(57)【要約】【課題】抗原コンフォメーンョンを保存し、抗原濃度を保持し、診断目的のために十分な体積をもたらす血漿を血液から調製するための、単純で、信頼性が高く、低コストで、使用が容易な手段が必要とされている。【解決手段】  本発明は、血漿を全血から分離するための方法及び装置に関する。本方法は、分離膜によるサイズ排除濾過と赤血球（RBC）凝集とを組み合わせたものである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液導入ポート及び血漿流出チャネルを含むハウジングと、
血液接触側及び反対側を有する濾過膜と
を含む血漿分離装置であって、
前記濾過膜は、複数の細孔及び約２００〜約４００μｍの厚さを含み、前記濾過膜は、血球凝集剤で被覆されている、
血漿分離装置。
【請求項２】
前記濾過膜が、前記血液導入ポートと前記血漿流出チャネルとの間に配置されている、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項３】
前記複数の細孔が、前記血球凝集剤で被覆された内表面を含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項４】
前記濾過膜が、当該膜の前記血液接触側で約３０〜３５０μｍ、当該膜の前記反対側で約０．８〜２μｍの範囲である複数の細孔を含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項５】
前記濾過膜が、当該膜の前記反対側における細孔の平均直径よりも平均直径が大きい、当該膜の前記血液接触側における細孔を含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項６】
前記細孔が、約１．５μｍの直径範囲を有する、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項７】
前記血球凝集剤が、レクチン、ポリビニル硫酸、ポリマー及びヘパリンからなる群から選択される、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項８】
前記濾過膜が、ウシ血清アルブミンのコーティングをさらに含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項９】
前記血球凝集剤が、添付書類Ａに示すＡＡＬ、ＰＳＡ、ＳＴＬ、ＣｏｎＡ、ＳＮＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＳ、ｓ−ＷＧＡ及びＤＳＬ、並びにそれらの組合せからなるレクチン及び凝集素の群から選択される、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項１０】
前記濾過膜が、約４００μｍの厚さを含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項１１】
前記濾過膜が、ポリスルホン−ＰＶＰ又はポリスルホンを含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項１２】
全血から血液の非細胞性流体部分を分離するための方法であって、
（ａ）全血試料を血球凝集剤と接触させる工程と、
（ｂ）約０．８μｍ〜約３５０μｍの範囲のサイズの細孔及び約２００〜約４００μｍの厚さを含む濾過膜により前記全血試料を濾過する工程と、
（ｃ）前記濾過された全血試料から前記非細胞性流体部分を採取する工程と
を含む、方法。
【請求項１３】
工程（ａ）が、前記全血試料を前記濾過膜上に被覆された血球凝集剤と接触させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
濾過が、前記膜の細孔における毛管力下で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
濾過が、血液試料が添加される前記膜の反対側に適用される減圧の存在下で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
濾過が、前記膜の細孔に前記膜の血液接触側から適用される圧力下で起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
血漿分離装置を製造するための方法であって、
濾過膜をプラスチックハウジングに結合する工程であって、前記濾過膜は、複数の細孔、血液接触側及び反対側を含む、工程と、
前記濾過膜を血球凝集剤と接触させることにより、血球凝集剤で前記濾過膜を被覆する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
前記血球凝集剤が、添付書類Ａに示すＡＡＬ、ＰＳＡ、ＳＴＬ、ＣｏｎＡ、ＳＮＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＳ、ｓ−ＷＧＡ及びＤＳＬ、並びにそれらの組合せからなるレクチン及び凝集素の群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
濾過膜を被覆する工程が、前記血球凝集剤を前記膜に適用するために、前記濾過膜を熱乾燥する工程、真空乾燥する工程、浸漬する工程、及び回転する工程からなる群から選択される工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離膜を血球凝集剤で被覆する工程が、当該膜の細孔に適用される毛管力下で前記細孔の表面を被覆することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記膜を血球凝集剤で被覆する工程が、前記膜の反対側の細孔に適用される減圧の存在下で前記細孔を被覆することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記膜を血球凝集剤で被覆する工程が、前記膜の血液接触側から細孔に適用される陽圧の存在下で前記細孔を被覆することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
