(57)【要約】【課題】従来技術の欠点を克服する、核酸をタンパク質に結合するための新規でロバストな方法を部分的に提供する。【解決手段】  タンパク質活性を維持する条件下での核酸及び目的のタンパク質の結合に関する方法及び組成物が提供される。核酸−タンパク質結合は、ＤＮＡオリガミ法を用いて作製されるもののような核酸ナノ構造において用いることができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＸＴＧＧＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号９）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体。
【請求項２】
前記タンパク質が、自然に存在するタンパク質であり、ＬＰＸＴＧＧＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号９）の前記アミノ酸配列が、自然に存在するタンパク質中に存在しない、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、ＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）である、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記核酸が、１〜１００ヌクレオチドの長さである、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体を単離形態で含む組成物。
【請求項６】
末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸、
ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｘ’ｎは、長さｎの独立して選択されるアミノ酸の一続きであり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号２）の末端アミノ酸配列を含むタンパク質、
ソルターゼ酵素、及び
ＴＥＶプロテアーゼ
の２以上の任意の組み合わせを含む組成物。
【請求項７】
前記末端アミノ酸配列が、ＬＰＥＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ’は、アミノ酸であり、ｎは０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号３）である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質、前記ソルターゼ酵素及び前記ＴＥＶプロテアーゼのいずれか１つ又は任意の組み合わせが、Ｈｉｓタグに結合している、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｈｉｓタグが、前記Ｘ’ｎアミノ酸配列に含まれる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｈｉｓタグと特異的に結合するビーズ（抗Ｈｉｓビーズ）をさらに含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ｎが、１〜１００、又は１〜９９、又は１〜９０の任意の数又は任意の数の範囲である、請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｈｉｓタグが、６ヒスチジン残基のアミノ酸配列（配列番号６）である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ｎが、１より大きい数である、請求項６から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸を、ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘは、アミノ酸であり、Ｘ’ｎは、長さｎの独立して選択されるアミノ酸の一続きであり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号２）の末端アミノ酸配列を含むタンパク質と、ソルターゼ酵素の存在下で反応させて、ＬＰＸＴＧＧＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号９）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーにより前記タンパク質に共有結合で結合した前記核酸を含む複合体を形成することを含む方法。
【請求項１５】
前記ソルターゼ酵素及びＬＰＸＴＧＸ’ｎ（配列番号２）の末端アミノ酸配列を含む前記タンパク質が、それぞれＨｉｓタグを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記末端アミノ酸配列が、ＬＰＥＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ’ｎは、長さｎのアミノ酸の一続きであり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号３）であり、前記アミノ酸リンカーのアミノ酸配列が、ＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｎが、１より大きい数である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した前記核酸が、バイオ直交型銅触媒型クリック化学反応により形成される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオ直交型銅触媒型クリック化学反応が、１又は複数のグリシン（Ｇ）残基及びＴＥＶ標的アミノ酸配列に結合した核酸を含む核酸中間体を形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸中間体を、ＴＥＶプロテアーゼと反応させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＥＶプロテアーゼが、Ｈｉｓタグに結合している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｈｉｓタグが、６ヒスチジン残基のアミノ酸配列（配列番号６）である、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年７月１０日に出願された「核酸−タンパク質複合体に関する組成物及び方法」と題する米国仮出願第６１／８４４，８１８号の利益を主張し、この仮出願の内容全体は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により支援された研究
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＤＣ００２２８１に基づく米国政府支援により行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡは、自己集合型ナノ構造の構築のために選択される足場になりつつある。これらの構造のプログラム化されたパターン形成のための技術は進歩していることから、現在では、複雑な集合体の創出が可能である（Linko及びDietz、Curr. Opin. Biotechnol. 24:555-561、2013）。これらの構造要素を採用してそれらを機能的ナノマシンにするために、非常に特異的な部位にタンパク質を組み込むことがしばしば必要である（Niemeyer、Trends in Biotech 20:395-401、2002）。目的のタンパク質をＤＮＡにうまくカップリングさせるための手段には障壁が付随する。タンパク質をオリゴヌクレオチド（オリゴ）と連結させるために日常的に用いられる化学的方法として、ジスルフィド結合及びチオール−第１級アミン結合が挙げられる（Cecconi C.ら、Eur. Biophys. J. 37（6）:729-38、2008）; Halvorsenら、Nanotechnol. 22:494005-494012、2011; Niemeyer及びSacca、Chem. Soc. Rev. 40: 5910-5921、2011）。これらの化学は時には効果的であるが、これらは生物学において一般的な官能基と反応する。よって、目的のタンパク質が内因性システインを有する場合、又は特定の第１級アミン（Ｎ末端に加えて、各リジンは第１級アミンを提供する）と結合させたい場合にはこれらの技術を用いることができない。これらの問題の多くを克服するために、銅を用いないクリック化学のようなバイオ直交型（bio-orthogonal）技術を開発するために研究しているグループがある（Gordonら、J. Am. Chem. Soc. 134: 9199-9208、2012）。これらの技術は特異性及び化学量論の問題点を克服するが、これらは、３つ全ての技術が直面する問題点に悩まされている。これらの技術は全て、最適以下の生理的条件で反応が行われる必要がある。室温、酸化／還元条件又は高／低ｐＨ条件のいずれかに長期間さらされると、あまり熱安定性でなく、これらの条件下で凝集したり及び／又は溶液から析出したりする傾向がある多くのタンパク質を用いる場合、これらの化学が機能しなくなる。これらの化学に伴うこれらの障害に加えて、タンパク質ごとに条件を周到に変更させなければならず、所望の生成物を選択的に精製する手段はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、従来技術の欠点を克服する、核酸をタンパク質に結合するための新規でロバストな方法を部分的に提供する。これらの方法は、オリゴヌクレオチドを含む核酸及び小型の典型的には合成のペプチドに対して行われる化学にまず取り組んでいる。このような核酸及びペプチドは、典型的に、本開示で企図されるある特定の化学を行うために用いられる場合がある非生理的条件に対してより耐容性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、まず、核酸（例えばＤＮＡ）を、短い、典型的には合成のペプチドに結合して、核酸−ペプチド結合を形成することと、次いで、トランスペプチダーゼ（例えばソルターゼ酵素）反応を用いて核酸−ペプチド結合を目的のタンパク質に結合することとを含む、２工程の方法及びその変形を提供する。２工程アプローチの少なくとも１つの利点は、タンパク質の活性を損なう可能性がある好ましくない反応環境からタンパク質を守ることができることである。２工程アプローチを用いて、第１工程でこれらの好ましくない反応条件を用い、第２工程でタンパク質を導入する。
【０００６】
よって、本開示の方法は、いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドのような核酸を、１又は複数の連続するＮ末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合することを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、３つの連続するＮ末端グリシン残基を含む。アミノ酸配列は、典型的に、短いペプチド、典型的に合成ペプチドに含まれる。Ｎ末端ＧＧＧモチーフは、本開示の方法において用いられるソルターゼ酵素により認識される。
【０００７】
アミノ酸配列は、精製の目的のために用いることができるさらなるアミノ酸配列をさらに含んでよい。これらのアミノ酸配列は、本明細書において精製タグ又は親和性標識と称する場合があり、それらに限定されないが、Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇ配列（又はＦｌａｇタグ）を含み、そのアミノ酸配列は当業界公知であり、本明細書に示される。
【０００８】
ペプチドへのオリゴヌクレオチドの結合は、例えばバイオ直交型銅触媒型クリック化学反応を用いて達成できる。ペプチドに結合するオリゴヌクレオチドは、アジドを含んでよい。アジドは、３’端若しくは５’端にあるか、又は内部アジドであってよい。結合するペプチドは、アルキンを含んでよく、アルキンは、相補的クリック試薬として働く。或いは、ペプチドは、アジドを含んでよく、オリゴヌクレオチドは、アルキンを含んでよい。核酸をペプチドへ結合するために他の結合法を用いてよいことが理解される。例えば、この第１工程は、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて達成して、シスチン（ペプチド中の）をアミン官能化オリゴヌクレオチドにカップリングさせることもできる。
【０００９】
この第１反応工程で得られる生成物は、１又は複数の（例えば３つの）グリシン残基と、任意選択により、それらに限定されないがＦｌａｇアミノ酸配列のような精製タグとを含むアミノ酸配列（すなわちペプチド）に結合した核酸（例えばオリゴヌクレオチド）である。ペプチドとカップリングした核酸は、除去（例えば他の反応物から分離）でき、任意選択により、精製タグを利用して反応混合物から精製できる。ある１つのアプローチは、磁性ビーズのようなビーズ、又はカラムに基づくビーズスラリーの使用であり、これらのいずれも、精製タグと結合する精製タグの結合パートナーを含む（例えば結合パートナーは、精製タグに特異的な抗体であってよい）。
【００１０】
アミノ酸配列は、さらなる切断可能配列をさらに含んでよい。このような配列は、酵素の存在下で又は別の機構により切断できる。このようにして、結合した核酸を他の反応物から一旦分離すると、精製タグを、結合した核酸から除去して、末端の１又は複数の（例えば３つの）グリシン残基だけを残すことができ、次いでこれらのグリシン残基は、第２工程において用いられるソルターゼ酵素への接近が可能になる。いくつかの実施形態では、酵素切断可能アミノ酸配列は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼにより切断可能である。ＴＥＶプロテアーゼにより切断可能なアミノ酸配列の例は、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号１）を含むアミノ酸配列である。或いは、切断可能配列は、光のような非酵素プロセスにより切断することができる。切断可能配列は、典型的に、精製タグと１又は複数の（例えば３つの）グリシン残基との間にある。
