(57)【要約】本明細書において、細胞の高効率な部位特異的ゲノム編集のための方法、組成物、およびキットが開示される。細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項２】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項３】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項４】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記変更が挿入欠失である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記変更が、ホモ接合性変更である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
各変更がホモ接合性変更である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が末梢血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８系列ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が肝細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記障害が遺伝障害である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６９】
前記障害が単一遺伝子障害である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７０】
前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７１】
前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７２】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＦＡＣｓが、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項９７】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項９８】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項９９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項１００】
図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０１】
図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０２】
図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０３】
図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０４】
図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０５】
前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１０】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１１】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１２】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１３】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１４】
緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２０】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項１２１】
ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２３】
前記細胞が初代細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞が初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞が自己初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３または１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞が同種初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍである、請求項１から２および１２３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列を含む、請求項１から２および１２３から１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項１から２および１２３から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む、請求項３から４および１２３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列を含む、請求項３から４、１２３から１２６、および１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項３から４、１２３から１２６、および１３０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項１から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記細胞が初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９８〜３０３からの２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む、請求項１３４から１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞が、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５または１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される、ＣＸＣＲ４におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１５１】
前記細胞が初代細胞を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子における異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０から１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍにおけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０から１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項１５６】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項１５７】
初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項１５８】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項１５９】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１６７、１６９、１７１、１７３、または１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１６８、１７０、１７２、１７４、または１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記変更が挿入欠失である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記変更が、ホモ接合性変更である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
各変更がホモ接合性変更である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
前記細胞が末梢血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８系列ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
前記細胞が肝細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記細胞が初代細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１３】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１４】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１５】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１６】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２０】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２１】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２７】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２８】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３７】
前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３８】
前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３９】
前記障害が遺伝障害である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記障害が単一遺伝子障害である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４１】
前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４２】
前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４３】
前記２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
前記２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５０】
各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５１】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５５】
前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５７】
各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６１】
前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６３】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６４】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
ＦＡＣｓが、Ｃａｓと蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６８】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項２６９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項２７０】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項２７１】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項２７２】
配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７３】
配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７４】
配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７５】
配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７６】
配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７７】
前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である、請求項２７２から２７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む、請求項２７２から２７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７９】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８０】
Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む、請求項２７９または２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８３】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８４】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８５】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８６】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８７】
検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８８】
蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８９】
前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項２７２から２８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９０】
前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている、請求項２８９に記載の組成物。
【請求項２９１】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２８９または２９０に記載の組成物。
【請求項２９２】
前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２８２から２９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９３】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項２８２から２９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９４】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９５】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９６】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９７】
ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む、請求項２９４から２９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９８】
ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項２９４から２９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９９】
細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３００】
細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０１】
前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列の切断が、前記結果として生じた１つまたは複数の細胞が前記対象に投与されたときに前記細胞が宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する、請求項２９９または３００に記載の方法。
【請求項３０２】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項２９９から３０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０３】
前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む、請求項２９９から３０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０４】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０５】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０６】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項２９９から３０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０７】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０８】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０９】
前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む、請求項２９９から３０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１０】
細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている、請求項２９９から３０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１１】
前記障害が遺伝障害を含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１２】
前記障害が感染症を含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１３】
前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１４】
前記障害が、がんを含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１５】
対象に投与された細胞が、前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１６】
対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記細胞または細胞集団が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減するリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸であって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断されるリボ核酸と、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項３１５から３１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１８】
前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む、請求項３１５から３１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１９】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２０】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２１】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項３１５から３２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２２】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２３】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２４】
前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む、請求項３１５から３２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２５】
細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている、請求項３１５から３２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２６】
前記障害が遺伝障害を含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２７】
前記障害が感染症を含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２８】
前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２９】
前記障害が、がんを含む、請求項３２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年４月４日に出願した米国仮出願第６１／８０８，５９４号の利益を主張する。米国仮出願第６１／８０８，５９４号の教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１−ＨＬ１１８７４４、Ｒ００−ＨＬ０９８３６４およびＲ０１−ＤＫ０９５３８４のもと、政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、哺乳動物細胞における所望のゲノム部位を標的化する新しいクラスのゲノム編集ツールである。最近公表されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前でヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列（ゆえに、（Ｎ）２０ＮＧＧ標的ＤＮＡ配列）とハイブリダイズする合成ガイドＲＮＡと複合体を形成することによって、ゲノム部位に標的化されるＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する。これは、ＮＧＧモチーフのヌクレオチド３個上流に二本鎖切断をもたらす。この二本鎖切断によって、エラーを起こしやすく、遺伝子アレルをノックアウトするフレームシフト変異を助長する非相同末端結合、またはゲノムにおける変異をノックインもしくは修正するために外因的に導入された二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ修復鋳型を使用して開発することができる相同組換え修復のいずれかが扇動される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、治療的応用のために有用なツールであり得るが、残念ながら、以前に公表された報告によって、ヒト幹細胞においてわずかに２％〜４％のアレル標的化効率が実証された（Maliら、Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Maliら、Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書記載の研究は、最大８０％の効率で変異細胞をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するアレル標的化方法を実証している。特に、本明細書記載の研究は、驚いたことに予想外に、初代体細胞ではなく細胞系（例えば、２９３Ｔ）において標的ポリヌクレオチド配列を効率的に欠失させることが発明者らによって実証された単一ガイド戦略とは対照的に、複数ガイド戦略（例えば、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列にガイドし、それとハイブリダイズする２つまたはそれを超えるリボ核酸を使用する）が、初代体細胞（例えば、ヒト血液細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞）において標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を効率的および効果的に欠失させることを実証している。これらの大いに改善された方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が治療目的で最初に効果的に利用されることを可能にする。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、特異的遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を標的化するのに有用な特定のガイド配列に加えて、有用なＲＮＡガイド配列を特異的に同定する方法が提供される。そのうえ、本明細書において開示された組成物および方法を利用する処置方法（例えば、ＨＩＶ感染症の処置方法）が提供される。
【０００５】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【０００６】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記機能的ドメインが、複合体を形成する。
【００１０】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記機能的ドメインが、複合体を形成する。
【００１１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される。
【００１２】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。
【００１３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。
【００１４】
一部の実施形態では、前記変更が挿入欠失である。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。
【００１５】
一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、各変更がホモ接合性変更である。
【００１６】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。
【００１７】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。
【００１８】
一部の実施形態では、前記細胞が末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が造血幹細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８系列ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が肝細胞である。
【００１９】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害である。一部の実施形態では、前記障害が単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
【００２５】
一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。
【００２６】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００２８】
一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００２９】
一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約５％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約１０％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約５０％〜約８０％である。
【００３０】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる。一部の実施形態では、前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である。
【００３１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される。
【００３２】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣｓが、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【００３４】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００３５】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００３６】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００３７】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００３８】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００３９】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４０】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４１】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４２】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４３】
一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む。
【００４４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４９】
一部の実施形態では、前記組成物は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
【００５０】
一部の実施形態では、前記組成物は、前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【００５１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【００５２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。一部の実施形態では、前記キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む。一部の実施形態では、前記キットは、ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が自己初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が同種初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍである。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９８〜３０３からの２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記細胞が、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される、ＣＸＣＲ４におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍを含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子における異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍにおけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【００５５】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である。
【００５６】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【００５７】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００５８】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって初代細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００５９】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００６０】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列を変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、ことを含む、方法を提供する。
【００６１】
一部の態様では、本開示は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって初代細胞におけるポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である
【００６２】
一部の態様では、本開示は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって初代細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００６３】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能的ドメインは複合体を形成する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能的ドメインは複合体を形成する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、複数のリボ核酸と複合体を形成される。
【００６４】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記変更が挿入欠失である。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、ホモ接合性変更である。
【００６５】
一部の実施形態では、各変更がホモ接合性変更である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。一部の実施形態では、前記細胞が末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が造血幹細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８系列ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が肝細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である。
【００６６】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害である。一部の実施形態では、前記障害が単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００７０】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００７１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる。一部の実施形態では、前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む。
【００７２】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記方法は、前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することを含む。一部の実施形態では、細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣｓが、Ｃａｓと蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【００７３】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列は切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約８％〜約８０％である。
【００７４】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００７５】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、変更効率は約８％〜約８０％である。
【００７６】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００７７】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である。
【００７８】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、を含む、方法を提供する。
【００７９】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約８％〜約８０％である。
【００８０】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００８１】
一部の態様では、本開示は、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８２】
一部の態様では、本開示は、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８３】
一部の態様では、本開示は、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８４】
一部の態様では、本開示は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８５】
一部の態様では、本開示は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８６】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸である。
【００８７】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む改変リボ核酸を含む。
【００８８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００８９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を提供する。
【００９０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９３】
一部の実施形態では、前記組成物は、検出可能なマーカーをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の実施形態では、前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【００９４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９７】
一部の実施形態では、前記キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団を含む。一部の態様では、前記キットは、ＤＮＡ修復鋳型を含む。
【００９８】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００９９】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１００】
一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列の切断が、前記結果として生じた１つまたは複数の細胞が前記対象に投与されたときに前記細胞が宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する。一部の態様では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている。一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害を含む。一部の実施形態では、前記障害が感染症を含む。一部の実施形態では、前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む。一部の実施形態では、前記障害が、がんを含む。
【０１０１】
一部の態様では、本発明は、対象に投与された細胞が、前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０２】
一部の態様では、本発明は、対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記細胞または細胞集団が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする見込みを低減するリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸であって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断されるリボ核酸と、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている。一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害を含む。一部の実施形態では、前記障害が感染症を含む。一部の実施形態では、前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む。一部の実施形態では、前記障害が、がんを含む。
【０１０４】
特許または特許出願のファイルは、有色で作製された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を有するこの特許または特許出願のコピーは、請求に応じて、および必要な手数料の支払いによって官庁が提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１−１】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−２】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−３】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−４】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−５】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−６】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−７】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−８】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−９】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−１０】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【０１０６】
【図２−１】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−２】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−３】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−４】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−５】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−６】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−７】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−８】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−９】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１０】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１１】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１２】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【０１０７】
【図３】図３は、Ｃａｓタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示す。黄色のハイライトは、Ｒｕｖ−Ｃ−様ドメインを示す。下線は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを示す。
【０１０８】
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためのヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（インデル％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）およびガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）をトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためのヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（インデル％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）およびガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）をトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためのヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（インデル％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）およびガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）をトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｅ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためのヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（インデル％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）およびガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）をトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ−標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【０１０９】
