(57)【要約】  PCL-PLA-PEG-PLA-PCLまたはPCL-PGA-PEG-PGA-PCL構造を有する新規なペンタブロックポリマー（式中、PEGはポリエチレングリコール、PCLはポリ（ε-カプロラクトン）、PGAはポリ（グリコール酸）、かつ、PLAはポリ（乳酸）である）並びに、該ペンタブロックポリマーからナノ粒子を製造する方法を開示する。また、本発明は、高濃度の生物活性剤または診断剤を含有するポリマーを含むナノ粒子組成物を調製するための方法にも関する。
2016520141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式CBABCに従うペンタブロックポリマーであって、
ポリエチレングリコール（PEG）；
ポリグリコール酸（PGA）またはポリ乳酸（PLA）；
ポリ（ε-カプロラクトン）（PCL）；を含み、かつ、
PCL-PLA-PEG-PLA-PCL構造またはPCL-PGA-PEG-PGA-PCL構造を有する前記ペンタブロックポリマー。
【請求項２】
前記ペンタブロックポリマーは、PCL-PLA-PEG-PLA-PCL構造を有し、かつ、
前記PEGは、200〜20,000 Daの平均分子量を有し；かつ、
前記PLAは、100〜10,000 Daの平均分子量を有し；かつ、
前記PCLは、500〜25,000 Daの平均分子量を有する、請求項１に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項３】
前記ペンタブロックポリマーは、PCL-PGA-PEG-PGA-PCL構造を有し、かつ、
前記PEGは、200〜20,000 Daの平均分子量を有し；かつ、
前記PGAは、100〜15,000 Daの平均分子量を有し；かつ、
前記PCLは、500〜25,000 Daの平均分子量を有する、請求項１に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項４】
前記ペンタブロックポリマーは、PCL-PLA-PEG-PLA-PCL構造を有し、かつ、
PCLC-PLAB-PEGA-PLAB-PCLCによって定義され、
式中、PEGはポリエチレングリコールであり；
PLAはポリ乳酸であり；
PCLはポリ（ε-カプロラクトン）であり；
Aは、200〜20,000 Daの平均分子量を規定し；
Bは、100〜10,000 Daの平均分子量を規定し；かつ、
Cは、500〜25,000 Daの平均分子量を規定する、請求項１に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項５】
Aは、1,000〜10,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Bは、1,000〜8,000 Daの平均分子量を規定し；または
Cは、3,000〜15,000 Daの平均分子量を規定する、請求項４に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項６】
Aは、2,000〜6,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Bは、3,000〜6,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Cは、6,000〜12,000 Daの平均分子量を規定する、請求項４に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項７】
前記PEGは30重量％未満であり、前記PLAは約10〜80重量％であり、かつ、前記PCLは約10〜80重量％である、請求項４に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項８】
前記ペンタブロックポリマーは、PCL-PGA-PEG-PGA-PCL構造を有し、かつ、
PCLF-PGAE-PEGD-PGAE-PCLFによって定義され、
式中、PEGはポリエチレングリコールであり；
PGAはポリグリコール酸であり；
PCLはポリ（ε-カプロラクトン）であり；
Dは、200〜20,000 Daの平均分子量を規定し；
Eは、500〜15,000 Daの平均分子量を規定し；かつ、
Fは、500〜25,000 Daの平均分子量を規定する、請求項１に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項９】
Dは、1,000〜10,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Eは、2,000〜10,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Fは、3,000〜15,000 Daの平均分子量を規定する、請求項８に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項１０】
Dは、2,000〜6,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Eは、3,000〜6,000 Daの平均分子量を規定し；または、
Fは、6,000〜12,000 Daの平均分子量を規定する、請求項８に記載のペンタブロックポリマー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペンタブロックポリマーを含むナノ粒子。
【請求項１２】
約１ミクロン未満の粒子サイズを有する、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
約300〜700nmの粒子サイズを有する、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１０に記載のペンタブロックポリマーのいずれかまたはそれらの組み合わせ、および有効量の生物活性剤または診断剤から本質的に成る生物活性または診断組成物。
【請求項１５】
前記生物活性剤または診断剤は、タンパク質またはペプチドを含む、請求項１４に記載の生物活性または診断組成物。
【請求項１６】
前記生物活性剤または診断剤は、該組成物の約0.01〜50wt％である、請求項１４に記載の生物活性または診断組成物。
【請求項１７】
前記生物活性剤は、抗体である、請求項１４に記載の生物活性または診断組成物。
【請求項１８】
複数のナノ粒子；及び、
感熱ゲル：を含む制御放出製剤であって、
前記複数のナノ粒子は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の第１のペンタブロックポリマー内部に薬剤または診断剤をカプセル化して含み、かつ、
前記複数のナノ粒子は前記感熱ゲル中に分散されている、前記制御放出製剤。
【請求項１９】
前記感熱ゲルは第２のペンタブロックポリマーを含む、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項２０】
前記第２のペンタブロックポリマーは、PEG-PCL-PLA-PCL-PEGによって定義され、式中、
PLAは、100〜5,000 Daの平均分子量を有し；
PEGは、100〜20,000 Daの平均分子量を有する、請求項１９に記載の制御放出製剤。
【請求項２１】
前記第２のペンタブロックポリマーは、PEG-PCL-PLA-PCL-PEGによって定義され、式中、
PLAは、200〜1,000 Daの平均分子量を有し；
PCLは、200〜900 Daの平均分子量を有し；かつ、
PEGは、200〜5,000 Daの平均分子量を有する、請求項１９に記載の制御放出製剤。
【請求項２２】
前記第２のペンタブロックポリマーは、PEG-PCL-PLA-PCL-PEGによって定義され、式中、
PLAは、200〜800 Daの平均分子量を有し；
PCLは、600〜850 Daの平均分子量を有し；かつ、
PEGは、300〜2,000 Daの平均分子量を有する、請求項１９に記載の制御放出製剤。
【請求項２３】
前記第２のペンタブロックポリマーについて、前記PEGは約10〜50重量％であり、前記PCLは約40〜60重量％であり、かつ、前記PLAは約5〜25重量％である、請求項２０に記載の制御放出製剤。
【請求項２４】
前記第２のペンタブロックポリマーについて、前記PEGは約25〜40重量％であり、前記PCLは約45〜55重量％であり、かつ、前記PLAは約10〜25重量％である、請求項２０に記載の制御放出製剤。
【請求項２５】
前記薬剤または診断剤は、タンパク質またはペプチドを含む、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項２６】
前記ナノ粒子は、前記第１のペンタブロックポリマーおよび前記薬剤または診断剤から本質的に成る、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項２７】
前記薬剤または診断剤は、タンパク質またはペプチドを含む、請求項２６に記載の制御放出製剤。
【請求項２８】
前記ナノ粒子は、約300〜700nmの粒子サイズを有する、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項２９】
前記ナノ粒子は、前記薬剤を約0.01〜50wt％の量で含む、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項３０】
前記感熱ゲルは、約35℃未満の下限臨界溶解温度を有する、請求項１８に記載の制御放出製剤。
【請求項３１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペンタブロックポリマーを含み、生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を調製するための方法であって、
以下の工程を含む前記方法：
W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程、ここで該W1溶液は生物活性剤または診断剤を水溶液内に含み、かつ該有機溶液Oは有機溶媒および前記ペンタブロックポリマーを含む；
前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；
場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；かつ、
前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから前記有機溶媒を除去し前記生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を形成する工程；
ここで、前記生物活性剤または診断剤の充填量は約10〜25％である。
【請求項３２】
ペンタブロックポリマー：生物活性剤または診断剤の初期比または公称比は約10：1〜2：1である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリマー：生物活性剤または診断剤の初期比または公称比は約6：1〜2：1である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
W1／O比は、W1溶液の体積：有機溶液Oの体積の比を表し、該W1／O比は約1：2〜1：6である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
W1／O比は、W1溶液の体積：有機溶液Oの体積の比を表し、該W1／O比は約1：3〜1：5である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
O／W2比は、有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該O／W2比は約1：1〜1：9である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
