(57)【要約】  本発明は、哺乳類の新生物疾患を処置する方法に関する。より具体的には、本発明は、原発腫瘍、二次性腫瘍、及び転移性腫瘍等の固形腫瘍を処置する方法を対象とする。本発明の方法は、幹細胞又はインビトロで作製された多系統前駆細胞(MLPC)の集団を投与することによって新生細胞の成長を下方制御することに基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数のMLPCを投与する工程を含み、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、方法。
【請求項２】
哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数の幹細胞を投与する工程を含み、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
から選択される表現型を発現する、方法。
【請求項３】
哺乳類の新生物疾患を処置するための医薬の製造におけるMLPCの使用であって、 前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、使用。
【請求項４】
哺乳類の新生物疾患を処置するための医薬の製造における幹細胞の使用であって、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
から選択される表現型を発現する、使用。
【請求項５】
前記新生物疾患が固形腫瘍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項６】
前記新生物疾患が悪性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項７】
前記悪性の疾患が転移性である、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項８】
前記新生物疾患が、中枢神経系の腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、扁平上皮細胞癌等の頭頸部癌、乳癌若しくは前立腺癌、肺癌、腎細胞腺癌等の腎臓癌、食道胃癌、肝細胞上皮性悪性腫瘍、腺癌若しくは膵島細胞腫瘍等の膵臓胆道新生物、結腸直腸癌、子宮頸癌若しくは肛門癌、子宮癌若しくは他の生殖器系の癌、尿管若しくは膀胱の癌等の尿管癌、精巣胚細胞腫瘍若しくは卵巣胚細胞腫瘍等の胚細胞腫瘍、上皮性卵巣癌等の卵巣癌、原発不明の上皮性悪性腫瘍、カポジ肉腫等のヒト免疫不全関連の悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、悪性黒色腫、肉腫、甲状腺の腫瘍等の内分泌腫瘍、中皮腫若しくは他の胸膜若しくは腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍、又はカルチノイド腫瘍である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項９】
前記細胞が局所投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
前記局所投与が腫瘍の部位におけるものである、請求項９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
前記細胞が全身投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
前記MLPCが化学療法と共に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
前記MLPCと化学療法とが同時に投与される、請求項１２に記載の方法又は使用。
【請求項１４】
前記MLPCと化学療法とが逐次的に投与される、請求項１２に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
前記MLPCが第一段階で投与され、前記化学療法が第二段階で行われる、請求項１４に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
前記化学療法が第一段階で行われ、前記MLPCが第二段階で投与される、請求項１４に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
前記10%〜20% v/vが15% v/vであり、前記60%〜80% v/vが70% v/vである、請求項１又は３に記載の方法又は使用。
【請求項１８】
前記アルブミン溶液が5%〜85%、5%〜80%、5%〜75%、5%〜70%、5%〜65%、5%〜60%、5%〜50%、5%〜45%、5%〜40%、5%〜35%、5%〜30%、5%〜25%、5%〜20%、5%〜15%、又は5%〜10%の濃度である、請求項１、３、又は１７に記載の方法又は使用。
【請求項１９】
前記アルブミンの濃度が5%〜20%である、請求項１、３、又は１７に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
前記アルブミンの濃度が5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である、請求項１、３、又は１７に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
前記細胞培養が10mg/Lのインスリン又はその機能的断片若しくは同等物を追加的に含む、１、３、及び１７〜２０のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
前記細胞が4日間〜7日間培養される、１、３、及び１７〜２１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
前記処置が治療的である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２４】
前記処置が緩和である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２５】
前記哺乳類がヒトである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２６】
利用される前記MLPC又は幹細胞が処置される哺乳類に対して自己由来である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生物疾患(neoplastic condition)を処置する方法に一般に関する。より具体的には、本発明は、原発腫瘍、二次性腫瘍、及び転移性腫瘍等の固形腫瘍を処置する方法を対象とする。本発明の方法は、インビトロで作製された多系統前駆細胞(MLPC)の集団を投与することによって腫瘍成長を下方制御することに基づく。
【背景技術】
【０００２】
本願明細書中に発明者らによって言及された刊行物の書誌的詳細は、説明の終わりにアルファベット順に集めてある。
【０００３】
本願明細書中のあらゆる先行文献(又はそれに由来する情報)への参照、又は周知の事項は、先行文献(又はそれに由来する情報)又は周知の事項が本願明細書の関連する試みの分野における技術常識の一部を形成するという、いかなる形式の示唆の同意や承認として受け取られないし、また受け取られるべきではない。
【０００４】
悪性腫瘍、又は癌は、制御されない様態で成長し、正常な組織に浸潤し、多くの場合、転移して原発組織から離れた部位で成長する。一般的に、癌は、悪性転換と呼ばれる、ほとんど解明されていないプロセスを経た、1個又はわずか数個の正常な細胞に由来する。癌は、体のほとんどあらゆる組織から発生し得る。上皮細胞に由来するものは、上皮性悪性腫瘍と呼ばれ、最も一般的な種類の癌である。肉腫(非上皮性悪性腫瘍)は、間葉組織の悪性腫瘍であり、繊維芽細胞、筋肉細胞、及び脂肪細胞等の細胞から発生する。リンパ組織の固形悪性腫瘍はリンパ腫と呼ばれ、骨髄及び血液によって運ばれるリンパ球及び他の造血細胞の悪性腫瘍は白血病と呼ばれる。
【０００５】
癌は、先進工業国における3つの主要な死因のひとつである。感染性疾患の治療及び循環器疾患の予防が改善し続け、平均余命が延長しているので、癌はこれらの国において最も一般的な致死的疾患になる見込である。したがって、癌の処置に成功するためには、患者を死なせることなく全ての悪性細胞を除去するか又は破壊することが必要である。これを達成するための理想的な方法は、腫瘍の細胞と、正常な細胞性の対応するものとを識別する、腫瘍に対する免疫応答を誘導することである。しかし、癌の処置に対する免疫学的アプローチは、何十年も試みられてきているが、持続不可能な結果となっている。
【０００６】
したがって、現在の癌の処置方法は、外科的切除(可能な場合)と、必要な場合は、その後の放射線療法及び/又は化学療法、という長く用いられてきたプロトコルに従い続けている。この相当に荒削りな形態の処置の成功率は、極めて変動的であるが、一般的には、腫瘍がより進行し、転移するにつれて、有意に減少する。さらに、これらの処置は、手術により外観が損なわれること及び瘢痕化(例えば乳房切除又は手足の切断)、化学療法による重度の悪心及び嘔吐、並びに最も顕著には、ほとんどの癌処置の一部を形成する、毒性のある薬剤の比較的非特異的な標的機構の結果として誘導される、毛包、腸、及び骨髄等の正常な組織への損傷を含む、重度の副作用と関連している。
【０００７】
固形腫瘍は、最も多数の癌による死を引き起こしており、上皮性悪性腫瘍として知られる、気管支及び消化管の内膜の腫瘍を主に含む。2000年、オーストラリアにおいて、癌は、男性の死亡の30%、及び女性の死亡の25%を占め(Cancer in Australia 2000, 2003)、2001年の米国においては、男性の死亡の24%、及び女性の死亡の22%を占めた(Ariasら 2003, National Vital Statistics Reports 52: 111-115)。固形腫瘍は、一旦全身に広がる、すなわち「転移」してしまうと、通常は治癒可能でない。転移性の固形腫瘍の予後は、過去50年間で、ごくわずかしか改善しなかった。固形腫瘍の治癒の最良の機会は、固形腫瘍が、その発生源である内膜に局在しており、腫瘍を流出させるリンパ節にも他の部位にも広がっていない場合の、手術及び/又は放射線療法等の局所治療の使用にとどまっている。それにも拘わらず、この初期の段階でさえも、特に腫瘍が流入領域リンパ節に広がってしまった場合は、微小転移として知られる癌の微視的堆積が、既に全身に広がってしまっている可能性があり、その後、患者の死亡につながる。この意味では、癌は、全身的に処置を施す必要がある、全身性疾患である。最初の腫瘍に対する決定的局所処置として手術及び/又は放射線療法を受け、微小転移を有する患者の中で、少数の一部の者は、細胞毒性化学療法又はホルモン等の補助全身処置を加えることにより、治癒するか、少なくとも癌からの長期寛解を達成する可能性がある。
【０００８】
従来、固形の癌は、手術及び/又は放射線療法を用いて局所的に処置されており、転移期の間は、全身投与される細胞毒性薬剤を用いて処置されていたが、これにより、多くの場合、正常な細胞と悪性の細胞の両方の細胞周期が妨げられる。悪性組織の処置のためのこのアプローチの相対的な選択性は、細胞毒性薬剤による損傷からの正常な組織のより迅速な回復にある程度基づいている。より最近では、癌の標的治療は、悪性組織への送達の特異性及び/又は精度を高め、一方で非悪性組織への有害な結果を最少にすることにより、癌の治療可能比を改善することを目標としてきている。標的治療の2つの主要なクラスは、(i) チロシンキナーゼインヒビターであるイマチニブメシル酸塩(グリベック(登録商標))、ゲフィニチブ(イレッサ(登録商標))、及びエルロチニブ(タルセバ(登録商標))等の低分子のインヒビター、並びに(ii) リツキシマブ(マブセラ(Mabthera)(登録商標))及びトラツズマブ(ハーセプチン(登録商標))等のモノクローナル抗体(mAb)である。
【０００９】
標的治療の開発と並行して、化学療法及び放射線療法等の従来の抗癌処置の少なくとも2種類を新規の方法で組み合わせることが、癌治療の開発のための別のアプローチである。種々の処置方法間の相乗的相互作用を利用することにより、組合せ処置方法は、組合せ処置の治療可能比が個々の処置の各々の治療可能比よりも優れたものになるように、処置の有効性を改善しようとしている。
【００１０】
外照射、並びに5-フルオロウラシル及びシスプラチン(化学放射線療法)等の放射性増感性化学療法薬剤を用いた組合せ処置方法により、局所的な腫瘍の制御の改善及び遠位の障害率の低減の両方の理由から、頭頸部、肺、食道、胃、膵臓、及び直腸等の多数の固形腫瘍における生存率が改善されてきた(TS Lawrence. Oncology (Huntington) 17, 23-28, 2003)。放射線増感剤は、腫瘍の応答を向上させるが、近接する正常な組織への毒性も増加させ、これは強力な次世代放射性増感剤であるゲムシタビン及びドセタキセルに特に当てはまる。しかし、放射線量を減少させることにより、ゲムシタビンの細胞毒性用量を、より臨床的に忍容させることができる(Lawrence TS. Oncology (Huntington) 17, 23-28, 2003)。化学放射線療法により、相互に増強し合う耐性機構が克服される可能性があるが、この耐性機構はインビボでのみ現れ得る。
【００１１】
