(57)【要約】  相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルを減少または増加させることにより、パッパリシンポリペプチドの活性を減少または増加させる方法を提供する。また、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、有効量のスタニオカルシンポリペプチドをヒトなどの哺乳類の対象に投与することを含む、方法を提供する。さらに、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤の有効量を、ヒトなどの哺乳類に投与することを含む、方法を提供する。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に使用するための、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加もしくは減少でき、かつ／またはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記薬剤が、スタニオカルシンポリペプチドまたはその一部、スタニオカルシンを標的化するｓｉＲＮＡまたはである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記薬剤が、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用を阻害する、スタニオカルシンまたはパッパリシンに特異的な遮断抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
創傷治癒および／もしくは骨のリモデリングもしくは骨の増殖での使用のため、ならびに／または再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、もしくは卵巣癌、精巣癌、肺癌、もしくは、腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌などの癌の処置に使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルを減少または増加させることにより、パッパリシンポリペプチドの活性を減少または増加させる方法。
【請求項６】
前記スタニオカルシンポリペプチドのレベルならびに／または前記相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルを減少または増加させることのできる薬剤が、前記パッパリシンポリペプチドを含む試料に提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ．前記パッパリシンポリペプチドの活性が、前記スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させることにより減少し、
ｂ．前記パッパリシンポリペプチドの活性が、前記スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少させることにより増加する、
請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記パッパリシンポリペプチドの活性が、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズする薬剤を提供することにより増大する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、スタニオカルシンに対するｓｉＲＮＡ、またはたとえば、パッパリシンポリペプチドまたはスタニオカルシンポリペプチドを特異的に結合する抗体といった、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる抗体などの抗体、特にパッパリシンまたはスタニオカルシンの結合領域に特異的に結合する抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記パッパリシンポリペプチドの活性が、スタニオカルシンポリペプチドとパッパリシンを接触させることにより阻害される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スタニオカルシンポリペプチドまたはその一部が、前記スタニオカルシンポリペプチドまたはその一部を発現する核酸ベクター、たとえばウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して細胞に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スタニオカルシンポリペプチドのレベルが、ヒト幹細胞などのヒトの細胞で増加または減少する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、前記方法が、前記ヒトなどの哺乳類の対象に有効量のスタニオカルシンポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記パッパリシンポリペプチドの活性が阻害される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記パッパリシンポリペプチドの活性が、少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドとパッパリシンポリペプチドの相互作用により阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記臨床状態が、増殖性障害である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
増殖性の過程が阻害される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記臨床状態が、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、または癌である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記臨床状態が、アテローム性動脈硬化または再狭窄などの血管性疾患である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記臨床状態が、卵巣癌患者の腹水の産生などの流体の蓄積が増加する状態である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記臨床状態が、ヒトの生殖に関連する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖性の過程が、パッパリシンの発現に関連する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖性の過程および／または増殖性障害が、ＩＧＦＢＰ４などのインスリン様成長因子‐結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）のパッパリシン媒介型切断に関連する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、卵巣癌、精巣癌、肺癌、または腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌であり、特に前記癌が、卵巣癌、肺癌、および結腸癌からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記臨床状態が、パッパリシン発現の増大などのパッパリシン発現に関連する癌であり、たとえば前記臨床状態が、パッパリシン発現の増大により特徴づけられる卵巣癌である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記スタニオカルシンポリペプチドが、ポリペプチドとして投与されるか、かつ／または前記スタニオカルシンポリペプチドを発現する核酸ベクターを使用して投与される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、前記ヒトなどの哺乳類の対象に、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
増殖性の過程が刺激される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記臨床状態が、骨の増殖または骨のリモデリングである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記臨床状態が傷であり、前記処置または回復が、創傷治癒である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、スタニオカルシンに対するｓｉＲＮＡおよび／またはパッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる抗体などの抗体である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用を阻害する、スタニオカルシンまたはパッパリシンに特異的である遮断抗体である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記臨床状態が、増殖性の過程に関連する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記増殖性の過程が、前記薬剤の局所投与により、皮膚組織などの前記ヒトなどの哺乳類の対象の特定の組織で調節される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのスタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドを含む、またはからなる共有結合性および／または非共有結合性の複合体と特異的に結合できる、抗体。
【請求項３６】
前記相互作用が、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合である、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる抗体。
【請求項３８】
前記抗体が、パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドと結合できる、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
前記相互作用が、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する方法であって、前記組成物が、スタニオカルシンポリペプチド、およびスタニオカルシンポリペプチドを含む複合体を本質的に含まず、前記方法が、
ａ．パッパリシンポリペプチドを含む組成物を提供し、前記組成物から、スタニオカルシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドを含む複合体を除去するステップと、
ｂ．細胞株で発現したパッパリシンポリペプチドを含む組成物を提供するステップであって、前記スタニオカルシンポリペプチドが、１つまたは複数のスタニオカルシンの遺伝子のノックアウトおよび／またはノックダウンにより除去されるステップと
を含む、方法。
【請求項４１】
遊離スタニオカルシンポリペプチドおよび／または他のポリペプチドと相互作用するスタニオカルシンポリペプチド、特にパッパリシンポリペプチドと相互作用するスタニオカルシンポリペプチドが除去される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記パッパリシンポリペプチドを含む組成物が、
ａ．パッパリシンを産生するために十分な時間、パッパリシンを発現する細胞株を培養するステップと、
ｂ．培養培地を収集するステップと、
ｃ．前記培養培地からスタニオカルシンポリペプチドを除去するステップと
により生産される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、
ａ．パッパリシンを発現する細胞株を提供することと、
ｂ．前記細胞株でスタニオカルシンをコードする遺伝子を欠失もしくは破壊し、かつ／またはＳＴＣ１および／もしくはＳＴＣ２を標的化するｓｉＲＮＡで前記細胞株をトランスフェクトすることと、
ｃ．パッパリシンを産生するために十分な時間、前記細胞株を培養することと、
ｄ．前記培養培地を収集することと
を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞株が、Ａ５４９細胞株である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記スタニオカルシンポリペプチドが、前記細胞株における１つまたは複数のスタニオカルシン遺伝子のノックアウトおよび／またはノックダウンにより除去される、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記スタニオカルシンポリペプチドが、アフィニティクロマトグラフィーにより除去される、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
パッパリシンを含む組成物であって、スタニオカルシンを本質的に含まない組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法により得られる、請求項４７に記載のパッパリシンポリペプチド。
【請求項４９】
試料中のパッパリシンポリペプチドのレベルを定量化する方法であって、
ａ．試料を提供することと、
ｂ．パッパリシンを含む参照試料を提供することであって、前記参照試料が、スタニオカルシンを本質的に含まないことと、
ｃ．前記試料および前記参照試料中のパッパリシンのレベルを測定することと、
ｄ．前記標準的な参照試料のレベルと、前記試料に関するステップｃで判定したパッパリシンのレベルを相関させることと、
ｅ．前記相関に基づき、前記試料のパッパリシンポリペプチドのレベルを定量化することと
を含む、方法。
【請求項５０】
少なくとも１つのパッパリシンポリペプチドおよび少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドを含む、またはからなる共有結合性または非共有結合性の複合体。
【請求項５１】
前記複合体が、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン２の間の共有結合性相互作用である、請求項５０に記載のパッパリシンポリペプチド。
【請求項５２】
相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに特異的な抗体を生産する方法であって、
ａ．マウスなどの動物を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドで前記動物を免疫化することと、
ｃ．前記動物から抗体を得ることと
を含む、方法。
【請求項５３】
前記方法が、
ａ．動物を提供するステップと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを提供するステップと、
ｃ．前記ステップｂの相互作用するポリペプチドを前記動物に投与するステップと、
ｄ．抗体を産生するために十分な時間、前記動物を飼育するステップと、
ｅ．前記動物から試料を得るステップと、
ｆ．前記試料から抗体を得るステップと
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドが、共有結合的または非共有結合的に相互作用する、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がモノクローナル抗体であり、前記方法が、
ａ．動物を提供するステップと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを提供するステップと、
ｃ．前記ステップｂの相互作用するポリペプチドを前記動物に投与するステップと、
ｄ．抗体を産生するために十分な時間、前記動物を飼育するステップと、
ｅ．脾臓の試料などの、前記動物由来の組織の試料を得るステップと、
ｆ．前記組織の試料の抗体産生細胞を単離するステップと、
ｇ．適切な細胞株と前記ステップｆの単離した細胞の融合により、抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成するステップと、
ｈ．前記モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を単離するステップと
を含む、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用を促進またはアンタゴナイズできる薬剤を同定する方法であって、
ａ．パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドを提供することと、
ｂ．前記薬剤を提供することと、
ｃ．前記パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと前記薬剤をインキュベートすることと、
ｄ．前記薬剤が存在する中、および前記薬剤が存在しない中で、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルを検出することと、
ｅ．ステップｄにおいて、前記薬剤が存在する中、および前記薬剤が存在しない中で、前記相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルに基づき、前記薬剤が、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用を促進またはアンタゴナイズできるかどうかを判定することと
を含む、方法。
【請求項５７】
ａ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドが存在しないことが、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を表し、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの存在が、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできない薬剤を表す、
請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬剤が抗体である、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
ａ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、
ｂ．パッパリシンもしくはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露した表面ではない、ポリペプチド領域、
ｃ．非結合パッパリシンポリペプチド、ならびに／または
ｄ．非結合スタニオカルシンポリペプチド
と特異的に結合できる薬剤を同定する方法であって、
ｉ．前記薬剤を提供することと、
ｉｉ．非結合スタニオカルシンポリペプチドならびに／または非結合パッパリシンポリペプチド、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと前記薬剤を接触させることと、
ｉｉｉ．前記薬剤が、前記非結合スタニオカルシンポリペプチド、ならびに／または非結合パッパリシンポリペプチド、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのうちの１つまたは複数と結合するかどうかを判定することと
を含む、方法。
【請求項６０】
相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合できる薬剤を同定し、前記方法が、
ａ．前記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと前記薬剤を接触させることと、
ｃ．前記薬剤が、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合する薬剤を選択することと
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域であって、前記領域が、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露した表面ではないポリペプチド領域と結合できる薬剤を同定し、前記方法が、
ａ．前記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、ならびに／または非結合パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと前記薬剤を接触させることと、
ｃ．前記薬剤が、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、ならびに／または非結合パッパリシンポリペプチドならびに／またスタニオカルシンポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することであって、前記薬剤が、非結合パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドと結合することと
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
非結合スタニオカルシンポリペプチドと結合できる薬剤を同定し、前記方法が、
ａ．前記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合スタニオカルシンポリペプチドならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと前記薬剤を接触させることと、
ｃ．前記薬剤がスタニオカルシンポリペプチドならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．非結合スタニオカルシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
非結合パッパリシンポリペプチドと結合できる薬剤を同定し、前記薬剤が、スタニオカルシンの結合部位を含む領域でパッパリシンと結合し、前記方法が、
ａ．前記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合パッパリシンポリペプチドと前記薬剤を接触させることと、
ｃ．前記薬剤が、パッパリシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しないかどうかを判定することと、
ｄ．パッパリシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記薬剤が抗体である、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記スタニオカルシンポリペプチドが、修飾ポリペプチドであり、置換された１つ以上のシステイン残基を有するスタニオカルシンポリペプチドなどの、スタニオカルシンダイマーを形成しない、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
試料においてパッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドの間の共有結合性または非共有結合性の複合体を検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記試料を提供することと、
ｂ．前記パッパリシンポリペプチドおよび／もしくは前記スタニオカルシンポリペプチドに親和性を有する少なくとも１つの抗体、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに親和性を有する少なくとも１つの抗体を提供することと、
ｃ．前記抗体に前記試料を曝露して前記抗体およびポリペプチドの間で複合体を形成することと、
ｄ．過度の非結合試料を除去することと、
ｅ．相互作用する抗体‐パッパリシン−スタニオカルシンポリペプチドを、前記抗体の内の１つに対するさらなる抗体に曝露することと、
ｆ．ｃおよび／またはｅの結合抗体の量を検出し、定量化することと
を含む、方法。
【請求項６７】
前記方法が、
ａ．前記試料を提供することと、
ｂ．前記パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのうちの１つに対する親和性を有する捕捉抗体に前記試料を曝露して、前記捕捉抗体および前記ポリペプチドの間に複合体を形成することと、
ｃ．前記パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのうちの別の１つに対する親和性を有する検出抗体に前記試料を曝露することと、
ｄ．前記抗体‐パッパリシン−スタニオカルシン複合体を、前記検出抗体に対するさらなる抗体に曝露することと、
ｅ．結合した検出抗体および／またはさらなる抗体の量を検出し、定量化することと
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドが、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合体である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
臨床状態を判定する方法であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを検出することを含む、方法。
【請求項７０】
前記相互作用が、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性の複合、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記相互作用が、２つの抗体などの少なくとも１つの抗体を使用して検出される、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記相互作用が、パッパリシンに特異的な抗体および／またはスタニオカルシンに特異的な抗体を使用して検出される、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記複合体が、請求項６２〜６８のいずれか１項に記載される方法により検出される、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記臨床状態が、卵巣癌、精巣癌、肺癌、または、腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌などの癌である、請求項６９〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記スタニオカルシンポリペプチドが、
ａ．スタニオカルシン１（配列番号１）および／またはスタニオカルシン２（配列番号２）と、
ｂ．配列番号１および配列番号２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのうちいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと
からなる群から選択される、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法、抗体、修飾物質、組成物、および複合体。
【請求項７６】
前記パッパリシンポリペプチドが、
ａ．ＰＡＰＰ−Ａ（配列番号３）またはＰＡＰＰ−Ａ２（配列番号４）と、
ｂ．配列番号３および配列番号４のうちいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのうちいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと、
ｄ．ａからｃのうちいずれかのポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドからなるダイマーと
からなる群から選択される、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の方法、抗体、修飾物質、組成物、および抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用および複合体形成、ならびにパッパリシンのレギュレーターとしてのスタニオカルシンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−系の重要なレギュレーターである。このタンパク質分解活性があるにも関わらず、ＰＡＰＰ−ＡはＩＧＦ系に対して活性を発揮することができ、これにより組織の増殖およびヒトの疾患などの鍵となる生物学的過程を調節する。
【０００３】
ＰＡＰＰ−Ａは、その主要な構造に基づき、メトジンシンスーパーファミリーに属するメタロプロテイナーゼとして特徴付けられる。しかしながら、ＰＡＰＰ−Ａはまた、他のメトジンシンと異なる特性を有し、それゆえパッパリシンと呼ばれるメトジンシンのサブグルーブに分類される。これはまた、ＰＡＰＰ−Ａの相同体ＰＡＰＰ−Ａ２をも含む。
【０００４】
妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）は、最初にヒトの妊娠に関連する血漿タンパク質として同定された。このタンパク質は胎盤由来であり、妊娠中の女性の血清で発見された。ＰＡＰＰ−Ａの濃度は妊娠の間増加し、妊娠初期における母体循環でのＰＡＰＰ−Ａレベルの減少は、胎児のダウン症候群の高いリスクと相関し、これにより２１トリソミーに関するＰＡＰＰ−Ａの臨床マーカーが作製された。さらに、母体の妊娠血清中のＰＡＰＰ−Ａの低濃度は、１８トリソミー、子癇前症、および低体重の正期産児の高いリスクと関連している。
【０００５】
ＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰ−４に対するＩＧＦ依存性タンパク質分解活性に関わりのあるプロテアーゼである。ＰＡＰＰ−Ａはまた、ＩＧＦＢＰ−５を特異的に切断し、ＩＧＦＢＰ−２をある程度まで特異的に切断する。特に、他のプロテイナーゼは、生理的な過程のＩＧＦＢＰ−４に示されるものではない。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ媒介型の切断は、ＩＧＦの存在により著しく加速する。切断したＩＧＦＢＰフラグメントは、ＩＧＦに対する親和性を減少させ、ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性は、結果的に、ＩＧＦ−Ｉ受容体と結合し、活性化させることのできる生理活性ＩＧＦの放出をもたらす。これにより、ＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰアンタゴニストとして機能する。
【０００６】
妊娠の間、ＰＡＰＰ−Ａは、４００ｋＤａのダイマーとしての胎盤から分泌されるが、５００ｋＤａの好酸球主要塩基性タンパク質のプロフォーム（ｐｒｏＭＢＰ）とジスルフィド結合した２：２の複合体として主に循環する。この、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰと記載されるヘテロ４量体複合体は、妊娠の間増加してゆく濃度で発見される。ＰＡＰＰ−Ａは、ｐｒｏＭＢＰと複合体を形成するとタンパク質分解活性が消失する。ｐｒｏＭＢＰ結合による阻害は、主に、ＰＡＰＰ−Ａ活性部位の阻害または活性部位の構造の立体構造の変化の誘導により起こる。ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体は、ｐｒｏＭＢＰサブユニットおよびＰＡＰＰ−Ａダイマーのサブユニットの間の２つの鎖間ジスルフィド結合、ならびに２つのｐｒｏＭＢＰサブユニットの間の２つの追加的な架橋によりまとめて保持される。