【００１１】
方法の第２工程では、１又は複数の（例えば３つの）末端グリシン残基に結合した、得られた核酸を、次いで、目的のタンパク質と反応させる。目的のタンパク質は、ソルターゼ酵素若しくは別のトランスペプチダーゼの標的配列でもあるアミノ酸配列を自然に含む可能性があるか、又は代わりに目的のタンパク質は、そのようなアミノ酸配列を含むように操作することができる。これらのアミノ酸配列は、本明細書において、ソルターゼ（又はトランスペプチダーゼ）標的配列とも称される。
【００１２】
ソルターゼ標的配列の一例は、ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ及びＸ’は、独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは、例えば１〜９０、１〜９９又は１〜１００を含むゼロより大きい任意の数又は任意の数の範囲である）（配列番号２）である。それゆえにＸ’ｎは、アミノ酸配列が一端に任意の数のアミノ酸残基（すなわち、ｎ個のＸ’アミノ酸残基、ここで、各Ｘ’アミノ酸残基は、全ての他のＸ’アミノ酸残基から独立して選択され、ｎは、１〜１００若しくは１〜９９若しくは１〜９０又はそれらの間の任意の数であってよい）を含み得ることを意図している。このようなある１つの配列は、ＬＰＥＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ’は、アミノ酸であり、ｎは、例えば１〜９０、１〜９９又は１〜１００を含むゼロより大きい任意の数又は任意の数の範囲である）（配列番号３）である。用語「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」は、本明細書において交換可能に用いられる。Ｘ及びＸ’は、本明細書に記載する任意の実施形態において任意のアミノ酸であり得ることも理解される。本明細書で記載する場合、ソルターゼ標的配列は、精製タグをさらに含んでよい。
【００１３】
目的のタンパク質とオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体との間の反応は、ソルターゼ酵素又は別のトランスペプチダーゼの存在下で生じる。いくつかの実施形態では、ソルターゼは、ソルターゼＡである。いくつかの実施形態では、ソルターゼは、ソルターゼＡの進化したバリアント、例えばＣｈｅｎら、ＰＮＡＳ  １０８：１１３９９−１１４０４、２０１１に記載されるものである。用語「ソルターゼ」及び「ソルターゼ酵素」は、本明細書において交換可能に用いられる。ソルターゼ酵素は、（結合したペプチドを介して）核酸に結合したグリシン残基及び目的のタンパク質に存在するか又は結合したソルターゼ標的配列中のグリシン残基の転位を行う。
【００１４】
この第２反応の生成物は、アミノ酸リンカーにより目的のタンパク質に結合した核酸である。アミノ酸リンカーは、ＬＰＸＴＧｎ（式中、ｎは、Ｇ残基の数を表し、ゼロより大きい任意の数又は任意の数の範囲である）（配列番号１７）の配列を有してよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＬＰＸＴＧＧＧ（配列番号９）の配列を有してよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＬＰＥＴＧｎ（式中、ｎは、Ｇ残基の数を表し、ゼロより大きい任意の数又は任意の数の範囲である）（配列番号４）の配列を有してよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）の配列を有する。
【００１５】
この最終の結合した生成物を、次いで、例えばビーズ又はその他の親和性ベースのプロセスを用いて精製することができる。このような精製は、他の反応成分、例えばソルターゼ酵素、ＴＥＶ酵素及び／又はソルターゼ媒介転位の後にタンパク質から放出される任意のアミノ酸配列から核酸−タンパク質結合体を分離することを必然的に伴う場合がある。このことは、ソルターゼ媒介作用の後の精製タグの異なった使用又は存在により達成することができる。例えば、反応成分、例えばソルターゼ酵素、ＴＥＶプロテアーゼ及び／又はソルターゼ媒介転位の後に目的のタンパク質から遊離されるアミノ酸配列を精製タグに結合することができ、このタグを用いてこれらの成分を目的の最終の結合した生成物から除去できる。ある好ましい実施形態では、例えば最終生成物から除去したい全ての成分を同じ精製タグに結合する。適切な精製タグとしては、Ｈｉｓタグ（例えば６Ｈｉｓ残基（配列番号６））又はＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７）を含むか若しくは該配列からなるＦｌａｇアミノ酸配列が挙げられる。このような精製工程は、目的の核酸−タンパク質結合体／複合体がいずれの副産物及び反応物も有さないようにするために有用である。
【００１６】
よって、一態様では、本開示は、（１）１又は複数のＮ末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸（例えばＤＮＡ）と、（２）ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ及びＸ’は、任意の独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは、１〜９９の範囲の任意の数である）（配列番号８）のＣ末端アミノ酸配列を含むタンパク質とを、ソルターゼ酵素の存在下で反応させて、ＬＰＸＴＧＧＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号９）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を形成することを含む。リンカー及び核酸は、結合後に目的のタンパク質のＣ末端又はその付近に存在していてもよい。
【００１７】
別の態様では、本開示は、（１）末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸（例えばＤＮＡ）及び（又は該核酸と）（２）ＬＰＥＴＧＸｎ（式中、Ｘは、アミノ酸であり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号１０）の末端アミノ酸配列を含むタンパク質を、ソルターゼ酵素の存在下で反応させて、ＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を形成することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、「ｎ」は、１〜９９アミノ酸の長さであってよい。いくつかの実施形態では、「ｎ」は、１より大きい数である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ソルターゼ酵素及びＬＰＥＴＧＸｎ（配列番号１０）の末端、例えばＣ末端アミノ酸配列を含むタンパク質は、それぞれＨｉｓタグを含む。目的のタンパク質の場合、Ｈｉｓタグは、ソルターゼ標的配列のＸｎ（又はＸ’ｎ）アミノ酸配列中に又は該配列の一部として提供できる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸は、核酸と１又は複数、好ましくは３つのＧ残基を含むペプチドとの間のバイオ直交型銅触媒型クリック化学反応により形成される。いくつかの実施形態では、バイオ直交型銅触媒型クリック化学反応は、１又は複数のグリシン（Ｇ）残基と、任意選択により、それらに限定されないがＦｌａｇ配列のような精製タグと、さらに任意選択により、好ましくはＧ残基と精製タグとの間にある、それらに限定されないがＴＥＶ標的（切断）配列のような切断可能アミノ酸配列とを含むアミノ酸配列に結合した核酸を含む結合体（これは、本明細書において、核酸中間体とも称される）を形成する。
【００２０】
方法は、よって、ソルターゼ酵素がグリシン残基に接近可能にするために、核酸中間体から精製タグを切断することをさらに含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、核酸中間体を、ＴＥＶプロテアーゼと反応させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＶプロテアーゼは、Ｈｉｓタグに結合している。Ｈｉｓタグは、６ヒスチジン残基（配列番号６）を含むか又はそれからなるアミノ酸配列であってよい。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＬＰＥＴＧＧＧ（アミノからカルボキシ）又はＧＧＧＴＥＰＬ（カルボキシからアミノ）（配列番号５）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を提供する。核酸と目的のタンパク質との間にこのリンカーを置くことについて、図面に示す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、自然に存在するタンパク質であり、ソルターゼ標的配列又はリンカー配列、例えば上で定義するＬＰＸＴＧＸ’ｎ（配列番号２）又はＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）は、自然に存在するタンパク質中に存在しない。
【００２３】
いくつかの実施形態では、核酸は、１〜１００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、ペプチドへの結合の前にＤＮＡを含むか又はＤＮＡからなる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上記の複合体又は結合体のいずれかを単離形態で含む組成物を提供し、このような複合体又は結合体は、中間体又は最終生成物のいずれかである。よって、本開示は、ペプチドに結合した核酸をそれぞれが含む１又は複数の結合体であって、ペプチドが、１又は複数の（例えば３つの）グリシンを含む結合体を提供する。これらの結合体は、それらの核酸配列の点で互いに異なることがあるが、同一アミノ酸配列を有することがある。本開示は、同様に、ソルターゼ標的配列、例えば上で定義するＬＰＸＴＧＸ’ｎ（配列番号２）をそれぞれが含む１又は複数の別個のタンパク質を提供する。本開示は、同様に、核酸−タンパク質複合体又は結合体を調製するために用いるための複数の上記の核酸−ペプチド結合体及びタンパク質を提供する。本開示は、ＬＰＸＴＧＧＧ（配列番号９）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に結合した核酸をそれぞれが含む１又は複数の結合体をさらに提供する。これらの結合体は、それらの核酸配列及び／又はそれらのアミノ酸配列の点で互いに異なることがある。よって、これらは、同一核酸配列を有することがあるか、又は同一アミノ酸配列を有することがあるか、又は異なる核酸及びアミノ酸配列を有することがある。よって、本開示は、それぞれが単離形態にあるか、又は複数が単離形態にあり、任意選択によりライブラリーの形態にある複数の任意の上記の複合体を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、以下の２つ以上の任意の組み合わせを含む組成物を提供する：末端グリシン（Ｇ）残基（３つのＧ残基を含む）を含むアミノ酸配列に結合した核酸、ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ及びＸ’は、独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは、例えば１〜９０、１〜９９又は１〜１００を含むゼロより大きい任意の数又は任意の数の範囲である）（配列番号２）の末端アミノ酸配列を含むタンパク質、ソルターゼ酵素、及びＴＥＶプロテアーゼ。
【００２６】
別の態様では、本発明は、以下の２つ以上の任意の組み合わせを含む組成物を提供する：末端グリシン（Ｇ）残基（３つのＧ残基を含む）を含むアミノ酸配列に結合した核酸、ＬＰＥＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ’は、アミノ酸であり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲、好ましくは１〜９９である）（配列番号１０）の末端アミノ酸配列を含むタンパク質、ソルターゼ酵素、及びＴＥＶプロテアーゼ。いくつかの実施形態では、ｎは、１より大きい数である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質、ソルターゼ酵素及びＴＥＶプロテアーゼのいずれか１つ又は任意の組み合わせは、それらに限定されないがＨｉｓタグのような精製タグに結合している。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、タンパク質の又はタンパク質に結合したソルターゼ標的配列のＸｎ（又はＸ’ｎ）アミノ酸配列に含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｈｉｓタグと特異的に結合するビーズ（抗Ｈｉｓビーズ）をさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ｎは、１〜１００又は１〜９９又は１〜９０の任意の数又は任意の数の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、６ヒスチジン残基のアミノ酸配列（配列番号６）である。
【００２９】
