(57)【要約】  本発明は、一般に、免疫療法組成物に関する。より特定すると、本発明は、ピーナッツアレルギーまたは他の樹木性堅果に対するアレルギーを有する対象中のＴリンパ球と免疫学的に相互作用する免疫療法組成物に関する。この組成物は、好ましくは、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２アレルゲンに対するアレルギーを有する対象中のＴ細胞との免疫相互作用を示す。本発明の組成物は、ピーナッツ、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはそれらの誘導体もしくはホモログに対する異常な、不適切な、またはそうでなければ不所望な免疫応答により特徴付けられる病態の治療または予防的治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節組成物であって、
【化１】
2016533341.tif 000068
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログの少なくとも５つを含み、残基Ｘが、システインまたはセリンであり、配列番号１〜６から選択される少なくとも１つのエピトープ領域および配列番号７〜８から選択される少なくとも１つのエピトープ領域を含む組成物。
【請求項２】
エピトープ領域
【化２】
2016533341.tif 000069
が、
【化３】
2016533341.tif 000070
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
エピトープ領域
【化４】
2016533341.tif 000071
が、
【化５】
2016533341.tif 000072
である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エピトープ領域の少なくとも６つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも７つのエピトープ領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記８つのエピトープ領域のそれぞれを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１つ以上のペプチドを含み、ペプチドのそれぞれが、最大６０連続アミノ酸長であり、ペプチドが、配列番号１〜８により定義されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域の１つ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
【化６】
2016533341.tif 000073
からなるリストから選択されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログを含み、残基Ｘが、システインまたはセリンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記残基Ｘが、セリンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
【化７】
2016533341.tif 000074
からなるリストから選択されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
【化８】
2016533341.tif 000075
からなるリストから選択されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２過敏症またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物に対する過敏症を、前記過敏症により特徴付けられる病態を有する対象に投与された場合に低減させ得る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
【化９】
2016533341.tif 000076
からなるリストから選択される１つ以上のペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログをさらに含み、残基Ｘが、システインまたはセリンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０または１３のいずれか一項に記載のエピトープおよびペプチドをコードし、またはそれらをコードする配列に相補的な１つ以上の核酸分子を含む組成物。
【請求項１５】
Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物中のアレルゲンに対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる対象における病態を治療および／または予防する方法であって、有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫調節組成物を、前記Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または他のアレルゲンに指向されるＴ細胞の前記対象における存在もしくは機能を除去または低減させるために十分な時間および条件下で前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１６】
Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２に対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる哺乳動物における病態の治療のための医薬品の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫調節組成物の使用。
【請求項１７】
病態が、ピーナッツまたはＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２もしくはＡｒａ  ｈ１様もしくはＡｒａ  ｈ２様分子を含有する樹木性堅果に対する過敏症である、請求項１５または１６に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記堅果が、ヘーゼルナッツ、アーモンドまたはブラジルナッツである、請求項１７に記載の方法または使用。
【請求項１９】
Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または前記組成物の他のアレルゲンに対して脱感作させ、またはそれに対する免疫学的寛容を誘導する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記脱感作または寛容が、Ｔ細胞アネルギーまたはアポトーシスを誘導することにより達成される、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記脱感作または寛容が、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することにより達成される、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記組成物を皮内または経皮投与する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記対象が、ヒトである、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫療法組成物に関する。より特定すると、本発明は、ピーナッツアレルギーまたは他の樹木性堅果に対するアレルギーを有する対象中のＴリンパ球と免疫学的に相互作用する免疫療法組成物に関する。この組成物は、好ましくは、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２アレルゲンに対するアレルギーを有する対象中のＴ細胞との免疫相互作用を示す。本発明の組成物は、ピーナッツ、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはそれらの誘導体もしくはホモログに対する異常な、不適切な、またはそうでなければ不所望な免疫応答により特徴付けられる病態の治療的または予防的治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者により引用される刊行物の参照文献目録は、本明細書の末尾に、アルファベット順にまとめる。
【０００３】
本明細書の任意の先行技術に対する参照文献は、その先行技術が共通の一般的知識の一部を形成することの同意でも、その任意の形式の示唆でもなく、そのように解釈されるべきでない。
【０００４】
ピーナッツアレルギーは、人口の約１％が罹患する致命的な不治の疾患である（Ｈｕｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６６（１）：１３６−４３，２０１２、Ｂｕｒｋｓ，Ｌａｎｃｅｔ．３７１（９６２３）：１５３８−４６，２００８）。ピーナッツアレルギーは、微量のピーナッツタンパク質に曝露された際に生じ得るアナフィラキシーの突然発症により特徴付けられる（Ｈｏｕｒｉｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １００：５９６−６００，１９９７；Ｐｕｍｐｈｒｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．４（４）：２８５−９０，２００４）。ピーナッツ誘導性アナフィラキシーは、非常に高頻度で死亡または致命的な特徴を伴うものである（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９（４）：１０１６−８，２００７；Ｂｕｒｋｓ  ２００８、前掲）。ピーナッツタンパク質は、一見安全な食物源内にも高頻度で隠れており、その結果、偶発的な接触が５年の期間にわたり罹患者の最大５０％に生じている（Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：ｅ６，１９９８）。驚くべきことではないが、ピーナッツおよび樹木性堅果アレルギーは、慢性消耗疾病、例えば、関節リウマチを罹患する者と同様、患者および同様に介護者について顕著に心理上の病的状態を伴う（Ｐｒｉｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３０：１１３５−４３，２０００；Ｋｅｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．１８８（９）：５０３−４，２００８）。治癒は、死亡原因としてのピーナッツおよび樹木性堅果アレルギーを除去するために必須である一方、ピーナッツアレルギー患者が抱える慢性的な心理的負担を除去するためにも必要である。
【０００５】
これまで、ピーナッツアレルギーについての免疫療法の試みの成果は、極端に限定されてきた。Ｎｅｌｓｏｎらは、ピーナッツの臨床的脱感作が、未分画ピーナッツ抽出物を用いるラッシュ免疫療法プロトコルを使用して誘導され得ることを示したが、その臨床的脱感作は維持投薬の間に対象の約半数において消失し、さらにその注射に、強化および維持期間の両方の間に対象の大多数における高頻度のアナフィラキシーのエピソードが伴う（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９：７４４−５１，１９９７）。Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒらは、研究において同様の知見を実証し、未分画ピーナッツ抽出物を用いる能動療法に、全身性のアナフィラキシーが高率で伴うことを再び示した。その研究におけるデータ収集は、ピーナッツ抽出物をプラセボランダム化対象に投与し、対象が死亡した後で終了し、この病態が危険な性質のものであることを強調した（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−６２，１９９２）。全ピーナッツ粉を用いる近年の経口免疫療法の研究により脱感作が実現可能である進展が提供されたが、観察された有害反応により深刻な安全性に関する懸念が強調された（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４，２８６，２００９；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，２９２，２００９；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ６４，１２１８，２００９；Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（３）：６５４−６０，２０１１；Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（６）：１３５１−２，２００９；Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．４１（９）：１２７３−８１，２０１１；Ａｌｌｅｎ＆Ｏ’Ｈｅｈｉｒ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．４１（９）：１１７２−４，２０１１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（２）：１７９−１８２，２０１２；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（１）：３１−２，２０１０；Ｂｌｕｍｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（１）：８３−９１，２０１０）。重度の症状または喘息の傾向がある子供を除いても、２つの研究において、ある例において、最初の食物チャレンジの間（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ６４，１２１８，２００９）、他方では、アナフィラキシーをこれまで経験しなかった子供の治療の間にアナフィラキシーエピソードが報告されている（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４，２８６，２００９）。
【０００６】
アレルゲン免疫療法に伴う病的状態を克服するための新規戦略の開発は、成功した免疫療法、およびその副作用に対する免疫学的な基礎の正確な理解に依存する。アレルゲン免疫療法に起因する病的状態はＩｇＥの架橋に起因すること、およびこの作用は長い間、そのような治療法の有効性に要求されないことが確立されている（Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８７：３６１−６１，９９８）。寛容の産生における慣用の（未分画ピーナッツ抽出物を用いる皮下注射または舌下または経口）免疫療法の重大な作用のうちの１つは、優勢な特異的Ｔ細胞の表現型を、ＴＨ２から制御性の表現型に変化させる能力であることも公知である。これらの制御性Ｔ細胞は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０および／またはＴＧＦβの産生を介して作用する（Ａｋｄｉｓ＆Ａｋｄｉｓ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：７３５−４６，２００９；Ａｋｄｉｓ＆Ａｋｄｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．８：６４５−６０．２００９；Ａｋｄｉｓ＆Ａｋｄｉｓ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１８−２７，２０１１）。
【０００７】
抗体およびリンパ球応答における重要な差異は、抗原の認識において、抗体が分子の三次元構造に依存する立体構造Ｂ細胞エピトープを認識する一方で、ＣＤ４＋Ｔ細胞が短い直鎖ペプチドを認識するという点である。抗原認識におけるこの差異は、免疫療法、例として、Ｔ細胞エピトープをベースとするペプチド、Ｂ細胞エピトープ突然変異体および変更ペプチドリガンドを使用するものの多くの新規戦略の基礎である（Ｒｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２１：２７３−２８４，２００９）。このような方法は、全てＩｇＥ架橋およびエフェクター細胞活性化が消失するような分子三次元構造または非存在の分子三次元構造の変更または不存在に依存する。ペプチド免疫療法は、効力が証明されている方法であり、ネコのフケアレルギーおよびハチ毒アレルギーの両方に関して報告されている。３つの異なる研究により、Ｔ細胞エピトープ含有配列を使用して、いかなる全身性の副作用も存在せず、主要なハチ毒アレルゲンであるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）について臨床および免疫学的寛容を達成することができることが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：７４７−５４，１９９８；Ｔａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．３６：４６５−７４，２００６；Ｆｅｌｌｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：８５４−６１，２００３）一方、いくつかの研究により、主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ１の構造をベースとするペプチドを使用して臨床応答の縮小を誘導することができることが実証されている（Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５４：１６２３−８，１９９６；Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０１：５０６−１３，１９９８；Ｐｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５７１−８，１９９８；Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３６０：４７−５３，２００２；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３５：５２−８，２００４；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ６０：１２６９−７４，２００５）。ごく最近、第ＩＩａ相試験により、Ｆｅｌ  ｄ１からの７ペプチド混合物（Ｔｏｌｅｒｏｍｕｎｅ  Ｃａｔ（登録商標）、Ｃｉｃａｓｓｉａ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）の安全性、寛容性および潜在的な効力が確認され（Ｗｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：８９−９７，２０１１）、第ＩＩｂ相試験が現在、行われている（Ｍｏｌｄａｖｅｒ＆Ｌａｒｃｈｅ．Ａｌｌｅｒｇｙ．６６：７８４−９１，２０１１；Ｗｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．２２（１０）：１３４７−１３５７，２０１３）。このような戦略開発の肝は、Ｔ細胞の表現型変化を誘導することができるようにＴ細胞エピトープを保持することである。