放射線免疫療法(RIT)は、抗体抗原相互作用の特異性及び親和性を利用して、標的の抗原を有する細胞に致死量の放射線を送達する、全身処置である。β粒子(例えば131ヨウ素、90イットリウム、188レニウム、及び67銅)を放出する放射性同位元素を通常用いて、治療的適用のためのモノクローナル抗体(mAb)を標識する。γ線からのエネルギーが、比較的低い強度で、ミリメートル単位で測定される距離にわたって、放出される(Waldmann, Science 252: 1657-1662, 1991；Benderら, Cancer Research 52: 121-126, 1992；O'Donoghueら Journal of Nuclear Medicine 36: 1902-1909, 1995；Griffithsら International Journal of Cancer 81: 985992, 1999)。したがって、90イットリウム等の高エネルギーのγ放射体が、より大きな不均一な固形腫瘍の処置に有用である(Liuら Bioconjugate Chemistry 12:7-34, 2001)。送達される放射線量が低いにも関わらず、RITの周囲の宿主細胞への有意かつ予想外の生物学的効果が観察されたため(Xueら Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 13765-13770, 2002)、放射線免疫療法に関する研究が再び活発になっている。さらに、RITにより送達される、より低線量だが生物学的に有効な線量の放射線は、外照射放射線療法として伝達されるより高線量の放射線よりも高い殺細胞効果を有していた(Dadachovaら Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 14865-14870, 2004)。それにも関わらず、固形腫瘍の処置としてのRITの効率は、腫瘍中の標的抗原を取り囲む組織バリアへの抗体の低浸透によって妨げられる可能性があり、この結果として抗体の循環半減期が延長される(Britz-Cunninghamら Journal of Nuclear Medicine 44: 1945-1961, 2003)。さらに、RITは、腫瘍内での標的抗体発現の不均一性によって妨げられることが多い。したがって、RITは、腫瘍細胞の分子標的を提供するが、RITの主要な制限は、依然として、十分なターゲティングを達成するために全身に送達される高線量の放射線から生じ得る毒性にある(Britz-Cunninghamら 2003、上記を参照；Christiansenら Molecular Cancer Therapy 3: 1493-1501, 2004)。要するに、RITを用いる有用な治療指数は、臨床的に達成することが困難であることが示されてきた(Sellersら Journal of Clinical Investigation 104: 16551661, 1999)。
【００１２】
腫瘍関連抗原は、正常な細胞を温存しながら腫瘍の差別的ターゲティングを可能にするため、癌研究の焦点にもなってきている。豊富でユビキタスな抗原は、より高濃度の利用可能なRITの標的を提供し得るが、これを採用した研究は極めて限定されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Cancer in Australia 2000, 2003
【非特許文献２】Ariasら 2003, National Vital Statistics Reports 52: 111-115
【非特許文献３】TS Lawrence. Oncology (Huntington) 17, 23-28, 2003Waldmann, Science 252: 1657-1662, 1991
【非特許文献４】Waldmann, Science 252: 1657-1662, 1991
【非特許文献５】Benderら, Cancer Research 52: 121-126, 1992
【非特許文献６】O'Donoghueら Journal of Nuclear Medicine 36: 1902-1909, 1995
【非特許文献７】Griffithsら International Journal of Cancer 81: 985-992, 1999
【非特許文献８】Liuら Bioconjugate Chemistry 12:7-34, 2001
【非特許文献９】Xueら Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 13765-13770, 2002
【非特許文献１０】Dadachovaら Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 14865-14870, 2004
【非特許文献１１】Britz-Cunninghamら Journal of Nuclear Medicine 44: 1945-1961, 2003
【非特許文献１２】Christiansenら Molecular Cancer Therapy 3: 1493-1501, 2004
【非特許文献１３】Sellersら Journal of Clinical Investigation 104: 1655-1661, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、固形癌、特に転移性癌の全身療法を開発することの緊急かつ継続中の必要性がある。
【００１５】
本発明を導く研究において、ある種の幹細胞亜集団(本願明細書において多系統前駆細胞[MLPC]と称する)を、腫瘍を有する患者に投与すると、腫瘍の成長が下方制御されることが、驚くべきことに突き止められた。幹細胞研究の分野においては、幹細胞の価値及び有用性は、通常、細胞、組織、若しくは器官の修復又は置換との関連に集中していたため、これは予想外の結果である。これは、例えば、適切な幹細胞を目的の臓器又は器官に投与し、それらの細胞が所望の体細胞性の表現型へのインビボ分化を受けることを可能にすることにより達成される。あるいは、幹細胞の指向性分化が、インビトロで達成されており、その後成熟体細胞が患者へ導入されて、損傷した組織又は器官の機能性を修復又は復元する。しかし、幹細胞の分化の発生又は方向付けは、困難で不確かであった。したがって、幹細胞を同定又は作製するための方法の開発は、インビトロ又はインビボでの系統特異的分化を方向付けるための方法の開発と併せて、広範な研究の焦点である。これは、特に、自家細胞を用いた器官の修復又は交換、及びそれによる器官及び組織の移植への依存の低減へのますます増加する関心に起因するものであるが、移植は、実用性が限定され利用可能性はさらに限定される。
【００１６】
したがって、本願明細書に開示される表現型の幹細胞又は本願明細書に開示される方法により製造される幹細胞が、腫瘍細胞成長を下方制御することができるという解明は、完全に予想外である。これらの細胞は、損傷した組織を生成又は置換する働きをするのではない。むしろ、これらは新生腫瘍に作用してその成長を下方制御し、実際、その退縮を誘導する。癌処置という点では、そのような結果は、今までは化学療法又は放射線療法によってのみ達成可能であった。全身投与された幹細胞集団が、新生細胞増殖へと向かうことができ、新生細胞の増殖を下方制御するだけでなく、腫瘍の退縮を誘導することもできるということは、予想外である。これにより、化学療法及び放射線療法により現在誘導される副作用よりも少ない副作用を伴う、原発性、続発性、又は転移性の腫瘍を治療的に処置する手段が提供されるため、これは極めて顕著な発展である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願明細書及び後に続く特許請求の範囲を通して、文脈が別段の要求をする場合を除き、用語「含む(comprise)」並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」等の変形は、述べられた整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の除外をも意味しないことが理解される。
【００１８】
本願明細書で用いられる用語「に由来する」は、特定の整数又は整数の群が、特定された種から生じたものであるが、必ずしもその特定した起源から直接得られてはいないことを示すものとする。さらに、本願明細書で用いる場合、単数形の「ある(a)」、「及び(and)」、及び「その(the)」は、文脈により明確な別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００１９】
別段の定義がない限り、本願明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
本発明の一態様は、哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数のMLPCを投与する工程を含み、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能(multilineage differentiative potential)を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、方法である。
【００２１】
別の態様において、哺乳類において固形腫瘍を特徴とする新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、前記腫瘍の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数のMLPCを投与する工程を含み、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００２２】
また別の態様において、哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数の幹細胞を投与する工程を含み、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
から選択される表現型を発現する、方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類の新生物疾患を処置するための医薬の製造に使用するためのMLPCであって、 前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、MLPCを提供する。
【００２４】
またさらなる態様において、哺乳類の新生物疾患を処置するための医薬の製造に使用するための幹細胞であって、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
について選択される表現型を発現する、幹細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は、それによりLG発現癌細胞が開発される方法を概略的に図示する。
【図２】図2は、pEGFP-C1プラスミドDNAマップを概略的に図示する。
【図３】図3は、pReceiver-Lv201のレンチウイルスベクターマップを概略的に図示する。
【図４】図4は、ホタルルシフェラーゼ及びeGFPレンチフェクト(lentifect)レンチウイルス粒子を用いたpEGFPトランスフェクションを概略的に図示する。
【図５】図5は、LG細胞を増殖させることにより得られた、蛍光、発光、及びMTTの相対強度をグラフで示す。
【図６】図6は、MLPC処置したA549/肺癌細胞又はSKOV3/卵巣癌細胞の増殖の下方制御をグラフで示す。
【図７】図7は、MLPC及びドキソルビシンで同時に処置したA549/肺癌細胞の増殖の下方制御をグラフで示す。
【図８】図8は、 MLPC及びドキソルビシンを用いた2段階処置による、A549/肺癌細胞の増殖の下方制御をグラフで示す。
【図９】図9は、マウスをPBS、CD14+由来MLPC、又はCD14-由来MLPCのいずれかで処置した場合の、6日目の腫瘍成長を写真で示す。
【図１０】図10は、PBS、CD14+由来MLPC、又はCD14-由来MLPC細胞のいずれかで処置した場合の、腫瘍成長の長期的なデータをグラフで示す。
【図１１】図11は、PBSか、ドキソルビシン及びMLPCのいずれかで処置したマウスの、7日目、14日目、及び21日目の腫瘍成長グラフで示す。
【図１２】図12は、インビボの治療スケジュールを概略的に図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、一部分では、本願明細書において開示されるMLPC細胞が新生細胞成長を下方制御するように作用するという予想外の解明を前提としている。この知見により、これらの細胞の使用が、重篤な副作用を示す、化学療法等の現在利用可能な治療レジメンの、有益で、おそらくは好ましい、代替となる。また、これにより、既存の治療プロトコルが成功しなかった場合の代替的治療の選択肢が提供される。
【００２７】
したがって、本発明の一態様は、哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数のMLPCを投与する工程を含み、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、方法を対象としている。
【００２８】
「新生物疾患(neoplastic condition)」への言及は、新生細胞の被包性若しくは非被包性の成長、若しくは凝集体の存在又は発達を特徴とする状態への言及として理解されるべきである。「新生細胞(neoplastic cell)」への言及は、異常な成長を示す細胞を指すものとして理解されるべきである。用語「成長(growth)」は、最も広い意味で理解されるべきであり、新生細胞サイズの増大及び増殖への言及を含む。
【００２９】
この文脈において、語句「異常な成長」は、正常な細胞成長と比べて、個々の細胞サイズ及び核/細胞質の比の増加、細胞分裂速度の増加、細胞分裂数の増加、細胞分裂の期間の長さの減少、細胞成長の期間の頻度の増加、又は無制限増殖及びアポトーシスの回避の1つ以上を示す、細胞成長への言及として意図される。本発明を制限するものでは決してないが、用語「新生物(新生組織形成)(neoplasia)」の一般的な医学的意味は、正常な成長制御への応答の喪失として生じる、「新しい細胞の成長」を指し、例えば、新生細胞成長を指す。新生物は、良性、前悪性、又は悪性であってもよい「腫瘍(tumour)」を含む。 用語「新生物(neoplasm)」は、病変、腫瘍、又は他の被包性若しくは非被包性の塊、又は新生細胞を含む他の形態の成長若しくは細胞凝集への言及として理解されるべきである。
【００３０】
本発明の文脈において、用語「新生物(neoplasm)」は、組織病理学的な型または侵襲の状態に関わらず、全ての型の癌性成長若しくは腫瘍形成プロセス、転移性組織、又は悪性形質転換した細胞、組織、若しくは器官への言及を含むと理解されるべきである。
【００３１】
