(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジー及び医学の分野に、より具体的には、機能性断片と輸送配列とを含むキメラペプチドの新規配列異型に関する。ここでは、該機能性断片は、配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列、並びに該配列に対する少なくとも60%の配列同一性を有するその相同配列を含む。本発明はさらに、配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列、並びに該配列に対する少なくとも60%の配列同一性を有するその相同配列によって表される、抗増殖活性を有する機能性ペプチドに関する。本発明はまた、腫瘍性疾患を治療するための先に言及したキメラペプチドの使用に、また抗増殖活性を有する医薬組成物の使用、及び腫瘍性疾患を治療するための方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への前記キメラペプチドの投与を含む前記方法に関する。本発明によって、標的細胞に効率的に浸透するかつ腫瘍細胞に対する高い細胞分裂停止及び細胞毒性効果を有する薬物製剤を開発することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%類似であるアミノ酸配列を含む機能性断片と、輸送配列とを含む、抗増殖活性を有するキメラペプチド。
【請求項２】
配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列を含む機能性断片と、輸送配列とを含む、抗増殖活性を有するキメラペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4を含む、前記ペプチドによって示される機能性断片を特徴とする、請求項1記載のキメラペプチド。
【請求項４】
配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%類似であるアミノ酸配列を含む、抗増殖活性を有する機能性ペプチド。
【請求項５】
配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗増殖活性を有する機能性ペプチド。
【請求項６】
タンパク質Antp又はタンパク質Tat由来の輸送配列を特徴とする、請求項1記載のキメラペプチド。
【請求項７】
悪性腫瘍を治療するための、請求項1記載のキメラペプチド。
【請求項８】
良性腫瘍を治療するための、請求項1記載のキメラペプチド。
【請求項９】
悪性腫瘍を治療するための、請求項4記載の機能性ペプチド。
【請求項１０】
良性腫瘍を治療するための、請求項4記載の機能性ペプチド。
【請求項１１】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項9記載のキメラペプチド:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項１２】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項9記載の機能性ペプチド:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項１３】
悪性腫瘍を治療するための、請求項1記載のキメラペプチドに基づく薬物。
【請求項１４】
良性腫瘍を治療するための、請求項1記載のキメラペプチドに基づく薬物。
【請求項１５】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項13記載の薬物:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項１６】
悪性腫瘍を治療するための、請求項4記載の機能性ペプチドに基づく薬物。
【請求項１７】
良性腫瘍を治療するための、請求項4記載の機能性ペプチドに基づく薬物。
【請求項１８】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項16記載の薬物:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項１９】
活性物質としての請求項1記載のキメラペプチド又は請求項4記載の機能性ペプチドと、医薬として許容し得る担体とを含む、抗増殖活性を有する医薬組成物。
【請求項２０】
以下の群から選択される、医薬として許容される追加の活性物質を含む、請求項19記載の医薬組成物:アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、白金誘導体、カンプトテシン誘導体、アルトレタミン、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、ダカルバジン、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、プロカルバジン、テモゾロミド、モノクローナル抗体、ホルモン、サイトカイン。
【請求項２１】
悪性腫瘍を治療するための、請求項19記載の医薬組成物に基づく薬物。
【請求項２２】
良性腫瘍を治療するための、請求項19記載の医薬組成物に基づく薬物。
【請求項２３】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項21記載の薬物:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項２４】
悪性腫瘍を治療するための、請求項20記載の医薬組成物に基づく薬物。
【請求項２５】
良性腫瘍を治療するための、請求項20記載の医薬組成物に基づく薬物。
【請求項２６】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項24記載の薬物:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項２７】
悪性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項1記載のキメラペプチド又は請求項4記載の機能性ペプチドの注射を含む、前記方法。
【請求項２８】
良性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項1記載のキメラペプチド又は請求項4記載の機能性ペプチドの注射を含む、前記方法。
【請求項２９】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項27記載の治療の方法:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項３０】
悪性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項19記載の医薬組成物の注射を含む、前記方法。
【請求項３１】
良性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項19記載の医薬組成物の注射を含む、前記方法。
【請求項３２】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項30記載の治療の方法:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【請求項３３】
悪性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項20記載の医薬組成物の注射を含む、前記方法。
【請求項３４】
良性腫瘍治療の方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への、医学的に許容される用量の請求項20記載の医薬組成物の注射を含む、前記方法。
【請求項３５】
以下の群から選択される悪性腫瘍を特徴とする、請求項33記載の治療の方法:結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明に関連する技術分野)
本発明は、バイオテクノロジー及び医学の分野に、より具体的には、機能性断片と輸送配列とを含むキメラペプチドの新規配列異型に関する。ここでは、該機能性断片は、配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列、並びに該配列に対する少なくとも60%の配列同一性を有するその相同配列を含む。本発明はさらに、配列番号:1〜配列番号:17の群から選択されるアミノ酸配列、並びに該配列に対する少なくとも60%の配列同一性を有するその相同配列によって表される、抗増殖活性を有する機能性ペプチドに関する。
【０００２】
本発明はまた、腫瘍性疾患を治療するための先に言及したキメラペプチドの使用に、また抗増殖活性を有する医薬組成物、及び腫瘍性疾患を治療するための方法であって、こうした治療を必要とする哺乳類への前記キメラペプチドの投与を含む前記方法に関する。本発明によって、標的細胞に効率的に浸透するかつ腫瘍細胞に対する高い細胞分裂停止及び細胞毒性効果を有する薬物製剤を開発することが可能になる。
【背景技術】
【０００３】
(従来技術の説明)
90年代初頭以来、毎年40万症例を超える悪性新生物が診断されている(M.I.Davydov、Y.M.Akselの文献、2008)。同時に、ヨーロッパでは、1985年から2002年までの期間の癌による年間死亡率は上昇し続けている。死亡原因の構成の中で、腫瘍性疾患は、心血管病態に次ぐ第二位を占めている。したがって、新規抗癌剤の探索は、最新の生物学及び医学の緊急性のある目的の一つである。
【０００４】
