(57)【要約】  本発明は、系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞からの神経細胞の作製のための少なくとも１つの新規な神経細胞分化培地；前記培地を使用した神経細胞分化のための方法；神経細胞運命に向かっての少なくとも１つの前駆細胞の系列特異的分化のための前記培地および前記方法の使用；および前記少なくとも１つの前記神経細胞分化培地を含む部分のキットに関する。
2016535586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞からの神経細胞の作製のための神経細胞分化培地であって、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液
を含むまたはこれらからなる神経細胞分化培地。
【請求項２】
その全ての組合せを含めた以下のもの：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト
の少なくとも任意の１つまたは複数をさらに含む、またはこれらからなる、請求項１に記載の神経細胞分化培地。
【請求項３】
前記細胞培養基本培地が、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を含む群から選択される、請求項１または２に記載の神経細胞分化培地。
【請求項４】
前記無血清栄養補助剤が、Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン栄養補助剤、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ（商標）を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項５】
前記周期阻害剤が、Ｇ１／Ｓ細胞チェックポイントの阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項６】
前記細胞周期阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１、ＡＺＤ５４３８、バイカレイン、ＣＩ８９８三塩酸塩、ダイゼイン、ＷＹＥ６８７二塩酸塩、ＹＣ１、フラボピリドール、インジスラム、プルバラノール、セリシクリブ、ミモシン、プルバラノールを含む群から選択される、請求項５に記載の神経細胞分化培地。
【請求項７】
前記トロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニストが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、またはその類似体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項８】
前記トロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニストが、７，８−ジヒドロキシフラボン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”トリス（２−ヒドロキシエチル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミド（ＬＭ２２Ａ４）、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボンを含む群から選択される、請求項７に記載の神経細胞分化培地。
【請求項９】
前記古典的Ｗｎｔ経路アゴニストが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）阻害剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１０】
前記古典的Ｗｎｔ経路アゴニストが、ＣＨＩＲ９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトオキシム（ＢＩＯ−アセトオキシム）、５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，−４−ｃ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（３Ｆ８）、１−（７−メトキシキノリン−４−イル）−３−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］尿素（Ａ１０７０７２２）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−Ｎ’−（５−ニトロ−２−チアゾリル）尿素（ＡＲ−Ａ０１４４１８）、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ２１６７６３）、３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ４１５２８６）、Ｎ−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−５−（４−ニトロフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−アミン（ＴＣ−Ｇ２４）、２−メチル−５−［３−［４−（メチルスルフィニル）フェニル］−５−ベンゾフラニル］−１，３，４−オキサジアゾール（ＴＣＳ２００２）、または３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，−３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシフェノール二トリフルオロ酢酸塩（ＴＷＳ１１９）を含む群から選択される、請求項９に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１１】
前記ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が、γ−セクレターゼ阻害剤である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１２】
前記ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、セマガセスタット、ＢＭＳ−２９９８９７、ＢＭＳ−７０８１６３、ジベンザゼピン、ＭＫ−０７５２、ＲＯ４９２９０９７、ＬＹ９００００９、ＬＹ３０３９４７８、ＬＹ４１１５７５、ＭＲＫ−００３、ＭＲＫ−００６、またはＢＭＳ−９０６０２４を含む群から選択される、請求項１１に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１３】
前記ＣＲＥＢ活性化因子が、アデニリルシクラーゼ活性化因子、ｃＡＭＰもしくはその類似体、またはホスホジエステラーゼ阻害剤を含む群から選択される、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１４】
前記アデニリルシクラーゼ活性化因子が、ホルスコリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（３Ｒ，４ａＲ，５Ｓ，６ａＳ，１０Ｓ，１０ａ−Ｒ，１０ｂＳ）−５−（アセチルオキシ）−３−エテニルドデカヒドロ−１０，１０ｂ−ジヒドロキシ−３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチル−１−オキソ−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−６−イルエステルβ−アラニン塩酸塩、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１−２７、１，９−ジデオキシホルスコリン、５−［［２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル］アミノ］−１−ペンタノール、またはコルホルシンダロパート塩酸塩を含む群から選択される、請求項１３に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１５】
前記ｃＡＭＰ類似体が、ジブチリル−ｃＡＭＰ、８−（４−クロロフェニルチオ）−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’，５’−環状一リン酸アセトキシメチルエステル、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、または（Ｓ）−アデノシン、環状３’，５’−（ハイドロゲンホスホロチオエート）トリエチルアンモニウムを含む群から選択される、請求項１３に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１６】
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤が、ＣＧＨ２４６６二塩酸塩、シロスタミド、シロスタゾール、５−［３−［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イルオキシ］−４−メトキシフェニル］テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン、ジピリダモール、ＥＨＮＡ塩酸塩、エノキシモン、エタゾレート塩酸塩、ジサデナフィルベシル酸塩、ＭＤＬ１２３３０Ａ塩酸塩、メソプラム、ロリプラム、ペントキシフィリン、アナグレリド塩酸塩、Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド、４−［（２Ｒ）−２−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］−２−フェニルエチル］−ピリジン塩酸塩、ビンポセチン、ザプリナスト、またはザルダベリンを含む群から選択される、請求項１３に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１７】
前記γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニストが、組換えγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アセチルホモタウリン酸カルシウム、１−（４−アミノブタノイル）−４−［１，３−ビス（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパン−２−イルオキシ］−７−ニトロインドリン−、イソグバシン塩酸塩、３−（２，５−ジフルオロフェニル）−７−（１，１−ジメチルエチル）−６−［（１−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル）メトキシ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン、ＭＫ０３４３、ＭＲＫ０１６、ムシモール、ｔｒａｎｓ−４−アミノクロトン酸、５−ニトロ−α−オキソ−Ｎ−（１Ｒ）−フェニルエチル］−１Ｈ−インドール−３−アセトアミド、２’，４−ジフルオロ−５’−［８−フルオロ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）イミダゾ［１，２−ａ］−ピリジン−３−イル］−［１，１−’−ビフェニル］−２−カルボニトリル、または（Ｚ）−３−［（アミノイミノメチル）チオ］プロパ−２−エン酸硫酸塩を含むが、これらに限定されない、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１８】
