(57)【要約】  インフルエンザウイルスの感染を抑制するタンパク質又は免疫原性組成物を開示され、免疫原性組成物は、A型インフルエンザウイルスのM2e及びHA2 FPドメインのような免疫源と、ヒトIgGのFcフラグメントのような免疫強化物質と、任意に安定化配列と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスマトリクスタンパク質M2eドメイン又はそのフラグメントと、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合ペプチド(FP)ドメイン又はそのフラグメントと、を有する免疫原配列と、
免疫強化物質配列と、
を備えることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
前記FPドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンサブタイプ1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17又は18である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記FPドメイン及び前記M2eドメインは、独立して、H1N1ウイルス、H1N2ウイルス、H2N2ウイルス、H3N2ウイルス、H5N1ウイルス、H7N2ウイルス、H7N3ウイルス、H7N7ウイルス、H7N9ウイルス、H9N2ウイルス、又はH10N8ウイルスから選択されたＡ型インフルエンザウイルスに由来する、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記FPドメインのアミノ酸配列は、配列番号No.3,7,17,18,19又は20の一つと、少なくとも９０％同一である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記M2eドメインのアミノ酸配列は、配列番号No.4,8,21,22,23又は24の一つと、少なくとも９０％同一である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、更に安定化配列を備える、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記安定化配列は、foldon(Fd)又はGCN4配列である、ことを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記免疫強化物質配列は、ヒトIgG FcのFcフラグメント配列、C3ｄ配列、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus ASP-1）配列、コレラトキシン配列、又はムラミールペプチド配列である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記免疫強化物質配列は、配列番号No.10のヒトIgG Fc配列と、少なくとも９０％同一である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質は融合タンパク質である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記免疫原は、M2e-FPを備える、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記免疫原は、FP-M2eを備える、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記免疫強化物質配列は、前記免疫原配列のＣ末端に結合される、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記安定化配列は、前記免疫原配列のＣ末端に結合され、前記免疫強化物質配列は、前記安定化配列のＣ末端に結合される、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は、M2e-FP-Fcを備える、ことを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は、FP-M2e-Fcを備える、ことを特徴とする請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は、M2e-FP-FdFcを備える、ことを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、FP-M2e-FdFcを備える、ことを特徴とする請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記融合タンパク質は、前記免疫原配列の前記M2eドメイン及び前記FPドメインの間、前記免疫原配列と前記安定化配列の間、及び前記安定化配列と前記免疫原増強物質配列の間のうちの少なくとも一つの位置に配置されたリンカー配列を更に備える、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記リンカーは、(GGGS)n、（nは０から８の間の整数）である、ことを特徴とする請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
nは１である、ことを特徴とする請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のタンパク質と、
少なくとも薬学的に許容される賦形剤と、
を備えることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物は、更にアジュバントを備える、ことを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
対象にインフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘導させる方法であって、
請求項１６に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与すること、を備える、
ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記免疫反応は、防御免疫反応である、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、又はＣ型インフルエンザウイルスである、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
対象のインフルエンザウイルス感染を防ぐ方法であって、
請求項１６に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを、備える、
ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記免疫反応は、防御免疫反応である、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、又はＣ型インフルエンザウイルスである、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2013年2月15日に出願された米国特許仮出願第61/765,519に対し、米国特許法第119条(e)の下に利益を請求するものであって、ここに引用することによって全体の内容を取り込むものとする。
【０００２】
