(57)【要約】  本発明は、被験体の胃腸器官に存在する例えば大腸菌などの腸内細菌の量を定量することにより、被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクを予測することに関する。本発明は、高トリグリセリド血症の被験者又は発症の条件を有するリスクのある被験者を治療することにも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクがあるかどうかを予測する方法であって、
ａ）前記被験体より得られたサンプルを変換して、前記サンプル中の大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の濃度を検出するステップ、
ｂ）対照試料に比べて前記サンプル中の大腸菌濃度がより高いことにより、前記被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクにあるという予測を決定するステップ、を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが糞便サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記大腸菌の濃度を検出するステップが、核酸増殖を実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌の濃度を検出するステップが、コロニー数の計数を実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対照試料が、健康な対照被験体、又は高トリグリセリド血症を発症するリスクのない被験体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクにある場合、治療薬物の治療有効量の投与、抗生物質の投与、バクテリオファージの投与、食事指導の実施、栄養療法の実施、又はそれらの組み合わせの実施を推奨するステップ、又はこれらを実施するステップ更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療薬物が、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記食事指導が、炭水化物の食事制限、脂肪の食事制限、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記栄養療法が、フィトステロール、タウリン、プロバイオティックス、炭水化物、タンパク質、食物繊維、ファイトニュートリエント及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
被験体の高トリグリセリド血症を治療する方法であって、
ａ）前記被験体より得られたサンプルを変換して、前記サンプル中の前記大腸菌の濃度を検出するステップと、
ｂ）対照試料に比べて前記サンプル中の大腸菌の濃度がより高いことにより、前記被験体が高トリグリセリド血症であるという診断を決定するステップと、
ｃ）前記被験体が高トリグリセリド血症と診断された場合、治療有効量の治療薬物、抗生物質、バクテリオファージの投与、食事指導、栄養療法の実施、又はそれらの組み合わせを実施するステップと、を含む方法。
【請求項１１】
前記サンプルが糞便サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記大腸菌の濃度を検出するステップが、核酸増殖を実施するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記大腸菌の濃度を検出するステップが、コロニー数の計数を実施するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照試料が糞便サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬物が、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記食事指導が、炭水化物の食事制限、脂肪の食事制限、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記栄養療法が、フィトステロール、タウリン、プロバイオティックス、炭水化物、タンパク質、食物繊維、ファイトニュートリエント及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
被験体の高トリグリセリド血症を診断する方法であって、
ａ）前記被験体より得られたサンプルを変換して、前記サンプル中の大腸菌濃度を検出するステップと、
ｂ）対照試料に比べて前記サンプル中の大腸菌濃度がより高いことにより、前記被験体が高トリグリセリド血症であるという診断を決定するステップと、を含む方法。
【請求項１９】
前記サンプルが糞便サンプルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記大腸菌の濃度を検出するステップが、核酸増殖を実施するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅が、その配列が配列番号３及び４に記載されているオリゴヌクレオチドを使用して実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸増幅が、腸内細菌反復遺伝子間コンセンサスＰＣＲ、又は反復遺伝子外ＰＣＲを含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]脂質異常症は、血中の異常な量の脂質（例えば、コレステロール及び／又は脂肪）により特徴付けられるリポタンパク質代謝の疾患である。高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）、高コレステロール血症、高リポたんぱく血症、又はそれらの組み合わせなど特に高脂血症などの脂質異常症の有病率は、発展途上国において高い。例えば、アメリカ合衆国において、高トリグリセリド血症の有病率は、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）超の血漿トリグリセリド濃度と定義され、女性では２７．６％、男性では約３５．１％である（Ｍｏｚｕｍｄａｒ  ａｎｄ  Ｌｉｇｕｏｒｉ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，３４（１）：２１６〜２１９（２０１１）；Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＭＡ，２８７（３）：３５６〜３５９（２００２））。
【０００２】
[0002]ＨＴＧは、トリグリセリド産出物の増加、トリグリセリド異化作用の減少、又はその両方の結果から生じ得る。高トリグリセリド血症の典型的な危険因子としては、脂肪分の多い飲食、過剰なアルコール摂取、座りがちな生活様式、年齢、肥満、及び／又は代謝性疾患などが挙げられる。他の危険因子としては、２型糖尿病、遺伝病（例えば、家族性高トリグリセリド血症、家族性複合型高脂血症、家族性異常βリポタンパク血症）、特定の薬物（例えば、ステロイド、β遮断薬、及び高エストロゲン経口避妊薬）及び他の病気（例えば、甲状腺機能低下症、高ホモシステイン血症、クッシング病、他の内分泌疾患、腎機能異常又は肝臓病、及び自己免疫疾患）などが挙げられる。
【０００３】
[0003]典型的に、ＨＴＧは、空腹時血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度に基づいた個々のカテゴリーに従って、診断される。例えば、内分泌学会の分類体系では、正常ＴＧ濃度は＜１．７ｍｍｏｌ／Ｌ、（＜１５０ｍｇ／ｄＬ、軽症ＨＴＧ濃度は１．７〜２．３ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０〜１９９ｍｇ／ｄＬ）、中等症ＨＴＧ濃度は２．３〜１１．２ｍｍｏｌ／Ｌ（２００〜９００ｍｇ／ｄＬ）、重症ＨＴＧ濃度は１１．２〜２２．４ｍｍｏｌ／Ｌ（１０００〜１９９９ｍｇ／ｄＬ）、及び最重症ＨＴＧ濃度は＞２２．４ｍｍｏｌ／Ｌ（＞２０００ｍｇ／ｄＬ）と定義されている。
【０００４】
[0004]腸内微生物叢が、肥満、糖尿病、及び心臓血管疾患などの代謝異常に関与していることが示されてきている。特定の理論にとらわれるものではないが、腸内細菌が、細菌の細胞壁に見られるリポ多糖体（ＬＰＳ）を介して、宿主である個体中で先天的免疫応答を誘導する可能性があり、宿主の炎症及び連鎖的な他の生理学的事象を引き起こすものと考えられている。更に、食品化合物の細菌代謝産物が、宿主中の生物学的活性を制限する可能性があるため、その結果、代謝異常に関与すると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0005]ＨＴＧ用の典型的なマーカーは、疾病に罹患する個体のリスクレベルに対応可能な選択性が欠如している。残念ながら、個体が代謝性の高トリグリセリド血症を発症するリスクを予測する迅速かつ正確な診断方法は、現在利用できない。本発明は、このニーズを満たし、関連する利点を供給する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0006]一実施形態において、本発明は、被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクがあるかどうかを予想する方法を提供する。本方法は、ａ）被験体より得られたサンプルを変換して、サンプル中の大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）濃度を検出するステップと、ｂ）対照試料に比べてサンプル中の大腸菌濃度が高いことにより、被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクにあるという予測を決定するステップと、を含む。
【０００７】
[0007]一部の態様では、サンプルは全血、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙液、他の任意の体液、組織サンプル（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）である。好適な態様では、サンプルは、糞便サンプルである。
【０００８】
[0008]一部の態様では、大腸菌濃度を検出するステップは、核酸増殖を実施するステップを含む。他の態様では、大腸菌濃度を検出するステップは、コロニーを計数するステップを含む。
【０００９】
[0009]一部の態様では、対照試料は、健康な対照被験体、又は高トリグリセリド血症を発症するリスクのない被験体に由来するものである。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態において、被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクにあるかどうかを予測する方法は、被験体が高トリグリセリド血症を発症するリスクにある場合、治療薬物の治療有効量の投与、抗生物質の投与、バクテリオファージの投与、食事指導の実施、栄養療法の実施、又はそれらの組み合わせの実施を推奨するステップを更に含む。
【００１１】
[0011]一部の態様では、治療薬物は、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００１２】
[0012]一部の態様では、食事指導は、炭水化物の食事制限、脂肪の食事制限、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００１３】
[0013]一部の態様では、栄養療法は、フィトステロール、タウリン、プロバイオティックス、炭水化物、タンパク質、食物繊維、ファイトニュートリエント及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの例において、栄養療法は、フィトステロール、長鎖多価不飽和脂肪酸、タウリン、プロバイオティックス、炭水化物、難消化性でんぷん、β−シクロデキストリン、タンパク質、大豆タンパク質、β−コングリシニン、グリシニン、食物繊維、オオバコ、ペクチン、β−グルカン、フラクトオリゴ糖、イヌリン、ファイトニュートリエント、イソフラボン、ポリフェノール、レスベラトロル、プニカラジン、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００１４】
[0014]他の実施形態において、本発明は、被験体の高トリグリセリド血症の治療法を提供する。本方法は、ａ）被験体より得られたサンプルを変換して、サンプル中の大腸菌濃度を検出するステップと、ｂ）対照試料に比べてサンプル中の大腸菌濃度が高いことにより、被験体が高トリグリセリド血症であるという診断を決定するステップと、ｃ）治療有効量の高トリグリセリド血症用の治療薬物の投与、抗生物質の投与、食事指導、栄養療法、又はそれらの組み合わせを実施するステップと、を含む。
【００１５】
[0015]一部の態様では、サンプルは全血、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙液、他の任意の体液、組織サンプル（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）である。好適な態様では、サンプルは、糞便サンプルである。
【００１６】
[0016]一部の態様では、大腸菌濃度を検出するステップは、核酸増殖を実施するステップを含む。他の態様では、大腸菌濃度を検出するステップは、コロニーを計数するステップを含む。
【００１７】