現在、分子生物学の成果に基づく新規抗癌剤の創出に、多くの研究が捧げられている(Richard J.P.らの文献、2003;Takeshima K.らの文献、2003;Jyotika A.らの文献、2005;B.P. Kopninの文献、2000)。一般に、新生細胞の基本的特徴は、細胞周期調節及びアポトーシスの侵害であることが受け入れられている(Chappuis P.O.、Kapusta L.の文献、2005)。細胞増殖過程の調節は、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ(CDK)の連続的活性化を介して制御されることが公知である。サイクリンキナーゼ活性は、それぞれのサイクリンの発現レベル及び特定のサイクリンキナーゼ阻害剤の活性によって決定される(Kastan М.B.、Bartek J.の文献、2004)。サイクリンキナーゼ阻害剤のいくつかのファミリーが存在する。最も研究されかつ実用的に重要であるのは、p16INK4a、p21CIP/KIP、p27 KIP1である(Lowe S.W.らの文献、2004)。サイクリンキナーゼ阻害剤遺伝子の変異又はプロモーターの高メチル化が、悪性リンパ腫、膵臓癌、及び他のいくつかの悪性新生物の40〜60％において認められる(Sawyers C.の文献、2004;Ortega S.らの文献、2002)。
【０００５】
これらの結果に基づいて、いくつかの低分子のサイクリンキナーゼ阻害剤が合成された。サイクリンキナーゼ阻害剤を創出するための別の可能な方式は、機能性配列及び相当する細胞内阻害剤を使用することによって提供することができる(Ziegler A.らの文献、2005)。p16 INK4タンパク質は、Cdk阻害剤群の最も興味深い候補の一つである(Xu D.らの文献、2004;Zhang Y.らの文献、2005)。p16INK4aタンパク質は、サイクリンD依存性キナーゼを、その結果、細胞周期のG1期の実行を阻害することが周知である(Fu G.H.らの文献、2005;Ben-Saadon R.らの文献、2004)。その機能は、広範な腫瘍性疾患において損なわれていることが示されている(Li J.Q.らの文献、2004)。最近、様々な起源の腫瘍の遺伝子治療のための遺伝子p16INK4a適用を記載している実験的研究が、発表されている(Lee A.W.C.、Li J-Hらの文献、2003;Liu S.X.、Tang S.Q.、Liang C.Y.の文献、2003;Zhang Y.、Liu J.らの文献、2005)。
【０００６】
ペプチド配列及び他の化学的性質の化合物(RNA、DNA)に関してベクター(輸送)機能を発揮することが可能である短いアミノ酸配列(n＝15〜30)の発見によって、天然のタンパク質増殖阻害剤の使用に関連する適用技術を探す更なる動機が与えられた(Fawell S.、Seery J.らの文献、1994;Vives E.、Brodin P.、Lebleu B.の文献、1997;Kaplan I.M.らの文献、2005;Gupta B.らの文献、2005;Fernandez-Carneado J.らの文献、2005)。
【０００７】
現在までに、科学者は、遺伝子送達法(遺伝子治療)に基づいて細胞内タンパク質の損なわれた機能を回復する上での問題点を解決することを試みた(G.P.Georgiyevの文献、2000;Wender P.A.らの文献、2000;A.Y.Baryshnikovの文献、2004)。しかし、この技術は、いくつかの本質的な問題点が原因で、まだ臨床に広範に適用されていない。
【０００８】
細胞膜を損傷することなく細胞に浸透することが可能なペプチドベクターの技術に基づく、この問題点を解決するための代替方法は、こうした化合物の弱い免疫原性、及びかなり大きな分子を運搬する能力のおかげで、非常に有望である。
【０００９】
細胞への標的ペプチド送達の可能性と、様々な細胞機能のタンパク質調節因子における短い機能性ドメインの検出との組み合わせによって、病原特性を有する分子の構造が、あらかじめ決定されている(Schutze-Redelmeier М.Р.らの文献、2004;Trehin R.、Merkle  Н.Р.の文献、2004;Cong-Mei Wuらの文献、2004)。こうした分子合成の相対的な容易さによって、これらに基づく新規の個々の化学療法薬物の創出の本質的可能性、すなわち、所与の腫瘍にとって典型的である病理学的変化に影響を与える薬物、を示唆する機会がもたらされる(Perea S.E.らの文献、2004)。
【００１０】
膜タンパク質の関与を伴わずに細胞に浸透することが可能であり、かつ関連するタンパク質断片及びオリゴヌクレオチドの細胞内輸送を行うペプチドの発見によって、生物学及び医学の発展の新たな段階が開ける。ペプチドpAntpは、大型分子を細胞に送達する、大型分子の有効な担体の一つである。その特性は、特に、Derossi D.らの刊行物「膜を通って移行するアンテナペディアホメオドメインの第三ヘリックス(The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes)」(J.Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450)、及びMorris MC.らの刊行物「哺乳類細胞における生物学的活性タンパク質送達のためのペプチド担体(A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells)」(Nat. Biotechnology. 19 (2001) 1173-1176)から周知である。
【００１１】
本発明者によれば、本発明に最も近い対応特許は、特許US 6569833 B1(Cyclacel Limited社、GB)である。この文献は、サイクリンキナーゼに結合し、かつ完全鎖長タンパク質p16のアミノ酸残基84-103を含み、かつシステイン残基間に現れるジスルフィド結合(これは、ペプチドp16のC-末端とペプチドAntpのN-末端とを付着させる)を介して送達タンパク質ペネトラチンの配列と組み合わせることができるペプチドを記載している。こうした方法の欠点は、キメラ分子の選択的かつ多段階の合成を必要とすることであり、このことは目的生成物を生成するスキームを複雑にし、かつ合成に必要な全体時間を長くする。
【発明の概要】
【００１２】
(発明の概要)
本発明は、バイオテクノロジー及び医学に関する。
【００１３】
本発明の目的は、複雑で労力を要する生成スキームを必要としない、治療効果が増大された新規のキメラペプチドを創出することである。本発明の技術的結果は、結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、悪性リンパ腫、及び乳腺線維腺腫などの疾患の腫瘍細胞に対する他の類似のペプチドと組み合わせた前記キメラペプチドの顕著な細胞毒性作用として客観的に現れる改善された生物医学的効果であり、さらに、段階の数の減少によるキメラペプチダーゼ生成の簡単さにも留意するべきである。第2の技術的結果は、腫瘍性疾患の治療のための薬物の数を増やすことによって提供される。さらに、本発明者は、前記キメラペプチドと、既存の化学療法抗腫瘍薬物(エトポシド、タキソール、5-フルオロラシル(5-Fluororacil))との組み合わせ使用の場合の顕著な相乗効果を、突然発見した。
【００１４】
これらの技術的結果は、機能性断片と輸送配列とを含有する、抗増殖効果を有するキメラペプチドを得ることによって実現する。ここでは、機能性断片は、アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4又は配列番号:5又は配列番号:6又は配列番号:7又は配列番号:8又は配列番号:9又は配列番号:10又は配列番号:11又は配列番号:12又は配列番号:13又は配列番号:14又は配列番号:15又は配列番号:16又は配列番号:17、及びこれらの配列に対する60%又はそれ以上の相同配列を含む。
【００１５】
本発明の一実施態様内では、本発明は、アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4配列番号:5又は配列番号:6又は配列番号:7又は配列番号:8又は配列番号:9又は配列番号:10又は配列番号:11又は配列番号:12又は配列番号:13又は配列番号:14又は配列番号:15又は配列番号:16又は配列番号:17、これらの配列に対する60%又はそれ以上の相同配列を含む、抗増殖活性を有する機能性ペプチドに関する。
【００１６】
本発明の他の実施態様内では、本発明は、薬物を生成するための、腫瘍性疾患を治療するのに適応される前記キメラペプチドの使用に関する。
【００１７】
本発明のある好ましい実施態様内では、本発明は、アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4によって示される機能性ペプチドを含むキメラペプチドに関する。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施態様内では、本発明は、アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4によって示される機能性ペプチドに関する。
【００１９】
本発明のある好ましい実施態様内では、本発明は、結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫を含む群から選択される悪性腫瘍を治療するために使用することができるキメラペプチドに関する。
【００２０】
最も好ましい実施態様内では、キメラペプチドは、結腸直腸癌を治療するために使用することができる。
【００２１】
好ましい実施態様内では、前記薬物は、結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫、及び悪性リンパ腫を含む群から選択される悪性腫瘍を治療するために使用することができる。
【００２２】
他の実施態様内では、本発明は、前記キメラペプチド又は機能性ペプチドを、活性な物質として、医薬として許容し得る担体と組み合わせて含む、抗増殖活性を有する医薬組成物に関する。
【００２３】
他の実施態様内では、本発明は、2種の活性な物質(1つは、前記キメラペプチド又は機能性ペプチドであり、第2のものは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、白金誘導体、カンプトテシン誘導体、アルトレタミン、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、ダカルバジン、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、プロカルバジン、テモゾロミド、モノクローナル抗体、ホルモン、サイトカインを含む群から選択される化学療法抗腫瘍薬物である)を含む、抗増殖活性を有する医薬組成物に関する。
【００２４】