【０００７】
ｐｒｏＭＢＰ媒介型阻害に加え、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験から、ＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａの活性は、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰに対するポリクローナル抗体の増加により阻害される。さらに、ＥＤＴＡおよび１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎａｎｔｒｏｌｉｎｅ）などの二価カチオンをキレートできる薬剤は、概してメタロプロテイナーゼの非特異的な阻害剤であり、それゆえＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性を消失させる（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ２０００）。最終的に、ファージ由来の単一可変鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体は、ＬＮＲ３の標的化を介してＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４ののタンパク質分解を阻害することが示されており、結果として、ＬＮＲ３はＰＡＰＰ−Ａのエキソサイトであると考えられている。ＬＮＲ３モジュールは、ＰＡＰＰ−ＡのＣ末端に位置する。ＰＡＰＰ−Ａは、抗体によるＩＧＦシグナリングおよびＬＮＲ３の標的化の治療上の制御における潜在的な標的であり、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解を選択的に阻害する方法を例証する。
【０００８】
現在まで、ｐｒｏＭＢＰは、単なるＰＡＰＰ−Ａの生理的阻害剤として知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、パッパリシンのタンパク質分解活性の阻害剤としてのスタニオカルシンを使用する態様、ならびにスタニオカルシンおよびパッパリシンの間の相互作用を使用する別の態様に関する。
【００１０】
パッパリシンは、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよび変異体を含む。具体的に、パッパリシンは、ＰＡＰＰ−Ａサブユニット、ＰＡＰＰ−Ａ２サブユニット、もしくはそのフラグメントもしくは変異体のダイマー、またはＰＡＰＰ−Ａ、およびＰＡＰＰ−Ａ２もしくはそれらのフラグメントもしくは変異体のパッパリシンヘテロダイマーを形成してもよい。
【００１１】
一態様では、本発明は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを相互作用するレベルを減少または増加させることにより、パッパリシンポリペプチドの活性を低減または増大させる方法に関する。
【００１２】
一実施形態では、パッパリシンポリペプチドの活性は、たとえばスタニオカルシン依存性ＲＮＡ、またはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる抗体などの抗体といった、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズする薬剤を投与することにより増大する。
【００１３】
別の実施形態では、パッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンポリペプチドを提供する、たとえばスタニオカルシンポリペプチドまたはその一部を発現する核酸ベクターを使用するか、または精製した形態または部分的に精製した形態のスタニオカルシンを提供することにより阻害される。
【００１４】
一般的に、パッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンのレベルと陰性的に相関し、これによりパッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルが増加すると減少し、スタニオカルシンポリペプチドのレベルが減少すると増加する。
【００１５】
一実施形態では、本方法は、ヒト幹細胞などのヒトの細胞におけるスタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加または減少させることにより実施される。したがって、本方法を用いてヒトなどの哺乳類の対象の特定の組織、たとえば癌組織などの、ヒトなどの哺乳類の対象におけるスタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加または減少させることができる。
【００１６】
他の態様では、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復する方法であって、有効量のスタニオカルシンポリペプチドをヒトなどの哺乳類の対象に投与することを含む、方法を提供する。有効量のスタニオカルシンを提供することにより、パッパリシンポリペプチドの活性を阻害することができる。
【００１７】
本方法は、増殖過程を阻害するよう作用し、したがって本方法は、好ましくは、癌、たとえば卵巣癌、精巣癌、肺癌、または腹部癌（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、小腸癌、直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌などの増殖性障害の予防、処置、または回復に使用される。特に癌は、卵巣癌、肺癌、および結腸癌からなる群から選択される。他の好ましい臨床状態として、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、およびヒトの生殖に関連する臨床状態が挙げられる。他の好ましい臨床状態として、卵巣癌患者での腹水の産生などの流体の蓄積が挙げられる。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤の有効量をヒトなどの哺乳類の対象に投与することを含む、方法に関する。このような薬剤を提供することにより、スタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドの間の相互作用がアンタゴナイズされ、スタニオカルシンはパッパリシンの阻害を阻止する。本方法は、増殖過程を刺激するために使用でき、したがって本方法は、骨のリモデリングまたは骨の増殖、および傷による骨折の処置などの臨床状態に適用可能であり、この処置または回復は創傷治癒である。
【００１９】
スタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドの間の相互作用は、好ましくはパッパリシンとスタニオカルシンの相互作用を阻害する遮断抗体などの抗体を提供することによりアンタゴナイズされる。
【００２０】
本発明の別の態様では、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合などの、相互作用するスタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドに特異的に結合できる抗体を提供する。この抗体は、好ましくは、個々のパッパリシンまたはスタニオカルシンよりもパッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドからなる、またはこれらを含む複合体に対して高い親和性を有する。この抗体は、相互作用するスタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドの検出に使用できる。しかしながら、この抗体は、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の共有結合性または非共有結合性の複合体の形成の安定化または促進にも使用でき、これによりパッパリシンを阻害するよう働く場合がある。
【００２１】
別の態様では、たとえばパッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドの結合による、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる抗体を提供する。
【００２２】
また本発明は、一態様では、薬剤に使用するための、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加または減少でき、かつ／またはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズもしくは促進できる薬剤をまたはこの薬剤を含む医薬組成物を提供する。このような薬剤は、たとえば、スタニオカルシンポリペプチドまたはその一部、スタニオカルシンを標的化するｓｉＲＮＡ、または本発明の抗体である。好ましい実施形態では、この薬剤は、創傷治癒および／または骨のリモデリングもしくは骨の増殖（たとえば骨折の処置における）に使用され、かつ／またはこの薬剤は、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、または卵巣癌、精巣癌、肺癌、もしくは室性癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌などの癌の処置に使用される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する方法であって、上記組成物が、スタニオカルシンポリペプチドを本質的に含んでおらず、上記方法が、パッパリシンを含む組成物ならびにパッパリシンおよびスタニオカルシンの複合体から、スタニオカルシンおよび／またはパッパリシンおよびスタニオカルシンの共有結合性複合体および非共有性複合体を除去することを含む、方法を提供する。この態様は、パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する方法であって、上記組成物がスタニオカルシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドを含む複合体を本質的に含んでおらず、上記方法が、
ａ．パッパリシンポリペプチドを含む組成物を提供し、上記組成物から、スタニオカルシンポリペプチド、およびスタニオカルシンおよびポリペプチドを含む複合体を除去するステップと、
ｂ．パッパリシンポリペプチドを含む組成物を提供するステップであって、
パッパリシンが、細胞株で発現しており、上記スタニオカルシンポリペプチドが、１つまたは複数のスタニオカルシンの遺伝子のノックアウトおよび／またはノックダウンにより除去されるステップと
を含む方法に関する。
【００２４】
また本発明は、別の態様では、上記の方法により得ることのできる組成物に関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、パッパリシンを含む組成物であって、スタニオカルシンを本質的に含まない、組成物に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、試料中のパッパリシンのレベルを定量化する方法であって、標準物質としてスタニオカルシンを本質的に含まない同種の組成物を使用することを含む、方法に関する。この態様では、
ａ．試料を提供するステップと、
ｂ．パッパリシンを含む参照試料を提供するステップであって、上記参照試料がスタニオカルシンを本質的に含まない、ステップと、
ｃ．上記試料および上記参照試料中のパッパリシンのレベルを測定するステップと、
ｄ．上記標準的な参照試料中のレベルと、上記試料について、ステップＣで判定したパッパリシンのレベルを相関させるステップと、
ｅ．上記相関に基づき、上記試料中のパッパリシンポリペプチドのレベルを定量化するステップと
を含む方法を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドと相互作用するパッパリシンポリペプチドを提供する。この相互作用は、一実施形態では、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性相互作用；ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン２の間の共有性相互作用である。
【００２８】
さらなる別の態様では、本発明は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの相互作用に特異的な抗体を生産する方法であって、
ａ．マウスなどの動物を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドで上記動物を免疫化することと、
ｃ．上記動物から抗体を得ることと
を含む、方法に関する。
【００２９】
さらに、本発明は、一態様で、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用を促進またはアンタゴナイズできる薬剤を同定する方法であって、  ａ．パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドを提供することと、
ｂ．上記薬剤を提供することと、
ｃ．上記パッパリシンおよびスタニオカルシンポリペプチドで上記薬剤をインキュベートすることと、
ｄ．上記薬剤が存在する中、および上記薬剤がない中で、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのレベルを検出することと、
ｅ．ステップｄで検出した、上記薬剤が存在する中、および上記薬剤がない中での相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルに基づき、上記薬剤がパッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできるかどうかを判定することと
を含む、方法を提供する。
【００３０】
この方法の好ましい実施形態では、
ａ．パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの相互作用がないことは、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を表し、
ｂ．パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの相互作用の存在は、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできない薬剤、またはこの相互作用を促進する薬剤を表す。
【００３１】
別の態様では、
ａ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと、
ｂ．パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露した表面ではない、ポリペプチド領域と、
ｃ．非結合パッパリシンポリペプチド（すなわち、パッパリシンポリペプチドであって、スタニオカルシンポリペプチドと相互作用せず、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない、パッパリシンポリペプチド）と、
ｄ．非結合スタニオカルシンポリペプチド（すなわちスタニオカルシンポリペプチドであって、パッパリシンポリペプチドと相互作用せず、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない、スタニオカルシンポリペプチド）と
結合できる薬剤を同定する方法であって、
ｉ．上記薬剤を提供することと、
ｉｉ．非結合スタニオカルシンポリペプチドおよび／または非結合パッパリシンポリペプチド、および／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｉｉｉ．薬剤が上記非結合スタニオカルシンポリペプチド、および／または非結合パッパリシンポリペプチド、および／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのうちの１つ以上と結合するかどうかを判定することと
を含む、方法を提供する。
【００３２】
この方法の一実施形態では、単独のパッパリシンまたはスタニオカルシンよりも高い親和性で、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合できる薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合する薬剤を選択することと
を含む方法により、同定する。
【００３３】
この方法の別の実施形態では、パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域に結合できる薬剤であって、この領域は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露した表面ではない、薬剤を
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、ならびに／または非結合のパッパリシンポリペプチドならびにスタニオカルシンポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドおよび／または非結合パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することであって、上記薬剤が、非結合パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドと結合することと
を含む方法により、同定する。
【００３４】
本方法の別の実施形態では、非結合パッパリシンポリペプチドと結合できる薬剤であって、スタニオカルシンに対する結合部位を含む領域でパッパリシンと結合する薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合パッパリシンポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が、パッパリシンポリペプチドおよび相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．パッパリシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む方法により、同定する。
【００３５】
本方法の第３の実施形態では、非結合スタニオカルシンと結合できる薬剤であって、パッパリシンの結合部位を含む領域でスタニオカルシンと結合する、薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合スタニオカルシンポリペプチドならびに相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が、スタニオカルシンポリペプチドならびに相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．スタニオカルシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む方法により、同定する。
【００３６】
また本発明は、一態様では、試料中のパッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドの間の相互作用を検出する方法であって、
ａ．上記試料を提供することと、
ｂ．上記パッパリシンポリペプチドまたは上記スタニオカルシンポリペプチド、または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対する親和性を有する少なくとも１つの抗体を提供することと、
ｃ．上記抗体に上記試料を曝露して、上記抗体およびポリペプチドの間に複合体を形成することと、
ｄ．過度の非結合試料を除去することと、
ｅ．上記抗体のうちの１つに対するさらなる抗体に相互作用する抗体‐パッパリシン−スタニオカルシンのポリペプチドを曝露することと、
ｆ．ｃおよび／またはｅの結合した抗体の量を検出し、定量化することと
を含む、方法を提供する。
【００３７】
さらに、一態様では、本発明は、臨床状態を判定する方法であって、ＰＡＰＰ−Ａおよび／またはスタニオカルシン２の間での非共有結合性および／または共有結合性の複合体と相互作用するＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１などの、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを検出することを含む、方法に関する。
【００３８】
この臨床状態は、たとえば、卵巣癌、精巣癌、肺癌、または腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌である。
【００３９】
本発明の方法、抗体、薬剤、組成物、およびポリペプチドでは、スタニオカルシンポリペプチドは、好ましくは、
ａ．スタニオカルシン１（配列番号１）および／またはスタニオカルシン２（配列番号２）と、
ｂ．配列番号１および配列番号２のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと、
ｄ．ａからｃのいずれかのポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドからなるダイマーと、
ｅ．共有結合の二量体化の因子である少なくとも１つのシステイン残基が、たとえばａからｃのいずれかのポリペプチドから独立して選択される１つのポリペプチドからなる、アラニン残基に変異する、モノマーと
からなる群から選択される。
【００４０】
さらに、本発明の方法、抗体、薬剤、組成物、ポリペプチドでは、パッパリシンポリペプチドは、好ましくは、
ａ．ＰＡＰＰ−Ａ（配列番号３）またはＰＡＰＰ−Ａ２（配列番号４）と、
ｂ．配列番号３および配列番号４のうちいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと、
ｄ．ａからｃのうちいずれかのポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドからなるダイマーと
からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】共有結合性ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体のＳＴＣ１およびＳＴＣ２の可視化を検出するウェスタンブロット。Ａ）トランスフェクト細胞由来の培養物の上清のＳＴＣ１に特異的なウェスタンブロット。細胞を、空のプラスミドＤＮＡ（モック）でトランスフェクトするか、またはＳＴＣ１  ｃＤＮＡおよび空のプラスミドＤＮＡもしくはＰＡＰＰ−Ａ（ＰＡ）ｃＤＮＡで同時にトランスフェクトした。Ｂ）トランスフェクト細胞由来の培養物の上清のＳＴＣ２に特異的なウェスタンブロット。細胞を、モックトランスフェクトするか、またはＳＴＣ２  ｃＤＮＡおよび空のプラスミドＤＮＡもしくはＰＡＰＰ−Ａ（ＰＡ）ｃＤＮＡのいずれかで同時にトランスフェクトした。図に例示されるように、試料を用いて、非還元性または還元性（赤色）の条件の下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣの複合体の局在化を、黒色の矢印で示す。
【図２】ＳＴＣ１またはＳＴＣ２での共発現の最中のＰＡＰＰ−Ａを検出したウェスタンブロット。試料は、トランスフェクト細胞由来の培養物の上清であった。細胞を、空のプラスミドＤＮＡ（モック）でトランスフェクトするか、またはＰＡＰＰ−Ａおよび空のプラスミドＤＮＡ、ＳＴＣ１（Ａ）、もしくはＳＴＣ２（Ｂ）のｃＤＮＡで同時にトランスフェクトした。ＰＡＰＰ−Ａの抗体（Ａｂ）をＰＡＰＰ−Ａの検出に使用した、Ａ）およびＢ）の矢印は、高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（ＬＭＷ）のＰＡＰＰ−Ａバンドの消失をそれぞれ示す。ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２と複合したＰＡＰＰ−Ａの局在化が示される。これらの結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表する。ＳＴＣ１またはＳＴＣ２のｃＤＮＡとトランスフェクトしていない細胞は、あるレベルの内在性ＳＴＣ２を表し、これは、ＰＡＰＰ−Ａの画分をゆっくりと移動させる。
【図３】ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体形成の検出  指定された時点で採取したＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２（Ａ）またはＰＡＰＰ−Ａおよびモック（Ｂ）の混合物を、ウェスタンブロットにより解析した。モックトランスフェクト細胞またはＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２  ｃＤＮＡ（ＰＡ＋ＳＴＣ２  ｃｏ−ｔｆ）で同時にトランスフェクトした細胞から条件付けされた培地を、対照として充填した。ＰＡＰＰ−Ａ抗体は、ＰＡＰＰ−Ａ検出に使用した。ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２と複合したＰＡＰＰ−Ａの局在化が表される。ＯＮは一晩のインキュベートを表す。内在性スタニオカルシン１の不飽和レベルが培地に存在することがＢから明らかである。
【図４】ＰＡＰＰ−Ａの試料におけるＳＴＣ２タンパク質の検出。Ａ）モック−培地、培養物上清中の組み換えＰＡＰＰ−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）、精製した（ｐｕｒ．）ＰＡＰＰ−Ａ−Ｅ４８３Ｑ、および精製したＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ（ＰＰ）の試料を、αＳＴＣ２抗体を使用したウェスタンブロッティングで試験した。Ｂ）組み換え型ＳＴＣ２を含む培養物の上清を、培養物の上清中のＰＡＰＰ−Ａ（ＳＴＣ２＋ＰＡ-Ｅ４８３Ｑ混合物）、またはモック培地に希釈した精製ＰＰ（ＳＴＣ２＋ＰＡ混合物）と混合し、αＳＴＣ２抗体を使用したウェスタンブロッティングで試験した。ＰＡＰＰ−Ａと複合したＳＴＣ１およびＳＴＣ２の局在化を表す。
【図５】精製したＳＴＣ１およびＳＴＣ２の溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。精製したＳＴＣ１  Ａ）およびＳＴＣ２  Ｂ）のタンパク質を、１０の画分に溶出した。画分♯１〜６を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。さらに、タンパク質の溶出前の洗浄溶出物（ｗａｓｈ  ｅｌｕａｔｅ）の試料、および最終的なカラムの条片由来のＥＤＴＡの試料を充填した。電気泳動ゲルを、クマシーブリリアントブルーで染色した。
【図６】ＳＴＣ１およびＳＴＣ２によるＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性の阻害。培養物の上清中のＰＡＰＰ−Ａを、モック培地、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２培地で一晩インキュベートし、１２５Ｉ標識したＩＧＦＢＰ−４を、ＩＧＦ−ＩＩを用いて３７℃で１５分予めインキュベートした。Ａ）試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性をモニタリングするために、０〜１２０分の時点での無処置（ｉ）および切断した（ｃ）の１２５Ｉ標識したＩＧＦＢＰ−４の量を測定した。無処置および切断したＩＧＦＢＰ−４の位置を、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２が存在しない（上側のゲル）か、またはＳＴＣ１（上側のゲル）またはＳＴＣ２（下側のゲル）の存在する中で、ＰＡＰＰ−Ａに対応して示した。Ｂ）タンパク質分解的に切断したＩＧＦＢＰ−４のパーセンテージを計算し、時間の関数として表した。これらの結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表する。
【図７】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析によるＰＡＰＰ−Ａの相互作用のパートナーの同定。総ＰＡＰＰ−Ａを、モノクローナルＰＡＰＰ−Ａ抗体を使用したヒト癌細胞株の培地から免疫沈降した。沈降した物質は、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２つのバンドとして現れた。４００ｋＤａの下側のバンドでは、ＰＡＰＰ−Ａ由来のペプチドのみが同定された。ＰＡＰＰ−Ａを除き、上側のバンドはスタニオカルシンペプチドをも含んだ。
【図８】ＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロット。モック、ＳＴＣ２、またはシステイン１２０がアラニン残基と置換した（Ｃ１２０Ａ）変異型ＳＴＣ２のいずれかから馴化培地で、ＰＡＰＰ−Ａを３７℃で一晩インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングし、ポリクローナル抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体でバンドを可視化した。バンドシフトが、Ｃ１２０Ａ変異で観察され、ＳＴＣ２のシステイン１２０が、ＰＡＰＰ−Ａとの共有結合性ジスルフィド結合の形成に関与することが例証された。
【図９】Ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＳＴＣ１：ＰＡＰＰ−Ａの相互作用に関する動的定数の決定（ＫＤ＝７５ｐＭ）。Ｂ．ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の間の相互作用の表面プラズモン共鳴試験。
【図１０】Ａ．ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ媒介型切断のＳＴＣ１阻害に関する阻害定数（Ｋｉ）の決定（Ｋｉ＝６８ｐＭ）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０  ソフトウェアのＯｎｅ  ｓｉｔｅ−Ｆｉｔ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）Ｋｉモデルを使用した。Ｂ．ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａの媒介型切断の変異型ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ変異）に関する阻害定数（Ｋｉ）の決定（Ｋｉ＝４７ｎＭ）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアのＯｎｅ  ｓｉｔｅ−Ｆｉｔ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）Ｋｉモデルを使用した。