[0017]一部の態様では、対照試料は、健康な対照被験体、又は高トリグリセリド血症を発症するリスクのない被験体に由来するものである。
【００１８】
[0018]一部の態様では、治療薬物は、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００１９】
[0019]一部の態様では、食事指導は、炭水化物の食事制限、脂肪の食事制限、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００２０】
[0020]一部の態様では、栄養療法は、フィトステロール、タウリン、プロバイオティックス、炭水化物、タンパク質、食物繊維、ファイトニュートリエント及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００２１】
[0021]他の実施形態において、本発明は、被験体の高トリグリセリド血症の診断法を提供する。本方法は、ａ）被験体より得られたサンプルを変換して、サンプル中の大腸菌濃度を検出するステップと、ｂ）対照試料に比べてサンプル中の大腸菌濃度が高いことにより、被験体が高トリグリセリド血症であるという診断を決定するステップと、を含む。
【００２２】
[0022]一部の態様では、サンプルは全血、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙液、他の任意の体液、組織サンプル（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）である。好適な態様では、サンプルは、糞便サンプルである。
【００２３】
[0023]一部の態様では、大腸菌濃度を検出するステップは、核酸増殖を実施するステップを含む。一部の態様では、核酸増幅は、その配列が配列番号３及び４に記載されているオリゴヌクレオチドを使用して実施される。他の実施形態において、核酸増幅法には、腸内細菌反復遺伝子間コンセンサスＰＣＲ、又は反復遺伝子外ＰＣＲが含まれる。
【００２４】
[0024]本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明より、当業者にとってより明確となるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．イントロダクション
[0025]高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）とは、空腹時血清トリグリセリド（ＴＧ）濃度が、トリグリセリド又はトリグリセリドに富んだリポタンパク質粒子の過剰産生及び／又は不十分な除去により、上昇した状態である。高トリグリセリド血症は、異常なトリグリセリド（ＴＧ）代謝を起こす遺伝的欠陥により発症する可能性がある。あるいは、高トリグリセリド血症は、高脂肪の食事、過剰なアルコール摂取、特定の薬物、真性糖尿病、甲状腺機能低下症、インスリン抵抗性、及び高血圧などの、他の脂質及び代謝条件により発症する可能性がある。
【００２６】
[0026]個体がＨＴＧを発症するリスクを予測することは、現在利用可能なバイオマーカーの選択肢が不足しているために、困難である可能性がある。その上、トリグリセリド濃度の上昇は、高脂血症、脂質異常症及び心血管疾患の家族歴、肥満、高血圧、グルコース代謝異常、肝機能障害などの二次的要因など、代謝性疾患及び心血管疾患の他の危険因子と絡めて、常に評価されるべきであると推奨されている。
【００２７】
[0027]個体の胃腸系内の大腸菌濃度の上昇により、高トリグリセリド血症の発症を予測できることが発見されてきた。本発明は、疾患の有効な治療法を提供するだけでなく、個体の高トリグリセリド血症の発症リスクを評価する方法も提供する。
【００２８】
[0028]特定の態様では、本発明の実施において、分子生物学分野の技術を利用している。本発明の使用の一般的方法を開示している基本的な文書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））などが挙げられる。
【００２９】
ＩＩ．定義
[0029]本明細書で用いられる場合、以下の用語は、特別な定めのない限り、それらの用語に帰する意味を有している。
【００３０】
[0030]「脂質異常症（dyslipidemia）」は、血漿コレステロール、トリグリセリド（ＴＧ）、又はその両方の増加、又は低い高比重リポタンパク質濃度により定義される任意の条件を含む。脂質異常症は、アステローム性動脈硬化症の発症に寄与する可能性があり、そのため、アステローム性動脈硬化症のリスクを増大させる。脂質及びリポタンパク質の上昇のパターンによって識別される脂質異常症の様々な分類がある。分類Ｉは、カイロミクロン及びＴＧの上昇と定義され、分類ＩＩａは、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）及びコレステロールの上昇と定義され、分類ＩＩｂは、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びＬＤＬの上昇、並びにＴＧ及びコレステロールの上昇と定義され、分類ＩＩＩ−は、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン残留物の上昇、並びにＴＧ及びコレステロールの上昇と定義され、分類ＩＶは、ＶＬＤＬ及びＴＧの上昇と定義され、分類Ｖは、カイロミクロン及びＶＬＤＬの上昇、並びにＴＧ及びコレステロールの上昇と定義される。
【００３１】
[0031]「高トリグリセリド血症（hypertriglyceridemia）」という用語は、特定のカットオフ閾値点超の空腹時血漿トリグリセリド（ＴＧ）測定値、又は年齢及び性別の一致した健康体の対照と比較して増加又は上昇している空腹時血漿トリグリセリド（ＴＧ）測定値を含む。診断は、血漿ＴＧ濃度が個体の年齢及び性別での９０又は９５パーセンタイル値などの閾値を超えて上昇した時に、確定できるものと定義する。
【００３２】
[0032]血漿トリグリセリドの２つの主要な供給源は、外因性（食物脂肪由来）でカイロミクロン中に運ばれるもの、及び内因性（肝臓由来）で超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）粒子中に運ばれるものである。
【００３３】
[0033]「サンプル（sample）」という用語には、個体から得られた任意の生物試料が含まれる。本発明において使用に適したサンプルとしては、これらに限定されるものではないが、全血、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙液、他の任意の体液、組織サンプル（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）などが挙げられる。好適な実施形態において、サンプルは、糞便サンプルである。
【００３４】
[0034]「個体（individual）」、「被験体（subject）」、又は「患者（patient）」という用語には、典型的にヒトを含むものであるが、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科の動物などの他の動物も含まれる。
【００３５】
[0035]「サンプルを変換する（transformingthe sample）」という用語には、本明細書で定義されるマーカー（例えば、大腸菌又は他の細菌）を抽出する及び／又は得るためのサンプルの物理的又は化学的変化が含まれる。マーカーを評価するためのサンプルの抽出、操作、化学沈殿、ＥＬＩＳＡ、免疫抽出、物理的又は化学的修飾、これらすべては、変換の構成要素である。変換ステップの前後のサンプルが一致しないのであれば、この変化は変換である。
【００３６】
[0036]「分類する（classifying）」という用語には、サンプルを病態と「関連付ける（to associate）」、又は病態に「分類する（to categorize）」という意味が含まれる。特定の例において、「分類する（classifying）」は、統計的エビデンス、経験的エビデンス、又はその両方に基づくものである。特定の実施形態において、分類方法及び分類システムは、既知の病態を有するサンプルのいわば訓練データ集合を用いる。訓練データ集合を一度設定すると、サンプルの未知の病態を分類するために、未知の試料の特徴と比較する基準、モデル又はテンプレートとして機能する。特定の例において、サンプルを分類することは、サンプルの病態を診断することと類似している。他の特定の例において、サンプルを分類することは、サンプルの病態を他の病態と識別することと類似している。
【００３７】
[0037]「食事指導（dietaryintervention）」という用語には、個体の飲食物又は食事摂取量と関連のある治療が含まれる。この治療には、欠乏を防ぐこと、個体の病気又は病状を治療すること、又はより一般的には、症状を緩和させること、病気の進行を管理すること、又は栄養学的、生理学的又は医学的な利点を個体に提供すること、これらを対象とした、食事に関連する成分、制限と推奨事項が含まれる。食事指導の例としては、これらに限定されるものではないが、炭水化物の削減、脂肪の削減、減量、アルコール消費量の削減、身体的活動の増加、低脂肪又は極低脂肪の食事の維持などが挙げられる。
【００３８】
[0038]「栄養療法（nutritionalintervention）」という用語には、個体の栄養摂取量と関連のある治療が含まれる。この治療には、欠乏を防ぐこと、個体の病気又は病状を治療すること、又はより一般的には、症状を緩和させること、病気の進行を管理すること、又は栄養学的、生理学的又は医学的な利点を個体に提供すること、これらを対象とした栄養に関連する成分、栄養補助食品と推奨事項が含まれる。栄養療法の例としては、これらに限定されるものではないが、オメガ３脂肪酸（例えば魚油）、フィトステロール、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）、タウリン、プロバイオティックス（例えば、ラクトバシラス・プランタラム、ビフィドバクテリウム・ロンガムなど）、炭水化物（例えば、難消化性でんぷん、β−シクロデキストリンなど）、タンパク質（例えば、大豆タンパク質、β−コングリシニン、グリシニンなど）、食物繊維（例えば、オオバコ、ペクチン、β−グルカン、フラクトオリゴ糖、イヌリンなど）、ファイトニュートリエント（例えば、イソフラボン、ブドウ由来のポリフェノール、レスベラトロル、ザクロ中のプニカラジン、緑茶、ウーロン茶など）、エイコサノイド、パルミトオレイン酸、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００３９】
[0039]「治療有効量又は服用量」という用語には、治療効果を必要としている被験体において、治療効果を達成することが可能である薬物の用量が含まれる。例えば、高トリグリセリド血症の治療に有用な薬物の治療有効量は、高トリグリセリド血症に関連する１つ又はそれ以上の症状を抑える又は緩和することが可能な量であってよい。正確な量は、既知の技術を用いて、当業者によって確かめられることが可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１〜３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓなどを参照）。
【００４０】
ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
[0040]本明細書に記載されているものは、患者の糞便サンプルなどのサンプル中の大腸菌濃度（例えば、腸内大腸菌）を測定することにより患者の高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）を予測する方法である。本発明は、ＨＴＧを発症するリスクのある患者、又はＨＴＧを発症しやすい患者の治療法も提供する。このように、本発明は、治療法の決定に導くために有用なＨＴＣの正確な診断予測法を提供する。
【００４１】
Ａ．大腸菌の検出
１．サンプルの調製
[0041]本明細書に記載されている方法は、高トリグリセリド血症の存在を検出し、発症のリスクを評価し及び／又は高トリグリセリド血症の進行を監視するための方法として、個体の胃腸組織、特に糞尿サンプルに見られる、大腸菌の量又は大腸菌に特有のＤＮＡ又はＲＮＡの量を測定することに関する。いくつかの実施形態において、発明を実施する最初のステップは、個体より糞便サンプルを得ること、及びサンプルから核酸を抽出することである。
【００４２】
[0042]サンプルは、高トリグリセリド血症などの脂質異常症を有することを試験又は監視される個体から、本発明の方法を使用して得ることが可能である。サンプルは、糞便、患者の組織から得ることが可能であり、サンプルはこれらに限定されるものではないが、口腔粘膜、鼻粘膜、肺粘膜、及び腸粘膜の組織を含む粘膜組織、又は例えば血液、唾液、尿、痰、リンパ液、涙液などの体液であってもよい。いくつかの実施形態において、適正な量のサンプルを集めて、更に調製する前に、標準手順に従ってこれを保管してもよい。
【００４３】
[0043]いくつかの例において、サンプルをバッファー又は培地内で懸濁させ、その後、サンプルは、細菌の増菌のために、半選択又は選択培地（例えば、ドリガルスキー成長培地）のどちらかに、様々な希釈度で蒔かれている。
【００４４】
[0044]本発明に従った個体の胃腸サンプルに見られる大腸菌ＲＮＡ又はＤＮＡの分析は、例えば、糞便又は胃腸の細胞を用いて実施してもよい。核酸抽出用組織サンプルの調製法は、当業者間ではよく知られている。例えば、被験体の胃腸細胞のサンプルは、細胞内に含まれる核酸を放出するために、細胞壁を破壊するための一次処理をすべきである。
【００４５】
２．核酸の抽出及び定量
