(57)【要約】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有する対象を処置する方法が本明細書に提供されている。さらに具体的には、肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制するためにＳＴＩＮＧの小分子量アゴニストによるマクロファージ、樹状細胞及び／または肝非実質細胞中の自然サイトカイン応答を刺激する方法が本明細書に開示されている。前記方法は、特に慢性ＨＢＶ感染の処置での使用に好適である。ＨＢＶ感染の処置に有用な化合物を同定する方法も、本明細書に開示されている。【選択図】図１０2016535731.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、前記対象に有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、マクロファージ、樹状細胞、肝非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ中の自然サイトカイン応答を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自然サイトカイン応答がサイトカインを介して媒介される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記自然サイトカイン応答が１型インターフェロンを介して媒介される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがフラボノイドを含む、請求項１から４のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項６】
前記フラボノイドが、１０−（カルボキシメチル）９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フラボノイドがＤＭＸＡＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが感染した肝細胞中のＢ型肝炎ウイルスの複製を抑制する、請求項１から７のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがＢ型肝炎ウイルスのキャプシド濃度を減少させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；
条件培地中で前記処置した細胞をインキュベートすること；
前記処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び
前記条件培地とＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞をインキュベートすること
を含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置に有用な化合物を同定する方法。
【請求項１１】
Ｂ型肝炎ウイルスの複製を測定することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記処置ステップが、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ内で自然サイトカイン免疫応答を刺激し、サイトカインを条件培地に放出する、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サイトカインがＩ型インターフェロンを含むが、これに限定されない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記条件培地が、前記感染した肝細胞中のＢ型肝炎の複製を抑制する、請求項１０から１３のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項１５】
関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；
条件培地中の前記処置した細胞をインキュベートすること；
前記処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び
対象に前記条件培地またはその一部を投与すること
を含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法。
【請求項１６】
前記関心対象の化合物が１つ以上のＳＴＩＮＧアゴニストを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、フラボノイドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フラボノイドが、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラボノイドがＤＭＸＡＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせがヒト細胞である、請求項１５から１９のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、変異体ＳＴＩＮＧを発現するように改変される、請求項１５から２０のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、前記処置ステップ前に、変異体ＳＴＩＮＧでトランスフェクトされるかまたはトランスフォームされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異体ＳＴＩＮＧがＳＴＩＮＧ Ｓ１６２Ａである、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが自己細胞である、請求項１５から２３のいずれかひとつに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／８９３，５２６号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本明細書に示した研究は、Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｍ．Ｂｌｏｃｋ博士に対するアメリカ国立衛生研究所の助成金第ＡＩ１０４６３６号によって支援を受けた。アメリカ政府は、本明細書に開示した事項に対して特定の権利を有している。
【０００３】
技術分野
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有する対象を処置する方法を提供する。さらに具体的には、肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制するためにＳＴＩＮＧの小分子量アゴニストによるマクロファージ、樹状細胞及び／または肝非実質細胞中の自然サイトカイン応答を刺激する方法が本明細書に開示されている。開示した方法は、特に慢性ＨＢＶ感染の処置での使用に好適である。ＨＢＶ感染の処置に有用な化合物を同定する方法も、本明細書に開示されている。
【背景技術】
【０００４】
背景
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、炎症性サイトカイン及びケモカインの産生を生じさせる細胞応答を活性化する、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）及び他の多くの受容体などの宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって、ウイルス感染が速やかに認識される。この初期のサイトカイン応答が、ウイルス複製及び拡散を制限するだけでなく、さらに特異的かつ強力な適応免疫応答の発現を組織化し、最終的にウイルスを除去する。ウイルス感染から防御するときのＰＲＲ媒介自然サイトカイン応答の基本的な役割は、ＰＲＲをコードする遺伝子またはそのシグナル成分が欠損したヒト及びマウスがウイルス感染に弱いという事実によって、うまく説明することができる。
【０００５】
感染を確立するために、病原ウイルスは、ＰＲＲ媒介自然免疫応答を回避する及び／またはこれに対応するように多数の機序を発達させた。実際、慢性Ｂ型肝炎を含む多くの慢性ウイルス感染で、ＰＲＲ媒介サイトカイン応答の活性化不良または不全が、観察されることが多く、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ抑制剤による現在の抗ウイルス療法では、治癒をもたらすことができない。
【０００６】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、絶えず世界中で３億５千万人以上に感染している非細胞変性ヘパドナウイルスである。慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、ウイルスを除去するために宿主が十分な免疫応答をマウントすることができないことによるものである。ＨＢＶ感染の転帰及び発生機序は、主として宿主の抗ウイルス免疫応答の性質及び大きさによって決定され、一般に感染時の年齢に関係している。成人感染者の９５％以上が、活発で多クローン性のＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答によって、６ヵ月以内で自然に除去されるが、暴露した新生児の９０％超及び１〜５歳の小児の約３０％が、慢性感染を発現する。これは、弱く、ほとんど検出されることがないウイルス特異的Ｔ細胞応答と関係している。
【０００７】
長期のヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体治療またはペグ化インターフェロンα（ＩＦＮ−α）治療の有限な持続時間によるウイルス複製の持続性抑制は、肝疾患の改善、肝代償機能障害の予防及び肝細胞癌罹病率及び死亡率の減少と関係している。しかし、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）血清学的陽性転換、感染の完全で持続性のある抑制によるＨＢＶに対して成功する免疫応答の特徴、または「機能的治癒」が、現在の治療で達成されるのはまれである。
【０００８】
ＴＬＲ及びＲＬＲアゴニストの抗ウイルス有効性が、ＨＢＶトランスジェニックマウス、ならびにＷＨＶまたはＤＨＢＶに感染した動物で認められているが、抗ウイルス効果を実現するために必要な用量のＰＲＲアゴニストの全身投与は、通常、広範囲の細胞応答及び炎症性サイトカインの大量産生の活性化による有意な有害作用と関係している。
【発明の概要】
【０００９】
前記対象に有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法が本明細書に開示されている。
【００１０】
また、関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；条件培地中で前記細胞をインキュベートすること；処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び条件培地とＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞をインキュベートすることを含むＢ型肝炎ウイルス感染の処置に有用な化合物を同定する方法が、提供されている。
【００１１】
また、関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；条件培地中で前記細胞をインキュベートすること；処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び前記対象に前記条件培地またはその一部を投与することを含むＢ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法が、本明細書に提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