抗凝固剤を前記全血試料に添加する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
血液の前記流体部分が血漿を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記非細胞性流体部分中の抗原の回収率が、細胞性要素を除去するために遠心分離により調製された血漿中の抗原の回収率と比較して８０％を超える、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原が心臓マーカーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記心臓マーカーが、トロポニン、ＮＴ−プロＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＢＮＰ、又は他のナトリウム利尿ペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インビトロの診断装置で使用するための臨床試料の調製は、正確で信頼性の高い結果を達成するにおいて、必須の工程である。細胞内成分、例えば核酸及びタンパク質の検出には、典型的には、それらの細胞を化学的、機械的又は酵素的手段（又はそれらの組合せ）で溶解させることを必要とする。最適な方法は、主として、標的抗原を持ち、動物、植物、真菌、細菌及び古細菌生物のあらゆるタイプの細胞に及ぶ特異的細胞に依存する。試料処理もまた、非細胞性病原体、例えばウイルス及びその成分を検出するための重要な検討事項である。多くの場合、診断検査において利用される技術に応じて、有効な検出を可能にするために、試料又は粗溶解物から細胞又は病原体をさらに精製及び／又は濃縮する工程が必要とされる。組織試料、血液、痰、糞便、尿、唾液、洗浄試料、胸膜液等に応じて方法がかなり異なってくるため、別の重要な検討事項は、生物試料それ自体のタイプである。すべての場合において、試料処理の必須の目的は、潜在的な妨害物質を除去し、標的抗原の構造を保存し、容易に検出できる形態の抗原を提示することにより試験試料の複雑性を減少させることである。分析感度を改善するために抗原を濃縮することもまた、試料処理の重要な目的でありうる。
【０００２】
多くの場合において、検出される抗原は細胞外物質として存在するため、細胞溶解の必要性がない。しかしながら、かかる抗原は、それでもなお、適切な試験性能を達成するために試料処理工程を必要とする場合がある。かかる抗原の重要なカテゴリーは、血液の血漿成分中に存在するものである。様々なヒト疾患が、血中抗原の出現又は上昇をもたらす細胞傷害を引き起こす。例えば、心臓発作は心筋細胞の傷害を引き起こし、心筋トロポニンを血流中に放出する。同様に、左心室の関連する心不全は、ＢＮＰ及びＮＴ−プロＢＮＰの血中への放出をもたらす。したがって、これらの心臓マーカー（抗原）の血漿中の存在及び量は、臨床疾患を同定するための高い診断価値を有し、これらの患者の管理全般において重要である。
【０００３】
しかしながら、血液は、複雑な生物試料であり、水の約５倍の粘性がある。血液は、血漿タンパク（例えばアルブミン、グロブリン、フィブリノゲン）、酵素、代謝産物、無機物（例えばカルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム）、炭水化物、脂質、ビタミン、ホルモン、溶解気体、白血球（すなわち白い血球）、赤血球（すなわち赤い血球又はRBC）、栓球（すなわち血小板）及び他の成分（例えばクレアチン、アミノ酸、コリン、ヒスタミン、ビリルビン）を含む多くの下位成分を含有する。特に赤血球は、血液の体積の約４３％を構成するが、これは年齢、性別及び病状とともに変化する。これは、血液１マイクロリットル当たり約５００万個のＲＢＣに等しく、一方で同じ体積中に白血球約７，０００個が存在する。さらに、身体から抜き出されると、血液は迅速に凝塊となり、試料の取扱い及び抗原検出がさらに複雑になる。
【０００４】
凝固の問題は、単に血液試料を採取するために使用される試験管に抗凝固剤を添加することにより解決されてきた。抗凝固剤は、凝固を防止し、常法として使用されている。抗凝固剤の例には、ヘパリン、ＥＤＴＡ及びクエン酸ナトリウムが含まれる。しかしながら、血中の多数のＲＢＣ及び白血球並びにそれらが占めるかなりの体積が、抗原、例えば上述した血漿中の心臓抗原を検出及び／又は定量するように意図された診断用機器システム及びアッセイにとってしばしば問題になることがわかっている。多くの診断システムが、技術的に抗凝固処理血液試料を取り扱うための設備をまったく備えていない。代わりにそれらは、血漿を細胞から分離し、次に血漿試料を診断システムに添加することにより血液試料を処理することをユーザーに頼っている。幸いにも、細胞を沈殿させ血漿を細胞の上の分離層として残すには、細胞採血管の低速遠心分離しか必要としないため、これは比較的容易である。しかしながら、この工程が、遠心分離及びその実施のための約１５分間を必要とするのは確かであり、生体にさらなる有害な曝露をもたらす可能性がある。ある種の状況、例えば救急部においては、血液の遠心分離は、ワークフロー、所要時間、曝露の懸念、及び設備（遠心機は典型的には利用できない）の観点で断じて許容できない。
【０００５】
したがって、多くの診断装置製造者が、自身のシステムで血液試料を自動処理する問題を解決することを試みてきた。一部の製造者は、遠心分離機構を自身の機器に組み込むことまでしてきた。遠心機構はシステムにかなりの複雑性を加えるだけでなく、実質的に機器のサイズを増し、さらに追加の高価な使い捨てプラスチック付属品を要する場合もある。一部の製造者は、血液細胞を妨害し、基質層（典型的にはニトロセルロース）に沿って血漿を検出区画へと運ぶのに役立つ吸収性材料及び膜材料の層を組み込んだラテラルフロー装置を開発した。これらの装置は、本当の意味での血漿分離を達成するのではなく、細胞のサイズを利用してラテラルフローにおけるその進行を血漿と比較して遅らせるものである。しかしこれらの装置は、使用が容易で迅速な結果をもたらすにもかかわらず、一般にそれほど定量性又は感度が高くないため、多くの状況において臨床的有用性を欠く。
