(57)【要約】  グリコシルヒドロラーゼ酵素の変異体、具体的には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の特定のオキシドレダクターゼの変異体が開示されている。グリコシルヒドロラーゼの変異体をコードする核酸、グリコシルヒドロラーゼの変異体を含む組成物、変異体を産生する方法及び変異体を使用する方法も記載されている。
2016533741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上した性質を少なくとも１つ有し、前記少なくとも１つの有意に向上した性質は、有意に高い融解温度（Ｔｍ）、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、有意に向上したタンパク質産生性、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異体。
【請求項２】
前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に高い融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイ及び希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体は、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ３１６Ｆ、Ｓ２９７Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体は、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体は、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｎ３１５Ｗ、Ｔ３０３Ｇ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体は、Ｈ２００Ａ、Ｓ１８５Ｄ、Ｐ３１６Ａ、Ｎ５１Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上したタンパク質産生性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体は、Ｖ８０Ｔ、Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｔ１０８Ｋ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ、Ａ１２９Ｎ、Ａ１６８Ｋ、Ａ１６Ｎ、Ａ２０１Ｄ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｍ、Ｇ２３５Ｋ、Ｇ２３５Ｌ、Ｇ２３５Ｓ、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｇ２９８Ｃ、Ｇ３０１Ｐ、Ｈ２００Ａ、Ｋ１０６Ｃ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｅ、Ｋ７０Ｌ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｓ、Ｌ２９０Ａ、Ｌ２９０Ｍ、Ｎ１０Ｄ、Ｎ３１５Ｗ、Ｎ５１Ｅ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｆ、Ｐ５２Ｆ、Ｑ１６７Ｋ、Ｑ３２０Ａ、Ｑ３２０Ｐ、Ｑ３２０Ｓ、Ｒ３０４Ｄ、Ｒ３０４Ｐ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１８５Ｄ、Ｓ１８７Ｄ、Ｓ２９７Ｃ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ３００Ｔ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｍ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｑ、Ｔ１０８Ａ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｔ２８７Ａ、Ｔ３０３Ｇ、Ｔ３０３Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ８０Ｔ、Ｙ２９１Ｆ、Ｙ２９１Ｗ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体は、１〜１０個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体は、組み合わせ変異体である、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１５】
前記親ＧＨ６１ポリペプチドは、真菌グリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記真菌ＧＨ６１Ａは、ヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ  ｓｐ．）、及びシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）に由来する、請求項１５に記載の変異体。。
【請求項１７】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１８】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の親ＧＨ６１ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２１】
前記ベクターは、発現ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１９に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載のベクター、又は請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞は、真菌細胞又は細菌細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記真菌細胞は、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハザリウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される糸状菌細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、又は前記発現ベクターによりコードされた親ＧＨ６１ポリペプチドの前記変異体を発現する、請求項２２、２３又は２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ＧＨ６１ポリペプチドの変異体を産生する方法であって、前記変異体を産生するのに好適な条件下において、好適な培地にて、請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２７】
前記産生した変異体を単離することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＧＨ６１変異体を含む、組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、洗剤、飼料、飼料添加物、及び細胞培養上清からなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物において、前記ＧＨ６１変異体が富化されている、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３１】
セルロース基質を加水分解する方法であって、前記基質を、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、全て２０１３年７月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／８５９，６３０号、同第６１／８５９，６６６号、同第６１／８５９，６８０号、同第６１／８５９，７０４号、同第６１／８５９，７１２号、同第６１／８５９，７２１号、及び同第６１／８５９，７３５号の優先権を主張し、これら全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は概ね、グリコシルヒドロラーゼ酵素の変異体、具体的には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の特定のオキシドレダクターゼの変異体に関する。グリコシルヒドロラーゼの変異体をコードする核酸、グリコシルヒドロラーゼの変異体を含む組成物、変異体を産生する方法及び変異体を使用する方法も記載されている。
【０００３】
（政府の権利）
本発明は、エネルギー省（Department of Energy）により承認された条件付き承認第Ｄｅ−Ｆｃ３６−０８ｇｏ１８０７８号に基づいた政府支援により行われた。政府は、この発明に対して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成により生成される最も豊富な植物材料である。これらは、ポリマー基質を加水分解してモノマー糖にすることができる細胞外酵素を産生する細菌、酵母及び真菌を含む多数の微生物により分解され、エネルギー源として使用することができる（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年）。非再生可能資源が限界に近づきつつあるので、主要な再生可能エネルギー資源となるセルロースの潜在性は計り知れない（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年）。生物学的なプロセスを介したセルロースの有効な利用は、食糧、飼料、及び燃料の不足を克服する１つの手法である（Ｏｈｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７年）。
【０００５】
セルラーゼは、セルロース（ベータ−１，４−グルカン又はベータＤ−グルコシド結合）を加水分解する酵素であり、グルコース、セルビオース、セロオリゴ糖などの形成をもたらす。セルラーゼは、伝統的に３つの主要な部類に分けられ、エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びベータ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）である。（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７年、Ｓｈｕｌｅｉｎ、１９８８年）。エンドグルカナーゼは、主にセルロース繊維の非晶質部分に作用し、一方、セロビオヒドロラーゼは、結晶質セルロースを分解することもできる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｔｔｉｌａ、１９９５年）。ベータ−グルコシダーゼは、Ｄ−グルコース単位をセルビオース、セロ−オリゴ糖、及び他のグルコシドから遊離させるように作用する（Ｆｒｅｅｒ、１９９３年）。
【０００６】
セルラーゼは、多数の細菌、酵母及び真菌により産生されることが知られている。特定の真菌は、結晶質形態のセルロースの分解が可能な完全なセルラーゼ系を産生し、その結果、セルラーゼは、発酵を介して容易に大量に産生される。糸状真菌は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような多くの酵母がセルロースを加水分解する能力を欠いているので、特別な役割を果たす。（例えば、Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年、Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年、及びＣｏｕｇｈｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．を参照すること）。
【０００７】
真菌セルラーゼの分類のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧは、各分類の範囲内で複数の構成要素を含むように更に拡大されてもよい。例えば、複数のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧは、２つのＣＢＨ、例えば、ＣＢＨ  Ｉ（Ｃｅｌ７Ａ又はグリコシルヒドロラーゼファミリー（ＧＨ）７Ａとしても知られている）及びＣＢＨ  ＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ又はＧＨ６Ａとしても知られている）、多数のＥＧ、例えば、ＥＧ  Ｉ（Ｃｅｌ７Ｂ又はＧＨ７Ｂ）としても知られている）、ＥＧ  ＩＩ（Ｃｅｌ５Ａ又はＧＨ５Ａとしても知られている）、ＥＧ  ＩＩＩ（Ｃｅｌ１２Ａ又はＧＨ１２Ａとしても知られている），ＥＧＶ（Ｃｅｌ４５Ａ又はＧＨ４５Ａとしても知られている）、ＥＧＶＩ（Ｃｅｌ７４Ａ又はＧＨ７４Ａとしても知られている）、ＥＧＶＩＩ（Ｃｅｌ６１Ｂ又はＧＨ６１ｂとしても知られている）及びＥＧＶＩＩＩ、並びに一連のＢＧ、例えば、ＢＧ１、ＢＧ３、及びＢＧ５のために既知の遺伝子を含有する、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を含む様々な真菌源から単離される。
【０００８】
結晶質セルロースをグルコースに効率的に変換するため、ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの分類のそれぞれからの成分又は酵素活性を含む完全なセルラーゼ系が典型的には必要であり、単離された成分は、結晶質セルロースを加水分解するにはあまり有効ではない（Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６年）。相乗的な関係が、異なる分類のセルラーゼ成分において観察されている。特に、ＥＧ型セルラーゼ及びＣＢＨ型セルラーゼは相乗的に相互作用して、より効率的にセルロースを分解する。（例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５年を参照すること）。
【０００９】
セルラーゼは、洗剤組成物の洗浄能力を向上するため、柔軟剤としての使用のため、綿布地の感触及び外観を向上するためなどの目的のために織物を処理するのに有用であることが、当該技術分野において既知である（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７年）。
【００１０】
向上した洗浄性能を有するセルラーゼ含有洗剤組成物（米国特許第４，４３５，３０７号、英国特許出願第２，０９５，２７５号及び同第２，０９４，８２６号）、並びに織物の感触及び外観を向上するための布地の処理における使用（米国特許第５，６４８，２６３号、同第５，６９１，１７８号、及び同第５，７７６，７５７号、英国特許出願第１，３５８，５９９号、Ｔｈｅ  Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ  Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．５４〜６１，１９８６年）が、記載されている。
【００１１】
セルラーゼは、セルロース原材料をエタノールに変換するのに有用であることが、当該技術分野において更に既知である。このプロセスは、そうでなければ（例えば、原材料の焼却又は埋め立てなど）廃棄される、大量の原材料が容易に利用できることを含む多数の利点を有する。主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンからなる他の材料、例えば、木材、草本作物、及び農業又は都市廃棄物は、エタノール生産の原材料としての使用が考えられている。近年、新たな部類のグリコシルヒドロラーゼが、セルロース材料の酵素加水分解を向上又は増強する更なる補助効果をもたらすことが確認されているが、これらの新たな補助酵素の多くの作用機序は、完全に解明されてはいない。初めはＧＨ６１ファミリーと注釈が付けられていた１つのそのようなグリコシルヒドロラーゼのファミリー（例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ６１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ，Ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  Ｆａｍｉｌｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０年，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．３３０５〜３３１６を参照すること）は、最近では、幾つかのファミリーメンバーが溶解性多糖モノオキシゲナーゼであると発見された後に、補助活性（ＡＡ）ファミリー９と繰り返し再注釈されている（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，「Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＺｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｒｅｄｏｘ  ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ２０１３年，ｖｏｌ  ６，ｉｓｓｕｅ  １，ｐｐ．４１）。少なくとも２つのＧＨ６１酵素がトリコデルマ・レーシに存在する（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  Ｍ．，「ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７年ｖｏｌ．２４９，ｉｓｓｕｅ  ２：ｐｐ．５８４〜９１、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌ６１Ａ（ＥＧ  ＩＶ）ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１年ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．６４９８〜６５０７、Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６１  ｍｅｍｂｅｒ，Ｃｅｌ６１Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ，ａｔ  １．６  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８年，ｖｏｌ．３８３  ｉｓｓｕｅ  １：ｐｐ  １４４〜１５４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍａｓｓ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｓｙｎ．Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８年，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．５５３〜５６０）。近年、これらのグリコシルヒドロラーゼの更に最大４つが、トリコデルマ・レーシのゲノムにおいて同定されたことが報告された（Ｈａｋｋｉｎｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，「Ｒｅ−ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＺｙ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」２０１２年，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．Ｖｏｌ  ４，ｉｓｓｕｅ  １１，ｐｐ．１３４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
１つ以上のセルラーゼと、場合により１つ以上のヘミセルラーゼとも組み合わされたとき向上した能力を有する一連のＧＨ６１酵素の変異体を提供して、リグノセルロースバイオマス基質を単糖、二糖、及び多糖に加水分解する効力及び効率を増強することが、当該技術分野において有益であるだろう。ＧＨ６１ポリペプチドの変異体の向上した性質には、変更された温度依存性活性プロファイル、熱安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、基質特異性、産物特異性、及び化学安定性が挙げられるが、これらに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、グリコシルヒドロリアーゼ（hydrolyase）ファミリー６１（ＧＨ６１）活性を有する単離されたポリペプチドの変異体、そのような酵素をコードする核酸、ＧＨ６１コード化ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞（例えば、ＧＨ６１ポリペプチドを発現する宿主細胞）、ＧＨ６１ポリペプチドを含有する組成物、及びそれを産生及び使用する方法を記載する。
【００１４】
このように、本発明の態様は、親ＧＨ６１酵素の変異体を提供し、ここで変異体は、セルロース増強活性を有し、配列番号３に少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）発現（収率／産生）、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）希酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ活性、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイ活性から選択される、親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質又は性能のうちの少なくとも１つを有する。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素はＧＨ６１Ａ酵素である。
【００１５】
特定の実施形態において、ＧＨ６１の変異体は、幾つかの突然変異を有し、ここで「幾つか」とは、１〜１０個の突然変異（例えば、親ＧＨ６１酵素と比較して、１〜１０個のアミノ酸置換）を意味する。
【００１６】
本発明の態様によるＧＨ６１の変異体には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１．親グルコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上した性質を少なくとも１つ有し、前記少なくとも１つの有意に向上した性質は、有意に高い融解温度（Ｔｍ）、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、有意に向上したタンパク質産生性、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異体。
２．前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に高い融解温度（Ｔｍ）を有する、１に記載の変異体。
３．前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、２に記載の変異体。
４．前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイ及び希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１に記載の変異体。
５．前記変異体は、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ３１６Ｆ、Ｓ２９７Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択さるアミノ酸置換を含む、４に記載の変異体。
６．前記変異体は、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１に記載の変異体。
７．前記変異体は、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｎ３１５Ｗ、Ｔ３０３Ｇ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、６に記載の変異体。
