(57)【要約】  本発明は、固体発酵（ＳＳＦ）及びハイブリッドＳＳＦによる、植物由来の材料を生物が利用可能なタンパク質と脂質に変化することによって、高品質のタンパク質濃縮物（ＨＱＰＣ）と脂質を生成するバイオベースのプロセスを記述し、このような方法で生成されたＨＱＰＣと脂質を栄養素として用いることを含む。これは、養殖飼料における魚肉の代替としての使用を含む。また、ＳＳＦリアクタと、そのリアクタを用いる方法が開示される。【選択図】図２
2016533743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非動物由来のタンパク質濃縮物を生成する方法であって、
穀物粒、ぬか、おがくず、泥炭、油科種子材料、木材チップ、及び、これらの組み合わせ、からなるグループから選択された実質的に乾燥した基体を接種することと、
オウレオバシディウム・プルラン（Aureobasidium pullulans）、フサリウム・ベネナトゥム（Fusarium venenatum）、スクレロティウム・グルカニクム（Sclerotium glucanicum）、スフィンゴモナス・ポシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、イッサチェンキア種（Issatchenkia spp）、アスペルギルス種（Aspergillus spp）、クリベロマイセス及びピキア種（Kluyveromyces and Pichia spp）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、リゾプス種（Rhizopus spp）、及び、これらの組み合わせからなるグループから選択された微生物による固体発酵（ＳＳＦ）に、前記接種された基体を供することと、
約２から約３より低いｐＨで、あるいは、約８より高いｐＨで、前記接種された基体を培養することと、
前記結果のタンパク質及び微生物を回収することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記微生物と基体を混合し、実質的に安定なペレットあるいはビレットを形成することであって、前記ペレットあるいはビレットは、ペレットあるいはビレット内部及びそれらの間に十分な空洞体積を含み、実質的に攪拌なしで、前記安定した基体−微生物混合物の通気と加湿を可能とすること、を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は、Ａ．プルラン（A. pullulans）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基体は、非押出しＤＤＧＳあるいは、非押出しＤＤＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質含有量は、約４０から約５０％（乾燥材料ベース）の間である、請求項１に記載の方法によって生成されたタンパク質濃縮物。
【請求項６】
混合物は、魚の飼料において、動物由来の魚肉を完全に代替する、請求項５に記載のタンパク質濃縮物を含む混合物。
【請求項７】
非動物由来のタンパク質濃縮物を生成する方法であって、
ａ）供給材料を第１のバイオリアクタに輸送することと、
ｂ）水性媒体内の少なくとも１つの微生物で、前記供給材料を接種することであって、前記微生物は、遊離糖をタンパク質と菌体外多糖に変換し、オプションとして、大量の液体に酵素を放出することと、
ｃ）ステップ（ｂ）の前記液体、及び、オプションとして、１以上の抗菌剤と混合することと、
ｄ）ステップ（ｃ）の前記混合物に追加の固体を混合し、ステップ（ｃ）の前記混合物の水分レベルを約４０から約６０％に減少し、前記水分が減少された混合物を第２のバイオリアクタに輸送することと、
を含み、
ステップ（ｄ）の前記混合物は、十分な時間、前記第２のバイオリアクタにおいて培養され、前記固体をタンパク質濃縮物に変換する、方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）は、約２４時間、約３０から約５０℃で実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）は、約５日間、約２５℃で実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物は、菌類である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記菌類は、Ａ．プルラン（A. pullulans）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記接種菌液に窒素源を追加すること、を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記窒素源は、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウムからなるグループから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のバイオリアクタは、円錐形状あるいは管状である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵は、外因性糖化酵素が存在しない状態で実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質含有量は、約５０から約６０％（乾燥材料ベース）の間である、請求項７に記載の方法によって生成されたタンパク質濃縮物。
【請求項１７】
混合物は、魚の飼料において、動物由来の魚肉を完全に代替する、請求項１６に記載のタンパク質濃縮物を含む混合物。
【請求項１８】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成する方法であって、
設けられるか、追加による、低ＰＵＦＡ脂質を含む基体を接種することであって、前記基体は、穀物粒、ぬか、おがくず、泥炭、油科種子材料、木材チップ、シロップ、及び、これらの組み合わせからなるグループから選択されることと、
フハイカビ（Pythium）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）及び、スキゾキトリウム（Schizochytrium）及び、これらの組み合わせからなるグループから選択された微生物による固体発酵（ＳＳＦ）に、前記接種された基体を供することと、
前記接種された基体を培養することと、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記結果のＰＵＦＡ増強材料を動物の飼料の成分として加える、あるいは、別に、前記結果のＰＵＦＡ増強脂質を回収すること、を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
混合物の前記脂質は、約５０−９０％のトリアシルグリセロール含有量を有している、請求項１８に記載の方法の生成物を含む混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜発明の背景＞
この研究は、部分的に、契約DBI-1005068の下に、米国科学財団（National Science Foundation）からの政府のサポートを受けてなされた。政府は、この発明において、ある権利を有することが出来る。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は、一般に、発酵プロセスに関し、特には、ＳＳＦリアクタを含む、高品質なタンパク質濃縮物及び脂質を生成するための固体発酵（ＳＳＦ）プロセス、それによって生成される生成物、栄養供給の形態のそのような生成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２００８年に、魚類及び甲殻類製品の一人当たりの消費の需要が、人口の増加と共に増加しているのと同時に、世界の野生の、海洋魚類の資源の２８％は、過剰に利用され、５２％が十分に使用された。野生の魚類の資源が徐々に減少するに従い、この増加する需要を満たすための努力において、商業水産養殖生産が、急激に増加した。しかし、水産養殖のための処方食の主要な構成物の一つ、魚肉タンパク質は、また、野生の捕獲漁場から導出される。魚肉の少なくとも６．７ｍｍｔは、２０１２年まで、商業水産養殖生産を支えるために要求され、これは、年を追うごとに増加するのみと予測される。これは、明らかに非持続可能な傾向である。
【０００４】
より少ないコスト、より持続可能な植物由来のタンパク質源が、水産養殖用食料において、魚肉に部分的に代わって用いられてきた。脱脂大豆肉（ＳＢＭ，４２−４８％のタンパク質）は、幾つかの種に対する成長食料において、全タンパク質の２０％まで代替するために、一般的に用いられ、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ，６５％のタンパク質）は、種の栄養状況に大きく支配されるが、より高い全タンパク質代替レベルにおいて、成功裏にテストされた。これらの大豆生成物は、高いタンパク質と相対的に良いアミノ酸プロファイルを提供するが、肉食の海洋魚によって要求される、幾つかの重要な栄養素（例えば、タウリン）において、依然欠点を有している。ＳＰＣは、大豆ミールより高いレベルで用いられることができ、これは、主に、ＳＰＣを生成するために用いられる溶媒抽出プロセスが、反栄養要因（anti-nutritional factors）（例えば、オリゴ糖）を除去し、従って、タンパク質の生物学的利用能（bioavailability ）を増加するからである。更に、熱ステップが、熱不安定抗原性要因を非活性化するために用いられた。現在の溶媒抽出プロセルの主な限界は、そのコスト、プロセスにおいて除去されるオリゴ糖の使用の欠如、及び、食料内の全タンパク質の５０％までの含有をしばしば制限する品質の問題である。更に、大豆材料を大豆肉あるいは大豆タンパク質濃縮物に処理することは、環境的に問題でありえ（例えば、ヘキサン抽出に関連した化学的廃棄物の廃棄についての問題）、最終生成物は、全魚肉代替を考える場合に、非加工あるいは精製脂質を加えることを要求するかもしれない。
【０００５】
可溶性剤を有する乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）を含むとうもろこし副産物は、また、２０％までの魚肉代替レベルにおいて、水産養殖食料において評価されてきた。ＤＤＧＳは、大豆生成物より低いタンパク質（２８−３２％）及び、より多い繊維を有するが、典型的には、脱脂大豆ミールの値の〜５０％の値が付いている。あるエタノール工場は、変換プロセスの前に、繊維と油の一部を除去する乾燥分割プロセス（dry fractionation process ）を組み込み、４２％までのタンパク質の乾燥分割ＤＤＧＳを生じた。この生成物は、水産養殖餌の魚肉の２０−４０％を代替するために用いられたが、より高タンパク質の、より消化のよいＤＤＧＳ水産供給生成物のニーズが残っている。そのような製品は、タンパク質成分が、リジン、メチオニン、及び、システインなどの重要なアミノ酸のより高いレベルを有するならば、特に魅力的であろう。
【０００６】
更に、微生物バイオマス由来の脂質成分は、高タンパク質供給を補うために、及び、溶媒除去の間に失われた植物由来脂質の代替として、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及び、オメガ−３脂肪酸の生成において、魅力的な再生可能な資源と考えられている。残念なことに、ポリエン脂肪酸、特に、C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n3, C22:5n-3, C22:5n-6 及び C22:6n-3などの、高不飽和脂肪酸を含む、微生物脂質を生成するコストは、部分的に、高ポリエン脂肪酸を含む真核微生物（eukaryotic microbe）を培養するときの密度が制限されること、及び、適当な生産性を達成するために必要な高細胞濃度とより高い温度の両方において利用できる酸素が制限されることによって、高いままである。
【０００７】
固体発酵（ＳＳＦ）は、代謝産物のための微生物及び／あるいは微生物改変基体を培養するために用いられることが出来る。ＳＳＦは、通常、規定された気相内であるが、自由水相がない、あるいは、ほぼない固体基体上の、菌類などの微生物の成長として定義される。過去十年の間、危険な化合物のバイオリメディエーション及び生分解、農産物の残留物の生物学的無害化、抗生物質、アルカロイド、植物成長因子、酵素、有機酸、生物系界面活性剤、芳香化合物などを含む、生物学的に活性な二次代謝産物などの付加価値生成物のバイオパルピング及び生成などのバイオプロセスの開発にとって、ＳＳＦに非常な関心が寄せられた。
【０００８】
伝統的な固体発酵プロセス技術は、厳しい無菌状態を要求する現代のバイオテクニカルプロセスに適用するには難しく、面倒なものであることが示されてきた。トレイリアクタにおいては、デッドスペースは、バイオリアクタの体積の約半分である。特定の生成物収穫に必要なバイオリアクタのサイズは、従って、トレイバイオリアクタにおけるよりも充填ベッドにおけるほうがかなり小さく、このためトレイタイプのバイオリアクタの有用性が低くなっている。トレイバイオリアクタの動作は、また、各トレイが、個々に、充填され、空にされ、洗浄されなければならないので、数多くの、手での作業を要求する。
【０００９】
これとは違い、充填ベッドバイオリアクタは、培養液を流し込み、流し出すことによって、容易に充填し、空にすることができ、洗浄も簡単である。充填ベッドバイオリアクタは、従って、トレイバイオリアクタよりも、コスト的、作業量的、及び、スペース的により効率的である。充填ベッドリアクタの欠点は、均一な接種を保証し、最適な培養条件を維持することである。
【００１０】
ミキサを有するリアクタが、現代のＳＳＦ適用のために開発されたが、モータが搭載された無菌混合デバイスは、非常に高いことがある。混合における機械的摩滅は、また、ある敏感な担体が用いられるとき、培養培地の空気のようなゆるい構造を損傷することがある。ドラムリアクタを回転することは、自由にローリングする構造のある種類を有する固体の培養培地についてのみ、十分な混合を提供することが出来る。
【００１１】
新規の固体発酵でも、様々な粉が加えられた穀物粒などの、複雑で、かさばる培地を用いてなされる。培養条件と生産物生成の最適な制御は、混合、あるいは、液体の中へ完全に浸すことに敏感となることの出来る、より規定された培地上において達成されることが出来る。
【００１２】
ＳＳＦにおける大きな関心は、深部発酵（ＳｍＦ）に比べたときのある利点のゆえに存在する。そのような利点は、薬学的に活性な物質と共に、酵素、芳香物質などの二次代謝物の効果的な生成、あるいは、脂質、タンパク質、ビタミン、あるいは、他の栄養生成物の豊富化において有効なことを含む。しかし、上記によると、ＳＳＦによって提供される利点を効率的に利用したプロセスによる高品質のタンパク質濃縮物を生成するニーズが残っている。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、固体発酵リアクタ及び、その使用方法を含む、人間が消費するために用いる動物への供給として用いられるのに適切な、濃縮源単独で、あるいは、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と組み合わせたものを含む、固体発酵（ＳＳＦ）による多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と共に、高度に消化可能で、濃縮されたタンパク質源に植物材料を変換するための、有機的、微生物由来のシステムに関する。更に、ＳＳＦとの深部発酵反応を組み合わせた方法も開示される。
【００１４】
実施形態においては、非動物由来のタンパク質濃縮物を生成する方法が開示され、それは、穀物粒、ぬか、おがくず、泥炭、油科種子材料、木材チップおよび、これらの組み合わせを含む、実質的に乾燥した培地を接種することを含み；接種された培地を微生物で固体発酵（ＳＳＦ）させる。微生物は、オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、フサリウム・ベネナトゥム（Fusarium venenatum）、サクレロティウム・グルカニクム（Sclerotium glucanicum）、スフィンゴモナス・パウシモビリス（ Sphingomonas paucimobilis,）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha,）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum,）、イザチェンキア属菌（ Issatchenkia spp,）、アスペルギルス種（ Aspergillus spp,）、クリベロマイセスおよびピキア種（Kluyveromyces and Pichia spp,）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei,）、ヒラタケ（ Pleurotus ostreatus,）、リゾプス種（ Rhizopus spp,）および、これらの組み合わせ、を含み；接種された培地を、約２から約３より少ないｐＨで、あるいは、約８より大きいｐＨで、培養し；結果のタンパク質と微生物を回収する。
【００１５】
一側面においては、この方法は、また、実質的に安定なペレットあるいはビレットを形成するために、微生物と基体を混合することを含み、このペレットあるいはビレットは、内部およびペレットあるいはビレットの間に、十分な空のボリュームを含み、実質的に攪拌なしで、安定化された基体−微生物混合物の通気と加湿を可能とする。
【００１６】
関連した側面においては、微生物は、Ａプルランス（A. pullulans）である。
【００１７】
他の側面においては、基体は、非押出しＤＤＧＳ（non-extruded DDGS）あるいは、非押出しＤＤＧ（non-extruded DDG）である。
【００１８】
一実施形態においては、上記方法によって生成されるタンパク質濃縮物が開示され、タンパク質含有量は、濃度が約４０から５０％（乾燥材料ベース）である。
【００１９】
他の実施形態においては、タンパク質濃縮物は、混合物に含まれ、この混合物は、魚への供給において、完全に、動物由来の魚肉を置き換えるものである。
【００２０】
一実施形態においては、非動物由来のタンパク質濃縮物を生成する方法は、供給原料を形成し、供給原料を第１のバイオリアクタに移すことと；供給原料を、水性培地内の少なくとも１つの微生物に接種することであって、微生物は、遊離された糖をタンパク質と菌体外多糖に変換し、オプションとして、大量の液体内に酵素を放出することと；液体を酸、および、オプションとして、１以上の抗菌剤と混合することと；追加の固体を混合物に混合し、混合物の水分レベルを、約４０から約６０％に減少し、水分が減少された混合物を第２のバイオリアクタに移すことであって、混合物は、十分な時間、第２のバイオリアクタで培養され、固体をタンパク質濃縮物に変換することと、を含む。