O／W2比は、有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該O／W2比は約1：1〜1：3である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
W1／O／W2比は、W1溶液の体積：有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該W1／O／W2比は約1：2：2〜1：6：54である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
W1／O／W2比は、W1溶液の体積：有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該W1／O／W2比は約1：4：8である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
W1／W2比は、W1溶液の体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該W1／W2比は、約1：2〜1：54である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
W1／W2比は、W1溶液の体積：外水相溶液W2の体積の比を表し、該W1／W2比は、約1：5〜1：10である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
W1／（W2＋W3）比は、W1溶液の体積：外水相溶液W2と希釈相W3との合計体積の比を表し、該W1／（W2＋W3）比は、約1：20〜1：100である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
W1／W3比は、W1水溶液の体積：希釈相W3の体積の比を表し、該W1／W3比は、約1：10〜約1：80である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
W1／W3比は、W1水溶液の体積：希釈相W3の体積の比を表し、該W1／W3比は、約1：10〜約1：50である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
W2／W3比は、外水相溶液W2の体積：希釈相W3の体積比を表し、該W2／W3比は、約1：1〜約1：50である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
W2／W3比は、外水相溶液W2の体積：希釈相W3の体積比を表し、該W2／W3比は、約1：1〜約1：10である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物活性剤または診断剤は、親水性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物活性剤または診断剤は、タンパク質またはペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物活性剤または診断剤は、IgGまたはIgG-Fabを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物活性剤または診断剤は、酵素を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５１】
前記W1溶液を形成する前記水溶液は、蒸留脱イオン水である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
前記有機溶液Oは、ジクロロメタンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
前記外水相溶液W2は、蒸留脱イオン水中にポリビニルアルコールを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５４】
前記水溶液W3は、蒸留脱イオン水中にポリビニルアルコールを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５５】
前記単離工程は、前記場合により希釈されたエマルション中の前記有機相を蒸発させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
前記ナノ粒子を遠心分離することを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
前記ナノ粒子は、約１ミクロン未満の粒子サイズを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ナノ粒子は、約300〜700nmの粒子サイズを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ナノ粒子は、約400〜600nmの粒子サイズを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項６０】
前記生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子は、生物活性剤または診断剤の充填量が約10〜25wt％である、請求項３１に記載の方法。
【請求項６１】
前記生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子は、生物活性剤または診断剤の封入効率が約45〜90％である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる2013年5月16日に出願された米国仮特許出願第61/824,063号および2013年9月27日に出願された米国仮特許出願第61/883,539号に基づき、それらの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、生物学的に活性な薬剤または診断剤、特に、ペプチドおよびタンパク質等の親水性化合物と、ポリマーを含むナノ粒子の投与に有用な新規なペンタブロックポリマーに関する。また、本発明は、ナノ粒子を感熱ゲル中に分散して含む制御放出製剤にも関する。ナノ粒子を製造する方法も記載する。本発明はさらに、高濃度の生物活性剤または診断剤およびポリマーを含むナノ粒子組成物を調製するための方法、並びにかかる方法により得られる組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
様々なブロックポリマーが当技術分野で知られている。例えば、Cha et al.の米国特許第5,702,717号では、ポリエチレングリコール（「PEG」）およびポリ（ε-カプロラクトン）（「PCL」）、およびポリラクチド（「PLA」）を含むPCL-PEG-PCL並びにPLA-PEG-PLA等のいくつかのトリブロックポリマートリブロックポリマーを開示する（Lui et al., Thermoreversible gel-sol behavior of biodegradable PCL-PEG-PCL triblock copolymer in aqueous solutions, J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. Jan 84 (1) 165-75 (2008)も参照）。ブロックポリマーを形成するこれらのポリマーは、全て公知かつFDAの認可を受けた生分解性かつ生体適合性の材料である。近年Mitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載のように、PGA-PCL-PEG-PCL-PGAまたはPEG-PCL-PLA-PCL-PEG構造を有するペンタブロックポリマーが本発明者らによって研究されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一態様は、数多くの障害または疾患の治療または診断に有用な生物活性剤および／または診断剤（特にタンパク質およびペプチド）の送達に有用である新規なペンタブロックポリマーに関する。
【０００５】
一態様では、本発明は、生物活性剤および／または診断剤が内部にカプセル化された（encapsulated therein）ナノ粒子を形成するのに有用である新規なペンタブロックポリマーに関する。これらのナノ粒子は、薬剤放出が一次速度論を示すことが予期される薬剤の送達に理想的である。
【０００６】
一態様では、ペンタブロックポリマーは、以下の式により定義される：
PCLC-PLAB-PEGA-PLAB-PCLC、
式中、
PEGはポリエチレングリコールであり；
PLAはポリ乳酸であり；
PCLはポリ（ε-カプロラクトン）であり；
Aは、200〜20,000 Daの平均分子量を規定し；
Bは、100〜10,000 Daの平均分子量を規定し；かつ、
Cは、500〜25,000 Daの平均分子量を規定する。
【０００７】
別の態様では、ペンタブロックポリマーは、以下の式により定義される：
PCLF-PGAE-PEGD-PGAE-PCLF、
式中、
PEGはポリエチレングリコールであり；
PGAはポリグリコール酸であり；
PCLはポリ（ε-カプロラクトン）であり；
Dは、200〜20,000 Daの平均分子量を規定し；
Eは、100〜15,000 Daの平均分子量を規定し；かつ、
Fは、500〜25,000 Daの平均分子量を規定する。
【０００８】
かかる開示に関し参照により本明細書に組み込まれるMitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載されるように、ナノ粒子は感熱ゲルと組み合わせてもよい。感熱ゲルは、好ましくは、体温より低い、最も好ましくは約35℃未満の下限臨界溶解温度（LCST）を有する。感熱ゲルは、好ましくは、PEG-PCL-PLA-PCL-PEG構造を有する感熱ペンタブロックポリマー、医薬的に許容される液体担体、および有効量の生物活性剤または診断剤を含む、逆熱的ゲル化特性（reverse thermal gelation properties）を有する注入可能な薬剤送達用の液体組成物である。一態様では、感熱ゲルを含むペンタブロックポリマーは、組成物の約1〜50wt％である。更に別の態様では、医薬的に許容される液体担体は、PBS、生理食塩水、およびデキストロース溶液からなる群から選択される。
【０００９】
更に別の態様では、本発明のナノ粒子および感熱ゲルを組み合わせて制御放出製剤を形成してもよい。一態様では、薬剤または診断剤がナノ粒子の内部にカプセル化される。これらのナノ粒子は、感熱ゲル中に分散される。従って、一態様では、本発明は、複数のナノ粒子を含む制御放出製剤に関する。ナノ粒子は、PCL500-25,000-PLA100-10,000-PEG200-20,000-PLA100-10,000-PCL500-25,000またはPCL500-25,000-PGA100-15,000-PEG200-20,000-PGA100-15,000-PCL500-25,000またはそれらの組み合わせに従うペンタブロックポリマー内部に薬剤または診断剤をカプセル化して含む。よって、これらのナノ粒子は、第２のペンタブロックポリマーを含む感熱ゲル中に分散される。
【００１０】
