(57)【要約】  本発明は、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法に関するものである。本発明は、このために、フィブリノゲンとアプロチニンを用いて第１物質を混合するステップ、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを用いて第２物質を混合するステップ、及び第１物質と第２物質とを相互に混合して第３物質を製造するステップが含まれる。前記のように構成された本発明は、現在市販されているフィブリンシーラントの短所である強度と分解性を補完すると共に、細胞親和的で、かつ血液内に含まれている血小板を活性化させて組織再生を誘導できるようにしたものであり、これによって、製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、ユーザである消費者の多様な欲求（ニーズ）を満たして良いイメージを植え付けることができるようにしたものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンとアプロチニンを混合して第１物質を製造するステップと、
トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを混合して第２物質を製造するステップと、
前記第１物質と第２物質とを相互に混合して第３物質を製造するステップと、
が含まれることを特徴とする、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法。
【請求項２】
前記フィブリノゲンの濃度は６５〜１３０ｍｇ／ｍＬ、アプロチニンの濃度は１，０００〜３、０００ＫＩＵ／ｍＬであり、
前記トロンビンの濃度は４０〜６００Ｕ／ｍｌ、塩化カルシウムの濃度は４〜１４０ｍｍｏｌ／ｍＬ、コラーゲンの濃度は６０ｍｇ／ｍＬ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法。
【請求項３】
前記コラーゲンの濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法。
【請求項４】
コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法は、フィブリノゲンとアプロチニンが備えられた第１物質を用意するステップ、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンが備えられた第２物質を用意するステップ、第１物質はデュアルキット（Two-way syringe）の一側に入れて、第２物質はデュアルキット（Two-way syringe）の他側に入れた後、相互に第１及び第２物質を混合するステップが含まれることを特徴とする、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法。
【請求項５】
前記フィブリノゲンとトロンビンにアプロチニンとカルシウム溶液を各々注入し、トロンビンにはコラーゲン溶液を混合してデュアルキットに装着することを特徴とする、請求項４に記載のコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法。
【請求項６】
請求項１から５のうち、いずれか一項の製造方法により製造されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法に関し、より詳しくは、現在市販されているフィブリンシーラントの短所である強度と分解性を補完すると共に、細胞親和的で、かつ血液内に含まれている血小板を活性化させて組織再生を誘導できるようにしたものであり、これによって、製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、ユーザである消費者の多様な欲求（ニーズ）を満たして良いイメージを植え付けることができるようにしたものである。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、医療用シーラントは外科用粘着、接着、及び止血に至るまで多様な分野に適用されており、長い間の歴史を持っている。医療用シーラント材質は人体組織に直接的に適用されるので、生体に適合した物質が使われなければならず、本質的に体液や血液に流入することがあるので、より厳密な生体適合し、生分解物質が使われなければならず、滅菌可能で、かつ毒性や危害が表れてはならない。また、シーラントは組織内に適用された以後にも生体組織との親和度が高くて元の組織で再生を妨害しない材料を選定することが重要である。
