(57)【要約】本発明は、操作された珪藻および珪藻を用いて油を生産する方法を提供する。本発明はまた、珪藻生物によって産生される脂質の量および／または質をゲノム工学によって改変する方法も提供する。また、そのような改変された珪藻から製造される油、燃料、オレオケミカル、化学的前駆体、および他の化合物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質代謝に関与する遺伝子が、TALヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼによって不活性化されている、改変された珪藻株。
【請求項２】
量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する、請求項1記載の珪藻。
【請求項３】
珪藻株が、その乾燥重量の少なくとも40％の脂質含有量を有する、請求項2記載の珪藻。
【請求項４】
量の増加した短鎖長脂肪酸および／または飽和度が低い脂肪酸を産生する、請求項2または3記載の珪藻。
【請求項５】
脂質代謝に関与している遺伝子が、Δ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、伸長酵素、およびUDPグルコースピロホスホリラーゼからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項６】
脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項７】
脂質代謝に関与している遺伝子内の配列を標的とすることができるTALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／もしくはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼ、またはそれをコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項８】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内の配列を標的とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項９】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項１０】
タラシオシラ（Thalassiosira）属の種またはフェオダクチラム（Phaeodactylum）属の種に由来する、請求項1〜9のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項１１】
タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種またはフェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）種より選択される、請求項10記載の珪藻。
【請求項１２】
（a）適応させた培地において請求項1〜11のいずれか一項記載の改変された珪藻株を培養する段階、
（b）任意で、該珪藻を採取する段階、
（c）該珪藻から脂質を抽出する段階
を含む、脂質を生産するための方法。
【請求項１３】
（a）脂質代謝に関与していると推定される珪藻株遺伝子内の標的配列を選択する段階、
（b）該遺伝子を標的とし不活性化するために、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを操作する段階、
（c）該TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを該珪藻に導入する段階、
（d）脂質代謝に関与していると推定される前記遺伝子が不活性化されて、量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する珪藻を選択する段階
を含む、珪藻において脂質を生産するための方法。
【請求項１４】
Trex2のようなエキソヌクレアーゼを珪藻にさらに導入して変異誘発を増加させる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
標的配列が、別の生物に由来するΔ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ活性、伸長酵素、またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼの遺伝子に対して70％より高い同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む珪藻遺伝子内で選択される、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
標的配列が、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内で選択される、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ドナーマトリックスと標的配列の間で相同組換えが起こるように、標的配列に対する少なくとも1つの相同領域を含むドナーマトリックスを珪藻に導入する段階をさらに含む、請求項13〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ドナーマトリックスが、脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
抽出された脂質からバイオ燃料を生産する段階をさらに含む、請求項12〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
抽出された脂質を化粧品または食品に変換する段階をさらに含む、請求項12〜19のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、操作された珪藻および珪藻を用いて油を生産する方法を提供する。本発明はまた、珪藻生物によって産生される脂質の量および／または質をゲノム工学によって改変する方法も提供する。また、そのような改変された珪藻から製造される油、燃料、オレオケミカル、化学的前駆体、および他の化合物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
化石燃料の価格上昇に関する懸念が原因となって、操作された微生物をバイオ燃料生産のための魅力的な供給源として開発することに強い関心が持たれるようになった。光合成藻類は、何十年間も、バイオ燃料資源になり得るものとしてかなりの関心が持たれてきた。珪藻は、惑星上で最も生態学的に上手くできている単細胞植物プランクトンのうちの1つであり、地球上の炭素固定の約20％を担っており、海洋食物網の主要関係者である。これらは、液体燃料に変換するのに適した豊富な量の脂質を蓄積することができ、多量かつ多様な脂質を産生できる高い潜在能力および優れた増殖効率が理由で、再生可能なバイオ燃料生産のための藻類の最も優れた綱のうちの1つとみなされている（Kroth 2007;Saade and Bowler 2009）。
【０００３】
それでもなお、これらの藻類における脂質代謝について知られていることは比較的少ない。複雑な脂質代謝経路に関する幅広い知識は、主に植物モデルまたは動物モデルの研究から得られる。珪藻の脂質遺伝子の遺伝子工学は、複雑な脂質代謝を理解し、脂質産生を改良するのに不可欠である。しかし、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）ゲノム（Armbrust, Berges et al. 2004）およびフェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）ゲノム（Bowler, Allen et al. 2008）に関する最近の発表にもかかわらず、現時点で利用できる、珪藻の遺伝的性質を調査するための遺伝学的ツールはごくわずかである。珪藻ゲノムのアノテーションは、実際の遺伝子機能を確認することなく、依然として、推定上のオープンリーディングフレームに本質的に基づいている。例えば、相同組換えによって標的遺伝子を直接操作することは困難と判明しており、挿入変異誘発または化学的変異誘発によって機能損失変異体を作製することは、珪藻が2倍体生物であるため、珪藻においては難易度が高い。このため、バイオ燃料用途にこれらの生物を使用することは、かなり制限される。1つの遺伝子工学研究が、珪藻内部の脂質の量を増加させることに成功した。しかし、これは、脂質代謝に関与する2つの導入遺伝子のランダムな組込みによってなされた（Radakovits, Eduafo et al. 2011）。
【発明の概要】
【０００４】
ゲノム比較およびタンパク質ホモロジー検索に基づいて、本発明者らは、脂質代謝に関与しているいくつかの標的遺伝子を選択し、初めて、バイオ燃料生産のための新しい珪藻株を作り出すためにそれらを選択的に不活性化した。特異的なレアカットエンドヌクレアーゼ、具体的には、TALヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを用いて、珪藻ゲノム内での特異的遺伝子ターゲティングを可能にすることによって、改変された珪藻の作製を容易にした。本発明者らは、それによって、選択遺伝子の不活性化によって脂質内容物の量の増加および／または質の向上が引き起こされる珪藻を作製した。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】緑色微細藻類におけるデンプン代謝。グルカンが、α-1,4グリコシド結合（WSP1）によって水溶性多糖類（WSP）に付加され、そして、分枝酵素が末端を著しく枝分れさせる（WSP2）。これらの分枝の一部が切り落とされ（WSP3）、デンプン粒が形成されるまで、このプロセスが繰り返される。加リン酸分解[デンプン-（P）n]経路および加水分解経路が示されている。αAMY、α-アミラーゼ；AGPase、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ；βAMY、β-アミラーゼ；BE、分枝酵素；DBE、脱分枝酵素；DPE、不均化酵素（1および2）  α-1,4グルカノトランスフェラーゼ；Glc、グルコース；GWD、グルカン-水ジキナーゼ；ISA、イソアミラーゼ；MEX1、マルトース輸送体；MOS、マルトオリゴ糖；PGM、色素体ホスホグルコムターゼ；P、リン酸；Pi、無機リン酸；PPi、ピロリン酸；SP、デンプンホスホリラーゼ；SS、デンプン合成酵素。（Radakovits, Jinkerson et al. 2010）
【図２】微細藻類の脂質生合成の代表的経路。遊離脂肪酸が葉緑体において合成されるのに対し、TAGはERで組み立てられ得る。ACCase、アセチル-CoAカルボキシラーゼ；ACP、アシルキャリアータンパク質；CoA、補酵素A；DAGAT、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；DHAP、ジヒドロキシアセトンリン酸；ENR、エノイル-ACPレダクターゼ；FAT、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ；G3PDH、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ；GPAT、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ；HD、3-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ；KAR、3-ケトアシル-ACP レダクターゼ；KAS、3-ケトアシル-ACP合成酵素；LPAAT、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ；LPAT、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ；MAT、マロニル-CoA:ACPトランスアシラーゼ；PDH、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；TAG、トリアシルグリセロール。（Radakovits, Eduafo et al. 2011）。
【図３】フェオダクチラム・トリコルヌツムにおいてエイコサペンタエン酸（EPA）生合成をもたらす、存在し得る生合成経路。古典的なω6経路およびω3経路を枠で囲み、代替のω3経路（Δ9伸長およびΔ8不飽和化を伴う）を破線の矢印で示している。（Domergue, Lerchl et al. 2002）
【図４】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるフェオダクチラム・トリコルヌツム（Pt）株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。TALEヌクレアーゼ切断部位を囲むPCRによるUGPase座位の増幅およびアガロースゲル上でのPCR産物の移動。4個のクローンが、予想サイズより大きなサイズのPCR産物を示し（37-5A3、37-7A1、37-7B2、および37-16A1）、1個のクローンは増幅されず（37-8A1）、7個は、空ベクターによる形質転換に由来する2個のクローン（37-3B1および37-3B2）において観察されるのと同様に予想サイズの位置にPCRバンドを示した。
【図５】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるフェオダクチラム・トリコルヌツム（Pt）株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け（実施例1）。UGP_TALEヌクレアーゼによる形質転換に由来する12個のクローンおよび空ベクターによる形質転換に由来する2個のクローンに対して実施したT7アッセイ法。陰性対照は、T7酵素によって消化されないクローン37-3B1（空プラスミドによって形質転換した）に対して実施したPCRに相当する。T7陽性対照は、変異誘発事象を有しているPCR産物に相当する。クローン37-5B4は、T7アッセイ法において陽性である。
【図６】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるフェオダクチラム・トリコルヌツム（Pt）株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け（実施例2）。（A）TALEヌクレアーゼ切断部位を囲むPCRによるUGPase座位の増幅およびアガロースゲル上でのPCR産物の移動。試験した11個のクローンにおいて、5個はPCRによって増幅されなかった（42-5A2、42-5A6、42-6B2、42-8B1、および42-7A7）。他のクローンは、予想サイズの位置にPCR産物を示した。クローン42-3B1および42-3B2は、空ベクターによる形質転換の結果として生じる対照に相当する。（B）UGP_TALEヌクレアーゼによる形質転換に由来する6個のクローンおよび空ベクターによる形質転換に由来する2個のクローンに対して実施したT7アッセイ法。陰性対照は、T7酵素によって消化されないクローン37-3B1（空プラスミドによって形質転換した）に対して実施したPCRに相当する。T7陽性対照は、変異誘発事象を有しているPCR産物に相当する。クローン42-5A1、42-6B5、42-7A2、および42-7A3は、T7アッセイ法において陽性である。
