(57)【要約】  本発明は、とりわけ飼育ブタに感染する新しいブタパルボウイルス５Ａ（ＰＰＶ５Ａ）の作製および使用に関する新規のヌクレオチド配列、タンパク質配列、免疫原性組成物、ワクチン、および方法を提供する。本組成物および方法は、前記新しいウイルスによる感染の検出、野生動物および飼育動物および群れにおけるウイルス配列の遺伝子変化のモニタリング、ならびにウイルスによる感染から動物を保護するための新規のワクチンの作製および使用をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１の核酸配列を有する、
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドをコードする核酸配列を有する、
ｃ）配列番号１と８０％同一である核酸配列を有し、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有するポリペプチドをコードする、
ｄ）配列番号１の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド配列を含む、配列番号１の核酸配列の断片である、または
ｅ）配列番号１の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド配列を含み、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の免疫学的に有効な活性をコードする配列番号１の核酸配列の断片である、
ポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有する、
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４と８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４によりコードされるポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有する、
ｃ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含む、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の断片である、
ｄ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、免疫学的に有効な活性を有する、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の断片である、または
ｅ）配列番号１のヌクレオチド８７〜１９６７、配列番号１のヌクレオチド１９７５〜２８４４、もしくは配列番号１のヌクレオチド２８４５〜５５４７の配列内に含まれる少なくとも１５個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質断片である
ポリペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ａ）配列番号１の核酸配列、または
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１と８０％同一である核酸配列
を含む、単離されたブタパルボウイルス５Ａ（ＰＰＶ５Ａ）。
【請求項４】
弱毒化した非病原性の形態のＰＰＶ５Ａを含む、請求項３に記載のＰＰＶ５Ａ。
【請求項５】
死菌化または弱毒化した形態の請求項３に記載のＰＰＶ５Ａを含む、毒性ＰＰＶ５Ａによる感染を治療または予防するためのワクチン。
【請求項６】
死菌化または弱毒化した形態の請求項３に記載のＰＰＶ５Ａのサブユニットを含む、毒性ＰＰＶ５Ａによる感染を治療または予防するためのワクチン。
【請求項７】
サブユニットが配列番号４のカプシドタンパク質である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
サブユニットが配列番号４のポリペプチドの免疫学的に有効な断片である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
免疫学的に有効な量の請求項２に記載のポリペプチドと、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む免疫原性調製物。
【請求項１０】
免疫学的に有効な量の請求項３に記載のＰＰＶ５Ａを投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１１】
免疫学的に有効な量の請求項２に記載のポリペプチドを投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１２】
免疫学的に有効な量の請求項５に記載のワクチンを投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１３】
免疫学的に有効な量の請求項６に記載のワクチンを投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１４】
免疫学的に有効な量の請求項７に記載のワクチンを投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１５】
哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１の配列を有するブタパルボウイルス５ＡポリヌクレオチドによりコードされるＰＰＶ５Ａポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体であって、前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、異なるパルボウイルスによりコードされるポリペプチドには結合しない抗体。
【請求項２１】
生体試料中のＰＰＶ５Ａの存在を同定する方法であって、
ａ）生体試料を請求項２１に記載の抗体と接触させるステップと、
ｂ）抗体とＰＰＶ５Ａポリペプチドの間の複合体の形成を検出するステップと
を含み、前記複合体の存在が、生体試料中にＰＰＶ５Ａが存在することを示す方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２０に記載の抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項２５】
ａ）請求項２１に記載の抗体と、
ｂ）抗体とＰＰＶ５Ａポリペプチドの間の複合体の形成を検出するための試薬と
を含む、生体試料中のＰＰＶ５Ａの存在を同定するための診断用キット。
【請求項２６】
ａ）動物をＰＰＶ５Ａ感染に関連する少なくとも１種の疾患に対して免疫するために有効である少なくとも１種の免疫原性ＰＰＶ５Ａペプチドと、
ｂ）少なくとも１種の担体またはアジュバント分子と、
ｃ）免疫原性組成物を包装するための容器と、
ｄ）印刷された指示書のセットと、
ｅ）免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサーと
を含む免疫原性キット。
【請求項２７】
動物を、少なくとも１種の他のブタ病原性のウイルスまたは細菌による感染に関連する疾患を引き起こすウイルスまたは細菌に対して免疫するために有効な少なくとも１種の免疫原性タンパク質をさらに含む、請求項２６に記載の免疫原性キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年３月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは１０−０１５０−ＷＯ−１−ＳＥＱ．ｔｘｔという名称であり、サイズが３４，５４２バイトである。
本発明は、動物の健康の分野にあり、ワクチン接種のための弱毒株を含めた新規のブタパルボウイルス株、前記新規のパルボウイルス株から得たワクチンの製造方法およびそれを使用した治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは多種多様な動物種に感染し、そのうちのいくつかは重症の臨床疾患に関与するが、これらのウイルスの大多数によって引き起こされるのは軽度または無症状の感染のみである。これらは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属し、２つの亜科：そのメンバーが昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ、および、そのメンバーが脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅを形成する。後者の亜科は、現在５つの属： Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ、Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ、ＢｏｃａｖｉｒｕｓおよびＰａｒｖｏｖｉｒｕｓを含む（１）。
パルボウイルスビリオンはエンベロープを有さず、また、およそ５〜６キロベース（ｋｂ）の一本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを含有する。ゲノムは、非構造タンパク質およびカプシドタンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。新しく記載されたボカウイルスは２つの主要なＯＲＦの間に第３のＯＲＦを有する（１）。
パルボウイルス属の古典的なブタパルボウイルス（ＰＰＶ１）株は世界中に広範に分布しており、ブタ（ｐｉｇ）の生殖障害、特にワクチン接種プロトコールが正確に守られていないまたは免疫抑制因子に起因してワクチン有効性が低下している群れにおけるブタの生殖障害に関与する。この１０年の間に、いくつもの新しいパルボウイルスがブタ（ｐｉｇ）から検出されている。これらとしては、ブタパルボウイルス２（ＰＰＶ２）（２）および関連するウイルス（３）が挙げられる。ブタパルボウイルスおよびウシパルボウイルスの新しい群、すなわちホコウイルス（ｈｏｋｏｖｉｒｕｓ）（ＰＨｏＶ、ＢＨｏＶ）は香港において同定され（４）、これらのウイルスはヒトＰＡＲＶ４およびＰＡＲＶ５と遺伝的に類似していることが見いだされた。これらは最初に香港にちなんでホコウイルスと名付けられたが、ＰＨｏＶをＰＰＶ３とする新しい分類が提唱された（５）。ＰＰＶ４はウシパルボウイルス２に対して最も高い類似性を示すが、ＰＰＶ４はボカウイルスと同様にＯＲＦ１とＯＲＦ２の間に位置する追加的なＯＲＦ３をコードするので、コード能力およびゲノム構成はボカウイルスのものと類似している。しかし、ＰＰＶ４にコードされる推定ＯＲＦ３タンパク質はボカウイルスのものとはかなり異なる（５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ブタ（ｓｗｉｎｅ）を新しいウイルスの出現に関してモニタリングすること、ならびに新しいウイルスに対するワクチン、治療および検出方法を開発することが継続的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ飼育ブタ（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｓｗｉｎｅ）に感染する新しいパルボウイルス株の作製および使用に関する新規のヌクレオチド配列、タンパク質配列、免疫原性組成物、ワクチン、および方法を提供する。これらの株は、臨床的に疾患を有する飼育ブタ由来の組織試料において同定された新規のブタパルボウイルスに関連し、公知のブタパルボウイルス種および株との配列相同性に基づいて、新規のウイルスをブタパルボウイルス５ＡまたはＰＰＶ５Ａと命名した。
本発明の組成物および方法は、前記新しいウイルスによる感染の検出、野生動物および飼育動物および群れにおけるウイルス配列の遺伝子変化のモニタリング、ならびにウイルスによる感染から動物を保護するための新規のワクチンの作製および使用をもたらす。
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、配列番号１の核酸配列によりコードされるポリペプチド配列、またはその免疫原性断片を含み、よりロバストな免疫原性応答を誘導するためのアジュバントを含んでもよい。
【０００５】
本発明の例示的な組成物は、配列番号２、配列番号３、配列番号４のポリペプチド配列のいずれか１つ、またはＰＰＶ５Ａに特異的な抗体に対して免疫反応性であるその断片を含む。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号２または配列番号４、特に配列番号４の配列を含む。これらのポリペプチド、またはその断片は、ＰＰＶ５Ａに特異的な抗体に対して免疫反応性であることが好ましい。
別の態様では、本発明は、１種または複数種のポリペプチド、抗体構築物、または抗体コンジュゲートをコードする核酸配列を提供する。ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１の配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、さらには８０％相同かつ／または同一である核酸配列、特に、配列番号１のヌクレオチド配列２８４５〜５５４７（カプシドタンパク質）、またはＰＰＶ５Ａに特異的な抗体に対して免疫反応性であるポリペプチドをコードする配列番号１の断片を含む。本発明の例示的な核酸配列としては、ＰＰＶ５Ａに特異的な抗体に対して免疫反応性であるポリペプチドをコードする配列番号１のヌクレオチド１９７５〜２８４４、および配列番号１のヌクレオチド２８４５〜５５４７の配列、およびその断片のいずれか１つが挙げられる。核酸配列、または遺伝子は、ＰＰＶ５Ａに特異的な抗体に対して免疫反応性であるポリペプチドまたはペプチドをコードするものであることが好ましい。
【０００６】
さらに、本発明のポリペプチドとは、本明細書で使用される場合（これらに限定されないが）、
ｉ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）のポリペプチドと少なくとも８０％相同かつ／または同一のポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）および／またはｉｉ）のポリペプチドの断片；
ｉｖ）配列番号２または配列番号４の配列内に含まれる少なくとも５個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、なおより好ましくは１５個の連続したアミノ酸を含むｉｉｉ）またはｉｖ）の断片；
ｖ）配列番号１のヌクレオチド１９７５〜２８４４、または配列番号１のヌクレオチド２８４５〜５５４７の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
ｖｉ）ｖｉ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％相同または同一であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
ｖｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１９７５〜２８４４、または配列番号１のヌクレオチド２８４５〜５５４７の配列内に含まれる少なくとも１５個、好ましくは２４個、より好ましくは３０個、なおより好ましくは４５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質断片
を含むポリペプチドを含む。