【０００３】
現在シーラントの材料には、シアノアクリレート、ポリウレタン、ゼラチン、フィブリンなどを用いて製品に適用している。一般的に、医療用シーラントは皮膚、血管、消化器、脳神経、成形外科、整形外科などの多様な領域で使われている。このようなシーラントに要求される特性は、水分環境での迅速な接着力、滅菌可能で無毒性、創傷面での充分の機械的物性、生分解性、止血効果、及び生体治癒に妨害されてはならない。
【０００４】
シアノアクリレートは主に工業用に使われている物質であって、医療用には５％以下に使われるが、縫合糸代替可能性のため、先進国中心の研究が活発に進められている。しかしながら、適用後に衝撃に弱くて、耐熱性、耐水性が落ちる短所と、一部の組織毒性と脆弱性の問題のため、現在制限的に使われている。
【０００５】
ポリウレタンは接着部の柔軟性が維持される長所を有する物質であって、水との反応性が良くて、速く硬化し、硬化物質が弾性を維持する長所がある。一方、合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性があるという短所がある。
【０００６】
ゼラチンを用いたグルーは生体由来シーラントであって、ゼラチンとレゾルシノールをホルマリンに架橋させた製品と、ゼラチンとポリグルタミン酸とカルボジイミドを用いた製品がある。この製品は、ホルマリンとカルボジイミドの化学的架橋剤を使用して毒性を出すことができる。ホルマリンを架橋剤として使用する製品の場合、一部の国家では使われているが、日本などにはまだ認許が進行中であり、有効性などの検討が進行中である。
【０００７】
フィブリングルーは、フィブリノゲン、トロンビン、塩化カルシウムなどを材料にして、フィブリン形成の原理を用いて製品に適用した製品である。接着が速くて熱や圧力が不要であり、接着部位の環境にあまり影響を受けず、生体適合し、生分解特性などの生物学的長所を有する一方、合成物質を用いたシーラントと比較して物理的特性が不足して、生分解速度が相対的に速いという短所がある。このような短所を克服するためにフィブリン重合体の分解速度を遅くし、形態を維持させるためにアプロチニンを添加してフィブリン分解酵素を阻害させる努力をしている。このような短所を補完するために、コラーゲンを添加物質として使用することはフィブリングルー製剤の補完に大きく寄与する。
【０００８】
フィブリングルーに使われるフィブリンは、天然材料の接着剤／止血剤として応用されて産業化されており、生体適合性及び生分解性を有する。フィブリンは数週内に一般的に傷の治癒過程で吸収され、炎症反応、免疫反応、組織壊死、または繊維肥大症などの副作用がないことと知られている。また、フィブリンは繊維芽細胞のための天然支持体などの形態で傷の治療に重要な役割を担当する。フィブリン製品は１９７０年代に概念が定立されて１９８２年ヨーロッパで最初の製品が商業化されて現在まで使われている。最近、多くの研究でフィブリンを生体組織工学的支持体として立証されており、整形外科、歯科、神経外科など、多様な分野に適用されている。
【０００９】
フィブリングルーの短所を補完するために添加物質として使用できるコラーゲンは構造蛋白質成分である。真皮（dermis）、腱／筋（tendon/ligament）、血管などの軟組織、
そして、骨、軟骨のような硬組織から構成され、哺乳類の場合、全体蛋白質の約１／３程度を占めている。コラーゲンの形態は２０種類以上が知られており、皮膚や腱／筋、骨などを構成するコラーゲンtype Iがコラーゲンのうちの９０％程度を占めている。コラーゲンの構造は３本から構成された分子量（molecular weight）３００，０００ダルトン（Dalton）（１本１００，０００Dalton程度）の蛋白質であり、アミノ酸のうち、最も小さな単位（分子量が最も小さな）であるGlycineが反復的に（−ＧＸＹ−；Glycineは続けて反復的に、Ｘ、Ｙは変わる構成）連結されている。したがって、Glycineがコラーゲンを構
成するアミノ酸で約１／３を占めている。コラーゲンを現在医療用に使用している分野は、止血剤、創傷被覆剤、人工血管、シワ改善用などに使われており、止血剤の場合には１９７４年子牛の皮（calf skin）から抽出したコラーゲン粉末形態であるアビデン（Aviten）という製品が最初に開発されて現在までも使われている。
【００１０】
