(57)【要約】本発明は、殺真菌性アゾールと組み合わせて向上した抗真菌活性を示すが最小限の抗細菌性を有する、環ＩＩＩの６位に特定の置換基を有するアミノグリコシド類似体を含む新規殺真菌化合物に関する。アミノグリコシド化合物はカナマイシンＡの類似体である。本発明の化合物の合成方法および使用方法も提供される。本発明の化合物は真菌性疾患の治療または予防に有用である。
2016520086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2016520086.tif 000010
を有するアミノグリコシド化合物、またはその塩と、
式中：
ＸはＯ、Ｓ、およびＮＲ２からなる群から選択される要素であり；
Ｒ１はＲ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；
Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである；
アゾールとを含む、殺真菌化合物。
【請求項２】
ＸがＯ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４からなる群から選択される要素であり、
Ｒ３がＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルであり、
Ｒ４がフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＸがＯであり、Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｒ３である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がｎ−Ｃ７Ｈ１５である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３がｎ−Ｃ９Ｈ１７である、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２Ｒ３である、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３がＣ６Ｈ１３である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３がＣ８Ｈ１７である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２Ｒ４である、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４がｐ−トリルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
ＸがＮＨであり、Ｒ１がＲ３である、請求項２に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３がＣ８Ｈ１７である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
アゾールがイトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、チオコナゾール、ケトコナゾール、メトコナゾール、テブコナゾール、およびピラクロストロビンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
殺真菌化合物を効果的な量でそれを必要とする宿主に投与するステップを備える、真菌感染の治療または予防方法であって、当該殺真菌化合物は、
式：
【化２】
2016520086.tif 000011
を有するアミノグリコシド化合物、またはその塩と、
式中：
ＸはＯ、Ｓ、およびＮＲ２からなる群から選択される要素であり；
Ｒ１はＲ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；
Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである；
アゾールとを含む殺真菌化合物である、真菌感染の治療または予防方法。
【請求項１５】
ＸがＯ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４からなる群から選択される要素であり、
Ｒ３がＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルであり、
Ｒ４がフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２Ｒ３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ３がＣ６Ｈ１３である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ３がＣ８Ｈ１７である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする前記宿主が植物または動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
アゾールがイトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、チオコナゾール、ケトコナゾール、メトコナゾール、テブコナゾール、およびピラクロストロビンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２０１３年５月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８２４，８４７号の優先権を主張し、２０１０年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／４２２，９８３号の利益を主張する２０１１年１２月１２日出願の米国特許出願第１３／３１６，７０２号の一部継続出願である。
【０００２】
本出願は、２００９年６月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６８２７号の一部継続出願であり、また２００８年６月１１日出願の米国仮特許出願第６１／０６０，６６１号の優先権を主張する２０１０年１２月１４日出願の米国特許出願第１２／９６８，０５２号に関し、これらの出願のそれぞれの全開示はこれにより本明細書に参照により組み入れられる。
【０００３】
本開示は活性な化学物質の組み合わせに関する。より詳細には、本開示はアミノグリコシドおよびアゾールの組み合わせならびにそれらの抗生物質活性に関する。
【背景技術】
【０００４】
アミノグリコシド抗生物質は６０年以上感染性疾患に対する治療剤として一般的に用いられてきたが、アミノグリコシド耐性細菌の流行はそれらの効果を顕著に低減させた。アミノグリコシドはグリコシド結合によってアミノシクリトール環に結合した２つ以上のアミノ糖を有する。自然発生アミノグリコシド（放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）により生成）は動物およびヒトの細菌感染に対する抗生物質として幅広く用いられている。これらとしては周知の抗生物質、カナマイシン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンが挙げられる。アミノグリコシド抗生物質は細菌タンパク質合成機構に対して作用し、欠損細胞タンパク質の形成をもたらすと考えられる。
【０００５】