添付した図面とともに読むと、概要、ならびに以下の詳細な説明がさらに理解される。開示した方法を示す目的で、図面に当該方法の例示的な実施形態が示されている；しかし、当該方法は開示した具体的な実施形態に限定されない。図面において：
【図１】図１Ａ〜１Ｃを含む図１は、Ａ）アッセイ戦略の例示的な図；Ｂ）ＴＬＲアゴニスト（直接処置）またはＴＬＲアゴニストで処置したＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地（間接処置）を含有する培地によるＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の処置及びＣ）ＴＬＲアゴニストで処置したＲＡＷ２６４．７細胞から採集した条件培地によるＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の間接処置を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂを含む図２は、Ａ）自然免疫エンハンサーとしてＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅライブラリーから同定した例示的なフラボノイドの構造；及びＢ）７，２'−ジヒドロキシフラボン化合物で直接処置したＡＭＬＨＢＶ１０細胞、または７，２'−ジヒドロキシフラボン化合物で処置したＲＡＷ２６４．７細胞からの条件培地で間接処置したＡＭＬＨＢＶ１０細胞の分析を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄを含む図３は、Ａ）例示的なマウスＩＦＮインデューサーの構造；Ｂ）ＤＭＸＡＡ（上段パネル）、ＣＭＡ（中段パネル）、チロロン（下段パネル）で直接処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞（直接処置）または１２時間、各化合物で処置したＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地で間接処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の例示的な分析；Ｃ）モック処置したかまたは１２５μＭのＤＭＸＡＡまたは１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置したＲＡＷ２６４．７及びＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の例示的な分析及びＤ）低用量のＤＭＸＡＡで直接または間接処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の例示的な分析を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅを含む図４は、ＤＭＸＡＡ、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４で直接処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞、またはＤＭＸＡＡまたはＴＬＲアゴニストで処置したＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地で間接処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の例示的な分析を示す。Ａ）細胞内ＨＢＶのＲＮＡは、ノーザンブロットによって測定した；Ｂ）ＨＢＶコアタンパク質は、ウェスタンブロットによって測定した；Ｃ）ＨＢＶキャプシドは、天然アガロースゲルアッセイによって測定した；Ｄ）キャプシド関連ＨＢＶのＤＮＡは、天然アガロースゲルアッセイによって測定した；及びＥ）細胞質ＨＢＶコアＤＮＡは、サザンブロットハイブリダイゼイションによって測定した。
【図５】図５Ａ〜５Ｅを含む図５は、示した時間、Ａ）１２５μＭのＤＭＸＡＡ、Ｂ）１μｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２アゴニスト）、Ｃ）３μＭのガーディキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）、Ｄ）１０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）、またはＥ）１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）で処置したＲＡＷ２６４．７細胞の例示的なウェスタンブロット分析を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｇを含む図６は、示した時間、１２５μＭのＤＭＸＡＡ、１μｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２アゴニスト）、１０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）または３μＭのガーディキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）で処置したＲＡＷ２６４．７細胞の例示的なＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。Ａ）ＩＦＮ−β、Ｂ）ＩＬ６、Ｃ）ＩＬ１、Ｄ）ＩＬ１０、Ｅ）ＴＮＦ−α、Ｆ）ＩＬ１２、及びＧ）ＣＸＣＬ１０の分析データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対する遺伝子発現の誘導倍率として示した。
【図７】図７Ａ〜７Ｃを含む図７は、抗Ｉ型インターフェロン受容体ＩＦＮＡＲ１（ＡｂＩＮＦＡＲ）単クローン性抗原と（円）またはこれなしで（正方形）事前にインキュベートし、続いて、Ａ）ｍＩＦＮ−αまたはＢ）ＤＭＸＡＡで処置したＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地で処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の例示的なＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝４）は、モック処置した対照（ＮＴ）のパーセンテージとして、示している。Ｃ）ＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αで処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを分析した。
【図８】図８Ａ〜８Ｄを含む図８は、Ａ）親細胞ＲＡＷ２６４．７細胞（ＷＴ）及びスクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ）またはマウスＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＴＩＮＧ）を発現するＲＡＷ２６４．７由来安定細胞系から抽出した総ＲＮＡの例示的な分析を示す。ＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ濃度は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定し、データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、ＷＴＲＡＷ２６４．７細胞中のＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡのパーセンテージとして示した。Ｂ）ｓｈｃｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＳＴＩＮＧを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞系をモック処置した、または３０分間、１２５μＭのＤＭＸＡＡで処置した。ＳＴＩＮＧ及びＴＢＫ１の発現及び活性化は、ウェスタンブロットアッセイによって測定した。１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置した細胞を対照とした。β−アクチンを負荷対照とした。Ｃ）ＳＴＩＮＧのノックダウンが、ＤＭＸＡＡ誘導ＩＦＮ−β遺伝子発現を阻害した。３時間、ＲＡＷ２６４．７由来ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ及びｓｈＳＴＩＮＧ細胞系を１２５μＭのＤＭＸＡＡで処置した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、ＩＦＮ−βｍＲＮＡを定量化した。データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対する遺伝子発現の誘導倍率として示した。Ｄ）ＳＴＩＮＧのノックダウンがＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス活性を抑制した。１日、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を、モック処置した、あるいはＲＡＷ２６４．７由来ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ、または１２時間、ＤＭＸＡＡ、ＬＰＳもしくはガーディキモドで処置したｓｈＳＴＩＮＧ細胞から採集した５０％の条件培地で、２日間、処置した。細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイによって定量化した。モック処置したＲＡＷ２６７．４細胞からの条件培地で処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を対照とした（ＮＴ）。ＨＢＶのＤＮＡ濃度（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、ＮＴ対照に対するパーセンテージとして示した。ステューデントｔ検定によってデータを統計的に分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示している。
【図９】図９Ａ〜９Ｃを含む図９は、ＨＢＶ流体力学的マウスモデルのＤＭＸＡＡの例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ分析を示す。ＨＢＶ  １．３ｍｅｒプラスミドの流体力学的注入の７日後、腹腔内注入による単一２５ｍｇ／ｋｇ用量のＤＭＸＡＡまたはビヒクルでマウスを処置した。Ａ）処置の２４時間後、肝からＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイによって分析した。対照群（マウス１０匹）及び処置群（マウス９匹）プロットは、投入プラスミドコピーのサブトラクション後の各動物のＨＢＶＤＮＡコピー／ｍｌを示す。マウスの肝からの、Ｂ）ＯＡＳ１ｂ及びＣ）ｖｉｐｅｒｉｎのｍＲＮＡ濃度全データは、中央値、四分位ならびに範囲（最小値、最大値）を示すためにボックスプロットに示し、ステューデントｔ検定によって統計的に分析した（Ｐ＜０．０５）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂを含む図１０は、ＴＨＰ−１細胞中のヒトＳＴＩＮＧ経路誘導サイトカイン応答及びヒト肝細胞癌細胞中の抗ウイルス作用の活性化の例示的な分析を示す。Ａ）２時間、ＤＭＸＡＡで処置したヒトＳＴＩＮＧのＳ１６２Ａ変異型を発現しているＴＨＰ−１ｈＳＴＩＮＧＳ１６２細胞からのＩＦＮ−βのｍＲＮＡ発現濃度データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対して正規化後の相対的遺伝子発現として示した（倍率）。Ｂ）１２時間、ＤＭＸＡＡで処置したＴＨＰ−１ｈＳＴＩＮＧＳ１６２細胞からの上清で処置したＤＥＳ１９細胞ＨＢＶのＤＮＡ発現濃度（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、モック処置した対照に対するパーセンテージとして示した。ＩＦＮ−αで処置したＤＥＳ１９細胞を陽性対照とした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示した方法は、この開示の一部を形成する添付図に関係した以下の詳細な説明を参照することによって、さらに容易に理解することができる。開示した方法は、本明細書に記載した、及び／または示した具体的な方法を限定するものではなく、本明細書に用いられる用語は、実施例によって特定の実施形態を記載する目的だけのためにあり、クレームされた方法を限定することを意図していないと理解しなければならない。
