(57)【要約】本発明はワクチン組成物を提供し、当該ワクチン組成物は、免疫量の豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む。当該ワクチン組成物は、抗体の産生を有効的に誘導し、豚ヘルペスウイルス強毒株の感染を予防し、豚を有効的に保護することができる。【選択図】図２
2016520294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｌで表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。  
【請求項２】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項３】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＤ糖タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株。
【請求項５】
配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＢ糖タンパク質を有する請求項４に記載の豚ヘルペスウイルス株。
【請求項６】
ＨＮ１２０１株又はその培養物であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である請求項５に記載の豚ヘルペスウイルス株。
【請求項７】
免疫量の請求項４〜６のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含み、好ましくは、免疫量の前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含むワクチン組成物。
【請求項８】
免疫量の請求項５に記載の豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含み、好ましくは、免疫量の上記の豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含むワクチン組成物。
【請求項９】
１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の不活化ワクチンを含む請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物のｇＤタンパク抗原を２５〜１００μｇ／ｄｏｓｅで含む請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
更に媒体、アジュバント、賦形剤を含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載のワクチン組成物を製造する方法であって、前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株又はその培養物を増殖して培養し、不活化し、アジュバントを添加して、均一に攪拌することを含む。
【請求項１３】
請求項８に記載のワクチン組成物を製造する方法であって、
（１）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク組み換え遺伝子をクローンすること、
（２）前記豚ヘルペスウイルスｇＤ組み換えタンパクを発現すること、
（３）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク抗原にアジュバントを一定の比率で混合し、乳化することを含む。
【請求項１４】
豚ヘルペスウイルスに起因する疾病の予防治療薬を製造するための請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン組成物に関し、動物ウイルス学分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科に属する豚ヘルペスウイルスＩ型（Ｓｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｓｔｒａｉｎ）感染を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で引き起こされ、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、わが国で広く存在しており、その被害が深刻化し、大規模養豚場の生産を妨害する主な疫病の一つである。豚オーエスキー病を感染すると、妊娠母豚では、流産、死産又はミイラ胎児が発生し、また、子豚では、神経症状、まひが発生し、死亡率が高い。ＰＲＶは強い向汎性、神経向性及び潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏しているウイルスが活性化され、感染力を持つウイルスになると、潜伏感染されている宿主は発病することになる。
【０００３】
これまでの研究で、サブユニットワクチンにより免疫動物を保護できることが分かってきた。サブユニットワクチンは遺伝子工学によって病原体の保護性抗原遺伝子を原核発現系或いは真核発現系にクローンし、効果的に発現させて製造したワクチンである。現在、ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤは、いずれも有機体に中和抗体を生じさせることができることが分かり、それらの抗体は、体内でも、体外でも、また、補体の有無にかかわらず、ＰＲＶ中和能を有する。非特許文献１には、既知の１１種類のヘルペスウイルス糖タンパク質において、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤはいずれも有機体に中和抗体を生じさせることが開示される。補体が関与しない場合、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤのモノクローナル抗体はＰＲＶを中和できる。豚と小鼠にｇＢ、ｇＣ、ｇＤのモノクローナル抗体を注射すると、いずれも、強毒型ＰＲＶの攻撃を抵抗できる。従って、ＰＲＶサブユニットワクチンの研究に対して、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤは第一選択タンパク質である。糖タンパク質ｇＤは重要な中和抗原であり、保護性抗体の主な目標でもあり、良好な保護反応を誘導させることができる。特許文献１と特許文献２には、豚ヘルペスウイルスのｇＤタンパクを利用して豚オーエスキー病を予防するためのワクチンを製造できることが開示される。
【０００４】
豚ＰＲＶはただ一つの血清型があり、一般的には、ウイルス株の交差保護力が強いと考えられているが、現在、商品化されたワクチンを子豚に注射した後、典型的な豚オーエスキー病が発病し、たとえば、体温が長時間にわたって上昇したり、意気消沈、食欲不振が持続したり、呼吸器及び／又は神経症状が出たりすることがある。目立つ現象として、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠する母豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状を引き起こす。従来のワクチンを接種した豚は、野生ウイルスの攻撃に完全には抵抗できず、依然として、高熱、意気消沈、食欲不振又は絶食などの症状が出る。感染率は８０％を超え、発病率は３０％を超え、死亡率は１０％〜２０％の範囲である。    
従来技術において、豚ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６８５８３８５号
【特許文献２】米国特許第６５２１２３１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「オーエスキー病サブユニットワクチンの研究進展」（楊承槐、高明、▲しん▼南輝《江西畜牧獣医雑誌》２００４年第３期）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術の問題点を解決するために、本発明は、動物実験で豚オーエスキー病に対して良い免疫作用を備えるワクチンを製造するための豚ヘルペスウイルス株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。
本出願において、「配列コード」とは、転写されて対応のＲＮＡ配列を得られるＤＮＡ配列である。
従来技術の問題点を解決するために、本発明は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＤ糖タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株を提供することを主目的とする。
本発明における「ｇＤ糖タンパク質」とは、豚ヘルペスウイルスが感染するのに必要な構造タンパク質であり、成熟ウイルス粒子の膜表面の主な糖タンパク質の一つであり、ｇｐ５０タンパクとも呼ばれる。
【０００９】
本発明における「相同性」とは、本出願では、二本のアミノ酸配列或いは二本のヌクレオチド配列の類似度である。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、本分野において公知の方法のうち、いずれかの適当な方法によって算出される。たとえば、目標となるアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列と参照アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列について、配列照合を行って、必要に応じて照合する二本の配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の数を最適化するように欠失を入れる上に、二本のアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の百分率を算出することができる。
【００１０】
アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の照合と相同性の計算は、本分野で既知のソフトウェア、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェア（ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）から入手可能、或いは、たとえば、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スウェ−デンバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）を参照）によって実現できるが、それに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合する際に、ソフトウェアの既定パラメーターを使用してもよく、または実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整してもよく、それはすべて当業者の知識範囲内にある。
【００１１】
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス株は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＢ糖タンパク質を有する。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のアミノ酸配列のｇＢ糖タンパク質を有する。
好ましくは、本発明に係る上記の豚ヘルペスウイルスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のアミノ酸配列のｇＣ糖タンパク質を有する。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス株はＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）或いはその培養物であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である。
