(57)【要約】本明細書において、末梢循環腫瘍細胞（CTC）の存在および／またはレベルに関する方法およびアッセイ法が記載される。これらのCTC-CはCTCの高転移性亜集団に相当する。一部の態様では、本明細書に記載される方法およびアッセイ法は癌の処置に関する。2016536303.tif 000015
2016536303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階；および
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加していない場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階
を含む、癌を処置する方法。
【請求項２】
対照レベルと比較して増加しているCTCクラスターのレベルを有すると判定された対象において、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階
を含む、乳癌または上皮癌を処置する方法。
【請求項３】
対照レベルと比較して増加していないCTCクラスターのレベルを有すると判定された対象において、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記転移を防止するかまたは減らすための処置が、
請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法；化学療法；放射線療法；または腫瘍の除去
からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
処置を行わない段階が、治療的介入なしでモニタリングする臨床アプローチを含むことができる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、癌転移を処置する方法。
【請求項１５】
前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階が、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与する段階を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害性核酸がsiRNAである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階； 
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階
を含む、アッセイ法。
【請求項１９】
前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
請求項18に記載のアッセイ法。
【請求項２０】
前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、請求項19に記載のアッセイ法。
【請求項２１】
前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項19または20に記載のアッセイ法。
【請求項２２】
前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項19〜21のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項２３】
前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、請求項18〜22のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項２４】
前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、請求項18〜23のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項２５】
増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項18〜24のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項２６】
増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項20〜25のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項２７】
乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階
を含む、対象の転移のリスクが増加しているかどうかを判定する方法。
【請求項２８】
前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項27〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、請求項27〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、請求項27〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、請求項27〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項27〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
癌を有する対象における循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを低下させる方法であって、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、方法。
【請求項３７】
前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階が、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与することを含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記阻害性核酸がsiRNAである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119（e）項に基づき、2013年10月21日に提出された米国特許仮出願第61/893,397号、2013年11月25日に提出された同第61/908,236号、および2013年12月20日に提出された同第61/918,923号の恩典を主張し、これらの出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2014年9月8日に作成された該ASCIIのコピーは、030258-079173-PCT_SL.txtと命名され、サイズが11,455バイトである。
【０００３】
技術分野
本明細書において記載される技術は癌の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
血行性転移の現行モデルは、原発性腫瘍細胞の血流中への移動から始まり、循環中での生存、腫瘍細胞の血流から新しい組織への移動、および新しい腫瘍の設立の一連の段階に基づく。末梢循環腫瘍細胞（CTC）は、多数の上皮癌において検出されており（Yu et al. JCB 2011 192:373）（非特許文献1）、それらは、癌における初期の播種事象を理解するための鍵を握っている。興味深いことに、CTCの数は患者における転移性病変の数を大きく上回り、このことはCTCが同程度に転移を引き起こす能力があるわけではないことを示している。大部分のCTCが血流中で死滅し、わずかな割合だけが、生存可能な転移前駆細胞に相当すると考えられる。CTC内の転移性プールの同定は、癌転移についての理解に磨きをかける潜在的可能性を有し、転移性ヒト腫瘍を処置するための新薬の開発を可能にし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yu et al. JCB 2011 192:373
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書において記載されるように、本発明者らは、末梢循環腫瘍細胞（CTC）のサブセットがCTCクラスター（CTC-C）として存在することを発見した。そのうえ、本発明者らは、これらのCTC-CがCTCの高転移性亜集団に相当することを見出した。これらのCTC-Cのマーカー、ならびにそれゆえにCTC-Cの存在および／またはレベルを検出する方法が、CTC-Cの成長、生存、および／または転移能を阻害することによって転移を減らすことに関する方法と同様に、本明細書に記載される。
【０００７】
一局面では、乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階、および、CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階を含む、アッセイ法が、本明細書において記載される。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、図9の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。一部の態様では、試料中の末梢循環腫瘍細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、対象から得られた癌細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、HBCTC-チップを用いて測定される。一部の態様では、対象は、癌のための処置を必要とする対象である。一部の態様では、増加したCTCクラスターのレベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。一部の態様では、増加したプラコグロビンの発現レベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。
【０００８】
