(57)【要約】ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する疾患について、対象を治療する方法。該方法は、対象において、リガンドＣＸＣＬ１７による受容体ＣＸＣＲ８の活性化を阻害することを含む。該方法において、阻害は、ＣＸＣＬ１７がＣＸＣＲ８に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含む。ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７に関与するスクリーニング方法、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びワクチンも提供される。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１７（ＣＸＣＬ１７）による受容体ＣＸＣＲ８の活性化を阻害することを含む、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体８（ＣＸＣＲ８）シグナル伝達の増加と関連する障害について対象を治療する方法。
【請求項２】
前記阻害が、ＣＸＣＬ１７がＣＸＣＲ８に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が、肺、消化器又は生殖系炎症性疾患である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症性疾患が、クローン病（ＣＤ）、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、潰瘍、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病（ｃｅｌｉａｃｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、気管支肺異形成症、特発性肺線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、気管支炎、肺気腫、無症候性間質性肺疾患（無症候性ＩＬＤ）、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、子宮内膜症、平滑筋腫、腺筋症、細菌性膣症、又は尿道の感染若しくは炎症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記物質が、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する抗体、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する小分子、又はＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合するアプタマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記障害が、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害であり、前記物質がＣＸＣＬ１７のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、
ａ）ＣＸＣＲ８と結合する抗体又はその断片；
ｂ）ＣＸＣＬ１７変異体；又は
ｃ）小分子化合物
から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する前記胃腸障害が：
ａ）クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病；
ｂ）胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、又は肝細胞がん、食堂がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、胃腸間質性腫瘍；
ｃ）自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の（非自己免疫性）肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肝線維症；並びに
ｄ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が媒介する肝硬変、及びヘリコバクターピロリが原因の消化管潰瘍
からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する前記代謝障害が、１型糖尿病又は２型糖尿病である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍障害が、白血病又はリンパ腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記白血病又はリンパ腫がＣＸＣＲ８を発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍障害が、膠芽腫又は関連脳腫瘍である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する前記呼吸系障害が：
ａ）小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん、又は中皮腫（悪性）；
ｂ）特発性肺線維症、過敏性肺炎、若しくは非特異的間質性肺炎；
ｃ）自己免疫疾患様関節リウマチ、若しくは強皮症を含む間質性肺疾患と関連する呼吸器疾患；
ｄ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、喘息；及び
ｅ）他の呼吸器がん
からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
他の呼吸系がんが、気管がん、喉頭のがん、気管支のがん、鼻腔／副鼻腔がんである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が：
ａ）局所投与、局所性投与、若しくは全身投与；
ｂ）エアロゾル若しくはミストとしての吸入；又は
ｃ）他の治療法との組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
対象において上昇した血圧を媒介させる方法であって、適当量のＣＸＣＲ８アゴニストを投与して前記血圧を媒介させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記上昇した血圧が高血圧である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アゴニストが：
ａ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１７；
ｂ）ヒトＣＸＣＬ１７のポリペプチド変異体；及び
ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体
からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
アテローム性動脈硬化症又は多発性硬化症を治療又は予防する方法であって、
ａ）ＣＸＣＲ８アンタゴニスト；若しくはＣＸＣＲ８発現の阻害剤；又は
ｂ）ＣＸＣＬ１７アンタゴニスト；若しくはＣＸＣＬ１７発現の阻害剤
の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記ＣＸＣＲ８アンタゴニストが：
ａ）ＣＸＣＲ８又はＣＸＣＲ８変異体と結合する抗体；
ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；
ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；
ｄ）小分子アンタゴニスト候補；及び
ｅ）アプタマー
からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＸＣＲ８発現の阻害剤が、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＸＣＬ１７アンタゴニストが：
ａ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＬ１７変異体と結合する抗体；
ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；
ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；
ｄ）小分子アンタゴニスト；及び
ｅ）アプタマー
からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＸＣＬ１７発現の阻害剤が、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、アテローム性動脈硬化症の治療又は予防法である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、多発性硬化症の治療又は予防法である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトの疾患の原因に関与する細胞のマーカーとしてＣＸＣＲ８を同定する方法であって、前記疾患が、胃腸障害、代謝疾患、若しくは呼吸器疾患、又はがんである、前記方法。
【請求項２８】
前記ＣＸＣＲ８が、白血病、リンパ腫、胃がん、結腸直腸がん、若しくは膵臓がんの転移細胞のマーカーであるか、又は無症候性間質性肺疾患（無症候性間質性ＩＬＤ）のバイオマーカーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＸＣＲ８が、小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん又は悪性中皮腫の転移細胞のバイオマーカーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＸＣＲ８が、消化器がん、又は呼吸器系がんに浸潤する細胞の予後バイオマーカーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
受容体ＣＸＣＲ８とリガンドＣＸＣＬ１７との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
ＣＸＣＲ８を発現する細胞にＣＸＣＬ１７を添加すること、及び
前記物質の存在下、細胞中でのＣＸＣＲ８シグナル伝達の減少を測定することを含む、前記方法。
【請求項３２】
前記物質が、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する抗体、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する小分子、又はＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合するアプタマーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
受容体ＣＸＣＲ８とリガンドＣＸＣＬ１７との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
ＣＸＣＲ８にＣＸＣＬ１７を添加すること、及び
前記物質の存在下、ＣＸＣＬ１７のＣＸＣＲ８への結合の減少を測定することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記物質が、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する抗体、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体、ＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合する小分子、又はＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８と結合するアプタマーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）ＣＸＣＲ８をＣＸＣＬ１７アンタゴニストと：
ｂ）ＣＸＣＬ１７を遮断薬と；又は
ｃ）ＣＸＣＲ８を発現する細胞を細胞シグナル伝達の遮断薬と
接触させることを含む、ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７シグナル伝達の阻害方法。
【請求項３６】
前記ＣＸＣＬ１７アンタゴニストが：
ａ）ＣＸＣＲ８又はＣＸＣＲ８変異体と結合する抗体又はその断片；
ｂ）ＣＸＣＬ１７変異体；及び
ｃ）小分子化合物
からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遮断薬が：
ａ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＬ１７変異体と結合する抗体又はその断片；
ｂ）ＣＸＣＲ８受容体断片、及び
ｃ）小分子化合物
からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞シグナル伝達の遮断薬が：
ａ）シグナル伝達経路メンバーのＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物；  
ｂ）シグナル伝達経路を遮断する抗体；又は
ｃ）シグナル伝達経路の小分子遮断薬である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３５の前記ＣＸＣＬ１７アンタゴニストのスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）又は関連検出器を含む細胞をベースとするアッセイを含む、前記方法。
【請求項４０】
前記スクリーニングが、
ａ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＬ１７変異体と結合する抗体；
ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；
ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；
ｄ）小分子アンタゴニスト候補；又は
ｅ）アプタマーライブラリー
を含む１種以上の化合物で行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３５の前記遮断薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）又は関連検出器を含む細胞をベースとするアッセイを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記スクリーニングが、
ａ）ＣＸＣＲ８又はＣＸＣＲ８変異体と結合する抗体；
ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；
ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；
ｄ）小分子アンタゴニスト候補；又は
ｅ）アプタマーライブラリー
を含む１種以上の化合物で行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｂａ／Ｆ３細胞株のＣＸＣＲ８形質転換体が、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＸＣＲ８の発現を阻害するＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を使用してＣＸＣＲ８受容体を減少させることを含む、ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７の阻害方法。
【請求項４５】
ＣＸＣＬ１７の発現を阻害するＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を使用してＣＸＣＬ１７を減少させることを含む、ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７の阻害方法。
【請求項４６】
ＣＸＣＲ８シグナル伝達の誘発方法であって、前記受容体を、その同族リガンドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記同族リガンドがＣＸＣＬ１７又はそのアゴニストである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アゴニストが、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、又はＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗−ＣＸＣＲ８抗体を、末梢血単核細胞調製物と混合すること、及び前記抗体によりＣＸＣＲ８陽性細胞を分離することを含む、ＣＸＣＲ８発現細胞の分離方法。
【請求項５０】
前記抗−ＣＸＣＲ８抗体が、モノクローナル抗体、中和抗体、若しくはヒト化抗体、又はそれらの組み合わせである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記分離が蛍光標識細胞分取による、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記分離が磁気ビーズ分離による、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＣＸＣＲ８受容体と選択的に結合する、ＣＸＣＲ８のリガンド。
【請求項５４】
前記リガンドが：
ａ）前記受容体を介してシグナル伝達し；
ｂ）ヒトＣＸＣＬ１７の９０％未満をシグナル伝達し；
ｃ）ＣＸＣＲ８のインバースアゴニストであり；
ｄ）ＣＸＣＲ８のアロステリック調節因子であり；
ｅ）ヒトＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体であり；
ｆ）ヒトＣＸＣＬ１７と少なくとも９７％の同一性を示す少なくとも１７個のアミノ酸部分を含み；又は
ｇ）霊長類のＣＸＣＲ８受容体と結合する、請求項５３に記載のリガンド。
【請求項５５】
前記リガンドが：
ａ）無菌組成物中にあり；
ｂ）全身投与用に製剤化され；
ｃ）治療用組成物中にあり；
ｄ）単回投与容器中にあり；又は
ｅ）ヒトＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体である、請求項５３に記載のリガンド。
【請求項５６】
請求項５３に記載のリガンドと選択的に結合し：
ａ）前記ＣＸＣＲ８受容体との結合を阻害し；又は
ｂ）ＣＸＣＲ８受容体によるシグナル伝達を阻害する抗体。
【請求項５７】
ＣＸＣＲ８である、ヒトＣＸＣＬ１７の受容体。
【請求項５８】
前記受容体が：
ａ）前記ヒトＣＸＣＬ１７の結合により更にシグナル伝達し；
ｂ）ＣＸＣＬ１７の結合により、ヒトＣＸＣＲ８と比較して少なくとも８０％のシグナルをシグナル伝達し；
ｃ）ヒトＣＸＣＲ８と少なくとも９５％の同一性を有し；又は
ｄ）霊長類のＣＸＣＬ１７と結合する、請求項５７に記載の受容体。
【請求項５９】
ＣＸＣＬ１７アゴニスト、又はＣＸＣＲ８の正のアロステリック調節因子を含むワクチン。
【請求項６０】
ヒトワクチン又は非ヒトワクチンにおいて、抗原を対象とする、請求項５９に記載のワクチン。
【請求項６１】
ワクチンが、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、ＤＰＴ、他のヒトワクチンである、請求項６０に記載のワクチン。
【請求項６２】
前記ワクチンが、腫瘍関連抗原、分散性白血病（ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）又はリンパ腫に対するワクチンである、請求項５９に記載のワクチン。
【請求項６３】
前記腫瘍が、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、又は膠芽腫由来である、請求項６２に記載のワクチン。
【請求項６４】
請求項５９に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔連邦政府によって後援を受けた研究又は開発に関する記載〕
本発明は、米国国立衛生研究所からの政府の支援（交付番号Ｒ０１−ＡＩ０９３５４８）により、なされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有するものである。
【０００２】
配列表に対する言及
２０１４年９月３０日に作成された、「１２７９５８８ＳＥＱＬＩＳＴ」と名付けられ、５１キロバイトの大きさを有するＡＳＣＩＩテキストファイルとして、配列表が本明細書に提出される。配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
技術分野
本発明は、ケモカインＣＸＣＬ１７、及びその受容体ＣＸＣＲ８／ＧＰＲ３５に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトケモカインスーパーファミリーは、約４８個のリガンドと、１９個の既知の受容体を含む。大部分のリガンドの受容体は同定されたが、一部はまだ「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」のままである（１）。ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１７（ＣＸＣＬ１７）は、発見された最新のケモカインリガンドである（２）。本発明者らは、ＣＸＣＬ１７が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の気管支肺胞洗浄において著しく発現増加する粘膜関連ケモカインであることを既に報告している（３）。重要なことに、それは、受容体が未だに同定されていない、わずかな「オーファン」ケモカインリガンドのうちの１つでもある（他はＣＸＣＬ１４である）（１）。