好ましい実施態様内では、抗増殖活性を有する前記医薬組成物の第2の活性物質は、エトポシド、タキソール、及び5-フルオロラシル(5-Fluororacil)を含む群から選択される化学療法抗腫瘍薬物であり得る。
【００２５】
他の実施態様内では、本発明は、前記キメラペプチド若しくは医薬組成物、又は薬物の、こうした治療を必要とする哺乳類への投与を含む、腫瘍性疾患治療計画に関する。
【００２６】
先に言及した計画の好ましい実施態様内では、腫瘍性疾患は、結腸直腸癌、腎癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、及び卵巣癌を含む群から選択される
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「キメラペプチド」には、キメラ分子内に、追加のアミノ酸残基(1から50)を含めた、2つの断片を結合する任意の長さの配列によって機能性断片及び送達断片を結合している限定された配列を含む、ペプチドが含まれ、同時に、アミノ酸配列の送達は、X基(ここでは、Xは、1から50個のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列によって示される)を介して、前記機能性配列のC末端に、選択的に付着させることができる。キメラペプチド生成の方法としては、RU2297241, 22.11.2004及びRU2435783, 29.09.2010に記載されている固相方法、並びに、RU2297241, 22.11.2004及びRU2435783, 29.09.2010に記載されている遺伝子工学的方法が挙げられる。これらのキメラペプチド特性の研究は、RU2435783に記載されている。
【００２８】
(研究する内在化ペプチドの構造)
【化１】
2016520547.tif 000002
ペプチド1〜3は、機能性部分p16INK4aと内在化配列pAntpからなるが、これらは、分子のN-、C-末端に対する機能群の位置の点で、並びに、ペプチド3(遺伝子工学の助けを借りて得られる)に関しては挿入部の存在の点で異なる。
【００２９】
ペプチドp16_pAntp(1〜2)は、機能群p16INK4aの位置の点で異なり:ペプチド1-p16INK4aは分子のС-末端に、ペプチド2-p16INK4aはΝ-末端に位置し、これらのペプチドは、固相合成の助けを借りて得られる。遺伝子工学の助けを借りて得られるキメラペプチドp16_pAntp(3)の場合、機能群p16INK4aは、Ν-末端に位置するが、44 AKO由来の挿入部が存在する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「機能性断片」は、アミノ酸配列・配列番号:1又は配列番号:2、又は配列番号:3、又は配列番号:4 配列番号:5又は配列番号:6又は配列番号:7又は配列番号:8又は配列番号:9又は配列番号:10又は配列番号:11又は配列番号:12又は配列番号:13又は配列番号:14又は配列番号:15又は配列番号:16又は配列番号:17、並びにこれらの配列に対する60%以上の相同体を含めて、記載した機能の実行を目的とする任意のサイズ、又は任意の構造、又は任意の分子の、任意のポリペプチド配列を表す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「抗増殖活性」には、サイクリンキナーゼ阻害剤、又はサイクリンキナーゼ阻害剤を含む組成物が、悪性及び良性腫瘍細胞に対する細胞分裂停止及び細胞毒性効果を有する能力が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「輸送配列」には、任意の輸送配列が含まれる。任意の輸送配列を使用し、主張する機能性配列を提供し、任意の大きさの他の任意のポリペプチド配列、又は任意の他の構造若しくは分子内に含有させ、本明細書に記載する機能を果たすことができる。サイクリンキナーゼ阻害剤を標的細胞に運ぶための送達因子として、ペプチドVP22(pAntp)、単純ヘルペスウイルスの配列、例えば、
【化２】
2016520547.tif 000003
も使用することができる。ペプチドTat配列についても同様である。Tatは、AIDSにおけるトランス活性化機能を果たすタンパク質である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」には、キメラペプチド又は機能性ペプチドを含有する、かつ医薬として許容し得る担体も含有することができる組成物が含まれる。経口投与の目的では、医薬として許容し得る担体には、結合物質、湿潤剤、崩壊剤、充填剤、可溶化剤、分散剤、安定剤、懸濁化剤、着色料、及び芳香剤が含まれ得る。注射可能製剤については、医薬として許容し得る担体には、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張剤、及び安定剤が含まれ得る。局所製剤については、医薬として許容し得る担体には、基剤(base)、充填剤、滑沢剤、及び保存剤が含まれ得る。本発明の医薬組成物は、前述の医薬として許容し得る担体を使用する、様々な薬物形態で調製することができる。例えば、経口投与については、医薬組成物は、錠剤、香錠、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、又はウェーハの形態で調製することができる。注射によって投与される薬物については、医薬組成物は、複数回投与のための薬物を含有するバイアル、又は単回投与のためのアンプルなどの、単一剤形に製剤化することができる。医薬組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、カプセル、及び持続放出製剤として製剤化することができる。
【００３４】
一方、医薬製剤を製造するのに適した担体、充填剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギナート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油が挙げられる。さらに、医薬製剤は、充填剤、抗凝血薬、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤を含有することができる。
【００３５】
一般に、担体として使用される発明された薬物物質の用量は、治療する疾患の種類、投与の型、患者の年齢、性別、及び体重、疾患の重さ、並びに活性な薬物物質の種類を含めた、いくつかの因子に応じて確立することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル化剤」には、以下が含まれる:
1.スルホン酸アルキル(ブスルファン、トレオスルファン)。
2.エチレンイミン(チオテパ)。
3.ニトロソウレア誘導体(カルムスチン、ロムスチン、ムストホラン(Mustophoran)、ニムスチン、ストレプトゾシン)、
4.クロロエチルアミン(ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、トロホスファミド)。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「代謝拮抗剤」には、以下が含まれる:
1.葉酸アンタゴニスト(メトトレキサット(Methotrexat)、ラリトレキセド(Ralitrexed))。
2.プリンアンタゴニスト(クラドリビン(Cladribin)、フルダラビン(Fludarabin)、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン(Tioguanin))。
3.ピリミジンアンタゴニスト(シタラビン、5-フルオロラシル(5-Fluororacil)、カペシタビン、ゲムシタビン)。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「植物アルカロイド」には、以下が含まれる:
1.ポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)。
2.タキサン(ドセタキセル、パクリタキセル)。
3.ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン(Vinorelbin)。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「抗腫瘍抗生物質」には、以下が含まれる:
1.アントラサイクリン(ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン(Mitoxantron)。
2.他の抗腫瘍抗生物質(ブレオマイシン(Bleomicin)、ダクチノマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン)。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「白金誘導体」には、以下が含まれる:カルボプラチン、シスプラチン(Cysplatin)、オキサリプラチン。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「カンプトテシン誘導体」には、以下が含まれる:イリノテカン、トポテカン。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」には、以下が含まれる:エデルコロマブ(Ederkolomab)、リツキシマブ、トラスツズマブ。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「ホルモン」には、以下が含まれる:
1.抗アンドロゲン(ビカルタミド、酢酸シプロテロン、フルタミド)。
2.抗エストロゲン(タモキシフェン、トレミフェン、ドロロキシフェン(Droloxiphen))。
3.アロマターゼ阻害剤(ホルメスタン、アナストロゾール、エキセメスタン)。
4.プロゲスチン(酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール)。
5.LH-RHアゴニスト(ブセレリン、ゴセレリン、酢酸リュープロリン(Leuprolin acetate)、トリプトレリン)。
6.エストロゲン(ホスフェストロール(Phosphoestrol)、ポリエストラジオール)。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「サイトカイン」には、以下が含まれる:
