(57)【要約】本発明は、ＨＥＣＴ及びＲＢＲファミリーを含むがこれらに限定されないＥ３Ｕｂリガーゼの活性部位システインチオール残基を、特異的に及び共有結合的に修飾する、機構に基づいた活性プローブを利用するスクリーニングを提供する。該活性プローブは、Ｅ３Ｕｂリガーゼの活性化因子及び阻害因子についてスクリーニングするため、及びヒト疾患におけるＥ３Ｕｂリガーゼの機能状態を調べるために使用される。2016523517.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；
ｂ）ａ）の混合物を、標識を含む活性プロ−ブと接触させること；及び
ｃ）前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定する方法であって、対照と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の増加または低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する、前記方法。
【請求項２】
前記リガーゼがＥ３リガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｅ３リガーゼがＨＥＣＴまたはＲＢＲファミリーリガーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性プローブが、ユビキチン結合ペプチド、反応性化学部分、ユビキチンペプチド及び標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ユビキチン結合ペプチドがＥ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標識が、蛍光、酵素または放射性標識である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記反応性化学部分が、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド、αアミノニトリル及びエポキシコハク酸からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記活性プローブがエピトープタグをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
標識の前記低減または増加が、ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ、及びＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記リガーゼの阻害因子を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガーゼ上のプローブ標識の増加が、前記リガーゼの活性化因子を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって同定される、ユビキチンリガーゼの小分子阻害因子。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって同定される、ユビキチンリガーゼの小分子活性化因子。
【請求項１５】
ａ）ユビキチン結合ペプチド；
ｂ）反応性化学部分；及び
ｃ）ユビキチンペプチド
を含む、活性プローブ。
【請求項１６】
標識をさらに含む、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項１７】
エピトープタグをさらに含む、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項１８】
前記ユビキチン結合ペプチドがＥ２ペプチドである、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項１９】
前記Ｅ２ペプチドがＥ２−Ｅ３相互作用ドメインを形成する、請求項１６に記載の活性プローブ。
【請求項２０】
前記化学部分がユビキチンリガーゼの活性部位システインと反応する、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項２１】
前記化学部分が、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド及びエポキシコハク酸からなる群より選択される、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項２２】
前記ユビキチンペプチドがＥ３−ユビキチン相互作用ドメインを含有する、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項２３】
前記ユビキチン結合ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択される、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項２４】
前記ユビキチンペプチドが、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項１５に記載の活性プローブ。
【請求項２５】
ａ）病原体由来のユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；
ｂ）ａ）の混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；及び
ｃ）前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、病原体由来のユビキチンリガーゼを阻害する化合物を同定する方法であって、対照と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性の阻害因子として同定する、前記方法。
【請求項２７】
前記ユビキチンリガーゼが、ＳｏｐＡ及び新規Ｅ３リガーゼファミリー（ＮＥＬ）からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記病原体が、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）ユビキチンリガーゼを含有する腫瘍試料を、標識を含む活性プローブと接触させること；及び
ｂ）前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、腫瘍内で増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する方法であって、対象と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の増加が、増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する、前記方法。
【請求項３０】
前記腫瘍が、リンパ腫、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、及び頭頸部癌からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１月２７日に出願された米国特許出願第６１／９３２，１３９号及び２０１３年５月２日に出願された米国特許出願第６１／８１８，７９６号の§１１９（ｅ）に基づく優先権の恩典を主張する。以前の出願の開示は、本出願の開示の一部と考えられ、参照によりその全体が本出願の開示に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概してタンパク質の修飾に関し、より具体的には、ユビキチン経路酵素をモジュレートする化合物を同定するための方法に関する。
【０００３】
配列表の組み込み
添付の配列表中の材料は参照により本出願に組み込まれる。Ｅ３Ｘ１１００＿３ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５という名称の添付の配列表テキストファイルは、２０１４年５月２日に作成され、３ＫＢである。該ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピュータにあるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用して評価され得る。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
ユビキチン（Ｕｂ）は、７６個のアミノ酸からなるタンパク質である。多くの生化学的経路は、Ｕｂ及びユビキチン様（ＵｂＬ）分子を用いたタンパク質の翻訳後修飾によって部分的に調節されている。ユビキチン化として知られるプロセスである、Ｕｂによるこのタンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質分解、遺伝子転写、細胞周期進行、ＤＮＡ修復、アポトーシス、ウイルス出芽及び受容体エンドサイトーシスなどの、生物学的プロセスの調節に関与する。Ｕｂ／ＵｂＬ特異的結合酵素及び脱結合酵素の相対する作用を通して精密な調節が達成される。Ｕｂ及びＵｂＬタンパク質ファミリーのメンバーには、Ｕｂ、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＦＡＴ１０、ＵＦＭ１、ＬＣ３、ＧＡＴＥ−１６、ＧＡＢＡＲＡＰ及びＡＴＧ１２が含まれる。これらの関連するタンパク質は構造的に類似し、Ｕｂの機構に類似した機構において活性化され、結合し、及び結合体から放出される。一つを超える種類の修飾因子によって標的とされるようになるいくつかの基質タンパク質との結合経路間でクロストークがある。Ｕｂは、Ｕｂが強い配列保存を示す真核生物においてのみ見出される。
【０００５】
Ｕｂ及びＵｂＬによるタンパク質の翻訳後修飾は、生物学のほとんどすべての態様を調節し、タンパク質安定性及び活性の複雑で可逆的な調節を可能にする。細胞生物学におけるこの広い役割のために、Ｕｂ経路酵素における機能不全は、多くのヒト疾患をもたらし、小分子操作に敏感に反応し得る酵素の大集団があることを示唆する。基質へのＵｂ／ＵｂＬの共有結合は、標準的なＥ１−Ｅ２−Ｅ３酵素カスケードを通して達成され、それによりＵｂはＥ１によって活性化され、高エネルギーのチオエステル結合を介してＥ２へと転移される。活性化Ｕｂを有するＥ２は、その後、基質上のリジン残基へのＵｂ転移を生じる態勢にあるＥ３酵素に結合する。Ｅ３から基質への転移の機構は、関与するＥ３リガーゼの特定のクラスに依存する。これらのリガーゼは、５００を超える異なるタンパク質を含み、そのＥ３機能活性の構造要素によって定義される複数のクラスに分類される。Ｅ３リガーゼは、二つの主要クラスに分類される：基質転移の前にＵｂを受け入れる役割を果たす活性部位システインを含有するＨＥＣＴリガーゼ、及びＥ２酵素から基質への直接のＵｂの転移を可能にする足場として作用するジンクフィンガー様ドメインを含有するＲＩＮＧ  Ｅ３リガーゼ。ＲＢＲ（ＲＩＮＧ−ｂｅｔｗｅｅｎ−ＲＩＮＧ）は、ＲＩＮＧリガーゼに類似してＺｎを配位しＥ２を結合する点、さらにＨＥＣＴリガーゼと類似して活性部位システインも含有する点で、ＲＩＮＧ／ＨＥＣＴハイブリッド型と考えられるＥ３Ｕｂリガーゼのサブクラスである。具体的には、ＨＥＣＴリガーゼ及びＲＩＮＧリガーゼは両方とも活性化Ｕｂをチオエステルから基質上のリジン残基の８アミノ酸基へと転移させる；しかしながら、ＨＥＣＴリガーゼは、Ｕｂとチオエステル結合中間体を形成する活性部位システインを有し、一方でＲＩＮＧリガーゼは、Ｅ２から基質への直接Ｕｂ転移を可能にする足場として機能する。