【０００６】
他の装置は、血漿を血液細胞から物理的に分離する必要なしに、抗凝固処理血液中で血漿抗原が検出されるように特化した技術及び特徴を用いることにより問題全体を回避してきた。かかる方法は有望ではあるが、おそらくは技術の実行の複雑性、費用及び信頼性又はアッセイ性能において払われる犠牲（例えば、感度、正確性、精度又はダイナミックレンジの損失）ゆえに、ほとんど市販されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、抗原コンフォメーンョンを保存し、抗原濃度を保持し、診断目的のために十分な体積をもたらす血漿を血液から調製するための、単純で、信頼性が高く、低コストで、使用が容易な手段が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般に、本明細書に記載の発明は、抗原、特に血液の流体部分中に細胞外物質として存在する抗原の損失なしに、血液の非細胞性流体部分、例えば血漿を、抗凝固処理全血から迅速に分離する分離装置及び方法に関する。本明細書に記載の発明は、先行技術の血漿分離装置及び方法に対して多くの利点を有する。例えば、これらに限られるものではないが、使用の容易さ、拡張性、自動化、製造の容易さ、安定性及び信頼性、血漿抗原の高回収率、高血漿収量、低コスト、並びに高ヘマトクリット血液試料、様々な抗凝固剤への応用性、並びに多くの用途及び構成における使用のための柔軟性が挙げられる。
【０００９】
一態様において、本発明は、ハウジング及び濾過（分離）膜を含む血漿分離装置に関する。本発明の一実施形態において、ハウジングは、血液導入ポート及び血漿流出チャネルを有する。濾過膜は、血液接触側及び反対側を有し、一実施形態において、ポリスルホン−ＰＶＰ又はポリスルホンを含む。濾過膜は、複数の細孔を特徴とし、約２００〜約４００μｍ、例えば４００μｍの厚さを有し、血球凝集剤で被覆されており、一実施形態において、ウシ血清アルブミンのコーティングをさらに含む。濾過膜は、ハウジングの、全血試料が導入される血液導入ポートと、血液が濾過膜を通過して流れる一方で細胞が除去された後に血漿が採取される血漿流出チャネルとの間に配置されている。
【００１０】
本発明の一実施形態において、血球凝集剤は、レクチン、ポリビニル硫酸、ポリマー及びヘパリンからなる群から選択される。凝集素及びかかるレクチンは、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＳＴＬ、ＣｏｎＡ、ＳＮＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＳ、ｓ−ＷＧＡ、及びＤＳＬ、並びにそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【００１１】
本発明による血漿分離装置の一実施形態において、濾過膜の複数の細孔は、血球凝集剤で被覆された内表面を含む。複数の細孔は、濾過膜の血液接触側で約３０〜３５０μｍ、濾過膜の反対側で約０．８〜２μｍ、例えば約１．５μｍの範囲のサイズである。血漿分離装置特定の一実施形態において、濾過膜の血液接触側における濾過膜の細孔の平均直径は、濾過膜の反対側における細孔の平均直径より大きい。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、血液の非細胞性流体部分、例えば血漿を全血から分離するための方法に関する。この方法の工程は、全血試料を血球凝集剤と接触させる工程と、約０．８μｍ〜約３５０μｍの範囲のサイズの細孔を含む、約２００〜約４００μｍの厚さの濾過膜により血液試料を濾過する工程と、分離装置の血漿流出チャネルで濾過された全血試料から全血試料の非細胞性流体部分を採取する工程とを含む。本発明の一実施形態において、全血試料を、濾過膜上に被覆された血球凝集剤と接触させるか、或いは、血液試料への血球凝集剤の直接添加により血球凝集剤と接触させる。本発明の方法の特定の一実施形態において、抗凝固剤が全血試料に添加される。
【００１３】
一実施形態において、全血試料は、濾過膜の細孔に膜の血液接触側から適用される圧力下で濾過される。或いは、また別の一実施形態において、全血試料は、血液試料が添加される膜の反対側に適用される減圧の存在下で濾過されるか、又は膜の細孔の毛管力下で濾過される。
【００１４】
血液の非細胞性部分を全血から分離するための本発明の方法の一実施形態によれば、上述の分離膜により濾過された全血の非細胞性流体部分中で回収された抗原は、細胞性要素を除去するために全血の遠心分離により調製された血漿中で回収された抗原と比較して８０％を超える。一実施形態において、回収された抗原は、心臓マーカー、例えばトロポニン、ＮＴ−プロＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＢＮＰ、又は他のナトリウム利尿ペプチド（naturietic peptides）である。
【００１５】
また別の一態様において、本発明は、血液の非細胞性部分、例えば血漿を全血から分離するための血漿分離装置を製造するための方法に関する。この製造方法は、複数の細孔、血液接触側及び反対側を有する濾過膜を、ハウジングに結合する工程を含む。ハウジングは、マイクロ流体デバイスの構成部であってもよい。濾過膜は、濾過膜を血球凝集剤と接触させることにより、血球凝集剤で被覆される。濾過膜は、血球凝集剤を濾過膜とともに例えば熱乾燥、真空乾燥、浸漬、又は回転し、血球凝集剤を濾過膜に適用することにより、血球凝集剤で被覆されていてもよい。
【００１６】
