(57)【要約】  本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析ユニット（１００）に関し、当該分析ユニット（１００）は、少なくとも１つの蓋凹部（１３５）を有する蓋部材（１３０）と、反応チャンバ（１１０）を形成すべく前記蓋凹部（１３５）に対向するように配置された少なくとも１つの底凹部（１５２）を有する底部材（１５０）とを有する。さらに分析ユニット（１００）は、前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間において少なくとも前記蓋凹部（１３５）の領域に配置された膜（１４０）を有する。前記分析ユニット（１００）は、前記反応チャンバ（１１０）の前記底凹部（１５２）内に流体を導入および／または導出するために前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間に形成された少なくとも１つの流路（１６０ａ，１６０ｂ）も有する。最後に分析ユニット（１００）は、生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブ（１５７）として備えている、前記底凹部（１５２）内に配置されたプローブキャリア（１５５）であって、当該プローブキャリア（１５５）上において前記指標物質は固体状態となっている、プローブキャリア（１５５）を有する。
2016540501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析ユニット（１００）であって、
・少なくとも１つの蓋凹部（１３５）を有する蓋部材（１３０）と、
・反応チャンバ（１１０）を形成すべく前記蓋凹部（１３５）に対向するように配置された少なくとも１つの底凹部（１５２）を有する底部材（１５０）と、
・前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間において少なくとも前記蓋凹部（１３５）の領域に配置された膜（１４０）と、
・前記反応チャンバ（１１０）の前記底凹部（１５２）内に流体を導入および／または導出するために前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間に形成された少なくとも１つの流路（１６０ａ，１６０ｂ）と、
・生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブ（１５７）として備えている、前記底凹部（１５２）内に配置されたプローブキャリア（１５５）と
を有し、
前記プローブキャリア（１５５）上において前記指標物質は固体状態となっている
ことを特徴とする分析ユニット（１００）。
【請求項２】
前記膜（１４０）が前記蓋部材（１３０）に固定されており、
特に、前記膜（１４０）は、前記蓋凹部（１３５）の、前記貫通口（１３７）に対向する開口部を流体密に封止し、および／または、前記蓋凹部（１３５）の領域において前記蓋部材（１３０）が貫通口（１３７）を有する、
請求項１記載の分析ユニット（１００）。
【請求項３】
前記蓋部材（１３０）は少なくとも１つの別の蓋凹部（２３５）を有し、かつ、前記底部材（１５０）は少なくとも１つの別の底凹部（２５２）を有し、
前記別の蓋凹部（２３５）は前記別の底凹部（２５２）に対向するように配置されており、
前記底凹部（１５２）と前記別の底凹部（２５２）とは、前記流路（１６０ａ，１６０ｂ）によって流体力学的に結合されている、
請求項１または２記載の分析ユニット（１００）。
【請求項４】
前記別の底凹部（２５２）内に別のプローブキャリア（２５５）が配置されており、
前記別のプローブキャリア（２５５）は、他の生化学的物質を同定するための少なくとも１つの別の指標物質を別のプローブ（２５７）として有し、
前記別のプローブキャリア（２５５）上において前記別の指標物質は固体状態となっている、
請求項３記載の分析ユニット（１００）。
【請求項５】
前記底凹部（１５２）は前記流路（１６０ａ，１６０ｂ）を少なくとも２つの部分流路に分割し、
少なくとも１つの部分流路（１６０ａ）は、前記分析ユニット（１００）の外周囲との流体連通を行うためのものであり、
特に、少なくとも１つの部分流路（１６０ａ，１６０ｂ）はバルブ（１６５）を有する、
請求項１から４までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）。
【請求項６】
前記部分流路は、前記底凹部（１５２）とは反対側の端部において互いに流体力学的に結合されているか、または流体力学的に結合可能となっており、
特に、前記部分流路は、環状流路（１６０ａ，１６０ｂ）の構成要素である、
請求項５記載の分析ユニット（１００）。
【請求項７】
ポリメラーゼ連鎖反応中に、生化学的物質を同定するための前記指標物質と物質との反応が行えるように、前記プローブキャリア（１５５）は構成および配置されている、
請求項１から６までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を動作させるための分析装置（７００）であって、
・前記分析ユニット（１００）を位置決めするため、および／または、前記分析装置の動作中に前記分析ユニット（１００）を保持するためのホルダ（７３０）と、
・前記ホルダにより保持された前記分析ユニット（１００）において流体または固体の調温を行うための調温ユニット（７１０）と、
・指標物質の変化を解析するための解析ユニット（７２０）と
を有することを特徴とする分析装置（７００）。
【請求項９】
前記調温ユニット（７１０）は、前記分析ユニット（１００）の複数の異なる区域を同時に、それぞれ別の温度にするように構成されている、
請求項８記載の分析装置（７００）。
【請求項１０】
請求項１から７までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を動作させる方法（８００）であって、
・前記分析ユニット（１００）を準備するステップ（８１０）と、
・前記分析ユニット（１００）において反応を行うため、分析対象の物質および／または触媒物質を前記分析ユニットへ供給するステップ（８２０）と、
・プローブキャリア（１５５）上における指標物質の変化を解析するステップ（８３０）と
を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記供給するステップと解析するステップとを、少なくとも一部について同時に行う、
請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記供給するステップ（８２０）および／または前記解析するステップ（８３０）において、前記分析対象の物質、触媒物質および／または指標物質の調温を行う、