核酸−タンパク質複合体又は結合体は、次いで、それらに限定されないがＤＮＡオリガミナノ構造のような核酸ナノ構造とともに用いることができるか又は該核酸ナノ構造に組み込むことができる。このことは、結合体の核酸部分を、ＤＮＡオリガミ構造中の足場鎖を含む核酸ナノ構造とハイブリダイズすることにより達成できる。或いは、核酸−ペプチド中間体を核酸ナノ構造に組み込むことができ、核酸ナノ構造が形成された後にタンパク質を結合できる。
【００３０】
いくつかの場合では、本明細書で提供する方法に従って形成された核酸−タンパク質複合体又は結合体の比活性は、結合しておらず操作されていない形態のタンパク質の比活性の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％又は約１００％である。よって、本明細書で提供する結合方法は、操作されたタンパク質の活性に著しく影響しない。
【００３１】
上記の概念及び以下にさらに詳細に論じる概念の全ての組み合わせは（但し、このような概念は互いに矛盾しないことを条件とする）、本明細書に開示する発明の主題の一部であることが企図されることが認識される。特に、本開示の最後にある請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示する発明の主題の一部であることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】トリグリシン（ＧＧＧ）オリゴヌクレオチド前駆体を創出するためのクリック化学を示す図である。銅（Ｉ）触媒クリック化学により、アジド修飾を有する合成オリゴヌクレオチドにカスタムペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫＥＮＬＹＦＱＧＧＧ−Ｐｒａ、配列番号１２）を連結する。
【図２】触媒Ｃｕ（I）及び過剰のカップリングしていないペプチドを除去するために用いるＱｉａｇｅｎＰＣＲクリーンアップキットを示す図である。反応生成物をＱｉａｇｅｎキットに流すことにより、カップリングしたか又はしていないオリゴの単離が可能になる。この図に示すように、カップリングしたオリゴヌクレオチドは、次いで、カップリングしていないオリゴヌクレオチドからその精製タグにより分離できる。過剰のペプチド及び銅は膜上に残り、かつ／又は洗浄工程において除去される。
【図３】精製タグによるカップリングしていないオリゴヌクレオチドの除去を示す図である。Ｑｉａｇｅｎヌクレオチド除去キットの生成物と市販の抗Ｆｌａｇビーズとの結合により、カップリングしていないオリゴヌクレオチドが除去され、所望のトリグリシンオリゴヌクレオチド前駆体（又はオリゴヌクレオチド-ペプチド結合体）だけが残る。Ｆｌａｇペプチドを用いる溶出により、親和性マトリクスからオリゴヌクレオチドが放出される。
【図４】ＴＥＶ切断、並びに過剰のカップリングしていないオリゴヌクレオチド除去の効果及びＴＥＶ切断の効率を示すポリアクリルアミドゲルを示す図である。ＴＥＶプロテアーゼ（三日月形）を用いてＦｌａｇ精製タグを切断し、ソルターゼ適合性ＧＧＧ−ペプチドオリゴヌクレオチドを得る。ゲルのレーンは、以下のとおりである：Ｂは、抗Ｆｌａｇビーズとの結合後の上清であり、Ｗ１〜Ｗ６は、洗浄物１〜６であり、Ｅ１及びＥ２は、溶出物１及び２であり、最も左のレーンは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ２０ｂｐ分子ルーラーである。ＴＥＶ前及びＴＥＶ後は、それぞれＴＥＶ切断の前後のことをいう。
【図５】タンパク質−ＤＮＡハイブリッドのソルターゼが触媒する生成を示す図である。方形で示す２つのグリシン残基の転位を示すソルターゼカップリングスキーム。ＬＰＥＴＧ含有タンパク質（ＬＰＥＴＧは、配列番号４である）、この場合ＣＤＨ２３  ＥＣｌ＋２を、ソルターゼを介してＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴヌクレオチドにカップリングさせる。ソルターゼは、方形で強調する２つのグリシン残基を入れ換えて、タンパク質とＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴとの間のペプチド結合の形成をもたらす。ソルターゼは、まずＬＰＸ１ＴＧＸ２（配列番号２）配列と結合する。この場合、タンパク質上の最もＣ末端にあるグリシンの後の配列は、Ｈｉｓタグ（配列番号６）であった。得られた結合体は、ＬＰＥＴＧＧＧリンカー（配列番号５）を含む。
【図６】反応物及び触媒の除去を示す図である。目的のタンパク質への核酸のカップリングの完了の際に、最終結合は、ＴＥＶプロテアーゼ、ソルターゼ酵素及び過剰で未反応の目的のタンパク質とともに存在する。この例では、全ての反応物は同じ精製タグ（すなわちＨｉｓタグ）を含み、よって、これらは、抗Ｈｉｓビーズを用いて捕捉して除去でき、最終の所望の核酸−タンパク質結合生成物だけが上清中に残る。ソルターゼは、転位反応の一部として最終生成物からＨｉｓタグを選択的に切り落とす。ＬＰＥＴＧは、配列番号４であり、ＬＰＥＴＧＧＧは、配列番号５である。
【図７Ａ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図７Ｂ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図７Ｃ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図７Ｄ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図７Ｅ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図７Ｆ】バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形成の方法を示す図である。直鎖状Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ（各パネル中の底の実線）、相補的オリゴヌクレオチド（実線に近接したより短い線）、ＣＤＨ２３  ＥＣ１＋２（パネルＣで導入する）、及びＰＣＤＨ１５  ＥＣ１＋２（パネルＥで導入する）。（Ａ〜Ｂ）Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ足場との官能化及び非官能化オリゴヌクレオチドのアニーリング。（Ｂ〜Ｃ）ソルターゼを用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＣＤＨ２３断片（本明細書の２．４．４項を参照されたい）と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−改変オリゴヌクレオチドとを結合させる。他のオリゴヌクレオチドは、Ｆｌａｇ−ＴＥＶ配列によりＮ末端がブロックされていることにより保護されている（本明細書の２．１項を参照されたい）。（Ｃ〜Ｄ）カップリングが成功した後に、ＴＥＶプロテアーゼを用いて第２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−オリゴを脱保護することにより、それをソルターゼカップリングのために準備する（本明細書の２．４．４ｅ項を参照されたい）。（Ｄ〜Ｅ）ソルターゼを、次いで、再び用いて、ＬＰＥＴＧ（配列番号４）を含むＰＣＤＨ１５断片を結合させる（本明細書の２．４．４ｋ項を参照されたい）。（Ｅ〜Ｆ及びその逆）ＣＤＨ２３とＰＣＤＨ１５との結合の際に、ＤＮＡ−ナノスイッチが閉まる。オリゴをＭ１３足場に熱によりアニーリングする前に例えばソルターゼベースのカップリング反応を個別のオリゴヌクレオチドに対して別々に行うことにより、すなわち保護Ｆｌａｇタグ（２．３）を必要とすることなく、熱安定性タンパク質もＤＮＡオリガミ足場に結合させることができる。
【図８】タンパク質−ＤＮＡカップリングのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検証を示す図である。この実験におけるカップリングの成功は、ＬＰＥＴＧ配列（配列番号４）を含むタンパク質、ＧＧＧ−オリゴ、ソルターゼ酵素及び二価カチオン（主にＣａ２＋）の存在を必要とした。必須構成成分の全てが存在する場合のみ（グリッドの最後の２つの縦欄）、カップリングした生成物が検出可能であった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、核酸−タンパク質複合体（本明細書において、交換可能に核酸-タンパク質結合体又はオリゴヌクレオチド-タンパク質結合体とも称される）に関する組成物及び方法を提供する。本開示は、このような複合体の合成の方法、このような複合体の使用の方法、及び複合体自体の組成物、並びに合成プロセスにおける中間体複合体又は結合体を含む中間体を含む組成物を提供する。
【００３４】
本明細書で提供する合成方法は、オリゴヌクレオチドのような核酸の目的のタンパク質への結合に適する。このようなタンパク質に結合した核酸は、次いで、それらに限定されないがアドレス指定できるナノ構造のようなナノ技術用途において用いることができる。
【００３５】
タンパク質機能の妨害を最小限にしてタンパク質をＤＮＡに共有結合でカップリングするための全般的なソルターゼベースのプロトコールを本明細書において開示する。２工程プロセスを用いてこの目的を達成する。まず、クリック化学を用いて、小型の合成ペプチドをＤＮＡオリゴヌクレオチドにバイオ直交的に共有結合でカップリングさせる。次に、酵素ソルターゼを用いてタンパク質適合性条件下でＤＮＡ−ペプチドキメラを目的のタンパク質に共有結合で連結する。このプロトコールにより、機能的ＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドの簡単なカップリング及び精製が可能になる。
【００３６】
例示的な応用として、この技術を用いて、カドヘリン−２３を有するオリゴヌクレオチド及びプロトカドヘリン−１５に連結したオリゴヌクレオチドを形成した。直鎖状Ｍ１３足場への組み込み（例えばＤＮＡオリガミ技術により）の際に、この例示的ハイブリッドのようなタンパク質−ＤＮＡハイブリッドは、本明細書においてより詳細に記載するように、バイナリナノスイッチに対するゲートとして働く。
【００３７】
開示するプロトコールは、信頼性が高く、モジュール式であり、組み合わせることにより機能的ＤＮＡ−タンパク質結合体及び場合によってはナノ構造を形成できる官能化オリゴヌクレオチド（すなわち１又は複数の（例えば３つの）連続するグリシンと最小限でカップリングしたオリゴヌクレオチド）及びタンパク質（すなわちソルターゼ標的配列を含むタンパク質）のライブラリーの構築を容易にする。これらの構造は、治療及び工業的プロセスのために用いることができる新しいクラスの機能的ナノ構造を可能にする。
【００３８】
開示するプロトコールは、よって、従来技術の方法の様々な問題点。タンパク質機能を保存するために、タンパク質−ＤＮＡカップリングを生理的条件下で行う。開示する２工程プロセスでは、小型の合成ペプチドをＤＮＡオリゴヌクレオチドにまずカップリングする。次いで、ソルターゼ酵素（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ  １０８：  １１３９９−１１４０４、２０１１；  Ｐｏｐｐら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：  ７０７−７０８、２００７）を利用して、選択したタンパク質をＤＮＡ−ペプチドキメラに生理的条件下でカップリングする。この方策は、非生理的条件に対してはるかにより耐容性があるオリゴヌクレオチド及び合成ペプチドに対して行われるように全てのタンパク質非適合化学にまず取り組んでいる。
【００３９】
ソルターゼは、あるタンパク質のＮ末端を別のタンパク質のＣ末端付近の位置に共有結合で連結する。ソルターゼは、Ｎ末端ＧＧＧ及びＣ末端ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ及びＸ’は、任意の独立して選択されるアミノ酸であり得、ｎは、例えば１〜９９を含む任意の数のアミノ酸であり得る）（配列番号２）を認識する。ソルターゼは、次いで、２つのタンパク質中のグリシン残基の転位を容易にして、２つのタンパク質間の共有結合及びＧＸ’ｎの放出をもたらす。
【００４０】
オリゴヌクレオチドのカップリングは親和性タグの除去により達成できるので、ソルターゼの使用は、精製を容易にするためにも用いることができる。以下に詳細に説明するこのプロトコールにより、市販の精製樹脂を用いていずれの副生成物及び反応物も有さない選択した生成物を得ることができる。この技術を用いて、ライブラリー中のいずれのタンパク質もＭ１３核酸のようなＤＮＡオリガミ足場のどこにでも容易かつ高い信頼性で結合させることができるオリゴヌクレオチド及びタンパク質のライブラリーを作製できる。
【００４１】
本開示は、自己集合型ナノ構造のためのＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドを作製するためのソルターゼ技術の使用を企図する。この技術の有用性を示すために、バイナリＤＮＡ−ナノスイッチの形態の単純なＤＮＡ−タンパク質ナノマシン（Halvorsenら、Nanotechnology 22:494005-494012、2011）を、相互作用するタンパク質の対であるカドヘリン−２３（ＣＤＨ２３）及びプロトカドヘリン−１５（ＰＣＤＨ１５）（Kazmierczakら、Nature 449:87-91、2007; Sotomayorら、Nature 492: 128-132、2012）によりゲーティングした。この自己集合型機械的スイッチは、状態を変えることにより分子生物学的結合の形成又は破壊を報告する（例えばスイッチは、ＣＤＨ２３がＰＣＤＨ１５と結合する場合に閉じ、そうでなければ開く）。ＣＤＨ２３は、ＤＮＡ足場（Ｍ１３）の一方の端から３分の１のところとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと共有結合で連結し、ＰＣＤＨ１５は、足場の他方の端から３分の１のところとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと連結する（図７）。その結果、タンパク質が相互作用していない場合は端から端までの長さが３μｍであり、タンパク質が相互作用している場合は端から端までの長さが２μｍであるナノスイッチが得られる。これらの２つの状態は、Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：４９４００５−４９４０１２、２０１１により記載されるように、ゲル電気泳動により分離可能である。
