(57)【要約】  単一診断試験において、抗生物質感受性プロフィールおよび細菌種同定が報告され、決定される。本方法は、細菌の試料に関して、細菌の同一性および細菌のそれぞれの抗生物質感受性を同時に報告し、本方法は、細菌を、抗生物質感受性の表現型性蛍光センサーおよび種または菌株特異的親和性プローブである抗生物質と接触させるステップを含み、前記プローブおよびセンサーは、それぞれ、細菌の同一性およびそれらのそれぞれの抗生物質感受性を同時に報告する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の同一性および細菌のそれぞれの抗生物質感受性を、細菌の試料に関して、同時に報告する方法であって、
前記細菌を、抗生物質、抗生物質感受性の表現型性蛍光センサー、および、種または菌株特異的親和性プローブと接触させるステップを含み、
前記プローブおよびセンサーが、それぞれ、細菌の同一性および細菌のそれぞれの抗生物質感受性を同時に報告する、方法。
【請求項２】
前記プローブが、各特異性に関する遺伝子座のパネルを用いて別個の遺伝子座で固定され、
前記接触させるステップが、細菌をプローブと接触させ、次いで、各パネルのプローブ結合細菌を対応する抗生物質およびセンサーと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させるステップが、細菌をセンサーと接触させ、次いで、細菌をサブセットに分けた後、サブセットの各々を対応する抗生物質およびプローブと接触させることを含み、
各特異性の前記プローブが、独自に標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記センサーが抗生物質感受性の指標として活性酸素種を報告する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記センサーがジヒドロローダミン１２３である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
３時間未満で実行される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
単一診断試験において１０の病原的に関連する細菌種の抗生物質感受性プロフィールおよび同一性を決定する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料が喀痰、血液、尿または糞便である生理学的検体である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細菌の同一性およびそれらのそれぞれの抗生物質感受性の指標として、それぞれ、プローブ−細菌結合およびセンサーシグナル伝達を、同時に検出するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１２日に出願された米国特許出願第６１／９０２，８９１号に対する優先権を主張し、この記載内容は参照により本明細書中で援用される。
【背景技術】
【０００２】
細菌性疾患の診断および処置は、初めは症候、徴候、そして時として画像処理（ＣＴスキャン）に基づいている。感染生物体に関する情報およびその感染についての薬剤感受性プロフィールは、７２時間を超えて引き継がれる。臨床結果は明らかに、感染生物体が感受性を示す適切な抗生物質の使用と関連する。多くの致死的細菌性疾患（敗血症、肺炎、ＵＴＩ等）が、新規の耐性機序を容易に獲得する細菌により引き起こされる。
【０００３】
本発明者らは、感染における生物体ならびに抗生物質のパネルに対する確定された表現型耐性を同定するための迅速な（３時間未満）診断、すなわち併用抗生物質感受性および細菌同定試験を開示する。本発明者らのシステムは、殺菌性薬剤が感受性細菌における活性酸素種（ＲＯＳ）の生成をもたらして、実施可能な臨床結果を提供するという事実を利用する。本システムは、また、異なる濃度の薬剤への曝露時にＲＯＳ生成を高感度で定量するために用いられる開示の新規蛍光染料になじみ易い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、単一診断試験において抗生物質感受性プロフィールおよび細菌種同定を報告および／または決定するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、細菌の試料に関して、細菌の同一性および細菌のそれぞれの抗生物質感受性に関して同時に報告する方法であって、細菌を、抗生物質、抗生物質感受性の表現型性蛍光センサーおよび種または菌株特異的親和性プローブと接触させるステップを含み、前記プローブおよびセンサーは、それぞれ、細菌の同一性およびそれらのそれぞれの抗生物質感受性を同時に報告する、方法を提供する。
【０００６】
本発明は、
前記プローブが、各特異性に関する遺伝子座のパネルを用いて別個の遺伝子座で固定され、前記接触させるステップが、細菌をプローブと接触させ、次いで、各パネルのプローブ結合細菌を対応する抗生物質およびセンサーと接触させることを含み、
前記接触させるステップが、細菌をセンサーと接触させ、次いで、細菌をサブセットに分けた後、サブセットの各々を対応する抗生物質およびプローブと接触させることを含み、各特異性の前記プローブは、独自に標識され、
前記センサーが抗生物質感受性の指標として活性酸素種を報告し、
前記プローブが抗体であり、
前記センサーがジヒドロローダミン１２３であり、
本方法が、３時間未満で実行され、