本明細書で定義されている少なくとも１種、または複数種のＰＰＶ５Ａポリペプチドを含む本発明の免疫原性組成物は、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せなどの生理的に許容されるビヒクルをさらに含んでよい。
本発明で提供される任意のＰＰＶ５Ａポリペプチドまたはこれらの本発明で提供されるＰＰＶ５Ａポリペプチドの１種または複数種を含む任意の免疫原性組成物を医薬として、好ましくはワクチンまたは免疫原性組成物として、最も好ましくはＰＰＶ５Ａ感染に対する対象の予防または治療のために使用することができる。
特に好ましいＰＰＶ５Ａポリペプチドとしては、ＰＰＶ５Ａに対して特異的な免疫学的応答を誘導する免疫原性エピトープを有するものが挙げられる。好ましいＰＰＶＡポリペプチドは、関連するＰＰＶ１において表面抗原であることが予測されるアミノ酸配列を有するものを含み（Simpson et al. JMB 315、2002）、それらとして、これだけに限定されないが、配列番号４の残基１４１〜１５６、２７２〜２７８、および３２９〜３３９が挙げられる。
【０００７】
本発明で使用する組成物には、公知の注射可能な、生理的に許容される滅菌溶液を組み込むことができることが当業者には理解されよう。非経口的な注射または注入のためにすぐに使える溶液を調製するために、水性等張性溶液、例えば、生理食塩水または血漿タンパク質溶液が容易に入手可能である。さらに、本発明の免疫原性組成物およびワクチン組成物は、獣医学的に許容される担体、希釈剤、等張化剤、安定剤、またはアジュバントを含んでよい。
本発明の方法は、これだけに限定されないが、本明細書で定義されている１種または複数種のＰＰＶ５Ａポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＰＰＶ５Ａ感染に対する免疫応答を惹起する方法を含む。ＰＰＶ５Ａの２種以上の血清型または株に対する免疫応答が惹起されることが好ましい。本発明の組成物を使用して、ＰＰＶ５Ａ感染を治療すること、あるいは予防することができる。そのような免疫応答により、１種または複数種のＰＰＶ５Ａ血清型への感染に付随するまたはそれによって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率またはその重症度が低下することが好ましい。
本明細書では、本発明の組成物を投与することができる適切な対象およびそれを必要とする対象としては、ウイルス、微生物、寄生虫、原生動物、細菌、または真菌に関連する感染、疾患または状態に対する予防薬または治療のいずれかを必要とする動物が挙げられる。本発明の組成物または方法を使用することによって免疫応答が刺激される動物としては、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、またはシチメンチョウ）、ヤギ、およびヒツジなどの家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、ならびにマウス、ウサギ、イヌ、ネコ、およびウマなどの飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）が挙げられる。好ましい動物としては、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ネズミ科の動物、ウマ科の動物、ウサギ目の動物、およびウシ科の動物が挙げられる。ブタ（ｓｗｉｎｅ）における免疫応答が刺激されることが最も好ましい。
【０００８】
本発明は、ＰＰＶ５Ａ感染に付随するまたはそれによって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率またはその重症度を低下させる方法であって、本発明で提供される１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドと、好ましくは担体分子とを含む本発明の免疫原性組成物を投与し、したがって、ＰＰＶ５Ａ感染の臨床徴候の発生率またはその重症度が、本発明で提供される免疫原性組成物を受けていない対象と比較して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましい少なくとも１００％低下するステップを含む方法も提供する。そのような臨床徴候としては、ＰＰＶ５Ａ単独での感染により生じるウイルス血症および免疫抑制が挙げられる。そのような臨床徴候としては、神経性の徴候（うつ病、運動失調、嗜眠）、下痢、呼吸困難、体調の低下、関節の腫脹（跛行および横臥を生じる）、毎日の体重増加の平均の減少、死亡、および別の生物体、例えば、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）への同時感染によって生じる多漿膜炎を挙げることができる。
さらなる態様によると、本発明は、ＰＰＶ５Ａ感染を予防するための方法であって、前記ＰＰＶ５Ａ感染が、配列番号１、２、３および／もしくは４のヌクレオチド配列に対して１００％配列同一性を有する、配列番号１、２、３および／もしくは４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する、配列番号１、２、３および／もしくは４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有する、または配列番号１、２、３および／もしくは４のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％配列同一性を有するＰＰＶ５Ａによって引き起こされ得るものであり、本発明で提供される１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを含む本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法にも関する。
【０００９】
本発明は、本発明で提供される任意の免疫原性組成物を調製する方法も提供し、当該方法は、本発明で提供される１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドと担体分子を、好ましくは、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドと担体分子が共有結合によりカップリングする、または互いとコンジュゲートするように混合することを含む。そのようなコンジュゲートは多価であっても一価であってもよい。多価の組成物またはワクチンとしては、多数のＰＰＶ５Ａペプチドと担体分子の免疫コンジュゲーションが挙げられる。さらなる態様では、本発明は、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを産生する方法を提供し、当該方法は、宿主細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞を、本発明で提供されるＰＰＶ５Ａペプチドのいずれかをコードする核酸分子を用いて形質転換することを含む。あるいは、宿主細胞は、動物細胞、昆虫細胞、原生細胞、植物細胞、または真菌細胞などの真核細胞であってよい。真核細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＣＯＳなどの哺乳動物の細胞、またはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌細胞、またはＳｆ９などの昆虫細胞であることが好ましい。本発明の核酸のバキュロウイルス発現も好ましい。
本発明の別の態様は、ＰＰＶ５Ａの少なくとも１種の遺伝的バリアントおよびより好ましくはＰＰＶ５Ａの２種以上の遺伝的バリアントに対する免疫応答を誘導する１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを産生する方法を提供する。これは、本明細書に開示されている１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドをコードし、発現する形質転換された発現ベクターを培養することを含む。発現されたタンパク質は、発現している生物体に保持されるか、または培養培地中に分泌される。発現は、ＰＰＶ５Ａに対する免疫応答を誘導することができるＰＰＶ５Ａペプチドが産生されるのに十分な条件下で行う。ＰＰＶ５Ａペプチドによって免疫応答が誘導されるＰＰＶ５Ａ血清型としては、これだけに限定されないが、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１または９０％の同一性を有する配列が挙げられる。
【００１０】
本発明の組成物を作製する方法は、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドと担体分子のコンジュゲートを、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せなどの生理的に許容されるビヒクルと混合することをさらに含んでよい。ビヒクル、アジュバント、または組合せの選択は、とりわけ、送達経路、個人的な嗜好、および動物種によって決定されることが当業者には理解されるであろう。
別の態様では、本発明は、対象におけるＰＰＶ５Ａ感染を診断する方法を提供する。当該方法は、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを用意するステップと、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを対象から得た試料と接触させるステップと、試料中に１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドに結合することができる抗体が検出された場合に、その対象がＰＰＶ５Ａ感染を有すると同定するステップとを含む。
別の点では、本発明は、対象が以前にＰＰＶ５Ａ感染に曝露したことがあり、ＰＰＶ５Ａに対する免疫応答を発現することができることを確認する方法を提供する。当該方法は、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを用意するステップと、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを対象から得た試料と接触させるステップと、試料中に１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドに結合することができる抗体が検出された場合に、その対象がＰＰＶ５Ａ感染を有すると同定するステップとを含む。
【００１１】
本発明は、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを、好ましくは担体分子と一緒に含む免疫原性組成物；免疫原性組成物を包装するための容器；印刷された指示書のセット；および免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサーを含むキットも提供する。１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドおよび担体分子は、コンジュゲートとして、または別々の化合物として包装することができる。別々に供給する場合には、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドと担体分子をコンジュゲートする手段、ならびに適切な印刷された指示書も供給する。
本発明は、動物へのワクチン接種のためのキットであって、印刷された指示書のセットと、１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを含む本発明で提供される免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサーとを含み、ＰＰＶ５Ａペプチドの少なくとも１種により、動物がＰＰＶ５Ａ感染に関連する少なくとも１種の疾患に対して有効に免疫されるキットも提供する。１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドは本発明で提供されるものから選択されることが好ましい。本発明のキットは、獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せをさらに含んでよい。
本発明のキット内のディスペンサーは、その内容物を液滴として分注することができるものであり、キット内に含まれる本発明で提供されるＰＰＶ５Ａペプチドを含む免疫原性組成物は、動物に、鼻腔内投与、経口投与、皮内投与、または筋肉内投与した場合にＰＰＶ５Ａ感染の少なくとも１つの臨床徴候の重症度を低下させることができるものである。臨床徴候の重症度は、無処置の感染動物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも１００％低下することが好ましい。
【００１２】
ＰＰＶ５Ａによって引き起こされる感染を治療または予防するための方法も開示されている。当該方法は、有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、前記治療または予防法は、ＰＰＶ５Ａ感染の徴候を減少させること、ＰＰＶ５Ａ感染の臨床徴候の重症度または発生率を低下させること、対象のＰＰＶ５Ａ感染による死亡率を低下させること、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
本発明の組成物は、獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せをさらに含む。そのような組成物は、ワクチンとして使用することができ、１種または複数種の追加的な弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、またはこれらの組合せを含む。そのようなワクチンにより、ブタパルボウイルス１、２、３、４、５Ａ、５Ｂ、他のブタパルボウイルス種、他のブタ病原性ウイルスおよび細菌、およびこれらの組合せからなる群から選択されるウイルスに関連する少なくとも１種の疾患に対する防御的な免疫学的応答が引き出される。ＰＰＶ５Ａに対するワクチンと組み合わせて同時投与することができる他の種類のワクチンとしては、これだけに限定されないが、ブタサーコウイルス２型（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ−ＭｙｃｏＦＬＥＸ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＡＴＰ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶ）、ブタパルボウイルス（例えば、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ−ＰＬＥ）、マイコプラズマ（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭｙｃｏＦＬＥＸ）などが挙げられる。
本発明で使用する組成物に公知の注射可能な、生理的に許容される滅菌溶液を組み込むことができることが当業者には理解されよう。非経口的な注射または注入のためにすぐに使える溶液を調製するために、水性等張性溶液、例えば、生理食塩水または血漿タンパク質溶液が容易に入手可能である。さらに、本発明の免疫原性組成物およびワクチン組成物は、薬学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、等張化剤、安定剤、またはアジュバントを含んでよい。
【００１３】
