(57)【要約】  本発明は、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する方法であって、該方法が、非ヒト哺乳動物卵母細胞に、(a)クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9タンパク質)または前記Cas9タンパク質をコードする核酸分子；ならびに(b-i)標的配列特異的CRISPR RNA (crRNA)およびトランス活性化crRNA (tracr RNA)もしくは前記RNAをコードする核酸分子；または(b-ii)標的配列特異的crRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列もしくは前記RNAをコードする核酸分子を導入する工程を含み、ここで、(a)で導入されるCas9タンパク質および(b-i)または(b-ii)で導入されるRNA配列(1つまたは複数)が、標的配列に特異的に結合し、かつ標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断を導入するタンパク質/RNA複合体を形成する、方法に関する。本発明はさらに、標的配列が、ドナー核酸配列を用いて、相同組み換えにより改変され、該方法が、(c)核酸分子を細胞に導入する工程をさらに含み、該核酸分子が、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む、発明の方法に関する。本発明はまた、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する方法であって、該方法が、非ヒト哺乳動物卵母細胞に
(a)  クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9タンパク質)または前記Cas9をコードする核酸分子；ならびに
(b-i)  標的配列特異的CRISPR RNA (crRNA)およびトランス活性化crRNA (tracr RNA)もしくは前記RNAをコードする核酸分子；または
(b-ii)  標的配列特異的crRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列もしくは前記RNAをコードする核酸分子
を導入する工程を含み、
ここで、(a)において導入される該Cas9タンパク質および(b-i)または(b-ii)において導入されるRNA配列(１つまたは複数)は、標的配列に特異的に結合し、かつ標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断(break)を導入するタンパク質/RNA複合体を形成する、方法。
【請求項２】
標的配列が、ドナー核酸配列を用いて、相同組み換えにより改変され、
該方法が、
(c)  核酸分子を細胞に導入する工程をさらに含み、該核酸分子が、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸分子が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(oligodesoxynucleotide)である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
卵母細胞が、受精した卵母細胞である、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
Cas9タンパク質もしくは同タンパク質をコードする核酸分子および/または(b-i)もしくは(b-ii)のRNAまたは前記RNAをコードする核酸分子が、マイクロインジェクションにより卵母細胞に導入される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
(c)の核酸分子が、マイクロインジェクションにより卵母細胞に導入される、請求項２〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
Cas9タンパク質をコードする核酸分子がmRNAである、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
Cas9タンパク質が配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
標的配列に相同な領域が、ドナー核酸配列の5'末端および3'末端に位置する、請求項２〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
(c)の核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域が、少なくとも400bpの長さを有する、請求項２〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
標的配列の改変が、標的配列の少なくとも一ヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される、請求項１〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
卵母細胞が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよび反芻動物からなる群より選択される非ヒト哺乳動物由来である、請求項１〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、
(a)  請求項１〜１２のいずれかに従って卵母細胞を作製する工程；
(b)  (a)において得られた卵母細胞を偽妊娠雌宿主に移す工程；および
(c)  該雌宿主により出産された子孫を、改変の存在について分析する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
該非ヒト哺乳動物が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよび反芻動物からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する方法であって、該方法が、非ヒト哺乳動物卵母細胞に、(a)クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9タンパク質)または前記Cas9タンパク質をコードする核酸分子；ならびに(b-i)標的配列特異的CRISPR RNA (crRNA)およびトランス活性化crRNA (tracr RNA)もしくは前記RNAをコードする核酸分子；または(b-ii)標的配列特異的crRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列もしくは前記RNAをコードする核酸分子を導入する工程を含み、ここで、(a)で導入されるCas9タンパク質および(b-i)または(b-ii)で導入されるRNA配列(1つまたは複数)が、標的配列に特異的に結合し、かつ標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断を導入するタンパク質/RNA複合体を形成する、方法に関する。本発明はさらに、標的配列が、ドナー核酸配列を用いて、相同組み換えにより改変され、該方法が、(c)核酸分子を細胞に導入する工程をさらに含み、該核酸分子が、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む、発明の方法に関する。本発明はまた、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの書類が引用される。これらの書類の開示は、この発明の特許性に関連があるものとはみなされず、その全体において、参照により本明細書に援用される。より具体的に、全ての参照される書類は、それぞれの個々の書類が具体的にかつ個々に参照により援用されることが示される場合と同程度に参照により援用される。
【０００３】
胚性幹(ES)細胞における遺伝子ターゲッティングは、哺乳動物のゲノム、特にマウスのゲノムを改変するために常套的に適用され、最も一般的に使用される遺伝学的動物モデルとしてマウスが確立された(Capecchi MR (2005))。逆マウス遺伝学(reverse mouse genetics)の基礎は、培養マウス胚盤胞からES細胞株が確立され、インビトロにおいてそれらの多能性分化状態を維持する培養条件が同定され(Evans MJ, Kaufman MH., Nature 1981; 292:154-6; Martin GR. Proc Natl Acad Sci U S A 1981; 78:7634-8)、ES細胞を胚盤胞内にマイクロインジェクションした際にES細胞がキメラマウス中で生殖細胞系をコロニー形成し得ることが見出された(Bradley et al., Nature 1984; 309:255-6; Gossler et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83:9065-9)、1980年代に最初に確立された。1987年のES細胞における相同組み換えの最初の立証(Thomas KR, Capecchi MR., Cell 1987; 51:503-12)および1989年の最初のノックアウトマウス系統の確立(Schwartzberg PL, Goff SP, Robertson EJ., Science 1989; 246:799-803)以来、遺伝子ターゲッティングは、多くの遺伝子に適用され、過去10年において3000を超えるノックアウトマウス系統を作製するために使用され、インビボにおける遺伝子機能の情報の富化をもたらした(Collins FS, Rossant J, Wurst W., Cell 2007; 128:9-13; Capecchi, M. R., Nat Rev Genet 2005; 6: 507-12)。したがって、ES細胞における遺伝子ターゲッティングは、遺伝学モデル系としてマウスを使用した哺乳動物の遺伝子機能のインビボ分析において、革命を起こした。しかしながら、これまで、遺伝学的に改変され得る生殖細胞系コンピテントES細胞系統がマウスのみでしか確立できなかったので、現在では、この逆遺伝学アプローチは、マウスに限定されている。ブタおよびヒツジ由来の始原細胞における相同組み換え後、組み換え体細胞由来の核を、除核した卵母細胞に移植すること(クローニング)により、この規則の例外が達成される(Lai L, Prather RS. 2003. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82; Gong M, Rong YS. 2003. Curr Opin Genet Dev 13:215-220)。しかし、この方法は不十分であり、時間がかかるので、単純な常套的手法には展開されなかった。
【０００４】
上述のようにターゲッティングされたマウス変異体の作製は、これまで常套的な手法として良好に確立されているが、このアプローチは、通常、ベクター構築、ES細胞培養、ならびにキメラの選択および飼育のための長時間の手作業を要するという欠点を有する。しばしば遺伝子ターゲッティングプロジェクトの間に起こるさらなる問題は、ES細胞における相同組み換えの効率が低く、長期間のインビトロ培養および選択段階の間にES細胞が生殖細胞系統のコンピテンスを消失するということである。そのため、単一系統のノックアウトマウスであっても、成功裡に作製するためには、かなりの時間、分子生物学の専門家の複合的な努力、ES細胞培養および胚操作、ならびにそれに伴う技術的な基礎が必要である。
【０００５】
モデル系における実験により、遺伝子ターゲッティングベクターの相同組み換えの頻度は、染色体標的配列中に二本鎖切断(break)を誘導した場合に大きく上昇することが実証された(Rouet, P., Smih, F., Jasin, M.; Mol Cell Biol 1994; 14: 8096-8106; Rouet, P., Smih, F.  Jasin, M.; Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 6064-6068)。相同性指向修復のための遺伝子ターゲッティングベクターの非存在下では、細胞は、非相同末端結合(NHEJ)により、切断を頻繁に閉鎖する。この機構は間違いを起こしやすい傾向がある(error-prone)ので、しばしば切断部位において多数のヌクレオチドの欠失または挿入を生じる。切断部位が遺伝子のコーディング領域中にある場合、それにより突然変異を起こした集団から、リーディングフレームシフト変異を示し、かつターゲッティングされた遺伝子の非機能的ノックアウト対立遺伝子を示す変異体を同定および選択することが可能になる。
【０００６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)およびTAL-ヌクレアーゼによる一細胞胚における直接的なゲノム編集(genome editing)は、最近では、マウス、ラット、ウサギおよびゼブラフィッシュにおいて、二本鎖切断系突然変異誘発アプローチとして確立されている(Carbery et al. (2010) Genetics186:451-9; Cui et al. (2011) Nat Biotechnol 29:64-7; Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol 26:702-8; Flisikowska et al. (2011) PLoS One6:e21045; Meyer et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:15022-6; Geurts AM, et al.(2009) Science 325:433; Huang (2011) Nat Biotechnol 29:699-700; Tesson (2011) Nat Biotechnol 29:695-696)。かかるヌクレアーゼは、あらかじめ選択されたゲノム標的部位で二本鎖切断(DSB)を誘導するように設計される(Klug (2010) Annu Rev Biochem 79:213-231; Porteus & Carroll (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; Porteus & Baltimore (2003) Science 300:763; Santiago et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105:5809-14)。コーディングエクソンに対して標的化されたDSBは、頻繁に配列欠失を起こして遺伝子ノックアウトを生じるか、または相同組み換え(HR)を介して遺伝子ターゲッティングベクター由来のDNA配列の挿入(ノックイン)を可能にする。マウス、ラットおよびウサギのZFN一細胞胚のマイクロインジェクションによるRosa26、Mdr1a、PxrおよびIgM座でのノックアウトおよびノックイン変異体の作製 (Cui et al.(2011) Nat Biotechnol 29:64-7; Flisikowska et al. (2011) PLoS One 6:e21045; Meyer et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:15022-6; Huang (2011) Nat Biotechnol 29:699-700; Tesson (2011) Nat Biotechnol 29:695-696)が、最近報告されている。