本方法が、単一診断試験において１０の病原的に関連する細菌種の抗生物質感受性プロフィールおよび同一性を決定し、
前記試料が喀痰、血液、尿または糞便である生理学的検体であり、
本方法が、細菌の同一性および細菌のそれぞれの抗生物質感受性の指標として、それぞれ、プローブ−細菌結合およびセンサーシグナル伝達を、同時に検出するステップをさらに含む、
実施形態およびその全ての組合せを提供する。
【０００７】
本発明は、本発明の方法ための材料および試薬を含み、ならびに本発明の方法のために構成されるキットも提供する。
【０００８】
本発明は、具体的には、各々が入念に個別に記述されたかのように、列挙した実施形態の全ての組合せを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】固相実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一般的プロトコールを、図１に示す。
【００１１】
１．生物学的検体（例えば、喀痰、血液、尿、糞便）を収集する、
２．検定緩衝液に移すかまたは検定緩衝液と混合する、
３．特定の捕捉試薬とともにインキュベートする、
４．薬剤およびＲＯＳ検出試薬を検体上に流す、ならびに
５．細菌および感受性の型を読み取る。
【００１２】
［実施例］
［実施例１］
ノルフロキサシン感受性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ２５９２２；ノルフロキサシン  ＭＩＣ＝０．０６４μｇ／ｍｌ）の培養を、ＯＤ６００読取値が０．４４になるまで、ＭＨＢ液体培地中に接種した。次いで、培養をＭＨＢでＯＤ６００読取値が約０．１になるまで希釈した。時間＝０時間で、ノルフロキサシン（最終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、５μＭ濃度のテスト実験センサー染料とともに各培養に添加した。次に試験管を、１４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃インキュベータ中でインキュベートした。１．５時間後、ＦＩＴＣ  ４８８ｎｍチャネルを用いたフローサイトメトリーにより標識化に関して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を分析した。結果は、ビヒクル対照と比較した場合の処置群における有意な増大（最大１０倍）を示した。
【表１】
2016536592.tif 000002
【００１３】
［実施例２］
ノルフロキサシン感受性緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３；シプロフロキサシン  ＭＩＣ＝０．２５μｇ／ｍｌ）の培養を、０．０８１のＯＤ６００でミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）３ｍｌ中に接種した。３７℃で２時間後、培養は０．１６１のＯＤ６００になった。時間＝０時間で、シプロフロキサシン（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）またはビヒクル（水）を、５μＭ最終濃度のテスト実験センサー染料とともに各培養に添加した。次に試験管を、１４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃インキュベータ中でインキュベートした。２時間および３時間時点で、ＦＩＴＣ  ４８８ｎｍチャネルを用いたフローサイトメトリーにより標識化に関して緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞を分析した。２および３時間結果はともに、ビヒクル対照と比較した場合の処置群における有意な増大（最大１０倍）を示した。
【表２】
2016536592.tif 000003
【００１４】
［実施例３］
抗生物質感受性の蛍光センサーは、種々のクラスの抗生物質とともに働く。
【００１５】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  ２７８５３）の培養を、０．０９１のＯＤ６００でミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）３ｍｌ中に接種した。３７℃で２時間後、培養は０．１７９のＯＤ６００になった。時間＝０時間で、テスト抗生物質（セフェピム＠４ｕｇ／ｍｌ、シプロフロキサシン＠０．０５ｕｇ／ｍｌ、メロペネム＠４ｕｇ／ｍｌ、アズトレオナム＠８ｕｇ／ｍｌ、トブラマイシン＠１ｕｇ／ｍｌ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、５μＭ最終濃度のジヒドロローダミン１２３とともに各培養に添加した。各抗生物質を実験的に決定したＭＩＣの２倍の濃度で試験した。次に試験管を、１４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃インキュベータ中でインキュベートした。２時間および３時間時点で、ＦＩＴＣ  ４８８ｎｍチャネルを用いたフローサイトメトリーにより標識化に関して、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞を分析した。結果は、抗生物質の各々に関する感受性プロフィールを示した。
【００１６】
［実施例４］
