(57)【要約】  本発明は、実体の存在について個体を検査するためのデバイスである。実体は、病原体、毒素または薬物であってもよい。デバイスは、個体から検査されるべき生物学的試料を回収するように適合される。検査デバイスは、実体を検出するために、貴金属ナノ粒子（すなわち、金、銀、又は銅）を含む。検査結果は、デバイスの窓から読み込まれる。凝集した貴金属ナノ粒子を用いた現在の視覚限界は、約５０ｎｍ〜約７５ｎｍの範囲の直径を有する塊である。実体の特異的な１つ以上のリガンドは、２つ以上の金属ナノ粒子に付着される。各個々のナノ粒子は、約１５ｎｍ〜約３５ｎｍの範囲の直径を有する。ナノ粒子に付着し、実体に特異的なリガンドは、例えば、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド、およびアプタマーであり得る。実体上の異なる部位に特異的な種々のリガンドは、標的の存在下でナノ粒子の凝集潜在性を高めるために使用されてもよい。検査は、試料回収後、デバイス内で行われる。アッセイの結果は、速やかに使用可能である。検査することができる条件は、例えば、ウイルス感染、細菌感染、毒素への曝露、および薬物使用を含む。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出は、実施例に記載されている。
2016507057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における病原体の存在を検査するための家庭用検査デバイスであって、生体物質の取り出し及び病原体についての該生体物質を検査するためのアッセイは単一デバイスで行われ、該デバイスは、生体物質を受けるためのユニットと、該物質中の生体分子を含む標的実体の存在について検査するためのチャンバーを含み、該生体分子の存在が該病原体の存在を確実にし、該チャンバーが生体分子を含む該標的実体の存在を検出することができるアッセイ分子を含む上記デバイス。
【請求項２】
病原体がＨＩＶである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
生体分子を含む標的実体がＨＩＶバイロンの成分である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
アッセイ分子がナノ粒子である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
ナノ粒子が貴金属ナノ粒子である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
貴金属ナノ粒子が金である、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
チャンバーが、最近に感染した患者に存在する、ある量のＨＩＶバイロン中の生体分子を含む十分な標的実体を検出するのに十分なアッセイ分子を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
患者が、家庭用検査デバイスを用いて、家庭内検査を行う前の約３０日以下に感染している、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
デバイスが、患者から採取した該生体物質中の数個のＨＩＶバイロンに存在する複数の生体分子を含む複数の標的実体を検出することができる、請求項７に記載のデバイス。
【請求項１０】
患者からの生体分子を取り出した後、別の個体による生体分子の汚染を防ぐために安全閉鎖具をさらに含む、請求項９に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野は、生体試料における標的実体を回収し、検査し、及び検出を報告するデバイスである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の病原因子、毒素、および薬物の検出は、継続的に改善され、取り除かれる。家庭用検査キットは、妊娠及び性感染症（ＳＴＤ）を含む、広範囲の状態を検査するために販売されている。多くの場合、家庭用検査から学んだ知識は、治療目的のために価値があり、他への感染性因子の感染のリスクを軽減するために価値がある。
【０００３】
多数のウイルス、細菌、および病原体が存在するが、そのための簡単な検査方法はない。感染性因子との接触が疑われ、または感染の徴候がある個人は、医療施設で医療従事者からの診断を試みることが要求される。いくつかの状態である、特にＨＩＶおよび他のウイルス感染では、標準的な検査様式は、早期発見を排除し、ＨＩＶの場合には、体液及び個体におけるＨＩＶに対する抗体の存在について検査することは、感染が疑われる日後の約６ヶ月まで待たなければならない。したがって、個人は、多くの場合、待機中の要求に起因して、おそらくは検査が医療施設で行わなければならないという経費に起因して、診断を求めることから落胆する。ほとんどのこれらの状態では、接触または感染後、迅速な治療が治療成功の可能性を増加させる。感染状態では、迅速な診断と治療が、他への状態の広がりを減らすことができる。
【０００４】
具体的には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の検出は、予防と治療戦略の両方に重要である。しかしながら、パンデミックの開始から３０年後でさえ、ＨＩＶ感染に検査に利用できる実験室ツールは不完全であり、非常に少数の個人が、最近の感染後に診断及び治療を受ける。毎年、世界中で３３４０万人を超える人々が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を被り、一方、２００万人が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）への進行により死亡している。発展途上国における６００万人が、抗レトロウイルス治療が緊急に必要であるが、たった７０万人が、現在、限られた利用可能性と高コストのために、効果的な治療を受けている。
【０００５】
生体試料中の検出可能な生物学的実体を検査する方法は、多数のグループによって探索されている。多くの研究グループが、主に、医療専門家が医療施設で使用するために、実験室および大規模な診断的使用に関する既存の技術の能力の最適化と増加に焦点を当てている。
【０００６】
ＨＩＶを含むウイルス感染症に関して、いくつかのグループは、家庭用スクリーニング検査用の抗体検出を用いるキットを開発しているが、これらのキットは、抗体が、感染した個体に出現するために、約６ヶ月の待機期間が必要である。検出アッセイのための標的として、感染性因子に特異的な抗体を用いるという欠点は、ヒト生体は、感染から約４〜６カ月後にのみ、多数の感染性因子に対する抗体を提示することである。したがって、感染性因子に特異的な抗体の検出は、個体が、感染後の少なくとも４〜６ヶ月間は不可能である。状態は、それが早期に感染症を検出することが極めて望ましいであろう幼児では特に深刻である。幼児は、感染後の約１年まで、病原性の感染性因子に対する抗体を作製しない。
【０００７】