【図１１】ＳＴＣ１およびＳＴＣ２は、ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性を阻害する。ａ．ｃＤＮＡの組み合わせでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地中放射標識したＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性。ｂ．切断反応の開始時に添加した精製済みＳＴＣ１またはＳＴＣ２が存在する中、または存在しない中での放射線標識したＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性。右のパネル：精製したタンパク質のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ｄ．ＰＡＰＰ−Ａに対するＳＴＣ１の結合性の表面プラズモン共鳴解析。ｅ．ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａの切断のＳＴＣ１阻害の動的解析。全てのゲルの画像およびイムノブロットは、少なくとも４つの独立した実験を代表する。
【図１２】ＳＴＣ２によるＰＡＰＰ−Ａの阻害は、共有結合性の複合体の形成を必要とする。ａ．示されるように、ｃＤＮＡの組み合わせでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地のＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロット。ｂ．ａ由来の試料のＳＴＣ２のウェスタンブロット。ｃ．ｃＤＮＡの組み合わせでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地のＰＡＰＰ−Ａウェスタンブロット。ｄ．別々に合成し、０〜１６時間インキュベートしたＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２のＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロット。ｅ．ｄからの１６時間目の試料における放射標識したＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性。ｆ．別々に合成し、０〜１６時間インキュベートしたＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１のＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロット。ｈ．イムノブロットおよびゲル画像は、少なくとも４つの独立した実験を代表する。
【図１３】ＰＡＰＰ−Ａに対する共有結合は、ＳＴＣ２のＣ１２０により媒介される。ａ．示されるように、ＳＴＣ２の野生型および変異型バリアントのＳＴＣ２のウェスタンブロット。ｂ．ｃＤＮＡの組み合わせでトランスフェクトｓちあＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地のＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロット。ｃ．ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａの切断のＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の阻害の解析。ｄ．ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−４、ＰＡＰＰ−Ａ、およびＳＴＣの組み合わせにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＧＦ−Ｉ受容体刺激の評価。ＩＧＦ−Ｉ単独でのシグナルで正規化した定量化シグナルは右に示される。結果を、４つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｄ．である。ｎｓ．統計的に有意ではない。ｅ．精製したＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の円二色性解析。挿入図は、精製したＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。全てのイムノブロットおよびゲル画像は、少なくとも４つの独立した実験を代表する。
【図１４】ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）ではなく、ＳＴＣ２の過剰発現がマウスの成長の遅延を引き起こす。ａ．ＳＴＣ２の循環レベルによってグループに分割された非トランスジェニックおよびＳＴＣ２トランスジェニックの雌性マウスの成長曲線。結果を、標準偏差（ｓ．ｄ．）を伴う平均値で示す。統計学的な有意性は、３週齢超のマウスの比較に基づく。ｂ．測定した導入遺伝子由来のＳＴＣ２の循環レベルの関数としての５週齢のＳＴＣ２トランスジェニック雌性マウスの体重。ｃ．非トランスジェニックおよびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）トランスジェニック雌性マウスの成長曲線。結果を、準偏差（ｓ．ｄ．）を伴う平均値で示す。Ｎｓは、統計的に有意なしとの意味である。ｄ．ＰＡＰＰ−Ａに特異的な阻害剤の、ｍＡｂ  １／４１の存在する中または存在しない中での非トランスジェニックマウス由来のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）から馴化培地中での、放射線標識したＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解活性。ｅ．ＳＴＣ２トランスジェニックまたは非トランスジェニックのＭＥＦから馴化培地中での放射線標識したＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解活性。右のパネル：トランスジェニックＳＴＣ２で共免疫沈降（ＩＰ）したマウスの内在性ＰＡＰＰ−Ａ。ｆ：ＩＧＦ−Ｉ受容体の刺激に間接的に影響を与える、活性型およびＳＴＣ阻害型のＰＡＰＰ−Ａの間の均衡を表すモデル。すべてのゲル画像およびイムノブロットは、少なくとも４つの独立した実験を代表する。
【図１５】ＳＴＣ１およびＳＴＣ２は、パッパリシンファミリー以外から選択したタンパク質分解性酵素に対する阻害性活性有していないが、ＰＡＰＰ−Ａ２を阻害する。ａ．バッファー、ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはＥＤＴＡで予めインキュベート（８時間）したマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ２、メトジンシン  メタロプロテイナーゼ）により放射線標識したＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解性の切断。ＩＧＦＢＰ−４とは対照的に、ＩＧＦＢＰ−５は、多くのプロテイナーゼにより乱雑に切断される。ｂ．Ａのようにではあるが、マトリプターゼ（セリンプロテイナーゼ）およびトリプシン（セリンプロテイナーゼ）およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を使用。ｆ．ヒトのＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ１またはＳＴＣ２をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地のＰＡＰＰ−Ａ２ウェスタンブロット。全てのゲルの画像およびイムノブロットは、少なくとも４つの独立した実験を代表する。
【図１６】ヒトのＳＴＣ１およびＳＴＣ２の配列アライメント。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ／）を使用したヒトのＳＴＣ１（ＮＭ＿００３１５５．２）およびＳＴＣ２（ＮＭ＿００３７１４．２）の配列アライメント。線により示されるＳＴＣ１のジスルフィド結合および二量体化は、公開されたデータによるものである。ＳＴＣ２のシステイン残基（Ｃ１２０、Ｃ１９７、およびＣ２０５）は、ＳＴＣ１に対応してはおらず、青色で示される。
【図１７】精製したＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の円二色性解析。ａ．２２２ｎｍでの平均残基楕円性の変化を示す温度スキャン。ｂ．２５℃および９５℃、および９５℃で２分のインキュベーションの後の２５℃で記録したスペクトラム。
【図１８】ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の抗体の反応性の評価。ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）に対する入手可能なモノクローナル抗体の相対結合性をプロットする。１つの値が、ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）に対する等しい結合性を示す。結果は、３重に実施した４つの独立した実験からの平均値±標準偏差である。比率の差異は統計的に有意ではない。
【図１９】マウスのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２は、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２により阻害されるが、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）では阻害された。ａ．ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を用いるか、または用いることなく予めインキュベートした、マウスのＰＡＰＰ−ＡをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地において、放射線標識したＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解活性。右のパネル：マウスのＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２の間での共有結合性複合体の形成を例証するウェスタンブロット（ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）では形成されない）。ｂ。マウスのＰＡＰＰ−ＡのＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の阻害の動態解析。ｃ．ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を用いて、または用いることなく予めインキュベートした、マウスのＰＡＰＰ−Ａ２（ｍＰＡＰＰ−Ａ２）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地における、放射線標識したＩＧＦＢＰ−５に対するタンパク質分解活性。全てのゲルの画像およびイムノブロットは、少なくとも４つの実験を代表する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明者らは、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）の阻害剤としてのスタニオカルシンポリペプチドを同定した。
【００４３】
本発明の一般的な発明の概念は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの新規の複合体に関する。したがって、本発明は、異なる方法でのこの複合体の適用およびこの複合体を含む生成物に関する。本発明の態様は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの間の複合体の使用、ならびにこの複合体に特異的に結合できる薬剤を生産し、スクリーニングする方法に関する。
【００４４】
本出願の本文で使用される用語「相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド」は、少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドと相互作用する少なくとも１つのパッパリシンポリペプチド、または少なくとも１つのパッパリシンポリペプチドと相互作用する少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドを指す。一般的に、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、２つのパッパリシンポリペプチドおよび２つのスタニオカルシンポリペプチドを含む。しかしながら、スタニオカルシンは、１つ以上のシステイン残基が共有結合性の二量体化を防止するために変異する組み換えで産生されるモノマーであってもよい。
【００４５】
パッパリシンおよびスタニオカルシンに関連して本明細書中で使用される用語「非結合」は、他のポリペプチドと相互作用しない代表的なポリペプチドのいずれかを指す。よって、用語「非結合パッパリシンポリペプチド」は、本明細書中では概して、スタニオカルシンと相互作用しないパッパリシンポリペプチドを指す。同様に、用語「非結合スタニオカルシンポリペプチド」は、本明細書中では概して、パッパリシンポリペプチドと相互作用しないスタニオカルシンポリペプチドを指す。この関連では、パッパリシンおよび／またはスタニオカルシンのポリペプチドのいずれかが、他のいずれかの相互作用のパートナーを有し得るかどうかは無視される。
【００４６】
パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド
驚くべきことに、本発明者らは、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドが、共有結合的かつ非共有結合的に相互作用することを発見した。よって本発明の主な態様は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに関する。
【００４７】
パッパリシンポリペプチド
パッパリシンは、タンパク質分解性酵素であり、メタロプロテアーゼのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２を含む。ＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−５などのＩＧＦ結合タンパク質を特異的に切断する。切断されたＩＧＦＢＰフラグメントは、ＩＧＦに対する親和性が低減し、結果的にＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性は、ＩＧＦ受容体と結合でき、これを活性化できる生理活性ＩＧＦを放出させる。ＩＧＦ受容体の活性化は、たとえば細胞増殖を引き起こすなどの活性化経路の引き金となる。
【００４８】
本発明の文脈では、用語「パッパリシン」は、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチドの両方を含む。この用語は、任意の種のパッパリシンポリペプチドを含み、よって、任意の哺乳類のパッパリシンタンパク質、すなわち、ヒトのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２に相同性を有する任意のポリペプチドを包有し、特にマウスのＰＡＰＰ−ＡおよびマウスのＰＡＰＰ−Ａ２をも含む。また、用語「パッパリシン」は、いずれかのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチドの変異体およびフラグメントをも含む。この用語は、ポリペプチドの単量体、ホモマーおよびヘテロマーといった多量体の形態の両方を包有する。具体的には、パッパリシンは、ＰＡＰＰ−ＡもしくはＰＡＰＰ−Ａ２、もしくはそれらのフラグメントもしくは変異体のホモダイマー、またはＰＡＰＰ−ＡもしくはＰＡＰＰ−Ａ２、もしくはそれらのフラグメントもしくは変異体のヘテロダイマーを形成してもよい。
【００４９】
具体的には、本明細書中で使用される用語「ＰＡＰＰ−Ａ」および「ＰＡＰＰ−Ａ２」は、いずれかの種のヒトのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２、特には、マウスまたはヒトのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２などの哺乳類のＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２の相同ポリペプチドが含まれることを意味し、ここでは、ヒトのＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２が最も好ましい。
【００５０】
本発明の方法、抗体、薬剤、組成物、およびポリペプチドのうち１つの好ましい実施形態では、パッパリシンポリペプチドは、ヒトのパッパリシンまたはそのフラグメントもしくは変異体である。具体的には、パッパリシンポリペプチドは、
ａ．ヒトのＰＡＰＰ−Ａ（配列番号３）またはヒトのＰＡＰＰ−Ａ２（配列番号４）と、
ｂ．配列番号３および配列番号４のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのうちいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと、
ｄ．ａからｃのうちいずれかのポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドからなるダイマーと
からなる群から選択される。
【００５１】
よって、１つの好ましい実施形態では、パッパリシンポリペプチドは、ヒトのＰＡＰＰ−ＡなどのＰＡＰＰ−Ａであり、別の好ましい実施形態では、パッパリシンポリペプチドはヒトのＰＡＰＰ−Ａ２などのＰＡＰＰ−Ａ２である。パッパリシンポリペプチドの変異体は、ＰＡＰＰ−Ａ（配列番号３）またはヒトのＰＡＰＰ−Ａ２（配列番号４）のいずれか１つと、少なくとも６０％、たとえば少なくとも７０％、少なくとも７５％、たとえば少なくとも８０、８５％、８６％、７６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％、または９９．５％のの同一性を有する変異体を含む。好ましい実施形態では、変異体は、ヒトのＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２などのＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２と少なくとも９５％または少なくとも９８％などの、少なくとも９０％の同一性を有する。
【００５２】
よって、パッパリシンポリペプチドは、完全長のＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチドおよびそれらの変異体、ならびにこれらの完全長のＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチドおよびそれらの変異体のフラグメントを含む。ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−Ａ２、またはそれらの変異体のフラグメントは、通常、ヒトのＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２などのＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２から選択される少なくとも５つ連続したアミノ酸を含む、またはからなる。フラグメントは、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−Ａ２、またはその変異体から選択される、少なくとも５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、または少なくとも１４００、または少なくとも１５００が連続したアミノ酸を含んでもよい。
【００５３】
さらに、本発明のフラグメントは、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−Ａ２、またはその変異体から選択される、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、７５未満、または５０未満、２５未満、または１０未満の連続したアミノ酸を含んでもよい。
【００５４】
本発明のパッパリシンフラグメントの好ましい長さは、特定のフラグメントの用途に依存する。免疫化に使用されるパッパリシンフラグメントは、完全長の酵素を必ずしも必要とするわけではない。しかしながら、生物試料中のパッパリシンポリペプチドを検出する方法は、概して、通常は完全長である天然のパッパリシンを生物学的に検出することを目的とする。
【００５５】
好ましくは、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２の変異体および／またはフラグメントは、機能的なフラグメント、特に、ＩＧＦＢＰ４および／またはＩＧＦＢＰ５などのＩＧＦＢＰを切断することができる金属タンパク質分解性フラグメントである。
【００５６】
スタニオカルシンポリペプチド
スタニオカルシンは糖タンパク質であり、スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）およびスタニオカルシン２（ＳＴＣ２）を含む。ヒトのＳＴＣ１およびＳＴＣ２（ｈＳＴＣ１およびｈＳＴＣ２）は、ホモダイマーの糖タンパク質（ｇｌｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）であり、それぞれ、約３０〜３５ｋＤａおよび約３５〜４０ｋＤａのサブユニットを有する。成熟したＳＴＣ１タンパク質は、２４７の長さのアミノ酸であり、ＳＴＣ２タンパク質はこれより長く、３０２のアミノ酸からなる。新規に合成されたＳＴＣのＮ末端部は疎水性であり、タンパク質分泌のためのシグナルペプチドとして機能する。ＳＴＣは、幅広い範囲の真核生物の中で保存される。
【００５７】
ＳＴＣのブラスト探索から、このタンパク質は、認識可能なタンパク質のモチーフを持たない固有のアミノ酸配列を有し、結果として、これら配列に基づきＳＴＣの生化学的な機能を予測することが不可能であることが明らかとなっている。さらに、ＳＴＣ２のアミノ酸配列は、所定の種でＳＴＣ１と３０％未満同一である。しかしながら、糖鎖付加部位の保存を含む、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の間でのある程度の配列相同性が存在する。さらに、ＳＴＣ１で見出される１１のすべてのシステイン残基が、ＳＴＣ２で保存されていると考えられる。さらに、エキソン−イントロン結合は、２つのＳＴＣの間で保存されており、共通する先祖遺伝子に由来することが示唆されている。保存されたＳＴＣのシステイン残基のうち１０個は、分子内ジスルフィド架橋を形成し、１１番目は、ＳＴＣのホモダイマーまたはヘテロダイマーのサブユニットと結合する、分子内ジスルフィド結合を形成する。ＳＴＣ２は、合計１４のシステイン残基を有し、ＳＴＣ１と比較して、ヒトＳＴＣ２は、ヒスチジンクラスター（ＨＨｘｘｘｘＨＨ）を含む延長されたＣ末端を有し、これにより二価金属イオンを配位できる。
【００５８】
本発明の文脈では、用語「スタニオカルシン」または「ＳＴＣ」は、スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）およびスタニオカルシン２（ＳＴＣ２）のポリペプチドが含まれることを意味する。この用語は、いずれかの種のスタニオカルシンポリペプチドを含み、よって、いずれかの哺乳類のスタニオカルシンのタンパク質、すなわち、特にマウスのＳＴＣ１およびマウスのＳＴＣ２をも含む、ヒトのＳＴＣ１およびヒトのＳＴＣ２との相同性を有するいずれかのスタニオカルシンを包有する。用語「スタニオカルシン」または「ＳＴＣ」はまた、いずれかのＳＴＣ１およびＳＴＣ２のポリペプチドの変異体およびフラグメントをも含む。この用語は、単量体、ならびにホモマー多量体およびヘテロマー多量体の両方といったポリペプチドの多量体の形態を包有する。具体的に、スタニオカルシンは、ＳＴＣ１のホモダイマーおよび／またはＳＴＣ２のダイマー、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を形成してもよく、またはＳＴＣ１およびＳＴＣ２のスタニオカルシンヘテロダイマーもしくはその変異体を形成してもよい。
【００５９】
具体的には、本明細書で使用される用語「ＳＴＣ１」および「ＳＴＣ２」は、特にマウスまたはヒトのＳＴＣ１およびＳＴＣ２などの哺乳類のＳＴＣ１およびＳＴＣ２といった、
いずれかの種のヒトＳＴＣ１およびＳＴＣ２の相同ポリペプチドを包有することを意味する。ここでは、ヒトのＳＴＣ１およびＳＴＣ２が最も好ましい。
【００６０】
本発明の方法、抗体、薬剤、組成物、およびポリペプチドの１つの好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドはヒトのスタニオカルシンまたはその変異体であり、具体的には、本発明の方法、抗体、薬剤、組成物、およびポリペプチドのスタニオカルシンポリペプチドは、
ａ．ヒトのスタニオカルシン１（配列番号１）および／またはヒトのスタニオカルシン２（配列番号２）と、
ｂ．配列番号１および配列番号２のいずれかと少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド変異体と、
ｃ．ａおよびｂのいずれかのポリペプチドのポリペプチドフラグメントと、
ｄ．ａからｃのいずれかのポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドからなるダイマーと
からなる群から選択される。
【００６１】
よって、１つの好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドはＳＴＣ１であり、別の好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドはＳＴＣ２である。スタニオカルシンポリペプチドの変異体は、ＳＴＣ１（配列番号１）またはＳＴＣ２（配列番号２）のいずれか１つと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％、または９９．５％の同一性を有する変異体を含む。好ましい実施形態では、変異体は、ヒトのＳＴＣ１またはＳＴＣ２などのＳＴＣ１またはＳＴＣ２と、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性といった、少なくとも９０％の同一性を有する。
【００６２】
よって、スタニオカルシンポリペプチドは、ヒトのＳＴＣ１またはＳＴＣ２などの完全長ＳＴＣ１およびＳＴＣ２のポリペプチドおよびそれらのいずれかの変異体、ならびにこの完全長のＳＴＣ１およびＳＴＣ２およびそれらの変異体のいずれかのフラグメントを含む。ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはそれらの変異体のフラグメントは、通常、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２から選択される少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。フラグメントは、ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはそれらの変異体から選択される、少なくとも５つ、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、または少なくとも２００の連続したアミノ酸を含んでもよい。
【００６３】
さらに、本発明のフラグメントは、ヒトのＳＴＣ１もしくはＳＴＣ２またはそれらの変異体などのＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはそれらの変異体から選択される、２００未満、１９０未満、１８０未満、１７０未満、１６０未満、１５０未満、１４０未満、１３０未満、１２０未満、１１０未満、１００未満、９０未満、または８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満の連続したアミノ酸を含んでもよい。
【００６４】
本発明のスタニオカルシンフラグメントの好ましい長さは、特定のフラグメントの用途に依存する。免疫化に使用されるパッパリシンフラグメントは、必ずしも完全長の酵素を必要としない。しかしながら、生物試料中のスタニオカルシンポリペプチドを検出する方法は、概して、通常完全長である天然のスタニオカルシンを生物学的に検出することを目的とする。
【００６５】
特定の実施形態では、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の変異体および／またはフラグメントは、機能的なフラグメント、特に、パッパリシンと相互作用できる変異体またはフラグメントなどの機能的なフラグメントである。具体的には、ＳＴＣ１の変異体およびフラグメントは、好ましくは、ＰＡＰＰ−Ａと非共有結合的に相互作用でき、ＳＴＣ２の変異体およびフラグメントは、好ましくは、ＰＡＰＰ−Ａと共有結合性の複合体を形成できる。
【００６６】
１つの好ましい実施形態では、ＳＴＣポリペプチドは、ＳＴＣ２のポリペプチドフラグメントであって、少なくともＣ１２０、すなわちシステイン−１２０に対応するアミノ酸を含む、フラグメントである。
【００６７】
パッパリシン−スタニオカルシンの相互作用
パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、非共有結合的、かつ共有結合的に相互作用する。一態様では、本発明は、少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドと相互作用するパッパリシンポリペプチドに関する。一実施形態では、この相互作用は、非共有結合性の相互作用である。しかしながら、別の実施形態では、この相互作用は、パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドの間の共有結合性の複合である。好ましい実施形態では、非共有結合性相互作用は、ＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２、およびスタニオカルシン１との間に提供され、すなわち、本発明は、ＳＴＣ１ポリペプチドと非共有結合的に相互作用するＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２のポリペプチドを提供する。別の好ましい実施形態では、ＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ２の間で共有結合性の複合体が提供される。
【００６８】
相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの検出
パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用は、パッパリシンの活性、特に、ＩＧＦＰＢ４などのＩＧＦＰＢに対するタンパク質分解活性を阻害する。この、パッパリシンの活性に関するスタニオカルシンの制御型の機能があるならば、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを検出する方法は、一般的な関心事となる。
【００６９】
