(57)【要約】被験者の気道への酵素の送達のための方法および組成物。いくつかの態様では、プラスミノーゲン活性化剤などの噴霧酵素組成物が提供される。さらなる態様では、プラスミノーゲン活性化などの酵素を含むパーフルオロカーボン組成物が提供される。いくつかの態様では、組成物は、吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）などの肺感染症または急性肺損傷の治療に用いることができる。本明細書では、酵素溶液を噴霧する（例えば、振動メッシュ噴霧器を使用して）ことを含む、被験者の気道へ投与するための酵素溶液の調製方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
噴霧溶液を提供するために酵素溶液を噴霧することを含む、被験者の気道に投与するための酵素溶液の調製方法。
【請求項２】
前記酵素はプラスミノーゲン活性化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラスミノーゲン活性化剤は、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素溶液の噴霧は振動メッシュ噴霧器を使用することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記振動メッシュ噴霧器はＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＮｅｂｕｌｉｚｅｒまたはＥＺ ＢｒｅａｔｈｅＡｔｏｍｉｚｅｒである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記噴霧はジェット噴霧器または超音波噴霧器の使用を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素溶液は水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素溶液は生理学的に許容される塩濃度を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素溶液はｐＨ緩衝剤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素溶液はｓｃｕＰＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素溶液の噴霧は以下を含む、請求項１に記載の方法：
（ｉ）凍結乾燥酵素組成物の取得；
（ｉｉ）酵素溶液を提供するための、水溶液中における前記凍結乾燥酵素組成物の再構成；
（ｉｉｉ）前記酵素溶液の噴霧。
【請求項１４】
前記酵素溶液の噴霧は、約２．５μｍと１０μｍの間のメジアン液滴サイズを有する噴霧溶液を提供するのに十分な噴霧エネルギー及び／または時間を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素溶液の噴霧は、約２．５μｍと８μｍの間のメジアン液滴サイズを有する噴霧溶液を提供するのに十分な噴霧エネルギー及び／または時間を提供することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素溶液の噴霧は、約３．０μｍと６μｍの間のメジアン液滴サイズを有する噴霧溶液を提供するのに十分な噴霧エネルギー及び／または時間を提供することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により製造された噴霧酵素溶液。
【請求項１８】
さらに、それを必要とする被験者の気道へ前記噴霧溶液を投与することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験者は急性肺損傷または感染症を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに化学的に誘発される肺損傷を有する被験者の前記気道へ前記噴霧溶液を投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらにプラスチック気管支炎、喘息または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する被験者の前記気道へ前記噴霧溶液を投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
さらに吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）を有する被験体に前記噴霧溶液を投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
被験者における吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療方法であって、気道を介して前記被験者に噴霧プラスミノーゲン活性化剤の治療有効量を投与することを含み、前記プラスミノーゲン活性化剤は振動メッシュ噴霧器を用いて噴霧される方法。
【請求項２４】
前記プラスミノーゲン活性化剤は、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の噴霧溶液を含む組成物。
【請求項２７】
前記溶液は水溶液である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記溶液は生理学的に許容される塩濃度を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記溶液はｐＨ緩衝剤を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ｓｃｕＰＡを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記噴霧溶液は、約２．５μｍと１０μｍの間のメジアン液滴サイズを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】
前記噴霧溶液は、約２．５μｍと８μｍの間のメジアン液滴サイズを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３４】
前記噴霧溶液は、約３．０μｍと６μｍの間のメジアン液滴サイズを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３５】
急性肺損傷または肺感染症の治療に使用するための組成物であって、請求項２６〜３４のいずれか１項に係る噴霧溶液を含む前記組成物。
【請求項３６】
化学物質誘発性肺損傷、プラスチック気管支炎、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療に使用するための、請求項３５の組成物。
【請求項３７】
吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療に使用するための組成物であって、請求項２６〜３４のいずれか１項に係る噴霧溶液を含む前記組成物
【請求項３８】
プラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボンを含む組成物。
【請求項３９】
前記プラスミノーゲン活性化剤は、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記パーフルオロカーボンはシクロアルキル基を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
前記パーフルオロカーボンは、パーフルオロデカリン及びパーフルオロオクチルブロミドから選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
前記パーフルオロカーボンはパーフルオロデカリンを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
急性肺損傷または感染症の治療に使用するための組成物であって、請求項３８〜４３のいずれか１項に係る組成物を含む前記組成物。