病原性因子の早期発見は、早期治療と他へのそれらの因子の感染の減少の両方を容易にするために役立つ。ウイルス、および細菌性因子、毒素及び薬物を含むすべての病原因子の早期検出方法を提供することは、医学界において大きな利点になる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、生物学的試料中の標的実体の存在を検査する機会を個体に提供する、検査デバイス、キット、アッセイ及び方法である。検査デバイスは、個体から回収した生物学的試料を含むように適合される。検査デバイスは、目的の標的実体を検出するために、回収した生物学的試料をアッセイするための試薬を含む。アッセイは、検査デバイス上又は検査デバイス中の結果ウィンドウから視覚的に報告されるナノ粒子に基づく比色アッセイである。結果は、例えば、比色的または定量的であってもよい。アッセイが行われ、生物学的試料を採取した後に結果がすぐに報告される。感染症に関して、検査デバイスは、デバイスが、他を感染し得る生きた感染性実体を運搬しないように、中和作用を有することができる。
【０００９】
アッセイは、生物学的試料中の標的実体を検出するための比色ナノ粒子のアプローチを採用する。アッセイを行う方法は、個体から生物学的試料を回収する工程を含む。試料を回収し、検査デバイス内のチャンバーに含有する。また、検査デバイス内に、比色ナノ粒子に基づく検出アッセイを行うために必要な試薬がある。使用することができる試薬は、それらの表面に結合させたリガンドを有する、複数の貴金属ナノ粒子を含む。リガンドは、試験される生物学的試料中の、標的実体、または標的実体の成分への結合に特異的である。試薬はまた、アッセイを行うための溶液および緩衝液、１つ以上のクラウディング剤、必要に応じて、対照アッセイを形成するための試薬、および比色ナノ粒子に基づく検出アッセイを行うために必要な他の試薬を含む。生物学的試料を回収した後、回収チャンバーを閉じてもよい。試料は、例えば、全血の他の成分から血漿を分離することによって、薬剤と混合する前に調製することができる。調製された試料は、デバイスにおける分析チャンバー内の試薬と直接混合することができる。分析が完了したとき、アッセイの結果は、デバイス上の結果ウィンドウに示される。比色アッセイは、肉眼で読まれる。結果を表示するためのオプションは、結果ウィンドウ内の色又は色変化を提示することを含む。定量は、色の強度、または色相の観点で測定することができ、所望であれば、数値読み出しをデジタル化することができる。比色アッセイの色は、例えば、センサーを用いて、数量若しくは色、又はそれらの両方として「読み取る」ことができる。定量化は、光の波長と強度の点の両方で、吸収された光又は反射された光を測定することを含むことができ、または標的実体に結合したナノ粒子の量を測定することを含むことができる。
【００１０】
デバイスは、個人に、医療専門家の援助なしに、該方法のすべてのステップを行う機会を提供するように設計されている。したがって、個人は、試料を自身で回収し、検査デバイスに開口を有するチャンバーに該試料を入れ、チャンバーを密閉し、デバイス上及びデバイス中の成分を操作して、検出アッセイ用の試薬を含む溶液に試料を接触させ、デバイスのウィンドウ中の色、又はデジタル化された値若しくは定量値として表示された結果を読むことができる。アッセイの結果はまた、デジタル化された場合には、スマートフォンまたは他のスマートデバイスに通知することができる。デバイス及びキット成分の使用説明書は、デバイスと他の成分を含むボックスに含めることができる。説明書は、デバイスの結果ウィンドウに提示された色、又は標的実体の検出を示す数値をどのように解釈すべきかなどの詳細を記述する。一般的に、試料は、（例えば、金粒子が使用される場合には青色を示すように）特定の色がウィンドウに示される場合、標的実体について陽性であるとみなされる。数値とそれらの意味は、較正によって画定され、使用説明書に記載される。
【００１１】
本発明の検査デバイス、キット、アッセイおよび方法は、全ての種類の病原体を検出するために用いることができ、ウイルス剤と細菌剤および毒素と薬物を含む。生物学的試料において検出可能な病原因子のすべての標的実体は、本明細書に記載される検査デバイス、キット及びアッセイの設計の基礎を形成することができる。標的実体から標的実体への変化するデバイスと発明の要素は、標的実体の性質、その実体を検出するために使用されるリガンド、その標的実体がアッセイされる生物学的流体又は組織、個人が生物学的試料を回収することができる、疑われた感染又は接触後の最適な時間、並びに検出される標的実体に固有の他の特異な詳細を取り扱わなければならない。
【００１２】
比色検出アッセイは、少なくともナノ粒子の直径と同じくらいに近い、凝集する貴金属ナノ粒子が、結合していないナノ粒子、同一の大きさと材料の非凝集ナノ粒子とは異なるプラズモン共鳴周波数で共振するという原理に基づいている。したがって、標的実体（又は標的実体の成分）の結合に特異的なリガンドでタグ化されたナノ粒子を用いることにより、標的実体の検出を促進することができる。ナノ粒子コンジュゲートは、近接して一緒になり、塊を形成する際に、色ずれが溶液中で起こる。色ずれは、試料中の標的実体の存在を示す。互いに近接したナノ粒子は、非凝集金属ナノ粒子が反映されることと比較して、可視光の異なる周波数を反映する。色ずれがない場合、金属ナノ粒子リガンドコンジュゲートは、任意の標的に結合していないままであり、従って、生物学的試料は標的実体について陰性である。
【００１３】
個体から回収した生物学的試料は、流体又は非流体であり得る。典型的には、試料の回収は、検査デバイスにおける開口を有するリザーバーに、少量の個体の体液を入れることを伴う。個体から回収した体液は、例えば、血液、リンパ液、唾液、または尿であってもよい。試料はまた、非流体材料、例えば、粘性または固体の材料であり得る。個人によって回収可能な非流体材料としては、例えば、皮膚、開放創からの組織、かさぶた、膿、毛髪、分泌物、粘液、または排泄物が挙げることができる。回収量は、アッセイを行うために必要な量であり、また、合理的に回収可能な量である。標的実体は、個体から回収した生物学的試料中に見出され、生物学的試料は、血液、精液、膣分泌物、母乳、羊水、またはリンパ液から選択することができる。生物学的試料中に見出される標的実体は、例えば、細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、ウイルス、細菌、有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、脂肪酸、炭水化物、薬物、ホルモン、細胞、元素、毒素、化学物質、代謝物、または前述のいずれかの項目の２以上を含む複合体であってもよい。
【００１４】
したがって、例えば、ＨＩＶ感染の場合、ＨＩＶの非常に低いレベルは、感染から７〜１０日後の血液中に、５０μｌの血液あたり１ＨＩＶバイロンのオーダーで存在する場合がある。したがって、５０μｌの血液が回収される。血液の１滴の体積は、液滴の大きさに依存し、どこかで２０μｌ〜５０μｌであることが報告されている。血液の２滴がデバイスに回収された場合、回収された体積は、約４０〜約１００μｌの範囲である。異なる検査状況と異なる条件は、多かれ少なかれ生物学的試料の流体と質量が必要な場合がある。
【００１５】
個体から回収した生物学的試料を検査するためのキットは、試料回収、検査、および検査結果を表示するための成分を有する検査デバイスを含むことができる。検査成分は、検出アッセイを行い、標的実体に特異的なリガンドに結合した、複数の貴金属ナノ粒子を含むための試薬を有する溶液を含むことができる。キットはまた、通常、使用するためのキット内容物用の容器と説明書を含む。検査デバイスは、個体からの生物学的試料を回収するためのチャンバーと、アッセイを行うための試薬が予め充填されたチャンバーを含むことができる。また、検査デバイスはまた、個人が検査結果を読み取ることができるウィンドウを含む。検査デバイスは、定量化を含むことができる。感染性病原体の場合、検査デバイスは、さらに、生きた病原体を中和又は不活性化し、試料回収の完了後に接触からそれを分離するためのシステム、試薬又は機械的特徴を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＨＩＶバイロンのポンチ絵である。
【図２】図２は、時間対検出可能なＨＩＶサブパートのチャートである。
【図３】図３は、検査デバイスの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
検査デバイス、アッセイおよびキットは、個体から採取した試料中の実体を検出するためのものである。試験アッセイは、試験されるべき生物学的試料を提供する個体によって自己投与され得て、試料を回収若しくは調製するための実験室を必要とせず、又は検査結果を読み、及び解釈するための臨床医を必要としない。ＨＩＶ検査に関して、検出アッセイの感受性は、疑われた接触後の５日以内にウイルスについて個体をする機会を提供する。
【００１８】
本発明の検査デバイス、検査キット、アッセイおよび方法は、溶液ベースの貴金属ナノ粒子比色検出の使用を含む。ナノ粒子は、対象実体に特異的なリガンドに結合している。リガンドは、標的実体、または標的実体の成分に特異的であり得て、異なる特異性を有する、同一または異なるリガンドにコンジュゲートしたナノ粒子が存在してもよい。特定のアッセイのためのリガンドの設計では、目標は、複数のナノ粒子が（それらのコンジュゲートしたリガンドを介して）標的実体またはその成分に結合したときに発生する標的実体の存在下でナノ粒子の凝集を促進することである。金属ナノ粒子の凝集は、溶液において色ずれを生じ、例えば、金ナノ粒子を用いた場合、溶液は、非凝集粒子を有する溶液では赤色であり、ナノ粒子が凝集したときは青色である。
【００１９】
例えば、直径にして約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の均一なサイズを有する金ナノ粒子の溶液は、いずれか１つのナノ粒子のいずれか１つの直径よりも大きな距離で溶液中で離間し、肉眼で赤色になる。溶液中のこれらのナノ粒子が強制的に凝集し、各ナノ粒子はが、１つ以上の他のナノ粒子に対するいずれか１つのナノ粒子の直径よりも近い場合に、他のナノ粒子と塊を形成するとき、溶液は青色に変化する。さらに、赤から青への色の変化の間に、塊の量を示す紫の色合いが、ある場合には観察することができる
【００２０】
本発明のためのアッセイは、貴金属ナノ粒子と、溶液中及び凝集体としての貴金属ナノ粒子に適用するプラズモン共鳴の原理を用いて行われる。この技術を報告している最初のグループの１つについては、“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｄ  Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，１０７８（１９９７）；ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２７７．５３２９．１０７８を参照されたい。Ｍｉｒｋｉｎは、メルカプトアルキルオリゴヌクレオチド修飾した金ナノ粒子プローブに基づく選択性の高い、比色ポリヌクレオチドの検出方法を報告している。最適化されていないシステムは、約１０フェムトモルのオリゴヌクレオチドを検出することができる。アッセイを実施するための材料、試薬及び条件、並びに他の技術的詳細に関する更なる技術的詳細については、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００５，１０５，１５４７−１５６２  １５４７“Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”．Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｌ．Ｒｏｓｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｄ  Ａ．Ｍｉｒｋｉｎを参照されたい。Ｍｉｒｋｉｎは、非常に特異的な金属配位を可能にするリガンド設計の継続的な改善が、ナノ構造化されたプローブを実装する、より選択的な金属イオン検出アッセイをもたらすと結論付けている。“Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．４  １５５５を参照されたい。Ｍｉｒｋｉｎの参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
溶液ベースのナノ粒子アッセイは、比色ナノ粒子のアプローチを使用し、測定可能な変化とナノ粒子表面プラズモン吸収バンドのシフトをもたらす、分析物が誘導された凝集事象を利用する。比色検出フォーマットの単純さは、多種多様の分析物を検出するためお一般的な方法として、その使用に対して指摘された。Ｈａｅｓ，Ａ．Ｊ．；Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ，Ｒ．Ｐ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１０５９６、及びＲｉｂｏｈ，Ｊ．Ｃ；Ｈａｅｓ，Ａ．Ｊ．；ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ａ．Ｄ．；Ｙｏｎｚｏｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ，Ｒ．Ｐ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００３，１０７，１７７２を参照されたい。Ｌｕｉおよび共同研究者らは、１００ｎＭ程度に低い濃度で、水性媒体中のＰｂ（ＩＩ）イオンと鉛含有の塗料試料を検出するための、オリゴヌクレオチドが会合したナノ粒子ネットワークを実施することによって、毒素について比色検出の例を提供した。Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｌｕ，Ｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，６６４２を参照されたい。Ｌｕｉのグループはまた、メルカプトカルボン酸などの適切に設計されたキレート基で官能化されたナノ粒子の凝集を誘導することによって検出された水銀毒素を使用した。金属イオンは、異なる金ナノ粒子のカルボキシレート部分を架橋し、赤から青への同時コロイド色の変化を生じさせた。Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｌｕ，Ｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，６６４２を参照されたい。Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ及びＬｕｉの参考文献は、全体として参照により組み込まれる。
【００２２】