【０００８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子上に直接結合する能力により、応答性Ｔ細胞（Ｍｏｌｄａｖｅｒ＆Ｌａｒｃｈｅ，Ａｌｌｅｒｇｙ  ６６：７８４−９１，２０１１）および／またはＭＨＣクラスＩＩを発現する他のＣＤ４＋Ｔ細胞において寛容、アネルギーおよび／または抑制活性の誘導を促進する炎症促進および共刺激シグナルを有さずに非プロフェッショナルまたは未成熟ＡＰＣによるペプチドの提示が可能となる。これにより、全分子からプロセシングされたペプチドよりも高頻度においてペプチドの提示が可能となり（Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９９，９６：１５０５６−６１）、それらは全アレルゲンよりも安全でもあるため、より高濃度においてペプチドを与えることができ、したがってＴ細胞応答がより効率的に再分極される。
【０００９】
重要なことに、主要アレルゲンの優性Ｔ細胞エピトープに特異的なＴ細胞の標的化により、全アレルゲン抽出物に対する応答を変更することができる（連鎖的抑制）。ネズミアレルギーモデルにおいて、成功したペプチド免疫療法を報告する多くの研究報告により、主要アレルゲンの優性Ｔ細胞エピトープペプチドの投与により、それらペプチドに対する寛容だけではなく、精製アレルゲンおよび全アレルゲン抽出物に対する寛容も誘導されることが実証された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４０（４）：６６８−７８，２０１０；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．１３（８）：４９９−５０３，２００７；Ｍａｒａｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５（２）：４３８−４５，２００８；Ｒｕｐａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ．６７（１）：７４−８２，２０１２；Ｈｏｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７８（５）：１７８３−８，１９９３；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２１（５−６）：５４９−６１，２００３）。
【００１０】
したがって、主要ピーナッツアレルゲンを同定すること、およびさらにそれらのアレルゲンのＴ細胞エピトープを同定することの両方が必要とされている。これらのＴ細胞エピトープの同定、特徴付け、および分析が、特異的免疫療法または予防法の開発に重要である。この目的のため、これまでＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２ピーナッツアレルゲン分子が分析対象であったが、有効なワクチン開発にはＴ細胞コアエピトープ領域の同定が必須である。
【００１１】
本発明に至る研究の中で、優性である、ＨＬＡデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２コアＴ細胞エピトープ領域が同定された。このコアＴ細胞エピトープ領域の群は、その高レベルの効力に関してユニークである。あるレベルのＴ細胞反応性を示す能力のみに基づき同定された既に研究された２０ｍｅｒのＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２ペプチドとは異なり、両方とも他のＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２ペプチド断片に対して免疫優性であり、２つ以上のＨＬＡ型に結合する点でＨＬＡデジェネレートでもあるコアＴ細胞エピトープ領域の選択されたセットが同定された。さらに、これらのＴ細胞エピトープコア領域の多くは、ＨＬＡ−ＤＱ分子により提示される。ＨＬＡ−ＤＱ分子は、混合集団においてＨＬＡ−ＤＲ分子よりも保存されている。したがって、ＨＬＡ−ＤＱ上で提示されるペプチドは、より広い集団カバレージを可能とする。
【００１２】
いっそうさらなる知見において、Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープの両方を含有するペプチドの７つの特異的な下位群が特に有効な免疫学的アウトカムを提供することも発見された。したがって、このユニークに有効なペプチドの群を同定することにより、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはその誘導体もしくはホモログに対する異常な、不適切な、またはそうでなければ不所望な免疫応答、他の樹木性堅果アレルギー、または例えば、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２分子を含有する組成物、例えば、食物に対するアレルゲンにより特徴付けられる病態を治療する特に有効な治療的予防方法の開発が容易になった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、特に文脈が要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述される整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群の包含が意味されるが、任意の他の整数またはステップの除外も整数またはステップの群の除外も意味するものではないと理解される。
【００１４】
本明細書において使用される場合、用語「〜に由来する」は、特定の整数または整数の群が規定された種からの起源であるが、必ずしも、その規定の源から直接得られたものではないことを示すと解釈されたい。さらに、本明細書において使用される場合、「ａ」、「および」および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。
【００１５】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１６】
主題明細書は、参照文献目録の後に本明細書に提示される、プログラムＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５を使用して準備されたアミノ酸配列情報を含有する。それぞれのアミノ酸配列は、数字見出し＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、など）により配列表中で識別される。配列の長さ、タイプ（タンパク質など）およびそれぞれの配列の源となった生物は、それぞれ、数字見出し欄＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞に提供される情報により示される。本明細書において言及されるアミノ酸配列は、配列番号の表示とそれに続く配列識別子により識別される（例えば、配列番号１、配列番号２、など）。本明細書において言及される配列識別子は、配列表中の数字見出し＜４００＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２、など）に提供される情報と相関する。すなわち、本明細書において詳述されるとおり、配列番号１は配列表中の＜４００＞１と示される配列と相関する。
【００１７】
本発明の１つの態様は、免疫調節組成物であって：
【化１】
2016533341.tif 000002
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログの少なくとも５つを含み、残基Ｘが、システインまたはセリンであり、配列番号１〜６から選択される少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域および配列番号７〜８から選択される少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域を含む組成物を対象とする。
【００１８】
別の態様において、前記
【化２】
2016533341.tif 000003
は、
【化３】
2016533341.tif 000004
である。
【００１９】
さらに別の態様において、前記
【化４】
2016533341.tif 000005
は、
【化５】
2016533341.tif 000006
である。
【００２０】
本発明のこれらの態様および実施形態によれば、前記組成物は、前記Ｔ細胞エピトープ領域の少なくとも６つを含む。
【００２１】
さらなる態様において、前記組成物は、前記Ｔ細胞エピトープ領域の少なくとも７つを含む。
【００２２】
いっそうさらなる態様において、前記組成物は、前記８つのＴ細胞エピトープ領域のそれぞれを含む。
【００２３】
別の態様において、
【化６】
2016533341.tif 000007
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含み、前記残基Ｘが、システインまたはセリンである免疫調節組成物が提供される。
【００２４】
さらに別の態様において、
【化７】
2016533341.tif 000008
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む免疫調節組成物が提供される。
【００２５】
関連態様において、本発明は、１つ以上のペプチドを含む免疫調節組成物であって、ペプチドのそれぞれが、最大６０連続アミノ酸長であり、ペプチドが、上記に詳述されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域の組合せのそれぞれを含む組成物を対象とする。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、１つ以上のペプチドを含む免疫調節組成物であって、それぞれのペプチドが、最大６０連続アミノ酸長であり、ペプチドが、
【化８】
2016533341.tif 000009
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む組成物を対象とする。
【００２７】
さらに別の態様において、前記ペプチドまたはＴ細胞エピトープ領域は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２に対する、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物、例えば、食物中に存在するアレルゲンに対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる病態を有する対象から単離されたＴ細胞に提示された場合、Ｔ細胞機能を改変し得るが、そのペプチドはＡｒａ  ｈ１特異的および／もしくはＡｒａ  ｈ２特異的ＩｇＥに結合し得ない。
【００２８】
これらの態様によれば、前記ペプチドは、
【化９】
2016533341.tif 000010
からなるリストまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログから選択され、残基Ｘは、システインまたはセリンである。
【００２９】
一実施形態において、前記残基Ｘは、セリンである。
【００３０】
さらなる態様において、前記ペプチドは、
【化１０】
2016533341.tif 000011
またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログから選択される。
【００３１】
別の態様において、前記免疫調節組成物は、
【化１１】
2016533341.tif 000012
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む。
【００３２】
いっそうさらなる態様において、本発明者らは、好ましい７つのペプチドのセットを設計し、その５つはＡｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープを含み、その２つはＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープを含み、一緒に投与された場合、特に有効に機能して脱感作または寛容を誘導し、それによりＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２を含む組成物、例えば、食物に対する過敏を予防または治療的に治療する。これらのペプチドは、
【化１２】
2016533341.tif 000013
である。
【００３３】
いっそうさらに別の態様において、
【化１３】
2016533341.tif 000014
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドのそれぞれを含む免疫調節組成物が提供される。
【００３４】
いっそうさらに別の態様において、
【化１４】
2016533341.tif 000015
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドのそれぞれを含み、
これらのペプチドが、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２過敏症またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物に対する過敏症を、前記過敏症により特徴付けられる病態を有する対象に投与された場合、低減し得る組成物が提供される。
【００３５】
本発明は、上記定義のペプチドを含む組成物を対象とする。しかし、主題組成物が追加の構成要素、例えば、追加のペプチドを含み得ることを理解されたい。組成物中に含めることができる他のペプチドの例としては、限定されるものではないが、
【化１５】
2016533341.tif 000016
またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログが挙げられ、残基Ｘは、システインまたはセリンである。
【００３６】
別の態様において、本発明は、上記定義のＴ細胞エピトープおよびペプチドもしくはそれらの誘導体、ホモログもしくはアナログをコードする、またはそれらをコードする配列に相補的な１つ以上の核酸分子を含む核酸分子組成物を提供する。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物中のアレルゲンに対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる対象における病態を治療および／または予防する方法であって、前記Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または他のアレルゲンに指向されるＴ細胞の前記対象における存在または機能を除去または低減させるために十分な時間および条件下で、前記対象に有効量の上記定義の免疫調節組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
さらなる態様において、前記病態は、ピーナッツまたはＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２もしくはＡｒａ  ｈ１様もしくはＡｒａ  ｈ２様分子を含有する樹木性堅果、例えば、ヘーゼルナッツ、アーモンドおよびブラジルナッツに対する過敏症である。
【００３９】
別の態様において、前記方法は、前記組成物のＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または他のアレルゲンに対して脱感作させ、またはそれに対する免疫学的寛容を誘導する。
【００４０】
さらに別の態様において、前記脱感作または寛容は、Ｔ細胞アネルギーまたはアポトーシスを誘導することにより達成される。
【００４１】
いっそうさらに別の態様において、前記脱感作または寛容は、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することにより達成される。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２に対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる哺乳動物における病態の治療のための医薬品の製造における、上記定義の免疫調節組成物の使用を企図する。
【００４３】
好ましくは、前記病態は、ピーナッツまたはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２もしくはＡｒａ  ｈ１様および／もしくはＡｒａ  ｈ２様分子を含有する樹木性堅果、例えば、ヘーゼルナッツに対する過敏症である。
【００４４】
さらに別のさらなる態様において、本発明は、上記定義の組成物を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤と一緒に含むワクチンを企図する。前記組成物は、活性成分と称される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法において使用される上記定義の組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ペプチド特異的ＰＢＭＣ  Ｔ細胞についてのＣＦＳＥスクリーンのグラフ表示：（Ａ）全ピーナッツ抽出物またはＶａｘ（７ペプチド編集物）とインキュベートされたピーナッツアレルギー対象からのＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ。枠は、活性化増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低）のパーセントを示す。ＳＩは、抗原なし対照を上回るＴ細胞活性化の増加倍率を示す。（Ｂ）７人の対象（全員、陽性ＳＩ＞２．５を有する）におけるＶａｘ（７ペプチド編集物）に応答するピーナッツアレルギードナーＰＢＭＣ  ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化および増殖の確認。