【０００６】
Ｐａｒｋｉｎは、特定の基質へのユビキチンの共有結合において機能するＲＢＲ  Ｅ３リガーゼであり、Ｐａｒｋｉｎにおける変異は、パーキンソン病、癌、及びマイコバクテリウム感染症につながる。Ｅ３リガーゼのＲＢＲファミリーは、標準的なＲＩＮＧドメイン及び通常ＨＥＣＴ Ｅ３リガーゼに限定されている触媒システイン残基を用いて機能することが示唆され、ゆえにＲＩＮＧ／ＨＥＣＴハイブリッド型酵素と名付けられた。Ｐａｒｋｉｎは、それが１つのタンパク質にＥ３リガーゼの主要クラスを両方とも包含するように、ＲＢＲリガーゼとして機能すると提唱されてきた。具体的には、それは触媒システイン及びＥ２を結合するための古典的なＲＩＮＧモチーフの両方を用いて機能し得る。近年の研究によって、Ｐａｒｋｉｎが８個の亜鉛（Ｚｎ）分子を配位する４つのＲＩＮＧドメインを有すると確立された一方で、これらのＺｎ原子を配位する正確な残基、及び互いに対するそれぞれのＲＩＮＧドメインの構成は知られていない。Ｐａｒｋｉｎは、細胞内でカルボニルシアニド−３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）によって活性化され得る潜在活性を有すると説明されているが、分子レベルでどのように潜在状態が活性化されるのかは完全には知られておらず、精製されたＰａｒｋｉｎタンパク質が同様の潜在状態を含有するのかどうかはまだ確立されていない。リン酸化によるＰａｒｋｉｎ活性の調節が説明されているが、リン酸化後の後続の分子事象は理解されていない。最後に、触媒ネットワークがＥ３リガーゼについて調査されているものの、それらが古典的な三残基（ｔｒｉａｄ）／二残基（ｄｙａｄ）に基づく機構で機能するのかどうか、または触媒が水素結合ネットワークを通して生じるのかどうかはまだ明らかでない。脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢＳ）については、基質からのＵｂの切断が、重要な触媒システイン残基及び近接するヒスチジン残基を利用する、古典的な三残基／二残基機構を通して生じると実証されてきた。
【０００７】
ＵｂをＥ３Ｕｂリガーゼによってタンパク質に付加するプロセスは、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）によって遂行されるＵｂの除去の逆反応である。様々なＵｂ活性プローブが、ＤＵＢによるＵｂの除去をモニターするために開発されてきた。本明細書に記載のように、Ｕｂ活性プローブは、Ｅ３Ｕｂリガーゼを活性化するまたは阻害する小分子を同定するためにスクリーニングする化合物をスクリーニングするためにも使用することができる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＨＥＣＴ及びＲＢＲファミリーを含むがこれらに限定されないＥ３ユビキチンリガーゼの活性部位システインチオール残基を、特異的に及び共有結合的に修飾する、機構に基づいた活性プローブを利用するスクリーニングを提供する。活性プローブは、Ｅ３Ｕｂリガーゼのモジュレーターについてスクリーニングするため、及びヒト疾患におけるＥ３Ｕｂリガーゼの機能状態を調べるために使用される。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定する方法であって、ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プロ−ブと接触させること；リガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加または低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する。一態様では、リガーゼはＥ３リガーゼである。好ましい態様では、Ｅ３リガーゼは、ＨＥＣＴまたはＲＢＲファミリーリガーゼである。別の態様では、化合物は小分子である。さらなる態様では、活性プローブはユビキチン結合ペプチド、反応性化学部分、ユビキチンペプチド及び標識を含む。さらなる態様では、ユビキチン結合ペプチドはＥ２である。別の態様では、標識は蛍光、酵素または放射性標識である。一態様では、反応性化学部分は、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミドまたはエポキシコハク酸である。さらなる態様では、活性プローブは、エピトープタグをさらに含む。一態様では、標識の低減または増加は、ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦまたはＥＬＩＳＡであり得る、当該分野で周知の方法によって決定される。さらなる態様では、リガーゼ上のプローブ標識の低減はリガーゼの阻害因子を示し、リガーゼ上のプローブ標識の増加はリガーゼの活性化因子を示す。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、ユビキチンリガーゼの小分子阻害因子または活性化因子を提供し、それはユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；リガーゼ上のプローブ標識を測定することによって同定され、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加または低減は、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、ユビキチン結合ペプチド、反応性化学部分及びユビキチンペプチドを含む活性プローブを提供する。一態様では、活性プローブは標識及びエピトープタグをさらに含む。一態様では、ユビキチン結合ペプチドはＥ２ペプチドである。好ましい態様では、Ｅ２ペプチドは、Ｅ３リガーゼとＥ２−Ｅ３相互作用ドメインを形成する。さらなる態様では、化学部分は、ユビキチンリガーゼの活性部位システインと反応する。さらなる態様では、化学部分は、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド、αアミノニトリルまたはエポキシコハク酸であり得る。別の態様では、ユビキチンペプチドは、Ｅ３−ユビキチン相互作用ドメインを含有する。一態様では、ユビキチン結合ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５である。別の態様では、ユビキチンペプチドは、配列番号６、配列番号７または配列番号８である。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、病原体由来のユビキチンリガーゼを阻害する化合物を同定する方法であって、前記ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；及びリガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性の阻害因子として同定する。一態様では、ユビキチンリガーゼは、ＳｏｐＡまたは新規Ｅ３リガーゼファミリー（ＮＥＬ）である。さらなる態様では、病原体は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、腫瘍内で増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する方法であって、ユビキチンリガーゼを含有する腫瘍試料を、標識を含む活性プローブと接触させること、及びリガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対象と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加が、増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する。一態様では、腫瘍は、リンパ腫、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、及び頭頸部癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ユビキチンリガーゼモジュレーターを同定するための方法であって、Ｅ３リガーゼタンパク質が小分子とインキュベートされ、その後活性プローブが添加され、プローブ標識のレベルが測定される、前記方法を図示する。
【図２】活性プローブを図示する。ユビキチン結合ペプチド（例えば、Ｅ２）は、ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｅ３）との相互作用ドメイン（矢印Ａ）、ユビキチンリガーゼの活性部位にあるシステインと反応する反応性化学部分（矢印Ｂ）及びユビキチンペプチド（矢印Ｃ）を形成する。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、全体的なＰａｒｋｉｎドメイン構成及びＲＩＮＧ構造を示す。Ａ．直線的なドメイン構成及び構造的なドメイン境界を示すＰａｒｋｉｎの概念図。Ｌはリンカーを示し、Ｔはテザーを示す。Ｂ．Ｒ０ＲＢＲの全体的なリボン図（左）及び全体的な表面構造（右）。Ｃ．個別のＲＩＮＧドメインの図。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、Ｒ０ＲＢＲがリンカーによって分離された二つのコンパクトなドメイングループへと構築されることを示す。Ａ．Ｒ０及びＲ１境界面は比較的親水性であり、Ｒ０−Ｒ１リンカーによって分離され、この領域がいくらかの構造的柔軟性を有し得ることを示唆する。Ｂ．テザー残基Ｗ４０３は、Ｒ１上の疎水性ポケットに位置し、テザーの二つのターンへリックスをＲ１に係留するための「ピン」としての役割を果たし得る。Ｗ４０３はまた、Ｖ４６５の末端カルボキシレートと水素結合を形成する。Ｒ２５６は、ヒトＰＤ変異の部位である。Ｃ．Ｒ０ドメインは、残基Ｗ４６２及びＦ４６３をＲ０の疎水性コアへと挿入して、疎水性境界面を触媒ドメインＲ２とともに形成する。触媒システインであるＣ４３１は、この境界面に隣接する。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、Ｐａｒｋｉｎの触媒機構を実証する。Ａ．活性プローブＨＡ−ＵｂＶＳを様々なＰａｒｋｉｎ構築体（またはＵＳＰ２対照）とインキュベートして、固有のＰａｒｋｉｎ酵素活性を決定した。Ｂ．潜在的な触媒三残基Ｃ４３１、Ｈ４３３及びＥ４４４を誤整列させた。Ｈ４３３は、Ｗ４６２との水を媒介する水素結合に関与し、Ｃ４３１から約５．１Åである。触媒中に古典的なオキシアニオンホールとしての役割を果たし得るＧＧ−Ｃ４３１モチーフが存在する。Ｃ．Ｐａｒｋｉｎプローブ反応性は、古典的な触媒三残基の要素を必要とする。