【０００７】
また、TAL因子をFokIヌクレアーゼドメインと組み合わせて、意図する標的領域において二本鎖切断を作製することを可能にするTAL-ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)が作製されている(Christian M et al. (2010). Genetics186:757-761; Cermak et al.  (2011) Nucleic Acids Res 39:e82; Miller et al. (2011) Nat Biotechnol29:143-148)。TALENは、哺乳動物細胞株、ならびにゼブラフィッシュ、マウスおよびラットの胚において遺伝子編集を可能にすることが示された(Sung et al. (2013) Nat Biotechnol 31:23-24; Tesson et al. (2011). Nat Biotechnol 29:695-696; Reyon et al. (2012). Nat Biotechnol 30:460-465)。
【０００８】
しかしながら、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用により高頻度の相同組み換えが起こるが、高い効率で新規のDNA標的配列に結合するジンクフィンガータンパク質を設計するためには、かなりの努力と時間が必要である。また、現在利用可能な供給源を使用して、哺乳動物ゲノムの1000塩基対の標的領域中にわずか1つのジンクフィンガーヌクレアーゼが見出され得ることが計算された(Maeder, et al. 2008 Mol Cell 31(2): 294-301; Maeder, et al. 2009 Nat Protoc 4(10): 1471-501)。さらに、TALENの使用は、それぞれの標的部位に特異的な2つの大きなTAL-ヌクレアーゼ融合タンパク質の新規の構築および発現を必要とするので、TALENの使用にはかなりの努力を伴う。また、TALペプチドDNA認識の原理は依然として完全には理解されておらず、それぞれのTALENを最適化するために、しばしば時間とコストがかかるさらなる実験の必要が生じる。
【０００９】
近年、標的核酸配列において一本鎖切断または二本鎖切断を誘導するための新規の系が見出された。この系は、当該技術分野においてCRISPR/Cas系と呼ばれ、「クラスター化され、規則的に間を開けた短いパリンドロームリピート(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat)(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質」を表す。これは、細菌および古細菌がウイルスおよびプラスミドの侵入を防ぐために進化させた適応防御機構に基づき、配列特異的検出および外来核酸のサイレンシングのための小分子RNAをあてにしたものである。CRISPR/Cas系は、オペロン(1つまたは複数)内で組織化されたcas遺伝子および同一のリピートが散在するゲノムターゲッティング配列(スペーサーと呼ばれる)からなるCRISPRアレイ(1つまたは複数)で構成される(Bhaya et al. (2011) Annu Rev Genet45:273-297; Barrangou R, Horvath P (2012) Annu Rev Food Sci Technol 3:143-162)。細菌および古細菌におけるCRISPR/Cas-媒介免疫は、3段階で起こる。適応段階において、1つ以上のCRISPR座を有する細菌および古細菌は、外来配列の短い断片(プロトスペーサー)を、CRISPRアレイの近位末端で宿主染色体に組込むことにより、ウイルスまたはプラスミドの攻撃に応答する。発現および干渉段階において、反復スペーサー因子が前駆体CRISPR RNA(プレ-crRNA)分子に転写され、次いで酵素切断により短いcrRNA (CRISPR RNA)が生じ、その後、crRNAは、侵入するウイルスまたはプラスミド標的の相補的なプロトスペーサー配列と対形成し得る。crRNAの標的認識は、crRNAとの複合体として機能するCasタンパク質により、外来配列のサイレンシングを誘導する。
【００１０】
3種類のCRISPR/Cas系がある(Makarova et al. (2011) Nat Rev Microbiol 9:467-477)。I型およびIII型の系は、特殊化されたCasエンドヌクレアーゼがプレ-crRNAをプロセッシングし、成熟すると、それぞれのcrRNAが、大きなマルチ-Casタンパク質複合体に集合し、crRNAと相補的な核酸を認識および切断し得るといういくつかの非常に重要な(overarching)特徴を共有する。
【００１１】
対照的に、II型の系は、プレ-crRNA中の反復配列に相補的なトランス活性化(trans-activating)crRNA (tracrRNA)が、Cas9(以前はCsn1)タンパク質の存在下で二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼRNase IIIによりプロセッシングを引き起こすという異なる機構によりプレcrRNAをプロセッシングする。Cas9は、外来DNAのcrRNA誘導性サイレンシングに応答し得る唯一のタンパク質である。
【００１２】
Jinekらは近年、Cas9エンドヌクレアーゼファミリーは、5'末端に標的認識配列、次いでtracrRNAとcrRNAの間で起こる塩基対形成相互作用を維持するヘアピン構造を含む単一の「キメラ」RNA分子によってもプログラム化され得ることを実証した(Jinek et al. (2012 Science 337:816-821)。この単一の転写産物は、crRNAの3'末端とtracrRNAの5'末端を効果的に融合させ、それによりCas9による部位特異的DNA切断を誘導するために必要な二重RNA構造を模倣する。
【００１３】
化膿連鎖球菌SF370 II型CRISPR座は、Cas9ヌクレアーゼ、ならびに2つのノンコーディングRNA：tracrRNAおよび同一の直接リピート(DR)の間に挟まれるヌクレアーゼ誘導配列(スペーサー)を含むプレ-crRNAアレイを含む4つの遺伝子からなる(Deltcheva et al. (2011) Nature471:602-607)。
【００１４】
Congら(Cong et al. (2013). Science 339:819-823)は近年、キーとなる構成要素のヘテロ発現を介して哺乳動物染色体に標的化された二本鎖切断(DSB)を導入するために、この原核生物RNAプログラム可能なヌクレアーゼ系を適用した。tracrRNA、プレ-crRNA、宿主因子RNase IIIおよびCas9ヌクレアーゼの発現は、インビトロにおけるDNAの切断に必要かつ十分であることが以前に示された(Jinek et al. (2012 Science 337:816-821)。コドンが最適化された化膿連鎖球菌Cas9(SpCas9)、89ヌクレオチド(nt)tracrRNAおよびDRに挟まれた単一誘導スペーサーを含むプレ-crRNAの発現が、ヒト293細胞で発現された。最初のスペーサーは、必要なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)であるNGGの先にあるヒトEMX1座の30塩基対(bp)部位(プロトスペーサー)を標的化するように設計された。CRISPR系(SpCas9、SpRNase III、tracrRNAおよびプレ-crRNA)のヘテロ発現により哺乳動物染色体の標的化された切断が達成された。また、合成ステム-ループを介して成熟crRNAを部分tracrRNAに融合させたキメラcrRNA-tracrRNAハイブリッドを使用して、天然のcrRNA:tracrRNA二重鎖を模倣した。Congらは、SpCas9をプレ-crRNA (DRスペーサー-DR)およびtracrRNAと共発現させた場合に、全てのプロトスペーサー標的の切断を観察した。さらに、Congらは、ストレプトコッカス サーモフィルスLMD-9 CRISPR1系も哺乳動物ゲノムの切断を媒介し得ることを示した。
【００１５】
別の近年の報告において、Maliら(Mali et al. (2013); Science 339: 823-826)は、いくつかのヒト細胞株において、効率の高いCRISPR媒介ゲノムターゲッティングを独立して確認し、一方でHwangら(Hwang et al. (2013); Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt.2501)は、この系がゼブラフィッシュにおいても使用され得ることを示した。
【００１６】
ヒト胚性腎臓細胞(例えば293Tまたは293FT細胞など)、ヒト慢性骨髄性白血病細胞(K562細胞など)または誘導性多能性幹細胞などの哺乳動物細胞において、この系が機能的であることが示されたが、この系を卵母細胞/接合体に使用する試みは報告されていない。
【００１７】
単一細胞中で動物全体の生殖細胞系がアクセス可能であるので、哺乳動物接合体は、全能性の単一実体として、ゲノム工学のための好ましい基質であるとみなさ得る。しかしながら、接合体の実験的なアクセス可能性および操作は、それらを利用可能(数千(dozens-hundred))な数が非常に限られていることおよび非常に短い持続的性質により、極めて限定的である。これらのパラメーターにより、1つの標準的な培養プレート中107個まで増殖された培養胚性幹細胞のみにおいて10-5程度(like)未満の頻度で遺伝子ターゲッティングを起こすきわめて多くのゲノム操作が成功裡に実施され得ることが容易に説明される。この規則の例外のみが、注入された接合体のうち30%までの高頻度でトランスジーンが組み込まれるために常套的な手法にまで開発された前核DNA注入によるトランスジェニックマウスの作製に関わる(Palmiter RD, Brinster RL.; Annu Rev Genet 1986; 20:465-499)。マイクロインジェクションされたトランスジーンは、無作為的にゲノムに組み込まれるので、この方法は、さらなる遺伝子を他の正常なゲノムのバックグラウンドで発現させるためのみに使用され得るが、内因性遺伝子の標的化改変は可能にしない。
【００１８】
標的化遺伝子操作のための接合体の能力を特徴づけるためのBrinsterによる初期の報告(Brinster RL, Braun RE, Lo D, Avarbock MR, Oram F, Palmiter RD.; Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86:7087-7091)では、このアプローチは、14ヶ月の注入のうち10,000より多くの接合体から1匹のターゲッティングマウスのみが得られたので実用的ではないことが示された。したがって、Brinsterらは、この方向の任意のさらなる試みを進めようとはしなかった。低い組み換え頻度に加えて、Brinsterらは、ターゲッティングされた対立遺伝子内で自発的に起こり、(修復された)組織適合性クラスII遺伝子の機能を大きく損なう多くの望ましくない突然変異に注意した。Brinsterらの経験から、高頻度で起こるトランスジーンのランダム組込み以外の、接合体の前核における生理学的、生化学的およびエピジェネティックなゲノムDNAの状況は、標的化された遺伝子操作を達成するには好ましくないということが推定できた。
【００１９】
また、卵母細胞の胚への発生の生態により、標的化された遺伝子操作のためのさらなる障害がもたらされる。
【００２０】
第1減数分裂前期の複糸期で止まった生育中のマウス卵母細胞は、自身の遺伝子の多くを転写および翻訳し、それにより8細胞期までの発生を支持するのに十分なタンパク質の貯蔵を産生する。これらの転写産物は、二段階の卵母細胞の成熟および卵活性化で、卵母細胞が接合体になるように誘導する。典型的に、卵母細胞は、排卵されて受精に対してコンピテントになり、その後第2の停止点に達する。卵母細胞が卵に成熟する際に、卵母細胞は、転写が停止し、mRNAの翻訳が減少する、第2減数分裂の中期で止まる。この時点で、排卵されたマウスの卵は、0.085mmの直径および約300ピコリットルの体積を有し、典型的な体細胞のサイズを1000倍ほど超える(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)。受精した卵母細胞の全能性接合体へのリモデリングは、生物学における最も複雑な細胞変態の1つである。顕著に、かつ他の哺乳動物細胞の型とは明らかに対照的に、この変化は、転写因子の非存在下で起こるので、卵形成の間に卵母細胞内に蓄積したタンパク質およびmRNAに依存する。哺乳動物の胚発生は、精子が卵と受精して接合体を形成した際に開始する。卵の受精により、卵の活性化が引き起こされ、減数分裂の完了および前核の形成にシグナルを伝達することにより、接合体への変態が完了する。この段階で、接合体は、精子由来の半数体父型前核および卵母細胞由来の半数体母型前核を含む一細胞胚に相当する。マウスにおいて、この全能性一細胞期は、第1体細胞分裂が起こるまで、約18時間だけ続く。
【００２１】
受精した哺乳動物の卵において、DNA複製を行う2つの前核は、直接は融合しないが、互いに接近し、別々のまま維持され、その後それぞれの前核の膜が壊れて接合体の第1体細胞分裂の準備が整い、2細胞胚が生じる。1細胞接合体段階は、特有の転写および翻訳調節機構を特徴とする。最も顕著な特徴の1つは時間依存的な機構であり、接合体時計(zygotic clock)と呼ばれ、1細胞胚がS期を完了して2細胞胚を形成したかどうかにかかわらず、受精後約24時間、接合体ゲノムの発現を遅らせる(Nothias JY, Majumder S, Kaneko KJ, DePamphilis ML.; J Biol Chem 1995;270:22077-22080)。自然には、接合体時計は、クロマチンが、凝縮した減数分裂状態から選択された遺伝子が転写され得る状態へとリモデリングされ得るまで、接合体遺伝子活性化(ZGA)を遅らせるという利点をもたらす。父型ゲノムは、ヒストンで置き換えられる必要があるプロタミンで完全に包まれるので、いくつかの遺伝子は、ZGAが防がれない場合は、早熟発現される。細胞特異的な転写には、特異的エンハンサーまたはトランスアクチベーターにより特異的プロモーターが活性化され得る状態へと発生が進むまで、新たに生成された(minted)接合体染色体が、全てではないがほとんどのプロモーターを抑制することが必要である。マウスにおいて、2細胞胚の形成は、母型遺伝子依存から接合体遺伝子活性化(ZGA)までの変化を示す。哺乳動物において、接合体遺伝子活性化(ZGA)前の発生の程度は、1から4卵割事象まで、種によって異なる。減数分裂成熟および2細胞胚の90%完成により、母型mRNAの分解が引き起こされるが、母型タンパク質合成は、8細胞期まで続く。転写調節に加えて、接合体時計は、2細胞期まで、発生期のmRNAの翻訳を遅らせる(Nothias JY, Miranda M, DePamphilis ML.; EMBO J 1996; 15:5715-5725)。そのため、前核に注入されたトランスジェニック発現ベクターからのタンパク質の産生は、mRNAの出現後10〜12時間まで達成されない。
