(57)【要約】  本発明は、タウメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的として用いる、具体的には、タウ発現を調節するマイクロＲＮＡを用いる、アルツハイマー病（ＡＤ）、濃縮体優位型認知症（ＴＰＤ）および異常なタウ発現と関連する他の疾患、例えばタウオパチーの治療および予防に関する。本発明は、このような疾患のスクリーニング、同定および診断の分野でもある。具体的には、本発明は、上記疾患のマイクロＲＮＡ形態のバイオマーカーを提供する。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウオパチーを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを含む組成物を治療的有効量投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がリガンド、コンジュゲート、ベクター、脂質、担体、補助剤または希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−２１９−５ｐからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−２１９−５ｐである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡが配列番号１、配列番号２、または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
タウオパチーを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを治療的有効量投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記対象がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物がリガンド、コンジュゲート、ベクター、脂質、担体、補助剤または希釈剤をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐおよびｍｉＲ−２１９−５ｐからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−２１９−５ｐである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロＲＮＡが配列番号１、配列番号２、または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
タウオパチーの予防または治療のための治療剤をスクリーニングまたは同定する方法であって、
ａ．被験薬剤を、微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含むヌクレオチドと接触させるかインキュベートする段階と、
ｂ．前記被験薬剤が微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含む前記ヌクレオチドに結合するかどうかを判定する段階と
を含み、前記被験薬剤が微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含む前記ヌクレオチドに結合すれば、前記被験薬剤がタウオパチーの予防剤または治療剤として同定される、方法。
【請求項１６】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タウオパチーの予防または治療のための治療剤をスクリーニングまたは同定する方法であって、
ａ．微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含むヌクレオチドに連結またはコンジュゲートしたヌクレオチドによって発現される表現型を測定する段階と、
ｂ．被験薬剤を、微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含み、測定可能な表現型を発現するヌクレオチドに連結またはコンジュゲートした前記ヌクレオチドと接触させるかインキュベートする段階と
ｃ．前記験被験薬剤との接触またはインキュベーション後に前記表現型を測定する段階と
を含み、前記表現型の発現が前記被験薬剤との接触またはインキュベーション後に変化すれば、前記被験薬剤がタウオパチーの治療剤または予防剤として同定される、方法。
【請求項１８】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タウオパチーの予防または治療のための治療剤をスクリーニングまたは同定する方法であって、
ａ．微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含むヌクレオチドに連結またはコンジュゲートしたヌクレオチドを有する宿主細胞または動物の表現型を測定する段階と、
ｂ．被験薬剤を、微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含むヌクレオチドに連結またはコンジュゲートしたヌクレオチドを有する前記宿主細胞または動物と接触させるかインキュベートする段階と、
ｃ．前記被験薬剤との接触またはインキュベーション後に前記表現型を測定する段階と
を含み、前記表現型の発現が前記被験薬剤との接触またはインキュベーション後に変化すれば、前記被験薬剤がタウオパチーの治療剤または予防剤として同定される、方法。
【請求項２０】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物がキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
タウオパチーの予防または治療のための治療剤をスクリーニングまたは同定する方法であって、
ａ．微小管関連タンパク質タウの遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡの発現と相関する測定可能な表現型を発現する宿主細胞または動物の表現型を測定する段階と、
ｂ．被験薬剤を宿主細胞または動物と接触させるかインキュベートする段階と、
ｃ．前記被験薬剤との接触またはインキュベーション後に前記表現型を測定する段階と
を含み、前記測定可能な表現型の発現が前記被験薬剤との接触またはインキュベーション後に変化すれば、前記被験薬剤がタウオパチーの治療剤として同定される、方法。
【請求項２３】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物がキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−２１９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
対象中のタウオパチーをスクリーニング、診断、予測または同定する方法であって、
ａ．前記対象から生体組織または体液を採取することと、
ｂ．前記生体組織または体液から核酸試料を単離および精製することと、
ｃ．前記核酸試料中のマイクロＲＮＡ量を測定することと、
ｄ．前記核酸試料中のマイクロＲＮＡ量をマイクロＲＮＡ量の基準値と比較し、前記基準値が正常な認知機能を表し、（ｃ）で測定されたマイクロＲＮＡ量の前記基準値からの逸脱を明らかにすることと
を含み、マイクロＲＮＡ量が少ないか、低いか、減少していれば、前記対象がタウオパチーを有すると判定、診断、予測または同定する、方法。
【請求項２７】
前記対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が軽度ないし重度の認知障害または前駆期の前認知症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体組織が脳、上皮、血液または血漿である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記体液が脳脊髄液、唾液、血漿、汗または尿である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸がＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−２１９−５ｐである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１８５−５ｐおよびｍｉＲ−１５１−５ｐからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロＲＮＡが表１１および表１３に挙げられるマイクロＲＮＡからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸試料中のマイクロＲＮＡをノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ポリ−Ａテール逆転写、マイクロＲＮＡ増幅プロファイリング、マイクロＲＮＡ遺伝子発現連続解析、マイクロアレイ、酵素増幅アッセイ、シーケンシング、ＲＮＡ−ｓｅｑ．、およびナノ粒子法からなる群より選択されるアッセイによって検出する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
対象中のタウオパチーをスクリーニング、診断、予測または同定する方法であって、
ａ．前記対象から生体組織または体液することと、
ｂ．前記生体組織または体液から核酸試料を単離および精製することと、
ｃ．前記核酸試料中のマイクロＲＮＡ量を測定することと、
ｄ．前記核酸試料中のマイクロＲＮＡ量をマイクロＲＮＡ量の基準値と比較し、前記基準値が正常な認知機能を表し、（ｃ）で測定されたマイクロＲＮＡ量の前記基準値からの逸脱を明らかにすることと
を含み、マイクロＲＮＡ量が高いか、増加していれば、前記対象がタウオパチーを有すると判定、診断、予測または同定する、方法。
【請求項３８】
前記対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が軽度ないし重度の認知障害または前駆期の前認知症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体組織が脳、上皮、血液または血漿である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記体液が脳脊髄液、唾液、血漿、汗または尿である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸がＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記タウオパチーがアルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１８１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４９である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記マイクロＲＮＡが表１２および表１４に挙げられるマイクロＲＮＡからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸試料中のマイクロＲＮＡをノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ポリ−Ａテール逆転写、マイクロＲＮＡ増幅プロファイリング、マイクロＲＮＡ遺伝子発現連続解析、マイクロアレイ、酵素増幅アッセイ、シーケンシング、ＲＮＡ−ｓｅｑ．、およびナノ粒法からなる群より選択されるアッセイによって検出する、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年７月１１日に出願された米国特許出願第６１／８４４，９７７号の優先権を主張するものであり、上記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、タウメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的として用い、具体的にはタウの発現を調節するマイクロＲＮＡを用いる、アルツハイマー病（ＡＤ）、濃縮体優位型認知症（ＴＰＤ）およびタウ発現異常に関連するその他の疾患、例えばタウオパチーならびに神経変性の治療ならびに予防に関する。本発明は、上記疾患のスクリーニング、同定、および診断の分野でもある。具体的には、本発明は、上記疾患のマイクロＲＮＡ形態のバイオマーカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
微小管関連タンパク質のタウからなる異常な神経線維およびグリア線維の封入物の存在は、タウオパチーと呼ばれる神経変性障害の異種のグループを定義する（Ｄｉｃｋｓｏｎ（２００９））。アルツハイマー病（ＡＤ）は現時点で、二次タウオパチーに分類され、毒性種のアミロイドベータペプチド（Αβ）のレベルが増大することによって生じる濃縮体を伴う（Ｈａｒｄｙ（２００６））。前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を引き起こす微小管関連タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）の変異の発見は、タウの機能障害自体が神経変性を引き起こすのに十分であることを示すが（Ｈｕｔｔｏｎら（１９９８）；Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（２００７））、濃縮体を伴う患者の大部分には、このような変異はみられない。孤発性で非変異型の一次タウオパチーの１つの具体例は濃縮体優位型認知症（ＴＰＤ）である（Ｕｌｒｉｃｈら（１９９２）；ＢａｎｃｈｅｒおよびＪｅｌｌｉｎｇｅｒ（１９９４））。このような例外的な患者には、局在性、形態学的特徴、超微構造および生化学的特徴が中等度段階のＡＤのものと同一の神経原線維濃縮体が認められるが、Αβ沈着斑はあまりみられない（Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｉａら（２０１２）（１））。現時点で、ＡＤまたはＴＰＤに効果的な治療法は存在しない。
【０００４】
成人の脳では、第１７染色体上の単一遺伝子（ＭＡＰＴ）から主として６種類のタウアイソフォームが生じる（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ（２０１２））。第１０エキソンの選択的スプライシングにより、チューブリンへの結合を仲介するタンデム微小管結合ドメイン反復を３つまたは４つ含むタウが生じる（Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら（１９７５））。ほかにも、第２および第３の選択的スプライシングが起こる。タウ発現は、オリゴデンドロサイトおよび星状膠細胞にもその存在が観察されていることから、ニューロンに限定されるものではない（Ｂｉｎｄｅｒｓら（１９８５）；ＣｈｉｎおよびＧｏｌｄｍａｎ（１９９６））。タウは細胞体樹状突起区画にみられ、そこで様々なタンパク質および細胞膜と相互作用して多種多様な過程およびシグナル伝達経路を調節する（Ｔａｓｈｉｒｏら（１９９７）；Ｍａａｓら（２０００）；Ａｖｉｌａら（２００４）；Ｍｏｒｒｉｓら（２０１１））。タウは軸索中に極めて豊富に存在し（ＭａｎｄｅｌｌおよびＢａｎｋｅｒ（１９９５）；Ｄｏｔｉｉら（１９８７）；Ｔｒｏｊａｎｓｋｉら（１９８９）；Ｌｉｔｍａｎら（１９９３））、そこで微小管の核となり、微小管を束ねて安定させることによって、チューブリンの集合を促進する。タウはまたアクチンに結合し、重合に影響を及ぼし、細胞骨格ネットワークの形成において微小管とアクチン重合体の相互作用を統合すると考えられる（Ｋｏｔａｎｉら（１９８５）；Ｆｕｌｇａら（２００７）；Ｈｅら（２００９）；Ｆａｒｉａｓら（２００２））。タウはまた、分子モーターであるキネシンなどの他のタンパク質の部位と重なるチューブリン上の部位に結合することによって、軸索輸送に影響を及ぼし得る（Ｅｂｎｅｔｈら（１９９８）；Ｔｅｒｗｅｌら（２００２））。最後に、タウはニューロン新生において何らかの役割を演じている可能性もある（Ｂｕｌｌｍａｎｎら（２００７）；Ｈｏｎｇら（２０１０））。
【０００５】
タウには多数の機能があることから、機能獲得作用および機能喪失作用をともに含む多数の方法で神経変性に寄与すると思われる。病的状況下では、タウは高リン酸化され（Ｌｉｐｐｅｎｓら（２０１２））、凝集し（ＭａｎｄｅｌｋｏｗおよびＭａｎｄｅｌｋｏｗ（２０１２）；ＨｅｒｎａｎｄｅｚおよびＡｖｉｌａ（２００８））かつ隣接するニューロンに拡散する（Ｌｅら（２０１２）；Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｉａら（２０１２）（２））。コード領域の変異も選択的スプライシングの不均衡もなしにこのような現象がどうやって起こるのかは明らかにされていないが、二次的な翻訳後修飾が何らかの役割を演じている（Ｌｉｐｐｅｎｓら（２０１２）；ＭａｎｄｅｌｋｏｗおよびＭａｎｄｅｌｋｏｗ（２０１２））。あるいは、タンパク質分解系の障害によって、異常なタウタンパク質の蓄積が促進されるとも考えられる（ＷａｎｇおよびＭａｎｄｅｌｋｏｗ（２０１２））。未だ直接検討されてはいないが、１つの機序としてほかにも、マイクロＲＮＡによるタウ翻訳の調節異常を原因とするタウ合成の増大がタウオパチーに何らかの役割を演じている可能性がある。
【０００６】
マイクロＲＮＡは平均２２個のヌクレオチドからなる小分子非コードＲＮＡであり、その標的ｍＲＮＡ転写産物の発現を調節し（Ａｍｂｒｏｓ（２００４）；Ｂａｔｔｅｌ（２００９））、脳の加齢、神経変性および神経保護に何らかの役割を演じている可能性がある（Ｋｏｓｉｋ（２００６）；Ｓａｕｇｓｔａｄ（２０１０）；ＡｂｅおよびＢｏｎｉｎｉ（２０１３）；ＧａｓｃｏｎおよびＧａｏ（２０１２）；ＳｃｈｏｎｒｏｃｋおよびＧｏｔｚ（２０１２））。成熟マイクロＲＮＡは、７０〜１００ｂｐの前駆体が核内および細胞質内でそれぞれ、ＩＩＩ型ＲＮアーゼであるＤｒｏｓｈａおよびダイサーによるプロセシングを受けて生じる（ＰｅｒｒｏｎおよびＰｒｏｖｏｓｔ（２００９））。次いで、ＲＮＡ鎖がＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体に組み込まれる。マイクロＲＮＡのその標的への結合は、マイクロＲＮＡの２〜８位と、翻訳、安定性および局在化に影響を及ぼすｍＲＮＡ構成要素（Ｍａｚｕｍｄｅｒら（２００３）；ＫｕｅｒｓｔｅｎおよびＧｏｏｄｗｉｎ（２００３）；Ｍａｔｏｕｌｋｏｖａら（２０１２））である標的３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（Ｂａｒｔｅｌ（２００９）との間の相補的な塩基対形成によって指定される。マイクロＲＮＡがその標的を抑制する正確な機序については議論が続いている（Ｅｕｌａｌｉｏら（２００８）；ＦｌｙｎｔおよびＬａｉ（２００８））。
【０００７】
タウは翻訳後に調節されるが、マイクロＲＮＡが何らかの直接的な役割を演じているかどうかは明らかにされていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、マイクロＲＮＡの調節異常がタウオパチーの発現に寄与するという驚くべ発見に基づく。具体的には、これらのマイクロＲＮＡはタウ遺伝子ＭＡＰＴから生じるタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合し、タウの発現を調節する。アルツハイマー病および濃縮体優位型認知症などのタウオパチーの患者では、ｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡの１つを含むいくつかのマイクロＲＮＡのレベルが低下することにより、病的タウが過剰に発現する。この発見は、タウオパチーの、特にアルツハイマー病および濃縮体優位型認知症のスクリーニング、診断、予防および治療を含む多数の用途に利用できる。また過剰なタウを原因とする疾患および障害の治療剤として有望な薬剤のスクリーニングのほか、タウオパチーに関する研究モデルの基礎にも利用できる。
【０００９】
本発明の一実施形態は、それを必要とする対象中でタウｍＲＮＡ遺伝子の３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡのレベルを増大させることによって、対象においてタウオパチー、特にアルツハイマー病および濃縮体優位型認知症を治療または予防する方法である。この増大は、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡの産生を増大させる薬剤、またはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲへのマイクロＲＮＡの結合を増大もしくは促進する薬剤の治療的有効量を投与することによって達成できる。
【００１０】
この増大はまた、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを含む組成物の治療的有効量を投与することによって達成できる。この組成物はまた、リガンド、コンジュゲート、ベクター、脂質、リポソーム、担体、補助剤または希釈剤を含み得る。この方法に使用できるマイクロＲＮＡとしては、表４および５に挙げるマイクロＲＮＡのほか、ｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲ−１８１ａｂｃｄ／４２６２、ｍｉＲ−２７ＡＢＣ／２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａｃ／３４ｂｃ−５ｐ／４４９ａｂｃ／４４９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２／２１２／２１／−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａｃ／１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４／２０４ｂ／２１１、およびｍｉＲ−２１９−５ｐ／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐのマイクロＲＮＡが挙げられる。この方法に使用できる追加的なマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、およびｍｉＲ−４０９−３ｐが挙げられる。この方法に使用するのに好ましいマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−２１９−５ｐである。
【００１１】
この方法に使用するのに最も好ましいマイクロＲＮＡは、ファミリーｍｉＲ２１９−５ｐ／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐ由来でありより具体的には配列番号１のヌクレオチド配列を含みｍｉＲ−２１９−５ｐと命名され、またはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を維持するのに十分な、配列番号１の配列との類似性もしくは相同性があるヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡである。この方法に使用できるその他の好ましいマイクロＲＮＡとしては、特に限定されないが、配列番号２のヌクレオチド配列を含みｍｉＲ−４８５−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡ、配列番号３のヌクレオチド配列を含むマイクロＲＮＡ  １８１ｄ−５ｐ、ならびにｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ１８１ｂ−５ｐ、およびｍｉＲ−２０４−５ｐが挙げられる。
【００１２】
さらに、配列情報を用いることによって、タウＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲに由来するタウｍＲＮＡに結合するマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物を設計できる。ＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲのＨ１ハプロタイプは第１７染色体の塩基対４４，１０１２９５〜４４，１０５，７２７に存在し、配列番号４で表される。ＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲのＨ２ハプロタイプは第１７染色体の塩基対７６，２１９６〜７６，６６９８に存在し、配列番号５で表される。
【００１３】
より具体的には、配列：
５’−ｇｕｇａｕｃｕｕａａａｕｇａｇｇａｃａａｕｃｃ−３’  配列番号６
を用いて、ｍｉＲ−２１９−５ｐが結合するＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡの保存された領域に結合するマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物を設計できる。