貴金属ナノ粒子は、貴金属粒子のサイズに応じて可視光の吸収周波数の変化を決定するプラズモン共鳴の原理に基づいて、生物学的試料中の実体を検出するために使用されている。例えば、直径が約３０ｎｍ未満の金ナノ粒子は、溶液中で赤く見える。粒子サイズが６０ｎｍを超えて増加すると、凝集体は、溶液の色を赤から青にシフトさせる。赤と青の間のシフトは、凝集しているナノ粒子の成長しているサイズに関連して、紫色の勾配が観察し得る。本発明は、貴金属ナノ粒子（即ち、金、銀又は銅）に、標的実体に特異的なリガンドを結合させることによって形成される分析物を使用する。例えば、溶液中の金ナノ粒子は、それぞれ約２０〜３０ｎｍの直径を有し、溶液中で赤色を示す。標的に特異的なリガンドでタグ化されたナノ粒子は、標的が検査されるべき生物学的試料に存在する場合、標的の周囲に凝集し、標的に特異的なリガンドがコンジュゲートしたナノ粒子全ての凝集体を形成する。サイズ範囲が約２０ｎｍ〜約３０ｎｍである２つ、３つ、またはそれを超えるナノ粒子の凝集体は、６０ｎｍよりも大きな塊を形成する。次に、金ナノ粒子のプラズモン共鳴は、反射された可視光の波長を青色にシフトさせ、溶液は肉眼で青色に見える。
【００２３】
検査デバイスおよびアッセイの設計における具体的な考察事項は、ハイブリダイゼーションのシグナルが、高分子凝集体内のナノ粒子の間隔に部分的に依存する、ナノ粒子の光学的特性によって支配されるという事実などの詳細を含む。平均粒径よりも実質的に大きい粒子間距離を有するナノ粒子凝集体は赤色を示すが、これらの凝集体における粒子間距離は、およそ平均粒径未満に減少させるため、色は青になる。金の表面プラズモン共鳴（ＡＵ）に起因するこのシフトは、凝集体構造へのナノ粒子を編成するためのオリゴヌクレオチドと非オリゴヌクレオチドに基づく戦略で観察され、理論的に研究されている。直径が１３ｎｍである金粒子が使用され、これは、それらが、サイズの狂いが僅か（２ｎｍ）であり、容易に調製され得て、鋭いプラズモン吸収帯（波長５２０ｎｍで最大吸光度）を示すためである。
【００２４】
したがって、本発明のアッセイの要素と考察事項には、ナノ粒子の大きさと量、ナノ粒子の形状、ナノ粒子にコンジュゲートしたリガンドの性質と特徴、リガンドに対する標的結合パートナー、標的上の同一又は異なった部位への複数のナノ粒子の結合における立体的な考察事項、並びに検査デバイスのアッセイチャンバー内に回収された生物学的試料の体積及び質量を用いたアッセイを行うための実施可能性が含まれる。
【００２５】
アッセイは、個体からの流体または非流体物質を含む試料を含む。試料は、流体であってもよく、流体は、血液、リンパ液、精液、膣液、母乳、唾液、尿、脳脊髄液、胸膜液、心膜流体、羊水、滑液、及び間質液から選択することができる。
【００２６】
生物学的試料中で検出することができる病原因子は、例えば、ウイルスまたは細菌因子である。他のウイルス感染因子としては、例えば、インフルエンザ、肝炎、ヘルペス、パピローマ、アデノ随伴ウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｔ細胞リンパ球向性ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、パルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、トマトブッシースタントウイルスなど、並びに他のウイルスによって引き起こされまたはウイルスに関連した感染症が挙げられる。すべてのタイプの細菌感染を検出することができ、例えば、大腸菌感染、ウイルス感染後に発症することがあり、敗血症、破傷風、及び他の一般的な細菌又はあまり一般的でない細菌が挙げられ、ウイルス感染後に発症し得る二次感染が含まれる。さらに、本発明の検査デバイスおよびアッセイにおける標的実体の基礎とすることができる検出可能なマーカーを有する状態を検出することができる。このような状態には、例えば、変性疾患、アルツハイマー病および他の神経変性疾患、及び筋肉変性が関与する疾患、癌、および再狭窄などの増殖状態、例えば、自己免疫疾患、過敏性障害、及びアレルギーなどの炎症状態、糖尿病、及び消火器疾患などの代謝状態、検出可能なマーカーを出現させる遺伝的状態が含まれ得る。生物学的病原体に加えて、本発明は、環境曝露からの毒素などの毒素、及び性能向上する薬物などの薬物を検出することができる。一般に、感染又は状態のためのマーカーとして、及びリガンドが、標的実体を検出するための基礎として開発及び使用され得るマーカーとして役立つ標的実体を有する任意の状態は、特定の検査デバイス、キット、アッセイ及び方法の基礎となり得る。
【００２７】
個体は、検査されるべき状態に陽性である場合、標的実体は、個体から回収した生物学的試料中に存在する。このような標的実体は、例えば、状態のマーカーであってもよく、またはそれらは、求められる実際の毒素、薬物若しくは病原体であってもよい。したがって、標的実体（又は標的実体の成分）は、例えば、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、炭水化物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、イオン、代謝産物、誘導体、類似体、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、凝固因子、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、細胞、細胞表面分子、微生物、有機小分子、バイロン、細菌、毒素、薬物、細胞、細胞膜、膜画分、タンパク質複合体、抗原、ハプテン、受容体、巨大分子、または分子複合体であってもよい。
【００２８】
他の標的実体はまた、アッセイで使用することも可能である。したがって、アッセイによる標的実体は、生物学的試料中に見出され、求められる状態のマーカーとして考察されるに任意の実体であり得る。標的実体は、生物学的試料内に見出される１つ以上の分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子、要素および他の実体であってもよく、貴金属ナノ粒子にコンジュゲートさせ得るリガンドが存在する。
【００２９】
リガンドは、既知の結合技術を用いて、貴金属ナノ粒子にコンジュゲートされる。リガンドは、標的実体または標的実体の成分に結合する。標的実体の特定の結合部位または成分は、状態から状態に変化し得て、慎重に選択する必要がある。標的実体又は標的実体の成分の選択における考察事項は、タイミングを含むことができる：例えば、病原体または感染のライフサイクルにおいて、その標的実体が個体にいつ存在するかという質問を尋ねることができる。考察はまた場所を含むことができる：例えば、個体において、標的実体が見出され、検査デバイスに回収され得る生体試料の種類においてどこに存在するのかという質問を尋ねることができる。標的実体または標的実体の成分に特異的なリガンドは、例えば、抗体、抗原、受容体、アプタマー、タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸、または標的実体又は標的実体の成分に結合することができる任意の結合実体であってもよい。リガンドは、標的上の結合メンバーと結合対を形成することができ、例えば、結合対は、抗原と抗体の特異的な対、ビオチンとアビジン対、炭水化物とレクチン対、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクターと受容体分子、酵素補因子と酵素、または酵素阻害剤と酵素であってもよい。多くの異なるリガンドと結合対は、単一のアッセイにおいて標的を検出するために使用することができる。貴金属ナノ粒子にコンジュゲートされ、標的実体に結合するように設計された特異的リガンド又は結合メンバーは、列挙された標的実体又は標的実体の成分のいずれかの結合及び検出に特異的なリガンドを含むことができ、また、遺伝子、コード配列、コドン、非コード配列、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖核酸、二本鎖核酸、相補的ヌクレオチド配列は、分枝ＤＮＡ、核酸をコピーするための成分、アンプリコン、天然の核酸、合成核酸、転写因子、リガーゼ、酵素、及びこれらのいずれかのサブユニットが含まれる。
