(57)【要約】  支持体にタンパク質を固定化する方法であって、前記タンパク質が不連続接触真空ミキサー乾燥機において水相中で支持体とインキュベートされ、その後、固定化タンパク質を直ちに乾燥し、場合によっては、前記乾燥が同じ接触真空ミキサー乾燥機中での任意選択による洗浄ステップに後続する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体にタンパク質を固定化する方法であって、前記タンパク質が、不連続接触真空ミキサー乾燥機において水相中で支持体とインキュベートされ、その後、固定化タンパク質を直ちに乾燥し、場合によっては、前記乾燥が同じ接触真空ミキサー乾燥機中での任意選択による洗浄ステップに後続する方法。
【請求項２】
使用される接触真空ミキサー乾燥機が、100L超の内容積をもつ回転式乾燥機である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
使用されるタンパク質が、酵素である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
使用される酵素が、リパーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
使用されるリパーゼが、カンジダ・アンタークティカ由来リパーゼB(CALB)又は構造的にそれに由来するリパーゼである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
使用される支持体が、疎水性表面をもつ物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
使用されるポリマー支持体が、架橋ポリ(メタ)アクリレート含有樹脂である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
使用されるポリマー支持体が、球状ビーズ形態の、ジビニルベンゼンで架橋されたマクロ多孔性ポリ(メタ)アクリレート樹脂であって、その粒子が少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%の質量及び50μm〜2000μmのサイズを有する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
支持体とタンパク質のインキュベーション時間が2〜30時間である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が0℃〜40℃の温度で支持体とインキュベートされる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
固定化酵素の乾燥温度が30〜60℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
乾燥が減圧下で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
乾燥が5〜800mbarの範囲で行われる、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に酵素、具体的にはリパーゼを固定化及び乾燥する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
EP382767はリパーゼを固定化する方法を記載している。この事例では、所与のリパーゼの水溶液を、固定pHで室温下、樹脂(例えばLewatit(登録商標))と共に回転することにより混合する。固定化リパーゼを有する樹脂を次いでろ過により回収し、その後、水で洗浄し、減圧下で乾燥させる。
【０００３】
酵素の固定化は、一般に、支持体での非結合の結果として又はすでに結合した酵素の脱離(「流出(bleeding)」)による、酵素の損失を伴う。さらに、固定化酵素は、固定化の方法ステップの間、酵素活性の損失を往々にして起こし、著しい収率の損失及びとりわけ工業規模でのそれに付随するコストの上昇をもたらす。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、達成されるべき支持体においてタンパク質の効率的な固定化を可能にする方法であって、酵素学的に活性なタンパク質の場合には、支持体に存在する酵素の総量が可能な限り多く持続的に結合及び残留し、可能な限り固定化後に固定化前と同様の高酵素活性が得られることを示す方法を見出すことであった。
【０００５】
支持体にタンパク質を固定化する方法であって、当該タンパク質が、不連続接触真空ミキサー乾燥機(discontinuous contact vacuum mixer dryer)において水相中で支持体とインキュベートされ、その後、固定化タンパク質を直ちに乾燥し、場合によっては、前記乾燥が同じ接触真空ミキサー乾燥機中での任意選択による洗浄ステップに後続する方法が見出されている。
【０００６】