【００４２】
合成方法を以下に記載する。
【００４３】
第１工程では、合成オリゴヌクレオチドを、小型の合成ペプチドに連結させる（ともに市販で入手可能である）。一例では、結合は、バイオ直交型銅（Ｉ）触媒型クリック化学反応を用いて生じる（図１）。触媒銅及び過剰の試薬を、次いで、例えば市販のキット及び精製樹脂を用いて除去できる（図２及び３）。
【００４４】
小型の合成ペプチドのある領域を精製目的のために用いることができる。もし該領域が存在するならば、これを次いで酵素又は非酵素切断反応により除去できる。図４に示すように、一例では、ペプチド配列は、精製タグ、酵素切断可能配列及びＧＧＧ配列を含む。切断可能配列を標的にするプロテアーゼ、例えばタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）から単離されたプロテアーゼとのインキュベーションにより、トリグリシンアミノ酸配列と共有結合したオリゴヌクレオチドが得られる。
【００４５】
このオリゴ−ペプチドハイブリッド（又は複合体）を、次いで、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＸ’ｎアミノ酸配列、例えばＬＰＥＴＧＸ’ｎアミノ酸配列（式中、Ｘ及びＸ’は、任意の独立して選択されるアミノ酸を表し、Ｘ’ｎがそれらに限定されないが１〜９０の範囲の任意の数のアミノ酸を含む１又は複数のアミノ酸を表すように、ｎは、ゼロより大きい数である）（それぞれ配列番号２及び配列番号３）を有する任意のタンパク質に共有結合で連結させることができる。ソルターゼ酵素の存在下で、図５において方形で示す２つのグリシン残基（そのうちの一方は目的のタンパク質と結合しているペプチド配列中にあり、他方はオリゴヌクレオチドと結合しているペプチド中にある）が入れ換わって、オリゴヌクレオチドとタンパク質との共有結合、及びグリシン−Ｘ’ペプチドの切断をもたらす。
【００４６】
タンパク質精製の場合に大抵そうであるようにＸ’が６ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）（配列番号６）となるように選択されるならば、このシステムは、内蔵された精製スキームを有する。目的のタンパク質、ＴＥＶプロテアーゼ及びソルターゼ酵素が全てＨｉｓタグを有し、ソルターゼ反応が最終生成物のＨｉｓタグを選択的に切り落とすならば、反応生成物を市販の抗Ｈｉｓビーズに対して洗浄することにより、所望の生成物だけを含む上清が得られる（図６）。
【００４７】
本開示は、アミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を提供する。アミノ酸リンカーは、ＬＰＸＴＧｎ（ＮからＣの順）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは、１又はそれより大きい）（配列番号１７）のアミノ酸配列を有してよい。アミノ酸リンカーは、ＬＰＥＴＧｎ（ＮからＣの順、配列番号４）（式中、ｎは、１又はそれより大きい）のアミノ酸配列を有してよい。好ましい実施形態では、ｎは、３であり、リンカーは、ＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を有する。複合体は、以下の構造：
核酸−ＧＧＧＴＥＰＬ−目的のタンパク質−ＮＨ２
（式中、ＮＨ２は、目的のタンパク質のアミノ末端のことをいう）を有する。言い換えると、タンパク質は、リンカーにより、そのカルボキシ末端を介して核酸に結合している。このことを図面に示す。示すように、ＧＧＧＴＥＰＬ配列がＣからＮの方向である（配列番号５）ことは当業者に明らかである。他の実施形態では、タンパク質は、そのアミノ末端を介してリンカーに結合できる。
【００４８】
核酸は、任意の長さであってよい。その長さは、複合体の最終的な使用によることができる。よって、より短い核酸が所望される場合では、核酸は、１〜１０００、１〜５００、１〜１００、１〜５０又はその間の任意の範囲の長さの範囲であり得るオリゴヌクレオチドであってよい。核酸は、自然に存在してもよいか、又は自然に存在しなくてもよい。核酸は、天然の供給源から調製してよいか、又は例えば自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いる合成によって調製してもよい。核酸は、自然に存在するヌクレオチド又は自然に存在しないヌクレオチドを含んでよい。核酸は、自然に存在する主鎖結合又は自然に存在しない主鎖結合を含んでよい。核酸は、ＤＮＡを含むか又はＤＮＡからなってよい。
【００４９】
目的のタンパク質は、自然に存在するタンパク質及び自然に存在しないタンパク質（例えば操作されたタンパク質など）を含む実質的に任意のタンパク質であってよい。タンパク質は、ソルターゼ標的配列（その例は、ＬＰＥＴＧｎ（アミノからカルボキシへの配列）（又はＧｎＴＥＰＬカルボキシからアミノへの配列（配列番号４）である）を自然に含んでいてもよい。別の例は、ＬＰＥＴＧＧＧ配列（配列番号５）である。タンパク質は、ＬＰＥＴＧＧＧ（アミノからカルボキシ）配列（配列番号５）を含む、ＬＰＥＴＧｎ配列を含むＬＰＸＴＧｎ配列（それぞれ配列番号１７及び配列番号４）と結合できる。これらの配列の向きは、図面に示す。この結合は、合成後又は合成中に生じることができる。タンパク質は、抗体、抗原結合抗体断片を含む抗体断片、細胞接着タンパク質、例えばＣＡＭ、インテグリン、カドヘリンなど、転写因子、リガンド受容体、リガンド、シグナル伝達タンパク質、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、ケモカインなどであってよい。
【００５０】
本開示は、よって、１又は複数、好ましくは少なくとも３つの隣接グリシン残基を含むペプチドと核酸を反応させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸及びペプチドは、バイオ直交型銅（Ｉ）触媒型クリック化学反応を用いて反応させる。いくつかの実施形態では、核酸は、アジドを含み、ペプチドは、アルキンを含む。或いは、核酸は、アルキンを含んでよく、ペプチドは、アジドを含んでよい。別の実施形態では、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて、シスチン含有ペプチドをアミン官能化オリゴヌクレオチドと反応させることができる。ペプチドは、グリシンの他に、精製タグ、及び精製タグとグリシンとの間にある切断可能アミノ酸配列を含んでよい。精製タグは、Ｈｉｓタグ又はＦｌａｇ配列（又はＦｌａｇタグ）であってよい。切断可能アミノ酸配列は、酵素切断可能アミノ酸配列、例えばＴＥＶ酵素標的配列であってよい。方法は、ペプチドに結合した核酸、よって、少なくともグリシン、並びに任意選択により精製タグ及び切断可能配列に結合した核酸を生成する。この結合体は、本明細書において核酸−ペプチド結合体とも称される。方法は、反応混合物から核酸−ペプチド結合体を単離することをさらに含んでいてもよい。このような単離は、放出されたＣｕ（Ｉ）及びカップリングしていないペプチドの除去、並びに／又は精製タグによるカップリングしたオリゴヌクレオチドのポジティブ選択を含んでいてもよい。ポジティブ選択は、例えばビーズ、カラム、スラリーなどの精製タグに対する結合パートナーを含む親和性アプローチを用いて達成してよい。このような結合パートナーは、抗体又は抗体断片であってよい。一旦単離されると、核酸−ペプチド結合体は、精製タグを放出するために切断配列にて切断できる。このことは、核酸−ペプチド結合体を酵素、例えばＴＥＶプロテアーゼと反応させることにより達成してよい。核酸−ペプチド結合体は、よって、ソルターゼ酵素が接近可能になったグリシンに結合した核酸を含む。結合体を、次いで、以下に記載するようにソルターゼに接近可能なタンパク質と反応させる。
【００５１】
本開示は、
（１）１又は複数の（３つを含む）末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸と、
（２）ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（式中、Ｘ及びＸ’は、任意の独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号２）の末端アミノ酸配列に結合したタンパク質を、
ソルターゼ酵素の存在下で反応させて、ＬＰＸＴＧＧＧ（ＮからＣ）又はＧＧＧＴＸＰＬ（ＣからＮ）（配列番号９）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を形成することを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、「ｎ」は、１より大きい数である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、方法は、
（１）１又は複数の（３つを含む）末端グリシン（Ｇ）残基を含むアミノ酸配列に結合した核酸と、
（２）ＬＰＥＴＧＸｎ（式中、Ｘは、アミノ酸であり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号３）の末端アミノ酸配列に結合したタンパク質を、
ソルターゼ酵素の存在下で反応させて、ＬＰＥＴＧＧＧ（ＮからＣ）又はＧＧＧＴＥＰＬ（ＣからＮ）（配列番号５）のアミノ酸配列を有するアミノ酸リンカーによりタンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、「ｎ」は、１より大きい数である。
【００５３】
ソルターゼ酵素及び末端アミノ酸は、それぞれ、それらに限定されないが、Ｈｉｓタグのような精製タグを含んでよい。
【００５４】
方法は、タンパク質に共有結合で結合した核酸を含む複合体を単離することをさらに含んでよい。このような単離は、精製タグ（好ましくは同じ精製タグ）を含む反応成分を、本明細書に記載するもののような親和性アプローチを用いて除去することにより達成できる。典型的に、ソルターゼ標的配列中に存在する任意の精製タグは、ソルターゼ転位が一旦生じると放出される。よって、最終の核酸−タンパク質生成物は、精製タグについての選択の後に上清中に残る。
【００５５】
上述したように、アミノ酸配列に結合した核酸は、本明細書に示すように、例えばバイオ直交型銅触媒型クリック化学反応を用いて合成できる。バイオ直交型銅触媒型クリック化学反応は、１又は複数のグリシン、及び任意選択により切断可能配列、例えばＴＥＶプロテアーゼ（本明細書においてＴＥＶとも称される）により切断できるアミノ酸配列を含む酵素切断可能配列に結合した核酸を含む核酸中間体を形成する。ＴＥＶ切断可能配列は、本明細書においてＴＥＶ標的配列とも称される。ＴＥＶ標的配列は、しかし、Ｅ−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−Ｑ−（Ｇ／Ｓ）（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、独立して選択されるアミノ酸を表す）であってよい。切断は、典型的に、ＱとＧ又はＱとＳとの間で生じる。ＴＥＶ標的配列としては、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１４）が挙げられる。
【００５６】
中間体は、切断可能配列を標的にする酵素と反応させることができる。一例では、酵素は、ＴＥＶプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、それらに限定されないが、Ｈｉｓタグのような精製配列に結合できる。
【００５７】
本明細書に示す方法は、試薬の喪失を最小限にして、よって最大限の効率及び収率で行うことができる。複合体は、基質、中間体、酵素及び副産物を含まないことを含んで、反応成分を含まずに得ることもできる。
【００５８】
本明細書に示す方法は、結合プロセスを通して目的のタンパク質の活性を維持又は保存する。酵素又は活性を測定できる他のタンパク質の場合、タンパク質は、元の比活性又はそれに近い比活性を維持する。よって、核酸−タンパク質複合体又は結合体中のタンパク質の比活性は、結合しておらず操作されていない形のタンパク質の比活性の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は約１００％である。比活性は、タンパク質１ｍｇあたりの活性として定義できる。酵素の場合、活性単位は、ｐＨ及び温度についての特定の反応条件下で単位時間あたりに生成物に変換される基質の量である酵素単位として表すことができる。
【００５９】
本明細書に示す方法は、従来技術の様々な問題点及び／又は欠点を克服する。例えば、本明細書に示す方法は、室温、酸化／還元条件又は非生理的ｐＨでの長いインキュベーションを含む、最適以下のタンパク質反応条件を含まない。本明細書に示す方法は、従来技術の条件下で凝集しかつ／又は析出して溶液でなくなる傾向がある熱不安定性タンパク質に適切である。さらに、親和性標識の同時除去により成功した反応を直接標識することにより、本明細書に示す方法は、反応物からの生成物の精製を容易にもする。またこれらの方法は、汎用性もあってロバストであり、個別のタンパク質について最適化される傾向があった従来技術の方法とは異なり実質的にいずれのタンパク質にも用いることができる。
【００６０】
本開示は、単離形態の任意の上記の中間体核酸−ペプチド複合体又は最終核酸−タンパク質複合体をさらに提供する。単離形態とは、基質、中間体、副産物、酵素などを含む、いくつかの場合では全ての他の反応成分を含む他の反応成分から複合体が物理的に分離されることを意図する。
【００６１】
本開示は、以下の２つ以上の任意の組み合わせを含む種々の組成物をさらに提供する：
