(57)【要約】  ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、中程度から重度の出血において補助剤又は一次治療として使用するために設計された凍結乾燥したフィブリン止血剤である。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、開腹手順において又は非侵襲性シーラントとして傷に直接適用することができる。その架橋技術によって、大量止血に要求される強くて安全な接着性フィブリンシーラントが生成される。その塊の付着特性、並びに、フィブリンクロットの迅速な形成及び安定性は、強くて安定したフィブリンクロットが、傷のグレードに応じて１から５分以内に形成されるということを確実にしている。その薬剤は、安心で生体適合性且つ生分解性であり、さらに、室温にて１年間保管することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）凍結乾燥したｄｅｓＡＢフィブリンＩＩポリマーの層と、
ｂ）凍結乾燥したトロンビンの層と、
を含む、最小限に加圧して出血を制御するためのフィブリンシーラント組成物。
【請求項２】
前記フィブリンポリマーが、中和緩衝液とのフィブリンＩＩモノマーの反応によって作製され、前記中和緩衝液は、１：１の体積比で添加される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
体積基準で添加される約１％から約５％のグリセロールをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記中和緩衝液は、
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、
３ｍＭ  ＣａＣｌ２、
０．１２ｇ／ｍＬ  Ａｃｔｉｖａ（カルシウム非依存的グルタミン転移酵素）、及び、
中和緩衝液１ｍｌあたり２１ローリー単位の第ＸＩＩＩ因子、
を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
８．５のｐＨを有する、請求項４に記載の中和緩衝液。
【請求項６】
前記フィブリンポリマーは、前記中和緩衝液内に混ぜ合わされるカルシウム非依存的グルタミン転移酵素を使用して架橋される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
生体適合性であるとして特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
出血している傷つけられた組織に適用される場合に、血液を吸収してゲルを形成し、前記ゲルは、傷の上に安定したフィブリンクロットの形成をもたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
止血が、前記傷つけられた組織への当該組成物の適用後１分以内に、加圧して又は加圧せずにもたらされる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
出血を制御するための装置であって、請求項１に記載の組成物を、接着性支持体上に置くか又は支持体なしで使用することができる、装置。
【請求項１１】
前記接着性支持体は、生分解性であり、さらに、除去可能である、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記接着性支持体は、非生分解性の接着性包帯である、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記フィブリンポリマーは、種々の形状及びサイズを有する型において凍結乾燥される、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年６月１８日に出願し、２０１２年１１月６日に特許査定が通知され、さらに、特許料が２０１３年２月６日までに支払われるべきである（許可された）米国特許出願第１２／４８７，０５７号の一部継続出願である。全ての説明、図面及びその中で明記された教示は、参照によりはっきりと本願に援用され、さらに、その中ではっきりとされた教示に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、接着性シーラント成分及び止血剤としての適用に対する、滅菌した生体適合性の凍結乾燥したｄｅｓＡＢフィブリンポリマー、又は、酸性溶液中の濃縮されたｄｅｓＡＢフィブリンモノマー若しくはフィブリンＩＩモノマーからのフィブリンＩＩポリマー組成物、及び、凍結乾燥したトロンビンを含む二成分又は二重膜系を生成する方法に関する。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋと商標が登録された製剤（発明）が種々の固体形状及び厚さで与えられ、加圧して及び加圧せずにｉｎ  ｖｉｖｏで出血を止めるか又は組織を塞ぐために使用することができる。本発明は、特に、組織を塞ぎ、さらに、血管性、表皮性、骨又は内部の出血を制御するために生分解性支持体又は出血している傷にわたる適用後に剥離することができる支持体を要することなくフィブリンクロットを貼る必要性に関する。本発明は、ヒアルロン酸又は他の生分解性ポリマーで作製された生分解性支持体を含んでもよい。
【背景技術】
【０００３】
臓器切除、外傷又は大きな皮膚創傷に対する重度の出血は、制御するのが困難な場合がある。最近では、フィブリンベースのパッチが、セルロース又はゼラチンの支持体を使用してグレードＩＶ／Ｖの傷を塞ぐかテストされてきた。しかし、これらの技術は、インターベンショナルラジオロジー、整形外科手術又は腹腔鏡手術等、特定タイプの手技に対して適用することができない。加えて、これらの生成物によって使用される「支持体」は、生分解されるまで体内に残り、異物に対する重度の炎症反応を引き起こす。
【０００４】
現在の解決策及び制限
一般に、合成接着剤が、血管又は肺の密封に対して、及び、皮膚切開の縁を「接着する」ために使用される。これらの接着剤は、一般には、傷が跡を残した後で、生分解、吸収によって、又は、瘡蓋の形状での単純な剥離によって除去される。種々の技術が、組織接着剤の製法に対して開発されてきた。それらの一部は、シアノアクリレート（２−ブチルシアノアクリレート、２−オクチルシアノアクリレート）に基づく接着剤等、合成起源のもの又は合成ポリマーであり、さらに、他のものが、止血特性を加えて有するコラーゲン又はフィブリン等の生物学的物質を含有する。
【０００５】
その止血及び接着特性の結果として、シーラント、特にフィブリンシーラントが、重合するに従いヒト組織に接着する能力のため、２０年以上もの間、失血及び術後出血を減らすためにほとんどの外科専門領域において広く使用されてきた（１、２、３）。これらの化合物は、縫合されたか又はホチキスでとめられた傷の封着を塞ぐか又は補強するために使用され；損傷した領域にわたって圧力をかけながら使用することもできる。フィブリンシーラントは、血液凝固カスケードの最後のステップを模倣する生物学的接着剤である（４）。シーラントの主成分は、一方でフィブリノゲン、血漿タンパク質及び第ＸＩＩＩ因子であり、もう一方でトロンビン及び塩化カルシウムである。成分は、ヒト血漿から抽出されるか又は組換え技術によって生成されることが多くある。フィブリノゲン及びトロンビンを混ぜ合わせることによってポリマーバリア（フィブリン）が作られ、ポリマーバリア（フィブリン）は、自然な血液凝固カスケードの最後の段階をシミュレートして、生理学的なクロットと類似の構造化されたフィブリンクロットを形成する。