薬剤耐性細菌株から薬剤感受性細菌株を区別するための蛍光化合物の使用。一般的プロトコール：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感受性および耐性菌株を、一連のノルフロキサシン濃度範囲で２時間かけて処理した。結果は、その濃度範囲に亘って菌株の示差的感受性を示した。
【００１７】
［実施例５］
細菌病原体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｕｒｉｇｉｎｏｓａ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）への抗生物質感受性方法の適用。
【００１８】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  ２７８５３）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養を、それぞれ０．１４７、０．１６６および０．１５６の初期ＯＤ６００でミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）３ｍｌ中に接種した。３７℃で２時間後、培養は緑膿菌０．１６１、肺炎桿菌０．６０４および大腸菌０．６５９のＯＤ６００になった。次いで、培養に、７５ｕｌのビヒクル（水）または７５ｕｌのシプロ（２×ＭＩＣ濃度）を、その後、１５ｕｌのＤＨＲを添加した。次に試験管を、１４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃インキュベータ中でインキュベートした。２、３および４時間時点で、ＦＩＴＣ  ４８８ｎｍチャネルを用いたフローサイトメトリーにより標識化に関して細胞を分析した。結果は、各試験細菌病原体に関する経時的感受性プロフィールを示した。
【００１９】
［実施例６］
実施例５の抗生物質感受性試験手順の適用を、細菌種同定のためのマーカー、例えば細菌特異的抗体を用いて同時に実行した。
【００２０】
一般的プロトコール
１．細胞ストレスの蛍光センサーを添加する、
２．試験抗生物質を入れたウェル中に単離物／試料を分割する、
３．示差的に標識された病原体識別子プローブを添加する、ならびに
４．各ウェルに関するマーカーパターンを分析して、感受性および病原体同定を確定する。
【００２１】
単一検定において、本発明者らは、抗生物質感受性に関するマーカー（ＤＨＲ１２３）および種同定に関するマーカー（抗緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗体）を同時に測定することができた。
【００２２】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３）の培養を、０．０６のＯＤ６００でミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）３ｍｌ中に接種した。３７℃で２時間後、培養は０．１５０のＯＤ６００になった。時間＝０時間で、試験抗生物質（シプロフロキサシン）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、５μＭ最終濃度のジヒドロローダミン１２３とともに各培養に添加した。３時間および４時間時点で、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞１ｍＬを遠心分離し、第一抗シュードモナス抗体（ウサギポリクローナル抗シュードモナス抗体（ａｂ６８５３８、ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））とともにＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１５分間インキュベートした。次に試験管を遠心分離し、第二抗体（Ｃｙ７染料で標識したヤギ抗ウサギ抗体）とともにさらに１５分間、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。次いで、試料を、分析のためにＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーター上で直接移動させた。結果は、抗生物質に関する、ならびに抗ＰＡ抗体に関する用量依存的応答を示した。
【００２３】
本明細書中に記述される特許、特許出願および出版物は全て、その全体が参照により本明細書中で援用される。しかしながら、明確な定義を含有する特許、特許出願または出版物が参照により援用される場合、それらの明確な定義は、それらが見出される、参照により援用される特許、特許出願または出版物に適用され、本願の本文の残りの部分、特に本願の特許請求の範囲には適用されない、と理解されるべきである。
【００２４】
本発明をその好ましい特定の実施形態とともに記載してきたが、前記の記載およびそれに続く実施例は、本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではない、と理解されるべきである。本発明の範囲を逸脱しない限り、種々の変更がなされ得るし、等価物が置き換えられ得ると当業者に理解されるであろうし、さらにその他の態様、利点および修正は、本発明が関連する業界の当業者には明らかである。
【図１】
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【国際調査報告】
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