(57)【要約】本発明は、組換えミトコンドリア内膜ポリペプチド、及びミトコンドリア疾患を処置するための方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ミトコンドリア内膜移行シグナル、及び
ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体
を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２若しくは配列番号３に示されたアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ミトコンドリア内膜移行シグナルが、配列番号４、配列番号５、配列番号２５、及び配列番号４、配列番号５又は配列番号２５に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
該ポリペプチドが配列番号６に示された配列を有する、請求項１〜３のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
配列番号７に示された配列を有する、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
処置方法における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項５若しくは６記載の核酸。
【請求項８】
患者におけるミトコンドリア疾患を処置するための方法における使用のための、請求項７記載のポリペプチド又は核酸。
【請求項９】
該ミトコンドリア疾患が、複合体Ｉ欠損症、ミオパチー疾患；カルジオリピン欠損症；糖尿病；肥満；虚血及び／又は再灌流障害；神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及び網膜の病変、例えば網膜剥離、網膜色素変性症及び糖尿病性網膜症からなる群より選択される、請求項８記載の使用のためのポリペプチド又は核酸。
【請求項１０】
該複合体Ｉ欠損症が、リー症候群、肥大型心筋症及び脳筋症、大頭症、ロイコジストロフィー及びミオクローヌス癲癇からなる群より選択される、請求項９記載の使用のためのポリペプチド又は核酸。
【請求項１１】
該患者が、ＡＩＦをコードする遺伝子及び／又はＭＩＡ４０をコードする遺伝子の低下した発現を示す、請求項７〜１０記載の使用のためのポリペプチド又は核酸。
【請求項１２】
該患者が、ＡＩＦとのその相互作用及び／又はその活性を変化させるＭＩＡ４０遺伝子の多型を示す、請求項７〜１１記載の使用のためのポリペプチド又は核酸。
【請求項１３】
該患者が、ＭＩＡ４０遺伝子のｒｓ９８３９８３３多型を示す、請求項７〜１２のいずれか記載の使用のためのポリペプチド又は核酸。
【請求項１４】
ＡＩＦをコードする遺伝子及び／又はＭＩＡ４０をコードする遺伝子の低下した発現を検出するための方法。
【請求項１５】
患者から得られた生物学的試料中のＭＩＡ４０をコードする遺伝子を分析する工程を含む、該患者におけるミトコンドリア疾患を診断するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換えタンパク質又は遺伝子療法を使用してミトコンドリア疾患及び神経変性疾病を処置するための方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
殆どの真核細胞に見られるミトコンドリアは、エネルギーの生成及び多くの重要な代謝シグナル伝達経路の調節を通して、増殖、分化及び死などの細胞プロセスを制御する。
【０００３】
ミトコンドリア機能不全は加齢関連の病態に関連しているだけでなく、「ミトコンドリア疾患」の名称の下で集められたヒト疾病にも関連している。これらの疾患は、最も重要なエネルギー生成代謝機構（これはミトコンドリア呼吸鎖（ＲＣ）である）の機能不全によって引き起こされる一群の異質性疾病である。この鎖は、ミトコンドリア内膜に包埋された５つの多タンパク質複合体から構成され、食物分子エネルギーを、全ての生細胞のエネルギー源であるＡＴＰに変換させる。
【０００４】
ミトコンドリアＲＣは、ミトコンドリア遺伝子及び核内遺伝子の両方によって制御される唯一の細胞機構であり、この理由から、両方のゲノムに見られる多くの突然変異がミトコンドリア疾患に関連している。細胞分裂中に、ミトコンドリアは娘細胞に無作為に分配され、その数は細胞毎に異なる。種々の細胞型におけるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の数は、数百個から数千個の範囲であり得、正常細胞においては全てのｍｔＤＮＡ分子は同一であることが注記されるべきである。
【０００５】
ｍｔＤＮＡを標的化する突然変異は、細胞内に存在する分子の一部にしか見られず、この理由から、病的突然変異の臨床的発現は、突然変異したｍｔＤＮＡと正常なｍｔＤＮＡの相対的比率に依存する。結論すると、最小数の突然変異分子が、ミトコンドリア機能不全の誘導に必要とされる。逆に、ミトコンドリアタンパク質をコードする核内遺伝子における突然変異は、メンデル遺伝の法則に従う。
【０００６】
ミトコンドリア疾患は非常に多様である。脳での併発と共に筋肉症状を伴うこれらの疾病のサブクラスはしばしば、ミトコンドリア脳筋症と呼ばれる。
【０００７】
症状としては、成長不良、筋肉協調の低下、筋力低下、視覚障害、聴覚障害、学習障害、心臓病、肝臓病、腎臓病、消化器疾患、呼吸器疾患、神経学的障害、自律神経機能障害、及び認知症が挙げられ得る。
【０００８】
具体的なミトコンドリア異常の重篤度も大又は小であり得る。いくつかの小さな異常は「運動不耐性」のみを引き起こし、重度の病気又は能力障害は全く起こらない。いくつかの異常は複数の組織を冒し、結果として多系統疾患に至り得る。
【０００９】
ミトコンドリア病は、ヒトによりその発現が大きく異なるが、これらの容態のいくつかの主要な臨床的カテゴリーは、該容態を引き起こす傾向のある特定の突然変異に関連した、最も一般的な表現型特徴、症状、及び兆候に基づいて定義されている。
【００１０】
ミトコンドリア病は、遺伝性又は後天性突然変異によって誘起され得る。米国では４，０００人に１人の小児が１０歳までにミトコンドリア病を発症する。米国では１年に４，０００人以下の小児があるタイプのミトコンドリア病を持って生まれる。罹患した小児の一部はかなり通常の生活を営むが、重度に罹患したその他の小児は青年期前にその疾病のために死亡することがあり得る。
【００１１】
成人もまた、後期発症型ミトコンドリア病と診断され得、罹患した小児と同じように罹患し得る。
【００１２】
ミトコンドリア異常はまた、アルツハイマー病、パーキンソン、心臓血管疾患、及びまた癌又は２型糖尿病を含む、最も一般的な加齢性疾病にも連関している。
【００１３】
ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜、膜間腔、ミトコンドリア内膜、及びマトリックスから構成される。ＲＣを構成する多タンパク質複合体はミトコンドリア内膜に包埋され、電子ドナー及びアクセプターの酵素系に相当する。各電子ドナーは電子をより電気陰性のアクセプターに渡し、次いでこれはこれらの電子を別のアクセプターに供与し、このプロセスは系を下って、電子が、鎖の中で最も電気陰性で末端の電子アクセプターである酸素に渡されるまで続く。電子は複合体Ｉから複合体ＩＶまで移動し、これはプロトン勾配を生じさせ、この勾配は複合体Ｖによって使用されて、ＡＴＰを合成する。全プロセスは酸化的リン酸化と呼ばれる。なぜなら、ＡＤＰはＡＴＰにリン酸化されるからである。
【００１４】
ミトコンドリアゲノムによってコードされるタンパク質サブユニットのみを含むＲＣ複合体ＩＩ以外の他の４つの複合体（複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ）は、ミトコンドリア遺伝子及び核内遺伝子の両方によってコードされるサブユニットから構成される。ＲＣの最適な機能は、各々の多タンパク質複合体の正しい生合成、移入及びアセンブリに依存する。
【００１５】
複合体のアセンブリ又は安定性に関与することによってＲＣ活性を調節すると記載されたミトコンドリア因子の１つは、核によりコードされたタンパク質ＡＩＦである。
【００１６】
アポトーシス誘発因子（ＡＩＦ）は当初、健常細胞に由来するミトコンドリアの膜間腔に含まれるが、アポトーシスに伴うミトコンドリア外膜透過（ＭＯＭＰ）誘発時にサイトゾル及び核へと移動する、酸化還元活性のあるフラボタンパク質として特徴付けられた。ＡＩＦは、真核生物系統樹全体を通して、哺乳動物、ハエ、線虫及び酵母においてアポトーシスの調節及び遂行に関与している。サイトゾルにおいては、ＡＩＦは、形質膜上へのホスファチジルセリンの露出のためのシグナルを伝達し得る。さらに、核においては、ＡＩＦは、おそらくＤＮＡホスホジエステル骨格との、並びに、潜在性のデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する他のタンパク質との直接的な静電気的相互作用を通して、クロマチン凝縮及びカスパーゼ非依存性大規模ＤＮＡフラグメンテーションに関与し得る。ＡＩＦ欠損細胞は、限られた一団の細胞死誘導因子に対して抵抗性である。特に、相同的組換えによってＡＩＦを欠失したマウス胚幹（ＥＳ）細胞（Ａｉｆ−/ｙ）は、個体発生過程中のプログラム化細胞死の第一波を反映する、初期発達中胚内における細胞減少の過程である空洞化を受けない。
【００１７】
アポトーシスにおけるその役割を超越して、ＡＩＦはまた、正常なミトコンドリア代謝にも関与している。実際に、ＡＩＦの不在は、調べた全ての種において呼吸鎖の異常を引き起こす（Hangen et al., 2010a; Vahsen et al., 2004; Joza et al., 2008; Wissing et al., 2004; Pospisilik et al., 2007）。形質発現作用の低いＡＩＦ突然変異によって影響を受けたマウス（「ハーレクインマウス」）は、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶに属するタンパク質サブユニットの転写後ダウンレギュレーションに共役した呼吸鎖欠損症を現わす（Vahsen et al., 2004; Posposilik et al., 2007）。類似の表現型が、ＡＩＦの組織特異的ノックアウトによって再現され得（Joza et al., 2005）、ＡＩＦの機能欠失型突然変異を有するヒト乳児において観察される（Ghezzi et al., 2010）。ハーレクインマウス及びＡＩＦ欠損乳児の両方が、同じように重篤な神経筋ミトコンドリア病を発症し、早死に至る（Ghezzi et al., 2012; Klein et al., 2002）。
【００１８】
ＡＩＦが呼吸鎖複合体のアセンブリ又は安定性に影響を及ぼす機序は不明であり、現在までに成功裡の療法は開発されていない。
【００１９】
従って、ミトコンドリア疾患、特に複合体Ｉ疾患を処置するための効果的な療法は当技術分野において依然として存在しない。
【００２０】
発明の要約
本発明者らは、正常なミトコンドリアにおいては、ＡＩＦが、直接的なタンパク質間相互作用を通してＭＩＡ４０として知られる別のミトコンドリアタンパク質の安定化を可能とし、ＭＩＡ４０がＡＩＦの下流において作用して、呼吸鎖超複合体の最適な量及び機能を確実なものとすることを発見した。
【００２１】
本発明者らは、ミトコンドリア内膜に直接標的化され、ＡＩＦの必要性を迂回する、組換えＭＩＡ４０を開発した。
【００２２】
従って、１つの態様において、本発明は、
ａ）ミトコンドリア内膜移行シグナル、及び
ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体
を含むポリペプチドに関する。
【００２３】
配列番号１に示されたアミノ酸配列は、ＭＩＡ４０タンパク質アイソフォーム１のアミノ酸２８〜１４２に相当する。それはオキシダーゼモチーフ及びＣＸ９Ｃ−ＣＸ９Ｃドメインを包含し、その両方がＭＩＡ４０の機能において役割を果たすことが示された。
【００２４】
別の態様において、本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、療法における使用のための上記に定義されたようなポリペプチド又は核酸に関する。
【００２６】
最後に、本発明はまた、患者から得られた生物学的試料中のＭＩＡ４０をコードする遺伝子を分析する工程を含む、該患者におけるミトコンドリア疾患を診断するための方法に関する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明によるポリペプチド
１つの態様において、本発明は、
ａ）ミトコンドリア内膜移行シグナル、及び
ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体