【００１４】
このほか、配列：
５’−ａａｕｇｕｃｃｃｇａａｕｕｃｃｃａｇｃｃｕｃａ−３’  配列番号７
を用いて、ｍｉＲ−４８５−５ｐが結合するＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡの保存された領域に結合するマイクロＲＮＡを設計できる。
【００１５】
ほかにも、配列：
５’−ｕｕａｇｃｕｕｕｃｕｇｕｃｕｇｕｇａａｕｇｕｃ−３’  配列番号８
を用いて、ｍｉＲ−１８１−５ｐが結合するＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡの保存された領域に結合するマイクロＲＮＡを設計できる。
【００１６】
この増大はまた、表４および５に挙げるマイクロＲＮＡを含むタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡならびにｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲ−１８１ａｂｃｄ／４２６２、ｍｉＲ−２７ＡＢＣ／２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａｃ／３４ｂｃ−５ｐ／４４９ａｂｃ／４４９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２／２１２／２１／−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａｃ／１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４／２０４ｂ／２１１、およびｍｉＲ−２１９−５ｐ／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐ由来のマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物の治療的有効量を投与することによって達成できる。この方法には、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、およびｍｉＲ−４０９−３ｐをコードするＤＮＡも使用できる。この方法に使用するのに好ましいマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ．ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐおよびｍｉＲ−２１９−５ｐである。
【００１７】
組成物はまた、リガンド、コンジュゲート、ベクター、脂質、リポソーム、担体、補助剤または希釈剤を含み得る。この方法に使用するのに好ましいＤＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列を含みｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡ、またはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を維持するのに十分な、配列番号１の配列との類似性もしくは相同性があるヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡである。この方法に使用できるその他のＤＮＡとしては、特に限定されないが、配列番号２のヌクレオチド配列を含みｍｉＲ−４８５−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡ、またはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を維持するのに十分な、配列番号２の配列との類似性もしくは相同性があるヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、配列番号３のヌクレオチド配列を含みｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡ、またはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を維持するのに十分な、配列番号３の配列との類似性もしくは相同性があるヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡならびに配列番号４〜８を含むヌクレオチドに結合するよう設計されたマイクロＲＮＡまたはｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、もしくはｍｉＲ−２０４−５ｐをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、タウオパチー、特にアルツハイマー病または濃縮体優位型認知症をスクリーニング、診断、予測および／または同定する方法であり、この方法は、対象から生体組織および／または体液を採取することと、その組織または体液からＲＮＡを精製および／または単離することと、特定のマイクロＲＮＡの有無を検出することとを含む。
【００１９】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有し、ｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるｍｉＲＮＡを含むがこれに限定されない、いくつかのマイクロＲＮＡのレベルが明らかに低いかまたは存在せず、かつ／または配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有し、ｍｉＲ１８１ｄ−５ｐと命名されるｍｉＲＮＡを含むがこれに限定されない、いくつかのマイクロＲＮＡのレベルが高い場合、患者がＡＤまたはＴＰＤを含むタウオパチーを有すると判定、診断、予測または同定される。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、タウオパチー、特にアルツハイマー病および／または濃縮体優位型認知症をスクリーニング、診断、予測、および／または同定する方法であり、この方法は、対象から生体組織および／または体液を採取することと、上記生体組織からＲＮＡを精製および単離することと、精製および単離したＲＮＡ試料中のｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡを含むがこれに限定されないマイクロＲＮＡのレベルを検出することとを含む。ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−２１９−５ｐのレベルを健常対照由来のＲＮＡ試料中のレベルと比較する。例えば、ｍｉＲ−２１９−５ｐのレベルが、例えば、可視化によって定性的に異なっている、または例えば、健常対照中の既知の量のタンパク質と比較して定量的に異なる場合、患者がタウオパチーを有すると診断または同定できる。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、タウオパチー、特にアルツハイマー病および／または濃縮体優位型認知症をスクリーニング、診断、予測、および／または同定する方法であり、この方法は、対象から生体組織および／または体液を採取することと、上記生体組織からＲＮＡを精製および単離することと、精製および単離したＲＮＡ試料中のｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡを含むがこれに限定されないマイクロＲＮＡのレベルを検出することとを含む。ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐのレベルを健常対照由来のＲＮＡ試料中のレベルと比較する。ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐのレベルが、例えば、可視化によって定性的に異なっている、または例えば、健常対照中の既知の量のタンパク質と比較して定量的に異なる場合、患者がタウオパチーを有すると診断または同定できる。
【００２２】
好ましい実施形態では、検査対象の患者には、アルツハイマー病および／または濃縮体優位型認知症と診断され得る認知障害がある。
【００２３】
精製および／または単離されるＲＮＡは、任意の生体組織から得られる。好ましい生体組織としては、特に限定されないが、脳、表皮、全血、および血漿が挙げられる。
【００２４】
精製および／または単離されるＲＮＡは、任意の体液から得られる。好ましい体液としては、特に限定されないが、脳脊髄液、血漿、唾液、汗および尿が挙げられる。
【００２５】
マイクロＲＮＡは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて精製および単離できる。
【００２６】
マイクロＲＮＡを検出する方法としては、特に限定されないが、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ポリ−Ａテール逆転写、マイクロＲＮＡ増幅プロファイリング、マイクロＲＮＡ遺伝子発現連続解析、マイクロアレイ、酵素増幅アッセイ、シーケンシング、ＲＮＡ−ｓｅｑ．、およびナノ粒子法が挙げられる。
【００２７】
好ましい実施形態では、対象由来のＲＮＡ試料中のｍｉＲＮＡ量を測定し、健常対照中のｍｉＲＮＡ量の基準値と比較し、ここでは、基準値は正常な認知機能の既知の診断値または予測値であり、対象のＲＮＡ試料からのｍｉＲＮＡ量と基準値の偏差を明らかにし、ここでは、対象のＲＮＡ試料のｍｉＲＮＡ量が基準値と異なる場合、対象がＡＤまたはＴＰＤを有すると判定、診断、予測または同定できる。
【００２８】
タウオパチー、特にアルツハイマー病また濃縮体優位型認知症をスクリーニング、診断、予測および／または同定する方法には他のｍｉＲＮＡを使用してもよい。アルツハイマー病または濃縮体優位型認知症で差次的に発現する任意のｍｉＲＮＡを使用できる。アルツハイマー病の患者でダウレギュレートされるか低レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１１に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。アルツハイマー病でアップレギュレートされるか高レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１２に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。濃縮体優位型認知症の患者でダウンレギュレートされるか低レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１３に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。濃縮体優位型認知症の患者でアップレギュレートされるか高レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１４に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。アルツハイマー病の患者と比べ濃縮体優位型認知症の患者での方がダウンレギュレートされるか低レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１５に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。アルツハイマー病の患者と比べ濃縮体優位型認知症の患者での方がアップレギュレートされるか高レベルでみられるｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、表１６に挙げるｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００２９】
本発明はまた、上記アッセイおよび方法のいずれかを実施するキットも含む。
【００３０】
本発明はまた、薬物設計、薬剤の試験のための方法およびツール、ならびにアルツハイマー病および濃縮体優位型認知症を含むタウオパチーの原因および病因に関する基礎研究のためのツールを提供する。本発明はまた、上記疾患に関する薬物開発および基礎研究のための標的遺伝子またはタンパク質を決定する方法を提供する。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含む、タウオパチーの予防および／または治療のための被験薬剤をスクリーニングおよび／または同定する方法および／またはアッセイであり、この方法および／またはアッセイは、被験薬剤を、特に限定されないが配列番号４〜８を含むＭＡＰＴの３’ＵＴＲまたはその一部分を含むヌクレオチドと接触させるかインキュベートすることと、被験薬剤がヌクレオチド、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに結合するかどうかを決定することとを含み、被験薬剤がヌクレオチドに結合すれば、被験薬剤は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの治療剤および／または予防剤として同定される。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含む、タウオパチーの予防および／または治療のための被験薬剤をスクリーニングおよび／または同定する方法および／またはアッセイであり、この方法および／またはアッセイは、被験薬剤を、特に限定されないが配列番号４〜８を含むＭＡＰＴの３’ＵＴＲまたはその一部分を含むヌクレオチドと接触させるかインキュベートすることと、被験薬剤との接触またはインキュベーション前後のヌクレオチドの発現を検出することとを含み、被験薬剤との接触またはインキュベーション後にヌクレオチドの発現が減少すれば、被験薬剤は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの治療剤および／または予防剤として同定される。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含む、タウオパチーの予防および／または治療のための被験薬剤をスクリーニングおよび／または同定する方法および／またはアッセイであり、この方法および／またはアッセイは、被験薬剤を、特に限定されないが配列番号４〜８を含むＭＡＰＴの３’ＵＴＲまたはその一部分を含むヌクレオチドを含む遺伝子構築物と接触させるかインキュベートすることと、被験薬剤を遺伝子構築物と接触させるかインキュベートする前後に遺伝子構築物内でのヌクレオチドの発現を検出することとを含み、被験薬剤との接触後に遺伝子の発現が低下または減少すれば、被験薬剤は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの治療剤および／または予防剤として同定される。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含む、タウオパチーの予防および／または治療のための被験薬剤をスクリーニングおよび／または同定する方法および／またはアッセイであり、この方法および／またはアッセイは、特に限定されないが配列番号４〜８を含むＭＡＰＴの３’ＵＴＲまたはその一部分を含むヌクレオチドを含む遺伝子構築物で宿主細胞を形質転換することと、宿主細胞内でのヌクレオチドの発現を検出することと、被験薬剤を宿主細胞と接触させることと、被験薬剤または化合物との接触後に宿主細胞内でのヌクレオチドの発現を検出することとを含み、被験薬剤または化合物との接触後にヌクレオチドの発現が低下または減少すれば、被験薬剤は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの治療剤および／または予防剤として同定される。
【００３５】
ヌクレオチドまたは遺伝子の発現は、その遺伝子本来の測定可能な表現型またはレポーター遺伝子などの人為的に連結した測定可能な表現型のいずれかを用いて決定できる。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含む、タウオパチーの予防および／または治療のための被験薬剤をスクリーニングおよび／または同定する方法および／またはアッセイであり、この方法および／またはアッセイは、被験薬剤を、特に限定されないが配列番号４〜８を含むＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲもしくはその一部分と相関する表現型および／またはマイクロＲＮＡの発現と相関する表現型および／または過剰なタウ発現と相関する表現型を含む動物と接触させるかインキュベートすることと、動物での表現型を検出または観察することと、被験薬剤を動物と接触させるかインキュベートすることと、被験薬剤との接触またはインキュベーション後に表現型を検出または観察することとを含み、被験薬剤との接触またはインキュベーション後に表現型の改変または変化が認められれば、被験薬剤は、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの治療剤および／または予防剤として同定される。
【００３７】
表現型は、動物本来のものであっても、人為的に作製されたもの、例えば、トランスジェニックショウジョウバエであってもよい。
【００３８】
被験薬剤は、標的遺伝子を有することが未だ明らかにされていないマイクロＲＮＡを含み得る。
【００３９】
本発明を説明する目的で、本発明の特定の実施形態が図面に図示されている。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】ＲＮＡ−ｓｅｑ実験から得られたアルツハイマー病（ＡＤ）、濃縮体優位型認知症（ＴＰＤ）および対照対象のリード頻度に対する平均リード頻度を示すグラフである。
【図１Ｂ】各非コードＲＮＡサブグループに対し位置付けられるリードの割合を示すヒストグラムおよび円グラフである。
【図２Ａ】低分子ＲＮＡシーケンシングのヒートマップ図形を、ＡＤ（ｎ＝６）、ＴＰＤ（ｎ＝３）および対照（ｎ＝７）におけるマイクロＲＮＡの変化の教師なし階層的クラスタリングで示す図である。データは擬似カラーのヒートマップ（正規化したリード頻度の相対発現値をｌｏｇ２で変換したもの）として示されている。
【図２Ｂ】低分子ＲＮＡシーケンシングのヒートマップ図形を、ＡＤ（ｎ＝６）、ＴＰＤ（ｎ＝３）および対照（ｎ＝７）中で同定された最も有意な２５種類のマイクロＲＮＡ（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５、未補正）からの平均レベルにおけるマイクロＲＮＡの変化の教師なし階層的クラスタリングで示す図である。
【図３】Ｔａｑｍａｎアッセイを用いたＱＰＣＲの結果を示す図である。ＴＰＤ（ｎ＝１９）およびＡＤ（ｎ＝７）のｍｉＲ−２１９−５ｐのレベルが対照（ｎ＝２０）に比して低下したことが確認される。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】全タウ３’ＵＴＲを含み、様々なマイクロＲＮＡと共トランスフェクトしたルシフェラーゼレポーター構築物、および空のベクター対照のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図４Ｂ】ｍｉＲ−２１９−５ｐ認識エレメントに部位特異的変異を誘発した構築物および部位特異的変異を誘発していない構築物のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】Ａ−Ｃ。ｍｉＲ−２１９前駆体とＧＦＰとを含むレンチウイルスベクターで形質導入した初代海馬ニューロンにおけるニューロンマーカーＭＡＰ２を標的とする抗血清を用いた免疫組織化学の画像である。スケールバー＝２５μｍ。Ｄ。ｍｉｒ−２１９レンチウイルスで形質導入した培養物から単離した全ＲＮＡのＱＰＣＲの結果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５。
【図６】Ａ。ｍｉＲ−２１９を含むベクター、スクランブルｍｉＲを含むネガティブ対照レンチウイルスベクター、および空のベクター対照と共に全ヒトタウ３’ＵＴＲの上流にホタルルシフェラーゼを含むレンチウイルスベクターで共形質導入した海馬培養物でのルシフェラーゼ活性の結果を示すグラフである。Ｂ。全タウを標的とする抗血清（ＴａｕＣ）を用いた初代海馬培養物の、代表的な免疫ブロット解析の画像および定量化した結果の両方を示す図である。Ｃ。ｍｉＲ−２１９を含むベクター、スクランブルｍｉＲを含むネガティブ対照レンチウイルスベクター、および空のベクター対照と共に全ヒトタウ３’ＵＴＲの上流にホタルルシフェラーゼを含むレンチウイルスベクターで形質導入した初代海馬培養物でのタウｍＲＮＡレベルのＱＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５。
【図７−１】Ａ。全タウを標的とする抗血清を用いた代表的な免疫ブロット解析の画像および定量化した結果の両方を示す図である。ＮＧＦ処置後のＰＣ１２細胞では対照に比してタウタンパク質の発現が増大しているのがわかる。Ｂ。対照中の、およびＮＧＦで３日間ならびに７日間処置したＰＣ１２細胞中のタウｍＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｃ。対照中の、およびＮＧＦで３日間ならびに７日間処置したＰＣ１２細胞中のｍｉＲ−２１９−５ｐレベルを示すグラフである。
【図７−２】Ｄ。レンチウイルス形質導入後のｍｉＲ−２１９−５ｐレベルのＱＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。Ｅ。レンチウイルスｍｉＲ−２１９−５ｐおよびスクランブルｍｉＲで形質導入した細胞中のタウｍＲＮＡレベルのＱＰＣＲ解析を示すグラフである。Ｆ。ｍｉＲ−２１９−５ｐ、スクランブルＲＮＡ、または空のベクターで形質導入したＰＣ１２細胞の、全タウに対する抗血清を用いた代表的な免疫ブロット解析の画像および定量化した結果の両方を示す図である。
【図７−３】Ｇ−Ｈ。ＮＧＦに曝露しなかったＰＣ１２細胞およびＮＧＦに７日間曝露したＰＣ１２細胞の、全タウを認識する抗血清を用いた免疫組織化学の画像である。Ｉ−Ｋ。レンチウイルスｍｉＲ−２１９−５ｐおよびＧＦＰレポーターで形質導入したＰＣ１２細胞の、免疫蛍光共焦点顕微鏡法を用いて観察された画像である。図７Ｋは図８Ｉおよび図８Ｊのマージ画像である。スケールバー＝２５μｍ。＊ｐ＜０．０５。
【図８−１】Ａ−Ｄ。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。図８ＡはｍｉＲ−２１９が過剰発現するハエを示す。これらのハエは、図８Ｂに示される対照と比較して翅が持ち上がった表現型を有する。図８Ｃは、負の走地性またはよじ登りアッセイでのハエを示しており、左の筒中が対照、中央の筒中がｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエ、右の筒中がｍｉＲ−１３４を過剰発現するハエである。図８Ｄは、負の走地性アッセイの結果を定量化したものである。
【図８−２】Ｅ−Ｇ。対照ハエ、ｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエ、およびｍｉＲ−３４を過剰発現するハエの全身（図８Ｅ）、頭部（図８Ｆ）、および胴体（図８Ｇ）でのショウジョウバエタウを標的とする抗血清を用いた、代表的な免疫ブロットの、画像および結果を定量化したグラフの両方を示す図である。
【図９−１】Ａ。ｅｌａｖ−ＧＡＬＡニューロンドライバーを用いてｍｉＲ−２１９を過剰発現させたショウジョウバエ、ショウジョウバエスクランブルｍｉＲＮＡ対照、多数のｍｉＲ−２１９認識エレメントを含む導入遺伝子であるｍｉＲＮＡスポンジ阻害剤を過剰発現するショウジョウバエ、およびショウジョウバエスクランブル対照スポンジからの抽出物の免疫ブロットの画像である。Ｂ。上記免疫ブロットの結果を定量化したグラフである。
【図９−２】Ｃ。ｅｌａｖ−ＧＡＬＡを用いてｍｉＲ−２１９またはｍｉＲ−２１９スポンジを過剰発現させたハエからの全ＲＮＡの結果を対照と比較して示すグラフである。Ｄ。ヒトタウ３’ＵＴＲに融合したホタルルシフェラーゼを、ｍｉＲ−２１９、スクランブル対照、ｍｉＲ−２１スポンジ阻害剤、およびスクランブル対照スポンジと共発現するハエからの溶解物のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示すグラフである。正規化にはルシフェラーゼに融合したヒトＧＡＰＤＨ  ３’ＵＴＲを有する対照系を用いた。
【図９−３】Ｅ。ｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエ、対照およびスクランブルのハエにおけるｍｉＲ−２１９レベルの定量化を示すグラフである。正規化には２ｓＲＮＡレベルを用いた。Ｆ。ｍｉＲ−２１９スポンジ、対照およびスクランブルスポンジを発現するハエでの定量化を示すグラフである。データは平均値±ＳＥＭであり、３回以上の実験の代表的なものである。スチューデントのｔ検定（両側分布、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１）を用いて統計解析を実施した。
【図１０】Ａ−Ｅ。ショウジョウバエの眼球の画像である。