（１）それらに限定されないがＧＧＧアミノ酸配列、ＧＧＧ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ配列（この文脈において「ＴＥＶ」はＴＥＶ標的配列のことをいう）若しくは少なくとも１つのグリシン残基（好ましくは３つのそのような残基）を含む任意の他の配列のような末端グリシン（Ｇ）残基、それらに限定されないがＴＥＶ標的配列のような切断可能配列、及びそれらに限定されないがＨｉｓタグ若しくはＦｌａｇ配列のような精製タグを含むアミノ酸配列に結合した核酸；
（２）ＬＰＸＴＧＸ’ｎ（配列番号２）（式中、Ｘ及びＸ’は、任意の独立して選択されるアミノ酸であり、ｎは、０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）の末端アミノ酸配列に結合したタンパク質；
（３）ソルターゼ酵素；並びに
（４）ＴＥＶプロテアーゼ。
【００６２】
本開示は、以下の２つ以上の任意の組み合わせを含む種々の組成物をさらに提供する：
（１）それらに限定されないがＧＧＧアミノ酸配列、ＧＧＧ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ配列（この文脈において「ＴＥＶ」はＴＥＶ標的配列のことをいう）若しくは少なくとも１つのグリシン残基（好ましくは３つのそのような残基）を含む任意の他の配列のような末端グリシン（Ｇ）残基、それらに限定されないがＴＥＶ標的配列のような切断可能配列、及びそれらに限定されないがＨｉｓタグ若しくはＦｌａｇ配列のようなタグのような精製配列を含むアミノ酸配列に結合した核酸；
（２）ＬＰＥＴＧＸｎ（式中、Ｘは、アミノ酸であり、ｎは０より大きい数又は０より大きい数の範囲である）（配列番号３）の末端アミノ酸配列に結合したタンパク質；
（３）ソルターゼ酵素；並びに
（４）ＴＥＶプロテアーゼ。
【００６３】
いくつかの実施形態では、「ｎ」は、１より大きい数である。
【００６４】
タンパク質、ソルターゼ酵素及びＴＥＶプロテアーゼのいずれか１つ又は任意の組み合わせは、それらに限定されないがＨｉｓタグ又はＦｌａｇタグのような精製タグに結合できる。同じ又は異なる精製配列を用いることができる。Ｈｉｓタグは、目的のタンパク質に結合したＸ’ｎアミノ酸配列に含まれてよい。
【００６５】
組成物を、ビーズ又は精製タグ若しくは配列と特異的に結合する他の親和性マトリクスと接触させることができる。例えば、ビーズは、抗Ｈｉｓタグビーズであってよい。なぜなら、これらは、それらの表面に、抗体又は抗体断片又はＨｉｓタグに対する他の結合パートナーを含むからである。Ｈｉｓタグは、それらに限定されないが６ヒスチジン残基（配列番号６）を含む隣接ヒスチジン残基で構成されるアミノ酸配列である。
【００６６】
上で用いる「ｎ」は、それらに限定されないが、１〜１００又は１〜９９又は１〜９０を含む任意の数又は任意の数の範囲であってよい。
【００６７】
本開示は、組成物中の任意の上記の核酸−タンパク質複合体をさらに提供する。これらの組成物及び本明細書で提供する他の組成物のいずれも、それらに限定されないが薬学的に許容される担体のような担体を含む担体をさらに含んでいてもよい。用語「薬学的に許容される担体」は、ヒト若しくは本開示が企図する他の対象への投与のために適切な１又は複数の適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。用語「担体」は、複合体を懸濁して投与を容易にする有機又は無機の成分、自然又は天然のものをいう。医薬組成物の成分は、所望の薬学的効率を実質的に損なう可能性がある相互作用を排除する様式で混合される。担体は、或いは、薬学的に許容されないがｉｎ  ｖｉｔｒｏ作業に適切な担体であってよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、滅菌されており、任意選択により保存剤を含んでよい。組成物は、１又は複数の器又は容器、任意選択により使用説明書を含むキットであってよい。組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためであってよい。
【００６９】
本明細書で提供する複合体は、例えば分子相互作用の動態の測定及びスクリーニングアッセイにおける分子結合パートナー（既知又は未知の候補から）の同定を含む無数の用途において用いることができる。結合相互作用の研究は、それらに限定されないがゲル電気泳動、光ピンセット、磁性ピンセット、テザー粒子運動、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、遠心力顕微鏡観察（ＣＦＭ）及び単分子蛍光イメージングのような単分子力プローブを含む任意の数の方法を用いて行うことができる。用途は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１３／０６７４８９にさらに記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７０】
本開示は、それらに限定されないが核酸ナノ構造のような１又は複数のナノ技術用途において核酸−タンパク質複合体を用いる方法をさらに提供する。複合体を用いて、結合相互作用及び結合親和性及びタンパク質−タンパク質相互作用の強さを研究することもできる。複合体を用いて、表面にタンパク質をつなぎとめることもできる。
【００７１】
本明細書で用いる場合、「核酸ナノ構造」は、個別の核酸から自己集合した合理的に設計された人工的な（例えば自然に存在しない）構造である。このようなナノ構造は、オリゴヌクレオチドを含む成分核酸の配列相補性に基づいて自己集合できる。「自己集合」は、配列特異的様式で、予想される様式で、かつ外部からの制御なしで互いにアニーリングする核酸（及びいくつかの場合では核酸ナノ構造）の能力のことをいう。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造自己集合法は、核酸（例えば一本鎖核酸又はオリゴヌクレオチド）を単一の器で組み合わせることと、配列相補性に基づいて核酸を互いにアニーリングさせることとを含む。いくつかの実施形態では、このアニーリングプロセスは、核酸を上昇した温度におくことと、次いで温度を徐々に低下させて配列特異的結合に好ましいようにすることとを含む。様々な核酸ナノ構造又は自己集合法が既知であり、本明細書に記載する。
【００７２】
核酸ナノ構造は、典型的にナノメートルの尺度の構造（例えば１〜１０００ナノメートルの長さの尺度を有する）であるが、いくつかの場合では、用語「核酸ナノ構造」及び「ＤＮＡナノ構造」は、本明細書において、マイクロメートルの尺度の構造（例えばナノメートルの尺度又はマイクロメートルの尺度の１つより多い構造から集合する）のことをいうことがある。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、１〜１０００ｎｍ、１〜９００ｎｍ、１〜８００ｎｍ、１〜７００ｎｍ、１〜６００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜４００ｎｍ、１〜３００ｎｍ、１〜２００ｎｍ、１〜１００ｎｍ又は１〜５０ｎｍの長さの尺度を有する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、１０００ｎｍより大きい長さの尺度を有する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、１マイクロメートル〜２マイクロメートルの長さの尺度を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、複数の異なる核酸（例えば一本鎖核酸）から集合する。例えば、核酸ナノ構造は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００の核酸から集合してよい。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００以上の核酸から集合する。用語「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」を包含する。ＤＮＡナノ構造の関係では、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜２０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜７０ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド又は１０〜９０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２０〜５０、２０〜７５又は２０〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００７４】
これらの核酸のいくつかは、精製タグあり又はなしで例えば３つのグリシンに結合した核酸であってよい。或いは、これらの核酸のいくつかは、タンパク質に結合した核酸であってよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、一本鎖核酸、二本鎖核酸又は一本鎖及び二本鎖核酸の組み合わせから集合する。
【００７６】
核酸ナノ構造は、いくつかの実施形態では、複数の不均質な核酸（例えばオリゴヌクレオチド）から集合してよい。「不均質な」核酸は、ヌクレオチド配列に関して互いに異なってよい。例えば、核酸Ａ、Ｂ及びＣを含む複数の不均質のものにおいて、核酸Ａのヌクレオチド配列は、核酸Ｂのヌクレオチド配列と異なり、核酸Ｂのヌクレオチド配列は、核酸Ｃのヌクレオチド配列と異なる。不均質な核酸は、長さ及び化学組成（例えば単離と合成）に関して異なっていてもよい。
【００７７】
自己集合型核酸ナノ構造を設計するための基本的な原理は、核酸鎖における配列相補性が、相補的セグメントを対形成することにより、適当な物理的条件下で核酸鎖が予め定義したナノ構造に自己組織化されるようにコードされることである。この技術は、当該技術において記載されている。例えばSeeman N.C.J.Theor.Biol.99:237、1982;Seeman N.C.Nature 421:427、2003;Shih W.M.らCurr.Opin.Struct.Biol.20:276、2010を参照できる。この技術は、様々な構造を作製するために用いられている。このような構造は、限定することなく、格子（例えばWinfree E.らNature 394: 539、1998; Yan H.らScience 301: 1882、2003; Yan H.らProc. Natl. Acad. of Sci. USA 100; 8103、2003; Liu D.らJ. Am. Chem. Soc. 126: 2324、2004; Rothemund P.W.K.らPLoS Biology 2: 2041、2004を参照されたい）、リボン（例えばPark S.H.らNano Lett. 5: 729、2005; Yin P.らScience 321: 824、2008を参照されたい）、チューブ（例えばYan H. Science、2003; P. Yin、2008を参照されたい）、規定された形状を有する有限２次元及び３次元物体（例えばChen J.らNature 350: 631、1991; Rothemund P. W. K.、Nature、2006; He Y.らNature 452: 198、2008; Ke Y.らNano. Lett. 9: 2445、2009; Douglas S. M.らNature 459: 414、2009; Dietz H.らScience 325: 725、2009; Andersen E. S.らNature 459: 73、2009; Liedl T.らNature Nanotech. 5: 520、2010; Han D.らScience 332: 342、2011を参照されたい）並びに巨視的結晶（例えばMeng J. P.らNature 461: 74、2009を参照されたい）を含む。これらの教示の全ては、本明細書に参照により組み込まれている。
【００７８】
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、核酸（例えばＤＮＡ）オリガミアプローチを用いて集合する。ＤＮＡオリガミアプローチを用いて、例えば、比較的より短い「ステープル」鎖との相互作用により、長い「足場」核酸鎖を予め設計された形状に折り畳む。よって、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造の集合のための一本鎖核酸は、少なくとも５００塩基対、少なくとも１キロベース、少なくとも２キロベース、少なくとも３キロベース、少なくとも４キロベース、少なくとも５キロベース、少なくとも６キロベース、少なくとも７キロベース、少なくとも８キロベース、少なくとも９キロベース又は少なくとも１０キロベースの長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造の集合のための一本鎖核酸は、５００塩基対〜１０キロベース以上の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造の集合のための一本鎖核酸は、７〜８キロベースの長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造の集合のための一本鎖核酸は、Ｍ１３ウイルスゲノムを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造は、一本鎖タイル（ＳＳＴ）（例えばWei B.らNature 485: 626、2012を参照されたい）又は核酸「レンガ」（例えばKe Y.らScience 388: 1177、2012;国際公開番号ＷＯ２０１４／０１８６７５Ａ１、２０１４年１月３０日に公開を参照されたい）から集合する。例えば、一本鎖の２又は４ドメインオリゴヌクレオチドは、配列特異的アニーリングにより、所定の（例えば予想される）様式で２次元及び／又は３次元ナノ構造に自己集合する。その結果、ナノ構造中の各オリゴヌクレオチドの位置がわかる。このようにして、核酸ナノ構造を、例えば特定の位置にオリゴヌクレオチドを付加、除去又は置き換えることにより改変できる。ナノ構造は、例えば特定の位置に部分を結合させることによって改変することもできる。このことは、改変オリゴヌクレオチドを出発材料として用いることにより、又はナノ構造が形成された後に特定のオリゴヌクレオチドを改変することにより達成できる。よって、得られるナノ構造の出発オリゴヌクレオチドのそれぞれの位置を知ることにより、ナノ構造をアドレス指定できる能力が得られる。