【００１４】
このほか、単一の実施形態と組み合わせて、明確さのために個々の実施形態の文脈で本明細書に記載して、開示した方法の特定の特徴を提供することができると理解される。反対に、このほか、別にまたは任意の副組み合せに、簡潔のため単一の実施形態の文脈に記載して、開示した方法のさまざまな特徴を提供することができる。
【００１５】
本明細書に用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形を含む。
【００１６】
以下の略名が、本明細書全体を通して用いられる：ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス感染）；ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）；ＰＲＲ（パターン認識受容体）；ＣＭＡ（１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン）；ＤＭＸＡＡ（５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸）；ｈＳＴＩＮＧＳ１６２（Ｓ１６２Ａ変異を含むヒトＳＴＩＮＧ）。
【００１７】
本明細書に用いる場合、「処置すること」及び類似の用語は、慢性ＨＢＶ症状の重症度及び／または頻度を減少させること、ＨＢＶ症状及び／または前記症状の原因を除去すること、ＨＢＶ症状及び／またはその原因の頻度または尤度を減少させること、ならびに、ＨＢＶによって、直接または間接に生じた損傷を改善する、または治療することを指す。
【００１８】
本明細書に用いる場合、「前記患者に投与する」及び類似の用語は、ＳＴＩＮＧアゴニストまたは条件培地もしくはその一部が、患者に提供され、その結果、対象の身体の標的細胞、組織、またはセグメントが、条件培地からの活性成分と接触する手順を示す。ＳＴＩＮＧアゴニストまたは条件培地もしくはその一部を投与する好適な方法は、注入または経口デリバリーを含む。
【００１９】
用語「対象」は、本明細書に用いる場合、任意の動物、特に、哺乳動物を意味することを意図する。マウスのＨＢＶ複製のＳＴＩＮＧアゴニスト誘導抑制が本明細書に例示されているが、開示した方法を用いて任意の種類の哺乳動物を処置することができる。このように、当該方法は、好ましくはマウス及びヒト、最も好ましくはヒトに用いられるが、ヒト及び非ヒト動物に適用することができる。「対象」及び「患者」は、交換可能に本明細書に用いられる。
【００２０】
用語「条件培地」は、本明細書に用いる場合、培養した細胞から採集される培地を指す。
【００２１】
前記対象に有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法が本明細書に提供されている。
【００２２】
ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）が、細菌のセカンドメッセンジャー、環状ジ−アデノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ）及び環状ジ−グアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を認識する、多数の細胞質ＤＮＡ受容体及びパターン認識受容体（ＰＲＲ）のアダプターであることが当業者に知られている。細胞質ＤＮＡが、環状グアノシン一リン酸−アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）生成酵素（ｃＧＡＳ）に結合し、環状グアノシン一リン酸−アデノシン一リン酸（環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、またはｃＧＡＭＰ）を生成し、その後、アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧに結合し、活性化し、ＩＦＮを誘導する。ＳＴＩＮＧは、５つの推定上の膜貫通領域を含み、主として小胞体に存在し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３転写経路をともに活性化し、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）の発現を誘導し、発現後に強力な抗ウイルス状態とすることができる。
【００２３】
ＳＴＩＮＧアゴニストは、マクロファージ、樹状細胞、肝非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ中の自然サイトカイン応答を刺激することができる。このため、いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストがマクロファージ中の自然サイトカイン応答を刺激することができる。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストが樹状細胞中の自然サイトカイン応答を刺激することができる。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストが肝非実質細胞中の自然サイトカイン応答を刺激することができる。さらに他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストが前記に示した細胞の任意の組み合わせ中の自然サイトカイン応答を刺激することができる。
【００２４】
ＳＴＩＮＧアゴニストによる自然サイトカイン応答の刺激はサイトカインを介して媒介される。いくつかの実施形態では、例えば、自然サイトカイン応答は、１型インターフェロンを介して媒介することができる。
【００２５】
開示した方法に使用するのに好適なＳＴＩＮＧアゴニストとしては、フラボノイドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、フラボノイドを含むことができる。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、フラボノイドからなるものとすることができる。好適なフラボノイドとしては、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）とすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）とすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、メトキシボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、６，４'−ジメトキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、４'−メトキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３'，６'−ジヒドロキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、７，２'−ジヒドロキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ダイゼインとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ホルモノネチンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、レツシン７−メチルエーテルとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、キサントンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、前記フラボノイドの任意の組み合わせとすることができる。このため、例えば、いくつかの実施形態ではフラボノイドがＤＭＸＡＡを含む。
【００２６】
ＨＢＶを有する対象にＳＴＩＮＧアゴニストを投与すると、感染した肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストがＢ型肝炎ウイルスキャプシド濃度を減少させることができる。
【００２７】
また、Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置に有用な化合物を同定する方法が、本明細書に提供されている。ＨＢＶ感染の処置に有用な化合物を同定するために細胞培養系が確立されている。図１Ａに示したとおり、例示的な細胞培養系は、マクロファージのサイトカイン応答を活性化し、続いて肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する化合物の同定のために、マウスマクロファージ肝細胞を組み合わせた細胞培養系を含むことができる。この細胞培養系を用いて、ＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、ＤＭＸＡＡが、主にＩ型ＩＦＮによって媒介され、ウイルスキャプシドを減少させることによってＨＢＶ複製を抑制する強力な抗ウイルス応答を誘導することが示されている。
【００２８】
このため、いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染の処置に有用な化合物を同定する方法が、１）関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；２）条件培地中で前記細胞をインキュベートすること；３）処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び４）条件培地とＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞をインキュベートすることを含む。
【００２９】
いくつかの態様では、当該方法が、関心対象の化合物で肝固有樹状細胞を処置することを含む。他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物でマクロファージを処置することを含む。他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物で非実質細胞を処置することを含む。さらに他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物で前記細胞型の任意の組み合わせを処置することを含む。
【００３０】