上記の「培養物」とは、ウイルスの異なる世代の継代培養物であり、当業者は、異なる世代の遺伝子配列の間には、わずかな変異しか起こらないことが分かっている。上記培養物は、５〜３５代以内の培養物であることが好ましい。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、豚ヘルペスウイルスのワクチン組成物を提供することである。前記ワクチン組成物は、免疫量の豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む。
好ましくは、前記ワクチン組成物は、免疫量の前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ペプチドワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む。
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、前記豚ヘルペスウイルス或いはその抗原を活性成分として含む。ワクチン組成物に用いられる豚ヘルペスウイルスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列或いはそれと９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるｇＤ糖タンパク質を有する。
好ましくは、前記ワクチン組成物の豚ヘルペスウイルスは、ＨＮ１２０１株或いはその培養物である。
【００１３】
本発明に用いられる抗原はウイルス組成成分における抗原部分であり、免疫応答を引き起こし、且つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列を有する。
抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のアミノ酸配列或いはその断片と９５％以上のヌクレオチド相同性を有するｇＢタンパクを含んでも良い。
抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のアミノ酸配列或いはその断片と９５％以上のヌクレオチド相同性を有するｇＣタンパクを含んでも良い。
本発明における「生ワクチン」とは、毒性を弱めたが、宿主の体内或いは細胞に複製できるウイルスから製造されたワクチンである。本発明における「弱毒化」という用語は、病原体が病原性を失ったが、免疫原性を保持するように、遺伝子を突然変異して人工的に病原体の毒性を低下させることである。一般的には、ＵＶ照射、化学処理或いは体外連続高次継代培養によって病原体毒性を弱める弱毒化を実現する。人工的に遺伝子を変更し、たとえば既知の配列における特定のヌクレオチドを欠失させて毒性を弱める。
かかる「不活化ワクチン」とは、失活ワクチンとも呼ばれ、抗原として免疫力を生じさせる不活化ウイルスの懸濁液である。不活化ワクチンの例として、ホールウイルスワクチン（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）とスプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）が含まれる。既知の方法を用いて、不活化ワクチンを容易に生成できる。たとえば、ホルムアルデヒド溶液でウイルスを処理することにより、ホールウイルス不活化ワクチンが得られる。スプリットワクチンは、エーテルで処理した後、ウイルスによりエンベロープして製造される。
【００１４】
「サブユニットワクチン」とは、遺伝子工学方法により、病原体の保護性抗原の遺伝子を原核或いは真核発現系にクローンして、効果的に発現させて製造したワクチンである。サブユニットワクチンは、ホールウイルスワクチンよりも、副反応を引き起こす可能性が低い。たとえば、発現した豚ヘルペスウイルスのｇＤ或いはｇＣタンパクはサブユニットワクチンの製造に用いられる。
「合成ペプチドワクチン」とは、免疫決定基の組成成分のみを含む小ペプチドであり、即ち、天然タンパク質のアミノ酸配列に従って保護性短ペプチドを人工的に合成して、ベクターと接続した後、アジュバントを添加して製造したワクチンである。
好ましくは、前記ワクチン組成物は１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の不活化ワクチンを含む。
好ましくは、本発明に係わるワクチン組成物は１０６．０ＴＣＩＤ５０／頭の量で豚ヘルペスウイルスを含有する。豚ヘルペスウイルスを１０６．０ＴＣＩＤ５０未満の量で使用する時は、ワクチンは有効的に刺激して抗体を生じさせることができない。一方、それ以上の量は不経済である。
好ましくは、前記ワクチン組成物は２５〜１００μｇ／ｄｏｓｅで豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物のｇＤタンパク抗原を含む。
また、本発明に係わる豚ヘルペスウイルスを他の不活化病原体又は抗原と組み合わせて使用し、豚オーエスキー病を含む各種類の疾病を抵抗するための混合ワクチン又は複合ワクチンを製造できる。本発明における「混合ワクチン」とは、本発明の豚ヘルペスウイルスと少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンである。
【００１５】
「複合ワクチン」とはウイルスと細菌から製造したワクチンである。たとえば、本発明の豚ヘルペスウイルスを豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合するあるいは組み合わせることができる。
好ましくは、前記ワクチン組成物は媒体、アジュバント、賦形剤をさらに含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。ワクチン組成物に用いられるアジュバントの例として、フロイントの不完全アジュバント或いは完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル、植物油或いは鉱物油などが挙げられる。賦形剤の例として、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと硫酸アルミニウムカリウムが挙げられるが、それに限定されない。実際に、ワクチンの製造に用いられる当業者にとって既知のあらゆる物質はいずれも本発明のワクチン組成物に適用できる。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株を増殖して培養し、不活化し、アジュバントを添加して、均一に攪拌することを含む、前記ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
具体的には、前記方法は、（１）豚ヘルペスウイルスワクチン株をそれぞれの感受性細胞に接種して、接種後の前記感受性細胞を培養し、細胞培養物を得る。
（２）ホルムアルデヒド溶液、ＢＰＬ（β−プロピオラクトン）或いはＢＥＩ（ジエチレンイミン）を用いて、工程（１）で得られたウイルスを処理する。
前記感受性細胞は継代細胞系であってもよく、初代細胞であってもよい。豚ヘルペスウイルスに適する感受性細胞として、ＳＴ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ＰＫ−１５細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）、アフリカミドリザルの腎臓細胞由来のＭａｒｃ−１４５細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、牛腎臓細胞由来のＭＤＢＫ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ精巣継代細胞由来のＢＴ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、Ｖｅｒｏ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、ＢＨＫ−２１細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）、豚腎臓継代細胞系（例えばＩＢＲＳ−２、ＤＥＣＡＳＴＲＯ，Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＢ−ＲＳ−２ｓｗｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞系（ＲＫ、例えばＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）などの継代細胞系、又はニワトリ胚線維芽細胞と豚腎臓細胞などの初代細胞が挙げられるが、それらに限定されない。初代細胞は、本分野に既知の方法で、動物生体内の組織を用いて分離して製造することができる。
本発明に係るワクチン組成物は経口投与剤又は非経口投与剤として製造される。経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻或いは硬膜外に投与される非経口投与剤であることが好ましい。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、（１）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク組み換え遺伝子をクローンすること、（２）前記豚ヘルペスウイルスｇＤ組み換えタンパクを発現すること、（３）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク抗原にアジュバントを一定の比率で混合し、乳化することを含む、前記ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
本発明のまた一つの目的は、豚ヘルペスウイルスに起因する疾病の予防治療薬を製造するための前記ワクチン組成物の使用を提供する。
本明細書中に用いられる「豚ヘルペスウイルス感染に起因する疾病」という用語は、豚ヘルペスウイルスを感染して罹患される疾病を意味として用いられる。その例として、発病した子豚は明らかな神経症状、昏睡、鳴き、嘔吐、下痢、体温上昇などの症状を示し、一旦発病すると、妊娠する母豚は流産し、ミイラ胎児又は死産胎を産出し、又は繁殖障害が引き起こされるが、それに限定されない。
【００１８】
本明細書中に用いられる用語「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」は、以下の症状を示す意味としても用いられることがある。どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠する母豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状が出る。ただし、それらに限定されものではない。
【００１９】
上記の症状と従来技術において普通の豚ヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染された成熟豚（体重が５０ｋｇ以上の豚である）は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至ることである。初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上に上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることである。また、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などを示す呼吸系症状である。
本明細書中に用いられる用語「予防」とは、本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるようなすべての行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするようなすべての行為である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨＮ１２０１株ｇＣアミノ酸配列とＳＡ２１５株ｇＣアミノ酸配列との相同性の分析結果を示す図である。
