(57)【要約】  アンモニアを用いて前処理されたリグノセルロース系バイオマスであって、反応混合物中の前記バイオマスの濃度が経時的に減少させられたリグノセルロース系バイオマスは、一定濃度で前処理された等価のバイオマスと比較して、糖化後により多くの糖を生成することが見いだされた。バイオマスの濃度は、質量対質量ベースでの全前処理反応混合物に対する乾燥バイオマスのパーセントである固形分濃度である。
2016517271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系バイオマスから発酵性糖を生成する方法であって：
ａ）開始時点ｔ0に反応容器内へ：
ｉ）質量対質量ベースで全混合物に対する乾燥バイオマスのパーセントで測定して、固形分濃度約４０％〜約７０％のセルロース系バイオマス；および
ｉｉ）前記バイオマスの乾燥質量に対して装填濃度が約４％〜約２４％であるアンモニア、
を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）前記反応混合物の液体含量を最終時点ｔnへ経時的に増加させる工程であって、前記固形分濃度が前処理バイオマスを製造しながら約２０％〜約３０％に減少する工程；および
ｃ）発酵性糖を生成するための条件下で前記前処理バイオマスを糖化酵素共同体と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記反応混合物の温度が、反応時間の間に約１００℃〜約２００℃の温度で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応時間が、約１０分間〜約２時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物の液体含量が、前記反応容器への蒸気、水、アンモニア溶液およびそれらの組合せからなる群から選択される物質の導入によって増加させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
バイオマス固形分のパーセントのｔ0からｔnへの減少が直線的である、単調であるが直線的ではない、または、ある期間にわたりｔ0〜ｔnの間に少なくとも１回、固形分濃度が一定に保持されて段階的に減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンモニアが、アンモニア溶液、無水アンモニア、アンモニア蒸気およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アンモニアが、再生アンモニアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が、ｔ0〜ｔnで変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が、ｔ0〜ｔnで上昇または低下する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルロース系バイオマスが、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記セルロース系バイオマスが、コーンストーバー、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ穀物繊維、草、てん菜パルプ、麦かん、小麦籾殻、燕麦わら、大麦わら、大麦外皮、干し草、稲わら、籾殻、スイッチグラス、ススキ、イネ科牧草類、クサヨシ、古紙、サトウキビバガス、モロコシバガス、モロコシストーバー、ダイズストーバー、穀類のミル粉砕から得られた成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、パーム廃棄物、低木および灌木、野菜、果実、花および動物性肥料からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵性糖が、発酵法のための生体触媒の炭水化物源を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵性糖が、一定バイオマス固形分濃度を用いる方法からの収率より少なくとも約３％高い収率で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記発酵性糖が、標的化合物を製造するために生体触媒と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的化合物が、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、グリセロール、キシリトール、マンニトール、乳酸、酢酸、ギ酸、コハク酸、グルタミン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、マレイン酸および酪酸からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１２日に出願され、参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６１／７７６９４６号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
発酵性糖を得るためのバイオマスを処理する方法が提供される。詳細には、本発明は、アンモニアを使用してリグノセルロース系バイオマスを前処理する方法であって、バイオマス固形分のパーセントが経時的に減少させられる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロース系供給原料および廃棄物、例えば農業残留物、木材、林業廃棄物、製紙業からの汚泥ならびに都市および産業固形廃棄物は、化学薬品、プラスチック、燃料および飼料を製造するための潜在的に大量の再生可能供給原料を提供する。炭水化物ポリマーであるセルロースおよびヘミセルロースならびにリグニンを含有するリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、一般的には様々な化学的、機械的および酵素的手段によって処理され、主として六炭糖および五炭糖が放出され、これらはその後に有用な生成物に発酵させることができる。
【０００４】
前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスの炭水化物ポリマーまたは多糖類を糖化に使用されるセルロース分解酵素へより容易に接近可能にするために使用される。バイオマスのアンモニア前処理を含む様々な前処理方法は、公知である。例えば、共同所有される米国特許第７，９３２，０６３号明細書は、高い固形分および低い水性アンモニア濃度の条件下でバイオマスを前処理する方法を開示している。使用されるアンモニアの濃度は、最小限でバイオマス−水性アンモニア混合液のｐＨをアルカリ性に、および最大限でバイオマスの乾燥質量に対して約１２質量％未満に維持するために十分な濃度である。バイオマスの乾燥質量は、バイオマス−水性アンモニア混合液の少なくとも約１５質量％〜約８０質量％である。
米国特許出願第２０１０／０１８４１７６号明細書は、バイオマス熱水分解装置であって、バイオマスが本体内に供給され、装置内でバイオマス濃度の勾配が発生するように他方の端から高温圧縮水が供給されるバイオマス熱水分解装置を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、発酵性糖および発酵中の生体触媒製造生成物の製造の強化を支援する容易に糖化可能な物質を生成する、アンモニアを用いてリグノセルロース系バイオマスを前処理する方法に対する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、糖化後に生体触媒により製造される生成物の製造の強化を支援するリグノセルロース系バイオマスを前処理するための方法を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、セルロース系バイオマスから発酵性糖を生成する方法であって：
ａ）開始時点ｔ0に反応容器内へ：
ｉ）質量対質量ベースで全混合物に対する質量乾燥バイオマスのパーセントで測定して、固形分濃度が約４０％〜約７０％のセルロース系バイオマス；および
ｉｉ）バイオマスの乾燥質量に対して装填濃度が約４％〜約２４％であるアンモニア、
を含む反応混合物を提供する工程、
ｂ）反応混合物の液体含量を最終時点ｔnへ経時的に増加させる工程であって、固形分濃度が前処理バイオマスを製造しながら約２０％〜約３０％に減少する工程；および
ｃ）発酵性糖を生成するための条件下で前処理バイオマスを糖化酵素共同体と接触させる工程であって、上記発酵性糖は発酵工程のための生体触媒の炭水化物源を提供する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】１段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分４０％の乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図２】１段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分５２．５％の乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図３】１段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分６５％の乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図４】固形分（％）の勾配を用いた前処理（Ａ）および一定の固形分４０％を用いた前処理（Ｂ）における経時的な固形分（％）およびアンモニア濃度のグラフを示す。
【図５】３段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分６５％、次に５２．５％、その次に４０％の勾配乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図６】３段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分６５％の乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図７】３段階で実施した、８％のＮＨ3／ｇ（固形分４０％の乾燥バイオマス）を用いて前処理したストーバーを用いて開始した、糖化中（２４時間後、４８時間後）のグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度ならびに発酵中（０時間後、２６時間後および２つ目の４８時間後）のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフである。
【図８】蒸気注入または乾式加熱および水の添加のいずれかを用いて製造した、一定の固形分４０％、５２．５％もしくは６５％の、または固形分６５％〜４０％の勾配を使用して前処理したコーンストーバーの糖化４８時間後のグルコース、キシロースおよびアラビノース収率を示すグラフである。
【図９】蒸気注入または乾式加熱および水の添加のいずれかを用いて製造した、一定の固形分４０％、５２．５％もしくは６５％の、または固形分６５％〜４０％の勾配を使用して前処理したコーンストーバーから製造された加水分解物を使用した１２０時間の発酵後のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフであり、このとき発酵は２（ｖ／ｖ）％の接種材料で開始した。
【図１０】蒸気注入または乾式加熱および水の添加のいずれかを用いて製造した、一定の固形分４０％、５２．５％もしくは６５％の、または固形分６５％〜４０％の勾配を使用して前処理したコーンストーバーから製造された加水分解物を使用した発酵の時点＝０でのグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフであり、このとき発酵は１０（ｖ／ｖ）％の接種材料で開始した。