を含むポリペプチドに関する。
【００２８】
言い換えれば、本発明によるポリペプチドは、ミトコンドリア内膜移行シグナルを含む、組換えＭＩＡ４０である。
【００２９】
上記に説明されているように、配列番号１に示されたアミノ酸配列は、ＭＩＡ４０タンパク質アイソフォーム１のアミノ酸２８〜１４２に相当する。この配列はＭＩＡ４０．１及びＭＩＡ４０．２アイソフォームの両方に存在する。
【００３０】
本明細書において使用される「ＭＩＡ４０」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。それは、任意の哺乳動物種に由来する、ＭＩＡ４０タンパク質の任意のアイソフォームを指す。ＭＩＡ４０はまた、ＣＨＣＨＤ４としても知られる。
【００３１】
ヒトにおいては、ＭＩＡ４０は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号遺伝子ＩＤ：１３１４７４の下で参照される遺伝子によってコードされる。この遺伝子は、ＭＩＡ４０の２つのスプライス変異体をコードする：
−  ＭＩＡ４０．１（又はＭＩＡ４０アイソフォーム１）が優勢なアイソフォームである。それは、ＭＩＡ４０遺伝子のエキソン１、３及び４によってコードされ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０９１９７２．１としても知られる配列番号２に示される配列を有する
−  ＭＩＡ４０．２（又はＭＩＡ４０アイソフォーム２）はＭＩＡ４０遺伝子のエキソン１、２、３及び４によってコードされ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５３２３７．１としても知られる配列番号３に示される配列を有する。
【００３２】
ＭＩＡ４０は哺乳動物種間で良好に保存されたタンパク質である。
【００３３】
実際に、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム１と他の種のＭＩＡ４０アイソフォーム１との間の同一率は以下の通りである：
−  チンパンジー（Pan troglotydes）（チンパンジー、霊長類）：９９．３％
−  ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ラット、げっ歯類）：８３．９％
−  ハツカネズミ（Mus musculus）（マウス、げっ歯類）：８３．２％
−  ウシ（Bos taurus）（ウシ（cow）、ウシ（bovine））：８０．７％
【００３４】
同一率は、当技術分野における標準的な方法に従って計算され得る。比較しようとする２つの配列をアラインさせ、同一残基の数を計算し、アラインさせた残基の総数で割る。
【００３５】
典型的には、２つのポリペプチド間の同一率は、Lipman-Pearsonタンパク質アラインメントに基づいたソフトウェアによって計算され得る。
【００３６】
１つの実施態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【００３７】
好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８５％。好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する。
【００３８】
典型的には、本発明の組換えＭＩＡ４０タンパク質は、配列番号２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％。好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２は、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム１に相当する。
【００３９】
典型的には、本発明の組換えＭＩＡ４０タンパク質は、配列番号３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する配列を含み、配列番号３は、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム２に相当する。
【００４０】
１つの実施態様において、本発明の組換えＭＩＡ４０タンパク質は少なくとも４つのシステイン残基を含み、４つの該システイン残基は、ＭＩＡ４０アイソフォーム１（配列番号２に示される）のアミノ酸６４、７４、８７及び９７に相当する。これらのシステイン残基は、ＭＩＡ４０の正常な機能において役割を果たすことが示されている。
【００４１】
別の実施態様において、本発明の組換えＭＩＡ４０タンパク質は少なくとも６つのシステイン残基を含み、６つの該システイン残基はＭＩＡ４０アイソフォーム１（配列番号２に示される）のアミノ酸５３、５５、６４、７４、８７及び９７に相当する。
【００４２】
５３位及び５５位に位置するシステインは、ＭＩＡ４０の機能に必要なＭＩＡ４０のオキシダーゼモチーフの一部である。
【００４３】
典型的には、本発明の組換えＭＩＡ４０タンパク質は、ＡＩＦ枯渇細胞において、呼吸鎖複合体Ｉサブユニットのレベルを回復することができる。典型的には、組換えタンパク質がＡＩＦ枯渇細胞において正常な機能を回復する能力は、以下の試験に従って測定され得る：
ｓｉＲＮＡを用いてＡＩＦをノックダウンさせた４日後、配列番号１２及び配列番号１３に示される配列を有する分子を過剰発現しているコンフルエントなＵ２ＯＳ細胞を１％ＳＤＳ中に溶解し、その後、溶解液中に存在するタンパク質を定量し（バイオラッドＤＣタンパク質アッセイ）、直接的なウェスタンブロット分析にかけ、呼吸鎖複合体サブユニットのレベルを、特異的抗体を使用して評価し、対照レベルと比較する。
【００４４】
本明細書において使用される「ミトコンドリア内膜移行シグナル」（ＭＬＳ）という表現は、所与のポリペプチドをミトコンドリア内膜へと標的化させ、かつ組換えタンパク質の機能的部分が膜間腔に直面することを可能とする、アミノ酸配列を指す。
【００４５】
典型的には、ＭＬＳは、１）ミトコンドリアへの組換えタンパク質の移入を可能とし、２）それを細胞小器官の内膜へと標的化させ、かつ３）組換えタンパク質の機能的部分が膜間腔に直面することを可能とする（Schmidt, et al., 2010）。
【００４６】
ミトコンドリア内膜に挿入されかつ細胞小器官の膜間腔において機能する多くの核によりコードされたタンパク質が、二つの領域に分かれているＮ末端ＭＬＳを有する前駆体タンパク質として細胞質において合成されることが十分に確立されている（Claros et al. 1996; Claros et al., 1997 Herrmann et al. 2005; Schmidt et al., 2010）。簡潔に言えば、ＭＬＳのＮ末端部分は、タンパク質を、順次、ミトコンドリア外膜及び内膜移入機構トランスロカーゼを通して方向づけ、その後、マトリックスに局在するミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）などのミトコンドリアペプチダーゼによって切断される１５〜５０の正に荷電したアミノ酸ストレッチからなる。ＭＬＳの第二の半分は、内膜へのタンパク質のＮ末端のアンカー、及び、膜間腔へのタンパク質のＣ末端機能的部分の選別を可能とする、疎水性アミノ酸ストレッチからなる（Schmidt et al. 2010）。
【００４７】
１つの実施態様において、ミトコンドリア内膜移行シグナル（ＭＬＳ）は、配列番号４、配列番号５、配列番号２５、及び配列番号４、配列番号５又は配列番号２５に対して少なくとも９０％の同一性を有するその変異体からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する。
【００４８】
好ましい実施態様において、本発明によるＭＬＳのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５及び配列番号２５からなる群より選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する。
【００４９】
好ましい実施態様において、本発明によるミトコンドリア内膜移行シグナルは、ＡＩＦタンパク質のミトコンドリア内膜移行シグナルであり得る（Susin et al., 1999; Otera, et al. 2005; Herrmann et al., 2005）。このミトコンドリア内膜移行シグナルは、配列番号４に示された配列を有し、これはヒトＡＩＦタンパク質の残基１〜１２０に相当する。上記のＡＩＦのセグメントは、５２残基長のＮ末端ミトコンドリアアドレッシングシグナル、５３位における前駆体の切断を通してタンパク質の成熟を可能とするＭＰＰ切断部位、及び最後に、タンパク質のＩＭＳへの正しい選別及びそのタンパク質の内膜へのアンカーに必要とされる６６位から８４位までの疎水性残基クラスターから構成される、典型的な二つの領域に分かれているＭＬＳ（Otera et al. 2005）を含むことが実験的に証明されている。
【００５０】
別の実施態様において、本発明によるミトコンドリア内膜移行シグナルは、配列番号５に示された配列を有する。このミトコンドリア内膜移行シグナルは、ＨＴＲＡ２タンパク質（ｏｍｉとしても知られる）の残基１〜１３３に相当し、これは前駆体形のタンパク質がミトコンドリアに標的化され、膜間腔に直面してミトコンドリア内膜に局在化することを可能とする。
【００５１】
別の実施態様において、ミトコンドリア内膜移行シグナルは、ミトコンドリアへの移入及びＭＩＡ４０の内膜への付着を可能とすることのできる配列番号５のフラグメントである。
【００５２】
別の実施態様において、本発明によるミトコンドリア内膜移行シグナルは、配列番号２５に示された配列を有する。このミトコンドリア内膜移行シグナルはコプロポルフィリノーゲン−ＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）タンパク質の残基１〜１０５に相当し、これは前駆体形のタンパク質がミトコンドリアに標的化され、膜間腔に直面してミトコンドリア内膜に局在化することを可能とする（Hermann et al. 2005）。
【００５３】
別の実施態様において、ミトコンドリア内膜移行シグナルは、ミトコンドリアへの移入及びＭＩＡ４０の内膜への付着を可能とすることのできる配列番号２５のフラグメントである。
【００５４】
当業者は容易に他の適切な配列を同定することができる。典型的には、ポリペプチドのミトコンドリア膜間腔への標的化及び該ポリペプチドのミトコンドリア内膜への会合を可能とする、ミトコンドリア内膜移行配列は、ミトコンドリア外膜の選択的破壊、続くウェスタンブロット分析によるミトコンドリアの精製及びマイトプラストの調製を含む、生化学的技術によって試験され得る。あるいは、組換えタンパク質の亜区画局在は、ジギトニンと呼ばれる界面活性剤を使用したミトコンドリア外膜の選択的透過処理後に蛍光顕微鏡に基づいた技術によってモニタリングされ得る（Otera et al., 2005; Hangen et al, 2010b）。
【００５５】
好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、
ａ）配列番号４に示されたアミノ酸配列（ＡＩＦのＭＬＳ）、及び
ｂ）配列番号２に示されたアミノ酸配列（ＭＩＡ４０アイソフォーム１）
を含む。
【００５６】
好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、
ｂ）配列番号２に示されたアミノ酸配列（ＭＩＡ４０アイソフォーム１）にＮ末端で融合している、
ａ）配列番号４に示されたアミノ酸配列（ＡＩＦのＭＬＳ）
からなり、アルギニン及びセリンアミノ酸が、配列番号４と配列番号６の間のリンカーとして作用している。
【００５７】
このポリペプチドは、配列番号６に示された配列を有する。
【００５８】
本発明による核酸
１つの態様において、本発明はまた、上記に定義されているようなポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００５９】
好ましい実施態様において、該核酸は、配列番号７に示される配列を有する。この核酸は配列番号６に示されたポリペプチドをコードする。
【００６０】
以下の配列が、本出願において言及されている：
配列番号１は、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム１のアミノ酸２８〜１４２を示す。それはＭＩＡ４０のオキシダーゼモチーフ及びＣＸ９Ｃ−ＣＸ９Ｃドメインを含む。配列番号２は、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム１のポリペプチド配列を示す。配列番号３は、ヒトＭＩＡ４０アイソフォーム２のポリペプチド配列を示す。配列番号４はＡＩＦに由来するＮ末端ＭＬＳである。配列番号５は、ＨＴＲＡ２由来のＮ末端ＭＬＳである（ＨＴＲＡ２由来のアミノ酸１〜１３３）。配列番号６は、本発明による組換えポリペプチドの配列である：ＭＬＳ（ＡＩＦ）−ＭＩＡ４０。配列番号７は、配列番号６をコードする核酸配列である。配列番号２５は、ＣＰＯＸ由来のＮ末端ＭＬＳである（ＣＰＯＸ由来のアミノ酸１〜１０５）。