【００３０】
検査デバイスから検査デバイスへ、及びアッセイからアッセイへ変更してもよい本発明の態様は、本質的には、検出されるべき標的実体の性質によって特徴付けられ、以下：標的実体、標的実体に結合するリガンド、及びリガンドが結合し得る標的実体上の結合部位が挙げられる。
【００３１】
他の考察事項は、標的実体がリガンドに対して高親和性で結合するかどうか、及びその結合プロセスに何らかの立体障害又は結合競合問題が存在するかどうかを含むことができる。また、ナノ粒子にコンジュゲートされるリガンドの設計において、リガンドが、ナノ粒子が互いに近接するようになるように促進する方法で標的実体に結合し得るかどうかという問題が懸念され、そのため、色ずれは、標的実体の存在に起こる。最後に、標的実体又は標的実体の異なる成分に結合する１を超える種類のリガンドが選択される場合、これらのリガンドは、アッセイにおいて所望の色ずれをもたらすように相乗作用するかどうかという質問が尋ねられる。
【００３２】
金属ナノ粒子のサイズ、形状、および組成物は、材料を多重分析物の検出のために適したものにする特定の放射、吸収、及び光散乱特性を有する材料を製造するように系統的に変えることができる；ナノワイヤー及びナノチューブの組成物はまた調節され得て、このようにして、標的の存在におけるそれらの導電特性を測定し、変化させることができる。金及び銀のナノ構造のプラズモン特性は、特定の生物学的用途のために設計されたナノ構造を可能にするために、それらのサイズ、形状、組成、及び媒体を介して金属ナノ粒子のプラズモン共鳴特性の独特な調整可能性を含む。ナノロッド、ナノシェル、およびナノ粒子の対を含む、既知のナノ構造体形状は、劇的に強化された、調整可能なプラズモン共鳴を示すことができ、それらを、検出および診断などのバイオ用途に非常に適したものにする。ナノ構造体形状（例えば、ナノプリズム、ナノロッド、またはナノシェル）を調整することは、生物学的試料と標的実体への局在化された表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の感度を向上させる別の手段である。金属ナノ粒子対またはアセンブリーは、電界結合の結果として、距離に依存したプラズモン共鳴を示す。ユニバーサルスケーリングモデルは、粒子サイズの点で粒子間距離にプラズモン共鳴周波数を関連付け、生物学的システム内の状態の診断に潜在的に有用となる。
【００３３】
本明細書で提供される貴金属ナノ構造体の用途としては、プラズモンナノ材料が大きな範囲、汎用性、およびそれらの光学属性の体系的調整可能性を示すため、生物学および医学の他の領域に容易に一般化することができる。最近、ナノ構造化された材料の進歩によって大いに影響を受けている分野は、生物学、生物物理学、および医学である。ナノバイオロジーのツールキットは、貴金属ナノ構造によって強化され、これは、生物物理学的研究、貴金属ナノ構造の光学的特性を含むバイオ用途の範囲のために非常に多用途であり、調整可能な材料であることが証明され、それらのバイオ用途における細菌の研究進歩を検討している。
【００３４】
金属ナノ粒子は、分子特異性を達成するための小分子または生体分子標的または認識リガンドとコンジュゲートさせることができる。各金属ナノ粒子は、最大百万個の色素分子に同等の光プローブと考えることができる。これは、プロービング感度を向上させるための大きなマージンを提供する。色素とは異なり、金属ナノ粒子は、光安定であり、光退色を受けず、より高い光励起エネルギー及びより長期のプロービング時間を可能にする。ＬＳＰＲに関連した、ある範囲の拡張した放射と非放射性の属性がある。光学プロービング戦略は、このようにして、特定の生物学的用途に応じて選択することができる。別のストラテジーを組み合わせてもよい。ＬＳＰＲの別の固有な特性は、それが、バイオ用途に適合するために、ナノ構造のサイズ、形状、組成、又は環境を変えることによって調整することができるということである。１０ｎｍのサイズ範囲の金ナノ粒子は、水中で約５２０ｎｍに強い吸収極大を有する。これは、銀ナノ粒子については約３９０ｎｍに発生する。
【００３５】
キットは、標的実体の定量化のために凝集した貴金属ナノ粒子の対照量と比較して、生物学的試料の混合物中のプラズモン共鳴の量を測定するためのデバイスコンポーネントを含むことができる。実体が検出された事象において、デバイスはまた、試料中の実体の量の定量化を含むことができる。定量化は、典型的には、対照量と比較して、高量の実体の存在下で色の強度が増大することによって示される。定量化はまた、多くのナノ粒子がどのように標的に結合しているかを検出することによって達成されてもよい。デバイスが状態の進行または退行を監視するためである場合に定量化に有用である。典型的には、例えば、個人は、特定の治療が動作しているかどうかを学ぶことを望む場合がある。治療が動作しているかどうかは、測定される体液の体積あたりのウイルス粒子の力価の減少を検出することで知られ得る。対照溶液中の非凝集貴金属粒子のプラズモン共鳴周波数と比較して、凝集貴金属ナノ粒子のプラズモン共鳴周波数の指標を、デバイス中のウィンドウから同定することができ、ここで、試料と混合された粒子の凝集は、試料が実体に対して陽性であることを示す。さらに、アッセイは、試料中の実体の量を定量するために、非凝集粒子からのプラズモン共鳴の対照量と比較して、凝集からのプラズモン共鳴の量を測定することを含む。
【００３６】
ハンドヘルドのデバイス内で行うアッセイは、個体から試験される試料を回収することができ、その試料内で実体の存在を検出することができる。アッセイは、それらの外表面に付着したリガンドを有する貴金属ナノ粒子の検出溶液でハンドヘルドのデバイスのチャンバーをあらかじめ装填することを含むことができる。リガンドの特徴は、それらがアッセイによって検出される実体上の部分に特異的であることを含む。試料は、個体から回収され、デバイスのリザーバー内に配置される。試料は、予め装填された検出溶液と混合され、実体は、標的実体上または標的実体内に特異的なリガンドを有する分析物ナノ粒子と接触させることができる。アッセイを実施する方法は、検査デバイスに血液試料を引き出すか、または血液が指刺しから回収チャンバーに滴下させることを含み得る。回収チャンバーから、血液は、デバイスに内蔵されたメンブレンを通って液体を通過させることによってろ過され、血漿が単離され得る。圧力および真空を用いて、回収チャンバーからアッセイチャンバーに血漿を移動させることができる。アッセイチャンバーにおいて、試料は、アッセイを行うために試薬と接触させることができる。
【００３７】
