(57)【要約】  本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む脳神経細胞のアポトーシス抑制用組成物、健康機能食品及びアポトーシス抑制方法に関する。本発明によると、ＰＤＥ５阻害剤は、脳神経細胞のアポトーシスを抑制することにより、神経細胞保護作用を示す。したがって、本発明は、脳神経疾患の予防、改善及び治療に有用に利用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤の薬剤学的有効量と、
（ｉｉ）薬剤学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする脳神経細胞のアポトーシス抑制用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ウデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、ダサンタフィル（ｄａｓａｎｔａｆｉｌ）、アバナフィル（ａｖａｎａｆｉｌ）、これらの薬剤学的に許容される塩、溶媒和物、及び水和物からなる群から選択される請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記薬剤学的に許容される塩が、ミロデナフィル塩酸塩、シルデナフィルクエン酸塩又はバルデナフィル塩酸塩である請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記組成物が、脳神経疾患の予防又は治療のためのものである請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記脳神経疾患が、神経変性疾患、虚血性脳卒中、認知機能障害及び運動機能障害からなる群から選択された疾患である請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記神経変性疾患が、痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される神経性疾患である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記認知機能障害が、記憶力減退、学習障害、失認症、健忘症、失語症、失行症又は譫妄である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記運動機能障害が、運動障害（ｍｏｔｏｒ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）、麻痺、運動失調（ａｔａｘｉａ）、ジスキネジア（ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）又は筋失調症（ｄｙｓｔｏｎｉａ）である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記神経細胞のアポトーシスが、外傷性脳損傷により引き起こされた請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、脳組織において変性ニューロン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎ）の形成を抑制するか、又は神経細胞においてｃａｓｐａｓｅ−３又はＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の発現を抑制する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、ヒトに経口投与されるか、あるいは頭部以外の部位に非経口投与される請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１２】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤の経口投与時、前記組成物が、フィルム剤形である請求項１１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
（ｉ）ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤と、
（ｉｉ）食品学的に許容される食品補助添加剤と、
を含むことを特徴とする脳神経細胞のアポトーシス抑制用健康機能食品。
【請求項１４】
ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む組成物を有効量として、これを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する工程を含むことを特徴とする脳神経細胞のアポトーシスを抑制する方法。
【請求項１５】
前記対象が、脳神経疾患患者である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記脳神経疾患が、神経変性疾患、虚血性脳卒中、認知機能障害及び運動機能障害からなる群から選択された疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経変性疾患が、痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される神経性疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記認知機能障害が、記憶力減退、学習障害、失認症、健忘症、失語症、失行症又は譫妄である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記運動機能障害が、運動障害（ｍｏｔｏｒ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）、麻痺、運動失調（ａｔａｘｉａ）、ジスキネジア（ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）又は筋失調症（ｄｙｓｔｏｎｉａ）である請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経細胞のアポトーシスが、外傷性脳損傷により引き起こされた請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、脳組織において変性ニューロン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎ）の形成を抑制するか、又は神経細胞においてｃａｓｐａｓｅ−３又はＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の発現を抑制する請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物は、ヒトに経口投与されるか、あるいは頭部以外の部位に非経口投与される請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物の経口投与時、前記組成物が、フィルム剤形である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む脳神経細胞のアポトーシス抑制用組成物、健康機能食品及びアポトーシス抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ，ＰＥＤ）は、細胞において、サイクリックＡＭＰ及び／又はサイクリックＧＭＰをそれぞれ５−ＡＭＰ及び５−ＧＭＰに加水分解させることを触媒する酵素であって、これにより、これらは、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰに基づく細胞性調節に重要である。ＰＤＥは、今まで計１１種が知られている（非特許文献１）。前記ＰＤＥの中で、ＰＤＥ５は、ｃＧＭＰを分解して５’−ＧＭＰを生成する酵素であるため、これを阻害すると、ｃＧＭＰの濃度を維持し、勃起が持続されると報告された（非特許文献２）。
【０００３】
バイアグラＴＭ（一般名：シルデナフィル；特許文献１）が米国ＦＤＡによって最初の男性用勃起不全治療剤として承認されて、またシアリスＴＭ（一般名：タダラフィル；特許文献２）及びレビトラＴＭ（一般名：バルデナフィル；非特許文献３）が許可された。ＰＤＥ５阻害剤として、エムビックスＴＭ（一般名：ミロデナフィル；ＫＲ０３５８０８３）も知られている。前記薬剤は、優れた治療効果を示し、患者の約７０％において性機能を改善すると知られている。ＰＤＥ５阻害剤の他の医薬用途として、門脈性高血圧、肝−腎臓症候群、肝−肺症候群に対する治療効果が知られており（特許文献３）、哺乳動物の生殖能力を改善させる効果も報告された（特許文献４）。
【０００４】
また、ＰＤＥ５阻害剤であるシルデナフィル及びバルデナフィルが慢性Ｂリンパ球性白血病細胞（Ｂ−ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ）のｃａｓｐａｓｅ−依存的アポトーシスを誘導するということが報告された（非特許文献４）。
【０００５】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／２８９０２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９５／１９９７８号パンフレット
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１２−００２４８０７号
【特許文献４】韓国公開特許第１０−２００２−００３１０６２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，６７４−６８２（２００２）
【非特許文献２】Ｂｏｏｌｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，７８，２５７−２６１（１９９６）
【非特許文献３】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ
【非特許文献４】Ｍａｒｉｋａ  Ｓａｒｆａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．１（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＰＤＥ５阻害剤に対する研究を続け、ＰＤＥ５阻害剤が脳神経細胞では却ってアポトーシスを抑制することを見出した。具体的に、脳損傷により神経細胞のアポトーシスが誘発された動物モデルにＰＤＥ５阻害剤を投与した結果、脳神経細胞のアポトーシスが著しく抑制され、神経細胞のアポトーシス抑制による神経細胞の保護効果によって、動物モデルの認知及び運動機能の低下が改善されることを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、脳神経細胞のアポトーシス抑制用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、脳神経細胞のアポトーシス抑制用健康機能食品を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、脳神経細胞のアポトーシス抑制方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の特徴及び利点を要約すると、下記の通りである：
（ｉ）本発明は、ＰＤＥ５阻害剤を含む脳神経細胞のアポトーシス抑制用組成物、健康機能食品及びアポトーシス抑制方法を提供する。
（ｉｉ）本発明によると、ＰＤＥ５阻害剤は、脳神経細胞のアポトーシスを抑制することにより、神経細胞保護作用を示す。
（ｉｉｉ）本発明の組成物は、脳神経細胞のアポトーシス抑制を通じて、脳神経疾患を予防、改善及び治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ミロデナフィルの神経細胞保護効果（脳萎縮性、変性ニューロン、Ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ）を示す組織病理学的写真である。  Ａ：Ｓｈａｍ対照群  Ｂ：神経細胞アポトーシス対照群  Ｃ：ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群  Ｄ：ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇ投与群  Ｅ：ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群  スケールバー＝１００μｍ  矢印は、中大脳動脈近位部を示す。
