(57)【要約】  乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法が提供される。また、乳癌に罹患している被験者の処置に対する奏功性を決定する方法も提供される。さらに、乳癌に罹患している被験者を処置する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法であって、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいて複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；および
乳癌疾患の診断における前記複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析に基づき、被験者の癌再発リスクが低いか高いかを分類すること
を含んでなり、
前記複数の遺伝子の分析が、およそ５年のアジュバント療法を受けた後の癌再発リスクを、５年を超える転帰を有する後向きＥＲ＋乳癌患者データセット、またはその代表サンプルと比べた場合に、低リスク群において約５％未満とし、かつ、
前記被験者がおよそ５年のアジュバント療法を受けており、その療法後に無病である、
方法。
【請求項２】
中リスクカテゴリーもまた分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低リスク群がＥＲ＋患者の５０％超を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
低リスク群がＥＲ＋患者の５５％超を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
低リスク群がＥＲ＋患者の６０％超を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
５年後再発リスクが決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
遠隔再発リスクが決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
局所再発リスクが決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の遺伝子のうちの１つがＨｏｘＢ１３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
複数の遺伝子のうちの１つがＩＬ１７ＢＲである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲの発現レベルの比が決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複数の遺伝子のうちの１つがＢｕｂ１Ｂである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
複数の遺伝子のうちの少なくとも１つがＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルが決定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ（Ｈ：Ｉ）の発現レベルの比が決定される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルが合計され、ＭＧＩ指数を得るために適用される係数、およびＨ：ＩおよびＭＧＩを連続変数として連結してＢＣＩ値とされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＢＣＩが、個々の癌再発リスクを連続ＢＣＩ変数の一部として評価することにより計算され、再発リスクがＢＣＩ変数と直線的関係で増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法であって、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より高いＢＣＩ値がより高い癌再発リスクと相関し、より低いＢＣＩ値がより低い癌再発リスクと相関すること；ならびに
前記サンプルをＢＣＩ値に基づき、前記被験者において中リスクカテゴリーを用いずに、癌再発の低リスクまたは高リスクを示すとして分類すること
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
前記発現レベルが、
ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲの発現レベルの比（「Ｈ：Ｉ」）を計算すること；
Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルを、ＭＧＩ指数を得るための係数を用いて合計すること；ならびに
Ｈ：ＩとＭＧＩを連続変数として連結すること
によって合計される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記係数が主成分分析から決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）であり、前記癌再発が局所再発を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記再発が晩期再発（初期療法後５年を超える）である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記指示が、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合の被験者における高リスク遠隔再発であり、かつ、前記被験者を化学療法で処置することをさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記指示が、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合の被験者における低リスク遠隔再発であり、かつ、前記被験者を前記アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置することをさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記指示が、さらに５年の間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置されない場合の被験者における高リスク遠隔再発であり、かつ、前記被験者をアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法または別のアジュバント療法で処置することをさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験者を、癌再発無く最大５年の期間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による処置を受けたと同定すること；
前記被験者をＢＣＩ値に基づき、前記処置の終了後に癌の高い遠隔再発リスクを有するまたは有さないと分類すること；ならびに
前記被験者が高い再発リスクを有する場合には、前記被験者をさらなる期間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置すること
をさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
乳癌に罹患している被験者の長期処置の必要性を決定する方法であって、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値が、５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期治療後にアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による追加処理を必要としないことと相関すること；ならびに
前記サンプルをＢＣＩに基づき、追加処置の必要が有ることまたは無いことを示すとして分類すること
を含んでなる、方法。
【請求項２９】
前記追加処置が５年以下の初期治療後、５年以上の期間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
乳癌に罹患している被験者を処置する方法であって、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値がより低い遠隔再発リスクと相関すること；ならびに
前記被験者に前記被験者のＢＣＩ値決定と一致した処置を施すこと
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
被験者における高い遠隔再発リスクが、５年以下の初期期間中にアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合に示され、前記被験者が化学療法で処置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験者における低い遠隔再発リスクが、５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合に示され、前記被験者がアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
被験者における高い遠隔再発リスクが、さらに５年の期間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置されない場合に示され、前記被験者がアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法または別のアジュバント療法で処置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者がリンパ節転移陰性（Ｎ０）乳癌を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験者がＨＥＲ２陰性乳癌を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｍＲＮＡ発現レベルが、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製することにより決定される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてさらに増幅される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記決定がアレイの使用を含んでなる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが前記被験者から摘出された組織から切り出される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＢＣＩが、個々の癌再発リスクを連続ＢＣＩ変数の一部として評価することにより計算され、再発リスクがＢＣＩ変数と直線的関係で増加する、請求項１９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法がタモキシフェンである、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記再発リスクが遠隔再発リスクである、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
（１）発明の分野
本開示は、乳癌再発に臨床的関連を有する遺伝子発現プロファイル、またはパターンの同定および使用に関する。特に、本開示は、アジュバントタモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤などの抗乳癌療法による初期治療の後の癌再発の見込みを決定するアッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
エストロゲン受容体陽性乳癌は、長期の再発リスクを有する疾患である。アジュバントタモキシフェンの５年後、患者は、診断後少なくとも１５年間、持続的な疾患再発および死亡リスクを有する。アリミデックス、タモキシフェン、アロネオリン組合せ（ＡＴＡＣ）治験およびＢｒｅａｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ（ＢＩＧ）１−９８試験(Cuzick et al., 2010)を含む、アジュバントアロマターゼ阻害剤の中核先行治験からの長期追跡調査は、初期療法後に年間約２％の持続的再発率を示し、５年のアジュバント内分泌療法後に見られる全再発の半分より多い。これらの所見は、長期アジュバント療法および治療意思決定プロセスの指針となり得るバイオマーカーの必要を強調する。
【０００３】
エストロゲン受容体陽性乳癌における再発リスクの評価のために過去１０年に研究された多遺伝子発現シグネチャーは、主として、増殖関連の遺伝子発現の定量的測定に頼るものである。２１遺伝子再発スコア(Oncotype DX; Genomic Health, Redwood City, CA, USA)を含む、これらの多遺伝子シグネチャーは、遠隔再発の強力な予測因子であるが、それらの予後能は、診断から５年を超えてリスクを評価する場合には低下する(Sgroi et al., 2012)。対照的に、晩期再発の予測因子は十分な特徴付けがなされておらず、早期再発と晩期再発には異なる機構が関連していると思われる。５年の内分泌療法だけで十分に処置される患者、および逆に、長期アジュバント内分泌療法または他の療法を保証し得る晩期再発リスクの高い患者を同定するためには、バイオマーカーが必要とされる。
【０００４】
従前の研究で、２つの独立に開発された遺伝子発現バイオマーカーセット：分子グレード指数（ＭＧＩ）およびＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲからなる乳癌指数（ＢＣＩ）アッセイを開発し、妥当性の確認を行った。ＭＧＩ、腫瘍グレードおよび増殖を再現する５遺伝子予測因子は、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者において予後能が高い。腫瘍グレードまたは増殖とは独立に開発されたＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲは、早期および晩期遠隔再発の予後能があり、初期エストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者における長期アジュバントアロマターゼ阻害剤の利益の予測能がある。ＢＣＩおよび２１遺伝子再発スコアアッセイは両方とも、定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子発現を測定するが、それらが検出する遺伝子は異なる。ＩＨＣ４は、最も情報が得られる免疫組織化学的バイオマーカーのうちの４つ：エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２、およびＫｉ−６７のタンパク質発現を測定するもう１つの予後のモデルであるが(Cusick et al., 2011)、その中にＢＣＩアッセイの遺伝子のよってコードされているものはない。ＢＣＩは、エストロゲン受容体陰性乳癌またはトリプルネガティブ乳癌を有する患者では評価されていない。米国特許第７，９３０，１０５号および同第７，５０４，２１４号、米国特許公開第２０１１／０１３６６８０号および同第２０１３／０２８１５０２号、およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１２／０７９０５９号参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，９３０，１０５号
【特許文献２】米国特許第７，５０４，２１４号
【特許文献３】米国特許公開第２０１１／０１３６６８０号
【特許文献４】米国特許公開第２０１３／０２８１５０２号
【特許文献５】ＷＯ／２０１２／０７９０５９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cuzick et al., Lancet Oncol. 11:1135-1141 (2010).
【非特許文献２】Sgroi, et al., Proc SABVS; Abstract S1-9 (2012).