用語「上皮性悪性腫瘍(carcinoma)」は、当業者に認識されており、呼吸器系上皮性悪性腫瘍、消化器系上皮性悪性腫瘍、泌尿生殖器系上皮性悪性腫瘍、精巣上皮性悪性腫瘍、乳房上皮性悪性腫瘍、前立腺上皮性悪性腫瘍、内分泌系上皮性悪性腫瘍、及び黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。また、この用語は、例えば、癌性及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む、癌肉腫(carcinosarcoma)を含む。「腺がん(adenocarcinoma)」は、腺組織に由来するか、又はその新生細胞が認識可能な腺構造を形成する、上皮性悪性腫瘍を指す。
【００３２】
新生物を含む新生細胞は、任意の細胞の種類であってもよく、上皮細胞又は非上皮細胞等の任意の組織に由来するものであってもよい。用語「悪性新生物」、及び「癌」及び「上皮性悪性腫瘍」への言及は、本願明細書において互換可能なものとして理解される。
【００３３】
用語「新生物(neoplasm)」は、病変、腫瘍、又は他の被包性若しくは非被包性の塊、又は新生細胞を含む他の形態の成長若しくは細胞凝集への言及として理解されるべきである。新生物を含む新生細胞は、任意の細胞の種類であってもよく、上皮細胞又は非上皮細胞等の任意の組織に由来するものであってもよい。本発明に包含される新生物及び新生細胞の例には、中枢神経系の腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、頭頸部癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、乳癌及び前立腺癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌の両方）、腎臓癌（例えば腎細胞腺癌）、食道胃癌、肝細胞上皮性悪性腫瘍、膵臓胆道新生物（例えば、腺癌及び膵島細胞腫瘍）、結腸直腸癌、子宮頸癌及び肛門癌、子宮癌及び他の生殖器系の癌、尿管癌（例えば、尿管及び膀胱の）、胚細胞腫瘍（例えば、精巣胚細胞腫瘍又は卵巣胚細胞腫瘍）、卵巣癌（例えば上皮性卵巣癌）、原発不明の上皮性悪性腫瘍、ヒト免疫不全関連の悪性腫瘍（例えば、カポジ肉腫）、リンパ腫、白血病、悪性黒色腫、肉腫、内分泌腫瘍（例えば、甲状腺の）、中皮腫及び他の胸膜又は腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍、並びにカルチノイド腫瘍が含まれるが、これに限定されない。
【００３４】
一つの実施態様において、前記新生物疾患は、固形腫瘍である。
【００３５】
本実施態様に従って、哺乳類において固形腫瘍を特徴とする新生物疾患を処置する方法であって、前記哺乳類に、前記腫瘍の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数のMLPCを投与する工程を含み、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、方法が提供される。
【００３６】
本発明の方法は、(固形腫瘍であるか否かに関わらず)任意の新生物の処置に適用することができるが、転移した新生物の処置に関して特に有用であることが認識される。本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、非転移の原発細胞は、本発明の方法、又は腫瘍の外科的切除若しくは放射線療法等の従来の治療レジメンのいずれによっても、治癒可能である。しかし、転移してしまった腫瘍は、多くの場合転移性結節が広範囲に拡散し成長するため、これらの従来の治療レジメンによっては治癒できない。したがって、そのような状態は、全身性の化学療法を施すことによってのみ治療可能であるが、この治療レジメンは、多くの場合重篤な副作用を引き起こす。また、化学療法は、多くの場合、例えば化学療法抵抗性の新生細胞の出現により、限定的な治癒可能性を有している。またさらに、 転移していないように見える原発腫瘍との関連であっても、 転移性拡散が起こっているがまだ検出可能でないという場合に備えて、手術及び放射線療法に続いて、多くの場合、化学療法がさらに推奨される。これは、乳癌及び結腸癌等の、伝統的に侵襲性が強いとみなされている癌との関連において、特に一般的な慣行である。そこで、本発明の方法は、侵襲性の強い全身性化学療法治療レジメンの適用の代替を提供する。本発明の MLPCは、局所的に又は全身に投与して、転移性の癌等の新生物を処置することができる。
【００３７】
したがって、一つの実施態様において、前記新生物疾患は、悪性の新生物疾患である。
【００３８】
別の実施態様において、前記悪性の疾患は、転移性の悪性疾患である。
【００３９】
「転移性(metastatic)」への言及は、転移(metastatisation)を経たか、又は転移を経た可能性がある状態を指すものとして理解されるべきである。
【００４０】
上記に詳述したとおり、本発明の方法は、本願明細書に記述する方法に従って作製するMLPCが、間葉系及び造血系ポテンシャルを呈し、それによりこれらの細胞の信頼できる供給源を提供するという文脈において有用であるだけではなく、また新生細胞成長の下方制御を誘導するように機能もするという、予想外の解明を前提としており、この機能は幹細胞の非典型的な機能属性である。
【００４１】
本発明をいかなる理論にも作用様式にも限定するものではないが、本発明は、成体幹細胞の増殖が、特定の体細胞系統に沿った幹細胞の再生及び分化をもたらすための非対称幹細胞分裂の発生に必ずしも基づいていないということを以前に見出した。特に、多能性幹細胞は、多分化能(multilineage potential)の状態への移行を誘導されたCD4+単球、Tリンパ球、又はBリンパ球から供給することができる。インビトロで幹細胞の再生及び分化を効率的に誘導する方法が実現されていなかったことは、当該技術分野において特に難事であったので、この発見は非常に重要である。したがって、本方法の開発により、成熟した哺乳類細胞の、多分化能を呈する幹細胞の表現型への脱分化の誘導に基づいて、哺乳類の幹細胞を定常的にインビトロで作製するための手段が提供される。したがって、これらの発見の潜在的なインビボ及びインビトロの適用は、幹細胞集団のインビトロ作製、対照の幹細胞のインビトロ又はインビボでの指向性分化、並びに、造血障害、循環障害、脳卒中、心筋梗塞、高血圧、2型糖尿病、不妊症、軟骨若しくは他の組織の損傷若しくは形態異常、ヘルニア修復、支持メッシュ及び生物学的足場を用いた骨盤底脱手術、他の筋骨格系障害のための細胞治療、及び加齢、手術、若しくは外傷に関連した欠損支持組織の交換等の、異常な造血又は間葉機能を特徴とする処置状態に基づいた治療的又は予防的な処置レジメンの観点から、極めて広範囲にわたった。このような状況において、これらの細胞は、幹細胞として患者に投与することができ、又は、適切に分化した体細胞が患者に投与される前に、インビトロの指向性分化を受けることができる。しかし、新生物を治療するためのMLPCの使用は予想されておらず、この種類の幹細胞の機能又は適用の典型ではない。
【００４２】
これらのMLPCが作製される方法との関連では、「単核細胞」への言及は、単一の各を有する細胞を指すものとして理解されるべきである。白血球との関連では、これは主に単球及びリンパ球を記述する。本発明は、本発明の方法に従って培養された場合、CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する単核細胞の多分化能の状態への移行が誘導され得るという解明を対象とするものである。CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する細胞への言及は、CD4及びCD8抗原のいずれか若しくは両方を発現する、又はCD14、CD25、若しくはCD19を発現する単核細胞を指すものとして理解されるべきである。これらの細胞表面分子の発現は、T細胞分化における、胸腺細胞でのCD4及びCD8の二重陽性発現等、一時的であってもよいし、継続的であってもよい。しかし、CD4/CD8発現が一時的であるか継続的であるかに関わらず、本発明の方法は、初期培養の時点でCD4及び/又はCD8を発現する細胞の使用を対象とすることが理解されるべきである。対応する意味が、CD14、CD25又はCD19を発現する細胞に適用されることが理解されるべきである。すなわち、初期培養の時点で単核細胞が細胞表面マーカーのCD25及びCD19の1つを発現していることを条件として、これらのCD25又はCD19を一時的に又は継続的に発現する単核細胞を指すものである。本願明細書に詳述するとおり、CD14、CD4、CD8、CD25、及びCD19分子は、主に単球、リンパ球、及びNK細胞において広く発現される。「リンパ球」への言及は、その分化の発達段階又は関連するCD分子の発現レベルに関わらず、リンパ球又はNK細胞を指すものとして理解されるべきである。また、本発明の方法において用いられるMLPCは、PCT/AU2013/001426及びオーストラリア仮特許出願第2014902175号にも記述され、これらは参照により本願明細書に組み込まれる。
【００４３】
CD14+単核細胞への言及は、細胞表面分子CD14を発現する単核細胞を指すものとして理解されるべきである。本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、CD14は、細菌性リポ多糖の検出のための共受容体として(Toll様受容体TLR 4及びMD-2と一緒になって)作用する。CD14は、リポ多糖結合タンパク質の存在下においてのみ、リポ多糖に結合することができる。リポ多糖がその主要なリガンドであると考えられているが、CD14もまた他の病原体関連分子パターンを認識する。CD14は、主にマクロファージ及び単球により発現され、より低い程度で好中性顆粒球により発現される。また、樹状細胞によっても発現される。
【００４４】
CD4+及び/若しくはCD8+又はCD25+「リンパ球」への言及は、ナイーブT細胞、メモリーT細胞、及び活性化T細胞並びにNK細胞を含む二重陽性及び単一陽性の胸腺細胞及びT細胞を含むが、これに限定されない、任意の発達の分化段階のリンパ球を指すものとして理解されるべきである。さらに、本発明を決して限定するものではないが、大部分のT細胞がαβT細胞受容体を発現する一方で、γδT細胞受容体細胞の亜集団も、CD4又はCD8を発現することが解明された。したがって、γδかαβに関わらず、CD4又はCD8の一方又は両方を発現すれば、任意のリンパ球が本発明の方法の範囲に含まれることが理解されるべきである。同様に、CD19+リンパ球への言及は、任意の分化段階のB細胞を指すものとして理解されるべきである。
【００４５】
この目的を達成するために、「CD14」、「CD4」、「CD8」、「CD25」、及び「CD19」への言及は、全ての形態のCD14、CD4、CD8、CD25、及びCD19を指すものとして、及びこれらの分子のmRNAの選択的スプライシングから生じ得る異性体を含む、これらの分子の機能変異体又は多形体を指すものとして理解されるべきである。また、「CD14」、「CD4」、「CD8」、「CD25」、及び「CD19」への言及は、細胞表面において発現され得る全ての前駆体、プロタンパク質、又は中間体の形態を含む、これらの分子の全ての形態への言及を含むものとしても理解されるべきである。また、二量体、多量体、又は融合タンパク質として存在するかに関わらず、任意のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19細胞表面分子にまで及ぶことも理解されるべきである。
【００４６】
関連する態様において、本発明の方法において用いることができる細胞は、本願明細書に開示される方法により作製してもよく、又は、単離又は製造される細胞が本願明細書に記述される方法により作製される細胞と同じ表現型を呈するならば、任意の他の適切な方法により作製若しくは単離してもよい。具体的には、例示される方法により作製したMLPCは以下の表現型の特徴を示す：
(i)  CD14+由来MLPCは、CD14+、CD34+、CD105+、CD44+、CD45+及びCD24+を発現する、又はCD14+、CD34+、CD105+、CD44+、CD45+、CD38+、CD31+及びCD59+を発現する；
(ii)  CD4+由来多分化能細胞は、CD44+及びCD45+を発現する；
(iii)  CD8+由来多分化能細胞は、CD45+及びCD47+を発現する；
(iv)  CD25+由来多分化能細胞は、CD23+を発現する；
(v)  CD19+由来多分化能細胞は、CD44+及びCD45+を発現する。
【００４７】
したがって、これらの表現型の一つを呈する任意の幹細胞を用いてもよい。表現型を評価して細胞表面の発現を決定することは、十分当業者の技能の範囲内である。例示的な方法が本願明細書に開示される。
【００４８】
したがって、この態様に従って、、哺乳類の新生物疾患を処置する方法であって、 前記哺乳類に、新生細胞の成長を下方制御するために十分な時間及び条件下で有効な数の幹細胞を投与する工程を含み、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
から選択される表現型を発現する、方法が提供される。
【００４９】
「幹細胞」への言及は、特定の遺伝子構成を与えられ、多系統の方向に発達する潜在状態(potentiality)を呈し、それにより新たな生物を形成するか又は生物の組織若しくは細胞集団を再生成する、任意の細胞を指すものとして理解されるべきである。本発明の方法に従って利用される幹細胞は、2以上の系統に沿って分化することができる、任意の適切な型であってよく、胚性幹細胞、成体幹細胞、臍帯幹細胞、全能性細胞、前駆細胞(progenitor cell)、前駆細胞(単能)(precursor cell)、多能性細胞、複能性細胞(multipotent cell)、又は脱分化細胞(上述したMLPC等)を含むが、これに限定されない。「全能性(totipotent)」は、対象の幹細胞が自己再生できることを意味する。「多能性(pluripotent)」は、対象の幹細胞が分化して、とりわけ、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の3つの胚葉の任意の1つを形成することができることを意味する。
【００５０】