【図２】好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）のグラフ表示。（Ａ）全ピーナッツ抽出物またはＶａｘ（７ペプチド編集物）とインキュベートされたピーナッツアレルギー対象からの血液を示すＦＡＣＳプロット。好塩基球は、ＩｇＥｈｉ細胞（枠、最初のプロット）として識別され、活性化好塩基球は、ＣＤ６３ｈｉ（枠、プロット２〜４）として識別される。（Ｂ）ＢＡＴデータおよび（Ｃ）増加濃度（  ｇ／ｍｌ）の全ピーナッツ抽出物またはＶａｘとのインキュベーション後のピーナッツアレルギー対象からのヒスタミン放出データ（市販のキットにより計測）。陽性対照は、抗ＩｇＥおよびｆＭＬＰである。全ピーナッツ抽出物は、高度な好塩基球活性化およびヒスタミン放出を引き起こすが、Ｖａｘは引き起こさない。データは、試験された１４人のピーナッツアレルギー対象の代表である。
【図３】主要ピーナッツアレルゲンＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２の優性エピトープを同定するために用いられる方法の概略表示である。
【図４】ピーナッツアレルギードナーの全ＰＢＭＣ中のＴ細胞増殖を誘導する優性２０ｍｅｒペプチドの能力を検出するために設計された７日間ＣＦＳＥアッセイの概略表示である。枠内の数字は、分裂する（ＣＦＳＥ低）ＣＤ４＋Ｔ細胞の％を示し、ＳＩ＝未刺激対照を上回る分裂細胞の増加倍率。
【図５】Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒペプチドに対するＴ細胞系のレスポンダー頻度を実証するグラフ表示である。枠は、（複数のパラメータに基づき）最終的に選択された９つの優性２０ｍｅｒを示す。
【図６】優性Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒを用いるＰＢＭＣスクリーニングのグラフ表示である。ピーナッツアレルギードナーからのＰＢＭＣ中の特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的化する優性２０ｍｅｒの能力を試験した。
【図７】Ａｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒペプチドに対するＴ細胞系のレスポンダー頻度および２０ｍｅｒ当たりの特異的ＴＣＬの数を実証するグラフ表示である。枠は、複数のパラメータに基づき最終的に選択された４つの優性２０ｍｅｒペプチドを示す。
【図８】コアＴ細胞エピトープマッピング結果のグラフ表示である。
【図９】優性Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープのＨＬＡ拘束のグラフ表示である。
【図１０】選択システイン残基がセリン残基により置き換えられたペプチドのＴ細胞認識のグラフ表示である。３Ｈチミジン取り込みにより決定された「親」（システイン含有）またはセリン置換Ａｒａ  ｈ２ペプチドに応答するＴＣＬ増殖。グラフは、それぞれのエピトープについての代表的なＴＣＬを示す（平均ｃｐｍレプリケートウェル＋ＳＤ）。Ａ）Ａｒａ  ｈ２（３２〜４４）、Ｂ）Ａｒａ  ｈ２（３７〜４７）；Ｃ）Ａｒａ  ｈ２（９１〜１０２）；Ｄ）Ａｒａ  ｈ２（９５〜１０７）；Ｅ）Ａｒａ  ｈ２（１２８〜１４１）。
【図１１】選択システイン残基がセリン残基により置き換えられたペプチドに応答するＴ細胞サイトカイン産生のグラフ表示である。ＥＬＩＳＰＯＴにより決定された「親」またはシステイン置換Ａｒａ  ｈ２ペプチドに応答するサイトカイン分泌。グラフは、それぞれのエピトープに特異的な代表的なＴＣＬを示す（レプリケートウェルの平均スポット数＋ＳＤ）。ＩＬ−４、黒色バー；ＩＬ−５、斜線バー；ＩＦＮ−  、白色バー；Ａ）Ａｒａ  ｈ２（３２〜４４）、Ｂ）Ａｒａ  ｈ２（３７〜４７）；Ｃ）Ａｒａ  ｈ２（９１〜１０２）；Ｄ）Ａｒａ  ｈ２（９５〜１０７）；Ｅ）Ａｒａ  ｈ２（１２８〜１４１）。
【図１２】ペプチドプールと全ピーナッツに対するＰＢＭＣ応答のグラフ表示である。それぞれのプール中に含まれるペプチドを表２３に示す。Ｐ値は、ウィルコクソンのマッチドペア符号順位検定を示す（ノンパラメトリックデータについて）。
【図１３】ペプチドプールと全ピーナッツに対するＰＢＭＣ応答のグラフ表示である。それぞれのプール中に含まれるペプチドを表２３に示す。Ｐ値は、ウィルコクソンのマッチドペア符号順位検定を示す（ノンパラメトリックデータについて）。
【図１４】好ましい７ペプチドプールに対するＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答を含むグラフ表示である。統計：複数群間の差を試験するための、ダンポストホック相関を用いるノンパラメトリックデータについてのクラスカル・ウォリス検定。＊データは、異なるプールについて分析された異なるコホート中の異なる対象における応答の大きさの変動に起因して全ピーナッツに対する応答の％に正規化した。
【図１５】Ｔ細胞増殖のＡｒａ  ｈ２ペプチド誘導阻害のグラフ表示である。
【図１６】Ｔ細胞増殖のＡｒａ  ｈ１ペプチド誘導阻害のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、部分的には、一緒に投与された場合、少なくとも５つの群において、単独で、またはエピトープの他の組合せまたは他のＡｒａ  ｈ１もしくはＡｒａ  ｈ２ペプチドと一緒に使用されるエピトープのいずれよりも有効な免疫学的アウトカムを産生するＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２エピトープの群の同定に基礎を置く。特に、８つ全てのエピトープの使用が特に群を抜いて有効な機能的アウトカムを産生することが決定された（最も特定すると、これら８つのエピトープが本明細書に例示される７つのペプチドに関して投与される場合）。この組成物の設計により、病態、例えば、限定されるものではないが、ピーナッツアレルギーにこれまで利用可能であったものよりも有意に有効な治療および予防組成物ならびに治療アプローチの開発が可能となる。
【００４８】
したがって、本発明の一態様は、免疫調節組成物であって、
【化１６】
2016533341.tif 000017
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログの少なくとも５つを含み、残基Ｘが、システインまたはセリンであり、配列番号１〜６から選択される少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域および配列番号７〜８から選択される少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域を含む組成物を対象とする。
【００４９】
一実施形態において、前記
【化１７】
2016533341.tif 000018
は、
【化１８】
2016533341.tif 000019
である。
【００５０】
別の実施形態において、前記
【化１９】
2016533341.tif 000020
は、
【化２０】
2016533341.tif 000021
である。
【００５１】
本発明のこれらの態様および実施形態によれば、前記組成物は、前記Ｔ細胞エピトープ領域の少なくとも６つを含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、前記組成物は、前記Ｔ細胞エピトープ領域の少なくとも７つを含む。
【００５３】
いっそうさらなる実施形態において、前記組成物は、前記８つのＴ細胞エピトープ領域のそれぞれを含む。
【００５４】
したがって、この実施形態によれば、
【化２１】
2016533341.tif 000022
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含み、前記残基Ｘが、システインまたはセリンである免疫調節組成物が提供される。
【００５５】
別の実施形態において、
【化２２】
2016533341.tif 000023
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む免疫調節組成物が提供される。
【００５６】
関連態様において、本発明は、１つ以上のペプチドを含む免疫調節組成物であって、ペプチドのそれぞれが、最大６０連続アミノ酸長であり、ペプチドが、上記に詳述されるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域の組合せのそれぞれを含む組成物を対象とする。
【００５７】
この態様によれば、本発明は、１つ以上のペプチドを含む免疫調節組成物であって、ペプチドのそれぞれが、最大６０連続アミノ酸長であり、ペプチドが、
【化２３】
2016533341.tif 000024
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ領域またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む組成物を対象とする。
【００５８】
本発明の上記態様の別の実施形態において、前記ペプチドまたはＴ細胞エピトープ領域は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２に対する、またはＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２を含む組成物、例えば、食物中に存在するアレルゲンに対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる病態を有する対象から単離されたＴ細胞に提示された場合、Ｔ細胞機能を改変し得るが、そのペプチドはＡｒａ  ｈ１特異的および／またはＡｒａ  ｈ２特異的ＩｇＥに結合し得ない。
【００５９】
本発明を決して限定するものではないが、ピーナッツは、多くのタンパク質を含有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で可視的な区別されるバンドの数は、使用される方法に依存する。高速液体クロマトグラフィー後、最大５３個のバンドが可視的である（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２８：７４３−５１，１９９８）。これらタンパク質の２つのみが、標準的な基準を使用して主要アレルゲンとしての分類を保証し、それによりピーナッツアレルギー人口の５０％を超える範囲内でＩｇＥ反応性が生じ；これらのタンパク質は、Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２と称される（Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  ５３：７２５−３０，１９９８）。多数の研究により、Ａｒａ  ｈ２がこれら２つのアレルゲンのより強力なものであることが示されている（Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００９；３９（８）：１２７７−８５；Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００４；３４（４）：５８３−９０；Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１１５（３）：３０２−１２）が、Ａｒａ  ｈ１もピーナッツアレルギーの発症機序において主要な役割を担っており、多数の研究により、症状の重症度とＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２の両方に対するＩｇＥ反応性との間の強力な相関が報告されている（Ｇｌａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ．２０１２；６７（２）：２４２−７；Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；２１（２  Ｐｔ  ２）：ｅ４２９−３８；Ａｓａｒｎｏｊ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ．２０１０，６５（９）：１１８９−９５；Ｍｏｖｅｒａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１５６（３）：２８２−９０；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．２０１２；Ｐｅｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００７；３７（１）：１０８−１５）。Ａｒａ  ｈ１は、ピーナッツ中の最も豊富な主要アレルゲンであり、総ピーナッツタンパク質の１２〜１６％を占める（Ｋｏｐｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ．２００１；５６（２）：１３２−７）。
【００６０】
さらに、本発明を決して限定するものではないが、Ａｒａ  ｈ１アレルゲンは、７Ｓ種子貯蔵糖タンパク質またはビシリンである。ピーナッツ中のＡｒａ  ｈ１の濃度は、仁のサイズとともに増加するため（４〜１６ｍｇの抽出Ａｒａ  ｈ１／１ｇのピーナッツ）、そのタンパク質の発現はピーナッツの成熟度に関連する（Ｐｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３６（６）：８２４−３０）。Ａｒａ  ｈ１は、単量体の遠位端において疎水性区域を介して一緒に保持されるホモ三量体であり、ＩｇＥ結合Ｂ細胞エピトープのほとんどがそこに局在する。それぞれの６４．５ｋＤ単量体は、それぞれα−ヘリックスのループドメインに会合している２つのコアβ−バレルからなるクピンモチーフを有する。
【００６１】
Ａｒａ  ｈ２は、コングルチニン種子貯蔵ファミリーのメンバーとして同定された糖タンパク質である。Ａｒａ  ｈ２分子量の２０％は炭水化物側鎖を表し、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でダブレットとして移動し、平均分子量は１７．５ｋＤａである（Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１９：１６５−１７２，１９９２）。これは、試験された６つの血清のうちの６つとのその反応性に基づき主要アレルゲンとして特徴付けられている（Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２、前掲）。他の研究者らもその重要性を確認しており；Ｃｌａｒｋｅは、粗製ピーナッツ抽出物のウエスタンブロッティング時に対象の７１％がＡｒａ  ｈ２に対する特異的ＩｇＥを有することを実証した。Ｋｌｅｂｅｒ−Ｊａｎｋｅらは、対象の８５％が、ウエスタンブロット時にそれらの組換え体に対するＩｇＥを有することを実証しており、ｄｅ  Ｊｏｎｇのグループは、それらの群の約７８％が精製天然Ａｒａ  ｈ２に対する特異的ＩｇＥを実証することを示している（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２８：１２５１−７，１９９８；ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９８  前掲；Ｋｌｅｂｅｒ−Ｊａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１９：２６５−２７４，１９９９）。
【００６２】
「Ａｒａ  ｈ１」への言及は、この分子の全ての形態への言及、例として、Ａｒａ  ｈ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じ得る任意のアイソフォーム、またはＡｒａ  ｈ１の機能的突然変異体もしくは多型体への言及として理解されたい。さらに、Ａｒａ  ｈ１遺伝子によりコードされる任意のタンパク質、任意のサブユニットポリペプチド、例えば、単量体、多量体または融合タンパク質として存在するかに関わらず、生成することができる前駆体にまで拡張されると理解されたい。これは、例えば、天然でＡｒａ  ｈ１を含有する産物が、例えば、製品、例えば、食物添加物を生成する目的のために、合成により生成される場合に生じ得るＡｒａ  ｈ１のアナログまたは均等物への言及も含む。これにより、本発明は、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ１様分子に対する過敏症により特徴付けられる任意の病態、例えば、ピーナッツアレルギーもしくは樹木性堅果アレルギー、またはＡｒａ  ｈ１も含有する組成物、例えば、食物中に存在する抗原に対するアレルギーの診断および治療における使用のためのＴ細胞エピトープおよび方法を提示する。好ましくは、前記Ａｒａ  ｈ１は、配列番号９に記載の配列を含み、Ａｒａ  ｈ２は、配列番号１０に記載の配列を含む。
【００６３】
「Ｔ細胞」への言及は、Ｔ細胞受容体を含有する任意の細胞への言及として理解されたい。これに関して、Ｔ細胞受容体は、  、  、  または  鎖の任意の１つ以上を含み得る。本発明は任意の特定のＴ細胞の機能的サブクラスに限定されるものではないが、好ましい実施態様において、主題Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞であり、いっそうより好ましくは、Ｔｈ２型の細胞および／またはＴｒｅｇ細胞である。これに関して、「Ｔ細胞機能を改変する」への言及は、Ｔ細胞が遂行し得る任意の１つ以上の機能を改変することへの言及と理解されたい。例えば、主題機能は、増殖、分化または他の形態の細胞の機能的活性、例えば、サイトカインの産生であり得る。一実施形態において、主題機能的活性は、増殖である。
【００６４】
Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２に対する、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物に対する異常な、不所望な、または不適切な免疫応答により特徴付けられる病態を有する対象から単離されたＴ細胞の「機能を改変する」に関して、これは必ずしも所与の生物学的試料中の全てのＴ細胞の機能を改変することを言及せず、実際、試料中のＴ細胞のほんの一部の機能の改変を示す可能性が高いということを理解されたい。例えば、所与のＴ細胞試料中のＴヘルパー細胞のほんの一部が、主題ペプチドとの接触に対して機能的に応答し得る。このような部分的な応答は、本発明の範囲内であることを理解されたい。対象から誘導されたＴ細胞は、回収されたばかりのＴ細胞であり得、または試験前に何らかの形態のインビトロまたはインビボ操作の受けたものであり得ることも理解されたい。例えば、Ｔ細胞系は、細胞試料から生成することができたものであり得、次いでこれらのＴ細胞系は、本発明により試験される対象由来Ｔ細胞集団を形成する。主題機能的活性がＴ細胞増殖である限り、好ましくは、Ｔ細胞増殖アッセイが、本明細書に開示されるとおり実施される。いっそうさらに好ましくは、Ｔ細胞機能の主題改変は、増殖の誘導である。これに関して、「Ａｒａ  ｈ１反応性」または「Ａｒａｈ２反応性」Ｔ細胞への言及は、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープのＨＬＡ提示に対してそれぞれ機能的に応答するＴ細胞への言及として理解されたい。同様に、「Ａｒａ  ｈ１特異的」または「Ａｒａ  ｈ２特異的」ＩｇＥへの言及は、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２Ｂ細胞エピトープにそれぞれ指向されるＩｇＥへの言及として理解されたい。
【００６５】
「異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な」免疫応答への言及は、１つ以上の免疫細胞の活性化および／または機能が関与する生理学的活性の任意の形態への言及として理解されたく、その活性は、不適切な型のものであり、または不適切な程度にまで進行するという点で不適切である。これは、公知の免疫学的原理に従い、生じるべき場合に生じないこと、または生じるべきでない場合に生じること点において異常であり得る。別の例において、免疫応答は、それが生理学的に正常な応答であるが、必要ではない、および／または不所望である点、例えば、無害なアレルゲンに対するＩ型過敏性応答に関して生じる点で不適切であり得る。本発明に関して、この免疫応答は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２に指向され得、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２と一緒に組成物中に存在する異なるアレルゲンに指向され得る。本発明をいずれか１つの理論または作用機序に限定するものではないが、過敏性応答がＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２以外のアレルゲンに指向される場合であっても、そのアレルゲンがＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２を含む組成物中に存在する場合、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２に指向される本発明の方法を介する治療は、それにもかかわらず、Ｔｈ２およびＴｒｅｇ機能の有益な改変を誘導し、その結果、それにもかかわらず、無関連アレルゲンに対して存在する過敏症を低減させることが決定された。好ましくは、前記免疫応答は、ピーナッツ過敏症である。
【００６６】
「ピーナッツ過敏症」は、ＩｇＥ介在性ピーナッツ過敏症の臨床症状の誘導を意味する。しかしながら、臨床症状が明白であり得るが、全てのそのような個体が必ずしも、Ｋａｌｌｅｓｔａｄ  Ａｌｌｅｒｃｏａｔ  ＥＡＳＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＳＡ）を使用して計測される検出可能なレベルのピーナッツ特異的血清ＩｇＥを示すわけではないが、そのような個体も「ピーナッツ過敏症」を示す個体の定義の範囲内に入ることを理解されたい。あるいは、試験は、ＥＡＳＴ，ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＵｎｉＣａｐシステムまたはアレルゲン皮膚プリック試験のいずれかを利用して進行し得る。「Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２過敏症」への言及は、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２タンパク質に対する反応性に関して対応する意味を有すると理解されたい。
【００６７】
上記の態様によれば、前記ペプチドは、
【化２４】
2016533341.tif 000025
からなるリストまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログから選択され、残基Ｘは、システインまたはセリンである。
【００６８】
一実施形態において、前記残基Ｘは、セリンである。
【００６９】
好ましくは、前記ペプチドは、
【化２５】
2016533341.tif 000026
またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログから選択される。
【００７０】
別の実施形態において、前記免疫調節組成物は、
【化２６】
2016533341.tif 000027
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドまたはそれらの機能的誘導体もしくはホモログのそれぞれを含む。
【００７１】
ピーナッツＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２過敏症（およびより一般にはアレルギー過敏症）の低減を以下により詳細に考察する。しかしながら、手短に述べると、これは、個体をＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２特異的に、またはピーナッツまたはより一般的な他のタンパク質に対して部分的もしくは完全に脱感作または寛容化させる形態をとり得る。
【００７２】
「ペプチド」への言及は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの一部への言及を含む。ペプチドはグリコシル化されていてよく、もしくは非グリコシル化であってよく、および／またはタンパク質、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物または他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に融合、連結、結合している、またはそうでなければ会合している一連の他の分子を含有し得る。以下、「ペプチド」への言及は、アミノ酸の配列を含むペプチドおよび他の分子、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物または他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質と会合しているペプチドを含む。
【００７３】
「誘導体」は、天然、合成または組換え源、例として、融合タンパク質からの断片、部分、一部およびバリアントを含む。部分または断片は、例えば、主題ペプチドの活性領域を含む。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から誘導することができる。アミノ酸挿入誘導体としては、アミノおよび／またはカルボキシ末端融合物ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入物が挙げられる。挿入アミノ酸配列バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質中の所定部位中に導入されているものであるが、ランダム挿入も得られる産物の好適なスクリーニングについて可能である。欠失バリアントは、配列からの１つ以上のアミノ酸の除去により特徴付けられる。
【００７４】
置換アミノ酸バリアントは、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。置換アミノ酸バリアントの例は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換としては、典型的には、以下の群内の置換が挙げられる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。アミノ酸配列への付加としては、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合が挙げられる。一実施形態において、システイン残基は、本明細書に例示のとおり、セリンにより置換されている。
【００７５】
主題ペプチドの化学的および機能的な均等物は、それらの分子の機能的活性のいずれか１つ以上を示す分子と理解されたく、任意の源から誘導することができ、例えば、化学合成し、またはスクリーニングプロセス、例えば、天然産物スクリーニングを介して同定することができる。
【００７６】
ホモログとしては、ピーナッツ以外の品種から誘導されたペプチド、例えば、他の樹木性堅果に由来するペプチドが挙げられる。
【００７７】
本明細書において企図されるアナログとしては、限定されるものではないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、ならびに架橋剤の使用、ならびにタンパク質性分子またはそのアナログに対して立体構造制約を与える他の方法の使用が挙げられる。突然変異体としては、改変された機能的活性を示す分子（例えば、１つ以上のＴ細胞エピトープを発現するが、Ｂ細胞反応性を欠くＡｒａ  ｈ１ペプチド）が挙げられる。
【００７８】
本発明により企図される側鎖修飾の例としては、アミノ基の修飾、例えば、アルデヒドとの反応とそれに続くＮａＢＨ４による還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサル−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＨ４による還元によるものが挙げられる。
【００７９】
アルギニン残基のグアニジン基は、試薬、例えば、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルとの複素環縮合生成物の形成により修飾することができる。カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成とそれに続く、例えば、対応するアミドへの後続の誘導体化を介するカルボジイミド活性化により修飾することができる。スルフヒドリル基は、例えば、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸に対する過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロ水銀安息香酸塩、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールおよび他の水銀物質を使用する水銀誘導体の形成；アルカリｐＨにおけるシアン酸塩によるカルバモイル化などの方法により修飾することができる。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物もしくはスルフェニルハロゲン化物によるインドール環のアルキル化などにより修飾することができる。他方でチロシン残基は、テトラニトロメタンにより窒化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することにより変更することができる。
【００８０】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシ化により達成することができる。
【００８１】
タンパク質合成の間の非天然アミノ酸および誘導体の組み込みの例としては、限定されるものではないが、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられる。本明細書において企図される非天然アミノ酸のリストを表１に示す。
【００８２】
【表１】
2016533341.tif 000028
【００８３】
【表２】
2016533341.tif 000029
【００８４】
【表３】
2016533341.tif 000030
【００８５】
例えば、ホモ二価架橋剤、例えば、（ＣＨ２）ｎスペーサー基（ｎ＝１〜ｎ＝６）を有する二価イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ならびに通常、アミノ反応性部分、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび他の基特異的反応部分を含有するヘテロ二価試薬を使用して３Ｄ立体構造を安定化させるため、架橋剤を使用することができる。
【００８６】
種々の目的のため、例えば、溶解度を増加させる、治療もしくは予防効力を向上させる、安定性を向上させる、またはタンパク質分解に対する抵抗性を増加させる目的のため、本発明によるペプチドの構造を改変することが可能である。免疫原性を改変するため、および／またはアレルギー誘発性を低減させるため、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加により、アミノ酸配列が変更された改変ペプチドを産生することができる。同様の構成要素を本発明のペプチドに付加して同じ結果をもたらすすることができる。
【００８７】
例えば、ペプチドがＴ細胞アネルギーを誘導する能力を示すようにペプチドを改変することができる。この例において、公知技術（例えば、それぞれの残基の置換およびＴ細胞反応性の有無の決定）を使用してＴ細胞受容体について重要な結合残基を決定することができる。一例において、Ｔ細胞受容体との相互作用に必須であると示されている残基は、必須アミノ酸を、存在がＴ細胞反応性またはＴ細胞の機能を変更することが示されている別の、好ましくは類似のアミノ酸残基により置き換えること（保存的置換）により改変することができる。さらに、Ｔ細胞受容体相互作用に必須ではないアミノ酸残基は、取り込みが次いでＴ細胞反応性またはＴ細胞機能を変更し得るが、例えば、関連ＭＨＣタンパク質への結合を排除しない別のアミノ酸により置き換えることにより改変することができる。さらに別の例において、正常なＴ細胞結合を示すが、ＩｇＥ結合を消失した突然変異ペプチドを作出することができる。
【００８８】
例示的な保存的置換を以下に詳述し、以下のものが挙げられる：
【００８９】
【表４】
2016533341.tif 000031
【００９０】
このような改変は、本明細書において定義される主題ペプチドの「突然変異体」の範囲内である分子の産生をもたらす。「突然変異体」は、非突然変異ペプチド相当物により示されるものとは区別される１つ以上の構造的特徴または機能的活性を示すペプチドへの言及と理解されたい。
【００９１】
本発明のペプチドは、天然アレル変異から生じる１つ以上の多形を取り込むように改変することもでき、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログをペプチド中に置換して本発明の範囲内にある改変ペプチドを産生することができる。ペプチドは、公知技術によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションにより改変することもできる。精製を容易にするため、および本発明によるペプチドの溶解度を潜在的に増加させるためにレポーター基を付加することもできる。他の周知の改変のタイプ、例として、特異的エンドプロテアーゼ開裂部位の挿入、官能基の付加または疎水性残基の低疎水性残基による置換、ならびに本発明のペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異導入を使用して広範な目的に有用であり得る改変を導入するすることもできる。上記の本発明によるペプチドに対する種々の改変は、例として言及されるにすぎず、行うことができる広範な改変を示すことのみが意図されている。
【００９２】
上記に詳述されるとおり、本発明は、Ｔ細胞と相互作用する能力の全てまたは一部を保持するが、部分的に、もしくは完全に阻害され、消失し、またはそうでなければ下方制御されている抗体反応性を示すペプチドを提供する。当業者に周知の方法である任意の好適な方法により抗体反応性の下方制御を生じさせることができる。例えば、Ｂ細胞エピトープがその直鎖アミノ酸配列により定義される限り、天然存在配列と区別される突然変異直鎖配列とするために、１つ以上のアミノ酸残基を付加し、欠失させ、または置換することができる。さらに、または代替的に、エピトープが立体構造エピトープにより定義され得る限り、ペプチドの２°構造、またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体が存在する限り、ペプチドの３°構造を破壊することにより、その立体構造の破壊に努めることができる。これは、例えば、２°および／または３°構造を安定化させることが公知の結合、例えば、ジスルフィド結合の形成を破壊することにより達成することができる。上記定義のＴ細胞エピトープに関して、これらのＴ細胞エピトープ領域は、Ｂ細胞エピトープを含まない。
【００９３】
関連態様において、本発明者らは、好ましい７つのペプチドのセットを設計し、その５つは、Ａｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープを含み、その２つは、Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープを含み、一緒に投与された場合、特に有効に機能して脱感作または寛容を誘導し、それによりＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２を含む組成物、例えば、食物に対する過敏症を予防または治療的に治療する。これらのペプチドは、
【化２７】
2016533341.tif 000032
である。
【００９４】
したがって、好ましい実施形態において、
【化２８】
2016533341.tif 000033