【非特許文献３】Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-4278 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者における晩期再発に対する長期アジュバント内分泌療法のリスク−利益を改善するためにバイオマーカーの必要があることは明らかである。本発明はその必要に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な概要
本開示は、１つには、（ａ）２つのカテゴリースキーム（高リスク、低リスク）が従来技術の中リスク分類の不明確性を避けるためにＢＣＩ分析で効果的に使用可能である；（ｂ）線形ＢＣＩモデル（ＢＣＩ−Ｌ）は、キュービックモデル（ＢＣＩ−Ｃ）よりも再発リスクに対して優れた予後能を有する；および（ｃ）上記の発見は、治療選択肢の選択に使用することができる、癌再発などの予後情報および特定の療法に対する奏功性などの予測情報を提供するための、ＢＣＩのより簡単かつより正確な適用を可能とする、という発見に基づく。
【０００９】
本明細書では、乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法が提供される。本方法は、を含んでなる。（ａ）前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいて複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；および（ｂ）乳癌疾患の診断における前記複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析に基づき、被験者の癌再発リスクが低いか高いかを分類することを含んでなる。この方法では、複数の遺伝子の分析は、およそ５年のアジュバント療法を受けた後の癌再発リスクを、５年を超える転帰を有する後向きＥＲ＋乳癌患者データセット、またはその代表サンプルと比べた場合に、低リスク群において約５％未満とする。多くの実施形態では、被験者は、およそ５年のアジュバント療法を受けており、その療法後に無病である。
【００１０】
よって、いくつかの実施形態では、本発明は、乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法を対象とする。本方法は、前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より高いＢＣＩ値がより高い癌再発リスクと相関し、より低いＢＣＩ値がより低い癌再発リスクと相関すること；ならびに
前記サンプルをＢＣＩ値に基づき、前記被験者において中リスクカテゴリーを用いずに、癌再発の低リスクまたは高リスクを示すとして分類すること
を含んでなる、方法。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、乳癌に罹患している被験者の処置に対する奏功性を決定する方法を対象とする。本方法は、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値が、５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期治療の後のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による追加処置に対する奏功性と相関すること；ならびに
前記サンプルをＢＣＩ値に基づき、前記奏功性またはその欠如を示すとして分類すること
を含んでなる。
【００１２】
さらに、本発明は、乳癌に罹患している被験者を処置する方法を対象とする。本方法は、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値が、（ａ）５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期治療の後のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による追加処置に対する奏功性、および（ｂ）より低い遠隔再発リスクと相関すること；および
前記被験者にＢＣＩ値決定と一致した処置を施すこと
を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明に記載のコンソートのためのＡＴＡＣ  ＣＯＮＳＯＲＴ図である。
【図２Ａ】図２Ａは、総てのＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関してＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌに基づき予め指定されたリスク群の成績を示すグラフである。パネルＡ−ＢＣＩ−Ｃ。
【図２Ｂ】図２Ｂは、総てのＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関してＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌに基づき予め指定されたリスク群の成績を示すグラフである。パネルＢ−ＢＣＩ−Ｌ。
【図３】図３は、全１０年遠隔再発のリスクをＥＲ＋Ｎ０患者における連続ＢＣＩ直線指数の関数として示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＥＲ＋Ｎ０ＨＥＲ２陰性患者における全１０年遠隔再発に関してＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌモデルに基づき予め指定されたリスク群の成績を示すグラフである。パネルＡ）ＢＣＩ−Ｃ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＥＲ＋Ｎ０ＨＥＲ２陰性患者における全１０年遠隔再発に関してＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌモデルに基づき予め指定されたリスク群の成績を示すグラフである。パネルＢ）ＢＣＩ−Ｌ。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＲ＋Ｎ０患者における初期および晩期遠隔再発に関する所定のＢＣＩリスク群の成績を示すグラフである。５Ａ）は、早期０〜５年遠隔再発。集団ＰＩは、早期再発に関する、所定の低リスク群および中リスク群を意味し、Ｐ２は高リスク群を意味する。Ｐ３は、晩期再発に関する、所定の低リスク群を意味し、Ｐ４は中リスク群および高リスク群を意味する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＲ＋Ｎ０患者における初期および晩期遠隔再発に関する所定のＢＣＩリスク群の成績を示すグラフである。５Ｂ）晩期５〜１０年遠隔再発。集団ＰＩは、早期再発に関する、所定の低リスク群および中リスク群を意味し、Ｐ２は高リスク群を意味する。Ｐ３は、晩期再発に関する、所定の低リスク群を意味し、Ｐ４は中リスク群および高リスク群を意味する。
【図６Ａ】図６Ａは、早期および晩期遠隔再発のリスクをＥＲ＋Ｎ０患者における連続ＢＣ指数の関数として示すグラフである。６Ａ）早期０〜５年遠隔再発のリスク。垂線は、所定の低、中（Ｉｎｔｅｒ）および高ＢＣＩリスク群の間の境界を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、早期および晩期遠隔再発のリスクをＥＲ＋Ｎ０患者における連続ＢＣ指数の関数として示すグラフである。６Ｂ）晩期５〜１０年遠隔再発のリスク。垂線は、所定の低、中（Ｉｎｔｅｒ）および高ＢＣＩリスク群の間の境界を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＥＲ＋Ｎ０ＨＥＲ２陰性患者における早期および晩期遠隔再発に関する所定のＢＣＩリスク群の成績を示すグラフである。パネルＡ）早期（０〜５年）遠隔再発のリスク。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＥＲ＋Ｎ０ＨＥＲ２陰性患者における早期および晩期遠隔再発に関する所定のＢＣＩリスク群の成績を示すグラフである。パネルＢ）晩期（５〜１０年）遠隔再発のリスク。
【図８Ａ】図８Ａは、早期（０〜５年）および晩期（５〜１０年）遠隔再発のリスクをＥＲ＋Ｎ０  ＨＥＲ２陰性患者におけるＢＣＩ指数の関数として示すグラフである。パネルＡ−早期遠隔再発のリスク。
【図８Ｂ】図８Ｂは、早期（０〜５年）および晩期（５〜１０年）遠隔再発のリスクをＥＲ＋Ｎ０  ＨＥＲ２陰性患者におけるＢＣＩ指数の関数として示すグラフである。パネルＢ−晩期遠隔再発のリスク。
【図９Ａ】図９Ａは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＡ−両アームを合わせた場合のＢＣＩ。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＢ−両アームを合わせた場合のＲＳ。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＣ−両アームを合わせた場合のＩＨＣ４。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＤ−アストロゾールアーム単独の場合のＢＣＩ。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＥ−アストロゾールアーム単独の場合のＲＳ。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＦ−アストロゾールアーム単独の場合のＩＨＣ４。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＧ−タモキシフェンアーム単独の場合のＢＣＩ。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＨ−タモキシフェンアーム単独の場合のＲＳ。
【図９Ｉ】図９Ｉは、ＥＲ＋Ｎ０患者における全１０年遠隔再発に関する、ＢＣＩおよびＲＳの所定リスク群ならびにＩＨＣ４の事後決定されたカテゴリーリスク群の成績を示す、両アームを合わせた場合とアストロゾール（ＡＮＡ）およびタモキシフェン（ＴＡＭ）アーム単独の場合のグラフである。パネルＩ−タモキシフェンアーム単独の場合のＩＨＣ４。
【図１０】図１０は、ＥＲ＋リンパ節転移陽性患者における全１０年遠隔再発に関する所定のリスク群ンの成績を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数形も同様に含むものとする。さらに、「または」の使用は、文脈がそうではないことを明示しない限り、「および／または」を含むものとする。
【００１５】
定義
遺伝子発現「パターン」または「プロファイル」または「シグネチャー」は、転帰間を識別することができるものと相関される２つ以上の臨床転帰、癌転帰、癌再発および／または生存転帰の間の、１以上の遺伝子の相対的発現を意味する。いくつかの場合では、転帰は乳癌の転帰である。
【００１６】
「遺伝子」は、本来ＲＮＡであれタンパク質性であれ、不連続産物をコードするポリヌクレオチドである。２以上のポリヌクレオチドは不連続産物をコードすることができると考えられる。この用語には対立遺伝子、および同じ産物をコードする遺伝子の多形、または染色体の位置および正常な有糸分裂中の組換えに基づく、機能的に関連するその類似体（機能の獲得、欠損、または調節を含む）が含まれる。
【００１７】
用語「相関する」または「相関」またはその等価表現は、１以上の遺伝子の発現間と本発明に記載の方法の使用により同定される細胞のある生理状態（１以上の他の状態を除く）との間の関連を意味する。遺伝子は、より高いレベルまたはより低いレベルで発現されることがあるが、１以上の癌状態または転帰となお相関する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態である。この用語は、分子の一次構造のみを意味する。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それはまた、当技術分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１以上の天然ヌクレオチドの、類似体での置換、および非電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾を含む既知のタイプの修飾、ならびに非修飾型のポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
用語「増幅する」は、当技術分野で公知のように、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて作製することができる増幅産物の作出を意味して広義で用いられる。「増幅」は、本明細書で使用する場合、一般に、所望の配列の、特にサンプルの、複数のコピーを作製するプロセスを意味する。「複数のコピー」とは、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、必ずしも完全な配列相補性または鋳型配列との同一性を意味しない。
【００２０】
対応するとは、ある核酸分子が別の核酸分子と実質的量の配列同一性を共有することを意味する。実質的量とは、少なくとも９５％、通常には少なくとも９８％、より通常には少なくとも９９％を意味し、配列同一性は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているようにＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定される（公開されているデフォルト状態、すなわち、パラメーターｗ＝４、ｔ＝１７を使用）。ｍＲＮＡを増幅するための方法は一般に当技術分野で公知であり、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および米国特許第号６，７９４，１４１号に記載のものを含む。使用可能な別の方法は定量的ＰＣＲ（またはＱ−ＰＣＲ）である。あるいは、ＲＮＡは、当技術分野で公知の方法により、対応するｃＤＮＡとして直接標識してもよい。
