。
【００１４】
本開示の上述および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する、以下の詳細な記載からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−１Ｅ】ＨＳＣにおける機能性ＶＤＲの特異的発現。（Ａ）ネズミの肝臓、初代肝細胞およびＨＳＣにおける相対的ＶＤＲ  ｍＲＮＡ発現（肝臓における発現＝１）。レベルはＲＴ−ｑＰＣＲにより定量した。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、***ｐ＜０．００１）。（Ｂ）（Ａ）の試料由来タンパク質溶解物中のＶＤＲに関するウエスタンブロット。（Ｃ）新鮮に単離された初代ネズミＨＳＣをＶＤＲ特異的抗体で染色し、ＶＤＲの発現をモニターした。ＤＮＡを、ＤＡＰＩ染色により可視化した。（Ｄ）および（Ｅ）ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した、表示の濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３またはカルシポトリオール（Ｃａｌ）と一緒に１６時間、インキュベートした初代ネズミＨＳＣ（ｍＨＳＣ）またはＬＸ−２細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１  ｍＲＮＡの相対的発現（未処置ＨＳＣの発現＝１）。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。
【図２Ａ−２Ｆ】ＣＣｌ４−処置マウスにおける肝臓線維症の際のカルシポトリオールの予防効果。（Ａ）カルシトリオール（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）およびカルシポトリオールの分子構造。（Ｃ）カルシポトリオール（Ｃａｌ、２０μｇ／ｋｇ、経口強制栄養）による前処置、その後のＣＣｌ４／カルシポトリオールの共処置を４週間（ｎ＝５）実施した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の代表的肝臓のシリウスレッド（左）およびＨ＆Ｅ（右）による染色。（Ｄ）および（Ｅ）シリウスレッド染色に基づく線維症の定量（Ｄ）およびＨ＆Ｅ染色に基づき肝臓線維症を評価するＩｓｈａｋスコア（Ｅ）。（Ｆ）および（Ｂ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）（ｎ＝３）、四塩化炭素（ＣＣｌ４、０．５ｍｌ／ｋｇ、ｎ＝６）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝３）およびＣＣｌ４＋カルシポトリオール（ｎ＝６）により４週間処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける肝ヒドロキシプロリン含有量（Ｆ）、血清カルシウム濃度（Ｂ）（図３を参照されたい）。
【図３Ａ−３Ｇ】図３Ａ〜３Ｊ。カルシポトリオールの全身投与は、ＣＣｌ４処置マウスにおいて肝臓線維症を減弱し、一方、Ｖｄｒの遺伝子阻害（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ）は特発性肝臓線維症をもたらす。（Ａ）シリウスレッド（左）およびＨ＆Ｅ（右）により染色された、４週間処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の肝臓（ビヒクル（ＤＭＳＯ）（ｎ＝３）、四塩化炭素（ＣＣｌ４、０．５ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝６）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、２０μｇ／ｋｇ  経口強制栄養、ｎ＝３）およびＣＣｌ４＋カルシポトリオール（ｎ＝６））。スケールバー、２００μｍ。（Ｂ）シリウスレッド染色、（Ｃ）ヒドロキシプロリン含有量および（Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色（Ｉｓｈａｋスコア）により定量された線維症。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。（Ｅ）−（Ｇ）Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆβ１およびＴｉｍｐ１の肝臓遺伝子発現レベルのＲＴ−ｑＰＣＲ測定。データは、平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。カルシウムおよびホスフェートを補充した救済食餌（２％カルシウム、１．２５％リン、２０％ラクトース）で６カ月飼育し、その後犠牲にしたＶｄｒ＋／＋（ｎ＝３）、Ｖｄｒ＋／−（ｎ＝４）およびＶｄｒ−／−（ｎ＝４のうちの２）マウス由来の、（Ｈ）シリウスレッド（上）およびＨ＆Ｅ（下）染色された肝臓切片。矢印は、それぞれ、類洞周囲の線維症（Ｖｄｒ＋／−マウス）および炎症細胞の浸潤（Ｖｄｒ−／−マウス）を示す。スケールバー、５０μｍ。（Ｉ）ヒドロキシプロリン含有量により定量された線維症および（Ｊ）シリウスレッド染色により線維症が最も軽度であることを示すＶｄｒ−／−マウス由来の４つの肝臓のうちの２つを使用したＣｏｌ１ａ１  ｍＲＮＡの発現（結果を参照されたい）。データは平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５）。
【図３Ｈ−３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊ。カルシポトリオールの全身投与は、ＣＣｌ４処置マウスにおいて肝臓線維症を減弱し、一方、Ｖｄｒの遺伝子阻害（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ）は特発性肝臓線維症をもたらす。（Ａ）シリウスレッド（左）およびＨ＆Ｅ（右）により染色された、４週間処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の肝臓（ビヒクル（ＤＭＳＯ）（ｎ＝３）、四塩化炭素（ＣＣｌ４、０．５ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝６）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、２０μｇ／ｋｇ  経口強制栄養、ｎ＝３）およびＣＣｌ４＋カルシポトリオール（ｎ＝６））。スケールバー、２００μｍ。（Ｂ）シリウスレッド染色、（Ｃ）ヒドロキシプロリン含有量および（Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色（Ｉｓｈａｋスコア）により定量された線維症。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。（Ｅ）−（Ｇ）Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆβ１およびＴｉｍｐ１の肝臓遺伝子発現レベルのＲＴ−ｑＰＣＲ測定。データは、平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。カルシウムおよびホスフェートを補充した救済食餌（２％カルシウム、１．２５％リン、２０％ラクトース）で６カ月飼育し、その後犠牲にしたＶｄｒ＋／＋（ｎ＝３）、Ｖｄｒ＋／−（ｎ＝４）およびＶｄｒ−／−（ｎ＝４のうちの２）マウス由来の、（Ｈ）シリウスレッド（上）およびＨ＆Ｅ（下）染色された肝臓切片。矢印は、それぞれ、類洞周囲の線維症（Ｖｄｒ＋／−マウス）および炎症細胞の浸潤（Ｖｄｒ−／−マウス）を示す。スケールバー、５０μｍ。（Ｉ）ヒドロキシプロリン含有量により定量された線維症および（Ｊ）シリウスレッド染色により線維症が最も軽度であることを示すＶｄｒ−／−マウス由来の４つの肝臓のうちの２つを使用したＣｏｌ１ａ１  ｍＲＮＡの発現（結果を参照されたい）。データは平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５）。
【図４Ａ−４Ｃ】ＶＤＲシグナル伝達は、ＴＧＦβ誘導性線維化促進遺伝子を抑制する。（Ａ）新鮮に単離されたラットのＨＳＣ（静止ＨＳＣ、Ｑ−ＨＳＣ）、活性化ＨＳＣ（Ａ−ＨＳＣ、プラスチック上で３日培養）および１０ｎＭの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の存在下の細胞培養物（Ａ−ＨＳＣｓ＋１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）中の、５１９の差次的発現遺伝子を比較するヒートマップ。ｌｏｇ２変換されたマイクロアレイ発現データを使用した、行および列の両方のユークリッドクラスタリング、ｎ＝２／処置群。（Ｂ）ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）およびＴＧＦβ１＋１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１００ｎＭ）で２４時間処置した初代ラットＨＳＣにおける線維症に関与する遺伝子の倍数発現変化のヒートマップ、ｎ＝２／処置群。（Ｃ）対照（ｓｉＣＮＴＬ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、１００ｎＭ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）もしくはＴＧＦβ１＋Ｃａｌで１６時間処理した、ＶＤＲ特異的（ｓｉＶＤＲ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＸ−２細胞における線維化遺伝子発現。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【図５Ａ−５Ｂ】ＳＭＡＤ２／３は、ＴＧＦβ誘導性線維化遺伝子発現に必要である。（Ａ）対照（ＣＮＴＬ）、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３またはＳＭＡＤ２／３特異的ｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクトし、その後ビヒクルまたはＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理したＬＸ−２細胞中の、ＲＴ−ｑＰＣＲにより決定されたＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２の相対的発現。（Ｂ）ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）＋／−カルシポトリオール（１００ｎＭ）で表示の時間処理したＬＸ−２細胞中の合計ＳＭＡＤ３およびリン酸化ＳＭＡＤ３。核抽出物をＳＭＡＤ２／３抗体を使用して免疫沈降させ、その後ウエスタンブロット分析を行った。星印は、非特異的バンドを表す。
【図６Ａ−６Ｈ】肝星細胞中のＶＤＲおよびＳＭＡＤ３のシストローム。（Ａ）および（Ｅ）処理したＬＸ−２細胞（１６時間のカルシポトリオール（１００ｎＭ）前処理の後、カルシポトリオール（１００ｎＭ）およびＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）で４時間、ＦＤＲ＜０．０００１）中のＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合部位のゲノム位置を例示する円グラフ。プロモーター領域、ＴＳＳから＜２ｋｂ；遺伝子間領域はプロモーター領域、イントロン領域、エクソン領域を含まない。（Ｂ）および（Ｆ）それぞれ、ＣＹＰ２４Ａ１およびＩＤ１遺伝子にアライメントされたＶＤＲおよびＳＭＡＤ３に関する代表的ＣｈＩＰ−Ｓｅｑリード。（Ｃ）および（Ｇ）ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３結合部位をアノテーションされた遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類。（Ｄ）および（Ｈ）１００ｂｐのＶＤＲおよびＳＭＡＤ３ピーク内に配置された配列に対して実施された新規なモチーフ解析（ＦＤＲ＜０．０００１）。
【図７Ａ−７Ｄ】それらの標的遺伝子に対して正規化されたＶＤＲおよびＳＭＡＤ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑタグを表す遺伝子トラック。（Ａ）ＳＰＰ１、（Ｂ）ＢＧＬＡＰ、（Ｃ）ＳＭＡＤ７および（Ｄ）ＴＧＦβ１。
【図８Ａ−８Ｆ】ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３の遺伝子クロストークを介したＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニズム。（Ａ）図４のように処理したＬＸ−２細胞におけるＶＤＲおよびＳＭＡＤ３のゲノム結合部位の重複を表すベン図である。（Ｂ）統計的に有意なＳＭＡＤ３結合ピークの中心からの、距離の関数としてのＣｈＩＰ断片密度の階層的クラスタリングを示す強度プロット（２３，５３２ピーク、ＦＤＲ＝０．０００１）。ＶＤＲ（青）の０位の周りの強度は重複するＶＤＲ／ＳＭＡＤ３部位を示し、ＳＭＡＤ３（赤）は陽性対照として機能する。（Ｃ）ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の共結合部位においてｑＰＣＲにより分析された、処理したＬＸ−２のＣｈＩＰ−ｒｅ−ＣｈＩＰ。占有率は、インプットクロマチンと比べて表される。（Ｄ）ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共占有される遺伝子において富化された一般的ヒト表現型。（Ｅ）ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共占有されるゲノム部位を含有する、ＴＧＦβ１／ＶＤＲにより共調節される線維化促進遺伝子の数。（Ｆ）図６Ａ〜６Ｈのように処理したＬＸ−２細胞においてＴＧＦβ１およびＶＤＲにより共調節された線維化促進遺伝子において観察される、ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位の数。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。表３および図９Ａ〜９Ｂもまた参照されたい。
【図９Ａ−９Ｂ】ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３の共結合部位は、ビタミンＤとＴＧＦβとの間の拮抗作用を媒介する。（Ａ）空ｐＧＬ３レポーターまたは図１０Ｃに表されたＣＯＬ１Ａ１の２つの（１＋２）ＶＤＲ／ＳＭＡＤ共結合部位を担持するｐＧＬ３レポーターと、内部標準のβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＸ−ＬａｃＺ）とをトランスフェクトされたＬＸ−２細胞を、表示のさまざまな条件で処置した。トランスフェクトされた全細胞溶解物を、β−ガラクトシダーゼ活性を内部標準として使用して、正規化されたルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）は、同じレポーターをトランスフェクトして、ビヒクルで処理した細胞において得られた正規化ルシフェラーゼ活性を任意に値１として割り当て、これに比べて表される。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立したトランスフェクションの平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、**ｐ＜０．０１）。（Ｂ）２００ｂｐウインドウ内のＳＭＡＤ３結合頻度の移動平均を、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共結合されるゲノム領域内のＶＤＲ結合部位の中心とする。
【図１０Ａ−１０Ｇ】ＶＤＲとＳＭＡＤとの間のゲノムアンタゴニズム。（Ａ）および（Ｂ）ＬＸ−２細胞におけるＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位の中心と比べたＶＤＲおよびＳＭＡＤ３  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑのシグナル強度のプロット（ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）±カルシポトリオール（１００ｎＭ）、４時間）。（Ｃ）処理したＬＸ−２細胞（ビヒクル（ＤＭＳＯ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、１００ｎＭ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ１＋カルシポトリオール）におけるＶＤＲおよびＳＭＡＤ３に関して、ＣＯＬ１Ａ１にアライメントされた代表的ＣｈＩＰ−Ｓｅｑリード。３つの共占有部位を、１、２および３と指定する。（Ｄ）および（Ｆ）上記のように処理したＬＸ−２細胞において、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共結合されたＣＯＬ１Ａ１調節領域１番におけるＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ。（Ｅ）および（Ｇ）上記のように処理した、対照（ｓｉＣＮＴＬ）、ＶＤＲ特異的（ｓｉＶＤＲ）またはＳＭＡＤ３特異的（ｓｉＳＭＡＤ３）なｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＬＸ−２細胞の、ＣＯＬ１Ａ１調節領域１番におけるＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ。占有率は、インプットクロマチンと比べて表される。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【図１１Ａ−１１Ｆ】（Ａ）−（Ｆ）に表示された異なる条件下の、線維化遺伝子のための正規化されたＶＤＲおよびＳＭＡＤ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑタグを表す遺伝子トラック。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＶＤＲおよびＳＭＡＤにより共占有された線維化遺伝子の調節領域における、コアクチベーター／コリプレッサーの動員およびヒストンＨ３アセチル化状態。（Ａ）処理したＬＸ−２細胞（ビヒクル（ＤＭＳＯ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ、１００ｎＭ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ１＋カルシポトリオール）を、ＣＢＰ、ｐ３００およびアセチル化ヒストンＨ３を認識する抗体を使用して免疫沈降させ、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共結合されたＣＯＬ１Ａ１調節領域１番に隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）プライマーを使用したｑＰＣＲにより分析した。占有率のレベルは、対応する条件で処理したＬＸ−２細胞において、インプットクロマチンに対して表される。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、統計的有意差を表す（スチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５）。（Ｂ）処理したＬＸ−２細胞（ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）＋／−カルシポトリオール（１００ｎＭ））を、表示の抗体で免疫沈降させ、ＣＯＬ１Ａ１またはＣＯＬ１Ａ２の調節領域のいずれかに隣接するプライマーを使用したｑＰＣＲにより分析した。占有率のレベルは、対応する条件で処理したＬＸ−２細胞において、インプットクロマチンと比べて表される。
【図１３Ａ−１３Ｆ】ＴＧＦβは、シグナル依存性ＶＤＲシストローム（Citrome）をアンマスクする。（Ａ）処理したＬＸ−２細胞において重複するＶＤＲシストロームを表すベン図（ＦＤＲ＜０．０００１）。（Ｂ）ＬＸ−２細胞のＳＭＡＤ３結合部位の中心に対する、ＶＤＲ  Ｃａｌ／ＴＧＦβ１＋Ｃａｌ（３，５３７の重複）、ＶＤＲ  Ｃａｌ単独（２，７４４のカルシポトリオール単独）またはＶＤＲ  ＴＧＦβ１＋Ｃａｌ単独（２１，４４７カルシポトリオール＋ＴＧＦβ１単独）として分類される、（Ａ）に表されたＶＤＲ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑのピーク位置のプロット。（Ｃ）表示のように処理したＬＸ−２細胞中のＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位の中心に対するＶＤＲ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑシグナル強度のプロット。（Ｄ）上記のように処理したＬＸ−２細胞由来の核抽出物および全細胞抽出物（ＮＥ、ＷＣＥ）中のＶＤＲに対するウエスタンブロット。ＴＦＩＩＨ（ｐ８９）を、負荷対照として使用した。（Ｅ）ＶＤＲＥを含有する、カルシポトリオール単独、カルシポトリオール＋ＴＧＦβ１単独またはカルシポトリオール／カルシポトリオール＋ＴＧＦβ１重複ＶＤＲ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピークの百分率。（Ｆ）表示のように処理したＬＸ−２細胞におけるＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位の中心に対するヒストンＨ３  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑシグナル強度のプロット。
【図１４Ａ−１４Ｄ】ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路。（Ａ）および（Ｂ）処理したＬＸ−２細胞（ビヒクル（ＤＭＳＯ）、カルシポトリオール（１００ｎＭ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）＋カルシポトリオール（１００ｎＭ））のＣＯＬ１Ａ１調節領域１番におけるＶＤＲおよびＳＭＡＤ３結合の、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲにより決定したタイムコース。ＬＸ−２細胞を、カルシポトリオール（１００ｎＭ）で１６時間前処置し、その後のタイムコースアッセイを実施し、占有率は、インプットクロマチンと比べて表される。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。星印は、対応する時点のカルシポトリオール誘導性ＶＤＲの占有率またはＴＧＦβ１誘導性ＳＭＡＤ３の占有率と比較した統計的有意差を表す（対応のないスチューデントｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。（Ｃ）それぞれ、カルシポトリオール単独またはＴＧＦβ１単独に対して正規化された、ＴＧＦβ１＋カルシポトリオール誘導性のＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合のタイムコース。データは、三連で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。（Ｄ）ＨＳＣにおいて線維化促進反応を制御する、提唱されたＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路を表すモデル。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列表
核酸配列は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されているヌクレオチド塩基についての標準的な省略文字を使用して示される。各々の核酸配列の一本鎖のみが示されるが、示された鎖に対する任意の参照により相補鎖が含まれることは理解される。
【００１７】