【図２】ＨＮ１２０１株ｇＤアミノ酸配列とＳＡ２１５株ｇＤアミノ酸配列との相同性の分析結果を示す図である。
【００２１】
なお、配列表において：
配列１は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＤアミノ酸配列である。
配列２は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢアミノ酸配列である。
配列３は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＣアミノ酸配列である。
配列４は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＤヌクレオチド配列である。
配列５は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢヌクレオチド配列である。
配列６は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＣヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を結合して、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は単なる実例であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、当業者は、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができ、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入る。
本発明における用語「頭分」とは、豚に対して１頭当たりのワクチン注射量である。
本発明に記載されている「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）とは、５０％の細胞培養物を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す指標の一つである。
ＭＥＭ液体培地（液）は、アメリカＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入したＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、説明書により調製したものである。
本発明のＤＭＥＭ培地は、ＧＢ／Ｔ１８６４１−２００２付録Ａの調製方法により調製したものである。
本発明に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
【実施例１】
【００２３】
（ウイルスの採取・分離）
中国河南省からの豚ヘルペスウイルス感染が疑われるサンプルから、サンプルを分離して、豚の脳組織を無菌採取し、１：１０（体積比）でＭＥＭ培養液を加え、研磨し、組織懸濁液を調製した。凍結融解を３回繰り返した後、２０００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心し、上澄みを収集し、更に０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ＰＫ−１５細胞には３７℃で１時間継代培養し、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培養液に交換し、３７℃で５日培養した。ウイルスを含む培養液を獲得し、２回凍結融解した後、ウイルスを採集し、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培養液に交換した。豚ヘルペスウイルスＰＣＲ検出キット（北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）を利用して、豚ヘルペスウイルスを検査し、陽性という検査結果が得られた。分離したウイルスに対して、ＰＣＲキットを利用して、外来性ウイルスの検出（豚青耳病ウイルスＲＴ−ＰＣＲ検出キット、豚パルボウイルスＰＣＲ検出キット、豚コレラウイルスＲＴ−ＰＣＲ検出キットはいずれも北京世紀元亨動物防疫技術有限公司の製品である）を行い、ＰＣＲ検出結果がいずれも陰性であったので、純粋なウイルスシードであることを確認した。
分離して得られたヘルペスウイルスを寄託した。前記豚ヘルペスウイルス株はＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である。
【実施例２】
【００２４】
（分離したウイルスの遺伝形質）
遺伝子解析により、実施例１で分離したウイルスの遺伝形質を同定した。ＰＫ１５細胞で分離した豚ヘルペスウイルスゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表１に示されるプライマーを使用してＰＣＲを行った。それぞれＰｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ５．０を使用して、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子を増幅するためのプライマー配列を設計した。
抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、テンプレートＤＮＡ 100μg、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、２×ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ、上下流プライマーそれぞれ１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）４μｌを使用し、また、蒸留水を用いて体積が５０μｌとなるように、ＰＣＲ増幅系を製造した。二段階ＰＣＲ反応を行い、すなわち、９８℃で１０ｓｅｃ変性した後、６８℃でアニールして伸長させ（ｌｋｂ／ｍｉｎに基づき所要時間を計算する）、これを合計３０サイクルとした。４℃でＰＣＲ反応を停止させた。臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルにおいて電気泳動を行うことにより、得られたＰＣＲ産物を分析した。ＰＣＲ産物の配列を測定した。そして、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアにより、得られた配列データを解析した。
【００２５】
表１  ＰＣＲプライマー配列
【表１】
2016520294.tif 000003
【実施例３】
【００２６】
（ウイルスの病原性実験）
３．１  日齢の異なる子豚への病原性
３４〜３５日齢の豚オーエスキー病抗体陰性の子豚６頭をランダムに４頭／群（実験群）と２頭／群（対照群）との二つの群に分け、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（投与量が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭）を点鼻接種し、対照群に対して、ＤＭＥＭ培地を接種するとともに、４９日齢の子豚４頭に、寄託後３代培養した強毒型ＨＮ１２０１株（投与量が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭）を接種し、その対照群も３５日齢の子豚とした。ウイルス接種後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し。具体的な結果を表２に示す。
【００２７】
表２  豚ヘルペスウイルス強毒型ＨＮ１２０１株の日齢が異なる子豚への病原性
【表２】
2016520294.tif 000004
結果から分かるように、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を日齢の異なる子豚に接種することにより、子豚いずれも発病し、且つ、３／４以上の子豚が死亡することになった。
【００２８】
３．２  異なる接種量による子豚への病原性
４９日齢の豚ヘルペスウイルス抗体陰性の子豚８頭をランダムに４頭ずつで２群に分けて、別途に２頭の子豚を対照群とした。実験用の豚群では、それぞれ２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／頭と２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭の接種量で、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を点鼻接種し、対照群では、ＤＭＥＭ培地を接種した。ウイルス接種後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表３に示す。
【００２９】
表３  異なる接種量の豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の子豚への病原性
【表３】
2016520294.tif 000005
結果から分かるように、豚ヘルペスウイルス臨床分離ＨＮ１２０１を異なる接種量で４９日齢の子豚に接種することにより、子豚いずれも発病し、且つ４／４の子豚が死亡することになった。
【実施例４】
【００３０】
（豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンの製造）
表４に基づき、まず、分離したウイルス株の異なる世代の培養物をＰＫ−１５細胞培養物に接種してシードロットを形成し、次に、ウイルス培養液の１％（Ｖ／Ｖ）の量で単層となるＰＫ細胞培養物に接種し、３７℃で旋回培養し、病変が８０％となるときに、ウイルス細胞を含む培養液を獲得し、２回凍結融解した後、ウイルスを収集し、ウイルスの力価を測定した。異なる世代のウイルス液に１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液を添加して、ホルムアルデヒドの最終濃度を０．２％（Ｖ／Ｖ）とし、３７℃で１８時間不活化し、４時間毎に１０ｍｉｎ攪拌し、不活化した後、ウイルス液をＰＨ７．４のＰＢＳ液で表４に示されるウイルス含有量に希釈した。次に、２０６アジュバント（フランスＳＥＰＰＩＣ社製品）と体積比５４：４６で混合し、３０℃で１２０回転／分間で１５分間攪拌した。
【００３１】
表４  各群の豚オーエスキー病ワクチンの製造
【表４】
2016520294.tif 000006
【実施例５】
【００３２】
（不活化ワクチンの免疫原性実験）
２１日齢のＰＲＶ抗体陰性の子豚１６頭をランダムに４頭／群で４群に分けて、表４に基づきワクチンを注射し、不活化ワクチン注射群に対して、実施例４で製造した豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンを２ｍｌ／頭で注射し、対照ワクチンとして、ＣＮ１０１１８６９０２に開示された方法により製造した豚ヘルペスウイルス生ワクチンＳＡ２１５株を採用し、その説明書に記載される免疫原性測定方法に基づき使用し、対照群にＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／頭で接種した。免疫２８日後ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭であり、ウイルス接種後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した（結果を表５に示す）。
【００３３】
表５  免疫原性実験動物群
【表５】
2016520294.tif 000007
ワクチン免疫後、毎周、ＧＢ／Ｔ１８６４１−２００２の方法における血清中和実験の方法を参照して、不活化ワクチン群の中和抗体の力価を測定した。結果を表６に示す。
【００３４】
表６  豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンによる免疫を獲得した子豚の異なる時間での抗体状況
【表６】
2016520294.tif 000008
表６から分かるように、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後、より高い中和抗体を生成できて、また、免疫時間が経つにつれて上昇していた。