[0045]生体サンプル由来のＲＮＡ又はＤＮＡの抽出方法は、分子生物学の当業者にはよく知られており、頻繁に実施されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｓｕｐｒａを参照）。ＲＮＡの混在物は、ＤＮＡ分析に障害となることを避けるために、除去されるべきである。例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｓｔｏｏｌ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ），ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｆｅｃａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），ＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），ＰｏｗｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ（商標）ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ｓｔｏｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ）などの市販されているキットは、細菌の核酸の抽出用にも使用可能である。
【００４６】
３．核酸の検出及び定量
[0046]サンプル中の大腸菌のＤＮＡ又はＲＮＡ濃度（量）（及びその結果大腸菌の細菌濃度）を決定するために使用可能であるアッセイとしては、これらに限定されるものではないが、電気泳動分析、制限断片長多型分析、配列分析、ハイブリダイゼーション分析、リボタイピング分析、リボソームＤＮＡの不均一性分析、及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲベースの変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）、反復遺伝子外パリンドロームＰＣＲ（ｒｅｐ−ＰＣＲ）、及び腸内細菌反復遺伝子間コンセンサスＰＣＲ（ＥＲＩＣ−ＰＣＲ）などのＰＣＲ分析などが挙げられる。これらのアッセイは明確に説明されており、標準法は当該技術分野において既知である。たとたとえ例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４〜２００８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ７  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７；Ｔｈｅｏｐｈｉｌｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，「ＰＣＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，（２００２）；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４〜２００８）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４〜２００８）などを参照。これらの文書すべては、その全体が参照によりすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【００４７】
[0047]いくつかの実施形態において、サンプル中の大腸菌濃度は、ＰＣＲ分析などの標準的な核酸増幅法により定量される。一実施形態において、以下のオリゴヌクレオチド・プライマー対が使用される。５’−ＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＡ（配列番号３）、及び５’−ＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡ（配列番号４）反応条件には、以下のステップが含まれていてもよい。５０℃で２分間の変性、以下の条件でのＰＣＲでの増幅：９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、これらを４０サイクルで行う。増幅産物は、当該技術分野で既知である標準的な方法により検出及び測定することが可能である。
【００４８】
[0048]他の実施形態において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子特異的ＰＣＲが、大腸菌濃度を検出するために使用される。例えば、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの超可変領域を、領域特異的なプライマーを用いて増幅させ、単位複製配列を作成することが可能である。
【００４９】
[0049]ＥＲＩＣ−ＰＣＲとは、特異的な腸内細菌反復配列（例えばＤａｌｌａ−Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：２２７〜２３４（１９９８）を参照）用のプライマーを用いて増幅産物が産出されるＰＣＲ分析タイプのことを指す。本発明の一実施形態において、サンプル中の大腸菌ＤＮＡ濃度は、以下のオリゴヌクレオチド・プライマー対を用いて、ＥＲＩＣ−ＰＣＲを実施することで、決定される。５’−ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ（配列番号２９）、及び５’−ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ（配列番号３０）典型的なＰＣＲ反応混合物には、テンプレートＤＮＡ、オリゴヌクレオチド・プライマー、ｄＮＴＰ、増幅用バッファー、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれていてもよい。代表的な反応条件には、９５℃で５分間の変性、及び以下の条件でのＰＣＲ増幅が含まれる。９５℃で４５秒、５２℃で１分間、７０℃で１０分間、これらを３５サイクル行い、及び７０℃で２０分間延長して実施する。増幅産物は、ゲル電気泳動、又は当該技術分野で既知である他の方法により分離が可能である。
【００５０】
[0050]Ｒｅｐ−ＰＣＲ  ＤＮＡ指紋法とは、隣接する反復遺伝子内の要素間のＤＮＡ増幅を、株特異的なＤＮＡ指紋鑑定結果を得るために使用するＰＣＲ分析タイプのことを指す。本発明の一実施形態において、サンプル中の大腸菌ＤＮＡの存在は、以下のオリゴヌクレオチド・プライマー対を用いて、ｒｅｐ−ＰＣＲを実施することで、決定される。５’−ＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧ（配列番号３１）いくつかの実施例において、全細胞懸濁液が増幅用のテンプレートとして使用される。いくつかの実施形態において、反応条件には、９５℃で２分間の変性、以下の条件でのＰＣＲ増幅が含まれる。９５℃で３秒間、９２℃で３０秒間、５０℃で１分間、６５℃で８分間、これらを３０サイクル行い、及び６５℃で８分間延長して実施する。増幅産物は、ゲル電気泳動法により分析可能である。増幅産物のゲルの画像は、デジタルに画像化し、統計分析を実施することで、標準化されたＤＮＡ指紋鑑定画像と比較することが可能である。
【００５１】
４．細菌の検出及び定量
[0051]本発明の一部の態様では、免疫学的イムノアッセイなどの方法を、サンプル内の大腸菌濃度の検出に使用することが可能である。イムノアッセイの非限定的な例としては、ＥＬＩＳＡ、固相イムノアッセイ、ウエスタンブロット、及びタンパク質マイクロアレイなどが挙げられる。
【００５２】
[0052]本発明の一部の態様では、細菌の培養に基づく分析が、好気的条件又は嫌気的条件のいずれかにおける培地上での細菌の培養（播種）、及び形成されたコロニー数の定量により実施される。一実施形態において、サンプルは培地（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ培地）内で希釈され、ＴＳＳ培地などの非選択的な培地上で、好気的条件又は嫌気的条件のいずれかで、約２４〜４８時間、３７℃で播種される。サンプル中の細菌数は、サンプルサイズに対して形成されたコロニー数と比例する。本方法の詳細な説明は、例えば、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２３：２３５〜２４５（２００５）などで見られる。
【００５３】
[0053]他の実施形態において、サンプル内の腸内細菌科は、以下の方法により定量される。１）培地（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ培地）内のサンプルを希釈し、振盪し、遠心分離（例えば、１０，０００ｒｐｍで１０分間）を行い、２）培地（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ培地）内でペレットを再懸濁し、３）細胞をドリガルスキー培地及びＥＭＢ培地のプレート上に広げて、好気性条件において、３７℃で約１８〜２４時間培養し、４）形成されたコロニーを定量する。本方法の詳細な説明は、例えば、Ｍｅｍｂｒｅｚ  ｅｔ  ａｔ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒ．，２２：２４１６〜２４２６（２００８）などで見られる。
【００５４】
[0054]更に別の実施形態において、上述のステップ１）のバクテリア細胞のペレットを洗浄後、細胞の懸濁液を、腸内細菌科の増菌用培養液（Ｅ．Ｅ．ｂｒｏｔｈ；Ｏｘｏｉｄ  ＬＴＤ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に２４時間、３７℃で植菌し、その後、細胞をＥＭＢ寒天培地上に広げる。コロニーの腸内細菌科は、ＡＰＩ  ＩＤ３２Ｅ  ｔｅｓｔ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）などの標準的な技術を用いて、同定が可能である。本方法の詳細な説明は、例えば、Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（２００３）などで見られる。
【００５５】
[0055]いくつかの実施形態において、高トリグリセリド血症と関連がある細菌は、サンプルを検出培地に植菌することで検知可能であり、この培地は、基質の選択を通じて検知したい細菌の酵素活性などの代謝活性に特異的な特定の基質を含んでおり、反応の有無によって、微生物の特質を特徴化することが可能である。そのような方法の例が、例えば、米国特許第８，３３４，１１２号に詳細に説明されている。
【００５６】
[0056]いくつかの実施形態において、腸内細菌科の濃度は、大腸菌などの関心のある腸内細菌科に特異的な結合分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマーなど）を用いて、検出可能である。
【００５７】
[0057]他の実施形態において、腸内細菌科の濃度は、大腸菌などの関心のある腸内細菌科に特異的な分子（例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、化合物など）を検出することにより測定可能である。一実施形態において、例えば、サンプル中の大腸菌などの腸内細菌科の濃度を検知する方法には、サンプルと、細菌から産出される及び／又は分泌される酵素用の検出可能な標識基質とを、酵素による基質の修飾が起きる条件下で、接触させるステップ、及び修飾又は基質の修飾がないことを検出するステップが含まれる。基質が修飾されることは、サンプル内に腸内細菌科が存在することを示し、基質が修飾されないことは、サンプル内に細菌が存在しないことを示す。そのような方法の例が、例えば、米国特許第８，３７７，６５１号に詳細に説明されている。
【００５８】
[0058]特定の大腸菌株を同定する方法は、本発明において有用である。そのような方法としては、リボタイピング、シーケンシング（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシング）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、末端標識制限断片長多型法、リボソームの遺伝子間スペーサーＰＣＲ分析、ＤＮＡマイクロアッセイ、ＦＩＳＨ、ｑＰＣＲ、及びｑＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられる。
【００５９】
Ｂ．高トリグリセリド血症の予測
[0059]いくつかの実施形態において、個体サンプル中の大腸菌濃度が、対照試料（例えば、健康体の対照被験体又は高トリグリセリド血症を有していない個体に由来するサンプル）の大腸菌濃度よりも高い場合に、その個体にはＨＴＧ発症のリスクがある又はＨＴＧが発症しやすいと決定される。いくつかの実施形態において、大腸菌濃度が、対照試料の大腸菌濃度よりも、例えば、少なくとも約２×、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、あるいはそれ以上など、少なくとも２倍（２×）高い場合に、ＨＴＧが予測される。いくつかの実施形態において、大腸菌濃度が、対照試料の大腸菌濃度よりも、例えば、少なくとも約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、あるいはそれ以上など、少なくとも５倍（５×）高い場合に、ＨＴＧが予測される。
【００６０】
[0060]いくつかの実施形態において、サンプル中の大腸菌濃度が、対照試料の大腸菌濃度と同じかあるいは低い場合、個体はＨＴＧを発症するリスクを有していない、又はＨＴＧを発症していないとしている。
