(57)【要約】本発明は、ｐ３４の発現抑制剤または活性抑制剤を有効成分で含む癌の治療または転移抑制用組成物に関する。本発明によれば、ｐ３４タンパク質のノックダウン(ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ)は、ＰＴＥＮのモノユビキチン化を起こしてＰＴＥＮの核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を促進させる結果、腫瘍の生存、増殖、浸湿性及び転移性と関連されたＡｋｔ経路を抑制することで、ＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１を同時発現する多様な癌細胞の腫瘍発生性及び集落形成能を顕著に減少させる効果がある。したがって、本発明のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤は癌の治療剤または転移抑制剤として有用に使用することができる。【選択図】図６１
2016522162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項２】
前記発現抑制剤は、ｐ３４遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、短ヘアピンＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ)及びリボザイム(ｒｉｂｏｚｙｍｅ)からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項３】
前記活性抑制剤は、ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣体、気質類似体、アプタマー及び抗体からなる群より選択された1種以上であることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項４】
前記ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物は、下記化学式１で表示される化合物またはその薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする請求項３に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【化１】
2016522162.tif 000006
【請求項５】
前記癌は、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、骨癌、膵膓癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大膓癌、小腸癌、直腸癌、喇叭管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、ホジキン病(Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ)、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、リンパ球リンパ種、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、１次中枢神経系リンパ種、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫のうち選択された１種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項４のうちいずれか１項に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項６】
前記癌は、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)を同時に発現する癌であることを特徴とする請求項１〜請求項４のうちいずれか１項に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項７】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の予防または改善用食品組成物。 
【請求項８】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の転移抑制用薬学的組成物。 
【請求項９】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を個体に投与する段階を含むことを特徴とする癌の治療または転移抑制方法。 
【請求項１０】
１)ｐ３４タンパク質発現細胞株に被検物質を処理する段階と、
２)前記細胞株でｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度を測定する段階と、
３)前記ｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度が被検物質を処理しない対照群に比べて減少した被検物質を選別する段階と、を含むことを特徴とする癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１１】
前記２)段階で遺伝子の発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲ(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ)、ノーザンブロット(Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ)、ｃＤＮＡマイクロアレイ混成化反応及びｉｎ ｓｉｔｕ混成化反応からなる群より選択された１種以上の方法で測定することを特徴とする請求項１０に記載の癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１２】
前記２)段階でタンパク質の活性程度は、免疫沈降法(ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組職化学、ウエスタンブロット(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)及びプローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)からなる群より選択された１種以上の方法で測定することを特徴とする請求項１０に記載の癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１３】
１)生物学的試料にＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)の発現抑制剤または活性抑制剤を処理する段階と、
２)前記生物学的試料で癌細胞の増殖可否を測定する段階と、を含むことを特徴とするｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。 
【請求項１４】
前記１)段階の生物学的試料は、癌にかかった個体の血液、小便、唾液及び組職からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１３に記載のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。 
【請求項１５】
前記方法は、３)生物学的試料の癌細胞が増殖されると、ｐ３４の発現抑制剤または活性抑制剤の癌に対する治療効果が存在しないで、生物学的試料の癌細胞が増殖されないと、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の治療効果が存在すると予測する段階を含むことを特徴とする請求項１３に記載のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ３４の発現抑制剤または活性抑制剤を有効成分で含む癌の治療または転移抑制用薬学的組成物に関する。      
【背景技術】
【０００２】
癌は、人類の健康を脅威する最大の疾病の中で一つとして、細胞が一連の突然変異過程を経て、無制限的で非調節的な方式で増殖して不死化されて発生する疾病である。癌発生の原因としては、化学物質、ウイルス、細菌、電離放射線などの環境的または外的要因と、先天性遺伝子変異などの内的要因と、を挙げることができる(Ｋｌａｕｎｉｇ＆Ｋａｍｅｎｄｕｌｉｓ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ., ４４：２３９-２６７、２００４)。初期に発見された癌の場合、手術、放射線治療、化学的療法などの治療法があるが、その副作用が大きい問題になっており、末期癌や転移された癌の場合、特別な治療法なしに時限付き人生で生を終える状況である。
【０００３】
最近、癌と関連された多様な生化学的機序が糾明され、それによる治療剤が開発されているが、今まで癌に対する根本的な治療方法は提示されていない。これによって、癌と関連された多様な生体内分子を同定し、これを標的とする薬物を開発しようとする研究が活発に進行されている。このような薬物のうち一部を組み合わせて癌治療の効果を増進させようとする努力も試みされている。したがって、癌と関連された標的分子を追加的に掘り出す努力は非常に重要であるといえる。
【０００４】
ＰＩ３Ｋ(Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ-３−ｋｉｎａｓｅ)信号伝逹段階の中心的な陰性調節因子であるＰＴＥＮ(Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ)腫瘍抑制子は、ヒトの癌において一番頻繁に変異または欠失される遺伝子で知られている。最近の研究によれば、腫瘍抑制子であるＰＴＥＮの機能の調節においてユビキチン化と関連された重要な疑問が提起され、ＰＴＥＮのユビキチン化に必要な調節機序に対して続いて研究が進行されている。
【０００５】
本発明者らは、ＰＴＥＮのユビキチン化と関連された機序に関して研究するうち、ＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)の結合パートナーであるｐ３４タンパク質がＮＥＤＤ４−１タンパク質の安全性を調節し、これを通じてＰＴＥＮのモノユビキチン化及びポリユビキチン化の転換を調節することを確認した。
【０００６】
より具体的には、ｐ３４の発現増加は、Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＮＥＤＤ４−１のＷＷ１ドメインと相互作用してそのタンパク質の安全性を向上させる結果、ＰＴＥＮのポリユビキチン化及びＰＴＥＮタンパク質の分解をもたらした一方、ｐ３４のノックダウン(ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ)は 、ＰＴＥＮのモノユビキチン化を起こしてＰＴＥＮの核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を促進させる結果、腫瘍の生存、増殖、浸湿性乃至は転移性と関連されたＡｋｔ経路を抑制した。
【０００７】
したがって、本発明者らは、ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１タンパク質の安全性を調節することで、ＰＴＥＮユビキチン化経路で重要な調節子として作用し、特に、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮと関連された癌の治療において効果的なターゲットになることを確認し、本発明を完成した。      
【発明の開示】
【０００８】
技術的解決課題
本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の予防または治療用組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の転移抑制用組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を個体に投与する段階を含む癌の治療または転移抑制方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ｐ３４を利用した癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、生物学的試料にＮＥＤＤ４−１の発現抑制剤または活性抑制剤を処理する段階を含むｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法を提供することを目的とする。
【技術的解決方法】
【００１３】
前記課題を解決するために、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を個体に投与する段階を含む癌の治療または転移抑制方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、下記の段階を含む癌治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法を提供する：
１)ｐ３４タンパク質の発現細胞株に被検物質を処理する段階；
２)前記細胞株でｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度を測定する段階；及び
３)前記ｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度が被検物質を処理しない対照群に比べて減少した被検物質を選別する段階。
【００１８】
また、本発明は、下記の段階を含むｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法を提供する：
１)生物学的試料にＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)の発現抑制剤または活性抑制剤を処理する段階；及び
２)前記生物学的試料で癌細胞の増殖可否を測定する段階。
発明の効果  
【００１９】