【００２１】
「マイクロアレイ」は、限定されるものではないが、ガラス、プラスチック、または合成膜などの固相支持体の表面に形成された、定義された領域をそれぞれ備えた、好ましくは不連続領域の線形アレイまたは二次元アレイである。マイクロアレイ上の不連続領域の密度は、単一の固相支持体の表面上の、検出される固定化ポリヌクレオチドの総数によって決定され、好ましくは、少なくとも約５０／ｃｍ２、より好ましくは、少なくとも約１００／ｃｍ２、いっそうより好ましくは、少なくとも約５００／ｃｍ２であるが、好ましくは、約１，０００／ｃｍ２未満である。
【００２２】
好ましくは、アレイは、合計約５００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または約３０００未満の固定化ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、ＤＮＡマイクロアレイは、サンプルから増幅またはクローニングされたポリヌクレオチドにハイブリダイズさせるために用いるチップまたは他の表面上に配置されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアレイである。アレイ内のプライマーの各特定群の位置は既知であるので、サンプルポリヌクレオチドの同一性が、マイクロアレイ内の特定の位置へのそれらの結合に基づいて決定可能である。
【００２３】
本開示は、過剰発現または過少発現される遺伝子の同定に頼るものであるので、本開示の一実施形態は、サンプル細胞のｍＲＮＡ、またはその増幅もしくはクローニング形態の、特定の遺伝子配列に対してユニークなポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって発現を決定することを含む。このタイプの好ましいポリヌクレオチドは、他の遺伝子配列には見られない少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、または少なくとも約３２の連続塩基対の遺伝子配列を含む。用語「約」は、前文で使用される場合、示された数値から１の増減を意味する。他の遺伝子配列には見られない少なくとももしくは約５０、少なくとももしくは約１００、少なくとももしくは約１５０、少なくとももしくは約２００、少なくとももしくは約２５０、少なくとももしくは約３００、少なくとももしくは約３５０、または少なくとももしくは約４００塩基対の遺伝子配列のポリヌクレオチドがいっそうより好ましい。用語「約」は、前文で使用される場合、示された数値からの１０％の増減を意味する。このようなポリヌクレオチドはまた、本発明に記載の遺伝子の配列、またはそのユニークな部分とハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプローブと呼ばれることもある。好ましくは、これらの配列は、これらの遺伝子のよりコードされるｍＲＮＡ、このようなｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ、および／またはこのような配列の増幅形態の配列である。本開示の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、それらのプローブが位置しているアレイ上、他のデバイス上、または個々のスポット内に固定化される。
【００２４】
本開示の別の実施形態では、開示配列の全部または一部は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ならびに限定されるものではないが、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリアルタイムＰＣＲ、場合により、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどのその変形形態といった方法によって増幅および検出され得る。このような方法では開示配列の一部と相補的な１以上のプライマーを使用し、これらのプライマーは核酸合成をプライムするために使用される。新たに合成された核酸は場合によって標識されてもよく、直接または本開示のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出され得る。新たに合成された核酸は、本開示のポリヌクレオチド（配列を含む）と、それらのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で接触させればよい。
【００２５】
あるいは、また、本開示の別の実施形態では、遺伝子発現は、細胞サンプル中の個々の遺伝子産物（タンパク質）の１以上のエピトープに特異的な１以上の抗体の使用による、対象とする細胞サンプル中の発現タンパク質の分析により決定され得る。このような抗体は好ましくは、遺伝子産物との結合の後にそれらの容易な検出を可能とするように標識される。
【００２６】
用語「標識」は、標識された分子の存在の指標となる検出可能なシグナルを産生し得る組成物を意味する。好適な標識としては、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分などが含まれる。従って、標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的また化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【００２７】
用語「支持体」は、ビーズ、粒子、ディップスティック、繊維、フィルター、膜およびスライドガラスなどのシランまたはシリケート支持体といった従来の支持体を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「癌組織サンプル」または「癌細胞サンプル」は、対応する癌に罹患している個人から単離された組織の細胞含有サンプルを意味する。サンプルは、生検などの外科的手順を介して取り出された材料に由来してもよい。このようなサンプルは、初代単離物（培養細胞に対して）であり、当技術分野で認識されているいずれの好適な手段によって採取してもよい。いくつかの実施形態では、「サンプル」は、限定されるものではないが、掻爬または細針穿刺吸引を含む非侵襲的方法によって採取してもよい。
【００２９】
「乳房組織サンプル」または「乳房細胞サンプル」は、乳癌に罹患していることが疑われる、または乳癌を発症するリスクのある個人から単離された乳房組織または体液のサンプルを意味する。このようなサンプルは、初代単離物（培養細胞に対して）であり、限定されるものではないが、乳管洗浄、細針穿刺吸引、針生検、米国特許第６，３２８，７０９号に記載のデバイスおよび方法、または当技術分野で認識されてうる他の任意の好適な手段を含む、任意の非侵襲的手段によって採取してよい。あるいは、「サンプル」は、限定されるものではないが、生検などを含む侵襲的方法によって採取してもよい。
【００３０】
「発現」および「遺伝子発現」には、核酸材料の転写および／または翻訳が含まれる。当然のことながら、この用語はまた、そのように指定されている場合には、核酸の転写のみを指すように限定されてもよい。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「を含んでなる(comprising)」およびその同語源語は包含の意味で使用され、すなわち、「含む(including)」およびその対応する同語源語に等しい。
【００３２】
ハイブリダイゼーション、鎖の伸長などの、ある事象を起こすことを可能とする条件またはある事象が起こるのに「好適な」条件、または「好適な」条件は、そのような事象が起こることを妨げない条件である。よって、これらの条件は、その事象を可能とする、促進する、助長する、および／または助けとなる。当技術分野で公知の、本発明に記載のこのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、およびバッファー条件によって異なる。これらの条件はまた、ハイブリダイゼーション、切断、鎖の伸長または転写など、どの事象が望まれるかによって異なる。
【００３３】
配列「突然変異」は、本明細書で使用する場合、参照配列に比べての、本明細書に開示される着目する遺伝子の任意の配列の変更を意味する。配列突然変異としては、置換、欠失または挿入などの機構による一ヌクレオチド変化、または配列内の２つ以上のヌクレオチドの変更が含まれる。一塩基多型（ＳＮＰ）も本明細書で使用される配列突然変異である。本開示は遺伝子発現の相対的レベルに基づくので、本明細書に開示される遺伝子の非コード領域における突然変異も、本開示の実施においてアッセイ可能である。
【００３４】
「検出」は、遺伝子発現およびその変化の直接的および間接的検出を含む任意の検出手段を含む。例えば、「検出可能により少ない」産物が直接的または間接的に観察される場合があり、この用語はいずれの減少（検出可能なシグナルの不在を含む）も示す。同様に、「検出可能により多い」産物は、直接的に観察される場合であれ間接的に観察される場合であれ、いずれの増加も意味する。
【００３５】
評価する２つの条件（例えば、高再発リスクまたは低発現リスク）間での開示配列の発現の違いは、その２条件の間の発現のパーセントまたは変化倍率に基づく以下の用語で定義される。２条件間の違いは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００％であり得る。
【００３６】
あるいは、一方の条件から他方の条件への倍率の増加または減少は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０であり得る。
【００３７】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３８】
本発明は、ある面では、以下にさらに述べるいくつかの発見に基づくものである。第１の発見は、従来技術の中リスク分類の不明確性を避けるために、２つのカテゴリースキーム（高リスク、低リスク）がＢＣＩ分析で効果的に使用できるということである。例えば、以下の実施例２を参照。第２の発見は、線形ＢＣＩモデル（ＢＣＩ−Ｌ）がキュービックモデル（ＢＣＩ−Ｃ）よりも優れた再発リスクの予後能を有するということである。これらの発見は、治療選択肢の選択に使用することができる、癌再発などの予後情報および特定の療法に対する奏功性などの予測情報を提供するための、ＢＣＩのより簡単かつより正確な適用を可能とする。従って、ＢＣＩは、乳癌患者の６０％超を包含する５％未満の再発リスクを有する低リスク群を同定することができた（実施例２）。これにより、初期療法を受けている患者の６０％超が、再発リスクがほとんど無く長期療法を無しで済ますようになる。
【００３９】
これらの利点は、これとともに、本明細書に開示される発現パターンに関してアッセイすることにより予後および／または癌再発を決定する方法として提供される。従って、癌患者の予後および／または処置の決定にこれまで主観的解釈が用いられてきたところ、本開示は、単独で使用可能な、または生存および癌の再発を含む患者転帰のより正確な評価を提供するための主観的基準と併用可能な客観的な遺伝子発現パターンを提供する。
【００４０】
よって、いくつかの実施形態では、乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法が提供される。本方法は、（ａ）前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいて複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；および（ｂ）乳癌疾患の診断における前記複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析に基づき、被験者の癌再発リスクが低いか高いかを分類することを含んでなる。この方法では、複数の遺伝子の分析は、およそ５年のアジュバント療法を受けた後の癌再発リスクを、５年を超える転帰を有する後向きＥＲ＋乳癌患者データセット、またはその代表サンプルと比べた場合に、低リスク群において約５％未満とする。多くの実施形態では、被験者はおよそ５年のアジュバント療法を受けており、その療法後に無病である。
【００４１】
これらの方法は、低および高リスク分類のみを用いて実施することができる。別の実施形態では、中リスクカテゴリーもまた分類される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、低リスク群は、データセットの５０％超を含んでなる。他の実施形態では、低リスク群は、データセットの５５％超を含んでなる。さらなる実施形態では、低リスク群は、データセットの６０％超を含んでなる。
【００４３】
これらの方法は、例えば、５年以下、５年を超える、１０年、１０年を超えるなどの、いずれの期間の再発リスクも評価することできる。加えて、これらの方法は、遠隔再発または局所再発のリスク、または両者を評価することができる。
【００４４】
発現レベルが分析され、５％未満の再発リスクを有する低リスク群を同定可能な限り、いずれの複数の遺伝子もこれらの方法に使用できる。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子のうちの１つはＨｏｘＢ１３である。他の実施形態では、複数の遺伝子のうちの１つはＩＬ１７ＢＲである。さらなる実施形態では、ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ（Ｈ：Ｉ）の発現レベルの比が決定される。
