(57)【要約】本発明は、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療のための医薬組成物に関するものである。さらに詳細には、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子変異で生成された変異酵素Ｔ３１５Ｉを選択的に阻害するユリノキの樹皮から抽出された抽出物を有効成分として含む医薬組成物に関するものである。また、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物の活性有効成分であるエピツリピノリド(epi-Tulipinolide）の用途に関するものである。
2016517864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユリノキの樹皮から抽出物されたエピツリピノリドを有効成分として含有するＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子による変異酵素であるＴ３１５Ｉを選択的に阻害することにより、慢性骨髄性白血病の治療に有用な医薬組成物。
【請求項２】
上記医薬組成物は、変異酵素Ｔ３１５Ｉによるイマチニブ耐性の慢性骨髄性白血病細胞株を選択的に阻害してＤＮＡ断片化を介してアポトーシスを誘発する薬理効果を持つことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記医薬組成物に薬剤学的に許容可能な物質がさらに含まれていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
請求項３の医薬組成物を含有する、錠剤、丸剤、散剤、硬質カプセル剤、ゼラチンバンドが付された硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、キャラメルまたはゼリータイプのチューイン錠、および経口用液剤から選択された経口用製剤。
【請求項５】
上記経口用製剤は、軟質カプセル剤、または水溶液を含有する経口用液剤であることを特徴とする請求項４に記載の経口用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療のための医薬組成物に関するものである。さらに詳細には、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるBCR-ABL融合遺伝子変異で生成された変異酵素T315Iを選択的に阻害するユリノキの樹皮から抽出された抽出物を有効成分として含む医薬組成物に関するものである。また、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物の活性有効成分であるエピツリピノリド(epi-Tulipinolide）の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユリノキ（Liriodendron tulipifera L.、Yellow-poplar）は、モクレン科（Magnoliaceae）に属する落葉高木で、ユリノキの樹皮から抽出された抽出物は、アルカロイド、セスキテルペンおよびリグナン化合物が含有されている。
【０００３】
ユリノキの抽出物には、コスツノリド、ツリピノリド（tulipinolide）、エピツリピノリド（epi-tulipinolide）、エピツリプジエノリド（Epitulipdienolide）とγ−リリオデノリド（gamma-liriodenolide）などセスキテルペンラクトン（sesquiterpene lactone）類が含まれている。
【０００４】
これらのセスキテルペンラクトンのうち、パルテノライド（parthenolide）は、核転写因子ＮＦ−κＢ、ｐ２１、およびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１等を介して抗炎症または抗癌効果を示す物質として知られている。特にパルテノライドとパルテノライドの合成誘導体であるLC-1（dimethylamino-parthenolide）は、核転写因子ＮＦ−κＢの活動の抑制を介してアポトーシスを誘導するため、急性骨髄性白血病（Acute myeloid leukemia（AML））に抗がん効果を示すことが報告された。
【０００５】
白血病は、血液細胞のうち白血球が異常増殖する血液腫瘍の一種である。未成熟白血球が大量に血液中に残留する病気である。白血球の異常な増殖と比べて、正常な血球細胞の数は極めて少なくなる。したがって、免疫機能はもちろん、酸素運搬や栄養の供給などの基本的な血液の機能を果たすことができなくなって、異常に増殖した白血球は、自己免疫疾患と同様に正常組織を破壊することもある。
【０００６】
慢性骨髄性白血病は、骨髄内骨髄性白血球細胞がランダム増殖して血液中の蓄積された骨髄増殖性疾患である。白血病の種類は、大きく急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（Acute lymphocytic leukemia、ALL）、慢性リンパ性白血病（Chronic lymphocytic leukemia、CLL）に分けられる。
【０００７】
慢性骨髄性白血病の場合、外見上は異常未熟骨髄系細胞が成熟したことが観察されるが、正常機能を発揮しない。これらの慢性骨髄性白血病は、フィラデルフィア染色体（Philadelphia chromosome）と呼ばれる遺伝子異常と関連している。
【０００８】
慢性骨髄性白血病は、普遍的に他の白血病の症状との違いを持っ？？ており、特に、徐々に進行される異常な細胞の慢性（chronic）増殖（multiplication）段階から突然増殖する急性期への移行が発生することである。慢性骨髄性白血病は、３〜４年の間慢性の状態を維持することもある。したがって、治療方法は、病気を完治するより抑制することがより効果的である。しかし、突然の症状の切り替えが生じる患者のほとんどは治療が非常に困難なのが実情である。
