(57)【要約】本発明は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)来由のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物に関するものである。本発明によるヒト型結核菌(Mycobacteriumtuberculosis)由来のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質は、LPSと結合してLPS及び細胞間の結合を抑制する效果を持ち、敗血症動物モデルで生存率を高め、肺での炎症反応及び腓腸での細胞死滅を抑制するなど、敗血症に対して優れた治療效果を持っている。
2016520596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＫ(AdenosineKinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＡＤＫタンパク質は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)来由であることを特徴とする、請求項１に記載の敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＡＤＫタンパク質は、配列番号１で示されることを特徴とする、請求項１に記載の敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＡＤＫタンパク質は、配列番号２で示される塩基配列でエンコードされることを特徴とする、請求項１に記載の敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＡＤＫタンパク質は、LPS(lipopolysaccharide)と結合することを特徴とする、請求項１に記載の敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
ＡＤＫ(AdenosineKinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)来由のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
敗血症(sepsis)は、病原性グラム陰性細菌が生体に感染された場合、細胞壁の成分であるリポ多糖(lipopolysaccharide、LPS)が毒素として作用し、生体の免疫体系が過度に活性化されることによって引き起こされる炎症反応であって、全身に感染症を起こしたり、症状が重い場合はショックを伴ったりする。具体的に、敗血症は悪性腫傷、白血病、悪性リンパ腫、後天性兔疫不全症侯群(AIDS)、膠原病、腎不全、肝疾患、脳血管障害、糖尿病などの基礎疾患を持つ患者や高齢者、未熟児のような体液性免疫不全または細胞性免疫不全を持つ抵抗力の弱い宿主が副腎ステロイドや抗腫瘍剤の化学療法、コバルト照射という放射線治療または留置カテーテル、血液透析、臓器移植、心臓手術などの処置、手術を受けた場合に主に発病する。敗血症は病院の重患者病棟に入院した患者が死亡する主な原因となり、これによる致死率が普通30%以上の非常に深刻な疾病であり、医学技術の発展にもかかわらず、まだ全世界的に手術の後遺症で感染され敗血症が発生する場合も多く、また新生児や年寄りのように体内免疫力が弱い人が感染された場合、敗血症へと進む場合も多い。代表的に、新生児敗血症の場合、臨月で生まれた子の場合、1,000人当たり3人くらいが発生すると知られており、未熟児の場合、発病率が3〜4倍増加すると知られている。敗血症にかかった場合、大体抗生剤治療を受けることになるが、適切な処置が遅れて菌がたくさん増殖した場合や抗生剤に対する耐性が強い菌株によって感染された場合には、抗生剤だけでは效果的な治療ができない。
【０００３】
このように多様な抗生剤に対する耐性を持つ病源菌が次第に増加する現象と関連して、敗血症または敗血症性ショックの治療が非常に重要な問題とされているが、いまだこれに対する適合な治療剤は開発されていない。
【０００４】
本発明者らは、前記のような要求を満たすために研究を重ねた結果、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質がLPSと結合して優秀な敗血症治療效果を有することを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、ＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または改善用食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記のような課題を解決するために、本発明はＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明はＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質は、LPSと結合してLPS及び細胞間の結合を抑制する效果を持ち、敗血症の動物モデルで生存率を高め、肺での炎症反応及び腓腸での細胞の死滅を抑制するなど、敗血症または敗血症性ショックに対して優れた治療效果を持っている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組み替えＡＤＫタンパク質をSDS-PAGEを通じて確認した結果を示した図である。