本発明の方法は、本発明の組成物を獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せと混合することも含んでよい。担体、アジュバント、または組合せの選択は、とりわけ、送達経路、個人的な嗜好、および動物種によって決定されることが当業者には理解されるであろう。
本発明は、組成物を動物に投与することによって動物において進行中のＰＰＶ５Ａ感染の重症度を低下させる方法も提供する。組成物は、弱毒化ウイルス培養物または１種または複数種のＰＰＶ５Ａペプチドを、許容される獣医学的担体と組み合わせて含んでよい。
好ましい投与経路としては、鼻腔内、経口（例えば、飲料水に入れて）、皮内、および筋肉内が挙げられる。最も好ましくは単回投薬での筋肉内投与が好ましい。本発明の組成物を２つ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることが当業者には理解されよう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、気管内、皮内、心臓内、葉内、髄内、肺内、または膣内が挙げられる。所望の治療の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物を、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヶ月にわたって毎日、異なる投与量で投与することができる。
【００１４】
本発明は、印刷された指示書のセット；動物にワクチンを投与することができるディスペンサー；および、ＰＰＶ５Ａ、他のパルボウイルス株、他の病原体、および／またはその組合せに関連する少なくとも１種の疾患に対して動物を有効に免疫する、これだけに限定されないが、細菌細胞培養物、真菌細胞培養物、昆虫細胞培養物または哺乳動物細胞培養物を含めた細胞培養物からの少なくとも１つの単離物を含む、動物へのワクチン接種のためのキットも提供する。本発明のキットは、獣医学的に許容される担体、アジュバント、またはその組合せをさらに含んでよい。
本発明のキット内のディスペンサーは、その内容物を液滴として分注することができるものであり、キット内に含まれる分離物は、動物に、鼻腔内投与、経口投与、皮内投与、または筋肉内投与した場合にＰＰＶ５Ａ感染の少なくとも１つの臨床徴候の重症度を低下させることができるものである。いくつかのキットでは、分離物は、ＰＰＶ５Ａ感染の少なくとも１つの臨床徴候の重症度を低下させることができるものである。臨床徴候の重症度が無処置の感染動物と比較して少なくとも１０％低下することが好ましい。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この発明の詳細な説明から、本発明の主旨および範囲内のさまざまな変化および改変が当業者に明らかになるので、発明の詳細な説明および特定の実施例には本発明の好ましい実施形態が単に例示として示されていることが理解されるべきである。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよく理解することができる。本出願は、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。この特許出願公開のカラーの図面を伴うコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】ＰＰＶ５Ａの核酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２】ＰＰＶ５Ａレプリカーゼのタンパク質配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ＰＰＶ５Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）タンパク質のタンパク質配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】ＰＰＶ５Ａカプシドタンパク質のタンパク質配列（配列番号４）を示す図である。
【図５】ＰＰＶ５Ａカプシドタンパク質のタンパク質配列と多数の他のウイルス配列のペアワイズアミノ酸同一性比較を示す図である。ウイルス配列についての参照は表１に列挙されている。
【表１】
2016502845.tif 000002
2016502845.tif 000003
【図６】ＰＰＶ５ＡのＶＰ１／ＣＡＰ領域と表１に列挙されている他のウイルスのＶＰ１およびカプシドタンパク質を比較した系統発生解析を示す図である。
【図７−１】ＰＰＶ５Ａカプシドタンパク質（配列番号４の残基５５〜７９２）の、最も近いＰＰＶ４の関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＭ７３８７１（配列番号５））に対する同一性を示す図であり、４０％（３１０／７７４）の配列同一性を示す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】ＰＰＶ５Ａレプリカーゼタンパク質（配列番号２の残基１５〜５１６）の、最も近いＰＰＶ４の関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＤＢ２０２１０（配列番号１１））に対する同一性を示す図であり、５８％（２９２／５０４）の配列同一性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、本明細書において開示されている新規のブタパルボウイルス５Ａおよびそのバリアントに関連する核酸およびその断片、ポリペプチドおよび免疫学的に有効なその断片、ワクチン、免疫学的に有効な調製物、抗体、診断アッセイおよびキット、ならびに前記組成物および調製物を作製し、使用する方法を提供する。
本発明の実施には、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989);DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986);Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986);Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００１７】
本発明を詳細に説明する前に、ＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメータは当然変動し得るので、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、単に本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形 「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａｎ（１つの）抗原」への言及は、２つ以上の抗原の混合物を含み、「ａｎ（１つの）賦形剤」への言及は、２つ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
Ａ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。この用語の意味および範囲は明らかであるはずだが、あらゆる潜在的な多義性の事象では、本明細書において提供される定義が辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書では、「または（ｏｒ）」の使用は、別段の指定のない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態は限定的なものではない。本明細書で言及される特許および刊行物は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」および同様の句は、１種または複数種の本発明の治療用組成物、またはこれらの組合せを投与することによって生じる、疾患または状態に対する応答を意味し、その結果、疾患または感染に曝露された免疫されていない対象において予測されるものよりも生じる有害作用が少ないことを意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、その旨明確に記載される。完全な予防と記載されていなければ、この用語は、部分的な予防を包含する。
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」とは、野生型感染と比較した、群内の感染した対象の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象の数の減少もしくは排除、または１または複数の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味するが、これに限定されない。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはＰＰＶ５Ａへの感染の任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。本発明の治療用組成物を受けた１または複数の対象において、組成物を受けずに感染する対象と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少することが好ましい。本発明の組成物を受けた対象において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは 少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも５０％減少することがより好ましい。
【００１９】
「防御の増大」という用語は、本明細書では、感染因子、好ましくはＰＰＶ５Ａによる感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種された対象の群において、ワクチン接種されていない対象の対照群に対して有意に減少することを意味するが、これに限定されない。「有意な臨床症状の減少」という用語は、感染因子による攻撃後に、ワクチン接種された対象の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、なおより好ましくは５０％、なおより好ましくは７０％低いことを意味するが、これに限定されない。
「長期にわたる防御」とは、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月にわたって持続する「改善された有効性」を指すものとする。家畜の場合では、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
「免疫原性組成物または免疫学的組成物」とは、組成物に対する細胞または抗体に媒介される免疫応答である宿主における免疫学的応答を引き出す少なくとも１種のＰＰＶ５Ａタンパク質もしくはポリペプチドまたはその免疫原性部分を含む組成物を指す。本発明の好ましい実施形態では、免疫原性組成物により、免疫応答が誘導され、ＰＰＶ５Ａ感染の臨床徴候のうちの１つまたは複数に対する防御免疫が付与されることがより好ましい。
【００２０】
「免疫原性」ＰＰＶ５Ａポリペプチド、または「抗原」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すポリペプチドまたはタンパク質を指す。「免疫原性」ＰＰＶ５Ａタンパク質またはポリペプチドとは、本明細書において同定される任意のコード配列の全長配列またはその類似体もしくは免疫原性断片を包含する。「免疫原性断片」または「免疫原性部分」という用語は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出す、ＰＰＶ５Ａタンパク質のアミノ酸配列の断片または、短縮されたおよび／もしくは置換された形態を指す。一般に、そのような短縮されたおよび／もしくは置換された形態、または断片は、全長のタンパク質、例えば、カプシドタンパク質からの少なくとも６つの連続したアミノ酸を含むまたはそれをコードする。短縮されたもしくは置換された形態、または断片は、全長のタンパク質、例えば、カプシドタンパク質からの少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個、さらに好ましくは少なくとも１９個、なおより好ましくは３０個の連続したアミノ酸を有することがより好ましい。
【００２１】
「エピトープ」という用語は、免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される組成物のセグメントまたは断片、例えば、タンパク質またはポリペプチドを意味する。本発明では、エピトープは、一般に、ウイルスタンパク質のポリペプチド配列の１つまたは複数の断片である。
そのような断片は、任意の数の当技術分野で周知のエピトープマッピング技法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直線状エピトープは、固体支持体上で多数のペプチドを同時に合成することによって決定することができ、ペプチドはタンパク質分子の部分に対応し、ペプチドは抗体と反応する一方でペプチドはなお支持体に付着している。そのような技法は当技術分野において公知であり、記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715を参照されたい。同様に、立体構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴によってなどでアミノ酸の空間的なコンフォメーションを決定することにより、容易に同定される。Epitope Mapping Protocols、上記を参照されたい。合成の抗原、例えば、ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｅ）、フランキングエピトープ（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、および他の組換え抗原または合成により誘導された抗原もこの定義に包含される。例えば, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781；Bergmann et al. (1996) , J. Immunol. 157: 3242-3249；Suhrbier, A. (1997) , Immunol. and Cell Biol. 75: 402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998を参照されたい（その教示および内容が全て参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２２】
「免疫応答」または「免疫学的応答」とは、対象の組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体に媒介される免疫応答の発生を意味するが、これに限定されない。通常、免疫応答または免疫学的応答は以下の作用の１つまたは複数を含む(ただしこれらに限定されない)：対象の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、かつ／または疾患の臨床的な重症度が低下することが好ましい。そのような防御は、症状の数の減少、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数が存在しないこと、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