【図２】図２は、ミロデナフィル処理による動物モデルの体重変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ミロデナフィルの神経細胞保護効果（脳萎縮性、変性ニューロン、Ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ）を示す脳切片の組織病理学的写真である。  Ａ：Ｓｈａｍ対照群  Ｂ：神経細胞アポトーシス対照群  Ｃ：施術後２４時間からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群  Ｄ：施術後７２時間からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群  Ｅ：施術後１６８時間からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群  スケールバー＝１００μｍ  矢印は、神経細胞アポトーシス施術（大脳損傷）の同側面を示す。
【図４】図４は、ミロデナフィル処理時期による動物モデルの体重変化を示すグラフである。
【図５】図５は、ミロデナフィル処理時期による前肢配置検数の変化を示すグラフである。  ＬＳＤテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ａｐ＜０．０１  ＬＳＤテストによる神経細胞アポトーシス対照群と比較し、ｂｐ＜０．０１  ＭＷテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ｃｐ＜０．０１
【図６】図６は、ミロデナフィル処理時期による後肢配置検数の変化を示すグラフである。  ＬＳＤテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ａｐ＜０．０１及びｂｐ＜０．０５  ＬＳＤテストによる神経細胞アポトーシス対照群と比較し、ｃｐ＜０．０１  ＭＷテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ｄｐ＜０．０１
【図７】図７は、ミロデナフィル処理時期によるボディースイングの変化を示す。値は、８匹ラットのｍｅａｎ±ＳＤで表現した。  ＬＳＤテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ａｐ＜０．０１  ＬＳＤテストによる神経細胞アポトーシス対照群と比較し、ｂｐ＜０．０１
【図８】図８は、ミロデナフィル処理時期による認知的運動行動（水迷路検査）の変化を示すグラフである。値は、８匹ラットのｍｅａｎ±ＳＤで表現した。  ＬＳＤテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ａｐ＜０．０１及びｂｐ＜０．０５  ＬＳＤテストによる神経細胞アポトーシス対照群と比較し、ｃｐ＜０．０１、ｄｐ＜０．０５  ＬＳＤテストによるｓｈａｍ対照群と比較し、ｅｐ＜０．０１  ＬＳＤテストによる神経細胞アポトーシス対照群と比較し、ｆｐ＜０．０１及びｇｐ＜０．０５
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、（ｉ）ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤の薬剤学的有効量と、（ｉｉ）薬剤学的に許容される担体と、を含む、脳神経細胞のアポトーシス抑制用薬剤学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の一様態によると、本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む組成物を有効量として、これを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する工程を含む、脳神経細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供する。
【００１７】
本発明のまた他の一様態によると、本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む組成物を有効量として、これを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する工程を含む、認知機能障害又は運動機能障害を改善させる方法を提供する。
【００１８】
本発明者らは、ＰＤＥ５阻害剤に対する研究を続け、ＰＤＥ５阻害剤が脳神経細胞では却ってアポトーシスを抑制することを見出した。具体的に、脳損傷により神経細胞のアポトーシスが誘発された動物モデルにＰＤＥ５阻害剤を投与した結果、脳神経細胞のアポトーシスが著しく抑制され、神経細胞のアポトーシス抑制による神経細胞の保護効果によって、動物モデルの認知及び運動機能の低下が改善されることを確認した。
【００１９】
本明細書において、用語‘ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤’又は‘ＰＤＥ５阻害剤’は、ＰＤＥ５の触媒作用を選択的に又は非選択的に抑制又は減少できる物質を意味する。前記ＰＤＥ５阻害剤は、化合物、ペプチド、小分子、抗体又はこれの断片、及び天然抽出物を含む。
【００２０】
一つの特定例において、前記ＰＤＥ５阻害剤は、化合物である。
【００２１】
本発明の一具現例によると、前記ＰＤＥ５阻害剤は、ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ウデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、ダサンタフィル（ｄａｓａｎｔａｆｉｌ）、アバナフィル（ａｖａｎａｆｉｌ）、これらの薬剤学的に許容される塩、溶媒和物、及び水和物からなる群から選択される。
【００２２】
一つの特定例において、前記ＰＤＥ５阻害剤は、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル又はこれらの薬剤学的に許容される塩である。
【００２３】
前記薬剤学的に許容される塩は、化合物が投与される有機体に深刻な刺激を誘発せず、化合物の生物学的活性と物性を損傷しない、化合物の剤形を意味する。前記薬剤学的に許容される塩は、薬剤学的に許容可能な、実質的に非毒性の有機酸及び無機酸を利用する当業界によく知られた通常の方法で製造される。前記酸は、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、アセト酸、トリクロロアセト酸、トリフルオロアセト酸、カプリン酸、イソブタン酸、マロン酸、コハク酸、フタル酸、グルコン酸、ベンゾ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機酸を含む。また、本発明の化合物を塩基と反応させて、アンモニウム塩；ナトリウム又はカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム又はマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などの塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどの有機塩基の塩；及びアルギニン、リシンなどのアミノ酸塩を形成することもできる。
【００２４】
本発明の一具現例によると、前記薬剤学的に許容される塩は、ミロデナフィル塩酸塩、シルデナフィルクエン酸塩又はバルデナフィル塩酸塩である。
【００２５】
前記水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）は、非共有的分子間力（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｃｅ）により結合された化学量論的（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）又は非化学量論的（ｎｏｎ−ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量の水を含んでいる本発明の化合物又はそれの塩を意味する。
【００２６】
前記溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅ）は、非供給的分子間力により結合された化学量論的又は非化学量論的量の溶媒を含んでいる本発明の化合物又はそれの塩を意味する。それに関する好ましい溶媒としては、揮発性、非毒性及び／又はヒトに投与するのに適した溶媒である。
【００２７】
下記実施例で証明されたように、前記ＰＤＥ５阻害剤を有効成分として含む本発明の組成物は、脳神経細胞のアポトーシスを抑制し、神経細胞を保護する。本明細書において、用語‘神経細胞’は、中枢神経系、脳、脳幹、脊髄、中枢神経系と末梢神経系の接合部分などの構造をなすニューロン、神経支持細胞、シュワン細胞などを含む。本明細書において、用語‘神経細胞の保護’は、神経性侵襲（ｎｅｒｖｏｕｓ  ｉｎｓｕｌｔ）を軽減又は改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）する作用、又は神経性侵襲による神経細胞のアポトーシスを軽減又は抑制する作用、又は神経性侵襲により損傷を受けた細胞の保護又は回復させる作用を意味する。また、本明細書における用語‘神経性侵襲’は、様々な原因（例えば、外傷性脳損傷のような外部要因、遺伝的原因、代謝性原因、毒性原因、神経毒性原因、生理的原因及び生化学的原因など）により招来される神経細胞又は神経組織の損傷を意味する。
【００２８】
本発明の一具現例によると、前記組成物は、脳神経疾患の予防又は治療に適用できる。本明細書における用語‘予防’は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において脳神経疾患の可能性／危険を減少させるか、対象において脳神経疾患の発生を遅延させるか、又はこれらの組み合わせを意味する。本明細書における用語‘治療’は、対象で発生した脳神経疾患の発展を抑制させるか、対象で発生した脳神経疾患の症状を減少（緩和）させるか、対象で発生した脳神経疾患を除去するか、又はこれらの組み合わせを意味する。本明細書における用語‘改善’は、用語‘治療’と同一な意味として使用される。本発明の薬剤学的組成物で予防又は治療される‘対象’は、ヒト又はヒト以外の動物を意味し、好ましくは、ヒトを意味する。
【００２９】
本発明の一具現例によると、前記脳神経疾患は、神経変性疾患、虚血性脳卒中、認知機能障害及び運動機能障害からなる群から選択された疾患である。
【００３０】
本発明の組成物により予防又は治療される前記神経変性疾患は、痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症を含む。前記痴呆は、ＡＩＤＳ誘発痴呆、レビー小体痴呆、前頭側頭葉性痴呆、多発性梗塞性痴呆、意味痴呆、アルツハイマー性痴呆及び血管性痴呆を含む。
【００３１】
本発明の組成物により予防又は治療される前記認知機能障害は、記憶力減退、学習障害、失認症、健忘症、失語症、失行症又は譫妄を含む。
【００３２】
本発明の組成物により予防又は治療される前記運動機能障害は、運動障害（ｍｏｔｏｒ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）、麻痺、運動失調（ａｔａｘｉａ）、ジスキネジア（ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）又は筋失調症（ｄｙｓｔｏｎｉａ）を含む。前記運動障害は、一般に身体の髄意的運動、例えば、四肢、胴体、首、顔、顔面、舌などを動かす運動が自分の意思でよくできない状態を意味する。前記麻痺は、神経や筋肉が形態の変化無しに機能を失ってしまう状態であって、感覚がなくなるか、動けない状態を意味する。このような麻痺は、症状によって、動けない状態を主症状とする運動麻痺と、感覚がなくなってしまう感覚麻痺とに大別されて、単麻痺、片麻痺、対麻痺及び四肢麻痺を含む。
【００３３】