【０００９】
慢性骨髄性白血病は、９番染色体のＡＢＬ遺伝子と２２番染色体のＢＣＲ遺伝子がトランスロケーション（translocation）されたフィラデルフィア染色体のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子によって発症される。これらのＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子は、チロシンキナーゼ（Tyrosine kinase）活性を有する融合タンパク質を発現させ、発癌タンパク質ｐ２１０生合成に関与し、生合成されたｐ２１０タンパク質は、骨髄前駆細胞のアポトーシスを抑えて、最終的に骨髄前駆細胞の異常な増殖に起因する骨髄増殖性疾患をもたらすものである。
【００１０】
イマチニブ（Imatinib）（商品名：グリベック）は第１世代の「BCR-ABL」のチロシンキナーゼ阻害剤として骨髄性白血病の1次治療薬として長期間使用されたが、イマチニブ（Imatinib）に耐性を持った患者が発生するなどの問題が発生した。これに対してダサチニブ（Dasatinib）、ニロチニブ（Nilotinib）、ボスチニブ（Bosutinib）のイマチニブ耐性を克服した第２世代の治療薬が開発され、より効果的かつ多様な薬物治療が開発された。
【００１１】
しかしながら、最近「BCR-ABL」の突然変異「Ｔ３１５Ｉ」で変異遺伝子が発生することにより、これらの第２世代の薬剤も、それ以上の治療効果を示さない場合が発生した。第１世代の治療薬と第2世代の治療薬に抵抗または耐性の原因となる突然変異「Ｔ３１５Ｉ」の変異遺伝子の抑制に効果的な第3世代の治療薬の開発が要求される。
【００１２】
そのため、本発明者らはユリノキの樹皮から抽出されたエピツリピノリドとコスツノリドと同じ薬理活性成分の抽出分離精製を試みた後、それぞれの活性成分の慢性骨髄性白血病の治療効果を実験を通して測定した。
【００１３】
これにより、本発明者らはユリノキの樹皮から抽出物内主成分であるエピツリピノリドが慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第1世代の治療薬であるイマチニブと第2世代の治療に抵抗性を持つ慢性骨髄性白血病に効果的であることを実験により確認した。慢性骨髄性白血病の治療に必要とされるＴ３１５Ｉ突然変異の効果的な発現抑制のためのユリノキの樹皮から抽出物を有効成分として含有する医薬組成物を開発することにより、本発明を完成するに至ったものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、ユリノキの樹皮から抽出物内主成分であるエピツリピノリドを介して慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第1世代の治療薬であるイマチニブと第2世代の治療に抵抗性を持つ慢性骨髄性白血病に効果的な治療法を開発することである。つまり、慢性骨髄性白血病の治療に必要とされるT315I突然変異の効果的な発現抑制のためのユリノキの樹皮から抽出物を有効成分として含有する医薬組成物を開発しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、ユリノキの樹皮から抽出物されたエピツリピノリドを有効成分として含有し、BCR-ABL融合遺伝子による変異酵素であるT315Iを選択的に阻害することにより、慢性骨髄性白血病を治療するのに有用な医薬組成物を提供することである。
【００１６】
上記医薬組成物は、変異酵素T315Iによるイマチニブ耐性の慢性骨髄性白血病細胞株を選択的に阻害してDNA断片化を介してアポトーシスを誘発する薬理効果を持つことを特徴とする。
【００１７】
一方、上記医薬組成物に薬剤学的に許容可能な物質がさらに含まれていることを特徴とする。
【００１８】
一方、本発明のもう一つの目的は、前記医薬組成物を含有する錠剤、丸剤、散剤、硬質カプセル剤、ゼラチンバンディングした硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、キャラメルまたはゼリータイプのチューイン錠と経口用液剤で選択された経口用製剤を提供することである。
【００１９】
このとき、上記経口用製剤は、軟質カプセル剤、または水溶液を含有する経口用液剤であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の効果は、ユリノキの樹皮から抽出物内主成分であるエピツリピノリドを介して慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、第１世代の治療薬であるイマチニブと第２世代の治療に抵抗性を持つＴ３１５Ｉ変異の発現抑制が可能な慢性骨髄性白血病治療剤としてユリノキの樹皮から抽出物を有効成分として含有する医薬組成物を提供することである。また、本発明のユリノキの樹皮から抽出物を有効成分として含有する医薬組成物は、Ｔ３１５Ｉを含む慢性骨髄性白血病細胞を選択的に阻害し、アポトーシス誘導DNA断片化を誘発する効果を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は、白血病細胞株由来の細胞の生存率を観察するために、慢性骨髄性白血病の既存の治療薬である第1世代の薬物（以下、Imatinib）と慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の突然変異として知られてＴ３１５Ｉを選択的に阻害する有用な医薬組成物（以下、CD-200）、そしてCD-200の主な成分であるエピツリピノリド（以下、CD-EPT）で処理した後、XTTアッセイを介して細胞生存率を比較評価した結果を示したある。