一局面では、乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階、および、CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階を含む、対象の転移のリスクが増加しているかどうかを判定する方法が、本明細書において記載される。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、図9の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。一部の態様では、試料中の末梢循環腫瘍細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、対象から得られた癌細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、HBCTC-チップを用いて測定される。一部の態様では、対象は癌のための処置を必要とする対象である。一部の態様では、増加したCTCクラスターのレベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。一部の態様では、増加したプラコグロビン発現レベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。
【０００９】
一局面では、癌を有する対象における末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを低下させる方法であって、図9の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、方法が、本明細書において記載される。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階は、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与することを含む。一部の態様では、阻害性核酸はsiRNAである。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。
【００１０】
一局面では、図9の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、癌転移を処置する方法が本明細書において記載される。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階は、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与することを含む。一部の態様では、阻害性核酸はsiRNAである。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。
【００１１】
一局面では、乳癌または上皮癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階；およびCTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加していない場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階を含む、癌を処置する方法が、本明細書において記載される。一部の態様では、転移を防止するかまたは減らすための処置は、前段落に記載の癌転移を処置する方法；化学療法；放射線療法；または腫瘍の除去からなる群より選択される。一部の態様では、処置を行わないことは、治療的介入なしでモニタリングする臨床アプローチを含むことができる。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、図9の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、対象から得られた試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、CTC-Cマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4の一覧表より選択される遺伝子である。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。一部の態様では、試料中の末梢循環腫瘍細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、対象から得られた癌細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、CTCクラスターのレベルは、HBCTC-チップを用いて測定される。一部の態様では、対象は、癌のための処置を必要とする対象である。一部の態様では、増加したCTCクラスターのレベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。一部の態様では、増加したプラコグロビン発現レベルは、対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1Aおよび1Bは、乳癌患者におけるCTC-クラスターの存在が、疾患の進行増加と相関することを実証する。図1Aは、合計で患者79人および265個の時点が、単独CTCおよびCTC-クラスターの存在について分析され、患者79人中54人がCTC陽性のスコアであったことを実証するグラフを示す。棒グラフは、単独CTCのみを有するCTC陽性患者（灰色）、1つの時点にCTC-クラスターを有する患者（白）および複数の時点中にCTC-クラスターを有する患者（青）のパーセンテージを示す。図1Bは、単独CTCが豊富な患者（平均無増悪生存期間160.6日）についての進行速度を、CTC-クラスターが豊富な患者（平均無増悪生存期間76.1日）に対して示す、カプラン-マイヤー（Kaplan-Meier）無増悪生存率のプロットを示す。ログランク検定によりP＝0.063。
【図２】図2A〜2Cは、CTC-クラスターが単独CTCと比較して高い転移能をもつことを実証する。図2Aは、LM2-SCを注射されたマウスまたはLM2-CLを注射されたマウスからの肺における切断型カスパーゼ3陽性細胞の平均パーセンテージの棒グラフを示す。n＝4、*スチューデントt検定によりP＜0.02。図2Bは、HBCTC-チップ（上）によって捕捉された単独CTCに対するCTC-クラスターの平均パーセンテージおよび単独CTCに対するCTC-クラスターに由来する肺病巣の平均パーセンテージ（下）の棒グラフを示す。n＝5。図2Cは、単独CTCおよびCTC-クラスターの正規化した転移能の棒グラフを示す。n＝5、*スチューデントt検定によりP＝0.031。
【図３】CTC-クラスターが、血流からのより速いクリアランス速度に関連するオリゴクローナルなユニットであることを実証する。単独CTCおよびCTC-クラスターのクリアランス曲線のグラフを示す。単独CTCについてn＝5およびCTC-クラスターについてn＝4、*二元配置ANOVAによりP＜0.01。
【図４Ａ】CTC-クラスターおよび単独CTCのRNAシーケンシングが、CTC-クラスターに関連する遺伝子セットを明らかにすることを実証する。図4Aは、実験の模式図を示す。乳癌患者から得られた血液試料をnegCTC-iチップで処理して、CTC濃縮産物を得た。次に、生存染色を行って、CTC（緑）および白血球（赤）を標識した。単独CTCおよびCTC-クラスターをマイクロマニピュレーターで単離し、RNAシーケンシング用に処理した。
【図４Ｂ】CTC-クラスターおよび単独CTCのRNAシーケンシングが、CTC-クラスターに関連する遺伝子セットを明らかにすることを実証する。図4Bは、乳癌患者10人から単離された、単独CTCのプール15個および対応するCTC-クラスター14個の教師なし階層的クラスタリングを説明しているヒートマップを示す。
【図４Ｃ】CTC-クラスターおよび単独CTCのRNAシーケンシングが、CTC-クラスターに関連する遺伝子セットを明らかにすることを実証する。図4Cは、CTC-クラスターで上方制御されている転写物上位31種を説明しているヒートマップを示す。単独CTCについてn＝15およびCTC-クラスターについてn＝14；患者内比較の70％超でq＜0.01、log2変化倍率＞1。
【図４Ｄ】CTC-クラスターおよび単独CTCのRNAシーケンシングが、CTC-クラスターに関連する遺伝子セットを明らかにすることを実証する。図4Dは、単独CTCに対する対応するCTC-クラスターにおけるプラコグロビンの増加倍率を説明しているグラフを示す。閾値の線は、q＜0.01およびlog2変化倍率＞1を表す。
【図５Ａ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Aは、プラコグロビンの存在下または非存在下でのパネルまたは乳腺上皮細胞および乳癌細胞系における相対的な細胞間接着を実証する棒グラフを示す。n＝5:*P＜0.04。
【図５Ｂ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Bは、プラコグロビンの存在下または非存在下でのLM2腫瘍の成長曲線を示す。n＝4；NS＝有意差なし。
【図５Ｃ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Cは、血液1mlあたりの正規化した単独CTC数（左）およびCTC-クラスター数（右）を実証している棒グラフを示す。血液試料は、原発性腫瘍が発生した4週間に単離し、HBCTC-チップを用いて処理した。n＝4；*スチューデントt検定によりP＜0.05。
【図５Ｄ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Dは、LM2 CTRLまたはプラコグロビンノックダウン原発性腫瘍を4週間有するマウスからの正規化した肺光子数を実証する棒グラフを示す。n＝4；*スチューデントt検定によりP＜0.045。
【図５Ｅ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Eは、原発性腫瘍が「低プラコグロビン」転写物または「高プラコグロビン」転写物のいずれかを発現した患者についての進行速度を実証しているカプラン-マイヤー無遠隔転移生存率のプロットを示す。n＝1353；ログランク検定によりP＝8.2e-0.5。
【図５Ｆ】プラコグロビンがCTC-クラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。図5Fは、原発性腫瘍における「高プラコグロビン」領域が、高い転移能を有するCTC-クラスターを生成する可能性が高いことを説明する模式図を示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、LM2-SCおよびLM2-CLの転移能を実証する。図6Aは、LM2-SCまたはLM2-CLを注射されたマウスからの肺転移成長曲線のグラフを示す。n＝4；*スチューデントt検定によりP＜0.03。図6Bは、LM2-SCまたはLM2-CLを注射されたマウスについての生存率を示すカプラン-マイヤー生存プロットのグラフを示す。n＝4；ログランク検定によりP＜0.016。