前記運動失調は、筋力が正常的に維持されているにもかかわらず、運動に関与する筋群の相互協調がうまくいかないため、目的とする運動を円滑にできなくなる状態を意味する。前記ジスキネジア（ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）は、髄意的な動きが減少されて、不髄意的な動き（チック障害や舞踏病）が現れる現象を意味する。前記痙縮は、伸張反射の過興奮による筋肉伸張速度に比例して増加する筋肉緊張を意味する。ここで伸張反射とは、骨格筋を持続的に伸張する時、その伸張に抵抗するように、伸張された筋肉に反射的に収縮が起こり、緊張が高調する現象を意味する。前記筋失調症は、持続的な筋肉収縮によって身体の一部がねじれたり、反復的な運動や非正常的な姿勢を示すなどの症状を総称する意味である。
【００３４】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、外傷性脳損傷によって引き起こされた脳神経細胞のアポトーシスを抑制することができる。したがって、本発明の組成物は、外傷性脳損傷による神経細胞のアポトーシスにより引き起こされる神経学的及び認知的運動行動障害を改善するに利用できる。
【００３５】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物に含まれるホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤は、（ｉ）脳組織において変性ニューロンの形成を抑制するか、又は（ｉｉ）神経細胞においてｃａｓｐａｓｅ−３又はＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の発現を抑制する。
【００３６】
本発明の一具現例によると、前記ＰＤＥ５阻害剤は、脳神経細胞のアポトーシスの抑制が必要な対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に０．５〜２ｍｇ／ｋｇの容量で投与できる（実施例１参照）。このような投与は、一日１回行うことができる。
【００３７】
一つの特定例において、前記ＰＤＥ５阻害剤は、対象に１〜２ｍｇ／ｋｇの容量で投与できる。
【００３８】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、脳神経細胞のアポトーシス誘発２４〜７２時間後から対象に投与できる。
【００３９】
本発明の他の一具現例によると、本発明の組成物の最初投与時期は、脳神経細胞のアポトーシス誘発後２４〜１６８時間である。一つの特定例において、本発明の組成物の最初投与時期は、脳神経細胞のアポトーシス誘発後２４〜７２時間である。
【００４０】
上記のように投与する場合、下記実施例２に示されたように、最適の神経細胞保護効果が得られる。このような投与は、一日１回施される。
【００４１】
本発明の一具現例によると、前記脳神経細胞のアポトーシス誘発は、脳損傷（例えば、虚血性脳損傷）によって引き起こされる。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与できる。
【００４３】
本発明の一具現例によると、本発明の薬剤学的組成物は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に経口投与されるか、あるいは頭部以外の部位に非経口投与される。即ち、本発明の組成物は、脳組織、脳組織を包んでいる身体組織（例えば、頭皮）及びこれに隣接した部位に直接投与されない場合も、本発明で意図した効果を示すことができる。一つの特定例において、前記非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、腹腔注入、経皮投与又は筋肉内投与であり、他の特定例では、皮下投与、静脈内投与又は筋肉内投与である。これと関連し、脳血管障壁（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）は、全身血液循環から脳を隔離させる中枢神経系（ＣＮＳ）の唯一の構造である。ＢＢＢは、血液内で循環する種々の物質（色素、薬物、トキシン）が脳に接近することを防止し、脳を効果的に保護するが、一方では、脳疾患の薬理学的治療において主要障害になる。しかし、下記実施例で立証されたように、ＰＤＥ５阻害剤を対象に背部皮下注射した後、大脳組織に対する組織病理学的評価を実施した結果、ＰＤＥ５阻害剤投与による大脳萎縮の減少、変性ニューロンの減少、アポトーシスマーカーであるｃａｐａｓｅ−３発現抑制及びＰＡＲＰ発現抑制を確認した。このような結果は、脳部位に直接投与されなかったＰＤＥ５阻害剤が脳細胞又は組織に直接的な薬理効果を示し、即ち、ＢＢＢを通過して脳に直接的な薬理作用を示すと思われる。このような結果は、一般に、薬物がＢＢＢを通過することが難しいという点及びこれによって脳組織で直接的な薬理効果を示すことが難しいという当業界に周知の事実からみて、驚くべき結果である。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、又は多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、フィルム又はカプセル剤形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００４６】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が経口投与される場合、本発明の組成物は、フィルム剤形を有することができる。本発明において、前記フィルムは、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）、口腔溶解フィルム（ｏｒａｌｌｙ  ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ  ｆｉｌｍ）、口腔崩壊フィルム（ｏｒａｌｌｙ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｆｉｌｍ）などと命名されて、舌上、口腔粘膜、舌下など、口腔内に貼って溶かして服用する剤形を意味する。このようなフィルム剤形は、水無しに服用可能であるという長所がある。
【００４７】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ｉ）ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤と、（ｉｉ）食品学的に許容される食品補助添加剤と、を含む、脳神経細胞のアポトーシス抑制用健康機能食品を提供する。
【００４８】
本発明の健康機能食品は、上述のＰＤＥ５阻害剤を含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【００４９】
本発明の健康機能食品は、特に制限はなく、健康機能性食品、栄養補助剤、栄養剤、ファーマフーズ（ｐｈａｒｍａｆｏｏｄ）、健康食品、ニュートラシューティカル（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）、デザイナフード、食品添加剤などのあらゆる形態の食品が含まれるが、好ましくは、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を始めとした酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが含まれる。
【００５０】
本発明の健康機能食品は、有効成分としてＰＤＥ５阻害剤だけではなく、食品製造時に通常的に添加される成分を含むが、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述の炭水化物の例は、単糖類（例えば、ブドウ糖、果糖など）、二糖類（マルトース、スクロース、オリゴ糖など）、及び多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）のような通常的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤［ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）］及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。
【００５１】
上記の他に、本発明の食品は、様々な栄養剤、ビタミン類、鉱物（電解質）、食餌成分、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレート）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。食品に対する容易な接近性を考慮すると、本発明の食品は、脳神経細胞のアポトーシス抑制、及び脳神経疾患の予防及び治療に非常に有用である。
【００５２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００５３】
実施例１．ＰＤＥ５阻害剤のニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）保護効果
実験材料及び実験方法
１．実験動物の準備
６週齢の１００匹の健康な雄性スプラーグドーリーラット（体重１８０〜２００ｇ；ＳＬＣ，日本）を１００日間環境に適応させた後、実験に使用した。２０〜２５℃の温度及び５０〜５５％の湿度でケージ当り５匹のラットを飼育した。暗周期は、１２ｈｒ：１２ｈｒにして、水と餌（標準げっ歯類餌、サンヤン、韓国）は、自由に摂取するようにした。全ての動物は、実験動物資源機関、生命科学委員会、米国国立研究会議（１９９６）に基づいたデグ漢医大学校の実験動物の飼育及び使用指針にしたがって扱った。具体的な実験グループは、下記の通りである。
【００５４】
【表１】
2016502561.tif 000003
【００５５】
２．試験物質の準備及び投与
ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ  ２ＨＣｌ；ＳＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ，韓国）を実験に使用した。ミロデナフィルは、白色パウダーであって、食塩水によく溶解される。ミロデナフィルを光と湿気から保護するために、４℃の冷蔵庫に保管した。ミロデナフィルを生理食塩水に０．５、１及び２ｍｇ／ｍｌとして溶解させた後、施術２４時間後から２８日間、一日１回ラットの背部皮膚にｋｇ当り１ｍｌの容量で皮下投与した。各対照群には、ミロデナフィルの代わりに同量の食塩水を投与した。
【００５６】
３．神経細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）動物モデルの製造
下記の方法で実験動物の大脳右半球に損傷を加えて、神経細胞のアポトーシスを誘導した。具体的に、７０％Ｎ２Ｏと２８．５％Ｏ２ガスに２％又は３％イソフルランを混合した麻酔ガスで全身麻酔を施した後、手術台に固定し、眼窩と外耳道との間に右側頭部皮膚を横に切開して側頭筋を露出させた後、顔面神経と眼窩骨に損傷がないように切除し、側頭骨の一部を露出させた。その後、歯科用ドリルを利用した側頭下切除術（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ）を通じて、近位部中大脳動脈（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ＭＣＡ）を露出させた。その後、嗅索付近で大脳静脈直下でマイクロバイポーラ凝固法（ｍｉｃｒｏｂｉｐｏｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を実施し、近位部中大脳動脈を永久的に閉鎖した。吸入全身麻酔後、直腸温度計と熱パッドを利用して体温を一定に維持し、全体的な死亡率は、５％以下として観察された。Ｓｈａｍ対照群は、上記と同一な方法で近位部中大脳動脈を露出させた後、マイクロバイポーラ凝固法を実施せず、創腔を閉鎖した。
【００５７】
４．免疫組織化学的評価