【０００５】
ケモカインは、体内で白血球及び他の細胞の輸送を行う走化性サイトカインのファミリーである。ケモカインは、標的細胞表面に発現するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合して、細胞内シグナル伝達カスケードを開始し、走化性を誘導する。ほとんどのケモカインの同族受容体は特性解析されているが（４）、最近報告されたケモカイン、ＣＸＣＬ１７の受容体は、未だ同定されていない。本明細書に記載されるように、ＧＰＲ３５はＣＸＣＬ１７の受容体である。ＣＸＣＬ１７は、マクロファージ及び樹状細胞を化学的に誘因することが知られている（２）。ＧＰＲ３５は、ＣＸＣＬ１７−応答性ヒト単球、樹状細胞（ＤＣ）、及びＴＨＰ−１単球様細胞系により／又はそこで発現する。更に、カルシウム動員アッセイにより測定されるように、ＧＰＲ３５のＢａ／Ｆ３細胞へのトランスフェクションにより、ＣＸＣＬ１７に対する応答性が付与される。ＣＸＣＬ１７は、粘膜組織で発現するケモカインであり（３）；ＧＰＲ３５の発現は、粘膜の発現パターンに酷似している。ＧＰＲ３５は、ＤＲＹボックス及びＴｘＰモチーフを含む、ケモカイン受容体のいくつかの構造的特徴をも示す。ＧＰＲ３５は新規なケモカイン受容体であると結論され、それ故、それはケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体８（ＣＸＣＲ８）と命名されるであろう。ＧＰＲ３５はヒトの疾患と関連づけられ；ＧＷＡＳ試験により、それは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連付けられた（５）。まとめると、これらの観察は、新規な粘膜ケモカインＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸が、呼吸器系及び消化器系の病態生理学的又は炎症過程における治療介入のための重要な標的を示すことを強く示唆する。この組み合わせはヒトで証明されているが、異なる種においても対応物は同様の組み合わせであろう。異なる種の対応物が組み合わせられる可能性があり、通常の交差反応性を示すか、天然の組み合わせと比較し、異なる親和性又はシグナル伝達能力を有する可能性がある。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する障害のための対象の治療方法が提供される。該方法は、対象において、リガンドＣＸＣＬ１７による受容体ＣＸＣＲ８の活性化を阻害することを含む。該方法においては：ａ）阻害は、ＣＸＣＬ１７がＣＸＣＲ８に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含むことができ；ｂ）障害は、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害であってもよく、特定の実施形態では、肺、消化器又は生殖系炎症性疾患であってもよく；ｃ）このような炎症性疾患としては、クローン病（ＣＤ）、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、潰瘍、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病（ｃｅｌｉａｃｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、気管支肺異形成症、特発性肺線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、気管支炎、肺気腫、無症候性間質性肺疾患（無症候性ＩＬＤ）、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、子宮内膜症、平滑筋腫、腺筋症、細菌性膣症、又は尿道の感染若しくは炎症を挙げることができ；ｄ）又はａ）〜ｃ）の任意の組み合わせである。
【０００７】
他の態様では、受容体ＣＸＣＲ８とリガンドＣＸＣＬ１７との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。該方法は、ＣＸＣＲ８を発現する細胞にＣＸＣＬ１７を添加すること、及び物質の存在下、細胞中でのＣＸＣＲ８シグナル伝達の減少を測定することを含む。例えば、Ｂａ／Ｆ３細胞株のＣＸＣＲ８形質転換体を、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。
【０００８】
更なる態様では、受容体ＣＸＣＲ８とリガンドＣＸＣＬ１７との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。該方法は、ＣＸＣＲ８にＣＸＣＬ１７を添加すること、及び物質の存在下、ＣＸＣＬ１７のＣＸＣＲ８への結合の減少を測定することを含む。
【０００９】
本明細書に記載される、これらの又は他の方法では、物質は、ａ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＲ８と結合する抗体又はその断片；ｂ）天然又は変異体のＣＸＣＬ１７の配列を示すポリペプチド；ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；ｄ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＲ８と結合する小分子；ｅ）ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＲ８と結合するアプタマー；又はａ）からｅ）の任意の組み合わせであってもよい。
【００１０】
更なる態様でおいては、以下のものが提供される：
【００１１】
ａ）リガンドがＣＸＣＲ８受容体と選択的に結合する、ＣＸＣＲ８のリガンドが提供される。リガンドは、前記受容体を介してシグナル伝達するもの、例えばアゴニスト；ヒトＣＸＣＬ１７の８５％未満、９０％未満、９５％未満又はそれ以上をシグナル伝達するもの、例えばアンタゴニスト；インバースアゴニスト（ＣＸＣＲ８の定常活性を阻害するもの）；アロステリック調節因子（ＣＸＣＲ８のシグナル伝達活性を変化させるが、リガンド（ＣＸＣＬ１７）の結合を阻害しないもの）；ヒトＣＸＣＬ１７と少なくとも約８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の同一性を有するもの、例えばムテイン；ヒトＣＸＣＬ１７と少なくとも９４％の同一性を示す、少なくとも１７、１９、２３、２７、３１個若しくはそれ以上のアミノ酸部分を含むもの；及び／又は霊長類のＣＸＣＲ８受容体と結合するものであってもよい。リガンドは、無菌組成物中にあるもの、全身又は局所用に製剤化されたもの；治療用組成物中にあるもの；単回投与容器中にあるもの；及び／又はヒトＣＸＣＬ１７と少なくとも９０％の配列同一性を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１７と少なくとも約８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の配列同一性を含み、実施形態は、ヒトＣＸＣＬ１７の天然の配列と同一の配列を含まない。
【００１２】
ｂ）ＣＸＣＲ８のリガンドと選択的に結合する抗体が提供される。該抗体は、ＣＸＣＲ８受容体との結合を阻害し；ＣＸＣＲ８受容体によるシグナル伝達を阻害し得る。
【００１３】
ｃ）ヒトＣＸＣＬ１７に対する受容体又は結合タンパク質が提供される。受容体又は結合タンパク質は：前記ヒトＣＸＣＬ１７の結合により更にシグナル伝達し；ＣＸＣＬ１７の結合により、ヒトＣＸＣＲ８と比較して少なくとも約８０％のシグナルをシグナル伝達し；ヒトＣＸＣＲ８と少なくとも約９５％の同一性を有し；又は霊長類のＣＸＣＬ１７と結合することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＣＸＣＲ８と少なくとも約９５％以上の配列同一性を含み、該実施形態は、ヒトＣＸＣＲ８の天然の配列と同一の配列を含まない。
【００１４】
ｄ）ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７シグナル伝達の阻害方法も提供される。該方法は、ａ）ＣＸＣＲ８（受容体）をＣＸＣＬ１７（リガンド）アンタゴニストと：ｂ）ＣＸＣＬ１７（リガンド）を遮断薬と；及び／又はｃ）ＣＸＣＲ８を発現する細胞を細胞シグナル伝達の遮断薬と接触させることを含む。ＣＸＣＬ１７（リガンド）アンタゴニストは；ａ）ＣＸＣＲ８（受容体）又は種変異体と結合する抗体（又はその断片）；ｂ）ＣＸＣＬ１７（ケモカイン）変異体（例えば、結合するが、シグナル伝達しない；種変異体及び対応物）；又はｃ）小分子化合物から選択することができる。遮断薬は：ａ）ＣＸＣＬ１７と結合する抗体（又はその断片）（例えば、ケモカイン、結合を阻害し；種変異体を含む）；ｂ）受容体の可溶性部分であってもよい、受容体の断片；及び／又はｃ）小分子化合物から選択することができる。細胞シグナル伝達の遮断薬は：例えば、シグナル伝達経路のメンバーのａ）ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、若しくはＴＡＬＥＮ化合物；ｂ）シグナル伝達経路を阻害する抗体；又はｃ）小分子化合物であってもよい。
【００１５】
ｅ）ＣＸＣＲ８（受容体）シグナル伝達の誘発方法であって、前記受容体を、その同族リガンド（ＣＸＣＬ１７又はそのアゴニストであってもよい）と接触させることを含む、前記方法。アゴニストは、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、又はＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体若しくはその断片であってもよい。
【００１６】
ｆ）前記ＣＸＣＬ１７アンタゴニストのスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、ＦＬＩＰＲアッセイ、細胞をベースとするアッセイ、生化学的アッセイ、又は他のアッセイから選択されるアッセイを含む、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）又は関連検出システムを使用する、細胞をベースとするアッセイを使用する。該方法においては、前記スクリーニングは：ｉ）種変異体又は対応物を含む、ＣＸＣＬ１７と結合する抗体；ｉｉ）種変異体を含む、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；ｉｉｉ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体、例えば、グルコシル化又は他の修飾体；ｉｖ）小分子アンタゴニスト候補；又はｖ）アプタマーライブラリーを含む１種以上の化合物で行われる。
【００１７】
ｇ）（ｆ）に記載される前記遮断薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、ＦＬＩＰＲ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／ＦＬＩＰＲ−Ｓｙｓｔｅｍｓ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）アッセイ、細胞をベースとするアッセイ、又は生化学的アッセイ等のアッセイを使用する方法；ｉ）ＣＸＣＲ８又は種変異体と結合する抗体；ｉｉ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体、例えば、可溶性受容体断片又は種変異体；ｉｉｉ）グリコシル化又は他の修飾等の、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；ｉｖ）小分子アンタゴニスト候補；及び／又はｖ）アプタマーライブラリーを含む１種以上の化合物で行われる。
【００１８】
ｈ）前記ＣＸＣＬ１７アンタゴニスト又は遮断薬のスクリーニング方法であって、Ｂａ／Ｆ３細胞株のＣＸＣＲ８形質転換体が、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用され得る、前記方法。特定の実施形態では、前記スクリーニングは、細胞をベースとするアッセイ、生化学的アッセイ、又は他のアッセイであってもよい、ＦＬＩＰＲ又は関連検出システムを使用する、細胞をベースとするアッセイを使用する。更なる実施形態では、前記スクリーニングは：ａ）ＣＸＣＬ１７又は種変異体と結合する抗体；ｂ）ＣＸＣＬ１７又は種変異体のポリペプチド配列変異体；ｃ）グリコシル化又は他の修飾を含む、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；ｄ）小分子アンタゴニスト候補；又はｅ）アプタマーライブラリーを含む１種以上の化合物で行われる。前記スクリーニングが、ＦＬＩＰＲアッセイ、細胞をベースとするアッセイ、又は生化学的アッセイを使用する方法が、同様に提供される。追加の実施形態は、前記スクリーニングが：ａ）ＣＸＣＲ８、又は種対応物若しくは変異体と結合する抗体；ｂ）可溶性受容体断片及び種対応物若しくは変異体を含む、ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体；ｃ）グリコシル化又は他の修飾を含む、ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体；ｄ）小分子アンタゴニスト候補；又はアプタマーライブラリーを含む１種以上の化合物で行われる。特定の一実施形態では、Ｂａ／Ｆ３細胞株のＣＸＣＲ８形質転換体が、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするために使用される。
【００１９】
ｉ）ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる、種々の胃腸障害としては：ａ）クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、セリアック病、又は過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病；ｂ）胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、又は肝細胞がん、食堂がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、胃腸間質性腫瘍；ｃ）自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の（非自己免疫性）肝硬変、原発性硬化性胆管炎、若しくは肝線維症；又はｄ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が媒介する肝硬変、ヘリコバクターピロリが原因の消化管潰瘍が挙げられる。例えば、Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．Ｃ．Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｂｏａｒｄ  Ｒｅｖｉｅｗ，第４版、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３；Ｈａｗｋｅｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１２；及びＹａｍａｄａ  Ｔ．ら、Ｙａｍａｄａ'ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１３を参照のこと。
【００２０】
ｊ）ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる代謝障害としては、１型糖尿病、又は２型糖尿病が挙げられる。例えば、Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｖ．Ａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２を参照のこと。
【００２１】
ｋ）ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる腫瘍学的代謝障害としては、白血病、リンパ腫、膠芽腫及び関連脳腫瘍が挙げられる。例えば、Ｍｕｇｈａｌ，Ｔ．Ｉ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ，Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｍｙｅｌｏｍａｓ，第２版、Ｉｎｆｏｒｍａ  ２０１２；並びにＫａｙｅ，Ａ．Ｈ．及びＬａｗｓ  Ｅ．Ｒ．Ｊｒ．Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ，第３版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２０１２を参照のこと。
【００２２】
ｌ）ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる呼吸器障害は、ａ）小細胞肺がん（７）又は非小細胞肺がん（８）を含む肺がん（６）、若しくは中皮腫（９）（悪性）；ｂ）特発性肺線維症（１０）、過敏性肺炎（１１）、若しくは非特異的間質性肺炎；ｃ）関節リウマチ若しくは強皮症等の自己免疫疾患を含む間質性肺障害と関連のある呼吸器障害；ｄ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（１２）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）（１３）、若しくは喘息（１４）；及び／又はｅ）気管がん、喉頭のがん、食道がん、気管支のがん、鼻腔／副鼻腔がんを含む、他の呼吸器系がんから選択することができる。例えば、Ｊｕｄｄ，Ｓ，Ｊ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ，第２版、Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，２０１２；及びＬｅｃｈｎｅｒ，Ａ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ  ＬＡＮＧＥ，２０１２を参照のこと。
【００２３】
ｍ）  投与は、ａ）局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局所的（ｌｏｃａｌ）、又は全身；ｂ）エアロゾル又はミストとしての吸入；又はｃ）他の治療法との組み合わせであってもよい。
【００２４】
ｎ）例えば、アジュバント及び／又はアゴニストとして、ＣＸＣＬ１７アゴニストを含むワクチンが提供され、又は正のアロステリック調節因子を含む受容体（ＣＸＣＲ８）のシグナル伝達能力を変化させる、アゴニスト又はアンタゴニスト活性（ＣＸＣＬ１７に対する）を有しない分子を含むワクチンが提供される。該ワクチンは、例えば、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、ＤＰＴ、及び／又は麻疹ウイルスに対するワクチンにおけるもののような、防御抗原を含んでいてもよい。いくつかのケースでは、標的抗原は、腫瘍関連抗原（以下のがん：すなわち、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、及び／又は膠芽腫）、若しくは分散性（ｄｉｓｐｅｒｓｅ）白血病及びリンパ腫における抗原である。ワクチンは、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、又は膠芽腫のために使用することができる。ワクチンは、対象に投与され得る。例えば、Ｐｌｏｔｎｉｋ，Ｓ．Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第６版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２０１２を参照されたい。他の実施形態では、ワクチンは、寛容原性細胞の動員を阻害し得る、的確な濃度で、ＣＸＣＬ１７のアンタゴニストを含んでいてもよい。
【００２５】
ｏ）対象において上昇した血圧を媒介させる方法であって、適当量のＣＸＣＲ８アゴニストを投与して前記血圧を媒介させることを含む、前記方法。いくつかの実施形態では、上昇した血圧は高血圧である。アゴニストは：ａ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１７；ｂ）ヒトＣＸＣＬ１７（種変異体を含む）のポリペプチド変異体；ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体（例えば、グリコシル化又は他の修飾）から選択することができる。
【００２６】
ｐ）マクロファージ又は樹状細胞を動員する方法であって、前記方法は、ＣＸＣＲ８アンタゴニストを投与すること（及び、例えば、前記細胞を収集すること）を含み；更に、ＣＣＲ２発現細胞中でカルシウム流を誘発する分子等として定義される、ＣＣＬ２のような、ＣＣＲ２アゴニストを投与することを含んでもよい。
【００２７】
ｑ）胃腸、代謝及び呼吸器系疾患、及びがんを含む、ヒトの疾患の原因に関与する細胞のマーカー、白血病、リンパ腫、胃がん、結腸直腸がん、若しくは膵臓がんの転移細胞のバイオマーカー、小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん又は悪性中皮腫の転移細胞のバイオマーカー、無症候性間質性肺疾患（無症候性ＩＬＤ）のバイオマーカー、胃腸若しくは呼吸器系がんに浸潤する細胞の予後バイオマーカーとしてＣＸＣＲ８を使用する方法。
【００２８】