1.成長因子(フィルグラスチム、レノグラスチム、モルグラモスチム、エリスロポエチン、トロンボポエチン)。
2.インターフェロン(a-インターフェロン、p-インターフェロン、y-インターフェロン)。
3.インターロイキン(インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-П)。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍性疾患」には、悪性及び良性腫瘍が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
(図面の簡単な説明)
【図１】図1は、異なる濃度のペプチドD37K、F26K-1、及びW26K-1の、細胞培地への注入時の、血液単核球のアポトーシスレベル(アネキシン陽性粒子)の変化(平均値)である。インキュベーション時間24時間。
【図２】図2は、健常ドナーの血液単核画分細胞の、異なる濃度の研究ペプチド配列D37K、F26K-1、及びW26K-1とのインキュベーション時の、「生きている」/無傷細胞の数の変化である。インキュベーション時間24時間。
【図３】図3は、研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、細胞培養株HCT-116のアポトーシスレベルの変化である。インキュベーション時間24時間。
【図４】図4は、研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、細胞培養株MCF-7のアポトーシスレベルの変化である。インキュベーション時間24時間。
【図５】図5は、ヨウ化プロピジウムを含む死細胞の数の変化(培養株HCT-116、研究ペプチド配列とのインキュベーション-24時間)である。ペプチド濃度-5μM、10μM、20μM、40μM。
【図６】図6は、ヨウ化プロピジウムを含む死細胞の数の変化(培養株MCF-7、研究ペプチド配列とのインキュベーション-24時間)である。ペプチド濃度-5μM、10μM、20μM、40μM。
【図７】図7は、研究ペプチド配列との24時間のインキュベーション時の、培養株HCT-116における生細胞の相対数の変化である。基準試料中の生細胞の数を、100%とみなす(20μM DMSO);研究ペプチドの濃度は、5μM、10μM、20μM、40μMを含んでいた。
【図８】図8は、研究ペプチド配列との24時間のインキュベーション時の、培養株MCF-7における生細胞の数の変化である。研究ペプチドの濃度は、5μM、10μM、20μM、40μMを含んでいた。
【図９】図9は、MCF-7及びHCT-116株の活性な増殖性細胞の、10及び40μMの濃度のペプチド配列D37K、F26K-1、F26K-2、W26K-1、W26K-2との24時間のインキュベーション時の、S及びG2/M期内の細胞の数の変化である。
【図１０】図10は、同調させた培養株の、40μMの濃度の研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、培養株HCT-116における細胞周期のG0/G1期の細胞レベルの変化である。
【図１１】図11は、同調させた培養株の、40μMの濃度の研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、培養株MCF-7における細胞周期のG0/G1期の細胞レベルの変化である。
【図１２】図12は、同調させた培養株の、40μMの濃度の研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、培養株A549における細胞周期のG0/G1期の細胞レベルの変化である。
【図１３】図13は、同調させた培養株の、40μMの濃度の研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、培養株A549における細胞周期のS期の細胞レベルの変化である。
【図１４】図14は、40μMの濃度のペプチド配列F26K-1、W26K-1、及びD37Kとの0、4、6、及び8時間のインキュベーション時の、細胞培養株A549のS期のレベルの差である。
【図１５】図15は、SKOV株細胞の、研究ペプチド配列との24時間のインキュベーション時の、細胞周期のG0/G1期の細胞レベルの変化である。
【図１６】図16は、SKOV株細胞の、研究ペプチド配列との24時間のインキュベーション時の、細胞周期のS+G2/M期の細胞の数の変化である。
【図１７】図17は、研究ペプチドとの24時間のインキュベーション時の、DNA-ヒストグラム上での低二倍体(hypodiploid)ピークとして推定される、細胞培養株SKOVのアポトーシスレベルの変化である。ペプチド濃度は、5μM、10μM、20μM、30μM、40μMを含んでいた。培養株は、枯渇培地を用いて、G0/G1期に予備的に同調させた。
【図１８】図18は、配列D37K、F26K-1、F26K-2、W26K-1、及びW26K-2とのインキュベーション時の、HCT-116株細胞におけるタンパク質Bcl-2のレベルの変化である。インキュベーション時間24時間。Bcl-2レベルの変化を研究した後、ペプチドD37K及びW26K-1が、24時間かつ40μMのペプチド濃度でのインキュベーション時に、培養株におけるBcl-2陽性細胞のレベルを5%低下させる最小の効果を有することが判明した。ペプチドW26K-2及びF26K-1は、Bcl-2レベルを、15%より大きく低下させた。
【図１９】図19は、研究ペプチド配列D37K、F26K-1、F26K-2、W26K-1、及びW26K-2とのインキュベーション時の、培養株MCF-7におけるリン酸化pRbのレベルの変化である。インキュベーション時間24時間、ペプチド濃度:A-10μM、B-40μM。
【図２０】図20は、研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、細胞培養株HCT-116における「低リン酸化(under-phosphorylated)」pRbのレベルの変化である。A-ペプチド濃度-10μM、B-ペプチド濃度-40μM。
【図２１】図21は、研究ペプチド配列とのインキュベーション時の、細胞培養株SKOVにおける「低リン酸化」pRbのレベルの変化である。A-ペプチド濃度-10μM、B-ペプチド濃度-40μM。
【図２２】図22は、HCT-116死細胞数の、薬物濃度(エトポシド、タキソール)に対する依存性である。MTT-分析の助けを借りて、細胞毒性効果を記録した。インキュベーション時間は、24時間、薬物濃度は、1、10、及び30μMであった。
【図２３】図23は、HCT-116死細胞数の、内在化配列(F26K-1、D37K)の濃度に対する依存性である。MTT-分析の助けを借りて、細胞毒性効果を記録した。インキュベーション時間は、24時間、配列濃度は、1、10、及び30μMであった。細胞毒性効果は、ペプチドF26K-1について、より有意であるように思われ、濃度依存性が存在する。
【図２４】図24は、配列D37Kと薬物(タキソール、エティポシド(Etiposide))との、HCT-116細胞に対する組み合わせ効果(濃度-1、10、及び30μM、インキュベーション時間-24時間)である。
【図２５】図25は、1、10、及び30μMの濃度の配列F26K-1と、同じ濃度のエトポシドとの、HCT-116培養株に対する組み合わせ効果である。インキュベーション時間-24時間、方法-MTT-分析。
【図２６】図26は、1、10、及び30μMの濃度の配列F26K-1と、同じ濃度のタキソールとの、HCT-116培養株に対する組み合わせ効果である。インキュベーション時間-24時間、方法-MTT-分析。
【図２７】図27は、MCF-7に対する、タキソールと配列D37K(A)及びF26K-2(B)との組み合わせ効果の研究である。調製物濃度-10、20、30μM、インキュベーション時間-24時間。
【図２８】図28は、MCF-7に対する、5-フルオロウラシルと配列D37K(A)及びF26K-2(B)との組み合わせ効果の研究である。調製物濃度-10、20、30μM、インキュベーション時間-24時間。
【図２９】図29は、ペプチド配列(A)との細胞インキュベーション時のН460培養株におけるアポトーシスレベルの変化、及び、エトポシドと配列(B)との組み合わせ効果である。インキュベーション時間-24時間、PI染色、固定試料。
【図３０】図30は、ペプチド配列(A)との細胞インキュベーション時のН460培養株におけるアポトーシスレベルの変化、及び、エトポシドと配列(B)との組み合わせ効果である。インキュベーション時間-24時間、アネキシンV-PI染色。
【図３１】図31は、ペプチド配列との細胞インキュベーション及び10μMの濃度のエトポシドとの予備インキュベーション時のН460培養株におけるアポトーシスレベルの変化。ペプチドとのインキュベーションの時間-24時間、アネキシンV-PI染色。
【図３２】図32は、ペプチド配列との細胞インキュベーション及び10μMの濃度のエトポシドとの予備インキュベーション時のН460培養株におけるアポトーシスレベルの変化である。ペプチドとのインキュベーションの時間-24時間、試料の予備固定を伴うPI染色。
【図３３】図33は、時間の経過における細胞A549におけるタンパク質pAntp_pl6の分布である。タンパク質添加の1、15、及び30分後。Leica社のレーザー走査型顕微鏡。
【図３４】図34は、キメラ内在化ペプチドAntp_pl6の腫瘍への注射時の、胸腺摘出マウスの細胞接種した腫瘍体積の変化である。マウスには、細胞培養株A549を接種し、0.1及び0.2mgの用量のペプチドAntp_pl6を注射した。
【図３５】図35は、キメラ内在化ペプチドAntp_pl6の腫瘍への注射時の、胸腺摘出マウスの細胞接種した腫瘍体積の変化である。マウスには、HCT-116細胞を接種し、ペプチドは、0.1mgの用量で注射した。
【図３６】図36は、研究される内在化ペプチドP16_Antpの7回目の注射時の被験動物の写真である。A及びB-細胞A549が移植されたマウスの写真。A-試験の16日目の対照群からのマウス;腫瘍は6.0×7.0mmの大きさである。B-0.1mg P16_Antpを注射した、試験の16日目の試験群からのマウス;腫瘍は、3.0×3.0mmの大きさであった。図C及びD-細胞HCT-116が移植されたマウス。С-腫瘍細胞移植後の18日目の対照群からのマウス(腫瘍は、11.5×13.5mmの大きさであった)。D-0.1mg P16_Antpの7回の注射後の試験群からのマウス;腫瘍は、4.5×4.5mmの大きさであった。