【図１Ａ】図１ａは、Ｂａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ/Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株に対するイマチニブの濃度別の細胞生存率を表示したグラフである。
【図１Ｂ】図１ｂは、Ｂａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株のＣＤ−２００の濃度別の細胞生存率を表示したグラフである。
【図１Ｃ】図１ｃはＢａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株のＣＤ−ＥＰＴの濃度別の細胞生存率を表示したグラフである。
【図２Ａ】図２は、白血病細胞株由来の細胞の生存率を観察するためにイマチニブ（Imatinib）、ＣＤ−２００、またはＣＤ−ＥＰＴで処理した後、ＸＴＴアッセイを介したＩＣ50を比較して、評価した結果を示したものである。
【００２２】
図２ａは、Ｂａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株に対するイマチニブの濃度別の細胞生存率を表示したグラフである。
【図２Ｂ】図２ｂは、Ｂａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株のＣＤ−２００の濃度別の細胞生存率を表示したグラフである。
【図２Ｃ】図２ｃは、Ｂａ／Ｆ３細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株のＣＤ−ＥＰＴの濃度別の細胞生存能を表示したグラフである。
【図３】図３は、白血病細胞株で慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を選択的に阻害することを確認するために、Ｂａ／Ｆ３野生型とＢａ／Ｆ３／Ｔ３１５Ｉ細胞株についてイマチニブ、ダサチニブ（Dasatinib）、ＣＤ−２００で処理した後、それぞれのＢＣＲタンパク質の自己リン酸化（Autophosphorylation）阻害するかどうかをウエスタンブロットを介して示したものである。
【図４Ａ】図４は、白血病細胞株由来の細胞の細胞周期の変化を観察するために、ＣＤ−２００で処理し、２４時間後にフローサイトメトリー（flow cytometry）で確認した結果を示したものである。図４ａは、ＣＤ−２００で処理していない対照群のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４Ｂ】図４ｂは、１μｇ／ｍＬのＣＤ−２００で処理した試験群のフローサイトメトリー分析の結果である。
【図４Ｃ】図４ｃは、５μｇ／ｍＬのＣＤ−２００で処理した試験群のフローサイトメトリー分析の結果である。
【図５】図５は、図４で示されたフローサイトメトリー分析試験の結果を確認するために、プロピオンスタジアムヨウ素（PI; Propidium iodide）で３０分以上の染色後フローサイトメトリーで分析して、細胞周期の変化を確認し、その割合をグラフで表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の目的は、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子による変異酵素であるＴ３１５Ｉを選択的に阻害するのに有用なユリノキの樹皮から抽出物の医薬組成物とその有効成分であるエピツリピノリドを提供する。
【００２４】
また、本発明のもう一つの目的は、前記医薬組成物を含有する錠剤、丸剤、散剤、硬質カプセル剤、ゼラチンバンディング硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、キャラメルまたはゼリータイプのチューイン錠および経口用液剤から選択された経口用製剤を提供することである。
【００２５】
本発明は、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるBCR-ABL融合遺伝子による変異酵素であるT315Iを選択的に阻害するのに有用なユリノキの抽出物の医薬組成物とその有効成分であるエピツリピノリドを提供するものである。薬学的組成物または抽出物のような効果を持つ公知の有効成分を1種以上含有することができる。
【００２６】
本発明のユリノキの樹皮からの抽出物が有効な活性を示す慢性骨髄性白血病は、骨髄や血液の悪性癌の一種で、血液細胞がランダムに成長する。また、慢性白血病は非常にゆっくりと進行して、異常な増殖が誘導されて成熟細胞の範囲が拡大されている特徴を有する。
【００２７】
また、本発明のユリノキの樹皮から抽出物の有効成分としてエピツリプジエノリド（Epitulipdienolide）、リデンチン（Ridentin）またはデアセチルリピフェロリド（Deacetyllipiferolide）をさらに含むことを特徴とする。
【００２８】
上記医薬組成物は、錠剤、顆粒、カプセル、粉末、シロップ、軟膏、坐剤、注射、筋肉内注射または静脈内注射などの一般的な剤形の形態で投与することができ、１日１０〜５００ｍｇを1回ないし数回に分けて服用することができる。
【００２９】
また、本発明は、前記医薬組成物を含む経口用製剤を提供する。上記の経口用製剤は、錠剤、丸剤、散剤、硬質カプセル剤、ゼラチンバンドが付された硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、キャラメルまたはゼリータイプのチューイング錠、または水溶液などの経口用液剤である。
【００３０】