ｒ）アテローム性動脈硬化症（例えば、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ２０１２を参照のこと）を治療若しくは予防し、又は多発性硬化症（例えば、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｎ．ら．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，第４版、Ｄｅｍｏｓ  Ｈｅａｌｔｈ，２０１２を参照のこと）を治療若しくは予防する方法であって、有効量の：ａ）ＣＸＣＲ８アンタゴニスト、若しくはＣＸＣＲ８発現の阻害剤；又はｂ）ＣＸＣＬ１７アンタゴニスト若しくはＣＸＣＬ１７発現の阻害剤を対象に投与することを含む、前記方法。ＣＸＣＲ８アンタゴニストは：ａ）ＣＸＣＲ８（又は種変異体、例えば、結合するがシグナルを伝達しない）と結合する抗体；ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体（例えば、可溶性受容体断片；種変異体）；ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体（例えば、グリコシル化又は他の修飾）；ｄ）小分子アンタゴニスト；又はｅ）アプタマーから選択することができる。ＣＸＣＲ８発現又は下流シグナル伝達の阻害剤は、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ化合物等を使用することができる。ＣＸＣＬ１７アンタゴニストは：ａ）ＣＸＣＬ１７（又は種変異体；結合するが、シグナルを伝達しない）と結合する抗体；ｂ）ＣＸＣＬ１７のポリペプチド配列変異体（種変異体を含む）；ｃ）ＣＸＣＬ１７の非ペプチド結合変異体（例えば、グリコシル化又は他の修飾）；ｄ）小分子アンタゴニスト；又はｅ）アプタマーから選択することができる。ＣＸＣＬ１７発現又はシグナル伝達の阻害剤は、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ化合物等を使用することができる。
【００２９】
ｓ）ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７シグナル伝達の阻害方法であって、ＣＸＣＲ８（受容体）の発現を阻害するＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を用いて、ＣＸＣＲ８受容体を減少させることを含む、前記方法。また、ＣＸＣＲ８を介したＣＸＣＬ１７シグナル伝達の阻害方法であって、ＣＸＣＬ１７（リガンド）の発現を阻害するＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、又はＴＡＬＥＮ化合物を用いて、ＣＸＣＬ１７を減少させることを含む、前記方法。
【００３０】
ｔ）抗−ＣＸＣＲ８抗体を、末梢血単核細胞調製物と混合すること、及び前記抗体によりＣＸＣＲ８陽性細胞を分離することを含む、ＣＸＣＲ８発現細胞の分離方法。該方法においては、抗−ＣＸＣＲ８抗体は、モノクローナル抗体、中和抗体、若しくはヒト化抗体、又はそれらの組み合わせであってもよく；分離は、蛍光標識細胞分取によることができ、及び／又は分離は磁気ビーズ分離によることができる。
【００３１】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ８シグナル伝達の増加と関連する障害について対象を治療する方法が含まれ、物質、アゴニスト又はアンタゴニストは、以下のもの：キヌレニン酸、２−アシルリゾホスファチジン酸、クロモリン、ジクマロール、ルテオリン、ニフルミン酸、ＮＰＰＢ、パモ酸塩及びパモ酸、ケルセチン、チロホスチン−５１、ザプリナスト、ＭＬ１４４、ＭＬ１４５、又はＣＩＤ−２７６５４８７を含まない。
【００３２】
分子ＧＰＲ３５は、本出願を通してＣＸＣＲ８とも呼ばれる。
【００３３】
対象は、ヒト又は他の動物であってもよく、通常は霊長類又は哺乳類である。
【００３４】
様々な種由来のＣＸＣＬ１７の配列は、以下の受け入れ番号（全ては参照により本明細書に組み入れられる）を有する；ＨＧＮＣ：１９２３２（ヒトＣＸＣＬ１７）（ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅデータベース）；  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ：ＭＧＩ：２３８７６４２  （マウスＣｘｃｌ１７）（ＭＧＩデータベース）；ＲＧＤ：１３０４７１７（ラットＣｘｃｌ１７）（ＲＧＤデータベース）；ヌクレオチド配列：ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ１９８４７７（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）；タンパク質配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＸＢ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ）。ＧＥＮＢＡＮＫ、ＮＣＢＩ、ｄｂｅｓｔ、Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、Ｒｅｆｓｅｑ、ｎｒ−ａａ、ＰＲＦ、又はＰＤＢＳＴＲも参照のこと。
【００３５】
様々な種由来のＣＸＣＲ８／ＧＰＲ３５の配列は、以下の受け入れ番号（全ては参照により本明細書に組み入れられる）を有する；ＨＧＮＣ：４４９２（ヒトＧＰＲ３５）（ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅデータベース）；Ｈｏｍｏｌｏｇｓ：ＭＧＩ：１９２９５０９（マウスＧｐｒ３５）（ＭＧＩデータベース）；ＲＧＤ：１３０９４０４（ラットＧｐｒ３５）（ＲＧＤデータベース）；ヌクレオチド配列：ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ  ００１１９５３８２（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）；タンパク質配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＣ９７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ）。ＧＥＮＢＡＮＫ、ＮＣＢＩ、ｄｂｅｓｔ、Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、Ｒｅｆｓｅｑ、ｎｒ−ａａ、ＰＲＦ、又はＰＤＢＳＴＲも参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本発明のより完璧な理解のために、添付の図面と併用される下記の記載を参照する。
【図１Ａ】図１Ａは、ＴＨＰ−１細胞がＣＸＣＬ１７に応答することを示す結果のパネルである。図１Ａ、両者とも休止状態下、又はＰＧＥ２前処理条件下における、ＴＨＰ−１細胞は、ＣＸＣＬ１７指向性走化性トランスウェルアッセイで試験し；これらの細胞も、百日咳毒素（ＰＴＸ）で前処理した後、同じ方法で試験した。バーは、トランスウェルプレートの低いチャンバー内の回収された細胞（走化した）の総数を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＨＰ−１細胞がＣＸＣＬ１７に応答することを示す結果のパネルである。図１Ｂ、１００ｎＭのＣＸＣＬ１７で刺激した時の、休止しているか、ＰＧＥ２処理したＴＨＰ−１細胞（Ｃａ+2感応性染料を負荷）の代表的カルシウム流応答。ｎ＝２。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＴＨＰ−１細胞がＣＸＣＬ１７に応答することを示す結果のパネルである。図１Ｃ、ＴＨＰ−１細胞により発現するＣＸＣＬ１７受容体の脱感作について、細胞のカルシウム流応答を誘発するために、示した時点で、１００ｎＭのＣＸＣＬ１７又はＣＣＬ２を別に加える。代表的なグラフを示した。ｎ＝３。
【図２Ａ】図２Ａは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図２Ａ、ヒト第２染色体長腕の末端領域におけるＧＰＲ３５遺伝子の位置；示すように、近くに、隣接してＣＸＣＲ７遺伝子をミルことが可能である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図２Ｂ、既知のケモカイン受容体のタンパク質配列の系統発生分析。ＧＰＲ３５に最も近い関連メンバーがＣＸＣＲ７であることを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図２Ｃ、ＢＩＧＥ（ＣＣＲ１（配列番号３）、ＣＣＲ２（配列番号１）、ＣＣＲ５（配列番号２）及びＣＸＣＲ４（配列番号４））、並びにＣＸＣＲ７（配列番号５）及びＧＰＲ３５（配列番号６）による、休止状態の単球における最も大量にあるケモカイン受容体のタンパク質配列の配列比較。保護レベルは、各アミノ酸の背景に濃い灰色の陰影として示される。７つの膜貫通（ＴＭ）ドメインが示される。ボックスは、ＤＲＹボックス及びＴｘＰモチーフを示している。矢印の頭部は、第二のＴＭ領域に保存されたアスパラギン酸を示す。コンセンサス配列（配列番号７）も観察される。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＰＲ３５がＴＨＰ−１細胞中で発現していることを示す結果のパネルである。図３Ａ、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した、休止状態、又はＰＧＥ２処理したＴＨＰ−１細胞中のＧＰＲ３５の相対的発現。データは、試料中のＧＡＰＤＨの相対的発現を用いて標準化した。代表的実験、ｎ＝２。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＧＰＲ３５がＴＨＰ−１細胞中で発現していることを示す結果のパネルである。図３Ｂ、アイソタイプ対照（ウサギＩｇＧ）に対する、得られたＴＨＰ−１細胞（陽性である）及びＢａ／Ｆ３細胞（陰性である）におけるＧＰＲ３５の発現を比較するフローサイトメトリーにより測定したＧＰＲ３５タンパク質発現。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣＸＣＬ１７が、ＧＰＲ３５を介した細胞性カルシウム動員を誘発することを示す結果のパネルである。図４Ａ、模倣細胞、又はＣＸＣＬ１７［１００ｎＭ］の添加により、Ｃａ+2感応性染料を負荷した、ＧＰＲ３５で一時的にトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞におけるカルシウム流応答。実施した３つの実験の代表的グラフ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣＸＣＬ１７が、ＧＰＲ３５を介した細胞性カルシウム動員を誘発することを示す結果のパネルである。図４Ｂ、種々の量のＣＸＣＬ１７の添加により、ＧＰＲ３５でトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞において観察される用量反応相関。
【図５】図５は、ＢＩＧＥデータベース由来の人体の種々の細胞又は組織における、ＧＰＲ３５の相対的発現を示す表（表１）である。データは、マイクロアレイ分析、及びこれらの組織／細胞の各々に対応するｍＲＮＡにハイブリダイズするＧＰＲ３５に対応するプローブセットの能力を意味する平均強度を示す。
【図６】図６は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ３５の発現が、それらをＣＸＣＬ１７に応答するようにすることを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＧＰＲ３５コード配列を含む発現ベクターでトランスフェクトし、材料及び方法の項に記載したＣａ+2動員アプローチによるトランスフェクション７２時間後に分析した。印をつけた時点で、１００ｎｇのＣＸＣＬ１７を加えて細胞を刺激した。
【図７】図７は、粘膜のケモカインＣＸＣＬ１４又はＣＣＬ２８がＧＰＲ３５シグナル伝達を誘発しないことを示すグラフである。指示した時点で、独立にヒトＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ１４及びＣＣＬ２８（１００ｎＭの濃度で）を用いたＣａ+2動員について、ＧＰＲ３５／ＣＸＣＲ８  Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト細胞を試験した。
【図８Ａ】図８Ａは、ヒトの単球により発現するＧＰＣＲを示す表（表２）である。図８Ａは、表の一部を含む。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトの単球により発現するＧＰＣＲを示す表（表２）である。図８Ｂは、表の一部を含む。
【図９】図９は、いくつかのケモカイン受容体の放射性リガンド置換研究の結果を示す表（表３）である（ｎ．ｄ．は検出できないことを意味する）。
【図１０】図１０は、ケモカインが誘発するβ−アレスチンの動員の結果を示す表（表４）である。
【図１１】図１１は、サルモネラに感染したマウスにおける、ＣＸＣＲ８及びＣＸＣＬ１７の発現を示すグラフのパネルである。
【図１２】図１２は、潰瘍性大腸炎のマウスモデルにおいてＣＸＣＲ８が増加したことを示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＣＸＣＲ８：ＣＸＣＬ１７が媒介する走化性が、重要なマクロファージ化学誘因物質であるＣＣＲ２に匹敵することを示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、種々の動物由来のＣＸＣＲ８の配列比較である。配列比較は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏｍｅｇａ多配列アライメントツール（Ｓｉｅｖｅｒｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１０７９：１０５−１６）を使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、（*）は特定の残基におおける完全配列同一性を示すが、（．）及び（：）は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。イエネコ（配列番号８）、ウシ（配列番号９）、ヒト（配列番号１０）、チンパンジー（配列番号１１）、アカゲザル（配列番号１２）、ラット（配列番号１３）及びマウス（配列番号１４）由来のＣＸＣＲ８の配列が示される。図１４Ａは、配列比較の一部を含む。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、種々の動物由来のＣＸＣＲ８の配列比較である。配列比較は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏｍｅｇａ多配列アライメントツール（Ｓｉｅｖｅｒｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１０７９：１０５−１６）を使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、（*）は特定の残基における完全配列同一性を示すが、（．）及び（：）は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。イエネコ（配列番号８）、ウシ（配列番号９）、ヒト（配列番号１０）、チンパンジー（配列番号１１）、アカゲザル（配列番号１２）、ラット（配列番号１３）及びマウス（配列番号１４）由来のＣＸＣＲ８の配列が示される。図１４Ｂは、配列比較の一部を含む。
【図１５】図１５は、種々の動物由来のＣＸＣＬ１７の配列比較である。配列比較は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏｍｅｇａ多配列アライメントツールを使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、（*）は特定の残基における完全配列同一性を示すが、（．）及び（：）は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。マウス（配列番号１５）、ラット（配列番号１６）、ウシ（配列番号１７）、イエネコ（配列番号１８）、アカゲザル（配列番号１９）、ヒト（配列番号２０）及びチンパンジー（配列番号２１）由来のＣＸＣＬ１７の配列が示される。
【図１６】図１６は、膜タンパク質の軽い架橋の後のＣＸＣＬ１７に対する走化性応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下の出願、すなわち２０１３年９月３０日に出願された、米国仮特許出願第６１／８８４，５７６号は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
ケモカイン及びケモカイン受容体は、体内での細胞の移動を制御するが、所定のリガンドの適切な受容体を発現する応答細胞の恒常性を変化し得ることで知られている（１，１５）。本発明の実施形態は、部分的に、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３５により表わされる、ケモカインＣＸＣＬ１７の同族受容体の同定に基づいている。この同定の結果として、ＧＰＲ３５は、ケモカイン受容体命名法の確立されたガイドラインに従って、現在、ＣＸＣＲ８と新たに命名することができる（１）。
【００３９】
ＣＸＣＬ１７ケモカイン（種の対応物を含む）
ケモカインＣＸＣＬ１７は、ヒト（ＬｏｃｕｓタグＵＮＱ４７３／ＰＲＯ８４２）（Ｑ６ＵＸＢ２（ＵｎｉＰａｒｃ））（ＮＰ＿９４０８７９．１）、マウス（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２８４３４０）（ＮＰ＿７０５８０４．２）、チンパンジー（ＸＰ＿００１１５４７２６．１）、並びにイヌ、ゾウ及びゴリラを含む他の動物に存在している。ＣＸＣＬ１７は、おそらく多くの種に存在しており、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ又はＮＲ−ＡＡ（例えば、ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／におけるワールドワイドウェブを参照のこと）等の総合データベースのＢＬＡＳＴサーチにより同定することができる。多くのケースで、天然の配列は、少なくとも約８０％の同一性、約８５％、又は約９０％の同一性、又は少なくとも約９５％又は１００％同一性を含む、それ以上の同一性の特定の実施形態を含む、その変異体により置換され得る。例えば、比較の断片は、長さにおいてアミノ酸の約９５％であってもよく、又は比較のために、アミノ酸の長さの約９０％、８５％、又は８０％であってもよい。比較の長さは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、又は７５アミノ酸であってもよい。変異体は、一般的な天然の配列の特定の物理化学的又は機能的特徴を維持する場合があるが、他の変異体は、構造的及び機能的特徴を組み合わせて修飾されている場合がある。いくつかの実施形態では、変異体は、天然のヒトのＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８配列、又は他の動物の天然のＣＸＣＬ１７若しくはＣＸＣＲ８配列と同一の配列を含んでいない。記載されるような機能を示す、切断バージョン又は他の断片との融合体が提供される。本発明の実施形態は、構造変化に対応する機能の評価を可能にする。
【００４０】
ＣＸＣＲ８ケモカイン受容体（種の対応物を含む）
ＣＸＣＲ８ケモカイン受容体（種の対応物を含む）が記載される。本明細書において、適切な機能を有する配列の変異体が提供される。特に、変異体は、通常、天然の配列に対し、配列において、少なくとも約８０％、８５％、９０％、及び９５％又はそれ以上の同一性を維持するであろう。他の実施形態では、変異体は、異なる同一性の領域を有し、種々の長さ、例えば、特定の同一性の２０、３０、４０、５０、７０、１００又はそれ以上のアミノ酸の断片、例えば、基準配列に対し、１００％、約９５％、９０％、８５％、８０％又はそれ以下の同一性を有していてもよい。好ましいヒトの配列は前述し、受け入れ番号：ＮＰ＿００１１８２３１０；Ｑ９ＨＣ９７；ＢＣ０９５５００を含む。
【００４１】
ＣＸＣＬ１７ケモカイン及びＣＸＣＲ８ケモカイン受容体対（リガンド−受容体対）
本発明の実施形態は、ＣＸＣＬ１７ケモカインの受容体の同定を記載する。それは、現在、ＣＸＣＲ８と新たに命名することのできる、Ｇタンパク質共役受容体ＧＰＲ３５である。この発見の重要性は、両者が、他の機能の中でも、恒常性を維持し、これらの組織中で炎症反応を制御するマクロファージ、単球及び樹状細胞を含む免疫系の種々の細胞を動員する粘膜部で発現するタンパク質であることである。これらの組織中には、ヒトの疾患の原因となる多くの炎症性疾患があり、したがって、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸を制御することは、治療効果を得るために重要である。
【００４２】
対形成機能（リガンド精製、受容体結合、シグナル伝達、エフェクター機能）
ヒトゲノム中には多数の（２７３個以上）クラスＡのＧＰＣＲがあることを考えると、新規なケモカイン受容体を同定するのは容易でない。受容体が同定されていないいくつかのケモカインがある（他の１つはＣＸＣＬ１４である）（１）。最初に応答細胞により発現する全てのＧＰＣＲの同定が、次いで、ＣＸＣＬ１７シグナル伝達を介した正しい受容体が見つかるまでそれぞれを試験する必要があるので、本発明者らは、ＣＸＣＲ８の同定が困難かつ明白でないと考える。ＣＸＣＲ８の同定は、それがシグナル伝達し、ＣＸＣＬ１７のエフェクター機能を媒介することを、本発明者らが予測することを可能にする。ＣＸＣＬ１７及びＣＸＣＲ８の両者は、炎症性疾患の下で過剰発現し、これは、炎症反応に関与する他のケモカイン／受容体軸の共通の特徴である（１６）。ケモカインのその受容体への最初の結合により引き起こされる最初のカルシウム流に続き、細胞骨格の変化をもたらし、移動反応のためにそれを調製する、多くのリン酸化ステップがある（１６）。