対象の細胞は、治療の対象である個体から新たに単離されたものでもよいし、(例えば、細胞数が増殖された及び/又は細胞が分化シグナルを受容可能な状態になるように培養された)培養、又はどこかの以前の時点で個体から単離された細胞の凍結ストック由来の、又は別の供給源由来等の、新鮮でない供給源から供給されたものでもよい。また、対象の細胞は、分化を経る前に、精製、細胞周期の状態の改変、又は胚性幹細胞株等の細胞株の形成等であるがこれに限定されない、何らかの他の形態の処理又は操作を受けていてもよいことも理解されるべきである。したがって、対象の細胞は初代細胞であっても二次細胞であってもよい。初代細胞は、個体から単離されたものである。二次細胞は、その単離に続いて、本発明の方法の適用の前に、胚性幹細胞株の調製等の何らかの形態のインビトロ操作を受けたものである。
【００５１】
上記に詳述したとおり、成熟体細胞、特にリンパ球等の単核細胞を誘導して多系統分化能(multilineage differentiation potential)の状態へと移行させることができる。したがって、「多系統分化能」又は「多分化能」を呈する細胞への言及は、1つ以上の体細胞の分化経路に沿って発達する潜在状態を呈する細胞を指すものとして理解されるべきである。例えば、細胞は様々な体細胞型を生成する能力があるものでもよく、そのような細胞は通常多能性又は複能性と称される。これらの細胞は、万能細胞よりもより限定された範囲の系統への拘束性(コミットメント)を呈するが、後者は、全ての体細胞系統及び配偶子を含む、生得的に可能な任意の分化方向に発達することができる細胞である。本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、幹細胞が出生後の組織に由来する限りにおいて、幹細胞はしばしば「成体幹細胞」とも称される。古典的に「前駆」細胞又は「前駆(単能)」細胞と名付けられる多くの細胞は、適切な刺激条件下で、1つ以上の体細胞系統の細胞を生じさせることができるということに基づいて、「多系統分化能」の定義の範囲にも含まれ得る。「幹細胞」への言及が、本願明細書において、本発明の方法により作製された細胞に関してなされる限りにおいて、これは、本願明細書に記述する多系統分化能を呈する細胞を指すものとして理解されるべきである。
【００５２】
CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞を誘導して、造血系統又は間葉系統等の多系統に沿って分化する潜在状態を呈する多系統分化能の表現型へ移行させることができる。例えば、適切な刺激下で、対象の複能性細胞を、単核の造血細胞(リンパ球又は単球等)、多形核の造血細胞(好中球、好塩基球、又は好酸球等)、赤血球細胞、若しくは血小板を含む造血系統へと、又は骨、軟骨、平滑筋、腱、靭帯、間質、骨髄、真皮、及び脂肪等の結合組織等の間葉系統に沿って分化させることができる。また、適切な刺激の存在下で、これらの細胞を誘導して神経系統等の他の系統に沿って分化させることもできる。また、本発明の方法に従って作製される多分化能細胞の全てが、多数の異なる出発集団に由来することができるが、これらは全て多系統に沿って分化する潜在状態を呈することも理解されるべきである。
【００５３】
本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、本発明のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19の出発細胞から作製される多系統細胞は、特有の表現型プロファイルを呈する。これらの細胞の全てが複能性を呈するが、これらの細胞は、もしあれば、特異的な細胞外刺激の非存在下において特定の系統に沿って分化する性質に関して、機能的差異を呈してもよい。しかし、特異的な刺激が与えられる場合、分化を任意の所望の系統へ向けることができる。
【００５４】
本発明の治療的方法に用いられるMLPCは、好ましくは未分化の形態で用いられ、投与前に指向性分化を経ない。しかし、これは、自己再生するように培養中に維持されるか、又は培養している間に何らかの自発的分化若しくは指向性分化を経ている可能性があるがそれでもなお多分化能を保持している、すなわち細胞がまだ2つ以上の系統に分化する能力を有していること意味する、MLPCの使用への制限として理解されるべきではない。また、本発明の任意の態様に従って投与されるMLPC幹細胞の集団は、1つ以上の細胞の亜集団を含んでいてもよいことが理解されるべきである。すなわち、MLPCは、CD14、CD4、CD8、CD25、若しくはCD19を発現する2つ以上の異なる単核細胞を含む出発集団から作製されたものであってもよく、又は分離された幹細胞の表現型：
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
の2つ以上を含んでいてもよい。
【００５５】
本態様の一つの実施態様において、前記新生物疾患は固形腫瘍である。
【００５６】
別の実施態様において、前記新生物疾患は悪性新生物である。
【００５７】
さらに別の実施態様において、前記悪性新生物は転移性である。
【００５８】
単球等の単核細胞のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19のへの「移行」を誘導して多分化能の表現型にすることへの言及は、体細胞の表現型を本願明細書に規定する型である多分化能の表現型へと変化させるために必要な、遺伝的、形態的、及び/又は機能的変化を誘導することを指すものとして理解されるべきである。
【００５９】
CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞のインビトロ脱分化を誘導して多分化能細胞にすることに関して言えば、小スケールのインビトロ組織培養又は大スケールのバイオリアクター製造のどちらとの関連においても、 達成することができる。
【００６０】
上記に詳述したとおり、CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞の多分化能細胞への移行は、前記細胞に対して特有の細胞培養法を行うことにより、インビトロで達成することができる。具体的には、単核細胞の出発サンプルを、アルブミン及び細胞培養培地と共に特定の比率で培養する。これは、本方法の特別な利点である。なぜならば、大部分の細胞培養系と異なり、この培養の確立は、細胞数の決定及び細胞濃度の適切な調整を必要とする、特定の濃度の細胞の培養に基づくものではなく、体積中の実際の細胞数に関係なく体積比率を中心とする培養の設計に基づいているからである。これにより、本方法は、扱うことが可能であるか又は扱うのに好都合である、どのような出発量のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞に基づいても、非常に単純で定常的に実行できる。
【００６１】
したがって、インビトロ細胞培養系は、CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞懸濁液の出発体積を中心として確立される。「懸濁液」への言及は、非接着細胞のサンプルを指すものとして理解されるべきである。これらの細胞は、細胞を成長可能な状態に維持する、等張液(例えば、PBS、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、又は他の種類の平衡塩溶液)、細胞培養培地、体液(例えば血清)等の任意の適切な培地中に含有されていてもよい。対象の細胞は、ポジティブ又はネガティブな磁気ビーズ分離等の他の方法による濃縮又は処理を経たものであってもよく、これにより、利用する方法の性質に応じた様々な異なる等張液の任意のものに含まれるCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞の最終的な懸濁液が得られる。得られた細胞の実際の濃度に関わらず、任意の適切な細胞の量を用いて培養を確立することができる。この量は、使用しようとする培養系に基づいて選択される。例えば、フラスコに基づく系、バッグに基づく系、又はローラーボトルに基づく系で培養する場合、最大約1リットルという比較的少ない量で、細胞培養の総量が形成されることが多い。しかし、バイオリアクターとの関連においては、有意に多い量の細胞培養を収容することができ、これにより、より多い出発量を用いることができる。利用する特定の細胞培養系との関連において使用する最終細胞培養量を決定することは、十分当業者の技能の範囲内である。
【００６２】
最初に細胞培養を確立することとの関連において、培養工程を行う最終的な体積は、約15% v/vのCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞懸濁液を、約15% v/vの5%〜85%アルブミン溶液及び約70% v/vの細胞培養培地と共に含む。本願明細書に詳述するとおり、これらのパーセント値への言及は、これらの特定のパーセントからの何らかの逸脱が、許容範囲にあり、機能的の同等の比率を与える限りにおいて、概算である。例示される培養系の非常に単純で定常的な性質に基づいて、上記のパーセント値からのどの程度までの逸脱が可能とされるかを決定することは、十分当業者の技能の範囲内である。例えば、約10%〜20% v/vの単核細胞懸濁液及び5%〜85%アルブミン溶液、特に11%〜19%、12%〜18%、13%〜17%、又は14%〜16%が有効であり得ることが予想される。対象のアルブミン溶液に関して、約4%〜90%、又は5%〜86%、又は好ましくは5%〜7%の溶液が等しく有効であり得る。
【００６３】
本発明を決して限定することなく、非常に広い範囲にわたるアルブミン濃度が有効である。したがって、5%〜85%、5%〜80%、5%〜75%、5%〜70%、5%〜65%、5%〜60%、5%〜50%、5%〜45%、5%〜40%、5%〜35%、5%〜30%、5%〜25%、5%〜20%、5%〜15%、5%〜10%の濃度範囲を用いてもよい。一つの実施態様において、前記濃度は5%〜20%である。
【００６４】
別の実施態様において、前記アルブミン濃度は。5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%である。
【００６５】
本方法は、本願明細書に現れる、例えば、15% v/vの細胞、5%〜20% v/vのアルブミン、又は70%の細胞培養培地を厳守することへの言及により限定されるべきではなく、この範囲内に、機能性を保持し、当業者により定常的かつ容易に評価することができる、これらのパーセントの変動を含む。
【００６６】
出発細胞懸濁液中のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞の濃度は、任意の細胞数にすることができる。その細胞数が比較的少なかろうと比較的多かろうと、本発明の重要な側面は、出発細胞懸濁液が、その懸濁液中の細胞の濃度に関わらず、出発細胞培養の総量の15% v/vであることである。それでもなお、好ましい実施態様において、出発細胞に下限も上限も無いが、細胞数は、培養中にこれらの単核細胞が接着するための培養容器の表面積が不十分になるほど多くするべきではないことが示唆される。本方法は、それでもなお、出発細胞濃度が高すぎてこれらの細胞が接着する表面積が不十分である可能性がある範囲内において、多系統分化能を呈する細胞の製造に成功するが、接着することができない細胞が幹細胞へと脱分化せず、そのため本方法は有効ではあるものの最適に効率的ではないことが観察され得るのみである。したがって、この点において、効率を最大化するという観点から、出発細胞培養の一部を形成する細胞濃度を、存在する全ての細胞が使用を選択した特定の組織培養容器に接着することができる環境で培養することを確保することが望まれ得る。例えば、培養バッグ容器を用いる場合、106細胞/ml以下の細胞濃度が適切である。
【００６７】
用いられるアルブミン溶液に関しては、6%アルブミン溶液が一般的に市販されているが、そうでない場合は、生理食塩水等の任意の適切な等張液中に調製することができる。「アルブミン」への言及は、蒸留水及び半飽和の硫酸アンモニウムの溶液には可溶性であるが、完全に飽和した硫酸アンモニウム溶液には不溶である、球状タンパク質の群を指すものとして意図されることが理解されるべきである。例えば、血清の主要なタンパク質である、血清アルブミンは、細胞培養との関連において用いることができる。しかし、ラクトアルブミン又はオボアルブミン等の任意のアルブミン分子を利用してもよいことが理解されるべきである。また、任意の合成的組換えの又は誘導体の形態のアルブミンを本発明の方法に用いることもできることも理解されるべきである。6%アルブミン溶液を、例えば、出発培養量の15% v/vの比率で使用することにより、0.9%の有効な濃度のアルブミンが得られることが当業者に認識される。
【００６８】
出発培養量の残りは、細胞培養培地から成り、これは出発細胞培養量の70% v/vを形成する。「細胞培養培地」への言及は、哺乳類細胞の成長を支えるように設計される液体又はゲル、特に幹細胞培養を支える培地を指すものとして理解されるべきである。この目的を達成するために、細胞の成長に必要な最小限の栄養素を供給する最少培地、又は哺乳類細胞の生存率及び成長の維持を促進する追加の栄養素を含有し得る強化培地を含む任意の適切な細胞培養培地を用いてもよい。使用するのに適切な培地の例には、DMEM及びRPMIが含まれる。また、細胞の生存率及び成長の維持を促進するアミノ酸又は糖等の追加の選択された物質を含有する、補充最少培地を用いることもできる。また、培地は、任意の他の適切な物質、例えば抗生物質をさらに添加されてもよい。別の例では、細胞の生存率及び成長をさらに支えるために、細胞培養培地はインスリンを添加される。さらに別の例では、特定の患者のために自己由来のMLPCを調製するが、培養培地はその患者から採取した血清を添加されてもよい。70% v/vの細胞培養培地への言及は、独立した要件であって、生理食塩水等の等張溶液であるか又は最少培養培地であるかに関わらず、出発時のCD14、CD4、CD8、CD25、若しくはCD19単核細胞又はアルブミンが懸濁されている溶液の性質によって影響されないことが理解されるべきである。実際、培養系への導入前、単核細胞が最初に懸濁されている溶液又はアルブミンが溶解されている溶液の性質に関わらず、出発細胞培養集団の総量のパーセントとしての70% v/vの細胞培養培地が不変のままであるということは、特に有利である。
【００６９】
一つの実施態様において、前記細胞培養は、10 mg/Lのインスリンを追加的に含む。.
