(57)【要約】特異的補体を標的化する阻害剤であって、前記特異的補体を標的化する阻害剤はタンパク質であり、前記タンパク質は補体活性化に対する標的阻害機能を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列はＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインを含み、前記タンパク質のアミノ酸配列は、直接連結されるか、または２つのドメインを連結できるリンカーを介して間接的に連結される前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインから構成される。特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法は、遺伝子操作手法によってＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインのタンパク質ポリペプチドを連結することを含む。タンパク質は補体活性化の阻害を標的化する薬物を調製するために使用され得る。特異的補体を標的化する阻害剤、その調製方法および本発明によって提供される用途が、補体活性化傷害によって引き起こされるヒト疾患の治療および予防に使用され得る。これは大きな潜在的用途の価値および開発の可能性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的補体を標的化する阻害剤であって、前記特異的補体を標的化する阻害剤はタンパク質であり、前記タンパク質は補体活性化に対する標的阻害機能を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列はＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインを含み、前記タンパク質のアミノ酸配列は、直接連結されるか、または２つのドメインを連結できるリンカーを介して間接的に連結される前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインにより構成され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい、特異的補体を標的化する阻害剤。
【請求項２】
前記タンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２または配列番号４として示される、請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
前記核酸の塩基配列が、配列番号１または配列番号３として示される、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
請求項３記載の核酸を含有するベクター。
【請求項６】
請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法であって、前記方法は、遺伝子操作手法によって、直接連結されるか、または間接的に連結される、前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインのタンパク質ポリペプチドを作製することを含み、
前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１０として示され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい、方法。
【請求項７】
前記遺伝子操作手法が、
ＣＲＩｇ細胞外ドメインをコードする核酸配列および補体阻害ドメインをコードする核酸配列を、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、直接連結するか、またはフレキシブルな連結ペプチドセグメントをコードする核酸配列を介して間接的に連結する工程、次いで融合配列を得、それを真核生物発現ベクター内に挿入する工程、真核生物タンパク質発現系を介して特異的補体を標的化する阻害剤のタンパク質発現を誘導する工程、および最後に、得られたタンパク質を精製する工程を含む、請求項６記載の特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法。
【請求項８】
補体活性化の阻害を標的とする薬物の製造における請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤の使用。
【請求項９】
発作性夜間ヘモグロビン尿症を有する患者における血液細胞を保護するため、および他の疾患の補体により攻撃される細胞を補体攻撃から保護するための薬物の製造における請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤の使用。
【請求項１０】
有効成分が請求項１記載のタンパク質である、薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学および薬学の分野における補体阻害剤、その開発および用途に関し、特に、特異的補体を標的化する阻害剤ならびにその調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は先天性免疫の主な構成要素であり、それはまた、適応免疫の重要な調節因子であり、免疫学的監視において重要な役割を果たす。それは、侵入した病原菌および宿主細胞残屑を取り除くことができるだけではなく、免疫学的および炎症プロセス全体も調整できる。補体系は３つの方法：古典的経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）およびレクチン経路（ＬＰ）により活性化され得、活性化後に形成される生成物を主に介して生理的機能を果たす。経路は、攻撃される細胞の膜表面に堆積されるＣ３ｂ／ｉＣ３ｂを含み、貪食により標的細胞を排除するために単核細胞などの免疫エフェクター細胞を動員し、Ｃ３ａ／Ｃ４ａ／Ｃ５ａなどのアナフィラトキシンは局所炎症を引き起こし、膜攻撃複合体（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｔｔａｃｋ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＡＣ、すなわちＣ５ｂ−９ｎ）が標的細胞膜の表面上の極に集合し、最終的に細胞溶解および死を導く。
【０００３】
プロセスにおける正常な宿主細胞に対する補体活性化の「バイスタンダー（ｂｙ−ｓｔａｎｄｅｒ）傷害」作用を防ぐために、宿主は、細胞膜の表面上で発現される循環Ｃ１−ＩＮＨ（Ｃ１阻害剤）、Ｃ４ＢＰ（Ｃ４結合タンパク質）、Ｉ因子、Ｈ因子、プロテインＳ、クラスタリンおよび膜結合タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９を含む、１０種より多い調節タンパク質を発達させ、別の補体膜調節タンパク質ＣＲＩｇが最近見出された。
【０００４】
ＣＲＩｇは、肝臓マクロファージ（クッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ’ｓ  ｃｅｌｌ））の表面上に発現されるＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ受容体として最初に識別された。Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂとのＣＲＩｇ結合を介して、クッパー細胞は病原体または他の粒子を食菌できる。結晶構造研究の結果により、Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂとの特異的結合およびその後のＣ３転換酵素の阻害を介して、ＣＲＩｇは、副経路上のカノニカル補体阻害剤、Ｈ因子と比較して低い有効性で初期段階にて副経路により補体活性化を阻害できることが実証された。今まで、Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂとのＣＲＩｇ結合の特有の特徴を利用することによって標的補体阻害剤を開発している報告は一つもない。
【０００５】
補体系の多様な機能は活性化と阻害との間の微妙なバランスを構築するために細かく調整され得るが、この微妙なバランスの上端部は、種々のヒト傷害の開始、進行および処置に起因している。
【０００６】
多数の研究により、過剰な補体活性化は、様々な程度で、種々のヒト疾患、例えば、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、再生不良性貧血、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、アテローム性動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病（老年性認知症）、ぜんそく、アレルギー、乾癬、重症筋無力症、多発性硬化症、クローン病の腸疾患の発生および進行に起因することが実証されている。したがって、補体系の阻害剤を含む治療標的としての補体の薬物研究および開発が再び注目されている。補体系阻害剤、特に補体標的治療は社会的および経済的価値に対して大きな可能性を保持している。
【０００７】
Ｃ３と組み合わせたタンパク質コンパスタチン（Ｃｏｍｐａｓｔａｔｉｎ）およびＣ５に対する組換えモノクローナル抗体エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）（Ｓｏｌｉｒｉｓ、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む補体標的阻害剤の研究および開発に関する数十年の調査の後、両方とも明らかな欠陥があった。コンパスタチンは前臨床試験に入っていたが、それは全ての部分のＣ３機能を阻害するので、感染の潜在的リスクをもたらす。