免疫２８日後、ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭であり、臨床症状と死亡状況を観察した結果を表７に示し、スチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定した結果を表８に示す。
【００３５】
表７  豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験状況
【表７】
2016520294.tif 000009
【００３６】
表８  豚ヘルペスウイルスワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験後の体温変化
【表８】
2016520294.tif 000010
表７と表８から分かるように、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後、ウイルス感染を抑制することはできない（臨床症状が出る）が、子豚への保護率は１００％（４／４）となる一方、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後に全部死亡した。従って、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンは良好な保護力を有する。また、対照群の生ワクチンに対して、不活化ワクチン免疫群の子豚の体温上昇時間がより短くて、食欲もほぼ正常であり、しかも臨床症状がほとんどなく、優れた免疫保護を示した。
【実施例６】
【００３７】
（豚ヘルペスウイルスｇＤタンパクの製造）
ｌ．ＰＲＶｇＤ遺伝子の増幅
良好に成長したＰＫ１５細胞にＰＲＶ  ＨＮ１２０１ウイルス或いは異なる世代の培養物（豚ヘルペスウイルス株がＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である）を接種した。当該異なる世代の培養物は５〜３５代以内の培養物であり、ウイルスを獲得した後、ＴＡＫＡＲＡ社のＭｉｎｉＢＥＳＴ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ／  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．０キットを使って、ＰＲＶゲノムＤＮＡを抽出した。１μlゲノムＤＮＡをテンプレートとして取り、ｇＤ特異性プライマーとしてｇＤＳＦ：５’ＡＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣ  ３’とｇＤＳＲ：５’ＣＴＡＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴＡＧ３’を使ってＰＣＲ増幅を行った。ＴＡＫＡＲＡのハイフィデリティー酵素Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ(R)ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、増幅条件は、９４℃  ３ｍｉｎ、９４℃  ３０ｓ、６８℃  ９０ｓ、３０ｃｙｃｌｅｓ、７２℃  ５ｍｉｎであった。ＰＣＲ産物の名称をｇＤとした。そのヌクレオチド配列をＳＥＱ  Ｎｏ．４で表し、そのアミノ酸配列がＳＥＱＮＯ．１であると導き出した。
【００３８】
２．組み換えＢａｃｍｉｄの獲得及び同定
ハイフィデリティー酵素により増幅して獲得したＰＣＲ産物ｇＤをｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、型番Ａ１１３３９）にクローンし、クローン系はＰＣＲ産物ｇＤ  ４μl、Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（塩溶液）１μl、ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ１μl、合計で６μlであった。それらを均一に混合し、室温で５ｍｉｎ培養して、Ｏｎｅ  ＳｈｏｔＲ  ＭａｃｈｌＴＭＴｌＲコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性プレートを塗布し、単クローン同定ｇＤ遺伝子の挿入方向を選別し、挿入方向が正しいプラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社へ送って配列を測定し、ｇＤ配列の正しさを同定した。配列が正しかったプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤと名づけた。
ｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤプラスミドで、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセル（由来）を形質転換し、ｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤとコンピテントセルにおけるシャトルプラスミドＢａｃｍｉｄを転位して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを利用して、獲得した組み換えプラスミドを抽出し、また、ｐＵＣＭ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ／ｐＵＣＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを使って、ｇＤの挿入を同定し、陽性ＢａｃｍｉｄをＢａｃｍｉｄ−ｇＤと名づけた。
【００３９】
３．トランスフェクションによる組み換えバキュロウイルスの獲得
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  ＨＢＭ  ＴＯＰＯ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの明細書に提供される方法により行った。６ウェルプレートには、１ウェルあたりに、８×１０５個ｓｆ９細胞を播種し、細胞が壁に付着した後、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩトランスフェクション試薬の説明書に基づき、トランスフェクションを行った。８μｌ  Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩと1μｇＢａｃｍｉｄ−ｇＤ  ＤＮＡをそれぞれ100ｕｌ  ＳＦ−９００  ＩＩ培地に希釈して、Ｖｏｒｔｅｘで均一に混合し、希釈したＤＮＡと希釈したＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩを混合し（総体積が２１０μｌとなる）、均一に混合し、室温で１５〜３０ｍｉｎ培養し、一滴ずつ細胞に滴下した。トランスフェクション７２時間後、細胞病変が現れた後に、細胞培養の上澄みを採集して、Ｐ０代組み換えウイルスｖＢａｃ−ｇＤと記した。Ｐ０代組み換えウイルスｖＢａｃ−ｇＤでｓｆ細胞を感染し、３代増幅培養した後に、Ｐ３代ｖＢａｃ−ｇＤを獲得して、組み換えタンパクの発現に用いられた。
【００４０】
４．組み換えバキュロウイルスでＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞を感染することによる組み換えタンパクの獲得
Ｐ３代組み換えバキュロウイルスｖＢａｃ−ｇＤをＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入し、型番Ｂ８５５０２）に接種した。５００ｍｌ三角フラスコにＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞を、細胞密度が７．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌになるまでに懸濁培養し、１ＭＯＩの量でウイルスを接種し、感染７２時間後に、細胞培養上澄みを採集した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのタンジェント流ろ過システムを利用して、体積が最初体積の１／１０となるように濃縮した。１％（体積比）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｓｉｇｍａより購入）を使ってバキュロウイルスを不活化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ光密度法により測定した結果、タンパク含有量が２０（ｇ／ｍｌ）であった。
【実施例７】
【００４１】
（豚ヘルペスウイルスｇＤサブユニットワクチンの製造）
実施例６で製造したサブユニット抗原を、ＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で、表９に記載される体積に希釈し、２０６アジュバント（法国ＳＥＰＰＩＣ社の製品）と体積比５４：４６で混合し、３０℃に１２０回転／分間で１５分間攪拌した。
【００４２】
表９  各群の豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンの製造
【表９】
2016520294.tif 000011
【実施例８】
【００４３】
（ワクチンの豚に対する免疫原性実験）
２１日齢のＰＲＶ抗体陰性の子豚１２頭を４頭／群でランダムに３群に分けて、表２により実施例２で製造したワクチンを注射し、２ｍｌ／頭の量で豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンを接種した。対照群に２ｍｌ／頭でＤＭＥＭ培地を接種した。免疫２８日後、ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭であり、スチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した（結果を表１０に示す）。
【００４４】
表１０  免疫原性実験動物群
【表１０】
2016520294.tif 000012
免疫２８日後ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭分である。臨床症状と死亡状況を観察した結果を表１１に示し、スチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定した結果を表１２に示す。
【００４５】
表１１  豚ヘルペスウイルススサブユニットワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験状況
【表１１】
2016520294.tif 000013
【００４６】
表１２  豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験後の体温変化
【表１２】
2016520294.tif 000014
【００４７】
表１１と表１２から分かるように、豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後に、ウイルス感染を抑制することができない（臨床症状が現れる）が、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後に全部死亡したに対して、子豚への免疫保護率は１００％（４／４）となり、良好な免疫保護を示している。
【００４８】
以上の記載は単に本発明の好ましい実施例であるだけで、本発明を限定するものではない。本発明の主旨と原則の範囲内に行われる修正、等価置換、改良などはいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
2016520294.tif 000015
【図２】
2016520294.tif 000016
【配列表】
2016520294000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月29日(2015.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｌで表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。  