一実施形態において、血球凝集剤は、ＡＡＬ、ＰＳＡ、ＳＴＬ、ＣｏｎＡ、ＳＮＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＳ、ｓ−ＷＧＡ、及びＤＳＬ、並びにそれらの組合せからなるレクチン及び凝集素の群から選択されてもよい。
【００１７】
本発明による一実施形態において、濾過膜は、濾過膜の細孔に適用される毛管力下で濾過膜の細孔の内表面を被覆することにより、血球凝集剤で被覆される。
【００１８】
本発明によるまた別の一実施形態において、濾過膜は、濾過膜の血液接触側から細孔に適用される陽圧の存在下で濾過膜の細孔の内表面を被覆することにより、血球凝集剤で被覆される。
【００１９】
本発明による別の一実施形態において、濾過膜は、濾過膜の反対側上で細孔に適用される減圧の存在下で濾過膜の細孔の内表面を被覆することにより、血球凝集剤で被覆される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態による例示的血漿分離装置の横断面及び細孔サイズ指標を概略的に示す図である。
【図２】マイクロ流体デバイスの構成部として含まれる図１に示す血漿分離装置の横断面を概略的に示す図である。
【図３】血球凝集剤被覆膜を有する図１に示す血漿分離装置を示す図である。
【図４】未処理及びＳＴＬ処理分離膜からの血漿収量を示すグラフである。
【図５】ＳＴＬ処理分離膜での濾過により調製された血漿中のトロポニンを従来の遠心分離と対比した相関プロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで図１を参照すると、一態様において、本明細書に記載の発明は、ハウジング９０、血液導入ポート９２、血漿流出チャネル９４、及び血液導入ポート９２と血漿流出チャネルとの間に配置された濾過膜８０を有する血漿分離装置１００に関する。本発明によれば、分離装置１００は、血液の非細胞性成分、例えば血漿１０２を、血液の細胞９６、例えば赤血球及び白血球から分離するのに有用である。一実施形態において、分離装置１００は、例えば図２に示すとおり、患者血液試料における分析物を分析するためのマイクロ流体デバイス１０と連結されるか、又はその構成部である。
【００２２】
再び図１を参照すると、血漿濾過（分離とも呼ばれる）膜８０を、血液導入ポート９２と血漿流出チャネル９４との間に配置することにより、血液導入ポート９２を通じて導入された全血が、導入ポート９２から分離膜８０を通過して流れることが意図される。分離膜８０において、血漿は血液の細胞成分から分離され、もはや血液細胞９６を実質的に含まない血漿１０２が、濾過膜８０から血漿流出チャネル９４へと放出され、そこから血漿１０２が最終的に採取される。
【００２３】
濾過又は分離膜８０とも呼ばれるが、これは、好適な濾過膜材料でできており、かかる材料の例のいくつかを挙げれば、ポリスルホン、ポリスルホン−ＰＶＰ、ガラス繊維、及び酢酸セルロースを含むが、これに限られない。濾過膜８０は、典型的には、平面状であり、約２００〜８００μｍ、３００〜６００μｍ、３５０〜４５０μｍの範囲、好ましくは約４００μｍの厚さを有していてもよい。濾過膜８０は、血液導入ポート９２を介して導入された血液試料と接触する血液接触側８２、及び反対側８６を有する。濾過膜８０は、血液試料接触側８２の表面から濾過膜８０のメッシュ又は本体８３を通って、最終的に濾過膜８０の反対側８６の表面を通って、濾過膜８０を貫通して伸長する複数の細孔８４を含む。本明細書において使用される「細孔」という用語は、濾過膜８０の格子様メッシュ８３内の蛇行経路に関する。細孔８４は、濾過膜の血液接触表面又は反対表面と垂直に伸長するルートを通る経路と比較してねじ曲がって間接的でありうる経路を介して、濾過膜８０の一表面から反対表面へと伸長していてもよい。典型的には、平均的細孔の直径は、血液接触側８２で約３０μｍ〜約３５０μｍの範囲であり、濾過膜８０の反対側８６で約０．８μｍ〜約２．０μｍまで減少する。
【００２４】
図３を参照すると、一実施形態において、分離膜８０は、少なくとも１つの血球凝集剤８８、例えばこれに限られないが、レクチン又は凝集素、例えば下の表ＩＩに示すＡＡＬ、ＰＳＡ、ＳＴＬ、ＣｏｎＡ、ＳＮＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＳ、ｓ−ＷＧＡ、及びＤＳＬ、並びに／又はポリビニル硫酸、ポリマー、ヘパリン、並びにそれらの組合せで被覆される。本発明の一実施形態において、すべての膜表面には、分離膜８０の外側の表面、例えば血液接触表面８２及び反対側表面８６が含まれるだけでなく、細孔８４の内表面８５もまた同様に血球凝集剤８８で被覆される。
【００２５】
典型的には、濾過膜８０は、膜の反対側８６上の細孔８４の平均直径よりも平均直径が大きい、膜の血液接触側８２上の細孔８４を有する。
【００２６】
本発明の一実施形態において、濾過膜８０は、ウシ血清アルブミンのコーティングをさらに含む。
【００２７】
別の一態様において、本発明は、血漿を全血試料から分離するための方法に関する。全血試料は、血液導入ポートを通じて上で論じた血漿分離装置へと導入され、血球凝集剤と接触させられる。一実施形態において、血球凝集剤は、細孔の表面を含む分離膜の表面上に位置する。血液は、例えば膜に適用される毛管作用、減圧（陰圧）、又は陽圧により、濾過膜の細孔を通じて浸出する。濾過された血液は、分離膜の反対側を血漿流出チャネルへと出て、そこから血漿が採取される。
【００２８】
別の一態様において、本発明は、上述の血漿分離装置を製造するための方法に関する。上述のとおり、分離膜は、当業者に知られている方法、例えばこれに限られないが、熱結合、及び／又は接着剤により、ハウジング、例えばプラスチックハウジングと結合される。プラスチックハウジングは、患者血液試料中の分析物を分析するためのマイクロ流体デバイスと連結されてもよく、マイクロ流体デバイスの構成部であってもよい。分離膜は、上で論じたとおり、好ましくは血球凝集剤を、非対称膜の反対側の細孔より大きな平均直径を有する細孔を有する非対称膜の血液接触側と接触させることにより、血球凝集剤で被覆される。分離膜を血球凝集剤で被覆することは、当業者により知られている方法、例えばこれに限られないが、濾過膜を熱乾燥、真空乾燥、接着剤適用、浸漬、及び回転して、血球凝集剤を膜に適用することにより達成される。毛管力、陽圧の適用、又は分離膜の細孔への減圧の適用が、血球凝集剤を分離膜の細孔へと引き出すために使用できる。