【０００８】
エクリズマブは発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を治療するために使用されているが、その知的財産権の所有権は外国に属しており、それは極めて高価な額であり、単年の治療費は＄４０９，５００である。２００９年および２０１０年におけるＳｏｌｉｒｉｓの年間売上高はＵＳドルで２９億５千万ドルおよび５４億１千万ドルである。
【０００９】
ＰＮＨはＰＩＧ−Ａ変異に起因する後天的な出血性疾患であり、それにより血球膜上の２つのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合補体膜調節タンパク質ＣＤ５５およびＣＤ５９の不在を生じる。したがって、ＰＮＨ血球は補体攻撃の影響を非常に受けやすく、白血球減少によって引き起こされる感染症、赤血球破壊によって引き起こされる溶血、および血小板活性化の傾向がある。これは最終的に、反復性感染症、溶血、血栓症、腎不全、骨髄機能不全および肺静脈圧上昇および他の疾患をもたらす。次第に悪化するこれらの疾患は、エクリズマブモノクローナル抗体の出現前は治癒せず、患者の生命を深刻に脅かしていた。エクリズマブの機構はＣ５との結合を介し、補体カスケードの終わりに補体活性化を阻害し、その後、血球の膜上のＭＡＣ沈着、血球、特に赤血球の溶解を遮断し、エクリズマブはＰＮＨを有する患者の臨床治療において良好な効果を有し、血栓症を有意に低減させ得る。単年の治療により、６６％のＰＮＨ患者の輸血を停止できる。
【００１０】
しかしながら、ＰＮＨ患者の状態は、Ｃ３補体カスケード活性化のレベルが持続するので、理論的にエクリズマブモノクローナル抗体の適用後にも依然として完全に寛解せず、Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂの発生、血球の表面上へのそれらの沈着をもたらし、それらの血球は単核細胞貪食により消費され、最終的に血管外溶血をもたらす。これがまた、エクリズマブ治療が十分ではない理由である。したがって、エクリズマブの末期におけるＣ５レベルの代わりに補体の初期活性化におけるＣ３レベルでの補体の活性化を阻止することによって、ＭＡＣ媒介性血管内溶血およびＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ媒介性血管外溶血の両方を有意に低減させることができ、それにより治療効果をより良くする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、補体系阻害剤、その調製方法および補体活性化を阻害する薬物の調製における使用を提供することであり、この種の薬物は補体活性化に対する標的阻害の効果を達成でき、異常活性化補体媒介性疾患の治療および予防に使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明は、特異的補体を標的化する阻害剤であって、前記特異的補体を標的化する阻害剤はタンパク質であり、前記タンパク質は補体活性化に対する標的阻害機能を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列はＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインを含み、前記タンパク質のアミノ酸配列は、直接連結されるか、または２つのドメインを連結できるリンカーを介して間接的に連結される前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインにより構成され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい、特異的補体を標的化する阻害剤を提供する。
【００１３】
リンカーは、好ましくは、フレキシブルな連結ペプチドセグメントであるが、他のリンカーもまた、作用できる。
【００１４】
タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２または配列番号４として示される。
【００１５】
本発明はまた、核酸を提供し、その核酸の配列は前記タンパク質をコードする。
【００１６】
核酸の塩基配列は配列番号１または配列番号３として示される。
【００１７】
本発明はまた、前記核酸を含有するベクターを提供する。
【００１８】
本発明はまた、特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法であって、前記方法は、遺伝子操作手法によってＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインのタンパク質ポリペプチドを連結することを含む。
【００１９】
前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１０として示される。
【００２０】
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい。
【００２１】
前記遺伝子操作手法は、ＣＲＩｇ細胞外ドメインをコードする核酸配列および補体阻害ドメインをコードする核酸配列を、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ  ＰＣＲ）によって、直接連結するか、またはフレキシブルな連結ペプチドセグメントをコードする核酸配列を介して間接的に連結する工程、次いで融合配列を真核生物発現ベクター内に挿入する工程、真核生物タンパク質発現系を介して特異的補体を標的化する阻害剤のタンパク質発現を誘導する工程、および最後に、得られたタンパク質を精製する工程を含む。
【００２２】
タンパク質発現系は、宿主系、外因性遺伝子、ベクターなどによって構成され、宿主内で外因性遺伝子の発現を実現できる。宿主はタンパク質を発現する生物であり、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などであってもよい。異なる起源が種々の生物の異なる特性に起因して異なるタンパク質発現に適している。ベクターの種は宿主と一致している。異なる宿主によれば、ベクターは、真核生物（細菌）発現ベクター、酵母発現ベクター、植物発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、昆虫発現ベクターなどに分けられてもよい。ベクターは、そのベクターを介して宿主内で発現され得る外来性遺伝子断片を含有する。
【００２３】
本発明はまた、補体活性化の阻害を標的化する薬物の製造における特異的補体を標的化する阻害剤の使用を提供する。
【００２４】
本発明はまた、発作性夜間ヘモグロビン尿症を有する患者における血液細胞を保護するため、および他の疾患、例えば、膜性増殖性糸球体腎炎、非定型可溶性出血性尿毒症性症候群および加齢に関連した黄斑変性症の補体により攻撃される細胞を補体攻撃から保護するための薬物の製造における特異的補体を標的化する阻害剤の使用を提供する。
【００２５】
本発明はまた、薬物を提供し、前記薬物の有効成分は、特異的補体を標的化する阻害剤として使用されるタンパク質である。その薬物は、標的補体阻害機能および良好な薬物結合特性が確認されている、インビボおよびインビトロ実験で真核生物系における分泌発現から精製され、得られたタンパク質を選んでいる。薬物は、ＰＮＨ患者を使用したインビトロ実験において１００ｎＭ未満のＩＣ５０を示すことが実証されている。インビボ実験においてラットのメサンギウム増殖性糸球体腎炎が薬物処置によって顕著に減衰したことが示された。
【００２６】
薬物の剤形は好ましくは注射用である。外部コーティングなどの他の剤形も使用されてもよい。
【００２７】
薬物の投与様式は以下を含む：
（１）直接投与、
（２）薬物投与を実施または示すことができる媒体系を介する。
【００２８】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点および技術的効果を有する。
【００２９】
本発明は、遺伝子操作法を使用して、補体構成要素Ｃ３の活性化からの断片Ｃ３ｂおよび／またはｉＣ３ｂとの結合後に標的作用を有するＣＲＩｇ、および補体阻害効果を有する別の補体、例えば、Ｈ因子を直接的に連結するか、またはフレキシブルなペプチドセグメント（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３などを介して間接的に連結して融合タンパク質を調製し、最後に標的とする補体活性化の阻害の効果を達成する。
【００３０】
本発明は、インビボで補体の活性化部位に特異的に標的化でき、補体活性化ならびに補体活性化によって媒介される細胞および組織損傷を長期間阻害する新規標的補体阻害剤である。したがって、本発明によって提供される標的補体阻害剤は、医学的応用の有益性および開発の見込みに大きな可能性を有する。この種の薬物は補体異常活性化に関連する種々のヒト疾患の処置および予防に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの発現および精製を示す。
【図２】ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨとＣ３活性化分解産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄとの間の相互作用の動態分析および結合力の決定の結果を示す。