また更なる態様では、本発明は、本発明のペンタブロックポリマーを用いる生物活性剤または診断剤の様々な送達方法に関する。よって、一態様では、本発明は、以下の工程（a）および（b）を含む、生物活性剤または診断剤を対象に非経口的に送達する方法に関する：（a）（1）有効量の生物活性剤または診断剤を、PCL500-25,000-PLA100-10,000-PEG200-20,000-PLA100-10,000-PCL500-25,000またはPCL500-25,000-PGA100-15,000-PEG200-20,000-PGA100-15,000-PCL500-25,000またはそれらの組み合わせに従うペンタブロックポリマー内部にカプセル化して有するナノ粒子、および（2）Mitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載のPEG-PCL-PLA-PCL-PEG構造を有するペンタブロックポリマー等の感熱ゲルを含む医薬組成物を設ける工程、ここで、該ナノ粒子は、該感熱ゲル中に分散されている：並びに（b）該医薬組成物を患者に投与する工程。この組成物は、好ましくは対象に筋肉内または皮下経路で投与する。好ましい態様では、この方法は、逆熱的ゲル化特性を有する注入可能な薬剤送達液を設ける工程を含み、ここで感熱ゲルペンタブロックポリマーは、対象の体温より低いLCSTを有する。この方法は、薬剤送達液を、ペンタブロックポリマーのLCSTより低い温度で維持する工程も含む。次に、この方法は、前記薬剤送達液体を非経口的に対象に注入し、該液体の温度が、前記対象の体温により前記ポリマーのLCSTを超えて上昇したら前記薬剤およびペンタブロックポリマーのゲルデポーを形成させる工程を含む。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、ポリマーナノ粒子に充填された生物活性剤または診断剤を調製して高い充填量、典型的には約10〜25％の生物活性剤または診断剤を得るための方法に関する。また、本発明は、本発明に従う方法により調製された、ポリマーおよび生物活性剤または診断剤を含む、該生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子組成物にも関する。また、ポリマーは、本発明の新規なペンタブロックポリマー、または本明細書に記載される別のポリマーであってもよい。
【００１２】
本発明の一態様では、薬剤充填方法は、以下の工程を含む：生物活性剤または診断剤を水溶液内に含むW1溶液を設ける工程；有機溶媒およびポリマーを含む有機溶液Oを設ける工程；W1溶液を前記有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程；前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して、希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；および生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を、前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから単離する（isolating）工程。例示的な態様では、ポリマーは、PLA100-20,000-PCL500-20,000-PEG100-10,000-PCL500-20,000-PLA100-20,000に従うものとして定義される。乳化工程における体積比は、生物活性剤または診断剤の充填量を向上するようにする。例えば、好ましい態様では、W1／O比は約1：2〜1：6で、O／W2比は約1：1〜1：9である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ポリマーナノ粒子製剤における生物活性剤または診断剤の充填量を向上または最適化するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：（a）生物活性剤または診断剤を水溶液内に含むW1溶液または懸濁液を設ける工程；（b）有機溶媒およびポリマーを含む有機溶液Oを設ける工程；（c）前記W1溶液を前記有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程；（d）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；（e）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して、希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；（f）前記W1／O／W2ダブルエマルションから有機溶媒を蒸発させて水性ナノ粒子懸濁液を形成する工程；（g）薬剤ポリマーナノ粒子製剤を、前記水性ナノ粒子懸濁液から単離する工程；および（h）該ナノ粒子製剤における該生物活性剤または診断剤の充填量を測定する工程。該方法は、ポリマーの分子量、W1／O比（v／v）、O／W2（v／v）、W1／O／W2（v／v／v）、W1／W2比（v／v）、W1／W3比（v／v）、W2／W3比（v／v）、W1／（W2＋W3）、およびポリマー：生物活性剤または診断剤の初期比または公称比（w／w）、並びにそれらの組み合わせよりなる群から選択される１つまたは複数のパラメータを変えながら、工程（a）〜（h）を繰り返す工程。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、付随する利点及び新規な特徴と共に、一部は以下の説明に記載され、一部は以下を検討することにより当業者に明らかであろうし、あるいは本発明の実施からわかり得る。本発明の目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲に記載する手段および組合せによって実現・達成し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、PCL-PLA-PEG-PLA-PCL構造を有するポリマーを合成するための反応スキームを示す。２つのペンタブロックポリマー：PCL7000-PLA3000-PEG4000-PLA3000-PCL7000（ペンタブロックポリマー−E）およびPCL10,000-PLA6000-PEG4000-PLA6000-PCL10,000（ペンタブロックポリマーF）を調製した。
【００１６】
【図２】図２は、ペンタブロックポリマーEの1H-NMRスペクトルを示す。
【００１７】
【図３】図３は、ペンタブロックポリマーFの1H-NMRスペクトルを示す。
【００１８】
【図４】図４は、本発明のナノ粒子組成物において使用するためのペンタブロックポリマーを合成するための例示的なスキームである。
【００１９】
【図５Ａ】図５は、図４のペンタブロックポリマーの1H-NMRスペクトルである。図５Aは、PLA3000-PCL7000-PEG2000-PCL7000-PLA3000（ペンタブロックポリマーA）の1H-NMRスペクトルである。
【図５Ｂ】図５は、図４のペンタブロックポリマーの1H-NMRスペクトルである。図５Bは、PLA3000-PCL7000-PEG4000-PCL7000-PLA3000（ペンタブロックポリマーB）の1H-NMRスペクトルである。
【００２０】
【図６】図６は、ペンタブロックポリマーBおよびペンタブロックポリマーFのX線回折パターンを示す。
【００２１】
【図７】図７は、感熱ゲル（20wt％）に懸濁した３種の異なるペンタブロックナノ粒子（ペンタブロックポリマーA、PGA3000-PCL7000-PEG2000-PCL7000-PGA3000（ペンタブロックポリマーD）、およびペンタブロックポリマーF）からIgG-Fabのインビトロでの放出を示す（n＝3）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、薬剤送達システムに有用である新規なペンタブロックポリマーに関する。ポリマーは、生分解性かつ生体適合性である。これらのペンタブロックポリマーの多くは、生物活性剤または診断剤を内部に含むナノ粒子を形成するために使用できる。これらのナノ粒子は、ポリマー溶液、特に可逆的で感熱性のゾルゲル挙動（reversible thermalsol-to-gel behavior）を示し、良好な薬剤放出特性を有するペンタブロックポリマー溶液、に組み込んでもよい。
【００２３】
また、本発明は、本発明のペンタブロックポリマーを製造するための方法、ならびにペプチドおよびタンパク質といった親水性薬剤を有する生分解性かつ生体適合性のペンタブロックポリマーを含む組成物に関する。本発明は、親水性薬物、特に、水溶性の高いペプチドおよびタンパク質薬剤の投与に良好に適する。しかし、本発明は、疎水性分子を投与するために使用することもできる。薬剤はポリマーマトリックスの対応する生分解性により制御された速度で放出される。
【００２４】
本発明は、高い充填量の生物活性剤または診断剤を含有する生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むナノ粒子組成物を調製するためのダブルエマルション溶媒蒸発法、ならびにかかる方法により得られる組成物に関する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「投与」および類似の用語は、処置対象の個体に組成物を送達することを意味する。好ましくは、本発明のペンタブロックポリマーおよび任意の生物活性剤または診断剤を含む組成物は、結膜下、硝子体内、皮下、筋肉内、経皮、経口、粘膜、または腹腔内経路によって投与される。投与は、滑膜空間（例えば、関節炎の治療のため）への送達、髄腔内注入（例えば、脳疾患の治療のため）、局所送達（例えば、感染性皮膚疾患の治療のため）、局所的鼻腔送達、局所的眼送達、全身送達用の皮下注入などを含みうる。
【００２６】
「生体適合性」とは、人体に有害な影響を引き起こさない物質、あるいは物質から可溶化加水分解あるいは生体産物（生物の酵素または他の産物等であり得る）の作用により生じる中間体または最終生成物を意味する。
【００２７】
「生分解性」とは、生物活性剤または診断剤が全て放出した後に、体内でポリマーが毒性のない成分に崩壊または分解することを意味する。
【００２８】
「デポー（Depot）」とは、温血動物へ注入した後に温度がLCSTまたはそれを超えて上昇するとゲルを形成する薬剤送達液を意味する。
【００２９】
「薬剤」または「生物活性剤」または「診断薬」とは、生物活性を有し、かつ治療または診断目的に適し採用される任意の無機または有機化合物または物質を意味する。
【００３０】
「薬剤送達液」または「逆熱的ゲル化特性を有する薬剤送達液」とは、温度がポリマーのLCSTまたはそれを超えて上昇するとデポーを形成する温血動物への注入に適した「溶液」を意味するものとする。
【００３１】
「有効量」とは、医学的な治療または診断の検査に使用したときに、妥当な危険度／受益度比で所望の局所的または全身的な効果をもたらすのに十分な生物活性剤または診断剤の量を意味する。これは、患者、疾患、対象の治療、および薬剤の性質に依存して変化する。
【００３２】
LCST以上の温度におけるペンタブロックポリマーおよび／または薬剤の組合せに関連して使用される「ゲル」は、性質として概ね半固体である組み合わせを含むものである。
【００３３】
「親水性」とは、水に溶解する能力を意味する。本発明において親水性の薬剤または診断薬の関連で使用される場合、この用語は、USP-NFの定義に従い、好ましくは難可溶性（sparingly soluble）、より好ましくは可溶性であり、さらに好ましくは自由に可溶性（freely soluble）であり、さらに最も好ましくは非常に可溶性の物質を包含する。
【００３４】
「LCST」または「下限臨界溶解温度（lower critical solution temperature）」とは、ペンタブロックポリマーに逆熱的ゲル化（reverse thermal gelation）が起こる温度、すなわち、それより低いとポリマーが水溶性になり、それより高いとペンタブロックポリマーが相分離を起こし薬剤およびペンタブロックポリマーを含む半固体を形成する温度を意味する。用語「LCST」、「ゲル化温度」、および「逆熱的ゲル化温度」等は、LCSTを称するのに互換的に使用される。
【００３５】