【請求項４５】
化学物質誘発性肺損傷、プラスチック気管支炎、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療に使用するための、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療に使用するための組成物であって、請求項３８〜４３のいずれか１項に係る組成物を含む前記組成物。
【請求項４７】
肺感染症または肺障害を有する被験者を治療する方法であって、被験者の気道へ請求項３８〜４３のいずれか１項に係る組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４８】
前記被験体は化学的に誘発される肺損傷を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体はプラスチック気管支炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）を有する被験体を治療する方法であって、前記被験者の気道へ請求項３８〜４３のいずれか１項に係る組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項５１】
被験者における吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）を治療する方法であって、前記被験者にプラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボンを含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項５２】
前記プラスミノーゲン活性化剤は、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記パーフルオロカーボンは、パーフルオロデカリン及びパーフルオロオクチルブロミドから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記パーフルオロカーボンはパーフルオロデカリンを含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１１月４日に出願された米国仮特許出願Ｎｏ．６１／８９９，７３９の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、分子生物学、薬物送達及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、被験者の呼吸器系への治療酵素組成物の送達のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
重度の火傷と煙曝露患者の多くは、３０〜４０％の死亡率、長引く入院や長期の病的状態に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と呼ばれるＡＬＩ（急性肺障害）の重症型を進行させる。吸入煙（ＩＳ）誘発ＡＬＩ（ＩＳＡＬＩ）は、激しい気道閉塞、気道線維キャスト及びデブリ並びに肺胞フィブリン沈着によって特徴付けられる。ＩＳＡＬＩのための効果的な、具体的な治療が現在欠如している。
【０００４】
火傷傷害は毎年米国では１００万人以上の患者に影響を与え、ＩＳＡＬＩは毎年民間及び軍事演習において煙曝露患者数千人に影響を与える（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒｅｔ ａｌ．，２００４ａ）。ＩＳＡＬＩは、毎年米国における３０００以上の死者及び１７，０００火災災害、並びに先進国で最高の一つである２〜３／人口１０万人の火災に関連した死亡率に寄与しており、これは先進国で最も高いものの１つである［Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０５：１３５５−１３５７］。支持療法は、次善で、長引き、高価である。結果は、かなりの死亡率及び罹患率を伴う。人工呼吸を含む現在の支持療法にもかかわらず、ＩＳＡＬＩに関連するものを含むＡＲＤＳの死亡率は、３０〜４０パーセントに近づいている（Ｐｈｕａｅｔ ａｌ．，２００９）。
これらの考察は、新しい、潜在的に、より効果的な治療法の試験を要求する。ＩＳＡＬＩは、重篤な呼吸障害、長引く入院と、多くの場合、人工呼吸の必要性に関連付けられる。ＩＳＡＬＩの長期合併症は、気管支反応性、加速性肺線維症及び気管支拡張症を含む。ＡＬＩのすべての形態の中で、ＩＳＡＬＩは大きな気道内で形成するフィブリンキャスト及び肺胞内のフィブリンを含む異常なフィブリンターンオーバーに特に傾向がある（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒｅｔ ａｌ．，２００４ａ）。気管支キャストは、ガス交換を妨害し、多くの場合、気管支鏡のクリアランスを必要とし、無気肺を助長する。噴霧されたヘパリン及びＮ−アセチルシステインが臨床で使用されているが、ＩＳＡＬＩの患者に噴霧されたヘパリンの有効性は、任意のランダム化や将来に向かっての臨床試験では証明されていないままであり（Ｔｕｉｎｍａｎｅｔ ａｌ．，２０１２）、我々の羊の研究で試験した場合、ヘパリン単独ではＩＳＡＬＩを改善することは示されていない（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｅｎｋｈｂａａｔａｒｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。ヘパリンは、確立された血栓をクリアせず、噴霧ヘパリンはＩＳＡＬＩにおける全身の血液凝固障害を開始し得る（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，２０１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ１０５：１３５５−１３５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、酵素溶液を噴霧する（例えば、振動メッシュ噴霧器を使用して）ことを含む、被験者の気道へ投与するための酵素溶液の調製方法が提供される。酵素は、組織プラスミノーゲン活性化剤であり、これは、単鎖ウロキーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、振動メッシュ噴霧器は、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒまたはＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒである。
【０００７】
従って、第1の実施形態では、噴霧溶液を提供するために、酵素溶液を噴霧することを含む、被験者の気道への投与のための酵素溶液の調製方法が提供される。特定の態様では、酵素は、単鎖ウロキーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）などの、プラスミノーゲン活性化剤であることができる。特定の態様では、酵素溶液の噴霧は振動メッシュ噴霧器を使用することによることができる。いくつかの態様では、酵素溶液の噴霧は、ジェット噴霧器または超音波噴霧器の使用を含まない。特定の態様では、実施形態の酵素溶液の噴霧は、約２．５μｍと１０μｍの間、２．５μｍと８μｍの間、または３．0μｍと６μｍの間、のメジアン液滴サイズを有する噴霧溶液を提供するのに十分な噴霧エネルギー及び／または時間を提供することを含む。いくつかの特定の態様では、酵素溶液の噴霧は、凍結乾燥酵素組成物の取得、酵素溶液を提供するための、溶液（例えば、水溶液）中における凍結乾燥酵素組成物の再構成、及び酵素溶液の噴霧、を含む。従って、さらなる実施形態では、実施例の方法に従って製造された噴霧酵素溶液が提供される。
【０００８】