前記非古典的Ｗｎｔ経路アゴニストが、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子である、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項１９】
前記非古典的Ｗｎｔ経路アゴニストが、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、ホルボール１２，１３−ジブチレート、コレステロール硫酸、ブリオスタチン１，２−［（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］シクロプロパンオクタン酸（ＦＲ２３６９２４）、（２Ｓ，５Ｓ）−１，２，４，５，６，８−ヘキサヒドロ−５−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−２−（１−メチルエチル）−３Ｈ−ピロロ−［４，３，２−ｇｈ］−１，４−ベンゾジアゾニン−３−オン、インゲノール３−アンゲレート、または５−クロロ−Ｎ−ヘプチルナフタレン−１−スルホンアミド、５−クロロ−Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１−ナフタレンスルホンアミドを含む群から選択される、請求項１８に記載の神経細胞分化培地。
【請求項２０】
ｉｉｉ）〜ｖ）およびｖｉｉｉ）〜ｘｉ）の任意の１つまたは複数が、小分子化合物または単離もしくは組換えペプチド、タンパク質または抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項２１】
前記化学イオンの溶液が、塩化カルシウムである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地を含むｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地。
【請求項２３】
請求項２〜２１のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地を含むｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地。
【請求項２４】
系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞を培養培地中で培養することを含む、神経細胞分化のための方法であって、前記培養培地が請求項１〜２３のいずれか一項に記載の神経細胞分化培地を含み、前記培地中での培養後、前記前駆細胞が神経細胞に発達する、神経細胞分化のための方法。
【請求項２５】
前記前駆細胞が、幹細胞；多能性または多分化能プロジェニター細胞；胚幹細胞（ＥＳＣ）；誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；成体幹細胞；体性幹細胞；がん幹細胞；および神経細胞への系列特異的分化の能力がある任意の細胞を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経細胞が、神経系；ニューロン；アストロサイト；およびグリア細胞の部分として分類される任意の細胞型を含む群から選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２に記載の第１の神経細胞分化培地中で前記細胞を培養することであって、前記培地がｉ〜ｘを含むまたはこれらからなること；
その後、請求項２に記載の第２の神経細胞分化培地中で前記細胞を培養することであって、前記培地がｉ〜ｖｉｉおよびｘｉを含むまたはこれらからなること
を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
以下の日、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０日を含むまたはこれらからなる群から選択される日数の間、前記第１の神経細胞分化培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
以下の日、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０日を含むまたはこれらからなる群から選択される日数の間、前記第２の神経細胞分化培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項２７〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
神経細胞への少なくとも１つの前駆細胞の系列特異的分化のための請求項１〜２１に記載の神経細胞分化培地または請求項２２または２３に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地の使用。
【請求項３１】
前記神経細胞が、ニューロンである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
神経細胞への系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞の分化のためのキットであって、
ａ．ｉ〜ｘを含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地；
ｂ．ｉ〜ｖｉｉおよびｘｉを含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地；および
任意選択で、試薬および前記神経細胞分化培地の使用に関する説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞からの神経細胞の作製のための少なくとも１つの新規な神経細胞分化培地；前記培地を使用した神経細胞分化のための方法；神経細胞運命に向かっての少なくとも１つの前駆細胞の系列特異的分化のための前記培地および前記方法の使用；および前記少なくとも１つの前記神経細胞分化培地を含む部分のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、全ての多細胞生物において見出される生物学的細胞であり、これは、分裂し、多様な特殊化した細胞型に分化することができ、自己複製して、より多くの幹細胞を作製することができる。哺乳動物では、幹細胞の２つの自然発生の広範な型がある：胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚幹細胞、および様々な組織において見出される成体幹細胞。人工であり、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として既知である幹細胞の第３のクラスもある。ｉＰＳＣは、成体細胞を幹細胞様表現型に脱分化することによって作られる。成体生物では、幹細胞およびプロジェニター細胞は、身体のための修復系として働き、成体組織を補充する。発生中の胚では、幹細胞は、全ての特殊化した細胞に分化することができるが（それらは、多能性細胞である）、それらはまた、血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。
【０００３】
胚性および体性幹細胞は、任意の細胞型に分化する能力を有し、したがって、それらは、比類なく、定義された細胞集団を破壊する、または損傷する／害する疾患のための細胞置換療法に適している。幹細胞の類のない多能性は、適切な発生（または培養）条件下でそれらを再生する、また３つ全ての胚性胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉および内胚葉の様々な細胞型に発達するための潜在力をそれらに提供する。ＥＳＣ、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、成体または組織特異的幹細胞などが特殊化した細胞に成長する潜在力は、これらの細胞を使用した新しい処置を開発することを望んでいる研究者からの関心を引いた。
【０００４】
再生医学は、損傷した組織を置換することによって、および／または身体自体の修復機構を刺激して、以前は回復不能であった組織または器官を治癒することによって、身体における損傷した組織および器官を再生することに焦点を置いている。これは、細胞または組織療法における細胞または組織の使用をしばしば伴う。自己（患者からの）または同種（別のドナーからの）である幹細胞またはプロジェニター細胞の移植；成熟、機能的細胞の移植（細胞置換療法）；および必要な物質を作製するために使用される改変ヒト細胞の適用（細胞に基づく遺伝子治療）を含めた、細胞療法の多くの潜在的形がある。通常、細胞療法において利用される細胞または組織は、同じ個体、別のドナー個体から得られたもの、または代わりに、実験室でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖または発達させたものである。分化した体細胞からのｉＰＳＣの産出は、細胞移植を通して疾患を治療するための可能な手段としての大きな見込みを提供する。個々の患者由来の体細胞からｉＰＳＣ細胞を産出する可能性は、免疫拒絶のリスクがより少ない患者特異的療法の開発も可能にし得る。
【０００５】
これらの細胞の別の適用は、多量の幹細胞を特定のヒト細胞型に分化することおよび医薬品試験または毒性試験のためにこれらの細胞を使用することを伴う。したがって、系列特異的な分化した幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ、細胞系列特異化および分化の複雑な機構の解明、および診断または予後マーカーとしての使用に活用され得る差異である、正常と疾患したまたは損傷した状態間の決定的な生化学的差異を同定することを含めたいろいろな目的のための価値ある研究ツールでもある。
【０００６】
神経変性疾患に関する治療学およびモデル系としての胚性および体性幹細胞の力は、よく探求されてきた。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などの進行型の神経変性状態における神経機能の再構築は、細胞死によって失われた神経細胞の置換を必要とする。よく定義され、しばしば遺伝的に決定されたニューロン病理学を有するヒト患者からのｉＰＳＣは、疾患モデリングと信頼性のあるハイスループットな薬物スクリーニングの両方に関して巨大な潜在力を有する。
【０００７】
様々な因子および分子が幹細胞のニューロンへの分化を調節し、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）および繊維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）は、細胞を未分化状態に保持しながら、増殖を促進する。さらに、インスリンおよびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）も、神経幹細胞成長および増殖に必須であることが示された。レチノイン酸、インスリン、Ｉｆｇ１、Ｎｏｇｏ−６６、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４は、幹細胞のニューロンまたはアストロサイトへの分化を制御することが既知である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、神経化のプログラム、ニューロンサブタイプ運命特異化、細胞周期離脱、有糸分裂後ニューロン分化および調節された興奮性の機能的成熟を通してニューロンに分化する。
【０００８】