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、二重ガイド戦略が、高い有効性を伴って臨床的に関連性のある細胞においてゲノム編集を達成することを示す。図５Ａは、単一のガイド（ＡまたはＢ）と比較して、２つのガイドの組合せ（Ａ＋Ｂ）が、Ｋ５６２細胞系においてＣＣＲ５の標的化においてロバストな編集効率性を示したことを示す。図５Ｂは、様々なガイドの組合せ、および配向を伴う各ガイド対の間のスペーシングを示す（上のパネル）。ＰＣＲ結果（下の左のパネル）およびＣＥＬアッセイ（下の右）は、試験したガイド対についてのロバストなゲノム編集を示す。図５Ｃは、２つのガイドの間のＤＮＡ配列を効果的に除去しなかったニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）と対照的に、２つのガイドの組合せによって、野性型Ｃａｓ９が２つのガイドの間のＤＮＡ配列を効果的に除去したことを示すＰＣＲ分析の結果を示す。図５Ｄは、二重Ｂ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲの組合せを示す概略図である。
【０１１０】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２つのガイドアプローチを使用したヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける有効なゲノム編集を示す。図６Ａは、２つのガイドを使用した効率的なクローン除去の頻度を示す代表的なゲルの写真である。クローン除去効率性は、メチルセルロース上で増殖している個々のコロニー上で行ったＰＣＲによって決定した。図６Ｂは、２つの独立したクローン除去実験から得たデータを示す表であり、これは２つのガイドアプローチを使用した初代ヒトＣＤ３４＋細胞における有効なゲノム編集を示唆する。
【０１１１】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、二重ガイド戦略が、初代細胞と対照的に、２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍ編集の効率性を改善させないことを示す。図７Ａは、６ウェルフォーマットにおいてトランスフェクションの７２時間後に１μｇのＣａｓ９、および０．５μｇのｇＲＮＡまたは０．２５μｇ＋０．２５μｇのＢ２Ｍを標的化するｇＲＮＡでエレクトロポレーションした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。図７Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡによるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す（７２時間）。図７Ｃは、初代細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を有意に改善させる二重ガイド戦略と対照的に、二重ガイド戦略が２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を改善させないことを示す（図５）。
【図７Ｃ】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、二重ガイド戦略が、初代細胞と対照的に、２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍ編集の効率性を改善させないことを示す。図７Ａは、６ウェルフォーマットにおいてトランスフェクションの７２時間後に１μｇのＣａｓ９、および０．５μｇのｇＲＮＡまたは０．２５μｇ＋０．２５μｇのＢ２Ｍを標的化するｇＲＮＡでエレクトロポレーションした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。図７Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡによるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す（７２時間）。図７Ｃは、初代細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を有意に改善させる二重ガイド戦略と対照的に、二重ガイド戦略が２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を改善させないことを示す（図５）。
【０１１２】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、二重ガイド戦略を使用した体細胞（例えば、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞）におけるＢ２Ｍ表面発現の切除を示す。図８Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（総生細胞）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ＋細胞をゲート）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を定量化する表を示す。図８Ｄは、生／７ＡＡＤネガティブ／ＧＦＰ＋細胞をゲートした細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、これは二重ガイド戦略がＢ２Ｍ表面発現の切除をもたらすことを示す。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、二重ガイド戦略を使用した体細胞（例えば、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞）におけるＢ２Ｍ表面発現の切除を示す。図８Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（総生細胞）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ＋細胞をゲート）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を定量化する表を示す。図８Ｄは、生／７ＡＡＤネガティブ／ＧＦＰ＋細胞をゲートした細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、これは二重ガイド戦略がＢ２Ｍ表面発現の切除をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
発明の詳細な説明
本明細書記載の研究は、最大８０％の効率で変異細胞をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するアレル標的化方法を実証している。特に、本明細書記載の研究は、驚いたことに予想外に、初代体細胞ではなく細胞系（例えば、２９３Ｔ）において標的ポリヌクレオチド配列を効率的に欠失させることが発明者らによって実証された単一ガイド戦略とは対照的に、複数ガイド戦略（例えば、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列にガイドし、それとハイブリダイズする２つまたはそれを超えるリボ核酸を使用する）が、初代体細胞（例えば、ヒト血液細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞）において標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を効率的および効果的に欠失させることを実証している。これらの大いに改善された方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が治療目的で最初に効果的に利用されることを可能にする。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、特異的遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を標的化するのに有用な特定のガイド配列に加えて、有用なＲＮＡガイド配列を特異的に同定する方法が提供される。そのうえ、本明細書において開示された組成物および方法を利用する処置方法（例えば、ＨＩＶ感染症の処置方法）が提供される。そのうえ、本明細書に開示された組成物および方法を利用した、細胞を投与する方法（例えば、宿主免疫応答をトリガーする見込みが低減した細胞を投与する方法）が提供される。
【０１１４】
一態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法を提供する。
【０１１５】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための例示的な一方法は、ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列は切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である。
【０１１６】
本明細書において使用される用語「接触させること」（すなわち、ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および／またはリボ核酸と接触させること）は、細胞においてＣａｓタンパク質および／もしくはリボ核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば、Ｃａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸を培養細胞に添加すること）または細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含むことが意図される。本明細書開示の標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸と接触させるステップは、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、細胞は、接着培養または懸濁培養の状態で処置され得る。本明細書開示のＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸と接触された細胞は、また、増殖因子もしくは他の分化剤のような別の薬剤または細胞を安定化するためもしくは細胞をさらに分化させるための環境と、同時にまたは続いて接触させることができることが理解されている。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１８】
単離された細胞に適用される用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などには、細胞を任意の種類のプロセスもしくは状態に供すること、または細胞に任意の種類の操作もしくは手順を行うことが含まれる。対象に適用されるとき、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列が本明細書記載の方法によりｅｘ  ｖｉｖｏで変更された細胞を個体に提供することを指す。個体は、通常、病気もしくは負傷しており、または集団の平均メンバーと比べて病気になるリスクが増加しており、そのような注意、ケア、もしくは管理を必要とする。
【０１１９】
本明細書に使用される用語「処置すること」および「処置」は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患における改善、例えば有益な、または所望の臨床結果を有するように、標的ポリヌクレオチド配列が本明細書記載の方法によりｅｘ  ｖｉｖｏで変更された細胞の有効量を対象に投与することを指す。本発明のために、有益な、または所望の臨床結果には、非限定的に、検出可能または検出不可能のいずれにしても、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または完全のいずれにしても）が含まれる。処置することは、処置を受けていない場合に予想される生存期間よりも生存期間を延長することを指すことがある。したがって、当業者は、処置が病状を改善し得るが、疾患の全快ではないおそれがあることを認識している。本明細書において使用される用語「処置」には予防が含まれる。あるいは、疾患の進行が低減または休止するならば、処置は「有効」である。「処置」は、また、処置を受けていない場合に予想される生存期間よりも生存期間を延長することを意味することがある。処置を必要とする者には、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断された者、および遺伝感受性または他の要因によりそのような障害を発生する見込みがある者が含まれる。
【０１２０】
疾患または障害の「処置」、「予防」または「改善」は、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防すること、そのような疾患または障害に関連する状態の進行または重症度の進行、増悪または悪化を後退、軽減、改善、阻害、減速または停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。
【０１２１】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための例示的な一方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む。
【０１２２】
本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用する当業者の求めに応じられる任意の様式で標的ポリヌクレオチド配列を変更することを考えている。細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更する能力がある任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。そのようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多様なＣａｓタンパク質を採用することができる（Haftら、PLoS  Comput  Bioi．２００５年；１巻（６号）ｅ６０頁）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更させるＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系である。
【０１２３】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するために使用することができる。本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を任意の目的で変更することを考えている。一部の実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、変異細胞を産生するために変更される。本明細書に使用される「変異細胞」は、結果として生じた遺伝子型がその本来の遺伝子型と異なる細胞を指す。場合により、例えば、正常に機能している遺伝子が本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して変更された場合、「変異細胞」は変異表現型を表す。他の場合には、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が変異遺伝子型を修正するために使用された場合、「変異細胞」は野生型表現型を表す。一部の実施形態では、遺伝子変異を修正または修復するために（例えば、細胞に正常な表現型を回復させるために）、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は変更される。一部の実施形態では、遺伝子変異を誘導するために（例えば、遺伝子またはゲノムエレメントの機能を破壊するために）、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は変更される。
【０１２４】
一部の実施形態では、変更は挿入欠失である。本明細書に使用される「挿入欠失」は、挿入、欠失、またはその組合せに起因する変異を指す。当業者によって認識されるように、ゲノム配列のコード領域における挿入欠失は、その挿入欠失の長さが３の倍数でない限りフレームシフト変異をもたらす。一部の実施形態では、変更は点変異である。本明細書に使用される「点変異」は、ヌクレオチドの１つを交換する置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列において任意の長さの挿入欠失または点変異を誘導するために使用することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその部分のノックアウトをもたらす。標的ポリヌクレオチド配列またはその部分を本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してノックアウトすることは、多様な適用のために有用であり得る。例えば、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ目的のために、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するために有用であり得る（例えば、細胞における変異型アレルをｅｘ  ｖｉｖｏでノックアウトし、ノックアウトされた変異型アレルを含むそれらの細胞を対象に導入することによる）。
【０１２６】
本明細書に使用される「ノックアウト」には、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨害する方法で標的ポリヌクレオチド配列の全部または部分を欠失させることが含まれる。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えばＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列に挿入欠失を誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって果たすことができる。当業者は、本明細書記載の詳細に基づき、標的ポリヌクレオチド配列またはその部分をノックアウトするために本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をいかにして使用するかを容易に認識する。
【０１２７】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。用語「減少する」、「低減される」、「低減」、および「減少」は、全て、統計的に有意な量の減少を意味するために、本明細書において全般的に使用される。しかし、疑いを避けるために、減少する」、「低減される」、「低減」、および「減少」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の減少、例えば参照レベルと比べて少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％もしくは１００％を含む最大１００％の減少（すなわち参照試料と比べて不在のレベル）の減少、または１０〜１００％の間の任意の減少を意味する。
【０１２８】
用語「増加した」、「増加する」または「強化する」または「活性化する」は、全て、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において全般的に使用される。任意の疑いを避けるために、用語「増加した」、「増加する」または「強化する」または「活性化する」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の増加、例えば参照レベルと比べて少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％を含む最大１００％の増加、または１０〜１００％の間の任意の増加、または参照レベルと比べて少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍から１０倍もしくはそれを超える間の任意の増加を意味する。
【０１２９】
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般的にマーカーの正常濃度から２標準偏差（２ＳＤ）下またはそれ未満の濃度を意味する。この用語は、差があるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真である場合に、帰無仮説を棄却する決定を行う確率として定義される。その決定は、しばしばｐ値を使用して行われる。
【０１３０】
一部の実施形態では、変更は、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、変更はヘテロ接合性変更である。
【０１３１】
一部の実施形態では、変更は、望まれない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列の任意の種類の変異またはエラーを修正するために使用することができる。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、欠失が原因で標的ポリヌクレオチド配列から欠落しているヌクレオチド配列を挿入するために使用することができる。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、また、挿入変異が原因で標的ポリヌクレオチド配列からヌクレオチド配列を欠失させるまたは切除するために使用することができる。場合により、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、誤ったヌクレオチド配列を正しいヌクレオチド配列と交換するために（例えば、機能喪失型変異、すなわちＳＮＰが原因で障害された標的ポリヌクレオチド配列の機能を回復するために）使用することができる。
【０１３２】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と比較して驚くほどの高効率で標的ポリヌクレオチドを変更することができる。ある特定の実施形態では、変更効率は、少なくとも約５％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、少なくとも約１０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約１０％〜約８０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約３０％〜約８０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約５０％〜約８０％である。一部の実施形態では、変更効率は、約８０％より大きいかまたはそれに等しい。
【０１３３】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変更するのに使用することができる。当業者であれば、いずれか特定の細胞における変更させようとする所望の標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、またはそれとは異なり細胞への病原体の侵入を容易にする任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に認識する。例えば、細胞において変更させようとする所望の標的ポリヌクレオチド配列は、疾患関連の単一ポリヌクレオチド多型を含有するゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であってもよい。このような例において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、疾患関連のＳＮＰを野生型アレルで置き換えることによって、細胞において疾患関連のＳＮＰを修正するのに使用することができる。別の例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の機能を破壊して病原体の細胞への侵入または細胞内部での増殖を防ぐための欠失または挿入にとって好適な標的であり得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物のゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノム配列である。
【０１３５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、病原性のゲノム配列である。例示的な病原性のゲノム配列には、非限定的に、ウイルスのゲノム配列、細菌のゲノム配列、菌類のゲノム配列、毒性のゲノム配列、または寄生虫性のゲノム配列が含まれる。このような実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、病原体のゲノム配列（例えば、細胞への侵入にとって重要なゲノム配列、または病原体が細胞内部に入ったら、増殖、成長もしくは生存に関与するゲノム配列）を切断することによって、病原体の機能を破壊する（例えば、病原体による感染症を処置または予防する）のに使用することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ；遺伝子番号５６７）である。Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列は、実質的に全ての有核細胞の表面で発現される主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の重鎖と会合する血清タンパク質をコードする。Ｂ２Ｍタンパク質は、ある特定の病態においてアミロイド原線維を形成することが見出されたベータ−プリーツシート構造を含む。Ｂ２Ｍ遺伝子は、およそ８ｋｂに及ぶ４つのエキソンを有する。Ｂ２Ｍは、正常な個体の血清中で観察されているが、ウィルソン病、カドミウム中毒、および腎尿細管の機能不全を引き起こす様々な状態を有する患者からの尿中ではより多くの量で観察される。Ｂ２Ｍに関連することが公知の他の病態には、非限定的に、家族性の異化亢進による低タンパク血症を有する個体で報告されているＢ２Ｍ遺伝子中のホモ接合性変異（例えば、ａｌａ１１ｐｒｏ）、家族性の内臓性アミロイド症（visceral  amyloidosis）を有する個体で報告されているＢ２Ｍ遺伝子中のヘテロ接合性変異（例えば、ａｓｐ７６ａｓｎ）が含まれる。
【０１３７】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオーソログである。
【０１３８】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１；遺伝子番号３２５１）である。
【０１３９】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５（遺伝子番号１２３４、またＣＣ−ＣＫＲ−５、ＣＣＣＫＲ５、ＣＣＲ−５、ＣＤ１９５、ＣＫＲ−５、ＣＫＲ５、ＣＭＫＢＲ５、およびＩＤＤＭ２２としても公知）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５のバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５のオーソログである。
【０１４０】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４（遺伝子番号７８５２、またＦＢ２２；ＨＭ８９；ＬＡＰ３；ＬＣＲ１；ＮＰＹＲ；ＷＨＩＭ；ＣＤ１８４；ＬＥＳＴＲ；ＮＰＹ３Ｒ；ＮＰＹＲＬ；ＨＳＹ３ＲＲ；ＮＰＹＹ３Ｒ；およびＤ２Ｓ２０１Ｅとしても公知）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４のバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４の相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４のオーソログである。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、様々な方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断できることが認識される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
【０１４１】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズさせることを可能にする好適な標的モチーフを含有する限りは、本発明の方法は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変更するのに使用することができる。当業者は、特定のポリヌクレオチドを標的化するための標的モチーフは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および標的化しようとするポリヌクレオチドの配列に依存することを認識している。
【０１４２】
一部の実施形態では、標的モチーフは、少なくとも２０ｂｐの長さである。一部の実施形態では、標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的モチーフは、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。
【０１４３】
本発明の標的モチーフは、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のオフターゲット作用（off-target  effects）を最小化するように選択されてもよい。一部の実施形態では、標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。当業者は、オフターゲット作用を最小化するための好適な標的モチーフを選択するのに、様々な技術（例えば、バイオインフォマティクス分析）を使用できることを認識している。
【０１４４】
一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列を修正するための相同組換え修復を利用する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復は、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡ修復鋳型は、どのような長さを有していてもよい。当業者は、いずれか特定のＤＮＡ修復鋳型の長さは、修正しようとする標的ポリヌクレオチド配列に依存すると予想されることを認識している。ＤＮＡ修復鋳型は、任意の標的ポリヌクレオチド配列、特に疾患関連の多型（例えば、ＳＮＰ）を含む標的ポリヌクレオチド配列を修復したり、または置き換えたりするために設計することができる。例えば、このようなＳＮＰを含む変異型アレルの相同組換え修復は、変異型アレルに隣接する２つの標的モチーフを選択して、野生型アレルとマッチするようにＤＮＡ修復鋳型を設計することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により達成することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズすることができる１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つとを含む。
【０１４６】
「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、ペプチド結合によって結合した一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指し、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化（glycosolated）など）およびアミノ酸類似体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、パラログ、断片ならびに他の等価体、バリアント、およびそれらの類似体が含まれる。
【０１４７】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換または改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一部の場合では、置換および／または改変は、タンパク質分解を予防または低減したり、および／または細胞におけるポリペプチドの半減期を延長したりすることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合の置換え（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ある部分（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含むための改変を含んでいてもよい。
【０１４８】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質には、非限定的に、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプ（またＣＡＳＳ２としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＥ．ｃｏｌｉサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、およびＣａｓ５ｅが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（またＣＡＳＳ３としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、およびＣｓｙ４が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（またＣＡＳＳ４としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（またＣＡＳＳ１としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、およびＣａｓ５ｄが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（またＣＡＳＳ７としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。例示的なＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、およびＣａｓ５ｈが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（またＣＡＳＳ５としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、およびＣａｓ５ａが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（またＣＡＳＳ６としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。例示的なＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、およびＣｓｍ５が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、非限定的に、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６が含まれる。
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的にはトランスにコード化された低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系の一員である。Ｃａｓ９タンパク質（またＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。図３に、例示的なＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２９８）を示す。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６および９８２〜９８９）と、ｃｒＲＮＡと相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）とを包含する２つのエンドヌクレアーゼ（enconuclease）ドメインを含有する。図３では、ＲｕｖＣ様ドメインを黄色で強調表示し、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを下線で示す。
【０１５０】
「機能的部分」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成して標的ポリヌクレオチド配列を切断するペプチドの能力を保持するペプチドの部分を指す。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能的ドメインは、複合体を形成する。
【０１５１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。
【０１５２】
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と接触させる様々な方法を考えていることが認識される。一部の実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチドの形態で細胞に導入させることができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合させることができる。「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、本明細書で使用される場合、それぞれ細胞への分子の取込みを容易にするポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有していてもよい。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、電荷を有する（例えば、正の、負のまたは全体的に中性の電荷を有する）タンパク質にコンジュゲートまたは融合させることができる。このような連結は、共有結合であってもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を過剰に正電荷を有するＧＦＰに融合させて、Ｃａｓタンパク質の細胞に浸透する能力を有意に増加させることができる（Cronicanら、ACS  Chem  Biol．２０１０年；５巻（８号）：７４７〜５２頁）。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させて、Ｃａｓタンパク質の細胞への侵入を容易にすることができる。例示的なＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、およびペネトラチンが含まれる。
【０１５５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、過剰に正電荷を有するＧＦＰに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成できる。好適な技術には、リン酸カルシウムまたは脂質が媒介するトランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用する形質導入または感染が含まれる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書記載のような改変ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書記載のような改変ｍＲＮＡ（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書記載のような修飾核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。
【０１５８】
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を考えている。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者に認識されるように、本発明のリボ核酸は、採用される特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて多種多様の標的モチーフとハイブリダイズするように選択されてもよい。また１〜２つのリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択されてもよい。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、デオキシリボ核酸モチーフが、標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。
【０１５９】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質を、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドリボ核酸配列は、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖における配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆の鎖における配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆の鎖における配列と相補的ではなく、かつ／またはハイブリダイズしない。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオーバーラップする標的モチーフと相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフと相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
【０１６５】
また本発明は、多重ゲノム編集（multiplex  genomic  editing）も考えている。当業者は、上記の単一の遺伝子のゲノム編集に関する説明は、後述する多重ゲノム編集の実施形態にも等しく適用可能であることを認識している。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法を提供する。
【０１６７】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための例示的な方法は、ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【０１６８】
さらに別の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法を提供する。
【０１６９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための例示的な方法は、（ａ）ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する。
【０１７０】
本明細書において使用される用語「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」は、所望の部位に導入された細胞を少なくとも部分的に局在化させる方法または経路によって、細胞、例えば本発明の方法に従って変更された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書記載の細胞を対象に配置する状況において同義的に使用される。細胞は、所望の部位に直接埋め込まれてもよいし、またはその代わりに、埋め込まれた細胞の少なくとも一部分または細胞の成分が生存可能な、対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与されてもよい。対象に投与した後の細胞の生存期間は、短くて数時間、例えば２４時間〜数日から、長くて数年であってもよい。一部の場合では、細胞はまた、肝臓または皮下などの所望の部位以外の位置に、例えば、埋め込んだ位置に埋め込まれた細胞を維持して埋め込まれた細胞の移動を回避するためにカプセル中で投与されてもよい。
【０１７１】
ｅｘ  ｖｉｖｏの方法の場合、細胞は、自己細胞、すなわち、１つまたは複数の細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更することが必要な対象から採取した１つまたは複数の細胞（すなわち、ドナーとレシピエントとが同じ個体である）を含んでいてもよい。自己細胞は、あらゆる免疫学に基づく細胞の拒絶反応を回避する利点を有する。その代わりに、細胞は、例えばドナーから採取された異種細胞であってもよい。第２の対象は、同一または異なる種の対象であってもよい。典型的には、細胞がドナー由来の場合、その細胞は、免疫抑制の必要性を減らすかまたはなくすために、免疫学的にレシピエントと十分な適合性を有するドナー由来であり、すなわち移植による拒絶反応に晒されないと予想される。一部の実施形態では、細胞は、異種の源から採取され、すなわち、免疫学的にレシピエントと十分適合するように遺伝子工学的に改変された非ヒト哺乳動物、またはレシピエントの種から採取される。免疫学的適合性を決定するための方法は当業界において公知であり、ＨＬＡおよびＡＢＯ決定基に関してドナー−レシピエントの適合性を評価するための組織型別が含まれる。例えば、Transplantation  Immunology、BachおよびAuchincloss編（Wiley,  John  &  Sons,  Incorporated、１９９４年）を参照されたい。
【０１７２】
本発明のｅｘ  ｖｉｖｏの方法のために、任意の好適な細胞培養培地を使用することができる。
【０１７３】
用語「対象」および「個体」は、本明細書において同義的に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、および／または本明細書記載のような細胞を用いた予防的処置などの処置が提供されるヒトを指す。特定の動物、例えばヒト対象にとって特定の感染症、状態または病態を処置する場合、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書において同義的に使用される「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類が含まれる。また用語「対象」は、これらに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類などの任意の脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または他の哺乳動物、例えば家畜哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、および同種のもの、または生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、および同種のものである。
【０１７４】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、変更は、望まれない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、各変更は、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約５％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約１０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約３０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約５０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約８０％より大きいかまたはそれに等しい。
【０１７５】
