(57)【要約】  方法およびデバイスは、前線維コラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を原線維の組織化配列に組織化するために制御された引張ひずみを用いることに関して記載される。本開示の方法およびデバイスによって産生されるコラーゲン原線維の組織化配列は、組織工学適用のために使用できる。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前線維溶液を原線維の組織化した配列に組織化する方法であって、コラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を調製し、ここで前記コラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維であり、前記前線維溶液を通って前記コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維に制御された引張ひずみおよびせん断ひずみを生じる液体流を生じさせることを含み、ここで前記引張ひずみおよびせん断ひずみは前記前線維を原線維の組織化配列に集合させることを誘発するのに十分である、上記方法。
【請求項２】
前記引張ひずみが高く、前記せん断ひずみが低い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液がさらにフィブロネクチンおよび／またはプロテオグリカンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
引き抜きプローブが前記引張ひずみを生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が液滴、シート、球体、または円柱の形状である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ひずみの適用の際に溶液に補充用前線維を加えることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前線維構造を約１μｍ／秒から約１ｍｍ／秒の速度で連続的に引っ張ることをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記前線維構造を共貧溶媒性物質の存在下で引っ張ることをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
原線維の前記組織化配列を、再結晶を促進する溶液に暴露することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が高張剤を含む緩衝剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記高張剤がポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、またはグリコサミノグリカンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原線維が再結晶するときに前記原線維の前記組織化配列に伸長を加えることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記前線維溶液の濃度が約１．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記前線維溶液の濃度が約２．４ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの流入口および少なくとも１つの流出口を含むデバイスの上または内部にチャンネルを含むマイクロ流体デバイスであって、ここで構造上の第一マイクロ流体流入口は制御された流速でコラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を移送するように構成され、ここでコラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維であり、少なくとも１つの流入口のそれぞれは少なくとも１つの流出口と接続するチャンネルに結合するように構成され、ここで制御された流速は前線維を原線維の組織化配列に集合させることを誘発するのに十分な引張ひずみおよびせん断ひずみを生じる、上記マイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
前記引張ひずみが高く、前記せん断ひずみが低い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロ流体デバイスが平坦構造または円柱構造である、請求項１５または１６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
前記チャンネルの内壁に沿って生体適合性で非混和性の液体を移送するように構成された構造の上または内部に第二マイクロ流体流入口をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
前記液体がシリコーンオイルまたはペルフルオロデカリンである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
前記液体が低せん断粘度を有する、請求項１９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
前記チャンネルの内壁に沿って、第二液体層を越えて前記前線維溶液を中和および濃縮する液体を移送するように構成される構造上の第三マイクロ流体流入口をさらに含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
前記前線維溶液を中和および濃縮する前記液体がポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、および／またはグリコサミノグリカンを含む、請求項２１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
前記デバイスが引張ひずみ率を制御するように構成される、請求項１５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
少なくとも１つの流入口の端近辺の前記チャンネルが少なくとも１つの流出口の端近辺と比べて狭い直径を有し、ここで前記チャンネルの狭い直径が引張ひずみ率およびせん断ひずみ率を制御できる、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
前記原線維溶液のｐＨ、イオン強度、および／または濃度が調整可能である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維溶液の濃度が約１．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌである、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維溶液の濃度が約２．４ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
前記溶液がさらにフィブロネクチンおよび／またはプロテオグリカンを含む、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
コラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を第一マイクロ流体流入チャンネルに供給し、ここで前記コラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維であり、前記前線維溶液を通り前記コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維を原線維の組織化配列に集合させる制御された引張ひずみおよびせん断ひずみを生じる液体流を発生させ、コラーゲン原線維の前記組織化配列を収集することを含む、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用いた方法。
【請求項３０】
前記溶液の流速と同じまたは速い速度で前記原線維を収集する装置を用いて原線維の前記組織化配列を収集することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記装置が糸巻きである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１３年２月４日に出願した米国仮出願第６１／７６０，３９６号の利益を主張し、その全体の内容が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成番号ＮＥＩ  ＥＹ０１５５０に基づく政府支援によってなされた。
【０００３】
参照による引用
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書に記載される発明の日付においてその当業者に知られている技術の記載をより完全に説明するために、その内容全体として参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
本開示は組織工学および医療の分野におけるものである。
【０００５】
コラーゲンは多くの生物に存在する。コラーゲンは、脊椎動物において耐荷重分子の主たるものとして発達されており、ヒト筋骨格系内の非常に大きな力を支えるために重要である。またコラーゲンは血管、角膜、筋膜、骨膜、強膜、および皮膚を含む他の特殊化した様々な結合組織で選ばれた構造的分子である。不幸にもコラーゲン組織が機能せずに修復しない場合、その結果として患者の移動性に大きな影響を及ぼし、他の既存症状の重篤度を高め、最終的に余命を短くし得る。損傷または罹患した靭帯、腱、および角膜のような耐荷重細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を置換する天然移植片を「組織工学化」するために多大な努力が払われているが、臨床的に実行可能な構築体は作製されていない。我々は現在、方法を損傷した耐荷重コラーゲン組織を修復または置換することに限定している。インビボでの線維芽細胞による合成におけるコラーゲンの組織化または形態学をつかさどる機構についてほとんど知られておらず、これがしばしば修復不能な組織化されたコラーゲンの欠如または損傷であるためである。例えば、新たにコラーゲン構造を再生できないため、線維芽細胞がどのように結合組織産生を制御するのか理解を乏しくしている（Cowin, S.C., J Biomech Eng, 2000. 122(6): p. 553-69; Cowin, S.C., J. of Non-Newtonian Fluid Mechanics, 2004. 119(1-3): p. 155-162.）。インビボでのコラーゲン線維形成の制御に関する真相を導き出せるモデルはなく、組織工学は限定的に成功している、マトリックスを産生させる播種された細胞に大きく依存している。