【００４３】
リガンド類似構造体、アゴニスト及びアンタゴニスト
これらのタンパク質相互作用セグメント又は結合部位に変異を導入することにより、ＣＸＣＬ１７にＣＸＣＲ８への結合を消失し得ると予測することができる。ＣＸＣＲ８のリガンド結合部位は、受け入れ番号ＮＰ＿００５２９２の約７３〜約１０５残基、及び約１５０〜１７５残基を含み得る、約１〜２５のＮＨ2末端、及び細胞の外部に面するＧＰＣＲの暴露部位を含むべきである。図２Ｃは、ＣＸＣＲ８（ＧＰＲ３５）と、いくつかの他のヒトケモカイン受容体分子間の配列相同性を示す。コンセンサス配列、及び全ての受容体間の保存の相対的程度を示す。７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ）等のＧＰＣＲファミリーと共通のドメイン、ＴｘＰモチーフ及びＤＲＹボックスが示される。図１４は、種々の動物由来のＣＸＣＲ８の配列比較である。
【００４４】
同様に、ＣＸＣＬ１７変異体は、ケモカインのコア内より構築することができ、ケモカインの特徴的な２つのジスルフィド架橋間の領域への突然変異により構築することができる。ＣＸＣＬ１７は、なぜ、それが発見された最新のケモカイン（２）であるかを部分的に説明する、いくつかの独自の構造を示し、他の領域、例えば、受け入れ番号ＮＰ＿９４０８７９の約２３〜約４９、及び約１０４〜約１１９残基の突然変異は、それをＣＸＣＲ８に結合することができなくする。図１５は、種々の動物由来のＣＸＣＬ１７の配列比較である。変異誘発法及び分析は、当業者によく知られている通常の技術であり、そのため、ＣＸＣＬ１７及びＣＣＲ８タンパク質内の構造変異体によって機能がどのように影響されるかを経験的に同定するのに問題があってはいけない。
【００４５】
ＣＸＣＬ１７変異体は、その可溶性の本質のため、アンタゴニストとして使用するのがより有利であろう（結合するが、シグナル伝達しない場合）、又はいくつかの変異体は、増強した結合及びシグナル伝達を示し、特定の応答細胞の動員において他の用途を有する可能性がある。
【００４６】
リガンドに対する、受容体に対する抗体構造、断片、アプタマー；非ペプチド性構造（例えば、非ペプチド結合；修飾ポリペプチド）；受容体／リガンド相互作用に影響するＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ化合物；受容体結合のスクリーニング（陽性コントロールとしてリガンドを使用）、及び化合物ライブラリーは、本発明の実施形態である。
【００４７】
ＣＸＣＲ８又はＣＸＣＬ１７に対するアンタゴニストとしては、これらのタンパク質、並びに変異体ＣＸＣＬ１７タンパク質に対する特定の抗体が挙げられる。ＦＬＩＰＲ技術をベースとするもののようなカルシウム流をベースとするスクリーニングアッセイにおいて使用するためのＣＸＣＲ８トランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞を用いることにより同定し得る小分子アンタゴニストを使用することも可能である（１７）。ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）アッセイは、マルチウェル細胞培養プレートのトランスレーザー照射（ｔｒａｎｓ−ｌａｓｅｒ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を使用し、上記から発光を検出する。通常、細胞は、Ｃａ2+指標物質フルオロフォア（例えば、Ｆｌｕｏ３）が負荷され、放出した蛍光は、照射細胞内の相対的Ｃａ2+レベルを示す。試験化合物は、予め測定された化合物を含むマルチウェルプレートから、細胞を含むアッセイプレートに直接添加することができる。この構成は、試験化合物の添加の前後の細胞Ｃａ2+レベルの連続測定を可能にし、試験細胞のシグナル伝達能力に関する化合物の活性の測定を可能にする。種々の化合物ライブラリーは、Ｍｅｒｃｋ、Ｌｉｌｌｙ、Ｐｆｉｚｅｒ等の企業によって使用されるものを含む方法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｗｅｌｃｏｍｅ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ／のワールドワイドウェブを参照のこと。
【００４８】
特に重要なのは、本明細書で提供される対は、スクリーニングアッセイの陽性対照として機能するということである。それは、例えば、特定の活性、及び天然の相互作用の薬理学的シグナル伝達を評価するために定量的に使用することができる。異型の特異的活性は、部分アゴニスト又は部分アンタゴニストとして評価することができる。異なる形態は、種々の治療亜集団に見られる異なる受容体変異体にわたって異なる活性スペクトルを有する可能性がある。したがって、別の変異体は、例えば、異なる受容体アイソタイプを発現する異種の標的集団に対する応答において、多かれ少なかれ変動を有する可能性がある。
【００４９】
結合又は他の薬理に影響し得る他の特徴としては、グリコシル化、メチル化、アセチル化、又は他の修飾が挙げられる。特定の実施形態では、ペプチド配列の非ペプチド結合が、２つのペプチドを連結するための同一の機能を達成し得る。これらには、特定の標的分子と結合するオリゴ核酸分子であるアプタマーが含まれる。ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用の他の可能な阻害剤としては、ＲＮＡｉ（遺伝子発現を阻害するために使用される干渉ＲＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｋ．及びＭａｈａｔｏ  Ｒ．Ｉ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡｉ，Ｗｉｌｅｙ，２０１２を参照のこと）。細胞内に導入されたＲＮＡｉ分子は、正常細胞経路を介して細胞内ＲＮＡの破壊をもたらし、それによって、ＤＮＡ配列及び結果として得られるｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の発現を防止するであろう。ＲＮＡｉ分子は、しばしば、生物学的研究において、標的分子の発言を低減又は排除するために使用される。治療設定においては、ｍＲＮＡは、ＣＸＣＲ８又はＣＸＣＬ１７タンパク質の発現を低減又は排除し、それによってＣＸＣＬ１７及びＣＸＣＲ８のシグナル伝達及び生物効果を低減するために使用することができる。受容体リガンド相互作用に影響する、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ化合物も使用することができる（ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４１／６１４８／８３３．ｆｕｌｌ  のワールドワイドウェブを参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮ分子技術は、ゲノム中のＤＮＡ配列に対して関連したヌクレアーゼ分子を誘導するために、ＤＮＡ−結合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）又はＲＮＡ分子（ＣＲＩＳＰＲ）を使用する。ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ切断を導入する。導入部位に特異的なホモロジーアームが存在する場合、変異、欠失及び挿入を標的部位に導入することができる。このような技術は、ＣＸＣＲ１７及びＣＸＣＲ８の相互作用により通常に作動するシグナル伝達を増加又は減少するための研究又は臨床背景において使用され得る。
【００５０】
対の診断用途；ものの標識、他のものについてのアッセイ、機能感受性等
選択的相互作用は、パートナーを検出するために使用される対の１つを使用することを可能にするであろう。ものの標識は、パートナーを同定することを可能にする。標識としては、放射活性、アイソトープ、蛍光又はその他が挙げられる。抗体は、身体、器官、及び組織分布を検出し、評価するためにも使用することができる。これらの分布は、例えば、記載される臨床的適応のための診断的評価として有用であり得る。
診断方法（例えば、ケモカイン／受容体をベースとする患者サブセット）
【００５１】
ＣＸＣＬ１７及びＣＸＣＲ８は、特定の診断用途のバイオマーカーとしても有用であり得る。これらには、患者の血液中のＣＸＣＲ８＋細胞又はサブタイプを定量する能力が含まれ、これらの数若しくは型、又は又はＥＬＩＳＡ又は同様の方法により測定することのできる体液中のＣＸＣＬ１７の濃度は、種々の病理条件で変化し得る。例えば、Ｐａｇａｎａ及びＰａｇａｎａ，Ｍｏｓｂｙ'ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ、第４版、Ｍｏｓｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２０１３を参照のこと。ＣＸＣＬ１７及び／又はＣＸＣＲ８は、無症候性間質性肺疾患（無症候性ＩＬＤ）のバイオマーカーとして使用することもできる。
【００５２】
ケモカイン又は受容体を使用する治療法（臨床的適応）
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８の相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、呼吸器、消化器及び女性の生殖系の粘膜部位が含まれる、これらのタンパク質の発現パターンに基づき、種々の臨床的適応にとって有用であると期待される。これらのタンパク質は、膠芽腫若しくは他の脳のがんを含むいくつかのがん、並びに多発性硬化症の原因に関与し、それらは、おそらく血圧の制御に関与するであろう。
【００５３】
対象は、例えば、哺乳類、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、ヒト、家禽類、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、ヒツジ、齧歯類、イヌ、ブタ、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ウズラ、又はガチョウであってもよい。陳列（ｄｉｓｐｌａｙ）動物又は展示動物、例えば、ひれ足類動物、イルカ、ライオン、トラを含む、動物園の動物、又は芸をするように仕込まれた動物、及び他の獣医学の対象も治療することができる。
【００５４】
併用療法（他の治療との組み合わせ）
本発明の実施形態の好ましい使用は、炎症を制御することであろう。ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、非ステロイド系抗炎症剤、アスピリン、又はヒュミラ、レミケード若しくはエンブレル等の抗−ＴＮＦα薬を含む、他の確立された抗−炎症剤とともに使用することができる。特に、治療用抗体との併用が提供される。他の適応は、その有効性が本明細書で提供される方法と相乗的である古典的な方法で処理することができる。
【００５５】
ケモカイン、類似体（組換え体、化学的結合、グリコシル化等）の作製；受容体類似体；発現構築物、プラスミド、細胞、核酸を含む動物（真核生物、原核生物）を含む、類似体をコードする核酸の作製。
【００５６】
リガンド、受容体及び変異体を生産及び製造する標準的方法が適用される。構築物をコードする組換え型核酸の設計を含む、組換え法を開発することができる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｄ．Ａ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２０１１を参照のこと。例えば、コード領域に操作可能に連結したプロモータを有する発現ベクターを案出することができる。原核細胞及び真核細胞を含む、ベクターを含む細胞が提供される。適合発現法も開発することができる。
【００５７】
通常、細胞壁分解ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞で機能的なプロモータの制御下に配置される。非常に多様なプロモータは周知であり、特定の用途に依存して、本発明の実施形態の発現ベクターで使用することができる。通常、選択されるプロモータは、プロモータが活性である細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位等の他の発現制御配列も、必要に応じて含んでもよい。１以上のこれらの制御配列を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。したがって、本発明の実施形態は、関連する機能的ポリペプチドをコードする核酸が、高いレベルの発現のために所望の宿主細胞内に導入されている発現カセットが提供される（例えば、Ｒｅａｍ  Ｗ及びＦｉｅｌｄ  Ｋ．Ｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．２０１２を参照のこと）。
【００５８】
少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９２、９５、９８〜９９％又はそれ以上の均一性が最も好ましい。精製されたポリペプチドは、例えば、抗体が免疫選択精製法において使用し得る抗体の生産のための免疫源として使用することもできる。
【００５９】
製剤
投与の最適経路に依存し、種々の製剤（無菌、緩衝化、持続放出、制御放出、安定剤、軟膏等）を使用することができる。例えば、Ｎｉａｚｉ  Ｓ．Ｋ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２０１２を参照のこと。抗炎症と同様に、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、治療成績を最適化するための他の確立された薬剤と併用して使用することができる。更に、化合物は、単一の製剤手段において他の治療薬と併用して使用することができる。所望の薬物動態学的結果（分泌、半減期、溶解性、又は最適な排泄経路）を得るために、薬理学的変形をしようすることができる。
【００６０】
正確な用量は治療の目的に依存し、公知の技術を使用し、当業者によって確認することが可能である。例えば、Ａｎｓｅｌ，ら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３），Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０８２４７７０８４６，０８２４７６９１８Ｘ，０８２４７１２６９２，０８２４７１６９８１；Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ；並びにＰｉｃｋａｒ  （１９９９）Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓを参照のこと。当該技術分野において知られているように、タンパク質分解、全身に対して局所的送達、及び新しいプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、一般健康状態、性別、食生活、投与の時間、薬物相互作用、及び症状の重篤度に対する調整が必要な場合があり、当業者により、日常の実験で確認可能である。
【００６１】
種々の薬剤的に許容できる賦形剤が当該技術分野において周知である。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される賦形剤」としては、組成物の活性成分と組み合わされた場合に、その成分が、対象の免疫系と破壊的な反応を引き起こすことなく、生物活性を保持することを可能にする物質が挙げられる。そのようなものとしては、安定剤、保存剤、塩又は糖の複合体又は結晶等を挙げることができる。例えば、Ｎｉａｚｉ  Ｓ．Ｋ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２０１２を参照のこと。
【００６２】
例示的な薬学的担体としては、非水性溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルション等のエマルション、及び種々のタイプの湿潤剤等の標準的な薬学的賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機酸エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁剤、例えば、食塩水及び緩衝化媒質が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液及び栄養分補充液（ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充液（ブドウ糖加リンゲル液に基づくもの等）等が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、徐放性粒子、ガラスビーズ、包帯、眼上挿入物（ｉｎｓｅｒｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｙｅ）、及び局所的形態を含む固体マトリックスに組み込まれる。投与経路としては以下のものを挙げることができる：局所的、全身、呼吸器、経口的、眼、植込、経膣、経肛門、坐剤、徐放性デバイス、舌下、頬、経鼻、吸入、非経口、臓器内、皮下、皮内、筋肉内、静脈内等。
【００６３】
本発明は付随する実施例を参照することでより深い理解が得られるが、その記載は例証のみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の説明は、1つ又は複数の態様、並びに特定の変形物及び修正物の説明を含むが、例えば、本開示を理解した後に当業者の技術及び知識の範囲内となり得るような他の変形物及び修正物も本発明の範囲に含まれる。本明細書で引用される出版物、特許、特許出願、Gｅｎｂａｎｋ番号、及びウェブサイトは全て、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６４】
実施例１：
本発明者らは、ＣＸＣＬ１７と反応する細胞を同定することから開始した。この目的のために、本発明者らは、トランスウェルをベースとするアッセイを使用し、組換え型ＣＸＣＬ１７に対する複数の細胞株の反応を測定した。ＣＸＣＬ１７により誘導される最もよい遊走反応のうちの１つは、ＴＨＰ−１ヒト細胞株で観察された（図１Ａ）。ＴＨＰ−１細胞は、急性単球性白血病患者に由来し（１８）、単球／マクロファージ研究のために広く使用されてきた。
【００６５】
ＣＸＣＬ１７が単球及び樹状細胞を動員することが知られている（２）ことを考えると、本発明者らは、ＴＨＰ−１がＣＸＣＬ１７受容体を発現しているに違いないと結論づけた。重要なことに、本発明者らは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を用いた処理に次いで、ＣＸＣＬ１７に対するＴＨＰ−１の反応が増加することもわかった（図１Ａ）。以前の報告により、ＰＧＥ２処理に次ぐ、他のケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１４）に対するＴＨＰ−１の遊走反応において同様の観察がなされた（１９）。更に、ＴＨＰ−１細胞の遊走反応は、百日咳毒素（ＰＴＸ）に感受性である（図１Ａ）。ＰＴＸは、Ｇαi/oタンパク質シグナル伝達経路を阻害することが知られている（２０〜２１）。ほとんどのケモカイン受容体は、Ｇαi/oタンパク質を介してその反応を誘発するので、この観察により、ＣＸＣＬ１７受容体が同じシグナル伝達経路を活性化していることが示唆された。
【００６６】
ケモカインのそれらの受容体への結合により、細胞質カルシウムの特徴的な増加が引き起こされ、これはその同族受容体リガンド結合に反応して細胞内で起こる最も早い生化学イベントのうちの１つを代表する（２１〜２２）。したがって、本発明者らは、ＴＨＰ−１細胞がＣＸＣＬ１７が媒介するＣａ+2流を示すはずであるとの仮説をたてた。図１Ｂに見られるように、本発明者らは残りの及びＰＧＥ２で処理した細胞の両方へ、強いＣａ+2流に次いで、ＣＸＣＬ１７の添加を観察した。遊走反応と一致し、ＰＧＥ２で処理したＴＨＰ−１細胞も、強いＣａ+2流シグナル伝達を誘発した（図１Ｂ）。
【００６７】
ケモカインに対する細胞応答は、いくつかの調節段階に支配されている。これらの調節プロセスの例としては、アゴニスト及びケモカイン受容体の合成又はケモカイン分解の両方の制御が挙げられる（２３）。更に、脱感作として知られている受容体の不活性化のシグナル伝達経路の活性化を伴う迅速な機構が存在する。この現象は、アレスチン及びＧタンパク質共役受容体キナーゼを含む、フィードバック阻害剤のカスケードの活性化に起因し（２４）、長期の活性化の潜在的な損傷効果を防止するように設計することができる。したがって、ケモカイン受容体は、活性化後の一定期間、脱感作状態となる。
【００６８】
本発明者らは、ＴＨＰ−１細胞を用いて、ＣＸＣＬ１７主導の（ＣＸＣＬ１７−ｄｒｉｖｅｎ）脱感作を試験した。図１Ｃに示すように、ＣＸＣＬ１７は、それ自体を脱感作するが、ＴＨＰ−１細胞中で強い反応を誘発する他のケモカインであるＣＣＬ２により誘発されるＣａ+2流を脱感作しない（２５）。逆に言うと、ＣＣＬ２は、ＣＸＣＬ１７が媒介する反応を脱感作しなかった。これは、これら２種のケモカインが異なる受容体（ＣＣＬ２がＣＣＲ２に結合する）を介してシグナル伝達することを示している。
【００６９】