【００６１】
本発明の医薬組成物及び処置方法
本発明によるポリペプチド及び核酸は、療法に有用である。それ故、本発明はまた、医薬品として使用のための上記のポリペプチド又は核酸に関する。言い換えれば、本発明はまた、処置方法における使用のための上記のポリペプチド又は核酸に関する。特に、本発明は、患者におけるミトコンドリア疾患を処置するための方法における使用のための上記のポリペプチド又は核酸に関する。
【００６２】
本明細書において使用される「処置する」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、このような用語が適用される疾患若しくは容態を元に戻す、寛解する、その進行を阻止する、若しくは予防すること、又は、このような用語が適用される疾患若しくは容態の１つ以上の症状を元に戻す、寛解する、その進行を阻止する、若しくは予防することを指す。
【００６３】
本明細書において使用される「患者」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ及び霊長類を示す。好ましくは、本発明による患者はヒトである。
【００６４】
本明細書において使用される「ミトコンドリア疾患」という表現は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ミトコンドリア機能障害によって引き起こされる又は悪化する任意の疾病を指す。ミトコンドリア疾患としては、複合体Ｉ欠損症、ミオパチー疾患；カルジオリピン欠損症；糖尿病；肥満；虚血及び／又は再灌流障害；神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及び網膜の病変、例えば網膜剥離、網膜色素変性症及び糖尿病性網膜症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
好ましい実施態様において、該ミトコンドリア疾患は複合体Ｉ欠損症である。複合体Ｉ欠損症は、リー症候群、肥大型心筋症及び脳筋症、大頭症、ロイコジストロフィー及びミオクローヌス癲癇などの様々なヒト病態に観察される。
【００６６】
好ましい実施態様において、該ミトコンドリア疾患は、リー症候群、肥大型心筋症及び脳筋症、大頭症、ロイコジストロフィー及びミオクローヌス癲癇からなる群より選択される。
【００６７】
１つの実施態様において、該患者は、ＡＩＦをコードする遺伝子及び／又はＭＩＡ４０をコードする遺伝子の低下した発現を示す。１つの実施態様において、該患者は、その活性を変化させるＡＩＦ遺伝子の多型を示す。
【００６８】
１つの実施態様において、該患者は、ＡＩＦとのその相互作用及び／又はその活性を変化させるＭＩＡ４０遺伝子の多型を示す。
【００６９】
好ましい実施態様において、該患者は、ＭＩＡ４０遺伝子のｒｓ９８３９８３３多型を示す。
【００７０】
実際に、ＡＩＦとの機能的相互作用を必要とすることなくＭＩＡ４０の機能を回復させるために、このような患者を本発明によるポリペプチド又は核酸を用いて処置することは特に有益である。
【００７１】
さらなる態様において、本発明はまた、上記のようなポリペプチド又は核酸及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。上記のような本発明の任意の治療剤を薬学的に許容される賦形剤と、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと合わせて、治療組成物を形成し得る。
【００７２】
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性で固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化助剤を指す。
【００７３】
医薬組成物の剤形、投与経路、投与量、及び処方計画は、当然に、処置しようとする容態、病気の重度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下投与などのために製剤化され得る。
【００７５】
本発明のポリペプチド及び核酸は、任意の化学的、生物学的、遺伝子学的又は酵素学的技術などであるがこれらに限定されない当技術分野においてそれ自体公知である任意の技術を単独で又は組み合わせることによって生成され得る。
【００７６】
本発明の核酸は、遺伝子療法に適した任意の方法によって患者に投与され得る。典型的には、本発明による核酸は、発現ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターに取り込まれ得る。プラスミドの例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いての一過性トランスフェクトによって生成され得る。
【００７７】
本発明によるポリペプチド又はその変異体又は核酸は、ミトコンドリア疾患を処置するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用され得る。
【００７８】
本発明による診断法
別の態様において、本発明はまた、ＡＩＦをコードする遺伝子及び／又はＭＩＡ４０をコードする遺伝子の低下した発現を検出するための方法に関する。この検出は、上記の処置方法から最も恩恵を受けるであろう患者を同定をするのに特に有用である。この検出工程は、トランスクリプトーム及び／又はプロテオームをベースとした方法などの当技術分野において公知の任意の適切な方法によって実施され得る。典型的には、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０ｍＲＮＡ発現分析のために、全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、遺伝子特異的プライマー及びプローブを使用してリアルタイムＰＣＲによって定量した。タンパク質発現レベルは、ＡＩＦ及びＭＩＡ４０に対して指向される抗体を使用してウェスタンブロット分析によって評価され得る。
【００７９】
別の態様において、本発明はまた、患者から得られた生物学的試料中のＭＩＡ４０をコードする遺伝子を分析する工程を含む、該患者におけるミトコンドリア疾患を診断するための方法に関する。典型的には、ＭＩＡ４０をコードする遺伝子を分析して、ＡＩＦとの相互作用が、突然変異又は多型に因り減少し得るかどうかを評価する。実際に、本発明者らは、ＭＩＡ４０タンパク質がＡＩＦと相互作用する能力を変化させ、それ故、ＭＩＡ４０タンパク質がミトコンドリア内膜へと正しく標的化されることを妨げる、ＭＩＡ４０遺伝子の多型が存在することを発見した。
【００８０】
好ましい実施態様において、ＭＩＡ４０をコードする遺伝子を、ＭＩＡ４０アイソフォーム１のアミノ酸１〜２７をコードする領域における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在について分析する。別の実施態様において、ＭＩＡ４０をコードする遺伝子を、ＭＩＡ４０アイソフォーム１のアミノ酸１〜５７をコードする領域における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在について分析する。実際に、本発明者らは、配列番号２のアミノ酸１〜２７は、ＭＩＡ４０とＡＩＦの間の相互作用にとって特に重要であることを示した（最小相互作用ドメイン）。本発明者らはまた、ＡＩＦとの相互作用はさらに、ＭＩＡ４０アイソフォーム１のアミノ酸１〜５７を含むポリペプチドにおいてはさらに増加していることを示した。
【００８１】
本発明を実施するのに適した生物学的試料は、体液、例えば血清、血漿、血液又は尿であり得る。それはまた、任意の種類の組織生検材料でもよい。好ましい実施態様において、生物学的試料は血清である。該血清は新たに収集された血清又は凍結血清であり得る。
【００８２】
典型的には、該生物学的試料中に存在するゲノムＤＮＡを分析して、ＭＩＡ４０をコードする遺伝子に存在する多型を検出する。例えば、本発明者らは、ｄｓＳＮＰデータベースに番号ｒｓ９８３９８３３の下で同定された多型が、８位のアミノ酸がグリシンからトリプトファンへと変換されている（以後Ｇ８Ｗ）ＭＩＡ４０タンパク質をコードすることを示した。このＧ８Ｗ多型により、ＡＩＦとの相互作用能は低下する。
【００８３】
それ故、ＡＩＦとの相互作用の必要性なくＭＩＡ４０の機能を回復させるために、本発明によるポリペプチド又は核酸を用いて、ＭＩＡ４０遺伝子においてこの多型（及びその他）を示す患者を処置することが特に有益である。
【００８４】
さらに別の態様において、本発明は、ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の相互作用を変化させるＡＩＦ及び／又はＭＩＡ４０変異体をスクリーニングするための方法に関する。典型的には、変異体は、ｍＲＮＡシークエンス、共免疫沈降法、プルダウン及び２−ハイブリッドを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって同定され得る。
【００８５】
プルダウンアッセイは、１）２つのタンパク質間の相互作用レベルを評価すること、並びに２）各々の対タンパク質に対する突然変異及び切断短縮の効果を研究することを可能とするインビトロの方法である。アッセイにおいては、第一の「おとり」タンパク質（タグ化ＡＩＦ又はＭＩＡ４０；野生型又は突然変異型）を、ビーズに固定されたタグ特異的アフィニティリガンド上で捕捉し、その後、「プレイ」タンパク質（野生型又は突然変異型ＡＩＦ又はＭＩＡ４０）を含むタンパク質源（精製組換えタンパク質又は細胞溶解液）と共にインキュベートする。最後に、会合したタンパク質をビーズから溶出し、ゲル電気泳動によって分離し、ウェスタンによって分析する。
【００８６】
以下において、本発明は、以下の実施例を用いて説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１−１】ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の物理的相互作用。Ａ。ＡＩＦ（又は対照としてのアイソタイプの一致した精製ウサギＩｇＧ）の免疫沈降、その後、１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動後の共免疫沈降タンパク質バンド（矢印）の切り出し、及び（下線の）ＭＩＡ４０に一致するペプチドの質量分析による同定による、ＡＩＦ結合タンパク質としてのＭＩＡ４０の同定。Ｂ。ヒト癌細胞溶解液で実施された、内因性ＡＩＦ及びＭＩＡ４０タンパク質の共免疫沈降。Ｃ。内因性ＭＩＡ４０と、一団のＦｌａｇでタグ化されたＡＩＦのＣ末端切断短縮突然変異体との共免疫沈降。Ｄ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液中に含まれるＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の切断短縮突然変異体とＡＩＦとの相互作用。指定されたＭＩＡ４０誘導体をビーズ上に固定し、その後、ＡＩＦタンパク質を保持するその能力について評価した。Ｅ。最初の６つのＮ末端残基を欠失した突然変異ペプチド（ペプチド１〜２７デルタ）の存在下ではなく、ＭＩＡ４０のＮ末端（ペプチド１〜２７）に相当する合成ペプチドの存在下での、組換えＡＩＦ（グルタチオンセファロースビーズ上に保持）と組換えＨｉｓタグ化ＭＩＡ４０タンパク質との間の相互作用の競合的破壊。全ての実験は少なくとも３回実施され、類似の結果が得られた。
【図１−２】ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の物理的相互作用。Ａ。ＡＩＦ（又は対照としてのアイソタイプの一致した精製ウサギＩｇＧ）の免疫沈降、その後、１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動後の共免疫沈降タンパク質バンド（矢印）の切り出し、及び（下線の）ＭＩＡ４０に一致するペプチドの質量分析による同定による、ＡＩＦ結合タンパク質としてのＭＩＡ４０の同定。Ｂ。ヒト癌細胞溶解液で実施された、内因性ＡＩＦ及びＭＩＡ４０タンパク質の共免疫沈降。Ｃ。内因性ＭＩＡ４０と、一団のＦｌａｇでタグ化されたＡＩＦのＣ末端切断短縮突然変異体との共免疫沈降。Ｄ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液中に含まれるＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の切断短縮突然変異体とＡＩＦとの相互作用。指定されたＭＩＡ４０誘導体をビーズ上に固定し、その後、ＡＩＦタンパク質を保持するその能力について評価した。Ｅ。最初の６つのＮ末端残基を欠失した突然変異ペプチド（ペプチド１〜２７デルタ）の存在下ではなく、ＭＩＡ４０のＮ末端（ペプチド１〜２７）に相当する合成ペプチドの存在下での、組換えＡＩＦ（グルタチオンセファロースビーズ上に保持）と組換えＨｉｓタグ化ＭＩＡ４０タンパク質との間の相互作用の競合的破壊。全ての実験は少なくとも３回実施され、類似の結果が得られた。