【図６】図６Ａ〜Ｆは、ミトコンドリアへのストレスがＰａｒｋｉｎを活性化し、活性部位Ｃ４３１を曝露させることを実証する。Ａ．Ｐａｒｋｉｎ活性部位変異体Ｃ４３１Ｓ／Ｃ４３１Ａは、細胞のＴｏｍ２０レベルを低減させるＰａｒｋｉｎの能力を含む。Ｂ．完全長Ｐａｒｋｉｎ  Ｃ４３１Ｓを発現する細胞のみにおけるミトコンドリアへのストレス（ＣＣＣＰ）中の、約８ｋＤａのＰａｒｋｉｎ免疫反応種の形成を示すウェスタンブロット。Ｃ．完全長Ｐａｒｋｉｎ  Ｃ４３１Ｓ上でのＵｂオキシエステル形成を示す、約８ｋＤａのＰａｒｋｉｎ免疫反応種が水酸化ナトリウム処理に感受性であることを示す、ウェスタンブロット。Ｄ．完全長野生型Ｐａｒｋｉｎと比較して細胞活性が増強された完全長Ｐａｒｋｉｎ  Ｆ４６３Ｙ。Ｅ．野生型Ｒ０ＲＢＲと比較してＲ０ＲＢＲ  Ｆ４６３Ｙの自己ユビキチン化が増加した。Ｆ．野生型Ｒ０ＲＢＲと比較して増加したＲ０ＲＢＲ  Ｆ４６３ＹのＨＡ−ＵｂＶＳプローブ標識。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、Ｐａｒｋｉｎ−Ｒ０ＲＢＲ上にマッピングされたヒト遺伝子のＰＤ変異を示す。Ａ．ＰＤにおいて変異され得る残基を示すＰａｒｋｉｎ−Ｒ０ＲＢＲの概念図。Ｂ．ＲＯＲＢＲリボン表示（左）及び二つの１８０°図を伴う空間充填モデル（右）。Ｐａｒｋｉｎの一面は、もう一方の面よりも変異の数が多い。いくつかの領域では、変異の密度がより高く、これらの領域を円で囲った。これらの機能的領域はＲ１：ＩＢＲ境界面に近い領域、推定上のＥ２結合部位、及び触媒Ｃ４３１の周辺領域を含む。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳとのＰａｒｋｉｎ反応性が特異的であること、及びＰａｒｋｉｎは脱ユビキチン化（ｄｅｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｎｇ）酵素（ＤＵＢ）でないことを示す。Ａ．ＤＵＢ  ＵＳＰ２は、ＨＡ−ＵｂＶＳ及びＨＡ−Ｉｓｇ１５Ｖｓと反応し、陽性対照として使用された。Ｐａｒｋｉｎは、特異的にＨＡ−ＵｂＶＳと、及び弱い程度にＮＥＤＤ８と反応し、他のＵＢ様ＶＳプローブとは反応しない。Ｂ．ＰａｒｋｉｎまたはＵＳＰ２を純粋なＵｂＫ４８（２−７）または（ＵｂＫ６３）（２−７）鎖とインキュベートした。
【図９Ａ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【図９Ｂ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【図９Ｃ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【図９Ｄ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【図９Ｅ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【図９Ｆ】反応性化学部分の一般的な構造を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＥＣＴ及びＲＢＲファミリーを含むがこれらに限定されないＥ３Ｕｂリガーゼの活性部位システインチオール残基を、特異的に及び共有結合的に修飾する、機構に基づいた活性プローブを利用するスクリーニングを提供する。活性プローブは、Ｅ３Ｕｂリガーゼの活性化因子及び阻害因子についてスクリーニングするため、及びヒト疾患におけるＥ３Ｕｂリガーゼの機能状態を調べるために使用される。
【００１６】
本発明の組成物及び方法を記載する前に、かかる組成物、方法及び条件が変動し得るために、本発明は記載の特定の組成物、方法及び実験条件に限定されないことが理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定され得るため、本明細書で使用される用語は単に特定の実施形態を説明することを目的とし、限定を意図しないことも理解されたい。
【００１７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は複数の言及を含む。ゆえに、例えば、「方法」に対する言及は、１つまたは複数の方法及び／または本開示を読んだ際などに当業者に明らかになるであろう本明細書に記載のタイプのステップを含む。
【００１８】
別段の定義が無い限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料は本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００１９】
ユビキチン化は、ユビキチンが基質タンパク質に付着する翻訳後修飾である。ユビキチンの付加は、いろいろな形でタンパク質に影響を与えることができる：プロテアソームを介するタンパク質の分解を合図すること、タンパク質の細胞配置を変えること、タンパク質の活性に影響を与えること、及びタンパク質相互作用を促進するまたは防止することができる。ユビキチン化は、三つの主なステップにて実行される：それぞれ、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、及びユビキチンリガーゼ（Ｅ３）によって活性化、結合及び連結が行われる。この一連のカスケードの結果、ユビキチンは、タンパク質上のリジン残基にイソペプチド結合を介して、またはタンパク質のＮ末端のアミノ基にペプチド結合を介して結合する。
【００２０】
Ｅ１酵素としても知られる、ユビキチン活性化酵素は、ユビキチン化反応における第一ステップを触媒し、それは（とりわけ）プロテアソームを介して分解されるタンパク質を標的にすることができる。ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の、標的とされたタンパク質への共有結合は、真核生物においてタンパク質機能を調節するための主な機構である。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）は、ユビキチン化プロセスを開始する。ＡＴＰを伴うＥ１酵素は、ユビキチンタンパク質に結合する。次いで、Ｅ１酵素は、ユビキチンタンパク質を、ユビキチン担体または結合タンパク質（Ｅ２）と呼ばれる第二タンパク質に渡す。Ｅ２タンパク質は、ユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）と複合体化する。このユビキチンタンパク質リガーゼは、どのタンパク質がタグ付けされるべきかを認識し、そのタンパク質へのユビキチンの転移を触媒する。この経過は、標的タンパク質がそれ自体に付着するユビキチンが完全鎖を有するまで、それ自体反復する。
【００２１】
Ｅ２酵素として、及びより稀にはユビキチン担体酵素としても知られる、ユビキチン結合酵素は、プロテアソームを介して分解されるタンパク質を標的とするユビキチン化反応において第二ステップを行う。ユビキチン化プロセスは、７６個のアミノ酸の短いタンパク質であるユビキチンを、標的タンパク質上のリジン残基に共有結合させる。一度タンパク質が一つのユビキチン分子でタグ付けされると、ユビキチン化のさらなる繰り返しが、プロテアソームの２０Ｓコア粒子への通過を可能にする標的タンパク質のＡＴＰ依存性アンフォールディングを引き起こす、プロテアソームの１９Ｓ調節粒子によって認識されるポリユビキチン鎖を形成し、ここでプロテアーゼは、細胞による再利用のために標的を短いペプチド断片へと分解する。
【００２２】
ユビキチンリガーゼ（Ｅ３ユビキチンリガーゼとも呼ばれる）は、ユビキチン含有Ｅ２ユビキチン結合酵素と組み合わさり、ユビキチン化される標的タンパク質を認識し、イソペプチド結合を介して標的タンパク質上のリジンへのユビキチンの付着を引き起こすリガーゼ酵素である。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、プロテアソームによって分解される特定のタンパク質基質を標的にする。一般に、ユビキチンリガーゼは、ポリユビキチン化に関与する：第二ユビキチンは第一に付着し、第三は第二に付着し、同じように続く。ポリユビキチン化は、プロテアソームによって分解されるタンパク質をマークする。それぞれ、Ｅ２コンジュガーゼを結合することができる特定のタンパク質ドメイン、ならびに標的を結合するための基質特異的ドメインを含有する。多くのＥ２結合ドメイン及び基質結合ドメインが存在する。この豊富な種類は、Ｅ２コンジュガーゼを結合し、Ｅ２−Ｅ３複合体における酵素活性を媒介することが見出され得るＲＩＮＧ（Ｒｅａｌｌｙ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅ）ドメイン及びＥ２から基質へのユビキチンの転移に関与するＨＥＣＴドメインを含むユビキチンリガーゼファミリーと呼ばれる特定の群に分類されることが発見されている。分子生物学では、ＲＩＮＧフィンガードメインは、二つのＺｎカチオンを結合するＣｙｓ３ＨｉｓＣｙｓ４アミノ酸モチーフを含有するジンクフィンガータイプのタンパク質の構造ドメインである。このタンパク質ドメインは、４０から６０個のアミノ酸を含有する。ＲＩＮＧフィンガーを含有する多くのタンパク質はユビキチン化経路において重要な役割を担う。ＨＥＣＴドメインは、ユビキチン−タンパク質リガーゼにて見出されるタンパク質ドメインである。このドメインをＣ末端で含有するタンパク質は、ＣＤＣ２５のユビキチン化を調節するユビキチン−タンパク質リガーゼを含む。ユビキチン−タンパク質リガーゼは、Ｅ２ユビキチン結合酵素からチオエステルの形態でユビキチンを受け入れ、次いで、ユビキチンを標的基質に直接転移させる。システイン残基は、ユビキチン−チオエステル形成に必要とされる。
【００２３】
Ｅ３リガーゼの例としては、Ｅ３Ａ、ｍｄｍ２、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５（ＥＤＤ１）、ＳＯＣＳ／ＢＣ−ｂｏｘ／ｅｌｏＢＣ／ＣＵＬ５／ＲＩＮＧ、ＬＮＸｐ８０、ＣＢＸ４、ＣＢＬＬ１、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＣＷ１、ＨＥＣＷ２、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、Ｐａｒｋｉｎ、ＰＰＩＬ、ＰＲＰＦ１９、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１及びＷＷＰ２が挙げられる。
【００２４】
Ｅ３ＵｂリガーゼによってＵｂがタンパク質に付加されるプロセスは、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）によって遂行されるＵｂの除去の逆反応である。様々なＵｂ活性プローブが、ＤＵＢによるＵｂの除去をモニターするために開発されてきた。Ｕｂ活性プローブは、エピトープタグをＮ末端で有し、末端グリシン−グリシン（ＧｌｙＧｌｙ）の後に、求電子性トラップ（例えば、ビニルスルホン（ＶＳ））などの反応性化学部分が来るように修飾されたＣ末端を有するＵｂ部分からなる。反応性化学部分は、Ｅ３Ｕｂリガーゼの活性部位システインと不可逆的に反応する。Ｕｂ活性プローブの使用は、Ｅ３Ｕｂリガーゼを活性化するまたは阻害する小分子を同定するための化合物スクリーニングの基礎である。Ｕｂ活性プローブとのＥ３Ｕｂリガーゼの反応の程度が、Ｅ３Ｕｂリガーゼの自己ユビキチン化活性の程度と直接相関することが見出された。