この複雑な発達により、幹細胞からの機能的ニューロンの一貫した、再現可能な産出は、神経疾患の細胞モデルの開発に重大である。ニューロン分化に関するいくつかのプロトコールが提案された。例えば、ＷＯ２００４／０４６３４８は、骨髄由来幹細胞からの神経様細胞の産出に関する分化プロトコールを教示している。ＷＯ２００６／１３４６０２は、神経栄養因子分泌細胞の産出に関する分化プロトコールを教示している。ＷＯ２００７／０６６３３８は、オリゴデンドロサイト様細胞の産出に関する分化プロトコールを教示している。ＷＯ２０１０／０９０８４３は、歯肉由来間葉系幹細胞ならびに免疫調節および再構築におけるそれらの使用を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ニューロン分化のための多数のプロトコールがニューロンモデルを作製することが既知である一方で、少数のみが機能的ニューロン成熟およびシナプス形成の頑強なまたは信頼性のある尺度を提供する。したがって、ニューロン細胞と類似性を共有するにもかかわらず、既存のプロトコールの多くは、十分に機能的であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで得られた細胞を忠実に複製するニューロン細胞を産出しないので、これは、疾患モデリングとｉｎ  ｖｉｔｒｏでの新規な療法の開発の両方に関する分化細胞の有用性を限定する。多くの既存のプロトコールは、有効性の第１の尺度として分子および細胞マーカーに頼る；例えば、ニューロンサブタイプ特異的運命決定のマーカーと一緒のβ−III−チューブリンおよび微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）２。かかるマーカーは、各プロトコールがどれくらい神経原性であるかを決定するのに有用であるが、それらは、分化細胞が機能的ニューロンの決定的な特徴を発現するかどうかに関する非常にわずかな指示しか与えない。ニューロン疾患をモデル化するための患者由来幹細胞の最適な使用は、引き出されたニューロンの適切な生理学的成熟に決定的に依存している。
【００１０】
さらに、幹細胞神経化および神経プロジェニター運命特異化に関するプロトコールの開発における著しい進歩にもかかわらず、神経分化の後期段階は、制御することが今なお困難である。特に、発達研究は、長期の培養下の進行中のプロジェニター増殖および神経発生によって混乱させられる。さらに、分化したニューロンが機能的に成熟するのに必要な培養下の長引く期間は、しばしば１００日を超える。
【００１１】
本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、成体幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化の能力がある任意の他の細胞を含むことができるが、これらに限定されない多能性または多分化能幹細胞由来の神経プロジェニターのニューロン分化に関する。幹細胞分化、特に神経幹細胞分化を制御するための新規な方法および細胞培養培地が本明細書で開示される。しばしば数ヶ月かかり得る既存の技法とは対照的に、有利に、開示された方法および培地が、２〜３週内に機能的、自発的に電気的に興奮性のニューロンの高い収量を作製する幹細胞由来神経プロジェニターの成熟をもたらすことが見出された。さらに、方法および培地は、４週までにニューロン分化におけるほぼ１００％の効率をもたらす優れた忠実度を有する。
【００１２】
したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来ニューロンの機能的成熟を促進し、加速する単純で、便利な方法を提供する。ヒトまたは動物幹細胞の機能的ニューロン細胞への効果的で加速された制御された分化は、培養時間、およびそれによってコストを減少させることになる一方、より正確にｉｎ  ｖｉｖｏで存在するものを反映する細胞も産出する。これは、神経系の初期発生中の事象の実験的解剖および新しい治療学的標的の同定を可能にすることになる。追加の薬学適用は、神経保護化合物に関するハイスループットなスクリーンなどの毒物学および創薬に関する新しいアッセイの創造を含み得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞からの神経細胞の産出は、組織再構築のためおよび神経系における遺伝子の送達および発現のための神経細胞の無制限の供給源として役立ち得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞からの神経細胞の作製のための神経細胞分化培地であって、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液
を含むまたはこれらからなる神経細胞分化培地が提供される。
【００１４】
神経細胞分化培地への本明細書での言及は、細胞の培養および成長における使用のためのおよび細胞分化、特に神経前駆細胞の神経細胞への系列特異的分化を制御するための細胞培養培地であって、前記前駆体が、例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、成体幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、プロジェニター細胞または神経細胞への系列特異的分化の能力がある任意の他の細胞だが、これらに限定されない、多能性または多分化能幹細胞から産出される細胞培養培地を表す。神経細胞は、例えば、ニューロン、アストロサイトまたはグリア細胞だが、これらに限定されない神経系の部分として分類される任意の細胞型と解釈される。
【００１５】
細胞培養基本培地への本明細書での言及は、前駆細胞、特に幹細胞またはプロジェニター細胞の成長を支持するように設計されている液体またはゲルへの言及を含む。当業者によって認識されることになるように、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  （ＳＬ）およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）だが、これらに限定されない化学培地の多くの異なる型が培養下の幹またはプロジェニター細胞の成長を支持するために使用され得る。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、前記細胞培養基本培地は、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地、または加えられた無血清栄養補助剤を有する製剤であるＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２である。理想的には、前記細胞培養基本培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００１７】
無血清栄養補助剤への本明細書での言及は、培養下の神経細胞を支持する、奨励する、駆動する、促進するまたは維持するが、いかなる検出可能な血清もその構成成分も含有しない栄養補助剤へのものである。例は、Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤およびＮｅｕｒｏＢｒｅｗ２１（商標）などを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
細胞周期阻害剤への本明細書での言及は、細胞周期進行を遅くする、停止する、または中止する任意の化合物へのものである。当業者に既知であるように、細胞周期停止は、細胞周期の種々の時期で、例えばＧ１−Ｓ、Ｇ２−ＭまたはＭ細胞チェックポイントで誘導され得、細胞分裂の速度および活発にサイクルしている細胞の数を減少させる。細胞周期阻害剤の小分子の例は、当業者に既知であり、例えば、ＡＢＴ７５１、ＡＺＤ５４３８、バイカレイン、８−クロロアデノシン、ＣＩ８９８三塩酸塩、ダイゼイン、ＤＩＭ、エポチロンＢ、インジルビン−３’−オキシム、メトトレキサート、ナルシクラシン、プルンバギン、ＳＫＰｉｎ  Ｃ１、ＷＹＥ６８７二塩酸塩、ＹＣ１、フラボピリドール、オロモウシン、インジスラム、ＳＮＳ−０３２、ブリオスタチン−１、セリシクリブ、ＰＤ０３３２９９１、ミモシン、デフェロキサミン、プルバラノール、ＳＣＨ７２７９６５などだが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、前記細胞周期阻害剤は、例えば、ＰＤ０３３２９９１、ＡＺＤ５４３８、バイカレイン、ＣＩ８９８三塩酸塩、ダイゼイン、ＷＹＥ６８７二塩酸塩、ＹＣ１、フラボピリドール、インジスラム、プルバラノール、セリシクリブ、ミモシン、プルバラノールだが、これらに限定されない、Ｇ１−Ｓ時期チェックポイントを標的にする細胞周期進行の阻害剤である。
【００２０】
最も好ましくは、前記細胞周期阻害剤は、ＰＤ０３３２９９１である。
【００２１】
しかしながら、本発明は、例えば、ＤＱ６５−７９、ＴＧＦベータ、アクチビン、および抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブだが、これらに限定されない、単離または組換えペプチド、タンパク質または抗体などの生体分子である細胞周期阻害剤も包含する。
【００２２】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニストへの本明細書での言及は、別個の細胞集団の生存および分化を誘導する小さいタンパク質成長因子であるいくつかの「ニューロトロフィン」に関する高親和性触媒受容体である、ＴｒｋＢ受容体活性を促進するまたは増加させる任意の化合物である。かかる化合物は、ニューロトロフィン、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）およびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびその類似体の組換えタンパク質、および例えば、７，８−ジヒドロキシフラボン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”トリス（２−ヒドロキシエチル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミド（ＬＭ２２Ａ４）、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボンなどだが、これらに限定されない小分子ＴｒｋＢアゴニストを含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＴｒｋＢ受容体アゴニストは、組換えＢＤＮＦまたはＬＭ２２Ａ４である。
【００２４】
しかしながら、本発明は、例えば、ＴＡＭ−１８３だが、これに限定されないＴｒｋＢ受容体を刺激する単離または組換えペプチド、タンパク質または抗体などの生体分子であるトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニストも包含する。
【００２５】