【００２１】
一側面においては、接種ステップは、約２４時間の間、約３０から約５０℃で、実行される。他の側面においては、追加の固体を混合するステップは、５日間、約２５℃で行われる。
【００２２】
関連した側面においては、微生物は、菌である。更に関連した側面においては、菌は、オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）である。
【００２３】
他の側面においては、この方法は、接種菌液に窒素源を加えることを含む。関連した側面においては、窒素源は、硫酸アンモニウム、尿素、及び、塩化アンモニウムを含む。
【００２４】
他の側面においては、第２のバイオリアクタは、円錐状あるいは管状である。
【００２５】
一側面においては、発酵は、外因性糖化酵素なしで行われる。
【００２６】
一実施形態においては、上記方法によって生成されるタンパク質濃縮物が開示され、タンパク質含有量は、約５０から約６０％（乾燥材料ベース）の間である。
【００２７】
他の実施形態においては、上記タンパク質濃縮物を含む混合物が開示され、この混合物は、魚への供給において、動物由来魚肉の完全な代替物である。
【００２８】
一実施形態においては、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成する方法が開示され、これは、提供され、あるいは追加により、低ＰＵＦＡ脂質を含む基体を接種することであって、基体は、穀物粒、ぬか、おがくず、泥炭、油科種子材料、木材チップ、シロップ及びこれらの組み合わせを含むことと；接種された基体を、フカイカビ（Pythium ）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium ）及びスキゾキトリウム（Schizochytrium ）、及び、それらの組み合わせを含む微生物で、固体発酵させることと；接種された基体を培養することと、を含む。
【００２９】
関連した側面においては、この方法は、更に、動物への供給における成分として、結果のＰＵＦＡ増強材料を加える、あるいは、別に、結果のＰＵＦＡ増強脂質を回収する、ことを含む。
【００３０】
更なる関連した側面においては、上記方法の生成物が開示され、混合物の脂質は、約５０から９０％のトリアシルグリセロール（triacylglycerol）含有量を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＳＳＦリアクタの模式図を示す。
【図２】相対成長、供給変換率、フルトンの条件因子（Ｋ）、及び、１１２日目のビセラルソマティックインデックス（ＶＳＩ）平均を示す。文字は、食料処置間でのかなりの差を示し、誤差バーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本混合物、方法、手段を記述する前に、この発明は、混合物、方法及び条件が変化するであろうから、特定の混合物、方法、記述される実験条件には限定されないことを理解されたい。ここに用いられる用語は、特定の実施形態を記述するためのみのものであり、本発明の範囲は、添付の請求項においてのみ限定されるであろうから、限定的であることは意図しないことも理解されたい。
【００３３】
この明細書及び添付の請求項に用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び、「ｔｈｅ」は、文脈が別に明確に示さない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「lipid」への参照は、１以上の脂質、及び／あるいは、当業者が、この開示などを読めば、明確になるであろうように、ここに記述された種類の混合物を含む。
【００３４】
別に規定されない限り、ここに用いられる全ての技術及び科学用語は、この発明が属する当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。改変及び変形は、本開示の精神と範囲内に含まれることが理解されるだろうから、ここに記述されるものと同一あるいは同等な任意の方法及び材料は、本発明の実施あるいはテストに用いられることが出来る。
【００３５】
ここに用いられるように、「about」、「approximately」、「substantially」及び「significantly」は、当業者によれば、理解されるだろうし、これらが用いられる文脈に依存して、ある範囲で変化するだろう。用いられる文脈が与えられても、当業者に明確でない語句の使用がある時、「about」及び「approximately」は、特定の語句のプラスあるいはマイナス≦１０％を意味するだろうし、「substantially」及び「significantly」は、特定の語句のプラスあるいはマイナス＞１０％を意味するだろう。
【００３６】
ここに用いられるように、「consisting essentially of」は、特定のコンポーネントを意味し、他のコンポーネントを含むことができ、この他のコンポーネントは、特定のコンポーネントの新規の特徴あるいは側面を変化させない。
【００３７】
ここに用いられるように、語句「動物」は、動物界に属する任意の有機体を意味し、限定することなく、魚（例えば、マス、鮭、パーチ）、軟体動物（例えば、二枚貝）及び、甲殻類（例えば、ロブスター、小エビ）などの水産養殖生物と共に、人間、鳥（例えば、家禽）、哺乳動物（例えば、牛、豚、ゴール、羊、猫、犬、マウス、及び馬）を含む。
【００３８】
語句「魚」の使用は、すべての脊椎のある魚を含み、これは、骨質の（硬骨魚）あるいは、軟骨性の（軟骨魚）魚類であることが出来る。
【００３９】
ここに用いられるように、「非動物由来のタンパク質」は、タンパク質濃縮物が、（乾燥材料ベースで）混合物の粗繊維／１００ｇの少なくとも０．８１ｇを含む、ことを意味し、この粗繊維は、主に、セルロース、ヘミセルロース及び、植物物質の化学的解析において残留物として得られるリグニン材料である。
【００４０】
ここに用いられるように、「培養プロセス」は、バクテリアあるいは細胞の培養と成長のための適切な条件を提供することを意味し、そのようなバクテリアあるいは細胞は、様々な供給原料を代謝するために、生合成経路を用いる。実施形態においては、培養プロセスは、例えば、好気性条件の下で実行されることが出来る。他の実施形態においては、培養プロセスは、嫌気発酵を含むことが出来る。
【００４１】
ここに用いられるように、語句「培養生成物」は、培養プロセス／反応から直接得られる任意の残留物質を意味する。ある例においては、培養生成物は、微生物を含み、それが、そのような微生物がいない場合の培養生成物に比べ、増強された栄養含有量を有するようにする。培養生成物は、培養液（incubation broth ）からの適切な成分を含むことが出来る。例えば、培養生成物は、培養液からの溶解された、及び／あるいは懸濁された成分を含むことが出来る。懸濁された成分は、培養液内にある、溶解されていない可溶性成分（例えば、溶液が１以上の成分で過飽和となっている）及び／あるいは、不溶性物質を含むことが出来る。培養生成物は、培養の終わりに存在する乾燥固体の実質的にすべて（例えば、培養液と、培養によって生成されたバイオマスをスプレードライすることにより）を含むことができ、あるいは、その一部を含むことが出来る。培養生成物は、微生物が、物質の栄養含有量を増加するために、分画され、及び／あるいは、部分的に純化されることができる、培養からの原材料を含むことが出来る。
【００４２】
ここに用いられるように、「変換培養株」は、例えば、水と栄養などの、微生物の培養に十分な物質を含む培地内に含まれる微生物の培養株を意味する。語句「栄養」は、栄養価のある任意の物質を意味する。これは、動物への供給あるいは、動物のための餌のサプリメントの一部であることが出来る。例示的な栄養は、これらには限定されないが、タンパク質、ペプチド、脂肪、脂肪酸、脂質、水及び脂肪可溶ビタミン、必須アミノ酸、炭水化物、ステロール、酵素、機能性有機酸、及び、リン、鉄、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、すず、及び、シリコンなどの微量ミネラルを含む。
【００４３】
変換は、タンパク質／炭水化物／多糖物質、例えば、大豆材料を高品質タンパク質濃縮物に変換するのに適した条件の下で、変換培養株において、微生物を培養するプロセスである。十分な変換は、微生物細胞塊及び／あるいは、タンパク質あるいは脂質を生成するために、特定の炭水化物の９０％以上を利用することを意味する。実施形態においては、変換は、好気性あるいは嫌気性であることが出来る。
【００４４】
ここに用いられるように、「凝集剤」あるいは、「清澄剤」は、凝集により、コロイドが懸濁液から析出することを促進する化学物質であり、多価イオンやポリマーを含むが、これらに限定されない。実施形態においては、そのような、凝集剤／清澄剤は、菌体外多糖などのバイオ凝集剤を含むことが出来る。
【００４５】
ここに用いられるように、「ハイブリッド固体発酵」は、（水性培地内での）ＳＭＦあるいは深部発酵が、約２４時間、微生物の存在下で実行され、接種の源としての細胞数を増加し、接種された微生物が、菌体外酵素を生成し、その酵素を大量の液体内に放出し、細胞と酵素の両方が、次のステップの固体と反応するために利用でき、このステップは、上記液体を追加の酸と抗菌剤（任意）と、十分な固体と共にブレンドし、混合物の湿気レベルを約４０から約６０％に減少し、後者が、ＳＳＦリアクタ内で、培養のために用いられる固体状態となることを含む、第１のステップを含む、２ステッププロセスを示す。実施形態においては、１５％の固相は、２４時間、水に浸されて放置され、次に、固体を追加し、固体基体を５０％固体に作り、後者は、５日間その状態で放置される。
【００４６】
植物性タンパク質源の多くは、変換のための供給原料として、本開示に関して用いられることが出来る。供給産業において、植物性タンパク質を用いる主な理由は、動物性タンパク質源のようなより高価なタンパク質源を代替することである。他の重要な要因は、同種の動物の動物性タンパク質を供給することによる、病気の伝搬の危険性である。植物性タンパク質源の例は、これらには限定されないが、大豆及びピーナッツによって例示される植物属豆類からの、キャノーラ、綿の実によって例示される植物属アブラナ科からの、ひまわりを含むがこれには限定されない、植物属キク科、及び、コプラを含む植物属ヤシ科からのタンパク質を含む。これらのタンパク質源は、また、通常、油科種子として規定され、タンパク質は、全体として供給されることが出来るが、油分が除去された後の副産物として供給されるほうがより一般的である。他の植物性タンパク質源は、シリアル、及び、穀類、特に、とうもろこし、小麦、及び、米、あるいは、ジャガイモ、キャッサバ、豆科植物（えんどう豆、及び、その他の豆）、ジャームミール（germ meal ）あるいは、とうもろこしグルテンミール（corn gluten meal ）を含む、ある製粉副産物、あるいは、蒸留酒製造／醸造副産物などの、イネ科としても知られる、禾本科からの植物性タンパク質源を含む。実施形態においては、タンパク質の供給原料は、これらには限定されないが、大豆、ピーナッツ、ナタネ、大麦、キャノーラ、ゴマ、綿の実、オイルやしの種、ブドウ種子、オリーブ、ベニバナ、ひまわり、コプラ、とうもろこし、ココナッツ、アマの種、ハシバミの実、小麦、米、じゃがいも、キャッサバ、豆科植物、アマナズナの種、からし種、ジャームミール、とうもろこしグルテンミール、蒸留酒製造／醸造副産物及び、これらの組み合わせ、からの植物性材料を含む。
【００４７】
魚養殖産業においては、使用が報告されている植物由来の、主な魚肉代替物は、これらに限定はされないが、大豆ミール（ＳＢＭ）、とうもろこしグルテンミール、ナタネ／キャノーラ（アブラナ属(Brassica sp.)）ミール、ハウチワマメ（外皮をとられた白の核ミールにおけるタンパク質のような、ハウチワマメ属（Lupinus sp））（シロバナハウチワマメ(Lupinus albus)）、甘味な（Ｌ．アングスチホリン(L. angustifolius)）及び黄色の（Ｌ．単球菌(L. luteus)）ハウチワマメ、ひまわり（ひまわり属(Helianthus annuus)）種子ミール、結晶アミノ酸；共に、ピーミール（えんどう豆(Pisum sativum)）、綿の実（綿(Gossypium sp.)）ミール、ピーナッツ（ピーナッツ（groundnut）；落花生（Arachis hypogaea））ミール及び油かす、大豆タンパク質濃縮物、とうもろこし（とうもろこし（Zea mays））グルテンミール及び小麦（コムギ（Triticum aestivum））グルテン、じゃがいも（バレイショ（Solanum tuberosum L.））タンパク質濃縮物、更に、ワサビノキ（ワサビノキ（Moringa oleifera Lam.））の葉などの他の植物供給飼料、これらすべての様々な濃縮度及び組み合わせ、を含む。
【００４８】
タンパク質源は、非加工植物材料及び、加工及び／あるいは、抽出植物タンパク質の形態とすることが出来る。例として、熱加工された大豆生成物は、高いタンパク質消化性を有する。
【００４９】
タンパク質材料は、任意の種類のタンパク質あるいはペプチドを含む。実施形態においては、大豆材料などが、丸大豆として使用することが出来る。丸大豆は、標準的な、商品化された大豆とすることが出来；ある方法で、遺伝子改変（ＧＭ）された大豆とすることができ；あるいは、非ＧＭ同一性保持大豆とすることが出来る。例示的ＧＭ大豆は、例えば、スタキオース及びラフィノースの他に、炭水化物を生成するように操作された大豆を含む。例示的非ＧＭ大豆は、例えば、低炭水化物、低脂肪、及び、低トリプシン阻害のために、系統育成されたシリンガー（現出）バラエティー（Schillinger (Emerge) varieties）を含む。
【００５０】
他の種類の大豆材料は、大豆タンパク質粉、大豆タンパク質濃縮物、大豆ミール、及び、大豆タンパク質単離物、あるいは、それらの混合物を含む。丸大豆を、大豆タンパク質粉、大豆タンパク質濃縮物、大豆ミール、及び、大豆タンパク質単離物などの大豆タンパク質の他の形態にする伝統的な処理は、精製された、生の丸大豆を数個の破片、典型的には６個から８個に割り、大豆チップと、後に除去される外皮、を生成することを含む。大豆チップは、それから、約６０℃の状態に置かれ、約０．２５ミリメータ厚のフレークにされる。結果のフレークは、それから、典型的にはヘキサンである、炭化水素溶媒などの不活性溶媒により、対向流抽出システムのいくつかの種類の一つにおいて、抽出され、大豆油が除去される。大豆タンパク質粉、大豆タンパク質濃縮物、及び、大豆タンパク質単離物に対し、フレークが、水溶性大豆タンパク質の高含有量を保持するために、大豆タンパク質の調理あるいは焼き上げの量が最小化されるように、脱溶媒化されることが重要である。これは、蒸気脱溶媒化器あるいはフラッシュ脱溶媒化器を用いることによって典型的には達成される。このプロセスの結果のフレークは、一般に、「食用脱脂肪フレーク」あるいは「白大豆（豆）フレーク」と呼ばれる。
【００５１】
白大豆フレーク、これは、大豆タンパク質粉の開始材料であるが、大豆タンパク質濃縮物、及び、大豆タンパク質単離物は、約５０％のタンパク質含有量を有している。白大豆フレークは、それから、ハンマーミル、クラシファイヤーミル、ローラミル、あるいは、インパクトピンミルによって、通常、オープンループグラインディングシステムにおいて、最初に、ひき割りに、更なる粉砕で、所望の粒子サイズの大豆粉に挽かれる。スクリーニングは、典型的に、均一な粒子サイズ範囲に生成物のサイズをするために用いられ、シェイカースクリーンあるいは、円筒遠心スクリーナーによって達成することが出来る。他の油科種子は、同様に、処理されることが出来る。
【００５２】
実施形態においては、蒸留乾燥穀物可溶性剤（ＤＤＧＳ）を用いることが出来る。ＤＤＧＳは、とうもろこしエタノール産業によって現在製造される。伝統的なＤＤＧＳは、乾燥穀物工場に由来し、これは、全とうもろこし核が、粉砕され、処理される。これらの工場におけるＤＤＧＳ（例えば、「フロントエンド」発酵）は、典型的には、２８−３２％のタンパク質と、約９から約１３％の間の粗脂肪を含む。しかし、「バックエンド」油分抽出においては、とうもろこし油の約１／３は、油分抽出なしで生成されるＤＤＧＳに対して、わずかにより多いタンパク質と繊維を有する「油分減少」ＤＤＧＳ（約５から約９％の粗脂肪を含む）を生成する前に、例えば、薄い蒸留廃液から、抽出される。関連する側面においては、減少分の油あるいは伝統的なＤＤＧＳが用いられることが出来る。
【００５３】
タンパク質源は、非加工植物材料及び、加工及び／あるいは、抽出植物タンパク質の形態とすることが出来る。例として、加熱大豆生成物は、高タンパク質消化性を有する。依然、肉食性魚の代謝における含全脂肪あるいは脱脂肪大豆ミール含有の上限含有レベルは、熱不安定性栄養阻害を除去したとしても、２０から３０％の含有レベルの間である。魚においては、大豆タンパク質は、３０％より多いタンパク質濃度含有レベルで魚に飼料を与えることは、腸の損傷を引き起こし、一般に、異なる魚の種における成長度合いを減少することを示す。事実、多くの農家は、これらの効果のために、全代謝において、１０％より多い植物タンパク質を用いることに消極的である。
【００５４】
本発明は、この問題を解決し、他の要因の中でも、供給される動物の種、植物性タンパク質源の起源、異なる植物性タンパク質源の比、タンパク質濃度、及び、グルカン及び／あるいはマンナンの量、起源、分子構造及び濃度に依存して、４０まで、あるいは、５０％もの植物性タンパク質含有レベルを可能にする。実施形態においては、植物性タンパク質含有レベルは、４０％までであり、好ましくは、２０あるいは３０％までである。典型的には、食料内にある植物性タンパク質は、５と４０％の間であるが、好ましくは、１０あるいは１５と３０％との間である。これらのパーセンテージは、動物の飼料あるいは代謝物内の全植物性タンパク質源のパーセンテージ量を規定し、これは、脂肪、灰などを含む。実施形態においては、純タンパク質レベルは、５０％までで、典型的には、４５％までで、実施形態においては、５−９５％である。
【００５５】
全供給あるいは食料内における植物性タンパク質の他のタンパク質に対する割合は、５：９５から９５：５、１５：８５から５０：５０、あるいは、２５：７５から４５：５５とすることが出来る。
【００５６】
微生物