請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から７までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を製造する方法（９００）であって、
・少なくとも１つの蓋凹部（１３５）を有する蓋部材であって、当該蓋凹部（１３５）の領域に貫通口（１３７）を有する蓋部材（１３０）と、
少なくとも１つの底凹部（１５２）を有する底部材（１５０）と、
膜（１４０）と、
生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブ（１５７）として有するプローブキャリア（１５５）であって、当該指標物質はプローブキャリア上において固体状態となっているプローブキャリア（１５５）と
を準備するステップ（９１０）と、
・前記底凹部（１５２）内に前記プローブキャリア（１５５）を配置するステップ（９２０）と、
・前記蓋凹部（１３５）を前記膜（１４０）によってカバーするステップ（９３０）と、
・反応チャンバ（１１０）の前記底凹部（１５２）内へ流体を導入および／または導出するための流路領域（１６０ａ，１６０ｂ）の形成を行うステップ（９４０）であって、当該形成は、前記反応チャンバ（１１０）を形成するために当該蓋凹部（１３５）に対向して前記底凹部（１５２）を配置することにより行われるステップ（９４０）と
を有することを特徴とする方法（９００）。
【請求項１４】
請求項１０から１３までのいずれか１項記載の方法（８００，９００）の各ステップを制御および／または実行するように構成されたユニットを備えた制御装置。
【請求項１５】
コンピュータプログラム製品であって、
前記プログラム製品が装置上で実行されるときに請求項１０から１３までのいずれか１項記載の方法（８００，９００）を実施または制御するためのプログラムコードを有する、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
従来技術
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析装置、分析装置、分析ユニットの動作方法、分析ユニットの製造方法、および、対応するコンピュータプログラム製品に関する。
【０００２】
ラボ・オン・チップ（ＬＯＣ）等のマイクロ流体診断システムにより、非常に多岐にわたる種々の分子を特異的に検出するための複雑な作業フローの小型化および統合された実施が可能となる。刊行物記載のＬＯＣシステムでは、まず最初にＰＣＲを用いて検査対象の試料を増幅し、その次にマイクロアレイ上にて分析する（たとえば、J.Choi et al:“An integrated allele-specific polymerase chain reaction-microarray chip for multiplex single nucleotide polymorphism typing, Lab on a Chip, vol. 12, 2012”にも記載されており、参照されたい）。これら２つの作業を繋げてマルチステッププロセス制御を行うと、処理時間が長くなり、プロセス制御が面倒になる。
【０００３】
発明の開示
上述のことを背景として、本発明にて開示する手段では、独立請求項に記載されたポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析装置、分析装置、分析ユニットの動作方法、分析ユニットの製造方法、および、対応するコンピュータプログラム製品を開示する。
【０００４】
各従属請求項と以下の記載内容とから、有利な実施形態を導き出すことができる。
【０００５】
本発明にて開示する手段は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析ユニットであって、当該分析装置が以下の構成を有する分析ユニットを実現したものである：
・少なくとも１つの蓋凹部を有する蓋部材。
・少なくとも１つの底凹部を有する底部材。底凹部は、反応チャンバを形成すべく、蓋凹部に対向するように配置されている。
・蓋部材と底部材との間において少なくとも蓋凹部の領域に配置された膜。
・反応チャンバの底凹部内に流体を導入および／または導出するための、蓋部材と底部材との間に形成された少なくとも１つの流路。
・生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブとして備えている、底凹部内に配置されたプローブキャリア。プローブキャリア上の指標物質は固体状態である。
【０００６】
「蓋部材」および／または「底部材」とはたとえば、プラスチックから、特にポリマーから作製された構成要素を指すことができる。「凹部」とはたとえば、蓋部材または底部材の凹んだ部分を指すことができる。「膜」とは、たとえばプラスチック層等の面状のフレキシブル部材を指すことができる。この膜は、流体透過性とすることができる。「プローブキャリア」とは剛性の部材、特に、表面上に指標物質を配置および固定した部材を指すことができる。「指標物質」とはたとえば、所定の生化学的物質と接触したときに、（たとえば光学的分析により）同定可能および／または評価可能な状態変化を生ずる化学的試薬または生分子を指すことができる。「同定」とは、所定の物質の有無自体の判定、および／または、所定の物質の量ならびに／もしくは質の判定を含み得る。
【０００７】
本発明にて開示している手段は、生化学分析プロセスの範囲における固相反応を、生化学反応プロセスの液相反応も行う１つの反応チャンバ内で直接行うことが可能であるとの認識に基づいている。大抵、指標物質は固相すなわち固体状態になっているので、生化学反応プロセス全部を、１つの小さいコンパクトな分析ユニットにおいて実施することができる。かかる場合、分析対象の出発物質と、場合によっては、たとえば生化学反応プロセスの中間産物の生成ないしは合成に必要な触媒物質が必要である場合には触媒物質とを、流体の形態で流路を介して反応チャンバないしは底凹部に導入することができる。
【０００８】
本発明にて開示している手段の利点は、複数の異なるプロセス段階から得られた生化学反応の中間産物を手動で一緒にまとめる必要なく、生化学反応を行える非常に簡単な技術的手段が実現されることである。特に、固相反応が行われる第２の部分反応を実施するため、液相反応が行われる第１の部分反応の中間産物を別個の区画に手動で移すのを不要とすることができる。よって、特に所望の生化学反応が、それぞれ異なる物質状態の物質に基づいて行われる２つの別個の部分ないしは部分反応を有する場合、本発明にて開示している手段により、所望の生化学反応を格段に低コストかつ迅速に行うことが可能となる。
