(57)【要約】即時使用マスター混合物を提供する酵素組成物及びその使用方法を開示する。当該組成物は、以下のものと予め混合された、５'−３'及び３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠く改変好熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、並びに、反応緩衝液及びヌクレオシド三リン酸を含む、ＤＮＡの平滑化、リン酸化、及び単一ヌクレオチド伸長反応を１本のチューブ内で２段階で実施するために必要な他の構成成分すべて。他の利点の中でも、異なる酵素、緩衝液、及びヌクレオシド三リン酸の混合物は、長期保存中に安定である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド三リン酸を含む緩衝液と、ＤＮＡ断片の平滑化、リン酸化、及びアデニル化を別々に行うことができる複数の酵素とを単一容器内に含む酵素組成物であって、該組成物が４℃で少なくとも１週間安定であり、ＤＮＡアデニル化を行うことができる該酵素が好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼである、前記組成物。
【請求項２】
ＤＮＡ断片を平滑化及びリン酸化できる前記酵素が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼが、５'−３'及び３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼが、非特異的ＤＮＡ結合ドメインに融合されたテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の好熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼが、Ｓｓｏファミリー由来の非特異的ＤＮＡ結合ドメインに融合されたテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヌクレオシド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰであり、ここで、ｄＡＴＰの濃度範囲が０．４〜３ｍＭであり、ｄＣＴＰの濃度範囲が０．２〜０．６ｍＭであり、ｄＴＴＰの濃度範囲が０．２〜０．６ｍＭであり、かつｄＧＴＰの濃度範囲が０．１〜０．４ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ｄＡＴＰの濃度が約２ｍＭであり、ｄＣＴＰの濃度が約０．４ｍＭであり、ｄＴＴＰの濃度が約０．４ｍＭであり、かつｄＧＴＰの濃度が約０．２ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ＭｇＣｌ２；ＤＴＴ；ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＬｉＣｌより選択される１価金属塩酸塩；ＡＴＰ；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；グリセリン；ＮＰ ４０；ＥＤＴＡ；並びにＴｗｅｅｎ ２０からなる群より選択される少なくとも１種の成分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
存在する場合、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度範囲がｐＨ８．０〜８．８で１００ｍＭ以上１０５ｍＭ以下であり；ＭｇＣｌ２の濃度範囲が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下であり、ＤＴＴの濃度範囲が１５ｍＭ以上３０ｍＭ以下であり、１価金属塩酸塩の濃度範囲が２０ｍＭ以上５０ｍＭ以下であり、ＡＴＰの濃度範囲が１．５ｍＭ以上２．５ｍＭ以下であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度範囲が０．１％以上０．４％以下であり、グリセリンの濃度範囲が１０％以上２０％以下であり、ＮＰ ４０の濃度範囲が０．０５％以上０．１５％以下であり、ＥＤＴＡの濃度範囲が０．０２ｍＭ以上０．１ｍＭ以下であり、かつＴｗｅｅｎ ２０の濃度範囲が０．０５％以上０．１５％以下である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの濃度範囲が０．２Ｕ／μｌ以上０．５Ｕ／μｌ以下であり、クレノウ断片の濃度範囲が０．１Ｕ／μｌ以上０．２Ｕ／μｌ以下であり、かつＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼの濃度範囲が０．５Ｕ／μｌ以上１．５Ｕ／μｌ以下である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの濃度が約０．３２Ｕ／μｌであり、クレノウ断片の濃度が約０．１２Ｕ／μｌであり、かつＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼの濃度が約１Ｕ／μｌである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼの濃度範囲が０．１Ｕ／μｌ以上０．５Ｕ／μｌ以下である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼの濃度が約０．２Ｕ／μｌである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＫＣｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＡＴＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、グリセリン、ＮＰ ４０、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、及び、Ｓｓｏファミリー由来のＤＮＡ結合ドメインに融合されたテルムス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）またはテルムス ｓｐ．（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）由来の好熱性改変ＤＮＡポリメラーゼを単一容器内に含み、単一容器内に含有されて、保存安定性のある、酵素組成物。
【請求項１５】
ｄＡＴＰの濃度が、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰそれぞれの濃度の少なくとも５倍である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＤＮＡライブラリーを作製するための方法であって、該ＤＮＡライブラリーが３'末端及び５'末端をそれぞれ有するＤＮＡ断片を含み、該ＤＮＡ断片が該ＤＮＡ断片の該３'及び５'のそれぞれに結合した合成ＤＮＡアダプターを有し、前記方法が、