さらに他の実施形態では、ｓｃｕＰＡまたはｔＰＡの噴霧溶液を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、実施形態の組成物または酵素溶液は水性溶液であり得る。特定の態様では、酵素溶液は、生理学的に許容される塩濃度及び／またはｐＨ緩衝剤を含む。例えば、酵素溶液は滅菌生理食塩溶液またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であることができる。好ましい態様では、組成物または酵素溶液はｓｃｕＰＡを含む。
【０００９】
さらなる実施形態では、それを必要とする被験者の気道へ噴霧酵素溶液（例えば、ｔＰＡ及び／またはｓｃｕＰＡ酵素溶液）を投与することを含む、被験者の治療方法が提供される。例えば、被験者は急性肺損傷または感染症を有することができる。さらに他の態様では、治療のための被験者は、吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）、化学物質誘発性肺損傷、プラスチック気管支炎、激しい喘息、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する。この実施形態では、プラスミノーゲン活性化剤は、振動メッシュ噴霧器（例えば、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒまたはＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒ）などの噴霧器を使用して噴霧される。当業者は、酵素の治療的及び薬学的に許容される投与量を送達する、噴霧器などの任意のタイプのアトマイザーが、実施形態に従って使用するのに適していることを理解する。
【００１０】
さらなる実施形態では、プラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボン（例えば、「呼吸液体」）を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡ及び／またはｔＰＡである。いくつかの態様では、パーフルオロカーボンは、シクロアルキル基を含むことができる。例えば、パーフルオロカーボンはペルフルオロデカリン及び／またはパーフルオロオクチルブロミドであり得る。
【００１１】
本発明の別のさらなる実施形態は、プラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボンを含む組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む、肺感染症または肺障害を有する被験者の治療方法を提供する。いくつかの態様では、プラスミノーゲン活性化剤はｓｃｕＰＡまたはｔＰＡである。特定の態様では、パーフルオロカーボンは、パーフルオロデカリン及び／またはパーフルオロオクチルブロミドであり得る。
【００１２】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び修正はこの詳細な説明から当業者に明らかとなるので、詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示の方法によってのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組合せてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってより理解することができる。
【図１】図１は、ＢＡＬ ｕＰＡ活性を増大させるブレオマイシン誘発ＡＬＩを有するマウスにおける組換えｓｃｕＰＡの気管内送達を示すグラフである。
【図２】図２は、噴霧ｓｃｕＰＡによる羊の治療が、ｓｃｕＰＡ処理後のヒトのｕＰＡ抗原（レーン３）に関連した検出可能なｕＰＡ活性を提供したことを示す。ｕＰＡの抗原及び活性は、ｓｃｕＰＡで治療した動物からの肺ホモジネート（レーン４）で同様に見出された。レーン１：ｕＰＡ標準及びレーン２：ベースラインｕＰＡ活性。
【図３】図３は、いくつかの異なる噴霧単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）製剤の調製方法の模式図である。
【図４】図４は、図３に従って調製した噴霧ｓｃｕＰＡ製剤の活性の模式図である。
【図５】図５は、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）またはパーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＢ）と一度混合した組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の活性の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｉ．本発明
振動メッシュ噴霧器などの噴霧器を使用して酵素液を噴霧することを含む、被験者の気道に投与するための酵素液の調製方法が、本明細書で提供される。振動メッシュ噴霧器の使用によるなどの酵素の噴霧が、有意な酵素活性レベルを維持する噴霧組成物をもたらすということは、本明細書に詳述される本研究の驚くべき発見である。気道を介して噴霧プラスミノーゲン活性化剤の治療有効量を被験者に投与することによる、被験者における吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）などの肺損傷及び感染症を治療する方法も本明細書で提供される。いくつかの例では、プラスミノーゲン活性化剤は振動メッシュ噴霧器を使用して噴霧される。さらに、本明細書では、プラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボンを含む組成物、並びに肺損傷及び感染症（例えば、ＩＳＡＬＩ）を治療するためのプラスミノーゲン活性化剤／パーフルオロカーボン組成物を使用する方法が提供される。いくつかの実施形態では、実施形態に従って使用する酵素は、プロ酵素である。さらなる態様では、酵素はプラスミノーゲン活性化剤である。
【００１５】
さらに他の実施形態では、本明細書で使用する酵素は、ｔＰＡ及びｓｃｕＰＡから選択されるプラスミノーゲン活性化剤である。用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」と「ｔＰＡ」は同じ意味で使用され、本明細書では、プラスミンへのプラスミノーゲンの変換に関与することができるセリンプロテアーゼ（いくつかの実施形態では、ＥＣ ３．４．２１．６８）を指す。用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」及び「ｔＰＡ」は、アルテパーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びデスモテプラーゼを含むがこれらに限定されない組換え形態を含むことが理解されるべきである。用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」及び「ｔＰＡ」は、さらに、単鎖形態（ｓｃ−ｔＰＡ）、２本鎖形態（ｄｓ−ｔＰＡ）、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ｔＰＡは、ヒトのｔＰＡまたはヒト由来のｔＰＡである。用語「単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤」と「ｓｃｕＰＡ」は同じ意味で使用され、本明細書では、ウロキナーゼセリン プロテアーゼのプロ酵素（いくつかの実施形態では、ＥＣ３．４．２１．７３）を指し、ここでセリン プロテアーゼはプラスミノーゲンのプラスミンへの変換に関与することができる。「単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤」または「ｓｃｕＰＡ」は、Ｌｙｓ１５８とＩｌｅ１５９の間のタンパク質分解切断によって活性化することができ、セリンプロテアーゼ酵素を形成するジスルフィド結合により連結された２つの鎖が得られる。実施例３及び図４は、以下に、振動メッシュ噴霧器を使用したｓｃｕＰＡの噴霧と、噴霧の先行技術の方法に比べて、噴霧に続いて達成される驚くほど高い酵素活性を説明する。いくつかの実施形態では、振動メッシュ噴霧器はＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒまたはＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒである。