本明細書では、「特異的に免疫反応性」とは、ＰＰＶ５Ａ感染に特徴的な抗原は認識するが、厳密な攻撃対照に特徴的な抗原とは反応しない免疫反応性タンパク質またはポリペプチドを指す。潜在的なＰＰＶ５Ａ免疫反応性タンパク質または他のポリペプチドの特異性を決定するために、種々のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、ウエスタンブロット）を使用して、タンパク質を、遺伝的に類似したウイルスを含有する動物血清に対して試験する。同様に、タンパク質を、種々のイムノアッセイにおいて、発現方法（バキュロウイルス、Ｓｆ９細胞など）に関連するタンパク質を含有する材料に対して試験する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「薬学的または獣医学的に許容される担体」または「賦形剤」とは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、被覆剤、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、吸着遅延剤などを包含する。一部の好ましい実施形態、特に凍結乾燥した免疫原性組成物を含む実施形態では、本発明において使用するための安定化剤は、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含有する。「アジュバント」とは、本明細書で使用される場合、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水エマルション、水中油エマルション、水中油中水エマルションを含み得る。エマルションは、特に、軽質流動パラフィン油（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ  ｔｙｐｅ）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー形成によって生じる油；直鎖アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル、より詳細には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）または二オレイン酸プロピレングリコール；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づくものであってよい。油を乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）と組み合わせて使用して、エマルションを形成する。乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）は、非イオン性界面活性物質、特に、エトキシ化されていてもよい、ソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えば、無水マンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステルおよびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル、ならびに、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体ブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１であることが好ましい。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S), JohnWiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (１９９７)を参照されたい。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルション、および同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルションＭＦ５９である。
【００２５】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体から選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物はカルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅ）化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載されている米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。Ｃａｒｂｏｐｏｌの名称で販売されている製品（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリル ペンタエリスリトールと架橋している。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９３４ＰおよびＣａｒｂｏｐｏｌ  ９７１Ｐを挙げることができる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７１Ｐを使用することが最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体としては、共重合体ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が挙げられ、これらは無水マレイン酸とエチレンの共重合体である。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
【００２６】
さらに適切なアジュバントとしては、多くの他のものの中でも、これだけに限定されないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他のやり方）、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカインの放出の刺激薬が挙げられる。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができることが予想される。あるいは、アジュバントは、最終製品の体積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、さらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。等張化剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
【００２７】
「単離された」とは、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元の環境から変化したまたは取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でこの用語が使用される場合、生きている生物体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
「安全性」とは、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、これだけに限定されないが、生ウイルスに基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含めた有害な結果が存在しないことを指す。
「ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」または「ワクチン接種すること（ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ）」という用語またはその変形は、本明細書で使用される場合、動物に投与されると、動物におけるＰＰＶ５Ａに対する免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物を投与することを含むプロセスを意味するが、これに限定されない。
「死亡率」とは、本発明に関しては、ＰＰＶ５Ａ感染、および／またはＰＰＶ５Ａ感染によって増強される他の生物体との同時感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
【００２８】
「弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）」とは、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、ＰＰＶ５Ａ感染の臨床徴候を引き起こさないが標的哺乳動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ＰＰＶ５Ａを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないＰＰＶ５Ａを感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、「低下する／低下した」という用語は、上で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、なおより好ましくは５０％、さらに好ましくは６０％、なおより好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、弱毒化した弱毒性ＰＰＶ５Ａ株は、改変生ＰＰＶ５Ａウイルスを含む免疫原性組成物に組み込むために適したものである。
「死菌」または「不活化」とは、ＰＰＶ５Ａウイルスを死滅させ、かつ／または他のやり方で再生することができないようにする物理的または化学的な薬剤を用いて処理することを意味する。ＰＰＶ５Ａは、例えば、熱、放射線または紫外線の存在下のソラレンなどの従来の手段によって死滅させることができる。ＰＰＶ５Ａは、例えば、これだけに限定されないが、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、ベータ−プロピオラクトン、ホルマリン、グルタルアルデヒド、および／またはドデシル硫酸ナトリウムのうちの１つまたは複数を含めた１種または複数種の化学的な不活化剤を使用した化学的不活化によるものなどの従来の手段によって不活化することができる。これらのウイルスの毒性株を弱毒化する方法および不活化ウイルス調製物を作製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｕ．Ｓ．４，５６７，０４２および４，５６７，０４３に記載されている。したがって、本発明のワクチン組成物において使用するためのＰＰＶ５Ａ由来の抗原は、とりわけ、改変および／または弱毒化した生ウイルス調製物または死滅または不活化ウイルス調製物であるウイルス全体の形態であってよい。
【００２９】
「抗体」とは、本明細書で使用される場合、抗ＰＰＶ５Ａ抗体、例えば、本発明のＰＰＶ５Ａポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含めた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ブタ抗体、およびＣＤＲ移植抗体を含む。「に特異的」という用語は、本発明の抗体の可変領域が、排他的にＰＰＶ５Ａポリペプチドを認識し、それに結合し（すなわち、単一のＰＰＶ５Ａポリペプチドを、関連するポリペプチドと、ポリペプチドのファミリーに見いだされる配列同一性、相同性、または類似性にもかかわらず区別することができる）、また、抗体の可変領域、特に、抗体分子の定常領域の外側の配列との相互作用によって他のタンパク質と相互作用することが可能である（してもよい）（例えば、ＥＬＩＳＡ技法におけるＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡまたは他の抗体）ことを示す。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当技術分野において周知であり、常套的に実施される。そのようなアッセイの包括的な考察に関しては、Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6を参照されたい。本発明のＰＰＶ５Ａポリペプチドの断片を認識し、それに結合する抗体も、抗体が、上で定義されている通り、その断片が由来する本発明のＰＰＶ５Ａポリペプチドに対して、第１に、真っ先に特異的であるのであれば意図される。明瞭にするために、「抗体」とは、特異的な抗原に、その抗原に対する免疫応答の結果として結合することができる免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有する「軽」ポリペプチド鎖および「重」ポリペプチド鎖で構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２を含めた種々の形態で、ならびに単鎖で存在してよく、１つまたは複数の抗体単鎖ポリペプチド配列の全部または一部を含有する合成ポリペプチドを包含する。
【００３０】
本明細書では、「有効用量」とは、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味するが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、組成物に関しては、動物において感染または疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、用量当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数または同等の尺度によって測定される弱毒化生ウイルス調製物の有効量を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）、すなわち、接種され、感染しやすい細胞培養物の５０％において病理学的変化を生じさせる病原因子の量によってモニタリングする。死菌ワクチンまたは抗原性サブユニットに関しては、有効量とは、相対的な抗原含有量（ＲＡＣ）、すなわち、有効用量当たりの抗原の包含レベルを指す。あるいは、療法に関しては、「有効量」という用語は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状を再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは治療を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
【００３１】