ＤＮＡ試料をせん断してＤＮＡ断片を作製する工程；
該ＤＮＡ断片を、請求項１に記載の組成物と単一容器内で混合する工程；
以下により、該単一容器内で該ＤＮＡ断片のＤＮＡ末端修復及びｄＡ尾部付加を実施する工程：
該単一容器の内容物を、該ＤＮＡ末端修復反応を促進する第１の反応条件に供すること、並びにその後に
該単一容器の内容物を、該ｄＡ尾部付加反応を促進しかつ該ＤＮＡ末端修復反応を不活性化する第２の反応条件に供すること、ここで、該ＤＮＡ末端修復反応は該ＤＮＡ断片の平滑化及びリン酸化を含み、かつ該ｄＡ尾部付加反応は、末端が修復されたＤＮＡ断片の３'末端に単一のｄＡを付加することによる該ＤＮＡ断片のアデニル化を含む、並びに
末端が修復されｄＡ尾部が付加されたＤＮＡ断片を、３'末端にｄＴ伸長部を有する合成ＤＮＡアダプターに連結させること
を含む、前記ＤＮＡライブラリーを作製するための方法。
【請求項１７】
前記第１の反応条件が、前記容器内容物を温度１８℃以上２２℃以下に５分以上１０分以下の時間供することを含み、前記第２の反応条件が、前記容器内容物を温度７２℃以上７５℃以下に１０分以上２０分以下の時間供することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の反応条件が、前記容器内容物を温度約２０℃に約５分間供することを含み、前記第２の反応条件が、前記容器内容物を温度７２℃に約１０分間供することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｄＡ尾部が付加されたＤＮＡ断片の収率が７５％を超える、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物と、請求項１６に記載の方法を実施するための指示書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年９月２５日に出願された米国特許出願第６１／８８２，４８０号、及び２０１３年１１月１５日に出願された第６１／９０４，５４３号に対する優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのハイスループットＤＮＡ塩基配列決定法（Ｎａｔｕｒｅ．  ４３７，３７６−３８０（２００５）（非特許文献1）；Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０９（２００５）  １７２８−１７３２（非特許文献2））は、普遍的な増幅反応に依存し、これにより、ＤＮＡ試料は無作為に断片化された後、異なる断片の末端すべてに同一ＤＮＡ配列が含有されるよう処理される。普遍的な末端を有する断片は、増幅用プライマー１組との単一反応で増幅させることができる。増幅を行う前に断片ライブラリーを単一分子レベルまで分離することで、増幅した分子は確実に個々の集団別に形成される。その後、これらの別個の集団をさらに分析することができる。このような分離は、エマルジョン中でも（Ｎａｔｕｒｅ．  ４３７，３７６−３８０（２００５）（非特許文献1）；Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０９，  ５７４１，  １７２８−１７３２（２００５）（非特許文献2））、または、表面上でも（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，  ｅ３４（１９９９）（非特許文献3）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８，  ｅ８７（２０００）（非特許文献4））実施可能である。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させるべき標的の末端にプライミング用ユニバーサル配列を加えることは、当業者に公知の多種多様な方法により達成可能である。例えば、普遍的配列をその５'末端に、また、縮重配列をその３'末端に含有しているユニバーサルプライマーを、ＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ、例えば、ＰＮＡＳ  ９３（１９９６）  １４６７６−１４６７９（非特許文献5））に使用して、複雑な標的配列または標的配列の複雑な混合物から断片を無作為に増幅させることができる。プライマーの縮重３'部分はＤＮＡの無作為な位置でアニーリングするため、それを伸長させて普遍的な配列をその５'末端に有する標的の複製物を生成することができる。
【０００４】
別法として、普遍的なプライミング配列を含有するアダプターを標的配列の末端に連結させることができる。アダプターは、一本鎖でも二本鎖でもよい。二本鎖アダプターは、突出末端を有してよく、または、平滑末端を有してよい。突出末端を有するアダプターは、制限エンドヌクレアーゼで消化させて作製した、または、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端転移酵素で付加された標的配列の突出末端に対し相補的である。平滑末端を有するアダプターは、ＤＮＡをせん断して断片化する過程で形成された、または当業者には公知の末端修復反応により形成された、やはり平滑末端である標的とともに使用される。
【０００５】
単一アダプターまたは２種の異なるアダプターを、標的配列とのライゲーション反応で使用してよい。標的に対し、その両端が同一、すなわちどちらも平滑である、若しくはどちらも同一の突出端であるように操作されている場合は、適合性のある単一アダプターのライゲーションを行えば、そのアダプターを両端に有する鋳型が生成されることになる。しかし、２種の適合性のあるアダプターであるアダプターＡ及びアダプターＢを使用する場合、連結産物の順列は３種、すなわち、両端にアダプターＡを有する鋳型、両端にアダプターＢを有する鋳型、及び、一端にアダプターＡを有し，もう一端にアダプターＢを有する鋳型が生成される。この最後の産物は、状況によっては、ライゲーション反応の唯一の所望産物であり、結果として、ライゲーション反応後、両端に同一アダプターを有するライゲーション産物を精製するためのさらなる精製工程が必要になる。
【０００６】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用ＤＮＡライブラリー調製のような、分子生物学を研究する多くの技術及び用途では、合成ＤＮＡアダプターを対象ＤＮＡ断片の両端に付加する必要がある。合成アダプターは、通常、以下の工程により付加される：（１）対象ＤＮＡ試料を物理的にまたは酵素によりせん断する、（２）得られたＤＮＡ断片を平滑化及びリン酸化する、（３）平滑化したＤＮＡ断片の３'末端をｄＡＴＰで選択的に１ヌクレオチドずつ伸長させる、（４）得られたＤＮＡ断片を、３'末端にｄＴＴＰ伸長部を有するアダプターに連結する。標的ＤＮＡ断片にｄＡ尾部を付加することで、これらの断片と他のＤＮＡ断片との分子内または分子間ライゲーションが妨げられ、期待構造断片の収率が向上する。