冒頭で定義された方法は、支持体とタンパク質の効率的なインキュベーション、場合によっては固定化タンパク質を洗浄及び固定化タンパク質を乾燥させることなどの固定化の全体的なステップが、単一の装置で行われ、容易に保管及び輸送できる安定した生成物を得ることができるため、特に有利な結果をもたらすことが現在見出されている。
【０００７】
本方法は、特に、固定化タンパク質が数百キログラムからトン単位の規模で生成される場合の、工業規模に非常に適している。
【０００８】
本発明による方法を使用することで、数多くのタンパク質を固定化することができる。具体的には、本方法は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ及びトランスフェラーゼなどの酵素を固定化するのに適している。
【０００９】
本方法は、ヒドロラーゼ、特にリパーゼを固定化するのによく適している。
【００１０】
リパーゼのうち、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼ、特にカンジダ・アンタークティカ由来リパーゼB(CALB; Candida antarctica lipase B)又は構造的にそれに由来するそのような酵素は、特に有効に固定化され得る。構造的にCALBに由来するそのようなリパーゼは、CALBポリペプチド配列と比較して、挿入、欠失又は置換など、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上のアミノ酸変異を有するリパーゼである。
【００１１】
構造的にCALBに由来するそのようなリパーゼの例としては、WO 2009/080676(「CALB変異タンパク質」)に記載されており、WO 2009/080676のCALB変異タンパク質に関する開示内容は、参照により明示的に組み込まれる。
【００１２】
固定化される酵素は、既知の方法により元の生物(original organism)から単離され得るか、又はバチルス(Bacillus)、大腸菌(E.coli)、ピキア(Pichia)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アスペルギルス(Aspergillus)及びサッカロマイセス(Saccharomyces)などの好適な宿主生物内で組換えDNA技術により生成され得る。
【００１３】
好適な支持体は、シリカゲル、活性炭又はポリマー支持体など、様々な有機又は無機材料である。好適なポリマー支持体は、100〜1000μmの粒子径及び10〜20nmの平均孔半径を有するマクロ多孔性架橋ポリマーである。特に好適なものは、ジビニルベンゼンで架橋されたポリ(メタ)アクリレートなどのマクロ多孔性架橋アクリレートポリマーであり、例えば、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸及びメタクリル酸エステルを含み得る。そのようなポリマーは、例えば、LanxessよりLewatit(登録商標)VP OC 1600の商品名又はDOWよりAmberlite(登録商標)XAD-7の商品名で販売されている。
【００１４】
好適な不連続接触真空ミキサー乾燥機は、文献(例えば、Friedrich Kneule,「Das Trocknen」[Drying], Sauerlaender AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941-0429-3))から当業者に知られている。特に有利なのは、真空回転式乾燥機(vacuum tumble dryer)又はダブルコーン乾燥機(double-cone dryer)の使用である。よく適しているのは、10リットル超、好ましくは100リットル超、好ましくは1立方メートル超の内容積をもつ回転式乾燥機である。
【００１５】
固定化されるタンパク質は、一般に緩衝液により、特定のpHに調節された水相中で支持体とインキュベートされる。
【００１６】
pHは、固定化される酵素の性質、主に酵素の等電点に左右される。3〜11、特に4〜8の範囲のpHが有利であることが立証されている。
【００１７】
4.8〜5.2の範囲のpHがCALBリパーゼに推奨される。
【００１８】
水相にとって好適な緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液及び酢酸緩衝液である。
【００１９】
インキュベーションは、一般に0℃〜40℃、特に4℃〜30℃の温度で行う。固定化する酵素が特に温度に対して耐性がある場合、50度を超える温度であっても好適であり得る。
【００２０】
インキュベーション後、酵素含有出発溶液を固定化酵素から分離する。これは、回転式乾燥機に取り付けられたふるい板を介したろ過により最も平易に行われる。固定化酵素は、引き続いて精製することができ、所望であれば洗浄ステップにおいて精製され得る。そのような洗浄ステップはまた、固定化酵素を洗浄液、一般には水と混合し、引き続いて、一体化したろ過ユニットを介して固定化酵素から分離することによって行われる。
【００２１】