【００１６】
用語「酵素溶液」は、本明細書では、噴霧に適した酵素を含む任意の液体製剤を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で定義されるように、酵素溶液は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。酵素溶液は、吸入または当業者に公知の任意の他の方法を介して、被験者の気道に投与される。用語「気道」は、本明細書では、上気道、呼吸気道、及び肺を含む気道の任意の部分を指す。上気道は、鼻及び鼻腔、口、並びに喉を含む。呼吸気道は、喉頭、気管、気管支及び細気管支を含む。肺は呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢及び肺胞を含む。
【００１７】
気道を介して噴霧プラスミノーゲン活性化剤の治療有効量を被験者に投与することを含む、被験者における吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療方法も本明細書で提供され、この場合、プラスミノーゲン活性化剤は振動メッシュ噴霧器を使用して噴霧される。いくつかの実施形態では、プラスミノーゲン活性化剤は、ｔＰＡ及びｓｃｕＰＡから選択される。他のまたはさらなる実施形態では、振動メッシュ噴霧器は、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒまたはＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒである。
【００１８】
「ＩＳＡＬＩを治療する」は、部分的にまたは完全に、ＩＳＡＬＩ病態などの障害または病態の１つまたは複数の付随する症状の強度を、遅延、軽減、緩和または低減すること、及び／またはＩＳＡＬＩ病態などの障害または病態の１つまたは複数の原因を軽減、緩和または妨害することを指す。本発明による治療は予防的に（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｌｙ）、予防的に（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）、対症的にまたは治療的に適用することができる。いくつかの例では、用語「治療する」、「治療している」、「治療」及びそれらの文法的変形は、被験者の治療前に比較して、または一般の研究集団におけるそのような病態または症状の発生率と比較して、ＩＳＡＬＩ病態に関連した病態または症状を部分的にまたは完全に軽減することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩの病態は、以下の１つまたは複数を含む：酸素化の減少、気道閉塞（重症気道閉塞を含む）、気道線維キャストまたはデブリ、及び肺胞フィブリン沈着。従って、ＩＳＡＬＩ病態の治療は、酸素化、気道閉塞の低減、気道線維キャストまたはデブリの低減、及び肺胞フィブリン沈着の低減の１つまたは複数の改善を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩ病態は出血の発生率低減によって治療される。
【００１９】
さらに、本明細書では、プラスミノーゲン活性化剤及びパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物中のプラスミノーゲン活性化剤は、ｔＰＡ及びｓｃｕＰＡから選択される。他のまたはさらなる実施形態では、組成物中のＰＦＣは、パーフルオロデカリン、パーフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサン、ＦＣ−７５、パーフルオロオクタン及びパーフルオロ−オクチルブロミドから選択される。いくつかの態様では、ＰＦＣは、パーフルオロデカリン、パーフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサンまたはＦＣ−７５などのシクロアルキル基を有するＰＦＣであるか、または、それを含む。プラスミノーゲン活性化剤とＰＦＣは任意の比率または濃度であり得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＦＣの約０．００５〜０．０４０ｍｇ／ｍＬの濃度のプラスミノーゲン活性化剤を含む。
【００２０】
さらにまた、プラスミノーゲン活性化剤及びＰＦＣを含む組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む、被験者の吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）の治療方法が提供される。実施例４及び図５は、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡが、パーフルオロカーボン混合物中で活性を保持したことを示す。さらに、ＰＦＣ及びプラスミノーゲン活性化剤は、気道デブリ除去並びに肺胞フィブリンのクリアランス及び結果の改善などを付加的に助長する。具体的には、ＰＦＣは、気道のガス交換をサポートしつつ、１）気道キャストの溶解と除去；２）気道及び肺胞のデブリの除去、を助長するプラスミノーゲン活性化剤を効果的に送達する。機構的に、ＰＦＣは、肺容量を効果的に回復する。ＰＦＣ液の低表面張力を与えられると、ＰＦＣはプラスミノーゲン活性化剤を、キャストと気道壁との間に潜在的に、肺を通して分布させ、従って、新たなキャストの形成を遅らせつつ、それらが形成されているときにキャストを破壊する。ＰＦＣが肺から揮発するとき、プラスミノーゲン活性化剤は残って、さらに気道のキャストと肺胞フィブリンを溶解するように作用する。ＰＦＣ懸濁液を再投与すると、ＰＦＣボリュームは追加の薬剤を付着させるばかりでなく、キャスト及び肺胞のデブリを除去する。ＰＦＣは非圧縮性であるため、破損した小さな気道を開くようにステントし、それにより補強を助ける。我々は、任意の特定の機構によっては束縛されないが、ＰＦＣとの接触は、凝固の減衰を通じて、基礎となる上皮を保護することもでき、これはＡＬＩの事実上すべての形態の小さな気道及び肺胞の組織因子によって開始される。インラインの吸引により、低密度のデブリは比較的より高密度のＰＦＣ中にフロートし、気道フィブリンキャスト断片及びデブリの除去を容易にする。
【００２１】
従って、プラスミノーゲン活性化剤とＰＦＣの組成物を投与する方法のいくつかの実施形態では、プラスミノーゲン活性化剤はｔＰＡ及びｓｃｕＰＡから選択される。プラスミノーゲン活性化剤とＰＦＣの組成物を投与する方法の他のまたはさらなる実施形態では、組成物中のＰＦＣは、パーフルオロデカリン及びパーフルオロ−オクチルブロミドから選択される。
【００２２】
上記は本発明の好ましい実施形態に関連しており、その多くの変更が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。本発明はさらに、その範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない以下の実施例により例示される。逆に、本明細書の説明を読んだ後、本発明及び／または添付の特許請求の範囲の精神から逸脱することなく当業者に示唆し得る、様々な他の実施形態、変形例、及びそれらの均等物に対して手段が持たれ得ることが、明確に理解されるべきである。本明細書で参照されるすべての特許、特許出願、及び刊行物は、すべての目的のためにその全体が参照により組込まれる。本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語の定義は以下の通りである。
ＩＩ．定義