何よりもコラーゲンを医療再生分野に使用する一番の特徴は、人体組織に生体適合して細胞親和性を示す物質であるので、細胞の付着と増殖、そして生存力維持に重要な物質ということである。また、血液内に含まれている血小板を刺激して血小板内に含まれている増殖因子を誘導して欠損した組織を再生する役割をする。それだけでなく、コラーゲンの構造は、三重螺旋構造は単一構造の蛋白質より相対的に分解性が維持されて人体内でスカフォールドの役割をすることができる。
【００１１】
このような物質の結合は、基本的に組織シーラントが有するべき生分解性特性を有し、再生を妨害しない特性を維持するだけでなく、フィブリングルーの足りない物性である物理的特性を補完し、分解程度を遅らせて分解性の再生骨格を提供する。それで、単純シーラントとして役割に加えて組織再生を促進し、再生過程を加速して治療過程を短縮させる。そして、速かに使用するためにプレフィルドタイプで装着して冷凍保管する剤形も可能である。
【００１２】
組織シーラントは、傷の手術部位の縫合、塗布する場合、従来の方法より少ない苦痛と、感染危険が少なく、手術時間が短縮されるなど、患者の施術的負担を減らし、満足度を極大化する製品であって、この分野に大きく脚光を浴びるものであり、市場規模も徐々に拡大されている。また、このような製品の開発は組織の再生を助けるだけでなく、今後、薬物伝達システム及び再生用スカフォールドなどに使用して、再生医学分野にも大きく寄与する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】大韓民国公開特許第２０１２−０１２５４６５号（出願番号第２０１２−７０１８１０９号）（名称：乾燥粉末フィブリンシーラント）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記のような従来技術の諸問題点を解消するために案出したものであって、フィブリノゲンとアプロチニンを用いて第１物質を混合するステップと、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを用いて第２物質を混合するステップ、及び第１物質と第２物質とを相互混合して第３物質を製造するステップが含まれることを第１目的としたものであり、上記の技術的構成による本発明の第２目的は、物理的強度を比較した結果、コラーゲンが含まれたシーラントが高い強度を示すことを確認したものであり、第３の目的は、長期／短期分解性試験結果、コラーゲンが含まれたシーラントが分解されることが低いことを示すことを確認したものであり、第４の目的は、電子顕微鏡観察を通じてコラーゲンとフィブリンとが結合されて安定した構造を示すことを確認したものであり、第５の目的は、軟骨細胞、骨細胞、脂肪抽出細胞を用いて増殖及び生存力を比較した結果、コラーゲンが含まれた構造で増殖率が良かったし、高い生存力を示すことを確認したものであり、第６の目的は、コラーゲンが含まれれば高い強度と安定した構造の維持、及び細胞／血液親和的な物質が供給されて、欠損／損傷部位の再生に大きい助けになるということを確認したものであり、第７の目的は、血液内に含まれている血小板を活性化させて組織再生を誘導できるようにしたものであり、第８の目的は、これによって製品の品質と信頼性を格段に向上させるので、ユーザである消費者の多様な欲求（ニーズ）を満たして、良いイメージを植え付けることができるようにしたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
このような目的の達成のために、本発明はフィブリノゲンとアプロチニンを混合して第１物質を製造するステップ、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを混合して第２物質を製造するステップ、及び第１物質と第２物質とを相互混合して第３物質を製造するステップが含まれることを特徴とする、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法を提供する。
【００１６】
また、本発明はフィブリノゲンとアプロチニンを用いて第１物質を混合するステップ、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを用いて第２物質を混合するステップ、及び第１物質と第２物質とを相互混合して第３物質を製造するステップを経てコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
前述したように、本発明はフィブリノゲンとアプロチニンを用いて第１物質を混合するステップ、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを用いて第２物質を混合するステップ、及び第１物質と第２物質とを相互混合して第３物質を製造するステップが含まれる。