【００７０】
上記に詳述したとおり、MLPCを作製する方法は、特定の比率のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞の集団を細胞培養培地及び5%〜85%のアルブミン溶液と共に培養して、単核細胞の間葉系/造血幹細胞の表現型への脱分化を誘導することに基づく。前記CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞は、対象の幹細胞の表現型が得られるような時まで、インビトロで培養される。一つの実施態様において、3〜8日間の培養期間、特に4〜7日間が、対象の幹細胞を作製するために適切であると判断された。インビトロ培養された細胞をサンプリングして、必要な程度の脱分化が起こったか否かを判定することは、十分当業者の技能の範囲内であることが認識される。また、温度及びCO2パーセントに関して、細胞を培養するための最も適切な条件を決定することも、十分当業者の技能の範囲内であることが認識される。本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、ヒトCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞を培養する場合は、4日間〜5日間のインキュベーションが特に適していることが解明された。培養は、数日間の培養期間にわたり、良好な細胞の生存率及び成長を維持するために適切であると考えられる条件下において行うことができる。この目的を達成するために、適切な細胞培養条件を確立することは、当業者が定常的に行う手順であることが認識される。
【００７１】
この細胞培養方法は、CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞に対して、インビトロで行われる。この目的を達成するために、対象の細胞は、(治療の対象であってもよい個体等の)個体から新たに単離されたものでもよいし、(例えば、細胞数が増殖された及び/又は細胞が分化シグナルを受容可能な状態になるように培養された)培養、又はどこかの以前の時点で個体から単離されたか若しくは別の供給源由来の(例えば確立されたT細胞株等の)細胞の凍結ストック等の、新鮮でない供給源から供給されたものでもよいことが理解されるべきである。また、対象の細胞は、分化を経る前に、濃縮若しくは精製、細胞周期の状態の改変、又は細胞株の形成等であるがこれに限定されない、何らかの形態のインビトロの操作を受けていてもよいことも理解されるべきである。したがって、対象の細胞は初代細胞であっても二次細胞であってもよい。初代細胞は、個体から単離されたものである。二次細胞は、その単離に続いて、本発明の方法の適用の前に、細胞株の調製等の何らかの形態のインビトロ操作を受けたものである。また、出発時のCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19単核細胞集団は、比較的純粋であってもよく、又は末梢血細胞の集団等の不均一な細胞集団の一部であってもよいことも理解されるべきである。これについて後にさらに述べる。
【００７２】
上記に詳述したとおり、幹細胞をCD14、CD4、CD18、CD25、又はCD19単核細胞から作製することができる。この目的を達成するために、全ての出発集団のCD14、CD4、CD8、CD25、及びCD19細胞の移行を方向付けることとの関連において、又はこれらの出発集団の体細胞の亜集団の移行を方向づけることとの関連においてのいずれにおいても、これが達成されてもよいことが理解されるべきである。これは、例えば、出発細胞集団の純度及び/又は不均一度に依存することが多い。またさらに、培養系は、不均一な細胞の集団の製造をもたらしてもよい。これは、例えば、全ての出発集団の細胞がMLPC表現型へ移行しない場合に起こり得る。そういった状況であれば、全ての出発集団の細胞が必ずしもMLPCの表現型へと分化していない可能性があるので、方法は、所望の表現型を呈する細胞を同定及び単離するためのスクリーニング及び選抜工程を適用する必要がある。同定方法は、当業者に周知であり、以下を含むが、これに限定されない。
【００７３】
(i)  細胞系統特異的構造の検出
細胞系統特異的構造の検出は、同定する構造の種類に応じて、例えば、光学顕微鏡法、蛍光親和性標識法、蛍光顕微鏡法、又は電子顕微鏡法によって行うことができる。光学顕微鏡法は、リンパ球と多形核球と赤血球細胞核とで比較する特徴等の形態的特徴、又は多核の骨格筋細胞を検出するために用いることができる。別の例では、直径約10〜30μmの単核細胞で、円形または桿状の形態的特徴の未熟な心筋細胞を同定することができる。電子顕微鏡法は、サルコメア、X帯(X-band)、Z体(Z-body)、介在版(intercalated disc)、ギャップ結合(gap junction)、又は接着斑(desmosome)等の構造を検出するために用いることができる。蛍光親和性標識法及び蛍光顕微鏡法は、分子、一般的には抗体を蛍光標識することにより、細胞系統特異的構造を検出するために用いることができるが、この分子は目的の構造に特異的に結合し、直接的に又は間接的に蛍光色素分子にコンジュゲートされる。このような構造の自動定量化を、適切な検出及び計算系を用いて行うことができる。
【００７４】
(ii)  細胞系統特異的タンパク質の検出
細胞表面タンパク質又は細胞内タンパク質等の細胞系統特異的タンパク質の検出は、蛍光親和性標識法及び蛍光顕微鏡法によって、好都合に達成されてもよい。特異的タンパク質は、前細胞及び組織の両方において検出することができる。簡潔に言うと、蛍光標識した抗体を固定した細胞上でインキュベートして特異的心臓マーカーを検出する。あるいは、ウエスタン免疫ブロッティング又はハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「タンパク質チップ」)等の手法を採用してもよい。この方法によって検出することができるタンパク質は、特定の細胞集団に特徴的な任意のタンパク質であってよい。例えば、前駆(単能)細胞/前駆細胞型のクラスは、1つ以上の細胞表面分子の発現の有無によって識別することができる。この点において、この方法は、任意の1以上の分子の発現に基づくポジティブ又はネガティブセレクション工程によって細胞型を同定するために利用することができる。より成熟した細胞は、通常、文献で十分に定義されている様々な特異的な細胞表面タンパク質又は細胞内タンパク質の発現に基づいてキャラクタライズすることができる。例えば、全ての造血細胞型の分化ステージが、細胞表面分子発現パターンに関して十分に定義されている。同様に、筋肉細胞及び他の間葉系由来の細胞型も、様々な発達の分化ステージにわたって、タンパク質発現プロファイルとの関連において十分に文書化されている。この目的を達成するために、本発明のMLPCは、典型的には本願明細書に例示する様々な細胞表面マーカーを発現し、これらは単球系幹細胞一般、間葉系幹細胞、造血幹細胞、多分化能細胞、及び神経幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーである。
【００７５】
(iii)  細胞系統特異的RNA又はDNAの検出
本方法は、好ましくはRT-PCR又はリアルタイム(qRT-PCR)を用いて達成される。あるいは、用いることができる他の方法には、ハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「RNAチップ」)又はノーザンブロッティング若しくはサザンブロッティングが含まれる。RT-PCRは、上記(ii)に詳述されるタンパク質、又は、分泌されるタンパク質若しくはそうでない場合は(ii)の点で詳述した手法によって好都合に検出可能ではないタンパク質等の、本質的に任意のタンパク質をコードする特異的なRNAを検出するために用いることができる。例えば、初期B細胞分化との関連において、免疫グロブリン遺伝子の再構成は、再構成された免疫グロブリン分子の細胞表面での発現の前にDNAレベルで検出可能である。
【００７６】
(iv)  細胞系統特異的機能活性の検出
機能に関する細胞集団の分析は、一般的には(i)〜(iii)の点のスクリーニング方法よりも不便な方法と考えられているが、いくつかの例においては当てはまらない可能性がある。例えば、心臓細胞を作製しようとする限りにおいては、光学顕微鏡法で、単に心臓特異的な機械的収縮をスクリーニングすればよい。
【００７７】
本願明細書に記述される培養方法の適用によって得られる細胞の集団をキャラクタライズすることとの関連において、上記に詳述した1つ以上の手法を利用することができることが理解されるべきである。
【００７８】
本願明細書に開示する方法による培養前にCD14、CD4、CD8、CD25、若しくはCD19リンパ球の成熟体細胞集団を濃縮することに関して、又はそこから由来するMLPC細胞集団を単離する若しくは濃縮することに関して、この場合も同様に、行うことができる様々な周知の手法がある。上記に詳述したとおり、抗体及びレクチン等の他の細胞表面結合分子が、特定の細胞系統及び/又は分化のステージに関連するマーカーを同定するために特に有用である。抗体は、分離を可能にするために固体支持体に付着されていてもよい。しかし、他の細胞分離手法には、物理的特徴の違いに基づくもの(密度勾配遠心分離法及びカウンターフロー遠心力エルトリエーション(counter-flow centrifugal elutriation))並びに染色染色の性質の違いに基づくもの(ミトコンドリア結合染料ローダミン123及びDNA結合染料Hoechst 33342)が含まれる。
【００７９】
分離のための手順は、抗体若しくはレクチンでコーティングした磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着させた抗体を用いる「パンニング」、又は任意の他の好都合な手法を含んでいてもよい。特に精密な分離を提供する他の手法には、蛍光活性化細胞ソーティングが含まれるが、またこの手法は、側方光散乱に対する前方光散乱によって認識できる形態的特徴に基づく細胞の分離にも適用可能である。これらの手法をポジティブ又はネガティブセレクションとの関連において適用することができるが、追加的なネガティブセレクション手法には、細胞溶解剤、アポトーシス剤、又はそれ以外の有毒物質の部位特異的投与が含まれるが、これに限定されない。これは、指向性送達を促進するために、そのような剤をモノクローナル抗体へカップリングすることによって最も好都合に達成され得る。別の例では、抗体によるオプソニン化、それに続く補体投与によっても、同じ結果が達成され得る。
【００８０】
これらの手法を、所望の精製又は濃縮レベルを得るために単一工程の又は複数工程のいずれのプロトコルとしても行うことができる。
【００８１】
本願明細書に記述される培養方法は、インビトロで行われる。インビトロ技術に関して、MLPCは小スケール又はより大スケールのいずれでも製造することができる。例えば組織培養フラスコ又はバッグで実現してもよい、小スケール製造に関して、所定の個体のための細胞の集団の製造のために、及び特定の状態との関連において、これは特に適切である可能性がある。大スケール製造に関して、本方法は、大スケールのニーズを満たす実行可能な手段を提供する。本方法に従って大スケール製造を達成する1つの手段は、バイオリアクターの使用によるものである。
【００８２】
バイオリアクターは、インビボの栄養濃度及び速度を模した、制御された濃度及び速度で培地及び酸素補給を送達できる培養プロセスを提供するように設計される。バイオリアクターは、長年にわたり市販されており、様々な種類の培養技術を採用している。哺乳類細胞培養に用いらる種々のバイオリアクター中、大部分は単一の細胞型の高密度培養の製造を可能にするように設計されており、そのようなものとして、本発明における用途が見出される。典型的なこれらの高密度系の適用は、最終製品としての、細胞により生産される馴化培地の製造である。例えば、モノクローナル抗体のハイブリドーマ製造及びウイルスベクター製造のためのパッケージング細胞株がそうである。しかし、これらの適用は、本発明のような、治療的最終製品が採取した細胞自体である適用とは異なっている。
【００８３】
ひとたび運転すると、バイオリアクターは調節された培地の流出入、酸素の送達、並びに温度及びpH制御を自動的に提供し、一般的には多数の細胞の製造を可能にする。したがってバイオリアクターは労力の節約及びプロセス中間でのコンタミネーションの可能性の最小化を提供し、最も高性能のバイオリアクターは、手動の労力の必要性及び開放系での処理工程が関与する、立ち上げ、成長、選抜、及び採取の手順を可能にする。このようなバイオリアクターは、最も有利には、本発明で検討される均一な細胞混合物又は凝集した細胞集団を用いる使用のために設計される。本発明において使用するための適切なバイオリアクターには、米国特許第5,763,194号、米国特許第5,985,653号及び第6,238,908号、米国特許第5,512,480号、米国特許第5,459,069号、第5,763,266号、第5,888,807号、及び第5,688,687号に記述されるものが含まれるが、これに限定されない。
【００８４】
大容量に伴って、複数の基本的なパラメーターは制御を必要とする。培養は、細胞の生存率の維持、増殖、及び分化(恐らくは複数の別個の分化培養及び条件との関連において)、並びに最終的な細胞培養の保存を可能にする培地を供給されなければならない。典型的には、様々な培地がバイオリアクター中のポンピング機構により細胞へと送達され、定期的に培地が供給され、交換される。交換プロセスにより副産物を培養から取り除くことが可能となる。細胞又は組織の成長には、酸素源が必要である。細胞型によって酸素の必要性が異なる可能性がある。したがって、酸素を細胞へと供給するための柔軟かつ調節可能な手段が、所望の構成要素である。
【００８５】
特定の培養によっては、培養チャンバー中の細胞集団及び培地供給の分布さえも、重要なプロセス制御となり得る。そのような制御は懸濁培養設計の使用により達成される場合が多く、この設計は細胞間相互作用が重要ではない場合に有効であり得る。懸濁培養系の例には、様々なタンクリアクター設計及び気体透過性のプラスチックバッグが含まれる。3次元構造の構築を必要としない、又は間質層若しくはフィーダー層を必要しない(大部分の血液細胞前駆細胞又は成熟血液細胞等の)細胞に関して、このような懸濁設計を用いてもよい。
【００８６】