開示の微生物は、炭水化物及び他の栄養を、変換培養株において、高品質タンパク質濃縮物に、変換できなくてはならない。実施形態においては、微生物は、イースト様の菌類である。イースト様菌類の例は、オウロバシディウム・プルラン（Aurobasidium pullulans ）である。他の例示的微生物は、クリベロマイセス（Kluyveromyces ）及びピキア種（Pichia spp ）、乳酸菌、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ヒラタケ（ Pleurotus ostreatus）、リゾプス種（ Rhizopus spp）及びリグノセルロース劣化微生物の多くの種類などのイーストを含む。一般に、例示的微生物は、スタキオース、ラフィノース、キシロース、及び、他の糖類を代謝することの出来る、そのような微生物を含む。しかし、余計な実験なしに、開示された方法に基づいて、他の適切な微生物を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００５７】
実施形態において、本プロセスに用いることが出来る微生物は、これらには限定されないが、オウロバシディウム・プルラン（Aureobasidium pullulans）、フサリウム・ベネナトゥム（ Fusarium venenatum）、サクレロティウム・グルカニクム（ Sclerotium glucanicum）、スフィンゴモナス・パウシモビリス（ Sphingomonas paucimobilis）、ラルストニア・ユートロファ（ Ralstonia eutropha）、ロドスピリラム・ラブラム（ Rhodospirillum rubrum）、イッサチェンキア種（ Issatchenkia spp）、ペニシリウム種（ Penicillium spp）、クリベロマイセス及びピキア種（ Kluyveromyces and Pichia spp）、トリコデルマ・リーゼイ（ Trichoderma reesei）、ヒラタケ（ Pleurotus ostreatus）、リゾプス種（ Rhizopus spp） 及び、これらの組み合わせを含む。実施形態においては、微生物は、Aureobasidium pullulansである。
【００５８】
実施形態においては、A. pullulans は、変換中に出会う様々な環境／ストレスに適応される。実施形態においては、２０１２年１１月３０日のブダペスト条約の条件の下に、イリノイ州、ペオリアのAgricultural Research Culture Collection （ＮＲＲＬ）に寄託されたＮＲＲＬ寄託番号５０７９３によって示されるA. pullulans系統は、低いガム生成を示し、ＤＤＧＳ及びＳＢＭ由来の培地に適用される。実施形態においては、２０１２年１１月３０日のブダペスト条約の条件の下に、イリノイ州、ペオリアのAgricultural Research Culture Collection （ＮＲＲＬ）に寄託されたＮＲＲＬ寄託番号５０７９２によって示されるA. pullulans系統は、抗生物質テトラサイクリンの高レベル（例えば、約７５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンから約２００μｇ／ｍｌテトラサイクリン）に適応される。実施形態においては、２０１２年１１月３０日のブダペスト条約の条件の下に、イリノイ州、ペオリアのAgricultural Research Culture Collection （ＮＲＲＬ）に寄託されたＮＲＲＬ寄託番号５０７９４によって示されるA. pullulans系統は、抗生物質lactrol （登録商標）の高レベル（例えば、約２μｇ／ｍｌのヴァージニアマイシンから約６μｇ／ｍｌのヴァージニアマイシン）に適応される。実施形態においては、２０１２年１１月３０日のブダペスト条約の条件の下に、イリノイ州、ペオリアのAgricultural Research Culture Collection （ＮＲＲＬ）に寄託されたＮＲＲＬ寄託番号５０７９５によって示されるA. pullulans系統は、濃縮とうもろこし可溶性剤に順応される。
【００５９】
他の実施形態においては、A. pullulans系統は、４５０−５５０ｐｐｍのlactrol （登録商標）（例えば、ヴァージニアマイシン）に順応されることが出来る。実施形態においては、A. pullulans系統は、ｐＨ１．５−１．７５に順応されることが出来る。実施形態においては、A. pullulans系統は、９０−１１０ｐｐｍのIsostab に順応されることが出来る。実施形態においては、A. pullulans系統は、８０−１００ｐｐｍのBetastab に順応されることが出来る。実施形態においては、A. pullulans系統は、セルラーゼ酵素を生成することができ、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。実施形態においては、A. pullulans系統は、ＮＲＲＬ４２０２３、ＮＲＲＬ５８５２２あるいはＹ−２３１１−１から選択される。
【００６０】
他の実施形態においては、Thermotolerant Pichia 系統は、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。
【００６１】
実施形態においては、Issatchenkia spp 系統は、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。
【００６２】
実施形態においては、Fusarium venenatum 系統は、セルラーゼ酵素を生成することができ、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。
【００６３】
他の実施形態においては、Penicillium spp 系統は、セルラーゼ酵素を生成することができ、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。
【００６４】
実施形態においては、Aspergillus orzyae 系統は、大豆ミールとＤＤＧＳに順応されることが出来る。
【００６５】
実施形態においては、オメガ−３及び／あるいは、オメガ−６多価不飽和脂肪酸を含む、脂質を生成することが出来る微生物は、ＤＨＡを生成することができる微生物を含む。関連した側面においては、そのような生物は、例えば、Thraustochytriales目のThraustochytrids、より詳しくは、その全体がここに参照によって組み込まれる米国特許第５，３４０，５９４号及び第５，３４０，７４２号に開示されるThraustochytriales を含む、Thraustochytrium 属及びSchizochytrium 属のThraustochytriales などの、藻類などの海洋微生物を含む。しかし、本発明は全体として、そのように限定されることを意図しておらず、当業者は、本発明のコンセプトが、ここに開示された技術に従って、他の脂質混合物を含む、様々な他の化合物を生成する他の微生物に適用可能であろうことを認識するだろう。
【００６６】
ここに用いられるように、「脂肪酸」は、脂肪族モノカルボン酸を意味する。脂質は、関連する、ホスファチド、ステロール、アルコール、炭化水素、ケトン、及び、関連する化合物と共に、脂肪酸のグリセリドエステルを含む、脂肪あるいは油であると認識される。
【００６７】
通常用いられる省略方式が、脂肪酸の構造を示すために、この開示で用いられる（例えば、Weete, "Lipid Biochemistry of Fungi and Other Organisms". Plenum Press, New York (1980)）。この方式は、炭化水素鎖における炭素の数を示すための番号を伴い、その後に、コロンと、二重結合の数を示す番号が続く文字「Ｃ」を用いる。例えば、Ｃ２０：５、エイコサペンタエン酸。脂肪酸は、カルボキシ炭素から始まって、番号付けられる。二重結合の位置は、ギリシャ文字デルタ（Δ）、その後に二重結合の炭素数を追加することによって示される。つまり、Ｃ２０：５  オメガ−３Δ５，８，１１，１４，１７。「オメガ」の表示は、カルボキシ末端炭素からの番号付けを用いる、不飽和脂肪酸用の省略方式である。便利のため、特に、ここで用いられる数字的省略学名命名法を用いる場合、「オメガ−３」のシンボルとして、ω３が用いられるだろう。オメガ−３高不飽和脂肪酸は、最終のエチレン結合が、脂肪酸の末端エチル群からの３つの炭素と、これらを含む、多価エチレン脂肪酸であると理解される。従って、エイコサペンタエン酸、オメガ−３高不飽和脂肪酸、の完全な学名は、C20:5ω3Δ5,8,11,14,17であろう。簡単のため、二重結合位置(Δ5,8,11,14,17)は、省略されるだろう。エイコサペンタエン酸は、従って、C20:5ω3と表され、ドコサペンタエン酸(C22:5ω3Δ7,10,13,16,19)は、C22:5ω3であり、ドコサヘキサエン酸(C22:6ω3Δ4,7,10,13,16,19)は、C22:6ω3である。学名「高不飽和脂肪酸」は、４以上の二重結合を有する脂肪酸を意味する。「飽和脂肪酸」は、１から３個の二重結合を有する脂肪酸を意味する。
【００６８】
オメガ−３高不飽和脂肪酸の生成のための有機体の望ましい特性は、これらに限られないが：１）従属栄養成長が可能であり；２）オメガ−３高不飽和脂肪酸を多く含み；３）単細胞で；４）飽和及びオメガ−６高不飽和脂肪酸が少なく；５）熱耐性であり（３０℃より上の温度で成長可能）；及び、６）広塩性である（低塩分を含む、広い塩分の範囲にわたって成長することが出来る）、物を含む。
【００６９】
脂質は、１以上の以下の化合物を含む：リプスタチン（lipstatin ）、スタチン（statin ）、ＴＡＰＳ、ピマリシン（pimaricine ）、ニスタチン（nystatine ）、脂肪可溶抗生物質（例えば、ライドロマイシン（laidlomycin ））、脂肪可溶抗酸化剤（例えば、コエンザイムＱ１０）、コレステロール、植物ステロール、デスモステロール（desmosterol ）、トコトリエノール（tocotrienol ）、トコフェロール（tocopherol ）、カロテノイド（carotenoid ）、あるいは、キサントフィル（xanthophylls ）、例えば、βカロチン、ルテイン（lutein ）、リコペン（lycopene ）、アスタキサンチン（astaxanthin ）、ゼアキサンチン（zeaxanthin ）、あるいは、カンタキサンチン（canthaxanthin ）、共役リノール酸（conjungated linoleic acids ）あるいは、多価不飽和脂肪酸（PUFA）などの脂肪酸。実施形態においては、脂質は、約５ｗｔ．％あるいは、少なくとも約１０ｗｔ．％の濃度の上記化合物の少なくとも１つを含む（脂質の重量に対し）。
【００７０】
脂質は、例えば、トリグリセリド（triglyceride ）、リン脂質（phospholipid ）、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル（例えば、メチルあるいはエチルエステル）及び／あるいは、これらの組み合わせを含んで、得られる。実施形態においては、脂質は、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、あるいは、少なくとも約９０％のトリアシルグリセロール含有量を有する。
【００７１】
実施形態においては、脂質は、例えば、C18 PUFA, C20 PUFA またはC22PUFA などの、少なくとも１８個の炭素原子を有する、例えば、ＰＵＦＡなどの、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む。実施形態においては、ＰＵＦＡは、オメガ−３ＰＵＦＡ（ω３）あるいはオメガ−６ＰＵＦＡ（ω６）である。関連する側面においては、ＰＵＦＡは、少なくとも３つの二重結合を有する。実施形態においては、ＰＵＦＡは：ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid）(DHA, 22:6 ω3)；γ―リノレン酸（γ-linolenic acid）(GLA, 18:3 ω6)；α−リノレン酸（α-linolenic acid ）(ALA, 18:3 ω3)；ジホモ−γ−リノレン酸（dihomo-γ-linolenic acid）(DGLA, 20:3 ω6)；アラキドン酸（arachidonic acid）(ARA, 20:4 ω6)；及び、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid）(EPA, 20:5 ω3)である。
【００７２】
実施形態においては、脂質は、少なくとも約５ｗｔ．％、例えば、少なくとも約１０ｗｔ．％、例えば、少なくとも約２０ｗｔ．％（脂質の重量に対し）、の濃度で、少なくとも１つのＰＵＦＡ（例えば、ＡＲＡあるいはＤＨＡ）を含む。
【００７３】
ＰＵＦＡは、（モノ、ジ、あるいは、トリ）グリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル（例えば、メチル、あるいは、エチルエステル）及び／あるいは、これらの組み合わせの形態とすることが出来る。関連する側面においては、脂質は、全ＰＵＦＡの少なくとも約５０％がトリグリセリドの形態で、得ることが出来る。
【００７４】
脂質は、例えば、ＰＵＦＡを含む油など、油あるいは脂肪であることが出来る。
【００７５】
細胞は、脂質を含む任意の細胞とすることが出来る。典型的には、細胞は脂質を生成する。細胞は、細胞全体、あるいは、破裂細胞（ruptured cell）とすることが出来る。細胞は、任意の適した起源のものとすることが出来る。細胞は、例えば、植物細胞とすることができ、例えば、種子からの細胞あるいは、微生物からの細胞（微生物細胞あるいは微生物）とすることが出来る。微生物細胞あるいは微生物の例は、イースト細胞、バクテリア細胞、真菌細胞、及び、藻類細胞である。実施形態においては、菌類が、用いられることができ、例えば、それらは、例えば、モルチエレラ（Mortierella）、 ヒゲカビ（Phycomyces）、ブラケスレア（ Blakeslea）、 アスペルギルス（Aspergillus）、スラウストキトリウム（ Thraustochytrium）、フハイカビ（ Pythium ）あるいは、ハエカビ（ Entomophthora ）などの、ケカビ（Mucorales ）目などである。実施形態においては、アラキドン酸（ＡＲＡ）源は、モルティエラ・アルピナ（Mortierella alpina）、 ブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、アスペルギルス・テレウス（ Aspergillus terreus ）あるいは、ピシウム・インシジオスム（ Pythium insidiosum ）からとすることが出来る。藻類は、渦鞭毛藻類とすることが出来、及び／あるいは、ポルフィリディウム（Porphyridium）、ニツチア（ Nitszchia） あるいは、 クリプテコジニウム（Crypthecodinium ）（例えば、クリプテコジニウム・コニー(Crypthecodinium cohnii)）を含むことが出来る。イーストは、 ピキア・シフェリ（Pichia ciferii ）などの、ピキア（Pichia ）属あるいは、酵母菌 （Saccharomyces）属のものを含むことが出来る。バクテリアは、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium ）属のものとすることが出来る。脂質を含む植物細胞の例は、大豆、ナタネ、キャノーラ、ひまわり、ココナッツ、亜麻及びヤシの種からの細胞である。実施形態においては、細胞は、ＡＲＡを含む、脂質を含む植物細胞である。実施形態においては、開示される細胞は、単独で、あるいは、組み合わせて使用することが出来る。
【００７６】
実施形態においては、細胞は、発酵に用いられる。
【００７７】
実施形態においては、本開示に従ったプロセスは、１以上の以下のステップを含む：（ｉ）細胞を加熱、あるいは、殺菌する；（ｉｉ）機械的分離によって細胞から水分を分離する；（ｉｉｉ）細胞を洗浄する；及び、（ｉｖ）細胞を圧搾する。
【００７８】
加熱あるいは滅菌は、約６５℃から約１２０℃の温度で行われることが出来る。リパーゼ及び／あるいは、リボキシゲナーゼなどの酵素を非活性化あるいは変性することが出来る。
【００７９】
機械的分離によって細胞から水分を分離することは、ここに開示するように、水分含有量及び／あるいは、乾燥材料含有量の値を得るために用いられることが出来る。機械的分離は、例えば、フィルタリング、遠心分離、圧搾、沈殿、あるいは、液体サイクロンの使用を含むことが出来る。
【００８０】
脂質は更に、任意の適切な方法で、処理されることが出来る。脂質が、溶媒を使った抽出で回収されるならば、脂質は、溶媒の蒸発によって、溶媒から得ることが出来る。
【００８１】
本開示に従ったプロセスによって得る、あるいは、得られる脂質は、更なる処理に曝されることが出来る。例えば、酸処理（また、精錬とも呼ばれる）、アルカリ処理（また、中和化とも呼ばれる）、漂白、脱臭気、冷却（また、脱ろうとも呼ばれる）である。
【００８２】
本開示に従ったプロセスによって得る、あるいは、得られる脂質は、多くの用途がある。例えば、それは、例えば、人間の食料品（例えば、幼児製品）あるいは、動物飼料製品などの食品の調製に用いられることが出来る。それは、また、薬品、あるいは、化粧品の調製に用いられることも出来る。従って、本開示は、また、本開示に従ったプロセスによって得る、あるいは、得られる脂質を含む、食品（例えば、栄養強化食品あるいは、栄養サプリメント）、例えば、人間の食品（例えば、幼児製品）、あるいは、動物飼料製品、薬品、化粧品を提供する。
【００８３】
変換培養株
例示的実施形態においては、前処理の後、タンパク質材料（押し出された大豆白フレーク）は、約４．５−５．５にｐＨが調整されて、少なくとも約５％の固体搭載速度（solid loading rate ）で、水とブレンドされることが出来る。そして、加水分解酵素の適切な投与量が加えられ、懸濁液が、約３−２４時間の間、約５０℃で、約５０−２５０ｒｐｍで、攪拌されながら、培養された。約３５℃に冷却した後、A. pullulans の接種菌液が加えられ、溶媒株は、更に７２−１２０時間あるいは、炭水化物が消費されるまで、培養されることが出来る。培養の間、無菌空気が、約０．５−１Ｌ／Ｌ／ｈの速度で、リアクタ内に散布されることが出来る。実施形態においては、変換培養株は、約９６時間未満の間、大豆材料による培養によって変換をこうむる。実施形態においては、変換培養株は、約９６時間と約１２０時間の間の時間、培養されるだろう。実施形態においては、変換培養株は、約１２０時間より多くの時間培養されるだろう。変換培養株は、約３５℃で培養されることが出来る。
【００８４】
実施形態においては、変換をこうむる間、変換培養株のｐＨは、約４．５から約５．５とすることが出来る。実施形態においては、変換培養株のｐＨは、４．５未満（例えば、ｐＨ３）とすることが出来る。実施形態においては、変換培養株は、Deshpande et al., Aureobasidiumpullulans in applied microbiology: A status report, Enzyme and Microbial Technology (1992), 14(7):514に開示されているように、能動的に、通気されることが出来る。