一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
【０１７６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、各標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフは、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、各標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。
【０１７８】
一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復は、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は一本鎖である。一部の実施形態では、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は二本鎖である。
【０１８０】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、複数のリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される（例えば、単一の標的ポリヌクレオチド配列の複数の変更）。一部の実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される（例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の１つまたは複数の変更）。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、デオキシリボ核酸モチーフが、標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。
【０１８１】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。
【０１８４】
Ｃａｓタンパク質またはリボ核酸はいずれも、プラスミドから発現させることができることが認識されるものとする。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはリボ核酸はいずれも、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）における発現増加に最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む。本発明は、細胞を選択するための任意の好適な方法を考えている。一部の実施形態では、細胞を選択することは、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣは、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【０１８６】
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する様々な障害を処置および／または予防することを考えている。本明細書記載の方法および組成物は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の発現増加、および標的ポリヌクレオチド配列の発現減少に関連する障害を処置または予防するために使用できることが認識されるものとする。標的ポリヌクレオチド配列の発現増加および発現減少は、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増加または減少する環境、ならびに標的ポリヌクレオチド配列の発現産物の機能および／または活性レベルが、正常な発現および／または活性レベルと比べてそれぞれ増加または減少する環境を含む。当業者は、標的ポリヌクレオチド配列の発現増加に関連する障害を処置または予防することは、細胞を本明細書記載の組成物と接触させた後に関連細胞において標的ポリヌクレオチド配列（またはそれらの発現産物）のレベルおよび／または活性が減少するかどうかを決定することによって評価できることを認識している。当業者はまた、標的ポリヌクレオチド配列の発現減少に関連する障害を処置または予防することは、細胞を本明細書記載の組成物と接触させた後に関連細胞において標的ポリヌクレオチド配列（またはそれらの発現産物）のレベルおよび／または活性が増加するかどうかを決定することによって評価できることも認識している。
【０１８７】
一部の実施形態では、障害は、遺伝障害である。一部の実施形態では、障害は、単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、障害は、多重遺伝子障害である。一部の実施形態では、障害は、１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害である。例示的な１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害としては、米国特許第７，６２７，４３６号に記載された複合的な疾患、ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ／２００９／１１２８８２号で記載されたようなアルツハイマー病、米国特許公開公報第２０１１／００３９９１８号で記載されたような炎症性疾患、米国特許公開公報第２０１２／０３０９６４２号で記載されたような多嚢胞卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号で記載されたような心臓血管疾患、米国特許公報第２０１２／０１３６０３９号で記載されたようなハンチントン病、欧州特許公開公報ＥＰ２５３５４２４号で記載されたような血栓塞栓性疾患、ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ／２０１２／００１６１３号で記載されたような神経血管疾患、米国特許公開公報第２０１０／０２９２２１１号で記載されたような精神病、米国特許公開公報第２０１１／０３１９２８８号で記載されたような多発性硬化症、ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ／２００６／０２３７１９号Ａ２で記載されたような統合失調症、統合失調性感情障害、および双極性障害、米国特許公開公報Ｕ．Ｓ．２０１１／０１０４６７４で記載されたような双極性障害および他の疾患、ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ／２００６／１０４３７０号Ａ１で記載されたような結腸直腸がん、米国特許公開公報Ｕ．Ｓ．２００６／０２０４９６９号で記載されたようなＡＫＴ１遺伝子座に隣接するＳＮＰに関連する障害、ＰＣＴ国際出願公報ＷＯ／２００３／０１２１４３号Ａ１で記載されたような摂食障害、米国特許公開公報Ｕ．Ｓ．２００７／０２６９８２７号で記載されたような自己免疫疾患、米国特許第７，７９０，３７０号で記載されたようなクローン病を有する患者における線維性狭窄疾患、および米国特許第８，１８７，８１１号で記載されたようなパーキンソン病が挙げられ、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当業者には、本発明の方法に従って処置または予防できる他の１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害は明らかであると予想される。
【０１８８】
一部の実施形態では、障害はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、障害は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
【０１８９】
本発明の方法は、多種多様の細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、それに続く対象内への導入のために、細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更するために使用される。一部の実施形態では、細胞は、末梢血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８系列ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト多能性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自己初代細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自己初代体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、同種初代細胞である。一部の実施形態では、細胞は、同種初代体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、有核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非形質転換細胞である。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞ではない。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞ではない。一部の実施形態では、細胞は、形質転換細胞ではない。
【０１９０】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【０１９１】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０１９２】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【０１９３】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０１９４】
また本発明は、本発明のＣａｓタンパク質またはその機能的部分、Ｃａｓタンパク質またはその機能的部分をコードする核酸と、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチドの標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするリボ核酸配列とを含む組成物も提供する。
【０１９５】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９６】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９７】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９８】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９９】
一部の態様では、本発明は、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０２００】
一部の実施形態では、組成物中のリボ核酸のうちの少なくとも１つは、本明細書記載のような改変リボ核酸（例えば、合成改変リボ核酸、例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトジン（5-methylcytodine）、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチド、または他の任意の修飾ヌクレオチド、または本明細書記載の改変を含むもの）である。
【０２０１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸は、本明細書記載のような改変リボ核酸（例えば、本明細書記載の合成改変ｍＲＮＡ、例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、または他の任意の修飾ヌクレオチド、または本明細書記載の改変を含むもの）を含む。
【０２０３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチをそれぞれが有する異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３００を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３００を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３０１を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および２９９を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号３０１および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０２を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０１を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０９】
一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０２１０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２１１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、プロモーターは、初代ヒト細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【０２１２】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【０２１３】
また本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキット、および本発明の組成物とキットを使用するための説明書とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットも提供する。
【０２１４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。一部の実施形態では、配列番号２９８〜３０３の少なくとも２つのリボ核酸配列は、オフセット標的配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
【０２３２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団を含む。一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ修復鋳型を含む。
【０２３７】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３８】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列にＣａｓタンパク質を方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３９】
Ｂ２Ｍは、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現のために必要な、ＭＨＣクラスＩタンパク質のアクセサリー鎖である。表面ＭＨＣクラスＩを欠いている細胞（例えば、変異細胞）を人工的に作り出すことによって、人工的に作り出された細胞が宿主に投与されたとき、人工的に作り出された細胞が細胞傷害性Ｔ細胞によって検出される可能性を低減し得ると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列の切断は、細胞が対象に投与されたとき、このように得られた細胞（複数可）が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる。
【０２４０】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、こと；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４１】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより細胞または細胞集団が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、リボ核酸、ならびに（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのさらなるリボ核酸であって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、リボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞（複数可）を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４２】
細胞を投与する方法は、任意の目的のために適応させることができ、ここでは、このような細胞を投与することが望ましいことが意図されている。いくつかの実施形態において、細胞の投与を必要とする対象は、障害を患っている。例えば、対象は、特定の細胞が機能または数において減少している障害を患っていてもよく、特定の細胞が適切に機能している健康または正常な個体から得た機能的細胞を投与し、かつ適切な数のこれらの健康な細胞を個体に投与して、これらの細胞（例えば、細胞数または機能が減少したホルモン産生細胞、細胞数または機能が減少した免疫細胞など）によって実現される機能を修復することが望ましくてもよい。このような場合において、健康な細胞は、健康な細胞の宿主拒絶の可能性を減少させるように人工的に作り出すことができる。いくつかの実施形態において、障害は、遺伝性障害を含む。いくつかの実施形態において、障害は、感染症を含む。いくつかの実施形態において、障害は、ＨＩＶまたはＡＩＤを含む。いくつかの実施形態において、障害は、がんを含む。
【０２４３】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、こと；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞をこのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４４】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより細胞または細胞集団が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、リボ核酸、ならびに（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのさらなるリボ核酸であって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、リボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞（複数可）をこのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。本明細書において使用する場合、「核酸」は、その最も広い意味において、ホスホジエステル結合によって連結しているヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。例示的な核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそのハイブリッドが含まれる。これらはまた、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん体形成を誘発するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、修飾核酸（例えば、本明細書に記載されている合成された改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。
【０２４５】
本発明は、当業者が利用可能な任意の核酸改変の使用を意図する。本発明の核酸は、任意の数の改変を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸は、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む。
【０２４６】
本発明の改変ＲＮＡの製造または合成において使用される改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製は、様々な化学基の保護および脱保護が関与することができる。保護および脱保護の必要性、ならびに適当な保護基の選択は、当業者が容易に決定することができる。
【０２４７】
保護基の化学的性質は、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれているGreeneら、Protective  Groups  in  Organic  Synthesis、第２版、Wiley  &  Sons、１９９１年において見出すことができる。
【０２４８】
改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、これらのそれぞれがその全体が参照により組み込まれているOgataら、Journal  of  Organic  Chemistry、７４巻：２５８５〜２５８８頁、２００９年；Purmalら、Nucleic  Acids  Research、２２巻（１号）：７２〜７８頁、１９９４年；Fukuharaら、Biochemistry、１巻（４号）：５６３〜５６８頁、１９６２年；およびXuら、Tetrahedron、４８巻（９号）：１７２９〜１７４０頁、１９９２年に記載されている合成法によって調製することができる。
【０２４９】
修飾核酸（例えば、リボ核酸）は、分子の全長に沿って均一に改変する必要はない。異なるヌクレオチド改変および／または骨格構造は、核酸において様々な位置において存在し得る。ヌクレオチド類似体または他の改変（複数可）は、核酸の機能が実質的に減少しないように、核酸の任意の位置（複数可）に配置し得ることを当業者は認識する。改変はまた、５’または３’末端改変であり得る。核酸は、最小でも１つの、および最大で１００％修飾ヌクレオチド、または任意の中間の百分率、例えば、少なくとも５０％修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態において、１〜２つのリボ核酸のそれぞれは、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸のうちの少なくとも１つは、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸の多数は改変されている。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸のそれぞれは改変されている。改変リボ核酸は、本明細書に記載されている核酸改変の１つまたは複数を含むことができることを当業者なら理解するであろう。
【０２５１】
いくつかの態様において、本明細書において提供するのは、ポリペプチドをコードする合成された改変ＲＮＡ分子であり、細胞へ合成された改変ＲＮＡ分子を導入することが、１つまたは複数の改変を含まないポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触した細胞と比べて、先天性免疫応答の低減をもたらすように、合成された改変ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の改変を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする合成された改変ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする合成された改変ＲＮＡ分子を含む。
【０２５２】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによる急速な分解を防止し、かつＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を回避または低減させる改変を含む。改変には、これらに限定されないが、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）、３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基改変、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基、またはコンジュゲートされた塩基による置換え、（ｃ）糖改変（例えば、２’位もしくは４’位における）または糖の置換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の改変または置換えを含めたヌクレオシド間連結改変が含まれる。このような改変が翻訳を妨げる（すなわち、例えば、ウサギ網状赤血球のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳アッセイにおいて改変の欠如と比べて翻訳における５０％またはそれ超の低減をもたらす）範囲内において、改変は、本明細書に記載されている方法および組成物に適していない。本明細書に記載の方法において有用な合成された改変ＲＮＡ組成物の具体例には、これらに限定されないが、改変または非天然ヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡ分子が含まれる。改変ヌクレオシド間連結を有する合成された改変ＲＮＡは、数ある中でも、ヌクレオシド間連結においてリン原子を有さないものを含む。他の実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、そのヌクレオシド間連結（複数可）においてリン原子を有する。
【０２５３】
改変ヌクレオシド間連結の非限定的例は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、および極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’を５’−３’に連結し、または２’−５’を５’−２’に連結する）を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態がまた含まれる。
【０２５４】
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６，２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれる。
【０２５５】
その中にリン原子を含まない改変ヌクレオシド間連結は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるヌクレオシド間連結を有する。これらは、モルホリノ連結（部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル（thioformacetyl）骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものを含む。
【０２５６】
改変オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が含まれる。
【０２５７】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡのいくつかの実施形態は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸、およびヘテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、および特に、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして公知である］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号（これらの両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において注目される核酸配列は、その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０２５８】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有することができる。本明細書において注目される核酸は、２’位において下記の１つを含むことができる。Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても、もしくは置換されていなくてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである）。例示的な改変は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、ｎおよびｍは、１〜約１０である。いくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、２’位において下記の１つを含む。Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、レポーター基、インターカレーター、ＲＮＡの薬物動態特性を改善させるための基、または合成された改変ＲＮＡの薬力学的特性を改善させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、改変は、２’メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または−ＭＯＥとしてもまた公知である）（Martinら、Helv.  Chim.  Acta、１９９５年、７８巻：４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な改変は、２’−ＤＭＡＯＥ、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしてまた当技術分野において公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２としてまた公知である２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基である。
【０２５９】
他の改変は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の改変はまた、核酸配列上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することができる。合成された改変ＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、糖模倣物、例えば、シクロブチル部分を有することができる。このような改変された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのいくつかは本出願と共同所有されおり、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が含まれる。
【０２６０】
非限定的例として、本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’−アミノ−改変ヌクレオシド、２’−アルキル−改変ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミデートもしくは非天然塩基、または任意のこれらの組合せを含めた少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含むことができる。
【０２６１】
本明細書に記載されているこの態様および全ての他のこのような態様のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。
【０２６２】
代わりに、合成された改変ＲＮＡは、少なくとも２つの改変ヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれ超、ヌクレオチドの全長までを含むことができる。最小でも、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む合成された改変ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のような改変を有する単一のヌクレオシドを含む。所与の合成された改変ＲＮＡにおける全ての位置が均一に改変されることは必要なく、実際、上記の改変の複数を、単一の合成された改変ＲＮＡにおいて、または合成された改変ＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてさえも組み込むことができる。しかし、分子における所与のヌクレオシドの出現毎に改変される（例えば、各シトシンは、改変シトシン、例えば、５ｍＣである）ことが好ましいが、必要とは限らない。しかし、同じヌクレオシドが異なって出現する毎に、所与の合成された改変ＲＮＡ分子において異なる方法で改変されることができることがまた意図される（例えば、いくつかのシトシンは５ｍＣとして改変され、他は２’−Ｏ−メチルシチジンまたは他のシトシン類似体として改変される）。改変は、合成された改変ＲＮＡにおける複数の改変ヌクレオシドのそれぞれについて同じである必要はない。さらに、本明細書に記載されている態様のいくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、少なくとも２種の異なる改変ヌクレオシドを含む。本明細書に記載されている態様のいくつかのこのような好ましい実施形態において、少なくとも２種の異なる改変ヌクレオシドは、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンである。合成された改変ＲＮＡはまた、改変および非改変ヌクレオシドの両方の混合物を含有することができる。
【０２６３】
本明細書において使用する場合、「非改変」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基は、プリン塩であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）の改変または置換を含む。改変ヌクレオシドは、他の合成および天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン（nubularine）、イソグアノシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）  Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）  ５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）  ２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）  ４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）  ２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラ��ル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（例えば、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１−置換プソイドウラシル、１−置換２（チオ）−プソイドウラシル、１−置換４（チオ）プソイドウラシル、１−置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン��キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、ツベルシジン、イソグアノシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（napthalenyl）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、０６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、または任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化されたその誘導体を含む。改変ヌクレオシドはまた、コンジュゲート部分、例えば、リガンドを含む天然塩基を含む。本明細書において上で考察されているように、改変ヌクレオシドを含有するＲＮＡは、宿主細胞において翻訳可能でなくてはならない（すなわち、改変ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの翻訳を防止しない）。例えば、ｓ２Ｕおよびｍ６Ａを含有する転写物は、ウサギ網状赤血球ライセートにおいて不十分に翻訳され、一方、プソイドウリジン、ｍ５Ｕ、およびｍ５Ｃは、効率的な翻訳と適合性である。さらに、転写物のヌクレアーゼ抵抗性を増加させるのに有用な２’−フルオロ−改変塩基は、非常に非効率的な翻訳をもたらすことは当技術分野において公知である。翻訳は、例えば、ウサギ網状赤血球ライセート翻訳アッセイを使用して当業者がアッセイすることができる。
【０２６４】
さらに修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているもの、Modified  Nucleosides  in  Biochemistry,  Biotechnology  and  Medicine、Herdewijn,  P.編、Wiley-VCH、２００８年において開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８，４２５号において開示されているもの；The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering、８５８〜８５９頁、Kroschwitz,  J.  L編、John  Wiley  &  Sons、１９９０年において開示されているもの、およびEnglischら、Angewandte  Chemie,  International  Edition、１９９１年、３０巻、６１３頁において開示されているものを含む。
【０２６５】
上記で留意される修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基のいくつかの調製について教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、上記で留意されるこれらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５７，１９１号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号、ならびにまたその内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第５，７５０，６９２号が含まれる。
【０２６６】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡで使用するための別の改変は、ＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートをＲＮＡに化学的に連結させることを伴う。本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、５’キャップをさらに含むことができる。本明細書に記載されている態様のいくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、５’−５’トリホスフェート連結を使用してＲＮＡ分子の５’末端に連結した改変グアニンヌクレオチドを含む５’キャップを含む。本明細書において使用する場合、「５’キャップ」という用語はまた、例えば、５’ジグアノシンキャップ、メチレン−ビス（ホスホネート）部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Rydzik,  A  Mら、（２００９年）Org  Biomol  Chem、７巻（２２号）：４７６３〜７６頁を参照されたい）、ホスホロチオエート改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Kowalska,  J.ら、（２００８年）RNA、１４巻（６号）：１１１９〜１１３１頁を参照されたい）、非架橋酸素のための硫黄置換を有するキャップ類似体（例えば、Grudzien-Nogalska,  E.ら、（２００７年）RNA、１３巻（１０号）：１７４５〜１７５５頁を参照されたい）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Grudzien,  E.ら、（２００４年）RNA、１０巻（９号）：１４７９〜１４８７頁を参照されたい）、または抗リバースキャップ類似体（例えば、Jemielity,  J.ら、（２００３年）RNA、９巻（９号）：１１０８〜１１２２頁およびStepinski,  J.ら、（２００１年）RNA、７巻（１０号）：１４８６〜１４９５頁を参照されたい）を含めて他の５’キャップ類似体を包含することを意図する。１つのこのような実施形態において、５’キャップ類似体は、５’ジグアノシンキャップである。いくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、５’トリホスフェートを含まない。
【０２６７】
５’キャップは、翻訳を開始させる、ｍＲＮＡの認識、およびリボソームへのｍＲＮＡの付着のために重要である。５’キャップはまた、合成された改変ＲＮＡを５’エクソヌクレアーゼが媒介する分解から保護する。合成された改変ＲＮＡが５’キャップを含むことは絶対に必要ではなく、したがって、他の実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、５’キャップを欠いている。しかし、５’キャップを含む合成された改変ＲＮＡのより長い半減期、および翻訳の効率性の増加によって、５’キャップを含む合成された改変ＲＮＡは、本明細書において好ましい。
【０２６８】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含むことができる。非翻訳領域は、開始コドン（５’）の前および終止コドン（３’）の後のＲＮＡの領域であり、したがって、翻訳機構によって翻訳されない。非翻訳領域はリボヌクレアーゼおよびＲＮＡ分解に関与する他のタンパク質を妨げることができるため、１つまたは複数の非翻訳領域を有するＲＮＡ分子の改変は、ｍＲＮＡの安定性を改善させることができる。さらに、５’および／または３’非翻訳領域を有するＲＮＡの改変は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合を変更させる結合タンパク質によって翻訳の効率性を増強させることができる。３’ＵＴＲを有するＲＮＡの改変を使用して、ＲＮＡの細胞質局在化を維持することができ、翻訳が細胞の細胞質において起こることを可能とする。一実施形態において、本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含まない。別の実施形態において、合成された改変ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含む。別の実施形態において、本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態において、５’および／または３’ＵＴＲは、細胞において高い安定性を有することが公知であるｍＲＮＡから選択される（例えば、マウスのアルファ−グロビン３’ＵＴＲ）。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または両方は、１つまたは複数の改変ヌクレオシドを含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている合成された改変ＲＮＡは、コザック配列をさらに含む。「コザック配列」とは、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これに別の「Ｇ」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始する。典型的には、開始は、転写物の５’末端の近位にある翻訳機構が遭遇する最初のＡＵＧコドンにおいて起こる。しかし、場合によって、このＡＵＧコドンは、リーキースキャニングと称されるプロセスにおいて迂回することができる。正しいポリペプチドの翻訳が起こるように、ＡＵＧコドンの近くのコザック配列の存在は、翻訳の開始部位としてそのコドンを強化する。さらに、開始コドンに関してアンビギュイティが存在しなくても、合成された改変ＲＮＡへのコザック配列の付加は、より効率的な翻訳を促進する。このように、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている合成された改変ＲＮＡは、所望の部位において翻訳の開始のためのコザックコンセンサス配列をさらに含み、正しい長さのポリペプチドを産生する。いくつかのこのような実施形態において、コザック配列は、１つまたは複数の改変ヌクレオシドを含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、「ポリ（Ａ）テイル」をさらに含み、これはアデニンヌクレオチドの３’ホモポリマーテイルを指し、これは長さが異なることができ（例えば、少なくとも５つのアデニンヌクレオチド）、数百までのアデニンヌクレオチドであり得る。３’ポリ（Ａ）テイルを含むことは、合成された改変ＲＮＡを細胞における分解から保護することができ、また核外局在化を促進して、翻訳効率性を増強させる。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１〜５００のアデニンヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００のアデニンヌクレオチドまたはそれ超を含む。一実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１〜１５０のアデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、９０〜１２０のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかのこのような実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１つまたは複数の改変ヌクレオシドを含む。
【０２７１】
本明細書に記載されている合成された改変ＲＮＡへの１つまたは複数の改変は、細胞における合成された改変ＲＮＡのより大きな安定性を可能とすることが意図されている。このような改変が、翻訳を可能とし、改変を有する合成された改変ＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を低減させ、または増悪させない程度まで、このような改変は、本明細書における使用のために特に意図される。一般に、合成された改変ＲＮＡの安定性が高いほど、より多くのタンパク質をその合成された改変ＲＮＡから生成することができる。典型的には、哺乳動物のｍＲＮＡにおけるＡＵに富んだ領域の存在は、転写物を不安定化する傾向がある。細胞タンパク質はＡＵに富んだ領域に補充され、転写物のポリ（Ａ）テイルの除去を刺激するからである。合成された改変ＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの喪失は、ＲＮＡ分解の増加をもたらすことができる。このように、一実施形態において、本明細書に記載のような合成された改変ＲＮＡは、ＡＵに富んだ領域を含まない。特に、３’ＵＴＲが、ＡＵＵＵＡ配列要素を実質的に欠くことが好ましい。
【０２７２】
一実施形態において、リガンドは、細胞取込み、細胞内の標的化またはリガンドが組み込まれる合成された改変ＲＮＡの半減期を変更する。いくつかの実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠いている組成物と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞型、細胞内コンパートメント、例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソームについて増強された親和性を実現する。好ましいリガンドは、合成された改変ＲＮＡからのポリペプチドの発現を妨げない。
【０２７３】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を撹乱することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを撹乱することによって、細胞への合成された改変ＲＮＡまたはその組成物の取込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、ｔａｘｏｌ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド（japlakinolide）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（myoservin）でよい。