古典的Ｗｎｔ経路アゴニストへの本明細書での言及は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を促進するまたは活性化する任意の化合物である。当業者に既知であるように、古典的Ｗｎｔ経路（またはＷｎｔ／β−カテニン経路）は、細胞質におけるβ−カテニンの蓄積および核中へのその最終的な移行を引き起こして、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーに属する転写因子の転写コアクチベーターとして働くＷｎｔ経路である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、前記古典的Ｗｎｔ経路アゴニストは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）阻害剤である。当業者に既知であるように、ＧＳＫ−３は、ベータカテニンをリン酸化し、したがって、それを分解の標的とすることが示され、このタンパク質の阻害剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を特異的に促進することが既知である。かかる化合物は、ＣＨＩＲ９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトオキシム（ＢＩＯ−アセトオキシム）、５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，−４−ｃ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（３Ｆ８）、１−（７−メトキシキノリン−４−イル）−３−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］尿素（Ａ１０７０７２２）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−Ｎ’−（５−ニトロ−２−チアゾリル）尿素（ＡＲ−Ａ０１４４１８）、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ２１６７６３）、３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ４１５２８６）、Ｎ−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−５−（４−ニトロフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−アミン（ＴＣ−Ｇ２４）、２−メチル−５−［３−［４−（メチルスルフィニル）フェニル］−５−ベンゾフラニル］−１，３，４−オキサジアゾール（ＴＣＳ２００２）、３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，−３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシフェノール二トリフルオロ酢酸塩（ＴＷＳ１１９）などを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
最も理想的には、前記古典的Ｗｎｔ経路アゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【００２８】
アスコルビン酸への本明細書での言及は、多くの酵素反応における重要な補助因子である、ビタミンＣの１つの型を構成する有機化合物を表す。しかしながら、当業者によって認識されるように、ビタミンＣおよびその誘導体の代替の型が本発明に従って利用される。
【００２９】
カルシウムイオンの溶液への本明細書での言及は、遊離のＣａ２＋イオン、最も好ましくは塩化カルシウムを含む任意の化学溶液を表す。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前記神経細胞分化培地は、追加的に、または代わりに、その全ての組合せを含めた以下のものの少なくとも任意の１つまたは複数をさらに含む、またはこれらからなる：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的ＷＮＴ経路アゴニスト。
【００３１】
ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤への本明細書での言及は、細胞周期離脱を促進し、神経原性促進性遺伝子発現を調節することが既知であるｎｏｔｃｈシグナル伝達細胞経路をアンタゴナイズするまたは阻害する任意の化合物である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、前記ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、例えば、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、セマガセスタット、ＢＭＳ−２９９８９７、ＢＭＳ−７０８１６３、ジベンザゼピン、ＭＫ−０７５２、ＲＯ４９２９０９７、ＬＹ９００００９、ＬＹ３０３９４７８、ＬＹ４１１５７５、ＭＲＫ−００３、ＭＲＫ−００６、ＢＭＳ−９０６０２４などだが、これらに限定されないγ−セクレターゼ阻害剤である。
【００３３】
最も好ましくは、前記ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、ＤＡＰＴ、セマガセスタット、ＢＭＳ−２９９８９７、またはＢＭＳ−７０８１６３である。
【００３４】
ＣＲＥＢ活性化因子への本明細書での言及は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に結合し、それによって下流遺伝子の転写を増加または減少させる細胞転写因子であるＣＲＥＢのリン酸化を促進する任意の化合物である。
【００３５】
当業者に既知であるように、ＣＲＥＢリン酸化は、例えば、アデニリルシクラーゼの活性化、ｃＡＭＰまたはその類似体の使用、またはホスホジエステラーゼの阻害剤だが、これらに限定されない多数の手段を通して達成され得る。しかしながら、ＣＲＥＢのリン酸化を増加させるシグナル伝達経路を上方または下方調節する任意の適した化合物が同じ効果で使用され得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＲＥＢ活性化因子は、例えば、ホルスコリン、Ν，Ν−ジメチル−（３Ｒ，４ａＲ，５Ｓ，６ａＳ，１０Ｓ，１０ａ−Ｒ，１０ｂＳ）−５−（アセチルオキシ）−３−エテニルドデカヒドロ−１０，１０ｂ−−ジヒドロキシ−３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチル−１−オキソ−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−６−イルエステルβ−アラニン塩酸塩、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１−２７、１，９−ジデオキシホルスコリン、５−［［２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル］アミノ］−１−ペンタノール、コルホルシンダロパート塩酸塩などだが、これらに限定されないアデニリルシクラーゼ活性化因子である。
【００３７】
最も理想的には、前記ＣＲＥＢ活性化因子は、ホルスコリンである。
【００３８】
代わりに、前記ＣＲＥＢ活性化因子は、ｃＡＭＰもしくはその類似体、または細胞内ドメイン内の環状ヌクレオチドシグナル伝達の局在化、期間、および広さを調節するｃＡＭＰにおけるホスホジエステル結合を切断するホスホジエステラーゼの阻害剤である。
【００３９】
ｃＡＭＰ類似体の例は、ジブチリル−ｃＡＭＰ、８−（４−クロロフェニルチオ）−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’，５’−環状一リン酸アセトキシメチルエステル、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、または（Ｓ）−アデノシン、環状３’，５’−（ハイドロゲンホスホロチオエート）トリエチルアンモニウムなどを含む。
【００４０】
ホスホジエステラーゼ阻害剤の例は、ＣＧＨ２４６６二塩酸塩、シロスタミド、シロスタゾール、５−［３−［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−−２−イルオキシ］−４−メトキシフェニル］テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン、ジピリダモール、ＥＨＮＡ塩酸塩、エノキシモン、エタゾレート塩酸塩、ジサデナフィルベシル酸塩、ＭＤＬ１２３３０Ａ塩酸塩、メソプラム、ロリプラム、ペントキシフィリン、アナグレリド塩酸塩、Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド、４−［（２Ｒ）−２−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］−２−フェニルエチル］−ピリジン塩酸塩、ビンポセチン、ザプリナスト、ザルダベリンなどを含む。
【００４１】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニストへの本明細書での言及は、活性化時にニューロンの過分極をもたらす、ＧＡＢＡ受容体、イオンチャネル型受容体およびリガンド開口型イオンチャネルを結合し活性化する任意の化合物である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、前記γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニストは、組換えγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アセチルホモタウリン酸カルシウム、１−（４−アミノブタノイル）−４−［１，３−ビス（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパン−２−イルオキシ］−７−ニトロインドリン−、イソグバシン塩酸塩、３−（２，５−ジフルオロフェニル）−７−（１，１−ジメチルエチル）−６−［（１−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル）メトキシ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン、ＭＫ０３４３、ＭＲＫ０１６、ムシモール、ｔｒａｎｓ−４−アミノクロトン酸、５−ニトロ−α−オキソ−Ｎ−（１Ｒ）−フェニルエチル］−１Ｈ−−インドール−３−アセトアミド、２’，４−ジフルオロ−５’−［８−フルオロ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）イミダゾ［１，２−ａ］−ピリジン−３−イル］−［１，１−’−ビフェニル］−２−カルボニトリル、（Ｚ）−３−［（アミノイミノメチル）チオ］プロパ−−２−エン酸硫酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
最も理想的には、前記ＧＡＢＡ受容体アゴニストは、ＧＡＢＡである。
【００４４】
非古典的Ｗｎｔ経路アゴニストへの本明細書での言及は、非古典的Ｗｎｔ／カルシウムシグナル伝達経路を促進するまたは活性化する任意の化合物である。当業者に既知であるように、非古典的Ｗｎｔ／カルシウム経路は、β−カテニンに関与せず、細胞内カルシウムレベルの調節に関与するＷｎｔシグナル伝達経路である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、前記非古典的Ｗｎｔ経路アゴニストは、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、ホルボール１２，１３−ジブチレート、コレステロール硫酸、ブリオスタチン１，２−［（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］シクロプロパンオクタン酸（ＦＲ２３６９２４）、（２Ｓ，５Ｓ）−１，２，４，５，６，８−ヘキサヒドロ−５−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−２−（１−メチルエチル）−３Ｈ−ピロロ−［４，３，２−ｇｈ］−１，４−ベンゾジアゾニン−３−オン、インゲノール３−アンゲレート、５−クロロ−Ｎ−ヘプチルナフタレン−１−スルホンアミド、５−クロロ−Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１−ナフタレンスルホンアミドなどを含むが、これらに限定されないタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子である。
【００４６】
最も理想的には、前記非古典的Ｗｎｔ経路アゴニストは、ＰＭＡである。