配列番号１〜３４は様々な遺伝子の発現を測定するために使用されるプライマー配列である。
【００１８】
詳細な説明
用語および方法の以下の説明は、本開示をより良く記載し、当業者に本開示の実施の指針を示すために提供される。単数形「一つの（a）」、「一つの（an）」および「その」は、文脈が他のことを明確に示さない限り、１つまたは１つ超を指す。例えば、「細胞を含む」という用語は、単一または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞を含む」という語句と等価とみなされる。「または」という用語は、文脈が他のことを明確に示さない限り、述べられている代替のエレメントの単一のエレメントまたは２つまたはそれ超のエレメントの組合せを指す。本明細書に使用される場合、「含む（comprises）」は「含む（includes）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、追加のエレメントを排除せずに「Ａ、ＢまたはＡおよびＢを含む」ことを意味する。本明細書に参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号は２０１４年４月２４日に利用可能となった配列に関して参照により組み込まれる。本明細書に引用される特許および特許出願ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号を含む、全ての参考文献は参照により組み込まれる。
【００１９】
他のことを説明されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料が本開示の実施または試験に使用されてもよいが、好適な方法および材料が以下に記載される。材料、方法および例は例示のみであり、限定することを意図していない。
【００２０】
本開示の実施または試験に好適な方法および材料は以下に記載される。しかしながら、提供される材料、方法および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。したがって、他のことを記載している場合を除いて、本開示の方法および技術は、記載されているものと類似もしくは等価の方法および材料に従って、ならびに／または当技術分野において周知であり、本明細書全体を通して引用され、論じられている様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されている従来の方法に従って実施されてもよい。
【００２１】
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される：
【００２２】
投与：本明細書に提供される組成物は、経口、経鼻、吸入、直腸、膣、経皮および非経口投与などの、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、それを必要とする被験体に送達されてもよい。一般に、非経口製剤は、摂取を除く任意の可能な様式を介して投与されるものである。この用語はまた、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、関節内、腫瘍内または皮下に投与されるかどうかに関わらず注射、ならびに例えば、鼻腔内、吸入、皮内および局所適用を含む、様々な表面適用を指す。
【００２３】
接触：ある作用物質を別の作用物質に近接させることにより、それらの作用物質が相互作用することを可能にすること。例えば、ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含有する組成物が細胞（例えば組織培養物中）に適用されてもよいか、または被験体に投与されてもよく、それによりナノ粒子／ＶＤＲアゴニストがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞と相互作用することを可能にする。
【００２４】
線維症：器官または組織の正常な構成要素としての線維化組織の形成とは対照的に、修復または反応プロセスとしての器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成または発生を指す。線維症という用語は、少なくとも肝臓／肝線維症、腎臓／腎線維症および膵臓線維症を含む。特定の例において、本明細書において処置される被験体は肝臓線維症などの線維症を有する。
【００２５】
肝線維症は、異常な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の蓄積および結果として起こる肝機能の損失であり、慢性肝臓傷害により引き起こされる炎症により駆動される創傷治癒プロセスを伴う（BatallerおよびBrenner  ２００５年  J  Clin  Invest.、１１５巻（２号）：２０９〜１８頁）。線維症をもたらす肝臓傷害の一般的な原因には、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症、アルコール乱用、慢性Ｂ型肝炎感染症（ＨＢＶ）および座りがちな生活様式が増加している状況において肥満および関連するインスリン抵抗性を上昇させる肝代謝結果を表す、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる（BatallerおよびBrenner  ２００５年  J  Clin  Invest.、１１５巻（２号）：２０９〜１８頁；Friedman  １９９９年  Am  J  Med.、１０７巻（６Ｂ号）：２７Ｓ〜３０Ｓ頁；Siegmundら、２００５年  Dig  Dis.、２３巻（３〜４号）：２６４〜７４頁；Friedman  &  Bansal  Hepatology.、４３巻（２号  補遺１）：Ｓ８２〜８頁）。肝傷害によって生じる炎症プロセスは、細胞修復、再生、増加した細胞外マトリックス代謝回転、および最終的に一部の患者において重篤な線維症を含む、様々な細胞反応を引き起こす。肝臓の進行性線維症は最終的に、肝硬変、肝臓機能の損失（非代償性肝硬変）、門脈圧亢進症および肝細胞癌を生じ得る（Bataller  &  Brenner  ２００５年  J  Clin  Invest.  １１５巻（２号）：２０９〜１８頁；Friedman  ２００３年  J.  Hepatol.  ３８巻（補遺１）：Ｓ３８〜Ｓ５３頁）。
【００２６】
理論によって束縛されないが、肝線維形成は、壊死細胞またはアポトーシス細胞を置きかえるために実質細胞が増殖する、継続した肝臓傷害後に起こる創傷治癒プロセスの結果であると考えられる。このプロセスは炎症反応およびＥＣＭの制限された沈着と関連する。肝傷害が持続する場合、最終的に肝細胞は、線維状コラーゲンを含む、豊富なＥＣＭ構成成分で置きかえられる。肝臓の小葉構築物内のこの線維性物質の分布は肝臓傷害の起源に依存する。慢性ウイルス性肝炎および慢性胆汁鬱滞性障害において線維化組織は最初に門脈路周囲に位置するのに対して、アルコール性肝臓疾患およびＮＡＳＨにおいて線維化組織は中心周辺および類洞周囲領域に見出される（Friedman  ２００３年  J.  Hepatol.、３８巻（補遺１）：Ｓ３８〜Ｓ５３頁；Popper  &  Uenfriend  １９７０年.  Am.  J.  Med.、４９巻：７０７〜７２１頁）。線維化肝臓疾患が進行するにつれて、病状が、単離されたコラーゲンバンドから架橋線維症（bridging  fibrosis）、および最終的にＩ型コラーゲンバンド内に封入される肝細胞の再生結節を伴う確立された肝硬変へ進む（Popper  &  Uenfriend  １９７０年.  Am.  J.  Med.、４９巻：７０７〜７２１頁）。
【００２７】
腎線維症は、透析または腎臓移植の必要性をもたらす一次後天性病変として顕著な罹患率および死亡率の原因となる。腎線維症は、腎臓の機能単位である、ネフロンの濾過または再吸収構成成分のいずれかにおいて起こり得る。実験モデルは、腎瘢痕化、特に糸球体濾過の自己調節に関与する生理の障害の一因となる多くの因子が同定された。このことは次に、蓄積された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）での正常な構造物の置きかえをもたらす。個々の細胞の生理の様々な変化は、瘢痕化を支持するためにＥＣＭ合成と分解との間の平衡の変化を刺激する多数のペプチド線維（fibrogen）および非ペプチド線維の産生をもたらす。末期の腎疾患（ＥＳＲＤ）のほとんど全ての形態は重篤な腎線維症によって特徴付けられる。
【００２８】
膵臓の線維症は慢性膵炎の様々な病因のうちの特有の特徴であり、壊死／アポトーシス、炎症および管閉塞のようなプロセスによって引き起こされる。膵臓における線維形成を誘導する初期事象は、間質間葉細胞、導管細胞および／または腺房細胞に関与し得る傷害である。膵臓のこれらの組織区画のいずれか１つに対する障害は、常在する線維芽細胞／膵臓星細胞の筋線維芽細胞へのサイトカイン誘発性形質転換ならびにその後の細胞外マトリックスの産生および沈着と関連する。膵臓および関与する組織区画における傷害部位に応じて、主に小葉間（辺縁）線維症(inter(peri)lobular  fibrosis)（慢性アルコール性膵炎のような）、管周囲線維症（遺伝性膵炎のような）、管周囲および小葉間線維症（自己免疫性膵炎のような）またはびまん性小葉間および小葉内線維症（閉塞性慢性膵炎のような）が発症する。
【００２９】
肝星細胞（ＨＳＣ）：肝臓の類洞周囲腔（類洞と肝細胞との間の小領域）に見出される周皮細胞を含む。肝星細胞は肝臓線維症に関与する主要な細胞型であり、これは肝臓障害に反応する瘢痕組織の形成である。星細胞は塩化金で選択的に染色され得るが、通常の組織学的調製物におけるそれらの静止（非活性化）状態におけるそれらの際立った特徴は、紫外（ＵＶ）光に曝露された場合、自己蛍光を発する、それらの細胞質内の複数のビタミンＡリッチ脂質滴の存在である。
【００３０】
正常な肝臓において星細胞は静止状態で存在する。静止星細胞は肝臓細胞の総数の５〜８％を表す。各細胞は、細胞体から延び、類洞に巻き付く数個の長い突起部を有する。細胞体内の脂質滴はビタミンＡを貯蔵する。理論によって束縛されないが、静止肝星細胞は、生理的（正常）ＥＣＭ産生および代謝回転において役割を果たし、さらに、肝臓に常在する抗原提示細胞として作用し、脂質抗原をＮＫＴ細胞に提示し、ＮＫＴ細胞の増殖を刺激すると考えられる。
【００３１】
肝臓が障害を受ける場合、星細胞は活性化した状態に変化し得る。活性化した星細胞は、増殖、収縮性および走化性によって特徴付けられる。貯蔵されるビタミンＡの量は肝臓傷害において徐々に減少する。活性化した星細胞はまた、分泌過剰および病的ＥＣＭ構成成分の原因となり、さらに、マトリックス分解酵素の産生を減少させ、これにより線維症をもたらす。
【００３２】
高カルシウム血症：血液中の上昇向上したカルシウムレベルは、例えば、上昇したレベルの１α，２５（ＯＨ）２−ＶｉｔＤ３（正常範囲：約８．５〜１０．５ｍｇ／ｄＬまたは２．２〜２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）によって引き起こされ得る。これは、過剰な骨格カルシウム放出、増加した腸管でのカルシウム吸収または低下した腎臓でのカルシウム排泄に起因し得る。
【００３３】
高カルシウム血症自体は、疲労、うつ、錯乱、食欲不振、吐き気、嘔吐、便秘、膵炎または排尿増加をもたらし得る。心拍リズムの異常も生じる可能性があり、短いＱＴ間隔および拡大したＴ波のＥＫＧ所見は高カルシウム血症を示唆している。
【００３４】
症状は高カルシウムレベル（１２．０ｍｇ／ｄＬまたは３ｍｍｏｌ／ｌ）においてより一般的である。重度の高カルシウム血症（１５〜１６ｍｇ／ｄＬ超または３．７５〜４ｍｍｏｌ／ｌ超）は医学的緊急事態とみなされ：これらのレベルにおいて、昏睡および心停止が生じる可能性がある。
【００３５】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸分子、ペプチドまたは細胞など）は、混合試料（細胞抽出物など）中の他の生物学的構成成分から精製されている。例えば、「単離された」ペプチドまたは核酸分子は、ペプチドまたは核酸分子が存在している細胞（組換えペプチドまたは核酸分子についての発現宿主細胞など）の他の構成成分から分離されているペプチドまたは核酸分子である。
【００３６】
薬学的に許容される担体：本開示に有用な薬学的に許容される担体は従来の通りである。E.  W.  MartinによるRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）は、本明細書に開示される組成物の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。例えば、本明細書に提供される組成物は１種または複数の薬学的に許容される担体の存在下で投与されてもよい。
【００３７】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理的に許容される流体を含む注射可能な流体、例えば、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む。固体組成物（例えば、粉剤、丸薬、錠剤またはカプセル形態）に関して、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含んでもよい。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有してもよい。他の医薬組成物の実施形態は、当業者に公知であるような従来の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび対イオンを用いて調製されてもよい。いくつかの実施形態において組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、粉剤、溶液剤または懸濁剤などの固体、半固体および液体剤形において単位用量の形態である。
【００３８】
ＳＭＡＤ３（デカペンタプレジックホモログ３に対する起源）：ＯＭＩＭ６０３１０９。ＳＭＡＤ３核酸分子およびタンパク質を含む。ＳＭＡＤ３タンパク質は大いに細胞に関与し、ＴＧＦβシグナルをモジュレートする。ＳＭＡＤ３配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公的に利用可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿００１１３８５７４．１およびＡＡＢ８１７５５．１は例示的なＳＭＡＤ３タンパク質配列を提供するのに対して、受託番号ＡＨ０１１３９０．１、ＮＭ＿００１１４５１０２．１およびＡＦ０１６１８９．１は例示的なＳＭＡＤ３核酸配列を提供する）。当業者は、ＳＭＡＤ３生物活性を保持するＳＭＡＤ３バリアント（これらの公的に利用可能な配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、またはＳＭＡＤ３の成熟形態とこのような量を有するこれらのバリアント配列など）を含む、さらなるＳＭＡＤ３核酸配列およびタンパク質配列を同定できる。
【００３９】
被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む分類である、生存している多細胞脊椎動物。本明細書に開示される方法および組成物は、医学的および獣医学的状況において同等の用途を有する。したがって、「被験体」という一般用語は、限定されないが、ヒトまたは他の霊長類（サルを含む）、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなどの獣医学的被験体を含む、全ての動物を含むことが理解される。一例において、被験体は、肝臓、膵臓または腎臓の線維症を発症する危険性を有するか、または危険性がある被験体である。
【００４０】
治療有効量：単独または他の薬剤と組み合わせた治療剤（ＶＤＲアゴニストを含む本明細書に提供される組成物など）の量は、疾患の進行を予防し、疾患の退縮を引き起こすのに十分であるか、または肝臓、膵臓もしくは腎臓の線維症と関連する症状、例えば、発熱、呼吸器症状、線維化内容物（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）、疼痛もしくは腫れなどの疾患によって引き起こされる症状を緩和できる。一例において、治療有効量は、線維症の症状を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％減少させるのに十分なＶＤＲアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量である。一例において、治療有効量は、上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の量を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％増加させるのに十分なＶＤＲアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量である。一例において、治療有効量は、上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の量を保持するのに十分なＶＤＲアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量であり、このような量は，１０％以下、５％以下または１％以下など、２０％超まで低下させない。
【００４１】
形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）：ＯＭＩＭ  １９０１８０。ＴＧＦ−β１核酸分子およびタンパク質を含む。ＴＧＦβ−１タンパク質は細胞の成長および分裂（増殖）、細胞が特定の機能（分化）、細胞運動（運動性）および細胞の自滅（アポトーシス）を実施するために成熟するプロセスを制御するのに役立つ。ＴＧＦ−β１配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公的に利用可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿０００６５１．３およびＮＰ＿０３５７０７．１は例示的なＴＧＦ−β１タンパク質配列を提供するのに対して、受託番号ＮＭ＿０００６６０およびＮＭ＿０１１５７７は例示的なＴＧＦ−β１核酸配列を提供する）。当業者は、ＴＧＦ−β１生物活性を保持するＴＧＦ−β１バリアント（これらの公的に利用可能な配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、またはＴＧＦ−β１の成熟形態とこのような量の同一性を有するこれらのバリアント配列など）を含む、さらなるＴＧＦ−β１核酸配列およびタンパク質配列を同定できる。
【００４２】
疾患を処置する：「処置」とは、疾患または病態（例えば線維症）の兆候または症状が発症し始めた後、それを改善する治療的介入を指す。「予防」とは、例えば、肝臓、膵臓または腎臓の線維症を発症する危険性があったまたは危険性があるヒトなどの、疾患にかかりやすいことが知られているヒトにおいて疾患の完全な発症を阻止することを指す。
【００４３】
ビタミンＤ：脂溶性セコステロイドプロホルモンおよびホルモンの群、それらの２つの主要な形態はビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ３（コレカルシフェロール）であり、それらは、ビタミンＤの生理的に活性な形態である、カルシトリオールとしても公知である、１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）に変換される。
【００４４】
ビタミンＤアゴニストまたは類似体：ＶＤＲリガンド（例えば、カルシトリオール）、ＶＤＲアゴニスト前駆体、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ前駆体などの、ＶＤＲに結合し、活性化する、合成または天然の任意の化合物。
【００４５】
天然および合成のビタミンＤアゴニストおよび類似体の特定の非限定的な例には、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、カルシポトリオール、ＬＧ１９００９０、ＬＧ９１９０１１９、ＬＧ１９０１５５、ＬＧ１９０１７６およびＬＧ１９０１７８（例えば、Boehmら、（１９９９年）  Chemistry  &  Biology、６巻：２６５〜２７５頁を参照のこと）；ＬＹ２１０８４９１およびＬＹ２１０９８６６（Maら、（２００６年）  J  Clin.  Invest.、１１６巻：８９２〜９０４頁）；２β−（３−ヒドロキシプロポキシ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＤ−７１）（Tsurukamiら、（１９９４年）  Calcif.  Tiss.  Int.  ５４巻：１４２〜１４９頁）；ＥＢ１０８９（Pepperら、（２００３年）  Blood、１０１巻：２４５４〜２４６０頁）；ＯＣＴ（２２−オキサ−カルシトロール）（Makibayashiら、（２００１年）  Am.  J.  Path.、１５８巻：１７３３〜１７４１頁）；（１αＯＨ−２，１９−ｎｏｒ−２５ヒドロキシビタミンＤ３）および（１，３−デオキシ−２−ＣＨＣＨ２ＯＨ−１９−ｎｏｒ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３）（Posnerら、（２００５年）  Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry、１３巻：２９５９〜２９６６頁）およびReyら、（１９９９年）  J.  Organic  Chem.、６４巻：３１９６〜３２０６頁に開示されているビタミンＤ類似体のいずれか；ならびにリトコール酸(lithochoic  acid)（ＬＣＡ）およびウルソデオキシコール酸(ursodoxycholic  acid)（ＵＤＣＡ）などの胆汁酸誘導体（例えば、Nehringら、（２００７年）  PNAS、１０４巻：１０００６〜１０００９頁；Makishimaら、（２００２年）  Science、２９６巻：１３１３〜１３１６頁；Copaciら、（２００５年）  Rom.  J.  Gastroenterol.、１４巻：２５９〜２６６頁を参照のこと）が含まれる。これらの参考文献の各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
ビタミンＤ前駆体：酵素によってビタミンＤ受容体のアゴニストに変換できる任意の化合物。ある特定の非限定的な例において、その酵素はＣＹＰ２７Ｂ１である。ビタミンＤ前駆体の特定の非限定的な例には、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ならびにビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびその前駆体が含まれる。
【００４７】
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）：核ホルモン受容体（ＮＨＲ）スーパーファミリーのメンバーであって、それは、カルシウム恒常性および骨格健康の重要な調節因子である（Bouillonら、２００８年；Goltzmanら、２００４年）。ＶＤＲは共通の核受容体構造を有し、例えば、Ｎ末端活性化ドメイン、２つの亜鉛フィンガードメインを有するＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）、ヒンジ領域およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から構成される。ＶＤＲ活性化遺伝子転写は、インポーチン−αによる初期の核移行、ＲＸＲとのヘテロ二量化および標的遺伝子に存在する反応エレメントとの結合を必要とする。ＶＤＲは腸および腎臓内のカルシウムおよびリン酸恒常性の維持と関連する遺伝子を調節する。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体によって開始されるシグナルは、共活性化または共抑制タンパク質の会合によってモジュレートされ、また、核区画内の他のシグナル伝達パートナーにも依存する。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体は、ＲＸＲリガンドの存在または非存在がＶＤＲ反応に影響を及ぼすことが知られていないという点で、非許容性である。
【００４８】