【００２２】
WO2011/051390には、哺乳動物または鳥類卵母細胞のゲノムにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた相同組み換えにより標的配列を改変するための方法、およびそれによりゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法が記載される。しかしながら、この方法は、ジンクフィンガータンパク質を使用するので、ジンクフィンガータンパク質に関する上述の欠点を伴う。卵母細胞における成功裡の組み換えが、ジンクフィンガータンパク質以外の他の任意の手段により達成され得るということは、WO2011/051390には示されない。
【００２３】
WO2011/154393には、真核細胞のゲノムにおいて、標的配列を改変する方法であって、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質を使用して、標的配列に二本鎖切断を導入し、それにより相同組み換えによる標的配列の改変を高める方法が記載される。該方法は卵母細胞に適用され得ること、および該方法はゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物または脊椎動物を作製するために使用され得ることが、さらに記載される。しかしながら、WO2011/154393に記載される二本鎖切断を導入し、相同組み換えの頻度を高めるための方法だけは、ジンクフィンガータンパク質、またはTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質を使用するものである。CRISPR/Cas系についての参照はなされておらず、ジンクフィンガータンパク質または特許請求される融合タンパク質以外の任意の手段により卵母細胞における相同組み換えの頻度を高め得ることは示されない。
【００２４】
そのため、ゲノム中に標的化された改変を保有するトランスジェニック動物の作製のための方法は、当該分野において記載されるが、遺伝的に改変された動物を、先行技術の方法のいずれかを使用するよりも速く、簡単にかつ費用効果的に作製するための手段を提供する必要が依然としてある。
【００２５】
この必要性は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することにより対処される。
【００２６】
したがって、本発明は、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する方法であって、該方法が、非ヒト哺乳動物卵母細胞に、(a)クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9タンパク質)または前記Cas9タンパク質をコードする核酸分子；ならびに(b-i)標的配列特異的CRISPR RNA (crRNA)およびトランス活性化crRNA (tracr RNA)もしくは前記RNAをコードする核酸分子；または(b-ii)標的配列特異的crRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列もしくは前記RNAをコードする核酸分子を導入する工程を含み、ここで、(a)で導入されるCas9タンパク質および(b-i)または(b-ii)で導入されるRNA配列(1つまたは複数)が、標的配列に特異的に結合し、かつ標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断を導入するタンパク質/RNA複合体を形成する、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「卵母細胞」は、生殖に関与する雌性生殖細胞、すなわち卵子または卵細胞をいう。本発明によると、用語「卵母細胞」は、受精前の卵母細胞、および接合体とも称される受精した卵母細胞の両方を含む。したがって、受精前の卵母細胞は、母型染色体のみを含み、受精後の卵母細胞は母型および父型の染色体の両方を含む。受精後、卵母細胞は、数時間、二重半数体状態を維持し、例えばマウスにおいては受精後18時間まで二重半数体状態を維持する。
【００２８】
発明の方法のより好ましい態様において、卵母細胞は受精した卵母細胞である。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「受精した卵母細胞」は、受精した精子との融合した後の卵母細胞をいう。受精後長時間(マウスにおいて18時間まで)、卵母細胞は、二重半数体状態であり、1つの母型半数体前核および1つの父型半数体前核を含む。二つの前核が一緒に移動した後、それらの膜は壊れ、二つのゲノムは染色体へと凝縮し、それにより二倍体生物が再構成される。この受精した卵母細胞はまた、1細胞接合体ならびに2細胞期および4細胞期接合体とも称され、本明細書で使用される場合の用語「受精した卵母細胞」にも含まれる。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法において使用される哺乳動物卵母細胞は、二重半数体状態の受精した哺乳動物卵母細胞である。
【００３１】
本発明によると、「改変された標的配列」は、ゲノム操作によりそれぞれの標的ヌクレオチド配列の改変が引き起こされたヌクレオチド配列である。本明細書で使用する場合、用語「ゲノム中の標的配列」は、発明の方法により改変される予定のゲノム位置をいう。「ゲノム中の標的配列」は、特定の改変に供されるヌクレオチド(1つまたは複数)には限定されず、すなわち「ゲノム中の標的配列」は、改変される関連のあるヌクレオチド(1つまたは複数)の周囲にある配列も含む。好ましくは、「ゲノム中の標的配列」は、改変される関連のあるヌクレオチド(1つまたは複数)の少なくとも10、例えば少なくとも100、例えば少なくとも200、例えば少なくとも500、例えば少なくとも1000ヌクレオチドの上流および/または下流も含む。
【００３２】
より好ましくは、用語「標的配列」は、改変される遺伝子全体をいう。
【００３３】
用語「改変」としては、限定されないが、標的配列中で置換、挿入および欠失される1つ以上のヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「置換」は、直接関係のある技術に従って定義され、ヌクレオチドの他のヌクレオチドでの置き換えをいう。該用語は、例えば、点突然変異を生じる1つのヌクレオチドの置き換えを含む。前記点突然変異は、得られるタンパク質産物中でアミノ酸の交換を生じ得るが、アミノ酸レベルでは反映されないこともある(すなわちサイレント変異)。用語「置換」には、例えば遺伝子の一部、エクソンまたはイントロンの一部など複数のヌクレオチドの置き換え、ならびに遺伝子全体の置き換えを生じさせる突然変異も含まれる。初めから存在するヌクレオチドを置き換えるヌクレオチドの数は、除去されるヌクレオチドの数と同じであっても異なっても(すなわちより多いまたはより少なくても)よい。好ましくは、置き換えヌクレオチドの数は、置換される初めから存在するヌクレオチドの数に対応する。
【００３５】
本発明によると、用語「挿入」は、直接関係のある技術に従って定義され、核酸分子への1つ以上のヌクレオチドの組み込みをいう。用語「挿入」には、エクソンまたはイントロンの一部などの遺伝子の一部ならびに遺伝子全体の挿入も含まれる。挿入されるヌクレオチドの数が3で割り切れない場合は、挿入は、遺伝子のコーディング配列中にフレームシフト変異を生じ得る。かかるフレームシフト変異は、変異後に遺伝子にコードされるアミノ酸を変化させる。いくつかの場合において、かかる変異は、遺伝子のアクティブな翻訳を引き起こし、早熟なストップコドンに遭遇すると、翻訳の終結および切断型(truncated)タンパク質の産生を生じる。その代り、挿入されるヌクレオチドの数が3で割り切れる場合は、得られる挿入は「インフレーム挿入」である。この場合、挿入後のリーディングフレームは完全なままであり、挿入されるヌクレオチドがストップコドンをコードしなければ翻訳は完全に進む可能性が最も高い。しかし、挿入されるヌクレオチドにより、完成されるタンパク質は、挿入のサイズに応じて、タンパク質の機能に影響し得る1つまたは複数の新規のアミノ酸を含む。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「欠失」は、直接関係のある技術に従って定義され、ヌクレオチド、またはエクソンもしくはイントロンなどの遺伝子のより大きな部分および遺伝子全体の消失をいう。用語「挿入」に関して定義されるように、3で割り切れないいくつかのヌクレオチドの欠失は、フレームシフト変異を生じ、欠失後に生じるコドンの全てが翻訳時に不正確に読まれ、重大な改変を生じる可能性があり、機能的でないタンパク質を生じる可能性が最も高くなる。欠失がフレームシフト変異を生じない場合、すなわち欠失されるヌクレオチドの数が3で割り切れるので、完成されるタンパク質が、欠失のサイズに応じてタンパク質の機能に影響し得る1つまたはいくつかのアミノ酸を欠くように、生じるタンパク質はそれでもなお改変される。
【００３７】
上述の改変は、ゲノム中のコーディング領域に限定されず、標的ゲノムのノンコーディング領域、例えばプロモーターもしくはエンハンサー因子などの調節領域またはイントロン中にも導入され得る。
【００３８】
標的ゲノムの改変の例は、標的化改変およびランダム改変の両方、例えば遺伝子の機能に対する効果を分析するための野生型遺伝子への変異の導入；変異した遺伝子での遺伝子全体の置き換え、あるいは標的配列が変異(1つまたは複数)を含む場合、どの変異が特定の効果の原因であるかを同定するための変異の改変；遺伝子全体もしくはタンパク質の除去または遺伝子もしくはタンパク質からの調節因子の除去ならびに例えばhisタグもしくはtapタグなどの精製タグなどの融合パートナーの導入を含む。
【００３９】
第1の工程、工程(a)において、クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9タンパク質または前記Cas9をコードする核酸分子)を非ヒト哺乳動物卵母細胞に導入する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「卵母細胞に導入すること」は、タンパク質または核酸分子を卵母細胞に入れる任意の公知の方法に関する。非限定的な例としては、マイクロインジェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポレーションおよびカチオン性脂質を用いた製剤化(formulation)が挙げられる。
【００４１】
これらの全ての方法は当該技術分野で周知である。
【００４２】
用語「Cas9タンパク質」は、「クラスター化され、規則的に間を開けられた短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9」をいう。この用語は、当該技術分野で周知であり、例えば、Makarova et al. (2011). Nat Rev Microbiol9:467-477およびMakarova et al. (2011) Biol Direct 6:38に記載されている。
【００４３】
Casタンパク質は、本明細書において上述のように、細菌および古細菌がウイルスおよびプラスミドの進入を防ぐために進化させた適応防御機構の一部を形成するエンドヌクレアーゼである。Cas9タンパク質は、標的dsDNAを切断するために、活性化tracrRNAとターゲッティングcrRNAの間に形成される塩対構造を必要とする酵素のファミリーを構成する。部位特異的な切断は、crRNAと標的プロトスペーサーDNAの間の塩基対相補性、および標的DNA中の相補的な領域に並列されるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と称される短いモチーフの両方により決定される位置で起こる(Jinek et al. (2012 Science337:816-821))。tracrRNA:crRNA-誘導性Cas9タンパク質は、標的DNA中の二本鎖を切断するために、別々のエンドヌクレアーゼドメイン(HNHおよびRuvC様ドメイン)を使用する。例えば化膿連鎖球菌SF370 II型Cas9による標的の認識には、crRNA中のシード配列およびDNA標的中のcrRNA結合領域に隣接するGGジヌクレオチド含有PAM配列の両方が必要である(Jinek et al. (2012 Science 337:816-821)。
【００４４】
