(57)【要約】  本発明は幹細胞由来のエキソソームを有効成分に含む脳血管疾患治療用薬学的組成物に関するものである。本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血（ＩＶＨ）動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、脳水頭症を減少させ、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な神経細胞保護効果を有しているため、脳室内出血などをはじめとする脳血管疾患の治療に有用に利用され得る。
2016540014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分に含む、脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞および羊膜上皮細胞で構成された群から選択される１種以上の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される１種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記脳血管疾患は脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化症、クモ膜下出血、脳血栓症および脳塞栓症からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記脳血管疾患は脳室内出血（ＩＶＨ、ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）であることを特徴とする、請求項５に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は幹細胞由来のエキソソームを有効成分に含む脳血管疾患治療用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、未分化な細胞であって、自己複製能力を有しつつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞である。幹細胞は分化能により万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、全分化能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、多分化能（多能性）幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に分類することができ、細胞学的由来により胚性幹細胞と成体幹細胞に分類することができる。胚性幹細胞は着床前受精卵や発生中の胎児生殖器組織などから由来する反面、成体幹細胞は成体内に存在する各器官、例えば骨髓、脳、肝、膵臓などから由来する。
【０００３】
最近幹細胞を脳梗塞、外傷性神経損傷、筋骨格系疾患など多様な疾患に適用した前臨床、臨床研究が試みられている。しかし、現在の技術的な水準は単純に幹細胞の抽出および培養／増殖とこれを注入する程度に関する研究までにしか及んでおらず、最近までの臨床研究結果、このような幹細胞治療はまだ明確な効果を示していないものと知られている。したがって、治療効果を増進するための多様な遺伝子操作幹細胞に対する研究が進行されているものの、遺伝子を利用した細胞治療は倫理的な問題のため、人体に適用することが不可能である限界点がある。
【０００４】
その他にも幹細胞を利用する治療方法を臨床に適用するにはいくつかの問題点がある。例えば、幹細胞が組織に生着した後腫塊形成の危険性があり、幹細胞自体の大きさが大きいことにより動脈閉塞を誘発して脳梗塞を招く可能性があり、急性期のように脳−血管障壁が開かれた状態では脳内への移動が容易であるが慢性期では幹細胞自体の大きさが大きいことによって移動に制限がある。
【０００５】
一方、脳血管疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）とは、脳の正常な血液供給障害による神経疾患（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｔ）を指し、脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化症、クモ膜下出血、脳血栓症または脳塞栓症などを含む。
【０００６】
最近の少子化問題は国家的に最も深刻な問題中の一つであるが、出産した産婦の平均年齢の増加と不妊による補助生殖術利用の増加により、生まれる新生児中の未熟児出産が顕著に増加している。未熟児の生活の質を決定する最も主要な因子は治療後の脳神経発達であり、このうち、未熟児脳室内出血（Ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ）は未熟児出生後の最初の１週間以内によく発生し、出血後水頭症をはじめとする脳性麻痺、精神遅滞、聴覚、視力消失などの深刻な後遺症を引き起こす最も重要かつ危険な疾患である。脳室内出血は未熟な周囲の脳組織の損傷および出血後水頭症を引き起こして深刻な脳損傷を引き起こすが、現在までこれに対する明確な治療法がなく、これに対する治療法の開発こそ未熟児治療における最も切実で緊急な課題である。
【０００７】
現在まで脳血管疾患治療剤を開発するための研究が活発に進行されているが、未だ脳血管疾患、特に脳室内出血と幹細胞由来のエキソソームの関係に対しては全く開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者らは新しい脳血管疾患治療剤を開発するために研究を続けた結果、幹細胞由来のエキソソームが脳室内出血動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な脳血管疾患治療効果を有していることを確認することによって本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は幹細胞由来のエキソソームを有効成分に含む脳血管疾患治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は幹細胞由来のエキソソームを有効成分に含む脳血管疾患治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血（ＩＶＨ）動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、脳水頭症を減少させ、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な神経細胞保護効果を有しているため、脳室内出血などをはじめとする脳血管疾患の治療に有用に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明において分離した幹細胞由来のエキソソームの形態をＳＥＭイメージ分析を通じて確認した図面。