【０００６】
脊椎動物における原線維形成コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ型）は、血管、骨、軟骨、角膜、椎間板、靭帯、強膜、皮膚、および腱における耐荷重に関与する主要なタンパク質である。コラーゲン耐荷重構造の変性または損傷は数百万人の生活の質を著しく低下し続けている。椎間板変性は腰痛となる可能性があり、米国で年間１，０００億ドル以上費やしている（Nagda, et al., Clin Orthop Relat Res, 2010. 468(5): p. 1418-22; Katz, J.N., J Bone Joint Surg Am, 2006. 88 Suppl 2: p. 21-4.）。毎年米国で１７５，０００例ものＡＣＬ修復が、５〜１０億ドルの推定費用で実施される（Lyman et al., J Bone Joint Surg Am, 2009. 91(10): p. 2321-8）。変形性関節症に続発する軟骨におけるコラーゲン変性は、７５歳過ぎの８０％、６０歳過ぎの半分を超える米国人の生活に悪影響を及ぼす。（(Arden, N. and M.C. Nevitt, Best Pract Res Clin Rheumatol, 2006. 20(1): p. 3-25.)。腱断裂、大動脈瘤、および角膜における円錐角膜は、最終的にはコラーゲンネットワーク不具合に起因する。また、エーラー・ダンロス症候群、ベスレムミオパチー、アルポート症候群、クノブロッフ症候群、骨粗しょう症（いくつかの症例）、骨形成不全症、動脈瘤、および関節リウマチ（自己免疫）を含む遺伝子変異による多くのコラーゲン関連疾患がある。これらの症状のすべてについて満足のいく治療はほとんどない。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、前線維構造タンパク質溶液に制御された引張ひずみおよびせん断ひずみを加えることによって前線維溶液を原線維の配列への組織化が誘発できるという発見に少なくとも一部が基づいている。いくつかの実施形態では、高い引張ひずみと低いせん断ひずみがコラーゲンおよびエラスチン原線維を含む原線維の組織化された配列を生じるために加えられる。前線維溶液を原線維の組織化配列に組織化するための方法およびデバイスが開示される。
【０００８】
いくつかの態様では、前線維溶液を原線維の組織化配列に組織化する方法が開示される。本方法にはコラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を用意し、ここでコラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維であり、前線維溶液を通る液流を生じさせてコラーゲンおよび／またはエラスチン前線維に制御された引張ひずみおよびせん断ひずみを引き起こすことが含まれる。いくつかの実施形態では、引張ひずみおよびせん断ひずみは前線維が原線維の組織化配列に集合することを誘発するのに適している。いくつかの実施形態では、引張ひずみは高く、せん断ひずみは低い。いくつかの実施形態では、溶液はさらにフィブロネクチンおよび／またはプロテオグリカンを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、引き抜きプローブが引張ひずみを生じるために使用される。 いくつかの実施形態では、溶液は液滴、シート、球状、または円柱の形態である。いくつかの実施形態では、本方法は引っ張りを加える際に溶液に補充用モノマーを加えることを含む。いくつかの実施形態では、溶液は約１μｍ／秒〜約１ｍｍ／秒の速度を含む様々な速度でコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維構造を連続的に引っ張ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに共貧溶媒性物質の存在下でコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維構造を引っ張ることを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法はコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維の組織化配列を、再結晶化を促進する溶液に暴露することを含む。いくつかの実施形態では、本溶液は高張剤を含む緩衝剤溶液である。いくつかの実施形態では、高張剤はポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、またはグリコサミノグリカンである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本方法は原線維が再結晶するように原線維の組織化配列に引っ張りを加えることを含む。いくつかの実施形態では、前線維溶液の濃度は、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、前線維溶液の濃度は、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。
【００１２】
いくつかの態様では、マイクロ流体デバイスが開示される。本デバイスは少なくとも１つの流入口および少なくとも１つの流出口を含むデバイス上またはデバイス内にチャンネルを含む。いくつかの実施形態では、構造上の第一マイクロ流体流入口は、コラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を制御された流速で移送するように構成され、コラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流入口のそれぞれは、少なくとも１つの流出口に接続するチャンネルに統合するように構成され、制御された流速は、前線維が原線維の組織化配列に集合することを誘発するのに十分な引張ひずみおよびせん断ひずみを生じる。いくつかの実施形態では、引張ひずみは高く、せん断ひずみは低い。
【００１３】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは平坦構造または円柱構造である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスはチャンネルの内壁に沿って生体適合性で不混和性の液体を移送するように構成される構造上または構造内に第二マイクロ流体流入口を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性の不混和性液体はシリコーンオイルまたはペルフルオロデカリンである。いくつかの実施形態では、液体は低いせん断粘度を有する。いくつかの実施形態では、デバイスはさらにチャンネルの内壁に沿って第二液体層を超えてコラーゲンおよび/またはエラスチン溶液を中和および濃縮する液体を移送するように構成される構造上に第三マイクロ流体流入口を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、コラーゲンおよび/またはエラスチン溶液を中和および濃縮する本液体はポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、またはグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、デバイスは引張ひずみ率を制御するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流入口の端に近いチャンネルは少なくとも１つの流出口の端に近くと比べて狭い直径を有し、チャンネルの直径が狭いことによって引張ひずみ率およびせん断ひずみ率を制御できる。いくつかの実施形態では、原線維溶液のｐＨ、イオン強度、および／または濃度は、本開示デバイスで調整可能である。いくつかの実施形態では、コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維溶液の濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、コラーゲンおよび／またはエラスチン前線維溶液の濃度は約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本溶液はさらにフィブロネクチンおよび／またはプロテオグリカンを含む。
【００１５】
いくかの態様では、マイクロ流体デバイスを用いた方法はコラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を第一マイクロ流体流入チャンネルに加えることを含み、ここでコラーゲンおよび／またはエラスチンは前線維である。本方法は、制御された引張ひずみおよびせん断ひずみをコラーゲンおよび／またはエラスチン前線維に生じてコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維を組織化配列に集合させる、前線維溶液を通る液流を生じることを含む。本方法はさらにコラーゲン原線維の組織化配列を収集することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに溶液の流速と同じまたはこれより速い速度で原線維を収集する装置を用いてコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維の組織化配列を収集することを含む。いくつかの実施形態では、本装置は糸巻きである。
【００１６】
これらならびに本開示の他の態様および実施形態を下記に図示および説明する。
本発明の前述および他の目的、これらの様々な特徴、ならびに本発明自体は、添付の図とともに読むとき、後述の説明からより完全に理解できる。図は説明の目的のためだけに提示され、本発明を制限することは意図されない。 
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本開示のいくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】いくつかの実施形態による前線維コラーゲン溶液の液滴から直接的に引かれた薄いコラーゲン線維を示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】開示された方法の実施形態を用いて前線維コラーゲン溶液の液滴から引かれたコラーゲン線維の括れ領域を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図４Ａ−Ｃ】本方法およびデバイスの実施形態を用いて産生されたコラーゲン原線維の組織化配列のマイクロ／ナノスケール形態学を示すＤＩＣ画像（図４Ａ）およびＳＥＭ顕微鏡写真（図４Ｂ−Ｃ）を表す図である。図４Ｃは引張ひずみを加えずに産生された非組織化コラーゲン原線維構造を示すＳＥＭ顕微鏡写真を表す図である。