以前の結果は、ＣＸＣＬ１７が、ＣＸＣＬ１７応答細胞により発現する未同定の受容体を介してシグナル伝達することを示す。上述したように、ＣＸＣＬ１７は、単球及び樹状細胞の走化性を誘発する（図１Ａ、（２））。したがって、本発明者らは、、包括的なヒト遺伝子発現マイクロアレイデータベース、『Ｂｏｄｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ』（ＢＩＧＥ）（２６〜２７）を使用し、単球によって発現するＧＰＣＲを同定した。このスクリーンは、９０に近いＧＰＣＲを与え、そのうちの１０個は嗅覚としてアノテーションされ、６０個は公知であり（アノテーションされ）、２０個はオーファンとしてアノテーションされる（既知の内在性リガンドがないＧＰＣＲ）（図８、表２）。その受容体を検索するには、まずＣＸＣＬ１７が結合した、又はマクロファージによって発現することが知られているものを含む他の既知のケモカイン受容体を活性化するかどうかを試験した。結合及び／又はシグナル伝達試験により、ＣＸＣＬ１７が、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７及びＣＣＸ−ＣＫＲと結合しないか、シグナル伝達しないことを確認した。更に、ＣＸＣＬ１４又はＣＣＬ２８はＧＰＲ３５のいずれとも結合しない（図７）。したがって、本発明者らは、ＣＸＣＬ１７が、未だに未同定のケモカイン受容体として新規でなければならないと予測した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１７受容体の同定を目的とした実験に着手することを決定した。
【００７０】
本発明者らは、オーファンＧＰＣＲに焦点を合わせ、他のケモカイン受容体との構造的類似、並びにＣＸＣＬ１７と類似する発現パターンを示す、これらのＧＰＣＲをスクリーニングすることを優先させた。これらの基準は、候補のリストを縮小した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１７を用いたＣａ+2流アッセイにおいて試験を行った形質転換体を製造することにより、多くのケモカイン受容体様特徴を示し、マクロファージ及びＤＣ中で発現する（２８）ＣＣＲＬ２、ＧＰＣＲを最初にスクリーニングした。最近の報告（２９）と一致し、本発明者らは、ＣＸＣＬ１７と反応するカルシウム流を観察しなかった（データは示さず）。本発明者らの次の候補はＧＰＲ３５であった。ＧＰＲ３５は、最初、クラスＡのオーファンＧＰＣＲ遺伝子として同定された（３０）。ＧＰＲ３５は、消化管を含むいくつかの粘膜組織（３１）、並びに単球（３２）、好塩基球及び好酸球（３３）等のいくつかの造血細胞で発現し、成人の肺で比較的高い発現を示す（３４）。ＧＰＲ３５の上方制御は、ＩｇＥ抗体で刺激した肥満細胞（３３）、ベンゾ［ａ］ピレンで処理したヒトマクロファージ（３５）及び胃がん細胞（３１）で見られる。
【００７１】
キヌレニン酸、キヌレニン経路のトリプトファン代謝産物、２−アシルリゾホスファチン酸（２−アシル−ＬＰＡ）及びいくつかのチロシン代謝産物がＧＰＲ３５のアゴニストとして同定された（３６〜３７）。しかし、他の内在性ＧＰＲ３５アゴニストが存在するかどうかには議論の余地がある。
【００７２】
ＢＩＧＥデータベース内のＧＰＲ３５の発現は、最上位のＧＰＲ３５発現部位／細胞が休止単球を含むことを示し（図５、表１）、予想通り、休止ＤＣもこのリスト中に存在し、ＧＰＲ３５の比較的高い発現を示す（図５、表１）。これらの免疫細胞型は、ＣＸＣＬ１７に応答して走化性を示す（（２）及び未公開データ）。このリストの残りの組織での受容体発現は強く、粘膜であり、公知のＣＸＣＬ１７発現パターン（３）と相関する。
【００７３】
ＧＰＲ３５遺伝子は、第２染色体の２ｑ３７．３の長腕に位置する（図２Ａ）。興味深いことに、ＣＸＣＲ７をコードする遺伝子は、隣接する場所に位置する。系統発生分析が、ＣＸＣＲ７がＧＰＲ３５と密接に関連していることを示しているので、この観察は興味深い（図２Ｂ）。しかし、それはＣＸＣＲ７発現細胞から125Ｉ−ＣＸＣＬ１２を置換しないので、ＣＸＣＬ１７はＣＸＣＲ７と結合しない。その後のＧＰＲ３５タンパク質配列の試験により、第２の細胞内ループでのＤＲＹボックスの存在を明らかにした（図２Ｃ）。最も知られている機能的ケモカイン受容体の対応する位置に存在するこのモチーフは、これらの膜貫通分子へのＧタンパク質結合のための主要な部位を表し（３８）、また、β−アレスチンの動員規制リガンド依存性受容体の内在化と関連している（３９）。更に、本発明者らは、第２の膜貫通ドメインにおいて、保存されたＡｓｐ残基及びＴｘｐ（Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｐｒｏ）モチーフの存在をも検出した。これらの特徴は、ケモカイン受容体中の硬度に保存された構造決定要素であり、受容体の活性化において重要な役割を果たす（４０〜４１）。組織発現パターンと同様に、これらのＧＰＲ３５の構造的特徴は、ＧＰＣＲ３５がＣＸＣＬ１７受容体であり得ることを強く示唆した。
【００７４】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用い、本発明者らは、ＧＰＲ３５が休止ＴＨＰ−１単球中で発現し、ＰＧＥ２刺激により著しく上方制御されていることを確認した（図３Ａ）。ＴＨＰ−１細胞中でのＧＰＲ３５の発現は、フローサイトメトリーにより確認された（図３Ｂ）。本発明者らは、ＧＰＲ３５を含まない細胞株に、この受容体をトランスフェクトすることにより、これまでの非応答性細胞におけるＣＸＣＬ１７に対する反応におけるカルシウム流を確立できることを証明しようとした。マウスプロＢ細胞株、Ｂａ／Ｆ３はＧＰＲ３５を発現しないので（４２）、本発明者らは、これらの細胞をトランスフェクションの実験に使用した。ヒトＧＰＲ３５でトランスフェクトしたマウスＢａ／Ｆ３細胞を組換え型ヒトＣＸＣＬ１７で刺激した時、本発明者らは、強いカルシウム流反応を観察した（図４Ａ）。重要なことに、この反応は、模倣トランスフェクトコントロール細胞では検出されなかった。更に、本発明者らは、ＣＸＣＬ１７の濃度上昇に対応する、Ｃａ+2スパイクの増加に伴う、ＣＸＣＬ１７用量反応パターンにも気づいた（図４Ｂ）。ＧＰＲ３５を他の細胞にトランスフェクトした時に、同様な結果が得られた（図６）。更に、本発明者らは、ＣＸＣＬ１４又はＣＣＬ２８等の他の粘膜発現ケモカインが、成功せずに、ＧＰＲ３５を介したシグナル伝達を誘発し得るかどうかを試験した（図７）。総合すれば、これらの観察は、ＧＰＲ３５がＣＸＣＬ１７の受容体であることを示している。
【００７５】
ＣＸＣＬ１７は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインサブファミリーに属し、これらのリガンドは、通常、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体に結合する（４３）。７種のＧＰＣＲメンバー：ＣＸＣＲ１からＣＸＣＲ７が、ケモカイン受容体のこのサブクラスを構成する（１）。ＣＸＣＬ１７に機能的に反応するＧＰＲ３５の能力を考慮すると、本発明者らは、ＧＰＲ３５ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）を受容体８（ＣＸＣＲ８）と名前を変更することを提案する。
【００７６】
最後のケモカイン結合受容体（ＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ１２と結合するＣＸＣＲ７）は、８年以上前に報告された（４４）ので、ＣＸＣＬ１７受容体としてのＣＸＣＲ８の同定はケモカインの分野にとって重要な貢献を示す。粘膜部位における、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸の生理的意義は検討されていないままである。しかし、ＧＰＲ３５は、すでに胃腸障害の潜在的に重要な標的として同定されている（３１）。重要なことに、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、原発性硬化性胆管炎を後続の潰瘍性大腸炎と強く関連させる、ミスセンス単一ヌクレオチド多形が同定された（５）。総合すれば、これらの観察は、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸が呼吸器系及び消化器系における重要なマクロファージ動員シグナルであることを強く示唆し、この軸が、消化管の炎症性疾患の原因に関与していることを更に示唆し、ＩＰＦ（３）、また肺病理における強いＣＸＣＬ１７の上方制御を本発明者らは観察した。肺及び消化管の両方の病態における炎症の重要性を考えると、本発明者らは、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸が、種々のヒトの疾患において大きく関与していると予測する。
【００７７】
実施例２：
細胞及び試薬
ヒトＴＨＰ−１、急性単球性白血病細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及びＩＬ−３−非依存性クローンのマウス骨髄由来プロＢ−細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン  １０００  Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン  １０００  Ｕ／ｍＬ、及びグルタミン  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、全ては、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ由来）中で維持する。提示される種々の実験に使用する試薬は：精製ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、及びポリクローナルウサギ抗−ヒトＧＰＲ３５（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を含む。ＥｃｏＲＩ（５'）及びＸｈｏＩ（３'）でｐｃＤＮＡ３．１＋発現ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングされた、Ｇタンパク質共役受容体３５（ＧＰＲ３５）（野生型）のｃＤＮＡを含む、ヒトＧＰＲ３５クローンは、Ｔｈｅ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｏｌｌａ，ＭＯ）から得ることができる。オープンリーディングフレームは、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。挿入サイズ＝９３０ｂｐ。Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ受け入れ番号、ＡＹ２７５４６７。
【００７８】
ＢＩＧＥデータベース
ＢＩＧＥデータベースの構成を説明する（３、２７）。手短に言えば、人体の１０５の異なる部位に対応する組織又は細胞を、死後５時間以内に得た。記載したようにしてＲＮＡを調製し、Ｕ１３３  ２．０遺伝子アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とハイブリダイズするｃＤＮＡを調製するために使用した。得られたデータを標準化し、ＧＰＲ３５（２１０２６４＿ａｔ）に対応するプローブセットを使用し、人体におけるＧＰＲ３５の発現を測定した。
【００７９】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）データは、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙをベースとするシステム（Ｒｏｃｈｅのアノテーションはここに行く必要がある）を使用し、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０により作成する。手短に言えば、全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ'ｓ  ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ精製キットを用いて、ＴＨＰ−１細胞から抽出する。ｃＤＮＡを生成するために、等濃度の全ＲＮＡを、逆転写反応で使用する（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。４０サイクルのＰＣＲの実行あたり、５０ｎｇの各ｃＤＮＡを使用する。ＣＸＣＬ１７の量を定量的に決定し、各組織試料において遺伝子を制御するために、各反応について、遺伝子特異的プライマー、及び対応するＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙを使用する。結果を処理し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  におけるワールドワイドウェブ）を使用して分析する。
【００８０】
走化性アッセイ
走化性アッセイは、上部の挿入部及び下部のチャンバーを備える、２４ウェルのトランスウェル遊走プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて実施する。６００μＬの走化性緩衝液（Ｃ−緩衝液）（不完全ＲＰＭＩ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中の２００ｎｇ／ｍＬの組換え型ケモカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、トランスウェルプレートの底部のチャンバーに加える。これらのアッセイに使用するトランスウェルプレートは、５．０μｍの大きさの穴を有していた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）。特に指摘しない限り、０．５〜１．０×１０6個の細胞を、全ての細胞株の細胞の入力数として使用する。アッセイプレートの上部の挿入部にそれらを加える前に、細胞をＣ−緩衝液中で３回洗浄する。アッセイは、３７℃及び５％  ＣＯ2中で１８〜２０時間インキュベートする。走化性は、顕微鏡を使用して定期的に監視する。言及される場合、細胞は、走化性アッセイの開始前に、２００ｎｇ／ｍＬの百日咳毒素（ＰＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又は１０μＭのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（Ｓｉｇｍａ）で２４時間処理する。
【００８１】
フローサイトメトリーによる、走化性の定量
このプロトコルは、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら（４５）から適応される。手短に言えば、走化性アッセイの終了時に、走化性細胞をプレートの底部のチャンバーから収集し、ＦＡＣＳチューブに遠心沈殿し、２００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁する。標準は、２００μＬの１×ＰＢＳ中の１．０×１０6〜１．０×１０2細胞の範囲の細胞の１０倍希釈により生成することができる。標準及び全ての走化性細胞の細胞カウントは、３０秒内にカウントされたイベントの数として記録される。細胞の正確な数は規格として知られているので、それらの細胞のカウントは、標準曲線を作成するために使用される。この標準曲線から得られた近似曲線及び式は、分析される各細胞株又は初代細胞の走化性細胞の相対数を計算するために使用される。これら定量実験のために、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒマシン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が使用される。
【００８２】
ＧＰＲ３５トランスフェクションアッセイ
Ｂａ／Ｆ３細胞をＣｙｔｏｍｉｘ緩衝液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ2、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ  ７．６、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に、２×１０7細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁し、５００μＬの懸濁液を、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｃａｌａ，ＦＬ）に移す。次いで、２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋／ＧＰＲ３５  ＤＮＡを細胞にトランスフェクトする。キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドＤＮＡを加え、ゆっくりとピペッティングすることにより混合する。次いで、混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）パルスシステムを用い、９６０μＦの静電容量で３００Ｖの単一の電気パルスに曝す。収集前に、細胞を、完全培地中、３７℃（５％  ＣＯ2雰囲気）中で４８時間回復させ、Ｃａ+2動員アッセイを実施する。
【００８３】
カルシウム動員アッセイ
ＴＨＰ−１又はトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞におけるカルシウム試験のために、５×１０7細胞／ｍＬに、カルシウムグリーン−１−ＡＭ及びｆｕｒａ−ｒｅｄ−ＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、両者とも１０μｍｏｌ／Ｌの最終線量濃度で、補充していないＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で３０分間負荷する。負荷した細胞を、０．１４ｇ／ＬのＣａＣｌ2を含むハンクスのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ，Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｅｌｌｇｒｏ）で１度洗浄し、ＨＢＳＳ中、１．５×１０6細胞／ｍＬで再懸濁し、光から保護しながら、すぐに氷上に置く。活性化の前に、細胞を３７℃で１５分間加温する。３０秒間のデータ獲得に次ぎ、種々の量のヒト組換え型ＣＸＣＬ１７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を加えることにより細胞を刺激し、陽性対象−刺激を表す、分析される全ての細胞群の生存率を決定するための最終段階で、１００μＭのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による刺激を用いる。個々の細胞のｆｕｒａ  ｒｅｄ蛍光に対するカルシウムグリーンの比を、活性化剤の添加の前後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ  ＦＡＣＳソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析する。データは、時間に対する蛍光の関数（相対的細胞内カルシウム）のような任意の単位で示す。
【００８４】
実施例３：
「エピトープ」という用語は、抗体又は骨格をベースとする、又は受容体タンパク質の１以上のループのような、結合ドメインに特異的に結合することのできるタンパク質決定因子を意味する。
【００８５】
これらのエピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が後者ではないが、変性溶媒又は熱処理の存在下で失われる点で区別される。
【００８６】
立体構造エピトープは、標的分子の直鎖状配列の異なる部分からのアミノ酸が３次元空間に近接して一緒になるときに起こる、標的分子の立体的折りたたみから生じる。
【００８７】
ケモカインは、保存された３次元構造、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基によって安定化された、いわゆるＩＬ８様ケモカイン折りたたみを共有する。
【００８８】
興味深いことに、活褶曲を維持しながら、ＣＸＣＬ１７の予測されるＩＬ８様ケモカイン構造は、３次元構造における非標準領域中のジスルフィド結合を明らかにする。既知のケモカインのものとは異なる他の既知のファミリーのメンバーとそのシステインパターンとの低い配列類似性は、ケモカインＣＸＣＬ１７が、標準的な配列に基づく方法によって、アノテーションを免れた理由である（２）。
【００８９】
ケモカイン受容体の活性には、ケモカインＮ−ループと受容体Ｎ−末端残基との相互作用、及びケモカインＮ−末端と受容体細胞外／膜貫通残基を必要とし（４６）、これは、この相互作用の立体配座状態が非常に重要であることを示している。
【００９０】
そこで、組換え型ＣＸＣＬ１７調製物を加熱し（９５℃、１０分間）、その後の即座の熱ショック（４℃、５分間）により、本発明者らは、ケモカインを変性させ、活性立体構造への再生を防止することができる。これを実施することにより、タンパク質の元の３次元構造が破壊されるが、アミノ酸配列により定義される、タンパク質の一次構造は無傷のままのはずである。ポリペプチド及び配列が無傷のままであることを証明するために、無傷のポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は他の分析法により評価してもよい。
【００９１】
元の「立体的に活性な」ＣＸＣＬ１７を、予めＣａ＋２感受染料（Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ及びカルシウムグリーン）を負荷して、ＣＸＣＲ８でトランスフェクトした細胞に添加すると、蛍光比の増加により測定される細胞内Ｃａ＋２濃度の増加は、フローサイトメトリーにより検出することができる。同じアッセイに熱変性したＣＸＣＬ１７を加えた場合、Ｃａ＋２シグナル伝達が存在しないことにより示されるように、細胞は応答性でない。この反応は、ＣＸＣＬ１７自体によるポリペプチド配列がＣＸＣＲ８との結合及び機能的活性化の原因でないが、それは立体的に完全な天然型であることを示している。
【００９２】
実施例４：