【００１８】
上記の技術的構成による本発明は、物理的強度を比較した結果、コラーゲンが含まれたシーラントが高い強度を示すことを確認した。
【００１９】
そして、本発明は長期／短期分解性を試験した結果、コラーゲンが含まれたシーラントが分解されることが低いことを確認した。
【００２０】
また、本発明は電子顕微鏡観察を通じてコラーゲンとフィブリンとが結合されて安定した構造を示すことを確認した。
【００２１】
そして、本発明は軟骨細胞、骨細胞、脂肪抽出細胞を用いて増殖及び生存力を比較した結果、コラーゲンが含まれた構造で増殖率が良かったし、高い生存力を示すことを確認した。
【００２２】
併せて、本発明はコラーゲンが含まれれば高い強度と安定した構造の維持、及び細胞／血液親和的な物質が供給されて欠損／損傷部位の再生に大きい助けになるということを確認した。
【００２３】
また、本発明は血液内に含まれている血小板を活性化させて組織再生を誘導できるようにしたものである。
【００２４】
本発明は、上記の効果により製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、ユーザである消費者の多様な欲求（ニーズ）を満たして、良いイメージを植え付けることができるようにした非常に有用な発明である。
【００２５】
以下、このような効果達成のための本発明の好ましい実施形態を添付の図面によって詳細に説明すると、次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの図面代用電子顕微鏡写真（２０，０００Ｘ、臨界点乾燥）である。
【図２】本発明のコラーゲンと細胞との結合を示す概念図である。
【図３】本発明のコラーゲンの血小板活性化を示す概念図である。
【図４】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの分解度比較グラフである。
【図５】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント内での軟骨細胞増殖率グラフである。
【図６】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント内での軟骨細胞増殖及び生存率確認の図面代用写真である。
【図７】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント内での骨細胞増殖率グラフである。
【図８】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント内での骨細胞増殖及び生存率確認の図面代用写真である。
【図９】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント内での脂肪抽出細胞増殖及び生存率確認の図面代用写真である。
【図１０】本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントをデュアル装置に装着した状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に適用されたコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法は、図１から図１０に示すように構成される。
【００２８】
以下、本発明を説明するに当たって、関連した公知機能または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を曖昧にすることがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
【００２９】
そして、後述する用語は本発明での機能を考慮して設定された用語であって、これは生産者の意図または慣例によって変わることがあるので、その定義は本明細書の全般に亘る内容に基づいて下さなければならない。
【００３０】
まず、本発明はフィブリノゲンとアプロチニンを用いて第１物質を混合するステップが備えられる。
【００３１】
そして、本発明はトロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンを用いて第２物質を混合するステップが備えられる。
【００３２】
また、本発明は第１物質と第２物質とを相互混合して第３物質を製造するステップが備えられて、コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを製造するようになる。