【図１１】蒸気注入または乾式加熱および水の添加のいずれかを用いて製造した、一定の固形分４０％、５２．５％もしくは６５％の、または固形分６５％〜４０％の勾配を使用して前処理したコーンストーバーから製造された加水分解物を使用した４８時間の発酵後のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度を示すグラフであり、このとき発酵は１０（ｖ／ｖ）％の接種材料で開始した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、発酵性糖を生成するためにリグノセルロース系バイオマスを前処理し、その前処理バイオマスを糖化するための方法に関する。前処理中に使用するバイオマス固形分の最適濃度に関しては、バイオマスから放出させることのできる糖の量および同様に放出させられる阻害剤の量ならびに前処理剤へのバイオマスの接近性を含む対立する要素が存在する。本明細書に記載した条件下では、高いバイオマス固形分濃度から出発して、前処理反応中にバイオマス固形分濃度を減少させるのが効果的である。この方法を用いると、前処理バイオマス生成物はより効果的に糖化され、より高収率の発酵性糖を生成し、発酵中の生体触媒生成物合成の強化がもたらされる。
【００１０】
以下の定義および略語は、本特許の請求の範囲および明細書を解釈するために、使用する。
本明細書で使用する用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」、「有している」、「含有する」または「含有している」またはそれらの任意の変形は、非排他的な包含を含むと意図されている。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、製品または装置は、それらの要素に必ずしも限定されるものではなく、明示的に列挙されていない、またはそのような組成物、混合物、工程、方法、製品または装置に固有ではない他の要素を含んでいてもよい。さらに、特に反対のことを明示的に述べていない限り、「または」は、包括的な「または」を意味し、排他的な「または」を意味するものではない。例えば、「条件ＡまたはＢ」は下記のいずれか１つによって満たされる：Ａは真であり（または存在し）、およびＢは偽である（または非存在である）、Ａは偽であり（または非存在であり）、およびＢは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢはどちらも真である（または存在する）。
【００１１】
さらに、本発明の要素もしくは構成成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その要素もしくは構成成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非制限的であることが意図されている。このため、「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読み取るべきであり、単数形の要素もしくは構成成分は、その数が明白に単数であることを意味していない限り複数も含んでいる。
本明細書で使用する用語「発明」または「本発明」は、非限定的用語であり、特定の発明のいずれか１つの実施形態に関することを意図するものではなく、明細書および特許請求の範囲に記載された全ての可能性のある実施形態を包括している。
【００１２】
本明細書で使用する、本発明の成分または反応物質の使用される量を修飾する用語「約」は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を作成するために使用される典型的な計量および液体処理手順によって、これらの手順における偶発的誤差によって、組成物を作成するため、または本方法を実施するために使用される成分の製造、供給源または純度の差によってなど、発生し得る数量における変動を意味している。用語「約」は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する様々な平衡条件を原因として異なる量もまた含んでいる。用語「約」によって修飾されているかどうかにはかかわらず、特許請求の範囲は、量に関する同等の量を含んでいる。１つの実施形態では、用語「約」は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００１３】
用語「発酵性糖」は、発酵工程において微生物による炭素源として使用できるオリゴ糖類および炭糖類を意味する。
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含む組成物を意味する。リグノセルロース系材料は、ヘミセルロースもまた含んでいてもよい。
用語「セルロース系」は、セルロースとヘミセルロースを含む追加の成分とを含む組成物を意味する。
用語「糖化」は、多糖類からの発酵性糖の製造を意味する。
用語「前処理バイオマス」は、糖化の前に前処理にかけられているバイオマスを意味する。
用語「ブタノール」は、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノールまたはそれらの組み合わせを意味する。
【００１４】
用語「リグノセルロース系バイオマス」は、任意のリグノセルロース系材料を意味し、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類を含む材料を含んでいる。バイオマスは、さらに例えばタンパク質、脂質、灰分および／または抽出物などの追加の成分を含んでいてもよい。バイオマスは、単一起源に由来していてもよい、またはバイオマスは、２つ以上の起源に由来する混合物を含み得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバーの混合物または草や葉の混合物を含むことができよう。リグノセルロース系バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残留物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるがそれらに限定されない。バイオマスの例には、トウモロコシ穂軸、例えばトウモロコシ皮、コーンストーバー、トウモロコシ穀物繊維などの作物残留物、草、てん菜パルプ、麦かん、小麦籾殻、燕麦わら、大麦わら、大麦外皮、干し草、稲わら、籾殻、スイッチグラス、ススキ、イネ科牧草類、クサヨシ、古紙、サトウキビバガス、モロコシバガス、モロコシストーバー、ダイズストーバー、穀類のミル粉砕から得られた成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、パーム廃棄物、低木および灌木、野菜、果実、花および動物性肥料が含まれるがそれらに限定されない。
【００１５】
用語「乾燥物質含量」は、物質の液体内容物が除去された後に存在する対象材料の質量による量を意味する。
用語「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化の結果として生じる生成物を意味する。バイオマスは、糖化の前に前処理または予備処理されていてもよい。
用語「バイオマス加水分解物発酵ブロス」は、バイオマス加水分解物を含む培地中の生体触媒の増殖および製造の結果として生じる生成物を含有するブロスである。このブロスは、生体触媒によって消費されないバイオマス加水分解物の成分ならびに生体触媒自体および生体触媒により作成された生成物を含んでいる。
用語「標的化合物」もしくは「標的生成物」は、発酵において微生物生成宿主細胞によって生成される任意の生成物を意味する。標的化合物は、宿主細胞内での遺伝子組み換え酵素経路の結果であってもよく、または内因性経路によって生成されていてもよい。典型的な標的化合物には、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質および医薬品が含まれるがそれらに限定されない。
【００１６】
バイオマス固形分の勾配を使用する前処理
本方法では、前処理反応中のバイオマス固形分の濃度は、反応の時間経過に伴って減少する。バイオマスの濃度は、質量対質量ベースでの全前処理反応混合物に対する乾燥バイオマスのパーセントである固形分濃度である。
【００１７】
バイオマスは、任意のセルロース系もしくはリグノセルロース系材料、例えば、バイオエネルギー作物、農業残留物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、庭廃棄物、木材、林業廃棄物およびそれらの組み合わせを意味する。様々な実施形態では、バイオマスは、例えば、研削、ミル粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニングおよび／または裁断により第１サイズに減少させられる。さらに、バイオマスは、例えば空気乾燥または加熱乾燥により乾燥されていてもよい。
【００１８】
前処理反応混合物は、バイオマスと前処理剤としてのアンモニアとを含んでいる。アンモニアは、液体状態または無水状態で使用されていてもよい。アンモニアは、アンモニア溶液、無水アンモニア、アンモニア蒸気またはこれらの任意の混合物であってもよい。１つの実施形態では、アンモニアの一部または全部がリサイクルされていてもよい。前処理反応混合物中のアンモニア装填量は、反応混合物中のバイオマスの乾燥質量に対して約４％〜約２４％である量である。１つの実施形態では、アンモニアは、バイオマスの乾燥質量に対して約４質量％〜約１２質量％である。バイオマスの乾燥質量に対するアンモニアの量は、前処理反応中に変動していてもよく、約４％〜約２４％に留まる。１つの実施形態では、反応混合物中のアンモニアの濃度は、反応混合物の液体含量が増加するにつれて減少する。別の実施形態では、液体含量が増加するにつれて、アンモニア濃度を維持するために追加のアンモニアが加えられる。
【００１９】
前処理反応のための出発時点ｔ0でのバイオマスの固形分濃度は、約４０％〜約７０％である。様々な実施形態では、固形分濃度は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％である。バイオマスは、反応容器内への装填の前または後のいずれかに、所望の濃度に達するために、アンモニア、および必要に応じて水と混合される。容器の液体含量は、初期固形分濃度に対して最終時点ｔnである前処理終了時に約２０％〜約３０％減少するようにバイオマス固形分濃度を減少させるために経時的に増加させられる。１つの実施形態では、液体濃度は、反応容器に蒸気を加えることにより上昇させられる。別の実施形態では、液体濃度は、反応容器に水を加えることにより上昇させられる。他の実施形態では、液体濃度は、単独または蒸気もしくは水と組み合わせてのいずれかでアンモニア溶液を反応容器へ加えることによって増加させられる。加えられたアンモニアは、バイオマス固形分濃度に対して一定濃度を維持する量にあってもよい。または、反応混合物中で濃度を一定に保持するために、または反応中に変動する記載した範囲内にある濃度を有するために、アンモニアを加えてもよい。
【００２０】
１つの実施形態では、固形分濃度のｔ0からｔnへの減少は直線的である。別の実施形態では、固形分濃度における減少は、単調ではあるが直線的ではない。典型的には、減少速度は反応の開始時には高速であるが、時点ｔnに向けて緩徐化する。別の実施形態では、固形分濃度の減少は段階的であり、固形分濃度はｔ0〜ｔnの間では１回以上一定に保持される。
【００２１】
反応容器は、前処理中の反応混合物の温度が約１００℃〜約２００℃で維持されるように加熱される。様々な実施形態では、反応混合物は、約１００、１２０、１４０、１６０、１８０もしくは２００℃の温度を有するか、または前処理中にこれらの温度のいくつかの間で変動していてもよい。追加の実施形態では、温度は、前処理中に、約１００℃〜２２０℃、または約１００℃〜２３０℃で維持され、さらにこれらの温度のいくつかの間で変動していてもよい。変動は、温度の上昇または減少のいずれかであってもよい。反応容器は、例えば外部的、または蒸気を加えることによる内部的などの任意の手段によって加熱されていてもよい。
【００２２】