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用は、消化器の炎症性疾患において重要な役割を果たしている可能性がある（３１）。重要なことに、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、原発性硬化性胆管炎を後続の潰瘍性大腸炎と強く関連させる、ＣＸＣＲ８／ＧＰＲ３５ミスセンス単一ヌクレオチド多形が同定された（５）。この種の情報は、おそらく消化器の炎症性疾患においてＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８の関与を生じる。ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用のアゴニスト及び／又はアンタゴニストの効果は、胃腸障害の前臨床マウスモデルを用いてアッセイすることができる。２種の大腸炎の優勢なマウスのモデルが、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（４７〜４８）、又は２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（４９〜５１）を用いて誘発される。それは急性又は慢性の形態のいずれかで誘導することができるので、ＤＳＳモデルは、より多くのＴＮＢＳモデルよりも、ヒト大腸炎を模倣する（４７〜４９）。
【００９３】
これらのモデルは十分に確立されており、一貫して再現性のある結果をもたらすことが示されている。したがって、これらのシステムにアゴニスト又はアンタゴニストを加えることの効果は、アゴニスト／アンタゴニスト処理及び未処理マウスの応答を、治療範囲内の選択された薬理学的投与において比較した場合に、アッセイ読み出しにおいて検出するのが容易であるべきである。特に、疾患の病因及び重症度は、動物の２つのコホート間で比較されることになる。アゴニスト／アンタゴニストの理想的な投与量及び送達経路は、容易に変化することもあり、試験することもでき、最終的にこれらのモデルを使用して決定することもできる。
【００９４】
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８欠損（ノックアウト）マウス株は、胃腸障害におけるアンタゴニストの効果を予測するために使用することもできる。これらのマウス株は、リガンド又は受容体のいずれかの発現を欠くため、アンタゴニストで処理した野生型（ＷＴ）マウスと同様に挙動する。大腸炎の前臨床マウスモデルに対する、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８欠損マウスの応答は、野生型マウスの応答と比較することができ、特異的なアンタゴニストの効果に関する結論を出すことができる。動物モデルは、ケモカイン又は受容体の評価が、用量及び治療方針を決定するために特定の動物の診断又は治療サブセットを提供し得るかどうかを確立するために使用することができる。
【００９５】
１つの実施例では、ＣＸＣＬ１７に対して標的とするモノクローナル抗体を、大腸炎の急性マウスＤＳＳモデル（５２）に使用する。抗体は、図面に示すように、ＣＸＣＲ８でトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞で観察されたカルシウム流を阻害することにより、抗体がＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用を阻害することを確認するために選択される。実験は、マウスの４種のコホート、例えば、アイソタイプ対照抗体を受ける１つのコホート、抗−ＣＸＣＬ１７抗体を受ける１つのコホート、アイソタイプ対照抗体とＤＳＳとを受ける１つのコホート、及び抗−ＣＸＣＬ１７抗体とＤＳＳとを受ける最終のコホートを使用することができる。実験期間にわたり、ＤＳＳを受けるマウスは、１日及び５日に飲料水中に投与され；対象マウスは、単にオートクレーブ処理された飲料水が与えられる。抗−ＣＸＣＬ１７抗体又はアイソタイプ対照抗体は、ＤＳＳ処理の間、３回（ＤＳＳ処理開始前に１回の注射、ＤＳＳ処理の間に２回の注射）、腹腔（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射を介して適切な用量でマウスに与えられる。
【００９６】
抗−ＣＸＣＬ１７抗体の効果は、マウスの体重の変化、胃腸症状、例えばＤＳＳ処理の経過の際の下痢／血便の発生を分析することにより、アッセイすることができる（５２）。結腸の炎症のレベルは、例えば、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、及び／又は個々の免疫細胞集団の免疫表現型を用い、実験終了時に分析する（５２）。
【００９７】
例は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は他の疾患のような胃腸障害を有するヒトを含む他の対象で使用することができる。例えば、Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．Ｃ．Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｂｏａｒｄ  Ｒｅｖｉｅｗ，第４版、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３；Ｈａｗｋｅｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１２；並びにＹａｍａｄａ  Ｔ．ら、Ｙａｍａｄａ'ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１３を参照のこと。遺伝的モデル、例えばノックアウトマウスは、治療試験のための試験対象として特に有用である。
【００９８】
実施例５：
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用の標的におけるアゴニスト又はアンタゴニストの効果は、呼吸器疾患の前臨床マウスモデルを使用して示すことができる。ヒト特発性肺線維症（ＩＰＦ）のマウスブレオマイシンモデルが、動物におけるＩＰＦを調査するために使用されている（５３〜５５）。例えば、Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏａｎ  Ｇｉｌ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９０；及びＦｉｓｈｍａｎ'ｓ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｉｓｈｍａｎら，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  ２００８を参照のこと。
【００９９】
動物の２つのコホート（未処理に対するアゴニスト／アンタゴニスト処理）を用い、両コホートにおける疾患の進行及び重症度を比較する。適切な治療用量及び治療処置が動物に適用される。アゴニスト／アンタゴニストに関する結論は、これらの実験結果の分析後に行われる。更に、アゴニスト／アンタゴニストの量及び送達経路を、このモデルを使用して比較する。
【０１００】
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８欠損（ノックアウト）マウス株は、呼吸器疾患におけるアンタゴニストの効果を予測するために使用される。これらのマウス株は、リガンド又は受容体のいずれかの発現を欠き、それ故、アンタゴニストで処理した野生型（ＷＴ）マウスと同様の挙動をする。ＩＰＦの前臨床マウスモデルに対するＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８欠損マウスの応答を、ＷＴマウスの応答と比較し、特定のアンタゴニストの効果に関する結論がなされる。
【０１０１】
１つの例は、ＩＰＦのマウスブレオマイシンモデルにおいて、リガンドアンタゴニストとして、ＣＸＣＲ８を標的とするモノクローナル抗体を使用する。抗体は、それが、図示されるようにＣＸＣＲ８でトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞において観察されるカルシウム流を阻害することにより、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用を阻害することを確認するために試験をされる。実験は、例えば４つのコホート：アイソタイプ対照抗体を受ける１つのコホート、抗−ＣＸＣＲ８抗体を受ける１つのコホート、アイソタイプ対照抗体とブレオマイシンとを受ける１つのコホート、及び抗−ＣＸＣＲ８抗体とブレオマイシンとをふける最終のコホートを使用することができる。実験期間にわたり、ブレオマイシンを受けるマウスは、例えば、腹腔内（ｉ．ｐ．）又は器官内（ｉ．ｔ．）滴下（２２２９４２２６）を介して投与を受ける。肺の繊維化を達成するため、２〜３週間にわたってブレオマイシンが複数回投与され、その後、肺の繊維化を評価する。抗ＣＸＣＲ８抗体又はアイソタイプ対照抗体は、ブレオマイシン処理の間、３回、腹腔（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射を介してマウスに与えられる。１回の注射はブレオマイシン処理前であり、２回の注射はブレオマイシン処理の間である。
【０１０２】
抗−ＣＸＣＲ８抗体の効果は、ＤＳＳ処理の経過の際のマウスの体重の変化を分析することにより、アッセイする（５６）。肺の炎症は、例えば、肺のコラーゲン及び／又はヒドロプリン含量を測定し、及び／又は免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により、実験終了時に分析される（５６）。
【０１０３】
類似の例は、例えば、特発性肺線維症又は他の呼吸器疾患の影響を受けているヒトを含む、他の対照に適用可能である。例えば、Ｊｕｄｄ，Ｓ，Ｊ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ，第２版、Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，２０１２；及びＬｅｃｈｎｅｒ，Ａ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ  ＬＡＮＧＥ，２０１２を参照のこと。
【０１０４】
実施例６：
多発性硬化症（ＭＳ）は、若年成人における身体障害の最も一般的な非外傷性の原因である、ヒトの中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫媒介性脱髄疾患である。Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｎ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，第４版、ｄｅｍｏｓ  Ｈｅａｌｔｈ  ２０１２を参照のこと。それは、損傷部位へのＴ細胞及びマクロファージの活性化及び動員、並びに脱髄性抗体の産生を特徴とする（５７）。
【０１０５】
実験的自己免疫性脳髄膜炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの動物モデルである（５８）。それは、注入されたミエリンタンパク質に対する自己免疫応答の誘導に基づいている。
【０１０６】
ＥＡＥは、ミエリン抗原に対するＴ細胞の受動伝達によっても誘導することができる。種々の免疫プロトコルを用い、急性及び慢性−再発性ＥＡＥモデルを誘導することができる。
【０１０７】
ＥＡＥの原因における、種々のケモカイン及びケモカイン受容体の役割は、広く研究されてきた。ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１６ケモカインは、ＥＡＥモデルのＣＮＳで発現することが報告された。ＣＣＬ２ケモカイン（単球走化性タンパク質−１）は、ＣＣＲ２受容体と結合することにより、単球、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びミクログリアで作用する。ＣＣＬ２は、星状細胞、ミクログリア、内皮細胞、及びマクロファージにより産生され得る。興味深いことに、ＣＣＬ２欠損マウスはＥＡＥの誘発に対して著しく耐性であり、ＣＮＳへのマクロファージ動員を著しく減少させる（５９）。更に、ＣＣＲ２ノックアウトマウスは疾患の臨床兆候を発生せず、ＣＮＳにおけるＣＣＬ２ケモカイン及びＣＣＲ２受容体の両方の上方制御は、ＥＡＥの再発と関連している（６０−６１）。
【０１０８】
結果は、ＣＣＲ１ノックアウトマウスが、減衰形態の疾患を発生し得ることも示す（６２）。ＣＣＲ１リガンドの中に、ＣＣＬ３（ＭＩＰ１−ａ、マクロファージ炎症性タンパク質−１）、及びＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ、活性化時に調節される、発現及び分泌された正常Ｔ細胞）、ＥＡＥのＣＮＳ障害において発現するケモカインがある。抗−ＣＣＬ３抗体による処理ＥＡＥの発症を阻害し、ＣＮＳにおける単球細胞の蓄積が減少することがわかった（６３）。
【０１０９】
ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８軸は、単球／マクロファージの主要な走化性決定基（ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８）であるので、ＭＳの処理は、ケモカイン又はＣＮＳに対するこれらの細胞の受容体誘発性動員のいずれかを遮断する治療を含める必要がある。この実施例における遮断薬（アンタゴニスト）は、ＣＸＣＲ８と結合するがシグナル伝達しないＣＸＣＬ１７ムテインである。これは、ネイティブ（非変異）ＣＸＣＬ１７により誘導されるＣＸＣＲ８におけるＣＸＣＬ１７により誘導されるカルシウム流を阻害する能力により示される。ＣＸＣＬ１７ムテインが、ＣＸＣＲ８トランスフェクタントにおけるカルシウム流を誘発しないことも示されている。マウスは、それに対する免疫応答を誘導し、動物における実験的アレルギー性脳脊髄炎を誘発するアジュバント中のミエリン塩基性タンパク質が投与される。対象群は、プラセボを投与され、実験群はＣＸＣＬ１７ムテインを投与される。ＣＸＣＬ１７ムテインの効果は、例えば、プラセボ又はＣＸＣＬ１７ムテインを投与されたマウスにおけるＥＡＥの進行を追跡することにより評価される。実験マウスへのムテインの投与により、ＥＡＥの進行が減少する。
【０１１０】
実施例７：
本発明の実施形態の他の使用は、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用又は模倣ＣＸＣＬ１７（ＣＸＣＲ８のアゴニストである）を拮抗する化合物を同定することである。この目的を達成するため、ＣＸＣＬ１７の能力を阻害し、ＣＸＣＲ８トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発する化合物のための化合物ライブラリーをスクリーニングするために、上述したＦＬＩＰＲのような技術を使用することが可能である。他の戦略においては、トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発するが、対応するトランスフェクトしていない細胞では誘発しない化合物を同定するために、ＣＸＣＲ８を使用することができる。後者の化合物はＣＸＣＲ８のアゴニストである。
【０１１１】
他の実施形態では、本発明は、ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８相互作用を阻害する抗体を同定するために使用することもできる。この目的を達成するため、抗体は、リガンド（ＣＸＣＬ１７）に対するものであっても、受容体（ＣＸＣＲ８）に対するものであってもよい。しかし、本発明者らは、これらのタンパク質に対する抗体のサブセットのみが、ＣＸＣＬ１７の、ＣＸＣＲ８を介したシグナル伝達をする能力を阻害することができると予測することができる。これらの阻止抗体を同定するために、本発明者らは、ＣＸＣＲ８トランスフェクタント内でＣＸＣＬ１７によって誘導されるカルシウム流を阻害するそれらの能力について、抗体を試験することができる。これを実施するため、本発明者らは、ＣＸＣＲ８トランスフェクタントを試験すべき抗体と一緒に配置した後、種々の機器（蛍光光度計、蛍光標示式細胞分取器等）によって検出可能なカルシウム流を誘導するためにＣＸＣＬ１７を加える。カルシウム流を阻害する抗体は阻止抗体（ＣＸＣＬ１７／ＣＸＣＲ８アンタゴニスト）を表す。抗体は、ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＲ８のいずれかで免役した動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）から製造することができる。力価を測定すると、脾臓を、ハイブリドーマを生産するために骨髄腫細胞パートナーと融合するために使用することができ、又はファージディスプレイライブラリーを製造することができる。いずれかの技術により、ＣＸＣＬ１７又はＣＸＣＲ８のいずれかと結合する抗体の同定を導くことができ、ＣＸＣＲ８を介したシグナル伝達を阻害する、それらの能力は、カルシウム流の阻害により測定することができる。
【０１１２】
実施例８：
種々の走化性受容体の放射性リガンド置換試験を実施した。放射性リガンドアッセイのために、それぞれのケモカイン受容体を一時的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の膜を、約５０ｐｍｏｌの125Ｉ−ケモカインとインキュベートし、ケモカイン（対照）又はＣＸＣＬ１７の濃度を上昇させた。細胞を、４℃で３時間インキュベートし、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む結合緩衝液で２回洗浄した。溶解緩衝液で試料を収集した後、残った細胞結合放射活性をカウントした。図９（表３）の結果は、ＣＸＣＬ１７がそれぞれの受容体由来の種々のリガンドを示さないことを示す（ｎ．ｄ．＝検出できない）。
【０１１３】
β−アレスチン動員アッセイは、酵素相補に基づき、ケモカイン誘導β−アレスチン動員を監視するために、β−アレスチン細胞を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ２  （ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ））を用いて実施した。図１０（表４）の結果は、ＣＸＣＬ１７が細胞で効果を有していないことを示す。
【０１１４】
実施例９：
サルモネラ感染マウスにおけるＣＸＣＲ８及びＣＸＣＬ１７の発現を測定した。サルモネラに感染した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の小腸を、実験終了時（１週目）に収集した。ＲＴ−ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析のために、各腸からＲＮＡを抽出した。図１１に示すように、感染を模倣したマウスと比較し、サルモネラ感染したマウスで、ＣＸＣＲ８及びＣＸＣＬ１７の発現が増加していた。これらの結果は、ＣＸＣＲ８及びＣＸＣＬ１７の両方の発現が、炎症状態により腸内に誘導され、これは、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７の消化管炎症における役割を示唆している。
【０１１５】
実施例１０：
潰瘍性大腸炎のマウスモデルで、ＣＸＣＲ８レベルを調査した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を、野生型（Ｃ５７Ｂ１／６）マウスにおける潰瘍性大腸炎モデルとしての消化管炎症を誘導させるために使用した。処理の７日後、遺伝子発現分析のために、ＤＳＳ処理したマウス、及び模倣処理したマウスからクローンを収集した。図１２に示すように、Ｈ２Ｏで処理したマウスと比較し、ＤＳＳ処理したマウスでは、ＣＸＣＲ８の発現が増加していた。これらの結果は、消化管の炎症性疾患の原因における、ＣＸＣＲ８／ＣＸＣＬ１７軸の役割を示唆している。
【０１１６】
実施例１１：
ＣＸＣＲ８：ＣＸＣＬ１７の走化性活性を、確立され、十分に特徴付けられたマクロファージ走化性軸である、ＣＣＲ２：ＣＣＬ２の走化性活性と比較した。底部チャンバーに１００ｎｇの組換え型ヒトケモカインを負荷したトランスウェル走化性プレートの上部チャンバーに、１×１０＾６個のＴＨＰ−１細胞を負荷した。２０時間後、底部チャンバーに移動した細胞をカウントすることにより、走化性を測定した。百日咳毒素（ＰＴＸ）を使用して走化性反応を阻害し、それがＧ−タンパク質シグナル伝達に関与することを確認した。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ2）は、ＣＸＣＬ１７及びＣＣＬ２の両方に対して走化性を高める。図１３に示すように、ＣＸＣＲ８：ＣＸＣＬ１７により媒介される走化性は、ＣＣＬ２と匹敵していた。
【０１１７】
実施例１２：
トランスウェル移動アッセイを用いて、組換え型ヒトＣＸＣＬ１７に対する走化性応答について、ＴＨＰ−１細胞を試験した。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、百日咳毒素（ＰＴＸ）による２４時間の前処理の後、又はグルタルアルデヒドによる処理後に、細胞を単独で試験した。ＰＴＸは、ケモカイン受容体（Ｇαｉ  Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ））を介したシグナル伝達を阻害するので、ＴＨＰ−１細胞は、ＣＸＣＬ１７に反応して遊走することができない。細胞生存度を低下させることなく、それらの走化性能力を消失させる、ＴＨＰ−１細胞の全ての膜タンパク質を架橋するために、０．０５％グルタルアルデヒドを使用した。ＣＣＬ２は、陽性対照として使用した。走化性を誘発するために、２００ｎｇ／ｍＬのケモカインを使用した。架橋の結果を図１６に示す。結果は、膜タンパク質の穏やかな架橋がＣＸＣＬ１７に対する走化性を排除することを示す。
【０１１８】
参考文献