【００８５】
高品質タンパク質濃縮物（ＨＱＰＣ）は、プルラン及びシデロホアと共に、オプションとしての、アルコール沈殿及び、遠心分離によって変換プロセスに続いて、変換培養株から回収されることが出来る。例示的アルコールはエタノールである。もっとも、当業者は、他のアルコールでの良いことを理解するだろう。実施形態においては、塩も沈殿に用いられることが出来る。例示的塩は、カリウム、ナトリウム、及び、塩化マグネシウムの塩とすることが出来る。実施形態においては、ポリマーあるいは多価イオンは、単独で、あるいは、アルコールと組み合わせて、用いられることが出来る。
【００８６】
実施形態においては、最終タンパク質濃縮物固体回収は、様々な培養時間によって変わるだろう。例えば、約７５％のタンパク質は、１４日の培養で達成することができ、固体回収は、約１６−２０％である。実施形態においては、２−２．５日は、約６０−６４％に固体回収を増加し、ＨＱＰＣにおいて、５８−６０％のタンパク質レベルとなる。実施形態においては、４−５日の培養は、タンパク質含有量（例えば、約７０％より大きいが、これには限定されない）と固体回収（例えば、約６０％より大きいが、これには限定されない）の両方を最大化することが出来る。これらの数字は、供給材料に依存して、高くも低くもなり得る。実施形態においては、タンパク質濃縮物（つまり、ＨＱＳＰＣあるいは、ＨＰ−ＤＤＧＳ）は、特定の脂質：タンパク質比、例えば、約０．０１０：１から約０．０３：１、約０．０２０：１から約０．０２５：１あるいは、約０．０２１：１から約０．０２３：１、を有することが出来る。
【００８７】
実施形態においては、供給材料は、他の形状及び比を用いることが出来るが、１：２０のバレル長対スクリュー直径及び、３：１の圧縮比を有する単一のスクリュー押出し機(例えば、 Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000, Hackensack, NJ)において、押し出されることが出来る。供給材料は、約１０％から約１５％の水分、約１５％までの、あるいは、約２５％までの水分に調整されることが出来る。押出し機の供給、バレル、及び、出口セクションの温度は、約４０℃から約５０℃の間、あるいは、約５０℃から約１００℃の間、約１００℃から約１５０℃の間、約１５０℃から約１７０℃の間、に保持されることが出来、スクリュー速度は、約５０ｒｐｍから約７５ｒｐｍ、あるいは、約７５ｒｐｍから約１００ｒｐｍ、あるいは、約１００ｒｐｍから約２００ｒｐｍから約２５０ｒｐｍに設定されることが出来る。実施形態においては、スクリュー速度は、バレルの両側の隆起チャネルに対し、せん断効果を提供するのに十分である。実施形態においては、スクリュー速度は、糖放出を最大化するように選択される。
【００８８】
実施形態においては、押し出された供給材料物質（例えば、植物性タンパク質あるいはＤＤＧＳ）は、リアクタ(例えば、 a 5 L New Brunswick Bioflo 3 bioreactor; 3-4 L 作業体積)において、少なくとも５％の固体搭載速度を達成するために、水と混合されることが出来る。懸濁液は、オートクレーブされ、冷却され、そして、これらには限定されないが、エンドキシナラーゼ（endo-xylanase ）及び、ベータキシロシダーゼ（beta-xylosidase ）、糖質加水分解酵素（Glycoside Hydrolase ）、β―グルコシダーゼ（s-glucosidases ）、ヘミセルラーゼ（hemicellulase ）の活動を含む酵素のカクテルを用いて、酵素加水分解することによって、糖化されることが出来る。一側面においては、酵素のカクテルは、Novozyme （登録商標）酵素を含む。投薬量は、６％のCellicCtek （登録商標）（グルカンｇｍ当たり）、０．３％のCellicHtek （登録商標）（全固体ｇｍ当たり）、及び、０．１５％のNovozyme960（登録商標）（全固体ｇｍ当たり）を含むことが出来る。糖化は、繊維とオリゴ糖を単糖に可溶化するために、４０℃から約５０℃で、約１５０ｒｐｍから約２００ｒｐｍで、約１２時間から約２４時間の間、実施することが出来る。温度は、そして、約３０℃から約３７℃の間、実施形態では、約３５℃、に減少され、懸濁液は、２４時間の２％（ｖ／ｖ）の微生物の培養株で、培養されることが出来る。懸濁液は、０．５Ｌ／Ｌ／分で通気され、培養は、糖分の消費が収まるまで、あるいは、約９６時間から約１２０時間の間、継続されることが出来る。流加変換（fed-batch conversions）においては、より多くの押し出された供給材料は、糖化及び／あるいは、微生物変換相の何れかの間に、追加されることが出来る。
【００８９】
実施形態においては、供給材料及び／あるいは、押出し物は、例えば、望ましくないバクテリア系統によって汚染されるのを防ぐために、変換微生物で培養する前に、１以上の抗生物質（例えば、これらには限定されないが、テトラサイクリン、ペニシリン、エリスロマイシン、タイロシン、ヴァージニアマイシン、及び、これらの組み合わせ）によって処理されることが出来る。
【００９０】
培養の間、サンプルは、６−１２時間間隔で除去されることが出来る。ＨＰＬＣ解析のためのサンプルは、煮沸され、遠心分離され、フィルタリングされ（例えば、０．２２−μｍフィルタで）、オートサンプラーのバイアルに入れられ、解析まで凍結される。実施形態においては、サンプルは、他のＨＰＬＣシステムを用いることが出来るが、Waters HPLC システムを用いて、炭水化物と有機溶媒に対し、アッセイされることが出来る。サンプルは、微生物の個体群を調べるため、プレートあるいは、血球計数器計数に供されることが出来る。サンプルは、国立再生可能エネルギー研究所（National Renewable Energy Laboratory）法を用いて、セルロース、ヘミセルロース、及び、ペクチンのレベルも、アッセイされることが出来る。
【００９１】
実施形態においては、変換培養株は、脂質生成微生物と組み合わされることができ、及び／あるいは、脂質生成培養株の生成物は、変換培養株の生成物と組み合わされることが出来る。関連する側面においては、脂質生成微生物は、個別のＳｍＦプロセスで培養されることが出来る。更なる関連する側面においては、脂質生成微生物は、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）とすることができ、基体は、シロップで、有機体は、シロップの高塩分及び高脂肪含有量に耐えることを含む、塩水への耐性を持つ。
【００９２】
ＳＳＦ
本開示の方法によれば、固体発酵（ＳＳＦ）リアクタ内の固体成長培地は、特に、動物の飼料のための食料の生成に用いられることが出来る。
【００９３】
固体成長培地の制御された質量流が、接種点を通過する場合、それは、均一に、連続的に接種されることが出来る。固体成長培地は、様々な有機的あるいは無機的担体を含み、これは、垂直攪拌を通過することにより移動されることができ、螺旋形のきりセクションは、通気を増加し、熱を分散し、水分を拡散し、基体の固定と包み込みを防止するために、発酵基体を上昇することができる。
【００９４】
無機担体は、これらには限定されないが、蛭石、真珠岩、アモルファス石英、あるいは、顆粒状粘土を含むことが出来る。物質のこれらの種類は、０．５−５０ｍｍの粒子サイズ及び、広い面積を有する、緩くて、通気性の良い顆粒状構造を形成するので、通常使用される。有機担体は、これらには限定されないが、穀物粒、ぬか、おがくず、泥炭、油科種子材料、木材チップ、あるいは、これらの組み合わせを含むことが出来る。関連する側面においては、これらの担体は、最終タンパク質生成物から分離されることが出来る。
【００９５】
更に、固体成長培地は、微生物のための追加の栄養素を含むことが出来る。典型的には、これらは、炭水化物（糖、でんぷん）、タンパク質あるいは脂肪などの炭素源、有機形態の窒素源（タンパク質、アミノ酸）あるいは、無機窒素塩（アンモニウムおよび、硝酸塩、尿素）、微量元素あるいは、他の成長因子（ビタミン、ｐＨ調整剤）を含む。固体成長培地は、例えば、ポリアクリルアミドである、超吸収剤などの構造的混合物の支援を含むことが出来る。当業者には、栄養濃度、水分含有量、ｐＨなどは、培養条件を最適化するために調整されることが出来ることは明らかであろう。
【００９６】
実施形態においては、固体成長培地は、無菌とすることが出来る。例えば、垂直攪拌ベッドを通過することは、リアクタ本体とは切り離されており、固体成長培地で満たされており、例えば、オートクレーブにおいて、無菌とされ、その後、それは、動作を開始する前に、無菌で、リアクタ本体に再び取り付けられることが出来る。他の実施形態においては、バクテリア培養は、防止されることができ、安定化二酸化塩素生成物(例えば、 E.I. DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE からのFERMASURE（商標）)、あるいは、これらには限られないが、過酸化水素、リン、塩酸、テトラサイクリン、及び、合成抗菌剤(例えば、米国特許公開公報 20130084615を参照されたい、この全体は参照によってここに組み込まれる)を含む、人間及び動物の消費に対し安全と認可された他の抗菌代替剤の追加によって、オートクレービングによって代替されることが出来る。
【００９７】
実施形態においては、培地無菌化ユニット内の固体成長培地は、例えば、スチームの支援によって、接種を開始する前に、インサイチュ（in situ）で、無菌化される。他の実施形態においては、培地は、殺菌され、あるいは、オプションとして、全く加熱されず、低水分活性と低ｐＨの使用が、バクテリアの培養を制御するために利用されることが出来る。
【００９８】
接種菌液は、液体あるいは固体の形態の本発明に従って、リアクタに供給されることが出来る。
【００９９】
液体培地が接種に用いられるならば、それは、例えば、スプレー技術を用いることが出来るような小さな粒子サイズの懸濁液の形態とすることが出来る。実施形態においては、液体培地は、接種点を通過する固体成長培地の連続的なストリームで、スプレーされることが出来る。
【０１００】
接種菌液が固体形態である場合には、垂直攪拌／オーガによって、固体成長培地を運送するのと同様に、接種点に運送されることが出来る。実施形態においては、固体接種菌液は、スクリューあるいはベルトコンベヤを用いて運送されることが出来る。これは、微生物が培養のために、同様に運送されることが出来ることを保証する。他の実施形態においては、基体と接種菌液は、混合され、安定なペレットを生成するために、低温の押出し機を通過されることができ、そのようなペレットは、機械的攪拌なしで、リアクタ内により効果的な空気流を可能とするだろう。
【０１０１】
開示されたＳＳＦの機能を実現するために、幾つかの異なる構成が存在するだろう。
【０１０２】
実施形態においては、ＳＳＦシステムは、図１に示されるようなエンティティを含むリアクタ１０のリアクタ本体１０１を含むところが開示されている。２つの主な区画があり、上部区画「Ａ」とコーン形状下部「Ｂ」は、穴の開いた「偽」フロア１０２によって、相互に分離されており、穴の開いたフロア１０２は、フロア１０２が、材料が、下に流れ、リアクタ１０からコーン形状下部Ｂへと重力によって放出されることが出来るように、実質的に解放されるように、下方向に回転するセグメントに構成され、複数の通過混合スクリュー１０３は、シャフト１０５に取り付けられた配置器１０４を有し、そのスクリュー１０３は、リアクタ本体１０１に渡って、水平に移動するよう構成される。フロア１０２の移動は、配置器１０２ｂを用いて、複数の軸ロッド１０２ａによって制御される。コーン形状下部Ｂは、通気入り口１０６と生成物出口１０７を含み、この放出された材料は、リアクタ１０から向こうに移動するために、コンベヤあるいは個別のオーガ型デバイス２０上に搭載されることが出来る。実施形態においては、混合スクリュー上の材料は、十分な発酵の後、沈殿されるべき放出された材料を含む。
【０１０３】
実施形態においては、リアクタ１０は、フロア１０２の下のコーン形状下部Ｂに、温度制御された湿度のある空気を受け入れるように構成されている。そのような構成は、微生物に必要な酸素を提供し、熱を除去し、及び、水分を制御する。
【０１０４】
一側面においては、熱風が、発酵サイクルの最後に導入される。これにより、通気フロア１０２と混合スクリュー１０３による垂直攪拌と組み合わせて、方法が、生成物を、最終的に望ましい水分量まで乾燥することを可能とする。
【０１０５】
ここに開示されるような発酵プロセスの性質は、それが、発酵リアクタ１０において乾燥を可能とすることである。発酵リアクタ１０の使用は、また、低温でのタンパク質生成物のより効率的な乾燥を可能とし、また、生成物内の酵素活動を維持することも出来る。更に、通気乾燥の使用は、ガス−蒸気混合物の物理的及び熱力学的性質（つまり、psychrometrics ）を利用するので、より効果的で、エネルギー消費を抑えるものである。リアクタ１０内で、生成物を乾燥することは、また、改善された可流性を提供し、高水分含有量材料を扱い、運ぶことを避けるので、生成物が、重力によって放出されることを可能とする。更に、開示されるように、デバイス１０は、別個の乾燥システム及び、関連するコンベヤ、制御装置、及び、付随する大きなフットプリントの使用を防止する。
【０１０６】
実施形態においては、混合及びベッドの成層の減少は、固定と凝集の減少を達成するように提供される。他の実施形態においては、上部区画に渡る水平の移動の速度及びパターンは、プログラム可能で、任意の好ましい条件に対して選択可能である。実施形態においては、リアクタ空気接種は、選択可能な温度と湿度レベルを含む。一側面においては、選択された培養期間の後、湿度は減少され、温度は、材料を乾燥するために、上昇され、放出プロセスのアシストをすることが出来る。リアクタ区画の形状及びサイズは、培養と使用される材料の必要に応じて変化することが出来る。形状は、はっきり規定された形状に限定される必要は無く、成形可能であったり、プラスチック状であることが出来る。実施形態においては、容器の形状は、円筒形、角ばったもの、あるいは、円錐形である。
【０１０７】
実施形態においては、ＳＳＦ及びＳｍＦは、最終生成物を生成するために、任意の順番で、シリアルに用いられることが出来る。
【０１０８】
実施形態においては、ＳＳＦ及びＳｍＦは、ハイブリッド固体発酵（ハイブリッドＳＳＦ）を達成するために組み合わされる。ＳＭＦあるいは、深部発酵は、約２４時間実行され、接種菌液源として、細胞数を増加し、接種された微生物は、細胞外酵素を生成し、その酵素をバルクの液体内に放出し、細胞と酵素の両方は、次のステップの固体との反応のために利用できる。そのステップは、上記液体を、十分な固体と共に追加の酸及び抗菌剤（必要に応じて）とブレンドし、約４０から約６０％に混合物の水分レベルを減少し、後者は、ＳＳＦリアクタにおける培養のために用いられる固体相状態となる。実施形態においては、１５％の固体は、２４時間水に浸けられて放置され、続いて、固体を追加して、固体基体を５０％固体とし、後者は、５日間その状態で放置される。
【０１０９】
食料製剤
【０１１０】
例示的実施形態においては、回収された高品質タンパク質濃縮物及び脂質は、食料製剤として用いられる。実施形態においては、回収された高品質タンパク質濃縮物（ＨＱＰＣ）は、食料製剤において唯一のタンパク質源であろう。食料製剤内のタンパク質源の割合は、限定的なことを意味しないが、２４から８０％のタンパク質を含むだろう。実施形態においては、高品質タンパク質濃縮物（ＨＱＰＣ）は、全食料製剤タンパク質源の約５０％より多く、６０％のり多く、あるいは、７０％より多いだろう。回収されたＨＱＰＣ／脂質の組み合わせは、魚肉、大豆ミール、小麦及びとうもろこし粉及びグルテン及び濃縮物などの源、及び、血液、家禽及び羽毛ミールなどの動物の副産物を代替することが出来る。回収されたＨＱＰＣ／脂質を用いた食料製剤は、また、適切な場合、残りの栄養条件を満たすために、ミネラル及びビタミンプレミックスなどのサプリメントを含むことが出来る。
【０１１１】
ある実施形態においては、高品質大豆タンパク質濃縮物（ＨＱＳＰＣ）あるいは、高品質ＤＤＧＳ（ＨＰ−ＤＤＧＳ）あるいは、単独の、あるいは、生成された脂質との組み合わせの他の改善された植物由来のミールなどのＨＱＰＣの性質は、成長、飼料変換、タンパク質効率、高品質タンパク質濃縮物食料製剤の動物の、魚肉などの対照食料製剤を供給された動物に対する生き残りを比較することによって測定することが出来る。実施形態においては、テスト用製剤は、同一のタンパク質、脂質、及び、エネルギー含有量を含む。例えば、動物が魚の場合、内臓（脂肪沈着）及び臓器（肝臓及び脾臓）特性、屠殺割合（dress-out percentage）、及び、フィレット近似解析（fillet proximate analysis）は、腸組織学（intestinal histology）（腸炎）と共に、代謝応答を調べることによって測定することが出来る。
【０１１２】
理解されるように、回収されたＨＱＰＣ及び／あるいは、回収された脂質との組み合わせを含む個々の食料製剤は、異なる種類の動物に対し最適化されることが出来る。実施形態においては、動物は、商業養殖場で育てられた魚である。食料製剤の最適化の方法は、既知であり、無用な実験なしで、当業者により容易に確認することが出来る。
【０１１３】
完成された成長食料は、様々な動物種に対する既知の影響要件に従って、ＨＱＰＣを用いて製剤化されることが出来る。実施形態においては、製剤は、イエローパーチに対して使用されることが出来る（例えば、４２％のタンパク質、８％の脂質）。実施形態においては、製剤は、虹鱒に対して使用されることが出来る（３５％のタンパク質、１６％の脂質）。実施形態においては、製剤は、上に引用した動物のいずれか一つに対して使用されることが出来る。
【０１１４】
植物由来の食料のための基本ミネラルとビタミンプレミックスは、微量栄養素要件が満たされることを保証するために、用いられることが出来る。任意のサプリメント（解析によって必要とみなされた場合）は、サプリメントがない同一の製剤に対して比較することにより、評価されることができ；従って、供給試験は、サプリメントの効果を考慮に入れた要因分析において実施されることが出来る。実施形態においては、供給試験は、魚肉由来の対照食料、ＥＳＰＣ−及びＬＳＰＣ−由来の参照食料を含むことができる［従来のＳＰＣ（ＴＳＰＣ）は、溶媒で大豆フレークを洗浄し、可溶炭水化物を除去することによって生成される；質感が加えられたＳＰＣ（ＥＳＰＣ）は、水分、高温度の下に、ＴＳＰＣを押し出すことにより生成される；及び、低抗原ＳＰＣ（ＬＳＰＣ）は、プロセス中の溶媒洗浄及び温度を変えることにより、ＴＳＰＣから精製される］。供給試験のためのペレットは、ラボスケールの単一のスクリュー押出し機(例えば、 BrabenderPlasti-corder Extruder Model PL2000)を用いて生成されることが出来る。
【０１１５】
供給試験