当該技術分野で公知の任意のCas9タンパク質は、本発明に従って使用され得る。これまでに、少なくとも65種類の、化膿連鎖球菌SF370 II型Cas9タンパク質に関連する異なるCas9タンパク質が記載されている。以前にCsn1と命名されたこれらのタンパク質は、Cas9タンパク質のファミリーに再分類された(Makarova et al. (2011). Nat Rev Microbiol 9:467-477; Makarova et al. (2011) Biol Direct 6:38)。Cas9ファミリーとしては、限定されないが、eggNOG (evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups)データベース(ワールドワイドウェブeggnog.embl.de/version_3.0/参照)に従って、それらの遺伝子番号により言及される以下のファミリーメンバー：アシドテルムス セルロリチクス(Acidothermus cellulolyticus)の遺伝子番号Acel_1951(HNHエンドヌクレアーゼ)(配列番号:17)、アケルマンシア ムチニフィラ(Akkermansia muciniphila)の遺伝子番号Amuc_2010(仮定のタンパク質)(配列番号:18)、アクチノバチルス スクシノゲンス(Actinobacillus succinogenes)の遺伝子番号Asuc_0376 (CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:19)、ブラジリゾビウム種BTAi1の遺伝子番号BBta_3952(仮定のタンパク質)(配列番号:20)、バクテロイデス フラギリス9343の遺伝子番号BF3954(仮定のタンパク質)(配列番号:21)、クロストリジウム セルロリティカムの遺伝子番号Ccel_3120(CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー)(配列番号:22)、カンピロバクター ジェジュニ11168の遺伝子番号Cj1523c(推定CRISPR関連タンパク質)(配列番号:23)、カプノサイトファージ オクラカエ(Capnocytophaga ochracea)の遺伝子番号Coch_0568(CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー)(配列番号:24)、コリネバクテリウム ジフテリエの遺伝子番号DIP0036(仮定のタンパク質)(配列番号:25)、ジノロセオバクター シバエ(Dinoroseobacter shibae)の遺伝子番号Dshi_0400(CRISPR関連タンパク質)(配列番号:26)、ジアホロバクター種(Diaphorobacter sp.) TPSYの遺伝子番号Dtpsy_0060(CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー)(配列番号:27)、エルシミクロビウム ミヌトゥムの遺伝子番号Emin_0243(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:28)、ユーバクテリウム レクタル(Eubacterium rectal)の遺伝子番号EUBREC_1713(CRISPR系関連タンパク質)(配列番号:29)、フィブロバクター スクシノゲンス(Fibrobacter succinogenes)の遺伝子番号Fisuc_0140(CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー)(配列番号:30)、フィネゴルディア マグナの遺伝子番号FMG_0058(仮定のタンパク質)(配列番号:31)、フラボバクテリウム サイクロフィルム(Flavobacterium psychrophilumの遺伝子番号FP1524(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:32)、ストレプトコッカス アガラクチアNEM316の遺伝子番号gbs0911(仮定のタンパク質)(配列番号:33)、グルコンアセトバクター ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)の遺伝子番号GDI2123(仮定のタンパク質)(配列番号:34)、ヘリコバクター ヘパティカスの遺伝子番号HH_1476(仮定のタンパク質)(配列番号:35)、ラクトバチルス カゼイBL23の遺伝子番号LCABL_23780(仮定のタンパク質)(配列番号:36)、リステリア イノキュアの遺伝子番号lin2744(仮定のタンパク質)(配列番号:37)、ラクトバチルス サリバリウス(Lactobacillus salivarius)の遺伝子番号LSL_0095(仮定のタンパク質)(配列番号:38)、化膿連鎖球菌MGAS6180の遺伝子番号M28_Spy0748(推定細胞質タンパク質)(配列番号:39)、化膿連鎖球菌MGAS10270の遺伝子番号MGAS10270_Spy0886(推定細胞質タンパク質)(配列番号:40)、化膿連鎖球菌MGAS10750の遺伝子番号MGAS10750_Spy0921(仮定のサイトゾルタンパク質)(配列番号:41)、化膿連鎖球菌MGAS2096の遺伝子番号MGAS2096_Spy0843(推定細胞質タンパク質)(配列番号:42)、化膿連鎖球菌MGAS9429の遺伝子番号MGAS9429_Spy0885(推定細胞質タンパク質)(配列番号:43)、マイコプラズマ モービレ(Mycoplasma mobile)の遺伝子番号MMOB0330(仮定のタンパク質)(配列番号:44)、マイコプラズマ シノビエの遺伝子番号MS53_0582(仮定のタンパク質)(配列番号:45)、ニトロバクター ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)の遺伝子番号Nham_2832(仮定のタンパク質)(配列番号:46)、ニトロバクター ハンブルゲンシスの遺伝子番号Nham_4054(仮定のタンパク質)(配列番号:47)、ナイセリア メニンギティディスZ2491の遺伝子番号NMA0631(仮定のタンパク質)(配列番号:48)、ナイセリア メニンギティディスalpha14の遺伝子番号NMO_0348(推定CRISPR関連タンパク質)(配列番号:49)、パルビバクルム ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)の遺伝子番号Plav_0099(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:50)、パスツルラ マルトシダの遺伝子番号PM1127(仮定のタンパク質)(配列番号:51)、ロドシュードモナス パルストリスBisB18の遺伝子番号RPC_4489(仮定のタンパク質)(配列番号:52)、ロドシュードモナス パルストリスBisB5の遺伝子番号RPD_1029(CRISPR関連Cas5eファミリータンパク質)(配列番号:53)、ロドスピリラム ラブラムの遺伝子番号Rru_A0453(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:54)、ストレプトコッカス アガラクチア2603V/Rの遺伝子番号SAG0894(仮定のタンパク質)(配列番号:55)、ストレプトコッカス アガラクチアA909の遺伝子番号 SAK_1017(仮定のタンパク質)(配列番号:56)、ストレプトバチルス モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)の遺伝子番号Smon_1063(CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー)(配列番号:57)、ストレプトコッカス ミュータンスの遺伝子番号SMU_1405c(仮定のタンパク質)(配列番号:58)、化膿連鎖球菌SSI1の遺伝子番号SPs1176(仮定のタンパク質)(配列番号:59)、化膿連鎖球菌NZ131の遺伝子番号Spy49_0823(仮定のタンパク質)(配列番号:60)、化膿連鎖球菌M1GASの遺伝子番号SPy_1046(仮定のタンパク質)(配列番号:61)、化膿連鎖球菌MGAS5005の遺伝子番号SPy_1046(推定細胞質タンパク質)(配列番号:62)、ストレプトコッカス サーモフィルスLMD9の遺伝子番号 STER_0709 (CRISPR系様タンパク質) (配列番号:63)、ストレプトコッカス サーモフィルスLMD9の遺伝子番号STER_1477(CRISPR系様タンパク質)(配列番号:64)、ストレプトコッカス サーモフィルスZ1066の遺伝子番号str0657(仮定のタンパク質)(配列番号:65)、ストレプトコッカス サーモフィルス18311の遺伝子番号stu0657(仮定のタンパク質)(配列番号:66)、トレポネーマ デンティコラの遺伝子番号TDE_0327(CRISPR関連Cas5eファミリータンパク質)(配列番号:67)、培養不可能な細菌(Uncultered bacterium)TG1RsD17の遺伝子番号TGRD_056(Csn1様CRISPR関連タンパク質)(配列番号:68)、培養不可能な細菌のTG1RsD17の遺伝子番号TGRD_222(CRISPR関連タンパク質Csn1)(配列番号:69)、バーミネフロバクター エイセニア(Verminephrobacter eiseniae)の遺伝子番号Veis_1230(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCsn1ファミリータンパク質)(配列番号:70)、ウォリネラ スクシノゲンス(Wolinella succinogenes)の遺伝子番号WS1445(仮定のタンパク質)(配列番号:71)および配列番号:72〜81の微生物タンパク質が挙げられる。
【００４５】
化膿連鎖球菌SF370 II型Cas9は、例えばJinekら(2012 Science 337:816-821)に記載されており、配列番号:14に示されるアミノ酸配列を有する。哺乳動物細胞における使用のために最適化されたこのCas9タンパク質のバージョンは、添付の実施例において使用されており、配列番号:2に示される。
【００４６】
Cas9タンパク質はまた、改変されたCas9タンパク質でもあり得、該タンパク質のヌクレアーゼ機能は、ニッキング(nicking)エンドヌクレアーゼ機能に変更される。すなわち、二本鎖標的DNAの両方の鎖を切断する天然に存在するCas9エンドヌクレアーゼ機能は、鎖の一本のみを切断する(すなわちニックを入れる)エンドヌクレアーゼに変更される。したがって、Cas9タンパク質を改変する手段および方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ヌクレアーゼドメインの1つを不活性にするCas9へのアミノ酸置換の導入が挙げられる。より具体的に、Cong et al. (2013) Science 339:819-823に示されるように、化膿連鎖球菌Cas9の10位で例えばアスパラギン酸がアラニンに置換され得る(例えば、配列番号:15に示されるCas9 D10Aバリアントを参照)。
【００４７】
ニッキングエンドヌクレアーゼ機能を有する改変されたCas9タンパク質の使用により、ゲノム中にそのように導入されたDNA損傷が、非相同性末端連結の代わりに相同組み換えにより修復される可能性が高くなるという利点が提供される。
【００４８】
発明の方法によると、Cas9タンパク質は、タンパク質として導入され得るが、代替的に、Cas9タンパク質は、前記タンパク質をコードする核酸分子の形態で導入されてもよい。卵母細胞における発現により、機能的なCas9タンパク質を生じるように発現可能な形態で、核酸分子が前記Cas9タンパク質をコードすることが理解されよう。機能的なポリペプチドの発現を確実にする手段および方法は当該技術分野で周知である。例えば、コーディング配列を、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは例えば遺伝子工学において従来から使用される別のベクターに含ませ得る。ベクターに挿入されるコーディング配列は、例えば標準的な方法により合成され得るか、または天然の供給源から単離され得る。コーディング配列はさらに、転写調節因子および/または他のアミノ酸コーディング配列に連結されてもよい。かかる調節配列は、当業者に周知であり、限定されないが、転写の開始を確実にする調節配列、内部リボソーム進入部位(IRES)(Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476)、ならびに任意に転写の終結および転写産物の安定化を確実にする調節因子が挙げられる。転写の開始を確実にする調節因子の非限定的な例は、翻訳開始コドン、例えばSV40エンハンサーなどの転写エンハンサー、インシュレーターおよび/または例えばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、lacZプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、CAGプロモーター(ニワトリβアクチンプロモーターとサイトメガロウイルス直前エンハンサーの組合せ)、gai10プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーター、AOX1プロモーター、GAL1プロモーター CaMキナーゼプロモーター、lac、trpもしくはtacのプロモーター、lacUV5プロモーター、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス(autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)(AcMNPV)多面体プロモーターまたは哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるグロビンイントロンなどのプロモーターを含む。転写終結を確実にする調節因子についての非限定的な例としては、V40-ポリA部位、tk-ポリA部位またはSV40、lacZもしくはAcMNPV多面体ポリアデニル化シグナルがあげられ、これらは、発明の核酸配列の下流に導入されることになる。さらなる調節因子としては、翻訳エンハンサー、Kozak配列およびRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられ得る。さらに、複製起点、薬物耐性遺伝子またはレギュレーター(誘導性プロモーターの一部として)などの因子も含まれ得る。
【００４９】
前記Cas9タンパク質をコードする核酸分子としては、cDNAまたはゲノムDNAなどのDNAおよびRNAが挙げられる。好ましくは、「RNA」と記載する態様は、mRNAに関する。
【００５０】
1つより多くの核酸分子が、遺伝子コードの縮重のために、本発明によるCas9タンパク質をコードし得ることは、当業者に容易に理解されよう。三つ組みコードは、20種類のアミノ酸およびストップコドンを指定するので縮重が生じる。遺伝子情報をコードするために利用される4つの塩基が存在するので、少なくとも21種類の異なるコードを生じるために三つ組みコードが必要となる。三つ組み中の塩基について起こり得る43の可能性は64種類の起こり得るコドンを生じ、これは、いくつかの縮重が存在するはずであるということを意味する。結果的に、いくつかのアミノ酸は1つより多く、例えば6個までの三つ組みによりコードされる。ほとんどの場合、縮重は、三つ組みの3番目の位置の変化によりおこる。これは、異なる配列を有するが同じCas9タンパク質をコードする核酸分子が、本発明に従って使用され得ることを意味する。
【００５１】
本発明に従って使用される核酸分子は、天然起源であっても、(半)合成起源であってもよい。したがって、核酸分子は、例えば従来の有機化学のプロトコルにより合成された核酸分子であり得る。当業者は、前記プローブの調製および使用に精通している(例えば、Sambrook and Russel 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)参照)。
【００５２】
また、本発明によると、発明に従って使用される核酸分子は、核酸分子の合成または半合成誘導体および混合ポリマーなどの当該技術分野で公知の核酸模倣分子であり得る。当業者に容易に理解されるように、それらは、さらなる非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得、発明の核酸模倣分子または核酸誘導体としては、限定されないが、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミデート核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸(HNA)、ペプチド核酸(PNA)およびロックト核酸(LNA)が挙げられる。
【００５３】