医療では、真菌性疾患は過去２５年で大きな公衆衛生問題として出現した。この増加の顕著な理由のなかでも、有効な抗真菌剤の欠如、免疫無防備条件（例えば、臓器移植およびＨＩＶ／ＡＩＤＳ）の増加、およびもっとも一般的に用いられる抗真菌剤に対する広範な耐性がある。医療に用いられるもっとも強い抗真菌剤、アムホテリシンＢは、効果的な薬剤であるが、患者に対する毒性も強い。入手可能な抗真菌剤の毒性レベルは医療従事者の共通の懸念である。Ｎｏｖｉｃｋ，Ｊｒ．（１９９１）の米国特許第５，０３９，６６６号は、アミノグリコシドにより誘導される腎毒性を低減させたアミノグリコシド化合物「ゲンタマイシン」を示す。他の一般的な抗真菌剤は、水虫、白癬、カンジダ症（鵞口瘡）のような感染症、クリプトコッカス髄膜炎のような重篤な全身性感染症、等を治療するのに用いられている。
【０００６】
農業では、殺生物剤の直接適用による作物病害の制御は依然としてもっとも効果的であり、もっとも広く用いられている戦略である。それにもかかわらず、一貫性がなく低下する効果、環境への影響、動物／ヒトに対する毒性、およびコストに関する懸念は、現行の殺生物剤の使用にとって継続的な課題である。従来より、アミノグリコシドは細菌に対する抗生物質として開発および使用されてきた。最近のレポートは、しかしながら、従来の天然アミノグリコシドによる（とくにパロモマイシンによる）植物病原性真菌の阻害を提案する。作物病原体の１つの具体的な例としては、北米における小麦および大麦の胴枯れ病のもっとも一般的な原因物質である、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）がある。Ｆ・グラミネアラム感染は予測が困難であり、壊滅的な作物損失をもたらし得る。
【０００７】
カナマイシンは既知のアミノグリコシド抗生物質である。カナマイシンの抗生物質作用は細菌の３０Ｓリボソームサブユニットに影響を及ぼし、フレームシフト変異を引き起こす、またはＲＮＡの翻訳を防止するその能力に関連し得る。フレームシフト変異またはＲＮＡ翻訳の欠如のいずれかは細菌タンパク質合成の低減または欠如および、最終的には、細菌死をもたらし得る。残念ながら、カナマイシンは耐性細菌の出現のため臨床ではほとんど使用されなくなった。
【０００８】
ヒトの医療および作物の病害の両方において、耐性細菌および真菌の問題を解決する新規抗菌剤のニーズが明らかに存在する。毒性が低減された新規抗菌剤、とくに抗真菌剤の明らかなニーズもある。さらに、細菌性または真菌性疾患のいずれか一方の治療が他方における抗菌剤耐性の構築に寄与しないように、新規抗菌化合物は細菌または真菌のいずれかに対して選択的であることが望ましい。選択的抗菌活性は、作物が治療される際におそらく多量の抗菌剤が環境中に放出されるため、フザリウム胴枯れ病のような作物病害を治療するのに用いられる抗真菌剤にとってとくに望ましい。本発明は、効果的であり、比較的低レベルの毒性を有し、真菌病原体に対して選択的である新規アミノグリコシド抗菌剤を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は態様および実施形態において、殺生物効果を有するアゾール−アミノグリコシド化合物を提供することにより、これらのさまざまなニーズおよび問題を解決する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、殺真菌化合物は式：
【化１】
2016520086.tif 000003
を有するアミノグリコシド化合物、またはその塩と、
式中：
ＸはＯ、Ｓ、およびＮＲ２からなる群から選択される要素であり；
Ｒ１はＲ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；
Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである；
アゾールとを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；Ｒ１はＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４からなる群から選択される要素であり、Ｒ３はＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルであり、Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＸはＯであり、Ｒ１はＣ（Ｏ）Ｒ３である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ３はｎ−Ｃ７Ｈ１５またはｎ−Ｃ９Ｈ１７である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＸはＯであり、Ｒ１はＳ（Ｏ）２Ｒ３である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ３はＣ６Ｈ１３であり、またはＲ３はＣ８Ｈ１７である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＸはＯであり、Ｒ１はＳ（Ｏ）２Ｒ４である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ４はｐ−トリルである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＸはＮＨであり、Ｒ１はＲ３である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ３はＣ８Ｈ１７である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、アゾールはイトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、チオコナゾール、ケトコナゾール、メトコナゾール、テブコナゾール、およびピラクロストロビンからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記化合物はそれを必要とする宿主に殺真菌化合物を効果的な量で投与するステップを備える真菌感染の治療または予防方法として用いてもよく、その化合物は式：
【化２】
2016520086.tif 000004
を有するアミノグリコシド化合物、またはその塩と、
式中：
ＸはＯ、Ｓ、およびＮＲ２からなる群から選択される要素であり；
Ｒ１はＲ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ３、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；
Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである；
アゾールとを含む。
【００１８】
アミノグリコシド類似体はカナマイシンＡの親分子に由来する。
【００１９】
同様に殺生物、抗菌、または抗真菌効果を示す選択されるアゾール化合物と組み合わされる場合、向上した抗菌、とくに抗真菌性を有する式Ｉの新規アミノグリコシド類似体化合物を提供することも本発明の目的である。
【００２０】
本発明のまたさらなる目的は、式Ｉのアミノグリコシド類似体化合物の合成方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、向上した殺真菌活性を有する殺生物剤としての式Ｉのアミノグリコシド類似体化合物の使用方法を提供することである。
【００２１】