本発明は、米国立衛生研究所より付与された許可番号第R03AI088449号の下、政府の協力を得てなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、インフルエンザ感染を抑制するための免疫原性組成物の分野に関連する。
【背景技術】
【０００４】
オルトミクソウイルス科に属するＡ型インフルエンザウイルスは、ヒト、鳥、又は食用の家畜に対してインフルエンザを引き起こすことがある。ウイルスは、それらの表面の糖タンパク質であるヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)に基づいて、更に異なるサブタイプへと分類されることがある。既知の１８のHA及び１１のNAの中で、３つのHA型(H1，H2及びH3)と２つのNA型(N1及びN2)が最も一般的にヒトで発見される。H1N1及びH3N2は、ヒトに季節性インフルエンザとインフルエンザの世界的規模の流行とを引き起こす主なサブタイプである。2009年に、豚由来のＡ型インフルエンザウイルスH1N1の世界的な流行が発生した。これにより、高病原性鳥インフルエンザ(HPAI)H5N1ウイルスによる世界的流行の潜在的可能性への関心が高まった。このようにして、インフルエンザの将来的な大流行を防ぐため、Ａ型インフルエンザウイルスの分岐株に対する効果的且つ安全なワクチンの開発が、至急必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インフルエンザウイルス感染の予防及び治療のためのタンパク質及び免疫原性組成物を、ここに開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスマトリクスタンパク質M2eドメイン又はそのフラグメントと、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合ペプチド(FP)ドメイン又はそのフラグメントと、を含む免疫原配列と、免疫強化物質配列と、を含むタンパク質が提供される。
【０００７】
実施形態において、FPドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンサブタイプ1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17及び18に由来する。他の実施形態では、FPドメインとM2eドメインは、独立して、H1N1ウイルス、H1N2ウイルス、H2N2ウイルス、H3N2ウイルス、H5N1ウイルス、H7N2ウイルス、H7N3ウイルス、H7N7ウイルス、H7N9ウイルス、H9N2ウイルス、H10N8ウイルスのいずれかから選択されたＡ型インフルエンザウイルスに由来する。更に別の実施形態では、FPドメインのアミノ酸配列は、配列番号No.3,7,17,18,19又は20の１つと、少なくとも９０％が同一である。別の実施形態では、M2eドメインのアミノ酸配列は、配列番号No.4,8,21,22,23又は24の１つと、少なくとも９０％が同一である。ある実施形態では、免疫原は、M2e-FP又はFP-M2eを含む。
【０００８】
他の実施形態では、タンパク質は、更に安定化配列を含む。他の実施形態では、安定化配列は、foldon(Fd)又はGCN4配列である。
【０００９】
他の実施形態では、免疫強化物質配列は、ヒトIgG FcのFcフラグメント配列、C3d配列、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）のASP-1配列、コレラトキシン配列、又はムラミールペプチド配列である。更に他の実施形態では、免疫強化物質の配列は、配列番号No.10のヒトIgG Fc配列と、少なくとも９０％が同一である。
【００１０】
他の実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質である。一つの実施形態では、免疫強化物質配列は、免疫原配列のＣ末端に結合される。更に他の実施形態では、安定化配列は、免疫原配列のＣ末端に結合されており、免疫強化物質の配列が安定化配列のＣ末端に結合される。ある実施形態では、融合タンパク質は、M2e-FP-Fc、FP-M2e-Fc、M2e-FP-FdFc、又はFP-M2e-FdFcを含む。
【００１１】
他の実施形態では、融合タンパク質は、免疫原配列のM2eドメインとFPドメインとの間、免疫原配列と安定化配列との間、安定化配列と免疫強化物質配列との間の少なくとも１つの位置に設けられたリンカー配列を更に含む。他の実施形態では、リンカーは(GGGGS)nであり、nは０から８の間の整数である。１つの実施形態では、nは１である。
【００１２】
ここで開示されているタンパク質及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物も提供される。他の実施形態では、免疫原性組成物は更にアジュバントを含む。
【００１３】
更に、ここで開示されている免疫原性組成物又はタンパク質を対象に対して投与することを含む、対象内のインフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘導させる方法が提供される。他の実施形態では、免疫反応は防御免疫反応である。別の実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、又はＣ型インフルエンザウイルスである。
【００１４】
更に、ここで開示された免疫原性組成物又はタンパク質を対象に投与することを含む、対象のインフルエンザウイルス感染を防ぐ方法が提供される。他の実施形態では、免疫反応は防御免疫反応である。別の実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、又はＣ型インフルエンザウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ及びＢは、Ａ型インフルエンザウイルスH5N1のM2e及びFPドメインが、folon(Fd)及びヒトIgGの結晶性フラグメント(Fc)部分と融合されたもの(M2e-FP-FdFc、M2e-FP-FdFcと称される)、又はFcと融合されたもの(M2e-FP-Fc)、又はM2eがFcのみと融合されたもの(M2e-Fc)、同様にH7N9のM2e及びFPがヒトIgGのFd及びFcと融合されたもの(H7N9 M2e-FP-FdFc)を含む、構成された組換え型融合タンパク質の概略構造を示す図である。Fd配列と同様にA型インフルエンザウイルスH5N1及びH7N9のM2e及びFPの高度に保存された領域が、一番上に記載されている。H5N1とH7N9のM2e及びFP内のアミノ酸残基の差異に下線が付されている。
【図２】図２Ａ乃至Ｃは、SDS-PAGE及びウエスタンブロットによって、組換えM2e-FP融合タンパク質の特性を示す。精製H5N1 M2e-FP融合タンパク質を、クマシーブルー染色によるSDS-PAGE（図２Ａ）、及びH5N1 M2eを用いたウエスタンブロット（図２Ｂ）、及びHA2特異的モノクロナール抗体を用いたウエスタンブロット（図２Ｃ）によってそれぞれ解析した。タンパク質の分子量マーカ(kDa)は左に示した。モノクロナール抗体の希釈は、M2e(#16)及びH5N1ウイルスのHA2(1B12)に対し、1:3000である。
【図３】図３Ａ及びＢは、組換えH5N1 M2e-FP融合タンパク質によって誘導された抗インフルエンザIgG抗体反応を示す。ネガティブコントロールとしては、PBSを使用した。図３Ａ：それぞれワクチン接種の10日後に採取されたマウスの血清(1:6,400)において検出されたH5N1 M2e-FP特異的IgG抗体反応である。データは、１群あたり５匹のマウスのA450±平均標準偏差(SD)として表される。図３Ｂ：組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質に結合されたIgG抗体の能力である。ここで、IgG抗体は、最新のワクチン接種の１０日後に採取されたマウスの血清において検出された。データは、様々な希釈点（dilution  point）において、１群あたり５匹のマウスのA450±平均標準偏差(SD)として表される。