よって、本発明は、一態様では、試料中における、パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンポリペプチドの間の相互作用を検出する方法を提供する。このような方法は、パッパリシンポリペプチド、スタニオカルシンポリペプチド、および／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対する親和性を有する薬剤の検出を行ってもよい。抗体は特に適切な薬剤であり、これは、抗体が、簡単に検出可能でありながら特異的なタンパク質に対する特異的に活性を有したまま増加することができるためである。
【００７０】
よって、一実施形態では、本方法は、
ａ．上記試料を提供するステップと、
ｂ．パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチド、および相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対する親和性を有する少なくとも１つの抗体を提供するステップと、
ｃ．上記試料を上記抗体に曝露して、上記抗体およびポリペプチドの間に複合体を形成するステップと、
ｄ．過度の非結合の試料を除去するステップと、
ｅ．相互作用する抗体‐パッパリシン‐スタニオカルシンのポリペプチドを、上記抗体のうちの１つに対するさらなる抗体に曝露するステップと、
ｆ．ｃおよび／またはｅの結合抗体の量を検出し、定量化するステップと
を含む。
【００７１】
よって、一実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対して特異的な活性を有する抗体が提供され、すなわち、このような抗体は、独立したパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対する親和性を有していないか、またはほとんど有しておらず、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドであって、両方が非共有結合的に相互作用するポリペプチド、ならびに／または、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを含む、またはからなる共有結合性複合体に高い親和性を有する。またこのような抗体は、本明細書中の他の部分に記載されるように本発明に包有されており、好ましい実施形態では、本発明のこのような抗体は、本発明の検出方法に使用される。
【００７２】
別の実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンを検出する方法は、少なくとも２つの異なる抗体を使用し、１つの抗体は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのうちの１つに対して親和性を有し、別の抗体が、上記パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの内の別の１つに対して親和性を有し、たとえば、１つの抗体はパッパリシンに親和性を有し、別の抗体はスタニオカルシンに親和性を有するか、またはこれらが逆であってもよい。第１の抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける捕捉抗体であってもよく、第２の抗体は結合抗体であってもよい。
【００７３】
よって、一実施形態では、
ａ．上記試料を提供するステップと、
ｂ．パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドの内の１つに対する親和性を有する捕捉抗体に上記試料を曝露して、上記捕捉抗体を上記ポリペプチドに結合させるステップと、
ｃ．上記パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドの内の別の１つに対する親和性を有する結合抗体に上記試料を曝露するステップと、
ｄ．上記捕捉抗体または検出抗体のうちの１つに対するさらなる抗体に、抗体‐パッパリシン−スタニオカルシンの複合体を曝露するステップと、
ｅ．結合した検出抗体および／またはさらなる抗体の量を検出し、定量化するステップと
を含む検出方法が提供される。
【００７４】
好ましい実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合体である。別の好ましい実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、ＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合体である。
【００７５】
試料の選択は、本方法を使用する状況に依存する。本方法を、臨床状態の診断で使用する場合、この試料は、ヒトなどの哺乳類の対象から得られる生物学的な試料、たとえば血液試料または組織試料とすることができる。しかしながら、本方法は、細胞培養物から分泌される相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの量を検出するために使用してもよい。この場合、試料は、このような細胞培養物の培養培地とすることができる。
【００７６】
また本方法は、本明細書中の他の部分に記載されるように、共有結合性および／または非共有結合性の複合体の形成を調節（すなわち刺激または防止）できる薬剤をスクリーニングするために使用してもよい。
【００７７】
パッパリシン組成物
パッパリシンは、スタニオカルシンと安定かつ大量の共有結合性および／または非共有結合性の相互作用を形成し、よってパッパリシン組成物は、一般的に、スタニオカルシンと共有結合的に複合体を形成し、かつ／またはスタニオカルシンと非共有結合的に相互作用する特定量のパッパリシンを含む。よって、分泌したパッパリシンとして得られる組成物中の遊離パッパリシンのレベルは一般的に知られておらず、これは知られていないパッパリシンの画分がスタニオカルシンポリペプチドと結合しているためである。よって、本発明は、一態様では、パッパリシンを含む組成物であって、スタニオカルシンを本質的に含まない組成物に関する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する方法であって、上記組成物が、スタニオカルシンポリペプチドを本質的に含まず、上記方法が、パッパリシンを含む組成物からスタニオカルシンを除去することを含む、方法に関する。一実施形態では、本方法は、
ａ．パッパリシンポリペプチドを含む組成物を提供するステップと、
ｂ．スタニオカルシンポリペプチドを除去するステップと
を含む。
【００７９】
スタニオカルシンを除去することは、遊離スタニオカルシンポリペプチドおよび／または他のポリペプチド、特にパッパリシンポリペプチドと相互作用するスタニオカルシンポリペプチドの両方を除去することを含む。遊離スタニオカルシンおよび複合体化／相互作用するスタニオカルシンの両方を本組成物から除去することが好ましい。
【００８０】
スタニオカルシンは、当業者にとって利用可能ないずれかの方法により除去されてもよい。一実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーにより除去される。しかしながら、他の方法もまた利用可能であり、当業者は使用できる。本発明は、分離に使用する方法に関わらず、ＰＡＰＰ−Ａ、ならびにＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシンの複合体の分離をモニタリングすることを含む。このモニタリングは、本明細書中に記載される方法によるＰＡＰＰ−ＡならびにＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシンの検出を含む。また本発明は、上記方法による分離の検証をも含む。
【００８１】
一実施形態では、パッパリシンポリペプチドを含む組成物は、
ａ．パッパリシンを産生するために十分な時間、パッパリシンを発現する細胞株を培養するステップと、
ｂ．培養培地を収集するステップと、
ｂ．上記培養培地からスタニオカルシンポリペプチドを除去するステップと
により生産される。
【００８２】
この細胞株は、パッパリシンを発現するいずれかの細胞株から選択されてもよく、好ましくはこの細胞株は、ヒトの癌細胞株などのヒト細胞株である。
【００８３】
重要なことに、スタニオカルシンポリペプチドを、培養した細胞株中の１つまたは複数のスタニオカルシンの遺伝子の欠失または破壊により除去してもよい。スタニオカルシンはまた、ＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２のノックダウンなどのｓｉＲＮＡのノックダウンといった、ノックダウンにより除去されてもよい。好ましくは、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の両方がノックダウンされるか、欠失しているか、または破壊されている。遺伝子のノックダウン、破壊、および欠失／ノックアウトの技術は当業者に良く知られている。よって、一実施形態では、本発明は、パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する方法であって、上記組成物が、スタニオカルシンポリペプチドを本質的に含んでおらず、上記方法が、
ａ．パッパリシンを発現する細胞株を提供することと、
ｂ．上記細胞株中スタニオカルシンをコードする遺伝子を欠失もしくは破壊し、かつ／またはＳＴＣ１および／もしくはＳＴＣ２を標的化するｓｉＲＮＡで上記細胞株をトランスフェクトすることと、
ｃ．パッパリシンを産生するために十分な時間、上記細胞株を培養することと
ｄ．上記培養培地を収集することと
を含む、方法を提供する。
【００８４】
また本発明は、別の態様では、パッパリシンポリペプチドを含む組成物を生産する本発明の方法により得ることのできる、または得られる組成物であって、スタニオカルシンポリペプチドを本質的に含んでおらず、上記方法が上述の通りである、組成物に関する。
【００８５】
パッパリシンの定量化
パッパリシンを含む本発明の組成物であって、スタニオカルシンを本質的に含まない組成物は、試料中のパッパリシンのレベル／量を定量化する方法に特に使用される。遊離パッパリシンのレベルは、参照物質がＰＡＰＰ−Ａおよび／またはＰＡＰＰ−Ａ２などの知られているパッパリシンの濃度で利用可能な場合のみ正確に決定できる。本発明の組成物は、この組成物が、スタニオカルシンを本質的に含まず、よってスタニオカルシンと結合していないパッパリシンのみを含むため、このような参照物質または標準物質として使用できる。
【００８６】
よって、一態様では、本発明は、試料中のパッパリシンのレベルを定量化する方法であって、標準物質としてスタニオカルシンを本質的に含んでいない組成物を使用することを含む、方法を提供する。本組成物は、好ましくは、上述で定義される本発明のパッパリシン組成物である。
【００８７】
本方法は、
ａ．試料を得るか、または提供するステップと、
ｂ．知られている濃度のパッパリシンポリペプチドを含む１つ以上の参照組成物を提供するステップであって、１つ以上の参照組成物は、スタニオカルシンポリペプチドを本質的に含んでいないステップと、
ｃ．上記試料および上記参照試料中のパッパリシンポリペプチドのレベルを判定するステップと、
ｄ．上記１つ以上の参照組成物のレベルと、上記試料で決定したパッパリシンポリペプチドのレベルを相関させるステップと
を含んでもよい。
【００８８】
参照試料は、パッパリシンを含まない陰性対照を含んでもよく、追加的な試料は、任意のレベルの、たとえば、約０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬおよび／または１０００ｎｇ／ｍＬなどの、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬのいずれかのレベル非結合パッパリシンを含む。
【００８９】
パッパリシン活性の調節
本発明は、パッパリシンのレギュレーターとしてのスタニオカルシンの広い範囲の使用に関する。本発明者らは、スタニオカルシンが、パッパリシンと安定した非共有結合性相互作用および／または共有結合性の複合体を形成することを発見した。特に、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用は、パッパリシンのタンパク質分解活性を阻害するよう作用することが分かっている。よって、スタニオカルシンはパッパリシンの阻害剤として機能する。このことは、パッパリシンの活性が、スタニオカルシンおよびパッパリシンの間の相互作用の調節を介して制御できることを意味する。たとえば、パッパリシン−スタニオカルシンの相互作用のレベルは、スタニオカルシンを提供することにより増加し、これにより、パッパリシン−スタニオカルシンの相互作用の形成を促進し、結果としてパッパリシンポリペプチドの活性を阻害する。
【００９０】
あるいは、パッパリシン−スタニオカルシンの相互作用のレベルは、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を提供することにより減少でき、これにより、触媒的に活性であり、すなわち、パッパリシンポリペプチドを活性化させる非結合パッパリシン（スタニオカルシンと結合していないパッパリシン）のレベルを増加させることができる。
【００９１】
このように、一般的にパッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンのレベルと陰性的に相関し、よってパッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させることにより減少し、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少することにより増加してもよい。よって本発明の１つの実施形態は、パッパリシンポリペプチドの活性を減少、または増加させる方法であって、
ａ．パッパリシンポリペプチドの活性は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させることにより減少し、
ｂ．パッパリシンポリペプチドの活性が、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少することにより増加する、
方法に関する。
【００９２】
この方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であり、パッパリシンの活性は、試料中、たとえば１つ以上のパッパリシンポリペプチドを発現する細胞培養物などの細胞培養物を含む試料中で制御される。
【００９３】
一実施形態では、本方法は、ヒトの幹細胞などのヒトの細胞におけるスタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加または減少させることにより実施する。本明細書中上述されるように、スタニオカルシンポリペプチドは、任意の種に由来するスタニオカルシンポリペプチドであってもよく、よって、任意の哺乳類のスタニオカルシンポリペプチドとすることができる。好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドは、ヒトまたはマウスのＳＴＣ１またはＳＴＣ２である。本方法は、ヒトなどの哺乳類の対象の特定の組織、たとえば癌組織などの、ヒトなどの哺乳類の対象におけるスタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させるか、または減少させるために使用できる。
【００９４】
よって、一態様では、本発明は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのレベルを減少させるか、または増加させることにより、パッパリシンポリペプチドの活性を減少させるか、または増加させる方法に関する。
【００９５】
スタニオカルシンのレベルは、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少させるか、または増加させることのできる薬剤を試料に提供するか、または投与することにより増加または減少でき、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのレベルは、上記パッパリシンポリペプチドを含む使用に提供される。薬剤の選択は、パッパリシンの活性が増加または減少すると意図されるかどうかに依存する。
【００９６】
一実施形態では、遊離スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少させることにより、パッパリシンポリペプチドの活性を増加させる方法が提供される。一実施形態では、パッパリシンポリペプチドの活性は、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズする薬剤を投与することにより、増大する。
【００９７】
パッパリシンとのこの相互作用をアンタゴナイズするようにスタニオカルシンと結合できる、任意のアンタゴニスト、ポリペプチド、抗体、アプタマー、小分子または他のいずれかの薬剤を、パッパリシンの活性を増大させるために本発明の方法で提供するか、または投与できる。また、パッパリシンの活性に影響を与えることなく、もしくは、パッパリシンの活性に少なくとも大きくは影響を与えることなく、スタニオカルシンとの相互作用をアンタゴナイズするようにパッパリシンと結合できる任意のアンタゴニスト、ポリペプチド、抗体、アプタマー、小分子、または他のいずれかの薬剤を、本方法で提供するか、または投与できる。
【００９８】
たとえば、この薬剤は、スタニオカルシンに対するｓｉＲＮＡ、またはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる抗体などの抗体とすることができる。本発明の方法で使用するための特異的な薬剤は、以下の本明細書中に記載される。
【００９９】
別の実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドを提供または投与することにより、
パッパリシンポリペプチドの活性を阻害する方法が提供される。
【０１００】
スタニオカルシンポリペプチドを提供するための当業者にとって利用可能な多くの方法が存在する。生化学的なアッセイでは、スタニオカルシンポリペプチドは、たとえば、組み換えタンパク質として、適切な緩衝溶液中に提供され得る。細胞系で、スタニオカルシンポリペプチドがヒトなどの哺乳類の対象に投与される場合、スタニオカルシンは、適切な緩衝溶液中のスタニオカルシンポリペプチドとして提供または投与できる。あるいは、たとえば、組み換え型の哺乳類のベクター、またはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターといった、適切なベクターでトランスフェクションした後の導入遺伝子の発現に関与する、送達系を使用することができる。よって、スタニオカルシンポリペプチドを、たとえばレトロウイルスベクターを使用するなどスタニオカルシンポリペプチドまたはその一部を発現する核酸ベクターを使用して、スタニオカルシンポリペプチドを提供することができる。
【０１０１】
治療
パッパリシン、特にＰＡＰＰ−Ａの活性は、多くの臨床状態、特に、増殖性過程の調節に関与する臨床状態で行われている。本発明は、臨床状態の予防、処置、または回復のための方法であって、上記処置が、ＰＡＰＰ−Ａなどのパッパリシンの活性化、またはＰＡＰＰ−Ａなどのパッパリシンの不活性化のいずれかを含む、方法に関する。パッパリシンの活性化は、骨のリモデリングまたは骨の増殖および／もしくは創傷治癒などの、細胞増殖の刺激が望ましい臨床状態の処置に関連している。パッパリシンの不活性化または阻害は、癌の処置などの細胞増殖の阻害が望ましい臨床状態の処置に関連している。
【０１０２】
よって、本発明の一態様では、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、ヒトなどの哺乳類の対象に、有効量のスタニオカルシンポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。本明細書中に上述されるように、スタニオカルシンポリペプチドは、任意の種に由来するスタニオカルシンポリペプチドであってもよく、よって任意の哺乳類のスタニオカルシンポリペプチドとすることができる。好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドは、ヒトまたはマウスのＳＴＣ１またはＳＴＣ２である。有効量のスタニオカルシンを提供することにより、パッパリシンポリペプチドの活性を阻害することができる。パッパリシンポリペプチドの活性は、少なくとも１つのスタニオカルシンポリペプチドとパッパリシンポリペプチドの相互作用により阻害されるが、天然のスタニオカルシンポリペプチドは概してダイマーを形成するため、パッパリシンは大抵の場合、２つのスタニオカルシンダイマーとの相互作用により阻害される。しかしながら、スタニオカルシンはまた、スタニオカルシンモノマーの形態で使用されてもよい。スタニオカルシンモノマーは、１つ以上のシステイン残基の欠失を有するスタニオカルシン変異体の組み換え発現により産生され、これにより、システイン残基のチオール基間のジスルフィド架橋の形成を防止する。この場合、パッパリシンは、２つのスタニオカルシンモノマーとの相互作用など、スタニオカルシンモノマーとの相互作用により阻害される。
【０１０３】
さらなる態様では、薬剤に使用するための、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用を促進できる薬剤、またはこのような薬剤を含む医薬組成物を提供する。このような薬剤は、本明細書中の他の部分に記載されるように、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合できる抗体とすることができる。
【０１０４】
この方法および用途は、増殖性の過程を阻害するよう働き、よって、本方法は、好ましくは、増殖性障害の予防、処置、または回復のために使用される。増殖性過程は、パッパリシンの発現と関連するか、またはパッパリシンの発現の増大に関連することが好ましい。パッパリシンのレベルを判定する方法が、本明細書の他の部分に記載される。具体的には、パッパリシンのレベルの増加を特徴とする、増殖性過程および臨床状態に関連する。また本方法は、インスリン様成長因子‐結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）のパッパリシン媒介型切断に関連する増殖性過程および／または増殖性障害、特にＩＧＦＢＰ４のパッパリシン媒介型の切断に関連する増殖性過程および／または増殖性障害に関連する。
【０１０５】
好ましい実施形態では、臨床状態は癌、特に高いレベルのパッパリシンを特徴とする種類の癌であり、好ましくはスタニオカルシンポリペプチドと相互作用しない高いレベルのパッパリシンを特徴とするいずれかの種類の癌である。
【０１０６】
別の好ましい実施形態では、臨床状態は血管性疾患、特にアテローム性動脈硬化または再狭窄である。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、臨床状態は、卵巣癌患者での腹水の産生などの流体の蓄積が増加する病態である。
【０１０８】
１つの実施形態では、臨床状態は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、星状細胞腫（たとえば小児の小脳または小児の大脳）、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、大脳の星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫（小児上衣腫（Ｅｐｄｎｄｙｍｏｍａ）など）、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍（小児頭蓋外胚細胞腫瘍など）、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌（眼球内黒色腫または網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、妊娠性トロホブラスト腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路の神経膠腫（小児性視床下部および視覚路の神経膠腫など）、眼球内黒色腫、膵島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、唇癌および口腔癌、肺癌（非小細胞もしくは小細胞）、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫など）、マクログロブリン血症（ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症など）、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫（小児髄芽腫など）、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（成年の悪性中皮腫または小児中皮腫など）、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群（小児で発症するものなど）、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、上咽頭癌（小児上咽頭癌など）、神経芽細胞腫、中咽頭癌、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌（小児卵巣癌など）、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣の低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔癌および鼻腔癌、甲状腺癌副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫および上側頭骨（ｓｕｐｒａｔｅｍｐｏｒａｌ）原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺癌、腎盂および尿管の移行細胞の癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（小児横紋筋肉腫など）、唾液腺癌、成年に発症する軟部肉腫、軟部肉腫（小児軟部肉腫など）、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫皮膚癌など）、メルケル細胞の皮膚細胞癌、小腸癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍（小児に発症するものなど）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、トロホブラスト腫瘍（妊娠性トロホブラスト腫瘍など）、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部性神経膠腫（小児性の視覚路および視床下部の神経膠腫）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症またはウィルムス腫瘍から選択される癌である。
【０１０９】
好ましい実施形態では、癌は、卵巣癌、精巣癌、肺癌、または腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌からなる群から選択され、特に、癌は、卵巣癌、肺癌、および結腸癌からなる群から選択される。１つの好ましい実施形態では、癌は卵巣癌である。他の好ましい臨床状態として、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、およびヒトの生殖に関連する臨床状態が挙げられる。
【０１１０】
ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復させる方法であって、有効量のスタニオカルシンポリペプチドをヒトなどの哺乳類の対象に投与することを含む方法では、スタニオカルシンポリペプチドは、当業者にとって利用可能ないずれかの適切な方法により投与できる。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドは、治療上使用するよう適合した適切な緩衝溶液中のスタニオカルシンポリペプチドとして投与される。あるいは、たとえば、組み換え型の哺乳類発現ベクターまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターといった適切なベクターでトランスフェクションした後の導入遺伝子の発現に関与する、送達系を使用できる。よって、スタニオカルシンポリペプチドは、たとえばレトロウイルスベクターを使用するなど、スタニオカルシンポリペプチドまたはその一部を発現する核酸のベクターを使用して、提供できる。
【０１１２】
重要なことに、本発明はまた、細胞増殖の増大が望ましい臨床状態を処置する方法を提供する。このような方法では、パッパリシンは、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用を阻害することにより活性化される。このことにより、たとえば、ＩＧＦ系を刺激するＩＧＦＢ４などのＩＧＦＢＰに対してタンパク質分解活性である、より多くの非結合パッパリシンがもたらされる。
【０１１３】
よって、一態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳類の対象の臨床状態を予防、処置、または回復する方法であって、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる有効量の薬剤を、ヒトなどの哺乳類の対象に投与することを含む、方法に関する。よって薬剤などを提供することにより、スタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドの間の相互作用がアンタゴナイズされ、スタニオカルシンが、パッパリシンを阻害しないようにする。この方法は、増殖性の過程を刺激するために使用でき、よってこの方法は骨折などの臨床状態に適用可能であり、この処置は、骨のリモデリングおよび／または骨の増殖、ならびに創傷であり、この処置または回復は、創傷治癒である。よって好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少できる薬剤を、創傷治癒および／または骨のリモデリングもしくは骨の増殖に使用する。
【０１１４】
さらなる態様では、薬剤に使用するための、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤またはこのような薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの間の相互作用は、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用をアンタゴナイズできるいずれかの薬剤を提供することにより阻害できる。このような薬剤は、たとえば、パッパリシンとの相互作用をアンタゴナイズするようにのスタニオカルシンを結合できる任意のアンタゴニスト、ポリペプチド、抗体、アプタマー、小分子、または他のいずれかの薬剤を含む。また、パッパリシンの活性に影響を与えることなく、またはパッパリシンの活性に少なくとも大きくは影響を与えることなく、スタニオカルシンとの相互作用をアンタゴナイズするようにのパッパリシンを結合できる任意のアンタゴニスト、アプタマー、小分子、または他のいずれかの薬剤を、本発明の方法で提供または投与できる。
【０１１６】
たとえば、薬剤は、スタニオカルシンに対するｓｉＲＮＡまたはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる抗体などの抗体とすることができる。本発明の方法に使用するための具体的な薬剤は、以下の本明細書に記載される。
【０１１７】