第2の工程の工程(b)において、CRISPR/Cas系の残りの必要な構成要素、すなわち(b-i)標的配列特異的なCRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)もしくは前記RNAをコードする核酸分子；または(b-ii)標的配列特異的なcrRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列もしくは前記RNAをコードする核酸分子が細胞に導入される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸特異的CRISPR RNA (crRNA)」は、当該技術分野において、例えばMakarova et al. (2011). Nat Rev Microbiol 9:467-477；Makarova et al. (2011) Biol Direct 6:38；Bhaya et al. (2011) Annu Rev Genet 45:273-297；Barrangou R, Horvath P (2012) Annu Rev Food Sci Technol 3:143-162；Jinek et al. (2012) Science 337:816-821、Cong et al. (2013). Science 339:819-823；Mali et al. (2013) Science 339: 823-826またはHwang et al. (2013); Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt.2501に記載されている。crRNAは、Cas9系に応じて異なるが、典型的に、21〜46ヌクレオチド長の2つの直接リピート(DR)に挟まれた21〜72ヌクレオチド長の標的配列を含む。化膿連鎖球菌の場合は、DRは36ヌクレオチド長であり、標的配列は30ヌクレオチド長である(図3CおよびDを参照、ここで白色矢印はDR配列を示し、標的配列はこれら2つのDRの間に位置する)。3'に位置するcrRNAのDRは、対応するtracrRNAに相補的であり該tracrRNAとハイブリダイズし、次いでCas9タンパク質に結合する。本明細書において上述のように、3つの因子Cas9、tracrRNAおよびcrRNAをコードする遺伝子は、典型的にオペロン(1つまたは複数)中で組織化される。
【００５５】
化膿連鎖球菌Cas9タンパク質(配列番号:2および配列番号:14)での使用について好ましいDR配列は、配列番号:16に示される配列である。
【００５６】
他の細菌種のCas9タンパク質と共に機能するDR配列は、(Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607)に示されるように、それぞれのCrispr/Casオペロン中に存在する配列繰り返しのバイオインフォマティック解析により、ならびにCas9タンパク質およびtracrRNAと標的配列に隣接する推定DR配列との実験的結合試験により同定され得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「トランス活性化(trans-activating)crRNA (tracr RNA)」は、プレcrRNAに相補的で、プレcrRNAと塩基対を形成して、それによりRNA二重鎖を形成する小さなRNAをいう。このプレcrRNAは、その後RNA特異的リボヌクレアーゼにより切断され、crRNA/tracrRNAハイブリッドを形成し、次いで侵入した核酸を切断するエンドヌクレアーゼCas9のガイドとして働く。
【００５８】
他の細菌種のCas9タンパク質と共に機能するtracrRNAは、(Deltcheva et al. (2011) Nature471:602-607)により最初に記載されるように、差異的(differential)RNA配列決定により同定され得る。
【００５９】
化膿連鎖球菌Cas9タンパク質(配列番号:2および配列番号:14)での使用について好ましいtracrRNA配列は、配列番号:4に示される配列である。
【００６０】
代替的に、かかる標的配列特異的なcrRNAおよびtracrRNAを含むキメラRNA配列が使用されてもよい。
【００６１】
かかるキメラ(ch)RNAは、(Jinek et al. Science 337:816-821)に示されるように、20nt以上の特異的標的配列と、DR配列の一部または全体(crRNAの一部として規定される)と、tracrRNAの全体または一部との融合により設計され得る。該キメラRNA中、DRの断片およびtracrRNA配列は、ハイブリダイズ可能であり、かつヘアピン構造を形成し得るように相補的である。
【００６２】
化膿連鎖球菌Cas9タンパク質(配列番号:2および配列番号:14)での使用について好ましいキメラRNA配列は、配列番号:6に示される配列である。
【００６３】
さらに、工程(b)によるRNAは、核酸分子によってもコードされ得る。Cas9タンパク質をコードする核酸分子に関する上述の定義および好ましい態様は、これらのRNAをコードする核酸分子にも準用される。
【００６４】
本発明の方法によると、工程(a)および(b-i)または(b-ii)は、いずれも付随して、すなわち同時に行われるか、または別々に、すなわち異なる時点で行われる。該工程を同時に行う場合、Cas9タンパク質と(b-i)もしくは(b-ii)のRNAの両方、またはそれらをコードする核酸分子は、例えば2つの別々の注入針を使用して同時に導入され得るか、あるいは一緒に混合されて、例えば1つの針を使用して注入され得る。Cas9タンパク質を、(b-i)または(b-ii)のRNAと一緒にタンパク質として導入する場合、卵母細胞への導入前にタンパク質とRNAの複合体を形成し、その後前記複合体を卵母細胞、好ましくは1つまたは両方の前核に導入することが特に好ましい。
【００６５】
本明細書において上述されるように、工程(a)で導入されるCas9タンパク質および工程(b-i)または(b-ii)で導入されるRNA配列(1つまたは複数)は、標的配列に特異的に結合するタンパク質/RNA複合体を形成し、標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断を導入する。
【００６６】
本発明によると、用語「標的配列に特異的に結合する」は、複合体が統計的に特定の配列のみに結合し、ゲノム中の他の場所の関係ない配列には結合しないように、Cas9タンパク質およびtracr/cr/chRNAを設計することを意味する。本発明によるCas9タンパク質/RNA複合体のDNA結合特異性を試験するための方法は当業者に公知であり、限定されないが、転写レポーター遺伝子アッセイおよび電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)が挙げられる。
【００６７】
用語「標的配列中に一本鎖または二本鎖の切断を導入する」は、DNA二重らせんのDNA鎖(1本または2本)の中断に関し、二重らせん中の二本鎖のいずれか1本(一本鎖切断)または両方の鎖(二本鎖切断)が切断される。
【００６８】
ゲノムDNA中のかかる一本鎖または二本鎖切断の存在は、細胞内修復機構を引き起こす。典型的に(排他的ではないが)、一本鎖切断の場合、かかる切断は、相同組み換えにより修復され、二本鎖切断は、典型的に非相同末端連結(NHEJ)または相同組み換えのいずれかで修復される。
【００６９】
好ましくは、発明によるCas9タンパク質/RNA複合体の結合部位は、本発明により改変されるヌクレオチド(1つまたは複数)の500ヌクレオチドまで、例えば250ヌクレオチドまで、100ヌクレオチドまで、50ヌクレオチドまで、25ヌクレオチドまで、10ヌクレオチドまで、例えば5ヌクレオチドまでの上流(すなわち5')または下流(すなわち3')である。
【００７０】
本発明によると、驚くべきことに、標的化遺伝子改変などの遺伝子改変を哺乳動物卵母細胞のゲノムに導入し、一般的な(generic)Cas9タンパク質を、tracr/crRNAの標的特異的ペア、または前記ペアを含むキメラRNAのいずれかと一緒に使用することにより、10%までの予期できない高頻度の相同組み換えを達成できることが見出された。
【００７１】
発明の方法の切断工程を実施することにより、非相同末端連結(NHEJ)修復による二本鎖切断の修復に伴うヌクレオチドの消失による自発的なゲノム改変が高頻度で引き起こされることになる。また、ドナー核酸配列を含む核酸分子および標的配列に相同な領域を提供することにより、高い特異性でゲノムの標的化改変を達成し得る。
【００７２】
遺伝子改変の頻度の向上を達成するためのいくつかの方法は当該技術分野で公知である。かかる方法としては、例えば、相同組み換えを達成するためのジンクフィンガーまたはTALヌクレアーゼの使用が挙げられる。
【００７３】
しかしながら、本明細書で上述されるように、ジンクフィンガータンパク質またはTALENの設計および使用は、かなりの努力と時間を要する。さらに、隣り合うジンクフィンガーは、一般的に互いに影響し合う。したがって、配列特異性を高めるために、組み合わせ法において、これらをより大きなタンパク質へと単純に組み合わせることはできない。結果的に、あらかじめ選択したジンクフィンガータンパク質に新規のジンクフィンガーを付加することは、それぞれ個々の工程について手間を要するスクリーニングおよび選択手順を必要とする。さらに、完全には知られていないDNA結合コードおよびジンクフィンガードメインをコードする限られた供給源により、任意の所定のDNA標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質に融合されるヌクレアーゼの設計がさらに妨害される。また、新たに誘導したTALENペアのヌクレアーゼ活性は、TALペプチドDNA認識のまだわかっていない原理のために10倍より大きく変化し得る(Reyon et al. (2012). Nat Biotechnol 30:460-465)。そのため、特異的なジンクフィンガーまたはTALENタンパク質ペアの設計は、前進せず、いずれかの技術の使用は、通常かなりの努力と時間を伴う。
【００７４】
標的配列特異的DNA二本鎖切断を達成するために使用される別の方法は、哺乳類ゲノム中には天然には存在しない特異的な18bp認識配列に結合する制限酵素様I-SceIを示す酵母由来メガヌクレアーゼの使用である。しかしながら、メガヌクレアーゼのDNA結合特異性のための組合せコードはまだ明らかにはなっていない。これまでのメガヌクレアーゼのDNA結合ドメインの再設計では、天然の結合配列中の1つまたはいくつかのヌクレオチドの置換が可能になっただけである(Paeques and Duchateau, 2007 Curr Gene Ther 7(1): 49-66)。そのため、メガヌクレアーゼ標的部位の選択は制限されており、哺乳動物ゲノム中の任意の好ましい標的領域に結合する新規のメガヌクレアーゼを設計することは現在では可能ではない。
【００７５】
これらの方法とは対照的に、II型CRISPR-Cas技術は、標的特異性を規定する1つの短い合成キメラRNAまたは2つの短い合成tracr/crRNAと組み合わせた一般的なCas9ヌクレアーゼタンパク質の発現を必要とするのみである。そのため、CRISPR-Cas技術は、大きなTALENタンパク質の困難で新規の構築を回避し、代わりに、標的特異的な一本鎖または二本鎖切断の作製におけるかなりの簡易化を意味する時間の消費がより短い1つまたは2つの短いRNAのインビトロ転写を必要とする。
【００７６】
本明細書で上述されるように、哺乳動物接合体は、ゲノム工学のための好ましい基質であるとみなされ得る。しかしながら、ほとんどのゲノム操作の効率は低いために、前核DNA注入によるトランスジェニックマウスの作製が常套手段として開発されただけであった。さらに、接合体における標的化された遺伝子操作は、組み換え効率ビット(bit)が低いだけでなく、標的化された対立遺伝子において自発的に生じる多くの望ましくない変異も伴うことが報告された(Brinster RL, Braun RE, Lo D, Avarbock MR, Oram F, Palmiter RD.; Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86:7087-7091)。したがって、接合体前核は、標的化遺伝子操作を達成するには好ましくないと推定することができた。
【００７７】
驚くべきことに、本発明によると、II型CRISPR-Cas技術は、非ヒト哺乳動物卵母細胞における標的化遺伝子操作を達成するために使用できることが見出された。
【００７８】
したがって、標的ゲノムに遺伝子改変を導入する本発明の方法は、現在当業者が取り組んでいる前述の課題を解消する。特に、短い標的特異的RNAは、一般的なCas9ヌクレアーゼと合わせて、配列特異的ヌクレアーゼ複合体を形成し、本発明により、一本鎖または二本鎖切断を生成し得る。よって、対象の任意の配列は、ここでは費用効果的で、容易かつ迅速な方法で標的化され得る。さらに、本発明によると、II型CRISPR-Cas技術はまた、非ヒト哺乳動物卵母細胞における標的化された遺伝子操作を達成するため、およびゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製するために使用され得ることが見出された。
【００７９】
好ましい態様において、卵母細胞は、標的ゲノムの成功裡の改変について分析される。改変の有無を分析するための方法は当該技術分野で公知であり、限定されないが、核酸分子の物理的分離、配列決定アッセイ、ならびに切断および消化アッセイに基づくアッセイ、ならびにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA分析が挙げられる。
【００８０】
核酸分子の物理的分離に基づくアッセイの例としては、限定されないが、MALDI-TOF、変性勾配ゲル電気泳動および当該技術分野で公知の他のかかる方法が挙げられ、例えば、Petersen et al., Hum. Mutat. 20 (2002) 253-259; Hsia et al., Theor. Appl. Genet. 111 (2005) 218-225; Tost and Gut, Clin. Biochem. 35 (2005) 335-350; Palais et al., Anal. Biochem. 346 (2005) 167-175を参照のこと。
【００８１】
配列決定アッセイの例は、限定されないが、直接配列決定、自動DNAシーケンサにおける蛍光SSCPおよびパイロシーケンスによる配列分析のアプローチが含まれる。これらの手法は当該技術分野で一般的であり、例えばAdams et al. (編)、「Automated DNA Sequencing and Analysis」、Academic Press, 1994；Alphey、「DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics」、Springer Verlag Publishing, 1997；Ramon et al., J. Transl. Med. 1 (2003) 9；Meng et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 90 (2005) 3419-3422を参照のこと。