【図１１】Ａ−Ｃ。ショウジョウバエの眼球の画像である。
【図１２】様々なマイクロＲＮＡと共トランスフェクトした、全タウ３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポーター構築物のルシフェラーゼ活性を対照（ｈｔａｕ  ３’ＵＴＲのみ）と比較したグラフである。（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書で使用される用語は一般に、本発明の文脈および各用語が使用される文脈の範囲内において、当該技術分野でのその本来の意味を有する。本発明の方法およびその使用方法を説明するうえで、実施者にさらなる指針を提供するべく、以下の部分または本明細書の他の箇所で特定の用語について記述する。さらに、同じ事柄を２つ以上の方法で述べることが可能であることが理解されよう。したがって、本明細書に記載される任意の１つまたは複数の用語に対して代替的な言葉および同義語が使用されることがあり、また、ある用語が本明細書で詳細に論じられる、または記述されるかどうかに何ら特別の意味はない。特定の用語の同義語が記載される。１つまたは複数の同義語が記載されても、それ以外の同義語の使用が排除されるわけではない。具体例を用いる場合、本明細書で記述される任意の用語の具体例を含め、それが本明細書のいずれの箇所であっても、それは単に例示的なものであり、本発明または例示されるあらゆる用語の範囲および意味を決して限定するものではない。本発明も同様に、その好ましい実施形態に限定されるものではない。
【００４２】
本願で使用される「対象」という用語は、鳥類および哺乳類などの免疫系を有する動物を意味する。哺乳類としては、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、および霊長類が挙げられる。鳥類としては、特に限定されないが、家禽類、鳴禽類、および猛禽類が挙げられる。したがって、本発明は、例えば、動物園の伴侶動物、家畜、実験動物、および野生の動物を治療するために獣医学で用いることができる。本発明は特に、ヒトの医療に適用するのが望ましい。
【００４３】
本願で使用される「患者」という用語は、ヒト対象を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、「患者」とは、軽度ないし重度の認知障害の患者、または前駆期の前認知症の患者のことである。
【００４４】
「健常対照」または「対照」という用語は、認知症性疾患がなく認知機能が正常なヒト対象のことである。さらに、健常対照は妥当な範囲内で対象と同年齢であるのが好ましい。
【００４５】
本願で使用される「軽度認知障害」または「ＭＣＩ」という用語は、通常の加齢で予想される認知低下と認知症にみられるより重篤な認知低下との間にある中間段階を意味する。ＭＣＩは、個人の年齢および教育に基づいて予想される認知障害より重度であるが、日常生活に支障を来たさない程度の認知障害の発症および進行を含む脳機能症候群の１つである。ＭＣＩは、通常の加齢と認知症との間の移行段階であるとみられることが多い。ＭＣＩは様々な症状を来たし得るが、記憶喪失を主症状とする場合、「健忘性ＭＣＩ」と呼ばれ、アルツハイマー病の前駆段階としてみられることが多い。
【００４６】
「アルツハイマー病」および「ＡＤ」という用語は互換的に使用され、軽度認知障害およびΑβを含むアミロイド斑の存在が認められる疾患のことである。
【００４７】
「濃縮体優位型認知症」、「濃縮体単独認知症」、「ＴＯＤ」、および「ＴＰＤ」、「濃縮体優位型老人性認知症」、「濃縮体型老人性認知症」、「濃縮体を伴う老人性認知症」、ならびに「辺縁系神経原線維濃縮体認知症」という用語は、本願では互換的に使用され、局在性、形態学的特徴、超微構造および生化学的特徴が中等度段階のＡＤのものとほぼ同じであるが、Αβ沈着斑はあまりみられない神経原線維濃縮体を呈する患者と定義される（Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｉａら（２０１２）（１））。
【００４８】
本明細書で使用される「タウオパチー」という用語は、脳内のタウタンパク質蓄積を特徴とする神経変性疾患を意味する。このようなタウオパチーとしては、特に限定されないが、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症が挙げられる。
【００４９】
「治療する」、「治療」などの用語は、疾患の少なくとも１つの症状の進行を遅らせる、緩和する、改善もしくは軽減する、または疾患発症後にそれを正常に戻す手段を指す。
【００５０】
「予防する」、「予防」などの用語は、疾患の進行を防ぐ、疾患の程度を最小限に抑える、または疾患の進行過程を遅らせるために、疾患発症が明白になる前に実施する行為を指す。
【００５１】
「それを必要とする」という用語は、アルツハイマー病、濃縮体優位型認知症、もしくは別のタウオパチーまたは神経変性を引き起こす疾患もしくは病態がある、あるいはそのリスクがあることが明らかであるか、それが疑われる対象のことである。ＡＤまたはＴＰＤの場合、対象は、軽度ないし重度の認知障害、または前駆期の前認知症のある対象であり得る。
【００５２】
本明細書で使用される「薬剤」という用語は、何らかの効果をもたらす、またはもたらすことができる物質を意味し、特に限定されないが、化学薬品、医薬品、生物学的製剤、有機小分子、抗体、核酸、ペプチド、およびタンパク質を含む。
【００５３】
「治療有効量」という語句は、本明細書では、対象において臨床的に重要な病態を改善するために、あるいは疾患に関連する１つまたは複数の症状を遅延させるか最小限に抑えるか軽減するために、または対象において生理学的状態の所望の有益な変化をもたらすために十分な量を意味するのに使用される。
【００５４】
本明細書で使用される「スクリーニングする」および「スクリーニング」などの用語は、対象または患者が特定の疾病または疾患、本発明の場合はＡＤ、ＴＰＤまたは別のタウオパチーを有するかどうかを決定するために、その対象または患者を検査することを意味する。この用語はまた、ある薬剤が特定の作用または効果を有するかどうかを決定するために、その薬剤を試験することを意味する。
【００５５】
本明細書で使用される「診断」、「診断する」、「診断すること」などの用語は、対象または患者がどのような身体的疾患または疾病、本発明の場合はＡＤ、ＴＰＤまたは別のタウオパチーを有するかを決定することを意味する。
【００５６】
本明細書で使用される「同定」、「同定する」、「同定すること」などの用語は、対象または患者において疾患、本発明の場合はＡＤ、ＴＰＤまたは別のタウオパチーを確認することを意味する。この用語はまた、ある薬剤が特定の用途に効果的であると確認することを意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「予測」、「予測する」、「予測すること」などの用語は、専門知識に基づいて予め伝えることを意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「基準値」という用語は、健常対照からの試料中に含まれる特定のタンパク質または核酸の一定量を意味する。
【００５９】
「ＭＡＰＴ」、「ＭＡＰＴ遺伝子」および「ＭＡＰＴ遺伝子座」という用語は、本願では互換的に使用され、微小管関連タンパク質であるタウの遺伝子を意味する。
【００６０】
「３’ＵＴＲ」または「ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲ」という用語は、本願では互換的に使用され、様々な機能の中でもとりわけ、ｍＲＮＡの安定性および局在に影響を及ぼすことによって、転写後レベルで遺伝子発現を調節できる重要なシス作用性調節エレメントを意味する（Ａｒｏｎｏｖら（２００１）；Ａｒｏｎｏｖら（１９９９））。
【００６１】
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は互換的に使用され、標的ｍＲＮＡ転写産物の発現を調節する平均２２個のヌクレオチドからなる小分子非コードＲＮＡと定義される（Ａｍｂｒｏｓ（２００４）；Ｂａｒｔｅｌ（２００９））。
【００６２】
「マイクロＲＮＡ模倣物」という用語は、３’ＵＴＲの標的配列に対し部分的に相補的な配列モチーフを５’末端に含むよう構築された、非天然または人工の二本鎖マイクロＲＮＡ様ＲＮＡフラグメントを含むと定義される。
【００６３】
「マイクロＲＮＡファミリー」または「ｍｉＲＮＡファミリー」という用語は、本願全体を通して互換的に使用され、同じシードを有するマイクロＲＮＡを指し、シードとは成熟マイクロＲＮＡの５’末端の２〜８位のヌクレオチドと定義される。例えば、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐとｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐはマイクロＲＮＡファミリー、ｍｉＲ−１８１ａｂｃｄ／４２６２由来であり、同一のシード配列を有する。したがって、あるファミリー由来の１つまたは２つのマイクロＲＮＡがＭＡＰＴの３’ＵＴＲに結合することが示されるか、予測される場合、そのファミリーに属する他のマイクロＲＮＡもまたＭＡＰＴの３’ＵＴＲに結合すると考えられる。
【００６４】
「ｍｉＲ−２１９−５ｐ」または「ｍｉＲ−２１９」という用語は、本願全体を通じて互換的に使用され、予防および治療に有用であると同定されたマイクロＲＮＡの１つを指す。２つの成熟マイクロＲＮＡが同じプレｍｉＲＮＡの反対側の腕から生じる場合、それらは接尾語−３または−５ｐとともに記される。当業者であれば、一方のｍｉＲＮＡが他方のｍｉＲＮＡよりも多数存在すること、および本願全体を通じて記載される他のマイクロＲＮＡに関して、例えばｍｉＲ−１８１ｄとｍｉｒ−１８１ｄ−５ｐのように、「５ｐ」または「３ｐ」の表記があるものもあれば、このような表記がないものもあるが、いずれも同じマイクロＲＮＡを表すことを理解するであろう。
【００６５】
「アンチセンスＤＮＡ」という用語は、二本鎖ＤＮＡにおいてコード鎖に相補的な非コード鎖のことである。
【００６６】
本明細書で使用される「単離（された）」などの用語は、言及される物質が、その物質が通常見出される天然の環境下でみられる成分を含んでいないことを意味する。具体的には、単離された生物学的物質は細胞成分を含まない。核酸分子の場合、単離された核酸は、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、単離されたゲノムＤＮＡ、または制限酵素断片を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、それが見出される染色体から好ましくは切り出される。単離された核酸分子をプラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入できる。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞内でそれに付随している他のタンパク質もしくは核酸またはその両方と結合していてもよく、または単離されたタンパク質が膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてもよい。単離された物質は、必ずしも必要ではないが、精製されてもよい。
【００６７】
本明細書で使用される「精製された」などの用語は、無関係な物質、すなわち夾雑物を減らす、または除去する条件下で単離された物質を指す。例えば、精製されたタンパク質は、細胞内でそれに付随している他のタンパク質または核酸を好ましくは実質的に含まず；精製された核酸分子は、細胞内でそれとともに見出されるタンパク質または他の無関係な核酸分子を好ましくは実質的に含まない。本明細書で使用される「実質的に含まない」という用語は、物質の分析試験の文脈において操作的に使用される。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された物質は少なくとも５０％の純度であり；より好ましくは少なくとも９０％の純度であり、さらにより好ましくは少なくとも９９％の純度である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、およびその他の当該技術分野で公知の方法によって評価できる。
【００６８】
「核酸ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの一本鎖核酸間の逆並行水素結合を指し、この結合では、ＡとＴ（ＲＮＡ核酸の場合はＵ）、ＣとＧがそれぞれ対を形成する。ある核酸分子の少なくとも一方の鎖が、定められたストリンジェンシー下で別の核酸分子の相補的な塩基と水素結合を形成できる場合、その核酸分子は互いに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、（ｉ）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を実施する温度、（ｉｉ）イオン強度ならびに（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液のホルムアミドなどの変性剤の濃度、ならびに他のパラメータによって決まる。ハイブリダイゼーションには、２本の鎖が実質的に相補的な配列を含んでいることが必要である。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、ある程度のミスマッチが許容される。「低ストリンジェンシー」条件下では、より大きなミスマッチの割合が許容される（すなわち、逆並行ハイブリッドの形成が阻害されない）。
【００６９】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主細胞内にＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を導入して、宿主を形質転換して導入した配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進できる輸送媒体を意味する。ベクターとしては、特に限定されないが、プラスミド、ファージ、およびウイルスが挙げられる。
【００７０】
ベクターは通常、伝達性媒介物のＤＮＡを含み、これに外来ＤＮＡを挿入する。あるＤＮＡセグメントを別のＤＮＡセグメントに挿入するのによく用いられる方法は、ＤＮＡを制限部位と呼ばれる特異的部位（ヌクレオチドの特異的グループ）で切断する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」は、ベクターの定められた制限部位に挿入可能な発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを指す。カセット制限部位は、カセットがしかるべきリーディングフレームに挿入されるように設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位に挿入され、その後ベクターによって伝達性のベクターＤＮＡとともに宿主細胞内に運ばれる。ＤＮＡが挿入または付加されたＤＮＡの配列またはセグメント、例えば発現ベクターなどは、「ＤＮＡ構築物」と呼ばれることもある。よく用いられる種類のベクターは「プラスミド」である。プラスミドは一般に、自立した二本鎖ＤＮＡ分子であり、通常は細菌に由来し、ほかの（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、かつ適切な宿主細胞内に容易に導入できる。プラスミドベクターは多くの場合、コードＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡの挿入に適した制限部位を１つまたは複数有する。コードＤＮＡとは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のことである。プロモーターＤＮＡとは、コードＤＮＡの発現を開始させる、調節する、あるいは別の方法で仲介または制御するＤＮＡ配列のことである。プロモーターＤＮＡとコードＤＮＡは同じ遺伝子に由来しても、異なる遺伝子に由来してもよく、また同じ生物体に由来しても、異なる生物体に由来してもよい。様々な真核および原核宿主での複製および／また発現のためのベクターが、プラスミドおよび真菌ベクターを含み、多数記載されており、また多数のしかるべき宿主細胞が当業者に公知である。組換えクローニングベクターは多くの場合、クローン化または発現のための１つまたは複数の複製系、宿主での選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
【００７１】
「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の産生のため、例えば、細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の発現のために、任意の方法で選択、改変、形質転換、増殖または操作される、任意の生物体の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、本明細書に記載されるように、スクリーニングまたはその他のアッセイにさらに用いることができる。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）のことであり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列には通常、細胞機構がタンパク質および酵素の生成に用いる情報を含む、遺伝情報が収められている。上記用語には、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成ポリヌクレオチドおよび遺伝子操作したポリヌクレオチド、ならびにセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドの両方が含まれる。これには、一本鎖分子および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸主鎖にコンジュゲートすることによって生成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これにはまた、修飾塩基、例えば、チオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルを含む核酸が含まれる。
【００７３】
本明細書の核酸には、天然の調節（発現制御）配列が隣接していてもよく、あるいはプロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’非コード領域などを含む、異種配列が結合していてもよい。核酸はまた、当該技術分野で公知の多数の手段によって修飾されていてもよい。このような修飾の非限定的な具体例としては、メチル化、「キャップ」、類似体による１つまたは複数の天然のヌクレオチドの置換、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合による修飾（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど）および荷電結合による修飾（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）などが挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などの１つまたは複数の追加の共有結合部分を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルホスホトリエステル結合またはアルキルホスホラミダート結合の形成によって誘導体化されてもよい。さらに、本明細書のポリヌクレオチドはまた、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを供給できる標識で修飾されていてもよい。例示的な標識としては、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００７４】
「パーセント（％）配列類似性」、「パーセント（％）配列同一性」などの用語は一般に、異なる核酸分子のヌクレオチド配列またはタンパク質のアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指し、これらの配列は進化上の起源を同じくするものであっても、そうでなくてもよい。配列同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、またはＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、マディソン、ウィスコンシン州）などの多数の公開されている配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて決定できる。
【００７５】
「実質的に相同である」または「実質的に類似している」という用語は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒなどの配列比較アルゴリズムにより決定して、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％もしくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチドが、ＤＮＡ配列の定められた長さにわたって一致する場合を指す。このような配列の具体例は、本発明の特異的遺伝子の対立遺伝子変異体または種変異体である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、または例えば、その特定のシステム用に定められたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で特定できる。
【００７６】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の数値の許容可能な誤差の範囲内を意味し、この範囲は部分的には、数値を測定または決定する方法、すなわち、測定システムの限界、すなわち、医薬製剤などの特定の目的に必要な精度に左右される。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例に従って、１以内の、または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の数値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的な系または過程に関しては、この用語は、数値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本願および特許請求の範囲に特定の数値が記載される場合、特に明記されない限り、特定の数値の許容可能な誤差の範囲内を意味する「約」という用語を想定するべきである。
【００７７】
タウの調節因子としてのマイクロＲＮＡ
少なくとも２３種類の脳疾患では、タウタンパク質が神経原線維濃縮体として細胞内で凝集し蓄積する現象が、ニューロンおよびグリアの細胞体および突起で起こり、このような疾患のうち最もよくみられるのがアルツハイマー病（ＡＤ）である。タウ発現を抑制するマイクロＲＮＡの調節不全が、タウｍＲＮＡレベルとも不均衡なスプライシングとも無関係にタウタンパク質レベルの増大を引き起こすことによって、神経原線維濃縮体形成の発生機序に何らかの役割を演じているとする仮説が立てられた。この仮説は、ＡＤをはじめとする神経変性疾患におけるマイクロＲＮＡの変化について記載したそれまでの研究を土台にしている（Ｗａｎｇら（２００８）；Ｈｅｂｅｒｔら（２００８）；Ｎｕｎｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓら（２０１０）；Ｓｍｉｔｈら（２０１１）；Ｋｉｍら（２００７）；Ｐａｃｋｅｒら（２００８）；Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら（２００８）；Ｗａｎｇら（２０１０））。この仮説はまた、ヒト遺伝子の大部分がマイクロＲＮＡによって調節されており（Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２００９））、ＭＡＰＴが多数の保存された予測マイクロＲＮＡ認識エレメントを有する比較的大きな（４．２Ｋｂ）３’ＵＴＲを有するという事実に基づいている。
【００７８】
本研究では、低分子ＲＮＡ配列が定量的でハイブリダイゼーションの影響を受けないことから、低分子ＲＮＡ配列を用いてハイブリダイゼーションプローブの交差反応性を回避した。本研究では、厳格な神経病理学的選択基準を用い、ＡＤ患者およびＴＰＤ患者の両方に対象を絞って、ＡＤの顕著な特徴である側頭葉へのタウ蓄積と関係のあるマイクロＲＮＡを特定できた。さらに、対照の採用を厳格に実施し、ＲｏｗｅおよびＫｈａｎ（１９８７）が提唱するモデルに基づいて症例を層別した。加齢に伴い濃縮体が観察されることが多いが、「脳の」加齢が良好と言われる一部の高齢者には、加齢に関係する側頭葉の濃縮体が実質的にみられない（Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｉａら（２０１２）（２））。このような対照は、神経原線維変性を免れ、かつ保護因子が多数存在するため、病理所見のみられない若年対照とは根本的に異なる。以上のことをまとめると、この方法によって、ＡＤおよびＴＰＤと加齢による認知障害とを識別するのに有用であり得るほか、ＡＤおよびＴＰＤをはじめとする神経変性病変の治療に使用し得る独特のマイクロＲＮＡシグネチャーのセットを作製できた。