好ましい実施形態では、スタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドの間の相互作用は、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用を阻害する、遮断抗体などの抗体を提供することによりアンタゴナイズされる。
【０１１８】
本発明のｓｉＲＮＡ、抗体、およびポリペプチドなどの臨床薬剤は、本明細書中、当業者により利用可能な適切ないずれかの方法により投与されてもよい。主な投与経路は、以下に記載されるように、非経口注射、経口、および局所投与である。薬剤を標的部位に送達するか、または血流に薬剤を導入するために有効な皮下注射などの他の薬剤投与方法もまた考慮される。さらに、鼻腔内投与および肺性吸入による投与は、都合が良く、使用できる有効な投与方法である。
【０１１９】
臨床薬剤は、たとえば経口錠剤として経口的に投与されてもよい。これは、大部分の患者にも好まれている、簡便な非侵襲性の投与手法である。この投与は、消化管を介して簡単に摂取される薬剤に使用できる。
【０１２０】
しかしながら、より好ましい実施形態では、臨床薬剤を非経口的に投与してもよい。これはまた、薬剤が非経口注入を必要とする、追加的な薬剤と併用して投与される場合に適切であり得る。よって本発明の一実施形態では、本明細書中提供される臨床薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、または腹腔内投与により、非経口的に投与される。非経口投与の静脈内形態が、一般的に好ましい。このような投与のための適切な剤形は、従来の技術により調製されてもよい。また臨床薬剤は、鼻腔内および経口の吸入投与によるものである吸入により投与されてもよい。好ましい実施形態では、本発明の臨床薬剤は、静脈内投与、皮下投与、および／または筋肉内投与により送達される。
【０１２１】
用量
用量の必要条件は、使用する特定の臨床薬剤、投与経路、および処置される特定の個体により変動する。理想的には、本方法により処置される個体に、薬剤耐性が起こる前に必要とされる用量よりも一般的に高くない最大耐用量において、薬学的な有効量の臨床薬剤を投与する。
【０１２２】
本発明の方法および用途は、ｓｉＲＮＡ、抗体、またはペプチドなどの臨床薬剤が、有効量で投与されることを提供する。本明細書中の「有効量」は、投与される治療上の作用をもたらす用量を意味する。正確な用量は、処置される臨床状態または障害に依存し、知られている技術を使用して当業者により確認できる。たとえば、本発明の抗体またはペプチドは、１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量を１人の人物に投与できる。さらに、当業者に知られているように、年齢、および体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤の相互作用、投与経路および形式、ならびに臨床状態の重症度に応じた調節が必要な場合があり、これは当業者により通例の実験を用いて確認されるものである。
【０１２３】
本発明の抗体またはポリペプチドは、１日あたり５μｇ〜約２０ｇの範囲の用量で投与できる。一実施形態では、抗体またはポリペプチドの適切な用量範囲は、概して、１日に１〜５００ｍｇ、好ましくは１日に１〜１００ｍｇ、１日に７０〜２００ｍｇ、１日に７０〜１５０ｍｇ、最も好ましくは１日に１〜３０ｍｇ、１日に３０〜７０ｍｇ、１日に４０〜６０ｍｇ、１日に４５〜５５ｍｇ、または１日に約５０ｍｇである。別の実施形態では、抗体またはポリペプチドの適切な用量は、１日に５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１０〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、またはさらには、２０〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、または２５〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、または３０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、または４０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、または５０〜６０ｍｇ／ｋｇである。
【０１２４】
本明細書中他の部分で定義されるように、ｓｉＲＮＡ、抗体、またはポリペプチドなどの臨床薬剤は、好ましくは、少なくとも１日に１回投与され、したがって１日に１回または２回投与されてもよい。本明細書中他の部分に記載されるように、臨床薬剤の投与は、好ましくは、たとえば静脈内注入により、非経口的に投与される。
【０１２５】
パッパリシン活性に対する制御性薬剤
本発明の方法は、スタニオカルシンポリペプチドと相互作用する、パッパリシンポリペプチドのレベルに影響を与えることによりパッパリシンの活性を増大させるか、または減少させることのできる異なる制御性薬剤を使用する。よって、本明細書中の他の部分に記載される方法で使用される薬剤は、以下の段落で定義される。このような薬剤は、たとえば、本発明のスタニオカルシンポリペプチドもしくはその一部、スタニオカルシン標的化ｓｉＲＮＡ、または抗体である。
【０１２６】
本発明は、特定の態様では、このような制御性薬剤に関する。一態様では、本発明は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させるか、または減少させることのできる薬剤を提供する。
【０１２７】
スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加させることが可能な薬剤
一態様は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加できる薬剤に関する。スタニオカルシンポリペプチドのレベルを増加できる薬剤は、スタニオカルシンに関する発現、安定性、分解に対する抵抗などを増大させるよう作用する、いずれかの薬剤を含む。別の態様では、この薬剤は、パッパリシンと相互作用できる、ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはそれらの変異体もしくはフラグメントなどのスタニオカルシンポリペプチドである。好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドは、ヒトのＳＴＣ１またはＳＴＣ２などのＳＴＣ１またはＳＴＣ２である。
【０１２８】
好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少できる薬剤は、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、または卵巣癌、精巣癌、もしくは腹部癌、結腸癌、小腸癌、および直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌などの癌の処置に使用される。
【０１２９】
スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少させることのできる薬剤
別の態様では、本発明は、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少できる薬剤に関する。このような薬剤は、スタニオカルシンの発現および／または安定性を阻害するいずれかの薬剤を含む。
【０１３０】
一実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少できる薬剤は、ＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２などのスタニオカルシンを標的化するｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡを設計する方法は当業者に良く知られている。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号５により同定されるヒトＳＴＣ１遺伝子または配列番号６により同定されるヒトＳＴＣ２遺伝子などのＳＴＣ１またはＳＴＣ２の遺伝子から選択される、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む、またはからなる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号５により同定されるヒトＳＴＣ１遺伝子または配列番号６により同定されるヒトＳＴＣ２遺伝子などのＳＴＣ１またはＳＴＣ２の遺伝子から選択される、５〜３０、１０〜２５、好ましくは１８〜２２の連続したヌクレオチドの配列を含む、またはからなる。しかしながら、いずれかの種類の干渉核酸を使用することができる。
【０１３１】
パッパリシン‐スタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤
別の態様では、本発明は、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤に関する。このような薬剤は、スタニオカルシンの発現および／または安定性を阻害するいずれかの薬剤を含む。
【０１３２】
好ましい実施形態では、スタニオカルシンポリペプチドのレベルを減少でき、かつ／またはパッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤は、創傷治癒および／または骨のリモデリングもしくは骨の増殖に使用される。
【０１３３】
パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤は、パッパリシンとの相互作用をアンタゴナイズする方法でスタニオカルシンポリペプチドと結合できる、任意のアンタゴニスト、ポリペプチド、抗体、、アプタマー、小分子、または他のいずれかの薬剤から選択されてもよい。また、パッパリシンの活性に影響を与えることなく、またはパッパリシンポリペプチドの活性に少なくとも大きくは影響を与えることなく、スタニオカルシンポリペプチドとの相互作用をアンタゴナイズする方法で、パッパリシンと結合できる任意のアンタゴニスト、ポリペプチド、抗体、アプタマー、小分子、または他のいずれかの薬剤が、適切な薬剤である。
【０１３４】
一実施形態では、薬剤は本明細書中以下に記載される抗体である。
【０１３５】
抗体
好ましい実施形態では、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤は、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用の相互作用をアンタゴナイズするようにスタニオカルシンポリペプチドと特異的に結合できる抗体などの、スタニオカルシンポリペプチドに対する抗体である。この抗体は、好ましくは、ヒトのＳＴＣ１またはＳＴＣ２などのＳＴＣ１またはＳＴＣ２に対する抗体である。しかしながら、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の両方を標的化する抗体も使用可能である。本発明者らは、パッパリシンとＳＴＣ２の共有結合に関与しているＳＴＣ２のＣ１２０を同定した。よって、好ましい実施形態では、ＳＴＣおよびパッパリシン（ｐａｐｐｌｙｓｉｎ）の間の相互作用をアンタゴナイズできる抗体は、ＳＴＣ２のＣ１２０残基を含む、１つ以上のペプチドに対する抗体である。たとえば抗体は、ＳＴＣ２のアミノ酸残基６０〜１８０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基７０〜１７０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基８０〜１６０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基９０〜１５０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基１００〜１４０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基の１１０〜１３０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基１１５〜１３０の間の領域、ＳＴＣ２のアミノ酸残基１１９〜１２５の間の領域から選択される３〜１５個のアミノ酸フラグメントに特異的である。
【０１３６】
スタニオカルシンを特異的に標的とし、パッパリシンポリペプチドとの相互作用をアンタゴナイズする候補となる抗体の特質は、本発明の方法により検証できる。
【０１３７】
また、パッパリシンポリペプチドを標的化する抗体は、パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの間の相互作用のアンタゴナイズに関連する薬剤である。よって別の実施形態では、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤は、パッパリシンポリペプチドに対する抗体であり、パッパリシンの活性に影響を与えることなく、またはパッパリシンの活性に少なくとも大きくは影響を与えることなく、スタニオカルシンとの相互作用をアンタゴナイズするように、パッパリシンと結合できる。
【０１３８】
本発明の一態様では、相互作用するスタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドと特異的に結合できる抗体が提供される。この態様では、たとえば、パッパリシンポリペプチドおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドを結合することにより、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用を促進できる抗体が提供される。パッパリシンおよびスタニオカルシンは、共有結合的に、かつ／または非共有結合的に相互作用してもよい。たとえば、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１は、非共有結合的に相互作用し、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２は、共有結合性の複合体を形成する。よって、本発明の抗体は、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合体など、相互作用するスタニオカルシンおよびパッパリシンのポリペプチドを特異的に結合できる。抗体は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと同時に結合してもよい。しかしながらあるいは、抗体は、ポリペプチドが相互作用する際に立体構造が観察される、パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのいずれかの特異的な立体構造を認識してもよい。
【０１３９】
抗体の正確な標的にも関わらず、抗体は、パッパリシン単独またはスタニオカルシン単独のいずれかよりも相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対して高い親和性を有することが好ましい。
【０１４０】
本発明の抗体は、動物の免疫化による従来の方法により増加できる。またこのような方法は、通免疫化に起因する抗体の選択のように本発明の範囲内でもある。
【０１４１】
一態様では、本発明は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに対して特異的な抗体を生産する方法であって、
ａ．マウスなどの動物を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびびスタニオカルシンのポリペプチドで上記マウスを免疫化することと、
ｃ．上記動物から抗体を得ることと
を含む、方法に関する。
【０１４２】
より具体的には、抗体は、
ａ．動物を提供するステップと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを提供するステップと、
ｃ．上記ステップｂの相互作用するポリペプチドを上記動物に投与するステップと、
ｄ．抗体を産生するために十分な時間上記動物を飼育するするステップと、
ｅ．上記動物から試料を得るステップと、
ｆ．上記試料から抗体を得るステップと
を含む方法で生産できる。
【０１４３】
免疫化に使用されるパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、共有結合的に、または非共有結合的に相互作用してもよく、一実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ２の間の共有結合性の複合である。
【０１４４】
組み換え型のパッパリシンおよび／またはＳＴＣポリペプチドを使用して、抗体を生成できる。パッパリシンおよび／またはＳＴＣと反応するモノクローナル抗体は、標準的な技術を使用して生産できる。よって、一実施形態では、本発明は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を生産する方法であって、
ａ．動物を提供するステップと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを提供するステップと、
ｃ．上記ステップｂの相互作用するポリペプチドを上記動物に投与するステップと、
ｄ．抗体を産生するために十分な時間上記動物を飼育するステップと、
ｅ．脾臓の試料などの組織の試料を上記動物から得るステップと、
ｆ．上記組織の試料の抗体産生細胞を単離するステップと、
ｇ．上記ステップｆの単離細胞を適切な細胞株と融合することにより抗体産生ハイブリドーマ細胞を生成するステップと、
ｈ．上記モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を単離するステップと
を含む、方法に関する。
【０１４５】
本明細書中で使用される単一特異性の抗体は、パッパリシンおよび／またはＳＴＣに対する特異的結合の特徴を有する単一の種類の抗体または複数の種類の抗体として定義される。本明細書中で使用されるように、特異的結合は、たとえばパッパリシンに対するＳＴＣの結合部位、またはＳＴＣに対するパッパリシンの結合部位といった、パッパリシンおよび／またはＳＴＣに関連するものなどの特異的な抗原またはエピトープに結合する種類の抗体の特質を指す。パッパリシンおよび／またはＳＴＣに特異的な抗体は、概して、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫化することにより増加し得る。ここではウサギまたはマウスが好ましく、免疫アジュバントを用いるか、または用いることなくパッパリシンおよび／またはＳＴＣの抗原の適切な濃度を用いる。たとえば、パッパリシンおよび／またはＳＴＣに対して特異的な抗体は、研究室の試薬として、および抗体系診断キットにおける、天然および組み換え型のパッパリシンおよび／またはＳＴＣの精製に使用できる。
【０１４６】
パッパリシンおよび／またはＳＴＣと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、パッパリシンおよび／またはＳＴＣポリペプチド／抗原で近交系マウスを免疫化するなどの従来の方法により調製できる。このマウスを、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのパッパリシンおよび／またはＳＴＣのポリペプチド／抗原を含む、当量の適用可能なアジュバントが組み込まれる約０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水で免疫化する。完全フロイントアジュバントが好ましい。マウスに、０日目に最初の免疫化を行い、約３〜３０週間休息させる。免疫化したマウスに、約０．１〜約１０ｍｇのパッパリシンおよび／またはＳＴＣポリペプチド／抗原を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝溶液の１つ以上の追加免疫を、静脈内（ＩＶ）経路により与えてもよい。抗体陽性マウス由来のリンパ球は、当業者に知られている標準的な手法により免疫化したマウスから脾臓を除去することにより得られる。ハイブリドーマ細胞は、安定したハイブリドーマの形成を可能にする条件下で、適切な融合パートナーと脾臓のリンパ球を混合することにより産生される。融合したハイブリドーマ細胞は、当業者に知られている手法によるヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖により選別される。上清流体は、約１４、１８、および２１日目に増殖が陽性のウェルから回収され、抗原としてのパッパリシンおよび／またはＳＴＣを使用した固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイにより、抗体産生に関してスクリーニングする。また、培養流体は、ｍＡＢのアイソタイプを決定するため、オークタロニー沈殿アッセイで試験する。次いで、抗体陽性のウェル由来のハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０１４７】
抗パッパリシンまたは抗ＳＴＣのｉｎ  ｖｉｔｏｒｏでの産生は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、培養培地でハイブリドーマを増殖することにより実行される。ｍＡｂは、当業者に知られた技術で精製される。
【０１４８】
腹水またはハイブリドーマ培養流体の抗体の力価は、限定するものではないが、沈殿、受動凝縮、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の技術を含む、様々な血清学的または免疫学的アッセイにより決定される。
【０１４９】
また「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。同定されたファージ抗体は、細菌中で発現させることにより産生できる。
【０１５０】
上述したような方法は、パッパリシンおよび／またはＳＴＣポリペプチドのフラグメント、または完全長の新生パッパリシンおよび／またはＳＴＣポリペプチドに対して特異的な単一特異性抗体を産生するために使用されてもよい。
【０１５１】
パッパリシンおよび／またはＳＴＣの抗体の親和性カラムは、アフィゲル１０（バイオラッド）、抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで前活性化するゲル担体などのゲル担体に抗体を添加することにより作製できる。次いで抗体は、スペーサーアームとのアミド結合を介してゲルに結合する。残りの活性化エステルを、１ＭのエタノールアミンＨＣＩ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭのグリシンＨＣＩ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合型抗体または外来性のタンパク質のいずれかを除去する。次いでカラムを、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡にし、パッパリシンおよび／もしくはＳＴＣ、またはパッパリシンおよび／もしくはＳＴＣフラグメントを含む細胞培養物の上清または細胞抽出物を、ゆっくりとカラムに通す。次いでカラムを洗浄し。タンパク質を溶出させる。次に精製したパッパリシンおよび／またはＳＴＣのタンパク質を、リン酸緩衝食塩水に対して透析する。
【０１５２】
非トランスフェクト細胞株（内在的にＳＴＣを分泌する）由来のヒトの血漿もしくは血清、組織抽出物、または培地などの供給源由来の天然のパッパリシンおよび／またはＳＴＣはまた、抗体親和性カラムを使用することにより精製してもよい。
【０１５３】
パッパリシンおよび／ＳＴＣに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して、多くのアッセイが、パッパリシンおよび／またはＳＴＣの抗原、特に、体液または組織および細胞抽出物中の不活性パッパリシンおよびＳＴＣポリペプチドの測定に関して構築されてもよい。抗体に基づくキットは、診断の目的に使用されてもよい。このアッセイとして、限定するものではないが、沈降、受動凝縮、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）技術、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術が挙げられる。
【０１５４】
たとえば、ＥＬＩＳＡを使用して、試料に存在する抗原が、免疫化されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体（ＳＴＣ）により捕捉されるサンドイッチアッセイが構築できる。次いで、１つ以上のモノクローナルパッパリシン抗体およびペルオキシダーゼ結合型抗（マウスＩｇＧ）を使用することにより検出が行われる。別のアッセイでは、試料に存在する抗原は、免疫化したモノクローナルまたはポリクローナル抗（パッパリシン）により捕捉され、ビオチン化ポリクローナル抗（ＳＴＣ）を使用して検出される。
【０１５５】
また、試料に存在するいずれかの抗原を、免疫化モノクローナル抗体により捕捉するＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを構築できる。次いで、ビオチン化抗体などの結合型モノクローナル抗体を使用することにより検出を行う。よって別の実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを、パッパリシンおよびスタニオカルシンの共有結合性および／または非共有結合性の複合体と特異的に結合するモノクローナル抗体と試料を接触させ、次いで、ビオチン化抗体などの結合型モノクローナル抗体と、パッパリシン／スタニオカルシン抗体複合体を接触させることにより検出する
【０１５６】
精製したパッパリシンおよび／またはＳＴＣを使用して、特に知られている濃度の非結合パッパリシンまたは知られている濃度の相互作用するパッパリシンおよびＳＴＣのポリペプチドを含む濃度を使用して、アッセイを較正できる。このような較正は、段階希釈による標準曲線を構築することを含む。
【０１５７】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を使用して、パッパリシンとＳＴＣの相互作用を阻害してもよいが、好ましい実施形態ではモノクローナル抗体を使用する。また、このような抗体は、本明細書中では遮断抗体と呼ばれる。特に、このような抗体を使用して、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２を含む、もしくはからなる共有結合性複合体の形成、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ１の間の非共有結合性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａ２およびＳＴＣ２を含む、もしくはからなる共有結合性の複合体の形成を阻害することができる。
【０１５８】
また、特定のモノクローナル抗体は、パッパリシンとＳＴＣの相互作用に関して阻害性であってもよい。このようなモノクローナル抗体は、パッパリシンの結合部位におけるエピトープを認識しやすいが、阻害活性は隣接するエピトープへの結合に基づく場合がある。阻害性モノクローナル抗体は、パッパリシンおよび／もしくはＳＴＣのポリペプチド、またはそのフラグメントでの免疫化により得ることができる。
【０１５９】
パッパリシンとＳＴＣの相互作用は、ＩＧＦ−ＢＰ４などのＩＧＦＢＰのパッパリシン媒介型切断を阻害し、よって、パッパリシンに結合するＳＴＣを阻害できる抗体がまた、ＩＧＦ−ＢＰ４のパッパリシン媒介型切断を活性化または促進するようにも働き、これにより次にＩＧＦ受容体の活性化がもたらされる。ＩＧＦ受容体の活性化は、細胞増殖に関与することが知られており、同様に動脈硬化プラークに関連することも知られている。
【０１６０】
パッパリシンおよびＳＴＣの間の相互作用に対して阻害性である抗体は、パッパリシンの活性を増大させることが望ましい臨床状態において治療効果を有する。このような状態として、たとえば、本明細書中に上述される創傷治癒および骨のリモデリングが挙げられる。
【０１６１】
臨床状態を判定する方法
多くの障害、特に特定の癌形態に、パッパリシンまたはスタニオカルシンの変質した発現が関連している。よって一態様では、本発明は、臨床状態を判定する方法であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドを検出することを含む方法に関する。
【０１６２】
一実施形態では、本方法は、スタニオカルシンポリペプチドと相互作用するパッパリシンポリペプチドを検出することを含む。しかしながら、別の実施形態では、パッパリシンポリペプチドと相互作用するスタニオカルシンポリペプチドを検出する。
【０１６３】
いずれかの特定のパッパリシン／スタニオカルシンの相互作用は、診断方法で検出されてもよい。相互作用は、非共有結合性相互作用および共有結合性の複合体を含んでもよい。一実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−ＡならびにＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２の間の非共有結合性相互作用である。別の実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−Ａ２ならびにＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２の間の非共有結合性相互作用である。さらなる実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−ＡならびにＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２の間の共有結合性の複合であり、さらなる別の実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−Ａ２ならびにＳＴＣ１および／またはＳＴＣ２の間共有結合性の複合である。好ましい実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有結合性の複合である。別の実施形態では、相互作用は、ＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合である。
【０１６４】
診断方法は、いずれかの適切な臨床状態、特にパッパリシンおよび／またはスタニオカルシンに関連する状態の判定に使用してもよい。
【０１６５】