用語「ナノ粒子（nanoparticle）」またはその変形（例えば、ナノ粒子（nanoparticulate）は、概して、最大寸法が1ミクロン未満、例えば、約1,000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、等より小さい粒子を指す。よって、例えば、本発明のナノ粒子は、約100〜1,000nm、200〜900nm、300〜700nm、400〜600nm、400〜900nm、または450〜850nmの範囲にあり得る。
【００３６】
「非経口」とは、消化管以外の任意の投与経路を意味し、具体的には、筋肉内、腹腔内、腹部内、皮下、および、実現可能な範囲で、静脈内を含むものとする。
【００３７】
「医薬的に許容される」とは、一般に安全かつ非毒性であり、生物学的もしくは他の観点で有害ではない医薬組成物を調製するのに有用で、獣医学的用途ならびにヒトの医薬的用途に許容可能であることを含む意味である。「医薬的に許容される液体担体」としては、水、有機溶媒、ゲル、クリーム等が挙げられる。好ましい医薬的に許容される水性液体としては、PBS、生理食塩水、およびデキストロース溶液が挙げられる。
【００３８】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」は、ペプチドまたはタンパク質薬剤に言及する場合、互換可能に使用されるものとし、特に記載がない限り、いかなる特定の分子量、ペプチド配列、長さ、生物活性の分野、診断的用途、または治療的用途に限定されない。
【００３９】
しかしながら、好ましいタンパク質およびペプチドは、約1kDa〜500kDaの範囲（例えば、約1、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、または500kDaあるいはそれらの間のいずれかの範囲内）の分子量を有する。
【００４０】
「溶液」、「水溶液」等は、かかる溶液における薬剤およびペンタブロックポリマーの組み合わせに言及する場合、当該薬剤／ポリマーの組み合わせが機能的な濃度で溶解または均一に懸濁し、かつ、該ブロックポリマーのLCSTよりも低い温度に維持されている水ベースの溶液を意味するものとする。
【００４１】
用語「感熱（thermosensitive）」とは、周囲温度近辺では一般に透明な溶液として水中に存在するが、温度がLCSTに上昇すると（体温程度であることが好ましい）、相互作用してゲル、エマルジョン、または懸濁液を形成するポリマーを指す。
【００４２】
用語「治療（treatment）」または「治療する（treating）」とは、（i）疾患または状態を予防する、すなわち疾患または状態の臨床症状が進行しないようにする、（ii）疾患または状態を阻害する、すなわち、臨床症状の進行を阻止する、および／または（iii）疾患または状態を軽減する、すなわち、臨床症状を退行させること、を含めた目的で薬剤を投与することを意味する。
【００４３】
以下、例示的な実施形態を示し、これらを説明するために特定の用語を使用するが、本発明の範囲を限定する意図ではないことを理解すべきである。本明細書で説明する発明の特徴の改変や更なる変更、並びに本明細書で説明する本発明の原理の更なる応用は、関連する分野における当業者にとって、本開示に関連し、本発明の範囲内であるとすべきである。
【００４４】
本発明は、（1）PEG、（2）PCL、および（3）PGAまたはPLAを含む新規なペンタブロックポリマーに関する。当該ブロックポリマーは、概して、ペンタブロックポリマー、すなわち、CBABC型ブロックポリマーである。
【００４５】
ポリマーおよびナノ粒子
本発明のナノ粒子に使用されるペンタブロックポリマーの調製には、ペンタブロックポリマーがPCL-PLA-PEG-PLA-PCLまたはPCL-PGA-PEG-PGA-PCL構造を有するのが好ましい。
【００４６】
親水性Aブロックセグメントは、好ましくは約200〜20,000 Da（例えば、約200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000 Daあるいはそれらの間のいずれかの範囲内）の平均分子量、より好ましくは約1,000〜10,000 Daの平均分子量、更により好ましくは約2,000〜6,000の平均分子量、そして最も好ましくは約4,000 Daの平均分子量を有するPEGである。
【００４７】
疎水性Bブロックセグメントは、好ましくはラクチドまたはグリコリドから誘導される。一態様では、Bブロックセグメントは、好ましくは、約100〜10,000 Da（例えば、約100、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000 Daあるいはそれらの間のいずれかの範囲内）、より好ましくは約1,000および8,000 Da、更により好ましくは約3,000および6,000 Daの平均分子量を有するPLAを含む。別の態様では、疎水性Bブロックセグメントは、約100〜15,000 Da（例えば、約100、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000 Daあるいはそれらの間のいずれかの範囲内）、より好ましくは約2,000および10,000 Da、更により好ましくは約3,000および6,000 Daの平均分子量を有するPGAを含む。
【００４８】
疎水性Cブロックセグメントは、好ましくは環状ラクトンから誘導され、最も好ましくはε-カプロラクトンから誘導される。よって、Cブロックセグメントは、約500 Da〜25,000 Da（例えば、約500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000 Daあるいはそれらの間のいずれかの範囲内）、より好ましくは約3,000〜15,000 Da、更により好ましくは約6,000〜12,000 Da、そして最も好ましくは約7,000〜10,000 Daの平均分子量を有するPCLを含む。
【００４９】
従って、一態様では、本発明に係るナノ粒子を製造するために使用されるペンタブロックポリマーは、下記式に従うものとして定義できる：
H-[-O-(CH2)5-CO-]C-[-O-CH(CH3)-CO-]B-[-O-CH2-CH2-]A-[-O-CO-CH(CH3)-]B-[-O-CO-(CH2)5-]C-OH
上記式中、A、B、およびCは、該ポリマーが、以下の式に従うものとして定義できる整数である：
PCLC-PLAB-PEGA-PLAB-PCLC、
Aは、200〜20,000 Da、好ましくは1,000〜10,000 Da、更により好ましくは2,000〜6,000 Da、そして最も好ましくは4,000 Daの平均分子量を規定し；
Bは、100 Da〜10,000 Da、好ましくは1,000〜8,000 Da、更により好ましくは3,000〜6,000Daの平均分子量を規定し；かつ、
Cは、500〜25,000 Da、好ましくは3,000〜15,000 Da、更により好ましくは6,000〜12,000 Da、そして最も好ましくは7,000〜10,000 Daの平均分子量を規定する。
【００５０】
別の態様では、本発明に係るナノ粒子を製造するために使用されるペンタブロックポリマーは、下記式に従うものとして定義できる：
H-[-O-(CH2)5-CO-]F-[-O-CH2-CO-]E-[-O-CH2-CH2-]D-[-O-CO-CH2-]E-[-O-CO-(CH2)5-]F-OH
上記式中、D、E、およびFは、該ポリマーが、以下の式に従うものとして定義できる整数である：
PCLF-PGAE-PEGD-PGAE-PCLF、
Dは、200〜20,000 Da、好ましくは1,000〜10,000 Da、更により好ましくは2,000〜6,000 Da、そして最も好ましくは4,000 Daの平均分子量を規定し；
Eは、100 Da〜15,000 Da、好ましくは2,000〜10,000 Da、更により好ましくは3,000〜6,000 Daの平均分子量を規定し；かつ、
Fは、500〜25,000 Da、好ましくは3,000〜15,000 Da、更により好ましくは6,000〜12,000 Da、そして最も好ましくは7,000〜10,000 Daの平均分子量を規定する。
【００５１】
A、B、およびCブロックの分子量を様々に変化させることにより、本明細書に開示のように合成されるペンタブロックポリマーが様々な疎水性および親水性のブロックを有し、これにより、ナノ粒子がインビトロおよびインビボで分解する態様が変わり得る。親水性ブロックの分子量に対する疎水性ブロックの分子量の比が3より大きい場合、一般的にナノ粒子が形成される。
【００５２】
それらの生分解性および生体適合性の特性によって、親水性のAブロック、並びに疎水性のBおよびCブロックを合成し使用する。これらの疎水性ポリマーブロックのインビトロおよびインビボでの分解は十分に理解されており、分解生成物は、容易に身体により排除される天然の代謝産物である。一般に、ナノ粒子の調製のためには、親水性Aブロック（PEGブロック）は約30重量％未満（例えば、約30、20、15、または10重量％未満）であるべきで、Bブロック（PLA、PGAブロック）は約10〜80重量％（例えば、約10、20、30、40、50、60、70または80重量％）であるべきで、Cブロック（PCLブロック）は約10〜80重量％（例えば、約10、20、30、40、50、60、70または80重量％）であるべきである。
【００５３】
実施例に示すように、本発明のペンタブロックポリマー化合物は、有効量の生物活性剤または診断剤をカプセル化可能なナノ粒子の形成に適しているのが理想的である。かかる薬剤の例を、以下に開示する。本発明のペンタブロックポリマーを含むナノ粒子は、生物活性剤または診断剤の制御または持続放出に寄与する。一般的に、ペンタブロックポリマーは、選択した薬剤放出速度を有するように設計でき、ナノ粒子からの薬剤放出は、典型的には、一次薬剤放出動態を示す。ナノ粒子に充填された薬剤または診断剤の量は、該薬剤の性質による。しかし、薬剤および／または診断剤は、典型的には組成物の約0.01〜50wt％、より好ましくは組成物の約0.1〜10％wt、最も好ましくは、組成物の約1〜5wt％である。
【００５４】
ダブルエマルション溶媒蒸発法
本発明は、高い充填量の生物活性剤または診断剤を含有する生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むナノ粒子組成物を調製するためのダブルエマルション溶媒蒸発法、ならびにかかる方法により得られる組成物に関する。
【００５５】
ナノ粒子組成物は、好ましくは生物活性剤または診断剤の充填量（loading）が約10〜25wt％（例えば、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25wt％あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。一態様では、生物活性剤または診断剤の充填量は、約13〜18wt％である。
【００５６】
ナノ粒子組成物は、好ましくは生物活性剤または診断剤の封入効率（entrapment efficiency）が約40％を超える（例えば、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90％あるいはそれらの間のいずれかの範囲内を超える）。一態様では、生物活性剤または診断剤の封入効率は約45％〜90％であり、別の態様では、封入効率は約60％〜90％である。
【００５７】