また、前記組成物は、薬効に悪影響を及ぼさない範囲内で、薬学的に通常許容される物質を含むことができる。例えば、ユリノキの樹皮のエキスの溶解度および消化管内吸収を増加させ、経口投与時に水と一緒に分散し、乳化して溶出の増加と生体利用率の向上に必要な物質である。酸、脂肪酸または脂肪酸アルコールなどの添加剤;白糖、麦芽イオン飴、精白糖、ゼラチン、砂糖や水飴などの糖類;ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤;微結晶セルロース、リン酸一水素カルシウム、デンプン、マンニトール等の賦形剤;製剤が酸化されるのを防止する抗酸化剤;着香剤;防腐剤;芳香剤;甘味料;色素; pH調整剤および粘度調整剤をさらに含むことができる。これらはユリノキの樹皮のエキスに対して一般的に許容される量で添加することが好ましい。
【００３１】
本発明の組成物に使用することができる酸、脂肪酸または脂肪酸アルコールには、クエン酸、オレイン酸、ステアリルアルコール、ミリスチン酸（myristic acid）、リノール酸またはラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸（caproic acid）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物に使用することができる抗酸化剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン、亜硫酸水素ナトリウム（sodium bisulfite）、α-トコフェロール、ビタミンC、β-カロチン、酢酸トコフェロール、フマル酸、nalic酸（nalic acid）malic acid、ブチルヒドロキシアニソール（butylated hydroxyanisole）、没食子酸プロピル（propyl galate）およびアスコルビン酸ナトリウムなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の組成物に使用することができる着香剤は、ミックスフルーツの香り、リンゴの香り、果実の香り、チェリーの香り、ミントの香り、バニラ香、ヨーグルトの香りやドリンクの香りなどが使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の組成物に使用することができる保存剤は、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エチルパラベン、メチルパラベン、またはプロピルパラベンなどを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物に使用することができる芳香剤は、メントール、ミント、オレンジ油、クローブ油、シナモン油、果実エッセンス、その他の通常の果実の香りや植物のエッセンスなどが使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の組成物に使用することができる甘味剤は、精白糖、ブドウ糖、果糖、アスパルテーム、ステビア（ステビオサイド）、ソルビトール、マンニトール、オリゴ糖、水飴や麦芽糖飴などが使用できるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物に使用することができる色素は、緑色3号、赤色2号、赤色3号、青色1号、青色2号、黄色4号、黄色5号、水溶性マンニトール、カラメル、酸化チタンや酸化鉄などが使用されることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物に使用することができるpH調整剤は、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンまたはモノエタノールアミン等が使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の組成物に使用することができる粘度調節剤は、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（CMC）、アカシア（acacia）、ベントナイト（bentonite）、アルギン酸、プロピレングリコールアルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（PVC)、カーボポール（carbopol）（登録商標）、ポリカルボピル（polycarbopil）、トラガントガム（tragacanth）またはキサンタンガム（xanthan gum）などを用いることがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
また、本発明の薬学的組成物の投与のために、上記有効成分に加えて薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含むことができる。
【００３７】
これにより、含むことができる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、精製水、4-ヒドロキシ安息香酸メチル（メチルヒドロキシベンゾエート）、4-ヒドロキシ安息香酸プロピル（プロピルヒドロキシベンゾエート）、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油から選ばれた１種以上であることができる。
【００３８】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、キャラメルまたはゼリータイプのチューイン錠などが含まれ、これらの固形製剤は、前記有効成分の少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して使用することができる。また、他にもステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用することができる。
【００３９】