【図３】ＣＲＩｇ−ｆＨとＣ３活性化分解産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄとの間の相互作用の動態分析および結合力の決定の結果を示す。
【図４】７人の症例におけるＰＮＨ患者の赤血球の補体副経路によって誘導される溶血からのＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの保護効果の概略図である。
【図５】７人の症例におけるＰＮＨ患者の赤血球の補体古典的経路によって誘導される溶血からのＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの保護効果の概略図である。
【図６】上昇した血清尿素窒素のＴｈｙ−１Ｎラット腎炎病的症状に対するＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの軽減効果の結果の概略図である。
【図７】上昇した血清クレアチニンのＴｈｙ−１Ｎラット腎炎病的症状に対するＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの軽減効果の結果の概略図である。
【図８】尿中への全タンパク質漏出のＴｈｙ−１Ｎラット腎炎病的症状に対するＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの軽減効果の結果の概略図である。
【図９】血尿のＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨ  Ｔｈｙ−１Ｎラット腎炎病的症状に対する軽減効果の結果の概略図である。
【図１０】ＩｇＧ、Ｃ３断片、ＭＡＣおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの各群のラット腎臓低温切開片の免疫蛍光検出の沈着物の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
図面と共に以下の例示は本発明の実施形態に対するさらなる説明である。
【００３３】
本発明は、特異的補体を標的化する阻害剤であって、前記阻害剤はタンパク質であり、前記タンパク質は補体活性化に対する標的阻害機能を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列はＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインを含み、前記タンパク質のアミノ酸配列は、直接連結されるか、または２つのドメインを連結できるリンカーを介して間接的に連結される前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインにより構成され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい、特異的補体を標的化する阻害剤を提供する。
【００３４】
リンカーは、好ましくは、フレキシブルな連結ペプチドセグメントであるが、他のリンカーもまた、作用できる。
【００３５】
本発明によって提供される特異的補体を標的化する阻害剤は、ＣＲＩｇの２つの特有の特性を使用し（Ｃ３ｂの特異的認識およびＣ３転換酵素の活性化の阻害を介して、ＣＲＩｇは補体カスケードの初期段階において阻害効果を生じることができ、ＣＲＩｇの機能的部位は細胞外領域に位置する）、ＣＲＩｇ細胞外ドメイン遺伝子はクローニングされ、他の補体調節タンパク質との融合発現を与える。ＣＲＩｇおよびＣ３ｂ／ｉＣ３ｂの特異的標的効果によって、組換え連結補体調節タンパク質は、補体の活性化を阻害するために局所補体活性化部位に移され得、それにより疾患を予防し、治療する。
【００３６】
ＣＲＩｇ細胞外ドメインの遺伝子配列は配列番号９として示され、そのアミノ酸配列は配列番号１０として示される。
【００３７】
さらに、ＣＲＩｇと連結される他の部分は、補体活性化を阻害できる全ての構成要素、例えば、補体調節タンパク質Ｃ１−ＩＮＨ、Ｃ４ＢＰ、Ｉ因子、Ｈ因子、プロテインＳ、クラステリン、ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦおよびＣＤ５９、さらにＣＲＩｇ自体の完全長または部分的配列を含む。連結手段は、直接連結すること、または物理、化学もしくは生物手段などを介して他の分子によって間接的に連結することを含む。
【００３８】
すなわち、ＣＲＩｇは、血液循環においてＣ１−ＩＮＨ（Ｃ１阻害剤）、Ｃ４ＢＰ（Ｃ４結合タンパク質）、Ｉ因子、Ｈ因子、プロテインＳおよびクラステリン（凝集タンパク質）、ならびにＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５  ＤＡＦおよびＣＤ５９を含む細胞膜の表面上に発現される補体膜調節タンパク質などを含む異なる種類の補体阻害剤、さらにＣＲＩｇ自体および補体阻害機能を有する他の物質に連結される。
【００３９】
他の補体阻害剤とのＣＲＩｇの連結様式は以下を含む：
（１）いかなる他のリンカーも有さない直接連結、
（２）生物学的方法を介する連結、
（３）化学的方法を介する連結。
好ましくは、タンパク質はＣＲＩｇおよびＨ因子（ｆＨ）からなる。
【００４０】
本発明は、ＣＲＩｇ細胞外ドメインをＨ因子（ｆＨ）ドメインと直接連結して、組換えタンパク質ＣＲＩｇ−ｆＨを得るか、またはフレキシブルな連結ペプチドセグメント（Ｓｅｒ１Ｇｌｙ４）３により間接的に連結して、組換えタンパク質ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨを得る例を示し、組換えタンパク質ＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの阻害効果について記載する。
【００４１】
本発明の一実施形態において、タンパク質は、ＣＲＩｇ細胞外ドメイン、Ｈ因子およびその２つの間のリンカーからなる。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２または配列番号４として示される。
【００４３】
本発明は上記のタンパク質をコードする核酸を提供する。好ましくは、ヌクレオチドコード配列は配列番号１または配列番号３として示される。
【００４４】
核酸は、特異的補体を標的化する阻害剤として補体活性化を阻害する機能を有し、コードされたＣＲＩｇおよび補体阻害剤配列を含有するタンパク質をコードする。
【００４５】
本発明はまた、上述の核酸を含有するベクターを提供する。例としてＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ｆＨを考慮すると、ベクターは配列番号１または配列番号３として示される核酸の塩基配列を含有する。
【００４６】
本発明はまた、上述の核酸を含有する細胞を提供する。
【００４７】
本発明はまた、特異的補体を標的化する阻害剤の調製方法であって、ＣＲＩｇ細胞外ドメインのタンパク質ポリペプチドおよび補体阻害ドメインを遺伝子操作手法によって直接または間接的に連結することを含む、方法を提供する。
【００４８】
ＣＲＩｇ細胞外ドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１０として示される。
【００４９】
補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい。
【００５０】
遺伝子操作手法は以下を含む：
ＣＲＩｇ細胞外ドメインをコードする核酸配列および補体阻害ドメインをコードする核酸配列を、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ  ＰＣＲ）によって、直接連結するか、またはフレキシブルな連結ペプチドセグメントをコードする核酸配列を介して間接的に連結する工程、次いで融合配列を真核生物発現ベクター内に挿入する工程、真核生物タンパク質発現系を介して特異的補体を標的化する阻害剤のタンパク質発現を誘導する工程、および最後に、得られたタンパク質を精製する工程。
【００５１】
タンパク質発現系は、宿主系、外因性遺伝子、ベクターなどによって構成され、それらは宿主内で外因性遺伝子の発現を実現できる。宿主はタンパク質を発現する生物であり、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などであってもよい。異なる起源が種々の生物の異なる特性に起因して異なるタンパク質発現に適している。ベクターの種は宿主と一致する。異なる宿主に応じて、ベクターは、真核生物（細菌）発現ベクター、酵母発現ベクター、植物発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、昆虫発現ベクターなどに分けられてもよい。ベクターは、そのベクターを介して宿主内で発現され得る外因性遺伝子断片を含有する。
【００５２】
本発明のタンパク質は、遺伝子操作手法、好ましくはＣＲＩｇタンパク質およびＨ因子タンパク質を連結する工程を使用できる。ＣＲＩｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６として示され、Ｈ因子タンパク質のアミノ酸配列は配列番号８として示される。アミノ酸残基はまた、タンパク質配列に応じて一つずつ連結されてもよい。
【００５３】
本発明の核酸は、遺伝子操作手法、好ましくはＣＲＩｇタンパク質およびＨ因子タンパク質のコード配列を連結する工程、または核酸配列に応じて一つずつ塩基を連結する工程を使用できる。
【００５４】
本発明は、特異的補体を標的化する阻害剤、および補体活性化を阻害するか、または補体の攻撃から細胞を防御し、ヘマトクリット値を増加させる薬物の調製における上記のタンパク質の使用を提供する。