一実施形態では、臨床状態は癌である。一実施形態では、臨床状態は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、星状細胞腫（たとえば小児の小脳または小児の大脳）、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、大脳の星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫（小児上衣腫（Ｅｐｄｎｄｙｍｏｍａ）など）、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍（小児頭蓋外胚細胞腫瘍など）、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌（眼球内黒色腫または網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、妊娠性トロホブラスト腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路の神経膠腫（小児性視床下部および視覚路の神経膠腫など）、眼球内黒色腫、膵島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、唇癌および口腔癌、肺癌（非小細胞もしくは小細胞）、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫など）、マクログロブリン血症（ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症など）、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫（小児髄芽腫など）、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（成年の悪性中皮腫または小児中皮腫など）、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群（小児で発症するものなど）、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、上咽頭癌（小児上咽頭癌など）、神経芽細胞腫、中咽頭癌、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌（小児卵巣癌など）、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣の低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔癌および鼻腔癌、甲状腺癌副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫および上側頭骨（ｓｕｐｒａｔｅｍｐｏｒａｌ）原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（小児横紋筋肉腫など）、唾液腺癌、成年に発症する軟部肉腫、軟部肉腫（小児軟部肉腫など）、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫皮膚癌など）、メルケル細胞の皮膚細胞癌、小腸癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍（小児に発症するものなど）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、トロホブラスト腫瘍（妊娠性トロホブラスト腫瘍など）、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部性神経膠腫（小児性の視覚路および視床下部の神経膠腫）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症またはウィルムス腫瘍から選択される癌である。
【０１６６】
好ましい実施形態では、癌は、卵巣癌、精巣癌、肺癌、または腹部癌、結腸癌、小腸癌、直腸癌を含む消化器系のいずれかの癌からなる群から選択され、特に癌は、卵巣癌、肺癌、および結腸癌からなる群から選択される。１つの好ましい実施形態では、癌は卵巣癌である。他の好ましい臨床状態として、再狭窄、アテローム性動脈硬化、排卵、線維症、およびヒトの生殖に関連する臨床状態が挙げられる。
【０１６７】
本発明の診断方法では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドは、本明細書中の他の部分に定義されように、いずれかの適切な方法、特に本発明のいずれかの方法を使用して検出されてもよい。一実施形態では、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用は、少なくとも１つの抗体を使用して検出される。この相互作用は、好ましくは、ＥＬＩＳＡなどの固相イムノアッセイで２つの異なる抗体を使用して検出される。たとえば、相互作用は、パッパリシンに特異的な抗体および／またはスタニオカルシンに特異的な抗体を使用して検出されてもよい。たとえば、パッパリシンに特異的な抗体は、捕捉抗体として使用することができ、次いでスタニオカルシンに特異的な抗体を検出抗体として使用することができる。本来、抗体の機能は交換し得るものであり、スタニオカルシンに特異的な抗体を捕捉抗体として使用し、パッパリシンに特異的な抗体を検出抗体として使用できる。
【０１６８】
スクリーニング方法
本発明の主な態様は、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに関する。このような相互作用するポリペプチドは、多くの異なる応用に使用されており、これらもまた本発明の範囲内にある。よって、本発明の特定の態様は、相互作用するパッパリシンおよび／またはスタニオカルシンのポリペプチドの検出および／または調節に使用できる特定の薬剤を同定する方法、特にＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン１の間の非共有性相互作用、ならびに／またはＰＡＰＰ−Ａおよびスタニオカルシン２の間の共有結合性の複合の検出ならびに／または調節に使用できる特定の薬剤を同定する方法における、パッパリシンおよび／またはスタニオカルシンの相互作用または複合体の使用に関する。
【０１６９】
相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの潜在的な検出薬剤、または調節／修飾薬剤は、治療可能性を有する任意の薬剤などの、任意の関連する薬剤を含んでもよい。一実施形態では、薬剤は、パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドまたはその一部のエピトープに対する抗体などの抗体である。
【０１７０】
アンタゴナイズ薬剤
一態様では、パッパリシンポリペプチドとスタニオカルシンポリペプチドの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を同定する方法が提供される。
【０１７１】
スタニオカルシンおよびパッパリシンの間の相互作用に関連して本明細書中で使用される用語「アンタゴナイズ」は、パッパリシンおよびスタニオカルシンの間の相互作用
を阻害する薬剤の特質を指す。
【０１７２】
本発明の方法は、
ａ．パッパリシンポリペプチドおよびスタニオカルシンのポリペプチドを提供するステップと、
ｂ．上記薬剤を提供するステップと、
ｃ．上記パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤をインキュベートするステップと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの存在の有無を検出するステップと、
ｅ．ステップｄで検出される、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドの存在の有無に基づき、上記薬剤がパッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできるかどうかを判定するステップと
を含む。
【０１７３】
この方法の好ましい実施形態では、
ａ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドがないことは、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできる薬剤を表し、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドが存在することは、パッパリシンとスタニオカルシンの相互作用をアンタゴナイズできない薬剤を表す。
【０１７４】
たとえば、抗パッパリシン抗体などのパッパリシンに対する薬剤の収集物を、スタニオカルシンとパッパリシンの相互作用をアンタゴナイズするように、パッパリシンと結合する特質に関してスクリーニングできる。あるいは、抗スタニオカルシン抗体などのスタニオカルシンに対する薬剤の収集物を、パッパリシンとスタニオカルシンとの相互作用をアンタゴナイズするようにスタニオカルシンを結合する特質に関してスクリーニングできる。
【０１７５】
特定の結合薬剤
別の態様では、
ａ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、
ｂ．パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露する表面ではない、領域、
ｃ．パッパリシンポリペプチドであって、スタニオカルシンポリペプチドと相互作用しない、パッパリシンポリペプチド、
ｄ．スタニオカルシンポリペプチドであって、パッパリシンポリペプチドと相互作用しない、スタニオカルシンポリペプチド
と結合できる薬剤を同定する方法であって、
ｉ．上記薬剤を提供することと、
ｉｉ．パッパリシンと相互作用しないスタニオカルシンポリペプチド、ならびに／またはスタニオカルシンと相互作用しないパッパリシンポリペプチド、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｉｉｉ．薬剤が、パッパリシンと相互作用しないスタニオカルシンポリペプチド、ならびに／またはスタニオカルシンと相互作用しないパッパリシンポリペプチド、ならびに／または相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドのうち１つ以上と結合するかどうかを判定することと
を含む方法が提供される。
【０１７６】
この方法の一実施形態では、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合できる薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合する薬剤を選択することと
を含む方法により同定する。
【０１７７】
この方法の別の実施形態では、パッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドのポリペプチド領域であって、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドに曝露した表面でない領域に結合できる薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチド、ならびに／または非結合パッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触することと、
ｃ．薬剤が相互作用するパッパリシンおよび／またはスタニオカルシンのポリペプチド、ならびに／または非結合パッパリシンポリペプチドおよび／もしくはスタニオカルシンポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することであって、上記薬剤が非結合パッパリシンおよび／またはスタニオカルシンポリペプチドと結合することと
を含む方法により同定される。
【０１７８】
本方法の別の実施形態では、非結合パッパリシンポリペプチド（すなわちスタニオカルシンポリペプチドと相互作用しないパッパリシン）と結合できる薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合パッパリシンポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤が非結合パッパリシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しないかどうかを判定することと、
ｄ．非結合パッパリシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む方法により同定し、上記薬剤は、スタニオカルシンに関する結合部位を含む領域でパッパリシンと結合する。
【０１７９】
本方法の別の実施形態では、非結合スタニオカルシンポリペプチド（すなわち、パッパリシンポリペプチドと相互作用しないスタニオカルシン）と結合できる薬剤を、
ａ．上記薬剤を提供することと、
ｂ．非結合スタニオカルシンポリペプチドならびに相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと上記薬剤を接触させることと、
ｃ．薬剤がスタニオカルシンポリペプチドならびに相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合するかどうかを判定することと、
ｄ．スタニオカルシンポリペプチドと結合し、相互作用するパッパリシンおよびスタニオカルシンのポリペプチドと結合しない薬剤を選択することと
を含む方法により同定する。
【０１８０】
たとえば、パッパリシンおよび／またはスタニオカルシンのいずれかと特異的に結合する抗体などの様々な薬剤を、非相互作用性のパッパリシンまたはスタニオカルシンのポリペプチドと結合することなく、相互作用するパッパリシン／スタニオカルシンのポリペプチドと選択的に結合する特質に関してスクリーニングできる。
【０１８１】
実施例
実施例１
材料および方法
提示する結果を得るために使用した実験上の手順をこのセクションで説明する。
【０１８２】
細胞培養およびトランスフェクション
すべての細胞を５％のＣＯ２の中、３７℃で培養した。ヒトの胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ  １９８７）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸、およびゲンタマイシン（１０％ＳＥＭ）を補充した高‐グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。
【０１８３】
一過性のトランスフェクションのために、２．５×１０６の細胞を６ｃｍの培養皿の上に播種するか、または６．３×１０６の細胞を１０ｃｍの培養皿上に播種し、２ｍＭ、ｐＨ７．４のトリスに溶出したＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により調製した、それぞれ１０または２０μｇのプラスミドを使用して、リン酸カルシウムでの共沈により、（６０〜７０％の細胞のコンフルエンスで）２０時間後にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０％のＳＥＭまたは無血清培地（ＳＦＭ）中で維持した。収集した培養培地を遠心（３分、３２００ｒｐｍ）により除去し、培養物の上清を保存した。
【０１８４】
トランスフェクションに使用したプラスミドのｃＤＮＡ構築物
ヒトのｗｔ  ＰＡＰＰ−Ａ  ｃＤＮＡ：成熟したＰＡＰＰ−ＡポリペプチドのＣＤ１１シグナルペプチドおよび残基１〜１５４７をコードするｐｃＤＮＡ３．１−ｈｕＰＡＰＰ−Ａは（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ２０００）に記載。
空のプラスミド：ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｃＤＮＡ：ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＧＴ
ＰＡＰＰ−Ａ変異体：ＰＡＰＰ−Ａ変異体をコードするｃＤＮＡを含む構築物は従来より記載；ＰＡＰＰ−Ａ−Ｅ４８３Ｑ（Ｂｏｌｄｔ  ２００１）、ＰＡＰＰ−ＡｄＬＮＲ１、ＰＡＰＰ−ＡｄＬＮＲ２、ＰＡＰＰ−ＡｄＬＮＲ１−２、ＰＡＰＰ−Ａ−３５６Ａ、ＰＡＰＰ−Ａ３８９Ａ（Ｗｅｙｅｒ  ２００７）、ＰＡＰＰ−Ａ／ＰＡＰＰ−Ａ２キメラ（Ｅ．Ｇａｉｄａｍａｕｓｋｕｓ、Ｃ．  Ｏｘｖｉｇ、未公開）、ｚｆＰＡＰＰ−Ａ（Ｋｊａｓｒ−Ｓ０ｒｅｎｓｅｎ  ２００９、未公開）、ｍｕＰＡＰＰ−Ａ（Ｓｏｅ  ２００２）
ヒトのＳＴＣ１  ｃＤＮＡ：ｍｙｃ−ｈｉｓ−タグ化ヒトＳＴＣ１のＣ末端にコードされるｐｃＤＮＡ３．１−ＳＴＣ１（Ｊ．  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｃ．  Ｏｘｖｉｇにより作製、未公開）
ヒトのＳＴＣ２  ｃＤＮＡ：ｍｙｃ−ｈｉｓ−タグ化ヒトＳＴＣ２のＣ末端にコードされるｐｃＤＮＡ３．１−ＳＴＣ２（Ｊ．  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｃ．  Ｏｘｖｉｇにより作製、未公開）
ｐｒｏＭＢＰ  ｃＤＮＡ：ｐｃＤＮＡ３．１−ｐｒｏＭＢＰは、従来通り作製された（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ  ２００４）。
【０１８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加により非還元性にするか、または還元した。その後試料を、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーに添加し、５〜１５％、１０〜２０％、または１２％のトリス−グリシンゲルに充填する前に１００℃で２分間加熱した。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動ににおいて、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中３０ｍＡで４０〜６０分間ゲルを泳動させた。タンパク質を、クマシーブリリアントブルー染色またはウェスタンブロッティングにより可視化した。放射性標識したタンパク質を、Ｔｙｐｈｏｏｎホスフォイメージャーを使用するオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１８６】
ウェスタンブロッティング（ＷＢ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、試料を、エタノールブロッティングバッファー（２０％のエタノール、０．２Ｍのグリシン、２５ｍＭのトリス、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．８）中、１．５〜２時間、５００ｍＡおよび２００Ｖでのエレクトロブロットにより、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）上に移した。この膜を２％のＴｗｅｅｎを含むＴＳＴ（５０ｍＭのトリス、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ９．０）で１０分間ブロッキングし、２％のＭ−ＴＳＴ（ＴＳＴ中に希釈した２％のスキムミルク粉末）中に希釈した一次抗体と共に一晩（ＯＮ）インキュベートした。二次的な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型抗体を同様に２％のＭ−ＴＳＴに希釈し、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、展開する前に膜と共に１時間インキュベートした。画像をＸ線フィルム上に記録した。全てのインキュベーションステップの間、膜を、ＴＳＴで徹底的に洗浄した。全てのステップを室温で実行した。使用した抗体を、以下のセクション７．１．９および７．１．１０で列挙する。
【０１８７】
ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ複合体の形成
組み換え型ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１またはＳＴＣ２の共発現では、２９３Ｔ細胞を、５μｇのＰＡＰＰ−Ａおよび５μｇの空のプラスミドＤＮＡ（比較のため）、５μｇのＳＴＣ１またはＳＴＣ２のｃＤＮＡと同時にトランスフェクトした。ＰＡＰＰ−Ａとの共発現では、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の細胞を、５μｇのＰＡＰＰ−Ａ、２．５μｇのＳＴＣ１および２．５μｇのＳＴＣ２のｃＤＮＡと同時にトランスフェクトした、比較した細胞は、常に当量のＤＮＡでトランスフェクトした。次いで、形成された複合体を可視化するために、培養物の上清を、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰを検出するポリクローナル抗体（効果的なポリクローナル抗体）またはヒトのＳＴＣ１またはＳＴＣ２を検出するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングにより解析した。
【０１８８】
別々のタンパク質合成の後のＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ複合体の形成のため、組み換えＰＡＰＰ−ＡまたはＰＡＰＰ−Ａ−Ｅ３８９Ｑ  およびＳＴＣ１またはＳＴＣ２を含む培養物の上清を１：１の容量で混合した。精製したＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体を試験する際、精製したタンパク質をまず、モックトランスフェクト細胞由来の培地と混合し（１０μｇ／ｍｌの濃度のＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰを得るため）、次いで１：１のＳＴＣ２‐培地と混合した。混合物を３７℃で一晩インキュベートするか、または試料を所定の時点で採取し、凍結させて複合体形成を停止させた。形成した複合体を可視化するために、ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰを検出するポリクローナル抗体またはＳＴＣ１もしくはＳＴＣ２を検出するポリクローナル抗体を使用した複合体に特異的なＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングにより混合物を解析した。
【０１８９】
組み換え型ＳＴＣタンパク質の精製
２９３Ｔ細胞を、セクション７．１．１．で説明されるようにリン酸カルシウムの共沈により、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２のｃＤＮＡ（１０ｃｍのプレートあたり２０μｇのプラスミドＤＮＡ）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後に、１０％のＳＥＭを、無血清培地（ＳＦＭ）へと変化させ、回収し、２日後に新鮮なＳＦＭ培地と交換し、さらに２日後に回収した。
【０１９０】
組み換え型ヒトＳＴＣ１またはＳＴＣ２を含むＳＦＭを、結合バッファー（２０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）と１：１で混合し、アフィニティカラムに充填する前に滅菌濾過した。カラムをＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で充填し、Ｈ２Ｏ中の２％のＮｉＳＯ４の添加によりＮｉ２＋で荷電させ、結合バッファーで平衡化した。試料の溶液を、１ｍｌ／分の流速でカラムに添加した。その後カラムを結合バッファーで洗浄し、タンパク質を、２５０μＬの溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）の１０の画分に溶出した
【０１９１】
質量分析
精製したＳＴＣ１およびＳＴＣ２のタンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー染色により可視化した。視覚可能なバンドを切り取り、質量分析のため調製した。よってまず、ゲルプラグを、１５分間Ｓｐｅｅｄｖａｃを使用して脱水し、次いで１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の２０ｍＭのＤＴＴを用いて１０分間還元した。その後、試料を、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中のヨードアセトアミド（ＩＡＮ）で１０分間アルキル化し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の１２．５ｎｇ／μｌのトリプシンを用いて氷上で４５分間消化させた。全てのステップの間、試料を脱水させ、５０％または１００％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて洗浄した。トリプシンバッファーを廃棄し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３消化バッファーを試料に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。最終的に、１００％のＡＣＮを試料に添加し、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析により解析した。モノクローナル抗体を使用して、ＰＡＰＰ−Ａを、ヒトの癌細胞株由来の条件付けされた培地からイムノ沈殿した。タンパク質を、３〜８％のグラジエントゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー染色により可視化した。クマシー染色したタンパク質のバンドを切除し、トリプシン処理し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドマスフィンガープリンティングを行った。
【０１９２】
ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解性アッセイ
ＰＡＰＰ−Ａを、モック培地、ＳＴＣ１−培地、またはＳＴＣ２‐培地と１：１の容量で、３７℃で一晩予めインキュベートした。ＰＡＰＰ−Ａ試料（２００×希釈）を、精製した１２５Ｉ−標識ＩＧＦＢＰ−４（ＩＧＦ−ＩＩ、５０ｎＭ、０．３５μｇ／ｍＬと予めインキュベート）またはＩＧＦＢＰ−５（１０ｎＭ、０．３０μｇ／ｍＬ）を含む５０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カルシウム（ｐＨ７．５）を用いて３７℃でインキュベートした。反応混合物の試料を、０〜１８０分までの所定の時点で採取し、反応を、２０ｍＭのＥＤＴＡを含む試料バッファーを添加することにより停止させた。タンパク質分解活性を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％のトリス−グリシンＬａｅｍｍｌｉゲル）により試料を分離することによりモニタリングした。切断したＩＧＦＢＰ−４または−５および無処置のＩＧＦＢＰ−４または−５のバンド強度を、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒで測定した。バックグラウンドを減算した後、％切断ＩＧＦＢＰ−４または−５を、切断／合計×１００％のＩＧＦＢＰとして計算し、時間の関数としてプロットした。
【０１９３】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）
すべてのＳＰＲ解析を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行した。要約すると、５０００ＲＵのＰＡＰＰ−Ａモノクローナル抗体を、標準的なアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に免疫化した。残りの活性基をエタノールアミンでブロッキングした。条件付けしたＨＥＫ２９３培地中の組み換え型ＰＡＰＰ−Ａを、２００ＲＵのレベルに捕捉した。段階希釈した精製済のＳＴＣ１またはＳＴＣ２を表面に注入した。各ラウンドの結合の後、チップの表面を、低ｐＨバッファーの注入により再度作製した。潜在的なデータを、標準物質１：１ラングミュアモデルと適合させた。
【０１９４】
酵素活性の阻害
まとめると、２０ｐＭのＰＡＰＰ−Ａを、段階希釈した既知の濃度の組み換え発現し、精製したＳＴＣ１またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）と混合し、１時間インキュベートさせた。酵素反応を、１００ｎＭのＩＧＦ−ＩＩと共に１０ｎＭのＩ−１２５標識したＩＧＦＢＰ−４の添加により開始した。試料を異なる時点で採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。切断の度合いを、リン光体イメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｉｎｇ）を使用する濃度測定により判定した。各ＳＴＣの濃度の相対的な初期の速度（％活性としての発現）を推定し、その時点をグラフにプロットした。阻害定数Ｋｉの推定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアのＯｎｅ  ｓｉｔｅ  Ｆｉｔ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）Ｋｉモデルを使用して行った。
【０１９５】
結果
ＳＴＣタンパク質の発現およびＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ複合体の解析
ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の検討を可能にするために、組み換えタンパク質の発現を行った。組み換え型のヒトのＳＴＣ１およびＳＴＣ２をコードするｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを構築し、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の発現を、これらの構築物でトランスフェクトした細胞で検証した。さらに、本出願人は、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１またはＳＴＣ２のいずれかのｃＤＮＡで２９３Ｔ細胞を共トランスフェクトすることにより、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１またはＳＴＣ２の間のタンパク質複合体形成の可能性を試験した。トランスフェクションの後に、培養物の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元または非還元条件下で実施し、ＳＴＣに特異的なウェスタンブロットを作製した（図１）。ＳＴＣ２およびＳＴＣ１に対するＳＴＣ１に特異的な抗体（ａＳＴＣ１  Ａｂｓ）およびＳＴＣ２に特異的な抗体（ａＳＴＣ２  Ａｂｓ）の交差反応性の可能性をそれぞれ、ウェスタンブロッティングにより除外した（不図示）。
【０１９６】
馴化培地中のＳＴＣ１およびＳＴＣ２の存在を、還元性条件および非還元性条件の両方の下検出した。非還元性条件下では、ＳＴＣ１を、〜７０ｋＤａのかすかなバンドで検出し、これは、共有結合したＳＴＣ１ダイマーを表す（図１Ａ）。より大量の試料を充填すると、より別個のバンドがもたらされる。還元性条件下では、〜３５ｋＤａの１つのＳＴＣ１のバンドが現れ、これは、ＳＴＣ１モノマーに対応した。ＳＴＣ２モノマーもまた還元性条件下で現れ、〜４５ｋＤａの別のバンドにより表された（図１Ｂ）。非還元性条件下では、ＳＴＣ２タンパク質は、主に〜１００ｋＤａのバンドにより表されるが、より高い分子量である〜２００ｋＤａおよび〜１５０ｋＤａ、および＞２５０ｋＤａのバンドも検出可能であった。これらのバンドは、恐らく、ＳＴＣ２タンパク質の多量体を表したものであった。一般的にＳＴＣ検出抗体は、非還元性タンパク質よりも還元性ＳＴＣを良好に認識するようであった。
【０１９７】