【００２９】
一態様において、本発明は、血漿を抗凝固処理血液から分離する方法に関する。本発明の方法の基礎原理は、サイズ排除濾過である。本明細書に記載の発明は、先行技術の血漿分離装置を特徴付ける望ましくない複雑化要因、例えばＲＢＣ漏出、血漿分離装置を通る血流量の低さ、分離膜の目詰まり、抗原損失、低血漿体積収量、質の悪い血漿、例えば溶血血漿、及び１つのロットと別のロットとの間の不整合を含む、先行技術の血漿分離装置及び方法の数多くの問題を解決する。
【００３０】
本明細書に開示の血漿分離のための方法及び装置を開発する一方で、膜に対する様々な実験的処理（例えば、高いpHでのカゼイン、スクロース、Tweenでの処理）を研究した。これらの処理は、抗原回収率を改善したが、遅い血流量、試料溶血、及び材料のいくつかのバッチにおける実質的なＲＢＣ漏出に関して、あまり望ましくない。多くの他の成分が、膜処理として評価された（下の表Ｉを参照のこと）。示されているものは、試験された濃度の範囲、試験されたポリマー分子量の範囲及び、重要なことに試験されたこれら要素の様々な組合せを含んでいないことから、研究したものを単に例示したにすぎない。
【００３１】
これら研究の結果は、効果、有害効果を含まず、ある領域で性能は向上したが別の領域では性能が低下した（例えば、流量の上昇又は溶血の欠如はあるが、抗原の損失を伴う）。低い流量又は溶血を解決する一方で同時に抗原を保存する所望の処理溶液は、これらの初期探査的研究からは見出されなかった。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
図１〜図３を全体に参照すると、本明細書に記載の発明は、血漿を全血から分離するための方法及び装置に関する。本方法は、分離（濾過）膜によるサイズ排除濾過と赤血球（RBC）凝集とを組み合わせる。ＲＢＣを凝集させることは、そうでなければ血液試料が濾過される分離膜の細孔構造に侵入して膜の細孔開口部を目詰まりさせる個別のＲＢＣの数を減少させることにより、濾過率を劇的に改善する。
【００３４】
本発明による分離膜は、可能な膜材料のいくつかを挙げれば、ポリスルホン、ポリスルホン−ＰＶＰ、酢酸セルロース、ガラス繊維、及び様々なポリマーでできていてもよい。
【００３５】
本発明の一実施形態において、非対称（非対称とは、膜の一方の側の細孔の平均直径が、膜の他方の側の細孔の平均直径と異なることを意味する）ポリスルホン膜の平均細孔サイズは、約０．８μｍ〜約２．０μｍ、好ましくは１．３μｍである。本発明者らは、１．３μｍが、ＲＢＣが分離膜を通って漏出するのを防止するのに有効であることを見出した。しかしながら、より小さな細孔によって制約をより大きくすることはまた、特により高い血液ヘマトクリット（血中の血球体積に相当）で、化学的膜処理、例えばカゼイン、スクロース、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリマー（上の表Ｉを参照のこと）を使用する際、実質的に流量を減少させる（０．０４マイクロＬ／秒〜０．０１マイクロＬ／秒）。この流量制限は、分離膜構造の細孔に深く浸透することができない大きなＲＢＣの凝集体を作成し、ＲＢＣが細孔を目詰まりさせることを防止することによって大幅に克服される。この点に関して、分離膜の厚さを約２００〜８００μｍ、３００〜６００μｍ、３５０〜４５０μｍの間の範囲、好ましくは約４００μｍまで増加させることにより分離膜の濾過能力を増加させることも重要であることがわかった。したがって、一方の側の約２００μｍから他方の側の約１μｍまでの範囲の平均細孔構造を有し（以下ではILM膜と呼ぶ）、下に記載するＲＢＣ凝集メカニズムを有する、約４００μｍ厚のポリスルホン−ＰＶＰ分離膜は、抗凝固処理血液からの効率的な血漿分離と関連する主要な問題を解決する。所望の流量は、約０．１５マイクロＬ／秒〜約１．０マイクロＬ／秒であると考えられる。しかしながら、より大きな膜表面積で、もっとはるかに大きな流量が可能である。本明細書に記載の血漿分離の血漿分離装置及び方法は、速い流量、高い抗原回収率及び、高い質の血漿の高い収量を可能にする。
【００３６】
本発明の方法の一実施形態において、抗凝固処理全血試料におけるＲＢＣの凝集は、血液試料を膜濾過システムと接触させる前の、血球凝集成分の血液への直接添加により達成される。例えば、多量のヘパリン又はポリマーの添加は、細胞表面と共溶質との間の境界層での枯渇メカニズムにより誘導されたと考えられるＲＢＣ凝集を引き起こす。４８％ヘマトクリット血液試料にヘパリン３４ｍｇ／ｍＬが添加され、次にＩＬＭ未処理分離膜（すなわち、血球凝集剤で被覆されていない）で濾過されると、血漿分離時間がヘパリンなしの３．５分と比較して、１８秒のみになった。同様の結果が、分離膜で濾過する前の、血液への合成ポリマー（ポリビニル硫酸１６ｍｇ／ｍＬ、１７０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量）の添加により達成された。さらにまた同様の結果が、細胞表面糖タンパクの炭水化物の特異的相互作用及び架橋により血球凝集を引き起こす、濾過前に血液に添加された様々なレクチン及び凝集素（AAL、PSA、STL、ConA、SNA、LCA、PHA-E、WGA、s-WGA、DSL、下の表ＩＩに添付のレクチン及び凝集素の表を参照のこと）で達成された。特異的凝集メカニズムゆえに、はるかに少ない量（約０．２ｍｇ／ｍＬ）のレクチンが、上述の他の可能な血球凝集剤と比較して、これらの速い流量及び血漿分離を達成するために有効であった。すべての場合において、ＲＢＣの凝集は顕微鏡視覚化により確認された。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