【０２７４】
別の態様において、リガンドは、宿主細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または例えば、がん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。また含まれるのは、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。
【０２７５】
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（antennopedia）である。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたはプソイドペプチド連結、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、これは改変することができる。ヘリックス剤は好ましくは、親油性および疎油性相を好ましくは有するアルファヘリックス剤である。
【０２７６】
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、αヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはＣｅｒｏｐｉｎ  ＰＩ）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシンもしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の主要なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）でよい。例えば、細胞透過ペプチドは、２つの部分からなる両親媒性ペプチド、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＨＩＶ−１ｇｐ４１およびＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧでよい（Simeoniら、Nucl.  Acids  Res.、３１巻：２７１７〜２７２４頁、２００３年）。
【０２７７】
本明細書に記載する合成された改変ＲＮＡは、当技術分野で十分に確立されている方法、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている「Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry」、Beaucage,  S.  L.ら（編）、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.、USAに記載されているものによって合成および／または改変することができる。転写方法は、本明細書の実施例においてさらに記載する。
【０２７８】
本明細書に記載されている態様の一実施形態において、合成された改変ＲＮＡについての鋳型は、「スプリントが媒介するライゲーション」を使用して合成され、これは長いオリゴおよび／またはｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物の制御された鎖状体形成によるＤＮＡ構築体の急速な合成を可能とし、結合領域において制限部位を導入する必要性を伴わない。これを使用して、Ｔ７鋳型生成の間に遺伝子のコード配列に一般的な非翻訳領域（ＵＴＲ）を加えることができる。スプリントが媒介するライゲーションをまた使用して、オープンリーディングフレームに核局在化配列を加え、野性型オープンリーディングフレームから開始する点変異を有するドミナントネガティブな構築物を作製することができる。手短に言えば、一本鎖および／または変性ｄｓＤＮＡ構成要素を、スプリントオリゴにアニーリングし、これによって所望の末端を結合させ、末端を熱安定性ＤＮＡリガーゼによってライゲーションし、所望の構築物をＰＣＲによって増幅させる。次いで、合成された改変ＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して鋳型から合成する。合成された改変ＲＮＡの合成が完了した後、本明細書に記載の方法による使用の前に、ＤＮＡ鋳型を転写反応から除去する。
【０２７９】
これらの態様のいくつかの実施形態において、合成された改変ＲＮＡを、アルカリホスファターゼでさらに処置する。
【０２８０】
本発明は、目的を果たし、記載した目標および利点、ならびにその中の固有のものを得るように良好に適合されていることを当業者は容易に認識する。本明細書における記載および実施例の詳細は、特定の実施形態の代表的なものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図しない。その中の改変および他の使用について、当業者は思い当たる。これらの改変は、本発明の精神内に含有される。本発明の範囲と精神から逸脱することなく、変化する置換および改変を本明細書において開示されている本発明に対して行い得ることは当業者には容易に明白である。
【０２８１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において使用する場合、明細書および請求項において、それとは反対に明らかに示さない限り、複数の参照対象を含むと理解すべきである。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示さない限り、またはその他の点で状況から明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、または全てが、所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点で関連性がある場合、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点で関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、群メンバーの複数、または全てが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点で関連性がある実施形態を含む。さらに、本発明は、全てのバリエーション、組合せ、および並べ替えを提供することを理解すべきであり、ここでは一覧表示した請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限度、要素、条項、記述用語などが、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、同じ基本請求項（または、関連性があれば、任意の他の請求項）に依存して別の請求項に導入される。本明細書に記載されている全ての実施形態は、適切な場合には、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが意図されている。実施形態または態様のいずれかを、適当と認められるときは、１つまたは複数の他のこのような実施形態または態様と自由に合わせることができることがまた意図される。要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示される場合、要素の各部分群がまた開示されており、任意の要素（複数可）を群から除去することができることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、フィーチャなどを含むと称される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、フィーチャなどからなり、またはこのような要素、フィーチャなどから本質的になることを理解すべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書において多くの言葉で特に記載してこなかった。特定の除外が明細書において記載されているかいないかに関わらず、本発明の任意の実施形態または態様を明示的に請求項から除外することができることをまた理解すべきである。例えば、任意の１種または複数の活性剤、添加物、成分、任意選択の薬剤、生物のタイプ、障害、対象、またはこれらの組合せを、除外することができる。
【０２８２】
請求項または記載が対象の組成物に関する場合、本明細書において開示されている方法のいずれかによって対象の組成物を作製または使用する方法、および本明細書において開示されている目的のいずれかのために対象の組成物を使用する方法は、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。請求項または記載が方法に関する場合、例えば、方法を行うために有用な組成物を作製する方法、および方法によって生成される生成物が、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。
【０２８３】
本明細書において範囲が示される場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、および１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントが除外される実施形態を含む。両方のエンドポイントは他に示さない限り含まれることを想定すべきである。さらに、他に示さない限り、またはその他の点で状況および当業者の理解から明らかでない限り、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲として表される値は、範囲の下限の１０分の１まで、任意の特定の値、または異なる本発明の実施形態において記述した範囲内の部分範囲を想定することができることを理解すべきである。一連の数値が本明細書において記述される場合、本発明は、任意のその間にある値またはその一連の任意の２つの値によって定義される範囲に類似するように関する実施形態を含み、かつ最も低い値は、最小として受け取り得、最も大きな値は、最大として受け取り得ることがまた理解される。数値は、本明細書において使用する場合、百分率として表す値を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が記述される実施形態を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「概ね」によって前置きされる実施形態を含む。
【０２８４】
本明細書において使用する場合、「Ａおよび／またはＢ」（ＡおよびＢは、異なる請求項用語である）は一般に、Ａ、Ｂの少なくとも１つ、またはＡおよびＢの両方を意味する。例えば、別の配列に対して相補的であり、かつ／または別の配列にハイブリダイズする１つの配列は、（ｉ）１つの配列が、全ての条件下で他の配列に必ずしもハイブリダイズし得ないにも関わらず、他の配列に対して相補的である１つの配列、（ｉｉ）１つの配列が他の配列に対して完全に相補的でないにも関わらず、他の配列にハイブリダイズする１つの配列、ならびに（ｉｉｉ）他の配列に対して相補的であり、他の配列にハイブリダイズするものの両方である配列を含む。
【０２８５】
「概ね」または「約」は一般に、特に明記しない限り、またはその他の点で状況から明らかでない限り（このような数が、可能な値の１００％を許容されないほどに超える場合を除いて）、いずれかの方向（その数超またはその数未満）で、１％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の１０％の範囲内に入る数を含む。それとは反対に明らかに示さない限り、複数の実行を含む本明細書における特許請求する任意の方法において、方法の実行の順序は、必ずしも方法の実行が記述される順序に限定されないが、本発明は、順序がこのように限定されている実施形態を含む。他に示さない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書に記載されている任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考え得るとまた理解すべきであることを理解すべきである。
【０２８６】
本明細書において使用する場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明にとって必須である組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素（複数可）に関して使用するが、不特定の要素を含むことは、必須であろうと、またはそうでなくても自由である。
【０２８７】
本明細書において使用する場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態のために必要とされるこれらの要素を指す。この用語は、本発明のこの実施形態の基本的および新規または機能的特徴（複数可）に物質的に影響を与えないさらなる要素の存在を可能とする。
【０２８８】
「からなる」という用語は、実施形態のその記載において記述されない任意の要素を除いた、本明細書に記載のような組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【実施例】
【０２８９】
（実施例１）
【０２９０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノム部位の周りに対として結合し、ここでは二重鎖切断（ＤＳＢ）はＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの二量体によって導入される。厳密な疾患モデリングを行う手段として、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）において１５の異なる遺伝子の変異型アレルを急速および効率的に生じさせるＴＡＬＥＮゲノム編集系の使用は最近報告された（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。少なくとも１つの変異型アレルを担持するクローンの割合は、２％〜３４％の範囲であった。
【０２９１】
下記のように、同じｈＰＳＣ系において同じゲノム部位を標的とするＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮの相対的有効性は、従前に記載された同じ送達プラットホームの使用によってアセスメントされた（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。ＴＡＬＥＮゲノム編集系において、ＣＡＧプロモーターを使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を伴う各ＴＡＬＥＮを（ウイルスの２Ａペプチドを介して）同時翻訳した。ＣＲＩＳＰＲについて、ヒトコドン−最適化Ｃａｓ９遺伝子を、ＧＦＰを有する同じＣＡＧ発現プラスミドにＣ末端核移行シグナルと共にサブクローニングし（Maliら、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有するプラスミドから別々に発現させた（Maliら、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））。各ｇＲＮＡについての２０−ヌクレオチドプロトスペーサー配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする方法を使用して導入した。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲを使用しようとも、等しい量の２つのプラスミドをｈＰＳＣ中に同時エレクトロポレーションし（２５μｇの各プラスミド、またはノックインを試みる場合、２５μｇのＤＮＡ修復鋳型と共に１２．５μｇの各プラスミド）、それに続いて２４〜４８時間後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、単一の細胞のクローン性増殖、およびゲノム標的部位における変異についてＰＣＲによるスクリーニングを行った。
【０２９２】
ｇＲＮＡは、従前にＴＡＬＥＮで成功裏に標的とした６つの遺伝子（ＡＫＴ２、ＣＥＬＳＲ２、ＣＩＩＴＡ、ＧＬＵＴ４、ＬＩＮＣ００１１６、およびＳＯＲＴ１）における７つの座位（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））、ならびにＬＤＬＲにおける１つのさらなる座位におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧ配列をマッチさせて設計した。この系において、ＣＲＩＳＰＲは、座位およびｈＰＳＣ系に亘ってＴＡＬＥＮより一貫しておよび実質的に優れていた（表Ｓ１を参照されたい）。ＴＡＬＥＮは、０％〜３４％の効率性で少なくとも１つの変異型アレルを有するクローンを生じさせたが、マッチしたＣＲＩＳＰＲは、５１％〜７９％の効率性で変異型クローンを生じさせた（表Ｓ１）。ＴＡＬＥＮと同じぐらい、ＣＲＩＳＰＲは、予想される切断部位に集中してサイズが１つのヌクレオチドから数十のヌクレオチドの範囲のサイズの種々のインデルを生じたが、これはＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用するに関わらず、非相同末端結合突然変異誘発が同様に起こることを示唆する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、配列決定によって識別されるように、ホモ接合性変異体クローン（全てのクローンの７％〜２５％；表Ｓ１）を容易に生じさせた。
【０２９３】
ＡＫＴ２中へのＥ１７Ｋ変異のノックインをまた、従前に記載されているように、６７−ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して試みた（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。予想されるＣＲＩＳＰＲ切断部位は、それぞれ、点変異から１１および１３ヌクレオチドにおいて存在するが、ＣＲＩＳＰＲは、１１％の割合でノックインクローンを生じさせ、一方、ＴＡＬＥＮは、１．６％のみを生じさせた（表Ｓ１）。
【表Ｓ１】
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【０２９４】
Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧ標的配列についての必要条件は、部位の選択をいくらか限定することは注目に値する。いずれかのＤＮＡ鎖は標的とすることができるため、標的配列は平均して３２塩基対毎に起こる。これは任意のコード配列を標的とすることができる遺伝子ノックアウトについて障害ではないが、これは特定の場所において変異をノックインまたは補正しようとするとき困難を伴い得る。しかし、プロトスペーサーの開始においてＧを必要とすることは、ｇＲＮＡを発現するＵ６プロモーターの使用によって表され、代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、この必要条件を軽減することができる（Congら、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁（２０１３年））。これは、平均して８塩基対毎に見出される（Ｎ）２０ＮＧＧ標的配列の使用を可能とする。
【０２９５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット作用の程度は、依然として明らかにされておらず、高度に配列依存的である。従前の分析は、プロトスペーサーの最初の半分における１つのヌクレオチドミスマッチは、後半の半分におけるミスマッチより良好に許容されることを示唆した（Jinekら、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁（２０１２年）；Congら、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁（２０１３年））。ＡＫＴ２配列について、プロトスペーサーのより「許容性の」半分におけるヌクレオチド１および３において異なる２−ミスマッチ配列が存在する。ゼロクローンは、オンターゲット部位における６１％と比較してこの潜在的なオフターゲット部位における変異を伴って得た（表Ｓ１）。ＳＯＲＴ１配列の１つについて、一塩基多型が標的部位において１つのヌクレオチドミスマッチをもたらす異なるヒト多能性幹細胞系の使用は、当初の細胞系における６６％と比較して、４２％の効率性で変異型クローンを生じさせた。このように、標的部位の賢明な選択は、系統的オフターゲット作用を最小化するために必要である。完全なマッチ、またはゲノムにおける他の場所での単一のヌクレオチドミスマッチ配列を有する標的部位は、回避すべきである。
【０２９６】
実際的な面から、ＣＲＩＳＰＲは、ＴＡＬＥＮより実行するのにより容易である。各ＴＡＬＥＮ対は、新規に構築しなくてはならず、一方、ＣＲＩＳＰＲについて、Ｃａｓ９構成要素を固定し、ｇＲＮＡは、２０−ヌクレオチドプロトスペーサーのスワッピングのみを必要とする。この考察、およびその他の点では同一の系においてＴＡＬＥＮをＣＲＩＳＰＲで置き換える結果として本明細書において実質的に増加した効率性の実証を考慮すれば、ＣＲＩＳＰＲは、特に治療の状況においてゲノム編集のための非常に強力で広範に適用可能なツールであるように思われる。
【０２９７】
（実施例２）
初代体細胞における臨床的に関連性のある遺伝子の効率的な標的化
【０２９８】
本明細書に記載されている研究は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、二重ガイド戦略を使用することによって、高い効率性を伴って体細胞（例えば、初代）のゲノムを編集することができることを初めて示す。本発明者らは、この研究が、臨床的に関連性のある初代細胞におけるゲノム編集を現実のものとする一助となると推測する。
【０２９９】
任意の所望のゲノム部位を標的とすることを可能とするゲノム編集ツールの出現は、ヒト生物学および疾患の調査を非常に進展させてきた。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、その柔軟性および高い有効性によって標的とされるゲノム編集技術において標準的なものとなってきた。この系は、微生物タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼによって構成され、これは合成ガイドＲＮＡ分子における２０−ヌクレオチド領域によって特異的ゲノム座位に標的化される。他の標的とされるヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ）と同様に、Ｃａｓ９は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって主に修復される二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する（Congら、２０１３年；Jinekら、２０１３年；Maliら、２０１３年）。
【０３００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の実行は、不死化細胞系（Congら、２０１３年；Jinekら、２０１３年；Maliら、２０１３年）、ヒト多能性幹細胞（Dingら、２０１３年）、ならびにそれどころかマウス（Wangら、２０１３年）、ラット（Liら、２０１３年）および、最近では、サルの接合体（Niuら、２０１４年）において前例のないほどに高い標的化効率性を達成することを可能としてきており、古典的戦略と比較したとき非常に短期間でのノックアウト動物またはノックイン動物の産生がもたらされている。
【０３０１】
しかし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、再生医療および移植治療のためのゲノム編集の見込みの完全な実現のための必須のステップである、高い効率性を伴って臨床的に関連性のある初代体細胞のゲノムを編集することができるかどうかはまだ証明されていない。
【０３０２】
本発明者らは、初代体細胞において臨床的に関連性のある遺伝子を編集するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の適合性を試験することを探求した。この目的のために、本発明者らは、２つの治療関連遺伝子：ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）におけるＨＩＶについての共受容体であるＣＣＲ５、およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子のアクセサリー鎖であるＢ２Ｍを標的とすることを選択した。本発明者らは、単一ガイド戦略が、不死化細胞系、例えば、２９３ＴおよびＫ５６２における高い効率性にも関わらず、ＨＰＣおよびＴ細胞において非常に低いものから検出不能なものまでの変異割合を生じさせたことを見出した。対照的に、驚いたことにおよび予想外に、対象とする座位を標的とする異なるオフセットを伴う１対のｇＲＮＡによる二重ガイド戦略は、ＨＰＣおよびＴ細胞において４０％までのホモ接合性除去の効率性をもたらした。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、高い効率性を伴って臨床的に関連性のある体細胞においてゲノムを編集することができるという新規なアプローチを確立する。
【０３０３】
結果
【０３０４】
細胞系においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した効率的なおよび急速なゲノム編集
【０３０５】
本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣａｓ９、およびＢ２Ｍ座位を標的とする一連のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（図４）、およびＢ２Ｍが表面抗原であるという事実を利用したフローサイトメトリーに基づいてカッティング効率性を測定した。これらの実験は、細胞膜上のＢ２Ｍの半減期を説明するために、トランスフェクションのわずか７２時間後に行った。留意されることには、Ｂ２Ｍ表面発現は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の６０％までにおいて抑止された（図４）。さらに、本発明者らは、同じエキソンを標的とする場合でさえも、個々のガイドＲＮＡの間で幅広いバリエーションの効率性を観察した。例えば、単一のガイドカッティング効率性の間のバリエーションは、Ｂ２Ｍの最初のエキソンの６７ｂｐ長のタンパク質コード部分内の７つのガイドＲＮＡ結合の中で数倍であったが（図ＩＸ）、これはＣＲＩＳＰＲカッティング効率性が、主に案内配列依存性であることを強く示唆する。
【０３０６】
初代体細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化が無効である
【０３０７】
次に、本発明者らは、初代細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を試験した。本発明者らは、２つの臨床的に関連性のある免疫細胞タイプを選択した。初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）および初代ＣＤ４＋末梢血から単離したＴ細胞。驚いたことに、細胞系（２９３Ｔ細胞中のＢ２Ｍ、図４）において６０％までのカッティング効率性をもたらした同じガイドＲＮＡは、体細胞において無効であることが明らかにされた（図４）。本発明者らは、初代細胞における標的化効率性のこのような劇的な低下が、ヌクレオフェクトされた細胞におけるＣａｓ９ヌクレアーゼのより低い発現レベル、ＤＮＡ修復機序の増強、または両方の組合せによるものであると推測する。
【０３０８】
二重ガイド戦略は、初代細胞において標的化効率性を劇的に増加させる
【０３０９】
本発明者らは、治療において強力に使用されるのに十分に高い標的化効率性を達成することを望んで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した臨床的に関連性のある初代細胞におけるゲノム編集有効性を改善させることができるかどうかを決定しようと探求した。本発明者らは、二重ガイド戦略を考案したが、ここでは同じ座位を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを細胞に同時に送達した。
【０３１０】
ＨＰＲＴ座位を標的とする別のガイドＲＮＡの添加は、最初のガイドＲＮＡ単独と比較して、変異効率性の増加を殆ど変わらずもたらした。ＨＰＲＴが欠けた細胞は、６−チオグアニン（６−ＴＧ）への耐性によって選択した。さらなるｇＲＮＡの使用は、ＨＰＲＴ変異体の頻度の増加を変わらずもたらした。一実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＨＰＲＴ遺伝子配列を含む。
【０３１１】
異なるガイドＲＮＡ対を各座位について試験し、最も活性なものを初代細胞のさらなる研究のために使用した。図４Ａ〜４Ｅは、単一ガイド戦略が細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞においては達成しないことを示す。本発明者らが使用した２つの系において、二重ガイド戦略は、初代体細胞において伝統的な単一ガイド戦略より一貫しておよび実質的に優れていた。これらの結果を、図５Ａ〜５Ｅにおいて示し、これは二重ガイド戦略が臨床的に関連性のある細胞において高い効率性を伴ってゲノム編集を達成することを示す。
【０３１２】
考察
【０３１３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集分野の分野における主要な焦点の１つは、Ｃａｓ９によるカッティング効率性をモジュレートするパラメーターの捜索である。本明細書に記載されているデータは、この現象がｇＲＮＡ配列によって大部分が決定されているように思われることを示唆する。非常に近くマッチするｇＲＮＡ、またはそれどころか同じエキソン内の部分的にオーバーラップした配列は有意に異なる標的化効率性をもたらすためである（図４）。
【０３１４】
従前の報告において、標的とした二重鎖切断を導入するためにＣａｓ９ニッカーゼ変異体と対のガイドＲＮＡとを合わせるアプローチを使用して、オンターゲット効率性を犠牲にすることなしにＣＲＩＳＰＲオフターゲット作用を劇的に低減させた（Ranら、２０１３年）。しかし、本発明者らの研究において、この戦略は、有意な変異率を生じなかった（MaxおよびPankaj）。本発明者らは、ＷＴ  Ｃａｓ９とｇＲＮＡの対とをこのように合わせ、標的化が無効である細胞型（初代体細胞）におけるカッティング効率性を増加させた。
【０３１５】
Ｂ２Ｍは、ＭＨＣクラスＩタンパク質のアクセサリー鎖であり、細胞表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現のために必要である。表面ＭＨＣクラスＩを欠いており、したがって細胞傷害性Ｔ細胞に探知されない細胞を人工的に作り出すことは、移植および養子細胞治療において最大に重要なことである。
【０３１６】
全体で、本発明者らのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、二重ガイド戦略を使用することによって、有意な効率性を伴って臨床的に関連性のある初代体細胞のゲノムを編集することができることを示す。本発明者らは、この戦略が、治療への可能な翻訳のために関連性のある十分に高い効率性を伴って、体細胞における標的遺伝子に対する一般アプローチとなる可能性を有すると予想する。
【０３１７】
いくつかの実験手順
【０３１８】
フローサイトメトリー。細胞を、マウスモノクローナル抗Ｂ２Ｍ抗体２Ｍ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。
【０３１９】
初代血液細胞のエレクトロポレーション。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ４Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してロイコパク（ＭＧＨ）から単離し、Ａｍａｘａ  Ｔ細胞ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して内毒素非含有ＤＮＡでエレクトロポレーションした。
【０３２０】
ＨＰＲＴ欠乏のための６−ＴＧ選択。５＊１０６細胞を、２５ｕｇのＣａｓ９および１２．５ｕｇの各ｇＲＮＡによるエレクトロポレーションによって使用した。Ｃａｓ９対照について、非カッティングｇＲＮＡを使用して、総ＤＮＡ量を同じに維持した。ＦＡＣＳソーティングは、ＥＰの４８時間後に５〜８％ＧＦＰで結局相対的に同様となった。細胞を試料毎に１０ｃｍのプレート毎に４０，０００個で蒔き、コロニーを明瞭に見ることができるまで増殖させた。ｍＴＥＳＲ（例えば、３０μｍの濃度）中の３０ｕＭの６−チオグアニン（６−ＴＧ）を８〜９日間選択培地として使用し、コロニーを再び計数した。結果を下記の表１において示す。
【０３２１】
【表１】
2016522679.tif 000004
【０３２２】
下記の表２は、編集効率性によって順位付けた上の表１からの結果を示す。
【０３２３】
【表２】
2016522679.tif 000005
【０３２４】
実験において使用したｇＲＮＡを、下記に示す。
【０３２５】
１−ｇｔｃｔｔｇｃｔｃｇａｇａｔｇｔｇａｔｇ（配列番号２９８）
【０３２６】
３−ｔａａａｔｔｃｔｔｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃ（配列番号２９９）
【０３２７】
５−ｔａｇａｔｃｃａｔｔｃｃｔａｔｇａｃｔｇ（配列番号３００）
【０３２８】
７−ｃｔｔｃａｇｔｃｔｇａｔａａａａｔｃｔａ（配列番号３０１）
【０３２９】
９−ｔｔｔｇａｔｇｔａａｔｃｃａｇｃａｇｇｔ（配列番号３０２）
【０３３０】
１１−ｃａｃａｇａｇｇｇｃｔａｃａａｔｇｔｇａ（配列番号３０３）
【０３３１】
【表３】
2016522679.tif 000006
【図１−１】
2016522679.tif 000007
【図１−２】
2016522679.tif 000008
【図１−３】
2016522679.tif 000009
【図１−４】
2016522679.tif 000010
【図１−５】
2016522679.tif 000011
【図１−６】
2016522679.tif 000012
【図１−７】
2016522679.tif 000013
【図１−８】
2016522679.tif 000014
【図１−９】
2016522679.tif 000015
【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
2016522679.tif 000018
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
2016522679.tif 000022
【図２−７】
2016522679.tif 000023
【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
2016522679.tif 000026
【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2016522679.tif 000030
【図４Ｂ−Ｃ】
2016522679.tif 000031
【図４Ｄ】
2016522679.tif 000032
【図４Ｅ】
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【図５】
2016522679.tif 000034
【図６】
2016522679.tif 000035
【図７Ａ−Ｂ】
2016522679.tif 000036
【図７Ｃ】
2016522679.tif 000037
【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
2016522679000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年12月25日(2015.12.25)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年４月４日に出願した米国仮出願第６１／８０８，５９４号の利益を主張する。米国仮出願第６１／８０８，５９４号の教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１−ＨＬ１１８７４４、Ｒ００−ＨＬ０９８３６４およびＲ０１−ＤＫ０９５３８４のもと、政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、哺乳動物細胞における所望のゲノム部位を標的化する新しいクラスのゲノム編集ツールである。最近公表されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前でヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列（ゆえに、（Ｎ）２０ＮＧＧ標的ＤＮＡ配列）とハイブリダイズする合成ガイドＲＮＡと複合体を形成することによって、ゲノム部位に標的化されるＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する。これは、ＮＧＧモチーフのヌクレオチド３個上流に二本鎖切断をもたらす。この二本鎖切断によって、エラーを起こしやすく、遺伝子アレルをノックアウトするフレームシフト変異を助長する非相同末端結合、またはゲノムにおける変異をノックインもしくは修正するために外因的に導入された二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ修復鋳型を使用して開発することができる相同組換え修復のいずれかが扇動される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、治療的応用のために有用なツールであり得るが、残念ながら、以前に公表され
た報告によって、ヒト幹細胞においてわずかに２％〜４％のアレル標的化効率が実証された（Maliら、Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Maliら、Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書記載の研究は、最大８０％の効率で変異細胞をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するアレル標的化方法を実証している。特に、本明細書記載の研究は、驚いたことに予想外に、細胞系（例えば、２９３Ｔ）において標的ポリヌクレオチド配列を効率的に欠失させるが、初代体細胞ではそうではないことが本発明者らによって実証された単一ガイド戦略とは対照的に、複数ガイド戦略（例えば、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列にガイドし、それとハイブリダイズする２つまたはそれを超えるリボ核酸を使用する）が、初代体細胞（例えば、ヒト血液細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞）において標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を効率的および効果的に欠失させることを実証している。これらの大いに改善された方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が治療目的で初めて効果的に利用されることを可能にする。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、特異的遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を標的化するのに有用な特定のガイド配列に加えて、有用なＲＮＡガイド配列を特異的に同定する方法が提供される。そのうえ、本明細書において開示された組成物および方法を利用する処置方法（例えば、ＨＩＶ感染症の処置方法）が提供される。
【０００５】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【０００６】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が
約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記機能的ドメインが、複合体を形成する。
【００１０】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記機能的ドメインが、複合体を形成する。
【００１１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される。
【００１２】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。
【００１３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。
【００１４】
一部の実施形態では、前記変更が挿入欠失である。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。
【００１５】
一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、各変更がホモ接合性変更である。
【００１６】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。
【００１７】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。
【００１８】
一部の実施形態では、前記細胞が末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が造血幹細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞系−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞（CD34+CD38-Lineage-CD90+CD45RA-  cell）である。一部の実施形態では、前記細胞が肝細胞である。
【００１９】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレ
オチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害である。一部の実施形態では、前記障害が単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
【００２５】
一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。
【００２６】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００２８】
一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他の
ゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００２９】
一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約５％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約１０％である。一部の実施形態では、前記変更効率は少なくとも約５０％〜約８０％である。
【００３０】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる。一部の実施形態では、前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
【００３１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される。
【００３２】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣｓが、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【００３４】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００３５】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌク
レオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００３６】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００３７】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００３８】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００３９】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４０】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４１】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４２】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００４３】
一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに
含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む。
【００４４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００４９】
一部の実施形態では、前記組成物は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
【００５０】
一部の実施形態では、前記組成物は、前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【００５１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【００５２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。一部の実施形態では、前記キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細
胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む。一部の実施形態では、前記キットは、ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が自己初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞が同種初代体細胞を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍである。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９８〜３０３からの２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記細胞が、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される、ＣＸＣＲ４におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍ
を含む。一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子における異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍにおけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【００５５】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である。
【００５６】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法を提供する。
【００５７】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００５８】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００５９】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００６０】
一部の態様では、本発明は、初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列を変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、ことを含む、方法を提供する。
【００６１】
一部の態様では、本開示は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である
【００６２】
一部の態様では、本開示は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００６３】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記機能的ドメインは複合体を形成する。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、前記機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、前記