８．前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１に記載の変異体。
９．前記変異体は、Ｈ２００Ａ、Ｓ１８５Ｄ、Ｐ３１６Ａ、Ｎ５１Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、８に記載の変異体。
１０．前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上したタンパク質産生を有する、１に記載の変異体。
１１．前記変異体は、Ｖ８０Ｔ、Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｔ１０８Ｋ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、１０に記載の変異体。
１２．前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ、Ａ１２９Ｎ、Ａ１６８Ｋ、Ａ１６Ｎ、Ａ２０１Ｄ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｍ、Ｇ２３５Ｋ、Ｇ２３５Ｌ、Ｇ２３５Ｓ、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｇ２９８Ｃ、Ｇ３０１Ｐ、Ｈ２００Ａ、Ｋ１０６Ｃ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｅ、Ｋ７０Ｌ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｓ、Ｌ２９０Ａ、Ｌ２９０Ｍ、Ｎ１０Ｄ、Ｎ３１５Ｗ、Ｎ５１Ｅ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｆ、Ｐ５２Ｆ、Ｑ１６７Ｋ、Ｑ３２０Ａ、Ｑ３２０Ｐ、Ｑ３２０Ｓ、Ｒ３０４Ｄ、Ｒ３０４Ｐ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１８５Ｄ、Ｓ１８７Ｄ、Ｓ２９７Ｃ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ３００Ｔ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｍ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｑ、Ｔ１０８Ａ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｔ２８７Ａ、Ｔ３０３Ｇ、Ｔ３０３Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ８０Ｔ、Ｙ２９１Ｆ、Ｙ２９１Ｗ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、１に記載の変異体。
【００１７】
特定の実施形態において、親ＧＨ６１は、真菌グリコシルヒドロラーゼ６１（ＧＨ６１）、例えば、ヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、若しくはシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）（又はこれらのそれぞれのアナモルフ、テレオモルフ若しくはホロモルフ対応形態）からのＧＨ６１Ａ、例えば、配列番号３、７２、７３、７４、及び７７のいずれか１つから選択されるＧＨ６１Ａである。
【００１８】
本発明の態様は、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）の触媒ドメイン及び／又はヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号５１）の炭水化物結合ドメインに相同性を有する酵素の触媒及び／又は炭水化物結合ドメインに、変異体を含む。したがって、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａの触媒ドメインの範囲内に入る上記に記載された変異体のいずれか１つ又は任意の組み合わせを、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素の触媒ドメインに相同性がある触媒ドメインに適用することができる。同様に、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａの炭水化物結合ドメインの範囲内に入る上記に記載された変異体のいずれか１つ又は任意の組み合わせを、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素の炭水化物結合ドメインに相同性がある炭水化物結合ドメインに適用することができる。上記に記載されたように、これらの触媒ドメイン及び／又は炭水化物結合ドメイン変異体は、対応する親酵素よりも少なくとも１つの向上した性質を有する。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）に相同性のある触媒ドメインの例は、図２Ａ〜図２Ｃに示されている。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号５１）に相同性のある炭水化物結合ドメインの例は、図３に示されている。更に、（１）ＧＨ６１の変異体の触媒ドメイン及び第２の酵素の炭水化物結合ドメイン又は（２）ＧＨ６１の変異体の炭水化物結合ドメイン及び第２の酵素の触媒ドメインのいずれかを含むキメラ酵素が想到され、キメラ酵素のＧＨ６１ドメインは、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸の変異体を含有する。
【００１９】
主題発明の態様には、本明細書に記載されているように、親ＧＨ６１の変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ベクター、例えば発現ベクター又はポルヌクレオチドの繁殖用のベクターに存在することができる。ベクターは、ベクターを繁殖させ、かつ／又は本明細書に記載されているコードされたＧＨ６１の変異体を発現する宿主細胞に存在することができる。宿宿主細胞は、ＧＨ６１の変異体ポリヌクレオチドの繁殖及び／又はコードされたＧＨ６１の変異体の発現における使用が見出される任意の細胞、例えば、細菌細胞、真菌細胞などであってもよい。用いることができる適切な真菌細胞型の例には、糸状真菌細胞、例えば、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハザリウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の細胞が挙げられる。あるいは、真菌宿主細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、スキッゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、クルベロマイセス・ラクタス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｕｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（ａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、アルキスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、デバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、又はデバリオマイセス・ポリモルフス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）であり得る。
【００２０】
本発明の態様には、ＧＨ６１の変異体を産生する方法であって、ＧＨ６１の変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を、適切な培養培地中において、ポリヌクレオチドからＧＨ６１の変異体を発現（又は産生）する、例えば、ＧＨ６１をコードするポリヌクレオチドが発現ベクターに存在する（すなわち、ＧＨ６１の変異体コード化ポリヌクレオチドが、宿主細胞においてＧＨ６１の変異体の発現を導くプロモーターに作動可能に連結する）のに適した条件下で培養することを含む方法が含まれる。特定の実施形態において、方法は、産生したＧＨ６１の変異体を単離することを更に含む。
【００２１】
本発明の態様には、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体を含有する組成物も含まれる。適切な組成物の例には、洗剤組成物、飼料添加物、及びセルロース基質（例えば、セルロース含有織物、例えば、デニム、セルロース含有バイオマス材料、例えば前加水分解プロセスの前処理に場合により付されているリグノセルロースバイオマス材料の混合物など）を処理（又は加水分解）する組成物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体を含む組成物及びセルロース基質は、本発明の更なる態様を表す。ＧＨ６１の変異体含有洗剤組成物には、洗濯洗剤及び食器用洗剤が挙げられ、そのような洗剤は、追加の構成要素、例えば、界面活性剤を更に含むことができる。適切なセルロース基質の例には、草、スイッチグラス（switch grass）、コードグラス（cord grass）、ライグラス（rye grass）、クサヨシ（reed canary grass）、ススキ（miscanthus）、製糖残留物、サトウキビ搾りかす、農業廃棄物、稲わら、籾殻、大麦わら、トウモロコシの穂軸、穀物わら、麦わら、カノーラわら、オート麦わら、オート麦殻、トウモロコシ繊維、飼い葉、大豆茎葉、トウモロコシ茎葉、林業廃棄物、木材パルプ、再生木材パルプ繊維、製紙スラッジ、おがくず、硬材、軟材、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の態様には、セルロース基質を加水分解する方法であって、基質を、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体と接触させることを含む方法が含まれる。特定の実施形態において、ＧＨ６１の変異体は、無細胞組成物として提供され、一方、他の実施形態では、ＧＨ６１の変異体は、宿主細胞がＧＨ６１の変異体を発現する宿主細胞組成物として提供される。したがって、基質を、ＧＨ６１の変異体発現ベクターを含有する宿主細胞と接触させる、セルロース基質を加水分解する方法の特定の実施形態。特定の実施形態において、方法は、リグノセルロースバイオマスをグルコースに変換するためのものであり、これらの実施形態の幾つかにおいて、リグノセルロースバイオマスは、限定されることなく、草、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ススキ、製糖残留物、サトウキビ搾りかす、農業廃棄物、稲わら、籾殻、大麦わら、トウモロコシの穂軸、穀物わら、麦わら、カノーラわら、オート麦わら、オート麦殻、トウモロコシ繊維、飼い葉、大豆茎葉、トウモロコシ茎葉、林業廃棄物、木材パルプ、再生木材パルプ繊維、製紙スラッジ、おがくず、硬材、軟材、及びこれらの組み合わせから選択される。他の特定の実施形態において、セルロース基質は、セルロース含有織物、例えば、デニムであり、これらの実施形態の幾つかにおいて、方法は、インジゴ染色デニムを（例えば、ストーンウオッシュ加工において）処理するためのものである。
【００２３】
本発明の態様には、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体を含有する細胞培養上澄み組成物が含まれる。例えば、ＧＨ６１の変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を、適切な培養培地中において、ポリヌクレオチドからＧＨ６１の変異体を発現して、ＧＨ６１の変異体を細胞培養上澄みの中に分泌させるのに適した条件下で培養することによって得られる、細胞培養上澄み。そのような細胞培養上澄みは、内因的及び／又は外因的に発現されたタンパク質及び／又は酵素を含む、宿主細胞により産生される他のタンパク質及び／又は酵素を含むことができる。培養培地のそのような上澄みを、典型的には、細胞細片を除去するための濾過、細胞死滅手順、及び／又は酵素を豊富化若しくは濃縮する限界濾過又は他のステップを含みうる、産生後プロセスを最小限にして又は伴うことなくそのまま使用することができる。そのような上澄みは、本明細書において「全ブロス」又は「全セルラーゼブロス」と呼ばれる。
【００２４】
ＧＨ６１の変異体は、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼとの同時発現により産生することができる。あるいは、ＧＨ６１の変異体は、セルラーゼ又はヘミセルラーゼを用いることなく産生することができる。後者の場合では、ＧＨ６１の変異体を、場合により、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼと物理的に混合して、特定の用途、例えば、リグノセルロースバイオマス基質の加水分解に有用な酵素組成物を形成することができる。更なる実施形態において、ＧＨ６１の変異体は、更に、１つ以上の補助酵素と同時発現又は物理的に混合されてもよい。既知の補助酵素には、例えば、ヘミセルラーゼと特徴付けされる時もあり、大抵の場合には補助酵素と認められる特定のマンナナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ）、リパーゼ、特定の他のＧＨ６１ファミリー酵素、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ１様タンパク質、ＣＩＰ２、ＣＩＰ２様タンパク質、スオレニン、エクスパンション（expansions）、セルビオースヒドロゲナーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、及び例えば、セルロース結合モジュールであり得るセルロース破壊タンパク質が挙げられる。
【００２５】
所望のＧＨ６１酵素の変異体を含有する他の組成物、並びにそのような組成物を使用する方法も考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヒポクレア・ジェコリーナの野生型ＧＨ６１Ａ（ＧＨ６１Ａ）の核酸配列（上列）（配列番号１）及びアミノ酸配列（下列）（配列番号２）を示す。配列番号２のシグナル配列には下線が引いてある。
【図２Ａ】ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同性があるグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列の整列（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す。以下の酵素の触媒ドメインが整列している（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を表す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図２Ｂ】ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同性があるグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列の整列（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す。以下の酵素の触媒ドメインが整列している（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を表す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図２Ｃ】ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａに相同性があるグリコシルヒドロラーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列の整列（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す。以下の酵素の触媒ドメインが整列している（配列番号は、各酵素の触媒ドメインの配列を表す）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３４）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）ＥＧＩＶ（配列番号３５）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＥＧＩＶ（配列番号３６）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号３７）、トリコデルマ属ＥＧＩＶ（配列番号３８）、ヒポクレア・アトロビリディスＧＨ６１１（配列番号３９）、ヒポクレア・ビレンスＧＨ６１（配列番号４０）、シエラビア・テレストリスＧＨ６１（配列番号４１）、ニューロスポラ・テトラスペルマＥＧＩＶ（配列番号４２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ推定タンパク質（配列番号４３）、シエラビア・ヘテロタリカＧＨ６１（配列番号４４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＥＧＩＶ（配列番号４５）、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）推定タンパク質（配列番号４６）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＥＧＩＶ（配列番号４７）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）推定タンパク質（配列番号４８）、フサリウム・プソイドグラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）推定タンパク質（配列番号４９）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）推定タンパク質（配列番号５０）。
【図３】示されているグリコシルヒドロラーゼ酵素の以下の炭水化物結合ドメインのアミノ酸配列の整列（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を示す。ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａ（配列番号５１）、ヒポクレア・ビレンスのＧＨ６１酵素（配列番号５２）、シエラビア・テレストリスのグリコシルヒドロラーゼファミリー２８酵素（配列番号５３）、ヒポクレア・アトロビリディスのグリコシルヒドロラーゼファミリー４５酵素（配列番号５４）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔａ）の推定エンドグルカナーゼ（配列番号５５）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）の推定酵素（配列番号５６）、ヒポクレア・ジェコリーナのＣｉｐ１（配列番号５７）、ヒポクレア・ルーファのエキソグルカナーゼ１（配列番号５８）、ヒポクレア・ビレンスのグリコシルヒドロラーゼファミリー７酵素（配列番号５９）、ヒポクレア・アトロビリディスのグリコシルヒドロラーゼファミリー５酵素（配列番号６０）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）のグリコシルヒドロラーゼファミリー４５酵素（配列番号６１）、トリコデルマ・コニンギのエキソグルカナーゼ１（配列番号６２）、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）のグリコシルヒドロラーゼファミリー６１（配列番号６３）、コレトトリクム・グラミニコラのグリコシルヒドロラーゼファミリー６１（配列番号６４）、アルトロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）の推定酵素（配列番号６５）、トリコデルマ・ハザリウムのセロビオヒドロラーゼ（配列番号６６）、及びペニシリウム属のエンドグルカナーゼ（配列番号６７）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ここで本発明を、以下の定義及び実施例を参照のためだけに使用して詳細に説明する。本明細書に参照される全ての特許及び出版物は、そのような特許及び出版物に開示されている全ての配列を含めて、参照として本明細書に明確に組み込まれる。
【００２８】
特に本明細書において定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００７年）及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１年）は、本発明で使用される用語の多くを含む一般的辞書を当業者に提供する。本明細書に記載されているものに類似する又は同等である任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。数値範囲は、その範囲を画定する数を含む。特に示されない限り、核酸は、５’から３’の方向で左から右へ書かれており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右へ書かれている。実施者には、当該技術分野の定義及び用語について、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２年及びＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３年が具体的に対象とされている。本発明は、記載されている特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されず、これらは変わってもよいことが理解されるべきである。
【００２９】
本明細書に提示されている見出しは、本発明の様々な態様又は実施形態を限定するものではなく、明細書全体を参照するためにあり得る。したがって、真下に定義されている用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００３０】
本明細書に引用されている全ての出版物は、本発明に関連して使用することができる組成物及び方法論を記載及び開示する目的のために、参照として本明細書に明確に組み込まれている。
【００３１】
Ｉ．定義
用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義語であり、交換可能に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、これらを「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準的なアミノからカルボキシ末端への方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で提示される。
【００３２】
用語「核酸」は、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び合成分子を包含する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、化学的に修飾されていてもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用される。遺伝子コードが縮重しているので、２個以上のコドンを使用して、特定のアミノ酸をコードすることができ、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。このように、本発明は。ＧＨ６１又はその変異体をコードする全ての可能な変種ヌクレオチド配列を考慮し、これらは全て遺伝子コードの縮重をもたらす可能性がある。特に示されない限り、核酸配列は、５’から３’への方向で表される。
【００３３】
「セルラーゼ」又は「セルラーゼ酵素」は、細菌又は真菌のエキソグルカナーゼ若しくはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／又はエンドグルカナーゼ、及び／又はβ−グルコシダーゼを意味する。これらの３つの異なる種類のセルラーゼ酵素は、相乗的に作用して、セルロース及びその誘導体をグルコースに変換することが知られている。