培養プロセスの完了時の効率的な細胞の回収は、効率的な細胞培養系の重要な特性である。製品として細胞を製造するための1つのアプローチは、規定の空間内で、回復の物理的障壁なしに、細胞を培養し、細胞産物の単純な溶出により、本目的のために設計された市販の閉鎖系細胞洗浄装置での最終的な洗浄に適した、扱いやすく濃縮された量の細胞がもたらされるようにすることである。最も有利には、本系は、保存料を伴う若しくは伴わない医薬的に許容される担体の添加、又は細胞保存化合物の添加を可能にし、適切な無菌のパッケージへの効率的な採取を提供する。最も有利には、採取及びパッケージングプロセスは、培養チャンバーの流路の無菌バリアを破ることなく完了してもよい。
【００８７】
細胞培養手順に伴って、主要な懸念は無菌状態である。製造された細胞が患者に(しばしば患者が病気であるか免疫不全であるときに)移植される場合、微生物が存在しないことが義務付けられる。
【００８８】
本願明細書で規定するMLPCは、患者に投与された場合、新生物の成長を下方制御する。細胞又は新生物の「成長」は、対象の細胞の増殖、分化、及び/若しくは生存率の維持を指すものとして理解されるべきであり、細胞又は新生物の「成長を下方制御する」は、細胞老化のプロセスへの言及、又は対象の細胞の増殖、分化、及び/若しくは生存率の維持を防止若しくは阻害することへの言及である。好ましい実施態様において、対象の成長は増殖であり、対象の下方制御は殺細胞(killing)である。この点において、殺細胞は、腫瘍塊のサイズの減少により、又は腫瘍のさらなる成長の阻害により、若しくは細胞の成長の遅延により、証明される。この点において、本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、新生細胞は、直接的溶解若しくはアポトーシス誘導、又は何らかの他の機構等の任意の適切な機構により殺してもよい。したがって、本発明は、哺乳類の新生物疾患を減少させるか、そうでない場合は改善させることを包含することが理解されるべきである。これは、新生物疾患の1つ以上の症状の予防、減少、又は改善を指すものとして理解されるべきである。症状には、腫瘍成長の部位の疼痛、又は腫瘍成長に起因する代謝的若しくは生理的身体機能の障害を含むことができるが、これに限定されない。本発明の方法は、任意の1つ以上の症状の重症度を低減してもよいか、又は任意の1つ以上の症状を除去してもよいことが理解されるべきである。また、本発明の方法は、任意の1つ以上の症状の発症の予防にまで及ぶ。したがって、本発明の方法は、治療及び緩和(palliation)の両方に関して有用である。この目的を達成するために、「処置(treatment)」への言及は、治療的ケア及び緩和的ケアの両方を包含することが理解されるべきである。当業者に理解されるように、新生物疾患が治癒することが常に最も望ましい結果ではあるが、それでもやはり、たとえ完全に治癒しないとしても、新生物の進行を減速又は休止できることには、有意な利益がある。本発明を決して限定するものではないが、新生物疾患の中には、細胞分裂に関して十分に下方制御されれば、患者にとって致命的ではなくなり、その状態でも患者は妥当な生活の質を得ることができるというものがある。またさらに、本方法は、現存する処置レジメンの有用な代替方法を提供することが理解されるべきである。例えば、ある状況においては、本方法の治療的結果は化学療法又は放射線と同等であるかもしれないが、患者にとっての利益は、はるかに少ない副作用を誘導し、そのため患者にはるかに良く忍容される、処置レジメンである。また、用語「処置」は、対象が完全に回復するまで処置されることを必ずしも暗示しないことも理解されるべきである。したがって、上記に詳述したとおり、処置には、存在する状態の重症度の低減若しくは特定の状態の症状の改善、又は緩和が含まれる。
【００８９】
「哺乳類」への言及は、ヒト、霊長類、家畜動物(例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験動物(例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット)、愛玩動物(例えばイヌ、ネコ)、及び飼育下の野生動物(例えばキツネ、カンガルー、シカ)を包含することが理解されるべきである。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００９０】
個体に有効な数の本発明の細胞を「投与する」ことへの言及は、本発明の方法に従って作製されたか、又は必要な表現型を提示する、エクスビボの細胞の集団を哺乳類へ導入することを指すものとして理解されるべきである。
【００９１】
本発明によれば、対象のMLPCは、好ましくはエクスビボで作製され、最初に採取した個体に戻し投与される、自己由来の細胞である。しかし、本発明は、それでもなお、対象の細胞が、処置の対象である個体と同一の主要な組織適合性(histocompatability)プロファイルを呈する、任意の他の適切な供給源に由来する細胞の使用にまで及ぶことが理解される。したがって、そのような細胞は、外来性MHCプロファイルを呈する細胞の移植と通常関連する組織適合性の問題をもたらさないという点において、実際上は自己由来である。そのような細胞は、「自己由来(自家)(autologous)」の定義に含まれるものとして理解されるべきである。例えば、ある特定の状況下では、対象の細胞を遺伝的に同一の双生児から単離することが望ましいか、必要であるか、又は実際的意義がある可能性がある。また、細胞は、所望の腫瘍な組織適合性プロファイルを呈するように操作されていてもよい。そのような細胞の使用により、組織及び器官の移植との関連において本質的に直面する困難が克服される。しかし、自家細胞を単離又は作製することが可能でないか又は実行可能でない場合は、同種異系幹細胞を利用することが必要となる可能性がある。「同種異系(allogeneic)」細胞は、処置される対象と同一の種から単離されるが、異なるMHCプロファイルを呈するものである。治療との関連におけるそのような細胞の使用は免疫抑制処置の使用を余儀なくすることが多いが、それでもなお、この問題は、兄弟姉妹、親、又は子等の血縁者から単離/作製された細胞集団等の、処置される対象の細胞と類似性を示すMHCプロファイルを呈する細胞の使用により最小化することができる。また、本発明は、異種移植にまで及ぶことが理解されるべきである。すなわち、本発明の方法に従って作製され患者に導入される細胞は、処置される対象の種以外の哺乳類の種から単離される。
【００９２】
本発明をいかなる理論又は作用様式にも限定するものではないが、腫瘍サイズの部分的な減少でさえも、いくつかの症状を改善するように作用する。したがって、「有効な数」への言及は、所望の効果を少なくとも部分的に達成するか、又は処置される新生物疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、若しくは発症若しくは進行を完全に休止させるために必要な細胞数を意味する。そのような量は、当然、処置される特定の状態(例えば原発性癌か転移性癌か)、状態の重症度、並びに年齢、身体的状態、サイズ、体重、生理学的状態、併用処置、病歴を含む個々の患者のパラメーター、及び目的の障害に関連するパラメーターに依存する。当業者は、過度の実験を行うことなく、有効数を構成する本発明の細胞数及びその最適な投与方法を決定することができるが、この後者の論点については以下でさらに検討する。これらの因子は、当業者には周知であり、単なる定常的な実験だけで対処することができる。一般的に、最大の細胞数、すなわち、妥当な医学的判断による最高の安全な数が用いられることが好ましい。しかし、医学的理由により、心理学的理由により、又は任意の他の理由により、より少ない細胞数を投与してもよいことが当業者に理解される。
【００９３】
また、上述のとおり、本発明の方法は、移行された細胞を本願明細書に規定する状態を患う個体に導入することをその範囲に包含するが、個体に導入される集団の全ての細胞が、目的のMLPC表現型を必ずしも獲得しているとは限らないことも理解されるべきである。例えば、CD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19の集団がMLPCへの移行を経ており、全部を投与する場合、必要な表現型を呈する細胞への移行を経ていない一部の細胞が存在する可能性がある。したがって、本発明は、それにより導入される適切な割合の細胞が、上に定義する「有効な数」を構成するという条件で、達成される。しかし、特に好ましい実施態様において、MLPC表現型への移行を経た細胞の集団は、分化に成功した細胞の同定、その単離、及び対象の個体への導入を受ける。適用するために選択される方法の種類は、処置される状態の性質に依存する。しかし、一般的に、潜在的副作用を回避するために純粋な細胞の集団を投与することが望ましいことが予想される。したがって、「有効な数」への言及は、この場合、細胞が本発明の目的、すなわち対象の状態の処置を達成する活性のレベルを生じさせるために十分となるような、導入することが必要とされる細胞の総数を指すものとして理解されるべきである。
【００９４】
本発明の細胞は、任意の適切な方法により患者に投与されてもよい。例えば、細胞懸濁液は直接注入により導入してもよく、又は凝血塊の内部に導入してもよく、それにより細胞が塊に固定化されるので、移植が容易である。また、移植の前に細胞をカプセル化してもよい。カプセル化は、細胞の播種を防止するため、又は組織不適合拒絶の問題を最小化するために有用な手法である。しかし、カプセル化の有用性は、処置される新生物の性質に依存する。例えば、状態が転移性である場合は、細胞抑制の全身投与が好ましく、一方原発腫瘍との関連においては、局所化送達で十分である可能性がある。
【００９５】
本発明の一つの実施態様において、対象の細胞は、全身投与される。  
【００９６】
別の実施態様において、前記細胞は、局所的に、新生物の部位に投与される。
【００９７】
患者に投与される細胞は、任意の適切な経路による単一の又は複数の逐次的な投与として投与することができる。注射による投与は、必要な修復の種類によって、様々な組織又は器官の領域を対象とすることができる。
【００９８】
本発明のこれらの態様によれば、患者に投与される細胞は、細胞懸濁液又は細胞凝集体等の任意の適切な形態をとってもよいことが認識される。単一細胞懸濁液の作製に関して分化プロトコルは、細胞懸濁液の維持に有利にはたらくように設計されてもよい。あるいは、細胞凝集体を形成する場合、これらを分散させて細胞懸濁液にしてもよい。また、細胞懸濁液の利用に関して、MLPC等、患者に投与するための特定の細胞の亜集団を選び出すことも望ましい可能性がある。細胞凝集体又はカプセル化された細胞が患者へ移植されることが望ましい限りにおいて、これは通常、(針又はカテーテルを介する投与とは対照的に)外科的移植を必要とする。
【００９９】
本発明の方法によれば、他のタンパク質性又は非タンパク質性の分子を、対象の細胞の導入と共に、又はその前若しくはそれに続いて共投与してもよい。「共投与される(co-administered)」とは、同一の製剤での、又は同一の若しくは異なる経路を介した異なる製剤での同時投与、又は同一の若しくは異なる経路を介した逐次的投与を意味する。「逐次的(sequential)」投与とは、これらの細胞の導入とタンパク質性若しくは非タンパク質性の分子の投与との間の、又はこれらの細胞の機能活性の発現とタンパク質性若しくは非タンパク質性の分子の投与との間の、秒、分、時間、又は日の時差を意味する。そのような共投与が必要となる状況の例には、以下が含まれるが、これに限定されない。
【０１００】
非同系の細胞又は組織を対象に導入する場合であり、この場合、通常は、対象によるそのような細胞又は組織の免疫拒絶が起こる。この状況においては、免疫抑制レジメンを用いて患者を処置する必要があり、好ましくはそのような拒絶を最小化するためにそのような投与の前に開始する。同種異系移植片の拒絶を阻害するための免疫抑制プロトコルは、例えばシクロスポリンA、免疫抑制抗体等が広範かつ標準的な慣行である。
【０１０１】
処置される状態の性質に応じて、移植される細胞が完全に機能的になる時まで状態の症状を軽減するために、患者を鎮痛剤などの薬物治療状態に維持することが必要である可能性がある。あるいは、乳癌処置後のホルモン処置等、状態が処置されるときに、状態の再発を防止するために薬物の長期使用を開始する必要がある可能性がある。
【０１０２】
また、本発明の方法は、単独で行って目的の状態を処置することもできるし、対象の治療を促進又は増大させるように設計された1つ以上の追加の手法と一緒に行うこともできる。これらの追加的手法は他のタンパク質性又は非タンパク質性の分子、例えば放射線療法又は化学療法、の共投与の形態をとってもよい。一つの実施態様において、本発明の方法は、
(i)  MLPCを化学療法と一緒に共投与する；又は
(ii)  MLPCを化学療法と連続して投与する
ことにより行われる。
【０１０３】
これは2段階のプロセスとして行うことができ、化学療法ステップを最初に行い、その後MLPCの投与が続くか、又はその逆である。
【０１０４】
一つの実施態様において、前記MLPCは化学療法と同時に投与される。
【０１０５】
別の実施態様において、前記MLPCが2段階の逐次的プロトコルで投与され、MLPCが第一段階で投与され、化学療法が第二段階で投与される。
【０１０６】
また別の実施態様において、前記MLPCが2段階の逐次的プロトコルで投与され、、化学療法が第一段階で投与され、MLPCが第二段階で投与される。
【０１０７】
一つの実施態様において、前記方法は1サイクル、2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクル、又は6以上のサイクルで実行される。
【０１０８】
さらに本発明を決して限定することなく、本発明のMLPCは、複数回の逐次的投与で投与してもよく、各投与を「サイクル」と称する。同様に、MLPCが化学療法と同時に投与される限りは、1回のそのような投与は1「サイクル」である。MLPCと化学療法が2段階法で投与される場合、1回のそのような2段階の投与ステップは1「サイクル」である。したがって、患者の所望のエンドポイントをもたらすために必要に応じて複数回のサイクルを実行できることが理解されるべきである。本発明のさらに別の態様は、哺乳類の新生物疾患を処置する方法において使用するためのMLPCであって、前記MLPCが、
(i)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、単核細胞懸濁液であって、前記単核細胞がCD14、CD4、CD8、CD25、又はCD19を発現する、単核細胞懸濁液；
(ii)  15% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、およそ5%〜85%のアルブミン溶液；及び、