ＮＨＲスーパーファミリー内のＶＤＲの最も近い構造的および機能的類縁体には、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）およびプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）が含まれ、これらの全ては肝臓内の胆汁酸恒常性および生体異物解毒の調節因子である（Bookoutら、２００６年；Bouillonら、２００８年）。
【００４９】
ＶＤＲの内因性活性化因子には、ビタミンＤの生物学的に活性な形態（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（カルシトリオール））ならびにリトコール酸（ＬＣＡ）およびその誘導体（ＬＣＡ−アセテート、ＬＣＡ−ホルメート、３−ケトＬＣＡ）などの胆汁酸が含まれる（Makishimaら、２００２年；Nagpalら、２００５年）。
【００５０】
概説
肝臓線維症は肝星細胞（ＨＳＣ）のＴＧＦβ１活性化に関与する可逆的創傷治癒反応である。本明細書において、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）リガンドはＨＳＣ活性化を阻害し、肝臓線維症を阻害する（ａｂｒｏｇａｔｅ）のに対して、Ｖｄｒノックアウトマウスは肝線維症を自然発症することが示される。機構的に、ＴＧＦβ１線維化促進傷害によって引き起こされる、ＨＳＣにおけるゲノムワイドＶＤＲ結合部位（ＶＤＲシストローム）の明白な再分配が示される。このＴＧＦβ１誘導性ＶＤＲシストロームは、多くのセットの線維化促進遺伝子上で同定された多数のｃｉｓ調節エレメントにおいて共占有を有するＳＭＡＤ３結合部位と広範に重なる。ＶＤＲリガンドの付加は共調節遺伝子にてＳＭＡＤ３占有率を減少させ、肝線維形成を調節する交差するＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路を明らかにする。これらの結果は、肝臓における創傷治癒反応をモジュレートするための内分泌チェックポイントとしてのＶＤＲについての役割を提供し、肝臓線維症ならびに腎臓および膵臓などの他の器官の線維症のための治療としてのＶＤＲリガンドを示す。
【００５１】
１９９０年代の初期において正常肝臓および線維化肝臓においてＥＣＭを沈着させるための一次エフェクター細胞としてのＨＳＣの確立は肝線維症の病因を理解する際の画期的な発見であった（Friedman、１９９３年）。それ以来、ＨＳＣにおける広範囲の細胞シグナル伝達分子、ホルモン、細胞膜受容体および転写因子が調べられ、肝線維形成を促進することが見出された（Hernandez-GeaおよびFriedman、２０１１年）。しかしながら、この病理プロセスを能動的に予防する因子およびシグナル伝達カスケードは十分に理解されていない。
【００５２】
本明細書において、ＶＤＲの薬理学的活性化が実験動物モデルにおいて肝臓線維症の進行を弱めるのに対して、ＶＤＲ発現の遺伝子阻害は肝臓線維症の自然発症をもたらし、それにより肝臓において創傷治癒反応を負にモジュレートする内分泌チェックポイントにおいて、ＶＤＲに関与することが示される。機構的に、ＨＳＣにおける線維形成反応の強度を抑制でき、肝臓内の線維形成を支配することができるＶＤＲおよびＳＭＡＤ転写因子の反対作用から構成される、以前に認識されておらず、時間的に制御されるゲノム回路が提供される。特に、肝臓傷害に反応して、ＴＧＦβ１によるＨＳＣ活性化は、核へのＳＭＡＤ移行およびクロマチンリモデリングによって線維化促進遺伝子発現を誘導する。隣接するビタミンＤ反応エレメント（ＶＤＲＥ）への到達性を増加させることによって、ＳＭＡＤ活性化は、以前には隠れていたゲノム部位へのＶＤＲ動員を促進する。その後、リガンドが結合したＶＤＲはクロマチン上のＳＭＡＤ存在性に拮抗し、ヒストンＨ３のアセチル化を損ない、線維化促進遺伝子発現を最終的に抑制する（図１４Ｄ）。特に、ほぼ１０，５００のＴＧＦβ１誘導性ＳＭＡＤ結合部位およびＴＧＦβ１誘導性ＶＤＲ結合部位の位置の近接からクロマチン構造全体を同定し、統合されたＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路が、肝線維化反応の主要な調節因子として機能することを示す。
【００５３】
ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するクロマチン基盤の同定は調節標的としてＳＭＡＤ依存性転写に直接焦点を合わせる。このことは、ＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナル伝達が、後生動物生態のほぼ全ての態様において本質的な役割を果たし、その調節不全は、自己免疫から線維症およびがんに及ぶ多様なヒト疾患をもたらし得る（Hernandez-GeaおよびFriedman、２０１１年；LiおよびFlavell、２００８年；Massague、２００８年）。ＶＤＲとＳＭＡＤとの間のゲノム拮抗作用のこの所見は、クロマチンインターフェースにてＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナル伝達を弱める第１のＤＮＡ結合転写因子としてＶＤＲを確立するだけでなく、「転写クロストーク」のより一般的な概念について特異性（シストロン層（ｃｉｓｔｒｏｍｉｃ  ｌａｙｅｒ））も加える。
【００５４】
ＴＧＦβ−ＳＭＡＤ活性化により、ＳＭＡＤ標的を抑制するためにリガンド結合ＶＤＲの後の動員が可能となるという観察は、２つの内因性シグナル伝達経路が互いの活性を交差調節できる手段を明らかにする。したがって、このゲノム中継（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｌａｙ）は、後でＶＤＲによって阻害されるＳＭＡＤによる正の活性化を可能にし、それにより相互排他的様式で転写因子間の以前に報告されたゲノムクロストークから高度に同定可能である自己調整ゲノム回路を構成する（Barishら、２０１０年；Huaら、２００９年）。この回路は、正常および線維化の両方の肝臓においてＥＣＭ合成を組織化する能力をＨＳＣに与えることができる。
【００５５】
ＴＧＦβ−ＳＭＡＤ経路に加えて、線維症は、殆ど常に、臨床的に持続する炎症が先行する（Hernandez-GeaおよびFriedman、２０１１年；LeeおよびFriedman、２０１１年）。それ故、ＶＤＲシグナル伝達に対する広範な抗炎症の役割は肝臓におけるその抗線維化特性のに寄与し得る。これに関して、ＶＤＲは炎症反応の中心となるいくつかの細胞型においてその発現について実証されており（Barishら、２００５年；Griffinら、２００１年；von  Essenら、２０１０年）、ＶＤＲ自体のビタミンＤ欠損および多型の両方ならびにビタミンＤ代謝に関与する遺伝子は炎症性疾患の危険性および重症度の両方に関連している（Agmon-Levinら、２０１２年；Janssensら、２０１１年；Mungerら、２００６年；Ramagopalanら、２０１１年）。しかしながら、肝線維形成の文脈においてＶＤＲシグナル伝達の抗炎症作用の役割はほとんど解明されていない。一方で、Ｖｄｒ−／−マウスにおいて肝臓線維症の自然発症と関連した調節不全炎症反応は、ＶＤＲシグナル伝達が抗炎症機構により肝線維形成を制御できることを示す（図３Ｈ、右）。他方で、この考えは、Ｖｄｒ＋／−マウスにおいていかなる炎症反応も見出されない中程度の類洞周囲肝臓線維症表現型によって鈍らされる（図３Ｈ、中央）。さらに、炎症と線維症との間の引き起こされ得る関係は完全には確立されないままであり、肝線維形成の間の炎症の主要な線維形成促進の役割はＴＧＦβ−ＳＭＡＤ活性化に対してＨＳＣを感受性にするようである（Sekiら、２００７年；SekiおよびSchnabl、２０１２年）。したがって、ＶＤＲシグナル伝達の抗炎症特性はその抗線維化機能において主要な役割を果たすことができない。
【００５６】
本明細書における結果は肝臓病態生理においてＶＤＲシグナル伝達の認識されていない機能を明確にする。その非常に低い発現に起因して、ＶＤＲは、脂質およびグルコース代謝、薬物の処分、コレステロール流出および胆汁酸恒常性を含む肝機能のほぼ全ての態様に影響を与えるＦＸＲ、ＰＸＲおよびＣＡＲを含む、その高度に発現された同種クレードメンバーよりはるかに注目を集めていない（Bookoutら、２００６年；Chawlaら、２００１年）。しかしながら、低いビタミンＤレベルが、慢性肝臓疾患を有する患者における肝線維症の増加に関連し（Abramovitchら、２０１１年；LimおよびChalasani、２０１２年；Pettaら、２０１０年；Terrierら、２０１１年）、ビタミンＤがラットにおける肝臓線維症を阻害できる（Abramovitchら、２０１１年）ことを示している最近の研究は、肝ＶＤＲについての潜在的な生理的役割を示している。しかしながら、ＶＤＲが肝線維形成を直接的または間接的に調節するかどうかおよびどのように調節するかは解決されていないままである。ＶＤＲがＨＳＣ静止を促進し、ＴＧＦβシグナル伝達を制御するという本明細書における観察は、ビタミンＤがその抗線維化効果を発揮できる新たな機構を同定する。これらの結果は、ＶＤＲにおける多型が、肝臓線維症の進行の増加および肝硬変の進展と関連していることを示唆している研究と一致する（Baurら、２０１１年；Tanakaら、２００９年）。
【００５７】
先進国世界における死の最大で４５％までは線維化疾患に起因し得るが、少しの抗線維化薬物のみしか臨床用途のために現在承認されていない（Wynn、２００８年）。ＴＧＦβを中和するように設計された治療は広範な抗線維化活性を示すが（Rosenbloomら、２０１０年）、利点は非疾患組織においてＴＧＦβを不必要に遮断することによって損なわれる。ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路の同定は、全身のシグナル伝達を乱す代わりにＴＧＦβ阻害をＶＤＲ陽性細胞に制限することによって安全な抗線維化戦略を提供する。
【００５８】
まとめると、本明細書における結果は、肝線維形成を支配するＶＤＲ転写因子およびＳＭＡＤ転写因子を含む交差しているゲノム回路を提供する。この所見は、２つの異なるシグナル依存性転写因子がどのように互いに相互作用して細胞同一性および機能を確立するのかに対する理解を広げる。遺伝子モデルおよび誘導モデルの使用により、ＴＧＦβ１シグナル伝達に反応する全体のプログラムがどのように確立され、調節されるかが新たに明らかにされる。さらに、これらの研究は肝臓線維症を処置するための薬物標的としてのＶＤＲを確立し、ＶＤＲ依存性遺伝子発現調節の新たなパラダイムを提供する。ＶＤＲおよびＴＧＦβの遍在的発現パターンを考慮すると、ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路は広範囲のヒト疾患の病因に影響を与えることができる多くの他の細胞型に適用可能である。
【００５９】
これらの所見に基づいて、ナノ粒子およびビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の生物活性を増加させる化合物（本明細書においてＶＤＲアゴニストと称される）を含む組成物が本明細書に提供される。例えば、このような組成物は２つまたはそれ超の異なる種類のナノ粒子および／または２つまたはそれ超の異なるＶＤＲアゴニストを含んでもよい。一例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子および／もしくはポリマーナノ粒子であるか、または脂質ナノ粒子および／もしくはポリマーナノ粒子を含む。開示される組成物は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体）またはそれらの組合せなどの他の治療剤をさらに含んでもよい。いくつかの例において、組成物は薬学的に許容される担体を含む。
【００６０】
一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、星細胞（肝星細胞、腎星細胞、膵臓星細胞、心臓星細胞または肺星細胞など）などの目的の細胞を標的化するための作用物質を含む。一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−６−リン酸修飾アルブミン（例えば、ナノ粒子を肝星細胞に標的化するために本明細書に参照により組み込まれる、例えば、Liら、J.  Pharm.  Pharmacol.  ２００９年、６１巻（９号）：１１５５〜６１頁を参照のこと）、脂肪酸エステルまたはレチニルエステル（例えば、レチニルパルミテート）のうちの１つまたは複数を含む。一例において、アルブミンは血清アルブミン（ヒト［ＯＭＩＭ  １０３６００、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿０００４６８．１］またはウシ［例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿８５１３３５］など）である。別の例において、アルブミンはニワトリ卵白由来である。アルブミンは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている（例えば、カタログ番号Ａ２１５３、０５４７０、Ａ９７３１およびＡ５５０３）。いくつかの例において、アルブミンはマンノース６−リン酸を含むように修飾される。ナノ粒子と共に使用され得るレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）には、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公的に利用可能なもの（例えば、受託番号ＡＡＡ５９１８８．１、ＡＡＢ０６９５５．１、ＣＡＡ２４９５９．１およびＡＡＡ４２０１８．１ならびにこれらの公的に利用可能な配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、またはＲＢＰの成熟形態とこのような量の同一性を有するこれらのバリアント配列などの、ＲＢＰ生物活性を保持するＲＢＰバリアント）が含まれる。当技術分野において公知の任意の方法がこのような分子をナノ粒子に結合するために使用されてもよい。
【００６１】
いくつかの例において、ナノ粒子は、直径が少なくとも１ｎｍ、例えば少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍまたは少なくとも５００ｎｍ、例えば１〜１０００ｎｍ、１０〜１０００ｎｍ、５０〜５００ｎｍまたは１００〜５００ｎｍである。
【００６２】
例えば、いくつかの例において、ＶＤＲの生物活性を増加させる化合物（またはそれを含有する組成物）は、化合物の非存在下での生物活性と比較して、ＶＤＲの生物活性を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％増加させることができる。いくつかの例において、増加させるＶＤＲの生物活性は、細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵のうちの１つまたは複数である（例えばこのような作用物質の放出を減少させることによる）。したがって、例えば、ＶＤＲ（またはそれを含有する組成物）の生物活性を増加させる化合物は、化合物の非存在下での貯蔵と比較して、細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の貯蔵を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％増加させる。いくつかの例において、ＶＤＲの生物活性を増加させる化合物（またはそれを含有する組成物）は、化合物の非存在下での放出と比較して、細胞によるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質の放出を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％減少させる。いくつかの例において、ＶＤＲの生物活性を増加させる化合物（またはそれを含有する組成物）は、星細胞、上皮細胞または両方におけるＶＤＲの生物活性を増加させる。このような細胞の例には、膵臓星細胞、腎臓星細胞、肝星細胞、心臓星細胞および肺星細胞が含まれる。
【００６３】
ＶＤＲアゴニストの例には、限定されないが、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せが含まれる。ＶＤＲアゴニストの具体例には、限定されないが、カルシポトリオール、２５−ヒドロキシ−Ｄ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、１，α２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）またはそれらの組合せが含まれる。
【００６４】
開示される組成物を使用する方法もまた、提供される。一例において、上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するための方法が提供される。このような方法は、本明細書に提供される治療有効量の組成物を上皮細胞および／または星細胞と接触させ、それにより上皮細胞および／または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するステップを含んでもよい。このような方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてもよい。例えば、上皮細胞または星細胞は被験体中にあってもよく、接触させるステップが、治療有効量の組成物を被験体へ投与し、それにより上皮細胞または星細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加させるまたは保持するステップを含んでもよい。いくつかの例において、このような方法は、被験体における肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患などの疾患を処置する。開示される方法を使用して処置できる肝臓疾患の例には、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症／肝硬変、胆管線維症／胆汁性肝硬変、肝臓がん、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシスおよびウィルソン病のうちの１つまたは複数が含まれる。いくつかの例において、肝臓がんは肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫である。開示される方法で処置できる膵臓疾患の例には、限定されないが、膵臓線維症および膵管腺癌（ＰＤＡ）が含まれる。いくつかの例において、腎臓疾患は腎臓の線維症である。
【００６５】
本開示はまた、ＳＭＡＤ３とＶＤＲ共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメントの結合を減少させる方法を提供する。このような方法は、本明細書に提供される治療有効量の組成物（ナノ粒子およびＶＤＲアゴニスト（against）を含むものなど）を上皮細胞および／または星細胞と接触させ、それにより上皮細胞および／または星細胞上の共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメント上のＳＭＡＤ３の結合を減少させるステップを含んでもよい。いくつかの例において、組成物は、組成物の非存在下での生物活性と比較して、共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメント上のＳＭＡＤ３の結合を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。
【００６６】
本開示はまた、星細胞（膵臓星細胞、腎臓星細胞、肝星細胞、心臓星細胞または肺星細胞など）におけるＶＤＲの発現を増加させる方法を提供する。このような方法は、星細胞を、ＶＤＲアゴニストのＶＤＲへの結合を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍増強するのに十分な量の、ナノ粒子の部分であるＶＤＲアゴニストと接触させるステップを含んでもよい。
【００６７】
肝臓、膵臓または腎臓の線維症などの線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法もまた、提供される。特定の例において、方法は、肝星細胞、腎星細胞、肺星細胞、心臓星細胞、腎臓星細胞または膵臓星細胞を、１種または複数の試験作用物質および必要に応じてＴＧＦ−β１と接触させるステップを含む。続いて、細胞により産生されたＶＤＲアゴニスト、細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生または発現、星細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾または発現およびＶＤＲリガンドのＶＤＲへの結合のうちの１つまたは複数が検出される。１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるＶＤＲアゴニストの産生を少なくとも５倍（例えば少なくとも６倍、少なくとも８倍または少なくとも１０倍）増加させる、１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生または発現を少なくとも１．５倍（例えば少なくとも６倍、少なくとも８倍または少なくとも１０倍）増加させる、１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾もしくは発現を少なくとも５倍（例えば少なくとも６倍、少なくとも８倍または少なくとも１０倍）減少させる、またはそれらの組み合わせである試験作用物質であって、選択される試験作用物質は線維症を処置できる作用物質である。いくつかの例において、選択される試験作用物質はＶＤＲのＶＤＲアゴニストへの結合を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍増強する。スクリーニング方法は、１種または複数の選択された試験作用物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含んでもよい。いくつかの例において、方法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは両方において高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップを含む。
【００６８】
いくつかの例において、スクリーニング方法はｉｎ  ｖｉｖｏで試験するステップをさらに含む。例えば、方法は、選択された試験作用物質のうちの１種または複数を、線維症を有する哺乳動物（肝臓線維症、膵臓線維症または腎臓線維症の動物モデルなど）へ投与するステップ、および１種または複数の試験作用物質が線維症を処置または予防する（例えば、選択された試験作用物質の投与の非存在下でのこのような量と比べて、線維症を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低下させる、星細胞および／または上皮細胞におけるビタミンＡ、ビタミンＤ、脂質貯蔵を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加させる、またはそれらの組み合わせである）かどうかを決定するステップを含んでもよい。いくつかの例において、方法はまた、線維症を処置した試験作用物質を選択するステップを含む。
【００６９】
ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含有する組成物
本開示は、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物、すなわち、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せなどのＶＤＲアゴニストを含む組成物を提供する。このような組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、他の治療剤またはそれらの組合せなどのさらなる作用物質を含んでもよい。一例において、組成物は、化学療法剤（ゲムシタビンなど）、生物製剤（治療抗体など）またはそれらの組合せをさらに含む。使用できるＶＤＲアゴニストの具体例には、限定されないが、カルシポトリオール、２５−ヒドロキシ−Ｄ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）およびそれらの組合せが含まれる。ＶＤＲアゴニストはナノ粒子中に存在してもよいか、またはナノ粒子表面に結合してもよい。