【０００７】
ＤＮＡ断片の末端修復／平滑化及びｄＡ尾部付加反応の双方を１本の管内で行うことが最近実現され、これによると、まず、ＤＮＡの平滑化及びリン酸化反応を低温で実施し、次に、かかる平滑化したＤＮＡ断片に高温で尾部を付加する。これと同様の方法で使用できるＮＧＳ試料調製キットが市販されている（ＮｘＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｌｕｃｉｇｅｎ；ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ製）；ＰｕｒｅＧｅｎｏｍｅ  ＨＥ  ＮＧＳ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ製））。しかしながら、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のみが、ＤＮＡ３'末端の末端伸長に使用する酵素、好熱性ＮｏｖａＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを開示している。他のサプライヤー２社は、製品の推奨使用方法を提供しており（６５〜７２℃でインキュベーション）、これによると、ｄＡ尾部付加段階にも好熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されると当業者には考えられる。表１は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、及びＬｕｃｉｇｅｎ各社のＤＮＡ末端修復及びｄＡ尾部付加反応用の市販の試薬及びプロトコルを示す。
【０００８】
（表１）商業サプライヤー各社のキットに使用される１本のチューブ内でのＤＮＡ末端修復及びｄＡ尾部付加の条件及び試薬。
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【０００９】
ＮＥＢ及びＬｕｃｉｇｅｎの製品は試薬セットとなっており、ＤＮＡ末端修復（平滑化及びリン酸化）及びｄＡ尾部付加反応に必要なすべての酵素をユーザーが合わせて単一混合物（酵素カクテル）にする。しかしながら、反応緩衝液は別々に提供されており、酵素と予め混合した即時使用「マスターミックス」ではない。ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ製キットには、ＤＮＡ末端修復及びｄＡ尾部付加反応用のすべての構成要素が別々のバイアルで提供されている。他のサプライヤーは、構成要素２つのワークフローを提案しており、まず、対象ＤＮＡ断片の平滑化及びリン酸化を行い、次いで、この第１段階での酵素を不活性化または除去してから、ｄＡ尾部を付加する酵素を加えるというものである。
【００１０】
多くのクローニングプロトコルで使用されるｄＡ尾部付加反応用の好ましい酵素として、一般に、特性が明らかな２種のポリメラーゼが推奨されている。すなわち、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている好中温性クレノウ断片変異体、または好熱性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。これらの酵素が持つ、余剰ヌクレオチドをＤＮＡ断片のＤＮＡ３'末端に付加するといった鋳型非依存性の合成能は当業者に公知である。
【００１１】
しかし、両酵素とも、特定の選択性を示すことが知られており、そのうち最も重要なのは、３'末端にピリミジン（ｄＴまたはｄＣ）があるＤＮＡ断片の３'末端の伸長が選択的に行われ、３'末端にプリン（ｄＡまたはｄＧ）があるＤＮＡ断片はわずか一部しか伸長されないことである。結果として、非効率的なｄＡ尾部付加反応の後に残った平滑ＤＮＡ断片が、分子間ライゲーション反応に関与することがあり、これにより、野生型ゲノムには存在しないハイブリッドＤＮＡ分子が形成されてしまう。このようなハイブリッド分子の３'末端にｄＡ伸長が含有される場合、末端にアダプター配列を付加してよく、その後、こうした分子を塩基配列決定反応に進めてよい。ライブラリー調製物にこのようなキメラ分子が多く含まれると、その後のゲノム配列アセンブリに困難または支障をきたす。ＮＧＳ用途においてキメラＤＮＡ分子があると、配列決定ゲノムのアセンブリに支障をきたし得る。したがって、ＮＧＳライブラリー調製に使用する、バイアスのかかっていないＤＮＡ断片末端修復／尾部付加のための、改善された酵素組成物が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nature. 437, 376-380(2005)
【非特許文献２】Science.309(2005) 1728-1732
【非特許文献３】Nucleic Acids Research 27, e34(1999)
【非特許文献４】Nucleic Acids Research 28, e87(2000)
【非特許文献５】PNAS 93(1996) 14676-14679
【発明の概要】
【００１３】
本開示の酵素組成物は、長期保存中に安定であったことに加え、ｄＡ尾部付加段階に従来から使用されている好熱性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び好中温性クレノウ断片ｅｘｏ−変異体と比較して、効率に優れ、バイアスも少なかった。本開示の組成物のｄＡ尾部付加反応に使用される酵素はキメラＤＮＡポリメラーゼであり、これは、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性も、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性も持たず、テルムス ｓｐ．（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）のＤＮＡポリメラーゼと非特異的ＤＮＡ結合領域とを融合させて作製される。本発明に使用するこのようなキメラＤＮＡポリメラーゼを作製するために好適なＤＮＡ結合領域は、超好熱性の古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＳｓｏ７ｄ塩基性染色体タンパク質及びＳ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のＳａｃ７ｄタンパク質を非限定的に含む、ＳｓｏファミリーＤＮＡ結合タンパク質由来のＤＮＡ結合領域からなる群より選択されてよい。