【図２】ＡＤＫを処理した樹状細胞でタンパク質表面因子であるCD80、CD86、MHC class I、IIの発現量を示した図である。
【図３】ＡＤＫを処理した樹状細胞でサイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12 p70)の分泌量を示した図である。
【図４】ＡＤＫを処理した樹状細胞のデキストラン摂食能測定結果を示した図である。
【図５】樹状細胞でＡＤＫがTLR作用物質に及ぼす影響を示した図である。
【図６】樹状細胞でＡＤＫがLPSによって誘導されるTNF-αの分泌に及ぼす影響を示した図である。
【図７】樹状細胞でＡＤＫがLPSによって誘導されるAKT及びMAPKsのリン酸化に及ぼす影響を示した図である。
【図８】ＡＤＫとLPSの相互作用を免疫沈降法及びウェスタンブロットを通じて確認した図である。
【図９】ＡＤＫとLPSの相互作用をBlitz装備を利用して確認した図である。
【図１０】敗血症動物モデルでＡＤＫ投与群の生存率を示した図である。
【図１１】敗血症動物モデルでＡＤＫ投与群の血清内TNF-αの量を示した図である。
【図１２】敗血症動物モデルでＡＤＫ投与群の肺組職内の炎症誘発細胞の浸潤の度合を示した図である。
【図１３】敗血症動物モデルでＡＤＫ投与群の腓腸組職内の細胞死滅の度合を示した図である。
【図１４】敗血症動物モデルでＡＤＫ投与群の腓腸細胞内のB細胞及びT細胞の細胞死滅の度合を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物を提供する。
【００１２】
前記組成物は、薬学的組成物及び食品組成物を含む。
【００１３】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１４】
前記ＡＤＫタンパク質はヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来で、好ましくは配列番号1で示されるアミノ酸配列を持つタンパク質、または配列番号2で示される塩基配列にエンコードされるタンパク質、及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。本発明において "機能的同等物"とは、アミノ酸の付加、置き換え、または結実の結果、前記配列番号1で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の配列相同性を持つもので、配列番号1で示されるアミノ酸配列を持つタンパク質または配列番号2で示される塩基配列にエンコードされるタンパク質と実質的に同質の生理活性を表すタンパク質を言う。
【００１５】
本発明のＡＤＫタンパク質は、これの天然型アミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、これのアミノ酸配列の変異体がまた本発明の範囲に含まれる。ＡＤＫタンパク質の変異体とは、ＡＤＫ天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相違する配列を持つタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野において公知である。前記ＡＤＫタンパク質またはこれの変異体は、天然から抽出したり合成(Merrifleld、J.  Amer.  Chem.  Soc.  85:2149-2156、1963)またはDNA配列を基本とする遺伝子組み替え方法によって製造されることがある(Sambrook et al、Molecular Cloning、Cold Spring HarbourLaboratory Press、New York、USA、2版、1989)。
【００１６】
本発明において"敗血症"とは、微生物に感染されて全身に深刻な炎症反応が表れる状態を言う。体温が38度以上に上がる発熱症状、あるいは36度以下に下がる低体温症、呼吸数が１分当たり24回以上に増加(頻呼吸)、１分当たり90回以上の心拍数(頻脈)、血液検査上の白血球数の増加、あるいは顕著な減少の中で二つ以上の症状を見せる場合、これを全身性炎症反応症侯群(systemic inflammatory response syndrome；SIRS)という。このような全身性炎症反応症侯群が微生物の感染によるものである時、敗血症と言う。身体の感染病巣から病原菌が持続的または断続的に血流に入り、様々な臓器組職に定着し、病巣を作ってひどい全身症状を見せるのである。原因菌としては、葡萄状球菌、連鎖状球菌、大膓菌、緑膿菌、結核菌、肺炎かん菌、真菌、嫌気性菌などがある。
【００１７】
本発明によるヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のＡＤＫ(Adenosine Kinase)タンパク質は、LPSと結合してLPS及び細胞間の結合を抑制する效果を持ち、敗血症動物モデルで生存率を高め、肺での炎症反応及び腓腸での細胞死滅を抑制するなど、敗血症または敗血症性ショックに対する優秀な治療效果を持っている。
【００１８】
したがって、本発明のＡＤＫタンパク質は、敗血症または敗血症性ショックの予防または治療のための医薬品及び健康機能食品に有用に使われることができる。
【００１９】
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。本発明による薬学的組成物は、それぞれ常法によって散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われることがある。当該技術分野に知られた適合した製剤は、文献(Remington'sPharmaceutical Science、MackPublishing Company、Easton PA)に開示されているものを使用することが望ましい。