【図５Ａ−Ｃ】本開示の方法およびデバイスの実施形態を用いて生じたコラーゲン原線維の組織化配列を示すＴＥＭ顕微鏡写真を表す図である。図５Ｂは図５Ａの拡大図であり、図５Ｃは本開示のいくつかの実施形態による拡大スケールでのＴＥＭ顕微鏡写真を示す図である。
【図６】本開示の方法およびマイクロ流体デバイスの特定の実施形態の概略を示す図である。
【図７】本開示の方法およびデバイスの実施形態の概略を示す図である。
【図８】本開示の方法の実施形態を用いて生じたコラーゲン線維を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図９Ａ−Ｆ】本開示の方法の実施形態を用いて生じた線維のコラーゲン線維付着可動性を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図１０Ａ−Ｂ】本開示の方法の実施形態を用いて生じた線維のコラーゲン線維再付着を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図１１Ａ−Ｂ】本開示の方法の実施形態によるコラーゲン線維形成を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図１２Ａ−Ｄ】本開示の方法の実施形態を用いた原線維形成を示すＴＥＭ画像を表す図である。
【図１３】いくつかの実施形態による円柱形マイクロ流体デバイスの概略を示す図である。
【図１４Ａ−Ｃ】いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの概略を示す図である。
【図１５】いくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの概略を示す図である。
【図１６】本開示の方法の実施形態から生じたＤ−結合を示す分離された原線維のＴＥＭ画像を示す図である。
【図１７Ａ−Ｂ】本開示の方法を用いて産生されなかった多く巻き込まれてかなり組織化されなかった原線維を示すＤＩＣ画像を表す図である。
【図１８Ａ−Ｂ】引張ひずみ用の参照のフレームの概略を示す図である。
【図１９Ａ−Ｅ】シリコーンオイル下でのコラーゲン重合化の時間による画像を示す図であり、長い待機時間がコラーゲン溶液の重合化を生じ、引き抜かれた原線維は高度な組織化がなされなかった。
【図２０】蒸発濃縮が表面の密集を引き起こす際に疎水性タンパク質吸着が同様な役割を果たすが、度合が低いという概念を説明する概略を示す図である。
【００１８】
詳細な説明
本明細書に記載されるものと同じまたは同等な方法および材料を本発明の実施または試験に使用できるが、適切な方法および材料が下記で説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照はそれらの内容全体において参照によって組み込まれる。抵触する場合、定義を含め本明細書は照合する。さらに材料、方法、および実施例は説明のためのみであり、限定されることが意図されない。
【００１９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する従来技術の当業者によって一般的に理解される同じ意味を有する。
定義
【００２０】
範囲は「約（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書では表現することができる。用語「約」は本明細書では、おおよそ、の範囲にある、おおざっぱに、またはそのあたりを意味するために使用される。用語「約」は数字の範囲とともに使用されるとき、示される数値の上および下の限度を広げて範囲を変更する。全般的には、用語「約」は２０％の変動によって定められた値の上および下の数値を変更するために本明細書では使用される。このような範囲が示されるとき、別の実施形態は１つの特定な値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が前述の「約」の使用によっておおよそとして示されるとき、特定の値は別の実施形態を形成するものと理解される。さらに範囲のそれぞれのエンドポイントは他のエンドポイントとの関連および他のエンドポイントとは独立する両方において意味があるものとさらに理解される。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「原線維」は適切な拡大によって線維状に見える連続構造を形成するモノマー、ダイマー、オリゴマー、および微小線維の集合である。原線維は直径が約２０ｎｍ超である。いくつかの実施形態では、原線維は１μｍ〜約２０μｍの範囲で、ミリメーターからセンチメーターの可変的な長さを有する。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、「前線維」溶液は、原線維および線維／原線維配列で認められる連続構造を形成していないモノマー、ダイマー、トリマー、オリゴマー、および微小線維を含む溶液を意味する。「前線維」は直径が約２０ｎｍ未満で可変長の分子単位である。原線維が凝集して繊維を形成し、用語「繊維」および「原線維配列」は同じ意味で使用される。用語「重合化」および「結晶化」は同じ意味で使用され、「前線維」が原線維および／または繊維に集合するときを意味する。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「コラーゲン」はコラーゲン三重らせんを形成するポリペプチド鎖撚り合わせを含む３次元構造を有する、またはＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復ユニットを含む特徴的なアミノ酸組成またはその断片を有する細胞外マトリックスのタンパク質成分を意味する。コラーゲンは従来技術で知られているいずれのコラーゲンでもある（例、限定されないがＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＸＩ型を含むコラーゲン１〜２９型の１つ）。本明細書で記載される場合、いくつかの実施形態では、コラーゲンは共同的なエンジニアリング材料系における主要成分であり、この系は耐荷重組織を産生して最適化する線維芽細胞の能力を著しく高める。
【００２４】
全般
本明細書に記載される方法はコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維を含む原線維の組織化配列を産生するために使用できる。本明細書に記載される方法およびシステムは、引張ひずみが前線維構造タンパク質を組み立てて原線維の組織化配列を生じるのに使用できるという発見に少なくとも部分的に基づいている。いくつかの態様では、本開示の方法およびデバイスによってひずみ誘発性重合化概念の利点を得ることができる。いくつかの実施形態では、溶液／空気接触面が前線維の濃縮および重合を誘発する機械的なひずみを発生するために使用される。例えば、本明細書に記載される線維引き抜き法は現在では研究室で認められる最も整列されたコラーゲン構造を産生する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して制御された引張ひずみを加えて原線維の組織化配列を産生する。
【００２５】
引張ひずみ（垂直ひずみまたは次元ひずみとしても知られる）測定は特定の方向または軸に沿った長さで変動する。本開示の方法およびデバイスでは、引張ひずみは一軸上の引張ひずみに限定されない。いかなる方向（例えば、平坦シートの等軸伸長または球状シェルの膨張）にも伸長流を生じる力の適用が本開示で検討される。いくつかの実施形態では、引張ひずみは、依存性の可変方向に沿った速度における正の空間導関数によって少なくとも１方向に影響を受ける前線維コラーゲン溶液中で流れを生じる状態である。この概念を説明するため、図１８Ａはｘ、ｙ、およびｚ軸の参考のフレームを示し、Ｔは加えられる伸長である。正のｄｕ／ｄｘは、ｘ方向における速度であるｕがｘとともに増加することを示す。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組織化コラーゲン配列を産生するのに適している高い引張ひずみ率を有する溶液流は、低いせん断ひずみ率を必要とする。図１８Ｂはｘ軸とｙ軸のための参照のフレームを示す。せん断ひずみはせん断ストレスに反応する特定の２方向と関連する角度の変動を測定する。せん断ひずみが０または０に近い場合、角度は維持される。せん断ひずみを定めるため、せん断ねじれを実施する平面を形成する２つの方向を考慮することができる。いくつかの実施形態では、低せん断はｄｕ／ｄｘが０または０に近い値で達成される。図１８Ｂに示すように、ｘ方向の速度（すなわちｕ）はｙ位置で大きくは変化しない。さもなければ、いくつかの実施形態では、せん断ひずみが高すぎる場合、本方法は組織化しない回転を生じる。別の実施形態では、回転流またはせん断ひずみは原線維組織化の量を「調整」するために含まれる。例えば、図１２Ａ−Ｄでは、本開示の方法の実施形態を用いた原線維形成を示すＴＥＭ画像を示すが、原線維はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で再水和化された。図１２Ａは高度に整列した原線維構造を示す。図１２Ｂはより小さい原線維の波形パターンを示す。図１２Ｃは融合し始めたより小さい原線維を示し、図１２Ｄは脱組織化の領域を示す。このため図１２Ｂは回転流またはせん断ひずみが、ある種の天然組織を模倣できる、例えば「波形」組織化を有する原線維を生じるために制御できる例である。脱組織化は重合化の際の異なる流速を反映すると考えられる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、引張ひずみは、微小針を前線維溶液の液滴に接触させ、微小針を引き抜くことによって前線維溶液に加えることができる。図１２Ａは前線維コラーゲン溶液の液滴からコラーゲン原線維を産生する概略図を示す。前線維コラーゲン溶液の液滴は小金属針のような円筒支持体から下げられ、ガラス微小針が原線維を引き出すために使用される。微小針を液滴と接触させ、ゆっくりと引き抜き、括れ領域を生じさせ、動いたときにコラーゲン含有液体を引き、引きぬく方向に沿って回転力を生じさせる。溶液の前線維コラーゲン成分は回転力に沿って並び、原線維を集合する。いくつかの実施形態では、針の引き抜き速度が引張ひずみを与えることができる。いくつかの実施形態では、引き抜き速度は約０．０１μｍ／秒から約１ｍ／秒の範囲である。別の実施形態では、引き抜き速度は約１μｍ／秒から約１ｃｍ／秒の範囲である。原線維の引き出しの際、溶液における温度、イオン強度、ｐＨ、および緩衝剤はすべて調整可能なパラメーターである。