ナノ粒子組成物は、ダブルエマルション溶媒蒸発法によって調製される。一般的に、内部水性相および外部水性相は油層によって分離される。形成および安定性を補助するために界面活性剤および／または安定剤を利用してもよい。一次油中水型（w／o）エマルションを形成するために低いHLBを有する界面活性剤（単数または複数）を使用し、該油中水型エマルションを水中で乳化するために二次乳化を達成する高いHLBを有する他の界面活性剤（単数または複数）を使用してもよい。ナノ粒子の調製における乳化に使用できる界面活性剤および／または安定剤の例として、デキストラン70、プルロニックF68、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）、ソルビタンエステル（例えば、スパン20、スパン60、スパン65、スパン80）、ポリソルベート（例えば、ツイーン20、ツイーン80）、ポロキサマー（例えば、P188、P407）、グリセリルモノエステル、例えば、グリセリルモノステアレートおよびノニルフェノールエトキシレートが挙げられる。
【００５８】
水中油中水型ダブルエマルション溶媒蒸発法において、薬剤の水溶液または懸濁液（内部水性相、W1）は、有機溶媒中にポリマーを含む溶液中で乳化される。次いで、得られる一次エマルション（W1／O）を、適切な乳化剤を含む第２水性相（外部水性相、W2）に分散して、ダブルエマルション（W1／O／W2）を形成する。次いで、このW1／O／W2ダブルエマルションを、場合により水性相W3で希釈する。揮発性有機溶媒の除去により、固体ナノ粒子が形成される。固体ナノ粒子を、濾過または遠心分離によって分離する。残留する乳化剤を除去するために数回洗浄し、真空下で乾燥または凍結乾燥させてもよい。
【００５９】
一態様では、生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を調製するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（a）W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程、ここで、該W1溶液は、生物活性剤または診断剤を水溶液内に含み、かつ、該有機溶液Oは、有機溶媒およびポリマーを含む；（b）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；（c）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；および（d）前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから有機溶媒を除去し前記生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を形成する工程。生物活性剤または診断剤の充填量は、ポリマーナノ粒子中約10〜25％である。
【００６０】
別の態様では、生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を調製するための方法は、以下の工程を含んでもよい：（a）生物活性剤または診断剤を水溶液内に含むW1溶液を設ける工程；（b）有機溶媒およびポリマーを含む有機溶液Oを設ける工程；（c）W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程；（d）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；（e）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；（f）前記W1／O／W2ダブルエマルションから有機溶媒を蒸発させて水性ナノ粒子懸濁液を形成する工程；および（g）生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を、水性ナノ粒子懸濁液から単離する工程。生物活性剤または診断剤の充填量は、ポリマーナノ粒子中約10〜25％である。
【００６１】
更なる態様では、生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を調製するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（a）W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程、ここで、該W1溶液は、生物活性剤または診断剤を水溶液内に含み，かつ、該有機溶液Oは、有機溶媒としてのジクロロメタン、およびPLAz-PCLy-PEGx-PCLy-PLAzまたはPGAz-PCLy-PEGx-PCLy-PGAzまたはそれらの組み合わせに従うポリマーを含む（式中、Xは、100〜10,000 Daの平均分子量を規定し、Yは、500〜20,000 Daの平均分子量を規定し、Zは、100〜20,000 Daの平均分子量を規定する）；（b）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程、ここでW1／O比は約1：2〜1：6であり、かつO／W2比は約1：1〜1：6である；（c）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；および（d）前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから有機溶媒を除去し生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を形成する工程。
【００６２】
更に別の態様では、生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を調製するための方法は、以下の工程を含む：（a）生物活性剤または診断剤を水溶液内に含むW1溶液を設ける工程；（b）有機溶媒としてのジクロロメタン、およびPLAz-PCLy-PEGx-PCLy-PLAzまたはPGAz-PCLy-PEGx-PCLy-PGAzまたはそれらの組み合わせに従うポリマーを含む有機溶液Oを設ける工程（式中、Xは、100〜10,000 Daの平均分子量を規定し、Yは、500〜20,000 Daの平均分子量を規定し、Zは、100〜20,000 Daの平均分子量を規定する）；（b）W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程；（c）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程、ここでW1／O比は約1：2〜1：6であり、かつO／W2比は約1：1〜1：6である；（d）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；および（e）生物活性剤または診断剤が充填されたナノ粒子を、前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから単離する工程。
【００６３】
更に別の態様では、ポリマーナノ粒子製剤における生物活性剤または診断剤の充填量を向上または最適化するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（a）W1溶液を有機溶液O中に乳化してW1／O一次エマルションを形成する工程、ここで、該W1溶液は、生物活性剤または診断剤を水溶液内に含み，かつ、該有機溶液Oは、有機溶媒およびポリマーを含む；（b）前記一次エマルションを外水相溶液W2中に乳化してW1／O／W2ダブルエマルションを得る工程；（c）場合により前記W1／O／W2ダブルエマルションを水溶液W3で希釈して場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションを形成する工程；（d）前記場合により希釈されたW1／O／W2ダブルエマルションから有機溶媒を除去し、ポリマーナノ粒子製剤の中に充填された生物活性剤または診断剤を形成する工程；（e）ナノ粒子製剤における生物活性剤または診断剤の充填量を測定する工程；並びにポリマーの分子量、W1／O比（v／v）、O／W2（v／v）、W1／O／W2（v／v／v）、W1／W2比（v／v）、W1／W3比（v／v）、W2／W3比（v／v）、W1／（W2＋W3）、ポリマー：生物活性剤または診断剤の初期比または公称比（w／w）、並びにそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数のパラメータを変えながら、工程（a）〜（e）を繰り返す工程。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ポリマー：生物活性剤または診断剤の初期比または公称比は約10：1〜2：1（例えば、10：1、9：1、8：1、7：1、6.1、5：1、4：1、3：1、2：1、あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００６５】
特定の実施形態では、W1／O比は、W1水溶液の体積：有機溶液Oの体積の比を表す。典型的には、W1／O比は約1：2〜1：6（例えば、約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００６６】
更なる実施形態では、O／W2比は、有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表す。典型的には、O／W2比は約1：1〜1：9（例えば、約1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００６７】
いくつかの例では、W1／O／W2比は、W1水溶液の体積：有機溶液Oの体積：外水相溶液W2の体積の比を表す。好ましくは、W1／O／W2比は約1：2：2〜1：6：54（例えば、約1：2.5：4、1：3：6、1：3.5：7、1：4：8、1：4.5：15、1：5：20、1：6：36、1：6：54あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、W1／W2比は、W1水溶液の体積：外水相溶液W2の体積の比を表す。典型的には、W1／W2比は、約1：2〜1：54（例えば、約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：7、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：44、1：45、1：46、1：47、1：48、1：49、1：50、1：51、1：52、1：53、1：54、あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００６９】
特定の実施形態では、W1／（W2＋W3）比は、W1水溶液の体積：外水相溶液W2と希釈相W3との合計体積の比を表す。典型的には、W1／（W2＋W3）比は、約1：20〜1：100（例えば、約1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。好ましくは、W1／（W2＋W3）比は、約1：40〜約1：60である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、W1／W3比は、W1水溶液の体積：希釈相W3の体積の比を表す。典型的には、W1／W3比は、約1：10〜約1：80（例えば、約1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００７１】
一実施形態では、W2／W3比は、外水相溶液W2の体積：希釈相W3の体積比を表す。W2／W3比は、約1：1〜約1：50（例えば、約1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50あるいはそれらの間のいずれかの範囲内）である。
【００７２】
ダブルエマルション溶媒蒸発法によるナノ粒子の調整に用いられる揮発性有機溶媒は、好ましくは、残留溶媒の除去を容易にするために、沸点が低い。使用可能な種々の水非混和性溶媒としては、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、アルコール、またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