引き続いて、固定化酵素は、移送なしで、さらに乾燥器内を1013mbar未満、好ましくは100mbar未満の減圧下に設定された不連続接触真空ミキサー乾燥機内で乾燥され得る。
【００２２】
ジャケット温度は、100℃未満、好ましくは65℃未満に調節し、ここで、生成物温度が50℃、好ましくは40℃を上回らないようにするべきである。
【００２３】
酵素の熱失活を回避するため、一般に、乾燥する固定化酵素の温度を50℃超に設定しないことが推奨される。ただし、特に、温度非感受性の酵素の場合には、50℃超で乾燥させてもよい。
【００２４】
上記の条件の下、乾燥時間は、典型的には10〜30時間、好ましくは15〜20時間である。
【００２５】
本目的は一般に、5%未満、好ましくは2%未満、特に好ましくは0.5〜1.5%の水分の残留水分含量を有する固定化生成物を提供することである。
【００２６】
生成物を過剰に乾燥させた場合、取扱いを一部妨害する静電荷がもたらされる。
【００２７】
本発明による方法を用いて生成された生成物は、起こり得る活性の著しい損失なく、室温で保管することが容易となる。さらに、取扱いが容易、すなわち容易に充填及び移送することができる。
【００２８】
以下の実施例で新規の方法をより詳細に記載する。
【００２９】
［実施例］
500kgスケールでのLewatit(登録商標)でのCALBの固定化
本方法で使用されるT0055回転式乾燥機は、以下の技術的なデータを有する:
容積:6.3m3
加熱表面:17m2
【００３０】
1.使用する原材料
以下の各成分が実験工程で必要とされる:
Lewatit(登録商標)VP OC 1600  湿性(Lanxess)[544kg]
リパーゼ限外ろ過液CALB-2012-01[タンパク質21kg]
脱塩水(洗浄ステップ3回分[3x2000L]
窒素ストリッピングガス(N2 stripping gas)[5〜20Nm3/h]
【００３１】
プロトコールに従って総量544kgの湿性Lewatitを充填するべきである。この544kgの湿性Lewatitは、約233kgの乾燥Lewatitに相当する。
【００３２】
タンパク質の比活性460TBU/mg及びリパーゼについて61%の純度が明らかである。
【００３３】
全体で21kgの酵素を固定化に使用する。
【００３４】
2.実験工程
回転式乾燥機へのLewatit(登録商標)の供給及び初回の洗浄ステップ
8時15分、Lewatitドラムを秤量した後、漏斗を介した回転式乾燥機への移送を開始した
合計で544.1kgの湿性Lewatit VP OC 1600を乾燥機内に入れて、混合サンプルをすべてのドラムから回収した
その後、2000Lの脱塩水(水量計を介して)を、流速80〜90l/分でチューブを介して、さらには漏斗を通じて乾燥機へ供給した
このような方法で、漏斗にLewatit残留物が残らなかった
8時55分、充填プロセスを完了した
乾燥機内部を観察することで、水がわずかに乳白色に変色し、いくらかのタンパク質性の泡が表面に形成されているのを確認することができた。
この時点で、ふるいユニット(160μm)はマンホールカバーに取り付けられていた(09:20)
その後、漏れ試験のために、乾燥機内を78.6mbarに脱気した
その後、真空を解放し、標準圧(1020mbar)に戻した(09:30)
その後、混合物を2時間、標準圧、室温及び0.33rpmで混合した(この目的のために、回転式乾燥機の駆動モーターを5.5Hz(0.33rpmに相当)に設定した後、手動で再計測した:1rev/2.43min=0.41rpm)
加熱槽をフル冷却に設定した
2時間の過程の後(11:26)、T0055を蓋で下向きにして配置し、IBCに組み込まれた160μmふるいを介して洗浄水をろ過した
ろ過は100〜200mbarの陽圧で行った
陽圧は窒素供給によって生じさせた
20L、1000L及び1700L後、それぞれの場合について、サンプルを採取した
単に視覚的に確認したところ、第1のサンプルはわずかに混濁していたものの、底には沈殿していなかった
一方、第2及び第3のサンプルは透明であった;光に対して小さな個々の懸濁粒子を視認することができた
合計1700Lの水を排出した(11:30〜12:25)
IBCを2時間静置させた
引き続いて、懸濁粒子が底に沈殿していたかどうかを調べたが;今回は該当しなかった
洗浄水で充填したIBCを秤量した
IBC 1:1003kg net
IBC 2:717kg net
その後、水をbbAへ排出した
【００３５】
第2の洗浄ステップ
マンホールを再度上向きに配置した
引き続いて、水2000L(2000kg)(すでに各1000Lの2つのIBCとしている)を800〜700mbar absで吸引した(12:40〜13:22)
充填プロセスを容器1個当たり約20分で行った
その後、混合物を、室温で標準圧の下、回転式乾燥機内で0.33rpm(5.5Hz)で2時間混合した
2時間の過程の後、マンホールを下向きに配置し、IBCに組み込まれた160μmふるいを介して洗浄水をろ過した
これを再度100〜200mbarの陽圧でろ過した