１．Ｚｌｏｔｎｉｋ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｏ．  Ｙｏｓｈｉｅ．  ２０１２．  Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６：７０５−７１６．
２．Ｐｉｓａｂａｒｒｏ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｂ．  Ｌｅｕｎｇ，  Ｍ．  Ｋｗｏｎｇ，  Ｒ．  Ｃｏｒｐｕｚ，  Ｇ．  Ｄ．  Ｆｒａｎｔｚ，  Ｎ．  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｒ．  Ｖａｎｄｌｅｎ，  Ｌ．  Ｊ．  Ｄｉｅｈｌ，  Ｎ．  Ｓｋｅｌｔｏｎ，  Ｈ．  Ｓ．  Ｋｉｍ，  Ｄ．  Ｅａｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｎ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ．  ２００６．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｆｏｌｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：２０６９−２０７３．
３．Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｋ．  Ｐ．  Ｔａｉ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｆｌｏｒｅｓ−Ｇｕｉｔｅｒｒｅｚ，  Ｎ．  Ｖｉｌｃｈｅｓ−Ｃｉｓｎｅｒｏｓ，  Ｋ．  Ｋａｍｄａｒ，  Ｏ．  Ｂａｒｂｏｓａ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ｒ．  Ｖａｌｌｅ−Ｒｉｏｓ，  Ｐ．  Ａ．  Ｈｅｖｅｚｉ，  Ｊ．  Ｚｕｎｉｇａ，  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ，  Ａ．  Ｊ．  Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｚｌｏｔｎｉｋ．  ２０１２．  ＣＸＣＬ１７  ｉｓ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｏａｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８８：６３９９−６４０６．
４．Ｓｈａｒｍａ，  Ｍ．  ２０１０．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ａ  ｆｉｎｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３０：１−２２．
５．Ｅｌｌｉｎｇｈａｕｓ，  Ｄ．，  Ｔ．  Ｆｏｌｓｅｒａａｓ，  Ｋ．  Ｈｏｌｍ，  Ｅ．  Ｅｌｌｉｎｇｈａｕｓ，  Ｅ．  Ｍｅｌｕｍ，  Ｔ．  Ｂａｌｓｃｈｕｎ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｌａｅｒｄａｈｌ，  Ａ．  Ｓｈｉｒｙａｅｖ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｇｏｔｔｈａｒｄｔ，  Ｔ．  Ｊ．  Ｗｅｉｓｍｕｌｌｅｒ，  Ｃ．  Ｓｃｈｒａｍｍ，  Ｍ．  Ｗｉｔｔｉｇ，  Ａ．  Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ，  Ｅ．  Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎ，  Ｈ．  Ｕ．  Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，  Ｍ．  Ｖａｔｎ，  Ａ．  Ｔｅｕｆｅｌ，  Ｃ．  Ｒｕｓｔ，  Ｃ．  Ｇｉｅｇｅｒ，  Ｈ．  Ｅ．  Ｗｉｃｈｍａｎｎ，  Ｈ．  Ｒｕｎｚ，  Ｍ．  Ｓｔｅｒｎｅｃｋ，  Ｃ．  Ｒｕｐｐ，  Ｆ．  Ｂｒａｕｎ，  Ｒ．  Ｋ．  Ｗｅｅｒｓｍａ，  Ｃ．  Ｗｉｊｍｅｎｇａ，  Ｃ．  Ｙ．  Ｐｏｎｓｉｏｅｎ，  Ｃ．  Ｇ．  Ｍａｔｈｅｗ，  Ｐ．  Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ，  Ｓ．  Ｖｅｒｍｅｉｒｅ，  Ｅ．  Ｓｃｈｒｕｍｐｆ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｈｏｖ，  Ｍ．  Ｐ．  Ｍａｎｎｓ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｂｏｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ａ．  Ｆｒａｎｋｅ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｈ．  Ｋａｒｌｓｅｎ．  ２０１２．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｉｓｋ  ｌｏｃｉ  ａｔ  ＧＰＲ３５  ａｎｄ  ＴＣＦ４．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．
６．Ｈｅｒｂｓｔ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｊ．  Ｖ．  Ｈｅｙｍａｃｈ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｍ．  Ｌｉｐｐｍａｎ．  ２００８．  Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９：１３６７−１３８０．
７．Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｇ．  Ｓｐｉｒｏ．  ２００６．  Ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  １１：２４１−２４８．
８．Ｍｏｌｉｎａ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｐ．  Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｃａｓｓｉｖｉ，  Ｓ．  Ｅ．  Ｓｃｈｉｌｄ，  ａｎｄ  Ａ．  Ａ．  Ａｄｊｅｉ．  ２００８．  Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉｐ．  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ  ８３：５８４−５９４．
９．Ｒｅｍｏｎ，  Ｊ．，  Ｐ．  Ｌｉａｎｅｓ，  Ｓ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｍ．  Ｖｅｌａｓｃｏ，  Ｒ．  Ｑｕｅｒｏｌ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｚａｎｕｉ．  ２０１３．  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ：  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｒａｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３９：５８４−５９１．
１０．Ｋｉｎｇ，  Ｔ．  Ｅ．，  Ｊｒ．，  Ａ．  Ｐａｒｄｏ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓｅｌｍａｎ．  ２０１１．  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７８：１９４９−１９６１．
１１．Ｓｅｌｍａｎ，  Ｍ．，  Ａ．  Ｐａｒｄｏ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇ，  Ｊｒ．  ２０１２．  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８６：３１４−３２４．
１２．Ｃｏｓｉｏ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｍ．  Ｓａｅｔｔａ，  ａｎｄ  Ａ．  Ａｇｕｓｔｉ．  ２００９．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０：２４４５−２４５４．
１３．Ｊｏｂｅ，  Ａ．  Ｈ．  ２０１１．  Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ２３：１６７−１７２．
１４．Ｋｕｄｏ，  Ｍ．，  Ｙ．  Ｉｓｈｉｇａｔｓｕｂｏ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ａｏｋｉ．  ２０１３．  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４：２６３．
１５．Ｗｈｉｔｅ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ａ．  Ｊ．  Ｉｑｂａｌ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｇｒｅａｖｅｓ．  ２０１３．  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ６５：４７−８９．
１６．Ｓｕｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｄ．  Ｙｅ．  ２０１２．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ３３：３４２−３５０．
１７．Ｖｅｔｔｅｒ，  Ｉ．  ２０１２．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＩＰＲ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ＧＰＣＲｓ．  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ７４０：４５−８２．
１８．Ｑｉｎ，  Ｚ．  ２０１２．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＨＰ−１  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２２１：２−１１．
１９．Ｋｕｒｔｈ，  Ｉ．，  Ｋ．  Ｗｉｌｌｉｍａｎｎ，  Ｐ．  Ｓｃｈａｅｒｌｉ，  Ｔ．  Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，  Ｉ．  Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｍｏｓｅｒ．  ２００１．  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｋｉｄｎｅｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （ＢＲＡＫ）  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：８５５−８６１．
２０．  Ｂｕｒｎｓ，  Ｄ．  Ｌ．  １９８８．  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ５：２８５−２８７．
２１．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｐ．  Ｍ．  １９９６．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ７：４７−６４．
２２．  Ｂｏｋｏｃｈ，  Ｇ．  Ｍ．  １９９５．  Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ８６：１６４９−１６６０．
２３．  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ａ．  Ｄ．，  Ｉ．  Ｓｚａｂｏ，  Ｆ．  Ｂｅｄｎａｒ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｊ．  Ｒｏｇｅｒｓ．  ２００２．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｐｉｏｉｄ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １３：２０９−２２２．
２４．  Ｋｏｈｏｕｔ，  Ｔ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ．  ２００３．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６３：９−１８．
２５．  Ｇｏｕｗｙ，  Ｍ．，  Ｓ．  Ｓｔｒｕｙｆ，  Ｓ．  Ｎｏｐｐｅｎ，  Ｅ．  Ｓｃｈｕｔｙｓｅｒ，  Ｊ．  Ｙ．  Ｓｐｒｉｎｇａｅｌ，  Ｍ．  Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ，  Ｐ．  Ｐｒｏｏｓｔ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ．  ２００８．  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｐｒｏｄｕｃｅｄ  ＣＣ  ａｎｄ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｖｅｎｔｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：４８５−４９５．
２６．  Ｒｏｔｈ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｐ．  Ｈｅｖｅｚｉ，  Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ｄ．  Ｗｉｌｌｈｉｔｅ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ａ．  Ｃ．  Ｆｏｓｔｅｒ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｚｌｏｔｎｉｋ．  ２００６．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ２０  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＮＳ．  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６７−８０．
２７．  Ｌｅｅ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｈｅｖｅｒ，  Ｄ．  Ｗｉｌｌｈｉｔｅ，  Ａ．  Ｚｌｏｔｎｉｋ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｈｅｖｅｚｉ．  ２００５．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９：１３５６−１３５８．
２８．  Ｏｔｅｒｏ，  Ｋ．，  Ａ．  Ｖｅｃｃｈｉ，  Ｅ．  Ｈｉｒｓｃｈ，  Ｊ．  Ｋｅａｒｌｅｙ，  Ｗ．  Ｖｅｒｍｉ，  Ａ．  Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ，  Ｓ．  Ｇｏｎｚａｌｖｏ−Ｆｅｏ，  Ｃ．  Ｇａｒｌａｎｄａ，  Ｏ．  Ａｚｚｏｌｉｎｏ，  Ｌ．  Ｓａｌｏｇｎｉ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｌｌｏｙｄ，  Ｆ．  Ｆａｃｃｈｅｔｔｉ，  Ａ．  Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓｏｚｚａｎｉ．  ２０１０．  Ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＣＲＬ２  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．  Ｂｌｏｏｄ  １１６：２９４２−２９４９．
２９．  Ｌｅｅ，  Ｗ．  Ｙ．，  Ｃ．  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｔ．  Ｙ．  Ｌｉｎ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｈｓｉａｏ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｗ．  Ｌｕｏ．  ２０１３．  ＣＸＣＬ１７，  ａｎ  ｏｒｐｈａｎ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３０４：Ｅ３２−４０．
３０．  Ｏ'Ｄｏｗｄ，  Ｂ．  Ｆ．，  Ｔ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ａ．  Ｍａｒｃｈｅｓｅ，  Ｒ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｋ．  Ｒ．  Ｌｙｎｃｈ，  Ｈ．  Ｈ．  Ｈｅｎｇ，  Ｌ．  Ｆ．  Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ，  Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｒ．  Ｇｅｏｒｇｅ．  １９９８．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４７：３１０−３１３．
３１．  Ｏｋｕｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｈ．  Ｂａｂａ，  Ｔ．  Ｋｕｍａｄａ，  Ｋ．  Ｎａｎｍｏｋｕ，  Ｈ．  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｙ．  Ｎａｋａｎｅ，  Ｋ．  Ｈｉｏｋｉ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｉｋｅｎａｋａ．  ２００４．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｈｏｗｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ＮＩＨ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９５：１３１−１３５．
３２．  Ｂａｒｔｈ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｎ．  Ａｈｌｕｗａｌｉａ，  Ｔ．  Ｊ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｈａｒｄｙ，  Ｓ．  Ｓｉｎｈａ，  Ｊ．  Ａ．  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃａｒｄｏｎａ，  Ｉ．  Ｅ．  Ｐｒｕｉｔｔ，  Ｅ．  Ｐ．  Ｒｈｅｅ，  Ｒ．  Ａ．  Ｃｏｌｖｉｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｅ．  Ｇｅｒｓｚｔｅｎ．  ２００９．  Ｋｙｎｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｆｉｒｍ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：１９１８９−１９１９５．
３３．  Ｙａｎｇ，  Ｙ．，  Ｊ．  Ｙ．  Ｌｕ，  Ｘ．  Ｗｕ，  Ｓ．  Ｓｕｍｍｅｒ，  Ｊ．  Ｗｈｏｒｉｓｋｅｙ，  Ｃ．  Ｓａｒｉｓ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｒｅａｇａｎ．  ２０１０．  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３５  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｔｈｍａ  ｄｒｕｇｓ  ｃｒｏｍｏｌｙｎ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｎｅｄｏｃｒｏｍｉｌ  ｓｏｄｉｕｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８６：１−５．
３４．  Ｈｏｒｉｋａｗａ，  Ｙ．，  Ｎ．  Ｏｄａ，  Ｎ．  Ｊ．  Ｃｏｘ，  Ｘ．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｏｒｈｏ−Ｍｅｌａｎｄｅｒ，  Ｍ．  Ｈａｒａ，  Ｙ．  Ｈｉｎｏｋｉｏ，  Ｔ．  Ｈ．  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｈ．  Ｍａｓｈｉｍａ，  Ｐ．  Ｅ．  Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ｌ．  ｄｅｌ  Ｂｏｓｑｕｅ−Ｐｌａｔａ，  Ｙ．  Ｏｄａ，  Ｉ．  Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｃｏｌｉｌｌａ，  Ｋ．  Ｓ．  Ｐｏｌｏｎｓｋｙ，  Ｓ．  Ｗｅｉ，  Ｐ．  Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ，  Ｎ．  Ｉｗａｓａｋｉ，  Ｊ．  Ｓｃｈｕｌｚｅ，  Ｌ．  Ｊ．  Ｂａｉｅｒ，  Ｃ．  Ｂｏｇａｒｄｕｓ，  Ｌ．  Ｇｒｏｏｐ，  Ｅ．  Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｈａｎｉｓ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｉ．  Ｂｅｌｌ．  ２０００．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：１６３−１７５．