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドのそれぞれを含む免疫調節組成物が提供される。
【００９５】
さらなる態様において、
【化２９】
2016533341.tif 000034
からなるリストからのＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞ペプチドのそれぞれを含み、これらのペプチドが、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２過敏症またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物に対する過敏症を、前記過敏症により特徴付けられる病態を有する対象に投与された場合、低減し得る組成物が提供される。
【００９６】
本発明のペプチドは、組換えまたは化学合成手段により調製することができる。本発明の好ましい態様によれば、ピーナッツ過敏性を有する個体からのＴ細胞と優先的に免疫反応し、本発明のペプチド配列をコードするベクターにより形質転換された宿主細胞の発現により発現される組換えペプチドまたはその突然変異体が提供される。ペプチドは、別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合することができる。あるいは、ペプチドは、化学合成技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成手順により調製することができる。さらに、上記の配列の合成ペプチドは好ましい実施態様を提示するが、本発明は、天然存在ペプチドまたはその断片の生物学的に純粋な調製物にも及ぶ。「生物学的に純粋」は、重量、活性または他の好適な手段により決定して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、または好ましくは少なくとも約８０％、いっそうさらに好ましくは少なくとも約９０％またはそれよりも多くを含む調製物を意味する。
【００９７】
したがって、本発明は、上記定義のＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２の少なくとも１つのＴ細胞コアエピトープ領域を、他のアミノ酸（天然存在であってもなくてもよい）または他の化学種と同時に含むペプチドを包含するものと理解されたい。本発明の好ましい態様において、そのようなペプチドは、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２の１つ以上のエピトープ（エピトープは、Ｔ細胞コアエピトープ領域である）を含み得る。Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２の１つ以上のＴ細胞エピトープを有するペプチドが、治療有効性の増加に望ましい。
【００９８】
上記に詳述されるとおり、本発明は、上記定義のペプチドを含む組成物を対象とする。しかし、主題組成物は、追加の構成要素、例えば、追加のペプチドを含み得ることを理解されたい。これらのペプチドは、例えば、コア最小エピトープの部分領域を包含し得る。あるいは、これらは、本明細書に開示のＴ細胞エピトープのいかなる部分も含み得ないが、いずれかの理由のために取り込むことができる。組成物中に含めることができる他のペプチドの例としては、限定されるものではないが、
【化３０】
2016533341.tif 000035
またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログが挙げられ、残基Ｘは、システインまたはセリンである。
【００９９】
規定の状況の詳細を考慮して有利であり得るさらに他のペプチドまたは分子を含めることもできる。
【０１００】
別の態様において、本発明は、上記定義のＴ細胞エピトープおよびペプチドもしくはそれらの誘導体、ホモログもしくはアナログをコードし、またはそれらをコードする配列に相補的な１つ以上の核酸分子を含む核酸分子組成物を提供する。
【０１０１】
「ペプチド」への言及は、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むペプチドへの言及を含むことを理解されたい。主題ペプチドをコードする核酸分子は、好ましくは、デオキシリボ核酸の配列、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム配列である。ゲノム配列は、エクソンとイントロンを含み得る。ゲノム配列は、プロモーター領域または他の調節領域も含み得る。
【０１０２】
核酸分子は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞または植物細胞）中で発現し得る発現ベクターにライゲートすることができる。核酸分子は、別の実体、例えば、シグナルペプチドなどをコードする核酸分子とライゲートまたは融合またはそうでなければ会合させることができる。これは、３’もしくは５’末端部分または３’および５’末端部分の両方のいずれかにおいてその核酸分子と融合、連結またはそうでなければ会合している追加のヌクレオチド配列情報も含み得る。核酸分子は、ベクター、例えば、発現ベクターの部分でもあり得る。後者の実施形態により、形態が本発明により包含される主題ペプチドの組換え体の産生が容易となる。
【０１０３】
このような核酸は、適切なベクター中への挿入および好適な細胞系中への形質移入による、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２のＴ細胞エピトープまたはそれらを含むタンパク質の組換え体の産生に有用であり得る。このような発現ベクターおよび宿主細胞系も本発明の態様を形成する。
【０１０４】
組換え技術によるペプチドの産生において、本発明によるペプチドをコードする配列を有する核酸またはその核酸配列の機能的均等物により形質転換された宿主細胞を、特定の関連細胞に好適な培地中で培養する。次いで、ペプチドを細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から、当分野において周知の技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動またはそのペプチドに特異的な抗体を用いる免疫学的精製を使用して精製することができる。
【０１０５】
Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２のＴ細胞コアエピトープ領域を含有するペプチドをコードする核酸は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現させることができる。好適な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントは、Ｓａｍｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）に参照される。他の好適な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現エレメントは、当業者に周知である。酵母における好適な発現ベクターの例としては、Ｙｅｐ  Ｓｅｃ  １（Ｂａｌｄｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｅｍｂｏ  Ｊ．，６：２２９−２３４）；ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ．，１９８２，Ｃｅｌｌ．，３０：９３３−９４３）；ＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ．，５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。これらのベクターは、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系として自由に入手可能である。例えば、昆虫細胞中の発現のためのバキュロウイルス系が市販されている（ＰａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）一方、哺乳動物細胞中の発現のためのｐＭｓｇベクターも市販されている（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【０１０６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現について、好適な発現ベクターとしては、とりわけ、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ．，６９：３０１−３１５）、ｐＧｅｘ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ｐＭａｌ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）；ｐＲｉｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；ｐＥｔ−１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（Ｊａｍｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：３９６３−３９６６）およびｐＳｅｍ（Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．，８：２８０−２８１）が挙げられる。例えば、ｐＴＲＣ、およびｐＥｔ−１１ｄの使用は、未融合タンパク質の発現をもたらす。ｐＭａｌ、ｐＲｉｔ５、ｐＳｅｍおよびｐＧｅｘの使用は、マルトースＥ結合タンパク質（ｐＭａｌ）、プロテインＡ（ｐＲｉｔ５）、トランケートガラクトシダーゼ（ＰＳＥＭ）またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ｐＧｅｘ）に融合しているアレルゲンの発現をもたらす。Ａｒａ  ｈ１のＴ細胞エピトープまたはそれを含有するペプチドが融合タンパク質として発現される場合、担体タンパク質と関連ペプチドとの間の融合連結部において酵素開裂部位を導入することが特に有利である。次いで、本発明のペプチドは、酵素部位における酵素的開裂ならびにタンパク質およびペプチド精製のための慣用の方法を使用する生化学的精製を介して融合タンパク質から回収することができる。異なるベクターは、異なるプロモーター領域も有し、それにより、構成的発現もしくは誘導性発現または温度誘導が可能となる。さらに、組換え発現されるタンパク質を分解する変更能力を有する異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中で組換えペプチドを発現させることが適切であり得る。あるいは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により優先的に利用されるコドンを使用するために核酸配列を変更することが有利であり得、そのような核酸変更は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えないものである。
【０１０７】
宿主細胞は、慣用の技術、例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在形質移入またはエレクトロポレーションを使用して形質転換して本発明の核酸を発現させることができる。宿主細胞を形質転換するための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、および他の実験室テキストに見出すことができる。本発明の核酸配列は、標準的技術を使用して化学合成することもできる。
【０１０８】
本発明によるペプチドの組換え産生に加え、核酸は、実験または精製目的のためのプローブとして利用することができる。
【０１０９】
目下、本明細書に開示のペプチドの同定および合成により、ピーナッツ関連免疫病態に関して使用される一連の予防および治療的治療プロトコル開発が容易になる。その開発の中で使用される試薬の開発も容易になる。したがって、本発明は、患者の治療的および／または予防的治療におけるペプチドまたはその機能性誘導体、ホモログもしくはアナログの使用に及ぶことを理解されたい。このような治療方法としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：（ｉ）ピーナッツＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはＡｒａ  ｈ１様および／もしくはＡｒａ  ｈ２様分子に対する脱感作または免疫学的寛容の誘導の手段としての、患者への主題ペプチドまたはその突然変異体の投与。これは、例えば、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２指向Ｔｈ２アネルギーまたはアポトーシスを誘導することにより達成することができる。好ましい実施形態において、このようなアウトカムは、Ｔ細胞エピトープ反応性を維持するが、ＩｇＥ結合を受け得ないペプチドの使用により達成される。あるいは、寛容を導入するための規定のレジメンに従う規定濃度の所与のペプチドの投与に基づく治療プロトコルを利用することができる。このような方法により、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２過敏症を排除し得、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２過敏症もしくはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含有する組成物中に存在するアレルゲンに対する感受性、例えば、ピーナッツアレルギーの重症度を低減させ得る。本明細書における、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２感受性の治療への言及は、感受性がＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２以外のアレルゲンに対して指向されるとしても、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２を含む組成物、例えば、一般にピーナッツに対する感受性により特徴付けられる病態の治療の範囲内に包含されることを理解されたい。
【０１１０】
好ましくは、このような治療レジメンは、関連個体のＴ細胞応答またはＢおよびＴ細胞応答の両方を改変し得る。本明細書において使用される場合、ピーナッツ過敏症に罹患する個体のアレルギー応答の改変は、標準的な臨床手順により決定される、Ａｒａ  ｈ１分子に対する非応答性の誘導または症状の縮小のいずれかとして定義することができる（Ｖａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３０２：２６５−２６９）。症状の縮小としては、治療レジメンが完了した後の個体におけるＡｒａ  ｈ１に対するアレルギー応答の任意の低減が挙げられる。この縮小は、主観的であり得、または、例えば、当分野において公知の標準的な食物チャレンジ試験もしくは標準的な皮膚試験の使用により、臨床的に決定することができる。
【０１１１】
個体を本発明のペプチドに曝露させることにより、適切なＴ細胞下位集団を寛容化またはアネルギー化させることができ、その結果、それらはＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２に対して非応答性になり、そのような曝露時の免疫応答の刺激に関与しない。好ましくは、本発明によるペプチドは、免疫優性Ｔ細胞エピトープを保持するが、ＩｇＥ結合が消失している。さらに、問題のアレルゲンがＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２ではなく、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２と同一の組成物中に存在する異なるアレルゲン（例えば、異なるピーナッツアレルゲン）に指向されるとしても、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２による免疫化により、そのアレルゲンに対する過敏症の程度を低減させるように作用するバイスタンダー抑制効果を誘導し得る。
【０１１２】
本発明のペプチドの投与は、天然存在Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２アレルゲンに曝露された場合と比較してサイトカインの分泌プロファイルを改変し得る。この曝露はまた、通常、アレルギー応答に関与するＴ細胞下位集団を、アレルゲンに通常曝露されている１つまたは複数の部位から離れ、治療物投与の１つまたは複数の部位に向かって移動させ得る。このＴ細胞下位集団の再分布は、アレルゲンに通常曝露されている部位において通常の免疫応答を刺激する個体の免疫系の能力を良化または低減させ、アレルギー症状の縮小をもたらす。
【０１１３】
Ｂ細胞応答の改変は、例えば、上記に詳述されるＴ細胞により産生されるサイトカインプロファイルの改変を介して達成することができる。具体的には、Ｔ細胞誘導のＩＬ−４およびＩＬ−１３産生を減少させ、それによりＩｇＥ合成を減少させる。
【０１１４】
（ｉｉ）本発明のペプチドは、生物学的試料または患者からのＡｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２指向Ｔ細胞を除去する吸着剤という性質で使用することができる。
【０１１５】
したがって、別の態様において、本発明は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２、またはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２を含む組成物中のアレルゲンに対する、異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる対象における病態を治療および／または予防する方法であって、有効量の上記定義の免疫調節組成物を、前記Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または他のアレルゲンに指向されるＴ細胞の前記対象における存在もしくは機能を除去または低減させるために十分な時間および条件下で前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１１６】