【００２５】
ユビキチンリガーゼをモジュレートする小分子についてスクリーニングするために、自己阻害の増加または低減によってＥ３Ｕｂリガーゼをモジュレートする小分子を同定するようにスクリーニングを開発した。具体的には、Ｅ３Ｕｂリガーゼを、テスト化合物とインキュベートし、その後活性プローブを添加した。プローブ標識の増加は、化合物がＥ３Ｕｂリガーゼに対する活性プローブのアクセシビリティを増加させたことを示し、該化合物がＥ３Ｕｂリガーゼの活性化因子であることを示す。プローブ標識の低減は、化合物が活性部位に対するプローブのアクセシビリティを、おそらくは活性部位における活性部位システインに密接に結合することによって、またはプローブがもはや反応し得ないポイントへとリガーゼを変えることによって、効果的に遮断したことを示し得、それによって該化合物がＥ３リガーゼの阻害因子であることを示す。活性についての読み出しは、次のアッセイの１つ、ＴＲ−ＦＲＥＴ／ＨＴＲＦ／ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ／ＡｌｐｈａＬＩＳＡを通してなされると考えられる。これらは全て、Ｅ３Ｕｂリガーゼに共有結合した活性プローブの量をモニターするために、活性プローブ上のエピトープタグ（またはＵｂそれ自体に対する抗体）及びＥ３Ｕｂリガーゼの抗体を使用する類似した原理を有する（図１）。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定する方法であって、ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；リガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加または低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する。一態様では、リガーゼは、Ｅ３リガーゼである。好ましい態様では、Ｅ３リガーゼは、ＨＥＣＴまたはＲＢＲファミリーリガーゼである。別の態様では、化合物は小分子である。さらなる態様では、活性プローブは、ユビキチン結合ペプチド、反応性化学部分、ユビキチンペプチド及び標識を含む。さらなる態様では、ユビキチン結合ペプチドはＥ２である。別の態様では、標識は、蛍光、酵素または放射性標識である。一態様では、反応性化学部分は、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミドまたはエポキシコハク酸である。さらなる態様では、活性プローブは、エピトープタグをさらに含む。一態様では、標識の低減または増加は、ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦまたはＥＬＩＳＡであり得る、当該分野で周知の方法によって決定される。さらなる態様では、リガーゼ上のプローブ標識の低減はリガーゼの阻害因子を示し、リガーゼ上のプローブ標識の増加はリガーゼの活性化因子を示す。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明は、ユビキチンリガーゼの小分子阻害因子または活性化因子を提供し、それはユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；リガーゼ上のプローブ標識を測定することによって同定され、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加または低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する。
【００２８】
本明細書で用いるとき、「モジュレーター」は、ユビキチンリガーゼ活性を増加させるまたは低減させる任意の化合物または分子である。モジュレーターは小分子または生体分子などの化学化合物であることができる。
【００２９】
本明細書で用いるとき、「活性プローブ」は、ユビキチンリガーゼ活性を測定するために使用されるプローブである。プローブは三つの主な要素からなる：
１．ユビキチン結合酵素ペプチド、具体的には、Ｅ２−Ｅ３相互作用ドメインを形成するＥ２ペプチド；
２．Ｅ３リガーゼの活性部位システインと反応するように設計された反応性化学部分；及び
３．ユビキチンペプチド；具体的にはＵｂのｃ末端を形成し、Ｅ３−Ｕｂ相互作用ドメインを含有するのに十分な距離をＮ末端に延ばすＵｂペプチド。
【００３０】
これらの三つの要素は、反応性化学部分がＥ２ペプチドとＵｂペプチドとの間にあるように、１−２−３と順序立てされる。活性プローブは、標識及びエピトープタグをさらに含み得る。標識及びエピトープタグの例は、Ｈｉｓタグ及びＨＡ抗体を含む（実施例１を参照）。
【００３１】
本明細書で用いるとき、「反応性化学部分」は、ユビキチンリガーゼと反応する部分である。反応性化学部分は、ユビキチンリガーゼの活性部位と強くまたは不可逆的に反応する。具体的には、反応性化学部分は、Ｅ３リガーゼの活性部位にあるシステイン残基と反応する。反応性化学部分の例は、アクリル酸、ビニルスルホニル（ｓｕｌｆｏｎａｙｌｓ）、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド、αアミノニトリル及びエポキシコハク酸を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のアクリル酸について、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合し；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合している（図９ａ）。
【００３３】
特定の例では、本発明のビニルスルホニル（ｓｕｌｆｏｎａｙｌ）について、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合し；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合し；式中ＸはＯまたはＮであり；式中Ｒ４はＸがＯの場合には存在せず、ＸがＮであるときにメチルである（図９ｂ）。
【００３４】
特定の例では、本発明のアシルオキシメチルケトンについて、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合し；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合し；式中ＸはＯまたはＮであり；式中Ｒ４はＸがＯの場合には存在せずＸがＮの場合にメチルであり；及び式中Ｒ５は芳香族環であり、これは好適に置換されてＲ１への結合を可能にし、Ｅ３活性部位システインと相互作用するときに解離基として作用するＲ１−Ｒ５−ＣＯＯの能力を促進する（図９ｃ）。
【００３５】
特定の例では、本発明のβ−ラクトンについて、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合し；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合している（図９ｄ）。
【００３６】
特定の例では、本発明のシアナミドについて、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合しているか、またはＲ１は存在せず；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合し；式中ＸはＯまたはＮであり；式中Ｒ４はＸがＯの場合には存在せずＸがＮの場合にメチルであり；及び式中Ｒ５は芳香族環であり、これは好適に置換されてＲ１への結合を上述のように可能にし、Ｅ３活性部位システインと相互作用するときに解離基として作用するＲ１−Ｒ５−ＣＯＯの能力を促進する。一般的に、ＮＲ２Ｒ３は、環窒素に隣接する複素環に結合していない場合がある。Ａは、１〜３個の置換されていてもよい炭素であり得、環の一部であり得、Ｂは２〜３個の置換されていてもよい炭素であり得、環の一部であり得る（図９ｅ）。
【００３７】
特定の例では、本発明のエポキシコハク酸について、式中Ｒ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に、化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通してアミノ酸配列のシステイン残基へと、直接的にセリンへとまたはＯＨまたはＮＨ２を側鎖に有する別の天然または非天然アミノ酸へと、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に類似する配列内の天然または非天然アミノ酸の別の側鎖ＯＨまたはＮＨ２へと結合し；式中ｍ＝１〜６であり、かつｍは芳香族、複素芳香族、炭素環または複素環の一部であり得；式中Ｒ２はＨまたはメチルであり；式中Ｒ３は、直接的にまたは小さな化学的に安定な小さいアルキルリンカーを通して、配列番号６、配列番号７、配列番号８の配列または最大５残基までが他の天然に存在するアミノ酸であり得るより短い配列のＣ末端へと結合し、式中Ｎ＝２〜５であり、かつＮは環の一部であり得、式中Ｒ６はＨまたはメチル基である（図９ｆ）。
【００３８】
本発明の活性プローブは、活性部位システインを含有する病原体エフェクターＥ３Ｕｂリガーゼを阻害する小分子の同定のために使用することができる。病原体由来のエフェクターは、それら自身の利益のために哺乳類のＥ３Ｕｂリガーゼを模倣し、哺乳類Ｅ３Ｕｂリガーゼに対する全体の配列相同性は不一致であるが、活性部位システインの周辺の配列は保存されている。大半の場合において、これらのエフェクターリガーゼの基質は未知であるが、触媒作用的に活性のない（ｄｅａｄ）リガーゼの過剰発現は感染を防止し、これはＥ３Ｕｂリガーゼの活性が病原体にとって必要不可欠であることを示唆する。例として、サルモネラ・エンテリカからのＳｏｐＡ及び大腸菌からの新規Ｅ３リガーゼファミリー（ＮＥＬ）、赤痢菌及びシュードモナスが挙げられる。これらのエフェクターリガーゼの酵素活性の機能的読み出しとして活性プローブを使用して、本発明者らは、エフェクターＥ３Ｕｂリガーゼ活性を特異的に阻害する小分子を同定することを目指す。
【００３９】
本発明の活性プローブは、腫瘍内で活性化されるＥ３Ｕｂリガーゼの同定のために使用することもできる。ヒト癌の転写プロファイリングは、正常組織と疾患組織の間でそのレベルが異なる原因遺伝子を同定するために広く使用されている。しかしながら、転写産物量が常に活性に相関するわけではないために、酵素の研究についてはこのアプローチには限界がある；ゆえに、酵素活性について報告する正確な定量的測定に対する実際の必要性がある。タグ付けされた活性プローブ及び質量分析法は、腫瘍内で酵素活性が著しく増強されたＥ３Ｕｂリガーゼを同定するために使用することができる。