さまざまな細胞型を培養するための条件及び培地が、当業者に知られている。マクロファージは、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）中で培養することができる。それゆえに、いくつかの実施形態では、条件培地は、培養したマクロファージから採集した、ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、当該方法が、さらにＢ型肝炎ウイルス複製を測定することを含む。ＨＢＶ複製を測定するために、これらに限定されないが、サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡ複製中間体（ＲＣ、ＤＳＬ及びＳＳ）を測定することまたはリアルタイムＰＣＲによって総ＨＢＶコアＤＮＡを測定すること；ノーザンブロットによって細胞内ＨＢＶＲＮＡ（ＨＢＶエンベロープタンパク質を指定するｐｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を測定すること；ウェスタンブロットアッセイによってＨＢＶコアタンパク質を測定すること；天然アガロースゲル電気泳動に続いて、ニトロセルロース膜への移動によってＨＢＶキャプシド及びキャプシド関連ウイルスＤＮＡを測定すること；サザンブロットハイブリダイゼイションによってキャプシド関連ＨＢＶＤＮＡを測定すること；またはこれらの任意の組み合わせを含む、多くの技術が当該技術分野に知られている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせの処置が、自然サイトカイン免疫応答を刺激することができ、肝細胞のＢ型肝炎ウイルス複製を抑制することができる。例えば、当該処置ステップは、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ内で自然サイトカイン免疫応答を刺激し、サイトカインを条件培地に放出することができる。いくつかの態様では、サイトカインとしては、Ｉ型ＩＦＮが挙げられるが、これらに限定されない。当該条件培地は、続いて、感染した肝細胞中のＢ型肝炎複製を抑制することができる。
【００３３】
肝細胞がＨＢＶの主な宿主細胞であるが、肝非実質細胞（ＮＰＣ）が、効果的なＨＢＶ特異的抗ウイルス免疫の引き金となる重要な役割を演じることが示されている。例えば、肝マクロファージが活性化すると、マウスの肝中のＨＢＶに対する成功した免疫応答の引き金を調節する、特徴的なプロファイルのサイトカイン／ケモカインの発現を誘導する。
【００３４】
また、１）関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；２）条件培地中で前記細胞をインキュベートすること；３）処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び４）対象に前記条件培地またはその一部を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法が、本明細書に提供されている。
【００３５】
いくつかの態様では、当該方法が、関心対象の化合物で肝固有樹状細胞を処置することを含む。他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物でマクロファージを処置することを含む。他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物で非実質細胞を処置することを含む。さらに他の態様では、当該方法が、関心対象の化合物で前記細胞型の任意の組み合わせを処置することを含む。
【００３６】
当該方法に使用される関心対象の化合物としては、１つ以上のＳＴＩＮＧアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、フラボノイドを含むことができる。好適なフラボノイドとしては、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）とすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）とすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、メトキシボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、６，４'−ジメトキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、４'−メトキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３'，６'−ジヒドロキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、７，２'−ジヒドロキシフラボンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ダイゼインとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ホルモノネチンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、レツシン７−メチルエーテルとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、キサントンとすることができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、前記フラボノイドの任意の組み合わせとすることができる。このように、例えば、いくつかの実施形態ではフラボノイドがＤＭＸＡＡを含む。
【００３７】
開示した方法に使用される肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、任意の好適なソースから得ることができる。好ましくは、肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、哺乳動物のものである。いくつかの態様では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、マウス細胞とすることができる。いくつかの態様では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、ヒト細胞とすることができる。このように、いくつかの実施形態では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせは、ヒト細胞である。
【００３８】
肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、野生型細胞とすることができる、または改変細胞とすることができる。本明細書に用いる場合、「改変細胞」は非天然、非野生型、変異体、または濃度を変えたＤＮＡ及び／またはタンパク質を含有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、変異体ＳＴＩＮＧを発現するように改変される。いくつかの実施形態では、変異体ＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧＳ１６２Ａとすることができる。
【００３９】
改変細胞を生成するために、トランスフェクションまたはトランスフォーメーションを含む多くの技術が、当該技術分野に知られている。いくつかの実施形態では、ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、処置ステップ前に、変異体ＳＴＩＮＧでトランスフェクトされまたはトランスフォームされる。
【００４０】
肝固有樹状細胞、マクロファージ、及び／または非実質細胞は、多くの好適なソースからのものとすることができる。いくつかの態様では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、自己細胞である。他の態様では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、アロジェニック細胞である。さらに他の態様では、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、異種からの細胞である。
【実施例】
【００４１】
材料及び方法
細胞培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣＴＩＢ−７１）及びＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を維持した。Ｘｕ  Ｃらが記載したとおり、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０、テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導で、高濃度のＨＢＶ複製を支持する永久増殖マウス肝細胞（ＡＭＬ１２）由来細胞系を維持した。インターフェロンが、Ｂ型肝炎ウイルスの複製能ヌクレオキャプシドの崩壊を加速する。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１０；８４：９３３２−４０，ａｎｄ Ｃａｍｐａｇｎａ ＭＲ，ｅｔａｌ．Ｓｕｌｆａｍｏｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ２０１３．
【００４２】
試薬
Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからＤＭＸＡＡ、ＣＭＡ及び２，７−ビス［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］−９−フルオレノン（チロロン）を購入した。ＴＬＲ１／２アゴニスト Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＴＬＲ３アゴニスト ｐｏｌｙＩ：Ｃ、ＴＬＲ４アゴニスト リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＴＬＲ７アゴニスト ガーディキモドは、Ｉｎ  ｖｉｖｏｇｅｎからのものであった。遺伝子組換えマウスＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αは、ＰＢＬインターフェロンソースからのものであった。ＨＢＶコアタンパク質の抗カルボキシル末端側１４アミノ酸抗原について、以前にＸｕ  Ｃらが記載した。インターフェロンが、Ｂ型肝炎ウイルスの複製能ヌクレオキャプシドの崩壊を加速する。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１０；８４：９３３２−４０．抗β−アクチン抗体及びマウスＩＦＮＡＲ−１は、それぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。抗マウスＳＴＩＮＧ抗体、ＴＢＫ１、Ｓ１７２−リン酸化ＴＢＫ１、ＩｋＢα、ｐ３８、リン酸化−ｐ３８、ＪＮＫ、リン酸化−ＪＮＫ、ＥＲＫ、リン酸化−ＥＲＫは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。プラスミドｐＴｍｃｓ−ＨＢＶ１．３及びｐＣＭＶ−ＳＢは、Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｖ．  Ｃｈｉｓａｒｉ博士（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から快く提供を受けたものであった。
【００４３】
ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＲＮＡ及びヌクレオキャプシドの分析
ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞からのＨＢＶコアＤＮＡ抽出ならびにサザンブロットハイブリダイゼイション及びリアルタイムＰＣＲアッセイによる分析は、以前にＸｕ  Ｃらが記載したとおりであった。インターフェロンが、Ｂ型肝炎ウイルスの複製可能ヌクレオキャプシドの崩壊を加速する。Ｊ Ｖｉｒｏｌ２０１０；８４：９３３２−４０，ａｎｄ ＣａｍｐａｇｎａＭＲ，ｅｔａｌ．Ｓｕｌｆａｍｏｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１３．ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全細胞ＲＮＡを抽出した。α−３２Ｐ−ＵＴＰ−標識完全長マイナス鎖ＲＮＡプローブによるノーザンブロットハイブリダイゼイションによってＨＢＶのＲＮＡを分析した。天然アガロースゲル電気泳動に続いて、ニトロセルロース膜への移動によって、ＨＢＶキャプシド及びキャプシド関連ウイルスＤＮＡを分析した。抗ＨＢＶコアタンパク質抗原を含む膜をプローブし、続いて、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムで視覚化することによってＨＢＶキャプシドを検出した。放射能標識ＨＢＶリボプローブによるハイブリダイゼイションによって、キャプシド関連ＤＮＡを検出した。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲアッセイ
サイトカイン遺伝子発現の分析のために、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて総ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、定量リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイに用いられるプライマーが、表１に示されている。ＨＢＶのＤＮＡを検出するためにリアルタイムＰＣＲに用いられるプライマーも表１に示されている。
【００４５】
【表１】
2016535731.tif 000003
【００４６】
ＳＴＩＮＧノックダウン細胞系の生成
特異的にマウスＳＴＩＮＧを標的とするｓｈＲＮＡを発現しているプラスミドは、以下のｃＤＮＡ配列をｐＲＳベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）に挿入することによって構築される：
2016535731.tif 000004
。ＯｒｉｇｅｎｅからｐＲＳベクターからのスクランブルｓｈＲＮＡを発現している対照プラスミドを購入した。以前にＺｈａｏ  Ｘらが報告したとおり、スクランブルｓｈＲＮＡまたはＳＴＩＮＧ特異的ｓｈＲＮＡを発現している、ｐＣＭＶ／ＶＳＶ−Ｇ及びｐＲＳベクター由来プラスミドを用いたＧＰ２−２９３細胞中のＶＳＶ Ｇタンパク質偽型レトロウイルスのパッケージが、必要不可欠である。ＩＦＩＴＭタンパク質のインターフェロン誘導が、ヒトコロナウイルスＯＣ４３による感染を促進する。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ２０１４．以前にＺｈａｏ  Ｘらが記載したとおり、各ｓｈＲＮＡを発現している偽型レトロウイルスにより、ＲＡＷ２６４．７細胞を形質導入した。
【００４７】
ＨＢＶのＤＮＡ流体力学的マウスモデルのＤＭＸＡＡの抗ウイルス有効性
Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から１０週齢メスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを購入した。動物実験委員会の承認のもと全実験を実施した。ＨＢＶ流体力学的モデルを確立するため、前記に記載した手順に従って、尾静脈を介して、１．３ｍｅｒ  ＨＢＶゲノムを発現している１３．５μｇのプラスミドｐＴｍｃｓＨＢＶ１．３及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゼースを発現している４．５μｇのｐＣＭＶ−ＳＢを注入した。注入７日後、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＤＭＸＡＡの有効性を試験するため、腹腔内注入を介して２５ｍｇ／ｋｇのＤＭＸＡＡ（７．５％炭酸水素ナトリウムを含むＰＢＳ中で）またはビヒクルのいずれかでマウスを処置した。処置２４時間後に、マウスを殺処分した。肝内ＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて定量化した。肝内総ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによってインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）ＯＡＳ１ｂ及びｖｉｐｅｒｉｎのｍＲＮＡを測定した。処置前及び２４時間後に、個々のマウスの体重をモニターした。
【００４８】
実施例１−ＨＢＶに対するＰＲＲアゴニスト誘導抗ウイルス応答を評価するための細胞培養系の確立
多くの種類の体細胞に偏在的に発現するＲＩＧ−Ｉ−様受容体と異なり、ＴＬＲ及びｃＧＡＳなどの他のＰＲＲの発現は、通常、マクロファージ、樹状細胞及びいくつかの他の細胞型に限定される。ＴＬＲなどのＰＲＲの発現を欠く、または少量の発現のために、肝細胞を処置しても、通常、強固なサイトカイン応答を誘導しない。例えば、ＴＬＲアゴニストで肝細胞を直接処置すると、ごくわずかなサイトカイン応答を誘導する。しかし、肝固有樹状細胞、マクロファージ（クッパー細胞）及び他の肝非実質細胞（ＮＰＣ）は、高濃度のＴＬＲを発現し、このため、ＴＬＲアゴニストに応答し、炎症性サイトカインを生成する。
【００４９】
慢性Ｂ型肝炎の処置のために小分子量ＰＲＲアゴニストを選別するために、肝内環境とよく似た細胞系アッセイを開発した。図１Ａに示した、このユニークな細胞培養系は、ＨＢＶに感染した肝の状態によく似ている。具体的には、試験化合物でマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を処置し、その後、ＨＢＶが潜んでいる永久増殖マウス肝細胞（ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０）に処置したマクロファージの条件培地を適用し、マクロファージ中の化合物誘導抗ウイルスサイトカイン応答を試験した。
【００５０】
実施例２−ＴＬＲアゴニストがマクロファージ中の強力なサイトカイン応答を誘導し、肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する：概念実証実験
最初に公知のＴＬＲアゴニストでアッセイ系を実証した。１２−ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度でＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を播種し、テトラサイクリンの不存在下で培養した。２４時間後、細胞を示した濃度のＴＬＲアゴニストで処置（直接処置）した（図１Ｂ）。あるいは、ＴＬＲアゴニスト処置ＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地を含有する培地でＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を処置した（１２−ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの密度で培養し、１２時間、示した濃度のＴＬＲアゴニストで処置した）（間接処置）。処置２日後、サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを分析した。ＲＣ、弛緩型環状ＤＮＡ。ＤＳＬ、二本鎖直鎖ＤＮＡ。ＳＳ、一本鎖ＤＮＡ。ＮＴ、未処置対照であり、モック処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞からの試料（直接処置対照）またはモック処置したＲＡＷ２６４．７細胞からの５０％培地で処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞からの試料（間接処置対照）であった。図１Ｂに示したとおり、ＴＬＲ１／２（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ３（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）またはＴＬＲ７（ガーディキモド）のアゴニストを含むＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の直接処置では、明白にＨＢＶのＤＮＡ複製を抑制しなかったが、ＴＬＲアゴニスト処置したマクロファージから採集した条件培地でのＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞の処置（間接処置）では、強力にＨＢＶのＤＮＡ複製を抑制した。
【００５１】
もうひとつの例示的な分析では、一晩、１２−ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの密度で、ＤＭＥＭ培地中のＲＡＷ２６４．７細胞を播種し、１２時間、示した用量のＴＬＲアゴニストで処置した（図１Ｃ）。１日、１２−ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で、テトラサイクリンの不存在下で、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地で成長したＡＭＬＨＢＶ１０細胞を播種し、ＨＢＶ複製を放出した。その後、処置したＲＡＷ２６４．７細胞からの等量の上清をＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞に移した。処置２日後、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞からＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、サザンブロットアッセイによって検出した。対照ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞には、等量の新鮮なＤＭＥＭ培地（モック）または１２時間、モック処置したＲＡＷ２６４．７細胞から移したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭを含むモック）のいずれかであった。ＴＬＲアゴニストのパネルでＡＭＬ１２ＨＢＶ１０を直接処置しても、ＨＢＶのＤＮＡ複製に効果がなかった（データは示していない）。しかし、ＴＬＲアゴニストで処置したマクロファージからの条件培地でＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を培養すると、ＨＢＶのＤＮＡ複製を強力に抑制した（図１Ｃ）。マクロファージ中のＴＬＲアゴニストによって可溶性サイトカインの分泌が誘導されたと思われる。
【００５２】
このように、ＴＬＲアゴニストが肝細胞中の抗ウイルス応答を直接活性化することはできなかったが、ＴＬＲアゴニストは、肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する可溶性因子を生成するようにマクロファージを誘導する。
【００５３】
実施例３−選択したフラボノイドがマクロファージ中の抗ウイルス応答を誘導し、肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する