機能的ドメインは複合体を形成する。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される。
【００６４】
一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、前記変更が挿入欠失である。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、前記変更が、ホモ接合性変更である。
【００６５】
一部の実施形態では、各変更がホモ接合性変更である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である。一部の実施形態では、前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である。一部の実施形態では、前記細胞が末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が造血幹細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞系−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が肝細胞である。一部の実施形態では、前記細胞が初代細胞である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である。
【００６６】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり
かつ／またはハイブリダイズする配列を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害である。一部の実施形態では、前記障害が単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。一部
の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。
【００７０】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である。
【００７１】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる。一部の実施形態では、前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む。
【００７２】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記方法は、前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することを含む。一部の実施形態では、細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣｓが、Ｃａｓと蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【００７３】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列は切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約８％〜約８０％である。
【００７４】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した
規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【００７５】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、変更効率は約８％〜約８０％である。
【００７６】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００７７】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である。
【００７８】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、を含む、方法を提供する。
【００７９】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、およ
び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約８％〜約８０％である。
【００８０】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【００８１】
一部の態様では、本開示は、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８２】
一部の態様では、本開示は、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８３】
一部の態様では、本開示は、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８４】
一部の態様では、本開示は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８５】
一部の態様では、本開示は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【００８６】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
【００８７】
一部の実施形態では、前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’
−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む。
【００８８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００８９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を提供する。
【００９０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【００９３】
一部の実施形態では、前記組成物は、検出可能なマーカーをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記組成物は、前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の実施形態では、前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【００９４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる
配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを提供する。
【００９７】
一部の実施形態では、前記キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団を含む。一部の態様では、前記キットは、ＤＮＡ修復鋳型を含む。
【００９８】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００９９】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１００】
一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列の切断が、前記結果として生じた１つまたは複数の細胞が前記対象に投与されたときに前記細胞が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する。一部の態様では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的であり
かつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている。一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害を含む。一部の実施形態では、前記障害が感染症を含む。一部の実施形態では、前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む。一部の実施形態では、前記障害が、がんを含む。
【０１０１】
一部の態様では、本発明は、対象に投与された細胞が、前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０２】
一部の態様では、本発明は、対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記細胞または細胞集団が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減するリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸であって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断されるリボ核酸と、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０３】
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている。一部の実施形態では、前記障害が遺伝障害を含む。一部の実施形態では、前記障害が感染症を含む。一部の実施形態では、前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む。
一部の実施形態では、前記障害が、がんを含む。
【０１０４】
本特許または特許出願のファイルは、有色で作製された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を有するこの特許または特許出願の公報のコピーは、請求に応じて、および必要な手数料の支払いによってこの官庁が提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１−１】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−２】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−３】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−４】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−５】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−６】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−７】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−８】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−９】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図１−１０】図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＣＲ５であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【０１０６】
【図２−１】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−２】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−３】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−４】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−５】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−６】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−７】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−８】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−９】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１０】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１１】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【図２−１２】図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＸＣＲ４であるときに有用な例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【０１０７】
【図３】図３は、Ｃａｓタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示す。黄色の強調表示は、Ｒｕｖ−Ｃ様ドメインを示す。下線は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを示す。
【０１０８】
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｅ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【０１０９】
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、二重ガイド戦略が、高い有効性を伴って臨床的に関連性のある細胞においてゲノム編集を達成することを示す。図５Ａは、単一のガイド（ＡまたはＢ）と比較して、２つのガイドの組合せ（Ａ＋Ｂ）が、Ｋ５６２細胞系においてＣＣＲ５の標的化においてロバストな（ｒｏｂｕｓｔ）編集効率性を示したことを示す。図５Ｂは、様々なガイドの組合せ、および方向とともに各ガイド対の間のスペーシングを示す（上のパネル）。ＰＣＲ結果（下の左のパネル）およびＣＥＬアッセイ（下の右）は、試験したガイド対についてのロバストなゲノム編集を示す。図５Ｃは、２つのガイドの間のＤＮＡ配列を効果的に欠失しなかったニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）と対照的に、２つのガイドの組合せによって、野性型Ｃａｓ９が２つのガイドの間のＤＮＡ配列を効果的に欠失したことを示すＰＣＲ分析の結果を示す。図５Ｄは、二重Ｂ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲの組合せを示す概略図である。
【０１１０】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２つのガイドでのアプローチを使用したヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける有効なゲノム編集を示す。図６Ａは、２つのガイドを使用した効率的なクローン欠失の頻度を示す代表的なゲルの写真である。クローン欠失効率性は、メチルセルロース上で増殖している個々のコロニーで行ったＰＣＲによって決定した。図６Ｂは、２つの独立したクローン欠失実験から得たデータを示す表であり、これは２つのガイドでのアプローチを使用した初代ヒトＣＤ３４＋細胞における有効なゲノム編集を示唆する。
【０１１１】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、二重ガイド戦略が、初代細胞と対照的に、２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍ編集の効率性を改善させないことを示す。図７Ａは、６ウェルフォーマットにおいてトランスフェクションの７２時間後に１μｇのＣａｓ９、および０．５μｇのｇＲＮＡまたは０．２５μｇ＋０．２５μｇのＢ２Ｍを標的化するｇＲＮＡのいずれかでエレクトロポレーションした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。図７Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡによるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す（７２時間）。図７Ｃは、初代細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を有意に改善させる二重ガイド戦略と対照的に、二重ガイド戦略が２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を改善させないことを示す（図５）。
【図７Ｃ】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、二重ガイド戦略が、初代細胞と対照的に、２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍ編集の効率性を改善させないことを示す。図７Ａは、６ウェルフォーマットにおいてトランスフェクションの７２時間後に１μｇのＣａｓ９、および０．５μｇのｇＲＮＡまたは０．２５μｇ＋０．２５μｇのＢ２Ｍを標的化するｇＲＮＡのいずれかでエレクトロポレーションした２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。図７Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡによるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す（７２時間）。図７Ｃは、初代細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を有意に改善させる二重ガイド戦略と対照的に、二重ガイド戦略が２９３Ｔ細胞においてＢ２Ｍカッティング効率性を改善させないことを示す（図５）。
【０１１２】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、二重ガイド戦略を使用した体細胞（例えば、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞）におけるＢ２Ｍ表面発現の切除を示す。図８Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（総生存細胞）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ＋細胞をゲート）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を定量化する表を示す。図８Ｄは、生存／７ＡＡＤ  ｎｅｇ（ネガティブ）／ＧＦＰ＋細胞をゲートした細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、これは二重ガイド戦略がＢ２Ｍ表面発現の切除をもたらすことを示す。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、二重ガイド戦略を使用した体細胞（例えば、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞）におけるＢ２Ｍ表面発現の切除を示す。図８Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（総生存細胞）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ＋細胞をゲート）におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図８Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍノックアウト効率性を示すフローサイトメトリー分析の結果を定量化する表を示す。図８Ｄは、生存／７ＡＡＤ  ｎｅｇ（ネガティブ）／ＧＦＰ＋細胞をゲートした細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、これは二重ガイド戦略がＢ２Ｍ表面発現の切除をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
発明の詳細な説明
本明細書記載の研究は、最大８０％の効率で変異細胞をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するアレル標的化方法を実証している。特に、本明細書記載の研究は、驚いたことに予想外に、細胞系（例えば、２９３Ｔ）においては標的ポリヌクレオチド配列を効率的に欠失させるが初代体細胞においてはそうではないことが本発明者らによって実証された単一ガイド戦略とは対照的に、複数ガイド戦略（例えば、Ｃａｓタンパク質を標的ポリ
ヌクレオチド配列にガイドし、それとハイブリダイズする２つまたはそれを超えるリボ核酸を使用する）が、初代体細胞（例えば、ヒト血液細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞）において標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を効率的および効果的に欠失させることを実証している。これらの大いに改善された方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が治療目的で初めて効果的に利用されることを可能にする。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、特定の遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）を標的化するのに有用な特定のガイド配列に加えて、有用なＲＮＡガイド配列を特異的に同定する方法が提供される。そのうえ、本明細書において開示された組成物および方法を利用する処置方法（例えば、ＨＩＶ感染症の処置方法）が提供される。そのうえ、本明細書に開示された組成物および方法を利用した、細胞を投与する方法（例えば、宿主免疫応答をトリガーする可能性が低減した細胞を投与する方法）が提供される。
【０１１４】
一態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法を提供する。
【０１１５】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための例示的な一方法は、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列は切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率は約５０％〜約８０％である。
【０１１６】
本明細書において使用される用語「接触させること」（すなわち、ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および／またはリボ核酸と接触させること）は、細胞におけるＣａｓタンパク質および／もしくはリボ核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば、Ｃａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸を培養中の細胞に添加すること）または細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含むことが意図される。本明細書開示の標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸と接触させるステップは、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、細胞は、接着培養または懸濁培養の状態で処理され得る。本明細書開示のＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸と接触された細胞は、また、増殖因子もしくは他の分化剤のような別の薬剤または細胞を安定化するためもしくは細胞をさらに分化させるための環境と、同時にまたは続いて接触させることができることが理解されている。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１８】
単離された細胞に適用される用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などには、細胞を任意の種類のプロセスもしくは状態に供すること、または細胞に任意の種類の操作もしくは手順を行うことが含まれる。対象に適用されるとき、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列が本明細書記載の方法によりｅｘ  ｖｉｖｏで変更された細胞を個体に提供することを指す。個体は、通常、病気もしくは負傷しており、または集団の平均メンバーと比べて病気になるリスクが増加しており、そのような注意、ケア、もしくは管理を必要とする。
【０１１９】
本明細書に使用される用語「処置すること」および「処置」は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患における改善、例えば有益な、または所望の臨床結果を有するように、標的ポリヌクレオチド配列が本明細書記載の方法によりｅｘ  ｖｉｖｏで変
更された細胞の有効量を対象に投与することを指す。本発明のために、有益な、または所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能のいずれにしても、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または完全のいずれにしても）が挙げられるがこれらに限定されない。処置することは、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを指してもよい。したがって、当業者は、処置が病状を改善し得るが、疾患の完全治癒ではないおそれがあることを認識している。本明細書において使用される用語「処置」には予防が含まれる。あるいは、疾患の進行が低減または休止するならば、処置は「有効」である。「処置」は、また、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを意味してもよい。処置を必要とする者には、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断された者、および遺伝感受性または他の要因によりそのような障害を発生する可能性が高い者が含まれる。
【０１２０】
疾患または障害の「処置」、「予防」または「改善」は、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防すること、そのような疾患または障害に関連する状態の進行または重症度の進行、増悪または悪化を後退、軽減、改善、阻害、減速または停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。
【０１２１】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための例示的な一方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する。
【０１２２】
本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用して当業者に利用可能な任意の様式で標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更する能力がある任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。そのようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多様なＣａｓタンパク質を採用することができる（Haftら、PLoS  Comput  Biol．２００５年；１巻（６号）ｅ６０頁）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更させるこのようなＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系である。
【０１２３】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するために使用することができる。本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を任意の目的で変更することを企図する。一部の実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、変異細胞を産生するために変更される。本明細書に使用される「変異細胞」は、結果として生じた遺伝子型がその本来の遺伝子型と異なる細胞を指す。場合により、例えば、正常に機能している遺伝子が本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して変更された場合、「変異細胞」は変異表現型を表す。他の場合には、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が変異遺伝子型を修正するために使用された場合、「変異細胞」は野生
型表現型を表す。一部の実施形態では、遺伝子変異を修正または修復するために（例えば、細胞に正常な表現型を回復させるために）、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は変更される。一部の実施形態では、遺伝子変異を誘導するために（例えば、遺伝子またはゲノムエレメントの機能を破壊するために）、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は変更される。
【０１２４】
一部の実施形態では、変更は挿入欠失である。本明細書に使用される「挿入欠失」は、挿入、欠失、またはその組合せに起因する変異を指す。当業者によって認識されるように、ゲノム配列のコード領域における挿入欠失は、その挿入欠失の長さが３の倍数でない限りフレームシフト変異をもたらす。一部の実施形態では、変更は点変異である。本明細書に使用される「点変異」は、ヌクレオチドの１つを交換する置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列において任意の長さの挿入欠失または点変異を誘導するために使用することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその部分のノックアウトをもたらす。標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分を本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してノックアウトすることは、多様な適用のために有用であり得る。例えば、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ目的のために、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するために有用であり得る（例えば、細胞における変異型アレルをｅｘ  ｖｉｖｏでノックアウトし、ノックアウトされた変異型アレルを含むそれらの細胞を対象に導入することによる）。
【０１２６】
本明細書に使用される「ノックアウト」には、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨害する方法で標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部分を欠失させることが含まれる。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えばＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列に挿入欠失を誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本明細書記載の詳細に基づき、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分をノックアウトするために本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をいかにして使用するかを容易に認識する。
【０１２７】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。用語「減少」、「低減した」、「低減」、および「減少」は、全て一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために、本明細書において使用される。しかし、疑いを避けるために、「減少」、「低減した」、「低減」、および「減少」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の減少、例えば参照レベルと比べて少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％もしくは１００％を含む最大１００％の減少（すなわち参照試料と比べて不在のレベル）、または１０〜１００％の間の任意の減少を意味する。
【０１２８】
用語「増加した」、「増加」または「強化」または「活性化」は、全て一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。任意の疑いを避けるために、用語「増加した」、「増加」または「強化」または「活性化」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の増加、例えば参照レベルと比べて少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％を含む最大１００％の増加、または１０〜１００％の間の任意の増加、または参照レベルと比べて少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍から１０倍もしくはそれを超える間の任意の増加を意味する。
【０１２９】
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般的にマーカーの正常濃度から２標準偏差（２ＳＤ）下またはそれ未満の濃度を意味する。この用語は、差があるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真である場合に、帰無仮説を棄却する決定を行う確率として定義される。その決定は、しばしばｐ値を使用して行われる。
【０１３０】
一部の実施形態では、変更は、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、変更はヘテロ接合性変更である。
【０１３１】
一部の実施形態では、変更は、望まれない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列の任意の種類の変異またはエラーを修正するために使用することができる。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、欠失が原因で標的ポリヌクレオチド配列から欠落しているヌクレオチド配列を挿入するために使用することができる。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、また、標的ポリヌクレオチド配列から挿入変異が原因のヌクレオチド配列を欠失させるまたは切除するために使用することができる。場合により、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、誤ったヌクレオチド配列を正しいヌクレオチド配列と交換するために（例えば、機能喪失型変異、すなわちＳＮＰが原因で損なわれた標的ポリヌクレオチド配列の機能を回復するために）使用することができる。
【０１３２】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と比較して驚くほどの高効率で標的ポリヌクレオチドを変更することができる。ある特定の実施形態では、変更効率は、少なくとも約５％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、少なくとも約１０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約１０％〜約８０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約３０％〜約８０％である。ある特定の実施形態では、変更効率は、約５０％〜約８０％である。一部の実施形態では、変更効率は、約８０％より大きいかまたはそれに等しい。
【０１３３】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変更するのに使用することができる。当業者であれば、いずれか特定の細胞における変更させようとする所望の標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、またはそれとは異なり細胞への病原体の侵入を容易にする任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に認識する。例えば、細胞において変更させようとする所望の標的ポリヌクレオチド配列は、疾患関連の単一ポリヌクレオチド多型を含有するゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であってもよい。このような例において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、疾患関連のＳＮＰを野生型アレルで置き換えることによって、細胞において疾患関連のＳＮＰを修正するのに使用することができる。別の例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の機能を破壊して病原体の細胞への侵入または細胞内部での増殖を防ぐための欠失または挿入にとって好適な標的であり得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物のゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノム配列である。
【０１３５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、病原性のゲノム配列である。例示的な病原性のゲノム配列としては、ウイルスのゲノム配列、細菌のゲノム配列、真菌類のゲノム配列、毒素のゲノム配列、または寄生虫性のゲノム配列が挙げられるがこれらに限定されない。このような実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、病原体のゲノム配列（例えば、細胞への侵入にとって重要なゲノム配列、または病原体が細胞内部に入ったら、増殖、成長もしくは生存に関与するゲノム配列）を切断することによって、病原体の機能を破壊する（例えば、病原体による感染症を処置または予防する）のに使用することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ；遺伝子番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ）５６７）である。Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列は、実質的に全ての有核細胞の表面で発現される主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の重鎖と会合する血清タンパク質をコードする。Ｂ２Ｍタンパク質は、ある特定の病態においてアミロイド原線維を形成することが見出されたベータ−プリーツシート構造を含む。Ｂ２Ｍ遺伝子は、およそ８ｋｂに及ぶ４つのエキソンを有する。Ｂ２Ｍは、正常な個体の血清中で観察されているが、ウィルソン病、カドミウム中毒、および腎尿細管の機能不全を引き起こす様々な状態を有する患者からの尿中ではより多くの量で観察される。Ｂ２Ｍに関連することが公知の他の病態としては、家族性の異化亢進による低タンパク血症を有する個体で報告されているＢ２Ｍ遺伝子中のホモ接合性変異（例えば、ａｌａ１１ｐｒｏ）、家族性の内臓性アミロイド症（visceral  amyloidosis）を有する個体で報告されているＢ２Ｍ遺伝子中のヘテロ接合性変異（例えば、ａｓｐ７６ａｓｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３７】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオーソログである。
【０１３８】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１；遺伝子番号３２５１）である。
【０１３９】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５（遺伝子番号１２３４、またＣＣ−ＣＫＲ−５、ＣＣＣＫＲ５、ＣＣＲ−５、ＣＤ１９５、ＣＫＲ−５、ＣＫＲ５、ＣＭＫＢＲ５、およびＩＤＤＭ２２としても公知）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５のバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５のオーソログである。
【０１４０】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４（遺伝子番号７８５２、またＦＢ２２；ＨＭ８９；ＬＡＰ３；ＬＣＲ１；ＮＰＹＲ；ＷＨＩＭ；ＣＤ１８４；ＬＥＳＴＲ；ＮＰＹ３Ｒ；ＮＰＹＲＬ；ＨＳＹ３ＲＲ；ＮＰＹＹ３Ｒ；およびＤ２Ｓ２０１Ｅとしても公知）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４のバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４の相同体である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４のオーソログである。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、様々な方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断できることが認識されるべきである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
【０１４１】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリ
ダイズさせることを可能にする好適な標的モチーフを含有する限りは、本発明の方法は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変更するのに使用することができる。当業者は、特定のポリヌクレオチドを標的化するための標的モチーフは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および標的化しようとするポリヌクレオチドの配列に依存することを認識している。
【０１４２】
一部の実施形態では、標的モチーフは、少なくとも２０ｂｐの長さである。一部の実施形態では、標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的モチーフは、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。
【０１４３】
本発明の標的モチーフは、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のオフターゲット作用（off-target  effects）を最小化するように選択されてもよい。一部の実施形態では、標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。一部の実施形態では、標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。当業者は、オフターゲット作用を最小化するための好適な標的モチーフを選択するのに、様々な技術（例えば、バイオインフォマティクス分析）を使用できることを認識している。
【０１４４】
一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列を修正するための相同組換え修復（homology-directed  repair）を利用する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復は、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡ修復鋳型は、どのような長さのものであっていてもよい。当業者は、いずれか特定のＤＮＡ修復鋳型の長さは、修正しようとする標的ポリヌクレオチド配列に依存することを認識している。ＤＮＡ修復鋳型は、任意の標的ポリヌクレオチド配列、特に疾患関連の多型（例えば、ＳＮＰ）を含む標的ポリヌクレオチド配列を修復したり、または置き換えたりするために設計することができる。例えば、このようなＳＮＰを含む変異型アレルの相同組換え修復は、変異型アレルに隣接する２つの標的モチーフを選択して、野生型アレルとマッチするようにＤＮＡ修復鋳
型を設計することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により達成することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズすることができる、少なくとも１つから２つ、１つのリボ核酸（at  least  one  to  two  one  ribonucleic  acids）とを含む。
【０１４６】
「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって結合した一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すように交換可能に使用され、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化（glycosolated）など）およびアミノ酸類似体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、パラログ、断片ならびに他の等価体、バリアント、およびそれらの類似体が含まれる。
【０１４７】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換または修飾（modification）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一部の場合では、置換および／または修飾は、タンパク質分解性分解を予防または低減したり、および／または細胞におけるポリペプチドの半減期を延長したりすることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合の置換え（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ある部分（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含むための修飾を含んでいてもよい。
【０１４８】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプ（またＣＡＳＳ２としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、およびＣａｓ５ｅが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（またＣＡＳＳ３としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、およびＣｓｙ４が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（またＣＡＳＳ４としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（またＣＡＳＳ１としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、およびＣａｓ５ｄが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（またＣＡＳＳ７としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、およびＣａｓ５ｈが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（またＣＡＳＳ５としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、およびＣａｓ５ａが挙げられるがこれらに限定さ