【図２】本発明において分離した幹細胞由来のエキソソームでエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９が正常に発現するかを確認した図面。
【図３】本発明において分離した幹細胞由来のエキソソームで成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦが正常に発現するかを確認した図面。
【図４】神経細胞にトロンビンを処理した時、トロンビンの処理濃度および時間にともなう神経細胞の生存能を示した図面。
【図５】神経細胞にトロンビンを処理した後、本発明の幹細胞由来のエキソソームを処理した時、神経細胞の生存能を示した図面。
【図６】神経細胞にトロンビンを処理した後、本発明の幹細胞由来のエキソソームを処理した時、神経細胞の形態を観察した図面。
【図７】脳室内出血治療効果を確認するための動物実験デザインを示した図面。
【図８】ＩＶＨ誘導１、６および２８日後、脳ＭＲＩイメージ分析を通じて脳室拡張の程度を観察した図面。
【図９】ＩＶＨ誘導１、６および２８日後、脳ＭＲＩイメージ分析を通じて全体脳室の体積／全体脳の体積を求めた結果を示した図面。
【図１０】脳室内出血動物モデルで陰性走地性評価結果を示した図面。
【図１１】脳室内出血動物モデルでロータロッド評価結果を示した図面。
【図１２】脳室内出血動物モデルの脳組織でＴＵＮＥＬ  ＡＳＳＡＹ結果を示した図面。
【図１３】脳室内出血動物モデルの脳組織でＧＦＡＰ抗体を利用した免疫組織化学染色結果を示した図面。
【図１４】脳室内出血動物モデルの脳組織でＥＤ−１抗体を利用した免疫組織化学染色結果を示した図面。
【図１５】脳室内出血動物モデルの脳組織でＭＢＰ抗体を利用した免疫組織化学染色結果を示した図面。
【図１６】脳室内出血動物モデルの脳組織でＥＬＩＳＡを利用して炎症性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）の濃度を測定した結果を示した図面。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明は幹細胞由来のエキソソームを有効成分に含む脳血管疾患治療用薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明において、「幹細胞」とは、未分化な細胞であって、自己複製能力を有しつつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞である。
【００１６】
本発明の幹細胞は自家または同種由来の幹細胞であり得、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む任意の類型の動物由来であり得、前記幹細胞が成体から由来したものであれ胎芽から由来したものであれ、これに限定されない。
【００１７】
本発明の幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは成体幹細胞である。前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞または羊膜上皮細胞であり得、好ましくは間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤などから由来した間葉系幹細胞であり得るが、これに限定されない。
【００１８】
本発明で「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい小胞を意味する。エキソソームの直径は概略３０−１００ｎｍであり、多胞体と原形質膜の融合が起こり、細胞外環境に放出される小胞を意味する。
【００１９】
本発明で「脳血管疾患」は脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化症、クモ膜下出血、脳血栓症または脳塞栓症を含み、前記脳出血は好ましくは脳室内出血（ＩＶＨ、ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）であるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血（ＩＶＨ）動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、脳水頭症を減少させ、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な神経細胞保護効果を有している。
【００２１】
したがって、本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血などをはじめとする脳血管疾患の治療に有用に利用され得る。
【００２２】
本発明の組成物は幹細胞由来のエキソソームと共に脳血管疾患の治療効果を有する公知の有効成分を１種以上さらに含有することができる。
【００２３】
本発明の組成物は薬学的分野において通常の方法により個体の身体内投与に適合した単位投与型の製剤に剤形化させて投与することができる。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バッグのような注入剤、およびエアゾール製剤のような噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては生理食塩水、葡萄糖、リンガー液などを使うことができる。また、注入バッグは塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを使うことができる。
【００２４】
本発明の組成物は薬学的組成物の製造に通常的に用いられる適切な坦体をさらに含むことができる。例えば、注射剤の場合には保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、局所投与用製剤の場合には基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤または保存剤などをさらに含むことができる。
【００２５】
本発明の組成物は多様な経路で個体に投与することができる。すべての投与方式が予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与することができ、好ましくは、治療が必要な個体の脳室内に直接生着または移植することが可能であるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明の組成物は、脳血管疾患治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使うことができる。
【００２７】
また、本発明は個体に薬学的有効量の幹細胞由来のエキソソームを投与して脳血管疾患を治療する方法を提供する。