３５．  Ｓｐａｒｆｅｌ，  Ｌ．，  Ｍ．  Ｌ．  Ｐｉｎｅｌ−Ｍａｒｉｅ，  Ｍ．  Ｂｏｉｚｅ，  Ｓ．  Ｋｏｓｃｉｅｌｎｙ，  Ｓ．  Ｄｅｓｍｏｔｓ，  Ａ．  Ｐｅｒｙ，  ａｎｄ  Ｏ．  Ｆａｒｄｅｌ．  ２０１０．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  １１４：２４７−２５９．
３６．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  Ｇ．  ２０１１．  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉａｓ：  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＧＰＲ３５．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ３２：３１７−３２５．
３７．  Ｄｅｎｇ，  Ｈ．，  Ｈ．  Ｈｕ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｆａｎｇ．  ２０１２．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｒｅ  ＧＰＲ３５  ａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２：３７３．
３８．  Ｄａｉｙａｓｕ，  Ｈ．，  Ｗ．  Ｎｅｍｏｔｏ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｔｏｈ．  ２０１２．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ  ａｍｏｎｇ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｄｅｃｏｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：２６４．
３９．  Ｋｉｍ，  Ｋ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇ．  Ｃａｒｏｎ．  ２００８．  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＲＹ  ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｔａｉｌ  ｏｆ  ＧＰＣＲＳ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ａｒｒｅｓｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３６６：４２−４７．
４０．  Ｇｏｖａｅｒｔｓ，  Ｃ．，  Ｃ．  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ｘ．  Ｄｅｕｐｉ，  Ｓ．  Ｂａｌｌｅｔ，  Ｊ．  Ａ．  Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ，  Ｓ．  Ｊ．  Ｗｏｄａｋ，  Ｇ．  Ｖａｓｓａｒｔ，  Ｌ．  Ｐａｒｄｏ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ＴＸＰ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ＣＣＲ５．  Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１３２１７−１３２２５．
４１．  Ｃａｎｃｅｌｌｉｅｒｉ，  Ｃ．，  Ｎ．  Ｃａｒｏｎｎｉ，  Ａ．  Ｖａｃｃｈｉｎｉ，  Ｂ．  Ｓａｖｉｎｏ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｂｏｒｒｏｎｉ，  Ｍ．  Ｌｏｃａｔｉ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｏｎｅｃｃｈｉ．  ２０１３．  Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄ６．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５５：８７−９３．
４２．  Ｗｕ，  Ｃ．，  Ｃ．  Ｏｒｏｚｃｏ，  Ｊ．  Ｂｏｙｅｒ，  Ｍ．  Ｌｅｇｌｉｓｅ，  Ｊ．  Ｇｏｏｄａｌｅ，  Ｓ．  Ｂａｔａｌｏｖ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｈｏｄｇｅ，  Ｊ．  Ｈａａｓｅ，  Ｊ．  Ｊａｎｅｓ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｈｕｓｓ，  ３ｒｄ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｉ．  Ｓｕ．  ２００９．  ＢｉｏＧＰＳ：  ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ  ｐｏｒｔａｌ  ｆｏｒ  ｑｕｅｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０：Ｒ１３０．
４３．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  Ｉ．  Ｆ．  Ｃｈａｒｏ，  Ｃ．  Ａ．  Ｈｅｂｅｒｔ，  Ｒ．  Ｈｏｒｕｋ，  Ｋ．  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，  Ｌ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ａ．  Ｐｏｗｅｒ．  ２０００．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ＸＸＩＩ．  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５２：１４５−１７６．
４４．  Ｈａｎ，  Ｄ．  Ｋ．，  Ｓ．  Ｙ．  Ｊｅｏｎｇ，  Ｙ．  Ｈ．  Ｋｉｍ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｇ．  Ｍｉｎ．  １９９２．  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｓ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｂｙ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏａｌｋｙｌ  ｃｈａｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ３：２２９−２４１．
４５．  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｃ．  Ａ．  Ｐｏｗｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｃｈｕｒｃｈ，  Ｄ．  Ｓｏｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｍａｃｋ．  ２００１．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ｕｎｉｔ１２  １４．
４６．  Ｊｏｓｅｐｈ，  Ｐ．  Ｒ．，  Ｋ．  Ｖ．  Ｓａｗａｎｔ，  Ａ．  Ｉｓｌｅｙ，  Ｍ．  Ｐｅｄｒｏｚａ，  Ｒ．  Ｐ．  Ｇａｒｏｆａｌｏ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ．  ２０１３．  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．
４７．  Ｗｈｉｔｔｅｍ，  Ｃ．  Ｇ．，  Ａ．  Ｄ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ．  ２０１０．  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  （ＤＳＳ）．  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．
４８．  Ｐｅｒｓｅ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｃｅｒａｒ．  ２０１２．  Ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ：  ｔｒａｐｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｃｋｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１２：７１８６１７．
４９．  Ｗｉｒｔｚ，  Ｓ．，  Ｃ．  Ｎｅｕｆｅｒｔ，  Ｂ．  Ｗｅｉｇｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆ．  Ｎｅｕｒａｔｈ．  ２００７．  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２：５４１−５４６．
５０．  Ｋａｗａｄａ，  Ｍ．，  Ａ．  Ａｒｉｈｉｒｏ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ．  ２００７．  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １３：５５８１−５５９３．
５１．  ｔｅ  Ｖｅｌｄｅ，  Ａ．  Ａ．，  Ｍ．  Ｉ．  Ｖｅｒｓｔｅｇｅ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｗ．  Ｈｏｍｍｅｓ．  ２００６．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ＴＮＢＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  １２：９９５−９９９．
５２．  Ｗａｌｄｎｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆ．  Ｎｅｕｒａｔｈ．  ２００９．  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：Ｕｎｉｔ  ５  ５５．
５３．  Ｐｅｎｇ，  Ｒ．，  Ｓ．  Ｓｒｉｄｈａｒ，  Ｇ．  Ｔｙａｇｉ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｐ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｌ．  Ｂｕｒｎｓ，  Ｌ．  Ｒｅｎｔｅｒｉａ，  Ｊ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ａｌｌａｒｄ，  Ｐ．  Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，  Ｈ．  Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｚ．  Ｌｉａｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｈｏｇａｂｏａｍ，  Ｃ．  Ｋｉｔｓｏｎ，  Ｄ．  Ｃ．  Ｂｕｄｄ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｆｉｎｅ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｂａｕｅｒ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓ．  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ．  ２０１３．  Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  “ａｃｔｉｖｅ”  ｄｉｓｅａｓｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５９３４８．
５４．  Ｍｏｅｌｌｅｒ，  Ａ．，  Ｋ．  Ａｓｋ，  Ｄ．  Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｇａｕｌｄｉｅ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋｏｌｂ．  ２００８．  Ｔｈｅ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ：  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４０：３６２−３８２．
５５．  Ｍｏｕｒａｔｉｓ，  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｖ．  Ａｉｄｉｎｉｓ．  ２０１１．  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｕｌｍ  Ｍｅｄ  １７：３５５−３６１．
５６．  Ｗａｌｔｅｒｓ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｒ．  Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ．  ２００８．  Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：Ｕｎｉｔ  ５  ４６．
５７．  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｎ．，  Ｉ．  Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｕｓ，  Ｍ．  Ｐｅｓｉｃ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｍｕｅｓ．  ２０１２．  Ａｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｄｙｓｓｅｙ：  ｈｏｗ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＣＮＳ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４８：１４０−１５５．
５８．  Ａｔｔｆｉｅｌｄ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｃ．  Ａ．  Ｄｅｎｄｒｏｕ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｆｕｇｇｅｒ．  ２０１２．  Ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇａｐ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４８：１０−２２．
５９．  Ｈｕａｎｇ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｐ．  Ｋｉｖｉｓａｋｋ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｒｏｌｌｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｍ．  Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ．  ２００１．  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  １  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３：７１３−７２６．
６０．  Ｉｚｉｋｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｒ．  Ｓ．  Ｋｌｅｉｎ，  Ｉ．  Ｆ．  Ｃｈａｒｏ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｗｅｉｎｅｒ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｄ．  Ｌｕｓｔｅｒ．  ２０００．  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＣＲ）２．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０７５−１０８０．
６１．  Ｆｉｆｅ，  Ｂ．  Ｔ．，  Ｇ．  Ｂ．  Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ，  Ｗ．  Ａ．  Ｋｕｚｉｅｌ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｊ．  Ｋａｒｐｕｓ．  ２０００．  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：８９９−９０５．
６２，  Ｒｏｔｔｍａｎ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ａ．  Ｊ．  Ｓｌａｖｉｎ，  Ｒ．  Ｓｉｌｖａ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｃ．  Ｇ．  Ｇｅｒａｒｄ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｗ．  Ｈａｎｃｏｃｋ．  ２０００．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｓ  ＣＣＲ１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：２３７２−２３７７．
６３．  Ｋａｒｐｕｓ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｎ．  Ｗ．  Ｌｕｋａｃｓ，  Ｂ．  Ｌ．  ＭｃＲａｅ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｔｒｉｅｔｅｒ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｋｕｎｋｅｌ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｄ．  Ｍｉｌｌｅｒ．  １９９５．  Ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：５００３−５０１０．
【０１１９】
本発明は、好ましい実施形態に関して記載されているが、修正及び変動が、本発明の原理及び範囲を逸脱することなく利用されてもよく、当業者はこのことを容易に理解するものである。従って、そのような修正は、本発明及び以下の特許請求の範囲内にて実施されてもよい。
【図１Ａ】
2016540033.tif 000003
【図１Ｂ】
2016540033.tif 000004
【図１Ｃ】
2016540033.tif 000005
【図２Ａ】
2016540033.tif 000006
【図２Ｂ】
2016540033.tif 000007
【図２Ｃ】
2016540033.tif 000008
【図３Ａ】
2016540033.tif 000009
【図３Ｂ】
2016540033.tif 000010
【図４Ａ】
2016540033.tif 000011
【図４Ｂ】
2016540033.tif 000012
【図５】
2016540033.tif 000013
【図６】
2016540033.tif 000014
【図７】
2016540033.tif 000015
【図８Ａ】
2016540033.tif 000016
【図８Ｂ】
2016540033.tif 000017
【図９】
2016540033.tif 000018
【図１０】
2016540033.tif 000019
【図１１】
2016540033.tif 000020
【図１２】
2016540033.tif 000021
【図１３】
2016540033.tif 000022
【図１４Ａ】
2016540033.tif 000023
【図１４Ｂ】
2016540033.tif 000024
【図１５】
2016540033.tif 000025
【図１６】
2016540033.tif 000026
【配列表】
2016540033000001.app
【国際調査報告】
2016540033.tif 000027
2016540033.tif 000028
2016540033.tif 000029