しかしながら、血液へのＲＢＣ凝集剤の直接添加は、診断機器において自動化するのが容易でない。さらに、かかる工程は、時間及び追加工程、添加剤の保存、分注機器の必要性、慎重で正確な送達の必要性、生体有害物質へのさらなる曝露、並びに他の診断試験のためのその使用を限定する試料への不純物混入ゆえに、一部の臨床的状況、例えば救急室においては非実用的である。
【００３９】
上述の実際的な問題は、血液試料と接触する分離膜の側（図３を参照して上述した膜の血液接触側）（すなわち、分離膜の反対側の細孔側と比較して、より大きな細孔の側）を、血球凝集剤が分離膜の血液接触側から分離膜の反対側まで分離膜の間隙全体に浸透し、血球凝集剤を細孔の内表面と接触させるのを確実にするために十分な時間、十分な量の血球凝集剤で曝露することにより解決された。適切な血球凝集剤を選択する際の問題は、乾燥後に、長期貯蔵後であっても血球凝集剤が膜表面上で安定でなければならないというものである。また、血球凝集剤は、血液試料により容易に可溶化されなければならず、可溶化されるとその活性を迅速に回復しなければならない。可溶化し活性化されると、血球凝集剤は、赤血球が分離膜細孔を目詰まりさせる前に、赤血球を迅速に凝集させなければならない。なぜなら、血液試料は、毛管力により分離膜の血液接触側から膜内へと急速に引かれるからである。分離膜の表面上を被覆した血球凝集剤は、膜の目詰まりを阻害するのに必要な試料中のＲＢＣの十分な量だけを凝集させる。換言すれば、血球凝集剤が血液試料体積全体に拡散する必要はない。ＲＢＣ凝集は、それらの細胞が分離膜細孔内に移動することを伴う動的過程である。
【００４０】
ヘパリン及びポリビニル硫酸は、それらの血液への直接添加とは対照的に、血漿分離時間のわずかな改善のみが見られ、膜を処理するためにほとんど有効でないことがわかった。これらの試剤によるＲＢＣの非特異的凝集には高い濃度が必要であるため、これは、分離膜上への乾燥及びそれに続く可溶化後のこれらの試剤の量が不十分であることに起因する可能性が高い。
【００４１】
対照的に、ＩＬＭ膜のレクチン処理は、血漿分離のために非常に有効であることが証明され、これは、血漿抗原の損失なしに濾過により血漿を血液から迅速に採取するための本発明の実施の具体例である。試料の若干の溶血は、それが仮に生じるとすれば、レクチン及びウシ血清アルブミン（BSA）でのＩＬＭ膜の共処理により緩和できる。
【実施例】
【００４２】
ＩＬＭ未処理分離膜ディスク（直径１３ｍｍ）を、マイクロ流体カートリッジのために設計されたポリスチレンハウジングと熱結合した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２中にジャガイモ（Solanum tuberosum）レクチン（STL）０．２ｍｇ／ｍＬを含有する１０マイクロリットル（１０μＬ）の溶液を、分離膜の大きな細孔の側（血液試料と接触する側）と接触させた。次に、分離膜を真空オーブン内で、３４℃、３０分間乾燥させた。この実施例において使用されない代替的一実施形態において、より大きな分離膜片を血球凝集剤で最初に処理でき、適切な処理分離膜片を切り出して、次にハウジングに結合することが考えられる。
【００４３】
本発明者らは、１２個の別個のトロポニン添加血液試料（ヘマトクリット平均４１％、３６〜４５％の範囲）を、上述のＩＬＭ膜のＳＴＬ処理側（大きな細孔、すなわち血液接触側）に添加し、処理分離膜での濾過により血漿を血液試料から分離する研究を実施した。得られた血漿は、減圧によりマイクロ流体カートリッジ内のチャネルへと回収された。約５．２μＬの血漿を、減圧をオフにする前に装置内へと引き出した。平均血漿分離時間（減圧のオンからオフまでの時間として定義される）は、１７秒のみで、１１〜２６秒の範囲だった。このように、分離膜を通過する非常に速い血流量が、レクチン処理により達成され、全血からの血漿の非常に迅速な分離をもたらした。さらに、平均トロポニン（TnI）回収率は９４％だった（７９％〜１０４％の範囲）。データは、下の表ＩＩＩに要約されている。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
５．２μＬの血漿収量は、マイクロ流体カートリッジシステムにおいて診断結果をもたらすのに必要とされる全体積であり、本発明によるＳＴＬ処理ＩＬＭ膜による血漿の最大収量として解釈されるべきではないことに留意すべきである。
【００４６】
最大収量を決定するために、別の研究が実施された。９０μＬの血液を、ＳＴＬ処理又は未処理ＩＬＭ分離膜（ハウジングに結合）に添加し、直径１３ｍｍの吸収性ディスクの事前に質量を測定したスタックとの直接接触下に置いた。３分後、吸収性ディスクの質量を測定し、質量差を分離血漿の最大体積の尺度として使用した。この実験は、３９％〜５０％の範囲のヘマトクリットを有する４つの血液試料で実施した。予測どおり、ＳＴＬ処理及び未処理分離膜の両方について、血漿収量は、ヘマトクリットの増加とともに、より多くのＲＢＣにより誘導される濾過速度の低下及び／又は膜の目詰まりにより減少した。下の図４にグラフで示すとおり、すべての場合において、血漿収量は、未処理ＩＬＭ膜と比較してＳＴＬ処理ＩＬＭ膜でより大きく、未処理膜よりも平均で４２％大きい体積（３２％〜５５％）だった。ＳＴＬ処理膜は、５０％ヘマトクリット試料から約１１．５μＬの血漿をもたらした。パーセント収量もまた推定できる。５０％ヘマトクリット血液試料９０μＬ中、最大利用可能血漿は４５μＬである。ＩＬＭ膜の隙間のデッドスペース（ディスクの直径及びその厚さを考慮）は、約３５μＬであると測定された。このスペース中の物質は、極端に高い毛管力ゆえに回収できないと考えられる。このスペースの半分が血漿で占められ、他の半分が血液細胞で占められる場合、得られる最大血漿量は４５μＬ−（３５μＬ／２）＝２７．５μＬである。したがって、パーセント収量は、１１．５／２７．５＝４２％であった。