【００８２】
切断および消化アッセイの例としては、限定されないが、制限断片長多形アッセイ(RFLPアッセイ)、RNase保護アッセイ、化学的切断法に基づくアッセイおよび酵素ミスマッチ切断アッセイなどの制限消化アッセイが挙げられ、例えば、Youil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 87-91；Todd et al., J. Oral Maxil. Surg. 59 (2001) 660-667；Amar et al., J. Clin. Microbiol. 40 (2002) 446-452を参照のこと。
【００８３】
代替的に、所望の改変の有無について卵母細胞を分析する代わりに、適切な選択マーカーの組み込みにより成功裡に改変された卵母細胞を選択し得る。選択マーカーとしては陽性および陰性の選択マーカーが挙げられ、これらは当該技術分野で周知であり、当業者により常套的に使用される。選択マーカーの非限定的な例としては、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418またはグルタミンシンターゼ(GS)が挙げられる(Murphy et al., Biochem J. 1991, 227:277; Bebbington et al., Bio/Technology 1992, 10:169)。これらのマーカーを使用して、卵母細胞を選択培地中で増殖させ、最も高い抵抗性を有する卵母細胞が選択される。組み合された陽性-陰性選択マーカーも構想され、これらは相同組み換えまたはランダム組込みにより標的ゲノムに組み込まれ得る。陽性選択後、リコンビナーゼ認識部位に隣接する陽性選択マーカーを含む第1のカセットは、第2のマーカーを持たないカセットに対するリコンビナーゼが媒介するカセット交換により交換される。次いで、陰性選択により、所望の交換カセットを含むクローンが得られる。
【００８４】
発明の方法の好ましい態様において、標的配列は、(c)核酸分子を細胞に導入する工程をさらに含むドナー核酸配列を用いた相同組み換えにより改変され、ここで該核酸分子はドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「相同組み換え」は、当該技術分野で提示される定義に従って使用される。よって、該用語は、同様のヌクレオチド配列を含む二本のDNA鎖が遺伝子材料を交換する遺伝子組み換えの機構をいう。細胞は、DNAの再編成のために機能して完全に特有の半数体染色体のセットを生成する減数分裂の際に相同組み換えを使用するが、損傷したDNAの修復のため、特に一本鎖および二本鎖切断の修復のためにも相同組み換えを使用する。相同組み換えの機構は当業者に周知であり、例えばPaques and Haber (Paques F, Haber JE.; Microbiol Mol Biol Rev 1999; 63:349-404)に記載される。
【００８６】
本発明によると、用語「ドナー核酸配列」は、相同組み換えのプロセスにおいて鋳型として機能し、標的配列に導入される改変を保有する核酸配列をいう。このドナー核酸配列を鋳型として使用することにより、改変を含む遺伝情報が、卵母細胞のゲノム中の標的配列へとコピーされる。非限定的な例において、ドナー核酸配列は、相同組み換えの際に異なり、かつ点突然変異の導入を生じる1つのヌクレオチド以外の、または標的配列中に以前は存在しなかった追加の遺伝子からなる1つのヌクレオチド以外の、置き換えられる標的配列の一部と本質的に同一であり得る。ドナー核酸配列は、二本鎖核酸配列または一本鎖核酸分子であり得る。
【００８７】
ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する本発明の方法によると、工程(c)で細胞に導入される核酸分子は、先に定義されたドナー核酸配列および標的配列または標的配列の一部に相同なさらなる領域を含む。
【００８８】
用語「標的配列に相同な領域」(本明細書において「相同性アーム」とも称する)は、本発明によると、標的配列への特異的な結合を確実にするのに十分な配列同一性を有する領域をいう。2本の核酸配列の間の同一性レベルを評価する方法は当該技術分野で周知である。例えば、該配列は、当該技術分野で公知の適切なコンピュータープログラムを使用して電子的に整列され得る。かかるプログラムは、BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403)、WU-BLAST (Altschul and Gish (1996) Methods Enzymol. 266, 460)などのその変形、FASTA (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444)またはSmith-Watermanアルゴリズムの実行(SSEARCH, Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol., 147, 195)を含む。ペアワイズ配列整列を提供することに加えて、これらのプログラムは、配列同一性レベル(通常パーセント同一性)および偶然に整列が生じる可能性(P値)も報告する。本発明によると、2本の核酸配列の間の同一性レベルを決定するためにBLASTを使用することが好ましい。
【００８９】
好ましくは、該「標的配列に相同な領域」は、標的配列の対応する部分と、少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、さらに好ましくは少なくとも99.9%および最も好ましくは100%の配列同一性を有する。先に定義された配列同一性は、相同性アームについての結合部位として働く標的配列の一部のみに関して定義される。よって、標的配列全体と本発明の方法の工程(c)の核酸分子の相同領域との間の全体的な配列同一性は、ドナー核酸配列により置き換えられる標的配列の一部が存在するので、先に定義された配列同一性とは異なり得る。
【００９０】
標的配列に相同な少なくとも2つの領域が(c)の核酸分子中に存在することが好ましい。
【００９１】
本発明の方法のこの好ましい態様によると、工程(a)および(b-i)または(b-ii)ならびに工程(c)は、いずれも付随的に、すなわち同時に実施されるか、または異なる時点で実施される。例えば、3つ全ての工程は、例えば3つの別々の注入針を使用して、または1つの針を使用して注入される混合物の形態で、付随的に実施され得る。代替的に、工程(a)および(b-i)/(b-ii)は、付随的に実施され得るが、一方で工程(c)は、異なる(早いかまたは遅い)時点で実施される。また、工程(c)は、工程(a)と付随して実施され得、工程(b-i)/(b-ii)は、異なる(早いかまたは遅い)時点で実施される。さらに、工程(c)はまた、工程(b-i)/(b-ii)と付随して実施され得、一方で工程(a)は、異なる(早いかまたは遅い)時点で実施される。
【００９２】
したがって、工程(c)で細胞に導入される核酸分子およびCas9タンパク質をコードする核酸分子および/または工程(b-i)もしくは(b-ii)のRNAをコードする核酸分子が、1つの核酸配列、例えば1つのベクターまたはプラスミド中に含まれ得ることも当業者には理解されよう。代替的に、工程(c)の核酸分子は、工程(a)および/または(b-i)もしくは(b-ii)による核酸分子(1つまたは複数)の他に、導入されるさらなる核酸分子であり得る。
【００９３】
発明の方法のより好ましい態様において、工程(c)の核酸分子は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(oligodesoxynucleotide)である。
【００９４】
用語「オリゴデオキシヌクレオチド(oligodesoxynucleotide)(ODN)」は、デオキシヌクレオチド残基の配列で構成される核酸ポリマーをいう。本発明によるODNは、オリゴデオキシヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドの両方をいい、少なくとも30ヌクレオチド長、例えば少なくとも40ヌクレオチド長、例えば少なくとも50ヌクレオチド長、例えば少なくとも60ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも70ヌクレオチド長、例えば少なくとも80ヌクレオチド長、例えば少なくとも90ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも100ヌクレオチド長、例えば少なくとも110ヌクレオチド長、例えば少なくとも120ヌクレオチド長、例えば少なくとも130ヌクレオチド長、例えば少なくとも140ヌクレオチド長、および最も好ましくは少なくとも150ヌクレオチド長である。本発明によるODNは、500ヌクレオチド長未満、例えば400ヌクレオチド長未満、例えば300ヌクレオチド長未満および最も好ましくは200ヌクレオチド長未満であることがさらに好ましい。
【００９５】
さらに、この好ましい態様によるオリゴデオキシヌクレオチドは一本鎖ODN (ssODN)であり、すなわち第2の異なる(すなわち相補的または部分的に相補的な)オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズしていない。それにもかかわらず、ssODNは、それ自身が折りたたまれて、一本のオリゴデオキシヌクレオチド鎖からなる部分的または完全な二本鎖分子を形成し得ることが理解されよう。好ましくは、この好ましい態様によるssODNは、部分的または完全な二本鎖分子を形成するようには折りたたまれず、そのかわり長さ全体にわたり一本鎖である。
【００９６】
発明の方法の別の好ましい態様において、卵母細胞は受精した卵母細胞である。
【００９７】
発明の方法のさらに好ましい態様において、Cas9タンパク質またはそれをコードする核酸分子および/または(b-i)もしくは(b-ii)のRNAもしくは前記RNAをコードする核酸分子は、マイクロインジェクションにより卵母細胞に導入される。
【００９８】
卵母細胞へのマイクロインジェクションは、(受精前の)核、(受精後の)母型および/または父型前核への注入により、および/または(受精の前後両方の)細胞質への注入により実施され得る。受精した卵母細胞を使用する場合、前核への注入は、1つの前核または両方の前核のいずれかについて実施される。好ましくは、前核の1つのみへの注入について、サイズが大きいために父型の前核が選択される。
【００９９】
工程(a)のCas9タンパク質または工程(b-i)もしくは(b-ii)のRNAの注入は、好ましくは細胞質内であるが、前記タンパク質またはRNAをコードする核酸分子の注入は、好ましくは核/前核、受精した卵母細胞の場合は好ましくは両方の前核への注入である。核/前核および細胞質の両方への注入によりマイクロインジェクションを実施することがより好ましい。例えば、核/前核に針を導入し、工程(a)のCas9タンパク質および/または工程(b-i)もしくは(b-ii)のRNAおよび/またはそれらをコードする核酸分子の第1の量を、核/前核に注入し得る。卵母細胞から針を抜きながら、工程(a)のCas9タンパク質および/または工程(b-i)もしくは(b-ii)のRNAおよび/またはそれらをコードする核酸分子の第2の量を細胞質に注入する。核/前核内に存在する必要のある核酸分子、例えばCas9タンパク質をコードするDNA分子を細胞質に注入する場合、前記核酸分子は、核/前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むべきである。
【０１００】
マイクロインジェクションを実施する方法は当該技術分野で周知であり、例えばNagyら(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)、および下記の実施例に記載される。
【０１０１】
発明の方法の別の好ましい態様において、工程(c)の核酸分子は、マイクロインジェクションにより卵母細胞に注入する。
【０１０２】
工程(c)の核酸分子の注入は、好ましくは核/前核内への注入である。しかしながら、工程(c)の核酸分子の注入は、前記核酸分子が上述のように核局在化シグナルを有する核酸配列として提供される場合は、細胞質中にも実施され得る。
【０１０３】
発明の方法の別の好ましい態様において、Cas9タンパク質をコードする核酸分子はmRNAである。
【０１０４】
発明の方法のさらに好ましい態様において、Cas9タンパク質は、配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する。
【０１０５】
配列番号:2のアミノ酸配列は、化膿連鎖球菌由来のCas9タンパク質を表す。
【０１０６】
発明の方法の別の好ましい態様において、標的配列に相同な領域は、ドナー核酸配列の5'および3'末端に局在する。
【０１０７】
この好ましい態様において、ドナー核酸配列は、標的配列に相同な2つの領域に挟まれ、従って本発明の方法に使用される核酸分子は、標的配列に相同な第1の領域、次いでドナー核酸配列、次いで標的配列に相同な第2の領域からなる。
【０１０８】
発明の方法のさらに好ましい態様において、(c)の核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域は、少なくとも400bpの長さを有する。より好ましくは、該領域はそれぞれ、少なくとも500ヌクレオチド、例えば少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも750bpヌクレオチド、より好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド、例えば少なくとも1500ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも2000ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも2500ヌクレオチドの長さを有する。これらの最短の長さは、(c)の核酸分子に存在する相同領域のそれぞれの長さのことをいい、すなわち2つの相同領域が存在し、それぞれの相同は独立して少なくとも400bp、500bpなどの長さを有し、ここで相同領域は、それぞれが記載される最短の長さを有するのであれば同じ長さまたは異なる長さを有し得る。核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域の最長の長さは、使用されるクローニングベクターの種類に依存し、通常、大腸菌のcol EI複製起点を使用する高コピープラスミド(例えばpBluescript)においてそれぞれ20,000ヌクレオチド長まで、またはF因子起点を使用するプラスミドにおいて(例えばpTARBAC1などのBACベクターにおいて)それぞれ300,000ヌクレオチド長までであり得る。
【０１０９】