【図７】CTC-クラスターで上方制御されている転写物を得るために使用された単独CTCの試料15個およびCTC-クラスターの試料14個における、CTC関連転写物（ケラチン7、8、18、19、カドヘリン1、EpCAM、EGFR、ErbB2、Met、およびカドヘリン11）、および白血球関連転写物（PTPRC/CD45、CD14、およびCD16）の発現レベルを示すヒートマップを示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、プラコグロビンの発現レベルを示す。図8Aは、プラコグロビンの存在下または非存在下で成長した、非形質転換乳腺上皮細胞（HMEC、MCF10A）および乳癌細胞系（LM2、BT474、MCF7、T47D、BT549、BT20、ZR-75-1）のパネルからの溶解物中のプラコグロビンおよびβ-アクチン（ローディング対照）の発現レベルを実証するイムノブロットを示す。図8Bは、プラコグロビンの存在下または非存在下で30日間成長したLM2異種移植片からの溶解物中のプラコグロビンおよびβ-アクチン（ローディング対照）の発現レベルを実証するイムノブロットを示す。
【図９−１】単独CTCと比較してCTC-クラスターで上方制御されている転写物の表を示す。数は変化倍率を示す。
【図９−２】図9-1の続きの図である。単独CTCと比較してCTC-クラスターで上方制御されている転写物の表を示す。数は変化倍率を示す。
【図９−３】図9-2の続きの図である。単独CTCと比較してCTC-クラスターで上方制御されている転写物の表を示す。数は変化倍率を示す。
【図９−４】図9-3の続きの図である。単独CTCと比較してCTC-クラスターで上方制御されている転写物の表を示す。数は変化倍率を示す。
【図９−５】図9-4の続きの図である。単独CTCと比較してCTC-クラスターで上方制御されている転写物の表を示す。数は変化倍率を示す。
【図１０Ａ】デスモソームおよび接着結合のポリペプチドがCTC-C細胞において上方制御されていることを実証する。図10Aは、CTC-クラスターで上方制御されている転写物を得るために使用された、単独CTC試料15個およびCTC-クラスター試料14個におけるデスモソーム（上）および接着結合（下）のマーカー遺伝子の発現レベルのヒートマップを示す。
【図１０Ｂ】デスモソームおよび接着結合のポリペプチドがCTC-C細胞において上方制御されていることを実証する。図10Bは、全ての「CTC-クラスター対単独CTC」の患者間比較における、デスモソーム（上）および接着結合（下）のマーカー遺伝子の変化倍率を表すヒートマップを示す。
【図１０Ｃ】デスモソームおよび接着結合のポリペプチドがCTC-C細胞において上方制御されていることを実証する。図10Cは、全ての「CTC-クラスター対単独CTC」の患者内比較におけるデスモソームおよび接着結合のメタ遺伝子（metagene）の変化倍率のヒートマップを示す。
【図１０Ｄ】デスモソームおよび接着結合のポリペプチドがCTC-C細胞において上方制御されていることを実証する。図10Dは、デスモソーム（上）および接着結合（下）と同じサイズのランダムに生成したメタ遺伝子についてq＜0.01および変化倍率＞2を有する「CTC-クラスター対単独CTC」対の頻度の表示である。デスモソーム（上）および接着結合（下）のメタ遺伝子についてq＜0.01および変化倍率＞2を有する「CTC-クラスター対単独CTC」対の実際の数を直線として示す。
【図１１Ａ】CTCクラスターが単独CTCと比較して高い転移能を示すことを実証する。図11Aは、実験の模式図を示す。GFPを発現しているMDA-MB-231-LM2（LM2）細胞（LM2-GFP）またはmCherryを発現しているLM2（LM2-mCherry）細胞を1:1の比で混合し、免疫欠損マウスの右側乳腺に注射して、単色の単独CTCおよび多色のCTCクラスターを生成させた。したがって、単色の転移巣は単独CTC由来であり、一方で多色の転移巣は、主にCTCクラスターから生じている。
【図１１Ｂ】CTCクラスターが単独CTCと比較して高い転移能を示すことを実証する。図11Bは、HBCTC-チップによって捕捉された単色対多色CTC事象の平均パーセンテージ（左）、単色対多色CTCクラスターの平均パーセンテージ（中央）、および単色対多色肺病巣の平均パーセンテージ（右）を示す棒グラフを示す。n＝5。
【図１１Ｃ】CTCクラスターが単独CTCと比較して高い転移能を示すことを実証する。図11Cは、単独CTCおよびCTCクラスターの正規化した転移能を示す棒グラフを示す。エラーバーはSEMを表す。n＝5、*スチューデントt検定によりp＝0.031。
【図１１Ｄ】CTCクラスターが単独CTCと比較して高い転移能を示すことを実証する。図11Dは実験の模式図を示す。免疫欠損マウスの右側乳腺にLM2-GFP細胞を注射し、一方で左側乳腺にLM2-mCherry細胞を注射して、単色の単独CTCおよびCTCクラスターならびに希少な多色CTCクラスター（凝集事象に起因する）を生じる腫瘍を発生させた。したがって、単色の転移巣は、単一のCTCまたは1つのCTCクラスター由来であり、一方で多色の病巣はCTC凝集物に由来する。
【図１１Ｅ】CTCクラスターが単独CTCと比較して高い転移能を示すことを実証する。図11Eは、HBCTC-チップによって捕捉された単色対希少多色CTC事象の平均パーセンテージ（左）、単色対多色CTCクラスターの平均パーセンテージ（中央）、および単色対多色肺病巣の平均パーセンテージ（右）を示す棒グラフを示す。n＝5。
【図１２】図12Aおよび12Bは、CTCクラスターの方が遠位転移部位でのアポトーシスに対する抵抗性が高いことを実証する。図12Aは、LM2-SCまたはLM2-CL細胞の尾静脈注射の0、6、および12日後の代表的な生物ルミネセンス画像を示す（左）。n＝4。LM2-SCまたはLM2-CL細胞を注射後のマウス肺のGFP染色切片の代表的な画像（右）。図12Bは、LM2-SCまたはLM2-CLを注射されたマウスの肺におけるGFP陽性細胞の平均パーセンテージの棒グラフを示す。エラーバーはSEMを表す。n＝4；NS＝有意差なし、*スチューデントt検定によりp＝0.03。
【図１３】CTCクラスターが血流からのより速いクリアランス速度を示すことを実証する。単独CTCおよびCTCクラスターのクリアランス時間を測定するための実験設定を示す模式図を示す。簡潔には、DiD染色したLM2細胞をLM2-SCまたはLM2-CLとして調製し、免疫欠損マウスの尾静脈に注射した。耳血管にインビボフローサイトメトリーを適用して、注射後55分間にわたり単独CTCおよびCTCクラスターを検出した。グラフは、耳血管への単独CTCまたはCTCクラスターの通過に対応する代表的な蛍光ピークを示す。
【図１４】図14A〜14Dは、癌を有する患者におけるCTCクラスターの存在が予後不良と相関することを実証する。図14Aは、CTCの存在について分析され、患者79人のうち54人がCTC陽性のスコアであった乳癌患者合計79人の結果を示す（265個の時点に対応）。棒グラフは、3つ超の時点中にCTCクラスターを有するCTC陽性患者（濃灰色）、1〜3つの時点にわたりCTCクラスターを有するCTC陽性患者（明灰色）または単独CTCのみを有するCTC陽性患者（黒）のパーセンテージを示す。図14Bは、3つ超の時点中にCTCクラスターを有する乳癌患者（濃灰色）、1〜3つの時点にわたりCTCクラスターを有するCTCクラスターを有する乳癌患者（明灰色）または単独CTCのみを有する乳癌患者（黒）についての進行速度を示すカプラン-マイヤー無増悪生存率プロットを示す。各群についての平均無増悪生存期間をカッコ内に示す。ログランク検定によりp＝0.0002。図14Cは、CTCの存在について分析され、患者64人のうち48人がCTCについて陽性スコアであった前立腺癌患者合計64人の結果を示す（202個の時点に対応）。棒グラフに、少なくとも1つの時点にCTCクラスターを有するCTC陽性患者または単独CTCのみを有するCTC陽性患者（黒）のパーセンテージを示す。図14Dは、少なくとも1つの時点にCTCクラスターを有する前立腺癌患者または単独CTCのみを有する前立腺癌患者（黒）についての、進行速度を示すカプラン-マイヤー全生存率プロットを示す。各群についての平均全生存期間をカッコ内に示す。ログランク検定によりp＝0.0001。
【図１５】プラコグロビンの発現が無遠隔転移生存率の減少と相関することを実証する。同じ患者から単離された対応する単独CTCおよびCTCクラスターにおけるプラコグロビンの100万あたりのリード数（reads per million）の棒グラフ。エラーバーはSEMを表す。n＝3；*p＝0.031。
【図１６】プラコグロビンがCTCクラスターの形成および肺転移に必要であることを実証する。対照shRNAまたはプラコグロビンshRNAを発現しており、かつ単独細胞（SC）またはクラスター（CL）として調製されたLM2-GFP-ルシフェラーゼ（左）細胞またはBT474-GFP-ルシフェラーゼ（右）細胞を注射されたマウスからの肺転移成長曲線。エラーバーはSEMを表す。n＝4；*p＜0.05、**スチューデントt検定によりp＜0.04。プラコグロビン存在下または非存在下でのLM2-GFP-ルシフェラーゼ腫瘍成長曲線。n＝4；NS＝有意差なし。
【図１７】図17A〜17Dは、LM2および4T1異種移植片における単色および多色事象の計数を示す。図17Aは、「LM2-GFP/LM2-mCherry 1:1」モデルならびに「LM2-GFP（右）およびLM2-mCherry（左）」モデルの両方からのCTCおよび肺病巣内の単色対多色事象の計数を示す表を示す。結果は、平均±SEMを表す。図17Bは、本発明者らの実験設定を与えられたマウス1匹あたりのGFPのみまたはmCherryのみのCTCクラスターの期待数を描く分布曲線を示し、実際の値を赤い破線で示す（上）。原発性腫瘍発生の5週間後に血液試料を単離した。図17Cは、「4T1-GFP/4T1-mCherry 1:1」モデルならびに「4T1-GFP（右）および4T1-mCherry（左）」モデルの両方からのCTCおよび肺病巣内の単色対多色事象の計数を示す表を示す。原発性腫瘍発生の3週間後にCTCおよび肺単離のためにマウスを屠殺した。結果は平均±SEM（n＝4）を表す（左）。図17Dは、4T1の単独CTCおよびCTCクラスターの正規化した転移能を示す棒グラフを示す。n＝4、*スチューデントt検定によりp＜0.036。