【図２−１】ミトコンドリアプロテオームに対するＡＩＦ及びＭＩＡ４０の枯渇の影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＡＩＦ（ＡＩＦａ）、ＭＩＡ４０（ＭＩＡ４０ａ、ＭＩＡ４０ｂ）又は対照（Ｃｏ）としてのエメリンを枯渇させる特異的ｓｉＲＮＡを用いてのトランスフェクトにかけた。４日後、３つ作製された試料における、指定されたタンパク質の量をイムノブロットによって測定し（Ａ）、タンパク質の相対的発現レベルを画像分析によって定量した（Ｂ、Ｃ、Ｆ）。複合体Ｉ及びＩＶタンパク質の相対的欠損度（複合体Ｖに対する）を、酸素濃度計で透過細胞を使用して個々の呼吸鎖複合体の測定によって確認した（Ｄ、Ｅ）。さらに、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０をコードする相対的ｍＲＮＡレベルを定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定し、１とした対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における３つのハウスキーピング遺伝子に対するＡＩＦ又はＭＩＡ４０の比を定めた（Ｆ）。数値は３回の平均値±ＳＥＭである。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、少なくとも３回の実験の代表であり、これは同等な結果をもたらした。
【図２−２】ミトコンドリアプロテオームに対するＡＩＦ及びＭＩＡ４０の枯渇の影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＡＩＦ（ＡＩＦａ）、ＭＩＡ４０（ＭＩＡ４０ａ、ＭＩＡ４０ｂ）又は対照（Ｃｏ）としてのエメリンを枯渇させる特異的ｓｉＲＮＡを用いてのトランスフェクトにかけた。４日後、３つ作製された試料における、指定されたタンパク質の量をイムノブロットによって測定し（Ａ）、タンパク質の相対的発現レベルを画像分析によって定量した（Ｂ、Ｃ、Ｆ）。複合体Ｉ及びＩＶタンパク質の相対的欠損度（複合体Ｖに対する）を、酸素濃度計で透過細胞を使用して個々の呼吸鎖複合体の測定によって確認した（Ｄ、Ｅ）。さらに、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０をコードする相対的ｍＲＮＡレベルを定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定し、１とした対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における３つのハウスキーピング遺伝子に対するＡＩＦ又はＭＩＡ４０の比を定めた（Ｆ）。数値は３回の平均値±ＳＥＭである。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、少なくとも３回の実験の代表であり、これは同等な結果をもたらした。
【図３−１】ＡＩＦ／ＭＩＡ４０経路の反応次数。Ｕ２ＯＳ細胞を、１〜４日間、指定されたｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及びβ−アクチンの量をイムノブロットによって決定し（Ａ）、画像分析によって定量した（Ｂ）。オフターゲットの効果を排除するために、細胞を同時にＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｍＲＮＡの３つの非翻訳領域［ＵＴＲ］を標的化するＡＩＦｂ）及び２つの中のいずれかのＡＩＦアイソフォームをコードするプラスミド（Ｆｌａｇタグ化、３’ＵＴＲを欠失）、又はベクターのみを用いてトランスフェクトした（Ｃ）。あるいは（Ｄ）、細胞を、ＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ＨＡタグ化ＭＩＡ４０をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし（４８時間目）、イムノブロットによってＨＡタグ化タンパク質の新規発現を測定した（４８時間目）。ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及び複合体Ｉ−２０タンパク質発現に対するＨＱ突然変異の動態学的影響を、産後の指定された日に回収された脳試料において決定した。野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆｈｑ／ｙ）マウスからの２つ作製した試料をイムノブロットによって分析し（Ｅ）、各タンパク質の相対量を、定量的画像分析によって決定した（Ｆ）。エラーバーは２回の平均値±標準偏差を示す。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。これらの実験は２回繰り返され、類似の結果をもたらした。
【図３−２】ＡＩＦ／ＭＩＡ４０経路の反応次数。Ｕ２ＯＳ細胞を、１〜４日間、指定されたｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及びβ−アクチンの量をイムノブロットによって決定し（Ａ）、画像分析によって定量した（Ｂ）。オフターゲットの効果を排除するために、細胞を同時にＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｍＲＮＡの３つの非翻訳領域［ＵＴＲ］を標的化するＡＩＦｂ）及び２つの中のいずれかのＡＩＦアイソフォームをコードするプラスミド（Ｆｌａｇタグ化、３’ＵＴＲを欠失）、又はベクターのみを用いてトランスフェクトした（Ｃ）。あるいは（Ｄ）、細胞を、ＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、その後、ＨＡタグ化ＭＩＡ４０をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし（４８時間目）、イムノブロットによってＨＡタグ化タンパク質の新規発現を測定した（４８時間目）。ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及び複合体Ｉ−２０タンパク質発現に対するＨＱ突然変異の動態学的影響を、産後の指定された日に回収された脳試料において決定した。野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆｈｑ／ｙ）マウスからの２つ作製した試料をイムノブロットによって分析し（Ｅ）、各タンパク質の相対量を、定量的画像分析によって決定した（Ｆ）。エラーバーは２回の平均値±標準偏差を示す。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。これらの実験は２回繰り返され、類似の結果をもたらした。
【図４−１】ミトコンドリアに標的化されたＭＩＡ４０によるＡＩＦ異常の表現型回復。Ａ。ミトコンドリアに標的化されたＭＩＡ４０（ＭＭ）及びＢｉｒＡ（ＭＢ）の図示であって、どちらもＡＩＦ１（残基１〜１２０）に由来する同一のミトコンドリア移行配列（ＭＬＳ）を共有する。Ｂ。ＡＩＦの枯渇した細胞のミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ及びＭＢの影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＭＭ又はＭＢのいずれかを用いて安定にトランスフェクトさせ、その後、エメリン（対照、Ｃｏ）のノックダウン、又はＡＩＦのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｃ）若しくはＡＩＦ及びＭＭ又はＭＢ（全て、同一のＡＩＦに由来するＮ末端を含む）の両方を標的化する別のｓｉＲＮＡ（ＡＩＦａ）のいずれかを使用してＡＩＦのノックダウンにかけた。４日後、指定されたタンパク質の量を決定した。Ｃ。ＡＩＦヌル突然変異体ＥＳ細胞におけるミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ及びＭＢの影響。野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異体（Ａｉｆ−／ｙ）細胞を、ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトさせた。その後、溶解液をＥＳ細胞（ＬＩＦの存在下）又は胚様体（ＥＢ１０；１０日間ＬＩＦの中止によって生成）から調製し、トランスジェニック又は内因性タンパク質の発現について分析した。Ｄ。ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトされた野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆ−／ｙ）ＥＳ細胞の呼吸機能。Ｅ−Ｆ。ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトされた野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆ−／ｙ）ＥＳ細胞に由来する胚様体の表現型。指定された表現型の胚様体についての代表的な写真が示されている（Ｅ）。嚢胞性ＥＢの比率（Ｆの上のパネル）及びその周囲長が決定された（Ｆの下のパネル）。
【図４−２】ミトコンドリアに標的化されたＭＩＡ４０によるＡＩＦ異常の表現型回復。Ａ。ミトコンドリアに標的化されたＭＩＡ４０（ＭＭ）及びＢｉｒＡ（ＭＢ）の図示であって、どちらもＡＩＦ１（残基１〜１２０）に由来する同一のミトコンドリア移行配列（ＭＬＳ）を共有する。Ｂ。ＡＩＦの枯渇した細胞のミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ及びＭＢの影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＭＭ又はＭＢのいずれかを用いて安定にトランスフェクトさせ、その後、エメリン（対照、Ｃｏ）のノックダウン、又はＡＩＦのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｃ）若しくはＡＩＦ及びＭＭ又はＭＢ（全て、同一のＡＩＦに由来するＮ末端を含む）の両方を標的化する別のｓｉＲＮＡ（ＡＩＦａ）のいずれかを使用してＡＩＦのノックダウンにかけた。４日後、指定されたタンパク質の量を決定した。Ｃ。ＡＩＦヌル突然変異体ＥＳ細胞におけるミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ及びＭＢの影響。野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異体（Ａｉｆ−／ｙ）細胞を、ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトさせた。その後、溶解液をＥＳ細胞（ＬＩＦの存在下）又は胚様体（ＥＢ１０；１０日間ＬＩＦの中止によって生成）から調製し、トランスジェニック又は内因性タンパク質の発現について分析した。Ｄ。ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトされた野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆ−／ｙ）ＥＳ細胞の呼吸機能。Ｅ−Ｆ。ＭＭ又はＭＢを用いて安定にトランスフェクトされた野生型（Ａｉｆ＋／ｙ）及び突然変異型（Ａｉｆ−／ｙ）ＥＳ細胞に由来する胚様体の表現型。指定された表現型の胚様体についての代表的な写真が示されている（Ｅ）。嚢胞性ＥＢの比率（Ｆの上のパネル）及びその周囲長が決定された（Ｆの下のパネル）。
