(57)【要約】  本発明は、ウイルス力価を増加させるための、レンチウイルスベクターへのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の挿入に関する。本発明は、これらのベクター、該ベクターの作製方法、および医薬用途を含むベクターの使用方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜１１００ヌクレオチドを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの製造方法。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜６００ヌクレオチドを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜４００ヌクレオチドを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの上流に挿入される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向で挿入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上流プロモーター配列が、β２ミクログロブリン上流プロモーター配列である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上流プロモーター配列が、配列番号：１または配列番号：２７のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロモーターがＭＨＣクラスＩプロモーターである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターがβ２ミクログロブリンプロモーターである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜１１００ヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
【請求項１２】
ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜６００ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１３】
ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜４００ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１４】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの上流である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１５】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向である、請求項１４に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１６】
上流プロモーター配列が、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１７】
上流プロモーター配列が、β２ミクログロブリン上流プロモーター配列である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１８】
上流プロモーター配列が、配列番号：１または配列番号：２７のヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
プロモーターがＭＨＣクラスＩプロモーターである、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２０】
プロモーターがβ２ミクログロブリンプロモーターである、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２１】
ＭＨＣクラスＩプロモーターが、ＨＬＡ−Ａ２プロモーターである、請求項１９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２２】
ＭＨＣクラスＩプロモーターが、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーターである、請求項１９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２３】
ＭＨＣクラスＩプロモーターが、ＨＬＡ−Ｅプロモーターである、請求項１９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２４】
ＭＨＣクラスＩプロモーターが、ＨＬＡ−Ｅプロモーターである、請求項１９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２５】
上流プロモーター配列が、ＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列である、請求項１１から１６および１９から２４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２６】
レンチウイルスのｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含む、請求項１１から２５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２７】
レンチウイルスのΨ（プサイ）配列を含む、請求項１１から２５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２８】
請求項１１から２７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２９】
医薬またはワクチンとして使用するための、請求項１７から２７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３０】
上流プロモーター配列が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５または配列番号：３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１から６、９から１６および１９から２９のいずれか一項に記載の方法、レンチウイルスベクターまたは宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えワクチン技術の分野の発明であり、治療および予防ワクチンとして使用することができるレンチウイルスベクターの改良に関する。ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含有する該ベクターは、他のベクターに比べて改良された特徴を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えワクチンは、改変ウイルスを作製するためのウイルスゲノムの改変を可能にする組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い開発されてきた。このようにして、宿主で特異的免疫応答を発生させるために、感染すると標的細胞で発現される免疫原性タンパク質をコードするように遺伝子配列を非病原性ウイルスに導入することは可能であった。
【０００３】
このようなワクチンは、ワクチン技術における大きな進歩となっている（Ｋｕｔｚｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、９（１０）：７７６〜７８８頁、２００８）。特に、これらは伝統的なワクチンに比べて、生（弱毒化）ウイルスを回避し、不活化ワクチンの製造に伴うリスクを排除する利点を有する。
【０００４】
改変レトロウイルス（レトロウイルスベクター）を用いる遺伝子送達は、１９８０年代前半にＭａｎｎら（Ｃｅｌｌ、３３（１）：１５３〜９頁、１９８３）により紹介された。最も一般的に使用されるオンコレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく。該ウイルスは、ポリタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖが作製される単純なゲノムを有し、ウイルスの複製にトランスで必要とされる（Ｂｒｅｃｋｐｏｔら、２００７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１４（１１）：８４７〜６２頁；Ｈｅら  ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）。シスで通常必要とされる配列は、長末端反復配列（ＬＴＲ）ならびにこの近接：組み込みに必要とされる逆方向反復（ＩＲまたはａｔｔ部位）、パッケージング配列Ψ、トランスポートＲＮＡ結合部位（プライマー結合部位、ＰＢＳ）、および逆転写に関与する幾つかの付加配列（ＬＴＲ内の反復Ｒ、およびプラス鎖開始に必要なポリプリントラクト、ＰＰＴ）である。複製欠損レトロウイルスベクターを生成するには、一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を完全に欠失させ、発現カセットと置き換える。
【０００５】
レンチウイルスゲノムに由来するレトロウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）は、他のウイルス系に比べて幾つかの利点を示すため、遺伝子治療および免疫療法目的の両方に対する有望なツールとして現れた。特に、レンチウイルスベクター自体毒性でなく、他のレトロウイルスと異なりレンチウイルスは、非分裂細胞、特に樹状細胞を形質導入することができ（Ｈｅら  ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）、内因性経路を通じた抗原提示を可能にする。
【０００６】
レンチウイルスは、遺伝子組成の類似性、複製の分子機構、および該ウイルスの宿主との生物学的相互作用により連結される。レンチウイルスは、長期の不顕性感染後に知らぬ間に始まりゆっくりと進行するスロー病（ｓｌｏｗ  ｄｉｓｅａｓｅ）症候群の病原体として最もよく知られ、故に、レンチウイルスは「スロー」ウイルスと呼ばれている（Ｎａｒａｙａｎら、１９８９、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、７０（７）：１６１７〜３９頁）。レンチウイルスは、全てのレトロウイルスと同じ基本構成を有するが、インビボでのレンチウイルス複製において重要な役割を果たすアクセサリー遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔ、およびｒｅｖ）の存在のためより複雑である。
【０００７】
レンチウイルスはレトロウイルス科のスローウイルス属に相当し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含む。レンチウイルスは宿主中でいつまでも持続し得、生涯にわたる感染の過程において可変的な速度で継続的に複製し得る。宿主における該ウイルスの持続複製は、宿主防御を回避する該ウイルスの能力に依存する。
【０００８】
組換え組み込みレンチウイルスベクターの設計は、レンチウイルスのシス作用性配列とトランス作用性配列の分離に基づく。非分裂細胞への効率的な形質導入は、レンチウイルスゲノム中の２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、樹状細胞（ＤＣ）を含む非分裂細胞の核への遺伝子移入の効率を最大化する、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす（Ｚｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１（２）１７３〜８５頁；Ａｒｈｅｌら、２００７、ＥＭＢＯ  Ｊ、２６（１２）：３０２５〜３７頁）。
【０００９】
樹状細胞は、主な機能が抗原を提示し免疫応答を開始することである抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要なクラスを構成するため、抗原提示に最も重要である。
【００１０】
免疫応答を生じるには、抗原タンパク質が細胞によりペプチドに処理され、該ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）により細胞表面に示されなければならない。循環ＡＰＣは、ペプチド−ＭＨＣ複合体を流入領域リンパ節でＴ細胞に提示し、該リンパ節で該複合体はＴ細胞受容体と相互作用し、共刺激シグナルと共にＴ細胞を活性化する。
【００１１】
様々な研究が、レンチウイルスベクターの接種はＤＣによる抗原提示、および抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）の強い活性化をもたらすことを示している。したがって、レンチウイルスベクターは、遺伝子導入および免疫療法適用のために操作されてきた。
【００１２】
レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ  Ｕ３配列の除去により安全性が改善され、ＬＴＲ内にもともと存在するウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列を完全に欠く「自己不活性化」ベクターをもたらした。
【００１３】
レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルス粒子は、種々のＤＮＡプラスミド、すなわち
（ｉ）パッケージングプラスミド（少なくともＧａｇ、Ｐｏｌ  Ｒｅｖ、Ｔａｔおよび、幾つかの場合ではトランスファー構築物のパッケージングに必要な構造タンパク質および酵素タンパク質を発現する）；
（ｉｉ）トランスファープラスミド（発現カセットならびにパッケージング、逆転写、および組み込みに必要なＨＩＶシス作用性因子を含有する）；ならびに
（ｉｉｉ）エンベロープコードプラスミド（ほとんどの場合、幅広い種類の細胞、特に、ＤＣを含む主要組織適合（ＭＨＣ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にすることができる混合粒子（偽型）の形成を可能にするタンパク質である、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ．Ｇ））
によりＨＥＫ  ２９３Ｔヒト培養細胞を一過性トランスフェクションしたときに組換え技術により作製することができる。
【００１４】