【００２８】
前記薬学的有効量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定され得るものであるということは当業者に自明なことである。特定個体に対する具体的な薬学的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によって、他の製剤が使われるかの可否をはじめとする具体的組成物、個体の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使われるか同時使用される薬品をはじめとする多様な因子と医薬分野に良く知られている類似因子によって異ならせて適用することが好ましい。
【００２９】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより簡単に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容は実施例によって限定されるものではない。
【００３０】
実施例１．幹細胞由来のエキソソームの分離
幹細胞由来のエキソソームを分離するために、超遠心分離機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を利用した。より具体的に、間葉系幹細胞を１×１０５細胞／ｍｌの濃度となるように希釈した後、６０ｍｍ培養皿に３ｍｌずつ分注して１週間の間培養した。培養皿に細胞がいっぱいに増殖したことを確認した後、５０Ｕ／ｍｌ濃度のトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）が希釈されている培養培地に取り替え、さらに２４時間の間培養した。その後、培養液を２ｍｌ遠心分離チューブに分けて入れて、４℃、１００００ｇで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。前記上澄み液を再び４℃、１００，０００ｇで２時間の間超遠心分離し、上澄み液を除去してエキソソームを分離した。
【００３１】
前記過程を通じて分離したエキソソームをＳＥＭイメージを通じて観察し、ウェスタンブロットを利用して公知のエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）の発現を確認した。また、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Ｐｒｏｃａｒｔａ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してエキソソーム内成長因子であるＨＧＦとＶＥＧＦの量を測定した。その結果をそれぞれ図１〜図３に示した。
【００３２】
図１に示した通り、前記のような方法を通じて収得されたエキソソームは約１００ｎｍ直径の球状を呈する正常な形態を示していることを確認した。
【００３３】
また、図２および図３に示した通り、前記のような方法を通じて収得されたエキソソームはエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９を正常に発現しており、エキソソーム内に成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦが存在することを確認した。
【００３４】
実施例２．幹細胞由来のエキソソームの神経細胞保護効果検証
前記実施例１で収得した幹細胞由来のエキソソームの神経細胞保護効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証するために、下記のような実験を遂行した。
【００３５】
２−１．トロンビン処理濃度確認
妊娠週齢１８．５日となった白ネズミから胎児を取り出して大脳皮質を分離した後、神経細胞を７日間培養した。培養された神経細胞にトロンビン処理濃度（１０〜８０Ｕ／ｍｌ）および時間（８または１６時間）を異ならせて細胞死滅を誘導した。Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して細胞生存能を測定した。その結果を図４に示した。
【００３６】
図４に示した通り、神経細胞にトロンビンを８０Ｕ／ｍｌの濃度で８時間処理したり、４０Ｕ／ｍｌの濃度で１６時間処理した時、神経細胞の生存率が５０％程度となることを確認し、この二つの条件でその後の実験を進めた。
【００３７】
２−２．神経細胞保護効果検証
前記実施例２−１と同じ方法でトロンビンを処理して細胞死滅が誘導された神経細胞に前記実施例１で収得した幹細胞由来のエキソソームを１５μｇ／ｍｌの濃度で１ｍｌを処理した後、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔを利用して細胞生存能を測定した。その結果を図５および図６に示した。
【００３８】
図５および図６に示した通り、トロンビンを処理して細胞死滅が誘導された神経細胞に本発明に係る幹細胞由来のエキソソームを処理する場合、神経細胞の死滅程度が顕著に抑制された。前記結果を通じて、幹細胞由来のエキソソームが神経細胞保護効果を有していることを確認した。
【００３９】
実施例３．幹細胞由来のエキソソームの脳室内出血動物モデルでの治療効果検証
前記実施例１で収得した幹細胞由来のエキソソームの脳血管疾患治療効果をｉｎ  ｖｉｖｏで検証するために、下記のような実験を遂行した。
【００４０】
３−１．脳室内出血動物モデルおよび実験デザイン
実験動物としては、雄ＳＤ白ネズミ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ、Ｏｒｉｅｎｔ  Ｃｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を利用し、実験は出生４日目（Ｐ４）から３２日（Ｐ３２）まで進行された。脳室内出血（ＩＶＨ）を誘導するために、Ｐ４の白ネズミを１．５％〜２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を利用して麻酔させた後、白ネズミの母親の微静脈から採取した２００μＬの血液をｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  （Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｆｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ、ＭｙＮｅｕｒｏｌａｂ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ：ｘ＝±０．５、ｙ＝＋１．０、ｚ＝＋２．５ｍｍ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｂｒｅｇｍａ）を利用してゆっくり両側の脳室内に投与した（右側、左側脳室にそれぞれ１００μｌずつ投与）。対照群（ＮＣ）の場合、血液を投与することなく同じ手術だけを遂行した。ＩＶＨ誘導１日後である、出生５日目（Ｐ５）白ネズミの脳を７−ｔｅｓｌａｒ  ＭＲＩを利用して撮影し、脳室内出血が正常に誘導されたかを確認した。ＩＶＨ誘導２日後である、出生６日目（Ｐ６）の白ネズミを１．５％〜２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を利用して麻酔させた後、食塩水（ｓａｌｉｎｅ）（ＩＣ）、２０μｇ間葉系幹細胞由来のエキソソーム（ＩＭ  ｅｘｏ）、または２０μｇ繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）由来のエキソソーム（ＩＦ  ｅｘｏ）を各白ネズミの右側脳室内にゆっくり投与した。ＩＶＨ誘導７および２８日後（Ｐ１１およびＰ３２）に白ネズミの脳ＭＲＩイメージを収得し、ＩＶＨ誘導２８日後に白ネズミを殺して脳組織を分析した。以上の具体的な実験デザインを図７に示した。