【図１８】図18A〜18Cは、BT474および4T1のクラスターの方が遠隔転移部位でアポトーシスに対する抵抗性が高いことを実証する。図18Aは、BT474または4T1のSCに対してCLを注射されたマウスからの肺におけるGFP陽性細胞の平均パーセンテージの棒グラフを示す（右）。n＝4；NS＝有意差なし、*スチューデントt検定によりp＝0.003 **p＝0.002。図18Bは、BT474または4T1のSCに対してCLを注射されたマウスからの肺における切断型カスパーゼ3陽性細胞の平均パーセンテージの棒グラフを示す。n＝4；*スチューデントt検定によりp＝0.037、**p＝0.028。図18Cは、BT474または4T1のSCに対してCLを注射されたマウスからの肺転移成長曲線を示す。n＝4；***スチューデントt検定によりp＜0.02、*p＜0.027、*p＜0.05。
【図１９】CTCクラスターの細胞組成の分析を示す。CTCクラスターで上方制御されている転写物を得るために使用された単独CTC試料15個およびCTCクラスター試料14個中の、CTC、白血球、T細胞、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、造血幹細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、血小板、内皮細胞、および線維芽細胞に関連する転写物の発現レベルを示すヒートマップを示す。
【図２０−１】CTC-クラスター関連遺伝子のカプラン-マイヤープロットを示す。原発性腫瘍が「低」または「高」レベルのいずれかの上位CTCクラスター関連マーカー遺伝子を発現していた患者についての進行速度を示す、カプラン-マイヤー無遠隔転移生存率プロット。
【図２０−２】図20-1の続きの図である。CTC-クラスター関連遺伝子のカプラン-マイヤープロットを示す。原発性腫瘍が「低」または「高」レベルのいずれかの上位CTCクラスター関連マーカー遺伝子を発現していた患者についての進行速度を示す、カプラン-マイヤー無遠隔転移生存率プロット。
【図２０−３】図20-2の続きの図である。CTC-クラスター関連遺伝子のカプラン-マイヤープロットを示す。原発性腫瘍が「低」または「高」レベルのいずれかの上位CTCクラスター関連マーカー遺伝子を発現していた患者についての進行速度を示す、カプラン-マイヤー無遠隔転移生存率プロット。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本明細書において記載されるように、本発明者らは、末梢循環腫瘍細胞のクラスター（CTC-C）が、特に高い転移能を有することを発見した。したがって、これらのCTC-Cは、癌の管理および処置のための診断標的および治療標的の両方である。CTC-Cおよびそれらが転移を生じる傾向に関する診断、予後判定、および処置の方法が本明細書において提供される。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「末梢循環腫瘍細胞」または「CTC」は、腫瘍から脱落し、血中すなわち循環中に存在する腫瘍細胞を表す。CTCを同定するため、および／または血液の他の成分から単離するために使用できる細胞表面マーカーを本明細書において後述する。CTCのマーカー、ならびにそれらを単離および／または検出する方法は、例えばその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yu et al. JBC 2011 192:373に記載されている。
【００１５】
これらのCTCの一部は、癌患者においてCTCクラスター（CTC-C）として存在する可能性がある。本明細書において使用される場合、「CTC-クラスター」、「CTCクラスター」、または「CTC-C」は、少なくとも2個またはそれ以上の（例えば2個もしくはそれ以上の、3個もしくはそれ以上の、4個もしくはそれ以上の、5個もしくはそれ以上の、またはそれ上回る）CTCが、すなわち1つまたは複数の癌細胞マーカーが陽性であり、かつ核形態が無傷の細胞が、接着した集団を表す。癌細胞マーカーは、癌の種類に応じて変動する可能性があり、様々な種類の癌に適切なマーカーは当技術分野において公知である。非限定的な例として、例えば乳癌細胞についての癌細胞マーカーは、EPCAM、EGFR、Met、カドヘリン11およびHER2の1つまたは複数を含むことができる。CTC-CのCTCは、循環血液の状態であっても十分に結合しているほど接着性である。CTC-Cは、循環中の白血球（WBC）と結合して見つかることができる。結果として、場合によってはWBCマーカーがCTC-Cに発現（および／または存在）していることができる。本明細書において実証されるように、CTC-Cは、例えば単独CTCよりも転移を引き起こす可能性がずっと高い。したがって、対象におけるCTC-Cの存在、またはCTC-Cレベルの増加は、転移のリスクの増加を示す。
【００１６】
一局面では、癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階、および、CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階を含む、アッセイ法が、本明細書において記載される。一局面では、癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階、および、CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階を含む、対象の転移のリスクが増加しているかどうかを判定する方法が、本明細書において記載される。一部の態様では、癌は乳癌または上皮癌である。試料中に存在するCTC-Cのレベルは、例えば存在するCTC-Cの数を測定することおよび／またはCTC-Cのマーカーのレベルを測定することによって測定することができる。
【００１７】
CTC-Cのレベルは、例えば試料中の腫瘍細胞のクラスター数を検出することによって直接測定することができる。腫瘍細胞は、例えば腫瘍細胞表面マーカーを発現している細胞を検出するための免疫学的方法によって検出することができる。CTC細胞表面マーカーの非限定的な例には、EpCAM、EGFR、HER2、CDH11、および／またはMETが含まれることができる。顕微鏡法によって腫瘍細胞を視覚化して、クラスターを視覚的に同定することができるか、または例えばFACSによって選別してクラスターを検出することができる。一部の態様では、CTC-Cは、実施例およびその全体が参照により本明細書に組み入れられるYu et al. Science 2013 339:580に記載のHBCTC-チップを使用して検出することができる。さらなる非限定的な一例として、試料、例えば血液試料を赤血球溶解に供し、残りの試料をハイスループット画像スキャナーによって分析して、細胞凝集物（例えば、体積／直径が細胞1個よりも大きい事象）を検出することができる。
【００１８】
一部の態様では、CTC-Cのレベルは、試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子を測定することによって測定することができる。一部の態様では、複数のマーカー遺伝子、例えば2つのマーカー遺伝子、3つのマーカー遺伝子、またはそれ以上のマーカー遺伝子の発現レベルを判定することができる。
【００１９】
本明細書において記載されるように、本発明者らは、CTC-Cにおいて参照レベルと比較して統計的に有意な程度に差次的に調節されているある種の遺伝子を同定した。同定された遺伝子は、CTC-C細胞に関するマーカーであることに関係していることを示すために、本明細書において時にマーカー遺伝子と称される。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子は、CTC-Cおよび／またはCTC-C細胞を単独CTCと区別することができる。したがって、本発明の一部の態様は、一般的に、CTC-Cのレベルおよび／または転移を経験している対象のリスクを評価するためのアッセイ法、方法、およびシステムに関する。特定の態様では、アッセイ法および方法は、対象の生物学的試料中の遺伝子産物（例えばタンパク質および／またはmRNAのような遺伝子転写物）の発現レベルの判定および／または測定に指向している。特定の態様では、アッセイ法および方法は、対象の生物学的試料中の少なくとも2つの遺伝子、すなわち少なくとも2つの遺伝子、少なくとも3つの遺伝子、少なくとも4つの遺伝子、少なくとも5つの遺伝子、少なくとも6つの遺伝子、少なくとも7つの遺伝子、少なくとも8つの遺伝子、少なくとも9つの遺伝子、少なくとも10個の遺伝子、...少なくとも15個の遺伝子、...少なくとも25個の遺伝子、...少なくとも30個の遺伝子、もしくはそれ以上の遺伝子、または本明細書に記載の図9、表2、表3、および／もしくは表4より選択される任意の数の遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの判定に指向している。一部の態様では、マーカー遺伝子は、表2、3、および／または4に挙げられる群より選択される。一部の態様では、本明細書に記載のアッセイ法、方法、およびシステムは、対象の生物学的試料中の少なくとも2つの遺伝子、例えば少なくとも2つの遺伝子、もしくは少なくとも3つの遺伝子、もしくは少なくとも4つの遺伝子、または例えば表2、3、および／もしくは4の全遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの判定に指向している。
【００２０】
（表２）例示的なCTC-Cマーカー遺伝子
2016536303.tif 000003
【００２１】
（表３）デスモソームマーカー遺伝子
2016536303.tif 000004
【００２２】
（表４）接着マーカー遺伝子
2016536303.tif 000005
【００２３】
一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンであることができる。本明細書において使用される場合、「プラコグロビン」、「γ-カテニン」、「ジャンクションプラコグロビン」、または「JUP」は、デスモソームおよび中間結合によく見られることが公知である遺伝子を表す。それは、例えばデスモグレインIおよびE-カドヘリンのような細胞間結合部タンパク質と相互作用する。プラコグロビン遺伝子および遺伝子発現産物の配列は、いくつかの種について公知であり、例えばヒトプラコグロビン（NCBI遺伝子ID:3728；mRNA（NCBI参照配列:NM_002230；SEQ ID NO:1）；ポリペプチド（NCBI参照配列:NP_002221；SEQ ID NO:2）である。
【００２４】
表2、3、および／または4ならびに図9に挙げられた遺伝子名は、一般名である。表2、3、および／または4ならびに図9に挙げられた各遺伝子のNCBI遺伝子ID番号は、クエリとして一般名を使用してNCBIの「遺伝子」データベース（World Wide Web上のhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/から利用可能）を検索し、最初に返ったホモ・サピエンス（Homo sapiens）遺伝子を選択することによって得ることができる。