この手順は、トランスフェクト細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの一過性産生を得られるようにする。しかし、レンチウイルス粒子ベクターは、パッケージング遺伝子、プロウイルスコードＤＮＡ、およびエンベロープ遺伝子を細胞ゲノムに安定に挿入して、細胞により継続的に産生することもできる。これは、一過性トランスフェクションを必要とせずに細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの継続的産生を可能にする。当然のことながら、これらの手順の組み合わせが使用されてもよく、ＤＮＡ／プラスミドの幾つかは細胞ゲノムに組み込まれ、他は一過性トランスフェクションにより提供される。
【００１５】
非組み込みレンチウイルスベクターは、特にワクチン接種目的での挿入変異事象に関連した潜在的発癌のリスクを軽減するように設計されている。
【００１６】
抗原コード組み込みレンチウイルスベクターの直接注射に基づくワクチン接種において、関連する抗原を発現する形質導入細胞は、誘発された免疫応答の標的になり、数日または数週間以内にワクチン接種された生物から排除される。
【００１７】
さらに、自己不活性化レンチウイルスベクターにおけるウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、内因性プロモーター活性化の可能性を制限する。この欠失は、Ｘ連鎖（ＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子）重症免疫不全症の稀な形態に罹患している子どもにモロニーウイルスベースのレトロウイルスベクターを用いて行われた、１９９８〜１９９９年に実施されたＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子治療試験から得られた経験に直接対処する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８８（５４６６）：６６９〜７２頁）。この試験中、ヒトＬＭ０２癌原遺伝子のすぐ近くでのモロニー由来レトロウイルスベクターの組み込みの結果、子ども９名中４名が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、２００８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１８（９）：３１３２〜３１４２頁）。悪性腫瘍は、ＬＭ０２癌原遺伝子へのウイルスＵ３プロモーター／エンハンサーの近接の結果であることが示された。
【００１８】
エンハンサーは、転写活性化因子として離れて作用することができるシス作用性配列である。エンハンサーは、様々な細胞タイプ、特にＤＣにおいて導入遺伝子強発現を得るのに最も効率的であると思われるため、ウイルス由来ベクターで幅広く使用されている（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、２０００、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１（１３）：１９０１〜９頁；Ｒｏｕａｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（９）：７１５〜２４頁；Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（７）：１３９０〜９頁；Ｇｒｕｈら、２００８、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １０（１）２１〜３２頁）。しかし、挿入変異の安全性問題を考えると、このような転写エンハンサー配列は、エンハンサー近接効果による挿入変異のリスクをなくすためにレンチウイルスベクター構築物から欠失させるべきである。このエンハンサー近接効果は、挿入変異の圧倒的に最も多い機構であり、遺伝子導入後の腫瘍形成事象のヒトまたは動物症例において記載された唯一の効果である。
【００１９】
よって、ウイルスエンハンサーを含まず、かつ免疫原性ペプチドをコードする導入遺伝子の十分な発現、できればＣＭＶプロモーターを用いる場合に観察されるのと同じ程度の発現を可能にするレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターを開発する必要がある。特に、力価が改良されたベクターが必要とされている。
【００２０】
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ遺伝子（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（７）：１３９０〜９頁）およびデクチン−２遺伝子（Ｌｏｐｅｓら、２００８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２（１）：８６〜９５頁）に由来するＤＣ特異的プロモーターによるウイルスプロモーターの置換について報告している研究がある。Ｌｏｐｅｓらにおいて使用されたデクチン−２遺伝子プロモーターは、推定エンハンサーおよびアデノウイルス保存配列（アデノウイルスプロモーター中の逆方向末端反復）を含有する（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。Ｋｉｍｕｒａらにより使用されたＭＨＣクラスＩＩ遺伝子プロモーターは、いずれの既知のエンハンサーも含有しない。
【００２１】
けれども、エンハンサーがなければ、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、ＤＣにおける十分な導入遺伝子発現をもたらさないことが見出された。特に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーで観察された免疫応答と対照的に、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで免疫反応を引き起こさなかった。マウスに注射後、組み込みおよび持続的導入遺伝子発現は観察されたが、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを通じて転写されたレンチウイルスベクターは、ワクチン接種ブースト後でさえ抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激しなかった。したがって、これらの研究の著者らは、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの使用は、免疫療法との関連ではなく遺伝子置換療法のように発現の持続性が求められる適用にのみ対象となると結論付けた。
【００２２】
よって、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、抗原に対する免疫応答の誘導に関してレンチウイルスベクターの適切なプロモーターではない。さらに、デクチン−２プロモーターは樹状細胞特異的であり、他の非発現細胞タイプに組み込まれるベクターを排除できない。さらに、デクチン−２プロモーターは、エンハンサーを含有するようだ。よって、デクチン−２プロモーターは、安全性の理由のため、レンチウイルスベクターの良好なプロモーターではない。
【００２３】
好ましくは、免疫療法においてレンチウイルスベクターは、所望の特異的免疫応答を誘発する導入遺伝子の有効な発現を提供する。これは、樹状細胞などのＡＰＣにおいて発現が高レベルであることを必要とする。
【００２４】
レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞は、より高度の安全性を提供するために免疫応答により排除されることも好ましい。すなわち、導入遺伝子に対して生じた免疫応答は、レンチウイルスベクターにより形質導入される細胞を排除するのに十分な宿主における免疫応答を誘発することができる。形質導入細胞の排除は、宿主におけるレンチウイルスベクターの持続性、および該ベクターの起こり得る副次的影響を排除する。形質導入細胞が排除されるためには、発現は、非樹状細胞において免疫応答による排除を可能にするレベルで求められる。
【００２５】
同時に、プロモーターは、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞の活性化に関与する重要な細胞（すなわち、樹状細胞）による免疫刺激を最大化すべきであり、悪性腫瘍をもたらす幹細胞における挿入変異および遺伝毒性のリスクを最小化すべきである。故に、プロモーターは、樹状および他の細胞において十分に高い活性を有するべきであるが、エンハンサーを含有すべきでない。これらの基準に基づき、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは、強力なエンハンサーが存在するため理想ではない。これらの基準は、次のように要約される：
１．最大の免疫応答を誘導するための、樹状細胞における高発現；
２．誘導された免疫応答による排除に十分な他の形質導入細胞タイプにおける発現；および
３．挿入による影響を回避するためのエンハンサーエレメントの欠如
ベクターは、混入物質を最小限にしながら、運搬および発現を最大限にするために高い力価で生成される必要がある。
【００２６】
よって、改良されたベクターに対する必要性が当技術分野に存在する。本発明は、当技術分野におけるこれらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、レンチウイルスベクターを含む組成物および該ベクターの作製および使用方法を包含する。ある実施形態では、  本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含む、好ましくはＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターをさらに含む、レンチウイルスベクターを包含する。
【００２８】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の少なくとも３００ヌクレオチド、好ましくは３００〜４００、３００〜６００または３００〜１１００ヌクレオチドを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの製造方法を包含する。
【００２９】
好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの上流に挿入される。最も好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向で挿入される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、上流プロモーター配列は、β２ミクログロブリン上流プロモーター配列であり、好ましくは配列番号：１または配列番号：２７を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、プロモーターはＭＨＣクラスＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはβ２ミクログロブリンプロモーターである。
【００３２】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の少なくとも３００ヌクレオチド、好ましくは３００〜４００、３００〜６００または３００〜１１００ヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００３３】
好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの上流である。最も好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、上流プロモーター配列はＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、上流プロモーター配列は、β２ミクログロブリン上流プロモーター配列であり、好ましくは配列番号：１または配列番号：２７を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはＭＨＣクラスＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはβ２ミクログロブリンプロモーターである。
【００３５】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーターまたはＨＬＡ−Ｅプロモーターである。
【００３６】
好ましくは、上流プロモーター配列は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、またはＨＬＡ−Ｅ、またはＨＬＡ−ＤＲα上流プロモーター配列である。
【００３７】
好ましくは、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含む。好ましくは、レンチウイルスベクターはレンチウイルスΨ（プサイ）配列を含む。
【００３８】
本発明は、本発明のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。本発明は、特に遺伝子治療のための医薬またはワクチンとして使用するための、本発明のレンチウイルスベクターを包含する。
【００３９】
好ましい実施形態では、上流プロモーター配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、または配列番号：３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】（Ａ）β２ｍプロモーター（プロモーター領域および上流染色体領域）、（Ｂ）ＭＨＣクラスＩプロモーター、および（Ｃ）ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの模式図を示す。
【図２】種々のプロモーターの上流にクローニングしたβ２ｍ上流プロモーター配列の有無と種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。β２ｍ上流プロモーター配列は融合ＰＣＲにより種々のプロモーターの上流にクローニングした。結果としてレンチウイルスベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入に用い、形質導入された細胞の割合を特異的ｑＰＣＲ法により評価した。
【図３】正方向または逆方向で種々のプロモーターの上流にクローニングしたβ２ｍ上流プロモーター配列の有無と種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。β２ｍ上流プロモーター配列は正方向（５’−３’）または逆方向（３’−５’）のいずれかで融合ＰＣＲにより種々のプロモーターの上流にクローニングした。結果としてレンチウイルスベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入に用い、形質導入された細胞の割合を特異的ｑＰＣＲ法により評価した。