本発明をいずれかの特定の使用方法に限定することなく、本発明の化合物は予想外にも真菌病原体についての向上した特異性およびいくつかの一般的な細菌病原体に対する活性の欠如を示す。加えて、添加されるアゾールの相乗効果は大幅に向上した殺生物効果を示す。
【００２２】
他の合成アミノグリコシドおよび天然アミノグリコシドは殺細菌性のみまたは殺細菌性および殺真菌性の両方である。真菌病原体についてのその予想外の特異性の結果として、本発明の化合物は、従来のアミノグリコシドに対する病原性細菌の耐性を促進しないことにより、および非病原性細菌を損傷または排除しないことにより、真菌病原体の有利な治療を提供する。本発明のさまざまな実施形態、ならびに本発明の化合物の合成方法および使用方法の実施例は以下で議論される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】例となるアミノグリコシドの例となる合成方法を示す。
【図２】カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ１０２３１のイトラコナゾールおよびＫ２０による相乗的阻害を示す。
【図３】カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１のイトラコナゾールおよびＫ２０による相乗的阻害の殺菌時間曲線を示す。
【図４】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対するイトラコナゾールおよびＫ２０の混合物の細胞毒性を示す。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本開示はアミノグリコシドおよびアゾールを含む活性化合物の組成物、キット、試薬、および関連方法を対象とする。以下の説明では、特定の好適な実施形態の完全な理解のため多数の特定の詳細が提供される。しかしながら、当業者であれば、特定の詳細の１つ以上がなくても、または他の方法、成分、材料、等でも、実施形態を実行することができることを認識するだろう。いくつかの例では、周知の構造、材料、または操作は好適な実施形態の不明瞭な態様を回避するため詳細に図示または説明されていない。さらに、記載される特徴、構造、または特性はさまざまな代替実施形態においていずれかの適切な方法で組み合わせてもよい。よって、いくつかの態様では図面に例示されるような、本発明の実施形態の以下のより詳細な説明は、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明のさまざまな実施形態の単に代表例である。
【００２５】
本明細書および以下の特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」のような単数形は、とくに内容に明確な指示のない限り、複数形を含む。本明細書に開示されるすべての範囲は、具体的な指示のない限り、すべての終点および中間値を含む。また、「任意の」または「任意で」とは、例えば、その後記載される状況が起こってもよいしまたは起こらなくてもよい場合を指し、その状況が起こる場合およびその状況が起こらない場合を含む。「１つ以上」および「少なくとも１つ」の語は、例えば、その後記載される状況の１つが起こる場合、およびその後記載される状況の１つよりも多くが起こる場合を指す。
【００２６】
Ａ．定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、用いられる場合の以下の用語、および慣例についてまず定義する。
【００２７】
宿主：「宿主」の語は、本明細書では真菌病原体に感染している、または少なくともいくらか感染する可能性があるいずれかの生きた有機体と定義され、前記病原体および前記病原体により引き起こされるいずれかの感染、または前記病原体により引き起こされる潜在的な感染は本明細書において特許請求される式Ｉの化合物の１つ以上での治療に感受性であり、前記治療は前記病原体により引き起こされる感染の排除、回避、または軽減をもたらす可能性がある。
【００２８】
以下は式Ｉ、図１、表１、表２、等を参照する：式Ｉ、図２、ならびに表１および２においてとくに指示のない限り、すべての炭素鎖は直鎖、すなわちｎ−アルキルまたはｎ−アルキレン基であり、分岐鎖ではない。
【００２９】
ＸがＯであり、Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｃ７Ｈ１５である場合、化合物は本明細書ではＫ０５と示され、６”−Ｏ−オクタノイルカナマイシンＡと称される。
【００３０】
ＸがＯであり、Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｃ９Ｈ１９である場合、化合物は本明細書ではＫ０７と示され、６”−Ｏ−デカノイルカナマイシンＡと称される。
【００３１】
ＸがＮＨであり、Ｒ１がＣ８Ｈ１７である場合、化合物は本明細書ではＫ１７と示され、６”−デオキシ−６”−オクチルアミノカナマイシンＡと称される。
【００３２】
ＸがＳであり、Ｒ１がＣ８Ｈ１７である場合、化合物は本明細書ではＫ１８と示され、６”−デオキシ−６”−オクチルチオカナマイシンＡと称される。
【００３３】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２ｐ−トリルである場合、化合物は本明細書ではＫ１９と示され、６”−Ｏ−トルエンスルホニルカナマイシンＡと称される。
【００３４】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２Ｃ８Ｈ１７である場合、化合物は本明細書ではＫ２０と示され、６”−Ｏ−オクタンスルホニルカナマイシンＡと称される。
【００３５】
ＸがＯであり、Ｒ１がＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ１３である場合、化合物は本明細書ではＫ２２と示され、６”−Ｏ−ヘキサンスルホニルカナマイシンＡと称される。
【００３６】
比較を目的として、カナマイシンＡは構造：
【化３】
2016520086.tif 000005
を有する。
【００３７】
以下の定義のいくつかまたはすべては本開示全体を通して用いられることがある。
【００３８】
真菌感染：「真菌感染」の語は本明細書では、関連が実際か潜在的かにかかわらず、真菌有機体の宿主との関連と定義される。例えば、実際の関連は真菌が宿主上またはその中に物理的に存在する場合起こる。潜在的な関連の例は、真菌が宿主に少なくともいくらか能動的または受動的に転移される可能性がある、宿主の周囲の環境上またはその中の真菌を含む。真菌有機体と宿主との間の関連のタイプをさらに限定することを望むことなく、真菌有機体の宿主との関連の例としては、病原性もしくは非病原性、寄生虫性もしくは非寄生虫性、共生性もしくは非共生性、相利共生性もしくは非相利共生性、片利共生性、自然発生もしくは人工であってもよい生物学的関連、またはその他の生物学的相互作用がある。
【００３９】
それを必要とする宿主：「それを必要とする宿主」のフレーズは本明細書では、真菌有機体と関連または潜在的に関連した、いずれかの宿主であって、前記宿主は真菌感染の排除、予防、または軽減から実際または潜在的に利益を得ることができる、宿主と定義される。
【００４０】
フザリウム胴枯れ病：「フザリウム胴枯れ病」のフレーズは本明細書では真菌フザリウム・グラミネアラムにより引き起こされるいずれかの真菌性疾患と定義される。
【００４１】
界面活性剤：「界面活性剤」の語は一般的な実験室界面活性剤Ｃ５８Ｈ１１４Ｏ２６を示すのに用いられる。「界面活性剤」の語のすべての使用は、とくに指示のない限り、Ｃ５８Ｈ１１４Ｏ２６を指す。
【００４２】