【図３７】図37は、乳房細胞の2パラメータサイトグラムである。X軸-PI染色、Y軸-サイトケラチン(cytokeratine)染色。「サイトケラチン(cytokeratine)陽性アポトーシス」領域を、矢印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
(発明の実施態様)
【表１】
2016520547.tif 000004
【実施例】
【００４８】
(実施例1.末梢血の非分裂単核球に対するペプチド配列D37K、F26K-1、及びW26K-1の効果の研究)
配列D37K、F26K-1、及びW26K-1について、非分裂血液細胞に対する細胞毒性効果を評価するために、健常ドナーの白血球の単核画分に対して、いくつかの試験を実施した。この目的のために、本発明者らは、密度勾配р=1.007を用いて抗凝血薬(EDTA)を用いて全静脈血から単核画分を分離し、これらの細胞をPBSで洗浄し、1mlあたり150,000個の量で24ウェルプレートに入れた。本発明者らは、この細胞懸濁液に、研究ペプチドを10、20、30、40、50、及び60μMの濃度で添加し、ペプチドをPBSに溶解した。RPMI培地(10% PBS)中で、37℃及び5% CO2で、24時間、インキュベーションを続けた。
【００４９】
インキュベーション後、細胞をマイクロバイアルに採取し、培地を洗浄し、この試料を、製造業者の方法を使用して抗体アネキシンV(Recombinant Human Annexin V FITC複合体)、CALTAG Laboratories、U.S.A.)及びPIを使用して染色した。これらの結果を、Becman Coulterフローサイトメーターを使用して評価した。
【００５０】
研究されたペプチド配列は、アポトーシスを誘導する能力があることが示された(図1);注射されるペプチドの量に対する、血液単核球のアポトーシスレベルの、明確に表される濃度依存性が存在し、3つの研究された配列に関して、アポトーシス値は近い。アネキシンV/PIでの染色中の無傷細胞/非染色細胞の数として評価される生細胞の量は、研究されるペプチドとのインキュベーション中に急激に低下し、これは、細胞毒性活性の発現を意味する(図2)。同時に、この効果は、配列D37Kについて、より顕著である。
【００５１】
(実施例2.増殖性細胞株に対する細胞毒性活性の研究)
本発明者らは、移植された細胞培養株MCF-7(乳癌)、A549(肺腺癌)、SKOV(卵巣癌)、及びHCT116(結腸腺癌)の細胞に対する、ペプチド配列D37K、F26K-1、F26K-2、W26K-1、W26K-2の効果を研究した。
【００５２】
実験のための準備をする際には、細胞培養株を、ウェルあたり1*104細胞の量で、24ウェルプレートに入れ、グルタミン、ゲンタマイシン、10% PBSを含有するDMEM培地(PanEco社、Russia)で37℃及び5% CO2で、48時間、インキュベートした。こうしたインキュベーションの後、この細胞培養株は、密でない単層を形成した。実験準備:培地を、5μM、10μM、20μM、40μMの濃度の研究ペプチドを含有する培地で置き換えた;対照試料においては、溶媒の影響を決定するために、培地は、DMSO 20μLを含有していた(ペプチドは、DMSOに溶解した)。インキュベーション時間は、24時間であった。次いで、細胞を、トリプシンを使用してマトリクスから注意深く除去し(ペプチドを含むウェル内の細胞は、対照試料よりも強く付着していた)、3,000回転での7分間の遠心分離によって培地を除去し、上清流体を除去し、二重標識アネキシンV/PIを使用して染色を実施した。フローサイトメーターを使用して分析を実施し、アネキシンVを含む細胞-アポトーシスの数、ヨウ化プロピジウムを含む細胞-死細胞の数、無傷細胞-生細胞の数を評価した。
【００５３】
アポトーシスレベルを研究した際に、増殖性細胞の培地へのペプチド配列の注入は、該培養株におけるアポトーシスの増大をもたらし、アポトーシスは、ペプチド濃度の増大に比例して増加することが示された(図3、4)。
【００５４】
これらの結果は、ペプチド配列
【化３】
2016520547.tif 000005
が、研究された細胞株に対する、より顕著なプロアポトーシス効果を有することを示した。他の研究された配列については、誘導されたアポトーシスのレベルにおける有意差は存在しなかった。
【００５５】
死細胞(ヨウ化プロピジウムを含む)の数も、ペプチドを培地に添加した場合に増大し、これは濃度依存性である(図5、6)。
【００５６】
本発明者らは、死細胞の量を研究した際には、ペプチド効果の程度に関して有意差を得られなかったが、培養株HCT-116における死細胞の数は、培養株MCF-7における数よりも多く、これは、培養株HCT-116における、より高いレベルの自然細胞死によって説明できそうである。
【００５７】
生細胞の数は、培地に入れられたペプチド配列の量と逆相関する(図7、8)。
【００５８】
本発明者らは、培養株A549及びSKOVに対するペプチド配列の細胞毒性効果を研究した際に、配列F26K-1及びW26K-1が、最も強力な効果を有することが分かった。すなわち、培養株A549については、40μMの濃度の配列で、アネキシン陽性細胞のレベルは、配列F26K-1及びW26K-1について43.5及び52.1%であった;サブ二倍体(subdiploid)/断片化DNAを有する粒子の数は、46.4及び48.2%であった(研究される配列と共に24時間インキュベートした場合)。A549株の細胞を、40μMの濃度の配列D37Kと共に24時間インキュベートした場合、アネキシン陽性細胞の数は33.8%であった;断片化DNAを有する粒子の数は、36.3%であった。対照試料では、アネキシン陽性粒子の量は、わずか8%であり、断片化DNAを有する粒子のレベルは、わずか10%であった。
【００５９】
SKOV培養株については、「初期」アポトーシスレベル(アネキシン陽性粒子)の値は、配列F26K-1について41.8%及び配列W26K-1について45.2%であった。ペプチド配列D37Kについては、「初期」アポトーシスレベルは、37.6%であった。配列F26K-1及びW26K-1との24時間のインキュベーションを用いる、この培養株における、断片化DNAを有する粒子の数は、それぞれ、42.6%及び44.1%であった。D37K配列とのインキュベーションにおける断片化DNAのレベルは、31.5%であった;対照試料における断片化DNAのレベルは、どちらの培養株についても、8%であった。異なる配列について、生細胞の数の変化における差は存在しなかった。
【００６０】
(実施例3.細胞分裂停止効果の研究)
本発明者らは、細胞株MCF-7、HCT-116、A549(肺腺癌)、及びSKOV(卵巣癌)を使用して、細胞増殖活性に対する該ペプチド配列の効果を研究した。この実験は、枯渇培地を使用する、細胞周期のG0/G1期の細胞の同調を含んでいた。細胞を、24ウェルプレート中で、0.5% PBSを含有する培地中で48時間維持し、次いで、培地の、5% PBSと様々な濃度の研究ペプチドとを含有する培地での置き換えによって同調ブロックを除去した。これを、24時間インキュベートし、次いで、細胞を、トリプシンを使用してマトリクスから除去し、PSBで洗浄し、エタノールで固定した。試料を染色し、PBSでエタノールから洗い流し、遠心分離を使用し、RNAアーゼと共にインキュベーションし、ヨウ化プロピジウムで染色した。フローサイトメトリーを使用して分析を実施し、本発明者らは、ModFit 3.0ソフトウェアを使用するDNAヒストグラム上で、細胞周期の期における細胞の分布を評価した。本発明者らは、細胞培養株MCF-7及びHCT-116について、10及び40μMの濃度の5つのペプチド配列の効果を研究した。これらの研究配列が、分裂細胞の増殖活性を低下させることが可能であることが示された(図9)。
【００６１】
これらの配列とのインキュベーション時間に応じた細胞周期の期における細胞の分布の変化を研究した際に、配列F26K-2、W26K-1、W26K-2について、最も明確な抗増殖効果及びその濃度依存性が見られることが示された。配列D37Kについては、抗増殖効果が、細胞株MCF-7については現れたが、細胞株HCT-116については見られなかった。したがって、培養株HCT-116については、配列F26K-1、F26K-2、W26K-1、W26K-2に曝露される場合、休止期のままである細胞における遅延は、8〜12時間であり、最も大きな遅延は、細胞を配列W26K-2と共にインキュベートする場合に見られた(12時間、G0/G1期の細胞の数-72%)(図10)。
【００６２】
培養株MCF-7については、研究されたすべてのペプチド配列について、増殖の遅延(同調ブロック後の細胞の離脱)が見られ、配列F26K-1、F26K-2、W26K-1、W26K-2、及びD37Kの効果の間に有意差は見られなかった。
【００６３】
細胞培養株A549株における細胞周期の期のレベルの変化を推定した際に、G0/G1期からの細胞の離脱の遅延は存在しなかった(図12)。
【００６４】
A549株は、培養株MCF-7及びHCT-116よりも円滑な、同調からの離脱を示し、インキュベーションの8時間後までの対照試料の細胞は、60%を超える量でG0/G1期のままであった。G0/G1期のレベルに対する研究配列の効果は最小であった。しかし、本発明者らは、S期レベルの変化を分析した際、F26K-1、W26K-1、及びD37Kなどの配列の培地への添加が、細胞のS期への「進入」の遅延をもたらすことを発見した。対照試料では、S期レベルは、同調ブロックの除去の直後に増大を始めたが、配列F26K-1、W26K-1、及びD37Kを含む試料では、S期レベルは、同調因子の排除の8時間後にようやく増大を始めた(図13、14)。
【００６５】
したがって、A549細胞培養株については、本発明者らは、配列F26K-1、W26K-1、及びD37Kについて、第2のR点(restriction point)段階、S-G2移行での遅延を得た。これは、おそらく、この細胞株の特殊性によって説明される。
【００６６】