【００３４】
「エンドグルカナーゼ」又は「ＥＧ」又は「ＥＧ酵素」又は「ＥＧポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、セルロースの１，４β−Ｄ−グルコシド連結の内部加水分解（endohydrolysis）を触媒するエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、リケニン及び穀物β−Ｄ−グルカンと定義される。セルロース加水分解では、この活性は、ＣＢＨ作用の基質である新たな鎖末端を生じる。ＥＧは、また、１，３−連結も含有するβ−Ｄ−グルカンの１，４−連結を加水分解する。特定のＥＧは、結晶質セルロースに対して「前進的」に作用することが示されている［例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．Ｔｈｒｅｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８年，１１２５，２８９〜２９７、及びＬｉ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ  ３ｃ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  Ｃｅｌ９Ａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０年，７６，２５８２〜２５８８を参照すること］。
【００３５】
「ＧＨ６１」又は「ＧＨ６１酵素」などは、グリコシルヒドロラーゼ６１ファミリー、例えば、グリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）ファミリーに属する酵素を意味する。ＧＨ６１酵素は、真菌類又は卵菌類の亜門の糸状真菌を含む真菌細胞からのものであり得る。糸状真菌は、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体により特徴付けられ、偏性好気性である菌糸伸長及び炭素異化作用により栄養成長する。糸状真菌親細胞は、トリコデルマ属、例えば、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハザリウム、ペニシリウム属、フミコーラ・インソレンス及びフミコーラ・グリセアを含むフミコーラ属、クリソスポリウム・ラックノウエンスを含むクリソスポリウム属、ミセリオフトラ属、グリオクラジウム属、アスペルギルス属、フサリウム属、ニューロスポラ属、ヒポクレア属、例えばヒポクレア・ジェコリーナ、並びに、エメリセラ属であるが、これらに限定されない種の細胞であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「トリコデルマ」又は「トリコデルマ属」は、以前にトリコデルマと分類された又は現在トリコデルマと分類されている任意の真菌株を指す。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素は、非線状真菌細胞からのものであり得る。ＧＨ６１Ａ酵素の例には、ヒポクレア・ジェコリーナ（トリコデルマ・レーシ）、ヒポクレア・ルーファ、ヒポクレア・オリエンタリス、ヒポクレア・アトロビリディス、ヒポクレア・ビレンス、エメリセラ・ニデュランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス、トリコデルマ・サツリスポラム、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・クラッサ、ネオサルトリヤ・フミゲート、ネオサルトリヤ・フミゲート、ネオサルトリヤ・フィシェリ、シエラビア・テレストリス、及びシエラビア・ヘテロタリカにおいて見出されるものが挙げられる。特定の態様において、ＧＨ６１酵素は、配列番号３、７２、７３、７４、７７に示されている成熟ＧＨ６１酵素配列のうちのいずれかのアミノ酸配列、それに少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、その対立変異体、又はセルラーゼ増強活性を有するそのフラグメントを含む。特定の実施形態において、ＧＨ６１Ａ酵素は、セルラーゼ増強活性を有し、配列番号３に少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性があるアミノ酸配列又はセルラーゼ増強活性を有するそ���フラグメント若しくは誘導体を含有する。
【００３６】
「ＧＨ６１活性」又は「ＧＨ６１Ａ活性」又は「活性」とは、ＧＨ６１酵素を参照したとき、ＧＨ６１ファミリーメンバーに特徴的なセルラーゼ増強活性を意味する。具体的には、ＧＨ６１酵素は、特定のセルラーゼと組み合わされたとき、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解して、例えば、単糖、二糖、及び多糖を生成する効力及び効率を増強する、向上した能力を実証している。
【００３７】
酵素、タンパク質、ポリペプチド、核酸、又はポリヌクレオチドの「変異体」は、本明細書で使用されるとき、変異体が親ポリペプチド又は親核酸（例えば、未変性、野生型又は他の定義された親ポリペプチド又は核酸）から誘導され、その親と比較して少なくとも１個の修飾又は変更を含み、そのような修飾又は変更がヒトの介入によって生じることを意味する。したがって、変異体は、親と比較して数個の突然変異を有していてもよく、ここで「数個」とは、１〜１０個の突然変異を意味する。例えば、配列番号３と比較して１〜１０個のアミノ酸置換を有する変異体は、数個の置換を有するＧＨ６１の変異体と呼ぶことができる。変更／修飾には、親におけるアミノ酸／核酸残基の１つ以上の部位での異なるアミノ酸／核酸による置換、親における１つ以上の部位でのアミノ酸／核酸残基（又は一連のアミノ酸／核酸残基）の欠失、親における１つ以上の部位でのアミノ酸／核酸残基（又は一連のアミノ酸／核酸残基）の挿入、アミノ及び／若しくはカルボキシ末端アミノ酸配列、又は５’及び若しくは３’核酸配列の切断、並びにこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。本発明の態様によるＧＨ６１酵素の変異体（時々、「ＧＨ６１の変異体」又は「ＧＨ６１Ａの変異体」と呼ばれる）は、セルラーゼ増強活性を保持するが、幾つかの特定の態様において変更された性質、例えば向上した性質を有することもある。例えば、ＧＨ６１酵素の変異体は、変更された最適ｐＨ、向上した熱安定性、若しくは酸化安定性、又はこれらの組み合わせを有することができるが、特徴的なセルラーゼ増強活性を保持している。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体は、上記に定義され、かつセルラーゼ増強活性を有するＧＨ６１Ａ酵素の変異体である。本発明の幾つかの態様において、ＧＨ６１Ａ酵素の変異体は、配列番号３に少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性があるアミノ酸配列又は酵素的に活性なそのフラグメントを含有する。
【００３８】
「組み合わせ変異体」は、２個以上の突然変異、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。
【００３９】
「親（parent）」又は「親の（parental）」ポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくは酵素配列（例えば、「親ＧＨ６１酵素」）又はその同等物は、本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は酵素の変異体を設計するために出発点又はテンプレートとして使用したポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は酵素配列を指す。特定の実施形態において、親酵素は、上記に記載されたＧＨ６１Ａ酵素（例えば、配列番号３）である。単語「親」及び「親の」は、本文脈において交換可能に使用されることが、更に留意される。
【００４０】
用語「野生型」は、天然に生じるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、すなわち、人工の変異体を含まないものを指す。場合によっては、野生型配列が親の配列として使用される。
【００４１】
用語「異種」は、核酸の一部を参照して使用されるとき、核酸が、通常天然では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、例えば、新たな機能性核酸、例えば、プロモーターを１つの源から、コード領域を別の源から作製するように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有するように組み換え的に産生される。同様に、異種ポリペプチドには、多くの場合、天然では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列が参照される（例えば、融合ポリペプチド）。
【００４２】
用語「組み換え」とは、例えば、細胞又は核酸、ポリペプチド又はベクターを参照して使用されるとき、細胞、核酸、ポリペプチド又はベクターが、異種核酸若しくはポリペプチドの導入により又は未変性核酸若しくはポリペプチドの変更により修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の未変性（非組み換え）形態には見出されない遺伝子を発現する、又はそうでなければ異常発現しているか、過小発現している未変性遺伝子を発現する、若しくは未変性遺伝子を全く発現しない。
【００４３】
用語「単離」又は「精製」は、本明細書で使用されるとき、構成要素が天然に産生されている環境から除去されることを指す。一般に、単離又は精製された核酸又はポリペプチド試料において、目的の（複数種の）核酸又は（複数種の）ポリペプチドは、これらが天然に産生される環境と比較して、増加した絶対又は相対濃度で存在する。
【００４４】
用語「豊富化」は、組成物（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）の成分又は材料を記載するとき、成分又は材料が、豊富化組成物が生成された出発組成物と比較して、相対的に増加した濃度でその組成物に存在することを意味する。例えば、豊富化ＧＨ６１組成物（又は試料）は、ＧＨ６１の相対又は絶対濃度が、宿主生物体の初期発酵産物と比較して増加しているものである。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、一般に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に対して適している。プロモーターは、転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、所定の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「構成的」プロモーターは、大部分の環境及び発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発生調節下で活性であるプロモーターである。本発明に有用な誘導性プロモーターの例は、受入番号Ｄ８６２３５でＧｅｎＢａｎｋに寄託されているトリコデルマ・レーシ（ヒポクレア・ジェコリーナ）ｃｂｈ１プロモーターである。別の態様において、プロモーターは、ヒポクレア・ジェコリーナのｃｂｈＩＩ又はキシラナーゼプロモーターである。適切なプロモーターの例には、アスペルギルス・アワモリ又はアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，２３０６〜２３１５、Ｂｏｅｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，１５８１〜１５８５）、ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）のカルボキシルプロテアーゼ遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４年）欧州特許出願第ＥＰ０１３７２８０Ａ１号）、アスペルギルス・ニデュランスのｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，１４７０〜１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７〜４５）、アスペルギルス・ニデュランスのａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６年）Ｇｅｎｅ  ３３，１３７〜１４９）、アスペルギルス・ニデュランスのｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６年）Ｃｅｌｌ  ４６，１４３〜１４７）、アスペルギルス・ニデュランスのａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３，１４３０〜１４３９）、ヒポクレア・ジェコリーナのｘｌｎ１遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのｃｂｈ２遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのｅｇ１遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのｅｇ２遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのｅｇ３遺伝子及びＳＶ４０初期プロモーターのような高等真核生物プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，２１１７〜２１３０）からのプロモーターが挙げられる。
【００４６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると、「作動可能に連結」する。例えば、分泌リーダー、すなわちシグナルペプチドをコードするＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結する、プロモーター又はエンハンサーが、配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結する、あるいはリボソーム結合部位が、転写を促進するように位置する場合には、コード配列に作動可能に連結する。一般に、「作動可能に連結する」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合では、隣接し、読み取り相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要がない。連結は、都合の良い制限部位における連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施に従って使用される。したがって、用語「作動可能に連結する」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、一連の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との間の機能的な連結を指し、ここで発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４７】
用語「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「分泌配列」、「分泌ペプチド」、「分泌シグナル配列」、「分泌シグナルペプチド」などは、大型のポリペプチドの構成要素として、大型のポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路を介して方向付けるペプチド配列、並びにそのようなペプチドをコードする核酸を意味する。一般に、大型のポリペプチド（又はタンパク質）は、分泌経路を通って移行する時に一般的には切断されて、分泌／シグナルペプチドが除去され、ポリペプチドの切断形態（すなわち、シグナル／分泌ペプチドのない形態）は、多くの場合、本明細書において「成熟形態」のポリペプチドと呼ばれる。例えば、配列番号２は、シグナルペプチドを有する、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａのアミノ酸配列を提供し、一方、配列番号３は、シグナルペプチドを有さない、ヒポクレア・ジェコリーナの成熟形態のＧＨ６１Ａのアミノ酸配列を提供する。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、異なる宿主細胞の間を移動するように設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来性細胞に異種ＤＮＡフラグメントを組み込み、発現させる効力を有するベクターを指す。多くの原核生物及び真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４９】
したがって、「発現カセット」又は「発現ベクター」は、標的細胞において特定の核酸の転写を許容する一連の特別な核酸要素により、組み換え的又は合成的に生成される核酸構築物である。組み換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセットの部分は、配列のうち、とりわけ、転写されるべき核酸配列及びプロモーターを含む。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「プラスミド」は、多くの細菌及び幾つかの真核生物に存在する場合、染色体外自己複製遺伝子要素を形成する環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指す。プラスミドを、多数の異なる目的のいずれかのために、例えば、クローニングベクター、繁殖ベクター、発現ベクターなどとして用いることができる。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「選択可能なマーカー」は、細胞における発現が可能なヌクレオチド配列又はそれによりコードされたポリペプチドを指し、細胞における選択可能なマーカーの発現は、選択可能なマーカーを発現しない細胞と区別される能力を付与する。特定の実施形態において、選択可能なマーカーは、それを発現する細胞が、対応する選択的な薬剤の存在下又は対応する選択的な増殖条件下で増殖することを可能にする。他の実施形態において、選択可能なマーカーは、それを発現する細胞が、物理的特徴によって、例えば蛍光、免疫反応性などの差異によって、それを発現しない細胞から特定及び／又は単離されることを可能にする。
【００５２】
一般に、ＧＨ６１Ａの変異体をコードする核酸分子は、中程度から高度な厳密条件下において、本明細書に配列番号１（未変性ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ）として提供されている野生型配列（又はその補体）とハイブリッド形成する。しかし、場合によっては、実質的に異なるコドンの使用を有するＧＨ６１Ａコード化ヌクレオチド配列が用いられ、一方、ＧＨ６１Ａコード化ヌクレオチド配列によりコードされる酵素は、未変性酵素と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コード配列は、修飾されて、特定のコドンが宿主により利用される頻度に応じて、特定の原核生物又は真核生物発現系においてＧＨ６１Ａのより速い発現を促進することができる（一般的に、「コドン最適化」と呼ばれる）。Ｔｅｏ，ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９０：１３〜１９，２０００年）は、例えば、糸状真菌における遺伝子発現の最適化を記載する。そのような核酸配列は、時々、「縮重」又は「縮重配列」と呼ばれる。
【００５３】
核酸配列は、２つの配列が中程度から高度に厳密なハイブリッド形成及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリッド形成する場合、基準核酸配列と「選択的にハイブリッド形成することができる」と考慮される。ハイブリッド形成条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最高の厳密性」は、約Ｔｍ−５℃のとき（プローブのＴｍを５°下回るとき）、「高度な厳密性」は、Ｔｍを約５〜１０°下回るとき、「中程度な」又は「中間の厳密性」は、プローブのＴｍを約１０〜２０°下回るとき、「低度な厳密性」は、Ｔｍを約２０〜２５°下回るときに、典型的に生じる。機能的には、最高に厳密な条件を使用して、ハイブリッド形成プローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を特定することができ、一方、高度に厳密な条件を使用して、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を特定する。
【００５４】
中程度及び高度に厳密なハイブリッド形成条件は、当該技術分野において周知である（例えば、参照として本明細書に明確に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９年，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９及び１１、並びにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３年を参照すること）。高度に厳密な条件の例には、５０％のホルムアミド、５ＸのＳＳＣ、５Ｘのデンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬの変性担体ＤＮＡにおいて約４２℃でハイブリッド形成し、続いて２ＸのＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳにより室温で２回、０．１ＸのＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳにより４２℃で更に２回洗浄することが挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、細胞を参照した用語「形質転換された」、「安定して形質転換された」又は「遺伝子導入」は、細胞が、ゲノムに統合された、又は複数の世代にわたって維持されているエピソームプラスミドとしての、非未変性（異種）核酸配列を有することを意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスには、一般に、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００５７】
核酸配列を細胞に挿入する文脈における用語「導入された」は、「形質移入」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列が、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律性レプリコンに変換され得る、又は一時的に発現され得る（例えば、形質移入ｍＲＮＡ）場合、真核又は原核細胞への核酸配列の組み込みについての言及を含む。
【００５８】
用語「所望のグリコシルヒドロラーゼ発現」又は同等のものは、所望のグリコシルヒドロラーゼ遺伝子の転写及び翻訳を指し、その産物には、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳処理後ポリペプチドが含まれることが、理解される。例として、ＧＨ６１Ａ発現のアッセイには、ＧＨ６１Ａ酵素のウエスタンブロット、ＧＨ６１Ａ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、並びにセルラーゼ増強活性アッセイ、例えば、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８年，５２３：１３３〜１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８年）に記載されている増強アッセイが挙げられる。
【００５９】