【図７】UDPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（UGPase）を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【図８−１】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−２】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−３】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−４】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−５】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−６】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−７】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−８】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図８−９】UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによるPt株の形質転換に由来するクローンの分子的特徴付け。クローン37-7A1:UGPase遺伝子が100％変異、空ベクターによる形質転換に由来するクローン37-3B1およびPt野生型株は、脂質プローブ（ボディパイ（Bodipy）（493／503）、Molecular Probe）で標識した。フローサイトメトリーによって、蛍光強度を測定した。グラフは、3つの独立した実験の細胞数と蛍光強度の相関関係（function）を表している。
【図９】変異体UGPase KO（37-7A1）に対応するトランスジェニック珪藻株ならびにそれに関連する対照の空ベクターおよびPt野生型における、脂肪酸（FA）およびトリアシルグリセロール（TAG）の含有量の定量的解析。
【図１０】推定上の伸長酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発。推定上の伸長酵素に特異的な標的を囲むPCRを実施した。左のパネルにおいて、予想サイズの位置のPCRバンドとサイズのより大きな別のバンドとを等比率で示しているクローンから、明らかな変異誘発事象が明示される。伸長酵素TALEヌクレアーゼによる形質転換の結果として生じる4個のクローンおよび空ベクターによる形質転換の結果として生じる3個のクローンにおいて、T7アッセイ法を行って評価した。クローン2は、T7アッセイ法において陽性である。
【図１１】伸長酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【図１２】伸長酵素変異体に対応するトランスジェニック珪藻株およびそれに関連する対照空ベクターにおける、脂肪酸（FA）およびトリアシルグリセロール（TAG）の含有量の定量的解析。
【図１３】内在性グリセロール3リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）内の、TALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【図１４】内在性ω3不飽和化酵素遺伝子内の、TALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【図１５】内在性パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ遺伝子内の、TALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【図１６】内在性エノイルACPレダクターゼ遺伝子内の、TALEヌクレアーゼによって誘導される変異誘発事象の例。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本明細書において特に規定されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０００７】
本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料はすべて、本発明の実践または試験において使用することができ、適切な方法および材料は、本明細書において説明される。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、別段の指定が無い限り、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【０００８】
本発明の実践は、別段の定めが無い限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の技能の範囲内である。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology （Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, （Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）; Oligonucleotide Synthesis （M. J. Gait ed., 1984）; Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization （B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984）; Transcription And Translation （B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）; Culture Of Animal Cells （R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）;Immobilized Cells And Enzymes （IRL Press, 1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning （1984）; Methods In ENZYMOLOGYシリーズ（J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York）、具体的には第154巻および第155巻（Wu et al. eds.） ならびに第185巻、"Gene Expression Technology" （D. Goeddel, ed.）; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells （J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology （Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987）; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV （D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986）;ならびにManipulating the Mouse Embryo, （Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）を参照されたい。本発明は、特にバイオ燃料生産のための、脂質の量が多いか、かつ／または質の高い内容物を有する改変された珪藻株に関する。具体的には、本発明は、脂質代謝に関与する遺伝子が不活性化された、改変された珪藻株に関する。不活性化とは、その遺伝子が、非機能性タンパク質をコードするか、またはタンパク質を発現しないことを意味する。前記遺伝子は、好ましくは、レアカットエンドヌクレアーゼによって、より好ましくは、TALEヌクレアーゼ、MBBDヌクレアーゼ、またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼによって、不活性化される。
【０００９】
遺伝子不活性化のための別の選択肢は、遺伝子発現をノックダウンするためのRNAサイレンシング（De Riso, Raniello et al. 2009）および特に、脂質代謝に関与するタンパク質をコードする核酸を標的とする低分子ヘアピン型RNA（shRNA）の使用である。遺伝子ノックダウン戦略の最近の進歩には、より特異的かつ安定であると報告されているハイスループットな人工マイクロRNA（armiRNA）技術の開発が含まれる（Molnar, Bassett et al. 2009;Zhao, Wang et al. 2009）。別の不活性化手段は、タンパク質の発現または機能を妨害することができる、二本鎖DNA、リプレッサー分子、またはドミナントネガティブな阻害タンパク質であり得る。
【００１０】
結果として、前記遺伝子の不活性化により、珪藻において、量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質の産生が引き起こされる。
【００１１】
珪藻は、非晶質のシリカ細胞壁という種特異的形態に基づいて同定される単細胞光合成生物であり、ナノメートル規模で互いに異なる。珪藻には、非制限的な例として、フェオダクチラム属（Phaeodactylum）、フラギラリオプシス属（Fragilariopsis）、タラシオシラ属（Thalassiosira）、コスキノディスクス属（Coscinodiscus）、アラクノイディスクスム属（Arachnoidiscusm）、アステロムファルス属（Asteromphalus）、ナビクラ（Navicula）属、キートケロス属（Chaetoceros）、コレスロン属（Chorethron）、シリンドロテカ・フシフォルミス（Cylindrotheca fusiformis）、シクロテラ属（Cyclotella）、ランプリスカス属（Lampriscus）、ギロシグマ属（Gyrosigma）、アクナンテス属（Achnanthes）、コッコネイス属（Cocconeis）、ニッチア属（Nitzschia）、アンフォラ属（Amphora）、およびオドンテラ属（Odontella）が含まれる。
【００１２】
より好ましい態様において、本発明による珪藻は、次の種：タラシオシラ・シュードナナまたはフェオダクチラム・トリコルヌツムに由来する。
【００１３】
「脂質代謝に関与している遺伝子」とは、脂質の生合成および異化の生化学的反応の1つ、具体的には、図1、2、または3に示した経路ならびに脂肪酸の長さおよび／または飽和度を改変する経路のうちの1つに参加するタンパク質をコードする、文献において特徴付けがなされた遺伝子と類似している、珪藻ゲノムに由来する任意の推定上の遺伝子を意味する（概要については、（Radakovits, Jinkerson et al. 2010）を参照されたい）。
【００１４】
本発明は、脂質の産生もしくは貯蔵（内部蓄積）を増加させるため、および／または脂質の質を向上させるために、脂質生合成に関与している多くの遺伝子を個別にまたはまとめてノックアウトまたはノックインに供することができることを想定する。
【００１５】
脂肪酸合成の経路に関与する酵素をコードする遺伝子は、例えば、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素、3-ケトアシル-アシルキャリアータンパク質合成酵素III、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）、エノイル-アシルキャリアータンパク質レダクターゼ（エノイル-ACP-レダクターゼ）、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼのような脂肪酸チオエステラーゼ、またはリンゴ酸酵素の活性を有するタンパク質をコードし得る（図2を参照されたい）。
【００１６】
珪藻内での脂質蓄積を誘導するための別の戦略は、脂質の異化を減少させることである。トリアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸の両方の活性化に関与している遺伝子、ならびに脂肪酸のβ-酸化に直接関与している遺伝子を不活性化して、細胞の脂質含有量を増加させることができる。例えば、アシル-CoA合成酵素、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼの活性、ホスホグルコムターゼを不活性化することができる。リパーゼは、トリアシルグリセロールおよびリン脂質などのカルボキシルエステルを脱エステル化する酵素である。推定上のリパーゼの多くが、珪藻中に存在し得る。P.トリコルヌツムにおける非限定的な例として、推定上のトリアシルグリセロールリパーゼをコードするPhatrdraft_44231、Phatrdraft_50397を不活性化して、脂質蓄積を誘導することができる。
【００１７】
本発明によれば、珪藻の細胞脂質含有量はまた、クリソラミナリン（β-1,3-グルカン）のような高エネルギー貯蔵化合物の蓄積をもたらす代謝経路を不活性化することによって、増加させることもできる。例えば、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、イソアミラーゼの遺伝子を、これらの珪藻株において不活性化することができる（図1を参照されたい）。
【００１８】
さらに、供給原料である珪藻から得られるバイオ燃料のコールドフロー特性および酸化安定性特性に影響を及ぼし得る脂肪酸の炭素鎖長および不飽和度に関与している遺伝子を改変することによって、バイオ燃料としての適性に関して、脂質の質を高めることもできる。これらの例は、Δ12不飽和化酵素、Δ9不飽和化酵素、ω3不飽和化酵素、および伸長酵素である（図3を参照されたい）。
【００１９】
別の局面において、非限定的な例として、短鎖長脂肪酸に特異的なアシル-ACPチオエステラーゼのようなチオエステラーゼ酵素を過剰発現させて、コールドフロー特性を改善することができる（Hu, Sommerfeld et al. 2008; Radakovits, Jinkerson et al. 2010）。
【００２０】
本明細書において、本発明者らは、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ω3不飽和化酵素、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、Δ12不飽和化酵素、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、および伸長酵素からなる群より選択される推定上の酵素をコードする、珪藻ゲノム中の推定上の遺伝子の選択物を、より具体的に同定した。
【００２１】
本発明者らは、これらの遺伝子、またはSEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、95％の配列同一性を有する遺伝子配列を標的とすることができるレアカットエンドヌクレアーゼを設計した。特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される標的配列を切断することができる。
【００２２】
本発明に従って改変して得られる珪藻は、細胞1個当たりの量が野生型株と比べて少なくとも10％、野生型株と比べて、特に少なくとも20％、30％、40％、50％、より好ましくは少なくとも75％、100％、200％、300％増加した脂質を産生することができる。言い換えると、本発明は、脂質含有量が乾燥重量の少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、50％、60％、70％、80％である、改変された珪藻に関する。