【００４５】
さらなる実施形態では、複数の遺伝子は、ＭＧＩ遺伝子、すなわち、Ｂｕｂ  １Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ総てを含んでなる。いくつかの実施形態では、Ｂｕｂ  １Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルが決定される。これらの実施形態のいくつかでは、ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ（Ｈ：Ｉ）の発現レベルの比もまた決定される。これらの実施形態の様々な態様では、Ｂｕｂ  １Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルが合計され、ＭＧＩ指数を得るために適用されるとＨ：ＩおよびＭＧＩを連続変数として連結してＢＣＩ値とする。
【００４６】
ＢＣＩが使用される場合、ＢＣＩは、当技術分野で公知のいずれの方法によって計算してもよい。いくつかの実施形態では、ＢＣＩは、連続ＢＣＩ変数の一部としての個々の癌再発リスクを評価することによって計算され、この場合、再発リスクはＢＣＩ変数と直線的関係で増加する。
【００４７】
本発明はまた、乳癌に罹患している被験者において癌再発リスクを決定する方法を対象とする。本方法は、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ  １Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より高いＢＣＩ値がより高い癌再発リスクと相関し、より低いＢＣＩ値がより低い癌再発リスクと相関すること；ならびに
前記サンプルをＢＣＩ値に基づき、前記被験者において中リスクカテゴリーを用いずに、癌再発の低リスクまたは高リスクを示すとして分類すること
を含んでなる。
【００４８】
本開示の方法のいくつかは、ＢＣＩの成分としての、被験者の乳癌細胞におけるＨｏｘＢ１３の発現レベルを含む、特定の遺伝子の発現レベルに基づく。いくつかの実施形態では、ＨｏｘＢ１３発現対ＩＬ１７ＢＲ発現の２遺伝子比（またはＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比）が使用される（米国特許出願公開第２００５／０２３９０７９号、同第２００５／０２３９０８３号、および同第２００６／０１５４２６７号）。乳癌指数の別の実施形態では、ＨｏｘＢ１３発現対ＣＨＤＨ発現の２遺伝子比が使用される。
【００４９】
ＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ（Ｈ：Ｉ）比は、標準的な予後因子を超える臨床転帰を予測する新規なバイオマーカーの研究に基づいて発見された。癌再発を起こした患者は、そうではなかった患者と腫瘍ステージおよびグレードを一致させた。単純なＨ：Ｉ比が、アジュバントタモキシフェン療法を受けているエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌を有する患者において癌再発を予測するために好適であることが判明した。続いての研究(Ma et al., 2006; Goetz et al., 2006; Jerevall et al., 2007; Jansen et al., 2007)は、後向き臨床試験および無作為化臨床試験の両方の中で、この比が、腫瘍の悪性度の指標となることで予後能を持ち、また、タモキシフェン利益（すなわち、タモキシフェン奏効／耐性）の予測能があることをさらに示した。
【００５０】
ＢＣＩは、ＨｏｘＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ発現と組み合わせた１以上の付加的遺伝子の発現を含む。この組合せは、以下のように付加的に開示される遺伝子のうちいずれか１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ総てを伴い得る。本開示のこれらの付加的遺伝子は、Ｂｕｂ  １Ｂ("budding uninhibited by benzimidazoles I beta)またはｐ２１タンパク質活性化キナーゼ６（ＰＡＫ６）；ＣＥＮＰＡ(セントロメアタンパク質Ａ、アイソフォームａ)；ＮＥＫ２（ＮＩＭＡ関連キナーゼ２または"never in mitosis gene a"関連キナーゼ２）；ＲＡＣＧＡＰ１（Ｒａｃ  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１）；およびＲＲＭ２（リボヌクレオチドレダクターゼＭ２）をコードする。これらの５つの遺伝子単独の使用は、本明細書では分子グレード指数(Molecular Grade Index)（ＭＧＩ）とも呼ばれる。ＭＧＩを計算する方法は、例えば、以下の実施例２およびＵＳ特許公開第２０１１／０１３６６８０号に述べられている。いくつかの実施形態では、ＭＧＩは、Ｂｕｂ  １Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２の発現レベルを、各遺伝子の発現レベルの係数を用いて合計することにより計算される。これらの係数は当技術分野で公知のいずれの方法によって決定してもよい。種々の実施形態では、これらの係数は主成分分析から決定される。
【００５１】
本開示の態様は、予後情報を提供するため、および／または臨床奏功性の予測を提供するために、ＨｏｘＢ１３発現の使用に関して記載された組成物および方法を、ＩＬＩ７ＢＲとともに、上記５つの検討遺伝子のうち１以上の発現レベルと組み合わせて含む。
【００５２】
これらの５つのＭＧＩ遺伝子は細胞周期に役割を有し、ピーク発現は次のように報告されている。
2016536004.tif 000003
これらの遺伝子の属性の詳細についてはＰＣＴ特許出願第ＷＯ／２０１２／０７９０５９号を参照。
【００５３】
よって、本開示は、ある面では、遺伝子発現レベルが被験者に対して予後決定および予測決定を提供するために有用であるという発見に基づく。７つ総ての開示遺伝子の使用は、乳癌指数（ＢＣＩ）と呼ばれる。
【００５４】
実施例に示されるように、ＢＣＩは、内分泌療法、標的療法またはアロマターゼ阻害剤による処置の最大５年の初期期間中に中リスクを有する被験者を低リスクまたは高リスクのいずれかに割り付けることにより、乳癌患者における再発リスクの選りすぐれた階層化を提供する。よって、どの期間においても、３つの異なるリスク群ではなく２群の同定（早期再発に関しては中リスクと低リスクを一緒に分類し、晩期再発に関しては中リスクと高リスクを一緒に分類することによる）は、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する患者の４０％といった多くを見込み得る中リスクカテゴリーの排除を可能とするので、ＢＣＩは他の現行の遺伝子発現シグネチャーよりも有利である。いくつかの場合では、ＢＣＩは、長期アジュバント内分泌療法およびその有害な副作用なしで済ますことができる患者を同定する手段を可能とするので、晩期疾患再発の状況で適用される。
【００５５】
リンパ節の状態および腫瘍サイズなどの臨床病理因子は、より高い晩期再発リスクに関連し；しかしながら、本明細書に開示される結果は、晩期再発リスクの個別化評価を可能にし、かつ、臨床病理因子を超える予後成績に統計学的に有意な改善をもたらす精密化を表す。言い換えれば、本開示の方法は、リンパ節の状態および腫瘍サイズなどの臨床病理因子を使用せずに、または場合により前記臨床病理因子と併用して実施することができる。他の遺伝子発現に基づくアッセイ（ＥｎｄｏＰｒｅｄｉｃｔおよびＰＡＭ  ５０）は、晩期再発に関して臨床病理因子を超える予後能を有する。これらの研究はさらに、晩期疾患再発リスクの評価のための分子に基づくアッセイの臨床使用の妥当性を検証する。
【００５６】
本開示の実施において遺伝子の発現レベルを決定するためには、当技術分野で公知のいずれの方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書において同定および開示遺伝子とハイブリダイズするｍＲＮＡの検出に基づく発現が使用される。これは、限定されるものではないが、逆転写ＰＣＲ、米国特許第６，７９４，１４１号に開示されている方法、およびＲＮＡ安定化または不安定化配列の有無を検出するための方法など、当技術分野で公知のまたは等価と認識されている任意のｍＲＮＡの検出または増幅＋検出法によって容易に実施される。種々の実施形態では、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに変換される。
【００５７】
鑑別能は、個々の遺伝子の発現を関連があるとして同定することによって付与されるものであって、実際の発現レベルを決定するために使用されるアッセイの形態によるのではない。そのアッセイが「トランスクリプトーム」（ゲノム中の遺伝子の転写画分）または「プロテオーム」（ゲノム中の発現遺伝子の翻訳画分）における遺伝子の発現を定量的または定性的に表す限り、本明細書に開示される同定済みの個々の遺伝子の特徴についていずれの同定を行うアッセイも使用可能である。特徴の同定には、限定されるものではないが、コード（ＤＮＡ）、または発現（ＲＮＡ）に用いられているユニークな核酸配列が含まれ、前記遺伝子または前記遺伝子によりコードされているタンパク質に特異的なエピトープまたは前記タンパク質の活性が含まれる。必要とされるのは、癌転帰と発現アッセイにおいて使用するための適当な細胞を含有するサンプルとの間で鑑別を行うのに必要な遺伝子の同定だけである。同様に、本開示の方法では新鮮組織、新鮮冷凍組織、および固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織が使用可能であるので、細胞含有サンプルの性質は限定されない。
【００５８】
タンパク質レベルまたは活性の存在、増加、または減少の検出に基づく発現もまた、使用可能である。検出は、当技術分野で公知であり、かつ、タンパク質の検出に適当であると認識されている、任意の免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づく、血液に基づく（特に、分泌タンパク質向け）、抗体（そのタンパク質の対する自己抗体を含む）に基づく、剥離細胞（癌からの）に基づく、質量分析に基づく、および画像（標識リガンドの使用を含む）に基づく方法により実施することができる。抗体および画像に基づく方法は、癌細胞の供給源が知られていない場合に、非侵襲的手順（乳管洗浄または細針穿刺吸引など）により得られる細胞の使用による癌の決定の後の腫瘍の位置決定にさらに有用である。標識抗体またはリガンドは、患者内での癌腫の位置決定のために使用可能である。
【００５９】
発現を決定するための核酸に基づくアッセイを用いた一実施形態は、限定されるものではないが、アレイもしくはビーズなどの固相基質を含む固相支持体上への本明細書で同定された遺伝子の１以上の配列の固定化、または当技術分野で公知のビーズに基づく技術による。あるいは、当技術分野で公知の溶液に基づく発現アッセイも使用可能である。
【００６０】
１または複数の固定化遺伝子は、ポリヌクレオチドがその１または複数の遺伝子に対応するＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし得るように、その１または複数の遺伝子にユニークなまたはそうでなければ特異的なポリヌクレオチドの形態であり得る。これらのポリヌクレオチドは、１もしくは複数の遺伝子の全長またはそれらの遺伝子のより短い配列（例えば、その配列の５’または３’末端からの欠失によるなどで、当技術分野で公知の全長配列より最大１ヌクレオチド短い）であってよく、これらは、それらの１または複数の遺伝子に対応するＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションが影響を受けないように、場合により最小限の中断があってもよい（ミスマッチまたは挿入非相補的塩基対によるなど）。いくつかの場合では、使用されるポリヌクレオチドは、遺伝子の３’末端に由来し、例えば、遺伝子または発現配列のポリアデニル化シグナルまたはポリアデニル化部位由来の約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１００、または約５０ヌクレオチドである。
【００６１】
当業者ならば、同一のまたは保存された変化の領域を、他の遺伝子と比較してこれらの遺伝子のそれぞれを独自に同定する領域として特定するために、これらの遺伝子のそれぞれについて既知の発現配列のうちいずれか２つ以上をアラインすることが十分可能である。さらに、当業者ならば、発現配列うち１以上にユニークな領域を、少なくとも１つの他の発現配列に比べて１つの既知の発現配列を独自に同定する領域として特定するために、これらの遺伝子のそれぞれについて既知の発現配列のうちいずれか２つ以上をアラインすることが十分可能である。限定されない例として、ユニークな領域は、その領域が変異体の発現を同定するために使用可能なように、既知の遺伝子の１つの発現配列の変異体内にあり得る。
【００６２】
また、同じ遺伝子の配列が他の動物種からも同定され、特性決定されている。よって、当業者には、他の動物の遺伝子に対して開示遺伝子をどのようにして同定すればよいかが自明である。当業者はまた場合により、種々の動物源からの開示遺伝子の既知の配列を比較して、保存されている領域および他の遺伝子に比べてこれらの遺伝子にユニークな配列を同定することができる。
【００６３】