【０００６】
入手可能な商品（Ｆｌｏｓｅａｌ、Ｇｅｌｆｏａｍ、Ｅｖｉｃｅｌ、Ｂｉｏｇｌｕｅ、ｓｕｒｇｉｃｅｌ、ｔａｃｈｏｓｅａｌ等）がいくつかある（３、５）。しかし、これらの製品は著しい限定を有し、外科手術における、さらに、救急医療、整形外科的及び介入的画像診断並びに腹腔鏡手術における重度の出血の場合のその広範な使用を妨げてきた。腔内出血に対する全ての現存する止血剤は、軽度から中程度の出血において補助剤として使用されるように設計されており、さらに、過度の加圧を要求している。最小限に加圧可能な出血に対する組織接着剤及びシーラントの組成物の開発及び／又は使用において直面する主要な限定の１つは、おびただしい出血がある場合に組織に対して十分に強い結合を形成することができないこと、及び、適用の１０分以内に安定したクロットを生成することができないことである。従って、組織接着剤及びシーラントは、許容できる実行に対して要求される組織結合強度を減らすように、加圧方法、縫合及び／又はホチキス留め、並びに接着性パッチと組み合わせて利用されなければならない。しかし、強い加圧、縫合及び／又はホチキス留めの使用が、（例えば、骨、インターベンショナルラジオロジーにおいて等）望ましくない、不適切又は不可能な状況が多くある。
【０００７】
本願の代わりとなるアプローチ：
血液の流れに抵抗する物理的バリアを形成するために、接着性マトリックスが、その瞬間に、強いフィブリンインターフェースを形成し、血液が流れる中で組織と結合し、さらに、裂傷した部位に残ってクロットを形成しなくてはならない。四角、丸いパッチ、球、円筒又は円錐の形状の製品の体裁のそれぞれのヒト組織に接着する能力は、血液凝固カスケードを刺激するための、フィブリンの組成及び生成方法、並びに、トロンビンとのその相互作用（組合せ）に関連付けられる。技術の本質的な態様は、フィブリンモノマーを生成するフィブリノゲンの切断プロセス、及び、その後の重合、凍結乾燥をバイパスする能力、並びに、血液を吸収してフィブリンクロットを形成する能力である。薬剤が、すでに安定化されたＩフィブリンポリマーからクロット形成プロセスを開始し、Ｉフィブリンポリマーは、血液凝固カスケードを刺激するのに必要な成分（トロンビン）を含有する凍結乾燥し架橋したポリマー内に血液を吸収し、さらに、適用の２分以内に機能的なフィブリンクロットになる物理的バリアを形成する（６）。
【０００８】
本願のアプローチにおいて、これらの結果は、ａ）血液を吸収して、裂傷した部位に付着する非常に粘着性のゲルの様なマトリックスを形成する重合による架橋され凍結乾燥したフィブリンネットワークの適用；及びｂ）製品中に取り込まれたカルシウム非依存的グルタミン転移酵素によって、及び、血液由来の第ＸＩＩＩ因子によって安定化される強力なフィブリンクロットの迅速な形成に寄与するトロンビン層の取り込み；を介して得られる。
【０００９】
生分解性で除去可能な支持体上の後の層における凍結乾燥プロセスは、その適用を促進し、さらに、長期の保管、輸送及び準備を可能にする。
【００１０】
加えて、フィブリンベースではない製品が、深い切り傷又は大きな創面（ｂｅｄ）の皮膚の傷からの出血を停止する必要性に取り組むために開発されてきており、深い切り傷又は大きな創面の皮膚の傷は、ひと針又は縫合を要求することが多くあるそのような重度の出血を引き起こす。
【００１１】
組成物
本願における技術の形状、すなわち四角形、球形、円筒形又は円錐形の全てが、酸性溶液においてフィブリンモノマーを取り込み、活性化されたグルタミン転移酵素（カルシウム非依存的）及び第ＸＩＩＩ因子（カルシウム依存的）（カルシウム依存及びカルシウム非依存）並びに塩化カルシウムの存在下で、緩衝液により中和されたｐＨの変化によって重合される。フィブリンポリマーが形成され且つ架橋されると、トロンビンの第２の層が取り込まれ、後に凍結乾燥される（図１）。
【００１２】
モノマーを約１％から約５％の量のグリセロールと混ぜ合わせて、適用のタイプの順応される特定の粘弾特性を達成することができる。塊による血液の吸収は、凍結乾燥したフィブリンをゲルにし、それが、損傷の部位にてフィブリンクロットを形成する（７）。
【００１３】
血液凝固の条件下で、カルシウム非依存的グルタミン転移酵素及び血液由来の活性化された第ＸＩＩＩ因子が、共有結合を介してフィブリンクロットを安定化させることによってこのプロセスに寄与する。
【００１４】
鍵となる特質、重合／接着
傷を塞ぐフィブリンゲルが、凍結乾燥した二重膜材料による血液の吸収の結果として形成され、その二重膜材料は、固体からゲルの状態に変わりながら共有結合を維持する。クロットは、機械的に安定し、傷によく統合され、さらに、架橋していないクロット（８）又は他のフィブリンシーラントと比較してプラスミンによる溶解に対してより耐性である。カルシウム非依存的グルタミン転移酵素の包含によって、フィブリン促進性のインテグリンクラスター形成におけるグルタミン転移酵素が媒介するａＣドメインポリマーの架橋が促進され、その結果、細胞接着及び伸展を増加させ、それが、フィブリンを刺激して、ａｖｂ３−、ａｖｂ５−及びａ５ｂ１−インテグリンを内皮細胞上に結合させる（９）。オリゴマー形成も、接着班キナーゼ（ＦＡＫ）及び細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）を介したインテグリン依存的細胞シグナル伝達を促進し、それが、細胞接着及び細胞遊走を増加させる（１０）。カルシウムイオンの存在は、炎症反応から血液凝固カスケードへの進行（第１の段階）を強化し、さらに、第ＸＩＩＩ因子を活性化する。
【００１５】
きわめて重要なヒト組織に対する接着特徴、及び、提案した薬剤の重合の動態学が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでテストされてきた。得られたデータは、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの種々の体裁の、実質臓器又は軟組織内の誘発された腹腔内の傷において最小限に加圧して出血を止める及び止血を達成する能力、さらに、ブタモデルにおける人工膝関節置換及び人工股関節置換の髄内の骨出血を止める能力の十分な証拠を提供している。
【００１６】