50L、1000L及び2000L後、それぞれの場合について、サンプルを採取した
合計で約2050Lの水を排出した
ろ過を容器1個当たり(すなわち1000Lにつき)約30分で行った
その後、洗浄水で充填したIBCを秤量した
IBC 1:1002kg net
IBC 2:1043kg net
その後、水をbbAへ排出した
その後、洗浄したLewatitのサンプルを抽出した
ここで、乾燥機の回転を停止させた後、フィルターケーキ(filter cake)が内壁にわずかにななめについていたことが明らかとなった
塊の形成を回避するため、回転式乾燥機を一晩、1時間ごとに1回回転させた
【００３６】
リパーゼ添加及び固定化
最初に、供給された冷却リパーゼドラムを再度秤量した
正味1749.6kgのリパーゼ
その後、各ドラムからサンプル2Lを取り出した(09:30〜09:50)
全部で9個のドラム(各200L)のリパーゼCALB-2012-01を回転式乾燥機に充填した
この目的のため、3個のドラムのそれぞれの内容物を乾燥機へ吸引した
この目的のため、300mbarの減圧をかけた
最初に、容器7、8、9を装填した(10:19〜10:32)
きわめて少量の酵素溶液のみがドラム内に残留していた
3個のドラムのそれぞれの内容物を添加した後、乾燥機を10分おきに0.33rpmで回転させた
引き続いて、容器3、2、1の内容物を吸引し(11:06〜11:23)、10分ごとに0.33rpmで回転させた
最後に、容器6、5、4の内容物を吸引した(11:52〜12:07)
12時20分から13時00分まで、ドラムを200mbar abs及び0.33rpmで回転させた
13時00分、回転式乾燥機を900mbar absに脱気した
引き続き、13時15分まで内容物をさらに100〜200mbarの減圧で混合した
ここで内部温度は20℃であった;したがって24℃に設定した冷却はオフにした
その後、100〜200mbarのわずかな陽圧を乾燥機にかけた
このような条件下で、乾燥機を0.33rpmで15時間稼働した
1時間ごとに圧力及び温度を記録した
最初の3時間が経過した後(15:15)、第1のサンプル(250ml)を固定化物(immobilizate)の上澄みを採取し、8〜14℃で冷蔵で保管した
全体で、固定化から3、5、7、9、12及び15時間後にサンプルを採取した
15時間後、乾燥機のスイッチをオフにし、(翌日7時00分まで)1時間ごとに1回(1回転)だけ回転させた
【００３７】
固定化後の酵素-Lewatit溶液のろ過
7時00分、再度乾燥機を回転させ、マンホールカバーを下向きにして配置した
乾燥機内におよそ100mbarの陽圧をかけた
その後、母液を160μmふるいを通してIBCへ流し出した(07:10〜08:20)
約300L後、第1のサンプルをガラスフラスコに取り出した
ここで、サンプルの混濁が増し、色も前日と比べてかなりの同程度濃緑色であるとはいえず、泡立っていたことに気付いた
したがって、当該サンプルは、場合によっては、前日と比べてより透明(brighter)且つ混濁(cloudy)し、もはや臭いも異なっていた(ブタン酸の)
約900L後、第2のサンプルを同様にガラスフラスコに取り出した
IBCへの充填の際、母液が著しく泡立ったことから、第1のIBCには900Lの母液を充填することのみ可能であった
その後、最初に、第2のIBCを窒素でパージし、同様に約700Lの母液で満たした
このため、栓を閉めて10分間放置し、母液が底に沈殿する時間を設けた
その後、母液の残りをIBCに加えた
ここで、第3のサンプルをガラスフラスコに取り出した
終わりに、第2のIBCを総量750Lの母液で満たした
最後に、両方のIBCを秤量した
IBC 1+2=1683kg net
【００３８】
固定化リパーゼの洗浄
母液を排出した後、最初に、回転式乾燥機を再度1回回転させ、スライドを上向きにして配置した
その後、湿性の未洗浄の固定化物のサンプルを、スライドを介して採取した
固定化物が再度乾燥機の側面から落ちた
固定化物は淡緑色の色合いを有していた
その後、マンホールカバーが上向きになるように乾燥機を再度回転させた
乾燥器内に約300mbarの減圧をかけた
その後、2000Lの脱塩水(2つのIBCにビンづめしたもの)を回転式乾燥機へ吸引した(08:55〜09:30)
その後、0.33rpm、室温、標準圧下で2時間混合
2時間後、マンホールカバーを下向きに配置した
400〜580mbarの陽圧を乾燥機内にかけ、洗浄水をIBCへ排出した(11:45〜13:15)
第1のサンプルを50L後、第2のサンプルを1000L後及び第3のサンプルを1825L後に採取した
いずれのサンプルもわずかに混濁した緑がかった色をしていた;しかし、沈降物はみられなかった
サンプル間で大きな差異はみられなかった
約1750Lの洗浄水を排出した後、最初に混合物を窒素でパージした
約1850Lの洗浄水を排出した後、きわめて大量の窒素をパージしてから、第3のIBCを外側に配置し、ラインを外側に加えた
水の全量を効果的にろ過するために、今度は900mbarの陽圧を乾燥機内にかけた