(iii)  70% v/v、又はこれと機能的に同等の比率の、細胞培養培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養により作製されたものであり、
前記細胞培養が、前記単核細胞の多系統分化能を呈する細胞への移行を誘導するために十分な時間及び条件下で維持される、MLPCを提供する。
【０１０９】
またさらなる態様において、哺乳類の新生物疾患を処置するための医薬の製造に使用するための幹細胞であって、前記幹細胞が、
(i)  CD14+、CD34+、CD105+、及びCD44+；
(ii)  CD14+、CD34+、CD105+、CD44+；
(iii)  CD44+及びCD45+；
(iv)  CD45+及びCD47+；
(v)  CD23+；
(vi)  CD44+及びCD45+
について選択される表現型を発現する、幹細胞が提供される。
【０１１０】
これらの態様によれば、一つの実施態様において、前記新生物疾患は固形腫瘍である。
【０１１１】
別の実施態様において、前記新生物疾患は、悪性新生物である。
【０１１２】
また別の実施態様において、前記悪性の新生物疾患は転移性である。
【０１１３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに説明される。
【実施例】
【０１１４】
実施例1
CD14+ PBMCからのMLPCの製造
標準的な技術を用いて、健康なヒトの成人から静脈血を抽出し、密度勾配遠心分離法を用いて末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。
【０１１５】
CD14+ PBMCのサンプルをFEP血液バッグに入れた。CD14+ PBMCサンプルと等しい体積の6%ヒト血清アルブミン溶液を加えた。
【０１１６】
幹細胞培養に適した細胞培養培地を加えた。最終的な混合物は、おおよそ、15%のCD14+ PBMC、15%の6%ヒト血清アルブミン溶液、及び70%の細胞培養培地から構成された。
【０１１７】
任意選択の10mg/Lの量のインスリンを加えて細胞増殖を促進することができる。
【０１１８】
その後、細胞培養を、5% CO2インキュベーター中、37℃で90分間インキュベートして、PBMCがバッグ内に接着するようにした。接着後、細胞を1〜7日間インキュベートしたが、この期間を通して、MLPCが誘導される。7日目に、細胞培養をバッグの壁面から除去し、0.9%の無菌生理食塩水で洗浄した。得られたMLPCは分析され、自己由来のドナーへの再導入に利用可能であった。
【０１１９】
実施例2
CD4+、CD8+、CD19+、及びCD25+リンパ球からのMLPCの製造
末梢血単核細胞(PBMC)を20歳〜40歳の健康なボランティアから、GE Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Instructions 71-7167-00 AG)により採集した。実験的手順は、手書き原稿(manuscript)の標準作業に従った。
【０１２０】
CD4+、CD8+、CD19+、及びCD25+リンパ球を、PBMCからの選択的接着法(selected adherent method)を用いて作製した。簡潔に述べると、4つのリンパ球を個別のMacrobeads (MACS)によりPBMCから精製し、純度はフローサイトメトリーにより確かめられ、定常的に集団の>90%であった。
【０１２１】
4つのリンパ球を完全培地(completely medium)中で培養し、無菌のFEP血液バッグに個別に入れた。完全培地の最終的な混合物は、おおよそ、それぞれ20%のCD4+、CD8+、CD19+、及びCD25+リンパ球、20%〜70%の6%ヒトアルブミン(CSLベーリング社)溶液、並びに10%〜60%の細胞培養培地から構成された。10 mg/Lのインスリンを細胞増殖のために加えた。細胞を、4日間〜7日間、75℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１２２】
4つのリンパ球において個別に得られた膜、細胞質、核のタンパク質発現をフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、2DE、及びMALDI-TOF/MS/MSの実験的方法により培養期間中に分析した。
【０１２３】
実施例3
MLPCのキャラクタリゼーション
1.  MLPCの形態的観察
37℃のCO2インキュベーターでのインキュベート後1日、2日、3日、4日、5日、6日、及び7日の細胞培養のサンプルを用いてスライドを作成した。MLPCの生物学的特徴を試験するために、細胞培養期間中、倒立顕微鏡により接着細胞の表現型を分析した。
【０１２４】
2.  フローサイトメトリー解析
MLPC幹細胞発現を同定するために、フローサイトメトリーにより表面マーカーを分析した。閉鎖バッグ系からMLPCを採取してPBSで洗浄し、1500 rpm、4℃で5分間遠心分離し、細胞ペレットを保持した。細胞密度をチューブあたり1 x 106細胞に調整し、細胞を100マイクロリットルのPBS緩衝液に再懸濁して1.5 mLバイアルに移した。MLPCをCD14-FITC、CD29-PE、C31-PE、CD34-PE、IgG-PEアイソタイプ対照(MACS社、ドイツ)、CD38-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD105-PE、(BD PharMingen、カリフォルニア州)を含む5〜20 μlの蛍光色素標識抗体と共に、4℃で20〜30分間インキュベートし、その後2000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。細胞ペレットをPBS洗浄工程後に保持し、細胞ペレットに固定緩衝液(eBioscience社)を100マイクロリットル、4℃で30分間加えた。最後に、固定したMLPCサンプルを2000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを4℃でPBS緩衝液に再懸濁した。生細胞を、CellQuestソフトウェアを用いることにより特定し、データは対数ヒストグラムとして示される。
【０１２５】
3.  結果の解析
90分間の培養後、CD14陽性PBMCは培養バッグの内側に接着し、大部分は丸く見える。1〜2日目には、細胞は卵型になる。これらの接着細胞はその後、3〜5日目に、顕著なテール(tail)と同時の、支配的な紡錘体及び線維芽細胞様の形態を呈する。6日目及び7日目には、細胞は卵型の表現型に戻るが、テールは残っている。MLPC作製はこのようにして完了する。
【０１２６】
フローサイトメトリー解析の結果に関して、1日のインキュベーション後、MLPCサンプルを解析し、以下のプロファイルを発現することを発見した：CD14+、CD34 low、CD45+、CD29+、CD44+。3日のインキュベーション後、MLPCサンプルを解析し、以下の表現型を発現することを発見した：CD31+、CD38+、CD90-、CD105+。6日のインキュベーション後、MLPCサンプルを解析し、以下の表現型を発現することを発見した：CD14+、CD29+、CD34 low、CD44+、CD45+。7日のインキュベーション後、MLPCサンプルを解析し、以下の表現型を発現することを発見した：CD14+、CD34 low、CD44+、CD45+。
【０１２７】
実施例4
フローサイトメトリー解析によるCD4+、CD8+、CD19+、及びCD25+白血球のCDマーカー発現
FEP血液バッグから、CD4+、CD8+、CD19+、及びCD25+リンパ球をそれぞれ採取し、PBS(2% FBS含有)で洗浄し、1500 rpm、4℃で5分間遠心分離し、細胞ペレットを保持した。フローサイトメトリーアッセイ様に、細胞密度をチューブあたり3 x 105細胞に調整した。4つの白血球を、蛍光標識抗体により蛍光色素標識抗体で標識する。実験的手順は、手書き原稿の標準作業に従った。最後に、細胞ペレットに固定緩衝液(BD)100マイクロリットルを加え、4℃で20分間静置し、フローサイトメトリー解析(Bacton Dickinson社)まで、遮光して4℃で保管した。生細胞を、CellQuestソフトウェアを用いることにより特定し、データは対数ヒストグラムとして示される。
【０１２８】
実施例5
症例研究 − 癌
症例研究：35歳の末期胸腺癌患者における、末梢血採取を介した自家幹細胞処置
【０１２９】
本症例研究は、ステージ4の転移性胸腺癌を患う末期の35歳の男性のものである。彼に、実施例1に従って調製した3ラウンドの自家幹細胞を注射した。
【０１３０】
到着時、彼は車椅子に拘束されており、重篤な貧血及びneutrapericであった。彼は以前に腫瘍の外科的切除、化学療法を受けていた。彼の左肺は完全に崩壊しており、心エコー検査で存在する心臓転移があった。
【０１３１】
彼の血液250mlを16ゲージのカテーテルを用いた静脈穿刺により採血し、その後幹細胞の自家転換(autologous conversion)のために、自家幹細胞技術(autologous Stem Cell Technology)の研究室に輸送した。
【０１３２】
2.3 x 108個の患者の幹細胞の再注入が、2013年4月13日に行われた。この処置の目的は、骨髄を回復させ、免疫系を強化することであったが、これらは複数ラウンドの化学療法後、激減してほとんど存在しなくなっていた。
【０１３３】
処置後、有害事象は記録されなかった。
【０１３４】
骨髄が十分に回復した時点で、第二の250mlの血液を患者から採取し、再注入を行った。この自家幹細胞処置の目的は、白血球数を増加させて十分な数の探究を自家幹細胞転換用に採取することができるようにすることである。処置後、患者は自力で歩くことができ、食欲の増進及び活力レベルの増加が報告された。
【０１３５】
第三の、かつ最終の250mlの血液が患者から採血され、3.6 x 108個の幹細胞の再注入を行った。この処置の目的は、癌を特異的に標的化することである。
【０１３６】
3回の幹細胞処置後、彼のヘモグロビンは、定常的な濃厚赤血球輸血を受ける必要がないところまで改善した。彼の全体的な強さ及び活力は、自力で歩けるところまで改善した。彼の酸素飽和度は、幹細胞処置後に顕著に改善したことが記録された。彼は全ての病理パラメーターにおいて改善し続け、処置後の台湾の医師からの画像報告により、心臓及び大血管(greater vessel)周辺の腫瘍の退縮が示される。悪性腹水による腹部膨満は、処置後改善した。また、腎臓及び肝臓の機能が改善するにつれて、末梢浮腫も続いて減少した。彼は回復し続けている。
【０１３７】
実施例6
癌細胞で安定的に発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)の確立
材料及び方法
細胞培養
A549、COLO205、SKOV-3は、それぞれヒトの非小肺癌細胞(NSLCCs)、ヒトの結腸腺癌細胞、及びヒトの卵巣癌細胞株である。A549及びCOLO205は、RPMI 1640 (Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)中で培養し、SKOV3は、DMEM/F12 (Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)培地中で培養し、どちらも10 %ウシ胎児血清(HyClone、ローガン、ユタ州)を補った。細胞を、5% CO2の加湿インキュベーター中、37℃で培養した。
【０１３８】
細胞のトランスフェクション
A549細胞を、pEGFP-C1プラスミドでトランスフェクトして(図2)、EGFPを安定的に発現する細胞を作製した。pEGFP-C1プラスミドは、市販品を購入し(Promega社)、DH5αコンピテント細胞に、pEGFP-C1プラスミド選抜用の耐性遺伝子発現のカナマイシン(濃度50μg/ml)と共に形質転換した。リポソーム媒介性の形質転換を、Lipofectamine 2000 (Gibco BRL)のメーカーのプロトコルに従って行った。抗生物質G418をGFP発現細胞に適用し、安定的に発現している細胞を選抜した。安定な細胞株をA549-GFP細胞と名付けた。
【０１３９】
SKOV-3及びA549細胞を、どちらも、ホタルルシフェラーゼとEGFP蛍光の両方を発現するレンチウイルス粒子と共にトランスフェクトした(図3)。トランスフェクションを、LP-HLUC-LV201-0200(登録商標)(GeneCopoeia社)のメーカーのプロトコルに従って行った(図4)。抗生物質ピューロマイシン二塩酸塩(Sigma社)を用いて、安定な発現細胞を選抜し、SKOV3-LG及びA549-LG細胞と名付けた。LGは、ホタルルシフェラーゼとEGFP蛍光とを共発現する細胞を意味する。
【０１４０】
モノクローナル選抜
モノクローナル選抜を以下のとおり行った。細胞を1:1で段階希釈し、384ウェルプレートに播種した。細胞の選抜を、G418及びピューロマイシンを用いて行い、G418をA549に対しては600ug/mlの濃度で、SKOV3細胞に対しては350ug/mlの濃度で用いた。ピューロマイシンを、SKOV3に対して1uM/mlの濃度で用いた。細胞を観察し、24ウェル及び96ウェルプレートへのさらなる播種用に選抜し、その後再度のG418及びピューロマイシンの選抜を、上記の濃度で行った。最後に、安定なモノクローンの細胞を選抜し、10 cmペトリ皿で増殖させた。
【０１４１】
MTTアッセイ
MTT (3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロマイド)代謝アッセイを、Monks A.らによって記述されるとおりに実行した。A549-GFP及びSKOV3-LGの単一細胞懸濁液を、単層培養のトリプシン処理により得て、トリパンブルー排除法により計数した。簡潔に述べると、細胞を1000細胞、2000細胞、4000細胞、5000細胞、6000細胞、及び10,000細胞という様々な密度で透明マイクロリッタープレート(Nunc)に播種し、200マイクロリットルの培養培地中で3日間インキュベートした。20マイクロリットルのMTT溶液(5mg/ml)を培養培地に加え、37℃で3〜5時間インキュベートした。170マイクロリットルの培地を除去した後、200マイクロリットルのDMSOを培地に加えてMTT-ホルマザン結晶を溶解させた。最後に、吸光度を545nmで、参照(リファレンス)を690nmで測定した(マイクロプレートリーダー、Molecular Device社)。細胞増殖比率を、式(薬剤処理のO.D./対照O.D.) x 100%に従って計算した。
【０１４２】
蛍光測定