予防的：「予防的」の語は本明細書では疾患の予防のための抗菌化合物の投与を指すのに用いられる。
【００４３】
Ｎ／Ａ：本明細書においてデータ点を記載するのに用いられる場合、「Ｎ／Ａ」の略語は未試験を意味する。
【００４４】
補助剤：「補助剤」の語は本明細書では、薬剤の薬理効果を補助および増強、または免疫系を刺激する抗原の能力を向上させる物質と定義される。
【００４５】
賦形剤：「賦形剤」の語は本明細書では薬剤の活性成分の担体として用いられる不活性物質と定義される。
【００４６】
希釈剤：「希釈剤」の語は本明細書では活性成分を希釈または担持するのに用いられるいずれかの液体または固体材料と定義される。
【００４７】
抗真菌量または抗真菌効果的：とくに指示のない限り、「抗真菌量」または「抗真菌効果的」のフレーズは本明細書では宿主上またはその中の真菌感染または真菌感染の症状を低減、排除、または軽減するのに十分な抗真菌剤の量を記載するのに用いられる。
【００４８】
ＭＩＣ：ＭＩＣの語は最小発育阻止濃度または２４、４８、もしくは７２時間のインキュベーション後に微生物の視認できる増殖を阻害する抗菌剤の最低濃度を意味する。
【００４９】
添加混合：「添加混合」の語は本明細書では他の化学物質または化合物との混合物または組み合わせ中の化学物質または化合物を記載するのに用いられる。
【００５０】
投与：「投与」の語は本明細書では、有機体が化学物質または化合物の曝露、処理、供給または適用から実際または潜在的に利益を得るだろう、化学物質または化合物をいずれかの生きた有機体または生きた有機体と関連した無生物に提供、曝露、処理、またはいずれかの方法で物理的に供給もしくは適用する行為を記載するものと定義される。
【００５１】
局所：「局所」の語は本明細書では、身体部分の表面、植物の表面部分、または土壌のような、無生物もしくは組成物の表面に関すると定義される。例えば、医療では、局所薬剤は皮膚または粘膜のような体表、例えば、喉、目および耳に適用される。
【００５２】
担体：「担体」の語は本明細書では薬剤または抗菌剤の送達および効果を向上させるのに役立ついずれかの物質と定義され、上で定義された賦形剤を含む。例としては：生分解性ポリマー、ポリ（ラクティック−ｃｏ−グリコリック）酸からなるミクロスフェア、アルブミンミクロスフェア、合成ポリマー（可溶性）、タンパク質−ＤＮＡ複合体、タンパク質複合体、赤血球、ナノ粒子、およびリポソームが挙げられる。
【００５３】
穀物の穂：本明細書において用いられる場合「穀物の穂」の語は小穀物および大穀物の両方を含むことを意図する。
【００５４】
温血動物：本明細書において用いられる「温血動物」のフレーズは、環境温度に関係なく比較的一定の温かい体温を維持することにより特徴づけられる；恒温性の動物を意味する。
【００５５】
本明細書中の特定の用語は、それらの使用の文脈により示されるように、医療、抗菌剤、および作物病害の技術分野において一般的に用いられるように解釈されるものである。これらの用語は、スプレーノズル、液滴、治療的、外側、スプレー、局所、治療、および予防を含む。
【００５６】
ＰＤＢ−ＣＡ：ＰＤＢ−ＣＡの語はＭＩＣ試験において真菌増殖のために希釈剤として用いられるポテトデキストロース液体培地＋カザミノ酸培地を指す。１ＬのＰＤＢ−ＣＡを製造するには、２００ｇの角切りにした新鮮なジャガイモを５００ｍＬの蒸留水中で３０分間茹でた。液体培地を２層のチーズクロスを通して濾過し、体積を１Ｌに合わせた。２０ｇのグルコース（２％、ｗ／ｖ）および４ｇのカザミノ酸（０．４％、ｗ／ｖ）の添加後、すべての固体が溶解するまでその混合物を磁気棒で撹拌した。ｐＨはＨＣｌおよびＮａＯＨで５．１に調整した。次に、その培地を３０分間オートクレーブすることにより滅菌した。
【００５７】
ＰＤＡ−ＣＡ：ＰＤＡ−ＣＡの語はＰＤＢ−ＣＡに溶解した２％の寒天からなる固体増殖培地を指す。混合物を３０分間オートクレーブすることにより滅菌し、滅菌ペトリ皿プレートに注ぎ、室温まで冷却してプレート中で凝固させた。
【００５８】
ＲＰＭＩ１６４０：ＲＰＭＩ１６４０の語は２０のアミノ酸、１１のビタミン、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２４Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、二塩基性硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）無水物、デキストロース、グルタチオン（還元）からなり、０．１６５Ｍのモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液で７．０のｐＨまで緩衝された、化学的に明確な細胞増殖培地（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，Ｇｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｈ．Ａ．（１９６７）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９に記載）を指す。本明細書に記載される実験のためＲＰＭＩ１６４０を米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。
【００５９】
Ｂ．アミノグリコシド
本発明はアミノグリコシドおよびアゾールを含む抗菌化合物に関する。例となるアミノグリコシドとしては、次の式Ｉ：
【化４】
2016520086.tif 000006
の化合物があり、
式中：
ＸはＯ、Ｓ、およびＮＲ２からなる群から選択される要素であり；
Ｒ１はＲ３（アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３（アルコキシカルボニル）、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３（アルキルアミノカルボニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３（アルキルスルホニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４（フェニルスルホニル）、Ｓ（Ｏ）Ｒ３（アルキルスルフィニル）、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３（アルキルホスホニル）、Ｃ（Ｏ）Ｒ３（アルカノイル）、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６分岐もしくは直鎖アルキルであり；
Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；
Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである。
【００６０】
上述した炭素鎖では、記載範囲内のいずれの整数を用いてもよい。例えば、Ｒ１中のフェニル基は分岐または直鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル基で置換してもよく；Ｒ２は分岐または直鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル基であってもよく；Ｒ３は分岐または直鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、またはＣ１２アルキル基であってもよく；Ｒ４はＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル（直鎖または分岐）置換フェニルであってもよい。