本発明によれば、ｐ３４タンパク質のノックダウン(ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ)は、ＰＴＥＮのモノユビキチン化を起こしてＰＴＥＮの核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を促進させる結果、腫瘍の生存、増殖、浸湿性及び転移性と関連されたＡｋｔ経路を抑制することで、ＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１を同時発現する多様な癌細胞の腫瘍発生性及び集落形成能を顕著に減少させる効果がある。したがって、本発明のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤は、癌の治療剤または転移抑制剤として有用に使用されることができる。      
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、２９３、ＤＵ１４５及びＭＣＦ−７細胞でＮＥＤＤ−１を利用した免疫沈降反応の結果を示した図である。
【図２】図２は、２９３、ＤＵ１４５及びＭＣＦ−７細胞でｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図３】図３は、ＤＵ１４５及びＭＣＦ−７細胞の免疫沈降物でｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図４】図４は、ＬＳ１０３４及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞でＮＥＤＤ４−１タンパク質に対する免疫沈降反応の結果を示した図である。
【図５】図５は、多様な結腸癌及び乳房癌細胞株でｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図６】図６は、２９３細胞でｐ３４及びＮＥＤＤ４−１に対する免疫沈降反応の結果を示した図である。
【図７】図７は、ＧＳＴプルダウン分析及びウエスタンブロットを通じたｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現程度を分析した結果を示した図である。
【図８】図８は、ＧＳＴプルダウン分析及びウエスタンブロットを通じたｐ３４、ＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１の発現程度を分析した結果を示した図である。
【図９】図９は、ＮＥＤＤ４−１変異体の地図及びＧＳＴプルダウン分析を通じたｐ３４及びＮＥＤＤ４−１タンパク質の相互作用分析結果を示した図である。
【図１０】図１０は、ＷＷ１ドメインが欠失されたＮＥＤＤ４−１タンパク質でＧＳＴプルダウン分析結果を示した図である。
【図１１】図１１は、ＧＳＴプルダウン分析を通じたｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮタンパク質の相互作用分析結果を示した図である。
【図１２】図１２は、ｐ３４の発現及びＭＧ１３２処理条件によるＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化を免疫沈降反応を通じて示した図である。
【図１３】図１３は、ｐ３４の発現によるＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化をＧＳＴプルダウン分析を通じて示した図である。
【図１４】図１４は、ｐ３４またはＮＥＤＤ４−１の発現及びＣＨＸ処理条件によるＮＥＤＤ４−１の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図１５】図１５は、ｐ３４のノックダウンによるＮＥＤＤ４−１及びｐ３４タンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図１６】図１６は、ｐ３４のノックダウンによるＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図１７】図１７は、ｐ３４の発現によるＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図１８】図１８は、ｐ３４のノックダウン及びＣＨＸ処理条件によるＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図１９】図１９は、２９３細胞でｐ３４にトランスフェクション及びＭＧ１３２処理によるＰＴＥＮタンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図２０】図２０は、各細胞でｐ３４にトランスフェクション及びＭＧ１３２処理によるＰＴＥＮタンパク質のユビキチン化程度を示した図である。
【図２１】図２１は、各細胞内でｐ３４ノックダウンによるＰＴＥＮタンパク質のポリユビキチン化程度を示した図である。
【図２２】図２２は、２９３細胞でｐ３４の発現によるＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性を示した図である。
【図２３】図２３は、ＮＥＤＤ４−１ ｓｉＲＮＡ/ｓｈＲＮＡ及びｐ３４をトランスフェクションさせた細胞でＰＴＥＮの発現程度及びＡｋｔリン酸化をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図２４】図２４は、ｐ３４、ＮＥＤＤ４−１ ｓｉＲＮＡ及びＣＨＸ処理によるＰＴＥＮの発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図２５】図２５は、ＮＥＤＤ４−１ ｓｉＲＮＡ/ｓｈＲＮＡ、ｐ３４のトランスフェクション及びＭＧ１３２処理によるＰＴＥＮタンパク質のユビキチン化程度を示した図である。
【図２６】図２６は、ｐ３４の発現及びＮＥＤＤ４−１のノックダウンによるＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性を示した図である。
【図２７】図２７は、ＸＩＡＰをノックアウトさせたＭＥＦ細胞でのＸＩＡＰの発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図２８】図２８は、ＸＩＡＰ−ノックアウトＭＥＦ細胞でｐ３４のトランスフェクション結果によるＰＴＥＮタンパク質発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図２９】図２９は、ＸＩＡＰ−ノックアウトＭＥＦ細胞でｐ３４のトランスフェクション結果によるＰＴＥＮタンパク質発現程度を免疫沈降及びウエスタンブロットを通じて分析した結果を示した図である。
【図３０】図３０は、ｐ３４−ノックダウンＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＤＵ１４５及びＬＳ１０３４細胞でのモノユビキチン化されたＰＴＥＮの発現程度を示した図である。
【図３１】図３１は、ｐ３４−ノックダウンＭＥＦ細胞でモノユビキチン化されたＰＴＥＮの発現程度を核分画物/細胞質(ｃｙｔｏｓｏｌ)の位置別に示した図である。
【図３２】図３２は、ｐ３４またはＮＥＤＤ４−１ノックアウトによるＭＣＦ−７細胞でモノユビキチン化ＰＴＥＮの発現程度を示した図である。
【図３３】図３３は、ＮＥＤＤ４−１またはｐ３４の発現によるポリユビキチン化ＰＴＥＮの発現程度を示した図である。
【図３４】図３４は、ＮＥＤＤ４−１またはｐ３４の発現によるポリユビキチン化ＰＴＥＮの発現程度を示した図である。
【図３５】図３５は、Ｅ２酵素の存在及びｐ３４、ＮＥＤＤ４−１の発現によるＰＴＥＮのユビキチン化程度を示した図である。
【図３６】図３６は、ｐ３４ノックアウト可否によるＬＳ１０３５及びＭＣＦ７細胞の成長率を示した図である。
【図３７】図３７は、ｐ３４ノックアウト可否によるＬＳ１０３５及びＭＣＦ７細胞の集落形成能を示した図である。
【図３８】図３８は、ｐ３４ノックアウト可否によるＬＳ１０３５及びＭＣＦ７細胞の集落の大きさを示した図である。
【図３９】図３９は、ｐ３４ノックアウト可否によるＬＳ１０３５及びＭＣＦ７細胞でのｐ３４、サイクリンＥ２及びｃｄｃ６遺伝子の発現程度を示した図である。
【図４０】図４０は、テトラサイクリン誘導性ｐ３４−ｓｈＲＮＡベクターを発現するＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株の確立をＴｅｔＲの発現有無確認を通じて示した図である。
【図４１】図４１は、テトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株にテトラサイクリン処理後、ｐ３４、ＰＴＥＮ及びリン酸化Ａｋｔの発現程度を示した図である。
【図４２】図４２は、テトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株にテトラサイクリン処理後、ＰＴＥＮリン酸分解酵素活性程度を示した図である。
【図４３】図４３は、テトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株にテトラサイクリン処理後、集落形成能を示した図である。
【図４４】図４４は、テトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株にテトラサイクリン処理後、細胞成長率を示した図である。
【図４５】図４５は、テトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株にテトラサイクリン処理後 、ＢｒｄＵ混成程度を示した図である。
【図４６】図４６は、ｐ３４発現Ｈｓ５７８Ｔ細胞株でＰＴＥＮの発現及び集落形成能を示した図である。
【図４７】図４７は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与によるＰＴＥＮ、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現程度を示した図である。
【図４８】図４８は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与によるＰＴＥＮ、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現程度 示した図である。
【図４９】図４９は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与による腫瘍の体積変化を示した図である。
【図５０】図５０は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与による腫瘍の体積変化を示した図である。
【図５１】図５１は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＤＵ１４５変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与によるＰＴＥＮタンパク質の核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を示した図である。
【図５２】図５２は、マウスにテトラサイクリン誘導性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株を注入して腫瘍を形成させた後、テトラサイクリンの投与によるＰＴＥＮタンパク質の核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を示した図である。
【図５３】図５３は、ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１タンパク質の発現程度を示した図である。
【図５４】図５４は、ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＲａｓ、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現による集落形成能を示した図である。
【図５５】図５５は、ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１タンパク質の発現程度を示した図である。
【図５６】図５６は、ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＲａｓ、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現による集落形成能を示した図である。
【図５７】図５７は、ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＰＴＥＮのポリユビキチン化程度を示した図である。
【図５８】図５８は、ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でＲａｓ活性を示した図である。
【図５９】図５９は、多様な乳房癌及び結腸癌細胞でのＮＥＤＤ４−１/ｐ３４の発現によるＰＴＥＮタンパク質の発現割合を示した図である。
【図６０】図６０は、多様な乳房癌及び結腸癌細胞でのＮＥＤＤ４−１/ｐ３４の発現によるＰＴＥＮタンパク質の発現割合を示した図である。
【図６１】図６１は、ｐ３４とＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮ間の総合的な相互作用を図式的に示した図である。
【図６２】図６２は、ヒト乳房癌細胞及び大膓癌細胞でｐ３４活性抑制剤処理によるＰＴＥＮユビキチン化抑制程度を示した図である。
【図６３】図６３は、ｐ３４活性抑制剤処理によるｐ３４及びＮＥＤＤ４−１タンパク質の結合抑制効果を示した図である。
【図６４】図６４は、ヒト乳房癌細胞株でｐ３４活性抑制剤処理が細胞死滅及びタンパク質発現に及ぶ影響を示した図である。
【図６５】図６５は、ヒト乳房癌細胞株でｐ３４活性抑制剤処理がＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性に及ぶ影響を示した図である。
【図６６】図６６は、ヒト大膓癌細胞株でｐ３４活性抑制剤処理が細胞死滅及びタンパク質発現に及ぶ影響を示した図である。
【図６７】図６７は、ヒト大膓癌細胞株でｐ３４活性抑制剤処理がＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性に及ぶ影響を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２２】
本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含む癌の転移抑制用組成物を提供する。
【００２４】
前記組成物は、薬学的組成物または食品組成物を含む。
【００２５】