【請求項２】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項３】
実質上、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＤ糖タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株。
【請求項５】
配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＢ糖タンパク質を有する請求項４に記載の豚ヘルペスウイルス株。
【請求項６】
ＨＮ１２０１株又はその培養物であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である請求項５に記載の豚ヘルペスウイルス株。
【請求項７】
免疫量の請求項４〜６のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ペプチドワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含むワクチン組成物。
【請求項８】
免疫量の前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ペプチドワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の不活化ワクチンを含む請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物のｇＤタンパク抗原を２５〜１００μｇ／ｄｏｓｅで含む請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
更に媒体、アジュバント、賦形剤を含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載のワクチン組成物を製造する方法であって、前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株又はその培養物を増殖して培養し、不活化し、アジュバントを添加して、均一に攪拌することを含む。
【請求項１３】
請求項８に記載のワクチン組成物を製造する方法であって、  （１）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク組み換え遺伝子をクローンすること、  （２）前記豚ヘルペスウイルスｇＤ組み換えタンパクを発現すること、  （３）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク抗原にアジュバントを一定の比率で混合し、乳化することを含む。
【請求項１４】
豚ヘルペスウイルスに起因する疾病の予防治療薬を製造するための請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はワクチン組成物に関し、動物ウイルス学分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】  オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科に属する豚ヘルペスウイルスＩ型（Ｓｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｓｔｒａｉｎ）感染を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で引き起こされ、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、わが国で広く存在しており、その被害が深刻化し、大規模養豚場の生産を妨害する主な疫病の一つである。豚オーエスキー病を感染すると、妊娠母豚では、流産、死産又はミイラ胎児が発生し、また、子豚では、神経症状、まひが発生し、死亡率が高い。ＰＲＶは強い向汎性、神経向性及び潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏しているウイルスが活性化され、感染力を持つウイルスになると、潜伏感染されている宿主は発病することになる。【０００３】  これまでの研究で、サブユニットワクチンにより免疫動物を保護できることが分かってきた。サブユニットワクチンは遺伝子工学によって病原体の保護性抗原遺伝子を原核発現系或いは真核発現系にクローンし、効果的に発現させて製造したワクチンである。現在、ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤは、いずれも有機体に中和抗体を生じさせることができることが分かり、それらの抗体は、体内でも、体外でも、また、補体の有無にかかわらず、ＰＲＶ中和能を有する。非特許文献１には、既知の１１種類のヘルペスウイルス糖タンパク質において、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤはいずれも有機体に中和抗体を生じさせることが開示される。補体が関与しない場合、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤのモノクローナル抗体はＰＲＶを中和できる。豚と小鼠にｇＢ、ｇＣ、ｇＤのモノクローナル抗体を注射すると、いずれも、強毒型ＰＲＶの攻撃を抵抗できる。従って、ＰＲＶサブユニットワクチンの研究に対して、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤは第一選択タンパク質である。糖タンパク質ｇＤは重要な中和抗原であり、保護性抗体の主な目標でもあり、良好な保護反応を誘導させることができる。特許文献１と特許文献２には、豚ヘルペスウイルスのｇＤタンパクを利用して豚オーエスキー病を予防するためのワクチンを製造できることが開示される。【０００４】  豚ＰＲＶはただ一つの血清型があり、一般的には、ウイルス株の交差保護力が強いと考えられているが、現在、商品化されたワクチンを子豚に注射した後、典型的な豚オーエスキー病が発病し、たとえば、体温が長時間にわたって上昇したり、意気消沈、食欲不振が持続したり、呼吸器及び／又は神経症状が出たりすることがある。目立つ現象として、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液���質が低下し、妊娠する母豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状を引き起こす。従来のワクチンを接種した豚は、野生ウイルスの攻撃に完全には抵抗できず、依然として、高熱、意気消沈、食欲不振又は絶食などの症状が出る。感染率は８０％を超え、発病率は３０％を超え、死亡率は１０％〜２０％の範囲である。      従来技術において、豚ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６８５８３８５号
【特許文献２】米国特許第６５２１２３１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「オーエスキー病サブユニットワクチンの研究進展」（楊承槐、▲ろう▼高明、▲しん▼南輝《江西畜牧獣医雑誌》２００４年第３期）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従来技術の問題点を解決するために、本発明は、動物実験で豚オーエスキー病に対して良い免疫作用を備えるワクチンを製造するための豚ヘルペスウイルス株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。  本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。  本発明は、実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で表されるタンパクをコードする、ヌクレオチド配列を提供する。  本出願において、「ヌクレオチド配列」とは、転写されて対応のＲＮＡ配列を得られるＤＮＡ配列である。  従来技術の問題点を解決するために、本発明は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＤ糖タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株を提供することを主目的とする。  本発明における「ｇＤ糖タンパク質」とは、豚ヘルペスウイルスが感染するのに必要な構造タンパク質であり、成熟ウイルス粒子の膜表面の主な糖タンパク質の一つであり、ｇｐ５０タンパクとも呼ばれる。【０００９】  本発明における「相同性」とは、本出願では、二本のアミノ酸配列或いは二本のヌクレオチド配列の類似度である。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、本分野において公知の方法のうち、いずれかの適当な方法によって算出される。たとえば、目標となるアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列と参照アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列について、配列照合を行って、必要に応じて照合する二本の配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の数を最適化するように欠失を入れる上に、二本のアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の間に同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の百分率を算出することができる。【００１０】  アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の照合と相同性の計算は、本分野で既知のソフトウェア、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェア（ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）から入手可能、或いは、たとえば、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スイスバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能、或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，���．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）を参照）によって実現できるが、それに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合する際に、ソフトウェアの既定パラメーターを使用してもよく、または実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整してもよく、それはすべて当業者の知識範囲内にある。【００１１】  好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス株は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で表されるヌクレオチド配列によってコードされるｇＢ糖タンパク質を有する。  好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のアミノ酸配列のｇＢ糖タンパク質を有する。  好ましくは、本発明に係る上記の豚ヘルペスウイルスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のアミノ酸配列のｇＣ糖タンパク質を有する。  