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しなければ、複数の言及を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことを明確に示すかまたは代替物が相互に排他的でなければ、「及び／または」を意味するのに使用されるが、本開示は代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味することができる。
【００２５】
本出願を通して、用語「約」は、値がデバイスの誤差の固有の変動を含むことを示すのに使用され、この方法は、値、または試験被験者の間に存在する変動を決定するために使用される。
【００２６】
用語「投与する」は、吸入により、または埋め込み式リザーバーを介して、経口、局所、静脈内、皮下、経皮、経皮、筋肉内、関節、非経口、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣で投与することを意味する。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射または注入技術を含む。いくつかの実施形態では、投与は、噴霧組成物の吸入を介する。
【００２７】
用語「気道」は、本明細書では、上気道、呼吸気道、及び肺を含む呼吸気道の任意の部分を指す。上気道は、鼻と鼻腔、口、及び喉を含む。呼吸気道は、喉頭、気管、気管支及び細気管支を含む。肺は呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢及び肺胞を含む。
【００２８】
「組成物」は、活性剤と、アジュバントなどの、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性の、別の化合物または組成物の組合せを意味することが意図されている。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物及び方法が引用された要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図されている。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、組合せに対して任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するであろう。従って、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製法からの微量混入物、及び例えば、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しないであろう。「からなる」は、本発明の組成物を投与するためのその他の成分及び実質的な方法工程の微量元素以外を排除することを意味する。これらの遷移用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３０】
「対照」は、比較目的で実験に使用される代替被験者、またはサンプルである。対照は、「肯定的」か「否定的」であることができる。治療目的の「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜及び農場動物、ヒト以外の霊長類、並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、などの、動物園、スポーツ、またはペット動物を含む。
【００３１】
用語「酵素」は、本明細書では、特定の生化学反応またはプロ酵素に触媒反応を及ぼす１つまたは複数のポリペプチドを指す。用語「プロ酵素」は、酵素に代謝される、生物学的に活性な物質を指す。一実施形態では、酵素は、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）である。他のまたはさらなる実施形態では、酵素は、プロ酵素であり、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）である。
【００３２】
用語「フィブリノリジン」は、血餅の溶解を促進するいくつかのタンパク質分解酵素の任意のものを指す。フィブリノリジンは、プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ、ｓｃ−ｔＰＡ及びｄｃ−ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、及びウロキナーゼのプロ酵素（ｓｃｕＰＡ）を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
用語「同一性」または「相同性」は、必要に応じて全体の配列の最大同一性パーセントを達成するために、配列を整列し、ギャップを導入した後に、それが比較される対応配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味すると解釈され、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。いずれもＮ末端またはＣ末端の伸長も挿入も同一性または相同性を減少させるものとして解釈されないであろう。アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。配列同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて測定することができる。
【００３４】
用語「吸入煙誘発性急性肺損傷」と「ＩＳＡＬＩ」は、本明細書では同じ意味で使用され、煙の吸入によって引き起こされる急性肺損傷（ＡＬＩ）の形態を指す。ＡＬＩは「マイルドＡＲＤＳ」とも呼ばれる。ＡＬＩは、被験者において以下の１つまたは複数の病態を見出すことによって定義することができる：１）胸部Ｘ線での両側の肺の浸潤、２）臨床的に示される右心カテーテル法により測定した場合、肺毛細血管楔入圧＜１８ｍｍＨｇ（２．４ｋＰａ）、及び３）ＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００ｍｍＨｇ（４０ｋＰａ）。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩの治療は、以下の病態の１つまたは複数の治療を含む：減少した酸素化を、気道閉塞（重症気道閉塞を含む）、気道線維キャストまたはデブリ、及び肺胞フィブリン沈着。
【００３５】
用語「噴霧する」、「噴霧した」及び他の文法上の変形は、本明細書では、液体を小さなエアロゾル液滴に変換するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、エアロゾル液滴は、約２〜１０μｍのメジアン直径を有する。いくつかの実施形態では、エアロゾル液滴は、約２〜４μｍのメジアン直径を有する。
【００３６】
用語「パーフルオロカーボン」と「ＰＦＣ」は同じ意味で用いられ、本明細書では、主に炭素とフッ素を含む有機フッ素化合物を指す。用語「パーフルオロカーボン」は、炭素及びフッ素に加えて分子を含む、一般にフルオロカーボンと呼ばれる高度にフッ素化された分子を含むことを意味することが理解されるべきである。パーフルオロカーボンの例としては、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクチルブロミド、ＦＣ７７、ＰＦ５０６０及びＲｉｍａｒ１０１が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って使用されるＰＦＣは、ガス溶解度、密度及び表面張力に関して類似した物理化学的性質を共有するが、デブリドマン時に気道キャストの可視化と可動性に影響を与え得る放射線不透過性及び動粘度に関して異なり得る。各リストされたパーフルオロカーボンは、立体異性体、鏡像異性体、及びジアステレオマーなどの関連するすべての異性体を含む。
【００３７】
用語「プラスミノーゲン活性化剤」は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する、セリン プロテアーゼ ポリペプチドを指し、本明細書で定義されるｔＰＡ、ｕＰＡ（２本鎖または活性型）及びプロ酵素のｓｃｕＰＡを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