【００２３】
特定の態様において、本発明は、野生型と比べて量が増加した短鎖長脂肪酸、好ましくは、炭素が12個、14個、16個、18個、20個、好ましくは16個〜20個の間、より好ましくは炭素が16個〜18個の間、さらにより好ましくは炭素が12個〜16個の間の鎖を有する脂肪酸を好ましくは産生する、改変された珪藻に関する。別の特定の態様において、本発明は、不飽和度が低い脂肪酸を好ましくは産生する改変された珪藻に関し、好ましくは、改変された珪藻は、量が増加した、5個以下、好ましくは、4個、3個、2個、または1個の二重結合を炭素原子間に有する脂肪酸、より好ましくは、炭素原子間に二重結合を有していない脂肪酸（飽和脂肪酸）を産生する。
【００２４】
量が増加した産生物とは、改変された珪藻が、野生型株と比べて少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、30％、40％、または50％、より好ましくは少なくとも75％、100％、200％、300％増加した産生量を示すことを意味する。
【００２５】
脂質含有量の解析は、（Vieler, Wilhelm et al. 2007;Lamaziere, Wolf et al. 2012;Lamaziere, Wolf et al. 2013）において以前に説明されているプロトコールに従って実施することができる。
【００２６】
本発明の遺伝子工学方法は容易であるため、改変された珪藻株は、脂質代謝経路を調節するための同時改変、例えば、脂質代謝に関与しているいくつかの鍵となる酵素の同時活性化および／または同時不活性化を含むことができる。
【００２７】
特定の態様において、改変された珪藻は、導入遺伝子の挿入による1つの不活性化された脂質遺伝子を含むことができる。特定の態様において、前記導入遺伝子は、脂質代謝に関与している酵素をコードする。この場合、内在性遺伝子の不活性化および導入遺伝子の過剰発現の両方が、珪藻内部の脂質の産生量および質を向上させることができる。非限定的な例として、前記改変された珪藻は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ω3不飽和化酵素、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、伸長酵素、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、およびΔ12不飽和化酵素の遺伝子からなる群より選択される不活性化遺伝子、ならびに少なくとも1つのチオエステラーゼ遺伝子を含む導入遺伝子を含むことができる。
【００２８】
本発明による脂質遺伝子は、関心対象の脂質遺伝子を特異的に標的とするDNA結合ドメインを珪藻に導入することによって改変することができる。具体的には、珪藻における脂質遺伝子を標的とした改変のための方法は、脂質代謝に関与していると推定される珪藻株遺伝子内の標的配列を選択する段階；該遺伝子を標的とするためのDNA結合ドメインを提供する段階；該DNA結合ドメインを珪藻に導入する段階；量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する珪藻を任意で選択する段階を含み得る。前記DNA結合ドメインは、非限定的な例として、TALE結合ドメインまたはMBBBD結合ドメインであり得る。前記DNA結合ドメインは、転写活性化因子もしくは抑制因子（すなわち、転写調節因子）と、またはDNAプロセシングに関係している他のタンパク質と相互に作用するか、もしくはそれらを改変するタンパク質と、融合されてよい。DNAプロセシング活動の非限定的な例は、例えば、エピジェネティックな調節エレメントを作製または改変すること、DNAにおいて部位特異的な挿入、欠失、または修復を起こすこと、遺伝子発現を制御すること、およびクロマチン構造を改変することであり得る。
【００２９】
本発明の特定の局面において、本発明による脂質遺伝子は、関心対象の脂質遺伝子を特異的に切断するレアカットエンドヌクレアーゼを珪藻に導入することによって改変することができる。具体的には、珪藻における脂質遺伝子を標的とした改変のための方法は、脂質代謝に関与していると推定される珪藻株遺伝子内の標的配列を選択する段階；該遺伝子を標的とし、かつ不活性化するためのレアカットエンドヌクレアーゼを提供する段階；該レアカットエンドヌクレアーゼを珪藻に導入する段階；脂質代謝に関与している前記推定上の遺伝子が不活性化され、かつ量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する珪藻を、任意で選択する段階を含み得る。前記レアカットエンドヌクレアーゼは、非限定的な例として、選択された標的配列を特異的に標的とすることができる、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼであり得る。好ましくは、選択された標的配列は、前述の脂質代謝に関与している推定上の遺伝子の内部に含まれる。具体的には、前記標的配列は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ω3不飽和化酵素、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、伸長酵素、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、およびΔ12不飽和化酵素の遺伝子からなる群より選択される遺伝子の内部に含まれる。より具体的には、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、95％の配列同一性を有する遺伝子を標的とすることができる。特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される標的配列を切断することができる。「切断」とは、標的配列中の二本鎖の分断（break）または一本鎖の分断を意味する。前記TALEヌクレアーゼ、好ましくは、SEQ ID NO: 4、5、15、16、23、24、31、32、37、38、43、44、49、および50からなる群より選択されるプラスミド配列にコードされる前記TALEヌクレアーゼもまた、本発明に包含される。
【００３０】
前記改変された標的配列は、NHEJ事象または相同組換えの結果として生じ得る。前記レアカットエンドヌクレアーゼによって引き起こされる二本鎖切断は、一般に、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）といった異なる機序によって修復される。典型的には、相同組換えは、遺伝子損傷の完全な修復を果たすための原料になる（from）ドナーマトリックス（donor matrix）として、損傷したDNAの姉妹染色分体を使用するが、NHEJは、DNA配列の二本鎖切断部位にしばしば変化をもたらす、不完全な修復プロセスである。機序は、直接的再連結（Critchlow and Jackson 1998）またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Ma, Kim et al. 2003）によって、2つのDNA末端の残部を再結合させることを含む。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は、しばしば、小規模の挿入または欠失をもたらし、特異的遺伝子ノックアウトを作り出すために使用され得る。
【００３１】
本明細書において想定される方法の特定の態様において、触媒ドメインをコードする別の導入遺伝子で細胞をトランスフェクトすることによって、変異誘発が増加される。より好ましい態様において、該触媒ドメインは、DNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例には、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素、および鋳型非依存性DNAポリメラーゼが含まれる。このような触媒ドメインの非限定的な例は、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大腸菌（E.coli）ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT（末端デオキシヌクレオチド転移酵素）、ヒトDNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）からなる群より選択されるタンパク質ドメインまたは該タンパク質ドメインの触媒として活性な誘導体を含む。より好ましい態様において、前記触媒ドメインは、エキソヌクレアーゼ活性、特に、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する。より好ましい態様において、前記触媒ドメインは、TREXエキソヌクレアーゼ活性、より好ましくは、TREX2活性を有する。別の好ましい態様において、前記触媒ドメインは、単鎖のTREXポリペプチドにコードされる。特定の態様において、前記触媒ドメインは、前記レアカットエンドヌクレアーゼのN末端またはC末端に融合される。酵素SCTREX2をTALEヌクレアーゼのようなエンドヌクレアーゼと連結することにより、高頻度の標的変異誘発が確実になることが判明している（WO2012054858、WO2013009525）。
【００３２】
ヌクレオチド鎖内部の結合の切断は、相同組換えを促進することが公知である。したがって、特定の態様において、前記改変された標的配列は、ゲノムの選択された座位へのドナーマトリックス挿入（ノックイン）の結果であり得る。特定の態様において、ノックイン珪藻は、該珪藻に、前述のゲノム工学によるヌクレアーゼを導入して、標的配列の内部または近傍に切断を誘導し、かつ導入遺伝子を含むドナーマトリックスを導入して、ノックイン事象によって該導入遺伝子を導入することによって、作製する。該ドナーマトリックスは、標的DNA配列とドナーマトリックスの間で相同組換えが起こるように、標的核酸配列の少なくとも一部分に相同な配列を含む。特定の態様において、該ドナーマトリックスは、標的核酸の5'領域および3'領域にそれぞれ相同である第1の部分および第2の部分を含む。標的核酸配列の切断に続いて、標的核酸配列を含むゲノムとドナーマトリックスの間の相同組換え事象を促進する。好ましくは、少なくとも50bp、好ましくは100bpより大きい、およびより好ましくは200bpより大きい相同配列が、前記ドナーマトリックス内部で使用される。したがって、ドナーマトリックスは、好ましくは200bp〜6000bp、より好ましくは1000bp〜2000bpである。
【００３３】
切断事象が起こる標的とされた配列の位置によって、そのようなドナーマトリックスは、ある遺伝子をノックアウトするのに（例えば、該遺伝子のオープンリーディングフレーム内にドナーマトリックスが配置される場合）、または関心対象の新しい配列もしくは遺伝子を導入するのに、使用され得る。そのようなドナーマトリックスを用いることによる配列挿入は、標的とされた既存の遺伝子を、該遺伝子の訂正もしくは置換によって改変するのに（非限定的な例として、対立遺伝子交換）、または標的とされた遺伝子の発現を上方調節もしくは下方調節するのに（非限定的な例として、プロモーター交換）使用され得、該標的とされた遺伝子の訂正または置換は、1つまたはいくつかの商業的に望ましい形質を与える。
【００３４】
特定の態様において、前記ドナーマトリックスは、脂質代謝に関与している酵素をコードする導入遺伝子を含み得る。前記ドナーマトリックスは、相同組換えによって標的配列中に挿入することができる。導入遺伝子は、標的遺伝子を置換し、不活性化する。この場合、内在性遺伝子の不活性化および導入遺伝子の過剰発現の両方が、珪藻内部の脂質の産生量および質を向上させることができる。非限定的な例として、前記ドナーマトリックスはチオエステラーゼ遺伝子を含んでよく、標的配列は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ω3不飽和化酵素、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、Δ12不飽和化酵素、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、および伸長酵素の遺伝子からなる群より選択されてよい。
【００３５】
当技術分野において周知の形質転換方法によって、珪藻中に分子を導入することができる。様々な態様において、ヌクレオチド配列、例えば、レアカットエンドヌクレアーゼをコードするベクターおよび／またはドナーマトリックスは、例えば、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、磁気泳動、微粒子銃によって、珪藻の核中に導入され得る。珪藻における精製した本発明のエンドヌクレアーゼの直接的導入が、検討され得る。
【００３６】
形質転換方法は、成功した形質転換体細胞を判別するための有効な選択マーカーを必要とする。選択マーカーの大多数は、抗生物質に対する耐性を有する遺伝子を含む。珪藻において使用できる選択マーカーに言及している刊行物は、ごく小数しかない。（Dunahay, Jarvis et al. 1995）は、シクロテラ・クリプティカ（Cyclotella cryptica）種、ナビクラ・サプロフィラ（Navicula saprophila）種、およびフェオダクチラム・トリコルヌツム種における、リン酸化によってG418を不活性化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）の使用を報告している。（Falciatore, Casotti et al. 1999;Zaslavskaia, Lippmeier et al. 2001）は、フェオダクチラム・トリコルヌツム種およびシリンドロテカ・フシフォルミス種における、化学量論的結合によって作用するゼオシン耐性またはフレオマイシン耐性の遺伝子（Sh ble）の使用を報告している。（Falciatore, Casotti et al. 1999;Zaslavskaia, Lippmeier et al. 2001）では、酵素的アセチル化によってノウルセオトリシン（Nourseothricin）に対する耐性を与えるN-アセチルトランスフェラーゼ1遺伝子（Nat1）のフェオダクチラム・トリコルヌツムおよびタラシオシラ・シュードナナにおける使用が、報告されている。これまでの特異的な選択マーカーの使用が本発明の範囲に含まれること、および例えば、限定されるわけではないが、抗生物質耐性に関与する遺伝子を含む、他の選択マーカーをコードする他の遺伝子の使用が理解される。より好ましい態様において、選択マーカーをコードしているベクターおよびレアカットエンドヌクレアーゼをコードしているベクターは、異なるベクターである。
【００３７】
脂質合成の増加は、細胞分裂の減少をもたらし得る。このような場合、脂質遺伝子発現の改変は、例えば、改変された珪藻が高密度まで増殖し、定常期に入った後に活性化され得る誘導性プロモーターによってそれらを制御できる場合、有益であり得る。したがって、特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子または本発明による導入遺伝子は、プロモーターの制御下に置かれ得る。誘導性プロモーターは、何らかの特定の（典型的には外部の）刺激にさらされた場合にのみ転写を開始するプロモーターである。本発明にとって特に好ましいのは、次のものである:光調節プロモーター、硝酸レダクターゼプロモーター、重金属のレベル上昇によって誘導される真核生物のメタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド（IPTG）に応答して誘導される原核生物のlacZプロモーター、ステロイド応答性プロモーター、テトラサイクリン依存性プロモーター、および温度上昇によって誘導される真核生物の熱ショックプロモーター。