【００６１】
これらの化合物はカナマイシンＡの置換類似体である。本発明はこうした類似体の合成方法およびそれらの抗真菌剤としての使用方法にも関する。
【００６２】
ここで本発明をより詳細に見ると、式Ｉでは本発明に関する化合物の構造が示される。本発明に関する化合物は親分子カナマイシンＡの類似体である。本発明に関する構造は親分子カナマイシンＡとは環ＩＩＩの６位のアルキルまたはフェニル基のいずれかで終端している官能基の存在により異なる。
【００６３】
より具体的には、式Ｉを見ると、環ＩＩＩの６位の官能基はＸＲ１と示され、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＲ２からなる群から選択される要素であり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ１はＲ３（アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３（アルコキシカルボニル）、ＮＨ（ＣＯ）Ｒ３（アルキルアミノカルボニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３（アルキルスルホニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４（フェニルスルホニル）、Ｓ（Ｏ）Ｒ３（アルキルスルフィニル）、Ｐ（Ｏ）２Ｒ３（アルキルホスホニル）、Ｃ（Ｏ）Ｒ３（アルカノイル）、およびフェニルからなる群から選択される要素であり、フェニル基はＣ１〜Ｃ６アルキル置換してもよく；Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６分岐または直鎖アルキルであり；Ｒ３は直鎖または分岐鎖Ｃ４〜Ｃ１２アルキル基であり；Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである。とくに指示のない限りＲ３は好適にはｎ−アルキルである。
【００６４】
より好適な実施形態では、ＸはＯまたはＳであり、Ｏがとくに好適であるが、ＮＲ２とすることもでき、Ｒ２は好適にはＨである。Ｒ１は好適にはＣ（Ｏ）ＯＲ３（アルコキシカルボニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ３（アルキルスルホニル）、Ｓ（Ｏ）２Ｒ４（フェニルスルホニル）、およびＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される要素である。Ｒ３もＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルである。Ｒ４はフェニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキル置換フェニルである。ＸがＳまたはＮＲ２である場合、Ｒ１はＣ４〜Ｃ１２直鎖または分岐鎖アルキルである。
【００６５】
実施形態では、アミノグリコシドは塩、または標的有機体への送達に適したその他の形態として、以上で示したように用いてもよい。
【００６６】
Ｃ．アゾール
上述および式Ｉに記載したアミノグリコシドは１つ以上の適切なアゾールと組み合わせてもよい。アゾールは、１つの窒素原子、２つ以上の窒素原子、１つの窒素原子および１つの酸素原子、ならびに１つの窒素原子および１つの硫黄原子を含むアゾールのような、窒素、硫黄、または酸素のいずれかの少なくとも１つの他の非炭素原子を含有する５員窒素複素環を有する化合物を含む。５員窒素複素環はさらに置換してもよい。
【００６７】
殺生物または抗生物質効果のため化合物が用いられるいくつかの実施形態では、適切なアゾールは少なくともいくらかの所望の殺生物効果を有するものを含む。例となるアゾールとしては、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ペンタゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾールおよびイソチアゾールが挙げられる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、アゾールは下記：イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、チオコナゾール、ケトコナゾール、メトコナゾール、テブコナゾール、およびピラクロストロビンの１つ以上から選択してもよい。
【００６９】
実施形態では、アゾールは塩、または標的有機体への送達に適したその他の形態として、以上で示したように用いてもよい。
【００７０】
Ｄ．組み合わせ
アミノグリコシドおよびアゾールはいずれかの適切な比または組み合わせで用いてもよい。アゾール対アミノグリコシドの比は約１：１〜約１：１０００、約１：５〜約１：６００、約１：２０〜約１：５００、約１：３０〜約１：２００、および約１：５０〜約１：１００であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、アゾール：アミノグリコシドの比は約１：５、１：２１、１：３２、１：５３、１：１８０、および１：５３３であってもよい。
【００７１】
本発明の１つの好適な実施形態は、宿主と関連した細菌の排除または低減が望ましくない、それを必要とする宿主における真菌感染の治療である。本発明の範囲をいずれの方法でも限定することを望むことなく、１つのこうした使用はヒトまたは非ヒト哺乳類において行うことができ、Ｋ２０のような本発明のアミノグリコシドでの真菌感染の治療は真菌感染を排除または軽減するが、宿主の腸内細菌叢の完全性には影響を及ぼさない。同様に、本発明を限定することなく、第２の例は、宿主作物の細菌の多様性または存在量に影響を及ぼすことが望ましくない、宿主作物における真菌性疾患の治療または予防である。
【００７２】
広範な実施形態では、本発明は新規抗真菌化合物、前記新規抗真菌化合物の合成方法、およびヒト、動物、土壌、または植物を治療し、真菌増殖および活性を排除するための前記新規抗真菌化合物の使用方法に関する。１つの広範な実施形態では、本発明に関する構造は、カナマイシンＡの環ＩＩＩと同等の環ＩＩＩ上のさまざまな置換基の付加により修飾することができるカナマイシンＡ以外の親アミノグリコシド分子に由来する。環ＩＩＩ上の本明細書に示される炭素アルキル鎖の付加がとくに好ましい。
【００７３】
また別の広範な実施形態では、本発明は本明細書に示される合成方法による親アミノグリコシド分子に由来するが、本発明に関する構造の環ＩＩＩ上の炭素アルキル鎖のような置換基は炭素原子および水素原子の数が異なる。
【００７４】
さらにまた別の広範な実施形態では、本発明はヒト、作物、または動物の疾患に関するさまざまな真菌病原体を治療するのに用いられる。
【００７５】
さらに広範な実施形態では、本発明の化合物は、真菌性疾患を引き起こす、または引き起こし得る真菌病原体により直ちに脅威を受ける、または潜在的に脅威を受けるヒト、動物、または作物のいずれかに、スプレー、直接注入、局所塗布、摂取（本発明に関する構造を含む医薬組成物を含む）、または水分補給に含めることにより投与され、本発明の化合物の投与は真菌性疾患を低減、排除、または回避する。
【実施例】
【００７６】
下記実施例は例示的のみであり、本開示をいずれの方法でも限定することを意図しない。下記材料および方法を以下で挙げる実施例の１つ以上に用いた。さらなる材料および方法は各実施例の説明において提供される。