全体として本発明を例示するために、検査デバイス、キット、アッセイおよび方法は、ヒトにおけるＨＩＶ感染を検出するために記載されている。後天性免疫不全症候群またはＡＩＤＳとして知られている生命を脅かす感染症は、ヒト免疫不全ウイルス又はＨＩＶに感染によって引き起こされる。ＨＩＶ感染の早期検出は、ＨＩＶ感染の最初の１０日以内中またはその間のエクリプス期直後に、ウイルス量を減少させることによって、ＨＩＶ治療において大きな成功をもたらすことがある（図２参照）。本発明は、感染の最初の５〜７日以内にヒト免疫不全ウイルスを検出する能力の多大な利点を提供する。ＨＩＶのための現在の検査方法は、感染後の約６ヶ月までにＨＩＶを検出することはできない。さらに、ＨＩＶとの接触が疑われる乳児は、生後１年後まで抗体について検査することができない。したがって、ＨＩＶに関する現在の検査の不足が深刻である。現在の検査は、ＨＩＶ感染を検出するための標的実体として、ＨＩＶに対する抗体を使用する。本発明は、感染からできるだけ約５日で、生物学的試料中のＨＩＶの存在を示す、多数の異なる標的実体の数を使用するように適合される。ＨＩＶについて検査するためのアッセイの目的で、生物学的試料は、例えば、血液、精液、膣液、母乳、血液を含む他の体液であってもよい。ＨＩＶに感染したヒトからの特定の体液（血液、精液、膣分泌物、及び母乳）だけは、ＨＩＶを感染することができる。ＨＩＶは、血液、精液、膣分泌液、母乳、唾液、及び涙中の濃度または量が変化することが見出される。
【００３８】
アッセイにおける標的実体として機能することができるＨＩＶバイロンの成分としては、例えば、外被タンパク質ｇｐ１２０、ＲＮＡゲノムまたはＨＩＶ  ＲＮＡの配列、またはカプシドタンパク質Ｐ２４が挙げられる。例えば、本発明は、ＨＩＶ由来のＲＮＡ、ＨＩＶゲノムのカプシド入れ子を形成するｐ２４タンパク質を検出するためのリガンド、またはＨＩＶ  ｇｐ１２０の外被タンパク質の領域を認識し、結合するリガンドを使用することができる。他のタンパク質、酵素または材料などのＨＩＶの他の標的実体はまた、ＨＩＶを検出するためのアッセイ用に標的実体として使用することができる。標的実体の異なる成分に対するリガンドを用いることができ、陽性シグナルの検出の可能性及び強度を増加させる。標的実体の異なる成分を結合する同じ標的実体に対する異なるリガンドを設計し、標的の検出を最適化するためのアッセイで一緒に使用することができる。ＨＩＶの場合、例えば、ＨＩＶバイロン又はＨＩＶバイロンの成分は標的実体であり得る。したがって、ＨＩＶのＲＮＡゲノム、ＨＩＶバイロンの成分は、標的実体であってもよく、ＲＮＡゲノムの領域への結合に特異的なリガンドは、ウイルスを検出するために使用することができる。あるいは、ＲＮＡゲノムの異なる配列または領域への結合に特異的な異なるリガンドを使用することができる。また、例えば、ＨＩＶのバイロンの他の成分に特異的なリガンドをさらに使用することができ、例えば、カプシドタンパク質ｐ２４に特異的なリガンド、及びｇｐ１２０外被タンパク質に特異的なリガンドが挙げられ。
【００３９】
標的実体のタイミングと選択の考察に関して、具体的にはＨＩＶの検出に関して、感染後約５日以内に、感染した個体の血液に存在する標的実体を用いるアッセイを行うことができる。ＨＩＶに対する従前及び現在利用可能な検査は、ＨＩＶに対する抗体を検出し、これらの抗体は、感染後の約６ヶ月まで、感染した個体には出現しない。ＨＩＶに対する抗体は、感染後の１２ヶ月までに、感染した乳児に出現しない。従って、ＨＩＶを検出するためのアッセイにおいて使用することができる標的実体は、感染後の約５日以内に、感染した個体の血液中に非常に低レベルで存在するＨＩＶバイロン又はバイロンの成分を含む。
【００４０】
検査デバイス内に回収された個体からの生物学的試料中のＨＩＶを検出するための検査デバイス、検査キットは、アッセイ及び方法の課題に対処するために、ＨＩＶの構造、活性、および生物学の態様を理解し、考慮すべきである。ヒトにおけるＨＩＶ感染の構造及び挙動性を理解するために有益であって、診断及び治療に影響を及ぼし得る態様の理解において、ＨＩＶの病期分類に関して、論文「Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｄｏｎｏｒｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｆｉｅｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ２００３，１７：１８７１−１８７９を参照されたい。ここでは、初回ＨＩＶ感染中の装填濃度が分析及び検討される。Ｆｅｉｂｉｇらは、その全体が参考として援用される。
【００４１】
体内のＨＩＶの生物学は、ここで関連性がある。放出されたＨＩＶ粒子は、ある広範囲の直径を示すが、１２０〜２００ｎｍに伸長する。ＨＩＶにおけるバイロンの大多数は単一のコアを有する。ＨＩＶバイロンオンは、ウイルス表面へのｇｐ４１タンパク質とともに固定されたｇｐ１２０の三量体タンパク質のアセンブリーの７２個のスパイクで被覆されている（図１）。ウイルスコア（またはカプシド）は、タンパク質ｐ２４から作られる。コア内部には、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼと呼ばれるＨＩＶ複製のために必要な３つの酵素がある。また、コア内には、ＨＩＶの遺伝物質が保持され、これは、ＲＮＡの２つの同一の鎖からなる。ＨＩＶはレトロウイルスであり、その遺伝子は、ＲＮＡ（リボ核酸）から構成されている。ＨＩＶは、９個の遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、及びｖｐｕを有する。約１５０ｎｍ径のバイロンは、７２個のスパイクを常駐する約７０，６８５ｎｍ2の球状表面積を有する。ｇｐ１２０およびＰ２４、ならびにＨＩＶ  ＲＮＡ配列を含む、ＨＩＶの多数の可能なマーカーが存在する。本発明のＲＮＡベースのＨＩＶの検出検査は、疑われた接触後の約５日以内にＨＩＶ感染を検出するために、血液１滴あたりＨＩＶの約１コピーのおよその感度を有する。現在、血漿ベースの非常に低いバイロンアッセイは、ＨＩＶ−１感染の診断にＦＤＡ承認されておらず、感染から１５日目以降に可能であり得る任意の初期検査は、医療施設を除いて可能ではない。
【００４２】
ＨＩＶを検出するための溶液において、ＨＩＶバイロン上の１つの標的実体は、バイロンがｇｐ１２０タンパク質で被覆されているため、ｇｐ１２０であってもよい。バイロン表面上のｇｐ１２０タンパク質の部分に特異的な抗体は、金ナノ粒子にコンジュゲートさせ得る。表面積＝４πｒ2（ここで、ｒ＝約１５０ｎｍの直径の１／２又はｒ＝約７５ｎｍ）を有するＨＩＶバイロンは、表面積＝約４×３．１４×７５2＝７０６８５ｎｍ2である。ナノ粒子の表面積は、例えば、１５ｎｍ径＝４×３．１４×７．５2＝７０６．５ｎｍ2である。１５ｎｍ径のナノ粒子の表面積でバイロンの表面積を割ることは、バイロン表面上の１００個のナノ粒子用に結合空間を提供するものと考えられる。７２個のｇｐ１２０スパイクが存在するため、３個のｇｐ１２０タンパク質を有するスパイクは、立体的な問題を予測するために保存的なアプローチなどを採用すると、およそ２０〜６０ナノ粒子であり、可視光スペクトルにおける赤色から青色へのシフトを明確に示す大規模なナノ粒子クラスターを作製する単一のＨＩＶバイロンを結合することができた。ナノ粒子間の距離は、いずれか１つのナノ粒子の直径よりも小さい場合、可視スペクトルで示されるプラズモンシフトが起こる。したがって、ナノ粒子がより小さくなると、それらは、色ずれを促進するために、それらの標的に結合するときに互いにより近接しなければならない。プラズモン共鳴および色づれの原理は、ナノ粒子の凝集に依存し、標的分析物の低いレベルは、ナノ粒子がナノ粒子の直径より互いに近くなるように、バイロンの豊富な標的への適切な直径のコンジュゲートの十分なナノ粒子を確認することによって補うことができる。