【００４０】
Ｅ３Ｕｂリガーゼは、生物学の多くの分野に関する重要な細胞調節因子であり、本発明者らが同定する分子はそれ自体、代謝障害、神経変性、炎症、感染、癌を含むがこれらに限定されない多くの適応症にわたって使用され得る。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、病原体由来のユビキチンリガーゼを阻害する化合物を同定する方法であって、前記ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること；その混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること；及びリガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対照と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性の阻害因子として同定する。一態様では、ユビキチンリガーゼはＳｏｐＡまたは新規Ｅ３リガーゼファミリー（ＮＥＬ）である。さらなる態様では、病原体は、サルモネラ・エンテリカ、大腸菌、赤痢菌またはシュードモナスである。
【００４２】
一態様では、本発明は、腫瘍内で増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する方法であって、ユビキチンリガーゼを含有する腫瘍試料を、標識を含む活性プローブと接触させること、及びリガーゼ上のプローブ標識を測定することを含む、前記方法を提供し、ここで対象と比較したときのリガーゼ上のプローブ標識の増加が、増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する。一態様では、腫瘍は、リンパ腫、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、または頭頸部癌である。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。それらは使用され得るものの典型であるが、当業者に周知の他の手順、方法論、または技術を代替的に使用してもよい。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
ユビキチンリガーゼのモジュレーターを同定するために、Ｅ３Ｕｂリガーゼをアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ＮＰ４０、ｐＨ６．８）に希釈し、マルチウェル非結合プレートのウェルに添加する。化合物を各ウェルに添加した後、少なくとも３０分間インキュベートする。活性プローブ（Ｕｂ−ビニルスルホン（Ｕｂ−ＶＳ）など）を添加し、室温で反応を進行させる。ユウロピウム（ＩＩＩ）クリプテートまたはニッケルキレートアクセプタービーズなどのドナーとコンジュゲートしたＥ３Ｕｂリガーゼのエピトープタグ（例えばＨｉｓ）に対する抗体をウェルに添加する。ＸＬ６６５などのアクセプターとコンジュゲートしたＵｂ−ＶＳのエピトープタグ（例えばＨＡ）に対する抗体、またはビオチン標識されたＵｂ抗体（ストレプトアビジンドナービーズとコンジュゲートした）を停止緩衝液中のウェルに添加し、及び混合物を、決定された最適化された時間にわたってインキュベートする。
【００４５】
プレートリーダーを使用して発光を読み取った。発光量は、活性プローブと反応する活性Ｅ３の量に比例する。プローブにコンジュゲートしたＥ３Ｕｂリガーゼの存在下では、二つのビーズはお互いに近接する。ドナービーズの励起は、アクセプタービーズにおけるエネルギー転移を引き起こす一重項酸素分子の遊離をもたらし、結果発光する。発光は、ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ及びＥＬＩＳＡを含む、当該分野で周知の任意の方法で測定することができる。プローブ標識に低減があった場合、化合物はユビキチンリガーゼを阻害した。プローブ標識に増加があった場合、化合物はユビキチンリガーゼを活性化した。
【００４６】
実施例２
Ｅ３リガーゼの構造及び触媒活性の決定
ＰａｒｋｉｎはＥ３リガーゼの一例である。１．５８Å構造のＰａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲが表され、それは、４つのＲＩＮＧドメインの折り畳み構造（ｆｏｌｄ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）及びいくつかの予期せぬ境界面を明らかにする。Ｐａｒｋｉｎ活性部位の検査は、触媒ネットワークがＣ４３１及びＨ４３３からなることを示唆する。細胞では、Ｃ４３１の変異がミトコンドリアのＰａｒｋｉｎ触媒性分解を消失させ、ユビキチンオキシエステルの捕捉がＣ４３１をＰａｒｋｉｎの細胞活性部位として確証させた。本発明者らのデータは、ＰａｒｋｉｎがＲＩＮＧ／ＨＥＣＴハイブリッド型であること、及び原子分解能でのＲＢＲ Ｅ３リガーゼの最初の結晶構造であることを確かにし、この疾患に関連するタンパク質に対する見識を提供する。Ｐａｒｋｉｎのドメイン構成及びＰａｒｋｉｎリガーゼ活性の調節に対する見識を得るためには、高分解能でＰａｒｋｉｎの結晶構造を得ることが求められた。この１．５８Å構造は、Ｐａｒｋｉｎが複数の予期せぬドメイン境界面を有する比較的コンパクトな全体構造を形成することを明らかにする。これらの境界面は、Ｐａｒｋｉｎについての潜在性及び活性化状態の理解のための基盤を形成し、ならびに活性部位システインＣ４３１の役割及び触媒作用を促進するＣ４３１に近接する残基のネットワークに対する見識を提供する。
【００４７】
Ｅ３リガーゼのＲＢＲクラスに対する見識を得るために、ＲＩＮＧ（Ｒ０）及びＲＢＲドメインを含むＰａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ（残基１４１〜４６５）（図３ａ及び３ｂ）の結晶を成長させた。構造を、個別のＲＩＮＧドメインによって結合されたＺｎイオンからの信号を使用して多波長異常分散法（ＭＡＤ）データの分析によって決定し、１．５８Åへと高分解能データに対して精密化した（座標及び構造因子は、ＲＣＳＢ蛋白質構造データバンクに、アクセッションコード４Ｉ１Ｆ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｐ２２３）及び４Ｉ１Ｈ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｓ２２３）で寄託されている）。Ｐａｒｋｉｎの二つの構造を解析して、Ｐａｒｋｉｎの元来報告されている配列（Ｐ２２３を含有する）とアップデートされた配列（Ｓ２２３）との間に任意の顕著な構造的差異があるかどうか決定した。全体的な二つの構造は非常に類似する；しかしながら、Ｓ２２３を含有するループはＰａｒｋｉｎ−Ｒ０ＲＢＲでは目に見えるが、Ｐ２２３構造では見えない。各ＲＩＮＧドメインは二つのＺｎイオンを結合し、Ｚｎ配位に関する文献における矛盾を解決する（図３ｃ）。Ｒ０ドメイン（残基１４１〜２１６）は、以前は観察されなかったドメインフォールドであり（Ｄａｌｉに基づく）、一方でＲ１（残基２２８〜３２８）は、古典的なクロスブレース配置及び標準的なＲＩＮＧドメインのＺｎ配位を示す。ＩＢＲドメインは、公表されたＮＭＲ構造に類似する。ＰａｒｋｉｎのＲ２ドメインはＩＢＲドメインに最もよく似ており、ＨＯＩＰ ＩＢＲドメインに非常に類似する。反対に、Ｒ２は、密接に関わるＨＨＡＲ１ Ｒ２ ＮＭＲ構造から著しく異なる。
【００４８】
全体的なＲ０ＲＢＲ構造は、二つのリンカーによって分離された二つのコンパクトなドメイングループを明らかにした（図３ｂ）。一方のドメインは、小さな疎水性パッチによってそれらの界面境界にて形成されるＲＩＮＧ１（Ｒ１）及びＩＢＲ間の会合で構成される。Ｒ１が標準的なＲＩＮＧ構造を有するために、他のＲＩＮＧリガーゼの構造に基づき、Ｅ２への結合部位として可視化され得る。他方のドメインは、Ｒ２のＣ末端領域及びＲ０の疎水性コア間の合計約１３３０Ａ２表面領域を必然的に含む、Ｒ０及びＲ２の密接な会合によって形成される（図３ｂ、４ｃ）。Ｒ２は、Ｒ０との疎水性境界面に近い本提唱の触媒システイン（Ｃ４３１）を含有する。Ｒ０：Ｒ２境界面は、他のＲＢＲリガーゼとは異なる配列をＲ０内ならびにＲ２のＣ末端内に必然的に含むためにＰａｒｋｉｎに特有である。二つの主要なドメイン間のＲ０−Ｒ１リンカー領域はコイルコンフォメーションを有し、比較的親水性の境界面に属し（図４ａ）、これが潜在的構造柔軟性の領域であり得ることを示唆する。ＩＢＲ−Ｒ２リンカー領域（テザーと呼ばれる：残基３７８〜４１４）は３７残基長である。テザーの始まり（１４残基）の大半は無秩序であるが、後半部はＲ１の表面を横断する。テザーはＲ１と重要な相互作用を形成するが、潜在的柔軟性の領域でもある。二つのターンへリックス（残基３９４〜４０１）はＲ１に対して集まり、近くにある残基Ｗ４０３はテザーをＲ１に留めるため及びそれをＲ２と会合させるための「ピン」として役割を果たし得る（図２ｂ）。Ｗ４０３の側鎖はいくつかのＲ１残基によって形成された疎水性ポケット内に位置し、哺乳類においてのみ見出される残基であるＶ４６５の末端カルボキシレートと水素結合を形成する。上述のように、Ｒ１は、Ｐａｒｋｉｎ上のＥ２結合部位である可能性があり、テザーの位置はこの相互作用を調節する可能性を有する（図４ｂ）。
【００４９】
チオール交換反応（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）におけるＥ２の相互作用からもたらされる交絡因子を伴わないＰａｒｋｉｎの触媒機構のアクセシビリティを調べるために、活性プローブＵｂ−ビニルスルホン（Ｕｂ−ＶＳ）を使用した。Ｕｂ−ＶＳは、ＤＵＢ及びＨＥＣＴリガーゼの活性部位システインを、Ｕｂの特異的認識及びＶＳ部分の指向性配置を通して、共有結合修飾すると考えられる特定のプローブである。ＰａｒｋｉｎのＲ０ＲＢＲドメインはＵｂ−ＶＳと弱く反応し、一方でＰａｒｋｉｎのＲＢＲドメインは、分子量で約８ｋＤａのシフトを生成し、これはＰａｒｋｉｎのＲＢＲドメインがＲ０ＲＢＲよりもプローブにより反応性であることを示した。Ｎ末端でＳＵＭＯタグ付けされたＲ０ＲＢＲもこのアッセイにおいて活性であった（図５ａ）。これらの結果は、Ｒ２と近くに並べられた、Ｒ０の除去または修飾は、活性部位付近での立体構造変化を可能にして、プローブ反応性を亢進し得ることを示唆する。Ｕｂ−ＶＳプローブ標識の強さは、酵素の活性部位の機能状態と相関することが示唆されており、この考えを支持するとして、本発明者らは自己ユビキチン化活性がプローブ結合と一致することを見出した（図５ａ）。さらには、これらの結果は、Ｒ０ＲＢＲ  Ｐａｒｋｉｎ構築物と比較してＲＢＲの活性のレベルが高いことを実証する最近発表された研究と一致する。質量分析法を使用して、本発明者らはＵｂ−ＶＳがＰａｒｋｉｎのＣ４３１にのみ付着することを確かめ、他のＵｂ様ＶＳ部分が強くＰａｒｋｉｎを標識しなかったためＰａｒｋｉｎの標識はＵｂ−ＶＳに特異的であることを確かめた。ＤＵＢ活性も有するリガーゼ（Ａ２０）の例があるが、これはＰａｒｋｉｎの場合ではなく、ＰａｒｋｉｎがＵｂ−ＶＳプローブで標識され得る理由でもないと思われる。