「医薬組成物」は、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断または治療上の使用に適した組成物を製造する、不活性または活性な担体と活性剤の組合せを含むことが意図されている。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は、リン酸緩衝生理食塩溶液、生理食塩水（滅菌生理食塩水を含む）、水、及び油／水または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、などの標準的な医薬担体の任意のものを包含し、ここで、「油」は、水、薬学的に許容されるエマルションの不混和性相、及び様々なタイプの湿潤剤を表す。組成物は、安定剤及び防腐剤を含むこともできる。担体、安定剤及びアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））参照。
【００４０】
用語「薬学的に許容される塩」は、それらが塩の医薬用量で投与される被験者に、その対イオンが非毒性である任意の酸または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩の具体例は、当業者に公知である。
【００４１】
用語「薬学的有効量」、「治療有効量」または「治療有効用量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医により求められる組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発するＡＣＰＤ組成物などの化合物の量を指す。
【００４２】
用語「ポリペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。サブユニットはペプチド結合により連結されていてもよい。別の実施形態では、サブユニットは他の結合、例えば、エステル、エーテル、などによって連結されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシン及びＤまたはＬ光学異性体の両方、並びにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣物を含む、天然及び／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを意味する。ペプチド鎖が短い場合、３つ以上のアミノ酸のペプチドは、一般的にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００４３】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列と一定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」または「相同性」を有するということは、整列したときに、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが２つの配列の比較において同一であることを意味する。この整列及びパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ７．７．１に記載されたものを用いて決定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメーターが使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いる、ＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰである：Ｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
【００４４】
本明細書で使用される、用語「防止する」、「防止している」、「防止」及びその文法上の変形は、障害もしくは病態及び／またはその付随する症状の１つまたは複数の発症または再発を部分的にまたは完全に遅らせるかまたは妨げる、被験者が障害もしくは病態を取得または再取得することを妨げる、または障害もしくは病態または１つまたは複数のその付随する症状を取得または再取得する被験者のリスクを低減する方法を指す。
【００４５】
用語「被験者」は、本明細書では、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む哺乳動物などの動物を含むように定義されるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
【００４６】
用語「薬学的有効量」、「治療有効量」または「治療有効用量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医により求められる組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発するｔＰＡ及び／またはｓｃｕＰＡ組成物などの化合物の量を指す。
【００４７】
用語「単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤」と「ｓｃｕＰＡ」は、同じ意味で使用され、本明細書では、ウロキナーゼ セリンプロテアーゼ ポリペプチドのプロ酵素（いくつかの実施形態では、ＥＣ ３．４．２１．７３）を指し、このセリン プロテアーゼは、参照により本明細書に組込まれる米国特許Ｎｏ．７，３３２，４６９に記載されているように、プラスミノーゲンのプラスミンへの、またはプロ酵素への変換に関与することができる。「単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤」または「ｓｃｕＰＡ」は、Ｌｙｓ１５８とＩｌｅ１５９の間のタンパク質分解切断によって活性化することができ、セリンプロテアーゼ酵素を形成するジスルフィド結合により連結された２つの鎖が得られる。ｓｃｕＰＡ相同体も本発明に含まれることが理解されるべきである。用語「ｓｃｕＰＡのホモログ」は、本明細書では、ＥＣ３．４．２１．７３として識別されるウロキナーゼセリン ロテアーゼ リペプチドのプロ酵素のホモログ、オルソログ、及びパラログ、並びに、ＥＣ３．４．２１．７３として識別されるウロキナーゼ セリン ロテアーゼ リペプチドのプロ酵素、または米国特許Ｎｏ．７，３３２，４６９に記載されるプロ酵素に、７０％を超える相同性を有する他の配列を指す。
【００４８】
「被験者」、「個体」または「患者」は、本明細書では同じ意味に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、及びペットを含むがこれらに限定されない。
【００４９】
用語「治療有効量」は、投与された場合に、治療されるＩＳＡＬＩ異常の症状の１つまたは複数の進行を防止するか、またはある程度軽減するのに十分なｔＰＡ及び／またはｓｃｕＰＡの組成物などの化合物のその量を含む。治療有効量は、ｔＰＡ及び／またはｓｃｕＰＡの組成物などの化合物、疾患または病態及びその重症度、投与経路、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、治療する医師の判断、剤形、及び治療される被験者の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び／または食事などに依存して変化するであろう。
【００５０】