凍結乾燥したフィブリンＩＩは、フィブリンＩＩモノマーの重合から得られ：（許可された）米国特許出願第１２／４８７，０５７号が、フィブリンモノマーを調製する方法を記載している。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋシーラント組成物は、フィブリンモノマーの中和から得られる凍結乾燥したフィブリンポリマーを使用する。この特許出願に記載されるフィブリンＩＩの一部の組成及び生成方法、並びに、中和のプロセス及びポリマーの架橋は、提案された技術の実行に重大な意味を持ち、その技術は、フィブリン自体の特徴（繊維の厚さ、枝分かれ部位の数、多孔度及び透過性）、並びに、凝固因子を定める他の重合特徴に依存する。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋによって生成されるクロットは、厚い繊維の不透明なマトリックスを作り、従って、管腔形成が、透明なマトリックスよりも速い速度にて進む。フィブリンモノマーを生成するためのトロンビンの濃度、従って、ＦＰＡの放出速度も、重合プロセスに対して重要な影響を有する。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋに対して確立された記載される濃度、希釈度及びｐＨは、速められた速度にて最適なフィブリン構造を生成する。
【００１７】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの体裁：
フィブリンポリマーは、適用のタイプ（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）に順応させるために、種々のサイズ、厚さ及び形状で生成且つ凍結乾燥することができ、腹腔鏡下のポート又はインターベンショナルラジオロジーの場合に血管を介して導入されるように、１／４インチの直径の小さい球又は円筒で構成することができ；脾臓裂傷又は臓器切除における使用に対して、１／４、１／２、１’’の厚さで種々のサイズの丸い又は四角い平らな固形ブロックで成形することもでき；又は、接着ガーゼ包帯にわたって置いて、深い皮膚の切り傷をカバーすることができる。凍結乾燥した形態を、水中に浸漬する及び封着のり又はゲルとして使用することもできる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、生分解性且つ無毒性の、例えば、開腹手術若しくは腹腔鏡手術における止血に対する補助剤として、又は、整形外科手術、外傷（脾臓裂傷）、インターベンショナルラジオロジー及び大きな創面の傷における一次治療として、治療用途を目的とした生物学的接着剤及び組織シーラントの領域内にある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
一態様において、本発明は、生体再吸収性且つ無毒性である、外科的又は治療的使用に対する生体適合性の接着性フィブリンポリマーに関する。本発明は、血液凝固を刺激するために所与の部位において放出することができる生理活性物質を含有する二重膜の適用にも関する。別の態様において、本発明は、そのような接着性ポリマーを生成するプロセスに関する。
【００２０】
広範囲にわたるｉｎ  ｖｉｖｏでの研究によって、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、中程度から重度の出血を制御する優れた止血剤の候補であるということが示されている。その異なる体裁は、種々のタイプの外科的及び外傷適用における止血効果を最大限にする。その薬剤は、耐久性があり、保管するのが容易で、最小限のリスクを提起し、使用するのにほとんど訓練を要求せず、さらに、中程度から重度の出血に対して非常に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの層分けを示した図である。
【図２】可能な形状を示した図であり：Ａ  球形及び円筒形；Ｂ  パッチ又はブロック；Ｃ  包帯を示した図である。
【図３】Ｔｉｓｓｅｌ、Ｆｌｏｓｅａｌ及びＥｖｉｃｅｌとの、クロットの塊（Ｃｌｏｔｃａｋｅ）の組織内粘着強度の比較を示した図である。
【図４】ＡＣＴＩＶＡ及びＡｃｔｉｖａ＋第ＸＩＩＩ因子の存在下でのフィブリンの重合、架橋及び安定化を示した図である。
【図５】ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの適用による胃部分切除における一次治療としての術中出血の制御を示した図であり、適用後５分*以内（３．２±１．４分の中央値）の固形クロットの形成を示した図である。
【図６】パッキング又は縫合なしの一次治療としての脾臓裂傷出血の制御を示した図である。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの適用によって、止血を適用後５分以内に達成した。
【図７】ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの適用によるグレードＩＶの肝損傷における一次治療としての術中出血の制御を示した図である。止血を５分以内に達成した。肝部分切除における術中出血を制御するための、止血に対する補助剤としてのゲル形状でのＣｌｏｔＢｌｏｃｋの止血効果が示されている。止血を適用後５分以内に達成した。
【図８】適用後２週間（Ａ）での腎臓及び肝臓中の間質内空間において捕捉された蛍光での痕跡を５週間（Ｂ）後と比較した、紫外光下での顕微鏡検査を示した図である。
【図９】サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を使用した、ブタにおいて生成することができるトロンビンに対する抗体の検出を示した図である。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ製剤に曝露したヒト線維芽細胞の培養におけるａ．  ＨＦ−未処理ｂ．  ＨＦ＋ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ、Ｄａｙ５
【図１０】サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を使用した、ブタにおいて生成することができるトロンビンに対する抗体の検出を示した図である。
【図１１】ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ製剤に曝露したヒト線維芽細胞を示した図であり、細胞に対するダメージ又は毒性は全くなく、さらに、いかなる細菌又は真菌の汚染もなく；細胞は、対照の未処理の培養におけるものよりもわずかに大きいよう見えた。ａ．  −未処理、Ｄａｙ５ｂ．  線維芽細胞＋ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ、Ｄａｙ５
【図１２】ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ製剤に曝露したヒト上皮細胞の培養（Ａ５４９）を示した図であり、細胞に対するダメージ又は毒性は全くなく、さらに、いかなる細菌又は真菌の汚染もなく；細胞は、対照の未処理の培養におけるものよりもわずかに大きいように見えた。ｃ．  Ａ５４９細胞−未処理、Ｄａｙ５ｄ．  Ａ５４９細胞＋ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ、Ｄａｙ５