好ましくは、前記病態は、ピーナッツまたはＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２様もしくはＡｒａ  ｈ１もしくはＡｒａ  ｈ２様分子を含有する樹木性堅果、例えば、ヘーゼルナッツ、アーモンドまたはブラジルナッツに対する過敏症である。
【０１１７】
一実施形態において、前記方法は、Ａｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２または前記組成物の他のアレルゲンに対して脱感作させ、またはそれに対する免疫学的寛容を誘導する。
【０１１８】
別の実施態様において、前記脱感作または寛容は、Ｔ細胞アネルギーまたはアポトーシスを誘導することにより達成される。
【０１１９】
いっそうさらに別の実施態様において、前記脱感作または寛容は、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することにより達成される。
【０１２０】
「有効量」は、少なくとも部分的に所望される免疫応答を獲得するため、または治療される特定の病態の発症を遅延させるため、または進行を阻害するため、または発生もしくは進行を完全に停止させるために必要な量を意味する。量は、治療される個体の健康状態および体調、治療すべき個体の分類群、所望される保護の程度、組成物の配合、医学的状況の評価、および他の関連因子に応じて変動する。この量は、定型的試験を介して決定することができる比較的広い範囲であることが予測される。
【０１２１】
治療または予防の対象は、一般に、哺乳動物、例えば、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）である。好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０１２２】
本明細書において、「治療」および「予防」への言及は、その最も広い内容で考慮すべきである。用語「治療」は、必ずしも、対象が完全回復するまで治療されるということを意味しない。同様に「予防」は、必ずしも、対象が最終的に疾患状態にならないことを意味しない。したがって、治療および予防は、特定の状態の症状を良化させること、または特定の病態を発現することを妨害すること、もしくはそうでなければ特定の病態を発現するリスクを減少させることを含む。用語「予防」は、特定の病態の重症度または発症を低減させるものとみなすことができる。「治療」も、既存の病態の重症度を低減させ得る。
【０１２３】
医薬組成物の形態の本発明の組成物（本明細書において「薬剤」と呼称される）の投与は、任意の簡便な手段により実施することができる。特定の症例に依存する量で投与された場合、医薬組成物の薬剤は治療活性を示すことが企図される。変動は、例えば、ヒトまたは動物および選択される薬剤に依存する。広範囲の用量が適用可能であり得る。患者を考慮して、例えば、約０．０１  ｇ〜約１ｍｇの薬剤を、１用量当たり投与することができる。投与量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日、毎週、毎月または他の好適な時間間隔で投与することができ、または用量は急を要する状況により指示されるとおり比例的に低減させることができる。別の例において、前記組成物を最初に投与して寛容を誘導し、次いで、必要により、組成物のブースター投与を施して寛容を維持する。これらのブースターは、例えば、毎月投与し、任意の期間、例として、患者の一生にわたり投与することができる。
【０１２４】
薬剤は、簡便な様式、例えば、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内（慣習的な針または経皮送達デバイスの使用の有無を問わない）、経皮、鼻腔内、舌下もしくは坐剤の経路、または移植（例えば、徐放性分子を使用する）により投与することができる。好ましくは、前記組成物は、皮内投与する。薬剤は、薬学的に許容可能な非毒性の塩、例えば、酸付加塩または金属錯体、例えば、亜鉛、鉄などとの錯体（本出願の目的のための塩とみなされる）の形態で投与することができる。このような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤の形態で投与すべき場合、錠剤は、結合剤、例えば、トラガカント、トウモロコシデンプンまたはゼラチン；崩壊剤、例えば、アルギン酸；および滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含有し得る。
【０１２５】
これらの方法によれば、本発明により定義される薬剤は、１つ以上の他の化合物または分子と同時投与することができる。「同時投与する」は、同一の配合物中もしくは２つの異なる配合物中の、同一もしくは異なる経路を介する同時投与、または同一もしくは異なる経路による連続投与を意味する。「連続」投与は、２つのタイプの分子の投与の間が、秒、分、時または日の時間差であることを意味する。これらの分子は、任意の順序で投与することができる。本発明のペプチドをそれ自体、同時または連続投与することができることも理解されたい。これらは、１つ以上の組成物として、同時または連続投与することができる。例えば、１つの配合物中でペプチドのいくつかを、および別個の配合物中で他のペプチドを配合することができ；これら２つの配合物をそれぞれの腕部中に１回与える。あるいは、追加の別個の配合物を生成し、異なる部位に同時に、または連続投与することができる。適切な配合物または配合物の混合物の産生を設計および生成することは当業者の技能の十分範囲内である。
【０１２６】
本発明の別の態様は、Ａｒａ  ｈ１および／またはＡｒａ  ｈ２に対する異常な、不所望な、またはそうでなければ不適切な免疫応答により特徴付けられる哺乳動物における病態の治療のための医薬品の製造における上記定義の免疫調節組成物の使用を企図する。
【０１２７】
好ましくは、前記病態は、ピーナッツまたはＡｒａ  ｈ１および／もしくはＡｒａ  ｈ２またはＡｒａ  ｈ１様および／もしくはＡｒａ  ｈ２様分子を含有する樹木性堅果、例えば、ヘーゼルナッツに対する過敏症である。
【０１２８】
さらに別のさらなる態様において、本発明は、上記定義の組成物を１つ以上の薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤と一緒に含むワクチンを企図する。前記組成物は、活性成分と称される。
【０１２９】
注射使用に好適な医薬形態としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられ、またはクリーム剤の形態もしくは他の局所適用に好適な形態であり得る。これは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の妨害は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。等張性調節剤は、ヒト血漿と等張の調製物を保持し、したがって組織損傷を回避するために有用である。一般に使用される等張剤としては、デキストロース、トレハロース、グリセリンおよびマンニトールが挙げられる。グリセロールおよび塩化ナトリウムは、他の任意選択であるが、一般に使用されることは少ない。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することにより行うことができる。
【０１３０】
滅菌注射溶液は、上記の他の種々の成分とともに適切な溶媒中で、要求量で活性成分を取り込み、必要に応じて、次いで濾過滅菌を行うことにより調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒および上記の要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に種々の滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望成分の粉末を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１３１】
活性成分が、好適に保護される場合、それらは、例えば、不活性な希釈剤もしくは吸収可能な食用担体とともに経口投与することができ、または硬もしくは軟シェルカプセル剤中に密封することができ、または錠剤に圧縮することができ、または食事に直接取り込むことができる。経口治療投与について、活性成分は、賦形剤とともに取り込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウェファー剤などの形態で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物の割合は、もちろん変えることができ、便宜上、単位重量の約５〜約８０％の間であり得る。このような治療有用組成物中の活性化合物の量は、好適な投与量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物または調製物は、経口単位剤形が、約０．１μｇ〜１０００μｇの間の活性化合物を含有するように調製される。
【０１３２】
錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤などは、以下に列記される構成要素も含有し得る：結合剤、例えば、ゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えばスクロース、ラクトースもしくはサッカリン、または香味剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香味料を添加することができる。単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上記のタイプの材料に加え、液体担体を含有し得る。種々の他の材料がコーティングとして存在し得、またはそうでなければ投与量単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸薬またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方によりコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびに香味料、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含有し得る。もちろん、任意の単位剤形の調製において使用される任意の材料は、薬学的に純粋であるべきであり、用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、徐放調製物および配合物中に取り込むことができる。
【０１３３】
医薬組成物は、遺伝子分子、例えば、標的細胞を形質移入し得、調節剤をコードする核酸分子を担持するベクターも含み得る。ベクターは、例えば、ウイルスベクターであり得る。
【０１３４】
投与経路としては、限定されるものではないが、呼吸器（例えば、エアロゾルを介して鼻腔内または口腔内）、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、経皮、筋肉内、眼内、鞘内、大脳内、鼻腔内、点滴、経口、直腸内、ＩＶドリップパッチ（ｄｒｉｐ  ｐａｔｃｈ）を介して、植込および舌下が挙げられる。好ましくは、前記投与経路は、皮下、皮内、経皮または鼻腔内である。
【０１３５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法において使用される上記定義の組成物に関する。
【０１３６】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに記載される。
【実施例】
【０１３７】
実施例１
Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２は、ピーナッツ中の最もアレルギー性の豊富なタンパク質であり、それにより、それらの優性Ｔ細胞エピトープを含むペプチドが治療法における包含に必須となる。免疫療法のためのペプチドを選択する場合の別の重要な検討事項は、それらが異なるＭＨＣクラスＩＩ分子（ヒトにおけるＨＬＡ分子）により提示され得、したがって遺伝的に多様なヒト集団の治療に好適か否かである。Ｔ細胞に対するペプチド提示のＨＬＡ拘束は、遮断抗体およびＨＬＡゲノタイピングを使用して試験し、同定された全てのＴ細胞エピトープが２つ以上の異なるＨＬＡ分子上で提示され得ることを示した。さらに、同定されたＴ細胞エピトープが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ分子の組合せ上で集合的に提示されることが実証された（表２）。ＨＬＡ−ＤＱおよびＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープの包含は、治療物に特に有利である。それというのも、これらのＨＬＡ型は、混合集団中でＨＬＡ−ＤＲ分子よりも保存されており、より少ないＴ細胞エピトープ配列についてより広い集団カバレージが可能となるためである。
【０１３８】
隣接または重複Ｔ細胞エピトープは、単一ペプチド（＜２０ａａ長）に合わせて最終治療物セット中のペプチドの数を最小化し、Ａｒａ  ｈ２からの３つの候補ペプチドおよびＡｒａ  ｈ１からの７つの候補ペプチドをもたらした。システイン残基はペプチド安定性および生物学的反応性にとって問題であり得るため、システイン残基を、構造的に保存されているが反応性が低いセリン残基により置換した。安定性および／または溶解度を改善するために２つのＡｒａ  ｈ１ペプチドに対してわずかな変化も作製した（表２）。全ての場合において、バリアントペプチドに対するＴ細胞反応性が保持されることが確認された。
【０１３９】
【表５】
2016533341.tif 000036
【０１４０】
これらのペプチドの前臨床スクリーニングにより、ＰＢＭＣ  Ｔ細胞反応性（図１）、炎症細胞活性化の欠落（図２）および追加のピーナッツアレルギーコホート（ｎ＝４０）における血清安定性が確認される。分析対象（ｎ＝２０）の１００％においてこれら１０個のペプチドの１つ以上のＰＢＭＣ  Ｔ細胞認識が確認され、５０〜９０％がそれぞれのペプチドに応答した。これまでの分析は、上記表２の１０個のペプチドが十分な、実現可能な好適な混合物を提供することを明確に実証している。
【０１４１】
実施例２
【０１４２】
【表６】
2016533341.tif 000037
【０１４３】
材料および方法
対象：ピーナッツアレルギー成人対象を、Ｔｈｅ  Ａｌｆｒｅｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから採用した。ピーナッツアレルギー対象は、ＩｇＥ介在性ピーナッツアレルギーの臨床症状およびピーナッツ特異的ＩｇＥ  ＣＡＰスコア  ２（  １．１６ｋＵＡ／ｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を有し、多くはアナフィラキシーの病歴を有した。一部の対象を、Ｖｉｃｔｏｒｉａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅによりゲノタイピング（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、−ＤＱＢ１および−ＤＰＢ１、エクソン２）した。試験は、Ｔｈｅ  Ａｌｆｒｅｄ  ａｎｄ  Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより承認され、それぞれの対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【０１４４】
抗原：粗製ピーナッツ抽出物（ＣＰＥ）を、市販の無塩ドライローストピーナッツから、他で記載されるとおり調製し（ｄｅ  Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００３；３３（９）：１２７３−８０）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、フィルタ滅菌（０．２  ｍ）した。天然Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２を、公開されている方法に基づきＣＰＥから濃縮した（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＥＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．１９９８；２８（６）：７４３−５１）。手短に述べると、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＣＰＥを２０ｍＭのＴＲＩＳ−ビス−プロパン（ＴＢＰ）、ｐＨ７．２中に緩衝液交換し、ＴＢＰにより平衡化された５ｍＬのＭｏｎｏ−Ｑ  １０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ，ＵＫ）上にアプライした。ＴＢＰにより洗浄した後、３０ｍＬの０〜１ＭのＮａＣｌ／ＴＢＰの線形勾配をアプライして結合タンパク質を溶出させた（１ｍＬ／分）。０．５ｍＬの分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２を最小の他のタンパク質とともに含有するものをプールし、ＰＢＳに対して透析した。エンドトキシン含有量は、ＣＰＥ、Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２について、それぞれで１．７、４．０および７８．０ＥＵ／ｍｇであった（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬアッセイ、Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）。ペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＡｕｓｔｒａｌｉａおよびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を、１０％のジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（２０ｍｅｒおよびトランケートペプチドセット）またはＰＢＳ、１〜２％の酢酸または０．１Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液中で１〜４ｍｇ／ｍｌにおいて規定のとおり中で再構成した（カスタム合成コアペプチド）。全ての抗原は、記載のとおり細胞分裂促進性でも毒性でもないことが確認された（Ｅｕｓｅｂｉｕｓ  ＮＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１２７（３）：２３４−４４）。