【０００９】
好適には、本発明の１つの実施形態では、膜が蓋部材に固定されている。その際には特に、膜は、蓋凹部の、当該貫通口に対向する開口部を流体密に封止し、および／または、蓋凹部の領域において蓋部材が貫通口を有する。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、たとえば底凹部内ないしは反応チャンバ内から流体または他の物質を搬出するため、および／または他の反応チャンバ内へ押し込むため、流体または他の物質が底凹部内ないしは反応チャンバ内にて非常に容易に（更に）移動できることである。たとえば、流体または他の物質のこの移動は、蓋凹部の領域において蓋部材に圧力をかけ、この圧力が膜を介して底凹部内の流体に伝達されることにより、行うことができる。蓋部材が蓋凹部の領域において貫通口を有し、この貫通口を介して空気圧が蓋凹部内に導入されることにより膜に圧力をかけ、その結果として膜が底凹部の領域において凸状に湾曲することにより、流体または他の物質の上述の移動を特に簡単に行うことができる。
【００１０】
本発明の特に有利な実施形態では、蓋部材は少なくとも１つの別の蓋凹部を有し、かつ、底部材は少なくとも１つの別の底凹部を有することができる。かかる実施形態では、当該別の蓋凹部は当該別の底凹部に対向するように配置され、底凹部と別の底凹部とが流路によって流体力学的に結合されている。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、２つの異なる反応チャンバを準備することにより、たとえば生化学的反応の、たとえば所要反応温度が異なる複数の異なるプロセス段階を、分析ユニットのそれぞれ異なる領域において（すなわち、反応チャンバのそれぞれ異なる領域において）実施できることである。このことにより、１つの分析ユニットを、異なる生化学反応に応じて非常にフレキシブルに使用できるという利点が奏される。
【００１１】
たとえば指標物質と反応するために必要とする反応温度が異なる各生化学的物質を、特にフレキシブルかつ高精度で検出できるようにするため、本発明の他の１つの実施形態では、上述の別の底凹部内に１つの別のプローブキャリアを配置することができ、この別のプローブキャリアは、他の生化学的物質を同定するための少なくとも１つの別の指標物質を別のプローブとして有し、当該別のプローブキャリア上において当該別の指標物質は固体状態となっている。
【００１２】
本発明の他の１つの実施形態では、底凹部は上述の流路を少なくとも２つの部分流路に分割することもできる。その際には、少なくとも１つの部分流路は、分析装置の外周囲との流体連通を行うためのものであり、特に、少なくとも１つの部分流路はバルブを有する。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、物質を、特に流体物質を底凹部内ないしは反応チャンバ内から特に簡単におよび／または制御しながら取り出しまたは充填できることである。
【００１３】
とりわけ複数のプロセス段階を周期的に繰り返せるようにするため、本発明の特に有利な１つの実施形態では、部分流路は、底凹部とは反対側の端部において互いに流体力学的に結合されているかまたは流体力学的に結合可能となっており、その際には特に、部分流路は環状流路の一部の構成要素である。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、生化学的試薬に対応して移動方向を変更する必要なく、部分流路を介して周期的に更にシフトすることにより、生化学的試薬をたとえば複数の異なる底凹部内ないしは反応チャンバ内に行うことができることである。
【００１４】
特に有利には、本発明の１つの実施形態では、プローブキャリアはプローブとして、少なくとも１つの追加の生化学的物質を同定するための少なくとも１つの別の少なくとも１つの追加的な指標物質を備えており、プローブキャリア上において当該追加的な指標物質は固体状態である。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、１つのプローブキャリア上にて複数の異なる生化学的物質を、および／または、生化学的物質の複数の異なる濃度を同定できること、ないしは、異なる生化学的物質および／またはその異なる濃度の検出を、特に低コストで、迅速かつ技術的に簡単に実現できることである。
【００１５】
指標物質がプローブキャリア上にて所定の位置に配置された状態で不変的に維持されることを保証するため、本発明の１つの有利な実施形態では、プローブキャリアは少なくとも１つのプローブキャリア凹部を有し、このプローブキャリア凹部内に上述の少なくとも１つの指標物質が配置され、その際には特に、プローブキャリア凹部は所定の最小深さを有する。
【００１６】
さらに１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応中に、生化学的物質を同定するための指標物質と物質との反応が行えるように、プローブキャリアを構成および配置することも可能である。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、分析ユニットの構成を特にコンパクトにすることができ、その上、分析ユニットを非常に低コストで製造できるということである。
【００１７】
また、本発明にて開示する手段は、本発明にて開示したいずれかの態様の分析ユニットを動作するための分析装置であって、以下の構成を有する分析装置を実現したものである：
・分析ユニットを位置決めするため、および／または、分析装置の動作中に分析ユニットを保持するためのホルダ。
・前記ホルダにより保持された分析ユニットにおいて流体または固体の調温を行うための調温ユニット。
・指標物質の変化を解析するための解析ユニット。
【００１８】
「ホルダ」とはたとえば、分析装置の動作中に分析ユニットが載置される載置面も指すことができる。「調温ユニット」とは、分析ユニットの少なくとも１つの部分区域を加熱または冷却するユニットを指すことができる。「解析ユニット」とは、たとえば、上述の少なくとも１つの指標物質によって（または、生化学的物質によって変化した指標物質によって）変換または放出された電磁波の光学的解析により当該指標物質の状態変化を検出するユニットを指すことができる。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、低コストかつ簡単に準備可能な分析ユニットを用いて生化学的物質の非常にコンパクトな分析を行えることである。
【００１９】