【００５０】
チオール交換反応では、活性部位システインは、Ｅ２−Ｕｂチオエステルカルボニル結合の求核攻撃のために活性化される必要がある。システインの活性化及び結果得られる四面体中間体の安定化は、システインプロテアーゼまたはＤＵＢに見出される特徴的要素の存在を要する：活性化する触媒二残基または三残基、及び骨格または側鎖水素結合ドナーによって骨組みされるオキシアニンホール。Ｐａｒｋｉｎの活性部位Ｃ４３１を囲む残基の検査によって、推定上の活性部位三残基がＣ４３１、Ｈ４３３及びＥ４４４からなることが明らかになった（図５ｂ）。これらの残基は、検査されたＰａｒｋｉｎの全ての種にわたって保存され、Ｆ１４３３及びＥ４４４の変異は、中性ｐＨでのＵｂ−ＶＳプローブの反応性を著しく崩壊させ（図５ｃ）、Ｃ４３１の変異によって反応性は完全に消失した（図５ａ、ｃ）。触媒二残基または三残基内のヒスチジンの役割は、活性化のためにシステインを脱プロトン化する塩基として機能することであり、ｐＨを高めることによって不必要になり得る可能性がある役割である。この機構と一致して、Ｈ４３３ＡまたはＨ４３３Ｎが中性ｐＨでほとんどプローブ反応性を示さない一方で、プローブ標識はｐＨ滴定で修復されたことが見出された（図５ｃ）。ＤＵＢによくあるように、この構造ではＣ４３１及びＨ４３３は触媒するには十分に整列されておらず、触媒を起こすためには立体構造的再編成が生じなければならないことを暗示する（図５ｂ）。
【００５１】
細胞では、ＣＣＣＰなどのミトコンドリア毒素で処置した後、Ｐａｒｋｉｎが、ミトコンドリアタンパク質のＰａｒｋｉｎ触媒性分解において重要な役割を果たすということが示されている。細胞内のＣ４３１の機能活性をアッセイするため、Ｔｏｍ２０損失を、ＣＣＣＰ処置後のミトコンドリアタンパク質のＰａｒｋｉｎ触媒性分解の尺度として検査した。マイトフュージン及び他のミトコンドリアタンパク質がＰａｒｋｉｎ基質であると報告されている一方、ここでのＴｏｍ２０損失は、ＣＣＣＰ処置後の高度に再現性があるＰａｒｋｉｎ依存性事象であった。活性部位システイン変異体であるＣ４３１Ｓ及びＣ４３１Ａは、可溶性でありかつ良好に動作する一方で、この細胞アッセイにおいては機能することができなかった（図６ａ）。これは、ミトコンドリアへのストレス中のＰａｒｋｉｎの活性部位Ｃ４３１の利用と矛盾しない。さらには、Ｃ４３１Ｓ変異体がＣＣＣＰの存在下でのみＵｂオキシエステルを形成することが実証され、これはＣ４３１を細胞内の活性部位残基として（図６ｂ、ｃ）、及びＰａｒｋｉｎがＣＣＣＰによって活性化され得る潜在活性を有することを直接支持する。しかし、ミトコンドリアへのＰａｒｋｉｎの転座にもＣ４３１が関与する正式な可能性がある。本発明者らの細胞アッセイにおけるＨ４３３及びＥ４４４の変異は、どちらの変異もタンパク質レベルに影響を与えなかったものの、Ｈ４３３についての必要性を明らかにしたが、Ｅ４４４について必要性はなかったことを明らかにした。なぜＥ４４４が細胞において必ずしも必要でないのかは明らかではないが、ＰａｒｋｉｎはＨｉｓの配置においてＧｌｕの役割を提供する結合パートナーを細胞内で有し得るか、またはミトコンドリア膜でのｐＨが、Ｃ４３１の脱プロトン化にＥ４４４を必ずしも必要としないようにする可能性がある。Ｃｙｓ、Ｈｉｓ及びＧｌｕ残基が全ての種類のＰａｒｋｉｎにわたって完全に保存されている一方で、モチーフは全てのＲＢＲリガーゼにわたって保存されておらず、他のＲＢＲリガーゼは異なる触媒機構を使用し得る。
【００５２】
ＰａｒｋｉｎのＣ末端先端の検査は、−３位で保存されたフェニルアラニン（Ｆ）、Ｆ４６３を明らかにし、−５位から−３位のＰｈｅは、ＨＥＣＴリガーゼ内に入ってくる基質リジンの配置のために重要な決定因子であると記載されてきた。Ｆ４６３のチロシンへの変異（図６ｄ）は、Ｔｏｍ２０損失の細胞におけるＰａｒｋｉｎの活性、ならびにインビトロでの自己ユビキチン化活性およびＲ０ＲＢＲのＵｂ−ＶＳプローブ結合の劇的な増加を亢進した（図６ｅ、ｆ）。これは、ＰａｒｋｉｎのＣ末端先端で保存されたＦ４６３が、これまで構造的に記載されていたＨＥＣＴリガーゼのＣ末端先端とは異なる能力において役立つ可能性があることを示唆する。本発明者らの構造では、Ｆ４６３は、Ｒ０：Ｒ２境界面の統合性に寄与すると予測される重要な疎水性相互作用に関与し（図４Ｃ）、上述のデータと合わせて、この結果はＰａｒｋｉｎ構造において規定されているＲ０：Ｒ２境界面がＰａｒｋｉｎの活性部位の調節において重要であることを示唆する。実際、Ｒ０：Ｒ２境界面を含むいずれの疎水性残基の変異も、自己ユビキチン化活性の増大をもたらす。ゆえに、Ｐａｒｋｉｎにおける−３Ｐｈｅは、他のＨＥＣＴリガーゼにおいて同じように置かれた残基とは異なるように機能し、Ｐａｒｋｉｎ活性をＲ０：Ｒ２境界面の統合性における変化を通して増大させることができることを示唆する。
【００５３】
Ｐａｒｋｉｎにおける２８個（おおよそ７０個の内の）のヒト遺伝的変異は、本発明者らの構造におけるマッピング解析のために様々なＰａｒｋｉｎドメイン（Ｒ０ＲＢＲ内）全体を通して公平な分布を表すように選択された。Ｐａｒｋｉｎにおけるこれらの変異の検査は、Ｚｎ配位と直接関わるまたは密接に並べられた残基に対して１０箇所マッピングされたことを明らかにした。他の変異は、それぞれの４つのドメイン及びテザーに存在し（図７）、二つの機能領域にざっと分類することができる；Ｅ２結合及び触媒システインを囲む領域。テザーの短いα−へリックスの領域内でＲ１と密接に会合するリンカーにおいて生じる三つのＰＤ変異（Ｒ３９６Ｇ、Ａ３９８Ｔ、Ｒ４０２Ｃ／Ｈ）があり、Ａ３９８ＴはＲ１との相互作用を直接撹乱すると予測され得、Ｅ２結合と関連を有する。さらには、Ｒ１変異Ｔ２４０Ｒは、実験によって報告されたようにＥ２結合を妨害し得る。ＩＢＲドメイン及びＲ１：ＩＢＲ境界面における変異は、構造的統合性及びＥ２結合を崩壊させ得る。最後に、数多くの変異が触媒Ｃ４３１の周辺で生じ、これらの変異は基質／補因子結合または触媒有効性を崩壊させる可能性がある。
【００５４】
Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲの構造を高分解能で解析した。全体的に、この構造は、ＨＨＡＲＩの以前の生化学分析によって示唆されてきたように、ＲＩＮＧ及びＨＥＣＴリガーゼの特徴を実証する。この構造の分析は、Ｐａｒｋｉｎタンパク質のいくつかの新しい態様を明らかにし、それは、線形マッピング研究からは示されなかった、Ｒ０及びＲ２についての新規ＲＩＮＧ構造、分子レベルでの触媒活性に対する見識、ドメイン間の予期しない境界面、及びヒトＰＤ変異のクラスター形成を含む。
【００５５】
Ｐａｒｋｉｎについての個別のＲＩＮＧドメインは、Ｚｎイオンを配位する特定の残基、ならびに古典的なＥ２結合ドメインを規定する標準的なＲＩＮＧクロスブレース構造に対するそれらの関係に関して多くの議論の対象とされてきた。Ｒ１は、このドメインを規定するクロスブレース構造を有する、典型的なＥ２結合モチーフを実証するＰａｒｋｉｎの唯一のＲＩＮＧドメインである。Ｒ０は、新規ドメイン構造であるが、Ｅ３ ＲＩＮＧドメインよりもジンクフィンガードメインにより類似する（図１）。ＩＢＲドメインは、主に、Ｐａｒｋｉｎから単離されたＩＢＲドメインの高品質ＮＭＲ研究から予測されたものである。ＲＩＮＧ２は、Ｐａｒｋｉｎ及びＨＯＩＰのＩＢＲドメインに類似する。しかしながら、どちらもクロスブレース構造を有さず、標準的なＲＩＮＧドメインモチーフに似ていない。これらの知見は、ＲＩＮＧ命名法がＲ０、ＩＢＲ及びＲ２ドメインにとって実際に適切であるかどうかに疑問を投げかける。
【００５６】
ＲＢＲリガーゼをＲＩＮＧ／ＨＥＣＴハイブリッド型と規定する以前の研究は、Ｒ２ドメイン中にＨＥＣＴ様触媒システイン残基を予測した。Ｒ２ドメインが典型的なＨＥＣＴ構造に似ていない一方、本発明者らの分析はＣ４３１に触媒システインがあることを確かにした。Ｐａｒｋｉｎについて見いだされているものと同様に、一連の細菌性リガーゼは触媒システイン残基を通して機能すると最近記載されているが、ＨＥＣＴドメインに対して類似する配列または構造は有さない。ゆえに、細菌性リガーゼ、ＲＢＲリガーゼ及びＨＥＣＴリガーゼは触媒システインを通して機能するが、構造的及び配列に関しては異なる。
【００５７】
機構的に、残基は、Ｃ４３１を用いて機能して触媒を促進し得る触媒性コアにおいて同定される。Ｈ４３３及びＥ４４４の変異研究は、インビトロ及び細胞内で、Ｃ４３１を通して触媒活性を促進するためにＨ４３３が必要とされることを実証した。この知見がＤＵＢについて実証されてきたように触媒三残基／二残基機構を表すかどうか、または他の残基との水素結合ネットワークを通して機能する機構を表すのかどうかはまだ、より詳細な変異分析を通して決定されるべきである。しかしながら、Ｕｂ−ＶＳプローブの使用は、Ｈ４３３がＣ４３１でのＥ２からＥ３へのチオール交換ステップに関与することを明確に実証する。重要なことに、Ｃ４３１へのアクセスは、制限され得、Ｐａｒｋｉｎ活性を調節する方法として役立ち得る。
【００５８】
Ｒ０ＲＢＲ構造は、分子が二つに折りたたまれて、Ｎ末端及びＣ末端が、二つのリンカーによって分離された二つのコンパクトなドメイングループを含む広大な境界面を形成することを明らかにした（図３ｂ）。一方のドメイングループは、Ｒ１及びＩＢＲ間の会合で構成され、他方のドメイングループは、Ｒ０及びＲ２の密接な会合によって形成される。Ｒ１：ＩＢＲドメイングループは、本発明者らが「テザー」と命名した、ＩＢＲの一部によって妨害されるように見える、推定上のＥ２結合部位を含有する。Ｗ４０３を含むこのテザー領域の変異解析によって、Ｅ２アクセスに関するＰａｒｋｉｎの活性化に対する重要な見識を得る可能性がある。Ｒ０：Ｒ２ドメイングループの鍵となる特徴は、Ｒ０上の疎水性領域へのＰａｒｋｉｎ  Ｒ２のＣ末端の配置である。Ｒ０：Ｒ２境界面は二つの方法でＰａｒｋｉｎ活性化の調節に寄与し得る：Ｐａｒｋｉｎ  Ｃ４３１へ入ってくるＵｂのＣ末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアクセスを制限することによる方法、及びＰａｒｋｉｎの触媒機構、つまりＨ４３３及びＣ４３１のミスアライメントによる方法。Ｒ０：Ｒ２境界面の機能分析は、個別の疎水性残基の変異が、Ｐａｒｋｉｎの自己ユビキチン化の活性化、及びプローブ標識をもたらしたことを示した（図６）。プローブ標識は、活性部位へのアクセス、及び触媒残基の適切な配置に依存するため、この結果は、Ｒ０：Ｒ２境界面変異が上述の二つの方法の一方または両方において機能する可能性があることを示唆する。ＢｉａｃｏｒｅではＵｂ結合の増加はこれらの変異体において観察されず、これは、それらがＵｂへの親和性を増加するようには機能しないことを示唆する。本発明者らの構造では、Ｈ４３３は、Ｗ４６２との水を媒介する水素結合に関与し、Ｃ４３１の脱プロトン化（図５ｃ）には利用可能ではなく、これは、触媒残基のミスアライメントを通した酵素の不活性な状態を表している。