前処理反応混合物の温度は、前処理バイオマスを製造するために約１０分間〜２時間である反応時間に対しては、約１００℃〜約２００℃、または約１００℃〜約２２０℃、または約１００℃〜約２３０℃で維持される。典型的には、反応時間は、約２０分間〜６０分間である。さらに、反応時間は、１、２、３、４、５、６、７、８または９分間であってもよい。一般に、反応温度が高い場合にはより短い反応時間が効果的である。
【００２３】
バイオマスの前処理は、任意の適切な反応容器中で実施される。典型的には、容器は、圧力に抵抗できる容器であり、加熱できる、または加熱のための機構を有している、および内容物を混合するための機構を有している。混合が欠如する、または混合が作動させられない容器もまた使用されていてもよい。市販で利用できる容器には、例えば、Ｐａｒｒ反応器（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、イリノイ州モリーン）、Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ（登録商標）反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ、ペンシルベニア州エリー）、Ｊａｙｇｏ反応器（Ｊａｙｇｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州モーウォー）およびスチームガン反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ、ペンシルベニア州エリー）が含まれる。類似の能力を備えるはるかに大規模の反応器もまた使用されていてもよい。
【００２４】
本発明のバイオマス勾配固形分濃度法によって前処理されたバイオマスは、本明細書の実施例３において、以下で記載する糖化後に、比較一定バイオマス固形分濃度法によって前処理されたバイオマスより高い収率で発酵性糖を生成することが示された。全糖収率は、一定前処理サンプルについてよりも勾配前処理サンプルについての方が少なくとも約４％高かった。様々な実施形態では、糖収率は、類似するが非勾配法で前処理されたバイオマスからの収率よりも、少なくとも約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれを上回って高い。
本明細書の実施例３では、勾配バイオマス固形分濃度法によって前処理されたバイオマスからの加水分解物における、エタノールを製造するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を使用した発酵性糖の発酵は、グルコースおよびキシロース利用に基づく比較一定バイオマス固形分濃度法によって前処理されたバイオマスからの加水分解物の発酵およびエタノール製造よりはるかに効果的であることが証明された。
【００２５】
糖化
本発明の方法では、前処理バイオマスは発酵性糖を生成するために適合する条件下で糖化酵素共同体と接触させられ、発酵性糖は発酵工程のための生体触媒の炭水化物源を提供する。糖化の前に、前処理バイオマスは、糖化酵素共同体中の酵素が活性となるようにｐＨ、組成または温度を変化させるために処理されていてもよい。ｐＨは、固体形または液体形にある酸の添加を通して変化させられていてもよい。または、発酵から回収されていてもよい二酸化炭素（ＣＯ2）は、ｐＨを低下させるために利用されていてもよい。例えば、ＣＯ2は、発酵槽から収集してフラッシュタンク内の前処理生成物ヘッドスペース内に供給されていてもよい、またはｐＨを監視している間に適正な液体が存在する場合は、所望のｐＨが達成されるまで前処理バイオマスに通して起泡させられていてもよい。温度は、以下に記載するように、糖化酵素活性と適合する温度にさせられる。典型的には、適切な条件は、約４０℃〜５０℃および約４．８〜５．８のｐＨを含んでいてもよい。
【００２６】
セルロース系もしくはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、典型的には、セルロースおよび／またはヘミセルロースを分解するため、および例えばグルコース、キシロースおよびアラビノースなどの糖を含有する加水分解物を製造するために酵素組成物もしくは酵素混合物を利用する。糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）の中で概説されている。少なくとも１種の酵素が使用され、典型的には１種以上のグリコシダーゼを含む糖化酵素混合物が使用される。グリコシダーゼは、二糖類、オリゴ糖類および多糖類のエーテル結合を加水分解し、一般群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ、補遺１（１９９３），補遺２（１９９４），補遺３（１９９５），補遺４（１９９７）および補遺５［各々、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９］）の中に見いだされる。本方法において有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス成分によって分類できる。本方法のために有用なグリコシダーゼには、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が含まれていてもよい。さらに、バイオマスの他の成分からの多糖類の放出を促進するために、糖化酵素の組合せ、例えばペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）またはフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）に他の活性を加えるのが有用であってもよい。当分野では、多糖加水分解酵素を生成する微生物は、例えば、様々な基質特異性を有する数種の酵素もしくは酵素群によって触媒されるセルロースを分解する能力などの活性を示すことが多いことは公知である。そこで、微生物からの「セルラーゼ」は、１群の酵素を含んでいてもよく、それらの１種以上または全部は、セルロース分解活性に寄与していてもよい。商業的もしくは非商業的酵素調製物、例えばセルラーゼは、酵素を得るために利用される精製スキームに依存して数多くの酵素を含んでいてもよい。糖化のために有用である多数のグリコシルヒドロラーゼ酵素およびそれらの組成物は、国際公開第２０１１／０３８０１９号パンフレットに開示されている。
【００２７】
糖化酵素は、市販で入手されていてもよい。そのような酵素には、例えば、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴおよびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）Ｔｒｉｏ（商標）（Ｄｕｐｏｎｔ（商標）／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標）、デラウェア州ウィルミントン）ならびにＮｏｖｏｚｙｍｅ−１８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、２８８０バウスヴェア、デンマーク）が含まれる。さらに、糖化酵素は未精製で、細胞抽出物または全細胞調製物として提供されていてもよい。酵素は、１種以上の糖化酵素を発現させるために遺伝子組み換えされている組み換え微生物を使用して製造されていてもよい。
【００２８】
糖化のための追加の酵素には、例えば、ＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０およびＧＨ１１ファミリーのメンバーなどのグリコシルヒドロラーゼが含まれる。ＧＨは、２つ以上の炭水化物間、または１つの炭水化物部分と非炭水化物部分との間の配糖体結合を加水分解する１群の酵素である。ＧＨのファミリーは、配列類似性に基づいて分類されており、分類は炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（データベース発行）：Ｄ２３３−２３８）内で入手できる。特定のこれらの酵素は、様々な基質に作用することができ、糖化酵素としての有効性を証明してきた。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素は、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；および／またはβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）活性を含む公知の多数の活性を有している。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素もまた、例えば、α−Ｌ−イヅロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）および／またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を含む多数の公知の活性を有している。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素もまた、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；エンドアラビナナーゼ（ＥＣ３．２．１．９９）；および／またはガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４５）活性を含む多数の公知の活性を有している。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）および／またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性を有することが公知である。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）は、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２４０３−２４１２およびＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０９：３０３−３０８）の中に詳細に記載されており、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「ＧＨ１１」）は、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９６１７−２４の中に記載されている。
【００２９】
生体触媒
グルコースおよび好ましくはさらにキシロースを利用して、自然に、または遺伝子組み換えのいずれかにより標的化合物を生成する任意の生体触媒は、本方法を使用して生成される発酵性糖を発酵させるために使用されていてもよい。発酵によって製造できる標的化合物には、例えば、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質および医薬品が含まれていてもよい。アルコールには、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、マンニトールおよびソルビトールが含まれるがそれらに限定されない。酸は、酢酸、ギ酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、酪酸、グルコン酸、イタコン酸、クエン酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、マレイン酸およびレブリン酸を含んでいていてもよい。アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、リジン、グリシン、アルギニン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含んでいてもよい。追加の標的化合物には、メタン、エチレン、アセトンおよび工業用酵素が含まれる。
【００３０】
標的化合物への糖の発酵は、一段階または多段階発酵において１種以上の適切な生体触媒によって実施されていてもよい。生体触媒は、細菌、糸状菌および酵母から選択される微生物であってもよい。生体触媒は、野生型微生物または組み換え微生物であってもよく、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａ）の属に属する生物を含んでいてもよい。生体触媒の典型的な例には、組み換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）およびピキア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）が含まれる。