【図４】正方向または逆方向で導入遺伝子（ＧＦＰ）の下流にクローニングしたβ２ｍ上流プロモーター配列の有無と種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。β２ｍ上流プロモーター配列は正方向（５’−３’）または逆方向（３’−５’）のいずれかで種々のプロモーターを持つレンチウイルスコンストラクトの導入遺伝子（ＧＦＰ）の下流にクローニングした。結果としてレンチウイルスベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入に用い、形質導入された細胞の割合を特異的ｑＰＣＲ法により評価した。
【図５】正方向または逆方向で（プラスミドの主鎖内でかつ）プロウイルスの配列の外側にクローニングしたβ２ｍ上流プロモーター配列の有無と種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。β２ｍ上流プロモーター配列は正方向（５’−３’）または逆方向（３’−５’）のいずれかで種々のプロモーターを持つコンストラクトの（プラスミドの主鎖内の）プロウイルスの配列の外側にクローニングした。結果としてレンチウイルスベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入に用い、形質導入された細胞の割合を特異的ｑＰＣＲ法により評価した。
【図６】正方向または逆方向で種々のプロモーターの上流にクローニングしたＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列の有無と種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。ＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列は正方向（５’−３’）または逆方向（３’−５’）のいずれかで融合ＰＣＲにより種々のプロモーターの上流にクローニングした。結果としてレンチウイルスベクターを作製し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入に用い、形質導入された細胞の割合をＦＡＣＳ分析により評価した。
【図７】β２ミクログロブリン（配列番号：１）およびＭＨＣクラスＩ（配列番号：２〜７）の上流プロモーター配列のヌクレオチド配列を示す。コンセンサス配列を示す（配列番号：８）。
【図８Ａ】β２ｍミクログロブリン（配列番号：４０）、ＭＨＣクラスＩ（配列番号：３７〜３９）およびＭＨＣクラスＩＩ（配列番号：４１）プロモーターおよび短い上流プロモーター配列のヌクレオチド配列を示す。κＢ、ＩＳＲＥおよびＳＸＹモジュールの位置を示す。
【図８Ｂ】図８の続き。
【図９Ａ】β２ｍミクログロブリン（配列番号：４５）、ＭＨＣクラスＩ（配列番号：４２〜４４）およびＭＨＣクラスＩＩ（配列番号：４６）プロモーターおよび長い上流プロモーター配列のヌクレオチド配列を示す。κＢ、ＩＳＲＥおよびＳＸＹモジュールの位置を示す。
【図９Ｂ】図９の続き。
【図９Ｃ】図９の続き。
【図１０】短いまたは長いβ２−ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−ＤＲα上流プロモーター配列をそれら天然のプロモーターの上流に正方向で持つ種々のレンチウイルスコンストラクトの産生収率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列のレンチウイルスベクターの力価に対する影響を調査した。上流プロモーター配列は、β２ミクログロブリンおよびＭＨＣクラスＩプロモーターに見られるＥｔｓ／ＩＳＲＥおよびＮＦ−Ｋｂ結合部位の上流に位置する（図１）。上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターに見られるＳＸＹモジュールの上流に位置する（図１）。ヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターはＭＨＣクラスＩプロモーターにいくらかの類似性があるが、単一ＮＦ−Ｋｂ結合部位のＩＳＲＥ上流を含む。
【００４２】
β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターの上流プロモーター配列は、ヌクレオチドレベルでいくらか類似している（図７）。β２ｍおよびＨＬＡ−Ｅの２つの上流プロモーター配列を分析のために選択した。
【００４３】
まず、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍおよびＭＨＣＩプロモーターであるＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅと同じ方向で且つ上流に挿入した。比較のために、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、ユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）と同じ方向で且つ上流に挿入した。これらのベクターでは、プロモーターが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を作動する。
【００４４】
基本的にはＮａｌｄｉｎｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３〜２６７頁に記載されるように、発現を起こさせるために、ベクターを、カプセル化プラスミドおよびＶＳＶ．Ｇエンベロープを提供するプラスミドと共にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時に核酸移入することによってパッケージ化した。次いで、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、異なるベクターの粒子により形質導入した。すべてのベクターを持つ細胞において発現を検出した。
【００４５】
β２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅプロモーターと共にレンチウイルスベクターにβ２ｍ上流プロモーター配列を付加すると、ウイルス力価がおよそ２〜５倍増加した。これに反して、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーターまたはＨＬＡ−Ａ２プロモーターと共にレンチウイルスベクターにβ２ｍ上流プロモーター配列を付加すると、力価にはほとんど影響が無かった（図２）。よって、β２ｍ上流プロモーター配列は、β２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターを含有するレンチウイルスベクターから力価を増加しうる。
【００４６】
次に、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍおよびＭＨＣＩプロモーターであるＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅと逆の方向で且つ上流に挿入した。比較のために、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、ユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）と逆の方向で且つ上流に挿入した。レンチウイルスベクター内の、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅプロモーターとは逆向きに且つ上流にβ２ｍ上流プロモーター配列を付加すると、ウイルス力価は増加しなかった（図３）。実際、逆向きで挿入したβ２ｍの上流プロモーター配列を有する種々のレンチウイルスベクターは、力価の減少を示した。よって、β２ｍ上流プロモーター配列によるレンチウイルスベクターの力価の増加は、方向に依存していた。
【００４７】
次に、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍおよびＭＨＣＩプロモーターであるＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅと同じまたは逆の方向で且つ導入遺伝子の下流に挿入した。比較のために、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、ユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）と同じまたは逆の方向で且つ導入遺伝子の下流に挿入した。β２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅプロモーターと同じ方向で且つ導入遺伝子の下流にβ２ｍ上流プロモーター配列を付加すると、ウイルス力価がわずかに増加するのみであった（図４）。よって、β２ｍ上流プロモーター配列によるレンチウイルスベクターの力価の増加は、位置に依存していた。
【００４８】
次に、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍおよびＭＨＣＩプロモーターであるＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅと同じまたは逆の方向で且つＬＴＲ−ＬＴＲ領域の外側に挿入した。比較のために、β２ｍの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、ユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）と同じまたは逆の方向で且つＬＴＲ−ＬＴＲ領域の外側に挿入した。同じまたは逆の方向で且つＬＴＲ−ＬＴＲ領域の外側にβ２ｍ上流プロモーター配列を付加すると、ウイルス力価に見かけ上の変化がなかった（図５）。よって、β２ｍ上流プロモーター配列によるレンチウイルスベクターの力価の増加は、ベクター内のＬＴＲの間にあることに依存していた。
【００４９】
次に、ＨＬＡ−Ｅの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍおよびＭＨＣＩプロモーターであるＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅと同じまたは逆の方向でその上流に挿入した。比較のために、ＨＬＡ−Ｅの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、ユビキチン（ＵＢＣ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＭＨＣＩＩプロモーター（ＨＬＡ−ＤＲα）と同じまたは逆の方向で且つその上流に挿入した。
【００５０】
レンチウイルスベクター内の、β２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７またはＨＬＡ−Ｅプロモーターの下流にＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列を付加すると、ウイルス力価がおよそ２〜４倍に増加した（図６）。ほとんどのコンストラクトにおいて、ＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列はいずれの方向でも同じように働いた。ＣＭＶプロモーターまたはＵＢＣプロモーターを持つレンチウイルスベクターにＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列を付加すると、力価のおよそ２倍の増加を示した（図６）。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＲαプロモーターを持つレンチウイルスベクター内にＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列を付加しても、力価にほとんどまたはまったく影響しなかった。よって、ＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列は、β２ｍ、ＭＨＣＩ、ＣＭＶまたはＵＢＣプロモーターを含むレンチウイルスベクターの力価を増加させることができる。
【００５１】
ＨＬＡ−Ａ２の上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターと同じまたは逆の方向で且つその上流に挿入した。レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターの上流にＨＬＡ−Ａ２上流プロモーター配列を付加すると、いずれの方向でもウイルス力価がおよそ３〜４倍増加した。
【００５２】
ＨＬＡ−Ｂ７の上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターと同じまたは逆の方向で且つその上流に挿入した。レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターの上流にＨＬＡ−Ｂ７上流プロモーター配列を付加すると、同じ方向の場合にはウイルス力価がおよそ１０倍増加し、逆向きの場合にはウイルス力価がおよそ４倍増加した。
【００５３】
ＨＬＡ−ＤＲαの上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターと同じまたは逆の方向で且つその上流に挿入した。レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターの上流にＨＬＡ−ＤＲα上流プロモーター配列を付加すると、同じ方向の場合にはウイルス力価がおよそ６倍増加し、逆向きの場合にはウイルス力価がおよそ４倍増加した。
【００５４】
上流配列はすべておよそ３００〜４００ｎｔの大きさであったので、より長い上流配列（５００〜１１００ｎｔ）の影響を調べた。β２ｍのより長い上流プロモーター配列（１０５８ｂｐ）を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターと同じ方向で且つその上流に挿入した。長い上流プロモーター配列は、小さな（３３０ｂｐ）上流配列と比較して、ウイルス力価をさらに増加することはなかったが、増加したウイルス力価をほぼ維持した（図１０）。
【００５５】
ＨＬＡ−Ａ２の長い上流プロモーター配列（５３１ｂｐ）を、レンチウイルスベクター内の、ＨＬＡ−Ａ２プロモーターと同じ方向で且つその上流に挿入した。この場合、長いＨＬＡ−Ａ２上流プロモーター配列はウイルス力価を３倍増加し、小さな（３２２ｂｐ）ＨＬＡ−Ａ２上流配列はＨＬＡ−Ａ２プロモーターに対して負の効果を示した（図１０）。
【００５６】
ＨＬＡ−Ｂ７の長い上流プロモーター配列（５１１ｂｐ）を、レンチウイルスベクター内の、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーターと同じ方向で且つその上流に挿入した。この場合、長いＨＬＡ−Ｂ７上流プロモーター配列は、小さな（３５２ｂｐ）ＨＬＡ−Ｂ７上流配列と比較してさらにウイルス力価を２〜３倍増加した（図１０）。ＨＬＡ−Ｅの長い上流プロモーター配列（１０４７ｂｐ）を、レンチウイルスベクター内の、ＨＬＡ−Ｅプロモーターと同じ方向で且つその上流に挿入した。長い上流プロモーター配列は、小さな（３２８ｂｐ）上流配列と比較してウイルス力価の増加を除去した（図１０）。