本発明によるｐ３４遺伝子の発現抑制剤は、ｐ３４遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、短ヘアピンＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ)及びリボザイム(ｒｉｂｏｚｙｍｅ)で構成された群から選択された１種以上であることができるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明によるｐ３４タンパク質の活性抑制剤は、ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣体、気質類似体、アプタマー及び抗体で構成された群から選択された１種以上であることができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
前記アンチセンスヌクレオチドは、ワトソン−クリック(Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ)塩基対に定義されたことによって、ＤＮＡ、未成熟−ｍＲＮＡまたは成熟されたｍＲＮＡの相補的塩基配列に結合(混成化)してＤＮＡにおいてタンパク質として遺伝情報の流れを妨害する。
【００２８】
前記ｓｉＲＮＡは、ｐ３４タンパク質を暗号化する遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列内で選択される１５〜３０ｍｅｒのセンス配列及び前記センス配列に相補的に結合するアンチセンス配列で構成され、この時、前記センス配列は、特別にこれに限定されるものではないが、２５個の塩基で構成されることが好ましい。
【００２９】
前記化合物は、ｐ３４タンパク質に特異的に結合してその活性を抑制することができる任意の化合物を全て含み、好ましくは、ｐ３４とＮＥＤＤ４−１タンパク質の結合を抑制する活性を有するものであるが、これに限定されない。本発明の一実施例では、前記ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物の一例として、下記化学式１で表示される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提示する。
【００３０】
【化１】
2016522162.tif 000003
本発明で「薬学的に許容可能な塩」は、個体に比較的非毒性で且つ無害な有効作用を有する濃度として、この塩に起因した副作用が化学式１で表示される化合物のよい効能を低下させない前記化合物の任意の全ての有機または無機付加塩を意味する。前記化学式１で表示される化合物の薬学的に許容可能な塩は、特定しない限り、化学式１で表示される化合物に存在することができる酸性または塩基性基の塩を全て含む。
【００３１】
前記ペプチド模倣体(Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ)は、ｐ３４タンパク質の結合ドメインを抑制してｐ３４タンパク質の活性を抑制する。ペプチド模倣体は、ペプチドまたは非ペプチドであることができ、ｐｓｉ結合のような非ペプチド結合によって結合されたアミノ酸で構成されることができる。また、「構造的に強制された(ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ)」ペプチド、環状模倣体(ｃｙｃｌｉｃ ｍｉｍｅｔｉｃｓ)、少なくとも一つのエキソサイクリックドメイン(ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ)、結合部分(結合アミノ酸)及び活性部位を含む環状模倣対であることができる。ペプチド模倣体は、ｐ３４タンパク質の二次構造特性と類似に構造化され、抗体または水溶性受容体のような巨大な分子の抑制特性を模倣することができ、天然の拮抗剤と同等な効果で作用できる新規した小分子であることができる。
【００３２】
前記アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)は、単一鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子として、ＳＥＬＥＸ(ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ)と呼ばれるオリゴヌクレオチド(ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)ライブラリーを利用した進化的な方法によって特定化学分子や生物学的分子に高い親和力と選別力を有して結合するオリゴマーを分離して収得することができる。アプタマーは、標的に特異的に結合して標的の活性を調整することができ、例えば、結合を通じて標的の機能を遮断することができる。
【００３３】
前記抗体は、ｐ３４タンパク質に特異的で直接的に結合してｐ３４タンパク質の活性を効果的に抑制することができる。前記ｐ３４タンパク質に特異的に結合する抗体としは、ポリクローナル(ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ)抗体またはモノクローなる(ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ)抗体を使用することが好ましい。前記ｐ３４タンパク質に特異的に結合する抗体は、当業者において知られた公知の方法で製作するか、商業的に知られたｐ３４抗体を購入して使用することができる。前記抗体は、当業者において知られた従来方法によって免疫原であるｐ３４タンパク質を外部宿主に注射することで製造することができる。外部宿主は、マウス、ラット、羊、兎のような哺乳動物を含む。免疫原は、筋肉内、腹腔内または皮下注射方法により注射され、一般的に抗原性を増加させるための補助剤(ａｄｊｕｖａｎｔ)と一緒に投与することができる。外部宿主から定期的に血液を採取して形成された力価及び抗原に対する特異性を示す血清を収去して抗体を分離することができる。
【００３４】
本発明によれば、ｐ３４を抑制する場合、ＰＴＥＮのモノユビキチン化を起こしてＰＴＥＮの核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)を促進させる結果、腫瘍の生存、増殖、浸湿性及び転移性と関連されたＡｋｔ経路を抑制することで、ＰＴＥＮ及びＮＥＤＤ４−１を同時発現する多様な癌細胞の腫瘍発生性及び集落形成能を顕著に減少させる効果がある。したがって、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤は、癌の治療または転移抑制剤として有用に使用されることができる。
【００３５】
前記癌は、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、骨癌、膵膓癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大膓癌、小腸癌、直腸癌、喇叭管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、ホジキン病(Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ)、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、リンパ球リンパ種、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、１次中枢神経系リンパ種、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫などを含み、好ましくは、乳房癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌などを含むが、これに限定されない。
【００３６】
また、前記癌は、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１を同時に発現する癌を全て含むが、これに限定されない。
【００３７】
本発明の組成物は、坑癌効果を有する公知の有効成分を１種以上さらに含むことができる。
【００３８】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に適合な形態で剤型化されることができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などのような経口投与用担体及び水、適合なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、ここに安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適合な安定化剤としては、亜黄酸水素ナトリウム、亜黄酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合な保存剤としては、塩化ベンサコ二ウム、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その外の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参照することができる(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ., Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５)。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、目的する方法によって経口投与するか非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用)することができ、投与量は、個体の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、投与期間または間隔、排泄率、体質特異性、製剤の性質などによってその範囲が多様である。本発明の薬学的組成物の一日投与量は、約０.００１〜１０００ｍｇ/ｋｇであるか、臨床実験結果によって加減されることができ、一日一回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、投薬単位形態で剤型化されることができる。例えば、前記剤型化された投薬単位は、前記有効化合物の１日個別投薬量の１、２、３または４倍の単位で投与するか、または１/２，１/３または１/４倍を含むことができる。好ましくは、前記個別投薬量は、有効化合物が１回に投与される量を含有し、これは、通常１日投与量の全部、１/２、１/３または１/４倍に該当する。
【００４１】
また、本発明の組成物は、癌の予防または改善に効果的な薬剤、食品及び飲料などに多様に利用されることができる。
【００４２】
本発明のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を添加することができる食品としては、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲料の形態で使用することができる。この時、食品または飲料内の前記有効成分の量は、一般的に全体食品重量の０.０１〜１５重量％で添加することができ、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準として０.０２〜１０ｇ、好ましくは、０.３〜１ｇの割合で加えることができる。
【００４３】
本発明の健康機能食品は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有するもの以外に、食品学的に許容可能な食品補助添加剤、例えば、多様な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例には、葡萄糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類及びデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類のような通常的な糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールがある。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤(ソーマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオサイドａ、グリシチルリチンなど))及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康機能食品１００ｍｌ当たり一般的に約１〜２０ｇである。前記外に本発明の健康機能食品は、多様な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の健康機能食品は、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。
【００４４】
また、本発明は、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を個体に投与する段階を含む癌の治療または転移抑制方法を提供する。
【００４５】
本発明の癌の治療または転移抑制方法は、本発明のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質を治療的有効量で個体に投与することを含む。特定個体に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が使用されるか否かだけではなく、具体的組成物、個体の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と一緒に使用されるか同時使用される薬物を含めた多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって相違に適用することが好ましい。したがって、本発明の目的に適合な組成物の有効量は、上述の事項を考慮して決定することが好ましい。
【００４６】
本発明で個体は、癌にかかった任意の哺乳動物に適用可能であり、前記哺乳動物は、ヒト及び霊長類だけではなく、牛、豚、羊、馬、犬及び猫などの家畜を含む。
【００４７】
また、本発明は、１)ｐ３４タンパク質発現細胞株に被検物質を処理する段階；２)前記細胞株でｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度を測定する段階；及び３)前記ｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度が被検物質を処理しない対照群に比べて減少した被検物質を選別する段階；を含む癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