これらのペプチド配列のSKOV細胞培養株に対する効果を研究する際、配列F26K-1、F26K-2、W26K-1、及びW26K-2を伴うインキュベーションを実施した。細胞は、0.5% PBS(ウシ胎児血清)を含有する枯渇培地を使用してあらかじめ同調させ、同調ブロックの除去及び栄養培地の10% PBS含有培地との置き換えと共に、培地にペプチドを加えた。
【００６７】
図15、16は、G0/G1及びS+G2/M期の細胞の数の変化を示す。研究されたすべてのペプチドは、ペプチド濃度の増大時のG0/G1期の細胞の数の増加及び増殖性細胞(S+G2/M期)の減少を示す。配列W26K-2については、この場合には、わずかに低い抗増殖効果が認められる。配列F26K-1、F26K-2、W26K-1は、SKOV細胞株の増殖の遅延(有意差なし)を引き起こした。
【００６８】
DNA-ヒストグラム上の低二倍体ピークとして推定されるアポトーシスレベルは、注入されたペプチドの濃度と相関し、対照試料における17.8%から、40μMの濃度のペプチドF26K-1を伴う24時間インキュベーションでは31.2%まで、ペプチドW26K-2(40μM)を伴うインキュベーションでは35.3%まで増大する(図17)。
【００６９】
同調の他の方法を使用して:ヒドロキシ尿素(G0/G1期での停止)、タキソール(G2期での停止)、及びエプトポシド(Eptoposide)(S期での停止)を使用して、ペプチド配列の細胞分裂停止効果を試験しようと試みた場合、信頼できる結果は得られなかった。研究される配列を細胞培養株に添加した場合の試験データは、細胞周期の期における細胞の分布の適切な分析の可能性を除いて、70%超について細胞死を示した。
【００７０】
(実施例4.Bcl-2のレベルの変化に対するペプチド配列効果の研究)
モノクローナル抗体Anti Human Bcl-2(Caltag Laboratories社、USA)を使用して、し研究されるペプチド配列と共にインキュベートした場合のHCT-116細胞におけるBcl-2のレベルの変化を推定することができる。細胞を、ウェルあたり1×104個で24ウェルプレートに移し、通常条件(DMEM培地、10%)下で48時間培養し、次いで、0.5% PBSを含有する枯渇培地を使用して48時間同調させた。同調ブロックを除去した時に、10% PBSを含有する培地を細胞に添加し、ペプチド配列を、10及び40μMの濃度で研究した。ペプチドを伴うインキュベーションを24時間実施し、次いで、トリプシンの助けを借りて培養株を除去し、1%ホルムアルデヒドを含有するPBSを用いて1時間固定し、次いで、エタノールで固定した。抗体の製造業者の指示書に従って、染色及び分析を実施した。研究された配列は、Bcl-2タンパク質の発現を抑制する能力があり、最も強い抑制が、配列F26K-1、F26K-2、W26K-2によって影響を受けていることが判明し、本発明者らはまた、これらの配列について、ペプチド濃度に依存するレベルのBc2-2を得た(図18)。それによって、ペプチド配列の培地への導入によって誘導されるアポトーシスが、細胞の特定の分子過程に対するペプチドの影響によっておそらく説明されることが示された。
【００７１】
Bc2-2レベルの変化の研究では、ペプチドD37K及びW26Kが、培養株におけるBcl-2陽性細胞のレベルを、24時間のインキュベーション及び40μMのペプチド濃度で、5%低下させる、最小の効果を示すことが判明した。ペプチドW26K及びF26K-2は、Bcl-2のレベルを15%超低下させた。
【００７２】
(実施例5.細胞培養株のペプチド配列とのインキュベーション中のリン酸化pRbの量の変化の研究)
この作業の目的の一つは、研究ペプチドの抗増殖効果が、その構造内のサイクリンキナーゼ阻害剤断片の特定の作用と関係があることを証明することであった。文献では、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化機能を阻害するための、こうしたペプチド特性の維持が記載されているが、これは、細胞抽出物において確認された。本発明者らは、フローサイトメトリー方法の助けを借りて、細胞レベルで、p16INK4aとの相同性を有する配列を含む研究されるペプチドのバックグラウンドに対する、pRBリン酸化(D型サイクリンキナーゼの分子標的)のレベルの変化を観察した。
【００７３】
細胞自体のp16INK4aの活性化は、pRbリン酸化の抑制をもたらす。低リン酸化pRbの蓄積は、E2F1の抑制及びサイクリンA及びB発現の低下(これは、細胞周期停止における重要な機構の一つである)をもたらす。リン酸化したpRbの量によって、p16の活性を推定することができる。
【００７４】
フローサイトメトリーは、pRb産物が「低リン酸化」状態である細胞を提供することを可能にする。蛍光標識した抗体は、「低リン酸化」pRbと相互作用する。
【００７５】
「低リン酸化」pRbの量を決定するために、一連の実験を実施した。ここでは、研究ペプチド配列を、細胞培養株に添加し、同調ブロックを除去した後、枯渇細胞培地方法(MCF-7、HCT-116)の助けを借りて同調させ、次いで、細胞を2時間ごとに採取した。各プレートからの細胞の一部を固定して、細胞周期の期をさらに定義し、また、「低リン酸化」pRbの量を決定した。同調させた細胞試料の形態であるがペプチドを添加しない陰性対照も準備した。細胞培養株へのペプチド配列の導入が、pRbリン酸化を抑制し、かつその培養株におけるpRbリン酸化の最大レベルを低下させることが示された(図19)。
【００７６】
図19でわかる通り、「低リン酸化」pRbのレベルは、ペプチドを添加していない対照試料では、同調ブロックの除去後に増大を始め、細胞株に応じてある時点(インキュベーションの4又は6時間)までに最大値に到達し、その後、低下を始める。ペプチドを含む試料では、「低リン酸化」pRbのレベルは、より後に増大を始め、インキュベーションの12〜18時間後にその最大値に到達し、pRbの最大レベルへの到達の遅延は、ペプチド配列の濃度に依存する。MCF-7細胞(図19)の培養株については、F26K-2及びW26K-2を用いると、「低リン酸化」pRb配列の形成の最も大きな遅延が得られた。ペプチド配列と共にインキュベートした場合のHCT-116細胞の培養株における「低リン酸化」pRbのレベルの変化の研究では、配列F26K-1及びF26K-2について、遅延の最も大きな効果が得られた。HCT-116培養株については、本発明者らは、3回の試験を実施して、「低リン酸化」pRbのレベルを決定した。枯渇培地によって細胞を(0.5% PBSを含有する培地中で48時間)同調させ、培地を10% PBSを含有する培地に変更した際に、標的配列を、10及び40μMの濃度で培養株に添加した。本発明者らは、2時間ごとに「低リン酸化」pRbのレベルを分析した;最大インキュベーション時間は、24時間であった。
【００７７】
図20に示す通り、HCT-116培養株については、配列F26K-1及びF26K-2によって、「低リン酸化」pRbの形成の遅延による最も大きな効果が発揮された。これらの配列に関しては、10μMのペプチド濃度での「低リン酸化」pRbの最大レベルは、インキュベーションの16時間後に、40μMの濃度では20時間後に観察された。D37K配列については、遅延の効果は、時間に関しては同じであると観察されたが、「低リン酸化」pRbのレベルは、より低かった。
【００７８】
SKOV細胞株を使用する「低リン酸化」pRbレベルの研究では、「低リン酸化」pRbの形成における遅延効果は、培養株MCF-7及びHCT-116よりも低かったが、この細胞株は、研究ペプチド配列との細胞のインキュベーション中に増殖遅延効果を有することが以前に示された。図21は、SKOV細胞培養株における「低リン酸化」pRbのレベルの変化を示す(細胞は、10μM(A)及び40μM(B)の濃度の配列D37K、F26K-1、2-F26K、W26K-1、W26K-2に曝露された)。対照試料と比較すると明らかな「低リン酸化」pRb形成遅延効果であるが、SKOV細胞株の場合、MCF-7及びHCT-116の培養株よりも、やや効果が低かった。この場合、D37K配列が、最も強い効果を有するが、F26K-2も、対照と比較して4〜10時間の「低リン酸化」pRbの形成の遅延を引き起こす。
【００７９】
したがって、研究されたペプチド配列D37K、F26K-1、2-F26K、W26K-1、及びW26K-2が、活発に増殖している細胞におけるアポトーシスを誘導する、かつ、増殖プロセスを抑制する能力があることが判明した。研究された配列の中では、インキュベーション中に配列F26K-1及びF26K-2によって、最も顕著な細胞毒性及び細胞分裂停止効果(これと共に、アポトーシスは、増殖性細胞について、わずかに高い値を有する)、細胞増殖(細胞周期のG0/G1期の細胞の数の増加)の遅延、濃度に依存するBcl-2の低下が示される。研究された他の配列も、細胞毒性及び細胞分裂停止効果を示したが、これらはそれほど顕著ではなかった。
【００８０】
(実施例6.内在化配列と薬物との組み合わせ効果の研究)
内在化配列F26K-1及びD37Kと、抗腫瘍活性を有する薬物(タキソール、エトポシド)との組み合わせ効果を研究するために、HCT-116細胞培養株を使用する、一連の実験を設定した。下に示すのは、3回の実験の平均である。薬物及び内在化配列を、1、10、及び30μMの最終濃度で培地に添加し、24時間インキュベートした。MTT分析によって、細胞毒性効果を評価した。この方法は、代謝的に活性な生細胞のミトコンドリア細胞質脱水素酵素が、非染色形の3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテララゾール(diphenylterarazole)(MTT試薬)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶性の青い結晶性のファルマザン(pharmazane)に回復させる能力に基づいている。
【００８１】
MTT分析を実施するために、細胞を、2×106/mlの濃度で、100μlの培地体積を有する96ウェルプレートのウェルに入れ、24時間インキュベートし、次いで、培地を、薬物物質(drug agent)(DA)と内在化配列とを含有する培地と置き換え、24時間インキュベートし、培地を採取し、30μLの純粋な「完全」培地を添加し、次いで、PBS 170μLとMTT 20μLとを添加した。37℃で30分間、インキュベーションを実施した。上清を収集した。