【００５７】
ＨＬＡ−ＤＲαの長い上流プロモーター配列（５２２ｂｐ）を、レンチウイルスベクター内の、ＨＬＡ−ＤＲαプロモーターと同じ方向で且つその上流に挿入した。この場合、長いＨＬＡ−ＤＲα上流プロモーター配列は、小さな（３５６ｂｐ）ＨＬＡ−ＤＲα上流配列と比較してウイルス力価に対して同じ影響があった（図１０）。
【００５８】
複数の上流プロモーター配列の挿入の影響を調査した。ＨＬＡ−Ｅ上流プロモーター配列を、レンチウイルスベクター内の、β２ｍプロモーターの上流、下流および上流と下流の両方に挿入した。上流への挿入により力価が３〜４倍増加したのに対して、下流への挿入は力価に対して影響がなく、上流および下流の両方への挿入ではウイルス力価が減少した。
【００５９】
よって、本発明は、主な目的として、β２ｍまたはＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ上流プロモーター配列を含むレンチウイルスベクター、および該ベクターの作製および使用方法である。
【００６０】
レンチウイルスベクター
本発明の文脈内では「レンチウイルスベクター」は、シス作用性レンチウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、トランスで提供されるレンチウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ）を必要とする導入遺伝子による宿主細胞の形質導入のための非複製ベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、シス作用性パッケージング配列を含むが、機能性Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現を欠く。レンチウイルスベクターは、前記レトロウイルスベクターの作製または開発の段階に応じてＲＮＡまたはＤＮＡ分子の形態で存在してもよい。
【００６１】
レンチウイルスベクターは、プラスミドなどの組換えＤＮＡ分子の形態にあってもよい。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスおよび他のタンパク質の複合体内のＲＮＡ分子などのレンチウイルス粒子ベクターの形態であってもよい。典型的には、改変または組換えレンチウイルス粒子に相当するレンチウイルス粒子ベクターは、一本鎖ＲＮＡの２つのコピーからなるゲノムを含む。これらのＲＮＡ配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖ＤＮＡ配列（プロウイルスベクターＤＮＡ）からの転写により得ることができ、または形質転換された宿主細胞でのプラスミドＤＮＡ（プラスミドベクターＤＮＡ）の一過性発現から得ることができる。
【００６２】
レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来し、病原性に関与する遺伝的決定基を除去し、治療効果を得るのに有用な新たな決定基を導入するために改変される。
【００６３】
このようなベクターは、シスおよびトランス作用性配列の分離に基づく。複製欠損ベクターを生成するために、トランス作用性配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ遺伝子）を欠失させ、導入遺伝子をコードする発現カセットに置き換えることができる。
【００６４】
非分裂細胞への効率的な組み込みおよび複製は、通常、レンチウイルスゲノムの中心に２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらし、該フラップは、樹状細胞などの非分裂細胞の核孔での組み込み前複合体の脱コート、および核への発現カセットの効率的な移入のためのシグナルとして作用する。
【００６５】
ある実施形態において、本発明は、特に、欧州特許出願ＥＰ  ２  １６９  ０７３号に記載されているようなｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列と呼ばれるセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００６６】
宿主細胞ゲノムへのベクタープロウイルスＤＮＡ配列の組み込みに関与する長末端反復配列（ＬＴＲ）などのさらなる配列は、通常はシスで存在する。ベクターは、例えば前記ＬＴＲのドメインＵ３（ΔＵ３）中のＬＴＲ配列を変異させて得ることができる（Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｈら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１０）：８１５０〜７頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）：９８７３〜８０頁）。
【００６７】
ある実施形態において、本発明は、３’ＬＴＲ中のプロモーターおよびエンハンサー配列を除去している変異Ｕ３領域（ΔＵ３）を好ましくは有するＬＴＲ配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００６８】
パッケージング配列Ψ（プサイ）は、ポリヌクレオチド配列のキャプシド形成を助けるためにベクター粒子に取り込まれる（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１（９）：１８５９〜７４頁；Ｐａｓｃｈｅｎら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １２（６）：１９６〜２０３頁）。
【００６９】
ある実施形態において、本発明は、レンチウイルスパッケージング配列Ψ（プサイ）、およびＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００７０】
トランスポートＲＮＡ結合部位もしくはプライマー結合部位（ＰＢＳ）またはウッドチャック後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ＰｏｓｔＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）などのさらなる追加の機能性配列も、インビボで導入遺伝子のより安定な発現を得るために、有利には本発明のレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に含まれてもよい。
【００７１】
ある実施形態において、本発明は、ＰＢＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。ある実施形態において、本発明は、ＷＰＲＥおよび／またはＩＲＥＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００７２】
よって、好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列、少なくとも１つのｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、１つのΨ配列、１つの（好ましくは２つの）ＬＴＲ配列、およびプロモーター、特にＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの転写制御下で導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
【００７３】
導入遺伝子
本発明は、導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを包含する。本発明の文脈内で「導入遺伝子」は、レンチウイルスベクターで形質導入される細胞に普通は存在しない、レンチウイルスベクター内の核酸配列である。レンチウイルスベクターは、形質導入細胞にこの配列を導入するのに役立つ。用語「導入遺伝子」は、導入遺伝子の形質導入を促進するようなベクターの配列を含まない。導入遺伝子は、別の生物由来の核酸配列であってもよい。あるいは、導入遺伝子は、同じ生物由来であるが、発現を制御する異なる調節配列を有する核酸配列であってもよい。導入遺伝子は、センスまたはアンチセンス核酸分子であってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、導入遺伝子配列は免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００７４】
好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、ウイルス、寄生虫、細菌、または真菌性である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは腫瘍抗原である。
【００７５】
この免疫原性ポリペプチドは好ましくは、感染症の病原体由来の１つまたは幾つかのエピトープ、例えばＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＮｅｆタンパク質由来の抗原を含む。
【００７６】
ポリエピトープを形成する幾つかのエピトープも、本発明の導入遺伝子によりコードされてもよい。
【００７７】
特定の実施形態において、このようなエピトープは、腫瘍において同定された標的抗原に由来し、細胞媒介免疫応答がエピトープに対して得られるように選択することができる。腫瘍の幾つかのタイプに関して、および腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、白血病およびリンパ腫を含む、特にメラノーマまたは癌腫において選択され得る標的抗原は、当技術分野において十分に記述されている。
【００７８】
β２ＭおよびＭＨＣＩプロモーター
本発明は、レンチウイルスベクターへのβ２ｍまたはＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーターの挿入を包含する。本明細書で使用されるとき、「ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーター」は、自然発生または合成ＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。用語「ＭＨＣクラスＩプロモーター」は、β２ｍプロモーターを含まない。
【００７９】
自然発生ＭＨＣＩおよびβ２ｍプロモーター
自然発生ＭＨＣＩプロモーターの例は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子プロモーターである。これらの自然発生ＭＨＣＩプロモーターは通常、ＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子、またはゲノムデータベース（例えば：ＮＣＢＩポリヌクレオチドデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／ｄｎａ−ｒｎａ）中のこのようなタンパク質を推定的にコードすると見なされる遺伝子のプロモーター領域からクローン化または複製される。β２ｍおよびクラスＩ  ＭＨＣタンパク質は両方とも、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に進入する。好ましいプロモーターは、米国公開特許２０１４／０１２０１３２Ａ１に記載されており、その開示内容は出典明記によってここに包含される。
【００８０】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、ほぼ全ての細胞タイプにおいて見出される。ＭＨＣＩタンパク質は通常、白血球の膜の表面に存在し、ここでβ２ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質と結合する。これらの結合タンパク質の役割は、内因性供給源由来のペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することである。よってこれらは、抗原特異的免疫応答の生成に中心的な役割を果たす。β２ｍおよびＭＨＣタンパク質は、多年の間広く研究および記載されてきたため、この遺伝子は十分に特徴付けされ、およびＢＬＡＳＴ方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）．Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３〜４１０頁）などの配列比較ツールを用いて検出可能である。
【００８１】
β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターは、樹状細胞で強力に活性化される能力のほか、他のヒト体組織の大部分において強度を低下させる能力を共有する。
【００８２】
本発明のβ２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターは、１つまたは複数のＳｐ１およびＥＴｓ結合部位などのさらなる調節エレメントを含有することができる。好ましい実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、２つのＳｐ１結合部位および１つのＥｔｓ結合部位を含有する。他の実施形態において、Ａｐ１および／またはＡｐ２部位がＭＨＣクラスＩプロモーターにさらに含有される。
【００８３】
好ましいＭＨＣクラスＩプロモーターは、ヒトＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇプロモーターである。
【００８４】
合成β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーター
β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターはまた、合成であってもよい。合成β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターには、β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターの個々の成分を会合（アセンブル）するために分子生物学的手法を用いて合成されるプロモーター、または分子生物学的手法を用いる自然発生β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターに由来するプロモーターが含まれる。
【００８５】
ＩＳＲＥ
β２ｍおよびＭＨＣクラス遺伝子の転写は、通常は２つの主要な調節エレメント：インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）およびＳＸＹモジュール（Ｗ／Ｓ、Ｘ１Ｘ２／部位αおよびＹ／エンハンサーＢ調節エレメントを包含する）（図１参照）により媒介される。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）  ４８：２０８〜２１１頁も参照のこと。