【０１４５】
Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞系（ＴＣＬ）の生成：５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ベースの方法を使用してＡｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２特異的オリゴクローナルＴＣＬを、ピーナッツアレルギー対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成した（Ｍａｎｎｅｒｉｎｇ  ＳＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；２９８（１−２）：８３−９２；Ｐｒｉｃｋｅｔｔ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２７（３）：６０８−１５  ｅ１−５）。手短に述べると、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５％のヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ｃＲＰＭＩ）中で培養を実施した。ＰＢＭＣを０．１μＭのＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）により標識し、ｃＲＰＭＩ単独、ＣＰＥ（１００μｇ／ｍＬ）、Ａｒａ  ｈ１もしくはＡｒａ  ｈ２（１０μｇ／ｍＬ）、Ａｒａ  ｈ１もしくはＡｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒペプチドプール（１０  ｇ／ｍＬ／ペプチド）または対照としての破傷風毒素（ＴＴ；１０ＬｆＵ／ｍＬ；Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３７℃において７日間培養した（２．５×１０６／ｍＬ）。ＣＤ４−ＰＥおよび７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）により染色した後、記載のとおり放射線照射同種異系フィーダー細胞、抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）、ｒＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）およびＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を含有する９６Ｕウェルプレート中にＣＤ４＋ＣＦＳＥ弱７ＡＡＤ細胞をソートした（１０個の細胞／ウェル）。必要に応じて細胞にｒＩＬ−２をフィードし、１０〜１４日後、４８ウェルプレートに移し、Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２（１０  ｇ／ｍＬ）の増殖について試験した。Ａｒａ  ｈ１またはＡｒａ  ｈ２陽性ＴＣＬをＴ２５培養フラスコ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）中で抗ＣＤ３およびｒＩＬ−２により１０〜１２日間拡張させ、次いでそれぞれの配列に跨る重複２０ｍｅｒペプチド（１０  ｇ／ｍＬ）に対する特異性（増殖）について試験した。コアエピトープ配列を、記載のとおり２０ｍｅｒのＮまたはＣ末端からトランケートされたペプチドセットを使用して選択２０ｍｅｒ内でマッピングした（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌｃ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２７（３）：６０８−１５  ｅ１−５）。
【０１４６】
Ｔ細胞アッセイ：全ての培養は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５％の熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ｃＲＰＭＩ）中で実施した。抗原誘導ＴＣＬ増殖は、３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）取り込みアッセイにより以下のとおり評価した：アッセイは、１×１０４個のＴ細胞／ウェル、抗原提示細胞としての１×１０４個の放射線照射（５０００ｒａｄｓ）自己ＥＢＶ形質転換ＰＢＭＣ（ＥＢＶ−Ｂ細胞）および抗原を規定のとおり含有する９６Ｕウェルプレート中の７２時間のデュプリケートまたはトリプリケートの培養物に対して実施した。陰性対照はｃＲＰＭＩ単独であった。細胞を３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ；０．５  Ｃｉ／ウェル）により最後の１６時間パルス処理し、取り込みをレプリケート培養物の１分当たりの平均カウント（ｃｐｍ）として記録した。  ２．５の刺激指数（ＳＩ；ｃｐｍ抗原刺激Ｔ細胞／ｃｐｍ未刺激Ｔ細胞）を陽性とみなし、全ての陽性応答が  ２つのアッセイにおいて確認された。全ＰＢＭＣ内のペプチド誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の検出を可能とするため、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣの７日間培養をＴＣＬ生成について記載のとおり設定し、抗ＣＤ２５抗体（ＢＤ）を添加して増殖に加えてＴ細胞活性化を評価した。少なくとも１０，０００個のＣＤ４＋Ｔ細胞を試料ごとに分析し、抗原を有するＣＤ４＋ＣＦＳＥ低（増殖）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（活性化）またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低（活性化および増殖）細胞の割合を、抗原を有さない同一集団（バックグラウンド）の割合により割ってＳＩを計算した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低（活性化および増殖）細胞の分析は、Ｔ細胞応答の検出のための最も感受性の方法を提供し、陽性としてＳＩ  １．５を指定する。
【０１４７】
ＨＬＡクラスＩＩ遮断アッセイ：Ｔ細胞および放射線照射ＥＢＶ−Ｂ細胞  （それぞれ１×１０４個）を、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＨＬＡ−ＤＱ（ＳＶＰ−Ｌ３）もしくはＨＬＡ−ＤＰ（Ｂ７／２１）に対する０．１〜１０  ｇ／ｍＬの遮断モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ２ａ：ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ＩｇＧ１：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）とともに３７℃において１時間インキュベートしてからペプチド（２〜１０  ｇ／ｍＬ）またはＣＰＥ（１００  ｇ／ｍＬ）を添加し、上記のとおり増殖応答を試験した。
【０１４８】
サイトカインＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：ＭＡＩＰ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中１０  ｇ／ｍＬのＩＬ−４、ＩＦＮ−  またはＩＬ−５抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）により４℃において一晩コーティングした。ウェルをブロッキングし（ｃＲＰＭＩ、１時間、３７℃）、次いでＰＢＭＣ（３．５×１０５個）またはＴ細胞および放射線照射ＥＢＶ−Ｂ細胞（それぞれ１×１０４個）を、ＣＰＥ（１００  ｇ／ｍＬ）、ｎＡｒａ  ｈ２（１０  ｇ／ｍＬ）またはペプチド（１０  ｇ／ｍＬ）を有するデュプリケート１００  Ｌ培養物中で添加した。対照は、ｃＲＰＭＩ単独、ＴＴ（１０ｌｆＵ／ｍｌ）およびフィトヘマグルチニン（１  ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。４８時間の３７℃における培養後、プレートをビオチン化ＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＦＮ−  抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１  ｇ／ｍｌのＰＢＳ、２時間）、次いでＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１／３，０００ＰＢＳ、２時間）とともにインキュベートしてから、アルカリホスファターゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により発色させた。スポットが陽性対照ウェル中で出現した場合、プレートを洗浄し、空気乾燥させ、読み取った（ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ４．０ｈリーダー、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ，Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１４９】
好塩基球活性化試験：好塩基球活性化は、記載のとおりフローサイトメトリーにより検出されるＣＤ６３上方調節により評価した（Ｄｒｅｗ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７３（９）：５８７２−９）。陽性対照は、ウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体（７．５μｇ／ｍＬ；ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｎ−ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）（０．４μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）およびＣＰＥであった。ＣＰＥは、３ｌｏｇ濃度範囲（５０、５および０．５μｇ／ｍＬ）にわたり試験し、ペプチドプールを４ｌｏｇ濃度範囲（５０、５、０．５および０．０５μｇ／ｍＬ）にわたり試験した。ヒスタミン放出は、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ＲｅｌｅａｓｅおよびＨｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用して評価した。
【０１５０】
結果
優性２０ｍｅｒ選択において考慮される因子としては、以下が挙げられる：
・レスポンダー頻度
・患者ごとに生成された特異的ＴＣＬの数／患者ＰＢＭＣ中の特異的Ｔ細胞の発生率
・Ｔ細胞応答の大きさ
・Ｔ細胞応答のパターン（対象内および間で認識されるペプチド組合せ）
・ペプチドを用いて全ＰＢＭＣ集団のうち特異的Ｔ細胞を直接標的化する能力（ＣＦＳＥスクリーニング）
・Ｔ細胞応答の一貫性
・２０ｍｅｒペプチド内のコアＴ細胞エピトープの同定
【０１５１】
Ａｒａ  ｈ１優性２０ｍｅｒ選択
１４５個のＡｒａ  ｈ１特異的Ｔ細胞系（ＴＣＬ）を１８人のピーナッツアレルギードナーから生成し、Ａｒａ  ｈ１に跨る６５／６９個の重複２０ｍｅｒペプチドがそれらのＴＣＬにより認識された（表３および図５参照）。これら６５個の２０ｍｅｒの１４個を最も高頻度で認識されるものとして選択した（１８人のレスポンダーの４〜６人；２２〜３３％）（ペプチド番号２３、２４、２６、３８、４０、４４〜５１および５７）。これら１４個のペプチドのうち、９つをさらなる分析のために選択した（ペプチド番号２３、２４、４０、４６、４７、４９、５０、５１および５７）（表４）。
【０１５２】
これらの選択は、対象当たりの特異的ＴＣＬの数、ＴＣＬ応答の大きさ、ＴＣＬ応答の再現性およびＰＢＭＣ中の特異的Ｔ細胞を標的化する能力に基づき行った。選択された９つの２０ｍｅｒは：
・このコホート中の１８人の対象の１６人（８９％）からのＴＣＬにより集合的に認識され、
・典型的には、特異的ＴＣＬ中の強力で一貫した応答を誘導し、
・それぞれ、多くのレスポンダーからの複数のＴＣＬにより認識され、
・それぞれ、ドナーＰＢＭＣ中の特異的Ｔ細胞を標的化し得た（１８／２０人の追加の対象において検出可能なＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答を集合的に誘導し、２０ｍｅｒ当たり８〜１６人のレスポンダー（４０〜８０％）であった。
【０１５３】
９つの２０ｍｅｒの１つ以上は、ＴＣＬ単離および／またはＣＦＳＥスクリーニングにより分析された３８人の対象の３５人（９２％）におけるＴ細胞により認識された（表３）。
【０１５４】
【表７】
2016533341.tif 000038
【０１５５】
【表８】
2016533341.tif 000039
【０１５６】
優性Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒを用いるＰＢＭＣスクリーニング
表５は、  １つの優性２０ｍｅｒペプチドが１８／２０人（または全データの２２／２４人）により認識されることを示す。それぞれの２０ｍｅｒペプチドは、少なくとも７人の対象により認識される。ＣＦＳＥおよびＴＣＬデータを合わせ：認識は、４３／４５人の対象において確認された。
【０１５７】
【表９】
2016533341.tif 000040
【０１５８】
Ａｒａ  ｈ２優性２０ｍｅｒ選択
６９個のＡｒａ  ｈ２特異的Ｔ細胞系（ＴＣＬ）を、１６人のピーナッツアレルギードナーから生成し、Ａｒａ  ｈ２に跨る１６／１７個の重複２０ｍｅｒペプチドがそれらのＴＣＬにより認識された（表６）。これら１６個の２０ｍｅｒの４つを最も高頻度に認識されるものとした選択した（それぞれ、１６人のレスポンダーの７〜９人；４４〜４６％）（ペプチド番号４、５、１１、１５）（図７）。これらの選択は、対象当たりの特異的ＴＣＬの数、ＴＣＬ応答の大きさ、ＴＣＬ応答の再現性およびＰＢＭＣ中の特異的Ｔ細胞を標的化する能力に基づき行った。選択された４つの２０ｍｅｒペプチドは：
・このコホート中の１６人の対象全員（１００％）からのＴＣＬにより集合的に認識され、
・典型的には、特異的ＴＣＬ中の強力で一貫した応答を誘導し、
・それぞれ、多くのレスポンダーからの複数のＴＣＬにより認識され、
・６９個全てのＴＣＬの約８０％により集合的に認識され、
・それぞれ、ドナーＰＢＭＣ中の特異的Ｔ細胞を標的化し得た（検出可能なＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答は、試験された６人の対象において実証された）。
【０１５９】
４つの２０ｍｅｒの１つ以上は、ＴＣＬ単離および／またはＣＦＳＥスクリーニングにより分析された１６／１６人の対象（１００％）におけるＴ細胞により認識された（表６）。
【０１６０】
【表１０】
2016533341.tif 000041
【０１６１】
【表１１】
2016533341.tif 000042
【０１６２】
コアＴ細胞エピトープマッピング
技術的アプローチ
異なる対象からのＴＣＬを使用してそれぞれのコアＴ細胞エピトープをマッピングした。正確なＴ細胞エピトープは、ＴＣＬおよび対象間で変動した。それぞれの選択２０ｍｅｒ内の最小Ｔ細胞刺激配列（コアエピトープ）を、トランケートペプチドセットに対する異なる対象からの反応性ＴＣＬの増殖の試験により決定した（図８）。最大Ｔ細胞増殖を誘導するために要求される残基の数は、異なるＴＣＬおよび／または対象間で６〜１９ａａで変動した（表８および９）。最適なエピトープ認識に要求されるフランキング残基の数の変動に起因して、ＴＣＬは、共通のコア配列を含有するペプチドが認識を誘導した場合に同一のエピトープを認識するとみなした。この基準に基づき、１０個の区別されるＡｒａ  ｈ１および５つの区別されるＡｒａ  ｈ２ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定し（「併合エピトープ」、表８および９）、共通の「最小コアエピトープ」配列は、５〜１２ａａで変動した（下線配列、表８および９）。「併合エピトープ」配列は、考えられる最も広い認識を確保するための異なる対象にわたる最適なＴ細胞反応性に要求される全ての残基を包含する最小配列であった。
【０１６３】
（ｉ）優性Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒ中に見出されるコアＴ細胞エピトープ
コアＴ細胞エピトープ配列を、優性Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒペプチド内でマッピングした。重複Ｔ細胞エピトープの４つのペアを含む１０個のＡｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープを同定した（「併合Ｔ細胞エピトープ」）（表８）。
【０１６４】
【表１２】
2016533341.tif 000043
【０１６５】
（ｉｉ）優性Ａｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒ中に見出されるコアＴ細胞エピトープ
コアＴ細胞エピトープ配列を、優性Ａｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒペプチド内でマッピングした。重複Ｔ細胞エピトープの２つのペアを含む５つのＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープを同定した（「併合Ｔ細胞エピトープ」）（表９）。
【０１６６】
【表１３】
2016533341.tif 000044
【０１６７】
Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープのＨＬＡ拘束