【００５５】
本発明は、発作性夜間血色素尿症を有する患者における血球を防御するための薬物の調製における特異的補体を標的化する阻害剤の使用を提供する。それはまた、膜性増殖性糸球体腎炎、非定型可溶性出血性尿毒症性症候群および加齢に関連した黄斑変性症などの他の疾患の補体攻撃から、補体により攻撃される細胞を防御するための薬物または化学物質の調製に使用され得る。
【００５６】
本発明はまた、薬物を提供し、その薬物の有効成分は特異的補体を標的化する阻害剤として使用されるタンパク質であり、好ましくはその薬物はＣＲＩｇおよびＨ因子のドメインを含有する。薬物は補体活性化の阻害剤である。薬物は配列番号２または配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含有する。
【００５７】
薬物は、標的補体阻害機能および良好な薬物結合特性が確認されている、インビボおよびインビトロ実験で真核生物系における分泌発現から精製され、得られたタンパク質を選んでいる。薬物は、ＰＮＨ患者の赤血球を使用したインビトロ実験において１００ｎＭ未満のＩＣ５０を示すことが実証されている。インビボ実験においてラットのメサンギウム増殖性糸球体腎炎が薬物処置によって顕著に減衰したことが示された。
【００５８】
薬物の剤形は好ましくは注射用である。外部コーティングなどの他の剤形も使用されてもよい。
【００５９】
薬物の投与様式は以下を含む：
（１）直接投与、
（２）薬物投与を実施または示すことができる媒体系を介する。
【００６０】
本発明によって提供される標的特異的補体系阻害剤であるＣＲＩｇ−ｆＨを、別の標的補体阻害剤であるＣＲ２−ＣＤ５９と比較した。ＣＲ２−ＣＤ５９の親和定数（Ｋａ）はＣＲＩｇ−ｆＨより３倍大きく（ＣＲＩｇ−ｆＨについて１．０９３×１０４、ＣＲ２−ＣＤ５９について３．４５×１０４  １／Ｍｓ）、ＣＲ２−ＣＤ５９の解離定数（Ｋｄ）はＣＲＩｇ−ｆＨより４６倍大きい（ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨについて３．６５６×１０−３、ＣＲ２−ＣＤ５９について０．１６９  １／ｓ）ので、ＣＲＩｇ−ｆＨの平衡解離定数（ＫＤ）はＣＲ２−ＣＤ５の１／１５未満であり、ＣＲＩｇ−ｆＨがより薬理学的に活性であることを意味する。Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂへのＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの結合速度はＣＲ２−ＣＤ５９の１／３のみであるが、一旦結合すると、解離しにくくなるので、投与頻度を減少させることができ、長期のＰＮＨ患者に非常に有益である。ＣＲ２−ｆＨデータの不足のために、標的機能部分はＣＤ５９およびｆＨではなく、ＣＲＩｇおよびＣＲ２であり、それらは両方のある程度の比較可能性を有する。
【００６１】
現在、別の標的補体阻害剤ＣＲＩｇ−Ｆｃのデータが不足している。しかし、ＣＲＩｇがＣ３転換酵素の分解を阻害できず、（Ｈ因子のような）Ｉ因子によるＣ３ｂ分解の促進の活性を有さないことを考慮して、ＣＲＩｇのみが非常に弱い補体阻害活性を有すると仮定される。比較により、ＣＲＩｇを抗体部分Ｆｃの代わりにｆＨと連結したので、良好な補体阻害効果を有する。
【００６２】
非標的補体阻害剤ｍｉｎｉＦＨと比較して、ＣＲＩｇ−ｆＨの利点はより明らかであり、それは標的だけではなく、良好な親和定数も有し、そのＫＤはｍｉｎｉＦＨ  ＫＤに対して１／３である。
【００６３】
より重要なことには、本発明者らの実験は、ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨが補体のＡＰおよびＣＰの両方を阻害できるが、上述の全ての他の補体阻害剤は補体のＣＰのみを阻害できることを証明した。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質発現ベクターの構築、真核生物発現および精製
１．機器および材料
Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｐｒｏ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＰＣＲ機器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）、ＤＫ−８Ｄ型電気加熱定温タンク（上海精宏実験設備有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｎｇｈｏｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＣＯ．，Ｌｔｄ．）製）、ＩＱ３５０ゲル現像システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）、ＣＯ２細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、ＦＲ−９８０Ａ生物電気泳動画像分析システム（複日科技公司（Ｆｕｒｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍａｐｎｙ）製）、ＢｉｏＲＡＤ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲＡＤ製）、ＮａｎｏＶｕｅ  Ｒ  Ａ／ＤＮＡ濃度／純度検出器（ＩＫＡ製）。
【００６５】
２．実験方法
２．１．遺伝子クローニングおよびベクター構築
ＣＲＩｇはマクロファージの表面上で多量に発現される補体受容体であるので、Ｔｒｉｚｏｌ法によってヒト組織球性リンパ腫細胞株Ｕ９３７から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する。報告されている文献によれば、ＣＲＩｇ細胞外ドメインのタンパク質配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ＮＰ＿００１１７１７５９．１、残基１９〜１３７）から見出され、ＣＲＩｇ遺伝子の核酸配列はＮＣＢＩ遺伝子データベース（ＮＭ＿００１１８４８３０．１）から見出される。ＣＲＩｇ細胞外ドメインをクローニングするために上流および下流プライマー配列を設計し、ＰＣＲ増幅によってＵ９３７のｃＤＮＡからＣＲＩｇ細胞外ドメインの核酸配列を取得し、それをｐＭＤ１８  Ｔベクターに連結し、転移させ、陽性クローンについて青白ブロット試験によりスクリーニングし、陽性コロニーを採取し、培養して増殖させ、次いでシークエンシングに送る。
【００６６】
同様に、補体調節タンパク質Ｈ因子は肝細胞において高度に発現するので、Ｔｒｉｚｏｌ法によってヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する。Ｈ因子ＳＣＲ１−５ドメイン（ＮＰ＿００１１７１７５９．１、残基１９〜１３７）について報告された文献によれば、タンパク質配列はＮＣＢＩタンパク質データベースから見出され、Ｈ因子遺伝子の対応する核酸配列はＮＣＢＩ遺伝子データベースから見出される。ＦＨ  ＳＣＲ１−５ドメインをクローニングするために上流および下流プライマー配列を設計し、ＰＣＲ増幅によってＨｅｐＧ２のｃＤＮＡからＦＨ  ＳＣＲ１−５ドメインの核酸配列を取得し、それをｐＭＤ１８  Ｔベクターに連結し、転移させ、陽性クローンについて青白ブロット試験でスクリーニングし、陽性細胞を採取し、培養して増殖させ、次いでシークエンシングに送る。シークエンシング結果から正確なクローンを選択し、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲのための鋳型としてプラスミドを抽出する。
【００６７】
さらに、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥＰＣＲ）によってＨ因子のＣＲＩｇ細胞外ドメインおよびＳＣＲ１−５ドメインを直接（ＣＲＩｇ−ｆＨ）またはフレキシブルな連結ペプチド配列（ＳｅｒＧｌｙ４）３を介して間接的（ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨ）に連結する。
【００６８】
遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲの原理は以下の通りである。相補的末端を有するプライマーを使用して、オーバーラップ領域を含有する二本鎖を有するＰＣＲ産物を形成させ、次いでＰＣＲ増幅反応の第２ラウンドにおいて、オーバーラップ鎖の伸長を介して、異なる起源からの伸長断片を重複させ、ＣＲＩｇ細胞外ドメイン、Ｈ因子のＳＣＲ１−５ドメインおよびリンカー配列（フレキシブルな連結ペプチド配列）（Ｌ，（Ｓｅｒ１Ｇｌｙ４）３）（ＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡ）を含む融合配列を構築するために分割する。融合配列を、ｐＨＬｓｅｃにおいて真核生物発現ベクター内に挿入し、挿入配列を双方向で配列決定し、ベクターをｐＨＬｓｅｃ−ＣＲＩｇ−ｆＨおよびｐＨＬｓｅｃ−ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨと命名する。
【００６９】
ＣＲＩｇ核酸配列（配列番号５）：
ＡＴＧＧＧＧＡＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＧＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＴＡＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＣＴＧＴＣＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＡＣＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＴＡＡ
【００７０】
ＣＲＩｇタンパク質配列（配列番号６）：
ＭＧＩＬＬＧＬＬＬＬＧＨＬＴＶＤＴＹＧＲＰＩＬＥＶＰＥＳＶＴＧＰＷＫＧＤＶＮＬＰＣＴＹＤＰＬＱＧＹＴＱＶＬＶＫＷＬＶＱＲＧＳＤＰＶＴＩＦＬＲＤＳＳＧＤＨＩＱＱＡＫＹＱＧＲＬＨＶＳＨＫＶＰＧＤＶＳＬＱＬＳＴＬＥＭＤＤＲＳＨＹＴＣＥＶＴＷＱＴＰＤＧＮＱＶＶＲＤＫＩＴＥＬＲＶＱＫＬＳＶＳＫＰＴＶＴＴＧＳＧＹＧＦＴＶＰＱＧＭＲＩＳＬＱＣＱＡＲＧＳＰＰＩＳＹＩＷＹＫＱＱＴＮＮＱＥＰＩＫＶＡＴＬＳＴＬＬＦＫＰＡＶＩＡＤＳＧＳＹＦＣＴＡＫＧＱＶＧＳＥＱＨＳＤＩＶＫＦＶＶＫＤＳＳＫＬＬＫＴＫＴＥＡＰＴＴＭＴＹＰＬＫＡＴＳＴＶＫＱＳＷＤＷＴＴＤＭＤＧＹＬＧＥＴＳＡＧＰＧＫＳＬＰＶＦＡＩＩＬＩＩＳＬＣＣＭＶＶＦＴＭＡＹＩＭＬＣＲＫＴＳＱＱＥＨＶＹＥＡＡＲＡＨＡＲＥＡＮＤＳＧＥＴＭＲＶＡＩＦＡＳＧＣＳＳＤＥＰＴＳＱＮＬＧＮＮＹＳＤＥＰＣＩＧＱＥＹＱＩＩＡＱＩＮＧＮＹＡＲＬＬＤＴＶＰＬＤＹＥＦＬＡＴＥＧＫＳＶＣ
【００７１】
Ｈ因子核酸配列（配列番号７）：
ＡＴＧＡＧＡＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＧＣＧＴＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＧＣＴＧＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＴＴＣＡＴＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＧＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＣＡＣＡＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＴＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＴＡＣＡＣＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＴＡＴＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＡＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＧＴＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＴＧＴＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＧＡＡＣＡＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＡＣＴＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＣＧＴＡＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＣＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＧＣＧＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＧＴＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＣＧＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＧ
【００７２】
Ｈ因子タンパク質配列（配列番号８）：
ＭＲＬＬＡＫＩＩＣＬＭＬＷＡＩＣＶＡＥＤＣＮＥＬＰＰＲＲＮＴＥＩＬＴＧＳＷＳＤＱＴＹＰＥＧＴＱＡＩＹＫＣＲＰＧＹＲＳＬＧＮＶＩＭＶＣＲＫＧＥＷＶＡＬＮＰＬＲＫＣＱＫＲＰＣＧＨＰＧＤＴＰＦＧＴＦＴＬＴＧＧＮＶＦＥＹＧＶＫＡＶＹＴＣＮＥＧＹＱＬＬＧＥＩＮＹＲＥＣＤＴＤＧＷＴＮＤＩＰＩＣＥＶＶＫＣＬＰＶＴＡＰＥＮＧＫＩＶＳＳＡＭＥＰＤＲＥＹＨＦＧＱＡＶＲＦＶＣＮＳＧＹＫＩＥＧＤＥＥＭＨＣＳＤＤＧＦＷＳＫＥＫＰＫＣＶＥＩＳＣＫＳＰＤＶＩＮＧＳＰＩＳＱＫＩＩＹＫＥＮＥＲＦＱＹＫＣＮＭＧＹＥＹＳＥＲＧＤＡＶＣＴＥＳＧＷＲＰＬＰＳＣＥＥＫＳＣＤＮＰＹＩＰＮＧＤＹＳＰＬＲＩＫＨＲＴＧＤＥＩＴＹＱＣＲＮＧＦＹＰＡＴＲＧＮＴＡＫＣＴＳＴＧＷＩＰＡＰＲＣＴＬＫＰＣＤＹＰＤＩＫＨＧＧＬＹＨＥＮＭＲＲＰＹＦＰＶＡＶＧＫＹＹＳＹＹＣＤＥＨＦＥＴＰＳＧＳＹＷＤＨＩＨＣＴＱＤＧＷＳＰＡＶＰＣＬＲＫＣＹＦＰＹＬＥＮＧＹＮＱＮＨＧＲＫＦＶＱＧＫＳＩＤＶＡＣＨＰＧＹＡＬＰＫＡＱＴＴＶＴＣＭＥＮＧＷＳＰＴＰＲＣＩＲＶＫＴＣＳＫＳＳＩＤＩＥＮＧＦＩＳＥＳＱＹＴＹＡＬＫＥＫＡＫＹＱＣＫＬＧＹＶＴＡＤＧＥＴＳＧＳＩＴＣＧＫＤＧＷＳＡＱＰＴＣＩＫＳＣＤＩＰＶＦＭＮＡＲＴＫＮＤＦＴＷＦＫＬＮＤＴＬＤＹＥＣＨＤＧＹＥＳＮＴＧＳＴＴＧＳＩＶＣＧＹＮＧＷＳＤＬＰＩＣＹＥＲＥＣＥＬＰＫＩＤＶＨＬＶＰＤＲＫＫＤＱＹＫＶＧＥＶＬＫＦＳＣＫＰＧＦＴＩＶＧＰＮＳＶＱＣＹＨＦＧＬＳＰＤＬＰＩＣＫＥＱＶＱＳＣＧＰＰＰＥＬＬＮＧＮＶＫＥＫＴＫＥＥＹＧＨＳＥＶＶＥＹＹＣＮＰＲＦＬＭＫＧＰＮＫＩＱＣＶＤＧＥＷＴＴＬＰＶＣＩＶＥＥＳＴＣＧＤＩＰＥＬＥＨＧＷＡＱＬＳＳＰＰＹＹＹＧＤＳＶＥＦＮＣＳＥＳＦＴＭＩＧＨＲＳＩＴＣＩＨＧＶＷＴＱＬＰＱＣＶＡＩＤＫＬＫＫＣＫＳＳＮＬＩＩＬＥＥＨＬＫＮＫＫＥＦＤＨＮＳＮＩＲＹＲＣＲＧＫＥＧＷＩＨＴＶＣＩＮＧＲＷＤＰＥＶＮＣＳＭＡＱＩＱＬＣＰＰＰＰＱＩＰＮＳＨＮＭＴＴＴＬＮＹＲＤＧＥＫＶＳＶＬＣＱＥＮＹＬＩＱＥＧＥＥＩＴＣＫＤＧＲＷＱＳＩＰＬＣＶＥＫＩＰＣＳＱＰＰＱＩＥＨＧＴＩＮＳＳＲＳＳＱＥＳＹＡＨＧＴＫＬＳＹＴＣＥＧＧＦＲＩＳＥＥＮＥＴＴＣＹＭＧＫＷＳＳＰＰＱＣＥＧＬＰＣＫＳＰＰＥＩＳＨＧＶＶＡＨＭＳＤＳＹＱＹＧＥＥＶＴＹＫＣＦＥＧＦＧＩＤＧＰＡＩＡＫＣＬＧＥＫＷＳＨＰＰＳＣＩＫＴＤＣＬＳＬＰＳＦＥＮＡＩＰＭＧＥＫＫＤＶＹＫＡＧＥＱＶＴＹＴＣＡＴＹＹＫＭＤＧＡＳＮＶＴＣＩＮＳＲＷＴＧＲＰＴＣＲＤＴＳＣＶＮＰＰＴＶＱＮＡＹＩＶＳＲＱＭＳＫＹＰＳＧＥＲＶＲＹＱＣＲＳＰＹＥＭＦＧＤＥＥＶＭＣＬＮＧＮＷＴＥＰＰＱＣＫＤＳＴＧＫＣＧＰＰＰＰＩＤＮＧＤＩＴＳＦＰＬＳＶＹＡＰＡＳＳＶＥＹＱＣＱＮＬＹＱＬＥＧＮＫＲＩＴＣＲＮＧＱＷＳＥＰＰＫＣＬＨＰＣＶＩＳＲＥＩＭＥＮＹＮＩＡＬＲＷＴＡＫＱＫＬＹＳＲＴＧＥＳＶＥＦＶＣＫＲＧＹＲＬＳＳＲＳＨＴＬＲＴＴＣＷＤＧＫＬＥＹＰＴＣＡＫＲ
【００７３】
ＣＲＩｇ細胞外ドメイン
核酸配列（３５７ｂｐｓ）（配列番号９）：
ｇｇｃｃｇｔｃｃｃａｔｃｃｔｇｇａａｇｔｇｃｃａｇａｇａｇｔｇｔａａｃａｇｇａｃｃｔｔｇｇａａａｇｇｇｇａｔｇｔｇａａｔｃｔｔｃｃｃｔｇｃａｃｃｔａｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｔａｃａｃｃｃａａｇｔｃｔｔｇｇｔｇａａｇｔｇｇｃｔｇｇｔａｃａａｃｇｔｇｇｃｔｃａｇａｃｃｃｔｇｔｃａｃｃａｔｃｔｔｔｃｔａｃｇｔｇａｃｔｃｔｔｃｔｇｇａｇａｃｃａｔａｔｃｃａｇｃａｇｇｃａａａｇｔａｃｃａｇｇｇｃｃｇｃｃｔｇｃａｔｇｔｇａｇｃｃａｃａａｇｇｔｔｃｃａｇｇａｇａｔｇｔａｔｃｃｃｔｃｃａａｔｔｇａｇｃａｃｃｃｔｇｇａｇａｔｇｇａｔｇａｃｃｇｇａｇｃｃａｃｔａｃａｃｇｔｇｔｇａａｇｔｃａｃｃｔｇｇｃａｇａｃｔｃｃｔｇａｔｇｇｃａａｃｃａａｇｔｃｇｔｇａｇａｇａｔａａｇａｔｔａｃｔｇａｇｃｔｃｃｇｔｇｔｃｃａｇａａａ
【００７４】
タンパク質配列（１１９ａａ）（配列番号１０）
ＧＲＰＩＬＥＶＰＥＳＶＴＧＰＷＫＧＤＶＮＬＰＣＴＹＤＰＬＱＧＹＴＱＶＬＶＫＷＬＶＱＲＧＳＤＰＶＴＩＦＬＲＤＳＳＧＤＨＩＱＱＡＫＹＱＧＲＬＨＶＳＨＫＶＰＧＤＶＳＬＱＬＳＴＬＥＭＤＤＲＳＨＹＴＣＥＶＴＷＱＴＰＤＧＮＱＶＶＲＤＫＩＴＥＬＲＶＱＫ
【００７５】
Ｈ因子ＳＣＲ１−５ドメイン
核酸配列（９１５ｂｐ）（配列番号１１）：
Ｇａａｇａｔｔｇｃａａｔｇａａｃｔｔｃｃｔｃｃａａｇａａｇａａａｔａｃａｇａａａｔｔｃｔｇａｃａｇｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｔｇａｃｃａａａｃａｔａｔｃｃａｇａａｇｇｃａｃｃｃａｇｇｃｔａｔｃｔａｔａａａｔｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇａｔａｔａｇａｔｃｔｃｔｔｇｇａａａｔｇｔａａｔａａｔｇｇｔａｔｇｃａｇｇａａｇｇｇａｇａａｔｇｇｇｔｔｇｃｔｃｔｔａａｔｃｃａｔｔａａｇｇａａａｔｇｔｃａｇａａａａｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｃａｔｃｃｔｇｇａｇａｔａｃｔｃｃｔｔｔｔｇｇｔａｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｃａｇｇａｇｇａａａｔｇｔｇｔｔｔｇａａｔａｔｇｇｔｇｔａａａａｇｃｔｇｔｇｔａｔａｃａｔｇｔａａｔｇａｇｇｇｇｔａｔｃａａｔｔｇｃｔａｇｇｔｇａｇａｔｔａａｔｔａｃｃｇｔｇａａｔｇｔｇａｃａｃａｇａｔｇｇａｔｇｇａｃｃａａｔｇａｔａｔｔｃｃｔａｔａｔｇｔｇａａｇｔｔｇｔｇａａｇｔｇｔｔｔａｃｃａｇｔｇａｃａｇｃａｃｃａｇａｇａａｔｇｇａａａａａｔｔｇｔｃａｇｔａｇｔｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｇａｔｃｇｇｇａａｔａｃｃａｔｔｔｔｇｇａｃａａｇｃａｇｔａｃｇｇｔｔｔｇｔａｔｇｔａａｃｔｃａｇｇｃｔａｃａａｇａｔｔｇａａｇｇａｇａｔｇａａｇａａａｔｇｃａｔｔｇｔｔｃａｇａｃｇａｔｇｇｔｔｔｔｔｇｇａｇｔａａａｇａｇａａａｃｃａａａｇｔｇｔｇｔｇｇａａａｔｔｔｃａｔｇｃａａａｔｃｃｃｃａｇａｔｇｔｔａｔａａａｔｇｇａｔｃｔｃｃｔａｔａｔｃｔｃａｇａａｇａｔｔａｔｔｔａｔａａｇｇａｇａａｔｇａａｃｇａｔｔｔｃａａｔａｔａａａｔｇｔａａｃａｔｇｇｇｔｔａｔｇａａｔａｃａｇｔｇａａａｇａｇｇａｇａｔｇｃｔｇｔａｔｇｃａｃｔｇａａｔｃｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｃｃｇｔｔｇｃｃｔｔｃａｔｇｔｇａａｇａａａａａｔｃａｔｇｔｇａｔａａｔｃｃｔｔａｔａｔｔｃｃａａａｔｇｇｔｇａｃｔａｃｔｃａｃｃｔｔｔａａｇｇａｔｔａａａｃａｃａｇａａｃｔｇｇａｇａｔｇａａａｔｃａｃｇｔａｃｃａｇｔｇｔａｇａａａｔｇｇｔｔｔｔｔａｔｃｃｔｇｃａａｃｃｃｇｇｇｇａａａｔａｃａｇｃａａａａｔｇｃａｃａａｇｔａｃｔｇｇｃｔｇｇａｔａｃｃｔｇｃｔｃｃｇａｇａｔｇｔａｃｃｔｔｇａａａ