【００２８】
図２Ａ−Ｂおよび図３Ａ−Ｂは、本明細書におけるより詳細を説明し、いくつかの実施形態による、前線維コラーゲン溶液含有液滴から直接的に引かれた薄いコラーゲン線維の代表を示す。図２Ａ−Ｂおよび図３Ａ−Ｂは、コラーゲン繊維が産生される位置である括れ領域を示す。括れ領域はコラーゲン繊維が領域を出るときに高い引張ひずみ率を低いせん断率で生じ、コラーゲン原線維の高度な組織化配列を生じる。待機時間は約５分であり、これによって繊維が液滴から引かれる前に原線維溶液は重合化していないことを確実にした。いくつかの実施態様では、本明細書でさらに詳細が考察されているように、前線維溶液は酸性が維持されてマイクロ流体法における共流溶液によって中和され、線維の脱組織化した配列を生じ、原線維が生じる前には溶液は確実に重合化されていない。
【００２９】
本明細書に記載される集合方法の特徴は、前線維溶液は、前線維溶液中に原線維または繊維を必要とせず、実際に含まないということである。引っ張り力を加える前の溶液における原線維または繊維集合は、最終生成物における原線維整列の減少と関連している。図１９Ａ−Ｅはイオン強度またはｐＨの変化を防止するシリコーンオイル下でのコラーゲン重合化の時間に伴う一連の画像を示す。具体的には、画像は２５℃、シリコーンオイル下で集合された微小容積の３．０ｍｇ／ｍｌコラーゲンである。画像中、スケールバーは２００μｍである。画像は、時間の関数として重合化の進行を示す （ｐＨ７．３で０分、５分、１０分、１５分、２０分）。集合の動力学を示していることに加えて、これらの画像はまた、コラーゲン形態学における差を検出する。図１９Ｅは溶液が明らかにより小さくて短い原線維領域を有することを示す。これらの画像は、すでに重合化されている（２０分での場合）溶液から繊維が引かれると、原線維は短く、高度に巻き込まれ、かなり脱組織化されることを示す。同様に、図１７Ａ−Ｂは本開示の方法を用いて生じなかった、高度に巻き込まれ、かなり脱組織化された繊維を示すＤＩＣ画像である。これらの画像はコラーゲン溶液が重合化して安定状態に達した後に引き抜かれた原線維を示す。図１７Ａ−Ｂに示すように、得られる原線維は高度に巻き込まれて組織化されなかった。使用した溶液の濃度は１．２ｍｇ／ｍｌだった。
【００３０】
いくつかの態様では、本開示はコラーゲン原線維の組織化配列をボトムアップで産生する方法およびデバイスについて説明する。いくつかの態様では、これらの配列は埋め込みにおいて生物学的および機械的に機能的である。天然コラーゲンをベースとした組織をボトムアップで産生する過去の努力は、組織がどのように形成されるかという知識における大きなギャップによって妨げられた。最も重要なことに、コラーゲンモノマーが細胞から出た時点から組織化された組織が生じるまでの集合動力学の理解が限定されている。（Cowin 2000; Cowin 2004）。より大きな繊維または薄膜内の高度に配列された原線維の発生に対する進歩は遅く、多くの失敗を経験した。天然組織の組織化および正確な整列コントロールで構造を産生している従来技術で知られている方法はない。
【００３１】
いかなる理論とも結び付かないが、本開示は細胞が間接的にコラーゲン原線維の形成および成長に局所的に影響するが、最終的な組織化および長い範囲の整列はコラーゲン原線維集合が力／ひずみに依存するために生じるという理論に基づいている。本開示の方法およびデバイスは引っ張りおよびせん断ひずみを制御でき、コラーゲンおよび／またはエラスチン原線維および繊維の高度に組織化された配列を産生できる。
【００３２】
本開示は、いくつかの点において、コラーゲンの機械的感受性が天然組織（限定されないが、血管から骨まで含む）を強く模倣するマルチスケールの階層的な構造の産生に使用でき、このような構造を産生するために使用される引張ひずみが制御できるという発見に基づいている。いくつかの態様では、本開示は正確に制御された内部原線維整列を有するコラーゲン繊維／薄膜を産生するマイクロ流体デバイスを用いた方法およびデバイスを含む。本開示の方法およびデバイスは低いせん断率で引張ひずみを使用してコラーゲン原線維の高度に組織化された配列を産生する。前線維コラーゲン溶液の濃度、ｐＨ、およびイオン強度は、原線維形成を誘発するために調整または設定される。
【００３３】
本開示はコラーゲンが引張ひずみを加えられたときに安定化／保持されて集合することを示唆した我々の「スマートマトリックス」モデルによって情報が提供される。本開示の方法およびデバイスは、コラーゲン原線維組織化をナノスケールで正確に制御でき、非常に模倣的な組織代替えをボトムアップで構築できる。本開示はコラーゲン集合を工学的レベルで工程管理できる。
【００３４】
コラーゲン
いくつかの実施形態では、本開示の方法およびデバイスはコラーゲン原線維の高度に組織化された配列を産生する。コラーゲンは脊椎動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）における最も豊富なタンパク質であり、引っ張り荷重耐性適用において最も一般的な構造分子である。２９種類を超える異なるコラーゲン配列が知られている。原線維コラーゲン（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＸＩ型）は耐荷重細胞外マトリックスにおける主要な構造成分であり、細胞に相互作用して三次元の多細胞生物を形成するネットワークをもたらす。コラーゲンは、その相補的アミノ酸配列が右巻き超分子三重らせんの形成を生じる３つの左巻きらせんα鎖を含む線状らせん構造を有している。コラーゲンはアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの反復配列を含み、ここでＸは通常プロリンであり、Ｙは通常ヒドロキシプロリンである。
【００３５】
様々なタイプのコラーゲンを本明細書で記載される方法およびデバイスで使用でき、天然源から分離または抽出、生物化学的または合成によって製造、遺伝子工学によって産生、あるいは他の手段またはこれらの組合せによって産生することができる。さらにコラーゲンは市販品を利用できる（例、Ｉｎａｍｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，フレモント、カリフォルニア州、およびＦｉｂｒｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．，サンフランシスコ，カリフォルニア州）。天然源には、限定されないが、生きた生物（限定されないが、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、およびヒトを含む）の組織によって産生され、または組織内に含まれるコラーゲンが含まれる。天然コラーゲンは既知の抽出法によって、例えば、腱、骨、軟骨、皮膚、または他の器官から得ることができる。例として天然源にはラットの尾腱および仔ウシの皮膚を含む。 
【００３６】
本明細書に記載される方法およびデバイスで使用できるいくつかのコラーゲンには、限定されないが、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、およびＸＩＸ型が含まれる。合成コラーゲンはいかなる人工的な手段によって産生されるコラーゲンを含むことができ、従来技術で知られているコラーゲンおよび他のタンパク質を産生するための多くの方法を使用できる。例えば、合成コラーゲンは天然コラーゲンと同一または異なる特定のアミノ酸配列のような特定配列を用いて調製できる。工学的コラーゲンは、例えばポリペプチド合成を含むいかなる従来技術で知られた方法によって産生できる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、原線維の組織化配列はＤ−結合コラーゲン原線維を含む。図１６は本開示の方法の実施形態から産生されたＤ−結合を示す分離された原線維のＴＥＭ画像を示す。図１６は引張ひずみから産生された繊維の原線維におけるコラーゲン結合を示し、Ｄ−結合は天然コラーゲン組織の模倣体である。原線維は２７５μｍ／秒の速度で引き抜かれた、６ｍｇ／ｍｌの中和化されたコラーゲンの液滴から生じた。この後、原線維は５０μｇ／ｍｌプロテオグリカンデコリンを含むＰＢＳ中で、３７℃で４８時間インキュベーションした。ついで原線維を組織グラインダーにかけ、原線維を画像化用のＴＥＭグリッド上に収集した。
【００３８】
線維性タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の方法およびデバイスは、限定されないが、エラスチン原線維などの他の型の原線維の高度に組織化された配列を生じる。エラスチンは構造に柔軟性を付与することができる線維性タンパク質である。エラスチンは細胞外マトリックスの一部としてある種の組織に本来認められる。本開示は、他の線維性タンパク質および柔軟性を付与するタンパク質、限定されないが、エラスチン、コラーゲン、およびフィブロネクチン、またはこれらの組合せを含む高度に組織化された配列を産生するために使用できる。このようなタンパク質の特性を模倣する非天然由来タンパク質も考慮される。
【００３９】
天然の耐荷重ＥＣＭにおけるコラーゲンの構造的整列
【００４０】
天然コラーゲンマトリックスの構造は、コラーゲン原線維のナノスケール組織化に基づいている。骨を除き（骨単位またはハーバース系を含むその独自のリモデリング機構のため）、耐荷重組織の構造は、発達の際の「設定」であり、成人における一般的な長期組織化で認められるほど変化しない。コラーゲン原線維には主に２つの組織化型があり、１）一軸角筒、および２）一軸シートまたは「薄膜」である。一軸シートまたは薄膜の場合、三次元構造がこれらの薄膜を連続的に積み重ねることによって「組立て」られ、薄層間の角度が変化する。積み重ねは同心円の円柱（層板骨、骨単位骨、線維輪など）または入れ子の半球（角膜など）で形成できる。これらの構造は実は二次元（加算）であり、薄膜の平面における引っ張りに耐えるため（角膜など）、またはねじれに抵抗するため（線維輪など）に自然に最適化される。
【００４１】
前線維溶液
【００４２】
本明細書に記載される方法およびデバイスはコラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を含み、コラーゲンおよび／またはエラスチンは原線維または繊維に凝集していない前線維である。コラーゲンが前線維溶液の例として使用されるが、本開示の方法およびシステムはコラーゲンに限定されず、本明細書で考察される他の線維性タンパク質または関連する合成材料を含むことができる。
【００４３】