れない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（またＣＡＳＳ６としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、およびＣｓｍ５が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的にはトランスにコード化された低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（またＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。図３に、Ｃａｓ９タンパク質の例示的なアミノ酸配列（配列番号２９８）を示す。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６および９８２〜９８９）と、ｃｒＲＮＡと相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）とを包含する２つのエンドヌクレアーゼ（enconuclease）ドメインを含有する。図３では、ＲｕｖＣ様ドメインを黄色で強調表示し、ＨＮＨヌクレアーゼドメインに下線を付す。
【０１５０】
「機能的部分」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成して標的ポリヌクレオチド配列を切断するペプチドの能力を保持するペプチドの一部分を指す。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能的ドメインは、複合体を形成する。
【０１５１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。
【０１５２】
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と接触させる様々な方法を企図することが認識されるべきである。一部の実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチドの形態で細胞に導入させることができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞膜透過性ポリペプチド（cell-penetrating  polypeptide）または細胞膜透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合させることができる。「細胞膜透過性ポリペプチド」および「細胞膜透過性ペプチド」は、本明細書で使用される場合、それぞれ細胞への分子の取込みを容易にするポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞膜透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有していてもよい。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、電荷を有する（例えば、正の、負のまたは全体的に中性の電荷を有する）タンパク質にコンジュゲートまたは融合させることができる。このような連結は、共有結合であってもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を過剰に正電荷を有するＧＦＰに融合させて、Ｃａｓタンパク質の細胞に浸透する能力を有意に増加させることができる（Cronicanら、ACS  Chem  Biol．２０１０年；５巻（８号）：７４７〜５２頁）。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させて、Ｃａｓタンパク質の細胞への侵入を容易にすることができる。例示的なＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、およびペネトラチンが含まれる。
【０１５５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞膜透過性ペプチドに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、過剰に正電荷を有するＧＦＰに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成できる。好適な技術には、リン酸カルシウムまたは脂質が媒介するトランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用する形質導入または感染が含まれる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書記載のような修飾ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書記載のような修飾ｍＲＮＡ（例えば、合成修飾ｍＲＮＡ）を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体を形成される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書記載のような修飾核酸（例えば、合成修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。
【０１５８】
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を企図する。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者に認識されるように、本発明のリボ核酸は、採用される特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて多種多様の異なる標的モチーフとハイブリダイズするように選択されてもよい。また１〜２つのリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択されてもよい。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、デオキシリボ核酸モチーフが、標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。
【０１５９】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、１〜２つのリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質を、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜１３９からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイ
ドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドリボ核酸配列は、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列と相補的なＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なる配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む２つの異なるオフセット配列にハイブリダイズするＲＮＡ配列を含む２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖における配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆の鎖における配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆の鎖における配列と相補的ではなく、かつ／またはハイブリダイズしない。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオー
バーラップする標的モチーフと相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフと相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
【０１６５】
また本発明は、多重ゲノム編集（multiplex  genomic  editing）も企図する。当業者は、上記の単一の遺伝子のゲノム編集に関する説明は、後述する多重ゲノム編集の実施形態にも等しく適用可能であることを認識している。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法を提供する。
【０１６７】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための例示的な方法は、標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である。
【０１６８】
さらに別の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法を提供する。
【０１６９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための例示的な方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する。
【０１７０】
本明細書において使用される用語「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」は、所望の部位に導入された細胞を少なくとも部分的に局在化させる方法または経路によって、細胞、例えば本発明の方法に従って変更された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書記載の細胞を対象に配置する状況において交換可能に使用される。細胞は、所望の部位に直接埋め込まれてもよいし、またはその代わりに、埋め込まれた細胞の少なくとも一部分または細胞の成分が生存可能な、対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与されてもよい。対象に投与した後の細胞の生存期間は、短くて数時間、例えば２４時間〜数日から、長くて数年であってもよい。一部の場合では、細胞はまた、肝臓または皮下などの所望の部位以外の位置に、例えば、埋め込んだ位置に埋め込まれた細胞を維持して埋め込まれた細胞の移動を回避するためにカプセル中で投与されてもよい。
【０１７１】
ｅｘ  ｖｉｖｏの方法の場合、細胞は、自己細胞、すなわち、１つまたは複数の細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更することが必要な対象から採取した１つまたは複数の細胞（すなわち、ドナーとレシピエントとが同じ個体である）を含んでいてもよい。自己細胞は、免疫学に基づく細胞のあらゆる拒絶反応を回避する利点を有する。その代わりに、細胞は、例えばドナーから採取された、異種細胞であってもよい。第２の対象は、同一または異なる種の対象であってもよい。典型的には、細胞がドナー由来の場合、その細胞は、免疫抑制の必要性を減らすかまたはなくすために、免疫学的にレシピエントと十
分な適合性を有するドナー由来であり、すなわち移植による拒絶反応に晒されないと予想される。一部の実施形態では、細胞は、異種の源から採取され、すなわち、免疫学的にレシピエントと十分適合するように遺伝子操作された非ヒト哺乳動物、またはレシピエントの種から採取される。免疫学的適合性を決定するための方法は当該技術分野において公知であり、ＨＬＡおよびＡＢＯ決定基に関してドナー−レシピエントの適合性を評価するための組織型別が含まれる。例えば、Transplantation  Immunology、BachおよびAuchincloss編（Wiley,  John  &  Sons,  Incorporated、１９９４年）を参照されたい。
【０１７２】
本発明のｅｘ  ｖｉｖｏの方法のために、任意の好適な細胞培養培地を使用することができる。
【０１７３】
用語「対象」および「個体」は、本明細書において交換可能に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、および／または本明細書記載のような細胞を用いた予防的処置などの処置が提供されるヒトを指す。特定の動物、例えばヒト対象にとって特定の感染症、状態または病態を処置する場合、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書において交換可能に使用される「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類が含まれる。また用語「対象」は、これらに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類などの任意の脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または他の哺乳動物、例えば家畜哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等、または生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ等である。
【０１７４】
一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす。一部の実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、変更は、望まれない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。一部の実施形態では、各変更は、ホモ接合性変更である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約５％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約１０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約３０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約５０％から約８０％である。一部の実施形態では、各遺伝子座での変更効率は約８０％より大きいかまたはそれに等しい。
【０１７５】
一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。一部の実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
【０１７６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、各標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、各標的モチーフは、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフは、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。一部の実施形態では、各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。一部の実施形態では、各標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。
一部の実施形態では、各標的モチーフは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。
【０１７８】
一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、各標的モチーフは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列と比べて少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含む異なるＤＮＡ配列を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる。一部の実施形態では、相同組換え修復は、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる。一部の実施形態では、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は一本鎖である。一部の実施形態では、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型は二本鎖である。
【０１８０】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、複数のリボ核酸と複合体を形成する。一部の実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される（例えば、単一の標的ポリヌクレオチド配列の複数の変更）。一部の実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される（例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の１つまたは複数の変更）。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、デオキシリボ核酸モチーフが、標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する。
【０１８１】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそ
れぞれは、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、複数のリボ核酸のそれぞれは、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする異なるリボ核酸配列を含む。
【０１８４】
Ｃａｓタンパク質またはリボ核酸はいずれも、プラスミドから発現させることができることが認識されるものとする。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはリボ核酸はいずれも、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）における発現増加に最適化されたプロモーターを使用して発現される。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む。本発明は、細胞を選択するための任意の好適な方法を企図する。一部の実施形態では、細胞を選択することは、ＦＡＣＳを含む。一部の実施形態では、ＦＡＣｓは、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される。
【０１８６】
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する様々な障害を処置および／または予防することを企図する。本明細書記載の方法および組成物は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の発現増加、および標的ポリヌクレオチド配列の発現減少に関連する障害を処置または予防するために使用できることが認識されるものとする。標的ポリヌクレオチド配列の発現増加および発現減少は、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増加または減少する環境、ならびに標的ポリヌクレオチド配列の発現産物の機能および／または活性レベルが、正常な発現および／または活性レベルと比べてそれぞれ増加または減少する環境を含む。当業者は、標的ポリヌクレオチド配列の発現増加に関連する障害を処置または予防することは、細胞を本明細書記載の組成物と接触させた後に関連細胞において標的ポリヌクレオチド配列（またはそれらの発現産物）のレベルおよび／または活性が減少するかどうかを決定することによって評価できることを認識している。当業者はまた、標的ポリヌクレオチド配列の発現減少に関連する障害を処置または予防すること
は、細胞を本明細書記載の組成物と接触させた後に関連細胞において標的ポリヌクレオチド配列（またはそれらの発現産物）のレベルおよび／または活性が増加するかどうかを決定することによって評価できることも認識している。
【０１８７】
一部の実施形態では、障害は、遺伝障害である。一部の実施形態では、障害は、単一遺伝子障害である。一部の実施形態では、障害は、多重遺伝子障害である。一部の実施形態では、障害は、１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害である。例示的な１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害としては、米国特許第７，６２７，４３６号に記載された複合的な疾患、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００９／１１２８８２号で記載されたようなアルツハイマー病、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１８号で記載されたような炎症性疾患、米国特許出願公開第２０１２／０３０９６４２号で記載されたような多嚢胞卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号で記載されたような心臓血管疾患、米国特許出願公開第２０１２／０１３６０３９号で記載されたようなハンチントン病、欧州特許出願公開第ＥＰ２５３５４２４号で記載されたような血栓塞栓性疾患、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２０１２／００１６１３号で記載されたような神経血管疾患、米国特許出願公開第２０１０／０２９２２１１号で記載されたような精神病、米国特許出願公開第２０１１／０３１９２８８号で記載されたような多発性硬化症、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００６／０２３７１９号Ａ２で記載されたような統合失調症、統合失調性感情障害、および双極性障害、米国特許出願公開第２０１１／０１０４６７４で記載されたような双極性障害および他の疾患、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００６／１０４３７０号Ａ１で記載されたような結腸直腸がん、米国特許出願公開第２００６／０２０４９６９号で記載されたようなＡＫＴ１遺伝子座に隣接するＳＮＰに関連する障害、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００３／０１２１４３号Ａ１で記載されたような摂食障害、米国特許出願公開第２００７／０２６９８２７号で記載されたような自己免疫疾患、米国特許第７，７９０，３７０号で記載されたようなクローン病を有する患者における線維性狭窄疾患、および米国特許第８，１８７，８１１号で記載されたようなパーキンソン病が挙げられ、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当業者には、本発明の方法に従って処置または予防できる他の１つまたは複数のＳＮＰに関連する障害は明らかであると予想される。
【０１８８】
一部の実施形態では、障害はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。一部の実施形態では、障害は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
【０１８９】
本発明の方法は、多種多様の細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、それに続く対象内への導入のために、細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更するために使用される。一部の実施形態では、細胞は、末梢血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞または多能性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋骨髄細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞系−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト多能性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自己初代細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自己初代体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、同種初代細胞である。一部の実施形態では、細胞は、同種初代体細胞で
ある。一部の実施形態では、細胞は、有核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非形質転換細胞である。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞ではない。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞ではない。一部の実施形態では、細胞は、形質転換細胞ではない。
【０１９０】
一部の態様では、本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【０１９１】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０１９２】
一部の態様では、本発明は、細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法を提供する。
【０１９３】
一部の態様では、本発明は、対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞におけるポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）細胞を対象内に導入することを含み、それによりポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法を提供する。
【０１９４】
また本発明は、本発明のＣａｓタンパク質またはその機能的部分、Ｃａｓタンパク質またはその機能的部分をコードする核酸と、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチドの標的モチーフに方向づけ、かつ標的モチーフとハイブリダイズするリボ核酸配列とを含む組成物も提供する。
【０１９５】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９６】
一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９７】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９８】
一部の態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０１９９】
一部の態様では、本発明は、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０２００】
一部の実施形態では、組成物中のリボ核酸のうちの少なくとも１つは、本明細書記載のような修飾リボ核酸（例えば、合成修飾リボ核酸、例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトジン（5-methylcytodine）、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチド、または他の任意の修飾ヌクレオチド、または本明細書記載の修飾を含むもの）である。
【０２０１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸は、本明細書記載のような修飾リボ核酸（例えば、本明細書記載の合成修飾ｍＲＮＡ、例えば、
プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、または他の任意の修飾ヌクレオチド、または本明細書記載の修飾を含むもの）を含む。
【０２０３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチをそれぞれが有する異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する
。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図１）からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３００を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３００を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９９および３０１を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および２９９を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号３０１および３０３を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０２を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８および３０１を含む２つのガイドリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２０９】
一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相
補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
【０２１０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
【０２１１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、プロモーターは、初代ヒト細胞における発現増加のために最適化されている。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
【０２１２】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。
【０２１３】
また本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキット、および本発明の組成物とキットを使用するための説明書とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットも提供する。
【０２１４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１
つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９（図１）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２１９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１〜１３９（図１）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２６】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７（図２）のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更する
ためのキットを含む。
【０２２７】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２８】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２２９】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３０】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号１４０〜２９７（図２）からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３１】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。一部の実施形態では、配列番号２９８〜３０３の少なくとも２つのリボ核酸配列は、オフセット標的配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
【０２３２】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３３】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３４】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む異なる配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３５】
一部の態様では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸と、それぞれ配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含むオフセット配列と相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む細胞における標的ポリヌクレオ
チド配列を変更するためのキットを含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団を含む。一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ修復鋳型を含む。
【０２３７】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３８】
一部の態様では、本発明は、細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列にＣａｓタンパク質を方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２３９】
Ｂ２Ｍは、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現のために必要な、ＭＨＣクラスＩタンパク質のアクセサリー鎖である。表面ＭＨＣクラスＩを欠いている細胞（例えば、変異細胞）を人工的に作り出すことによって、人工的に作り出された細胞が宿主に投与されたとき、人工的に作り出された細胞が細胞傷害性Ｔ細胞によって検出される可能性を低減し得ると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列の切断は、細胞が対象に投与されたとき、このように得られた１つまたは複数の細胞が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる。
【０２４０】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、こと；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４１】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより細胞または細胞集団が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、リボ核酸、および（ｉｉｉ
）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのさらなるリボ核酸であって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、リボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４２】
細胞を投与する方法は、そのような細胞を投与することが望ましい任意の目的のために適応させることができることが企図されている。いくつかの実施形態において、細胞の投与を必要とする対象は、障害を患っている。例えば、対象は、特定の細胞が機能または数において減少している障害を患っていてもよく、特定の細胞が適切に機能している健康または正常な個体から得た機能的細胞を投与し、かつ適切な数のこれらの健康な細胞を個体に投与して、これらの細胞（例えば、細胞数または機能が減少したホルモン産生細胞、細胞数または機能が減少した免疫細胞など）によって実現される機能を修復することが望ましくてもよい。このような場合において、健康な細胞は、健康な細胞の宿主拒絶の可能性を減少させるように人工的に作り出すことができる。いくつかの実施形態において、障害は、遺伝性障害を含む。いくつかの実施形態において、障害は、感染症を含む。いくつかの実施形態において、障害は、ＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む。いくつかの実施形態において、障害は、がんを含む。
【０２４３】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、こと；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞をこのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２４４】
いくつかの態様において、本発明は、対象に投与された細胞が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより細胞または細胞集団が対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減させる、リボ核酸、ならびに（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのさらなるリボ核酸であって、標的ポリヌクレオチド配列が切断される、リボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること；ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞（複数可）をこのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。本明細書において使用する場合、「核酸」は、その最も広い意味において、ホスホジエステル結合によって連結しているヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。例示的な核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそのハイブリッドが含まれる。これらはまた、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん体形成を誘発するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、修飾核酸（例えば、本明細書に記載されている合
成された修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。
【０２４５】
本発明は、当業者が利用可能な任意の核酸修飾（modification）の使用を意図する。本発明の核酸は、任意の数の修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸は、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む。
【０２４６】
本発明の修飾ＲＮＡの製造または合成において使用される修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製は、様々な化学基の保護および脱保護が関与することができる。保護および脱保護の必要性、ならびに適当な保護基の選択は、当業者が容易に決定することができる。
【０２４７】
保護基の化学的性質は、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれているGreeneら、Protective  Groups  in  Organic  Synthesis、第２版、Wiley  &  Sons、１
９９１年において見出すことができる。
【０２４８】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、これらのそれぞれがその全体が参照により組み込まれているOgataら、Journal  of  Organic  Chemistry、７４巻：２５８５〜２５８８頁、２００９年；Purmalら、Nucleic  Acids  Research、２２巻（１号）：７２〜７８頁、１９９４年；Fukuharaら、Biochemistry、１巻（４号）：５６３〜５６８頁、１９６２年；およびXuら、Tetrahedron、４８巻（９号）：１７２９〜１７４０頁、１９９２年に記載されている合成法によって調製することができる。
【０２４９】
修飾核酸（例えば、リボ核酸）は、分子の全長に沿って均一に修飾する必要はない。異なるヌクレオチド修飾および／または骨格構造は、核酸において様々な位置において存在し得る。ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）は、核酸の機能が実質的に減少しないように、核酸の任意の位置（複数可）に配置し得ることを当業者は認識する。修飾はまた、５’または３’末端修飾であり得る。核酸は、最小で１つの、および最大で１００％修飾ヌクレオチド、または任意の中間の百分率、例えば、少なくとも５０％修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態において、１〜２つのリボ核酸のそれぞれは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸のうちの少なくとも１つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸の多数は修飾されている。いくつかの実施形態において、複数のリボ核酸のそれぞれは修飾されている。修飾リボ核酸は、本明細書に記載されている核酸修飾の１つまたは複数を含むことができることを当業者なら理解するであろう。
【０２５１】
いくつかの態様において、本明細書において提供するのは、ポリペプチドをコードする合成された修飾ＲＮＡ分子であり、細胞へ合成された修飾ＲＮＡ分子を導入することが、１つまたは複数の修飾を含まないポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触した細胞と比べて、先天性免疫応答の低減をもたらすように、合成された修飾ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする合成された修飾ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする合成された修飾ＲＮＡ分子を含む。
【０２５２】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによる急速な分解を防止し、かつＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を回避または低減させる修飾を含む。修飾には、これらに限定されないが、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基、またはコンジュゲートされた塩基による置換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位もしくは４’位における）または糖の置換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置換えを含めたヌクレオシド間連結修飾が含まれる。このような修飾が翻訳を妨げる（すなわち、例えば、ウサギ網状赤血球のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳アッセイにおいて修飾の欠如と比べて翻訳における５０％またはそれ超の低減をもたらす）範囲内において、修飾は、本明細書に記載されている方法および組成物に適していない。本明細書に記載の方法において有用な合成された修飾ＲＮＡ組成物の具体例には、これらに限定されないが、修飾または非天然ヌクレオシド間連
結を含有するＲＮＡ分子が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結を有する合成された修飾ＲＮＡは、数ある中でも、ヌクレオシド間連結においてリン原子を有さないものを含む。他の実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間連結（複数可）においてリン原子を有する。
【０２５３】
修飾ヌクレオシド間連結の非限定的例は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、および逆極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’が５’−３’と連結され、または２’−５’が５’−２’と連結される）を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態がまた含まれる。
【０２５４】
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６，２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれる。
【０２５５】
その中にリン原子を含まない修飾ヌクレオシド間連結は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるヌクレオシド間連結を有する。これらは、モルホリノ連結（部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル（thioformacetyl）骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものを含む。
【０２５６】
修飾オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５
，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が含まれる。
【０２５７】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡのいくつかの実施形態は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸、およびヘテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、および特に、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして公知である］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号（これらの両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において注目される核酸配列は、その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０２５８】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有することができる。本明細書において注目される核酸は、２’位において下記の１つを含むことができる。Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても、もしくは置換されていなくてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである）。例示的な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、ｎおよびｍは、１〜約１０である。いくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、２’位において下記の１つを含む。Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、レポーター基、インターカレーター、ＲＮＡの薬物動態特性を改善させるための基、または合成された修飾ＲＮＡの薬力学的特性を改善させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は、２’メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた公知である）（Martinら、Helv.  Chim.  Acta、１９９５年、７８巻：４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、２’−ＤＭＡＯＥ、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしてまた当技術分野において公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２としてまた公知である２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基である。