【図４】図４Ａ及びＢは、組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質に結合されたIgG1（図４Ａ）及びIgG2a（図４Ｂ）抗体の能力を示す。ここで、抗体は、最新のワクチン接種の１０日後に採取されたマウスの血清で検出された。PBSをネガティブコントロールとして使用した。データは、様々な希釈点（dilution  point）において、１群あたり５匹のマウスのA450±平均標準偏差(SD)として表される。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、半数致死量(LD50)の１０倍のH5N1ウイルスの抗原投与に対して、組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質によって誘導される交叉クレードの予防効果を示す。ワクチンを投与されたマウスは、LD50の１０倍のH5N1ウイルス  クレード1:A/Vietnam/1194/2004 (VN/1194)（図５Ａ）、又はクレード2.3.4:A/Shenzhen/406H/06 (SZ/406H)（図５Ｂ）をそれぞれ鼻腔内(i.n.)に抗原投与され、抗原投与されたマウスの生存率（％）を２週間の間、モニタリングした。１群あたり８匹のマウスから得られた生存曲線間の有意性は、ログランク検定を用いたカプランマイヤー法の生存率解析によって解析した。*と**とは、それぞれ対照群と比較したP<0.05、P<0.01を示す。
【図６】図６Ａ及びＢは、LD50の３倍のH5N1ウイルスの抗原投与に対して、組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質によって誘導される交叉クレードの予防効果を示す。ワクチンを投与されたマウスは、LD50の３倍のH5N1ウイルス  クレード1:VN/1194（図６Ａ）、又はクレード2.3.4:SZ/406H（図６Ｂ）をそれぞれ鼻腔内に抗原投与され、抗原投与されたマウスの生存率（％）を２週間の間、モニタリングした。１群あたり８匹のマウスから得られた生存曲線間の有意性は、ログランク検定を用いたカプランマイヤー法の生存率解析によって解析した。**と***とは、それぞれ対照群と比較したP<0.01、P<0.0001を示す。
【図７】図７Ａ及びＢは、致死性のH5N1ウイルスを抗原投与した後の、組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質をワクチン投与されたマウスの肺組織からのウイルス力価を示す。ワクチン投与されたマウスは、H5N1ウイルス  クレード1:VN/1194又はクレード2.3.4:SZ/406Hを、それそれ、LD50の１０倍（図７Ａ）又は３倍（図７Ｂ）、鼻腔内に抗原投与し、ウイルス力価は採取した肺組織において抗原投与後５日間検出した。データは、肺組織のLog10TCID50/gとして表され、1群あたり５匹のマウスの幾何平均力価(GMT)±SDとして示されている。検出の下限は、組織の1.5 Log10TCID50/gである。異なる群の間のP値が示されている。
【図８】図８は、組換え型H7N9 M2e-FP-FdFcタンパク質と共に組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質によって誘導されるIgG抗体反応の交叉反応の検出を示す。PBSをネガティブコントロールとして用いた。IgG抗体は、ワクチン投与後１０日に採取されたマウスの血清において検出した。データは、様々な希釈点において、１群あたり５匹のマウスのA450±SDで示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（単語の定義）
以下の詳細な説明、実施例、添付の請求項の理解を容易とするため、以下の定義を参照することが有用である。これらの定義は、全く限定をするものではなく、単に読者にとっての便宜のために提供される。
【００１７】
遺伝子(gene)：ここで用いられる遺伝子(gene)とは、プロモーター及び／又は遺伝的構造に必要とされる、若しくは遺伝的構造の発現を改変する、他の調節配列を有する遺伝的構造の少なくとも部分を指す。
【００１８】
ホスト：ここで用いられるホスト(host)とは、本発明の免疫原性組成物の受容者を示す。例えば、ホストは、これに限るものではないが、霊長類、げっ歯類、牛、馬、犬、猫、羊、山羊、豚及び象を含む哺乳類である。本発明の一つの実施形態では、ホストは人間である。本開示の目的にとって、ホストはワクチン接種を受けた者と同義である。
【００１９】
免疫原：免疫原(immunogen)という用語は、ここではホストに免疫反応を引き起こす任意の基質を指す。
【００２０】
免疫原性組成物：ここで用いられている免疫原性組成物（immunogenic composition）は、アジュバンドを用いて又はアジュバントを用いずに、生体内(in vivo)で免疫原を発現及び／又は分泌し、免疫原がホストに免疫反応を引き起こす、発現タンパク質又は組換えベクターを示す。ここで開示されている。ここで開示される免疫原性組成物は、免疫防御又は治療のためであっても、なくてもよい。免疫原性組成物が、ホストの疾病を防ぐ、改善する、軽くする、又は除去するならば、その場合は免疫原性組成物は、選択的にはワクチンと呼ばれてもよい。しかしながら、免疫原性組成物がワクチンに限られることを意図しない。
【００２１】
融合タンパク質：ここ用いられている融合タンパク質（fusion protein）という用語は、本来、別々のタンパク質又はペプチドのためにコードされた二つ又はそれ以上の核酸配列の結合を介して生成されるタンパク質を指す。融合タンパク質は、典型的には組換えＤＮＡ技術によって人為的に生成される。組み合わせられたヌクレオチド配列の発現によって、ソース全体由来の配列を含む融合タンパク質がもたらされる。
【００２２】
（詳細な説明）
多様なＡ型インフルエンザウイルス(IAVs)に対する効果的且つ安全な免疫原性組成物の開発は、特に高病原性インフルエンザ(HPAI)H5N1ウイルスの分岐株にパンデミックの潜在的可能性があることにより、インフルエンザの将来的な大流行を抑制するため、至急必要とされている。本開示では、マトリックスタンパク質２(M2e)の細胞外ドメインと、IAVのヘマグルチニン(HA)2の”融合ペプチド”ドメイン（FP)と、に基づくインフルエンザ免疫原性組成物の開発について説明する。この免疫原性組成物は、強い免疫反応と、免疫力を付与された動物において広範囲な交叉防御免疫力とを誘導した。
【００２３】
異なるサブタイプ（heterosubtype）への免疫力を付与することができるユニバーサル(universal)なインフルエンザ免疫原性組成物は、公衆衛生にとって驚異的な前進となりうる。ここでは、二つの免疫原として、M2eの細胞外ドメインとIAVのHA2タンパク質のFPドメインとを有し、これらが免疫強化物質と結合されたインフルエンザ免疫原性組成物融合タンパク質が開示されている。任意で三量体安定化配列が免疫原と免疫強化物質との間に配置される。免疫原はどの順であってもよいが、免疫強化物質は、免疫原に対するＣ末端である。
【００２４】