前記方法において、１)段階の細胞株は、癌細胞株を全て含み、好ましくは、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１を同時に発現する癌細胞株を含むが、これに限定されない。
【００４９】
前記方法において、２)段階で遺伝子の発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲ(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ)、ノーザンブロット(Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ)、ｃＤＮＡマイクロアレイ混成化反応及びｉｎ ｓｉｔｕ混成化反応などの方法を通じて測定することができ、当業者において知られた遺伝子の量を測定する全ての方法を使用することができるが、これに限定されない。
【００５０】
前記方法において、２)段階でタンパク質の活性程度は、免疫沈降法(ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組職化学、ウエスタンブロット(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)及びプローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)などの方法を通じて測定することができ、当業者において知られたタンパク質の量を測定する全ての方法を使用することができるが、これに限定されない。
【００５１】
また、本発明は、１)生物学的試料にＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)の発現抑制剤または活性抑制剤を処理する段階；及び２)前記生物学的試料で癌細胞の増殖可否を測定する段階；を含むｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法を提供する。
【００５２】
前記方法において、１)段階の生物学的試料は、癌にかかった個体の血液、小便、唾液及び組職などを含むが、これに限定されない。
【００５３】
前記方法は、３)生物学的試料の癌細胞が増殖されると、ｐ３４の発現抑制剤または活性抑制剤の癌に対する治療効果が存在しないで、生物学的試料の癌細胞が増殖されないと、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の治療効果が存在すると予測する段階；をさらに含むことを特徴とする。
【００５４】
ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮのみを発現する癌及びＰＴＥＮのみを発現する癌では、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の処理による治療効果がなく、ＮＥＤＤ４−１、ＰＴＥＮ及びｐ３４が同時に発現する癌では、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の処理による坑癌效果を有することができる。
【００５５】
以下、本発明の好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されたものに過ぎず、下記実施例よって本発明の内容が限定されるものではない。
【００５６】
実施例１．ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の間の生体内及び試験管内の相互作用及びｐ３４がＮＥＤＤ４−１タンパク質の安全性に及ぶ影響の分析
１−１．内因性ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の間の相互作用の分析
(１)ＮＥＤＤ４−１に相互作用するタンパク質を同定するため、細胞溶解液からＮＥＤＤ４−１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降法、タンデム親和性精製及び質量分析を実行した。まず、免疫沈降法を実行するために、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、前立腺癌細胞であるＤＵ１４５及び乳房癌細胞であるＭＣＦ７の溶解液を抗−ＮＥＤＤ４−１抗体と各々混合した後、４℃で１２時間の間培養した。その後、２０μｌのタンパク質Ａ/Ｇ Ｐｌｕｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ)を前記培養物に加えて混合した後、２時間の間追加培養した。収得された免疫沈降物を溶解緩衝液(ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ)で５回洗浄した後、２０μｌの２ｘＳＤＳサンプル緩衝液を処理し加熱した。
【００５７】
また、ウエスタンブロットを実行するために、各細胞から分離したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分離した後、これをメンブレインＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎｍｅｍｂｒａｎｅｓ(Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ)に移した後、多様な抗体(ａｎｔｉ−ＰＴＥＮ(Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＣＡ、ＵＳＡ)、ａｎｔｉ−ｐ３４(Ｅｎｚｏ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ)、ａｎｔｉ−ＮＥＤＤ４−１及びｇ−ｔｕｂｕｌｉｎ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ))を利用して従来公知された方法によって実験を実行した。
【００５８】
その結果を図１及び図２に示した。
【００５９】
図１に示したように、ＮＥＤＤ４−１と相互作用する多様なタンパク質のうちｐ３４が存在することを確認した(赤色矢印で表示)。図２に示したように、３個の細胞株のうち２個の癌細胞株(ＤＵ１４５及びＭＣＦ７細胞)でｐ３４が発現されることを確認した。ｐ３４は、ＣＤＫ４(ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ４)及びＸＩＡＰ(Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ)に結合することで知られている。
【００６０】
(２)前記結果を検証するために、本発明者らは、ＤＵ１４５、ＭＣＦ７及びＬＳ１０３４細胞内で内因性ｐ３４とＮＥＤＤ４−１の相互作用を免疫沈降法及びウエスタンブロットを通じて観察した。その結果を図３及び図４に示した。
【００６１】
図３及び図４に示したように、ＤＵ１４５、ＭＣＦ７及びＬＳ１０３４細胞で全てｐ３４−結合ＮＥＤＤ４−１及びＮＥＤＤ４−１結合ｐ３４を確認した。
【００６２】
(３)前記実験結果を他の癌細胞株で確認するために、本発明者らは、多様な結腸癌及び乳房癌細胞株(ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ，ＤＬＤ１、ＣｏＬｏ２０１、ＬＳ１０３４、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８Ｔなど)でｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の発現を分析した。その結果を図５に示した。
【００６３】
図５に示したように、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の相互作用は、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１タンパク質を同時発現するＬＳ１０３４細胞株とＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株でも観察された。
【００６４】
１−２．外因性ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の間の相互作用の分析
外因性に発現されるｐ３４とＮＥＤＤ４−１の間の相互作用を調査するために、内因性ではｐ３４を発現しない２９３細胞をＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４及び/またはｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１を発現する構造物(ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ)でトランスフェクションさせた。以後、２９３細胞の溶解物を免疫ブロットを通じて分析した。その結果を図６に示した。
【００６５】
図６に示したように、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４は、前記２９３細胞のｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１免疫沈降物から検出された。したがって、外因性に発現されるｐ３４とＮＥＤＤ４−１の間にも相互作用が起きることを確認することができた。
【００６６】
１−３．ｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮの間の相互作用の分析
ｐ３４とＮＥＤＤ４−１、ＰＴＥＮの間の相互作用を観察するために、下記のようにＧＳＴプルダウン分析(ＧＳＴ Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｎａｌｙｓｉｓ)を実行した。まず、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ−２１(ＤＥ３)株から発現されて精製された５００ｎｇのＧＳＴ−ｐ３４タンパク質またはＧＳＴタンパク質(対照群)を準備した後、これをＮＥＤＤ４−１が欠失された変異細胞株と反応緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１２０ｍＭ ＮａＣｌ)で混合した後、３０℃で１時間の間培養した。次に、ＧＳＴプルダウン緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０.０２％ ＢＳＡ、５ｍＭメルカプトエタノール)を加えて反応を停止させた。その後、ＧＳＴ及び関連タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズを利用して４℃で１時間の間プルダウンさせた。タンパク質複合体をＧＳＴプルダウン緩衝液で６回洗浄して２ｘ ＳＤＳサンプル緩衝液を加えた。免疫沈降物内のｐ３４及びＮＥＤＤ４−１の存在は、抗−ＧＳＴ、抗―Ｔ７抗体を利用した免疫ブロットを通じて各々分析した。その結果を図７及び図８に示した。
【００６７】
図７に示したように、免疫沈降物内でｐ３４が結合されたＮＥＤＤ４−１タンパク質が検出されることを確認した。
【００６８】
また、図８に示したように、精製された組換えＧＳＴ−ＰＴＥＮをＭｙｃ−ＮＥＤＤ４−１と培養してｐ３４とＰＴＥＮとの結合を分析した結果、ＰＴＥＮが結合されたｐ３４タンパク質は検出されなかった。これを通じて、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１と異なりＰＴＥＮには結合しないことを確認した。
【００６９】
前記実験結果から、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１と直接的に相互作用するが、ＰＴＥＮとは相互作用しないことが分かった。
【００７０】
１−４．ｐ３４と相互作用するＮＥＤＤ４−１ドメインの分析
(１)前記実施例１−３を通じて、ｐ３４と相互作用すると確認されたＮＥＤＤ４−１タンパク質のドメインを分析した。このために、ＮＥＤＤ４−１ ｃＤＮＡを発現するプラスミドからＴ７−ｔａｇｇｅｄベクターを利用してＴ７−ｔａｇｇｅｄ野生型(ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ)ＮＥＤＤ４−１とＮＥＤＤ４−１の一部ドメインが欠失されたＮＥＤＤ４−１変異体を製造した。精製されたＧＳＴ−ｐ３４タンパク質を、Ｔ７−ｔａｇｇｅｄ野生型ＮＥＤＤ４−１またはＮＥＤＤ４−１変異体(Ｃ２、ＷＷｓ及びＨＥＣＴ(ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅ６−ＡＰ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎｕｓ)ドメイン欠失(Ｎ１)、ＷＷｓ及びＨＥＣＴドメイン欠失(Ｎ２)、Ｃ２、ＷＷ３、ＷＷ４及びＨＥＣＴドメイン欠失(Ｎ３)、Ｃ２、ＷＷ１、ＷＷ２及びＨＥＣＴドメイン欠失(Ｎ４)、Ｃ２及びＷＷｓドメイン欠失(Ｎ５))を発現する２９３細胞の溶解液と一緒に培養した。以後、ＧＳＴプルダウンアッセイを通じてｐ３４が結合するＮＥＤＤ４−１のドメインを分析した。その結果を図９に示した。
【００７１】
図９に示したように、ＧＳＴ−ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１−野生型及びＮＥＤＤ４−１−Ｎ３から検出された。これは、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１のＷＷ１及びＷＷ２を含むドメインと相互作用することを意味した。
【００７２】
前記実験結果に基づいて、ｐ３４との直接的な結合に関連されたドメインがＮＥＤＤ４−１のＷＷ１またはＷＷ２ドメインのうちどれかを確認した。このために、ＷＷ１またはＷＷ２ドメインのみを各々有するＮＥＤＤ４−１の２種の変異体構造物(Ｎ６、Ｎ７)を製造した。精製されたＧＳＴ−ｐ３４タンパク質を、前記ＮＥＤＤ４−１の変異体を発現する細胞の溶解液と一緒に培養した後、ＧＳＴプルダウンアッセイを実行した。その結果を図９に示した。
【００７３】
図９に示したように、ＧＳＴ−３４は、ＮＥＤＤ４−１のＷＷ１ドメインから明確に検出された。これを通じて、ｐ３４が直接的にＮＥＤＤ４−１のＷＷ１ドメインに結合することを確認した。