実施形態においては、処置ごとの４つの実験ユニットの複製（つまり、各実験及び対照食料ブレンド）が用いられることが出来る（例えば、約６０から１２０日ごと）。試験は、遠心ポンプによって駆動され、固体溜まり、及び、バイオリアクタフィルタ（１００μｍバッグ、炭素及び紫外線）を備える、閉ループ再循環システムに平行に接続された１１０−Ｌ循環タンク（２０匹／タンク）で実行されることが出来る。熱ポンプは、種に特有な成長のための最適化された温度を維持するために要求されるので、用いられることが出来る。水質（例えば、溶解酸素、ｐＨ、温度、アンモニア及び亜硝酸塩）は、すべてのシステムでモニタされることが出来る。
【０１１６】
実施形態においては、実験食料は、魚のサイズに従って供給され、一日に２回から５回の供給に分割されることが出来る。成長度合いは、１から４週間で測定される（魚のサイズ及び試験期間に応じて）全体重測定によって決定される；比は、飽食供給を可能とし、廃棄物ストリームを減少するために、ゲインに従って、調整されることが出来る。消費は、各タンクからの食べられなかった食料の収集から、２週間ごとに調べられることが出来る。食べられなかった食料は、一定の温度に乾燥され、冷却され、重さが測られ、供給変換効率を評価することが出来る。供給タンパク質とエネルギーの消化性は、各実験の中間点の間に手で取除かれた排泄物質から、あるいは、供給試験の結果における、死体解剖によって、大腸管から決定することが出来る。生存、体重増加、成長率、健康指数、食料変換、タンパク質及びエネルギー消化性、及び、タンパク質効率は、処置グループ間で比較されることが出来る。解剖された魚の一般分析は、食料処置間のフィレットの混合物を比較するために実施されることが出来る。アミノ及び脂肪酸の解析は、供給試験の目的に従って、フィレット成分への必要に応じて実施されることが出来る。食料処置の供給試験応答は、ＨＱＰＣ食料の効能が、対照応答に合致するか、あるいは、これを超えるか否かを確認するために、対照（例えば、魚肉）食料応答と比較されることが出来る。
【０１１７】
食料及び供給試験応答の統計的解析は、a priori α = 0.05で行うことが出来る。処置間での効能パラメータの解析は、分散あるいは共分散の適切な解析（Proc Mixed ）及び、必要に応じて、post hoc な複数の比較によって実行されることが出来る。魚の効能及び内臓応答の解析は、非線形モデルによって調べられることが出来る。
【０１１８】
実施形態においては、本開示は、例えば、ＧＲＡＳ−状態微生物を用いて、大豆フレーク／ミールあるいはＤＤＧＳ内の繊維及び他の炭水化物を、更なるタンパク質に変換することを提案する。微生物菌体外多糖（例えば、ガム）は、また、押し出された供給ペレット製剤を促進し、結合剤の必要を否定することが出来るものが生成されることが出来る。この微生物ガムは、また、魚を、ストレスから起因する一般的な病原体から保護する将来の防御機構を活性化する 免疫賦活薬活動を提供することが出来る。β−グルカン、バクテリア生成物、および、植物成分などの免疫賦活薬物質は、感染病による経済的損失を減少し、抗生物質の使用を最小限にするために、商業供給においてますます多く使われている。本開示の微生物は、また、細胞外ぺプチダーゼを生成し、これは、代謝の間、とうもろこしタンパク質消化性と吸収を増加し、より高い飼料効率及び、収穫を提供するべきである。ここに開示されるように、この微生物培養プロセスは、ＳＢＭ、ＳＰＣ、及び魚肉よりも、タンパク質単位で、より安価な、価値のある、持続可能な養殖餌を提供する。
【０１１９】
開示されるように、この微生物は、大豆フレーク／ミールあるいはＤＤＧＳ内の個々の炭水化物を代謝することができ、細胞集団（タンパク質）及び微生物ガムの両方を生成する。これらの微生物の様々な系統は、また、繊維分解を増強する。本発明の微生物は、また、大豆及びとうもろこしタンパク質を、より消化可能なペプチド及びアミノ酸に変換することが出来る。実施形態においては、以下のアクションが実行されることが出来る：１）前処理された大豆タンパク質、油科種子タンパク質、ＤＤＧＳなどを変換するために本開示の選択された微生物を用いることの効率を決定し、約４５％と５５％の間の、あるいは、少なくとも約５０％の、タンパク質濃度を有する高品質タンパク質濃縮物（ＨＱＰＣ）を収穫し、２）魚肉に代替する場合のＨＱＰＣの効率を調べる。実施形態においては、大豆、油科種子、及び、ＤＤＧＳ前処理と、変換条件を最適化することは、微生物の効能と頑健さを改善し、商業的に重要な魚の範囲に対する結果の成長飼料をテストし、プロセスコストとエネルギー要求を確認し、スケールアップと商業化のステップを完成するために実行されることが出来る。実施形態においては、本開示のＨＱＰＣは、魚肉の少なくとも５０％を代替することが出来、増加された成長率及び変換効率を提供する。製造コストは、商業大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）より少なく、実質的に、魚肉より少ないべきである。
【０１２０】
押出し前処理の後、セルロース分解酵素は、糖を生成すると評価されることができ、これは、本開示の微生物が、タンパク質とガムに変換することが出来るものである。実施形態においては、これらの酵素のシーケンシャルな省略、及び、セルロール分解性微生物と共に培養株とすることの評価が用いられることが出来る。エタノールは、ガムを凝集し、ＨＱＰＣの遠心回収を改善すると評価されることが出来る。乾燥の後、ＨＱＰＣは、実用的な食料製剤に組み込まれることが出来る。実施形態においては、テスト用成長食料は、（ミネラルとビタミンプレミックスと共に）製剤化されることが出来、例えば、イエローパーチあるいは虹鱒などの商業的に重要な魚での供給試験における、魚肉対照と商業ＳＰＣ（ＳＰＣは、大豆ミールとは決定的に異なり、オリゴ多糖、抗原性物質、グリシニン及び、ｂ−コングリシニンの少量を含む）食料の比較が実施されることが出来る。効能（例えば、成長、供給変換、タンパク質効率）、内臓特性、及び、腸組織学は、魚の応答を調べるために、調査されることが出来る。
【０１２１】
他の実施形態においては、プロセス入力を最小化しつつ、ＨＱＰＣ／脂質生成プロセスの、最適な前処理及び変換条件を決定することによる最適化すること、微生物の効能と頑健さを改善すること、商業的に重要な魚の範囲において結果の成長飼料をテストすること、プロセスコストとエネルギー要件を確認すること、スケールアップと商業化の最初のステップを完成すること、が実行されることが出来る。
【０１２２】
過去数年においては、小数の工場が、エタノール精製プロセスの前に、とうもろこしの外皮及び種を除去する乾燥粉砕機能を実装していた。この乾燥分別プロセスは、４２％までのタンパク質を有するＤＤＧＳを収穫する（ここでは、乾燥分別ＤＤＧＳと参照する）。実施形態においては、パーチへの供給試験に用いるための高たんぱく質ＤＤＧＳ（ＨＰ−ＤＤＧＳ）の十分な量を高速に生成するために以前に決定された条件の下に、従来の及び乾燥分別ＤＤＧＳが比較されることが出来る。実施形態においては、この変換の（化学的混合物変化を介しての）性能の注意深いモニタリングが実行され、ＨＰ−ＤＤＧＳ品質への最も大きいインパクトを有するパラメータが特定される。幾つかの実施形態においては、低油ＤＤＧＳは、変換の基体として用いられることができ、そのような低油ＤＤＧＳは、従来のＤＤＧＳよりも高いタンパク質レベルを有する。関連する側面においては、低油ＤＤＧＳは、従来のＤＤＧＳに比較し、A. pullulansの培養速度を増加する。
【０１２３】
幾つかのグループが、魚肉を、大豆ミール及びＤＤＧＳなどの植物由来のタンパク質に部分的に置き換えることを評価している。しかし、より低いタンパク質含有量、不十分なアミノ酸バランス、及び、反栄養要因の存在は、代替レベルを２０−４０％に制限してきた。予備的成長試験は、現在のＤＤＧＳあるいはＳＰＣ由来の食料は、魚肉対照食料と同等な効能を提供しないことを示す。幾つかの欠点が、商業的に生産されるＤＤＧＳ及びＳＰＣの間で特定され、それらは、主にタンパク質及びアミノ酸混合物であり、これは、成長効能及び魚混合物に違いをもたらす。しかし、ここに開示される、栄養サプリメント（すべての条件を満たし、あるいは、超過するように製剤化された）を含むＨＰ−ＤＤＧＳ及びＨＱＳＰＣ食料は、魚肉対照と同等あるいは、これを超過する成長結果を提供した。従って、ここに開示したプロセス、及び、それから開発される生成物は、より高品質なＨＱＳＰＣあるいはＨＰ−ＤＤＧＳ（栄養要件に対して）を提供し、魚肉を含む食料と同等、あるいは、より良い成長効能をサポートする。
【０１２４】
本開示の魚飼料混合物を供給され得る魚は、これらには限定されないが、シベリアチョウザメ（Siberian sturgeon）、カワリチョウザメ（ Sterlet sturgeon）、スタリーチョウザメ（ Starry sturgeon）、シロチョウザメ（ White sturgeon）、ピラルクー（ Arapaima）、ニホンウナギ（ Japanese eel）、アメリカウナギ（ American eel）、ショートフィンウナギ（ Short-finned eel）、ロングフィンウナギ（ Long-finned eel）、ヨーロッパウナギ（ European eel）、カノスカノス（ Chanos chanos）、サバヒー（ Milkfish）、ブルーギルサンフィッシュ（ Bluegill sunfish）、グリーンサンフィッシュ（ Green sunfish）、白クラッピー（ White crappie）、黒クラッピー（ Black crappie）、 エジプロコブラ（Asp）、カトラ（ Catla）、金魚（ Goldfish）、フナ（ Crucian carp）、 ケンヒー（Mud carp）、ムリガルコイ（ Mrigal carp）、草魚（ Grass carp）、鯉（ Common carp）、ハクレン（ Silver carp）、コクレン（Bighead carp）、オレンジフィンラベオ（ Orangefin labeo）、ロウホウラベオ（ Roho labeo）、ホーブンズカープ（ Hoven's carp）、ウーチャンブリーム（ Wuchang bream）、真鯉（ Black carp）、ゴールデンシャイナー（ Golden shiner）、ニレムカープ（ Nilem carp）、ホワイトアムールブリーム（ White amur bream）、タイシルバーバーブ（ Thai silver barb）、ジャワ（ Java）、ローチ（ Roach）、テンチ（ Tench）、ポンドローチ（ Pond loach）、ボカチコ（ Bocachico）、ドラダ（ Dorada）、コロソマ（ Cachama）、カカマブランカ（ Cachama Blanca）、パコ（ Paco）、ブラックブルヘッド（ Black bullhead）、アメリカナマズ（Channel catfish）、バグリッドキャットフィッシュ（ Bagrid catfish）、ブルーキャットフィッシュ（ Blue catfish）、ヨーロッパオオナマズ（ Wels catfish）、パンガシウス（ スワイ、トラ、バサ）キャットフィッシュ（（Pangasius (Swai, Tra, Basa) catfish）、ストリップトキャットフィッシュ（ Striped catfish）、アミア（ Mudfish）、フィリピンキャットフィッシュ（ Philippine catfish）、ホンコンキャットフィッシュ（ Hong Kong catfish）、北アフリカキャットフィッシュ（ North African catfish）、ビッグヘッドキャットフィッシュ（ Bighead catfish）、サンパ（ Sampa）、南米ナマズ（ South American catfish）、アチパ（ Atipa）、ノーザンパイク（ Northern pike）、アユスイートフィッシュ（ Ayu sweetfish）、ベンダス（ Vendace）、ホワイトフィッシュ（ Whitefish）、カラフトマス（ Pink salmon）、シロザケ（ Chum salmon）、ギンザケ（ Coho salmon）、桜鱒（ Masu salmon）、虹鱒（ Rainbow trout）、ベニマス（ Sockeye salmon）、マスノスケ（ Chinook salmon）、タイセイヨウサケ（ Atlantic salmon）、鱒（ Sea trout）、北極岩魚（ Arctic char）、カワマス（ Brook trout）、レイクトラウト （Lake trout）、タイセイヨウダラ（ Atlantic cod）、ペヘレイ（ Pejerrey）、レイ（ Lai）、コモンスヌーク（ Common snook）、バラマンディ／アジアンシーバス（ Barramundi/Asian sea bass）、ナイルパーチ（ Nile perch）、マレーコッド（ Murray cod）、ゴールデンパーチ（ Golden perch）、シマスズキ（ Striped bass）、ホワイトバス（ White bass）、ヨーロピアンシーバス（ European seabass）、キジハタ（ Hong Kong grouper）、アレオレートグルーパー（ Areolate grouper）、グリージーグルーパー（ Greasy grouper）、スポッティドコラルグルーパー（ Spotted coralgrouper）、シルバーパーチ（ Silver perch）、ホワイトパーチ（ White perch）、ジェイドパーチ（ Jade perch）��オオクチバス（ Largemouth bass）、コクチバス（ Smallmouth bass）、ヨーロピアンパーチ（ European perch）、サンダー（パイクパーチ）（ Zander (Pike-perch)）、 イエローパーチ（Yellow Perch）、ソージャー（ Sauger）、ウォールアイ（ Walleye）、ブルーフィッシュ（ Bluefish）、カンパチ（ Greater amberjack）、ブリ（ Japanese amberjack）、スナブノーズポンパノ（ Snubnose pompano）、フロリダポンパノ（ Florida pompano）、パロメタポンパノ（ Palometa pompano）、真鯵（Japanese jack mackerel）、スギ（ Cobia）、ゴマフエダイ（ Mangrove red snapper）、イエローテイルスナッパー（ Yellowtail snapper）、ダークシーブリーム（ Dark seabream）、ホワイトシーブリーム（ White seabream）、チダイ（ Crimson seabream）、真鯛（ Red seabream）、 レッドポルジー（Red porgy）、ゴールドラインドシーブリーム（Goldlined seabream）、ゴウシュウマダイ（ Gilthead seabream）、レッドドラム（ Red drum）、グリーンテラー（ Green terror）、ブラックベルトシクリド（ Blackbelt cichlid）、ジャガーグアポーチ（ Jaguar guapote）、メキシカンマヤラ（ Mexican mojarra）、パールスポット（ Pearlspot）、スリースポッティドティラピア（ Three spotted tilapia）、ブルーティラピア（ Blue tilapia）、ロングフィンティラピア（ Longfin tilapia）、モザンビークティラピア（ Mozambique tilapia）、ナイルティラピア（ Nile tilapia）、ティラピア（ Tilapia）、ワミティラピア（ Wami tilapia）、ブラックチンティラピア（ Blackchin tilapia）、レッドブレストティラピア（ Redbreast tilapia）、ジルティラピア（ Redbelly tilapia）、ゴールデングレイマレット（ Golden grey mullet）、ラージスケールマレット（ Largescale mullet）、ゴールドスポットマレット（ Gold-spot mullet）、チンリップグレイマレット（ Thinlip grey mullet）、リーピングマレット（ Leaping mullet）、テイドマレット（ Tade mullet）、フラットヘッドグレイマレット（ Flathead grey mullet）、ホワイトマレット（ White mullet）、ルブランシュマレット（ Lebranche mullet）、パシフィックファットスリーパー（ Pacific fat sleeper）、マーブルゴビー（ Marble goby）、ホワイトスポッティドスパインフット（ White-spotted spinefoot）、ゴールドラインドスパインフット（Goldlined spinefoot）、マーブルドスパインフット（Marbled spinefoot）、ミナミマグロ（ Southern bluefin tuna）、大西洋黒マグロ（ Northern bluefin tuna）、木登り魚（ Climbing perch）、スネークスキングラミー（ Snakeskin gourami）、キッシンググラミー（ Kissing gourami）、ジャイアントグラミー（ Giant gourami）、雷魚（ Snakehead）、インドネシアンスネークヘッド（ Indonesian snakehead）、スポッティッドスネークヘッド（Spotted snakehead）、ストライプドスネークヘッド（ Striped snakehead）、ターボット（ Turbot）、ヒラメ（ Bastard halibut (Japanese flounder)）、サマーフラウンダー（ Summer Flounder）、サザンフラウンダー（ Southern flounder）、冬ヒラメ（ Winter flounder）、アトランティックハリブット（ Atlantic Halibut）、グリーンバックフラウンダー（ Greenback flounder）、コモンソール（ Common sole）and combinations thereof、及び、これらの組み合わせを含む。
【０１２５】
当業者によれば、本開示の魚飼料混合物は、薬学的に活性な物質の便利な担体として用いられることが出来ることが理解されるだろう。
【０１２６】
本開示による魚飼料混合物は、液体として、散布可能なエマルジョン、あるいは、ペーストの形態、あるいは、例えば、押出し物、粒、パウダー、あるいは、フレークなどの乾燥形態などとして、提供されることが出来る。魚飼料混合物が、エマルジョン、水中脂質エマルジョンなどとして提供される場合には、それは、比較的濃縮された形態とすることが出来る。そのような濃縮されたエマルジョン形態は、また、有機体への最終的濃縮媒質を提供する水性媒質における１以上のステップにおいて希釈されることが出来るので、プレエマルジョンといわれる。
【０１２７】