【００３８】
別の局面において、前述の方法によって得られた、または得ることができる改変された藻類細胞もまた、本発明の範囲に包含される。特定の態様において、このような改変された藻類細胞は、レアカットエンドヌクレアーゼ導入遺伝子をコードする配列の存在と、標的とされた脂質遺伝子の、好ましくは両方の対立遺伝子における改変とを特徴とする。
【００３９】
本発明はまた、前述の改変された珪藻を用いてバイオ燃料を生産するための方法にも関する。
【００４０】
具体的には、本発明は、
（a）適応させた培地において前述の改変された珪藻株を培養する段階、
（b）任意で、改変された珪藻株を採取する段階、
（c）珪藻から脂質を抽出する段階
のうちの1つまたはいくつかを含む、脂質を生産するための方法に関する。
【００４１】
いくつかの脂質抽出方法が、当技術分野において周知である：物理的抽出、化学的抽出、超臨界流体抽出、インサイチュー抽出、超音波補助抽出、またはパルス電界技術。物理的方法は、藻類細胞を破壊するものであり、超音波処理、ホモジナイゼーション、フレンチプレス処理、圧搾（expelling）、およびビーズミル処理からなる。化学的溶媒抽出の場合、いくつかの抽出装置（extractors）および混合物が公知である；例えば、ヘキサン、クロロホルム、メタノール、イソプロパノール、およびアセトン。超臨界流体抽出の場合、抽出媒体は、多くの場合、CO2である。インサイチュー抽出の場合、藻類は採取せず、脱水する必要も乾燥させる必要もない。脂質は、生細胞から抽出される（Frenz, Largeau et al. 1989; King 1996;Lee, Yoon et al. 1998; Sievers 1998; Hejazi and Wijffels 2004; Herrero, Jaime et al. 2006; Doucha and Livansky 2008; Wei, Gao et al. 2008; Shen, Yuan et al. 2009; Mercer and Armenta 2011）。
【００４２】
本発明はまた、珪藻によって産生された脂質、特にトリアシルグリセロール化合物からバイオ燃料を生産する段階を含む方法にも関する。
【００４３】
バイオ燃料生産は、（Kroger and Muller-Langer 2012）、WO2009063296）で説明されているようにして実施することができる。バイオ燃料生産は、エステル（交換）、藻類培地を溶媒、触媒、およびアルコールと直接混合するインサイチューエステル交換によって、藻類脂質の水素化処理によって（水素化処理エステルおよび脂肪酸と呼ばれる）、実現することができる。本発明はまた、特に、必須脂肪酸の含有量が高いため、より具体的には、ドコサヘキサエン酸（DHA）およびエイコサペンタエン酸（EPAまたはイコサペンタエン酸）などのω-3脂肪酸を含むため、抽出された脂質を化粧品または食品に変換する段階に関する。本発明はまた、改変された珪藻またはそれらの摘出された脂質の他の使用も包含する。具体的には、本発明による改変された珪藻は、それらの油内容物を得るために培養し、動物栄養補給における脂肪酸の不可欠な供給源として、特に、魚または貝を繁殖させるために、珪藻形態で直接使用することができる。
【００４４】
定義:
「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質の一部分をコードする、染色体に沿って直線的に配列されたDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。典型的には、遺伝子は、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコード配列（エキソン）、任意で、イントロン、および3'非翻訳領域を含む。遺伝子はさらに、ターミネーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーからなってもよい。
【００４５】
「ゲノム」とは、核ゲノム、葉緑体ゲノム、ミトコンドリアゲノムなど、細胞中に含まれる遺伝物質全体を意味する。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「座位」という用語は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、または葉緑体ゲノム上の（例えば、ある遺伝子の）DNA配列の特定の物理的位置である。本明細書において使用される場合、「座位」という用語は、通常、エンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的位置に関する。本発明によるエンドヌクレアーゼによって認識および切断される標的配列を含むこのような座位は、「本発明による座位」と呼ばれる。
【００４７】
「標的配列」とは、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼによってプロセシングされ得るポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、細胞中の特定のDNA位置、好ましくはゲノム位置を意味するが、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾンなど、遺伝物質の主体から独立して存在できるか、または非限定的な例としてのミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞小器官中に存在できる、遺伝物質の一部分もまた、意味する。核酸標的配列は、該標的の1つの鎖の5'から3'への配列によって定められる。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、藻類ゲノム中に挿入される配列を意味する。好ましくは、これは、あるポリペプチドをコードする配列を意味する。好ましくは、導入遺伝子にコードされるポリペプチドは、その導入遺伝子が挿入される珪藻において、発現されないか、または発現されるが生物学的に活性ではないかのいずれかである。最も好ましくは、導入遺伝子は、珪藻中の脂質の量の増加および／または質の向上のために有用なポリペプチドをコードする。また、導入遺伝子は、干渉RNAを生じさせるために藻類ゲノム中に挿入される配列であってもよい。
【００４９】
「相同」とは、配列間の相同組換えをもたらすのに十分な同一性を別の配列に対して有する、より具体的には、少なくとも95％の同一性、好ましくは97％の同一性、およびより好ましくは99％の同一性を有する、配列を意味する。
【００５０】
「同一性」とは、2つの核酸分子間またはポリペプチド間の配列同一性を意味する。同一性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中のある位置が同じ塩基によって占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、それらの核酸配列が共有する位置における同一または一致しているヌクレオチドの数の関数である。GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部分として利用可能であり、例えば、既定の設定を用いて使用することができるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を算出することができる。
【００５１】
「DNA結合ドメイン」とは、標的核酸配列、好ましくはDNA分子に結合できるタンパク質ドメインを意味する。DNA結合ドメインは、「核酸標的配列」とさらに呼ばれる、核酸の特定のポリヌクレオチド配列を認識し、結合する。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、細菌種キサントモナス（Xanthomonas）に由来するタンパク質であり、これは、複数の反復配列を含み、各反復部分は、標的とされた核酸配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である12位および13位の二残基（RVD）を含む。TALE結合ドメインは、アミノ酸33〜35個からなる様々な数の反復モジュールによって構成されている。これらの反復モジュールは、12位および13位に位置する2つの可変アミノ酸（すなわち、反復可変二残基（Repeat Variable Di residue）、RVD）以外は、互いにほぼ同一である。残基12および13の性質が、個々の反復モジュールの塩基選択性を決定する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連付けられているRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、およびTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重大な意味を持つアミノ酸12および13を、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対するそれらの特異性を調整するために、ならびに特に、この特異性を強化するために、他のアミノ酸残基に変異させることができる。同様の塩基対塩基核酸結合特性を有する結合ドメイン（モジュール塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン（MBBBD）もまた、本出願者が別の細菌種において最近発見した新しいモジュールタンパク質から誘導することができる。該MBBBDは、例えば、新しく同定されたタンパク質、すなわち、内部共生体真菌であるバークホルデリア・リゾキニカ（Burkholderia Rhizoxinica）の最近配列決定されたゲノム（Lackner, Moebius et al. 2011）に由来するEAV36_BURRHタンパク質、E5AW43_BURRHタンパク質、E5AW45_BURRHタンパク質、およびE5AW46_BURRHタンパク質から、人工的に作製することができる。
【００５２】
「レアカットエンドヌクレアーゼ」とは、DNA分子またはRNA分子、好ましくはDNA分子の内部の核酸間結合の加水分解（切断）を触媒できる、任意の野生型酵素または変種酵素を意味する。レアカットエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、長さが10〜45塩基対（bp）の範囲の、通常、長さが10〜35塩基対の範囲の核酸標的部位を認識する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、「核酸標的配列」とさらに呼ばれる特異的なポリヌクレオチド配列において核酸を認識し、切断する。
【００５３】
「TALEヌクレアーゼ」または「MBBBDヌクレアーゼ」とは、典型的には転写活性化因子様エフェクタータンパク質（TALE）またはMBBBD結合ドメインに由来する核酸結合ドメインとエンドヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合の結果として生じる、操作されたタンパク質を意味する。このような触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、およびより好ましくは、例えばI-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iのような、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。より好ましい態様において、該ヌクレアーゼは、単量体のTALEヌクレアーゼまたはMBBBDヌクレアーゼである。単量体ヌクレアーゼとは、WO2012138927で説明されている操作されたTALE反復とI-TevIの触媒ドメインとの融合物のような、特異的な認識および切断のために二量体形成を必要としないヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼは、既に説明されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝改変を促進するために使用されている（Boch, Scholze et al. 2009;Moscou and Bogdanove 2009;Christian, Cermak et al. 2010）。このような操作されたTALヌクレアーゼは、TALEN（商標）という商品名で市販されている（Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France）。
【００５４】
本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼはまた、Cas9エンドヌクレアーゼであってよい。最近、新しいゲノム工学ツールが、原核生物のII型CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）獲得免疫系に由来する、RNAによって導かれるCas9ヌクレアーゼ（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）に基づいて開発された（総説については、（Sorek, Lawrence et al. 2013）を参照されたい）。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見された。これは、ウイルスまたはプラスミドのいずれかの外来DNAに対する防御として機能する。CRISPRを媒介としたゲノム工学は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接する標的配列の選択によって進行する。標的配列の選択後、この標的配列と相補的な特異的crRNAを人工的に作製する。II型CRISPR系において必要とされるトランス活性化型crRNA（tracrRNA）は、crRNAとペアになって、提供されるCas9タンパク質に結合した。Cas9は、tracRNAとcRNAの塩基対合を容易にする分子アンカーの役割を果たす（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）。この三元複合体において、2部分からなるtracrRNA:crRNA構造体は、同起源の標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を方向付けるガイドRNAの役割を果たす。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAの間の相同性について標的配列を調査することによって開始される。標的配列とcrRNAの相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ-PAM）の存在を必要とする。二重RNAと標的配列との対形成後、続いてCas9は、PAMモチーフの3塩基上流に、断面が平滑な（blunt）二本鎖切断を導入する（Garneau, Dupuis et al. 2010）。
【００５５】
本出願において説明するレアカットエンドヌクレアーゼの配列に対してヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルで高比率の同一性または高比率の相同性を有する配列を提示する、レアカットエンドヌクレアーゼ変種もまた、本発明の範囲に包含される。高比率の同一性または高比率の相同性とは、70％、より好ましくは75％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、より好ましくは95、より好ましくは97％、より好ましくは99％、または70％〜99％の間に含まれる任意の整数を意図する。