用語「宿主細胞」とは、ベクターを含有し、発現構築物の複製及び／又は転写、並びに／又は転写及び翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。本発明での使用のための宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞又は酵母、植物、昆虫、両生類、若しくは哺乳類細胞のような真核細胞であり得る。特定の実施形態において、宿主細胞は、糸状真菌である。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「洗剤組成物」は、汚れた、セルロース含有布地の洗濯用洗浄媒体での使用が意図される混合物を指す。本発明の文脈において、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青み付け剤及び蛍光染料、粘結抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、酸化防止剤、並びに可溶化剤を含むことができる。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「界面活性剤」は、表面活性の性質を有するとして当該技術分野において一般に認識されている任意の化合物を指す。したがって、例えば、界面活性剤は、洗剤において一般的に見出されるような、アニオン性、カチオン性、及び非イオン性界面活性剤を含む。アニオン性界面活性剤には、直鎖又は分岐鎖アルキルベンゼンスルホネート、直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート、アルキル又はアルケニルスルフェート、オレフィンスルホネート、及びアルカンスルホネートが挙げられる。両性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩スルホネート及びベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、正及び負荷電基の両方を同じ分子内に有する。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、脂肪酸グリセリンモノステアレートなどを含むことができる。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「セルロース含有布地」は、セルロースを含有する綿若しくは非綿から又は天然のセルロース及び人工セルロース（例えば、ジュート、フラックス、ラミー、レーヨン、及びリオセル）を含むセルロースブレンドを含有する綿若しくは非綿から作製される任意の縫製若しくは無縫製布地、織り糸又は繊維を指す。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「綿含有布地」は、綿織布、綿ニット、綿デニム、綿織り糸、原綿などを含む、純綿又は綿ブレンドから作製される縫製若しくは無縫製布地、織り糸又は繊維を指す。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「ストーンウオッシュ組成物」は、セルロース含有布地をストーンウオッシュするのに使用される製剤を指す。ストーンウオッシュ組成物は、販売される前に、すなわち製造プロセスにおいてセルロース含有布地を変性するために使用される。対照的に、洗剤組成物は、汚れた衣類を洗浄することが意図され、製造プロセス中に使用されない。
【００６５】
第１のポリペプチドのアミノ酸位置（又は残基）が第２の関連するポリペプチドのアミノ酸位置と「同等」であると示される場合、第１のポリペプチドのアミノ酸位置は、（ｉ）一次配列の整列（下記の配列の整列及び配列同一性についての記載を参照すること）、（ｉｉ）構造的配列相同性、又は（ｉｉｉ）類似した機能性質のうち１つ以上によって、第２の関連するポリペプチドにおいて示される位置に対応することを意味する。したがって、第１のＧＨ６１酵素（又はその変異体）のアミノ酸位置は、第２のＧＨ６１Ａ酵素における（又は複数の異なるＧＨ６１酵素においても）アミノ酸位置と「同等」である（又は「相同性」がある）と特定することができる。
【００６６】
一次配列の整列：同等のアミノ酸位置は、一次アミノ酸配列整列法を使用して決定することができ、これらの多くは当該技術分野において既知である。例えば、２つ以上の異なるＧＨ６１酵素の一次アミノ酸配列を整列することによって、１つのＧＨ６１酵素のアミノ酸位置の番号が別の整列されたＧＨ６１酵素の位置番号と同等であると指定することが可能である。このように、１つのＧＨ６１酵素（例えば、配列番号３に示されているＧＨ６１Ａ酵素）のアミノ酸配列から始まる番号付与法を使用して、他のＧＨ６１酵素において同等な（又は相同性のある）アミノ酸残基を特定することができる。例えば、図２及び図３に示されている整列を参照すること。
【００６７】
構造的配列相同性：一次配列整列法を使用した「同等な」アミノ酸位置の決定に加えて、「同等な」アミノ酸位置は、二次及び／又は三次構造のレベルにおいて相同性を決定することによっても特定することができる。例えば、三次構造がＸ線結晶学によって決定されたグルコシルヒドロラーゼでは、同等の残基は、グルコシルヒドロラーゼの特定のアミノ酸残基の２個以上の主要鎖原子の原子座標が、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａと整列した後（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対Ｃ、及びＯ対Ｏ）、０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であると定義することができる。整列は、最適なモデルが方向及び位置付けされて、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａに対して、当該のグリコシルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大限の重複を与えた後に達成される。最適なモデルは、利用可能な最高の解像度をもたらす結晶学的モデルである。２つ以上の異なるモデルが等しい解像度を有する場合、下記の方程式を使用して、実験回折データの最低Ｒ因子を有するモデルを使用する。
【００６８】
【数１】
2016533741.tif 000003
【００６９】
類似した機能的性質：第２の関連するポリペプチドの特定の残基に機能的に類似している第１のポリペプチドにおける同等のアミノ酸残基（例えば、第１のグリコシルヒドロラーゼ及びヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａ）は、第２の関連するポリペプチド（例えば、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａ）の特定の残基に限定及び起因するように、ポリペプチド構造、基質結合、又は触媒作用を変更する、修飾する又はこれらに寄与するような立体配座を採用する、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸と定義される。三次構造が第１のポリペプチドのＸ線結晶学によって得られた場合、第２のポリペプチドに機能的に類似している第１のポリペプチドのアミノ酸残基は、所定の残基の主な鎖原子が相同的な位置を占有することに基づいた同等性の基準を満たさないこともあるが、残基の少なくとも２個の側鎖原子の原子座標は第２のポリペプチド（例えば、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａ）の対応する側鎖原子の０．１３ｎｍの範囲内にあるという程度まで類似した位置を占有する。
【００７０】
酵素の変異体（例えば、ＧＨ６１の変異体）に関する用語「向上した」又は「向上した性質」又は「向上した性能」などは、対応する親酵素と比較して向上した酵素の変異体に関連する特徴又は活性として本明細書において定義される。向上した性質には、宿主細胞における向上した産生又は発現（収率と呼ばれる場合もある）、向上した熱安定性又は変更された温度依存性活性プロファイル、所望のｐＨ又はｐＨ範囲における向上した活性又は安定性、向上した基質特異性、向上した産物特異性、及びセルロース加水分解プロセス工程における化学的又は他の構成要素の存在下での向上した安定性などが挙げられるが、これらに限定されない。向上した性能は、（ａ）発現（タンパク質含有量決定又は収率）、（ｂ）熱安定性及び／又は融解温度（Ｔｍ）、（ｃ）希酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイが挙げられるが、これらに限定されない（複数の）特定のアッセイを使用して決定することができる。
【００７１】
ポリペプチドの変異体（例えば、ＧＨ６１の変異体）に関する用語「向上した熱安定性」は、親酵素と比べて上昇した温度で一定期間にわたってインキュベートした後に、酵素の変異体が酵素活性の保持（又は特別な場合のＧＨ６１酵素では、セルラーゼ活性を増強する酵素の能力の保持）を示すことと、本明細書において定義される。そのような変異体は、親と比べて変化した熱的活性プロファイル（thermal activity profile）を示すことも、示さないこともある。例えば、変異体は、親と比べて上昇した温度でインキュベートした後、再折りたたみの向上した能力を有することができる。
【００７２】
「向上した産物特異性」とは、酵素の変異体が、親酵素と比較して変化した産物プロファイルを示すことを意味し、ここで変異体の変更された産物プロファイルは、親と比較して、所定の用途において向上している。「産物プロファイル」は、目的の酵素により産生された反応産物の化学組成として本明細書において定義される。
【００７３】
「向上した化学安定性」とは、酵素の変異体が、同じ条件下で親酵素の酵素活性を低減する化学薬品の存在下で一定期間にわたってインキュベートした後、酵素活性の保持を示すことを意味する。向上した化学安定性を有する変異体は、親酵素と比較して、そのような化学薬品の存在下で反応をより良好に触媒することができる。
【００７４】
「ｐＨ範囲」は、酵素を参照すると、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００７５】
用語「ｐＨ安定」及び「ｐＨ安定性」は、酵素を参照すると、所定時間（例えば、１５分、３０分、１時間）、広範囲のｐＨ値にわたって活性を保持する酵素の能力に関する。
【００７６】
「配列同一性の率」又は文法的に同等なものは、特定の配列が、整列アルゴリズムを使用して、特定の基準配列と同一性がある少なくとも特定の割合のアミノ酸残基を有することを意味する。配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さを持つワードと整列したときに幾つかの正値閾値スコアＴに一致するか又はそれを満たすかのいずれかである、長さＷの短いワードを問い合わせ配列内で特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための起点として機能する。ワードのヒットは、累積整列スコアを増加することができる限り、比較される２つの配列のそれぞれに沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの伸長は、累積整列スコアが最大達成値から量Ｘだけ下降したとき、累積スコアが０若しくはそれ以下になったとき、又はどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，（１９８９年）を参照すること）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両方の鎖の比較を初期設定として使用する。
【００７７】
次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３年）を参照すること）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似性の測度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然によって生じる確率を示す。例えば、試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列との比較で最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、アミノ酸配列はプロテアーゼと類似していると考慮される。
【００７８】
配列同一性の率の問題が生じるとき、初期設定パラメーターを有するＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用する整列が実施される。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜６８０を参照すること。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムの初期設定パラメーターは、以下である。
【００７９】
【表１】
2016533741.tif 000004
【００８０】
ＩＩ．分子生物学
主題発明の実施形態は、目的の宿主細胞、例えば、糸状真菌において機能するプロモーターの制御下で、グルコシルヒドロラーゼコード化核酸から所望のグリコシルヒドロラーゼ酵素（又はグリコシルヒドロラーゼ酵素の組み合わせ）の発現をもたらす。したがって、本発明は、組み換え遺伝学の分野における多数の日常的な技術に依存している。適切な組み換え遺伝学の方法の例を開示する基本的な内容は、上記に示されている。
【００８１】
突然変異を親核酸／ポリペプチドに導入することができる当該技術分野に既知の任意の方法が、本発明により想到されている。
【００８２】
本発明は、ＧＨ６１酵素の変異体、例えば、ＧＨ６１Ａ酵素の発現、精製及び／又は単離、並びに使用に関する。これらの酵素は、配列番号２〜１１、１３、１４、及び１６のＧＨ６１Ａ／ＧＨ６１酵素、例えばヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａを含む、当該技術分野において既知のＧＨ６１酵素をコードする多数のｇｈ６１遺伝子のいずれかを利用する組み換え方法により調製することができる。部位特異的突然変異誘発を含む、突然変異を導入する任意の従来の方法を用いることができる。上記に示されているように、突然変異（又は変異）には、発現したＧＨ６１の変異体における１個以上のアミノ酸変化に対応することとなる置換、付加、欠失、又は切断が挙げられる。ここでも、発現したタンパク質にＤＮＡレベルでアミノ酸変化を組み込む部位特異的突然変異誘発及び他の方法は、多数の参考文献、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．２０１２年及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．において見出すことができる。
【００８３】
親ＧＨ６１のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において既知の様々な方法により調製される。これらの方法には、部位特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及び親ＧＨ６１Ａ酵素をコードする初めに調製されたＤＮＡのカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
部位特異的突然変異誘発は、置換変異体を調製するのに用いることができる１つの方法である。この技術は、当該技術において周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５年）、及びＫｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８７年）を参照すること）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を実施するためには、出発ＤＮＡが、まず、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドと、そのような出発ＤＮＡの一本鎖とのハイブリッド形成によって変更される。ハイブリッド形成した後、プライマーとしてハイブリッド形成オリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして出発ＤＮＡの一本鎖を使用して第２の鎖全体を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼが使用される。このように、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
【００８５】
ＰＣＲ突然変異誘発も、親ＧＨ６１のアミノ酸配列変異体を作製するのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７〜１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０年）、及びＶａｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３〜７３３（１９８９年）を参照すること。簡潔には、少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲの出発材料として使用される場合、テンプレートＤＮＡの対応する領域の配列と僅かに異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列と異なる、比較的多量の特定のＤＮＡフラグメントを生成することができる。
【００８６】
変異体を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５年）に記載されている技術に基づいている。出発材料は、突然変異される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。突然変異される出発ＤＮＡの（複数の）コドンは、特定されている。（複数の）特定された突然変異部位の両側に、特有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。そのような制限部位が存在しない場合、上記に記載されたオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法の使用により生成して、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な位置に導入することができる。プラスミドＤＮＡはこれらの部位で切断され、直線化される。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の（複数の）突然変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な手順を使用して合成され、ここでオリゴヌクレオチドの２本の鎖は、別々に合成され、次に標準的な技術の使用により一緒にハイブリッド形成される。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、直線化プラスミドの末端と適合性がある５’及び３’末端を有するように設計され、それによりプラスミドと直接連結することができる。これでこのプラスミドは、突然変異ＤＮＡ配列を含有する。
【００８７】
代替的に又は追加的に、所望のＧＨ６１の変異体の所望のアミノ酸配列を決定することができ、そのようなＧＨ６１の変異体をコードする核酸配列を合成的に生成することができる。
【００８８】
そのように調製された所望のＧＨ６１を、多くの場合、意図される用途に応じて更なる修飾に付すことができる。そのような修飾は、アミノ酸配列の更なる変更、（複数種の）異種ポリペプチドへの融合及び／又は共有結合的修飾を伴ってもよい。
【００８９】
ＩＩＩ．ＧＨ６１ポリペプチドの変異体及びそれをコードする核酸
１つの態様では、ＧＨ６１酵素の変異体が提供される。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体は、親ＧＨ６１酵素に対して、本明細書に記載されている１個以上の突然変異を有し、成熟形態のヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３）に、少なくとも６０％（すなわち、６０％以上、１００％未満）のアミノ酸配列同一性を更に有し、配列番号３への少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．６％までを含むアミノ酸配列同一性が含まれる。特定の実施形態において、親ＧＨ６１は、（上記に定義されている通り）真菌ＧＨ６１Ａである。更に、ＧＨ６１酵素の変異体は、セルラーゼ増強活性を有し、特定の実施形態において、ＧＨ６１の変異体は、親ＧＨ６１と比較して向上した性質を有する（本明細書に詳述されている）。野生型完全長形態のヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａのアミノ酸配列は、図１に示されている（配列番号２）。ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａの触媒ドメイン及び炭水化物結合ドメインと、多数の他のグルコシルヒドロラーゼとの配列整列は、図２及び図３にそれぞれ示されている。
【００９０】
特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体は、ヒポクレア・ジェコリーナの成熟形態のＧＨ６１Ａ（配列番号３）の１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。本発明の態様における特定の親ＧＨ６１酵素は、ヒポクレア・ジェコリーナの野生型ＧＨ６１Ａと同じアミノ酸を有さなくてもよく、上記に示された残基に対応するアミノ酸位置（例えば、アミノ酸位置Ｋ５８）は、位置番号のみ（例えば、表２に示されているアミノ酸位置５８）により又は接頭辞「Ｘ」（例えば、アミノ酸位置Ｘ５８）により、指定されてもよい。ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａの特定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置を指定する３つ全ての方法は交換可能であることが、本明細書において留意される。場合によっては、語「位置」は、省略されてもよい（例えば、アミノ酸５８、アミノ酸Ｋ５８、又はアミノ酸Ｘ５８）。
【００９１】
ＧＨ６１の変異体のアミノ酸配列は、親アミノ酸配列の１個以上のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入によって親ＧＨ６１アミノ酸配列と異なる。ＧＨ６１の変異体の残基（アミノ酸）は、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａの特定の残基又はその残基の一部に相同性がある（すなわち、一次若しくは三次構造の位置に対応する）又は機能的類似性がある（すなわち、化学的若しくは構造的に組み合わせる、反応する、若しくは相互作用する、同じ若しくは同様の機能的能力を有する）場合、ヒポクレア・ジェコリーナのＧＨ６１Ａの残基と同等である。本明細書で使用されるとき、番号付けは、図１に例示されている成熟ＧＨ６１Ａアミノ酸配列に対応することが意図される。
【００９２】
相同性を決定するアミノ酸配列の整列は、「配列比較アルゴリズム」を使用して決定することができる。配列比較のための最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索方法により、コンピュータを使用したこれらのアルゴリズム（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）の実施により、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｃａｎａｄａ）の目視検査又はＭＯＥより、実施することができる。上記の定義のセクションに提供されている「配列同一性の率」についての記載も参照すること。
【００９３】
特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体における（複数の）突然変異は、置換の部位がヒポクレア・ジェコリーナの成熟形態のＧＨ６１Ａ（配列番号３）に対応する、表１、表２に示され、かつ／又は解析コホート（Deconvoluted Cohort）（１〜４）（実施例３を参照すること）のいずれかに存在する、アミノ酸置換である。表１、表２、及び／又は解析コホートに示されている置換の全ての可能な組み合わせが、本発明に考慮される実施形態であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１．親グルコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上した性質を少なくとも１つ有し、前記少なくとも１つの有意に向上した性質は、有意に高い融解温度（Ｔｍ）、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、有意に向上したタンパク質産生性、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異体。