【００４７】
本発明の第２の態様では、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液
を含む、またはこれらからなるｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地が提供される。
【００４８】
本発明の第２の態様のさらなる好ましい実施形態では、前記ｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地は、追加的に、または代わりに、その全ての組合せを含めた以下のものの少なくとも任意の１つまたは複数をさらに含む、またはこれらからなる：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的ＷＮＴ経路アゴニスト。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明のこのさらなる態様は、上記の特色のいずれかを含んでもまたはこれらによって特徴付けられてもよい。
【００５０】
本発明の第３の態様では、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液
を含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地中で系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞を培養することを含む、神経細胞分化のための方法が提供される。
【００５１】
より好ましくは、前記前駆細胞は、未熟神経細胞もしくは神経プロジェニター細胞、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、成体幹細胞、体性幹細胞、またはがん幹細胞を含む群から選択される。
【００５２】
本発明の第３の態様のさらなる好ましい実施形態では、前記方法は、その全ての組合せを含めた以下のものの少なくとも任意の１つまたは複数を追加的にさらに含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地中で前記細胞（複数可）を培養することを含む：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的ＷＮＴ経路アゴニスト。
【００５３】
本発明の第３の態様のさらなる好ましい実施形態では、前記方法は、
ｉ〜ｘを含む第１の神経細胞分化培地中で前記神経プロジェニター細胞（複数可）を培養すること；
その後ｉ〜ｖｉｉプラスｘｉを含む第２の神経細胞分化培地中で前記細胞（複数可）を培養すること
を含む。
【００５４】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、前記方法は、第１の神経細胞分化培地中で前記細胞（複数可）を、少なくとも１〜２０日、またはより理想的には３〜１４日、またはさらにより理想的には以下の日、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４日を含むまたはこれらからなる群から選択されるさらにいくつかの日の間、培養することを含む。
【００５５】
追加的に、本発明の第３の態様のさらなる好ましい実施形態では、当業者は、細胞が３０日間を超えて培養下で保持され得ることを認識することになるが、前記方法は、第２の神経細胞分化培地中で前記細胞を少なくとも１〜３０日間培養することを含む。理想的には、当業者は、細胞が３０日間を超えて培養下で保持され得ることを認識することになるが、前記細胞は、第２の神経細胞分化培地中で３〜３０日間培養される。さらにより理想的には、前記細胞は、第２の神経細胞分化培地中で以下の日、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０日以上を含むまたはこれらからなる群から選択される日数の間、培養される。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明のこのさらなる態様は、上記の特色のいずれかを含んでもまたはこれらによって特徴付けられてもよい。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、神経細胞への少なくとも１つの前駆細胞の系列特異的分化のための、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液
を含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地の使用が提供される。
【００５８】
最も好ましくは、前記前駆細胞は、例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、成体幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または神経細胞への系列特異的分化の能力がある任意の他の細胞だが、これらに限定されない、多能性もしくは多分化能幹細胞またはプロジェニター細胞を含む群から選択される。神経細胞は、例えば、ニューロン、アストロサイトまたはグリア細胞だが、これらに限定されない神経系の部分として分類される任意の細胞型と解釈される。
【００５９】
本発明のこのさらなる態様のさらなる好ましい実施形態では、前記神経細胞分化培地は、追加的に、または代わりに、その全ての組合せを含めた以下のものの少なくとも任意の１つまたは複数をさらに含む、またはこれらからなる：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的ＷＮＴ経路アゴニスト。
【００６０】
本発明のこのさらなる態様の好ましい実施形態では、前記神経細胞分化培地は、ニューロンを作製する、増数させるまたは成長させるために使用される。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、
ａ．以下のものを含む、またはこれらからなる神経細胞分化培地、
ｉ）少なくとも１つの細胞培養基本培地；
ｉｉ）神経細胞培養のための少なくとも１つの無血清栄養補助剤；
ｉｉｉ）細胞周期阻害剤；
ｉｖ）少なくとも１つのトロポミオシン受容体キナーゼＢ［ＴｒｋＢ］受容体アゴニスト；
ｖ）古典的Ｗｎｔ経路アゴニスト；
ｖｉ）アスコルビン酸もしくはビタミンＣまたはその塩もしくは誘導体；および
ｖｉｉ）カルシウムイオンの溶液。
ｂ．任意選択で、試薬および前記神経分化培地の使用に関する説明書
を含む、神経細胞への系列特異的分化の能力がある少なくとも１つの前駆細胞の培養および／または分化のためのキットが提供される。
【００６２】
本発明のこのさらなる態様のさらなる好ましい実施形態では、前記神経細胞分化培地は、追加的に、または代わりに、その全ての組合せを含めた以下のものの少なくとも任意の１つまたは複数をさらに含む、またはこれらからなる：
ｖｉｉｉ）ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
ｉｘ）ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質）活性化因子；
ｘ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体アゴニスト；および
ｘｉ）非古典的ＷＮＴ経路アゴニスト。
【００６３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前記キットは、
ａ．ｉ〜ｘを含む第１の神経細胞分化培地；
ｂ．ｉ〜ｖｉｉ、その上ｘｉを含む第２の神経分化培地；および
ｃ．任意選択で、試薬ならびに前記第１および第２の神経分化培地の使用に関する説明書
を含む。
【００６４】
以下の特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、さもなければ文脈がはっきりとした言い回しまたは必要な含蓄により要求する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という言葉、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化体は、包括的な意味で使用される、すなわち、述べられた特色の存在を規定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特色の存在または追加を排除しない。
【００６５】
本明細書において引用された全ての特許または特許出願を含めた全ての参考文献は、参照によりここに組み込まれている。いかなる参考文献も、従来技術を構成すると認められない。さらに、従来技術のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の部分を構成すると認められない。
【００６６】
本発明の各態様の好ましい特色は、他の態様のいずれかと関連して記載され得る。
【００６７】
本発明の他の特色は、以下の例から明らかとなろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含めた）において開示された特色の任意の新規な１つ、または任意の新規な組合せに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例と関連して記載された特色、整数、特徴、化合物または化学的部分は、それとともに不適合でない限り、本明細書で記載された任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。
【００６８】
さらに、特に記述がない限り、本明細書で開示された任意の特色は、同じまたは類似した目的を果たす代替の特色によって置き換えられ得る。
【００６９】
ここで、本発明は、ほんの一例として、以下の図の特定の参照で記載されることになる：
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ヒトｉＰＳ細胞の効率的神経化。ヒトｉＰＳ細胞を、二重のＳＭＡＤ阻害プロトコールを通してＴＧＦベータシグナル伝達を阻害するためにＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９処置を使用してロゼットに神経化した。特に、ヒトｉＰＳ細胞をｍＴｅｓＲ培養培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のマトリゲルがコーティングされたプレート上で成長させた。６０〜７０％コンフルエントの時、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＳＬＩ分化培地（レチノイン酸を有さない２％Ｂ２７および１０マイクロモルＳＢ４３１５４２、１マイクロモルＬＤＮ１９３１８９および１．５マイクロモルＩＷＲ１（全てＴｏｃｒｉｓ製）で補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２中で８日間培養した。その後、細胞を同じであるが、ＳＢ４３１５４２を有さない培地（ＳＬ培地）中で培養した。１６日で、神経ロゼットを免疫細胞化学的検査のために固定し、プロセシングした。  左のパネル、上部（Ａ）および下部（Ｅ）は、青でのＤＡＰＩでの核染色を示す。上部パネルは、各ＦＯＸＧ１−陽性ロゼット（Ｂ、赤）の中心へのＺＯ−１局在化（Ｃ、緑）によって同定されるように、特徴的な神経ロゼット構造体を示す。ＢおよびＣの合併であるＤは、ロゼット構造体を例示する。  下部パネルは、神経プロジェニターマーカーネスチン（Ｆ、緑）およびＳｏｘ２（Ｇ、赤）の同時発現を示す。Ｈは、ＦおよびＧの合併である。  スケールバーは、示されたように、１００マイクロメーターを表す。