【００３３】
特に、本発明に適用された上記フィブリノゲンの濃度は６５〜１３０ｍｇ／ｍＬ、アプロチニンの濃度は１，０００〜３，０００ＫＩＵ／ｍＬからなることが好ましい。
【００３４】
そして、上記トロンビンの濃度は４０〜６００Ｕ／ｍｌ、塩化カルシウムの濃度は４〜１４０ｍｍｏｌ／ｍＬ、コラーゲンの濃度は６０ｍｇ／ｍＬ以下からなることが好ましい。
【００３５】
この際、上記フィブリノゲンの好ましい濃度は６５〜１３０ｍｇ／ｍＬであり、これはフィブリノゲンが６５ｍｇ／ｍＬ以下の場合には物理的強度が弱くなり、フィブリノゲンが１３０ｍｇ／ｍＬ以上の場合には物理的構造が稠密になって、空隙のサイズが小さくなって、細胞の活性を阻害させることがあるので、上記フィブリノゲンの濃度は６５〜１３０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【００３６】
また、上記アプロチニンの好ましい濃度は１，０００〜３，０００ＫＩＵ／ｍＬであり、これはアプロチニンが１，０００ＫＩＵ／ｍＬ以下の場合には組成物の分解が速く進行され、アプロチニンが３，０００ＫＩＵ／ｍＬ以上の場合にはアナフィラキシーを誘発する危険性が増加するため、上記アプロチニンの濃度は１，０００〜３，０００ＫＩＵ／ｍＬが好ましい。
【００３７】
また、上記トロンビンの好ましい濃度は４０〜６００Ｕ／ｍｌであり、これはトロンビンが４０Ｕ／ｍｌ以下の場合には組成物の物理的強度が弱くなり、トロンビンが６００Ｕ／ｍｌ以上の場合には組成物の構造が稠密になって細胞親和的でなく、ゲル化速度が急激に速くなって適用部位にシーラントとして役割できない可能性があるため、上記トロンビンの濃度は４０〜６００Ｕ／ｍｌが好ましい。
【００３８】
また、上記塩化カルシウムの好ましい濃度は４〜１４０ｍｍｏｌ／ｍＬであり、これは塩化カルシウムが４ｍｍｏｌ／ｍＬ以下の場合にはゲル化速度があまりに遅く、塩化カルシウムが１４０ｍｍｏｌ／ｍＬ以上の場合には高い浸透圧の影響により細胞によくない影響を及ぼすことがあるので、上記塩化カルシウムの濃度は４〜１４０ｍｍｏｌ／ｍＬが好ましい。
【００３９】
最後に、上記コラーゲンの濃度は６０ｍｇ／ｍＬ以下からなることが好ましく、特に、上記コラーゲンの好ましい濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍＬからなることが好ましい。
【００４０】
即ち、上記コラーゲンが１０ｍｇ／ｍＬ以下の場合には物理的強度が弱くなり、コラーゲンが３０ｍｇ／ｍＬ以上の場合には分解性と安定した構造維持及び細胞血液内親和的でないので、上記コラーゲンの濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍＬからなることが好ましい。
【００４１】
一方、本発明に適用された上記コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントの製造方法をより具体的に説明すると、次の通りである。
【００４２】
まず、フィブリノゲンとアプロチニンとが備えられた第１物質を用意するステップを経る。
【００４３】
以後、トロンビンと塩化カルシウム及びコラーゲンが備えられた第２物質を用意するステップを経る。
【００４４】
次に、上記第１物質はデュアルキット（Two-way syringe）の一側に入れて、第２物質
はデュアルキット（Two-way syringe）の他側に入れた後、相互に第１及び第２物質を混
合するステップを経てコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを製造するようになる。
【００４５】
加えて、本発明は上記フィブリノゲンとトロンビンにアプロチニンとカルシウム溶液を各々注入し、トロンビンにはコラーゲン溶液を混合してデュアルキットに装着してコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを製造するようになる。
【００４６】
本発明は、上記のコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを製造する各ステップを経てコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラントを製造できるようになる。
【００４７】
上記の本願発明コラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法を実施形態を挙げて説明すると、次の通りである。