A549-GFP、A549-LG、及びSKOV3-LGの単一細胞懸濁液を、単層培養のトリプシン処理により得て、トリパンブルー排除法により計数した。簡潔に述べると、細胞を1000細胞、2000細胞、4000細胞、5000細胞、6000細胞、及び10,000細胞という様々な密度で黒色マイクロリッタープレート(Nunc)に播種し、200マイクロリットルの培養培地中で3日間インキュベートした。その後、細胞培養の上清を100 マイクロリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)と取り換えた。蛍光強度を、蛍光マイクロプレートリーダー(BMG)での励起及び発光により測定した。
【０１４３】
発光測定
SKOV3-LG及びA549-LGの単一細胞懸濁液を、単層培養のトリプシン処理により得て、トリパンブルー排除法により計数した。簡潔に述べると、細胞を1000細胞、2000細胞、4000細胞、5000細胞、6000細胞、及び10,000細胞という様々な密度で白色マイクロリッタープレート(Nunc)に播種し、200マイクロリットルの培養培地中で3日間インキュベートした。3日後、これらの細胞の上清を100 マイクロリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)と取り換え、反応用のルシフェラーゼ基質(Promega社)を加えて反応を誘導した。発光強度を、BMG発光マイクロプレートリーダーにより測定した。
【０１４４】
図1は、LG共発現癌細胞を作製する方法を図式的に示す。
【０１４５】
結果
MTTアッセイによるSKOV3-LGの増殖比率は、測定した蛍光強度及び発光強度と一致していた。SKOV3-LG細胞は、ホタルルシフェラーゼ及びEGFP蛍光が同時にかつ一貫して発現していたことを実証する。A549-GFP細胞は、SKOV3-LG細胞と同様であり、増殖比率がMTTアッセイ及びEGFP蛍光強度とで一貫することを実証する(図5)。
【０１４６】
実施例7
多系統前駆細胞(MLPC)の癌細胞に対するインビトロの抗増殖効果
材料と方法
MLPCの作製
末梢血単核細胞(PBMCs)を20歳〜40歳の健康なボランティアから、GE Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Instructions 71-7167-00 AG)により採集した。PBMCを、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。培養後、実施例1及び2により詳細に説明されるとおり、抗増殖処置用に、MLPCを採取した。
【０１４７】
CD14+ PBMCの培養
CD14+由来MLPC細胞を、実施例1の方法を用いて作製した。簡潔に述べると、CD14+ PBMCのサンプルを個別のMacrobeads (MACS)により単離し、その後20 mL培養培地中で培養し、無菌の閉鎖バッグに入れた。細胞を、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１４８】
CD14- PBMC培養
CD14-細胞を、ネガティブセレクションにより回収し、20 mL培養培地中で培養し、無菌の閉鎖バッグに入れた。細胞を、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１４９】
CD4+ PBMCの培養
CD4+由来MLPCを、実施例2の方法を用いて作製した。簡潔に述べると、CD4+ PBMCのサンプルを個別のMacrobeads (MACS)により単離し、その後20 mL培養培地中で培養し、無菌の閉鎖バッグに入れた。細胞を、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１５０】
CD8+ PBMCの培養
CD8+由来MLPCを、実施例2の方法を用いて作製した。簡潔に述べると、CD8+ PBMCのサンプルを個別のMacrobeads (MACS)により単離し、その後20 mL培養培地中で培養し、無菌の閉鎖バッグに入れた。細胞を、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１５１】
CD19+ PBMC細胞の培養
CD19+由来MLPCを、実施例2の方法を用いて作製した。簡潔に述べると、CD19+ PBMCのサンプルを個別のMacrobeads (MACS)により単離し、その後20 mL培養培地中で培養し、無菌の閉鎖バッグに入れた。細胞を、20%〜30%自己血清、ヒトアルブミン5%〜10% (CSLベーリング社)、及びインスリン(Gibco BRL、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を補った低グルコースDMEM培地(Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク州)中に維持した。細胞を、4〜7日間、37℃で、5% CO2の加湿インキュベーター中で培養した。
【０１５２】
増殖アッセイ
A549-GFP及びSKOV3-LGを、単層培養のトリプシン処理により得て、トリパンブルー排除法により計数した。癌細胞の増殖、特に増殖の下方制御を、個別、同時、2段階モデルにより評価した。MLPC及び化学療法薬剤を同時にA549-GFP及びSKOV3-LG細胞に3日間加えた。2段階実験においては、第一段階でMLPCをA549-GFP及びSKOV3-LG細胞に3日間加えた。第二段階において、細胞の上清を除去し、化学療法薬剤を3日間加えた。あるいは、これらの2つの段階を反転させた、すなわち化学療法薬剤を第一段階で加え、MLPCを第二段階で加える、実験を行った。MLPCのインビトロ処理実験については、A549-GFP及びSKOV3-LGに加えるときに、細胞を1倍(1x)、2倍(2x)、4倍(4x)、5倍(5x)、及び10倍(10x)の細胞の濃度で用いた。簡潔に述べると、A549-GFP及びSKOV3-LG細胞を4000細胞の密度で黒色マイクロリッタープレート(Nunc)に播種し、180マイクロリットルの培養培地中で一晩インキュベートした。上記の様々なMLPCの細胞数を、20マイクロリットルの分注液(aliquot)として加えた。MLPC処理は、A549-GFP細胞については、1x、2x、及び4x、A549-GFPについては、1x、5x、及び10xを含んだ。化学療法の製剤については、4 μM及び0.8 μMの終濃度のドキソルビシン(Sigma社)を、個別、同時、及び2段階モデルでの3日間の処置として用いた。蛍光強度を測定し、様々な処置及び対照の癌細胞増殖への効果を評価した。
【０１５３】
結果
個別の、又は組み合わせの、MLPC及び化学療法処置の効果
個別の処置
A549/肺、及びSKOV3/卵巣の癌細胞を、様々な数のMLPC/幹細胞処置で72時間処置した、図6を参照。蛍光強度を、その後の72時間測定し、それにより、MLPCの場合、5x及び10x処置が、対象と比べた場合の卵巣癌細胞増殖の統計的に有意な減少を示すことが明らかであった。肺癌細胞株において、増殖の減少傾向が観察されたものの、対照サンプルと1x、2x、又は4x MLPC処置との間に統計的に有意な差は無かった。
【０１５４】
MLPC及び化学療法：同時処置
A549/肺の癌細胞を1x、2x、又は4x MLPC及び0.8 μM又は4 μMの化学療法剤ドキソルビシンで同時に処置し、72時間インキュベートした。図7は、各処置について相対的蛍光強度のグラフ表示を図示する：ドキソルビシン単独、MLPC + ドキソルビシン(0.8 μM)、及びMLPC + ドキソルビシン(4 μM)。結果は、ドキソルビシン群と、MLPC及びドキソルビシンで同時に処置された細胞の両方が、癌細胞増殖を有意に減少させたことを実証する。
【０１５５】
MLPC及び化学療法：2段階処置
次に、2段階でのA549/肺の癌細胞の処置が、癌細胞増殖に効果を有するかどうかを調査した。A549細胞を、1x、5x、又は10x濃度のMLPCと共に、0.8 μM又は4 μMのいずれかのドキソルビシンで処置した。図8に関して、左のグラフは、第一にドキソルビシン、その後第二段階でMLPCを用いて処置した細胞を表す。右のグラフは、第一にMLPC、その後第二段階でドキソルビシンを用いて処置した細胞を表す。結果は、どちらの2段階処置レジメンも癌細胞増殖を減少させることを示す。しかし、ドキソルビシン単独に対して、細胞を第一段階でMLPCを用いて処置し、その後に第二段階のドキソルビシンが続く場合では、統計的に有意な差がある。
【０１５６】
実施例8
MLPCによるインビボの腫瘍成長阻害
材料と方法
以下の実験を行って、CD14+由来MLPC (T1)細胞を用いた処置と、CD14-由来MLPC (T2)細胞を用いた処置との違いを調査した。以下のプロトコルに従って、マウスに細胞を投与した。
【０１５７】
1日目
対照：COLO205 5x106 細胞/マウスを皮下経路で投与し固形腫瘍を誘導
T1：COLO205 5x106 細胞/マウスを6x103 CD14+由来MLPCと共に皮下経路で投与し固形腫瘍を誘導
T2：COLO205 5x106 細胞/マウスを3x103 CD14-由来MLPCと共に皮下経路で投与し固形腫瘍を誘導
【０１５８】
10日目
T1：追加の1x105 CD14+由来MLPCを静脈注射で投与
T2：追加の2x106 CD14-由来MLPCを静脈注射で投与
【０１５９】
17日目
T1：追加の1.6x105 CD14+由来MLPCを静脈注射で投与
T2：追加の2.3x105 CD14-由来MLPCを静脈注射で投与
【０１６０】
23日目
T1：追加の0.8x105 CD14+由来MLPCを静脈注射で投与
T2：追加の2x107 CD14-由来MLPCを静脈注射で投与
【０１６１】
結果
6日目には、CD14-由来MLPCで処置したマウスの腫瘍成長は、対照群のサイズ(120mm)のおよそ3分の1(48mm)であった、図9を参照。CD14+由来MLPC細胞で処置したマウスは、平均値74mmの腫瘍成長を呈した。したがって、MLPC処置により腫瘍成長が減少した。腫瘍成長の長期的なデータを、図10及び図11に図示する。24日間の後、CD14+由来MLPC及びCD14-由来MLPCの両方についての腫瘍のサイズは、対照マウスのサイズのおよそ半分であった。CD14+由来MLPC細胞で処置したマウス(白丸)及びCD14-由来MLPC細胞で処置したマウス(黒三角形)と比較して、対照群は、腫瘍サイズ(黒丸)の実質的な増加を明示した。黒い矢印は10日目、17日目、及び23日目に投与したMLPCの再供給を示す。
【０１６２】
腫瘍サイズは、2次元キャリパー(ノギス)測定を用いて推定され、0.5xL x W2として、楕円方程式の公式を用いて計算され、式中、Lは主軸であり、Wは腫瘍の幅である。腫瘍成長は、6日目のサイズを参照として用いて、腫瘍サイズの差として計算された。
【０１６３】
【表１Ａ】
2016540770.tif 000002
【表１Ｂ】
2016540770.tif 000003
【表１Ｃ】
2016540770.tif 000004
【表１Ｄ】
2016540770.tif 000005
【表１Ｅ】
2016540770.tif 000006
【表１Ｆ】
2016540770.tif 000007
【表１Ｇ】
2016540770.tif 000008
【表１Ｈ】
2016540770.tif 000009
【表１Ｉ】
2016540770.tif 000010
【表１Ｊ】
2016540770.tif 000011
【表１Ｋ】
2016540770.tif 000012
【表１Ｌ】
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【０１６４】
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【表２Ｃ】
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【表２Ｄ】
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【表２Ｅ】
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【表２Ｆ】
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【表２Ｇ】
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【表２Ｈ】
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【表２Ｉ】
2016540770.tif 000022
【表２Ｊ】
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【表２Ｋ】
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【０１６５】
【表３Ａ】
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【表３Ｂ】
2016540770.tif 000026
【表３Ｃ】
2016540770.tif 000027
【表３Ｄ】
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【表３Ｅ】
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【表３Ｆ】
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【表３Ｇ】
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【表３Ｈ】
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【０１６６】
【表４Ａ】
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【表４Ｂ】
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【０１６７】
当業者であれば、本願明細書に説明される発明は、特に説明したもの以外の変化及び改変を許すことができることを認識する。本発明は、全てのそのような変化及び改変を含むことが理解される。また、本発明は、この明細書中に言及された又は示された全ての工程、機構、組成物、及び化合物を、単独で又は一括して含み、これらの工程又は機構の任意の2以上の任意の及び全ての組み合わせも含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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