【００３１】
典型的には、生体触媒は、グルコースおよびキシロースを利用できるが、さらにアラビノースも利用してもよい。例えば、所望の標的化合物を製造するために効果的な生体触媒であるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の任意の菌株が使用されていてもよい。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、発酵基質としてのグルコース、フルクトースおよび／またはスクロースを使用して自然にエタノールを製造するが、キシロースは代謝されない。下記のように実施されている、キシロース利用のために遺伝子組み換えされているザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用するのが所望である。典型的には、米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１）およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載されているように、キシロース利用代謝経路を作り出すためにキシロース代謝に含まれている４種の酵素を発現させるために４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）内に導入されている。これらには、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼおよびキシルロース５−ホスフェートを形成するためにキシルロースをリン酸化するキシルウロキナーゼをコードする遺伝子が含まれる。さらに発現させられるのは、キシロースからエタノールへの代謝を許容する解糖性のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ経路にペントース代謝を結合する中間体へキシルロース５−ホスフェートを変換させるペントースリン酸経路の２種の酵素であるトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼである（図１参照）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、キシロースを代謝できる数多くの微生物、例えば腸内細菌ならびに一部の酵母および真菌のいずれかから入手されていてもよい。コード領域の起源には、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が含まれていてもよい。典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域が使用される。
【００３２】
コードＤＮＡ配列は、例えばザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞内で発現するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモーター）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモーター）などのプロモーターと機能的に連結している。米国特許第７，９８９，２０６号明細書に開示されている増加した発現を示す変異ＧＡＰプロモーターもまたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現のために有用である。コード領域は、プロモーターから個別に発現させられていてもよく、または２つ以上のコード領域が同一プロモーターからの発現を示すオペロン内で結合されていてもよい。結果として生じるキメラ遺伝子をザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞内に導入してプラスミド上で維持していてもよく、または例えば相同組み換え、部位特異的組み込みまたはランダム組み込みを使用してゲノム内に組み込んでいてもよい。キシロース利用代謝経路を発現するように組み換えられた株の例には、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書）、８ｂ（米国特許第７，２２３，５７５号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５８）が含まれる。キシロース利用代謝経路を発現するために組み換えられたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細胞は、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖できるようになる前に、一般にキシロース含有培地中での適応期間を必要とする。
【００３３】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されたように、アラビノース利用のためにさらに操作されていてもよい。アラビノース利用を可能にするために、キシロース利用経路の遺伝子に加えて発現させられる遺伝子には：１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースへ変換させるためのＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸へ変換させるためのＬ−リブロキナーゼ、および３）Ｌ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースへ変換させるためのＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５，８４３，７６０号明細書）が含まれる。米国特許出願公開第２０１１／０１４３４０８号明細書に開示されたように、改良されたアラビノース利用は、アラビノース−プロトンシンポーターを追加して発現させることによって、例えばａｒａＥ遺伝子からコード領域を発現させることなどによって達成できる。
【００３４】
さらに、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、例えば増殖速度および／または細胞質量を増加させる、キシロースの利用を増加させる、および／または例えばアラビノースなどの他の糖の使用を可能にする、例えば酢酸塩などの阻害性化合物に対する耐性を増加させる、またはエタノールの産生を増加させる株などの株を改良する１つ以上の追加の遺伝的改変を有していてもよい。例えば、組み込み宿主因子のαサブユニットをコードする内因性ｈｉｍＡ遺伝子は、米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されたようにその発現を減少させるように遺伝的に改変されていてもよく、それにより酢酸塩を含有する培地中での増殖が改良される。酢酸塩はバイオマス加水分解物中に存在するので、そこでバイオマス加水分解物を含有する培地を使用する場合は、この成分に対する耐性の増加が望ましい。
【００３５】
別の実施例では、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載したようなグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）活性を減少させる遺伝子組み換えが行われていてもよい。ＧＦＯＲならびにｈｉｍＡ遺伝子の発現の減少は、アルドースレダクターゼ活性を減少させるために上述した方法などの任意の方法によってであってもよい。
別の実施例では、共同所有される同時係属中の米国特許出願公開第２０１２／０１５６７４６号明細書に開示されているように、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性を増加させる遺伝的改変が実施されていてもよい。ＲＰＩ発現の増加は、例えば天然プロモーターよりはるかに活性の高いプロモーターを用いて、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）におけるリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を備える任意のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させることによって内因性ＲＰＩコード遺伝子の発現を増加させることによって実施されていてもよい。
【００３６】
別の実施例では、キシロース利用代謝経路の一部として発現するキシロースイソメラーゼは、米国特許第７，９８９，２０６号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書に開示されている変異高活性プロモーターを使用して発現させられる。上記特許に開示された変異プロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである。さらに、キシロースイソメラーゼは、米国特許第８，６２３，６２３号明細書として発行された、共同所有される同時係属中の米国特許出願公開第２０１１／０３１８８０１号明細書に開示されたように、ＥＣ５．３．１．５によって同定された酵素クラスに含まれるＩ群キシロースイソメラーゼであってもよい。上記特許の中では、例えばアクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）から単離されたコード領域から発現したようなＩ群キシロースイソメラーゼは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）において２群キシロースイソメラーゼより高い活性を有すると開示されている。その中でＩ群キシロースイソメラーゼは、分子系統学的バイオインフォマティクス解析（ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅパッケージバージョン３．５ｃ；Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９）Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ  ５：１６４−１６６）に実装されるＰＨＹＬＩＰ近隣結合アルゴリズムを使用する）、ＧｒｏｕｐＳｉｍ解析（Ｃａｐｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：１４７３−１４８０）およびプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズム；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ、バージニア州アシュバーンを使用する）によって定義されている。
【００３７】
別の実施例では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、米国特許第８，２４７，２０８号明細書に開示されたように、エタノールおよび酢酸アンモニウムを含有するストレス培養中での増殖のために適応させられていてもよい。改良された酢酸耐性を備えるこれらのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、酢酸塩を含有する発酵培地を含有するセルロース系バイオマス加水分解物を使用する場合は、特に有用である。
上記の参考文献に開示された株および本明細書に記載した株は、生体触媒として使用されていてもよい株の例を提供しており、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ、ＡｃＲ＃３、ＺＷ７０５、ＡＲ３ ７−３２１、ＺＷ１−ＸＡ１１１およびＲ７０Ｂ１を含んでいる。
【００３８】