一実施形態では、酵素は、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性も３'−５'エキソヌクレアーゼ活性も持たない非特異的ＤＮＡ結合領域（ｍｏｄ−Ｔｂｒ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＤｙＮＡｍｏ（商標）製品で使用の酵素例であり、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｔｖｉａ（ＭＳＣＬ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１３９７、識別のための表示：ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＲＡＴ５−ＤＩＶＯｐｔ）に寄託されている）と融合された、テルムス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、酵素は、ＭＳＣＬ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１３９６、識別のための表示：ＥＲ２５６６（ｐＬＡＴＥ５１−ｆｕｓｉｏｎ９））に寄託されている、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性も３'−５'エキソヌクレアーゼ活性も持たない非特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ｍｏｄ−Ｔａｑ）と融合されたテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼである。
【００１４】
一実施形態は、即時使用のマスター混合物（「マスターミックス」）で提供される、本開示の酵素組成物である。「マスターミックス」は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、並びに、反応緩衝液及びヌクレオシド三リン酸など、ＤＮＡ平滑化、リン酸化及びｄＡ尾部付加反応をワンチューブで２段階反応で実施するのに必要な他の構成要素すべてと予め混合したｍｏｄ−Ｔｂｒまたはｍｏｄ−Ｔａｑを含有し、ここで、ｄＡＴＰ濃度は、ｄＧＴＰ濃度より１０倍、また、ｄＴＴＰ濃度及びｄＣＴＰ濃度より５倍高い。異なる種類の酵素、緩衝液及びヌクレオシド三リン酸からなるこのような混合物は温度−２０℃での長期保存中でも安定である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例２に使用する、末端がそれぞれＧ、Ｃ、Ｔ、及びＡである二本鎖オリゴを示す。
【図２】図２は、さまざまな反応緩衝液中でクレノウ断片ｅｘｏ−で処理した図１の分離二重鎖オリゴが示す、ｄＡ尾部付加効率を示す。
【図３】図３は、ｐＨをさまざまに変えた各種反応緩衝液中でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで処理した図１の分離二重鎖オリゴが示す、ｄＡ尾部付加効率を示す。
【図４】図４は、基質濃度をさまざまに変えて、改変されたＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓのＤＮＡポリメラーゼで処理した図１の分離二重鎖オリゴが示す、ｄＡ尾部付加効率を示す。
【図５】図５は、一実施形態による単回反応混合物中でのＤＮＡ末端修復及び３'末端伸長を概略的に示す。
【図６】図６は、異なるポリメラーゼを使用した単回反応混合物中でのＤＮＡ末端修復及び３'末端伸長を示す。
【図７】図７は、一実施形態による記載組成物の安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態では、本開示の組成物は以下の構成要素を含む：
酵素：
１ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
０．３２ｕ／μｌ  Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ
０．１２ｕ／μｌクレノウ断片
０．２ｕ／μｌ  ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ
反応補因子及びヌクレオチド：
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２ｍＭ  ｄＡＴＰ
０．４ｍＭ  ｄＣＴＰ
０．４ｍＭ  ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ
２ｍＭ  ＡＴＰ
【００１７】
組成物のイオン強度及びｐＨは、１００ｍＭ〜１０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３及び１価金属塩酸塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌを使用して、２０ｍＭ〜５０ｍＭ範囲の濃度で調合してよい。一実施形態では、組成物は、以下の安定剤及び凍結保護剤、すなわち、２０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１２％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．０７％  ＮＰ ４０、０．０７％Ｔｗｅｅｎ ２０、及び０．０２４ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する。
【００１８】
一実施形態は、ＤＮＡ末端修復及び末端のヌクレオチド付加をエッペンドルフ型チューブ、９６ウェルプレートまたは酵素反応準備に使用される任意の他の液体用容器などの単一容器内で行う方法である。一実施形態では、ＤＮＡ末端修復は、末端が平滑化及びリン酸化されたＤＮＡ断片を作製することを含む。一実施形態では、ＤＮＡ断片を記載の組成物と単一容器内で混合し、かかるＤＮＡ断片のＤＮＡ末端修復及びヌクレオチド尾部付加をかかる単一容器内で実施する。一実施形態では、末端ヌクレオチドはアデノシンであり、これはＤＮＡ断片の３'末端に付加され、これをｄＡ尾部付加と呼ぶ。一実施形態では、単一容器の内容物を第１の反応条件に供してＤＮＡ末端修復反応を促進し、次に、その容器の内容物を第２の反応条件に供してｄＡ尾部の付加反応を促進し、かつ、ＤＮＡ末端修復反応を不活性化させ、ここで、ＤＮＡ末端修復反応は、ＤＮＡ断片の平滑化及びリン酸化を含み、ｄＡ尾部付加反応は、末端修復済みＤＮＡ断片の３'末端に単一ｄＡを付加することによるＤＮＡ断片のアデニル化を含む。一実施形態では、第１の反応条件は、単一容器の内容物を１８℃以上２２℃以下の範囲の温度に５分以上１０分以下の間供することを含み、第２の反応条件は、容器内容物を温度７２℃以上７５℃以下に１０分以上２０分以下の時間供すること含む。一実施形態では、第１の反応条件は、容器内容物を温度約２０℃に約５分間供することを含み、第２の反応条件は、容器内容物を温度約７２℃に約１０分間供することを含む。一実施形態では、ｄＡ尾部が付加されたＤＮＡ断片の収率は７５％を超える。
【００１９】