【００７７】
アミノグリコシド
すべてのアミノグリコシドはＤｒ．Ｃｈｅｎｇ−Ｗｅｉ  Ｔ．Ｃｈａｎｇ（ユタ州立大学化学・生化学科）の実験室より提供した。抗真菌剤試験のため、ストック溶液を１０ｍｇｍＬ−１水溶液として調製し、マイナス２０℃で保存した。
【００７８】
真菌増殖培地
全体を通してＰＤＢ−ＣＡおよびＰＤＡ−ＣＡ増殖培地を用いた。しかしながら、実施形態ではＲＰＭＩ１６４０、またはその他の適切な増殖培地を用いてもよい。
【００７９】
細菌および真菌有機体
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＧＩ、大腸菌Ｂ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ６５３８、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、およびカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手した。フザリウム・グラミネアラム菌株Ｂ−４−５Ａは米国ミネソタ州ミネアポリスのミネソタ大学Ｓｍａｌｌ  Ｇｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３Ｃおよびロドトルラ・ピリミネ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｐｉｌｉｍｉｎａｅ）はＤｒ．Ｊ．Ｙ．Ｔａｋｅｍｏｔｏ（米国ユタ州ローガンのユタ州立大学）から入手した。アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ミクロドキウム・ニバル（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ウロクラジウム属種（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）およびクラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）はＤｒ．Ｂ．Ｋｒｏｐｐ（米国ユタ州ローガンのユタ州立大学）から入手し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）はＤｒ．Ｃ．Ｎｉｓｃｈｗｉｔｚ（米国ユタ州ローガンのユタ州立大学）から入手した。糸状菌および酵母はＰＤＢ−ＣＡにおいて３５℃で培養した。ミューラー−ヒントン培地（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）上で増殖させた黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８を除き、細菌株はルリア−ベルターニ培地（１４）上、２４時間３７℃で増殖させた。
【００８０】
インビトロ抗真菌剤試験の手順
インビトロ抗真菌活性は臨床・検査標準協会の一般的な方法（ＮＣＣＬＳ。糸状菌の液体培地希釈抗真菌剤感受性試験の参照方法。認可標準Ｍ３８−Ａ（米国臨床検査標準委員会、ペンシルバニア州ウェイン、２００２））により決定した。ＭＩＣ試験のため、フザリウム・グラミネアラム、ロドトルラ・ピリミネ、およびアスペルギルス・フラバスをＰＤＢ−ＣＡ培地において４８時間２８℃で好気的に振盪しながら増殖させた。ディスク拡散増殖阻害アッセイのため、さまざまな真菌種をＰＤＡ−ＣＡ培地プレート表面の中央に接種した。滅菌済みペーパーディスク（直径０．５ｃｍ）を接種済み寒天培地表面上に等距離で真菌接種材料の周囲に配置した。８μＬアリコートの試験溶液（１０ｍｇｍＬ−１）をディスクに塗布し、そのプレートを２４〜４８時間２８℃でインキュベートした後、ディスク周囲の増殖阻害のクリアゾーンとして見られる阻害パターンの試験を行った。ＭＩＣ決定アッセイを滅菌平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州コーニング）において５００〜１μｇｍＬ−１の範囲内で行った。類似体のストック溶液を水中で２ｍｇｍＬ−１の濃度で調製した。マイクロタイタープレートでは、５０μＬアリコートのストック溶液を第３列中に添加し、１０個の連続した２倍段階希釈液を各行において滅菌蒸留水で生成した。次に、４０μＬのＰＤＢ−ＣＡ培地および１０μＬアリコートの１００，０００大分生子／真菌懸濁液ｍＬを各ウェルに添加した。陰性（９０μＬの増殖培地および１０μＬの水）および陽性（９０μＬの増殖培地および１０μＬの培養物または大分生子）対照を別々のウェルに入れた。マイクロタイタープレートを２８℃でインキュベートし、２４時間毎に目視検査を行い、点数をつけた。単一のＭＩＣ試験での微量液体培地希釈アッセイを３回繰り返し、各試験を少なくとも２回繰り返した。
【００８１】
実施例１：６”−Ｏ−オクタンスルホニルカナマイシンＡ（Ｋ２０）
図１を参照して、テトラ−Ｂｏｃ保護カナマイシン（Ｂ４Ｋ）を報告された方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３４，１４６８−１４７６）で調製することができる。無水ピリジン（８００ｍＬ）中のＢ４Ｋ（９０ｇ）、塩化オクタンスルホニル（６４ｍＬ）の溶液を０℃で一晩撹拌し、温度を室温まで上昇させた。その透明な褐色がかった混合物をさらに６日間室温で、そして１日間４０℃で撹拌した後、油性粗生成物に濃縮した。水（５００ｍＬ）を添加し、その混合物をもう１日間撹拌した。その混合物を、さらなる水およびＥｔＯＡｃ（２Ｌ）を含む分液漏斗に移した。その有機層を０．５ＮのＨＣｌ（ａｑ）（×２）および水で洗浄した。一連の洗浄を３〜４回繰り返した。固体沈殿（ほぼ未反応Ｂ４Ｋ）が発生した場合、その有機層をまず濾過してその固体を除去した。洗浄の完了後、ＥｔＯＡｃ溶液はフリット漏斗を通して濾過し、ＥｔＯＡｃは蒸発させた。その褐色がかった粗生成物をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／４）の溶液（２００ｍＬ）で処理した。一晩撹拌した後、その溶媒を除去した。水を添加し、残留酸を確実に除去するように蒸発させた。その粗生成物を水に溶解し、ＥｔＯＡｃ中の色が透明になるまでＥｔＯＡｃで洗浄した。その水溶液は蒸発させ、Ｄｏｗｅｘ１Ｘ−８（Ｃｌ形態）を充填したカラムに通した。溶媒の除去後、所望のＫ２０を黄色がかった固体として得た。
【００８２】
他のＫ２０類似体、すなわちＫ０５、Ｋ０７、Ｋ１７、Ｋ１８、Ｋ１９およびＫ２２は塩化オクタンスルホニルの代わりに適切な反応物質を用いて同様の方法で調製することができる。
【００８３】
実施例２：細菌および真菌種に対するＫ２０の相対増殖阻害活性
ここで表１を参照すると、ディスク拡散寒天プレートアッセイにより決定される細菌および真菌のさまざまな種に対するＫ２０の相対増殖阻害活性が示される。
【００８４】
【表１】
2016520086.tif 000007
【００８５】
フザリウム・グラミネアラムに対して示される活性はかなり重要である。フザリウム・グラミネアラムは小麦に感染する真菌であり、その病害は赤かび病またはフザリウム胴枯れ病としても知られ、良質な小麦の収穫に対する深刻な妨害であり、多くの場合農業従事者は作物を処分せざるを得ない。表１に示されるディスク拡散アッセイデータと一貫して、フザリウム・グラミネアラムに対するＫ２０のＭＩＣ試験はＰＤＢ−ＣＡ増殖培地を用いて７．８〜１５．６μｇｍＬ−１のＭＩＣをもたらした。
【００８６】
実施例３：フザリウム・グラミネアラムおよび／またはロドトルラ・ピリミネに対するＫ２０類似体の抗真菌活性