開示遺伝子の配列に比べて突然変異を含むポリヌクレオチドもまた、それらの突然変異の存在がなおハイブリダイゼーションを可能として検出可能なシグナルを生じる限り、使用可能である。１または複数の固定化遺伝子を用いて、それに関してサンプルの被験者（例えば、そのサンプルが得られる患者）の転帰が分かっていない、またはサンプルの被験者にすでに割り付けられている転帰の確認のための、サンプル癌細胞または乳房細胞から調製した核酸サンプルの状態を決定するために使用することができる。本開示を限定することなく、このような細胞は、ＥＲ＋乳癌を有する患者に由来し得る。固定化ポリヌクレオチドは、好適な条件下でサンプル由来の対応する核酸分子と特異的にハイブリダイズするに十分なものであることだけを要する。
【００６４】
当業者により認識されているように、上記の対応する配列のいくつかは、開示配列のユニーク性に寄与しない３’ポリＡ（または相補鎖上のポリＴ）ストレッチを含む。よって、本開示は、３’ポリＡ（またはポリＴ）ストレッチを欠く配列で実施してもよい。開示配列のユニーク性は、遺伝子の３’非翻訳部分に見られるユニークな配列を含む、開示遺伝子の核酸にのみ見られる配列の一部または全部を意味する。本開示の実施に好ましいユニークな配列は、それらのユニークな配列が一部の個人に存在する多形に特異的なものではなく多様な個人における発現を検出するのに有用となるように、３セットそれぞれのコンセンサス配列に寄与するものである。あるいは、ある個人またはある部分集団にユニークな配列を使用してもよい。好ましいユニークな配列は好ましくは、本明細書に述べられている本開示のポリヌクレオチドの長さのものである。
【００６５】
ＲＮＡ安定性の増強（発現の増強の観察をもたらす）またはＲＮＡ安定性の低下（発現の低下の観察をもたらす）を同定するための方法もまた使用可能である。これらの方法には、遺伝子の配列を含むｍＲＮＡの安定性を増強または低下させる配列の検出を含む。
【００６６】
これらの方法はまた、ｍＲＮＡ分解の増強の検出を含む。本開示のいくつかの実施形態では、上記開示配列の３’非翻訳および／または非コード領域に存在する配列を有するポリヌクレオチドが、癌細胞または乳房細胞における遺伝子配列の発現レベルを検出するために使用される。このようなポリヌクレオチドは場合により、上記開示配列のコード領域の３’部分に見られる配列を含む。
【００６７】
コード領域および３’非コード領域由来の配列の組合せを含有するポリヌクレオチドは、好ましくは、介在する異種配列無く、連続的に配置された配列を有する。
【００６８】
あるいは、本開示は、癌細胞、または乳房細胞における遺伝子配列の５’非翻訳および／または非コード領域に存在する配列を有するポリヌクレオチドを用い、それらの発現レベルを検出するために実施することができる。このようなポリヌクレオチドは場合により、コード領域の５’部分に見られる配列を含む。コードおよび５’非コード領域由来の配列の組合せを含有するポリヌクレオチドは、好ましくは、介在する異種配列無く、連続的に配置された配列を有する。本開示はまた、開示遺伝子配列のコード領域に存在する配列を用いて実施してもよい。
【００６９】
非限定ポリヌクレオチドは、少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、少なくとも約３２、少なくとも約３４、少なくとも約３６、少なくとも約３８、少なくとも約４０、少なくとも約４２、少なくとも約４４、または少なくとも約４６の連続するヌクレオチドの３’または５’非翻訳および／または非コード領域に由来する配列を含む。用語「約」は、前文で使用される場合、示された数値から１の増減を意味する。少なくとももしくは約５０、少なくとももしくは約１００、少なくとももしくは約１５０、少なくとももしくは約２００、少なくとももしくは約２５０、少なくとももしくは約３００、少なくとももしくは約３５０、または少なくとももしくは約４００の連続するヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドがいっそうより好ましい。用語「約」は、前文で使用される場合、示された数値からの１０％の増減を意味する。
【００７０】
開示のポリヌクレオチドに見られる上記のコード領域の３’または５’末端由来の配列は、それらが本来コード領域の長さに限定されないということ以外は、上記のものと同じ長さである。コード領域の３’末端は、コード領域の最大３’側半分の配列を含み得る。逆に、コード領域の５’末端は、コード領域の最大５’側半分の配列を含み得る。当然のことながら、上記の配列、またはコード領域およびその一部を含むポリヌクレオチドは、それらの全長を用いてもよい。
【００７１】
３’非翻訳および／または非コード領域由来の配列とコード領域の関連の３’末端由来の配列を組み合わせたポリヌクレオチドは、少なくともまたは約１００、少なくともまたは約１５０、少なくともまたは約２００、少なくとももしくは約２５０、少なくとももしくは約３００、少なくとももしくは約３５０、または少なくとももしくは約４００の連続するヌクレオチドであり得る。好ましくは、使用されるポリヌクレオチドは、遺伝子の３’末端に由来し、例えば、遺伝子または発現配列のポリアデニル化シグナルまたはポリアデニル化部位由来の約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１００、または約５０ヌクレオチドの範囲内である。開示遺伝子の配列に対して突然変異を含むポリヌクレオチドもまた、それらの突然変異の存在がなおハイブリダイゼーションを可能として検出可能なシグナルを生じる限り使用可能である。
【００７２】
本開示の別の実施形態では、上記開示配列の５’および／または３’末端に由来するヌクレオチドの欠失を含むポリヌクレオチドが使用可能である。欠失は、好ましくは、５’および／または３’末端由来の１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０、１５０〜１７５、または１７５〜２００ヌクレオチドものであるが、欠失の程度は本来、配列の長さおよび発現レベルの検出にそれらのポリヌクレオチドが使用できるという必要に限定されない。
【００７３】
上記開示配列の３’末端由来の、開示の他のポリヌクレオチドは、定量的ＰＣＲのプライマーおよび任意選択のプローブのものである。いくつかの実施形態では、プライマーおよびプローブは、遺伝子または発現配列のポリアデニル化シグナルまたはポリアデニル化部位由来の約３５０未満、約３００未満、約２５０未満、約２００未満、約１５０未満、約１００未満、または約５０未満のヌクレオチドの領域を増幅するものである。
【００７４】
本開示のさらに他の実施形態では、３’末端を含む上記開示配列の一部を含むポリヌクレオチドが使用可能である。このようなポリヌクレオチドは、開示配列の３’末端に由来する少なくとももしくは約５０、少なくとももしくは約１００、少なくとももしくは約１５０、少なくとももしくは約２００、少なくとももしくは約２５０、少なくとももしくは約３００、少なくとももしくは約３５０、または少なくとももしくは約４００の連続するヌクレオチドを含む。
【００７５】
本開示はまた、乳癌細胞において遺伝子発現を検出するために使用されるポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、それらの配列との組合せでは本来見られない異種配列との組合せで上記遺伝子中に見られる配列からなるより短いポリヌクレオチドを含んでなり得る。限定されない例としては、クローニングベクターに由来する、または本発明に記載の標識プローブもしくはプライマーを調製するために使用される制限断片に存在する短い配列が含まれる。
【００７６】
必要な発現レベルは、使用する遺伝子に関して本発明に記載の方法により同定されるものであり得る。さらに、本アッセイは、場合によりＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または本発明に記載の他の分析法で使用するためのサンプルからＲＮＡを調製することを含み得る。ＰＣＲ方は場合によりＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであり得る。あるいは、本アッセイは、マイクロアレイなどのアレイの使用によるか、次世代シーケンシングによるか、または当技術分野で公知の他の任意の方法により行ってもよい。場合により、癌細胞のサンプルは、前記被験者から摘出されたまたは得られた組織から切り出されたものである。本発明に記載されるように、限定されない例としてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルを含む、多様なサンプル種が使用可能である。また、本発明に記載されているように、本方法は、本明細書に開示されるサンプルにおいてＨ：Ｉ比（ＨｏｘＢ１３とＩＬ１７ＢＲの発現レベルの比）をアッセイまたは決定することを含み得る。
【００７７】
限定されない例として、ＭＧＩの５つ総ての遺伝子が、本明細書に開示されるように、ＭＧＩに関して「高リスク」である（カットオフを超える）値に相当する発現レベルを検出するために、またはＭＧＩに関して「低リスク」である（カットオフ以下である）値に相当する発現レベルを検出するためにアッセイおよび使用することができる。いくつかの場合では、ＭＧＩカットオフ閾値は０（ゼロ）であってよく、例えばこの場合には、発現レベルの測定値は、標準偏差を１として、０（ゼロ）に対して正規化される。別の実施形態では、カットオフは、０．０５または約０．０５、０．１０または約０．１０、０．１５または約０．１５、０．２０または約０．２０、０．２５または約０．２５、−０．０５または約−０．０５、−０．１０または約−０．１０、−０．１５または約−０．１５、−０．２０または約−０．２０、−０．２５または約−０．２５、−０．３０または約−０．３０、−０．３５または約−０．３５、−０．４０または約−０．４０、−０．４５または約−０．４５、−０．５０または約−０．５０、−０．５５または約−０．５５、−０．６０または約−０．６０、−０．６５または約−０．６５、−０．７０または約−０．７０、−０．７５または約−０．７５、−０．８０または約−０．８０、−０．８５または約−０．８５、−０．９０または約−０．９０、−０．９５または約−０．９５、−１．０または約−１．０、−１．１または約−１．１、−１．２または約−１．２、−１．３または約−１．３、−１．４または約−１．４、−１．５または約−１．５、−１．６または約−１．６、−１．７または約−１．７、−１．８または約−１．８、−１．９または約−１．９、−２．０または約−２．０またはそれより低い値であり得る。Ｈ：Ｉ比に関して、その決定は、Ma et al., 2004 and Ma et al., 2006に記載される通りに行うことができる。例えば、サンプルが「高リスク」（＞０．０６）または「低リスク」（０．０６）Ｈ：Ｉ比を持つかを決定するためには、０．０６の値を用いればよい。
【００７８】
従って、５つ総ての遺伝子を用いるＭＧＩの限定されない例として閾値またはカットオフ０（ゼロ）を用いると、開示の方法は、所与のサンプルに関して、０（ゼロ）を超える値に相当する「高リスクＭＧＩ」および０の値に相当する「低リスクＭＧＩ」の、２つの可能性のあるアッセイ転帰を与える。「高リスクＭＧＩ」は、当技術分野で公知の方法および標準によって定義されるグレードＩＩＩ腫瘍のリスクに類似する乳癌を含む「高リスク」癌の指標となる。「低リスクＭＧＩ」は、当技術分野で公知の方法および標準によって定義されるグレードＩ腫瘍のリスクに類似する乳癌を含む「低リスク」癌の指標となる。
【００７９】
中リスクの癌再発を決定するために使用される閾値またはカットオフは本明細書で開示されるものであってよく、またはその２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超える範囲内である。
【００８０】
限定されない例として、癌細胞は、被験者において癌を診断するために使用される術前組織学的サンプル、または生検由来のものであってよい。このような非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）を有する被験者では、現行の標準治療は手術であり、ＤＣＩＳを除去するためには根治的乳房切除術よりも乳房温存術が好ましい。この後、多く場合、術後放射線療法、場合により、タモキシフェン、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体下方調節薬（ＳＥＲＤ）、レトロゾールなどのアロマターゼ阻害剤（ＡＩ）による処置などの内分泌療法、抗ｍＴＯＲ療法（例えば、アフィニトール（登録商標）による）などの標的療法または抗ＨＥＲ２療法（例えば、ハーセプチン（登録商標））および／または当技術分野で公知の任意の化合物を用いた。
【００８１】
遺伝子発現の検出およびＢＣＩの決定は、当然のことながら、本発明に記載のいずれの好適な細胞を含有するサンプルにおいてであってもよい。本開示で使用するための細胞の限定されない例としては、被験者から新しく単離されたもの、単離後に冷凍されたもの、および固定および／または包埋されているもの、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）が含まれる。ほとんどの実施形態では、細胞は乳癌細胞などの乳房細胞である。
【００８２】
本明細書で開示されるように、ＢＣＩは、乳癌に罹患している患者において癌再発リスクを決定するために使用される。晩期再発の限定されない例としては、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法、例えば、タモキシフェンによる処置の５年後が含まれるが、４年後、３年後、または２年後もしくはそれより短い処置期間も含まれる。同様に、ＢＣＩは、上記の期間後のアナストロゾールもしくはレトロゾールなどの抗アロマターゼ療法、標的療法または抗エストロゲン作用薬療法に対する奏功性を予測するために使用してもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＤＣＩＳサンプルなどの、被験者由来の乳癌細胞を含有するサンプルに対して有利に使用することができるが、本発明に記載の方法は、任意の非浸潤性、浸潤性乳癌、例えば、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、男性乳癌、転移性乳癌、再発性乳癌、乳頭状癌腫、トリプルネガティブ乳癌、乳頭のパジェット病、乳房肉腫、髄様癌腫、腺管癌腫、粘液癌腫、化生性癌腫、腺嚢癌腫、葉状腫瘍および血管肉腫を含む任意のタイプの乳癌とともに使用することができる。
