(57)【要約】本発明は、封入体形状の治療用物質及び美容用物質を経皮輸送するための方法、組成物、及び装置に関するものである。そのような封入体は、皮膚バリアを通して治療用及び美容用物質を送達し、皮膚内の深部に到達し得る。本開示の組成物は、皮膚の疾患及び状態を処置するために用いられ得る。2016535770.tif 000009
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリアを越えて美容用物質を送達する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を、対象の皮膚に適用することを含み、前記少なくとも１つの美容用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法。
【請求項２】
皮膚バリアを越えて治療用物質を送達する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を、対象の皮膚に適用することを含み、前記少なくとも１つの治療用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法。
【請求項３】
処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質と、皮膚科学的に許容され得る担体とを含む、美容に有効な量の美容用物質組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用することを含む、方法。
【請求項４】
処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質と、薬学的に許容され得る担体とを含む、治療に有効な量の治療用物質又は治療用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用することを含む、方法。
【請求項５】
美容用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、前記美容用物質の浸透が、可溶型の同じ美容用物質の浸透と比較して増進される、方法。
【請求項６】
治療用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、前記治療用物質の浸透が、可溶型の同じ治療用物質の浸透と比較して増進される、方法。
【請求項７】
組織の再生を刺激する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し、前記組織に到達して、組織の再生を刺激する、方法。
【請求項８】
真核細胞の増殖を刺激する方法であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、前記封入体が、皮膚バリアに浸透し、真核細胞の増殖を刺激する、方法。
【請求項９】
経皮送達システムを構築する方法であって、（ｉ）封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を供給すること、及び（ｉｉ）前記封入体を担体と混合することにより経皮送達システムを構築することを含む、方法。
【請求項１０】
前記封入体が不溶性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記封入体が可溶化されていない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記封入体が部分的に可溶化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記封入体が微粒子形状である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微粒子形状が約２０から約１５００ｎｍまでの粒径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記微粒子形状が約１００ｎｍから約５００ｎｍまでの粒径を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微粒子形状が約１５０ｎｍから約３００ｎｍまでの粒径を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記微粒子形状が水和された非晶質の形状である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記封入体が標的細胞に取り込まれる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞が表皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞が表皮細胞以外の細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的細胞が神経細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細胞が筋細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的細胞が脂肪細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記封入体が少なくとも一層の皮膚層に浸透し得る、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記封入体が角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））、半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））又は基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））に浸透し得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記美容用物質又は治療用物質がポリペプチドを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドに生物学的活性がある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドがプロドラッグである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチド若しくはその断片、天然のポリペプチド若しくはその断片、又は化学合成ポリペプチドである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが複合タンパク質である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドがキメラである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えポリペプチドが、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択された細胞で発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが封入体誘導ポリペプチドと遺伝的に融合又は複合体形成されている、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記封入体誘導ポリペプチドがウイルスタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスタンパク質がカプシドタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記封入体誘導ポリペプチドが、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１の５量体を形成するカプシドタンパク質又はその断片を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドがタンパク質精製用タグ又は可視化用タグと複合体形成されている、請求項２６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質精製用タグがＨｉｓ６−タグである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記可視化用タグが蛍光タグである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン抑制ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピン若しくは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨ若しくは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ若しくはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管抑制因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、内皮増殖因子、α−１アンチトリプシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シクロスポリン、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、カタラーゼ、又はシャペロンからなる群から選択される、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドがＩＬ−１０及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ、及び／又はそれらの断片、変種、又はそれらの誘導体を含む、からなる、又はから本質的になる、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記皮膚の状態が、乾癬、セルライト、尋常性ざ瘡、嚢胞性ざ瘡、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬、ウイルス感染症、真菌感染症、及び細菌性皮膚感染症から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記皮膚の状態が、乾癬、ざ瘡、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、蜂窩織炎、口唇ヘルペス、ふけ、皮膚炎、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、膿痂疹、及び感染症から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項４５】
封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を含む経皮送達システム。
【請求項４６】
封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を含む経皮送達システム。
【請求項４７】
前記送達システムがパッチ、スプレー、綿棒、スポンジ、スティック、又はシャンプーである、請求項４５又は請求項４６に記載の経皮送達システム。
【請求項４８】
塗布器に連結された容器と、前記容器に取り込まれた請求項４５又は請求項４６に記載の経皮送達システムと、を含む器具。
【請求項４９】
単離された封入体形状に少なくとも１つの美容用物質を含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の美容用組成物。
【請求項５０】
単離された封入体形状に少なくとも１つの治療用物質を含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の治療用組成物。
【請求項５１】
前記組成物が、溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エマルジョン、懸濁液、エアゾール、エアゾール泡沫、塗布薬、チンキ、膏薬、湿布、乾燥粉末、又はそれらの組み合わせである、請求項４９又は請求項５０に記載の局所用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入体形状で治療用及び美容用物質を経皮送達するための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は異物及び感染に対する防護バリアを提供する。このバリアは、哺乳動物では主に、皮膚の表面に角質層（ＳＣ）と呼ばれる高度に不溶なタンパク質及び脂質による構造を形成することにより達成される（Ｄｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．２１０〜２２１（１９９３）（非特許文献１）、Ｐｏｎｅｃ，Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｅｉｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３５１〜３６３（１９９４）非特許文献２）。角質層は、角質層下の組織を感染、乾燥、化学物質、及び物理的ストレスから守るための、バリア（時に皮膚バリアと呼ばれる）となる。角質層の細胞は、皮膚を水分の蒸発から守り保湿を補助するタンパク質であるケラチンからなる密な網状構造を有する。これらの細胞は吸水能も持ち、さらに保湿に役立つ。加えて、角質層は皮膚の「ハリ」又は弾性に関係する。角質層の厚さは体の部分で異なっている。手のひら及び足の裏（時にひざ、ひじ、指関節及びその他の部分）では、角質層は、細胞にケラチンを濃縮させ堅くさせて独特のより厚くより結合性の高いＳＣにする透明層（明るく見える部分）により安定化されており、構築されている。一般的に角質層は１５から２０層の死細胞を含有する。角質層の厚さは１０から４０μｍの間である。
【０００３】
皮膚は利用しやすく面積も広いので、皮膚、局所、又は全身に対する効果のいずれを求めるかに関わらず、薬剤投与に有望な経路であると長く考えられてきた。薬剤投与における局所経路は、非経口処置に関係する危険及び不便さを回避できるので時に望ましい。また、経口処置で見られる吸収及び代謝の変動も回避され得、そして薬剤投与を連続的に行うことができることから、生物学的半減期の短い治療上活性のある物質の利用が可能になる。さらなる利点は、多くの化合物が引き起こす消化管への刺激が回避され得るというものであり、それに加え、全身投与よりも効果的に疾患の皮膚症状が処置され得る。しかしほとんどの場合、治療用又は美容用の高分子物質の皮膚浸透は、特にタンパク質及びペプチドで、実質的な限界がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．２１０〜２２１（１９９３）
【非特許文献２】Ｐｏｎｅｃ，Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｅｉｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３５１〜３６３（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ほとんどの経皮送達組成物（例えば治療用又は美容用組成物）は、皮膚浸透を促進する担体又は賦形剤を用いることにより皮膚浸透を達成している。このような（化合物又は化合物の混合物からなる）担体又は賦形剤は、「浸透促進剤」又は「スキンエンハンサ」として当業者に知られている。文献に記載されているいくつかのスキンエンハンサは経皮吸収を促進するが、それらは以下に示すある種の欠点を有する。（ｉ）あるものは毒性があると考えられている、（ｉｉ）あるものは皮膚刺激性である、（ｉｉｉ）あるものは長期の使用により皮膚を薄くする影響がある、（ｉｖ）あるものはもともとの皮膚構造を変化させ、薬剤の拡散能の変化を引き起こす、及び（ｖ）いずれのスキンエンハンサも、例えばペプチド及びタンパク質のような高分子量の医薬及び美容用物質を送達できない。
【０００６】
他の代替的な取り組みには、タンパク質又はペプチドの浸透を促進するために、微小穿刺又は擦過傷により局部的に皮膚を損傷する方法がある。これらの方法もまた皮膚への刺激及び損傷が生じ、そして長期の皮膚損傷を引き起こしかねない。したがって、広範囲の医薬及び美容用物質、特に高分子物質（例えばタンパク質及びペプチド）、の皮膚バリアを通した送達を可能とする経皮送達組成物及び方法を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単な概要
本開示は、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含む、少なくとも１つの美容用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、皮膚バリアを越えて美容用物質を送達するための方法を提供する。同様に提供されるのは、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を必要とする対象の皮膚に適用することを含む、少なくとも１つの治療用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、皮膚バリアを越えて治療用物質を送達する方法である。
【０００８】
加えて、本開示は、処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質と、皮膚科学的に許容され得る担体と、を含む、美容に有効な量の美容用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために対象の皮膚に局所適用することを含む、方法を提供する。
【０００９】
本開示は、処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、治療に有効な量の治療用物質又は治療用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために対象の皮膚に局所適用することを含む、方法も提供する。同様に、美容用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、美容用物質の浸透が、前述のものと同じ美容物質の可溶型と比較して増進される、方法も提供される。
【００１０】
同様に、治療用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を、適用を必要とする対象の皮膚に適用することを含み、治療用物質の浸透が、前述のものと同じ治療用物質の可溶型のものの浸透と比較して増進される、方法も提供される。
【００１１】
本開示は、組織の再生を刺激する方法であって、適用を必要とする対象の皮膚に、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を適用することを含み、封入体が、皮膚バリアに浸透し、組織に到達して、組織の再生を刺激する、方法も提供する。同様に、真核細胞の増殖を刺激する方法であって、適用を必要とする対象の皮膚に、単離された封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を適用することを含み、封入体が、皮膚バリアに浸透し、真核細胞の増殖を刺激する、方法も提供される。同様に、（ｉ）封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を供給すること、（ｉｉ）封入体を担体と混合すること、及び（ｉｉｉ）封入体を担体と混合することにより経皮送達システムを構築すること、を含む経皮送達システムを構築する方法も提供される。
【００１２】
本開示の方法及び組成物におけるいくつかの態様では、封入体は不溶性である。他の態様では、封入体は可溶化されていない。いくつかの態様では、封入体は部分的に可溶化されている。他の態様では、封入体は微粒子形状である。いくつかの態様では、微粒子形状は約２０ｎｍから約１５００ｎｍまでの粒径を有する。いくつかの態様では、微粒子形状は約１００ｎｍから約５００ｎｍまでの粒径を有する。他の態様では、微粒子形状は約１５０ｎｍから約３００ｎｍまでの粒径を有する。
【００１３】
いくつかの態様では、微粒子形状は水和された非晶質の形状である。いくつかの態様では、封入体は標的細胞に取り込まれる。いくつかの態様では、標的細胞は表皮細胞である。他の態様では、標的細胞は表皮細胞以外の細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は神経細胞である。他の態様では、標的細胞は筋細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は脂肪細胞である。
【００１４】
いくつかの態様では、封入体は少なくとも一層の皮膚層に浸透し得る。他の態様では、封入体は角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））、半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））又は基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））に浸透し得る。
【００１５】
本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、美容用物質又は治療用物質はポリペプチドを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは生物学的活性がある。他の態様では、ポリペプチドはプロドラッグである。いくつかの態様では、ポリペプチドは、組換えポリペプチド若しくはその断片、天然のポリペプチド若しくはその断片、又は化学合成ポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドは融合タンパク質である。他の態様では、ポリペプチドは複合タンパク質である。いくつかの態様では、ポリペプチドはキメラである。他の態様では、組換えポリペプチドは、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択された細胞で発現する。
【００１６】
本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、ポリペプチドは封入体誘導ポリペプチドと遺伝的に融合又は複合体形成されている。いくつかの態様では、封入体誘導ポリペプチドはウイルスタンパク質である。いくつかの態様では、ウイルスタンパク質はカプシドタンパク質である。いくつかの態様では、封入体誘導ポリペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１の５量体を形成するカプシドタンパク質又はその断片を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドはタンパク質精製用タグ又は可視化用タグと複合体形成されている。いくつかの態様では、タンパク質精製用タグはＨｉｓ６−タグである。他の態様では、可視化用タグは蛍光タグである。
【００１７】
本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン抑制ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピン若しくは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨ若しくは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ若しくはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管抑制因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、内皮増殖因子、α−１アンチトリプシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シクロスポリン、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、カタラーゼ、又はシャペロンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ポリペプチドはＨｓｐ７０又はその機能性断片を含む。他の態様では、ポリペプチドはＩＬ−１０及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ、及び／又はそれらの断片、変種、又はそれらの誘導体を含む、からなる、又は本質的にからなる。
【００１８】
本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、美容用物質で処置されるべき皮膚の状態は、乾癬、セルライト、尋常性ざ瘡、嚢胞性ざ瘡、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬、ウイルス感染、真菌感染、及び細菌性皮膚感染から選択される。いくつかの態様では、治療用物質で処置されるべき皮膚の状態は、乾癬、ざ瘡、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、蜂窩織炎、口唇ヘルペス、ふけ、皮膚炎、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、膿痂疹、及び感染症から選択される。
【００１９】
本開示では、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を含む経皮送達システムも提供する。同様に、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を含む経皮送達システムも提供される。いくつかの態様では、送達システムはパッチ、スプレー、綿棒、スポンジ、スティック、又はシャンプーである。
【００２０】
同様に、塗布器に連結された容器と、容器に取り込まれた本開示の経皮送達システムと、を含む器具も提供される。
【００２１】
同様に、局所用の美容用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の美容用組成物も提供される。同様に、局所用の治療用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の治療用組成物も提供される。いくつかの態様では、組成物は、溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エマルジョン、懸濁液、エアゾール、エアゾール泡沫、塗布薬、チンキ、膏薬、湿布、乾燥粉末、又はそれらの組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】培養液中の再構成ヒト皮膚（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）の３つのインサートに対応する蛍光顕微鏡像を示す。Ａはコントロール、Ｂは封入体と共に培養した試料（ＣＩ）、及びＣは可溶性ＧＦＰと共に培養した試料を示す。
【図２】再構成ヒト皮膚（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料と共に培養した後の、３つの試料に対応する蛍光顕微鏡像を示す。（Ａ）コントロール（ＣＴＲＬ）、（Ｂ）可溶性ＧＦＰ（ＧＦＰ）、及び（Ｃ）ＧＦＰ封入体（ＣＩ）。倍率及び露光時間は各々の試料に示されている。Ｄ、Ｅ、及びＦは、それぞれＡ、Ｂ、及びＣの試料の透過型顕微鏡像に対応する。Ｄ、Ｅ、及びＦは、モデル表皮（「ｍ」）の成長に用いられた膜基材の位置及び角質層（ＳＣ）の位置も示している。
【図３】再構成ヒト皮膚（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料と共に培養した後の、ＧＦＰ封入体試料（ＣＩ）の蛍光顕微鏡像を示す。
【図４】再構成ヒト皮膚（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料と共に培養した後の、ＧＦＰ封入体試料（ＣＩ）の（Ａ）蛍光顕微鏡、及び（Ｂ）透過光、による像を示しており、いくつかの角質層（ＳＣ）が部分的に分離していることを表す。
【図５】（Ａ）異なる焦点で撮られた同一視野の３つの蛍光顕微鏡像から得られた合成画像、及び（Ｂ）その試料のＡと同じ透過型顕微鏡像が重ねられた像を示す。再構成ヒト皮膚モデル（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料は、ＧＦＰ封入体と共に培養された。
【図６】可溶性ＧＦＰと共に培養された再構成ヒト皮膚モデル（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料の蛍光顕微鏡像を示す。（Ａ）露光時間４秒、又は（Ｂ）露光時間３０秒で撮られた同一視野を示す。
【図７】再構成ヒト皮膚モデル（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）のコントロール試料の蛍光顕微鏡像を示す。（Ａ）露光時間４秒、又は（Ｂ）露光時間３０秒で撮られた同一視野を示す。
【図８】再構成ヒト皮膚モデル（ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ／ＥＰＩ）試料と共に培養された、（Ａ）Ｍ００３７−ＣＩ（封入体）試料及び（Ｂ）Ｍ０００３７−ＧＦＰ（可溶性ＧＦＰ）の蛍光像を示す。
【図９】Ｍ００３７−ＣＩ試料（封入体）の蛍光シグナルが、角質層（ＳＣ）、表皮の最外層、並びに多くの場合では加えて表皮の中間及び深い領域内にある蛍光凝集体として検出されたことを示す。示されているのは、（Ａ）共焦点蛍光顕微鏡像、（Ｂ）透過型顕微鏡像、及び（Ｃ）透過型顕微鏡像に重ねられた共焦点蛍光顕微鏡像、である。
【図１０】Ｍ００３７−ＧＦＰ試料（可溶性ＧＦＰ）の大部分の蛍光が分散しており、角質層領域の中に特異的に存在していたことを示す。本図は、（Ａ）共焦点蛍光顕微鏡像、（Ｂ）透過型顕微鏡像、及び（Ｃ）透過型顕微鏡像の上に重ねられた共焦点蛍光顕微鏡像、を示す。
【図１１】（Ａ）ヒト表皮の構造図、（Ｂ）ヒト表皮の構造を表す顕微鏡写真、及び（Ｃ）ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）再構成ヒト皮膚モデルシステムの典型的な顕微鏡写真、の例を示す。
【図１２】乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのＶＥＧＦの発現に対応する（Ａ）クマシーブルーで染色されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル及び（Ｂ）ウェスタンブロットを示す。レーン１は、タンパク質スタンダードのＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２である。レーン２〜７は可溶性抽出物である。レーン８〜１３は不溶性抽出物である。レーン２：ＵＰ１４２１株（ＨＣＮ，ｗｔ）、レーン３：ＵＰ１４２４株（ＭＣＮ，ｗｔ）、レーン４：ＵＰ１４２７株（ＨＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン５：ＵＰ１４３０株（ＭＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン６：ＵＰ１４３３株（ＨＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン７：ＵＰ１４３６株（ＭＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン８：ＵＰ１４２１株（ＨＣＮ，ｗｔ）、レーン９：ＵＰ１４２４株（ＭＣＮ，ｗｔ）、レーン１０：ＵＰ１４２７株（ＨＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン１１：ＵＰ１４３０株（ＭＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン１２：ＵＰ１４３３株（ＨＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン１３：ＵＰ１４３６株（ＭＣＮ，ｃｌｐＰ）。