ここで表２を参照すると、ＭＩＣアッセイまたはディスク拡散寒天プレートアッセイにより決定されるフザリウム・グラミネアラムおよび／またはロドトルラ・ピリミネに対するＫ２０類似体の相対増殖阻害活性が示される。
【００８７】
【表２】
2016520086.tif 000008
【００８８】
カナマイシンＡのアルキルスルホニル、アルキルカルボニル、およびアルキルチオ誘導体は、それでもいくらかの抗真菌活性を示すアルキルアミノおよびトルエン（ｐ−メチルフェニル）誘導体より活性であることが示された。
【００８９】
実施例４：Ｋ２０の選択的抗菌活性
Ｋ２０のＭＩＣを選択される細菌病原体について決定した。この段落で議論される実験を目的として、ＭＩＣは細菌の増殖を阻害するのに必要な化合物の最低濃度と定義される。選択される細菌の溶液をトリプチケースソイ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）中に３５℃で接種し、１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、細菌濃度を決定し、６２５ｎｍで０．０８〜０．１の吸収値まで、必要に応じて、液体培地で希釈した。その調整した接種済み培地（１００ｍＬ）を１０ｍＬの液体培地で希釈した後、９６ウェルマイクロタイタープレート（５０ｍＬ）に塗布した。一連のＫ２０の溶液（それぞれ２倍希釈液中５０ｍＬ）を試験ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３５℃で１２〜１８時間インキュベートした。ＭＩＣ試験を少なくとも３回繰り返した。Ｋ２０のＭＩＣ値（μｇｍＬ−１）は大腸菌Ｂについて２５０、ミクロコッカス・ルテウスについて６２．５であった。カナマイシンＡおよびＢの対応するＭＩＣ値はミクロコッカス・ルテウスについて０．９８μｇｍＬ−１、大腸菌Ｂについて１．９５μｇｍＬ−１であった。カナマイシンＡおよびＢのＭＩＣ値は効果的な抗細菌活性を示したが、Ｋ２０について決定された細菌ＭＩＣ値は一般的に候補化合物の効果的な抗細菌抗生物質としての検討を促す値（＜１６μｇｍＬ−１）を超えた。
【００９０】
まとめると、本発明のアミノグリコシド類似体は不十分な抗細菌活性を示し、または抗細菌活性をまったく示さず、環ＩＩＩ上の炭素アルキル鎖またはアリール環の存在のためカナマイシンＡとは構造的に異なる。親分子カナマイシンＡ上に存在しない環ＩＩＩ上の炭素アルキル鎖またはアリール環は、本発明の新規抗真菌活性の要因である可能性が高い本発明の構造的特徴である。従来のアミノグリコシドは細菌耐性を促進するが、本発明の使用は細菌耐性を促進しないので、本発明の真菌特異性は作物保護戦略に利益をもたらすだろう。
【００９１】
実施例５：イトラコナゾールおよびＫ２０によるアゾール耐性カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１の相乗的阻害を決定するディスク拡散試験
方法：ディスク拡散増殖阻害アッセイにより決定されるインビトロ抗真菌活性は臨床・検査標準協会により推奨される方法２、３によって決定した。カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１酵母細胞をＰＤＢ−ＣＡ培地において４８時間３０℃で好気的に振盪しながら増殖させた。培養密度を〜５×１０５ｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１に調整し、その真菌培養物をＰＤＢ−ＣＡ寒天プレート培地表面上に塗抹した。滅菌済みペーパーディスク（直径０．５ｃｍ）を接種済み寒天培地表面上に配置した。図２に示されるように、１０μＬのイトラコナゾール（ＩＴＣ）＋Ｋ２０（０．５＋３２μｇ／ｍＬ）、ＩＴＣ（０．５μｇ／ｍＬ）、Ｋ２０（３２μｇ／ｍＬ）および蒸留水をそのディスク上に（それぞれ、左から右に）塗布した。そのプレートを２４〜４８時間最適な増殖温度（３０℃）でインキュベートした後、増殖阻害について観測される阻害クリアゾーンの直径の試験および測定を行った。
【００９２】
結果：増殖阻害ゾーンはＩＴＣ＋Ｋ２０の組み合わせのみで視認でき（図２）、相乗的殺真菌活性を示した。ディスク当たり０．５μｇｍＬ−１および３２μｇｍＬ−１のＩＴＣおよびＫ２０単独では殺真菌活性を有さなかった。
【００９３】
実施例６：アゾールおよびＫ２０によるアゾール耐性カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１の相乗的阻害を決定するチェッカーボードアッセイ
方法：アゾール耐性Ｃ．アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１に対するＫ２０とアゾールとの間の相互作用は酵母のＣＬＳＩ  Ｍ２７−Ａガイドラインに従って微量希釈チェッカーボード法を用いて試験した。相乗的相互作用は９６ウェル平底マイクロタイタープレートを用いて行った。Ｃ．アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１接種材料は寒天プレート上の生細胞コロニー計数により決定される１×１０５ｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１の生細胞密度であった。薬剤の最終濃度はイトラコナゾール（ＩＴＣ）について０．０４〜３μｇｍＬ−１；フルコナゾール（ＦＬＣ）について０．３〜４８μｇｍＬ−１；ボリコナゾール（ＶＲＺ）について０．０１〜１μｇｍＬ−１；メトコナゾールについて０．０７〜２．５μｇｍＬ−１；ピラクロストロビンについて０．０４〜３μｇｍＬ−１；クロトリマゾールについて０．０７〜２．５μｇｍＬ−１；チオコナゾールについて０．００５〜０．５μｇｍＬ−１；ポサコナゾールについて０．００５〜２μｇｍＬ−１；ケトコナゾールについて０．３〜２４μｇｍＬ−１；およびＫ２０について２〜２５６μｇｍＬ−１の範囲であった。
【００９４】
マイクロタイタープレートでは、５０μＬアリコートのＫ２０のストック溶液を第９列中に添加し、８個の連続した２倍段階希釈液を各行において滅菌蒸留水で生成した。同様に、１００μＬアリコートのアゾールのストック溶液を第８行中に添加し、８個の連続した２倍段階希釈液を各列においてＫ２０および滅菌蒸留水と混合して生成した。この方法では、すべてのアゾール標準希釈液を適切な濃度のＫ２０化合物と混合し、こうして一連のアゾールおよびＫ２０化合物の組み合わせを得た。次に、９０μＬのＰＤＢ−ＣＡ増殖培地および１０μＬの真菌培養物を各ウェルに添加した。陰性（１９０μＬの増殖培地および１０μＬの水）および陽性（１９０μＬの増殖培地および１０μＬの有機体）対照を別々のウェルに入れた。プレートを室温または３０℃でインキュベートし、２４〜４８時間毎に目視検査を行い、点数をつけた。単一の試験でのチェッカーボード微量液体培地希釈アッセイを３回繰り返し、各試験を少なくとも２回繰り返した。Ｋ２０およびアゾールの組み合わせの分析は分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）を下記：ＦＩＣＩ＝（ＭＩＣ薬剤Ａ組み合わせ／ＭＩＣ薬剤Ａ単独）＋（ＭＩＣ薬剤Ｂ組み合わせ／ＭＩＣ薬剤Ｂ単独）のように計算することにより得た。薬剤相互作用は分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）に従って相乗、無作用、または相反と分類した。相互作用は、ＦＩＣＩが≦０．５であった場合に相乗、＞０．５だが＜４．０であった場合に無作用、＞４．０であった場合に相反と定義した。
【００９５】