【００６１】
[0061]いくつかの実施形態において、個体サンプル中の大腸菌濃度が、対照試料（例えば、健康体の対照被験体又は高トリグリセリド血症を有していない個体に由来するサンプル）の大腸菌濃度よりも高い場合に、その個体がＨＴＧを有していると診断する。いくつかの例において、試験サンプル中の大腸菌濃度が、対照試料の大腸菌濃度よりも、例えば、少なくとも約２×、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、あるいはそれ以上など、少なくとも２倍（２×）高い場合に、ＨＴＧであると診断する。いくつかの実施形態において、大腸菌濃度が、対照試料の大腸菌濃度よりも、例えば、少なくとも約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、あるいはそれ以上など、少なくとも５倍（５×）高い場合に、ＨＴＧであると診断する。
【００６２】
Ｃ．治療薬の投与
[0062]いくつかの実施形態において、本方法には、治療有効量の治療薬の投与、抗生物質の投与、食事指導、栄養療法の実施、又はそれらの組み合わせを実施することが含まれ、その結果として高トリグリセリド血症又はその症状を治療することが含まれる。いくつかの例において、治療有効量が、腸内細菌の全量、又は腸内の腸内細菌の相対量を削減するよう、選択される。
【００６３】
[0062]いくつかの実施形態において、腸内細菌の全量に対する腸内細菌の相対量の、約１％〜約１００％、好ましく約５０％〜約１００％、更に好ましくは約７５％〜約１００％が削減又は取り除かれている。他の実施形態において、相対量の、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％が削減されている。いくつかの例において、その割合（パーセンテージ）は、腸内に存在する細菌種のコロニー形成単位（ｃｆｕ）に基づいて、計算されている。
【００６４】
[0062]いくつかの実施形態において、治療薬の治療有効量が、単独で投与される。他の実施形態において、治療薬は、栄養療法での治療有効量と組み合わせて投与される。
【００６５】
[0062]ＨＴＧに関連する１つ又はそれ以上の症状又はこれらの臨床サブタイプの治療に役立つ好適な薬物としては、これらに限定されるものではないが、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせを含むフィブラートなどが挙げられる。
【００６６】
[0063]治療薬の適用において、高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）薬は、単独で、又は１つ又はそれ以上の追加のＨＴＧ薬及び／又はＨＴＧ薬と関連する副作用を低減する１つ又はそれ以上の薬物との組み合わせと同時に投与することが可能である。
【００６７】
[0064]ＨＴＧ薬は、必要に応じて、好適な医薬品賦形剤と共に投与してもよく、任意の許容されている投与法により投与してもよい。このように、投与法は、例えば、静脈内、局所、皮下、経皮（transcutaneous）、経皮的（transdermal）、筋肉内、経口、口腔、舌下、歯肉、口蓋、関節内、非経口、細動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣内、又は吸入であってもよい。「同時投与（co-administer）」によりとは、ＨＴＧ薬を、二次薬（例えば、他のＨＴＧ薬、ＨＴＧ薬の副作用を低減するのに有効な薬など）の投与と同時に、投与直前に又は投与直後に投与することを意味する。
【００６８】
[0065]ＨＴＧ薬の治療の有効量を、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はそれ以上の回数繰り返し投与してもよく、あるいは持続注入による投与であってもよい。投与は、例えば、錠剤、ピル、ペレット剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳剤、座薬、停留かん腸、クリーム、軟膏、ローション、ジェル、エアロゾル、泡、又はこれと同類のものなど、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体の剤形であってもよく、好ましくは正確な投与量の簡易投与に適した単位剤形であってもよい。
【００６９】
[0066]本明細書で使用される場合、「単位剤形（unit dosage form）」という用語には、ヒトである被験者、及び他の哺乳動物への単一の投与に適した物理的に個別の単位が含まれ、各単位は好適な医薬品賦形剤（例えば、アンプル）と関連した、望ましい発現、忍容性、及び／又は治療効果を作り出すために計算された、所定量のＨＴＧ薬を含む。更に、より高濃度の剤形を調製してもよく、その高濃度の剤形から、より低濃度の単位剤形を作成してもよい。このように、より高濃度の剤形には、実質的にＨＴＧ薬の量超、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、又はそれ以上の量が、含まれていることになる。
【００７０】
[0067]好適な賦形剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び例えばＣａｒｂｏｐｏｌ  ９４１、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９８０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９８１などのカーボポール（Carbopol）などのポリアクリル酸が挙げられる。剤形は、更に、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、メチル、エチル、及びプロピル−ヒドロキシ−ベンゾエート（例えば、パラベン）などの保存剤、無機及び有機の酸及び塩基などのｐＨ調整剤、甘味剤、及び香味剤を含んでいてもよい。剤形には、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接錯体も含まれていてよい。
【００７１】
[0068]経口投与では、治療の有効量は、錠剤、カプセル、乳剤、懸濁液、溶液、シロップ剤、スプレー剤、トローチ剤、粉末、及び徐放性製剤の形態であってもよい。経口投与用の好適な賦形剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、及びこれらと同類のものなどが挙げられる。
【００７２】
[0069]いくつかの実施形態において、治療の有効量は、ピル、錠剤、又はカプセルの形態であり、そのため、剤形は、ＨＴＧ薬と共に、以下のうちのいずれかを含んでいてもよい。ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、及びこれと同類のものなどの希釈剤、デンプン、又はその誘導体などの錠剤分解物質、ステアリン酸マグネシウム及びこれと同類のものなどの潤滑剤、及びデンプン、アカシア・ゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース、及びこれらの誘導体などの結合剤。ＨＴＧ薬は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体中で処理された坐薬中でも処方してよい。
【００７３】
[0070]液体の剤形は、例えば、経口用、局所用、又は静脈内投与用などの溶液又は懸濁液を作成するために、ＨＴＧ薬、及び任意追加的に例えば、生理食塩水溶液（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、及びこれらと同類のものなどの担体中の１つ又はそれ以上の医薬的に許容されるアジュバントを溶解させ、又は分散させることで調製が可能である。ＨＴＧ薬は、停留かん腸中で処方することも可能である。
【００７４】
[0071]好ましくは、注射剤は、約４．５〜約７．５のｐＨで処方する。
【００７５】
[0072]治療有効量を、凍結乾燥された形態で供給してもよい。そのような剤形は、投与前に液体でもどすために、例えば重炭酸塩などのバッファーを含んでいてもよく、又はバッファーが、例えば水を使って元にもどすために、凍結乾燥された剤形中に含まれていてもよい。凍結乾燥された剤形は、例えばエピネフリンなどの好適な血管収収縮薬を更に含んでいてもよい。凍結乾燥された剤形は、シリンジで供給してもよく、水でもどした剤形をすぐに個体へ投与が可能なように、任意選択的に水でもどすためのバッファーと組み合わせて包装してもよい。
【００７６】
Ｄ．食事指導
[0073]いくつかの実施形態において、食事指導が、ＨＴＧを発症するリスクのある又はＨＴＧと診断された個人に実施される。そのような指導としては、個人の食事、体重管理（減量）プログラム、運動の増加、行動変容、及びカロリー制限などが挙げられる。いくつかの実施形態において、食事指導には、食事における炭水化物及び／又は脂肪の制限が含まれる。
【００７７】
[0074]いくつかの実施形態において、食事指導とは、炭水化物が毎日のカロリー摂取量の２０％未満である低炭水化物食である。低炭水化物食は、炭水化物摂取量を一日約２０〜６０ｇに制限する規定食であってもよい。
【００７８】
[0075]いくつかの実施形態において、食事指導とは、脂肪が毎日のカロリー摂取量の約２０〜３０％又はこれ未満である低脂肪食である。
【００７９】
Ｅ．栄養療法（栄養補助食品）
[0076]いくつかの実施形態において、栄養療法としては、例えば、長鎖多価不飽和脂肪酸（例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのオメガ３多価不飽和脂肪酸、オメガ６多価不飽和脂肪酸、及びαリノレン酸）及び単不飽和脂肪酸などのフィトステロール、タウリン、植物化学物質、フィトステロール（例えば、植物ステロール、及び植物スタノール）、プロバイオティクス（例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ロイテリ、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム）、炭水化物（例えば、難消化性でんぷん、β−シクロデキストリン）、タンパク質（例えば、大豆タンパク質、β−コングリシニン、グリシニン）、食物繊維（例えば、オオバコ、ペクチン、β−グルカン、イヌリン）、ファイトニュートリエント／植物化学物質（例えば、イソフラボンや、フラボノイド、フラボノール、アントシアニン、タンニン、及びレスベラトロルなどのブドウ由来ポリフェノール、プニカラギン、カテキン）、ハーブ、香辛料及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。他の栄養療法としては、これらに限定されるものではないが、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、部分的に加水分解されたグアーガム（ＰＨＧ６）、ＰＨＧ６／ＦＯＳ混合物、魚油、ｎ−６脂肪酸及びｎ−３脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、クロリン、ナイアシン、難消化性でんぷん、エイコサノイド、パルミトオレイン酸、プレバイオティクス、酵母、抗生物質、食品、飲料製品、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００８０】
[0077]いくつかの実施形態において、栄養療法は、経管栄養の処方物、又は経口の栄養補助食である（例えば液体又は固体）。他の実施形態において、栄養療法は、食品又は飲料製品である。
【００８１】
[0078]栄養療法として、例えば高トリグリセリド血症などの高脂血症の個体のトリグリセリドの上昇を低減するのに有効な用量及び期間で、剤形中に投与してもよい。
【００８２】
[0079]いくつかの実施形態において、栄養療法の治療有効量が、単独で投与される。他の実施形態において、栄養療法は、治療薬の治療有効量と組み合わせて投与される。治療薬の非限定的な例としては、例えば、ベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ）、シプロフィブラート（Ｍｏｄａｌｉｍ）、クロフィブラート（Ａｂｉｔｒａｔｅ、Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ）、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（Ｌｉｆｉｂｒ、Ａｎｔａｒａ、Ｌｉｐｏｆｅｎ、Ｔｒｉｇｌｉｄｅ、ＴｒｉＣｏｒ）、及びそれらの組み合わせなどのフィブラート類が挙げられる。フィブラート類には、血漿脂質値を下げるために使用可能な任意のフィブリン酸誘導体剤が含まれる。
【００８３】
[0080]いくつかの実施形態において、栄養療法は、フィトステロール源である。フィトステロールには、植物ステロール及びスタノールエステルが含まれる。栄養療法の処方物には、限られた量の飽和脂肪酸（例えば、栄養療法における合計のエネルギーの７％未満）、コレステロール（例えば、２００ｍｇ未満）、及びトランス脂肪酸が含まれていてもよい。
【００８４】
[0081]他の実施形態において、栄養療法は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）源である。栄養補助食品は、一日に２〜４ｇのＥＰＡ及びＤＨＡなどのオメガ３脂肪酸又は海産魚由来のオメガ３脂肪酸であってもよい。他の実施形態において、補助食品は、一日に３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８ｇなど、一日に約３〜１８ｇの量の魚油であってもよい。栄養療法としては、オメガ３多価不飽和脂肪酸、又はオメガ６多価不飽和脂肪酸に富んだ食事であってもよい。