【図１３】乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのＫＧＦの発現に対応する（Ａ）クマシーブルーで染色されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル及び（Ｂ）ウェスタンブロットを示す。レーン１は、タンパク質スタンダードのＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２である。レーン２〜７は可溶性抽出物である。レーン８〜１３は不溶性抽出物である。レーン２：ＵＰ１４２２株（ＨＣＮ，ｗｔ）、レーン３：ＵＰ１４２５株（ＭＣＮ，ｗｔ）、レーン４：ＵＰ１４２８株（ＨＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン５：ＵＰ１４３１株（ＭＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン６：ＵＰ１４３４株（ＨＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン７：ＵＰ１４３７株（ＭＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン８：ＵＰ１４２２株（ＨＣＮ，ｗｔ）、レーン９：ＵＰ１４２５株（ＭＣＮ，ｗｔ）、レーン１０：ＵＰ１４２８株（ＨＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン１１：ＵＰ１４３１株（ＭＣＮ，ｈｔｒＡ）、レーン１２：ＵＰ１４３４株（ＨＣＮ，ｃｌｐＰ）、レーン１３：ＵＰ１４３７株（ＭＣＮ，ｃｌｐＰ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、低分子量、中間分子量、及び高分子量の治療用又は美容用の物質（例えばペプチド及びタンパク質）を含む組成物を経皮送達するための方法、組成物、システム、及び装置を提供する。本開示は、治療及び美容用途の経皮送達組成物、適用を必要とする対象にそのような経皮送達組成物を供給するための経皮送達装置、並びにそれらを生産及び使用する方法を含む。いくつかの実施形態では、本開示の経皮送達組成物は診断のためにも使用され得る。
【００２４】
１．定義
本発明の詳細な説明の前に、本発明が特定の組成又は工程段階に限定されることはなく、それら自体可変のものであることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、文脈から明確に他を指定する場合を除き、単数形の不定冠詞及び定冠詞でも複数形の指示対象を含む。単数不定冠詞と同様に「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書中では互いに可換として用いられ得る。
【００２５】
さらに、本明細書で用いられる「及び／又は」は、２つの明記された特徴若しくは要素の各々が共に用いられる又は他を伴わないという特定の開示ととらえられるべきである。したがって、「及び／又は」という用語は「Ａ及び／又はＢ」というような句が本明細書中で用いられた場合には、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ（単独）」及び「Ｂ（単独）」を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」というような句で用いられた場合には「及び／又は」という用語は、以下の状況のいずれかを含むことを意図する。Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【００２６】
他に定義がない場合には、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する通常の技能を持つ当業者によって一般に理解されるのと同様の意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、技術者にとって本開示で用いられる多くの用語の一般的な辞書となる。
【００２７】
単位、プレフィックス及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められる形式で表示する。数値の範囲は、範囲を規定する数値を含める。本明細書中の冒頭部分は、種々の態様を限定するものではなく、明細書全体の参考として記述されるものであり得る。したがって、次に定義する用語は、明細書全体の参考としてさらに十分に定義される。
【００２８】
本明細書中の「含む」という言葉で記述されるどのような場合でも、「からなる」及び／又は「本質的にからなる」と記述される他の同様の状況をも表すと理解される。
【００２９】
本明細書で用いられる「約」という用語は、通常は記載された値のプラスマイナス５％を意味し、より限定的には記載された値のプラスマイナス４％、さらには記載された値のプラスマイナス３％、さらには記載された値のプラスマイナス２％、さらには記載された値のプラスマイナス１％、そしてさらには記載された値のプラスマイナス０．５％を意味する。
【００３０】
本開示を通して、ある種の実施形態においては範囲の形式で開示される場合もある。範囲形式での記述は、簡潔さ及び簡便さのみのためであると理解されるべきであり、開示範囲が変更できない限度として解釈されるべきものではない。
【００３１】
「単離」された本開示のポリペプチド、タンパク質、封入体、又は他の組成とは、天然には見出されない形状の本開示のポリペプチド、タンパク質、封入体、又は他の組成である。本開示の単離されたポリペプチド、タンパク質、封入体、又は他の組成物は、天然に見出されたままの形状ではなくなったある程度精製されたものを含む。いくつかの態様では、単離されたものとして本明細書中で開示されたポリペプチド、タンパク質、封入体、又は他の組成物は、ほぼ純粋である。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」は、本明細書中では互いに可換であり、長さに関わらずヌクレオチドの重合体を表し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド若しくは塩基が修飾されたもの、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより重合体に取り込まれ得るいかなる基質でもあり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体のような修飾されたヌクレオチドを含み得る。これらの記載はＲＮＡ及びＤＮＡを含む本明細書中で記載されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。いくつかの態様では、本開示の治療用、予防用、又は美容用のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）は、コドンが最適化されている（例えば合成ポリヌクレオチド）。例えばＧｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：２１、Ｍａｕｒｏ  ＆  Ｃｈａｐｐｅｌｌ（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ｐｉｉ：Ｓ１４７１−４９１４（１４）００１４０−３、又はＥｌｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２１に記載されているような多数のコドン最適化法が当業者に知られており、これらの記載すべてはそれらの全部分について本明細書に参考により援用される。
【００３３】
「ベクター」という用語は、目的とする１つ以上の遺伝子又は塩基配列を宿主細胞へ送達し、いくつかの態様では発現させることが可能であるような、構築物を意味する。以下の記載に限定されるものではないが、ベクターの例には、ウイルスベクター、ＤＮＡ若しくはＲＮＡそのものである発現ベクター、プラスミド、コスミド若しくはファージベクター、陽イオン性濃縮剤を伴うＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、並びにプロデューサー細胞のようなある種の真核細胞が含まれる。いくつかの態様では、本開示の治療用、予防用、又は美容用のタンパク質は、１つ以上の核酸にコードされることもあり得、そして１つ以上のベクターとなり得る。したがって、本開示の治療用、予防用、又は美容用のタンパク質が、２、３又はそれ以上のサブユニットを含む場合、それらサブユニットのそれぞれが１つのポリヌクレオチドにコードされることもある。そのようなポリヌクレオチドのすべてが、１つのプロモータにより制御される又は複数のプロモータに制御される（例えば１つのサブユニットをコードするそれぞれの核酸配列のためのプロモータ）１つのベクターに挿入されることもある。もうひとつの態様では、ポリヌクレオチドのそれぞれが異なるベクターに挿入され得る。１つ以上のベクターを用いる場合、ベクターは同じでもよいし、それぞれのポリヌクレオチドに対し異なるベクターを用いてもよい。
【００３４】
本明細書中では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は可換であり、長さに関わらずアミノ酸の重合体を表す。この重合体は、直鎖でも分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸も含み得、アミノ酸でない物質により分断されていてもよい。例えば、ジスルフィド結合の形成、糖鎖付加、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、又は標識用成分（例えば染色剤）、治療用物質（例えば抗がん剤）若しくは美容用物質との複合体形成のようなその他すべての操作又は修飾などのような、自然又は介入により修飾されたアミノ酸重合体もこれらの用語は含む。定義には、例えば１つ以上のアミノ酸の類似体（例えば非天然アミノ酸など）を含有するポリペプチド、それに加えて当業者に知られている他の修飾も含まれる。
【００３５】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を用い生産されたポリペプチド又はタンパク質のことを表す。操作された宿主細胞で発現する組換え技術により生産されたポリペプチド及びタンパク質は、あらゆる適切な技術により分離、分画、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドとして、本発明の目的のために単離されることが考えられる。本開示のポリペプチドは、当業者に知られている方法を用いて組換え技術により生産され得る。その他の方法として、本開示のタンパク質及びペプチドは化学的に合成され得る。組換えによる治療用物質及び美容用物質の生産について、以下にさらに詳しく開示する。組換えタンパク質は、例えば以下であり得る。
（ａ）野生型タンパク質、
（ｂ）変異タンパク質（例えば点変異又は欠失／挿入変異）、
（ｃ）変種タンパク質（例えば、ある自然部分集団で、野生型タンパク質のある場所で通常見られるアミノ酸が自然に他のアミノ酸に置換しているタンパク質）、
（ｄ）スプライス変種、
（ｅ）野生型、変異、変種若しくはスプライス変種タンパク質の断片（例えば組換え技術を用いて得られた断片）、
（ｆ）２つ以上の治療用、予防用若しくは美容用タンパク質の部分を含む融合タンパク質、
（ｇ）１つ、２つ、３つ又はそれ以上の治療用、予防用若しくは美容用タンパク質の部分を含み、例えば、Ｆｃ部位、アルブミン、ＸＴＥＮ、ＨＡＰなど（例えば、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８：２４７〜２５２を参照）血清半減期を伸ばすことのできるペプチド部分のように、薬物動態的特徴を改良することのできる少なくとも１つの付加的な部分をさらに含む融合タンパク質、
（ｈ）１つ、２つ、３つ又はそれ以上の治療用、予防用若しくは美容用タンパク質の部分を含み、例えば、アフィニティタグ、蛍光タンパク質など（例えば、Ｎａｈａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：４５４〜４６１を参照）診断方法のための少なくとも１つの検出可能な部分をさらに含む融合タンパク質、
（ｉ）複合タンパク質（例えば、Ｔａｌａｆｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １２：１６、Ｓｈｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２４：２０７６〜２０８７を参照）、又は、
（ｊ）それらの組み合わせ。
【００３６】
組換えタンパク質という用語は、例えば、炭水化物、脂質、リポ多糖、核酸、他の生化学要素、又はそれらの組み合わせといった、タンパク質ではない部分を有するポリペプチドも含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「免疫原ワクチン」という用語は、動物に注入した際に液性免疫応答を引き起こすタンパク質（例えば、上記の組換えタンパク質）を表し、例えばワクチンの調製に特別に用いられるＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを含む。異種タンパク質の大部分は生体で免疫反応を引き起こすが、免疫原、免疫原ワクチンという用語及びそれらの文法上の異形は、本開示の文脈の中では、（ｉ）対象において免疫応答を引き起こし得る、並びに（ｉｉ）ワクチン又はワクチン関連組成物（例えばワクチンと共に投与される追加免疫剤）に用いられるタンパク質を表す。ワクチンという用語は、感染の影響を防止又は改善するために、疾患に対する能動免疫を起こすのに用いられる抗原製剤を定義するものとして用いられる。
【００３８】
本明細書で用いられる「封入体」又は「ＩＢ」という表現は、微生物（例えば原核又は真核生物）又は適切な組換え発現システム（例えば細胞システム又は無細胞システム）中で生産される、不溶性凝集体形状である組換えタンパク質（複数可）の部分的又は完全な沈殿物を表す。略語「ＩＢ」は、通例、封入体（単数形）を表すのに用い、略語「ＩＢｓ」は封入体（複数形）を表すのに用いる。通常、その範囲は変化し得るが、ＩＢｓは０．０５μｍから１μｍまでの粒径を有する。いくつかの態様では、ＩＢの粒径（例えば、直径の平均として、ＩＢの最大の径として、又は一定の割合、例えば５％〜２０％、より多くのＩＢｓが通過できないようなふるいの網目の大きさとして計測された）は、約０．０５μｍ、約０．０６μｍ、約０．０７μｍ、約０．０８μｍ、約０．０９μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ又は約２０μｍであり得る。
【００３９】
いくつかの態様では、ＩＢの粒径は２０から１５００ｎｍまでである。いくつかの態様では、ＩＢの粒径（particle side）は、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、約１０００μｍ、約１１００μｍ、約１２００μｍ、約１３００μｍ、約１４００μｍ又は約１５００μｍである。いくつかの態様では、ＩＢの粒径は１５００μｍより大きい。
【００４０】
すべての場合ではないが、ある場合には、これらのＩＢｓは光学顕微鏡で明るい屈折性の点として認識することができる。ＩＢは通常、外来遺伝子産物の不溶形状の凝集物により形成される。プラスミドに導入された外来遺伝子は、異種又は同種のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。異種タンパク質は、それらを生成する細胞にとって外来タンパク質なのでＩＢｓを形成する可能性が高い。にもかかわらず、同種タンパク質も、例えば封入体形状のタンパク質の生産を増強する特有の配列との融合により、ＩＢｓを生産し得る。過剰発現されたタンパク質は、治療用物質（例えばタンパク質又はペプチド）又は美容用物質（例えばタンパク質又はペプチド）であり得る。
【００４１】
本明細書で用いられる「封入体形状」という用語は、不溶性タンパク質凝集物に含有される、一般的にはタンパク質である美容用物質又は治療用物質を表す。いくつかの態様では、タンパク質ではない美容用又は治療用物質（例えば核酸）は、局所的に送達可能な粒子を生産するために封入体中に取り込まれ得る。その場合、例えばそのような治療用又は美容用物質（例えば核酸）は、「封入体形状」の中にあると考え得る。本開示の封入体形状の治療用物質又は美容用物質の投与とは、封入体として無傷の状態を（全体的に又は部分的に）保持する間、封入体が皮膚バリアに浸透し得ることも意味する。
【００４２】
「異種タンパク質」とは、例えば組換え技術で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により生産されるヒトタンパク質のように、用いられる宿主細胞にとって外来のタンパク質である。異種タンパク質は原核生物又は真核生物由来である可能性があるが、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳動物そして最も好ましくはヒト由来である。ある種の態様では、異種タンパク質は組換え技術により生産される（例えばそれは組換えポリペプチド又は組換えタンパク質である）。
【００４３】
ＩＢｓは、組換えタンパク質が細胞質に蓄積されるように又はペリプラズムに分泌されるように設計されたかどうかにより、細胞質又は原核細胞のペリプラズムに蓄積され得る。治療用のタンパク質は、原核細胞のペリプラズム又は真核細胞の場合はある細胞区画へ誘導される可能性があり、このタンパク質は封入体を形成する場合がある。
【００４４】
タンパク質の存在場所はシグナル配列を用いることにより指示することができる。本発明を実施するために、実質的にいかなるシグナル配列も使用され得る（例えば、Ｇａｌｌｉｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８３：１７５〜１８２、Ｓｔａｍｐｏｌｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４８４：８〜１５、Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ  ＆  Ｍｏｎｔｅｉｒｏ（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９０：４７〜６１）。例えば、発現タンパク質は、ＰＴＳ（ペルオキシソームターゲット配列）を用いペルオキシソームへ、ＭＴＳ（ミトコンドリア標的シグナル）を用いミトコンドリアのマトリクスへ、ＮＬＳ（核局在シグナル）を用い核へ、又はＳＲＰ（シグナル認識ペプチド）を用い小胞体へ向け直すことができる。本開示の文脈の中では、「シグナルペプチド」という用語は標的シグナル、シグナル配列、トランジットペプチド及び局在化シグナルを含む。
【００４５】
過剰発現タンパク質をコードする組換え核酸配列は、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１タンパク質、ヒトＡｂ−アミロイドタンパク質のＦ１９Ｄ変異体、又はバキュロウイルスのポリへドリンのような、動作可能なように治療用タンパク質と連結された封入体融合相手（すなわち、封入体誘導用タンパク質、ペプチド又はポリペプチド）を含めることができる（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１１８３〜１１９０を参照）。封入体融合相手と事前に選定されたポリペプチドの連結が、封入体を形成する直列ポリペプチドになり得ることは、当業者に知られている。封入体融合相手のアミノ酸配列が、有用な特質を示す封入体を生産するよう変化し得ることも当業者に知られている。
【００４６】
通常、過剰発現タンパク質はＩＢ材料の７０〜１００％であり、少量の、他のタンパク質（例えば膜タンパク質など）、リボソーム構成要素、並びに細胞溶解の後に吸着される少量のリン脂質及び核酸を含有し得る。いくつかのシャペロン又は折り畳み調節因子（ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ及びＩｂｐＡ／Ｂのようなもの）は時に、常時というわけではないが、ＩＢ形成に関連する。いくつかの態様では、過剰発現タンパク質はＩＢ材料の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％である。
【００４７】
いくつかの態様では、本開示の封入体は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、又はそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
本明細書で用いられる「ＶＥＧＦ」という用語は、成長因子のサブファミリー、より詳細にはシスチンノット成長因子である血小板由来成長因子ファミリーである。ＶＥＧＦファミリーは、脈管形成（胚性の循環系の新生）及び血管新生（既存の脈管からの血管の成長）に関わる重要なシグナル伝達タンパク質を含む。ＶＥＧＦファミリーの構成要素は、ＶＥＧＦ−Ａ（一般的な血管新生に関わる）、ＶＥＧＦ−Ｂ（胚性の血管新生に関わる）、ＶＥＧＦ−Ｃ（リンパ脈管形成に関わる）、ＶＥＧＦ−Ｄ（肺細気管支周囲のリンパ管発生に必要）及びＰ１ＧＦ（脈管形成に重要、虚血、炎症、創傷治癒及びがんにおける血管新生に関わる）を含む。
【００４９】
ＶＥＧＦファミリーのすべての構成要素は、細胞表面でチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合することにより細胞応答を刺激し、それぞれ場所、タイミング及び程度は異なるが、それらの二量体化及びリン酸基転移による活性化を引き起こす。すべてのＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外の部分、１つの膜貫通領域、及び分断されたチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内に存在する部分を有する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（ＤＲ  Ｆｌｋ−１）に結合する。ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄは、３番目の受容体（ＶＥＧＦＲ−３）のリガンドであり、リンパ脈管新生を媒介する。
【００５０】
本明細書で用いられる「ヒトＶＥＧＦ」という用語は、自然に存在する対立形質の、及び加工された形のそれらの成長因子と共に、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６（１９８９）、及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０６（１９９１）に記載されているように、アミノ酸数が１６５個のヒト血管内皮成長因子、並びに関連するアミノ酸数が１２１個、１８９個及び２０６個のヒトアミノ酸ヒト血管内皮成長因子を表す。
【００５１】
「ＶＥＧＦ」という用語は、アミノ酸数が１６５個のヒト血管内皮成長因子のアミノ酸８から１０９個又は１から１０９個を有する切断型のＶＥＧＦポリペプチドを表すのにも用いられる。例えば、「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」のように、ＶＥＧＦのいかなるそのような型の言及も本出願の中に見出し得る。切断型の野生型ＶＥＧＦのアミノ酸部位は、野生型ＶＥＧＦ配列に示される番号で表される。例えば、切断型の野生型ＶＥＧＦアミノ酸部位１７（メチオニン）は、野生型ＶＥＧＦでも部位１７（メチオニン）である。切断型の野生型ＶＥＧＦは、野生型ＶＥＧＦと同様にＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対する結合親和性を有する。例えば、国際公開第１９９７／０２０９２５号、国際公開第２００７／０４４５３４号、国際公開第２００８／１１６１１１号、国際公開第２００５／０１１７２２号、国際公開第２００１／０７４３１７号、国際公開第２００６／１３８４６８号、欧州特許番号：欧州特許第１６９２１５８（Ｂ１）号、又は欧州特許公開番号：欧州特許公開第２４４７２８０号を参照、これらすべてはそれらの全部分について本明細書に参照により援用される。ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列は、登録番号Ｐ１５６９２でＵｎｉｐｒｏｔデータベースから、変種ＶＥＧＦ２０６（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１）、ＶＥＧＦ１８９（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−２）、ＶＥＧＦ１８３（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−３）、ＶＥＧＦ１６５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−４）、ＶＥＧＦ１４８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−５）、ＶＥＧＦ１４５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−６）、ＶＥＧＦ１６５Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−８）、ＶＥＧＦ１２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−９）、ＶＥＧＦ１１１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１０）、Ｌ−ＶＥＧＦ１６５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１１）、Ｌ−ＶＥＧＦ１２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１２）、Ｌ−ＶＥＧＦ１８９（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１３）、Ｌ−ＶＥＧＦ２０６（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１４）、ＶＥＧＦ  １５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１５）、ＶＥＧＦ  １６（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１６）、ＶＥＧＦ  １７（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１７）、ＶＥＧＦ  １８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１５６９２−１８）の配列も含めて取得可能である。ＶＥＧＦという用語は、ヒト以外の型のタンパク質も含む。
【００５２】
ＶＥＧＦは、血管新生の制御を助けることにより新規血管形成への刺激を促進する。血管の形成は、創傷又は皮膚障害の修復に重要であり、したがってＶＥＧＦの投与は傷の処置又は皮膚障害を処置するために使用され得る。ＶＥＧＦは、血管透過性向上にも有用であり、それにより他の外用剤の透過を促進する。ＶＥＧＦ投与は、毛細血管の破損を低減するのに用いることができ、したがって酒さのような状態を処置するために使用され得る。
【００５３】
本明細書で用いられる「インターロイキン−１０」又は「ＩＬ−１０」は、（ｉ）米国特許第５，２３１，０１２号で開示されているような、成熟ＩＬ−１０のアミノ酸配列（例えば分泌のためのリーダー配列を欠失）を有する、及び（ｉｉ）野生型のＩＬ−１０に共通の生物学的活性がある、タンパク質として定義される。さらに含められるのは、ＩＬ−１０の生物学的活性を保持している、エプスタイン・バーウイルスのタンパク質ＢＣＲＦ１（ウイルス性ＩＬ−１０）を含むムテイン及び他の類似体である。例えば、米国特許第５７５３２１８号、米国特許第５７７６４５１号、米国特許出願第６５４４５０４号、米国特許第７０５２６８６号、米国特許第５６６５３４５号、米国特許公開第２００５／０１５８７６０号、又は国際公開第２０１３／１３０９１３号、国際公開第１９９７／００５８９６号、国際公開第２０１４／０２３６７３号を参照、これらすべてはそれらの全部分について本明細書に参照により援用される。インターロイキン−１０のタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースでアクセッション番号Ｐ２２３０１により見出し得る。インターロイキン−１０という用語は、ヒト以外の型のタンパク質も含む。
【００５４】
本明細書で用いられる「ケラチノサイト成長因子」又は「ＫＧＦ」という用語は、ＦＧＦＲ−２に結合でき、繊維芽細胞における顕著な活性を欠いており、上皮細胞で顕著に特異的であり、そして角化細胞において特に活性が高いＦＧＦファミリータンパク質グループの構成要素を表す。ＫＧＦ、類似体及びそれらの断片は、合成又は組換え技術により生産され得る。さらにＫＧＦは、例えばヒト組織など、すべての哺乳動物源のいずれかの組織のような天然源から単離され得る。
【００５５】
「成熟、全長ＫＧＦ」、「長型ＫＧＦ」、「ＦＬ−ＫＧＦ」、「野生型ＫＧＦ」又は「ＫＧＦ１６３」という用語は、１６３アミノ酸残基を有する成熟ポリペプチドを表す。「ＫＧＦ断片」という用語は、ＫＧＦ１６３の配列全部が含まれるわけではないＫＧＦ１６３に由来するポリペプチドを表す。そのような断片は、全長分子が切断されたもの、あるいは内部が欠失したポリペプチドであり得る。例えば、国際公開第２００３／０１６５０５号、国際公開第１９９５／００１４３４号、国際公開第１９９８／００６８４４号、国際公開第２００２／０６２８４２号、米国特許第７２６５０８９号、米国特許第５７７３５８６号、米国特許第５８６３７６７号、又は欧州特許番号：欧州特許第０８７１７３０（Ｂ１）号、若しくは欧州特許第１０１２１８６（Ｂ）号を参照、これらすべてはそれらの全部分について本明細書に参照により援用される。ＫＧＦタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースでアクセッション番号Ｐ２１７８１により見出し得る。２つのヒトＫＧＦのアイソフォーム、アイソフォーム１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２１７８１−１）及びアイソフォーム２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２１７８１−２）が知られている。本明細書で用いられるＫＧＦという用語は、ヒト以外の型のタンパク質も含む。
【００５６】
本明細書で用いられる「ＥＧＦ」という用語は、上皮成長因子の全長配列及びそれらの生物学的活性を保持する、ＥＧＦ分子のＣ末で切断された型（Ｃａｌｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｕｔ  ２０００，４７  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．６２２〜６２７）又はＮ末端が切断された型（Ｓｖｏｄｏｃａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４，１２０６：３５〜４１、Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９５，１６：２０５〜２１０）のような、いかなる断片をも表す。ＥＧＦという用語は、アミノ酸置換を持つ変種（Ｓｈｉａｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２，２６７：２４０３４〜２４０４０、Ｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０１１，５８５：１１３５〜１１３９、国際公開第２００７／０６５４６４号）も含む。