当技術分野で知られた「配列同一性」とは、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち、参照配列と、その参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、所与の配列と参照配列を、配列をそのような配列のひと続きの間のマッチングによって決定される最も高い程度の配列類似性が生じるように、必要であればギャップ導入を伴って最適にアラインメントした後に比較することによって決定する。そのようにアラインメントしたら、位置ごとに配列同一性を確認し、例えば、配列は、特定の位置においてヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であればその位置において「同一」である。次いで、そのような位置同一性の総数を参照配列内のヌクレオチドまたは残基の総数で割って％配列同一性をもたらす。配列同一性は、以下に限定されないが、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988) , Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993) ;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.,  and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994) ;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987) ;Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) ; and Carillo, H.,  and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されているものを含めた公知の方法によって容易に算出することができる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きなマッチングが生じるように設計される。配列同一性を決定するための方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。そのようなプログラムの例としては、これだけに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1) : 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990)）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al. , NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul,S. F. et al. , J. Molec. Biol, 215:403-410(1990)、その教示が参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムでは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を生じさせるために、初期値のギャップ重みを使用して配列を最適にアラインメントする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、所与のポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに１５個まで、好ましくは１０個まで、なおより好ましくは５個までの点変異を含み得る以外は所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と比較して少なくとも８５％、好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、参照配列内のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％まで、なおより好ましくは５％までが欠失しているか別のヌクレオチドで置換されていてもよく、参照配列内の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％まで、なおより好ましくは５％までのいくつものヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。これらの参照配列の変異は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位もしくは３’末端位において、またはこれらの末端位の間のどこにおいても起こり得、参照配列内のヌクレオチドの間に個別に散在しているか、または参照配列内の１つもしくは複数の連続した群として散在している。同様に、参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が、所与のポリペプチド配列が参照アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり１５個まで、好ましくは１０個まで、なおより好ましくは５個までのアミノ酸の変更を含み得る以外は参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るためには、参照配列内のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％まで、なおより好ましくは５％までが欠失しているかまたは別のアミノ酸で置換されていてもよく、参照配列内のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、なおより好ましくは５％までのいくつものアミノ酸が参照配列に挿入されていてよい。これらの参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位もしくはカルボキシ末端位において、またはこれらの末端位の間のどこにおいても起こり得、参照配列内の残基の間に個別に散在しているか、または参照配列内に１つもしくは複数の連続した群として散在している。同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが好ましい。しかし、保存的置換は配列同一性を決定する際にマッチングとして含まれない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「配列相同性」とは２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、２つ以上の配列を最適にアラインメントし、必要であればギャップを導入する。しかし、「配列同一性」とは対照的に、保存的アミノ酸置換も配列相同性を決定する際にマッチングとして計数される。言い換えれば、参照配列に対して９５％の配列相同性を有するポリペプチドを得るためには、参照配列内のアミノ酸残基の８５％、好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％がマッチングするか、または別のアミノ酸との保存的置換を含まなければならない、または、参照配列内の、保存的置換を含めずに、総アミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％まで、なおより好ましくは５％までのいくつものアミノ酸が参照配列に挿入されていてよい。相同な配列は、相同なアミノ酸をコードする少なくとも５０ヌクレオチドのひと続き、さらに好ましくは１００ヌクレオチドのひと続き、さらに好ましくは２５０ヌクレオチドのひと続き、さらに好ましくは５００ヌクレオチドのひと続きを含むことが好ましい。
「保存的置換」とは、アミノ酸残基のサイズ、疎水性などを含めた特性または性質が類似しており、したがって全体的な機能性が有意に変化しない別のアミノ酸残基による置換を指す。これは、保存的アミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換も意味し得る。
【００３３】
Ｂ．担体分子
本発明のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドをコンジュゲートまたは共有結合により連結することができる担体分子は上記のものであることが好ましい。動物への使用に好ましい担体はウシ血清アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンである。担体タンパク質自体が免疫原であることが好ましい。
本発明のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドは、当技術分野で公知の任意の都合のよい方法によって担体と共有結合によりカップリングさせることができる。Schneerson et al, J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980)に記載されているアジピン酸ジヒドラジドなどの対称のリンカー、またはFattom et al, Infection and Immunity, 56, 2292-2298(1988)に記載されているＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートなどのヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーの使用は本発明の範囲内であるが、いかなるリンカーの使用も回避し、その代わりに本発明のＰＰＶ５Ａペプチドを直接担体分子とカップリングすることが好ましい。そのようなカップリングは、Landi et al J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981)に記載されている還元的アミノ化の手段によって実現することができる。
平均分子量によって定義される免疫原性組成物のサイズは変動し、選択されるＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）、およびＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）を担体とカップリングする方法に左右される。したがって、これは１，０００ダルトン（１０3）ほど小さくもなり得、１０6ダルトンを超えることもあり得る。還元的アミノ化カップリング法を用いて、ＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）の分子量は、通常、５，０００〜５００，０００の範囲またはそれ以上であり、例えば、配列番号４のカプシドタンパク質に関しては、分子量はおよそ８０，０００ダルトンであることが予測され、これは、６０個の単量体タンパク質で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することが予測される。
【００３４】
本発明のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドに特異的に結合する担体分子、すなわちペプチド、その誘導体および類似体、ならびにペプチド模倣薬は、これだけに限定されないが、固相合成または溶液によるもの（Nakanishi et al., 1993、Gene 137: 51-56; Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154; Neurath, H. et al., Eds., The Proteins, Vol II, 3d Ed., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含めた、当技術分野で公知のさまざまな方法によって産生することができる。
本発明のＰＰＶ５Ａタンパク質もしくはペプチドまたは本発明の抗体もしくはその結合性部分は、薬学的または獣医学的担体を伴う希釈剤中の液剤または懸濁剤により注射可能な投与量で投与することができる。
そのような分子の安全性および有効性は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（ＣＶＢ）により記載され、規制されている細胞培養物または実験動物における標準の手順によって決定される。そのような分子の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致死的な用量）を決定するための標準の薬学的手順によって決定することができる。
本発明のワクチンは多価であっても一価であってもよい。多価ワクチンは多数のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドと担体分子の免疫コンジュゲーションによって作製される。
一態様では、ＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチド組成物は、好ましくは免疫賦活薬と組み合わせた有効な免疫量の免疫原性コンジュゲート；および生理的に許容されるビヒクルを含む。この状況において使用される場合、「免疫賦活薬」とは、免疫応答の１つまたは複数のエレメントの活性に対する、特異的な抗原と組み合わせた特異的な強化効果であるか、単に独立した効果であるかにかかわらず、免疫系の活性を増強する能力を有するあらゆる化合物または組成物を包含するものとする。免疫賦活薬化合物としては、これだけに限定されないが、無機物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム；リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの表面活性物質；ポリアニオン；ペプチド；油エマルション；ミョウバン、およびＭＤＰが挙げられる。これらの材料を利用する方法が当技術分野で公知であり、所与のワクチンに対する刺激薬の最適量を決定することは十分に当業者の能力の範囲内である。２種以上の免疫賦活薬を所与の製剤に使用することができる。免疫原は、リポソームに組み込むこともでき、ワクチン製剤に使用するための多糖および／または他のポリマーとコンジュゲートすることもできる。
【００３５】
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスター包装などの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタ（ｐｉｇ）に投与するための指示書が付随してよい。
Ｃ．アジュバント
本発明で提供される、１つまたは複数のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドを含有する免疫原性組成物は、その免疫原性をさらに増大させるために、１つまたは複数のアジュバントも含んでよい。
アジュバントは、以前に記載されているまたは当技術分野で公知の任意の技法によって精製することができる。好ましい精製技法は、シリカゲルクロマトグラフィー、特に、W. Clark Still et al, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925(1978)に記載されている「フラッシュ」（迅速）クロマトグラフィー技法である。しかし、ＨＰＬＣを含めた他のクロマトグラフィー法をアジュバントの精製に使用することができる。結晶化を使用してアジュバントを精製することもできる。いくつかの場合には、分析的な純度の産物が合成により直接得られるので精製は必要ない。
【００３６】
本発明のワクチン組成物は、アジュバントとＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）を適切な滅菌条件で、アジュバント添加組成物を産生するための公知の技法に従って物理的に混合することによって調製される。ＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）とアジュバントの複合体形成は、コンジュゲート上に、長鎖アルキル化合物アジュバント上に存在する正電荷に静電気的に誘引される正味の負電荷が存在することによって容易になる。
【００３７】
Ｄ．生理的に許容されるビヒクル
本発明のワクチン組成物は、他の医薬ポリペプチド組成物に使用されるものと同様の技法を使用して製剤化することができる。したがって、アジュバント、および好ましくは担体分子とコンジュゲートし、かつ／またはアジュバントと混和したＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）を凍結乾燥した形態で保管し、投与前に生理的に許容されるビヒクル中に再構成して懸濁剤を形成することができる。あるいは、アジュバントおよびコンジュゲートをビヒクル中で保管することができる。好ましいビヒクルは、滅菌溶液、特に、滅菌緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水などである。免疫原性組成物の免疫学的効果が改善されるようにアジュバントとコンジュゲートをビヒクル中に組み合わせる方法のいずれも適する。