ナノ粒子組成物のポリマーは、生分解性かつ生体適合性である。例示的な実施形態では、ナノ粒子組成物は、生物活性剤または診断剤を含有するまたは該生物活性剤または診断剤が内部にカプセル化されたナノ粒子を形成するブロックポリマーを含む。ブロックポリマーは、好ましくはPEG、PCL、PGA、および／またはPLAを含む。ブロックポリマーの例として、参照により本明細書に組み込まれるMitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載のようなペンタブロックポリマーがある。ペンタブロックポリマーは、（1）PEG、（2）PCL、および（3）PGAまたはPLAを含んでもよい。一態様では、ブロックポリマーは、ペンタブロックポリマー、すなわち、CBABC型のブロックポリマーである。ペンタブロックポリマーは、好ましくはPGA-PCL-PEG-PCL-PGA、またはPLA-PCL-PEG-PCL-PLA、またはPCL-PLA-PEG-PLA-PCL、またはPCL-PGA-PEG-PGA-PCLまたはそれらの組み合わせに従う構造を有する。
【００７４】
一態様では、ペンタブロックポリマーは、以下の式により定義されてもよい：
PLA100-20,000-PCL500-20,000-PEG100-10,000-PCL500-20,000-PLA100-20,000；
PLA500-10,000-PCL2500-15,000-PEG500-7000-PCL2500-15,000-PLA500-10,000；
PLA1000-5000-PCL5000-10,000-PEG2000-5000-PCL5000-10,000-PLA1000-5000；または
PLA2000-4000-PCL6000-8000-PEG1000-6000-PCL6000-8000-PLA2000-4000。
【００７５】
別の態様では、ペンタブロックポリマーは、以下の式により定義されてもよい：
PGA100-20,000-PCL500-20,000-PEG100-10,000-PCL500-20,000-PGA100-20,000；
PGA500-10,000-PCL2500-15,000-PEG500-7000-PCL2500-15,000-PGA500-10,000；
PGA1000-5000-PCL5000-10,000-PEG2000-5000-PCL5000-10,000-PGA1000-5000；または
PGA2000-4000-PCL6000-8000-PEG1000-6000-PCL6000-8000-PGA2000-4000。
【００７６】
別の態様では、ペンタブロックポリマーは、以下の式により定義されてもよい：
PGA100-5000-PCL1000-20,000-PEG200-20,000-PCL1000-20,000-PGA100-5000；
PGA200-1000-PCL2500-15,000-PEG500-5000-PCL2500-15,000-PGA200-1000；または
PGA200-800-PCL5000-10,000-PEG500-1500-PCL5000-10,000-PGA200-800。
【００７７】
別の態様では、ペンタブロックポリマーは、以下を含む、上記のような本発明の新規なポリマーであってもよい：
PCL500-25,000-PLA100-10,000-PEG200-20,000-PLA100-10,000-PCL500-25,000;
PCL500-25,000-PGA100-15,000-PEG200-20,000-PGA100-15,000-PCL500-25,000;
PCL500-25,000-PLA100-10,000-PEG200-20,000-PLA100-10,000-PCL500-25,000;または、
PCL500-25,000-PGA100-15,000-PEG200-20,000-PGA100-15,000-PCL500-25,000。
【００７８】
生物活性剤または診断剤
本発明のペンタブロックポリマーは、１つまたは複数の生物活性剤または診断剤を送達用としてカプセル化するのに有用である。適切な生物活性剤または診断剤の例として、治療または診断活性を有する合成無機および有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖類その他の糖類、脂質、ガングリオシド、および核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補的なDNAに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。組み込まれる薬剤は、様々な生物学的活性を有し得て、例えば、血管作用薬、神経活性化剤、ホルモン剤、抗凝固薬、免疫調節剤、細胞毒性剤、抗生物質、抗ウイルス剤、アンチセンス、抗原、および抗体等が挙げられる。具体的な材料としては、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤（ステロイド性および非ステロイド性の両方）、抗腫瘍薬、抗痙攣剤（チャネル遮断薬を含む）、細胞-細胞外マトリックス間相互作用の調節因子（細胞増殖阻害剤および抗接着分子を含む）、酵素および酵素阻害剤、抗凝血剤および／または抗血栓剤、成長因子、DNA、RNA、DNAまたはRNAまたはタンパク質合成の阻害剤，細胞の遊走、増殖、および／または成長を調節する化合物、血管拡張剤、および一般に組織の損傷の治療に使用されるその他の薬物が挙げられる。これらの化合物の具体例としては、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、プロスタサイクリン、ヘパリン、サリチル酸塩、硝酸塩、カルシウムチャネル遮断剤、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（「TPA」）およびアニソイル化プラスミノーゲン活性化因子（「APA」）およびアニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（「APSAC」）、コルヒチンおよびアルキル化剤、およびアプタマーが挙げられる。細胞間相互作用の調節因子の具体例としては、インターロイキン、血小板由来成長因子、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（「FGF」）、形質転換成長因子β（「TGFベータ」）、上皮増殖因子（「EGF」）、インスリン様増殖因子、およびそれらに対する抗体が挙げられる。核酸の具体例としては、タンパク質をコードする遺伝子及びcDNA、発現ベクター、アンチセンスその他のオリゴヌクレオチド、例えば、遺伝子の発現を調節または阻止するために使用され得るリボザイム、が挙げられる。他の生物活性剤の具体例としては、修飾された細胞外マトリックス成分またはそれらの受容体、ならびに脂質およびコレステロール金属イオン封鎖剤が挙げられる。典型的な抗癌剤としては、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、アクチノマイシンD、等が挙げられる。代表的な診断剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種が挙げられる。
【００７９】
特にこれらに限定されるというわけではないが、薬学的に有用なポリペプチドは、以下からなる群から選択され得る：トリアムシノロン、アセトニド、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、血小板由来増殖因子（「PDGF」）、プロラクチン、ルリベリン、または黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン−2（「IL−2」）、インターフェロンα、β、γ、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（「TRH」）、腫瘍壊死因子（「TNF」）、神経成長因子（「NGF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G−CSF」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM−CSF」）、マクロファージコロニー刺激因子（「M−CSF」）、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、モノクローナル抗体（例えば、IgG等）、ならびにそれらの合成類似体、改変体、および薬理学的に活性な断片、および可溶性ワクチン。
【００８０】
酵素の具体例としては、アミノペプチダーゼ、αアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、βグルカナーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドキシラナーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチントランスエリミナーゼ、ペクチンエチルエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、ラムノガラクツロナンリアーゼ、ラムノグルカナーゼ、ラムノガラクツロナナーゼ、リボヌクレアーゼ、SPSアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、およびキシログルカナーゼが挙げられる。
【００８１】
好ましい生物活性剤または診断剤としては、ペプチドやタンパク質などの親水性薬剤が挙げられる。本発明は、高親水性薬剤、特に高水溶性ペプチドおよびタンパク質薬剤をポリマーナノ粒子に充填するのに非常に適している。薬剤はポリマーマトリックスの対応する生分解により制御された速度で放出される。
【００８２】
本発明にかかるポリマーナノ粒子内部にタンパク質をカプセル化する工程は、一般に、穏やかな乳化プロセスを伴う。これは、タンパク質が三次／四次構造を保持し生物学的活性を有するために重要である。このプロセスは、一般に、タンパク質を変性し不活化しがちな有機溶媒への暴露を最小限に抑える。
【００８３】
本発明のナノ粒子組成物は、医薬的に許容される担体と共に、治療を必要とする患者に投与できる。
【００８４】
いくつかの例において、本発明のペンタブロックポリマーと共にある生物活性剤または診断剤の物理的安定性は、ペプチドまたはタンパク質薬剤の水溶液に種々の添加剤を添加することよって増大させることもできる。このような添加剤として、ポリオール（糖を含む）、アミノ酸、コラーゲンやゼラチン等のタンパク質、および特定の塩等を使用できる。これらの添加剤は、容易に本発明の逆熱的ゲル化組成物に組み込むことができる。
【００８５】
ペンタブロック感熱ゲル中のペンタブロックナノ粒子
本発明のペンタブロックポリマーは、感熱ゲル中に分散してもよい。感熱ゲルは、好ましくはPEG-PCL-PLA-PCL-PEG構造を有するポリマーといったペンタブロックポリマーである。このようなポリマーは、かかる開示に関し参照により本明細書に組み込まれるMitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載されている。よって、別の態様では、本発明は、生物活性剤または診断剤を内部に組み込んで含むペンタブロックナノ粒子がペンタブロック感熱ゲル中に分散されている組成物に関する。
【００８６】
感熱ゲルの調製に用いられるペンタブロックポリマーは、典型的には、まず、医薬的に許容される液体、好ましくは緩衝液、に溶解される。緩衝液は、好ましくは4℃で10mMリン酸緩衝生理食塩水を含む。典型的には、感熱ゲル化ペンタブロックポリマーの濃度は約5〜75wt％である。好ましくは、ペンタブロックポリマーの濃度は、約10〜50wt％であり、約20wt％の感熱ポリマー溶液が最も好ましい。その後、ナノ粒子を感熱ポリマー溶液中に分散させて、ナノ粒子を感熱ゲル中に懸濁させて含む複合製剤を形成できる。