【図２】ＰＤ０３３２９９１およびＤＡＰＴは、分化中に神経プロジェニター増殖を阻害する。  ＡおよびＢ．棒グラフは、Ｃｙｑｕａｎｔ細胞増殖アッセイを使用して決定された相対蛍光値（細胞数と比例する）を示す。細胞をＰＤ０３３２９９１（Ａ）またはＤＡＰＴ（Ｂ）の濃度を増加させながら蒔き、培養の３、６、９および１２日後にアッセイした。アスタリスクは、経時的な細胞数の有意な増加、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０１を示す。ＮＳは、薬物処置による成長阻害から生じるアッセイ蛍光の有意な増加がないことを示す。  Ｃ．対照培地、あるいは２μΜ  ＰＤ０３３２９９１もしくは１０μＭ  ＤＡＰＴ、または両方で補充した培地に蒔いた後３日（上部のパネル）および７日（最下部のパネル）でのＫｉ６７免疫反応性（緑）および神経プロジェニター培養物中のＤＡＰＩ（青）での細胞核染色。スケールバーは、示されたように、１００マイクロメーターを表す。  Ｄ．対照培地または２μΜ  ＰＤ０３３２９９１および１０μΜ  ＤＡＰＴで補充した培地中で７日間分化したｉＰＳ由来神経プロジェニターのネスチン（上部のパネル）およびβ−ＩＩＩ−チューブリン（下部のパネル）免疫反応性。スケールバーは、示されたように、１００マイクロメーターを表す。
【図３】アストロサイト馴化培地は、自発的な電気活性によって測定されるように、シナプス形成を増強する。  Ａ．各週での興奮した細胞の比率（％）を示す棒グラフである（天然の膜電位（Ｖｍ）での電流固定（Ｉ＝０ｐＡ）中の自発的活動電位（ｓＡＰ）。カイ二乗検定を各週で行い、対照（ＡＣＭ−）およびＡＣＭ処置（ＡＣＭ＋）ｉＰＳ由来ニューロンを比較した。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ有意差なし；ｎ＝１４７。  Ｂ．最大３週間の対照培地（ｃｏｎｔ、円）またはＡＣＭ（四角）中で分化したニューロンの平均静止膜電位（Ｖｍ）の比較。Ｔ検定を各週で行って、対照培地およびＡＣＭ処置細胞を比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ有意差なし；ｎ＝１４７。  Ｃ．Ｖｍに対してプロットされた自発的活性を実証したまたは実証しなかった全ての細胞を比較するボックスおよびウィスカープロットである。水平のバーは、平均であり、ボックスは、９５％信頼を示し、ウィスカーは、上位および下位四分位数を示す。Ｔ検定を行って、２つの平均値を比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝２９８。  Ｄ．１０μＭビククリンでのＧＡＢＡＡ受容体遮断の非存在（上部のトレース）および存在（下部のトレース）下でのＡＣＭ中で３週間分化した細胞におけるテトロドトキシン非感受性自発的微小内向き電流を示す電圧固定（Ｖｈ＝−２０ｍＶ）中の例の電流記録である。
【図４】Ｃａ２＋またはＧＡＢＡＡシグナル伝達の遮断は、ＡＣＭのシナプス形成効果を閉鎖する。ＡＣＭ単独、または１０μΜビククリン（ＧＡＢＡＡアンタゴニスト）を有する、２μΜニフェジピン（Ｌ型Ｃａ２＋チャネルアンタゴニスト）を有する、１００ｎＭコノトキシン（Ｎ型Ｃａ２＋チャネル毒素）を有するもしくは１００ｎＭ  ＳＮＸ４８２（Ｒ型Ｃａ２＋チャネル毒素）を有するＡＣＭ中の分化の３週後のｓＡＰを興奮させている細胞の比率（Ａ）および平均Ｖｍ（Ｂ）を比較する棒グラフである。カイ二乗検定を行って、ＡＣＭ単独に対して各毒素を有するＡＣＭを比較した。±Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ有意差なし、ｎ＝５７。
【図５】高Ｃａ２＋またはＧＡＢＡは、ＡＣＭの効果を部分的に模倣して、過分極および自発的活性を促進することができる。対照培地（０．６ｍＭ  Ｃａ２＋）、高Ｃａ２＋培地（１．８ｍＭ  Ｃａ２＋）、３００μΜ  ＧＡＢＡを有する対照培地、および１０μΜビククリンを有する高Ｃａ２＋培地中の分化の１および２週後のｓＡＰを興奮させている細胞の比率（Ｃ）および平均Ｖｍ（Ｄ）を比較する棒グラフである）。Ｔ検定を行って、各週に関してＧＡＢＡおよび高Ｃａ２＋培地を対照培地と、およびビククリン培地を高Ｃａ２＋培地と比較した。±Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ有意差なし、ｎ＝１３３。
【図６】高Ｃａ２＋培地中のＧＡＢＡＡおよびＣａ２＋電流の操作：効果および機能的救出。対照培地（０．６ｍＭ  Ｃａ２＋）、高Ｃａ２＋培地（１．８ｍＭ  Ｃａ２＋）ならびに１０μΜビククリンを有する、２μΜニフェジピンを有する、１００ｎＭコノトキシンを有する、および１００ｎＭアガトキシン（強力なＰ／Ｑ型Ｃａ２＋チャネル毒素）を有する高Ｃａ２＋培地で処置した場合の、週２でのｓＡＰを興奮させている細胞の比率（Ａ）および平均Ｖｍ（Ｂ）を比較する棒グラフである。カイ二乗検定を行って、高Ｃａ２＋培地単独に対して各毒素を有する高Ｃａ２＋培地を比較した。±Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ有意差なし、ｎ＝９０。  高Ｃａ２＋培地（１．８ｍＭ  Ｃａ２＋）および１００ｎＭコノトキシンを有する高Ｃａ２＋培地、３００μΜ  ＧＡＢＡを有するコノトキシン、１０μΜビククリンおよび１μΜ  ＢａｙＫ８６４４（Ｌ型Ｃａ２＋チャネルのアゴニスト）を有するビククリンで処置した週２でのｓＡＰを興奮させている細胞の比率（Ｃ）および平均Ｖｍ（Ｄ）を比較した棒グラフである。カイ二乗検定を行って、コノトキシン対ＧＡＢＡを有するコノトキシンおよびビククリン対ＢａｙＫ８６４４を有するビククリンで処置した細胞の比率を比較した。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ＝６５。
【図７】プロトコールは、ＰＳＣ由来ニューロンが誘導活動電位列を興奮させる能力を劇的に増強する。標準およびシナプス形成促進性培地中の誘導性活動電位産出：標準（ＳＦＤＭ４）およびシナプス形成促進性（ＳＣＭ１／２）培地（１６日目ロゼットから蒔かれた細胞、ＳＣＭ１／２、ｎ＝１４、ロゼット後２１〜２３日（ＤＰＲ）でパッチされた。ＳＦＤＭ４、ｎ＝１０、２４ＤＰＲでパッチされた）中のｉＡＰを示す細胞の百分率を底部に円グラフで示す。例のトレースを上に示す。
【図８】プロトコールは、ＰＳＣ由来ニューロンの自発的活動電位活性を劇的に増強する。標準およびシナプス形成促進性培地中の自発的活動電位産出：標準（ＳＦＤＭ４）およびシナプス形成促進性（ＳＣＭ１／２）培地（１６日目ロゼットから蒔かれた細胞。ＳＣＭ１／２、ｎ＝１５、２１〜２３ＤＰＲでパッチされた。ＳＦＤＭ４、ｎ＝１０、２４ＤＰＲでパッチされた）中のｓＡＰを示す細胞の百分率を底部に円グラフで示す。例のトレースを図８に示す。
【図９】プロトコールは、微小シナプス電流の高周波数の発生を促進する。例は、上記のプロトコールによって分化したニューロン中の高周波数ＧＡＢＡＡＲ依存微小シナプス電流を示す。微小電流を５０ｎＭ  ＴＴＸの存在下で電圧固定（保持電位＝−７０ｍＶ）で測定し、これは、ネットワーク化されたニューロンのシナプス間隙での神経伝達物質の自発的小胞放出を示している。これらの電流を選択的ＧＡＢＡＡＲアンタゴニストである１０μΜビククリンの追加によって完全に消滅させた（ｎ＝５）。
【図１０】プロトコールは、高度な均一性を有する機能的に成熟したニューロンを産出する。細胞をＳＣＭ１／２に１６日目ロゼットから蒔き、ロゼット後２１日（ＤＰＲ）で画像化した。  Ａ．プロトコールを使用して分化したｈＰＳＣ由来のニューロン中の細胞内Ｃａ２＋濃度のＦｕｒａ２蛍光記録の例示的時間経過を示すグラフである。各矢印で、細胞を以下の溶液に１５ｓ間経時的に曝露した：細胞脱分極を誘起するための高塩化カリウム濃度（ＮａＣｌを等張性に置き換える５０ｍＭ）を有するＥＣＳ；３００マイクロモルＧＡＢＡを含有するＥＣＳ；３００マイクロモルＧＡＢＡを有する低塩化ナトリウム濃度（イセチオン酸ナトリウムによって等張性に置き換えられた最終１５ｍＭ）を有するＥＣＳ、１００マイクロモルＮＭＤＡプラス１０マイクロモルグリシンを含有するＥＣＳ；１００マイクロモルＡＭＰＡを含有するＥＣＳ、および：１００マイクロモルカイナイトを含有するＥＣＳ。  Ｂ．分野内のプロトコールを使用して分化したｈＰＳＣ由来ニューロンの全てにおける細胞内Ｃａ２＋濃度のＦｕｒａ２蛍光記録の提示時間経過を示すグラフである。溶液追加は、正確にパネルＡに記載されたとおりである。各記録は、各トレースを明確に示すために右上方に移動されていることに注目されたい（疑似３−Ｄビュー）。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
表１．第１の神経分化培地構成成分（ＳＣＭ１）、それらの機能およびその代替の構成成分；
表２．第２の神経分化培地構成成分（ＳＣＭ２）、それらの機能およびその代替の構成成分；
表３．細胞培養培地構成成分および構成成分濃度；
表４．ＳＣＭ１分化培地構成成分および構成成分濃度；
表５．ＳＣＭ２分化培地構成成分および構成成分濃度。
【００７２】
方法
分化プロトコールの開発のバックグラウンド
前記プロセスにおけるニューロン分化を促進することにおけるアストロサイト馴化培地（ＡＣＭ）の機能および電圧活性化Ｃａ２＋チャネルの特定の役割を分析している間に、高Ｃａ２＋濃度およびＧＡＢＡ追加の有意性が発見された。これらの研究では、神経プロジェニター細胞がマウス皮質アストロサイトで馴化されたまたはされていないＢ２７で補充された培地に前述のように蒔かれ、分化された。
【００７３】
ＡＣＭの作製
Ｐ１およびＰ２でのコンフルエントな培養物を使用して、神経分化基本培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：３）、２％Ｂ２７、１％非必須アミノ酸；全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ、Ｕ．Ｋ．製）を馴化した。ＡＣＭを７２ｈ後に回収し、ろ過滅菌し、アリコートし、後の使用のために−８０℃で保管した。ＡＣＭの種々のバッチをマウスＣＣＬ２（ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド２）ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１イムノアッセイ。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｏｎ．、Ｕ．Ｋ．）を使用して比較し、１ｍｇ．ｍｌ−１のＣＣＬ２の一定最終濃度に標準化した。ニューロンを分化するために、ＡＣＭを１：１比で分化基本培地と混合した。
【００７４】
分化プロトコール
プロトコールを神経プロジェニター細胞のニューロン分化に適用する。神経プロジェニター細胞は、いろいろな供給源、特にＰＳＣからネスチン／Ｐａｘ６／Ｓｏｘ２陽性神経ロゼット段階プロジェニターへの神経誘導および分化から得られ得る。様々な発表されたプロトコールによって従来法でＰＳＣから誘導された神経プロジェニター細胞の細胞懸濁液（新鮮に調製されたまたは凍結したものから採取された）を神経分化のために直接蒔く。細胞は、任意の組合せで、ポリ−Ｄ−リシン、マトリゲル、ポリ−Ｌ−リシンおよびラミニンを含むが排他的ではない、任意の確立されたコーティングの１つでコーティングされていてもまたはされていなくてもよいガラスカバースリップ上に蒔いてもよい。細胞は、組織培養プラスチック上にも蒔いてもよい。
【００７５】
添付の図に示されたデータに関して、神経プロジェニターの単一細胞懸濁液（ａｃｃｕｔａｓｅ処置によって得られた）を２４ウェル組織培養プレートのウェル内のポリ−Ｄ−リシン／マトリゲルがコーティングされたカバースリップ上に約１×１０６細胞／ｍｌの密度で蒔いた。蒔かれた細胞を３７℃で１ｈ、接着させておき、次いで５００マイクロリットルのＳＣＭ１分化培地（神経原性培地表４）中で培養し、培地を蒔いた後２および５日で新鮮ＳＣＭ１分化培地と８０：２０置換によって交換した。