【００５７】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、自然に存在する比較的短い１本鎖ポリペプチドであり、マウス顎下腺から最初に単離された。マウス及びヒトの上皮成長因子（後者は、ある種の初期の公表ではウロガストロンとも呼ばれた）は、どちらも５３個のアミノ酸を有する。これらのうち３７個は、マウス上皮成長因子（ｍＥＧＦ）及びヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）のアミノ酸配列と同一であり、その構造に存在する３つのジスルフィド結合の相対位置も同一である。（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２５７：３２５（１９７５）、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６：１７６５（１９７５））このポリペプチドは、βｈＥＧＦに見出されるＣ末のアルギニン残基を欠失した５２アミノ酸型（γ−ｈＥＧＦ）としても存在する。ｈＥＧＦのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，「Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｕｒｏｇａｓｔｒｏｎｅ，Ａ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｃｑｕｉｒｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｓｔａｔｅｓ」；ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９），ｐｐ．６９〜１１０、又はＵｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：７４６１（１９８３）に開示されている。
【００５８】
ｈＥＧＦの４８個のアミノ酸を有する型（Ｃ末の５アミノ酸を欠失）は、日本特許出願第８６１４６９６４号（出願公開第６３００３７９１号、公開日１９８８．２．８）に記載がある。天然型の分子は、残基６〜２０、１４〜３１及び３３〜４２の間にジスルフィド結合を有し、そして８つのＥＧＦ様領域からなる約１２００個のアミノ酸の前駆分子から生成する（例えば、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，２１：８４２７（１９８６）を参照）。ラットＥＧＦの４８アミノ酸を有する型は、日本特許出願第８７３６４９８号（出願公開第６３２０２３８７号、公開日１９８８．８．２２）に開示されている。ｍＥＧＦ及びｈＥＧＦは両者とも、さらにそれらの既知の類似体も、異なる物質では活性の程度又はスペクトラムが異なる可能性があるが、同様の薬理活性を示す。一般的にＥＧＦは、胃酸の分泌を抑制し、そして細胞の成長を促進する。それゆえ、抗潰瘍物質として及び外傷治癒における、治療能について有望とされる。米国特許第６１９１１０６号、米国特許第５０３４３７５号、米国特許第５１０２７８９号、米国特許第５１８３８０５号、米国特許公開第２００９／００８１２２２号、米国特許公開第２００６／００１４６８４号、又は国際公開第１９９２／００３４７６号も参照、これらすべてはそれらの全部分について本明細書に参照により援用される。ＥＧＦという用語は、ヒト以外の型のＥＧＦも含む。ヒトＥＧＦタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースでアクセッション番号Ｐ０１１３３により見出し得る。同様にＵｎｉｐｒｏｔデータベースに含まれているのは、アイソフォーム１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１１３３−１）、アイソフォーム２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１１３３−２）、アイソフォーム３（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１１３３−３）のようなＥＧＦアイソフォームの配列である。当業者に知られている天然の変種は、以下の部位において置換を有する変種を含む。Ｓ１６Ｒ、Ｈ１５１Ｙ、Ｄ２５７Ｙ、Ｌ２９２Ｈ、Ｒ４３１Ｋ、Ｓ６３８Ｒ、Ｍ７０８Ｉ、Ｇ７２３Ｒ、Ｄ７８４Ｖ、Ｍ８４２Ｔ、Ｅ９２０Ｖ、Ｄ９８１Ｅ、Ｌ１０４３Ｆ、Ａ１０８４Ｇ。
【００５９】
「対象」という用語は、以下の記載に限定されるものではないが、本開示の経皮組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物、又は封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物）により個々の処置を受けるものとなる、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、及びその他同様のものを含むいかなる動物（例えば哺乳動物）をも表す。通常は、「対象」及び「患者」という用語は、ヒトという対象を意味するものとして本明細書中では互いに可換として用いられる。
【００６０】
本明細書で用いられる「治療用物質」という用語は、局所投与に適しており、そして求められる生理学的効果を誘起する化学物質又は化合物を表す。「治療用物質」という用語は、例えば治療用ポリペプチド（例えば治療用タンパク質又はペプチド）を含む。「治療用タンパク質」又は「治療用ポリペプチド」とは、宿主に投与されたとき、又は宿主の細胞内で発現したときに、宿主に治療上の利益をもたらすことにより、疾患（例えば皮膚疾患）の処置又は予防医学において役立つ可能性を持つ価値ある生物学的特性を有する、いかなる自然に存在する又は自然に存在しないタンパク質若しくはポリペプチドをも意味する。本発明の目的では、治療用タンパク質の有益な又は望ましい治療結果は、以下の記載に限定されるものではないが、検出可能及び検出不可能でも、症状の緩和、疾患範囲の縮小、病理学的状態の安定（特に悪化しないこと）、疾患進行の遅延若しくは阻止、病理学的状態の改善若しくは緩和並びに緩解（どちらも部分的に及び全体的に）を含む。
【００６１】
通常の当業者であれば、有益な又は望ましい治療結果が上に列挙されたものに限定されないことを理解するであろう。いくつかの態様では、治療用物質は免疫原である。したがって、いくつかの態様では、本開示の治療用組成物はワクチンを含む。
【００６２】
本明細書で用いられる「美容用物質」という用語は、対象の皮膚の外見（例えば、色、きめ、見た目、肌ざわりなど）又はにおいの向上又は保護を促進する、例えばペプチド又はタンパク質のような、物質を表す。美容用物質は皮膚の内部構造を変化させ得る。特に「美容用物質」という用語は、すり込まれること、注入されること、振りかけられること、スプレーされること、導入されること、又は対象の体若しくはその部分へなされ得る他の適用が意図されるすべての物質加えてそれらの構成成分をも意味する。
【００６３】
美容用物質は、米国食品医薬品局により一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）物質、食品添加物、及び市販薬を含む美容用以外の消費者製品に用いられる物質を含み得る。いくつかの実施形態では、美容用物質は、皮膚への局所適用に適した皮膚科学的に許容され得る担体を含む美容用組成物に取り込まれ得る。
【００６４】
美容用物質は例えば、以下を含む。
（ｉ）皮膚組織に少なくとも１つの効果（正又は負の）を誘導又は誘起することが知られている化学物質、化合物、低分子若しくは高分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）皮膚組織に少なくとも１つの効果（正又は負の）を誘導又は誘起することが知られていて、提供される方法及びシステムを用いることにより皮膚組織に少なくとも１つのこれまでに未知の効果（正又は負の）を誘導又は誘起することが発見された化学物質、化合物、低分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせ、並びに
（ｉｉｉ）皮膚組織に効果を有することが知られておらず、提供される方法及びシステムを用いることにより皮膚組織に効果を誘導又は誘起することが発見された化学物質、化合物、低分子、抽出物、製剤、又はそれらの組み合わせ。
【００６５】
美容用物質又は美容用として作用可能な物質のいくつかの例は、例えば、米国国立衛生研究所のＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、米国パーソナルケア製品評議会の成分データベース（Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｐｅｒｓｏｎａｌｃａｒｅｃｏｕｎｃｉｌ．ｏｒｇ）、米国パーソナルケア製品評議会により出版された２０１０  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、欧州連合の化粧品成分物質リスト（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｌｉｓｔ）、日本の化粧品成分リスト（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｉｓｔ）、米国パーソナルケア製品評議会のＳｋｉｎＤｅｅｐデータベース（ｗｗｗ．ｃｏｓｍｅｔｉｃｓｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ）、米国食品医薬品局の認可賦形剤リスト（Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｌｉｓｔ）、米国食品医薬品局のＯＴＣリスト、日本の医薬部外品リスト（Ｑｕａｓｉ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｓｔ）、米国食品医薬品局のデータベース「米国における食品添加物のすべて」、欧州連合の食品添加物リスト（Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｌｉｓｔ）、日本の成分規格のある食品添加物リスト、認可香料リスト（Ｅｘｉｓｔｉｎｇ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，Ｆｌａｖｏｒ  ＧＲＡＳ  ｌｉｓｔ）、米国食品医薬品局のＳｅｌｅｃｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ、米国の家庭用品データベース（Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、Ｇｌｏｂａｌ  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓデータベース（ＧＮＰＤ）パーソナルケア（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ）、ヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）、食品／飲料／ペット及び家庭用品（Ｆｏｏｄ／Ｄｒｉｎｋ／Ｐｅｔ  ａｎｄ  Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ）データベース（ｗｗｗ．ｇｎｐｄ．ｃｏｍ）、並びに化粧品の成分及び植物成分の供給者から見出し得る。
【００６６】
「治療用組成物」という用語は、活性成分（例えば、封入体形状のタンパク質又はポリペプチド）の生物学的活性を効果的にする形状であり、組成物を投与されようとする対象に対して許容できない毒性を示す他の付加的な構成成分を含有しない、治療用物質を含む製剤を表す。そのような組成物は無菌であり得る。
【００６７】
「美容用組成物」という用語は、活性成分（例えば、封入体形状のタンパク質又はポリペプチド）の求められる活性を有効にする（例えば、対象の皮膚の色、きめ、見た目、肌触りなどのような外見又はにおいの向上又は保護を促進する）形状であり、組成物が投与されようとする対象に対して許容できない毒性を示す付加的な構成成分を含有しない、美容用物質を含む製剤を表す。
【００６８】
本開示の、封入体形状の治療用物質又は美容用物質の「有効な量」とは、特定の目的を達成するのに十分な量のことである。「有効な量」は、その目的に関する実験及び定型方法により決定され得る。したがって、本明細書で用いられる「有効な量」という用語は、処置される状態にとって処置を施すのに、又はある種の美容効果（例えば、しわの低減又は皮膚柔軟性の増強）を達成するのに十分な投与量を表す。これは、対象、状態及びなされる処置法、又は治療上及び／又は美容上の期待される効果により変化し得る。必要とされる正確な量は、対象の種、齢、及び対象の全般的状態、用いられる個々の担体若しくは補助剤、投与の方法、並びにその他同様のものに依存し、対象それぞれに応じて変化し得る。そのように、有効な量は個々の状況に基づいて変化し得るものであり、そして適切な効果を生じる量は個々の場合ごとに、通常の当業者により定型の実験法のみを用いることで、決定され得る。
【００６９】
「治療上有効な量」という用語は、本開示の封入体形状の治療用物質単独又は他の薬剤と組み合わせた場合の量であり、対象又は哺乳動物において疾患又は不調を「処置する」ために有効である量を表す。
【００７０】
「美容上有効な量」という用語は、本開示の封入体形状の美容用物質単独又は他の薬剤と組み合わせた場合の量であり、対象又は哺乳動物において皮膚の状態を「改善する」ために有効である量を表す。
【００７１】
「標識」という単語は、本明細書で用いられる場合、「標識された」治療用物質又は美容用物質を生成するために、直接又は間接的（例えばリンカーを経由して）に、本開示の治療用物質又は美容用物質と複合体形成された又は融合された検出可能な化合物又は組成物を表す。標識はそれ自身検出可能であり得（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は酵素的標識の場合は、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的な変化を触媒し得る。
【００７２】
本明細書で用いられる「皮膚」という用語は、例えば顔、首、胸、背中、腕、手、脚及び頭の皮膚を含む。粘膜組織への投与も可能性があると理解されるべきである本明細書で用いられる「皮膚バリア」という用語は、皮膚の角質層によりもたらされる、環境と深部皮膚層との間の物理的及び化学的バリアを表す。
【００７３】
本開示の組成物、方法、及び装置が用いられる場合の「局所投与」という用語は、例えば様々な皮膚の状態又は不調の処置のための、封入体形状の治療用物質又は美容用物質の皮膚又は粘膜組織への適用を表す。「局所用組成物」は、局所投与に適した組成物である。
【００７４】
本明細書で用いられる「経皮」という用語は、例えば、皮膚、皮膚下、又は例えば血流を通して到達し得るような適用箇所から離れた場所に到達するような、封入体形状の治療用物質又は美容用物質の皮膚バリアを通した送達（例えば治療用又は美容用物質の分子集団の少なくともいくらかの部分が皮膚の内層に到達するような送達）を表す。したがって、本開示は、例えば、「経皮送達組成物」（すなわち封入体形状の治療用物質又は美容用物質を含む組成物）、「経皮送達システム」（すなわち封入体形状の治療用物質又は美容用物質を含むシステム）、及び「経皮送達装置／器具」（すなわち封入体形状の治療用物質又は美容用物質を含む装置又は器具）を提供する。
【００７５】
経皮送達は、例えば対象の皮膚又は皮下領域を標的とする美容用物質及び治療用物質に限定されることを意図してはいない。この点で、経皮送達は治療用物質又は美容用物質の血流への送達をも含む。
【００７６】
ＩＩ．封入体の経皮送達
本開示は、封入体形状の治療用物質及び美容用物質を、それらを必要とする対象に供給するための経皮送達方法、組成物、及び装置を提供する。本発明の態様は、対象に対する、高（又は、低及び高両方の）分子量の医薬、予防薬、診断薬、及び美容用物質の経皮送達に用いられ得る。
【００７７】
発明者は、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、２３８アミノ酸残基からなるタンパク質（２６．９ｋＤａ）、のような大きなポリペプチドを、封入体形状で調製し、確立されている試験管内ヒト皮膚浸透モデルを適用すると、角質層を通して浸透し深部外皮層に到達させることが可能であることを示した。対照的に、可溶性ＧＦＰのようなほとんどの可溶性タンパク質は皮膚の角質層バリアを越えることができない。これらＧＦＰ封入体は、平均寸法が、長さ３００ｎｍ及び直径１７０ｎｍの球形又は円筒形物質である（Ｇａｒｃｉａ−Ｆｒｕｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：４２４９〜４２５３）。可溶型の大きなタンパク質は、角質層によるバリアのために受動的に皮膚を越えて透過することができないこと、そしてそれゆえこのバリアを克服するための促進技術が必要であることは当業者によく知られている（Ｋａｌｌｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ  １２（１）：４３１〜４４１）。それゆえ、可溶化されていない封入体、数百ナノメートルの大きさである高度に純粋なタンパク質沈殿、が皮膚バリアに浸透できるという発見は、医学及び美容において長らく感じられていた必要性に対する解決を提供する。米国特許出願第１３／１４２，２９５号（米国特許公開第２０１１／０２６８７７３号として公開）、及び米国特許出願第１３／３１９，７７２号（米国特許公開第２０１２／０１４８５２９号として公開）、加えてそれら２つの米国特許出願で引用されている参考文献のすべては、それらの全部分について本明細書に参照により援用される。さらに、発明者は、封入体形状中のＩＬ−１０のようなタンパク質（炎症を抑制することにより治療用物質として並びに炎症に伴う赤み及び腫れを抑制することにより美容用物質として同時に機能し得る）が、皮膚バリアに浸透し得ること及びヒト乾癬の皮膚試料に有効であることを示した。
【００７８】
本開示は、皮膚バリアを越えて美容用物質を送達するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含む、少なくとも１つの美容用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法を提供する。したがって、無傷のＩＢが対象の皮膚に用いられた後、それは皮膚を通して透過し、そして皮膚内の深部にある場合でもＩＢは構造上無傷の状態を維持する。これらの方法は、封入体形状の治療用物質の皮膚バリアを越えた送達にも適用し得る。したがって、本開示は、治療用組成物を、それらを必要とする対象の皮膚に適用することを含む、皮膚バリアを越えて治療用物質を送達するための方法であって、治療用組成物が封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含むものであり、少なくとも１つの治療用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法も提供する。
【００７９】
封入体形状で送達される治療用及び美容用物質は、例えば皮膚の状態を処置するために用いられ得る。例えば、美容用物質は、しわ、日焼け、又はセルライトのような皮膚の状態を改善するために送達され得る。いくつかの態様では、美容用物質は、日焼けのような皮膚の状態を防止するために送達され得る（例えば、美容用物質が日焼け止めの一部として用いられる場合）。この点で、本開示は、処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質と、皮膚科学的に許容され得る担体と、を含む、美容に有効な量の美容用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために対象に局所適用することを含む、方法を提供する。いくつかの場合においては、治療用物質は、炎症（例えば感染又は自己免疫反応を含む免疫反応により引き起こされる）又はがんのような皮膚の状態を改善するために送達され得る。したがって、本開示は、それらを必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、治療に有効な量の治療用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために対象の皮膚に局所適用することを含む、方法を提供する。
【００８０】
タンパク質のような高分子量の分子は、一般的に皮膚バリアを通して透過することができないので、本開示の封入体形状の治療用及び美容用物質（例えばタンパク質）の供給は、通常皮膚透過しない治療用及び美容用物質（例えばタンパク質）の浸透能を増強するために用いられ得る。したがって、本開示は、美容用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、美容用物質の浸透が、前述のものと同じ美容用物質の可溶型のものの浸透と比較して増進される、方法を提供する。この浸透の改善は、治療用物質（例えば治療用タンパク質）にも用いられ得る。それゆえ、本開示は、治療用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、前述の治療用物質の浸透が、前述のものと同じ美容用物質の可溶型のものの浸透と比較して増進される、方法も提供する。
【００８１】
試験管内で組織の再生を刺激する、及び真核細胞の増殖を刺激する封入体の能力は、米国特許出願第１３／１４２，２９５号（米国特許公開第２０１１／０２６８７７３号として公開）に開示されており、その全部分について本明細書に参照により援用される。したがって、本開示は、組織の再生を刺激する方法であって、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、封入体が皮膚バリアに浸透し、組織に到達して、組織の再生を刺激する、方法を提供する。同様に、真核細胞の増殖を刺激する方法であって、単離された封入体形状の少なくとも少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、封入体が皮膚バリアに浸透し真核細胞の増殖を刺激する、方法も提供される。
【００８２】
本開示の封入体は経皮送達システム（例えばパッチ、スプレー、綿棒、スポンジ、スティック、シャンプーなど）に取り込まれ得る。ゆえに、本開示は（ｉ）封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を供給すること、及び（ｉｉ）封入体を担体と混合することにより経皮送達システムを構築すること、を含む経皮送達システムを構築する方法も提供する。
【００８３】
いくつかの態様では、封入体は不溶性である。他の態様では、封入体は可溶性であるが、可溶化されてはいない。さらに他の態様では、封入体は部分的に可溶化されている。いくつかの場合、封入体は、例えば、界面活性剤又は有機溶媒のような可溶化剤を含有する溶液で１回以上洗浄することにより、部分的に可溶化され得る。部分的な可溶化は、例えば封入体の周囲の脂質膜を取り除くために、又は封入体の外層に付着する宿主細胞の夾雑物をはがすために用いられ得る。いくつかの態様では、外層の部分的な可溶化は封入体の純度向上のために用いられ得る。
【００８４】
いくつかの態様では、封入体は微粒子形状である。特に、本開示の封入体は２０ｎｍから１５００ｎｍまでの粒径であり得る。粒径は、それらが実質的に球形である粒子の直径を表す。粒子は球形以外であり得、その場合粒径の範囲は球形粒子と比べて同等の粒子直径を表し得る。
【００８５】
いくつかの態様では、封入体の平均粒径は、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１９０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２１０ｎｍ、約２２０ｎｍ、約２３０ｎｍ、約２４０ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２６０ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２８０ｎｍ、約２９０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約９５０ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１０５０ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１１５０ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１２５０ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１３５０ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１４５０ｎｍ、又は約１５００ｎｍである。
【００８６】
いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１００ｎｍから約２００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約２００ｎｍから約３００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約３００ｎｍから約４００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約４００ｎｍから約５００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約５００ｎｍから約６００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約６００ｎｍから約７００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約７００ｎｍから約８００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約８００ｎｍから約９００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約９００ｎｍから約１０００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１０００ｎｍから約１１００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１１００ｎｍから約１２００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１２００ｎｍから約１３００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１３００ｎｍから約１４００ｎｍまでである。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１４００ｎｍから約１５００ｎｍまでである。
【００８７】
いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１５０ｎｍから約３００ｎｍまでの粒径を有する。いくつかの態様では、封入体の平均粒径は約１００ｎｍから約５００ｎｍまでの粒径を有する。
【００８８】
いくつかの態様では、封入体は水和された非晶質の形状である。いくつかの態様では、封入体は皮膚バリアに浸透した後、標的細胞に取り込まれ得る。いくつかの態様では、標的細胞は表皮細胞である。他の態様では、標的細胞は表皮細胞以外の細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は、例えば神経細胞、筋細胞、脂肪細胞、メラニン形成細胞、毛包細胞、汗腺細胞、皮脂腺細胞、血管の細胞、角化細胞、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、又はそれらの組み合わせである。このリストは限定的なものではない。
【００８９】
いくつかの態様では、封入体は少なくとも一層の皮膚層、一般的には角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））に浸透し得るものの、他の態様では、封入体は皮膚のより深部に浸透し得る。したがって、いくつかの態様では、封入体は半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））又は基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））に浸透し得る。いくつかの態様では、封入体は表皮より深部に浸透し得る。いくつかの態様では、封入体形状の治療用物質は皮膚に浸透し、血流へ送達され得る。
【００９０】
いくつかの態様では、封入体は上皮組織層、例えば表１に記載される上皮組織の１つの層に浸透し得る。
【００９１】
（表１）上皮組織のタイプ
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【００９２】
いくつかの態様では、封入体形状の美容用物質又は治療用物質は、ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは生物学的活性を有するが、他の態様では、ポリペプチドはプロドラッグである。本明細書で用いられる「プロドラッグ」という用語は、生体内への投与が対象になされた場合、化学的及び／又は酵素的な加水分解により切断され、それにより治療用又は美容用の親物質を生成し、したがって、対象に送達されることが意図される十分な量の物質が、持続性放出の様式で、意図される治療又は美容使用に利用可能となるような、親物質の不安定な誘導化合物である、本開示の治療用又は美容用物質を意味する。
【００９３】
本明細書で用いられる「不安定」という用語は、生体内で酵素的及び／又は化学的切断を受けそれにより親物質を生成するプロドラッグの能力を表す。「持続性放出」という用語は（時に、当業者に「持続性送達」又は「徐放」と表される）、単独で投与される場合の（すなわちプロドラッグとしてではなく）親である治療用又は美容用物質の作用期間より、プロドラッグから放出される親である治療用又は美容用物質が長期の作用期間を与えるような、ゆっくりとした１次吸収速度論又はゼロ次吸収速度論を含むいかなる機構によってでも、親である治療用又は美容用物質の放出をプロドラッグが実現することを示す。
【００９４】
いくつかの態様では、ポリペプチドは、組換えポリペプチド若しくはその断片、天然のポリペプチド若しくはその断片、又は化学合成ポリペプチドである。封入体を生成するための組換え技術によるタンパク質生産の方法は、当業者に知られている。封入体特有の生産、精製及び特性評価方法は、以下に詳細に開示される。ペプチドの化学合成方法も当業者によく知られている。したがって、本明細書で用いられる封入体という用語は、例えば化学合成ペプチド及びタンパク質から、天然源から得られたペプチド及びタンパク質から、又は人工のウイルス様粒子から生産された、不溶性タンパク質沈殿又はナノ粒子も含む（例えば、Ｄｏｍｉｎｇｏ−Ｅｓｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：１０４７〜１０６１、Ｄｏｍｉｎｇｏ−Ｅｓｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５０：４３７〜４３８を参照）。
【００９５】