【００４７】
ＳＴＬ処理ＩＬＭ膜を、心筋トロポニンアッセイが依頼された胸痛又は他の徴候を有する患者から前もって収集した血液試料を使用した研究において、さらに試験した。３８人の患者をこの研究において評価した。各患者の血液試料からのアリコートを遠心分離し、従来の手段により血漿を調製した。次に、血液及び血漿試料を、ＳＴＬ処理ＩＬＭ膜を使用したマイクロ流体カートリッジシステム上で処理した。トロポニンの平均回収率（レクチン処理膜での血液試料の濾過により調製されるトロポニンシグナルの量を、血液試料の遠心分離により調製される血漿中のトロポニンシグナルで割ることにより決定）は、９５％だった（６９％〜１２０％の範囲）。さらに、血中のトロポニン濃度を血漿と対比した相関プロットは、ｙ＝１．００２ｘ（線形フィット（linear fit）、ｒ^２＝０．９９２４）又はｙ＝０．９３３ｘ^１．００３（累乗フィット（power fit）、ｒ^２＝０．９９６９）の回帰曲線との優れた一致を示した。両対数プロットでの累乗フィットの結果を、以下の図５で示す。
【００４８】
本発明による血漿分離方法は、容易且つ迅速に血漿を抗凝固処理全血から血漿抗原の損失なしに分離する。本発明の一実施形態の重要な特徴は、ＲＢＣ凝集を誘導する試剤で処理された、非対称細孔構造を有するポリスルホン−ＰＶＰ膜である。
【００４９】
本発明の血漿濾過装置の特定の一実施形態において、膜フィルターは、約０．８〜約２．０μｍの直径を有する小さな細孔を有する。膜を処理してＲＢＣ凝集及び迅速な濾過率を促進するのに、レクチンが有効な試剤であることが示された。この血漿膜は、例えば、膜上に乾燥させた２μｇのジャガイモレクチンを有する。当業者は、本発明が本明細書に開示のレクチン及び凝集素に限定されないことを認めると考えられる。なぜなら、ＲＢＣ凝集を引き起こす他の試剤、例えばヘパリン、ポリマー、及び他の試剤、例えば表ＩＩに示すものもまた使用できるからである。
【００５０】
また、本明細書に記載の発明は、例示的実施例において使用された濃度、適用方法、又は乾燥条件に限定されない。さらに、本発明は、ポリスルホン−ＰＶＰ以外の材料でできた膜に適用されてもよく、血液と接触する膜の側の細孔の平均直径が膜の反対側の細孔の平均直径よりも大きい非対称細孔構造に限定されない。本明細書に記載の実施例が、マイクロ流体カートリッジに取り付けられたハウジングに結合したＳＴＬ処理膜を使用し、分離された血漿が減圧を使用してマイクロ流体カートリッジのマイクロチャネル内に回収されたとはいえ、分離された血漿をもたらすために本発明を他の装置設計に適用する多くの仕方が存在する。例えば、より大きな膜面積又は他の膜構成（例えば接線流構成）を使用してもよいし、表面積を増加させてさらに多くの血漿体積をもたらしてもよい。
【００５１】
本明細書に記載の本発明による血漿分離方法及び装置の主要な利点の１つは、使用の容易さである。本発明の一実施形態において、膜処理方法は、単に血球凝集剤、例えばＳＴＬの溶液を、膜に接触させ、続いて試剤を膜の表面に結合するために乾燥させる等の工程を伴うだけである。
【００５２】
膜調製は、例えば浸漬タンク及び膜のロールを使用し、続いて急速熱風ナイフ又はトンネル乾燥器を使用することにより、容易にスケーリングして自動化することができる。全血がＳＴＬ処理膜の大きな細孔の側に適用されるとき、外力又はいかなる装置又は機器の必要もなしに、血漿分離がただちに開始される。これは、膜の細孔構造内に生み出される毛管力によってのみ起こる。細孔は、導入された血液試料と接触する膜の側とは反対の膜の側でより小さいので、毛管力はより小さい細孔に向かって増加し、血漿はその方向に流れる。分離された血漿は、小さな細孔の側（反対側）の表面上に自動的に蓄積し、本明細書に記載のものを含めた当業者に知られている多くの手段、例えば減圧又は吸収性材料でのウィッキングにより、その表面から回収されうる。
【００５３】
したがって、本発明は、診断用途のために血液から血漿を調製するための多くの利点を有する。製造が容易である。低コストである。使用が容易である。信頼性が高く安定している。非常に迅速な血漿分離を可能にする。血漿抗原の高回収率が達成される。適用される血液体積のパーセンテージとしての高い血漿回収率が達成される。高ヘマトクリット血液試料及び様々な抗凝固剤とともに動作する。多くの用途及び構成で柔軟に使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月28日(2014.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液導入ポート及び血漿流出チャネルを含むハウジングと、
血液接触側及び前記血漿流出チャネルに隣接する反対側を有する濾過膜と、
を含む血漿分離装置であって、
前記濾過膜は、細孔を含み、
前記細孔は、（ｉ）前記濾過膜の前記血液接触側から前記濾過膜の前記反対側へと前記細孔の直径のサイズが減少している直径と、（ｉｉ）内表面とを含む、
血漿分離装置。
【請求項２】
前記細孔の前記内表面が、血球凝集剤で被覆されている、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項３】
前記血球凝集剤が、レクチン及び凝集素並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の血漿分離装置。
【請求項４】
前記細孔の直径が、前記膜の前記血液接触側で約３０μｍ〜約３５０μｍ、当該膜の前記反対側で約０．８μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項５】
前記血球凝集剤が、ポリビニル硫酸、ポリマー及びヘパリン並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の血漿分離装置。
【請求項６】
前記濾過膜が、ウシ血清アルブミンのコーティングをさらに含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項７】