【００７６】
タンパク質配列（３０５ａａ）（配列番号１２）：
ＥＤＣＮＥＬＰＰＲＲＮＴＥＩＬＴＧＳＷＳＤＱＴＹＰＥＧＴＱＡＩＹＫＣＲＰＧＹＲＳＬＧＮＶＩＭＶＣＲＫＧＥＷＶＡＬＮＰＬＲＫＣＱＫＲＰＣＧＨＰＧＤＴＰＦＧＴＦＴＬＴＧＧＮＶＦＥＹＧＶＫＡＶＹＴＣＮＥＧＹＱＬＬＧＥＩＮＹＲＥＣＤＴＤＧＷＴＮＤＩＰＩＣＥＶＶＫＣＬＰＶＴＡＰＥＮＧＫＩＶＳＳＡＭＥＰＤＲＥＹＨＦＧＱＡＶＲＦＶＣＮＳＧＹＫＩＥＧＤＥＥＭＨＣＳＤＤＧＦＷＳＫＥＫＰＫＣＶＥＩＳＣＫＳＰＤＶＩＮＧＳＰＩＳＱＫＩＩＹＫＥＮＥＲＦＱＹＫＣＮＭＧＹＥＹＳＥＲＧＤＡＶＣＴＥＳＧＷＲＰＬＰＳＣＥＥＫＳＣＤＮＰＹＩＰＮＧＤＹＳＰＬＲＩＫＨＲＴＧＤＥＩＴＹＱＣＲＮＧＦＹＰＡＴＲＧＮＴＡＫＣＴＳＴＧＷＩＰＡＰＲＣＴＬＫ
【００７７】
２．２  真核生物タンパク質発現系の構築
対数増殖期の２９３ＦＴ細胞を、１５ｃｍの直径を有する細胞培養皿中で各皿に対して１．２×１０７の細胞密度まで増殖させ、次いでＰＥＩ法によってＰＨＬｓｅｃ−ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨおよびｐＨＬｓｅｃ−ＣＲＩｇ−ｆＨプラスミドのそれぞれをトランスフェクトする。培養インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２にて６時間培養した後、２９３発現培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）と置き換える。３日間培養を維持し、次いで細胞上清を収集し、細胞および細胞残屑を遠心分離によって除去する。
【００７８】
２．３  タンパク質親和性精製、透析およびスクロース濃縮
Ｎｉ２＋カラム親和性精製法により、細胞上清中のＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨを精製し、緩衝液に溶出し、透析チューブ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）に移し、次いで緩衝液をＰＢＳ（リン酸緩衝液）と置き換え、スクロース吸収法による濃縮後、ＰＢＳにより透析する。
【００７９】
３．  実験結果
上述の方法により、ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−ｆＨ融合タンパク質を、真核生物発現系を使用することによる誘導発現および精製から得る。ＰＡＧＥ電気泳動（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は単一片のみを示し、図１に示される濃縮の後、濃度は１〜２ｍｇ／ｍｌに到達し得る。
【００８０】
関連配列を以下に示す：
ＣＲＩｇ−ｆＨ核酸配列（配列番号１）：
ＡＴＧＧＧＣＣＧＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＧＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＡＡ
【００８１】
ＣＲＩｇ−ｆＨタンパク質配列（配列番号２）：
ＭＧＲＰＩＬＥＶＰＥＳＶＴＧＰＷＫＧＤＶＮＬＰＣＴＹＤＰＬＱＧＹＴＱＶＬＶＫＷＬＶＱＲＧＳＤＰＶＴＩＦＬＲＤＳＳＧＤＨＩＱＱＡＫＹＱＧＲＬＨＶＳＨＫＶＰＧＤＶＳＬＱＬＳＴＬＥＭＤＤＲＳＨＹＴＣＥＶＴＷＱＴＰＤＧＮＱＶＶＲＤＫＩＴＥＬＲＶＱＫＥＤＣＮＥＬＰＰＲＲＮＴＥＩＬＴＧＳＷＳＤＱＴＹＰＥＧＴＱＡＩＹＫＣＲＰＧＹＲＳＬＧＮＶＩＭＶＣＲＫＧＥＷＶＡＬＮＰＬＲＫＣＱＫＲＰＣＧＨＰＧＤＴＰＦＧＴＦＴＬＴＧＧＮＶＦＥＹＧＶＫＡＶＹＴＣＮＥＧＹＱＬＬＧＥＩＮＹＲＥＣＤＴＤＧＷＴＮＤＩＰＩＣＥＶＶＫＣＬＰＶＴＡＰＥＮＧＫＩＶＳＳＡＭＥＰＤＲＥＹＨＦＧＱＡＶＲＦＶＣＮＳＧＹＫＩＥＧＤＥＥＭＨＣＳＤＤＧＦＷＳＫＥＫＰＫＣＶＥＩＳＣＫＳＰＤＶＩＮＧＳＰＩＳＱＫＩＩＹＫＥＮＥＲＦＱＹＫＣＮＭＧＹＥＹＳＥＲＧＤＡＶＣＴＥＳＧＷＲＰＬＰＳＣＥＥＫＳＣＤＮＰＹＩＰＮＧＤＹＳＰＬＲＩＫＨＲＴＧＤＥＩＴＹＱＣＲＮＧＦＹＰＡＴＲＧＮＴＡＫＣＴＳＴＧＷＩＰＡＰＲＣＴＬＫＳｔｏｐ
【００８２】
ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨ核酸配列（配列番号３）：
ＡＴＧＧＧＣＣＧＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＧＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＡＡ
【００８３】
ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質配列（配列番号４）：
ＭＧＲＰＩＬＥＶＰＥＳＶＴＧＰＷＫＧＤＶＮＬＰＣＴＹＤＰＬＱＧＹＴＱＶＬＶＫＷＬＶＱＲＧＳＤＰＶＴＩＦＬＲＤＳＳＧＤＨＩＱＱＡＫＹＱＧＲＬＨＶＳＨＫＶＰＧＤＶＳＬＱＬＳＴＬＥＭＤＤＲＳＨＹＴＣＥＶＴＷＱＴＰＤＧＮＱＶＶＲＤＫＩＴＥＬＲＶＱＫＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＤＣＮＥＬＰＰＲＲＮＴＥＩＬＴＧＳＷＳＤＱＴＹＰＥＧＴＱＡＩＹＫＣＲＰＧＹＲＳＬＧＮＶＩＭＶＣＲＫＧＥＷＶＡＬＮＰＬＲＫＣＱＫＲＰＣＧＨＰＧＤＴＰＦＧＴＦＴＬＴＧＧＮＶＦＥＹＧＶＫＡＶＹＴＣＮＥＧＹＱＬＬＧＥＩＮＹＲＥＣＤＴＤＧＷＴＮＤＩＰＩＣＥＶＶＫＣＬＰＶＴＡＰＥＮＧＫＩＶＳＳＡＭＥＰＤＲＥＹＨＦＧＱＡＶＲＦＶＣＮＳＧＹＫＩＥＧＤＥＥＭＨＣＳＤＤＧＦＷＳＫＥＫＰＫＣＶＥＩＳＣＫＳＰＤＶＩＮＧＳＰＩＳＱＫＩＩＹＫＥＮＥＲＦＱＹＫＣＮＭＧＹＥＹＳＥＲＧＤＡＶＣＴＥＳＧＷＲＰＬＰＳＣＥＥＫＳＣＤＮＰＹＩＰＮＧＤＹＳＰＬＲＩＫＨＲＴＧＤＥＩＴＹＱＣＲＮＧＦＹＰＡＴＲＧＮＴＡＫＣＴＳＴＧＷＩＰＡＰＲＣＴＬＫＳｔｏｐ
【００８４】
実施例２：ＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨと、Ｃ３活性化分解断片との間の相互作用の動態分析および親和性決定
１．機器および材料
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（タンパク質相互作用分析器、Ｃｏｍｐａｎｙ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＮＴＡ  ｃｈｉｐ、ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質溶液、タンパク質補体（Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）のＣ３活性化および分解、溶液ＨＢＳ−Ｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）。
【００８５】
２．実験方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は生体高分子相互作用を分析するために使用される技術であり、これは、２つの分子間の相互作用が存在するかどうかを定性的に評価できるか、または様々な分子との分子間の相互作用の強度を比較できる。それはまた、親和性パラメーター（平衡定数）および動的パラメーター（速度定数）、さらに熱力学的パラメーター（反応エンタルピー）をリアルタイムで定性的に決定できる。この技術は物理光学の原理を利用する。２つの分子間の相互作用の研究において、分子はセンサチップの表面上に固定され、別の種類の分子の溶液がチップの表面を通して流れる。２つの分子の組み合わせはセンサチップ表面の屈折率を変化させ、これは２つの分子間の相互作用を検出するために使用され得る。Ｃ３酵素性分解産物との補体阻害剤ＣＲＩｇ−ｆＨの動態分析および親和性決定は、ＳＰＲの原理に基づいてＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用することによって実施される。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＮＴＡチップをＣＲＩｇ−ｆＨＨｉ標識のために選択する。実験方法は以下の通りである：
（１）チップ前処理：ＮＴＡセンサチップモジュールをＢＩＡｃｏｒｅ機器内に埋め込み、ＨＢＳ−Ｎランニング緩衝液（緩衝溶液）を調製し、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００タンパク質相互作用分析器を起動し、プログラムを設定する。最初に、チップを洗浄するために２５℃の温度にてＨＢＳ−Ｎランニング緩衝液を２回予備注入する。流量は１２０μｌ／分であり、各注入はベースラインが一定になるまで５分継続する。