【００２０】
本発明の薬学的組成物に含まれることができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムケイ酸塩、セルローズ、メチルセルローズ、未晶質セルローズ、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアリン酸塩及び鉱物油を挙げられる。製剤化する場合は、普通使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って製造される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記有效成分に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて製造される。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムステアリン酸塩、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることがある。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水系溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水系溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのように注射可能なエステルなどが使われることができる。座剤の基剤としては、ウィテップゾール(witepsol)、マクロゴ−ル、トゥイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリナム、グリセロゼラチンなどが使われることができる。
【００２１】
本発明で使われる用語"投与"は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００２２】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の度合、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜選択されることができる。好ましい效果のために、本発明の組成物は1日当たり0.001〜1000mg/kgで投与することができる。投与は、一日に一回投与することができ、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いずれにしても本発明の範囲を限定するものではない。前記投与量は、個体の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使われる薬物を含んだ要素、及びその他の医学分野によく知られた要素によって決められる。
【００２３】
本発明の薬学的組成物は、多様な経路を通じて個体に投与されることができる。投与のすべての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内の注射によって投与されることができる。しかし、経口投与時、タンパク質は消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。より好ましくは注射剤形態で投与されることができる。
【００２４】
本発明による薬学的組成物は、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤及び抗生剤からなる群から選択された一つ以上の薬剤をさらに含むことができる。
【００２５】
例えば、前記気管支拡張剤としては、β-效能剤、抗コリン剤、メチルザンチンなどを使うことができ、前記抗ヒスタミン剤としては、アクリパスチン(acrivastine)、セチリジン(cetirizine)、デスロラタジン(desloratadine)、フェキソフェナジン(fexofenadine)、レボセチリジン(levocertirizine)、ロラタジン(loratadine)、ミゾラスチン(mizolastine)、アリメマジン(ailmemazine)、クロセチリジン(chlocertirizine)、クレマスチン(clemastine)、シプロヘプタジン(cypropheptadine)、ハイドロキシジン(hydroxyzine)、ケトチフェン(ketotifen)、プロメンタジン(promenthazine)などを使うことができ、前記消炎鎮痛剤としては、アスピリン(aspirin)、ジクロフェナク(diclofenac)、フェノプロフェン(fenoprofen)、フルルビプロフェン(flurbiprofen)、イブプロフェン(ibuprofen)、インドメタシン(indomethacin)、ケトプロフェン(ketoprofen)、ナプロキセン(naproxen)、ピロキシカム(piroxicam)、スリンダク(sulindac)、セレコキシブ(celecoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)、ロフェコキシブ(rofecoxib)などを使うことができ、前記抗生剤としては、セファロスポリン系抗生剤、ペニシリン系抗生剤、キノロン系抗生剤、アミノグリコシド系抗生剤、ベータラクタム系抗生剤などを使うことができる。