【００７４】
(２)前記結果を検証するために、ＧＳＴ−ｔａｇｇｅｄされてＷＷ１ドメインが欠失された野生型ＮＥＤＤ４−１の変異体(ＧＳＴ−ｄｅｌＷＷ１)を含むプラスミドを製作した。前記ＮＥＤＤ４−１の変異体タンパク質をＨｉｓ−ｐ３４を発現する細胞から分離した細胞溶解液と培養した後、ＧＳＴプルダウンアッセイを実行した。その結果を図１０に示した。
【００７５】
図１０に示したように、ｐ３４タンパク質は、野生型ＮＥＤＤ４−１タンパク質と相互作用したが、ＷＷ１ドメインが欠失されたＮＥＤＤ４−１タンパク質とは相互作用しなかった。これを通じて、ＮＥＤＤ４−１のＷＷ１ドメインにｐ３４が直接的に結合することを確認した。
【００７６】
１−５．ｐ３４がＰＴＥＮとＮＥＤＤ４−１の結合に及ぶ影響の分析
ｐ３４がＰＴＥＮとＮＥＤＤ４−１の結合に影響を及ぼすか否かを調査するために、ＧＳＴ−ＰＴＥＮ融合タンパク質をＭｙｃ−ＮＥＤＤ４−１及びＨｉｓ−ｐ３４を発現する細胞の融解液と培養した後、ＧＳＴプルダウンアッセイを実行した。対照群としては、ＧＳＴタンパク質を利用した。その結果を図１１に示した。
【００７７】
図１１に示したように、ＰＴＥＮは、ｐ３４の存在/不在下でＮＥＤＤ４−１と相互作用したが、ｐ３４がない時よりはｐ３４が存在する時に強く相互作用した。これは、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１とＰＴＥＮの結合親和性に影響を及ぼすことができることを暗示する。
【００７８】
前記実験結果から、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１のＷＷ１ドメインと相互作用するが、ＰＴＥＮとは相互作用しないで、ＮＥＤＤ４−１とＰＴＥＮの相互作用を妨害しないことを確認した。また、前記実験結果から、ｐ３４によるＮＥＤＤ４−１タンパク質の向上された安全性がＰＴＥＮのポリユビキチン化(ｐｏｌｙ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ)に影響を及ぼすことが分かる。
【００７９】
１−６．ｐ３４がＮＥＤＤ４−１の細胞内の自己ユビキチン化に及ぶ影響分析
(１)ＮＥＤＤ４−１が細胞内で自己ユビキチン化(ａｕｔｏ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ)されると以前から報告されたので、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化に及ぶ影響を分析した。２９３細胞をＮＥＤＤ４−１及び/またはｐ３４でトランスフェクションした後、前記細胞にＭＧ１３２(２５ｍＭ)を処理し、６時間の間培養した。細胞培養物を収得してその抗−Ｍｙｃ免疫沈降物を分析した。その結果を図１２に示した。
【００８０】
図１２に示したように、ＭＧ１３２で処理された細胞内で、ＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化はｐ３４の存在によって顕著に減少した。
【００８１】
(２)前記結果を検証するために、精製されたタンパク質を利用した細胞−フリーシステムでＮＥＤＤ４−１のユビキチン化を分析した。まず、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄベクターを使用してｐ３４ ｃＤＮＡ発現プラスミドからＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４を製造した。精製されたＧＳＴ−ＮＥＤＤ４−１タンパク質をＥ１、ＵｂｃＨ５ｃ及び前記Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４を発現する２９３細胞抽出物と一緒に培養した後、自己ユビキチン化を測定した。その結果を図１３に示した。
【００８２】
図１３に示したように、ＧＳＴ−ＮＥＤＤ４−１ユビキチン化は、ｐ３４の発現によって漸次的に減少した。これを通じて、ｐ３４が完全な細胞(ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌ)及び細胞−フリーシステムで全てＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化を抑制することを確認した。
【００８３】
(３)２９３及びＭＣＦ７細胞を各々ｐ３４を発現するプラスミドで２４時間の間トランスフェクションするか、ｐ３４に対するｓｉＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ)で４８時間の間トランスフェクションした。前記細胞にＣＨＸ(ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、５０ｍｇ/ｍｌ)を各時間帯別に処理して、ＮＥＤＤ４−１タンパク質を確認するためにウエスタンブロットを実行した。その結果を図１４及図１５に示した。
【００８４】
図１４に示したように、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４とｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１で同時トランスフェクションされた細胞内でのＮＥＤＤ４−１タンパク質の水準は、ｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１のみで処理された細胞内でより一層増加され且つ高い状態で維持された。
【００８５】
また、図１５に示したように、ｐ３４に対するｓｉＲＮＡを使用してｐ３４をノックダウンさせた細胞内でのＮＥＤＤ４−１タンパク質の水準は、スクランブル(ｓｃｒａｍｂｌｅｄ)ｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較してよほど減少した。これを通じて、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１タンパク質を安定化させることを確認した。
【００８６】
このような結果は、ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１の自己ユビキチン化を抑制してＮＥＤＤ４−１タンパク質を安定化させるという事実を強く暗示する。
【００８７】
実施例２．ｐ３４がＮＥＤＤ4-1により媒介されるＰＴＥＮのポリユビキチン化調節に及ぶ影響の分析
(１) ｐ３４のｓｉＲＮＡを使用して、ｐ３４の発現抑制による沈黙効果を分析した(ｐ３４−ｓｉＲＮＡ：Ｉ：５'−ＧＣＡＡＧＧ ＧＵＣＵＧＡＡＧＣＧＧＡＡ−３、ＩＩ：５'−ＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ−３'、ＩＩＩ：５'−ＣＣＧＡＡＵＵＧＧＡＣＵＡＣＣＵＣＡＵ−３')。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ７細胞をｐ３４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、各タンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した。その結果を図１６に示した。
【００８８】
図１６に示したように、ｐ３４−ｓｉＲＮＡは、濃度依存的にＰＴＥＮの発現増加及びｐ−Ａｋｔの発現減少を誘導することを確認した。
【００８９】
また、２９３及びＭＥＦ(ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ)細胞をＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４でトランスフェクションした後、各タンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した。その結果を図１７に示した。
【００９０】
図１７に示したように、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４の発現は、内因性ｐ３４を発現しない２９３またはＭＥＦ細胞でＰＴＥＮタンパク質の水準を減少させた。また、Ａｋｔのリン酸化水準は、ｐ３４発現水準によって増加し、ＰＴＥＮの発現水準と反比例した。
【００９１】
これを通じて、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１に結合することでＰＴＥＮタンパク質の水準に影響を与えることができることを確認した。
【００９２】
(２)前記実験結果に基づいて、本発明者らは、ＭＣＦ７細胞をｐ３４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、タンパク質合成阻害剤であるＣＨＸ(ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ)で処理し、時間によって内因性に発現されるｐ３４タンパク質水準の変化を測定することで、ＰＴＥＮのターンオーバーの調節においてのｐ３４の役目を調査した。その結果を図１８に示した。
【００９３】
図１８に示したように、内因性でｐ３４を発現するＭＣＦ７細胞をｐ３４−ｓｉＲＮＡを利用してｐ３４をノックダウンさせた場合、ＰＴＥＮタンパク質の水準が実質的に変わらなかったが、対照群ｓｉＲＮＡ(スクランブルｓｉＲＮＡ)でトランスフェクションした細胞の場合、ＰＴＥＮの発現が減少した。このような結果は、ｐ３４がＰＴＥＮタンパク質の安全性を減少させることでＰＩ３Ｋ信号経路を陽性的に調節することを意味する。
【００９４】
(３)ｐ３４がタンパク質の分解経路を通じてＰＴＥＮタンパク質の安全性を調節するか否かを確認するために、内因性でｐ３４を発現しない２９３細胞をＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４でトランスフェクションさせた後、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を処理した。各タンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した。その結果を図１９に示した。
【００９５】
図１９に示したように、外因性でｐ３４を発現し、ＭＧ１３２に処理された細胞のＰＴＥＮタンパク質水準は、対照群ベクター(ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ)でトランスフェクションした細胞と比較してよほど減少した。
【００９６】
(４)ｐ３４がＰＴＥＮのポリユビキチン化に影響を及ぼすか否かをさらに確認するために、ユビキチン化分析(ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ)を実行した。
【００９７】
まず、２９３またはＭＥＦ細胞にＧＦＰ−ｐ３４をトランスフェクションした後、ＭＧ１３２と一緒に培養し、ＰＴＥＮのユビキチン化を分析した。その結果を図２０に示した。
【００９８】
図２０に示したように、ｐ３４を離巣性発現させた後にＭＧ１３２を処理した２９３細胞またはＭＥＦ細胞でポリユビキチン化された形態のＰＴＥＮが検出された。
【００９９】
また、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＤＵ１４５細胞にｐ３４−ｓｉＲＮＡを２４時間の間トランスフェクションした後、ＭＧ１３２と一緒に培養し、ＰＴＥＮのユビキチン化を分析した。その結果を図２１に示した。
【０１００】
図２１に示したように、ｐ３４をノックダウンしたＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＤＵ１４５細胞でＰＴＥＮのポリユビキチン化が漸次的に減少した。
【０１０１】
また、２９３細胞を野生型ＰＴＥＮ及び/またはｐ３４で２４時間の間トランスフェクションした後、ＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性を測定した。より具体的には、前記細胞を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ及びプロテアーゼ抑制剤を含む１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００緩衝液でとかした後、抗−ＰＴＥＮ抗体を利用してＰＴＥＮを免疫沈降した。前記免疫沈降物を洗浄した後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)内の水溶性のｄｉＣ８−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３,４,５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び１０ｍＭ ＤＴＴと一緒に３７℃で４０分間培養した。その後、上層液を集めて、Ｂｉｏｍｏｌ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)と一緒に常温で３０分間培養した。ＰＴＥＮの活性は、６５０ｎｍでのＯＤ値を測定してリン酸塩の放出を計算することで測定された。陰性対照群として、１２３番目アミノ酸のシステイン(Ｃｙｓｔｅｉｎ)がセリン(Ｓｅｒｉｎｅ)に変異された脂質リン酸分解酵素−欠乏ＰＴＥＮ Ｃ１２４Ｓ変異株を使用した。その結果を図２２に示した。
【０１０２】
図２２に示したように、ＰＴＥＮの脂質リン酸分解酵素活性は、対照群に比べてｐ３４を離巣性に発現する細胞で顕著に減少した。
【０１０３】
このような結果は、ｐ３４がＰＴＥＮのポリユビキチン化及びプロテアソーム性の分解を媒介することを示す。
【０１０４】
(５)最近、ＰＴＥＮのユビキチン化及びプロテアソーム性の分解がＮＥＤＤ４−１により部分的に調節され、ＮＥＤＤ４−１がＥ３ユビキチンリカーゼとして機能すると報告された(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００７)。前記実施例１で本発明者らは、ｐ３４が直接的にＮＥＤＤ４−１と相互作用することを明かしたので、ＮＥＤＤ４−１がＰＴＥＮのユビキチン化及びプロテアソーム性の分解に及ぶ影響がｐ３４の発現水準に依存的であるか否かを調査した。
【０１０５】