一実施形態では、方法は、ＤＮＡ末端修復を行う前にＤＮＡ断片を作製することをさらに含む。ＤＮＡ断片は、超音波霧化及び流体力学的せん断のような物理的にＤＮＡをせん断する方法、またはＤＮａｓｅＩまたは他のエンドヌクレアーゼを使用して酵素による消化で作製してよい。一実施形態では、ＤＮＡ試料は、ゲノムＤＮＡを含む。一実施形態では、方法は、尾部にヌクレオチドが付加されたＤＮＡ断片のいずれか一端または両端に合成ＤＮＡアダプターを結合させることによりＤＮＡライブラリーを作製することをさらに含んでよい。一実施形態では、方法は、末端が修復されｄＡ尾部が付加されたＤＮＡ断片を、その３'末端にｄＴ伸長を有する合成ＤＮＡアダプターに連結させることをさらに含む。
【００２０】
一実施形態は、本開示の組成物、並びに、１本のチューブ内でＤＮＡ平滑化及びｄＡ尾部付加を行うための本開示の方法を実施するための指示書を含有するキットである。一実施形態では、本開示の組成物は、０．５ｕ／μｌ〜１．５ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、０．２ｕ／μｌ〜０．５ｕ／μｌ  Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、０．１ｕ／μｌ〜０．２ｕ／μｌクレノウ断片、及び０．１ｕ／μｌ〜０．５ｕ／μｌ  ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ；反応補因子及びヌクレオチド：２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ０．４ｍＭ〜３ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ〜０．６ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ〜０．６ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ〜０．４ｍＭ  ｄＧＴＰ、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭ  ＡＴＰ；イオン強度及びｐＨ調整剤：１００ｍＭ〜１０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．８；１価金属塩酸塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、範囲２０ｍＭ〜５０ｍＭ；並びに、安定剤及び凍結保護剤：１５ｍＭ〜３０ｍＭ  ＤＴＴ；０．１％〜０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１０％〜２０％（ｖ／ｖ）グリセリン；０．０５％〜０．１５％ＮＰ ４０；０．０５％〜０．１５％Ｔｗｅｅｎ ２０；及び、０．０２ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
【００２１】
一実施形態では、本開示の組成物は、酵素：１ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、０．３２ｕ／μｌ  Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、０．１２ｕ／μｌクレノウ断片、及び０．２ｕ／μｌ  ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ；反応補因子及びヌクレオチド：２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、２ｍＭ  ＡＴＰ；イオン強度及びｐＨ調整剤：１００〜１０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１価金属塩酸塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、範囲２０ｍＭ〜５０ｍＭ；並びに、安定剤及び凍結保護剤：２０ｍＭ  ＤＴＴ；０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１２％（ｖ／ｖ）グリセリン；０．０７％ＮＰ ４０；０．０７％Ｔｗｅｅｎ ２０；及び、０．０２４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
【００２２】
以下の実施例を参照しつつ、あくまでも説明のため、本発明をさらに詳細に記載していく。
【実施例】
【００２３】
実施例１
異なる酵素には異なる緩衝液を要することの実証
至適な保存及び反応条件は、酵素ごとに固有であることは当技術分野で公知である。酵素保存条件は、以下のサプライヤー：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている、ＤＮＡ平滑化、リン酸化及びｄＡ尾部付加の各酵素の保存用及び反応用緩衝液の構成成分を示す表２で示されるように、推奨される反応条件とは異なることが多い。
【００２４】
（表２）ＤＮＡ断片の平滑化、リン酸化、及びｄＡ尾部の付加に使用される酵素の保存緩衝液（ＳＢ）及び反応緩衝液（ＲＢ）
2016535979.tif 000003
2016535979.tif 000004
【００２５】
本発明の組成物を達成するためには、上記のすべての酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、及び、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓまたはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼのような末端尾部付加活性を有する改変好熱性ポリメラーゼを、同じ容器内で単一段階で予め混合し、ＤＮＡ断片の平滑化、リン酸化、及びｄＡ尾部付加を効率的に行うことができる安定なブレンドにする必要がある。このことは決して些細なことではなく、当業者であっても、保存時に安定であり、酵素反応に使用した際に効率的な混合物を得るために、保存及び反応条件を大量に試験する必要があるであろうことに加え、至適な保存及び反応条件が得られる保証はないであろうことに留意されるのは重要なことである。こうした混合物の酵素は、至適要件が異なる場合があり、単一ブレンドには不適である。さらに、即時使用の１Ｘ−２Ｘ酵素混合物を調製する際、グリセリンなどの凍結保護剤を高濃度で使用することは、物理的及び化学的環境に影響を与えて反応条件が変わってしまい、酵素反応にマイナスの影響を与えるため不適当であることが多い。また、高濃度の凍結保護剤は、酵素活性に対し阻害作用がある場合がある。結果として、低濃度の凍結保護剤しか使用できず、酵素ブレンドの凍結予防には不十分なことが多い。したがって、凍結−融解サイクルを何度も行ううちに酵素が失活するリスクが非常に高い。１種の酵素に必要な添加物が、成分ブレンドの別の酵素の保存及び／または触媒活性に有害となることがある。同じことは、緩衝系に使用される塩類、その濃度、及び即時使用混合物のｐＨにも言える。一般に、即時使用混合物の安定性は、１価塩に対する耐性及び十分なイオン強度の存在により決定される。１価塩は、金属、例えば、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉが溶液中で正味１＋電荷を有する、任意の塩であってよい。