大脳パラフィン片（ｓｅｃｔｉｏｎ）の脱パラフィン後、文献Ｓｈｉ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４１：１５９９−６０４（１９９３）に開示の方法にしたがって、シトレートバッファー抗原（ｅｐｉｔｏｐｅ）回収前処理を行った。簡略に説明すると、１０ｍＭシトレートバッファー（ｐＨ６．０）を含有する染色皿の浸された水槽を９５〜１００℃に予熱して、スライドを染色皿に浸し、皿上に蓋を緩くのせた後、２０分間インキュベーションし、染色皿を常温に放置してスライドを２０分間冷やした。エピトープ回収後、各部分を下記工程にしたがって免疫染色した：
各部分をメタノール及び０．３％Ｈ２Ｏ２と共に３０分間常温でインキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄（ｐＨ７．２）；
恒湿チャンバーで各部分を正常馬血清遮断剤（（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．  Ｉｎｃ．、米国；希釈１：１００）と共に常温で１時間インキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄；
恒湿チャンバーで各部分を１次抗−血清  （Ａｎｔｉ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３（Ａｓｐ１７５）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，希釈１：４００；Ａｎｔｉ−ｃｌｅａｖｅｄ  ＰＡＲＰ（Ａｓｐ２１４）ｒａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，希釈１：１００）と共に４℃で一晩中インキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄；
恒湿チャンバーで各部分をビオチン化ユニバーサル２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．米国；希釈１：５０）と共に常温で１時間インキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄；
恒湿チャンバーで各部分をＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．希釈１：５０）と共に常温で１時間インキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄；
各部分をペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．）で常温で５分間インキュベーションし、３分間０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄；
Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン溶液で対比染色後、流水で３０分間洗浄；
９５％エタノールで２分間、１００％エタノールで３分間脱水後、キシレンで２回透明化作業；及び
永久封入剤（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）でカバースリップ後、光学顕微鏡で観察（ニコン、日本）。
【００５８】
組織形態計測：Ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に対して１０％以上の免疫反応性で満たされた神経細胞を免疫反応性として見なした。同側性損傷周辺部位大脳皮質のｍｍ２中に存在するＣａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応性細胞の数をイメージ分析プログラムを使用して測定した。
【００５９】
５．組織病理学的評価
前記神経細胞アポトーシス処置２９日後にラットを犠牲させた。脳を除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、脳ステンレススチール頭部マトリックス（ｂｒａｉｎ  ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｃｏｒｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ；Ｈａｒｖａｒｄ，米国）を利用して、前頭極（ｆｒｏｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｐｏｌｅ）から２〜１４ｍｍ範囲で連続的な６個の冠状断面（２ｍｍ厚）に分けた。ステンレススチール頭部マトリックスを利用して製造された脳部分を１０％ＮＢＦに固定させた（ＴＴＣ染色せず）。その後、大脳皮質の組織病理学的検査のために、Ｈ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色を行った。Ｈ＆Ｅ染色下、組織形態計測（Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）を通じて、大脳皮質の萎縮性％（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｔｒｏｐｈｉｃ％）及び変性ニューロン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ；好酸球と見える）の数を計算した。分析のために、組織病理学者らにグループの偏在に対する情報を提供しなかった。
【００６０】
組織形態計測：製造した組織染色標本の正常の対側性（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）半球と比較し、同側性（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）大脳皮質の萎縮％を下記数学式１によって計算した。また、単位面積当たり（ｍｍ２）変性ニューロンの数を測定した。
【００６１】
［数学式１］
脳萎縮形成＝（対側性大脳皮質の面積−同側性大脳皮質の面積）／対側性大脳皮質の面積×１００
【００６２】
６．体重測定
神経細胞のアポトーシス誘発の一日前、誘発当日及び誘発後１、７、１４、２１、２８及び２９日に体重を測定した。各動物間の差を減らすために、誘発後体重増加量と連続的な試験物質の投与を、下記数学式２によって計算した。
【００６３】
［数学式２］
神経細胞のアポトーシス誘発後２９日間の体重増加量＝（神経細胞のアポトーシス誘発２９日後の体重−神経細胞のアポトーシス誘発後各日の体重）
【００６４】
７．感覚運動機能評価（ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）−神経学的運動行動検査
感覚運動機能を四肢配置検査（（ｌｉｍｂ  ｐｌａｃｉｎｇ  ｔｅｓｔ；ｄｅ  Ｒｙｃｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２０：１３８３−９０（１９８９））及びボディースイング検査（ｂｏｄｙ  ｓｗｉｎｇ；Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｂｅｒｇ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：５３７２−８（１９９５））によって評価した。基準を得るために、検査を神経細胞のアポトーシス誘発の一日前に行った後、誘発後、１、３、７、１４、２１及び２８日目に行った。行動検査は、薬物投与前に完了した。評価を担当する調査官には、実験物質処理に対する情報を提供しなかった。
【００６５】
四肢配置検査：前肢及び後肢配置を独立的に評価した。前肢配置検査のために、ラットの前足を自由にしつつ、胴体をつかんで徐々にテーブル上端の縁に移動させて、ラットの髭の短いタッチを止めて（視覚誘導された配置のため）、ラット髭をタッチして（髭誘導された配置のため）、前記テーブル上端の縁まで前足に光を照らし（触覚誘導された配置のため）、増加された圧力でテーブルの縁に前足を押した（固有受容性誘導された配置のため）。後肢配置も同様に前記方法にしたがって評価した。視覚、髭、触覚及び固有受容性刺激に対する各四肢の反応を、下記基準にしたがって点数化した（前肢テストで計１２点及び後肢テストで６点は、最大神経欠損を意味し、０点は、正常行動を意味する）：
正常行動＝０点；
一足でした行動（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｍｂ）＝１点；
遅延（２秒）及び／又は不完全行動＝２点；
行動無し＝３点。
【００６６】
ボディースイング検査：尻尾端から約２ｃｍ位置で実験動物をつかみ、テーブル表面の上に１インチずつ増加させた。ラットが頭を垂直軸から１０°以上動いた後、再び垂直姿勢に戻る度に回転（ｓｗｉｎｇ）を記録した。動物当り計３０回の回転をカウントした。右半球に神経細胞のアポトーシスを誘発させた後、実験動物は、反対側脳（左側）側に回転する傾向があるため、回復率測定で右側への回転数及びパーセントを、正常動物の点数記録と共に記録した。
【００６７】
８．認知的運動行動評価（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）
認知検査のために、水迷路検査（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１：４７−６０（１９８４））を行った。神経細胞のアポトーシス誘発１４日及び２８日後、２２．０±１．０℃温度の水が満たされた暗い色相のタンク（直径１５０ｃｍ×高さ５０ｃｍ）で１０分間隔で３回実施した。１５×３０ｃｍ水中プラットフォーム（水表面から２ｍｍ下）を水槽の北西側四分面（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ｑｕａｄｒａｎｔ）に配置した。リリースポイント（ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｏｉｎｔ）は、常に水槽の南側にした。実験動物を水槽の壁を向き合うようにしながら入水させた後、リリースした。各実施例における実験動物の水泳経路をカメラトラッキングシステム（Ｓｍａｒｔ  ｊｕｎｉｏｒ，ＰａｎＬａｂ，スペイン）を使用して記録し、回避プラットフォーム（ｅｓｃａｐｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）に到達するまで移動した距離（ｍ）及び時間（秒）を計算した。
【００６８】
９．統計分析
全てのデータは、１０匹ラットのｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｄ．）で表現した。服用量の異なるグループのための多重比較検査を行った。変異均質性（Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ（Ｌｅｖｅｎｅ  Ａ，Ｃｌｉｎ  Ｏｔａｌａｒｙ，１９８１；６：１４５−５１）を使用して調査した。Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ結果が変異均質性から有意性のない偏差が導出された場合、グループ比較のどのグループ対が相当相異なっているかを決定するために、得られたデータをｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ後のｌｅａｓｔ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＬＳＤ）ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによって分析した。また、変異均質性から有意な偏差がＬｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔで観察される場合は、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔを行った。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔで有意な差が観察された場合、非常に異なる差を示す特定グループ対を決定するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｗ  ｔｅｓｔを行った。統計学的分析は、ＳＰＳＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ  １４Ｋ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；Ｌｕｄｂｒｏｏｋ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７；２４：２９４−６）を使用して行った。また、試験物質の効率に対する理解のために、神経細胞アポトーシス対照群とミロデナフィル処理実験群間の変化を下記数学式３によって計算した。