好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス株はＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）或いはその培養物であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である。  上記の「培養物」とは、ウイルスの異なる世代の継代培養物であり、当業者は、異なる世代の遺伝子配列の間には、わずかな変異しか起こらないことが分かっている。上記培養物は、５〜３５代以内の培養物であることが好ましい。【００１２】  本発明のもう一つの目的は、豚ヘルペスウイルスのワクチン組成物を提供することである。前記ワクチン組成物は、免疫量の前記豚ヘルペスウイルス株の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ペプチドワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む。  好ましくは、前記ワクチン組成物は、免疫量の前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、合成ペプチドワクチン或いは遺伝子工学ワクチンを含む。  好ましくは、本発明のワクチン組成物は、前記豚ヘルペスウイルス或いはその抗原を活性成分として含む。ワクチン組成物に用いられる豚ヘルペスウイルスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列或いはそれと９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるｇＤ糖タンパク質を有する。  好ましくは、前記ワクチン組成物の豚ヘルペスウイルスは、ＨＮ１２０１株或いはその培養物である。【００１３】  本発明に用いられる抗原はウイルス組成成分における抗原部分であり、免疫応答を引き起こし、且つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列のｇＤ糖タンパク質を有する。  抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のアミノ酸配列或いはその断片と９５％以上のヌクレオチド相同性を有するｇＢタンパクを含んでも良い。  抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のアミノ酸配列或いはその断片と９５％以上のヌクレオチド相同性を有するｇＣタンパクを含んでも良い。  本発明における「生ワクチン」とは、毒性を弱めたが、宿主の体内或いは細胞に複製できるウイルスから製造されたワクチンである。本発明における「弱毒化」という用語は、病原体が病原性を失ったが、免疫原性を保持するように、遺伝子を突然変異して人工的に病原体の毒性を低下させることである。一般的には、ＵＶ��射、化学処理或いは体外連続高次継代培養によって病原体毒性を弱める弱毒化を実現する。人工的に遺伝子を変更し、たとえば既知の配列における特定のヌクレオチドを欠失させて毒性を弱める。  かかる「不活化ワクチン」とは、失活ワクチンとも呼ばれ、抗原として免疫力を生じさせる不活化ウイルスの懸濁液である。不活化ワクチンの例として、ホールウイルスワクチン（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）とスプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）が含まれる。既知の方法を用いて、不活化ワクチンを容易に生成できる。たとえば、ホルムアルデヒド溶液でウイルスを処理することにより、ホールウイルス不活化ワクチンが得られる。スプリットワクチンは、エーテルで処理した後、ウイルスによりエンベロープして製造される。【００１４】  「サブユニットワクチン」とは、遺伝子工学方法により、病原体の保護性抗原の遺伝子を原核或いは真核発現系にクローンして、効果的に発現させて製造したワクチンである。サブユニットワクチンは、ホールウイルスワクチンよりも、副反応を引き起こす可能性が低い。たとえば、発現した豚ヘルペスウイルスのｇＤ或いはｇＣタンパクはサブユニットワクチンの製造に用いられる。  「合成ペプチドワクチン」とは、免疫決定基の組成成分のみを含む小ペプチドであり、即ち、天然タンパク質のアミノ酸配列に従って保護性短ペプチドを人工的に合成して、ベクターと接続した後、アジュバントを添加して製造したワクチンである。  好ましくは、前記ワクチン組成物は１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物の不活化ワクチンを含む。  好ましくは、本発明に係わるワクチン組成物は１０６．０ＴＣＩＤ５０／頭の量で豚ヘルペスウイルスを含有する。豚ヘルペスウイルスを１０６．０ＴＣＩＤ５０未満の量で使用する時は、ワクチンは有効的に刺激して抗体を生じさせることができない。一方、それ以上の量は不経済である。  好ましくは、前記ワクチン組成物は２５〜１００μｇ／ｄｏｓｅで豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株或いはその培養物のｇＤタンパク抗原を含む。  また、本発明に係わる豚ヘルペスウイルスを他の不活化病原体又は抗原と組み合わせて使用し、豚オーエスキー病を含む各種類の疾病を抵抗するための混合ワクチン又は複合ワクチンを製造できる。本発明における「混合ワクチン」とは、本発明の豚ヘルペスウイルスと少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンである。【００１５】  「複合ワクチン」とはウイルスと細菌から製造したワクチンである。たとえば、本発明の豚ヘルペスウイルスを豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合するあるいは組み合わせることができる。  好ましくは、前記ワクチン組成物は媒体、アジュバント、賦形剤をさらに含有する。  本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。ワクチン組成物に用いられるアジュバントの例として、フロイントの不完全アジュバント或いは完全アジュバント、水酸化アル���ニウムゲル、植物油或いは鉱物油などが挙げられる。賦形剤の例として、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと硫酸アルミニウムカリウムが挙げられるが、それに限定されない。実際に、ワクチンの製造に用いられる当業者にとって既知のあらゆる物質はいずれも本発明のワクチン組成物に適用できる。【００１６】  本発明のもう一つの目的は、前記豚ヘルペスウイルス株ＨＮ１２０１株を増殖して培養し、不活化し、アジュバントを添加して、均一に攪拌することを含む、前記ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。  具体的には、前記方法は、（１）豚ヘルペスウイルスワクチン株をそれぞれの感受性細胞に接種して、接種後の前記感受性細胞を培養し、細胞培養物を得る。  （２）ホルムアルデヒド溶液、ＢＰＬ（β−プロピオラクトン）或いはＢＥＩ（ジエチレンイミン）を用いて、工程（１）で得られたウイルスを処理する。  前記感受性細胞は継代細胞系であってもよく、初代細胞であってもよい。豚ヘルペスウイルスに適する感受性細胞として、ＳＴ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ＰＫ−１５細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）、アフリカミドリザルの腎臓細胞由来のＭａｒｃ−１４５細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、牛腎臓細胞由来のＭＤＢＫ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ鼻甲介継代細胞由来のＢＴ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、Ｖｅｒｏ細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、ＢＨＫ−２１細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）、豚腎臓継代細胞系（例えばＩＢＲＳ−２、ＤＥＣＡＳＴＲＯ，Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＢ−ＲＳ−２ｓｗｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞系（ＲＫ、例えばＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）などの継代細胞系、又はニワトリ胚線維芽細胞と豚腎臓細胞などの初代細胞が挙げられるが、それらに限定されない。初代細胞は、本分野に既知の方法で、動物生体内の組織を用いて分離して製造することができる。  本発明に係るワクチン組成物は経口投与剤又は非経口投与剤として製造される。経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻或いは硬膜外に投与される非経口投与剤であることが好ましい。【００１７】  本発明のもう一つの目的は、（１）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク組み換え遺伝子をクローンすること、（２）前記豚ヘルペスウイルスｇＤ組み換えタンパクを発現すること、（３）前記豚ヘルペスウイルスｇＤタンパク抗原にアジュバントを一定の比率で混合し、乳化することを含む、前記ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。  本発明のまた一つの目的は、豚ヘルペスウイルスに起因する疾病の予防治療薬を製造するための前記ワクチン組成物の使用を提供する。  本明細書中に用いられる「豚ヘルペスウイルス感染に起因する疾病」という用語は、豚ヘルペスウイルスを感染して罹患される疾病を意味として用いられる。その例として、発病した子豚は明らかな神経症状、昏睡、��き、嘔吐、下痢、体温上昇などの症状を示し、一旦発病すると、妊娠する母豚は流産し、ミイラ胎児又は死産胎を産出し、又は繁殖障害が引き起こされるが、それに限定されない。【００１８】  本明細書中に用いられる用語「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」は、以下の症状を示す意味としても用いられることがある。どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠する母豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が１４日齢になる前に全部死亡）するなどの生殖障害症状が出る。ただし、それらに限定されものではない。【００１９】  上記の症状と従来技術において普通の豚ヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染された成熟豚（体重が５０ｋｇ以上の豚である）は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、水泳のように引き、最後に不全による死亡に至ることである。初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上に上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることである。また、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などを示す呼吸系症状である。  本明細書中に用いられる用語「予防」とは、本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるようなすべての行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするようなすべての行為である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨＮ１２０１株ｇＣアミノ酸配列とＳＡ２１５株ｇＣアミノ酸配列との相同性の分析結果を示す図である。