まず、内因性ＮＥＤＤ４−１を発現するが、ｐ３４は発現しない２９３細胞またはＭＥＦ細胞をＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４プラスミド(またはＧＦＰ対照群ベクター)及びＮＥＤＤ４−１−ｓｉＲＮＡ/ｓｈＲＮＡ(またはスクランブルｓｉＲＮＡ)と共トランスフェクションさせた(ＮＥＤＤ４−１−ｓｉＲＮＡ：５'−ＴＧＧＣＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡ−３')。各タンパク質の発現程度をウエスタンブロットを通じて分析した。その結果を図２３に示した。
【０１０６】
図２３に示したように、ＮＥＤＤ４−１−ｓｉＲＮＡ/ｓｈＲＮＡ及びＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４を共トランスフェクションさせた細胞では、ＰＴＥＮタンパク質の水準が実質的にほとんど変わらなかったが、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４のみをトランスフェクションさせた細胞では、ＰＴＥＮタンパク質の水準が顕著に減少した。一貫的に、Ａｋｔのリン酸化は、ＰＴＥＮタンパク質水準に反比例した。
【０１０７】
(６)タンパク質合成阻害剤であるＣＨＸ(ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ)の存在下で、ｐ３４の離巣性発現及びＮＥＤＤ４−１ノックダウンによってＰＴＥＮのターンオーバーが影響を受けるか否かを調査した。このために、２９３細胞をｐ３４発現プラスミド及びＮＥＤＤ４−１ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ＰＴＥＮタンパク質の半減期を分析した。その結果を図２４に示した。
【０１０８】
図２４に示したように、ＰＴＥＮの水準は、ＮＥＤＤ４−１−ノックダウン２９３細胞で外因性ｐ３４の発現によって減少したが、ＣＨＸの処理後には漸進的な増加を示した。これを通じて、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１依存的にＰＴＥＮのプロテアソーム性の分解を媒介することを確認した。
【０１０９】
(７)ｐ３４がＮＥＤＤ４−１に依存的にＰＴＥＮのポリユビキチン化を媒介するか否かを確認するために、ｐ３４発現プラスミドで野生型(２９３またはＭＥＦ細胞)及びＮＥＤＤ４−１ノックダウン細胞をトランスフェクションした後、ＭＧ１３２を処理し、Ｉｎｔａｃｔ−ｃｅｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを実行した。その結果を図２５に示した。
【０１１０】
図２５に示したように、ポリユビキチン化されたＰＴＥＮは、ｐ３４発現プラスミドでトランスフェクションした野生型細胞で明確に検出されたが、ｐ３４発現プラスミドでトランスフェクションしたＮＥＤＤ４−１ノックダウン細胞では検出されなかった。
【０１１１】
また、前記２９３細胞のＰＴＥＮ脂質リン酸解酵素活性を分析した。その結果を図２６に示した。
【０１１２】
図２６に示したように、ＰＴＥＮの脂質リン酸分解酵素活性は、ｐ３４を離巣性に発現する２９３細胞のＮＥＤＤ４−１ノックダウン時に維持されたが、前記細胞をスクランブルｓｉＲＮＡで処理した場合、このような活性が喪失されることを確認した。
【０１１３】
このような結果は、ＮＥＤＤ４−１がｐ３４に依存的にＰＴＥＮのポリユビキチン化を誘導することを示す。
【０１１４】
(８)最近、ＸＩＡＰがＰＴＥＮのポリユビキチン化を誘導すると報告された(Ｖａｎ Ｔｈｅｍｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ., ２００９)。したがって、ｐ３４がＸＩＡＰにより誘導されたＰＴＥＮポリユビキチン化に影響を与えるか否かを評価するために、ＸＩＡＰノックアウトＭＥＦ細胞でポリユビキチン化実験を実行した。ＸＩＡＰノックアウトＭＥＦ細胞は、Ｄｒ. Ｄｕｃｋｅｔｔ(Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ)から提供を受けた。その結果を図２７〜図２９に示した。
【０１１５】
図２７に示したように、ウエスタンブロットを通じてＸＩＡＰノックアウトＭＥＦ細胞でＸＩＡＰの発現がないことを確認した。
【０１１６】
また、図２８に示したように、ＸＩＡＰノックアウトＭＥＦ細胞をＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４でトランスフェクションさせる場合、ＰＴＥＮタンパク質の水準が顕著に減少されることを確認した。
【０１１７】
また、図２９に示したように、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４でトランスフェクションさせたＸＩＡＰノックアウトＭＥＦ細胞でＰＴＥＮが強くポリユビキチン化されることを確認した。
【０１１８】
前記結果から、ｐ３４は、ＸＩＡＰに独立的にＮＥＤＤ４−１を通じてＰＴＥＮのポリユビキチン化を調節することを確認した。
【０１１９】
実施例３．ｐ３４のＮＥＤＤ４−１を通じたＰＴＥＮのモノユビキチン化及びポリユビキチン化調節の分析
(１)最近、ＮＥＤＤ４−１がＰＴＥＮの試験管内及び細胞内のポリユビキチン化だけではなく、モノユビキチン化を媒介し、ＰＴＥＮのモノユビキチン化は、ＰＴＥＮの核膜孔を通じた核移動(ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ)を媒介することで報告された(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００７)。前記実施例２に示したように、ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１を通じてＰＴＥＮポリユビキチン化を調節することを確認した。前記結果に基づいて、本発明者らは、ｐ３４がＰＴＥＮのモノユビキチン化に影響を及ぼすか否かを分析した。
【０１２０】
まず、内因性でｐ３４及びＮＥＤＤ４−１を発現する４個の癌細胞株(ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＤＵ１４５及びＬＳ１０３４)をｐ３４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクションさせて、Ｉｎｔａｃｔ−ｃｅｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを通じてＰＴＥＮのユビキチン化状態を調査した。その結果を図３０に示した。
【０１２１】
図３０に示したように、ｐ３４のノックダウンは、全ての癌細胞株でＰＴＥＮのモノユビキチン化を増加させた。
【０１２２】
また、ＭＣＦ７細胞をｐ３４−ｓｉＲＮＡで２４時間の間トランスフェクションさせた後、核とサイトゾル区画を分画した。ウエスタンブロットを利用してＰＴＥＮの発現を分析した。その結果を図３１に示した。
【０１２３】
図３１に示したように、ＰＴＥＮタンパク質は、ｐ３４−ノックダウンＭＣＦ７細胞の核分画物で強く検出されたが、スクランブルｓｉＲＮＡで理された細胞では、ＰＴＥＮの核局在化がほとんど現われなかった。さらに、モノユビキチン化されたＰＴＥＮは、ｐ３４−ノックダウンＭＣＦ７細胞の核分画物でのみ検出された。これは、ｐ３４の発現は、ＰＴＥＮのモノユビキチン化及び核局在化(ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ)に影響を与えることを示す。
【０１２４】
(２)ＮＥＤＤ４−１がｐ３４の発現によってＰＴＥＮのモノユビキチン化に影響を及ぼすか否かを調査するために、ＭＣＦ７細胞をＮＥＤＤ４−１−ｓｉＲＮＡ、ｐ３４−ｓｉＲＮＡ及び/またはＧＦＰ ｔａｇｇｅｄ ｐ３４で２４時間の間トランスフェクションさせた後、ＰＴＥＮのユビキチン化を分析した。その結果を図３２に示した。
【０１２５】
図３２に示したように、モノユビキチン化されたＰＴＥＮは、ｐ３４−ノックダウン細胞では観察されたが、ＮＥＤＤ４−１−ｓｉＲＮＡ及びｐ３４−ｓｉＲＮＡで共トランスフェクションした細胞では観察されなかった。
【０１２６】
(３)これを検証するために、本発明者らは、Ｅ１及びＥ２酵素の存在下で、精製されたＧＳＴ−ＰＴＥＮタンパク質をＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１を発現する２９３細胞から分離したタンパク質抽出物及び/またはＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４と培養した。その後、ＧＳＴ−ＰＴＥＮのＣｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを実行した。その結果を図３３及び図３４に示した。
【０１２７】
図３３に示したように、ＰＴＥＮは、ＮＥＤＤ４−１のみが存在する場合、モノユビキチン化されたが、ＮＥＤＤ４−１及びｐ３４が全て存在する場合、強くポリユビキチン化された。
【０１２８】
また、図３４に示したように、ＰＴＥＮのポリユビキチン化は、ｐ３４に依存的にますます減少した。これは、ＮＥＤＤ４−１により媒介されるＰＴＥＮのモノ及びポリユビキチン化がｐ３４の発現に依存的であることを意味する。
【０１２９】
(４)ｐ３４がＮＥＤＤ４−１−媒介ＰＴＥＮユビキチン化過程でＥ２−類似酵素の役目をするか否かを調査した。Ｅ１及びＥ２の存在または不在下で、ＧＳＴ−ＰＴＥＮをｐ３４及びＮＥＤＤ４−１と培養した後、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを通じてＰＴＥＮのユビキチン化を分析した。その結果を図３５に示した。
【０１３０】
図３５に示したように、精製されたＧＳＴ−ＰＴＥＮは、Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ ＮＥＤＤ４−１及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐ３４を発現する２９３細胞から得た抽出物でＥ２酵素の存在下でユビキチン化されたが、Ｅ２酵素がない場合は、ユビキチン化されなかった。これを通じて、ｐ３４がＥ２−類似酵素としての役目をしないことを確認した。したがって、前記結果から、ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１により媒介されるＰＴＥＮのモノユビキチン化及びポリユビキチン化を調節することが分かる。
【０１３１】
実施例４．ｐ３４と癌細胞増殖との関係分析
前記実施例１〜実施例３の実験結果を通じて、ｐ３４は、ＮＥＤＤ４−１の自己ビクキチン化を阻害することでＮＥＤＤ４−１タンパク質の安定性を陽性的に調節するので、ｐ３４のノックダウンは、ＰＴＥＮポリユビキチン化を減少させて、ＮＥＤＤ４−１により媒介されるＰＴＥＮのモノユビキチン化を通じてＰＴＥＮタンパク質水準を増加させることを確認した。
【０１３２】
(１)ｐ３４がＮＥＤＤ４−１/ＰＴＥＮ経路で強い原腫瘍遺伝子として機能することができるかどうかを確認するために、ｐ３４−ｓｉＲＮＡを発現するＭＣＦ７及びＬＳ１０３４細胞の増殖を検査した。集落形成アッセイ(Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ)及びソフトアガーアッセイを実行した。
【０１３３】
集落形成アッセイを実行するために、６ウェルプレート当たり３００個の濃度で細胞を植えた後、クローン原生容量(ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ)を測定した。プレーティングをして１０〜１４日が経た後、細胞を固定し、０.０１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。
【０１３４】
ソフトアガーアッセイは、下記のように実行した。１.６％アガロースを１０％ＦＢＳを含む２Ｘ ＤＭＥＭまたは２Ｘ ＲＰＭＩ−１６４０培地を利用して製造した後、これを６ウェルプレートに添加してソフトアガープレートを準備した。ここに、０.７％のアガロース及び１０％のＦＢＳを含む２Ｘ ＤＭＥＭまた２Ｘ ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させた細胞(１Ｘ１０４)を植えた。これを２〜３週間３７℃の培養器で培養した後、顕微鏡集落を計算した。
【０１３５】
その結果を図３６〜図３８に示した。
【０１３６】
図３６に示したように、ｐ３４−ｓｉＲＮＡを発現するＭＣＦ７及びＬＳ１０３４細胞の成長は、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞に比べて顕著に減少した。
【０１３７】
また、図３７及び図３８に示したように、ｐ３４−ｓｉＲＮＡで処理された細胞の集落形成頻度は、対照群に比べて顕著に減少され(図３７)、集落の大きさも減少された(図３８)。
【０１３８】
(２)ＰＴＥＮのターゲット遺伝子であるサイクリンＥ２とｃｄｃ６遺伝子の発現水準を下記のようにＲＴ−ｑＰＣＲ分析を通じて確認した。細胞をｐ３４−ｓｉＲＮＡまたはスクロムブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションさせた後、前記細胞から総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を利用して分離し、ＲＴプリイミクス(Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ)及びオリゴｄＴ１６−１８プライマーを利用して相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)本を製造した。その後、下記表１のプライマーセットを利用してｐ３４、ｃｄｃ６、サイクリンＥ２遺伝子に対してＲＴ−ｑＰＣＲを実行した。その結果を図３９に示した。
【０１３９】
【表１】
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図３９に示したように、ｐ３４−ノックダウン細胞でＰＴＥＮのターゲット遺伝子であるサイクリンＥ２及びｃｄｃ６遺伝子の発現水準が減少した。これを通じて、ｐ３４のノックダウンは、サイクリンＥ２及びｃｄｃ６遺伝子を下向き調節することで癌細胞の成長を抑制することを確認した。
【０１４０】