【００４１】
３−２．脳ＭＲＩイメージ分析
ＩＶＨ誘導１、７および２８日後に収得した白ネズミの脳ＭＲＩイメージを分析した。Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して脳室の拡張程度を分析し、全体脳室のｖｏｌｕｍｅ／全体脳のｖｏｌｕｍｅを求めた。その結果を図８および図９に示した。
【００４２】
図８および図９に示した通り、ＩＶＨ誘導によって白ネズミの脳室が拡張されて脳水頭症（ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）が誘発された反面、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群は顕著に脳水頭症の減少効果が現れたことを確認した。一方、繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群（ＩＣ）と有意な差が現れなかった。
【００４３】
３−３．感覚運動の行動評価
陰性走地性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｇｅｏｔａｘｉｓ）評価は従来の公知の方法にしたがって傾斜板の上に白ネズミの頭が下方を向くようにしておき、前記頭が傾斜面の上側を向くのに要される時間を記録することによって分析し、評価はＰ１１、Ｐ１８、Ｐ２５、およびＰ３２にそれぞれ遂行した。また、長期的な運動機能に及ぼす影響を分析するためのロータロッド（ｒｏｔａｔｏｄ）評価は従来の公知の方法にしたがってＰ３０からＰ３２まで連続して遂行した。その結果をそれぞれ図１０および図１１に示した。
【００４４】
図１０および図１１に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群と比べて有意に損傷された感覚運動機能を見せ、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群は陰性走地性およびロータロッド評価で、ともに好転した効果を示していることを確認した。
【００４５】
３−４．細胞死滅程度分析
実験終了後、脳を分離してパラフィンに包埋させた後、４μｍ厚さのパラフィンを除去した脳組織切片を製造した。脳室周囲の白色物質（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ）での細胞死滅を分析するために、ＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｙｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ｋｉｔ  Ｓ７１１０  ＡｐｏｐＴａｇ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を利用した免疫蛍光分析を遂行した。この時、脳ブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）で＋０．９５ｍｍ〜−０．１１ｍｍ位置（ｃｏｒｏｎａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）で三つのセクションを無作為で選定し、このうち顕微鏡で無作為部位をそれぞれ３回検査して、これらの平均値で統計的分析を施行した。その結果を図１２に示した。
【００４６】
図１２に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群と比べてＴＵＮＥＬ陽性細胞の数が大きく増加し、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群および繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群に比べて統計的に有意にＴＵＮＥＬ陽性細胞の数が少なく現れたことを確認した。これを通じて、間葉系幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血によって増加した脳細胞死滅を抑制する効果があることを確認した。
【００４７】
３−５．反応性神経膠症分析
反応性神経膠症（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｌｉｏｓｉｓ）の程度を分析するために、前記実施例３−４と同じ方法で収得した脳組織切片で従来の公知の方法にしたがってＧＦＡＰ（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ；１：１０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を利用して免疫組織化学分析を遂行した。その結果を図１３に示した
【００４８】
図１３に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群に比べてＧＦＡＰ染色程度が増加し、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群および繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群に比べて統計的に有意にＧＦＡＰ染色程度が低く現れたことを確認した。これを通じて、間葉系幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血によって増加した反応性神経膠症を減少させる効果があることを確認した。
【００４９】
３−６．活性化された小膠細胞分析
脳炎症反応で特徴的に観察できる活性化された小膠細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を分析するために、前記実施例３−４と同じ方法で収得した脳組織切片でＥＤ−１抗体（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｎｃｏｒｄ  Ｒｏａｄ、ＭＡ、ＵＳＡ；１：１００ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を利用して免疫組織化学分析を遂行した。その結果を図１４に示した
【００５０】
図１４に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群に比べてＥＤ−１陽性細胞の数が大きく増加し、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群および繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群に比べて統計的に有意にＥＤ−１陽性細胞の数が少なく現れたことを確認した。これを通じて、間葉系幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血によって増加した炎症細胞を減少させる効果があることを確認した。
【００５１】
３−７．髄鞘化分析
髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）の程度を分析するために、前記実施例３−４と同じ方法で収得した脳組織切片でＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ；１：１０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を利用して免疫組織化学分析を遂行した。その結果を図１５に示した
【００５２】
図１５に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群に比べてＭＢＰ染色程度が減少し、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群および繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群に比べて統計的に有意にＭＢＰ染色程度が高く現れたことを確認した。これを通じて、間葉系幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血によって損傷して減少した髄鞘化を好転させる効果があることを確認した。
【００５３】
３−８．炎症性サイトカイン分析
脳組織の均質懸濁液でＭｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を利用して炎症性サイトカインであるＩＬ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）−αの濃度を測定した。その結果を図１６に示した
【００５４】
図１６に示した通り、ＩＶＨ誘導群は正常群に比べて炎症性サイトカインの濃度が増加し、間葉系幹細胞由来のエキソソームを投与した群はＩＶＨ誘導群および繊維芽細胞由来のエキソソームを投与した群に比べて統計的に有意に炎症性サイトカインの濃度が減少したことを確認した。これを通じて、間葉系幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血によって増加した炎症反応を減少させる効果があることを確認した。
【００５５】
以上の実験結果を通じて、本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血（ＩＶＨ）動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、脳水頭症を減少させ、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な神経細胞保護効果を有しているため、脳室内出血などをはじめとする脳血管疾患の治療に有用に利用できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る幹細胞由来のエキソソームは脳室内出血（ＩＶＨ）動物モデルにおいて脳室の拡張を抑制し、脳水頭症を減少させ、神経細胞の死滅および炎症細胞を抑制するなどの優秀な神経細胞保護効果を有しているため、脳室内出血などをはじめとする脳血管疾患の治療に有用に利用され得る。
【図１】
2016540014.tif 000003
【図２】
2016540014.tif 000004
【図３】
2016540014.tif 000005
【図４】
2016540014.tif 000006
【図５】
2016540014.tif 000007
【図６】
2016540014.tif 000008
【図７】
2016540014.tif 000009
【図８】
2016540014.tif 000010
【図９】
2016540014.tif 000011
【図１０】
2016540014.tif 000012
【図１１】
2016540014.tif 000013
【図１２】
2016540014.tif 000014
【図１３】
2016540014.tif 000015
【図１４】
2016540014.tif 000016
【図１５】
2016540014.tif 000017
【図１６】
2016540014.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月10日(2016.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞および羊膜上皮細胞で構成された群から選択される１種以上の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される１種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記脳血管疾患は脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化症、クモ膜下出血、脳血栓症および脳塞栓症からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記脳血管疾患は脳室内出血（ＩＶＨ、ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）であることを特徴とする、請求項５に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記幹細胞がトロンビン処理されていることを特徴とする、請求項１に記載の脳血管疾患治療用薬学的組成物。
【国際調査報告】
2016540014.tif 000019
2016540014.tif 000020
2016540014.tif 000021
2016540014.tif 000022
2016540014.tif 000023
2016540014.tif 000024