【００２６】
本発明において‘健康機能食品'とは、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法などを利用して該当食品の機能を特定目的に作用、発現するように付加価置を付与した食品群や、食品造成が持つ生体防御リズムの調節、疾病防止と回復などに関する体内調節機能を生体に対して充分に発現するように設計して加工した食品を意味する。
【００２７】
前記健康機能食品には、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、健康機能食品の製造に通常使われる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００２８】
本発明の組成物を食品添加物として使う場合、前記組成物をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使うことができるし、通常の方法によって適切に使うことができる。有效成分の混合量は、使用目的(予防、健康または治療的処置)によって適合に決められる。一般的に、食品または飲み物の製造時、本発明の組成物は原料に対して15重量%以下、好ましくは10重量%以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の攝取の場合、前記範囲の以下であることもあり、安全性の面で何ら問題がないので、有效成分は前記範囲以上の量でも使われる。
【００２９】
前記の他に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含むことができる。その他、本発明の組成物は天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立にまたは組み合わせて使うことができる。このような添加剤の割合はさほど重要ではないが、本発明の組成物100重量部当たり0.01〜0.1重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００３０】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明をより容易に理解できるように例示するものであって、本発明の内容が実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
実施例１.樹状細胞の分離及び組み替えＡＤＫのクローニング
【００３２】
1.1  樹状細胞の分離及び誘導
【００３３】
6〜8週齢になったC57BL/6マウスから骨髓採取用注射を使用して大腿部の骨髓を採取した。採取した骨髓を洗浄した後、塩化アンモニウムを利用して赤血球をとり除いた。分離した細胞は、RPMI 1640(10%FBS(Fetal bovine serum、子牛血清)、2mML-グルタミン、100U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、50μM メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、1mM ピルビン酸ナトリウム、20ng/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4を含む)培地を分株した6-ウエルプレートで37℃、5%CO2の条件で8日間培養した。GM-CSF及びIL-4は、樹状細胞への分化を誘導するために使用した。
【００３４】
1.2  組み替えＡＤＫ(Rv0733)のクローニング
【００３５】
ヒト型結核菌のゲノムDNAを鋳型で利用して、PCRを通じてＡＤＫ(Rv0733)部位を増幅した(プリマー: 5'-CATATGAGAGTTTTGTTGCTGGGACCG-3'及び5'-AAGCTTCTTTCCCAGAGCCCGCAACGC-3')。分離されたPCR産物をNdeIとHindIII酵素で切断し、発現ベクターであるpET-28aベクターに挿入した。ＡＤＫ遺伝子が挿入されたpET-28aベクターに形質を転換させたE.coli BL21をLB培地(100μg/ml アンピシリンを含む)、37℃で12時間培養した。その後、1mMのイソプロピル-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加した後、6時間培養し、溶解緩衝液(lysis buffer、1M DTT、リゾチーム、PMSFを含む)で細胞を溶かした。組み替えタンパク質は、ニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)アガロースを利用して製造社の方法に準して精製した。最終的に精製した組み替えＡＤＫタンパク質をSDS-PAGEで分析し、確認した。その結果を図1に示した。
【００３６】
実施例2.  ＡＤＫによる樹状細胞の表面因子発現分析
【００３７】
ＡＤＫが樹状細胞の表面因子発現に及ぼす影響を確認するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に1、5または10μg/ml濃度のＡＤＫ及び50ng/ml濃度のLPSをそれぞれ24時間処理した後、樹状細胞を回収した。LPSは樹状細胞の成熟を促進するものとして知られた物質である。樹状細胞の表面因子発現分析のために抗-CD11c-FITC、抗-CD80-PE、抗-CD86-PE、抗-MHCI-PE及び抗-MHC II-PEなど細胞表面因子の抗体を利用して30分間染色した後、PBSで洗浄した。これを4%のパラホルムアルデヒドで固定した後、フローサイトメトリFACSCaliburflow cytometer(Becton Dickinson、San Jose、CA)で分析した。その結果を図2に示した。