【００７０】
開示される組成物に使用され得るナノ粒子の例には、限定されないが、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３０２８７６８８号、同第２０１３０２８７８５７号、同第２０１００２３３２５１号、同第２０１０００９２４２５号、同第２０１２００２７８０８号、同第２００８０２２６７３９号および同第２００５０２１５５０７号ならびに米国特許第７４２７３９４号、同第８３４３４９７号、同第８５６２９９８号、同第７５５０４４１号、同第７７２７９６９号、同第８３４３４９８号および同第８２７７８１２号に提供されるものが含まれる。いくつかの例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子である。一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−６−リン酸修飾アルブミン（例えば、Liら、J.  Pharm.    Pharmacol.  ２００９年、６１巻（９号）：１１５５〜６１頁を参照のこと）、脂肪酸エステルまたはレチニルエステル（例えば、レチニルパルミテート）のうちの１つまたは複数を含む。ナノ粒子はまた、所定の標的に対するリガンド（例えば、星細胞（肺、肝臓、腎臓、心臓または膵臓に存在するものなど）に対するリガンド、ＶＤＲアゴニストまたはそれらの組合せ）、樹状突起およびリガンドを樹状突起に連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、生物活性材料を封入するための直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーを含んでもよい。いくつかの例において、ナノ粒子は、直径が約０．１ｎｍおよび５０００ｎｍ、例えば、１〜１００ｎｍ、０．１〜１ｎｍ、５〜２０ｎｍ、５〜１５ｎｍ、１０〜５，０００ｎｍ、２０〜１，０００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜２５ｎｍ、２０〜４０ｎｍまたは１０、１５、２０、２５、３５、４５、５０、７５、１００、１５０もしくは２００ｎｍの間である。
【００７１】
開示される組成物によって増加され得るＶＤＲの生物活性は、細胞からのビタミンＡの放出の減少、細胞からのビタミンＤの放出の減少、細胞からの脂質の放出の減少またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの例において、細胞は星細胞（膵臓星細胞、腎臓星細胞または肝星細胞など）、上皮細胞または両方である。例えば、傷害またはストレスに反応して、ビタミンＡおよびＤならびに脂質は活性化した細胞（活性化した上皮細胞または星細胞など）から放出され得、これにより線維症などの他の傷害が生じ得る。したがって、線維症などのこれらの他の傷害を減少させるために、ＶＤＲの機能が増加されて細胞を静止状態に反転させ得る。
【００７２】
ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物（例えば、ＶＤＲアゴニスト）を含む組成物は、ＶＤＲ活性を少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％またはさらにいくつかの例において少なくとも５００％増加させることができる。したがって、一例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）からのビタミンＡの放出を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。一例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）からのビタミンＤの放出を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。一例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）からの脂質の放出を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。
【００７３】
いくつかの例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）によるビタミンＡの保持または貯蔵を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％増加させることができる。一例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）によるビタミンＤの保持または貯蔵を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％増加させることができる。一例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞（星細胞または上皮細胞など）による脂質の保持または貯蔵を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を増加させることができる。
【００７４】
細胞内のビタミンＡ、ビタミンＤおよび脂質を測定する方法は公知であり、本明細書に提供され、このようなアッセイは、化合物がＶＤＲ活性を増加させ、それにより本明細書に提供される組成物に使用できるかどうかを決定するために使用され得る。細胞内のビタミンＡを測定するための例示的な方法は、Vogelら（J.  Lipid  Res.  ４１巻（６号）：８８２〜９３頁、２０００年）に提供され、細胞内のビタミンＤを測定するための方法は、Blumら（Endocrine.  ３３巻（１号）：９０〜４頁、２００８年）に提供される。一例において、星細胞などの細胞を静止状態に反転する化合物または組成物の能力は、化合物／組成物の存在下および非存在下で（例えば化合物／組成物と接触させる前後に）、中性脂質に結合するＢＯＤＩＰＹ（登録商標）蛍光色素を用いて細胞を染色することによって決定され得る。静止細胞は、活性化した細胞状態において損失し、静止を誘導するＶＤＲの生物活性を増加させる化合物などの薬物での活性化した細胞の処理により蓄積する、細胞質内脂質滴によって特徴付けられる。したがって、活性化した細胞の処理、その後のＢＯＤＩＰＹ（登録商標）染色および蛍光測定が、細胞（星細胞など）を静止状態に駆動するＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を同定するために使用され得る。
【００７５】
例示的なＶＤＲアゴニスト
開示される組成物は、例えば、肝臓、膵臓および／または腎臓における傷害、炎症および線維形成のプロセスを予防または弱めるためにＶＤＲに結合でき、ＶＤＲを活性化できる１つまたは複数のＶＤＲアゴニスト（ＶＤＲリガンドなど）を含む。ＶＤＲアゴニストには、限定されないが、１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３ならびにその前駆体および類似体、ＶＤＲリガンドおよびＶＤＲアゴニスト前駆体が含まれる。本開示は特定のビタミンＤアゴニストに限定されない。様々な生物学的に活性なビタミンＤアゴニストが意図される。例示的な作用物質は当技術分野において公知である。
【００７６】
いくつかの例において、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３またはビタミンＤ前駆体もしくは類似体がＶＤＲアゴニストとして使用される。有益な治療効果を達成するためにビタミンＤの最も生物学的に活性な形態を使用することは必要ではない。ビタミンＤ受容体の天然に存在するリガンドはカルシトリオールである。一実施形態において、カルシトリオールの前駆体（カルシジオールなど）が被験体に投与され、次いで標的細胞集団内でカルシトリオールに変換される。
【００７７】
加えて、ＨＳＣは、側鎖ヒドロキシル化によってカルシトリオールの生物学的効果を終結させるシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２４Ａ１を発現する。したがって、一実施形態において、ＣＹＰ２４Ａ１による非活性化に抵抗性であるＶＤＲリガンドまたは他のＶＤＲアゴニストまたはアゴニスト前駆体が、標的細胞集団において、より効果的かつより長く継続するＶＤＲ活性化を達成するために使用される。具体例において、ＶＤＲリガンドはＣＹＰ２７Ｂ１によって活性化され得るが、ＣＹＰ２４Ａ１による非活性化に抵抗性であるものである。これにより、肝臓（例えば、ＨＳＣ）、膵臓および腎臓内の標的細胞集団におけるＶＤＲ活性化が可能となるが、カルシウム恒常性に対する望ましくない全身作用を最小化する。
【００７８】
一例において、ＶＤＲアゴニストまたはその前駆体は広範な肝代謝に起因して高い初回通過肝クリアランスの特性を示す。この特性を有する分子は、経口投与される場合、門脈を介して肝臓に吸収され、輸送される。肝臓内で、分子は、肝星細胞、クッパー細胞および類洞内皮細胞などの細胞集団においてＶＤＲを活性化するが、低い全身バイオアベイラビリティに起因してカルシウム恒常性に対して最小の全身作用を示す。
【００７９】
使用され得るＶＤＲアゴニストには、ＶＤＲを活性化させるこれらの分子が含まれる。作用物質がＶＤＲアゴニストであるかどうかを決定する方法は慣用されている。例えば、ＣＹＰ２４Ａ１発現の誘導は作用物質と接触したＶＤＲを発現する細胞内で測定でき、ＣＹＰ２４Ａ１発現の増加（例えば、発現の１０〜２０倍の増加）は、作用物質がＶＤＲアゴニストであることを示す。他の方法には、トランスフェクトされたレポーター遺伝子構築およびＦＲＥＴアッセイが含まれる。いくつかの例において、アゴニストの精製したＬＢＤへの結合は共活性化因子ペプチド（例えば、ＬＸＸＬＬ）について誘導された動員を測定することによって検出される。例えば、ＶＤＲアゴニストは、アゴニストの非存在と比較して、ＶＤＲ発現細胞においてＣＹＰ２４Ａ１発現を少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％またはさらに少なくとも１０００％超、増加させることができる。
【００８０】
ＶＤＲアゴニストには、ビタミンＤ化合物、その前駆体および類似体が含まれる。ビタミンＤ化合物には、限定されないが、以下の特徴：Ｄ−環に結合した任意の側鎖と一緒にビタミンＤの５，７ジエン二重結合系によって相互接続したビタミンＤのＣ−環、Ｄ−環および３β−ヒドロキシシクロヘキサンＡ−環のうちの少なくとも１つを有する化合物（例えば、「ビタミンＤ核」およびＤ−環に結合した側鎖と一緒にビタミンＤに特有である５，７ジエン二重結合系によって相互接続した置換または非置換Ａ−、Ｃ−およびＤ−環を有する化合物）が含まれる。
【００８１】
ビタミンＤ類似体には、セコステロイドカルシトリオールの様々な活性を模倣できるこれらの非セコステロイド化合物が含まれる。このような化合物の例には、限定されないが、ＬＧ１９００９０、ＬＧ１９０１１９、ＬＧ１９０１５５、ＬＧ１９０１７６およびＬＧ１９００１７８が含まれる（Boehmら、Chemistry  &  Biology  ６巻：２６５〜２７５頁、１９９９年を参照のこと）。
【００８２】
ビタミンＤ化合物には、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であるか、または化合物がｉｎ  ｖｉｖｏで活性になるように哺乳動物被験体中で作用する、これらのビタミンＤ化合物およびビタミンＤ類似体が含まれる。このような化合物の例には、限定されないが、ビタミンＤ、カルシトリオールおよびその類似体［例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ３（１α−ＯＨ−Ｄ３）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１，２５−（ＯＨ２）Ｄ２）、１α−ヒドロキシビタミンＤ２（１α−ＯＨ−Ｄ２）、１α，２５−（ＯＨ）２−１６−エン−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−オキソ−１６−エン−Ｄ３、１α，２４Ｒ（ＯＨ）２−Ｄ３、１α，２５（ＯＨ）２−２２−オキサ−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２４ｂ，−ジホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２６ａ，２７ａ，−トリホモ−１α２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、１，２５−（ＯＨ）２−１６，２３Ｅ−ジエン−２６−トリフルオロ−１９−ノル−Ｄ３および非セコステロイド性ビタミンＤ模倣物が含まれる。
【００８３】
一例において、ＶＤＲアゴニストは、以下のビタミンＤ、１，α２５ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシポトリオール、１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５−（ＯＨ）２−１６−エン−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−オキソ−１６−エン−Ｄ３、１α，２４Ｒ（ＯＨ）２−Ｄ３、１α，２５（ＯＨ）２−２２−オキサ−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２４ｂ，−ジホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２６ａ，２７ａ，−トリホモ−１α２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３および１，２５−（ＯＨ）２−１６，２３Ｅ−ジエン−２６−トリフルオロ−１９−ノル−Ｄ３のうちの１つまたは複数である。
一実施形態において、生物学的に活性なビタミンＤ化合物は、１，α２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシ−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−ビタミンＤ３および１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−ビタミンＤ３および非セコステロイド性ビタミンＤ模倣物から選択される。さらなる例において、生物学的に活性なＶＤＲアゴニストは、以下の式：
【化１】
2016520572.tif 000002
（式中、Ｘ１およびＸ２は各々、水素およびアシルからなる群から選択され、Ｙ１およびＹ２はＨであってもよく、または一方はＯ−アリールもしくはＯ−アルキルであってもよく、他方は水素であり、βもしくはα配置を有していてもよく、Ｚ１およびＺ２は両方、Ｈであり、またはＺ１およびＺ２は一緒にＣＨ２になり、Ｒはアルキル、ヒドロキシアルキルもしくはフルオロアルキル基であり、またはＲは以下の側鎖：
【化２】
2016520572.tif 000003
（式中、（ａ）はＳもしくはＲ配置を有していてもよく、Ｒ１は水素、ヒドロキシもしくはＯ−アシルを表し、Ｒ２およびＲ３は各々、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、または一緒になる場合、基−−（ＣＨ２）ｍ−−（式中、ｍは２〜５の値を有する整数である）を表し、Ｒ４は水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択され、Ｒ５は水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ４およびＲ５は一緒になって、二重結合した酸素を表し、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ８はＨまたはＣＨ３であってもよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、側鎖における２０、２２もしくは２３位の任意の１つにおける炭素はＯ、ＳもしくはＮ原子によって置換されていてもよい）を表していてもよい）
によって表される類似体から選択される。
【００８４】
一例において、本明細書に提供される方法に使用されるＶＤＲアゴニストは、被験体に投与された場合に高カルシウム血症の症状を引き起こさない。別の例において、ＶＤＲアゴニストは、被験体に投与された場合、カルシトリオールに匹敵するほどの多くのカルシウム血性反応を生じない（すなわち程度が低い）。一例において、ＶＤＲアゴニストはカルシトリオールと比較して低いカルシウム血性反応特性を有する。別の実施形態において、これらの化合物は、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−エピ−Ｄ２、１α，２５−（ＯＨ）２−２４ａ−ホモ−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２２４ａ−ジホモ−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−１９−ノル−Ｄ３および２０−エピ−２４−ホモ−１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３から選択される。
【００８５】
使用できる他の例示的なＶＤＲアゴニストは表１に提供される。
【００８６】
【表１】
2016520572.tif 000004
【００８７】
他の作用物質
【００８８】
開示される組成物は、他の治療剤、例えば、化学療法剤、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体、阻害ＲＮＡ分子）などを含んでもよい。具体例が以下に開示される。
【００８９】
いくつかの例において、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤などを含む。具体例が以下に開示される。
【００９０】
ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含有する組成物の使用方法。
本開示は、上皮細胞または星細胞などの細胞においてビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加または保持するために、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む開示される組成物を使用する方法もまた提供する。したがって、活性な星細胞または上皮細胞をその静止状態に戻す、または星細胞または上皮細胞を静止状態に維持するために使用可能な方法を提供する。
【００９１】
いくつかの例において、該方法は、治療有効量の１または複数の開示される組成物と、細胞（例えば、ＶＤＲ陽性細胞）、例えば上皮細胞または星細胞、例えば活性化上皮細胞または星細胞とを接触させるステップを含む。このような方法を使用して、細胞中のビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加または保持することができ、したがって、該方法を使用して、活性な星細胞もしくは上皮細胞をその静止状態に戻す、または星細胞もしくは上皮細胞を静止状態に維持することができる。いくつかの例において、細胞は被験体中にあり、接触させるステップは、治療有効量の組成物を被験体に投与して、それによって、対象の細胞（例えば、上皮細胞および／または星細胞、例えば膵臓星細胞、肝臓星細胞、心臓星細胞、肺星細胞および／または腎臓星細胞）においてビタミンＡ、ビタミンＤおよび／または脂質を増加または保持するステップを含む。
【００９２】
いくつかの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞（例えば、星細胞または上皮細胞）によるビタミンＡの保持または貯蔵を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％増加させる。１つの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞（例えば、星細胞または上皮細胞）によるビタミンＤの保持または貯蔵を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％増加させる。１つの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞（例えば、星細胞または上皮細胞）による脂質の保持または貯蔵を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％増加させる。
【００９３】
いくつかの例において、処置される被験体は、肝臓疾患、例えば、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症／肝硬変、胆管線維症／胆汁性肝硬変、肝臓がん（例えば、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫）、肝炎、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、ヘマクロマトーシスまたはウィルソン病の１つまたは複数を有する。いくつかの例において、処置される被験体は、膵臓疾患、例えば、膵臓線維症、膵管腺癌（ＰＤＡ）または両方を有する。いくつかの例において、処置される被験体は、腎臓疾患、例えば、腎臓の線維症または腎細胞癌を有する。したがって、開示される組成物を使用して、これらの疾患の１つまたは複数を処置または予防可能である。
【００９４】
１つの例において、被験体は、肝臓、膵臓または腎臓の線維症の症状を示す。例えば、被験体は、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎に感染している恐れがある。いくつかの例において、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む治療組成物の投与は、線維症の症状を減少させる。いくつかの例において、被験体は、線維症発症のリスクにあり（例えば、Ｂ型肝炎に感染している、またはアルコール性肝臓疾患である、もしくは他の肝臓疾患を有する）、治療組成物は予防的に投与される。
【００９５】
いくつかの例において、開示される方法は、開示される組成物による処置をしなかった場合と比較して、線維症の１つまたは複数を（例えば、線維化肝臓、腎臓または膵臓の線維化内容物を減少させることによって）低減させる、腫瘍の成長、サイズもしくは体積および転移性病巣を減少させるために使用することができる。したがって、いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、線維症を（例えば、線維化肝臓、腎臓または膵臓の線維化内容物を減少させることによって）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、腫瘍（例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍）の成長速度を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、腫瘍（例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍）のサイズもしくは体積を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、転移（例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍の転移）の数、サイズまたは体積を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させる。
【００９６】