【００２５】
一部の態様では、本明細書に記載の方法およびアッセイ法は、（a）遺伝子発現産物を検出可能な遺伝子標的に変換する段階；（b）検出可能な遺伝子標的の量を測定する段階；および（c）検出可能な遺伝子標的の量を参照量と比較する段階を含み、検出可能な遺伝子標的の量が参照レベルの量と統計的に有意に異なる場合に、試料はCTC-Cを含有すると特定され、かつ／または試料の入手先の対象に転移を発生するリスクがあると特定される。一部の態様では、検出可能な遺伝子標的の量が、参照レベルの量と統計的に有意に異ならない場合に、対象は、転移を発生する可能性が低いと特定される。
【００２６】
特定の態様では、マーカー遺伝子は、表2、3、および／もしくは4ならびに／または図9に挙げられた遺伝子より選択される。特定の態様では、1つまたは複数のマーカー遺伝子は、表2、3、および／または4に挙げられた遺伝子の群より選択される。
【００２７】
転移のリスクがある対象、および／またはCTC-C細胞である細胞において、表2、3および／もしくは4ならびに／または図9に挙げられたマーカー遺伝子は、上方制御されていることができ、例えば表2、3、および／または4に挙げられたマーカー遺伝子について、対象において測定されたマーカー遺伝子発現がそのマーカー遺伝子の発現の参照レベルと比較してより高い場合に、対象は、転移を発生する可能性が高いと特定される。好ましくは、統計的に有意な変化に着目する。しかし、たとえ群内の少数の遺伝子が正常と差がないとしても、例えば、群の全般的な変化が有意な変化、好ましくは統計的に有意な変化を示す場合に、対象に転移を発生する可能性が高いと特定することができる。
【００２８】
マーカー遺伝子の参照レベルと比較して、参照量よりも少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約80％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約500％、もしくは少なくとも約1000％、またはそれ以上高い、図9ならびに／または表2、3および／もしくは4におけるマーカー遺伝子の遺伝子発現産物のレベルは、細胞がCTC-C細胞であることおよび／または対象に転移を発生するリスクがあることを示す。2つまたはそれ以上の示されたマーカーの全ての可能な組み合わせが、本明細書において考えられる。
【００２９】
本明細書において記載されるように、デスモソームおよび／または接着結合と関連することが公知の遺伝子が、CTC-C細胞において上方制御されており、かつそのバイオマーカーとして役立つことができる。一部の態様では、マーカー遺伝子の遺伝子発現産物のレベルは、デスモソームまたは接着結合のマーカー遺伝子である。デスモソームおよび接着結合の生物学的性質（biology）は、それに関連する構造遺伝子および調節遺伝子を含めて、当技術分野において公知である（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるKowalczyk and Green. Prog Mol Biol Transl Scie 2013 116:95-118; Brooke et al. J Pathol 2012 226:158-171; Delmar et al. Circ Res. 2010 107:700-714; Thomason et la. Biochem J 2010 429:419-433; Alberts et al. "Molecular Biology of the Cell" 4th edition、Garland Science、2002;およびChoi and Weis. HEP 2004 165:23-52を参照されたい）。デスモソーム遺伝子および接着結合遺伝子の非限定的な例は、それぞれ表3および4に提供される。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「変換すること」または「変換」という用語は、物体または物質、例えば生物学的試料、核酸またはタンパク質を別の物質に変化させることを表す。変換は、物理的、生物学的または化学的であることができる。例示的な物理的変換には、非限定的に、例えば分画遠心法またはマイクロ流体選別による全血から特定のサイズ範囲の細胞または細胞群の集団への、生物学的試料の前処理が含まれる。生物学的／化学的変換は、反応に少なくとも1種の酵素および／または化学試薬を伴うことができる。例えば、DNA試料を1種または複数種の制限酵素によって断片に消化することができ、または断片化したDNA試料に外因性分子をリガーゼで結合させることができる。一部の態様では、DNA試料は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって酵素的複製を受けることができる。
【００３１】
本明細書において記載されるマーカー遺伝子に関連する遺伝子発現産物を測定するための方法は、当業者に周知である。遺伝子発現産物、例えばタンパク質のレベルを測定するためのそのような方法には、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、ウエスタンブロット、および免疫沈降、抗体またはタンパク質結合物質のような検出試薬を用いた免疫蛍光が含まれる。あるいは、対象に標識抗ペプチド抗体および他の種類の検出物質を導入することによって、ペプチドを対象において検出することができる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識することができ、対象におけるその存在および位置は、標準的なイメージング技術によって検出される。
【００３２】
例えば、本明細書に記載のマーカー遺伝子のポリペプチド発現産物に対する抗体、例えば抗プラコグロビン（Cat. No. 12083; Abcam; Cambridge、MA）は、市販されており、それを本発明のために使用して、タンパク質発現レベルを測定することができる。あるいは、本明細書に記載のマーカー遺伝子についてのアミノ酸配列が公知であり、NCBIウェブサイトから公的に入手可能であるので、当業者は、本発明のためにこれらの関心対象のタンパク質に対する彼ら自身の抗体を産生させることができる。本明細書に記載のマーカー遺伝子のアミノ酸配列は、ヒト、マウスおよびラットなどの異なる種についてNCBIアクセッション番号が割り当てられている。
【００３３】
一部の態様では、免疫組織化学（「IHC」）および免疫細胞化学（「ICC」）技法を使用することができる。IHCは、組織切片への免疫化学法の適用であり、一方でICCは、細胞または組織インプリントが、例えば、液体に基づく調製のような特異的細胞学的調製を受けた後での、それらへの免疫化学法の適用である。免疫化学は、抗体の使用に基づく技法の一ファミリーであり、抗体は、細胞内部または細胞表面の分子を特異的に標的化するために使用される。抗体は、典型的には生化学反応を受けるマーカーを含むことによって、標的化された分子と出会うと色の変化を経る。時には、マーカー染料またはマーカーシグナルを含む二次抗体が、特異的一次抗体の適用に続く特定のプロトコールに、シグナル増幅を組み入れることができる。
【００３４】
一部の態様では、アッセイ法は、ウエスタンブロット分析であることができる。あるいは、タンパク質を、二次元ゲル電気泳動システムによって分離することができる。二次元ゲル電気泳動は、当技術分野において周知であり、典型的には、第一次元に沿った等電点電気泳動に続く第二次元に沿ったSDS-PAGE電気泳動を伴う。これらの方法は、かなりの量の細胞物質も必要とする。2D SDS-PAGEゲルの分析は、ゲル上のタンパク質スポットの強度を判定することによって行うことができる、または免疫検出を用いて行うことができる。他の態様では、タンパク質試料は質量分析法によって分析される。
【００３５】
免疫学的検査は、本明細書に記載の方法およびアッセイ法と共に使用することができ、それには例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、例えばラテックス凝集、補体結合アッセイ法、免疫放射線測定アッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、例えばFIA（蛍光結合イムノアッセイ法）、化学ルミネセンスイムノアッセイ法（CLIA）、電気化学ルミネセンスイムノアッセイ法（ECLIA、計数イムノアッセイ法（counting immunoassay）（CIA）、側方流動検査またはイムノアッセイ法（LFIA）、磁気イムノアッセイ法（MIA）、およびプロテインAイムノアッセイ法のような技術を用いた競合および非競合アッセイシステムが含まれる。適切な抗体試薬が入手可能であるならば、そのようなアッセイ法を行うための方法は、当技術分野において公知である。一部の態様では、イムノアッセイ法は、定量または半定量イムノアッセイ法であることができる。
【００３６】
イムノアッセイ法は、1種または複数種の抗体とその抗原との相互作用を利用する、生物学的試料中、典型的には血清のような流体試料中の物質の濃度を測定する生化学的検査である。アッセイ法は、抗体とその抗原との高度に特異的な結合を利用する。本明細書に記載の方法およびアッセイ法のために、標的ポリペプチドとそれぞれのタンパク質もしくはタンパク質断片、または単離されたペプチド、または本明細書に記載の融合タンパク質との特異的結合が、イムノアッセイ法において起こり、標的タンパク質／ペプチド複合体を形成する。次に、複合体は、当技術分野において公知の多様な方法によって検出される。イムノアッセイ法はまた、多くの場合に検出抗体の使用を伴う。
【００３７】
ELISA、酵素イムノアッセイ法またはEIAとも称される酵素結合免疫吸着検定法は、主に免疫学において試料中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学技法である。ELISAは、医学および植物病理学における診断ツールとして、ならびに様々な産業における品質管理チェックとして利用されている。
【００３８】