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者等は、Ｃｌｏｔｂｌｏｃｋとして商標を登録した、種々の形状及び支持体で形づくることができる止血剤を開発した。その薬剤は、トロンビンによって補われる新規のフィブリンシーラント（フィブリンＩＩモノマーの中和によって作製される純なフィブリンＩＩ）であり、さらに、重度の出血の場合に止血を促進するように、並びに、最小限に加圧して、臓器切除、外傷及び／又は実質臓器の傷、軟組織、骨及び大きな創面の傷から生じる出血を止めるように設計されている。このシーラント剤は、血液凝固を促進し、さらに、止血だけでなく、ダメージを受けた組織の表面間の接着性を提供する。本発明のフィブリンシーラントは、１）重度の出血に対する補助剤として若しくは一次治療として使用することができるか；又は、２）腹腔鏡下のポートを介した送達に対して形づくることができるか、若しくは、臓器切除における加圧として使用することができるか；又は、３）皮膚裂傷の場合に使用するために支持体上に配置することができるか；又は、４）インターベンショナルラジオロジーの場合にカテーテルを介して送達されるように形づくることができるか；又は、５）整形外科手術若しくは外傷から起こる髄内出血を塞ぐように形づくることができる。
【００２３】
体裁のそれぞれは：１）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた酢酸溶液（ｐＨ３．４）におけるフィブリンモノマーの中和によって生成され、且つ、活性化された第ＸＩＩＩ因子及びカルシウム非依存的グルタミン転移酵素によって架橋されたフィブリンＩＩポリマー；２）各４ｍｌのフィブリンに対して１ｍｌの割合でＨＥＰＥＳ水溶液において溶解された２０ＮＩＨ単位／ｍｌの濃度のトロンビンの層；及び、３）フィブリンとトロンビンの層の間に第３の層ＰＬＧＡフィブロネクチン包埋微粒子を添加する選択肢；を含む凍結乾燥した二重膜を含む（図１）。
【００２４】
凍結乾燥した二重膜は、裂傷した出血組織上に適用され、血液を吸収して、粘着性でゴム様のゲルバリアを形成し、後に、フィブリンによって血液が吸収されるに従いフィブリンクロットを形成する。薬剤は、１）２分以内に傷を塞ぎ、２）裂傷した組織と共に結合する。
【００２５】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、必要に応じて形状、弾性及び凝固強度が変わるいくつかの製剤で開発されてきた。
【００２６】
組成及び適用
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、２つの層で生成され、凍結乾燥したフィブリンポリマーを含み、凍結乾燥したトロンビンの層の上にのせられている。第１の層は、参照により本願に援用する米国特許出願第１２／４８７，０５７号において記載される方法によって、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１２ｇ／ｍＬ  Ａｃｔｉｖａ（カルシウム非依存的グルタミン転移酵素）及び中和緩衝液１ｍｌあたり２１ローリー単位の第ＸＩＩＩ因子で構成される緩衝液ｐＨ８．５と混ぜ合わされる酢酸溶液におけるフィブリンモノマーの中和によって生成される架橋されたフィブリンポリマーを含有する。これら２つの溶液は、滅菌した型の内側で１：１の比で混ぜ合わされる。この組成に対して、所望のブロックの可撓性に応じて１％から５％のグリセロールを添加することができる。
【００２７】
この型は、ＴＹＶＥＫ（Ｅ．Ｉ．Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ（ＤＥ）の登録商標）滅菌袋の内側で密封され、さらに、３７℃にて４時間インキュベートされる。
【００２８】
第２の層は、２０単位／ｍＬの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝液において溶解されたトロンビンの溶液を、フィブリンに対して１：４の割合で含有する。
【００２９】
ステップ１：各成分が、０．２２ミクロンＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタを通した濾過によって滅菌される。各層は、所望の形状（円形、楕円形又は四角形）のシリコン型に注がれ、ポリグラクチンメッシュ、又は、ｓＤ，Ｌ−ラクチドポリマー合成メッシュ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）／ポリ（グリコリド−ｃｏ−ラクチド）コポリマー（ＰＬＧＡ）膜若しくはポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ等、除去可能又は生分解性のポリマーのメッシュによって；或いは、皮膚裂傷の場合に使用するための自着包帯によって；支持することができる約３／４から１’’の厚さの「塊」を生成する。
【００３０】
ステップ２：Ｃｌｏｔｂｌｏｃｋは、次に、２００〜４００ミリトルの圧力にて１８〜７２時間もの間、−４０℃から−５０℃の冷却器の温度、２１℃の棚の温度にて凍結乾燥される。
【００３１】
ステップ３：ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの各断片が、水分損失を防ぎ且つ滅菌性を維持するために気密に塞がれたプラスチックバッグにおいて包装される。
【００３２】
ステップ４：ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、１から２分間、中程度に加圧しながら直接傷上に適用される。３分以内に、フィブリンクロットが傷上に形成される。
【００３３】
代わりとなる送達方法：
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、１／２’’の直径及び１’’から２’’の長さの小さな円筒に形づくることができ、それは、腹腔鏡下のポートを介して腔内の傷に、又は、カテーテルを介して出血している血管を塞ぐために送達することができる。
【００３４】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、４：２の割合で水に溶かして液体ゲルを形成することができ、液体ゲルは、１つの注射器を用いて裂傷又は傷の上に適用することができる。
【００３５】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、粘着剤又は非粘着剤の上に置くことができ、酸性溶液における濃縮ｄｅｓＡＢフィブリンモノマー又はフィブリンＩＩモノマー由来の、可撓性でファブリックの接着包帯及び滅菌の生体適合性の凍結乾燥したｄｅｓＡＢフィブリンポリマー又はフィブリンＩＩポリマー組成物を含む二重膜系であり、出血を止めるか又は皮膚組織を塞ぐために使用することができる。この送達方法は、特に、包帯により加圧されるフィブリンクロットを貼ることによって大きいか又は深い皮膚の切り傷からの出血を停止する必要性に関連付けられる。
【００３６】
実施例