本発明のワクチンの単一用量の体積は変動し得るが、一般に、従来のワクチンに関して一般に使用される範囲内に入る。単一用量の体積は、上記のコンジュゲートおよびアジュバントの濃度で、約０．１ｍｌから約３ｍｌ、好ましくは約０．２ｍｌから約１．５ｍｌ、より好ましくは約１．０ｍｌであることが好ましい。
本発明のワクチン組成物は、任意の都合のよい手段によって投与することができる。
【００３８】
Ｅ．製剤
担体分子とカップリングしたＰＰＶ５Ａタンパク質（複数可）またはペプチド（複数可）を含む免疫原性コンジュゲートを、ＰＰＶ５Ａの１種または複数種の血清型に対して免疫するためのワクチンとして使用することができる。生理的に許容されるビヒクル中に免疫原性コンジュゲートを含むワクチンは、動物、好ましくはブタ（ｓｗｉｎｅ）を、ＰＰＶ５Ａによる感染の治療または予防のために免疫する方法において有用である。
免疫原性コンジュゲートを用いた免疫によって本発明の免疫原性コンジュゲートに対して生じる抗体を、ＰＰＶ５Ａの感染を治療または予防するための受動免疫療法および抗イディオタイプ抗体の生成において使用することができる。
組成物を投与する対象は、これだけに限定されないが、ウシ（ｃｏｗ）、ウマ、ヒツジ、ブタ（ｐｉｇ）、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット；最も好ましくはブタ（ｐｉｇ）を含めた動物であることが好ましい。
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物またはそれに対する抗体および生理的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、またはｐＨ 緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルション、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口的な製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
【００３９】
Ｆ．有効用量
本明細書に記載の化合物は、ＰＰＶ５Ａに関連する疾患を治療するために治療有効用量で対象に投与することができる。投与量は、ワクチンを受ける宿主ならびに宿主のサイズ、体重、および年齢などの因子に左右される。
製剤中に使用される本発明の免疫原性コンジュゲートまたは抗体の正確な量は、投与経路および対象の性質（例えば、種、年齢、サイズ、疾患の病期／レベル）に左右され、実医師の判断および各対象の状況に応じて、標準の臨床的技法に従って決定されるべきである。有効な免疫量は、対象におけるＰＰＶ５Ａ感染症を治療または予防するために十分な量である。有効用量は、動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定することもでき、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで変動し得る。
組成物の免疫原性は、試験対象の免疫応答を、組成物を用いて免疫した後に当技術分野で公知の任意のイムノアッセイを使用することによってモニタリングすることにより決定することができる。体液性の（抗体）応答および／または細胞性免疫の生成を免疫応答の指標とすることができる。試験対象は、ブタ（ｐｉｇ）、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ（ｃｏｗ）、ウマ、ヒツジ、および家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウ）などの動物を含み得る。
試験対象の免疫応答は、公知の技法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット、免疫沈降などによってアッセイされる、免疫原性コンジュゲートに対して得られた免疫血清の反応性などの種々の手法によって、または、感染症病原因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）のレベルをアッセイするための当技術分野で公知の任意の方法、例えば定量的ＰＣＲ、ウイルス単離または当技術分野で公知の他の技法によって決定される、免疫された宿主の病原体による感染に対する防御および／もしくは免疫された宿主における病原体による感染に起因する症状の減弱によって分析することができる。感染症病原因子のレベルは、免疫グロブリンが指向した抗原のレベルを測定することによって決定することもできる。感染症病原因子のレベルの低下または感染症の症状の好転は、組成物が有効であることを示す。
【００４０】
本発明の治療薬を、動物におけるin vivoでの使用の前にin vitroにおいて所望の治療活性または予防活性について試験することができる。例えば、特定の治療薬の投与が必要であるかどうかを決定するために使用することができるin vitroアッセイとしては、細胞株由来の適切な細胞または特定の疾患または障害を有する対象から培養された細胞を治療薬に曝露させるまたは他のやり方で治療薬を投与し、細胞に対する治療薬の効果を観察する、in vitro細胞培養アッセイが挙げられる。
あるいは、治療薬は、感染症病原因子による感染を受けやすいがその感染症病原因子に感染していない細胞（対象または培養細胞株のいずれかから培養したもの）に治療薬を接触させ、細胞を感染症病原因子に曝露させ、次いで、治療薬と接触させた細胞の感染率が、治療薬と接触させていない細胞の感染率よりも低いかどうかを決定することによってアッセイすることができる。感染症病原因子による細胞の感染は、当技術分野で公知の任意の方法によってアッセイすることができる。
さらに、治療薬は、動物モデル対象における抗体が対象とする分子のレベルを、療法の前、その間、またはその後に適切な時間間隔で測定することによって評価することができる。分子の量の任意の変化または変化がないことを同定し、対象に対する治療の効果と相関させることができる。分子のレベルは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
動物に本発明の方法および組成物を使用してＰＰＶ５Ａに対するワクチン接種を行った後、当技術分野で公知の任意の結合アッセイを使用して、生じた抗体と特定の分子の間の結合を評価することができる。特定の抗原に対して高い親和性または特異性を示す抗体を選択するためにこれらのアッセイを実施することもできる。
【００４１】
Ｇ．検出および診断方法
本発明のネイティブなＰＰＶ５Ａ、弱毒化ウイルス、タンパク質またはペプチドの使用によって生じる抗体、またはその結合性部分は、試料中のＰＰＶ５Ａの存在を検出するために有用である。この検出方法は、本発明のネイティブなＰＰＶ５Ａ、弱毒化ウイルス、タンパク質またはペプチドに対して生じた単離された抗体またはその結合性部分を用意するステップと、単離された抗体またはその結合性部分にある分量のＰＰＶ５Ａウイルスを含有する疑いのある試料を添加するステップと、単離された抗体またはその結合性部分とＰＰＶ５Ａウイルスが結合した複合体の存在を検出するステップとを含む。
本発明の抗体またはその結合性部分は、試料中のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドの存在を検出するためにも有用である。この検出方法は、ネイティブなＰＰＶ５Ａ、弱毒化ウイルス、タンパク質またはペプチドに対して生じた単離された抗体またはその結合性部分を用意するステップと、単離された抗体またはその結合性部分にある分量のＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドを含有する疑いのある試料を添加するステップと、単離された抗体またはその結合性部分とＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドが結合した複合体の存在を検出するステップとを含む。
結合対のメンバーである特異的な分子に結合する免疫グロブリン、特に抗体（および機能的に活性なその断片）を、本明細書に記載の通り診断薬（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および予後判定薬（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓ）として使用することができる。種々の実施形態では、本発明は、結合対のメンバーの測定値およびそのような測定値の臨床的適用における使用を提供する。本発明における免疫グロブリンは、例えば、生体試料中の抗原の検出において使用することができ、それにより、対象を、免疫グロブリンが結合する分子の異常なレベルについて、および／またはそのような分子の正常でない形態の存在について試験することができる。「異常なレベル」とは、疾患を有さない対象の体の一部または対象に由来する類似した試料中に存在するレベルまたは疾患を有さない対象の体の一部または対象に由来する類似した試料存在するレベルを代表する標準のレベルと比較して、上昇または低下していることを意味する。本発明の抗体は、診断技法または予後判定技法において使用するためのキットに試薬として含めることもできる。
【００４２】
一態様では、ＰＰＶ５Ａのネイティブなまたは弱毒化されたウイルス、タンパク質またはペプチドに免疫特異的に結合する本発明の抗体を使用して、ＰＰＶ５Ａ感染について診断、予後判定またはスクリーニングすることができる。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ５Ａ感染の存在またはそれに対する免疫について診断またはスクリーニングする方法であって、対象において抗体と対象由来の試料の免疫特異性結合のレベルを測定することを含み、抗体がＰＰＶ５Ａタンパク質またはペプチドに免疫特異的に結合し、前記免疫特異性結合のレベルが、感染症病原因子を有さない対象由来の類似した試料における前記免疫特異性結合のレベルと比較して上昇していることにより、ＰＰＶ５Ａの存在が示される方法を提供する。
ＰＰＶ５Ａペプチドまたはそれに対するアンタゴニストの存在を検出するための適切なアッセイの例としては、これだけに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ゲル内拡散沈降反応アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、または免疫電気泳動アッセイが挙げられる。
特定の分子に対するイムノアッセイは、一般には、生体液、組織抽出物、新たに回収した細胞、または培養細胞の溶解物などの試料を、検出可能に標識した抗体の存在下でインキュベートし、結合した抗体を当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかによって検出することを含む。
所与の抗体の結合活性は、よく知られた方法に従って決定することができる。当業者は、各決定に対する効力のある最適なアッセイ条件を常套的な実験を使用することによって決定することができる。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、ＰＰＶ５Ａを検出または測定するための診断用キットに関する。１つまたは複数の容器内に、抗ＰＰＶ５Ａ抗体を含み、抗体に対する標識された結合パートナーを含んでもよい、診断に使用するためのキットが提供される。あるいは、抗ＰＰＶ５Ａ抗体が標識されていてもよい（検出可能なマーカー、例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、または放射性部分を用いて）。したがって、本発明は、抗ＰＰＶ５Ａ抗体および対照免疫グロブリンを含む診断用キットを提供する。特定の実施形態では、前述の容器の化合物のうちの１つが検出可能に標識されていてよい。キットは、容器内に、標準物質または対照として使用するための、キットの抗体によって認識される所定量のＰＰＶ５Ａウイルス、タンパク質またはペプチドをさらに含んでもよい。
【００４４】
Ｈ．対象への投与
投与経路としては、鼻腔内、経口（例えば、飲料水に入れて）、皮内、および筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。筋肉内投与が特に好ましい。本発明の組成物は１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、かつ、他の投与経路によって投与することもできることが当業者には理解されよう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、気管内、心臓内、葉内、髄内、肺内、および膣内が挙げられる。所望の治療の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物を、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヶ月にわたって毎日、異なる投与量で投与することができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。実施例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法に従い、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【００４５】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、表題"Porcine Parvovirus 5B, Methods of Use and Vaccine," Attorney Docket No. BIC-1153と同日付で出願された出願に関連する。
【００４６】
（実施例）
材料および方法
材料の供給源：
３匹のブタ（ｐｉｇ）由来の組織ホモジネートを、異常な大発生の調査から入手した。農場における病歴は、全身筋振動せんが安静時に存在し運動時に激化した90.7kg（200lb）のブタ（ｐｉｇ）に関するものであった。ウイルス性病原因子（ｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔ）が示唆された（顕微鏡レベルの病変に基づいて）ものの病原因子Ｘ（非古典的豚コレラウイルス関連ペスチウイルス）と同定されただけであった獣医学的診断診察室における広範囲にわたる試験の後、これらの動物におけるＣＮＳ徴候の根本原因の決定を補助するために試料が本発明者らに提供された。
【００４７】
ＤＮＡおよびタンパク質の分析：
罹患したブタ（ｐｉｇ）由来の試料のＤＮＡ分析を、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ  ＣＴ）からのハイスループット配列決定（「４５４技術」）を使用し、Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＬ）による実施で行った。試料を、概してVictoria et. al PLoS pathogen 2008 Sep 26; 4 (9): e1000163に記載の通り実施したウイルス粒子保護核酸のヌクレアーゼ処理、その後の抽出、ランダム増幅およびハイスループットな配列決定によってウイルス配列について濃縮した。