いくつかの例において、開示される方法は予防的である。例えば、該方法は、線維症発症のリスクのある被験体に、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む治療組成物を投与するステップを含むことができる。このような予防的投与は、肝臓、腎臓または膵臓の線維症の症状の発症を遅延させることができる。例えば、ナノ粒子およびＶＤＲの生物活性を増加させる化合物を含む組成物の予防的投与は、線維症の症状または特徴の１つまたは複数の発症を予防するために使用することができる。例えば、臓器が線維症に侵された場合、臓器の機能性細胞集団は瘢痕組織（コラーゲンおよび他の異常なマトリックス成分）により置き換えられるので、臓器の機能性細胞集団が減少する。加えて、線維症は、機能を衰えさせ得る構造組織崩壊を引き起こし、病理、例えば門脈圧亢進症をもたらし、肝臓の場合、肝細胞癌のリスクが増加する。重度の門脈圧亢進症は通常、食道の出血/胃静脈瘤および／または腹水（ascities）として現れる。腎臓および膵臓において、進行した線維症の特徴は、腎不全ならびに内分泌性および／または外分泌性膵臓不全である。
【００９７】
モニタリング療法
ある特定の実施形態において、本明細書に提供された組成物のこれらの作用は、限定するものではないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、ビリルビン、アルファ−２マクログロブリン、ハプトグロビン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害因子、ヒアルロン酸、タイプＩＩＩコラーゲンのアミノ末端プロペプチドならびに他のコラーゲン前駆体および代謝産物、血小板数、アポリポタンパク質Ａ１、Ｃ−反応タンパク質ならびにフェリチンを含む、肝臓の炎症、傷害および線維形成の血液、血清および血漿マーカーによりモニターされる。いくつかの例において、これらの試験は単独で使用され、一方、他の例において、これらの試験は組み合わせて使用される。肝線維症はまた、一過性エラストグラフィー（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標））の技術によりモニターすることができる。さらなる実施形態は、肝臓生検により得られた肝臓組織の直接検査による、処置の影響のモニタリングを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、開示される方法の膵臓の疾患に対する効果は、血液、血清、血漿のアミラーゼまたはリパーゼならびに膵臓の外分泌および内分泌機能の試験によりモニターされる。他の実施形態において、膵炎は、限定するものではないが、放射線学、核医学、超音波および磁気共鳴を含む画像化技術によりモニターされる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、開示される方法の腎臓の疾患に対する効果は、血液、血清もしくは血漿の尿素もしくはクレアチニンの測定または腎機能の他の試験を単独で、または組み合わせてモニターされる。いくつかの実施形態において、腎臓疾患は、限定するものではないが、放射線学、核医学、超音波および磁気共鳴を含む画像化技術によりモニターされる。別の実施形態において、腎臓に対する処置の影響は、腎臓生検により得られた組織の直接検査によりモニターされる。
【０１００】
他の治療剤との併用
開示される組成物を、他の治療剤、例えば化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）および生物療法剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）と組み合わせて処置に使用することができる。１つの例において、他の治療剤としては、限定するものではないが、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−ガンマ（ＰＰＡＲ−γ、ＮＲ１Ｃ３）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−アルファ（ＰＰＡＲ−α、ＮＲ１Ｃ１）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−デルタ（ＰＰＡＲ−δ、ＮＲ１Ｃ２）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ、ＮＲ１Ｈ４）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、クルクミンに対するリガンドを含む、１つまたは複数の核内受容体リガンド、限定するものではないが、ビタミンＥ、レチノイド、例えばビタミンＡを含む抗酸化剤および、病理ＥＣＭを分解するためにプロテアーゼを肝臓に送達する療法剤が挙げられる。いくつかの例において、他の治療剤は、本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物の一部である。
【０１０１】
「共投与」、「組み合わせて投与される」およびこれらの文法的等価用語は、２またはそれ超の治療剤の単一被験体への投与を包含することを意味し、薬剤が、同一もしくは異なる投与経路により、または同一もしくは異なる時間に投与される処置レジメンを含むことが意図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つまたは複数の組成物は、他の薬剤と共投与される。これらの用語は、２またはそれ超の薬剤を、両方の薬剤および／またはこれらの代謝産物が、被験体中に同時に存在するように被験体に投与されることを包含する。それらは、別個の組成物の同時投与、別個の組成物で異なる時間における投与および／または両方の薬剤が存在する１つの組成物で投与することを含む。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および他の薬剤（複数可）は、単一組成物で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および他の薬剤（複数可）は、組成物中に混合される。
【０１０２】
例示的化学療法剤および生物学的治療剤
開示される方法は、開示される組成物を他の治療剤、例えば化学療法剤および生物療法剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、このような化学療法剤および／または生物療法剤は、本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物の一部である。化学療法剤および生物療法剤としては、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤ならびに他の薬剤、例えば抗体を挙げることができる。このような薬剤の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。下記の分類の１つまたは複数に分類できるとは限らない他の治療剤、例えば、抗腫瘍剤もまた、記載の組成物と組み合わせた投与に適切である。このような薬剤の選択および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。
【０１０３】
１つの例において、化学療法剤または生物療法剤は、細胞、例えば、肝臓細胞、膵臓細胞または腎臓細胞の死滅化を増加させる（またはこれらの生存能力を減少させる）。このような細胞死は、細胞の１００％の減少をもたらす必要はなく、例えば、生存細胞（例えば、がん細胞）の数を、（例えば、化学療法剤または生物療法剤による処置をしない場合と比較して）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させる化学療法剤が、本明細書に提供される方法に使用可能である。例えば、化学療法剤または生物療法剤は、細胞（例えば、がん細胞）の成長を、（例えば、該化学療法剤または生物療法剤を使用しない場合と比較して）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。
【０１０４】
使用可能な（およびいくつかの例において、ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含む組成物の一部である）化学療法剤の特定の例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金含有化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン；葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えばポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；微小管結合剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）ビンクリスチン、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、リゾキシンならびにこれらの誘導体および類似体）、ＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミドならびにこれらの誘導体および類似体）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、メトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシルおよびこれらの類似体）；アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）；代謝拮抗物質、例えば、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、ブレオマイシン、リファンビシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、メチルアミノレブリネート、ポリフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン、酵素、酵素阻害剤（例えば、カンプトテシン、エトポシド、フォルメスタン、トリコスタチンならびにこれらの誘導体および類似体）、キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブおよびエルロチニブ（erolitinib））、遺伝子調節剤（例えば、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストンならびにこれらの誘導体および類似体）；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（vemurafinib）、バンデタニブおよびトレチノインが挙げられる。
【０１０５】
１つの例において、生物療法剤（ｂｉｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）（いくつかの例において、ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含む組成物の一部である）は、抗体、例えばヒト化抗体を含む、またはこれからなる。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体であってよい。上記のように、特定の標的に対して特異的である抗体の作製方法は日常的な方法である。いくつかの例において、治療抗体は毒素とコンジュゲートされる。例示的生物療法剤としては、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラツズマブが挙げられる。
【０１０６】
生物療法剤（いくつかの例において、ナノ粒子およびＶＤＲアゴニストを含む組成物の一部である）の他の例としては、抑制性核酸分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡまたはリボザイムが挙げられる。標的核酸を特異的に標的化し、標的核酸の発現を調節する任意のタイプのアンチセンス化合物の使用が企図される。アンチセンス化合物は、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズし、標的核酸分子の発現をモジュレートする化合物である。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝型またはヘアピン化合物として導入することができ、構造エレメント、例えば、内部または末端のバルジまたはループを含有し得る。二本鎖アンチセンス化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する２つの鎖であるか、またはハイブリダイゼーションおよび完全または部分的な二本鎖化合物の形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖であってよい。いくつかの例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、二本鎖がＲＮａｓｅＨにより認識され、ｍＲＮＡの切断をもたらすような一本鎖アンチセンス化合物である。他の例において、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子発現を調節するｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補性である、約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。さらなる例において、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡへ切断される強固なヘアピンを形成するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ分子は、概して約２０〜２５ヌクレオチド長であり、２つのヌクレオチドオーバーハングを３’末端に有してよく、または平滑末端であってもよい。概して、ｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的核酸に少なくとも部分的に相補性である。遺伝子を特異的に標的化するアンチセンス化合物は、標的ヌクレオチド配列、例えばｍＲＮＡ配列に相補的な化合物をデザインすることによって調製することができる。アンチセンス化合物は、標的を特異的にハイブリダイズして、その発現を調節する標的核酸分子に１００％相補性である必要はない。例えば、アンチセンス化合物または該化合物のアンチセンス鎖は、二本鎖化合物の場合、標的核酸配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％相補性であってよい。特異性のためのアンチセンス化合物のスクリーニング方法は周知である（例えば、米国特許出願公開第２００３−０２２８６８９号を参照されたい）。加えて、抑制性核酸分子をデザイン、調製および使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。
【０１０７】
治療剤の投与
いくつかの例において、開示される方法は、治療有効量の開示される組成物の１つまたは複数を単独または別の治療剤、例えば、化学療法剤または生物療法剤と組み合わせて被験体に提供するステップを含む。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。いくつかの例において、開示される方法は、外科手術および／または照射線療法を、本明細書に記載の処置と組み合わせて、（例えば、順次、実質的に同時にまたは同時に）被験体に提供するステップをさらに含む。投与は、単回用量または複数回用量により達成することができる。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重および全体的状態、使用する特定の治療剤およびその投与様式に依存して、被験体ごとに変動する。
【０１０８】
本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物を含む治療剤は、当分野において公知の任意の適切な手段を使用して、処置を必要とする被験体に投与することができる。投与の方法としては、限定するものではないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、非経口、腫瘍内、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻腔内、吸入、経口または遺伝子銃による投与が挙げられる。鼻腔内投与は、鼻孔の１つまたは両方を介した、組成物の鼻および鼻道内への送達を指し、治療剤の噴霧機構、液滴機構またはエアロゾル化による送達を含むことができる。
【０１０９】
吸入による治療剤の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達を介した鼻または口によるものであってよい。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域に直接的であってよい。非経口投与は、概して注射により達成される。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体としての溶液もしくは懸濁液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に適切な固体形態またはエマルジョンのいずれかとして既存の形態で調製することができる。注射溶液および注射懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。投与は全身であっても、または局所であってもよい。
【０１１０】
本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物を含む治療剤は、任意の適切な様式で、例えば薬学的に許容される担体と一緒に投与することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物および組成物の投与に使用される特定の方法により一部決定される。したがって、広範囲の本開示の医薬組成物の適切な製剤が存在する。本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、既存である。E.  W.  Martinによる、Remington’s  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療剤の薬学的送達に適切な組成物および製剤を記載している。
【０１１１】
非経口投与のための調製物としては、滅菌の水性溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに基づく）などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在してよい。
【０１１２】
本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物の局所投与を含む、局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、液滴、坐薬、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。既存の薬学的担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。
【０１１３】
本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物の経口投与を含む、経口投与のための治療剤としては、粉末もしくは顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェまたは錠剤が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【０１１４】
本明細書に提供されるナノ粒子／ＶＤＲアゴニスト組成物を含む治療剤は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸ならびに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸との反応により、または無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムならびに有機塩基、例えば、モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンとの反応により形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる。
【０１１５】
いくつかの例において、ＶＤＲ活性を増加させる薬剤およびナノ粒子を含む組成物の用量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇまたは約５０ｍｇ〜約１００ｍｇである。いくつかの例において、該組成物の用量は、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００、約７００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約３０００ｍｇ、約４０００ｍｇ、約５０００ｍｇ、約６０００ｍｇ、約７０００ｍｇ、約９０００ｍｇまたは約１０，０００ｍｇである。いくつかの実施形態において、該組成物の用量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例において、該組成物の用量は、約１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇである。これらの投薬量は単なる例であり、適切な用量は、日常的な実験だけを使用して、当業者により決定可能であることは十分に理解される。１つの例において、用量は約２０μｇ／ｋｇＰＯである。
【０１１６】
１つの例において、治療有効用量のビタミンＤ２およびＤ３は、約５０ＩＵから約５０，０００ＩＵの範囲である。いくつかの実施形態において、ビタミンＤ２および／またはＤ３は、例えば、約７５ＩＵ、約１００ＩＵ、約２５０ＩＵ、約５００ＩＵ、約７５０ＩＵ、約１，０００ＩＵ、約１，５００ＩＵ、約２，０００ＩＵ、約２，５００ＩＵ、約５，０００ＩＵ、約７，５００ＩＵ、約１０，０００ＩＵ、約１５，０００ＩＵ、約２０，０００ＩＵ、約２５，０００ＩＵ、約４０，０００ＩＵもしくは約５０，０００ＩＵまたはそれ超未満の経口用量で投与される。他の実施形態において、カルシトリオールは、０．００１から１０マイクログラムの用量で投与される。例えば、カルシトリオール（calcitrol）は、いくつかの実施形態において、約０．０１μｇ、約０．０５μｇ、約０．１μｇ、約０．２５μｇ、約０．５μｇ、約１μｇ、約５μｇまたは約１０μｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＶＤＲアゴニストのより大きい用量が、目的の臓器、例えば、肝臓、腎臓または膵臓を標的化する送達経路を介して投与される。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、ナノ粒子と、ＶＤＲ活性を増加させる薬剤とを含有する組成物は、例えば単回用量または分割用量で経口投与される。経口投与のために、組成物は、例えば、処置される被験体に対する投薬量の症候的調整のために、１．０から１０００ｍｇの活性成分、例えば、少なくとも７５ＩＵ、少なくとも１００ＩＵ、少なくとも２５０ＩＵ、少なくとも５００ＩＵ、少なくとも７５０ＩＵ、少なくとも８００ＩＵ、少なくとも１，０００ＩＵ、少なくとも１，５００ＩＵ、少なくとも２，０００ＩＵ、少なくとも２，５００ＩＵ、少なくとも５，０００ＩＵ、少なくとも７，５００ＩＵ、少なくとも１０，０００ＩＵ、少なくとも１５，０００ＩＵ、少なくとも２０，０００ＩＵ、少なくとも２５，０００ＩＵ、少なくとも４０，０００ＩＵまたは少なくとも５０，０００ＩＵ／日、例えば、５０ＩＵから２０００ＩＵ／日、１００ＩＵから１０００ＩＵ／日、例えば、８００ＩＵ／日、またはそれ超の活性成分を含有する錠剤の形態で提供される。有効な非経口用量は、化合物に依存して、より低い、例えば約０．００１μｇから約１０μｇの範囲を予想することができる。
【０１１８】
別の実施形態において、ナノ粒子組成物中のＶＤＲ活性を増加させる薬剤が、１α−ヒドロキシ化合物ではない場合、１．０から１００μｇの間／日／１６０ポンドの患者の１日用量が投与され、例えば、５．０から５０μｇの間／日／１６０ポンドの患者が投与される。異なる実施形態において、生物学的活性ビタミンＤ化合物が１α−ヒドロキシ化合物である場合、０．１から２０μｇの間／日／１６０ポンドの患者の１日用量が投与されるが、好ましい用量は、０．５から１０μの間／日／１６０ポンドの患者である。特定の例において、用量は３〜１０μｇの間／日である。
【０１１９】