止血特徴が、動物研究においてテストされ、ＣＬＯＴＢＬＯＣＫシーラントは、他のシーラントよりも強く且つ速くフィブリンクロットを形成することが示されてきた。この接着剤は、フィブリンシーラントに対して観察されるものよりも優位に高い強度で、裂傷した組織に接着し且つ相反する組織を共に結合させると予想される。
【００３７】
以下の臨床検査を、動物実験（グレードＩＩＩ及びＩＶの肝臓の傷に対するネズミ、ウサギ及びブタのモデル）と相互作用的に行った。
【実施例１】
【００３８】
ベースラインの製剤に対するＥｘ−ｖｉｖｏでの実験：接着及び血液凝固特性
本発明者等は、スプラーグドーリーラットの肝組織においてアイソメトリックトランスデューサを用いて接着及び張力測定（組織内粘着性及びクロット強度）を行った。
【００３９】
張力測定：２つの最も大きな肝葉を分離した。１つの葉を、後にアイソメトリックトランスデューサに固定した保持器に付着させた。もう１つの葉を、トランスデューサの保持器内の肝臓の断片との接触をもたらすために徐々に上げる及び下げることができる容器内の平らなガーゼの土台に置いた。１ｃｍ２のダメージを受けた領域を、両方の肝臓の断片において生成した。組織の粘着性に対してテストされることになる製剤を、２つの断片の間に堆積させた。検体を、０ｇｒのベースライン圧力にて接触させて置いた。種々の時点（曝露及び接触の１、５及び１０分）にて、それらを完全に離すのに必要とされる圧力を記録した。本発明者等は、Ｔｉｓｓｅｌ、Ｆｌｏｓｅａｌ及びＥｖｉｃｅｌと、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの組織内粘着性を比較した。組織内粘着性の結果は、図５において描かれている。１０分後のＣｌｏｔＢｌｏｃｋによって誘発された粘着の力は、組織内接着モデル（図３）において、Ｅｖｉｃｅｌの１５０％を超える強さであり、さらに、対照の８００％を超える強さである。
【実施例２】
【００４０】
フィブリン重合の分子化学
本発明者等は、フィブリンモノマーの重合（ｐＨ中和）の効果、及び、活性化された第ＸＩＩＩ因子による安定化（架橋）対Ｃａ非依存的グルタミン転移酵素による安定化（架橋）を比較するために分子化学アッセイを行った（図４）。
【００４１】
２．１  フィブリン安定化に対するＡＣＴＩＶＡの効果を決定するための調査
Ｃａ２＋の存在下での第ＸＩＩＩ因子が、フィブリンポリマーの架橋を触媒して、不溶性のフィブリンクロットをもたらすということは十分に確立されている。しかし、反応混合物におけるカルシウム非依存的グルタミン転移酵素の存在がフィブリンの架橋を触媒するかどうかは確立されていなかった。カルシウム非依存的グルタミン転移酵素及び活性化された第ＸＩＩＩ因子の相乗効果があるかどうかも確立されていない。これらの反応を追従するために、第一に濃度依存的反応として、後に時間依存的反応として、カルシウム非依存的グルタミン転移酵素処理をフィブリンに受けさせた。
【００４２】
濃度依存的及び時間依存的（１、５、１０分）反応をモニターした。２ｍｇ／ｍＬの量の酸性フィブリン溶液を、可変の濃度（１．０〜２０．０Ｕ／ｍｌ）の２ｍＭ  ＣａＣｌ２を有する６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）においてＡｃｔｉｖａと迅速に混ぜ合わせて中和を達成した。フィブリンを、抗フィブリノゲン抗体（１：５０）を用いて可視化させた。アッセイは、ａ）１、５及び１０分後のカルシウム非依存的グルタミン転移酵素によるフィブリン及びフィブリノゲンの架橋を比較し（図４）、さらに、２０ｕ／ｍｌ、１９Ｕ／ｍｌ及び１Ｕ／ｍｌの濃度でのカルシウム非依存的グルタミン転移酵素によるフィブリン架橋を比較した。
【００４３】
図は、１分後のカルシウム非依存的グルタミン転移酵素及び第ＸＩＩＩ因子を用いたフィブリン架橋の間の強ガンマディマー（ｓｔｒｏｎｇ  ｇａｍｍａ  ｄｉｍｍｅｒ）の形成を示している。この時、ガンマディマーは、フィブリノゲンサンプルにおいてまだ存在していない。
【実施例３】
【００４４】
動物モデルにおける実験
本発明者等は、血液の吸収によるフィブリンクロットの形成を評価するため、及び、出血を制御する能力を決定するために、ブタモデルにおける腔内の術中出血に対する調査を行った。
【００４５】
調査の目的：腹腔鏡下腎部分切除の間の中程度から重度の出血を止めることにおけるＣｌｏｔＢｌｏｃｋ対標準的な外科的実行を比較し、さらに、止血が安全であり且つ術中出血を制御する（術中の失血を最小限にする）ことができるかどうかを決定した。
【００４６】
３．１  プロトコル：腎部分切除における一次治療としての術中出血の制御に対するＣｌｏｔＢｌｏｃｋの評価
６匹の雌のヨークシャーが交雑したブタ（月齢２．５か月、重量３７±２ｋｇ）を使用した。プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ＴＭＣＩによって認可された。動物に、開腹術を介した腎臓の２５％の切除を受けさせた。ダメージを誘発した後、１％グリセロールを含有する組成＃１Ｆの直径が２．５’’の６０ＣＣ  ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ二重膜の丸いブロックを、実質組織における切除部分に対して押しつけた。
【００４７】
結果：１分の小葉間動脈からの大量出血に続いて、６匹全ての動物において、適用後５分*（３．２±１．４分の中央値）以内の固形クロットの形成と共に止血を達成した（図５）。*止血まで５分という時間は、Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって、止血を達成することにおける有効性を実証する最長時間として定められている。
【００４８】
３．２  パッキング又は縫合なしの一次治療としての脾臓裂傷出血の制御に対するＣｌｏｔＢｌｏｃｋの評価
この調査の目的は、ＣｌｏＢｌｏｃｋが、外傷性脾臓裂傷の場合に、適用後５分以内に大量出血を止めることができるかどうかを決定することである。
【００４９】
方法：８匹の雌のヨークシャーが交雑したブタ（月齢２．５か月、重量３７±２ｋｇ）を使用した。プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【００５０】
動物に、１インチの切開術を脾臓の側面の中央部分において受けさせた（１１ブレードメスによって鋭く作った）。ダメージを誘発した後、６０ＣＣの１％グリセロールを含有するＣｌｏｔＢｌｏｃｋ組成＃１Ｆの直径が２．５’’の丸いブロックを、２分間裂傷部分に対して押しつけた。全ての動物において、適用後５分以内に止血を達成した（図６）。
【００５１】
結果：全ての動物（ｎ＝６）が、適用後５分*（３．２±１．４分の中央値を有する）以内に止血を達成した。
*止血まで５分という時間は、Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって、止血を達成することにおける有効性を実証する最長時間として定められている。
【００５２】
３．３  肝損傷グレードＩＶにおける一次治療としての術中出血の制御に対するＣｌｏｔＢｌｏｃｋの評価