いくつかの態様では、ポリペプチドは融合タンパク質又は複合タンパク質である。例えば、ポリペプチドは、例えば封入体誘導ペプチドのような、他のタンパク質と化学的に複合体形成された治療用又は美容用物質を含み得る。複合体形成は、当業者に知られている誘導体化可能な置換基及び方法を用い実施され得る。アミノ基、スルフヒドリル基、オキシアミノ側基、又は他の求核基のような、選択的に誘導体化可能な置換基は当業者によく知られている。誘導体化可能な置換基は、１つ以上のリンカーを介してポリペプチド鎖に結合され得る。リガンド（例えば、付加的な治療用物質又は美容用物質、検出可能な標識、半減期延長ポリマーなど）は、適切な連結の化学反応を用いて誘導体化可能な置換基に付加され得る。このカップリングの化学反応には、例えば、アミド、尿素、チオ尿素、オキシム、アミノアセチルアミドなどを含み得る。複合体形成に適したクロスリンカーは、適切なスペーサによって隔てられた２つの異なる反応基を有するヘテロ二官能性（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）であるものを含む。そのようなクロスリンカーは、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩから入手可能である。その他二官能性カップリング試薬は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸スクシンイミジル、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩のようなもの）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルのようなもの）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのようなもの）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ジアミノヘキサンのようなもの）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのようなもの）、ジイソシアネート（２，６−トルエンジイソシアネートのようなもの）、及びビス−活性フルオリン化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのようなもの）を含む。
【００９６】
いくつかの態様では、ポリペプチドはキメラであり、すなわちポリペプチドは少なくとも２つのタンパク質又はその断片を融合又は化学的に複合体形成させ得られたものである。いくつかの態様では、他の場合にはキメラタンパク質の構成要素は異なる種の生物のタンパク質から得ることができるが、そのようなタンパク質は同種の生物から得られる。いくつかの態様では、組換えポリペプチドは、例えば細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞のような細胞で発現する。当業者は、どのような細胞発現システム、無細胞発現システム、又は封入体を得るその他の方法であっても、本開示の方法に従って使用する封入体を得ることに適用できることを理解するであろう。
【００９７】
いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質精製用タグ、又は検出可能な標識、例えば可視化用タグと複合体形成されている。いくつかの態様では、タンパク質精製用タグはＨｉｓ−６タグである。いくつかの態様では、可視化用タグは蛍光タグである。有用である検出可能な標識は、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン、ランタノイド蛍光体及びその他同様のもの）、検出に有効である酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びその他同様のもの）、放射性標識、又は２次レポータにより認識されるエピトープ（例えば、ロイシンジッパー結合配列、２次抗体の結合部位、金属結合領域、エピトープタグなど）を含む。いくつかの態様では、検出可能な標識には立体障害の可能性を減少させるために様々な長さのスペーサアームが付加され得る。
【００９８】
いくつかの態様では、美容用物質はＩＬ−１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である。他の態様では、治療用物質は、ＩＬ−１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である。
【００９９】
ＩＩＩ．美容用物質及び治療用物質
本開示の方法、組成物、及び装置は、物質が例えば低若しくは高（又は低及び高両方の）分子量の医薬、予防薬、診断薬、及び美容用物質である、封入体形状の治療用物質及び／又は美容用物質を用い得る。本開示の治療用物質及び美容用物質は、例えば、核酸、ポリペプチド、ペプチド、修飾されたペプチド、低分子、免疫原性製剤、及びその他同様のものを含む。
【０１００】
本開示の封入体は、例えば、ホルモン、麻酔薬、コラーゲン製剤、心臓血管に対する医薬化合物、抗感染化合物（例えば、抗生物質及び抗ウイルス化合物）、糖尿病関連処置、免疫原性組成物、ワクチン、免疫応答調節剤、酵素阻害剤、鎮痛剤、片頭痛治療法、鎮静剤、造影剤を投与するために用いられ得る。これらの例は本発明の態様が低及び高両分子量化合物の経皮送達に用いられ得ることを開示するために提供されるものであり、そして治療上、予防上又は美容上有益である量の本開示の分子を用いることによって他の多くの分子が効果的に体に送達され得ることが理解されるべきである。
【０１０１】
いくつかの態様では、封入体は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン抑制ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピン若しくは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨ若しくは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ若しくはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管抑制因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、内皮増殖因子、α−１アンチトリプシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シクロスポリン、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、カタラーゼ、又はシャペロン（例えばＨｓｐ７０）のようなポリペプチドを含む。
【０１０２】
特別な態様では、封入体中のタンパク質は、ＥＧＦ、ＫＧＦ、又はＶＥＧＦ、又は少なくとも野生型タンパク質の治療上、予防上、又は美容上の特性の一部を保持しているそれらの断片、変種又は誘導体を含む。
【０１０３】
ひとつの態様では、封入体は、ＥＧＦ、ＥＧＦ断片、ＥＧＦ変種、ＥＧＦ誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、単一の治療用、予防用、又は美容用タンパク質を含む。
【０１０４】
他の態様では、封入体は、ＫＧＦ、ＫＧＦ断片、ＫＧＦ変種、ＫＧＦ誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、単一の治療用、予防用、又は美容用タンパク質を含む。
【０１０５】
さらに他の態様では、封入体は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ断片、ＶＥＧＦ変種、ＶＥＧＦ誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、単一の治療用、予防用、又は美容用タンパク質を含む。
【０１０６】
多数の成長因子が、皮膚の局所用製剤（例えばクリーム）として用いられ得る。皮膚の局所用製剤（例えばクリーム）は、単一の成長因子又は複数の成長因子及びサイトカインを含有し得る。そのような製剤は、可溶性コラーゲン、マトリクスタンパク質及び遊離ラジカルを中和する抗酸化物質をも含有し得る。皮膚の局所用製剤に含まれ得る成長因子の例を、表２（下記）に記載する。
【０１０７】
（表２) 成長因子及び皮膚の局所用製剤としてのそれらの機能
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【０１０８】
局所用製剤に取り込まれた場合、成長因子は（ｉ）自然老化の過程によりもたらされる内因性の老化及び／又は（ｉｉ）環境因子によりもたらされる外因性の老化の徴候及び症状を逆転、防止又は処置し得る。逆転、予防、又は処置され得る内因性の老化の影響は、細胞の増殖若しくは分裂を停止する傾向、皮膚のコラーゲン量の減少、皮膚のコラーゲンの分解、皮膚の薄化、弾性の喪失、及び皮膚のたるみ増加などを含む。逆転、予防、又は処置され得る外因性の老化（例えば、空気の乾燥、又は紫外線、又はケミカルピーリング若しくはレーザー治療のような人為因子などの環境因子により引き起こされる）の影響は、きめの粗いしわ、破損した血管、皮膚のたるみ、乾燥、毛穴の目立ち、皮膚の変色、不均一な皮膚の雰囲気などを含む。したがって、いくつかの態様では、成長因子（例えばＶＥＧＦ、ＫＧＦ、又はＥＧＦ）を含む局所用製剤は、縦じわ及び／又はしわの出現減少、しみの出現改善、色素沈着の均一化、皮膚の粗さの減少、皮膚のきめの改善、皮膚の弾性の改善、皮膚のなめらかさの改善、皮膚のはり増強、又はそれらの組み合わせのために用いられ得る。例えば、Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：３５０〜３５９、Ｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８：４〜１３７、Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＨ．Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６：１９７〜２０２を参照、これらはそれらの全部分について本明細書に参照により援用される。
【０１０９】
本明細書で用いられる「成長因子」という用語は、成長因子様のペプチドも含む。ＣＴＦＡ（米国化粧品工業会）に登録されている成長因子成分は、例えば、ＥＦＧ（抗老化）、ＩＦ−１（抗老化、ヘアケア）、ｂＦＧＦ（抗老化、ヘアケア）、ＴＲＸ（抗老化、抗色素沈着、ヘアケア）、ＫＧＦ（抗老化、ヘアケア）、ＳＣＦ（ヘアケア）、ＴＧＦ−β３（ヘアケア）、ＩＬ−１０（抗炎症）、ＰＤＧＦ（抗老化）、ＶＥＧＦ（ヘアケア）、ＦＧＦ１０（ヘアケア）、ａＦＧＦ（抗老化、ヘアケア）、ＴＧＦ−α（抗老化）、ＩＬ−４（抗炎症）、チモシン−β４（抗老化、ヘアケア）、ノギン（ヘアケア）、ｈＮＧＦ（ヘアケア）などを含む。ＣＦＴＡに登録されている成長因子様ペプチドは、例えば、ＣＧ−ＩＤＰ２（商標）（抗老化、ヘアケア）、ＣＧ−ＩＤＰ３（商標）（抗老化）、ＣＧ−ＩＤＰ４（商標）（抗老化）、ＣＧ−ＩＤＰ５（商標）（抗老化、ヘアケア）、ＣＧ−ＥＤＰ１（商標）（抗老化）、アロペクチン（商標）（ＡＬＯＰＥＣＴＩＮ、ヘアケア）、リタードリン（ＲＥＴＡＲＤＲＩＮ、ヘアケア）（商標）、レジュリン（商標）（ＲＥＪＵＬＩＮＥ、抗老化、ヘアケア）などを含む。
【０１１０】
封入体形状の多くの異なる治療用物質又は美容用物質が、本開示の様々な経皮送達組成物、システム、及び装置に取り込まれ得る（そして本開示の方法によって用いられ得る）。本明細書で用いられる「経皮送達組成物」という用語は、本開示の治療用物質及び美容用物質の両方を含む。低分子量及び高分子量の治療用又は美容用物質は、本開示の態様を用いることにより効果的に経皮送達され得る。
【０１１１】
本開示の封入体形状の治療用又は美容用物質を含む経皮送達組成物は、治療上、予防上、診断上又は美容上有益な量の５０ダルトンから２，０００，０００ダルトン以下の分子量までの治療用又は美容用物質を提供し得る。すなわち、本開示の経皮送達組成物は、好ましくは分子量が５０、１００、２００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、４６，０００、４７，０００、４８，０００、４９，０００、５０，０００、５１，０００、５２，０００、５３，０００、５４，０００、５５，０００、５６，０００、５７，０００、５８，０００、５９，０００、６０，０００、６１，０００、６２，０００、６３，０００、６４，０００、６５，０００、６６，０００、６７，０００、６８，０００、６９，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、２００，０００、２２５，０００、２５０，０００、２７５，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、１，７５０，０００、及び２，０００，０００ダルトン以下又は以上の、送達される治療用又は美容用物質を提供する。
【０１１２】
いくつかの態様では、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び核酸は、本開示の経皮送達組成物及び方法の態様を用いることにより、封入体形状で生体の細胞へ経皮送達される。すなわち、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７０００、若しくは１０，０００アミノ酸であるか、それ以下又は以上のいかなるペプチド又はポリペプチドでも、本明細書中に記載されている経皮送達組成物、システム、又は装置に取り込まれ得（そして本開示の方法に従い使用され得）、送達される治療用又は美容用物質は組成物適用の後、短時間のうちに生体の細胞へ送達され得る。
【０１１３】
これらのペプチド又はポリペプチドは、例えば、免疫応答の刺激、炎症の抑制、創傷治癒の促進、コラーゲン合成の誘導などのために用いられ得る。本開示のペプチド又はポリペプチドはペプチドホルモンも含む。ある種の態様で送達される物質であるペプチドホルモンの限定されない例は、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、性腺刺激ホルモン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性腸管ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、チロシンチロシンペプチド、ニューロペプチドチロシン、アンフィレグリン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトジェン、リラキシン、インヒビンＡ、インヒビンＢ、エンドルフィン、アンジオテンシンＩＩ、又は心房性ナトリウム利尿ペプチドを含む。
【０１１４】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７０００、若しくは１０，０００又はより多くのヌクレオチドを有する、いかなるヌクレオチド若しくはヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド若しくはヌクレオシド、又は核酸でも、本開示の経皮送達組成物、システム、又は装置に取り込まれ得、（そして本開示の方法に従い使用され得）、送達される治療用及又は美容用物質は組成物の適用の後、短時間のうちに生体の細胞へ送達され得る。
【０１１５】
これらのヌクレオチド又はヌクレオシドは、例えば、免疫応答の刺激、炎症の抑制、創傷治癒の促進、又はコラーゲン合成の誘導などのために用いられ得る。いくつかの核酸免疫原及び／又はワクチン並びに治療法は当業者に知られていて、本開示の経皮送達組成物、方法、システム、及び装置の態様において送達される物質として有用であり得る。宿主への投与によって免疫応答（液性及び細胞性両方の）を誘導するいくつかの核酸免疫原が報告されてきた。いくつかのウイルスに加えて、腫瘍に対するＤＮＡワクチンが知られている。当業者は、宿主への投与に際して、免疫原が宿主の細胞機構に各々の送達される核酸にコードされている翻訳産物を生産させるような、必須の制御要素を、核酸免疫原が含有することを理解するであろう。本明細書で用いられるように、免疫原は治療用物質と考えられ、免疫原を含む組成物は治療用組成物と考えられる。
【０１１６】
低分子量の送達物質及び中間分子量の送達物質に加えて、いくつかの高分子量の送達物質（例えば糖タンパク質）も、本開示の経皮送達組成物、方法、システム、及び装置の態様を用いることにより、生体の細胞へ送達され得る。糖タンパク質は高分子量の化合物であり、一般に補欠分子族として１つ以上の異糖類を含有する複合タンパク質として特徴づけられるいくつかの糖タンパク質の型が生体内で見出される。例えば、多くの膜結合タンパク質は糖タンパク質であり、細胞間隙をうめる物質（例えば細胞外マトリクスタンパク質）は糖タンパク質であり、コラーゲン、プロテオグリカン、ムコ多糖、グリコサミノグリカン及び細胞基質を構成する化合物は糖タンパク質である。糖タンパク質を含む封入体形状の治療用又は美容用物質を生体細胞へ投与し得る経皮送達システムには、以下に限定されるものではないが、皮膚の弾性及び硬さ回復（例えば小じわ及びしわの出現減少）並びに柔軟及び丈夫な関節の回復（例えばプロテオグリカンの経皮送達による関節における水分保持の増強によりもたらされる）を含むいくつかの治療目的及び美容目的の使用がある。
【０１１７】
当業者に知られている美容用のペプチドは、本開示の経皮送達組成物、方法、システム、及び装置により送達され得る。例えば、美容用のペプチドは、米国特許公開第２００９／０１３６５９５号、米国特許公開第２０１０／０１９６３０２号、米国特許公開第２００５／０２２６８３９号、米国特許公開第２００９／０１５５３１７号、米国特許公開第２００６／０２９３２２７号、米国特許公開第２００９／０１４３２９５号、米国特許公開第２００７／０１１０６８６号、米国特許公開第２０１１／０３０５７３５号、米国特許公開第２０１０／００９８７６９号、米国特許公開第２００９／０１５５３１７号、米国特許公開第２０１１／０１９５１０２号、米国特許公開第２０１２／００２１０２９号、米国特許公開第２０１２／０１２１６７５号、並びに米国特許第７９４３１５６号、米国特許第７０２２６６８号、米国特許第８１１４４３９号、米国特許第７４７３６７９号、米国特許第６８７５７４４号、米国特許第６３３３０４２号、及び米国特許第７０１５１９２号に開示されている。
【０１１８】
本開示に従って送達され得る治療用ペプチドは、例えば、インスリン、エキセンジン及び誘導体例えばリキシセナチド（例えば、米国特許第６９８９３６６号、米国特許第７２９７７６１号、米国特許第７１１５５６９号、米国特許第７１３８３７５号、及び米国特許第６９５６０２６号、並びに米国特許公開第２００５／０２１５４６９号に開示されている）、筋弛緩ペプチド（例えば、米国特許公開第２００９／０２２６３８７号に開示されている）、抗腫瘍ペプチド（例えば、米国特許公開第２００３／０１０９４３７号、２００８／００２７００５号、米国特許第７２４１７３８号に開示されている）、抗細菌ペプチド（例えば、米国特許公開第２００２／００３５０６１号、米国特許公開第２００３／０２３２７５０号、米国特許第６５０３８８１号、米国特許第５９９４３０６号、米国特許第７００１９８３号に開示されている）、神経開口分泌抑制ペプチド（例えば、米国特許公開第２０１０／００２１５１０号、米国特許公開第２００８／０２４１８８１号、米国特許公開第２０１１／０３０５７３５号、などに開示されている）を含む。いくつかの態様では、例えば、ボツリヌス毒素、その変種、及び断片（例えば、Ａ型ボツリヌス神経毒素又は米国特許第５８３７２６５号に開示されている分子）又はボツリヌス神経毒素様の作用を有するペプチド（例えば、米国特許公開第２０１０／００２１５１０号、又は米国特許第７４７３６７９号に開示されている）のように、治療用ペプチド及びタンパク質は、美容目的で送達され得る。笑いじわの出現を回避する又は和らげるために、シナプスレベルでの神経筋接合部の抑制を標的としたそれらと異なる美容用産物が、本開示の組成物及び方法を用いることにより投与され得る。例えば、欧州特許番号：欧州特許第１１８０５２４（Ｂ１）号及び国際公開第１９９７／０３４６２０号は、シナプス前でＳＮＡＲＥ複合体形成においてＳＮＡＰ−２５と競合し、ＡＣｈ放出減少の誘起及び神経筋接合部での神経伝達阻害を引き起こすＳＮＡＰ−２５というタンパク質から得られたペプチドの使用について記載している。
【０１１９】
欧州特許公開第１８０９６５２（Ａ２）号は、神経伝達を阻止し、そしてしわの出現を防止するために、ワグレリン−１に類似した作用機構でシナプス後に作用するＡＣｈＲの拮抗ペプチドについて記載している。活性のある美容用ペンタペプチド−３も、神経伝達をブロックし、そしてしわの出現を防止するために、ツボクラリンに類似した作用機構でＡＣｈＲを抑制することによりシナプス後に作用する。
【０１２０】
ＩＶ．治療用及び美容用組成物
本開示の治療用及び美容用組成物は、少なくとも１つの治療用物質及び／又は少なくとも１つの美容用物質のそれぞれに加え、担体（一般的には皮膚科学上許容できる担体）をさらに含み得る。したがって、本開示は、局所用の美容用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得るものであり、いくつかの態様ではそのような美容用組成物が少なくとも１つの担体を含む、美容用組成物を提供する。
【０１２１】
同様に、局所用の治療用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得るものであり、いくつかの態様ではそのような治療用組成物が少なくとも１つの担体を含む、治療用組成物が提供される。
【０１２２】
したがって、本明細書に記載された治療用又は美容用組成物は、上記に開示された封入体形状の治療用又は美容用物質に加えて、例えば水（蒸留、脱イオン、ろ過、又は他の調製による）、アルコール、非イオン性可溶化剤、又は乳化剤のような担体及び補助剤をさらに含み得る。適切な親水性構成成分は、限定されるものではないが、水、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルポリシロキサン（ＤＭＰＸ）、オレイン酸、カプリル酸、イソプロピルアルコール、１−オクタノール、エタノール（変性又は無水）、並びに医薬グレード若しくは無水の他のアルコールを含む。
【０１２３】
アルコール、水及び他の水溶性補助剤のような担体は、本開示の経皮送達組成物のいくつかの製剤には存在しない。添加する構成成分が封入体形状の治療用又は美容用物質の経皮送達に悪影響を与えない限り、香料、クリーム、軟膏、色素、及びその他の化合物を含む他の物質も本発明の経皮送達構成成分になり得る。
【０１２４】
本明細書で用いられる「担体」という用語は、物質（例えば治療用及び／又は美容用物質）と共に対象へ投与され、生体内及び／又は試験管内で物質の安定性を増強する、物質の生理学的活性の減少を防ぐ、又はそれらの組み合わせための分子（例えば希釈剤、補助剤、添加物又は賦形剤）を表す。
【０１２５】
本開示の文脈の中では、「皮膚科学的に許容できる担体」という用語は、本開示の治療用及び／又は美容用組成物の使用に適切な担体が、ヒトの皮膚組織への接触使用において安全であるべきということを表す。適切な担体は、水及び／又は水溶性溶媒を含み得る。本開示の封入体形状の治療用又は美容用物質を経皮送達するための治療用及び美容用組成物は、約１重量％から約９５重量％までの水及び／又は水溶性溶媒を含み得る。組成物は、約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又は８５％から、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％までの水及び／又は水溶性溶媒を含み得る。適切な水溶性溶媒は、１価アルコール、２価アルコール、多価アルコール、グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、及びそれらの混合物を含む。本開示の経皮送達組成物がエマルジョンである場合は、水及び／又は水溶性溶媒は通常、水相に関係する担体である。
【０１２６】
適切な担体は油も含む。本開示の経皮送達組成物は、約１重量％から約９５重量％までの１種以上の油を含み得る。組成物は、約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％から、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は３％までの１種以上の油を含み得る。油は、水又は水溶性溶媒に適さない物質を可溶化、分散又は保持するために使用され得る。適切な油は、シリコーン、炭化水素、エステル、アミド、エーテル、及びそれらの混合物を含む。油は揮発性又は不揮発性であり得る。
【０１２７】
適切なシリコーン油はポリシロキサンを含む。商業的に入手可能なポリシロキサンは、信越化学工業株式会社のＤＭ−Ｆｌｕｉｄシリーズ、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．により販売されているＶｉｃａｓｉｆ'シリーズ、及びＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）２００シリーズを例として含む、ジメチコンとしても知られているポリジメチルシロキサンを含む。適切なポリジメチルシロキサンの特別な例は、粘度が０．６５、１．５、５０、１００、３５０、１０，０００、１２，５００、１００，０００、及び３００，０００センチストークスであるＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ＊２００  ｆｌｕｉｄｓ（Ｘｉａｍｅｔｅｒ"  ＰＭＸ−２００  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆｌｕｉｄｓとしても販売されている）を含む。
【０１２８】
適切な炭化水素油は、直鎖、分枝、又は環状のアルカン及びアルケンを含む。鎖長は、揮発性などの求められる機能特性に基づき選択され得る。適切な揮発性炭化水素は５〜２０個の炭素原子又は８〜１６個の炭素原子を有し得る。他の適切な油はエステルを含む。適切なエステルは通常少なくとも１０個の炭素原子を含有していた。これらのエステルは、脂肪酸又はアルコールに由来するヒドロカルビル鎖を有するエステル（例えばモノエステル、多価アルコールエステル、並びにジ−及びトリ−カルボン酸エステル）を含む。これらエステルのヒドロカルビルラジカルは、アミド及びアルコキシ部分（例えばエトキシ又はエーテル結合など）などの他の適合性のある官能基を含み得る又はそれらと共有結合し得る。
【０１２９】
他の適切な油はアミドを含む。アミドは、アミド官能基を有し、かつ２５℃で液体であり水に不溶である化合物を含む。適切なアミドは、Ｎ−アセチル−Ｎ−ブチルアミノプロピオン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸イソプロピル及びＮ，Ｎ，−ジエチルトルアミドを含む。他の適切なアミドは米国特許第６，８７２，４０１号に開示されている。他の適切な油はエーテルを含む。適切なエーテルは、多価アルコールの飽和及び不飽和脂肪エーテル、並びにそれらのアルコキシ化誘導体を含む。代表的なエーテルは、ポリプロピレングリコールＣ４．２０アルキルエーテル、及びジ−Ｃｓ−３ｏアルキルエーテルを含む。これらの物質の適切な例はＰＰＧ−１４ブチルエーテル、ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル、ジオクチルエーテル、ドデシルオクチルエーテル、及びそれらの混合物を含む。
【０１３０】
本開示の経皮送達組成物は乳化剤を含み得る。乳化剤は組成物がエマルジョンである場合又は非混和性の物質を併有している場合、特に適している。局所用の治療用及び／又は美容用組成物は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、又は１％から、約２０％、１０％、５％、３％、２％、又は１％までの乳化剤を含み得る。乳化剤は非イオン性、陰イオン性又は陽イオン性であり得る。乳化剤の限定されない例は、米国特許第３，７５５，５６０号、米国特許第４，４２１，７６９号、及びＭ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．から出版されているＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎのＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２０１０  Ａｎｎｕａｌ  Ｅｄ．に開示されている。
【０１３１】
他の適切な乳化剤は、米国パーソナルケア製品評議会のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６の機能分類「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ−Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ」にさらに記載されている。直鎖又は分枝型のシリコーン乳化剤も使用され得る。特に有用なポリエーテル修飾シリコーンは、信越化学工業株式会社のＫＦ−６０１１、ＫＦ−６０１２、ＫＦ−６０１３、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１７、ＫＦ−６０４３、ＫＦ−６０２８、及びＦ−６０３８を含む。また、特に有用であるのは、信越化学工業のＫＦ−６１００、ＫＦ−６１０４、及びＫＦ−６１０５を含むポリグリセロ化された直鎖又は分枝型のシロキサン乳化剤である。
【０１３２】
乳化剤は乳化シリコーンのエラストマーも含む。適切なシリコーンエラストマーは、粉状、又は揮発性若しくは非揮発性のシリコーン、又はシリコーンと互換のパラフィン系炭化水素若しくはエステルのような賦形剤などの溶媒に、分散若しくは可溶化されている場合がある。適切な乳化シリコーンエラストマーは、少なくとも１つのポリアルキルエーテル又はポリグリセル化された単位を含む。
【０１３３】
本開示の経皮送達組成物に粘度上昇、濃縮、凝固、又は固体若しくは結晶構造を与えるために、構造化剤が利用され得る。構造化剤は通常、溶解性、分散性、又は相の適合性に基づき分類される。水性又は水構造化剤の例は、高分子剤、天然若しくは合成ゴム、多糖、並びにその他同様のものを含む。ひとつの態様では、局所用の治療用及び／又は美容用組成物は、組成物の約０．０００１重量％、０．００１重量％、０．０１重量％、０．０５重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、５重量％から約２５重量％、２０重量％、１０重量％、７重量％、５重量％、４重量％、又は２重量％までの１つ以上の構造化剤を含み得る。
【０１３４】
多糖及びゴムは、水相の適切な増ちょう剤であり得る。適切な高分子構造化剤の種類は、限定されるものではないが、カルボン酸重合体、ポリアクリルアミド重合体、スルホン化重合体、高分子量ポリアルキルグリコール若しくはポリグリセリン、それらの共重合体、疎水性に修飾されたそれらの誘導体、並びにそれらの混合物を含む。シリコーンゴムは、もうひとつの油相構造化剤である。もうひとつの種類の油相構造化剤はシリコーンワックスを含む。シリコーンワックスは、アルキルシリコーンワックスと呼ばれることがあり、室温で半固体又は固体である。他の油相構造化剤は、１つ以上の動物、植物、又は鉱物性ワックスのような天然又は合成ワックスであり得る。
【０１３５】
本開示の経皮送達組成物は、ゲル化剤を含み得る。「ゲル化剤」という用語は、溶液、エマルジョン、及び懸濁液の濃縮並びに固化に用いられる物質を表す。それらは、ほとんど液体から構成されるが、生じたゲルに固形物の外観を与える内部構造を形成するコロイド混合物として液相に溶けている。ゲル化剤は増粘剤ときわめて類似している。
【０１３６】
本開示の経皮送達組成物は、界面活性剤を含み得る。「界面活性剤」は、水又は水溶液に溶解した場合に表面張力を減じる有機化合物を表す。エマルジョンでは界面活性剤は、親水性部分及び親油性部分を含み得、そのことによって非混和性の相間界面の表面張力を減じる機能を発揮する。機能的には、界面活性剤は乳化剤、湿潤剤、洗浄剤、起泡剤、及び可溶化剤を含む。
【０１３７】
界面活性剤は、分子のかなりの部分が親水性でありかなりの部分が親油性である、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は双性イオン性（例えば、限定されるものではないが、ベタイン（例えばコカミドプロピルベタイン）、洗剤及びアミノ酸を含む）の中間から高分子量のすべての化合物（約１００から３００，０００ダルトンまでのものなど）である。
【０１３８】