【００７９】
本明細書に記載される研究結果は、マイクロＲＮＡが神経原線維変性の調節因子であり、転写後レベルでタウ発現を減少させるとする仮説を裏付けるものである。タウ発現の減少がΑβによる認知障害の発症を防ぎ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚら（２００５）；Ｒｏｂｅｒｓｏｎら（２００７）；Ｒｏｂｅｒｓｏｎら（２０１１））、トランスジェニックマウスモデルではタウ減少が一般に耐容性に優れている（Ｄａｗｓｏｎら（２０１０））ことから、タウ発現を減少させることは、ＡＤおよびＴＰＤの治療には魅力的な戦略であり、マイクロＲＮＡを増大させることによって、この減少を達成できる。
【００８０】
本明細書に記載される結果は、マイクロＲＮＡ、特に配列番号１を含む配列を有しｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡがタウの調節因子であるとする主張を強く裏付けるものである。この研究結果は、タウ３’ＵＴＲにｍｉＲ−２１９−５ｐ認識エレメントが広範囲にわたって保存されていること（実施例２および３）およびルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で、ｍｉＲ−２１９−５ｐがタウ３’ＵＴＲに直接結合してその活性を抑制することが明らかになったこと（実施例４および１５）によって裏付けられる。海馬培養物にｍｉＲ−２１９−５ｐを形質導入したところ、タウタンパク質レベルに有意な低下が認められたのに対して、タウｍＲＮＡレベルには変化がなく、ｍｉＲ−２１９−５ｐがタウ発現を抑制する機序には転写抑制の誘導が含まれることを示している（実施例５）。
【００８１】
ｍｉＲ−２１９がタウ３’ＵＴＲと相互作用することが示されたことから、次に、この相互作用がより生理的な状況下で起こるかどうかを検討する必要があった。予測した標的の機能傾向解析から、ｍｉＲ−２１９がニューロン分化、軸索発生および遺伝子発現に何らかの役割を演じていることが示唆される（実施例１２；表９）。これまでの研究で、タウが重要な発生タンパク質であり、神経突起伸長に機能的な役割を演じていることが示されている（Ｄｒｕｂｉｎら（１９８８）；Ｄｒｕｂｉｎら（１９８５））。十分に確立された神経突起伸長モデルである、神経成長因子（ＮＧＦ）に曝露したＰＣ１２細胞を用いて、ＮＧＦの適用が、神経突起が伸長したニューロン様細胞への分化を誘導すると同時に、タウのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを増大することが確認された。また、ＮＧＦが、一過性ではあるがｍｉＲ−２１９の有意なダウンレギュレーションを誘導し、それは細胞が完全に分化するとベースラインに戻ることも見出された。このことは、活性なタウタンパク質合成とｍｉＲ−２１９レベルとの間に逆相関関係があることを示している。最後に、ニューロン増殖因子（ＮＧＦ）の適用後に、ｍｉＲ−２１９−５ｐの過剰発現がＰＣ１２細胞中のタウレベルの増大を阻止し、神経突起伸長を停止させることが見出された（実施例６）。以上の結果をまとめると、ＮＧＦに誘導されるタウタンパク質合成はｍｉＲ−２１９によって転写後に調節されることが示唆される。
【００８２】
本明細書の研究結果はいずれも、ショウジョウバエを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで再現された。ショウジョウバエのタンパク質調節機序の多くが、ｍｉＲＮＡ調節を含め、ヒトでも保存されている（Ｄａｉら（２０１２））。バイオインフォマティクス解析から、成熟ショウジョウバエｍｉＲ−２１９配列がヒトｍｉＲ−２１９と１００％の配列同一性を有することが明らかにされている。ショウジョウバエは、ヒトのタウとのアミノ酸類似性が６６％のタンパク質をコードする、単一のタウ遺伝子を有する。ショウジョウバエとヒトのタウは、微小管結合ドメインを含む、多数の重要な特徴を共有している（ＨｅｄａｒｉおよびＦｏｒｔｉｎｉｎ（２００１））。ショウジョウバエゲノムを検討したところ、ハエのタウ遺伝子には、以前に不完全な注釈が付けられた１４３９ｂｐにわたる３’ＵＴＲ領域があり、単一のｍｉＲ−２１９認識エレメントが含まれていることが明らかになった（実施例７；表８）。実際、ヒトタウを標的とすると予測される全ｍｉＲＮＡのうち、ショウジョウバエで保存されているのはｍｉＲ−２１９認識エレメントのみであり、顕著な進化的に保存された関係を示唆している。
【００８３】
ショウジョウバエタウもまたｍｉＲ−２１９によって調節されるのかどうかを検討するため、このｍｉＲＮＡをニューロンで過剰発現させた（Ｂｅｊａｒａｎｏら（２０１２））。ｍｉＲ−２１９をハエの脳で過剰発現させたところ、それらのハエには、ｗｉｎｇｓ  ｕｐ表現型および対照と同じ高さまでよじ登ることができないこと（実施例８）を含む、様々な表現型がみられた。またスクランブルｍｉＲＮＡ対照と比較して、タウタンパク質レベルの極めて有意な低下がみられた（実施例９）。しかし、縦列した多数のｍｉＲ−２１９結合部位を含む組換え転写産物であるスポンジ阻害剤をショウジョウバエで発現させたところ、ショウジョウバエニューロンに発現するｍｉＲ−２１９のレベルが低下し、対照に比して内因性タウタンパク質のレベルの有意な増大がみられた（実施例９）。ｍｉＲ−２１９スポンジの過剰発現により、ショウジョウバエタウｍＲＮＡもまた有意に増加した（実施例９）。しかし、ｍｉＲ−２１９を過剰発現させてもショウジョウバエタウｍＲＮＡのレベルに変化がなかったことは、ｍＲＮＡレベルおよび翻訳の両方に対する作用を示唆する（実施例９）。さらに、ヒトタウ３’ＵＴＲに融合したルシフェラーゼレポーターを発現するショウジョウバエを用いて、ｍｉＲ−２１９はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトタウ３’ＵＴＲ活性を調節することも可能なことが確認された。これに対して、ｍｉＲ−２１９スポンジ阻害剤はルシフェラーゼ活性を有意に低下させることから、進化的に保存された二方向性のタウ調節機序が確認される（実施例９）。
【００８４】
トランスジェニックショウジョウバエを用いた研究では、タウの過剰発現により著明なｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型が生じることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎら（２００２）；Ｗｉｔｔｍａｎら（２００１）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００））、この研究結果は本明細書でも再現された（実施例１０）。本研究の結果はまた、ｍｉＲ−２１９およびヒト３’ＵＴＲがともに表現型を救済することを示しており、ｍｉＲ−２１９がタウ毒性を調節し、３’ＵＴＲに保護的なシス作用性調節エレメントが存在することを示している（実施例１０および１１）。
【００８５】
タウ毒性に寄与するのではないかと思われる病理発生機序には、タウの高リン酸化、凝集、クリアランス低下および隣接するニューロンへの拡散がある（Ｍｏｒｒｉｓら（２０１１））。治療戦略の１つが、高リン酸化タウ（ｐ−タウ）の産生減少またはクリアランス増大のいずれかによって、ニューロン内の毒性タウ種の負荷量を減らすことである（Ｊｉｎｗａｌら（２０１３））。本明細書に示されるように、ｍｉＲ−２１９はまた、タウの高リン酸化に関与するプロリン指向性セリン／トレオニンキナーゼである、ＧＳＫ３βの発現を抑制すると予測される（実施例１４）。さらに、本明細書では、ｍｉＲ−２１９および他のｍｉＲＮＡがタウに関与するその他のキナーゼ、例えばヒトタウ−チューブリンキナーゼ１（ＴＴＢＫ１）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩガンマおよびタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）などを標的とすることが示される（実施例１４）。以上の研究結果は、ｍｉＲＮＡが関与するこれまで認められていない転写後機序が、タウおよびＧＳＫ３βの両方ならびに、おそらくタウに関与するその他のキナーゼの発現を調節しているという可能性を開くものである。
【００８６】
マイクロＲＮＡはΜΑΡΤの３’ＵＴＲを標的とすることから、マイクロＲＮＡを用いて他のタウオパチーも治療できる。タウオパチーは、脳内にタウタンパク質が蓄積することを特徴とする神経変性疾患である。このようなタウオパチーとしては、特に限定されないが、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症が挙げられる。
【００８７】
さらに、タウオパチーの根底にある機序には、タウ機能の獲得または喪失のいずれかが含まれると考えられるが、現時点では、毒性タウのレベル増大が神経原線維変性を引き起こすと主張する研究者が多い（Ｍｏｒｒｉｓら（２０１１）；ＭａｎｄｅｌｋｏｗおよびＭａｎｄｌｅｋｏｗ（２０１２））。マイクロＲＮＡ成熟に必要なエンドリボヌクレアーゼであるダイサーを遺伝的に不活性化させたこれまでの研究から、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびげっ歯類モデルではマイクロＲＮＡがタウ毒性のモジュレーターとしての役割を果たすとする提唱が裏付けられており（Ｈｅｂｅｒｔら（２０１０）；Ｂｉｌｅｎら（２００６））、マイクロＲＮＡの変化が多くの神経変性障害の原因となる役割を演じている可能性が浮上している（Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２００７））。ＮＧＦシグナル伝達の変化がＡＤの発生機序に寄与することが提唱されており、ＮＧＦが神経変性の治療剤として現在評価されている（Ｂｏｒｌｏｎｇｏｎ（２０１２））ことから、ニューロン増殖因子またはＮＧＦが仲介するｍｉＲ−２１９−５ｐの減少が、タウが仲介する神経突起伸長に影響を及ぼし得るという本明細書の研究結果は興味深い。ほかにも、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達が崩壊するとｍｉＲ−２１９−５ｐのレベルが低下することを示した研究があり（Ｋｏｃｅｒｈａら（２００９）；ＢｅｖｅｒｉｄｇｅおよびＣａｉｒｎｓ（２０１２））、したがって、マイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−２１９−５ｐが、ＮＭＤＡ受容体、非ＮＭＤＡ受容体および代謝型グルタミン酸受容体のアゴニストによって誘導されるタウ発現の調節を介して、グルタミン酸が引き起こす毒性に何らかの役割を演じている可能性がある（Ｓｉｎｄｏｕら（１９９２）；Ｃｏｕｒａｔｉｅｒら（１９９５）；Ｅｓｃｌａｉｒｅら（１９９７））。さらに、サイカシンとして知られるソテツ由来毒素および内因性グルタミン酸がタウ発現を増大させ、グアム島の筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合ではマイクロＲＮＡネットワークの変化を介してタウタンパク質蓄積および神経変性を促進している可能性がある（Ｓｐｅｎｃｅｒら（２０１２））。
【００８８】
さらに、マイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−２１９−５ｐの濃縮体形成における役割は、ｍｉＲ−２１９−５ｐがグリアにも存在し、そこでオリゴデンドロサイトの分化および有髄化を調節していることから、ニューロンに限定されない可能性も考えられる（Ｚｈａｏら（２０１０））。
【００８９】
したがって、マイクロＲＮＡを増加させることによって、グリアに関連する疾患ならびに他の神経変性疾患を治療できる。
【００９０】
以上のことをまとめると、本明細書に記載される結果から、タウ発現がｍｉＲＮＡ、より具体的には少なくともｍｉＲ−２１９によって調節されることが確認される。この結論は、ｍｉＲ−２１９がｉｎ  ｖｉｔｒｏではタウ３’ＵＴＲと特異的に結合し、ｉｎ  ｖｉｖｏではｍｉＲ−２１９の過剰発現および阻害によって二方向性に調節されるという事実に基づくものである。タウ３’ＵＴＲには多数のｍｉＲＮＡ認識エレメントが存在し、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、タウ調節ｍｉＲＮＡの候補がほかにも存在することが示唆されたことから、ｍｉＲ−２１９がヒトタウを調節できる唯一のｍｉＲＮＡであるとは限らないと思われる。このようなｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉｒ−１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡが挙げられる。さらに、本明細書に記載される結果はまた、これらのｍｉＲＮＡのファミリーが、タウオパチーに関する他のキナーゼを標的とすることを示している（実施例１４）。
【００９１】
本明細書ではまた、マイクロＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲを介してヒトタウを調節してタウの過剰発現により生じるネガティブな表現型を減少させ得ることが示される。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの結果は、ｍｉＲＮＡがタウの過剰発現およびタウ毒性を原因とするタウオパチーの予防薬および治療剤として極めて有望であることを示すものである。
【００９２】
マイクロＲＮＡ
本明細書に記載される結果は、マイクロＲＮＡが、特に限定されないがＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーならびにその他の神経変性疾患および病態に関与することを示している。
【００９３】
最初に、本明細書に記載される結果は、アルツハイマー病と対照とで差次的に発現するｍｉＲＮＡが７６種類あり、濃縮体優位型認知症と対照とで差次的に発現するｍｉＲＮＡが１５２種類あり、濃縮体優位型認知症とアルツハイマー病とで差次的に発現するｍｉＲＮＡが５４種類あることを示している。実施例１３の表１１〜１６を参照されたい。
【００９４】
さらに、ある特定のｍｉＲＮＡがＡＤおよびＴＰＤで差次的に発現し、ＭＡＰＴを標的とすることが示された。このようなｍｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ１５１−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−４０９−３ｐが挙げられる。実施例２の表３を参照されたい。
【００９５】
タウの３’ＵＴＲを標的とするｍｉＲＮＡファミリーがほかにもあることが示された。このようなｍｉＲＮＡファミリーには、ｍｉＲ−１８１ａｂｃｄ／４２６２、ｍｉＲ−２７ＡＢＣ／２７ａ−３ｐ、ｍｉ−Ｒ３４ａｃ／３４ｂｃ−５ｐ／４４９ａｂｃ／４４９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２／２１２／２１／−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａｃ／１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４／２０４ｂ／２１１、およびｍｉＲ−２１９−５ｐ／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐがある（実施例２の表６；実施例１５）。上記ｍｉＲＮＡも、ＧＳＫ３βを含む、タウオパチーに関与するキナーゼを標的とすることが予測される（実施例１４の表１７）。
【００９６】
さらに、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎを用いて、複数のマイクロＲＮＡがタウを標的とすることが予測されており、これらは脊椎動物（表４）および哺乳動物（表５）で広く保存されている。
【００９７】
上に挙げたマイクロＲＮＡはいずれも、タウオパチーを治療および予防する本発明の方法ならびに、このような疾患をスクリーニング、同定、および診断する方法に使用できる。この方法に使用するのに好ましいマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−２１９−５ｐである。
【００９８】
ＴＰＤ、ＡＤ、および対照の脳から得られた発現プロファイリングＲＮＡを用いて、２種類のマイクロＲＮＡ、具体的にはｍｉＲ−２１９−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐがともに、多種の脊椎動物にわたってタウ３’ＵＴＲ中で保存されている予測認識エレメントを有することが見出された（実施例１および２）。ｍｉＲ−１８１は対照に比してＡＤおよびＴＰＤで増加している。これに対して、ｍｉＲ−２１９−５ｐは対照に比してＡＤおよびＴＰＤで減少している。
【００９９】
タウ発現を調節するｍｉＲＮＡの減少がタウ産生を増大させる理由は明らかであると思われるが、タウ発現を調節するｍｉＲＮＡの増加がタウ発現の増大を引き起こし、タウオパチーのマーカーとなる理由は明らかではない。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ｍｉＲ−１８１ｄを含むタウを標的とするいくつかのｍｉＲＮＡの増加は反応性の変化である。脳は、このタウ増加に応答して、タウの過剰発現を抑えるべくｍｉＲＮＡ産生を増大させるが、あまりにわずかで遅すぎるため、実際にはタウ発現が抑えられずにｍｉＲＮＡレベルが増大する。したがって、このｍｉＲＮＡを増加させることは、ＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの予防および／または治療に有益であるとも考えられる。
【０１００】
ｍｉｒ−２１９−１およびｍｉｒ−２１９−２と命名される２種類の前駆体は、それぞれ第６染色体および第９染色体上の別個の遺伝子から生じるが、両者は同じ成熟ｍｉＲ−２１９−５ｐを生じ得る。得られたプロファイルでは、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐはごくわずかなレベルでしか得られず、ｍｉｒ−２１９−２前駆体でみられる差はｍｉＲ−２１９−５ｐで観察される変化に寄与することを示唆する（表７）。
【０１０１】
成熟ｍｉＲ−２１９−５ｐの配列は高度に保存されており、タウを標的としないと予測されるｍｉＲ−２１９−２−３ｐとは異なる。これに対して、他の代表的な微小管関連タンパク質の３’ＵＴＲにはｍｉＲ−２１９−５ｐファミリー（ｍｉＲ−２１９−５／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐ）の認識エレメントは含まれていないが、ＭＡＰ１ａ、ＭＡＰ１ｂおよびＭＡＰ２の３’ＵＴＲには高度に保存されたｍｉＲ−１８１認識エレメントがみられ、ｍｉＲ−２１９−５ｐにはＭＡＰＴ由来転写産物に対する相対的選択性があることが示唆される（表６）。したがって、ｍｉＲ−２１９−５ｐは、ＡＤおよびＴＰＤの脳でのダウンレギュレートが観察されたタウを標的とすると予測される、高度に保存されたマイクロＲＮＡである。
【０１０２】
したがって、本発明の一実施形態は、マイクロＲＮＡ−２１９−５ｐと命名される単離マイクロＲＮＡおよびこの単離マイクロＲＮＡの使用であり、このマイクロＲＮＡは配列：
５’−ｕｇａｕｕｇｕｃｃａａａｃｇｃａａｕｕｃｕｕｇ−３’（配列番号１）
を含む。
【０１０３】
本発明の方法に有用な別のマイクロＲＮＡは、配列番号２の配列を含みｍｉＲ−４８５−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡである。したがって、本発明の別の実施形態は、マイクロＲＮＡ−４８５−５ｐと命名される単離マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ−４８−５ｐと命名される単離マイクロＲＮＡの使用であり、このマイクロＲＮＡは配列：
５’−ａｇａｇｇｃｕｇｇｃｃｇｕｇａｕｇａａｕｕｃ−３’（配列番号２）
を含む。
【０１０４】
本発明の方法に有用なまた別のマイクロＲＮＡは、配列番号３の配列を含みｍｉＲ−１８１ｄと命名されるマイクロＲＮＡである。したがって、本発明の別の実施形態は、マイクロＲＮＡ−１８１ｄ−５ｐと命名される単離マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ−１８１ｄ−５と命名される単離マイクロＲＮＡの使用であり、このマイクロＲＮＡは配列：
５’−ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｕｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕ−３’（配列番号３）
を含む。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、または３との配列相同性または類似性がある単離マイクロＲＮＡおよびＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、または３との配列相同性または類似性がある単離マイクロＲＮＡの使用である。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１、２または３を含むマイクロＲＮＡをコードする単離ＤＮＡおよび配列番号１、２、または３を含むマイクロＲＮＡをコードする単離ＤＮＡの使用である。
【０１０７】
本発明のまたさらなる実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、または３との配列相同性または類似性があるＲＮＡをコードする単離ＤＮＡおよびＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、または３との配列相同性または類似性があるＲＮＡをコードする単離ＤＮＡの使用である。
【０１０８】
本発明はまた、ＲＮＡまたは配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡと、ベクターと含み、形質転換した宿主細胞で発現させることができる組換え構築物を含む。本発明はまた、配列番号１、２、または３のヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡまたはこのマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡとベクターとを含む組換え構築物で形質転換した、宿主細胞を含む。
【０１０９】
本発明はまた、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、もしくは３との配列相同性があるＲＮＡまたはＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１、２、もしくは３との配列相同性があるマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡと、ベクターとを含み、形質転換した宿主細胞で発現させることができる組換え構築物を含む。本発明はまた、このマイクロＲＮＡまたはＤＮＡとベクターとを含む組換え構築物で形質転換した、宿主細胞を含む。
【０１１０】
本発明はまた、配列番号１、２、もしくは３を含むヌクレオチド配列のアンチセンスマイクロＲＮＡまたはＤＮＡの使用を含む。
【０１１１】
本発明はまた、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を有するアンチセンスマイクロＲＮＡまたはこのアンチセンスマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡと、ベクターとを含み、形質転換した宿主細胞で発現させることができる組換え構築物を含む。本発明はまた、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を有するアンチセンスマイクロＲＮＡまたはこのアンチセンスマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡとベクターとを含む組換え構築物で形質転換した、宿主細胞を含む。
【０１１２】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡおよび配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡの使用である。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡをコードする単離ＤＮＡおよび配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡをコードする単離ＤＮＡの使用である。