【図２】ＨＮ１２０１株ｇＤアミノ酸配列とＳＡ２１５株ｇＤアミノ酸配列との相同性の分析結果を示す図である。
【００２１】  なお、配列表において：  配列１は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＤアミノ酸配列である。  配列２は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢアミノ酸配列である。  配列３は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＣアミノ酸配列である。  配列４は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＤヌクレオチド配列である。  配列５は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢヌクレオチド配列である。  配列６は、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＣヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】  以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を結合して、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は単なる実例であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、当業者は、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができ、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入る。  本発明における用語「頭分」とは、豚に対して１頭当たりのワクチン注射量である。  本発明に記載されている「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）とは、５０％の細胞培養物を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す指標の一つである。  ＭＥＭ液体培地（液）は、アメリカＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入したＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、説明書により調製したものである。  本発明のＤＭＥＭ培地は、ＧＢ／Ｔ１８６４１−２００２付録Ａの調製方法により調製したものである。  本発明に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
【実施例１】
【００２３】  （ウイルスの採取・分離）  中国河南省からの豚ヘルペスウイルス感染が疑われるサンプルから、サンプルを分離して、豚の脳組織を無菌採取し、１：１０（体積比）でＭＥＭ培養液を加え、研磨し、組織懸濁液を調製した。凍結融解を３回繰り返した後、２０００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心し、上澄みを収集し、更に０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ＰＫ−１５細胞には３７℃で１時間継代培養し、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培養液に交換し、３７℃で５日培養した。ウイルスを含む培養液を獲得し、２回凍結融解した後、ウイルスを採集し、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培養液に交換した。豚ヘルペスウイルスＰＣＲ検出キット（北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）を利用して、豚ヘルペスウイルスを検査し、陽性という検査結果が得られた。分離したウイルスに対して、ＰＣＲキットを利用して、外来性ウイルスの検出（豚青耳病ウイルスＲＴ−ＰＣＲ検出キット、豚パルボウイルスＰＣＲ検出キット、豚コレラウイルスＲＴ−ＰＣＲ検出キットはいずれも北京世紀元亨動物防疫技術有限公司の製品である）を行い、ＰＣＲ検出結果がいずれも陰性であったので、純粋なウイルスシードであることを確認した。  分離して得られたヘルペスウイルスを寄託した。前記豚ヘルペスウイルス株はＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である。
【実施例２】
【００２４】  （分離したウイルスの遺伝形質）  遺伝子解析により、実施例１で分離したウイルスの遺伝形質を同定した。ＰＫ１５細胞で分離した豚ヘルペスウイルスゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表１に示されるプライマーを使用してＰＣＲを行った。それぞれＰｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ５．０を使用して、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子を増幅するためのプライマー配列を設計した。  抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、テンプレートＤＮＡ 100μg、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、２×ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ、上下流プライマーそれぞれ１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）４μｌを使用し、また、蒸留水を用いて体積が５０μｌとなるように、ＰＣＲ増幅系を製造した。二段階ＰＣＲ反応を行い、すなわち、９８℃で１０ｓｅｃ変性した後、６８℃でアニールして伸長させ（ｌｋｂ／ｍｉｎに基づき所要時間を計算する）、これを合計３０サイクルとした。４℃でＰＣＲ反応を停止させた。臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルにおいて電気泳動を行うことにより、得られたＰＣＲ産物を分析した。ＰＣＲ産物の配列を測定した。そして、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアにより、得られた配列データを解析した。【００２５】  表１  ＰＣＲプライマー配列【表１】
2016520294.tif 000017
【実施例３】
【００２６】  （ウイルスの病原性実験）  ３．１  日齢の異なる子豚への病原性  ３４〜３５日齢の豚オーエスキー病抗体陰性の子豚６頭をランダムに４頭／群（実験群）と２頭／群（対照群）との二つの群に分け、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（投与量が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭）を点鼻接種し、対照群に対して、ＤＭＥＭ培地を接種するとともに、４９日齢の子豚４頭に、寄託後３代培養した強毒型ＨＮ１２０１株（投与量が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭）を接種し、その対照群も３５日齢の子豚とした。ウイルス接種後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し。具体的な結果を表２に示す。【００２７】  表２  豚ヘルペスウイルス強毒型ＨＮ１２０１株の日齢が異なる子豚への病原性【表２】
2016520294.tif 000018
結果から分かるように、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を日齢の異なる子豚に接種することにより、子豚いずれも発病し、且つ、３／４以上の子豚が死亡することになった。
【００２８】  ３．２  異なる接種量による子豚への病原性  ４９日齢の豚ヘルペスウイルス抗体陰性の子豚８頭をランダムに４頭ずつで２群に分けて、別途に２頭の子豚を対照群とした。実験用の豚群では、それぞれ２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／頭、あるいは２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭の接種量で、豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を点鼻接種し、対照群では、ＤＭＥＭ培地を接種した。ウイルス接種後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表３に示す。【００２９】      表３  異なる接種量の豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の子豚への病原性【表３】
2016520294.tif 000019
結果から分かるように、豚ヘルペスウイルス臨床分離ＨＮ１２０１を異なる接種量で４９日齢の子豚に接種することにより、子豚いずれも発病し、且つ４／４の子豚が死亡することになった。
【実施例４】
【００３０】  （豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンの製造）  表４に基づき、まず、分離したウイルス株の異なる世代の培養物をＰＫ−１５細胞培養物に接種してシードロットを形成し、次に、ウイルス培養液の１％（Ｖ／Ｖ）の量で単層となるＰＫ細胞培養物に接種し、３７℃で旋回培養し、病変が８０％となるときに、ウイルス細胞を含む培養液を獲得し、２回凍結融解した後、ウイルスを収集し、ウイルスの力価を測定した。異なる世代のウイルス液に１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液を添加して、ホルムアルデヒドの最終濃度を０．２％（Ｖ／Ｖ）とし、３７℃で１８時間不活化し、４時間毎に１０ｍｉｎ攪拌し、不活化した後、ウイルス液をＰＨ７．４のＰＢＳ液で表４に示されるウイルス含有量に希釈した。次に、２０６アジュバント（フランスＳＥＰＰＩＣ社製品）と体積比５４：４６で混合し、３０℃で１２０回転／分間で１５分間攪拌した。【００３１】    表４  各群の豚オーエスキー病ワクチンの製造【表４】
2016520294.tif 000020
【実施例５】
【００３２】  （不活化ワクチンの免疫原性実験）  ２１日齢のＰＲＶ抗体陰性の子豚１６頭をランダムに４頭／群で４群に分けて、表５に基づきワクチンを注射し、不活化ワクチン注射群に対して、実施例４で製造した豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンを２ｍｌ／頭で注射し、対照ワクチンとして、ＣＮ１０１１８６９０２に開示された方法により製造した豚ヘルペスウイルス生ワクチンＳＡ２１５株を採用し、その説明書に記載される免疫原性測定方法に基づき使用し、対照群にＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／頭で接種した。【００３３】    表５  免疫原性実験動物群【表５】
2016520294.tif 000021
ワクチン免疫後、毎周、ＧＢ／Ｔ１８６４１−２００２の方法における血清中和実験の方法を参照して、不活化ワクチン群の中和抗体の力価を測定した。結果を表６に示す。
【００３４】  表６  豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンによる免疫を獲得した子豚の異なる時間での抗体状況【表６】
2016520294.tif 000022