１４匹の雌のヨークシャーが交雑したブタ（月齢２．５か月、重量３７±２ｋｇ）を、３つのグループにランダム化した。グループ１（ｎ＝６）は、開腹術を介してグレード４の肝損傷を受け、さらに、４０ＣＣ  ＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理した動物を含んだ。グループ２（ｎ＝６）は、類似の手順を受け、さらに、ＧｅｌＦｏａｍ（Ｐｆｉｚｅｒ）で処理した動物を含み；さらに、グループ３（ｎ＝４）は、類似の手順を受けた動物を含み、傷を縫合することによって出血を止め、生理食塩水でさらに処理した。
【００５３】
どちらの止血処理されたグループにおいても、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ又はＧｅｌｆｏａｍを適用し、さらに、傷に対して２分間押しつけた（図７）。このモデルの目的に対して、グレード４の損傷は、（１１ブレードメスによって鋭く作った）７ｃｍの長さの全層の実質組織裂傷として定められている。これらの損傷は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ  Ｏｒｇａｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍと一致した。
【００５４】
肝臓の中央にスポットを選択し、メスを用いて肝損傷を生成した。その位置を、肝上の管及び門脈の一部の枝に対する近似によって計算した。スポットを、マーカーを用いて標識した。ダメージを誘発した後で、支持体としてＰＬＧＡ膜を有する、４０ＣＣのＡｌｅｘａ蛍光色素で処理したパッチタイプのＣｌｏｔＢｌｏｃｋのブロック、又は、３×３インチのＧｅｌＦｏａｍの断片を、２分間傷に対して押しつけた。
【００５５】
乳酸リンゲル（ＬＲ）液を用いた輸液蘇生を、損傷後すぐに始めた。ＬＲは、可能であれば損傷前のＭＡＰの少なくとも８０％以内でＭＡＰを再確立するために、必要に応じて注入した。蘇生を、全観察期間続けた。６０分の調査の終わりにて、各動物のＭＡＰ及び注入した全蘇生量を記録した。
【００５６】
グループ２（Ｇｅｌｆｏａｍ）における全動物を、この手順が完了した後で安楽死させた。グループ１（ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ  ｎ＝３）及びグループ３（対照生理食塩水  ｎ＝２）における動物の半分を、調査の完了後２週間で安楽死させ、さらに、残りの半分（グループ１  ｎ＝３及びグループ３  ｎ＝２）を、完了後４週間で安楽死させた。死体解剖を行い、さらに、組織学的サンプルをいくつかの臓器から得た。
【００５７】
評価項目
プライマリーエンドポイント：損傷に続き５分以内に止血を達成した成功の割合。予め特定されたプライマリーエンドポイントは、適用から実質組織由来の出血又は滲出の終結までの時間間隔として定められる止血までの時間である。鞘部位からの再発性出血が最初の止血に続いて発生した場合、完全な止血を再確立するために要求されるさらなる非加圧適用のタイミング及び持続時間も記録した。
【００５８】
セカンダリーエンドポイント：総出血量、及び、ベースラインの１０％以内で血圧中央値を維持するのに要求される蘇生液の量。
【００５９】
結果：グループ１及び２における動物（グレードＩＶ損傷）に対するエンドポイントが、表１において示されている。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋを用いて（グループ１）及びＧｅｌＦｏａｍ（グループ２）を用いて処理したグレードＩＶの肝損傷に対する評価項目。全ての値を、平均±ＳＥＭとして報告した。
【００６０】
【表１】
2016507279.tif 000003
結論：ＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理した全動物が、適用後５分以内に止血を達成した。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、出血時間及び出血量を有意に減らし、さらに、裂傷且つダメージを受けた組織間の接着を有意に改善する。
【００６１】
３．４  一次治療としての重度の皮膚出血の制御に対する自着包帯上に置かれたＣｌｏｔＢｌｏｃｋの評価
１０匹の雌のヨークシャーが交雑したブタ（月齢２．５か月、重量３７±２ｋｇ）を、グループにランダム化した。グループ１（ｎ＝５）は、鼠蹊部損傷における３’’の長さの深く降りる裂傷を受け、さらに、１０分間自着包帯上に置かれるＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理した動物を含んだ。グループ２（ｎ＝５）は、類似の手順を受け且つ処理しない動物を含んだ。
【００６２】
評価項目
プライマリーエンドポイント：損傷に続き１０分以内に止血を達成した成功の割合。セカンダリーエンドポイント：総出血量。
【００６３】
結果：グループ１及び２における動物に対するエンドポイントが、表２において示されている。全ての値を、平均±ＳＥＭとして報告した。
【００６４】
【表２】
2016507279.tif 000004
結論：包帯の形状のＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理した全動物が、適用後１０分以内に止血を達成した。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、出血時間及び出血量を有意に減らし、さらに、裂傷且つダメージを受けた組織間の接着を有意に改善する。
【実施例４】
【００６５】
安全調査
開腹術を介してグレード４の肝損傷を受け、さらに、４０ＣＣ  ＣｌｏｔＢｌｏｃｋのブロックで処理したグループ１（ｎ＝６）の６匹のブタのうち３匹を、手術の完了後第２週で安楽死させ、さらに、残りの３匹を４週間で安楽死させた。同様に、２つの対照（グループ３）を追従し、２週間後に安楽死させ、さらに、２匹の動物を４週間後に安楽死させた。死体解剖を行い、さらに、主要な臓器からの組織サンプルを得た。
【００６６】
薬剤の安全性を、毒性、生理学的有害作用、生体適合性、遅発性血腫及び／又は浮腫形成、並びに、免疫学的リスクの評価を介して査定した。生理学的及び病理学的観察は：死亡率／罹患率；体重、摂食量、臓器重量を含んだ。
【００６７】
４．１  死体解剖にて巨視での評価によって、及び、組織学的調査によって急性毒性を査定した。薬剤が接触する組織及び組織の管の刺激作用を査定し、組織学におけるサイン又は刺激作用として急性及び／又は慢性の炎症の証拠を探した。血栓症、瘻孔及び膿瘍の形成を全ての臓器に対して査定した。
【００６８】
４．２  遅発性血腫の査定：被膜下又は実質内血腫形成のリスク。適用後２１日目に遅発性血腫及び浮腫形成を巨視的且つ組織学的に観察した。小さな血腫形成は、関連する続発症なく直径が≦４ｃｍの可視又は触知できる腫瘤として定められる。
【００６９】
４．３  肉眼的所見及び組織学
本発明者等は、手術の２週間後及び４週間後に、処理した全ての動物からの肺、腎臓、肝臓、脾臓における組織学的ダメージを分析し、さらに、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理したサンプルを（生理食塩水で処理した）対照と比較した。炎症に対するデータは、アポトーシス及び白血球浸潤を含んだ。炎症及び浮腫形成も、組織学的に査定した。