特に好適には、本発明の１つの実施形態では、調温ユニットは、分析ユニットの複数の異なる区域を同時にそれぞれ異なる温度にするように構成されている。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、所要反応温度が異なる複数の異なる部分反応を、分析ユニットの複数の異なる区域において同時に行えることである。このことにより、技術的に簡単に製造できる分析ユニットを用いて生化学的物質の分析を非常に迅速に行うことができる。
【００２０】
さらに、本発明にて開示する手段は、本発明にて開示したいずれかの態様の分析ユニットの動作方法であって、以下のステップを含む方法を実現したものである：
・分析ユニットを準備するステップ。
・分析ユニットにおいて反応を行うため、分析対象の物質および／または触媒物質を分析ユニットへ供給するステップ。
・プローブキャリア上における指標物質の変化を解析するステップ。
【００２１】
本発明のかかる実施形態により奏される利点は、生化学的物質の分析を特に迅速かつ低コストで行えることである。
【００２２】
また、前記供給するステップと解析するステップとを、少なくとも一部について同時に行う、本発明の実施形態も有利である。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応の複数の異なる部分ステップを同時または並行して実施することができ、これにより、ポリメラーゼ連鎖反応の結果物を非常に迅速に分析することができ、かつ、ポリメラーゼ連鎖反応を技術的に非常に簡単に、すなわち、特に手動の中間ステップ無しで実施できることである。
【００２３】
本発明の他の１つの実施形態では、前記供給するステップおよび／または前記解析するステップにおいて、分析対象の物質、触媒物質および／または指標物質の調温を行うことができる。本発明のかかる実施形態により奏される利点は、ポリメラーゼ連鎖反応の異なる部分ステップごとに異なる反応温度を使用することができ、これにより、ポリメラーゼ連鎖反応の各部分ステップを、各自最適な環境シナリオにおいて進行できることである。
【００２４】
本発明ではさらに、本発明にて開示したいずれかの態様の分析ユニットの製造方法であって、以下のステップを含む方法を開示する：
・少なくとも１つの蓋凹部を有する蓋部材と、少なくとも１つの底凹部を有する底部材と、膜と、生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブとして有するプローブキャリアと、を準備するステップ。当該蓋部材は、蓋凹部の領域に貫通口を有し、指標物質はプローブキャリア上において固体状態となっている。
・底凹部内にプローブキャリアを配置するステップ。
・蓋凹部を膜によってカバーするステップ。
・反応チャンバの底凹部内へ流体を導入および／または導出するための流路領域を形成するステップ。かかる形成は、反応チャンバを形成するために蓋凹部に対向して底凹部を配置することにより行われる。
【００２５】
本発明のかかる実施形態により奏される利点は、生化学的物質を特に低コストかつ迅速に同定するための分析ユニットを製造できることである。
【００２６】
本発明ではさらに、本発明にて開示した方法のいずれかの態様の各ステップを適切な装置で実行ないしは実施するように構成された制御装置も開示する。本発明をこのように制御装置の形態で具現化することによっても、本発明の基礎となる課題を迅速かつ効率的に解決することができる。
【００２７】
本願において「制御装置」とは、センサ信号を処理し当該センサ信号に依存して制御信号および／またはデータ信号を出力する電気機器を指すことができる。この制御装置はインタフェースを有することができ、このインタフェースは、ハードウェアおよび／またはソフトウェアで構成することができる。前記インタフェースをハードウェアで構成する場合、これは、前記制御装置の複数の非常に異なる機能を備えたいわゆるシステムＡＳＩＣの一部とすることができる。また、前記インタフェースを専用の集積回路とするか、または、前記インタフェースの少なくとも一部をディスクリート部品から構成することも可能である。前記インタフェースをソフトウェアで構成する場合、これは、たとえばマイクロコントローラ上に他のソフトウェアモジュールと共に設けられるソフトウェアモジュールとすることができる。
【００２８】
また、機械読取り可能な担体上に記憶することができるプログラムコードを有するコンピュータプログラム製品であって、当該コンピュータプログラム製品がコンピュータ上または装置上にて実行されるときに前記実施形態のうちいずれかの方法を実行するために用いられるプログラムコードを有するコンピュータプログラム製品も有利である。前記機械読取り可能な担体はたとえば、半導体メモリ、ハードディスク記憶装置または光メモリ等である。特に、本発明にて開示している手段は、装置上にて実行されるときに、本発明にて開示した方法の各ステップを実行または制御するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラム製品も開示している。
【００２９】
本発明ではさらに、本発明にて開示した方法のいずれかの態様の各ステップを適切な装置で実行ないしは実施するように構成された装置も開示する。本発明をこのように装置の形態で具現化することによっても、本発明の基礎となる課題を迅速かつ効率的に解決することができる。
【００３０】
本願において「装置」とは、センサ信号を処理し当該センサ信号に依存して制御信号および／またはデータ信号を出力する電気機器を指すことができる。この装置はインタフェースを有することができ、このインタフェースは、ハードウェアおよび／またはソフトウェアで構成することができる。前記インタフェースをハードウェアで構成する場合、これは、前記装置の複数の非常に異なる機能を備えたいわゆるシステムＡＳＩＣの一部とすることができる。また、前記インタフェースを専用の集積回路とするか、または、前記インタフェースの少なくとも一部をディスクリート部品から構成することも可能である。前記インタフェースをソフトウェアで構成する場合、これは、たとえばマイクロコントローラ上に他のソフトウェアモジュールと共に設けられるソフトウェアモジュールとすることができる。
【００３１】
以下、添付の図面を一例として参照して、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】本発明の一実施例の分析ユニットの平面図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示された本発明の一実施例の分析ユニットの断面図である。
【図２】本発明の他の一実施例の分析ユニットの平面図である。
【図３】図２に示された本発明の一実施例の分析ユニットの断面図である。
【図４】本発明の他の一実施例の分析ユニットの平面図である。