２．前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に高い融解温度（Ｔｍ）を有する、１に記載の変異体。
３．前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、２に記載の変異体。
４．前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイ及び希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１に記載の変異体。
５．前記変異体は、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ３１６Ｆ、Ｓ２９７Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、４に記載の変異体。
６．前記変異体は、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１の変異体。
７．前記変異体は、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｎ３１５Ｗ、Ｔ３０３Ｇ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、６に記載の変異体。
８．前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有する、１に記載の変異体。
９．前記変異体は、Ｈ２００Ａ、Ｓ１８５Ｄ、Ｐ３１６Ａ、Ｎ５１Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、８に記載の変異体。
１０．前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上したタンパク質産生性を有する、１に記載の変異体。
１１．前記変異体は、Ｖ８０Ｔ、Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｔ１０８Ｋ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、１０に記載の変異体。
１２．前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ、Ａ１２９Ｎ、Ａ１６８Ｋ、Ａ１６Ｎ、Ａ２０１Ｄ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｍ、Ｇ２３５Ｋ、Ｇ２３５Ｌ、Ｇ２３５Ｓ、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｇ２９８Ｃ、Ｇ３０１Ｐ、Ｈ２００Ａ、Ｋ１０６Ｃ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｅ、Ｋ７０Ｌ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｓ、Ｌ２９０Ａ、Ｌ２９０Ｍ、Ｎ１０Ｄ、Ｎ３１５Ｗ、Ｎ５１Ｅ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｆ、Ｐ５２Ｆ、Ｑ１６７Ｋ、Ｑ３２０Ａ、Ｑ３２０Ｐ、Ｑ３２０Ｓ、Ｒ３０４Ｄ、Ｒ３０４Ｐ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１８５Ｄ、Ｓ１８７Ｄ、Ｓ２９７Ｃ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ３００Ｔ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｍ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｑ、Ｔ１０８Ａ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｔ２８７Ａ、Ｔ３０３Ｇ、Ｔ３０３Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ８０Ｔ、Ｙ２９１Ｆ、Ｙ２９１Ｗ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、１に記載の変異体。
１３．前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ置換を含む、１２に記載の変異体。
１４．前記変異体は、Ｄ１２４Ｎ置換を含む、１２又は１３に記載の変異体。
１５．前記変異体は、Ｓ１６４Ｍ置換を含む、１２〜１４のいずれかに記載の変異体。
１６．前記変異体は、Ｙ３１８Ｗ置換を含む、１２〜１５のいずれかに記載の変異体。
１７．前記変異体は、Ａ１２９Ｎ置換を含む、１２〜１６のいずれかに記載の変異体。
１８．前記変異体は、Ａ１６８Ｋ置換を含む、１２〜１７のいずれかに記載の変異体。
１９．前記変異体は、Ａ１６Ｎ置換を含む、１２〜１８のいずれかに記載の変異体。
２０．前記変異体は、Ａ２０１Ｄ置換を含む、１２〜１９のいずれかに記載の変異体。
２１．前記変異体は、Ｄ１９７Ａ置換を含む、１２〜２０のいずれかに記載の変異体。
２２．前記変異体は、Ｄ１９７Ｅ置換を含む、１２〜２０のいずれかに記載の変異体。
２３．前記変異体は、Ｄ１９７Ｌ置換を含む、１２〜２０のいずれかに記載の変異体。
２４．前記変異体は、Ｄ１９７Ｍ置換を含む、１２〜２０のいずれかに記載の変異体。
２５．前記変異体は、Ｇ２３５Ｋ置換を含む、１２〜２４のいずれかに記載の変異体。
２６．前記変異体は、Ｇ２３５Ｌ置換を含む、１２〜２４のいずれかに記載の変異体。
２７．前記変異体は、Ｇ２３５Ｓ置換を含む、１２〜２４のいずれかに記載の変異体。
２８．前記変異体は、Ｇ２９５Ｃ置換を含む、１２〜２７のいずれかに記載の変異体。
３９．前記変異体は、Ｇ２９５Ｔ置換を含む、１２〜２７のいずれかに記載の変異体。
３０．前記変異体は、Ｇ２９８Ｃ置換を含む、１２〜２９のいずれかに記載の変異体。
３１．前記変異体は、Ｇ３０１Ｐ置換を含む、１２〜３０のいずれかに記載の変異体。
３２．前記変異体は、Ｈ２００Ａ置換を含む、１２〜３１のいずれかに記載の変異体。
３３．前記変異体は、Ｋ１０６Ｃ置換を含む、１２〜３２のいずれかに記載の変異体。
３４．前記変異体は、Ｋ５８Ｖ置換を含む、１２〜３３のいずれかに記載の変異体。
３５．前記変異体は、Ｋ６４Ｌ置換を含む、１２〜３４のいずれかに記載の変異体。
３６．前記変異体は、Ｋ７０Ｅ置換を含む、１２〜３５のいずれかに記載の変異体。
３７．前記変異体は、Ｋ７０Ｌ置換を含む、１２〜３５のいずれかに記載の変異体。
３８．前記変異体は、Ｋ７０Ｎ置換を含む、１２〜３５のいずれかに記載の変異体。
３９．前記変異体は、Ｋ７０Ｓ置換を含む、１２〜３５のいずれかの変異体。
４０．前記変異体は、Ｌ２９０Ａ置換を含む、１２〜３９のいずれかに記載の変異体。
４１．前記変異体は、Ｌ２９０Ｍ置換を含む、１２〜３９のいずれかに記載の変異体。
４２．前記変異体は、Ｎ１０Ｄ置換を含む、１２〜４１のいずれかに記載の変異体。
４３．前記変異体は、Ｎ３１５Ｗ置換を含む、１２〜４２のいずれかに記載の変異体。
４４．前記変異体は、Ｎ５１Ｅ置換を含む、１２〜４３のいずれかに記載の変異体。
４５．前記変異体は、Ｎ５１Ｈ置換を含む、１２〜４３のいずれかに記載の変異体。
４６．前記変異体は、Ｎ５１Ｔ置換を含む、１２〜４３のいずれかに記載の変異体。
４７．前記変異体は、Ｐ３１６Ａ置換を含む、１２〜４６のいずれかに記載の変異体。
４８．前記変異体は、Ｐ３１６Ｆ置換を含む、１２〜４６のいずれかに記載の変異体。
４９．前記変異体は、Ｐ５２Ｆ置換を含む、１２〜４８のいずれかに記載の変異体。
５０．前記変異体は、Ｑ１６７Ｋ置換を含む、１２〜４９のいずれかに記載の変異体。
５１．前記変異体は、Ｑ３２０Ａ置換を含む、１２〜５０のいずれかに記載の変異体。
５２．前記変異体は、Ｑ３２０Ｐ置換を含む、１２〜５１のいずれかに記載の変異体。
５３．前記変異体は、Ｑ３２０Ｓ置換を含む、１２〜５１のいずれかに記載の変異体。
５４．前記変異体は、Ｒ３０４Ｄ置換を含む、１２〜５３のいずれかに記載の変異体。
５５．前記変異体は、Ｒ３０４Ｐ置換を含む、１２〜５３のいずれかに記載の変異体。
５６．前記変異体は、Ｓ１３５Ｅ置換を含む、１２〜５５のいずれかに記載の変異体。
５７．前記変異体は、Ｓ１８５Ｄ置換を含む、１２〜５６のいずれかに記載の変異体。
５８．前記変異体は、Ｓ１８７Ｄ置換を含む、１２〜５７のいずれかに記載の変異体。
５９．前記変異体は、Ｓ２９７Ｃ置換を含む、１２〜５８のいずれかに記載の変異体。
６０．前記変異体は、Ｓ２９７Ｅ置換を含む、１２〜５８のいずれかに記載の変異体。
６１．前記変異体は、Ｓ３００Ｔ置換を含む、１２〜６０のいずれかに記載の変異体。
６２．前記変異体は、Ｔ１０７Ｅ置換を含む、１２〜６１のいずれかに記載の変異体。
６３．前記変異体は、Ｔ１０７Ｇ置換を含む、１２〜６１のいずれかに記載の変異体。
６４．前記変異体は、Ｔ１０７Ｍ置換を含む、１２〜６１のいずれかに記載の変異体。
６５．前記変異体は、Ｔ１０７Ｎ置換を含む、１２〜６１のいずれかに記載の変異体。
６６．前記変異体は、Ｔ１０７Ｑ置換を含む、１２〜６１のいずれかに記載の変異体。
６７．前記変異体は、Ｔ１０８Ａ置換を含む、１２〜６６のいずれかに記載の変異体。
６８．前記変異体は、Ｔ１０８Ｋ置換を含む、１２〜６６のいずれかに記載の変異体。
６９．前記変異体は、Ｔ１２７Ｉ置換を含む、１２〜６８のいずれかに記載の変異体。
７０．前記変異体は、Ｔ２８７Ａ置換を含む、１２〜６９のいずれかに記載の変異体。
７１．前記変異体は、Ｔ３０３Ｇ置換を含む、１２〜７０のいずれかに記載の変異体。
７２．前記変異体は、Ｔ３０３Ｐ置換を含む、１２〜７０のいずれかに記載の変異体。
７３．前記変異体は、Ｔ３１３Ｋ置換を含む、１２〜７２のいずれかに記載の変異体。
７４．前記変異体は、Ｖ１０４Ａ置換を含む、１２〜７３のいずれかに記載の変異体。
７５．前記変異体は、Ｖ８０Ｔ置換を含む、１２〜７４のいずれかに記載の変異体。
７６．前記変異体は、Ｙ２９１Ｆ置換を含む、１２〜７５のいずれかに記載の変異体。
７７．前記変異体は、Ｙ２９１Ｗ置換を含む、１２〜７５のいずれかに記載の変異体。
７８．前記変異体は、Ｙ３１７Ｗ置換を含む、１２〜７７のいずれかに記載の変異体。
７９．前記親ＧＨ６１酵素は、真菌グリコシドヒドロラーゼファミリー６１ａ（ＧＨ６１Ａ）酵素である、１〜７８のいずれかに記載の変異体。
【００９４】
別の態様では、親ＧＨ６１酵素（例えば、上記に記載されたもの）に対して１個以上の突然変異を有するＧＨ６１酵素の変異体をコードする核酸が、提供される。特定の実施形態において、核酸によりコードされる親ＧＨ６１酵素は、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ（配列番号３）に少なくとも８０％（すなわち、８０％以上、１００％未満）のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体をコードする核酸は、配列番号１に少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は更には少なくとも９９．９％の相同性／同一性がある（シグナル配列をコードする核酸の部分は除外される）。遺伝子コードの縮重に起因して、複数の核酸が同じＧＨ６１酵素の変異体をコードすることができることが理解される。更に、ＧＨ６１酵素の変異体をコードする核酸は、本明細書に記載されているように、コドン最適化するように改変されて、例えば、目的の宿主細胞における発現を向上することができる。特定のコドン最適化技術は、当該技術分野において既知である。
【００９５】
特定の実施形態において、ＧＨ６１酵素の変異体コード化核酸は、配列番号１に少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は更には少なくとも９９．９％の相同性／同一性を有するＧＨ６１をコードする核酸に対して厳密な（又はＧＨ６１をコードする核酸に対してに相補的な）条件下でハイブリッド形成する（シグナル配列をコードする核酸の部分は除外される）。
【００９６】
核酸は、シグナル配列を含む「完全長」（「ｆｌ」若しくは「ＦＬ」）ＧＨ６１酵素の変異体、シグナル配列を欠いている成熟形態のＧＨ６１酵素の変異体のみ又は成熟形態のＮ及び／若しくはＣ末端の部分を欠いている切断された形態のＧＨ６１酵素の変異体をコードすることができる。
【００９７】
ＧＨ６１酵素の変異体をコードする核酸は、下記に記載されているように、目的の（複数の）宿主細胞にＧＨ６１酵素の変異体を発現するのに適したベクターにおいて様々なプロモーター及びレギュレーターと作動可能に連結することができる。
【００９８】
ＩＶ．組み換えＧＨ６１の変異体の発現
主題発明の態様には、ＧＨ６１の変異体をコードする核酸の生成、そのような核酸を含有する宿主細胞、そのような宿主細胞によるＧＨ６１の変異体の産生、並びにＧＨ６１の変異体の単離、精製及び／又は使用に関する方法及び組成物が含まれる。
【００９９】
このように、本発明の実施形態は、所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸配列を含む発現ベクターにより形質導入、形質転換又は形質移入された宿主細胞を提供する。例えば、糸状真菌細胞又は酵母細胞は、所望のＧＨ６１の変異体が細胞系に発現するように所望のＧＨ６１の変異体をコードするＤＮＡセグメントと作動可能に連結している、宿主細胞系において機能するプロモーター若しくは生物学的に活性なプロモーターフラグメント又は１つ以上（例えば、一連）のエンハンサーを有する発現ベクターによって、形質移入される。
【０１００】
Ａ．核酸構築物／発現ベクター
所望のＧＨ６１の変異体をコードする天然又は合成ポリヌクレオチドフラグメントを、目的の宿主細胞（例えば、糸状真菌又は酵母細胞）への導入及びそこでの複製が可能である異種核酸構築物又はベクターに組み込むことができる。本明細書に開示されているベクター及び方法は、所望のＧＨ６１の変異体の発現のために、宿主細胞における使用に適している。導入される（複数の）宿主細胞の所望の複製／発現の特徴を満たす限り、任意のベクターを使用することができる（そのような特徴は、一般に、使用者によって定義される）。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に知られており、幾つかは市販されている。クローニング及び発現ベクターも、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９年、及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１年に記載されており、それぞれ参照として本明細書に明確に組み込まれる。真菌に適した発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１年）Ｉｎ、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６〜４２８に記載されている。適切なＤＮＡ配列を、様々な手順によりプラスミド又はベクター（本明細書において集合的に「ベクター」と呼ばれる）に挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、標準的な手順により（複数の）適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような手順及び関連するサブクローニングの手順は、当業者の知識の範囲内であると認められる。
【０１０１】
所望のＧＨ６１の変異体のためのコード配列を含む組み換え宿主細胞は、所望のＧＨ６１の変異体コード配列を含む異種核酸構築物を、（例えば、下記に更に詳細に記載される）所望の宿主細胞に導入することによって産生することができる。例えば、所望のＧＨ６１の変異体コード配列を、周知の組み換え技術に従って適切なベクターに挿入し、ＧＨ６１の発現が可能な糸状真菌の形質転換に使用することができる。上記に示されているように、遺伝子コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じ又は機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を使用して、所望のＧＨ６１の変異体をクローン及び発現することができる。したがって、コード領域におけるそような置換は、本発明に包含される配列変異体の範囲内に入ることが理解される。
【０１０２】
本発明には、上記に記載された、１つ以上の所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸配列を含む組み換え核酸構築物も含まれる。構築物は、本発明の配列が順又は逆方向で挿入されている、プラスミド又はウイルスベクターのようなベクターを含む。
【０１０３】
異種核酸構築物は、所望のＧＨ６１の変異体のためのコード配列を、（ｉ）分離して、（ｉｉ）所望のＧＨ６１の変異体コード配列が優勢なコード配列であるが、融合ポリペプチド又はシグナルペプチドコード配列のような追加のコード配列と組み合わせて、（ｉｉｉ）イントロンのような非コード配列と、並びに適切な宿主におけるコード配列の発現に有効なプロモーター及びターミネーター要素又は５’及び／若しくは３’非翻訳領域のような制御要素と組み合わせて、並びに／あるいは（ｉｖ）所望のＧＨ６１の変異体コード配列が異種遺伝子であるベクター又は宿主環境において、含むことができる。
【０１０４】
本発明の１つの態様では、異種核酸構築物を用いて、所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸配列を宿主細胞にインビトロで、例えば、確立された糸状真菌及び酵母系に移動させる。所望のＧＨ６１の変異体の長期産生は、ＧＨ６１の変異体の安定した発現を有する宿主細胞を生成することによって、達成することができる。このように、安定した形質転換物の生成に有効な任意の方法を、本発明の実施に使用できることが分かる。
【０１０５】
適切なベクターは、典型的には、選択可能なマーカーコード化核酸配列、挿入部位、並びにプロモーター及び終止配列のような適切な制御要素を備える。ベクターは、例えば、イントロンのような非コード配列、並びに制御要素、すなわち、宿主細胞（及び／又は修飾された可溶性タンパク質抗原コード配列が通常発現しないベクター若しくは宿主細胞環境）におけるコード配列の発現に有効なプロモーター及びターミネーター要素又は５’及び／若しくは３’非翻訳領域が含まれる調節配列を、コード配列と作動可能に連結して含むことができる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くは市販され、かつ／又はＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（ｓｕｐｒａ）に記載されている。
【０１０６】
適切なプロモーターの例には、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が挙げられ、その例には、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されたようなｔｅｔ−ｏｎ又はｔｅｔ−ｏｆｆシステム（ＣｌｏｎＴｅｃｈ  ａｎｄ  ＢＡＳＦ）にｔｅｔ応答要素（ＴＲＥ）を含有するプロモーター、ベータアクチンプロモーター、及び特定の金属塩の添加により上方制御され得るメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は、発現の目的のために特定の宿主細胞により認識されるＤＮＡ配列である。ＧＨ６１Ａポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結している。そのような連結は、プロモーターがＧＨ６１の変異体コード化配列の転写／翻訳を導くことができるように、発現ベクターにおけるＧＨ６１Ａポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡ配列の開始コドンに対して、プロモーターを位置付けすることを含む。プロモーター配列は、ＧＨ６１Ａポリペプチドの変異体の発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含有する。例には、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ又はアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼ、アルファ−アミラーゼ又はアルファ−グルコシダーゼコード遺伝子、アスペルギルス・ニデュランスのｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子、ニューロスポラ・クラッサのｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子、アスペルギルス・ニガー又はリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼコード遺伝子、ヒポクレア・ジェコリーナのｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、又は他のセルラーゼコード遺伝子が挙げられる。
【０１０７】
適切な選択可能なマーカーの選択は、宿主細胞に応じて決まり、様々な宿主に適したマーカーは、当該技術分野において周知である。典型的な選択可能なマーカーの遺伝子には、アスペルギルス・ニデュランス又はヒポクレア・ジェコリーナのａｒｇＢ、アスペルギルス・ニデュランスのａｍｄＳ、ニューロスポラ・クラッサ又はヒポクレア・ジェコリーナのｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・ニデュランスのｐｙｒＧが挙げられる。適切な選択可能なマーカーの追加の例には、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤ、又はｌｅｕ２が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、ｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−などのような突然変異体株を形質転換するために使用される異種核酸構築物に含まれる。
【０１０８】
そのような選択可能なマーカーは、糸状真菌により通常代謝されない代謝産物を利用する能力を、形質転換体に付与する。例えば、形質転換体の細胞が窒素源としてのアセトアミドに増殖することを可能にする酵素のアセトアミダーゼをコードする、ヒポクレア・ジェコリーナのａｍｄＳ遺伝子。選択可能なマーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は、栄養要求性突然変異体株の、選択的最小培地に増殖する能力を回復させることができ、又は選択可能なマーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は、阻害薬若しくは抗生物質の存在下で増殖する能力を形質転換体に付与することができる。
【０１０９】
選択可能なマーカーのコード配列は、当該技術分野において一般的に用いられる方法を使用して、任意の適切なプラスミドにクローンされる。適切なプラスミドの例には、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ、及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランスのＡＭＡ１配列を含有し、これをアスペルギルス・ニガーにおける複製を可能にする。
【０１１０】
本発明の実施は、特に示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９年、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７年、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３年、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年を参照すること。
【０１１１】