（２）Ｎｉカップリング：ニッケル溶液（０．５ｍＭのＮｉＣｌ２／ランニング緩衝液）を２５℃にて１回注入する。流量は３０μｌ／分であり、持続時間は６０秒であり、安定時間は３０秒である。
（３）リガンドカップリング：ＣＲＩｇ−ｆＨ融合タンパク質をＨＢＳ−Ｎランニング緩衝液によって０．２μｇ／ｍｌのリガンド溶液に希釈し、リガンド溶液を２５℃にて１回注入する。流量は３０１μｌ／分であり、持続時間は６０秒であり、安定時間は３０秒である。
（４）分析物注入：ＨＢＳ−Ｎランニング緩衝液を用いたＣ３酵素性分解産物の勾配希釈により分析溶液を調製し、２５℃にて特定の濃度のＣ３酵素性分解産物を有する分析溶液を１回注入する。流量は３０μ／分であり、持続時間は２分であり、安定時間は１２０秒である。
（５）チップ再生：２５℃にて再生溶液（再生溶液：３５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ｐＨ８．３）を１回注入する。流量は３０μｌ／分であり、持続時間は６０秒である。
（６）第２の濃度でのＣ３酵素性分解産物の反応速度曲線決定のために工程（２）から（５）を繰り返す。
（７）Ｃ３酵素性分解産物全ての濃度の全ての決定の完了後、ベースラインが一定になるまでチップを洗浄するために再生溶液を２回注入する。
（８）反応速度曲線をシミュレーションし、動態パラメーター（会合定数Ｋａ、解離定数Ｋｄおよび平衡解離定数ＫＤを含む）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００  ｖ２．０２ソフトウェアによって決定する。Ｋａ、ＫｄおよびＫＤを表１に示す。
【００８６】
【表１】
2016535062.tif 000002
【００８７】
３．実験結果
図２（ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨとＣ３活性化分解産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄとの間の相互作用）および図３（ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨとＣ３活性化分解産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄとの間の相互作用についての動態分析および結合力の決定の結果の概略図）を参照すると、ＣＲＩｇ−ｆＨおよびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの両方は、Ｃ３活性化分解産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３との異なる程度の結合を有する。ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの結合力はより強く、さらなる機能実験の動物モデルにおいてそれを選択する。
【００８８】
実施例３：ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨは補体ＡＰおよびＣＰにより誘導される溶血からＰＮＨ赤血球を保護する
１．機器および材料
７人のＰＮＨ患者の赤血球、正常なヒト血清、ＣＶＦ（コブラ毒因子：１ｍｇ／ｍｌ、Ｃｏｍｐｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、抗ヒト赤血球ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ多機能マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｆｉｎｌａｎｄ製）、Ｍｉｎｉｓｐｉｎ卓上高速遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｏｆ  Ｇｅｒｍａｎｙ製）、ＤＫ−８Ｄ型電気加熱定温水タンク（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｗａｔｅｒ  Ｃａｂｉｎｅｔ）（上海精宏実験設備有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｎｇｈｏｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）製）
【００８９】
２．実験方法
２．１．ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨはＰＮＨ赤血球の補体ＡＰにより誘導される溶血を阻害する
末端部血液採取により７人のＰＮＨ患者から採取した赤血球（ＲＢＣ）の試料を、ＰＢＳ（５０００ｒｐｍ、３分の遠心分離）によって３回洗浄し、次いでそれらを４％ＲＢＣ溶液中で調製する。２００μｌの反応系に、４％のＲＢＣ２５μｌ（１％の最終濃度）を加え、次いで希釈したＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質溶液を加えて最終０〜３μＭ濃度勾配のＣＶＦ（１００μｇ／ｍｌ）、４μｌの正常なヒト血清２０μｌ（１０％の最終濃度）を形成する。ブランク対照および全溶解対照を同じ時間にセットする。３７℃にて、３０分の水浴および１分の１０，０００ｒｐｍ遠心分離後、１００μｌの上清を得、ＯＤ４１４ｎｍにてマイクロプレートリーダーによる吸光度の検出に供する。
【００９０】
２．２．ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨはＰＮＨ赤血球の補体ＣＰにより誘導される溶血を阻害する
７人のＰＮＨ患者から採取した赤血球（ＲＢＣ）の試料をＰＢＳ（５０００ｒｐｍ、３分の遠心分離）により３回洗浄し、次いでそれらを４％ＲＢＣ溶液中で調製する。２００μｌの反応系に、４％のＲＢＣ２５μｌ（１％の最終濃度）を加え、次いで希釈したＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質溶液を加えて、最終０〜３μＭ濃度勾配の抗ヒトＲＢＣ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）、２μｌの正常なヒト血清２０μｌ（１０％の最終濃度）を形成する。ブランク対照および全溶解対照を同じ時間にセットする。３７℃にて、３０分の水浴、１分の１０，０００ｒｐｍの遠心分離後、１００μｌの上清を得、ＯＤ４１４ｎｍにてマイクロプレートリーダーにより吸光度の検出に供する。
【００９１】
２．３  統計処理方法
データは標準偏差（平均±ＳＤ）によって示す。グラフはＥｘｃｅｌ（登録商標）によって作成する。
【００９２】
３．実験結果
インビトロでの溶血実験の結果は、ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨタンパク質が、両方の補体ＡＰおよびＣＰにより誘導されるＰＮＨ赤血球溶血に対してある程度阻害し、図４および図５に示されるように補体ＡＰの阻害はより強力であることを示す。
【００９３】
実施例４：ラットＴｈｙ−ＩＮ腎炎に対するＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの遊離効果
１．機器および材料
Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ多機能マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｆｉｎｌａｎｄ製）、ＦＶ５００レーザー共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ製）、ＢＣＡタンパク質定量試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、Ｃｏｂａｓ  ６０００分析器、全自動生化学的分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、ＳＤラット、抗Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂ−ＦＩＴＣ抗体、抗ＳＣ５ｂ−９抗体、抗Ｈｉｓ抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（ウサギ抗マウス）。
【００９４】
２．実験方法
２．１  ラットＴｈｙ−１腎炎モデルの構築
雄性ＳＤラットをＳＰＦ（特定の病原体を含まない）レベルの環境で体重１５０〜２００ｇまで飼育し、モデリングのために３つの群に無作為に分ける。
（１）ＮＲＳ群（ｎ＝４）：正常なウサギ血清（ＮＲＳ）をラットに尾静脈注射により注射する。注射の投薬量は１ｍｌ／１００ｇ体重である。
（２）ＡＴＳ群（ｎ＝４）：ウサギ抗ラット胸腺細胞血清（ＡＴＳ）をラットに尾静脈注射により注射する。注射の投薬量は１ｍｌ／１００ｇ体重である。
（３）ＡＴＳ＋ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨ群（ｎ＝４）：ウサギ抗ラット胸腺細胞血清（ＡＴＳ）をラットに尾静脈注射により注射する。注射の投薬量は１ｍｌ／１００ｇ体重である。次いで尾静脈注射によりＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨと組み合わせて注射する。注射の投薬量は１ｍｇ／１００ｇ体重である。
【００９５】
２．２  ラット腎炎の指標の検出