また、アッセイの感度に影響を与える追加の要因は、多数のリガンドがどのようにして各ナノ粒子にコンジュゲートされるかということである。ナノ粒子は、ＨＩＶバイロンの成分への結合を促進するために、十分であるが、過剰ではない結合リガンドで被覆される。最後に、貴金属ナノ粒子コンジュゲートを用いた検出は、「混み合い（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）」と呼ばれるアッセイ技術を用いて最適化することができる。混み合いは、溶液中の実体間の空間を生み出し、また、溶液中の実体を互いにより密接に移動さえるための溶液にバルク分子を添加することである。従って、検出の最適化は、８キロダルトン（８Ｋ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ３５Ｋ、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０、Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、デキストラン７０Ｋ、デキストラン５００Ｋ、デキストラン２０００Ｋ、及び他の同様の試薬などの既知の巨大分子の添加を用いて、アッセイにおいて達成することができる。ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１，１１：５０  ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−１１−５０を参照されたい。同様に、Ｈｉｌｌ  ＣＳ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＭＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ２００１，１（４）：４４５−４５５を参照されたい。両方の参考文献は、その全体が本出願に援用される。
【００４３】
ＨＩＶを検出することは、最初、生物学的試料と、バイロン及びウイルスカプシドを溶解させるための溶解剤を接触させることによって達成させ得る。溶解剤としては、例えば、グアニジンチオシアネートであってもよい。溶解剤はまた、カプシド由来のｍＲＮＡ、またカプシドｐ２４を形成するタンパク質を放出する。次に、ＨＩＶゲノムの相補性配列を含むリガンドにコンジュゲートされたナノ粒子は、ＲＮＡの長さに沿ってＨＩＶ  ＲＮＡ（コンジュゲートされたリガンドを介して）に結合することができ、潜在的に、２つのＲＮＡ鎖を有する単一のバイロンは、比色ナノ粒子ベースの検出を用いて検出される。少なくとも６０ｎｍ径の凝集体、好ましくは、複数のこのような凝集体は、ＨＩＶ  ＲＮＡで形成し、溶液の赤色を青色にシフトさせる。最適には、全体のＲＮＡ長が溶液中でナノ粒子によって標的化するために使用されるため、ナノ粒子は、溶液中で一緒になるナノ粒子の数を増加させるために、ＲＮＡゲノム上の配列に相補的な異なる配列にコンジュゲートさせることがでる。比色ナノ粒子検出に基づくアッセイにおいて、バイロンに結合する相補的リガンドを形成するために使用され得るＨＩＶバイロン内の潜在的な標的配列に関する詳細については、Ｍｏｏｒｅ  ＭＤ，Ｎｉｋｏｌａｉｔｃｈｉｋ  ＯＡ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｈａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄ  Ｍ−Ｌ，Ｒｅｋｏｓｈ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｖｉｒｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５（１０）：ｅ１０００６２７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１０００６２７を参照されたい。  Ｍｏｏｒｅらの参考文献は、その全体が本明細書に援用される。個体から採取された血漿検体を溶解することができ、ＲＮＡを安定化させ、ウイルスＲＮＡに相補的なポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む磁性粒子上に捕捉することができます。
【００４４】
感染性因子を検出するための検査デバイスおよびキットは、生きたウイルスが不活性化であることを確認するための手段または成分を有することができる。ＨＩＶの場合、生きた細胞内に伝達されていないとき、個体を感染する能力が非常に貧弱〜全くないことが知られ、宿主の生体外に見出されるバイロンを用いた感染は不可能である。しかしながら、検査デバイスの設計は、アッセイの完了後に生きたウイルスを中和する機能を含むことができる。ＨＩＶは、アルカリ性又は酸性の変化に非常に感受性であり、したがって、７未満又は８を超えるｐＨレベルはＨＩＶの長期生存に適さないため、ウイルスに関する簡単な不活性化戦略は、酸又は塩基の添加によって、アッセイ前、後または最中に達成することができる。溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）不活性化は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒによって開発され、これまでに最も広く使用されているウイルス不活性化である。これは、主に、血漿業界で使用されているが、プロセスは、脂質被膜に包まれたウイルスに対してのみ有効である。この方法で使用される界面活性剤は、ウイルスの脂質被覆中の分子間の相互作用を中断する。大部分の包まれたウイルスは、それらの脂質被覆なしには生きられないため、これらの界面活性剤に晒されたときに死に至る。他のウイルスはなおも生きてもよいが、それらは繁殖することはできず、非感染性のままである。溶媒は、脂質被覆と界面活性剤の間での凝集反応がより迅速に起こる環境を作る。典型的には、使用される界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００である。
【００４５】
また、デバイスは、アッセイの結果を読み取るために、生物学的試料を保持するチャンバーが密閉され、遮断シールしなければならないように設計されてもよい。これは、回収チャンバーを密閉し、シールするためにスライドされる結果ウィンドウ全体に配置されたカバーを有すること、及び同時に結果ウィンドウを表示することによって達成され得る。図３を参照すると、概略図は、指先の皮膚を開くためのチップと可能なランセット１１を有する検査デバイス１０を示す。対照バー１３は、ハンドル１５を用いて、針又はランセット１１を押し出すことができる。開口部１７を有する回収チャンバーは、試料の回収のために提供する。フィルター及び取り出し機構２３は、アッセイチャンバー２９中で分析物２１と染色し、混合されるフィルター２３を介して試料を引く。場合により、カバー２９は、不活性化溶液２７が任意の生きたウイルスを不活性化するためのアッセイチャンバーに入れられた後、位置３１にスライドされ得る。カバー２９は、（図中の）右にスライドされ、不活性化溶液は、アッセイチャンバーに移され、カバー２９の下の結果ウィンドウは、アッセイの結果を表示するために開かれる。
【００４６】