Ｂ．ＧＨ６１及びＧＨ６１酵素の変異体産生のための宿主細胞及び培養条件
ＧＨ６１Ａの変異体ＧＨ６１Ａの変異体をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡ構築物にクローンされた後、ＤＮＡが使用されて、微生物を形質転換する。本発明のＧＨ６１Ａの変異体を発現する目的で形質転換される微生物は、多種多様な宿主細胞から選択することができる。下記のセクションは、宿主細胞／微生物の例として提供されており、本発明の態様の実施に用いることができる宿主細胞の範囲を制限することを意図しない。
【０１１２】
（ｉ）糸状真菌
本発明の態様には、対応する形質転換されていない親の糸状真菌と比べて、所望のＧＨ６１の変異体の産生又は発現をもたらすのに有効な方法で修飾、選択、及び培養されている糸状真菌が含まれる。
【０１１３】
所望のグリコシルヒドロラーゼ発現のために処理及び／又は修飾され得る親の糸状真菌の種の例には、トリコデルマ、ペニシリウム属、フミコーラ・インソレンスを含むフミコーラ属、アスペルギルス・ニガーを含むアスペルギルス属、クリソスポリウム属、ミセリオフトラ属、フサリウム属、ヒポクレア属、タラロミセス属、スポロトリクム属、及びエメリセラ属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
所望のＧＨ６１の変異体を発現する細胞は、親の真菌系を培養するために典型的に用いられる条件下で培養される。一般に、細胞は、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ７１〜８６，１９８８年及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７年に記載されているような、生理食塩及び栄養素を含有する標準的な培地において培養される。標準的な培養条件は、当該技術分野において既知であり、例えば、培養物は、振とう培養液又は発酵槽において、所望のレベルで所望のＧＨ６１の変異体の発現が達成されるまで、２８℃でインキュベートされる。
【０１１５】
所定の糸状真菌の培養条件は、例えば、科学文献及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような真菌の供給源において見出すことができる。真菌の増殖が確立された後、細胞は、所望のＧＨ６１の変異体の発現を引き起こす又は許容するのに有効な条件に曝露される。
【０１１６】
所望のＧＨ６１の変異体コード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、誘発剤、例えば、糖、金属塩又は抗生物質が、所望のＧＨ６１の変異体の発現を誘発するのに有効な濃度で培地に添加される。
【０１１７】
１つの実施形態において、菌株は、アスペルギルス・ニガー株であり、これは、過剰発現タンパク質を得るために有用な菌株である。例えば、アスペルギルス・ニガー変異体アワモリｄｇｒ２４６は、多量の分泌セルラーゼを分泌することが知られている（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２年）４１：８９〜９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４、及びＧＡＰ３−４のようなアスペルギルス・ニガー変異体アワモリの他の菌株が、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３年，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３）により知られている。
【０１１８】
別の実施形態において、菌株は、トリコデルマ・レーシ株であり、これは、過剰発現タンパク質を得るために有用な菌株である。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３（１９８４年）に記載されているＲＬ−Ｐ３７は、多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物には、トリコデルマ・レーシの菌株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）が挙げられる。これらの菌株も、ＧＨ６１の変異体を過剰発現するのに有用であることが想到される。
【０１１９】
潜在的に有害な天然のグルコシルヒドロラーゼ又はセルラーゼ活性の不在下でＧＨ６１の変異体を得ることが望ましい場合、１個以上のグルコシルヒドロラーゼ遺伝子（例えば、ｇｈ６１ａ遺伝子）及び／又はセルラーゼ遺伝子が、所望のＧＨ６１の変異体をコードするＤＮＡフラグメントを含有するＤＮＡ構築物又はプラスミドの導入の前に欠失されている、宿主細胞株を得ることが有用である。そのような菌株は、任意の従来の方法により、例えば米国特許第５，２４６，８５３号及び国際公開第９２／０６２０９号に開示されている方法により調製することができ、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。１個以上のグルコシルヒドロラーゼ遺伝子（例えば、宿主細胞の内在性ｇｈ６１ａ遺伝子）を失っている宿主微生物に所望のＧＨ６１の変異体を発現させることによって、特定及び望ましい場合には後続の精製の手順が簡素化される。
【０１２０】
遺伝子欠失は、欠失又は破壊される所望の遺伝子形態を、当該技術分野において既知の方法によりプラスミドに挿入することによって、達成することができる。次に欠失プラスミドは、所望の遺伝子コード領域及び選択可能なマーカーにより代えられている遺伝子コード配列又はその一部の内部にある、適切な（複数の）制限酵素部位で切断される。欠失又は破壊される遺伝子座に隣接しているＤＮＡ配列、例えば約０．５〜約２．０ｋｂは、選択可能なマーカー遺伝子の両側に残存したままであり得る。適切な欠失プラスミドは、隣接ＤＮＡ配列を含む欠失遺伝子含有フラグメント及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直線状の片として除去されることを可能にするように存在する、特有の制御酵素部位を一般に有することとなる。
【０１２１】
特定の実施形態では、所望のＧＨ６１の変異体をコードするＤＮＡの２個以上のコピーが宿主菌株に存在して、ＧＨ６１の変異体の過剰発現を促進することができる。例えば、宿主細胞は、ゲノムに組み込まれている、所望のＧＨ６１の変異体の複数のコピーを有してもよく、あるいは宿主生物体の中で自律的に複製することができるプラスミドベクターを含んでもよい。
【０１２２】
（ｉｉ）酵母
本発明は、所望のＧＨ６１の産生のための宿主細胞として、酵母の使用も考慮する。加水分解酵素をコードする幾つかの他の遺伝子が、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）の様々な菌株に発現している。これらには、トリコデルマ・レーシからの２つのエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７年）、２つのセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年）及び１つのベータ−グルコシダーゼ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｆｏｗｌｅｒ，１９９６）、アウレオバシドリウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｌｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）からのキシラナーゼ（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ，１９９６年）、小麦からのアルファ−アミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７年）などをコードする配列が挙げられる。加えて、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）のエンド−［ベータ］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のセロデキストリナーゼ（ＣＥＬ１）及びエンドマイセス・フィブリリザー（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｒ）のセロビアーゼ（Ｂｇｌ１）をコードするセルラーゼ遺伝子カセットは、サッカロマイセス・セレビシエの実験室菌株において成功裏に発現した（Ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年）。
【０１２３】
（ｉｉｉ）他
幾つかの実施形態において、昆虫細胞又は細菌細胞発現系を含む、糸状真菌細胞又は酵母細胞以外の宿主細胞の発現系を用いることができると、更に考慮される。特定の細菌宿主細胞は、例えば、目的の（複数の）酵素／（複数の）変異体を発現することができるだけでなく、特定の単糖及び他の発酵性の糖を代謝してエタノールにすることもできる、改変ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のようなエタノロゲン（ethanologen）でもあるものであり得る。宿主細胞の選択は、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体の使用者の要望によって決定され得るものであり、したがってその点において制約は意図されていない。
【０１２４】
Ｃ．所望のＧＨ６１コード化核酸配列の、宿主細胞への導入
本発明は、外因的に提供される所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸配列を含むように遺伝子修飾されている細胞及び細胞組成物を更に提供する。親の細胞又は細胞系は、クローニングベクター又は発現ベクターにより遺伝子修飾（例えば、形質導入、形質転換、又は形質移入）され得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってもよく、上記に更に記載されている。
【０１２５】
本発明の形質転換の方法は、形質転換ベクターの全て又は一部の、宿主細胞のゲノムへの安定した組み込みをもたらすことができる。しかしながら、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も想到される。
【０１２６】
外来性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する周知の手順のいずれかを、使用することができる。これらには、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン感染、プロトプラスト融合、電気穿孔、バイオリステック法、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクター又はクローンされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくは他の外来性遺伝子材料を宿主細胞に導入する他の周知の方法のいずれか（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照すること）の使用が挙げられる。基本的には、使用される特定の遺伝子改変手順は、ポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を、所望のＧＨ６１の変異体を発現することができる宿主に成功裏に導入することができるはずである。
【０１２７】
多くの標準的な形質移入の方法を使用して、大量の異種ポリペプチドを発現するトリコデルマ・レーシ細胞系を産生することができる。ＤＮＡ構築物をトリコデルマのセルラーゼ産生株に導入する公開されている方法の幾つかには、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ  ａｎｄ  Ｈａｒｍａｎ，１９９３年，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９〜３５６、Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，１９９０年，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９〜１７４、Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９８７年，Ｇｅｎｅ  ６：１５５〜１６４、アスペルギルスには、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｈａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，１９８４年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０〜１４７４、フサリウムには、Ｂａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ  ａｎｄ  Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２〜８２１２、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）には、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５年，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ、及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）には、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，１９９０年，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５〜１３８）が挙げられる。アスペルギルス属に適した形質転換プロセスの例は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６、１９８９年において見出すことができる。
【０１２８】
本発明には、真菌セルラーゼ及びグリコシルヒドロラーゼ組成物の産生に使用される宿主細胞、例えば、ヒポクレア・ジェコリーナ及びアスペルギルス・ニガーのような糸状真菌の、新規で有用な形質転換体が更に含まれる。したがって、主題発明の態様には、所望のＧＨ６１の変異体コード配列を含み、かつ１つ以上の内在性グルコシルヒドロラーゼコード配列の欠失又は不活性化突然変異も時々含む糸状真菌の形質転換対が含まれる（例えば、ｇｈ６１ａコード配列の欠失。グリコシルヒドロラーゼ及び／又はセルラーゼ遺伝子が欠失している宿主細胞も実施例に記載されている）。
【０１２９】
加えて、所望のグルコシルヒドロラーゼコード化核酸配列を含む異種核酸構築物を、インビトロで転写することができ、得られたＲＮＡを、周知の方法により、例えば、注入により宿主細胞に導入することができる。
【０１３０】
Ｄ．ＧＨ６１核酸コード配列及び／又はタンパク質発現の分析
所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸構築物により形質転換された細胞系による所望のＧＨ６１の変異体の発現を評価するため、アッセイを、タンパク質レベルにおいて、ＲＮＡレベルにおいて又はＧＨ６１活性及び／若しくは産生に特定の機能的バイオアッセイの使用により、実施することができる。
【０１３１】
一般に、所望のＧＨ６１の変異体の発現を分析するために用いられるアッセイには、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又は適切な標識プローブ（核酸コード配列に基づいた）を使用するインサイツハイブリッド形成、並びに従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
加えて、修飾ＧＨ６１の産生及び／又は発現は、試料を直接的に、例えば、ＧＨ６１活性（セルラーゼ増強活性）、発現及び／又は産生のアッセイにより測定することができる。ＧＨ６１セルラーゼ増強活性が評価され得るアッセイは、例えば、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．及びＢｒｏｗｎ，Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８年，５２３：１３３  １４６）、Ｓｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８年）、並びに米国特許第５，２４６，８５３号及び同第５，４７５，１０１号に記載されており、それぞれ参照として本明細書に明確に組み込まれる。修飾されたＧＨ６１が、単離された可溶性及び不溶性の基剤の加水分解を増強する能力は、Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）及びＯｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）に記載されているアッセイを使用して測定することができる。セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ−グルコシダーゼ活性に対するＧＨ６１による増強をアッセイするのに有用な基質には、結晶質セルロース、濾紙、リン酸膨張セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリルラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オルトニトロフェニルラクトシド、パラニトロフェニルラクトシド、オルトニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルセロビオシド、オルトニトロフェニルグルコシド、パラニトロフェニルグルコシド、メチルウンベリフェリルグルコシドが挙げられる。
【０１３３】
加えて、タンパク質発現は、ＥＬＩＳＡ、競合免疫測定法、放射免疫測定法、ウエスタンブロット、間接的な免疫蛍光アッセイなどのような免疫学的方法によって評価することができる。これらのアッセイの特定のものは、ＧＨ６１酵素を検出するように設計されている市販の試薬及び／又はキットを使用して実施することができる。そのような免疫測定法を使用して、所望のＧＨ６１の変異体の発現を定常的及び／又は定量的に評価することができる。そのような方法の詳細は、当業者に既知であり、そのような方法を実施する多くの試薬は、市販されている。特定の実施形態において、所望のＧＨ６１酵素の変異体に特異的であるが、その親ＧＨ６１には特異的でない免疫学的試薬を、例えば、ＧＨ６１置換に又はＧＨ６１の変異体の融合パートナー（例えば、Ｎ若しくはＣ末端タグ配列、例えば、ヘキサ−ヒスチジンタグ若しくはＦＬＡＧタグ）に特異的である抗体を用いることができる。したがって、本発明の態様には、所望のＧＨ６１の変異体の精製形態を使用して、様々な免疫測定法に使用される、発現されたポリペプチドに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかを産生することが含まれる。（例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年を参照すること）。
【０１３４】
Ｖ．ＧＨ６１の変異体ポリペプチドを豊富化、単離及び／又は精製する方法。
一般に、宿主細胞培養物において産生された所望のＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、（ＧＨ６１の変異体を含有する培養上澄みを産生する）培地に分泌され、例えば、細胞培養培地から不要な成分を除去することによって、豊富化、精製又は単離することができる。しかしながら、場合によっては、所望のＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、細胞形態で産生され、細胞溶解物からの回収を必要とすることもある。所望のＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、産生された細胞又は細胞上澄みから、当業者により日常的に用いられる技術を使用して採取される。例には、濾過（例えば、限外又は精密濾過）、遠心分離、密度勾配分画（例えば、密度勾配超遠心分離）、アフィニティクロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４年）、高分解能を有する材料を使用するイオン交換（Ｍｅｄｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年）を含むイオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年、Ｆｌｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３年、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４年、Ｅｌｌｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７年）、疎水性相互反応クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ  ａｎｄ  Ｑｕｅｉｒｏｚ，１９９９年）、及び二相分配（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９年）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
豊富化、単離、又は精製されたＧＨ６１の変異体ポリペプチドが時によって望ましい場合、他の実施形態では、ＧＨ６１の変異体ポリペプチドを発現する宿主細胞が、ＧＨ６１媒介セルラーゼ増強活性を必要とするアッセイに直接用いられる。したがって、所望のＧＨ６１の変異体ポリペプチドの変異体の豊富化、単離又は精製は、セルロースバイオマス加水分解アッセイ又はプロセスにおける使用が見出されるＧＨ６１の変異体ポリペプチド組成物を得る必要は必ずしもない。例えば、本発明の態様のセルラーゼ及びグリコシルヒドロラーゼ含有系を、本明細書に記載されるＧＨ６１Ａの変異体を発現する宿主細胞が、セルロース加水分解プロセスに直接的に、すなわち目的のアッセイに使用する前に宿主細胞からＧＨ６１Ａを単離することなく使用されることを可能にするように、設計することができる。
【０１３６】
ＶＩ．ＧＨ６１の変異体の有用性
所望のＧＨ６１の変異体コード化核酸、所望のＧＨ６１の変異体ポリペプチド及びそれを含む組成物は、多種多様な用途において有用性が見出されることを理解することができ、幾つかは下記に記載されている。本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体の向上した性質を、多くの方法で利用することができる。例えば、熱ストレスの条件下で向上した性能を有するＧＨ６１の変異体を使用して、高温（例えば、親ＧＨ６１が不十分に機能する温度）で実施されるアッセイにおいてセルラーゼ増強活性を増加させることができ、用いられるＧＨ６１の総量を、使用者が（親ＧＨ６１を使用したときと比較して）低減することを可能にする。変更された最適ｐＨ、界面活性剤の存在下で増加した安定性若しくは活性、基質への増加した特異的活性、変更された基質切断パターン及び／又は目的の宿主細胞における高レベルの発現を有するＧＨ６１の変異体を含む、ＧＨ６１変異体のポリペプチドの他の向上した性質を、セルラーゼ組成物のセルロース加水分解活性を決定するのに適したアッセイに利用することができる。
【０１３７】
本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体を、実質的に任意のセルロース材料の処理を増強するため、例えば、（例えば、バイオ仕上げ（biofinishing）若しくはバイオストーン加工（biostoning）などの）繊維産業における、洗剤における、動物飼料における、パルプ製紙産業における及び／又はバイオエタノール生産におけるプロセスを増強するために使用することができる。
【０１３８】
したがって、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、向上した洗浄能力を示す、柔軟剤として機能する及び／又は綿布地の感触を向上する（例えば、「ストーンウオッシュ」若しくは「バイオ仕上げ」）洗剤組成物における、木材パルプを糖に分解する（例えば、バイオエタノール生産用）組成物における、及び／又は飼料組成物における使用が見出される。ＧＨ６１の変異体の単離及び特徴付けにより、そのような組成物の特徴及び活性を制御する能力がもたらされる。