一般的には、組成物及び局所用組成物を製造する当業者に知られているような通常の方法により、本開示の経皮送達組成物は調製され得る。通常、そのような方法は成分の混合、又は比較的均一な状態にするための加熱、冷却、真空引き、及びその他同様のことを伴う若しくは伴わないより多くの段階を含む。一般的にエマルジョンは、まず水相の物質を脂肪相の物質と別々に混合し、そして求められる連続相を得るために適切に２相を合わせることにより調製される。
【０１３９】
本開示の経皮送達組成物は、好ましくは、活性成分の安定性（物理学的安定性、化学的安定性、光安定性など）及び／又は送達を最適化するように調製される。本開示の経皮送達組成物は、処置の期間十分な量の組成物を蓄えられるサイズのパッケージで供給され得る。
【０１４０】
いくつかの態様では、本開示の経皮送達組成物は、例えば溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エマルジョン、懸濁液、ペースト、エアゾール、エアゾール泡沫、エアゾール粉末、ローション、塗布薬、軟膏、チンキ、膏薬、湿布、スプレー、乾燥粉末、又はそれらの組み合わせとして調製及び／又は投与され得る。
【０１４１】
「溶液」という用語は、溶質（例えば治療用又は美容用物質）が液体溶媒に溶け化学的平衡にある系を表す。
【０１４２】
「ゲル」又は「ゼリー」という用語は、定常状態において流動性を示さない本質的には希薄な架橋された系からできたゼリー様の物質を表す。重量としては、ゲルはほとんど液体であるが、液体中の３次元架橋の網により固体のようにふるまう。
【０１４３】
「クリーム」という用語は、皮膚又は直腸若しくは膣にあるような粘膜へ適用するための局所用製剤を表す。クリームは、油及び水の混合物である半固体のエマルジョンである。それらは、連続的な水相に分散する小さな油滴から構成される水中油型（ＯＡＶ）クリーム、及び連続的な油相に分散する小さな水滴から構成される油中水型（Ｗ／Ｏ）クリームの２つの型に分けられる。
【０１４４】
「エマルジョン」は２つ以上の非混和性（混和できない）液体の混合物を表す。１方の液体（分散相）が他方（連続相）の中に分散している。エマルジョンは、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンであり得る。
【０１４５】
「懸濁液」という用語は、浮力により支えられている微細粒子が流体の中に懸濁している混合物、同様に微細粒子が流体より密度が高く、浮力により支えられていない混合物も表す。
【０１４６】
「ペースト」という用語は、脂肪基剤、水、及び粉末が懸濁している少なくとも１つの固形物からなる形状を表す。
【０１４７】
「エアゾール」という用語は、気体の中に微細固体粒子又は液滴が懸濁しているものを表す。
【０１４８】
「エアゾール泡沫」という用語は、液体又は固体の中に多数のガス泡を捕捉することにより形成される物質を表す。
【０１４９】
「エアゾール粉末」という用語は、固体粒子のエアゾール噴霧を生成する散布系の型を表す。
【０１５０】
「塗布薬」という用語は、皮膚へ適用するための薬用の局所用製剤を表す。この型の製剤はバーム又は塗布液とも呼ばれる。塗布薬はローションと同様の粘度を有する。塗布薬は一般的に軟膏又はクリームより顕著に粘度が低い。
【０１５１】
「ローション」という用語は、低から中程度の粘度をもつ局所用製剤を表す。
【０１５２】
「軟膏」という用語は、皮膚及び目（眼軟膏）、膣、肛門、及び鼻の粘膜のような様々な体表面に局所的に用いられる、粘性のある均一な半固体の製剤を表す。
【０１５３】
「チンキ」という用語は、アルコール抽出物又は不揮発性物質の溶液を表す。チンキとみなされるには、アルコール抽出物が少なくとも４０〜６０％のエタノールを有する必要がある。
【０１５４】
「膏薬」という用語は、頭又は他の体表面を落ち着かせるために用いられる薬用の軟膏を表す。
【０１５５】
「湿布」という用語は、しばしば加熱され、薬物が付与されており、うずく、炎症を起こした、又は痛む身体部分を処置するために布の上に塗り広げられ、皮膚上を覆う、柔らかで湿ったかたまりを表す。
【０１５６】
「スプレー」という用語は、液滴及びそれを包含する気体の集まりを表す。
【０１５７】
いくつかの特別な態様では、本開示の美容用又は治療用組成物は、封入体中の美容用及び／又は治療用物質がＩＬ−１０、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、からなる、又は本質的にからなる、封入体を含む。
【０１５８】
Ｖ．経皮送達システム及び器具
本開示は、封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含む美容用組成物を含む経皮送達システムも提供する。同様に、封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物を含む経皮送達システムも提供される。経皮送達システムは、例えばパッチ、定量スプレー、スプレー懸濁液、綿棒、スポンジ、スティック、懸濁シャンプー（ｓｈａｍｐｏｏ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、定量エアゾール、又はエアゾールスプレーであり得る。
【０１５９】
「パッチ」、「経皮パッチ」又は「皮膚パッチ」という用語は、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用又は美容用組成物の特定の用量を皮膚へ及び皮膚を通して送達するために、皮膚にのせられる粘着性のパッチを表す。パッチは、対象に対する、長期間にわたる治療用又は美容用組成物の制御放出を提供し得る。
【０１６０】
「定量スプレー」という用語は、液滴及びそれを包含する気体を一気に放出して与えることによって、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む特定の量の治療用又は美容用組成物の送達を補助する装置を表す。
【０１６１】
「スプレー懸濁液」という用語は、気体に包含された非常に小さな液滴中活性物質懸濁液として、表面（皮膚など）にスプレーできる、液体中活性物質（例えば美容用物質又は治療用物質）懸濁液を表す。
【０１６２】
「綿棒」という用語は、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用又は美容用組成物を適用するために用いられるガーゼ又はコットンなどの小片を表す。
【０１６３】
「スポンジ」という用語は、入浴、掃除、及び他の目的のために使用されるものと吸収性が類似する吸収材、多孔性プラスチック、ラバー、セルロース、又は他の材料のかたまりを表す。
【０１６４】
「スティック」又は「リップスティック」という用語は、通常、蜜蝋又はワセリンから製造され、表面被覆及び保湿を提供する、「棒状」のものを表す。被覆剤は水分の損失を防ぎ唇を快適に保つが、風味剤、着色剤、日焼け止め及び他の物質が追加の固有の効用を提供し得る。
【０１６５】
「シャンプー」という用語は、髪及び頭皮を洗うために用いられる様々ななんらかの液体状又はクリーム状の石鹸又は界面活性剤の製剤を表す。例えば治療用又は美容用物質のような活性物質を溶解され又は分散され含有するシャンプーは、これらの物質を経皮送達するために用いられ得る。
【０１６６】
「懸濁シャンプー」という用語は、洗浄の間に物質を経皮送達するための、シャンプーの中に活性物質（例えば美容用物質又は治療用物質）を懸濁され含有するシャンプーを表す。
【０１６７】
「定量エアゾール」という用語は、エアゾール化された薬剤を一気に放出して与えることによって、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む特定の量治療用又は美容用組成物の送達を補助する装置を表す。
【０１６８】
「エアゾールスプレー」という用語は、液体粒子の噴霧を生成する散布系の型を表す。
【０１６９】
本開示は、塗布器に連結された容器及び経皮送達システムを含む装置又は器具も提供する。したがって、いくつかの態様では、経皮送達組成物（例えば、本開示の封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）は、適用を容易にする装置に取り込まれる。
【０１７０】
通常、器具は塗布器に連結された容器を含み、本開示の経皮送達組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）が容器に取り込まれている。いくつかの装置は、例えば混合物の気化を促進することによって送達を容易にする。これらの器具は、霧吹きのような塗布器（例えばポンプ駆動霧吹き）に連結された容器に取り込まれた本開示の経皮送達組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）を有する。これらの態様は、取り込まれた経皮送達組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）を容器から出すための噴射剤も含み得る。他の器具がより焦点を当てた適用のために設計され得る。本開示の経皮送達組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）に焦点を当てた適用を容易にする装置は、経皮送達組成物（例えば、封入体形状の少なくとも１つの美容用又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）を収容する容器に連結された回転又は綿棒様塗布器を有し得る。
【０１７１】
いくつかの特別な態様では、本開示の経皮送達組成物は封入体を有する美容用又は治療用組成物を含み、封入体中の美容用及び／又は治療用物質は、ＩＬ−１０、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、からなる、又は本質的にからなる。
【０１７２】
ＶＩ．疾患及び状態並びに処置の方法
本明細書で開示される方法、組成物、送達システム、及び器具は、治療上（予防上を含む）、及び皮膚の不調を処置するための美容上の適用に用いられ得る。加えて、いくつかの態様では、本明細書で開示される方法、組成物、送達システム、及び器具は、皮膚疾患以外の疾患を処置するために治療上（予防上を含む）用いられ得る。いくつかの態様では、本明細書で開示される方法、組成物、送達システム、及び器具は、血流を介して皮膚表面から離れた箇所に治療用物質を送達するために用いられ得る。
【０１７３】
本明細書中では「皮膚の状態」「皮膚の不調」及び「皮膚疾患」という用語が、本開示の封入体中の美容用又は治療用物質の投与により防止又は処置され得る生理学的状態（例えば病理学的状態）を表すのに用いられる。例えばその用語は、感染、炎症、日焼け、又は自然老化に伴う又は引き起こされる皮膚の状態、不調又は疾患を含む。本発明で開示される方法、組成物、送達システム、及び器具を用いて処置され得る詳細な皮膚の状態及び不調の例は、以下に与えられる。
【０１７４】
「処置すること」若しくは「処置」又は「緩和すること」若しくは「緩和」という用語は、（１）例えば皮膚の状態若しくは不調のような、状態若しくは不調の進行を治す、遅らせる、症状を小さくする、及び／又は止める方策、並びに（２）例えば皮膚の状態若しくは不調のような、標的となる状態若しくは不調の進展を防止及び／又は遅延する予防若しくは防止の方策の両方を表す。したがって処置を必要とするものは、その状態若しくは不調をすでに伴うもの、その状態若しくは不調になる傾向にあるもの、並びにその状態若しくは不調が予防されるべきものを含む。
【０１７５】
ある種の態様では、本開示の方法に従って、対象が例えば全体的、部分的又は一過的な、例えば皮膚の状態又は不調のような状態又は不調の改善を示すならば、対象は首尾よく「処置」される。例えば、処置又は処置することは、限定されるものではないが、例えば免疫監視機構の増強による、過角化の大きさ及び厚さ減少、痛みの低減、かゆみの低減、実際に処置された領域ではない近接した領域（局所適用の場所から離れた赤み及び腫れ）の炎症の低減、病変の数の低減、新しい病変発生の低減、処置された領域を越えた病変の消散（「場効果」）、及び寛解に要する期間の短縮を含み得る。
【０１７６】
本明細書で用いられる「改善する」という用語は、例えば封入体形状の治療用又は美容用物質による局所的な処置後の皮膚の状態又は不調のような、状態の改善を例として表し、皮膚の状態又は不調の状況を計測又は定量化するパラメータ（例えば、皮膚老化におけるしわの存在若しくは非存在及び／又は深さ若しくは長さ）のいかなる統計的に有意な改善をも表す。したがって、この用語はそのようなパラメータの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の改善を含む。改善するという用語は、処置されていない状態又は不調に対して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、若しくは少なくとも約１８０倍又は、それより多くの改善も表す。
【０１７７】
本明細書で用いられる「防止する」及び「防止」という用語は、例えば皮膚の状態又は不調のような疾患又は不調の、再発、拡散、又は発症の防止を含む。本開示の方法、組成物、送達システム、及び器具は、完全な防止に限定されることを意図していない。いくつかの態様では、徴候は遅らされ、又は例えば皮膚の状態若しくは不調のような疾患若しくは不調のひどさが減じられる。
【０１７８】
多くの態様は、すでに皮膚の不調に悩まされている又は痛みに苦しんでいる対象を処置するための、防止の方策（例えば痛み又は皮膚の不調を避けるためのもの）としてでも又は治療上の方策としてでも対象の処置に適している。一般に、医薬又は美容剤に組み込まれ得るほとんどの薬剤、化学物質、及び美容用物質は、本発明の経皮輸送組成物に配合され得る。
【０１７９】
後に続く本発明の態様は例示目的のみのものであり、本開示の経皮送達組成物（例えば封入体形状の少なくとも１つの美容用物質又は治療用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）の広範な応用性を当業者は容易に理解し得、他の送達物質（例えば他の治療用物質及び／又は美容用物質）の経皮送達組成物への取り込みは複雑ではない。
【０１８０】
いくつかの態様では、皮膚の不調という用語は、対象の皮膚の健康に影響する疾患又は状態を表す。いくつかの態様では、皮膚の不調という用語は、粘膜に影響する疾患又は不調も含む。いくつかの態様では、皮膚の不調は、例えばざ瘡（尋常性ざ瘡、嚢胞性ざ瘡などを含む）、床ずれ、発疹、乾燥肌、皮膚の擦過傷、皮膚炎、日焼け、傷跡、過角化症、肉芽腫、皮膚の潰瘍、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、蜂窩織炎、口唇ヘルペス、ふけ、皮膚炎（限定されるものではないが、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、新生児頭部皮膚炎、貨幣状湿疹、口周囲皮膚炎、及び疱疹状皮膚炎を含む）、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、膿痂疹、感染症（限定されるものではないが、細菌、ウイルス、及び真菌感染）、小胞性水疱性皮疹、セルライト、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬などである。
【０１８１】
例えば１つの実施形態では、がん、関節炎、及びアルツハイマー病のような炎症、痛み、又はヒトの疾患の処置又は予防の方法は、本明細書中に記載の経皮送達組成物（例えば封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物）の使用を含む。ある取り組みでは、痛み又は炎症の減少において有効である送達物質を含む経皮送達組成物（例えば封入体形状の治療用物質）が必要とする対象に投与され、そして痛み又は炎症の減少が監視される。本明細書中に記載される経皮送達組成物（例えば封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含む治療用組成物）は、好ましくは、皮膚の炎症の領域又は痛み若しくは特定の状態を有する場所に適用され、そして処置は炎症、痛みの減少又は疾患の進行抑制に十分な時間継続される。
【０１８２】
もうひとつの方法では、しわを減少させる並びに皮膚のはり及び柔軟性を増強させる（まとめて「皮膚の調子を回復する」と表す）取り組みが提供される。そして、経皮送達組成物（例えば封入体形状の少なくとも１つの治療用物質及び／又は美容用物質を含む治療用組成物又は美容用組成物）が、処置を必要とする対象の皮膚に供給され接触する。
【０１８３】
加えて、しわを減少する、しみを取り除く、並びに皮膚のはり及び柔軟性を増強する方法が提供される。この取り組みによって、本開示の封入体形状で治療用物質及び／又は美容用物質を含む経皮送達組成物が必要とする対象に供給され、対象は経皮送達組成物に接触し、そして求める皮膚の調子を回復するのに（例えばしわ、しみの減少、又は皮膚の明るさ、はり及び柔軟性の回復）十分な時間処置が継続される。
【０１８４】
本明細書で開示される方法、組成物、送達システム、及び器具を用いて処置され得るいくつかの皮膚の状態及び不調の特別な定義は以下に与えられる。
【０１８５】
「癰」という用語は、膿を排出する通常１つ以上の開口部を皮膚上に伴うおできより大きい腫れものを表す。それは通常、ほとんどの場合黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細菌感染により引き起こされる。「蜂窩織炎」という用語は、真皮層及び皮下組織層の重度の炎症を伴った結合組織のびまん性の感染を表す。蜂窩織炎はある型の細菌が、通常、皮膚の切傷、擦過傷又は裂傷を経由して皮膚に侵入することにより引き起こされる。Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）はこれらの細菌の中で最もよく見られる。「皮膚炎」という用語は、皮膚のすべての炎症を表す（例えば発疹など）。「皮膚糸状菌症」という用語は、病原菌（皮膚糸状菌）により引き起こされる皮膚の真菌感染の一群を表す。
【０１８６】
「膿瘡」という用語は、膿痂疹の１種で、組織の深部にできる、通常、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）による。「湿疹性皮膚炎」又は通常呼ばれる「湿疹」という用語は、皮膚の上層に影響を及ぼすアレルギー状態のひとつの型である。その状態は、赤み、かゆみ、乾燥及び皮膚浮腫を伴う持続的かつ再発性の皮膚発疹により特徴づけられる。「丹毒」という用語は、炎症を引き起こし特徴的には下にある脂肪組織へ広がっていく、真皮の急性連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）感染症を表す。
【０１８７】
「多形性紅斑」という用語は、未知の病因、おそらくは先行感染又は薬物暴露に続いて通例生じる皮膚及び口腔粘膜の表面微細血管での免疫複合体の沈着、によりもたらされる皮膚の状態を表す。軽度の状態では通常、左右対称に手足から始まる軽度のかゆみ、ピンクから赤の斑点を示す。しばしば、色の薄い中央部の周囲に濃いピンク色の環を伴う、古典的な「標的病変」の外見を呈する。「紅色陰癬」という用語は、茶色の落屑に変わり得るピンクの斑点を引き起こす皮膚疾患を表す。この疾患は、細菌コリネバクテリウムミヌチシマム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ）により引き起こされる。「紅皮症」（「剥脱性皮膚炎」、「剥離性皮膚炎」及び「レッドマン症候群」としても知られている）という用語は、皮膚表面のほぼ全体を冒す紅斑及び落屑を伴う炎症性の皮膚疾患を表す。
【０１８８】
「毛包炎」という用語は、１つ以上の毛包の炎症を表す。その状態は皮膚のいかなる場所にも起こり得る。「癰」（又は「おでき」）という用語は、毛包の感染により引き起こされ、局所的な膿及び死組織の蓄積を生じる皮膚疾患を表す。「膿痂疹」という用語は、皮膚表面の細菌感染を表す。この感染は主として黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により、ときには化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）により引き起こされる。
【０１８９】
「ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群」という用語は、新生児天疱瘡又はリッター病としても知られ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる皮膚科学的な状態を表す。「トリコモナス症」という用語は、膣炎でよく見られる原因となる感染を表す。それは、単細胞の寄生原虫であるトリコモナスヴァギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）により引き起こされる。「膣疾患」（例えば細菌性膣疾患）という用語は、膣の感染を表す（膣炎）。それは、自然に存在する細菌叢の不均衡又は酵母（カンジダ症）若しくはトリコモナスヴァギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（トリコモナス症）の存在により引き起こされる。「小胞性水疱性皮疹」という用語は、細菌、ウイルス、全身性疾患、又は日光若しくは熱への暴露により引き起こされる水疱症を表す。
【０１９０】
本明細書で用いられる「皮膚老化」という用語は、遺伝子の発現若しくは抑制、環境因子（例えば日光への暴露、ＵＶＡ及び／又はＵＶＢへの暴露、喫煙）、内因性因子（例えば内因性の遊離ラジカル生成又は細胞老化）、又は１本以上の小じわ及び／又はしわ、乾燥肌、皮膚炎症、きめの粗い皮膚、黄ばんだ皮膚、毛細血管拡張症、たるんだ皮膚、拡大した毛穴、及びそれらの組み合わせを生む要因間の相互作用から生じる、ヒトの皮膚組織の状態を表す。本明細書で用いられる「内因性の皮膚状態の老化」という用語は、全体にわたる又は部分での年齢による皮膚の老化に由来する皮膚老化状態を表す。本明細書で用いられる「皮膚状態の光老化」という用語は、全体にわたる又は部分での日光及び／又は紫外線（例えばＵＶＲ、ＵＶＡ、ＵＶＢ、及び／又はＵＶＣ）への暴露に由来する皮膚老化状態を表す。
【０１９１】
本明細書で用いられる「皮膚がん」という用語は、悪性及び前がん状態の皮膚がんを表すのに用いられる。したがって、「皮膚がん」という用語は、悪性黒色腫及び悪性黒色腫以外の皮膚がん、日光角化症、基底細胞がん、正常所在扁平上皮がん若しくはボーエン病、上皮内黒色腫並びに他の切除不能ながん腫を包括している。「皮膚がん」という用語は、皮膚の原発がん及び二次がんを表す。これに関して、その用語は、原発皮膚がん又は皮膚に転移する他のがんによる転移巣を包括している。その用語は、以下の限定されない例をさらに含む。皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳房外パジェット病、悪性黒子、皮膚黒色腫転移、及び皮膚リーシュマニア症。
【０１９２】
いくつかの特定の態様では、ＩＬ−１０、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、からなる、又は本質的にからなる封入体の経皮投与によって、本開示の疾患及び／又は状態は処置され得る。いくつかの特定の態様では、ＩＬ−１０、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、からなる、又は本質的にからなる封入体は、美容目的で経皮的に投与され得る。
【０１９３】
ＶＩＩ．封入体の生産及び精製
封入体形状の治療用物質及び美容用物質は、当業者に知られており過度な実験を行うことのない多くの方法で生産され得る。
【０１９４】
いくつかの態様では、目的とする治療用又は美容用タンパク質と封入体誘導ポリペプチドとの遺伝的な融合（又は化学的な結合）により、封入体形成が促進され得る。いくつかの態様では、封入体誘導ポリペプチドはウイルスタンパク質である。特別な態様では、ウイルスタンパク質はカプシドタンパク質である。いくつかの態様では、封入体誘導ポリペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１の５量体を形成するカプシドタンパク質又はその断片を含む。他のＩＢ誘導タンパク質が当業者に知られている。したがって、実質的には発現のため選抜されたいかなる治療用又は美容用タンパク質も封入体として沈殿するよう指向させることができ、そしてその後本開示のように用いられ得る。
【０１９５】
いくつかの特定の態様では、本開示の封入体はＩＬ−１０、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、からなる、又は本質的にからなる。
【０１９６】
ヒト遺伝子構築物の２０〜４０％ほどが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で通常の細胞培養条件のもとで封入体として発現する（Ｓｔｅｖｅｎｓ（２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．８：Ｒ１７７〜１８５）。加えて、より高い誘導温度、ｐＨ制御なしの細胞培養、浸透圧変化、誘導の様式、プロモータの選択、細胞密度、培地、又は、一般的には、そのシステム全体の発現率に影響する因子すべてのような、複数の因子がＩＢ形成の誘因となり得る。
【０１９７】
本開示の封入体は、一般的には目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸塩基配列をＩＢｓを生産し得る適切な発現系に導入し、そしてＩＢｓの生産に適した条件で培養することを含む通常の方法により得ることができる。
【０１９８】
本明細書で用いられる「細菌」という用語は、真正細菌及び古細菌を含む。ある種の態様では、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む真正細菌が、本開示の方法で用いられる。ひとつの態様では、グラム陰性細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が用いられる。腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌の例は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）を含む。
【０１９９】
ひとつの態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が用いられる。ＭＣ４１００、ＤｎａＫ、及びＢＬ２１が、いくつかの態様で用いられる適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。他の適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＧ１５２２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＢＡＡ−１９０７（商標））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＭＣ  １９８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＭ−１１２２９（商標））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃｒｏｏｋｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＭ−８７３９（商標））、ＤＨ５α、ＢＬ２６、ＨＢ１０１、ＪＭ１０７、Ｄ２１、ＪＭ１０３、ＡＢ  １１５７、及び一般的にはイェール大学のＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ又は他のレポジトリから入手可能なすべての株を含む（Ｍａｌｏｙ  ＆  Ｈｕｇｈｅｓ（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４２１：３〜８）。
【０２００】
いくつかの態様では、グラム陽性細菌、例えばラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）が用いられる。ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属する細菌の例は、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、及び連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）を含む（例えば、Ｌｊｕｎｇｈ  ＆  Ｗａｄｓｔｒｏｍ（２００９）「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ」，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  １９０４４５５４１７、Ｃｈａｒａｌａｍｐｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｒａｓｔａｌｌ（２００９）「Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＩＳＢＮ  ０３８７７９０５７８を参照）。いくつかの特別な態様では、その細菌は乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の株である。いくつかの態様では、その乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）はプロテアーゼを欠損している。いくつかの態様では、その乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）はＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９００  ＨｔｒａＡ−ＣｌｐＰ−である。
【０２０１】
これらの例は限定するものではなく例示となるものである。上述の細菌のいかなる変異細胞もまた使用され得る。当然ながら、細菌細胞中での複製単位の複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、若しくはｐＫＮ４１０又は他の商業的に入手可能なベクターのようなよく知られたプラスミドが複製単位を供給するために使われる場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、又はサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種が、宿主として用いられるのに適切であり得る。いくつかの態様では、真菌、例えば、ゲオトリクムカンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、クルイベロミセスマーキシアヌス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、及びピキアファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）が利用され得る。
【０２０２】
本明細書で用いられる「細胞」、「細胞株」、「株」、及び「培養細胞」は可換であり、そのようなすべての呼称は子孫も含む。したがって、治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸が「細胞」又は「細胞株」に導入された場合、その用語は初代の対象細胞、及び継代の回数に関わらずそこから由来する培養物を含む。誘発又は偶発の変異によって、すべての子孫が正確に同一のＤＮＡ含有量であるわけではないことも理解される。元の形質転換細胞がスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異した子孫が含まれる。
【０２０３】
微生物及び細胞株への治療用又は美容用タンパク質をコードする配列の導入は、通常の方法で実施される。要するに、宿主ゲノムと関連して自律複製及びタンパク質発現が可能である発現ベクターが宿主細胞に導入される。適切な発現ベクターの構築物は当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＢａｎｅｙｘ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１１〜４２１を参照。