エタノールを製造する例えば酵母などの追加の生体触媒および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子組み換え株（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２）ならびに上記に列挙したような他の標的化合物を製造する生体触媒は、本方法を使用して生成される発酵性糖の発酵に使用されていてもよい。例えば、ブタノールを合成するための経路を発現するように遺伝子組み換えされた酵母細胞および１，３−プロパンジオールを生成するために遺伝子組み換えされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）については報告されている。生体触媒中でブタノール（イソブタノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールを含む）を合成するための経路の遺伝子組み換えは、例えば、米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書、米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書、米国特許第７，８５１，１８８号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８２３０８号明細書に開示されている。１，３−プロパンジオールのための生体触媒中の経路の遺伝子組み換えは、米国特許第６，５１４，７３３号明細書、米国特許第５，６８６，２７６号明細書、米国特許第７，００５，２９１号明細書、米国特許第６，０１３，４９４号明細書および米国特許第７，６２９，１５１号明細書に開示されている。
【００３９】
キシロースを炭素源として利用するためには、完全キシロース利用経路を発現させるために酵母細胞が遺伝子組み換えされていてもよい。キシロースからエタノールを製造するための例えばＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母の遺伝子組み換えは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）８４：３７−５３）およびＫｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（２００５）５：３９９−４０９）に記載されている。
【００４０】
乳酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組み換え株（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３９９−４０７）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の天然株（米国特許第７，０９８，００９号明細書）およびリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ｔａｙ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０：１−１２）による発酵で生成されてきた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組み換え株は、１，３−プロパンジオール（米国特許第６，０１３，４９４号明細書、米国特許第６，５１４，７３３号明細書）、およびアジピン酸（Ｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１）を生成するための発酵における生体触媒として使用されてきた。酢酸は、組み換えクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（Ｃｈｅｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−３３）および新規に同定された酵母株（Ｆｒｅｅｒ（２００２）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２７１−２７５）を使用する発酵によって作成されてきた。組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌によるコハク酸の生成は、米国特許第６，１５９，７３８号明細書に、および変異組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるコハク酸の生成はＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．７：１１６−１２７）に開示されている。ピルビン酸は、変異トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）酵母（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５５：６８０−６８５）および変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１６４−２１６７）によって生成されてきた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組み換え株は、パラ−ヒドロキシ桂皮酸（米国特許出願公開第２００３０１７０８３４号明細書）およびキナ酸（米国特許第７，６４２，０８３号明細書）を生成するための生体触媒として使用されてきた。
【００４１】
プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）の変異体は、プロピオン酸を生成するために発酵において使用されてきて（Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：３２５−３３７）、酪酸は、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）によって作成されてきた（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：９３−１０２）。プロピオン酸塩およびプロパノールは、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）１７ｃｒ１株によりトレオニンからの発酵によって作成されてきた（Ｊａｎｓｓｅｎ（２００４）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２：４８２−４８６）。酵母様オウレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）は、アスペルギリス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｇｅｒ）の変異体（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３９：１１３６−４３）によってグルコン酸を作成するために使用されてきた（Ａｎａｎｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：４９４−５０１）。５−ケト−Ｄ−グルコン酸は、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）の変異菌によって作成され（Ｅｌｆａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６６：６６８−６７４）、イタコン酸はアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）の変異菌によって生成され（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００２）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８５：６９−７１）、クエン酸は変異アスペルギリス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株によって生成され（Ｉｋｒａｍ−Ｕｌ−Ｈａｑ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：６４５−６４８）、キシリトールはカンジダ−ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＦＴＩ  ２００３７によって生成された（Ｍｕｓｓａｔｔｏ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｏ（２００３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：３３１−３３７）。さらに有意な量の３−ヒドロキシ酪酸３−ヒドロキシ吉相酸も含有する４−ヒドロキシ吉草酸含有バイオポリエステルは、組み換えシュードモナス−プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）によって生成された（Ｇｏｒｅｎｆｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２：４５−５７）。Ｌ−２，３−ブタンジオールは、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって作成された（Ｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：５３３−５３７）。
【００４２】
発酵によるアミノ酸の製造は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の栄養要求性株およびアミノ酸アナログ耐性株を使用して実施されてきた。例えば、ヒスチジンアナログに耐性の株を使用したヒスチジンの製造は、特開５６００８５９６号公報に記載されており、組み換え株を用いる生成は、欧州特許第１３６３５９号明細書に記載されている。トリプトファンアナログに耐性の株を使用したトリプトファンの製造は、特開４７００４５０５号公報および同５１０１９０３７号公報に記載されている。イソロイシンアナログに耐性の株を使用したイソロイシンの製造は、特開４７０３８９９５号公報、同５１００６２３７号公報および同５４０３２０７０号公報に記載されている。フェニルアラニンアナログに耐性の株を使用したフェニルアラニンの製造は、特開５６０１００３５号公報に記載されている。チロシンに耐性の、増殖のためにフェニルアラニンを必要とする株（Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ５０（１）Ｒ７９−Ｒ８７（１９７６）もしくは組み換え株（欧州特許第２６３５１５号明細書、欧州特許第３３２２３４号明細書）を使用したチロシンの製造およびＬ−アルギニンアナログに耐性の株を使用したアルギニンの製造（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２）３６：１６７５−１６８４、特開５４０３７２３５号公報および同５７１５０３８１号公報）は報告されている。フェニルアラニンは、さらにエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ３１８８２、３１８８３および３１８８４中での発酵によっても生成された。組み換えコリネフォルム（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）細菌中でのグルタミン酸の製造は、米国特許第６，９６２，８０５号明細書に記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異株によるトレオニンの生成は、Ｏｋａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．８９：８７−７９に記載されている。メチオニンは、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）の変異株によって製造された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：２８７−２９４）。
【００４３】
有用なペプチド、酵素および他のタンパク質もまた生体触媒によって作成されてきた（例えば、米国特許第６，８６１，２３７号明細書、米国特許第６，７７７，２０７号明細書および米国特許第６，２２８，６３０号明細書を参照）。