【００６９】
［数学式３］
神経細胞アポトーシス対照群と比較したパーセント変化（％）＝［（（ミロデナフィル処理グループのデータ−神経細胞アポトーシス対照群のデータ）／神経細胞アポトーシス対照群のデータ）×１００］
【００７０】
実験結果
１．ＰＤＥ５阻害剤の神経細胞アポトーシス抑制効果
損傷した脳組織周辺部位の病理学的標本において、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、損傷部位の右側大脳半球の有意な著しい萎縮と、単位面積当たり（ｍｍ２）大脳皮質内変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数的増加が確認された。その反面、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、大脳皮質内変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の有意な数的減少がそれぞれ確認された。ミロデナフィル１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、有意な大脳皮質萎縮抑制が確認されて（ｐ＜０．０１）、大脳皮質内変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数も有意な減少を示した（ｐ＜０．０１；表２及び図１）。
【００７１】
【表２】
2016502561.tif 000004
【００７２】
具体的に、ミロデナフィル０．５、１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷部位の右側大脳半球の萎縮程度が、対照群に比べ、それぞれ−８．７０、−４６．４２及び−５３．３１％の変化を示した。
【００７３】
ミロデナフィル０．５、１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷部位の右側大脳皮質において、単位面積当たり変性ニューロンの数が、対照群に比べ、それぞれ−４４．４７、−７３．４６及び−７６．５４％の変化を示した。
【００７４】
ミロデナフィル０．５、１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷部位の右側大脳皮質において、単位面積当たりｃａｓｐａｓｅ−３免疫反応ニューロンの数が、対照群に比べ、それぞれ−３３．４３、−７６．４４及び−７７．９６％の変化を示した。
【００７５】
ミロデナフィル０．５、１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷部位の右側大脳皮質において、単位面積当たりＰＡＲＰ免疫反応ニューロンの数が、対照群に比べ、それぞれ−３７．５８、−７６．７４及び−７８．３２％の変化を示した。
【００７６】
上記の結果から、ミロデナフィルのようなＰＤＥ５抑制剤が、脳神経細胞のアポトーシス抑制を通じて神経細胞保護活性を示すことを確認することができた。
【００７７】
２．神経細胞のアポトーシス抑制を通じて神経細胞保護効果を示すＰＤＥ５阻害剤が及ぼす神経学的及び認知的運動行動障害の改善効果
（１）体重変化
神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、有意な体重の減少が施術１４日後から観察され始め（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）、実験期間中の増体量も有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な増体量の増加が、ミロデナフィル１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群でそれぞれ観察されて（ｐ＜０．０１）、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群でも、対照群に比べ、著しい増体量の増加が観察された（表３及び図２）。神経細胞アポトーシス（大脳右半球損傷）誘発後、２９日間の増体量は、ミロデナフィル０．５、１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群において、対照群に比べ、それぞれ４５．５３、２１８．５２及び１５５．７４％の変化を示した。
【００７８】
【表３】
2016502561.tif 000005
【００７９】
（２）感覚運動機能に及ぼす影響分析
＜前肢配置評価＞
神経細胞損傷（大脳右半球損傷）対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、前肢配置検査点数の有意な増加が施術２４時間後から実験全期間にかけて観察された（ｐ＜０．０１）。ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷誘発１４日後に、神経細胞損傷対照群に比べて有意な前肢配置検査点数の減少が観察されて（ｐ＜０．０５）、ミロデナフィル１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ損傷誘発３日後から実験全期間にかけて、対照群に比べ有意な前肢配置検査点数の減少が観察された（ｐ＜０．０１；表４）。
【００８０】
【表４】
2016502561.tif 000006
【００８１】
具体的に、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、前肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−３．６１、−１０．３４、−１２．８２、−１１．１１及び−１２．９０％の変化を示した。
【００８２】
ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、前肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−１８．０７、−２９．８９、−３２．０５、−４１．６７及び−５６．４５％の変化を示した。
【００８３】
ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、前肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−２５．３０、−３４．４８、−３９．７４、−４３．０６及び−５８．０６％の変化を示した。
【００８４】
＜後肢配置評価＞
神経細胞損傷対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、後肢配置検査点数の有意な増加が損傷誘発２４時間後から実験全期間にかけて観察された（ｐ＜０．０１）。ミロデナフィル１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ損傷誘発３日後から実験全期間にかけて、対照群に比べ有意な後肢配置検査点数の減少が認定された（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５；表５）。
【００８５】
【表５】
2016502561.tif 000007
【００８６】
具体的に、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、後肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−６．９８、−８．５７、−９．６８、−１３．３３及び−１１．１１％の変化を示した。
【００８７】
ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、後肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−１８．８０、−２８．５７、−３２．２６、−４３．３３及び−５９．２６％の変化を示した。
【００８８】
ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、前肢配置検査点数が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ−２３．２６、−３４．２９、−４１．９４、−４６．６７及び−５９．２６％の変化を示した。
【００８９】
＜ボディースイング評価＞
神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、右側へのボディースイング回数及び比率の有意な減少が損傷誘発２４時間後から実験全期間にかけて観察された（ｐ＜０．０１）。ミロデナフィル０．５及び１ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ対照群に比べ、右側へのボディースイング回数及び比率の有意な増加が損傷誘発１４日後から実験全期間にかけて観察されて（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）、ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群では、損傷誘発３日後から実験全期間にかけて、対照群に比べて有意な右側へのボディースイング回数及び比率の増加が観察された（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５；表６）。
【００９０】
【表６】
2016502561.tif 000008
【００９１】
具体的に、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、右側へのボディースイング回数及び比率が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ１６．６７、９．０９、４４．８３、５０．００及び４４．１９％の変化を示した。
【００９２】
ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、右側へのボディースイング回数及び比率が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ５０．００、４０．９１、１００．００、１０２．７８及び１６７．４４％の変化を示した。
【００９３】
ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、右側へのボディースイング回数及び比率が損傷誘発３、７、１４、２１及び２８日後、それぞれ６６．６７、４５．４５、１０６．９０、１４４．４４及び１５８．１４％の変化を示した。
【００９４】
（３）認知的運動行動に及ぼす影響分析
Ｓｈａｍ対照群では、水迷路タンク内で回避プラットフォームまでの移動距離及び時間が、実施を繰り返す度に著しく減少されたが、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、プラットフォームまでの移動距離及び時間の有意な増加が損傷誘発１４日及び２８日後にそれぞれ観察されて（ｐ＜０．０１）、実施回数による移動距離及び時間の短縮も著しく抑制された。ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べて、有意なプラットフォームまでの移動距離の減少が、損傷誘発１４日後２回目の実施及び施術２８日後の全ての実施でそれぞれ確認されて（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）、プラットフォームまでの移動時間の有意な減少が、損傷誘発１４日後１回目の実施を除いた全ての実施でそれぞれ確認された（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）。また、ミロデナフィル１及び２ｍｇ／ｋｇ投与群においても、損傷誘発１４及び２８日後、プラットフォームまでの移動距離及び時間の有意な減少が、損傷誘発１４日後１回目の実施を除いた全ての実施で確認された（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５；表７）。