発明の方法のさらに好ましい態様において、標的配列の改変は、標的配列の少なくとも1ヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される。本発明によると、置換、例えば1〜3ヌクレオチドの置換および外因性配列、例えばloxP部位(34ヌクレオチド長)または例えばレポーター遺伝子のためのcDNAの挿入が好ましい。かかるレポーター遺伝子のためのcDNAは、例えば6kb長までであり得る。改変の目的に応じて、改変はインフレームであるべきかまたはフレームシフトを引き起こすべきである。当業者は、リーディングフレームが維持されるかまたはシフトされることを確実にする方法を知っており、特定の場合にどの選択(alternative)が望ましいかも理解する。
【０１１０】
発明の方法の別の好ましい態様において、卵母細胞は、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよび反芻動物からなる群より選択される非ヒト哺乳動物由来である。
【０１１１】
本明細書に記載される哺乳動物、鳥類および魚類の全ては、先行技術および当業者の一般的な知識により分類学的に定義される。
【０１１２】
「げっ歯類」の非限定的な例は、マウス、ラット、リス、シマリス、ジリス、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、デグー、チンチラ、プレイリードッグおよびウッドチャックである。
【０１１３】
「イヌ」の非限定的な例としては、イエイヌ亜種のメンバーならびにオオカミ、キツネ、ジャッカルおよびコヨーテが挙げられる。
【０１１４】
「ネコ」の非限定的な例としては、2つの亜科：ライオン、トラ、ジャガーおよびヒョウを含むヒョウ科ならびにクーガー、チーター、サーバル、オオヤマネコ、カラカル、オセロットおよびイエネコを含むネコ科のメンバーが挙げられる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「霊長類」は、例えばオナガザル(旧世界ザル)または広鼻猿類(新世界ザル)ならびにキツネザル、メガネザル、類人猿およびキヌザル(コモンマーモセット)を含む全てのサルをいう。
【０１１６】
本発明はまた、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法に関し、該方法は(a)請求項１〜１２のいずれかに従って卵母細胞を作製する工程、(b) (a)で得られた卵母細胞を偽妊娠雌宿主に移す工程、および(c)改変の存在について、該雌宿主から生まれた子孫を分析する工程を含む。
【０１１７】
本発明によると、用語「(a)で得られた卵母細胞を偽妊娠雌宿主に移す工程」は、受精した卵母細胞を移すことを含むが、例えば2細胞、4細胞、8細胞、16細胞および胚盤胞(70〜100細胞)期の着床前の胚を移すことも含む。前記着床前の胚は、卵母細胞が着床前の胚に発生するのに適した条件下で卵母細胞を培養することにより得られ得る。さらに、卵母細胞は、着床前の胚を得るために、胚盤胞に注入され得るかまたは胚盤胞と融合され得る。卵母細胞を胚盤胞に導入する方法および卵母細胞または着床前の胚を偽妊娠雌宿主に移すための方法は、当該技術分野で周知であり、例えばNagyら(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)に記載される。
【０１１８】
ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物を作製する方法によると、雌宿主への移植前に、成功裡のゲノム改変の分析工程を実施することがさらに構想される。非限定的な例としては、卵母細胞は、2細胞期、4細胞期または8細胞期まで培養され得、得られる胚を壊すかまたは改変することなく、1つの細胞が取り出され得る。次いで、ゲノム構成、例えばゲノム改変の有無についての分析は、例えばPCRまたはサザンブロット技術または本明細書に上述の方法のいずれかを使用して実施され得る。移植前のかかる成功裡のゲノム型の分析の方法は、当該技術分野で公知であり、例えばPeippoら(Peippo J, Viitala S, Virta J, Raty M, Tammiranta N, Lamminen T, Aro J, Myllymaki H, Vilkki J.; Mol Reprod Dev 2007; 74:1373-1378)に記載される。
【０１１９】
非哺乳動物を作製するこの方法のために、卵母細胞の受精が必要である。前記受精は、発明の非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法による工程(a)における標的配列の改変前に起こり得、すなわち受精した卵母細胞を、発明による標的配列を改変する方法に使用し得る。受精は、工程(a)における標的配列の改変後にも実施し得、すなわち発明による標的配列を改変する方法には未授精卵母細胞を使用し得、ここで該卵母細胞は、その後、偽妊娠雌宿主に移される前に受精される。
【０１２０】
雌宿主により生まれた子孫において改変の存在について分析する工程は、作製された非ヒト哺乳動物がゲノム中に改変された標的配列を保有するかどうかという必要な情報を提供する。よって、改変の存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を保有することを示し、一方で改変の非存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を保有しないことを示す。改変の有無について分析するための方法は先に詳述されている。ゲノム中に改変された標的配列を保有するこれらの子孫は、導入された改変が生殖系伝達を介して子孫へと伝わるかどうかを決定するためにその後さらに飼育され得る。改変の生殖系伝達が成功するこれらの哺乳動物は、次いでさらなる飼育のために使用され得る。
【０１２１】
発明の方法により作製される非ヒト哺乳動物は、とりわけ目的の遺伝子の機能およびかかる動物におけるゲノムの改変の表現型発現/結果を研究するために有用である。発明の非ヒト哺乳動物を、ヒト家族性筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭骨痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病および任意の他の遺伝的に起こる疾患のため、ならびに治療剤/組成物を試験するための疾患モデルとして使用し得ることがさらに構想される。さらに、発明の非ヒト哺乳動物は、家畜の飼育にも使用され得る。
【０１２２】
非ヒト哺乳動物を作製する発明のこの方法の好ましい態様において、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよび反芻動物からなる群より選択される。
【０１２３】
本発明はさらに、発明の上述の方法により得られる非ヒト哺乳動物に関する。
【０１２４】
ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物卵母細胞を作製する発明の方法に関して、先に定義される全ての定義および好ましい態様は、非ヒト哺乳動物を作製する発明のこの方法にも準用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図1は、マウスのCrispr/Cas9を介した生殖系改変の模式的概要である。Cas9 mRNA、tracrRNA、crRNAおよび任意に、合成、突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の、ドナー雌から単離した一細胞胚の前核の一方または両方へのマイクロインジェクションで始まる、Crispr/Cas9を介した胚に基づく遺伝子ターゲッティングの例示的ワークフローを示す。翻訳の際に、Cas9タンパク質は前核に輸入され、crRNAおよびtracrRNAと共に、父型および母型ゲノムの標的遺伝子に(一本鎖または)二本鎖切断(DSB)が生じる(図2)。DSBは、誤りを起こしやすいNHEJ修復(父型および母型のゲノムの両方で起こり得る)によりプロセッシングされるか、または突然変異誘発ODNが導入されたゲノムにおいて相同組み換えにより修復されるかのいずれかである。マイクロインジェクションされた胚を親(foster)雌に移す際に、生まれた子孫の遺伝子型をPCRおよび配列分析により決定して、生殖系にターゲッティングまたはノックアウト変異を有する創始動物(founder animal)を同定する。かかる創始マウスと野生型マウスの交配により、ヘテロ変異体を作製し、これを交雑させてホモ接合体変異体を得る。
【図２】図2は、マイクロインジェクションした一細胞胚の前核におけるCrisp/Cas9を介した遺伝子編集である。Cas9、crRNAおよびtracrRNAにより誘導される二本鎖切断(DSB)は、数乗(several orders)の規模で標的部位でのDNA修復を促進する。DSBは、配列相同性領域に隣り合う望ましい遺伝子改変を含む合成オリゴヌクレオチドまたは遺伝子ターゲッティングベクターを修復鋳型として使用して、相同組み換え(HR)経路により修復され得る。組み換えプロセスにおいて、遺伝子変換は、ベクターの相同性領域からヘテロ配列まで広がり、改変はゲノム(標的化対立遺伝子)に移る。代替的に、DSBは、開いたDNA末端を修復鋳型なしで再度連結する非相同末端連結(NHEJ)経路により閉じられ得る。この手段により、DNA末端は、多くの場合にコーディング領域中にフレームシフト(ノックアウト)変異を起こす複数のヌクレオチドの消失により頻繁に編集される。
【図３】図3は、Cas9 mRNA、tracrRNA、crRNAおよびchRNAの作製のための発明のDNA構築物である。(a)プラスミドpCAG-Cas9-bpAは、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来のCas9のコドン最適化コーディング領域の上流にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含み、N-およびC-末端核局在化配列(NLS)およびFLAGタグ、次いで直線化のためのMluI制限部位を付加して修飾される。(b)プラスミドpT7-tracrRNAは、示される配列の上流にT7プロモーターを含み、89ヌクレオチドtracrRNAのインビトロ転写を可能にする。(c)プラスミドpT7-crRNA-Rab38は、示される102ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来の2つの36nt直接繰り返し(DR)配列に挟まれた、マウスRab38遺伝子のエクソン1由来の30nt標的配列を含むcrRNA-Rab38のインビトロ転写を可能にする。(d)プラスミドpT7-crRNA-Fusは、示される102ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来の2つの36nt DR配列に挟まれたマウスFus遺伝子のエクソン15由来の30nt標的配列を含むcrRNA-Fusのインビトロ転写を可能にする。(e)プラスミドpT7-chRNA-Rab38は、示される103ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、マウスRab38遺伝子のエクソン1由来の20nt標的配列ならびにcrRNA (c)およびtracr RNA (b)由来のキメラRNA配列を含むchRNA-Rab38のインビトロ転写を可能にする。(f)プラスミドpT7-chRNA-Fusは、示される103ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、マウスFus遺伝子のエクソン15由来の20nt標的配列ならびにcrRNA (c)およびtracr RNA (b)由来のキメラRNA配列を含むchRNA-Fusのインビトロ転写を可能にする。
【図４】図4は、マウスRab38およびFus遺伝子における標的化された変異である。(a)マウスRab38遺伝子のコドン1〜23。(b)一細胞胚において示される標的領域におけるCas9、tracrRNA/crRNA-Rab38またはchRNA-Rab38(図3)誘導二本鎖切断のための修復鋳型として突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオチドODN-Rab38 (G19V)を使用して、グリシンからバリンへの置換およびSexAI部位がコドン19に生じる。(c)マウスFus遺伝子のエクソン15のコドン。(d)一細胞胚において示される標的領域におけるCas9、tracrRNA/crRNA-FusまたはchRNA-Fus(図3)誘導二本鎖切断のための修復の鋳型として突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオチドODN-Fus (R513G)を使用して、アルギニンからグリシンへの置換およびBccI部位がコドン513に生じる。
【実施例】
【０１２６】
該実施例は発明を説明する。
【０１２７】
実施例1：マウス一細胞胚におけるCas9、およびtracrRNA/crRNAまたはchRNAによるRab38およびFus遺伝子におけるノックアウトおよびノックイン変異の作製。
Cas9 mRNA、tracrRNA/crRNAまたはキメラRNA(chRNA)および任意に、合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の、ドナー雌から単離した一細胞胚の父型前核へのマイクロインジェクションによるCrispr/Cas9を介した胚に基づく遺伝子ターゲッティングのワークフロー。翻訳時に、Cas9ヌクレアーゼタンパク質は前核に輸入され、標的特異的crRNAおよび一般的tracrRNAと一緒に、または標的特異的chRNAと一緒に、父型および母型ゲノムの標的遺伝子中に二本鎖切断を生じる(図1)。父型ゲノムにおいて、DSBは、いずれか一方が相同組み換えにより突然変異誘発ODNで閉じられる(seal)か、または両方のゲノムにおいて間違いが起こりやすいNHEJ修復により処理され、ノックインまたはノックアウト対立遺伝子を生じる(図2)。マイクロインジェクションされた胚を親雌に移して(upon)、生まれる子孫をPCRおよび配列分析により遺伝子型決定し、生殖系にターゲッティングされた変異またはノックアウト変異を有する創始動物を同定する。かかる創始マウスと野生型マウスの交配により、ヘテロ接合体変異体を生じ、これを交雑してホモ接合体変異体を得る。
【０１２８】