用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」と「ｔＰＡ」は同じ意味で使用され、本明細書では、プラスミンへのプラスミノーゲンの変換に関与することができるセリンプロテアーゼ（いくつかの実施形態では、ＥＣ ３．４．２１．６８）を指す。用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」及び「ｔＰＡ」は、アルテパーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びデスモテプラーゼを含むがこれらに限定されない、組換え型を含むことが理解されるべきである。用語「組織プラスミノーゲン活性化剤」及び「ｔＰＡ」は、さらに、単鎖形態（ｓｃ−ｔＰＡ）、２本鎖形態（ｄｓ−ｔＰＡ）、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ｔＰＡは、ヒトのｔＰＡまたはヒト由来のｔＰＡである。ｔＰＡの相同体も本発明に含まれることが理解されるべきである。用語「ｔＰＡの相同体」は、ＥＣ３．４．２１．６８として識別される組織プラスミノーゲン活性化剤ポリペプチドのホモログ、オルソログ、及びパラログ、並びにＥＣ３．４．２１．６８として識別される組織プラスミノーゲン活性化剤ポリペプチドに７０％を超える相同性を有する他の配列を指す。いくつかの実施形態では、ｔＰＡはＡＬＴＥＰＡＳＥＴＭ形態などの単鎖形態である。
【００５１】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療している」、「治療」及びその文法上の変形は、部分的にまたは完全に、ＩＳＡＬＩ病態などの障害または病態の１つまたは複数の付随する症状の強度を、遅延、軽減、緩和または低減すること、及び／またはＩＳＡＬＩ病態などの障害または病態の１つまたは複数の原因を軽減、緩和または妨害することを含む。本発明による治療は予防的に（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｌｙ）、予防的に（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）、対症的にまたは治療的に適用することができる。いくつかの例では、用語「治療する」、「治療している」、「治療」及びそれらの文法的変形は、被験者の治療前に比較して、または一般の研究集団におけるそのような病態または症状の発生率と比較して、ＩＳＡＬＩ病態に関連した病態または症状を部分的にまたは完全に軽減することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩ病態は、以下の１つまたは複数を含む：減少した酸素化、気道閉塞（重症気道閉塞を含む）、気道線維キャストまたはデブリ、及び肺胞フィブリン沈着。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩ病態は出血の発生率低減によって治療される。
【００５２】
用語「振動メッシュ噴霧器」は、微粒子、低速度のエアロゾルを生成するために、振動メッシュまたは複数の開口部を備えたプレート（開口プレート）を使用する一般的な原理で動作する任意の噴霧器を指す。いくつかの噴霧器は、１０００〜７０００個の穴を備えたメッシュ／膜を含有することができ、そのメッシュ／膜は液体容器の上部で振動する（例えば、米国特許Ｐｕｂｌｎ．２００９０１３４２３５及びＷａｌｄｒｅｐａｎｄ Ｄｈａｎｄ ２００８参照、それぞれは参照により本明細書に組込まれる）。いくつかの実施形態では、振動メッシュ噴霧器は、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒ、Ｏｍｒｏｎ ＭＩＣＲＯＡＩＲ（登録商標）、Ｐａｒｉ ＥＦＬＯＷ（登録商標）またはＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒである。いくつかの態様では、振動メッシュ噴霧器は約５０〜２５０ｋＨｚ、７５〜２００ｋＨｚの１００〜１５０ｋＨｚまたは約１２０ｋＨｚの間の振動周波数を有する。これらのデバイスは、肺にエアロゾルを送達する高い効率を有し、これらのデバイスに残っている液体の体積は最小であって、これはプラスミノーゲン活性化剤などの高価かつ強力な化合物に対する利点である。
【実施例】
【００５３】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するために発明者によって発見された技術を表し、従ってその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている多くの特定の実施形態において多くの変更がなされて、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をもたらし得ることを理解するべきである。
実施例１−ブレオマイシン誘発ＡＬＩを有するマウスにおける組換えｓｃｕＰＡの気管内送達は、ＢＡＬのｕＰＡ活性を増加させる
【００５４】
Ｃ５７／Ｂ６マウスにおいて、０日目に２．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシンによりＡＬＩが誘発された（ｎ＝１０匹／群）。マウスは、２５，０００Ｕで毎日処置した；マイクロ噴霧器（１００μｌ）を介して、組換えヒトｓｃｕＰＡの１６７μｇ／マウス。７日目に、ｓｃｕＰＡの最後マイクロ噴霧器投与後４時間でＢＡＬが得られた。ｕＰＡ活性は、アミド分解基質Ｓ−２４４４を用いて測定した（直接＋１ｍＵ／ｍｌのプラスミンによるインキュベーション５時間後）。結果を図１に示す。プラスミン処理後のｕＰＡ活性の増加は、噴霧ｓｃｕＰＡの一部が肺胞ライニング流体内で無傷のままであり、インビボでのプラスミンによる活性化のために利用可能なままであることを示唆した。肺または全身出血は発生しなかった。これらのデータは、噴霧ｓｃｕＰＡは外傷誘発性ＡＬにおける洗浄線維素溶解活性を増大させ、良好な耐性であることを示す以前の報告（Ｍｕｎｓｔｅｒｅｔ ａｌ．，２００２）のデータを確認する。この結果は、ｓｃｕＰＡの耐久性線維素溶解活性（エアロゾル化後４時間の実質的な増加）がＡＬＩの肺に生成されたことも示す。
実施例２−噴霧ｓｃｕＰＡは気道キャストを溶解しＩＳＡＬＩを有する羊のＢＡＬにおいて検出可能である
【００５５】
羊を噴霧ｓｃｕＰＡで処置した（ＩＳＡＬＩの誘発後４時間で２ｍｇ／処置を開始し、４時間ごと×４８時間続けた）。気道キャスト負荷（閉塞スコア１２）は、４ｍｇｑ ４時間で噴霧ｔＰＡで処置した羊の範囲に低下した（ビヒクル処置したＩＳＡＬＩを有する羊の２０．７に対して）（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ）。図２に示すように、羊のＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）は、蛍光分析によって検出可能なベースラインｕＰＡ活性を有していなかった（レーン２）が、ｓｃｕＰＡ処理後にはヒトのｕＰＡ抗原に関連した検出可能なｕＰＡ活性を有しており（レーン３）、ｕＰＡ抗原及び活性は、同様に、ｓｃｕＰＡ処置された動物からの肺ホモジネート（レーン４）で発見された。レーン１：ｕＰＡ標準。
実施例３−噴霧ｓｃｕＰＡは気道キャストを溶解しＩＳＡＬＩを有する羊のＢＡＬにおいて検出可能である
【００５６】
試験はまた、生理緩衝食塩水または生理食塩水のいずれかに溶解した後、ＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ ＡｔｏｍｉｚｅｒとＡｅｒｏＮｅｂＰｒｏ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒの２種類の振動メッシュ噴霧器を使用して噴霧した１ｍｇ／ｍＬのｓｃｕＰＡを含むｓｃｕＰＡ溶液でも行った。ｓｃｕＰＡを容易に両方の液体担体に溶解した。噴霧前後のｓｃｕＰＡの活性は、噴霧条件（例えば、溶液の形成、噴霧器における噴霧プロセスからのシアー及び温度）の影響を受けないことが確認された。また、ｓｃｕＰＡ溶液のメジアン幾何学的粒子サイズは、狭い、許容されるサイズ分布を有する３〜４μｍであることが確認された。材料、方法及び結果を以下に示し、手順の概略を図３に示す。
リン酸塩は緩衝生理食塩水及び滅菌生理食塩水の調製：
【００５７】
リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｌｏｔ １４１９０−２５０，Ｇｉｂｃｏ）をＢｉｏｓｔｏｒｅ ａｔ ＵＴ−Ａｕｓｔｉｎから購入した。ＰＢＳの組成を表１に示す。
【表１】
2016535782.tif 000002
【００５８】