本明細書に記載される方法およびデバイスは主にコラーゲンモノマー溶液を含む前線維溶液を細胞外マトリックス分子のようなコラーゲン調節分子などの別の分子とともに含むことができる。このような分子には、限定されないが、プロテオグリカン（パーレカン、ベルシカン、シンデカン、デコリン、ルミカン、フィブロモジュリン、アグレカン、およびビグリカンなど）、プロテオグリカンコアタンパク質、グリコサミノグリカン、（ヒアルロン酸、コンドロイチン−４硫酸、コンドロイチン−６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびケラチン硫酸など）、原線維形成コラーゲン、ＦＡＣＩＴコラーゲン、酵素（マトリックスメタロプロテイナーゼまたはリシルオキシダーゼなど）、フィブロネクチン、および／またはエラスチンが含まれる。いくつかの実施形態では、前線維溶液の濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前線維溶液は幹細胞または線維芽細胞などの細胞を含む。この細胞は引張ひずみの適用前、適用中、または適用後に前線維溶液に加えることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、溶液は原線維溶液と混和性でない、またはわずかにだけ混合する物質である共貧溶媒性物質を含む。いくつかの実施形態では、これらの物質は利用可能な水分をコラーゲンおよび／またはエラスチンと競合し、このためコラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を濃縮する分子（例、高張剤）である。このような高張剤には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはこれらの組合せが含まれる。これらの物質はコラーゲン前線維含有溶液に、本明細書で記載される重合の前または後に加えることができる。驚くべきことに、いくつかの態様では、低いせん断率を伴う引張ひずみを利用して前線維コラーゲンおよび／またはエラスチン溶液を誘発し、コラーゲン原線維の組織化配列に集合させる。いくつかの実施形態では、この引張ひずみは、コラーゲンおよび／またはエラスチン原線維を含む原線維に自己集合しない前線維を有する前線維溶液に適用される。本開示の方法およびデバイスは、原線維の既に集合した配列よりも溶液中の不連続分散において高度に組織化された原線維を産生する。
【００４６】
いくつかの例では、コラーゲンは明細書に記載されたように重合化され、コラーゲン組織は最初のコラーゲン構築体に交差結合、機械的ひずみ、および／または酵素を加えて望ましくない（ひずみのない）原線維を除くことによってさらに純化される (例、Ruberti et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 336:483-489 (2005) を参照、)。コラーゲン原線維は機械的ひずみを促進するために交差結合される。従来技術で知られているいかなる適切な交差結合剤を使用でき、限定されないが、ホルムアルデヒド、リシルオキシダーゼ、ヘキサメチレンジイソシアナート、グルタルアルデヒド、ポリエポキシ化合物、γ線照射、およびリボフラビンを用いた紫外線照射が含まれる。交差結合はいかなる既知の方法によって実施できる。（例、Bailey et al., Radiat. Res. 22:606-621 (1964); Housley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 67:824-830 (1975); Siegel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71:4826-4830 (1974); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 45:644-653 (1971); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 41:1597-1604 (1970);およびShoshan et al., Biochim. Biophys. Acta 154:261-263 (1968)を参照）。
【００４７】
本明細書に記載される方法は、引っ張り伸長の適用および／または、限定されないが、コラゲナーゼ（例、細菌コラゲナーゼ）、カテプシン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を含むコラーゲン分解酵素への暴露を通してコラーゲンＥＣＭを「造形する」のに使用することができる。このため、いくつかの例では、コラーゲンはコラーゲン分解酵素と接触され、同時に引っ張り伸長が加えられる。
【００４８】
適用
【００４９】
本開示の方法の適用には、組織化コラーゲンスキャホルド化および修復のための組織の作製、他の分子（例、カーボンナノチューブのようなナノチューブ）のための整列誘導の提供、および研究室における結合組織再生が含まれる。本方法は細胞外マトリックスを無細胞で作製するための新規方法を示す。
【００５０】
本明細書に記載される方法およびデバイスによって産生されるコラーゲンは、組織または器官を作製するために使用でき、限定されないが、骨、歯系組織、関節、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、腱、半月板、靭帯、血管、ステント、心臓弁、角膜、鼓膜、神経ガイド、組織または器官のパッチまたはシーラント、欠損組織用充填剤、美容修復用シート、皮膚（皮膚同等物を作製するために加えられた細胞を有するシート）、喉の軟組織構造（気管、喉頭蓋、および声帯など）、他の軟骨性構造（関節軟骨、鼻軟骨、瞼板、気管輪、甲状軟骨、および披裂軟骨など）、結合組織、血管グラフトおよびこの成分、ならびに局所適用あるいは器官（肝臓、腎臓、および膵臓など）の修復または置換のためのシートが含まれる。
【００５１】
いくつかの状態では、コラーゲンは本明細書で記載される外部または内部鋳型によって決められる既定の形状のような予め定められた形状を有して産生される。具体的な例では、鋳型は例えば、次にインビボ使用するための神経ガイド、皮膚または筋肉パッチ、筋膜鞘、椎間円板、膝半月板、靭帯、腱、または血管グラフトの形状に形状化することができる。またコラーゲンは、例えば腫瘍が取り除かれた部位または皮膚の損傷部位（例、切断、バイオプシー部位、孔、または他の欠損）を充填するために欠損または部位に適合させる、あるいは欠如または粉砕した骨片を再建または置換するために形状化にすることができる。本明細書に記載される方法は、高い柔軟性およびコラーゲンを様々な形状にカスタマイズすることが可能であるという効果がある。具体的な形状には、限定されないが、円柱形、平らな楕円形、毛細管（腱など）、および同心円筒（動脈、線維輪、層板骨など）が含まれる。
【００５２】
いくつかの例では、さらに形状化は形成されたコラーゲンをマニュアル処理して達成することができる。例えば、形成されたコラーゲンは、縫合、シーリング、ステープル固定、さもなければ目的の形状を形成するために別のものと結合することができる。例えば、本方法はプリンターヘッドとして使用でき、例として所望の形状を三次元プリンターで直接的にプリントすることができる。
【００５３】
マイクロ流体デバイスおよび方法
【００５４】
いくつかの態様では、原線維はマイクロ流体処理およびデバイスを用いて連続工程で、またはより大規模に得ることができる。本開示はマイクロ流体構造を含むマイクロ流体デバイスを含み、構造上または構造内のチャンネルは少なくとも１つの流入口および少なくとも１つの流出口を含み、構造上の第一マイクロ流体流入口はコラーゲンおよび／またはエラスチンを含む溶液を制御された流速で移送するように構成され、コラーゲンおよび／またはエラスチンは原線維に集合されていない前線維である。これらのデバイスでは、複数の流入口それぞれは少なくとも１つの流出口と接続するチャンネルと合流するように構成され、制御された流速が前線維を誘発して原線維の組織化された配列を集合させるのに適した引張ひずみを生じる。いくつかの実施形態では、引張ひずみは流入口と流出口の間の圧力差によって生じる。他の実施形態では、本明細書に記載されているように、引き抜きプローブが引張ひずみを加えるために使用される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体構造は平坦構造または円柱構造である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、デバイスは生体適合性の非混和性液体を移送するように構成された構造上または構造内に第二マイクロ流体流入口を含む。いくつかの実施形態では、液体はシリコーンオイルまたはペルフルオロデカリンである。いくつかの実施形態では、液体は低いせん断粘度を有する。いくつかの実施形態では、この液体はマイクロ流体デバイスの壁近辺にせん断効果を分散できる低粘度の潤滑層である。他の実施形態では、この層の粘度を調整して重合化の際のせん断ひずみの量を制御できる。このため、原線維の得られる配列は異なる機械的特性を有することができ、例えば、ある配列は他の柔軟性が低い原線維とは対照的に柔軟性がより高い原線維である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、デバイスはコラーゲン溶液を中和および濃縮する液体を移送するように構成された構造上に第三マイクロ流体流入口を含む。いくつかの実施形態では、この液体はイオンと水分子を交換させて溶液のｐＨ、イオン強度、および濃度を調整できる。いくつかの実施形態では、コラーゲン溶液を中和および濃縮する液体はポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、またはグリコサミノグリカンを含む。いくつかの態様では、本開示のデバイスおよび方法は、コラーゲン溶液の引張ひずみ率、ｐＨ、イオン強度、および／または濃度を制御するように構成される。いくつかの実施形態では、前線維コラーゲン溶液の濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。
【００５７】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスを用いるための方法が開示される。本方法は前線維溶液を第一マイクロ流体流入チャンネルに供給し、制御された引張ひずみを溶液の流れから離れた方向に加えること含み、これによって前線維溶液の重合化およびコラーゲンおよび／またはエラスチン原線維の組織化配列への集合を誘発する。いくつかの実施形態では、本方法は溶液の流速と同等またはより速い速度で繊維を引き抜く装置を用いてコラーゲン原線維の組織化配列を獲得することを含む。いくつかの実施形態では、装置は糸巻きである。
【００５８】
いくつかの態様では、本開示のデバイスおよび方法はコラーゲン原線維の組織化配列を形成する方法において引張ひずみを制御できる。哺乳動物組織では、数千個の細胞がコラーゲンを制限された機械的負荷空間で分泌して耐荷重組織を産生する。
【００５９】