【０１１４】
本発明はまた、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡまたはこのマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡと、ベクターとを含み、形質転換した宿主細胞で発現させることができる、組換え構築物を含む。本発明はまた、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡまたはこのマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡとベクターとを含む組換え構築物で形質転換した、宿主細胞を含む。
【０１１５】
本発明はまた、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するヌクレオチド配列のアンチセンスマイクロＲＮＡまたはＤＮＡの使用を含む。
【０１１６】
本発明はまた、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するアンチセンスマイクロＲＮＡまたはこのアンチセンスマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡと、ベクターとを含み、宿主細胞で発現させることができる、組換え構築物を含む。本発明はまた、配列番号４〜８を含む配列から設計された３’ＵＴＲに結合するアンチセンスマイクロＲＮＡまたはこのアンチセンスマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡとベクターとを含む組換え構築物で形質転換した、宿主細胞を含む。
【０１１７】
マイクロＲＮＡを用いる本発明の治療、予防、診断またはスクリーニングの方法ではいずれも、マイクロＲＮＡ模倣物を用いることも可能であることが理解されよう。マイクロＲＮＡ模倣物は、遺伝子サイレンシング法のために設計された分子であり、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合できる非天然または人工の二本鎖マイクロＲＮＡ様ＲＮＡフラグメントを含む。
【０１１８】
ＡＤおよびＴＰＤおよび他のタウオパチーの治療法としてのマイクロＲＮＡ増加
本明細書に示されるように、ＡＤおよびＴＰＤの患者ではＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡのレベルが低いため、タウの発現が増大し、病的なタウ蓄積を来たす。したがって、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを増加させれば、このタウ過剰発現が減少すると思われる。
【０１１９】
したがって、本発明の一実施形態は、それを必要とする対象中のタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを増加させることによって、特に限定されないが、アルツハイマー病および濃縮体優位型認知症、ならびに進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症、第１７染色体連鎖パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ−タウ）、前頭側頭型認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、ピック病、および大脳皮質基底核変性症を含むタウオパチーを予防または治療することである。当業者には、表１１〜１６に挙げるマイクロＲＮＡを含むタウオパチーで差次的に発現する任意のマイクロＲＮＡを、タウオパチーを予防および治療するために増加させて使用し得ることが理解されよう。さらに、表３〜６に挙げるマイクロＲＮＡなどのタウＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とするマイクロＲＮＡを、タウオパチーを予防および治療するために増加させて使用することも可能である。
【０１２０】
この方法で増加させて使用できる好ましいマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐ、およびｍｉＲ−２１９−５ｐである。
【０１２１】
好ましい実施形態では、使用するマイクロＲＮＡは、配列番号１の配列を含みｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるものである。別の好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号１との類似性または相同性があるヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施形態では、使用するマイクロＲＮＡは、配列番号２の配列を含みｍｉＲ４８５−５ｐと命名されるものである。別の好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号２との類似性または相同性があるヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施形態では、使用するマイクロＲＮＡは、配列番号３の配列を含みｍｉＲ１８１ｄと命名されるものである。別の好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分な配列番号３との類似性または相同性があるヌクレオチド配列を含む。
【０１２２】
このマイクロＲＮＡなどは、上で述べたように、ＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの患者においてより高いレベルで見出されるが、これは患者がタウの過剰産生に反応しているからであり、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする任意のマイクロＲＮＡをタウオパチーの予防および／または治療に使用できる。
【０１２３】
別の実施形態では、マイクロＲＮＡは、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合してタウ発現を調節するヌクレオチド配列を含み得る。このようなマイクロＲＮＡは、既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計できる。
【０１２４】
マイクロＲＮＡの増加は様々な方法で達成できる。
【０１２５】
それを必要とする対象中のマイクロＲＮＡを増加させる１つの方法は、対象に治療有効量の薬剤を投与することであり、ここでは、薬剤はマイクロＲＮＡの産生を増大させる。
【０１２６】
タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを増加させる別の方法は、マイクロＲＮＡがその標的に結合する能力を増大させるか、最大限にする薬剤を投与することによるものである。
【０１２７】
それを必要とする対象中のマイクロＲＮＡを増加させるさらなる方法は、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡ模倣物またはＡＤもしくはＴＰＤで差次的に発現するマイクロＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡ模倣物を対象に投与することである。
【０１２８】
これは、このマイクロＲＮＡがタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合できる機能を維持するよう設計されたマイクロＲＮＡを用いて達成できる。このマイクロＲＮＡは、当該技術分野で公知の組換え法によって作製できる。このマイクロＲＮＡはまた、他の望ましい特性、例えば、増大した安定性、抑制された体内での分解、および増大した細胞内取込みなどを増大させるために修飾できる。
【０１２９】
ＲＮＡを送達するためのこのような方法の１つは受容体介在性エンドサイトーシスであり、この方法では、ＲＮＡを、特異的細胞表面受容体に結合できる標的分子にカップリングさせ、エンドサイトーシスを誘導して細胞内にＲＮＡを移行させる。カップリングは通常、ポリリジンを受容体分子に共有結合させた後、負に帯電したＲＮＡを正に帯電したポリリジン成分に（可逆的に）結合させることよって達成される。別の方法では、多くの細胞型に発現するトランスフェリン受容体または葉酸受容体を用いる。この投与方法のためにマイクロＲＮＡを作製する場合、目的とするマイクロＲＮＡと同一のガイド鎖と、細胞内取込みを増大させるために修飾して分子と結合させたパッセンジャー鎖とを有するようにマイクロＲＮＡを製造することが可能である。本発明には特に、ニューロンに固有のリガンド−受容体ペアが有用であると思われる。
【０１３０】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、ＲＮＡの細胞内取込みを増大させるリガンドもしくはコンジュゲートに結合される、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を含むもの、またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分なヌクレオチド配列を有するもの、または既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計されたものを含むマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物である。このコンジュゲーションは末端の５’／３’−ＯＨ位に生じ得るが、リガンドはまた、糖および／または塩基で生じてもよい。マイクロＲＮＡ分子に結合できるコンジュゲート／リガンドの具体例としては、特に限定されないが、トランスフェリン、葉酸、コレステロール部分、アクリジンなどの二本鎖インターカレーター、ポリ−Ｌ−リジン、およびホスホロモノチオアートが挙げられる。
【０１３１】
ＲＮＡをしかるべき組織に投与する別の方法は直接注入／粒子銃であり、この方法では、ＲＮＡをシリンジおよび針で筋肉などの特定の組織に直接注射する。
【０１３２】
また別の直接注入法は、粒子銃（「遺伝子銃」）技術を用いる。この方法では、ＲＮＡを金属ペレットにコーティングし、特殊な銃から細胞内に発射する。この方法を用いて、多数の様々な組織への遺伝子導入に成功している。このような直接注入技術は簡便で比較的安全性が高い。
【０１３３】
マイクロＲＮＡをしかるべき組織または細胞に送達するまた別の方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用することによるものである。このようなウイルスベクターで送達されるマイクロＲＮＡは、対象で発現しないマイクロＲＮＡの発現に代わって継続的に発現する。また、ＡＡＶには様々な血清型があり、個々のＡＡＶ血清型の様々な器官に対する天然の指向性および各ＡＡＶ血清型が相互作用する様々な細胞受容体により、組織特異的送達が可能になる。ＡＡＶ血清型に加えて、発現に組織特異的プロモーターを用いることにより、さらなる特異性がもたらされる。
【０１３４】
ＲＮＡの送達に使用し得るその他の哺乳動物ウイルスベクターとしては、オンコレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびレンチウイルスが挙げられる。
【０１３５】
特に、ＨＳＶベクターは中枢神経系（ＣＮＳ）に対する指向性があり、ニューロンに生涯にわたって潜伏感染を確立することが可能であるため、本発明に使用するのに好ましいベクターである。
【０１３６】
したがって、本発明のさらなる好ましい実施形態は、ウイルスベクターにパッケージされる、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を含むもの、またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分なヌクレオチド配列を有するもの、または既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計されたものを含むマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物である。
【０１３７】
リポソームは、生体膜の構造を模倣した合成脂質二重層からなる球状の小胞である。移入するＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでリポソームに封入し、これをそのまま使用してＲＮＡを適切な標的組織にｉｎ  ｖｉｖｏで移入する。脂質の被膜によってＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで存在し続けることが可能になり、細胞に結合して細胞内に取り込まれる。カチオン性リポソーム（リポソーム上の正電荷が負に帯電したＤＮＡの結合を安定化するもの）はリポソームの１種である。
【０１３８】
マイクロＲＮＡはまた、脂質とともに投与して細胞内取込みを増大できる。マイクロＲＮＡは、特に限定されないが、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質と組み合わせて投与し得る。
【０１３９】
ナノ粒子を含むその他の脂質またはリポソーム製剤および投与方法が、例えば、米国特許公開第２００３／０２０３８６５号、同第２００２／０１５０６２６号、同第２００３／００３２６１５号、および同第２００４／００４８７８７号に記載されている。粒子の形成に用いる方法もまた、米国特許第５，８４４，１０７号、同第５，８７７，３０２号、同第６，００８，３３６号、同第６，０７７，８３５号、同第５，９７２，９０１号、同第６，２００，８０１号、および同第５，９７２，９００号に開示されている。
【０１４０】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、リポソームに封入される、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を含むもの、またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分なヌクレオチド配列を有するもの、または既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計されたものを含むマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物である。本発明の別の実施形態は、脂質と組み合わせられる、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を含むもの、またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分なヌクレオチド配列を有するもの、または既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計されたものを含むマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物である。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列を含むｍｉＲＮＡ、またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する機能を維持するのに十分なヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡ、または既知のＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲの配列、特に配列番号４〜８を含むヌクレオチド配列を有する配列を用いて設計されたｍｉＲＮＡを含むマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤とを含む、医薬組成物である。マイクロＲＮＡに補助剤を添加して分解から保護してもよい。
【０１４２】
特定の実施形態では、マイクロＲＮＡを特定の組織または細胞に標的化する。好ましい実施形態では、組織は脳または神経組織であり、細胞はニューロンである。
【０１４３】
それを必要とする対象中のマイクロＲＮＡを増加させるさらなる方法は、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを対象に投与することである。
【０１４４】
これは上で概説したｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡを送達するための方法によって達成可能であり、ここでは、ＤＮＡは、配列番号１、２、もしくは３を含むｍｉＲＮＡおよび／またはタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するｍｉＲＮＡを含む、マイクロＲＮＡを発現する。
【０１４５】
古典的な遺伝子治療では通常、導入遺伝子がしかるべき高レベルで発現するように、クローン化した遺伝子を疾患細胞に効率的に移入する必要がある。遺伝子導入後、挿入された遺伝子は細胞の染色体に組み込まれ得るか、染色体外遺伝因子（エピソーム）として留まり得る。
【０１４６】
前者の場合、ＤＮＡは、細胞内に存在しマイクロＲＮＡを産生する内在遺伝子と組み換えを起こす。このような組換えには、マイクロＲＮＡを産生する遺伝子の変異が結果として修正される二重組換え事象が必要である。
【０１４７】
より好ましいのは、遺伝子が染色体外の位置から細胞によって発現される場合である。
【０１４８】
組換えまたは染色体外複製のいずれかでＤＮＡを導入するためのベクターは当該技術分野で公知であり、本明細書で既に述べた。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、およびウイルス形質導入を含む細胞内に遺伝子を導入する方法は、当該技術分野で公知である。
【０１４９】
タウオパチー、特にＡＤおよび／またはＴＰＤのスクリーニングまたは診断としてのマイクロＲＮＡの使用
上で述べたように、また実施例３で示されるように、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有しｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルが低いことはタウのより高いレベルと関連し、これがタウオパチーのきっかけとなる。したがって、本発明の一実施形態は、対象由来の試料中で、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有しｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルの低下を検出することによって、対象中のタウオパチーをスクリーニング、診断または同定することである。特に、認知障害はＡＤおよびＴＰＤ以外の他の多くの疾患および障害により起こり得るため、この方法は特に、認知障害のある対象でＡＤおよび／またはＴＰＤを同定および診断するためのスクリーニングに有用である。
【０１５０】
また示されるように、配列番号３を含むヌクレオチド配列を有しｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルの増大はＡＤおよびＴＰＤと相関する。したがって、本発明の一実施形態は、対象由来の試料中で、配列番号３を含むヌクレオチド配列を有しｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルの増大を検出することによって、対象中のタウオパチーをスクリーニング、診断または同定することである。特に、認知障害はＡＤおよびＴＰＤ以外の他の多くの疾患および障害により起こり得るため、この方法は特に、認知障害のある対象のＡＤおよび／またはＴＰＤを同定および診断するためのスクリーニングに有用である。
【０１５１】
アルツハイマー病および濃縮体優位型認知症と相関のあるマイクロＲＮＡのうちの１つを検出するためには、軽度ないし重度の認知障害、または前駆期の前認知症のある対象からの生物試料を採取し、調製し、マイクロＲＮＡの存在を分析する。これは、診断研究所、および／または健康管理提供者によって多数の方法で達成され得る。
【０１５２】
試料中に見出されるｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡおよび／またはｍｉＲ−１８１ｄ−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルを、健常対照中のこれらのマイクロＲＮＡのレベルと比較する。この比較は多数の方法で実施できる。精製および単離した健常対照由来のＲＮＡ試料に対し同じアッセイを同時に、または連続的に実施し、その結果を定性的に、例えば視覚的に比較する、すなわち、健常対照由来のＲＮＡ試料が同じアッセイでの対象由来のＲＮＡ試料と同じ強度のシグナルを発生するかどうかを比較してもよく、あるいは、その結果を定量的に比較する、例えば、対象由来のＲＮＡ試料のシグナルの値を求め、健常対照でのＲＮＡの既知の値と比較してもよい。
【０１５３】
対象由来の試料中のｍｉＲ−２１９−５ｐと命名されるマイクロＲＮＡのレベルが健常対照に比して低いことは、対象がタウオパチーを有することを示す。対象がＭＣＩであれば、それは対象がＡＤまたはＴＰＤを有することを示す。図３に示されるように、対照対象中のｍｉＲ−２１９レベルにはＡＤまたはＴＰＤに比して有意な差がある（約５倍を超える）。また表３に記載されるように、対照に対するＴＰＤでのこのｍｉＲＮＡの変化倍数は−１．４であり、対照に対するＡＤでのこのｍｉＲＮＡの変化倍数は−１．９である。
【０１５４】
対象由来の試料中のｍｉＲ−１８１ｄと命名されるマイクロＲＮＡのレベルが健常対照に比して高いことは、対象がタウオパチーを有することを示す。対象がＭＣＩであれば、それは対象がＡＤまたはＴＰＤを有することを示す。表３に記載されるように、対照に対するＴＰＤでのこのｍｉＲＮＡの変化倍数は＋０．８であり、対照に対するＡＤでのこのｍｉＲＮＡの変化倍数は＋０．６である。
【０１５５】
さらに、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１５１−５ｐを含む表３に挙げられるｍｉＲＮＡ、ならびに表１１および１３に挙げられるｍｉＲＮＡは、対照よりもＡＤおよびＴＰＤでの方が低レベルでみられるため、ｍｉＲ２１９−５ｐに関する方法と同様の方法で使用できる。ｍｉＲ−１４９を含む表３に挙げられるマイクロＲＮＡならびに表１２および１４に挙げられるマイクロＲＮＡは、対照よりもＡＤおよびＴＰＤでの方が高レベルでみられるため、ｍｉＲ−１８１に関する方法と同様の方法で使用できる。最後に、表１５および１６に挙げられるｍｉＲＮＡは、ＡＤの患者とＴＰＤの患者で差次的に発現するため、ＴＰＤからＡＤを診断または同定するのに使用できる。
【０１５６】
マイクロＲＮＡとＡＤおよびＴＰＤが相関するという驚くべき発見を利用して、認知障害の対象でのＡＤまたはＴＰＤのスクリーニング、診断、予測および同定に、マイクロＲＮＡを検出する任意の方法を用いることができる。
【０１５７】
軽度ないし重度の認知障害、または前駆期の前認知症のある患者でＡＤまたはＴＰＤをスクリーニングおよび診断する方法では、最初に患者から生体組織または体液の試料を採取し、その組織または体液から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を抽出、単離および／または精製する。
【０１５８】
核酸は任意の生体組織から採取できる。好ましい生体組織としては、特に限定されないが、脳、上皮、全血、および血漿が挙げられる。
【０１５９】
核酸は任意の体液から採取できる。好ましい体液としては、特に限定されないが、脳脊髄液、血漿、唾液、汗、および尿が挙げられる。
【０１６０】
核酸は、当該技術分野で公知の方法によって、組織の細胞または体液から抽出、単離および精製される。様々なキットおよび試薬を用いて高品質のＲＮＡを抽出するプロトコルが多数開発されている。マイクロアレイ解析に全ＲＮＡを用いることも可能であるが、低分子ＲＮＡは全ＲＮＡの約０．０１％を占めるにすぎないため、マイクロＲＮＡの濃縮により感度が高くなる。
【０１６１】
マイクロＲＮＡを検出する方法としては、特に限定されないが、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ポリ−Ａテール逆転写、マイクロＲＮＡ増幅プロファイリング、マイクロＲＮＡ遺伝子発現連続解析、マイクロアレイ、酵素増幅アッセイ、シーケンシング、およびナノ粒子法が挙げられる。
【０１６２】
マイクロＲＮＡが対象由来の試料中に存在するかどうかを決定するのに有用な技術の１つは、実施例１に例示されるように、バーコード化した低分子ＲＮＡ  ｃＤＮＡライブラリーを用いて試料のマイクロＲＮＡ発現プロファイルを作製する低分子ＲＮＡシーケンシングおよびアノテーションである。
【０１６３】