【００８２】
DMSO(ジメチルスルホキシド)200μLを添加し、暗所で室温で15分間インキュベートした。ELISAリーダー(Immunoassay Analyzer)で、492nmで、光学密度の値を読み取った。
【００８３】
図22は、細胞培養株に対する薬物の影響下での死細胞の数の変化を示す。この範囲の濃度での、かつ所与の細胞株についての、エトポシドの細胞毒性効果は、最小であった。タキソールは、30μMの濃度で、顕著な細胞毒性効果を生じた。研究配列については、配列F26K-1が細胞死を誘導し、死細胞の数の、培地における配列の濃度に対する依存性が存在することが示された(図23)。
【００８４】
配列D37Kと、薬物、すなわちタキソール、エトポシドとの組み合わせ効果の研究では、培養株HCT-116は、薬物の細胞毒性効果の増強を示さなかった(図24)。死細胞の数は、純粋な薬物に曝露した場合と同じであった。
【００８５】
配列F26K-1と薬物との組み合わせ効果の研究では、細胞毒性効果の加重が存在した。最も明らかな加重効果は、細胞と、配列F26K-1及びエトポシドとの共インキュベーション中に認められた(図25)。細胞と、配列F26K-1及びタキソールとのインキュベーション中に、1及び10μMのF26K-1濃度で、加重効果が認められたが、これは、F26K-1配列の濃度を30μMに上昇させた時には失われた(図26)。この効果は、すべての実験において再現されたが、この段階ではこれを説明することは可能ではなかった。おそらく、フィードバック制御の経路を含めた、アポトーシス促進機構の過剰活性化に応答した過飽和の機構が発生し、その結果、細胞死の抑制が起こる。
【００８６】
細胞培養株MCF-7(乳癌)では、DA、5-フルオロウラシル、及びタキソールと、配列D37K及びF26K-2(細胞毒性研究では、この配列は、MCF-7培養株に対する最も顕著な効果を有していた)との組み合わせ効果が研究された。細胞を、24ウェルプレート中で培養して70%の単層とし、続いて、培地を、標的配列と10、20、及び30μMの濃度の薬物とを含有する培地で置き換えた。インキュベーション時間は、24時間であった。アポトーシスに進入する、分析される細胞は、アネキシン及びヨウ化プロピジウム染色、フローサイトメトリーを使用して検出した。
【００８７】
タキソールとF26K-2配列との組み合わせ使用が、薬物の濃度に比例したアポトーシスのレベルの増大として現れる、細胞毒性効果の加重をもたらすことが示された。この効果は、F26K-2配列の濃度を30μMまで増大させるのに伴って、わずかに低下する(図27)。D37K配列の場合、10μMの濃度で、細胞毒性効果は最小であり、20及び30μMの濃度の効果は、実質的に同一である(図27、A)。5-フルオロウラシルと内在化配列D37K及びF26K-2との組み合わせ使用の場合、研究されるどちらの配列についても、細胞毒性効果の濃度に応じて、線形増幅が得られた。さらに、アポトーシス粒子の数については、同等の値であり、ペプチド配列の濃度を30μMまで増大させるのに伴って効果が低下した(図28)。
【００８８】
細胞培養株H460(肺癌)を使用して、F26K-1、F26K-2、W26K-1、W26K-2とエトポシドとの組み合わせ配列の効果を研究した。この試験では、細胞を、24ウェルプレート中でインキュベートして、70%の単層を形成し、次いで、培地を、5、10、20、及び30μMの濃度の内在化配列と、10μMの濃度のエトポシドとを含有する培地で置き換えた。インキュベーション時間は、24時間であった。アポトーシスを、アネキシン-ヨウ化プロピジウム染色(初期アポトーシス)によって検査し、断片化DNAを有する粒子の数を使用して、アポトーシスレベルを決定し、固定された細胞をヨウ化プロピジウムで染色した際に、サブ二倍体ピークを検出した。
【００８９】
研究されたすべての配列が、この細胞培養株に関してアポトーシス性の顕著な効果を有し、かつ、アポトーシスのレベルが、内在化ペプチド配列とエトポシドとの併用に伴って有意に増大したことが示された。
【００９０】
図29Aは、エトポシドを伴わない、ペプチド配列を伴うインキュベーション(インキュベーション時間24時間)時の細胞培養株H460におけるアポトーシスのレベルの変化を示す。アポトーシスは、サブ二倍体ピークとして分析した。図29では、配列とエトポシドとを伴う細胞のインキュベーション時のアポトーシスレベルの増大が見られる。
【００９１】
図30は、同じ試料を示すが、二重標識アネキシンV-PIによって染色され、培養株を、ペプチド配列(A)、及びペプチド配列とエトポシドとの効果の加重(B)に曝露した際の、アネキシンに対して陽性である初期アポトーシス細胞の著しい増大を示す。
【００９２】
培養株H460については、エトポシドとペプチド配列との組み合わせ効果を研究するために、改変実験も設定した。細胞を、24ウェルプレート中でインキュベートして70%の単層を形成し、次いで、培地を10μMの濃度のエトポシドを含む培地で置き換え、次いで、24時間インキュベーションを実施した。培地を、5、10、20、及び30μMの濃度の内在化配列を含有し、エトポシドを含まない培地で置き換えた。24時間、インキュベーションを実施した。アポトーシスを、アネキシン-ヨウ化プロピジウム染色(初期アポトーシス)によって検査し、断片化DNAを有する粒子の数によって、アポトーシスレベルを決定し、固定された細胞をヨウ化プロピジウムで染色することによって、サブ二倍体ピークを決定した。
【００９３】
5μMの濃度の配列F26K-1及びW26K-2でのアポトーシスの急激な増大が得られ、これは、80%超を構成した(図31)。
【００９４】
後期アポトーシス過程に相当する断片化DNAを有する細胞のレベルは、様々な依存形態を有していたが、依存の型は、研究されたすべてのペプチド配列について同一であった(図32)。この実験設計を用いると、薬物が、内在化配列と同時に培地に添加される実験と比較して、アポトーシスの全体的な増大が認められた。この効果は、エトポシド(S期からの離脱を阻止する)(それに対して、内在化配列は、サイクリン依存性キナーゼの能力を有し、エトポシドによって停止された細胞におけるアポトーシスの開始を刺激する)によって誘発される増殖の遅延によって説明することができる。
【００９５】
したがって、研究の過程では、研究されたすべてのペプチド配列(D37K、F26K-1、2-F26K、W26K-1、W26K-2)が、細胞増殖過程に影響を与えるアポトーシスを誘導する能力を有していたことが示された。効果のレベルは、配列及び細胞培養株に依存していた。これらのペプチド配列を比較すると、W26K-1が「最も弱い」ことが示され、残りの配列は、先に研究されたD37Kに勝る細胞毒性効果を示した。
【００９６】
内在化配列と医療で使用される薬物との組み合わせを使用するという好条件が強調される。抗腫瘍薬物の細胞毒特性の増強が示される。
【００９７】
(実施例7.内在化ペプチド浸透力の研究)
ペプチドの細胞への浸透を記録し、かつ蓄積の動態を研究するために、本発明者らは、蛍光標識フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合させた同一のキメラ配列を使用した。できあがったポリペプチド産物へFITC分子を含めることは、その物理化学特性の実質的変化及び生理活性の喪失をもたらすことが多いので、単独の単一のFITC分子を保持するリジン分子を、当初の配列のN末端に付加した。
【００９８】
光学蛍光顕微鏡法によって、研究されたペプチドが、細胞に結合し、かつ細胞株Raji、Jurkatt、A549、293及びヒト末梢血リンパ球へ浸透することが示された。フローサイトメトリーでは、ペプチドの細胞への結合、及び細胞内部のペプチドの蓄積を示すトリパンブルーでの蛍光消光の作用の不在が示された。
【００９９】
細胞内部のペプチドの蓄積に関する最も客観的なデータは、レーザー走査型顕微鏡法を使用して入手した。フルオレセインイソチオシアネートで標識したタンパク質を、0.9％NaClに溶解した。細胞株A549、293を、滅菌スライド上で増殖させ、顕微鏡接眼レンズの直下の特別なチャンバー内に置いた。培地を、被験タンパク質を含む培地で置き換えた。タンパク質の飽和を、経時的に観察した。さらに、細胞の層ごとの走査を実施して、ペプチドの局在を決定した。
【０１００】
この向上度での画像の解析では、細胞中の元々のp16-pAntpタンパク質の位置は明らかにならなかった。該タンパク質は、明らかに、細胞区画内に均一に分布している。該タンパク質の細胞への浸透は、十分に迅速に起こる。細胞内空間におけるその均一な分布は、15分のインキュベーションの直後に観察することができる(図33)。
【０１０１】
ヒト末梢血リンパ球及びBリンパ球細胞株(Raji、Jurkatt)におけるペプチドの浸透速度を、フローサイトメトリー法を使用して評価した。この方法は、高濃度の細胞を経時的に調べることを可能にし、かつ、被験ペプチドの浸透速度を推定するのに便利である。本発明者らは、pH7.5及びpH6.0でのタンパク質p16-rAntp-FITCに曝露したリンパ球の蛍光を測定した。この方法の原理は、より小さいFITC蛍光量子が、より酸性のpHを有する溶液中で生じることに基づいている。この測定は、十分に速く行われるので、細胞内部のpHは変わることができない。リンパ球を、ペプチドと共に1〜15分間インキュベートし、次いで、これに、20倍体積のpH6.0及びpH7.5のリン酸緩衝液を直ちに添加した。それと同時に、本発明者らは、蛍光強度の差を推定した。蛍光強度のほとんどの測定値は、15分のインキュベーション後には有意差がなかった。したがって、15分間インキュベーション後、ペプチドは、細胞内に完全に浸透したと推定することができる。
【０１０２】
細胞内のペプチドの蓄積の速度を研究するために、本発明者らは、フローサイトメトリー法を使用した。この目的のために、FITC標識されたペプチドを、フローサイトメーターの測定チューブに直接注入し、細胞蛍光の動態の変化を記録することを可能にした。本発明者らは、フィコール勾配で単離した健常ドナー由来の血液白血球の単核画分を研究した。短い誘導期の後、正常なリンパ球細胞内の該ペプチドの迅速な蓄積が見られた。最終濃度には、〜1分の時間で到達した。
【０１０３】