本明細書でより詳細に考察され、図６は高度に制御されたコラーゲン原線維組織化を有するコラーゲン原線維を産生する方法およびデバイスの実施形態を示す。３種類の溶液の並行流双曲線デバイスにおいて、コラーゲン溶液の引張ひずみ率、ｐＨ、イオン強度、および濃度が制御される。
【００６０】
いくつかの態様では、本開示のデバイスは前線維溶液に引っ張り流を加える。前線維溶液のｐＨ、イオン強度、および濃度は調整可能である。図１３は本開示の実施形態の概略図を示す。図は引張ひずみを生じるノズルを有する円柱形マイクロ流体デバイスの断面を示す。流入口１００は前線維溶液の中央流のための流入口である。流入口２００は前線維溶液の濃縮を促進できる高張溶液用の流入口であり、液体、イオン、および他の小分子の交換が可能である。流入口３００はせん断ストレスを低下する潤滑溶液の並行流を可能にする流入口である。いくつかの実施形態では、前駆溶液１００は酵素、他の細胞外タンパク質、細胞、または合成の構造的補強物（例、カーボンナノチューブ）も含むことができる。デバイスの流出口で収集される物質は、引張ひずみをさらに誘発する押し出し速度と同等またはそれより速い速度での収集を経ることができる。ノズル４００は引っ張り流を双曲線状で収縮させ、ここで重合化が誘発される。
【００６１】
いくつかの態様では、本開示のデバイスは前線維溶液に二次元の表面ひずみを加える。図１４は、二次元の表面ひずみを前線維溶液に加える実施形態の概略図である。取り囲む周囲状況が球体上に前線維溶液の高められた表面濃度を生じる。この高められた表面濃度は、例えば表面から離れる分子拡散を超える速度での蒸発、または高張溶液との相互作用を通した複数の状態で達成される。反対に、高い開始濃度の前線維溶液を使用してもよい。そのため、球体は新鮮な前線維、酵素、細胞、および／またはプロテオグリカンを含むことができる液体が追加される。球体の表面におけるこの等軸上のひずみは、高い前線維濃度を有し、引張ひずみの方向に整列した重合化を生じることができ、細胞外マトリックス成長およびリモデリングのための分析を提供する。本開示の方法は中立の浮揚性溶液の存在下で使用して、重力の影響から球体のひずみを最小限にすることができる。
【００６２】
いくつかの態様では、本開示のデバイスは前線維溶液に二次元の等軸上のひずみを加える。図１５は前線維溶液に二次元の等軸上の引張ひずみを加える実施形態の概略図である。この図では、デバイスは中央孔の切り抜きを有する弾性膜２００を有し、膜が伸ばされたときに等軸上に拡張する。前線維溶液１００は液体の粘性によって中央孔切り抜きに幾何学的に固定される。取り囲む周囲状況によって液体の液滴／層の表面濃度を高められる。これは、例えば表面から離れる分子拡散を超える速度での蒸発、または高張溶液との相互作用を通した複数の状態で達成される。反対に、高い濃度の前線維溶液を使用できる。液体の末端での等軸上のひずみは、ひずみの場の方向に整列した原線維重合化を生じ、細胞外マトリックス成長およびリモデリングのための調査分析を提供する。いくつかの実施形態では、追加の前線維溶液、酵素、細胞、プロテオグリカンを、ひずみの適用前、適用中、または適用後に加えることができる。
【００６３】
本発明はさらに次の実施例によって説明される。実施例は説明目的でのみ提供される。これらは決して本発明の範囲または内容を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００６４】
実施例
本発明は説明目的のみのために示される次の実施例によってさらに説明される。これらは決して本発明の範囲または内容を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００６５】
実施例１−コラーゲン液滴
【００６６】
いくつかの態様では、当該方法は接触面またはバルク溶液中に蓄積するコラーゲン前線維（例、原線維形成型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＸＩ）を使用した。蓄積したモノマーの濃度は、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態では、範囲は約２．０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、範囲は約２．４ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。コラーゲン前線維が蓄積または濃縮された後、引き抜きプローブまたは引き抜きプローブの配列を溶液接触面またはバルク溶液と接触させた。驚くべきことに、組織化されたコラーゲン原線維または一連の原線維が溶液から引き抜かれた。いくつかの実施形態では、引き抜き速度は約０．０１μｍ／秒〜約１ｍ／秒の範囲である。他の実施形態では、引き抜き速度は約１μｍ／秒〜約１ｃｍ／秒の範囲である。原線維の引き抜きの際、溶液中の温度、イオン強度、ｐＨ、および緩衝剤はすべて調整可能なパラメーターである。
【００６７】
さらなる実施形態では、原線維はコラーゲン溶液が第二液体と交わる別の接触面を通して取り出すことができる。第二液体がガスの場合、ガスの湿度は０％〜１００％の範囲の相対湿度（ＲＨ）に制御される。いくつかの実施形態では、ＲＨは０％〜５０％、０％〜４０％、０％〜３０％、０％〜２５％、０％〜２０％、０％〜１５％、および０〜１０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、ＲＨは１０％である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、原線維または原線維の配列が引き抜かれた後、これらを再結晶化を促進する溶液にさらに暴露することができる。いつかの実施形態では、この溶液はコラーゲン原線維形成緩衝液であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のような、限定されないが、高張剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、当該方法は原線維が再結晶するときにコラーゲン原線維の組織化配列に引っ張りを加えることを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、より多くのコラーゲンモノマー、コラーゲン溶解性酵素、およびプロテオグリカンに暴露するようなコラーゲン原線維をさらに純化する１種類以上の処理後段階を含む。いくつかの実施形態では、これらが再結晶化する際に引っ張りを原線維または原線維の配列に加えることができる。
【００７０】
当該方法におけるコラーゲン濃度範囲、ひずみの大きさおよび分布、ならびに再水和化環境は変動できることが予期される。
【００７１】
驚くべきことに、本開示の方法は液滴から遅い引き抜き速度で組織化原線維を生じる。引っ張り流は、長軸方向での流速が液体流として増加する場所である。このタイプの引っ張り流では、引っ張りプロファイルはせん断効果を支配して、前線維コラーゲンが開示されるデバイスの長軸方向に整列するように設計される。図３Ａ−Ｂは繊維が産生される部位である括れ領域における液滴の形状の図を示す。液体動力学のモデル化にＣＯＭＳＯＬソフトウェアを用いて、図３Ａ−Ｂはこの液流プロファイルが、コラーゲン繊維が液滴を出る場所の伸長によって支配され、原線維の高度な整列に導くことを示す。
【００７２】
図７はコラーゲン溶液の液滴からの例えばガラス微小針の原線維の引き抜きの概略図を示す。材料。アテロコラーゲンを室温において、ｐＨ７．３でＰＢＳ中に２．４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。 液滴サイズは約１０〜約２０μｌだった。引く速度は約５〜約１００μ／秒だった。
【００７３】
図２Ａはコラーゲン溶液の液滴からガラス微小針によって引き抜かれたコラーゲン原繊維を示すＤＩＣ画像の図である。図２Ｂでは、引き抜かれた原繊維は平行な位置に認められる。原繊維は前線維コラーゲン溶液１１０の液滴からガラス微小針１００によって引き抜かれる。図２Ａ−Ｂは短い５分の待機段階を使用して産生された。画像は引張ひずみの形態で分子密集および機械的刺激を用いることによる連続的な繊維の産生を示す。
【００７４】
図９Ａ−Ｆはコラーゲン繊維付着移動を示すＤＩＣコマ送り画像を示す。 図９Ａ−Ｆの画像は異なる時点で得られる（それぞれ０秒、２２秒、３３秒、５６秒、１分１１秒、および１分２９秒）。これらの画像は繊維の付着点が移動性を有することを示す。図３Ａ−Ｂに示すように、線維構造のみが括れ領域から短い距離を開始し始めるための付着点は自由に移動できる。
【００７５】
図１０Ａ−Ｂは断裂後に修復する繊維の能力を示すＤＩＣのコマ送り画像であり、連続的な原線維の引っ張りが修復部位でわずかな不具合しか残さない。図１０Ａでは、繊維は付着点から８秒で離れた。図１０Ｂは原線維が連続的に引っ張られた４４秒後における線維再付着を示す。
【００７６】
図１２Ａ−Ｄは特定条件下におけるコラーゲン繊維形成を示すＤＩＣ画像である。原線維は液滴がオイル下にあるときに３ｍｇ／ｍｌ前線維コラーゲン溶液から引き出された。図２０は蒸発濃縮が表面密集を誘導する間に、疎水性タンパク質吸着が、程度は低いが同様な役割を演じることができることの概念を示す。さらにオイル下の原線維引き出しは、その過程がｐＨまたはイオン強度における蒸発誘導変化の結果でないことを示す。
【００７７】
図１１は抜き取りがシリコーンオイル層を有する液滴溶液から原線維を引き抜くことによって実施された場所を示すＤＩＣコマ送り画像を示す。付着点は疎水性タンパク質吸着の弱い効果に起因する低い表面濃度によって移動性が高かった。図１１では、長い待機時間が使用され（約２０分）、遅い引き抜きが短い原線維を生じた。この図は単純な疎水性相互作用が十分であるシリコーンオイル下で実施されたため、蒸発は繊維の引き出しを必要としないことを示す。このため、線維形成はより速い引き抜きによる機械的刺激を有することを強いられない。その上、表面は適切な濃度を有するべきである。
【００７８】
図３Ａ−Ｂは原線維形成が目視できるようになる液滴からの括れ領域を示すＤＩＣ画像を示す。同様に図５は原線維形成が始まり（白色矢印で図示）、引っ張りがコラーゲン原線維集合を誘発することを示すＤＩＣ画像を示す。
【００７９】
図２Ａ−Ｂはいくつかの実施形態に従って、薄いコラーゲン原線維がＩ型ウシコラーゲンモノマーを含む液滴から直接引き抜かれたことを示す図である。本実験では、コラーゲン原線維は中和したＩ型ウシコラーゲンモノマーの液滴から引き出された。前線維溶液の濃度は２５℃で３．０ｍｇ／ｍｌだった。引き出された原線維は約１０ｍｍ×２０μｍである。図８はコラーゲン溶液の液滴からガラス微小針によって引き出されたコラーゲン繊維のＤＩＣ画像を示す。図２Ｂでは、引き抜かれた繊維は平行の位置に認められる。繊維は前線維コラーゲン溶液の液滴１１０からガラス微小針１００によって引き抜かれる。図２Ａ−Ｂは短い５分の待機段階を使用して産生された。画像は引張ひずみの形態で分子密集および機械的刺激を用いることによる連続的な原線維の産生を示す。いくつかの態様では、本開示は繊維が液滴から引き出される括れ領域での引張ひずみは原線維形成の重要な誘導事象だったという発見に基づいている。この図は原線維産生方法の連続的な性質を、前線維コラーゲン溶液の小液滴からでさえ示している。