シーケンシングによるマイクロＲＮＡの検出には、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）またはＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社およびＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）などの次世代シーケンシングプラットフォームも有用である。ディープシーケンシングは大量並列シーケンシングを用い、所与の試料から何百万もの低分子ＲＮＡ配列リードを得る。
【０１６４】
プローブを用いてマイクロＲＮＡの存在を検出する場合、分析する生物試料を処理して核酸を抽出しなければならない。標的とする核酸は通常、プローブ配列とハイブリッドを形成させるために、少なくとも一部を一本鎖にする必要がある。核酸が一本鎖であれば、変性は必要ない。しかし、プローブする核酸が二本鎖であれば、当該技術分野で公知の任意の方法によって、変性を実施しなければならない。
【０１６５】
分析する核酸とプローブを、プローブ内の標的配列と核酸内の標的配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートする。所望のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、標的とするゲノムの部分中のプローブの特異性などの因子によって決まり、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように、洗浄方法、温度、プローブの長さおよび当該技術分野で公知の他の条件によって変えることができる。
【０１６６】
ハイブリッドの検出には標識プローブを使用するか、あるいはプローブを、標識したリガンドに直接的または間接的に結合させる。適切な標識および標識方法は当該技術分野で公知であり、ビオチン、蛍光、化学発光、酵素、および放射活性を含む。
【０１６７】
このようなプローブを用いるアッセイとしては、ノーザンブロット解析が挙げられる。上記低分子ＲＮＡをゲルから膜に転写した後、ＵＶ架橋および／または膜を焼くことによってＲＮＡを膜に固定する。マイクロＲＮＡ分子は分子量が小さく、存在量が少ないため、マイクロＲＮＡの検出には感度を高めたオリゴヌクレオチドプローブの使用が必須である。ノーザンブロットプローブの、関連するマイクロＲＮＡ同士を識別する能力は、配列相同性のレベルおよび塩基ミスマッチ（１つまたは複数）の位置によって決まる。塩基ミスマッチがマイクロＲＮＡ配列の長さ全体にわたって分布している場合、プローブに特異性を付与するには３−ｂｐのミスマッチで十分である。
【０１６８】
マイクロＲＮＡのスクリーニングにドットブロットハイブリダイゼーションを用いることもできる。ＡＤまたはＴＰＤが疑われる対象からＲＮＡを含む核酸を採取し、変性させ、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上にスポットし、乾燥させる。標識した一本鎖プローブ配列の溶液に膜を曝し、十分に時間をかけてプローブと標的とのヘテロ二本鎖を形成させた後、プローブ溶液を除去して膜を洗浄し、乾燥させてオートラジオグラフィーのフィルムに感光させる。陽性スポットは対象のＲＮＡに標的配列があることを示し、スポットがなければ、対象のＲＮＡに標的配列がないことを示す。
【０１６９】
プローブを使用するマイクロＲＮＡの検出にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を用いることもできる。ＩＳＨはＲＮＡの分離も電気泳動分離も必要としない。プローブのハイブリダイゼーションは細胞または組織内で起こる。ＩＳＨでは、方法全体を通じて細胞の構造が維持されるため、組織試料内のｍＲＮＡの局在に関する情報が得られる。
【０１７０】
ＩＳＨは、試料を中性緩衝ホルマリンで固定し、組織をパラフィンで包埋することによって実施する。次いで、試料を薄片にスライスし、顕微鏡スライドに載せる（あるいは、組織を凍結して薄切し、パラホルムアルデヒドで後固定してもよい）。一連の洗浄により切片を脱ろうおよび再水和した後、プロテイナーゼＫ消化を実施してプローブの接近可能性を増大させ、次いで、標識プローブを試料切片にハイブリダイズさせる。放射性標識プローブはスライド上で乾燥させた液膜で可視化され、一方で非同位体標識プローブは比色試薬または蛍光試薬で簡便に検出される。
【０１７１】
マイクロＲＮＡの検出にヌクレアーゼ保護アッセイを用いることもできる。このアッセイは（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびＳＩヌクレアーゼアッセイをともに含む）、特異的マイクロＲＮＡを検出し定量化するのに極めて感度の高い方法である。ヌクレアーゼ保護アッセイの土台となるのは、アンチセンスプローブ（放射性標識されたまたは非同位体性）のＲＮＡ試料への溶液ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない一本鎖のプローブおよびＲＮＡをヌクレアーゼによって分解する。残りの保護されたフラグメントをアクリルアミドゲルで分離する。溶液ハイブリダイゼーションは通常、膜ベースのハイブリダイゼーションよりも効率が高く、１００μｇまでの試料ＲＮＡに適応可能であるのに対して、ブロットハイブリダイゼーションでは最大２０〜３０μｇである。
【０１７２】
マイクロＲＮＡのスクリーニングにＲＮＡマイクロアレイを用いることもできる。用いられる表面は多孔質膜ではなくガラスであり、逆ドットブロット法と同様に、ＲＮＡマイクロアレイ技術では、逆核酸ハイブリダイゼーション法を用いる。つまり、プローブは固体支持体（ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのアレイ）に固定した未標識ＤＮＡからなり、標的は標識されて溶液中にある。
【０１７３】
マイクロアレイ解析は、多数のマイクロＲＮＡを同時に解析することを可能にし、広範囲にわたる定められたマイクロＲＮＡの存在および／または調節を検出するのに用いることができる。ＲＮＡを抽出した後、成熟マイクロＲＮＡを、通常Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いてマイクロＲＮＡの３’末端にフルオロフォアで標識したヌクレオチドを１つまたは２つ付加することによって、直接標識できる。
【０１７４】
マイクロアレイ技術はまた、標的ＲＮＡの、通常、長さが約７〜８ヌクレオチドの既知の配列を有する一連のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にすることによって、ＲＮＡシーケンシングに代わる方法を可能にする。ハイブリダイゼーション条件が特異的であれば、ハイブリダイゼーションによってどのオリゴヌクレオチドが陽性であるかを検査し、その結果をコンピュータに入力し、プログラムを用いて配列の重複部分を検索して、必要なＤＮＡ配列を確立することが可能である。ＲＮＡマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる大規模なシーケンシングを可能にした。
【０１７５】
試料中にマイクロＲＮＡが存在するかどうかを判定するのによく用いられる別の好ましい技術は、リアルタイムＰＣＲの使用である。リアルタイムＰＣＲは実施例１３に例示される。
【０１７６】
マイクロＲＮＡリアルタイム反応では、最初にＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。マイクロＲＮＡの長さに制限があること（約２２ｎｔ）、配列にポリ（Ａ）テールのような共通の特徴がないこと、および成熟マイクロＲＮＡの配列がプリ−マイクロＲＮＡおよびプレ−マイクロＲＮＡ転写産物にも存在することが適切な逆転写に関するいくつかの課題をもたらしている。しかし、現在まで、逆転写には主として２つの異なる方法、すなわち、マイクロＲＮＡ特異的逆転写またはユニバーサル逆転写が用いられている。第一の方法では、ステムループ特異的逆転写プライマーを用いることによって、マイクロＲＮＡを個別に逆転写する。ステムループプライマーは、マイクロＲＮＡの３’末端の既知の配列に相補的な短い一本鎖領域、二本鎖部分（ステム）、およびユニバーサルプライマー結合配列を含むループを有するよう設計される。次いで、得られたｃＤＮＡを、１つのマイクロＲＮＡ特異的プライマーと第二のユニバーサルプライマーとを用いる定量的（ｑ）ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の鋳型として用いる。ステムループプライマーの設計はより困難であるが、その構造によりプライマーのプレ−マイクロＲＮＡおよびプリ−マイクロＲＮＡへのアニーリングが減少し、これによりアッセイの特異性が増大する。この技術は実施例３に例示される。
【０１７７】
第二の方法では、最初に全マイクロＲＮＡに共通の配列でテールを付加し、次いで、ユニバーサルプライマーを用いることによってマイクロＲＮＡを逆転写する。この方法は広く用いられており、特に、少量の出発材料から複数の異なるマイクロＲＮＡを解析する必要がある場合に有用である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ｍｉＲＣＵＲＹ、Ｅｘｉｑｏｎ社）を用いて、全マイクロＲＮＡの３’末端をポリ（Ａ）テールで伸長する。次いで、５’末端にユニバーサルプライマー結合配列を有するオリゴ（ｄＴ）配列からなるプライマーを用いて逆転写を開始し、ｑＰＣＲ反応で標的配列を増幅する。マイクロＲＮＡとオリゴ（ｄＴ）プライマーのユニバーサル配列との間にある「ｄＴ」伸長部分は、プライマーの５’末端にあってプライマーをマイクロＲＮＡの３’末端に固定する鋳型結合配列を用いることによって定められる。
【０１７８】
マイクロＲＮＡの検出に用いることができる別の新しい技術で、「光学液体スタンピング（ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｔａｍｐｉｎｇ）」と呼ばれるものは、感光性の液体に微粒子構造を刻み込むことによって機能する。得られた三次元ヒドロゲル粒子は、固有の「バーコード」でコードされており、多数の試料でマイクロＲＮＡを検出するのに用いることができる。このような粒子は、実質的にあらゆるフローサイトメータで読み取れるように特注設計される。この技術を用いた市販の製品では、ＦｉｒｅＰｌｅｘ  ｍｉＲＳｅｌｅｃｔが入手可能である。
【０１７９】
キット
本明細書に開示される診断アッセイおよびスクリーニングアッセイはいずれも、健康管理提供者および／または診断研究所によって使用されるキットの形態であってもよいことが企図される。
【０１８０】
ｍｉＲＮＡに基づく診断アッセイおよびスクリーニングアッセイは、例えば、ｍｉＲ−２１９と命名されるｍｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１８１−ｄと命名されるｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡのプローブ、生体組織または体液から核酸を単離および精製するための試薬、単離および精製した核酸にアッセイを実施するための試薬、使用説明書を含み、ｍｉＲＮＡを検出するためのキットには比較配列が含まれ得る。上記キットはまた、ＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲに特異的なプライマーを含み得る。
【０１８１】
薬剤スクリーニングおよび研究ツール
本発明のさらなる実施形態は、マイクロＲＮＡおよびタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するその結合部位の使用ならびにタウオパチー、特にアルツハイマー病および濃縮体優位型認知症の有望な治療剤をスクリーニングする方法として本明細書に記載される方法である。
【０１８２】
一実施形態では、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含むＤＮＡまたはｍＲＮＡを、より具体的には、マイクロＲＮＡが結合してタウを調節する保存された領域を、より具体的には、ｍｉＲ−２１９−５ｐが結合する領域を使用する。
【０１８３】
ＡＤおよび／またはＴＰＤを含むタウオパチーの有望な治療剤をスクリーニングするこのアッセイでは、薬剤をＤＮＡまたはＲＮＡと上記のように接触させ、当該技術分野で公知の方法によって、ＤＮＡまたはＲＮＡと薬剤との間の複合体を検出する。このような方法の１つは、ＤＮＡまたはＲＮＡを標識し、次いで、薬剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡから遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを分離することである。薬剤がＤＮＡまたはＲＮＡと結合すれば、その薬剤はＡＤおよび／またはＴＰＤ、または他のタウオパチーの有望な治療剤であると考えられる。
【０１８４】
さらに、本明細書に記載される方法により、配列番号９、１０、１３、および１４のヌクレオチド配列を含むプライマーなどのプライマーを用いてタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲを増幅し、本明細書に記載されるいずれかのベクター中にクローン化できる。３’ＵＴＲとベクターの組換え構築物はまた、３’ＵＴＲの発現を測定する手段、例えばレポーター構築物などを有し得る。このような構築物としては、特に限定されないが、実施例４に例示される構築物、二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターが挙げられる。３’ＵＴＲはまた、実施例５に例示されるように、タウなどの測定可能な表現型を有する別の遺伝子に連結できる。
【０１８５】
上記組換え構築物は、本明細書に記載される方法によって、本明細書に記載される任意の宿主細胞中にトランスフェクトできる。宿主細胞としては、特に限定されないが、神経芽腫細胞および海馬細胞が挙げられる。
【０１８６】
次いで、組換え構築物を有する宿主細胞をＡＤおよび／またはＴＰＤの治療剤のスクリーニングに使用できる。この実施形態では、薬剤と接触させる前に、連結した遺伝子の発現によって３’ＵＴＲの発現を測定する。次いで、形質転換した宿主細胞を薬剤と接触させ、３’ＵＴＲと連結した遺伝子の発現が減少すれば、その薬剤は３’ＵＴＲに結合して発現を阻止しており、ＡＤおよび／またはＴＰＤの有望な治療剤であると考えられる。
【０１８７】
この方法では、組換え構築物中の３’ＵＴＲのＤＮＡまたはＲＮＡを変異させて、ｍｉＲ−２１９−５ｐまたはタウの３’ＵＴＲを標的とすることがわかっている別のｍｉＲＮＡの保存された結合部位を欠失させ、薬剤スクリーニングアッセイに使用することもできる。全３’ＵＴＲを有する組換え構築物の発現を減少させた薬剤と接触させた後に、連結した遺伝子の発現が減少しなければ、その薬剤は、ｍｉＲ−２１９−５ｐの保存された結合部位で３’ＵＴＲに結合すると考えられる。この結合がタウの発現を減少させることが本明細書で示されていることから、ＭＡＰＴ遺伝子の３’ＵＴＲのこの部位に結合する薬剤はいずれも、タウの過剰発現による疾患および障害の治療剤であると考えられる。
【０１８８】
構築物および形質転換した宿主細胞はいずれも、ＡＤ、ＴＰＤ、および他のタウオパチーに関連する基礎研究にも使用できる。例えば、上記構築物および細胞を用いて、Αβペプチドまたはニューロン増殖因子などの天然の物質がタウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに及ぼす効果を測定できる。
【０１８９】
上記遺伝子構築物および上記遺伝子構築物で形質転換した宿主細胞は、研究ツールおよび治療剤を試験するトランスジェニック動物の土台にもなり得る。このような動物としては、特に限定されないが、ヌードマウスおよびショウジョウバエが挙げられる。表現型は遺伝子と関連づけられ、遺伝子が動物に及ぼす影響および可能性のある治療剤の投与または接触後の表現型の変化を決定するために観察され得る。
【０１９０】
さらに、タウＭＡＰＴ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを過剰発現または過小発現する宿主細胞および動物も本発明によって企図され、治療剤のスクリーニングおよび基礎研究の両方に有用である。このことは、ｍｉＲ−２１９を過剰発現するキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を用いた実施例７に例示される。これらのハエは、その対照ハエと比較すると、翅の表現型が異なっており、負の走地性アッセイによって示されるように、飛翔筋が弱い。被験薬剤をこれらのハエに投与するか、これらと接触させて、表現型を決定できる。さらに、被験薬剤を対照ハエに投与することが可能であり、その表現型がｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエに近くなれば、すなわち、よじ登る高さが低くなり、かつ／またはｗｉｎｇｓ  ｕｐ表現型がみられれば、被験薬剤は、タウ遺伝子に由来するタウｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡを増加させると考えるられ、ＡＤおよびＴＰＤを含むタウオパチーの有望な治療剤となる。
【０１９１】
同定可能な表現型を有し、タウを過剰発現する動物、例えば実施例１０に例示されるｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型を有するトランスジェニックハエなども治療剤および予防剤のスクリーニングならびに基礎研究に用いることができる。実施例に示されるように、ｍｉＲ−２１９は、タウ毒性と関連するこの表現型を救済した。
【実施例】
【０１９２】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろうが、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を一層十全に説明するために記載されるものである。これらは、広範囲に及ぶ本発明の範囲を一切限定するものではないと解釈されるべきである。
【０１９３】
実施例１−アルツハイマー病、濃縮体優位型認知症および対照の死後の脳におけるマイクロＲＮＡ発現
材料および方法
匿名化した新鮮凍結ヒト凍結剖検脳組織（表１）の前頭皮質（ブロードマン９野）をコロンビア大学のニューヨークブレインバンク、ケンタッキー大学（レキシントン、ケンタッキー州、米国）、カリフォルニア大学サンディエゴ校（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、バナー・サン保健研究所（サンシティ、アリゾナ州、米国）およびワシントン大学（シアトル、ワシントン州、米国）から入手し、患者試料とした。
【０１９４】
新鮮凍結脳組織を液体窒素中で微粉砕し、ＱＩＡｚｏｌで溶解し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムを用いてホモジナイズすることによって、ＲＮＡの単離物を得た。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ試料の一部をＴＲＩｚｏｌを用いて精製し、ほぼ同じ結果が得られた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州）。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙキットを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステムおよびＮａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）でＲＮＡを評価した。
【０１９５】
バーコード化した低分子ＲＮＡ  ｃＤＮＡライブラリーを用いて低分子ＲＮＡシーケンシングおよびアノテーションを実施し、これに続くプールしたライブラリーの調製段階を、Ｈａｆｎｅｒら（２０１１）に既に記載されているように新鮮凍結抽出ＲＮＡから実施した。２回のバーコード化シーケンシングでマイクロＲＮＡ発現プロファイルを作成した。コンピュータパイプラインを用いて、バーコードを抽出し、ゲノム（ｈｇ１９）に対して整列させ、リードに低分子ＲＮＡアノテーションを付与した。マイクロＲＮＡの存在量を最大２つのアノテーションミスマッチを有する全リードの合計として求め、正規化したリード頻度として表した。マイクロＲＮＡアノテーションには精選された定義を用いた。Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒの統計的枠組み（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎら（２００４）；ＡｎｄｅｒｓおよびＨｕｂｅｒ（２０１０））内でヒートマップ作成およびデータ分析を実施した。
【０１９６】
結果
Ｈａｆｎｅｒら（２０１１）に記載される確立された低分子ＲＮＡシーケンシングプロトコルを用いて、アルツハイマー病（ＡＤ、ｎ＝６）、濃縮体優位型認知症（ＴＰＤ、ｎ＝３）、および対照（ｎ＝７）（表１に示される）でのマイクロＲＮＡ発現をプロファイルした。各試料につき平均約１２９０万の配列リード（範囲＝３８０万〜４７２０万）が得られた（表２）。回帰分析から、正規化したリード数の間に強い相関があることが明らかになり（平均ｒ２＝０．８８、範囲＝０．７６〜０．９６）、全ての低分子ＲＮＡクラスは、類似したリードの分布を示した（図１ＡおよびＢ）。全対象で、リードにはマイクロＲＮＡが極めて濃縮されており、リードの約８６％は既知のマイクロＲＮＡに位置付けられ、残りのリードは、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｐｉＲＮＡを含むその他の非コード低分子ＲＮＡに位置付けられた（表２）。
【０１９７】
マイクロＲＮＡシグネチャーを作成するため、正規化したＡＤ、ＴＰＤおよび対照のリード頻度を比較した（図２Ａ）。有意度によって並べたところ、２５種類のマイクロＲＮＡでＡＤ、ＴＰＤおよび対照の間に差が認められた（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ、未補正、図２Ｂ）。差が認められるマイクロＲＮＡが、ＴＰＤと対照との間では１１種類、ＡＤと対照との間では２０種類、ＴＰＤとＡＤとの間では６種類同定された。同定されたマイクロＲＮＡのうち、脳に特異的であることがわかっているのはｍｉｒ−２１９−１およびｍｉｒ−２１９−２前駆体に由来するマイクロＲＮＡのみである（Ｓｅｍｐｅｒｅら（２００４））。特に、ニューロンのｍｉｒ−１２４には差がなく、観察された差がニューロン喪失によるものではないことが示唆される。
【０１９８】
【表１】
2016523980.tif 000003
【０１９９】
【表２】
2016523980.tif 000004
ＡＤ＝アルツハイマー病；ＴＰＤ＝濃縮体優位型認知症；その他のＲＮＡ＝ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ
【０２００】
実施例２−ＭＡＰＴ標的化の予測
材料および方法
現在、予測精度を改善してマイクロＲＮＡの生物学的機能を解明するのに最適な枠組みを作るためには、コンピュータを用いる様々な方法の統合が一般的な方法である（ＺｈａｎｇおよびＶｅｒｂｅｃｋ（２０１０））。利用可能なプログラムのうち、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２００９）；Ｌｅｗｉｓら（２００５）；Ｇｒｉｍｓｏｎら（２００７）；Ｇａｒｃｉａら（２０１１））およびｍｉＲＢａｓｅ（ＫｏｚｏｍａｒａおよびＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ（２０１１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら（２００８）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら（２００６）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ（２００４））を選択した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、多数の種にわたって保存されている結合部位とのシードおよび配列相補性に関する十分に確立されたアルゴリズムであり、標的検証において最も精度の高い予測をもたらすことが示されている（Ｂａｅｋら（２００８）；Ｓｅｌｂａｃｈら（２００８））。
【０２０１】
ＴａｒｇｅｔＳｃａｎを用いて、タウｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲを結合することが予測される候補マイクロＲＮＡを同定した（表３）。またＴａｒｇｅｔＳｃａｎを用いて、脊椎動物（表４）および哺乳動物（表５）で広く保存されているマイクロＲＮＡファミリーならびにその他の微小管関連タンパク質の一部を結合できるマイクロＲＮＡファミリー（表６）を同定した。
【０２０２】
結果