優性Ｔ細胞エピトープのＴ細胞認識を、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体により遮断した（図９）。一部のＴ細胞エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ分子上の両方で提示される一方、Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ上で集合的に提示された（表１０）。
【０１６８】
【表１４】
2016533341.tif 000045
【０１６９】
Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ提示のＨＬＡ拘束
優性Ｔ細胞エピトープを認識するＴＣＬを有する対象に対してＨＬＡタイピングを実施してＴ細胞エピトープを潜在的に提示し得るＨＬＡサブタイプを評価した。ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ／ＤＰ拘束が確認されたＴ細胞エピトープを認識する対象についての共有されるＨＬＡアレルの不存在は、Ｔ細胞エピトープＨＬＡ結合デジェネラシーを示した。Ａｒａ  ｈ１結果を表１１に示し、Ａｒａ  ｈ２結果を表１２に示す。
【０１７０】
【表１５】
2016533341.tif 000046
【０１７１】
【表１６】
2016533341.tif 000047
【０１７２】
Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ（９５〜１０７）の認識が抗ＨＬＡ−ＤＱにより遮断された全ての対象間で共有されるＨＬＡ−ＤＱＢ１アレルの不存在は、このＴ細胞エピトープが複数のＨＬＡ−ＤＱＢ１分子により提示されるはずであることを示した。同様に、Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ（１２７〜１４１）または（３７〜４７）の認識が抗ＨＬＡ−ＤＲにより遮断された対象間のＨＬＡ−ＤＲＢ１アレルの多様性は、複数のＨＬＡ−ＤＲＢ１分子についての両方のＴ細胞エピトープの結合デジェネラシーを示した。
【０１７３】
少なくとも２つのＨＬＡ−ＤＲ分子による提示に加え、Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ（３７〜４７）は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６：０９によっても提示された。それというのも、ＨＬＡ−ＤＱに関してこのＴ細胞エピトープを認識した両方の対象は、このアレルを有したためであり、対象９については、ＤＱＢ１アレルのみが存在した。
【０１７４】
ＤＰＢ１＊０４：０１またはＤＲＢ１＊１５：０１アレルは、Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープ（３２〜４４）（抗ＨＬＡ−ＤＰにより遮断）または（９５〜１０７）（抗ＨＬＡ−ＤＲにより遮断）をそれぞれ認識する全ての対象中に存在するため、それらのＴ細胞エピトープのデジェネラシーは決定することができなかった。しかしながら、ＤＰＢ１＊０４０１およびＤＲＢ１＊１５０１は世界中の人口において高頻度であるため、それらのＨＬＡ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、依然として広く認識される。
【０１７５】
所与のＨＬＡ型上で優性併合Ａｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープを認識する２人以上の対象間で共有されるアレルは存在せず、したがって、同定されたＡｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープのそれぞれが２つ以上の異なるＨＬＡ分子によっても提示されることが実証された。
【０１７６】
ＨＬＡ結合モチーフの予測：Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒペプチド
表１３は、優性Ａｒａ  ｈ１  ２０ｍｅｒ内の結合モチーフについてのＨＬＡ−ＤＲ予測アルゴリズムについての結果のまとめを提供する。
【０１７７】
【表１７】
2016533341.tif 000048
【０１７８】
ＨＬＡ結合モチーフの予測：Ａｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒペプチド
表１４は、３つの優性Ａｒａ  ｈ２  ２０ｍｅｒ内の結合モチーフについての２つのＨＬＡ−ＤＲ予測アルゴリズムについての結果のまとめを提供する（予測および実測エピトープとして示されないＮＢ優性「２０ｍｅｒ５」は、「２０ｍｅｒ４」と重複する）。
【０１７９】
【表１８】
2016533341.tif 000049
【０１８０】
【表１９】
2016533341.tif 000050
【０１８１】
治療送達のためのペプチドの純化
潜在的に問題となるシステイン残基を、構造的に保存されているが化学反応性が低いセリン残基により置き換えた。Ｔ細胞反応性の保持が確認された（図１０および１１）。セリン含有Ｔ細胞エピトープペプチドは、天然システイン含有ペプチドと同等のＴ細胞応答を示した。
【０１８２】
重複Ａｒａ  ｈ１Ｔ細胞エピトープを  ２０ａａ長の単一ペプチドに合わせる
【０１８３】
【表２０】
2016533341.tif 000051
【０１８４】
重複Ａｒａ  ｈ２Ｔ細胞エピトープを  ２０ａａ長の単一ペプチドに合わせる
【０１８５】
【表２１】
2016533341.tif 000052
【０１８６】
Ａｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２候補ペプチドのまとめ
１０個の候補ペプチドが存在する：Ａｒａ  ｈ１からの７つおよびＡｒａ  ｈ２からの３つ（表１８）。
【０１８７】
【表２２】
2016533341.tif 000053
【０１８８】
比較のため、１３個の追加のより短鎖のペプチドバリアント（単一Ｔ細胞エピトープベースとする）も設計する。一部の配列は、産生および溶解度のためにペプチド特性を改善するように延長または短縮した（天然配列およびＴ細胞認識に重要な残基に沿う）。これは、比較のための２３個の候補ペプチドのパネルをもたらした。ペプチドの詳細を表１９にまとめる。
【０１８９】
表１８のペプチドの全ては、９５〜９９．９％の純度において産生し、溶液を溶解度について測定した。次いで、Ｔ細胞応答を２５人のピーナッツアレルギー対象からのＰＢＭＣにおける２用量におけるそれらのペプチドのそれぞれと比較して最終的な治療物の組合せを選択した。
【０１９０】
【表２３】
2016533341.tif 000054
【０１９１】
・ＮＢ緩衝液：全てのペプチドを最初にＰＢＳ中で試験し；次いで、配列が高ｐＨについて優先性を示唆した場合、０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、または低ｐＨについては１％の酢酸；１％の酢酸中で可溶性でない場合、２、５、１０％などに増加させる。
・Ｎ末端「Ｗ」を「ペプチド２から除外して安定性および合成の容易性を改善した。
・Ｃ末端「Ｅ」を「ペプチド７に付加して溶解度を改善した（そうでなければペプチドは毒性緩衝液中を除き不溶性である）。
【０１９２】
最終ペプチドの選択についての考慮事項
目的：
集団カバレージおよび／またはＴ細胞反応性を最大化する一方、配列数および／または長さを最小化する。
ペプチド選択についての幅広い考慮事項：
・２３ペプチドスクリーンにおけるＴ細胞応答の比較
・従来のＴ細胞反応性データ（個々のＴ細胞エピトープ／ペプチドについて）
・配列（産生の容易性／溶解度）
・ＨＬＡ拘束（最もデジェネレートおよびＨＬＡ−ＤＱ拘束のＴ細胞エピトープ）
２３ペプチドスクリーンからのデータに基づく選択についての考慮事項：
・ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低細胞についてのＳＩ値に基づく主要評価基準
・１つまたは両方の濃度におけるペプチド当たりのドナーレスポンダー頻度
・長鎖バリアントと短鎖バリアントに対する応答を比較する
・応答の強度／一貫性（すなわち、両方の濃度に対して応答する対象と１つの濃度のみに対して応答する対象）
・応答のパターン
【０１９３】
表２０は、３４人のピーナッツアレルギー対象における２３個の候補ペプチドの完全セットに対するＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答の分析を示す。これらのデータは、ペプチドを用いる／未刺激の％ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低ＣＤ４＋Ｔ細胞についてのＳＩ値を示す。
【０１９４】
データをそれぞれのＴ細胞エピトープ含有領域の長鎖および短鎖バージョンにグループ化する（欄の境界参照；例えば、第１の「群」＝ペプチド１、２３および２４［Ｐｅｐ１は、別個のＴ細胞エピトープをそれぞれ含有する重複ｐｅｐ２３および２４を合わせる］）。それぞれの群の下段におけるまとめは、その群から選択された最適なペプチドについてコメントする（データは、ペプチドを用いる／未刺激の％ＣＤ２５＋ＣＦＳＥ低ＣＤ４＋Ｔ細胞についてのＳＩ値を示す）。
【０１９５】
データは、それぞれのペプチド「群」についての長鎖バージョンの５０  ｇの試料（または応答がこの用量に対して良好である１０  ｇの試料）についての値の降下によりソートする。ペプチド群内のそれぞれの行は、単一対象についてのデータを示すが、対象の順序はそれぞれのペプチド群において変動する。
【０１９６】
【表２４】
2016533341.tif 000055
【０１９７】
【表２５】
2016533341.tif 000056
【０１９８】
【表２６】
2016533341.tif 000057
【０１９９】
【表２７】
2016533341.tif 000058
【０２００】
【表２８】
2016533341.tif 000059
【０２０１】
３４人のコホートにおける２３ペプチドパネルに対する応答のまとめ
データは、選択された７つペプチドが最良の組合せであることを示すが、枠は、現プールへの置換（または付加）として他の実現可能ペプチドを含有する群を示す：
例えば、
１）ペプチド３をペプチド１５に置き換えることができる
２）ペプチド８をペプチド２１に置き換えることができる
３）ペプチド９をペプチド２３に置き換えることができる
【０２０２】
【表２９】
2016533341.tif 000060
【０２０３】
３９人のコホートにおける７ペプチド混合物のそれぞれのペプチドに対する応答のまとめ
・全員が１つ以上のペプチドを認識した
・１３／３９人（３３％）が、ペプチドの１００％を認識する
・２１／３９人（５４％）が、＞８５％（６つ以上）のペプチドを認識する
・３１／３９人（７９％）が、＞７０％（５つ以上）のペプチドを認識する
・それぞれのペプチドは、少なくとも２５／３９人の対象（６４％）により認識される
試験された７４人の対象のうち、全員が７つの選択ペプチドの少なくとも１つのペプチドに対して反応した。
【０２０４】
異なるペプチドプールに対する応答
【０２０５】
【表３０】
2016533341.tif 000061
【０２０６】
【表３１】
2016533341.tif 000062
【０２０７】
【表３２】
2016533341.tif 000063
【０２０８】
７ペプチドプール（プール７ｂ）に対する好塩基球応答
好塩基球反応性データを、３〜４ｌｏｇ濃度範囲（  ｇ／ｍｌ）にわたるピーナッツ（ＣＰＥ）または７ペプチドプール（プール７ｂ）とのインキュベーション後に１４人のピーナッツアレルギー対象から収集した（図２）。これらの対象において、好塩基球活性化およびヒスタミン放出は、全ピーナッツおよび陽性対照により誘導されたが、７ペプチド混合物によっては誘導されなかった。
【０２０９】
プール７ａおよび７ｂの選択前。続いて、プール７ａおよび７ｂを設計および試験した。
【０２１０】
ＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答を、全ピーナッツおよび表２３のペプチドプール１〜５と比較した（図１２および１３）。プール１〜５に関連して、プールは試験された対象全員において陽性Ｔ細胞応答を誘導し得なかった。ほぼ全ての応答は、全ピーナッツに対するものよりペプチドプールに対するものがかなり低く（試験濃度において）、プール２、３および４のそれぞれの１人の対象のみが全ピーナッツに関するペプチドに対する応答と同一以上の応答を示した。プール７ａおよび７ｂに関連して、１００％応答は、プール７ａおよび７ｂに対して記載した（ＳＩ＞１．５）。プール７ａおよび７ｂは、多くの患者において全ピーナッツに対する応答と同等以上の応答を誘導した、６／３０人＝  １００ＣＰＥ応答、６／３０人＝ＣＰＥ応答の５０〜８０％。
【０２１１】
７ペプチドプールに対するＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答を比較した場合（図１４）、プール７ａおよび７ｂ間に有意差は存在しなかった（対応があるデータを比較；１群当たりｎ＝１５；第３のＡｒａ  ｈ２ペプチドの添加に利点なし）。ノンパラメトリックデータ；ｐ＝０．９）についての対応がないマン・ホイットニー検定を使用してプール７ｂについての完全データセット（ｎ＝３０）をプール７ａについてのコホートと比較した場合、有意差は依然として存在しなかった。
【０２１２】
まとめると、プール７ａおよび７ｂは、両方とも、試験された他の５つのプールよりも有意に良好であった。プール７ｂに対してプール７ａの有意差は存在しなかった。プール７ｂは、試験された対象の１００％により認識され、対象の３３％超においてピーナッツと同等以上のＰＢＭＣ  Ｔ細胞応答を誘導した。プール１〜５は、対象の１００％により認識されず、全ピーナッツに等しい応答をほとんど誘導しなかった。
【０２１３】
【表３３】
2016533341.tif 000064
【０２１４】
【表３４】
2016533341.tif 000065
【０２１５】
実施例３
Ａｒａ  ｈ２エピトープ特異的ＴＣＣにおけるＡｒａ  ｈ２ペプチド誘導Ｔ細胞アネルギー（図１５）
Ａｒａ  ｈ２ペプチド特異的ヒトＴ細胞クローンのＴ細胞（１×１０６個／ｍｌ）を、Ａｒａ  ｈ２ペプチド
【化３１】
2016533341.tif 000066
の存在下で、１００μｇ／ｍｌにおいてアクセサリー細胞の不存在下で、または完全培地＊単独（抗原なし）中で１６時間培養した。次いで、Ｔ細胞を十分洗浄し、完全培地単独、ＩＬ−２  ５０Ｕ／ｍｌまたは免疫原性濃度のＡｒａ  ｈ２ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）により、アクセサリー細胞としての放射線照射自己ＰＢＭＣ（１０５個／ウェル）の存在下でリチャレンジした（１０４個／ウェル）。トリチウム化チミジン取り込みと相関する増殖を、７２時間において測定した。結果は、トリプリケート培養物について平均ｃｐｍ＋ＳＤとして表現する。＊完全培地：ＲＰＭＩ＋５％のＡＢ血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン＋１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２。
【０２１６】
Ａｒａ  ｈ１エピトープ特異的ＴＣＣにおけるＡｒａ  ｈ１ペプチド誘導Ｔ細胞アネルギー（図１６）
Ａｒａ  ｈ１ペプチド特異的ヒトＴ細胞クローンのＴ細胞（１×１０６個／ｍｌ）を、Ａｒａ  ｈＩペプチド
【化３２】
2016533341.tif 000067
または無関連バヒアグラスＰａｓ  ｎ１ペプチド（点線）の存在下で、１００μｇ／ｍｌにおいてアクセサリー細胞の不存在下で、または完全培地＊単独（抗原なし）中で１６時間培養した。次いで、Ｔ細胞を十分洗浄し、完全培地単独、ＩＬ−２  ５０Ｕ／ｍｌまたは免疫原性濃度のＡｒａ  ｈＩペプチド（１０μｇ／ｍｌ）により、アクセサリー細胞としての放射線照射自己ＰＢＭＣ（１０５個／ウェル）の存在下でリチャレンジした（１０４個／ウェル）。トリチウム化チミジン取り込みと相関する増殖を、７２時間において測定した。結果は、トリプリケート培養物について平均ｃｐｍとして表現する。＊完全培地：ＲＰＭＩ＋５％のＡＢ血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン＋１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２。
【０２１７】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記載されているもの以外の変動および改変を受け得ることを認識する。本発明は、そのような全ての変動および改変を含むと理解されたい。本発明は、本明細書において個々にまたは集合的に称され、または示されるステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに前記ステップまたは特徴のいずれか２つ以上の任意および全ての組合せも含む。
【０２１８】
参照文献目録
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【図１】
2016533341.tif 000077
【図２−１】
2016533341.tif 000078
【図２−２】
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【図３】
2016533341.tif 000080
【図４】
2016533341.tif 000081
【図５】
2016533341.tif 000082
【図６】
2016533341.tif 000083
【図７】
2016533341.tif 000084
【図８】
2016533341.tif 000085
【図９】
2016533341.tif 000086
【図１０】
2016533341.tif 000087
【図１１】
2016533341.tif 000088
【図１２−１】
2016533341.tif 000089
【図１２−２】
2016533341.tif 000090
【図１３】
2016533341.tif 000091
【図１４】
2016533341.tif 000092
【図１５】
2016533341.tif 000093
【図１６】
2016533341.tif 000094
【配列表】
2016533341000001.app
【国際調査報告】
2016533341.tif 000095
2016533341.tif 000096
2016533341.tif 000097