【００４８】
（実施形態１）
本発明と従来技術との物性比較
本発明の物理的特性を確認するために物性測定機を用いて最大応力、ジェル強度、引張強度などを確認した。
【００４９】
１．試料用意
１）従来技術はグリーンプラスト製品を使用した。
２）本発明の構成物はグリーンプラストのフィブリノゲンとトロンビン乾燥物にアプロチニン溶液とカルシウム溶液を各々注入して溶解させ、トロンビン溶液には３％コラーゲン溶液を混合してデュアルキットに装着して用意する。
３）物性の測定のために各々試料を円柱形態（Φ１２Ｘ１５ｍｍ）の鋳型に入れて形態を製作する。
【００５０】
２．物性測定
１）物性測定機：レオメータ（Rheometer）（CR-500DＸ、Sun scientific rheometer）
２）試験項目：最大応力（Ｎ）、ジェル強度（ｇ−ｃｍ）、引張強度（ｃ／ｃｍ２）
３）試験条件：進入距離（７．５ｍｍ）、テーブルスピード（５０ｍｍ／ｍｉｎ）、最大応力（１０ｋｇ）、アダプター（Ｎｏ．１ Φ２０ｍｍ）
【００５１】
３．試験結果
【表１】
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【００５２】
（実施形態２）
本発明と引用発明製品との分解性比較（短期／長期）
本発明の組成物の分解性を確認するために、フィブリングルー製品と一定期間の間物質の分解程度を確認する。
【００５３】
１．分解性（短期）
１）試料用意
−従来技術はグリーンプラスト製品を使用した。
−本発明の構成物はグリーンプラストのフィブリノゲンとトロンビン乾燥物にアプロチニン溶液とカルシウム溶液を各々注入して溶解させ、トロンビン溶液には３％コラーゲン溶液を混合してデュアルキットに装着して用意する。
−物性の測定のために各々試料を円柱形態（Φ８Ｘ５ｍｍ）の鋳型に入れて形態を製作する。
【００５４】
２）分解性確認のための処理条件
−溶媒は２つ条件を確認した。ＤＭＥＭ培地のみを使用した条件とリベラーゼ  ＴＭ(Liberase TM)が含まれたＤＭＥＭ培地を使用した条件で確認した。（Liberase TMの濃度は１０ｕｇ／ｍＬとする。）
−試料は１２ウエルプレート(well plate)に入れて１２時間の間２時間単位で組成物の残存重さにて分解性様相を確認する。
【００５５】
３）試験結果
−酵素処理した分解条件では従来技術の剤形が１２時間内に９０％以上の分解を確認したものであり、本発明の組成物は１２時間の間８０％位残留されることを確認することができる。ＤＭＥＭ条件では１２時間の間は分解程度を確認できなかった。
【００５６】
２．分解性（長期）
１）試料用意
−従来技術はグリーンプラスト製品を使用した。
−本発明の構成物はグリーンプラストのフィブリノゲンとトロンビン乾燥物にアプロチニン溶液とカルシウム溶液を各々注入して溶解させ、トロンビン溶液には３％コラーゲン溶液を混合してデュアルキットに装着して用意する。
−物性測定のために、各々試料を円柱形態（Φ１２Ｘ１５ｍｍ）の鋳型に入れて形態を製作する。
【００５７】
２）分解性確認のための処理条件
−溶媒はＤＭＥＭを使用し、３７℃条件で１ヶ月間肉眼観察する。
【００５８】
３）試験結果
−本発明の組成物は１ヶ月以上観察されるが、従来技術の剤形は３週内に分解された。本発明の組成物が従来技術の剤形より分解期間が長いことが確認された。
【００５９】
（実施形態３）
本発明の電子顕微鏡分析
本発明組成物の構造を電子顕微鏡で観察する。
【００６０】
１．試料用意
−組成物の製造はグリーンプラストのフィブリノゲン溶液とコラーゲンとが含まれたトロンビン／カルシウム溶液に各々用意する。コラーゲン溶液の濃度は３％（ｗ／ｖ）適用する。
−用意された各々の溶液はデュアルキットに適用して電子顕微鏡観察のためのトレーに分周してゲル化させる。
【００６１】
２．実験方法
−本発明の組成物は臨界点乾燥させた後、電子顕微鏡観察する。
−組成物の臨界点乾燥はアルコール処理を通じて進行し、臨界点乾燥器（Hitachi、Ｈ
ＣＰ−２）で進行する。
−電子顕微鏡で観察するための試料は検体切断してゴールドコーティングを実施した後、ＳＥＭ（Hitachi、Ｓ３５００）で観察する。
−電子顕微鏡分析は２万倍拡大して観察した。
【００６２】
３．試験結果
電子顕微鏡で２万倍拡大して観察した結果、コラーゲンとフィブリン成分が互いに交差して架橋される様相が確認された。コラーゲンの繊維構造も観察された。このような物質の交差を通じて物理的特性が補強されることを予想することができる。
【００６３】
（実施形態４）
本発明の細胞適合性及び増殖確認試験（軟骨細胞）