タウｍＲＮＡを標的とすると思われる候補マイクロＲＮＡについて、バイオインフォマティクス法を用いて、実施例１で得られた発現プロファイルを解析した。検出された全マイクロＲＮＡのうち、９．６１％は脳特異的であると考えられ（Ｓｅｍｐｅｒｅら（２００４））、１４．１３％はタウを標的とすると予測された。ＡＤ、ＴＰＤおよび対照の間で有意な差が認められるマイクロＲＮＡのうち、６種類がタウを標的とすると予測された（表３）。このうち、ｍｉＲ−２１９−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄの２種類はともに、タウ３’ＵＴＲ内に脊椎動物で広く保存されている予測認識エレメントを有する。ｍｉＲ−１８１ｄは対照に比してＡＤおよびＴＰＤで増加していた。これに対して、ｍｉＲ−２１９−５ｐは対照に比してＡＤおよびＴＰＤで減少していた。
【０２０３】
ｍｉｒ−２１９−１およびｍｉｒ−２１９−２と命名される２種類の前駆体は、それぞれ第６染色体および第９染色体上の別個の遺伝子から生じるが、同じ成熟ｍｉＲ−２１９−５ｐを生じ得る。得られたプロファイルでは、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐはごくわずかなレベルでしか得られず、ｍｉｒ−２１９−２前駆体にみられる差は、観察されたｍｉＲ−２１９−５ｐの変化に寄与することが示唆された（表７）。
【０２０４】
成熟ｍｉＲ−２１９−５ｐの配列は高度に保存されており、タウを標的にすると予測されないｍｉＲ−２１９−２−３ｐとは異なっていた。これに対して、他の代表的な微小管関連タンパク質の３’ＵＴＲにはｍｉＲ−２１９−５ｐファミリー（ｍｉＲ−２１９−５／５０８／５０８−３ｐ／４７８２−３ｐ）の認識エレメントは含まれていなかったが、ＭＡＰ１ａ、ＭＡＰ１ｂおよびＭＡＰ２の３’ＵＴＲには高度に保存されたｍｉＲ−１８１認識エレメントがみられ、ｍｉＲ−２１９−５ｐにはＭＡＰＴ由来転写産物に対する相対的選択性があることが示唆された（表６）。したがって、ｍｉＲ−２１９−５ｐは、ＡＤおよびＴＰＤの脳でダウンレギュレートされることが観察されたタウを標的とすると予測される、唯一の高度に保存されたマイクロＲＮＡである。
【０２０５】
【表３】
2016523980.tif 000005
ＴＰＤ、ＡＤおよび対照の間で異なりＭＡＰＴを標的とすると予測されるヒト脳マイクロＲＮＡ
【０２０６】
【表４】
2016523980.tif 000006
2016523980.tif 000007
2016523980.tif 000008
【０２０７】
【表５】
2016523980.tif 000009
2016523980.tif 000010
【０２０８】
【表６】
2016523980.tif 000011
【０２０９】
【表７】
2016523980.tif 000012
【０２１０】
実施例３−ＡＤ、ＴＰＤ、および対照の死後の脳におけるマイクロＲＮＡ−２１９−５ｐの差次的発現の検証
材料および方法
ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイを用いて、ＡＤ（ｎ＝７）、ＴＰＤ（ｎ＝１９）および対照（ｎ＝２０）のｍｉＲ−２１９−５ｐレベルを測定し（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ社／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバッド、カリフォルニア州）、実施例２の観察結果を検証した。
【０２１１】
特異的ステムループ逆転写プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて全ＲＮＡ  １００ｎｇを逆転写し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ハンブルク、ドイツ）でＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイによりｍｉＲ−２１９−５ｐレベルを測定した。比較ＣＴ法を用いた正規化の内在性対照としてＵ２４／ＳＮＯＲＤ２４およびＺ３０／ＳＮＯＲＤ７のレベルを用いた。
【０２１２】
結果
ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡを用いて、実施例２に記載される観察結果を検証したところ、ＡＤ試料およびＴＰＤ試料のいずれにおいても、認知障害のない対照に比してｍｉＲ−２１９−５ｐの有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）がみられた（図３）。以上の結果をまとめると、ＡＤおよびＴＰＤでは対照に比してｍｉＲ−２１９−５ｐ発現が減少することが確認される。
【０２１３】
実施例４−マイクロＲＮＡによるタウ発現の調節
材料および方法
次に挙げるプライマー：
Ｆ：５’−ＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣ  ＧＡＴＣＧＣＴＣＧＡ  ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＴ  ＴＴＧＴＧＡＴＣＡＧ  Ｇ−３’（配列番号９）および
Ｒ：５’−ＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣ  ＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＧＧＴＧＣＧＴ  ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＣ  ＴＴＡ−３’（配列番号１０）
を用いて、対照対象（ホモ接合型ＭＡＰＴＨ１）由来のゲノムＤＮＡから完全長ヒトＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲを増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローン化キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社／Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて、二重ルシフェラーゼレポーターｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）のＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にクローン化した。この定量化システムは、第一のウミシイタケルシフェラーゼレポーターと正規化のための第二のホタルルシフェラーゼレポーターの発現カセットを用い、トランスフェクション効率および細胞死を照合する。
【０２１４】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを用いて作製したプライマー：
ｍｉＲ−２１９部位＿Ｆ：
５’−ＣＡＣＧＣＴＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣ−３’；および
ｍｉＲ−２１９部位＿Ｒ：（配列番号１１）
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＣＣＣＴＣＡＴＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＡＧ  ＣＧＴＧ−３’（配列番号１２）
を使用してＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、サンタ・クララ、カリフォルニア州）を用いることにより、ｍｉＲ−２１９−５ｐ認識エレメントに部位特異的変異を誘発した。
【０２１５】
サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ社、サウス・プレインフィールド、ニュージャージー州）により全配列を検証した。
【０２１６】
トランスフェクションの２４時間前に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を１ウェル当たり細胞８×１０４個の密度で播種した（２４ウェルプレート中）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を製造業者のプロトコルの通りに使用して、ＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポーター構築物を、マイクロＲＮＡ  ｍｉｒＶａｎａ模倣物（Ａｍｂｉｏｎ社）と共トランスフェクトした。示される実験には、変異させたｍｉＲ−２１９−５ｐ結合部位ＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲベクターを対照として含めた。トランスフェクションの４８時間後に、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定した。個々の条件について統計的に有意なデータを得るため、トランスフェクションアッセイを少なくとも６回実施した。
【０２１７】
結果
ｍｉＲ−２１９−５ｐがｉｎ  ｖｉｔｒｏでタウ発現を抑制できるかどうかを明らかにするため、完全長ヒトタウ３’ＵＴＲを二重ルシフェラーゼレポーター構築物のウミシイタケルシフェラーゼの下流に挿入し、この構築物を、タウを標的とすると予測される３種類のマイクロＲＮＡ模倣物（すなわち、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ）およびタウを標的にすると予測されないマイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−２１７）とともに、ヒト神経芽腫細胞系（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）中に一過性に共トランスフェクトした。
【０２１８】
ｍｉＲ−２１９−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄはともに、タウ３’ＵＴＲに高度に保存された結合部位を１つ有するのに対して、ｍｉＲ−４８５−５ｐは保存度の低い結合部位を６つ有する。ｍｉＲ−２１９−５ｐ（ｐ＝０．０３６２）、ｍｉＲ−４８５−５ｐ（ｐ＝０．０１１５）およびｍｉＲ−１８１ｄ（ｐ＝０．０００９）はいずれも、モックトランスフェクションに比してルシフェラーゼ活性を有意に低下させることができるが、ｍｉＲ−２１７はできないことがわかった（図４Ａ）。
【０２１９】
さらに、ヒトタウ３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーターベクターにおけるｍｉＲ−２１９−５ｐ認識エレメントの変異は、抑制効果を無効にする（図４Ｂ）。以上の観察結果は、ｍｉＲ−２１９−５ｐによるタウ発現の抑制が、タウ３’ＵＴＲに予測され高度に保存される認識エレメントとの直接相互作用を介することを示している。
【０２２０】
実施例５−ｍｉＲ−２１９−５ｐは初代海馬ニューロン培養物におけるタウ発現を調節した
材料および方法
ヒトＭＡＰＴの完全長３’ＵＴＲもまたレンチウイルスルシフェラーゼ移入ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｌｕｃ−ＵＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）にクローン化した。
【０２２１】
次に挙げるプライマー：
Ｌｅｎｔｉ−ＭＡＰＴ３’ＵＴＲ−ＥｃｏＲＩ＿Ｆ：
５’−ＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）；および
ＬｅｎｔｉＭＡＰＴ３’ＵＴＲ−ＢａｍＨＩＪ＿Ｒ：
５’−ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＧＧＧＡＡＡＧＡＡ  ＣＴＴＡ−３’（配列番号１４）
を用いて、上記の同じ対照個人由来のゲノムＤＮＡを増幅し、ｐＬｅｎｔｉ−ＵＴＲ−ＬｕｃベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。レンチウイルスベクターｐＥＺＸ−ＭＲ０３（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社、ロックビル、メリーランド州）を用いて、ヒトｍｉｒ−２１９前駆体およびスクランブルマイクロＲＮＡ対照を作製した。ｍｉＲ−２１前駆体またはスクランブル対照とｌｅｎｔｉ−ＬｕｃＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲとを含むレンチウイルス移入ベクターのレンチウイルスへのパッケージングおよびストック作製を、ＦｏｌｌｅｎｚｉおよびＮａｌｄｉｎｉ（２００２）によって記載されている通りに実施した。
【０２２２】
ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定かつ構成的に発現し、最適なレンチウイルス産生を容易にするヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞系を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）をＣＯ２５％および空気９５％、３７℃の加湿雰囲気下で、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）のいずれかで増殖させた。Ｇｌｏｂａｌ  ＵｌｔｒａＲａｐｉｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、レンチウイルスストックの力価測定を実施した。
【０２２３】
雌雄の仔ラットの初代ラット海馬培養物を、Ｂｒｅｗｅｒら（１９９３）によって記載されている通りに作製した。海馬培養物を、Ｂ２７サプリメントおよびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）でコートしたディッシュに２．５×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで約１４〜２１日経過した後に培養物を使用した。
【０２２４】
初代海馬培養物をｍｉＲ−２１９前駆体またはスクランブル対照のいずれかと、ｌｅｎｔｉ−ＬｕｃＭＡＰＴ  ３’ＵＴＲとを含むベクターで共形質導入した。
【０２２５】
７２時間または９６時間後、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０２２６】
結果
神経芽腫細胞での観察結果が非腫瘍性ニューロンでも有効であるかどうかが明らかでなかったため、この結果をラット初代海馬ニューロン培養物で再現した。ｍｉＲ−２１９−５ｐ認識エレメントとヒトタウ３’ＵＴＲとの間の相互作用は高度に保存されていることから、この細胞モデルの使用は妥当である。
【０２２７】
上記培養物を全タウ３’ＵＴＲと、ｍｉＲ−２１９−５ｐまたはスクランブル対照のいずれかとを含むレンチウイルス構築物で共形質導入した。７２時間後、ｍｉＲ−２１９−５ｐ発現が６倍に増加しているのが観察された（図５Ｄ）。海馬培養物にｍｉＲ−２１９−５ｐとタウ３’ＵＴＲのレンチウイルス構築物を共形質導入した場合、３’ＵＴＲ活性の有意な低下が観察される。スクランブル対照のマイクロＲＮＡレンチウイルスでは差はみられなかった（図６Ａ）。レンチウイルスｍｉＲ−２１９−５ｐを形質導入すると、内因性タウタンパク質も有意に減少するが、スクランブル対照では減少しない（図６Ｂ）。リアルタイムＱＰＣＲ発現解析では、レンチウイルスｍｉＲ−２１−５ｐを形質導入した培養物にもスクランブル対照を形質導入した培養物にも、タウｍＲＮＡレベルに有意な差はみられず、ｍｉＲ−２１９−５ｐの作用機序はタンパク質翻訳を抑制することであると示唆される（図６Ｃ）。
【０２２８】
実施例６−ｍｉＲ−２１９によりＮＧＦ誘導性タウ発現および神経突起伸長が減少した
材料および方法
ＰＣ１２細胞または初代海馬ニューロンを４．０％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社／Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、イリノイ州）で固定し、ＰＢＳ中にて０．４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で透過処理し、ＴＢＳ中にてＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ロックフォード、イリノイ州）でブロックし、ＭＡＰ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、ダンバーズ、マサチューセッツ州）またはＴａｕＣ抗血清（ＤＡＫＯ社、グロストルプ、デンマーク）中にて一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とコンジュゲートした抗マウス二次抗血清コンジュゲートを用いた。
【０２２９】
４０×１．３ＮＡおよび１００×１．４ＮＡ油浸対物レンズを備えたＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡，ならびにＺｅｉｓｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１またはＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）のいずれかを用いて、標識したＰＣ１２細胞またはニューロンの画像を撮影した。走査にはアルゴンレーザーの２本の励起線（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８には４８８ｎｍ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８には５６８ｎｍ）を用いた。共焦点画像では、Ｚスタックを１．０μｍ間隔で収集した後、単一の画像に圧縮し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェア（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよびＶｏｌｏｃｉｔｙ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて解析した。ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ蛍光イメージングにはＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ４．８．２を使用した。
【０２３０】
ＰＣ１２細胞を、ＧｒｅｅｎｅおよびＴｉｓｃｈｌｅｒ（１９７６）ならびにＧｒａｕおよびＧｒｅｅｎｅ（２０１２）によって既に記載されている通りに、コラーゲンでコートしたディッシュで、１０％熱不活化ウマ血清および５％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。ＰＣ１２のニューロン分化培地は、ＮＧＦ（１ｍＬ当たりヒト組換えタンパク質１００ｎｇ）および１％加熱不活性化ドナーウマ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を含有する。
【０２３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより全タンパク質を分離して標準的な方法を用いてトランスブロットすることによって、イムノブロッティングを実施した。ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）をＴａｕＣ（ＤＡＫＯ社、グロストルプ、デンマーク）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）および二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）とインキュベートし、ＥＣＬキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビルリカ、マサチューセッツ州）およびＢｉｏｍａｘ  Ｌｉｇｈｔフィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、化学発光により可視化させた。
【０２３２】
結果
マイクロＲＮＡがタウ発現を調節することが可能であることが明らかになったため、マイクロＲＮＡが生理的状況下でタウを調節できるかどうかを検討した。これまでの研究では、神経成長因子（ＮＧＦ）に曝露した後にタウタンパク質がＰＣ１２細胞での神経突起伸長に何らかの機能的役割を果たすことが明らかにされている（Ｄｒｕｂｉｎら（１９８５）；Ｄｒｕｂｉｎら（１９８８））。
【０２３３】
ＰＣ１２細胞にＮＧＦを添加したところ、神経突起伸長を伴ったニューロン様細胞への分化が誘導され、同時にタウのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルが増大した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０２３４】
興味深いことに、ＮＧＦは３日目にｍｉＲ−２１９−５ｐの一過性の減少も引き起こすが、この減少は、７日目に細胞が完全に分化するとベースラインに戻ることが見出された（図７Ｃ）。
【０２３５】
ｍｉＲ−２１９−５ｐのこれらの変化がタウ仲介性の神経突起伸長に何らかの直接的役割を果たすかどうかを明らかにするため、ＮＧＦに曝露したＰＣ１２細胞でｍｉＲ−２１９−５ｐを過剰発現させた。ＱＰＣＲによりｍｉＲ−２１９−５ｐの過剰発現が確認された（図７Ｄ）。ＮＧＦ処置したＰＣ１２細胞での免疫ブロットおよびＱＰＣＲ解析から、ｍｉＲ−２１９−５ｐのレンチウイルス過剰発現がタウｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下させることが示された（図７Ｅおよび７Ｆ）。ｍｉＲ−２１９−５ｐ処置により、タウｍＲＮＡレベルの約３５％の低下が観察され、また、タウタンパク質レベルの約７５％の低下も観察された。
【０２３６】
ＮＧＦ処置したＰＣ１２細胞でのタウを認識する抗血清を用いた免疫蛍光顕微鏡法では、ＮＧＦ処置により神経突起伸長が起こることが確認された（図７Ｇおよび７Ｈ）。レンチウイルスｍｉＲ−２１９−５ｐおよびＧＦＰレポーターを形質導入した細胞では、未感染細胞に比してタウ陽性突起が伸長しない細胞がみられた（図７Ｉ〜７Ｋ）。以上の結果は、タウ仲介性の神経突起伸長に対するＮＧＦの作用は、ｍｉＲ−２１９−５ｐが転写後レベルでタウ発現に直接影響を及ぼすことによって調節されることを示唆している。マージ画像によって示されるように、タウに対する抗血清を用いた免疫蛍光共焦点顕微鏡法によって観察されるｍｉＲ−２１９−５ｐおよびＧＦＰレポーターの過剰発現は、神経突起伸長の停止を示した。ｍｉＲ−２１９−５ｐ構築物で形質導入されない細胞は神経突起を形成する能力を維持したことに留意されたい。
【０２３７】
実施例７−ショウジョウバエタウ３’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ認識エレメント
材料および方法
実施例２に記載されるＴａｒｇｅｔＳｃａｎをショウジョウバエゲノムに用いた。
【０２３８】
結果
ショウジョウバエゲノムを検討したところ、タウ遺伝子には、以前に不完全な注釈が付けられた１４３９塩基対にわたる３’ＵＴＲ領域があり、表８に示されるようにｍｉＲ−２１９認識エレメントが1つ含まれていることが明らかになった。
【０２３９】
【表８】
2016523980.tif 000013
【０２４０】
実施例８−キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるｍｉＲ−２１９の過剰発現がニューロン機能不全およびタウ発現減少を引き起こす
材料および方法
完全長ｍｉＲ−２１９マイクロＲＮＡを発現するキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）をブルーミントンストックセンターから入手した。これらのハエは汎ニューロンＥＬＡＶドライバーにおいてｍｉＲ−２１９を発現する。
【０２４１】
対照ハエとマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−３４を過剰発現するハエの表現型を視覚的に比較検討した。これらのハエを、負の走地性またはよじ登りアッセイにも供した。
【０２４２】
ショウジョウバエのイムノブロッティング
成体ショウジョウバエをＨａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＆  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加したＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎ−ＰＥＲ）中でホモジナイズした。溶解物を氷上で１０分間インキュベートし、４℃で１５分間、１３，０００×ｇで遠心分離した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質濃度を測定した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロットにより分析した。ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を抗ショウジョウバエタウ抗体（英国のＮｉｃｋ  Ｌｏｗｅ博士の厚意により寄贈されたもの）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）および二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とインキュベートし、ＥＣＬキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビルリカ、マサチューセッツ州）およびＢｉｏｍａｘ  Ｌｉｇｈｔフィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、化学発光により可視化させた。