注射後、ラットをラット代謝ケージで飼育する。注射の２４時間および７２時間後、血液試料を尾静脈を介して標準的な凝固チューブ中に採取する。室温にて３０分間静置させた後、試料を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、血液上清（血清）を採取し、Ｃｏｂａｓ  ６０００分析器によって腎機能指標（血中尿素窒素または血清クレアチニン）の検出およびデータ収集に適用する。
【００９６】
注射の２４時間、４８時間および７２時間後、ラット代謝ケージ中の尿試料を採取する。尿試料を５０倍に希釈する。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット測定を尿中の全タンパク質濃度の試験に適用する。全タンパク質（ｍｇ／２４時間）＝ＢＣＡタンパク質濃度×５０（希釈率）×尿の全体積である。１００μｌの希釈した尿を９６ウェルマイクロタイタープレートに加え、ＯＤ４１４ｎｍにおける吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーから直接読み取って尿中のヘモグロビン含有量を測定する。
【００９７】
２．３  ラット腎臓凍結切片のＩｇＧ、Ｃ３断片およびＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨの沈殿物の免疫蛍光検出
注射の３日および７日後、ラットを各群から無作為に選択し、エーテル麻酔後、左心室を心灌流のために固定する。最初に生理食塩水灌流を行い、肝臓が赤色から白色になったら、ラットが死ぬまで４％パラホルムアルデヒドで灌流する。左腎を取り除き、ＰＢＳに浸し、リンスにより数回洗浄し、３０分間液体窒素で細胞凍結保存チューブ中で凍結させ、次いで−８０℃で保存した。
【００９８】
凍結ミクロトームを作動し、温度が−２０℃に達したら、凍結腎臓組織を−８０℃から取り出し、ＯＣＴに埋め込む。周囲組織を凍結ミクロトームにより切断する。腎皮質および髄質の接合部に位置する組織化領域を選択し、６μｍの薄片に切断し、スライドガラスに固定する。薄片を４％パラホルムアルデヒドにより１５分間固定し、ＰＢＳによりリンスし、１０％の正常なヒツジ血清により遮断し、４℃にて一晩、抗Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂ、抗Ｈｉｓ、抗ＳＣ５ｂ−９抗体とインキュベートする。翌日、ＰＢＳによる３回の洗浄後、薄片を二次抗体とインキュベートし、次いでＰＢＳによりリンスし、密閉し、顕微鏡により検査する。
【００９９】
３．実験結果
未処置の群とのＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨ処置したＴｈｙ−ＩＮラットの比較により、血中尿素窒素（ＢＵＮ）および血清クレアチニン（Ｓｃｒ）の含有量が低下し、尿中の全タンパク質およびヘモグロビン（ＨＧＢ）のレベルが低下し、同じ時間に多くのＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨが糸球体メサンギウム領域（ＧＭＡ）中に沈着し、Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂ沈着はほとんどなかった。これらにより、ＣＲＩｇ−Ｌ−ｆＨは、図６〜１０（図１０：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝４）に示されるように、一定の程度でラットＴｈ−１Ｎ腎炎の症状を軽減できることが証明される。
【０１００】
まとめると、本発明によって提供される特異的補体を標的化する阻害剤は、インビボで補体の活性化部位に特異的に標的化でき、補体活性化ならびに補体活性化により媒介される細胞および組織損傷を長期間阻害できる、新規標的特異的補体阻害剤である。これは、補体攻撃によって引き起こされる溶血損傷からヒト欠損型ＰＮＨ赤血球を保護できるだけでなく、Ｔｈｙ−１腎炎ラットモデルにおける補体によって誘導されるメサンギウム増殖性病変を軽減するようでもある。さらに、特異的補体を標的化する阻害剤は、加齢黄斑変性症、非定型可溶性出血性尿毒症性症候群、関節リウマチ、強直性脊椎炎、エリテマトーデスなどの補体系過剰活性化の他の疾患のための治療に効果的であり得ることが示される。したがって、本発明によって提供される特異的補体を標的化する阻害剤は、医薬用途に有益であり、開発の展望に対して大きな可能性を有する。
【０１０１】
上記の本発明の詳細な説明にも関わらず、上記の説明は本発明を限定するものと考慮されることはできない。当業者が上記の内容を読むと、本発明の変形および代替が明らかになるであろう。したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲により限定される。
【図１０】
2016535062.tif 000003
【図１】
2016535062.tif 000004
【図２】
2016535062.tif 000005
【図３】
2016535062.tif 000006
【図４】
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【図５】
2016535062.tif 000008
【図６】
2016535062.tif 000009
【図７】
2016535062.tif 000010
【図８】
2016535062.tif 000011
【図９】
2016535062.tif 000012
【配列表】
2016535062000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月2日(2015.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的補体を標的化する阻害剤であって、前記特異的補体を標的化する阻害剤はタンパク質であり、前記タンパク質は補体活性化に対する標的阻害機能を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列はＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび補体阻害ドメインを含み、前記タンパク質のアミノ酸配列は、直接連結されるか、または２つのドメインを連結できるリンカーを介して間接的に連結される前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインにより構成され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよく、
前記タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２または配列番号４として示される、
特異的補体を標的化する阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸であって、前記核酸の塩基配列が、配列番号１または配列番号３として示される、核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含有するベクター。
【請求項４】
請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法であって、前記方法は、遺伝子操作手法によって、直接連結されるか、または間接的に連結される、前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインおよび前記補体阻害ドメインのタンパク質ポリペプチドを作製することを含み、
前記ＣＲＩｇ細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１０として示され、
前記補体阻害ドメインは、Ｈ因子、Ｃ１阻害タンパク質、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、プロテインＳ、クラステリン、補体膜調節タンパク質ＣＤ３５／ＣＲ１、ＣＤ４６／ＭＣＰ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５９またはＣＲＩｇ自体の完全長もしくは機能的断片からのいずれか１つまたは複数の種類の組み合わせであってもよい、方法。
【請求項５】
前記遺伝子操作手法が、
ＣＲＩｇ細胞外ドメインをコードする核酸配列および補体阻害ドメインをコードする核酸配列を、遺伝子組換えオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、直接連結するか、またはフレキシブルな連結ペプチドセグメントをコードする核酸配列を介して間接的に連結する工程、次いで融合配列を得、それを真核生物発現ベクター内に挿入する工程、真核生物タンパク質発現系を介して特異的補体を標的化する阻害剤のタンパク質発現を誘導する工程、および最後に、得られたタンパク質を精製する工程を含む、請求項４記載の特異的補体を標的化する阻害剤を調製する方法。
【請求項６】
補体活性化の阻害を標的とする薬物の製造における請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤の使用。
【請求項７】
発作性夜間ヘモグロビン尿症を有する患者における血液細胞を保護するため、および他の疾患の補体により攻撃される細胞を補体攻撃から保護するための薬物の製造における請求項１記載の特異的補体を標的化する阻害剤の使用。
【請求項８】
有効成分が請求項１記載のタンパク質である、薬物。
【国際調査報告】
2016535062.tif 000013
2016535062.tif 000014
2016535062.tif 000015
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