経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、一般的に使用される単純希釈剤である精製水、液状パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などが含まれることがある。
【００４０】
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれ、非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびエチルオールレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤は、ウィテプソル、マクロゴール、トゥウィーン（tween）（登録商標）61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００４１】
本発明のユリノキの樹皮から抽出物とその医薬組成物は、上記の経口投与に加えて目的とする方法に応じて、様々な経路で投与することができ、経口、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射などが含まれる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を製造実施例および実施例を介して詳細に説明する。しかし、下記の製造実施例および実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲が下記の製造実施例および実施例に限定されるものではない。
【００４３】
（製造実施例１）ユリノキの樹皮から抽出物（ＣＤ−２００）の分離製造
１．溶媒抽出工程
細した３〜５年生のユリノキの樹皮２００ｇを酢酸エチル２０００ｍＬに入れて、室温で２４時間振とうインキュベートして抽出し、抽出ろ液を減圧濃縮濾過した後、酢酸エチル１次抽出液を得て、得られた１次抽出液にブタノール５００ｍＬを加えて、室温で２〜４時間抽出した後、ブタノール層を分離除去してブタノールに溶解された成分を除去した後、減圧濃縮させて粗抽出物１２．５４ｇを得た。
【００４４】
２．精製工程
得られた粗抽出物１２．５４ｇを７０％エタノール２００ｍＬに溶解させた後、ｎ−ヘキサン２００ｍＬを加え、振とう分画し、７０％エタノール層を収得し、上記エタノール層を分離させ、減圧濃縮、凍結乾燥させた後、２．７５ｇの抽出物を得た。これをＣＤ−２００と呼ぶ。
【００４５】
（製造実施例２）ＣＤ−２００の主な成分であるエピツリピノリド（ＣＤ−ＥＰＴ）の分離製造
製造実施例１で分離し製造されたユリノキの樹皮から抽出物のＣＤ−２００をＷＡＴＥＲＳ社Alliance e2695 system高性能液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）を介して分離した。このとき分離条件は、逆相カラムKromasil C18カラムを使用して、試料濃度５ｍｇ／ｍＬと紫外線の波長２１５ｎｍで測定した（流速：１．０ｍＬ／分）。移動上の水とメタノールの混合溶媒を時間に伴うするグラデーション条件を使用した。滞留時間=〜31分の分画からエピツリピノリドを分離した。これCD-EPTと呼ぶ。
【００４６】
（製造実施例３）エピツリピノリド（ＣＤ−ＥＰＴ）の分離同定
上記分画内のエピツリピノリドの存在は、エピツリピノリドの標準品を購入してHPLCに２つの試料を注入して通液させて流出するまで要する滞留時間（retention time）が互いに一致することで確認した。また、エピツリピノリドの HYPERLINK "http://ejje.weblio.jp/content/%E6%AF%94%E6%97%8B%E5%85%89%E5%BA%A6" \o "比旋光度の英語" 比旋光度（specific rotation）を測定した結果、文献で報告されたエピツリピノリドの値（[α]Ｄ=＋７６）と、ＣＤ−２００から抽出分離された測定されたエピツリピノリドの実際の値（[α]Ｄ=＋７４）が一致して立体化学的にエピツリピノリドであることが確認された。
【００４７】
（実施例１）ＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴの白血病細胞株増殖抑制試験
ＢＣＲ−ＡＢＬが発現された白血病細胞株で、ＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴが、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の突然変異として知られるＴ３１５Ｉを選択的に阻害するかどうかを確認するために、ユリノキの樹皮から抽出物（ＣＤ−２００）とこの有効成分エピツリピノリド（ＣＤ−ＥＰＴ）による白血病細胞株の細胞増殖抑制効果を試験した。
【００４８】
細胞増殖抑制効果を確認するために試験管内（in vitro）で細胞生存率のアッセイ（ＸＴＴ  ａｓｓａｙ）を行った。具体的には、９６ウェルプレートにＢＣＲ−ＡＢＬが発現された白血病細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞を１×１０3個ローディングした後、慢性骨髄性白血病の既存の治療薬である第１世代の薬物（以下、Imatinib）を０．０１μＭから５０μＭまで投入処理して、ユリノキの樹皮から抽出物（ＣＤ−２００）と、この主成分エピツリピノリド（ＣＤ−ＥＰＴ）が、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の突然変異として知られてＴ３１５Ｉを選択的に阻害するかかどうかを確認した。それぞれの細胞株に０．０１μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで、０．０１μＭから５０μＭまで含量にそれぞれ投入処理して３７℃に４８時間の間の細胞株と一緒にインキュベーションさせた。インキュベーション後、ＸＴＴ ｆｏｒｍａｚａｎ（Ｗｅｌ Ｇｅｎｅ社）を処理して、37℃で4時間反応させた後、ELISAを用いて620nm、540nmの吸光度から細胞生存率を測定した（図1）。