得られた配列は、最初にＢＬＡＳＴｘ分析により、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の別のメンバーであると特徴付けられた。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用して配列をアッセッンブルし、これらのＤＮＡ分析の結果を標的化配列決定と併せることにより、ＰＰＶ５Ａと称されるウイルスの推定される完全なコード配列である配列番号１のＤＮＡ配列がもたらされた。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用したＤＮＡ配列のさらなる分析により、ウイルスレプリカーゼ（配列番号２）、オープンリーディングフレーム「ＯＲＦ３」（配列番号３）、およびウイルスカプシドタンパク質（配列番号４）を含む、他のパルボウイルス種に見いだされるものに対応する３つの推定コード領域が同定された。
【実施例１】
【００４８】
新規のウイルスの同定
異なる州からの無関係のブタ（ｐｉｇ）２匹の肺ホモジネートの試料において、４５４技術（ウイルスメタゲノミクス）によってＤＮＡ配列を同定した。ＢＬＡＳＴｎ分析およびＢＬＡＳＴｘ分析により、ブタパルボウイルス４との最も近い同一性が明らかになり、レプリカーゼ遺伝子（ＲＥＰ）の保存された領域のヌクレオチド同一性は最大で６７％であったが、カプシド（ＣＡＰ）コード領域ではヌクレオチドレベルで識別可能なマッチングは示されなかった。タンパク質レベルでは、推定レプリカーゼタンパク質は約６０％のアミノ酸同一性、カプシドタンパク質において約５０％の同一性を示した。このウイルスを新しい種、ブタパルボウイルス５Ａ（ＰＰＶ５Ａ）と名付けた。カプシドコード配列に基づいて特異的なプライマーを開発し、組織および病理学的／臨床的特性が類似したホモジネートのＰＣＲに基づくスクリーニングにより、試料の約１６％に当該病原因子が存在することが明らかになった。報告された臨床徴候およびスクリーニングした組織に関連するウイルス学的データに基づいて、いくつかの他のウイルス性病原因子および臨床病理／病理組織検査との統計的に有意な関連性が観察された。
【実施例２】
【００４９】
新規のパルボウイルスとしてのＰＰＶ５Ａの同定および系統発生解析
多数の公知のウイルス種の推定されるレプリカーゼ（ＲＥＰ）タンパク質およびカプシド（ＶＰ１／ＣＡＰ）タンパク質の両方についてのペアワイズアミノ酸同一性が図５に示されている。ＰＰＶ５Ａの、最も近い類縁であるＰＰＶ４に対するＲＥＰおよびＣＡＰの両方の配列同一性（それぞれ約６０％／５０％）により、新しい種としてのＰＰＶ５Ａの命名が支持される。
系統発生解析（図６）により、ＣＡＰタンパク質の保存された領域に基づいて、当該ウイルスがＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科パルボウイルス属の新規の種であることが示される。より保存されたＲＥＰタンパク質配列を使用して同様の結果が実現される（示されていない）。
【実施例３】
【００５０】
疾患の病原因子としてのＰＰＶ５Ａの確認
ウイルスを増幅し、新規のパルボウイルスとＰＲＲＳＶの同時感染により呼吸器の臨床徴候が増加するかどうかを決定するための試みにおいて、ＩＳＵ由来の３つのＰＰＶ５ａ  ＰＣＲ陽性組織ホモジネートを使用して、帝王切開由来初乳未摂取（cesarean-derived-colostrum-deprived）（ＣＤＣＤ）動物に接種した。この試験では、新規のパルボウイルスを含有する組織ホモジネートを接種した群における死亡数が予想外に高く（２０〜２２％）、カプシドコード領域を標的とするＰＰＶ５Ａ特異的ＰＣＲを使用して血清中の高力価のＰＰＶ５Ａが同定された。この試験では、次いで、１匹の動物由来の組織を使用してＣＤＣＤブタ（ｐｉｇ）を攻撃して臨床徴候を再現した。この試験では、高力価のウイルス血症の全身感染が大多数の感染動物において認められた。ＰＰＶ５Ａを含有する接種物を受けた群では、高死亡発生率（２０％）、跛行、毎日の体重増加（ｇａｉｎ）の平均の減少、発熱、および巨視レベルの病変と顕微鏡レベルの病変の両方が見られた。
【実施例４】
【００５１】
ＰＰＶ５Ａの培養、単離および精製
ＰＣＲ陽性組織の小さな切片（例えば、脾臓、脳、肺、腸 など）を、滅菌した乳鉢と乳棒ですりつぶす。すりつぶした組織を、ＨＥＰＥＳ緩衝液および抗生物質を含有する改変ＥＭＥＭ、５〜１０ｍｌに再懸濁させ、清澄化して大きな組織塊を排除する。上清を採取し、種々のフィルターを段階的に通過させて、細菌を含めた大きな粒子の大部分を排除する。さらに、ＰＣＲ陽性動物由来の糞便試料懸濁液および血清も同様にウイルス単離のために段階的に濾過することによって処理する。
濾液の希釈物をトリプシンで処理するかまたは無処理のまま放置し、６ウェルプレート中の樹立初代細胞培養物（以下に列挙されている）に特定の温度で吸着させる。種菌を吸引し、新鮮な維持培地２ｍｌと交換する。次いで、プレートを５％ＣＯ2雰囲気中、３３〜３７℃でインキュベートし、モック（培地のみ）を接種した対照と比較して、例えば、細胞の円形化、細胞間融合、脱落、細胞の集合などの細胞変性効果について毎日観察する。潜在的な陽性ウェルを、ウイルス成長／単離についてＰＣＲによってスクリーニングする。
ウイルスの単離において有用な樹立細胞系としては、とりわけ、ＳＴ（ブタ（ｓｗｉｎｅ）精巣）、ＳＫ６（ブタ（ｓｗｉｎｅ）腎臓）、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）、ＶＩＤＯ  Ｒ１（胎児ブタ網膜）、ＰＫ−１５  ＮＡＤＣ（ブタ腎臓）、ＰＫ／ＷＲＬ（ブタ腎臓）、ＨＲＴ−１８０（ヒト結腸直腸腺癌）、Ｈｅｐ２（ヒト上皮の）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）およびＲＫ−１３（ウサギ腎臓）が含まれた。
プロセスにおいて有用な初代細胞培養物としては、とりわけ、ブタ胎児の肺、腎臓、精巣、気管、および腸の培養物が含まれた。
ウイルスが単離されたら、それを多数のラウンドのプラーク精製または限界希釈によって精製し、より大きな数量に増幅し、動物実験用のストック培養物を生成する。
【実施例５】
【００５２】
不活化ウイルスおよびワクチンの調製
約３５〜３９℃、２〜１５ｍＭのＢＥＩの存在下、さらに好ましくは約１０ｍＭのＢＥＩの存在下で不活化を実施する。少なくとも２４時間、最大で２４〜７２時間にわたって不活化を実施する。次いで、溶液中の不活化剤を中和する薬剤を等価量で、例えば、チオ硫酸ナトリウムを等価量で添加する。不活化ウイルス調製物を当技術分野で公知の方法に従って、例えば、Preuss, T., et al., Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum, CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, (1997), 504-508またはBahnemann, H.G., Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine, VACCINE, (1990), 299-303に開示されている通り調製する。不活化ウイルスが調製されたら、最終的なワクチン製剤化のために材料を担体調製物と組み合わせる。
【実施例６】
【００５３】
弱毒化ウイルスおよびワクチンの調製
弱毒化ウイルス調製物を、当技術分野で公知の方法に従って、例えば、Vaccine Protocols, 2nd edition; Robinson, Husdon, Cranage, eds, Humana Press 2003に開示されている通り調製する。例えば、“…wild type viruses are extensively passaged in tissue culture/animal hosts until an acceptable balance is reached between loss of virulence and retention of immunogenicity…”
弱毒化ウイルスを、プラーク精製または限界希釈の多数のラウンドによって精製する。ＰＣＲアッセイ、ディープシークエンシングまたは免疫蛍光法アッセイを利用して、培養材料の特異性を決定する。
精製した弱毒化ウイルス調製物と担体調製物とを組み合わせることによって弱毒化ウイルスワクチンを調製する。
【実施例７】
【００５４】
カプシドタンパク質を含むサブユニットワクチンの調製 
配列番号４のカプシドタンパク質を、クローニングした配列番号４またはその断片を種々のタンパク質の発現系において発現させることによって調製した。
バキュロウイルス発現：配列番号４のＰＰＶ５Ａカプシドタンパク質をバキュロウイルスの発現系において、概してKost et al. (6), 2012に開示されている方法に従って発現させた。最初の精製の際にはタンパク質は不溶性画分中に低分量で見いだされた。収量および溶解性を増加させる方法としては、これだけに限定されないが、代替の緩衝条件（例えば、尿素または塩酸グアニジン）、代替の結合および精製条件（例えば、コバルトまたはニッケルアフィニティーカラム、陰イオンまたは陽イオン交換カラム）、または代替の発現条件（例えば、温度、時間、代替の細胞株）の使用が挙げられる。
細菌による発現： 配列番号４のＰＰＶ５Ａカプシドタンパク質を、概してEMD Chemicals Inc. Novagen User Protocol TB184に開示されている方法に従って、細菌発現系において発現させた。この方法は、産生されたタンパク質の精製を容易にするために、細菌ベクター（EMD Chemicals Inc., 2011(7)）に含有される固有のＨＩＳタグを添加することを含んだ。細菌によって発現されたＨＩＳタグ付きカプシドタンパク質を、概してGE Healthcare, 2012(8)に開示されている方法に従って精製し、生じた産物を使用して、実施例８に記載の通りＰＰＶ５Ａ特異的抗体を生成した。
弱毒化サブユニットワクチンを、精製されたカプシドタンパク質調製物と担体調製物とを組み合わせることによって調製した。
【実施例８】
【００５５】
ＰＰＶ５Ａに特異的に結合する抗体の調製
ＰＰＶ５Ａに特異的に結合する抗体を、ウサギをＰＰＶ５Ａウイルスの抗原性調製物、またはカプシド（配列番号４）タンパク質またはその断片のサブユニットタンパク質調製物で免疫することによって調製する。接種を行ったウサギ由来の血清試料を、ＰＰＶ５Ａ抗原に結合するポリクローナル抗体についてスクリーニングする。抗原に対する抗体を産生することが決定された、接種を行ったマウス由来の脾臓を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生した。次いで、ハイブリドーマを、ＰＰＶ５Ａ抗原との結合についてスクリーニングする。
ポリクローナル抗体：実施例７に従って調製した、細菌により発現されたＨＩＳタグ付きのカプシドタンパク質を使用して、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ２匹を受託抗体生産サービス（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）において免疫した。ウサギを、Ｄ０、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２８に、ウサギ当たり抗原およそ１００μｇを用いて免疫した。Ｄ０およびＤ７の接種については、動物の皮内に接種し、Ｄ１４およびＤ２８での接種は皮下投与した。最初の接種では完全フロイントアジュバントを使用し、その後の接種では不完全フロイントアジュバントを使用した。免疫前、および免疫の３８日後および４５日後に両方のウサギから血清試料を採取した。
【００５６】
ポリクローナル抗体調製物を、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓによって抗ＰＰＶ５Ａ特異性についてスクリーニングした。精製されたまたは部分的に精製されたＰＰＶ５Ａタンパク質に対して免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ウエスタンブロット、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による結合特異性を有する抗体を産生した。各アッセイの特異性についてのパラメータは以下の通りであった： ウエスタンブロットによる特異性は、予測される８８．８ｋＤａのサイズのタンパク質の検出によって測定し、ＩＦＡによる特異性は感染していない細胞と比較することによって測定し、ＥＬＩＳＡによる特異性はプレートを関連性のないタンパク質でコーティングすることによって測定した。
モノクローナル抗体：受託抗体生産サービス（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）において、実施例７に従って調製したバキュロウイルスにより発現されたＨＩＳタグ付きのカプシドタンパク質を使用してＢａｌｂ／ｃマウスでモノクローナル抗体を生成する。マウスを、受託抗体生産施設により設計された標準のプロトコールに従って種々のＰＰＶ５Ａ抗原性調製物を用いて免疫する。接種後の免疫応答を受託抗体生産施設によりモニタリングし、ハイブリドーマを生成するための抗体候補を選択する。モノクローナル抗体を生成するための標準のプロトコールは、例えば、Gabriele et al. (9), p.117-135に開示されている通り当業者には周知である。
Gabriele et al. (9), p.117-135に開示されている通り、標準のプロトコールに従って、ハイブリドーマ培地において増殖期まで培養したＢ細胞腫瘍細胞と、ＰＰＶ５Ａ抗原に対する抗体を産生することが決定された接種されたマウスから回収した脾臓細胞を組み合わせることによってハイブリドーマを生成する。融合し、ハイブリドーマを培養した後、ハイブリドーマを、ＰＰＶ５Ａ抗原との結合についてスクリーニングし、抗ＰＰＶ５Ａを産生するハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを使用し、Gabriele et al. (9), p.209-232に開示されている通り、標準のプロトコールに従って精製する。
【００５７】
ＰＰＶ５Ａに特異的な高親和性抗体を同定し、それらが結合するエピトープ、他の関連するウイルス種に対する抗体の特異性の決定を含めたさらなる特徴付けを行い、ＰＰＶ５Ａウイルス抗原（複数可）に対する特異性が高い適切な高親和性抗体を、当技術分野で周知の免疫学的技法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析およびエピトープマッピング（Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press、Totowa、New Jersey）を使用して選択する。
【実施例９】
【００５８】
ＰＰＶ５Ａに対する診断アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイ：実施例８に従って調製した抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ手順を使用して生体試料中のＰＰＶ５Ａを測定する。アッセイを以下の通り行う：