【００５９】
注目すべきことに、Ｆ４６３の変異はＰａｒｋｉｎ活性の損失をもたらさない。他方のＨＥＣＴリガーゼでは、同様に置かれたフェニルアラニンがＥ３リガーゼチオエステル結合Ｕｂを基質への転移のために位置付けると考えられており、活性のために重要である。ゆえに、ＰａｒｋｉｎがＨＥＣＴリガーゼに類似する触媒システイン活性を呈する一方で、−３Ｐｈｅが異なる能力で機能するように見えるために、機能的にも異なる。最後に、Ｒ１：ＩＢＲ及びＲ０：Ｒ２によって形成される二つの大きなドメイン間の境界面内での動きは、ＵｂｃＨ７（Ｒ１に結合する）の触媒システインとＰａｒｋｉｎのＲ２にある活性部位Ｃ４３１を並置するという方法を提供し得る。本発明者らの現在のモデルでは、Ｐａｒｋｉｎに結合したＥ２（ＵｂｃＨ７）は、Ｃ４３１のチオール交換を生じさせるには遠すぎる。該構造は、ＵｂｃＨ７からＰａｒｋｉｎへのチオール交換を容易にするための立体構造変化の可能性を示唆する。この動きは、それによってＲ１：ＩＢＲ及びＲ０：Ｒ２が、ベージュ色の柔軟なリンカー及びテザー領域（図３ｂ、ｃ、及び図４ａ）を介して互いに対して動くバタフライ効果（ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ  ｍｏｔｉｏｎ）のそれであると想定される。しかしながら、これらの境界面の完全な変異解析、及びチオール交換中のＵｂｃＨ７に結合したＰａｒｋｉｎの構造決定がこの問題に取り組むために必要と考えられる。かかる研究は、他のリガーゼについてはなされており、かなりの立体構造柔軟性を促進する及び可能にするリンカーを実証している。この構造分析及びＰａｒｋｉｎのＰＤ変異のマッピングは、変異によって影響を受ける鍵となる機能領域がＰａｒｋｉｎ上にあることを実証する。大きくは、変異は三つの群にまとめられる：１．全体的な構造の安定性に影響を与える可能性がある、Ｚｎ配位残基；２．Ｅ２への直接結合部位、ならびにテザー残基の動きに影響を与え得るまたはＥ２−Ｅ３結合相互作用についていまだに理解されていない態様に影響を与え得る予測されるＥ２結合部位に近位する領域に変異を有する、予測されるＥ２結合領域；及び３．残基Ｃ４３１周辺の触媒領域。このマップは、触媒、Ｅ２結合、立体構造柔軟性、潜在状態の活性化、ならびに重要な結合パートナーのための潜在的領域におけるこれらの変異の機能的役割について将来行われる調査研究において非常に有用となると考えられる。機能的研究は、単離したＰａｒｋｉｎ変異の鍵となる特徴も規定しており、いくつかのこれらの変異はミトコンドリアの局在化にとって重要であるＰａｒｋｉｎの領域の同定を助け得る。この研究においてマッピングされた変異が分子の一面上で大体生じるという事実は、他の分子に対する配向性に関する特異的機能性を示唆する。この研究の以前は、全体図にてＰａｒｋｉｎ変異を理解することは非常に難しかったが、この構造のスナップショットは新しい仮説を試験するための地図を提供すると考えられる。
【００６０】
この構造データ、生化学データ及び細胞データは、ＰａｒｋｉｎがＲＩＮＧ／ＨＥＣＴハイブリッド型として機能することを示す。おそらくＰａｒｋｉｎは標準的なＲＩＮＧドメイン上に保存された構造モチーフを通してＥ２を結合し、さらに、その活性がＲ０及びＲ２ドメイン間の相互作用を通して調節され得るＨＥＣＴ様活性部位システインを通して機能する。Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲのこの構造は、リガーゼ活性を増加させることを目的とする創薬の努力のために、ならびにＥ３リガーゼのこの新しいクラスにおけるユビキチン化の分子機構を解明するために有用であると考えられる。
【００６１】
方法
一般試薬及びＤＮＡ構築物
全てのＰａｒｋｉｎ構築物についてのＤＮＡ鋳型は、ＮＭ＿００４５６２及びＮＭ＿００４５６２．１であった。細菌での発現のために、完全長Ｐａｒｋｉｎ（１〜４６５）、Ｒ０ＲＢＲ（１４１〜４６５）及びＲＢＲ（２３８〜４６５）を、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  ＳＵＭＯベクターへと製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってクローニングした。哺乳類での発現のために、Ｐａｒｋｉｎ（タグ付けされていない完全長）を、ｐｃＤＮＡ３．１へとクローニングした。全ての変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して作製された。ウェスタンブロット法のために、製造業者の推奨に従い、全ての抗体を１：１０００で使用した。抗Ｐａｒｋｉｎ抗体（Ｐｒｋ８）はＳｉｇｍａ製であった。抗Ｐａｒｋｉｎ抗体（ＨＰＡ１Ａ）は、ＰａｒｋｉｎのＮ末端ペプチド（ａ．ａ．８５〜９６）に対して生じたウサギポリクローナル抗体であった。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。抗Ｕｂ抗体（ＦＫ２）は、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。ウサギ抗Ｔｏｍ２０抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製であった。Ａｌｅｘａ５９４及びＤａｐｉは、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製であった。マウス抗ＨＡ抗体は、Ｃｏｖａｎｃｅ製であった。ＣＣＣＰは、Ｓｉｇｍａ製であった。Ｅｌ、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ８、Ｕｂ、Ｍｇ−ＡＴＰ溶液は、全てＢｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ製であった。ＨＡ−ＵｂＶＳ及び全ての他のＵｂ様ＶＳは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ製であった。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース樹脂及び３Ｘ  ＦＬＡＧペプチドはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。プロテインＡビーズはＲｅｐｌｉｇｅｎ製であった。
【００６２】
タンパク質の発現
細菌発現構築物を、ＢＬ２１  ＤＥ３大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと形質転換した。新鮮なコロニーから播種された一晩培養したものを、２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で増殖させた。翌朝、一晩培養したものをＯＤ６００  ０．１まで希釈し、ＯＤ６００が０．４に達するまで３７℃で振とうし続け、次いでフラスコを１６℃に移し、ＯＤ６００が０．８から０．９の際に、培養物に、５０μＭの塩化亜鉛を補充した０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを導入し、発現を１８〜２０時間にわたって１６℃で進行させた。次いで、細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で凍結した。
【００６３】
タンパク質の精製
高性能Ｎｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ１０／１０陰イオン交換カラム、及びＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムは全てＧＥ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムでＦＰＬＣを行った。紫外可視吸光度読み取り値をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で取得した。タンパク質を、変性条件下で１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル上でＭＥＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。変性させたタンパク質についての吸光係数を、ｅ＝５６９０ｃｍ−１Ｍ−１×（ｔｒｐの数）＋１２８０ｃｍ−１Ｍ−１×（ｔｙｒの数）＋１２０ｃｍ−１Ｍ−１×（ｃｙｓの数、ここでｃｙｓ＝システインまたはジスルフィド結合）に従って、一次配列から決定した。
【００６４】
細菌由来のＳＵＭＯ−Ｐａｒｋｉｎ構築物の精製のために、細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２５０μＭ  ＴＣＥＰ、及びＥＤＴＡを含まないＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビタータブレット（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁し、マイクロフルイダイザーを使用して溶解した。溶菌液を清澄化（４５，０００ｇ、２５分、４°Ｃ）し、上清を高性能Ｎｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（０．６２５ｍｌ樹脂／Ｌ細胞培養液）を用いて４℃で１時間穏やかに撹拌した。ビーズを２０ｍＭのイミダゾールを含有する１０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、次いで４０ｍＭのイミダゾールを含有する１０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。タンパク質を２００ｍＭのイミダゾールを含有する１０カラム体積の緩衝液で溶出した。溶出の後、タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に４℃で２時間透析し、塩濃度を減少させた。次いで、タンパク質を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び２５０μＭ  ＴＣＥＰ）中で前もって平衡化されていたＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ１０／１０陰イオン交換カラムへと充填した。カラムを５０カラム体積にわたって０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配で展開し、タンパク質を１１３〜１８０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。次いで収集した画分を濃縮し、緩衝液Ｃ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で前もって平衡化されていたＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムへと注入した。カラムを１．５ＣＶの緩衝液Ｃで溶出した。
【００６５】