一態様では、特定の所望の抗原（すなわち本明細書に記載のマーカー遺伝子ポリペプチド）に対して特異性を有する少なくとも1種の抗体を伴うELISAも行うことができる。公知の量の試料および／または抗原が、固体支持体（通常はポリスチレン製マイクロタイタープレート）上に固定化される。固定化は、非特異的（例えば表面への吸着による）または特異的（例えば、表面に固定化された別の抗体が、抗原または一次抗体を捕捉するために使用される）のいずれかであることができる。抗原が固定化された後に、検出抗体が添加され、抗原と複合体を形成する。検出抗体は、酵素に共有結合していることができ、またはそれ自体が、バイオコンジュゲーションによって酵素に結合している二次抗体によって検出されることができる。各段階の間に、プレートは、典型的には弱い界面活性剤溶液で洗浄されて、特異的に結合していない任意のタンパク質または抗体が除去される。最終洗浄段階の後に、試料中の抗原の量を示す可視シグナルを生成するために酵素の基質を添加することによってプレートが呈色される。旧式のELISAは発色基質を用いるが、新式のアッセイ法はずっと高い感度を有する蛍光発生基質を用いる。
【００３９】
別の態様では、競合ELISAが使用される。標的ポリペプチドまたはその断片に対する精製抗体が、マルチウェルプレートの固相上にコーティングされ、すなわち固体表面にコンジュゲーションされる。いかなる固体支持体上にもコンジュゲーションしていない精製抗体の第2のバッチも必要とされる。これらの非コンジュゲーション型精製抗体は、検出目的のために標識され、例えば検出可能なシグナルを生成するためにホースラディッシュペルオキシダーゼで標識される。対象からの試料（例えば腫瘍、血液、血清または尿）が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体と一緒に公知の量の所望の抗原（例えば、公知の体積または濃度の、標的ポリペプチドを含む試料）と混合され、次に、その混合物がコーティング後のウェルに添加されて競合的組み合わせが形成される。インキュベーション後に、試料中のポリペプチドレベルが高い場合に、標識抗体試薬-抗原複合体が形成する。この複合体は、溶液中で遊離しており、洗浄除去することができる。ウェルの洗浄で複合体が除去される。次に、ウェル内のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーション型抗体の位置確認のために、ウェルがTMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジデン（tetramethylbenzidene））発色基質と共にインキュベーションされる。試料中の標的ポリペプチドレベルが高い場合に、変色はないか、またはわずかな変色である。試料中に標的ポリペプチドがほとんどまたは全く存在しない場合に、異なる複合体、すなわち固体支持体に結合した抗体試薬-標的ポリペプチド複合体が形成する。この複合体はプレート上に固定化されており、洗浄段階で洗浄除去されない。その後のTMBとのインキュベーションにより、大きな変色が生じる。そのような競合ELSA検査は、特異的で、高感度で、再現性があり、かつ操作が容易である。
【００４０】
当業者に周知の、他の異なる形式のELISAがある。ELISA用の当技術分野において公知の標準技法が、"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980；およびOellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904に記載されている。これらの参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４１】
一態様では、試料中のポリペプチドのレベルは、イムノクロマトグラフィーアッセイ法またはストリップ検査としても公知の側方流動イムノアッセイ検査（LFIA）によって検出することができる。LFIAは、流体試料中の抗原、例えばポリペプチドの存在（または非存在）を検出することを意図する簡単な器具である。在宅検査、ポイントオフケア検査、または実験室での使用のいずれかのための医学診断用に、現在多数のLFIA検査が使用されている。LFIA検査は、被験試料が毛細管現象により固体支持体に沿って流動するイムノアッセイ法の一形式である。試料が検査ストリップに適用された後に、試料は、マイクロパーティクルに結合している着色試薬（一般的に検査標的抗原に特異的な抗体を含む）と遭遇し、着色試薬は試料と混ざり、別の抗体または抗原で前処理された基質遭遇ラインまたは基質遭遇ゾーンを通過する。試料中に存在する標的ポリペプチドのレベルに応じて、着色試薬が捕捉され、検査ラインまたはゾーンに結合するようになることができる。LFIAは、本質的に、検査ストリップ形式またはディップスティック形式に好都合であるように、単一の軸に沿って作動するように適合されたイムノアッセイ法である。ストリップ検査は、極めて多用途であり、当業者は、尿、血液、水、および／または均一化された腫瘍試料などのような流体試料から莫大な範囲の抗原を検出するためにストリップ検査を容易に改変することができる。ストリップ検査は、被検流体試料中に検査ストリップを「液浸」する、文字通りの動作から付けられた名前であるディップスティック検査としても公知である。LFIAストリップ検査は、使用が容易で、最低限の訓練を必要とし、野外現場で使用するためにポイントオフケア検査（POCT）診断器の構成要素として容易に含めることができる。LFIA検査は、競合アッセイ法またはサンドイッチアッセイ法のいずれかとして機能することができる。サンドイッチLFIAは、サンドイッチELISAと類似である。試料は、標的抗原に対して産生された抗体で標識された着色パーティクルと最初に遭遇する。検査ラインも、抗原上の異なるエピトープに結合し得るものの、同じ標的に対する抗体を含有する。検査ラインは、陽性試料では着色したバンドとして示される。一部の態様では、側方流動イムノアッセイ法は、ダブル抗体サンドイッチアッセイ法、競合アッセイ法、定量アッセイ法またはそれらの変形であることができる。競合LFIAは、競合ELISAに類似している。試料は、最初に標的抗原または類似体で標識された着色パーティクルに遭遇する。検査ラインは、標的／その類似体に対する抗体を含有する。試料中の未標識抗原は、着色パーティクルの取り込みを阻止して抗体上の結合部位を遮断する。検査ラインは、陰性試料では着色したバンドとして現れる。側方流動技法に関していくつかの変形がある。複数の捕捉ゾーンを適用してマルチプレックス検査を生み出すことも可能である。
【００４２】
「ディップスティック」またはLFIA検査ストリップおよび他の固体支持体の使用は、いくつかの抗原バイオマーカー用のイムノアッセイ法に関連して当技術分野において記載されている。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,943,522号；同第6,485,982号；同第6,187,598号；同第5,770,460号；同第5,622,871号；同第6,565,808、米国特許出願第10/278,676号；米国特許出願第09/579,673号および米国特許出願第10/717,082号は、そのような側方流動検査器具の非限定的な例である。免疫化学アッセイ法により可溶性抗原を検出するための「ディップスティック」技法の使用を記載している特許の例には、非限定的に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,444,880号；同第4,305,924号；および同第4,135,884号が含まれる。これらの3つの特許の装置および方法は、第1成分が「ディップスティック」上の固体表面に固定され、そのディップスティックが、「ディップスティック」上に固定された成分に結合する可溶性抗原を含有する溶液に曝露され、その後、スティック上の成分-抗原複合体が検出されることを広範に記載している。本明細書に記載の抗体試薬を使用してポリペプチドを検出するために、この「ディップスティック」技法の教示を改変することは、当業者の技能の範囲内である。
【００４３】
試料中のポリペプチドレベルを検出するために他の技法を使用することができる。その1つの技法は、ドットブロット、およびウエスタンブロットの改変したものである（Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979))。ウエスタンブロットでは、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、界面活性剤および熱を用いて解離させ、SDS-PAGEゲル上で分離し、その後、ニトロセルロースまたはPVDFメンブランのような固体支持体に移行させることができる。メンブランは、標的ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体試薬と共にインキュベーションされる。次に、メンブランが洗浄されて、未結合のタンパク質および非特異的結合したタンパク質が除去される。次に、検出可能に標識された酵素結合二次抗体または検出抗体を使用して、被検試料中のポリペプチドの量を検出および評価することができる。検出可能な標識からのシグナル強度は、存在する酵素の量に、ひいてはポリペプチドの量に対応する。レベルは、例えばデンシトメトリーによって定量することができる。
【００４４】
特定の態様では、それよりむしろ、本明細書に記載のマーカー遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）発現レベルを判定することによって、本明細書に記載の遺伝子発現産物を判定することができる。そのような分子は、腫瘍生検のような生物学的試料から単離、由来、または増幅することができる。mRNA発現の検出は、当業者によって公知であり、例えば非限定的に、PCR手順、RT-PCR、ノーザンブロット分析、差次的遺伝子発現、RNAプロテクションアッセイ法、マイクロアレイ分析、ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンシングなどを含む。次世代シークエンス技法の非限定的な例には、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454；超並列シグネチャーシーケンシング固相型、可逆的ダイターミネーターシーケンシング；およびDNAナノボールシーケンシングが含まれることができる。
【００４５】
一般的に、PCR手順は、（i）核酸試料またはライブラリー内の特異的遺伝子または配列とのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ii）熱安定性DNAポリメラーゼを用いた複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴うその後の増幅、ならびに（iii）正確なサイズのバンドについてのPCR産物のスクリーニングから構成される、遺伝子増幅方法を言い表す。使用されるプライマーは、重合開始をもたらすために十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち各プライマーは、増幅されるべきゲノム座の鎖と相補的であるように特異的に設計される。代替的な一態様では、本明細書に記載の遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCRおよび定量RT-PCR（QRT-PCR）またはリアルタイムPCR法によって判定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は、当技術分野において周知である。本明細書に記載のマーカー遺伝子の核酸配列は、ヒト、マウスおよびラットなどの異なる種に関してNCBIアクセッション番号が割り当てられている。したがって、当業者は、それぞれの遺伝子のmRNAレベルを判定するために公知の配列に基づき適切なプライマーを設計することができる。