【図５−１】ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の物理的相互作用。９％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動によって判明した、ＡＩＦ（又は対照としてのアイソタイプの一致した精製ウサギＩｇＧ）の免疫沈降。Ｂ。ヒト癌細胞溶解液に対して実施された、内因性ＡＩＦ及び組換えＨＡタグ化ＭＩＡ４０タンパク質の共免疫沈降。Ｃ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液に含まれるＧＳＴでタグ化されたＡＩＦの切断短縮突然変異とＭＩＡ４０との相互作用。指定されたＡＩＦ欠失突然変異体をビーズ上に固定し、その後、ＭＩＡ４０タンパク質を保持するその能力について評価した。Ｄ。ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の切断短縮突然変異と組換えＡＩＦとの相互作用。指定されたＡＩＦ欠失突然変異体をビーズ上に固定し、その後、ＭＩＡ４０タンパク質を保持するその能力について評価した。Ｅ。ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の点突然変異体と組換えＡＩＦとの相互作用。指定されたＭＩＡ４０突然変異体（Ｃ４Ｓ；Ｃ５３Ｓ＋Ｃ５５Ｓ：Ｃ７４Ｓ；Ｃ８７Ｓ；Ｃ９７Ｓ）をビーズ上に固定し、その後、ＡＩＦタンパク質に結合するその能力について評価した。全ての実験は少なくとも３回実施され、類似の結果をもたらした。
【図５−２】ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の物理的相互作用。９％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動によって判明した、ＡＩＦ（又は対照としてのアイソタイプの一致した精製ウサギＩｇＧ）の免疫沈降。Ｂ。ヒト癌細胞溶解液に対して実施された、内因性ＡＩＦ及び組換えＨＡタグ化ＭＩＡ４０タンパク質の共免疫沈降。Ｃ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液に含まれるＧＳＴでタグ化されたＡＩＦの切断短縮突然変異とＭＩＡ４０との相互作用。指定されたＡＩＦ欠失突然変異体をビーズ上に固定し、その後、ＭＩＡ４０タンパク質を保持するその能力について評価した。Ｄ。ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の切断短縮突然変異と組換えＡＩＦとの相互作用。指定されたＡＩＦ欠失突然変異体をビーズ上に固定し、その後、ＭＩＡ４０タンパク質を保持するその能力について評価した。Ｅ。ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の点突然変異体と組換えＡＩＦとの相互作用。指定されたＭＩＡ４０突然変異体（Ｃ４Ｓ；Ｃ５３Ｓ＋Ｃ５５Ｓ：Ｃ７４Ｓ；Ｃ８７Ｓ；Ｃ９７Ｓ）をビーズ上に固定し、その後、ＡＩＦタンパク質に結合するその能力について評価した。全ての実験は少なくとも３回実施され、類似の結果をもたらした。
【図６】ミトコンドリアプロテオームに対するＡＩＦ及びＭＩＡ４０の枯渇の影響  Ａ及びＢ。Ｕ２ＯＳ細胞をＡＩＦ（ＡＩＦａ及びＡＩＦｂ）、ＣＨＣＨＤ３（ＣＨＣＨＤ３）、Ｍｉａ４０（ＭＩＡ４０ａ、ＭＩＡ４０ｂ、ＭＩＡ４０ｃ）又は対照（Ｃｏ）としてのエメリンを枯渇させる特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。４日後、指定されたタンパク質の量をイムノブロット（Ａ及びＢ）によって２つ作製された試料（Ａ）又は１つの試料（Ｂ）において測定し、タンパク質の相対的発現レベルを画像分析によって定量した（Ｃ）。Ｄ。ヒト癌細胞溶解液に対して実施された、内因性ＡＩＦ及びＭＩＡ４０タンパク質の共免疫沈降。指定されたタンパク質の存在をイムノブロットによって確認した。データは少なくとも３回の実験の代表であり、これは同等な結果をもたらした。
【図７−１】ＡＩＦ／ＭＩＡ４０経路の反応次数。Ａ。Ｕ２ＯＳ細胞を、内因性及びｆｌａｇタグ化ＡＩＦ１を排他的に枯渇させるＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＡＩＦａ）、及び２つのＡＩＦアイソフォーム（Ｆｌａｇでタグ化されたＡＩＦ１又はＡＩＦ２）のいずれかをコードするプラスミド、又はベクターのみを用いて同時にトランスフェクトした。４日後、指定されたタンパク質の量をイムノブロットによって２つ作製された試料において測定した。オフターゲットの効果を排除するために、細胞を、ＡＩＦ１特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＩＦ１ｍＲＮＡのみを標的化するＡＩＦａ）、及び２つのＡＩＦアイソフォームのいずれか（Ｆｌａｇでタグ化、３’ＵＴＲを欠失）をコードするプラスミド、又はベクターのみを用いて同時にトランスフェクトした。Ｂ、Ｃ。ＡＩＦｗｔ（Ａｉｆ＋／Ｙ）及びＡＩＦ欠損（Ａｉｆ−／Ｙ）マウス胚幹細胞（ｍＥＳ）株を、指定されたタンパク質の量についてウェスタンブロットによって分析し（Ｂの左）、タンパク質の相対的発現レベルを画像分析によって定量した（Ｂの右）。Ｃ。ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及び呼吸鎖複合体サブユニットタンパク質発現に対するＨＱ突然変異の影響を、成体マウスから切り出された様々な器官において決定した。野生型（Ａｉｆｙ＋／＋）及び突然変異型（Ａｉｆｙ／ｈｑ）マウスからの３つ作製された試料をイムノブロットによって分析し、各タンパク質の相対量を、定量画像分析によって決定した（Ｄ）。さらに、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０をコードする相対的ｍＲＮＡレベルを定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定し、対照器官における３つのハウスキーピング遺伝子に対するＡＩＦ又はＭＩＡ４０の比を定めた（Ｅ）。エラーバーは２回の平均値±標準偏差を示す。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。これらの実験は２回繰り返され、類似の結果をもたらした。
【図７−２】ＡＩＦ／ＭＩＡ４０経路の反応次数。Ａ。Ｕ２ＯＳ細胞を、内因性及びｆｌａｇタグ化ＡＩＦ１を排他的に枯渇させるＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＡＩＦａ）、及び２つのＡＩＦアイソフォーム（Ｆｌａｇでタグ化されたＡＩＦ１又はＡＩＦ２）のいずれかをコードするプラスミド、又はベクターのみを用いて同時にトランスフェクトした。４日後、指定されたタンパク質の量をイムノブロットによって２つ作製された試料において測定した。オフターゲットの効果を排除するために、細胞を、ＡＩＦ１特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＩＦ１ｍＲＮＡのみを標的化するＡＩＦａ）、及び２つのＡＩＦアイソフォームのいずれか（Ｆｌａｇでタグ化、３’ＵＴＲを欠失）をコードするプラスミド、又はベクターのみを用いて同時にトランスフェクトした。Ｂ、Ｃ。ＡＩＦｗｔ（Ａｉｆ＋／Ｙ）及びＡＩＦ欠損（Ａｉｆ−／Ｙ）マウス胚幹細胞（ｍＥＳ）株を、指定されたタンパク質の量についてウェスタンブロットによって分析し（Ｂの左）、タンパク質の相対的発現レベルを画像分析によって定量した（Ｂの右）。Ｃ。ＡＩＦ、ＭＩＡ４０及び呼吸鎖複合体サブユニットタンパク質発現に対するＨＱ突然変異の影響を、成体マウスから解体した様々な器官において決定した。野生型（Ａｉｆｙ＋／＋）及び突然変異型（Ａｉｆｙ／ｈｑ）マウスからの３つ作製された試料をイムノブロットによって分析し、各タンパク質の相対量を、定量画像分析によって決定した（Ｄ）。さらに、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０をコードする相対的ｍＲＮＡレベルを定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定し、対照器官における３つのハウスキーピング遺伝子に対するＡＩＦ又はＭＩＡ４０の比を定めた（Ｅ）。エラーバーは２回の平均値±標準偏差を示す。分散分析、その後ボンフェローニポスト分析によって計算された、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。これらの実験は２回繰り返され、類似の結果をもたらした。
【図８】ミトコンドリアに標的化されたＭＩＡ４０によるＡＩＦ異常の表現型回復。Ａ。ＡＩＦ枯渇細胞におけるミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ及びＭＢの影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＭＭ又は空ベクターのいずれかを用いて安定にトランスフェクトし、その後、エメリン（対照、Ｃｏ）のノックダウン、又はＡＩＦのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｃ）若しくはＡＩＦ及びＭＭ（これらは全て、ミトコンドリア移行配列をコードする同一でＡＩＦに由来するＮ末端を含む）の両方を標的化する別のｓｉＲＮＡ（ＡＩＦａ）のいずれかを使用してＡＩＦのノックダウンにかけた。４日後、指定されたタンパク質の量が決定された。
【図９】ＡＩＦと変異形ＭＩＡ４０（Ｇ８Ｗ）との間の物理的相互作用。Ａ。ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０変異体（ｗｔ及びＧ８Ｗ）の図示。Ｂ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液に含まれるＭＩＡ４０のＧＳＴでタグ化された完全長（全ての機能的システインを含む１４２残基）及び切断短縮型突然変異体（１〜５７）とＡＩＦとの相互作用。指定されたＧＳＴ−ＭＩＡ４０誘導体をビーズ上に固定し、その後、ＡＩＦタンパク質を保持するその能力について評価した。
【図１０】ＡＩＦとＭＩＡ４０アイソフォームとの間の物理的相互作用。Ａ。ＨＡタグ化ＭＩＡ４０アイソフォーム１変異体（ｗｔ及びＧ８Ｗ）及びＭＩＡ４０アイソフォーム２の図示。Ｂ。Ｕ２ＯＳ細胞の溶解液に含まれるＨＡタグ化完全ＭＩＡ４０アイソフォーム１変異体（ｗｔ及びＧ８Ｗ）及びＭＩＡ４０アイソフォーム２とＡＩＦとの共免疫沈降。プロテインＧビーズ上に固定された抗ＨＡタグ抗体を、ＡＩＦ／ＭＩＡ４０複合体の共免疫沈降のために使用した。
【図１１】ＡＩＦとＭＩＡ４０との間の物理的相互作用。Ａ。ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ）の非存在下又は存在下における、ＧＳＴタグ化ＡＩＦと組換えＨｉｓタグ化完全長ＭＩＡ４０との相互作用。ＧＳＴタグ化ＡＩＦをまずビーズ上に固定し、指定されたヌクレオチドと共にプレインキュベートし、その後、ＭＩＡ４０タンパク質を保持するその能力について評価した。Ｂ。ＮＡＤＨの非存在下又は存在下における、ＧＳＴでタグ化されたＭＩＡ４０の切断短縮型突然変異体又は点突然変異体と組換えＡＩＦ（１０３〜６１３）との相互作用。指定されたＭＩＡ４０誘導体をまずビーズ上に固定し、その後、ＮＡＤＨに予め結合した又は結合していないＡＩＦ（１０３〜６１３）タンパク質を保持するその能力について評価した。
【図１２】ＭＩＡ４０−／−ノックアウトマウス胚における呼吸鎖複合体ＣＩサブユニットの減少。Ａ。突然変異ＭＩＡ４０マウスの構築のための遺伝子捕捉ベクターの図示。ｌａｃＺ−ネオマイシン耐性融合カセットを含むレトロウイルスベクター（ＢＧＥＯ）をＭＩＡ４０／ＣＨＣＨＤ４遺伝子に挿入した。Ｂ。ＭＩＡ４０の無効化は、嚢胚形成時に胚の致死をもたらす。ヘテロ接合型マウスの交雑により、生誕時に生存可能な出生児の中からＭＩＡ４０−／−の仔は全く生じなかった。ＭＩＡ４０−／−胚の死滅時期を決定するために、同腹仔をＥ６から生誕まで調べた。Ｅ８．５以後は突然変異胚は全く検出されなかった。Ｅ７−８．５同腹仔からの胚を、体節を計数することによって又は体節前期においてDowns及びDavis（Downs et al., 1993）の基準に従って個々にステージ分類した。突然変異胚はほぼ常にＥ５．５−６のステージであった。Ｅ５．５−６におけるヘテロ接合型胚はまた、突然変異胚を含有するほぼ半分の同腹仔から回収された。共に、これらのデータは、嚢胚形成開始時における胚致死性を指摘する。Ｃ。Ｅ６からＥ９のヘテロ接合型胚のＸ−Ｇａｌによる染色は、最初期ステージにおける臓側内胚葉の例外を除き、広範囲に広がったＭＩＡ４０の発現を明らかとした。Ｄ。呼吸鎖複合体サブユニットタンパク質発現に対するＭＩＡ４０突然変異の影響。回収され、体節前期においてDowns及びDavis（Downs et al., 1993）の基準に従ってステージ分類された個々の胚の抽出物を、特異的抗体を使用して各々の指定されたタンパク質の相対量についてイムノブロットによって分析した。