本発明の組成物内で軟骨細胞の増殖（proliferation）と生存率（viability）の様相を確認するために、CCK-8 アッセイ(assay)及びカルセイン-AM及びEthD-1 染色 (Calcein-AM & EthD-1 staining)を用いた。
【００６４】
１．細胞及び組成物
−細胞は人間を除外した動物の軟骨細胞を使用した。細胞数は組成物混合液内の１，２００万個を適用した。
−組成物はフィブリングルー製品であるグリーンプラストとコラーゲンを各々３％、６％コラーゲンを混合して構成した。
−組成物の製造はグリーンプラストのフィブリノゲン乾燥物に軟骨細胞が含まれた溶液１ｍＬを適用して溶解させ、トロンビン／カルシウム溶液に各々濃度のコラーゲン溶液１ｍＬを混合した。
−軟骨細胞が含まれたフィブリノゲン溶液とコラーゲンが含まれたトロンビン溶液は総２ｍＬのコラーゲン−フィブリン溶液が用意される。
−用意されたコラーゲン−フィブリン構成物は培養のために２４well plateに０．２ｍＬずつ分周し、２−３日毎にＤＭＥＭ培地を取り替えながら２０日間観察する。
【００６５】
２．CCK-8 アッセイ(assay)
−培養物が盛られたウエル(well)（２４well plate）の培地を除去する。
−新たな培地１ｍＬを入れる。
−ＣＣＫ−８（Dojindo、ＣＫ０４−１１）試薬を培地容量の１０％である１００ｕＬ
ずつ各々wellに添加した後、５％ＣＯ2培養器で３７℃条件で３時間の間反応させる。
−反応が完了すれば、反応液をマイクロプレートリーダー(microplate reader)で吸光
度（４５０ｎｍ）を測定する。
−測定されたＯＤ値を用いて培養期間別の細胞増殖(cell proliferation)を確認する。
【００６６】
３．カルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM & EthD-1 staining)
−生/死 生存率/細胞毒性アッセイキット(The LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit)（Invitrogen、Ｌ３２２４）のカルセイン-AM (Calcein AM)とEthD-1を各々２μ
Ｍ、４μＭになるように緩衝溶液に混合して標準溶液(working solution)を作る。
−培養物を新たな２４ウエルプレート(well plate)に移して、標準溶液(working solution) １ｍＬを入れて光が遮断された状態で２０分間反応させた後、蛍光顕微鏡で生細胞(live cell)と死細胞(dead cell)を観察する。生きている細胞は黄緑で、死んだ細胞は赤
色で観察される。
【００６７】
４．試験結果
イ．CCK-8 アッセイ(assay)（図５）
ロ．カルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM & EthD-1 staining)（図６）
【００６８】
（実施形態５）
本発明の細胞適合性試験（骨細胞）
本発明の組成物内で骨細胞の増殖（proliferation）と生存率（viability）の様相を確認するために、CCK-8 アッセイ(assay)、及びカルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM
& EthD-1 staining)を用いた。
【００６９】
１．細胞及び組成物
−細胞は人間を除外した動物の骨細胞を使用した。細胞数は組成物混合液内の１，２００万個を適用した。
−組成物はフィブリングルー製品であるグリーンプラストとコラーゲンを各々３％、６％コラーゲンを混合して構成した。
−組成物の製造はグリーンプラストのフィブリノゲン乾燥物に軟骨細胞が含まれた溶液１ｍＬを適用して溶解させ、トロンビン／カルシウム溶液に各々濃度のコラーゲン溶液１ｍＬを混合した。
−骨細胞が含まれたフィブリノゲン溶液とコラーゲンが含まれたトロンビン溶液は総２ｍＬのコラーゲン−フィブリン溶液が用意される。
−用意されたコラーゲン−フィブリン構成物は培養のために２４well plateに０．２ｍＬずつ分周し、２−３日毎にα−ＭＥＭ培地を取り替えながら２０日間観察する。
【００７０】
２．CCK-8アッセイ (assay)
−培養物が盛られたwell（２４well plate）の培地を除去する。
−新たな培地１ｍＬを入れる。
−ＣＣＫ−８（Dojindo、ＣＫ０４−１１）試薬を培地容量の１０％である１００ｕＬ
ずつ各々wellに添加した後、５％ＣＯ2培養器で３７℃条件で３時間の間反応させる。