この原理の証拠として、Rab38遺伝子を標的化して、チョコレート変異体(chocolate mutants)のRab38cht対立遺伝子に見られるようにコドン19でのグリシン-バリンミスセンス変異(G19V)を得た(Loftus et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:4471-4476)。Rab38遺伝子は、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、肺胞細胞および血小板における細胞内小胞の輸送を制御する低分子GTPaseをコードする(Wasmeier et al. (2006) J Cell Biol 175:271-281)。変異体チョコレートマウス(Rab38cht)は、Rab38中にミスセンス変異を示し、ルビーラット(ruby rats)は、Rab38にナンセンス変異を示し、眼・皮膚白皮症(OCA)、進行性肺線維症および血小板蓄積病(platelet storage disease)を特徴とする疾患であるヘルマンスキー-パドラック症候群の表現型モデルと考えられる(Oiso et al. (2004) Mamm Genome 15:307-314; Di Pietro et al. (2005) Traffic 6:525-33; Lopes VS et al. (2007). Mol Biol Cell 18:3914-3927; Osanai et al. (2010) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 298:L243-251)。
【０１２９】
ターゲッティング分子として、コドン19の上流の47bpラギング鎖配列および94bpの下流配列をカバーする144ヌクレオチドの合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドODN-Rab38(G19V)(配列番号:1)を使用した。ODN-Rab38 (G19V)は、コドン19の第2位にバリン三つ組みおよびSexAI制限部位を生じるG-T置換、ならびに標的化されたRab38対立遺伝子の特有の識別因子であるサイレントなT-A交換を含む(図4)。
【０１３０】
ODN-Rab38 (G19V)は、pCAG-Cas9-bpA (配列番号:3)から転写される改変されたCas9タンパク質(配列番号:2)をコードするCas9mRNA、およびpT7-tracr-RNA(配列番号:4)から転写されるtracrRNAおよびpT7-crRNA-Rab38(配列番号:5)から転写されるcrRNA-Rab38と共に、またはCas9 mRNAおよびchRNA-Rab38(配列番号:6)と共に(図3)マウス一細胞胚にマイクロインジェクションされた(図1)。ゲノム尾部DNA由来のRab38の第1のエクソンをカバーする213bpの領域のPCR増幅により、遺伝子編集事象について、得られた子孫を分析した。
【０１３１】
G19V置換を有する創始マウスは、PCR産物のSexAIでの消化により最初に同定された。消化されたPCR産物が存在することで、組み替えられた創始動物として、crRNA-Rab38/tracrRNAおよびchRNA-Rab38の両方のマイクロインジェクション由来の子供(pup)の実質的な断片を同定した。その後、かかる創始動物由来の消化されないPCR産物をサブクローニングして、配列決定により10個のサブクローンを分析した。この分析により、G19V置換を有するRab38対立遺伝子の存在が明らかになったが、NHEJ修復のためのいくつかのヌクレオチドを消失したノックアウト対立遺伝子の存在も明らかになった。かかる創始マウスをさらに飼育することにより、変異体Rab38対立遺伝子を、生殖系を介して伝達することができ、変異体マウス系統の確立が可能になる。
【０１３２】
さらに、Fus遺伝子をターゲッティングして、運動ニューロンの消失ならびにFUSの核および細胞質での蓄積を生じる家族性筋萎縮側索硬化症(ALS)患者の変異体Fus対立遺伝子に見られるような、コドン513でのアルギニン-グリシンミスセンス変異(R513G)を作製した。FUSは、転写、スプライシングおよびRNA排出の制御において機能する核タンパク質である。大部分の変異は、核局在化シグナルを有するC末端尾部において起こるので、Fus R513Gマウス変異体は、家族性ALSの疾患モデルを提供する(Van Langenhove et al. (2012) Ann Med 44:817-828; Fiesel FC, Kahle PJ (2011) TDP FEBS J 278:3550-3568)。
【０１３３】
ターゲッティング分子として、マウスFus遺伝子のエクソン15をカバーする140ヌクレオチドの合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドODN-Fus(R513G) (配列番号:7)を使用した。ODN-Fus-(R513G)は、コドン513の第1位にCからGへの置換を含み、グリシン三つ組みおよびBccI制限部位を生じる(図4)。ODN-Fus (R513G)は、pCAG-Cas9-bpA (配列番号:3)から転写される(配列番号:2)内の改変されたCas9タンパク質をコードするCas9 mRNAおよびpT7-tracr-RNA (配列番号:4)から転写されるtracrRNAおよびpT7-crRNA-Fus (配列番号:8)から転写されるcrRNA-Fusと共に、またはCas9 mRNAおよびchRNA-Fus (配列番号:9)と共に(図3)、マウス一細胞胚にマイクロインジェクションされた(図1)。
【０１３４】
ゲノム尾部DNA由来のFusのエクソン15をカバーする576bpの領域のPCR増幅により、得られた子孫を、遺伝子編集事象について分析した。R513G置換を有する創始マウスは最初に、PCR産物のBccIでの消化により同定された。消化されたPCR産物の存在は、組み替えられた創始動物として、crRNA-Fus/tracrRNAおよびchRNA-Fusの両方のマイクロインジェクションに由来する子供(pup)の実質的な断片を同定した。その後、かかる創始動物由来の消化されなかったPCR産物をサブクローニングして、配列決定により10個のサブクローンを分析した。この分析により、R513G置換を有するFus対立遺伝子の存在が明らかになったが、NHEJ修復のためにいくつかのヌクレオチドを欠失したノックアウト対立遺伝子の存在も明らかになった。かかる創始マウスのさらなる飼育により、生殖系を介して変異体Fus対立遺伝子を伝達することができ、変異体マウス系統の確立が可能になる。
【０１３５】
方法
プラスミド構築
短いRNAのインビトロ転写のためのDNA構築物pT7-tracrRNA、pT7-crRNA-Rab38、pT7crRNA-Fus、pT7chRNA-Rab38およびpT7-chRNA-Fus(図3)を、DNA合成(Genscript, Piscataway, USA)により得て、プラスミドpUC57にクローニングした。crRNAは、化膿連鎖球菌SF370 II型CRISPR座PAM配列「NGG」の上流に位置するゲノム配列中の標的配列を認識するように設計した。プラスミドpCAG-Cas9-bpA (配列番号:3)は、合成Cas9コーディング領域を含むPacI-MluI断片の連結(Genscript, Piscataway, USA)により、プラスミドpCAG-venus-MluIの対応する部位に構築した。プラスミドpCAG-Cas9-bpAは、N末端およびC末端核局在化配列(NLS)およびFLAGタグ、次いで直線化のためのMluI制限部位の付加により改変された、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来のCas9のコドン最適化コーディング領域の上流にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含む。プラスミドpT7-tracrRNA (配列番号:4)は、指定される配列の上流にT7プロモーターを含み、89ヌクレオチドのtracrRNAのインビトロ転写を可能にする。プラスミドpT7-crRNA-Rab38 (配列番号:5)は指定される102ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来の2つの36nt直接リピート(DR)配列に挟まれたマウスRab38遺伝子のエクソン1由来の30nt標的配列を含むcrRNA-Rab38のインビトロ転写を可能にする。プラスミドpT7-crRNA-Fus (配列番号:8)は、指定される102ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、化膿連鎖球菌II型CRISPR座由来の2つの36nt DR配列で挟まれたマウスFus遺伝子のエクソン15由来の30nt標的配列を含むcrRNA-Fusのインビトロ転写を可能にする。プラスミドpT7-chRNA-Rab38 (配列番号:6)は、指定される103ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、マウスRab38遺伝子のエクソン1由来の20nt標的配列ならびにcrRNAおよびtracr RNA由来のキメラRNA配列を含むchRNA-Rab38(図3)のインビトロ転写を可能にする。プラスミドpT7-chRNA-Fus (配列番号:9)は、指定される103ヌクレオチド配列の上流にT7プロモーターを含み、マウスFus遺伝子のエクソン15由来の20nt標的配列ならびにcrRNAおよびtracr RNA由来のキメラRNA配列を含むchRNA-Fus(図3)のインビトロ転写を可能にする。
【０１３６】
一細胞胚のマイクロインジェクション
Cas9 mRNAのインジェクション、tracrRNA/crRNAまたはchRNAおよびターゲッティングODNのインジェクションは、ZFNについて以前に記載されたように実施される(Meyer et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:15022-6; Meyer et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109:9354-9359)。簡潔に、Cas9 mRNA(ポリアデニル化を含む)、tracrRNA/crRNAまたはchRNAs(ポリアデニル化を含まない)は、mMessage mMachine T7 UltraキットおよびMEGAclearキット(Life Technologies, Carlsbad, USA)を使用して、MluI (Cas9)またはAlwI (RNA)を用いて転写された領域の末端で直線化されたプラスミドDNAからのインビトロ転写により調製する。次いでRNAのそれぞれを注入バッファ(10mM Tris、0.1mM EDTA、pH7.2)中に20ng/μlの作業濃度まで希釈した。ターゲッティングオリゴデオキシヌクレオチド(Metabion, Martinsried, Germany)は注入バッファ内に入れ、30ng/μlの作業濃度まで希釈した。適切なRNAをそれぞれの突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、-80℃で保存した。C57BL/6N雄と排卵過剰(super-ovulated)FVB雌(Charles River, Sulzbach, Germany)の交配により一細胞胚を得た。過剰排卵3週齢FVB雌は、交配の2日前に2.5IUの妊馬血清(PMS)で処理し、交配日に2.5IUヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)で処理する。受精した卵母細胞をプラグ陽性(plug positive)雌の卵管から単離し、標準的な手法に従って、M2培地(Sigma-Aldrich Inc Cat. No. M7167)中でマイクロインジェクションした(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)。記載されるように、2段階手法で、胚にターゲッティングODNとRNAの混合物を注入した(Meyer et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:15022-6; Meyer et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109:9354-9359)。簡潔に、トランスジェニックマウスの作製に使用されるように、DNA/RNA混合物の第1のアリコートを、可能な場合はいつでも、大きい方の(雄)前核に注入し、DNAベクターを送達した。前核から注入針を引き抜く際に、DNA/RNA混合物の第2のアリコートを細胞質に注入し、Cas9 mRNAを翻訳機構に直接送達した。Leicaマイクロマニピュレーターおよび顕微鏡およびEppendorf FemtoJet注入デバイスを使用して注入を行った。注入した接合体を、偽妊娠CD1雌マウスに移し、生きた成体マウスを得た。
【０１３７】
創始マウスの遺伝子型決定
Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)のプロトコルに従い、マイクロインジェクション由来のマウスの尾の先端からゲノムDNAを単離した。得られたDNAペレットを100μl 10mM Tris-Cl、pH8.5に懸濁して、室温で一晩インキュベートし、さらなる分析のために4℃で保存した。Rab38遺伝子中の変異についての創始物(founder)の分析のために、PCRプライマーペアRab-for (配列番号:10) (5'-GGCCTCCAGGATGCAGACACC-3')およびRab-rev (配列番号:11) (5'-CCAGCAATGTCCCAGAGCTGC-3')を使用してエクソン1を増幅した。増幅は、95℃ 20秒、60℃ 15秒、72℃ 15秒の30サイクルの25μl反応において、Herculase IIポリメラーゼ(Agilent Technologies)を使用して行った。その後、PCR産物を、10UのSexAIで直接消化し、アガロースゲル上で分析した。陽性と同定された創始物由来の消化されなかった産物を、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)で精製し、pSC-B(Stratagene, La Jolla, USA)にクローニングし、配列決定した。Vector NTIソフトウェア(Invitrogen)を使用して、結果をゲノムRab38配列と比較した。
【０１３８】
Fus遺伝子中の変異について創始物を分析するために、PCRプライマーペアFus-for(配列番号:12)およびFus-rev(配列番号:13)を使用してエクソン15を増幅した。増幅は、95℃ 20秒、60℃ 15秒、72℃ 15秒の30サイクルの25μlの反応において、Herculase IIポリメラーゼ(Agilent Technologies)を使用して行った。その後、PCR産物を、10UのBccIで直接消化し、アガロースゲル上で分析した。陽性と同定された創始物由来の消化されなかった産物を、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)で精製し、pSC-B(Stratagene, La Jolla, USA)にクローニングし、配列決定した。Vector NTIソフトウェア(Invitrogen)を使用して、結果をゲノムFus配列と比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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