【００７６】
蒔いた後７日で、培地をＳＣＭ１からＳＣＭ２分化培地（シナプス形成培地表５）に換え、細胞培養を最大３０日間２〜３日毎にＳＣＭ２培地の８０：２０を交換しながらＳＣＭ２分化培地中で続けた。当業者は、必要な場合、３０日間を超えて分化細胞を培養できることを認識することになる。
【００７７】
細胞増殖
細胞周期およびＮｏｔｃｈ経路阻害剤で処置された培養物中の細胞増殖をＣｙｑｕａｎｔ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。簡潔に述べると、１×１０４神経プロジェニターをマトリゲルで前処置した透明底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｉｏｎ）の黒いウェル毎に蒔き、Ｂ２７およびＰＤ０３３２９９１またはＤＡＰＴなどの小分子阻害剤で補充したＡＤＦ培地中で培養した（図２）。プレートを製造者の説明書に従ってプロセシングし、蛍光Ｃｙｑｕａｎｔ測定値をボトムリード蛍光モードにおいてＦＩＴＣ（４８０ｎｍ励起／５３５ｎｍ発光）フィルターを使用してＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（商標）プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して培養の３、６、９および１２日目に三連の細胞から得た。各測定値をバックグラウンド蛍光を除去するためのブランクとしてブランク抑制色素を使用して較正した。
【００７８】
免疫細胞化学
上記のカバースリップ上で成長した細胞を室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を室温で２０分間透過性にし（リン酸緩衝生理食塩水中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、次いで１時間ブロッキング溶液（リン酸緩衝生理食塩水中の２％正常ヤギ血清、３％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００中でブロックした。細胞を同じ緩衝液中で希釈した一次抗体（ウサギ抗ＦＯＸＧ１、マウス抗Ｓｏｘ２（Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＺＯＩ（Ａｂｃａｍ）、マウス抗ネスチン（Ａｂｃａｍ）抗ＫＩ６７（Ｓｉｇｍａ）および抗βＩＩＩ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）で４℃で終夜インキュベートした。次いで、カバースリップを３回各５分間リン酸緩衝生理食塩水中の０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄し、ブロッキング緩衝液で適切に希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギａｌｅｘａ  ５９４またはヤギ抗マウス４８８二次抗体（１：４００、Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。カバースリップを上記のように洗浄し、ＤＡＰＩを有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを使用してスライド上に据え付け、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【００７９】
ニューロンの生理学的特徴付け
ホールセルパッチクランプ
細胞外溶液（ＥＣＳ）は、ｍＭで、１３５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、５ＨＥＰＥＳ、１０グルコース、１．２ＭｇＣｌ２、１．２５ＣａＣｌ２、ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨを含有した。細胞内液（ＩＣＳ）は、（ｍＭで）１１７ＫＣｌ、１０ＮａＣｌ、１１ＨＥＰＥＳ、１１ＥＧＴＡ、２ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２、２Ｎａ２．ＡＴＰ、ＫＯＨで７．２に調整されたｐＨを含有した。パッチクランプのためのＡｇ／ＡｇＣｌ電極を純銀線を終夜漂白させておくことによって作製した。パッチクランプヘッドステージに連結しているＡｇ／ＡｇＣｌペレット（Ｃｌａｒｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をバス（参照）電極として使用した。薄壁、フィラメントの、ホウケイ酸ガラス管（Ｗｏｒｌｄ−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を二段階ピペットプラー（ＰＰ−８３０、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、Ｊａｐａｎ）を使用して引き、内部ピペット溶液で満たされた場合、３〜６ΜΩの測定された先端抵抗を有するパッチピペットを得た。これらのピペットを使用して、パッチクランプ技法のホールセル配置を確立した。
【００８０】
ホールセルパッチクランプを室温で行った。ガラスカバースリップ上で成長した蒔かれた細胞を防振空気テーブル上のファラデーケージ内に据え付けられた位相差光学装置を備えた倒立顕微鏡のステージ上に据え付けられた灌流チャンバー中に移した（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）。ＥＣＳでの細胞の連続灌流をリザーバーとして５０ｍＬ使い捨てシリンジを使用して重力送りシステムによって維持した。連続灌流を分当り約２〜４ｍｌの速度で維持した。必要な場合、２０ｍｓもの速さの溶液交換を可能にし、重力送りラピッドソリューションチェンジャー（ＲＳＣ、ＲＳＣ−２００、Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、様々な溶液を細胞に直接適用した。廃液をＴｙｇｏｎ管を有する廃棄Ｂｕｃｈｎｅｒフラスコに連結された、炎で熱して引っ張ったガラス管を通して真空吸引経由で除去した。パッチクランプピペットをＩＣＳで部分的に満たし、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ７００Ａ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＤｉｇｉＤａｔａ  １３２０Ａ／Ｄインターフェースに付着しているＣＶ２０１ＡＵヘッドステージ上に据え付けた。
【００８１】
電流固定を使用して、Ａｘｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ  ｐＣｌａｍｐ９ソフトウェアを使用してパッチされた細胞に産出された電流プロトコールを適用した。これらをｐＣｌａｍｐソフトウェアを使用したさらなる分析のためにオンラインで記録した。オフラインデータレビューおよび分析をＡｘｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ  Ｃｌａｍｐｆｉｔ９、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍ６を使用して行った。自発的活動電位（ｓＡＰ）：細胞を静止膜電位（Ｖｍ）の記録および任意の自発的活動電位の観察のためにゼロ電流注入を有する電流固定において保持した。記録を、静止膜電位に影響を及ぼす実際のサイトゾル溶液でのピペットＩＣＳ透析の効果を減少させ、ホールセルアクセス後すぐに「ギャップフリー」プロトコールを使用して行った。記録をＶｍの平均算出のためにおよび自発的活動電位が記録されるのを可能にするために約６０ｓ間行った。
【００８２】
誘導活動電位（ｉＡＰ）：可変性電流注入を使用して、膜電位を−８０ｍＶ近くに保持した。１９スイープをとる１０ｐＡ増加での０ｐＡから１８０ｐＡの１０００ｍｓ間の電流の連続的注入を活動電位閾値に達し、通過する膜電位への活動電位応答を誘発する試みで使用した。
【００８３】
電流ステッププロトコールからのデータをＣｌａｍｐｆｉｔにおいて分析し、さらなるプロセシングのためにＥｘｃｅｌにエクスポートした。電流固定における６０ｓ「ギャップフリー」記録中の平均Ｖｍを静止膜電位とした。自発的活性を示している細胞では、ベースラインの推定をトレースから行った。ｓＡＰに関して、ゼロ電流注入モードにおける静止膜電位記録を以下のように分類した：ノー−明白な活動電位なし、未遂−０ｍＶを超える脱分極に失敗した活動電位様事象、およびイエス−０ｍＶを超えて脱分極した活動電位。ｉＡＰに関して、約−８０ｍＶを生成する保持電流から連続的に増加する電流ステップ中の膜電圧記録を以下のように分類した：ノー−明白な活動電位なし、未遂−０ｍＶを超える脱分極に失敗した活動電位様事象、イエス−０ｍＶを超えて脱分極した活動電位、未遂列−０ｍＶを超える脱分極に失敗した０ｍＶを超える最初の活動電位後の反復活動電位様事象、および列−０ｍＶを超えて脱分極した０ｍＶを超える最初の活動電位後の反復性活動電位。
【００８４】
Ｃａ２＋画像処理
レシオメトリックＣａ２＋感受性色素Ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）をＣａ２＋画像処理実験に使用した。この色素を５０μｇアリコートで乾燥粉末として購入した。使用前に、これらのアリコートをボルテックスによって５０μｌ  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解した。次いで、それらを３７℃で１ｈインキュベートし、色素が完全に溶解したことを保証した。１μｌの１ｍｇ／ｍｌ  Ｆｕｒａ−２−ＡＭストックを２５０μｌの正常細胞成長培地に加え、混合した。次いで、ガラスカバースリップ上の細胞をウェルに加え、加湿組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で３０分間インキュベートした。ストックと色素を含有する培地の両方を、色素の光退色を防ぐために直射日光の外で保管した。このインキュベーションは、Ｆｕｒａ−２−ＡＭが細胞に取り込まれ、切断され、活性色素Ｆｕｒａ−２に変わることを可能にした。Ｆｕｒａ−２がロードされた細胞をＣａｉｒｎモノクロメーターに基づく蛍光システム（Ｃａｉｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆａｖｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１上に据え付けられたカバースリップの底と顕微鏡油浸レンズの直接アクセスを可能にするように設計された特殊化された灌流チャンバーに置き、連続的にＥＣＳで灌流した。画像処理を室温で行った。Ｆｕｒａ−２を３４０および３８０ｎｍでモノクロメーターから発光される蛍光光を使用して交互に励起させた。５１０ｎｍでの画像をスロースキャンＣＣＤカメラ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）によって０．３３または０．２Ｈｚで得た。溶液、アゴニストおよびアンタゴニストを重力駆動ラピッドソリューションチェンジャーを使用して細胞に局所的に適用した。
【００８５】
Ｃａ２＋画像処理データ分析
３４０または３８０ｎｍでの交互の励起中の５１０ｎｍでの発光強度の形のローデータを記録し、保管した。バックグラウンド減算後、発光比（３４０／３８０）をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳ）を使用してオフラインで算出した。示す場合、データをさらなる分析を可能にするためおよび比較のために最初の１０フレームに標準化した。
【００８６】
結果