マクロファージ中の自然抗ウイルスサイトカイン応答の活性化可能な分子の同定へ向けての最初の取り組みは、２３２０ ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ化合物（ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に向けられた。このコレクションは、合成及び天然由来化合物の化学的クラス及び構造多様性を示すためのスペクトルセレクションであった。ＴＬＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞中のＩＦＮ−βプロモーター活性を向上させる９つの化合物を同定した。興味深いことには、これらの９つの化合物すべてがフラボン、フラボノールまたはイソフラボンであり、フラボノイド構造ファミリーに属している（図２Ａ）。
【００５４】
代表的な化合物７，２'ジヒドロキシフラボンを試験するために、１日、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬＨＢＶ１０細胞を、示した用量（μＭで）（図２Ｂ）の７，２'−ジヒドロキシフラボン化合物で直接処置した、または２日間、（１２時間、用量の化合物で処置したＲＡＷ２６４．７細胞から移した条件培地と培養することによって）間接処置した。ノーザンブロットによって細胞内ＨＢＶのＲＮＡを測定した（リボソームＲＮＡを負荷対照とした）。ＨＢＶコアタンパク質のカルボキシル末端１４アミノ酸に対する抗原を用いたウェスタンブロットアッセイによってＨＢＶコアタンパク質を測定した（β−アクチンを負荷対照とした）。粒子ゲルアッセイによってＨＢＶヌクレオキャプシドを検討し、インタクトヌクレオキャプシド及びキャプシド関連ＨＢＶのＤＮＡをともに検出した。サザンブロットアッセイによってキャプシド形成ＨＢＶ（コアＤＮＡ）の複製中間体（ＲＣ、ＤＳＬ及びＳＳ）を測定した。
【００５５】
図２Ｂに示したとおり、代表的な化合物、７，２'ジヒドロキシフラボンでＲＡＷ２６４．７細胞を処置すると、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞中のＨＢＶに対する抗ウイルス活性を誘導する。理論によって束縛されることを意図しないが、観察した応答は、抗ウイルスサイトカインによって媒介されている可能性が最も高い。
【００５６】
実施例４−マクロファージ中のＤＭＸＡＡが誘導した抗ウイルス応答が、肝細胞中のＨＢＶ複製を強力に抑制した
前記に記載したアッセイ系を用いて、ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ化合物コレクション（ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）の７５のフラボノイドを再び試験した。フラボノイド、７，２'−ジヒドロキシフラボンは、ＨＢＶに対する間接の抗ウイルス活性を示したが、直接の抗ウイルス活性を示さなかった。マウスの３つのフラボノイドまたは強力なＩＦＮ応答インデューサーとして同定したフラボノイド由来化合物（チロロン（ｔｉｌｏｒｉｎｅ）、ＣＭＡ及びＤＭＸＡＡ）（図３Ａ）をさらに分析した。簡潔にいうと、示した濃度のＤＭＸＡＡ（上段パネル）、ＣＭＡ（中段パネル）、チロロン（下段パネル）（直接処置）、またはＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地（１２時間、各化合物で処置した）（間接処置）で、実施例２、図１Ｂに記載したとおり播種し、培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を２日間、処置した。サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを分析した。ＮＴ対照は、図１Ｂ（図３Ｂ）に記載したとおりであった。３０及び６０分間、ＲＡＷ２６４．７及びＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞をモック処置した、または１２５μＭのＤＭＸＡＡまたは１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置した。ウェスタンブロットアッセイによってＳＴＩＮＧの発現及び活性化を測定した。矢印は、ＳＴＩＮＧリン酸化の結果として、ゲル移動度のシフトを示している。β−アクチンを負荷対照とした（図３Ｃ）。低用量のＤＭＸＡＡが用いられたことを除いてパネルＢに記載したとおり、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を直接または間接処置した。２日間、示した濃度のマウスαＩＦＮ（ｍＩＦＮ−α）で処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を陽性対照とした。サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを分析した（図３Ｄ）。
【００５７】
チロロン（ｔｉｌｏｒｉｎｅ）は、直接でも、間接でもＨＢＶ複製を抑制しなかったが、ＣＭＡ及びＤＭＸＡＡは、ともに強力な間接抗ＨＢＶ活性を示した（図３Ｂ）。図３Ｃに示したとおり、ＤＭＸＡＡは、ＲＡＷ２６４．７細胞中のＳＴＩＮＧのリン酸化を効果的に誘導するが、ＬＰＳは誘導しない。ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞が検出不可能な濃度のＳＴＩＮＧを発現する（図３Ｃ）という事実に合致して、ＤＭＸＡＡで肝細胞を直接処置してもＨＢＶＤＮＡ複製を抑制しない。しかし、ＤＭＸＡＡ処置ＲＡＷ２６４．７細胞から採集した条件培地は、マウス肝細胞中のＨＢＶのＤＮＡ複製を用量依存的に抑制する（図３Ｄ）。
【００５８】
実施例５−ＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答が細胞質ＨＢＶキャプシドの量を減少させた
マクロファージ中のＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答によって抑制されるＨＢＶ複製ステップ（単数及び複数）をマップするために、ＴＬＲアゴニストまたはＤＭＸＡＡ処置ＲＡＷ２６４．７細胞から採集した条件培地でＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を処置した。簡潔にいうと、１日、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を、示した濃度のＤＭＸＡＡ、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４で直接処置した、またはＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地（１２時間、示した濃度のＤＭＸＡＡまたはＴＬＲアゴニストで処置した）で間接処置した。処置２日後、以下の分析のために、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を採集した（図４Ａ）：ノーザンブロットによって細胞内ＨＢＶのＲＮＡを測定した（ｐｇＲＮＡ、プレゲノムＲＮＡ、ｅｎｖＲＮＡ、エンベロープタンパク質を指定するウイルスｍＲＮＡ、１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を負荷対照とした）；（図４Ｂ）全細胞ライゼートを用いたウェスタンブロットアッセイによってＨＢＶコアタンパク質測定した（β−アクチンを負荷対照とした）；天然アガロースゲルアッセイによってＨＢＶキャプシドの量（図４Ｃ）及びキャプシド関連ＨＢＶのＤＮＡ（図４Ｄ）を測定した；及び（図４Ｅ）サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを測定した。
【００５９】
図４に示したとおり、抗ウイルス応答が、ＤＭＸＡＡ、及び、転写後ＨＢＶキャプシドタンパク質の量が減少して、マクロファージ中のより少ないＴＬＲ１／２及びＴＬＲ３アゴニスト、及び、より多い、集められたキャプシドによって誘導される（図４Ａ、Ｂ及びＣ）。その結果、ＨＢＶのＤＮＡ複製中間体の量も減少した（図４Ｄ及びＥ）。
【００６０】
実施例６−ＤＭＸＡＡがサイトカイン応答の特異的特性を誘導する
ＤＭＸＡＡ処置ＲＡＷ２６４．７から採集した条件培地の抗ウイルス機序を明らかにするために、処置ＲＡＷ２６４．７中のＤＭＸＡＡならびに代表的なＴＬＲアゴニストによって誘導されたシグナル経路活性化及びサイトカイン特性を分析した。
【００６１】
示した時間、１２５μＭのＤＭＸＡＡ、１μｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２アゴニスト）、１０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）または３μＭのガーディキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）でＲＡＷ２６４．７細胞を処置した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって全細胞タンパク質を分画し、ＰＶＤＦ膜上に移した。その特異的抗体によるウェスタンブロットアッセイによって、全体及びリン酸化ＳＴＩＮＧ、ＴＢＫ１、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥｒｋならびにＩｋＢ−αを検出した。β−アクチンを負荷対照とした。
【００６２】
図５に示したとおり、ＤＭＸＡＡだけが、ＳＴＩＮＧリン酸化を誘導したが、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ３またはＴＬＲ４のアゴニストは、誘導しなかった。これは、３０分間超、ＤＭＸＡＡで処置した細胞中で検出可能であった。しかし、ＤＭＸＡＡならびに試験した全ＴＬＲアゴニストが効果的に、ＩＲＦ３リン酸化ならびにＳＴＩＮＧ及びＴＬＲ経路中のＩＦＮ−β誘導に不可欠なキナーゼであるＴＢＫ１のリン酸化を誘導した。また、ＤＭＸＡＡ及び試験した全ＴＬＲアゴニストが、ＩκＢαの分解を誘導した。興味深いことには、リン酸化ｐ３８α、ＪＮＫ及びＥＲＫの増加によって示されたとおり、この３つのＭＡＰＫ経路の活性化はすべて、４つのＴＬＲアゴニストのうちの任意のひとつで処置した細胞中で早くも１５分で明らかになったが、ＭＡＰＫ経路の活性化は遅れ、ＤＭＸＡＡ処置後、９０分で検出可能となっただけであった。
【００６３】
ＤＭＸＡＡによって誘導されたサイトカイン特性及びＲＡＷ２６４．７細胞中のＴＬＲアゴニストを、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定した（図６）。示した時間、１２５μＭのＤＭＸＡＡ、１μｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２アゴニスト）、１０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）または３μＭのガーディキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）でＲＡＷ２６４．７細胞を処置した（図６Ａ〜Ｇ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、特異的サイトカイン及びケモカインを指定するｍＲＮＡの量を定量化した。データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対する遺伝子発現の誘導倍率として示した。
【００６４】
図６に示したとおり、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、代表的なＴＬＲアゴニストと比較して、ＤＭＸＡＡが主としてＩＦＮ応答を誘導したが、炎症性サイトカイン応答は活発ではなかったことが明らかになった。ＤＭＸＡＡが、処置２時間後、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７アゴニストより約１００倍多い、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡ発現を誘導した（図６Ａ）。これに反して、試験したＴＬＲアゴニストは、ＤＭＸＡＡと比較して、一般に炎症性サイトカイン（図６Ｂ〜６Ｆ）及びケモカイン（図６Ｇ）のより強力な発現を誘導した。ＤＭＸＡＡによるより弱いサイトカイン応答は、少なくとも一部、ＭＡＰＫ経路の活性化が遅く、弱いためであると思われる。興味深いことに、ＴＬＲアゴニスト及びＤＭＸＡＡ誘導ＩＦＮ−β応答とも、処置から２時間で最高値に達するが、炎症性サイトカイン応答（ＩＬ−１及びＩＬ−１０）は、処置から６時間で、またはさらにのちに最高値に達する。