【図１３】ミトコンドリアに標的化された突然変異ＭＩＡ４０によるＡＩＦ異常の表現型回復。ＡＩＦ枯渇細胞のミトコンドリアタンパク質の量に対するＭＭ（ｗｔ及びｍｕｔｃｙｓ）の影響。Ｕ２ＯＳ細胞を、ｗｔＭＭ又はｍｕｔｃｙｓＭＭのいずれかを用いて安定にトランスフェクトさせ、その後、エメリン（対照、Ｃｏ）のノックダウン、又はＡＩＦのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＡＩＦｃ）若しくはＡＩＦ及びＭＭ（同一のＡＩＦに由来するＮ末端を含む）の両方を標的化する別のｓｉＲＮＡ（ＡＩＦａ）のいずれかを使用したＡＩＦのノックダウンにかけた。４日後、指定されたタンパク質の量を決定した。
【００８８】
実施例
実施例１  −  ＭＬＳ−ＭＩＡ４０は、ＡＩＦ欠損細胞において正常な呼吸機能を再確立することができる
材料及び方法
抗体：以下の抗体を使用した：抗アクチンマウスｍＡｂ（CHEMICON, MAB1501）；抗ＡＩＦマウスｍＡｂ（Santa Cruz, Sc13116）；抗ＡＩＦウサギＰＡＢ（Cell Signaling, 4642）；抗ＭＩＡ４０ウサギＰＡＢ（Santa Cruz sc98628）；抗ＣＩ ＳＵ ２０ｋＤａ（NDUFB8）マウスｍＡｂ（Mitosciences, MS105）；抗Ｔｉｍ２３ｍＡｂ（BD Transduction, 611222）；ポリクローナル抗ＶＤＡＣウサギｐＡｂ（Cell Signaling, 4866）；抗Ｈｓｐ６０マウスｍＡｂ（Stressgen, SPA-806）；抗全ヒトＯＸＰＨＯＳ ＷＢ抗体カクテルマウスＭＡＢ（Mitosciences ; MS601）；抗全げっ歯類ＯＸＰＨＯＳ ＷＢ抗体カクテルマウスＭＡＢ（Mitosciences ; MS604）；抗ＦｌａｇＭ２マウスｍＡｂ（SIGMA, F3165）。
【００８９】
合成ペプチド：合成ペプチドを、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学反応に従って固相法によって調製した。樹脂から切断し、ＬＣ−ＭＳによって特徴付けした後、それらをＲＰ−ＨＰＬＣにより均一となるまで精製し、凍結乾燥させた。
【００９０】
プラスミド及びｓｉＲＮＡ：組換えプラスミドｐＣＭＶ−ＡＩＦ１−３ｘＦｌａｇ及びｐＣＭＶ−ＡＩＦ２−３×Ｆｌａｇを記載のように（Hangen et al., 2010b.）構築した。ヒトＡＩＦ１の全てのＦＬＡＧタグ化Ｃ末端欠失突然変異体をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位を使用してベクターｐＣＭＶ−３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（Sigma）にクローニングした。指定されたＡＩＦ欠失突然変異体をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位を使用して細菌発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐにサブクローニングした。哺乳動物細胞（ｐＣＭＶ−ＭＩＡ４０−ＨＡ）又は細菌（ｐＴ７−Ｈｉｓ−ＭＩＡ４０及びｐＴ７−ＧＳＴ−ＭＩＡ４０）におけるヒトＭＩＡ４０の発現のための組換えプラスミドは、Genocopoeiaから入手した。指定されたＭＩＡ４０欠失突然変異体を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位を使用して細菌発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐにサブクローニングした。ＭＩＡ４０に存在するシステイン残基を、部位特異的突然変異誘発キット（QuickChange Site-directed Mutagenesis kit, Stratagene）及び記載のようなプライマー（Hofmann et al., 2005）を使用することによってセリンへと突然変異させた。
【００９１】
細菌ビオチンリガーゼ発現ベクター３ＸＨＡ−ＢｉＲＡ ｐＢＵＤｎｅｏは、John Strouboulis博士（de Boer et al., 2003）の親切な贈り物である。プラスミドｐＢＵＤｎｅｏ−ＭＬＳ−ＢｉｒＡ（ｐＢＵＤ−ＭＢ）の構築のために、３ＸＨＡタグをコードする配列を、ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素（New England Biolabs）を使用して３ＸＨＡ−ＢｉＲＡ ｐＢＵＤｎｅｏから除去し、最初の１２０アミノ酸をコードするヒトＡＩＦ１のＰＣＲにより増幅されたＮ末端セグメントによって置換した。ｐＢＵＤｎｅｏ−ＭＬＳ−ＭＩＡ４０（ｐＢＵＤ−ＭＭ）の構築のために、ＢｉｒＡをコードする配列を、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素（New England biolabs）を使用してｐＢＵＤｎｅｏ−ＭＬＳ−ＢｉｒＡ（ｐＢＵＤ−ＭＢ）から除去し、ヒトＭＩＡ４０のオープンリーディングフレームに相当するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅フラグメントによって置換した。
【００９２】
ＭＬＳ−ＭＩＡ４０（ＭＭ）及びＭＬＳ−ＢｉｒＡ（ＭＢ）のコード配列を、Platinum Taq ポリメラーゼ（Invitrogen）及び以下のプライマーを使用して、そのそれぞれのｐＢＵＤｎｅｏ宿主ベクターからＰＣＲ増幅した：5'-CGTAACTCCCGGGATCCTAAATGTTCCGGTGTGGAGG-3'（配列番号８）（左）及び5'-CGTAACTGCGGCCGCTTAGGGATAGGCTTACCTTCG-3'（配列番号９）（右）。ＰＣＲ産物をGeneclean system（MP Biomedicals）を使用してアガロースゲルにより精製し、ＸｍａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素（New England biolabs）を用いて消化した。その後、精製された消化産物を、強力かつ構成的なＣＡＧプロモーターの下流にある、エプシュタイン・バーウイルスをベースとしたエピソームベクター（D. Biardからの親切な贈り物、CEA、フランス）のＡｇｅＩ−ＮｏｔＩ部位に導入した。得られたｐＥＢＶ−ＭＭ及びｐＥＢＶ−ＭＢプラスミドの配列を確認して、対応するコード配列において突然変異が全く存在しないことを確認した。
【００９３】
ＲＮＡ干渉実験のために、以下のｓｉＲＮＡ配列を使用した：陰性対照：Ｃｏのために：CCG UGC UCC UGG GGC UGG G [dT][dT]（配列番号１０）；ヒトＡＩＦ：ＡＩＦａのために：GGG CAA AAU CGA UAA UUC U[dT][dT]（配列番号１１）；ＡＩＦｂのために：GCA GAC UUU CUC UGU GUA U[dT][dT]（配列番号１２）；ＡＩＦｃのために：GCA UGC UUC UAC GAU AUA [dT][dT]（配列番号１３）；ヒトＭＩＡ４０：ＭＩＡ４０ａのために：GCA UGG AUU GAU ACU GCC ATT [dT][dT]（配列番号１４）；ＭＩＡ４０ｂのために：GGA AGG AUC GAA UCA UAU UTT[dT][dT]（配列番号１５）；ＭＩＡ４０ｃのために：CGA GGA GCA UGG AUU GAU ATT [dT][dT]（配列番号１６）（Applied Biosystems）。
【００９４】
細胞培養及びトランスフェクション：ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９６）並びに子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）を３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンの補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco）中で培養した。プラスミド及びｓｉＲＮＡトランスフェクションを、リポフェクタミン−２０００試薬（Invitrogen）を使用して以下の製造業者の手順に従うことによって実施した。ＭＬＳ−ＭＩＡ４０（ＭＭ）又はＭＬＳ−ＢｉｒＡ（ＭＢ）を発現している安定にトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞のプールを、０．５mg/mlのジェネテシン（Invitrogen）の存在下での選択によって確立した。
【００９５】
ウェスタンブロット分析。Ｕ２ＯＳ細胞（トランスフェクトされた又はされていない）を、４℃で３０分間、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡ非含有のプロテアーゼ阻害剤タブレット−Roche Applied Science）及びホスファターゼ阻害剤（PhosSTOPホスファターゼ阻害剤タブレット−Roche Applied Science）の補充されたＮｅｔ．Ｎ１２０緩衝液（２０mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．５％ Igepal）中で、デオキシリボヌクレアーゼ非含有のリボヌクレアーゼ（１０μg/ml；Roche）の存在下又は非存在下で溶解した。溶解液を１３，０００ｇで１０分間遠心分離にかけて、細胞片を排除した。上清中に存在するタンパク質を定量し（Bio-Rad DCタンパク質アッセイ）、直接ウェスタンブロット分析にかけるか、又は免疫沈降、ＧＳＴプルダウン、続いてウェスタンブロット分析にかけた。
【００９６】
免疫沈降：簡潔に言えば、プロテインＧ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（５０％スラリー ５０μl、GE Healthcare）を、ＮｅｔＮ１２０緩衝液 ８００μl（２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．５％Igepal）中で４℃で２〜３時間インキュベートすることによって、指定された抗体（１回の免疫沈降あたり２μg）を用いてコーティングした。抗体でコーティングされたビーズをＮｅｔＮ１２０緩衝液中で洗浄し、細胞溶解液と共に最終容量 ８００μl中で４℃で２時間インキュベートした。ビーズを、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤で補充されたＮｅｔ．Ｎ１２０緩衝液を用いて３回洗浄し、その後、デオキシリボヌクレアーゼ非含有のリボヌクレアーゼ（２５０μg/ml）を含む又は含まない洗浄緩衝液 ５０μlと共に４℃で３０分間インキュベートした。ＮｅｔＮ１２０を用いての最後の洗浄後、試料を最終的に、１×ＳＢ（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、６２．５mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１００mM ジチオトレイトール）中で煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NUPAGE ; Invitrogen）によって直接分離した。電気泳動後、ゲルをウェスタンブロット分析に又は銀染色手順（Silver stain plus kit and procedure- Biorad）のいずれかにかけて、沈降したタンパク質バンドを可視化した。
【００９７】
質量分析によるＡＩＦ会合タンパク質の同定：抗ＡＩＦ抗体と共精製される特定のタンパク質バンドをゲルから切り出し、ゲル内でのトリプシンによる消化にかけ、ZipTip μC18ピペットチップ（Millipore）を用いて濃縮し、ＭＡＬＤＩターゲット上に直接共溶出した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを、Applied Biosystems 4700 MALDI TOF/TOFで実施した。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータの両方の解釈は、ＧＰＳエクスプローラソフトウェア（Version 3.6, Applied Biosystems）を用いて行なわれた。ＭＳペプチドフィンガープリントとＭＳ／ＭＳペプチドシークエンスサーチの組合せを、分類制限のないＮＣＢＩデータベースに対して、ＭＡＳＣＯＴサーチアルゴリズムを使用して実施した。これらは、消化酵素である特定のトリプシン、不変の修飾であるシステインのカルバミドメチル化、可変的な修飾であるメチオニンの部分的酸化、並びにセリン、トレオニン及びチロシンのリン酸化を探索し、１つの見過ごされたトリプシンの切断を可能とした。モノアイソトピック前駆イオン許容値は３０ppmに設定され、ＭＳ／ＭＳイオン許容値は０．３Ｄａに設定された。最小イオンスコア信頼区間が９５％以上であるＭＳ／ＭＳペプチドスペクトルが認められ：これは、データセットにおいて約３５個のイオンスコアカットオフ中央値に相当した。タンパク質の同定は、統計学的に有意なＭＡＳＣＯＴタンパク質サーチスコアが７５以上であれば認められ、これは、本発明者らのデータセットにおいてはｐ＜０．０５の誤差の確率に相当した。