【００９５】
【表７】
2016502561.tif 000009
【００９６】
具体的に、ミロデナフィル０．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、水迷路タンク内でプラットフォームまでの移動距離が、損傷誘発１４日後の２、３回目の実施及び損傷誘発２８日後の全ての実施において、それぞれ−７．９３、−９．４２、−９．８０、−１４．０２及び−１７．５６％のの変化を示し、プラットフォームまでの移動時間は、それぞれ−１０．４７、−１８．３７、−１１．４５、−２２．２３及び−２９．１６％の変化を示した。
【００９７】
ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、水迷路タンク内でプラットフォームまでの移動距離が、損傷誘発１４日後の２、３回目の実施及び損傷誘発２８日後の全ての実施において、それぞれ−１１．０７、−１９．２０、−１３．８０、−２８．５１及び−４７．３３％のの変化を示し、プラットフォームまでの移動時間は、それぞれ−１２．５２、−２４．８２、−１６．９８、−３１．１１及び−４４．４６％の変化を示した。
【００９８】
ミロデナフィル２ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群に比べ、水迷路タンク内でプラットフォームまでの移動距離が、損傷誘発１４日後の２、３回目の実施及び損傷誘発２８日後の全ての実施において、それぞれ−１２．５４、−２０．３７、−１４．０１、−２９．６５及び−４４．１４％のの変化を示し、プラットフォームまでの移動時間は、それぞれ−１２．０６、−２５．９０、−１７．０６、−３１．２８及び−４５．３２％の変化を示した。
【００９９】
実施例２．ＰＤＥ５阻害剤のニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）保護効果−投与時期分析
実験材料及び実験方法
１．実験動物の準備
６週齢の１００匹の健康な雄性スプラーグドーリーラット（体重１７０〜１９０ｇ；ＳＬＣ，日本）を１６日間環境に適応させた後、実験に使用した。２０〜２５℃の温度及び５０〜５５％の湿度でケージ当り５匹のラットを飼育した。暗周期は、１２ｈｒ：１２ｈｒにして、水と餌（標準けっ歯類餌、サンヤン、韓国）は、自由に摂取するようにした。全ての動物は、実験動物資源機関、生命科学委員会、米国国立研究会議（１９９６）に基いたデグ漢医大学校の実験動物の飼育及び使用指針にしたがって扱った。具体的な実験グループは、下記の通りである。
【０１００】
【表８】
2016502561.tif 000010
【０１０１】
２．試験物質の準備及び投与
ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ  ２ＨＣｌ；ＳＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ，韓国）を実験に使用した。ミロデナフィルは、白色パウダーであって、食塩水によく溶解される。ミロデナフィルを光と湿気から保護するために、４℃の冷蔵庫に保管した。ミロデナフィルを生理食塩水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、施術２４、７２及び１６８時間から１４日間、一日１回背部皮膚にｋｇ当り１ｍｌの容量で皮下投与した。ｓｈａｍ対照群及び神経細胞アポトーシス対照群には、ミロデナフィルの代わりに同量の食塩水を、施術後２４時間から２０日間皮下投与した。
【０１０２】
３．神経細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）動物モデルの製造
下記の方法で実験動物の大脳右半球に損傷を加えて、神経細胞のアポトーシスを誘導した。具体的に、７０％Ｎ２Ｏと２８．５％Ｏ２ガスに１．５％イソフルランを混合した麻酔ガスで全身麻酔を施した後、手術台に固定し、眼窩と外耳道との間に右側頭部皮膚を横に切開して側頭筋を露出させた後、顔面神経と眼窩骨に損傷がないように切除し、側頭骨の一部を露出させた。その後、歯科用ドリルを利用した側頭下切除術（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ）を通じて、近位部中大脳動脈（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ＭＣＡ）を露出させた。その後、嗅索近所で大脳静脈直下でマイクロバイポーラ凝固法（ｍｉｃｒｏｂｉｐｏｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を実施し、近位部中大脳動脈を永久的に閉鎖した。吸入全身麻酔後、直腸温度計と熱パッドを利用して体温を一定に維持し、全体的な死亡率は、５％以下として観察された。Ｓｈａｍ対照群は、上記と同一な方法で近位部中大脳動脈を露出させた後、マイクロバイポーラ凝固法を実施せず、創腔を閉鎖した。
【０１０３】
４．免疫組織化学的評価
大脳パラフィン片（ｓｅｃｔｉｏｎ）の脱パラフィン後、文献Ｓｈｉ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４１：１５９９−６０４（１９９３）に開示の方法にしたがって、シトレートバッファー抗原（ｅｐｉｔｏｐｅ）回収前処理を行った。簡略に説明すると、１０ｍＭシトレートバッファー（ｐＨ６．０）を含有する染色皿の浸された水槽を９５〜１００℃に予熱して、スライドを染色皿に浸し、皿上に蓋を緩くのせた後、２０分間インキュベーションし、染色皿を常温に放置してスライドを２０分間冷やした。エピトープ回収後、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰに対するアビジン−ビオチン複合体（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＡＢＣ）法を利用して切片を免疫染色した。簡略に説明すると、メタノール及び０．３％Ｈ２Ｏ２と共に３０分間常温でインキュベーションし、耐性のペルオキシダーゼ活性を抑制し、正常馬血清遮断剤（（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ．希釈１：１００）を使用して免疫グロブリンの非−特異的結合を遮断した。１次抗血清を４℃の温度で一晩中処理し、ビオチン化ユニバーサル２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．１：５０希釈）及びＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．希釈１：５０）を常温で１時間処理した。最後に、常温で３分間ペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．）と反応させた。各工程の途中に全ての切片を０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗浄した。ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰに対して１０％以上の免疫反応性（密度）で満たされた神経細胞を陽性と判断し、同側性損傷周辺部位大脳皮質のｍｍ２中に分散されているｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応性細胞の数を、イメージ分析プログラムを使用して測定した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。分析のために、組織病理学者らにグループの偏在に対する情報を提供しなかった。
【０１０４】
５．組織病理学的評価
前記神経細胞アポトーシス処置２９日後にラットを犠牲させた。脳を除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、脳ステンレススチール頭部マトリックス（ｂｒａｉｎ  ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｃｏｒｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ；Ｈａｒｖａｒｄ，米国）を利用して、前頭極（ｆｒｏｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｐｏｌｅ）から２〜１４ｍｍ範囲で連続的な６個の冠状断面（２ｍｍ厚）に分けた。製造された６番目大脳部分を１０％ＮＢＦに直接固定させた。その後、パラフィンに包埋して、横断面に切断した後、大脳皮質の組織病理学的検査のために、Ｈ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色を行った。Ｈ＆Ｅ染色下、組織形態計測（Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）を通じて、大脳皮質の萎縮性％（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｔｒｏｐｈｉｃ  ％）及び変性ニューロン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ；好酸球と見える）の数を計算した。分析のために、組織病理学者らにグループの偏在に対する情報を提供しなかった。
【０１０５】
組織形態計測：製造した組織染色標本の正常の対側性（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）半球と比較し、同側性（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）大脳皮質の萎縮％を下記数学式４によって計算した。また、単位面積当たり（ｍｍ２）変性ニューロンの数を測定した。
【０１０６】
［数学式４］
脳萎縮形成＝（対側性大脳皮質の面積−同側性大脳皮質の面積）／対側性大脳皮質の面積×１００（％）
【０１０７】
６．体重測定
神経細胞のアポトーシス誘発の一日前、誘発当日及び誘発後１、７、１４、２１、２８及び２９日に体重を測定した。各動物間の差を減らすために、神経細胞のアポトーシス誘発後体重増加量と連続的な試験物質の投与を、下記数学式５によって計算した。
【０１０８】
［数学式５］
神経細胞のアポトーシス誘発後２９日間の体重増加量＝（神経細胞のアポトーシス誘発２９日後の体重−神経細胞のアポトーシス誘発後各日の体重）
【０１０９】
７．感覚運動機能評価（ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）−神経学的運動行動検査
感覚運動機能を四肢配置検査（（ｌｉｍｂ  ｐｌａｃｉｎｇ  ｔｅｓｔ；ｄｅ  Ｒｙｃｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２０：１３８３−９０（１９８９））及びボディースイング検査（ｂｏｄｙ  ｓｗｉｎｇ；Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｂｅｒｇ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：５３７２−８（１９９５））によって評価した。検査は、神経細胞のアポトーシス誘発後１及び２８日目に行った。評価を担当する調査官には、実験物質処理に対する情報を提供しなかった。
【０１１０】
四肢配置検査：前肢及び後肢配置を独立的に評価した。前肢配置検査のために、ラットの前足を自由にしつつ、胴体をつかんで徐々にテーブル上端の縁に移動させて、ラットの髭の短いタッチを止めて（視覚誘導された配置のため）、ラット髭をタッチして（髭誘導された配置のため）、前記テーブル上端の縁まで前足に光を照らし（触覚誘導された配置のため）、増加された圧力でテーブルの縁に前足を押した（固有受容性誘導された配置のため）。後肢配置も同様に前記方法にしたがって評価した。視覚、髭、触覚及び固有受容性刺激に対する各四肢の反応を、下記基準にしたがって点数化した（前肢テストで計１２点及び後肢テストで６点は、最大神経欠損を意味し、０点は、正常行動を意味する）：
正常行動＝０点；