【００６５】
実施例７−Ｉ型ＩＦＮが、ＤＭＸＡＡの誘導によるＨＢＶに対する抗ウイルス応答のプライマリメディエーターである
前記に示した結果は、ＴＬＲアゴニスト及びＤＭＸＡＡが、特異な速度で量的に異なるサイトカイン応答を誘導することを示している。ＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答でのＩ型ＩＦＮ及び他のサイトカインの役割を明らかにするために、特にＩ型ＩＦＮ受容体を認識する単クローン性抗原によるＩ型ＩＦＮ応答の遮断がマクロファージ中のＤＭＸＡＡによって誘導された抗ウイルス活性を弱めるかどうかを調べた。
【００６６】
１０μｇ／ｍｌのＩ型インターフェロン受容体ＩＦＮＡＲ１に対する単クローン性抗原（Ａｂ ＩＮＦＡＲ）と、またはこれなしで、１日、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を、３７℃で、１時間、インキュベートした。続いて、示した濃度のｍＩＦＮ−α（図７Ａ）またはＲＡＷ２６４．７細胞から採集した５０％の条件培地で２日間、処置した（１２時間、示した濃度のＤＭＸＡＡで処置した）（図７Ｂ）。リアルタイムＰＣＲアッセイによって細胞質ＨＢＶのＤＮＡを定量化し、モック処置した対照（ＮＴ）のパーセンテージとしてデータ（平均値±標準偏差、Ｎ＝４）を示した。４日間、示した濃度のＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αでテトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を処置した（図７Ｃ）。サザンブロットハイブリダイゼイションによって細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを分析した。
【００６７】
図７Ａに示したとおり、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞中のＩ型ＩＦＮ受容体の遮断がＩＦＮ−αによって有意に抗ウイルス応答を減少させた。また、Ｉ型ＩＦＮ受容体抗原によりＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を処置すると、ＤＭＸＡＡ処置ＲＡＷ２６４．７細胞からの条件培地によって有意に抗ウイルス応答が弱まった（図７Ｂ）。これはＩ型ＩＦＮが、ＨＢＶに対するＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答のプライマリメディエーターである可能性があることを示唆している。
【００６８】
ＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答の他のサイトカインの役割を明らかにするために、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの抗ウイルス作用を試験した。図７Ｃに示したとおり、ＴＮＦ−αだけがＨＢＶのＤＮＡ複製を抑制した。このため、ＨＢＶに対するＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス応答で役割も演じている可能性がある。この結果は、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患及び乾癬の抗ＴＮＦ治療が、不活性保菌者のＨＢＶ感染を再活性化するという事実に一致しており、ＴＮＦ−αが、ヒトのＨＢＶ感染の免疫対照で重要な役割を演じていることを示唆している。
【００６９】
実施例８−ＤＭＸＡＡ誘導サイトカイン及び抗ウイルス応答は、ＳＴＩＮＧに依存している
前記に示したとおり、ＲＡＷ２６４．７細胞のＤＭＸＡＡ処置がＳＴＩＮＧを活性化し、マウス肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制する抗ウイルスサイトカイン応答を誘導した。さらにＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルスサイトカイン応答においてのＳＴＩＮＧの役割を明らかにするために、スクランブルｓｈＲＮＡ、または特異的にＳＴＩＮＧ ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡを発現しているＲＡＷ２６４．７由来安定細胞系を確立した。
【００７０】
親細胞ＲＡＷ２６４．７細胞（ＷＴ）及びスクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ）またはマウスＳＴＩＮＧ ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＴＩＮＧ）を発現するＲＡＷ２６４．７由来安定細胞系から総ＲＮＡを抽出した。ＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ濃度は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定し、データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、ＷＴ ＲＡＷ２６４．７細胞中のＳＴＩＮＧ ｍＲＮＡのパーセンテージとして示した（図８Ａ）。ｓｈｃｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＳＴＩＮＧを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞系をモック処置した、または３０分間、１２５μＭのＤＭＸＡＡで処置した。ＳＴＩＮＧ及びＴＢＫ１の発現及び活性化は、ウェスタンブロットアッセイによって測定した。１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置した細胞を対照とした。β−アクチンを負荷対照とした（図８Ｂ）。ＳＴＩＮＧのノックダウンが、ＤＭＸＡＡ誘導ＩＦＮ−β遺伝子発現を阻害した。３時間、ＲＡＷ２６４．７由来ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ及びｓｈＳＴＩＮＧ細胞系を１２５μＭのＤＭＸＡＡで処置した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡを定量化した。データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対する遺伝子発現の誘導倍率として示した（図８Ｃ）。ＳＴＩＮＧのノックダウンがＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルス活性を抑制した。１日、テトラサイクリンの不存在下で培養したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞をモック処置した、またはＲＡＷ２６４．７由来ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ、または１２時間、示した濃度のＤＭＸＡＡ、ＬＰＳまたはガーディキモドで処置したｓｈＳＴＩＮＧ細胞から採集した５０％の条件培地で、２日間、処置した。細胞質ＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイによって定量化した。モック処置したＲＡＷ２６７．４細胞からの条件培地で処置したＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を対照とした（ＮＴ）。ＨＢＶのＤＮＡ濃度（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、ＮＴ対照に対するパーセンテージとして示した（図８Ｄ）。ステューデントｔ検定によってデータを統計的に分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示している。
【００７１】
ＳＴＩＮＧ特異的ｓｈＲＮＡを発現している細胞中のＳＴＩＮＧ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の減少が、それぞれｑＲＴ−ＰＣＲ（図８Ａ）及びウェスタンブロットアッセイ（図８Ｂ）によって実証された。ＤＭＸＡＡ誘導し、ＬＰＳ誘導していないＴＢＫ−１活性化が、ＳＴＩＮＧ ｍＲＮＡ特異的ｓｈＲＮＡを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞中で有意に抑制された（図８Ｂ）。さらに、ＤＭＸＡＡ誘導ＩＦＮ−β発現（図８Ｃ）及びＨＢＶに対する抗ウイルス活性（図８Ｄ）が、ＳＴＩＮＧノックダウン細胞中で有意に弱まった。このため、この結果は、ＤＭＸＡＡ誘導抗ウイルスサイトカイン応答が、確かにＳＴＩＮＧに依存していることを示唆している。
【００７２】
実施例９−ＤＭＸＡＡがマウスのＨＢＶ複製を強力に抑制した
さらにｉｎ ｖｉｖｏでＤＭＸＡＡの抗ウイルス作用を実証するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨＢＶ １．３ｍｅｒプラスミドを流体力学的に注入し、肝細胞中のＨＢＶ複製を確立した。ＨＢＶ １．３ｍｅｒプラスミドの流体力学的注入７日後、腹腔内注入による単一用量のＤＭＸＡＡ  ２５ｍｇ／ｋｇまたはビヒクルのいずれかでマウスを処置した。（図９Ａ）処置の２４時間後、肝からＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイによって分析した。対照群にマウス１０匹を含め、処置群にマウス９匹を含めた。プロットは、投入プラスミドコピーのサブトラクション後の各動物のＨＢＶＤＮＡコピー／ｍｌを示す。（図９Ｂ及び９Ｃ）肝から総ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、ＯＡＳ１ｂ及びｖｉｐｅｒｉｎのｍＲＮＡ濃度を分析した。プロットは、各動物からのｍＲＮＡ濃度を示す。全データは、中央値、四分位及び範囲（最小値、最大値）を示すためにボックスプロットに示し、ステューデントｔ検定によって統計的に分析した（Ｐ＜０．０５）。
【００７３】
図９Ａに示したとおり、ビヒクル処置した対照群と比較して、単一用量のＤＭＸＡＡで処置すると、処置後２４時間で、肝内ＨＢＶコアＤＮＡが１．３−ｌｏｇ減少した。予測した抗ウイルス機序と一致して、ＤＭＸＡＡ処置した動物の肝で、ＯＡＳ１ｂ及びｖｉｐｅｒｉｎなどの代表的なＩＦＮ−刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現が、有意に誘導された（図９Ｂ及び９Ｃ）。注目に値するほど、ＤＭＸＡＡ−処置したマウスの平均体重が約８％減少した（データは示していない）。
【００７４】
実施例１０−ヒトのＳＴＩＮＧ経路及びヒト肝細胞癌細胞中の抗ウイルス作用の活性化