【００２６】
ＤＮＡ断片末端修復／ｄＡ尾部付加のための安定な酵素「マスターミックス」の調製では、本実施例で先に開示した情報とは対照的に、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｍｏｄ−Ｔｂｒまたはｍｏｄ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの各酵素、並びに、先に記載した他のすべての必要反応成分を含んでいる本開示の即時使用組成物により、１本のチューブ内でのＤＮＡ断片の平滑化、リン酸化及びｄＡ尾部付加を効率的に行うことができ、そのため、ｄＡＴＰが伸長されたＤＮＡ断片の収率が７５％を超える。本開示の組成物は、ＮＧＳライブラリー調製などＤＮＡ断片の調製に必要なピペット採取の段階数が、他の市販のＮＧＳ試料調製キットより少ないマスター混合物を提供する。ピペット採取の段階数が減ると、操作が少なく所要時間が短くてすみ、エラー発生が最小限になり、試料セットから得られる結果がより均一になるため、ＮＧＳライブラリー調製のワークフローが簡便化される。本開示の混合組成物では、非常に短い反応時間でＤＮＡ断片が修飾され、これによると、２０℃５分でＤＮＡ断片が平滑化及びリン酸化され、これらの断片の３'末端でのｄＡＴＰ付加は７２℃１０分で行われる。したがって、本開示の組成混合物を使用すると、両反応を合わせた所要時間はわずか１５分である。
【００２７】
本開示の組成物の一実施形態である、Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを試験した。Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、酵素、緩衝液、及び反応／保存に必要な他の構成成分を以下の２倍濃度及び比で含んでいた：１ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ；０．３２ｕ／μｌ  Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；０．１２ｕ／μｌクレノウ断片、及び０．２ｕ／μｌ  ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ。反応補因子及びヌクレオチドは、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．４ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．４ｍＭ  ｄＴＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；２ｍＭ  ＡＴＰであった。Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘのイオン強度及びｐＨは、１００ｍＭ〜１０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、及び１価金属塩酸塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌを２０ｍＭ〜５０ｍＭで使用して調合してよい。安定剤及び凍結保護剤は、２０ｍＭ  ＤＴＴ；０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１２％（ｖ／ｖ）グリセリン；０．０７％ＮＰ ４０；０．０７％Ｔｗｅｅｎ ２０；及び、０．０２４ｍＭ  ＥＤＴＡであった。
【００２８】
酵素ブレンドでの使用に好適な他の塩類及び安定剤は当業者には明らかになることに加え、平滑化及び／またはｄＡ尾部付加反応に使用する異なるＤＮＡポリメラーゼごとに異なり得る。
【００２９】
実施例２
平滑化、尾部付加、及びリン酸化に対する緩衝液及びポリメラーゼ組成物の効果
ＤＮＡ断片３'末端への尾部付加効率を試験し、３'末端ヌクレオチドに依存して発生し得るバイアスを分析するために、長さも３'末端ヌクレオチドも異なり、かつ、５'末端にＣｙ５で標識したオリゴ二重鎖系４モデルを作製して使用した（図１）。
【００３０】
クレノウ断片ｅｘｏ−変異体のｄＡ尾部付加能力を調べたものが図２に示されており、ここで、レーン（Ａ）は、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰを添加した至適なクレノウ断片緩衝液（１０×  反応緩衝液：ＥＰ０４２１）；レーン（Ｂ）は、１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．２ｍＭ  ｄＡＴＰを添加した市販の緩衝液Ｇ；及び、レーン（Ｃ）は、最適化されたＤＮＡ末端修復用緩衝液（Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ修復キット：Ｋ０７７１）。ｄＡ尾部付加反応を、図１のＣｙ−５標識化オリゴ二重鎖の等モル混合物７．５ｐｍｏｌを含有する反応混合物５０μｌ中で、５ユニットの酵素を使用して３７℃にて実施した。バンド対は、付加された単一ｄＡが付いているオリゴ二重鎖と付いていないオリゴ二重鎖を表す。
【００３１】
図２は、レーンＡ−１×  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液＋０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；レーンＢ−１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ添加１×  Ｇ緩衝液；及び、レーンＣ−１×  末端修復緩衝液を示す。
【００３２】
図２に表されている結果から、クレノウ断片ｅｘｏ−は、インキュベーションから３０分後でも、被験反応混合物全３種のいずれにおいてもオリゴヌクレオチドを均一に伸長させることはできず、３'末端にピリミジン（Ｃ／Ｔ）があるものの方が３'末端にプリン（Ａ／Ｇ）のあるものより効率的に伸長されたことが示唆された。さらに、クレノウ断片ｅｘｏ−によるｄＡ尾部付加は、酵素がＤＮＡ断片の平滑化及びリン酸化を行うのに至適であった（Ｃ）緩衝液中では効率が最も悪く、クレノウ断片には同緩衝液は最適下限であった。