図１Ａに示されるように。ＳＴＣ１およびＰＡＰＰ−ＡのｃＤＮＡとの共トランスフェクションは、ＳＴＣ１のウェスタンブロットにおいて追加的なバンドを全くもたらさなかった。しかしながら、２９３Ｔ細胞を、ＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−ＡのｃＤＮＡで共トランスフェクトする場合、＞＞２５０ｋＤａのＨＭＶバンドがＳＴＣ２のウェスタンブロットに現れた（図１Ｂ。黒色の矢印で示す）。このバンドは還元すると欠失することから、このタンパク質複合体の形成がジスルフィド結合に依存していることを示唆した。対応するＰＡＰＰ−Ａを検出するウェスタンブロットを作製した（図２）。
【０１９８】
ＳＴＣ１およびＰＡＰＰ−Ａを、２９３Ｔ細胞中で共発現する場合、低分子量（ＬＭＷ）のＰＡＰＰ−Ａのバンドのみを、ＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロットで検出した（図２Ａ、白色の矢印）。対照的に、ＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−Ａの共発現の間、ＨＭＶのＰＡＰＰ−Ａのバンドのみが観察された（図２Ｂ、白色の矢印）。
【０１９９】
これらの知見を組み合わせると、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣの共発現は、これらタンパク質間の複合体形成のパターンに影響するように思われた。ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２の共発現は、ＳＴＣ２のウェスタンブロットで還元可能なＨＭＶのバンドの出現をもたらし（図１Ｂ、黒色の矢印）、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２の間のＨＭＷのジスルフィド結合複合体が細胞培養培地に分泌したことを示唆した。この複合体は、ＰＡＰＰ−Ａのブロットで観察されたＨＭＷのバンドをおそらく生じさせた。よって、ＳＴＣ２のブロットにより示されるように、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２を過剰発現する細胞は、モル過剰のＳＴＣ２を合成し、すべてのＰＡＰＰ−ＡをＳＴＣ２と複合体化させた。よって、ＰＡＰＰ−Ａの試料のウェスタンブロット中のＨＭＷのＰＡＰＰ−Ａのバンドは、組み換え型ＰＡＰＰ−Ａおよび内在性ＳＴＣ２の間の複合体を表す可能性がある。
【０２００】
ＳＴＣ１およびＰＡＰＰ−Ａの間の対応する複合体が、ＳＴＣ１のウェスタンブロットで検出されておらず、潜在的なＳＴＣ１／ＰＡＰＰ−Ａ複合体が非共有結合性であることを示唆していた。ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１の共発現に関するＨＭＷのＰＡＰＰ−Ａのバンドの欠失は、非共有結合性ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ１複合体の形成により説明することができ、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの変性条件のため、ウェスタンブロッティングにより検出されなかった。これらを裏付けるものとして、組み換え型ＳＴＣ１タンパク質は、ＰＡＰＰ−Ａとの複合体形成における内在性ＳＴＣ２との競合に勝つようであり、これは、ＬＭＷのＰＡＰＰ−Ａのバンドのみの出現を説明するものであった（図２Ａ、白色の矢印）。さらに、細胞におけるＰＡＰＰ−Ａ、ＳＴＣ１、およびＳＴＣ２の共発現は、ウェスタンブロットで高分子のＳＴＣ１バンドを引き起こし、ＰＡＰＰ−Ａと複合体化するＳＴＣ１／ＳＴＣ２が恐らく表された。よって、ＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロットで観察されたＨＭＷバンドもまた、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１／ＳＴＣ２のヘテロダイマーの間での複合体の形成を表すことができた。
【０２０１】
複合体の形成は、最初、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２に対するものであり、潜在的な非共有結合性ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ１複合体に対するものではないウェスタンブロッティングでのみ検出可能であり、複合体が酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出できる場合に試験された。ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体は、ＥＬＩＳＡで容易に検出可能であった。
【０２０２】
ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ複合体形成のモニタリング（Ｍｏｎｉｔｏｒａｔｉｏｎ）
ｐｒｏＭＢＰは、良く知られたＰＡＰＰ−Ａの阻害剤である。ＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体の形成は、従来より、別々に合成した組み換えｐｒｏＭＢＰおよびＰＡＰＰ−Ａを含む培養物の上清を混合する際に細胞の外部で起こることが示されている。同様の実験では、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体形成が、細胞が存在しない中で可能であるかどうかを試験した。２９３Ｔ細胞を、空のプラスミドＤＮＡ（モック）、ＰＡＰＰ−ＡまたはＳＴＣ２のｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＰＡＰＰ−Ａトランスフェクト細胞由来の培養物の上清を、ＳＴＣ２培地またはモック培地のいずれかと１：１の容量で混合し、３７℃でインキュベートした。試料を、所定の時点で採取した。インキュベーションの後、ＰＡＰＰ−Ａのウェスタンブロットを、ＨＭＷのＰＡＰＰ−Ａのバンドの出現を試験するために作製した（図３）。
【０２０３】
インキュベーションの開始時に、ＨＭＷおよびＬＭＷのＰＡＰＰ−Ａのバンドを、前に観察されるようにＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２の混合物のウェスタンブロッティングにより検出した（図３Ａ）。この時間ＬＭＷのバンドは、次第にかすかになり、インキュベーションから４時間後、ＰＡＰＰ−Ａは、ＨＭＷの複合体としてのみ検出された。これらのＰＡＰＰ−Ａのバンドは、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２のｃＤＮＡと共トランスフェクションする際に観察されるＨＭＷのバンドと比較可能であり、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２の複合体が、インキュベーションの間に形成されたことを示唆した。時間に依存する、高分子量の対応するＳＴＣ２バンドの出現を、ＳＴＣ２のウェスタンブロットで検証した（不図示）。興味深いことに、ＰＡＰＰ−Ａおよびモック培地の混合物での類似する複合体の形成もまた観察可能であった（図３Ｂ）。ＰＡＰＰ−Ａおよびモック培地を混合すると、ＰＡＰＰ−Ａの画分の増加が時間外にＨＭＷ複合体で見出された。しかしながら、インキュベーションから〜１時間後、ＨＭＷ−ＰＡＰＰ−Ａの画分は一定して残っていた。このことから、モック培地中の内在性ＳＴＣ２タンパク質、またはＰＡＰＰ２培地中の残りの内在性ＳＴＣ２は、内在性のＳＴＣ２が使い切られるまでインキュベーションの間ＰＡＰＰ−Ａと複合体を形成したことが示めされる。
【０２０４】
組み合わせると、組み換えＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２を含む、またはからなる複合体は、別々に合成したＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ２のタンパク質を混合することにより、共トランスフェクトする際に形成できる。さらに、ＰＡＰＰ−Ａの試料のウェスタンブロッティングで観察されたＰＡＰＰ−ＡのＨＭＷのバンドは、ＰＡＰＰ−Ａおよび内在性のＳＴＣ２の複合体を表す可能性がある。ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１の間の共有結合性の複合体が検出されなかったにも関わらず、非共有結合性のＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ１の複合体が存在する可能性もある。このような複合体の存在は、納得できるものではないが、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ１を検出するＥＬＩＳＡにより、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ１と共発現した際にＰＡＰＰ−ＡのＬＭＷバンドのみを検出するウェスタンブロットにより裏付けられた。さらに、免疫沈降物の実験は、ＰＡＰＰ−ＡおよびＳＴＣ１の共免疫沈降を示す。
【０２０５】
ＰＡＰＰ−Ａの試料に存在する内在性ＳＴＣ
注目すべきＰＡＰＰ−Ａの画分が、組み換えＰＡＰＰ−Ａの発現の間内在性のＳＴＣ２およびＳＴＣ１と複合体化していたため、いくつかのＰＡＰＰ−Ａの試料を、ＳＴＣ２の存在に関して試験した。空のプラスミドのＤＮＡまたはＰＡＰＰ−ＡのｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞からの培養物の上清を試験し、精製したＰＡＰＰ−Ａ−Ｅ４８３Ｑおよび精製したＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰの複合体の試料も同様に試験した（図４Ａ）。さらに、組み換えＳＴＣ２を含む培地とこれらの試料を混合することにより、ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体が形成できるかどうかを評価した（図４Ｂ）。
【０２０６】
図４Ａに示されるように、ＳＴＣ２を、組み換えＰＡＰＰ−Ａを含む培地および精製したＰＡＰＰ−Ａ−Ｅ４８３Ｑの試料で検出した。両方の場合、ＳＴＣ２を、ＨＭＷの複合体で検出し、これは、ＰＡＰＰ−Ａに複合体化したことを示唆している。しかしながら、ＳＴＣ２は、精製したＰＡＰＰ−Ａ／ＰｒｏＭＢＰの複合体の試料では検出されなかった。これらの結果から、２９３Ｔ細胞により発現した組み換えＰＡＰＰ−Ａタンパク質の画分は、内在性ＳＴＣ２と複合体化したことを例証した。しかしながら、ＰｒｏＭＢＰの結合性は、おそらく同時に起こるＳＴＣ２の結合性を除外する。
【０２０７】
ＰＡＰＰ−Ａの試料を混合し、培養物の上清中の組み換えＳＴＣ２とインキュベートした場合、形成されるＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体を、同様にウェスタンブロットで検出した（図４Ｂ）。精製したＰＡＰＰ−Ａ／ｐｒｏＭＢＰ複合体を含む試料（ＰＰ混合）は、しかしながら、ＳＴＣ２複合体を形成しなかった。
【０２０８】
ＳＴＣ１およびＳＴＣ２のタンパク質の精製
いくつかの実験手法での精製したタンパク質の適用には、有用性があり得る。よって、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２のタンパク質を、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２のｃＤＮＡでそれぞれトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の無血清培地から精製した。Ｃ末端に挿入したｍｙｃ−ｈｉｓ−タグを利用することにより、ＳＴＣタンパク質を、固定化したＮｉ２＋アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製したＳＴＣ１およびＳＴＣ２のタンパク質を、溶出したタンパク質画分のクマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した（図５）。
【０２０９】
精製したタンパク質は、画分♯２〜６で可視化可能であった。ＳＴＣ１のウェスタンブロットにあるように、精製したＳＴＣ１は、主に〜７０ｋＤａのバンドに移動する（図５Ａ）。さらに、ＳＴＣ２のウェスタンブロットから予測されるように、精製したＳＴＣ２は、複数の大きさのバンドに移動し、主な１つの大きさは〜１００ｋＤａであった（図５Ｂ）。＞１７０ｋＤａのＨＭＷのＳＴＣ２のバンドの出現は、ＳＴＣ２の多量体の形成、または同定されていないタンパク質との複合体の形成を示唆する可能性がある。よって、特にＳＴＣ２に対していくつかのバンドが観察されたため、還元性条件および非還元性条件下で現れるタンパク質の同一性を調査した。還元性および非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥから観察した、〜３５〜４０ｋＤａおよび〜７０ｋＤａのＳＴＣ１のバンド、ならびに〜４０ｋＤａ、〜１００ｋＤａ、および＞１７０ｋＤａのＳＴＣ２のバンドを、質量解析により解析した。試験される精製したＳＴＣ１の全てのバンドでは、ＳＴＣ１のタンパク質のみを同定した。さらに、精製したＳＴＣ２のバンドでＳＴＣ２のタンパク質のみを同定した。このことから、現在の条件でのＳＴＣは、２９３Ｔ細胞により内在的に発現するいずれかのタンパク質と複合体を形成しなかったことが示唆された。
【０２１０】
ＳＴＣはＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性に影響を与える。
最終的に、ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性が、ＳＴＣとの複合体の形成により影響を受けるかどうかを試験した。ＰＡＰＰ−Ａを、モック培地または組み換え型ＳＴＣ１もしくはＳＴＣ２を含む培地と予めインキュベートした。ＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣ２複合体の形成をウェスタンブロッティングにより検証した。ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ／ＳＴＣのタンパク質分解活性を、上述に記載されるＩＧＦ−ＩＩと予めインキュベートした１２５Ｉ−ＩＧＦＢＰ−４を使用してモニタリングした。異なる時点でのＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ媒介型タンパク質分解性切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離される、無処置および切断したＩＧＦＢＰ−４を表すバンドの強度を相関させることにより決定した（図６Ａ）。
【０２１１】
１２０分後、モック培地と予めインキュベートしたＰＡＰＰ−Ａは、総ＩＧＦＢＰ−４の６０％を切断した。しかしながら、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２と予めインキュベートしたものは、ＰＡＰＰ−Ａがその基質を切断することができないようにした。図６Ｂに示されるように、総ＩＧＦＢＰ−４の〜１５％のみが、ＳＴＣ２の存在がＰＡＰＰ−Ａ媒介型ＩＧＦＢＰ−４切断を完全に阻害しながらＳＴＣ１が存在する場合に切断された。このことは、ＩＧＦＢＰ−４に対するＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性に関するＳＴＣの阻害性の機能を例証するものである。
【０２１２】
実施例２
スタニオカルシンは、ＩＧＦ軸のタンパク質分解性の阻害による哺乳類の成長を調節する。
材料および方法
タンパク質分解性の切断アッセイおよび動態解析を、１２５Ｉ−標識化した天然の基質（ＩＧＦＢＰ−４）で実行した。切断産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより無処置の基質から分離し、切断物を、輝尽性蛍光体（ｐｈｏｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）により解析した。タンパク質の相互作用の試験および円二色性解析を、精製した組み換えタンパク質を使用して行った。タンパク質濃縮物の評価を、定量アミノ酸解析またはイムノアッセイにより実施した。
【０２１３】
ＳＴＣ２およびヒトまたはマウスのパッパリシンの間の共有結合性複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける形成を、哺乳類細胞の共トランスフェクションまたは別々にトランスフェクトした細胞から培地をインキュベートすることにより実行した。複合体の形成は、ウェスタンブロッティングにより記録、またはモニタリングした。ＩＧＦ−Ｉ受容体の活性の解析を、ＩＧＦ−Ｉ受容体を安定に発現する細胞株を使用して行い、次いでウェスタンブロットによる受容体のリン酸化の定量化を行った。
【０２１４】
ＳＴＣ２またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を発現するトランスジェニックマウスを、一様に強力なプロモーターを使用して精製した。マウスの成長を、連続した重量計測によりモニタリングした。ＳＴＣ２に対するモノクローナル抗体を使用して、導入遺伝子由来のＳＴＣ２の循環レベル、およびトランスジェニック性の胚（Ｅ１３．５）に由来する一次線維芽細胞に存在する導入遺伝子由来のＳＴＣ２および内在性ＰＡＰＰ−Ａの免疫沈降に関するレベルを判定した。
【０２１５】
プラスミドの構築物および変異原性
ヒトＳＴＣ１（５’Ｘｈｏｌ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接するＮＭ＿００３１５５．２のｎｔ．２８５−１０２５）およびＳＴＣ２（５’Ｘｈｏｌ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接するＮＭ＿００３７１４．２のｎｔ．１１３１−２２１６）のコード配列を含むプラスミドＤＮＡを購入した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンニングして、ｐＳＴＣ１およびｐＳＴＣ２を得た。ヒトのＰＡＰＰ−Ａ、マウスのＰＡＰＰ−Ａ、ヒトのＰＡＰＰ−Ａ２、ヒトのＩＧＦＢＰ−４７、およびヒトのＩＧＦＢＰ−５３０をコードするプラスミド構築物の作製を他で記録した。マウスのＰＡＰＰ−Ａ２（ＮＭ＿００１０８５３７６．２）に関する発現プラスミドを作製するために、ｃＤＮＡを、２つの特異的なプライマーである、（５’−ＣＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧ−３’（ｎｔ．３１２０−３１０１）および５’−ＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣ−３’（ｎｔ．５４２５−５４０２）を使用してマウスの胎盤性ｍＲＮＡから合成した。２つの重複するフラグメントであり、両方が、ｎｔ．２９５７でＢｇＩＩＩ部位を含むフラグメントを、２組のプライマー（５’−ＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧ−３’（ｎｔ．１−２３，Ｋｐｎｌ  下線）および５’−ＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＣＡＡ−３’（ｎｔ．３０３０−３００９）；５’−ＣＣＧＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴ−３’（ｎｔ．２８８１−２９００）および５’−Ｇ  ＡＴ  ＣＴ  ＣＴ  ＡＧ  ＡＴＴ  ＡＣＴＧＧＴＴＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧ−３’（ｎｔ．５３７０−５３４６，Ｘｂａｌ  下線））を使用して、作製した。これらフラグメントを連結し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎｌ／Ｘｂａｌ部位にクローニングしてｐｍＰＡＰＰ−Ａ２を作製した。
【０２１６】
ｐＳＴＣ２の変異原性を、テンプレートとしてのｐＳＴＣ２、以下の組のプライマー（ＮＭ＿００３７１４．２のナンバリング、変異型ヌクレオチド  下線）：ｐＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）では５’−ＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＡＡＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧ−３’（ｎｔ．１６５５−１６８４）および５’−ＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣ−３’（ｎｔ．１６８４−１６５５）、ｐＳＴＣ２（Ｃ１９７Ａ）では５’−ＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧ−３’（ｎｔ．１８８３−１９１８）および５’−ＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧ−３’（ｎｔ．１９１８−１８８３）、ならびにｐＳＴＣ２（Ｃ２０５Ａ）では５’−ＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣ−３’（ｎｔ．１９０７−１９４０）および５’−ＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣ−３’（ｎｔ．１９４０−１９０７）を使用したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により実行した。変異したｃＤＮＡを、Ｘｈｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してＰＳＴＣ２に交換した。すべての構築物を配列解析により検証した。
【０２１７】
細胞の培養物およびトランスフェクション
ヒトの胚性腎臓２９３Ｔ細胞（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏ）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸、およびゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した高グルコースＤＭＥＭで維持した。一過性のトランスフェクションでは、６．０×１０６の細胞を、１０ｃｍの皿の上にプレーティングし、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）により調製した５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用したリン酸カルシウム共沈により１８時間後にトランスフェクトした。培養物の上清を、トランスフェクションから４８時間後に収集し、遠心により除去するか、または細胞をさらに血清フリー培地（ＣＤ２９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再度培養して精製を促進した。ＰＡＰＰ−Ａの分泌レベルを、商業的なＥＬＩＳＡ（ＡＬ−１０１、Ａｎｓｈ  Ｌａｂｓ）により決定し、ＰＡＰＰ−Ａ２のレベルを、上述するようにＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２１８】
タンパク質の精製
Ｈｉｓタグ化組み換えタンパク質の精製を、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でアフィニティクロマトグラフィーにより実行した。無血清培地を、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）と１：１で希釈し、カラムに１ｍｌ／分の流速で充填した。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．４）の２０カラム容量、次いで５カラム容量のＰＢＳで洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析した。ヨウ素化の前に、ＩＧＦＢＰ−４および−５を、説明されるようにＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＢＩＯ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ５カラム（４×２５０ｍｍ、Ｓｉｇｍａ）上で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によりさらに精製した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、精製したタンパク質の定量化をアミノ酸解析により行った。
【０２１９】
プロテイナーゼアッセイおよび動態解析
精製したＩＧＦＢＰ−４を、１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、切断反応を上述するように実行した。まとめると、ｐＳＴＣ１、ｐＳＴＣ２、またはｐＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を用いるか、または用いることのないヒトのＰＡＰＰ−ＡのｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞から収集した培地を、５０ｐＭのＰＡＰＰ−Ａに希釈し（１：５００）、予めインキュベートした１２５Ｉ−ＩＧＦＢＰ−４（１０ｎＭ）およびＩＧＦ−ＩＩ（１００ｎＭ）（ＧｒｏＰｅｐ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５と混合した。３７℃での１０〜４０分のインキュベート後、２５ｍＭのＥＤＴＡを補充したホットＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（ｈｏｔ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加することにより反応を停止させた。基質および切断産物を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ストレージフォスファスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）およびＴｙｐｈｏｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したオートラジオグラフィーにより可視化した。いくつかの理由により、ヒトまたはマウスのＰＡＰＰ−ＡのｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞から培地を、モル過剰のＳＴＣ１またはＳＴＣ２を含む培養培地で、３７℃で０〜１６時間インキュベートした後、希釈し、活性の解析を行った。
【０２２０】
ＳＴＣ１およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の阻害活性を定量的に評価するために、ＩＧＦＢＰ−４に対するヒトおよびマウスのＰＡＰＰ−Ａ（２０−５０ｐＭ）のタンパク質分解活性を、０〜１０００ｎＭの精製したＳＴＣ１またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の存在する中で解析した。別々の反応を、阻害剤の濃度に応じて、５つの異なる時点（０〜１２０分）で終わらせた。切断を上述のように可視化し、バンドの強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ  ８．１ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して定量化した。バックグラウンドシグナルを減算し、相対的な初期速度（Ｖ／Ｖ０）を線形回帰により判定し、基質が欠失したと推定した。阻害定数（Ｋｉ）の決定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０  ソフトウェアに包理されるＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｋｉモデル（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を使用することにより実行した。
【０２２１】
１２５Ｉ−ＩＧＦＢＰ−５の切断を、１０倍のモル過剰の精製したＳＴＣ１またはＳＴＣ２：ヒトのＭＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  ２５  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９０２−ＭＰ−０１０）、ヒトのＡＤＡＭ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９３６−ＡＤ−０２０）、ヒトのマトリプターゼ、ウシのトリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−８６４２）、およびヒトまたはマウスのＰＡＰＰ−Ａ２を用いるか、または用いることのなく、その後のプロテイナーゼに関して同様に評価した。トリプシン（０．２ｎＭ）およびＰＡＰＰ−Ａ２（５０ｐＭ）を除き酵素濃度は１００ｎＭであった。ＳＴＣ２を、すべてのプロテイナーゼと共に８時間プレインキュベートした。切断反応は、約３０％の基質の切断を得るためには、３０〜１８０分であった。
【０２２２】
一次抗体
ウェスタンブロッティングでは、以下の抗体を使用した：ウサギのポリクローナル抗（ヒトのＰＡＰＰ−Ａ）、ウサギのポリクローナル抗（ヒトのＰＡＰＰ−Ａ２）、マウスのモノクローナル抗（ｃ−ｍｙｃ）（９Ｅ１０、ＡＴＣＣ）、ヤギポリクローナル抗（ヒトＳＴＣ１）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２９５８）、ヤギポリクローナル抗（ヒトＳＴＣ２）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２８３０）、ホスホチロシン残基の検出用のマウスのモノクローナルＰＹ９９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−７０２０）、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体の検出用のマウスのモノクローナルＣＴ−１（ＧｒｏＰｅｐ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、ＭＡＪ１）、βアクチンの検出用のマウスのモノクローナルＡＣ−７４（Ｓｉｇｍａ、Ａ５３１６）、ならびにマウスのＰＡＰＰ−Ａの検出用のマウスのモノクローナル  Ｄ８−ｍｌｇＧ２ａ。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡでの使用、および免疫沈降では、ＳＴＣ２に対するモノクローナル抗体を産生した。５０μｇの精製した組み換えヒトＳＴＣ２の初期注入を、完全フロイントアジュバント（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）においてＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下的に行った。不完全フロイントアジュバント（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）におけるブースター注入を１か月後に行った。ＳＴＣ２でコーティングしたプレート上での尾の血液のスクリーニングに基づき、レスポンダーを、第１のブースター注入から１ヶ月後の最終的なブーストのために選択した。連続して４日間、マウスに１６０μｇのＳＴＣ２の腹腔内注入を行った。５日目に、マウスを屠殺し、脾臓を除去した。脾臓細胞を遠心し、一定の分量にし、液体窒素の中に保存した。ＳＰ２／０細胞との融合を、脾臓細胞の１つの一定分量で実施した。選択したクローンの培養物の上清を、ＳＴＣ２コーティングしたプレート上でスクリーニングし、陽性のクローンを再度クローン化した。結果として得られるクローンは、ＳＴＣ２１６、ＳＴＣ２２０、ＳＴＣ２２１、ＳＴＣ２２５、ＳＴＣ２３９、およびＳＴＣ２４３であった。これらクローンを、抗体産生のためＣＤハイブリドーマ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。