(３)ｐ３４ノックダウンの癌細胞増殖に対する抑制効果をさらに調査するために、本発明者らは、安定的にテトラサイクリン−誘導性ｐ３４−ｓｈＲＮＡベクターを発現するＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株の変異株を確立した。ます、ＴｅｔＲ−発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ６.０/ＴＲ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)をＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞でトランスフェクションさせた後、ブラストサイジン(ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ 10 μg/ｍｌ)で３週の間選別した。ＴｅｔＲを発現するクローン細胞は、抗−ＴｅｔＲ抗体で免疫ブロット分析を通じて確認された。二つのＴｅｔＲを過発現するクローンは、２次選別のためにＨ１−ｐ３４−ｓｈＲＮＡベクター(５'−ＣＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＴ−３')で更にトランスフェクションさせた後、ゼオシン(ｚｅｏｃｉｎ ３００μg/ｍｌ)で３週の間選別し、テトラサイクリン−誘導性(Ｔｅｔ−ｏｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ)ｐ３４細胞株を確立した。これらをテトラサイクリンに露出させた後、ＴｅｔＲを発現するＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株のクローンを選別した。また、前記変異株にテトラサイクリンを処理した後、ウエスタンブロットを利用して各タンパク質の発現を分析した。また、前記変異株のＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素活性及び集落形成アッセイを実行した。その結果を図４０〜図４３に示した。
【０１４１】
図４０に示したように、ＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株でＴｅｔＲの発現を確認した。図４１に示したように、ＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株にテトラサイクリン(Ｔｅｔ；１ｍｇ/ｍｌ)を処理する場合、ｐ３４の発現が阻害され、ＰＴＥＮ発現が増加することを確認した。リン酸化Ａｋｔは、ＰＴＥＮ水準に反比例した。
【０１４２】
また、図４２に示したように、ＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株でテトラサイクリン処理によりＰＴＥＮ脂質リン酸解酵素活性が増加した。
【０１４３】
また、図４３に示したように、ＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株でテトラサイクリン処理により集落形成が顕著に減少されることを確認した。
【０１４４】
追加的に、前記ＤＵ１４５またはＭＤＡ−ＭＢ２３１変異株の細胞成長を観察し、ＢｒｄＵアッセイを実行した。その結果を図４４及び図４５に示した。
【０１４５】
図４４に示したように、テトラサイクリンで処理された細胞は、テトラサイクリンで処理されない細胞に比べて成長が顕著に減少した。
【０１４６】
また、図４５に示したように、テトラサイクリンで処理された細胞は、ＢｒｄＵ(Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ)の混成が顕著に減少された。
【０１４７】
(４)ｐ３４が安定的に過発現される細胞を製造するために、ｐ３４が検出されないＨｓ５７８Ｔ細胞をレトロウイルス性ベクターであるｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ(対照群)またはｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ−ｐ３４でトランスフェクションさせた後、ピューロマイシン(ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ２μg/ｍｌ)で２週の間選別した。ｐ３４の発現は、抗−ｐ３４抗体を利用したウエスタンブロットを通じて確認した。前記方法で製造した細胞のタンパク質の分析のためにウエスタンブロットを実行し、集落形成を観察した。その結果を図４６に示した。
【０１４８】
図４６に示したように、対照群ベクターを発現する細胞よりｐ３４を安定的に発現するＨｓ５７８Ｔ細胞でＰＴＥＮの発現が減少し、集落形成が顕著に上昇した。
【０１４９】
このような結果から、ｐ３４がＰＴＥＮを通じた癌細胞増殖を抑制することを確認した。
【０１５０】
実施例５．ｐ３４の腫瘍発生性(ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ)の強化
(１)ｐ３４の発現がＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性に影響を及ぼすか否かを確認するために、前記実施例４−(３)で確立したテトラサイクリンに誘導が可能であり、ｐ３４ ｓｈＲＮＡを安定的に発現してｐ３４の発現を枯らしたＤＵ１４５変異株及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株を利用し、下記のように実験を実行した。確立された各細胞をＢａｌｂ/ｃヌードマウスの皮下に注入して異種移植片(ｘｅｎｏｇｒａｆｔ)腫瘍を形成させた。腫瘍の大きさを３日間隔で２週の間観察し、腫瘍の大きさが１８０ｍｍ３に到逹した時を０日として、１０ｍｇ/ｋｇの濃度でテトラサイクリンを投与し(対照群はｖｅｈｉｃｌｅで水投与)、腫瘍の大きさを続いて観察した。全ての動物実験は、牙山メディカルセンター敷設動物管理及び利用に関する委員会の承認を受けたプロトコルによって進行された。その結果を図４７〜図５２に示した。
【０１５１】
図４７及び図４８に示したように、ｐ３４−ｓｈＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＵ１４５変異株またはｐ３４−ｓｈＲＮＡ−トランスフェクションされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株を注入し、テトラサイクリンを投与した群でＰＴＥＮの発現が増加し、ＮＥＤＤ４−１の発現が減少した。
【０１５２】
また、図４９及び図５０に示したように、ｐ３４−ｓｈＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＵ１４５変異株またはｐ３４−ｓｈＲＮＡ−トランスフェクションされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１変異株の注入によって誘導された腫瘍の成長は、テトラサイクリンを投与した場合、対照群に比べて顕著に減少した。
【０１５３】
また、図５１及び図５２に示したように、各マウス腫瘍組職の免疫組職の化学分析結果、ＰＴＥＮタンパク質は、テトラサイクリン投与後、強い核局在化を示すことを確認した。
【０１５４】
このような結果から、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性の活性を強化することを確認した。
【０１５５】
(２)ｐ３４がＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性活性に及ぶ効果を検証するために、本発明者らは、内因性ｐ３４を発現しないｐ５４−ｎｕｌｌ ＭＥＦ(ｐ５３−/−/ＭＥＦ)細胞(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ)を活用した。ＮＥＤＤ４−１は、単独で原腫瘍性を有しないが、ＮＥＤＤ４−１の過発現がＲａｓにより媒介されるｐ５３−ｎｕｌｌ ＭＥＦ細胞の変形を増進させるという研究結果が報告された(Ｗａｎｇ et ａｌ., ２００７)。前記研究結果に基づいて、本発明者らは、ｐ３４の発現がＲａｓにより媒介されるｐ５３−ｎｕｌｌ ＭＥＦ細胞の変形に及ぶ効果を最初に調査した。ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞のタンパク質発現及び集落形成分析を実行した。その結果を図５３及び図５４に示した。
【０１５６】
図５３に示したように、ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞でタンパク質の発現を分析した結果、ｐ３４の発現は、ＰＴＥＮ発現の減少及びＮＥＤＤ４−１発現の増加を誘発した。
【０１５７】
また、図５４に示したように、ｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞で集落形成の分析を実行した結果、ｐ３４の発現は、Ｒａｓを発現するｐ５３−/−/ＭＥＦ細胞に比べて細胞集落の面で増加を示した。
【０１５８】
(３) レトロウイルス基盤のｓｈＲＮＡベクターを利用して製造したＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−ｎｕｌｌ(ｐ５３−/−)ＭＥＦ細胞でｐ３４の原腫瘍性の活性を観察した。ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−ｎｕｌｌ(ｐ５３−/−)ＭＥＦ細胞のタンパク質発現、集落形成及びユビキチン化を分析した。その結果を図５５〜図５７に示した。
【０１５９】
図５５に示したように、ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−ＭＥＦ細胞でｐ３４の発現は、ＰＴＥＮの減少を誘発しなかった。
【０１６０】
また、図５６に示したように、集落形成アッセイ結果、ＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−ＭＥＦ細胞でｐ３４の発現にもかかわらず細胞形成が抑制されることを確認した。
【０１６１】
また、図５７に示したように、ユビキチン化アッセイ結果、ｐ３４の発現は、対照群ｓｈＲＮＡを発現するｐ５３−ｎｕｌｌ ＭＥＦ細胞でＰＴＥＮのポリユビキチン化を誘導したが、ＮＥＤＤ４−１ ｓｈＲＮＡを発現するＮＥＤＤ４−１ノックダウン−ｐ５３−/−ＭＥＦ細胞では、ＰＴＥＮのポリユビキチン化を誘発しなかった。これは、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１に依存的に、Ｒａｓにより媒介されるｐ５３−ｎｕｌｌ ＭＥＦ細胞の変形を向上させることを意味する。
【０１６２】
(４)ｐ３４のＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性の活性に及ぶ効果がＰＴＥＮに依存的であるか否かを確認するために、ＰＴＥＮ ｓｈＲＮＡを発現するｐ５３−ｎｕｌｌ ＭＥＦ細胞を利用してウエスタンブロット及び集落形成の分析を実行した。その結果を図５８に示した。
【０１６３】
図５８に示したように、前記ＭＥＦ細胞でｐ３４の発現は、Ｒａｓの変形活性を向上させることに失敗した。これは、ｐ３４がＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性の活性をＰＴＥＮに依存的に向上させることを意味する。
【０１６４】
(５)ヒトの癌組職でｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及び/またはＰＴＥＮの臨床的な関連性を調査した。ＮＥＤＤ４−１を通じたＰＴＥＮユビキチン化の陽性的調節子としてｐ３４の機能を考慮した時、ヒトの癌組職でｐ３４の発現は、ＮＥＤＤ４−１により誘導されるＰＴＥＮタンパク質水準の減少に影響を及ぼす可能性があった。これを検証するために、本発明者らは、ｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮの発現を１３５個の分離された乳房癌及び１９１個の結腸癌のパラフィン包埋サンプルをＴＭＡ(Ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ)して評価した。
【０１６５】
１３５個の乳房癌サンプルのうち９０個(６６.７％)がｐ３４−陽性であり、４５個(３３.３％)がｐ３４−陰性であった。また、ＮＥＤＤ４−１の発現は、９０個のｐ３４陽性サンプルのうち８５個(９４.４％)のサンプルから検出され、大多数(５８/８５；６８.２％)のＮＥＤＤ４−１/ｐ３４陽性サンプルは、ＰＴＥＮタンパク質を発現した。ＮＥＤＤ４−１は、ｐ３４陰性サンプル(４５/４５；１００％)でも高く発現された。しかし、ｐ３４陽性サンプルでは、少数(２１/４５；４６.６７％)のみがＰＴＥＮを発現した。
【０１６６】
また、１９１個の結腸癌組職のうち、１７７個(６１.３％)のサンプルでｐ３４が陽性に検出され、７４個(３８.７％)のサンプルでｐ３４が陰性であることで現われた。また、ＰＴＥＮの発現は、１２７個のＮＥＤＤ４−１/ｐ３４二重陽性(ｄｏｕｂｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ)サンプルのうち、少数(１１.８％)でのみ検出された。一方、ｐ３４を発現しない１４９個のＮＥＤＤ４−１陽性サンプルの中では、８個のサンプルでのみＰＴＥＮが発現された。
【０１６７】
図５９及び図６０に示したように、乳房癌及び結腸癌サンプルでは、ｐ３４、ＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮの発現水準の間に著しい反比例関係があったが、結腸癌サンプルでは、ｐ３４陰性、ＮＥＤＤ４−１陽性は、ＰＴＥＮ水準に影響を及ぼさなかった。
【０１６８】
したがって、前記結果から、ヒトの乳房癌及び結腸癌でのｐ３４の発現は、ＮＥＤＤ４−１の原腫瘍性の活性に対してＰＴＥＮ依存的に寄与することを推論することができた。
【０１６９】
ｐ３４とＮＥＤＤ４−１及びＰＴＥＮの間の総合的な相互作用を図式的に表現すれば、図６１の通りである。
【０１７０】
実施例６．ｐ３４活性抑制剤の坑癌活性の検証
前記実施例１〜実施例５を通じて確認したように、ｐ３４活性抑制剤が実際坑癌活性を有するかを検証するための実験を実行した。まず、市販中の化合物ライブラリスクリーニングを通じてｐ３４タンパク質に結合してｐ３４の活性を抑制する化合物を同定した。同定された化合物の化学式を下記に示し、以下では、化合物２７(Ｃｏｍｐｏｕｎｄ２７)で名付けた。
【０１７１】
【化２】
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６−１．ｐ３４活性抑制剤がＰＴＥＮユビキチン化に及ぶ影響の検証