【００４４】
生体触媒による発酵で製造された標的化合物は、当分野において公知の様々な方法を使用して回収され得る。生成物は、遠心分離、ろ過、精密濾過およびナノろ過によって他の発酵成分から分離することができる。生成物は、イオン交換、溶媒抽出または電気透析によって抽出することもできる。生成物分離を補助するために凝集剤を使用できる。特定の例として、バイオ生成１−ブタノールは、ＡＢＥ発酵のための当分野において公知の方法を使用して発酵培地から単離されていてもよい（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）およびそれらの中の参考文献を参照されたい）。例えば、固形分は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去されていてもよい。次に、１−ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を使用して発酵培地から単離することができる。発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製は、例えば、有機溶媒を用いた抽出、蒸留およびカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することによって実施することができる（米国特許第５，３５６，８１２号明細書）。この方法のために特に優れた有機溶媒は、シクロヘキサンである（米国特許第５，００８，４７３号明細書）。アミノ酸は、例えばイオン交換樹脂吸着および／または結晶化などの方法によって発酵培地から収集することができる。アルコールは、典型的には蒸留およびモレキュラーシーブを用いて回収される。
【００４５】
発酵
本方法によって生成される発酵性糖を発酵させるためには、例えば上述したような任意の生体触媒が使用される。特定の生体触媒を用いて使用される発酵条件は、上記で言及した参考文献に記載されたとおりであってもよく、または当業者には公知のとおりであってもよい。
【００４６】
１つの例として、以下では、エタノールを製造するためのザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用する大規模発酵について記載した。所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を振とうフラスコ内の半複合培地中において、オービタルシェーカー内の約１５０ｒｐｍで撹拌しながら約３０℃〜約３７℃で増殖させ、次に類似の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽へ移した。種培養は、発酵パラメーターがエタノール製造のために最適化されている生成発酵槽内に移した時点にＯＤ600が３〜６になるまで種発酵槽内で嫌気性で増殖させた。種タンクから生成タンクへ移された典型的な接種菌量は約２（ｖ／ｖ）％〜約２０（ｖ／ｖ）％の範囲に及ぶ。発酵培地は、加水分解物単独から構成されていてもよい、または加水分解物に追加して、例えばソルビトールもしくはマンニトールなどの成分を米国特許第７，６２９，１５６号明細書に記載された約５ｍＭの最終濃度で含んでいてもよい。発酵は、バッチ法、フェドバッチ法もしくは連続法であってもよく、バッチおよびフェドバッチ培養法は当分野において一般的で周知であり、例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サンダーランドまたはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）の中に見いだすことができる。
【００４７】
発酵は、苛性アルカリ溶液（例えば、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム）および硫酸もしくはリン酸のいずれかを用いて典型的にはｐＨ４．５〜６．５で制御される。発酵槽の温度は、３０℃〜３７℃で制御される。発泡を最小限に抑えるために、必要に応じて容器に消泡剤（任意のクラスのシリコーン系、有機系など）が加えられていてもよい。
【００４８】
上述した任意の一連の条件および当分野において周知のこれらの条件における追加の変更は、キシロース利用組み換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール製造のための適切な条件である。典型的には、培養は、空気、酸素もしくは他の気体（例えば嫌気性、微好気性もしくは微嫌気性発酵などの条件を含んでいてもよい）を補給せずに、少なくとも２０時間インキュベートされてよい、および約４８時間、１２０時間以上ランされていてもよい。
さらに、発酵は、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）法またはハイブリッド糖化および発酵（ＨＳＦ）法を用いて実施することができる。ＨＳＦでは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の添加前に部分糖化が実施され、その後に糖化および発酵が同時に行われる。第２段階同時糖化および発酵は、米国特許第８，６４７，８５０号明細書として発行された米国特許出願公開第２０１１／０３１８８０３号明細書に記載されたように実施されていてもよい。本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、高濃度のエタノールを製造するための同時糖化および発酵反応中に糖化−発酵混合物中の高濃度の不溶性固形分を用いて低インペラー撹拌の条件下で増殖させた。
【００４９】
＜実施例＞
以下の実施例では、本発明についてさらに規定する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示するためにだけ提供されていることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確証することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適応させるために本発明を様々に変化させて、修飾を加えることができる。
【００５０】
略語の意味は、以下の通りである：「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ／Ｌ」はリットル当たりグラム数を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＯＤ600」は６００ｎｍで測定される光学濃度を意味し、「ｗ／ｖ」は体積当たりの質量を意味し、「ｗ／ｗ」は質量当たりの質量を意味し、「ｓａｃｃ」は糖化を意味し、「ｆｅｒｍ」は発酵を意味し、「ａｖ」は平均を意味し、「ｇｌｕｃ」はグルコースを意味し、「ｘｙｌ」はキシロースを意味し、「ａｒａｂ」はアラビノースを意味する。
【００５１】
一般方法
糖化
前処理コーンストーバーは酵素混合物Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）Ｔｒｉｏ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して酵素的に加水分解した。加水分解のための固形分装填量は、２０質量％または２５質量％で維持した。糖化の前に５．３へｐＨを調整するために必要とされる硫酸の量は、滴定によって決定した。糖化は、ｐＨ５．３、４７℃および２５０ｒｐｍでの撹拌により４８時間にわたり実施した。各加水分解は、２５０ｇの全糖化混合物を含む１．０Ｌのバッフル付きフラスコ内で実施した。ＨＰＬＣ分析のためのサンプルは、２４時間後および４８時間後に採取した。
【００５２】
生体触媒
ＣＤ２株
実施例１〜３では、エタノールを製造する発酵における生体触媒としてザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｃ２Ｄ株を使用した。Ｃ２Ｄ株は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，２４７，２０８号明細書に開示されているＺＷ７０５株に由来するＡＲ３  ７−３１株に由来した。ＡＲ３  ７−３１株は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２／０３２９１１４号明細書に記載されたタービドスタット（ｔｒｕｂｉｄｏｓｔａｔ）内でＺＷ７０５株を増殖させた後に単離した；この株は上記特許内では適応７−３１とも呼ばれている。この連続流式培養装置内で、酢酸アンモニウムおよびエタノールの濃度を加水分解物培地中で経時的に増加させた。ＡＲ３  ７−３１の全ゲノムの配列を決定し、ＺＷ７０５ゲノムの配列と比較した。ＡＲ３  ７−３１株は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＣ＿００６５２６．２）のｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム内に遺伝的改変を有することが見いだされた。ｚｍｏ１４３２は「フザリン酸耐性タンパク質」をコードすると注釈がついている。この改変の効果は、加水分解物培地中の株の挙動を改良することである。
【００５３】
さらなる改変がＡＲ３  ７−３１株の性能を改良するために加えられた。アラビノース利用経路は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／０１４３４０８号明細書に記載されたようにＰｇａｐ−ＢＡＤオペロンとしてａｒａＢ、ａｒａＡおよびａｒａＤ遺伝子発現を導入することによって加えた。Ｐｇａｐ−ＢＡＤオペロンは、参照により本明細書に組み入れられる共同所有される同時係属中の米国特許出願第１３／７１１６４６号明細書に開示されたように、ｐｎｐ遺伝子座からのＣ末端短縮タンパク質の発現を誘発するようにｐｎｐ遺伝子座内に組み込んだ。ａｒａＥアラビノース−プロトンシンポーターは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１４３４０８号明細書に開示されたアラビノース利用を改良するために発現させた。リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性の発現の増加は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１５６７４６号明細書に開示されたＲＰＩをコードする追加の遺伝子を導入することによって操作した。結果として生じる改変Ｃ２Ｄ株は、加水分解物培地中でのエタノール製造のためにキシロースおよびアラビノースを利用する。
【００５４】
Ｒ７０Ｂ１株
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ１−ＸＡ１１１は、ＺＷ１株（ＡＴＣＣ３１８２１）から調製した。ＺＷ１は、ＺＷ７０５について上述したように、４つのキシロース利用経路遺伝子：ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔｋｔおよびｔａｌを発現するように操作した。ｘｙｌＡコード領域は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌｏａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／０３１８８０１号明細書に開示されている）からであり、ｘｙｌＡおよびｔａｌ／ｔｋｔオペロンを発現するために、変異高活性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（参照により本明細書に組み込まれる、共同所有される米国特許第７，９８９，２０６号明細書に開示されている）を使用した。ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子の組み込みは、ｇｆｏｒ遺伝子座（（参照により本明細書に組み入れられる共同所有される米国特許第７，７４１，１１９号明細書）を不活性化した。この株は、参照により本明細書に組み入れられる共同所有される同時係属中の米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書に開示されたようにリボース−５−リン酸イソメラーゼ（Ｒｐｉ）および参照により本明細書に組み入れられる共同所有される同時係属中の米国特許出願第２０１３−０１５７３３１号明細書に開示されたようにリブロース−リン酸ー３−エピメラーゼ（Ｒｐｅ）の発現を増加させるために遺伝子組み換えした。生じた株は参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，６２９，１５６明細書に記載されたように適応のためにキシロース培地中で４倍にするために継代培養したが、その間に、キシロースをキシリトールへ変換させることのできるＮＡＤＰＨ依存性キシロースレダクターゼ活性を有する酵素をコードするザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＣ＿００６５２６．２）のｚｍｏ０９７６オープンリーディングフレーム内で遺伝的改変が発生した（Ａｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．；ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ７／０１／２０１１）。ｚｍｏ０９７６の破壊は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第２０１３−０１５７３３２号明細書に開示されたように、ＮＡＤＰＨ依存性キシロースレダクターゼ活性を９０％超減少させる。