【０２５９】
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾はまた、核酸配列上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することがで
きる。合成された修飾ＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、糖模倣物、例えば、シクロブチル部分を有することができる。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、これらのいくつかは本出願と共同所有されおり、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が含まれる。
【０２６０】
非限定的例として、本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミデートもしくは非天然塩基、または任意のこれらの組合せを含めた少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含むことができる。
【０２６１】
本明細書に記載されているこの態様および全ての他のこのような態様のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。
【０２６２】
代わりに、合成された修飾ＲＮＡは、少なくとも２つの修飾ヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれ超、ヌクレオチドの全長までを含むことができる。最小でも、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む合成された修飾ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のような修飾を有する単一のヌクレオシドを含む。所与の合成された修飾ＲＮＡにおける全ての位置が均一に修飾されることは必要なく、実際、上記の修飾の複数を、単一の合成された修飾ＲＮＡにおいて、または合成された修飾ＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてさえも組み込むことができる。しかし、分子における所与のヌクレオシドの出現毎に修飾される（例えば、各シトシンは、修飾シトシン、例えば、５ｍＣである）ことが好ましいが、絶対的に必要とは限らない。しかし、同じヌクレオシドが異なって出現する毎に、所与の合成された修飾ＲＮＡ分子において異なる方法で修飾されることができることがまた意図される（例えば、いくつかのシトシンは５ｍＣとして修飾され、他は２’−Ｏ−メチルシチジンまたは他のシトシン類似体として修飾される）。修飾は、合成された修飾ＲＮＡにおける複数の修飾ヌクレオシドのそれぞれについて同じである必要はない。さらに、本明細書に記載されている態様のいくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、少なくとも２種の異なる修飾ヌクレオシドを含む。本明細書に記載されている態様のいくつかのこのような好ましい実施形態において、少なくとも２種の異なる修飾ヌクレオシドは、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンである。合成された修飾ＲＮＡはまた、修飾および非修飾ヌクレオシドの両方の混合物を含有することができる。
【０２６３】
本明細書において使用する場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基は、プリン塩であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）の修飾または置換を含む。修飾ヌクレオシドは、他の合成および天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）  Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）  ５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）  ２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）  ４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）  ２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラ��ル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チ
オ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（napthalenyl）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、０６−置換プリン、置換１，２，４−トリア���ール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、または任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化されたその誘導体を含む。修飾ヌクレオシドはまた、コンジュゲート部分、例えば、リガンドを含む天然塩基を含む。本明細書において上で考察されているように、修飾ヌクレオシドを含有するＲＮＡは、宿主細胞において翻訳可能でなくてはならない（すなわち、修飾ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの翻訳を防止しない）。例えば、ｓ２Ｕおよびｍ６Ａを含有する転写物は、ウサギ網状赤血球ライセートにおいて不十分に翻訳され、一方、プソイドウリジン、ｍ５Ｕ、およびｍ５Ｃは、効率的な翻訳と適合性である。さらに、転写物のヌクレアーゼ抵抗
性を増加させるのに有用な２’−フルオロ−修飾塩基は、非常に非効率的な翻訳をもたらすことは当技術分野において公知である。翻訳は、例えば、ウサギ網状赤血球ライセート翻訳アッセイを使用して当業者がアッセイすることができる。
【０２６４】
さらに修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているもの、Modified  Nucleosides  in  Biochemistry,  Biotechnology  and  Medicine、Herdewijn,  P.編、Wiley-VCH、２００８年において開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８，４２５号において開示されているもの；The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering、８５８〜８５９頁、Kroschwitz,  J.  L編、John  Wiley  &  Sons、１９９０年において開示されているもの、およびEnglischら、Angewandte  Chemie,  International  Edition、１９９１年、３０巻、６１３頁において開示されているものを含む。
【０２６５】
上記で留意される修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基のいくつかの調製について教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、上記で留意されるこれらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５７，１９１号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号、ならびにまたその内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第５，７５０，６９２号が含まれる。
【０２６６】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡで使用するための別の修飾は、ＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートをＲＮＡに化学的に連結させることを伴う。本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、５’キャップをさらに含むことができる。本明細書に記載されている態様のいくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、５’−５’トリホスフェート連結を使用してＲＮＡ分子の５’末端に連結した修飾グアニンヌクレオチドを含む５’キャップを含む。本明細書において使用する場合、「５’キャップ」という用語はまた、例えば、５’ジグアノシンキャップ、メチレン−ビス（ホスホネート）部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Rydzik,  A  Mら、（２００９年）Org  Biomol  Chem、７巻（２２号）：４７６３〜７６頁を参照されたい）、ホスホロチオエート修飾を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Kowalska,  J.ら、（２００８年）RNA、１４巻（６号）：１１１９〜１１３１頁を参照されたい）、非架橋酸素のための硫黄置換を有するキャップ類似体（例えば、Grudzien-Nogalska,  E.ら、（２００７年）RNA、１３巻（１０号）：１７４５〜１７５５頁を参照されたい）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Grudzien,  E.ら、（２００４年）RNA、１０巻（９号）：１４７９〜１４８７頁を参照されたい）、または抗リバースキャップ類似体（例えば、Jemielity,  J.ら、（２００３年）RNA、９巻（９号）：１１０８〜１１２２頁およびStepinski,  J.ら、（２００１年）RNA、７巻（１０号）：１４８６〜１４９５頁を参照されたい）を含めて他の５’キャップ類似体を包含することを意図する。１つのこのような実施形態において、５’キャップ類似体は、５’ジグアノシンキャップである。いくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、５’トリホスフェートを含まない。
【０２６７】
５’キャップは、翻訳を開始させる、ｍＲＮＡの認識、およびリボソームへのｍＲＮＡの付着のために重要である。５’キャップはまた、合成された修飾ＲＮＡを５’エクソヌクレアーゼが媒介する分解から保護する。合成された修飾ＲＮＡが５’キャップを含むことは絶対に必要ではなく、したがって、他の実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、５’キャップを欠いている。しかし、５’キャップを含む合成された修飾ＲＮＡのより長い半減期、および翻訳の効率性の増加によって、５’キャップを含む合成された修飾ＲＮＡは、本明細書において好ましい。
【０２６８】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含むことができる。非翻訳領域は、開始コドン（５’）の前および終止コドン（３’）の後のＲＮＡの領域であり、したがって、翻訳機構によって翻訳されない。非翻訳領域はリボヌクレアーゼおよびＲＮＡ分解に関与する他のタンパク質を妨げることができるため、１つまたは複数の非翻訳領域を有するＲＮＡ分子の修飾は、ｍＲＮＡの安定性を改善させることができる。さらに、５’および／または３’非翻訳領域を有するＲＮＡの修飾は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合を変更させる結合タンパク質によって翻訳の効率性を増強させることができる。３’ＵＴＲを有するＲＮＡの修飾を使用して、ＲＮＡの細胞質局在化を維持することができ、翻訳が細胞の細胞質において起こることを可能とする。一実施形態において、本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含まない。別の実施形態において、合成された修飾ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含む。別の実施形態において、本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態において、５’および／または３’ＵＴＲは、細胞において高い安定性を有することが公知であるｍＲＮＡから選択される（例えば、マウスのアルファ−グロビン３’ＵＴＲ）。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または両方は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている合成された修飾ＲＮＡは、コザック配列をさらに含む。「コザック配列」とは、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これに別の「Ｇ」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始する。典型的には、開始は、転写物の５’末端の近位にある翻訳機構が遭遇する最初のＡＵＧコドンにおいて起こる。しかし、場合によって、このＡＵＧコドンは、リーキースキャニングと称されるプロセスにおいて迂回することができる。正しいポリペプチドの翻訳が起こるように、ＡＵＧコドンの近くのコザック配列の存在は、翻訳の開始部位としてそのコドンを強化する。さらに、開始コドンに関してアンビギュイティが存在しなくても、合成された修飾ＲＮＡへのコザック配列の付加は、より効率的な翻訳を促進する。このように、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている合成された修飾ＲＮＡは、所望の部位において翻訳の開始のためのコザックコンセンサス配列をさらに含み、正しい長さのポリペプチドを産生する。いくつかのこのような実施形態において、コザック配列は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、「ポリ（Ａ）テイル」をさらに含み、これはアデニンヌクレオチドの３’ホモポリマーテイルを指し、これは長さが異なることができ（例えば、少なくとも５つのアデニンヌクレオチド）、数百までのアデニンヌクレオチドであり得る。３’ポリ（Ａ）テイルを含むことは、合成された修飾ＲＮＡを細胞における分解から保護することができ、また核外局在化を促進して、翻訳効率性を増強させる。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１〜５００のアデニンヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少
なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００のアデニンヌクレオチドまたはそれ超を含む。一実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１〜１５０のアデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、９０〜１２０のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかのこのような実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。
【０２７１】
本明細書に記載されている合成された修飾ＲＮＡへの１つまたは複数の修飾は、細胞における合成された修飾ＲＮＡのより大きな安定性を可能とすることが意図されている。このような修飾が、翻訳を可能とし、修飾を有する合成された修飾ＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を低減させ、または増悪させない程度まで、このような修飾は、本明細書における使用のために特に意図される。一般に、合成された修飾ＲＮＡの安定性が高いほど、より多くのタンパク質をその合成された修飾ＲＮＡから生成することができる。典型的には、哺乳動物のｍＲＮＡにおけるＡＵに富んだ領域の存在は、転写物を不安定化する傾向がある。細胞タンパク質はＡＵに富んだ領域に補充され、転写物のポリ（Ａ）テイルの除去を刺激するからである。合成された修飾ＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの喪失は、ＲＮＡ分解の増加をもたらすことができる。このように、一実施形態において、本明細書に記載のような合成された修飾ＲＮＡは、ＡＵに富んだ領域を含まない。特に、３’ＵＴＲが、ＡＵＵＵＡ配列要素を実質的に欠くことが好ましい。
【０２７２】
一実施形態において、リガンドは、細胞取込み、細胞内の標的化またはリガンドが組み込まれる合成された修飾ＲＮＡの半減期を変更する。いくつかの実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠いている組成物と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞型、細胞内コンパートメント、例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソームについて増強された親和性を実現する。好ましいリガンドは、合成された修飾ＲＮＡからのポリペプチドの発現を妨げない。
【０２７３】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を撹乱することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを撹乱することによって、細胞への合成された修飾ＲＮＡまたはその組成物の取込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、ｔａｘｏｌ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド（japlakinolide）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（myoservin）でよい。
【０２７４】
別の態様において、リガンドは、宿主細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または例えば、がん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。また含まれるのは、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。
【０２７５】
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（antennopedia）である。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたはプソイドペプチド連結、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、これは修飾することができる。ヘリックス剤は好ましくは、親油性および疎
油性相を好ましくは有するアルファヘリックス剤である。
【０２７６】
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、αヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはＣｅｒｏｐｉｎ  Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシンもしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の主要なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）でよい。例えば、細胞透過ペプチドは、２つの部分からなる両親媒性ペプチド、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＨＩＶ−１ ｇｐ４１およびＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧでよい（Simeoniら、Nucl.  Acids  Res.、３１巻：２７１７〜２７２４頁、２００３年）。
【０２７７】
本明細書に記載する合成された修飾ＲＮＡは、当技術分野で十分に確立されている方法、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている「Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry」、Beaucage,  S.  L.ら（編）、John  Wiley  &  Sons,
Inc.、New  York、N.Y.、USAに記載されているものによって合成および／または修飾することができる。転写方法は、本明細書の実施例においてさらに記載する。
【０２７８】
本明細書に記載されている態様の一実施形態において、合成された修飾ＲＮＡについての鋳型は、「スプリントが媒介するライゲーション」を使用して合成され、これは長いオリゴおよび／またはｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物の制御された鎖状体形成によるＤＮＡ構築体の急速な合成を可能とし、結合領域において制限部位を導入する必要性を伴わない。これを使用して、Ｔ７鋳型生成の間に遺伝子のコード配列に一般的な非翻訳領域（ＵＴＲ）を加えることができる。スプリントが媒介するライゲーションをまた使用して、オープンリーディングフレームに核局在化配列を加え、野性型オープンリーディングフレームから開始する点変異を有するドミナントネガティブな構築物を作製することができる。手短に言えば、一本鎖および／または変性ｄｓＤＮＡ構成要素を、スプリントオリゴにアニーリングし、これによって所望の末端を結合させ、末端を熱安定性ＤＮＡリガーゼによってライゲーションし、所望の構築物をＰＣＲによって増幅させる。次いで、合成された修飾ＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して鋳型から合成する。合成された修飾ＲＮＡの合成が完了した後、本明細書に記載の方法による使用の前に、ＤＮＡ鋳型を転写反応から除去する。
【０２７９】
これらの態様のいくつかの実施形態において、合成された修飾ＲＮＡを、アルカリホスファターゼでさらに処置する。
【０２８０】
本発明は、目的を果たし、記載した目標および利点、ならびにその中の固有のものを得るように良好に適合されていることを当業者は容易に認識する。本明細書における記載および実施例の詳細は、特定の実施形態の代表的なものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図しない。その中の改変および他の使用について、当業者は思い当たる。これらの改変は、本発明の精神内に含有される。本発明の範囲と精神から逸脱することなく、変化する置換および改変を本明細書において開示されている本発明に対して行い得ることは当業者には容易に明白である。
【０２８１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において使用する場合、明細書および請求項において、それとは反対に明らかに示さない限り、複数の参照対象を含むと理解すべきである。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示さない限り、またはその他の点で状況から明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、または全てが、所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点
で関連性がある場合、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点で関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、群メンバーの複数、または全てが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物もしくはプロセスとその他の点で関連性がある実施形態を含む。さらに、本発明は、全てのバリエーション、組合せ、および並べ替えを提供することを理解すべきであり、ここでは一覧表示した請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限度、要素、条項、記述用語などが、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、同じ基本請求項（または、関連性があれば、任意の他の請求項）に依存して別の請求項に導入される。本明細書に記載されている全ての実施形態は、適切な場合には、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが意図されている。実施形態または態様のいずれかを、適当と認められるときは、１つまたは複数の他のこのような実施形態または態様と自由に合わせることができることがまた意図される。要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示される場合、要素の各部分群がまた開示されており、任意の要素（複数可）を群から除去することができることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、またはこのような要素、特徴などから本質的になることを理解すべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書において多くの言葉で具体的に記載してきたわけではない。特定の除外が明細書において記載されているかいないかに関わらず、本発明の任意の実施形態または態様を明示的に請求項から除外することができることをまた理解すべきである。例えば、任意の１種または複数の活性剤、添加物、成分、任意選択の薬剤、生物のタイプ、障害、対象、またはこれらの組合せを、除外することができる。
【０２８２】
請求項または記載が対象の組成物に関する場合、本明細書において開示されている方法のいずれかによって対象の組成物を作製または使用する方法、および本明細書において開示されている目的のいずれかのために対象の組成物を使用する方法は、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。請求項または記載が方法に関する場合、例えば、方法を行うために有用な組成物を作製する方法、および方法によって生成される生成物が、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。
【０２８３】
本明細書において範囲が示される場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、および１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントが除外される実施形態を含む。両方のエンドポイントは他に示さない限り含まれることを想定すべきである。さらに、他に示さない限り、またはその他の点で状況および当業者の理解から明らかでない限り、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲として表される値は、範囲の下限の１０分の１まで、任意の特定の値、または異なる本発明の実施形態において記述した範囲内の部分範囲を想定することができることを理解すべきである。一連の数値が本明細書において記述される場合、本発明は、任意のその間にある値またはその一連の任意の２つの値によって定義される範囲にアナログ的に関する実施形態を含み、かつ最も低い値は、最小として受け取り得、最も大きな値は、最大として受け取り得ることがまた理解される。数値は、本明細書において使用する場合、百分率として表す値を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が記述される実施形態を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「概ね」によって前置きされる実施形態を含む。
【０２８４】
本明細書において使用する場合、「Ａおよび／またはＢ」（ＡおよびＢは、異なる請求項用語である）は一般に、Ａ、Ｂの少なくとも１つ、またはＡおよびＢの両方を意味する。例えば、別の配列に対して相補的であり、かつ／または別の配列にハイブリダイズする１つの配列は、（ｉ）全ての条件下で他の配列に必ずしもハイブリダイズし得るわけではないけれど、他の配列に対して相補的である１つの配列、（ｉｉ）他の配列に対して完全に相補的であるわけではないけれど、他の配列にハイブリダイズする１つの配列、ならびに（ｉｉｉ）他の配列に対して相補的であり、かつ他の配列にハイブリダイズするものの両方である配列を含む。
【０２８５】
「概ね」または「約」は一般に、特に明記しない限り、またはその他の点で状況から明らかでない限り（このような数が、可能な値の１００％を許容されないほどに超える場合を除いて）、いずれかの方向（その数超またはその数未満）で、１％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態において、数の１０％の範囲内に入る数を含む。それとは反対に明らかに示さない限り、複数の実行を含む本明細書における特許請求する任意の方法において、方法の実行の順序は、必ずしも方法の実行が記述される順序に限定されないが、本発明は、順序がこのように限定されている実施形態を含む。他に示さない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書に記載されている任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考え得るとまた理解すべきである。
【０２８６】
本明細書において使用する場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明にとって必須である組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素（複数可）に関して使用するが、不特定の要素を含むことは、必須であろうと、またはそうでなくても自由である。
【０２８７】
本明細書において使用する場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態のために必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のこの実施形態の基礎および新規または機能的特徴（複数可）に物質的に影響を与えないさらなる要素の存在を可能とする。
【０２８８】
「からなる」という用語は、実施形態のその記載において記述されないいずれの要素をも除いた、本明細書に記載のような組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【実施例】
【０２８９】
（実施例１）
【０２９０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノム部位の周りに対として結合し、ここでは二重鎖切断（ＤＳＢ）はＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの二量体によって導入される。厳密な疾患モデリングを行う手段として、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）において１５の異なる遺伝子の変異型アレルを急速および効率的に生じさせるＴＡＬＥＮゲノム編集系の使用は最近報告された（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。少なくとも１つの変異型アレルを担持するクローンの割合は、２％〜３４％の範囲であった。
【０２９１】
下記のように、同じｈＰＳＣ系における同じゲノム部位を標的とするＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮの相対的有効性は、従前に記載された同じ送達プラットホームの使用によってアセスメントされた（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。ＴＡＬＥＮゲノム編集系において、ＣＡＧプロモーターを使用して、緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を伴う各ＴＡＬＥＮを（ウイルスの２Ａペプチドを介して）同時翻訳した。ＣＲＩＳＰＲについて、ヒトコドン−最適化Ｃａｓ９遺伝子を、ＧＦＰを有する同じＣＡＧ発現プラスミドにＣ末端核移行シグナルと共にサブクローニングし（Maliら、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有するプラスミドから別々に発現させた（Maliら、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁（２０１３年））。各ｇＲＮＡについての２０−ヌクレオチドプロトスペーサー配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする方法を使用して導入した。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲを使用しようとも、等しい量の２つのプラスミドをｈＰＳＣ中に共エレクトロポレーションし（２５μｇの各プラスミド、またはノックインを試みる場合、２５μｇのＤＮＡ修復鋳型と共に１２．５μｇの各プラスミド）、それに続いて２４〜４８時間後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、単一の細胞のクローン性増殖、およびゲノム標的部位における変異についてのＰＣＲによるスクリーニングを行った。
【０２９２】
ｇＲＮＡは、従前にＴＡＬＥＮで成功裏に標的とした６つの遺伝子（ＡＫＴ２、ＣＥＬＳＲ２、ＣＩＩＴＡ、ＧＬＵＴ４、ＬＩＮＣ００１１６、およびＳＯＲＴ１）における７つの座位（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））、ならびにＬＤＬＲにおける１つのさらなる座位におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧ配列をマッチさせて設計した。この系において、ＣＲＩＳＰＲは、座位およびｈＰＳＣ系に亘ってＴＡＬＥＮより一貫しておよび実質的に優れていた（表Ｓ１を参照されたい）。ＴＡＬＥＮは、０％〜３４％の効率で少なくとも１つの変異型アレルを有するクローンを生じさせたが、マッチさせたＣＲＩＳＰＲは、５１％〜７９％の効率で変異型クローンを生じさせた（表Ｓ１）。ＴＡＬＥＮと同じぐらい、ＣＲＩＳＰＲは、予想される切断部位を中心としてサイズが１つのヌクレオチドから数十のヌクレオチドの範囲のサイズの種々の挿入欠失を生じたが、これはＣＲＩＳＰＲを使用するかまたはＴＡＬＥＮを使用するかに関わらず、非相同末端結合突然変異誘発が同様に起こることを示唆する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、配列決定によって識別した場合、ホモ接合性変異体クローン（全てのクローンの７％〜２５％；表Ｓ１）を容易に生じさせた。
【０２９３】
ＡＫＴ２中へのＥ１７Ｋ変異のノックインをまた、従前に記載されているように、６７−ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して試みた（Dingら、Cell  Stem
Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。予想されるＣＲＩＳＰＲ切断部位は、それぞれ、点変異から１１および１３ヌクレオチドにおいて存在するが、ＣＲＩＳＰＲは、１１％の割合でノックインクローンを生じさせ、一方、ＴＡＬＥＮは、１．６％のみを生じさせた（表Ｓ１）。
【表Ｓ１】
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【０２９４】
Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧ標的配列についての必要条件は、部位の選択をいくらか限定することは注目に値する。いずれかのＤＮＡ鎖は標的とすることができるため、標的配列は平均
して３２塩基対毎に起こる。これは任意のコード配列を標的とすることができる遺伝子ノックアウトについて障害ではないが、これは特定の場所において変異をノックインまたは補正しようとするとき困難を伴い得る。しかし、プロトスペーサーの開始においてＧを必要とすることは、ｇＲＮＡを発現するＵ６プロモーターの使用によって表され、代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、この必要条件を軽減することができる（Congら、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁（２０１３年））。これは、平均して８塩基対毎に見出される（Ｎ）２０ＮＧＧ標的配列の使用を可能とする。
【０２９５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット作用の程度は、依然として明らかにされておらず、高度に配列依存的である。従前の分析は、プロトスペーサーの最初の半分における１つのヌクレオチドミスマッチは、後半の半分におけるミスマッチより良好に許容されることを示唆した（Jinekら、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁（２０１２年）；Congら、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁（２０１３年））。ＡＫＴ２配列について、プロトスペーサーのより「許容性の」半分におけるヌクレオチド１および３において異なる２−ミスマッチ配列が存在する。ゼロクローンは、オンターゲット部位における６１％と比較してこの潜在的なオフターゲット部位における変異を伴って得た（表Ｓ１）。ＳＯＲＴ１配列の１つについて、一塩基多型が標的部位において１つのヌクレオチドミスマッチをもたらす異なるヒト多能性幹細胞系の使用は、当初の細胞系における６６％と比較して、４２％の効率で変異型クローンを生じさせた。このように、標的部位の賢明な選択は、系におけるオフターゲット作用を最小化するために必要である。完全なマッチ、またはゲノムにおける他の場所での単一のヌクレオチドミスマッチ配列を有する標的部位は、回避すべきである。
【０２９６】
実際的な面から、ＣＲＩＳＰＲは、ＴＡＬＥＮより実行するのにより容易である。各ＴＡＬＥＮ対は、新規に構築しなくてはならず、一方、ＣＲＩＳＰＲについて、Ｃａｓ９構成要素は固定されており、ｇＲＮＡは、２０−ヌクレオチドプロトスペーサーのスワッピングのみを必要とする。この考察、およびその他の点では同一の系においてＴＡＬＥＮをＣＲＩＳＰＲで置き換えた結果としての効率性の実質的な増加についての本明細書における実証を考慮すれば、ＣＲＩＳＰＲは、特に治療の状況においてゲノム編集のための非常に強力で広範に適用可能なツールであるように思われる。
【０２９７】
（実施例２）
初代体細胞における臨床的に関連性のある遺伝子の効率的な標的化
【０２９８】
本明細書に記載されている研究は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、二重ガイド戦略を使用することによって、高効率に体細胞（例えば、初代）のゲノムを編集することができることを初めて示す。本発明者らは、この研究が、臨床的に関連性のある初代細胞におけるゲノム編集を現実のものとする一助となると推測する。
【０２９９】
任意の所望のゲノム部位を標的とすることを可能とするゲノム編集ツールの出現は、ヒト生物学および疾患の調査を非常に進展させた。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、その柔軟性および高い有効性によって標的化ゲノム編集技術において標準的なものとなってきた。この系は、微生物タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼによって構成され、これは合成ガイドＲＮＡ分子における２０−ヌクレオチド領域によって特異的ゲノム座位に標的化される。他の標的化ヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ）と同様に、Ｃａｓ９は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって主に修復される二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する（Congら、２０１３年；Jinekら、２０１３年；Maliら、２０１３年）。
【０３００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の実行は、不死化細胞系（Congら、２０１３年；Jinekら、
２０１３年；Maliら、２０１３年）、ヒト多能性幹細胞（Dingら、２０１３年）、ならびにそれどころかマウス（Wangら、２０１３年）、ラット（Liら、２０１３年）および、最近では、サルの接合体（Niuら、２０１４年）において前例のないほどに高い標的化効率性を達成することを可能としてきており、古典的戦略と比較したとき非常に短期間でのノックアウト動物またはノックイン動物の産生がもたらされている。
【０３０１】
しかし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、再生医療および移植治療についてのゲノム編集の見込みの完全な実現のための必須のステップである、高効率に臨床的に関連性のある初代体細胞のゲノムを編集することができるかどうかはまだ証明されていない。
【０３０２】
本発明者らは、初代体細胞において臨床的に関連性のある遺伝子を編集するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の適合性を試験することを探求した。この目的のために、本発明者らは、２つの治療関連遺伝子：ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）におけるＨＩＶについての共受容体であるＣＣＲ５、およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子のアクセサリー鎖であるＢ２Ｍを標的とすることを選択した。本発明者らは、単一ガイド戦略が、不死化細胞系、例えば、２９３ＴおよびＫ５６２における高い効率性にも関わらず、ＨＰＣおよびＴ細胞において非常に低いものから検出不能なものまでの変異割合を生じさせることを見出した。対照的に、驚いたことにおよび予想外に、対象とする座位を標的とする異なるオフセットを伴う対のｇＲＮＡによる二重ガイド戦略は、ＨＰＣおよびＴ細胞において４０％までのホモ接合性欠失の効率性をもたらした。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、高効率に臨床的に関連性のある体細胞においてゲノムを編集することができるという新規なアプローチを確立する。
【０３０３】
結果
【０３０４】
細胞系におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した効率的なおよび急速なゲノム編集
【０３０５】
本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣａｓ９、およびＢ２Ｍ座位を標的とする一連のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（図４）、およびＢ２Ｍが表面抗原であるという事実を利用したフローサイトメトリーに基づいてカッティング効率性を測定した。これらの実験は、細胞膜上のＢ２Ｍの半減期を説明するために、トランスフェクションのわずか７２時間後に行った。留意されることには、Ｂ２Ｍ表面発現は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の６０％までにおいて抑止された（図４）。さらに、本発明者らは、同じエキソンを標的とする場合でさえも、個々のガイドＲＮＡの間で幅広いバリエーションの効率性を観察した。例えば、単一のガイドカッティング効率性の間のバリエーションは、Ｂ２Ｍの最初のエキソンの６７ｂｐ長のタンパク質コード部分内に結合する７つのガイドＲＮＡの間で数倍であったが（図１Ｘ）、これはＣＲＩＳＰＲカッティング効率性が、主にガイド配列依存性であることを強く示唆する。
【０３０６】
初代体細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化が無効である
【０３０７】
次に、本発明者らは、初代細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を試験した。本発明者らは、２つの臨床的に関連性のある免疫細胞タイプを選択した。初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）および末梢血から単離した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞。驚いたことに、細胞系（２９３Ｔ細胞中のＢ２Ｍ、図４）において６０％までのカッティング効率性をもたらした同じガイドＲＮＡは、体細胞において無効であることが明らかにされた（図４）。本発明者らは、初代細胞における標的化効率性のこのような劇的な低下が、ヌクレオフェクトされた細胞におけるＣａｓ９ヌクレアーゼのより低い発現レベル、ＤＮＡ修復機序の増強、または両方の組合せによるものであると推測する。
【０３０８】
二重ガイド戦略は、初代細胞において標的化効率性を劇的に増加させる
【０３０９】
本発明者らは、治療において潜在的に使用されるのに十分に高い標的化効率性を達成することを望んで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した臨床的に関連性のある初代細胞におけるゲノム編集有効性を改善させることができるかどうかを決定しようと探求した。本発明者らは、二重ガイド戦略を考案したが、ここでは同じ座位を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを細胞に同時に送達した。
【０３１０】
ＨＰＲＴ座位を標的とする別のガイドＲＮＡの添加は、最初のガイドＲＮＡ単独と比較して、変異効率性の増加を殆ど常にもたらした。ＨＰＲＴが欠けた細胞は、６−チオグアニン（６−ＴＧ）への耐性によって選択した。さらなるｇＲＮＡの使用は、ＨＰＲＴ変異体の頻度の増加を常にもたらした。一実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＨＰＲＴ遺伝子配列を含む。
【０３１１】
異なるガイドＲＮＡ対を各座位について試験し、最も活性なものを初代細胞のさらなる研究のために使用した。図４Ａ〜４Ｅは、単一ガイド戦略が細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞においては達成しないことを示す。本発明者らが使用した２つの系において、二重ガイド戦略は、初代体細胞において伝統的な単一ガイド戦略より一貫しておよび実質的に優れていた。これらの結果を、図５Ａ〜５Ｅにおいて示し、これは二重ガイド戦略が臨床的に関連性のある細胞において高い効率性を伴ってゲノム編集を達成することを示す。
【０３１２】
考察
【０３１３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集分野の分野における主要な焦点の１つは、Ｃａｓ９によるカッティング効率性をモジュレートするパラメーターの捜索である。本明細書に記載されているデータは、この現象がｇＲＮＡ配列によって大部分が決定されているように思われることを示唆する。同じエキソン内の非常に近い配列、またはそれどころか部分的にオーバーラップする配列にマッチするｇＲＮＡは有意に異なる標的化効率性をもたらすためである（図４）。
【０３１４】
従前の報告において、標的とした二重鎖切断を導入するためにＣａｓ９ニッカーゼ変異体と対のガイドＲＮＡとを合わせるアプローチを使用して、オンターゲット効率性を犠牲にすることなしにＣＲＩＳＰＲオフターゲット作用を劇的に低減させた（Ranら、２０１３年）。しかし、本発明者らの研究において、この戦略は、有意な変異率を生じなかった（MaxおよびPankaj）。そのため、本発明者らは、ＷＴ  Ｃａｓ９とｇＲＮＡの対とを合わせ、標的化が無効である細胞型（初代体細胞）におけるカッティング効率性を増加させた。
【０３１５】
Ｂ２Ｍは、ＭＨＣクラスＩタンパク質のアクセサリー鎖であり、細胞表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現のために必要である。表面ＭＨＣクラスＩを欠いており、したがって細胞傷害性Ｔ細胞に探知されない細胞を人工的に作り出すことは、移植および養子細胞治療において最大に重要なことである。