実施形態においては、開示されるように、微生物由来のプロセスのためのセルロース含有開始材料は、とうもろこしである。とうもろこしは、約２／３がでんぷんで、これは、発酵及び蒸留プロセスの間に、エタノールと二酸化炭素に変換される。残留栄養素あるいは発酵生成物は、ＤＤＧＳのような、濃縮された蒸留可溶物あるいは蒸留粒となることができ、これは、飼料生成物において使用されることが出来る。一般に、このプロセスは、とうもろこしの乾燥ミリングあるいはグラインディングの初期準備ステップを含む。この処理されたとうもろこしは、それから、加水分解と、糖化ステップにおいて、主なでんぷん成分を分解するために加えられた酵素に供される。発酵の以下のステップは、二酸化炭素などのガス生成物を生成するために、本開示の実施形態に従って提供される微生物（例えば、イースト）を追加して、先に進むことが可能となる。発酵は、発酵培養液から蒸留されることが出来るエタノールの生成のために実行される。発酵培地の残りは、それから、ＤＤＧＳを含む、発酵生成物を生成するために、乾燥されることが出来る。このステップは、通常、固体相成分が収集される遠心分離による固体／液体分離プロセスを含む。濾過とスプレー乾燥技術を含む他の方法が、そのような分離を実行するために用いられることが出来る。液相成分は、更にその後、糖、グリセロール及びアミノ酸などの可溶連産品を、シロップあるいは、濃縮とうもろこし可溶体（ＣＣＳ）と呼ばれる材料に濃縮することが出来る蒸発ステップに供されることが出来る。ＣＣＳは、それから、培養生成物（ＤＤＧＳ）として、乾燥されるべき固相成分と再結合されることが出来る。主題の混合物は、増加された価を有する発酵生成物も生成する一体化されたエタノール生成プロセスを提供するために、ドライミリングに基づいた、新規の、あるいは、既に存在するエタノールプラントに適用されることが出来ることは理解されるべきである。
【０１２８】
実施形態においては、本開示によって生成された培養生成物は、従来の発酵生成物よりも高い商業的価値を有する。例えば、培養生成物は、改善されたアミノ酸と微量栄養素含有量を有する増強された乾燥固体を含むことが出来る。「金色」生成物は、従って、暗色ＨＱＳＰに比べ、より高いアミノ酸消化性を一般に示すものが提供されることが出来る。例えば、明るいＨＱＳＰは、一般により少ない栄養価の比較的暗色な生成物に比べ、ここの実施形態に従った、増加されたリジン濃縮率を有するものが生成されることが出来る。生成物の色は、発酵生成物あるいはＨＱＳＰの品質及び栄養消化性を調べるにおいて、重要な因子あるいは指標となることが出来る。色は、乾燥中の余分な熱への暴露の指標として用いられ、熱への暴露は、遊離アミノ基及び糖のカラメル化反応及びメイラード反応の原因となり、幾つかのアミノ酸の品質を減少する。
【０１２９】
乾燥ミルあるいは、グラインドエタノール製造プロセスにおける基本的ステップは、以下のように記述されることが出来る：とうもろこし、あるいは、他の穀物製品のミリングあるいはグラインド、糖化、発酵、及び、蒸留。例えば、選択された全とうもろこし核は、典型的には、ハンマーミルあるいはローラミルのいずれかによって、挽かれ、あるいは、グラインドされることが出来る。粒子サイズは、調理水和反応及び続く酵素変換に影響を与えることが出来る。挽かれた、あるいは、グラインドされたとうもろこしは、調理され、及び、冷却されるマッシュを作るために、水と混合されることが出来る。これは、ジェラチン化されたでんぷんの粘度を減少するために、この変換の初期ステップの間、酵素を含めることは有用であろう。混合物は、それから、糖化リアクタに伝送され、１４０華氏などの選択された温度に維持され、この温度で、でんぷんは、糖化酵素の追加により、ぶどう糖あるいは麦芽糖などの発酵可能糖に変換される。変換されたマッシュは、８４華氏などの望ましい温度に冷却され得、発酵リアクタに供給され、ここで、発酵可能糖は、本開示に従って提供される微生物の選択された系統の使用によって二酸化炭素に変換され、Saccharomyces イーストなどのより伝統的な成分に比較し、より栄養価の高い発酵生成物となる。結果の生成物は、二酸化炭素を分離するため、フラッシュ（flash）されることができ、結果の液体は、蒸留コラム及び、除去（stripping）コラムからなる回収システムに供給されることが出来る。エタノールストリームは、吸収技術を用いて、残留水を除去するモレキュラーシーブに送られることが出来る。純化エタノールは、少量のガソリンによって変性され、燃料用エタノールを生成することが出来る。他の生成物は、初期の蒸留エタノールを更に純化し、不純物を除去することによって、生成されることができ、燃料用でない、約９９．９５％のエタノールとすることが出来る。
【０１３０】
全蒸留廃液は、蒸留ユニットの底から除去され、蒸留ウェット穀粒（ＤＷＧ）と、希釈な蒸留廃液（液体）を生成するために遠心分離されることが出来る。ＤＷＧは、５５−６５％の水分で遠心分離を離れることができ、牛の餌として、湿気たまま販売されるか、あるいは、本開示に従って提供される増強された発酵生成物として乾燥される。これらの生成物は、蒸留乾燥穀物（ＤＤＧ）とここで呼ぶ、増強された最終製品を含む。蒸発器を用いることにより、希釈な蒸留廃液（液体）は、蒸留可溶液を形成するように濃縮されることが出来、これは、蒸留穀物プロセスストリームに戻されて加えられ、これらに結合され、乾燥されることが出来る。本開示の実施形態による、この結合された生成物は、増加されたアミノ酸及び、微量栄養素含有量を有する増強された発酵生成物として商品展開されることが出来る。本開示の様々なコンセプトは、ここに例示されたもの以外の、当分野で知られた他の発酵プロセスに適用されることが可能であることは理解されるべきである。
【０１３１】
本発明の他の側面は、栄養素の増強された濃縮物に特徴付けられる微生物を含む栄養素の増強された濃縮物を有する完成された魚肉混合物に向けられる。栄養素は、これらには、限定されないが、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、及び、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレニウム、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、すず、シリコンなどの微量ミネラル、及び、これらの組み合わせなどである。
【０１３２】
本開示の培養プロセスにおいては、炭素源は、アルコール及び他のガス生成物を生成するために、微生物によって、その成分の糖に加水分解されることが出来る。ガス生成物は、二酸化酸素を含み、アルコールは、エタノールを含む。培養プロセスの後に得られる培養生成物は、典型的に、より高い商業価値を有する。実施形態においては、培養生成物は、微生物のいない生成物に比べ、増強された栄養素含有量を有する微生物を含む。微生物は、培養システム、培養液、及び／あるいは、培養バイオマスに存在することが出来る。培養液及び／あるいは、バイオマスは、乾燥（例えば、スプレー乾燥）されることが出来、栄養素含有量の増強された含有量を有する培養生成物を生成する。
【０１３３】
例えば、培養プロセスに続いて、消費された、回収された乾燥固体は、本開示に従って増強される。これらの培養生成物は、一般に、無毒で、生分解性であり、容易に手に入り、安価で、栄養素が多い。微生物と培養条件の選択は、食料あるいは栄養サプリメントとして使用する、低毒性あるいは無毒性培養生成物を生成するために重要である。ぶどう糖は、穀物からのでんぷんの加水分解から生成される主な糖であるが、一般に、炭水化物として、唯一の糖と言うわけではない。非でんぷん炭水化物を大量に含む（例えば、セルロースを３５％含む、乾燥重量で、中性の、洗浄性繊維としてアラビノキシラン測定された）、伝統的乾燥ミルエタノール生成プロセスから生成されたＳＰＣあるいはＤＤＧとは違い、非でんぷん炭水化物の酵素加水分解で生成される主題の栄養増強培養生成物は、より味が良く、非反芻動物にとって消化しやすい。
【０１３４】
この開示の栄養増強培養生成物は、重量で、少なくとも約１％から約９５％の栄養含有量を有することが出来る。栄養素含有量は、好ましくは、重量で、少なくとも約１０％−２０％、２０％−３０％、３０％−４０％、４０％−５０％、５０％−６０％、６０％−７０％及び、７０％−８０％の範囲である。利用可能な栄養素含有量は、飼料が供給され、代謝の残留物の状況、及び、動物のライフサイクルのステージに依存することが出来る。例えば、肉牛は、泌乳牛よりもヒスチジンが少なくてよい。動物に飼料を与える場合の適切な栄養素含有量の選択は、当業者には良く知られている。
【０１３５】
培養生成物は、スプレー乾燥バイオマス生成物として調製されることが出来る。オプションとして、バイオマスは、遠心分離、濾過、分離、デカント、分離及びデカントの組み合わせ、限外濾過、あるいは、微量濾過などの既知の方法によって分離されることが出来る。バイオマス培養生成物は、更に、ルーメンバイパスを促進するために処理されることが出来る。実施形態においては、バイオマス生成物は、培養培地から分離され、スプレー乾燥され、オプションとして、ルーメンバイパスを可変するために処理され、栄養源として飼料供給するために追加されることが出来る。微生物を含む培養プロセスにおける栄養増強培養生成物を生成することに加え、栄養増強培養生成物は、また、遺伝子組み換え植物系において生成されることも出来る。遺伝子組み換え植物系を生成する方法は、当分野において知られている。あるいは、微生物ホストが、栄養素含有物を排泄する場合には、栄養増強培養液は、培養によって生成されるバイオマスから分離されることが出来、透明になった培養液は、液体形態あるいはスプレー乾燥形態のいずれかで、動物飼料成分として用いられることが出来る。
【０１３６】
微生物を用いた培養プロセスの後に得られる培養生成物は、動物の飼料、あるいは、人間の食料サプリメントとして用いられることが出来る。培養生成物は、非動物源（例えば、バクテリア、イースト、及び／あるいは、植物）由来の増強された栄養素含有量を有する少なくとも１つの成分を含む。特に、培養生成物は、以下の少なくとも１つ以上を多く含む：脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、及び、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレニウム、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、すず、及び、シリコンなどの微量ミネラル。実施形態においては、ペプチドは、少なくとも１つの必須アミノ酸を含む。他の実施形態においては、必須アミノ酸は、培養反応において用いられる主体改変微生物内に取り込まれる。実施形態においては、必須アミノ酸は、微生物によって排出される異種性のポリペプチドに含まれる。望まれる場合、異種性のポリペプチドは、適切な微生物（例えば、菌類）の封入体に排出され、格納される。
【０１３７】
実施形態においては、培養生成物は、高栄養素含有量を有する。結果として、培養生成物のより高い割合が、完成された動物飼料において用いられることが出来る。実施形態においては、飼料混合物は、重量で、培養生成物の少なくとも約１５％を含む。完成飼料あるいは、食料においては、この材料は、他の材料と共に供給されるだろう。他の材料の栄養素含有量、及び／あるいは、飼料が与えられる動物の栄養要件に依存して、改変された培養生成物は、飼料の１５％から飼料の１００％までの範囲とすることが出来る。実施形態においては、主題の培養生成物は、高栄養素含有量のために、低い割合のブレンドを提供することが出来る。他の実施形態においては、主題の培養生成物は、非常に高い割合の飼料、例えば、７５％より多い、を提供することが出来る。適切な実施形態においては、飼料混合物は、主題の培養生成物の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、あるいは、少なくとも約７５％を含む。通常、飼料混合物は、重量で、培養生成物の少なくとも約２０％を含む。より一般的には、飼料混合物は、培養生成物の重量で、少なくとも約１５−２５％、２５−２０％、２０−２５％、３０−４０％、４０−５０％、５０−６０％、あるいは、６０−７０％を含む。望まれる場合、主題の培養生成物は、飼料の唯一の源として用いられることが出来る。
【０１３８】
完成された魚肉混合物は、様々な目的のために、例えば、体重増加及び動物の健康の全体的改善のために、１以上の必須アミノ酸について、増強されたアミノ酸含有量を有することが出来る。完成された魚肉混合物は、培養生成物において、遊離アミノ酸が存在し、及び／あるいは、必須アミノ酸を含むタンパク質あるいはペプチドが存在するので、増強されたアミノ酸含有量を有することが出来る。必須アミノ酸は、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、タウリン（スルホン酸）、イソロイシン、及び／あるいは、トリプトファンを含むことができ、これらは、遊離アミノ酸として、あるいは、選択されたアミノ酸が多いタンパク質あるいはペプチドの一部として、完成された動物飼料に存在することが出来る。少なくとも１つの必須アミノ酸の多いペプチドあるいはタンパク質は、ペプチドあるいはタンパク質の全アミノ酸残留物ごとに、少なくとも１％の必須アミノ酸残留物を、ペプチドあるいはタンパク質の全アミノ酸残留物ごとに、少なくとも５％の必須アミノ酸残留物を、あるいは、タンパク質の全アミノ酸残留物ごとに、少なくとも１０％の必須アミノ酸残留物を、有することが出来る。動物に栄養がバランスされた飼料を供給することによって、栄養素含有量の最大使用がなされ、成長の相当する速度、ミルク生成、あるいは、廃棄物の生物汚染度を減少する排泄物内に存在する栄養素の減少を達成するために、より少ない飼料を必要とする。
【０１３９】
必須アミノ酸の増強された含有量を有する完成された魚肉混合物は、粗タンパク質及び全アミノ酸含有量の重量に対し、少なくとも２．０ｗｔ％の、より好適には、粗タンパク質及び全アミノ酸含有量の重量に対し、少なくとも５．０ｗｔ％の必須アミノ酸含有量（遊離必須アミノ酸、及び、タンパク質あるいはペプチド内に存在する必須アミノ酸を含む）を有することが出来る。完成された魚肉混合物は、これらには限定されないが、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、炭水化物、ステロール、酵素、微量ミネラルを含む、微生物由来の他の栄養素を含む。
【０１４０】
完成された魚肉混合物は、混合物からの完成された飼料、混合物からの濃縮物、混合物からのブレンド、及び、基本形態混合物を含むことが出来る。混合物が、完成された飼料の形態である場合には、栄養素が、培養生成物の微生物から得られるが、栄養レベルの割合は、約１０から約２５％であり、より好適には、約１４から約２４％であり、混合物が、濃縮物の形態の場合には、栄養レベルは、約３０から約５０％であり、より好適には、約３２から約４８％であることが出来る。混合物が、ブレンドの形態である場合には、混合物の栄養レベルは、約２０から約３０％であり、より好適には、約２４％から約２６％であり、混合物が、基本混合物の形態である場合には、混合物の栄養レベルは、約５５から約６５％とすることが出来る。ここに特に述べない限り、割合は、重量パーセントで述べられる。ＨＱＰＣが、例えば、Ｌｙｓなどの単一の栄養において高いならば、低割合で、サプリメントとして用いられることが出来、アミノ酸とビタミン、例えば、ビタミンＡとＥにおいてバランスされているのなら、それは、より完成された飼料であろうし、より高い割合で供給されるだろうし、コーンストーバー（corn stover）のように、低たんぱく質、低栄養飼料供給にサプリメントとして追加されるだろう。
【０１４１】
魚肉混合物は、少なくとも約２％の必須アミノ酸含有量を有する培養生成物に存在するペプチドあるいは粗タンパク質の割合を含むことが出来る。実施形態においては、ペプチドあるいは粗タンパク質の割合は、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、の必須アミノ酸含有量を有することが出来、実施形態においては、少なくとも約５０％である。実施形態においては、ペプチドは、１００％必須アミノ酸であることが出来る。一般的に、魚肉混合物は、約１０％までの必須アミノ酸含有量を有する培養生成物に存在する、ペプチドあるいは粗タンパク質の割合を含むことが出来る。より一般的には、魚肉混合物は、約２−１０％、３．０−８．０％、あるいは、４．０−６．０％の必須アミノ酸含有量を有する培養生成物に存在するペプチドあるいは粗タンパク質の割合を含むことが出来る。
【０１４２】
魚肉混合物は、少なくとも約２％のリジン含有量を有する培養生成物に存在するペプチドあるいは粗タンパク質を含むことが出来る。実施形態においては、ペプチドあるいは粗タンパク質の割合は、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％のリジン含有量を有することが出来、実施形態においては、少なくとも約５０％である。典型的には、魚肉混合物は、約１０％までのリジン含有量を有するペプチドあるいは粗たんぱく質の割合を含むことが出来る。望まれる場合には、魚肉混合物は、約２−１０％、３．０−８．０％あるいは、４．０−６．０％のリジン含有量を有するペプチドあるいは粗タンパク質の割合を含むことが出来る。
【０１４３】
魚肉混合物は、約１ｇ／Ｋｇ乾燥固体から９００ｇ／Ｋｇ乾燥固体の培養生成物内の栄養素を含むことが出来る。実施形態においては、魚肉混合物内の栄養素は、少なくとも、約２ｇ／Ｋｇ乾燥固体、約５ｇ／Ｋｇ乾燥固体、約１０ｇ／Ｋｇ乾燥固体、約５０ｇ／Ｋｇ乾燥固体、約１００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、約２００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、及び約３００ｇ／Ｋｇ乾燥固体まで存在することが出来る。実施形態においては、栄養素は、少なくとも約４００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも約５００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも約６００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも約７００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも約８００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、及び／あるいは、少なくとも約９００ｇ／Ｋｇ乾燥固体まで存在することが出来る。
【０１４４】