【００８０】
図３Ａ−Ｂは前線維コラーゲン溶液が本開示の方法の実施形態を用いてコラーゲン原線維を引き出した後に乾燥した液滴の括れ領域のＤＩＣ画像を示す。図３Ａでは、小さい矢印は前線維コラーゲン溶液の組織化コラーゲン原線維への最初の形成を示し、これらは液滴のくびれに引き抜かれてひずみ率が増加する。同様に、ＦＩＧ．３Ｂは異なる角度からの組織化コラーゲン原線維の形成を示す。ＦＩＧ．３Ａおよび３Ｂの両図では、原線維は括れ領域でのみ局所的に生じ、原線維は液滴表面の他の場所では観察されない。原線維は短い待機時間後（約１０分未満）に溶液から引き出され、伸張／引張ひずみが原線維形成の誘発に関与することを裏付ける。
【００８１】
図４Ａ−Ｃは原線維のマイクロ／ナノスケール形態学を示すＤＩＣ画像（図４Ａ）およびＳＥＭ顕微鏡画像（図４Ｂ−Ｃ）を示す。図４Ａでは、ＤＩＣ画像は引っ張り流から生じた原線維の組織化配列の驚くべき整列を示す（ここでは一実施形態として液滴から引き出し）。図は、ガラスカバースリップ上に置かれてリン酸緩衝化生理食塩水で再水和化された後に、対物２０倍を用いた原線維構造を示す。挿入バーは５μｍである。図４Ａは原線維軸に沿う以外はどの方向にも内部構造の証拠がないコラーゲン原線維を示す。図４Ｂは、前線維コラーゲン溶液から引き抜かれた高度に整列した原線維のナノスケール配列を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。これは外科用メスで原線維に切り込むことによって生じた原線維の内部部分を示す。図Ａ−Ｂは、引張ひずみが加えられずに原線維形成緩衝液によって産生された脱組織化コラーゲン線維構造を示す図４Ｃと明確な対比を示す(Paten et al., Biomaterials, 2013. 34(11): p. 2577-87を参照)。
【００８２】
図５Ａはコラーゲン原線維の組織化配列を示すＴＥＭ顕微鏡写真を示す。小さい矢印は一致した直径の原線維の驚くべき垂直な整列を示す。大きい白色矢印は引く方向を示す。図５Ｂはコラーゲン原線維の組織化配列の高拡大を示す。小さい矢印は単一コラーゲン原線維を示す。図５Ａ−ＢによってＳＥＭ顕微鏡写真（図４Ｂ−Ｃ）に示される整列が確証され、再度驚くべき原線維の直径の規則性が示される。同様に図５Ｃは大スケールでコラーゲン原線維の組織化配列を示すＴＥＭ顕微鏡写真である。
【００８３】
実施例２−マイクロ流体デバイスおよび方法
【００８４】
図１は本開示のいくつかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの図を示す。図１Ａはマイクロ流体の双曲線フローチャンバーである。図１Ｂに示すモデル化フロープロファイルは、引っ張り流の使用が高度に整列された原線維の組織化配列を生じることを実証する。
【００８５】
図６は高制御可能なコラーゲン原線維組織を有するコラーゲン原線維を産生する方法およびデバイスの実施形態を示す。３溶液並行流双曲線デバイスでは、コラーゲン溶液の引張ひずみ率、ｐＨ、イオン強度、および濃度が制御される。いくつかの実施形態では、デバイスは明らかな混合を発生せずに材料を側部交換させる低レイノルズ数マイクロ流体流の利点を得る。コアの流れは前線維溶液であり、イオンと溶媒の両方を第二条件化層であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と交換する際に、制御可能な引張ひずみが加えられる。ＰＥＧは生体適合性であり、コラーゲン原線維形成緩衝液中で高浸透圧剤として使用される。ＰＥＧ層はコラーゲンを濃縮してコントラクター中でそれを中和し、コラーゲンがデバイスの出口から引き出されるちょうどその時に（その前ではない）、原線維形成が行われる。並行流の第三層は低せん断粘度の生物適合性の不混和性液である（シリコーンオイルまたはペルフルオロデカリンが最初の選択肢である）。この液体はコラーゲンのほとんど固体の中心カラムをスピナレットからスライドさせる界面潤滑剤の役割を担う（背圧を低下させる）。いくつかの実施形態では、本開示の方法およびデバイスは、空気接触面を取り除き、引っ張り流を受けるコラーゲンの濃度を高める機能を維持する。本開示の方法およびデバイスはコラーゲン原線維形成を高度に制御する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、コラーゲン濃度、引張ひずみ率、および集合動力学を調整できるマイクロ流体デバイスのための方法およびシステムが開示される。
【００８７】
原線維の組織化配列の発生を誘発するのに必要な環境操作（濃度、ｐＨ、およびイオン強度）および引っ張り流プロファイルを映し出すデバイスを設計するために必要なパラメーター値を確定する。前線維コラーゲン溶液（コア流）および候補となる並行流条件化液体（例えば、ポリエチレングリコール）の溶液の流動学的な特性を研究し、条件化並行流液体の存在下におけるコラーゲン集合の動力学を抽出する。マルチフィジックスモデル（ＣＯＭＳＯＬ）は経験的に獲得された入力パラメーターを組込み、組織化原線維を産生するのに必要とされる最適な形状、流速、引き抜き速度、および溶液濃度を決定する。
【００８８】
試験はコラーゲンの複雑流体学および集合動力学、ならびにＰＥＧの流体学およびそのコラーゲン集合動力学に影響する能力に関して実施される。
【００８９】
コラーゲンおよびＰＥＧ溶液のせん断粘度（ｕ）および緩和時間（λ）。コラーゲンおよびＰＥＧ溶液の両方の複雑流体学を、定常せん断流および小規模振動せん断流において、円錐および平面ストレス制御せん断レオメーター（ＴＡ  ＤＨＲ−３）を用いて検査する。
【００９０】
方法：Ｉ型ウシテロコラーゲン（Ｉｎａｍｅｄ、カナダから入手）をすべての試験で使用する。コラーゲン溶液は異なる５つの濃度（５ｍｇ／ｍ、３０ｍｇ／ｍ、６０ｍｇ／ｍ、  １２０ｍｇ／ｍ、および２４０ｍｇ／ｍ）および複数のｐＨ値（２、４、６、７．３、および８）で試験する。１０００Ｈｚ-1までのせん断率、２０Ｈｚまでの周波数、および４℃〜３７℃の温度で実施する。３種類の分子量（４ｋ、２０ｋ、１００ｋ）および５種類の濃度（１％、５％、１０％、２０％、および３０％）の純粋な中性ｐＨのＰＥＧ溶液をコラーゲンと同一な方法で実施する。記載される以外、すべての実験は一連の試験を通して三重で実施する。すべてのコラーゲン溶液は購入の１月以内で使用し、使用前は４℃で保存する。
【００９１】
結果：コラーゲンおよびＰＥＧ溶液のせん断粘度（μ）をｐＨ、せん断率、温度、および濃度と関連させるマスターカーブを作成する。これによって本開示のデバイスの実施形態における圧力および可能性のあるせん断プロファイルが決定される。溶液中のコラーゲンモノマーの緩和時間（λ）を測定する。緩和時間は流れにおいて極めて重要であり、集中する収縮内で生じるように、液体（ε）が強いられる引張ひずみ率が液体の緩和時間の逆数よりも大きいときにＰＥＧおよびコラーゲンが伸長されて変形される。(Rothstein, J.P. and G.H. McKinley, J. Non-Newtonian Fluid Mech., 1999. 86(1-2): p. 61-88; Rothstein, J.P. and G.H. McKinley,. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 2001. 98: p. 33-63; Oliveira et al., Experiments in Fluids, 2007. 43: p. 437; Pipe, C.J. and G.H. McKinley, Mech. Res. Comm., 2009. 36: p. 110-120.)。緩和時間の逆数に等しいεのこの値は、臨界ひずみ率（εｃ）と言われ、１に等しいワイセンベルグと一致し、Ｗｉ＝εｃλ＝１．０、溶液中ポリマーのコイル−伸長転位を生じる。Bird, R.B. et al., 1987, New York: John Wiley & Sons。これらの試験において、Ｗｉが１．０を超えるときにモノマーが整列されてコラーゲンが集合する。
【００９２】
コラーゲン線維形成速度（ｆｔ）。コラーゲンの集合動力学は光学的方法および流体学的方法の両方によって研究される。ｐＨ、分子密集、および引張ひずみ率が集合を誘発するために使用され、集合の動力学におけるこれらのパラメーターそれぞれの効果を独立して測定することが重要である。本方法はコラーゲン溶液のひずみのない微小容量におけるベースライン動力学を最初に確立することを含む。第二に、システムは期待できる集合速度スケールで選択され、引張ひずみが原線維形成速度を高めるかどうかを測定する。
【００９３】
微小容量集合動力学試験：コラーゲン溶液の微小容量を異なる５種類の濃度（５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、および２４０ｍｇ／ｍｌ）でシリコーンオイル下、または中性ＰＥＧ溶液（濃度１％、５％、１０％、２０％、および３０％）にガラスマイクロピペットを用いて２５℃および３７℃で沈殿させる。
【００９４】
評価：原線維形成の速度は、例えばＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｅ顕微鏡に装着されたＤＩＣ顕微鏡によって追跡する。
【００９５】
結果：中性ＰＥＧ溶液は局所的な分子密集および中和化（プロトン輸送）によるコラーゲン集合の速度に有意に影響する。コラーゲン濃度、温度、ＰＥＧ濃度、およびＰＥＧ分子量に対するコラーゲン集合の速度をプロットする。この速度は本開示の方法およびデバイスに使用するコラーゲン濃度、温度、ＰＥＧ濃度、およびＰＥＧ分子量を決定するのに役立つ。
【００９６】
高濃度ＰＥＧは、この工程の動力学を観察するのを難しくする非常に速い原線維形成を生じるため、２つのガラスプレート間に制限された空間でＰＥＧにコラーゲンを注入して原線維前面移動を追跡した。集合がプロトンの分散係数の根に比例した割合でコラーゲンに前面移動するものとして、分散速度を補正した後に集合速度を評価する。このため、外挿して集合の速度を求めた。
【００９７】