【００４６】
核酸およびリボ核酸（RNA）分子は、特定の生物学的試料から、当技術分野において周知のいくつかの手順のいずれかを用いて単離することができ、選ばれる特定の単離手順は、特定の生物学的試料に適切である。例えば、凍結融解およびアルカリ溶解手順は、固体材料から核酸分子を得るために有用であることができ；熱およびアルカリ溶解手順は、尿から核酸分子を得るために有用であることができ；プロテイナーゼK抽出は、血液から核酸を得るために使用することができる（Roiff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)）。
【００４７】
一般的に、PCR手順は、（i）核酸試料またはライブラリー内の特異的遺伝子とのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ii）DNAポリメラーゼを用いた複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴うその後の増幅、ならびに（iii）正確なサイズのバンドについてのPCR産物のスクリーニングから構成される、遺伝子増幅方法を言い表す。使用されるプライマーは、重合開始をもたらすために十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち各プライマーは、増幅されるべき核酸分子の各鎖と相補的であるように特異的に設計される。
【００４８】
代替的な一態様では、本明細書に記載の遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCRおよび定量RT-PCR（QRT-PCR）またはリアルタイムPCR法によって判定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は、当技術分野において周知である。
【００４９】
一部の態様では、本明細書に記載の試薬（例えば抗体試薬および／または核酸プローブ）の1種または複数種は、検出可能な標識を含み、かつ／または検出可能なシグナルを発生する能力（例えば、化合物を検出可能な産物に変換する触媒反応により）を含むことができる。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素、または放射性標識を含むことができる。検出可能な標識、それらを検出する方法、およびそれらを試薬（例えば抗体および核酸プローブ）中に組み入れる方法は、当技術分野において周知である。
【００５０】
一部の態様では、検出可能な標識には、蛍光、化学蛍光、もしくは化学ルミネセンスのような分光手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、電磁的手段、放射化学的手段、もしくは化学的手段、または任意の他の適切な手段によって検出することができる標識を含むことができる。本明細書に記載の方法に使用される検出可能な標識は、一次標識（標識が、直接検出可能な部分を含む、または直接検出可能な部分を産生する部分を含む場合）または二次標識（例えば、二次抗体および三次抗体を用いた免疫学的標識化で一般的なように、検出可能な標識が、別の部分に結合して検出可能なシグナルを産生する場合）であることができる。検出可能な標識は、共有結合的または非共有結合的手段によって試薬に連結することができる。あるいは、検出可能な標識は、例えばリガンド-受容体結合対の配置を介して試薬への結合を達成する分子または他のそのような特異的認識分子を直接標識することによって、連結することができる。検出可能な標識には、非限定的に、放射性同位体、生物ルミネセンス化合物、発色団、抗体、化学ルミネセンス化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素が含まれることができる。
【００５１】
他の態様では、検出試薬は、蛍光化合物を有する標識である。蛍光標識抗体が適正な波長の光に曝露された場合、その存在を蛍光により検出することができる。一部の態様では、検出可能な標識は、非限定的にフルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリデニン（peridenin）クロロフィル、シアニン、フィコエリトリン-Cy5（商標）のようなタンデムコンジュゲート、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッドおよびテトラロージミン（tetrarhodimine）イソチオシアネート（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6-カルボキシフルオレセイン（carboxyfhiorescein）（略称FAMおよびFにより一般的に公知である）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（hexachlorofiuorescein）（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（dimethoxyfiuorescein）（JOEまたはJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110；シアニン色素、例えばCy3、Cy5およびCy7色素；クマリン、例えばウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えばHoechst 33258；フェナントリジン色素、例えばテキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えばCy3、Cy5他のようなシアニン色素；BODIPY色素およびキノリン色素を含む、蛍光色素分子または蛍光団であることができる。一部の態様では、検出可能な標識は、非限定的に3H、125I、35S、14C、32P、および33Pを含む、放射性標識であることができる。一部の態様では、検出可能な標識は、非限定的にホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む、酵素であることができる。酵素標識は、例えば、化学ルミネセンスシグナル、カラーシグナル、または蛍光シグナルを生成することができる。抗体試薬を検出可能に標識するための使用に考えられている酵素には、非限定的に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。一部の態様では、検出可能な標識は、非限定的にルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルを含む、化学ルミネセンス標識である。一部の態様では、検出可能な標識は、非限定的にコロイド金または色ガラスまたは色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプ���ピレン、およびラテックス）ビーズを含む、分光比色標識であることができる。
【００５２】
一部の態様では、検出試薬はまた、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS、またはビオチンのような検出可能なタグで標識することができる。他の検出システム、例えば、ビオチン-ストレプトアビジンシステムも使用することができる。このシステムでは、関心対象のバイオマーカーと免疫反応性の（すなわち特異的な）抗体は、ビオチン化されている。バイオマーカーに結合したビオチン化抗体の量は、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび色素産生性基質を用いて判定される。そのようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えばDAKO、Carpinteria、CAから市販されている。試薬はまた、152Euのような発蛍光金属またはランタン系列のその他を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のような金属キレート基を使用して試薬に結合させることができる。
【００５３】
一部の態様では、血液試料中のCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、試料中の末梢循環腫瘍細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。一部の態様では、試料中のCTC-CにおけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される。CTCおよびCTC-Cは、本明細書上記のように、例えばHB-CTC-チップまたはFACSを用いて単離することができる。一部の態様では、対象から得られた癌細胞におけるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定され、例えば腫瘍試料中の発現レベルを測定することができる。
【００５４】
本明細書において記載される任意の局面の一部の態様では、複数の遺伝子の発現産物のレベルは、同時に（例えば多重アッセイ法）または並行して判定することができる。一部の態様では、200種以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが判定される。一部の態様では、100種以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが判定される。一部の態様では、20種以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが判定される。一部の態様では、10種以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが判定される。
【００５５】