【００８０】
ナノ構造は、本開示の核酸結合体を用いて１又は複数の型のタンパク質を制御され、管理された様式で配置することによっても改変できる。
【００８１】
本開示のいくつかの態様は、アニーリングプロセスを用いて核酸ナノ構造を集合させることに向けられる。いくつかの実施形態では、核酸を、それらに限定されないがチューブ、ウェル又はバイアルのような単一の器で組み合わせる。用いられる核酸のモル量は、所望のナノ構造中の各核酸の頻度及び所望のナノ構造の量に依存してよい。いくつかの実施形態では、核酸は、等モル濃度で存在してよい。いくつかの実施形態では、各核酸（例えばオリゴヌクレオチド）は、約２００ｎＭの濃度で存在してよい。いくつかの実施形態では、核酸は、溶液中にある。アニーリング反応は緩衝剤の非存在下でも生じることができるが、溶液は緩衝されてよい。溶液は、それらに限定されないがＭｇ２＋のような二価カチオンをさらに含んでよい。カチオン又は塩濃度は、変動してよい。例示的な濃度は、約４９０ｍＭである。溶液は、ＥＤＴＡ又は他のヌクレアーゼ阻害剤も含んで、核酸の分解を妨げることができる。
【００８２】
アニーリング反応は、いくつかの実施形態では、核酸を含む溶液を加熱し、溶液をゆっくり冷却する（例えば加熱し、次いで室温環境におく）ことにより行われる。反応の温度は、ヘアピン構造のような任意の望ましくない２次構造を融解して、核酸が他の非相補的核酸と誤って結合しないことを確実にするように十分高い温度と予想される。温度は、よって、最初に、１００℃以下の任意の温度に上昇させてよい。例えば、温度は、最初に、１００℃、９５℃、９０℃、８５℃、８０℃、７５℃、７０℃、６５℃又は６０℃に上昇させてよい。温度は、器を温水浴、加熱ブロック又はサーマルサイクラー（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）装置）のような温度制御できる装置に入れることにより上昇させてよい。器は、その環境に数秒又は数分維持してよい。いくつかの実施形態では、約１〜１０分のインキュベーション時間で十分である。
【００８３】
上昇した温度での核酸インキュベーションが一旦完了したら、温度をいくつかの様式で下落させることができる。温度は、例えば、温度をある特定の量で下落させ、その温度をある特定の期間維持した後に温度を再び下落させるコンピュータアルゴリズムを用いる自動化様式で下落させることができる。このような自動化法は、各工程において１度又は各工程にて数度温度を下落させることを含んでよい。器は、よって、同じ装置で加熱及び冷却してよい。別の例として、加熱した溶液を室温において冷却してよい。温度を下落させるための例示的なプロセスは、以下のとおりである。約８０℃から約２４℃まで温度を下落させるために、１度あたり３分の割合（例えば８０℃で３分、７９℃で３分など）で１度の増分で８０℃から６１℃まで変化させる。温度を、次いで、１度の増分及び１度あたり約１２０分の割合（例えば６０℃で１２０分、５９℃で２１０分など）で６０℃から２４℃まで変化させる。このプロセスの全アニーリング時間は、約１７時間である。本開示に従って、これらの条件下で、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）は、所定の及び所望の形状及びサイズのナノ構造に自己集合する。
【００８４】
具体的なアニーリングプロセスの例は、１００の異なる２００ｎＭオリゴヌクレオチド溶液（例えば５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（TE）、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用い、溶液を約９０℃に加熱し、上記のように８０℃から６１℃の間に１度の下落あたり３分及び６０℃から２４℃の間に１度の下落あたり１２０分を用いて約７３時間の期間で約２４℃に冷却する。上記のアニーリングプロセスは、例示であり、他のアニーリングプロセスを本開示従って用いることができることが理解される。
【００８５】
本開示の核酸は、Ｄ型ＤＮＡ及びＬ型ＤＮＡのようなＤＮＡ、並びにＲＮＡ、並びにそれらの様々な修飾を含む。核酸修飾は、塩基修飾、糖修飾及び主鎖修飾を含む。このような修飾の非限定的な例を以下に示す。
【００８６】
本開示に従って用いることができる修飾ＤＮＡ核酸（例えばＤＮＡバリアント）としては、例えば、限定することなく、Ｌ−ＤＮＡ（文献において既知の、ＤＮＡの主鎖鏡像異性体）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸のような上記のものの共核酸が挙げられる。よって、本開示は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ又はそれらの組み合わせを含むナノ構造を企図する。本開示の方法及び組成物において用いる核酸は、本質的に、均質又は不均質であってよい。例えば、核酸は、本質的に、完全にＤＮＡであってよいか、又はこれらは、ＤＮＡ及び非ＤＮＡ（例えばＬＮＡ）の単量体又は配列で構成されてよい。よって、核酸要素の任意の組み合わせを用いてよい。核酸修飾により、核酸がある特定の条件下でより安定及び／又は分解に対して感受性が低くなることができる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼ耐性である。
【００８７】
本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、均質な主鎖（例えば完全にホスホジエステル又は完全にホスホロチオエート）又は不均質な（又はキメラ）主鎖を有する。ホスホロチオエート主鎖修飾により、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する感受性がより低くなり、よってある特定の条件下でより安定になることがある（天然のホスホジエステル主鎖核酸と比較して）。本開示の核酸をより安定にできる他の結合としては、限定することなく、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホロチオエート結合、ボラノホスホネート結合、ペプチド結合、アルキル結合及びデホスホ型結合が挙げられる。よって、いくつかの実施形態では、核酸は、自然に存在しない主鎖を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、生成物（例えばタンパク質）をコードしない。
【００８９】
本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、それらの糖に修飾をさらに又は代わりに含む。例えば、β−リボース単位又はβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位を修飾糖単位で置き換えることができ、この修飾糖単位は、例えば、ｂ−Ｄ−リボース、ａ−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、アラビノース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボース、好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースは２’−Ｏ−メチルリボースである、２’−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、ｂ−Ｄ−キシロ−フラノース、ａ−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−ｂ−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース並びに炭素環式（例えば本明細書に参照により組み込まれているFroehler J. Am. Chem. Soc. 114:8320、1992を参照されたい）及び／若しくは開放鎖糖類似体（例えば本明細書に参照により組み込まれているVandendriesscheらTetrahedron 49:7223、1993を参照されたい）並びに／又は二環式糖類似体（例えば本明細書に参照により組み込まれているTarkov M.らHelv. Chim. Acta. 76:481、1993を参照されたい）から選択される。
【００９０】
本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、それらの塩基に修飾を含む。修飾塩基としては、限定することなく、修飾シトシン（例えば５−置換シトシン（例えば５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン及び非置換又は置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えばＮ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えばＮ，Ｎ’−プロピレンシトシン又はフェンオキサジン）、並びにウラシル及びその誘導体（例えば５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）、修飾グアニン、例えば７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えばＮ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えばＮ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例えば８−ヒドロキシグアニン及び８−ブロモグアニン）、及び６−チオグアニンが挙げられる。核酸は、普遍的な塩基（例えば３−ニトロピロール、Ｐ−塩基、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール及びＫ−塩基）及び／又は芳香環系（例えばフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ベンズイミダゾール又はジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドに組み込むことができる特定の塩基対は、ＹａｎｇらＮＡＲ、２００６、３４（２１）：６０９５−６１０１により報告されるｄＺ及びｄＰ非標準ヌクレオ塩基対であってよい。ピリミジン類似体であるｄＺは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドンであり、プリン類似体であるそのワトソン−クリック相補体ｄＰは、２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−１’−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オンである。
【００９１】
本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される。よって、いくつかの実施形態では、核酸は、合成（例えば自然に存在しない）である。自動化核酸合成を含む核酸を合成するための方法は、既知である。例えば、修飾主鎖を有する核酸、例えばホスホロチオエート結合を含む主鎖、及びキメラ修飾主鎖を含むものを含む主鎖は、ホスホロアミデート又はＨ−ホスホネート化学のいずれかを採用する自動化技術を用いて合成できる（例えばF. E. Eckstein、“Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach” IRL Press、Oxford、UK、1991;及びMatteucci M. D.らTetrahedron Lett. 21: 719、1980を参照されたい）。アリール−及びアルキル−ホスホネート結合を有する核酸の合成も企図される（例えば米国特許第４，４６９，８６３号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、アルキルホスホトリエステル結合を有する核酸（例えば米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２，５７４号に記載されるように荷電酸素部分はアルキル化されている）は、市販の試薬を用いる自動化固相合成により調製する。他のＤＮＡ主鎖修飾及び置換を作製するための方法は、記載されており（例えばそれぞれが参照により組み込まれているUhlmann E.らChem. Rev. 90:544、1990; Goodchild J. Bioconjugate Chem. 1: 165、1990; Crooke S.T.らAnnu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107、1996;及びHunziker J.らMod Synth Methods 7:331、1995を参照されたい）、本開示に従って用いることができる。
【００９２】
本開示の様々な例示的実施形態を、以下の実施例においてより詳細に記載する。
【実施例】
【００９３】
方法
２．１）ソルターゼ適合性ＧＧＧ−ペプチドを有するＤＮＡ−オリゴヌクレオチドの形成、
２．２）ＤＮＡ−ペプチドキメラへのタンパク質のソルターゼにより触媒されるカップリング、及び
２．３／２．４）熱安定性／熱不安定性タンパク質のための自己集合型ナノ構造へのＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドの組み込み