１つの例において、ナノ粒子組成物中のＶＤＲアゴニストは、コレカルシフェロールまたはカルシジオールである。いくつかの例において、頻度は少ないが、普通より高い用量、例えば、５０，０００から５００，０００ユニットが毎週投与される。
【０１２０】
スクリーニング方法
ＶＤＲが線維症を処置または予防する作用物質を同定するための標的であるという観察に基づいて、線維症、例えば、肝臓、膵臓および／または腎臓の線維症を処置または予防することのできる１つまたは複数の作用物質を同定するスクリーニング方法を、本明細書において提供する。いくつかの例において、該方法は、細胞（例えば、肝星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎星細胞）と、１つまたは複数の試験作用物質とを接触させるステップを含む。１つの例において、細胞は、肝星細胞、例えば、初代細胞または肝星細胞由来の不死化細胞系または星細胞のいくつかの表型的または機能的特徴を保持する他の細胞系である。いくつかの例において、複数の細胞を、一度に１つの試験作用物質と接触させる。いくつかの例において、複数の細胞を、２種またはそれ超の異なる試験作用物質、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる試験作用物質と、同時に接触させる。添加する試験作用物質の量は、当業者により決定可能である。いくつかの例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に添加される試験作用物質（複数可）（例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される）の量は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、または１０００ｍＭ、例えば、１ｎＭ〜１Ｍ、１ｎＭ〜１００ｎＭまたは１ｎＭ〜１０ｎＭである。いくつかの例において、細胞は、少なくとも１国際単位（ＩＵ）、例えば、少なくとも５ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１００ＩＵ、少なくとも１０００ＩＵ、少なくとも５０００ＩＵ、少なくとも１０，０００ＩＵ、少なくとも５０，０００ＩＵ、少なくとも１００，０００ＩＵまたは少なくとも５００，０００ＩＵ、例えば、５ＩＵから約５０，０００ＩＵ、５〜１０，０００ＩＵ、１０〜１０００ＩＵ、または５０，０００〜５００，０００ＩＵの１種または複数の試験作用物質と一緒に培養される。いくつかの例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に添加される試験作用物質（複数可）（例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される）の量は、半対数（ｈａｌｆ−ｌｏｇ）漸増濃度においてスクリーニングされた１ｎＭから１０μＭである。特定の実施形態において、試験作用物質はＶＤＲアゴニストを含む。
【０１２１】
いくつかの例において、細胞を、細胞によるＶＤＲ発現を、ＴＧＦ−β１の非存在下での発現と比較して増加させるために十分な量のＴＧＦ−β１とさらに接触させる。いくつかの例において、細胞によるＶＤＲの発現は、ＴＧＦ−β１を添加しない発現量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍、例えば、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、２倍〜５倍、３倍、４倍、５倍または６倍増加させる。ＶＤＲ発現を測定する方法は、当分野において公知であり、限定するものではないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＦＩＳＨ、ウエスタンブロッティング、およびタンパク質の蛍光顕微鏡検査などを挙げることができる。いくつかの例において、該方法は、ＴＧＦ−β１の添加後のＶＤＲの発現を測定するステップをさらに含む。添加するＴＧＦ−β１の量は、当業者により決定可能である。いくつかの例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に添加するＴＧＦ−β１の量は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌまたは１０００ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌである。
【０１２２】
いくつかの例において、１種または複数の試験作用物質が、ＴＧＦ−β１と同じ時に、例えば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または同時に（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）細胞に添加される。いくつかの例において、試験作用物質は、ＴＧＦ−β１の前、例えば、ＴＧＦ−β１の少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間または少なくとも２４時間前の期間に添加される。いくつかの例において、ＴＧＦ−β１は、試験作用物質の前、例えば、試験作用物質（複数可）の少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間または少なくとも２４時間前の期間（例えば、４〜６時間前）に添加される。いくつかの例において、試験作用物質およびＴＧＦ−β１は細胞と一緒に、少なくとも３０分、例えば、少なくとも６０分、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間または少なくとも４８時間、例えば、６〜２４時間、６〜１２時間または８〜２４時間、例えば、２４時間インキュベートされる。
【０１２３】
１種または複数の試験作用物質およびＴＧＦ−β１と一緒のインキュベーション後、該方法は、（１）細胞によるＶＤＲアゴニストもしくはカルシトリオールの産生を検出するステップ、（２）細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生を検出するステップ、（３）細胞によるＳＭＡＤ３の産生、翻訳後修飾もしくは発現を検出するステップ、または（４）ＶＤＲのＶＤＲアゴニストへの結合を検出するステップ、の１つまたは複数を含むことができる。このような測定方法は当分野において周知であり、本開示は、特定の検出方法に限定されるものではない。例えば、細胞によるＶＤＲアゴニストの産生は、質量分析、イムノアッセイまたは他のアッセイ系（特定の化学構造物または化学構造物のファミリーを検出可能なｉｎ  ｖｉｖｏの細胞ベースおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのＶＤＲ／コアクチベーター会合アッセイを含む）により測定することができる。細胞によるＣＹＰ２４Ａ１および／またはＳＭＡＤ３の産生または発現は、核酸またはタンパク質発現の測定に使用される任意の方法、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１特異的抗体またはＳＭＡＤ３特異的抗体を使用する方法（例えば、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学など）およびＣＹＰ２４Ａ１特異的またはＳＭＡＤ３特異的なプローブまたはプライマーを使用する方法（例えば、ＰＣＲ増幅、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）により測定することができる。ＶＤＲのＶＤＲアゴニストへの結合を測定する方法は、限定するものではないが、リガンド誘導性受容体−コアクチベーター結合の測定（例えば、ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）系、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製を使用する）、リガンド誘導性受容体−コアクチベーター結合のＦＲＥＴ測定、競合リガンド結合アッセイ（例えば、放射標識されたＶＤＲリガンドを使用する）、リガンド結合ドメインの差次的熱安定性などを含む。
【０１２４】
試験作用物質は、（１）１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて細胞によるＶＤＲアゴニストまたはカルシトリオールの産生を少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍もしくは少なくとも１０倍増加させる、（２）１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて肝細胞によるＣＹＰ２４Ａ１の産生または発現を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍もしくは少なくとも１０倍増加させる、（３）１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて肝細胞によるＳＭＡＤ３の産生または発現を、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍もしくは少なくとも１０倍減少させる、または（４）１種または複数の試験作用物質の非存在下と比べてＶＤＲのＶＤＲアゴニストへの結合を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍もしくは少なくとも１０倍増加させる、のうちの１つまたは複数を行うものを選択することができ、ここで、該選択される作用物質が線維症を処置もしくは予防できる作用物質である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、スクリーニング方法は、細胞により産生されたＶＤＲアゴニストが、Ｃｙｐ２４Ａ１により分解され得るかどうかを決定するステップを含み、他の実施形態において、該方法は、Ｃｙｐ２４Ａ１によるＶＤＲアゴニストの分解をもたらさなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、該方法は、作用物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含み、ある特定の例において、該方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む。さらに他の実施形態において、該方法は、作用物質がｉｎ  ｖｉｖｏで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含み、ある特定の例において、該方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで高カルシウム血性効果を有さなかった（例えば、血中カルシウムレベル≧３ｍｍｏｌ／ｌを引き起こさなかった）試験作用物質を選択するステップもまた含む。
【０１２７】
さらなる実施形態は、選択した試験作用物質のうちの１種または複数を、線維症を有する哺乳動物に投与するステップ、および該１種または複数の試験作用物質が線維症を処置または予防するかどうかを決定するステップを含み、いくつかの例において、線維症を処置または予防した試験作用物質を選択するステップを含む。線維症の動物モデル、例えば、下記の実施例に記載の肝臓の傷害および線維症のＣＣｌ４モデルは周知である。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで星細胞によるＶＤＲの発現を増加させる方法もまた、本明細書において提供される。このような方法は、星細胞と、ＶＤＲアゴニストのＶＤＲへの結合を少なくとも１０倍増強するのに十分な量のＶＤＲアゴニストおよび必要に応じて、十分な量のＴＧＦ−β１とを接触させるステップを含むことができる。
【実施例】
【０１２９】
（実施例１）
実験手順
本実施例は、下記の実施例に記載の結果のための材料および方法を提供する。
【０１３０】
初代ＨＳＣの単離および培養
ＨＳＣを、１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＷｉｓｔａｒラットから、すでに報告されているｉｎ  ｓｉｔｕプロナーゼ、コラゲナーゼ潅流および単一ステップのＨｉｓｔｏｇｅｎｚ勾配（Hendriksら、１９８５年；Knookら、１９８２年）により単離した。単離されたＨＳＣを、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で６ウェルプレートにおいて４０時間培養し、その後エンドポイントアッセイを実施した。
【０１３１】
免疫沈降およびウエスタンブロット
全細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファーによる溶解を介して得、核抽出物の単離を、すでに報告されているように実施した（Dingら、２００８年）。全ＳＭＡＤ３および核ＳＭＡＤ３を、それぞれ、ＬＸ−２全細胞および核抽出物から抗ＳＭＡＤ２／３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１３３０９８）を使用して免疫沈降させ、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＳＭＡＤ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５２３）および抗ｐＳＭＡＤ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５２０）特異的抗体によるウエスタンブロット検出を行った。
【０１３２】
細胞培養、ルシフェラーゼアッセイおよびＲＴ−ｑＰＣＲ
Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｓｃｏｔｔ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹのご厚意により寄贈されたＬＸ−２細胞を、先に記載（Xuら、２００５年）のように培養した。ＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３およびカルシポトリオール（Ｔｏｃｒｉｓ）を、他のことが示された場合を除いて、それぞれ、１ｎｇ／ｍｌ、１００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。ルシフェラーゼアッセイのために、ＤＮＡトランスフェクションを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して製造業者の指示に従って実施した。ＤＮＡトランスフェクションの２４時間後、細胞を、ビヒクル、カルシポトリオールもしくはＴＧＦβ１または両方でさらに２４時間処置し、その後、ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。ＲＴ−ｑＰＣＲを行い、ＴＲＩｚｏｌ抽出の後で全ＲＮＡを精製して、ＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。ｃＤＮＡ合成を、ｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）により実施した。定量的ＰＣＲを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して技術的に三連で実施した。相対標準曲線法を定量（Ｂｉｏｒａｄ）のために使用した。発現レベルをＧａｐｄｈ（マウス）またはＵ３６Ｂ４（ヒト）の量のいずれかに対して正規化することによって計算した。プライマーの配列を表２に列挙する。
【表２】
2016520572.tif 000005
【０１３３】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションを、２０ｎＭの濃度の表示のｓｉＲＮＡで（ＳＭＡＤ２／３の場合、１０ｎＭの各ｓｉＲＮＡをトランスフェクション用に組み合わせた）、ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。トランスフェクトされた細胞を、撹乱せずに少なくとも４８時間培養し、その後末端アッセイを行った。
【０１３４】
肝臓の傷害および線維症のＣＣｌ４モデル
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５ｍｌ／ｋｇ体重のＣＣｌ４（Ｓｉｇｍａのコーン油中１：５０ｖ／ｖ）またはビヒクル（コーン油中ＤＭＳＯ）を、週に３回を４週間ＩＰ注射した。カルシポトリオール（２０μｇ／ｋｇ体重）を、経口強制栄養により、ＣＣｌ４の初回投与の２０日後に開始して週に５回投与した。動物を、最終ＣＣｌ４注射の７２時間後に終結させ、全肝臓および血清を、組織学的、細胞学的、生化学的および分子的分析用に回収した。
【０１３５】
Ｖｄｒノックアウトマウス
Ｖｄｒの標的除去についてヘテロ接合性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Liら、１９９７年）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ  Ｎｕｍｂｅｒ００６１３３）から入手した。野生型対照、Ｖｄｒ＋／−およびＶｄｒ−／−マウスを、２１％カルシウムおよび０．６７％のリンおよび２０％のラクトースを含有し、４．４ユニットのビタミンＤ／グラム食餌を補充したＶｄｒ−／−救済食餌（Amlingら、１９９９年）で６カ月飼育し、その後犠牲にした。肝臓を、上記の分析用に回収した。
【０１３６】
線維化スコアおよび肝コラーゲンおよびヒドロキシプロリン含有量の定量
ホルマリン固定肝臓の５μｍ切片を、標準的Ｈ＆Ｅおよびシリウスレッド法に従って染色し、実験条件を知らされていない病理学者が精査した。線維症を、Ｉｓｈａｋ変形組織学的活動指数（ＨＡＩ）スコアリング系を使用してスコア付けした。線維症を、またＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、１０の非隣接シリウスレッド染色切片に対して定量した。すべての画像は、×４／０．１３、×１０／０．３０、×２０／０．５０および×４０／０．７５のＵｐｌａｎＦＬ  Ｎ  ｐｌａｎ対物レンズを搭載したＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡に装着された高解像度Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ４２０デジタルカメラを使用して得、Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅで処理した。肝ヒドロキシプロリン含有量を、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｋ５５５−１００）による市販の比色アッセイを使用して測定した。
【０１３７】
ＣｈＩＰおよびＣｈＩＰ−Ｒｅ−ＣｈＩＰ
ＬＸ−２細胞を、カルシポトリオール（１００ｎＭ）で１６時間前処理し、その後、カルシポトリオール（１００ｎＭ）もしくはＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）または両方とさらに４時間インキュベーションした。次いで細胞をＣｈＩＰアッセイ用に収集した。ＣｈＩＰのための実験手順は、すでに記載されていた（Barishら、２０１０年）。簡潔に言うと、固定後、ＬＸ−２細胞から核を単離し、溶解して、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒでせん断して、２００〜１０００塩基対のサイズのＤＮＡ断片を得、その後以下に列挙した抗体：正常ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２０２７）、ＶＤＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１００８）、ＳＭＡＤ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ２８３７９）およびヒストンＨ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９１）を使用して免疫沈降させた。ＣｈＩＰ−Ｒｅ−ＣｈＩＰに関しては、第１のＣｈＩＰの後で、免疫沈降させたＤＮＡ−タンパク質複合体を、１０ｍＭ  ＤＴＴを使用してビーズから溶出させ、１００倍に希釈し、その後、第２の抗体、ｒｅ−ＣｈＩＰにより再免疫沈降させた。
【０１３８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ分析
この手順は既に記載されていた（Barishら、２０１０年）。簡潔に言うと、短鎖ＤＮＡリードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ１．７を使用してヒトｈｇ１８参照ゲノム（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１）に対してアライメントした。リードは、リード中の２つまでの不一致を許容するＢｏｗｔｉｅ  ａｌｉｇｎｅｒを使用してアライメントした。ゲノムに対してユニークにマッピングされたタグだけを、さらなる分析用と見なした。その後のピークコーリングおよびモチーフ分析を、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析に適切なソフトウェアであるＨＯＭＥＲを使用して実施した。下記のＨＯＭＥＲの方法は実装されており、http://biowhat.ucsd.edu/homer/（Heinzら、２０１０年）において自由に利用可能である。それぞれのユニークな位置に由来する１つのタグを検討して、ＣｈＩＰＳｅｑプロトコールの間の断片のクローン性増幅からもたらされたピークを除外した。２００ｂｐのスライディングウインドウ内のタグのクラスタに対して検索し、互いに少なくとも１ｋｂ離れた隣接クラスタを要求することによって、ピークを同定した。有効なピークを決定するタグの数に対する閾値は、ランダム化されたタグ位置を使用してピーク発見手順を反復することにより経験的に決定されるとおりに、＜０．０００１の偽発見率について、選択した。ゲノムの重複または非局在化結合を有する領域を同定することを回避するために、ピークは、インプットまたはＩｇＧ対照試料より（合計数に対して正規化された）少なくとも４倍超のタグおよび局所バックグラウンド領域（１０ｋｂ）と比べて４倍超のタグを有する必要がある。最も近いＲｅｆＳｅｑ転写開始部位を同定することによって、ピークを遺伝子産物に対してアノテーションする。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ結果の可視化は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ上にカスタムトラックをアップロードすることによって達成された。ヒト表現型分析は、ＧＲＥＡＴ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ  Ｔｏｏｌ）、http://great.stanford.edu/を使用して実施した。
【０１３９】
マイクロアレイデータ分析
初代のラットまたはマウスＨＳＣ由来の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して標準的プロトコールに従って単離した。ＲＮＡの完全性および品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して評価し、Ｉｌｌｕｍｉｎａのラットまたはマウスの遺伝子発現アッセイとのハイブリダイゼーション用に、標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコールに従って調製した。特徴抽出を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して実施した。生物学的重複（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）からの差次的に発現した遺伝子の正規化および同定を、ＶＡＭＰＩＲＥ、http://sasquatch.ucsd.edu/vampire/を使用して実施した。
【０１４０】
受託番号
全データセット（ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよびマイクロアレイ）のＧＥＯ受託番号はＧＳＥ３８１０３である。