【００３３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのｄＡ尾部付加能力を調べたものが図３に示されており、ここで、レーン（Ａ）は、最適化されたＤＮＡ末端修復用緩衝液ｐＨ７．５；レーン（Ｂ）は、ｐＨ８．０を除いてはＡと同一；及び、レーン（Ｃ）は、ｐＨ８．３、最適化緩衝液がＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  ＲｅｐａｉｒキットＫ０７７１の１０×  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘであることを除いてはＡと同一である。反応は、酵素７．５ユニットを使用して、図１に示すＣｙ−５標識化オリゴ二重鎖の等モル混合物７．５ｐｍｏｌを含有する反応混合物５０μｌ中で６０℃にて実施した。
【００３４】
図３中、Ａは、１×  末端修復緩衝液、ｐＨ７．５；Ｂは、１×  末端修復緩衝液、ｐＨ８．０；Ｃは、１×  末端修復緩衝液、ｐＨ８．３である。
【００３５】
図３に表された結果から、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、平滑化及びリン酸化反応に至適であるｐＨ７．５で３'末端ピリミジンに選択的に伸長したことが示唆された。ｐＨをｐＨ７．５からｐＨ８．３にしたところ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのｄＡ尾部付加の効率及び均一性に対しプラスの効果があった。ただし、３'末端にＧを有するオリゴヌクレオチドは、インキュベーションの２０分後でさえも、今回の実験で使用した他の基材に比べて伸長効率は低かった。
【００３６】
ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−）を用いた、反応条件を最適化する実験により、酵素は、ｄＡ尾部を付加するためには、ＴａｑポリメラーゼのようにｐＨが高い方を好むが、３'末端にＣまたはＴを有するＤＮＡ断片に対しては低い選択性を示す（図４参照）ことがわかった。ｄＡ尾部付加の優れた効率を確保するため、反応混合物をｄＡＴＰで濃縮し、その濃度を１ｍＭに高めた。平滑化及びｄＡ尾部付加をするべきＤＮＡ断片の量がさまざまである場合に同状況を模倣するために、高濃度ｄＡＴＰ（１ｍＭ）を使用してｐＨ８．３とした、最適化緩衝液（Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  ＲｅｐａｉｒキットＫ０７７１の１０×  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）中で、一定量（５ユニット）のｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、図１に示すオリゴ二重鎖の量を変えて実験を行った。
【００３７】
図４は、レーンＡ：二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物１．５ｐｍｏｌ；レーンＢ：二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物７．５ｐｍｏｌ；レーンＣ：二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物１５ｐｍｏｌ；レーンＤ：二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物２２．５ｐｍｏｌ；及び、レーンＥ：二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物３０ｐｍｏｌを示す。反応は、６０℃にて反応混合物５０μｌ中で１０分間実施した。
【００３８】
図４に表された結果は、ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼは、被験基材の広範な濃度においてＤＮＡ末端全種を効率的かつ均一に伸長したことから、クレノウ断片ｅｘｏ−及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの両酵素より優れていることを示している。
【００３９】
対照ＤＮＡ断片を使用して、単回反応混合物中でのＤＮＡ末端修復及びＤＮＡ３'末端尾部付加の両効率を試験した。ＤＮＡ断片は、３'末端及び５'末端に突出末端を有し、その５'末端でリン酸基を欠いた２６５ｂｐであり、Ｐｓｕｌ及びＰｓｔｌの開裂により作製した後、アルカリホスファターゼで処理した断片であった。このＤＮＡ基質は、ＤＮＡを物理的にせん断した後の状況を模倣しており、その場合、個々のＤＮＡ断片は、３'及び／または５'の突出末端を含み、かつ５'末端リン酸基を欠いていてもよい。
【００４０】
１μｇのＤＮＡ断片を、市販のＥｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ０７７１）及び５ユニットの好熱性ＤＮＡポリメラーゼ：ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ反応混合物５０μｌ中でインキュベートした。各反応混合物を２０℃で５分間インキュベートして、末端修復酵素でＤＮＡ断片の末端を平滑化及びリン酸化させ、その後、好中温性ＤＮＡ末端修復酵素の不活性化及び好熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ３'末端尾部付加を同時に行うのに好ましい条件である７２℃１０分間のインキュベーションを行った。この段階の後、長さが６０ｂｐで３'末端にｄＴ伸長を担持したＤＮＡアダプターを反応混合物に加えて最終濃度を１μＭとした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２２℃で５分使用してＤＮＡ断片にＤＮＡアダプターのライゲーションを達成し、得られた反応生成物を１％アガロースゲルで分析した。実験スキームを図５に示す。実験結果は図６に示されており、ここで、Ｄ１及びＤ２は、ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して調製した試料であり；Ｔ１及びＴ２は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して調製した試料であり；Ｆは、対照ＤＮＡ断片を表し；Ｌは、Ｏ'ＲａｎｇｅＲｕｌｅｒ  ５０  ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＭ０６１３）であり；Ａは、ＤＮＡ断片両端にアダプターが連結された３８１ｂｐの反応生成物（６０＋２６１＋６０ｂｐ）であり；かつ、Ｂは、ＤＮＡ断片の一端にアダプターが連結された３２１ｂｐの反応生成物（２６１＋６０ｂｐ）である。
【００４１】
図６に示すのは、レーンＤ１、Ｄ２−ＤｙＮＡｍｏＩＶ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して調製した試料；レーンＴ１、Ｔ２−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して調製した試料；Ｆ−対照ＤＮＡ断片；Ａは、ＤＮＡ断片の両端にアダプターが連結された３８１ｂｐの反応生成物（６０＋２６１＋６０ｂｐ）を示す；Ｂは、ＤＮＡ断片の一端にアダプターが連結された３２１ｂｐの反応生成物（２６１＋６０ｂｐ）を示す；Ｌ−Ｏ'ＲａｎｇｅＲｕｌｅｒ  ５０  ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＭ０６１３）である。