悪性リンパ腫細胞について、ペプチド蓄積の同様の動態が得られた。研究されたモデルには、Jurkat株(リンパ芽球性白血病に由来し、かつT細胞表現型を有する)、及びバーキットB細胞リンパ腫から産生されるRajiが含まれた。
【０１０４】
該ペプチドは、腫瘍細胞に非常に迅速に浸透する。最大濃度までの時間は、1分未満である。この蓄積動態は、室温(t＝20℃)で研究した。研究クラスのペプチドの浸透機構は今のところ公知ではないことが強調されるべきである。しかし、この蓄積は、＋5℃の温度であっても同様に有効に発生し、かつ、細胞内のエネルギー消費とは無関係であり、細胞受容体によって媒介されず、かつ、食作用及び飲作用経路を使用しないことが示された。本発明者らは、様々な温度(＋5℃まで)での、内在化成分を含有する合成ペプチドの蓄積も確認した。
【０１０５】
研究ペプチドは、細胞膜を両方向に横断することができるので、ペプチドは、細胞内に蓄積され、細胞外濃度が低下すると細胞を離れる可能性があるということを推定することができる。細胞からのペプチド排出プロセスの研究は、別の研究の主題であり得る。
【０１０６】
したがって、実験の結果として、内在化断片及びタンパク質p16INK4a断片を含有するキメラペプチドの蓄積動態は、C＝定数1＋定数2×t2型の依存性を有する程度特性を有することが示された。正常細胞と腫瘍細胞における該ペプチドの細胞内蓄積及び分布の動態は、蓄積の性質及び速度の点で異ならないことも示された。
【０１０７】
(実施例8.インビボ(局所投与)でのD37Kペプチドの抗腫瘍活性の研究)
胸腺摘出マウス(ヌード)を使用して、内在化キメラペプチドD37Kの抗腫瘍活性を研究した。
【０１０８】
マウスに、1マウスあたり約100万細胞の量の腫瘍ヒト細胞培養株A549及びHCT-116株を接種した。
【０１０９】
39匹のマウスに、A549細胞を接種し、そのうちの20匹で対照群を形成し、これらには後にプラセボを与えた。10匹のマウスで1つの実験群を形成した。これらのマウスには、触知可能な腫瘍の形成後(細胞移植の4日後)、0.1mgの被験ペプチドを、腫瘍に直接入れて与えた。第2の実験群には、9匹のマウスが含まれ、これらのマウスにも、移植後の4日目に、腫瘍結節の形成後に、0.2mgペプチドを、腫瘍床に注射して与えた。これらの実験群におけるペプチドは、2日に1回投与した。この実験を24日続けた。
【０１１０】
本発明者らは、これらの実験群において、腫瘍成長の減速を認め、ペプチド投与の開始後の6日目に、実験群における腫瘍体積の、対照と比較した場合の著しい低下を認めることができた(図34)。この実験は、24日続けた。この期間中、実験群には、キメラペプチドの10回の注射を実施した。対照群では、実験の24日目に、マウスの平均腫瘍体積は95.24mm3であり、1匹のマウスが死亡した。第1の実験群(ペプチドの投与量-0.1mg)では、平均腫瘍体積は39.29mm3であり、1匹のマウスが死亡した。第2の実験群(ペプチドの投与量-0.2mg)では、平均腫瘍体積は57.51mm3であったが、死亡した動物はいなかった。
【０１１１】
これらの動物を、ヒトHCT-116の移植される培養株を投与する時に、2つの群に分けた:対照群-分析されるペプチドがその後注射されない10匹のマウス、実験群(10匹のマウス)-腫瘍結節への0.1mgの分析されるP16_Antpキメラペプチドの注射を受ける。この実験を28日続けた。実験群には、ペプチドの11回の注射を行った;最初の注射は、腫瘍細胞接種後の6日目に行われた。HCT-116細胞由来の腫瘍結節は、かなりの大きさ及び潰瘍化が特徴であった。対照群では、実験の28日目に、平均腫瘍体積は679mm3に到達し、実験中に、3匹のマウスが死亡した。実験群は、腫瘍成長速度が、より低く(図35)、実験の28日目に、平均腫瘍体積は225.4 mm3であり、実験群における死亡した動物の数は、2匹であった。
【０１１２】
図36は、7回のペプチド注射後の、異なる群からのいくつかの対のマウスを示す。実験群において、腫瘍結節の有意な低下が認められる。
【０１１３】
キメラペプチドAntp-p16の局所投与は、ヒト腫瘍成長の実験モデル(乳癌、結腸直腸癌)の有意な(50%を超える)抑制をもたらす。
【０１１４】
(実施例9.ヒト腫瘍の短期間培養株におけるD37Kの細胞毒特性の研究)
本発明者らは、D37Kの抗腫瘍活性を研究した。150mgのD37Kペプチドを、固相合成によって合成した。本発明者らは、短期間培養の方法を使用して、ヒト腫瘍に対する効果を研究した。
【０１１５】
(手術標本から得られる腫瘍短期間培養の方法)
手術標本から、短期間培養株を得た。手術後のできるだけ早い機会に、病理学者が参加して、培養株を調製するための部分の採取を行った。組織片を平均サイズ1.5 cm3に切断した。組織を機械的にすりつぶし;この細胞懸濁液を、5% PBSを含有するRPMI培地に入れた。37℃及び5% CO2での24時間のインキュベーション後、培地を、キメラペプチド(濃度40μMのp16_Antp)を含有する培地で、又は、いくつかの実験についてはペプチドとタキソールの両方を含有する100nM又は500nMの濃度のタキソールで置き換えた。対照試料では、培地を、新鮮な培地によって置き換えた。ゼロ点-0時間と定めた。
【０１１６】
インキュベーションは、37℃及び5% CO2で24時間行い、一連の実験については、24時間及び48時間実施した。結果を、試料の二重アネキシンV-PI染色及び固定化材料のPI染色を使用するフローサイトメトリー方法(方法の説明については、「インビトロ法(In vitro Methods)」を参照のこと)の助けを借りて評価した。本発明者らは、アネキシンVに対して陽性の粒子のレベル(初期アポトーシス)、アネキシンV-PI二重標識に対して陽性の粒子のレベル(後期アポトーシス)、非固定試料中のPIを含み得る粒子の数(壊死);細胞周期の期による細胞の分布、サブ二倍体ピークレベル(断片化DNAを有する粒子の数、アポトーシス)を評価した。上皮細胞アポトーシスを検出するために、本発明者らは、サイトケラチン-FITC-PIに対する抗体を用いる二重染色を使用した(図37)。
【０１１７】
本発明者らは、合わせて126の組織試料を分析した:そのうちの63は、病理組織試料であった(63は、対照として採取された正常組織の試料であった)。63の病理標本から、悪性起源の47の腫瘍を研究した(10-乳癌、15-腎癌、6-子宮癌、4-前立腺癌、3-卵巣癌及び肺癌、並びに2例の胃癌、膵臓癌、膀胱癌)。さらに、本発明者らは、線維腺腫組織試料(N=9)、及び7試料の乳房組織(単純乳管過形成を伴う)を研究した。
【０１１８】
40μMの濃度のペプチドの添加の24及び48時間後に、アポトーシスのレベルを分析した。腫瘍細胞に対する従来の化学療法薬物とペプチドD37Kとの細胞毒性の組み合わせ効果を研究するために、いくつかの)実験を実施した。
【０１１９】
(実施例10.ペプチドD37Kの抗腫瘍活性の研究)
ペプチドD37Kの細胞毒性活性についての結果全体を、表3に示す。
【表２】
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【０１２０】
得られた結果の分析は、ペプチドD37Kの細胞毒性効果に対して最も感受性の高い癌の形態が、腎癌、乳癌、胃癌、膀胱癌であることを示した。短期間膀胱癌培養株が、非常に高いレベルの自発的アポトーシス(60〜70%まで)を特徴とすることは、特筆するに値する。ペプチドの添加によって、このバックグラウンドに対して、このレベルがほんのわずかに増大するという事実にもかかわらず、最終結果は象徴的ではない可能性がある。
【０１２１】
(実施例11.乳腺線維腺腫細胞に対する細胞毒性効果の研究)
乳腺線維腺腫組織試料を研究した時に、興味深い結果が得られた。低いレベルの自発的アポトーシス(最大20%まで、平均12.8%)を有するこれらの細胞の短期間培養株では、ペプチドр16は、有意な細胞毒性効果を発揮し、24時間で、平均レベル38.2%、最大80%までのアポトーシスの発現を引き起こした。乳房細胞については、単純乳管過形成の徴候を伴う、それほど顕著ではない細胞毒性効果が見られた(誘導されたアポトーシスの平均レベル14.5%)。これらの結果は、乳房病理組織における増殖活性と自発的アポトーシスレベルの比を研究した本発明者のデータと一致している。自発的アポトーシスに対する増殖の比は、線維腺腫組織について最も高く、乳癌細胞が2番目であり、それに単純乳管過形成及び正常な乳房組織が続くことが示された。ペプチドの細胞毒性効果に対する細胞の感受性を決定する因子の1つが、増殖阻害因子を含むならば、ペプチドD37Kに対する線維腺腫細胞の感受性は、かなり理にかなっている。乳房組織における良性の増殖プロセスの感受性の検出された効果は、治療にとって有望であり得る。移植された固形腫瘍を治療するための局所ペプチド注射の結果は、乳房組織における良性の増殖プロセスの領域に注射された場合のその有効性の推定を可能にする。得られた結果によって、ペプチドD37Kに対して感受性のヒト腫瘍の範囲を検出することが可能になった。乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、腎癌などの局在性が、研究されるペプチドの細胞毒性(抗腫瘍)効果の更なる研究にとって有望なものであることが判明した。入手可能な文献には、分析されたペプチドのヒト腫瘍に対する効果に関するデータはないので、得られた結果は、新規である。
【０１２２】
当分野の専門家は、発明実施態様の変形のいくつかの要素の互換性に同意するであろう。同様に、いくつかの先に言及した要素及び動作、並びに各要素、動作、又は方法に対する他の公知の等価物は、化合物を形成するために、先に言及した原則に従って、一般的な構成要素のうちの1つと組み合わせる又は一般的な構成要素のうちの1つによって置き換えることができる。ある種の発明実施態様の変形及び実施例に照らして情報が提供されてはいるが、当分野の専門家は、これが、先に言及した発明実施態様の変形の範囲内の使用よりも広い範囲の使用を包含する、及び/又は、これを複数の異なる改変物及び等価物の基礎として使用することができることに同意するであろう。したがって、情報は、提供された発明実施態様の変形内だけでの使用によって制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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