−反応が完了すれば、反応液をマイクロプレートリーダー(microplate reader)で吸光
度（４５０ｎｍ）を測定する。
−測定されたＯＤ値を用いて培養期間別の細胞増殖(cell proliferation)を確認する。
【００７１】
３．カルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM & EthD-1 staining)
−生/死 生存率/細胞毒性アッセイキット(The LIVE/DEAD Viability / Cytotoxicity Assay Kit)（Invitrogen、Ｌ３２２４）のCalcein AMとEthD-1が各々２μＭ、４μＭにな
るように緩衝溶液に混合して標準溶液(working solution)を作る。
−培養物を新たな２４ウエルプレート(well plate)に移して、標準溶液(working solution) １ｍＬを入れて、光が遮断された状態で２０分間反応させた後、蛍光顕微鏡で生細
胞(live cell)と死細胞(dead cell)を観察する。
【００７２】
４．試験結果
イ．CCK-8アッセイ (assay) （図７）
ロ．カルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM & EthD-1 staining)(図８）
【００７３】
（実施形態６）
本発明の細胞適合性試験（脂肪抽出細胞）
本発明の組成物内で脂肪抽出細胞の増殖（proliferation）と生存率（viability）の様相を確認するために、CCK-8 アッセイ(assay)及びカルセイン-AM及びEthD-1 染色(Calcein-AM & EthD-1 staining)を用いた。
【００７４】
１．細胞及び組成物
−細胞は脂肪から抽出された細胞を使用した。細胞数は組成物混合液内の１，２００万個を適用した。
−組成物はフィブリングルー製品であるグリーンプラストとコラーゲンを各々３％コラーゲンを混合して構成した。
−組成物の製造はグリーンプラストのフィブリノゲン乾燥物に軟骨細胞が含まれた溶液１ｍＬを適用して溶解させ、トロンビン／カルシウム溶液に各々濃度のコラーゲン溶液１ｍＬを混合した。
−脂肪抽出細胞が含まれたフィブリノゲン溶液とコラーゲンが含まれたトロンビン溶液は総２ｍＬのコラーゲン−フィブリン溶液が用意される。
−用意されたコラーゲン−フィブリン構成物は培養のために２４well plateに０．２ｍＬずつ分周し、２−３日毎にＤＭＥＭ培地を取り替えながら２０日間観察する。
【００７５】
２．カルセイン-AM及びEthD-1染色 (Calcein-AM & EthD-1 staining)
−生/死 生存率/細胞毒性アッセイキット(The LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit)（Invitrogen、Ｌ３２２４）のCalcein AMとEthD-1が各々２μＭ、４μＭになる
ようにＰＢＳに混合して標準溶液(working solution)を作る。
−培養物を新たな２４ウエルプレート(well plate)に移し、標準溶液(working solution) １ｍＬを入れて、光が遮断された状態で２０分間反応させた後、蛍光顕微鏡で生細胞(live cell)と死細胞(dead cell)を観察する。
【００７６】
３．試験結果
−カルセイン-AM及びEthD-1染色 (Calcein-AM & EthD-1 staining)（図９）
【００７７】
一方、本発明は上記の構成部を適用するに当たって、多様な変形が可能であり、さまざまな形態を取ることができる。
【００７８】
そして、本発明は上記の詳細な説明で言及される特別な形態に限定されるものでないことが理解されるべきであり、むしろ添付した請求範囲により定義される本発明の精神と範囲内にある全ての変形物と均等物及び取替物を含むことと理解されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明のコラーゲンとフィブリンとが混合された組織シーラント及びその製造方法の技術的思想は、実際に同一結果を反復実施可能なものであって、特にこのような本願発明を実施することによって、技術発展を促進して産業発展に資することができるので保護する価値が十分である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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