【０２０４】
適切な細菌を含む原核細胞及び発現ベクターは、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）を通して、商業的に入手可能である。大規模な原核細胞の生育方法、及び特に細菌細胞の培養は当業者によく知られており、これらの方法は本開示に関連して利用され得る。いくつかの態様では、ｐＴＶＰ１ＧＦＰ（Ａｐｒ）、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−ＭＯ２、及びｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｂ０１といったベクター（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）が利用され得る。
【０２０５】
例えば、目的とする治療用又は美容用組換えタンパク質をコードする発現又はクローニング用のベクターにより、原核細胞宿主は遺伝子導入され得、そしてプロモータの誘導、形質転換体の選抜、又は目的とする配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された通常の栄養培地で培養され得る。目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸は、目的とするポリペプチド（複数可）をコードするならば、いかなる供給源からのＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡであってもよい。ポリペプチド及びタンパク質（それらの変種を含む）を微生物宿主で発現するための適切な核酸を選択するための方法はよく知られている。目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸分子は、当業者に知られている様々な方法により調製される。例えば、Ｈｓｐ７０をコードするＤＮＡは、例えばＨｓｐ７０をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、単離及び配列決定され得る。同様に、ＩＬ−１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、又はそれらの断片、変種若しくは誘導体をコードするＤＮＡは、例えばＩＬ−１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ又はＶＥＧＦそれぞれをコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、単離及び配列決定され得る。
【０２０６】
治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、プロモータの制御のもと微生物での発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。この目的で多くのベクターが入手可能であり、そして適切なベクターの選択は、主としてベクターに挿入される核酸の大きさ及びそのベクターで形質転換される特定の宿主細胞によるであろう。各々のベクターは、特定の宿主細胞によって適合する様々な構成要素を含有する。宿主特有の型によって、ベクターの構成要素は一般に、限定されるものではないが、１つ以上の次のものを含む。シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、プロモータ、及び転写終結配列。
【０２０７】
いくつかの特別な態様では、核酸はＩＬ−１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ（融合タンパク質又は異種の部分からなる構築物のような、それらの断片、変種及び誘導体を含む）又はそれらの組み合わせをコードする。いくつかの特別な態様では、封入体中の治療用又は美容用タンパク質は、単一の核酸によりコードされ得る。他の態様では、封入体中の治療用又は美容用タンパク質は、複数の核酸によりコードされ得る（例えばタンパク質はいくつかのサブユニットから構成される場合があり、それらの各々が異なる核酸にコードされ得、そして異なる核酸の各々が同一のベクター又は異なるベクターに挿入され得る）。いくつかの態様では、本開示の治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸はコドンの最適化がなされている。
【０２０８】
一般に、微生物宿主に関連して、宿主細胞と適合する種に由来する複製単位及び制御配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。ベクターは通常、複製部位に加えて形質転換細胞の表現型選抜を可能とするマーカー配列を有する。
【０２０９】
（ｉ）シグナル配列：治療用及び美容用タンパク質は、組換え技術により直接にだけではなく、典型的にはシグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ペプチドを有する融合ポリペプチドとしても生産され得る。選択されたシグナル配列は一般的に、宿主細胞により認識されそして処理されるものである（すなわち、シグナルペプチダーゼによる切断）。異種のシグナル配列ペプチドを認識及び処理しない宿主原核細胞用に、シグナル配列は例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシラーゼ、１ｐｐ、又は熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの一群から選択された原核細胞シグナル配列で代替され得る。
【０２１０】
（ｉｉ）複製構成要素のオリジン：発現ベクターは、１つ以上の選択された宿主細胞で複製することをベクターに可能とさせる核酸配列を含有する。そのような配列は様々な微生物を扱う当業者によく知られている。
【０２１１】
（ｉｉｉ）遺伝子構成要素の選択：通常、発現ベクターは選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞の選択培地での生存又は生育に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を有するベクターにより形質転換されていない宿主細胞は、その培地上で生存し得ない。通常、選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンのような抗生物質若しくは他の毒素に対する抵抗性を付与する、（ｂ）遺伝的マーカー（複数可）の存在によるもの以外の栄養要求性を相補する、又は（ｃ）例えば、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）にとってのＤ−アラニンラセマーゼのような複合培地で供給されない不足している栄養分を供給する、タンパク質をコードする。
【０２１２】
選択の設計の一例は、宿主細胞の生育を抑止する薬剤の利用である。この場合、目的とする核酸で首尾よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるポリペプチドを生産し、その結果その選択培養下で生存する。そのような優性選択の例はネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＆  Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７〜３４１）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２〜２７）又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０〜４１３）といった薬剤の利用である。上述の３例は、適切な薬剤、それぞれＧ４１８若しくはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシン、に対する抵抗性を付与するために真核生物の制御のもとで細菌遺伝子を使用する。
【０２１３】
（ｉｖ）プロモータの構成要素：目的とする治療用又は美容用組換えタンパク質の生産のための発現ベクターは、宿主により認識され、そして目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードする核酸に動作可能な形で連結された適切なプロモータを含有する。原核生物宿主での使用に適切なプロモータは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１７〜６２４、Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４〜４８）、アラビノースプロモータ系（Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７７１６〜７７２８）、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７〜７４、及び欧州特許番号：欧州特許第３６７７６号）及びｔａｃプロモータ（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１〜２５）のようなハイブリッドプロモータを含む。ひとつの態様では、組換え遺伝子はイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔｒｃ（ｔｒｐ−ｌａｃ）プロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７〜１７８）の制御のもとで発現し得る。しかしながら、知られている他のプロモータが適している。それらの塩基配列は公開されており、それにより目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡに、いかなる必要な制限酵素切断部位をも与えるリンカー又はアダプタを用い、それらを動作可能な形で連結することが当業者に可能となる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９〜８１）。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及び上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．も参照。
【０２１４】
一般的に、細菌の系で用いるプロモータは、目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードするＤＮＡに動作可能な形で連結されたシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列も含有する。プロモータは、細菌由来ＤＮＡから制限酵素消化により取り出すことができ、そして目的とするＤＮＡを有するベクターへ挿入することができる。
【０２１５】
（ｖ）ベクターの構築及び解析：上に列挙された１つ以上の構成要素を含有する適切なベクターの構築には、標準の連結技術を使用する。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、求めるプラスミドを生成するのに望ましい形で、切断、適合、及び再連結される。構築されたプラスミドが正しい配列を有することを確認する解析のために、成功した形質転換体は抗生物質耐性により選択される。形質転換体のプラスミドは調製され、制限酵素消化により解析され、及び／又はＳａｎｇｅｒらの方法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３〜５４６７）若しくはＭｅｓｓｉｎｇら（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：３０９〜２１）、又はＭａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９〜５６０）により塩基配列決定される。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及び上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．も参照。
【０２１６】
次に、目的とする治療用又は美容用組換えタンパク質をコードする核酸は、宿主細胞に導入され得る。通常、これは宿主細胞を上述の発現ベクターで形質転換し、そして様々なプロモータの誘導のために適切に改変された通常の栄養培地で培養することによって行われる。
【０２１７】
（ｖｉ）宿主細胞の培養：前に論じられたように、適切な細胞は当業者によく知られている。治療用又は美容用組換えタンパク質を封入体形状で又はペリプラズム若しくは細胞内の空間で豊富に発現する宿主細胞が通常用いられる。治療用タンパク質の生産に用いられる原核細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））に広く記載されている培地を含む、当業者に知られていて選択された宿主細胞の培養に適した培地で生育する。細菌に適した培地は、限定されるものではないが、必要な補足栄養分を足した、ルリア・ベルターニ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈ）、ＡＰ５培地、ニュートリエントブロス（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ）、ナイトハルト最少培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ'ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）、及びＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．最少若しくは完全培地を含む。ある種の態様では、培地は、発現ベクターの構成に基づいて、その発現ベクターを有する原核細胞の生育を選択的に可能とするために選ばれる選択薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の生育のためにアンピシリンが培地に加えられる。炭素源、窒素源、及び無機リン酸源に加えて、いかなる必要な補足成分も単独又は他の補足成分若しくは複合窒素源のような培地との混合物として加えられ適切な濃度で含まれ得る。必要に応じて、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択された１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０２１８】
原核宿主細胞は適した温度で培養され得る。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の生育には、温度の範囲は例えば約２０℃から約３９℃、若しくは約２５℃から約３７℃、又は約３０℃である。プロモータが誘導性の場合には、目的とする治療用又は美容用タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するために、通常、誘導を起こすために細胞が特定の吸光度を示すまで、例えば高細胞密度工程を用い誘導が開始する（例えば誘導物質の添加、培地成分の消費、などにより）Ａ５５０で約２００まで、培養される。
【０２１９】
いかなる必要な補足成分も、単独又は他の補足成分若しくは複合窒素源のような培地との混合物として加えられ当業者に知られていると考えられる適切な濃度で含まれ得る。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じておよそ５から９までのいかなるｐＨでもあり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の最適なｐＨは、例えば約６．８から約７．４まで、又は約７．０である。
【０２２０】
ＩＢｓは、治療用又は美容用タンパク質を発現する宿主細胞から標準の技術のいずれかによって単離され得る。例えば、不溶性の治療用又は美容用組換えタンパク質は、ほとんどの宿主タンパク質を可溶化するものの、対象とする治療用若しくは美容用タンパク質は本質的に不溶である、適切なイオン強度の緩衝液に細胞をさらすことにより、又は封入体をペリプラズム若しくは細胞内の空間から遊離し、そして例えば遠心分離により、それらを回収するよう細胞を破砕することにより、適切な単離緩衝液に単離される。この技術はよく知られており、例えば米国特許第４，５１１，５０３号に記載されている。Ｋｌｅｉｄらは、均質化に続く遠心分離によるＩＢｓの精製を開示している（Ｋｌｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｏｃ．Ｉｎｄｕｓｔｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：２１７〜２３５）。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４１：３〜１３も参照。
【０２２１】
米国特許第５，４１０，０２６号は、ＩＢｓからタンパク質を回収するための通常の方法を記述しており、以下のように要約される。原核細胞が適切な緩衝液に懸濁される。通常、緩衝液はｐＨ  ５から９までの間若しくは約６から８までの間に緩衝するのに適した緩衝剤並びに塩からなる。塩化ナトリウムを含むいかなる適切な塩も、緩衝溶液の十分なイオン強度を保つために有益である。通常、イオン強度は約０．０１から２Ｍまで、又は０．１から０．２Ｍまでが使用される。この緩衝液に懸濁されると、細胞は一般に使用される技術、例えば機械的な方法、例えばホモジナイザ（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ  ｐｒｅｓｓ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、又はＮｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ）、フレンチプレス、ビーズミル、若しくは超音波ディスラプタ（プローブ型若しくは槽型）、又は化学的若しくは酵素による方法のような技術を用いて破砕又は溶解される。
【０２２２】
化学的又は酵素による細胞破砕方法の例は、細菌細胞壁を溶解するためにリゾチームの利用を伴うスフェロプラスト化（Ｎｅｕ  ＆  Ｈｅｐｐｅｌ（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７：２１５〜１９）並びにポリペプチドを遊離するための高浸透圧溶液による及び低浸透圧の冷水洗浄による生細胞の処理を伴う浸透ショック（Ｎｅｕ  ＆  Ｈｅｐｐｅｌ（１９６５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０：３６８５〜３６９２）を含む。超音波処理は、分析規模の培養液量に含まれる細菌の破砕に一般的に用いられる。より大きな規模では、高圧ホモジナイゼーションが通常用いられる。
【０２２３】
細胞が破砕された後、一般的には懸濁液は標準の遠心分離機で、通常５００程度から２５，０００×ｇ、例えばひとつの態様では、約１５，０００×ｇが用いられるが、低速度で本質的にすべての不溶性タンパク質がペレットになるのに十分な時間遠心分離される。この時間は、遠心分離される容量と遠心分離機の設計に基づいて単純に決定され得る。通常、約１０分間から０．５時間までがＩＢｓのペレット化に十分である。ひとつの態様では、懸濁液は１５，０００×ｇで１５分間遠心分離される。生じたペレットは本質的にすべてのＩＢｓを含有している。
【０２２４】
細胞破砕工程が完全でない場合、ペレットは無傷の細胞又は破砕細胞の断片も含有し得る。細胞破砕の完全性は、少量のペレットの同じ緩衝溶液への再懸濁及び位相差顕微鏡による懸濁液の検査により評価し得る。破壊された細胞断片又は細胞全体の存在は、断片若しくは細胞並びに他の汚染物質を取り除くためにさらなる超音波処理又は他の破砕方法が必要であることを示す。そのようなさらなる破砕の後、必要があれば懸濁液は再度遠心分離され、そしてペレットが回収され、再懸濁及び再検査され得る。その工程は、破壊された細胞断片がペレット物質中に存在しないことが視覚的な検査により明らかになるまで又はさらなる処理が得られたペレットの大きさを減じなくなるまで、繰り返され得る。
【０２２５】
治療用又は美容用物質を含む封入体の組換え技術による生産のための上述の工程は、ＩＢｓが細胞内又はペリプラズムの空間にあるかどうかに関わらず使用され得る。ひとつの態様では、本明細書中で示されるＩＢｓの生産及び単離の条件は、ＶＰ１のアミノ末端に融合されたＧＦＰを有するＩＢｓ及びＨｓｐ７０シャペロンを有するＩＢｓに向けられている。しかしながら、その工程及び手順は少しの改変で通常の組換えタンパク質に適用可能である。したがって、本開示と同じ工程、方法、及び条件は、通常、美容的及び／又は治療的に有効であり、ポリペプチドがＩＬ−１０及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ及び／又はそれらの断片、変種、若しくは誘導体を含む、からなる、又は本質的にからなるような、ポリペプチドを含むＩＢｓの生産、単離、及び特性評価（例えば生物物理学的及び／又は薬理学的）に適用可能である。
【０２２６】
ある種の態様では、その工程及び手順は治療用又は美容用タンパク質を有するＩＢｓの製造若しくは工業規模の生産並びに精製に適用可能である。
【０２２７】
ＩＢｓ中の不溶性の治療用又は美容用タンパク質が、ＩＢｓを可溶化又は希釈しタンパク質を再構成することによって、生物学的に活性のある形で回収され得ることは、当業者に知られている（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６３：２５９〜２８２、Ｃａｂｒｉｔａ  ＆  Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １０：３１〜５０を参照）。そして、これらの可溶化されそして再構成されたタンパク質は、治療又は美容目的の使用のために投与され得る。本開示の治療用及び美容用タンパク質の局所投与方法は、目的とする治療用又は美容用タンパク質がＩＢ形状で投与されるものであり、そのＩＢが皮膚に浸透する点で当業者に知られている方法とは異なる。このように、可溶性であり生理学的活性のあるタンパク質を得るための高価で時間のかかる可溶化及び再構成の工程は必要ではない。
【０２２８】
治療用又は美容用ペプチドの合成は、例えばペプチド固相合成法（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｊ．Ｄ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．、Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  Ｍ．ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（Ｆｌａ．，ＵＳＡ））、溶液合成法、固相合成法及び溶液合成法の組み合わせ又は酵素法（Ｋｕｌｌｍａｎｎ  Ｗ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，８２３４〜８２３８）の適用のような当業者に知られている通常の方法に従って実施され得る。これらのペプチドは、求める配列の生産を目的とした遺伝子工学により改変された又は改変されていない細菌株の発酵によって得られ得る。
【０２２９】
教科書、雑誌、論文、Ｇｅｎｂａｎｋ又は他の配列データベースの登録データ、公開された出願特許及び出願特許のような本明細書で言及したすべての出版物は、個々の出版物又は特許が具体的かつ個々に参照により援用されることが示された場合と同程度に本明細書に参照により援用される。
【実施例】
【０２３０】
実施例１
ＧＦＰ封入体は、モデル表皮試料に深く浸透し得る。
１．目的：
本研究の目的は、封入体試料の表皮浸透能力を評価することであった。タンパク質を封入体誘導ペプチドと融合することによって、通常可溶性であるタンパク質の封入体が生成した。封入体の浸透は、ヒト皮膚の代用として皮膚の治療法及び美容品の開発に当業者に広く用いられている再構成ヒト表皮（ＲＨＥ）モデルシステムである、ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）ＲＨＥ−ＥＰＩ／００１、を用い評価された。
【０２３１】
２．材料及び方法
２．１．生産物の評価：３つの試料が評価された。（１）Ｍ００３７  ＧＦＰと表示された、可溶性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むポジティブコントロール試料（Ｔｒｉｓ緩衝液５０μＬ中に５０μｇ）、（２）Ｍ００３７  ＣＩと表示された、ＧＦＰの細菌封入体を含む試料（ペレット形状で５０μｇ）、及び（３）Ｍ００３７  ＣＴＲＬと表示された、ネガティブコントロール試料（培養培地）。
【０２３２】
２．２．用いられた材料：再構成ヒト表皮（ＲＨＥ／ＥＰＩ／００１）インサート、ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬにより供給される生育培養培地及び維持培養培地、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、解剖用メス、凍結チューブグリッパー、試料を扱うための容器、イソペンタン（２−メチルブタン）、ドライアイス／液体窒素、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物、標準サイズのクリオモルド、ゼラチン化試料ホルダ及びカバーグラス、蛍光顕微鏡用封入剤。
【０２３３】
２．３．設備：細胞培養用一般設備（炭酸ガス培養器、クリーンベンチ、顕微鏡、遠心機）、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０顕微鏡デジタルカメラに連結したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６２自動蛍光顕微鏡、Ｌｅｉｃａ双眼蛍光顕微鏡。
【０２３４】
２．４．方法
２．４．１．再構成皮膚及び生産物の適用：ＲＨＥ／ＥＰＩインサートは、ＳＴＲＡＴＩＣＥＬＬ（登録商標）により提供された使用説明書に厳密に従い処理された。３７℃、２４時間の安定化期間の後、周囲３７℃、５％二酸化炭素及び湿潤条件で、生産物試料は以下のように調整し加えられた。
・Ｍ００３７  ＧＦＰ：Ｔｒｉｓ緩衝液５０μＬに維持培地２５μＬを加えた溶液中に５０μｇ  ＧＦＰ。
・Ｍ００３７  ＣＩ：５０μｇ  ＣＩと７５μＬ維持培地。
・Ｍ００３７  ＣＴＲＬ：７５μＬ維持培地。
【０２３５】
すべての生産物が加えられた後、試料は２４時間、３７℃、５％二酸化炭素条件下で培養された。培養期間後、試料は凍結のために処理された。
【０２３６】
２．４．２．マウンティング及び凍結
２４時間の培養期間の後、凍結のための試料処理の前に、試料は蛍光顕微鏡を用いて視覚的に評価された（図１）。その後、試料は無傷性を最大限確実にし、試料の質低下の可能性を減ずるために、急速凍結法（超急速凍結）を用いて処理された。実施した急速凍結の手順の詳細は以下のとおりである。
【０２３７】
以下のような急速凍結の調製及び試料凍結の手順が用いられた。イソペンタンは、容器を液体窒素又はドライアイス中につりさげることにより冷却された。イソペンタンは、ビーズが形成されて液体が濃く曇ってみえたとき、十分に冷却されたと考えられた。予め札をつけた及び／又は識別できるようにしたクリオモルド上にＯＣＴの薄い層が入れられた。培養液が再構成皮膚インサートから取り除かれた。そして解剖用メスを用いインサートから膜が除かれ、そして再構成皮膚試料は４℃のＰＢＳの入ったペトリ皿に置床された。各々の試料は、ＯＣＴ剤に入れられる直前にろ紙片上で軽く脱水された（なんらかの様式で表皮に紙が貼り付くことを注意深く回避しながら）。各々のインサートは重複試料を準備するために２つに分けられた。再構成皮膚試料は、それぞれの皮膚層がモルドの底に向くように（すなわち表皮はひとつの辺に向いた）、クリオモルド上のＯＣＴ層の上に置かれた。クライオスタットを用いて最適な組織切片を得るためには、組織をクリオモルド上に正しく置くことが重要であった。置床した組織断片はＯＣＴで覆われた。適切な位置に組織を置くため及び気泡の形成を防止するために、解剖用メス又はピペットのチップが用いられた。ピンセットを用いて、予冷されたイソペンタン内にクリオモルドが置床された。ひとたび試料が凍結されたら残りの試料が処理される間、クリオモルドはドライアイス内に保持された。試料は−８０℃の冷凍庫で保存された。運搬するときは液体窒素又はドライアイスが用いられた。
【０２３８】
２．４．３．切片の調製及びマウンティング
試料凍結の後、ＬＥＩＣＡ  ＣＭ３０５０  Ｓクライオスタットを用いて、厚さ２０μｍの切片が得られた。切片はゼラチン化試料ホルダ上に置床された。その後、蛍光検出用のマウンティング剤（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ）が、試料の半永久的マウンティングに用いられた。試料は光を避け４℃で保存された。
【０２３９】
２．４．４．観察及び画像取得
観察は、顕微鏡デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０）に連結した自動顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１）で、２０倍プラン・アクロマート対物レンズを用いて行われた。画像名は、取得番号（相対的な番号）、倍率、及び場合により露光時間を示す名称で表した。蛍光像に加えて蛍光シグナルの位置がわかるよう、各々の試料について透過光による像も取得された。
【０２４０】
蛍光像の取得は、自動モードを使わずに露光時間を３から４秒までに調節して手動モードで行われた。したがって、試料間の蛍光強度は比較可能であった。いくつかの可溶性ＧＦＰ又はコントロールの試料像では、常に画像の名称に示すが、露光を３０秒まで長くした。
【０２４１】
３．試料の長期保存
実験完了後、試料は−８０℃で長期保存された（２年まで）。
【０２４２】
４．結果
４．１．３つの試料の蛍光の比較
図２のＡ、Ｂ、及びＣは、３試料の相対的な蛍光強度を示す。すなわち、コントロール（ＣＴＲＬ）、可溶性ＧＦＰ（ＧＦＰ）、及びＧＦＰ封入体（ＣＩ）。それぞれ倍率は２０倍であった。露光時間はコントロール及び可溶性ＧＦＰ試料が４秒で、封入体試料は２．５秒であった。各々の試料では露光時間が同じであったので、画像に現れた蛍光強度の差は、実際の強度の差に対応している。図２のＤ、Ｅ、及びＦは、それぞれＡ、Ｂ、及びＣの試料に対応する透過型顕微鏡像を示す。各々の透過光による像は、人工表皮モデルの成長に用いられた膜（「ｍ」という文字で表示された）の位置及び角質層の位置、すなわち皮膚最外層（「ＳＣ」と示されている）を示した。
【０２４３】
４．２．Ｍ００３７−ＣＩ試料（封入体）
図３及び図４は、Ｍ００３７−ＣＩ試料、すなわち封入体形状のＧＦＰ、から得られた蛍光像のいくつかの例を提供する。ほとんどの観察で、蛍光は角質層（ＳＣ）内、又は表皮の外層内の蛍光凝集体に位置していた。他の染色又は標識を行っていなかったので、封入体が角質層内にあるのか又は表皮に深く浸透したのかを把握することは困難であった。浸透の程度は、染色の組み合わせ（Ｈ＆Ｅ、Ｃｏｌ７、など）及び共焦点顕微鏡による観察を利用することで把握されるであろう。いくつかのＭ００３７−ＣＩ試料では、いくらかのＳＣ断片が分離し始めていた（例えば図３及び図４参照）。このように、それらの場合では、封入体が主として角質層内にあるのか又は表皮深くに浸透したのかを把握することは困難であった。
【０２４４】
いくつかの切片では、標識は表皮深くに観察された。切片の厚さが２０μｍなので、通常の顕微鏡では十分に明瞭な観察像は得られなかった。図５は、異なる焦点で撮られた同一視野の３つの像の最大強度に対応する再構成画像を示す。
【０２４５】
４．３．Ｍ００３７−ＧＦＰ試料（可溶性ＧＦＰ）