【００８６】
これらの調節プロモーターエレメントは、転写開始部位の約２２０から約９５ヌクレオチド上流に広がる領域に局在化される。これらは、β２ｍおよびＭＨＣクラスＩ遺伝子の組織特異的転写およびサイトカイン誘導転写を媒介する。
【００８７】
β２ｍおよびＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターのＩＳＲＥは通常、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに対する結合部位を含有している。故に、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００８８】
ＮＦ−κＢ結合部位
別の調節エレメント、エンハンサーＡ（核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に対する結合部位を含有する）は、ほとんどの場合で存在する。よって、核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に結合することはβ２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００８９】
ＳＸＹモジュール
ＩＳＲＥに加えて、β２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターは通常、合わせてＳＸＹモジュールと呼ばれる４つの調節エレメント：ＳまたはＷボックス、Ｘ１／ＣＲＥＸ２ボックスまたは部位α、およびＹボックスまたはエンハンサーＢからなる保存された上流配列モチーフの別のセットを共有する。このＳＸＹモジュールは通常、調節因子Ｘ（ＲＦＸ；ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫおよびＲＦＸＡＰからなる）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）／活性化転写因子（ＡＴＦ）、および核内因子Ｙ（ＮＦＹ）を含有する多タンパク質複合体により協同的に結合され、これらの遺伝子のトランス活性化を駆動するエンハンセオソームとして作用する。よって、これらの因子に結合することはβ２ｍおよびＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
【００９０】
対照的に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはエンハンサーＡもＩＳＲＥエレメントも表示しない（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ４８：２０８〜２２１頁）。さらに、ＲＦＸサブユニットの１つまたはＣＩＩＴＡにおける変異による重症複合免疫不全、裸リンパ球症候群（ＢＬＳ）を有する患者から確立された細胞株を用いた研究により例証されているように、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子調節においてＲＦＸおよびＣＩＩＴＡは極めて重要であることが見出されている（ＤｅＳａｎｄｒｏ，Ａ．ら、１９９９、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、６５：２７９〜２８６頁）。また、ＣＩＩＴＡまたはＲＦＸサブユニットの１つのどちらかの欠如は、それぞれＭＨＣエンハンセオソームの機能および会合（アセンブル）に影響を及ぼし、ＭＨＣクラスＩＩの欠如およびＭＨＣクラスＩ転写レベルの低下をもたらす（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら  ２００４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６：６７〜７５頁）。
【００９１】
β２ｍおよびＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ上流プロモーター配列
本発明は、レンチウイルスベクター内に、β２ｍ、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）またはＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）上流プロモーター配列の挿入を包含する。ここで用いる「β２ｍ上流プロモーター配列」は、図８Ａ−Ｂおよび図９Ａ−Ｃに図示されるように、天然に生じるβ２ミクログロブリンプロモーター内のＥｔｓ／ＩＳＲＥ結合部位のすぐ上流に見られる配列の１１００塩基対以下を指す。また、出典明記によりここに援用されるＶａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００４、１６：６７−７５の図１を参照のこと。ここで用いる「ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）上流プロモーター配列は、図８Ａ−Ｂおよび図９Ａ−Ｃに図示されるように、天然に生じるＭＨＣクラスＩプロモーター内のＮＦ−Ｋｂ結合部位のすぐ上流に見られる配列の１１００塩基対以下を指す。β２ｍおよびＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）上流プロモーター配列の例を図７に示す。ここで用いる「ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）上流プロモーター配列」は、図８Ａ−Ｂおよび図９Ａ−Ｃに図示されるように、天然に生じるＭＨＣクラスＩＩプロモーター内のＳＸＹモジュールのすぐ上流に見られる配列の１１００塩基対以下を指す。
【００９２】
種々の実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５５０、５００、４５０、４００または３５０ヌクレオチド未満を含む。
【００９３】
種々の実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の少なくとも３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドを含む。
【００９４】
種々の実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０または５００から３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチド（可能なすべての組み合わせの範囲）を含む。好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００または３００〜１１００ヌクレオチドを含む。最も好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜３３５ヌクレオチドを含む。
【００９５】
好ましくは、Ｂ２Ｍ上流プロモーター配列は、ヌクレオチド配列：
AGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTC（配列番号：１）を含む。好ましくは、Ｂ２Ｍ上流プロモーター配列は、配列番号：２７または２８のヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ上流プロモーター配列を含む。
【００９７】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列は、配列番号：２〜７または配列番号：２９〜３４のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩ上流プロモーター配列は、ヌクレオチド配列：
CTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT（配列番号：２）を含む。
【００９９】
好ましい上流プロモーター配列は、以下を含む。
上流β２ｍ（３３０ｂｐ）：
GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACAT（配列番号：２７）
【０１００】
上流β２ｍ（１０５８ｂｐ）：
CTTCCAAGATCTCTGCCCCTCCCCATCGCCATGGTCCACTTCCTCTTCTCACTGTTCCTCTTAGAAAAGATCTGTGGACTCCACCACCACGAAATGGCGGCACCTTATTTATGGTCACTTTAGAGGGTAGGTTTTCTTAATGGGTCTGCCTGTCATGTTTAACGTCCTTGGCTGGGTCCAAGGCAGATGCAGTCCAAACTCTCACTAAAATTGCCGAGCCCTTTGTCTTCCAGTGTCTAAAATATTAATGTCAATGGAATCAGGCCAGAGTTTGAATTCTAGTCTCTTAGCCTTTGTTTCCCCTGTCCATAAAATGAATGGGGGTAATTCTTTCCTCCTACAGTTTATTTATATATTCACTAATTCATTCATTCATCCATCCATTCGTTCATTCGGTTTACTGAGTACCTACTATGTGCCAGCCCCTGTTCTAGGGTGGAAACTAAGAGAATGATGTACCTAGAGGGCGCTGGAAGCTCTAAAGCCCTAGCAGTTACTGCTTTTACTATTAGTGGTCGTTTTTTTCTCCCCCCCGCCCCCCGACAAATCAACAGAACAAAGAAAATTACCTAAACAGCAAGGACATAGGGAGGAACTTCTTGGCACAGAACTTTCCAAACACTTTTTCCTGAAGGGATACAAGAAGCAAGAAAGGTACTCTTTCACTAGGACCTTCTCTGAGCTGTCCTCAGGATGCTTTTGGGACTATTTTTCTTACCCAGAGAATGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCAAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCTGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACAT（配列番号：２８）
【０１０１】
上流ＨＬＡ−Ａ２（３２２ｂｐ）：
TACACCTCCATTCCCAGAGCAAGCTTACTCTCTGGCACCAAACTCCATGGGATGATTTTTCTTCTAGAAGAGTCCAGGTGGACAGGTAAGGAGTGGGAGTCAGGGAGTCCAGTTCCAGGGACAGAGATTACGGGATAAAAAGTGAAAGGAGAGGGACGGGGCCCATGCCGAGGGTTTCTCCCTTGTTTCTCAGACAGCTCTTGGGCCAAGACTCAGGGAGACATTGAGACAGAGCGCTTGGCACAGAAGCAGAGGGGTCAGGGCGAAGTCCAGGGCCCCAGGCGTTGGCTCTCAGGGTCTCAGGCCCCGAAGGCGGTGTATG（配列番号：２９）
【０１０２】
上流ＨＬＡ−Ａ２（５３１ｂｐ）：
GAGTCCTGTTGTAATGCTTTTGGACACATTTATACATTAAGGGGCCAAAGTCACATTTTTTACCTATTAGATTCCTGATCATTCAGGGGTTACCAAGATTCTGCTACCCACTGTAGTTAATAAACAAAGAGCAAATTGGTCTCTATTCTGTCTCATGCACTCAGGCACAACTTTTCCGGATTAAAAACAAAAACAACAACAACAAAAATCTACACCTCCATTCCCAGATCAAGCTTACTCTCTGGCACCAAACTCCATGGGGTGATTTTTCTTCTAGAAGAGTCCAGGTGGACAGGTAAGGAGTGGGAGTCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGAGATAATGGGATGAAAAGTGAAAGGAGAGGGACGGGGCCCATGCCGAGGGTTTCTCCCTTGTTTCTCAGACAGCTCCTGGGCCAAGACTCAGGGAGACATTGAGACAGAGCGCTTCGCACAGGAGCAGAGGGGTCAGGGCGAAGTCCCAGGGCCCCAGGCGTGGCTCTCAGAGTCTCAGGCCCCGAAGGCGGTGTATG（配列番号：３０）
【０１０３】
上流ＨＬＡ−Ｂ７（３５２ｂｐ）：
AGGTTTAAAGAGAAAACCCCTGTCTCTACACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTCTCTGGCATCAAGTTCCCCGTGCTCAGTTTCCCTACACAAGAGTCCAAGAGGAGAGGTAAGGAGTGGGAGGCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGGGATTCCAGGACGAGAAGTGAAGGGGAAGGGGCTGGGCGCAGCCTGGGGGTCTCTCCCTGGTTTCCACAGACAGATCCTTGTCCAGGACTCAGGCAGACAGTGTGACAAAGAGGCTTGGTGTAGGAGAAGAGGGATCAGGACGAAGTCCCAGGTCCCGGACGGGGCTCTCAGGGTCTCAGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAAT（配列番号：３１）
【０１０４】
上流ＨＬＡ−Ｂ７（５１１ｂｐ）
GAGTTTAATTGTAATGCTGTTTTGACACAGGTCTTTTACAAATTGGAATTCTAATCATTCAGGGATTACCAATATTGTGCTACCTACTGTATTAACAAACAAAAAGGAAACTGGTCTCTATGAGAATCCCTATGCGGTGCCTTCAGAGAAAACTTCACCAGGTTTAAAGAGAAAACCCCTGTCTCTACACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTCTCTGGCATCAAGTTCCCCGTGCTCAGTTTCCCTACACAAGAGTCCAAGAGGAGAGGTAAGGAGTGGGAGGCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGGGATTCCAGGACGAGAAGTGAAGGGGAAGGGGCTGGGCGCAGCCTGGGGGTCTCTCCCTGGTTTCCACAGACAGATCCTTGTCCAGGACTCAGGCAGACAGTGTGACAAAGAGGCTTGGTGTAGGAGAAGAGGGATCAGGACGAAGTCCCAGGTCCCGGACGGGGCTCTCAGGGTCTCAGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAAT（配列番号：３２）
【０１０５】
上流ＨＬＡ−Ｅ（３２８ｂｐ）：
ACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT（配列番号：３３）
【０１０６】
上流ＨＬＡ−Ｅ（１０４７ｂｐ）：
TTTTTTCCCCCTAGACATCTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGTGATCTCGGCTCACTGCAACCACCACCTCTCGGGTTCAAGCAATTCTCCTATCTCAGCCTCCAGAGTTGCTGGAATTACAGGCGCGCACCACCACACCCGGCTAATTTTTGTATTGTTAGTAGAGACAGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGTTAGTCTTGAACTCCTGACCTCGTGATCTGCCTGCCTCGGCCTACCAAAATGCTGCGATTACAGGCGTGAGCCACCGTTCCCGGCCTATACGTTGTTTATTTTGGAAAAATTAAAAATTAAGTTTTTTTTCATTAAAGATATGTTATTTCCGATCAAGAGATCAAGACCATCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCACACGCCTGTAGTTCCAGTTACTGGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGAAGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGACAGAGCAAGACTCTGACTCAAAAAAAAAAAAAGTTGTTTCTATTAACATGTAATGGGTTATTAATATTCTCTTAAATGAATTAATATTTTTAATATTTTGTTTTAATATCTTTTAATTTATATATGATAAAAATTGATACAATCCACAGAAACAAAATTTATTTGGGTCCTCACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT（配列番号：３４）
【０１０７】
上流ＨＬＡ−ＤＲα（３５６ｂｐ）：
ATACAGCCTTTCATCCTTCTCCAGTGTTGAGAGTGTTGAACCTCAGAGTTTCTCCTCTCATTTTCTCTAAATGAGATACAATGCCAGCCATCCCAAGCTCTTGGCCTGAGTTGATCATCTTGAAGTCTAGGACTCCAAGAAGCATGAAAGAGCTTCTTTAGTGAAGCTATGTCCTCAGTACTGCCAAAATTCAGACAATCTCCATGGCCTGACAATTTACCTTCTATTTGGGTAATTTATTGTCCCTTACGCAAACTCTCCAACTGTCATTGCACAGACATATGATCTGTATTTAGCTCTCACTTTAGGTGTTTCCATTGATTCTATTCTCACTAATGTGCTTCAGGTATATCCCT（配列番号：３５）
【０１０８】
上流ＨＬＡ−ＤＲα（５２２ｂｐ）：
TAGGCTTTGCCCATTATACTCTCTCATATTCATTGACCTGAATCCTCAAATGAGGTGTGTCCATTAGTCAACTCCAATCTCTTGTCATATATAAGATGGTAGAGATGAGAAGAAGGTAGCTCCTTTACAGCCCACTATTTCCACTAACTACTACCTGTGTTTCAAGATACAGCCTTTCATCCTTCTCCAGTGTTGAGAGTGTTGAACCTCAGAGTTTCTCCTCTCATTTTCTCTAAATGAGATACAATGCCAGCCATCCCAAGCTCTTGGCCTGAGTTGTTCATCTTGAAGTCTAGGACTCCAAGAAGCATGAAAGAGCTTCTTTAGTGAAGCTATGTCCTCAGTACTGCCAAAATTCAGACAATCTCCATGGCCTGACAATTTACCTTCTATTTGGGTAATTTATTGTCCCTTACGCAAACTCTCCAGCTGTCATGGCACAGACATATGATCTGTATTTAGCTCTCACTTTAGGTGTTTCCATTGATTCTATTCTCACTAATGTGCTTCAGGTATATCCCT（配列番号：３６）
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ベクターは配列番号：３７〜４６のいずれかを含む。
【０１１０】
レンチウイルスベクターの作製
ある実施形態では、本発明は、レンチウイルスベクターへのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を挿入することを含む方法を包含する。この方法はさらに、ＤＮＡフラップ配列などの、本明細書中の他の核酸エレメントのいずれかを挿入することを含みうる。
【０１１１】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の少なくとも３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドをレンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの作製方法を包含する。
【０１１２】
種々の実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５５０、５００、４５０、４００または３５０ヌクレオチド未満を含む。
【０１１３】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０または５００から３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチド（可能なすべての組み合わせの範囲）をレンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの作製方法を包含する。好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００または３００〜１１００ヌクレオチドを含む。
【０１１４】
最も好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜３３５ヌクレオチドを含む。
【０１１５】
好ましくは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターを含むレンチウイルスベクターへ挿入される。上流プロモーター配列は、前記プロモーターと同じまたは逆の方向であってよい。
【０１１６】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の少なくとも３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドと、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの作製方法を包含する。
【０１１７】
種々の実施形態では、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５５０、５００、４５０、４００または３５０ヌクレオチド未満を含む。
【０１１８】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０または５００から３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３５０、３５７、４００、４５０、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチド（可能なすべての組み合わせの範囲）と、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターを、レンチウイルスベクターに挿入することを含む、レンチウイルスベクターの作製方法を包含する。好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００または３００〜１１００ヌクレオチドを含む。最も好ましくは、上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の３００〜３３５ヌクレオチドを含む。
【０１１９】
ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの挿入の前に、レンチウイルスベクターへ挿入される。
【０１２０】
ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターの挿入の後に、レンチウイルスベクターへ挿入される。
【０１２１】
ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列と、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターは、共にレンチウイルスベクターへ挿入される。
【０１２２】
ある実施形態では、β２ミクログロブリン上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向で上流に挿入される。
【０１２３】
ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ上流プロモーター配列は、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターと同じ方向で上流に挿入される。
【０１２４】
好ましくは、前記上流プロモーター配列は、β２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ上流プロモーター配列を含み、前記プロモーターは、β２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇプロモーターである。すべての組み合わせはそれぞれ発明の一部と考慮される。
【０１２５】
好ましくは、上流プロモーター配列は、配列番号：１〜配列番号：７または配列番号：２７〜配列番号：３６のいずれかを含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
レンチウイルス粒子ベクターの作製
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含有するレンチウイルス粒子ベクターの作製方法を提供する。よって、本願発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含むレンチウイルス粒子ベクターを包含する。レンチウイルス粒子ベクター（またはレンチウイルスベクター粒子）は、ウイルスタンパク質に関連してレンチウイルスベクターを含む。
【０１２７】
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の挿入によりベクターの力価が増加しうる。
【０１２８】
この方法のある実施形態によれば、粒子ベクターは、ＤＮＡプラスミドで形質転換された宿主細胞において得られる。
【０１２９】
このようなＤＮＡプラスミドは、
−細菌複製起源（例えば、ｐＵＣ  ｏｒｉ）、
−選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えば、ＫａｎＲ）、およびより特定すると
−ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含むレンチウイルスベクター
を含み得る。
【０１３０】
本願発明により、以下のステップ：
ｉ）適切な宿主細胞にレンチウイルスベクターを核酸移入または形質導入するステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に、レトロウイルス（好ましくはレンチウイルス）の少なくとも構造タンパク質およびインテグラーゼタンパク質をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターを核酸移入または形質導入するステップと（このようなパッケージングプラスミドは当技術分野で記載されている（Ｄｕｌｌら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２（１１）：８４６３〜７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）：９８７３〜８０頁））、
ｉｉｉ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記核酸移入した宿主細胞を培養するステップと、
ｉｖ）前記培養宿主細胞におけるステップｉｉｉ）の発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含む、組換えベクター粒子の作製が可能となる。
【０１３１】
パッケージングプラスミドを核酸移入または形質導入した宿主細胞は、好適なパッケージング細胞株であってよい。ゆえに、前記方法は、
ｉ）パッケージング細胞株にレンチウイルスベクターを核酸移入または形質導入するステップと、
ｉｉ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記細胞株を培養するステップと、
ｉｉｉ）前記培養細胞株におけるステップｉｉ）の発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含み得る。
【０１３２】
種々の理由のため、得られたレトロウイルス粒子をシュードタイピングする、すなわち特異的粒子エンベロープタンパク質を付加または置換することが有用であり得る。例えば、これは、組換え粒子を天然粒子または他の組換え粒子と区別するために、異なるエンベロープタンパク質を有するのに有利であり得る。ワクチン接種戦略の問題において、患者がレンチウイルスに対して既に免疫を生じていた場合、シュードタイピングされた粒子ベクターは免疫系を免れる可能性が高い。疾患に対して患者を免疫するのに類似の粒子ベクターの連続注射が必要とされる場合、これは特に有用である。
【０１３３】
本発明のレトロウイルス粒子をシュードタイピングするために、宿主細胞は、ウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする１つまたは幾つかのエンベロープＤＮＡプラスミドでさらにトランスフェクトされ得る。
【０１３４】
適切な宿主細胞は、好ましくは、例えばＨＥＫ細胞株のようなヒト培養細胞株である。
【０１３５】
ベクター粒子の作製方法は、ゲノムが１つまたは複数の以下の成分、すなわち、レンチウイルスベクターＤＮＡ配列、パッケージング遺伝子、およびエンベロープ遺伝子で安定に形質転換されている宿主細胞において実施される。このようなＤＮＡ配列は、ベクター配列の転写を可能にし、および粒子産生速度を向上させる追加のプロモーターを含む本発明によるプロウイルスベクターに類似していると見なすことができる。