【００８５】
[0082]特定の例において、特に被験体のトリグリセリド濃度が高い場合、ｎ−３脂肪酸を与えてもよい。特定の例において、ＰＨＧ６／ＦＯＳの混合が特に好ましい。
【００８６】
[0083]プレバイオティクスには、腸内のプロバイオティクス細菌の成長を促進させる目的の食物が含まれる。例えば、プレバイオティクスは食物繊維であってもよい。食物繊維とは、人体で消化されない繊維である。食物繊維の非限定的な例としては、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ピロデキストリン、トランスガラクトしレーション化オリゴ糖、ラクツロース、β−グルカン、イヌリン、ラフィノース、スタキオース、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００８７】
[0084]プロバイオティクスは、微生物細胞の製剤、又は宿主の個体の健康又は福祉に有益な効果のある微生物細胞の構成成分のことを指す。プロバイオティクス細菌の非限定的な例としては、ビフィドバクテリウム、乳酸菌、ラクトコッカス、エンテロコッカス、ストレプトコッカス子嚢菌類、不完全菌門、デバリオマイセス属、クルイウェロマイセス属、サッカロマイセス属、ヤロウィア属、ジゴサッカロマイセス属、カンジダ、ロドトルラ属、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＮＣＣ４９０；ＣＮＣＭ  Ｉ−２１７０；ＮＣＣ２７０５；ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（ＮＣＣ２８１８；ＣＮＣＭ  １−３４４６；Ｂｂ１２）、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス（ＮＣＣ４００７；ＣＧＭＣＣ  １．３７２４）、ラクトバシラス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）、ラクトバシラス・パラカゼイ（ＮＣＣ２４６１；ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）、ラクトバシラス・ジョンソニー（ＮＣＣ５３３；ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・サリバリウス、エンテロコッカス・フェシウム、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、エンテロコッカス・フェシウムＳＦ  ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）、及びこれらの混合物などが挙げられる。中程度の高コレステロール血症であった２型糖尿病の個体の調査で、ラクトバシラス・アシドフィルス、及びビフィドバクテリウム・ラクティス含むプロバイオティクのヨーグルトを６週間毎日摂取することにより、ＬＤＬ−コレステロール濃度が減少したことが示された（Ｅｊｔａｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ，９４（７）：３２８８〜９４（２０１１））。
【００８８】
[0085]本発明で有用な抗生物質としては、これらに限定されるものではないが、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシンなどのアミノグリコシド系の抗生物質類、ポリミキシンＢなどのポリペプチド抗生物質類、アンピシリンなどのペニシリンβ−ラクタム類、及びシプロフロキサシン及びノルフロキサシンなどのキノロン系／フルオロキノロン系抗生物質類などが挙げられる。他の実施形態においては、バクテリオファージ、又は異なるバクテリオファージの組み合わせが用いられてもよい。バクテリオファージは、抗生物質耐性がある場合に、都合よく使用が可能である。バクテリオファージは細菌細胞に侵入するウイルスで、溶菌性ファージの場合は、細菌の代謝を妨害し、細菌の溶解を引き起こす。バクテリオファージは、病原菌の感染症を治療することにも使用可能である。ほとんどのファージは、一種の細菌に対して特異的であるため、単一のバクテリオファージ、又は異なるバクテリオファージの組み合わせが使用可能である。
【００８９】
[0086]他の実施形態において、栄養療法は、タンパク質源である。例えば、任意の好適な食品タンパク質、例えば、動物タンパク質（乳タンパク質、食肉タンパク質、及び卵タンパク質など）、植物タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質、及びエンドウ豆タンパク質など）、遊離アミノ酸（例えば、タウリン）、又はそれらの組み合わせなどが利用可能である。
【００９０】
[0087]大豆タンパク質の摂取による生物学的効果、並びに循環血液中の脂質及び心血管疾患を発症するリスクの減少が、かなり立証されている。例えば、大豆タンパク質添加は、炭水化物と比較した血漿トリグリセリド濃度の低下（Ｗｏｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，６６（４）：４１９〜２５（２０１２））及びＬＤＬコレステロール濃度の低下（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ，３０（２）：７９〜９１（２０１１））と著しく関係があることが示されている。大豆イソフラボン、β−コングリシニン、及びグリシニンなどの大豆タンパク質の構成成分でも、動物モデル中の循環血液中のＴＧ量を減少させた（ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｆｕｎｃ  Ｆｏｏｄｓ，２：２７５〜２８３（２０１０））。
【００９１】
[0088]動物又はヒトでの調査データにより、コレステロール濃度に対するタウリン（２−アミノエタンスルホン酸）のプラスの効果及び、血漿トリグリセリドに対するタウリンの潜在的なプラス効果が示されている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，４０３：６１５〜２２（１９９６）；Ｌｏｍｂａｒｄｉｎｉ  ａｎｄ  Ｍｉｌｉｔａｎｔｅ，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，５８３，２５１〜２５４（２００６））。
【００９２】
[0089]他の実施形態において、栄養剤は、炭水化物源である。炭水化物の非限定的な例としては、難消化性でんぷん、β−シクロデキストリン、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、固体のコーンシロップ、マルトデキストリン、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００９３】
[0090]ハイアミロースコーンスターチなどの難消化性でんぷんは、小腸で消化せずに、むしろ腸内微生物叢によりその（でんぷんの）発酵が起きる大腸をも通過してしまう任意のでんぷんのことである。ある調査では、ハイアミロースコーンスターチが、高脂血症の動物モデルでのＴＧ濃度を減少させることが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｔｒｉ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１（２）：８９〜９７（２０１０））。他の調査では、高コレステロールの食事へのβ−シクロデキストリンの添加が、ラットの血漿ＴＧ濃度を低下させた（Ｇａｒｃｉａ−Ｍｅｄｉａｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，９２（２）：９４〜９（２００３）；Ｆａｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４４（２）：２００〜６（１９９５））。
【００９４】
[0091]他の実施形態において、栄養剤は、食物繊維源である。食物繊維としては、これらに限定されるものではないが、オオバコ、ペクチン、オート麦のふすま又はオオムギ由来のβ−グルカン、フラクトオリゴ糖（例えば、イヌリン）、ペクチン、グアーガム、アカシア・ゴム、ガラクトオリゴ糖、シアリル−ラクトース、乳由来のオリゴ糖、及び果物、野菜、ナッツ及び穀物、及びそれらの組み合わせ由来の他の食物繊維などが挙げられる。
【００９５】
[0092]低脂肪、高炭水化物の食事は、通常、血漿ＴＧ濃度を増加させるが、しかしながら、食物繊維を含む治療により、これらの効果を弱めることが可能である。例えば、中程度に高炭水化物の食事へのイヌリンの添加により、健康体の個体の血漿ＴＧ濃度が減少した（Ｌｅｔｅｘｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，７７（３）：５５９〜６４）。オオバコの消費が、２型糖尿病の被験体内のＴＧを下げることが示されており（Ｓａｒｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，６３（１０）：１２６９〜７１（２００９））、肥満の若い被検体についても示されている（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９（３）：２３５〜４２（２００３））。更に、メタ分析調査により、オオバコが、血清の全コレステロール及びＬＤＬコレステロールを、時間依存的、及び用量依存的に減少させることが実証された（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，６３（７）：８２１〜７（２００９））。４０〜６０歳の被験体の疫学調査により、ペクチンの摂取が、血清ＴＧ濃度に逆比例することが示されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，７８（６）：１０８５〜９１（２００３））。更に、糖食へのフラクトオリゴ糖の添加により、インスリン抵抗性のラットモデル中での血漿ＴＧ濃度及び遊離脂肪酸濃度が改善する（Ａｇｈｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ，１２８（８）：１２８３〜８（１９９８））。
【００９６】
[0093]腸内の腸内細菌の量を減少させるために使用可能な他の栄養剤に、例えば、ファイトニュートリエントなどの植物化学物質が含まれていてもよい。植物化学物質は、植物又は果物由来の化合物のことを指し、ファイトニュートリエントは、食用植物由来の植物化学物質のことを指す。ファイトニュートリエント及び植物化学物質の非限定的な例としては、イソフラボンなどのファイトニュートリエント、フラバン、アントシアニン、クエルセチン、ミリセチン、ケンプフェロール、及びレスベラトロルなどのブドウ由来のポリフェノール、プニカラギン、エラジタンニン、ぺルラゴニジン、ペラルゴニジン、プニカリン、アントシアニン、シアニジン、及びエラグ酸などのザクロ由来の植物化学物質、インドール、ポリフェノール、エピガロカテキン、エピガロカテキン没食子酸塩、フラボノイド、タンニン、テアフラビン、タンニン酸、テオフィリン、テオブロミン、アントシアニン、及びプロシアニジンなどの緑茶、ウーロン茶、又はコーヒー由来の植物化学物質、（Ｅ）−２−ヘキセナールなどのカシューアップルフレーバー由来の植物化学物質、カルノソル、カルノジック酸、又はロスマリン酸などのローズマリー由来の植物化学物質、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００９７】
[0094]いくつかの実施形態において、栄養療法には、粉乳ベースの製品、インスタント飲料、レディ・トゥ・ドリンク処方物、栄養粉末、乳製品（例えば、ヨーグルト又はアイスクリーム）、シリアル製品、飲料、水、茶（例えば、緑茶又はウーロン茶）、コーヒー、エスプレッソベースの飲料、麦芽飲料、チョコレートフレーバーの飲料、食品及びスープなどを含む食糧製品が含まれる。一実施形態において、栄養剤とは、栄養学的に完全な処方物である。
【実施例】
【００９８】
ＩＶ．実施例
[0095]以下の実施例は、これらに限定されるわけではないが、請求項に係る発明を例示したものである。
【００９９】
実施例１：
[0096]インスリン感受性の調節におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）の役割を裏付けるエビデンスが増えているものの、腸内細菌由来の無傷ＬＰＳの、宿主のグルコース代謝への相対的寄与に関してはほとんど知られていない。この調査で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）個体数が、ｌｅａｎ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、ｏｂ／ｏｂマウスの回腸遠位部、盲腸及び結腸において、それぞれ２．０、３．１及び２．９（ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ）倍だけ多くなることが示されている。過剰の大腸菌個体数が、レプチン欠乏の結果であるというだけでなく、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満及びインスリン耐性に部分的に寄与しているかどうかを調査するために、大腸菌をｏｂ／ｏｂマウスの糞便から隔離し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの通常食に、飲料水を介して、９週間投与した。大腸菌の添加は、糞便及び盲腸の大腸菌数の継続的な増加を引き起こしたが、マウスの体重、身体組成及び耐糖能には影響しなかった。しかしながら、大腸菌処置したマウス中での血漿濃度（ｐ＝０．０７）及び肝臓トリグリセリド濃度（ｐ＝０．０５１）の増加の傾向が観察された。より重要なことには、賦形剤での治療と比べて、大腸菌投与は、経口脂肪負荷試験の間に、血漿トリグリセリドの出現を２０％有意に鈍らせ、この効果は、回腸内の脂質含有量の３１％の増加と同時に起きた。要するにこの結果は、常在している大腸菌が、肥満とは独立して、腸の脂質代謝及び腸の脂質蓄積に重要な役割を果たすことを実証している。調査結果により、腸内微生物叢と食物中の脂肪の恒常的な制御との間の関連性が成立する。