【００９８】
ＧＳＴプルダウン：全ての組換えｐＧＥＸプラスミドを、ＧＳＴ融合タンパク質生成のために使用した（Kaelin et al 1991）。ＧＳＴ融合タンパク質は細菌中で生成され、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（GE Healthcare）上に回収された。指示のある場合には、グルタチオンアフィニティ精製後、組換え融合タンパク質のＧＳＴ部分を、PreScissionプロテアーゼ（GE Healthcare）を用いての消化後に切断し、純粋な組換えＡＩＦ（１０３〜６１３）を消化後の上清中に回収した。競合実験のために、ＧＳＴ−ＡＩＦタンパク質をまずグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ上に回収し、その後、それぞれヒトＭＩＡ４０タンパク質のＮ末端残基１−２７及び７−２７に相当する合成ペプチドＭＩＡ４０１−２７（MSYCRQEGKDRIIFVTKEDHETPSSAE；配列番号１７）又はＭＩＡ４０ １−２７デルタ（EGKDRIIFVTKEDHETPSSAE；配列番号１８）と共にプレインキュベートし、その後、Ｈｉｓ−ＭＩＡ４０組換えタンパク質と共にインキュベートした。
【００９９】
イムノブロットのための組織抽出物の調製。野生型（ｗｔ）又はハーレクイン（Ｈｑ）マウスを麻酔し、指定された年齢で断頭によって殺滅した。全ての切り出した器官を瞬間凍結させ、その後、Precellysホモジナイザー（Bertin）を使用して、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤の補充された氷冷ＲＩＰＡ １×緩衝液中でホモジナイズした。
【０１００】
ＲＮＡの単離、及び定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による遺伝子発現分析：野生型（ｗｔ）又はハーレクイン（Ｈｑ）突然変異マウス器官からの全ＲＮＡを、Precellysホモジナイザー（Bertin）及びQiagenのＲＮＡ単離キットを使用して抽出した。培養液中のヒト細胞からのＲＮＡを、PARISキット（Ambion）を使用して抽出した。その後、全てのＲＮＡ試料を−８０℃で保存した。
【０１０１】
ＲＮＡ試料の定量は、Nanodrop ND-1000分光光度計を使用して達成され、ＲＮＡの完全性は、真核生物全ＲＮＡナノアッセイを用いてAgilent 2100バイオアナライザーを使用して確認された。全ＲＮＡ １μgを、製造業者の説明書に従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitをリボヌクレアーゼ阻害剤（Applied Biosystems）と共に使用して最終反応容量 ２０μl中で逆転写した。ヒト及びマウスＡＩＦ１のために、以下のプライマー及びＴａｑｍａｎ ＭＧＢプローブをApplied Biosystemsによってカスタムメイドした：ヒトＡＩＦ１；正方向（ｈＡＩＦ１Ｆ）のために：5'-GGCAAAATCGATAATTCTGTGTTAGTC-3'（配列番号１９）；逆方向（ｈＡＩＦＲ）のために：5'-CCACCAATTAGCAGGAAAGGAA-3'（配列番号２０）；プローブ（ｈＡＩＦｃｐ）のために：5'-TGTTTCTGTTCTGGTGTCAG-3'（配列番号２１）；マウスＡＩＦ１：正方向（ｍＡＩＦ−Ｆ）のために：5'-CGAGCCCGTGGTATTCGA-3'（配列番号２２）；逆方向（ｍＡＩＦ１Ｒ）のために；5'-CCATTGCTGGAACAAGTTGC-3'（配列番号２３）；プローブ（ｍＡＩＦＳｃ）のために：5'-ACGGTGCGTGGAAG-3'（配列番号２４）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、５’末端において６−ＦＡＭを用いて、３’末端において非蛍光ＭＧＢクエンチャーを用いて標識した。各プローブを、ＡＩＦ１の定量のために種々の正方向及び逆方向のプライマー（リストを参照）と合わせた。ヒトＭＩＡ４０（Hs 01027804_g1）、マウスＭＩＡ４０（Mm01183497_g1）、１８ＳリボソームＲＮＡ（Hs99999901_s1）、Ｇａｐｄｈ（Mm99999915_g1）、Ｐｇｋ１（Mm00435617_m1）、Ｔｂｐ（Mm00446973_m1）のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイは、Applied Biosystems製であった。定量ＰＣＲ反応を、ABI Prism 7900 HT配列検出システム（Applied Biosystems）を使用して実施した。リアルタイムｑ−ＰＣＲ増幅を実施した（９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４５サイクル）。技術的反復実験を、各々の生物学的試料について実施した。ＡＩＦ１及びＭＩＡ４０発現定量のために、リファレンス遺伝子を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）マウス内因性対照アレイを使用して選択した。簡潔に言えば、１６個のハウスキーピング遺伝子を、各々の試料について３回試験した。結果をＧｅｎｅｘ４．３．８（MultiD, Goteborg, Sweden）のＧｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍｆｉｎｄｅｒ関数を用いて分析することによって最も安定な遺伝子を選択した。３つのハウスキーピング遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１及びＴｂｐ）の幾何平均を使用して、相対的定量法を用いてのｑ−ＰＣＲ実験のさらなる分析のためにＡＩＦ１及びＭＩＡ４０の遺伝子発現レベルを標準化した。
【０１０２】
マウス胚幹細胞培養及びトランスフェクション：ＡＩＦｗｔ（ＡＩＦ＋／Ｙ）及びＡＩＦ欠損（ＡＩＦ−／Ｙ）マウス胚幹細胞（ｍＥＳ）株を、０．１％ゼラチン（Sigma）でコーティングされた皿の、１５％ ウシ胎児血清（Hyclone）、１mM ピルビン酸ナトリウム、１００U/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン、１％ 非必須アミノ酸、１００μM β−メルカプトエタノール（それらは全てInvitrogen製）、及び１０００U/ml 白血病抑制因子（ESGro、Millipore）で補充された高グルコース／グルタマックス−Ｉ ＤＭＥＭをベースとしたｍＥＳ培地中で増殖させた。トランスフェクションのために、１２ウェルプレートの１ウェルあたり２×１０４個のｍＥＳ細胞を播種した。翌日、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＢＶ−ＭＢ又はｐＥＢＶ−ＭＭ）をＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Promega）と２：１の比で製造業者の説明書に従って混合し、１ウェルあたり複合体 ５０μlを加えた。翌日、培地を交換し、０．５μg/ml ピューロマイシン（Invitrogen）を用いての選択を４８時間後に開始した。それぞれＭＢ（ＭＢ−ＡＩＦ ＋／Ｙ及びＭＢ−ＡＩＦ −／Ｙ）及びＭＭ（ＭＭ−ＡＩＦ＋／Ｙ及びＭＭ−ＡＩＦ −／Ｙ）を発現している４つの安定にトランスフェクトされた細胞株を確立し、その後、０．５μg/ml ピューロマイシンで補充されたｍＥＳ培地中で慣用的に増殖させた。培地を毎日交換し、細胞を、さらなる５％ＣＯ２を含む大気条件中で３７℃で増殖させた。
【０１０３】
胚様体（ＥＢ）形成：ＥＢの形成のために、１ウェルあたり２×１０５個のｍＥＳ細胞を、６ウェルの超低接触プレート（Corning）中の、１５％ウシ胎児血清（Hyclone）、２mM Ｌ−グルタミン（Invitrogen）、１００U/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン、５０μg/ml アスコルビン酸（Sigma）、４５０μM モノチオグリセロール（Sigma）、２００μg/ml 鉄飽和トランスフェリン（Sigma）及び０．３μg/ml ピューロマイシンで補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（Invitrogen）中に播種した。培地を４日間毎に交換し、プレートを５％ＣＯ２で補充された大気条件中で３７℃でインキュベートした。嚢胞性ＥＢの比率を形態によって評価した。
【０１０４】
呼吸鎖活性の評価：呼吸鎖活性を、０．０１％のジギトニンを用いて透過処理されたサブコンフルエントなｍＥＳ（ＭＢ又はＭＭを過剰発現している）又はＵ２ＯＳ細胞（選択されたｓｉＲＮＡを用いてＡＩＦ又はＭＩＡ４０をノックダウンした４日後）で測定した。ロテノン感受性ＮＡＤＨキノンレダクターゼ（複合体Ｉ；ＥＣ１．６．５．３）、オリゴマイシン感受性ＡＴＰヒドロラーゼ（複合体Ｖ；ＥＣ３．６．３．１４）、シアニド感受性チトクロムｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ；ＥＣ１．９．３．１）、マロン酸感受性コハク酸チトクロムｃレダクターゼ（コハク酸デヒドロゲナーゼの間接的な尺度−ＥＣ１．３．５．１−この活性に限定；ＥＣ１．３．９９．１）、グリセロールチトクロムｃレダクターゼ（グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼの間接的な尺度、−ＥＣ１．１．５．３−この活性に限定）、アンチマイシン感受性キノールチトクロムｃレダクターゼ（複合体ＩＩＩ；ＥＣ１．１０．２．２）を、以前に記載されているように（Benit et al., 2006）、偽二波長バリアンＣＡＲＹ５０分光光度計（Victoria, Australia）を使用して３７℃で分光光度的に測定した。結果は、活性比の平均値±ＳＥＭとして表現される。なぜなら、これらは、呼吸鎖における部分的異常を検出するための最も感度の高いマーカーであることが確立されているからである。全ての測定は３７℃で実施された。タンパク質レベルを、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォード法によって決定した。全ての化学物質は、Sigma Chemical社からの分析試薬等級のものであった。
【０１０５】
統計学的分析：ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔソフトウェアを統計学的分析のために使用した。群を、一元配置分散分析法、続いてボンフェローニポスト分析によって比較した。統計学的有意の基準は、ｐ＜０．０５と設定された。データは平均値±ＳＥＭとして表現される。
【０１０６】
結果
ヒト子宮頸癌細胞からのＡＩＦの免疫沈降、続いて質量分析により、ＡＩＦ結合対としての酵母Ｍｉａ４０（Ｔｉｍ４０）（Chacinska et al., 2004; Naoe et al., 2004）のヒトに相当するものである、ＣＨＣＨＤ４．１が同定された（図１Ａ、Ｂ、図５Ａ）。
【０１０７】
ヒトＭＩＡ４０は、ミトコンドリア膜間腔に局在する１６ｋＤａのタンパク質であり（Hofmann et al., 2005）、そこでそれはミトコンドリアへの移入に関与し、酸化的タンパク質フォールディングを触媒する（Chacinska et al., 2008; Banci et al., 2009）。内因性ＡＩＦ及びＭＩＡ４０は、ＡＩＦが、呼吸鎖サブユニット又はＣＨＣＨＤ３（Schauble et al., 2007）、ＭＩＡ４０ファミリーメンバーをはじめとする他のミトコンドリアタンパク質と相互作用できない条件において共免疫沈降した（図１Ｂ、図５Ｂ）。完全長ＡＩＦのみが、内因性ＭＩＡ４０と相互作用することができた（図１Ｃ、図５Ｃ）。プルダウン実験は、組換えＡＩＦタンパク質と、完全長ＭＩＡ４０タンパク質との、並びにそのＮ末端の２７アミノ酸を含む切断短縮形のＭＩＡ４０との直接的な相互作用を明らかとした（図１Ｄ、図５Ｄ）。このＮ末端に相当する合成ペプチドは、組換え完全長ＭＩＡ４０とＡＩＦの相互作用を競合的に破壊することができた（図１Ｅ）。そのミトコンドリアへの蓄積及び触媒活性（Hofmann et al., 2005; Banci et al., 2009）に関与するＭＩＡ４０のシステイン残基の突然変異は、ＡＩＦへの結合に影響を及ぼすことができず（図５Ｅ）、これは、両方のタンパク質間の直接的な酸化還元とは独立した相互作用を示唆する。
【０１０８】