配列番号４のカプシドタンパク質から選択されるコーティング抗原をコーティング緩衝液（０．０５Ｍの炭酸−炭酸水素緩衝液；ｐＨ９．６）中に希釈して８ｎｇ／μｌの最終濃度を実現する。プレート（高タンパク質結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレートＰｈｅｎｉｘ  ｃａｔ  ｎｏ．ＭＰＧ−６５５０６１）をウェル当たり５０μｌのコーティング抗原でコーティングする。プレートを密閉し、３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートする。コーティング溶液を除去し、プレートをウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。プレートをウェル当たり３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．５％ｗ／ｖの脱脂粉乳）でコーティングし、密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、プレートをウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。試料をブロッキング溶液中に１：１００に希釈し、ウェル当たり１００μｌの血清試料をプレートに加える。プレートを密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。血清試料を除去し、プレートをウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。二次抗体（ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ 抗ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１４−０３５−００３）をブロッキング溶液中１：１０，０００に希釈し、それを使用してウェル当たり１００μｌでプレートをコーティングする。プレートを密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。二次抗体を除去し、プレートをウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。プレートをウェル当たり５０μｌのＴＭＢ（３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン；ＫＰＬ  ｃａｔ  ｎｏ．５３−００−０１）でコーティングする。プレートを室温、暗闇中でおよそ１０分間インキュベートする。プレートをウェル当たり５０μｌの停止液（２ＭのＨ2ＳＯ4；ＫＰＬ  ｃａｔ  ｎｏ．５０−８５−０４）でコーティングする。４５０ｎｍにおける光学濃度を読み取る。
【００５９】
ＰＣＲアッセイ：ＰＰＶ５Ａについてのゲルに基づくＰＣＲおよびｑＰＣＲアッセイが最適化されている。これらのアッセイを以下の通り行う：ｑＰＣＲアッセイについては、各反応を、以下の試薬を添加することによって調製する：反応当たり１０μｌの２×ＳｓｏＦａｓｔ  ｐｒｏｂｅ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、ｃａｔ  ｎｏ．１７２−５２３３）、反応当たり５μｌのＤＥＰＣ−処理水、濃度６μＭ、反応当たり１μｌのフォワードプライマー（ＡＡＴ  ＧＣＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＡ：配列番号６）、濃度６μＭ、反応当たり１μｌのリバースプライマー（ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧ：配列番号７）、濃度４μＭ、反応当たり１μｌのプローブ（６−ＦＡＭ／ＴＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ／ＢＨＱ＿１：配列番号８８）、および反応当たり２μｌの抽出されたＤＮＡ。反応をＴ１００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、９５℃で２分を１サイクル、その後、９５℃で５秒、その後、６０℃で５秒の２つの温度の４０サイクルを実施する。ＣＦＸ９６  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータを読み取る。ゲルに基づくアッセイについては、各反応を、以下の試薬を添加することによって調製する：反応当たり１２．５μｌの２×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ  ｎｏ．４３０２７５８）、反応当たり８．０μｌのＤＥＰＣ処理水、濃度１０μＭ、反応当たり１．２５μｌのフォワードプライマー（ＧＴＡ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＣＧ：配列番号９）、濃度１０μＭ、反応当たり１．２５μｌのリバースプライマー（ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＧＣ：配列番号１０）、および反応当たり２μｌの抽出されたＤＮＡ。反応を、Ｔ１００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、９５℃で５分を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で４５秒の温度で４０サイクル、その後、７２℃で１０分の最終的な伸長で実施する。
【実施例１０】
【００６０】
ブタ（ｐｉｇ）におけるＰＰＶ５Ａワクチンの有効性の評価
ブタ（ｐｉｇ）における少なくとも１種のＰＰＶ５Ａタンパク質またはポリペプチド（プロトタイプＰＰＶ５Ａワクチン）を含む組成物の有効性を評価するために、３つの群にランダム化した５週齢の初乳未摂取帝王切開由来（colostrum-deprived-cesarean-derived）（ＣＤＣＤ）動物を使用したランダム化試験（表２参照）を実施する。試験０日目（Ｄ０）およびＤ１４に、動物に組成物またはプラセボ（リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ）をワクチン接種する。Ｄ２８に、ＰＰＶ５Ａを含有することが分かっている材料を用いて動物を攻撃する。臨床的観察、直腸の温度、体重測定値および血液採取をモニタリングする。Ｄ５６に、動物を剖検して肉眼で見える病変を評価する。ワクチン接種した動物とワクチン接種していない動物の間でパーセント死亡率、ウイルス血症（力価および持続時間）、抗体陽転（力価および持続時間）ならびに臨床徴候を統計学的に比較することによってＰＰＶ５Ａワクチンの有効性を決定する。
【００６１】
【表２】
2016502845.tif 000004
【００６２】
本明細書において開示され、特許請求されている組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法のステップまたは一連のステップに、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【００６３】
参考文献
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
(1) Csagola A, et al., Detection, prevalence and analysis of emerging porcine parvovirus infections.  Arch Virol. Jun; 157(6):1003-10 (2012).
(2) Hijikata M, et al., Identification of new parvovirus DNA sequence in swine sera from Myanmar. Jpn J Infect Dis 54:244-245 (2001).
(3) Wang F, et al., Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus Genes 41:305-308 (2010).
(4) Lau SK, et al., Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J Gen Virol 89:1840-1848 (2008).
(5) Cheung AK, et al., Identification and molecular cloning of a novel porcine parvovirus. Arch Virol 155(5):801-806 (2010).
(6) Kost et al., Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, Trends in Biotechnology, 20, 173-180, Apr. 2002. cited by other.
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(8) GE Healthcare. Recombinant Protein Purification Handbook. 18-1142-75.
(9) Gabriele et al. (eds.), Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2012, vol. 901, chapter 7.
【図１−１】
2016502845.tif 000005
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
2016502845000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月26日(2015.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１の核酸配列を有する、
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドをコードする核酸配列を有する、
ｃ）配列番号１と８０％同一である核酸配列を有し、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有するポリペプチドをコードする、
ｄ）配列番号１の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド配列を含む、配列番号１の核酸配列の断片である、または
ｅ）配列番号１の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド配列を含み、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の免疫学的に有効な活性をコードする配列番号１の核酸配列の断片である、
ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有する、
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４と８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４によりコードされるポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有する、
ｃ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含む、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の断片である、
ｄ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、免疫学的に有効な活性を有する、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列の断片である、または
ｅ）配列番号１のヌクレオチド８７〜１９６７、配列番号１のヌクレオチド１９７５〜２８４４、もしくは配列番号１のヌクレオチド２８４５〜５５４７の配列内に含まれる少なくとも１５個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質断片である
ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
ａ）配列番号１の核酸配列、または
ｂ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のポリペプチドの生物学的または免疫学的に有効な活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１と８０％同一である核酸配列
を含む、ブタパルボウイルス５Ａ（ＰＰＶ５Ａ）。
【請求項４】
弱毒化した非病原性の形態のＰＰＶ５Ａを含む、請求項３に記載のＰＰＶ５Ａ。
【請求項５】
死菌化または弱毒化した形態の請求項３に記載のＰＰＶ５Ａを含む、毒性ＰＰＶ５Ａによる感染を治療または予防するためのワクチン。
【請求項６】
死菌化または弱毒化した形態の請求項３に記載のＰＰＶ５Ａのサブユニットを含む、毒性ＰＰＶ５Ａによる感染を治療または予防するためのワクチン。
【請求項７】
サブユニットが配列番号４のカプシドタンパク質である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
サブユニットが配列番号４のポリペプチドの免疫学的に有効な断片である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
免疫学的に有効な量の請求項２に記載のポリペプチドと、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む免疫原性調製物。
【請求項１０】
免疫学的に有効な量の請求項２、３、または５〜７のいずれか１項に記載のＰＰＶ５Ａを投与することを含む、非ヒト哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物がブタ（ｓｗｉｎｅ）であり、免疫応答が、ＰＰＶ５Ａ感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１の配列を有するブタパルボウイルス５ＡポリヌクレオチドによりコードされるＰＰＶ５Ａポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、異なるパルボウイルスによりコードされるポリペプチドには結合しない抗体。
【請求項１３】
生体試料中のＰＰＶ５Ａの存在を同定する方法であって、
ａ）生体試料を請求項１２に記載の抗体と接触させるステップと、
ｂ）抗体とＰＰＶ５Ａポリペプチドの間の複合体の形成を検出するステップと
を含み、前記複合体の存在が、生体試料中にＰＰＶ５Ａが存在することを示す方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１２に記載の抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項１７】
ａ）請求項１２に記載の抗体と、
ｂ）前記抗体とＰＰＶ５Ａポリペプチドの間の複合体の形成を検出するための試薬と
を含む、生体試料中のＰＰＶ５Ａの存在を同定するための診断用キット。
【請求項１８】
ａ）動物をＰＰＶ５Ａ感染に関連する少なくとも１種の疾患に対して免疫するために有効である少なくとも１種の免疫原性ＰＰＶ５Ａペプチドと、
ｂ）少なくとも１種の担体またはアジュバント分子と、
ｃ）前記免疫原性組成物を包装するための容器と、
ｄ）印刷された指示書のセットと、
ｅ）前記免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサーと
を含む免疫原性キット。
【請求項１９】
動物を、少なくとも１種の他のブタ病原性のウイルスまたは細菌による感染に関連する疾患を引き起こすウイルスまたは細菌に対して免疫するために有効な少なくとも１種の免疫原性タンパク質をさらに含む、請求項１８に記載の免疫原性キット。
【国際調査報告】
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