ＳＵＭＯタグの除去については、Ｍｏｎｏ  Ｑカラムの後にタンパク質をＳＥＮＰ１（１０：１のタンパク質対ＳＥＮＰ１のｗ／ｗ比率）と２時間４℃でインキュベートしたことを除いて上述のように精製を行った。インキュベーションの後、１０ｍＭのイミダゾールを切断反応物に添加し、該反応物を高性能Ｎｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（０．６２５ｍｌ樹脂／Ｌ細胞培養物）で精製した。Ｎｉカラムを１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。Ｎｉカラムからの洗浄物及びフロースルーの両方を収集し、緩衝液Ｃ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で前もって平衡化されていたＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムへと注入した。カラムを１．５ＣＶの緩衝液Ｃで溶出した。
【００６６】
結晶化及び構造決定
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＴＣＥＰ中にそれぞれ０．３μＬの１２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質及び０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０％ＰＥＧ ４Ｋ、１０％イソプロパノール、１０ｍＭのＢａＣｌ２のリザーバーを含有するシッティングドロップ法においてＰａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｐ２２３タンパク質結晶を１０℃で成長させた。より高品質の結晶を得るためにシーディング法を使用し、結晶は概して４〜７日でフルサイズに達した。結晶を、液体窒素内で瞬間冷却する前にリザーバー溶液中の１５％エチレングリコールに移した。結晶は、空間群Ｃ２２２１（ａ＝８６．９６Å、ｂ＝１３３．１６Å、ｃ＝６５．３９Å）に属し、非対称単位あたり１分子を含有する。Ｚｎの異常や分散信号を測定するためにシンクロトロンＸ線データを、ピーク／屈折妥協点（ｐｅａｋ／ｉｎｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）及び遠隔波長で単一の結晶について収集した。回折データをＭＯＳＦＬＭで統合し、ＳＣＡＬＡでスケーリングした。９つの異常部位がＳＨＥＬＸＤによって発見され、位相をＭＬＰＨＡＲＥで精密化した。ＤＭを使用して１．１１５９Åで収集された高分解能データ（１．５８Å）に対して溶媒平滑化（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）を行い、明確に解釈可能な電子密度図を得た。平均性能指数は、ＭＬＰＨＡＲＥ後に０．２１７、溶媒平滑化後に０．７１５であった。モデルを手動でプログラムＣｏｏｔを使用してこの図に組み込んだ。異常部位の１つは、配位リガンドの特徴に基づいてバリウムとしてモデル化された。構造は、ＲＥＦＭＡＣを使用して高分解能に対して精密化され、３０６ａａ残基及び２６７水分子を含有する。両方の構造は、ｐｄｂコード４１１Ｆ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｐ２２３）及び４１１Ｈ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−５２２３）で蛋白質構造データバンクに寄託されている。
【００６７】
Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｓ２２３結晶を、Ｐａｒｋｉｎ  Ｒ０ＲＢＲ−Ｐ２２３と同じ緩衝液中それぞれ０．３μＬの１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質及び０．１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、及び２５％ＰＥＧ３３５０のリザーバーを使用してシッティングドロップ法において１０℃で成長させた。結晶を３日間にわたって成長させ、次いで、液体窒素中で瞬間冷却する前にリザーバー溶液中の１０％エチレングリコールへと移した。結晶はＣ２２２１（ａ＝８７．１１Å、ｂ＝１３３．９Å、ｃ＝６６．２１Å）に属した。データをｈｏｍｅ  ｓｏｕｒｃｅのＳａｔｕｒｎ９４４検出器及びＲｉｇａｋｕのＭｉｃｒｏＭａｘ００７ＨＦ発生装置を使用して収集し、ＭＯＳＦＬＭで処理し、ＳＣＡＬＡでスケーリングした。Ｐａｒｋｉｎ−Ｒ０ＲＢＲ−Ｐ２２３構造を、出発モデルとして使用し、必要に応じてＣｏｏｔにて再構築し、交互にＲＥＦＭＡＣにて２．０Åに精密化し、最終モデルは３０６ａａ及び２６３水を含有する。
【００６８】
生化学アッセイ
Ｐａｒｋｉｎの自己ユビキチン化反応は、一般的には、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の反応緩衝液中の２５μｌの反応体積中で、１時間にわたって３７℃でＥ１（２５０ｎＭ）、Ｅ２（５μＭ）Ｕｂ（２３．５μＭ）、Ｍｇ−ＡＴＰ溶液（１０ｍＭ）及びＰａｒｋｉｎ種（０．４６μＭ）を用いて実行された。反応はＳＤＳローディングバッファーの添加によって終了した。
【００６９】
ＨＡ−ＵｂＶＳを用いたＰａｒｋｉｎ活性プローブ標識。簡潔には、Ｐａｒｋｉｎ（５μｇ）をＨＡ−ＵｂＶＳ（または他のＵｂ様ＶＳ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、３：１のＰａｒｋｉｎ：ＵｂＶＳのモル比または１：１のＰａｒｋｉｎ：ＵｂＶＳのモル比で室温で３時間５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で、様々なｐＨにわたってインキュベートした。反応はＳＤＳローディングバッファーの添加によって終了した。
【００７０】
Ｐａｒｋｉｎ細胞アッセイ
細胞を一般的に２４ウェルのプラスティック皿で増殖させたことを除いて以前報告したように細胞を染色した。Ｔｏｍ２０ミトコンドリア染色を含有する細胞の割合（％）を定量化するためにＴａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用して画像をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴｉプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で取得した。細胞フィールドを１０倍対物レンズを使用して撮像し、フィールド当たり平均して２５０個の細胞が検出された。データを少なくとも２０００個／ウェル（９６ウェルプレート）の細胞から収集した。細胞アッセイの読み出しパラメータは、平均蛍光強度及びＴｏｍ２０染色をほとんどまたは全く示さない細胞の割合（％）であった。完全長野生型Ｐａｒｋｉｎに対するＴｏｍ２０損失の割合（％）を、ＣＣＣＰ処置後の完全長野生型Ｐａｒｋｉｎが誘発したＴｏｍ２０損失を１００％に設定して算出した。示されるデータは、３つから４つの独立した実験を表す（エラーバーは標準誤差を表す）。
【００７１】
統計解析
３つのアスタリスクはＰ＜０．００５を示し、２つのアスタリスクはＰ＜０．０１を示し、１つのアスタリスクはＰ＜０．０５を示す。有意水準を、両側検定の不等分散性のスチューデントのＴ検定を用いて決定した。タグ無し完全長Ｐａｒｋｉｎ（または変異体）をＨＡ−Ｕｂと一緒にそれぞれ１：１０のＤＮＡ比で使用して製造業者のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従ってＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは４８時間で、２４時間後に培地交換とＣＣＣＰ（１０μＭ最終）の添加を行った。ＥＤＴＡを含まないＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を有する、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトン−Ｘ−１００、ｐＨ７．２中で氷上で３０分間溶解した。溶菌液を４℃で１０分間１６，０００×ｇで卓上微量遠心機で清澄化した。タンパク質をＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。Ｐａｒｋｉｎ及びオキシエステル連結Ｐａｒｋｉｎの十分な分離を得るために、試料を、典型的には、１０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で２時間泳動（ｒｕｎ）させた。オキシエステル連結Ｐａｒｋｉｎの免疫沈降については、１ｍｇのタンパク質抽出物（プロテインＡビーズ単独で前もって１時間清澄化した後）をプロテインＡ樹脂及びＨＰＡ１Ａ（５μＭ）とともに一晩回転させながら４℃でインキュベートした。翌日、試料を溶解バッファーで３回洗浄し、その後ＳＤＳローディング色素を添加した。次いで反応物を、沸騰させる前にＮａＯＨ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）またはバッファー対照とともに２０分間３７℃でインキュベートした。
【００７２】
質量分析
Ｐａｒｋｉｎ−Ｃ４３１−ＵｂＶＳ修飾されたペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定のために、ＨＡ−ＵｂＶＳと反応させたＰａｒｋｉｎのトリプシン消化物を、ＡＢＳｃｉｅｘ  ５６００  ｑＴＯＦ質量分析計上で、各サーベイＭＳスキャンの後にＭＳスペクトルにおける３０の最も高いピークのＭＳ／ＭＳ分析を行う方法を使用して分析した。ペプチドの同定を、ペプチドマストレランス（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）について１０ｐｐｍ、及びＭＳ／ＭＳトレランス（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）について０．１ＤａでＭａｓｃｏｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．４を使用して行った。ペプチド同定を決定するために、酸化（Ｍ±１５．９９４９Ｄａ）、脱アミド（１＼１Ｑ±０．９８４０Ｄａ）、カルバミドメチル化（Ｃ±５７．０２１４Ｄａ）、及びＧＧ−ビニルスルホンレムナント（Ｃ±１９２．０５６９Ｄａ）を不確定の修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）として使用してＵｎｉｐｒｏｔデータベースを検索した。
【００７３】
本発明は上記の実施例に関連して説明してきたが、修正及び変形が本発明の精神及び範囲内に包含されることが理解されるだろう。従って、本発明は以下の特許請求の範囲によって限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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