【００５６】
「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味すると意図される。本発明において使用され得るベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体性核酸、非染色体性核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましいベクターは、自律複製できるもの（エピソームベクター）および／または連結されている核酸を発現できるもの（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。いくつかの有用なベクターには、例えば、非限定的に、pGEM13z、pGEMT、およびpGEMTEasy（Promega, Madison, WI）;pSTBlueI（EMD Chemicals Inc. San Diego, CA）;ならびにpcDNA3.1、pCR4-TOPO、pCR-TOPO-II、pCRBlunt-II-TOPO（Invitrogen, Carlsbad, CA）が含まれる。好ましくは、該ベクターは、本発明のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする配列が適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントの制御下に置かれて、該レアカットエンドヌクレアーゼの作製または合成を可能にする、発現ベクターである。したがって、該ポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位（ゲノムDNAが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これはまた、エンハンサーも含んでよい。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、前記レアカットエンドヌクレアーゼがヘテロ二量体である場合、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、プラスミド内組換え事象を避けるために、2つのベクター中に含まれる。別の態様において、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に推進することができる1つのベクター中に含まれる。いくつかの態様において、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼを発現させるためのベクターは、藻類特異的プロモーターに機能的に連結されてよい。いくつかの実施形態において、藻類特異的プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、藻類特異的プロモーターは、構成的プロモーターである。使用され得るプロモーターには、例えば、非限定的に、Pptca1プロモーター（P.トリコルヌツムに由来する葉緑体の炭酸脱水酵素遺伝子ptca1のCO2応答性プロモーター）、NITIプロモーター、AMTIプロモーター、AMT2プロモーター、AMT4プロモーター、RHIプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、タバコモザイクウイルスプロモーター、サルウイルス40プロモーター、ユビキチンプロモーター、PBCV-I VP54プロモーター、もしくはそれらの機能的断片、または当業者に公知である他の任意の適切なプロモーター配列が含まれる。本発明による別のより好ましい態様において、ベクターは、大腸菌中で増殖することもでき（適切な選択マーカーおよび複製起点を含む構築物）、かつ選択された藻類のゲノムにおける増殖または組込みに適合することもできる、シャトルベクターである。
【００５７】
本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、それが機能的に連結されている核酸配列の転写を指示するのに十分な、最小限の核酸配列を意味する。「プロモーター」という用語はまた、細胞型特異的発現、組織特異的発現のために制御可能であるか、または外部のシグナルもしくは作用物質によって誘導可能であるプロモーター依存性遺伝子発現のために十分なプロモーターエレメントを包含すると意図され、このようなエレメントは、天然に存在する遺伝子の5'領域または3'領域に位置し得る。
【００５８】
「誘導性プロモーター」とは、転写活性化因子に結合した場合に転写が活発になる、すなわち、特定の条件下、例えば、誘導性プロモーターへの転写活性化因子の結合に影響を及ぼすか（例えばCO2もしくはNO2）、かつ／または転写活性化因子それ自体の機能に影響を及ぼす特定の化学シグナルまたは化学シグナルの組合せの存在下で活性化される、プロモーターを意味する。
【００５９】
本明細書において使用される「トランスフェクション」または「形質転換」という用語は、宿主のものではない核酸配列の組入れ後に細胞において引き起こされる、恒常的または一過性の遺伝的変化、好ましくは、恒常的遺伝的変化を意味する。
【００６０】
「宿主細胞」という用語は、本発明の方法を用いて形質転換される細胞を意味する。一般に、本明細書において使用される宿主細胞とは、核酸標的配列が改変されている藻類細胞を意味する。
【００６１】
「触媒ドメイン」とは、酵素の活性部位を含む、酵素のタンパク質ドメインまたはモジュールを意図し、活性部位とは、基質の触媒作用が起こる、該酵素の部分を意図する。酵素だけでなく、それらの触媒ドメインもまた、それらが触媒する反応に基づいて分類され、名前を付けられている。酵素番号（EC番号）は、酵素が触媒する化学反応に基づく、それらを数字で分類する方式である（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/）。
【００６２】
「変異誘発」は、レアカットエンドヌクレアーゼの認識部位に隣接する、少なくとも1つの所与のDNA断片（少なくとも1つのヌクレオチド）または配列の除去または付加と理解される。
【００６３】
「NHEJ」（非相同末端結合）とは、相同な鋳型を必要とせずに切断末端が直接連結される、DNA中の二本鎖切断を修復する経路を意図する。NHEJは、少なくとも2つの異なるプロセスを含む。機序は、直接的再連結（Critchlow 1998 #17）またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Ma, Kim et al. 2003）によって、2つのDNA末端の残部を再結合させることを含み、これは、小規模の挿入または欠失をもたらし、特異的遺伝子ノックアウトを作り出すために使用され得る。
【００６４】
「相同組換え」という用語は、DSBおよび他のDNA損傷の修復に関与する、保存されたDNA維持経路を意味する。遺伝子ターゲティング実験では、内在性染色体配列と外来性DNA構築物との間の遺伝情報の交換が促進される。標的とされる構築物の設計によって、遺伝子は、合理的で、正確で、かつ効率的な様式で、ノックアウトされるか、ノックインされるか、置換されるか、訂正されるか、または変異させられ得る。このプロセスは、ターゲティング構築物と標的とされる座位との相同性を必要とする。好ましくは、相同組換えは、WO9011354で説明されているように、より正確な組込みを起こすために、内在性配列との同一性を有する2つのフランキング配列を用いて実施される。
【００６５】
本発明に関する上記の説明は、任意の当業者が本発明を作製および使用するのを可能にするように、本発明を作製および使用する様式および方法を提供し、この実施可能性は、特に、当初明細書の一部分を構成する添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
【００６６】
上記で使用したように、「からなる群より選択される」および「より選択される」などの語句は、特定された物質の混合物を含む。
【００６７】
数値的な限界または範囲が本明細書において記載される場合、終点が含まれる。また、数値的な限界または範囲内の値および部分範囲はすべて、はっきりと書き出されたかのように、具体的に含まれる。
【００６８】
上記の説明は、当業者が本発明を作製および使用するのを可能にするために提示され、特定の用途およびその要件に関連して提供される。好ましい態様に対する様々な修正は、当業者に容易に明らかになると考えられ、本明細書において定義する一般的原理は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の態様および用途に適用され得る。したがって、本発明は、示された態様に限定されるものではなく、本明細書において開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲を与えられるべきである。
【００６９】
本発明を一般的に説明したが、さらなる理解は、いくつかの具体例を参照することにより得ることができ、これらの具体例は、別段の指定が無い限り、単なる例示のために本明細書において提供され、限定することを意図しない。
【実施例】
【００７０】
実施例1：UDPグルコースピロホスホリラーゼ（UGPase）遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼを用いる、珪藻中の脂質含有量の増量
珪藻中の脂質含有量にUGPase遺伝子不活性化が与える影響を明らかにするために、珪藻中のUGPase遺伝子（SEQ ID NO: 3）に標的変異誘発を誘導するための1つの操作されたTALEヌクレアーゼ、すなわち、DNA配列
2016523093.tif 000002
を切断するように設計され、pCLS19745（SEQ ID NO: 4）プラスミドおよびpCLS19749（SEQ ID NO: 5）プラスミドにコードされる、UGP TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシン（nourseothricin）に対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、UGPase遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。特定したクローンの脂質含有量を、ボディパイ標識493／503（Molecular Probe）を用いて解析した。
【００７１】
材料および方法
培養条件
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリン（Bohlin）クローンCCMP2561を、Sanyo製インキュベーター（モデルMLR-351）において一定温度（20+／-0.5℃）で、シリカを含まないろ過したギラードf／2培地[（1×ギラードf／2海洋水濃縮溶液（Sigma G0154）を添加した、40°／°°w／v Sigma製海塩（Sea Salts）S9883]中で増殖させた。このインキュベーターには、約120μmol光子m-2s-1の照明および12時間の明期：12時間の暗期という光周期（午前9時から午後9時までが照明期間）をもたらす白色コールドネオン（cold neon）ライト管が備え付けられている。30回転／分の回転速度および角度5°のオービタルシェーカー（Polymax 1040, Heidolph）上に置いたベントキャップフラスコ中で、液体培養物を作製した。
【００７２】
遺伝的形質転換
遠心分離（3000rpm、20℃で10分間）によって、指数関数的に増殖している液体培養物（約106細胞／mlの濃度）から、5×107個の細胞を採取した。上清を廃棄し、500μlの新鮮なf／2培地に細胞沈殿物を再懸濁した。次いで、シリカを含まないf／2溶液を添加した20°／°°海塩を含む、10cmの1％寒天プレートの中央の3分の1に細胞懸濁液を塗り広げた。2時間後に、微粒子銃（バイオリスティックPDS-1000／Heパーティクルデリバリーシステム（BioRad））を用いて、形質転換を実施した。プロトコールは、Falciatore et al., （1999）およびApt et al., （1999）をわずかに修正して、適応させる。簡単に説明すると、製造業者の取扱い説明書に従って、1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて、M17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を、1.5μg（実験2）または3μg（実験1）のTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS19745およびpCLS19749）、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングした。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。形質転換しようとする珪藻を含む寒天プレートを、発射チャンバー内に停止スクリーンから7.5cmの位置（2番目の位置の標的棚）に配置した。1550 psiの破裂圧および25Hg／inの真空を使用した。発射後、12時間の明期：12時間の暗期という光周期で48時間、プレートをインキュベートした。
【００７３】
選択
形質転換後2日目に、撃ち込まれた細胞を、シリカを含まないf／2培地700μlを用いてそっとこそげ取り、300μg ml-1のノウルセオトリシン（Werner Bioagents）を含む10cmの1％寒天プレート（シリカを含まないf／2培地を添加した20°／°°海塩）2枚の上に塗り広げた。次いで、12時間の明期：12時間の暗期のサイクル下にあるインキュベーター中に少なくとも3週間、プレートを置いた。平均して形質転換後3〜4週間目に、安定な形質転換の結果として生じる耐性コロニーを、300μg・ml-1のノウルセオトリシンを含む新しい10cmの1％寒天プレート上に再び画線した。
【００７４】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
耐性コロニーを採取し、エッペンドルフチューブに入れた溶解緩衝液（1％トリトンX-100、20mM Tris-HCl pH8、2mM EDTA）20μlの中で分散させた（dissociated）。チューブを少なくとも30秒間ボルテックスし、次いで、氷上で15分間保存した。85℃で10分間加熱した後、チューブを室温で冷まし、短時間遠心分離して、細胞片をペレットにした。上清を直ちに使用するか、または4℃で保管した。ミリQ水（milliQ H2O）による上清の1:5希釈物5μlを各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー:
2016523093.tif 000003
。
【００７５】
B  変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー:
2016523093.tif 000004
と共にコロニー溶解物の1:5希釈物を用いて、UGPase標的を増幅した。
【００７６】