魚肉混合物は、約１ｇ／Ｋｇ乾燥固体から約９００ｇ／Ｋｇ乾燥固体の含有量を有する培養生成物に存在する少なくとも１つの必須アミノ酸を含む必須アミノ酸あるいはペプチドを含むことが出来る。実施形態においては、魚肉混合物内の少なくとも１つの必須アミノ酸を含む必須アミノ酸あるいはペプチドは、少なくとも約２ｇ／Ｋｇ乾燥固体、５ｇ／Ｋｇ乾燥固体、１０ｇ／Ｋｇ乾燥固体、５０ｇ／Ｋｇ乾燥固体、１００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、２００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、及び約３００ｇ／Ｋｇ乾燥固体まで存在することが出来る。実施形態においては、少なくとも１つの必須アミノ酸を含む、必須アミノ酸あるいはペプチドは、少なくとも４００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも５００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも６００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも７００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、少なくとも８００ｇ／Ｋｇ乾燥固体、及び／あるいは、少なくとも９００ｇ／Ｋｇ乾燥固体まで存在することが出来る。
【０１４５】
完成された魚肉混合物は、培養の間に形成されるバイオマスの形態の栄養増加培養生成物及び少なくとも１つの追加的栄養成分を含むことが出来る。他の例においては、魚肉混合物は、培養の間に形成される培養液に溶解され、懸濁された栄養増加培養生成物及び少なくとも１つの追加的栄養成分を含む。更なる実施形態においては、魚肉混合物は、少なくとも１つの必須アミノ酸が豊富なタンパク質を含む粗たんぱく質の割合を有する。魚肉混合物は、必須アミノ酸の改善されたバランスを配布するために製剤化されることが出来る。
【０１４６】
ＤＤＧＳを含む混合物については、完成された混合物形態は、シャープス（「ホイートミッズ」）、とうもろこし、大豆ミール、とうもろこしグルテンミール、蒸留穀物、あるいは、可溶物を有する蒸留穀物、塩、マクロミネラル、微量ミネラル、及び、ビタミンなどの１以上の成分を含むことが出来る。他の潜在的な成分は、通常、これらには限定されないが、ひまわりミール、麦芽の芽、及び、大豆の外皮を含むことが出来る。ブレンド形態の混合物は、シャープス、とうもろこしグルテンミール、蒸留穀物、あるいは、可溶物を有する蒸留穀物、塩、マクロミネラル、微量ミネラル、及び、ビタミンを含むことが出来る。別の成分は、通常、これらには限定されないが、とうもろこし、大豆ミール、ひまわりミール、綿ミール、麦芽の芽、及び、大豆の外皮を含むだろう。基本形態の混合物は、シャープス、とうもろこしグルテンミール、蒸留穀物、あるいは、可溶物を有する蒸留穀物を含むことが出来る。別の成分は、通常、これらには限定されないが、大豆ミール、ひまわりミール、麦芽の芽、マクロミネラル、微量ミネラル、及び、ビタミンを含むだろう。
【０１４７】
微生物内の高度に不飽和な脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、酸化条件に曝されると、あまり望ましくない不飽和脂肪酸あるいは、飽和脂肪酸に変換されるだろう。しかし、オメガ−３ＨＵＦＡの飽和は、合成抗酸化剤、あるいは、ベータ−カロチン、ビタミンＥ及び、ビタミンＣなどの自然の抗酸化剤を飼料の中に導入することにより、減少、あるいは、防止されることが出来る。BHT、BHA、TBHQあるいは、エトキシキンなどの合成抗酸化剤あるいは、トコフェロールなどの自然抗酸化剤は、生成物に加えるなどして、食料あるいは飼料生成物に組み込まれることができ、あるいは、それらは、適当な有機体内にインサイチュ（in situ ）生成物によって組み込まれることが出来る。このように組み込まれる抗酸化剤の量は、例えば、生成物製剤化、梱包方法、および、望ましい貯蔵寿命などの後続の使用要件に依存する。
【０１４８】
培養生成物あるいは、本開示の培養生成物を含む完成された魚肉は、また、人間用の入力物からプロセスが始まり、人間の食品標準がプロセスに渡って監視されるなら、人間の消費用の栄養サプリメントとして利用されることも出来る。培養生成物あるいは、ここに開示されるような完成された食料は、栄養素含有量が高い。タンパク質および繊維などの栄養素は、健康な代謝に関連している。レシピは、シリアル、クラッカー、パイ、クッキー、ケーキ、ピザの耳、サマーソーセージ、ミートボール、シェーキ、および、食用食品の任意の形態などの食品に、本開示の培養生成物あるいは完成された飼料を利用して開発することが可能である。他の選択肢は、本開示の培養生成物あるいは完成された飼料を、配布が便利な、食べやすい、グラノーラと同様な、スナック、あるいは、スナックバーへと開発することであろう。スナックバーは、グルコサミン、ＨＵＦＡなどの機能性食品、あるいは、ビタミンＱ−１０などの補助因子と共に、穀物からの、タンパク質、繊維、種、ビタミン、ミネラルを含むことが出来る。
【０１４９】
主題の培養生成物を含む魚肉は、更に、味が追加されることが出来る。特定の味の選択は、飼料が提供される動物に依存するだろう。味と芳香は、自然なものと人工的なもの両方とも、飼料をより受け入れやすく、味良くするのに用いられることが出来る。これらのサプリメントは、すべての成分と良くブレンドすることができ、液体あるいは乾燥生成物の形態で利用することが出来る。動物の飼料に追加されるべき、適切な味、誘引、芳香は、これらには限定されないが、魚フェロモン、コロハ、バナナ、さくらんぼ、ローズマリー、クミン、ニンジン、ペパーミント、オレガノ、バニラ、アニス、プラスラム、メープル、キャラメル、シトラスオイル、エチルブチレート、メンソール、アップル、シナモン、これらの任意の自然あるいは人工の組み合わせを含む。味および芳香は、異なる動物間で相互交換されることが出来る。同様に、様々なフルーツ味の人工あるいは自然なものは、人間の消費用の主題の培養生成物からなる食品サプリメントに加えられることが出来る。
【０１５０】
本開示の培養生成物あるいは完成された飼料の貯蔵寿命は、典型的には、微生物のいない培養生成物の貯蔵寿命より長い。貯蔵寿命は、製品の水分含有量、飼料体積にどの程度空気が通過することが出来るか、環境条件、防腐剤の仕様などの要因に依存する。防腐剤は、貯蔵寿命を数週間から数ヶ月に伸ばすために、完成された飼料に追加されることが出来る。貯蔵寿命を増加する他の方法は、他の飼料と混合して梱包する、プラスチックあるいはバッグで覆うなどの、サイレージ管理（silage management ）と同様な管理を含む。冷却条件、防腐剤、及び飼料体積から空気を追い出すことは、すべて、湿潤副産物の貯蔵寿命を延伸する。完成された飼料は、バンカーあるいは、サイロバッグに格納されることが出来る。湿潤培養生成物あるいは完成された飼料を乾燥することは、また、生成物の貯蔵寿命を増加し、密度と品質を改善することが出来る。
【０１５１】
本開示の完成された飼料は、長期間にわたって格納されることが出来る。貯蔵寿命は、サイロに入れる、有機酸などの防腐剤を追加する、あるいは、大豆の外皮などの他の飼料と共にブレンドすることにより、延長することが出来る。商品容器、あるいは、大量貯蔵庫は、完成された飼料を格納するのに用いられることが出来る。
【０１５２】
ここで用いられるように、「室温」とは、標準気圧の下に、約２５℃である。
【０１５３】
以下の実施例は、例示的なもので、開示された主題の範囲を限定することは意図しない。
［実施例］
【実施例１】
【０１５４】
ＨＰ−ＤＤＧＳの生成：
前処理評価においては、ＤＤＧは、バレル長がスクリュー直径に対して１：２０であり、圧縮比が３：１の単一のスクリュー押出し機(Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000, Hackensack, NJ)で押し出された。ＤＤＧは、水分を２５−３０％に調整され、押出し温度は、１７５℃に設定され、スクリュー速度は、５０ｒｐｍに設定され、バレルの両側において、隆起チャネルに対し、せん断効果を提供した。
【０１５５】
押出しＤＤＧ（５０Ｋｇ）は、それから、４５０Ｌの水と混合され、６００Ｌのバイオリアクタ内において、１０％の固体搭載比を達成した。ｐＨは、５に調整され、懸濁液は加熱された。懸濁液は、冷却後、酵素のカクテルを用いて糖化された。温度が、それから減少され、ｐＨは、３．０に調整され（細胞成長に最適な）、懸濁液は、２４時間の２％（ｖ／ｖ）の培養株で、接種された。懸濁液は、それから、９６時間、浸水した状態で通気された。培養の間、サンプルは、ｐＨ、ＨＰＬＣ（糖）及び、培養株純度解析のために、１２−２４時間間隔で除去された。培養に続いて、変換された懸濁液は、エタノール沈殿と遠心分離に供され、タンパク質と微生物バイオマス（ＨＰ−ＤＤＧＳ）が回収された。理論に縛られることは無いが、沈殿ガムが存在すると、懸濁固体の回収において、遠心分離の効率が改良される。約３３．３Ｋｇの固体が回収され、乾燥ベースで、４３．４３％のタンパク質濃度を得た。これはＨＰ−ＤＤＧＳ（水浸ＷＴ２８と呼ばれる）は、魚の供給試験に用いられた。
【０１５６】
固体試験
別個の試験が、非押出しＤＤＧＳ（試験ＰＡＴ２．３）対非押出しＤＤＧ（試験ＰＡＴ２．４）について実施された。両方の供給材料（３．５Ｋｇ）は、水と混合され、水分含有量５０％を達成し、ｐＨは、３−３．５に調整され、２ｍｌの商業用抗生物質の１０−２原液が、バクテリアによる汚染を防止するために加えられた。２４−４８時間微生物培養株の６．２５％（ｖ／ｖ）接種が固体果肉に混合された。これらの材料は、それから、偽底部にフィッティングされた７６ｃｍ高さで１６ｃｍ直径の個別のチューブ内に配置され、加湿空気の上昇流を可能とした。チューブは、室温で、１６８時間静的に培養された。培養に続いて、固体は除去され、乾燥され、タンパク質含有量が解析された。ＤＤＧＳサンプル（ＰＡＴ２．３）は、３９．７５％タンパク質であり、ＤＤＧ（ＰＡＴ２．４）は、４１．２８％タンパク質であった。従って、タンパク質レベルは、ＨＰ−ＤＤＧＳ生成物と比べて、非押出し供給材料のほうが、固体試験においてわずかに低かった。理論に縛られることはないが、これは、主に、前の水浸変換プロセスにおける「洗浄」効果によるものであった。ＳＳＦ生成物は、また、魚供給試験においてテストされた。
【０１５７】
水浸されたプロセスにおけるＤＤＧ前処理の比較
非押出しＤＤＧＳと対照としての非押出しＤＤＧを用いて、水浸プロセスを用いたＤＤＧへの幾つかの追加の前処理が評価された。希釈酸前処理が、１２１℃で20分間、１％H2SO4 を用いて実行された。熱湯調理前処理が、１６０℃で20分間実行された。２５−３０％の水分のＤＤＧの押出しが、上述のように（１７５℃で、５０ｒｐｍで）実行された。減少された繊維レベルを含む精製商業用ＤＤＧＳ(StillPro)もテストされた。
【０１５８】
変換のために、前処理供給材料は、水と混合され、ｐＨ５で、５ＬNew Brunswick Bioflo 3バイオリアクタ（３−４Ｌ作業体積）において、１０％の固体搭載比を達成した。オートクレーブ及び冷却の後、懸濁液は、２５時間糖化された。温度は、それから、３０℃に減少され、ｐＨは、５のままか、３に減少され、懸濁液は、２４時間、２％（ｖ／ｖ）の培養株で接種された。懸濁液は、そして、１２０時間通気された。培養の間、サンプルは、６−１２時間の間隔で除去された。サンプルは、炭水化物用のＨＰＬＣ解析と、血球計数器計数に供され、微生物の個体数が調べられた。サンプルは、また、エタノール沈殿と遠心分離に供され、タンパク質と微生物バイオマス（ＨＰ−ＤＤＧＳ）が分離された。
【０１５９】
パーチ飼料における魚肉の代替としてのＨＰ−ＤＤＧＳの効能の評価
上記プロセスから導出された生成物は、特にイエローパーチに注目するが、目的の種の必要を考えに入れた栄養能力についての解析がなされた。サンプルは、飼料製剤の前に、化学的解析（一般分析、繊維、不溶炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、及び、ミネラル）に供された。
【０１６０】
実験計画の概要
供給試験は、再循環水産養殖システム（RAS）において実行された。処置ごとの実験ユニット（２０匹／１１０Ｌタンク）の複製は、１１２日間続いた供給試験において用いられた。熱ポンプは、イエローパーチの成長用に、最適な温度を維持するために用いられた。水質（例えば、溶解酸素、ｐＨ、温度、アンモニア及び亜硝酸塩）は、毎日モニタされた。
【０１６１】
実験の試料は、魚のサイズ（〜５ｇの開始体重）に従って供給され、朝に、１日分の６０％の食料、夜に１日分の４０％の食料で、２回分けて毎日供給された。成長能は、４週間ごとに取られる全体重測定によって決定された。食料は、増加に従って調整され、供給について飽食を可能とし、廃棄物ストリームを減少させた。消費量は、供給の３０分後に、タンクに残っている、食べられなかったペレットを数えることにより調べられ、供給されたペレットの９０％が消費されるように調整した。生存、体重増加、成長率、健康指数、供給変換、タンパク質及びエネルギー消化性、及び、タンパク質効率が、処置グループ間で比較された。
【０１６２】
食事及び供給試験の応答の統計解析は、a priori α = 0.05でなされた。処置群間の効能パラメータの解析は、分散あるいは共分散(Proc Mixed)及び、必要に応じて、post hocな複数比較の適切な解析によりなされた。
【０１６３】
供給準備
完成された実用的な食事は、要因分析におけるイエローパーチの既知の栄養要件に従って、ＤＤＧＳあるいは、変換ＤＤＧＳを用いて製剤化された。植物由来の飼料の基本ミネラル及びビタミンは、微量栄養素要件に合致するように用いられた。すべての供給試験は、商業的にあるいは、実験的に得られる、魚肉由来の対照食料とＤＤＧＳ生成物のある範囲を含む食料を含んだ。
【０１６４】
実験的ＤＤＧＳ生成物、商業用ＤＤＧＳ、及び、魚料理用魚肉対照を含む、７つのテストタンパク質成分が、食料製剤に用いられた（表１）。食料は、穀物グルテン、穀物粉、セルフィル（cellufil）、魚油、とうもろこし油を調整することにより、等窒素かつ等脂質になるように製剤化された。目標の食料一般組成（ｄｍｂ）は、４５％のタンパク質、９％の脂質、タンパク質のエネルギーに対する比（ＰＥ）が約２７ｇタンパク質／ＭＪ  ＧＥであった（表２）。すべての食料は、化合物の実用的な飼料として製剤化され、これは、嗜好性及び、ペレット品質増加物と共に、ビタミン及びミネラルサプリメントを含んでいた。完全にランダムで、入れ子となったデザインが実装され、ＤＤＧＳ食料のそれぞれは、既知のイエローパーチの要件に合致する、あるいは、これを超えるように、タウリン、メチオニン、ヒスチジン、及び、アルギニンで、複製、及び、サプリメントの追加がなされた。
【表１】
2016533743.tif 000003
【０１６５】
大きな粒子の成分は、乾燥ブレンドの前に、０．５１ｍｍスクリーンで、Fitzpatrick comminutor (Fitzpatrick Company, Elmhurst, IL)を用いて、挽かれた。乾燥成分は、水と油が加えられる前に、Hobart HL200ミキサを用いて、１５分間ブレンドされ、更に５分ブレンドされた。飼料は、それから、２．０ｍｍダイのHobart 4146グラインダーを用いて、スクリュー圧縮され、２１０華氏において、Despatch コンベヤドライヤーによって乾燥された。乾燥に続いて、飼料は、−２０℃で、冷凍格納庫に置かれ、供給を待った。各食料の約７ｋｇは、見かけ消化性の決定のために、１％（乾燥食料）酸化クロムを含む３．５ｋｇを含めて、調製された。
【０１６６】
主なタンパク質源（表２）及び、飼料（表３）の化学的解析は、私設研究所においてなされた。解析は、リジンとメチオニンが、既知の濃縮物に加えられたので、４つの基本的な食料についてのみ行われた。解析は、粗タンパク質（ＡＯＡＣ２００６、方法９９０．０３）、粗脂肪（ＡＯＡＣ２００６、方法９９０．０３）、粗繊維（ＡＯＡＣ２００６、方法９７８．１０）、水分（ＡＯＡＣ２００６、方法９３４．０１）及び、灰（ＡＯＡＣ、方法９４２．０５）及び、アミノ酸（ＡＯＡＣ２００６、方法９８２．３０Ｅ（ａ，ｂ，ｃ））について行われた。
【表２】
2016533743.tif 000004
【表３】
2016533743.tif 000005
【０１６７】
供給試験デザイン
５６０匹のイエローパーチの稚魚(μ±SE, 4.13±0.64 g)が、ＲＡＳタンク内の２８の循環プラスチックタンク（１１０Ｌ）にランダムに格納された。初期タンク質量（タンクごとに２１匹の魚、86.78 ±2.94g ）は、タンク間で、大きな差はなかった(p=0.76)。商業食料への、３日間のシステム新環境順応の後、魚は、商業食料と特定処理食料の段階的な混合物に、４日間導入され、それから、１週間１００％処理食料が供給された。試験の始めにおいて、タンクごとの魚バイオマスの重量が測られ、視認での健康がモニタされた。
【０１６８】
魚が飽食になるまで、手で、１日２回餌やりが行われ、供給率は、タンクによる魚の体重、観察された成長速度、及び、供給消費調査に従って、変更された。消費率（％）は、食べられなかった重量を、全供給飼料で割ったものから評価された。食べられなかった飼料の重量は、ペレットが分解し始め、個々のペレットが食べられない、あるいは、区別できない時間に対応する供給後３０分に、食べられなかったペレットの数を数えることから計算された。これは、実施がしやすいことと、特定の供給期間食料と相関付けるために１週間に２回の評価消費により、消費方法として選択された。タンク消費評価は、１週間に２回実行され、供給消費（ｇ）を得るために供給された食料によって乗算された。タンク（＋０．０１ｇ）による魚バイオマスは、魚の健康をモニタし、成長率を計算するために４週間ごとに測定された。
【０１６９】
個々の長さ（ｍｍ）と重量（＋０．０１ｇ）は、また、各処置群からのランダムにサンプルされた魚について、４週間ごとに測定された。他の測定された効能変数は：
供給変換比（ＦＣＲ；以下の通り計算された：
【数１】
2016533743.tif 000006
タンパク質変換比（ＰＥＲ）；以下の通り計算された：
【数２】
2016533743.tif 000007
フルトン型状態因子（Ｋ）；以下の通り計算された：
【数３】
2016533743.tif 000008
比成長率（ＳＧＲ）；以下の通り計算された：
【数４】
2016533743.tif 000009
であった。
【０１７０】
試験成分のタンパク質及びエネルギー消化は、供給中の酸化クロム(CrO3)を用いて評価された。排泄物は、供給試験の終りに、腸管の末端１／３から、除去及び死体解剖によって収集された。
【０１７１】
結果及び議論
ＨＰ−ＤＤＧＳの組成が決定され、表４に示されている。
【表４】
2016533743.tif 000010
【０１７２】
押出しなしＤＤＧＳは、水浸試験において、４５．７５％のタンパク質性生物を得たのに対して、固体試験では〜４０％タンパク質であった。ここでも、理論に拘束されないが、水浸試験における追加の「洗浄」効果によるだろう。しかし、押出しなしＤＤＧ試験において、最終タンパク質レベルは、同様であった：水浸試験において３８−４２％（表４）に対し、以前の固体試験において、〜４１％。これらのタンパク質レベルは、また、ＨＰ−ＤＤＧＳ生成物における押出しＤＤＧの４１−４３％のタンパク質に比較することができ、押出しは、大きな利益とはならないことを示唆している。他のテストされた前処理については、希酸は、タンパク質濃度を改善しなかった。しかし、熱湯調理前処理は、大きな改善を見せた。