ここで、インフルエンザ免疫原性組成物について用いられているユニバーサルという用語は、免疫原の起源と異なるクレード又は株のインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を誘導することができる免疫原性組成物を示す。例えば、H5N1ウイルス由来の配列を備える免疫原性組成物が、H1N1又はH7N9ウイルスから防御する。更に、１つのIAVに由来する配列を含む免疫原性組成物は、全ての、又は、殆どの、他のIAVから防御する。加えて、複数のIAVに由来する配列を含む免疫原組成物は、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスから防御する。
【００２５】
Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルス表面の二つのタンパク質：HA及びノイラミニダーゼ(NA)に基づいて、サブタイプに分けられる。例えば、"H7N2ウイルス"は、HA7タンパク質とNA2タンパク質とから構成されるIAVサブタイプを指す。同様に、"H5N1"ウイルスは、HA5タンパク質とNA1タンパク質とから構成される。１８のHAサブタイプと、１１のNAサブタイプとが知られている。HA及びNAタンパク質の多くの異なる組み合わせが可能である。免疫原がどの株に由来するものであろうとも、請求項に係る免疫原性組成物は、他のIAV株による感染から防御する。加えて、開示の免疫原性組成物は、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスから防御する。
【００２６】
インフルエンザウイルスは、血清型によって更に分類され、ウイルスの形、地理的な起源、株番号、分離された年、及びウイルスのサブタイプによって特定される。例えば、A/Anhui/1/2005(H5N1)とは、2005年中国の安徽省を起源とするIAVを示し、株番号が1であり、H5N1サブタイプである。
【００２７】
ヘマグルチニン(HA)は、インフルエンザウイルスの、ホモ３量体の重要な膜糖タンパク質である。それは、シリンダー状の形であり、長さは約13.5ナノメートルである。HAを構成する３つの同じモノマーは、中心αヘリックスコイルを構成し、３つの球状の頭部はシアル酸結合部位を有する。HAモノマーは前駆体として合成され、次いでグルコシル化、開裂されて、２つの小さなポリペプチドであるHA1及びHA2サブユニットになる。それぞれのHAモノマーは、HA2によって膜に固定され、大きなHA1球体をかぶせられた長いらせん状の鎖からなる。HAの最も保存された領域は、HA2サブユニットのN末端にあり、"融合ペプチド"(FP)と呼ばれる比較的疎水性のアミノ酸(aa)配列である。１つの実施形態では、FPドメインは、IAVのHA2サブユニットの最初の20-30アミノ酸を有する。他の実施形態では、FPドメインは、IAVのHA2サブユニットの最初の21-29アミノ酸、最初の22-29アミノ酸、最初の23-28アミノ酸、最初の21アミノ酸、最初の22アミノ酸、最初の23アミノ酸、最初の24アミノ酸、最初の25アミノ酸、最初の26アミノ酸、最初の27アミノ酸、最初の28アミノ酸、又は最初の29アミノ酸を有する。例えば、FPドメインは、配列番号3,7,17,18,19及び20に見られる。
【００２８】
インフルエンザウイルスM2タンパク質は、プロトンをウイルスのエンベロープを通じて移動させ、ウイルスの核を酸性化させる透過型イオンチャンネル膜であり、これにより、核を偽らせてウイルスのRNAと核タンパクとを放出させる。M2タンパク質の外にあるドメイン(M2e)は、23アミノ酸長であり、高く保存された配列である。例えば、M2eドメインは、配列番号4,8,21,22,23及び24に見られる。
【００２９】
過去に考案されたHAベースのインフルエンザワクチンは、ホスト内に高い効果及び広い中和反応を誘導することができなかった。最も可能性のある理由としては、これらのワクチンが安定且つ可溶性の三量体の形態を正確に維持することができなかったか、高いレベルの中和抗体を誘導する効率的な免疫原性を欠いていたことである。本開示にかかる免疫原性組成物は、IgGのFcフラグメント（結晶性フラグメント）をIAVフラグメントに結合させることによって、このような問題を解決し、広い範囲のインフルエンザウイルスに対して高いレベルの交叉免疫を誘導するための免疫原の免疫原性を強める結果となる。加えて、Fcフラグメントは、それのジスルフィド結合を介して非共有結合性二量体を形成する傾向を有し、これにより、融合タンパク質に、二量体、六量体、又は他の形のオリゴマーを形成させることができ、より免疫原性の分子をもたらす。ある実施形態では、形態の安定性の改良が求められる場合、安定化又は三量体配列により、融合タンパク質を安定且つ可溶性の三量体の形態に維持することができる。
【００３０】
特定のウイルスの分岐株に対する抗体を誘導する能力は、全てのインフルエンザワクチンの製造者にとって重要なハードルであった、１つの株に１つのワクチンという問題を解決する。更には、開示の免疫原性組成物は、ウイルスを増殖させるための鶏卵を必要としない。主な利点は、製造時間とコストを有意に削減するだけでなく、妊娠している女性や鶏卵のタンパク質に対するアレルギーを有する人がワクチンを接種することを可能とすることである。開示されているタンパク質は、一般的な組換えタンパク質製造手法によって代わりに製造される。
【００３１】
１つの実施形態では、即時の免疫原性組成物又はタンパクの即時のFPドメインの構成は、あらゆるサブタイプ、例えばサブタイプH1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 又はH18のIAV HA由来の配列を含む。別の実施形態では、FPドメインの構成はサブタイプH1、サブタイプH2、サブタイプH5、サブタイプH7又はサブタイプH9のIAVのHAに由来する。他の実施形態では、FPドメインは、H1N1型IAV、H1N2型IAV、H2N2型IAV、H3N2型IAV、H5N1型IAV、H7N2型IAV、H7N3型IAV、H7N7型IAV、H7N9型IAV、H9N2型IAV、又はH10N8型IAV又はいずれかのIAVのFP配列に由来する。他の実施形態では、本免疫原性組成物のM2eの構成は、H1N1型IAV、H1N2型IAV、H2N2型IAV、H3N2型IAV、H5N1型IAV、H7N2型IAV、H7N3型IAV、H7N7型IAV、H7N9型IAV、H9N2型IAV、又はH10N8型IAV、又はいずれかのIAVのM2e配列に由来する配列を備えうる。上記の各ドメインのアミノ酸及び核酸配列は、インフルエンザリサーチデータベース(http://www.fludb.org/brc/home.do?decorator=influenza)において見られる。"タンパク質"及び"ポリペプチド"の用語は、同様の構造を示し、ここでは置換可能に用いられる。
【００３２】
表１：免疫増強剤が結合されたオリゴマーインフルエンザ免疫原性組成物のアミノ酸配列
配列番号 NO.1 [A/Anhui/1/2005(H5N1) HA]: 
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
配列番号 NO.2 [A/Anhui/1/2005(H5N1) HA2]: 
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI 
配列番号 NO.3 H5N1 FP:
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSN
配列番号 NO.4 H5N1 M2e:
MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD
配列番号 NO.5 [A/Anhui/1/2013(H7N9) HA]: 
MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI
配列番号 NO.6 [A/Anhui/1/2013(H7N9) HA2]:
GLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI
配列番号 NO.7 H7N9 FP:
GLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQN
配列番号 NO.8 H7N9 M2e:
MSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSE
配列番号 NO.9 [Foldon (Fd)]:
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
配列番号 NO.10 [ヒトIgG Fc (hFc)]:
RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号 NO.11 [マウスIgG Fc (mFc)]:
RSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
配列番号 NO.12 [ウサギIgG Fc (rFc)]:
RSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
配列番号 NO.17 H1 FP [A/California/06/2009(H1N1)]:
GLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQN
配列番号 NO.18 H2 FP [A/Japan/305/1957(H2N2)]: 
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSN
配列番号 NO.19 H3 FP [A/Arizona/08/2009(H3N2)]:
GIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQN
配列番号 NO.20 H9 FP [A/Hong Kong/1074/99(H9N2)]:
GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQHSN
配列番号 NO.21 H1 M2e [A/California/06/2009(H1N1)]:
MSLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD 
配列番号 NO.22 H2 M2e [Japan/305/1957(H2N2)]: 
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 
配列番号 NO.23 H3 M2e [A/Arizona/08/2009(H3N2)]: 
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD
配列番号 NO.24 H9 M2e [A/Hong Kong/1074/99(H9N2)]
MSLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD
配列番号 NO.25 [ヒト C3d (C3におけるアミノ酸残基1002-1303)]: 
HLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFdFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAPDHQELNLDVSLQLPSR
配列番号 NO.26 [コレラトキシンbサブユニット(アミノ酸1-124)]: 
MTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPRAIAAISMAN
【００３３】
１つの実施形態では、安定化配列は、HA配列を三量体又はオリゴマーの形態で安定化させる配列を含む。ここで用いられている安定化配列という用語は、三量体モチーフと三量体化配列とで、置換可能であり、同義である。適切な安定化配列は、これに限られるものではないが、T4フィブリチン配列（foldon状配列）(GYIPEAPRDGQAY VRKDGEWVLLSTFL;配列番号NO. 9又は GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL;配列番号NO. 13)のC末端ドメインの27アミノ酸領域、GCN4配列(MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARI KKLIGEV;配列番号NO. 14)、IQ配列（RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK; 配列番号NO. 15）、又はIZ配列(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK;配列番号NO. 16)を含む。他の適切な安定化方法は、これに限られるものではないが、2,2-ビピリジン-5-カルボン酸(BPY)、ジスルフィド結合、簡易連結反応が含まれる。
【００３４】
他の実施形態では、免疫強化物質は、免疫原性組成物の免疫原性を高める配列を含む。適切な免疫強化物質は、これに限られるものではないが、ヒトIgGのFcフラグメント(配列番号No.10)、C3d(配列番号No.25)、樹状細胞及びB細胞による取り込みを強める抗原に対して結合する抗体形成を促進させる補体フラグメント、Ov-ASP-1 (活性化関連分泌遺伝子ファミリーの回旋糸状虫)(米国特許出願公開第2006/0039921号明細書を参照、Ov-ASP-1アジュバントに関する開示の全てをここに引用によって取り込むものとする)、コレラトキシン(配列番号N0.26)、ムラミールジペプチド、及びそれらのフラグメント、を含む。
【００３５】
１つの実施形態では、免疫強化物質は、免疫グロブリンのFcフラグメントである。免疫グロブリン分子は、鎖がＹ字形状を形成するようにジスルフィド結合によって互いに保持された二つの軽鎖(LCs)と二つの重鎖(HCs)とからなる。Ｙのベース(HCのカルボキシル末端)は、免疫細胞の活性を調節する役割を果たす。この領域はFc領域と呼ばれ、抗体のクラスによって決まる２つ又は３つの定常ドメインに寄与する２つのHCから構成される。特定のタンパク質と結合することにより、Fc領域は、与えられた抗原に対して各抗体が適した免疫反応を確実に生成するようにする。Fc領域は、例えばFc受容体のような様々な細胞受容体、及び補体タンパク質のような他の免疫分子へ結合もする。これを行うことにより、オプソニン化、細胞溶解、及びマスト細胞と好塩基球と好酸球の脱顆粒を含む異なる生理学的効果を媒介する。
【００３６】
例えば、免疫原性組成物は、図１に示される。ある実施形態では、M2eドメイン及び融合タンパクのFPドメイン配列が、(GGGGS)n (配列番号NO.27)、ここでnは０と８の間の整数、を含むフレキシブルリンカーを介して結合される。ある実施形態では、nは０、nは１、nは２、nは３、nは４、nは５、nは６、nは７又はnは８である。加えると、融合タンパク質のFP及びFd及び／又はFc領域は、(GGGGS)n 、ここでnは０と８の間の整数、を含むフレキシブルリンカーを介して結合される。ある実施形態では、nは０、nは１、nは２、nは３、nは４、nは５、nは６、nは７又はnは８である。