【００４２】
図６に表されている結果から、ｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼがより多くの適正構造の産物（断片Ａ）を生成したことが示され、このことは、この酵素がＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼより優れており、単回反応混合物中におけるＤＮＡ末端修復酵素との併用にいっそう適していたことを指している。平滑化されてからｄＡ尾部が付加された対照ＤＮＡ断片のみが、ｄＴを含むアダプターに連結できる。最も幅が広く優勢なバンドＡは、両端にアダプターが連結したＤＮＡ断片を表し、一方、小さな画分の対照ＤＮＡ断片Ｆのみがプロセスを受けずに残った。
【００４３】
これらのデータから、ＤＮＡ末端修復の効率とＤＮＡ３'末端ｄＡ尾部付加反応の効率は、これらの反応を異なる種類の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して単一反応混合物中で実施した場合には異なってくること、さらには、ｍｏｄ−Ｔｂｒを含む本発明の反応混合物は、上記反応に先で使用された他の組成物より効率の面で優れていることが示された。また、発明組成物を使用した際、平滑化ＤＮＡ断片のｄＡ尾部付加が不完全な状態で現われていたであろう、より大きなＤＮＡ断片の痕跡はなかったものが、その後に、それらの断片が連結されていることは注目に値する。
【００４４】
実施例３
２×  濃度のＥＮＤ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸの安定性
安定性試験のために、開示の２×  Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを、加速安定性試験の代表とするべく−２０℃及び＋２５℃で異なる期間保存した。図５に示す同一実験スキームを使用して安定性試験を実施した。１μｇの対照ＤＮＡ断片を、−２０℃で保存してあった１×  Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ反応混合物５０μｌ中で５分間インキュベートし、ＤＮＡ末端修復酵素でＤＮＡ末端を平滑化及びリン酸化させ、その後、好中温性ＤＮＡ末端修復酵素の不活性化、及びｍｏｄ−Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ３'末端尾部付加を同時に行うのに好ましい条件である７２℃１０分間のインキュベーションを行った。この段階の後、長さが６０ｂｐで３'末端にｄＴ伸長を担持したＤＮＡアダプターを反応混合物に加えて最終濃度を１μＭとし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して２２℃５分間のライゲーションを実施した。得られた反応生成物を１％アガロースゲルで分析した。結果を図７に示すが、ここで、Ａ１及びＡ２は、−２０℃で２週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料であり；Ｂ１及びＢ２は、＋２５℃で１週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料であり；Ｃ１及びＣ２は、＋２５℃で２週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料であり；Ｆは、対照ＤＮＡ断片であり；Ｌは、Ｏ'ＲａｎｇｅＲｕｌｅｒ  ５０  ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＭ０６１３）であり；Ａは、ＤＮＡ断片両端にアダプターが連結された３８１ｂｐの反応生成物（６０＋２６１＋６０ｂｐ）であり；また、Ｂは、ＤＮＡ断片の一端にアダプターが連結された３２１ｂｐの反応生成物（２６１＋６０ｂｐ）である。
【００４５】
図７に示されるのは、Ａ１、Ａ２−−２０℃で２週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料；Ｂ１、Ｂ２−＋２５℃で１週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料；Ｃ１、Ｃ２−＋２５℃で２週間保存したＥｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して調製した試料；Ｆ−対照ＤＮＡ断片；Ａ−ＤＮＡ両端にアダプターが連結された３８１ｂｐの反応生成物（６０＋２６１＋６０ｂｐ）；Ｂ−ＤＮＡの一端にアダプターが連結された３２１ｂｐの反応生成物（２６１＋６０ｂｐ）；Ｌ−Ｏ'ＲａｎｇｅＲｕｌｅｒ  ５０  ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＭ０６１３）である。
【００４６】
図７に表された結果は、Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘが＋２５℃で２週間、機能的活性を維持したことを指しており、このことから、長期保存期間中、安定であると見なされる。組成物は、少なくとも１週間は４℃で安定であった。さらに、図７に表されている結果から、Ｅｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、単一混合物において効率的な平滑化、リン酸化、及びｄＡ尾部付加を提供することが示された。
【００４７】
出願人らは、コンピュータで読取り可能なＴｈｅｒｍｏ＿Ｆｉｓｈｅｒ＿Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＿Ｂａｌｔｉｃｓ＿ＵＡＢ＿３３＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして識別される添付の「配列表」（ファイル作成日時：２０１３年９月２４日１２：２９Ｐ．Ｍ．、ファイルサイズ：２．０６キロバイト）に含まれる資料を参照により組み入れる。
【００４８】
明細書内で示され記載されている実施形態は、当業者である発明者らの具体的な実施形態にすぎず、いかなる方法でも限定するものではない。したがって、それらの実施形態に対するさまざまな変更、修正、または変形が、以下の請求項の範囲内で本発明の趣旨から逸脱することなく行われてよい。上記にてあげた参考文献は、その全体が参照により本明細書に明白に組み入れられたものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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