【０１３６】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、全細胞を膨潤または死滅させることなしにウイルス粒子を培地中で連続的に産生することができるようにさらに改変される。ウイルス粒子を作製するためのこのような手法に関しては、Ｓｔｒａｎｇら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（３）：１１６５〜７１頁；Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２００５、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（３）：４５２〜９頁；Ｓｔｅｗａｒｔら、２００９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１６（６）：８０５〜１４頁；およびＳｔｕａｒｔら、２０１１、Ｈｕｍ  ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（印刷中）を参照することができる。
【０１３７】
本発明のある目的物は、レンチウイルス粒子ベクターで形質転換された宿主細胞からなる。
【０１３８】
レンチウイルス粒子ベクターは、以前に定義されているように、以下のエレメント：
−ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列と、
−プロモーターの制御下の導入遺伝子配列と、
−ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列、
および場合により、上に記載された追加のエレメントの１つと
を含みうる。
【０１３９】
導入遺伝子を細胞で発現させる方法
本発明は、導入遺伝子を細胞、好ましくは非分裂細胞で発現させる方法を包含する。方法は、導入遺伝子の発現を可能にする条件下で、細胞を本発明のレンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターで形質導入するステップを含む。
【０１４０】
細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。特に好ましいのはヒト非分裂細胞である。
【０１４１】
導入遺伝子は、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする。方法はさらに、ポリペプチドを回収または単離するステップを含んでもよい。
【０１４２】
レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターは、好ましくは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含む。好ましくは、ベクターはさらに、ＭＨＣクラスＩまたはβ２ミクログロブリンプロモーターを含む。
【０１４３】
ある実施形態において、本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列をレンチウイルスベクターへ挿入することと、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含有するベクターで細胞を形質導入することとを含む、導入遺伝子の発現方法を包含する。
【０１４４】
レンチウイルスベクターの治療的使用
本発明はさらに、エピトープ、より特にＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列を含むベクター中に存在する導入遺伝子によりコードされたエピトープに対する免疫学的反応の発生または改善を誘発するまたはこれに寄与することができる治療組成物またはワクチンを調製するための、本発明によるレンチウイルスベクター（特にはレンチウイルス粒子ベクターの形態で）の使用に関する。
【０１４５】
よって、本発明は、特に遺伝子治療のための医薬品またはワクチンとして有用であるベクターを提供する。
【０１４６】
これらのベクターは、感染症、特にはウイルス感染、より具体的には、ＡＩＤＳおよび他の免疫不全などのレトロウイルス感染に伴う疾患の治療または予防に優先的に使用される。
【０１４７】
本発明はまた、腫瘍および癌に対する治療プロトコルにおいて使用することもでき、特には腫瘍に対する免疫療法またはワクチン接種療法のプロトコルにおいて使用され得る。
【０１４８】
本発明のベクターは、樹状細胞をより特異的に標的にして、これらの細胞における導入遺伝子により発現された抗原に関連する細胞媒介免疫応答および特にはＣＴＬ応答を得ることから、本発明のベクターは、マイコバクテリウムまたはＨＩＶウイルスなどのスローまたは内因性病原微生物を標的にするワクチンとして特に有用である。
【０１４９】
したがって、本発明は、以前に定義されているようなレンチウイルスベクターを含む免疫原性組成物に関する。
【０１５０】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、標的細胞へのベクターゲノムの核移入を誘発または刺激するように、ベクターおよびベクター粒子中にｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列を含有する。
【０１５１】
逆転写中に、ｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列は、ＤＮＡ三重螺旋と呼ばれるＤＮＡベクター配列の核移入を刺激する３本鎖ＤＮＡ構造の形成を誘導する。好ましくは、ベクターは、導入遺伝子、ならびにレトロウイルスまたはレトロウイルス様起源の逆転写、発現およびキャプシド形成の調節シグナルを含み、組成物は、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によりコードされた１つまたは幾つかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）またはＣＤ４応答を誘導または刺激することができる。
【０１５２】
レンチウイルスベクターの力価は、ベクターへのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはβ２ミクログロブリン上流プロモーター配列の包含により改善される。
【０１５３】
よって、本発明によるレンチウイルスベクターは、記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導し、改善する能力、または一般に記憶ＣＴＬ応答の発生に関連する能力を有する。換言すると、該ベクターは、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ応答または記憶応答の誘導、刺激、または該応答の発生への関与により、腫瘍疾患または感染症を治療するための治療組成物の調製に使用することができる。
【０１５４】
本発明のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを宿主に投与するステップと、宿主において導入遺伝子に対する特異的免疫応答を発生させるステップとを含む治療方法、および免疫応答の誘導方法において使用することができる。これらの宿主で発生した細胞および抗体は、診断試薬として使用することができる。
【０１５５】
本発明によるレンチウイルスベクターは、全身、局所、または皮膚、筋肉内、皮内（例えば腫瘍内）投与経路を含む、既知の投与経路を通じて患者に直接投与することができる。エクスビボ投与、例えば標的細胞のエクスビボ形質導入とこれに続く治療される患者への処理細胞の投与も、本発明により包含される。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明による免疫原性組成物は、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ媒介免疫応答を誘導し、改善し、または該応答の発生にインビボで関与するように、患者に直接投与することができる。
【０１５７】
別の実施形態において、免疫原性組成物は、長期記憶細胞媒介応答の発生を可能にし得るように単回でまたは反復投与時に使用される。
【０１５８】
本発明の免疫原性組成物は、目的とするヌクレオチド配列、またはベクターもしくはベクター粒子中に存在する導入遺伝子によりコードされた多数のエピトープに対する細胞媒介免疫応答を誘発または刺激するために利用可能であり、本発明の免疫原性組成物はまた、遺伝子、例えば、少なくとも８から１５個のアミノ酸、好ましくは９から１２個のアミノ酸をコードすることができる病原体の遺伝子または前記遺伝子の断片の全配列の産物に対して、細胞媒介免疫応答を誘発または刺激するのに使用することもできる。
【０１５９】
本発明はまた、細胞応答を誘導する前記アミノ酸配列、および／または異なる病原体もしくは腫瘍抗原の２つのエピトープに対応する少なくとも２つの異なる配列を含有するアミノ酸配列の多数の反復（少なくとも２つの同一配列）をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターも包含する。
【０１６０】
結果として、本発明は、腫瘍の治療のための、ならびに特には抗癌または抗感染症治療としての予防的および／または治療的ワクチン接種プロトコルにおいて使用され得る組成物を包含する。
【０１６１】
特に、該組成物は、アジュバント、他の免疫原性組成物、化学療法、または任意の他の治療的処置と組み合わせて使用することができる。
【０１６２】
よって、本発明の種々の実施形態を記載してきたが、本明細書における開示は例示のみであること、ならびに様々な他の代替、適合、および変更が本発明の範囲内で行われ得ることが当業者により留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に例証されている特定の実施形態に限定されない。
【実施例】
【０１６３】
実施例１  細胞株
ＨＥＫ２９３Ｋ（ヒト胚性腎細胞株、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８（Ｇｒａｈａｍら、１９７７））細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）、１％Ｌ−グルタミン（ユーロビオ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズギブコ）および１％ピルビン酸ナトリウム（ライフテクノロジーズギブコ)を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／高変法、Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で維持した。細胞株は３７℃、５％ＣＯ２の加湿した大気中の保温器に維持した。
【０１６４】
実施例２  プラスミドの構築
ｐＦＬＡＰ−ＧＦＰプロウイルスプラスミドのＭｌｕｌ部位とＢａｍＨＩ部位との間にプロモーターをクローニングする。
前記プロモーターの上流にクローニングしたβ２ｍ＿上流配列（β２ｍ＿ＵＳ）：
ＧｅｎｅＡｒｔ  （ライフテクノロジーズ）からＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅプロモーターを購入し、元のプロモーター配列の５’末端上流にβ２ｍ上流プロモーター配列（β２ｍ＿ＵＳ）を含むように設計した。ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｅのプロウイルスプラスミドを作製するために、野生型プロモーター配列のみを増幅するようにＰＣＲ反応を行い、ｐＦｌａｐ−ＧＦＰプラスミドのＭｌｕｌ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングした。
ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＲα、ＣＭＶおよびＵＢＣプロモーターの５’末端にβ２ｍ上流配列（β２ｍ＿ＵＳ）を付加するために、融合ＰＣＲ反応を行った。簡単にいうと、３つの別々のＰＣＲ反応を行う。つまり、第一のＰＣＲでβ２ｍ＿ＵＳを増幅し、第二のＰＣＲでβ２ｍ＿ＵＳの末端と相同な２５ｂｐオーバーハングを含むプロモーターを増幅する。次いで、ＰＣＲ１および２の産物をアガロースゲルにて精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ）、第三のＰＣＲの基質として用い、最終ＤＮＡ産物（β２ｍ＿ＵＳプロモーター）を精製する。各プロモーターのこの３つのＰＣＲに用いたプライマーを表１にまとめる。ＰＣＲ３産物はゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ)にクローニングし、配列決定し、ＭｌｕｌおよびＢａｍＨＩ制限酵素によって消化し、ｐＦｌａｐ−ＧＦＰにクローニングした。
【０１６５】
前記プロモーターの上流に、逆方向でクローニングしたβ２ｍ＿上流配列：
逆方向のβ２ｍ上流プロモーター配列（β２ｍ＿ＵＳＲ）を上記の融合ＰＣＲを用いて各プロモーターの上流にクローニングした。すべてのＵＳＲ＿プロモーターはＡｓｃｌ部位とＢａｍＨＩ部位との間で増幅し、次いで、Ｍｌｕｌ部位およびＢａｍＨＩ部位を用いてｐｆｌａｐ−ＧＦＰにクローニングした。各プロモーターの３つのＰＣＲに用いたプライマーを表２に列挙する。
【０１６６】
順方向でＧＦＰの下流にクローニングするβ２ｍ＿上流配列：
β２ｍ＿ＵＳを、ＸｈｏｌおよびＫｐｎｌ制限酵素部位を用いてＧＦＰレポーター遺伝子の下流にクローニングした。まず、ＰＣＲを行って、β２ｍ＿ＵＳの５’および３’にそれぞれＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位を付加した。ＰＣＲに用いたプライマーは、フォワード：５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号：９）、リバース：５’−ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号：１０）である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ）にクローニングし、配列決定し、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素によって消化し、ｐＦｌａｐ−ＧＦＰのＸｈｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間にクローニングした。
【０１６７】
逆方向でＧＦＰの下流にクローニングしたβ２ｍ＿上流配列：
逆方向のβ２ｍ上流プロモーター配列（β２ｍ＿ＵＳＲ）を、ＸｈｏｌおよびＫｐｎｌ制限酵素部位を用いてＧＦＰレポーター遺伝子の下流にクローニングした。まず、ＰＣＲを行って、β２ｍ＿ＵＳＲの５’および３’にそれぞれＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位を付加した。ＰＣＲに用いたプライマーは、フォワード：５’−ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：１１）、リバース：５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号：１２）である。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ)にクローニングし、配列決定し、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素によって消化し、ｐＦｌａｐのＸｈｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間にクローニングした。