【００３７】
付加的な実施形態では、免疫原性組成物の保存的に改変された変異の利用が提供される。ここで開示される変異とは、親分子または起源の分子の生物活性を維持している。
【００３８】
ここで用いられている、"保存的置換"とは、以下の保存的置換グループの１つに見られる、1つのアミノ酸を他のアミノ酸へ置換することを含む。グループ１：アラニン(Ala)、グリシン (Gly)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、 グループ２：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)、グループ３：アスパラギン(Asn)、グルタミン (Gln)、グループ４：アルギニン (Arg)、リシン (Lys)、ヒスチジン (His)、グループ５：イソロイシン (Ile)、ロイシン (Leu)、メチオニン (Met)、バリン (Val)、グループ６：フェニルアラニン(Phe)、チロシン (Tyr)、トリプトファン (Trp)。
【００３９】
加えて、アミノ酸は、類似する機能又は化学構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫）によって、保存的置換グループへとグループ分けされうる。例えば酸性グループは、置換の目的のために、Gly、Ala、Val、Leu、及びIleを含みうる。互いに保存的置換されるとみなされるアミノ酸を含む他のグループは、含硫：Met及びシステイン(Cys)、酸性：Asp、Asn、Glu及びGln、小型脂肪族非極性又は微極性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及びGly、極性陰性残基及びそのアミド類：Asp、Asn、Glu及びGln、極性陽性残基：His、Arg及びLys、大型脂肪族非極性残基：Met、Leu、Ile、Val及びCys、大型芳香族残基：Phe、Tyr及びTrpを含む。
【００４０】
改変（通常主要配列を変えることはない）は、in vivo又はin vitroにおける、ポリペプチド又はタンパク質の化学誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化を含む。同様に、グルコシル化の改変、例えば合成又は処理の間、ポリペプチド又はタンパク質のグルコシル化パターンを改変することによってなされる改変、又は更なる処理工程において、例えば糖鎖付加に作用する酵素、例えば、哺乳類の糖鎖付加酵素又は脱糖鎖酵素にポリペプチド又はタンパク質を曝すことによってなされる改変も含まれる。同様に、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンのようなリン酸化アミノ酸残基を有する配列も利用される。
【００４１】
通常の分子生物学的技術を用いて、タンパク質分解に対する耐性を改良するように、又は溶解特性を最適化するように改変されたタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質の類似物は、天然のＬ−アミノ酸以外の例えばＤ−アミノ酸、又は合成されたアミノ酸の残基を含有するタンパク質を含む。ここで開示されているタンパク質は、ここで例示的に挙げられている特定の処理のいずれかによる生成物に限られない。
【００４２】
このように、M2eドメイン配列、FPドメイン配列、免疫強化物質配列、ヒトFc配列、Fd配列、GCN4配列、IQ配列、IZ配列、融合タンパク質配列、又は置換されていないペプチド又はタンパク質の生物活性を保持した、１つ又はいくつかのアミノ酸を欠失している、置換及び／又は付加されたタンパク質配列が、ここで開示されている。
【００４３】
ここで用いられている、実質的に同一なポリペプチド配列は、一般的に９５％超のアミノ酸の同一性を共有する。しかしながら、スプライス変異によって生ずる上述したレベルを下回る同一性を含む、又は保存的なアミノ酸置換（又は縮重コドンの置換）によって改変されたタンパク質（そのようなタンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ）が、本開示の範囲に入ることが予期されていることが認識されるべきである。当業者によれば容易に理解されるように、例えば、Henikoff及びHenikoff  全米科学アカデミー紀要  89:10915(1992)において説明されているBLOSUM62スコア行列のような、比較のために配列を調整する様々な方法が考案されている。この目的のために都合よく用いられるアルゴリズムは、広く利用可能である（例えば、Needleman及びWunch、Journal of Molecular Biology  48:443(1970)参照）。
【００４４】
それゆえ、ここで開示されているM2eドメイン配列、FPドメイン配列、免疫強化物質配列、ヒトFc配列、Fd配列、GCN4配列、IQ配列、IZ配列、融合タンパク質配列、又はタンパク質の配列に対してアミノ酸配列が８５％−１００％同一であることが、本開示の範囲に入る。この実施形態の観点において、アミノ酸配列は、ここで開示されているM2eドメイン配列、FPドメイン配列、免疫強化物質配列、ヒトFc配列、Fd配列、GCN4配列、IQ配列、IZ配列、融合タンパク質配列、又はタンパク質の配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。
【００４５】
開示されているタンパク質、免疫原、免疫原増強物質、安定化配列システム、の発現に用いるために、以下の発現システム：例えば、これに限られるものではないが、pcDNA及びGS遺伝子発現システムのような哺乳類の細胞発現システム；例えば、これに限られるものではないが、Bac-to-Bacバキュロウイルスのような昆虫細胞発現システム、DES発現システム、これに限られるものではないがpET、pSUMO及びGST発現システムを含む大腸菌発現システム、が好適である。
【００４６】
様々な利点が、哺乳類の細胞発現システムにおけるタンパク質の発現に付随する。哺乳類の細胞発現システムは、組換え型タンパク質の発現にとっては、比較的成熟した真核性のシステムである。発現されたタンパク質に元々の構造を維持させ、十分な生物活性を維持させつつ、適正に糖鎖付加され、正しく折り畳まれた可溶性タンパク質を得る可能性がより高くなる。このシステムは、一時的又は安定的に、組換え型の抗原を発現し、信号の合成を促進することができる。この方法で発現された組換え型のタンパク質は、良好な抗原性と免疫原性を維持し得る。しかしながら、昆虫及び細菌発現システムは、ある条件においては適切である、安価で効率のよいタンパク質発現を提供する。
【００４７】
最適な精製システムは、タグが融合タンパク質に結合又は融合されているか否かによる。もし融合タンパク質がIgG Fc、Aタンパク質、又はGタンパク質と融合される場合、アフィニティクロマトグラフィが精製に用いられる。仮に融合タンパク質がGSTタンパク質と融合されている場合、GSTカラムが精製に用いられる。仮に融合タンパク質がN又はC末端において6×Hisタグと結合する場合、発現されたタンパク質はHisタグカラムをもちいて精製され得る。仮に融合タンパク質にタグが結合されていない場合、発現されたタンパク質は、高速タンパク質液体クロマトグラフィ(FPLC)、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、又は他のクロマトグラフィによって精製され得る。
【００４８】