について記載する４つのプロトコールを示す。
【００９４】
これらの実験のための官能化したオリゴヌクレオチドは、「オリゴ１」及び「オリゴ２」と称するともに６０塩基対（ｂｐ）のオリゴヌクレオチドであった。オリゴ１は３’−アジドを用いて合成し、オリゴ２は５’−アジドを用いて合成し、ともに、カスタムオリゴヌクレオチド製造業者であるＩＤＴから市販で入手可能であった。これらの実験で用いたペプチドは、（アミノからカルボキシ又はＮからＣへ）Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−ＧＧＧ−Ｐｒａ（すなわちＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＥＮＬＹＦＱ−ＧＧＧ−Ｐｒａ）（式中、「Ｐｒａ」は非天然アミノ酸プロパギルグリシンである）（配列番号１２）の配列を有する。このような合成ペプチドは、ＮｅｏＢｉｏＬａｂのような商業的な供給源に注文する。Ｐｒａ残基は、相補的クリック試薬であるアルキンを提供する。さらに、精製を容易にするために、ＦｌａｇタグをペプチドのＮ末端に付加した（配列中で「Ｆｌａｇ」と示す）。ソルターゼ酵素は遊離のＮ末端上にＧＧＧを必要とするので、タバコエッチ病ウイルス切断部位（ＴＥＶ）を導入して、Ｆｌａｇタグの除去を可能にした。
【００９５】
２．１  ソルターゼ適合性ＧＧＧペプチドを有するオリゴヌクレオチドの形成のためのプロトコール
２．１．１  試薬の調製
ａ．ペプチドをヌクレアーゼ非含有水中で１ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍＭ）に可溶化する。プロパギルグリシンは、ペプチドの溶解性を低減し、少量の重炭酸アンモニウムを加えてペプチドを可溶化できる。
ｂ．オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ非含有水中で１００μＭにて可溶化する。
ｃ．９４．２ｇ／Ｌ（５９ｍＭ）水性ＣｕＳＯ４ストックを調製する。無水ＣｕＳ０４が好ましい。
ｄ．２６４．２ｇ／Ｌ（０．２１Ｍ）水性アスコルビン酸ストックを調製する。アスコルビン酸は、Ｃｕ（II）（青色）を触媒活性Ｃｕ（I）（緑色）に還元する。
【００９６】
２．１．２  オリゴヌクレオチドへのペプチドのクリックカップリング（図１）
ａ．２５０ｕＬ  ＤＮＡ低結合性チューブ中で以下のものをあわせる：
ｉ．アジド−オリゴ３５μＬ
ｉｉ．ペプチド３０μＬ
ｉｉｉ．アスコルビン酸１２μＬ
１．ＣＯ２（気体）を重炭酸アンモニウムから生成する
２．ペプチドは中性ｐＨにて不溶性であるが、わずかに塩基性の重炭酸アンモニウム条件及び酸性のアスコルビン酸条件下でともに可溶性である
ｉｖ．ＣｕＳＯ４  ８．５μＬ。
ｂ．反応を室温にて２時間そのままにして、確実に完了させる。
ｃ．いくらかのＣｕはＣｕ（０）金属に還元され、これは析出する。
【００９７】
２．１．３  ペプチド−オリゴヌクレオチドキメラの精製
ａ．カップリングしていないペプチドの除去（方法１又は方法２のいずれかを用いることができる）
方法１：中和
１．ＴＢＳ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６）２５０μＬの添加による溶液の中和は、カップリングしていないペプチドを析出させる。
２．金属銅及び析出ペプチドは、１６，０００ｇにて５分間の遠心分離によりペレットにできる。上清は、カップリングした及びカップリングしていないオリゴヌクレオチドを含み、過剰のＣｕ（Ｉ）は、６〜８ｋＤａ膜（Ｍｉｎｉ  ＧｅＢＡｆｌｅｘ−ｔｕｂｅ、Ｔ０７０−６）を用いて透析して除くことができる。
方法２：ＱｉａＱｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（Qiagen）
１．キットのプロトコールに従うことにより、金属銅、Ｃｕ（I）、Ｃｕ（II）及びカップリングしていないペプチドを除去する。
２．製造業者の指示通りにプロトコールに従うべきであるが、洗浄工程は２回反復すべきである。
３．ＴＢＳ  ２００μＬを用いて溶出を行う。
【００９８】
２．１．４  カップリングしていないオリゴヌクレオチドの除去（図３）
ａ．抗Ｆｌａｇ  Ｍ２磁性ビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ８８２３）１ｍｌをＴＢＳ  １ｍｌで３回洗浄する。
ｂ．Ｑｉａｇｅｎ精製カラムの生成物を用いて、室温にて撹拌しながら１〜２時間結合させる。
ｃ．ビーズを確実にかき混ぜながらＴＢＳ  ５００μｌを用いてビーズを少なくとも４回洗浄して、カップリングしていないオリゴを全て除去する。ビーズをかき混ぜる場合には大口径ピペットが好ましいことがある。
ｄ．ｅＴＢＳ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）Ｆｌａｇペプチド１ｍｌで溶出する。１時間室温にて撹拌して溶出させる。
ｅ．２回目の溶出を行うことができるが、＞８５％が１回目の溶出で回収される。
【００９９】
２．１．５  ＦｌａｇタグのＴＥＶ切断（図４）
ａ．溶出生成物１ｍｌあたり２ｍｇ／ｍｌのＴＥＶプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ４４５５）を加える。
ｂ．３０℃の水浴中で一晩インキュベートする。
ｃ．結合、洗浄及び溶出（切断及び未切断）上清を用いて４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを泳動することにより、カップリングしていないオリゴヌクレオチド（洗浄が成功すると６０ｂｐのバンドが消失する）から生成物がうまく精製され、切断された（切断後に、バンドは６０ｂｐ付近にシフトして戻る）ことがわかる。
【０１００】
２．１．６  ここで、最終生成物をＧＧＧ−オリゴと称する。
ａ．必要ではないが、ＴＥＶプロテアーゼ及び切断ペプチドは、上記のＱｉａｇｅｎヌクレオチド除去キットを反復することにより除去できる。この工程は、必要であることが示されていない。
【０１０１】
２．２  ＧＧＧ−オリゴヌクレオチドへのＬＰＥＴＧタグ付加タンパク質のソルターゼカップリングについてのプロトコール
２．２．１  試薬の調製
ａ．ポリアクリルアミドゲル上のバンド強度により判断して約２μＭの濃度のＧＧＧ−オリゴヌクレオチド。
ｉ．ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ１１４９４）で染色し、ＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ−９５００を用いて画像化し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、１．４６ｒ）を用いて分析した。
ｂ．２つのタンパク質、タンパク質１及び２を２つの異なるオリゴ、オリゴ１及び２にカップリングする。
ｉ．この例では、タンパク質１はＣＤＨ２３であり、タンパク質２はＰＣＤＨ１５であり、ともに（Sotomayorら、Nature、492: 128-132、2012; Sotomayorら、Neuron、66: 85-100、2010）に記載されるようにして生成する。
ｃ．タンパク質は、０．１ｍＭの最小濃度で使用してよい。
ｉ．ＣＤＨ２３及びＰＣＤＨ１５ストックは、ＴＢＳ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２（約０．１ｍＭ）中でそれぞれ２．５及び２．７ｍｇ／ｍｌであった。
１．ＣＤＨ２３−ＬＰＥＴＧ（配列番号４）は、結晶学研究において用いた２つの細胞外ドメインを含む断片であった（Sotomayorら、Nature、492: 128-132、2012）。タンパク質は、Ｈｉｓタグとタンパク質のＣ末端との間にＬＰＥＴＧ（配列番号４）を添えることにより改変した。
２．ＰＣＤＨ１５−ＬＰＥＴＧ（配列番号４）は、結晶学研究において用いた２つの細胞外ドメインを含む断片であった（Sotomayorら、Nature、492: 128-132、2012）。タンパク質は、Ｈｉｓタグとタンパク質のＣ末端との間にＬＰＥＴＧ（配列番号４）を添えることにより改変した。
ｄ．ソルターゼストックは、ＴＢＳ＋１０％−グリセロール中に１．５ｍｇ／ｍｌであった。
ｉ．ソルターゼの進化したバリアント（Chenら、PNAS 108: 11399-11404、2011）を用いた。
ｅ．ソルターゼ反応緩衝液は、以下のものからなった：
ｉ．３００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５
ｉｉ．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ｉｉｉ．５ｍＭ  ＣａＣｌ２
ｉｖ．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１０２】
２．２．２  オリゴ１へのタンパク質１のソルターゼカップリング（図５）
ａ．以下のものを２５０μＬミニＧＥＢＡｆｌｅｘ−チューブ中で混合する
ｉ．２μＭ  ＧＧＧ−オリゴ１  １４０μＬ
ｉｉ．０．１ｍＭタンパク質１−ＬＰＥＴＧ−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）４０μＬ
１．タンパク質は、オリゴに対してカップリングを完了させるために大過剰で加える
ｉｉｉ．ソルターゼ５μＬ
ｉｖ．ソルターゼＲｘｎ緩衝液６５μＬ
ｂ．ＧＥＢＡ  ＦｌｅｘチューブをソルターゼＲＸＮ緩衝液１Ｌ中に入れ、ＲＴにて１時間又は４℃にて４〜５時間反応させる
ｉ．透析カラムは、全てのＦｌａｇペプチドを透析で除くことを可能にし、オリゴと競合し得るソルターゼ反応副産物であるＧ−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６）を除去する
ｃ．図８は、全ての成分が存在する場合にタンパク質−オリゴヌクレオチドキメラのみが形成されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す
【０１０３】
２．２．３  タンパク質−オリゴヌクレオチドキメラの精製（図６）
ａ．ＴＥＶ、ソルターゼ、タンパク質１及びタンパク質２は全てＨｉｓタグを有する。ソルターゼ反応は、しかし、最終生成物のＨｉｓタグを選択的に切断する。よって、生成物を抗Ｈｉｓ磁性ビーズに通すことにより、これらの反応物が除去され、上清中に最終生成物が残る。
ｉ．Ｎｉ−ＮＴＡの代わりに抗Ｈｉｓビーズが好ましい場合がある。Ｎｉ−ＮＴＡビーズは、オリゴと比較的強く結合する傾向にある場合があり、これらを除去するために非常に高い塩が必要になることがある。
ｂ．磁性抗Ｈｉｓビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌ００２７５）１ｍｌをＴＢＳ  １ｍｌで２回洗浄する
ｉ．これは、貯蔵溶液から全てのリン酸塩を除去して、リン酸カルシウム結晶の形成を妨げるためである。この工程を省略すると、後続の工程での損失が大きくなることがある
ｃ．ＴＢＳ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２  １ｍｌでさらに３回洗浄する
ｄ．ソルターゼ反応の生成物を加え、結合のために４℃にて２時間撹拌する
ｅ．上清は、全ての他のタンパク質を含まないＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドを含む
【０１０４】
２．３  足場へのＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドのハイブリダイゼーションのためのプロトコール（熱安定性タンパク質）
目的のタンパク質が４０℃への加熱に耐えることができるならば、オリゴを１対１の比率で足場に加え、次いでサーモサイクラー中で１分あたり０．５度にて４０℃から２０℃まで減少させることにより（Halvorsenら、Nanotechnol. 22:494005-494012、2011）、足場、この場合は直鎖状Ｍ１３（Halvorsenら、Nanotechnol. 22:494005-494012、2011）へオリゴをハイブリダイズできる。
【０１０５】
９５℃から０．５度工程にて２０℃までで全ての非官能化オリゴをアニールできる。官能化オリゴは、サーモサイクラーが４０℃に一旦到達したらサーモサイクラーを休止させ、官能化オリゴを加えることによりこの運転中に加えることができる。タンパク質が熱安定性でないならば、以下の２．４項に記載するような代替のアプローチをとることができる。
【０１０６】
２．４  足場へのＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドのハイブリダイゼーションのためのプロトコール（熱不安定性タンパク質）
この例では、ＣＤＨ２３及びＰＣＤＨ１５断片はあまり熱安定性でなく、温度アニーリングによるハイブリダイゼーションは選択肢でなかった。この系のために、ＧＧＧ−オリゴを足場にハイブリダイズさせ、ソルターゼカップリングを足場上で直接ｉｎ  ｓｉｔｕで行った。ハイブリダイゼーションの前にオリゴへのカップリングを行うことにより、どのタンパク質がどのオリゴに結合するかを容易に制御できる。この系のために、Ｆｌａｇタグを保護基として用いて選択的カップリングを達成した。つまり、オリゴ１を完全に加工してＧＧＧ−オリゴをもたらす一方、オリゴ２はそのＦｌａｇタグのＴＥＶ切断を受けなかった。
【０１０７】
さらなる懸念は、足場上のそれぞれの部位がその相補的オリゴを受けることを確実にすることである。このことを達成するために、オリゴを５０倍過剰で加える。このことは、しかし、大余剰の遊離の浮遊オリゴをもたらす。このことは、ｉｎ  ｓｉｔｕ反応と競合するＧＧＧ−オリゴヌクレオチドが過剰に浮遊しているならば、問題になり得る。この問題を克服するために、過剰のオリゴを溶液から除く必要があった。
【０１０８】
２．４．１  試薬の調製
ａ．ＧＧＧ−及びＦｌａｇ−ＴＥＶ−ＧＧＧ−オリゴは、約１０μＭに濃縮すべきである