【０１４１】
（実施例２）
ＶＤＲは肝臓線維症を予防する
以前の結果（Abramovitchら、２０１１年；Gascon-Barreら、２００３年）と一致して、ＶｄｒはＨＳＣにおいて発現されるが、全肝臓または精製肝細胞のどちらにおいても検出不可であることが観察された（図１Ａ〜Ｃ）。さらに、十分に確立されたＴＧＦβ１応答性ヒトＨＳＣ細胞系（Xuら、２００５年）である初代ＨＳＣおよびＬＸ−２細胞の両方において、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３またはその低カルシウム血性類似体のカルシポトリオール（Ｃａｌ）（Nagpalら、２００５年）（図２Ａ）、のいずれかによるＣＹＰ２４Ａ１発現のリガンド誘導により決定した場合、ＨＳＣ発現ＶＤＲは、完全に機能性である（図１Ｄおよび１Ｅ）。
【０１４２】
ＶＤＲシグナル伝達が線維化遺伝子発現を抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝線維形成を妨害することができるかどうかに対処するために、肝臓線維症を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、広く使用される肝毒性物質の四塩化炭素（ＣＣｌ４）を０．５ｍｌ／ｋｇの用量で腹腔内（ＩＰ）注射を週に３回行うことによって誘導した。４週までに、ＣＣｌ４処置マウスは、相当のコラーゲン沈着を伴う広範囲に及ぶ肝臓架橋線維症を示したが、一方、ＣＣｌ４／カルシポトリオール共処置マウスは、シリウスレッド染色の定量、肝ヒドロキシプロリン含有量および組織学的線維化スコア付により実証されるとおり、線維症の有意な減少を有した（図３Ａ〜３Ｄ）。血清カルシウム濃度は、カルシポトリオール処置により有意に変化しなかった（図２Ｂ）。鍵となる線維化マーカー遺伝子、例えば、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆｂ１およびＴｉｍｐ１は、カルシポトリオールによる５０〜７０％の間の下方制御を明らかにした（図３Ｅ〜３Ｇ）。興味深いことに、マウスをカルシポトリオールで５週間前処置し、その後ＣＣｌ４／カルシポトリオールの共処置を行った場合、肝臓における線維形成反応は、ほぼ完全に阻害され（図２Ｃ〜Ｆ）、ＶＤＲアゴニストが線維症を弱める能力を保有するだけでなく、肝臓線維症をｉｎ  ｖｉｖｏで積極的に予防する潜在力を保有することが示唆された。
【０１４３】
このことから、本発明者らは、ＶＤＲの欠乏が、肝臓線維形成に影響を与え得るかどうかを検査するに至った。実際、６カ月齢のＶｄｒ−／−マウスは、コラーゲン沈着の増加により実証される特発性肝臓傷害／線維症表現型を示し、４匹のうちの２匹のマウスが、肝細胞壊死および門脈路周囲の壊死性炎症の病巣（図３Ｈ、右／下、矢印）を伴う明白な硬変（図３Ｈ、右／上）を発症した。肝臓切片のシリウスレッド染色を使用して観察された肝臓線維症の程度にいくらかの変動性が存在するので、肝ヒドロキシプロリン含有量を、最も軽度の線維症（非硬変マウス）を示す２匹のＶｄｒ−／−マウスにおいて測定し、野生型またはＶｄｒ＋／−マウスのいずれかに観察された含有量より有意に多いことをさらに見出した（図３Ｉ）。さらに、Ｖｄｒ＋／−マウスは、炎症性応答の非存在下で類洞周囲の線維症の複数の病巣を示し（図３Ｈ、中央／上、矢印）、同一のカルシウムおよびリン酸塩補充食餌で飼育された対照の野生型マウスにおいて、病理は観察されなかった（図３Ｈ、左）。組織学的所見を、肝ヒドロキシプロリン含有量の定量および鍵となる線維化マーカー遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の検査より確認した（図３Ｉ〜３Ｊ）。
【０１４４】
これらのデータは、両方のＶｄｒ対立遺伝子が正常な肝臓構造の維持に必要であり、完全に阻害された場合、線維形成の調節不全に加えて、局所炎症応答の制御の喪失をもたらすことを示している。
【０１４５】
（実施例３）
ＶＤＲシグナル伝達は、ＴＧＦβ誘導性線維化促進遺伝子を抑制する
発現プロファイルを使用して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ１＋１，２５（ＯＨ）２Ｄ３−処置初代ラットのＨＳＣにおけるＶＤＲシグナル伝達の影響の可能性を調査した。特に、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３処置は、ＨＳＣの培養誘導性活性化を減弱させ、したがって、処置細胞のトランスクリプトームは新鮮に単離された静止細胞と非常に似ており（図４Ａ）、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とＴＧＦβ１との共処置は、ＴＧＦβ１誘導遺伝子の大きなセットの著しい抑制をもたらした（完全なリストに関しては、Dingら、Cell、１５３：６１０〜１３頁、２０１３年の表Ｓ１を参照されたく、当該文献は本明細書に参照により組み込まれ、より短いリストを下記の表３に提供する）。
【０１４６】
【表３−１】
2016520572.tif 000006
【０１４７】
これらのうち、３９の遺伝子は、コラーゲン（BatallerおよびBrenner、２００５年；Tsukadaら、２００６年）、Ｔｇｆスーパーファミリのメンバー（InagakiおよびOkazaki、２００７年）、マトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのメンバー（Ｍｍｐｓ）（Arthur、２０００年；Han、２００６年）、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子（Ｔｉｍｐｓ）（Arthur、２０００年；Yoshijiら、２００２年）、インテグリン（PatsenkerおよびStickel、２０１１年）およびリシルオキシダーゼファミリーのメンバー（Barry-Hamiltonら、２０１１年；KaganおよびLi、２００３年；Vadaszら、２００５年）を含む肝臓線維形成の中心であった（図４Ｂ）。
【０１４８】
次に、初代マウスＨＳＣおよびＬＸ−２細胞の両方において、カルシポトリオールが線維化遺伝子発現を強力に抑制したことが確認され、ＶＤＲアゴニストの抗ＴＧＦβ特性は、哺乳動物種にわたって保存されている可能性があることを示唆していた（データ非掲載）。最後に、ＬＸ−２細胞においてＲＮＡｉを使用して、ＶＤＲの喪失が、ＴＧＦβ１誘導遺伝子発現のカルシポトリオール媒介性抑制を無効にすることが観察され（図４Ｃ）、併せて、ＶＤＲが、抗ＴＧＦβ／線維化ネットワークをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節することが明らかにされた。
【０１４９】
（実施例４）
ＨＳＣにおけるＶＤＲシストロームおよびＳＭＡＤ３シストロームの定義
この実施例は、ＶＤＲが、抗線維化遺伝子ネットワークの直接または間接的な調節因子であるかどうかを決定するために使用される方法を記載する。ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３は、ＨＳＣにおいてＴＧＦβ１誘導線維化促進遺伝子発現を必要とし（図５Ａ）、ＶＤＲの活性化は、ＴＧＦβ１誘導性リン酸化およびその後のＳＭＡＤ３の核移行に有意な影響を与えず（図５Ｂ）、ＶＤＲに対する直接調節の役割が提唱された。この可能性を調査するために、ゲノム全域にわたるＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合部位を、カルシポトリオールおよびＴＧＦβ１の両方と一緒に培養されたＬＸ−２細胞において、クロマチン免疫沈降をハイスループットディープシーケンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）と併せて使用して分析した。得られたシストロームにより、２４，９８４のＶＤＲおよび２３，５８１のＳＭＡＤ３高信頼度結合部位を同定した（ＦＤＲ＜０．０００１）（図６Ａおよび６Ｅ）。他の転写因子に対する包括的な結合パターンの報告（Barishら、２０１０年；Biddieら、２０１１年；Heinzら、２０１０年；Trompoukiら、２０１１年）と一致して、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合部位の大部分は局在化し、遺伝子間領域およびイントロン領域から離れており、わずか１６−２１％が遺伝子プロモーターに見出されている（図６Ａおよび６Ｅ）。
【０１５０】
ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合部位のリストから、すでに特徴付けられた機能性ビタミンＤ応答エレメント（ＶＤＲＥ）の数を、公知のビタミンＤ−誘導遺伝子、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１（図６Ｂ）、ＳＰＰ１、ＢＧＬＡＰ（図７Ａ〜７Ｂ）およびＩＤ１（図６Ｆ）、ＳＭＡＤ７ならびにＴＧＦβＩ（図７Ｃおよび７Ｄ）を含む、ＴＧＦβシグナル伝達標的遺伝子のためのＳＭＡＤ結合エレメント（ＳＢＥ）に関して確認した。遺伝子のアノテーション分析により最も近い転写開始部位への近接に基づいてピークを割り当て、個別のＶＤＲシストロームおよびＳＭＡＤ３シストローム中にそれぞれ１１，０３１および９，２１０の推定標的遺伝子を得た。これらのアノテーションを付与された遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、推定のＶＤＲ標的遺伝子およびＳＭＡＤ３標的遺伝子に関する最も一般的な分類された機能は、代謝（４７％）および細胞シグナル伝達（３４％）であったことが明らかにされた（図６Ｃおよび６Ｇ）。
【０１５１】
最後に、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３に関する最も有意に富化された結合モチーフを調べた。これらの配列シグネチャーの中で、３ｂｐスペーサーを有する直接六量体リピート（ＤＲ３）のコンセンサス配列がＶＤＲ部位における最も富化されたモチーフであり、ＶＤＲ結合ピークの７４％を説明しており（図６Ｄ、上）、一方、コンセンサスＳＢＥ配列、ＧＴＣＴモチーフはＳＭＡＤ３結合ピークの８３％を占める（図６Ｈ、上）。興味深いことに、この分析は、ＧＴＣＴおよびＤＲ３タイプのモチーフが、それぞれ、ＶＤＲ結合部位およびＳＭＡＤ３結合部位においてヌクレオソームの距離内で共富化されることを明らかにし、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３が、交差するシストロームを介して連絡していることを示唆していた（図６Ｄおよび６Ｈ、下）。
【０１５２】
（実施例５）
ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３ゲノムクロストークを介したＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニズム
この可能性に対処するために、バイオインフォマティクス分析を使用してＶＤＲおよびＳＭＡＤ３両方により結合された部位の数を計算することによって、シストロームの交差の程度を定量した。合計１０，４３６のゲノム部位が、共占有され（図８Ａ）、この共占有パターンは、ＳＭＡＤ３結合ピークの周囲のＶＤＲ部位を定量するヒートマップにより可視化されるとおり、ゲノム全域にわたった（図８Ｂ）。このゲノム交差が、ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３のクロストークを媒介する場合、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３は、これらの共占有部位と同時に相互作用可能である。逐次ＣｈＩＰ（ＣｈＩＰ−ｒｅ−ＣｈＩＰ）実験により、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３が、少なくとも一時的に、同じゲノム部位を共占有できることが確認された（図８Ｃ）。
【０１５３】
次に、抗ＴＧＦβシグナル伝達がＶＤＲ／ＳＭＡＤのゲノム交差により媒介される場合、その場合は、ＨＳＣ中の線維化促進遺伝子は、一緒に結合された調節エレメントにおいて大きな比率を占めるはずである。実際に、ヒト表現型を指定するＧＯ分析により、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３により共占有された病巣に関する「異常な瘢痕形成」応答の有意な富化（６７％）が示され（図８Ｄ）、早期に同定された３９の線維化促進遺伝子による潜在的ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有の検査に至った（図４Ｂ）。このサブセット内で、３４が、ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位を含有することが見出された（図８Ｅ）。さらに、これらの遺伝子の多くが、複数のＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有部位を含有することが見出された（図８Ｆおよび表３）。
【０１５４】
【表３−２】
2016520572.tif 000007
【表３−３】
2016520572.tif 000008
【０１５５】
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子上のＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共結合部位を担持するルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、これらのゲノムエレメントが、カルシポトリオールおよびＴＧＦβ１の対立する作用を、少なくとも部分的に再現できることが観察され、これらのシスエレメントが、線維化促進遺伝子発現のエンハンサーとして機能することを示した（図９Ａ）。
【０１５６】
（実施例６）
ＶＤＲ／ＳＭＡＤのゲノムアンタゴニズム
共占有ゲノム領域におけるＶＤＲとＳＭＡＤ３との間の空間的関係のインフォマティクス分析により、これらのそれぞれの応答エレメントが、１つのヌクレオソームウインドウ（≦２００塩基対）内に共局在していることを確認し（図９Ｂ）、近位のＤＮＡ結合によるゲノムアンタゴニズム（Barishら、２０１０年；Hua  ら、２００９年）の可能性をさらに支持している。
【０１５７】
ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノムアンタゴニズムの存在は、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の共占有部位の中心に対するこれらの平均ＣｈＩＰ−Ｓｅｑシグナル強度をプロットすることによって可視化可能である。これにより、カルシポトリオールの存在下で、ＳＭＡＤ３のＴＧＦβ誘導性動員が、全体的に約１．５倍損なわれたが、一方、ＶＤＲのこれらの部位への結合が、全体的にほぼ１０倍増強されたことが実証された（図１０Ａ〜１０Ｂ）。加えて、提唱されたゲノムアンタゴニズムを、ＶＤＲ／ＳＭＡＤ共占有調節エレメント、例えばＣＯＬ１Ａ１を含有する線維化促進遺伝子と共にその影響を検査することによって例示した。シーケンシングトラックの可視化により、カルシポトリオールが、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子上の３つの主要なＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共結合部位全てにおいてＶＤＲの占有を促進したことが明らかにされた（図１０Ｃ、中央の２つのトラック）。対照的に、ＴＧＦβ誘導性ＳＭＡＤ３結合は、概して、カルシポトリオール処理の際に遺伝子と共に減少した（図１０Ｃ、上の２つのトラックならびにＣｈＩＰ−ｑＰＣＲにより独立して検証された、図１０Ｄおよび１０Ｆ）。ＶＤＲの動員と併せたＳＭＡＤ３の同様の喪失は、他の線維化促進遺伝子、例えば、ＣＯＬ１Ａ２、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２およびＬＯＸＬ２の調節領域においても観察された（図１１Ａ〜Ｆ）。さらに、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ２／３のＲＮＡｉ媒介性枯渇は、それぞれ、ＳＭＡＤ３動員および共占有調節エレメントへのＴＧＦβ１誘導性ＶＤＲ結合のカルシポトリオール依存性喪失を阻害し、ＶＤＲおよびＳＭＡＤが、このゲノムアンタゴニズムを媒介するために必要であることを実証した（図１０Ｅおよび１０Ｇ）。
【０１５８】
ヒストン修飾補助因子、例えば、ＣＢＰおよびｐ３００の動員ならびにヒストンＨ３の過剰アセチル化は、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化のランドマークイベントとして確立されているので（Massagueら、２００５年）、ＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノムアンタゴニズムが、このエピジェネティックな経路に干渉することによって、ＴＧＦβシグナル伝達を抑えることができるかどうかを決定した。ヒストンＨ３のアセチル化ならびにＣＢＰおよびｐ３００のＶＤＲ／ＳＭＡＤ共占有部位への動員の状態を、カルシポトリオールもしくはＴＧＦβ１のいずれか、または両方により処理した細胞において検査した。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲにより、ＴＧＦβ１が、ＣＯＬ１Ａ１のＶＤＲ／ＳＭＡＤ共占有調節領域におけるｐ３００およびＣＢＰの動員ならびにヒストンＨ３の過剰アセチル化を誘導することが実証された。この効果は、カルシポトリオールおよびＴＧＦβ１により共処理した細胞において喪失され（図１２Ａ）、ＶＤＲ／ＳＭＡＤのゲノムアンタゴニズムが、コアクチベーターの動員およびヒストンの過剰アセチル化を損なうことによって、ＴＧＦβの活性化を制限することを示した。
【０１５９】
リガンド依存性コリプレッサーの動員または「トランス抑制」は、炎症遺伝子発現を負に調節する、核受容体、例えば、ＰＰＡＲγおよびＬＸＲの主要な機構として提唱されている（GlassおよびSaijo、２０１０年）。トランス抑制がアンタゴニズムに寄与するかどうかを試験するために、カルシポトリオールおよびＴＧＦβ１に応答した、ＮＣｏＲ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＣｏＲＥＳＴ、ＬＳＤ１およびＧ９ａを含むコリプレッサーの、線維化促進遺伝子、例えば、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２のＶＤＲ／ＳＭＡＤ３共占有調節領域への潜在的な誘導性動員を検査した。しかし、これらのコリプレッサーのこれらの部位への結合の変化は検出されず（図１２Ｂ）、これらの部位から転写活性化複合体の喪失が、コリプレッサーの動員の増加によるものではないことを示した。
【０１６０】
（実施例７）
ＴＧＦβは、シグナル依存性ＶＤＲシストロームをアンマスクする
ＶＤＲ／ＳＭＡＤ３ゲノムアンタゴニズムは確立されたが、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達が、ＣＯＬ１Ａ１のシス調節領域への、リガンド結合したＶＤＲの動員を増強するようであることが観察された（図１０Ｆおよび１０Ｇ）。この効果が、線維化促進遺伝子の他のＶＤＲ結合部位において観察されるかどうかを決定するために、ＶＤＲシストローム±カルシポトリオールを、ＴＧＦβ１の存在下、または非存在下において分析した。ＴＧＦβ１が、すべての線維化促進遺伝子において、リガンド結合したＶＤＲのシス調節領域への結合を促進するが、リガンド非結合ＶＤＲの結合は促進しないことが観察された（図１１Ｂおよび１１Ａ〜Ｆ、下の４つのトラック）。
【０１６１】
次に、カルシポトリオール誘導性ＶＤＲの全体的結合パターンを、ＴＧＦβ１の存在下、または非存在下において比較した。６，２８１の結合部位は、ＴＧＦβ１の非存在下で新規なＶＤＲシストロームを含むが、２４，９８４部位からなる新しいシストロームは、ＴＧＦβ１の存在下で誘導された（図６Ａ）。興味深いことに、わずか３，５３７部位は両方のシストロームにより共有され、ＴＧＦβ誘導性リガンド結合ＶＤＲの結合部位の８５％（２１，４４７部位）はユニークであり（図１３Ａ）、ＴＧＦβが、リガンド結合したＶＤＲのゲノム全域にわたる結合位置の劇的なシフトをもたらすことを示した。
【０１６２】
２つのＶＤＲシストロームの比較研究により、ＴＧＦβ１＋カルシポトリオール部位（カルシポトリオール単独部位ではない）は、ＳＭＡＤ３結合部位において高度に富化されていたことが明らかにされた（図１３Ｂ）。さらに、これらのゲノム部位へのＶＤＲの結合は、ＴＧＦβシグナル伝達により増強され（図１３Ｃ）、この効果は、ＶＤＲ発現の変化による可能性はなかった（図１３Ｄ）。
【０１６３】
ＶＤＲゲノム遺伝子座のさまざまなサブセットのＤＮＡ配列を検査し、７０％より多くが、新規のＶＤＲ調節部位を含有することが観察され（図１３Ｅ）、ＳＭＡＤ依存性テザリングと対照的に、ＶＤＲがＤＮＡに直接作用することを示した。興味深いことに、ＴＧＦβは、ＶＤＲ−ＳＭＡＤ３共結合部位においてヌクレオソームの有意な枯渇を誘導し（図１３Ｆ）、局所クロマチンリモデリングの増強および得られた接近可能性により、ＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナル伝達が、ＶＤＲのその隣接部位への結合を促進できることを示した。
【０１６４】
（実施例８）
ＶＤＲとＳＭＡＤとの間のゲノム回路
上で論じられた所見は、ＶＤＲとＴＧＦβ−ＳＭＡＤシグナル伝達との間の動的関係を示唆しており、おそらく、ＳＭＡＤのクロマチンへの結合のＴＧＦβ誘導は、ＳＭＡＤ抑制の一時的遅延を可能にすることができるリガンド結合されたＶＤＲに今や接近可能になる、新しいゲノムランドスケープを作り出す。この時空関係を調査するために、ＳＭＡＤ３およびＶＤＲの、線維化遺伝子（例えば、ＣＯＬ１Ａ１）の共占有シス調節エレメントへの動員の動態を、カルシポトリオールもしくはＴＧＦβ１のいずれかまたは両方の存在下で決定した。特に、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを用いて、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の、複数の時点（０、１、２、４、６、１６時間）におけるＣＯＬ１Ａ１のシス調節領域への結合をモニターした。
【０１６５】
特に、リガンド結合されたＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の両方のこの部位への結合は、処理の４時間後にＴＧＦβ１により最大に促進され、その後、１６時間後基底レベルまで徐々に減少し（図１４Ａ〜１４Ｂ）、ＶＤＲのクロマチンへの動員を容易にするＴＧＦβ１の役割を確認した。興味深いことに、ＴＧＦβ１刺激の際のＳＭＡＤ３の結合曲線は、カルシポトリオールの存在により劇的に変化し、ＴＧＦβ１処置のちょうど１時間後にＳＭＡＤ３の最大の結合を観察した。４時間後、ＳＭＡＤ３の動員は、７０％まで有意に減少した（図１４Ｂ）。さらに、カルシポトリオールおよびＴＧＦβ１両方の存在下のＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の結合の、これらの基底レベルに対する正規化は、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の占有は逆相関し（図１４Ｃ）、ＴＧＦβ誘導性クロマチン接近可能性が、ＶＤＲによるＳＭＡＤ活性化の逆転を容易にするゲノム構造を生み出すことを示した。まとめると、このＶＤＲ／ＳＭＡＤゲノム回路は、ＨＳＣにおけるＴＧＦβシグナル伝達に拮抗することによりＶＤＲが線維症をブロックする、クロマチンベースの機構を提供する。
【０１６６】
参考文献
Abramovitchら(2011).  Vitamin  D  inhibits  proliferation  and  profibrotic  marker  expression  in  hepatic  stellate  cells  and  decreases  thioacetamide-induced  liver  fibrosis  in  rats.  Gut  60,  1728-1737.