磁性ビーズ（Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter）を用いてPCR産物を精製し、NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Scientifioc）を用いて定量した。アンプリコン50ngを変性させ、次いで、Eppendorf MasterCycle勾配PCR機器を用いて、アニーリング緩衝液（10mM Tris-HCl pH8、100mM NaCl、1mM EDTA）10μl中でアニールした。アニーリングプログラムは次のとおりである：95℃で10分間；3℃／秒で85℃まで急速に冷却；および0.3℃／秒で25℃までゆっくりと冷却。アニールしたDNAの全体を、最終体積20μl（1×NEB緩衝液2、Biolabs）に溶かしたT7エンドヌクレアーゼI（10U／μl）（M0302, Biolabs）0.5μlを用いて37℃で15分間、消化した。次いで、消化物10μlを10％ポリアクリルアミドMiniProtean TBEプレキャストゲル（BioRad）上に載せた。移動後、ゲルをSYBRgreenで染色し、Gel Doc XR+装置（BioRad）を用いて調査した。
【００７７】
C  ディープシークエンシングによる、変異誘発頻度の測定
プライマー：
2016523093.tif 000005
および
2016523093.tif 000006
を用いて、454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した特異的プライマーを用いて、UGPase標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【００７８】
D  ボディパイ標識による、UDP KOクローンの表現型の特徴付け
5×105細胞／mlの密度で細胞を再懸濁し、培地（シリカを含まないろ過したギラードf／2培地）中で2回洗浄した。暗所、室温で10分間、10％DMSOの存在下で、最終濃度10μMのボディパイ493／503（Molecular Probe）を用いて、ボディパイ標識を実施した。フローサイトメトリー（MACSQuant Analyzer, Miltenyi Biotec）により、488nMで蛍光強度を測定した。
【００７９】
E  脂質含有量の解析
脂質含有量の解析は、（Vieler, Wilhelm et al. 2007; Lamaziere, Wolf et al. 2012; Lamaziere, Wolf et al. 2013）において以前に説明されているプロトコールを用いて、APLILIPID社（Applied Lipidomics Investigation）によって実施された。
【００８０】
結果
UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼを用いて、3つの独立した実験を実施した。それらのそれぞれについて、珪藻形質転換後3週目に得られたクローンにおける変異誘発事象の存在について解析した。
【００８１】
1つ目の実験の場合、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドで形質転換した珪藻に対応する条件で、18個のクローンを得た（条件1）。最後に、空ベクターによる形質転換の結果として生じる6個のクローンを得た（条件2）。条件1で得たクローン12個および条件2で得たクローン2個に対して、UGPase標的増幅を実施した。試験したクローン12個において、4個は、予想より高いPCRバンドを示して、明らかな変異誘発事象を示し、1個は、UGPase標的の増幅をまったく示さず、7個は、野生型の大きさの位置にバンドを示している。これら12個のクローンについて、T7アッセイ法で評価した（図4）。それらのうちの1個のクローンはT7アッセイ法において陽性であった。これは、変異誘発事象の存在を反映している（図5）。予想どおり、空ベクターに対応する条件（条件2）に由来する2個のクローンでは、シグナルは検出されなかった。
【００８２】
2つ目の実験の場合、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドで形質転換した珪藻に対応する条件で、62個のクローンを得た（条件1）。それらの内で36個を、両方のTALEヌクレアーゼ単量体をコードするDNA配列の存在に関して試験した。11／36（すなわち30.5％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。最後に、空ベクターによる形質転換の結果として生じる38個のクローンを得た（条件2）。条件1で得たクローン11個および条件2で得たクローン2個に対して、UGPase標的増幅を実施した。試験したクローン11個において、5個は、UGPase標的の増幅をまったく示さず、6個は、野生型の大きさの位置にバンドを示している（図6）。
【００８３】
サイズの大きな（higher）PCR増幅産物を提示する実験1の4個のクローン（図4）における変異誘発事象の性質を確認するために、本発明者らは、これらの断片を配列決定した。これらはすべて、それぞれコード配列中に停止コドンの存在を招く、261bp（37-5A3）、228bp（37-7A1）、55bp（37-7B2）、および330bp（37-16A1）の挿入を示している。T7アッセイ法で陽性シグナルを示すクローン37-3B4をディープシークエンシングによって特徴付けした。このクローンにおける変異誘発頻度は86％であり、いくつかのタイプの変異誘発事象を有した（挿入または欠失のいずれか）。変異した配列の例を図7に示している。
【００８４】
脂質含有量にUGPase遺伝子不活性化が与える影響を調査するために、UGPase標的中に変異誘発事象を含む1個のクローン（37-7A1）に対して、ボディパイ標識（Molecular Probe）を実施した。並行して、フェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株および空ベクターによる形質転換の結果として生じる1個のクローンを試験した。これらの結果を図8に提示する。本発明者らは、2つの対照株と比べた、UGPase遺伝子の不活性化を示すクローンにおける蛍光強度の上昇を観察した。この実験を3回再現し、蛍光強度の変化を毎回観察した。ボディパイ標識は細胞の脂質含有量を反映するため、これらの結果から、変異した株の脂質含有量の確固とした、かつ再現可能な増加が実証された。
【００８５】
脂肪酸（FA）およびトリアシルグリセロール（TAG）の含有量の定量的解析を実施するために、変異体37-7A1に対応する珪藻ならびにそれに関連する対照の空ベクターおよびフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型の湿ったペレットを、詳細なリピドミクス解析のためにAPlipid社に持って行った。対照（Pt野生型親株および耐性クローン）と比べて、変異体37-7A1（UGPase）は、細胞総数に対して報告されるFA含有量の2倍の増加を示している。TAG含有量（単位はnモルであり、細胞総数に対して報告される）は、変異体37-7A1の場合、24倍に増加している（図9）。
【００８６】
したがって、UGPase遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、再現可能であり（2回の独立した実験）高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で100％）。さらに、UGPase遺伝子の不活性化により、ボディパイ標識において脂質含有量の顕著かつ再現可能な増加がもたらされる。この定量により、対照と比べてUGPaseノックアウトクローンにおいて脂肪酸が2倍、TAGが24倍に増加していることが明らかになる。
【００８７】
実施例2:推定上の伸長酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量に推定上の伸長酵素遺伝子（SEQ ID NO: 14）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000007
を切断するように設計され、pCLS19746（SEQ ID NO: 15）プラスミドおよびpCLS19750（SEQ ID NO: 16）プラスミドにコードされる、伸長酵素_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。このTALEヌクレアーゼは、機能が未知であるタンパク質をコードする配列を標的とするが、この標的は、キンカチョウ（Taeniopygia guttata）の脂肪酸伸長酵素6（ELOVL6）のmRNAと86％の配列同一性を示し、シチメンチョウ（Meleagris gallopavo）の極長鎖脂肪酸伸長タンパク質6様（elongation of very long chain fatty acids protein 6-like ）（LOC100542840）と86％の配列同一性を示す。
【００８８】
TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、伸長酵素遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【００８９】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて1.5μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー （pCLS19746（SEQ ID NO: 15）およびpCLS19750（SEQ ID NO: 16））、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。
【００９０】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000008
。
【００９１】
B  変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー：
2016523093.tif 000009
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、伸長酵素標的を増幅した。
【００９２】
磁性ビーズ（Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter）を用いてPCR産物を精製し、NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Scientifioc）を用いて定量した。アンプリコン50ngを変性させ、次いで、Eppendorf MasterCycle勾配PCR機器を用いて、アニーリング緩衝液（10mM Tris-HCl pH8、100mM NaCl、1mM EDTA）10μl中でアニールした。アニーリングプログラムは次のとおりである：95℃で10分間；3℃／秒で85℃まで急速に冷却；および0.3℃／秒で25℃までゆっくりと冷却。アニールしたDNAの全体を、最終体積20μl（1×NEB緩衝液2、Biolabs）に溶かしたT7エンドヌクレアーゼI（10U／μl）（M0302, Biolabs）0.5μlを用いて37℃で15分間、消化した。次いで、消化物10μlを10％ポリアクリルアミドMiniProtean TBEプレキャストゲル（BioRad）上に載せた。移動後、ゲルをSYBRgreenで染色し、Gel Doc XR+装置（BioRad）を用いて調査した。
【００９３】
C  ディープシークエンシングによる、変異誘発頻度の測定
プライマー：
2016523093.tif 000010
を用いて、454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーを用いて、伸長酵素標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【００９４】
E  脂質含有量の解析
脂質含有量の解析は、（Vieler, Wilhelm et al. 2007;Lamaziere, Wolf et al. 2012;Lamaziere, Wolf et al. 2013）において以前に説明されているプロトコールを用いて、APLILIPID社（Applied Lipidomics Investigation）によって実施された。
【００９５】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応する条件で、62個のクローンを得た（条件1）。それらの内で35個を、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列の存在に関して試験した。11／27（すなわち40.7％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。最後に、空ベクターによる形質転換の結果として生じる38個のクローンを得た（条件2）。
【００９６】
両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性である11個のクローンをT7アッセイ法によって試験した。フェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株、ならびに空ベクターによる形質転換の結果として生じる4個のクローンを並行して試験した。4個のクローンは増幅を示さなかった。別の座位の増幅が可能であるため、溶解物の質は疑問視されない。したがって、増幅がないことから、伸長酵素の座位における大規模な変異誘発事象の存在が示唆され得る。1つのクローンは、予想されたサイズのPCR産物および重量が重い別のPCR産物を等比率で示し、実際に、明らかな変異誘発事象が実証された（図10）。1つのクローンはT7アッセイ法において陽性であった。これは、変異誘発事象の存在を反映している。9個のクローンはT7アッセイ法においてシグナルを示さなかった。予想どおり、空ベクターまたはフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株に対応する条件では、シグナルは検出されなかった。
【００９７】
サイズの大きなPCR増幅産物を提示するクローンにおける変異誘発事象の性質を確認するために、本発明者らは、この断片を配列決定した。コード配列中に停止コドンの存在を招く83bpの挿入を検出した。陽性T7シグナルを示すクローンをディープシークエンシングによって特徴付けした。このクローンにおける変異誘発頻度は5.9％であり、1種類の変異（22bpの欠失）であった。変異した配列の例を図11に示している。
【００９８】
脂肪酸（FA）およびトリアシルグリセロール（TAG）の含有量の定量的解析を実施するために、変異体およびそれに関連する対照空ベクターに対応する珪藻の湿ったペレットを、詳細なリピドミクス解析のためにAPlipid社に持って行った。対照（耐性クローン）と比べて、変異体（伸長酵素）は、細胞総数に対して報告されるFA含有量の3倍の増加を示している。TAG含有量（単位はnモルであり、細胞総数に対して報告される）は、変異体伸長酵素の場合、3倍に増加している（図12）。
【００９９】
したがって、伸長酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で50％）。脂質プロファイルに伸長酵素遺伝子不活性化が与える影響を調査するために、変異事象が50％であるクローンのサブクローニングを実施する。このクローンの脂質含有量の定量により、対照と比べて伸長酵素変異体クローンにおいて脂肪酸が3倍、TAGが3倍に増加していることが明らかになる。
【０１００】
実施例3：G3PDH遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量にグリセロール-3リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）遺伝子（SEQ ID NO: 22）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000011