【００３８】
図2に示したように、樹状細胞にＡＤＫとLPSを一緒に処理した場合、ＡＤＫの濃度が高くなるほどLPSによって増加された補助刺激因子であるCD80、CD86、MHC class I、MHC class IIの発現が減少することを確認した。
【００３９】
実施例3.  ＡＤＫが樹状細胞のサイトカイン分泌に及ぼす影響分析
【００４０】
ＡＤＫが樹状細胞のサイトカイン分泌に及ぼす影響を確認するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に1、5または10μg/ml濃度のＡＤＫを1時間前処理した後、50ng/ml濃度のLPSを24時間処理し、培地を回収した。ELISAを利用して回収した培地からサイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-1β及びIL-12 p70)の分泌量を測定した。その結果を図3に示した。
【００４１】
図3に示したように、樹状細胞に前処理したＡＤＫの濃度が高くなるほどLPSによって増加されたサイトカインの分泌が減らすことを確認した。
【００４２】
実施例4.  ＡＤＫが樹状細胞の大食活動に及ぼす影響分析
【００４３】
ＡＤＫが樹状細胞の大食活動(endocytic activity)に及ぼす影響を確認するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に10μg/ml濃度のＡＤＫを1時間前処理した後、50ng/ml濃度のLPSを24時間処理した。培養された樹状細胞に1ug/mlのフルオレセイン結合デキストラン(fluoresceinconjugateddextran、分子量40,000; Molecular Probes、Eugene、OR)を1時間添加した。前記樹状細胞を37℃と4℃でそれぞれ30分間培養した後、コールド染色緩衝液を添加して反応を停止させた後、細胞を洗浄した。その後、PE(Phycoerythrin)-結合CD11c(BD bioscience)で染色した後、フローサイトメトリを利用してデキストラン-FITC(Fluorescein isothiocyanate)貪食能を測定した。その結果を図4に示した。
【００４４】
図4に示したように、樹状細胞にLPSを単独で処理する場合、デキストラン摂食能が減少するが、ＡＤＫを前処理する場合、LPSによって減少されたデキストラン摂食能が増加することを確認した。これによって、ＡＤＫがLPSによる樹状細胞の成熟化を抑制することを確認した。
【００４５】
実施例5.  ＡＤＫがTLR作用物質に及ぼす影響分析
【００４６】
ＡＤＫがTLR(toll-likereceptor)作用物質に及ぼす影響を確認するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に10μg/ml濃度のＡＤＫを1時間前処理した後、多様なTLR作用物質を24時間処理し、培地を回収した。ELISAを利用して回収した培地からTNF-αの分泌の度合を測定した。その結果を図5に示した。
【００４７】
図5に示したように、他のTLR作用物質はＡＤＫ処理に影響を受けなかったが、TLR4 作用物質であるLPSを処理した群は、ＡＤＫ前処理によってTNF-αの分泌が著しく減少することを確認した。これによって、ＡＤＫがTLR4による信号を特異的に阻害することを確認した。
【００４８】
実施例6.  ＡＤＫがLPSを通じて樹状細胞の活性に及ぼす影響分析
【００４９】
ＡＤＫがLPSを通じて樹状細胞の活性に及ぼす影響を確認するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に10μg/ml濃度のＡＤＫまたは抗-ＡＤＫ抗体を1時間前処理した後、50ng/ml濃度のLPSを24時間処理し、培地を回収した。ELISAを利用して回収した培地でTNF-αの分泌の度合を測定した。その結果を図6に示した。
【００５０】
図6に示したように、樹状細胞にＡＤＫだけを前処理する場合、LPSによるTNF-αの分泌が抑制されるが、ＡＤＫと抗-ＡＤＫ抗体を同時に前処理する場合、再びTNF-αの分泌が増加することを確認した。
【００５１】
また、樹状細胞に10μg/ml濃度のＡＤＫを1時間前処理した後、50ng/ml濃度のLPSを 0、15、30または60分間処理し、樹状細胞内の全タンパク質を回収した。回収したタンパク質を利用してウェスタンブロットを行った。その結果を図7に示した。
【００５２】
図7に示したように、樹状細胞にＡＤＫを前処理する場合、LPSによって活性化されるAKT及びMAPKsのリン酸化の度合が減少することを確認した。
【００５３】
以上の実験結果を通じて、ＡＤＫがLPSとの結合を通じてLPSの機能を阻害する作用をすることを確認した。
【００５４】
実施例7.  ＡＤＫとLPSの相互作用分析
【００５５】
ＡＤＫとLPSの相互作用を分析するために、下記のような実験を行った。樹状細胞に100μgのＡＤＫ及び0.5mgのLPSを1時間処理した。以後、抗-MS IgGまたは抗-LPS抗体を利用して免疫沈降法を行い、抗-ＡＤＫ抗体を利用してウェスタンブロットを行った。その結果を図8に示した。
【００５６】
図8に示したように、ＡＤＫの大きさの約20kDaで帯を確認し、これを通じてＡＤＫとLPSがお互い結合することを確認した。