図６（Ａ及びＢ）は、Ｍ００３７−ＧＦＰ試料の蛍光像を示す。大部分の観察で、Ｍ００３７−ＣＩ（封入体）試料で観察されたものより蛍光ははるかに弱く、同じ条件で像が撮られた場合蛍光はほとんど検出されなかった。しかし、いくらかの蛍光シグナルがあり、露光時間を３０秒に延ばすといくつかの凝集体が観察できた。にもかかわらず、蛍光シグナルの分布は、ＧＦＰ封入体と培養された試料で観察されたシグナルより顕著に均一であった。いくつかの試料では、４秒の露光時間で微弱ではあるが、より強い蛍光強度が検出された（結果未記載）。
【０２４６】
４．４．Ｍ００３７−ＣＴＲＬ試料（コントロール）
図７は、コントロール試料Ｍ００３７−ＣＴＲＬに対応する蛍光像を示す。すべての観察で、検出された蛍光はＭ０００３７−ＣＩ（ＧＦＰ封入体）又はＭ００３７−ＧＦＰ（可溶性ＧＦＰ）試料よりはるかに弱く、ほとんど存在しなかった。露光時間を３０秒にすること及び絞りを最大に開くことで、試料全体にわたり均一に分布しているので自家蛍光又は背景の蛍光と考えられるいくらかの微弱な蛍光を検出することは可能であった。
【０２４７】
４．５．共焦点顕微鏡により得られた画像
Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点顕微鏡を用いて得られた一連の切片像（蛍光像）及び／又は位相差像の場合は透過光構成を用いて得られた同じ視野の像により、３次元再構成（最大値投影処理）が行われた。画像は２０μｍの切片を用い、上述の方法に従って得られた。
【０２４８】
図８（倍率２０倍、両方の画像とも同一の撮影条件）に示すように、試料の蛍光強度並びにシグナルの形及び分布に明確な相違があった。（Ａ）Ｍ００３７−ＣＩ試料（封入体）及び（Ｂ）Ｍ０００３７−ＧＦＰ（可溶性ＧＦＰ）。
【０２４９】
図９の例に示すように、大部分の観察でＭ００３７−ＣＩ試料の蛍光シグナルは、角質層（ＳＣ）内、表皮の最外層、並びに多くの場合では加えて中間及び深い領域にある蛍光凝集体として観察された。これに対し、図１０にある例に示すように、ほとんどの観察でＭ００３７−ＧＦＰ試料の蛍光は分散しており、もっぱら角質層領域の中に存在した。
【０２５０】
これらの観察は、微小粒子で不溶な形状の封入体が表皮に浸透することが可能であることを明確に示した。さらに、封入体が表皮内の中間及び深い場所でも観察され、無傷の封入体の浸透は表面に限られなかった。
【０２５１】
実施例２
ＧＦＰ封入体の生産及び特性評価
一般に、本明細書の開示による美容用及び／又は治療用物質のために用いられるべき封入体は、本実施例又は当業者に知られている方法に従って生産及び特性評価され得る。例えば、米国特許出願第１３／１４２，２９５号（米国特許公開第２０１１／０２６８７７３号として公開）、及び米国特許出願第１３／３１９，７７２号（米国特許公開第２０１２／０１４８５２９号として公開）を参照、加えてそれら２つの米国特許出願で引用されている参考文献のすべては、それらの全部分について本明細書に参照により援用される。
【０２５２】
封入体の生産：封入体（ＩＢｓ）は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＣ４１００株（タンパク質折り畳み及び分解に関して野生型（ＷＴ）、ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９  ｒｐｓＬ１５０  ｒｅｌＡ１  ｆｌｂＢ５３０１  ｄｅｏＣ１  ｐｔｓＦ２５  ｒｂｓＲ）及びそれに由来する株、以下ＤｎａＫ株と表すＪＧＴ２０（主要なシャペロンＤｎａＫ欠損、ｄｎａｋ７５６  ｔｈｒ：Ｔｎ１０）で生産された。これらの株は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の５量体を形成するカプシドタンパク質であるＶＰ１とアミノ末端で融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５：６３７〜６４２）をコードする発現ベクターｐＴＶＰ１ＧＦＰ（ＡｐＲ）（Ｇａｒｃｉａ−Ｆｒｕｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．４：２７）を用い形質転換された。この高度に疎水性であるウイルスタンパク質は、封入体として融合タンパク質の沈殿を促す（Ｄｏｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３：１９３〜２０１）。同様の構築物、ＶＰ１ＬＡＣは、前述のβ−ガラクトシダーゼとの融合物をコードする（Ｇａｒｃｉａ−Ｆｒｕｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．４：２７）。組換え遺伝子はイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔｒｃプロモータの制御のもとで発現された。細菌は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したルリア・ベルターニ（ＬＢ）富栄養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２８７６０  Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）で培養され、そして組換え遺伝子の発現は１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導された。封入体はＩＰＴＧ添加１時間後に検出可能である。
【０２５３】
封入体の精製：細菌培養液２００ｍＬの試料は、４℃で５，０００ｇ、５分間遠心分離され、５０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁された。氷に覆われた試料は、Ｂｒａｕｎ  ＬａｂｓｏｎｉｃＵ  ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用い、０．５秒サイクル、振幅４０％で２５から４０分間の超音波処理が行われた。超音波処理直後に、２８μＬの１００ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び２３μＬのリゾチームが試料に加えられ、その後３７℃で４５分間攪拌しながら保温した。その後、４０μＬのノニデットＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ−４０））が加えられ、混合物は４℃で１時間攪拌された。攪拌しながら３７℃で４５分間、１２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）及び１２０μＬの１Ｍ硫酸マグネシウムで処理することによりＤＮＡが取り除かれた。最終的に、試料は４℃で１５０００ｇ、１５分間遠心分離され、純粋な封入体を含有するペレットは０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶解緩衝液で洗浄され、解析されるまで−２０℃で保存された。
【０２５４】
細菌及び封入体の顕微鏡解析：試料はＬｅｉｃａ  ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、４８８ｎｍで励起した後に、アクロマート対物レンズ（ズーム８；１，０２４×１，０２４ピクセル）を用い解析され（６３倍（ＮＡ  １．４油浸））、画像は５００から６００ｎｍまでの間の発光波長で記録された。蛍光封入体を生産する細菌細胞の解析のために、ＩＰＴＧによる誘導１、２又は３時間後にとられた試料は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．２％のホルムアルデヒドで固定され、用いられる時まで４℃で保存された。単離された封入体は２０ｍＬのＰＢＳに再懸濁された。
【０２５５】
安定性の解析：５時間培養のＤｎａＫ−細胞で得られたＩＢｓは、１０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び６０ｇ／Ｌのショ糖を含むＰＢＳで、４０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下希釈され、一部がそれぞれ異なる温度で保温された（３７℃、２５℃又は４℃）。試料はその時々に、蛍光の測定まで−８０℃で凍結された。
【０２５６】
蛍光は、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計（Ｖａｒｉａｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）で、励起波長４５０ｎｍ、蛍光発光５１０ｎｍにより解析された。結果は、十分に安定であった−８０℃で保存されていたコントロール試料に対する残存活性又は蛍光の割合として表された。もう一組の試料は、Ｔｅｌｓｔａｒ（Ｔｅｒｒａｓｓａ，Ｓｐａｉｎ）のＣｒｙｄｏｓ−８０凍結乾燥器で凍結乾燥され、４℃又は２５℃で解析まで保存された。
【０２５７】
共焦点レーザー顕微鏡：ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞株；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２（商標））及びＮＩＨ３Ｔ３（繊維芽細胞株；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５８（商標））培養細胞は、２μＭ、５μＭ及び１０μＭの異なる濃度のＶＰ１ＧＦＰ封入体を加える２４時間前に、７０％密度でガラス板（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）に植え付けられた。封入体添加４時間後に、生細胞はスペクトル共焦点Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  ＡＯＢＳ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、アクロマート対物レンズ（６３倍（ＮＡ  １．４油浸））により調査された。核及び細胞膜の標識のために、細胞は５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及び５μｇ／ｍＬのＣｅｌｌＭａｓｋ（両方ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，ＵＳＡ）と、それぞれ室温で５分間保温され、共焦点の検出の前に２度洗浄された。核は４０５ｎｍのダイオードレーザビームで励起され４１４〜４６１ｎｍ（青チャンネル）で検出された。細胞膜は６３３ｎｍのヘリウムネオンレーザの励起により検出され蛍光は６５６〜７８９ｎｍ（遠赤チャンネル）で検出された。最終的に、４８８ｎｍのアルゴンレーザが、ＶＰ１ＧＦＰ封入体の像を得るために用いられた（緑チャンネル、検出＝５００〜５３７ｎｍ）。
【０２５８】
実施例３
Ｈｓｐ７０封入体の生産及び特性評価
ある場合には、封入体は美容用及び治療用、両方を目的として用いられ得る。Ｈｓｐ７０又はＨｓｐ３８などは、シャペロンという種のタンパク質に属する。ヒトＨｓｐ７０シャペロンは、治療的な価値がある他の活性（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：２５１８〜２５２７）と共に、細胞アポトーシスの阻害剤である可能性がある（Ｇａｍｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２：５７９〜５８４）。皮膚は数多くのストレス原因物質に対して体を防護する最初のバリアである。細胞のストレス応答は、環境からの攻撃に対する年齢に伴う細胞の防護低下を減じることが報告されているＨｓｐの発現誘導を含む。皮膚のＨｓｐ７０レベルの増加は、皮膚が高温及び低温ストレス条件にある場合、予防美容用品として、ＵＶＢ誘導細胞死に対する光防護として、細胞における乾燥からの防護において、又は多数のストレス原因により引き起こされる障害の防止のために用いられ得る。例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：５８４８〜５８５８、Ｊｏｎａｋ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｓｃｉ．２８：２３３〜４１、Ｌａｐｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６：１２９１〜３０１、Ｍａｙｔｉｎ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３１８９〜９６、Ｂｉｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２８：５３７〜４４、Ｆａｒｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８４６〜５０、Ｇａｒｍｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７：１２９０〜５を参照。
【０２５９】
封入体の生産：ヒスチジン−６精製タグがＮ末端に融合されたヒトＨｓｐ７０タンパク質（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ヒートショック７０ｋＤタンパク質１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＭ００５３４６；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＧＩ：１６７４６６１７２）を発現するようにした、Ｎ−Ｈｉｓタグ、Ｔ７プロモータ、及びアンピシリン耐性遺伝子を有する市販の発現ベクターｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｂ０１（ＯｍｉｃｓＬｉｎｋ（商標）ＯＲＦ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｃｌｏｎｅカタログ番号ＥＸ−Ｒ００６８−Ｂ１、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）で、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株で、実施例２に記載されたような以下の手順に従って、適合するよう改変しつつ、封入体は生産される。細菌細胞は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ富栄養培地で培養され、そして１ｍＭのＩＰＴＧ添加により組換え遺伝子の発現が誘導される。封入体はＩＰＴＧ添加の１時間後に検出可能である。Ｈｓｐ７０の凝集により形成された封入体は、実施例２に記載されたような手順に従い精製される。
【０２６０】
アポトーシスの評価：細胞のアポトーシスは、例えばＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ５７（例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ検出キット（Ｒｏｃｈｅ））による蛍光評価を用いて測定される。再構成表皮試料は、Ｈｓｐ７０封入体の有無それぞれのもとで、アポトーシスの起因となることが知られているストレス原因物質（例えば化成品）又はストレス環境の条件（例えば低温、高温、紫外線、乾燥）にさらされる。表皮試料は、ストレス原因物質又はストレス環境の条件の適用の前、同時に、又は続いてＨｓｐ７０封入体で処置され得る。封入体の皮膚細胞への考え得る有害な影響を検出する目的で、コントロールとして、ストレス原因物質又はストレス環境条件なしで同量の封入体が表皮試料に加えられる。一定時間の培養の後、皮膚細胞は製造者に推奨される方法でＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色され、蛍光強度が測定される。
【０２６１】
結果：Ｈｓｐ７０封入体を加えた表皮試料の培養は、封入体形状で局所投与された場合に、不溶性の封入体中に含有されるヒトＨｓｐ７０が天然の生物学的活性を発揮できるかどうか、及びその封入体が細胞死へと導くアポトーシス現象を顕著に抑制することができるかどうかを示すであろう。その結果は、アポトーシス誘導条件にさらされ、暴露前、同時、又はその後にＨｓｐ７０封入体で処置された皮膚細胞が生存能力を維持できるのかどうかを示すであろう。さらに、これらの観察は、不溶の封入体形状で生産されたタンパク質を局所投与できるかどうか、これらのタンパク質が局所投与後も生物学的に活性を有するかどうか、及び局所投与後の生物学的活性が治療上有効かどうかを示す。その結果は、局所投与されたときに封入体が治療上の価値を有するナノ粒子であるかどうか、並びに、それらが機械的及び機能的に安定であり十分に生体に適合するかどうかも加えて示す。
【０２６２】
実施例４
カタラーゼ封入体
スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、及び過酸化水素のような過酸化活性酸素種（ＲＯＳ）は、数多くの構造タンパク質及び機能タンパク質（酵素）、脂質膜、組織の多糖、並びに遺伝物質（ＤＮＡ）に有害な影響を引き起こす。皮膚でこれらの障害に対し防護すると考えられる分子は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＯ）、及びカタラーゼのような特定の酵素を含む。カタラーゼ及びＳＯＤのような外生供給源からの利用可能な酵素を美容処方において安定化するのは、通常容易ではない。
【０２６３】
美容目的の使用における外生ＳＯＤの適用については、例えばＭｉｙａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８９：１１１〜１１２、及びＦｉｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６：１１６〜１２１に記載されている。好熱微生物から得られた同様の酵素を、熱及び紫外線安定美容品として使用することも当業者に知られている（例えば、Ｍａｓ−Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌ  １１７：２２〜３０、Ｌｉｎｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＩＦＳＣＣ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  ５：１９５〜２００を参照）。米国特許第４１２９６４４号（スーパーオキシドジスムターゼを含む化粧組成物による皮膚及び毛髪の防護を開示）、米国特許第５１４５６４４号（過酸化水素破壊組成並びにその作製及び使用法を開示）、又は欧州特許公開番号：欧州特許公開第１００４２８９（Ａ２）号（カタラーゼを含む美容用及び皮膚防護用組成物を開示）も参照。
【０２６４】
近年、カタラーゼも美容業界で使用され始めている。いくつかの顔のマスク処置では、表皮の上層で細胞への酸素添加を促進する目的で、顔の上で酵素と過酸化水素を組み合わせる。カタラーゼレベルが低下すると体で自然に生産された過酸化水素が毛髪を脱色するので、カタラーゼレベルの低下はヒトの毛髪の白髪化の過程においても要因となる。したがって、例えばカタラーゼは白髪化に対する美容上の処置に組み込まれ得る。
【０２６５】
カタラーゼ封入体の生産：２０ｍＬの培養試料が、４℃で５，０００ｇ、５分間の遠心分離により収集され、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ  ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁され、−８０℃で凍結された。融解後、１００μＬの１００ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（又は他のタンパク質分解酵素阻害剤）及び４００μＬの５０ｍｇ／ｍＬリゾチームが添加され、試料は３７℃で２時間保温された。保温の後、１００μＬの０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む同じ溶解緩衝液が加えられ、室温で１時間保持された。そして試料は、超音波又は高圧ホモジナイゼーションのような他の破砕方法を用いて破砕された。その後、５μＬのＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ−４０）が加えられ、試料は４℃で１時間保持された。そして、１５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）及び１５μＬの１Ｍ硫酸マグネシウムで、３７℃、４５分間処理することによりＤＮＡが取り除かれた。最終的に試料は４℃で１５０００×ｇ、１５分間遠心分離され、純粋なカタラーゼ封入体を含有するペレットは０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む同じ溶解緩衝液１ｍＬで１度洗浄された。最後の４℃、１５０００×ｇ、１５分間の遠心分離の後、ペレットは解析まで−８０℃で保存された。すべての保温／保持は攪拌しながら行われた。本手順で用いられた量及び保温／保持時間は、より多量の試料が使用される場合には規模が拡大された。
【０２６６】
封入体中のカタラーゼに薬理学的活性があるかどうかを測定するための予備実験では、カタラーゼ封入体は試験管内で神経モデルシステムに投与された。モデルシステムではカタラーゼ封入体に酵素的活性があり、神経保護作用があることが明らかとなった（結果未記載）。
【０２６７】
結果：カタラーゼ封入体を加えた表皮試料の培養は、封入体形状で局所投与された場合に、不溶性の封入体中に含有されるカタラーゼが天然の生物学的活性を発揮できるかどうか、及びその封入体が活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化障害から細胞を顕著に防護できるかどうかを示すであろう。その結果は、活性酸素種にさらされ、暴露前、同時、又はその後にカタラーゼ封入体で処置された皮膚細胞が生存能力を維持できるのかどうかを示すであろう。
【０２６８】
実施例５
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）封入体
ヒトサイトカイン産生抑制因子（ＣＳＩＦ）としても知られるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０又はＩＬ１０）は、抗炎症サイトカインである。ＩＬ−１０のひとつの役割は、進行中の炎症過程による壊死の危険を減少することにより皮膚への重度の障害を防止することであり得る。例えば、Ｇｒｉｍｂａｌｄｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ  ８：１０９５〜１１０４（肥満細胞由来インターロイキン−１０が皮膚の接触性皮膚炎の病状、例えば、ポイズンアイビー又はウルシ、並びに紫外線Ｂの緩照射に対する反応を限定することを開示）を参照。したがって、ＩＬ−１０は皮膚炎症を抑えるための局所用組成物に組み込まれ得る。
【０２６９】
封入体の生産：２０ｍＬの培養試料が、４℃で５，０００×ｇ、５分間の遠心分離により収集され、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁され、−８０℃で凍結された。融解後、１００μＬの１００ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（又は他のタンパク質分解酵素阻害剤）及び４００μＬの５０ｍｇ／ｍＬリゾチームが添加され、試料は３７℃で２時間保温された。保温の後、１００μＬの０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む同じ溶解緩衝液が加えられ、室温で１時間保持された。そして試料は、超音波又は高圧ホモジナイゼーションのような他の破砕方法を用いて破砕された。その後、５μＬのＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ−４０）が加えられ、試料は４℃で１時間保持された。そして、１５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）及び１５μＬの１Ｍ硫酸マグネシウムで、３７℃、４５分間処理することによりＤＮＡが取り除かれた。最終的に試料は４℃で１５０００×ｇ、１５分間遠心分離され、純粋なＩＬ−１０封入体を含有するペレットは０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む同じ溶解緩衝液１ｍＬで１度洗浄された。最後の４℃、１５０００×ｇ、１５分間の遠心分離の後、ペレットは解析まで−８０℃で保存された。すべての保温／保持は攪拌しながら行われた。本手順で用いられた量及び保温／保持時間は、より多量の試料が使用される場合には規模が拡大された。
【０２７０】
結果：ＩＬ−１０封入体を加えた表皮試料の培養は、封入体形状で局所投与された場合に、不溶性の封入体中に含有されるＩＬ−１０が天然の生物学的活性を発揮できるかどうか、及びその封入体が進行中の炎症過程による壊死の危険を減少することにより皮膚への重度の障害を防止することを顕著に抑制することができ、皮膚の病状を限定することができるかどうか、又は皮膚炎症を抑えることができるかどうかを示すであろう。その結果は、炎症誘因刺激にさらされ、暴露前、同時、又はその後にＩＬ−１０封入体で処置された皮膚細胞が生存能力を維持できるのかどうかを示すであろう。
【０２７１】
実施例６
乾癬治療のためのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）封入体の使用
ＩＬ−１０は乾癬治療の、特に患者への皮下投与による臨床試験に用いられてきた。しかし、タンパク質の製造に伴う高い原価、必要量、及び長期投与を考えると、乾癬治療のためのＩＬ−１０の使用は経済上実用的ではない。ＩＬ−１０の局所投与は、ＩＬ−１０を用いた治療の費用を顕著に低減するであろう。
【０２７２】
乾癬を治療するためのＩＬ−１０使用の実行可能性を試験するために、乾癬を伴うヒト皮膚の培養生検（外植片）を含む生体外モデルシステムで、ＩＬ−１０封入体が用いられた。このモデルシステムは、ヒト皮膚の組織学的、細胞の、及び遺伝的特性を培養物中で数日間維持し得る。したがって、このモデルシステムは、乾癬及びアトピー性皮膚炎のような皮膚疾患又は状態における様々な刺激／抑制物質の影響を評価することに用いられ得る。加えて、この技術は試験物質の薬理学的活性を評価するための定量ＲＴ−ＰＣＲと組み合わせ得る。
【０２７３】
乾癬及び健常皮膚を用いた遺伝子発現研究は、乾癬病変において過剰発現された遺伝子の同定及び検証並びに治療の臨床的有効性と発現程度を関連付けることを可能とした。ＩＬ−１０の作用機序に関連する及び／又は乾癬の病状に関係する遺伝子の同定は、乾癬病変に生体外で適用されたＩＬ−１０封入体の評価を可能とした。生検用試料は患者から取得され、各試料で１０遺伝子の発現程度がＲＴ−ＰＣＴにより測定された。
【０２７４】
ＩＬ−１０封入体は、患者より得られた乾癬外植片に適用された。各々の外植片は４つの部分に分けられ、４つの異なる評価を行うためにそれぞれ用いられた。（ｉ）皮膚試料に局所適用されたそれぞれ異なる濃度のＩＬ−１０封入体での２つの実験、（ｉｉ）ＧＦＰ封入体（ＧＦＰ−ＶＰ１）が皮膚試料に適用されたコントロール実験、及び（ｉｉｉ）ネガティブコントロール（封入体なし）。
【０２７５】
ＩＬ−１０封入体で処置された乾癬外植片では、炎症の顕著な抑制が観察された（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−８、Ｋ１６、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、及びＩＬ−１７Ａの発現程度の減少が観察された）。ＧＦＰ封入体で処置された外植片では、コントロール試料に比較して炎症のわずかな増加が観察された（表３参照）。
【０２７６】
（表３）炎症に対するＩＬ−１０封入体の効果
2016535770.tif 000007
正規化：各々の条件で、１．８ｅ（Ｃｔ  ＧＡＤＰＨ−Ｃｔ対象遺伝子）×１０，０００（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２５７７〜２５８７（２００６）参照）
【０２７７】
これらの結果は、封入体形状の治療用に用いられる物質（炎症の抑制）又は美容用物質（赤み及び／又は腫れのような炎症の外見上の影響の減少）としてのＩＬ−１０の投与が、生体外のヒト乾癬モデルシステムで炎症を抑制することが可能であることを示した。
【０２７８】
コントロール／プラセボとして用いられたＧＦＰ−ＶＰ１封入体がわずかな炎症の影響を引き起こしたという観察は、封入体を生産する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用がわずかな炎症の影響を有し得ることを示唆した。したがって、ＧＲＡＳとして認識される生物であるプロバイオティックな細菌株を用いる他の封入体生産系が開発された（結果未記載）。
【０２７９】
実施例７
ＥＧＦ、ＫＧＦ及びＶＥＧＦ封入体
概要：ＥＧＦ、ＫＧＦ及びＶＥＧＦをコードする遺伝子が、２つのＰ１７０ベクター（Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ａ／Ｓ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｋ）にクローニングされた。クローニングされた構築物の配列はＤＮＡ塩基配列決定により確認された。３つの異なる乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株が形質転換され、総計１８の異なる株を生じた。ＫＧＦ、ＥＧＦ又はＶＥＧＦを発現する株で、フラスコでの発現実験が実施された。Ｆａｓｔ−ｐｒｅｐによる溶解物が、可溶性及び不溶性画分を得るのに用いられた。ウェスタンブロット解析は、可溶性又は不溶性画分それぞれを用い行われた。ウェスタンブロット解析は、ＫＧＦが主として不溶性画分で発現することを示した（多コピー数のプラスミド及びｃｌｐＰ株どちらでも）。ＶＥＧＦの発現は、それぞれの画分で異なるバンドパターンであったが、可溶性及び不溶性いずれの画分でも検出された。
【０２８０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現プラスミド構築：コドンの最適化がなされたヒトＥＧＦ（５５アミノ酸長）、ＫＧＦ（１６５アミノ酸長）及びＶＥＧＦ（２０８アミノ酸長）をコードする遺伝子が合成された。２つの発現ベクターが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への遺伝子クローニングに用いられた。（ｉ）ｐＡＭＪ３９８、細胞内生産用の中程度のコピー数のプラスミド（ＭＣＮ）、及び（ｉｉ）ｐＡＭＪ３２８、細胞内生産用の高コピー数のプラスミド（ＨＣＮ）。遺伝子は、ｐＡＭＪ３２８のＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素切断部位、並びにｐＡＭＪ３９８のＢｓｐＨＩ及びＳａｌＩ制限酵素切断部位を介して発現ベクターにクローニングされた。発現プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂで構築された（リサーチ・マスターセルバンク（ｒＭＣＢ）は−８０℃で保存された）。ＵＰ１４０６：ｐＡＭＪ３２８：ＥＧＦ、ＵＰ１４０７：ｐＡＭＪ３２８：ＶＥＧＦ、ＵＰ１４０８：ｐＡＭＪ３２８：ＫＧＦ、ＵＰ１４０９：ｐＡＭＪ３９８：ＥＧＦ、ＵＰ１４１０：ｐＡＭＪ３９８：ＶＥＧＦ、及びＵＰ１４１１：ｐＡＭＪ３９８：ＫＧＦ。
【０２８１】
乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）株の形質転換：プラスミドＤＮＡが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から精製された。プラスミドＤＮＡは、制限酵素切断地図作成、クローニングにおける連結部位の塩基配列決定、及びＭＧ１３６３（Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ａ／Ｓ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｋ）；ｗｔ，ｈｔｒＡ−，ｃｌｐＰ−に由来する３つの乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株の形質転換に用いられた。すべてのプラスミド構築物は、制限酵素切断地図作成及びＤＮＡ塩基配列決定により、確認及び検証された。ｒＭＣＢは、Ｍ１７Ｇ５−ｅｒｍ培地で生育後、グリセロール中に作製された（−８０℃で保存）。