原線維形成のために使用する一連の引張ひずみ率（εｃ）。本明細書に記載されるように、マイクロ流体構造は平面基板に加えて円柱状とすることができる。コラーゲンの集合動力学における引張ひずみの効果を試験するため、特注フィラメント伸長レオメーター（ＦｉＳＥＲ）を使用する。これらの試験では、最初のほとんど円柱状の液体サンプルを２つの円柱状プレート間に配置して、急激な速度で伸長して一定の単軸上の伸長（ε）を生じさせ、これはεと原線維形成の間の関係を測定するのに使用できる。フィラメント伸長の際の偏光顕微鏡法によって溶液複屈折の変化の検出が達成されることが知られており、(Bischoff-White, E. and J.P. Rothstein, Rheologica Acta, 2012. 51: p. 303-314; Chellamuthu, M. et al., J. Rheol., 2011. 55: p. 901-920; Rothstein, J.P., J. Rheol., 2003. 47: p. 1227-1247; Rothstein, J.P. and G.H. McKinley, Inhomogeneous transient uniaxial extensional rheometry. J. Rheol., 2002. 46: p. 1419-1443; Rothstein, J.P. and G.H. McKinley, J. Non-Newtonian Fluid Mech., 2002. 108: p. 275-290)、原線維形成開始を検出することが達成されることを裏付ける。
【００９８】
方法。コラーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、および２４０ｍｇ／ｍｌ）の小容量を異なるｐＨ値（２、４、６、７．３、または８）で反対側のプレート上に相対湿度１００％、２５℃または３７℃で加えた。プレートを分離して、せん断実験から計算して、ワイセンベルグ数が１．０（コラーゲン集合を生じると予想される値）となる設定引張ひずみ率（εｃ）を約２０％超える、これと等しい、または約２０％下回る引張ひずみ率を生じさせる。いくつかの実施形態では、引張ひずみ率は、設定引張ひずみ率を約３０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約４０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約５０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約６０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約７０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約８０％超えるまたは下回る、設定引張ひずみ率を約９０％超えるまたは下回る、あるいはそれ以上である。
【００９９】
評価。偏光画像および引っ張り粘度変化は重合化開始の確かな指標を与える。引っ張りレオメーターによって産生される原線維をＸ線、ＴＥＭ、およびＳＥＭによって試験する。
【０１００】
結果。２５℃または３７℃および異なるｐＨ値で各コラーゲン濃度についてコラーゲン原線維の組織化配列の集合を誘発する引張ひずみ率を測定する。データは本開示の方法およびデバイスのために使用するコラーゲン溶液濃度、ｐＨ、温度、引張ひずみ率などの最初のコントロールを設定するのに役立つ。
【０１０１】
マイクロ流体デバイス。本開示のデバイスの実施形態のＣＯＭＳＯＬマルチフィジックスモデルに情報提供するために測定した値（εｃ、ｆｔ、μ）を使用する。モデル化：前線維コラーゲン溶液と並行流する２つの液体（例、ＰＥＧおよびシリコーンオイル）を使用する。ＰＥＧ層はフィーダーコラーゲン溶液（両液体のために理論的にモデル化された浸透圧）を超えた浸透圧を有する非ニュートン液体（我々によって測定されたせん断依存粘度）としてモデル化される。スリップ層は低μを有する不混和性液体としてモデル化される（物質データベースでシリコーンオイルが認められる）。入力パラメーターは、ほとんど完全な原線維形成（ｆｔに基づく）を可能にするのに十分長い期間でεｃ直下の安定した引張ひずみ率を生じる双曲線形状に近づけるために逆に選択される。
【０１０２】
結果：モデルは本開示の方法およびデバイスのために一連の設計基準をもたらす。モデルの出力値はεｃ、ｆｔ、およびμの関数として双曲線コントラクターの限界を数学的に定める。
【０１０３】
実施例３−マイクロ流体デバイスのプロトタイプ
【０１０４】
実施例２で前述されたマルチフィジックスモデルから抽出するパラメーターに基づいた複数のプロトタイプデバイスを作製する。デバイスはコラーゲン原線維の組織化配列を産生するためにモデルによって予測されたパラメーターの範囲にわたって試験される。産生されたコラーゲン原線維および薄膜のサブ構造の複数評価がマイクロ機械的試験、Ｘ線、ＳＥＭ、ＴＥＭ、およびＡＦＭによって実施される。
【０１０５】
これらの実施例は、多くの結合組織（例、原線維および薄膜）に認められる基本的な構造単位とサイズが同じである構造内にナノスケールのコラーゲン整列および組織化を制御可能で産生する本開示のデバイスおよび方法の実施形態を生み出す。本開示のデバイスおよび方法はコラーゲンをベースとした組織の構造的複雑性を新たに再生するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のデバイスおよび方法によって産生される構造は、天然組織置換のために、さらに添加によって条件化され、さらにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、交差結合剤、および細胞の添加によって条件化される。
【０１０６】
マイクロ流体チップはＤｒａｐｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得る。いくつかの実施形態では、マイクロ／ナノ流体チップはミクロンよりも小さい開口分解能を有する。大きさの計算のオーダーから、３ｍｇ／ｍｌコラーゲンに関してεｃを得るように設計された双曲線コントラクターの最小寸法は約２００ミクロン（流出チャンネル幅）であることが示唆される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体構造は平坦または円柱状構造である。いくつかの実施形態では、平坦なマイクロ流体チップはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）上のガラスから作製される。
【０１０７】
方法。並行流マイクロ流体チップは我々のモデルによって定められる濃度および流速で３種類の溶液（いくつかの実施形態では、コラーゲン、ＰＥＧ、およびシリコーンオイル）が供給される。産生された原線維は、チップの流出口で原線維形成を開始する流れと同じまたは速い速度で原線維を引き出す小さい電動糸巻きに捕捉される（すなわち、上記εｃと同じまたは超えるまでひずみ率を上げる）。
【０１０８】
評価。原線維はその機械的強度が試験される（Paten, J.A., et al., Biomaterials, 2013. 34(11): p. 2577-87に記載された方法)。ＤＩＣイメージングによって原線維の全体的な形態学ならびにＱｕｉｃｋ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｅｅｐ  Ｅｔｃｈ（ＱＦＤＥ）／ＳＥＭおよびＴＥＭを用いてこれらのナノスケール組織化を検査する。これらの構造的整列（全体的な原線維異方性および結合パターン）の測定をＤｒ．ＭｉｎｕｓのＭＭ００７  ＨＭ高輝度Ｘ線源を用いて実施する。
【０１０９】
結果。本開示の方法およびデバイスは予測可能で制御可能な高度組織化コラーゲン構造を有するコラーゲン原線維を産生する。またコラーゲン分子に既にコード化されている本来の自己集合メカニズムを使用するため、正確な本来の構造を有する原線維を産生する。本開示の方法は量的なものであり、高い精度で工程管理できる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、コラーゲン原線維はＰＢＳにある時間浸漬される場合、適切な組織に強固化する（Caves, J.M., et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2010. 93(1): p. 24-38)。いくつかの実施形態では、このような強固化期間を用いて、高回転拡散スピードを与える適切な回転にコラーゲンを切り換えさせる。例えば、図５Ａ−Ｃはこのような強固化期間後に産生された。
【０１１１】
均等
本発明はその詳細記載とともに説明されているが、前述の記載は説明することが意図され、添付の請求項の範囲によって定められる本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。他の実施様態、利点、および変更は、下記の請求項の範囲内である。
【図２Ｂ】
2016507300.tif 000003
【図３Ｂ】
2016507300.tif 000004
【図４Ａ】
2016507300.tif 000005
【図４Ｂ】
2016507300.tif 000006
【図４Ｃ】
2016507300.tif 000007
【図５Ｃ】
2016507300.tif 000008
【図８】
2016507300.tif 000009
【図９Ａ】
2016507300.tif 000010
【図９Ｂ】
2016507300.tif 000011
【図９Ｃ】
2016507300.tif 000012
【図９Ｄ】
2016507300.tif 000013
【図９Ｅ】
2016507300.tif 000014
【図９Ｆ】
2016507300.tif 000015
【図１０Ａ】
2016507300.tif 000016
【図１０Ｂ】
2016507300.tif 000017
【図１１Ａ】
2016507300.tif 000018
【図１１Ｂ】
2016507300.tif 000019
【図１２】
2016507300.tif 000020
【図１３】
2016507300.tif 000021
【図１６】
2016507300.tif 000022
【図１７Ａ】
2016507300.tif 000023
【図１７Ｂ】
2016507300.tif 000024
【図１８Ａ】
2016507300.tif 000025
【図１９】
2016507300.tif 000026
【図１】
2016507300.tif 000027
【図２Ａ】
2016507300.tif 000028
【図３Ａ】
2016507300.tif 000029
【図５Ａ−Ｂ】
2016507300.tif 000030
【図６】
2016507300.tif 000031
【図７】
2016507300.tif 000032
【図１４Ａ】
2016507300.tif 000033
【図１４Ｂ】
2016507300.tif 000034
【図１４Ｃ】
2016507300.tif 000035
【図１５】
2016507300.tif 000036
【図１８Ｂ】
2016507300.tif 000037
【図２０】
2016507300.tif 000038
【国際調査報告】
2016507300.tif 000039
2016507300.tif 000040