【０１６７】
Agmon-Levinら(2012).  Vitamin  D  in  Systemic  and  Organ-Specific  Autoimmune  Diseases.  Clin  Rev  Allergy  Immunol  2012,  14.
【０１６８】
Amling,  ら(1999).  Rescue  of  the  skeletal  phenotype  of  vitamin  D  receptor-ablated  mice  in  the  setting  of  normal  mineral  ion  homeostasis:  formal  histomorphometric  and  biomechanical  analyses.  Endocrinology  140,  4982-4987.
【０１６９】
Arthur,  M.J.  (2000).  Fibrogenesis  II.  Metalloproteinases  and  their  inhibitors  in  liver  fibrosis.  Am  J  Physiol  Gastrointest  Liver  Physiol  279,  G245-249.
【０１７０】
Barishら(2005).  A  Nuclear  Receptor  Atlas:  macrophage  activation.  Mol  Endocrinol  19,  2466-2477.  Epub  2005  Jul  2428.
【０１７１】
Barishら(2010).  Bcl-6  and  NF-kappaB  cistromes  mediate  opposing  regulation  of  the  innate  immune  response.  Genes  Dev  24,  2760-2765.
【０１７２】
Barry-Hamiltonら(2011).  Allosteric  inhibition  of  lysyl  oxidase-like-2  impedes  the  development  of  a  pathologic  microenvironment.  Nat  Med  16,  1009-1017.
【０１７３】
Bataller,  R.,およびBrenner,  D.A.  (2005).  Liver  fibrosis.  J  Clin  Invest  115,  209-218.
【０１７４】
Baur,  ら(2011).  Combined  effect  of  25-OH  vitamin  D  plasma  levels  and  genetic  Vitamin  D  Receptor  (NR  1I1)  variants  on  fibrosis  progression  rate  in  HCV  patients.  Liver  Int.
【０１７５】
Biddieら(2011).  Transcription  factor  AP1  potentiates  chromatin  accessibility  and  glucocorticoid  receptor  binding.  Mol  Cell  43,  145-155.
【０１７６】
Bookoutら(2006).  Anatomical  profiling  of  nuclear  receptor  expression  reveals  a  hierarchical  transcriptional  network.  Cell  126,  789-799.
【０１７７】
Bouillonら(2008).  Vitamin  D  and  human  health:  lessons  from  vitamin  D  receptor  null  mice.  Endocr  Rev  29,  726-776.
【０１７８】
Bouwensら(1992).  Liver  cell  heterogeneity:  functions  of  non-parenchymal  cells.  Enzyme  46,  155-168.
【０１７９】
Breitkopf,  K.,  Godoy,  P.,  Ciuclan,  L.,  Singer,  M.V.,  and  Dooley,  S.  (2006).  TGF-beta/Smad  signaling  in  the  injured  liver.  Z  Gastroenterol  44,  57-66.
【０１８０】
Chawlaら(2001).  Nuclear  receptors  and  lipid  physiology:  opening  the  X-files.  Science  294,  1866-1870.
【０１８１】
Cohen-NaftalyおよびFriedman  (2011).  Current  status  of  novel  antifibrotic  therapies  in  patients  with  chronic  liver  disease.  Therap  Adv  Gastroenterol  4,  391-417.
【０１８２】
Dingら(2008).  Mediator  links  epigenetic  silencing  of  neuronal  gene  expression  with  x-linked  mental  retardation.  Mol  Cell  31,  347-359.
【０１８３】
FengおよびDerynck  (2005).  Specificity  and  versatility  in  tgf-beta  signaling  through  Smads.  Annu  Rev  Cell  Dev  Biol  21,  659-693.
【０１８４】
Friedman,  S.L.  (1993).  Seminars  in  medicine  of  the  Beth  Israel  Hospital,  Boston.  The  cellular  basis  of  hepatic  fibrosis.  Mechanisms  and  treatment  strategies.  N  Engl  J  Med  328,  1828-1835.
【０１８５】
Friedman,  S.L.  (1999).  Evaluation  of  fibrosis  and  hepatitis  C.  Am  J  Med  107,  27S-30S.
【０１８６】
Friedman,  S.L.  (2003).  Liver  fibrosis  --  from  bench  to  bedside.  J  Hepatol  38  Suppl  1,  S38-53.
【０１８７】
Friedman,  S.L.  (2008).  Hepatic  stellate  cells:  protean,  multifunctional,  and  enigmatic  cells  of  the  liver.  Physiol  Rev  88,  125-172.
【０１８８】
Friedman,  S.L.,  およびBansal,  M.B.  (2006).  Reversal  of  hepatic  fibrosis  --  fact  or  fantasy?  Hepatology  43,  S82-88.
【０１８９】
Friedman,  S.L.,  Roll,  F.J.,  Boyles,  J.,  およびBissell,  D.M.  (1985).  Hepatic  lipocytes:  the  principal  collagen-producing  cells  of  normal  rat  liver.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  82,  8681-8685.
【０１９０】
Gascon-Barreら(2003).  The  normal  liver  harbors  the  vitamin  D  nuclear  receptor  in  nonparenchymal  and  biliary  epithelial  cells.  Hepatology  37,  1034-1042.
【０１９１】
Geerts,  A.  (2001).  History,  heterogeneity,  developmental  biology,  and  functions  of  quiescent  hepatic  stellate  cells.  Semin  Liver  Dis  21,  311-335.
【０１９２】
Glass,  C.K.,  およびSaijo,  K.  (2010).  Nuclear  receptor  transrepression  pathways  that  regulate  inflammation  in  macrophages  and  T  cells.  Nat  Rev  Immunol  10,  365-376.
【０１９３】
Goltzmanら(2004).  Effects  of  calcium  and  of  the  Vitamin  D  system  on  skeletal  and  calcium  homeostasis:  lessons  from  genetic  models.  J  Steroid  Biochem  Mol  Biol  89-90,  485-489.
【０１９４】
Griffinら(2001).  Dendritic  cell  modulation  by  1alpha,25  dihydroxyvitamin  D3  and  its  analogs:  a  vitamin  D  receptor-dependent  pathway  that  promotes  a  persistent  state  of  immaturity  in  vitro  and  in  vivo.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  98,  6800-6805.  Epub  2001  May  6822.
【０１９５】
Hanら(2010).  A  novel  bile  acid-activated  vitamin  D  receptor  signaling  in  human  hepatocytes.  Mol  Endocrinol  24,  1151-1164.
【０１９６】
Han,  Y.P.  (2006).  Matrix  metalloproteinases,  the  pros  and  cons,  in  liver  fibrosis.  J  Gastroenterol  Hepatol  21  Suppl  3,  S88-91.
【０１９７】
Heinzら(2010).  Simple  combinations  of  lineage-determining  transcription  factors  prime  cis-regulatory  elements  required  for  macrophage  and  B  cell  identities.  Mol  Cell  38,  576-589.
【０１９８】
Hendriksら(1985).  Perisinusoidal  fat-storing  cells  are  the  main  vitamin  A  storage  sites  in  rat  liver.  Exp  Cell  Res  160,  138-149.
【０１９９】
Hernandez-Gea,  V.,およびFriedman,  S.L.  (2011).  Pathogenesis  of  liver  fibrosis.  Annu  Rev  Pathol  6,  425-456.
【０２００】
Huaら(2009).  Genomic  antagonism  between  retinoic  acid  and  estrogen  signaling  in  breast  cancer.  Cell  137,  1259-1271.
【０２０１】
Inagaki,  Y.,  およびOkazaki,  I.  (2007).  Emerging  insights  into  Transforming  growth  factor  beta  Smad  signal  in  hepatic  fibrogenesis.  Gut  56,  284-292.
【０２０２】
Janssens,  W.,  Mathieu,  C.,  Boonen,  S.,  およびDecramer,  M.  (2011).  Vitamin  D  deficiency  and  chronic  obstructive  pulmonary  disease:  a  vicious  circle.  Vitam  Horm  86,  379-399.
【０２０３】
Kagan,  H.M.,  およびLi,  W.  (2003).  Lysyl  oxidase:  properties,  specificity,  and  biological  roles  inside  and  outside  of  the  cell.  J  Cell  Biochem  88,  660-672.
【０２０４】
Kimら(2002).  Burden  of  liver  disease  in  the  United  States:  summary  of  a  workshop.  Hepatology  36,  227-242.
【０２０５】
Knookら(1982).  Fat-storing  cells  of  the  rat  liver.  Their  isolation  and  purification.  Exp  Cell  Res  139,  468-471.
【０２０６】
Lee,  U.E.,およびFriedman,  S.L.  (2011).  Mechanisms  of  hepatic  fibrogenesis.  Best  Pract  Res  Clin  Gastroenterol  25,  195-206.
【０２０７】
Li,  M.O.,  およびFlavell,  R.A.  (2008).  TGF-beta:  a  master  of  all  T  cell  trades.  Cell  134,  392-404.
【０２０８】
Li,  Y.C.,  Pirro,  A.E.,  Amling,  M.,  Delling,  G.,  Baron,  R.,  Bronson,  R.,  およびDemay,  M.B.  (1997).  Targeted  ablation  of  the  vitamin  D  receptor:  an  animal  model  of  vitamin  D-dependent  rickets  type  II  with  alopecia.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  94,  9831-9835.
【０２０９】
Lim,  L.Y.,  およびChalasani,  N.  (2012).  Vitamin  d  deficiency  in  patients  with  chronic  liver  disease  and  cirrhosis.  Curr  Gastroenterol  Rep  14,  67-73.
【０２１０】
Makishimaら(2002).  Vitamin  D  receptor  as  an  intestinal  bile  acid  sensor.  Science  296,  1313-1316.
【０２１１】
Massague,  J.  (2008).  TGFbeta  in  Cancer.  Cell  134,  215-230.
【０２１２】
Massagueら(2005).  Smad  transcription  factors.  Genes  Dev  19,  2783-2810.
【０２１３】
Mungerら(2006).  Serum  25-hydroxyvitamin  D  levels  and  risk  of  multiple  sclerosis.  Jama  296,  2832-2838.
【０２１４】
Nagpal,  S.,  Na,  S.,  およびRathnachalam,  R.  (2005).  Noncalcemic  actions  of  vitamin  D  receptor  ligands.  Endocr  Rev  26,  662-687.
【０２１５】
Patsenker,  E.,  およびStickel,  F.  (2011).  Role  of  integrins  in  fibrosing  liver  diseases.  Am  J  Physiol  Gastrointest  Liver  Physiol  301,  G425-434.
【０２１６】
Pettaら(2010).  Low  vitamin  D  serum  level  is  related  to  severe  fibrosis  and  low  responsiveness  to  interferon-based  therapy  in  genotype  1  chronic  hepatitis  C.  Hepatology  51,  1158-1167.
【０２１７】
Ramagopalanら(2011).  Rare  variants  in  the  CYP27B1  gene  are  associated  with  multiple  sclerosis.  Ann  Neurol  70,  881-886.
【０２１８】
Reynaertら(2002).  Hepatic  stellate  cells:  role  in  microcirculation  and  pathophysiology  of  portal  hypertension.  Gut  50,  571-581.
【０２１９】
Rosenbloomら(2010).  Narrative  review:  fibrotic  diseases:  cellular  and  molecular  mechanisms  and  novel  therapies.  Ann  Intern  Med  152,  159-166.
【０２２０】
Sekiら(2007).  TLR4  enhances  TGF-beta  signaling  and  hepatic  fibrosis.  Nat  Med  13,  1324-1332.
【０２２１】
Seki,  E.,  およびSchnabl,  B.  (2012).  Role  of  innate  immunity  and  the  microbiota  in  liver  fibrosis:  crosstalk  between  the  liver  and  gut.  J  Physiol  590,  447-458.
【０２２２】
Siegmundら(2005).  Molecular  mechanisms  of  alcohol-induced  hepatic  fibrosis.  Dig  Dis  23,  264-274.
【０２２３】
Tanakaら(2009).  Vitamin  D  receptor  polymorphisms  are  associated  with  increased  susceptibility  to  primary  biliary  cirrhosis  in  Japanese  and  Italian  populations.  J  Hepatol  50,  1202-1209.
【０２２４】
Terrierら(2011).  Low  25-OH  vitamin  D  serum  levels  correlate  with  severe  fibrosis  in  HIV-HCV  co-infected  patients  with  chronic  hepatitis.  J  Hepatol  55,  756-761.
【０２２５】
Trompoukiら(2011).  Lineage  regulators  direct  BMP  and  Wnt  pathways  to  cell-specific  programs  during  differentiation  and  regeneration.  Cell  147,  577-589.
【０２２６】
Tsukadaら(2006).  Mechanisms  of  liver  fibrosis.  Clin  Chim  Acta  364,  33-60.
【０２２７】
Vadaszら(2005).  Abnormal  deposition  of  collagen  around  hepatocytes  in  Wilson's  disease  is  associated  with  hepatocyte  specific  expression  of  lysyl  oxidase  and  lysyl  oxidase  like  protein-2.  J  Hepatol  43,  499-507.
【０２２８】
von  Essenら(2010).  Vitamin  D  controls  T  cell  antigen  receptor  signaling  and  activation  of  human  T  cells.  Nat  Immunol  11,  344-349.
【０２２９】
Williams,  R.  (2006).  Global  challenges  in  liver  disease.  Hepatology  44,  521-526.
【０２３０】
Wynn,  T.A.  (2008).  Cellular  and  molecular  mechanisms  of  fibrosis.  J  Pathol  214,  199-210.
【０２３１】
Xuら(2005).  Human  hepatic  stellate  cell  lines,  LX-1  and  LX-2:  new  tools  for  analysis  of  hepatic  fibrosis.  Gut  54,  142-151.
【０２３２】
Yoshijiら(2002).  Tissue  inhibitor  of  metalloproteinases-1  attenuates  spontaneous  liver  fibrosis  resolution  in  the  transgenic  mouse.  Hepatology  36,  850-860.
【０２３３】
本開示の原理が適用できる多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は、本発明の単なる例であると認識するべきであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。むしろ、本開示の範囲は下記の特許請求の範囲により規定される。従って、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内にあるすべてを本発明者らの発明として特許請求する。
【図１Ａ−１Ｅ】
2016520572.tif 000009
【図２Ａ−２Ｆ】
2016520572.tif 000010
【図３Ａ−３Ｇ】
2016520572.tif 000011
【図３Ｈ−３Ｊ】
2016520572.tif 000012
【図４Ａ−４Ｃ】
2016520572.tif 000013
【図５Ａ−５Ｂ】
2016520572.tif 000014
【図６Ａ−６Ｈ】
2016520572.tif 000015
【図７Ａ−７Ｄ】
2016520572.tif 000016
【図８Ａ−８Ｆ】
2016520572.tif 000017
【図９Ａ−９Ｂ】
2016520572.tif 000018
【図１０Ａ−１０Ｇ】
2016520572.tif 000019
【図１１Ａ−１１Ｆ】
2016520572.tif 000020
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2016520572.tif 000021
【図１３Ａ−１３Ｆ】
2016520572.tif 000022
【図１４Ａ−１４Ｄ】
2016520572.tif 000023
【配列表】
2016520572000001.app
【国際調査報告】
2016520572.tif 000024
2016520572.tif 000025
2016520572.tif 000026
2016520572.tif 000027
2016520572.tif 000028
2016520572.tif 000029