表６から分かるように、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後、より高い中和抗体を生成できて、また、免疫時間が経つにつれて上昇していた。  免疫２８日後、ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭であり、臨床症状と死亡状況を観察した結果を表７に示し、ウイルススチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定した結果を表８に示す。
【００３５】  表７  豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験状況【表７】
2016520294.tif 000023
【００３６】  表８  豚ヘルペスウイルスワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験後の体温変化【表８】
2016520294.tif 000024
表７と表８から分かるように、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後、ウイルス感染を抑制することはできない（臨床症状が出る）が、子豚への保護率は１００％（４／４）となる一方、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後に全部死亡した。従って、豚ヘルペスウイルス不活化ワクチンは良好な保護力を有する。また、対照群の生ワクチンに対して、不活化ワクチン免疫群の子豚の体温上昇時間がより短くて、食欲もほぼ正常であり、しかも臨床症状がほとんどなく、優れた免疫保護を示した。
【実施例６】
【００３７】  （豚ヘルペスウイルスｇＤタンパクの製造）  ｌ．ＰＲＶｇＤ遺伝子の増幅  良好に成長したＰＫ１５細胞にＰＲＶ  ＨＮ１２０１ウイルス或いは異なる世代の培養物（豚ヘルペスウイルス株がＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＨＮ１２０１）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ  ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託場所は湖北省武漢市武漢大学であり、寄託日は２０１３年５年２０日である）を接種した。当該異なる世代の培養物は５〜３５代以内の培養物であり、ウイルスを獲得した後、ＴＡＫＡＲＡ社のＭｉｎｉＢＥＳＴ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ／  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．０キットを使って、ＰＲＶゲノムＤＮＡを抽出した。１μlゲノムＤＮＡをテンプレートとして取り、ｇＤ特異性プライマーとしてｇＤＳＦ：５’ＡＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣ  ３’とｇＤＳＲ：５’ＣＴＡＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴＡＧ３’を使ってＰＣＲ増幅を行った。ＴＡＫＡＲＡのハイフィデリティー酵素Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ(R)ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、増幅条件は、９４℃  ３ｍｉｎ、９４℃  ３０ｓ、６８℃  ９０ｓ、３０ｃｙｃｌｅｓ、７２℃  ５ｍｉｎであった。ＰＣＲ産物の名称をｇＤとした。そのヌクレオチド配列をＳＥＱ  Ｎｏ．４で表し、そのアミノ酸配列がＳＥＱＮＯ．１であると導き出した。【００３８】  ２．組み換えＢａｃｍｉｄの獲得及び同定  ハイフィデリティー酵素により増幅して獲得したＰＣＲ産物ｇＤをｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、型番Ａ１１３３９）にクローンし、クローン系はＰＣＲ産物ｇＤ  ４μl、Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（塩溶液）１μl、ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ１μl、合計で６μlであった。それらを均一に混合し、室温で５ｍｉｎ培養して、Ｏｎｅ  ＳｈｏｔＲ  ＭａｃｈｌＴＭＴｌＲコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性プレートを塗布し、単クローン同定ｇＤ遺伝子の挿入方向を選別し、挿入方向が正しいプラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社へ送って配列を測定し、ｇＤ配列の正しさを同定した。配列が正しかったプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤと名づけた。  ｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤプラスミドで、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセル（由来）を形質転換し、ｐＦａｓｔＢａｃ／ＨＢＭ−ＴＯＰＯ−ｇＤとコンピテントセルにおけるシャトルプラスミドＢａｃｍｉｄを転位して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを利用して、獲得した組み換えプラスミドを抽出し、また、ｐＵＣＭ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ／ｐＵＣＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを使って、ｇＤの挿入を同定し、陽性ＢａｃｍｉｄをＢａｃｍｉｄ−ｇＤと名づけた。【００３９】  ３．トランスフェクションによる組み換えバキュロウイルスの獲得  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  ＨＢＭ  ＴＯＰＯ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの明細書に提供される方法により行った。６ウェルプレートには、１ウェルあたりに、８×１０５個ｓｆ９細胞を播種し、細胞が壁に付着した後、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩトランスフェクション試薬の説明書に基づき、トランスフェクションを行った。８μｌ  Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩと1μｇＢａｃｍｉｄ−ｇＤ  ＤＮＡをそれぞれ100ｕｌ  ＳＦ−９００  ＩＩ培地に希釈して、Ｖｏｒｔｅｘで均一に混合し、希釈したＤＮＡと希釈したＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩを混合し（総体積が２１０μｌとなる）、均一に混合し、室温で１５〜３０ｍｉｎ培養し、一滴ずつ細胞に滴下した。トランスフェクション７２時間後、細胞病変が現れた後に、細胞培養の上澄みを採集して、Ｐ０代組み換えウイルスｖＢａｃ−ｇＤと記した。Ｐ０代組み換えウイルスｖＢａｃ−ｇＤでｓｆ細胞を感染し、３代増幅培養した後に、Ｐ３代ｖＢａｃ−ｇＤを獲得して、組み換えタンパクの発現に用いられた。【００４０】  ４．組み換えバキュロウイルスでＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞を感染することによる組み換えタンパクの獲得  Ｐ３代組み換えバキュロウイルスｖＢａｃ−ｇＤをＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入し、型番Ｂ８５５０２）に接種した。５００ｍｌ三角フラスコにＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ細胞を、細胞密度が７．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌになるまでに懸濁培養し、１ＭＯＩの量でウイルスを接種し、感染７２時間後に、細胞培養上澄みを採集した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのタンジェント流ろ過システムを利用して、体積が最初体積の１／１０となるように濃縮した。１％（体積比）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｓｉｇｍａより購入）を使ってバキュロウイルスを不活化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ光密度法により測定した結果、タンパク含有量が２０（ｇ／ｍｌ）であった。
【実施例７】
【００４１】  （豚ヘルペスウイルスｇＤサブユニットワクチンの製造）  実施例６で製造したサブユニット抗原を、ＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で、表９に記載されるタンパク含有量に希釈し、２０６アジュバント（法国ＳＥＰＰＩＣ社の製品）と体積比５４：４６で混合し、３０℃に１２０回転／分間で１５分間攪拌した。【００４２】    表９  各群の豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンの製造【表９】
2016520294.tif 000025
【実施例８】
【００４３】  （ワクチンの豚に対する免疫原性実験）  ２１日齢のＰＲＶ抗体陰性の子豚１２頭を４頭／群でランダムに３群に分けて、表１０により実施例２で製造したワクチンを注射し、２ｍｌ／頭の量で豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンを接種した。対照群に２ｍｌ／頭でＤＭＥＭ培地を接種した。【００４４】    表１０  免疫原性実験動物群【表１０】
2016520294.tif 000026
免疫２８日後ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量は豚ＨＮ１２０１株が２×１０８．０ＴＣＩＤ５０／頭分である。臨床症状と死亡状況を観察した結果を表１１に示し、スチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定した結果を表１２に示す。
【００４５】  表１１  豚ヘルペスウイルススサブユニットワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験状況【表１１】
2016520294.tif 000027
【００４６】  表１２  豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンによる免疫を獲得した子豚のウイルスチャレンジ実験後の体温変化【表１２】
2016520294.tif 000028
【００４７】  表１１と表１２から分かるように、豚ヘルペスウイルスサブユニットワクチンにより子豚に免疫を獲得させた後に、ウイルス感染を抑制することができない（臨床症状が現れる）が、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後に全部死亡したに対して、子豚への免疫保護率は１００％（４／４）となり、良好な免疫保護を示している。【００４８】  以上の記載は単に本発明の好ましい実施例であるだけで、本発明を限定するものではない。本発明の主旨と原則の範囲内に行われる修正、等価置換、改良などはいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【国際調査報告】
2016520294.tif 000029
2016520294.tif 000030
2016520294.tif 000031
2016520294.tif 000032
2016520294.tif 000033
2016520294.tif 000034