【０１００】
イントロダクション
[0097]２型糖尿病は、世界的に流行している健康問題であり、国際糖尿病連合（International Diabetes Federation）は、この病気の全世界での患者数は、２０１２年末時点で３億７１００万人に達すると推定した［１］。運動不足、過度の肥満症、及びインスリン耐性は、急な２型糖尿病の発症の一因と見られ、アディポカイン、酸化的ストレス、ミトコンドリア機能障害、及び慢性で軽度の炎症を含む要因が、２型糖尿病の発症に影響を与えているということが提言されてきている［２］。
【０１０１】
[0098]最近のデータにおいて、腸内微生物叢が、２型糖尿病の発症に寄与する可能性があることを示している。いくつかの研究グループにより、２型糖尿病は、改変された腸内微生物叢と関連があること［３，４］、胃腸のメタゲノムと関連がある２型糖尿病の特徴が、糖の輸送、分枝アミノ酸、メタン代謝、及び生体異物の分解及び硫酸塩還元に関与している経路内で多く表れること［５］が報告されている。２型糖尿病の原因としての腸内微生物叢（説）を支持するものとして、腸内微生物叢の減少に基づく一系列のエビデンスが、無菌状態で飼育されたマウス、又は抗生物質をインスリン耐性のｏｂ／ｏｂマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに与えることで飼育されたマウスが、有意に高い経口グルコース負荷を示したということが示されている［６，７］。グラム陰性細菌の細胞壁にあるリポ多糖体（ＬＰＳ）の炎症反応を促進する性質に焦点を当てた他系列のエビデンスにより、ＬＰＳが、高脂肪の食事が誘導するインスリン耐性の部分的な原因となっていることが実証されている［８］。ＬＰＳをマウスに慢性的に与えると、軽度の肥満、耐糖能異常、及び肝臓のインスリン耐性を引き起こした［８］。これらのＬＰＳの効果は、ＬＰＳシグナリングに障害のあるＣＤ１４欠損マウス中で鈍くなり［８］、細菌由来のＬＰＳに対する炎症反応と、インスリン耐性の発現との間の病態生理学的関連性が示された。
【０１０２】
[0099]通常の生理学的条件において、少量のＬＰＳを、循環血液内で発見することが可能であるが、報告されるところによると、ＬＰＳ濃度は、健康体の被験体よりも２型糖尿病の被験体で高くなる［９，１０］。しかしながら、腸の上皮細胞によるＬＰＳ摂取の原因となっている基礎メカニズムは不明確である。細胞間経路及び細胞間隙経路の両方が提案されている［１１］。重要なことに、食物脂肪は、ＬＰＳ吸収を容易にする重要な栄養要因である［１２］。Ｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．は、マウスにおいて、高脂肪の摂食が、循環血液のＬＰＳ濃度を上昇させることを示した［８］。健康体の個体において、循環血液のＬＰＳ濃度は、エネルギー摂取量と正の相関関係があり［１３］、肥満の個体において、高トリグリセリド血症の程度は、血清中のＬＰＳ濃度と正の相関がある［１４］。近年、Ａｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．が、高脂肪の食事がＧＦＰ導入大腸菌の回腸粘膜への付着を引き起こすことを示し［１５］、その結果、大腸菌などの腸のグラム陰性細菌の、食事脂肪への動的な適応（という考え）を提唱した。
【０１０３】
[0100]大腸菌は、ヒトの腸内の主要な通性嫌気性細菌である。栄養分に富んだ、及び炭素に富んだ腸内環境中では通常無害である常在している大腸菌株は、窒素に富んだ尿路に入ると、病原となる可能性がある［１６］。腸管毒素原性大腸菌などの他の株は、病原性であり、下痢を引き起こす可能性がある［１７］。病原性大腸菌と反対に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株は、例えば、胃腸障害を改善するプロバイオティクスとして作用することが可能である［１８］。近年、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．は、通常の体重の妊婦と比べて、より高い大腸菌濃度が肥満の妊婦の腸内微生物叢において見つかったことを示した［１９］。
【０１０４】
[0101]高脂肪食とは無関係なインスリン耐性のある常在している大腸菌の役割を調査するために、一連の実験が実施され、まず、通常食を与えられている肥満でインスリン耐性のあるｏｂ／ｏｂマウスの腸の異なる部分における大腸菌の個体数が調査された。その後、大腸菌が、ｏｂ／ｏｂマウスの糞便から分離され、従来の通常食を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに投与された。処置したマウスのグルコース及び脂質の代謝が試験された。そのデータを本明細書に示す。
【０１０５】
材料及び方法
ｌｅａｎマウスに対するｏｂ／ｏｂマウスでの管腔の内容物の試験
[0102]生後６週のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｏｂ／ｏｂマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。マウスは、１２時間／１２時間の明／暗サイクル下で、集団（ケージごとに５匹）で飼育され、通常食（Ｋｌｉｂａ  ３４３７，Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  Ｎａｆａｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び水を自由に摂取することができた。３週間の馴化後、マウスは処分され、その胃腸管が集められ、胃から直腸まで約２．５ｃｍの９のセグメントに切断された。セグメントの重量を測定し、直後に液体窒素中で定量ＰＣＲ用に凍結させた。
【０１０６】
大腸菌によりマウスで形成されたコロニーが、ｏｂ／ｏｂマウスより得られた。
[0103]ｏｂ／ｏｂマウス由来の大腸菌による通常のｌｅａｎマウスでのコロニー形成は、一連の３つのプロトコルで、調査された。それぞれ（の試験）において、生後８週の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。マウスは、１２時間／１２時間の明／暗サイクル下で、個別に飼育され、通常食（Ｋｌｉｂａ  ３４３７，Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  Ｎａｆａｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＶｉｔｔｅｌ水を自由に摂取することができた。２週間の馴化後、マウスは体重の一致する２群のうちの、（どちらか）１群に割り当てられた。グループ１では、Ｖｉｔｔｅｌ水を与えられ、グループ２では、６５日間、飲料水中へ１０８ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌の添加を受けた。体重、水の摂取量及び食物の摂取量が、週に２回記録された。身体組成は、意識のある状態で、ＥｃｈｏＭＲＩ  ＴＭ  ３−ｉｎ−１（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて、ベースライン（０日目）で、添加期間の最終日（６３日目）まで、測定された。腸内細菌科は、−３日、＋３日、及びその後の処置期間中は２週間に一回、糞便で測定された。処置終了時、マウスに以下のいずれかを実施した。１）夜間絶食の後、処分、２）６時間の絶食後、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施、又は３）夜間絶食の後、経口脂質負荷試験（ＯＬＴＴ）を試した。すべてのマウスは、６６日目に殺処分された。血糖は、マウスがイソフルランにより麻酔をかけられる前に、マウスの尾の血液で測定した。血液サンプルは、大静脈から採取されて、ＥＤＴＡでコーティングされたチューブ内に集められ、遠心分離により血漿を集め、−４０℃で分析までの間保存した。脂肪組織、肝臓、腸及び盲腸の内容量の重量が測定され、肉を液体窒素中で凍結させ、−８０℃のフリーザー中に、次の分析用に保存した。２つの独立した実験が実施され、一実験グループ当たり総数１２匹のマウスが使用された。
【０１０７】
ｏｂ／ｏｂマウスの糞便由来の大腸菌の分離、調製及び検出
[0104]８匹のｏｂ／ｏｂマウスから得られた糞便を、腸内細菌科に特異的なドリガルスキー培地上に播種した。各マウスより得られた１〜２つの腸内細菌科コロニーを選択し、ＡＰＩ２０Ｅ  ｇａｌｌｅｒｙ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて分析した。同じコロニーに由来するＤＮＡを、腸内細菌反復遺伝子間コンセンサスＰＣＲ（ＥＲＩＣ−ＰＣＲ、例えばＤａｌｌａ−Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：２２７〜２３４（１９９８）を参照）、及び遺伝的同一性用の反復遺伝子外パリンドローム（ＲＥＰ）ＰＣＲを用いて、比較した［２０，２１］。
【０１０８】
[0105]選択された大腸菌コロニーを、ＬＢ培地を使用して調製した好気性の懸濁液中で数えた。週に２回、フレッシュな大腸菌の懸濁液は、前培養物を１５ｍＬのＬＢ培地に添加することで、凍結させたグリセロールのストックより調製された。前培養物を、３７℃で６〜８時間培養させた。その後、２．５ｍＬの飽和前培養液を、２５０ｍＬのＬＢ培地を満たした２つのフラスコに加え、この培養物を一晩培養させた。翌朝、細菌溶液を５０００×ｇ（４℃）で５分間遠心分離し、細菌のペレットを、最終量２．５ＬのＶｉｔｔｅｌ水中で再懸濁化し、その後それをマウスに与えた。大腸菌を用いたコロニー形成が成功したことを確認するために、糞便の大腸菌濃度は、取りたての糞便の懸濁液を、濃縮のために、半選択培地（ドリガルスキー成長培地）上に、異なる希釈率で播種させることにより、定量化した。更に、盲腸の大腸菌を、大腸菌に特異なプライマーを用いて、定量ＰＣＲを使用して定量化し、全細菌量と比較した。ＰＣＲ増幅用のプライマー及び条件を表１に示す。
【表１】
2016523566.tif 000002
【０１０９】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
[0106]ＯＧＴＴは、処置期間終了時に、明サイクル下で６時間の絶食後に実施した。動物の尾から得られた血中の空腹時グルコース濃度を、Ａｓｃｅｎｓｉａ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した後、時間０において、３０％グルコース溶液を２ｇ／ｋｇ（ｗｔ／ＢＷ）の用量で、マウスに強制経口投与した。血糖は、１５、３０、６０、及び１２０分後に測定した。血液も、インスリン分析用（ＩＢＬ；Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、０、１５、及び６０分に、ＥＤＴＡでコーティングされたチューブ内に採取された。
【０１１０】
経口脂肪負荷試験（ＯＬＴＴ）
[0107]独立した実験において、大腸菌処置されたマウス及び対照マウスは、夜間絶食（１４時間）後、ＯＬＴＴを実施された。ＯＧＴＴに関して、ＯＬＴＴは、処置期間の最後に実施した。マウスに、時間０において、６ｍｌ／ｇ（ｗｔ／ＢＷ）のコーンオイルを強制経口投与した。血液を０、６０、１２０、１８０、及び２４０分に、トリグリセリド（ＴＧ）分析及び非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）分析用に、ＥＤＴＡでコーティングされたチューブ内に集めた。ＴＧ及びＮＥＦＡは、それぞれＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（Ｆｒａｎｃｅ）と、Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）の市販キットを用いて測定した。
【０１１１】
血漿及び組織の分析
[0108]血漿トリグリセリド、総コレステロール、非エステル化脂肪酸（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）、β−ヒドロキシブチレート（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＣＯＢＡＳ  Ｃ１１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。血漿インスリン（ＩＢＬ；Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）濃度、及びＬＰＳ−結合タンパク質（ＥＬＩＳＡ−ＬＢＰ；＃ＣＫＭ０４３；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）濃度は、市販キットを用いて測定した。血糖は、Ａｓｃｅｎｓｉａ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、マウスの尾で測定した。血漿の炎症マーカーは、ＭＳＤ  Ｍｏｕｓｅ  ＴＨ１／ＴＨ２  ９−Ｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋｉｔ  ｐｌａｔｅ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）上で測定した。検出は、製造業者の取扱説明書を使用して、実施した。