を切断するように設計され、pCLS23159（SEQ ID NO: 23）プラスミドおよびpCLS23163（SEQ ID NO: 24）プラスミドにコードされる、G3PDH_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、G3PDH遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【０１０１】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて3μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS23159 （SEQ ID NO: 23）およびpCLS23163 （SEQ ID NO: 24））、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。形質転換しようとする珪藻を含む寒天プレートを、発射チャンバー内に停止スクリーンから7.5cmの位置（2番目の位置の標的棚）に配置した。1550psiの破裂圧および25Hg／inの真空を使用した。発射後、12時間の明期：12時間の暗期という光周期で48時間、プレートをインキュベートした。
【０１０２】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000012
。
【０１０３】
B  ディープシークエンシングによる変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー：
2016523093.tif 000013
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、G3PDH標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【０１０４】
E  脂質含有量の解析
脂質含有量の解析は、（Vieler, Wilhelm et al. 2007;Lamaziere, Wolf et al. 2012;Lamaziere, Wolf et al. 2013）において以前に説明されているプロトコールを用いて、APLILIPID社（Applied Lipidomics Investigation）によって実施された。
【０１０５】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応する条件で、13個のクローンを得た（条件1）。それらの内で7個を、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列の存在に関して試験した。7／13（すなわち53.8％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。それらのうちの1個は、TALEヌクレアーゼ認識部位において33％の標的変異誘発頻度を示す。変異した配列の例を図13に示している。予想どおり、空ベクターまたはフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株に対応する条件では、シグナルは検出されなかった。
【０１０６】
したがって、G3PDH遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で33％）。
【０１０７】
実施例4：ω3不飽和化酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量にω3不飽和化酵素遺伝子（SEQ ID NO: 30）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000014
を切断するように設計され、pCLS23158（SEQ ID NO: 31）プラスミドおよびpCLS23162（SEQ ID NO: 32）プラスミドにコードされる、ω3不飽和化酵素_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、ω3不飽和化酵素遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【０１０８】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて1.5μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS23158 （SEQ ID NO: 31）およびpCLS23162（SEQ ID NO: 32））、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。
【０１０９】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000015
。
【０１１０】
B  ディープシークエンシングによる変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー：
2016523093.tif 000016
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、ω3不飽和化酵素標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【０１１１】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応する条件で、9個のクローンを得た（条件1）。それらの内で6個を、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列の存在に関して試験した。6／9（すなわち66％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。6個のクローンのうちの3個において、ディープシークエンシングによって標的変異誘発頻度を測定した。それらすべてが、TALEヌクレアーゼ認識部位において高頻度の変異誘発事象を示す：14％、70％、および90％。変異した配列の例を図14に示している。予想どおり、空ベクターまたはフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株に対応する条件では、シグナルは検出されなかった。
【０１１２】
したがって、ω3不飽和化酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で90％）。
【０１１３】
実施例5：推定上のパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ遺伝子（PPT）を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量にPPT遺伝子（SEQ ID NO: 36）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000017
を切断するように設計され、pCLS19744（SEQ ID NO: 37）プラスミドおよびpCLS19748（SEQ ID NO: 38）プラスミドにコードされる、PPT_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、PPT遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【０１１４】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて1.5μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS19744 （SEQ ID NO: 37）およびpCLS19748 （SEQ ID NO: 38））、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。
【０１１５】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000018
。
【０１１６】
B  ディープシークエンシングによる、変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー:
2016523093.tif 000019
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、PPT標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【０１１７】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応する条件で、11個のクローンを得た（条件1）。それらの内で、3／11（すなわち27.3％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。3個のクローンのうちの1個において、ディープシークエンシングによって標的変異誘発頻度を測定した。このクローンは、TALEヌクレアーゼ認識部位において高頻度の変異誘発事象を示す：22％。変異した配列の例を図15に示している。予想どおり、空ベクターまたはフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株に対応する条件では、シグナルは検出されなかった。
【０１１８】
したがって、PPT遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で22％）。
【０１１９】
実施例6：エノイルACPレダクターゼ遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量にエノイルACPレダクターゼ遺伝子（SEQ ID NO: 42）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000020
を切断するように設計され、pCLS23157（SEQ ID NO: 43）プラスミドおよびpCLS23161（SEQ ID NO: 44）プラスミドにコードされる、エノイルACPレダクターゼ_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、エノイルACPレダクターゼ遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【０１２０】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて1.5μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS23157 （SEQ ID NO: 43）およびpCLS23161（SEQ ID NO: 44）、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。
【０１２１】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000021
。
【０１２２】
B  ディープシークエンシングによる、変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー：
2016523093.tif 000022
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、エノイルACPレダクターゼ標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【０１２３】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応する条件で、14個のクローンを得た（条件1）。それらの内で、2／14（すなわち14％）は、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列について陽性であった。2個のクローンのうちの1個において、ディープシークエンシングによって標的変異誘発頻度を測定した。このクローンは、TALEヌクレアーゼ認識部位において高頻度の変異誘発事象を示す：12％。変異した配列の例を図16に示している。予想どおり、空ベクターまたはフェオダクチラム・トリコルヌツム野生型株に対応する条件では、シグナルは検出されなかった。
【０１２４】
したがって、エノイルACPレダクターゼ遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼは、高頻度の標的変異誘発を誘導する（最高で12％）。
【０１２５】
実施例7：Δ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼによって誘導される、標的変異誘発
珪藻中の脂質含有量にΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（SEQ ID NO: 48）の不活性化が与える影響を明らかにするために、DNA配列
2016523093.tif 000023
を切断するように設計され、pCLS19743（SEQ ID NO: 49）プラスミドおよびpCLS19747（SEQ ID NO: 50）プラスミドにコードされる、Δ12不飽和化酵素_TALEヌクレアーゼと呼ばれる1つの操作されたTALEヌクレアーゼを使用した。TALEヌクレアーゼをコードするこれらのプラスミドを、野生型珪藻株にノウルセオトリシンに対する耐性を与えるプラスミド（NAT）と共に同時形質転換した。形質転換の結果として生じる個々のクローンを、Δ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の不活性化をもたらす変異誘発事象の存在についてスクリーニングした。
【０１２６】
材料および方法
フェオダクチラム・トリコルヌツム・ボーリンクローンCCMP2561を増殖させ、製造業者の取扱い説明書に従って1.25M CaCl2および20mMスペルミジンを用いて1.5μgのTALEヌクレアーゼの各モノマー（pCLS19743（SEQ ID NO: 49）およびpCLS19747（SEQ ID NO: 50））、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）（SEQ ID NO: 1）、および3μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）から構成される総量9μgのDNAでコーティングしたM17タングステン粒子（直径1.1μm、BioRad）を用いて、実施例1で説明した方法に従って形質転換した。陰性対照として、3μgのNAT選択プラスミド（pCLS16604）および6μgの空ベクター（pCLS0003）（SEQ ID NO: 2）を含むDNA混合物でビーズをコーティングした。
【０１２７】
特徴付け
A  コロニーのスクリーニング
選択後、耐性コロニーを採取し、実施例1で説明した方法に従って分散させた。上清を各PCR反応のために使用した。TALEヌクレアーゼスクリーニングのための特異的プライマー：
2016523093.tif 000024
。
【０１２８】
B  ディープシークエンシングによる、変異誘発事象の確認
454配列決定システム（454 Life Sciences）におけるHTS配列決定のために必要とされるアダプターが隣接した配列特異的プライマーならびに次の2つのプライマー：
2016523093.tif 000025
と共に溶解コロニーの1:5希釈物を用いて、Δ12脂肪酸不飽和化酵素標的を増幅した。試料1個につき5000〜10000個の配列を解析した。