マウスのマクロファージ肝細胞系で得られた結果を実証するために、Ｓ１６２Ａ変異（ｈＳＴＩＮＧ／Ｓ１６２）によりヒトＳＴＩＮＧを発現しているヒト単球ＴＨＰ１由来細胞系を確立し、ＤＭＸＡＡへの感受性を与えた。ＴＨＰ−１細胞中のサイトカイン応答のヒトＳＴＩＮＧ経路及びヒト肝細胞癌細胞中の抗ウイルス作用の活性化を分析するために、２時間、ＤＭＸＡＡで、ヒトＳＴＩＮＧのＳ１６２Ａ変異型を発現しているＴＨＰ−１ｈＳＴＩＮＧＳ１６２細胞を処置した。総細胞ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＩＦＮ−βのｍＲＮＡ発現濃度を検出した。データ（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、未処置対照に対して正規化後の相対的遺伝子発現として示した（倍率）（図１０Ａ）。さらに、１２時間、ＤＭＸＡＡでＴＨＰ−１ｈＳＴＩＮＧＳ１６２細胞を処置し、その後、示した希釈液を含む条件培地を、ＨＢＶ複製が潜んでいるヒト肝細胞癌細胞系であるＤＥＳ１９に移した。処置６日後、ＨＢＶコアＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲアッセイによって定量化した。ＨＢＶのＤＮＡ発現濃度（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）は、モック処置した対照に対するパーセンテージとして示した。ＩＦＮ−αで処置したＤＥＳ１９細胞を陽性対照とした（図１０Ｂ）。
【００７５】
ＴＨＰ１−ｈＳＴＩＮＧ／Ｓ１６２細胞をＤＭＸＡＡで処置すると、強固なＩＦＮ−β発現を誘導した（図１０Ａ）。さらに、ＤＭＸＡＡ処置したＴＨＰ１−ｈＳＴＩＮＧ／Ｓ１６２細胞からの条件培地が、ＨＢＶ複製を支持しているヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＤＥＳ１９）中のＨＢＶ複製を効果的に抑制した（図１０Ｂ）。このため、ヒト単球中のヒトＳＴＩＮＧの活性化が強固なサイトカイン応答を誘導し、ヒト肝細胞癌細胞中のＨＢＶ複製を抑制する。
【００７６】
本明細書に示した研究では、初めて、ＳＴＩＮＧアゴニストによるＳＴＩＮＧ経路の活性化がマクロファージ（肝ＮＰＣの可能性もある）中のサイトカイン応答を誘導し、続いて強力に肝細胞中のＨＢＶ複製を抑制することを示している。
【００７７】
ＴＬＲ及びＳＴＩＮＧアゴニストによって誘導された抗ウイルスサイトカイン応答の詳細なキャラクタライゼーションが、特異的な特性を明らかにした。具体的には、ＤＭＸＡＡがＭＡＰＫ経路の活性化の遅延を誘導した。ＤＭＸＡＡが、ＩＦＮ−βによって支配されていたマクロファージ中のサイトカイン応答を誘導し、肝細胞中のさらに強力なＨＢＶに対する抗ウイルス活性を示した。さらに、ＤＭＸＡＡが、ＴＬＲアゴニストと比較して活発ではない炎症性サイトカイン応答を誘導した。それゆえに、非細胞溶解性抗ウイルスサイトカイン応答を誘導する特性だけを考慮する場合、ＳＴＩＮＧ経路の肝内活性化が、ＴＬＲ経路の活性化より優れていると思われる。ＳＴＩＮＧアゴニストがさらに強力な抗ウイルス応答及び弱炎症性サイトカイン応答を誘導し、その結果、炎症性及び組織損傷が少なくなる可能性がある。それゆえに、ＳＴＩＮＧの肝内活性化が、慢性Ｂ型肝炎を処置するための理想的な治療的アプローチとなる可能性がある。この治療的アプローチが、ＨＢＶのさらに有効で持続的な抑制を提供するはずであり、治効がある可能性がある。これは、Ｂ型肝炎に対する現在のＦＤＡ承認治療によって達成されることはまれである。これは、慢性Ｂ型肝炎の新しい治療的概念及びアプローチを示す。
【００７８】
前記結果は、ＳＴＩＮＧが慢性Ｂ型肝炎の免疫療法の標的となる可能性があることを示した。肝マクロファージ中のＳＴＩＮＧ経路、または主にクッパー細胞による循環から除去されるＳＴＩＮＧアゴニストのリポソームデリバリーを介した他の非実質細胞を標的にした活性化によって、ＴＬＲアゴニスト免疫療法の全身投与と関係がある有害作用を回避することができる。
【００７９】
当業者であれば、当該方法の好ましい実施形態に多くの変更及び修正を加えることができ、開示した方法の趣旨から逸脱することなく、かかる変更及び修正を加えることができることを理解するであろう。それゆえに、添付したクレームが、当該方法の趣旨及び範囲内に入るような均等の変更すべてに及ぶことを意図している。
【００８０】
この明細書に引用または記載した特許、特許出願、及び出版物それぞれの開示が、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
実施形態
以下の実施形態のリストは、前記の説明を置き換えるまたは入れ替えるのではなく、補足することを意図している。
【００８２】
実施形態１
Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、前記対象に有効量のＳＴＩＮＧアゴニストを投与することを含む前記方法。
実施形態２
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、マクロファージ、樹状細胞、肝非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ中の自然サイトカイン応答を刺激する、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記自然サイトカイン応答がサイトカインを介して媒介される、実施形態２に記載の方法。
実施形態４
前記自然サイトカイン応答が１型インターフェロンを介して媒介される、実施形態３に記載の方法。
実施形態５
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがフラボノイドを含む、前記実施形態のいずれかひとつに記載の方法。
実施形態６
前記フラボノイドが、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
前記フラボノイドがＤＭＸＡＡを含む、実施形態６に記載の方法。
実施形態８
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが感染した肝細胞中のＢ型肝炎ウイルスの複製を抑制する、前記実施形態のいずれかひとつに記載の方法。
実施形態９
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがＢ型肝炎ウイルスのキャプシド濃度を減少させる、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０
関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；条件培地中で前記処置した細胞をインキュベートすること；前記処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び前記条件培地とＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞をインキュベートすることを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置に有用な化合物を同定する方法。
実施形態１１
Ｂ型肝炎ウイルスの複製を測定することをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記処置ステップが、肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせ内で自然サイトカイン免疫応答を刺激し、サイトカインを条件培地に放出する、実施形態１０または１１のいずれかに記載の方法。
実施形態１３
前記サイトカインがＩ型インターフェロンを含むが、これに限定されない、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４
前記条件培地が、前記感染した肝細胞中のＢ型肝炎の複製を抑制する、実施形態１０から１３のいずれかひとつに記載の方法。
実施形態１５
関心対象の化合物で肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせを処置すること；条件培地中の前記処置した細胞をインキュベートすること；前記処置した細胞から前記条件培地またはその一部を取り出すこと；及び対象に前記条件培地またはその一部を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する対象を処置する方法。
実施形態１６
前記関心対象の化合物が１つ以上のＳＴＩＮＧアゴニストを含む、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、フラボノイドを含む、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８
前記フラボノイドが、１０−（カルボキシメチル）−９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、メトキシボン、６，４'−ジメトキシフラボン、４'−メトキシフラボン、３'，６'−ジヒドロキシフラボン、７，２'−ジヒドロキシフラボン、ダイゼイン、ホルモノネチン、レツシン７−メチルエーテル、キサントン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９
前記フラボノイドがＤＭＸＡＡを含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０
前記肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせがヒト細胞である、実施形態１５から１９のいずれかひとつに記載の方法。
実施形態２１
前記ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、変異体ＳＴＩＮＧを発現するように改変される、実施形態１５から２０のいずれかひとつに記載の方法。
実施形態２２
前記ヒト肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが、前記処置ステップ前に、変異体ＳＴＩＮＧでトランスフェクトされるかまたはトランスフォームされる、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３
前記変異体ＳＴＩＮＧがＳＴＩＮＧ Ｓ１６２Ａである、実施形態２１または２２のいずれかに記載の方法。
実施形態２４
前記肝固有樹状細胞、マクロファージ、非実質細胞、またはこれらの任意の組み合わせが自己細胞である、実施形態１５から２３のいずれかひとつに記載の方法。
【図１Ａ】
2016535731.tif 000006
【図１Ｂ】
2016535731.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2016535731.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2016535731.tif 000013
【図３Ｄ】
2016535731.tif 000014
【図４】
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【図５】
2016535731.tif 000016
【図６Ａ】
2016535731.tif 000017
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2016535731.tif 000027
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2016535731.tif 000030
【図９】
2016535731.tif 000031
【図１０】
2016535731.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月21日(2016.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016535731000001.app
【国際調査報告】
2016535731.tif 000033
2016535731.tif 000034
2016535731.tif 000035
2016535731.tif 000036