【０２２４】
ビオチン化では、ｍＡｂＳＴＣ２１６を、２０倍のモル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２１３３５）と、７．４μＭで氷上で２時間インキュベートした。この反応を、１０ｍＭのトリス−ＨＣＩで停止させ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。
【０２２５】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＳＴＣ２の濃度の測定のため、９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、１００ｍＭのＮａ２ＨＣＯ３（ｐＨ９．４）中捕捉抗体（ｍＡｂ  ＳＴＣ２２１）７．５μｇｍｌ−１をウェル当たり１００μｌでコーティングした。次いでこのウェルを、ＴＢＳ（３０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をウェル当たり２００μｌで、３７℃で３０分間ブロッキングした。試料を、１％のＢＳＡを補充したＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で希釈し、コーティングしたウェル中で、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウェルを、１％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔを１μｇ／ｍｌ−１に希釈したビオチン化検出抗体（ＳＴＣ２１６）で、３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、１％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔで、１：２０，０００で希釈したアビジン結合型西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐ０３４７、ＤＡＫＯ）でインキュベートした。最終的な段階の洗浄の後、ウェルを、ＯＰＤ錠剤（Ｓ２０４５、ＤＡＫＯ）を使用して展開した。検量用試料は、１％のＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔで希釈した組み換えＳＴＣ２に基づくものであった。８つの較正点（６．２５−８００ｎｇｍｌ−１）を使用した。吸光度を、ＥｎＳｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、４９０ｎｍで測定した。ブランクの値を除算し、データを、３次曲線の近似を使用して解析した。２０％のＣＶでのアッセイの機能的な感受性が、２０ｎｇｍｌ−１であった。
【０２２６】
ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）に結合するモノクローナル抗体を評価するために、プレートを、２μｇｍｌ−１のポリクローナル抗（ＳＴＣ２）をウェル当たり１００μｌでコーティングした。検出を、入手可能なＳＴＣ２ｍＡｂ（１μｇｍｌ−１）、次いで１：２０００で希釈した抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ０２６０）で実行した。段階希釈したＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）からのシグナルを正規化し、各抗体に関して比較した。希釈および洗浄に関するバッファーは上述されていた。
【０２２７】
複合体形成の免疫ブロッティングおよび解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質は、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロッティングし、２％のＴｗｅｅｎ  ２０でブロッキングし、５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ９．０（ＴＳＴ）で平衡化した。一次抗体を０．５％のウシ胎児血清を含むＴＳＴで希釈（１〜５μｇｍｌ−１）し、ブロッティングを、室温で一晩インキュベートした。ブロッティングを、０．５％のウシ胎児血清を含むＴＳＴで１：２０００に希釈した二次抗体（ポリクローナルブタ抗‐ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ０２１７））、ポリクローナルウサギ抗‐ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ０１６０）、またはポリクローナルウサギ抗‐マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ０２６０）で、室温で１時間インキュベートした。ステップの間全てに洗浄を、ＴＳＴを用いて実行した。このブロッティングは、増強した化学発光（ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して展開し、画像を記録し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解析した。
【０２２８】
別々の細胞で合成したタンパク質の間の共有結合性の複合体の形成に関してプローブするために、培養培地を、３７℃で０〜１６時間でインキュベートし、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン当たり２μｌ）により分離し、上述のようにウェスタンブロッティングにより解析した。共トランスフェクトした細胞由来の培地を解析する前にインキュベートした。
【０２２９】
表面プラズモン共鳴解析
表面プラズモン共鳴の実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。アミン結合を使用して、精製したモノクローナル抗体２３４‐５を、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセル（ＦＣ）３および４で固定化した。５，０００の応答単位（ＲＵ）のカップリング密度に達するために、抗体を、ｐＨ４．７５の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで３０μｇｍｌ−１に希釈した。残りの活性基を、ｐＨ８．０の１Ｍのエタノールアミンを７分注入することにより遮断した。データの収集のため、培養培地中の組み換えヒトのＰＡＰＰ−Ａ（３５０ＲＵ）を、ＦＣ３を参照細胞として使用して、ＦＣ４のみで捕捉した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で２倍に段階希釈（６．２５ｎＭを１９５ｐＭへ）した精製した組み換えヒトＳＴＣ１を、３０μｌ／分で両方のＦＣにわたり注入した。会合相は１８０であり、次いで１０００の解離相であった。各結合周期の最後に、両方の表面を、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）、および０．５Ｍの塩酸グアニジンにより再度作製された。分析物（ＳＴＣ１）の濃度を、アミノ酸解析により決定した。結合解析を、２５℃で実施した。データを１０Ｈｚで収集した。記録したシグナルを、参照細胞から得た応答により決定されるように、バックグラウンドシグナルを除算した。１：１のラングミュアモデルのＧｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇの一般的な近似（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を使用して実施した。
【０２３０】
円二色性解析
円二色性解析を使用して、精製した野生型および変異型のタンパク質を比較した。解析の前に、精製したタンパク質を、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＮａＦ、ｐＨ７．４に対して透析した。１０のＣＤスペクトルを、０．５ｍｇｍｌ−１のポリペプチド濃度および２ｍｍの経路長のキュベットを使用したＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ（日本））上で各タンパク質について、２５℃で記録した。ＣＤのデータを、１．０ｎｍのバンド幅を使用して０．２ｎｍの解像度で、２６０〜１９０ｎｍの範囲で得た。スキャンの速度は、１００ｎｍ／分であり、応答時間は１秒であった。温度スキャンを、２６０〜２００ｎｍの範囲で実行し、融解曲線を２２２ｎＭで記録した。Δε（ｄｅｇｃｍ２ｄｍｏｌ−１と表す）を、１１０ｇ／ｍｏｌ−１残基−１の平均モル質量に基づき計算した。
【０２３１】
ＩＧＦ−Ｉ受容体シュミレーションアッセイ
ＩＧＦ−Ｉ受容体を安定して発現する細胞株の２９３−ＩＧＦＲ（クローンＨ）を使用して、記載されるように本質的にＩＧＦ−Ｉ受容体のリン酸化を測定した。飢餓細胞をＣａＣｌ−２（０．１ｍｇ／リットル）およびＭｇＣＩ２（０．１ｍｇ／リットル）、ｐＨ７．４を含むＰＢＳですすぎ、ＩＧＦ−Ｉ（１０ｎＭ）、ＩＧＦＢＰ−４（５０ｎＭ）、ＰＡＰＰ−Ａ（２．５ｎＭ）、およびＳＴＣ１（１５ｎＭ）またはＳＴＣ２（１５ｎＭ）の組み合わせで１５分間刺激した。刺激する前に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−４を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で、３７℃で２０分インキュベートして、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−４複合体を形成させた。次いで、ＰＡＰＰ−Ａを添加し、切断反応を、同一のバッファー中、３７℃で２０分間実行した。使用する前に、ＰＡＰＰ−Ａを、ＳＴＣ１、ＳＴＣ２、またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を含む血清培地を用いるか、または用いることなく３７℃で１６時間インキュベートした。刺激した細胞を、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ、Ｒ０２７８）を用いて氷上で溶解させ、コンプリート  プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０）およびホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩ）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５２４６２５）を１０分間にわたり補充した。切断した溶解物のウェスタンブロッティングを使用して、ｍＡｂＰＹ９９を使用したβ−サブユニットリン酸化を定量化した。総ＩＧＦ−Ｉ受容体の検出を、ｍＡＢ  ＣＴ−１を使用して行った。対照を充填するために、ブロッティングを取り除き、アクチンに対するｍＡＢ  ＡＣ−７４を再度プローブした。バンド強度の定量化を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。ｍＡｂ  ＰＹ９９のシグナルからバックグラウンドシグナルを除き、プロットした。
【０２３２】
動物実験
トランスジェニックマウスの産生のため、非タグ化ＳＴＣ２またはＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）をコードするＰＣＲフラグメントを、プライマー５’−ＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧ−３’（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａのｎｔ．７６９−７８９）および５’−ＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＡＣＴＣ−３’（ＮＭ＿００３７１４．２のｎｔ．２２１９−２１９６、ＢｇＩＩＩ部位  下線）、ならびにテンプレートとしてのｐＳＴＣ２およびｐＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）をそれぞれ使用することにより作製した。ＰＣＲフラグメントを、ｐＣＡＧＧＳ（ＢＣＣＭ、ＬＭＢＰ２４５３）のＸｈｏｌ／ＢｇＩＩＩ部位にクローン化して、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＴＣ２およびｐＣＡＧＧＳ−ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）を作製した。プラスミドＤＮＡを、Ｐｖｕｌで直線化し、Ｂ６Ｄ２Ｆ２接合子の雄性前核（Ｔａｃｏｎｉｃ）にマイクロ注入し、次いで、偽妊娠ＮＭＲＩ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に導入した。トランスジェニックマウスのＢ６Ｄ２Ｆ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２）またはＢ６Ｄ２Ｆ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ））を、ｐＣＡＧＧＳプラスミドに特異的なプライマー（５’−ＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣ−３’（ｎｔ．２１６−２４１），および５’−３０ＴＧＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧ−３’（ｎｔ．５１１−４８６）、および尾の生検から精製したゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲにより同定した。ｐＣＡＧＧＳ−ＳＴＣ２注入を行った４４匹のマウスのうち９匹が、トランスジェニック挿入物に陽性であった。これらのうち４匹が、血清中のＳＴＣ２抗原の検出可能なレベルを生じる形質転換を得ており、さらなる繁殖のために樹立マウスとして使用した。同様に、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）注入を行った３４匹のマウスの内、９匹が陽性であった。これらのうち３匹が、血清中のＳＴＣ２の検出可能なレベル有するトランスジェニック子孫を得ており、樹立マウスとして使用した。樹立マウスをＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて繁殖させ、Ｂ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２）Ｎ１またはＢ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ））Ｎマウスを含む同腹仔、および野生型の同腹仔を作製し、遺伝子型を同定し、連続した重量計測により成長を盲検で解析した。５〜８週間目で、血液を舌下静脈から抜き取り、血清を形成させ、試料を凍結して、さらなる解析まで−２０℃で保存した。重量を比較するために、マウスを個々のＳＴＣ２の血清レベルによってグループ分けした。Ｂ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２）Ｎ１のすべてのグループ、およびＢ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ））Ｎ１のグループの２〜８μｇｍｌ−１のグループでは、ｎは、全ての時点に含まれるマウスの数を指す。Ｂ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ））Ｎ１の非トランスジェニックのグループでは、ｎは、３週目（ｎ＝９）および７週目（ｎ＝５）を除くすべての時点に含まれるマウスの数を指す。このマウスを、１２時間の明期／１２時間の暗期の周期で飼育し、Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３１９（Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ）を適宜与えた。すべてのマウスの実験は、デンマーク国の官庁（Ｄｙｒｅｆｏｒｓφｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ）の許可を受けて行った。
【０２３３】
マウスの胚線維芽細胞の培養および解析
マウスの胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の一次培養は、Ｂ６；Ｄ２−Ｔｇ（ＳＴＣ２）Ｎ１の雌性および雄性の同腹仔を交配させることからもたらされたＥ１３．５の胚に由来したものであった。この胚を洗浄し、分割し、パパインで消化し、細胞懸濁物を、５５μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培養培地に播種した。２〜４の継代の細胞を、実験に使用した。各胚からの残りの組織を、遺伝子型判定に使用し、培養培地に分泌した導入遺伝子由来のＳＴＣ２の存在をＥＬＩＳＡにより確認した。非トランスジェニックまたはトランスジェニックのＭＥＦ由来の培養培地を、ＰＡＰＰ−１のタンパク質分解活性１７に対して阻害性のモノクローナル抗体である、ｍＡｂ１／４１（１００ｎＭ）を添加するか、または添加することなく、ＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解活性に関して評価した。モノクローナル抗体の阻害性に関して評価した。
【０２３４】
コンフルエントなプレートである培地中に含まれるトランスジェニックＳＴＣ２を、３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２０ｍＬの培地から免疫沈降し、記載されるように本質的にピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）架橋を使用することにより、ｍＡｂ  ＳＴＣ２２１を２ｍｇｍｌ−１で固定化した。溶出したタンパク質は、ｍＡｂ  Ｄ８−ｍｌｇＧ２ａを使用したウェスタンブロッティングにより内在性マウスＰＡＰＰ−Ａの存在に関して評価した。
【０２３５】
統計解析
すべての統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０を使用して実施した。マウスの出生後の成長データの統計解析を、各時点での片側スチューデントｔ検定を使用して実施した。ＩＧＦ−Ｉ受容体のシグナリングの統計解析を、一元配置分散分析、次いでダネット検定を使用して実施した。抗体結合の統計解析を、一元配置分散分析、次いでテューキー検定を使用して実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると考えた。
【０２３６】
結果
トランスフェクト細胞から分泌されるＰＡＰＰ−Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＧＦＢＰ−４を単一の部位で迅速に切断した。しかしながら、本出願人は、細胞から分泌したＰＡＰＰ−Ａのレベルに影響がないにもかかわらず（図１１ｂ）、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２のｃＤＮＡでの共トランスフェクションに関するＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解活性を検出しなかった（図１１ａ）。プロテイナーゼ阻害剤としてのＳＴＣ１およびＳＴＣ２の潜在的な機能を評価するために、次いで本出願人は、切断反応に対して別々に合成し、精製したＳＴＣ１を添加する作用を解析した。ＳＴＣ１はまだＰＡＰＰ−Ａを阻害するが、この実験では、ＳＴＣ２の阻害性作用が観察されなかった（図１１ｃ）。相互作用の定量評価から、ＳＴＣ１は、７５ｐｍのＫＤを用いてＰＡＰＰ−Ａに強力に結合（図１１ｄ）することが明らかになり、動態解析から、ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性を阻害（Ｋｉ＝６８ｐＭ）することを示した（図１１ｅ）。
【０２３７】
別々のトランスフェクションの後、約９０ｋＤａまたは４００ｋＤＡのダイマーとしてＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−ＡがＳＤＳ−ＰＡＧＥで移動したが、共トランスフェクションに関して、両方の抗原を含む約５００ｋＤａの高分子量のバンドが形成された（図１２ａ〜ｂ）。ＰＡＰＰ−Ａの移行に変化がないことが、ＳＴＣ１を用いた同様の実験で観察された（図１２ｃ）。本出願人は、ＳＴＣ２は、ＰＡＧＥを変性させる際に分離に抵抗するＰＡＰＰ−Ａを有する複合体を形成でき、よって多くの場合共有結合性を有する可能性があるが、ＳＴＣ１ではそうではないとの結論になった。さらに本出願人は、別々に合成したＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−Ａをインキュベートすることにより複合体の形成の過程を解析した。興味深いことに、５００ｋＤａのバンドを含むＰＡＰＰ−Ａは、インキュベーションの間に徐々に出現し（図１２ｄ）、細胞外の環境での複合体の形成を例証した。ＰＡＰＰ−Ａは、インキュベーション単独の後ではタンパク質分解的に活性であり、ＳＴＣ２とインキュベーションの１６時間後ではＰＡＰＰは活性がないことを示した（図１２ｅ）。共トランスフェクションの実験と一致して、ＳＴＣ１は、ＰＡＰＰ−Ａとインキュベーションすると、共有結合性の複合体を形成しなかった（図１２ｆ）。次いで、本出願人は、他のタンパク質分解性の酵素に対するＳＴＣの阻害性活性の可能性を評価した。試験したプロテイナーゼは、インキュベーション後に、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２により阻害されなかった（図１５ａ〜ｂ）。しかしながら、両方のＳＴＣは、ＰＡＰＰ−Ａ２（パッパリシン−２）、ＰＡＰＰ−Ａの相同体のみ、およびＳＴＣ２を部分的に阻害したが、ＳＴＣ１はそれと異なり、同様に、ＰＡＰＰ−Ａ２と共有結合性の複合体を形成した。よって、本出願人は、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２は、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰＡＰＰ−Ａ２を含むメタロプロテイナーゼのパッパリシンファミリーのプロテイナーゼ阻害剤としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能すると結論付けた。ＳＴＣ１は、高親和性プロテイナーゼ阻害剤複合体を形成することにより阻害性の機能を発揮し、ＳＴＣ２の阻害性活性は、標的プロテイナーゼとの共有結合性の複合体を形成することを必要とする。相同ＳＴＣは、生化学的な機能が予測され得る知られていないモジュールまたはモチーフを有する固有のアミノ酸配列を有することに注目することに関心が集まっている。
【０２３８】
ＳＴＣ１の１１のシステイン残基は、５つの分子内ジスルフィド結合を形成し、１つの残基が二量体化に関係していることが従来より示されている。これら１１のシステイン残基はＳＴＣ２に保存されており、興味深いことに３つの追加的なシステインのＣ１２０、Ｃ１９７、およびＣ２０５を含む（図１６）。これら３つの残基は、独立してアラニンに置換される場合、発現レベルは変化しなかった（図１３ａ）。しかしながら、変異型ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）は、ＰＡＰＰ−Ａと共有結合性の複合体を形成することができず（図１３ｂ）、Ｃ１２０に関与する分子内ジスルフィド結合は、ＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−Ａの間の共有結合に関する基盤となることを示唆している。ＳＤＴＣ２およびＰＡＰＰ−Ａの間のジスルフィド結合を可能にするために、分子はまず、非共有結合的に相互作用していなければならず、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）およびＰＡＰＰ−Ａの間の相対的に弱い相互作用により模倣されやすい。合致するように、動態解析から、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）は、ＰＡＰＰ−Ａに対するいくつかの阻害性活性（Ｋｉ＝４７ｎＭ）を有していることが示された（図１３ｃ）。阻害性の機序の観点から、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）は、この阻害性効力が、ＳＴＣ１よりも約７００倍低いが、非共有結合性のＳＴＣ１に類似している。よって、ＳＴＣ２およびＰＡＰＰ−Ａの間の共有結合の形成は、ＳＴＣ２の不十分な阻害活性を十分に補償するものである、。これらのデータと一致して、本出願人は、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＰＰ−Ａ媒介型ＩＧＦ受容体のシグナリングを効率的に阻害するが、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）はこれと異なることを発見した（図１３ｄ）。
【０２３９】
動物試験で使用する前に、本出願人は、円二色性解析により精製したＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）および野生型のＳＴＣ２をさらに比較した。類似のスペクトルおよび熱的安定性から、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の構造上の完全性は、単一のアミノ酸の置換により損なわれないことが示唆される（図１３ｅおよび図１７）。６つの入手可能なモノクローナル抗体によるＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の等しい認識はこの解釈を支持するものである（図１８）。さらに、本出願人は、ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）の両方の生化学的特性を、マウスの系に保存した（図１９ａ〜ｃ）。
【０２４０】
ＳＴＣ２の過剰発現がタンパク質分解性の阻害により成長の減少をもたらすとの本出願人の予測を試験するために、ＳＴＣ２およびＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）にトランスジェニックなマウスを作製し、比較した。初期の４つの知見と一致して、ＳＴＣ２の過剰発現は、非トランスジェニック動物と比較して、潜在的な成長速度の著しい減少を引き起こした（図１４ａ）。本出願人らのデータから、ＳＴＣ２循環レベルと、成長の遅延の重要度との間の相関がさらに示唆される（図１４ｂ）、厳密に比較すると、ＳＴＣ２（Ｃ１２０Ａ）のトランスジェニックの発現は、循環するタンパク質が高いレベルにあってさえ、成長速度に検出可能な変化がもたらされなかった（図１４ｃ）。
【０２４１】
ＰＡＰＰ−Ａノックアウトマウスから培養したマウスの胚繊維芽細胞（ＭＥＧＦ）は、ＩＧＦＢＰ−４に対するタンパク質分解性を欠いている。本出願人らは、非トランスジェニックマウス由来のＭＥＦから馴化培地中に存在するＩＧＦＢＰ−４に対する活性は、マウスおよびヒトのＰＡＰＰ−Ａの両方に特異的な新規の阻害性モノクローナル抗体を使用することにより、競合して阻害できることを発見した（図１４ｄ）。この実験は、結果的に、ＩＧＦＢＰ−４に対するＭＥＦ由来のタンパク質分解活性が、ＰＡＰＰ−Ａにより引き起こされることを示す。非トランスジェニックマウス由来のＭＥＦ培地とは対照的に、ＳＴＣ２トランスジェニックマウス由来のＭＥＦから条件付けしたマウスは、ＰＡＰＰ−Ａ活性における顕著な減少を示した（図１４ｅ）。重要なことに、阻害は、ＭＥＦ培養培地における内在性ＰＡＰＰ−Ａおよび導入遺伝子由来のＳＴＣ２の間の共有結合性複合体の存在により達成される（図１４ｅ）。よって、本出願人は、ＳＴＣ２トランスジェニックマウスが、ＰＡＰＰ−Ａの活性が失われるため、成長の遅延を示すとの結論に達した。
【０２４２】
ＰＡＰＰ−Ａのノックアウトまたは阻害の条件とは反対に、ＳＴＣ２ノックアウトマウスで従来観察された実質的な体重の増加から、ＳＴＣ２がないことが、ＰＡＰＰ−Ａの活性の増大を引き起こすことが示唆される。また、ＰＡＰＰ−Ａの強力な同化作用もまた、骨芽細胞での標的化したＰＡＰＰ−Ａのトランスジェニック発現に関する顕著な骨の厚さの増加、および筋芽細胞でのＰＡＰＰ−Ａのトランスジェニック発現に関する骨格筋の質量の大量増加により、例証された。最終的にヒトでは、ＰＡＰＰ−Ａが成長を調節する可能性が、出生体重と、第１期のＰＡＰＰ−Ａレベルとの間の陽性的な相関があるという強力な知見により強調される。
【０２４３】
まとめると、これらの知見は、ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性と、ＳＴＣの阻害性の活性との間の動的均衡が、ｉｎ  ｖｉｖｏで局所的なＩＧＦ受容体の刺激を決定するモデルを支持するものである（図１４ｆ）。これに関しては、ＩＧＦ媒介型の成長が組織のマイクロ環境での細胞周囲の生理活性的なＩＧＦのレベルに依存することを強調することが重要である。このことから、ＩＧＦ−Ｉの肝臓に特異的なノックアウトがＩＧＦ−Ｉの血清レベルを低下させる（７５％低下）が、成長に関して作用しないという重要な知見により強調される。また、循環するＩＧＦ−Ｉのレベルは、ＳＴＣ１またはＳＴＣ２の過剰発現の結果として萎縮症となるマウスで変質しないとの観察によっても強調される。ＰＡＰＰ−Ａ２に関する知識はほとんどないが、遺伝子の標的化は、軽度の成長の遅延を引き起こすことが知られている。よって、本出願人らの生化学的データに即して、類似のモデルは、ＰＡＰＰ−Ａと比較して広く発現していないが、ＰＡＰＰ−Ａ２に有効性がある。
【０２４４】
調節不全のＩＧＦ受容体シグナリングは、様々な疾患、特にヒトの癌に広範囲に関連している。また、癌の発症におけるＰＡＰＰ−Ａの関与はますます認識されており、ＰＡＰＰ−Ａノックアウトマウスは、年齢による自然発生性の癌（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  ａｇｅ）がほとんど全くおこらないという知見により強調される。よって、複数の報告が、ヒトの癌とＳＴＣ１またはＳＴＣ２を関連させることに注目している。たとえば、乳癌におけるＢＲＣＡ１腫瘍のサプレッサー機能の喪失が、ＳＴＣ１の発現を引き起こして検出できなくなり、乳癌の晩期再発が、ＳＴＣ１およびＳＴＣ２の高い発現と相関している。
【０２４５】
総合的に見て、本発明の実施例から、哺乳類のスタニオカルシンが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＧＦ受容体の活性化を調節する複合体の細胞外ネットワークの新規プロテイナーゼ阻害剤であることが例証される。
【０２４６】
配列
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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