【００５７】
前記実験結果を検証するために、Blitz装備を利用してＡＤＫとLPSの結合の度合及び相互作用を確認した。より具体的に、Blitz装備内のProtein AセンサーにLPSを結合するために抗-LPS抗体を結合した後、センサー内の非結合抗-LPS抗体をとり除くためにPBSで洗浄した。前記抗-LPS抗体が結合されたセンサーにLPSを結合した後、ＡＤＫの結合可否を分析した(青い線で表示)。陰性対照群としてはPBSを利用した(黒い線で表示)。その結果を図9に示した。
【００５８】
図9に示したように、LPSにＡＤＫが結合してピークが増加されることを確認した。
【００５９】
実施例8.  敗血症動物モデルからＡＤＫの治療效果分析
【００６０】
敗血症動物モデルからＡＤＫの治療效果を分析するために、下記のような実験を行った。動物モデルとしては、6週齢のBALB/cAnNCriliOriマウスを利用した。ＡＤＫ(5または10mg/kg)を1時間前に腹腔注射した実験群と対照群を分けた後、LPS(20mg/kg)を各マウスの腹腔内に注射して敗血症を誘導した。その後、前記マウスの時間による生存率を分析し、LPS投与から1時間後、血清を分離して血清内のTNF-αの量を測定した。その結果を図10及び図11に示した。
【００６１】
図10に示したように、敗血症動物モデルで、ＡＤＫ投与群の場合、対照群に比べて著しく生存率が増加することを確認し、図11に示したように、ＡＤＫ投与濃度に依存的で、LPSによって増加されたマウス血清内のTNF-αの量が減少することを確認した。
【００６２】
また、マウスに何も投与していない群；ＡＤＫ(10mg/kg)だけ投与した群；LPS(10mg/kg)だけ投与した群；及びＡＤＫ(10mg/kg)を1時間前に投与した後LPS(10mg/kg)を投与した群；に分けた後、24時間後に各マウスの肺及び腓腸を摘出した。肺及び腓腸組職をパラフィンセクションした後、H&E染色を行い、腓腸細胞を分離した後、フローサイトメトリを利用してB細胞及びT細胞の死滅度合を分析した。その結果を図12ないし図14に示した。
【００６３】
図12に示したように、ＡＤＫを前処理した群の肺組職で、LPSを単独投与した群の肺組職に比べて炎症誘発細胞の浸潤が著しく減少されることを確認した。
【００６４】
また、図13に示したように、ＡＤＫを前処理した群の腓腸組職で、LPSを単独投与した群の腓腸組職に比べて細胞死滅が著しく減少されることを確認した(細胞死滅時、核が破壊されて細胞の形が一定しない)。
【００６５】
また、図14に示したように、ＡＤＫを前処理した群の腓腸細胞で、LPSを単独投与した群の腓腸細胞に比べてB細胞及びT細胞の死滅が著しく減少されることを確認した。
【００６６】
以上の実験結果を通じて、本発明によるＡＤＫは、敗血症に対して優れた治療效果を持つことを確認した。
【００６７】
以下では、本発明の薬学的組成物及び食品組成物の製剤例を説明するが、これは本発明の限定ではなく、具体的な説明にその目的がある。
【００６８】
製剤例1.  薬学的組成物の製造
【００６９】
1-1.  散剤の製造
【００７０】
ＡＤＫタンパク質 2g
乳糖 1g
【００７１】
前記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造した。
【００７２】
1-2.  錠剤の製造
【００７３】
ＡＤＫタンパク質 100mg
コーンスターチ 100mg
乳糖100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
【００７４】
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【００７５】
1-3.  カプセル剤の製造
【００７６】
ＡＤＫタンパク質 100mg
コーンスターチ 100mg
乳糖100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
【００７７】
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によってゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００７８】
製剤例2.  食品組成物の製造
【００７９】
2-1.  健康食品の製造
【００８０】
ＡＤＫタンパク質 100mg
ビタミン混合物の適量
ビタミンA アセテート 70g
ビタミンE 1.0mg
ビタミンB1 0.13mg
ビタミンB2 0.15mg
ビタミンB6 0.5mg
ビタミンB12 0.2g
ビタミンC 10mg
ビオチン10g
ニコチン酸アミド 1.7mg
葉酸50g
パントテン酸カルシウム 0.5mg
無機質混合物の適量
硫酸第1鉄 1.75mg
酸化亜鉛 0.82mg
炭酸マグネシウム 25.3mg
第1リン酸カリウム 15mg
第2リン酸カルシウム 55mg
クエン酸カリウム 90mg
炭酸カルシウム 100mg
塩化マグネシウム 24.8mg
【００８１】
前記のビタミン及びミネラル混合物の造成比は比較的に健康食品に適合した成分を好ましい実施例として混合造成したが、その配合比を任意に変形して実施しても構わず、通常の健康食品の製造方法によって前記成分を混合した後、顆粒を製造し、常法によって健康食品の組成物製造に使うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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