神経プロジェニターは、文献に記載されているいろいろなプロトコールを使用して多能性幹細胞から誘導することができ、これらを本明細書で記載したプロトコールを使用したさらなるニューロン分化に使用することができる。神経発生およびニューロン成熟を図１の説明に記載したプロトコールを用いてｈＰＳＣから誘導された神経プロジェニターを使用して本明細書で例証する。かかる神経プロジェニターは、密着結合−１（ＺＯ−１）免疫反応性のフォーカス（図１）および高分裂指数（例えば、図２Ｂ、対照に示されたＫｉ６７免疫反応性を参照されたい）によって同定される神経ロゼット形成の高発生率でＦｏｘｇ１、Ｓｏｘ２およびネスチン陽性細胞として特徴付ける。
【００８７】
神経プロジェニターからニューロンへの移行における決定的なステップは、細胞周期離脱につながる細胞周期の延長である。神経発生を開始する培養培地を開発するために、我々は、最初に、２つの小分子を使用してプロジェニター細胞周期離脱を同期することを目標とした。最初に、我々は、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る進行をブロックし、Ｇ１において神経芽細胞を保持するためのサイクリン依存キナーゼ４／６の小分子阻害剤であるＰＤ０３３２９９１を使用した。図２Ａは、ＰＤ０３３２９９１で処置された培養物における濃度依存成長停止を示す。ＰＤ０３３２９９１での処置による強制的な細胞周期離脱が処置の３日後のＫｉ６７免疫陽性細胞の完全な喪失によって認められる（図２Ｃ）。さらに、我々は、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴによって例証される）を使用して、Ｎｏｔｃｈ経路シグナル伝達をブロックした。Ｎｏｔｃｈ経路阻害は、前神経遺伝子発現を活性化することが既知であり、それは、細胞増殖を減少させもする（図２Ｂ）。しかしながら、ＤＡＰＴ単独処置は、ＰＤ０３３２９９１処置培養物において認められるものと比較したＫｉ６７免疫染色のより進行性の喪失によって認められるように、細胞周期離脱および分化を同期するのに不十分であった（図２Ｃ）。したがって、組合せでは、ガンマセクレターゼ阻害および細胞周期停止は、同期的かつ持続性細胞周期離脱および神経原性促進性「プログラム」の増強をもたらした。処置の７日後のＰＤ０３３２９９１／ＤＡＰＴ処置培養物における神経分化は、対照培養物と比較した、ニューロフィラメントβ−ΙΙΙ−チューブリンの広範な発現、および神経プロジェニターマーカーネスチンの発現の顕著な減少によって認められた（図２Ｄ）。
【００８８】
アストロサイト共培養またはアストロサイト−馴化培地（ＡＣＭ）の使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのニューロン成熟を促進するために通例用いられてきた。しかしながら、ＡＣＭの作用の機構は、十分に定義されておらず、重大なことに、ＡＣＭの構成物は、全く定義されていない。そのように、ＡＣＭは、幹細胞研究のための頑強かつ再現可能な試薬として使用することができず、ここで、定義された培地の使用が最高である。我々は、より過分極した静止膜電位（図３Ａ）および自発的活動電位を産出することができる細胞の比率の大きな増加（図３Ｂ）によって評価されるように、ＡＣＭがＰＳＣ由来ニューロンの機能的成熟を促進することを観察した；静止膜電位と自発的活性の実証間の明白な相関があった（図３Ｃ）。さらに、ＡＣＭは、シナプス性に結合したニューロンの成熟ネットワークの発達を示す微小シナプス電位の高レベルを促進した（図３Ｄ）。
【００８９】
どのようにＡＣＭがＰＳＰ由来ニューロンのかかる機能的成熟を促進するかを理解するために、ＡＣＭにおける分化を特異的イオンチャネルブロッカーの存在または非存在下で行った。したがって、ＧＡＢＡＡ受容体ブロッカー、ビククリン、および特異的電圧活性化Ｃａ２＋チャネルアンタゴニスト、ニフェジピン、コノトキシンおよびＳＮＸ−４８２（それぞれ、Ｌ、ＮおよびＲ型チャネルをブロックする）は全て、自発的活性（図４Ａ）および過分極（図４Ｂ）のＡＣＭ誘起誘導を消滅させた。これらのデータは、ＡＣＭがＧＡＢＡＡおよびＣａ２＋シグナル伝達経路の調節を通してその効果を発揮し得ることを示唆している。
【００９０】
Ｃａ２＋流入がニューロン成熟の重要な決定因子であったという考えを試験するために、細胞外Ｃａ２＋濃度を対照培地中で０．６ｍＭから１．８ｍＭまで増加させ、静止Ｖｍと自発的活性の両方をホールセルパッチクランプを使用して再び測定した。増加したＣａ２＋濃度は、自発的活性を産出する細胞の比率の増強をもたらし、これは、２週目で有意になった（図５Ａ）。増加したＣａ２＋は、１週目での平均静止Ｖｍの有意な過分極も誘起した（図５Ｂ）。２週目までに、両方の群の静止Ｖｍは、この過分極したレベルで安定化した（図５Ｂ）。これらのデータは、増加するＣａ２＋流入がＡＣＭを部分的に模倣するであろうことを示唆している。しかしながら、有意な脱分極性刺激なしに、単独または組合せでの、増加したＣａ２＋チャネル発現も増加した駆動力も、増加した細胞内Ｃａ２＋を必ずしももたらさない。重要なことに、高細胞外Ｃａ２＋が細胞を過分極させ、自発的活性を増大させる能力は、ＧＡＢＡＡ受容体を１０μΜビククリンによってブロックした場合、完全に除去された（図５Ａ、Ｃ）。さらに、３００μΜ  ＧＡＢＡの追加は、増大している自発的活性および過分極しているＶｍにおいて１週目で増加した細胞外Ｃａ２＋と同じくらい効果的であった（図５Ａ、Ｃ）。これらのデータは、ＧＡＢＡ依存脱分極または高細胞外Ｃａ２＋がどちらも分化ニューロンのＡＣＭ誘起成熟を模倣する能力があることを示している。
【００９１】
適切なチャネルブロッカーを用いて、高Ｃａ２＋が特異的なＣａ２＋チャネルを通したＧＡＢＡＡ依存Ｃａ２＋流入を経由してニューロンの成熟を増大させるかどうかを試験した。実験のこの別々のセットでは、１．８ｍＭ  Ｃａ２＋における分化の２週は、自発的活性の増加を促進し、Ｖｍを過分極した（図６Ａ、Ｂ）。重要なことに、１．８ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下で、ビククリン、ニフェジピンまたはコノトキシンは、自発的活性を完全にブロックし、Ｖｍを脱分極した（図６Ａ、Ｂ）。対照的に、アガトキシン（Ｐ／Ｑチャネルブロッカー）は、全く影響がなく（図７Ａ、Ｂ）、高Ｃａ２＋の効果がＬおよびＮ型Ｃａ２＋チャネルおよびＧＡＢＡシグナル伝達に依存していたことを示唆している。
【００９２】
ＧＡＢＡＡ受容体またはＮ型Ｃａ２＋チャネル遮断が機能的成熟に及ぼす高Ｃａ２＋の正の効果を減少させたので、代替のＣａ２＋流入機構を活性化することによってそれぞれの効果をバイパスする試みを行った。したがって、高Ｃａ２＋でのコノトキシン共処置は、高Ｃａ２＋が自発的活性を増大させる能力を完全にブロックし（図６Ｃ）、細胞を脱分極した（図６Ｄ）。著しく、コノトキシンの効果は、ＧＡＢＡによって逆転され（図６Ｃ、Ｄ）、これは、細胞が活動電位を興奮させる能力を再建し、過分極を誘起した。同等に著しいのは、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルオープナー、Ｂａｙ  Ｋ８６４４が興奮性のビククリン誘起縮小を救出する能力であった（図６Ｃ、Ｄ）。
【００９３】
これらのデータは、ＰＳＣ由来ニューロンの機能的ニューロン成熟の速度および程度が電圧がゲート開閉するＣａ２＋チャネルを通したＧＡＢＡＡ受容体依存Ｃａ２＋流入を刺激することによって大きく増大され得ることを示唆しており、ｈＰＳＣ由来ニューロンの成熟のための定義された培地の我々の開発のための基礎を提供した。
【００９４】
我々の新規なバックグラウンド情報（図１〜６から）を利用して、新しいシナプス促進性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＳＣ分化プロトコールを開発した。したがって、神経ロゼット段階で、神経発生が細胞周期離脱を強制することによって同期され、前神経遺伝子活性化に結合され、高カルシウムの存在下で、ＧＡＢＡＡ受容体に関与する経路が活性化される。ＧＡＢＡＡ受容体活性化の１つの結果は、ＣＲＥＢリン酸化であり、これは、次に、神経原性遺伝子発現を調節することにおける主要な役割を果たす。重要なことに、持続性ホスホＣＲＥＢ活性は、ニューロン分化のシナプス前時期中に必要とされる。分化プロトコールの最初の神経原性時期中のＣＲＥＢ経路活性化の安定なレベルを維持するために、培地をホルスコリンなどの経路の小分子アゴニストでも補充した（表２）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、分化（緊張性のＧＡＢＡ刺激および安定なｐＣＲＥＢ活性によって特徴付けられる）の早期神経原性時期は、シナプス形成によって駆動される活性依存成熟の時期が後に続く。ＷＮＴシグナル伝達は、主要なシナプス形成経路の１つを提供するので、分化培地もＷＮＴ経路アゴニストＣＨＩ  Ｒ９９０２１で補充した。
【００９５】
このプロトコールの結果は、誘導活動電位の反復性列を興奮させ（図７）、自発的活性（図８）および微小シナプス電位（図９）の高レベルを３週内に産出する能力を促進するその能力によって証明されるように、ＰＳＣ由来ニューロンの成熟の速度および程度を大きく増強することであり、標準的なニューロン分化プロトコールによって入手不可能である結果である（図７および８）。さらに、このプロトコールは、成熟ニューロンの同種の集団の産出ももたらす。したがって、図１０に示されたＣａ２＋画像処理実験では、全ての細胞が本質的に類似した様式で応答した。特に、高カリウム曝露は、ニューロンが電圧がゲート開閉するＣａ２＋チャネルを含有したことを実証した。全てのニューロンが高塩素イオンでＧＡＢＡに応答したが、わずかな細胞のみが低塩素イオンでＧＡＢＡに応答し、これは、全てのニューロンがＧＡＢＡ（未熟ニューロンのマーカー）に応答して脱分極する機構を発現したけれども、非常にわずかのみがそれを行ったことを示している。言い換えれば、ニューロンの大部分が成熟した、出生後表現型を実証した。さらに、全ての細胞がＮＤＭＡ、ＡＭＰＡおよびカイナイトに同様に応答し、これは、それらが３つ全ての興奮性、イオンチャネル型グルタミン酸受容体を発現したことを示している。
【００９６】
要約
まとめると、プロトコールは、神経分化の２つの主要な段階；それぞれ異なるシグナル伝達必要条件によって特徴付けられる、神経原性時期およびシナプス形成時期を分離する。これらの必要条件は、蒔かれたＰＳＣ由来神経プロジェニター細胞上で連続的に使用した場合、急速なニューロン分化および機能的成熟につながる２つの定義された培地の製剤によって満たされた。
【００９７】
【表１−１】
2016535586.tif 000003
【００９８】
【表１−２】
2016535586.tif 000004
【００９９】
【表２】
2016535586.tif 000005
【０１００】
【表３】
2016535586.tif 000006
【０１０１】
【表４】
2016535586.tif 000007
【０１０２】
【表５】
2016535586.tif 000008
【図１】
2016535586.tif 000009
【図２】
2016535586.tif 000010
【図３】
2016535586.tif 000011
【図４】
2016535586.tif 000012
【図５】
2016535586.tif 000013
【図６】
2016535586.tif 000014
【図７】
2016535586.tif 000015
【図８】
2016535586.tif 000016
【図９】
2016535586.tif 000017
【図１０】
2016535586.tif 000018
【国際調査報告】
2016535586.tif 000019
2016535586.tif 000020
2016535586.tif 000021
2016535586.tif 000022