一足でした行動（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｍｂ）＝１点；
遅延（２秒）及び／又は不完全行動＝２点；
行動無し＝３点。
【０１１１】
ボディースイング検査：尻尾端から約２ｃｍ位置で実験動物をつかみ、テーブル表面の上に１インチずつ増加させた。ラットが頭を垂直軸から１０°以上動いた後、再び垂直姿勢に戻る度に回転（ｓｗｉｎｇ）を記録した。動物当り計３０回の回転をカウントした。右半球に神経細胞のアポトーシスを誘発させた後、実験動物は、反対側脳（左側）側に回転する傾向があるため、回復率測定で右側への回転数及びパーセントを、正常動物の点数記録と共に記録した。
【０１１２】
８．認知的運動行動評価（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）
認知検査のために、水迷路検査（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１：４７−６０（１９８４））を行った。神経細胞のアポトーシス誘発１４日及び２８日後、２２．０±１．０℃温度の水が満たされた暗い色相のタンク（直径１５０ｃｍ×高さ５０ｃｍ）で１０分間隔で３回実施した。１５×３０ｃｍ水中プラットフォーム（水表面から２ｍｍ下）を水槽の北西側四分面（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ｑｕａｄｒａｎｔ）に配置した。リリースポイント（ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｏｉｎｔ）は、常に水槽の南側にした。実験動物を水槽の壁を向き合うようにしながら入水させた後、リリースした。各実施例における実験動物の水泳経路をカメラトラッキングシステム（Ｓｍａｒｔ  ｊｕｎｉｏｒ，ＰａｎＬａｂ，スペイン）を使用して記録し、回避プラットフォーム（ｅｓｃａｐｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）に到達するまで移動した距離（ｍ）及び時間（秒）を計算した。
【０１１３】
９．統計分析
全てのデータは、１０匹ラットのｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｄ．）で表現した。服用量の異なるグループのための多重比較検査を行った。変異均質性（Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ（Ｌｅｖｅｎｅ  Ａ，Ｃｌｉｎ  Ｏｔａｌａｒｙ，１９８１；６：１４５−５１）を使用して調査した。Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ結果が変異均質性から有意性のない偏差が導出された場合、グループ比較のどのグループ対が相当相異なっているかを決定するために、得られたデータをｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ後のｌｅａｓｔ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＬＳＤ）ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによって分析した。また、変異均質性から有意な偏差がＬｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔで観察される場合は、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔを行った。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔで有意な差が観察された場合、非常に異なる差を示す特定グループ対を決定するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｗ  ｔｅｓｔを行った。統計学的分析は、ＳＰＳＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ  １４Ｋ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；Ｌｕｄｂｒｏｏｋ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７；２４：２９４−６）を使用して行った。また、試験物質の効率に対する理解のために、神経細胞アポトーシス対照群とミロデナフィル処理実験群間の変化をそれぞれ下記数学式６及び７によって計算した。
【０１１４】
［数学式６］
ｓｈａｍ対照群と比較したパーセント変化（％）＝［（（神経細胞アポトーシス対照群のデータ−ｓｈａｍ対照群のデータ）／ｓｈａｍ対照群のデータ）×１００］
【０１１５】
［数学式７］
神経細胞アポトーシス対照群と比較したパーセント変化（％）＝［（（ミロデナフィル処理グループのデータ−神経細胞アポトーシス対照群のデータ）／神経細胞アポトーシス対照群のデータ）×１００］
【０１１６】
実験結果
１．ＰＤＥ５阻害剤の神経細胞アポトーシス抑制効果
損傷した脳組織周辺部位の病理学的標本において、神経細胞アポトーシス対照群では、誘発部位の右側大脳半球の有意な（ｐ＜０．０１）著しい萎縮と、単位面積当たり（ｍｍ２）大脳皮質内変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数的増加が確認された。その反面、施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０１）大脳半球の萎縮抑制が確認されて、大脳皮質内変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数的減少も確認されて、施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群でも、対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０５）大脳半球の萎縮抑制、大脳皮質内変性ニューロン及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数的減少が確認されて、ｃａｓｐａｓｅ−３免疫反応細胞においても著しい減少が確認された（表９及び図３）。
【０１１７】
【表９】
2016502561.tif 000011
【０１１８】
具体的に、誘発部位の右側大脳半球の萎縮程度は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ、１５８１．６６％の変化を示したが、施術（大脳右半球損傷による神経細胞アポトーシス誘発）２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−６０．７１、−２６．３７及び−１２．３１％の変化を示した。
【０１１９】
誘発部位の右側大脳皮質において単位面積当たり変性ニューロンの数は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ、１６２５．８３％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−７０．６４、−４５．９０及び−１５．４０％の変化を示した。
【０１２０】
誘発部位の右側大脳皮質において単位面積当たりｃａｓｐａｓｅ−３免疫反応ニューロンの数は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ、１３６０．００％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−５７．２９、−４０．６３及び−１５．５７％の変化を示した。
【０１２１】
誘発部位の右側大脳皮質において単位面積当たりＰＡＲＰ免疫反応ニューロンの数は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ、９８３．５９％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−５３．９２、−３９．７２及び−１５．６８％の変化を示した。
【０１２２】
上記の結果から、ミロデナフィルのようなＰＤＥ５抑制剤が、脳神経細胞のアポトーシス抑制を通じて神経細胞保護活性を示すことを確認することができた。
【０１２３】
２．神経細胞のアポトーシス抑制を通じて神経細胞保護効果を示すＰＤＥ５阻害剤が及ぼす神経学的及び認知的運動行動障害の改善効果
（１）体重変化
神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が施術７日後から観察され始め、実験期間中の増体量も有意な（ｐ＜０．０１）減少を示した。神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の増加が、施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群でそれぞれ施術２８及び２９日に認められて、実験期間中の増体量も同様に、神経細胞アポトーシス対照群に比べ有意な（ｐ＜０．０１）増加を示した。一方、施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な体重及び増体量の変化は認められなかった（表１０及び図４）。施術後２９日間の増体量は、神経細胞アポトーシス対照群においてｓｈａｍ対照群に比べ−４８．４９％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ４３．２４、３３．７８及び１１．０４％の変化を示した。
【０１２４】
【表１０】
2016502561.tif 000012
【０１２５】
（２）感覚運動機能に及ぼす影響分析
＜前肢配置評価＞
施術２４時間後、前肢配置検査で最高点（ｓｃｏｒｅ１２）を取ったラットだけを選定して使用し、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）前肢配置検査点数の増加が施術２８日後にも確認された。施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）前肢配置検査点数の減少が施術２８日後それぞれ認められたが、施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意な前肢配置検査点数の変化は認められなかった（図５）。
【０１２６】
具体的に、施術２８日後の前肢配置検査点数は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ８００．００％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−５７．４１、−２９．６３及び−１１．１１％の変化を示した。
【０１２７】
＜後肢配置評価＞
施術２４時間後、後肢配置検査で最高点（ｓｃｏｒｅ６）を取ったラットだけを選定して使用し、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）後肢配置検査点数の増加が施術２８日後にも確認されたが、施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）後肢配置検査点数の減少がそれぞれ認められた。施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意な後肢配置検査点数の変化は認められなかった（図６）。
【０１２８】
具体的に、施術２８日後の後肢配置検査点数は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ１０５０．００％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−６５．２２、−３９．１３及び−１７．３９％の変化を示した。
【０１２９】
＜ボディースイング評価＞
施術２４時間後、右側手術部位側へのボディースイング回数及び比率の減少の一定な（１〜４回；３．３３〜１３．３３％）ラットだけを選定し使用して、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、右側手術部位へのボディースイング回数及び比率の有意な（ｐ＜０．０１）減少が施術２８日後にも認められた。施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）右側手術部位へのボディースイング回数及び比率の増加がそれぞれ認められたが、施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて有意なボディースイング回数及び比率の変化は認められなかった（図７）。