【０２４３】
また各グループの代表的なハエの全身、頭部のみ、および胴体のみからのタンパク質抽出物について、Ｎｉｃｋ  Ｌｏｗｅ博士から寄贈されたショウジョウバエタウ（ｄＴａｕ）を標的とする抗血清を用いて、免疫ブロットを実施した。
【０２４４】
結果
図８Ａに示されるように、ｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエは、図８Ｂの対照と比較して、ｗｉｎｇｓ  ｕｐ表現型を有する。
【０２４５】
負の走地性またはよじ登りアッセイを行ったところ、ｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエ（中央のシリンダー）は、対照（左のシリンダー）および、ハエタウ３’ＵＴＲで保存される認識エレメントを含まないｍｉＲ−３４を過剰発現するハエ（右のシリンダー）と同じ高さまでよじ登ることができなかった。図８Ｄも参照されたい。
【０２４６】
この検討結果およびｗｉｎｇｓ  ｕｐ表現型は飛翔筋が弱いことを示した。
【０２４７】
ｍｉＲ−２１９を過剰発現するハエはまた、対照およびｍｉＲ−３４を過剰発現するハエに比してタウ発現が減少していた（図８Ｅ〜８Ｇ）。
【０２４８】
実施例９−キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるｍｉｒ−２１９の過剰発現がタウ発現の低下を引き起こすさらなる証拠
材料および方法
ショウジョウバエ系統
ショウジョウバエｍｉＲ−２１９またはスクランブル対照系（Ｅｒｉｃ  Ｃ．Ｌａｉ氏の厚意により寄贈されたもの）はＵＡＳ−ＤｓＲｅｄ−ｍｉＲＮＡプラスミドコレクションに由来した（Ｂｅｊａｒａｎｏら（２０１２）；Ｓｉｌｖｅｒら（２００７））。このｍｉＲＮＡ挿入物は、プレｍｉＲＮＡヘアピンの両側にそれぞれ隣接する約２００〜２５０ヌクレオチドを含み、ｗ１１１８またはＣａｎｔｏｎ  ＳゲノムＤＮＡから増幅された。
【０２４９】
ショウジョウバエｍｉＲＮＡスポンジ（ｍｉＲ−２１９スポンジ）またはスクランブル対照を作製するため、安定性を増大させるために９位〜１２位にミスマッチを有するｍｉＲＮＡに相補的な１０個の反復配列を、ｐＵＡＳＴ発現ベクター内のＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲに導入した（Ｌｏｙａら（２００９）；ＥｂｅｒｔおよびＳｈａｒｐ（２０１０））。
【０２５０】
ショウジョウバエｐｈｉＣ３１に適合したｐＢＩＤ（ａｔｔＢ、Ｉｎｓｕｌａｔｅｄ、ＤｒｏｓｏｐｈＵａ）と呼ばれる一連のＧＡＬ４−ＵＡＳベクター（Ｗａｎｇら（２０１２））を用いて、対照ＧＡＰＤＨ  ３’ＵＴＲ（２００ｂｐ；ｍｉＲ−２１９結合部位を欠く）またはヒトタウ３’ＵＴＲ（４１６２ｂｐ）のいずれかと融合したルシフェラーゼコード領域を発現する、トランスジェニックルシフェラーゼレポーターショウジョウバエ系を作製した。汎ニューロンｅｌａｖ−ＧＡＬ４ドライバーを用いて導入遺伝子発現を駆動した。ショウジョウバエの交配はいずれも２５℃で維持した。
【０２５１】
Ｂｅｊａｒａｎｏら（２０１２）に従って、ショウジョウバエのニューロンにｍｉＲＮＡ−２１９を過剰発現させた。
【０２５２】
実施例７に記載される通りに免疫ブロットを実施した。
【０２５３】
ショウジョウバエルシフェラーゼレポーターアッセイ
ショウジョウバエルシフェラーゼレポーター系をｍｉＲ−２１９系またはｍｉＲ−２１９スポンジ系のいずれかと交配させた。汎ニューロンｅｌａｖ−ＧＡＬ４ドライバーを用いて導入遺伝子発現を駆動した。ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、プールした成体ショウジョウバエの頭部の溶解物からルシフェラーゼ活性を測定した。ＧＡＰＤＨ  ３’ＵＴＲを有する対照系を正規化に用いた。
【０２５４】
ショウジョウバエの定量的ＰＣＲ
ショウジョウバエの全身から全ＲＮＡを単離した。簡潔に述べると、ハエをＱＩＡｚｏｌ中で溶解し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムを用いてホモジナイズした。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計でＲＮＡ濃度を測定した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社、ロックビル、メリーランド州）を製造業者の説明書の通りに使用して、等量のＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスター、カリフォルニア州）を用いて、ショウジョウバエタウおよび内在性対照ＲｐＬ３２のＱＰＣＲを実施した。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（エッペンドルフ社、ホーポージ、ニューヨーク州）を使用し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェルプレートで、最初の段階を９５℃で１０分、次いで９５℃にて１５秒を４０サイクル、６０℃で１分という条件で、リアルタイムＰＣＲ反応を三重反復で実施した。ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを用いてｍｉＲ−２１９−５ｐレベルを測定した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。特異的ステムループ逆転写プライマー（ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて全ＲＮＡを逆転写し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（エッペンドルフ社）でＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイによりｍｉＲ−２１９−５ｐレベルを測定した。比較ＣＴ法を用いる正規化の内在性対照として、２ｓｒＲＮＡのレベルを用いた。各データポイントは、それぞれ３回の技術的反復からなる少なくとも３回の生物学的反復の結果である。
【０２５５】
結果
免疫ブロットによって示されるように、ハエの脳内にｍｉＲ−２１９を過剰発現させたところ、スクランブルｍｉＲＮＡ対照に比してタウタンパク質レベルの極めて有意な低下（６３．８％；Ｐ＜０．００１）がみられた（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｅ）。
【０２５６】
縦列した多数のｍｉＲ−２１９結合部位を含み、ショウジョウバエニューロンに発現させるとｍｉＲ−２１９レベルを有意に低下させる組換え転写産物であるスポンジ阻害剤を用いて、ｍｉＲ−２１９レベルを低下させた（図９Ｆ）。免疫ブロットによって示されるように、ｍｉＲ−２１９スポンジの発現により、内因性タウタンパク質のレベルが対照に比して有意に低下した（２３．１％；Ｐ＜０．０５）（図９Ａおよび９Ｂ）。定量的ＰＣＲによる測定では、ｍｉＲ−２１９スポンジの過剰発現により、ショウジョウバエタウｍＲＮＡの有意な減少がみられた（２２％；Ｐ＜０．０５）（図９Ｃ）。しかし、ｍｉＲ−２１９の過剰発現後にショウジョウバエタウｍＲＮＡのレベルは変化しなかったことから、ｍＲＮＡレベルおよび翻訳の両方に対する作用が示唆される。
【０２５７】
この解析を拡張し、ｍｉＲ−２１９がまた、ヒトタウ３’ＵＴＲ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節できたことを確認した。ヒトタウ３’ＵＴＲに融合したルシフェラーゼレポーターを発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。ｍｉＲ−２１９の過剰発現は、スクランブル対照に比してヒトタウ３’ＵＴＲ構築物のルシフェラーゼ活性を有意に低下させたことが見出された。これに対して、ｍｉＲ−２１９スポンジ阻害剤はルシフェラーゼ活性を有意に増大させることから、進化的に保存された二方向性のタウ調節機序が確認される（図９Ｄ）。
【０２５８】
実施例１０−ｍｉＲ−２１９によってショウジョウバエ眼球でのヒトタウ毒性が打ち消される
材料および方法
タウの過剰発現によりショウジョウバエに著明なｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型が生じることが複数の研究で示されている（Ｊａｃｋｓｏｎら（２００２）；Ｗｉｔｔｍａｎら（２００１）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００））。ｍｉＲ−２１９がタウ毒性に影響を及ぼすかどうかを明らかにするため、ショウジョウバエの眼球にｍｉＲ−２１９とｈｔａｕ（３’ＵＴＲが無い）を共発現させた。実施例９に記載される一連のｐＢＩＤベクターを用いて、３’ＵＴＲの無いｈｔａｕタンパク質コード領域を発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。交配はトランスジェニックｍｉＲ−２１９ハエ（ブルーミントンストック）、ｍｉＲ−２１９スポンジ阻害剤（実施例９に記載されるもの）またはスクランブルｍｉＲ（Ｖａｎ  Ｖａｃｔｏｒ博士の厚意により寄贈されたもの）で行った。ＧＭＲ−ＧＡＬ４ドライバーを用いて、導入遺伝子を眼球内に特異的に発現させた。羽化２日後に眼球表現型を記録した（ｎ＝３）。
【０２５９】
結果
ＧＭＲドライバーのみを発現する対照ハエは正常な眼球表現型を示した（図１０Ａ）。ｈｔａｕのみを過剰発現させると、予測された通り、対照に比してｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型（眼球の大きさが小さく、不規則な形態を有する）が生じた（図１０Ｂ）。ｈｔａｕとｍｉＲ−２１９を共過剰発現させると、ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型が部分的に正常に戻り、保護的役割と一致した（図１０Ｃ）。これに対して、ｈｔａｕとｍｉＲ−２１９スポンジを共過剰発現させると、表現型の増悪がみられ、二方向性が示された（図１０Ｄ）。ｈｔａｕとスクランブルｍｉＲＮＡ対照の共過剰発現は、ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型を救済しなかった（図１０Ｅ）。
【０２６０】
以上の結果から、ｍｉＲ−２１９がタウ毒性に影響を及ぼすことが示された。この観察結果から、ｍｉＲＮＡがタウ毒性を直接的に（おそらく内因性のハエタウを減少させることによって）、ＧＳＫ３を介して間接的に（このｈｔａｕ導入遺伝子が機能的なｍｉＲ−２１９部位を欠くことから）またはその両方により調節するという仮説が導かれた。
【０２６１】
実施例１１−ヒトタウ３’ＵＴＲはショウジョウバエ眼球でのタウ毒性を改善するシス作用エレメントを含む
材料および方法
合成ＳＶ４０ポリアデニル化部位を含まないＧａｔｅｗａｙカセットの上流にｈｔａｕタンパク質コード領域配列を挿入して実施例１０に記載されるｐＢＩＤベクター骨格を改変することによって、ｈｔａｕ３’ＵＴＲと融合したｈｔａｕコード配列を過剰発現するハエを作製した。次いで、ヒトＧＡＰＤＨおよびタウ３’ＵＴＲを挿入した。ハエを商業的に作製した。眼球での発現は実施例１０に記載されるＧＭＲドライバーを用いて行った。
【０２６２】
結果
ＧＭＲドライバーのみを発現する対照ハエは正常な眼球表現型を示した（図１１Ａ）。ＧＡＤＰＨ  ３’ＵＴＲに融合したｈｔａｕを過剰発現させると、予測された通り、対照に比してｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ表現型（眼球の大きさが小さく、不規則な形態を有する）が生じた（図１１Ｂ）。これに対して、タウ３’ＵＴＲに融合したタウを過剰発現させると、ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅの重症度が低下し、このことは、タウ３’ＵＴＲ内に保護的なシス作用調節エレメントが存在することを示している（図１１Ｃ）。
【０２６３】
実施例１２−ＭｉＲ−２１９はタウ以外の標的を有すると予測される
材料および方法
ＦｕｎｃＡｓｓｏｃｉａｔｅ  ２．０（Ｂｅｒｒｉｚら（２００９））を用いて、実施例２に記載されるようにＴａｒｇｅｔＳｃａｎを用いて予測されるｍｉＲ−２１９の標的について機能傾向解析を実施した。
【０２６４】
結果
表９に示されるように、ｍｉＲ−２１９がニューロン分化、軸索軸索発生、および遺伝子発現に何らかの役割を演じていることが予測された。
【０２６５】
【表９】
2016523980.tif 000014
【０２６６】
実施例１３−ＡＤ患者およびＴＰＤ患者で差次的に発現する追加的なｍｉＲＮＡの証拠
材料および方法
実施例１に記載される患者試料のうち、対照５例、濃縮体単独型認知症患者５例およびアルツハイマー病患者３例由来の試料を用いた。実施例１に記載される通りにＴｒｉｚｏｌまたはＱｉａｇｅｎによりＲＮＡを単離した。全部で約２５０，０００の細胞、および１反応あたり約５細胞で、ＳｍａｒｔＣｈｉｐ（Ｗａｆｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に約０．５μｇの全ＲＮＡを負荷した。ＳｍａｒｔＣｈｉｐ  ｍｉＲＮＡ  Ｐａｎｅｌ、ｖ３．０に試料を負荷し、１，０３６のｍｉＲＮＡアッセイで技術的反復をそれぞれ４回実施した。さらに、７つのオンチップ対照アッセイおよび４つの酵母ｃＤＮＡフラグメントプロセス対照を用いた。表１０を参照されたい。
【０２６７】
統計にはｂｉｏｇａｚｅｌｌｅ社製のｑｂａｓｅｐｌｕｓでマン・ホイトニーの検定を用いた。
【０２６８】
【表１０】
2016523980.tif 000015
2016523980.tif 000016
【０２６９】
結果
７８種類のｍｉＲＮＡでアルツハイマー病（ＡＤ）群と対照群との間に有意な差がみられた（ｐ≦０．０５）。これらの７８種類のうち、３３種類がダウンレギュレートされたものであり、表１１に挙げられ、また、４５種類がアップレギュレートされたものであり、表１２に挙げられる。
【０２７０】
【表１１】
2016523980.tif 000017
2016523980.tif 000018
【０２７１】
【表１２】
2016523980.tif 000019
2016523980.tif 000020
【０２７２】
１５２種類のｍｉＲＮＡが濃縮体単独型（ＴＯＤ）群と対照群との間で有意な差を示した。３６種類のｍｉＲＮＡがＴＯＤ群と対照群との間で有意な差を示し（ｐ≦０．０１）、４８種類のｍｉＲＮＡがＴＯＤ群と対照群との間で有意な差を示し（０．０１≦ｐ＜０．０２）、６８種類のｍｉＲＮＡがＴＯＤ群と対照群との間で有意な差を示した（０．０２≦ｐ＜０．０５）。
【０２７３】
これらの１５２種類のうち、７６種類がダウンレギュレートされたものであり、表１３に挙げられ、７６種類がアップレギュレートされたものであり、表１４に挙げられる。
【０２７４】
【表１３】
2016523980.tif 000021
2016523980.tif 000022
2016523980.tif 000023
【０２７５】
【表１４】
2016523980.tif 000024
2016523980.tif 000025
【０２７６】
５４種類のｍｉＲＮＡがＴＯＤ群とＡＤ群との間で有意な差を示した（ｐ≦０．０５）。２０種類がＴＯＤでＡＤに比してダウンレギュレートされたものであり、表１５に挙げられ、３４種類がＴＯＤでＡＤに比してアップレギュレートされたものであり、表１６に挙げられる。
【０２７７】
【表１５】
2016523980.tif 000026
【０２７８】
【表１６】
2016523980.tif 000027
2016523980.tif 000028
【０２７９】
実施例１４−ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ１８１および他のｍｉＲＮＡはＧＳＫ３βおよび他のタウホスホリラーゼを標的にすると予測される
材料および方法
実施例２に記載されるようにＴａｒｇｅｔＳｃａｎアルゴリズムを用いて、３’ＵＴＲ上に認識部位があることからタウを標的にすると予測されるｍｉＲＮＡファミリー（表６）について、タウオパチーに関与する他のタンパク質のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する可能性を検証した。
【０２８０】
結果
表１７に示されるように、ｍｉＲＮＡファミリーｍｉＲ−２１９−５ｐ／５０８／５０８−３ｐ／４７８２はＧＳＫ３βのみならず、ＰＫＣ１、ＴＴＢＫ１、ＣＡＭＫ２ＧおよびＰＫＡを含むタウオパチーに関与する他のキナーゼも標的にすると予測される。表１７からもわかるように、ｍｉＲ１８１ａｂｃｄ／４２６２  ｍｉＲＮＡファミリーもＧＳＫ３βおよび他のホスホリラーゼを標的とした。同じくタウを標的にすると予測されるｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲ−２０４／２０４ｂ／２１１、ｍｉＲ１４６ａｃ／１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ１３２／２１２／２１２−３ｐ、およびｍｉＲ３４ａｃ／３４ｂｃ−５ｐ／４４９ａｂｃ／４４９ｃ−５ｐ由来のものを含む他のｍｉＲＮＡも、これらの他のタンパク質を標的にすると予測される。
【０２８１】
【表１７】
2016523980.tif 000029
【０２８２】
実施例１５−追加的なマイクロＲＮＡがタウ発現を調節する
材料および方法
実施例４と同じルシフェラーゼレポーター遺伝子系および細胞を用いた。
【０２８３】
二重ルシフェラーゼレポーター構築物のウミシイタケルシフェラーゼの下流に完全長ヒトタウ３’ＵＴＲを挿入し、ＦｕＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、この構築物を、ヒトタウ３’ＵＴＲを標的にすると予測される保存されたマイクロＲＮＡである６種類のマイクロＲＮＡ  ｍｉｒＶａｎａ模倣物（Ａｍｂｉｏｎ社）（すなわち、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−１８１−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−２０４−５ｐ）とともにヒト神経芽腫細胞系（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）中に一過的に共トランスフェクトした。
【０２８４】
４８時間後に、トランスフェクション効率を照合する二重ルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイした（ｎ＝８）。
【０２８５】
結果
ｍｉＲ−２１９−５ｐおよびｍｉＲ−１８１だけでなく、ｍｉｒ−３４、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２０４はすべて、対照（ｈｔａｕ  ３’ＵＴＲのみ）に比してルシフェラーゼ活性を有意に低下させ得ることがわかった（図１２）。以上の観察結果は、上記マイクロＲＮＡによるタウ発現の抑制が、タウ３’ＵＴＲで予測され高度に保存される認識エレメントとの直接相互作用を介することを示している。
【０２８６】
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Ｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：５８−６３．
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Ｓｉｎｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７２：２４２−２４６．
Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：１９２．
Ｔａｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２７９７−２８０１．
Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：１５１−１６５．
Ｔｈｉｎａｋａｒｅｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏ  ２００８．
Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：２０９−２１５．
Ｕｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  １：２５７‐２８４．
Ｖａｎｄｒｏｖｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：７２６−７３４．
Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ  ２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ８：４７７−４７８．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４２１０２．
Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ  ２０１２．４０：６４４−６５２．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２８：１２１３−１２２３．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １２１：１９３−２０５．
Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７５．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ７２：１８５８−１８６２．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．４２８（４）：６３０−４０．
Ｗｉｔｔｍａｎｎ    ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５３０）：７１１−４．
Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｄｅｍｅｎｔ．Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｃｏｇｎ  Ｄｉｓｏｒｄ  １２：１１７−１２６
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎｅｕｒｏｎ  ６５：６１２−６２６．
Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｖｅｒｂｅｅｋ  ２０１０．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７．
【図１Ａ】
2016523980.tif 000030
【図１Ｂ】
2016523980.tif 000031
【図２Ａ】
2016523980.tif 000032
【図２Ｂ】
2016523980.tif 000033
【図３】
2016523980.tif 000034
【図４】
2016523980.tif 000035
【図５】
2016523980.tif 000036
【図６】
2016523980.tif 000037
【図７−１】
2016523980.tif 000038
【図７−２】
2016523980.tif 000039
【図７−３】
2016523980.tif 000040
【図８−１】
2016523980.tif 000041
【図８−２】
2016523980.tif 000042
【図９−１】
2016523980.tif 000043
【図９−２】
2016523980.tif 000044
【図９−３】
2016523980.tif 000045
【図１０】
2016523980.tif 000046
【図１１】
2016523980.tif 000047
【図１２】
2016523980.tif 000048
【国際調査報告】
2016523980.tif 000049
2016523980.tif 000050
2016523980.tif 000051
2016523980.tif 000052
2016523980.tif 000053