【００８４】
以下の実施例２に述べられているように、ＢＣＩを用いた再発リスクは、精度の喪失無く、中リスクカテゴリーを用いずに低リスクおよび高リスクとして分類することができる。このスキームでは、例えばＵＳ特許公開第２０１３／０２８１５０２号（例えば、その中の表２を参照）に記載されるような中分類は、５年以下（例えば、４年、３年、２年または１年）の再発リスクが分類される場合には低リスク群で分類することでき、５年を超える（例えば、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年またはそれを超える年数）の再発リスクが分類される場合には高リスク群で分類することができる。
【００８５】
ＢＣＩは、１〜１０の範囲の尺度とされ（例えば、図３、６および８参照）、中間群は約５〜６．５の間のＢＣＩスコアである。上述のように、ＢＣＩが１〜１０の範囲の尺度とされ、５年以下の再発リスクが分類される場合、中間群は低リスク群と一緒にすることができる。従って、低（＋中）リスク群と高リスク群の間のカットオフ値は、中間群が高リスク群を満たす場合、すなわち、約６．５、例えば、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３３、７．４または７．５、またはその間の任意の値である。これらの状況下でのカットオフ値は、再発リスクが決定される年数によって（年数が少ないほど高いカットオフ点が見込まれる）、また、オペレーターがどれほど内輪に見積もって患者を低いまたは高い再発リスクを有するとして示そうとするか（すなわち、その下の指数が低再発リスクである再発パーセンテージ）によって、５．５〜７．５の間であり得る。当業者ならば、過度な実験なく、所望の任意の特定の年数およびリスクレベルに関する適正なＢＣＩスコアを決定することができる。
【００８６】
同様に、ＢＣＩが１〜１０の範囲の尺度とされ、５年を超える再発リスクが分類される場合、中間群は高リスク群と一緒にすることができ、低リスク群と高（＋中間）群の間のカットオフは、中間群が低リスク群を満たす点、すなわち、約５、例えば、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、または６．０、またはその間の任意の値となる。
【００８７】
上記の具体的シナリオは、乳癌診断後のタモキシフェン、標的療法またはアロマターゼ阻害剤によるいずれかの前処置（初期処置）および／または外科的介入の後に低リスクの患者に対して、ＢＣＩ検査はさらなる全身療法の選択肢を提供しないことができることを示す。例えば、初期アジュバントタモキシフェン後に高再発リスクの患者（高ＨＯＸＢＩ３／ＴＬ１７ＢＲを有する患者）は、アロマターゼ阻害剤レトロゾールに切り替えた長期ホルモン療法から利益を受ける。これらの患者は高いＨ：Ｉ比またはＢＣＩスコアを示すと思われる。しかしながら、初期アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法の、再発リスクの高い患者は、長期アジュバントホルモン療法から、または実際にはいずれの全身療法からも利益を受ける場合あれば受けない場合もある。それらの患者はまた試験治療アプローチの候補でもあり得る。しかしながら、本開示は、それらの患者のより適正なトリアージュを助ける手段としてＢＣＩを提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、計算されたＢＣＩは低リスクまたは中リスクを示すので、計算されたＢＣＩは、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法、例えば、タモキシフェンで処置された場合の被験者において低リスク遠隔再発を示す。よって、この被験者は、最初の５年の期間、低再発リスクでアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法により処置することができる。この初期期間の後、計算されたＢＣＩが中リスクであれば、指示内容は、さらに５年の期間にアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置されない場合、被験者は癌再発が高リスクとなるというものである。
【００８９】
他の実施形態では、計算されたＢＣＩは高リスクまたは中リスクであるので、計算されたＢＣＩは、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法、例えば、タモキシフェンで処置された場合の被験者において高リスク遠隔再発を示す。よって、この被験者は、成功の期待が弱いながらアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置することができる。いくつかの場合では、被験者は、初期期間中、限定されない例として化学療法または放射線療法などの付加的療法でさらに処置してもよい。
【００９０】
本開示は、被験者を、５年以下の期間など、初期抗アロマターゼ、標的療法または内分泌療法の過程中の無再発生存期間の後に付加的療法から利益を受けると期待されるとして同定することを含む。
【００９１】
従って、本開示は、アジュバントタモキシフェン療法などの初期抗アロマターゼ療法、標的療法または内分泌療法後に、被験者における癌再発の高い見込みの指標としてのＢＣＩを決定することを含む。よって、これらの方法は、被験者を、局所癌再発または遠隔癌再発を受ける，見込みがあるまたはないとして同定することを含む。限定されない例として、長期の初期治療後療法の不在下での再発の見込みの決定は、その後最大５年またはそれを超える期間適用可能である。
【００９２】
本発明はまた、連続変数として計算されたＢＣＩの一部として、またはそれに関連して個々のリスク評価を行うことによって乳癌被験者における癌再発リスクを決定することを提供する。本明細書に開示されるように、乳癌サンプルの集団におけるＢＣＩの決定は、ＢＣＩが乳癌に罹患している被験者の癌再発リスクと相関する連続変数であることを示す。よって、再発リスクは、ＢＣＩ値の増加とともに直線的関係で増加する。いくつかの実施形態では、連続変数としてのＢＣＩ値の範囲を個々の乳癌サンプルについて決定されたＢＣＩ値と比較して、癌再発リスクを低リスク、中リスク、または高リスクとして評価する。
【００９３】
本明細書に開示される追加のまたは続いての期間の処置または療法は、第一選択（初期）療法後の、例えば、直後、第一選択療法終了後３か月以内、第一選択療法終了後６か月以内、第一選択療法終了後９か月以内、第一選択療法終了後１２か月以内、第一選択療法終了後１８か月以内、または第一選択療法終了後２４か月以内（またはそれを超える）などのいつ行ってもよい。
【００９４】
高再発リスクまたは低再発リスクを同定するための予後能は、処置コースを決定する手段となり得る情報を提供する。例えば、ＢＣＩが、その被験者（例えば、患者）が、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法、例えば、タモキシフェンで処置された場合に、高い遠隔再発リスクを有することを示す場合には、このような療法は禁忌となり、化学療法などの他の療法に置き換え可能である。
【００９５】
逆に、ＢＣＩが、その被験者が、５年以下の初期期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法、例えば、タモキシフェンで処置された場合に、低い遠隔再発リスクを有することを示す場合には、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による処置が指示され得る。
【００９６】
加えて、ＢＣＩが、さらに５年の期間、その被験者がアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置されない場合に、高い遠隔再発リスクを有することを示す場合には、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法または別のアジュバント療法による処置が指示され得る。
【００９７】
他の実施形態では、被験者は、最大５年の期間中、癌再発なく、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による処置を受けたと同定される。この被験者は次に、被験者の腫瘍のＢＣＩ値に基づき、処置の終了後に癌の高い遠隔再発リスクを有する、または有さないと分類される。被験者が高い再発リスクを有する場合には、その被験者は次に，追加の期間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置される。
【００９８】
知られているように、高いＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ指数は、アジュバント内分泌処置の利益に関して予後能があるだけでなく予測能もある。米国特許第７，５０４，２１４号およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１２／０７９０５９号参照。実施例２に述べられているように、ＢＣＩ−Ｃの奏功性予測能は、ＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ予後および内分泌処置予測の二重特性と混同される場合がある。対照的に、ＢＣＩ−Ｌは、ＭＧＩとＨＯＸＢ１３／ＴＬ１７ＢＲの相加的機能のみを含み、臨床転帰が乳癌の自然歴を表した非処置群の乳癌被験者において開発されたものである。実施例２で報告された所見は、ＢＣＩ−ＬがＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲの内分泌処置予測特性の交絡効果をなしで済ませ、結果として、ＢＣＩ−ＬはＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲとＭＧＩの組合せの好ましい予後形態であることを示唆する。
【００９９】
第２の態様において、本開示は、５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期治療後の処置、例えば、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による追加処置に対する奏功性を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、追加処置は、初期治療期間後、５年以上の期間である。
【０１００】
よって、さらなる実施形態では、本発明は、乳癌に罹患している被験者の長期処置の必要性を決定する方法を対象とする。本方法は、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値が、５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期治療後にアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法によるさらなる追加処理を必要としないことと相関すること；および
前記サンプルをＢＣＩに基づき、追加処置の必要が有ることまたは無いことを示すとして分類すること
を含んでなる。
【０１０１】
治療選択肢を提供するために、再発リスクを識別するＢＣＩの能力と処置に対する奏効を組み合わせることができる。
【０１０２】
よって、本発明はまた、乳癌に罹患している被験者を処置する方法を対象とする。本方法は、
前記被験者由来のＥＲ＋乳癌細胞のサンプルにおいてＨｏｘＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、およびＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること；
前記発現レベルを合計して乳癌指数（ＢＣＩ）値とし、より低いＢＣＩ値が、（ａ）５年以下のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による初期処置後のアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法による追加処置に対する奏功性、および（ｂ）より低い遠隔再発リスク；より遠隔再発リスクと相関すること；および
前記被験者に前記被験者のＢＣＩ値決定と一致した処置を施すこと
を含んでなる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＢＣＩ分析は、５年以下の初期期間中にアロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合の被験者において高い遠隔再発リスクを示す。このような被験者は化学療法で処置されてよい。
【０１０４】
他の実施形態では、ＢＣＩ分析は、５年以下の間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された場合の被験者において低い遠隔再発リスクを示す。このような被験者は、最初の５年の期間、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置された後、長期療法を受けなくてよい。
【０１０５】