【０３１６】
全体で、本発明者らのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、二重ガイド戦略を使用することによって、有意な効率で臨床的に関連性のある初代体細胞のゲノムを編集することができることを示す。本発明者らは、この戦略が、治療への可能な翻訳のために関連性のある十分に高い効率性を伴って、体細胞における標的遺伝子に対する一般アプローチとなる可能性を有すると予想する。
【０３１７】
いくつかの実験手順
【０３１８】
フローサイトメトリー。細胞を、マウスモノクローナル抗Ｂ２Ｍ抗体２Ｍ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。
【０３１９】
初代血液細胞のエレクトロポレーション。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ４ Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｌｅｕｋｏｐａｃｓ（ＭＧＨ）から単離し、Ａｍａｘａ  Ｔ細胞ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して内毒素非含有ＤＮＡでエレクトロポレーションした。
【０３２０】
ＨＰＲＴ欠失についての６−ＴＧ選択。５＊１０６細胞を、２５ｕｇのＣａｓ９および１２．５ｕｇの各ｇＲＮＡを用いたエレクトロポレーションごとに使用した。Ｃａｓ９対照について、非カッティングｇＲＮＡを使用して、総ＤＮＡ量を同じに維持した。ＦＡＣＳソーティングは、ＥＰの４８時間後に５〜８％ＧＦＰで結局相対的に同様となった。細胞を試料毎に１０ｃｍのプレート毎に４０，０００個で蒔き、コロニーを明瞭に見ることができるまで増殖させた。ｍＴＥＳＲ（例えば、３０μｍの濃度）中の３０ｕＭの６−チオグアニン（６−ＴＧ）を８〜９日間選択培地として使用し、コロニーを再び計数した。結果を下記の表１において示す。
【０３２１】
【表１】
2016522679.tif 000041
【０３２２】
下記の表２は、編集効率性によって順位付けた上の表１からの結果を示す。
【０３２３】
【表２】
2016522679.tif 000042
【０３２４】
実験において使用したｇＲＮＡを、下記に示す。
【０３２５】
１−ｇｔｃｔｔｇｃｔｃｇａｇａｔｇｔｇａｔｇ（配列番号２９８）
【０３２６】
３−ｔａａａｔｔｃｔｔｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃ（配列番号２９９）
【０３２７】
５−ｔａｇａｔｃｃａｔｔｃｃｔａｔｇａｃｔｇ（配列番号３００）
【０３２８】
７−ｃｔｔｃａｇｔｃｔｇａｔａａａａｔｃｔａ（配列番号３０１）
【０３２９】
９−ｔｔｔｇａｔｇｔａａｔｃｃａｇｃａｇｇｔ（配列番号３０２）
【０３３０】
１１−ｃａｃａｇａｇｇｇｃｔａｃａａｔｇｔｇａ（配列番号３０３）
【０３３１】
【表３】
2016522679.tif 000043
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項２】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記
標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項３】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項４】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列をクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記変更が挿入欠失である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項３から４の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記変更が、ホモ接合性変更である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
各変更がホモ接合性変更である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が末梢血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞系−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が肝細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、図１のリボ核酸配列および図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記障害が遺伝障害である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６９】
前記障害が単一遺伝子障害である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７０】
前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７１】
前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７２】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記１〜２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記１〜２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である、請求項３から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のた
めに最適化されたプロモーターを使用して発現される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＦＡＣｓが、Ｃａｓと、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項９７】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項９８】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項９９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複
数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防する、方法。
【請求項１００】
図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０１】
図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０２】
図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０３】
図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０４】
図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項１０５】
前記リボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１０】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１１】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列からなる群から選択さ
れる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１２】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１３】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項１１４】
緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２０】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、図１のリボ核酸配列、図２のリボ核酸配列、図１のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列、および図２のリボ核酸配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項１２１】
ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２３】
前記細胞が初代細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞が初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞が自己初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３または１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞が同種初代体細胞を含む、請求項１から４および１２３から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍである、請求項１から２および１２３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列を含む、請求項１から２および１２３から１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記１〜２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項１から２および１２３から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む、請求項３から４および１２３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列を含む、請求項３から４、１２３から１２６、および１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化するために最適化された異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む、請求項３から４、１２３から１２６、および１３０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項１から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記１〜２つのリボ核酸が、２つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記細胞が初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１〜１３９からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９８〜３０３からの２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む、請求項１３４から１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号３０４〜３３３からなる群から選択される、ＣＣＲ５におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１３４から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞が、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５または１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される、ＣＸＣＲ４におけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＢ２Ｍを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１５１】
前記細胞が初代細胞を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子における異なる配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるオフセット配列と相補的な２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０から１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、Ｂ２Ｍにおけるオフセット標的部位とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質を前記オフセット標的部位に標的化する２つのガイドリボ核酸配列の任意の組合せを含む、請求項１５０から１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
初代細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項１５６】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも２つのリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記少なくとも２つのリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項１５７】
初代細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、前記方法が、前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、方法。
【請求項１５８】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、初代細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズするガイドリボ核酸を含み、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約５０％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項１５９】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記Ｃａｓタンパク質が、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記機能的部分が、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組合せを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記機能的ドメインが、複合体を形成する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記１〜２つのリボ核酸と複合体を形成される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数のリボ核酸と複合体を形成される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
各標的モチーフが、Ｇで始まるヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
各標的モチーフが、ヌクレオチド２０個のＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
各標的モチーフがＧ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１５７から１５８のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項１７５】
前記標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
各標的モチーフが（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１６７、１６９、１７１、１７３、または１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記標的モチーフが、配列番号１〜２９７または３０４〜３３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１６８、１７０、１７２、１７４、または１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
各標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
各標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖切断が生じるように切断される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記変更が挿入欠失である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現低減をもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記変更が、前記標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記変更が、望まれない配列から所望の配列への前記標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記変更が、ホモ接合性変更である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
各変更がホモ接合性変更である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて相同組換え修復が起こる、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
相同組換え修復が、外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型を使用して行われる、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が一本鎖である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記外因的に導入されたＤＮＡ修復鋳型が二本鎖である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
前記細胞が末梢血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記細胞が、幹細胞または多能性細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記細胞がＣＤ３４＋動員末梢血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記細胞がＣＤ３４＋臍帯血細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
前記細胞がＣＤ３４＋骨髄細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞系−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
前記細胞が肝細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記細胞が初代細胞である、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記２つのガイドリボ核酸配列が、配列番号２９９および３０３、配列番号２９８および３００、配列番号２９９および３００、配列番号２９８および３０３、配列番号２９９および３０１、配列番号２９８および２９９、配列番号３０１および３０３、配列番号２９８および３０２、ならびに配列番号２９８および３０１からなる群から選択されるガイドリボ核酸の対を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１３】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１４】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１５】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１６】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２０】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２１】
前記２つのリボ核酸が、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有するオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の複数の異なる部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２７】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４の複数の異なる部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２８】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１４０〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＣＲ５の少なくとも一部分およびＣＸＣＲ４の少なくとも一部分を含む、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、配列番号１〜２９７および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３７】
前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３８】
前記複数のリボ核酸が、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択されるオフセット配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸配列とを含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３９】
前記障害が遺伝障害である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記障害が単一遺伝子障害である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４１】
前記障害がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４２】
前記障害が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である、請求項１５６または１５８に記載の方法。
【請求項２４３】
前記２つのリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
前記２つのリボ核酸のそれぞれが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記複数のリボ核酸が、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフのすぐ隣にある標的モチーフとハイブリダイズするように設計され、前記デオキシリボ核酸モチーフが、前記標的モチーフの間に位置する変異型アレルに隣接する、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記２つのリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記複数のリボ核酸が、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダ
イゼーションを最小化するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５０】
各標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５１】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
前記標的モチーフが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５４】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５５】
前記２つのリボ核酸が、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５６】
前記複数のリボ核酸のそれぞれが、前記細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフとハイブリダイズする、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５７】
各遺伝子座での変更効率が約５０％〜約８０％である、請求項１５７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
前記Ｃａｓタンパク質が、修飾核酸によってコードされる、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
前記修飾核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有するリボ核酸を含む、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−
５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６１】
前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項１５５から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、プラスミドから発現される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６３】
前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸のいずれかが、幹細胞における発現増加のために最適化されたプロモーターを使用して発現される、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６４】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項１５５から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
細胞を選択することが、ＦＡＣＳを含む、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
ＦＡＣｓが、Ｃａｓと蛍光タンパク質とを同時発現する細胞を選択するために使用される、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６８】
細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項２６９】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項２７０】
細胞における複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に変更するための方法であって、
前記方法が、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における前記ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、方法。
【請求項２７１】
対象におけるポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するための方法であって、前記方法が、（ａ）ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞における標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム様リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質および複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞における前記標的ポリヌクレオチド配列をｅｘ  ｖｉｖｏで変更することであって、前記リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を前記標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向づけ、かつ前記標的モチーフとハイブリダイズし、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変更効率が約８％〜約８０％である、こと、ならびに（ｂ）前記細胞を前記対象内に導入することを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防することを含む、方法。
【請求項２７２】
配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７３】
配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７４】
配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７５】
配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７６】
配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸を含む組成物。
【請求項２７７】
前記２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つが、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項２７２から２７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記２つのリボ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１〜２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項２７２から２７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７９】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８０】
Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項２７９または２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８３】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８４】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが有する少なくとも２つの追加的なリボ核酸とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８５】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８６】
Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される配列との単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つの追加的なリボ核酸配列とを含むキメラ核酸を含む組成物。
【請求項２８７】
検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８８】
蛍光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７２から２８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８９】
前記キメラ核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項２７２から２８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９０】
前記プロモーターが、ヒト幹細胞における発現増加のために最適化されている、請求項２８９に記載の組成物。
【請求項２９１】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ−アクチンプロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターからなる群から選
択される、請求項２８９または２９０に記載の組成物。
【請求項２９２】
前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸、および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２８２から２９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９３】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項２８２から２９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９４】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号２９８〜３０３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９５】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９６】
Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列をそれぞれが含む少なくとも２つのリボ核酸とを含む、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変更するためのキット。
【請求項２９７】
ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞、および非形質転換細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞系、細胞培養物、または細胞集団をさらに含む、請求項２９４から２９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９８】
ＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項２９４から２９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９９】
細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３００】
細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断される、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０１】
前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列の切断が、前記結果として生じた１つまたは複数の細胞が前記対象に投与されたときに前記細胞が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する、請求項２９９または３００に記載の方法。
【請求項３０２】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項２９９から３０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０３】
前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む、請求項２９９から３０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０４】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０５】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０６】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項２９９から３０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０７】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０８】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項２９９から３０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０９】
前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む、請求項２９９から３０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１０】
細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている、請求項２９９から３０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１１】
前記障害が遺伝障害を含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１２】
前記障害が感染症を含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１３】
前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１４】
前記障害が、がんを含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１５】
対象に投与された細胞が、前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのリボ核酸と
ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることであって、Ｂ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する、こと、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１６】
対象に投与された細胞が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団を、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つのリボ核酸であって、前記細胞または細胞集団におけるＢ２Ｍをコードする前記標的ポリヌクレオチド配列が切断され、それにより前記細胞または細胞集団が前記対象において宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減するリボ核酸、および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を前記細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列に方向づけ、かつ前記標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも２つの追加的なリボ核酸であって、前記標的ポリヌクレオチド配列が切断されるリボ核酸と、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること、ならびに（ｂ）（ａ）の結果として生じた１つまたは複数の細胞を、そのような細胞を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１７】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＣＲ５を含む、請求項３１５から３１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１８】
前記少なくとも２つのリボ核酸が、配列番号２９８〜３０３からなる群から選択される２つの異なる配列を含む、請求項３１５から３１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１９】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２０】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１３９および３０４〜３３３からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２１】
前記標的ポリヌクレオチド配列がＣＸＣＲ４を含む、請求項３１５から３２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２２】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２３】
前記少なくとも２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１４０〜２９７からなる群から選択される異なる配列との少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む配列と相補的でありかつ／またはハイブリダイズする配列を含む、請求項３１５から３２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２４】
前記細胞または細胞集団が初代細胞を含む、請求項３１５から３２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２５】
細胞の投与を必要とする前記対象が障害を患っている、請求項３１５から３２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２６】
前記障害が遺伝障害を含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２７】
前記障害が感染症を含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２８】
前記障害がＨＩＶまたはＡＩＤｓを含む、請求項３２５に記載の方法。
【請求項３２９】
前記障害が、がんを含む、請求項３２５に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月25日(2016.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、Ｂ２Ｍ座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、Ｂ２Ｍ座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、Ｂ２Ｍ座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【図４Ｅ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、単一ガイド戦略が、細胞系において高い効率性のゲノム編集を達成するが、臨床的に関連性のある初代体細胞において達成しないことを示す。図４Ａは、ＣＣＲ５座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位（単一のガイド）を示す表であり、これはＣＲＩＳＰＲデザインプログラム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ｍｉｔ．ｅｄｕにおいて入手可能）を使用して最適化されたガイドＲＮＡ配列のためにヒトケモカイン受容体ＣＣＲ５遺伝子をスキャニングすることによって見出された（左のパネル）。５０超のスコアを有する全部で１１のガイドＲＮＡを、Ｋ５６２細胞系において編集効率性について試験した。図４Ａ（右のパネル）は、ＣＥＬ  ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定した選択したガイドの７つの編集効率性（挿入欠失％）を示す。図４Ｂは、細胞系２９３Ｔ、Ｋ５６２（左の２つのパネル）および初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（右の２つのパネル）におけるゲノム編集効率性の比較分析を示し、初代ＣＤ３４＋細胞における非効率的なゲノム編集の効率性を例示する。細胞に、Ｃａｓ９（レーン１）を、ガイドＲＮＡ（レーン２）または発現プラスミド（レーン３）とともにトランスフェクトした。図４Ｃは、Ｂ２Ｍ座位におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を例示する概略図である（単一のガイド）。図４Ｄは、２９３Ｔ細胞における単一のガイドＲＮＡによるＢ２Ｍ座位の標的化の結果を示す。図４Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍを標的とする単一ガイド戦略を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示し、これはＢ２Ｍ  ＣＲＩＳＰＲが高い効率性を伴ってＢ２Ｍの表面発現を切除することを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的にはトランスにコード化された低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（またＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。図３に、Ｃａｓ９タンパク質の例示的なアミノ酸配列（配列番号３３４）を示す。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６および９８２〜９８９）と、ｃｒＲＮＡと相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）とを包含する２つのエンドヌクレアーゼ（enconuclease）ドメインを含有する。図３では、ＲｕｖＣ様ドメインを黄色で強調表示し、ＨＮＨヌクレアーゼドメインに下線を付す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
ＡＫＴ２中へのＥ１７Ｋ変異のノックインをまた、従前に記載されているように、６７−ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して試みた（Dingら、Cell  Stem  Cell、１２巻：２３８〜２５１頁（２０１３年））。予想されるＣＲＩＳＰＲ切断部位は、それぞれ、点変異から１１および１３ヌクレオチドにおいて存在するが、ＣＲＩＳＰＲは、１１％の割合でノックインクローンを生じさせ、一方、ＴＡＬＥＮは、１．６％のみを生じさせた（表Ｓ１）。
【表Ｓ１】
2016522679.tif 000044
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016522679000001.app
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2016522679.tif 000045
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ−Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ−Ｃ】
2016522679.tif 000046
【国際調査報告】
2016522679.tif 000047
2016522679.tif 000048
2016522679.tif 000049
2016522679.tif 000050