【０１３０】
具体的に、施術２８日後、右側手術部位側へのボディースイング回数及び比率は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ−５９．３５％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ８２．００、４８．００及び１４．００％の変化を示した。
【０１３１】
（３）認知的運動行動に及ぼす影響分析−水迷路検査
Ｓｈａｍ対照群では、水迷路タンク内で回避プラットフォームまでの移動距離及び時間が、実施を繰り返す度に著しく減少されたが、神経細胞アポトーシス対照群では、ｓｈａｍ対照群に比べ、プラットフォームまでの移動距離及び時間の有意な（ｐ＜０．０１）増加が施術２８日後にそれぞれ観察されて、実施回数による移動距離及び時間の短縮も著しく抑制された。施術２４及び７２時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）プラットフォームまでの移動距離及び時間の減少が、施術２日後、全ての実施でそれぞれ確認されたが、施術１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べて、有意なプラットフォームまでの移動距離及び時間の変化は認められなかった（図８）。
【０１３２】
具体的に、施術２８日後、水迷路タンク内でプラットフォームまでの平均移動距離は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ８５．７４％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−２６．４５、−１６．０５及び−６．４２％の変化を示した。
【０１３３】
施術２８日後、水迷路タンク内でプラットフォームまでの平均移動時間は、神経細胞アポトーシス対照群において、ｓｈａｍ対照群に比べ７９．６７％の変化を示したが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、それぞれ−２４．４９、−１７．３３及び−５．３６％の変化を示した。
【０１３４】
３．検討
本実験の結果、脳損傷による神経細胞アポトーシスにより、顕著な体重減少、神経学的及び認知的運動行動障害所見、即ち、四肢配置検査点数の増加、右側へのボディースイング回数及び比率の減少、回避プラットフォームまでの移動距離及び時間の増加と反復的実施による移動距離及び時間の短縮の抑制が認められて、組織病理学的標本において、誘発右側大脳半球の萎縮、大脳皮質内単位面積当たり変性ニューロン、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ陽性ニューロンの数的増加が招来された。
【０１３５】
このような脳損傷による体重減少、神経学的及び認知的運動行動障害及び脳損傷周辺部位大脳皮質ニューロンの変性所見は、施術２４及び７２時間からミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇの投与によりそれぞれ著しく抑制されて、施術１６８時間後から１４日間ミロデナフィル１ｍｇ／ｋｇを投与した実験群においても、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、著しい脳損傷周辺部位大脳皮質ニューロンの変性及びアポトーシス抑制所見が認められた。したがって、ミロデナフィルを脳損傷（神経細胞アポトーシス）２４〜７２時間後から投与を開始する場合、虚血性脳損傷による神経学的及び認知的運動行動障害の改善効果があらわれると判断される。
【０１３６】
虚血性脳損傷が進行されるにつれて、認知及び運動障害が招来されて、結果的に顕著な体重低下が伴われる［Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｃｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２］。本実験の結果においても、脳損傷７日後からｓｈａｍ対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が全ての手術群で認められて、実験期間中の増体量もｓｈａｍ対照群に比べ有意な（ｐ＜０．０１）減少を示した。その反面、施術２４及び７２時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重及び増体量の増加がそれぞれ認められたが、手術１６８時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、対照群に比べ、有意な体重及び増体量の変化は認められなかった。このような結果は、脳損傷２４〜７２時間後から投与を始めてこそ、ＰＤＥ５阻害剤が認知及び行動障害による体重減少を有意に抑制するということの直接的な証拠と判断される。
【０１３７】
四肢配置検査は、代表的な神経学的運動行動検査であって、前肢及び後肢の配置異常を等級化し、等級が高いほど強度の神経学的運動行動異常を示す。また、ボディースイング検査も同様に頻繁に使用される神経学的運動行動検査であって、正常動物では、左右側へのボディースイングが大略５：５である反面、虚血性脳損傷のある動物では、損傷部位へのボディースイングが著しく減少される（Ｒｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍｅｎｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。また、水迷路検査は、最も一般的に使用される認知的運動行動検査であって、認知行動障害がある場合、回避プラットフォームへの移動距離及び時間が著しく延長されて、特に、実施を繰り返す場合も、距離及び時間の減少が著しく抑制される。
【０１３８】
本実験の結果、施術２４及び７２時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、四肢配置、ボディースイング及び水迷路検査において、脳損傷により招来される神経学的及び認知的運動行動異常所見が著しく抑制されたが、施術１６８時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、神経細胞アポトーシス対照群に比べ、有意な神経学的及び認知的運動行動異常所見の変化は認められなかった。このような結果は、脳損傷２４〜７２時間後から投与を開始する場合、ＰＤＥ５阻害剤が虚血性脳損傷において認知及び運動機能を回復させる直接的な証拠と判断される。
【０１３９】
本実験の結果、虚血性脳損傷によって招来された脳損傷周辺部位に著しい大脳皮質の萎縮が招来されたが、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、それぞれ脳損傷周辺部位に大脳皮質の萎縮所見が有意に（ｐ＜０．０１）抑制されて、大脳皮質において、単位面積当たり変性ニューロンの増加も有意に（ｐ＜０．０１）抑制した。
【０１４０】
ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰは、代表的なアポトーシスマーカーであって（Ｎｕｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、大脳皮質において、ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰの増加は、アポトーシスによる脳損傷の増加を意味する。本実験の結果、施術２４、７２及び１６８時間後からミロデナフィルを投与した実験群では、それぞれ脳損傷による大脳皮質ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰ免疫反応細胞の数的増加が著しく抑制された。したがって、脳損傷２４〜１６８時間後から投与を開始する場合、ＰＤＥ５阻害剤は、脳損傷周辺部位においてある程度の神経保護効果を示すことが観察されたが、神経保護効果は、投与開始時期が遅れるほど低下することが確認された。
【０１４１】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月9日(2015.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤の薬剤学的有効量と、
（ｉｉ）薬剤学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする脳神経細胞のアポトーシス抑制用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ウデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、ダサンタフィル（ｄａｓａｎｔａｆｉｌ）、アバナフィル（ａｖａｎａｆｉｌ）、これらの薬剤学的に許容される塩、溶媒和物、及び水和物からなる群から選択される請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記薬剤学的に許容される塩が、ミロデナフィル塩酸塩、シルデナフィルクエン酸塩又はバルデナフィル塩酸塩である請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記組成物が、脳神経疾患の予防又は治療のためのものである請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記脳神経疾患が、神経変性疾患、虚血性脳卒中、認知機能障害及び運動機能障害からなる群から選択された疾患である請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記神経変性疾患が、痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される神経性疾患である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記認知機能障害が、記憶力減退、学習障害、失認症、健忘症、失語症、失行症又は譫妄である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記運動機能障害が、運動障害（ｍｏｔｏｒ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）、麻痺、運動失調（ａｔａｘｉａ）、ジスキネジア（ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）又は筋失調症（ｄｙｓｔｏｎｉａ）である請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記脳神経細胞のアポトーシスが、外傷性脳損傷により引き起こされた請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、脳組織において変性ニューロン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎ）の形成を抑制するか、又は神経細胞においてｃａｓｐａｓｅ−３又はＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の発現を抑制する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤が、ヒトに経口投与されるか、あるいは頭部以外の部位に非経口投与される請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１２】
前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤の経口投与時、前記組成物が、フィルム剤形である請求項１１に記載の薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
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