【図５】本発明の他の実施例の分析ユニットの平面図である。
【図６Ａ】本発明の一実施例のプローブキャリアの断面図である。
【図６Ｂ】本発明の他の一実施例のプローブキャリアの断面図である。
【図７】分析装置を概略的に示すと共に、分析装置内に組み込まれた分析ユニットを概略的に示す図である。
【図８】分析ユニットの動作方法の一実施例のフローチャートである。
【図９】分析ユニットの製造方法の一実施例のフローチャートである。
【００３３】
以下の、本発明の有利な実施例の説明では、複数の異なる図において示された同様の機能の要素には同一または同様の符号を使用しており、これらの要素について繰り返し説明することは省略する。
【００３４】
本発明にて開示している生化学的手段では、ＤＮＡマイクロアレイ（プローブキャリアの例示）がＰＣＲ反応チャンバ内に直接組み込まれている。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化されたＤＮＡプローブはＰＣＲに能動的に関与し、これにより、特異的に増幅産物（すなわち生化学的物質）を固定化する。生化学プロセス（たとえばＰＣＲ等）から得られる、表面拘束された産物（ないしは中間産物）は、リアルタイムまたは反応後に検出および／または評価することができる。
【００３５】
図１Ａは、本発明の一実施例の分析ユニット１００の平面図である。図１Ｂは、図１Ａに示された本発明の一実施例の、図１ＡのＡＡ’に沿った断面図である。同図中、分析ユニット１００はＰＣＲ反応チャンバ１１０を１つだけ有している。
【００３６】
図１Ｂを見ると、分析ユニット１００は複数の層を有するのが分かる。その層構成は、蓋凹部１３５および貫通口１３７を有する蓋部材１３０としての第１のポリマー基板を有しており、蓋部材１３０の下側に、変位可能なポリマーダイヤフラムが膜１４０として取り付けられている。たとえば、この膜１４０を蓋部材１３０に流体密に結合することにより、貫通口内を移動可能な媒質との接触が膜１４０外の領域に達しないようにすることができる。
【００３７】
蓋部材１３０の上述の構成体に対して面平行に、たとえば第２のポリマー基板の形態の底部材１５０が存在し、この底部材１５０は底部材凹部１５２に、プローブキャリア１５５としてのＤＮＡマイクロアレイを含むＰＣＲ反応チャンバ１１０を有する。マイクロアレイ１５５上には、プローブ１５７として複数の異なるオリゴヌクレオチドが個別のスポットの形態で固定化されている。充填および排出を行うため、それぞれマイクロ流体流路１６０がチャンバ１１０に接続されている（マイクロ流体流路１６０はたとえば、反応チャンバ１１０によって２つの部分流路１６０ａおよび１６０ｂに分割されている）。両流路１６０ａおよび１６０ｂは、ＰＣＲ反応混合物（すなわち、分析対象物質、および／または、生化学反応を行うために補助物質として必要な触媒物質を含む混合物）が充填されたチャンバ１１０を（生化学）反応中は封止状態に維持するため、それぞれ可制御バルブ１６５を有する。反応チャンバ１１０が配置される画定された領域１７５において、以下詳細に説明する分析装置によって、ＰＣＲを実施するための熱エネルギーを導入および取出することができる。
【００３８】
ＰＣＲを行うときには、鋳型ＤＮＡの特定のＤＮＡモチーフを、まず最初に液相で増幅させる。次に、形成されたＰＣＲ産物を、区画特異的な固定化されたオリゴヌクレオチドに結合させることができる。ＰＣＲ産物が結合したスポットを判別することにより、特定のＤＮＡモチーフの有無を知ることができる。
【００３９】
図２は、本発明の一実施例の分析ユニット１００の平面図である。図３は、図２に示された実施例の分析ユニット１００の切断線ＡＡ’に沿った断面図であり、ここで分析ユニット１００は、部分流路１６０ｂを介して互いに流体力学的に結合された２つのＰＣＲ反応チャンバ１１０および２１０を有する。ここで第２の反応チャンバ２１０は、（プローブキャリア１５５が存在している点を除いて）（第１の）反応チャンバと同様に形成することができる。たとえば、第２の反応チャンバ２１０を形成するため、蓋部材１３０はさらにもう１つの蓋凹部２３５を有することができ、このもう１つの蓋凹部２３５は、別の貫通口２３７を介して分析装置１００の外周部に流体連通されたものである。また、上述の膜が第２の蓋凹部２３５を、上記別の貫通口とは反対側において流体密に封止することもできる。底部材１５０は、上述の第２の反応チャンバ２１０を構成するためのもう１つの底凹部２５２を有することができる。
【００４０】
本実施例では、ＰＣＲの全時間にわたってそれぞれ一定かつ相違する温度に調整される、２つの画定された温度領域１７５および２２０が存在している。これにより、（たとえばペルティエ素子を用いて）数分の期間の間に温度を〜６０℃から〜９５℃までの間で変化させなければならないという、分析装置の調温ユニットに課される要求が、図１Ａおよび１Ｂに示された実施例の分析ユニット１００を動作させるための分析装置に比して緩和される。図２および３に示された実施例では、ＰＣＲ反応混合物を複数の異なる温度にさらすため、両チャンバ間において変位可能なポリマーダイヤフラム１４０を用いて反応容積を（すなわち、分析対象物質および／または触媒物質を含む流体を）往復移動させる。かかる往復移動はたとえば、貫通口１３７ないしは２３７を介して各反応チャンバ１１０ないしは２１０の両端間に設けられた膜１４０に圧力を掛けることによって行うことができる。このようにして、膜がこの反応チャンバ１１０ないしは２１０内に凸状に湾曲することにより、各反応チャンバ内に存在する流体を吐出することができる。
【００４１】
本発明にて開示している手段の重要な目的は、ＰＣＲを１つのポリマー多層複合体において実施するために適した構造およびプロセスフローを実現できる手段を達成することであると捉えることができる。かかる手段を達成することにより、プロセス時間が短縮し、たとえば核酸を検出するためのプロセス段階が削減される。
【００４２】
ここで、ＤＮＡマイクロアレイ１５５が集積された分析ユニット１００のポリマー積層構成体を使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイ１５５は、ＰＣＲ反応チャンバ１１０内に直接設けられているか、または別個のアレイチャンバ内に入れて設けられている。それぞれ異なる温度になっているチャンバ１１０ないしは２１０間における反応容積（すなわち、分析対象物質ないしは触媒物質を含む流体）の往復移動により、ＰＣＲ反応が行われる。マイクロアレイ１５５のプローブ１５７としての固定化されたオリゴヌクレオチドは、このＰＣＲ反応に能動的に関与し、これにより、アレイ１５５の特定の位置におけるＤＮＡシーケンスを位置特定することができる。