ｉ．このことは、ｓｐｅｅｄｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓａｖａｎｔ、ＳＣ２１０Ａ）又は３ｋＤａスピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００、ＶＳ０１９１）を用いることにより達成できる。ｓｐｅｅｄｖａｃを用いるならば、オリゴをまず水に対して透析して、濃縮前に塩を除去するべきである。
【０１０９】
２．４．２  オリゴのアニーリング
ａ．低結合性２５０μＬ  ＰＣＲチューブ中で以下のものを混合する
ｉｉ．２０ｎＭオリガミ足場（この場合、直鎖状Ｍ１３）５μＬ
ｉｉｉ．全ての非官能化オリゴの１００ｎＭ混合物（等部）１．１９μＬ
ｉｖ．１０ｎＭ  ＧＧＧ−オリゴ１  ０．５μＬ
ｖ．１０ｎＭ  Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−ＧＧＧ−オリゴ２  ０．５μＬ
ｂ．混合物を、０．５度の増分での９５℃から２０℃までの温度減少に供して、足場にオリゴをアニーリングする。
【０１１０】
２．４．３  ＰＥＧ沈殿（Hartley及びBowen、Focus、66: 27-28、1996からの改変）による過剰オリゴの除去
ａ．アニーリングの生成物を、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の４重量％の８Ｋ  ＰＥＧ（Ａｍｒｅｓｃｏ、０１５９）１１５μＬ中で希釈する
ｂ．十分に混合する
ｃ．１６，０００ｇにて３０分間、２５℃で遠心分離する
ｄ．上部の１１２μＬを除去し、沈殿した足場を含むはずである底の１０μＬを残す
ｅ．残りの１０μＬを、別の３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の４重量％の８Ｋ  ＰＥＧ（Ａｍｒｅｓｃｏ、０１５９）１１５μＬ中で希釈する
ｉ．確実に十分に混合する。
ｆ．１６，０００ｇにて３０分間、２５℃で遠心分離する
ｇ．上部の上清１１５μＬを除去する
ｈ．残りの１０μＬは、いずれの検出可能量のハイブリダイズしていないオリゴも含まずに足場を含むはずである
【０１１１】
２．４．４．１  ＧＧＧ−オリゴへのタンパク質１−ＬＰＥＴＧ−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）のｉｎ  ｓｉｔｕカップリング
ａ．以下のものを混合する
ｉ．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５  ４０μＬ
ｉｉ．１Ｍ  ＣａＣｌ２  ０．８μＬ
ｉｉｉ．３Ｍ  ＮａＣｌ  ８μＬ
ｉｖ．ＰＥＧ沈殿させた足場１０μＬ
ｖ．１４ｍｇ／ｍｌソルターゼ５０μＬ
ｖｉ．０．１Ｍタンパク質１−ＬＰＥＴＧ−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）１５μＬ
ｂ．混合物を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭｉｃｒｏＦｌｏａｔ−ａ−ｌｙｚｅｒ、Ｆ２３５０５３）に入れる
ｃ．Ｆｌｏａｔａｌｙｚｅｒをソルターゼ反応緩衝液１Ｌ中に入れる
ｄ．この反応を０．５〜１時間ＲＴにて行った後に、さらに２時間４℃に移す（４℃に移す際に、予冷したソルターゼ反応緩衝液１リットルに移すことが最適である）
ｅ．２ｍｇ／ｍｌ  ＴＥＶ  ４μＬを加え、室温にて１時間そのままにする
ｆ．磁性抗Ｈｉｓビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌ００２７５）１ｍｌをＴＢＳ  １ｍｌで２回洗浄する。これは、貯蔵溶液から全てのリン酸塩を除去して、リン酸カルシウム結晶の形成を妨げるためである。この工程を省略すると、後続の工程での損失が大きくなることがある。
ｇ．ＴＢＳ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２  １ｍｌでさらに３回洗浄する
ｈ．ソルターゼ反応の生成物を加え、結合のために４℃にて２時間撹拌する
ｉ．上清は、ＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドを含む。ＴＥＶ及び過剰のＣＤＨ２３を含まない
ｊ．以下のものを上清に加え、新しいＦｌｏａｔａｌｙｚｅｒに入れる
ｖｉｉ．０．１Ｍタンパク質２−ＬＰＥＴＧ−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）１５μＬ
ｖｉｉｉ．１４ｍｇ／ｍｌソルターゼ５０μＬ
ｋ．工程ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｇ及びｈを反復する
ｌ．上清は、純粋な部位特異的に二官能化されたＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドを含む。
ｍ．ナノスイッチの官能性は、（Halvorsenら、Nanotechnol. 22:494005-494012、2011）に以前に記載されたようにしてゲル電気泳動によりアッセイした。
【０１１２】
結論
本開示は、タンパク質機能を保存しながらＤＮＡ−オリゴにタンパク質を確実に連結させる詳細なプロトコールを示した。さらに、これらのキメラを自己集合型ナノ構造に組み込むための方法を提供する。これらの技術は、非生理的条件の影響をより受けやすい合成オリゴ及びペプチドに対する全ての厳しい化学にまず取り組んでいる。クリック化学を用いることにより、結合が確実にバイオ直交型で、部位特異的でかつ効率的になる。進化したソルターゼを用いることにより、タンパク質安定性のために好ましい条件下でタンパク質カップリングが可能になる。プロトコールは、目的のタンパク質の変更に対して柔軟なように設計され、全ての材料は市販で入手可能である。内蔵された精製スキームにより、迅速で効率的な精製が可能になり、キメラ生成物を直ちに用いることができる。ソルターゼ適合性オリゴ及びペプチドのライブラリーと組み合わせる場合、この柔軟でモジュール式のアプローチは、要求に応じた広範囲の機能的ナノ構造の創出を可能にした。さらに、このアプローチは、構築できる機能的ＤＮＡ−タンパク質キメラの範囲を拡張し、以前は利用できなかったタンパク質機構の組み込みを可能にして、以前は得ることができなかった機能を有するナノ構造を作製することを可能にする。
【０１１３】
等価物
いくつかの発明の実施形態を本明細書に記載して説明したが、当業者は、本明細書に記載する機能を行うためかつ／或いは結果及び／又は１若しくは複数の利点を得るための様々なその他の手段及び／又は構造を容易に構想し、そのような変動及び／又は改変のそれぞれは、本明細書に記載する発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より全般的には、当業者は、本明細書に記載する全てのパラメータ、寸法、材料及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が発明の教示を用いる具体的な１又は複数の用途に依存することを容易に認識する。当業者は、本明細書に記載する具体的な発明の実施形態についての多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験だけを用いてそのような等価物を確認できる。よって、上記の実施形態は例としてのみ示され、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、発明の実施形態を具体的に記載し請求する以外の形で行うことができることが理解される。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載するそれぞれ個別の特徴、系、物体、材料、キット及び／又は方法に向けられる。さらに、２つ以上のそのような特徴、系、物体、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、系、物体、材料、キット及び／又は方法が互いに矛盾しないものでないならば、本開示の発明の範囲に含まれる。
【０１１４】
本明細書で定義して用いる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれている文書における定義及び／又は定義される用語の通常の意味を超えて支配すると理解される。
【０１１５】
本明細書で開示する全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用された主題の点で、文書の全体を時折包含して、参照により組み込まれている。
【０１１６】
不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも１」を意味すると理解される。
【０１１７】
「及び／又は」の句は、本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、連結される要素、すなわち接続的に存在する場合があり、離接的に存在する場合もある要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解される。「及び／又は」とともに列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわちそのように連結される要素の「１又は複数」と解釈される。「及び／又は」節により具体的に特定される要素以外のその他の要素は、具体的に特定される要素と関連していてもいなくても、任意選択により存在してよい。よって、非限定的な例として、「含む」のような開放式の言語とともに用いる場合に「Ａ及び／又はＢ」に言及することは、一実施形態では、Ａのみ（任意選択によりB以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択によりA以外の要素を含む）、なお別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意選択によりその他の要素を含む）などのことをいうことができる。
【０１１８】
本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、「又は（若しくは）」は、上で定義する「及び／又は」と同じ意味を有すると理解される。例えば、一覧に記載の項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的と解釈され、すなわち一覧に記載の数又は要素の少なくとも１つ、また１つより多く等を、任意選択により列挙していないさらなる項目とともに含んでいてもよいと解釈される。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの厳密に１つ」又は特許請求の範囲で用いる場合の「からなる」のようなそうでないことを明確に示す用語のみが、一覧に記載の数又は要素のうち厳密に１つの要素を含むことを述べている。全般的に、用語「又は」は、本明細書で用いる場合、排他的用語、例えば「のいずれか」、「の１つ」、「のうちの１つのみ」又は「のうちの厳密に１つ」が先行する場合にのみ、排他的な二者択一（すなわち「一方又は他方であるが、両方でない」）を示すと解釈される。特許請求の範囲で用いる場合の「から本質的になる」は、特許法の分野で用いられる通常の意味を有する。
【０１１９】
本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、１又は複数の要素の一覧に関する「少なくとも１つの」という句は、要素一覧に記載された任意の１つ又は複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるが、要素の一覧内に具体的に列挙するそれぞれ全ての要素の少なくとも１つを必ず含むわけでなく、要素の一覧に記載の要素の任意の組み合わせを排除するわけではない。この定義は、具体的に特定される要素と関連していてもいなくても、「少なくとも１つの」との句が言及する要素の一覧内で具体的に特定される要素以外の要素が任意選択により存在し得ることも許容する。よって、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１」（又は等価には「Ａ又はＢの少なくとも１」又は等価には「Ａ及び／又はＢの少なくとも１」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない、任意選択により１より多くを含む少なくとも１のＡ（及び任意選択によりＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ａが存在しない、任意選択により１より多くを含む少なくとも１のＢ（及び任意選択によりＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、任意選択により１より多くを含む少なくとも１のＡと、任意選択により１より多くを含む少なくとも１のＢと（及び任意選択により他の要素を含む）のことなどをいうことができる。
【０１２０】
そうでないと明確に示さない限り、１より多い工程又は作業を含む本明細書で請求する任意の方法では、方法の工程又は作業の順序は、方法の工程又は作業が記載される順序に必ずしも限定されないことも理解される。
【０１２１】
上記の明細書及び特許請求の範囲では、全ての移行部の句、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「で構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などは、開放式であり、含むが限定されないことを意味することが理解される。「からなる」及び「から本質的になる」との移行部の句のみが、米国特許庁特許審査手順マニュアルの第２１１１．０３項に示されるように、それぞれ閉鎖式又は半閉鎖式の移行部の句である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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