【０２８２】
（表４）形質転換された乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株
2016535770.tif 000008
【０２８３】
乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）フラスコ実験：作製された１８の乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株（表４）は、１％グルコース及び１μｇ／ｍＬのエリスロマイシンが添加された富栄養培地（１．５×Ｍ１７）で一晩培養された。Ｐ１７０プロモータの誘導が起こっていることを確認するために、一晩培養後のｐＨ及び吸光度（ＯＤ６００）が測定された。予想されたとおり、ｐＨは、５．０〜５．５程度、ＯＤ６００は４〜５程度であった。一晩培養液１０ｍＬが回収され、細胞ペレットが−２０℃で保存された。細胞ペレットは１ｍＬのＰＳＢで洗浄され、細胞材料はそれぞれ５００μＬ細胞材料（〜５ｍＬ培養液）を含む２本の試験管に分けられた。１つのペレットがｆａｓｔ−ｐｒｅｐに使用され、他は−２０℃で保存された。改変されたｆａｓｔ−ｐｒｅｐの手順を用いて、可溶性及び不溶性画分が調製された。可溶性及び不溶性画分は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のクマシー染色及びウェスタンブロット解析により分析された（図１２及び図１３参照）。
【０２８４】
乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）フラスコ実験（ＶＥＧＦ）：ＶＥＧＦを有する発現ベクターを含む乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）細胞は、エリスロマイシンを含む１．５×Ｍ１７Ｇ１０培地で３０℃、一晩生育された。１０μＬの細胞内可溶性画分及び１０μＬの細胞内不溶性画分が、トリス−グリシンの１２％ＳＤＳゲルにのせられ、クマシー染色され（図１２Ａ）、ウェスタンブロット（図１２Ｂ）された。
【０２８５】
クマシー染色では、ＶＥＧＦの分子量に対応する明瞭なタンパク質は、可溶性、不溶性いずれでも見られなかった（図１２Ａ）。しかし、ウェスタンブロット解析では可溶性画分に明確なシグナルが観察された（すべての株すなわちレーン２−７で、ブロットの左側に矢印で示されている、図１２Ｂ）。分子量は予想されるバンド（２３ｋＤａ）の大きさより高分子であり、４０〜４２ｋＤａ程度であった。ヒト細胞株でＶＥＧＦの発現を解析した場合におけるこの分子量のＶＥＧＦバンドの存在は、Ａｂｃａｍ（ＶＥＧＦ抗体の供給元）の製品データシートにも記載されている。およそ５０ｋＤａのバンド及び１００ｋＤａより大きいバンドがほとんどの株で不溶性画分に検出され（レーン８〜１３で、ブロットの右側に矢印で示されている）、ＶＥＧＦが封入体中に存在することを示している。
【０２８６】
乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）フラスコ実験（ＫＧＦ）：ＫＧＦを有する発現ベクターを含む乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）細胞は、エリスロマイシンを含む１．５×Ｍ１７Ｇ１０培地で３０℃、一晩生育された。１０μＬの細胞内可溶性画分及び１０μＬの細胞内不溶性画分が、トリス−グリシンの１２％ＳＤＳゲルにのせられ、クマシー染色され（図１３Ａ）、ウェスタンブロット（図１３Ｂ）された。
【０２８７】
クマシー染色では、ＫＧＦの分子量に対応する明瞭なタンパク質は、可溶性、不溶性いずれでも見られなかった（図１３Ａ）。しかし、ウェスタンブロット解析ではｃｌｐＰ株の可溶性画分に明確なシグナルが観察された（レーン６〜７の２本のバンド、ブロットの右側に矢印、図１３Ｂ）。分子量はＫＧＦで予想されるバンド（１８ｋＤａ）の大きさに近く、２２ｋＤａ程度であった。同じバンドパターンが不溶性画分でも見られた。最も濃いバンドパターンは、高コピー数（ＨＣＮ）のプラスミドを有するｃｌｐＰ株で観察され（レーン１２、ＵＰ１４３７株）、ＫＧＦが封入体中に存在することを示している。
【０２８８】
乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）フラスコ実験（ＥＧＦ）：ＥＧＦを有する発現ベクターを含む乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）細胞は、エリスロマイシンを含む１．５×Ｍ１７Ｇ１０培地で３０℃、一晩生育された。１０μＬの細胞内可溶性画分及び１０μＬの細胞内不溶性画分が、トリス−グリシンの１２％ＳＤＳゲルにのせられ、クマシー染色され、ウェスタンブロットされる。これらの実験は、開示された株で発現するＥＧＦが封入体中に存在するかどうかを示すであろう。
【０２８９】
ＥＧＦ及び／又はＫＧＦ並びにＶＥＧＦ封入体（又は他のタンパク質若しくはタンパク質以外の治療用物質、添加物なども含む組成物）を加えた表皮試料の培養は、不溶性の封入体中に単独又は組み合わせて含有されるこれらの成長因子が封入体形状で局所投与された（すなわち、皮膚又は他の上皮組織に投与された）場合に、天然の生物学的活性を発揮できるかどうか、並びにその封入体が内因性及び／又は外因性の皮膚障害（例えば老化又は環境因子への暴露による）又は病理学的状態（例えば皮膚疾患又は状態）を顕著に抑制、改善又は治療することができることができるかどうかを示すであろう。したがって実験データは、美容用及び／又は治療用物質として効果的に機能するというこれら封入体の能力を示すであろう。結果は、皮膚障害条件にさらされ、暴露前、同時、又はその後にＥＧＦ及び／又はＫＧＦ並びにＶＥＧＦ封入体を含む組成で処置された皮膚細胞（例えば、人工モデルシステム、生体外モデル、又は対象の皮膚）が生存能力を維持できるのかどうかも示すであろう。
【０２９０】
概要及び要約の部分ではなく、「発明の詳細な説明」の部分が「特許請求の範囲」の解釈に用いられることを意図していると理解されるべきである。概要及び要約の部分は、本発明者により考案されたすべてではないが１つ以上の本発明の例示的な実施形態を明らかにし得るものであり、したがって本発明及び添付の「特許請求の範囲」を何らかの形で限定することを意図するものではない。
【０２９１】
本発明は、特定した機能及びその関連についての実施態様を例示する実用的な構成要素を用いて上に記載されている。これらの実用的な構成要素の境界は、明細書の便宜上本明細書中では任意に定義されてきた。特定した機能及びその関連が適切に実行される場合に限り他の境界が定義され得る。
【０２９２】
前述の特定の実施形態の記載は十分に発明の一般的な特性を明らかにしているので、当業者のもつ知識を適用することにより、種々の応用のため、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、他者はその特定の実施形態を容易に改変及び／又は適合させることができる。したがって、その適合及び改変は、本明細書中で公開された教示及び指導に基づいており、開示された実施形態に等しい意味及び範囲の中にあると意図される。本明細書中の語法又は用語は、説明の目的であり限定を目的としておらず、そのような本明細書中の用語又は語法は教示及び指導に照らし当業者により解釈されることが理解されるべきである。
【０２９３】
本発明の幅及び範囲は、いかなる上述の例示的な実施形態によっても限定されるべきではなく、次の特許請求の範囲及びその同等物に従ってのみ定義されるべきものである。
【図１】
2016535770.tif 000010
【図２】
2016535770.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2016535770.tif 000015
【図７】
2016535770.tif 000016
【図８】
2016535770.tif 000017
【図９】
2016535770.tif 000018
【図１０】
2016535770.tif 000019
【図１１】
2016535770.tif 000020
【図１２】
2016535770.tif 000021
【図１３】
2016535770.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月5日(2016.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３】
美容または治療に有効な量の封入体形状の美容用または治療用物質と、皮膚科学的にまたは薬学的に許容され得る担体とを含む、処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための美容用または治療用組成物であって、該組成物が、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用されることを特徴とする、美容用または治療用組成物。
【請求項２】
前記封入体が不溶性であるか、可溶化されていないか、部分的に可溶化されているか、または微粒子形状である、請求項１に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項３】
前記微粒子形状が２０から１５００ｎｍまでの粒径を有する、請求項２に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項４】
前記微粒子形状が水和された非晶質の形状である、請求項２または３に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項５】
前記封入体が標的細胞に取り込まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項６】
前記標的細胞が、表皮細胞、表皮細胞以外の細胞、神経細胞、筋細胞、または脂肪細胞である、請求項５に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項７】
前記封入体が、角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））、半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））、基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも一層の皮膚層に浸透し得る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項８】
前記美容用物質又は治療用物質がポリペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドに生物学的活性があるか、または前記ポリペプチドがプロドラッグである、請求項８に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチド若しくはその生物学的活性断片、天然のポリペプチド若しくはその生物学的活性断片、又は化学合成ポリペプチドである、請求項８または９に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、キメラタンパク質、融合タンパク質、または複合タンパク質である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドまたはその生物学的活性断片が、細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞で発現する、請求項１０に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが封入体誘導ポリペプチドと遺伝的に融合又は複合体形成されている、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがＩＬ−１０及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ、及び／又はそれらの断片、変種、又はそれらの誘導体を含む、からなる、又はから本質的になる、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１５】
前記皮膚の状態が、乾癬、セルライト、ざ瘡、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌性皮膚感染症、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、口唇ヘルペス、ふけ、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、及び膿痂疹から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
同様に、局所用の美容用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの美容用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の美容用組成物も提供される。同様に、局所用の治療用組成物であって、単離された封入体形状の少なくとも１つの治療用物質を含み、この封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の治療用組成物も提供される。いくつかの態様では、組成物は、溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エマルジョン、懸濁液、エアゾール、エアゾール泡沫、塗布薬、チンキ、膏薬、湿布、乾燥粉末、又はそれらの組み合わせである。
[本発明1001]
皮膚バリアを越えて美容用物質を送達する方法であって、封入体形状の少なくとも1つの美容用物質を含む美容用組成物を、対象の皮膚に適用することを含み、前記少なくとも1つの美容用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法。
[本発明1002]
皮膚バリアを越えて治療用物質を送達する方法であって、封入体形状の少なくとも1つの治療用物質を含む治療用組成物を、対象の皮膚に適用することを含み、前記少なくとも1つの治療用物質が封入体形状で皮膚バリアを越える、方法。
[本発明1003]
処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも1つの美容用物質と、皮膚科学的に許容され得る担体とを含む、美容に有効な量の美容用物質組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用することを含む、方法。
[本発明1004]
処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための方法であって、封入体形状の少なくとも1つの治療用物質と、薬学的に許容され得る担体とを含む、治療に有効な量の治療用物質又は治療用組成物を、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用することを含む、方法。
[本発明1005]
美容用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも1つの美容用物質を含む美容用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、前記美容用物質の浸透が、可溶型の同じ美容用物質の浸透と比較して増進される、方法。
[本発明1006]
治療用物質の皮膚浸透を促進する方法であって、封入体形状の少なくとも1つの治療用物質を含む治療用組成物を対象の皮膚に適用することを含み、前記治療用物質の浸透が、可溶型の同じ治療用物質の浸透と比較して増進される、方法。
[本発明1007]
組織の再生を刺激する方法であって、封入体形状の少なくとも1つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し、前記組織に到達して、組織の再生を刺激する、方法。
[本発明1008]
真核細胞の増殖を刺激する方法であって、単離された封入体形状の少なくとも1つの美容用物質又は治療用物質を対象の皮膚に適用することを含み、前記封入体が、皮膚バリアに浸透し、真核細胞の増殖を刺激する、方法。
[本発明1009]
経皮送達システムを構築する方法であって、（ｉ）封入体形状の少なくとも1つの美容用物質又は治療用物質を供給すること、及び（ｉｉ）前記封入体を担体と混合することにより経皮送達システムを構築することを含む、方法。
[本発明1010]
前記封入体が不溶性である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記封入体が可溶化されていない、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記封入体が部分的に可溶化されている、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記封入体が微粒子形状である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記微粒子形状が約20から約1500ｎｍまでの粒径を有する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記微粒子形状が約100ｎｍから約500ｎｍまでの粒径を有する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記微粒子形状が約150ｎｍから約300ｎｍまでの粒径を有する、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記微粒子形状が水和された非晶質の形状である、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記封入体が標的細胞に取り込まれる、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記標的細胞が表皮細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記標的細胞が表皮細胞以外の細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記標的細胞が神経細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1022]
前記標的細胞が筋細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1023]
前記標的細胞が脂肪細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1024]
前記封入体が少なくとも一層の皮膚層に浸透し得る、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記封入体が角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））、半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））又は基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））に浸透し得る、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記美容用物質又は治療用物質がポリペプチドを含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記ポリペプチドに生物学的活性がある、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ポリペプチドがプロドラッグである、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチド若しくはその断片、天然のポリペプチド若しくはその断片、又は化学合成ポリペプチドである、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記ポリペプチドが複合タンパク質である、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記ポリペプチドがキメラである、本発明1026〜1028のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記組換えポリペプチドが、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択された細胞で発現する、本発明1029の方法。
[本発明1034]
前記ポリペプチドが封入体誘導ポリペプチドと遺伝的に融合又は複合体形成されている、本発明1026〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記封入体誘導ポリペプチドがウイルスタンパク質である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記ウイルスタンパク質がカプシドタンパク質である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記封入体誘導ポリペプチドが、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ1の5量体を形成するカプシドタンパク質又はその断片を含む、本発明1034の方法。
[本発明1038]
前記ポリペプチドがタンパク質精製用タグ又は可視化用タグと複合体形成されている、本発明1026〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記タンパク質精製用タグがＨｉｓ6−タグである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記可視化用タグが蛍光タグである、本発明1038の方法。
[本発明1041]
前記ポリペプチドが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン抑制ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピン若しくは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨ若しくは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ若しくはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管抑制因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン1（ＩＬ−1）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン6（ＩＬ−6）、インターロイキン8（ＩＬ−8）、インターロイキン−10（ＩＬ−10）、インターロイキン12（ＩＬ−12）、インターロイキン16（ＩＬ−16）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、内皮増殖因子、α−1アンチトリプシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、シクロスポリン、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、カタラーゼ、又はシャペロンからなる群から選択される、本発明1026〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記ポリペプチドがＩＬ−10及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ、及び／又はそれらの断片、変種、又はそれらの誘導体を含む、からなる、又はから本質的になる、本発明1026〜1040のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記皮膚の状態が、乾癬、セルライト、尋常性ざ瘡、嚢胞性ざ瘡、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬、ウイルス感染症、真菌感染症、及び細菌性皮膚感染症から選択される、本発明1003の方法。
[本発明1044]
前記皮膚の状態が、乾癬、ざ瘡、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、蜂窩織炎、口唇ヘルペス、ふけ、皮膚炎、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、膿痂疹、及び感染症から選択される、本発明1004の方法。
[本発明1045]
封入体形状の少なくとも1つの美容用物質を含む美容用組成物を含む経皮送達システム。
[本発明1046]
封入体形状の少なくとも1つの治療用物質を含む治療用組成物を含む経皮送達システム。
[本発明1047]
前記送達システムがパッチ、スプレー、綿棒、スポンジ、スティック、又はシャンプーである、本発明1045又は本発明1046の経皮送達システム。
[本発明1048]
塗布器に連結された容器と、前記容器に取り込まれた本発明1045又は本発明1046の経皮送達システムと、を含む器具。
[本発明1049]
単離された封入体形状に少なくとも1つの美容用物質を含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の美容用組成物。
[本発明1050]
単離された封入体形状に少なくとも1つの治療用物質を含み、前記封入体が皮膚バリアに浸透し得る、局所用の治療用組成物。
[本発明1051]
前記組成物が、溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エマルジョン、懸濁液、エアゾール、エアゾール泡沫、塗布薬、チンキ、膏薬、湿布、乾燥粉末、又はそれらの組み合わせである、本発明1049又は本発明1050の局所用組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月5日(2016.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
美容または治療に有効な量の封入体形状の美容用または治療用物質と、皮膚科学的にまたは薬学的に許容され得る担体とを含む、処置を必要とする対象の皮膚の状態を処置するための美容用または治療用組成物であって、該組成物が、対象の皮膚の状態を改善するために前記対象の皮膚に局所適用されることを特徴とする、美容用または治療用組成物。
【請求項２】
前記封入体が不溶性であるか、可溶化されていないか、部分的に可溶化されているか、または微粒子形状である、請求項１に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項３】
前記微粒子形状が２０から１５００ｎｍまでの粒径を有する、請求項２に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項４】
前記微粒子形状が水和された非晶質の形状である、請求項２または３に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項５】
前記封入体が標的細胞に取り込まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項６】
前記標的細胞が、表皮細胞、表皮細胞以外の細胞、神経細胞、筋細胞、または脂肪細胞である、請求項５に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項７】
前記封入体が、角化層（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｌａｙｅｒ）（角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ））、半透明層（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）（透明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ））、顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）（顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ））、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）（有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ））、基底／胚芽層（ｂａｓａｌ／ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底／胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｂａｓａｌｅ／ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも一層の皮膚層に浸透し得る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項８】
前記美容用物質又は治療用物質がポリペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドに生物学的活性があるか、または前記ポリペプチドがプロドラッグである、請求項８に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチド若しくはその生物学的活性断片、天然のポリペプチド若しくはその生物学的活性断片、又は化学合成ポリペプチドである、請求項８または９に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、キメラタンパク質、融合タンパク質、または複合タンパク質である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドまたはその生物学的活性断片が、細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞で発現する、請求項１０に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが封入体誘導ポリペプチドと遺伝的に融合又は複合体形成されている、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがＩＬ−１０及び／又はＥＧＦ及び／又はＫＧＦ及び／又はＶＥＧＦ、及び／又はそれらの断片、変種、又はそれらの誘導体を含む、からなる、又はから本質的になる、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【請求項１５】
前記皮膚の状態が、乾癬、セルライト、ざ瘡、皮膚老化、皮膚のしわ、色素沈着過剰、角化症、皮膚のシミ、ふけ、いぼ、光線性皮膚障害、慢性皮膚疾患、皮膚炎、乾燥、魚鱗癬、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌性皮膚感染症、みずむし、口内炎、癰、カンジダ症、細菌性腟炎、膣疾患、口唇ヘルペス、ふけ、湿疹、紅色陰癬、丹毒、多形性紅斑、癰、及び膿痂疹から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の美容用または治療用組成物。
【国際調査報告】
2016535770.tif 000023
2016535770.tif 000024
2016535770.tif 000025