【００４３】
生化学的反応としてＰＣＲを例に挙げると、本発明にて開示している手段により奏される利点は以下の通りである：
・ハイブリダイゼーション前にＰＣＲ産物のバッファを交換しなくてもよいこと。
・ＬｏＣシステムがハイブリダイゼーションのためのバッファを必要としなくなること。
・ここで記載されている構造および方法により、プロセス実施をより迅速化させ、同時にプロセス制御を簡素化できること。
・遺伝子特徴の検出にかかる総時間が短縮されること。本願にて開示している方法の場合、ＰＣＲ産物はＰＣＲ実施中に既に空間分解式に、マイクロアレイの特定のスポットにて検出可能に固定化される。
・表面感受測定法が使用されること。
【００４４】
分析ユニット１００の他の１つの実施例では、反応は、図４の平面図に示されているように、部分流路１６０を介して互いに流体連通された３つのＰＣＲチャンバ１１０，２１０および３１０から成るシステムにおいて行われる。これら３つの分析チャンバ１１０，２１０および３１０の各構成は、互いに類似しており、最初の２つの分析チャンバ１１０，２１０内には、それぞれプローブキャリア２５５が配置されている。かかる構成により、３ステップＰＣＲに対応して、たとえば３ステップのＰＣＲ反応に対応して、異なる調温がなされる３つの領域／チャンバを実現することができる（たとえば、アニール温度１７５＝５０℃〜６５℃、伸長温度２２０＝７２℃、融解温度３２０＝９５℃）。アレイ１５５ないしは２５５は、チャンバ１１０内ではアニール温度１７５にあり、チャンバ２１０内では伸長温度２２０にあり、いずれかに配置することができる。さらに、第１の反応チャンバ１１０および第２の反応チャンバ３１０を、５５℃ないし７２℃の温度に調温し（アニール温度および伸長温度）、その間に位置するチャンバ２１０を融解温度に調温することも可能である。
【００４５】
２ステップＰＣＲの場合、反応容積をまず最初に（部分流路１６０ｂを用いて）たとえばチャンバ１１０と２１０との間において１周期ないし４０周期で往復移動させ、その次に（部分流路１６０ｃを用いて）チャンバ２１０と３１０との間において１周期ないし４０周期で往復移動させる。このようにすると、たとえば図４に示されたのとは異なり、チャンバ３１０のみが（第２の）アレイ２５５を包含することとなる。
【００４６】
図５Ａは、本発明の他の一実施例の分析ユニット１１０の平面図であり、この分析ユニット１１０では、反応チャンバ１１０（アレイチャンバ）がアレイ１５５を包含する。チャンバ１１０は、アニール温度の温度領域１７５内または伸長温度の温度領域２２０内のいずれかに位置する（このことは、たとえば図５Ｂの平面図を見ても明らかである）。この実施例により、差し当たり、アレイ１５５を有しないＰＣＲチャンバ４１０，２１０または３１０内においてＰＣＲを行うことが可能となる。その後、増幅が行われた後、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチド１５７に特異的に結合できるように、反応混合物をアレイチャンバ１１０内に送る。アニールはハイブリダイゼーションまたはプライマー伸長反応を用いて、たとえば、反応容積を融解温度のチャンバとアレイチャンバ１１０との間で往復移動させることにより、行うことができる。
【００４７】
他の１つの実施例では、図２，４，５Ａおよび５Ｂに示されたような流体構成のチャンバ入口１６０ａおよびチャンバ出口１６０ｂに、逆止弁１６５を設けることができる。これにより、容積押しのけの際に（１つの）ポンピング方向（のみ）を設定することができ、これにより流体の作動が簡略化される。
【００４８】
図６Ａおよび６Ｂの各図に、アレイ１５５の表面（特に、プローブ１５７として固定化されたオリゴヌクレオチドのスポット）を保護するための構造を示す。ＰＣＲ反応容積をＰＣＲチャンバ１１０から他のチャンバ（図２および図４に拠る）内へ移すためにポリマーダイヤフラム１４０が空気力によって変位されて、底凹部１５２の底の方向に押されるので、場合によっては、アレイ型１５５に固定化されたオリゴヌクレオチド１５７が損傷してしまうことがある。これに対応する措置として、アレイ１５５のスポットを凹部６１０内に固定化するか、または、微視的に粗面の表面６２０上に固定化することができる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド１５７は、従来技術から公知のあらゆる固定化スキーマを用いて、たとえば３‐アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、１‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐３‐エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、１，４‐フェニレンジイソチオシアナート（ＰＤＩＴＣ）、ｓ−ＳＩＡＢ、ｓ‐ＭＢＳ、ｓ‐ＧＭＢＳまたはｓ‐ＭＢＰを用いて、プローブキャリア１５５上の多岐にわたる種々の物質上に固定することができる。アレイ１５５は、ポリマー基板（すなわち底部材１３０）に直接固定化するか、または、基板１５５上にスポット状に形成することができ、これはその後、第２のステップにおいてＰＣＲチャンバ１１０内に入れられて固定される。
【００５０】
図７は、ポリマー積層構成体を有する、本発明の一実施例の分析ユニット１００を動作させるための一実施例の分析装置７００の断面図である。分析装置７００は、上面に加熱要素ないしは調温要素（調温ユニット）７１０を有し、当該分析装置７００の下面に検出ユニット７２０（解析ユニット）が設けられている。調温要素７１０と検出ユニット７２０の配置を逆にすることも可能である。また、調温要素７１０は複数の部分ユニットを含み、これらの各部分ユニットにおいて、分析ユニット１００の隣り合って配置された領域が、同時にそれぞれ異なる温度に調温されるようにすることも可能である。ＰＣＲを温度制御しながら行うための熱エネルギーはこの調温ユニット７１０から、とりわけ、調温されるフィンガー型加熱器、ペルティエ素子、赤外線源または対流を使用して導入することができる。分析ユニット１００を保持するため、さらにホルダ７３０を設けることもできる。このホルダ７３０は分析ユニット１００を、たとえば分析装置の動作中に調温ユニット７１０の表面上に固定する。
【００５１】
マイクロアレイ１５５に結合されたＰＣＲ産物は、反応中または反応後のいずれかにおいて、検出ユニット７２０において種々の手法により同定することができる。
【００５２】