【００５５】
この株は、キシロース利用のために導入されたトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性と協力してアラビノース資化経路を提供する、Ｌ−リブロースキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リブロース−５−ホスフェート−４−エピメラーゼを各々コードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤオペロンを発現するように操作した（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８４３，７６０号明細書）。ａｒａＢＡＤオペロンの組み込みは、参照により本明細書に組み入れられる共同所有される同時係属中の米国特許出願第２０１３−０１５７３３１号明細書に開示されたように、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードするｐｎｐ遺伝子を不活性化し、それによりキシロース利用およびエタノール製造の改良を提供した。生じた株は、米国特許第７，６２９，１５６号明細書に記載されたように、適応のためにキシロース培地中で１０倍に継代培養した。
キシロース利用をさらに改良するために、この株は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／１４３４０８号明細書に開示されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＥ遺伝子によってコードされる異種アラビノース−プロトンシンポーターを発現するように操作した。この工程で使用した有標のクロラムフェニコール耐性は、ＺＷ１−ＸＡ１１１株を生成するゲノムから取り除いた。
【００５６】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株Ｒ７０Ｂ１は、連続適応を通してＺＷ１−ＸＡ１１１から発生させた。手短には、ＺＷ１−ＸＡ１１１を蘇生させ、コーンストーバー（corn stover)(実をとった後のトウモロコシ茎葉)加水分解物Ｙ０１８内に配置した。
グルコースの全部およびキシロースのほぼ半分が消費された後、１０体積％の培養を取り出し、コーンストーバー加水分解物の新しい試験管内に配置した。これを７０回の移入にわたり繰り返した。７０回目の移入後、単一コロニーを単離するために集団をプレーティングしたが、Ｒ７０Ｂ１は単離コロニーの１つであった。
【００５７】
ストーバー加水分解物Ｙ０１８
前処理
コーンストーバーは、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載された低アンモニア法を使用して酵素的加水分解の前に前処理した。Ｙ０１８と名付けられた前処理トウモロコシ穂軸を生成する前処理のために、容器の本体周囲に蒸気を通過させるためのジャケットを含有する水平型Ｅｉｒｉｃｈ  ３４０Ｌ反応容器を使用した。この容器に、６０体積％（４０．８ｋｇ）に達するまでストーバーを装填した。ストーバーは、１／３２インチ（０．８ｍｍ）未満に減少した。
【００５８】
ストーバーは、０．２００ｇ／ｃｍ3の湿性の緩いバルク密度および８．０質量％の水分を有していた。ストーバーを装填後、容器内部の乾燥質量バイオマスおよび６５質量％の固形分に対してＮＨ3が８質量％となるように、水酸化アンモニウム溶液を導入する前に−０．９ｂａｒｇ（−９０ｋＰａｇ）に達するように容器を減圧した。全バッチで、反応器撹拌装置を４０Ｈｚ（４２ｒｐｍ）に設定し、ジャケット上の蒸気圧は３．２ｂａｒｇであった。アンモニア溶液を添加すると、容器内部温度を１４０℃へ上昇させて維持するために蒸気を１６ｂａｒｇ（１，６００ｋＰａｇ）で加えた。この温度を３０分間保持した。前処理の終了時、大気圧に達するようにベントコンデンサーを通して反応器を減圧した。続いて、容器の底弁を開いて前処理バイオマスを回収する前に温度を低下させて余分なアンモニアおよび水を前処理ストーバーから除去するために、−０．９ｂａｒｇ（−９０ｋＰａｇ）に達するように減圧した。上述のように調製した前処理ストーバーのバッチＹ０１８−Ｘ、Ｙ０１８−５およびＹ０１８−１０についての固形分の最終質量％は、各々５５．５％、６７．０％および６４．４％であった。
【００５９】
糖化
Ｙ０１８加水分解物は、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯを用いて処理した、上述したバッチからの前処理コーンストーバーの混合物を使用して１，０００Ｌ発酵槽内で生成した。発酵槽に水ヒール（ｗａｔｅｒ  ｈｅｅｌ）を加え、１２１℃へのジャケット加熱を用いて殺菌し、２０分間維持した。水を４７℃へ冷却し、タンクの上部にあるポートを通して前処理ストーバー混合物を加えた。この時点で、スラリーの固形分はおよそ８質量％であった。５質量％のＨ2ＳＯ4を用いてｐＨを５．３に調整し、酵素を加えた。酵素の用量は、反応器に加えるべき全ストーバー中のグルカン＋キシランのｇ当たりタンパク質１４ｍｇと等価であった。その後の２４時間をかけて、残留ストーバーを固形分２５質量％の標的に加え、５質量％のＨ2ＳＯ4を用いてｐＨを５．３に調整した。発酵槽をおよそ７２時間にわたり４７℃およびｐＨ５．３に制御した。この期間の終了時に、これらの実験に使用するために２０Ｌを取り出し、容器の残留内容物を発酵させた。加水分解物のサンプルを分析し、残りは使用時まで冷凍補完した。サンプル分析の結果は、下記の表３に示す。
【００６０】
表3:Y018についての糖化終了時の加水分解物の特性
2016517271.tif 000003
【００６１】
種培養物の調製
種培養を調製するために、Ｃ２Ｄ株のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を３３℃で１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏおよび１５０ｇ／Ｌのグルコースを含有する培地中で増殖させた。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）種培養は、高度に嫌気性条件下で、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３３℃で一晩増殖させた。種は、増殖の後期対数期に達した時点に収穫した。
【００６２】
発酵
発酵には、糖化から（上述したように）生成した加水分解物を使用した。発酵は、４８時間にわたり３３℃、初期ｐＨ５．８、１２０ｒｐｍで撹拌しながら、有効容量（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）が２７５ｍＬの１Ｌのバッフルなしフラスコ内で実施した。発酵を開始させるために、上述した種培養を加水分解物中に接種した。接種率は、実験デザインに依存して、２（ｗ／ｖ）％または１０（ｗ／ｖ）％であった。フラスコは、発酵中に形成される二酸化炭素を排気するために針で穿孔したゴム栓を用いて蓋をした。サンプルは発酵の経過中に採取した。ＨＰＬＣ分析装置を使用して、グルコース、キシロース、アラビノース、酢酸、アセトアミドおよびエタノールのプロフィールを測定した。
【００６３】
ＨＰＬＣ分析
発酵培養中のグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールの濃度は、Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを装備した高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して分析した。カラム温度を６０℃で維持し、移動相（１０ｍＭのＨ2ＳＯ4）は０．６ｍＬ／分の流量で維持した。
【００６４】
ＨＰＬＣ分析−２
糖化および発酵で生成したモノマーのグルコース、キシロースおよびアラビノースの濃度は、イオン形Ｈ＋／ＣＯ３脱灰ガードカラムおよびインラインプレフィルターを装備したＢｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ｐカラム上でＨＰＬＣを用いて分析した。カラム温度は８０〜８５℃で維持し、移動相（０．２μｍでろ過したＤＩ水）は０．６ｍＬ／分の流量で維持した。
発酵で生成したエタノールの濃度は、Ｃａｒｂｏ−Ｈガードカラムおよびインラインプレフィルターを装備したＢｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−Ｈカラム上でＨＰＬＣを用いて分析した。カラム温度は５５〜６５℃で維持し、移動相（０．２μｍでろ過したＤＩ水を用いて作成した０．０１Ｎ硫酸）は０．６ｍＬ／分の流量で維持した。
【実施例１】
【００６５】
一定プロファイル前処理を使用した様々な固形分（％）での前処理間の比較
コーンストーバーをミル粉砕し、１ｍｍスクリーンを通過させた。ＮＨ3の装填量８（ｗ／ｗ）％および固形分４０．０％を達成するために、ミル粉砕したストーバー（５２．５ｇの乾燥質量に等価）を水酸化アンモニウム溶液および蒸留水と混合した。この混合液を次に６００ｍＬのステンレススチール製Ｐａｒｒ反応器（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製、イリノイ州モリーン）内に装填し、ボルトで閉めた。Ｐａｒｒ反応器は、非撹拌式反応器であった。反応器を４０分間にわたり流動床砂浴中で１４０℃へ加熱した。保持時間後、反応器を氷浴中で５０℃未満へ冷却した。次に内容物を反応器から取り出し、６５℃の真空乾燥機内で一晩乾燥させた。これらの工程は、固形分５２．５％および固形分６５．０％を使用する以外は、個別に繰り返した。生じた乾燥前処理コーンストーバーサンプルを次に一般方法に記載したように糖化および発酵させた。糖化および発酵中の様々な時点にサンプルを採取し、一般方法に記載したようにグルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールについて分析した。
【００６６】
結果は、固形分４０％、固形分５２．５％および固形分６５％について図１、２および３に各々示したが、２４時間および４８時間は糖化時間を意味し、０、２６および２つ目の４８時間は発酵時間を意味する。これらの結果は、試験した最低固形分（４０％）での前処理は、固形分５２．５％および６５％での前処理と比較してエタノールの最高収率を生じさせることを証明した。
【実施例２】
【００６７】
勾配および非勾配前処理間の比較
バイオマス勾配固形分（実験１）、６５％の一定バイオマス固形分（実験２）および４０％の一定バイオマス固形分（実験３）を使用して、３種の実験を実施した。各実験は、表１に略述したように、３段階の前処理を有していた。