本発明者らは、ＭＩＡ４０を、２つの重複していない小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてノックダウンさせた。ＭＩＡ４０枯渇により、いくつかの呼吸鎖タンパク質、特に複合体Ｉ及びＩＶのサブユニットのタンパク質発現レベルが低下し（図２Ａ〜Ｃ）、複合体Ｉ及びＩＶの機能の低下が平行して起こった（図２Ｄ、Ｅ）。対照として、ＣＨＣＨＤ３の枯渇は、分析された呼吸鎖サブユニットの安定性に対する類似の効果を媒介できなかった（図６Ａ）。従って、ＭＩＡ４０枯渇は、呼吸鎖複合体のレベルで、ＡＩＦ枯渇の生化学的及び機能的な結果を表現型コピーする。従って、ＡＩＦ又はＭＩＡ４０のノックダウンは、２つのＭＩＡ４０基質であるＣＯＸ１７及びＤＤＰ１の量に対して類似の効果を及ぼしたが、他のミトコンドリアタンパク質、例えばＶＤＡＣ及びＨＳＰ６０の量には影響を及ぼさなかった（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ）。ＭＩＡ４０のノックダウンは、ＡＩＦの量を消失させなかった（図２Ａ、Ｆ）。著しく対照的には、ＡＩＦの枯渇により、ＭＩＡ４０特異的ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく（図２Ｇ）、ＭＩＡ４０タンパク質発現は低下した（図２Ａ、Ｆ）（しかしＣＨＣＨＤ３タンパク質発現は低下しなかった、図６Ａ）。２つの重複していないｓｉＲＮＡによるＡＩＦの枯渇は、数日間遅れてＭＩＡ４０タンパク質の転写後減少を伴い（図３Ａ、Ｂ）、非干渉性のプラスミド構築物によるＡＩＦ発現の再導入は、ＭＩＡ４０発現に対するＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡの作用を打ち消した（図３Ｃ、図７Ａ）。ＡＩＦのノックダウンは、ＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡと共にトランスフェクトされたＨＡタグ化ＭＩＡ４０構築物の新規発現を完全に消失させ（図３Ｄ）、このことはＡＩＦがＭＩＡ４０タンパク質の安定化に必要であることを示す。ＡＩＦ欠損（Ａｉｆ−／ｙ）ＥＳ細胞及び空洞形成している胚様体（ＥＢ）もまた、低下したＭＩＡ４０発現を示した（図７Ｂ）。形質発現作用の低いＡｉｆｈｑ／ｙ突然変異を有するマウスは、定量イムノブロット分析によって検出したところ（図３Ｅ、Ｆ）、産後の脳における進行的なＭＩＡ４０の異常を顕現し、その後、初期成人期の間に複合体Ｉサブユニットの異常が起こった。ＭＩＡ４０タンパク質発現のこの異常は、転写後レベルだけに起こり、またＡｉｆｈｑ／ｙマウスの他の器官においても観察された（図７Ｃ〜Ｅ）。
【０１０９】
本発明者らは、ＭＩＡ４０のミトコンドリアへの移入経路を改変し、そのＮ末端に融合したＡＩＦに由来する適切なミトコンドリア移行配列（ＭＬＳ）を用いて内膜へのその付着を強制することによって［３２］、ＡＩＦ枯渇細胞におけるＭＩＡ４０の発現を回復させた（図４Ａ）。ＭＬＳ−ＭＩＡ４０（ＭＭ）の発現レベルは、ＡＩＦ特異的ｓｉＲＮＡの１つ（ＡＩＦｃ）によって影響を受けなかったが、ＡＩＦ及びＭＭによって共有されるＭＬＳに相当するｍＲＮＡ配列ストレッチに標的化する別のｓｉＲＮＡ（ＡＩＦａ）によって強く減少した。重要なことには、ＭＭは、ＡＩＦの枯渇に続発するＤＤＰ１及び呼吸鎖複合体サブユニット（複合体Ｉ由来のＣ−Ｉ−２０、ＧＲＩＭ１９；複合体ＩＶ由来のＣ−ＩＶ−ＩＩ及びＣＯＸ１７）の異常を復帰させることができた（図４Ｂ、８Ａ）。これに対して、対照構築物（ＡＩＦ由来のＭＬＳと非関連タンパク質ＢｉｒＡから構成されるＭＢ）は、ＡＩＦの枯渇によって誘導された呼吸鎖サブユニット異常を元に戻すことができなかった（図４Ｂ）。ＭＭを用いての安定なトランスフェクションはまた、ＡＩＦ発現を欠失したＡｉｆ−／ｙＥＳ細胞においてＣ−Ｉ−２０の発現を回復することができた（しかしＭＢを用いてはできなかった）（図４Ｃ）。なぜならそれは呼吸機能を改善したからである（図４Ｄ）。同時に、ＭＭ（しかしＭＢではない）はＡｉｆ−／ｙＥＳ細胞が、多能性を通常維持しかつＥＳ細胞の分化を抑圧するサイトカインである白血病抑制因子（ＬＩＦ）の枯渇時に、空洞形成している胚様体（ＥＢ）を形成する能力を回復させた。ＭＭを発現しているＡｉｆ−／ｙＥＢは、ＭＢを発現している又はトランスフェクトされていない（示されていない）Ａｉｆ−／ｙＥＢが空洞化を受けることができない条件において、ＬＩＦの除去時に空洞化を受けた（図４Ｅ、Ｆの上のパネル）。対照的に、ＭＭはＥＢの形成及びサイズに対して全く影響を及ぼさなかった（図４Ｆの下のパネル）。要するに、これらの結果は、ＭＩＡ４０レベルを回復させることは、その代謝表現型及び細胞死表現型に関して、Ａｉｆ−／ｙＥＢ細胞の表現型を元に戻すことができることを示す。
【０１１０】
結論すると、初めて本発明者らの結果は、ＡＩＦの非存在が、どのように呼吸異常を誘発し得るかを説明する。ＡＩＦのノックダウン、ノックアウト又は形質発現作用の低い突然変異は識別不能に、ＭＩＡ４０タンパク質の低下した安定性に連関した、転写後レベルでのＭＩＡ４０タンパク質レベルの低下をもたらした。本発明者らは、ＡＩＦは、ＭＩＡ４０のＮ末端との相互作用、これによるＭＩＡ４０の安定化（これは、ちょうど他のミトコンドリア移入タンパク質と同じように、それと同場所に存在する場合にのみおそらく安定である）を通してＭＩＡ４０のミトコンドリアへの局在を確実とすると提唱する。ＭＩＡ４０の低下したレベルは、続いて、主に呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶによって構成されるミトコンドリア超複合体のタンパク質サブユニットの正しい移入及び／又は選別を妨害する。その後、低下した呼吸活性は、ミトコンドリア代謝及び細胞代謝に影響を及ぼして、細胞がアポトーシス（空洞化に関連した細胞死を含む）を受ける傾向を低下させる。逆に、ＭＩＡ４０レベルの回復は、ＡＩＦ欠損症によって駆動された代謝変化及び表現型変化を元に戻す。要するに、これらの観察は、ミトコンドリア機能と細胞死調節の間の新規な連関を確立する。
【０１１１】
本発明者らは、ＭＩＡ４０に融合させたＭＬＳを含むポリペプチドが、ＡＩＦの必要性を迂回し、正常な呼吸機能を回復させることを示した。
【０１１２】
実施例２  −  ＭＩＡ４０遺伝子の多型は、ＡＩＦとの相互作用を破壊する
ＡＩＦとのその相互作用に必要とされるＭＩＡ４０アイソフォーム１（残基１〜２７）の最小セグメントの境界を定めた後、本発明者らは、公共データベースにおいて、ＭＩＡ４０の同じ領域に標的化する多型を発見した。同定された多型は、８位のアミノ酸グリシンをトリプトファンに変換させる（Ｇ８Ｗ）。
【０１１３】
ＭＩＡ４０／ＡＩＦ複合体形成に対するＧ８Ｗ多型の影響は、ＭＩＡ４０アイソフォーム１の突然変異体を有する組換えプラスミドを構築することによって確認された。プルダウン実験は、完全長ｗｔ ＭＩＡ４０と比較して、Ｇ８Ｗ多型を有する変異体は、ＡＩＦとの低下した相互作用能を示したことを明らかとした（図９）。完全長タンパク質と同じ効力でＡＩＦに通常結合する切断短縮形のＭＩＡ４０（ＭＩＡ４０ １−５７）に突然変異が導入された場合に同じ観察がなされた（図９）。さらに、組換えＨＡタグ化ＭＩＡ４０アイソフォーム１（Ｇ８Ｗ）変異体をヒト骨肉腫由来細胞株（Ｕ２ＯＳ）において過剰発現させ、内因性ＡＩＦタンパク質とのその相互作用能について確認した。図９に示されているように、野生型形のＭＩＡ４０と再度比較して、変異体ＭＩＡ４０（Ｇ８Ｗ）は、内因性ＡＩＦと共免疫沈降する低下した能力を示した（図１０）。本発明者らは、Ｇ８Ｗ多型がＡＩＦに結合するＭＩＡ４０の能力を阻害すると結論する。
【０１１４】
実施例３  −  ＡＩＦとＭＩＡ４０の相互作用はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性である
ミトコンドリアに移入された後、成熟ＡＩＦタンパク質は、膜間腔に直面する内膜に挿入され、その捕因子ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）の取り込みを通してその最終的にフォールディングされた立体配置をとる（Susin et al., 1999）。結晶構造分析（Ye et al.,2002; Mate et al., 2002）は、フラボタンパク質ＡＩＦが、細菌ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性酸化還元酵素と同じようにフォールディングされていることを明らかとした。ＡＩＦは、非哺乳動物ＡＩＦオルソログで保存されている２つのＦＡＤ結合セグメント（残基１２８〜２６２及び４１０〜４８０）及びＮＡＤＨ結合セグメント（残基２６３〜４００）を含む（Modjtahedi et al., 2006; Hangen et al. 2010a）。ＮＡＤＨとの相互作用時に、ＡＩＦは顕著なコンフォメーション変化を受けるので、ＡＩＦ／ＮＡＤＨ複合体の形成は、重要なシグナル伝達機能を果たすに違いないと提唱されている（Sevrioukova et al., 2009）。
【０１１５】
ＡＩＦとそのミトコンドリア対であるＭＩＡ４０との物理的相互作用の特徴付けを遂行するために、ＡＩＦがＭＩＡ４０と相互作用する能力に対する、ＮＡＤＨ及び他のピリジンヌクレオチド（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨ）の影響を確認した。プルダウン実験は、組換えＡＩＦタンパク質と完全長ＭＩＡ４０タンパク質との、並びにそのＮ末端２７アミノ酸を含む切断短縮形のＭＩＡ４０との直接的な相互作用が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの存在下で顕著に増強されることを明らかとした（図１１Ａ及び１１Ｂ）。この結果は、その捕因子との相互作用は、ＭＩＡ４０との相互作用に必要とされる最適なコンフォメーションをＡＩＦがとることを可能とすることを示す。
【０１１６】
実施例４  −  呼吸鎖複合体ＣＩサブユニットに対するＭＩＡ４０ノックアウトの影響
細胞株における小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてのＭＩＡ４０のノックダウン、又は形質発現作用の低いＡｉｆｈｑ／ｙを有するマウス器官におけるそのダウンレギュレーションにより、いくつかの呼吸鎖タンパク質、特に複合体Ｉ及びＩＶのサブユニットのタンパク質発現レベルが低下した。嚢胚形成時に死滅するＭＩＡ４０−／−ノックアウトマウス胚における呼吸鎖タンパク質レベルを確認した（図１２Ａ〜Ｃ）。ヘテロ接合型マウスの交雑は、生誕時に生存可能な出生児の中からＭＩＡ４０−／−の仔を全く生じなかった。ＭＩＡ４０−／−胚の死滅時期は、ほぼ常にＥ５．５−６のステージ近辺であった。個々の突然変異体ＭＩＡ４０−／−胚から調製された抽出物のウェスタンブロット分析（図１２Ｄ）は、突然変異胚におけるＭＩＡ４０の枯渇が、複合体Ｉ及びＩＩＩのサブユニットのタンパク質発現レベルの低下をもたらしたことを示す（図１２Ｄ）。この観察は、初期胚形成中に、ＭＩＡ４０が、ミトコンドリアエネルギーの調節において重要な役割を果たすことを示す。
【０１１７】
実施例５  −  ミトコンドリアに標的化された突然変異体ＭＩＡ４０によるＡＩＦ異常の表現型回復
ＡＩＦ枯渇細胞におけるＭＩＡ４０の発現を、ＭＩＡ４０のミトコンドリアへの移入経路を改変し、ＭＩＡ４０のＮ末端に融合したＡＩＦ（Otera et al., 2005）由来の適切なミトコンドリア移行配列（ＭＬＳ）を用いて内膜へのその付着を強制することによって回復させた。この改変された膜結合ＭＩＡ４０タンパク質（ＭＭ）の安定な過剰発現は、ＡＩＦがノックダウンされた細胞においてＣ−Ｉ−２０の発現を回復させた（前の文書で示されている）。ここで、図１３において、ＭＭ（ｗｔＭＭ）と比較して、ＭＩＡ４０の全ての機能的システイン（Chacinska et al., 2004, Hofmann S.et al;, 2005）がセリンによって置換された突然変異ＭＭタンパク質（ｍｕｔ ｃｙｓＭＭ）は、ＡＩＦのノックダウンされた細胞において呼吸鎖複合体ＣＩ及びＣＩＶタンパク質の発現レベルを回復することはもはやできないことが示される（図１３）。この結果は、観察された修正の調節におけるＭＩＡ４０システインというモチーフの重要性を指摘する。
【０１１８】
参考文献
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
【表１】
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2016507522.tif 000003
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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