実験室研究で使用されるＨＩＶ濃度は、実際に血液または他の標本に見られるものよりはるかに高いため、ＨＩＶに感染したヒトの血液または他の体液を乾燥させることは、観察された−本質的にゼロである−環境伝播の理論的な危険性を減少する。さらに、ＨＩＶは、（適切な条件下でそうしてもよい多数の細菌又は真菌とは異なる）その生きた宿主外で再生することができない；したがって、ＨＩＶは、その宿主外で伝播し、感染性を維持することはない。しかしながら、予防策として、ＨＩＶ検査キットおよび検査デバイスについて、生物学的試料中の任意のなおも活性な生きたウイルスを不活性化するための化学的または物理的手段があってもよい。
【００４７】
アッセイを実施するための詳細の他の態様は、使用するための最良の試薬、溶液中のこれらの試薬の最良の濃度、ナノ粒子へのリガンドのコンジュゲートの仕方、適切なリガンドの選択、ナノ粒子に関するサイズ考察、アッセイを行う溶質の最適な体積、結果ウィンドウにおいて十分に強く、視認性のある発色における考察、及び他のこのような詳細を含み、以下のジャーナル論文の１つ以上に見出されてもよい。Ｆｏｘ，Ｍａｔｔｈｅｗ．「Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｉｓａ  ＨＩＶ  Ｍａｙ  ２０１０．Ｗｅｂ．＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｖｅｓｔｒｏｎｇ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／１３３１７６−ａｃｃｕｒａｃｙ−ｅｌｉｓａ−ｈｉｖ−ｔｅｓｔ＞．，Ｓｈａｈ，Ｉ．，ｅｔａｌ．２００６．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＨＩＶ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  Ｄｉａｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＪＡＰＩ  ５４：１９７−１９９，「Ｗｈａｔ  Ｋｉｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔｓ  Ａｒｅ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ？」ＨＩＶ  ＩｎＳｉｔｅ．ＵＣＳＦ，３Ａｕｇ．２０１１．Ｗｅｂ．ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖｉｎｓｉｔｅ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｉｎｓｉｔｅ？ｐａｇｅ＝ｂａｓｉｃｓ−０１−０１，Ｘｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｙｒｅｎｅ−ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｄｙａｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｒｎ−ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｈｉｏｌｓ．Ａｎａｌｙｓｔ  １３５：２３２３−２３２７，Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２６１：３４１−３６０，Ｋｉｍ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ−ｂａｓｅｄ  ＨＩＶ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２５：２５３−２５８，Ｗａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ＨＩＶ−１  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２８：７７０−７８１，Ａｈｎ，Ｃｈｏｎｇ  Ｈ．Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４．Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｍａｒｔ  ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ＩＥＥＥ，Ｖｏｌ  ９２，  Ｎｏ．１，Ｆｅｎｄ，Ｙａｎｙｉｎｇ．Ｊｕｎｅ  ２００３．Ｐａｓｓｉｖｅ  ｖａｌｖｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｍｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｏｓｉｎａ，Ｊ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｎｓｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｅ−Ｐｒｅｓｓ  Ａｒｔｉｃｌｅ，Ｂｕｓｈ，Ｖａｌｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｃｏｈｅｎ．２００９．Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｖａｃｕａｔｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔ���ｏｎ  Ｔｕｂｅｓ．ＬａｂＮｏｔｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １９，Ｎｏ．１，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｅｓｓｉｃａ．「Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．」Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．２３  Ｍａｙ  ２００７．Ｗｅｂ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｓｅｃ．ｏｈｉｏｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｅａｃｈｅｒ ｗｏｒｋｓｈｏｐ／Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ｐｄｆ，Ｓｔｏｗｅｌｌ，Ｄａｎ．「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ：ｇｐ１２０．」ｗｗｗ．ｍｃｌｄ．ｃｏ．ｕｋ．２００６．Ｗｅｂ．＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｃｌｄ．ｃｏ．ｕｋ／ｈｉｖ／？ｑ＝ｇｐ１２０＞．上記に引用された論文は、個体からの試料の回収後、検査デバイスに含まれる生物学的試料に対するアッセイを実施するための詳細を支持する際に使用するため、本明細書にその全体が参考として援用される。
【００４８】
本発明の範囲は、ここで説明された言語および詳細の最も広い解釈によって提供される。ここに提示された詳細は、本発明を例示するためであって、それを限定するものではないことが意図される。
【図３】
2016507057.tif 000003
【図１】
2016507057.tif 000004
【図２】
2016507057.tif 000005
【国際調査報告】
2016507057.tif 000006