【００８７】
実施例１：ナノ粒子用のペンタブロックポリマーの合成
本実施例では、PCL-PLA-PEG-PLA-PCLブロック構造を有する２種類のペンタブロックポリマーを調製した。より具体的には、PCL7000-PLA3000-PEG4000-PLA3000-PCL7000に従うペンタブロックポリマーE（PB-E）およびPCL10000-PLA6000-PEG4000-PLA6000-PCL10000に従うペンタブロックポリマーF（PB-F）（式中、下付の数字は、各ブロックの理論分子量を示す）を調製した。
【００８８】
ペンタブロックポリマーEおよびペンタブロックポリマーFを、図１に示す２工程の逐次開環重合により合成した。ポリ（エチレングリコール）をマクロ開始剤として、オクタン酸第一スズを触媒として使用した。第１工程では、トリブロックコポリマーポリ（ラクチド）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ラクチド）（PLA-PEG-PLA）（スキーム１）を、ポリ（エチレングリコール）（4000 Da）の両端の開ヒドロキシル末端にL−ラクチドを重合して合成した。簡単に述べると、PEGを無水トルエンに溶解し、続けて蒸留し残留水分を除去した。L−ラクチド及びオクタン酸第一スズ（0.5％w／w）を無水PEGに添加し、温度を150℃に上げた。24時間後、反応混合物（RM）を塩化メチレンに溶解し、続けて冷石油エーテル内に沈殿させた。沈殿したポリマーを濾過し、室温、真空下で24時間乾燥させた。
【００８９】
第２工程では、PLA-PEG-PLAトリブロックコポリマーを、ε-カプロラクトンと反応させ、PBコポリマーを調製した（スキーム２、PB-EおよびPB-F）。トリブロックコポリマーとε-カプロラクトンを、丸底フラスコに添加し、温度を不活性雰囲気下で150℃まで上げた。これに、オクタン酸第一スズ（0.5％w／w）を触媒として添加し、反応を24時間進行させた。ペンタブロックコポリマーを、第１工程で述べた冷エーテル沈殿法により精製した。ポリマーを真空下で乾燥させ、次に使用するまで−20℃で保存した。
【００９０】
得られたポリマーを、1H-NMRスペクトルによって分子量および純度について特徴付けた。ポリマー材料をCDCI3に溶解し、そのスペクトログラムを、Varian-400 NMR装置で記録した。結果を図２および図３に示す。
【００９１】
実施例２：ペンタブロックポリマーの合成
ポリ（ラクチド）−ポリ（カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（カプロラクトン）−ポリ（ラクチド）（PLA-PCL-PEG-PCL-PLA）ブロックコポリマーを、開環重合法により合成した。PLA3000-PCL7000-PEG2000-PCL7000-PLA3000（「PB-A」）およびPLA3000-PCL7000-PEG4000-PCL7000-PLA3000（「PB-B」）の組成を有するペンタブロックコポリマー（「PB」）を合成した。ポリマー組成の下付き文字は、各ブロックの理論分子量を表す。PBコポリマーは、逐次開環重合により２工程で調製した。第１工程では、εカプロラクトンを、触媒としてのオクタン酸第一スズの存在下で、分子量2000または4000のポリ（エチレングリコール）に重合させ、トリブロックコポリマーポリ（カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（カプロラクトン）（PCL-PEG-PCL）を形成した（図４、スキーム１）。簡単に述べると、PEGを無水トルエンに溶解し、続けて蒸留し残留水分を除去した。ε-カプロラクトンおよびオクタン酸第一スズ（反応物濃度の0.5％w／w）を無水PEGに添加し、温度を130℃に上げた。24時間後、脱気した（30分）反応混合物（「RM」）を塩化メチレンに溶解し、続けて冷石油エーテル内に沈殿させた。沈殿したポリマーを濾過し、室温、真空下で24時間乾燥させた。このスキームを図４に示す。
【００９２】
ポリマー組成を、1H-NMRスペクトルによって特徴付けた。スペクトルは、ポリマー材料をCDCI3に溶解し、Varian-400 NMR装置で記録した。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
【００９３】
実施例３：ナノ粒子の調製方法
タンパク質／ペプチドを充填したペンタブロック（「PB」）ナノ粒子（「NP」）は、W1／O／W2ダブルエマルション溶媒蒸発法によって調製できる。簡単に述べると、この方法の例示的な一実施形態では、溶解したペンタブロックポリマーを含む有機相（例えば、ジクロロメタン）を用意する。ペプチド／タンパク質を含有する水溶液（W1相）を、30秒間のプローブ音波処理により有機相中に乳化して、W1／O一次エマルションを形成する。この一次エマルションを、30秒間のプローブ音波処理により更に2％ポリビニルアルコール（PVA）を含む水相中に乳化して、W1／O／W2ダブルエマルションを得る。得られるダブルエマルションを、連続攪拌下で2％PVA（W3）で更に希釈する。その後、希釈エマルジョン中の有機相を、好ましくはロータリーエバポレーターを使用して、真空下で蒸発させてNPを得る。NPを30分間20,000rpmで超遠心分離によって分離する。粒子は、蒸留脱イオン水（「DDW」）で2回洗浄し、遠心分離して微量のPVAと未封入のペプチド／タンパク質を除去する。精製されたNPを、マンニトール（5％w／v）を用いて乾燥し、次に使用するまで−20℃で保存する。
【００９４】
例示的なペプチド／タンパク質およびペンタブロックナノ粒子の詳細なプロセスパラメータを、以下の実施例に記載する。相体積比、薬剤：ポリマー比、およびポリマーの種類といったプロセスパラメータを高い薬剤充填量を達成するために最適化する。
【００９５】
ナノ粒子は、封入効率、薬剤充填量、およびインビトロでの放出挙動（in vitro release behavior）について特徴付けてもよい。
【００９６】
封入効率および薬剤充填量：
上清中の未封入のタンパク質／ペプチドの量は、マイクロBCATMタンパク質アッセイキットを用いて業者のプロトコルに従って決定できる。
【００９７】
封入効率（entrapment efficiency：％EE）を下記式１により計算した。
【００９８】
【数１】
2016520141.tif 000003
【００９９】
ナノ粒子中の封入されたタンパク質／ペプチドの量は、UVスペクトルによって決定できる。
【０１００】
薬剤充填量（Drug loading：％DL）は、下記式２により計算できる。
【０１０１】
【数２】
2016520141.tif 000004
【０１０２】
DLの分母における薬剤とポリマーの全体量は、実際の量を示し、これは、実験的に誘導されることが当業者に理解されるであろう。
【０１０３】
実施例３Ａ：IgG-Fabが充填されたナノ粒子
IgG-Fabは、48kDaの分子量を有するIgGの断片である。高いIgG-Fabの充填量を達成するために、相体積比、薬剤：ポリマー比、およびポリマーの種類といった様々なプロセスパラメータを試験した。
【０１０４】
異なる疎水性を有する２種類のPBコポリマー、すなわち、PB-AおよびPB-A、を合成し、特徴づけたところ、PB-AポリマーはPB-Bポリマーに比べより疎水性である。
【０１０５】
PBコポリマーを含むナノ粒子は、前述したW1／O／W2ダブルエマルション溶媒蒸発法により調製した。プロセスパラメータおよび結果の詳細を表１に示す。IgG-FABを充填したNPは、両方のPBコポリマーを用いて調製し、薬剤充填量に対するポリマーの種類の影響を決定した。表１に示すように、薬剤充填量は、バッチ１および２についてそれぞれ5.62％および4.99％であった。PB-Aポリマーを含むNP（バッチ１）は、PB-B NP（バッチ２）に比べ高い薬剤充填量を示した。これは、PB-Aポリマーの疎水性のほうが比較的高いためという可能性が考えられる。溶媒の蒸発において、疎水性が高いと、より速くポリマーが沈殿し、より速くNPを形成するので、外部水性（W2）相中にIgG-Fabが拡散するのを防止している可能性も考えられる。バッチ１および２の結果に基づき、NPの更なる最適化のためにPB-Aポリマーを使用した。
【０１０６】
さらに、薬剤充填量を高めるために、薬物：ポリマー比を1：10（バッチ１および２）から1：4（バッチ３）に増加した。バッチ３では、薬剤：ポリマー比を上げても、薬剤充填量について先程のPB-A NPバッチ１との有意差がなかった。薬剤充填量が悪いのは、外部水性（W2）相の体積が大きいことに起因する可能性がある。したがって、更なる試験において、薬剤：ポリマー比を1：4で一定に保ちつつ、外部相（W2）の体積の影響について評価した。例えば、バッチ４において、外部相の合計体積を5mlに減らした。また、2mlの外部水性（W2）相を用いてダブルエマルションを調製し、水（W2相）中のタンパク質の区画（partition）を小さくした。得られるマルチプルエマルジョンを、3mlの2％PVA（W3相）で希釈することにより安定化した。興味深いことに、バッチ４では11.7％という薬剤充填量がみられ、これは先のバッチ全てに比べて有意に高かった。
【０１０７】
バッチ４の結果に基づき、薬剤：ポリマー比を高くしたまま外部相（W2）の体積を小さくすると、薬剤充填量に大きな影響を与えると推測できる。したがって、体積比を一定に維持しつつ、全ての相の体積をさらに低下させた。W2の体積が低いほど、水性相におけるタンパク質の区画を小さくなり充填効率が向上するという仮説を立てた。加えて、有機相の体積を小さくすることにより、ポリマー濃度が増加し、これにより、ポリマーの沈殿およびNPの形成が早くなっているという可能性がある。予想通り、バッチ５のNPで15.61％という薬剤充填量が見られた。しかし、体積を更に小さくしても、薬剤充填量はこれ以上良くならないことがバッチ６（表１）の薬剤充填量（15.47％）から分かる。
【０１０８】
【表１】
2016520141.tif 000005
【０１０９】
実施例３Ｂ：ペンタブロックポリマーナノ粒子中の薬剤のカプセル化
本実施例では、様々なペンタブロックコポリマーでIgG-Fabをカプセル化したナノ粒子を調製した。ペンタブロックコポリマーを含むナノ粒子は、上述のW1／O／W2ダブルエマルション溶媒蒸発法によって調製した。簡単に述べると、IgG-Fabの水溶液（W1相）を、一定の超音波下（2ワットの出力、30秒）で有機相（ペンタブロックポリマーを塩化メチレンに溶解させて含む）に滴下して加えた。次に、得られた一次エマルション（W1／O）を、一定の超音波下（2ワットの出力、45秒）でW2相（2％PVA）に滴下して加えた。得られたダブルエマルション（W1／O／W2）をW3相（2％PVA）で希釈し（連続撹拌下）、続けて低圧で塩化メチレンを蒸発させた。蒸発させた後、ナノ粒子を20,000rpmで30分間遠心分離した（4℃）。その後、ナノ粒子を蒸留脱イオン水で２回洗浄し、遠心分離した。ナノ粒子の最終ペレットをマンニトール溶液（1.5％／3％）中に懸濁させた。ナノ粒子を一晩凍結乾燥し、次に使用するまで−20℃で保存した。ナノ粒子は、封入効率、薬剤充填量およびインビトロでの放出挙動について特徴付けた。
【０１１０】
本明細書に記載の新規なペンタブロックポリマーと、参照により本明細書に組み込まれるMitra et al.の米国特許第8,551,531号に記載の配列を含む各種ペンタブロックポリマーを検査した。
【０１１１】
ペンタブロックポリマーA（PB-A）：  PLA3000-PCL7000-PEG2000-PCL7000-PLA3000
ペンタブロックポリマーB（PB-B）：  PLA3000-PCL7000-PEG4000-PCL7000-PLA3000