【０１６８】
ｐＵＣｏｒｉとＫａｎＲとの間にクローニングしたβ２ｍ＿上流配列：
ｐＵＣｏｒｉとＫａｎＲの配列の間に存在する制限酵素部位の数は限られているので、Ｐｍｌｌ部位にβ２ｍ＿ＵＳをクローニングするために選択した。Ｐｍｌｌ部位もｐＦｌａｐ主鎖の５’ＬＴＲに存在するので、まずは、融合ＰＣＲを用いてｐＵＣｏｒｉの上流にβ２ｍ＿ＵＳを付加し、次いで２つのＰｍｌｌ部位の間に全断片をクローニングした。ＰＣＲ１（β２ｍ＿ＵＳの増幅）に用いたプライマーは、Ｆ１＿５’−ＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：１３）およびＲ１＿５’−ＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号：１４）である。ＰＣＲ２（ｐＵＣｏｒｉおよびＳＶ４０の増幅）に用いたプライマーは、Ｆ２＿５−ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴ−３’（配列番号：１５）（β２ｍ＿ＵＳの末端に相同なオーバーハング（下線部）を含む）およびＲ２＿５’−ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：１６）である。ＰＣＲ１および２の産物はアガロースゲル上で精製し、第三のＰＣＲの基質として用い、Ｆ１およびＲ２プライマーを増幅に用いた。ＰＣＲ３産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）(ライフテクノロジーズ)にクローニングし、配列決定し、Ｐｍｌｌにより消化し、ｐｆｌａｐ−ＧＦＰ内の同じ部位の間にクローニングした。クローニングの方向は制限酵素消化によって制御した。
【０１６９】
逆方向でｐＵＣｏｒｉとＫａｎＲとの間にクローニングするβ２ｍ＿上流配列：
β２ｍ＿ＵＳＲは上記のようにＰｍｌｌ部位の間にクローニングした。ＰＣＲ１（β２ｍ＿ＵＳＲの増幅）に用いたプライマーは、Ｆ１＿５’−ＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧ−３’（配列番号：１７）およびＲ１＿５’−ＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：１８）である。ＰＣＲ２（ｐＵＣｏｒｉおよびＳＶ４０の増幅）に用いたプライマーは、Ｆ２＿５−ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴ−３’（配列番号：１９）（β２ｍ＿ＵＳＲの末端に相同なオーバーハング（下線部）を含む）およびＲ２＿５’−ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：２０）である。ＰＣＲ１および２の産物はゲル精製し、第三のＰＣＲの基質として用い、Ｆ１およびＲ２プライマーを増幅に用いた。ＰＣＲ３産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ）にクローニングし、配列決定し、Ｐｍｌｌにより消化し、ｐＦｌａｐ−ＧＦＰ内の同じ部位の間にクローニングした。クローニングの方向は制限酵素消化によって制御した。
プロモーターは、Ｍｌｕｌ部位およびＢａｍＨＩ部位を用いてｐＦｌａｐ−ＧＦＰプラスミド内にクローニングした。β２ｍおよびＨＬＡ−Ｂ７プロモーターはその配列内にＭｌｕｌ部位を含むので、Ａｓｃｌ部位（Ｍｌｕｌ部位と互換性をもつ）を置き換えに用い、Ｍｌｕｌ部位を消失させる。
【０１７０】
前記プロモーターの上流にクローニングした短い上流配列
ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−ＤＲαの短い上流配列はＧｅｎｅＡｒｔから購入し、Ｍｌｕｌ制限酵素部位を用いて各プロモーターの上流にクローニングした。挿入した配列の方向は配列決定によって制御した。ＨＬＡ−Ｂ７の短い上流配列は、融合ＰＣＲを用いてＨＬＡ−Ｂ７プロモーターの上流に付加した。ＰＣＲ１（ＨＬＡ−Ｂ７＿ＵＳの増幅）に用いるプライマーは、Ｆ１＿５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：１７）およびＲ１＿５’−ＡＴＴＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号：１８）である。ＰＣＲ２（ＨＬＡ−Ｂ７プロモーターの増幅）に用いたプライマーは、Ｆ２＿５−ＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＡＣＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号：１９）（ＨＬＡ−Ｂ７＿ＵＳの末端に相同なオーバーハング（下線部）を含む）およびＲ２＿５’−ＣＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＡＡ−３’（配列番号：２０）である。ＰＣＲ１および２の産物はゲル精製し、第三のＰＣＲの基質として用い、Ｆ１およびＲ２プライマーを増幅に用いた。ＰＣＲ３産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ）にクローニングし、配列決定し、ＭｌｕｌおよびＢａｍＨＩ制限酵素により消化し、ｐＦｌａｐ−ＧＦＰ内にクローニングした。
【０１７１】
前記プロモーターの上流にクローニングした長い上流配列
ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−ＤＲαの長い上流配列はＧｅｎｅＡｒｔから購入し、Ｍｌｕｌ制限酵素部位を用いて各プロモーターの上流にクローニングした。挿入した配列の方向は配列決定によって制御した。
β２ｍ＿ＵｐおよびＨＬＡ−Ｂ７＿Ｕｐブロック（プロモーター＋長い上流配列）はGeneArtから購入し、Ｍｌｕｌ／ＢａｍＨＩ制限酵素を用いてｐＦｌａｐ−ＧＦＰ内にクローニングした。
【０１７２】
二重上流配列
ＨＬＡ−Ｅ＿ＵＳを、ｐＦｌａｐ−ΔＵ３−β２ｍ＿Ｅ＿ＵＳ−ＧＦＰ内の、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位を用いてＧＦＰ遺伝子の上流にクローニングした。まず、ＰＣＲを行って、ＨＬＡ−Ｅ＿ＵＳ  の５’および３’にそれぞれＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位を付加した。ＰＣＲに用いるプライマーは、フォワード：５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＣＣ−３’およびリバース：５’−ＧＧＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＧＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＡ−３’である。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ）にクローニングし、配列決定し、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素により消化し、ｐＦｌａｐ−ΔＵ３−β２ｍ＿Ｅ＿ＵＳ−ＧＦＰ内の同じ部位の間にクローニングし、ｐＦｌａｐ−ΔＵ３−β２ｍ＿Ｅ＿ＵＳ−ＧＦＰ＿Ｅ＿ＵＳを得た。
【０１７３】
実施例３  レンチウイルスの作製
標準的なリン酸カルシウム沈殿プロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質転換によりレンチウイルスベクターを製造した。１０ｍｌの完全培養培地を含む１０ｃｍ２組織培養皿（ＢＤファルコン）に７×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播き、５％ＣＯ２の加湿大気、３７℃の恒温槽に２４時間維持し、接着させた。各ベクターの製造のために、一つの組織培養皿は以下のように形質転換する：レンチウイルス主鎖プラスミドｐＦｌａｐ（１０μｇ）、ｐＴｈＶ−Ｅｎｖ１コード化エンベローププラスミド（２μｇ）およびｐＴｈＶ−ＧＰパッケージ化プラスミド（１０μｇ）を、３５３μｌの滅菌水（ライフテクノロジーズギブコ）および１２５μｌのＣａＣｌ２（フルカ）と混合した。次いで、ＤＮＡ混合液を５００μｌの３７℃に予め温めたＨＢＳ２×、ｐＨ＝７．３に少しずつ加え、得られた１ｍｌの沈殿物を細胞の培養培地に加えた。次いで形質転換した細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地は、形質転換から２４時間後に、血清を含まない回収培地７ｍｌと交換し、さらに２４時間後に２５００ｒｐｍ、５分間遠心分離により分類してウイルス上清を回収し、−２０℃に保存した。
【０１７４】
実施例４  フローサイトメトリーによるレンチウイルスベクターの定量化
感染粒子の定量化のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを含む完全培地を含む２４ウェルプレート（ＢＤファルコン）に１×１０５細胞の濃度で播き、４時間インキュベートして接着させた。前記培地を、完全培地中ウイルス試料の１／１００、１／３００および１／９００希釈物３００μｌと置き換えて、細胞を形質導入し、その後３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。吸着後、１ｍｌの完全培地を各ウェルに加えた。形質導入の７２時間後に細胞をトリプシン処理し、３００μｌの完全培地に再懸濁し、ＧＦＰを発現する細胞の割合を、ＦＬ１チャネルを用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシーズ）により測定した。試験した各試料について３つの希釈物を２組測定した。３０％未満の形質導入した細胞の割合に相当する値を用いて、ウイルス再懸濁液中の形質導入単位（ＴＵ）のおよその数を算出した。
【数１】
2016520316.tif 000002
【０１７５】
実施例５  ＥＬＩＳＡｐ２４による製造された全粒子の定量化
市販のキット（パーキンエルマー）を用い、製造業者の指示に従って、各生成物の上清の希釈１０−５、１０−６および１０−７に基づいて全粒子の定量化を行った。
【０１７６】
実施例６  ｑＰＣＲによる製造された有効な粒子の定量化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養培地を含む６ウェルプレート（ＢＤファルコン）に播き、湿潤雰囲気下３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。レンチウイルスベクターの３つの連続する希釈物（１／５、１／１０および１／２０）により細胞を形質導入した。７２時間インキュベートした後、細胞を回収し、形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットを得た。−２０℃に保存した後、形質導入した細胞ペレットから、単一カラムおよび微量遠心機によりＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキットハンドブックに基づいた方法を用いて全ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはｑＰＣＲに用いるまで−２０℃に保存した。宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの定量化は、５’−３’Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に基づいて、最適化したＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを用いて抽出したＤＮＡに対して行った。
【０１７７】
プローブは、レンチウイルスベクターの配列の主鎖に特異的なオリゴヌクレオチドである。ポリメラーゼマスターミックス（フェルメンタスサーモサイエンティフィック）とＦｌａｐ  Ａプライマー（ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡ）（配列番号：２１）、Ｆｌａｐ  Ｓプライマー（ＡＧＡＣＡＡ  ＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣ）（配列番号：２２）、およびＬｅｎｔｉ  ＴＭプローブ（６ＦＡＭ−ＡＡＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧ−ＢＢＱ）（配列番号：２３）を用いて増幅を行った。回収した細胞の数に対する組み込みの数を正規化するために、同じマスターミックスとアクチンＡプライマー（ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴ）（配列番号：２４）、アクチンＳ  プライマー（ＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴ）（配列番号：２５）およびヒトＡＣＴ  ＴＭプローブ（６ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡ−ＢＢＱ）（配列番号：２６）を用いて、細胞のアクチン遺伝子の特異的増幅を平行して行った。サーマルプログラム（５０℃で２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６３℃１分を４０サイクル）の後に、マスターサイクラーＥｐ  Ｒｅａｌｐｌｅｘ  Ｓ（エッペンドルフ）にて両反応を行う。マスターサイクラーＥｐ  Ｒｅａｌｐｌｅｘソフトウエアにて分析を行った。
【図１】
2016520316.tif 000003
【図２】
2016520316.tif 000004
【図３】
2016520316.tif 000005
【図４】
2016520316.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
2016520316.tif 000009
【図８Ａ】
2016520316.tif 000010
【図８Ｂ】
2016520316.tif 000011
【図９Ａ】
2016520316.tif 000012
【図９Ｂ】
2016520316.tif 000013
【図９Ｃ】
2016520316.tif 000014
【図１０】
2016520316.tif 000015
【配列表】
2016520316000001.app
【国際調査報告】
2016520316.tif 000016
2016520316.tif 000017
2016520316.tif 000018
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