【０１１２】
[0109]脂質は、Ｆｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の方法［２２］に従い、２００ｍｇの凍結肝臓より抽出した。コレステロールを、市販のキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、測定した。初めにＴＧを塩基性溶液（エタノール中の０．５Ｎ  ＫＯＨ）内で加水分解し、その後、市販の酵素ＴＧ分析キット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、測定した。
【０１１３】
ｍＲＮＡ発現解析
[0110]全ＲＮＡは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡｄｖａｎｃｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者により提供されたプロトコルに従い、５０ｍｇの肝臓又は腸の部分から調製した。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）１５をプライマーとして用いたリアルタイムＰＣＲ用のファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ＡＭＶ；Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１．５μｇの全ＲＮＡ上で実行した。リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析は、蛍光温度サイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。プライマー配列を、表２に一覧化する。
【表２】
2016523566.tif 000003
【０１１４】
統計分析
[0111]データは、Ｍｅｄｉａｎ（メジアン）±ＳＥＭｅｄｉａｎ（メジアンの標準誤差）として表わされる。特異な時間的ポイントにおける結果を、ウィルコクソン検定により評価する一方で、両側ノンパラメトリック検定（マン・ホイットニー検定）を、対照群に対する治療の比較用に使用した。体重及び体重増加への大腸菌の影響を分析するために、混合効果モデルを適用した（繰り返し測定）。
【０１１５】
結果
[0112]大腸菌濃度は、遺伝的に肥満体の（ｏｂ／ｏｂ）マウスの末端部及び糞便中において、増加する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊをバックグラウンドとしたｏｂ／ｏｂマウス及び野生型マウスの管腔の含有物を、定量ＰＣＲ法で試験し、その結果、その総バクテリア数は、ｏｂ／ｏｂマウス及び野生型マウスで類似していることが示された（表３）一方、腸の末端部（すなわち、盲腸、結腸及び糞便）中の大腸菌の比率は、ｌｅａｎマウスのものと比べて、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、それぞれ２．０、３．１及び２．９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇだけ高くなった。大きな比重を占める株が、肥満と機能的に関連があるのかどうかを評価するために、大腸菌をこれらのマウスから分離した。この目的を達成するために、８匹のｏｂ／ｏｂマウスからの糞便を、内細菌科選択培地に添加し、選択的な条件で培養した。成長したコロニーを、ＡＰＩ２０Ｅ  ｇａｌｌｅｒｙで分析した結果、すべての成長コロニーが大腸菌と同定された。すべてのクローンの遺伝的同一性を、ＥＲＩＣ−ＰＣＲ及びＲＥＰ−ＰＣＲで比較した結果、すべてのコロニーが同一の分子署名を有していることが示された。これらの技術では、異なる分離株間においての違いが示されなかったため、最も体重の重いマウス由来の単一コロニーを、以降の試験で使用した。
【表３】
2016523566.tif 000004
【０１１６】
[0113]ｏｂ／ｏｂマウスから分離された大腸菌株の可能性のある生理学的影響を試験するために、通常食の与えられた野生型のマウスには、６５日間、１０８ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌を含む水の摂取を可能にした。水分摂取量を、週に２回測定した結果、大腸菌を添加したものとの違いは見られなかった（表４）。
【表４】
2016523566.tif 000005
【０１１７】
[0114]水分摂取量に基づいて、大腸菌の平均摂取量は、約８．６±０．２Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｄａｙとなった。コロニー形成の成功は、大腸菌処置マウスの糞便由来大腸菌の培地ベースの計数により、調査の間の異なる時間点において、モニタリングされた。表５で示されるように、処置されたマウスでは、糞便の大腸菌数の増加が示され、大腸菌数の上昇は、実験の経過中において継続した（６２日まで）。
【表５】
2016523566.tif 000006
【０１１８】
[0115]大腸菌のコロニー形成の増加は特異的であった。総糞便細菌量、フィルミクテス、バクテロイデス、腸内細菌科、バクテロイデスープレボテラ−ポルフィロモナス、ビフィドバクテリウム、及びラクトバチルス科の総量は、定量ＰＣＲ技術を用いて決定され、エンテロバクテリアセ（大腸菌が属している科）を除くすべての群は、大腸菌添加の影響を受けなかった（表６）。
【表６】
2016523566.tif 000007
【０１１９】
[0116]血漿ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）濃度は、血漿ＬＰＳ量と相関があることが報告されてきた［２３］。そのため、ＬＢＰを、ＬＰＳへの全身暴露用の代理マーカーとして使用した。ＬＢＰは両方のグループで見つかったが、その濃度は、対照動物と比較して、大腸菌処置した動物で高かった（表７）。このように、飲料水への大腸菌投与が、投与を受けたマウス中の大腸菌数を増加させ、これらのマウス中での大腸菌の良好で持続的なコロニー形成が実証された。
【表７】
2016523566.tif 000008
【０１２０】
[0117]
【０１２１】
[0118]血漿前炎症性サイトカインをマウスで測定し、夜間絶食状態において、大腸菌処置マウス及び対照マウスの間でのパラメータ（ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＫＣ−ＧＲＯ，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２−ｐ７０  及び  ＴＮα）の違いは見られなかった（表８）。空腸でのＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、及びＴＮＦα  ｍＲＮＡの発現も測定され、２つのグループにおいて違いは見られなかった（表８及び表９）。
【表８】
2016523566.tif 000009
【表９】
2016523566.tif 000010
【０１２２】
[0119]実験開始時に、両グループは同じ体重（大腸菌処置マウス：２５．２±０．３ｇ、対照マウス：２５．３±０．３）であり、実験過程における体重の増加は、大腸菌処置の影響は受けなかった（表１０）。
【表１０】
2016523566.tif 000011
【０１２３】
[0120]身体組成は、処置前及び処置後に測定され、その結果、大腸菌処置動物と各対照動物との間で、除脂肪重量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、及び脂肪重量（ｆａｔ  ｍａｓｓ）での違いは見られなかった（表１１）。大腸菌処置をしたマウスは、標準的な体重及び耐糖能を示した。
【表１１】
2016523566.tif 000012
【０１２４】
[0121]調査の最後に、マウスに経口グルコース負荷試験を実施した。表１２で示されるように、絶食時血糖は、両グループにおいてほぼ同じであり、耐糖曲線において、処置マウス、対照マウス間での違いは示されなかった。グルコースのデータと一致して、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）中の血漿インスリン値は、処置マウス、未処置マウス間での違いはなく（表１２）、このことは、通常食を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス中でのグルコース処理が、腸内大腸菌数の増加による影響を受けなかったことを示している。
【表１２】
2016523566.tif 000013
【０１２５】
[0122]大腸菌処置マウスの血漿及び肝臓中の脂質プロファイルの変更犠牲となる処置マウス、及び犠牲となる未処置マウスの臓器重量を、６時間の絶食後に比較したところ、２つのグループにおいて違いは見られなかった（表１３）。
【表１３】
2016523566.tif 000014
【０１２６】
[0123]しかしながら、大腸菌処置グループ中の血漿トリグリセリド（ＴＧ）の増加傾向が観察された（ｐ＝０．０７、表１４）一方で、血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）は、処置による影響を受けなかった。ＴＧの変化に加え、循環（血液中の）ケトン体β−ヒドロキシブチレート（β−ＨＢ）は、未処置グループよりも処置グループにおいて高くなる傾向があった（ｐ＝０．０７）。腸内において、空腸のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ、リポタンパク質分泌を含めトリグリセリドに関与している遺伝子）の発現は、血漿ＴＧ濃度に従い、対照マウスと比較して、処置マウスで増加する傾向を示した（＋３７％）（処置マウス：１０．８ｅ−２±１．８ｅ−２、対照マウス：８．６ｅ−２±０．９ｅ−２（ＧＡＰＤＨに対して）、ｐ＝０．０６９）。肝臓中において、ＴＧ濃度も同様に、大腸菌処置をしたマウスにおいて、２４％の率で高まった（ｐ＝０．０５１、表１４）。β−ＨＢの量が脂肪酸の酸化度を反映するため、肝臓中のいくつかの脂質酸化遺伝子のｍＲＮＡ発現が調査された。細胞質のマロニル−ＣｏＡの合成を制御する酵素であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）［２４］、及び細胞質のマロニル−ＣｏＡの濃縮物は、ミトコンドリアの長鎖脂肪酸トランスポーターＣＰＴ１ａを阻害することにより、脂質酸化に負の影響を及ぼす。ＡＣＣ２のｍＲＮＡ発現は、処置グループにおいて減少した（表１４）が、このことはミトコンドリアによる酸化のための脂肪酸摂取量が増加していることを示唆している。更に、脂質酸化プログラムの作動に関与する遺伝子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）［２５］は、大腸菌処置マウス中の発現の増加傾向を示した（表１４）。
【表１４】
2016523566.tif 000015
【０１２７】
[0124]このように、大腸菌処置が、６時間の絶食状態において肝臓脂肪酸β−酸化を促進することにより、マウスの身体組成及び経口グルコース負荷を、見かけは変化しているように見えるが変化させることなく、肝臓脂質代謝に選択的に影響を与えた。しかしながら、大腸菌処置マウスと未処置マウスとの間での、血漿ＴＧ濃度、β−ＨＢ濃度、及びＮＥＦＡ濃度、更に肝臓の含有物を、１４時間の夜間絶食後に比較した結果（表１５）のように、そのような大腸菌の効果は、絶食期間の延長に敏感に反応した。
【表１５】
2016523566.tif 000016
【０１２８】
[0125]大腸菌によって引き起こされる脂質代謝の変化を更に調査するために、マウスに経口脂質負荷試験（ＯＬＴＴ）を実施した。この目的を達成するために、１４時間絶食させたマウスに、脂質負荷試験で強制経口投与し、その血漿ＴＧ濃度を、４時間超測定した。予想されたように、対照マウスの血漿ＴＧ濃度は、ＯＬＴＴの間に増加し、強制投与後６０分がピークであった。（表１６）その一方、大腸菌処置したマウスでは、予想された血漿ＴＧの増加を示さず、ＴＧ濃度は、４時間の観察期間中、ベースライン付近に留まっていた。その一方、ＮＥＦＡ濃度は、脂質の強制経口投与後に減少し、その抑制の程度は、処置マウス及び対照マウスにおいて、ほぼ同程度であった（表１６）。
【表１６】
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【０１２９】
[0126]ＯＬＴＴ後の血漿パラメータは、ＮＥＦＡ又はコレステロールなどの他の脂質クラスは、処置の影響を受けないため、この効果はＴＧに特異的であることを示した（表１７）。ＯＬＴＴの後、かなりの量の脂質が盲腸内で見つかったが、その量は２つの動物のグループ中のものと類似していた（表１８）。しかしながら、回腸のＴＧは、大腸菌処置したマウス中で有意に高いことが判明し（表１８）、このことは、腸によるＴＧの保持が、処置マウスの経口脂質負荷に対する明確な非反応性の原因であることを示唆している。大腸菌処置したマウスは、経口脂質負荷及び回腸中の脂質の吸収に対する異常な反応によって、特徴化される。
【表１７】
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【表１８】
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【０１３０】