ペンタブロックポリマーC（PB-C）：  PGA3000-PCL7000-PEG4000-PCL7000-PGA3000
ペンタブロックポリマーD（PB-D）：  PGA3000-PCL7000-PEG2000-PCL7000-PGA3000
ペンタブロックポリマーE（PB-E）：  PCL7000-PLA3000-PEG4000-PLA3000-PCL7000
ペンタブロックポリマーF（PB-F）：  PCL10000-PLA6000-PEG4000-PLA6000-PCL10000
プロセスパラメータおよび結果の詳細を表２に示す。
【０１１２】
【表２】
2016520141.tif 000006
【０１１３】
ペンタブロックポリマーE及びペンタブロックポリマーFコポリマーの両方を用いてIgG-Fabを充填したナノ粒子を調製し、薬剤充填量に対するポリマーの種類の影響を決定した。表２に示すように、薬剤充填量は、PB-EおよびPB-Fについてそれぞれ9.69％および18.49％であった。PB-Fナノ粒子は、PB-Eナノ粒子に比べ有意に高い薬剤充填量を示した。これは、PB-Fポリマーの疎水性のほうが比較的高いためという可能性が考えられる。溶媒の蒸発において、疎水性が高いと、より速くポリマーが沈殿し、より速くナノ粒子を形成するので、外部水性（W2）相中にIgG-Fabが拡散するのを防止している可能性も考えられる。
【０１１４】
実施例３Ｃ：IgGを充填したナノ粒子
IgGは、150 kDaの分子量を有する完全長ヒト抗体である。バッチ５および６から得た最適プロセスパラメータでPB-Aポリマーを用いてIgGを充填したNPを調製した。IgGを充填したNPの結果を表３に示す。バッチ８のNPでは、薬剤充填量がわずか12％であった。バッチ８に比べ全ての相の体積が高いにもかかわらず、15.71％という高い薬剤充填量がバッチ７のNPで観察された（表３）。
【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
実施例３Ｄ：カタラーゼを充填したナノ粒子
抗体より大きいタンパク質をカプセル化するために最適化された新規なプロセスパラメータの適用性を決定するために、カタラーゼをモデルタンパク質として使用した。カタラーゼは、240kDaの分子量を有する水素ペルオキシダーゼ分解酵素である。カタラーゼを充填したPB NPを、バッチ５および６に記載の最適化されたプロセスパラメータに従って調製した。バッチ１５および１６の両方においてそれぞれ16.43％および16.12％という非常に高いタンパク質の充填量が観察された（表４）。この結果により、相体積をこれ以上低減させても、タンパク質の充填量に有意な影響を与えなないことが示唆される。
【０１１７】
【表４】
2016520141.tif 000008
【０１１８】
実施例３Ｅ：PB NPにおける低分子量のペプチド／タンパク質の充填量
更に、1kDa〜15kDaの範囲の低分子量のタンパク質およびペプチドの送達についてのPBコポリマーの適用性を評価した。バッチ５および６で得た最適化プロセスパラメータを用いてリゾチーム（14.7kDa）、インスリン（5.8kDa）、およびオクトレオチド（1kDa）を充填したNPを調製した。
【０１１９】
リゾチーム、インスリン、およびオクトレオチドが充填されたNPの充填効率をそれぞれ表５、６、および７に示す。上記全てのタンパク質／ペプチドで6〜9％という薬剤充填量が見られた（バッチ９〜１４）。興味深いことに、低分子量のペプチドおよびタンパク質の充填効率は、IgG-Fab、IgG、およびカタラーゼ等の高分子量のタンパク質よりも基本的に低かった。考えられる理由として、これらの薬剤の分子量が低いことで、外部水性相への拡散が速いからという可能性がある。これらの結果により、明らかに、タンパク質／ペプチドの分子量は薬剤充填量に大きく影響することが示唆される。さらに明確にするために、W1、W2、W3およびO相の体積をそれらの比と共に、表８に記載する。タンパク質およびペプチドを充填したPB NP（バッチ５〜１６）を、粒子サイズ及び多分散性について特徴付けた（表９）。結果、すべてのPB NPは、粒子サイズが1μmをかなり下回り（220〜910nmの範囲内）、多分散性は0.175〜0.660の範囲内にあることが明らかになった。
【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
2016520141.tif 000010
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
【表８】
2016520141.tif 000012
【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
実施例４：タンパク質／ペプチドが充填されたPB NP
本実施例では、大きなタンパク質およびペプチドの充填量を高くするために、グリコリド（PGA）ベースのPBコポリマーを用いたナノ粒子を開発した。異なる疎水性を有する２つのグリコリドベースのPBコポリマー、すなわち、PB-DおよびPB-C、を合成し特徴づけた。PB-Dは、PB-Cよりも疎水性の高いコポリマーである。
【０１２６】
PB-Aコポリマー（バッチ５および６）について先に最適化したW1／O／W2方法をPB-CおよびPB-Dコポリマーにも用いた。表１０に示すように，IgG-Fabの平均薬剤充填量はPB-Cだと10.49および12.49％（バッチ１７および１８）であった。しかし、IgG-Fabの平均薬剤充填量はPB-Dだと17.19および16.34％（バッチ１９および２０）であり、PB-Cコポリマーに比べ有意に高かった。充填効率が高いのは、PB-Dコポリマーの疎水性に起因する可能性がある。薬剤充填量について類似する傾向がIgGを充填したNPでも見られた。PB-Cコポリマーに比べPB-Dを用いると薬剤充填量がわずかに増加した（バッチ２１〜２４）。240kDaのタンパク質であるカタラーゼの場合、薬剤充填効率は、何れかの方法で調製したPB-CおよびPB-D NPの両方で比較的似通っていた（バッチ２５〜２８）。全体的に、タンパク質の分子量が48kDaから240kDaに増加すると、薬剤充填量につきPB-CとPB-Dとの差が小さくなる。これは、分子量が増えるとタンパク質の拡散性が低くなることに起因する可能性がある。
【０１２７】
【表１０】
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【０１２８】
実施例５：ペンタブロックポリマーナノ粒子からの薬剤の放出
ペンタブロックポリマー感熱ゲル中の分散
本実施例では、ペンタブロックポリマーPEG550-PCL825-PLA550-PCL825-PEG550を含む20％w／wの感熱ゲルを、4℃で一晩保持することによって10mMPBSに可溶化する。その後、実施例３Ｂに記載の1mgのIgG-Fab当量のナノ粒子を、100μLの20％w／w感熱ポリマー溶液に分散した。必要なナノ粒子の量は、薬剤充填量に基づいて計算する。組成物全体は注入用製剤の形態をとる。得られた懸濁液を30分間、37℃で1.5mLのバイアル中でインキュベートした。ゲルが固化した後、1mLのPBS（37℃でプレインキュベートした）をゆっくりと添加した。所定の時間間隔で、0.2mLの透明な上澄み液を採取し、同量の新鮮なPBS（37℃でプレインキュベートした）に置換した。試料の放出は、総タンパク質含有量をMicro BCATMによって分析した。Micro BCATMは、業者の説明書に従って行った。インビトロでの放出実験は三連で行い、累積薬剤放出（％）として経時的に表した。結果を図７に示す。
【０１２９】
PB-A、PB-C、およびPB-Dを、IgG-Fabが充填されたNPの調製に用いることは成功した。表２に示すように、ペンタブロックコポリマー（PB-A、PB-C、およびPB-D）は、より高い薬剤充填量を示した。これらのポリマー（PB-AおよびPB-D）は、非常に遅い放出速度を示した（≦2.5μg／day）（図７）。したがって、これらのポリマーは、非常に強力な薬剤に適している、または長い期間（約8〜10ヶ月）にわたり低速度の放出が必要な条件に適している。しかし、同等以上の薬剤充填量でより高い放出速度が要求される場合、これらのポリマー系（PB-AまたはPB-D）は有用ではない。したがって、少なくとも4〜6ヶ月間にわたり、より高い放出量を提供できる製剤を開発する必要があった。
【０１３０】
図７に示すように、ペンタブロックコポリマーのブロックの配列を変更すると（PCL-PLA-PEG-PLA-PCL、PB-F）、薬剤充填量が高くなった（〜18.5％）。また、感熱ゲル（20wt％）中に懸濁させたPB-Fのナノ粒子も、感熱ゲル（20wt％）中に懸濁させたPB-AまたはPB-Dナノ粒子に比べ有意に高い放出速度を示した（＞4.5μg／day、図７）。この放出速度だと、PB-Fのナノ粒子は、多くの疾患状態に理想的である約4〜6ヶ月間IgG-Fabを放出することが予想される。
【０１３１】
実施例６：X線回折
上述のように、変更した配列を有するペンタブロックコポリマー、すなわち、PCL-PLA-PEG-PLA-PCL、の合成により、ポリマー分解を向上させ、薬剤放出速度を向上させた。PLAの分解速度は、PCLよりも比較的速いことが広く報告されている。ポリマーブロックの配列は、PBコポリマーの結晶化度を決定する上で重要な役割を果たすことが示された。図６に示すように、末端にPLAが結合したPCL-PEG-PCLトリブロックコポリマー（PB-B）は、2θ＝21.5°および23.8°でピークを示していることから、半結晶性ポリマーであることが示唆される。興味深いことに、PCLとPEGブロックの間にPLAを結合すると、いかなる結晶ピークも存在しない結果となり、PB-Fが非晶質ポリマーであることが示唆される。従前公開された報告によると、ポリマーの分解速度はポリマーの結晶化度に有意に影響されることが示唆されている。結晶性ポリマーは、非晶質ポリマーと比べゆっくりと分解する。したがって、これは、速く分解するPB-FコポリマーのPB-Fナノ粒子からの薬剤放出速度のほうがゆっくりと分解するPB-AまたはPB-Bコポリマーベースのナノ粒子と比べて、比較的高くなるのかの理由を説明するのに役立つ。
【０１３２】
図７に示す結果により、感熱ゲル中に懸濁させたPB-Aナノ粒子からのIgG-Fabの放出は、感熱ゲル中に懸濁させたPB-F NPに比べて有意に低いことが実証された。これらは、PB-Fコポリマーの非晶質性に起因し得て、これによりブロックコポリマーの分解がより速くなり、薬物放出の速度がより高くなるという結果になっている可能性がある。ブロックの配列を変えることにより、所望の標的生成物プロファイル（TPP：target product profile）に応じて、薬剤放出およびポリマー分解の速度を容易に調節・調整し得る。
【０１３３】
上記から、本発明が、本明細書に記載した全ての結果及び目的を、本発明に固有で明白な他の利点と共に、達成するのに適していることが分かる。多くの可能な実施形態は、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明より導くことができるので、本明細書に添付の図面のすべての事項は、例示として解釈されるべきで、限定的な意味でないことを理解すべきである。特定の実施形態を示し説明したが、様々な改変は当然なされてもよく、本発明は、以下の特許請求の範囲に記載される限定を除き、本明細書に記載の特定の形態または部品の配置や工程に限定されるものではない。さらに、特定の特徴およびサブの組み合わせも有用であり、他の特徴およびサブの組み合わせを参照することなく採用し得ることが理解されるであろう。これは、特許請求の範囲内によって企図され、その範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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