【０１３９】
本明細書に記載されている所望のＧＨ６１の変異体を含有する酵素混合組成物をエタノール生産において使用することが見受けられる。このプロセスによるエタノールを、更に、オクタンエンハンサーとして又はガソリンの代わりに燃料として直接使用することができ、このことは、燃料源としてエタノールが、石油由来生成物よりも環境に優しいので有益である。エタノールの使用により、空気の質が向上され、可能であれば局所的なオゾンレベル及びスモッグが低減することが知られている。更に、ガソリンの代わりにエタノールを利用することにより、非再生可能エネルギー及び石油化学供給源の突然の移行の影響を緩和するのに戦略的に重要であり得る。
【０１４０】
別個の糖化及び発酵は、バイオマス、例えばトウモロコシ茎葉に存在するセルロースがグルコースに変換され、続いて酵母菌株がグルコースをエタノールに変換するプロセスである。同時発生的な糖化及び発酵は、バイオマスに存在するセルロースがグルコースに変換され、同時に、同じ反応器において、酵母菌株がグルコースをエタノールに変換するプロセスである。したがって、本発明のＧＨ６１の変異体は、バイオマスをエタノールに分解するこれらのプロセスの両方における使用が見出される。容易に利用可能なセルロース供給源からのエタノールの生産により、安定した再生可能な燃料供給源がもたらされる。幾つかのプロセスにおいて、バイオマスはグルコースに完全には分解されず（例えば、二糖を含有する）、そのような生成物は、エタノール生産以外の使用が見出されることも、更に留意される。
【０１４１】
セルロース系原材料は、様々な形態をとることができ、農業廃棄物、草木及び都市廃棄物（例えば、再生紙、庭の刈草など）のような他の低価値バイオマスを含有することができる。エタノールは、これらのセルロース原材料のいずれかの発酵によって生産することができる。このように、多岐にわたる原材料を、本発明の所望の（複数種の）グルコシルヒドロラーゼと共に使用することができ、使用のための選択は、変換が行われる地域に応じて決めることができる。例えば、米国の中西部では、麦わら、トウモロコシ茎葉及搾りかすのような農業廃棄物が主であり、一方、カリフォルニア州では稲わらが主である。しかしながら、任意の利用可能なセルロースバイオマスを任意の地域で使用できることが、理解されるべきである。
【０１４２】
別の実施形態において、セルロース原材料を前処理することができる。前処理は、高温及び希酸、濃酸又は希アルカリ溶液の添加によるものであってもよい。前処理溶液は、ヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間にわたって添加され、次に中和される。
【０１４３】
バイオマス変換に加えて、本明細書に記載されているＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、例えば、界面活性剤（アニオン性、非イオン性及び両性界面活性剤を含む）、ヒドロラーゼ、ビルディング剤（building agent）、漂白剤、青み付け剤及び蛍光染料、粘結抑制剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤などのいずれか１つ以上を含むことができる洗剤組成物に存在することができる。これらの成分は、全て、洗剤組成物の技術分野において既知である。ＧＨ６１の変異体ポリペプチド含有洗剤組成物は、液体、顆粒、乳剤、ゲル、ペーストなどを含む任意の都合の良い形態であり得る。特定の形態（例えば、顆粒）の場合では、洗剤組成物を、セルラーゼ保護剤を含有するように配合することができる。（例えば、参照として本明細書に組み込まれる、表題「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」の国際公開第１９９７０２００２５号を参照すること）。特定の実施形態において、ＧＨ６１の変異体ポリペプチドは、洗剤組成物全体に対して０．００００５重量パーセント〜５重量パーセント、例えば、洗剤組成物全体に対して約０．０００２重量パーセント〜約２重量パーセントで洗剤組成物に存在する。
【０１４４】
上記から分かるように、これらの親ＧＨ６１酵素と比較して向上した性質を有するＧＨ６１の変異体ポリペプチド（及びそれらをコードする核酸）は、典型的には少なくとも１つのセルラーゼの存在下でグルコシルヒドロラーゼを用いる多数のアッセイ及びプロセスのいずれかの向上における使用が見出される。
【実施例】
【０１４５】
本発明は、以下の実施例において更に詳細に記載され、これらは特許請求される本発明の範囲をいかようにも制限することを意図しない。添付図面は、本開示の明細書及び記載に不可欠な部分として考慮されることが意図される。引用されている全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てが参照として本明細書に特定的に組み込まれる。
【０１４６】
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される。Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｎＭ（ナノモル）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ及びｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）、℃（摂氏）、ＱＳ（十分量）、ＮＤ（実施されず）、ＮＡ（該当なし）、ｒｐｍ（毎分回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロベース対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｗ／ｖ（重量体積パーセント）、ｖ／ｖ（体積パーセント）、ｇ（重力）、ＯＤ（光学濃度）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ｗｈＰＣＳ（希酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物）、ｄａＣＳ（希アンモニウム前処理トウモロコシ茎葉）、Ｐｉ又はＰＩ（性能指数）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＦＡＢ（国際公開第２０１２／１２５９５１号に記載されている特定のハイブリッドベータグルコシダーゼ）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＲＰＣ（逆相クロマトグラフィー）、並びにＳＥＬ（部位評価ライブラリー）。
【０１４７】
（実施例１）
アッセイ
以下のアッセイを、下記に記載されている実施例に使用した。下記に提供されたプロトコールからの任意の偏差が、実施例において示されている。これらの実験において、分光光度計を使用して、反応の完了後に形成された生成物の吸光度を測定した。
【０１４８】
Ｉ．グルコースの測定
Ａ．残留グルコースの測定のためのヘキソキナーゼアッセイ
ｗｈＰＣＳから産生されたグルコースを、ヘキソキナーゼアッセイの使用により測定した。１０μＬの１０Ｘ希釈上澄みを、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）中の１９０μＬのグルコースヘキソキナーゼアッセイ混合物（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｒｅｄａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に加えた。プレートを室温で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、上澄みの吸光度を３４０ｎｍで測定した。残留グルコースを含有する培養物の上澄みを、更なる研究のためにプールしたものから除外した。
【０１４９】
Ｂ．グルコースの測定のためのＡＢＴＳアッセイ
ＧＨ６１ＡのＡｖｉｃｅｌ活性アッセイにおいて生成されたモノマーグルコースを、ＡＢＴＳアッセイを使用して検出した。アッセイ緩衝液は、５．４８ｇ／Ｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１８８８）、０．２Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼＶＩ−Ａ型（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８３７５）及び２Ｕ／ｍＬの食品等級グルコースオキシダーゼ（ＧＥＮＥＮＣＯＲ（登録商標）５９８９Ｕ／ｍＬ）を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液にｐＨ５．０で含有した。５０μＬのＧＨ６１Ａ活性アッセイミックス（下記のＶＩＩＩに記載されているＡｖｉｃｅｌアッセイからのもの）を、５０μＬのＡＢＴＳアッセイ溶液に加えた。活性アッセイミックスを添加した後、反応をＯＤ４２０、周囲温度２２℃で５分間、動力学的に追跡した。各アッセイ条件に適したグルコースの較正曲線を常に含めた。
【０１５０】
Ｃ．グルコース濃度決定のためのＨＰＬＣアッセイ
グルコース濃度を、ＲＥＺＥＸ  ＲＦＱ−Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  Ｈ＋（８％）１００×７．８ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣの使用により決定した。カラムは、８０℃及び流速０．９ｍＬ／ｍｉｎで動作し、溶出液として０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を用いた。３０μＬの試料を、９０μＬのｍｉｌｌｉＱと混合し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ  ９６ウエル濾過系により真空下で濾過した。１０μＬの４ｘ希釈試料を注入した。適切なグルコース較正セットを使用して、正確なグルコース濃度を決定した。
【０１５１】
ＩＩ．タンパク質精製及び透析
野生型又はＧＨ６１Ａの変異体を発現するヒポクレア・ジェコリーナ（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｍａｎ１）の上澄みを、１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ８．０に４Ｘで希釈して、最終容量の５００μＬを生じた。混合物を３０分間インキュベートし、その間に、１００ｍＭのＣｕＳＯ４を投入した２００μＬのＢｉｏｋａｌ  Ｗｏｒｋｂｅａｄ  ４０  ＩＤＡ  Ｈｉｇｈと共に混合（５回）した。通過画分に存在する精製したタンパク質試料を、１，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して得た。精製した試料を、「Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ９６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｐｏ  ｄｉａｌｙｚｅｒ」１０ｋＤ  ＭＷＣＯ（＃７４−０９０３）プレートの使用により、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０に４℃で一晩透析（４０ｘ）した。
【０１５２】
ＩＩＩ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、正規化及びエンドＨ処理によるタンパク質決定
タンパク質濃度は、標準としてＢＡＳを用いるＢｉｏＲａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイの使用により決定した。選択された試料では、Ｂｒａｄｆｏｒｄにより得られたタンパク質濃度を、標準として精製ＧＨ６１Ａを用いるＳＥＣ  ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ  ＨＰＬＣにより得られたタンパク質データと比較した。５０ｍＭ  ＮａＡＣ  ｐＨ  ５．０により適切に希釈してＧＨ６１Ａ試料を１００ｐｐｍに正規化することは、（必要であれば）ＨＰＬＣ値が示されるＢｒａｄｆｏｒｄとＨＰＬＣ測定値との間の補正率を考慮することによって行う。タンパク質試料を、ストレプトマイセス（S. plicatus）（例えば、ＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）からの１０ｐｐｍのエンドＨグリコシダーゼにより処理し、３７℃及び８００ｒｐｍで４〜２０時間インキュベートした。
【０１５３】
ＩＶ．正規化後のタンパク質含有量決定のためのＨＰＬＣアッセイ
Ａ．タンパク質決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
エンドＨ処理及び正規化されたＧＨ６１Ａの変異体の濃度は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ１２５  ＳＥＣ  １．７μｍ（４．６×１５０ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣにより決定した。２５μＬの試料を７５μＬのｍｉｌｌｉＱと混合した。１０μＬの試料をカラムに注入した。化合物は、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎで定組成的に４．５分間実施したＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ  ６．７５を使用して溶出した。タンパク質を、２２０ｎｍの波長で検出した。ＧＨ６１Ａの変異体のタンパク質濃度は、精製野生型ＧＨ６１Ａ（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬ）を使用して生成した較正曲線によって決定した。性能指数（ＰＩ）を計算するため、ＧＨ６１Ａの変異体の濃度を、同じプレートの野生型ＧＨ６１Ａ（例えば、基準酵素）の平均で割った。
【０１５４】
Ｂ．タンパク質決定のための逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）
精製培養上澄みにおけるＧＨ６１Ａの変異体タンパク質の濃度は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ  ３．６ｕ  ＸＢ−Ｃ８（５０×２．１ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣにより決定した。９０μＬの試料を１０μＬの５０％アセトニトリルと混合した。１０μＬの試料をカラムに注入した。化合物は、以下の勾配を使用して溶出した。溶出液Ａ（９０％で０分）、（７０％で１．５分）、（５５％で３．５分）、（５％で３．６分）、（５％で４．１分）、（９０％で４．２分）、（９０％で４．５分）。溶出液Ａは、ＭｉｌｌｉＱ＋０．１％のＴＦＡであり、溶出液Ｂは、アセトニトリル＋０．０７％のＴＦＡであった。タンパク質を、２２０ｎｍの波長で検出した。ＧＨ６１Ａの変異体のタンパク質濃度は、精製野生型ＧＨ６１Ａ（１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬ）を使用して生成した較正曲線によって決定した。性能指数（ＰＩ）を計算するため、ＧＨ６１Ａの変異体の濃度を、同じプレートの野生型ＧＨ６１Ａ（例えば、基準酵素）の平均で割った。
【０１５５】
Ｖ．熱安定性アッセイ
Ａ．熱安定性を測定するＡｖｉｃｅｌアッセイ（「Ａｖｉｃｅｌ  Ａｆｔｅｒ」とも呼ばれる）
熱不活性化後の（野生型及び変異体を含む）ＧＨ６１Ａポリペプチドの残留活性を、Ａｖｉｃｅｌアッセイの使用により決定した。２５μＬのアリコートを、ＰＣＲ機器の９６ウエルＰＣＲプレートにおいて６６℃で１時間、四重にインキュベートした。インキュベートした後、ＧＨ６１Ａポリペプチドの残留特異的活性を、下記（セクションＶＩＩＩ）に記載されているように決定した。野生型酵素に対する変異体の相対的な残留活性は、インキュベートした後の特異的活性の平均を、インキュベートする前の特異的活性の平均と比較することによって決定した。
【０１５６】
Ｂ．ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ及びＲＴ−ＰＣＲ機器を使用したタンパク質熱シフトアッセイ（「Ｔｍ」とも呼ばれる）
（野生型及び変異体を含む）ＧＨ６１Ａポリペプチドの折りたたみの解き（unfolding）を以下のように測定した。２５μＬのＧＨ６１Ａ野生型及び変異体タンパク質試料（非エンドＨ処理）と、８μＬの（５０ｍＭのＮａＡＣ  ｐＨ  ５．０で１０００ｘに希釈した）ＳＹＰＲＯ（登録商標）ｏｒａｎｇｅとを、９６ウエルＨａｒｄ  Ｓｈｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（ＨＳＰ９６４５  ＢｉｏＲａｄ）において混合した。試料を、ＲＴ−ＰＣＲ機器に接続したＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸにおいてインキュベートした。試料を、３０℃で１分間、続いて５秒毎に０．２℃増加しながら３０℃〜９０℃の勾配だけインキュベートした。５秒毎に蛍光データを収集し、データをＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  ｍａｇａｎｇｅｒソフトウエアの使用により分析した。各ＧＨ６１Ａの変異体の融解温度Ｔｍを決定し、上記に記載された方法に従って、野生型ＧＨ６１Ａの平均（中央値）Ｔｍ（複数回測定）と比較した。Ｔｍにおいて見られた改善の程度を記録した。
【０１５７】
ＶＩ．希酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイ
トウモロコシ茎葉を記載されたように２％ｗ／ｗのＨ２ＳＯ４により前処理し（例えば、Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０５：６９〜８６，２００３年を参照すること）、３Ｍの水酸化アンモニウムによりｐＨ  ５．０に滴定し、最終濃度０．０１％のアジ化ナトリウムを防腐のために加えた。次に酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を加えて、固形物１０％の最終濃度を得た。反応混合物中のセルロース濃度は、約３％であった。７０μＬのこのセルロース懸濁液を、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰＳ）の各ウエルに加えた。２つの異なる方法を用いて、ｗｈＰＣＳにおける性能を測定した。Ａ）４７μＬの２ｇ／Ｌ酵素バックグラウンド混合物をｗｈＰＣＳに加えた。この酵素混合物は、ＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧ酵素をそれぞれおよそ８：１：１の比でもたらした。次に、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａの変異体のいずれかを発現するヒポクレア・ジェコリーナ細胞の２２、１１、５及び３μＬの１００ｕｇ／ｍＬ精製上澄みを、ｗｈＰＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に加えた。補正量の酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、総容量の差を補った。Ｂ）２５μＬの０．２２５ｇ／Ｌ酵素バックグラウンド混合物をｗｈＰＣＳに加えた。酵素バックグラウンド混合物は、ＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧ酵素をそれぞれおよそ４：１．５：１の比でもたらし、並びに補助キシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素（混合物中の酵素のおよそ５％及び２０％を表す）をもたらした。次に、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａの変異体のいずれかを発現するヒポクレア・ジェコリーナ細胞の２５μＬの５０ｕｇ／ｍＬ精製上澄みを、ｗｈＰＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に加えた。補正量の酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、総容量の差を補った。密閉した後、プレートを恒温インキュベーターの中に、９００ｒｐｍで連続的に振とうしながら５０℃で設置した。７２時間後に、プレートを氷上に５分間置き、加水分解反応を、１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ１０を各ウエルに添加することによって停止させた。プレートを密閉し、３，０００ｒｐｍにより室温で２分間遠心分離した。上澄み中のグルコース放出加水分解反応産物を、ヘキソキナーゼ及び／又はＨＰＬＣグルコース濃度決定法により分析した。用量応答曲線を野生型ＧＨ６１Ａ酵素に関して生成した。性能指数（ＰＩ）を計算するため、ＧＨ６１Ａの変異体で産生された（平均）全糖を、同じドースでの野生型ＧＨ６１Ａ（例えば、基準酵素）で産生された（平均）全糖で割った。
【０１５８】
ＶＩＩ．希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイ
トウモロコシ茎葉を、０．９ｍｍスクリーンを通過するように粉砕し、次に国際公開第０６１１０９０１号又は公開された米国特許出願第２００７００３１９１８号、同第２００７００３１９１９号、同第２００７−００３１９５３号、若しくは同第２００７００３７２５９号の記載に従って希アンモニアにより前処理し、１ＭのＨ２ＳＯ４によりｐＨ５．０に滴定し、最終濃度０．０１％のアジ化ナトリウムを防腐のために加えた。次に酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて、固形物１０％の最終濃度を得た。反応混合物中のセルロース濃度は、約３％であった。７０μＬのこのセルロース懸濁液を、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底、非結合）の各ウエルに加えた。２５μＬの０．２２５ｇ／Ｌ酵素バックグラウンド混合物をｄａＣＳに加えた。酵素バックグラウンド混合物は、ＣＢＨ：ＢＧ：ＥＧ酵素を（それぞれおよそ４：１．５：１の比で）もたらし、並びに補助キシラナーゼ及びヘミセルラーゼ酵素（混合物中の酵素のおよそ５％及び２０％を表す）をもたらした。次に、野生型ＧＨ６１Ａ又はＧＨ６１Ａの変異体のいずれかを発現するヒポクレア・ジェコリーナ細胞の２５μＬの２５ｕｇ／ｍＬ精製上澄みを、ｄａＣＳ／バックグラウンド酵素混合物に加えた。補正量の酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、総容量の差を補った。密閉した後、プレートを恒温インキュベーターの中に、９００ｒｐｍで連続的に振とうしながら５０℃で設置した。７２時間後に、プレートを氷上に５分間置き、加水分解反応を、１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ１０を各ウエルに添加することによって停止させた。プレートを密閉し、３，０００ｒｐｍにより室温で２分間遠心分離した。上澄み中のグルコース放出加水分解反応産物を、ＨＰＬＣグルコース濃度決定法により分析した。用量応答曲線を野生型ＧＨ６１Ａ酵素に関して生成した。性能指数（ＰＩ）を計算するため、ＧＨ６１Ａの変異体で産生された（平均）全糖を、同じドースでの野生型ＧＨ６１Ａ（例えば、基準酵素）で産生された（平均）全糖によって割った。
【０１５９】
ＶＩＩＩ．Ａｖｉｃｅｌ活性アッセイ