さらなる実施形態では、ＢＣＩ分析は、さらに５年の期間中、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法で処置されない場合の被験者において高い遠隔再発リスクを示す。このような被験者は、アロマターゼ阻害剤、標的療法または内分泌療法または別のアジュバント療法で処置されてよい。上記方法はいずれも、閉経前の女性および閉経後の女性における臨床奏功性の予後因子または予測因子の決定に有用であり得る。閉経後の女性は５０歳を超える女性と定義され、閉経前の女性は５０歳未満の女性と定義され得る。いくつかの態様では、これらの女性は、抗アロマターゼ、標的療法または内分泌療法による処置を受けており、その期間、無癌を維持した。
【０１０６】
さらなる実施形態では、本開示は、夾雑細胞から切り離された、またはそうでなければ単離もしくは精製された単細胞または均質な細胞集団からブローバルな、またはグローバルに近い遺伝子発現を分析することによる、単純生検によって可能なものを超える遺伝子発現パターンの同定を提供する。多くの遺伝子の発現は異なる患者由来の細胞間で、ならびに同じ患者サンプルに由来する細胞間で変動するので、遺伝子発現のレベルは、その発現が患者の細胞でまたは患者間で比較的一定している１以上の「対照」または「標準化」遺伝子と比較して決定することができる。
【０１０７】
このアプローチの１つの利点は、夾雑する非癌細胞（例えば、浸潤リンパ球または他の免疫系細胞は、同定される遺伝子またはその後の患者の癌再発および／または生存転帰を同定するための遺伝子発現の分析に影響を及ぼす可能性があるほどには存在しない。このような夾雑は、多くの細胞種を含有する生検が遺伝子発現プロファイルのアッセイに使用される場合に存在する。
【０１０８】
本開示は主として、乳癌などのヒト癌に関して記載されるが、いずれの動物の癌に関して実施してもよい。本開示の適用に好ましい動物は哺乳動物、特に、農業適用に重要なもの（例えば、限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ウマ、および他の「農用動物」）、癌の動物モデル、およびヒト伴侶動物（例えば、限定されるものではないが、イヌおよびネコ）である。
【０１０９】
本開示より提供される方法はまた、全体的にまたは部分的に自動化可能である。
【０１１０】
キット
本開示の方法において使用するための材料は、周知の手順に従って製造されたキットの調製に適合しているのが理想的である。よって、本開示は、腫瘍グレードを分類するまたは癌転帰を決定するための開示遺伝子の発現を検出するための薬剤を含んでなるキットを提供する。このようなキットは場合により、薬剤を、本開示の方法におけるそれらの使用に関する識別記述またはラベルまたは説明とともに含んでなる。このようなキットは、例えば、既製マイクロアレイ、バッファー、適当なヌクレオチド３リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および本開示の１以上のプライマー複合体（例えば、適当な長さのポリ（Ｔ）またはＲＮＡポリメラーゼと反応製のあるプロモーターに連結されたランダムプライマー）を含む、本方法で使用される種々の試薬（一般に、濃縮形態）の１以上をそれぞれ含む容器を含んでなり得る。説明書一式もまた一般に含まれる。
【０１１１】
以下の実施例に好ましい実施形態を記載する。本明細書の特許請求の範囲内の他の実施形態は、本明細書に開示される明細または実施を考慮すれば当業者には自明である。明細は実施例とともに単に例と考えられ、本発明の範囲および趣旨は、実施例の後にある特許請求の範囲によって示されるものとする。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
試験計画および患者
前向き比較研究では、組織サンプルを、橋渡し研究を支援するためのＡＴＡＣ試験の単剤療法群に由来する、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する閉経後の患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発腫瘍ブロックの組織バンクを確立するために２００２年に開始されたＴｒａｎｓＡＴＡＣプロジェクトから得た(Paik et al., 2004; Dowsett et al., 2010)。ローカル検査に従ってエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陰性であることが分かっているもの、およびＡＴＡＣ試験の組合せ処置群に無作為に割り付けられたものを除き、２１遺伝子再発スコアおよびＩＨＣ４がすでに計算されている総ての患者の保存用腫瘍ブロックを要求した。本研究は、サウスイースト・ロンドン・リサーチ倫理委員会およびマサチューセッツ総合病院治験審査委員会によって承認されたものである。患者からは、患者の組織がさらなる治験に使用されることに関して書面による同意を得た。
【０１１３】
手順
事前に、２１遺伝子再発スコアを計算および試験するために、ＵＫ患者のＴｒａｎｓＡＴＡＣ組織バンクからのＦＦＰＥブロック（これらのサンプルは収集物の７９％を占めた）からＲＮＡを抽出する研究を行った(Paik et al., 2004)。次に、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７および腫瘍グレード評価のための免疫組織化学分析法を行い、ＩＨＣ４および臨床治療スコア（腫瘍のサイズおよびグレード、リンパ節の状態、年齢、および処置の古典的変数を用いる予後モデル）を、組織が２１遺伝子再発スコアを計算するために使用された同じ患者（これらの患者からは十分な追加組織が入手可能であった）からの組織サンプルを用いて計算した。
【０１１４】
本研究では、十分な残余ＲＮＡがある、従前の研究で使用したものと同じ適合サンプルを使用し、ＢＣＩ分析を行った。これらの遺伝子を検査し、プライマーおよびプローブ配列を分析し、従前に報告されているように（米国特許第７，９３０，１０５号および同第７，５０４，２１４号、ＵＳ特許公開第２０１１／０１３６６８０号および同第２０１３／０２８１５０２号、およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１２／０７９０５９号）、ＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲおよびＭＧＩを計算するためにＲＴ−ＰＣＲ手順を行った。所定の２つのＢＣＩモデルを試験した。これらのモデルは、変数のキュービックおよび線形組合せに基づきキュービック型（ＢＣＩ−Ｃ）と線形（ＢＣＩ−Ｌ）であった。
【０１１５】
ＢＣＩスコアは最終スコア（０〜１０）に直線的に尺度化した。群は低リスク、中リスク、および高リスクとして識別され、各モデルの所定のカットオフ点は：ＢＣＩ−Ｃ低リスク（＜５．０点）、ＢＣＩ−Ｃ中リスク（５．０〜６．４）、およびＢＣＩ−Ｃ高リスク（＞６．４）；およびＢＣＩ−Ｌ低リスク（＜５．０８２５点）、ＢＣＩ−Ｌ中リスク（５．０８２５〜６．５０２５）、およびＢＣＩ−Ｌ高リスク（＞６．５０２５）であった。２１遺伝子再発コア(21-gene recurrence core)リスク群は、従前に報告されているように同定した(Paik et al., 2004)。３つのＩＨＣ４リスク群は、ＴｒａｎｓＡＴＡＣコホートにおいてそれぞれ１０％および２０％の１０年遠隔再発率に相当する２つのカットオフ点を用いて確立した（すなわち＜１０％、＞１０％〜２０％、および＞２０％）。ＩＨＣ４カットオフは、独立に妥当性評価が行われていない。
【０１１６】
遠隔再発は、反対側性疾患、局所領域再発および同側性再発、ならびに他の二次的な原発性癌を除く、遠隔器官における総ての再発を指す一次エンドポイントとして前向きに定義した。また、局所領域再発の後に遠隔再発の時点で一事象として起こった遠隔再発も含めた。遠隔再発前に死亡した患者は場外した。全再発、乳癌により死亡、および全生存期間（原因によらず死亡するまでの期間）を二次エンドポイントと定義した。一次分析集団はエストロゲン受容体陽性、Ｎ０乳癌を有する患者であり、二次分析集団は、エストロゲン受容体陽性、Ｎ０、ＨＥＲ２陰性乳癌を有する患者、およびエストロゲン受容体陽性、リンパ節転移陽性乳癌を有する患者を含んだ。一次研究目標は、エストロゲン受容体陽性、Ｎ０乳癌を有する患者における遠隔再発に関するＢＣＩ−Ｃモデルの全体的な（０〜１０年）予後能の評価と前向きに定義された。二次的な目標は、ＢＣＩ−Ｌモデルとその成分、ＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲおよびＭＧＩの予後能を全体（０〜１０年）、早期（０〜５年）、および晩期（５〜１０年）遠隔再発に関して評価すること、ならびにＢＣＩ−Ｌの能力を再発スコアおよびＩＨＣ４の能力と比較することであった。
【０１１７】
統計分析
統計分析プランは、試験開始前にＡＴＡＣおよびＬＡＴＩＥ（長期アナストロゾール対タモキシフェン処置効果(Long-term Anastrozole versus Tamoxifen Treatment Effects)）治験の運営委員会により承認された。早期遠隔再発は、診断５年後の全患者の経過観察の打切りにより評価した。晩期遠隔再発は、その早期再発の予後効果が除かれた後に遺伝子シグネチャーが予後能を維持していたかどうかを評価するために、少なくとも５年間，無遠隔再発で留まった患者のサブセット内で評価した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルに基づく尤度比検定を用い、臨床治療スコアに基づく減法比例ハザードモデル(reduced proportional hazards model)と、ＢＣＩ、２１遺伝子再発コア(21-gene recurrence core)、またはＩＨＣ４を含む全比例ハザードモデルの間の有意差に関して検定した。予測の改善は、臨床治療スコアに比較してタイル遺伝子シグネチャーにより比例ハザードモデルに加えられた情報量を評価する尤度比χ２（ＬＲ−Δχ２）値の変化によって定量した。ＩＨＣ４はＴｒａｎｓＡＴＡＣサンプルのサブセットにおいて開発されたものであり、潜在的な過剰充填に関して補正を行うために、従前に記載の通りにサンプル分割を行った。カプラン−マイヤー生存分析を用いて、ＢＣＩの３つの所定のリスク群において遠隔再発を有する患者の割合をグラフ表示し、それらの曲線の質をログランク検定で検定した。
【０１１８】
遠隔再発リスクを、全体（０〜１０年）、早期（０〜５年）、および晩期（５〜１０年）遠隔再発に関してＣｏｘ比例ハザードモデルから得られた線形共変量としてのＢＣＩの関数として計算した。ＢＣＩ、２１遺伝子再発スコア、およびＩＨＣ４を比較するために、四分位数ハザード比（ＨＲ）を、バイオマーカーの連続スコアの７５パーセンタイル対２５パーセンタイルとＣｏｘ比例ハザードモデルからの関連の９５％ＣＩを比較することにより評価した。０．０５未満の両側ｐ値を統計的に有意と見なした。再発スコアはＴｒａｎｓＡＴＡＣにおいてすでに検討され、これらの患者のサブセットにおいてＩＨＣ４が開発されていたことから、連続スコアとしての２１遺伝子再発スコアおよびＩＨＣ４の能力はすでに指定されたものであり、いずれの多重検定補正も行われなかった。統計分析はＳＴＡＴＡバージョン１２．１を用いて行った。
【０１１９】
実施例２
患者およびサンプル
２１遺伝子再発スコア、ＩＨＣ４、およびＢＣＩを用いた値を９１５名（そのうち６６５名はエストロゲン受容体陽性、Ｎ０乳癌）の女性に関して計算した（図１）。これら６６５名の患者の臨床的特徴を表２に示し、ＡＴＡＣ試験に参加したがＴｒａｎｓＡＴＡＣには属していなかったエストロゲン受容体陽性、Ｎ０乳癌を有する５６１名のＵＫ患者の特徴と比較する。非ＴｒａｎｓＡＴＡＣコホートでＴｒａｎｓＡＴＡＣ患者よりも有意に十分に分化した腫瘍が多く、分化度の低い腫瘍が少なく、晩期遠隔再発が有意に少なかったこと以外は、これらの２つの群の間に有意差はなかった。
【０１２０】
【表１】
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ＢＣＩ  ＴｒａｎｓＡＴＡＣコホートのＮ０女性の中には、乳房切除後の７２名の遠隔再発および７名の局所再発を含む１０６名の再発があった。ＢＣＩ  ＴｒａｎｓＡＴＡＣコホートの経過観察期間中央値は９．９７年（ＩＱＲ８．５〜１０）であった。
【０１２１】
Ｈ／ＩおよびＭＧＩの計算
一般に、また、ＭＧＩに関して、開示遺伝子の発現レベルを合わせて、強力な予後因子および臨床転帰の予測因子として役立つ単一の指数とすることが好ましい。この指数は使用した遺伝子の発現レベルの総和であり、２つ以上の開示遺伝子の各場合を合わせて単一の指数とするために、主成分分析（ＰＣＡ）から決定された係数を用いる。これらの係数は、代表データセットの各遺伝子の発現レベルの標準偏差、および各サンプルの各遺伝子の発現値などの因子によって決定される。代表データセットは、本明細書に開示されている参照遺伝子の平均発現値に基づいて品質管理される。
【０１２２】
言い換えれば、例えば、マイクロアレイ、次世代シーケンシングまたはＲＴ−ＰＣＲからこれらの５つの遺伝子の正規化された発現レベルを、各データセット内のサンプルで平均値０および標準偏差１に標準化した後、第１の主成分を用いるＰＣＡにより各サンプルについて合わせ、単一の指数とした。異なるプラットフォーム（マイクロアレイ、シーケンシングおよびｒｔＰＣＲ）およびサンプルタイプ（冷凍およびＦＦＰＥ）を考慮するためには、各データセット内の一次発現データの標準化が必要であった。結果として、また、スケーリングパラメーターに従い、指数を定義する発現値の総和を求める式が作成される。次に、スケーリングパラメーターの精度は、データセットの遺伝子の発現レベルの平均値、標準誤差、および標準偏差（信頼区間を持つ）に基づいて検定することができる。よって、この指数のための式の作成は、データセット、参照遺伝子、およびＭＧＩの遺伝子に依存する。
【０１２３】
ＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比は、従前に記載されているように(Ma et al., 2006)、ＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲの間の、標準化した発現レベルの違いとして計算した。表２のコホートを標準化するために用いたＨＯＸＢ１３およびＩＬ１７ＢＲの平均値および標準偏差は、エストロゲン受容体陽性、リンパ節転移陰性乳癌患者の別集団に基づくコホートからの１９０のＦＦＰＥ組織切片の分析から導くことができる。
【０１２４】
ＭＧＩでは、明らかに異常な生のＣＴ値を、各遺伝子および各サンプルについて２反復の値の平均を求める前に除いた。次に、各遺伝子に関して平均をとった生ＣＴ値を、４つの参照遺伝子（ＡＣＴＢ、ＨＭＢＳ、ＳＤＨＡ、およびＵＢＣ）の平均ＣＴ値により正規化した。正規化発現レベル（ＣＴ）を０などの所定のカットオフ値と比較し、高いＭＧＩはカットオフを超え、低ＭＧＩはカットオフより小さい。
【０１２５】
乳癌指数（ＢＣＩ）
ＢＣＩは、Ｈ：ＩおよびＭＧＩを連続変数として連結することにより構築される。これらの２変数の直線性を、制限キュービックスプラインを備えたＣｏｘ比例ハザード回帰モデルの当てはめを行うことにより確認したところ、Ｈ：Ｉは有意な非直線性を示した。赤池情報量規準を用いた制限モデルを近似されるためにＨ：Ｉの多項式関数を用いた。最終的なＣｏｘ回帰モデルから得られた予測因子を次に０〜１０の範囲に尺度化し直し、これがＢＣＩと呼ばれる。
【０１２６】
ＢＣＩは、本発明に記載のように低リスク、中リスク、および高リスクの３つのレベルにさらに分類される。
【０１２７】
Ｈ／Ｉカットポイント：  本試験では、アジュバントタモキシフェンにより処置された患者を低再発リスクおよび高再発リスクに階層化するために従前に定義されたＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比に関する０．０６のカットポイントを使用した。
【０１２８】
６６５名のエストロゲン受容体陽性、Ｎ０患者において、ＢＣＩ−Ｃモデルのカプラン−マイヤー分析は、腫瘍のサイズおよびグレード、年齢、および処置の効果（臨床治療スコアで決定；図２Ａ参照）に関しての補正後に、所定のカテゴリーＢＣＩ−Ｃリスク群間で１０年の期間の絶対的遠隔再発に有意差を示し（ｐ＜０．００１）、また、低リスク群と他のリスク群の間でＨＲに違いを示した。定義されたカットオフを有するサブグループとしてではなく連続変数として分析したＢＣＩ−Ｃは、臨床治療スコアに関して補正した場合の全（０〜１０年）遠隔再発リスクと有意な関連が無かった（四分位間ＨＲ１．３９；ＬＲ−Δχ２＝３．７０；ｐ＝０．０５４）。
【０１２９】
同じ患者集団におけるＢＣＩ−Ｌの評価は、このバージョンは、臨床治療スコアに関して補正した場合のＢＣＩ−Ｃよりも全遠隔再発リスクとはるかに強い関連があった（四分位間ＨＲ２．３０；ＬＲ−Δχ２＝２２．６９；ｐ＜０．０００１：表２）。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
カプラン−マイヤー曲線は、所定のＢＣＩ−Ｌリスク群に従って絶対的遠隔再発率に明らかな違いを示す（ｐ＜０．００１；図２Ｂ）。全１０年遠隔再発リスクはＢＣＩ−Ｌの増加とともに直線的に増加した（図３）。
【０１３２】
５９７名の患者のＨＥＲ２陰性、Ｎ０サブセットでは、ＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌの両方が全遠隔再発リスクと有意に関連していた（ＢＣＩ−Ｃ四分位間ＨＲ１．６５、ＬＲ−Δχ２＝６．６１、ｐ＝０．０００１；ＢＣＩ−Ｌ四分位間ＨＲ２．４９、ＬＲ−Δχ２ ＝２１．９、ｐ＜０．０００１；表２）。両形態のＢＣＩに関する所定群のカプラン−マイヤー曲線は、絶対的遠隔再発に明瞭な違いを示した（図４Ａ−ＢＣＩ−Ｃ；４Ｂ−ＢＣＩ−Ｌ）。
【０１３３】
ＢＣＩ−ＬとＢＣＩ−Ｃの予後能を比較したところ、ＢＣＩ−Ｃとは異なり、ＢＣＩ−Ｌは続変数としてもカテゴリー変数としても再発リスクの有意な予測因子であり、臨床治療スコアに関する補正後のＨＲは、ＢＣＩ−ＣおよびＢＣＩ−Ｌの高リスク群と低リスク群の間でそれぞれ２．１９と４．８６であった。続いての以下の考察では線形モデル（ここではＢＣＩと呼ぶ）を用いる。
【０１３４】
ＢＣＩに基づく群
ＢＣＩは、臨床治療スコアに関して補正した場合、早期（０〜５年）遠隔再発リスクと有意な関連があった（表３）。カプラン−マイヤー曲線（図５Ａ）は、５年の絶対的遠隔再発率に違いを示した。３つのリスク群が事前に指定されたが、所定のカプラン−マイヤー分析からの結果は、低リスク患者と中リスク患者が同等の遠隔再発率を持っていたこと、および高リスク患者群とが明瞭に異なる一群を構成していることを示した。
【０１３５】
事後カプラン−マイヤー分析は、ＢＣＩ低リスク群と中リスク群の間で５年遠隔再発にほとんど違いを示さず、これらは６６５名のうち５５６名（８４％）の患者（ＰＩ）を含み、合わせた５年遠隔再発率は２〜６％であった（表３）。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
６６５名の患者のうち１０９名（１６％）を含んだＢＣＩ高リスク群（Ｐ２）の５年遠隔再発率は１８．１％であった。臨床治療スコアに関して補正した場合、ＰＩとＰ２の間のＨＲは４．６１であった。
【０１３８】
晩期（５〜１０年）再発では、ＢＣＩは、臨床治療スコアに関して補正した場合、遠隔再発リスクと有意に関連していた（表２）。カプラン−マイヤー曲線は、ＢＣＩ低リスク群、中リスク群、および高リスク群に関して、５〜１０年の絶対的遠隔再発率に違いを示した（図５Ｂ）。所定のカプラン−マイヤー分析からの結果は、中リスク患者と高リスク患者は極めて類似した再発率を持ち、低リスク患者の集団とは明瞭に異なった一集団を構成することを示した。さらなる事後カプラン−マイヤー分析（表３）は、ＢＣＩ低リスク群（Ｐ３）の５〜１０年遠隔再発率が３．５％であり、１３．４％の再発率であるＢＣＩ中リスク群と高リスク群を合わせたもの（Ｐ４）とは実質的に異なっていることを示した。臨床治療スコアに関して補正すると、Ｐ３とＰ４の間のＨＲは２．９４であった。遠隔再発リスクは、早期再発と晩期再発の両方に関して、ＢＣＩ値の増加とともに直線的に増加した（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１３９】
ＨＥＲ２の状態
エストロゲン受容体陽性、ＨＥＲ２陽性乳癌の自然歴はエストロゲン受容体陽性、ＨＥＲ２陰性乳癌の場合と異なっているので、全Ｎ０エストロゲン受容体陽性ＴｒａｎｓＡＴＡＣコホートにおけるＢＣＩの予後能が、ＨＥＲ２陽性患者のサブセットの包含によって過度に影響を受けたかどうかを評価するためにサブセット分析を行った。５９７名の患者（全供試研究群の９０％）のＨＥＲ２陰性Ｎ０サブセットにおいて、ＢＣＩは早期遠隔再発および晩期遠隔再発のリスクに有意に関連しているとともに（表２）、ＢＣＩリスク群による絶対的遠隔再発に明瞭な違いがあった（図７）。早期再発と晩期再発の両方に関して、遠隔再発リスクはＢＣＩ値の増加とともに増加した（図８）。
【０１４０】
アロマターゼ阻害剤および内分泌療法
全患者の２１遺伝子再発コア(21-gene recurrence core)およびＩＨＣ４リスク群の全（０〜１０年）遠隔再発のカプラン−マイヤー曲線を、処置群（アナストロゾールまたはタモキシフェン）に従って別々に図９に示す。合わせた全患者（すなわち、アナストロゾールまたはタモキシフェンのいずれかを受容した患者）について、ＢＣＩ低リスク群は、２１遺伝子再発スコア低リスク群（６．５％）およびＩＨＣ４低リスク群（６．２％）に比べて、１０年遠隔再発を有する患者の割合が最小であり（４．８％）、ＢＣＩ高リスク群は、２１遺伝子再発スコア高リスク群（２７．１％）およびＩＨＣ４高リスク群（２１．８％；図９）に比べて、遠隔再発の割合が最高であった（２９．０％）。
【０１４１】
加えて、図９Ｄ〜９Ｆに示されるように、ＢＣＩは、高リスクアナストロゾール群と低リスクアナストロゾール群の間の遠隔再発リスクを、２１遺伝子およびＩＨＣ４システムよりもはるかに良好に階層化し、これはＢＣＩがその高リスク群において最高の再発％（２１．６％対１３．５％および１５．６％）を有し、また、その低リスク群において最低の再発％（４．８％対９．４％および８．０％）を有していたためである。
【０１４２】
他の評価との比較
尤度比ＬＲ−Δχ２値の変化を用い、ＩＨＣ４および２１遺伝子再発スコアによるＢＣＩの直接的１対１比較を行った。各バイオマーカーの相対的予後能は遠隔再発時間枠によって異なった（表２）。早期再発では、ＢＣＩ、ＩＨＣ４、および２１遺伝子再発スコアは、単変量分析と多変量分析の両方で遠隔再発に関して総て予後能があった（表２）。全Ｎ０患者では、ＩＨＣ４は、臨床治療スコアに関する補正の後に再発スコアおよびＢＣＩよりも予後能が高かった。しかしながら、Ｎ０  ＨＥＲ２陰性患者では、ＢＣＩおよびＩＨＣ４は同等の予後能を持ち、これは両方とも臨床治療スコアに関する補正の後に２１遺伝子再発スコアの予後能よりも良好であった（表２）。晩期再発の多変量分析では、ＢＣＩだけが全Ｎ０およびＮ０  ＨＥＲ２陰性患者において強い予後能を維持しており、ＩＨＣ４および２１遺伝子再発スコアはともにいずれの集団においても予後能は無かった（表２）。エンドポイントとして全再発、乳癌死亡、および全生存期間を考える場合にも同様の結果が示された（表４）。
【０１４３】
【表４】
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2016536004.tif 000010
【０１４４】
リンパ節転移陽性乳癌
これらの実施例の一次分析はＮ０患者を中心としたが、リンパ節転移陽性患者の分析は、ＢＣＩがこれらの患者における遠隔再発にも予後能があったことを示した（ログランクｐ＝０．００４５；図１０）。さらに、比較分析は、Ｎ０サブセットでシメされたものよりもロバスト性は低いものの、ＢＣＩ、ＩＨＣ４、および２１遺伝子再発スコアは、この患者集団において極めて類似した予後能を持っていたことを示した（表５）。
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
表５は、癌再発に関する多変量分析を示す。
【０１４７】
上記によって示されたように、ＢＣＩは、５年のタモキシフェン処置後のＥＲ＋患者において晩期癌再発の予後能がある。ＨｏｘＢ１３発現もまた、５年のタモキシフェン処置後のＥＲ＋患者において晩期癌再発の予後能がある。
【０１４８】
参照文献
Cuzick et al., Lancet Oncol. 11:1135-1141 (2010).
Cuzick et al., J. Clin. Oncol. 29:4273-4278 (2011).
Dowsett et al., J. Clin. Oncol. 28:1829-1834 (2010).
Goetz et al., Clin Cancer Res. 12:2080-7 (2006).
Jansen et al., J. Clin. Oncol. 25:662-8 (2007).
Jerevall et al., Breast Cancer Res.Treat (2007).
Ma et al., Cancer Cell, 5:607-16 (2004).
Ma et al., J. Clin. Oncol., 24:4611-9 (2006).
Paik et al., N. Engl. J. Med. 351:2817-26 (2004).
Sgroi, et al., Proc SABVS; Abstract S1-9 (2012).
米国特許第６，２９１，１７０号
米国特許第６，７９４，１４１号
米国特許第７，９３０，１０５号
米国特許第７，５０４，２１４号
米国特許出願公開第２００５／０２３９０７９号
米国特許出願公開第２００５／０２３９０８３号
米国特許出願公開第２００６／０１５４２６７号
米国特許出願公開第２０１１／０１３６６８０号
米国特許出願公開第２０１３／０２８１５０２号
ＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１２／０７９０５９号
【０１４９】
上記を考慮すれば、本発明のいくつかの目的が達成され、他の利点も達成されると思われる。
【０１５０】
本発明の範囲から逸脱することなく上記の方法および組成物に種々の変更を行うことができるので、上記に含まれ、添付図面に示される総ての事項が例示であって限定の意味ではないと解釈されるべきであることが意図される。
【０１５１】
本明細書に引用されている総ての参照文献は、引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書の参照文献の記述は、著者らによって行われる主張の単に概略を述べることが意図され、参照文献が従来技術を構成することを何ら承認するものではない。さらに、それらの引例は、関連の開示の検索を示すものではない。出願者は引用されている参照文献の正確性および適切性に疑問を呈する権利を有する。
【図１】
2016536004.tif 000012
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2016536004.tif 000026
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2016536004.tif 000028
【図９Ｄ】
2016536004.tif 000029
【図９Ｅ】
2016536004.tif 000030
【図９Ｆ】
2016536004.tif 000031
【図９Ｇ】
2016536004.tif 000032
【図９Ｈ】
2016536004.tif 000033
【図９Ｉ】
2016536004.tif 000034
【図１０】
2016536004.tif 000035
【国際調査報告】
2016536004.tif 000036
2016536004.tif 000037