前記レクチン及び凝集素が、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ジャガイモレクチン（ＳＴＬ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）、レンズマメ凝集素（ＬＣＡ）、インゲンマメ赤血球凝集素（ＰＨＡ−Ｅ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＳ）、サクシニル化コムギ胚芽凝集素（ｓ−ＷＧＳ）、及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の血漿分離装置。
【請求項８】
前記濾過膜が、約２００μｍ〜約８００μｍの範囲の厚さを含む、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項９】
前記濾過膜が、ポリスルホン−ＰＶＰ及びポリスルホン並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の血漿分離装置。
【請求項１０】
全血試料から血液の非細胞性流体部分を分離するための方法であって、
（ａ）複数の細孔、血液接触側及び反対側を含む濾過膜を用意する工程と、
（ｂ）全血試料を血球凝集素と接触させる工程と、
（ｃ）前記全血試料を前記濾過膜の細孔で濾過する工程と、
（ｄ）前記濾過膜の反対側で濾過された全血試料から前記非細胞性流体部分を採取する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１】
濾過が、前記濾過膜の細孔における毛管力下で起こる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
濾過が、全血試料が添加される前記濾過膜の反対側に適用される減圧の存在下で起こる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
濾過が、前記濾過膜の細孔に前記濾過膜の血液接触側から適用される圧力下で起こる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
血漿分離装置を製造するための方法であって、
濾過膜をプラスチックハウジングに結合する工程であって、前記濾過膜は、内表面を含む複数の細孔、血液接触側、及び反対側を含む、工程と、
前記濾過膜を血球凝集剤と接触させることにより血球凝集剤で前記濾過膜を被覆する工程であって、前記細孔の前記内表面が血球凝集剤で被覆される、工程と、
を含む、血漿分離装置を製造するための方法。
【請求項１５】
前記血球凝集剤が、レクチン及び凝集素、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
濾過膜の被覆が、前記血球凝集剤を前記膜に適用するために、前記濾過膜を熱乾燥する工程、真空乾燥する工程、浸漬する工程、及び回転する工程からなる群から選択される工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記血球凝集剤での前記濾過膜の被覆が、当該膜の細孔に適用される毛管力下で前記細孔を被覆することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記細孔の被覆が、前記膜の反対側の細孔に適用される減圧の存在下でなされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記細孔の被覆が、前記膜の血液接触側から細孔に適用される陽圧の存在下でなされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
抗凝固剤を前記全血試料に添加する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
血液の前記非細胞性流体部分が血漿を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非細胞性流体部分中の抗原の回収率が、細胞性要素を除去するために遠心分離により調製された血漿中の抗原の回収率と比較して８０％を超える、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が心臓マーカーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記心臓マーカーが、トロポニン、ＮＴ−プロＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＢＮＰ、及び他のナトリウム利尿ペプチドからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
濾過膜が、約２００μｍ〜約８００μｍの範囲の厚さを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
レクチン及び凝集素が、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ジャガイモレクチン（ＳＴＬ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）、レンズマメ凝集素（ＬＣＡ）、インゲンマメ赤血球凝集素（ＰＨＡ−Ｅ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＳ）、サクシニル化コムギ胚芽凝集素（ｓ−ＷＧＳ）、及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
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2016520796.tif 000012
2016520796.tif 000013
2016520796.tif 000014
2016520796.tif 000015