この圧力で、混合物を15分間吹付けを行って乾燥させた(終了時に、窒素のみがラインから外に出て、時折洗浄水の滴下)
引き続いて、IBCを秤量した
IBC 1+2=1921kg net
その後、固形物のサンプル1Lをマンホールを介して採取した
このサンプルもまた、非常に淡い緑がかった色をしていた(しかし、以前に採取した固形サンプルほど目立つものではなかった)
【００３９】
真空乾燥
最初に回転式乾燥機を0.33rpmの回転下で脱気した
その後、回転を段階的に2.4rpmに上げた(1/1.5/2.0/2.4rpm)
乾燥機は外から判断したところ非常に静かであったが、これはつまり、固定化物が乾燥機壁から均一にスライド(スリップ)していた(したがって、この時点では、比較的大きな塊は形成されていなかった)ことを示唆する
14時20分、加熱を50度に設定した
17時30分、再度閉鎖し、代わりに窒素の除去を25m3/時間で維持した
2時15分、第1のサンプルを採取できるように、冷却を調節した
2時間の冷却時間の後、4時15分、固定化物の第1のサンプルを採取した
内部温度が39.3℃から23℃に低下した
残留水分の定量のため、会社内の研究室にサンプルを持ち込んだ
105℃/60分での残留水分定量:35.76%
8時25分、スライドを下向きにして乾燥機を配置し、5分間放置し、温度を測定した
内部温度は、回転式乾燥機が回転しているかどうか又は計測センサーが固形物に浸漬しているかどうかにより、温度に5℃の差異があった
13時45分、第2のサンプルを採取できるように、冷却を調節した
30分の冷却時間の後、サンプルを採取した
ここで、固定化物の白色ビーズの間に微小の暗(褐色)粒子が存在していることに気付いた
その後、会社内の研究室で残留水分を定量した
105℃/60分での残留水分定量:9.72%
その後、サンプルを冷蔵庫に保管した
17時28分、内部温度が46℃まで上昇した。槽を50度に設定
17時47分、内部温度が45.5℃に戻った。槽を53度に設定
18時00分、冷却を開始した
19時00分〜19時20分、残留水分を定量するため、サンプルを採取し、会社内の研究室にサンプルを持ち込んだ
105℃/60分での残留水分定量:1.4%
残留水分が目標値である3%未満であったことから、乾燥を終了した
20時30分、真空を解放した
ここで、温度が25℃から31.7℃まで上昇した
20時50分、内部温度が25.8℃でドライブのスイッチをオフにした
以降、乾燥機を2時間ごとに1回回転させた
【００４０】
ビンづめ
スライドを下向きにして乾燥機を配置した
その後、ふるいユニットを再度取り外した
ふるいにわずかな生成物の残留物
ビンづめ工程のためマンホールカバーを一部開口しておいた
ニブラー/アダプター搭載
その後、乾燥機を約2.4m3/hの窒素で不活性化する
Big Bag No.67291120をろ過装置に吊るし、窒素でパージし、接地した
充填装置を半分開口して排出
手動での流出により、最初は生成物を慎重に排出させる;後の段階でおよそ中間位置まで回転させた
固定化物は、フィルム上に又は乾燥機内に残留することなく、吊るしたBig Bag中に難なく散在した
Big Bagはまた、幾分より多くの生成物が短時間に外に排出した時、1回だけきわめて短時間の間に膨張した
なおも回転式乾燥機内に残っていた残留物は、その後排出した
全般に、回転式乾燥機内に主な残留物は残っていなかった(約DIN A3サイズの3か所のみ、おそらく2mm厚の層が形成されていた;他の点では、乾燥機の内壁は非常に微細な粉塵層で覆われていたのみであった)
別の1LのサンプルをBig Bagからプラスチック製フラスコに採取した
最後に、Big Bagを再度秤量し、引き続いて乾燥保管した
風袋: 25kg
総量: 271kg
充填工程自体は、約5分間を要したのみであった(調製の工程と合わせて、約20分間であった)
【００４１】
3. 分析結果
開始時に理論絶対活性度(theoretical absolute activity)の9 460 000 000TBUを算出した
【００４２】
【表１】
2016540515.tif 000002
2016540515.tif 000003
【００４３】
96.3%の固定化効率を達成した。
【００４４】
【表２】
2016540515.tif 000004
【００４５】
ビンづめ製品の残留水分含量
赤外バランスを用いて、充填済みBig Bagから抜き出したサンプルの平均乾燥含量の三つ組の測定値を求めた。
【００４６】
測定により次の結果が得られた(赤外バランス、エンドポイント:30秒のスケール安定性、三つ組の測定値:5.3g/9.3g/4.6g):
【００４７】
充填済み製品の平均乾燥含量は99.11%である。
【００４８】
これは、つまり残留水分含量0.89%に相当する。
【国際調査報告】
2016540515.tif 000005
2016540515.tif 000006
2016540515.tif 000007
2016540515.tif 000008