【００７０】
動物が屠殺されると、臓器を採取し、１０％ホルマリン中で固定し、さらに、パラフィンブロック内に包埋した。組織学的切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、さらに、オプティカル及び顕微鏡において１００Ｘ及び４００Ｘで検査した。これらのスライドを、表３において示されているように、委員会認定の獣医病理学者によって評価した。
【００７１】
結果：
【００７２】
【表３】
2016507279.tif 000005
形態学的診断の要約：
心臓：
有意な発見なし
肺：
１．無気肺、軽度から中程度、多巣性
２．浮腫、最小度から軽度、急性、瀰漫性
３．ヘモグロビン結晶、最小度、局所性、中程度の好中球性炎症を有する
腎臓：
１．顆粒円柱、管内、最小度、多巣性
２．硝子滴、細胞質内、近位尿細管上皮、最小度から軽度、多巣性
腹壁：
線維路、局所性、中心窩洞を有する、軽度から中程度の毛幹を有する肉芽腫性、好中球性、リンパ形質細胞性の炎症、及び、中程度の浮腫
肉眼的所見による発見が表４において要約されている。
【００７３】
【表４】
2016507279.tif 000006
結論：対照（縫合済み）も縫合していない処理された動物も、腹壁損傷の部位にて軽度の慢性炎症及び線維症を含んだ。処理された動物のみが、腹壁損傷部位、肝損傷部位及び播種隣接腹膜表面にて、異物に関連した肉芽腫性炎症の証拠を有した（ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ）。処理された動物は、いずれの臨床位置でも注目すべき出血の組織学的証拠を示さなかったけれども、縫合された対照は、重度の腹膜炎及び被膜下肝炎、並びに、壊死及び線維症を有する血腫の証拠を示した。いかなる他の臓器においても血栓塞栓症の証拠はなかった。対照動物は、前の外科的傷害からの出血に対する反応として解釈される髄外造血の証拠を脾臓において有した。著しい失血による貧血を示唆する変化は、いずれの動物においても見られなかった。
【００７４】
処理されたブタ及び対照のブタ全てが、傷つけられ且つ処理されたか又は縫合された場合に接着を展開した。従って、他のフィブリンシーラントと同様にＣｌｏｔＢｌｏｃｋも要因であり得るけれども、接着は、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋによって引き起こされているのではない。
【００７５】
４．４  生分解性調査を介した薬剤の薬物動態学的特性
タンパク質分解酵素による生分解を介した除去を、ｉｎ  ｖｉｖｏで決定した。
【００７６】
方法：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｌｏｔＦｏａｍの運命を検査するために、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋのバッチを、トレーサーとしてフルオレセインでタグをつけられたヒトフィブリノゲンを使用して調製した。このＣｌｏｔＢｌｏｃｋの調製品を、肝臓グレードＩＶの傷の手順（４．３）におけるグループ１の６匹の動物に適用し、それらの動物は、適用に続き２週間（ｎ＝３）及び４週間（ｎ＝３）で安楽死させた。動物が屠殺されると、臓器を採取し、１０％ホルマリン中で固定し、さらに、パラフィンブロック内に包埋した。組織学的切片を、蛍光顕微鏡において１００Ｘ及び４００Ｘで検査した。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの除去を、サンプル中の蛍光追跡の完全欠如によって、又は、２週間及び４週間にて観察した蛍光のレベルによって決定した。
【００７７】
結果：ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは、適用後４週間以内に全ての臓器において除去された（図８）。
【００７８】
４．５  免疫応答の評価
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋに対する起こり得る抗体応答を評価した。
【００７９】
方法：血清サンプルを、肝臓グレードＩＶ損傷（４．３）を受けた実験動物から採取し、手術後０日、７日及び２１日に前処理及び後処理し、さらに、分析まで−２０℃で凍結したまま保管した。ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの製剤に使用される成分に対して生成された抗体を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってテストした。
【００８０】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋの成分に対する、ブタにおいて生成することができる抗体を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を構築した。９６ウェルマイクロタイタープレートの底面を、４℃で一晩、フィブリン（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はトロンビン（ｎ  ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて被覆した。全てのウェルを、ＰＢＳを用いて５回洗浄した。ブタ血清のサンプルを、ＰＢＳにおいて１：２０の最終希釈度で加え、室温にて１時間インキュベートし、さらに、ＰＢＳを用いて５回洗浄した。ブタＩｇＧに対する酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、ＰＢＳにおいて１：２０の希釈度で全てのウェルに加え、室温にて１時間インキュベートし、さらに、ＰＢＳを用いて５回洗浄した。基質（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジ−アンモニウム塩、１０ｍｇ／カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のカプセル１つを、１００ｍｌのリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）において溶かすこと、及び、Ｈ２Ｏ２（０．２５ｍｌの３％溶液）を添加することによって、基質を調製した。室温での１０分間のインキュベーションに続いて、４０５ｎｍでの光学密度を、Ｂｉｏ  Ｔｅｋ  ＥＸ８００マイクロプレートリーダーを使用して決定した。
【００８１】
それぞれの標的にされた成分を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）において１：１００に希釈し、マイクロタイタープレートウェル上に被覆し、さらに、４℃で一晩インキュベートした。そのウェルを、ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）中０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳／０．２％Ｔｗｅｅｎ  ２０でブロックし、次に、５０μＬのブロッキング緩衝液における１：１０希釈度の動物血清と共に、３７℃で１時間インキュベートした。結合したＩｇＧ及びＩｇＭを、二次抗体に対する標準的なＥＬＩＳＡシステムとして検出した。