第１手法：蛍光測定検出法。ＰＣＲ実施中に、蛍光体が、対応するＰＣＲ産物中に組み込まれる。この蛍光体が（たとえばエバネッセント場、共焦点または透過光により）励起されると、その放出された蛍光信号が、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳチップまたは光電子増倍器を用いて、測定することができる。
【００５３】
第２手法：表面プラズモンの検出。オリゴヌクレオチド１５７はたとえば、金製のスポット上に固定化される。ＰＣＲ後またはＰＣＲ中、このスポットにおいて表面プラズモンが励起される。表面付近のＤＮＡ分子の量に依存して、プラズモン共鳴周波数がシフトする。スポットから放出された強度および／または周波数を測定および解析することにより、結合結果物を推定することができる。
【００５４】
反応混合物は、ポリメラーゼ、反応バッファ、ＰＣＲプライマーおよびヌクレオチドの成分と、たとえばＢＳＡおよび／またはツイーン等の反応を改善する成分とを含む。ＰＣＲにおいてビオチン‐ｄＵＴＰヌクレオチドを使用する場合、生じたＰＣＲ産物はビオチン分子によってラベリングされることとなり、後続のステップにおいて、これに蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートが結合し得る。これに代えて択一的に、ＰＣＲにおいて蛍光標識されたプライマーを使用することにより、生成されたＰＣＲ産物が蛍光体によって直接ラベリングされるようにすることもできる。非対称ＰＣＲを行うためには、２つのＰＣＲプライマーを異なる濃度で使用することができる。ポリマー基板の必要な構造は、たとえばフライス加工、射出成形、ホットエンボスまたはレーザパターニングによって形成することができる。マイクロアレイ１５５は、ポリマーに直接成形することができ、または、たとえばガラス製のインサートとして、ポリマー積層構成体内に挿入することができる。
【００５５】
物質例：
（たとえば蓋部材１３０および底部材１５０用の）ポリマー基板：熱可塑性物質（たとえばＰＣ、ＰＰ、ＰＥ、ＰＭＭＡ、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＥＥＫ）
ポリマーダイヤフラム（膜１４０）：エラストマ、熱可塑性エラストマＴＰＵ、ＴＰＳ、熱可塑性物質、高温接着フィルム、マイクロタイタープレート用のシールフィルム、ラテックス
【００５６】
生分子の成形例：
・オリゴヌクレオチド１５７の長さ：５〜１００個のヌクレオチド
・リンカー分子：チオール基、アミノ基、金、グルタルアルデヒド、アクリダイト（たとえば、炭素鎖を介してオリゴヌクレオチドに結合されている）
・ＰＣＲプライマー：長さ  ５個から１００個のヌクレオチド。ここで、両プライマーの融点は大きく異なり得る
・ポリメラーゼ：ホットスタートポリメラーゼ、校正ポリメラーゼ
・１つのスポットの径：１〜５００μｍ
【００５７】
実施例の寸法例：
・ポリマー基板厚さ：０．５ｍｍから５ｍｍ
・ポリマー基板の流路径：１０μｍから３ｍｍ
・ポリマーダイヤフラム厚さ：５μｍから５００μｍ
・ポリマー基板内の空洞の容積：１ｍｍ３から１０００ｍｍ３
【００５８】
ポリマーダイヤフラムを作動するための圧力例：
・０．２バール〜２バール
【００５９】
本発明は分析システム用に、とりわけ、環境分析用または医用診断用のマイクロ流体ラボ・オン・チップ・システム用に使用することができる。
【００６０】
図８は、分析ユニットの動作方法８００の一実施例のフローチャートである。本方法８００は、分析ユニットを準備するステップ８１０と、分析ユニットにおいて反応を行うため、分析対象の物質および／または触媒物質を分析ユニットへ供給するステップ８２０とを含む。最後に本方法８００は、プローブキャリア上における指標物質の変化を解析するステップ８３０を含む。
【００６１】
図９は、分析ユニットの製造方法９００の一実施例のフローチャートである。本方法９００は、少なくとも１つの蓋凹部を有する蓋部材と、少なくとも１つの底凹部を有する底部材と、膜と、生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブとして有するプローブキャリアと、を準備するステップ９１０を有する。上述の蓋部材は、蓋凹部の領域に貫通口を有し、指標物質はプローブキャリア上において固体状態となっている。さらに本方法９００は、プローブキャリアを底凹部内に配置するステップ９２０と、蓋凹部を膜によってカバーするステップ９３０と、を有する。最後に本方法９００は、反応チャンバの底凹部内へ流体を導入および／または導出するための流路領域を形成するステップ９４０を有し、かかる形成は、反応チャンバを形成するために蓋凹部に対向して底凹部を配置することにより行われる。
【００６２】
上述にて説明し図面に示した実施例は、単に一例として選択したものに過ぎず、複数の異なる実施例全体を相互に組み合わせること、または、これらの実施例の各特徴を相互に組み合わせることも可能である。また、いずれかの実施例にさらに別の実施例の一部の特徴を補足することも可能である。
【００６３】
さらに、本発明の方法の各ステップを繰り返して実施することも、また、ここで記載した順序と異なる順序で実施することも可能である。
【００６４】
いずれかの実施例において、第１の特徴と第２の特徴とが「および／または」によって結合されている場合には、この実施例は、第１の特徴と第２の特徴との双方を含む実施形態と、第１の特徴または第２の特徴のいずれかのみを含む別の実施形態とを含むと解すべきである。
【図１Ａ】
2016540501.tif 000003
【図１Ｂ】
2016540501.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための分析ユニット（１００）であって、
・少なくとも１つの蓋凹部（１３５）を有する蓋部材（１３０）と、
・反応チャンバ（１１０）を形成すべく前記蓋凹部（１３５）に対向するように配置された少なくとも１つの底凹部（１５２）を有する底部材（１５０）と、
・前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間において少なくとも前記蓋凹部（１３５）の領域に配置された膜（１４０）と、
・前記反応チャンバ（１１０）の前記底凹部（１５２）内に流体を導入および／または導出するために前記蓋部材（１３０）と前記底部材（１５０）との間に形成された少なくとも１つの流路（１６０ａ，１６０ｂ）と、
・生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブ（１５７）として備えている、前記底凹部（１５２）内に配置されたプローブキャリア（１５５）と
を有し、
前記プローブキャリア（１５５）上において前記指標物質は固体状態となっている
ことを特徴とする分析ユニット（１００）。
【請求項２】
前記膜（１４０）が前記蓋部材（１３０）に固定されている、