ＰＢＳのｐＨは７．３±０．１であった。滅菌生理食塩水をＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ（Ｌｏｔ Ｊ１Ｈ５７３）から購入した。両方の調製物は、周囲室温で保存して過度の熱を回避した。
デバイスの紹介：
【００５９】
ＥＺ Ｂｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒ噴霧器及びＡｅｒｏＮｅｂ ｐｒｏ噴霧器を、試験に使用した。Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＮｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（振動メッシュ、Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｇａｌｗａｙ）は、複数の患者に使用するためのポータブル医療機器であった。Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）は、吸入用に医師の処方薬をエアゾール化することを意図しており、汎用噴霧器による使用が承認されている。ＥＺＢｒｅａｔｈｅ Ａｔｏｍｉｚｅｒ（振動メッシュ、Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡ）は、人が呼吸するであろう空気中にエアロゾルの形態で液体の薬を噴霧することを意図しているデバイスである。これらのデバイスは、人工呼吸、または他の正圧呼吸補助ありなしで患者に使用され得る。
Ｓｃｕ−ＰＡ溶液の調製：
【００６０】
それぞれ３．５ｍｇ／ｍＬのｓｃｕ−ＰＡを含む８個のバイアルを得て−８０℃で保存した。２種類のｓｃｕ−ＰＡ 溶液を作るために、溶液を以下の方法で調製した：
【００６１】
Ａ．ｓｃｕ−ＰＡのバイアルを、それらが溶液に溶けるまで室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）で保持した。２ｍＬの溶液を、６ｍＬシリンジを使用して、バイアルから新しい１０ｍＬバイアルに移した。
【００６２】
Ｂ．２１ゲージの針が取付けられた６ｍＬのシリンジを使用して、３ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（または滅菌生理食塩水）を１つのバイアルに注入した。すべてのｓｃｕ−ＰＡ溶液が均一になるまで、内容物を手動で撹拌した。次いで、この溶液を、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（または滅菌生理食塩水）で希釈した。
幾何学的粒子サイズ分布（ＰＳＤ）試験：
【００６３】
両方の噴霧器を、サンプルとしての１ｍｇ／ｍＬの濃度の２種類の５ｍＬｓｃｕ−ＰＡとブランク対照としての純生理食塩水及び純ＰＢＳ（全部で８サンプル）で別々に充填した。幾何学的粒子サイズ分布（ＰＳＤ）を、ＭａｌｖｅｒｎＳｐｒａｙｔｅｃを使用して測定した。標準的な噴霧手順を５回行った；各試験は５秒間続けた。全ての測定は、周囲の室温、気圧、及び湿度で行った。
さらなる試験のために噴霧器から回収したサンプル：
【００６４】
１０秒後、噴霧手順を開始し、エアロゾル発生が安定するまで実行し、その後噴霧生成物ｓｃｕ−ＰＡの５００μＬサンプル（全４サンプル）を回収し、次いで、−８０°Ｃの冷蔵庫で凍結した。表２に示すように６個のサンプルを調製した。
【表２】
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結果：
【００６５】
表3はサンプルの幾何学的子サイズ（ＰＳＤ）の情報（n=5）を示し、図４は噴霧後の各サンプルの活性を示す。
【表３】
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【００６６】
これらの結果に基づいて、ｓｃｕＰＡ溶液は最高の噴霧器を特定することに焦点を当てて噴霧用に最適化される。噴霧器投与のために研究されている他のパラメーターには、処理パラメーター（例えば、ｓｃｕＰＡ活性に対する最適溶液組成、微粒子画分、質量メジアン空気力学的直径、及び総放出用量を含む空気力学的特性）の効果、噴霧中（例えば異なる噴霧器機構タイプを使用して）のｓｃｕＰＡ活性に及ぼす温度の影響、並びにｓｃｕＰＡ活性に及ぼす液体のシアー（例えば、噴霧圧、超音波振動、メッシュサイズ）の影響を確認することが含まれる。
実施例４−ＰＦＣ中のｔＰＡの懸濁液は安定であり、ｔＰＡ活性を保持する
【００６７】
図５は、ＰＦＣ中のｔＰＡの懸濁液が安定であり、ｔＰＡ活性が保持されることを示す。これらの研究のために、ｔＰＡ／ＰＦＣ懸濁液（０．２２ｍｇ／ｍＬで作製されたｔＰＡ−ＰＦＣ懸濁液１８ｍＬ）を、１０ｍＬのシリンジと２１ゲージの針を使用して、３７℃で５０分間の保持時間の間に気管内チューブ（７ｍｍの大人の気管内チューブ）を介して、注入した。これは、ｔＰＡは十分に濡れてＰＦＣ中で脱凝集することが注目された。ｔＰＡの投与のために研究されている他のパラメーターには、処理パラメーター（例、ｔＰＡの粒子サイズの減少、ＰＦＣ及び得られるｔＰＡ−ＰＦＣ懸濁液の粘度、固体のｔＰＡ−ＰＦＣ懸濁液の個体含量及びｔＰＡ活性に及ぼす気管支鏡管理中の投与の影響）を確認することが含まれる。次いで、同じアプローチが、ｓｃｕＰＡ−ＰＦＣ治療介入の製剤を分析するのに使用される。
【００６８】
ＰＦＣ及びフィブリノリジンは、気道の破片の除去並びに肺胞フィブリンのクリアランス及び結果の改善を付加的に促進する。具体的には、ＰＦＣは、気道のガス交換をサポートしつつ、１）気道キャストの溶解と除去；２）気道及び肺胞のデブリの除去を促進するフィブリノリジンを効果的に送達する。機構的に、ＰＦＣは、肺容量を効果的に回復する。ＰＦＣ液の低表面張力を与えられると、ＰＦＣはフィブリノリジンを、キャストと気道壁との間に潜在的に、肺を通して分布させ、従って新たなキャストの形成を遅らせつつ、それらが形成されているときにキャストを破壊する。ＰＦＣが肺から揮発するとき、フィブリノリジンは残って、さらに気道のキャストと肺胞フィブリンを溶解するように作用する。ＰＦＣ懸濁液を再投与すると、ＰＦＣボリュームは追加の薬剤を付着させるばかりでなく、キャスト及び肺胞のデブリを除去する。ＰＦＣは非圧縮性であるため、破損した小さな気道を開くようにステントし、それにより補強を助ける。ＰＦＣとの接触は、凝固の減衰を通じて、基礎となる上皮を保護することもでき、これはＡＬＩの事実上すべての形態の小さな気道及び肺胞の組織因子によって開始される。インラインの吸引により、低密度のデブリは比較的より高密度のＰＦＣ中にフロートし、気道フィブリンキャスト断片及びデブリの除去を容易にする。
さらなる試験のために噴霧器から回収されるサンプル：
【００６９】
本明細書に開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験をすることなく行われ、実行され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、その変形が、本明細書に記載された方法に、及び方法のステップまたはステップの順序において、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく適用され得ることが当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の薬剤は、同一または類似の結果を達成しつつ本明細書中に記載の薬剤に代替され得ることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の代替及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあると考えられる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、具体的に参照により本明細書に組込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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