ヒト乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１と大膓癌細胞株であるＬＳ１０３４にｐ３４活性抑制剤である化合物２７を１μＭの濃度で２４時間の間処理した後、ＰＴＥＮ抗体を利用して免疫沈降法を実行した。その後、ユビキチン抗体でウエスタンブロットを実行した。その結果を図６２に示した。
【０１７２】
図６２に示したように、ヒト乳房癌及び大膓癌細胞でｐ３４活性抑制剤である化合物２７は、ＰＴＥＮユビキチン化を抑制する活性を有していることを確認した。
【０１７３】
６−２．ｐ３４活性抑制剤がｐ３４とＮＥＤＤ４−１タンパク質の結合に及ぶ影響の検証
精製されたＮＥＤＤ４−１タンパク質、ｐ３４タンパク質に反応緩衝液(２０ｍＭ Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１２０ｍＭ ＮａＣｌ)及びｐ３４活性抑制剤である化合物２７を１ｍＭまたは３ｍＭの濃度で処理し、３０℃で１時間反応させた。以後、ＧＳＴプルダウン緩衝液(２０ｍＭ Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０.０２％ ＢＳＡ、５ｍＭメルカプトエタノール)を使用して反応を停止した後、グルタチオン−セファロースビーズを利用して４℃でプルダウンさせ、抗−Ｈｉｓ、抗−ＧＳＴ抗体を利用してウエスタンブロットを実行した。その結果を図６３に示した。
【０１７４】
図６３に示したように、ｐ３４活性抑制剤である化合物２７の処理によって濃度依存的にｐ３４タンパク質とＮＥＤＤ４−１タンパク質の結合が阻害されることを確認した。
【０１７５】
６−３．ｐ３４活性抑制剤のＰＴＥＮ再活性化誘導を通じた坑癌効果の検証
ヒト乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１にｐ３４活性抑制剤である化合物２７を濃度別に４８時間の間処理した後、トリパンブルー染色及びウエスタンブロットを実行した。その結果を図６４に示した。
【０１７６】
図６４に示したように、乳房癌細胞でｐ３４活性抑制剤である化合物２７の濃度依存的に細胞死滅が誘導され、ＰＴＥＮタンパク質が再活性化された。これによって、Ａｋｔの脱リン酸化が現われて、ｃａｓｐａｓｅ３が活性化されることが確認された。これを通じて、ｐ３４活性抑制剤の処理によりｐ３４−ＮＥＤＤ４−１のタンパク質結合が抑制されてＰＴＥＮが再活性化されることで細胞死滅が誘導されることを確認した。
【０１７７】
また、ヒト乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１にｐ３４活性抑制剤である化合物２７を濃度別に４８時間の間処理した後、細胞液を収去してＰＴＥＮ抗体で免疫沈降を実施した。その後、ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉＣ８−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３,４,５ ｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅが含まれた反応緩衝液(１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍＭ ＤＴＴ)と３７℃で４０分間反応させた後、上層液のみを収去してＢｉｏｍｏｌ Ｇｒｅｅｎ溶液と３０分間常温で反応させ、ＯＤ ６５０ｎｍでＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素の活性を測定した。その結果を図６５に示した。
【０１７８】
図６５に示したように、乳房癌細胞でｐ３４活性抑制剤である化合物２７の処理によってＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素の活性が増加されることを確認した。
【０１７９】
上述の実験と同一な実験をヒト大膓癌細胞株であるＬＳ１０３４を利用して実行した。その結果を図６６及び図６７に示した。
【０１８０】
図６６に示したように、大膓癌細胞でｐ３４活性抑制剤である化合物２７の濃度依存的に細胞死滅が誘導され、ＰＴＥＮタンパク質が再活性化された。これによって、Ａｋｔの脱リン酸化が現われて、ｃａｓｐａｓｅ３が活性化されることが確認された。
【０１８１】
また、図６７に示したように、大膓癌細胞でｐ３４活性抑制剤である化合物２７の処理によってＰＴＥＮ脂質リン酸分解酵素の活性が増加されることを確認した。
【０１８２】
以下、本発明の薬学的組成物及び食品組成物の製剤例を説明するが、これは、本発明を限定するものではなく、具体的に説明するためのことである。
【０１８３】
製剤例１．薬学的製剤の製造
１−１．散剤の製造
ｐ３４発現または活性抑制剤 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合し気密包に充填して散剤を製造した。
【０１８４】
１−２．錠剤の製造
ｐ３４の発現または活性抑制剤 １００ｍｇ
コンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【０１８５】
１−３．カプセル剤の製造
ｐ３４発現または活性抑制剤 １００ｇ
コンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１８６】
製剤例２．食品製剤の製造
２−１．健康食品の製造
ｐ３４発現または活性抑制剤 １００ｍｇ
ビタミン混合物  適量
ビタミンＡ アセテート ７０ｇ
ビタミンＥ １.０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０.１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０.１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０.５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０.２ｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｇ
ニコチン酸アミド １.７ｍｇ
葉酸 ５０ｇ
パントテン酸カルシウム ０.５ｍｇ
無機質混合物  適量
硫酸第一鉄 １.７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０.８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５.３ｍｇ
第１リン酸カリウム １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム ５５ｍｇ
枸椽酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４.８ｍｇ
前記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適合な成分を好ましい実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても関係なく、通常の健康食品製造方法によって前記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物製造に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016522162.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2016522162.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月18日(2015.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項２】
前記発現抑制剤は、ｐ３４遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、短ヘアピンＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ)及びリボザイム(ｒｉｂｏｚｙｍｅ)からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項３】
前記活性抑制剤は、ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣体、気質類似体、アプタマー及び抗体からなる群より選択された1種以上であることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項４】
前記ｐ３４タンパク質に特異的に結合する化合物は、下記化学式１で表示される化合物またはその薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする請求項３に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【化１】
2016522162.tif 000074
【請求項５】
前記癌は、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、骨癌、膵膓癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大膓癌、小腸癌、直腸癌、喇叭管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、ホジキン病(Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ)、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、リンパ球リンパ種、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、１次中枢神経系リンパ種、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫のうち選択された１種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項４のうちいずれか１項に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項６】
前記癌は、ｐ３４及びＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)を同時に発現する癌であることを特徴とする請求項１〜請求項４のうちいずれか１項に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。 
【請求項７】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の予防または改善用食品組成物。 
【請求項８】
ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤を有効成分で含むことを特徴とする癌の転移抑制用薬学的組成物。  
【請求項９】
１)ｐ３４タンパク質発現細胞株に被検物質を処理する段階と、
２)前記細胞株でｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度を測定する段階と、
３)前記ｐ３４遺伝子の発現程度またはｐ３４タンパク質の活性程度が被検物質を処理しない対照群に比べて減少した被検物質を選別する段階と、を含むことを特徴とする癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１０】
前記２)段階で遺伝子の発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲ(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ)、ノーザンブロット(Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ)、ｃＤＮＡマイクロアレイ混成化反応及びｉｎ ｓｉｔｕ混成化反応からなる群より選択された１種以上の方法で測定することを特徴とする請求項９に記載の癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１１】
前記２)段階でタンパク質の活性程度は、免疫沈降法(ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ)、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組職化学、ウエスタンブロット(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)及びプローサイトメトリー分析法(ＦＡＣＳ)からなる群より選択された１種以上の方法で測定することを特徴とする請求項９に記載の癌の治療または転移抑制用候補物質のスクリーニング方法。 
【請求項１２】
１)生物学的試料にＮＥＤＤ４−１(Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ４−１)の発現抑制剤または活性抑制剤を処理する段階と、
２)前記生物学的試料で癌細胞の増殖可否を測定する段階と、を含むことを特徴とするｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。 
【請求項１３】
前記１)段階の生物学的試料は、癌にかかった個体の血液、小便、唾液及び組職からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１２に記載のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。 
【請求項１４】
前記方法は、３)生物学的試料の癌細胞が増殖されると、ｐ３４の発現抑制剤または活性抑制剤の癌に対する治療効果が存在しないで、生物学的試料の癌細胞が増殖されないと、ｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の治療効果が存在すると予測する段階を含むことを特徴とする請求項１２に記載のｐ３４遺伝子の発現抑制剤またはｐ３４タンパク質の活性抑制剤の癌に対する治療効果予測方法。
【国際調査報告】
2016522162.tif 000075
2016522162.tif 000076
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