【００６８】
表1 前処理についての実験デザイン
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【００６９】
実験１のためには、固形分６５（ｗ／ｗ）％でアンモニア濃度１４．８６（ｗ／ｗ）％を含有するストーバー混合物を製造するために、５５．３ｇのサイズ１ｍｍのミル粉砕コーンストーバーを１４．４８ｇの２９％水酸化アンモニウムおよび１０．９４ｇの蒸留水と混合した。この混合液を次に６００ｍＬのステンレススチール製Ｐａｒｒ反応器（非撹拌式反応器）内に装填し、ボルトで閉めた。この反応器は、表１に表示したように、１５分間の第１段階保持時間にわたり流動床砂浴中で１４０℃へ加熱した。保持時間後、反応器は氷浴中で５０℃未満へ冷却した。次に内容物を反応器から取り出し、６５℃の真空乾燥機内で一晩乾燥させた。
【００７０】
実験１の第２段階のためには、第１段階前処理からの乾燥内容物は、固形分５２．５％の混合物を達成するために、１４．４８ｇの２９％水酸化アンモニウムおよび３０．１９ｇの蒸留水と混合した。この混合液は次に、砂浴中で加熱した１４０℃でのＰａｒｒ反応器内で１５分間の保持時間にわたり前処理した。次に反応器を氷浴中で５０℃未満へ冷却した。内容物を反応器から取り出し、６５℃の真空乾燥機内で一晩かけて完全に乾燥させた。
【００７１】
実験１の第３段階のためには、第２段階からの乾燥材料は、固形分４０％の混合物を達成するために、１４．４８ｇの２９％水酸化アンモニウムおよび６１．４３ｇの蒸留水と混合した。この混合液は次に、砂浴中で加熱した１４０℃のＰａｒｒ反応器内で１５分間の保持時間にわたり前処理した。保持時間後、反応器は氷浴中で５０℃未満へ冷却した。内容物を反応器から取り出し、６５℃の真空乾燥機内で一晩かけて完全に乾燥させた。
実験２および３については、この手順は、各実験の全３段階において各々固形分（％）が固形分６５％および固形分４０％で一定に維持されたことを除いて同一であった。表２は、全３種の実験における前処理混合物の成分を表示している。
【００７２】
表2:様々な固形分(%)での前処理混合物についてのレシピ
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【００７３】
固形分（％）およびアンモニア濃度を図４ＡおよびＢに勾配実験１および一定固形分４０％実験３について各々グラフ表示した。勾配実験では、アンモニア濃度は、固形分（％）を低下させるために加えた水の増加に起因して減少した。勾配実験中、バイオマスの乾燥質量に対するアンモニア量は一定に留まっていた。
全３種の実験において、３段階で前処理した後、一般方法に記載した手順を使用してストーバーを糖化および発酵させた。糖化および発酵中の様々な時点にサンプルを採取し、一般方法に記載したように、グルコース、キシロース、アラビノースおよびエタノールについて分析した。そこで、前処理における勾配固形分（％）を、２種の濃度での前処理における一定固形分（％）と比較した。
結果は、勾配固形分（％）、固形分６５％および固形分４０％実験について図５、６および７に各々示したが、２４時間および４８時間は糖化時間を意味し、０、２６および２つ目の４８時間は発酵時間を意味する。これらの結果は、勾配前処理が一定前処理に比較して最高エタノール収率を生じさせることを証明した。
【実施例３】
【００７４】
勾配を生じさせるために直接蒸気注入または乾式加熱を伴う水添加を使用した勾配および非勾配材料間の比較
１ｍｍスクリーンに通してハンマーミル粉砕した６２９．３ｇのコーンストーバーを６．７Ｌの撹拌式のジャケット付き水平式反応器に装填し、表３において各実験について列挙したような所望の初期固形分（％）を達成するために、水性アンモニアおよび水を加えた。
実験１、２および３のためには、反応器内に材料のさらなる追加を実施せずに温度を１４０℃に上昇させて維持するために、反応器ジャケットに蒸気を適用した。反応質量は、４０分間にわたり温度で保持し、その後に大気圧へ排気させ、過剰のアンモニアを除去するために減圧した。
実験４および５のためには、最初に固形分６５質量％を達成するために水性アンモニアおよび水を添加し、次に固形分４０質量％を達成するためにおよそ３５分間にわたり水または蒸気（表３を参照）を連続的に加えた。両方の実験において１４０℃の温度を維持するために、再びジャケットへ蒸気を添加した。温度での全４０分間の保持時間の終了時に、反応器を大気圧へ排気させ、過剰のアンモニアを除去するために減圧した。
【００７５】
表3 実験1〜5についてのアンモニア、固形分(%)、加熱および水分パラメーター
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【００７６】
各実験から生じた前処理バイオマスを一般方法に記載したように４８時間にわたり糖化した。生じた加水分解物中の糖収率は、ＨＰＬＣによってアラビノース、キシロースおよびグルコースについてアッセイすることによって評価した。図８に記載した結果は、勾配前処理実験からのグルコースおよび全糖収率は、一定前処理実験より高かった。全糖収率は、一定前処理サンプルよりも勾配前処理サンプルの方が少なくとも４％高かった。
実験から生じた加水分解物は、一般方法に記載したように、２（ｖ／ｖ）％の接種材料または１０（ｖ／ｖ）％の接種材料のいずれかを使用して発酵させた。１２０時間にわたる発酵が図９にグラフ化されている２％の接種材料実験の結果は、グルコースおよびキシロース利用ならびにエタノール製造によって測定されるように、発酵が一定前処理実験より勾配前処理実験からの加水分解物を使用する方がより効果的であることを証明している。
１０％の接種材料実験からの結果は、図１１に示されている。図１０は初期の糖およびエタノール濃度を示し、図１１は、４８時間の発酵後の糖およびエタノール濃度を示している。エタノール収率は、一定プロファイル前処理からの加水分解物に比較して、勾配前処理からの加水分解物の発酵からが最高であった。
【実施例４】
【００７７】
（予測的）    蒸気の品質を操作することによる勾配プロファイルの調整
１ｍｍスクリーンに通してハンマーミル粉砕したコーンストーバーは、蒸気注入システムを有する反応器内に装填し、所望の初期固形分（％）を達成するためにアンモニア溶液および水を加える。反応器を閉鎖する。温度を１２０〜２００℃へ上昇させるためにストーバー／アンモニア溶液／水の混合液に蒸気を直接添加する。流入蒸気の温度は、所定の温度範囲で程度の様々な勾配を達成するために調整する。流入蒸気圧は、３〜１６バールゲージ圧であった。流入蒸気温度を操作することによって、所定温度を維持するために必要とされる蒸気の量を操作できる。このため、様々な勾配プロファイルは、流入蒸気を操作することによって操作する。
【実施例５】
【００７８】
様々な第２段階の固形分（％）、温度および圧力での第２段階前処理の比較
コーンストーバーをミル粉砕して１／８インチのスクリーンを通過させた。ミル粉砕したストーバー（４８３ｋｇの乾燥質量に等価）および水酸化アンモニウム溶液（１４質量％、３１３ｋｇ）は、撹拌式および外部加熱型４，８００Ｌ反応器内に装填した。全１２（ｗ／ｗ）％のＮＨ3装填量および固形分５５％を目標とするために、容器内へ無水アンモニア（１４．３ｋｇ）を注入した。反応器は、６ｂａｒｇ（６００ｋＰａ（ゲージ））の圧力までの直接蒸気注入により加熱し、３０分間保持した（第１段階）。次に反応器を８〜１２ｂａｒｇ（８００および１，２００ｋＰａ（ゲージ））までの直接蒸気注入により加熱し、１０分間保持し（第２段階）、その後に大気圧へ排気させて、続いて過剰のアンモニアを除去するために減圧した。
前処理の詳細は、表４に列挙した。直接蒸気注入による第２段階圧力の上昇は、表４に示したように、対応してより高温およびより低い固形分（％）を生じさせた。
【００７９】
表4 実験1〜5についてのアンモニア装填量、圧力、温度および固形分(%)
2016517271.tif 000007
【００８０】
各実験から生じた前処理バイオマスは、一般方法に記載した手順を使用して、固形分装填量を２５％とし、下記の変更を加えて４８時間にわたり糖化した：各加水分解は、４７ｇの全糖化混合物を含む１２５ｍＬのフラスコ内で２００ｒｐｍで実施した。生じた加水分解物中の糖収率は、糖化の終了時に、ＨＰＬＣによってアラビノース、キシロースおよびグルコースについてアッセイすることによって評価した。
【００８１】
実験から生じた加水分解物は、一般方法に記載したように、１０（ｖ／ｖ）％のＲ７０Ｂ１株接種菌を使用して発酵させた。Ｒ７０Ｂ１種培養は、培地が１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏを含有すること以外は、Ｃ２Ｄ株について一般方法に記載したように調製した。サンプルは、糖化の４８時間後および発酵の４８時間後に、一般方法、ＨＰＬＣ分析−２に記載したようにＨＰＬＣによって評価した。
【００８２】
糖化および発酵の結果は、表５に示されている。糖化からの４８時間後の全糖および発酵からのＥｔＯＨ力価は実験＃１から実験＃５へ単調に増加した。これらの結果は、対応する高い温度および低い固形分（％）を伴うより高い第２段階圧力でのバイオマス処理が、糖化からのより多くの糖および発酵中のより多くのＥｔＯＨを生成したことを証明している。
【００８３】
表5 糖化および発酵の終了時の力価
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【実施例６】
【００８４】
様々な初期固形分（％）での２段階前処理の比較
コーンストーバーをミル粉砕して１／８インチのスクリーンを通過させた。ミル粉砕したストーバー（４８４ｋｇの乾燥質量と等価）ならびにおよび様々な量および強度の水酸化アンモニウム溶液（２３９〜５０８ｋｇおよび１８．２％〜８．６％のＮＨ3）は、９（ｗ／ｗ）％のＮＨ3を目標とするために撹拌式および外部加熱式４，８００Ｌ反応器内に装填した。続いて、全１２（ｗ／ｗ）％のＮＨ3装填量を達成するために、容器内へ無水アンモニアを注入した。蒸気注入前固形分装填量は、４４．３〜５７．３％（目標４５〜６０％）で変動した。反応器は、６ｂａｒｇ（６００ｋＰａ（ゲージ））の圧力までの直接蒸気注入により加熱し、３０分間保持した。次に反応器は、１２ｂａｒｇ（１，２００ｋＰａ（ゲージ））までの直接蒸気注入により加熱し、１０分間保持してその後に大気圧へ排気させ、過剰のアンモニアを除去するために減圧した。
【００８５】
前処理の詳細は、表６に列挙した。蒸気注入前、第１段階および第２段階固形分（％）は、実験＃１〜実験＃４へ単調に減少する。
【００８６】
表6 実験1〜4についてのアンモニア装填量、圧力、温度および固形分(%)
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【００８７】
各実験から生じた前処理バイオマスは、一般方法に記載した手順を使用して、固形分装填量は２５％とし、次の変更を加えて４８時間にわたり糖化した：各加水分解は、４７ｇの全糖化混合物を含む１２５ｍＬのフラスコ内で２００ｒｐｍで実施した。生じた加水分解物中の糖収率は、糖化の終了時に、ＨＰＬＣによってアラビノース、キシロースおよびグルコースについてアッセイすることによって評価した。
【００８８】
実験から生じた加水分解物は、一般方法に記載したように、１０（ｖ／ｖ）％のＲ７０Ｂ１接種菌を使用して発酵させた。Ｒ７０Ｂ１種培養は、培地が１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏを含有すること以外は、Ｃ２Ｄ株について一般方法に記載したように調製した。サンプルは、糖化の４８時間後および発酵の４８時間後に、一般方法、ＨＰＬＣ分析−２に記載したようにＨＰＬＣによって評価した。結果は、表７に表示した。
【００８９】
実験＃１では最高の全糖およびＥｔＯＨ力価が観察され、実験＃４では最低値が観察された。これらの結果は、より高い固形分（％）が同一の公称２段階前処理条件下でのより高い糖およびＥｔＯＨ収率に好都合であることを証明している。
【００９０】
表7 糖化および発酵終了時の力価
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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