ある実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを更に含む、又はアジュバントとともに投与される。動物において利用に適したアジュバントは、これに限られるものではないが、完全又は不完全フロイントアジュバント、Sigma Adjyuvant System(SAS)及びRibiアジュバントを含む。ヒトにおいて利用に適したアジュバントは、これに限られるものではないが、MF59（水中油型エマルジョンアジュバント）、モンタナイドISA  51又は720（鉱物油系、又は代謝性油系アジュバント）水酸化、リン酸、又は酸化アルミニウム、HAVLOGEN（登録商標）（アクリル酸ポリマー系アジュバント、Intervet Inc., Milsboro,DE）、ポリアクリル酸、BAYOL（商標）又はMARCOL（商標）（Esso Imperial Oil Limited, Canada）のような鉱物油系又はビタミンＥアセテートのような植物油系の水中油型又は油中水型エマルジョン、サポニン、又は回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）活性化−関連タンパク質１（Ov-ASP-1）（米国特許出願公開第2006/0039921号明細書を参照。Ov-ASP-1アジュバントに関する開示の全てを引用により取り込むこととする。）しかしながら、アジュバント活性を備える成分は、広く知られており、一般的に、ワクチン及び／又は免疫原性組成物の効能又は安全性を不利に妨げることがない、いずれのアジュバントを利用することができる。
【００４９】
ここで開示されている様々な実施形態に関する免疫原性組成物は、液体状、凍結された懸濁液状、又は凍結乾燥状で作製及び／又は販売することができる。典型的には、本開示に従って作製されたワクチン及び／又は免疫原性組成物は、そのような組成物について通例として用いられる薬学的に許容されるキャリア又は希釈液を含む。キャリアは、これに限られるものではないが、安定剤、防腐剤及びバッファを含む。好適な安定剤は、例えばSPGA,Tween組成物（例えば、A.G, Scientific, Inc., San Diego, CAより入手可能）、糖質（例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン、グルタミン酸塩、又はグルコース）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミン、又はカゼイン）又はそれらの分解物である。好適なバッファの非限定的な例は、アルカリ金属リン酸塩を含む。好適な防腐剤は、チメロサール、メルチオレート及びゲンタマイシンである。希釈剤は、水、水性バッファ（例えば緩衝食塩水）、アルコール、又はポリオール（例えばグリセロール）である。
【００５０】
開示されたタンパク質又は免疫原性組成物を用いてインフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘導する方法が、同様にここで開示されている。一般的に、タンパク質又は免疫原性組成物は、対象のインフルエンザウイルス感染の抑制及び／又はインフルエンザウイルス感染の治療のために効果的な量が、皮下、皮内、粘膜下又は筋肉注射として投与される。効果的な量は、伝染力の強いウイルスによる抗原投与に対して、ワクチンを接種された動物内で免疫を誘導する免疫タンパク質又は免疫原性組成物の量として決定される。ここでは、免疫とは、ワクチンを接種していない群と比較してワクチン接種後の動物の個体数において有意に高いレベルの防御を誘導すること、と定義される。
【００５１】
防御免疫反応は、液性免疫反応と細胞性免疫反応とを含みうる。インフルエンザに対する防御は、主には表面タンパク質を対象とする血清抗体（液性免疫反応）を介して与えられ、粘膜のIgA抗体及び細胞性免疫反応も機能を果たすと考えられている。細胞性免疫反応は、十分に証明されているCD4+及びCD8+T細胞反応を用い、インフルエンザウイルス感染に対する保護に有用である。CD8+免疫は、ウイルス感染した細胞を殺す点が特に重要である。
【００５２】
更に、タンパク質及び／又は免疫原性組成物の様々な製剤において、適切な賦形剤、安定剤等が添加されてもよく、それらは当業者にはよく知られている。
【００５３】
開示されているタンパク質、免疫原性組成物及び方法は、インフルエンザウイルスの感染を受けやすい対象である、これに限られるものではないが、例えば、ヒト、霊長類、家畜、野生動物又は鳥における、インフルエンザウイルスの感染を抑制するために使用されてもよい。
【００５４】
実施例
実施例１
H5N1ウイルスの組換え型免疫原タンパク質の構成及び実験
Fdと融合させたH5N1型IAVの２４アミノ酸M2eドメイン（M2eの1-24残基）と２８アミノ酸FPドメイン（HA2の１−２８残基）とをコードする遺伝子は、鋳型としてM2eを含むプラスミドとH5N1型IAV(A/Anhui/1/2005(H5N1))の全長HAプラスミドとをPCR法によって増幅させ、オーバーラッピングプライマーを用いてFdフラグメントと一緒に融合させ、続いて、pFUSE-hlgG1-Fc2発現ベクターに挿入し、H5N1 M2e-FP-FdFc（以下、M2e-FP-FdFc）を作製した。比較のため、増幅させたH5N1 M2e-FP遺伝子又はM2e遺伝子も、上記の発現ベクターに直接挿入し、それぞれM2e-FP-Fc、M2e-Fcを作製した（図１）。H7N9 M2e-FP-FdFc(例えばM2e-FP-FdFc)は、H7N9(A/Anhui/1/2013(H7N9))インフルエンザウイルスのM2e及びFP配列をPCR増幅させ、オーバーラッピングプライマーを使用してFdと融合させ、その後、pFUSE-hlgG1-Fc2発現ベクターに挿入することによって、構成した。配列が確認された組換えプラスミドは、哺乳類293T細胞内にリン酸カルシウム法によってトランスフェクトされ、関連付けられた組み換えタンパク質は、採取された培養上清を使ったプロテインAアフィニティクロマトグラフィによって精製された。発現タンパク質は、M2e及びHA2特異的モノクロナール抗体を用いたSDS-PAGE及びウエスタンブロットによって、発現と特異性について確認した(図２)。
【００５５】
３つの生成されたH5N1 M2e-FP融合タンパク質は、３週間間隔で３回マウスに免疫を付与させるために使用され、免疫付与前と、各ワクチン接種の１０日後とに、M2e特異的抗体及びFP特異的抗体の生成とサブタイプとを検出するため血清を採取した（図３及び４）。ワクチン接種されたマウスについて、クレード1:A/Vietnam/1194/2004(VN/1194)又はクレード2.3.4:A/Ahenzhen/406H/06(SZ/406H)をカバーするH5N1ウイルスの、それぞれ半数致死量の１０倍(10LD50)又は半数致死量の３倍(3LD50)の量の、抗原投与に対して交叉免疫防御が検出された（図５及び６）。抗原投与されたマウスは、２週間にわたってモニタリングされ、生存率（％）を計算した。ウイルス投与の５日後に採取したマウスの肺組織における、ウイルス力価も検出した（図７）。
【００５６】