【００８２】
正常範囲を、５つの正常な動物血清を用いて決定した。上昇した抗体レベルは、標準平均（ｎｏｒｍａｌ  ｍｅａｎ）を超える２つの標準偏差よりも大きいとして定められる。それぞれのプレートは、希釈された血清以外の全ての試薬を用いてインキュベートされたウェルを含み、それは、全ての結果から引かれたバックグラウンド吸光度を提供した。精製されたトロンビンに対する抗体を、精製されたトロンビン（５μｇ／ｍＬ）を使用してマイクロタイタープレートウェルを被覆したこと以外、プロトロンビンに対する抗体に対して記載されるように決定した。第Ｖ因子Ｃ２ドメインに結合する抑制性抗第Ｖ因子抗体が、出血徴候に関連づけられる。ヒト第Ｖ因子に対する抗体を、マウスモノクローナル抗ヒト第Ｖ因子抗体６Ａ５（５０μＬの２．５μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）でマイクロタイタープレートウェルを被覆することによって同定した。ウェルを、洗浄且つブロックし、その後、５０μＬの５μｇ／ｍＬヒト第Ｖ因子を用いてインキュベートした。ウェルを、１：１０希釈度の動物血漿を用いて、３７℃で１時間インキュベートした。結合したＩｇＧを、上記のように（標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡで）検出した。
【００８３】
その後、ヒト成分がネズミ及びブタにおいてテストされる異種間のモデルの酵素原システムが存在するということを考慮することが非常に重要である。動物が、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ成分のいずれに対する抗体を生成しても、結果をヒトにあてはめて推定することができるということは確かではない。前臨床段階にて類似の実験システムはない。
【００８４】
統計的分析
２つの処置腕における６つのランダム化されたサブグループ間の定量的変数の比較を、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて行った。Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を使用して、各ランダム化されたグループ間の差を査定した。統計学的分析を、Ｓｔａｔａ  ｖｅｒｓｉｏｎ９．０（Ｓｔａｔａ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を使用して行い、Ｐ＜．０５は、統計学的に有意であると考慮した。
【００８５】
結果及び結論：フィブリン又はトロンビンに対してテストした場合に、対照からＣｌｏｔＢｌｏｃｋで処理されたブタまで、０日、７日又は２１日に採取した血清を用いて観察したＯＤリーディングにおいて有意な差はなかった（図９及び１０）。本発明者等は、実験用ブタは、ＣｌｏｔＢｌｏｃｋに対して検出可能な抗体を生成しなかったということを結論づけた。
【実施例５】
【００８６】
滅菌法
滅菌したクロットの塊の調製品を調査した。
【００８７】
酸性のフィブリンモノマーを、Ｎａｌｇ  Ｎｕｎｃ５００ｍＬ装置を使用して生物学的安全キャビネットにおいて滅菌濾過した（Ｃａｔ＃４５０−００４５、ニトロセルロース膜、０．４５ｍフィルタ）。
【００８８】
増殖調査：一般的な実験プロトコルは、サンプル溶液の調製を含み、次に、そのサンプル溶液を、増殖のためにペトリ皿内のポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ＃Ｐ２１８１）及びトリプチックソイ寒天培地（ＴＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ＃Ｔ４５３６）ゲル上に置いた。ＰＤＡ及びＴＳＡゲルをインキュベートし、さらに、コロニー増殖（カビ及び／又は細菌）を示された時限にて観察した。
【００８９】
サンプルを３７℃で３０分インキュベートし、さらに、結果及び考察に項において示された時限にて肉眼でコロニー増殖に対して評価した。データテーブルにおいて１、２及び３で示されている多数のサンプルを用いて２回又は３回サンプルをランした。評価に対して使用したスケールは以下の通りである。
【００９０】
【表５】
2016507279.tif 000007
表６は、滅菌したＦＩＢＲＩＮ＿ＣｌｏｒＦｏａｍの成分のＰＤＡ及びＴＳＡ上での微生物増殖分析の調査の結果を示している。
【００９１】
【表６】
2016507279.tif 000008
増殖データは、滅菌した成分は、１１日後でさえも有意な増殖をもたらさなかったということを示している。さらに、以下の技術を滅菌に対して使用することができた。
【実施例６】
【００９２】
生体適合性
２つのＣｌｏｔＢｌｏｃｋ製剤を調製し、さらに、滅菌条件下でテストした。これらの製剤を、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）及びヒト上皮細胞（Ａ５４９細胞株、ＡＴＣＣ）を用いて生体適合性に対してテストした。
【００９３】
正常なヒト線維芽細胞（ＨＦ）を商業的供給源から得て、さらに、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地における６０ｍｍ組織培養プレート内で培養物を確立し、さらに、加湿された５％ＣＯ２大気（ＣＯ２インキュベータ）において３７℃で維持した。ヒト上皮細胞株Ａ５４９を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭグルタミンを補充した基礎培地において維持した。線維芽細胞及び上皮細胞培養物がサブコンフルエンスに達したときに、対照及び安息香酸ナトリウムＣｌｏｔＦｏａｍ製剤を混ぜ合わせて、すぐに個々の皿の中まで運んだ。培養物をＣＯ２インキュベータに戻し、さらに、全部で５日間毎日検査した。ＣｌｏｔＦｏａｍ材料及び培地を全ての培養物から取り除き、さらに、接着細胞を、クリスタルバイオレット（２％エタノール中０．１％）で染色した。
【００９４】
結果：主な観察は、細胞に対するダメージ又は毒性の完全欠如、及び、いかなる細菌又は真菌の汚染の欠如であった。
【００９５】
ＣｌｏｔＢｌｏｃｋ製剤に曝露されたヒト線維芽細胞培養物において、細胞は、対照の未処理の培養物よりもわずかに大きいか又は広がっているように見え（図１１（ｂ））、ヒト上皮細胞においても同様であった（図１２（ａ、ｂ））。
【００９６】
結論：ＣｌｏｔＢｌｏｃｋは生体適合性であり、細胞の成長及び分化を抑制はせず、正しくは刺激し、傷の治癒剤において重要な特質である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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