結果：（表３にまとめる）。アゾールおよびＫ２０の最小阻害濃度（ＭＩＣ）値はＣ．アルビカンス１０２３１に対してそれぞれ０．２５〜４８μｇｍＬ−１および１２８μｇｍＬ−１の範囲であった。同様に、アゾールおよびＫ２０のインビトロ相互作用はＣ．アルビカンス１０２３１に対して相乗効果を示し、ＦＩＣＩ値は０．１２〜０．３１の範囲であった。
【００９６】
【表３】
2016520086.tif 000009
【００９７】
実施例７：ＰＤＢ−ＣＡ培地において増殖するアゾール耐性カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１に対するイトラコナゾールおよびＫ２０の相乗的相互作用を観測する殺菌時間曲線
方法：菌株カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１をＰＤＢ−ＣＡ培地において１０５ｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１の接種材料サイズで調製した。用いた薬剤濃度はＫ２０について３２μｇｍＬ−１、イトラコナゾールについて０．１８μｇｍＬ−１であった。指定時間（インキュベーション後０、３、６、９、２４および４８時間）で、１００μＬアリコートを各溶液から除去し、滅菌水で１０倍段階希釈した。各希釈液の１００μＬをポテトデキストロース寒天プレートの寒天表面上にストリークし、増殖させた。コロニー数は４８時間のインキュベーション後決定した。実験は３回繰り返した。抗真菌剤の組み合わせの相互作用評価のため、次の基準を適用した：（ｉ）「相乗作用」はもっとも活性な成分と比較してｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１の≧２ｌｏｇ１０減少と定義され；（ｉｉ）「拮抗作用」はもっとも活性でない成分と比較してｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１の≧２ｌｏｇ１０増加と定義される。
【００９８】
結果：イトラコナゾールおよびＫ２０の相乗的相互作用はカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１に対する殺菌時間曲線により確認した（図２）。それぞれ０．１８＋３２μｇｍＬ−１（白抜きの四角、□）、およびそれぞれ０．３７＋３２μｇｍＬ−１（黒塗りのマル）のイトラコナゾールおよびＫ２０の組み合わせは、０．１８および０．３７μｇｍＬ−１のイトラコナゾール（それぞれ黒塗りの三角、およびバツ、×）ならびに３２μｇｍＬ−１のＫ２０（白抜きのひし形、◇）単独と比較してｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ−１の≧２ｌｏｇ１０減少をもたらした。３２μｇｍＬ−１のＫ２０単独での効果は化合物の添加のない対照（黒塗りの四角）と同じであった。
【００９９】
実施例８：チャイニーズハムスター卵巣細胞に対するイトラコナゾールおよびＫ２０の混合物の細胞毒性
方法：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（株１〜１５）は、標準的な動物細胞培養条件（５％ＣＯ２、３７℃）下、４８時間、往復振盪フラスコにおいて約５０〜１００ｒｐｍでＨｙＣｅｌｌ  ＣＨＯ増殖培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に維持および懸濁した。細胞を２．５×１０５細胞ｍＬ−１の細胞密度で１０ｍＬの培地を含有する滅菌５０ｍＬＦａｌｃｏｎコニカルプラスチックチューブに移した。０．１８：３２、０．３７：１６、０．９：１６０および３．７：８０の最終濃度比（［イトラコナゾール］：［Ｋ２０］（μｇｍＬ−１））でのイトラコナゾールおよびＫ２０の異なる組み合わせの混合物、イトラコナゾール単独（３．７μｇｍＬ−１）、Ｋ２０単独（１６０μｇｍＬ−１）、ならびに等量の滅菌再蒸留水（未処理の対照）をその懸濁細胞に別々に添加した。その懸濁液を加湿したインキュベータにおいて５％ＣＯ２、３７℃で４８時間、連続的に撹拌しながらインキュベートした。２４および４８時間後、１ｍＬポーションの細胞培養懸濁液（処理済みまたは未処理の薬剤）をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲカップに移し、トリパンブルーと混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ計数装置において細胞数および生存率を決定した。
【０１００】
結果および結論：最適な抗真菌剤ＦＩＣＩをもたらすイトラコナゾールおよびＫ２０の混合物（例えば０．１８：３２および０．３７：１６の［イトラコナゾール］：［Ｋ２０］（μｇｍＬ−１））は未処理の対照と比較してＣＨＯ細胞に対して毒性効果を示さなかった（図３）。しかしながら、生存率の３８％および６３％減少をそれぞれ０．９：１６０および３．７：８０の［イトラコナゾール］：［Ｋ２０］（μｇｍＬ−１）比で観測した。１６０μｇｍＬ−１のＫ２０単独では毒性でなく、未処理の対照のそれに匹敵する生存率を示した。３．７μｇｍＬ−１のイトラコナゾール単独では細胞生存率が６３％減少した。その結果は、最適なＦＩＣＩを示す、最低ＦＩＣ値を有する薬剤濃度のイトラコナゾール：Ｋ２０の組み合わせ混合物がＣＨＯ細胞に対して毒性でないことを示す。また、Ｋ２０はそのＭＩＣ（最大１６０μｇｍＬ−１）を超える濃度でＣＨＯ細胞に対して毒性でないが、イトラコナゾールはそのＭＩＣより５倍高い濃度でこれらの細胞に対して毒性である。図３に示されるデータは次のように説明され得る：棒は細胞生存率の程度を表し、薬剤処理なし（対照）（Ａ）、Ｋ２０（１６０μｇｍＬ−１）（Ｆ）およびイトラコナゾール（３．７μｇｍＬ−１）（Ｇ）での処理、ならびに０．１８：３２（Ｃ）、０．３７：１６（Ｄ）、０．９：１６０（Ｅ）、および３．７／８０（Ｆ）の［イトラコナゾール］：［Ｋ２０］（μｇｍＬ−１）比のイトラコナゾールおよびＫ２０の組み合わせでの処理である。
【０１０１】
本発明の前記説明は当業者が現在その最良の態様であるとみなされるものを製造および使用することを可能とするが、当業者であれば本明細書の特定の実施形態、方法、および実施例の変形、組み合わせ、および同等物の存在を理解するだろう。本発明はしたがって、上述した実施形態、方法、および実施例によって限定されるべきではなく、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲および精神内のすべての実施形態および方法により限定されるべきである。こうした実施形態は、これらに限定されないが、スプレー、局所塗布、または注入を含む、本発明の化合物の異なる適用手段を含んでもよい。さまざまな実施形態はまた真菌感染に感受性である異なる種類の宿主の治療を含んでもよい。宿主のタイプとしては、これらに限定されないが、温血動物（ヒトおよび他の哺乳類を含む）、植物、魚、または細菌培養物を挙げることができる。
【０１０２】
さまざまな上記および他の特徴および作用、またはこれらの代替は望ましくは多数の他の異なるシステムまたは用途に組み合わせてもよいことが理解されるだろう。また、現在まだそこで想定されていないさまざまな代替、変更、変形、または改善はその後当業者により行われ得、下記特許請求の範囲にも含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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