【００４９】
図1に示すように、細胞生存率を評価した結果、イマチニブ（Imatinib）1μMと同等のＣＤ−２００  １μｇ／ｍＬ、ＣＤ−ＥＰＴ  １μＭを比較したとき、ＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴの場合、Ｂａ／Ｆ３細胞株とＢａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ）細胞株で効果的に細胞増殖を抑制し、Ｂａ／Ｆ３（ＢＣＲ／ＡＢＬ）細胞株では、イマチニブに比べて有意な細胞生存能の抑制は測定されなかった。しかし、特にイマチニブ耐性を示すＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉ変異種でイマチニブよりＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴがより効果的に細胞増殖を抑制した（図１）。
【００５０】
（実施例  2）  CD-200とCD-EPTの白血病細胞株増殖抑制濃度測定試験
実施例１と同様の方法で、それぞれの細胞株にイマチニブとＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴを処理して、白血病細胞株のＩＣ50を測定し、その結果を図２に示した。
【００５１】
ＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉ変異種でＩＣ50値を比較したときのＣＤ−２００は１μｇ／ｍＬであり、ＣＤ−ＥＰＴは０．８μＭである、イマチニブは５μＭでイマチニブよりＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴは約５倍、またはその以上の強い阻害能を示した（図２）。したがって、本発明のＣＤ−２００とＣＤ−ＥＰＴは、試験管内での細胞増殖抑制効果があり、特にＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉ変異種で効果がある物質であることを確認した。
（実施例３）ＣＤ−２００のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の選択的阻害するかどうかを確認するためのウエスタンブロット
ＣＤ−２００のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を選択的に阻害するかどうかを確認するためにウエスタンブロットを行った。具体的には、１０ｃｍディッシュ（dish）にＢＣＲ−ＡＢＬが発現された白血病細胞株であるＢａＦ３／ＷＴとＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉの２種類を１×１０6細胞に分取した後、ＣＤ−２００  １μｇ／ｍＬと慢性骨髄性白血病の既存の治療剤のイマチニブ、ダサチニブ（Dasatinib）をそれぞれ１μＭずつ処理して、３７℃の温度で1時間ほど培養した。培養された細胞は、細胞溶解（Cell lysis）を介してタンパク質の単位でＢＣＲの自己リン酸化（autophosphorylation）阻害するかどうかを確認した（図３）。
【００５２】
図３に示すように、ＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉから既存の治療剤イマチニブよりＣＤ−２００の方がＢＣＲの自己リン酸化をより効果的に阻害することを確認した。したがって、本発明のＣＤ−２００は、従来の治療剤よりもＢＣＲ−ＡＢＬ／Ｔ３１５Ｉ変異種を選択的に阻害する物質であることを確認した。
（実施例４）ＣＤ−２００による細胞周期の変化を確認
ＣＤ−２００の細胞生存率に対する影響をより具体的に究明するために、白血病細胞株での細胞周期の変化を確認した。具体的には、１０ｃｍディッシュにＢＣＲ−ＡＢＬが発現された白血病細胞株であるＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉを２×１０5個分取した後、ＣＤ−２００で処理していない細胞株、およびＣＤ−２００ １μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬで処理した細胞株を、３７℃の温度で２４時間培養した。培養後、培養された細胞は、遠心分離を介して分離して７５％エタノールで−２０℃で１２時間以上固定させる。以後ヨウ化プロピジウム（PI; Propidium iodide）で３０分以上の染色した後、フローサイトメトリー（flow cytometry）で分析して、細胞周期の変化を確認し、その割合をグラフで確認した（図４，図５）。
【００５３】
図４及び図５に示すように、ＢａＦ３／Ｔ３１５ＩからＣＤ−２００を処理していない細胞と比較したとき、ＣＤ−２００の濃度が高くなるほど、アポトーシスが誘導された。Ｇ１期以前のサイクルでピークが現れており、これによりアポトーシスが誘導されることを確認することができる。アポトーシスが発生した細胞の割合を見ると、ＣＤ−２００を処理していない細胞では、３％程度のアポトーシスを発生したのに対し、ＣＤ−２００を５μｇ/ml処理した細胞では、３８％程度確認された。本発明のＣＤ−２００は、細胞周期内のＧ１期を停止するだけでなく、ＢａＦ３／Ｔ３１５Ｉ細胞の生存率も低下させる物質であることを確認した。
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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