Ａｖｉｃｅｌを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）で希釈して、３．３３％  ｗ／ｖ混合物を得た。７５μＬのこの懸濁液を、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底、非結合、ＰＳ）に分配した。続いて、１５μＬの１０ｍＭアスコルビン酸、１５μＬの１ｍＭ  ＣｕＣｌ２及びＦＡＢを発現する（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、ΔＭａｎ１）菌株（国際公開第２０１２／１２５９５１号を参照すること）の３５μＬの７１４μｇ／ｍＬ培養上澄みを、Ａｖｉｃｅｌ溶液に加えた。次に１０μＬの１００μｇ／ｍＬ精製ＧＨ６１Ａ野生型又はＧＨ６１Ａの変異体を、Ａｖｉｃｅｌ／ＦＡＢ混合物に加えた。野生型及び変異体をそれぞれ四重にアッセイした。マイクロタイタープレートを密閉し、恒温インキュベーターにおいて、９００ｒｐｍで連続的に振とうしながら５０℃でインキュベートした。２０時間後に、加水分解反応を、１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ１０を各ウエルに添加することによって停止させた。プレートを密閉し、３，０００ｒｐｍにより室温で２分間遠心分離した。上澄み（上記のＩ．ＢにおいてＧＨ６１Ａ活性アッセイミックスとも呼ばれる）中の加水分解反応産物を、ＡＢＴＳアッセイ（上記のＩ．Ｂを参照すること）により分析した。用量応答曲線を野生型ＧＨ６１Ａに関して生成した。性能指数（ＰＩ）を計算するため、ＧＨ６１Ａの変異体で産生された（平均）全糖を、同じドースでの野生型ＧＨ６１Ａ（例えば、基準酵素）で産生された（平均）全糖により割った。
【０１６０】
（実施例２）
Ｉ．ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ部位評価ライブラリー（「ＳＥＬ」）の生成
ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ酵素コード化配列（配列番号１）をｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターにクローンして、ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａプラスミドを産生した（ｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターは、ｐｙｒＧ遺伝子がｐｙｒ２遺伝子に代えられていることを除いて、参照として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０６３３０８号に記載されているｐＴＴＴｐｙｒＧベクターと類似している）。完全長ＧＨ６１Ａ酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａプラスミド又はＰＴＴＴｐｙｒＧを使用して、部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）を、ＧＨ６１Ａ成熟酵素（配列番号３）の、配列番号３のアミノ酸位置２３６〜２８６及びアミノ酸残基３１４を除く全ての部位において生成した。野生型ＧＨ６１Ａ酵素を産生し、同一のアミノ酸を部位においてコードした（例えば、Ｈ１Ｈ、Ｇ２Ｇなど）。
【０１６１】
下記の配列番号１は、基準ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１ＡコードＤＮＡ配列を記載する。
ＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＴＴＣＣＡＴＡＣＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＣＧＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＣＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＡＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＡＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＡＡＣ
【０１６２】
下記の配列番号２は、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ完全長酵素の配列を記載する。
ＭＩＱＫＬＳＮＬＬＶＴＡＬＡＶＡＴＧＶＶＧＨＧＨＩＮＤＩＶＩＮＧＶＷＹＱＡＹＤＰＴＴＦＰＹＥＳＮＰＰＩＶＶＧＷＴＡＡＤＬＤＮＧＦＶＳＰＤＡＹＱＮＰＤＩＩＣＨＫＮＡＴＮＡＫＧＨＡＳＶＫＡＧＤＴＩＬＦＱＷＶＰＶＰＷＰＨＰＧＰＩＶＤＹＬＡＮＣＮＧＤＣＥＴＶＤＫＴＴＬＥＦＦＫＩＤＧＶＧＬＬＳＧＧＤＰＧＴＷＡＳＤＶＬＩＳＮＮＮＴＷＶＶＫＩＰＤＮＬＡＰＧＮＹＶＬＲＨＥＩＩＡＬＨＳＡＧＱＡＮＧＡＱＮＹＰＱＣＦＮＩＡＶＳＧＳＧＳＬＱＰＳＧＶＬＧＴＤＬＹＨＡＴＤＰＧＶＬＩＮＩＹＴＳＰＬＮＹＩＩＰＧＰＴＶＶＳＧＬＰＴＳＶＡＱＧＳＳＡＡＴＡＴＡＳＡＴＶＰＧＧＧＳＧＰＴＳＲＴＴＴＴＡＲＴＴＱＡＳＳＲＰＳＳＴＰＰＡＴＴＳＡＰＡＧＧＰＴＱＴＬＹＧＱＣＧＧＳＧＹＳＧＰＴＲＣＡＰＰＡＴＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＬＮ
【０１６３】
下記の配列番号３は、ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ成熟酵素の配列を記載する。
ＨＧＨＩＮＤＩＶＩＮＧＶＷＹＱＡＹＤＰＴＴＦＰＹＥＳＮＰＰＩＶＶＧＷＴＡＡＤＬＤＮＧＦＶＳＰＤＡＹＱＮＰＤＩＩＣＨＫＮＡＴＮＡＫＧＨＡＳＶＫＡＧＤＴＩＬＦＱＷＶＰＶＰＷＰＨＰＧＰＩＶＤＹＬＡＮＣＮＧＤＣＥＴＶＤＫＴＴＬＥＦＦＫＩＤＧＶＧＬＬＳＧＧＤＰＧＴＷＡＳＤＶＬＩＳＮＮＮＴＷＶＶＫＩＰＤＮＬＡＰＧＮＹＶＬＲＨＥＩＩＡＬＨＳＡＧＱＡＮＧＡＱＮＹＰＱＣＦＮＩＡＶＳＧＳＧＳＬＱＰＳＧＶＬＧＴＤＬＹＨＡＴＤＰＧＶＬＩＮＩＹＴＳＰＬＮＹＩＩＰＧＰＴＶＶＳＧＬＰＴＳＶＡＱＧＳＳＡＡＴＡＴＡＳＡＴＶＰＧＧＧＳＧＰＴＳＲＴＴＴＴＡＲＴＴＱＡＳＳＲＰＳＳＴＰＰＡＴＴＳＡＰＡＧＧＰＴＱＴＬＹＧＱＣＧＧＳＧＹＳＧＰＴＲＣＡＰＰＡＴＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＬＮ
【０１６４】
選択された１７８個の部位のそれぞれにおいて、典型的には１４〜１６個の置換変異体を得た。ＳＥＬ変異体は、示された位置で置換されているＧＨ６１Ａの変異体配列をそれぞれコードする、個別に精製されたプラスミドとして受け取った。
【０１６５】
ＩＩ．ＧＨ６１Ａの変異体の産生
ヒポクレア・ジェコリーナ株（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｍａｎ１）のプロトプラストを、個別のｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａ又はｐＴＴＴｐｙｒＧ−ＧＨ６１Ａ  ＳＥＬ構築物により形質転換し（１回の形質転換毎に単一のＧＨ６１の変異体）、例えば、（参照として本明細書に組み込まれている）国際公開第２００９／０４８４８８号に既に記載されているように、アセトアミドを含有する選択された寒天において２８℃で７日間増殖させた。ヒポクレア・ジェコリーナのプロトプラストを、アセトアミド寒天において生成、採取、及び再平板培養し、２８℃で７日間インキュベートした。胞子を１５％グリセロールに採取し、−２０℃で保存した。ＧＨ６１Ａの変異体産生では、１０μＬの容量の胞子懸濁液を、ＰＶＤＦフィルタープレート中の、２％グルコース／ソホロース混合物を補充した２００μＬのグリシン最小培地に加えた。ＧＨ６１Ａの変異体をそれぞれ四重に増殖させた。プレートを酸素透過膜で密閉した後、プレートを、２２０ｒｐｍで振とうしながら、２８℃で６日間インキュベートした。培養培地をマイクロタイタープレートに低圧下で移すことによって、上澄みを採取した。残留グルコースを、実施例１、セクションＩ．Ａに記載されたようにヘキソキナーゼアッセイを使用して測定した。
【０１６６】
（実施例３）
ＧＨ６１Ａの変異体の特徴付け及び高度に組み合わせ可能な産生的置換の特定
ヒポクレア・ジェコリーナＧＨ６１Ａ  ＳＥＬの変異体酵素を、目的の様々な性質について試験した。特に、ＧＨ６１Ａの変異体は、実施例１、セクションＩＶ．Ａ又はＢに記載されたタンパク質発現、実施例１、セクションＶ．Ｂに記載された熱安定性（Ｔｍ）、残留グルコースの測定にヘキソキナーゼアッセイを使用する、実施例１、セクションＶＩ．Ａに記載されたｗｈＰＣＳの加水分解（ｗｈＰＣＳ  ＨＫ）及びグルコース濃度決定にＨＰＬＣアッセイを使用する、実施例１、セクションＶＩ．Ｂに記載されたｗｈＰＣＳの加水分解（ｗｈＰＣＳ  ＨＰＬＣ）について試験した。
【０１６７】
試験したＧＨ６１Ａの変異体のそれぞれの性能指数（ＰＩ）は、上記に示されたｗｈＰＣＳアッセイの両方により、特定のレベルのタンパク質産生を超えて決定した。ＰＩは、基準ＧＨ６１Ａ（すなわち、その部位に野生型アミノ酸を有するＧＨ６１Ａ）に対する、試験されるＧＨ６１Ａの変異体の性能の比である。０．０５以下のＰＩを、０．０５に概ね固定した。しかしながら、０．０のＨＰＬＣタンパク質発現値は、０．０４に固定した。野生型残基を有するＧＨ６１Ａ酵素のＰＩ値を、１．００に設定した。Ｔｍの改善は、変異体のＴｍ測定値と野生型親ＧＨ６１Ａの平均Ｔｍ測定値との比較によって実証した。
【０１６８】
ＳＥＬ変異体に対して決定されたＰＩ、並びに他の関連する性質の比較を使用して、ＧＨ６１Ａの産生位置を特定した。産生位置は、向上した特徴を示す組み合わせ変異体を作製するのに最も有用な分子内位置と本明細書において定義され、位置それ自体は、少なくとも１つの組み合わせ可能な突然変異を可能にする。高度に組み合わせ可能な突然変異は、組み合わせ変異体を作製するのに使用できる任意のアミノ酸位置における突然変異と、本明細書において定義される。高度に組み合わせ可能な突然変異は、分子の少なくとも１つの所望の性質を向上させ、一方で、発現、活性、又は安定性を有意に減少しない。
【０１６９】
下記の表１は、ＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体ライブラリーの構成に含まれる、上記のＳＥＬから選択されたＧＨ６１Ａにおける置換を列挙する。表１の置換は、単に、目的の向上した性質を有する代表的な置換として選択され、１つ以上の向上した性質を有する変異体の全範囲を表すことを意図しない。表１の置換に基づいて産生されたＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体ライブラリーの個別のメンバーは、それぞれ少なくとも２個の異なるアミノ酸置換を有する。表１のアミノ酸残基の番号は、野生型ＧＨ６１Ａの成熟アミノ酸配列、すなわち配列番号３を参照して割り当てた。
【０１７０】
【表２−１】
2016533741.tif 000005
【０１７１】
【表２−２】
2016533741.tif 000006
【０１７２】
【表２−３】
2016533741.tif 000007
【０１７３】
【表２−４】
2016533741.tif 000008
【０１７４】
ＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体コード化ポリヌクレオチドを、テンプレートとしてｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａベクターを使用して作製し、大腸菌に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと共に、２  ｘ  ＴＹ寒天プレート（１６ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ））に平板培養した。３７℃で一晩インキュベートした後、アンピシリン耐性大腸菌コロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２  ｘ  ＴＹ寒天プレートから取り出し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する１ｍＬの２  ｘ  ＴＹ培地を含有するマイクロタイタープレートにおいて３７℃で２４時間増殖させた。これらの細菌培養物をプラスミドＤＮＡの精製に使用した。
【０１７５】
ＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体をコードする精製ｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａ由来プラスミドを、１５０〜３００ｎｇ／μＬの濃度で使用した。５μＬのプラスミドＤＮＡを、例えば、米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号に記載されている真菌形質転換に使用した。ヒポクレア・ジェコリーナ株（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｅｇ３、Δｅｇ５、Δｅｇ６、Δｇｈ６１ａ、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｍａｎ１）のプロトプラストを個別のｐＴＴＴｐｙｒ２−ＧＨ６１Ａ構築物により形質転換し（すなわち、１回の形質転換に単一のＧＨ６１の変異体を含む）、２４ウエルマイクロタイタープレートにおいて、アセトアミドを含有する選択培地で２８℃で７日間増殖させた。
【０１７６】
個別の変異体の形質転換体のヒポクレア・ジェコリーナの初期個体群から胞子を採取し、アセトアミド寒天プレート上で再選択して、プラスミド由来胞子の数を増加させた。胞子を、生理食塩水の使用により採取し、９６ウエルマイクロタイタープレートに再び配列させ、ＧＨ６１Ａの変異体試料を生成する多数の産生培地の接種に使用した。この目的のため、４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌの１，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）ｐＨ  ５．５、６．０ｇ／Ｌのグリシン、５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２×６２Ｏを含有する２．５ｍＬ／Ｌの４０００×トリコデルマ・レーシ微量元素、２０ｇ／Ｌのグルコース、及び６．５ｇ／Ｌのソホロースを含有する２５０μＬのグリシン産生培地を各ウエルに含有する９６ウエルフィルタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｒｔ．Ｎｏ．３５０５）に、ヒポクレア・ジェコリーナ形質転換体の胞子懸濁液を四重に接種した。プレートを２８℃及び８０％の湿度で６〜８日間インキュベートした。培養上澄みを真空濾過により採取した。
【０１７７】
ＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体を培養上澄みから単離し、様々な活性について試験した。２つの定量化方法をそれぞれのＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体に使用し、その方法は、実施例１のセクションＩＶ．Ａに記載されたＳＥＣ及び実施例１のセクションＩＶ．Ｂに記載されたＲＰＣであった。培養上澄みに存在する酵素の量が野生型ＧＨ６１Ａと比較して増加したＧＨ６１Ａの変異体は、産生（又は収率）が向上した言える。変異体の向上した熱安定性は、変異体のＴｍ測定値と野生型親ポリペプチドのＴｍ測定値との比較によって決定した。性能指数（ＰＩ）値は、精製ＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体（ＳＥＣとＲＰＣの両方）において、以下のアッセイの１つ以上により決定した。（ｉ）実施例１のセクションＶＩに記載されたｗｈＰＣＳ加水分解アッセイ（ｗｈＰＣＳ）、（ｉｉ）実施例１のセクションＶＩＩに記載されたｄａＣＳ加水分解アッセイ（ｄａＣＳ）、及び（ｉｉｉ）上記の実施例１のセクションＶＩＩＩに記載されたＡｖｉｃｅｌ活性（Ａｖｉｃｅｌ）。
【０１７８】
上記において生成された組み合わせＧＨ６１Ａの変異体のそれぞれに対して得たデータを、線形モデル解析法の使用により分析し、それぞれの性質に対する置換の個別の影響を、全ての置換の加算性を推定する簡単な（相互作用項を使用しない）線形モデル回帰の使用により解析した。Ｉｈａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ」Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９９６年，５（３）：２９９〜３１４。具体的には、線形モデル形成は、全ての置換部位を、第１の因子として野生型アミノ酸を用いて因子変数に変換した後、Ｒの基本パッケージにおけるＩｍ関数を使用して実施した（下記を参照すること）。このように、ＧＨ６１Ａにおけるそれぞれの特定の置換の、Ｔｍ、タンパク質産生（収率）、ｄａＣＳアッセイにおける性能、及びｗｈＰＣＳアッセイにおける性能に対する効果を解析した。Ｔｍ、タンパク質産生（収率）、ｄａＣＳアッセイにおける性能、及びｗｈＰＣＳアッセイにおける性能のうち１つ以上における向上と相関するＧＨ６１Ａ置換を、以下の解析コホートに列挙する。
【０１７９】
解析コホート１：ｄａＣＳアッセイにおける向上した活性と相関するＧＨ６１Ａにおける置換：Ｎ１０Ｄ、Ｎ５１Ｅ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｓ、Ｋ７０Ｅ、Ｖ１０４Ａ、Ｋ１０６Ｃ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１０８Ａ、Ｔ１２７Ｉ、Ａ１２９Ｎ、Ｑ１６７Ｋ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｍ、Ａ２０１Ｄ、Ｔ２８７Ａ、Ｙ２９１Ｆ、Ｙ２９１Ｗ、Ｇ２９５Ｔ、Ｇ２９５Ｃ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ３００Ｔ、Ｔ３０３Ｇ、Ｔ３０３Ｐ、Ｒ３０４Ｄ、Ｒ３０４Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｎ３１５Ｗ、Ｐ３１６Ｆ、Ｙ３１７Ｗ、Ｑ３２０Ａ、Ｑ３２０Ｐ、及びＱ３２０Ｓ。
【０１８０】
解析コホート２：ｗｈＰＣＳアッセイにおける向上した活性と相関するＧＨ６１Ａにおける置換：Ｎ１０Ｄ、Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｅ、Ｐ５２Ｆ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｎ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｑ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｓ１８５Ｄ、Ｄ１９７Ｌ、Ｈ２００Ａ、Ｔ２８７Ａ、Ｙ２９１Ｆ、Ｓ２９７Ｅ、Ｔ３１３Ｋ、Ｐ３１６Ａ、及びＰ３１６Ｆ。
【０１８１】
解析コホート３：向上したＴｍと相関するＧＨ６１Ａにおける置換：Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｌ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｔ１２７Ｉ、Ｓ１６４Ｍ、Ｑ１６７Ｋ、Ａ１６８Ｋ、Ｓ１８７Ｄ、Ｄ１９７Ｅ、Ｇ２３５Ｋ、Ｔ２８７Ａ、Ｌ２９０Ａ、Ｓ２９７Ｃ、Ｇ２９８Ｃ、Ｇ３０１Ｓ、Ｇ３０１Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｐ３１６Ａ、Ｙ３１８Ｗ、及びＱ３２０Ａ。
【０１８２】
解析コホート４：向上した産生（収率）と相関するＧＨ６１Ａにおける置換：Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｋ７０Ｎ、Ｖ８０Ｔ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０８Ｋ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１８７Ｄ、Ｄ１９７Ｅ、Ｇ２３５Ｋ、Ｇ２３５Ｌ、Ｇ２３５Ｓ、Ｔ２８７Ａ、Ｌ２９０Ｍ、及びＰ３１６Ａ。
【０１８３】
解析コホート１、２、３及び／又は４のＧＨ６１Ａ置換のいずれか１つ又は任意の組み合わせには、主題発明の態様における使用が見出される。前のセクションに記載された単一のＳＥＬ変異体のように、多数のＧＨ６１Ａ置換が２つ以上の上記解析コホートの範囲内に入る。したがって、２つ以上、３つ以上、又は４つ全ての上記解析コホートの範囲内に入るＧＨ６１Ａ置換は、主題発明の態様における使用が見出される（例えば、ＧＨ６１Ａ置換Ｔ２８７Ａは、上記４つ全ての解析コホートに入る）。このように、向上した性質の類似した組み合わせ及び／又はレベルを有するＧＨ６１Ａ組み合わせ変異体は、特有の機能群を形成する。
【０１８４】
一例にすぎないが、以下のＧＨ６１Ａ置換は、上記の解析コホート１及び２の両方の範囲内に入る（しかし、必ずしも限定されることはなく、例えば、Ｔ２８７Ａは解析コホート３及び４の範囲内にも入る）。Ｎ１０Ｄ、Ｎ５１Ｅ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｔ２８７Ａ、Ｙ２９１Ｆ、Ｓ２９７Ｅ、Ｔ３１３Ｋ、及びＰ３１６Ｆ。
【０１８５】
下記の表２は、向上した性質の組み合わせ及びレベルに基づいた、上記の解析コホートの１つの可能な群分けを示す。群を、表２において以下のように割り当てた。
群１：ｄａＣＳとｗｈＰＣＳの両方に対してＰＩが少なくとも＋＋の改善、少なくとも１つのＰＩが少なくとも＋＋＋の改善。
【０１８６】
群２：ｄａＣＳに対してＰＩが少なくとも＋＋＋の改善及びｗｈＰＣＳ対してＰＩが＋＋未満の改善。
【０１８７】
群３：ｗｈＰＣＳに対してＰＩが少なくとも＋＋＋の改善、ｄａＣＳに対してＰＩが＋＋未満の改善。
【０１８８】
群４：ΔＴｍが少なくとも＋＋＋の改善。
【０１８９】
群５：産生に対してＰＩが少なくとも＋＋＋の改善。
【０１９０】
群６：任意の性質が少なくとも＋＋の改善。
【０１９１】
群７：任意の性質が少なくとも＋の改善。
【０１９２】
【表３−１】
2016533741.tif 000009
【０１９３】
【表３−２】
2016533741.tif 000010
【０１９４】
表２のスコア付けは以下の通りとした。
Ｔｍのスコア付け
＋＋＋＋＝Ｔｍの有意な増加≧１．５℃
＋＋＋＝Ｔｍの有意な増加≧１．０℃かつ＜１．５℃
＋＋＝Ｔｍの有意な増加≧０．５℃かつ＜１．０℃
＋＝Ｔｍの有意な増加＜０．５℃
他の全てのスコア付け（ＰＩに基づく）
＋＋＋＋＝有意な増加≧０．０３
＋＋＋＝有意な増加≧０．０２かつ＜０．０３
＋＋＝有意な増加≧０．０１かつ＜０．０２
＋＝有意な増加＜０．０１
【０１９５】
本明細書に記載された実施例及び実施態様は、説明の目的のみのためであり、それに関して多様な修正又は変更が当業者には示唆され、本出願の主旨及び範囲内、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用された全ての出版物、特許及び特許出願は、全ての目的においてその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
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Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５，１９８６年。
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【０１９７】
【表４−１】
2016533741.tif 000011
【０１９８】
【表４−２】
2016533741.tif 000012
【０１９９】
【表４−３】
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【０２００】
【表４−４】
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【０２０１】
【表４−５】
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【０２０２】
【表４−６】
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【０２０３】
【表４−７】
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【０２０４】
【表４−８】
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【０２０５】
【表４−９】
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【０２０６】
【表４−１０】
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【０２０７】
【表４−１１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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