請求項１記載の分析ユニット（１００）。
【請求項３】
前記蓋凹部（１３５）の領域において前記蓋部材（１３０）が貫通口（１３７）を有し、前記膜（１４０）は、前記蓋凹部（１３５）の、前記貫通口（１３７）に対向する開口部を流体密に封止する、
請求項２記載の分析ユニット（１００）。
【請求項４】
前記蓋部材（１３０）は少なくとも１つの別の蓋凹部（２３５）を有し、かつ、前記底部材（１５０）は少なくとも１つの別の底凹部（２５２）を有し、
前記別の蓋凹部（２３５）は前記別の底凹部（２５２）に対向するように配置されており、
前記底凹部（１５２）と前記別の底凹部（２５２）とは、前記流路（１６０ａ，１６０ｂ）によって流体力学的に結合されている、
請求項１から３までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）。
【請求項５】
前記別の底凹部（２５２）内に別のプローブキャリア（２５５）が配置されており、
前記別のプローブキャリア（２５５）は、他の生化学的物質を同定するための少なくとも１つの別の指標物質を別のプローブ（２５７）として有し、
前記別のプローブキャリア（２５５）上において前記別の指標物質は固体状態となっている、
請求項４記載の分析ユニット（１００）。
【請求項６】
前記底凹部（１５２）は前記流路（１６０ａ，１６０ｂ）を少なくとも２つの部分流路に分割し、
少なくとも１つの部分流路（１６０ａ）は、前記分析ユニット（１００）の外周囲との流体連通を行うためのものである、
請求項１から５までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）。
【請求項７】
少なくとも１つの部分流路（１６０ａ，１６０ｂ）はバルブ（１６５）を有する、
請求項６記載の分析ユニット（１００）。
【請求項８】
前記部分流路は、前記底凹部（１５２）とは反対側の端部において互いに流体力学的に結合されているか、または流体力学的に結合可能となっている、
請求項６または７記載の分析ユニット（１００）。
【請求項９】
前記部分流路は、環状流路（１６０ａ，１６０ｂ）の構成要素である、
請求項８記載の分析ユニット（１００）。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応中に、生化学的物質を同定するための前記指標物質と物質との反応が行えるように、前記プローブキャリア（１５５）は構成および配置されている、
請求項１から９までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を動作させるための分析装置（７００）であって、
・前記分析ユニット（１００）を位置決めするため、および／または、前記分析装置の動作中に前記分析ユニット（１００）を保持するためのホルダ（７３０）と、
・前記ホルダにより保持された前記分析ユニット（１００）において流体または固体の調温を行うための調温ユニット（７１０）と、
・指標物質の変化を解析するための解析ユニット（７２０）と
を有することを特徴とする分析装置（７００）。
【請求項１２】
前記調温ユニット（７１０）は、前記分析ユニット（１００）の複数の異なる区域を同時に、それぞれ別の温度にするように構成されている、
請求項１１記載の分析装置（７００）。
【請求項１３】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を動作させる方法（８００）であって、
・前記分析ユニット（１００）を準備するステップ（８１０）と、
・前記分析ユニット（１００）において反応を行うため、分析対象の物質および／または触媒物質を前記分析ユニットへ供給するステップ（８２０）と、
・プローブキャリア（１５５）上における指標物質の変化を解析するステップ（８３０）と
を有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記供給するステップと解析するステップとを、少なくとも一部について同時に行う、
請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記供給するステップ（８２０）および／または前記解析するステップ（８３０）において、前記分析対象の物質、触媒物質および／または指標物質の調温を行う、
請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の分析ユニット（１００）を製造する方法（９００）であって、
・少なくとも１つの蓋凹部（１３５）を有する蓋部材であって、当該蓋凹部（１３５）の領域に貫通口（１３７）を有する蓋部材（１３０）と、
少なくとも１つの底凹部（１５２）を有する底部材（１５０）と、
膜（１４０）と、
生化学的物質を同定するための少なくとも１つの指標物質をプローブ（１５７）として有するプローブキャリア（１５５）であって、当該指標物質はプローブキャリア上において固体状態となっているプローブキャリア（１５５）と
を準備するステップ（９１０）と、
・前記底凹部（１５２）内に前記プローブキャリア（１５５）を配置するステップ（９２０）と、
・前記蓋凹部（１３５）を前記膜（１４０）によってカバーするステップ（９３０）と、
・反応チャンバ（１１０）の前記底凹部（１５２）内へ流体を導入および／または導出するための流路領域（１６０ａ，１６０ｂ）の形成を行うステップ（９４０）であって、当該形成は、前記反応チャンバ（１１０）を形成するために当該蓋凹部（１３５）に対向して前記底凹部（１５２）を配置することにより行われるステップ（９４０）と
を有することを特徴とする方法（９００）。
【請求項１７】
請求項１３から１６までのいずれか１項記載の方法（８００，９００）の各ステップを制御および／または実行するように構成されたユニットを備えた制御装置。
【請求項１８】
コンピュータプログラム製品であって、
前記コンピュータプログラム製品が装置上で実行されるときに請求項１３から１６までのいずれか１項記載の方法（８００，９００）を実施または制御するためのプログラムコードを有する、コンピュータプログラム製品。
【国際調査報告】
2016540501.tif 000015
2016540501.tif 000016
2016540501.tif 000017
2016540501.tif 000018
2016540501.tif 000019
2016540501.tif 000020
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2016540501.tif 000023
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