実験結果は、高純度のトランスフェクト細胞の培養上清内で組換え型H5N1 M2e-FP融合タンパク質が発現され、IAVのM2e及びFPドメインを特にターゲットとするモノクロナール抗体によって認められ得ることを示した。３つの全ての融合タンパク質、特にFd及びFcと融合されたM2e-FP（M2e-FP-FdFc）が、立体配座構造を採る高分子量の分子を形成し得る（図２）。これらの融合タンパク質、とりわけM2e-FP-FdFcは、ワクチン接種されたマウスの血清内で、高い効き目のあるM2e及び／又はFP特異的IgG抗体及びIgG1及びIgG2aサブタイプを誘導し、最新のワクチン接種後にもっとも高い抗体力価に達した。一般的に、M2e-FP-FdFcタンパク質は、高分子量の分子の形成を促進させ、結果的に免疫原性を促進させるFd及びFcの添加に潜在的に起因して、M2e-FP-Fc又はM2e-Fcと比べて、比較的より強い抗体反応を誘導する（図３及び４）。重要なのは、Ｍｅ-FPの組換え型融合タンパク質は、それぞれ半数致死量の１０倍、半数致死量の３倍のH5N1ウイルスVN/1194及びSZ/406Hの実験された株に対して、ワクチン接種されたマウスを防御することができた。特に、M2e-FP-FdFcタンパク質は、半数致死量の３倍の致死量でクレード1:VN/1194及びクレード2.3.4:SZ/406Hウイルスを抗原投与された全てのワクチン接種されたマウスに、完全な交叉防御をもたらす一方、半数致死量の１０倍のこれら２つのウイルスの抗原投与に対しては、ワクチン接種されたマウスの交叉防御は７０％であった。比較すると、M2e-FP-Fc、特にM2e-Fcは有意に低い防御率を示した。PBSコントロール群のマウスは、２つのウイルス株の抗原投与に対して、９−１１日後は一匹も生存していなかった（図５及び６）。従って、それぞれH5N1ウイルスVN/1194及びSZ/406Hを半数致死量の３倍及び半数致死量の１０倍を用いた致死的な抗原投与の後、M2e-FP-FdFcを用いたワクチン接種されたマウスにおいて、より低いレベルのウイルス力価が検出され、続いてM2e-FP-Fc、M2-Fcタンパク質であった。しかしながら、PBSコントロール群のウイルス力価は、全ての実験されたマウス内においてワクチン投与されたグループと比較して、さらに有意に高かった（図７）。H5N9 M2e-FP-FdFcタンパク質を用いてワクチン投与されたマウスの血清における交叉反応の検出は、全ての３つのH5N1融合タンパク質が、ワクチン投与されたマウスにおいて、新しく出現したＡ型鳥インフルエンザウイルスH7N9型のM2e及びFPドメインの保存配列を有する組換え型タンパク質と交叉反応するIgG抗体反応を誘導することができることを示し（図８）、H7N9型IAVの感染に対してH5N1型融合タンパク質が潜在的な保護が示唆された。
【００５７】
上記の結果は、Fd及びFcと融合されたM2e及びFP（M2e-FP-FdFc）の高く保存されたエピト−プ配列を含む、発現された組換え型インフルエンザ免疫原性組成物が、IAVを含む多様なインフルエンザウイルスに対するユニバーサルインフルエンザワクチンへと発展する卓越した潜在性を有しており、将来的なインフルエンザパンデミックを防ぐ能力を示唆している。
【００５８】
他が示されている場合を除き、明細書及び請求項中で用いられている構成要素の量、分子量のような性質、反応条件及びその他、を表す全ての数字は、「約」という単語によって、全ての例において変更されると理解されるべきである。従って、正反対なことが指摘されている場合を除き、明細書及び添付の請求項で説明されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする望ましい特性によって変化しうる概ねの値である。少なくとも、請求項の範囲と同等の原理の出願を限定するような試みはなされるべきではなく、それぞれの数値パラメーターは、報告されている重要な数字を踏まえ、そして一般的な切り上げ方法を適用することによって、少なくとも理解されるべきである。発明の広い範囲を明らかとする数的範囲とパラメーターとは概ねの値ではあるが、特定の例で説明されている数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、何れの数値も、それぞれの実験測定において見られる一般的な逸脱から生ずる必然的なエラーを本質的に含んでいる。
【００５９】
発明を説明する文脈中（特に以下の請求項の文脈中）で用いられている"a"、"an"、"the（前記）"及び類似の指示物は、ここで示されている他、又は明確に文脈から否定されている場合を除き、単数及び複数をカバーするものと理解されるべきである。ここで値の範囲の記述は、その範囲内に入る離れた各数値を示す省略方法として機能させることを単に意図するものである。特に他が示されていない限り、各個別の数値は、それがあたかも個別にここで示されているかのように、明細書中に取り込まれる。ここで説明されている方法は、他が示されていない限り、又は明確に文脈上否定されていない限り、いずれの適した順番で実施されうる。いずれの、又は全ての例の使用、又はここで使用されている例示する言語（例えば、"such  as"）は、発明をより明らかにすることを意図しており、クレームされた他の発明の範囲に限定させるものではない。明細書中の言語は、クレーム化されていない発明の実施にとって本質的な要素を示していると、理解されるべきではない。
【００６０】
ここで開示されている発明の代わりの要素又は実施形態の分類は、限定と理解されるべきではない。各群の要素は、参照され、個別又はグループの他の要素又はここで見られる別の要素と組み合わせてクレームされる。グループの１つ又は複数の要素は、利便性及び／又は特許性の理由から１つのグループに含まれる、若しくはグループから削除され得ることが、予想される。そのような包含若しくは削除が生じた場合、明細書は、グループを含み、添付の請求項で用いられているマーカッシュ群の表現を満たすよう、に意図される。
【００６１】
本発明のある実施形態が、ここで開示されており、発明を実施にとって発明者に知られているベストモードを含む。もちろん、これらの開示されている実施形態における変形例は、説明をよめば当業者にとっては明白であろう。発明者たちは、当業者がそのような適切な変形を採ることは予期しており、発明者は、本発明が特にここで開示した以外の他の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、これに適用される法によって認められるように、全ての変形例を含み、添付の請求項に示された主題と同等なものを含む。更には、全ての可能な変形例における上述した要素のいずれの組み合わせも、他が示されている、又は文脈から明確に否定されている場合を除き、発明に包含される。
【００６２】
ここで開示されている特定の実施形態は、consiting of（からなる）又はconsistiong essentially of languegeを用いたクレームにおいて限定され得る。出願時又は補正による追加であろうと、クレーム内で用いられる場合、"consisting of"という移行部の単語は、クレーム中で特定されていない要素、ステップ又は構成要素を排除する。"consisting essentially of"という移行部の単語は、特定の材料又はステップに請求項の範囲を限定し、そして、基礎の又は普通の特性に物質的に影響を与えない。クレーム化された発明の実施の形態は、本質的に又は明確に、ここで開示されており、実施可能である。
【００６３】
更に、この明細書を通じて、特許及び公開公報に対して引用番号が付されている。上述した引用文献及び公開公報は、引用によってその全体がここに個別に取り込まれる。
【００６４】
最後に、ここで開示された実施形態は、本発明の原理を説明するものであると理解されるべきである。採用され得る他の修正は、本発明の範囲に入る。このように、限定ではなく例示によって、ここに教示されている範囲内で本発明の代替の構成を利用してもよい。従って、本発明は、正確に示されて説明されているものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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