【０１７３】
水浸プロセスにおける押出しＤＤＧに対するセルロース分解性菌の比較
高価なセルラーゼ酵素を、上記同一のプロトコルを用いて、押出しにより処理されたセルロース分解性菌ＤＤＧを用いて代替することが出来るか否かを確立することがテストされたが、セルラーゼ酵素と糖化ステップは省略された。結果は、セルラーゼ酵素が、非セルロース分解性系統と共に用いられたとき観察された３８−４２％のタンパク質レベルに比較して、セルラーゼ酵素が、特定のセルロース分解性菌と代替された場合に、３６−４５．６％のタンパク質レベルを示した。
【０１７４】
成長試験結果：供給栄養
４５％の予測された食料組成が、表５に示されている。すべての食料は、最小イエローパーチ要件を満たす、あるいは、これを超えるために、アルギニン、リジン、ヒスチジン、メチオニン、及び、タウリンがサプリメントとして追加された。
【表５】
2016533743.tif 000011
【０１７５】
成長率
成長試験計量は、１１２日最終サンプリングに続いて解析された。最終相対成長は、図２に示されている。魚肉対照は、最も高い相対成長(443.53±37.63 g)を示し、一方、ＳＳＦ  ＰＡＴ２．３(333.08±52.05 g; p=0.2059)とＰＡＴ２．４(313.86±40.44 g; p=0.3682)は、この基準食料と同様な効能を示した。水浸処理(111.61±15.91 g)は、最低の相対成長率を示し、魚肉対照食料(p<0.0001)からかなりの差があった。
【０１７６】
魚肉は、また、他のすべての処置群よりも、かなり多いタンクバイオマス（６７８．９０ｇ）を生成した。ＳＳＦ  ＰＡＴ２．４（５５７．３３ｇ）とＳＳＦ  ＰＡＴ２．３（５４２．６５ｇ）は、次に多いタンクバイオマスを生成した。水浸ＷＴ２８（２４８．７５ｇ）は、他のすべての処置群よりもかなり少ないバイオマスを生成した。商業とうもろこしベースの食料、Still Pro 50 (485.53g) 及び Novita (512.68g)は、同様なタンクバイオマスを生成した。
【０１７７】
ＳＧＲは、魚肉（２．０１）と同様な効能傾向をたどり、すべてのとうもろこしベースの食料より優れたが、水浸ＷＴ２８（０．８８）と、かなり異なるのみであった。生存は、群(p=0.3424)間でかなり異なった。ＳＳＦ  Ｐａｔ２．４とStill Pro 50は、最も高い生存率（９０％）を示したが、他の食料処置群とは、たいして異ならなかった。フルトンの条件因子（Ｋ）は、処置群(p=0.1324)間でたいして異ならなかったが、調理なし湿潤ケーク（１．３９）を供給された魚が最も高く、水浸ＷＴ２８（１．２４）で最も低かった。供給変換比（ＦＣＲ）は、食料(p=0.22)間でたいして差は無かった。この結果は、調理なし湿潤ケークが、最高のＦＣＲ（１．４３）を示したことを示す（図２）。ＳＳＦ  ＰＡＴ２．４は、また、実験用ＨＰ−ＤＤＧブレンドに対して、最も良いＦＣＲ（１．３７）を生成した。タンパク質効率比（ＰＥＲ）は、処置群(p=0.028)間でかなり異なった。ＰＥＲは、魚肉で最も高く（１．２５）、続いて調理なし湿潤ケーク（１．２１）であり、水浸ＷＴ２８（０．７９）とかなり異なるのみであった。
【０１７８】
死体解剖変化
試験を完了する際に、タンクごとに５匹の魚は、代謝応答による魚の健康を特性化するために、安楽死させ、切開された。実験的代謝の結果として、魚の形態と解剖学的構造に大きな差があった（表６）。
【表６】
2016533743.tif 000012
【０１７９】
処置群(p=0.051)間で、ビセラルファット指数（ＶＦＩ）には差は見られなかった。水浸ＷＴ２８は、最も低いＶＦＩ（３．４１）を示した。固体発酵食料（ＳＳＦ  ＰＡＴ２．４及びＳＳＦ  ＰＡＴ２．３）のすべては、平均で、商業Still Pro 50食料よりも高いＶＦＩを有する魚を生成した。ビセラルキャビティにおける脂肪は、不健康の指標であると考えられる。更に、余分な脂質は、見かけ、最終生成物の臭い、に影響を与え、屠体収量を減少させ得る。
【０１８０】
ヘパトソマティック指数（ＨＳＩ）は、食料(p=0.005)間でかなり異なる。死体解剖の間、ある処置群の魚の肝臓は、薄色を有しているように見えた。薄色の肝臓色は、必須脂肪酸がない食料が供給された他の種に見られた。魚が適切に脂質を使わない場合、あるいは、ｎ−３／ｎ−６脂肪酸のバランスが崩れている場合。水浸ＷＴ２８は、他の処置群を含むＨＳＩのものを有する他の食料よりもより大きな分散を有していた。スプリーンソマティック(p=0.659)あるいは、ビセラルファット指数(p=0.051)には顕著な違いは無かった。
【０１８１】
生成プロセスは、かなりの変更を受け、生成物コストにおけるかなりの減額となった。質量バランスの比較が表７に示されている。
【表７】
2016533743.tif 000013
【０１８２】
世代１データは、５０ｋｇプロセス実行からのもので、生成物３３ｋｇを生成し、６６％の生成物収穫となった。質量の損失は、呼吸損失と濃度の損失の両方から発生する。世代２データは、３．５ｋｇプロセス実行からのものであり、３．０ｋｇの生成物を生成し、８６％の生成物収穫となった。世代２プロセスは、濃縮物に関する損失が無いため、より効率の良い質量バランスとなる。濃縮物内の非タンパク質成分の損失は、タンパク質濃度の増加を与えるが、固体プロセスの更なる最適化は、この影響を弱めえることが予期される。生成物回収は、サンプリングと収集損失の影響が減少されることによって、プロセスがスケールアップするので、更に改善するだろうと予期される。
【０１８３】
結論
タンパク質濃度と栄養価を増加するためのＤＤＧＳの微生物による増強は、この研究の第１段階においてかなりの潜在能力を示した。プロセスは、コストを減少し、生成物効能を増加するために簡単化された。
【０１８４】
プロセスは、大スケール試験において、３６％より多く（３１．９３％から４３．４３％）タンパク質濃度を増加する能力を示し、あるベンチ試験は、５０％より多いタンパク質レベルを示した。これらの結果は、養殖用の餌における高タンパク質要件のために、養殖用の餌の成分として、ＤＤＧＳを用いることの可能性に重要である。
【０１８５】
ＨＰ−ＤＤＧＳの効能は、商品ＤＤＧより及び、StillPro あるいは Novamealのような専用ＤＤＧＳ生成物よりさえも上に改善されることが示された。StillPro あるいは Novamealの微生物変化プロセスとの組み合わせは、更なる改善及びより高いタンパク質レベルの可能性を提供する。
【０１８６】
魚肉代替物を開発するためのＤＤＧＳ内のタンパク質を微生物により増強する技術は、技術的に可能性があること、経済的に魅力的であること、及び、養殖の飼料における魚肉を代替するための品質の良いタンパク質成分の増加するニーズに対する持続的な解決を示した。
【実施例２】
【０１８７】
オムカン（Omcan）リアクタ（〜１００Ｌ）におけるハイブリッド固体発酵（ハイブリッドＳＳＦ）実験
供給材料は、以下のリストから選択された：大豆ミール（ＳＢＭ）、押出し大豆ミール、ＤＤＧＳ，押出しシロフレーク、あるいは、Novita Novameal。そして、供給材料の１５％固体搭載比が、蒸留水で水浸されたバイオリアクタに加えられ、全部で５Ｌになった。マグラバー泡止め剤（２ｍｌ）が加えられ、ｐＨが、濃縮硫酸を用いて、望ましいレベル（典型的に、３−５）に調整された。３０分間１２１℃でオートクレーブした後、材料は、１）糖化段階を行うならば５０℃あるいは、２）糖化段階が省略されるならば、３０℃まで冷却された。糖化が用いられる場合、Novozyme 酵素 Htec2（３ｍｌ）及びCtec（５ｍｌ）が追加され、懸濁液は、２４時間、２００ｒｐｍで攪拌された。３０℃に冷却した後、懸濁液は、５％のグルコース、０．５％のイースト抽出培地上に成長された接種菌液の２４培養株の５０ｍｌが接種された。テストされた培養株は、以下を含む：A. pullulans sp. 42023, A. pullulans sp. 58522, or A. pullulans sp Y-2311-1。抗菌剤もある発酵において追加された（例えば、FERMASURE あるいは Lactrol）。培養は、固体相基体を接種するために用いる前に、２４時間、２００ｒｐｍで行われた。
【０１８８】
オムカン（OMCAN ）(Mississauga, ON, Canada)リアクタは、最初、消毒され、それから、供給材料、水、硫酸、及び、抗菌剤（任意）が加えられ、５０％の固体搭載及び約３のｐＨを達成した。オムカンの内容物は、１２０時間、室温で培養され、３０分間１００ｒｐｍで１日２回混合した。サンプルは、２４時間ごとに取られ、乾燥重量、ｐＨ、微生物数、糖及びタンパク質がモニタされた。小さなサンプルが、５ｍｌの水で、１５ｍｌの円錐形のチューブ内に配置され、プレートを引っかき、グラムサテン、ｐＨ及びＨＰＬＣ解析のために用いられた。培養の後、残りの内容物は、上記のように、乾燥され、挽かれ、解析された。
【０１８９】
結果
【表８】
2016533743.tif 000014
【０１９０】
表８に見られるように、糖化は、ハイブリッドＳＳＦ方法を用いて、（例えば、表４のデータと比較して）５０％より多い、タンパク質含有量を達成するのに必要ではない。
【０１９１】
パーチ魚の魚肉代替としてのハイブリッドＳＳＦ  ＨＱＳＰＣの効能評価
商業的に得られるＳＰＣ間の幾つかの差異が、主に、タンパク質アミノ酸混合物と反栄養特性において以前に特定され、これは、成長率と魚成分における変化を引き起こした。それらの実験は、魚肉を含む食料と同等か、それ以上の成長率をサポートするだろう高品質ＳＰＣ生成物の開発のニーズを正当化する。供給試験は、商業ＳＰＣ及びMenhaden魚肉対照に比較した、ハイブリッドＳＳＦ  ＨＱＳＰＣ大豆生成物の調査を提供するために、イエローパーチを利用して実施されるだろう。
【０１９２】
各食料の約１２ｋｇが用意され、それらは、消化性決定用に、１ｇ／１００ｇの酸化クロムを含む２ｋｇを含むだろう。試験食料は、４２：１０の、適切なタンパク質：脂質目標を有する、同等のＳＰＣ量を含むように製剤化される。６９％の最小タンパク質含有量を有する大豆タンパク質濃縮物(SPC, e.g., from Solae, St. Louis, Missouri or Netzcon Ltd. Rehovot, Israel)は、脱脂した、トーストされていないシロフレークの含水アルコール抽出物によって作られる。ＳＰＣは、オリゴ多糖、抗原物質グリシニン及びｂ−コングリシニンを微量含むので、大豆ミールとは確かに異なっている。
【０１９３】
大粒子成分は、乾燥ブレンドの前に、０．５１ｍｍスクリーンを有するFitzpatrick comminutor (Elhurst, IL)によって挽かれる。乾燥成分は、増強バー(Vanguard Pharmaceutical Machinery, Inc., Spring, TX)を有するＶＩ−１０ミキサを用いて、２０分間ブレンドされる。乾燥ブレンド飼料は、それから、Hobart HL200 ミキサ (Troy, OH)に運送され、油と水が加えられ、約５分間ブレンドされる。飼料は、それから、３／１６”ダイを有するHobart 4146グラインダーを用いてスクリュー圧縮され、冷温の強制空気条件の下に乾燥される。乾燥に続いて、飼料は、フードプロセッサを用いて、ペレットに挽かれ、同一のペレットサイズとするためにふるいにかけられ、−２０℃の冷凍庫に配置される。
【０１９４】
ペレット特性
各食料のサンプルは、水分（％）、水分活性（ａｗ）、単位密度（ｋｇ／ｍ３）、ペレット耐久性指数（％）、水安定性（分）及び、色（Ｌ，ａ，ｂ）について、３回解析された；圧縮強度（ｇ）及び、直径（ｍｍ）は、ｎ＝１０複製によって決定される。水分（％）は、標準方法2.2.2.5 (NFTA, 2001)を用いて得られる。２ｇペレットサンプルの水分活性は、Lab Touch aw analyzer (Nocasina, Lachen SZ, Switzerland)によって測定される。３色変数は、ハンターＬ（輝度／暗度）、ハンターａ（赤さ、緑さ）及びハンターｂ（黄色さ／青さ）として、分光色彩計（spectrophotocolorimeter ）(LabScan XE, HunterLab, Reston, VA)によって解析される。単位密度（ＵＤ）は、１００ｍｌのペレットの重量を計り、質量（ｋｇ）を０．０００１ｍ３で割ることによって評価される。ペレット耐久性指数（ＰＤＩ）は、標準方法S269.4 (ASAE 2003)に従って決定される。ＰＤＩは、PDI (%) = (Ma/Mb) × 100として計算され、ここで、Ｍａは、タンブリング後の質量（ｇ）であり、Ｍｂは、タンブリング前の質量（ｇ）である。ペレット安定性（分）は、ペレットが消費されるまでの、タンク内に浸出するペレットを擬態するために、静的(Wstatic)方法(Ferouz et al., Cereal Chem (2011) 88:179-188)によって決定される。安定性は、初期サンプルの浸出／乾燥重量からの重量損失として計算される。ペレット直径は、従来の測径両脚器を用いて測定される。ペレットは、TA.XT Plus Texture Analyzer (Scarsdale, NY)を用いて、圧縮強度についてテストされる。
【０１９５】
供給試験
イエローパーチ(2.95g ± 0.05 SE)は、２１匹／タンクで、閉ループ再循環養殖システム（ＲＡＳ）に平行に接続された２８個の循環タンクにランダムに格納される。ＲＡＳ水流及び品質は、二重固体サプタンク（dual solids sup tanks ）、バイオリアクタ、ビーズフィルタ、ＵＶフィルタ、及び、熱ポンプを備える遠心分離ポンプによって維持される。システムの水は、脱塩素処理され、１５，２００Ｌタンクに格納される自治体のものである。各処置群の４つの複製が、タンクにランダムに適用されるだろう。水流は、〜１．５Ｌ／分／タンクに維持される。温度は、２２℃±１°に維持される。温度と溶解酸素は、YSI Pro Plus (Yellow Springs Instrument Company, Yellow Springs, OH)によって測定される。アンモニア態窒素、亜硝酸態窒素、硝酸態窒素、アルカリ度(CaCO3として)、及び、遊離塩素は、Hach DR 3900 分光光度計（Spectrophotometer） (Hach Company, Loveland, CO)を用いて、テストされる。
【０１９６】
魚は、１日２回、手で、飽食になるまで供給され、供給率は、タンクの重量、観察された成長率、及び、供給消費調査に従って、変更される。消費（％）は、供給された既知のペレット数から、及び、供給後３０分の、食べられていないペレットを計数することにより、評価される。食べられていない供給の収集に続く乾燥重量は、また、消費を評価するのに用いられる。１週ごとのタンク消費評価は、週間消費（ｇ）を得るために、週間食料によって乗算される。処置群の嗜好性は、消費された供給あるいは、拒絶された供給の量によって決定される。タンク質量(+ 0.01g)は、供給速度を調整し、効能指数を計算するために、隔週ごとに測定される。個々の体長（ｍｍ）及体重(+ 0.01g)は、また、各処置群からランダムにサンプルされた４匹の魚について、隔週で測定される。
【０１９７】
供給変換比（ＦＣＲ）は、以下のように計算される：
【数５】
2016533743.tif 000015
【０１９８】
タンパク質変換比は、以下のように計算される：
【数６】
2016533743.tif 000016
【０１９９】
フルトン型条件因子（Ｋ）は、以下のように計算される：
【数７】
2016533743.tif 000017
【０２００】
比成長速度（ＳＧＲ）は、以下の通り計算される：
【数８】
2016533743.tif 000018
【０２０１】
食料及び供給試験応答の統計解析は、分散(ANOVA, a priori α = 0.05)の解析で実行される。有意Ｆテストの次に、post hoc チューキー法（post hoc Tukey's test）が行われる。
【０２０２】
他のアッセイ
試験解析の最後は、死体解剖による、最終成長、ＦＣＲ、ＰＥＲ，消費、及び、栄養欠乏症の検討を含むことが出来る。プラズマアッセイは、標準的な方法を用いて、リジンとメチオニンについてなされることが出来る。個々の魚は、筋肉比、ヘパトソマティック指数、ビセロソマティック指数、フィレット組成、及び、隠蔽腸組織学的調査（hind gut histology ）（腸炎炎症スコア（enteritis inflammation scores ））を定量化するために、頚椎脱臼により安楽死されることが出来る。試験食料のタンパク質及びエネルギー利用可能性は、供給及び排泄物質内の酸化クロム(CrO3)マーカを用いて評価されることが出来る(Austreng E, Aquaculture (1978) 13:265-272)。排泄物質は、下部腸管から、死体解剖により収集されることが出来る。
【０２０３】
テスト食料における栄養素の明示的消化性係数（ＡＤＣ）は、以下の公式を用いて計算されることが出来る：
【数９】
2016533743.tif 000019
【０２０４】
ここで、Ｄｒｅｆ＝基準食料マッシュ（そのまま）の栄養素（ｋＪ／ｇ総エネルギー）の％であり、Ｄｉｎｇｒは、テスト成分（そのまま）の栄養素（ｋＪ／ｇ総エネルギー）の％である。
【実施例３】
【０２０５】
微生物変換を用いたＰＵＦＡの生成
約５％の残留脂肪を有するエキスペラー抽出大豆ミールが用いられた。得られた材料の水分含有量は、約１０％であった。大豆ミールのｐＨと水分含有量は、予め水と酸の適切な量を混合することで、調整された。例として、大豆ミールの８．８キログラムが測定された。個別に濃縮硫酸４１０グラムが、６リットルの水に混合された。ミール及び酸の溶液は、それから、水平パドルミキサ内で、完全に一緒に混合された。ｐＨは、それから、３．０の目標に近いことが確認された。次のステップは、用意されたT. aureum 接種菌液の１リットルが加え、再び完全に混合することであった。ミキサは、３時間ごとに５分間混合するように、タイマーがセットされた。発酵プロセスは、１４４時間進行可能とされた。材料は、低温度オーブン内で乾燥され、解析のために確保された。
【０２０６】
ここに引用されたすべての参照文献は、その全体が、参照によって組み込まれる。
【０２０７】
上記説明より、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神と範囲を外れることなく、様々な使用及び条件に適応するために、実施形態に様々な変更及び改変をすることが出来る。従って、ここに図示し、記述したものに加え、実施形態の様々な改変は、上記記述からすれば、当業者には明らかであろう。そのような改変も、添付の請求項の範囲内に入ることを意図している。
【図１】
2016533743.tif 000020
【図２】
2016533743.tif 000021
【国際調査報告】
2016533743.tif 000022
2016533743.tif 000023