[0127]マウスの調査（表３及び表１４）で観察されるように血漿トリグリセリドの増加と、腸内大腸菌数との間の相関関係が、２型糖尿病のヒトの被験者にも当てはまったかどうかを決定するために、肥満の糖尿病患者及び肥満の非糖尿病患者の血漿ＴＧ濃度及び糞便大腸菌数が測定された。糖尿病の被験体では、大腸菌数の増加と同様に、血漿ＴＧ濃度の統計学的に有意な増加を示した（表１９）。このデータは、より高いレベル（例えば、濃度）の腸内大腸菌を検出することで、血漿ＴＧの増加及び／又は肥満の被験者の糖尿病を予測可能であることを示している。
【表１９】
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【０１３１】
議論
[0128]ＬＰＳの前炎症性の特性が、インスリン耐性を引き起こすことは十分に裏付けられてきた。しかしながら、生存大腸菌を供給することによって、ＬＰＳの管腔量を増加させることが、インスリン感受性を害する可能性があるかどうかについては、ほとんど知られていない。そのため、大腸菌をｏｂ／ｏｂマウスより分離し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの通常食に添加した。ＬＰＳに関する最近の文献とは対照的に、処置を受けたマウスにおいて、体重及び経口グルコース負荷の有意な変化は、観察されなかった。その代わり、経口脂質負荷に反応して腸の脂質代謝が劇的に変化した。
【０１３２】
[0129]グラム陰性細菌の外膜のリポ多糖類（ＬＰＳ）が、代謝異常の病因に関与していることが示された［８］。この調査において、ｏｂ／ｏｂマウスの回腸末端部、盲腸及び結腸において、野生型マウスのこれらに対応する部分よりも、高い濃度のグラム陰性大腸菌が観察された。ｏｂ／ｏｂマウスが、野生型対照マウスよりも、循環血液中のＬＰＳ濃度が高いことを示しているため［２７］、常在している大腸菌の表面上のＬＰＳが、ｏｂ／ｏｂマウス中の損なわれたＧＬＰ−２−媒介の腸のバリアー機能が原因で、通常の（血液）循環に入り込む可能性があると想定される［２６］。ＬＰＳ測定の代わりにＬＢＰは、血漿ＬＢＰ濃度及び血漿ＬＰＳ濃度のいずれも、対照マウスよりもｏｂ／ｏｂマウスで高くなるため、ＬＰＳの代理マーカーとして提案されている［２３］。本調査において、大腸菌処置マウスのＬＢＰ濃度は、経口脂質負荷後と同様に、吸収後の状態においてより高くなったが、このことは、これらのマウスにおける前炎症状態を示唆している。しかしながら、夜間絶食時に測定された循環サイトカイン（表８）は、処置マウス、及び未処置マウスにおいて、見分けがつかなかったため、このことは大腸菌の添加に対するごくわずかな炎症反応であることを示している。以前、抗生物質処置が、ｏｂ／ｏｂマウスの耐糖性を改善し、腸のＴＮＦα  ｍＲＮＡ発現を減少させたことが示された［６］。本調査では、耐糖性の変化がほとんどないことは、腸のＴＮＦα  ｍＲＮＡ発現量の類似性に一致し、このことは、大腸菌処置が非肥満の通常食マウス中の真の炎症反応を引き起こさなかったという事実をサポートしている。しかしながら、大腸菌処置と高脂肪食との供給の組み合わせにより、バリアー機能を害し、マウスの前炎症性反応及びインスリン耐性を引き起こした可能性があった。
【０１３３】
[0130]最も予想外の調査結果は、どのように大腸菌処置により、異なるプールへの脂質の再分配が起きるのかであった。脂質負荷試験中、大腸菌処置マウスでは、血漿ＴＧの出現が鈍った。ＯＬＴＴ後、盲腸の脂質は、処置グループ、非処置グループで類似していたが、このことは、腸での脂質の吸収不良が、血漿ＴＧの発生の抑制を引き起こしそうにないことを示唆している。吸収後（明サイクル中で６時間絶食）の状態で、大腸菌処置したマウスは、血漿ＴＧの増加を示したが、この効果は夜間絶食後に消滅した。このデータに基づき、胃腸内の過剰な大腸菌のコロニー形成は、腸内の食事由来のＴＧの保持を引き起こし、血液循環へのＴＧの放出を遅らせるという仮説を立てた。この見解を支持することとして、ＭＴＴＰのｍＲＮＡ発現、腸内のリポタンパク質分泌に関与する遺伝子、及び血漿ＴＧ濃度は、吸収後の状態にある処置マウスにおいて、すべて上昇した。近年、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、脂質は、腸細胞中に貯蔵可能であり、グルコース負荷に応答して、数時間後に放出されることを示した［２８］。近年、最初の食事に由来する脂質の一部が、次の食事のカイロミクロン中に見られることも、Ｆｉｅｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．により実証された［２９］。これらのデータは、腸内大腸菌の量は、通常の血液循環に入る食物脂肪の動態の制御と臨床的な関連性があることを示している。
【０１３４】
[0131]異所性脂肪の蓄積は、インスリン耐性及びの顕著な特徴の１つであり、インスリン耐性のある個人及び動物体中の肝臓中や骨格筋中の過剰な脂肪の蓄積の所見が、この論拠をサポートしている。しかしながら、一時的な脂質の貯蔵プールとしての腸（の機能）は、十分認知されたわけではない。近年、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．は、コヒーレント反ストークスラマン分光画像法を用いて、腸細胞が、脂肪負荷後に、液滴中に脂質を貯蔵することが可能であることを観察した［３０］。その後、Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．は、肥満マウスにおいて、食事の脂肪負荷に応答して、腸内のＴＧ分泌が、ｌｅａｎマウスと比較して、減少することを示した［３１］。同様に、Ｄｏｕｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ｏｂ／ｏｂマウスは、給餌時及び経口的脂質負荷後に、腸内にＴＧを蓄積することを報告した［３２］。本調査において、通常食マウスを、ｏｂ／ｏｂマウスの糞便から分離した大腸菌で処置することにより、血液循環中のＴＧの出現が鈍り、経口脂質負荷後に回腸中で測定した脂質含有量が増加したが、このことはＤｏｕｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．により出版されたｏｂ／ｏｂマウスでの発見を想起させる。これらのデータは、ｏｂ／ｏｂマウスの腸内脂質代謝の制御解除が、ｏｂ／ｏｂマウスの糞便より分離された大腸菌をマウスに添加することで模倣可能なことを示している。その一方、経口グルコース負荷試験により計測された、過食症、肥満及びインスリン耐性など、レプチンの突然変異より生じた他の異常は、大腸菌処置の影響を受けなかった。
【０１３５】
[0132]他の異所性脂質プールは肝臓であり、肝臓内での脂肪の蓄積は、非アルコール性及びアルコール性脂肪肝疾患、更に非アルコール性脂肪性肝炎などの多くの病態と関連がある。腸内細菌叢内での腸内毒素症が、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを引き起こすという仮説が立てられている［３３］。本調査において、吸収後の状態で測定された肝臓ＴＧ濃度は、大腸菌処置マウスにおいて、大腸菌未処置マウスよりも高くなった。遺伝子発現解析及び血漿ケトン体測定により、ＮＡＦＬＤ中で通常見られる現象である、処置マウスでの脂肪酸酸化の代償性増加が示された［３４］。このデータは、腸内大腸菌とＮＡＦＬＤ発症との因果関係を暗示している。興味深いことに、夜間絶食状態において、肝脂肪、循環ＴＧとも、大腸菌処置の影響を受けなかった。
【０１３６】
[0133]要約すると、この例が、常在している大腸菌が、腸内、肝臓内及び血漿中におけるＴＧの分布を変化させることによって、宿主の脂質代謝を制御する上で重要な役割を果たしていることを実証している。しかしながら、マウスの体重及び経口グルコース負荷は、大腸菌添加の影響を受けなかった。要するに、このデータは、常在している大腸菌に関する感染症の発症以上の知識を、食物中の脂肪の恒常性制御における役割にまで拡大している。
【０１３７】
実施例２：
小腸において、食物中の脂肪は、腸細胞により吸収される前に、消化される。食物中の脂肪が細胞内に入ると、それらは、カイロミクロンを介して、リンパ循環へ放出される前に、多くの合成ステップ及び輸送ステップを経る。マウスの腸内の脂質代謝に対する大腸菌処置の影響を決定するために、我々は、脂質の合成及び脂質の輸送経路にとって重要な遺伝子発現及びタンパク質発現を解析した。最初に、我々は、食物中の脂肪の吸収を介在する主要なトランスポーターである脂肪酸輸送タンパク質４（ＦＡＴＰ４）の発現を調査した。我々の結果では、ｆａｔｐ４のｍＲＮＡ発現は、大腸菌処置又は経口脂質負荷試験による影響を受けないことが示された。しかしながら、ＦＡＴＰ４タンパク質濃度は、ｆａｔｐ４  ｍＲＮＡと同じ発現パターンを示さなかった。対照マウスにおいて、経口脂質負荷が、ＦＡＴＰ４タンパク質濃度を２倍増加させた一方、大腸菌処置マウスでは、ＦＡＴＰ４発現は、脂質負荷後も変化しなかった。２番目に、我々は、腸内のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）のｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現を調査した。腸細胞内において、ＭＧＡＴは、脂肪酸をエステル化してトリグリセリドを形成することに関与する酵素の１つである。ｍＲＮＡレベルにおいて、大腸菌処置及び脂質負荷は、ｍｇａｔ発現に影響を与えず、この結果はｆａｔｐ４のものと類似していた。タンパク質レベルにおいて、ＭＧＡＴ発現は、脂質負荷により、対照マウスにおいては高まったが、大腸菌処置マウスにおいては高まらず、この結果もＦＡＴＰ４のものと類似していた。３番目に、我々は、腸内のミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）のｍＲＮＡ及びタンパク質を測定した。ＭＴＴＰは、ａｐｏＢ４８リン脂質高含有の粒子を脂肪滴へ融合させることによる、小胞体（ＥＲ）中のトリグリセリド高含有のプレキロミクロン輸送小胞の合成に不可欠である（３５）。我々の結果により、脂質負荷が、未処置マウス及び大腸菌処置マウスの両方において、同程度に、ｍｔｔｐのｍＲＮＡ発現を誘導することが示された。同じ脂質負荷条件下において、ＭＴＴＰタンパク質濃度は、未処置マウスにおいて上昇したが、大腸菌処置マウスにおいては上昇しなかった。最後に、我々はＳＥＣ２４ｃのタンパク質濃度を測定した。ＳＥＣ２４ｃは、プレキロミクロン輸送小胞中に見られ、腸内の腸細胞中で、プレキロミクロン小胞をＥＲからゴルジまで輸送するのに重要である（３６）。未処置マウスにおいて、ＳＥＣ２４ｃタンパク質濃度は、脂質負荷前よりも負荷後において高くなった。大腸菌処置したマウスにおいて、ＳＥＣ２４ｃタンパク質濃度は、脂質負荷による影響を受けなかった。
【０１３８】
我々が計測したすべての遺伝子において、ｍＲＮＡ発現は、タンパク質濃度と必ずしも対応しなかった。ｍＲＮＡ濃度とタンパク質濃度との間の差異は、大腸菌の存在が、タンパク質合成、又はタンパク質分解に影響を与える可能性があり、脂質の合成及び脂質の輸送に必要な細胞タンパク質のダウンレギュレーションを引き起こすということを示唆している。腸嚢胞中において、ＥＲは、タンパク質の合成／分解及び脂質の合成／輸送にとって、重要な細胞小器官である。ＥＲ中の変性タンパク質の蓄積が、ＥＲストレスを引き起こし、ＥＲストレスが、２つのＥＲストレス経路であるＰＥＲＫ−ｅｉＦ２α−ＡＴＦ４及びＩＲＥ１α−ＸＢＰ１を経由して、脂質生成及び脂質代謝の維持に影響を与えることが示されている（３７）。更に、大腸菌は、腸内にＥＲストレスを引き起こすことが示されてきた（３８、３９）。文献のエビデンスに基づいて、我々は、ＥＲストレスが大腸菌処置マウス中で増加するという仮説を立てた。我々の結果は、大腸菌処置が、経口脂質負荷試験とは無関係に、ｘｂｐ１  ｍＲＮＡ濃度を上昇させることを示した。大腸菌処置は、未処置マウスと比較して、ａｔｆ４  ｍＲＮＡ及びｃｈｏｐ  ｍＲＮＡも増加させたが、その違いは脂質負荷試験の条件において顕著であった。
【０１３９】
結論として、我々のデータは、大腸菌処置が、腸内でのトリグリセリドの合成及び輸送に必要なタンパク質の食物脂肪によって引き起こされる発現を抑制することを示している。特に、ＭＴＴＰ及びＳＥＣ２４ｃタンパク質におけるアップレギュレーションの不足が、プレキロミクロン小胞のＥＲからゴルジへの輸送を制限する可能性があり、そのことが、大腸菌処置したマウス腸内での脂質の保持を説明している。分子レベルのメカニズムはまだ明らかになっていないが、腸内のＥＲストレスの上昇が、大腸菌処置により誘導された腸内脂質代謝を、異常調節することに寄与する可能性がある。
【０１４０】
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【０１４１】
[0134]本明細書中に引用されるすべての出版物及び特許出願は、個々の個人の出版物、又は特許出願が、あたかも明確かつ個々に、その全体が参照により本明細書に組み込まれることを示すがごとくに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
[0135]前述の発明は、理解の明瞭さを目的とした説明及び例示の方法により、少し詳しく記述されているものの、当業者は、ある種の変化及び修正が、添付の請求項の範囲内において実施可能であることを理解するであろう。更に、ここで与えられた各参考文献は、個々の参考文献が参照により本明細書に個別に組み込まれるがごとくに、参照により本明細書全体に同程度に組み込まれる。
【配列表】
2016523566000001.app
【国際調査報告】
2016523566.tif 000021
2016523566.tif 000022
2016523566.tif 000023