【０１２９】
結果
珪藻の形質転換後3週目に、TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いて実施した形質転換に対応して得られたクローン（条件1）を、両方のTALEヌクレアーゼ単量体DNA配列の存在についてスクリーニングした。標的変異誘発頻度が、陽性クローンに対するディープシークエンシングによって測定されるであろう。
【０１３０】
参照文献
2016523093.tif 000026
2016523093.tif 000027
2016523093.tif 000028
【図１】
2016523093.tif 000029
【図２】
2016523093.tif 000030
【図３】
2016523093.tif 000031
【図４】
2016523093.tif 000032
【図５】
2016523093.tif 000033
【図６】
2016523093.tif 000034
【図７】
2016523093.tif 000035
【図８−１】
2016523093.tif 000036
【図８−２】
2016523093.tif 000037
【図８−３】
2016523093.tif 000038
【図８−４】
2016523093.tif 000039
【図８−５】
2016523093.tif 000040
【図８−６】
2016523093.tif 000041
【図８−７】
2016523093.tif 000042
【図８−８】
2016523093.tif 000043
【図８−９】
2016523093.tif 000044
【図９】
2016523093.tif 000045
【図１０】
2016523093.tif 000046
【図１１】
2016523093.tif 000047
【図１２】
2016523093.tif 000048
【図１３】
2016523093.tif 000049
【図１４】
2016523093.tif 000050
【図１５】
2016523093.tif 000051
【図１６】
2016523093.tif 000052
【配列表】
2016523093000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月15日(2016.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、およびエノイルACPレダクターゼからなる群より選択される、脂質代謝に関与している遺伝子において遺伝子改変されている、珪藻株。
【請求項２】
珪藻株が、野生型と比べて、量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する、請求項1記載の珪藻。
【請求項３】
珪藻株が、その乾燥重量の少なくとも40％の脂質含有量を有する、請求項1または2記載の珪藻。
【請求項４】
脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項５】
脂質代謝に関与している選択された遺伝子内の配列を標的とすることができるTALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを発現することによって、前記遺伝子改変がなされる、請求項1〜4のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項６】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 3、14、22、30、および36からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内の配列を標的とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項７】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、および39からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項８】
タラシオシラ（Thalassiosira）属の種またはフェオダクチラム（Phaeodactylum）属の種に由来する、請求項1〜7のいずれか一項記載の珪藻。
【請求項９】
タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種またはフェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）種より選択される、請求項8記載の珪藻。
【請求項１０】
（a）脂質代謝に関与している遺伝子がエンドヌクレアーゼによって不活性化されている珪藻株を、適応させた培地において培養する段階、
（b）該培養した珪藻株を採取する段階、
（c）該採取した珪藻から脂質を抽出する段階
を含む、珪藻によって産生された脂質の質を改変するための方法。
【請求項１１】
以下の予備段階：
（i）脂質代謝に関与していると推定される珪藻株遺伝子内の標的配列を選択する段階、
（ii）該遺伝子を標的とし不活性化するために、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを操作する段階、
（iii）該TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを該珪藻に導入する段階、
（iv）脂質代謝に関与していると推定される前記遺伝子が不活性化されて、質の向上した脂質を産生する珪藻を選択する段階
を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
Trex2のようなエキソヌクレアーゼを珪藻にさらに導入して変異誘発を増加させる、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
標的配列が、別の生物に由来するΔ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ活性、伸長酵素、またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼの遺伝子に対して70％より高い同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む珪藻遺伝子内で選択される、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
標的配列が、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内で選択される、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
エンドヌクレアーゼが、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼである、請求項10〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
段階（a）で培養された前記珪藻株が、請求項1〜9記載のいずれかの株から選択される、請求項10〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ドナーマトリックスと標的配列の間で相同組換えが起こるように、標的配列に対する少なくとも1つの相同領域を含むドナーマトリックスを珪藻に導入する段階をさらに含む、請求項10〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ドナーマトリックスが、脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記珪藻が、量の増加した短鎖長脂肪酸および／または飽和度が低い脂肪酸を産生する、請求項10〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
量の増加した短鎖長脂肪酸および／または飽和度が低い脂肪酸が、バイオ燃料を産生するのに適している、請求項10〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
抽出された脂質からバイオ燃料を生産する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記脂質が、ドコサヘキサエン酸（DHA）およびエイコサペンタエン酸（EPAまたはイコサペンタエン酸）などのω-3脂肪酸の高い含有量を有する、請求項10〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
抽出された脂質を化粧品または食品に変換する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ゲノム比較およびタンパク質ホモロジー検索に基づいて、本発明者らは、脂質代謝に関与しているいくつかの標的遺伝子を選択し、初めて、バイオ燃料生産のための新しい珪藻株を作り出すためにそれらを選択的に不活性化した。特異的なレアカットエンドヌクレアーゼ、具体的には、TALヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを用いて、珪藻ゲノム内での特異的遺伝子ターゲティングを可能にすることによって、改変された珪藻の作製を容易にした。本発明者らは、それによって、選択遺伝子の不活性化によって脂質内容物の量の増加および／または質の向上が引き起こされる珪藻を作製した。
[本発明1001]
脂質代謝に関与する遺伝子が、TALヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼによって不活性化されている、改変された珪藻株。
[本発明1002]
量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する、本発明1001の珪藻。
[本発明1003]
珪藻株が、その乾燥重量の少なくとも40％の脂質含有量を有する、本発明1002の珪藻。
[本発明1004]
量の増加した短鎖長脂肪酸および／または飽和度が低い脂肪酸を産生する、本発明1002または1003の珪藻。
[本発明1005]
脂質代謝に関与している遺伝子が、Δ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ、伸長酵素、およびUDPグルコースピロホスホリラーゼからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの珪藻。
[本発明1006]
脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの珪藻。
[本発明1007]
脂質代謝に関与している遺伝子内の配列を標的とすることができるTALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／もしくはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼ、またはそれをコードする導入遺伝子を含む、本発明1001〜1006のいずれかの珪藻。
[本発明1008]
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内の配列を標的とする、本発明1001〜1007のいずれかの珪藻。
[本発明1009]
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、本発明1001〜1008のいずれかの珪藻。
[本発明1010]
タラシオシラ（Thalassiosira）属の種またはフェオダクチラム（Phaeodactylum）属の種に由来する、本発明1001〜1009のいずれかの珪藻。
[本発明1011]
タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種またはフェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）種より選択される、本発明1010の珪藻。
[本発明1012]
（a）適応させた培地において本発明1001〜1011のいずれかの改変された珪藻株を培養する段階、
（b）任意で、該珪藻を採取する段階、
（c）該珪藻から脂質を抽出する段階
を含む、脂質を生産するための方法。
[本発明1013]
（a）脂質代謝に関与していると推定される珪藻株遺伝子内の標的配列を選択する段階、
（b）該遺伝子を標的とし不活性化するために、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを操作する段階、
（c）該TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼを該珪藻に導入する段階、
（d）脂質代謝に関与していると推定される前記遺伝子が不活性化されて、量、貯蔵量の増加したおよび／または質の向上した脂質を産生する珪藻を選択する段階
を含む、珪藻において脂質を生産するための方法。
[本発明1014]
Trex2のようなエキソヌクレアーゼを珪藻にさらに導入して変異誘発を増加させる、本発明1013の方法。
[本発明1015]
標的配列が、別の生物に由来するΔ12不飽和化酵素、ω-3不飽和化酵素、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、エノイルACPレダクターゼ活性、伸長酵素、またはUDP-グルコースピロホスホリラーゼの遺伝子に対して70％より高い同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む珪藻遺伝子内で選択される、本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
標的配列が、SEQ ID NO: 3、14、22、30、36、42、および48からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する遺伝子内で選択される、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、および／またはCRISPR／Cas9ヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 6、17、25、33、39、45、および51からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を標的とする、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
ドナーマトリックスと標的配列の間で相同組換えが起こるように、標的配列に対する少なくとも1つの相同領域を含むドナーマトリックスを珪藻に導入する段階をさらに含む、本発明1013〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
ドナーマトリックスが、脂質代謝に関与している遺伝子をコードする導入遺伝子を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
抽出された脂質からバイオ燃料を生産する段階をさらに含む、本発明1012〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
抽出された脂質を化粧品または食品に変換する段階をさらに含む、本発明1012〜1019のいずれかの方法。
【国際調査報告】
2016523093.tif 000053
2016523093.tif 000054
2016523093.tif 000055
2016523093.tif 000056