一部の態様では、参照は、転移のリスクがないと実証された対象集団におけるマーカー遺伝子産物の発現レベルであることができる。一部の態様では、参照は、CTC、またはCTC-Cから単離されていないCTC集団におけるマーカー遺伝子産物の発現レベルであることができる。一部の態様では、参照はまた、対照試料中もしくは対照個体のプール試料中のマーカー遺伝子産物の発現レベル、またはそれに基づく数値もしくは値の範囲であることができる。
【００５６】
一部の態様では、増加したレベルのCTC-Cは、対照レベルより少なくとも1.5倍高い、例えば1.5倍もしくは1.5倍超、2倍もしくは2倍超、2.5倍もしくは2.5倍超、3倍もしくは3倍超、4倍もしくは4倍超、5倍もしくは5倍超、10倍もしくは10倍超、またはそれ以上のレベルである。一部の態様では、増加したレベルのCTC-Cマーカー遺伝子は、対照レベルより少なくとも1.5倍高い、例えば1.5倍もしくは1.5倍超、2倍もしくは2倍超、2.5倍もしくは2.5倍超、3倍もしくは3倍超、4倍もしくは4倍超、5倍もしくは5倍超、10倍もしくは10倍超、またはそれ以上のレベルである。
【００５７】
本明細書において使用される「試料」または「被験試料」という用語は、生物、例えば対象からの血液試料から採取または単離された試料を意味する。例示的な生物学的試料には、非限定的に、生物流体試料；血清；血漿；尿；唾液；腫瘍試料；腫瘍生検および／または組織試料などが含まれる。本用語には、上記試料の混合物も含まれる。「被験試料」という用語には、未処理の生物学的試料または前処理した（または予備加工処理した）生物学的試料も含まれる。一部の態様では、被験試料は、対象由来の細胞を含むことができる。一部の態様では、被験試料は、腫瘍細胞被験試料であることができ、例えば試料は、癌細胞、腫瘍由来の細胞、および／または腫瘍生検を含むことができる。一部の態様では、被験試料は血液試料であることができる。一部の態様では、被験試料は血清試料であることができる。
【００５８】
被験試料は、対象由来の細胞の試料を取り出すことによって得ることができるが、以前に単離された細胞（例えば、事前の時点で単離されたおよび同じ人または別人によって単離された）を使用することによっても成し遂げることができる。加えて、被験試料は、新たに収集された試料または以前に収集された試料であることができる。
【００５９】
一部の態様では、被験試料は、未処理の被験試料であることができる。本明細書において使用される場合、「未処理の被験試料」という語句は、溶液中への希釈および／または懸濁を除き、いかなる事前の試料の前処理も受けたことのない被験試料を表す。被験試料を処理するための例示的な方法には、非限定的に、遠心分離、濾過、超音波処理、均一化、加熱、凍結および融解、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。一部の態様では、被験試料は、凍結した被験試料、例えば凍結組織であることができる。凍結試料は、本明細書に記載の方法、アッセイ法、およびシステムを用いる前に解凍することができる。解凍後に、凍結試料を遠心分離し、その後本明細書に記載の方法、アッセイ法およびシステムに供することができる。一部の態様では、被験試料は、例えば遠心分離して、清澄化した被験試料を含む上清を収集することによる、清澄化した被験試料である。一部の態様では、被験試料は、予備加工処理した被験試料、例えば、遠心分離、濾過、融解、精製、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される処理に起因する上清または濾液であることができる。一部の態様では、被験試料は、化学試薬および／または生物学的試薬で処理することができる。化学試薬および／または生物学的試薬は、加工処理の間に、中に生体分子（例えば核酸およびタンパク質）を含む試料の安定性を保護および／または維持するために用いることができる。例示的な一試薬は、加工処理の間にタンパク質の安定性を保護または維持するために一般的に使用されるプロテアーゼ阻害物質である。当業者は、本明細書に記載の発現産物のレベルを判定するために必要な生物学的試料の予備加工処理に適切な方法および工程を十分に認識している。
【００６０】
本明細書において実証されたように、CTC-Cマーカー遺伝子の発現増加は、これらの細胞の転移能に寄与する。したがって、CTC-Cのレベル、および／またはCTC-Cの転移能は、1つまたは複数のCTC-Cマーカー遺伝子の発現および／または活性を阻害することによって低下させることができる。一局面では、癌を有する対象における末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを低下させる方法であって、CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、方法が、本明細書に記載される。一局面では、CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、癌転移を処置する方法が、本明細書に記載される。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「阻害物質」という用語は、標的化された発現産物（例えば標的をコードするmRNAまたは標的ポリペプチド）の発現および／または活性を、例えば少なくとも10％もしくはそれ以上、例えば10％もしくはそれ以上、50％もしくはそれ以上、70％もしくはそれ以上、80％もしくはそれ以上、90％もしくはそれ以上、95％もしくはそれ以上、または98％もしくはそれ以上減少させることができる作用物質を表す。例えばプラコグロビンの阻害物質の有効性、例えばそれがプラコグロビンのレベルおよび／または活性を低下させる能力は、例えばプラコグロビンの発現産物のレベルおよび／またはプラコグロビンの活性を測定することによって判定することができる。所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は、当業者に公知であり、例えばプライマーを用いたRTPCRを使用してRNAのレベルを判定することができ、抗体を用いたウエスタンブロット（例えば抗JUP抗体、例えばCat No. ab12083; Abcam; Cambridge, MA）を用いてポリペプチドのレベルを判定することができる。例えばプラコグロビンの活性、例えばCTC-Cが新しい腫瘍を形成する能力、例えば転移する能力は、当技術分野において公知の方法および本明細書下記の方法を用いて判定することができる。一部の態様では、JUPの阻害物質は、阻害性核酸；アプタマー；抗体試薬；抗体；または小分子の可能性がある。
【００６２】
一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階は、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与することを含む。一部の態様では、阻害性核酸はsiRNAである。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子はプラコグロビンである。
【００６３】
一局面では、対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階；およびCTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加していない場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階を含む、癌を処置する方法が、本明細書において記載される。一部の態様では、癌は、乳癌および／または上皮癌であることができる。
【００６４】
転移を防止するかおよび／または減らすための処置は、当業者に公知である。そのような処置の非限定的な例には、化学療法、放射線療法、腫瘍の除去（例えば外科的除去）、および／または本明細書の他の箇所に記載のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の投与が含まれることができる。一部の態様では、処置を行わないことは、治療的介入なしでモニタリングする臨床アプローチ、例えば「待機療法」を含むことができる。
【００６５】
一部の態様では、本明細書に記載の方法、アッセイ法、およびシステムは、対象から被験試料を得る段階をさらに含むことができる。一部の態様では、対象はヒト対象である。一部の態様では、対象は、癌を有するまたは癌を有すると診断された対象である。一部の態様では、対象は、癌のための処置を必要とする対象である。
【００６６】
一部の態様では、本明細書に記載の方法は、癌を有するまたは癌を有すると診断された対象を処置することに関する。一部の態様では、癌は、乳癌および／または上皮癌であることができる。癌を有する対象は、癌を診断する現行の方法を用いて医師によって特定されることができる。これらの状態を特徴決定しており診断を助ける癌の症候および／または合併症は、当技術分野において周知であり、それらには、非限定的に、例えば乳癌については、塊、炎症、掻痒、皮膚の外観および／もしくは肌目の変化、疼痛、分泌物、ならびに／または腫脹が含まれる。例えば乳癌の診断を支援し得る検査には、非限定的にマンモグラムおよび生検が含まれる。乳癌の家族歴または乳癌に関するリスク因子への曝露も、対象が癌を有する可能性があるかどうかを判定することまたは癌の診断を行うことを支援することができる。
【００６７】
本明細書において記載される組成物および方法は、癌を有するまたは癌を有すると診断された対象に投与することができる。一部の態様では、本明細書に記載の方法は、癌の症候を緩和するために、有効量の本明細書に記載の組成物、例えばCTC-Cマーカー遺伝子の阻害物質を対象に投与する段階を含む。本明細書において使用される場合、「癌の症候を緩和すること」は、癌に関連する任意の状態または症候を改善することである。等価の未処置対照と比較して、そのような軽減は、任意の標準技法によって測定した場合、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％、またはそれ以上である。本明細書に記載の組成物を対象に投与するための多様な手段は、当業者に公知である。そのような方法には、非限定的に、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、局所、注射、または腫瘍内投与が含まれることができる。投与は、局所または全身であることができる。
【００６８】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症候を緩和するために必要なCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の量を表し、所望の効果を提供するために十分な薬理学的組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与した場合に特定の抗癌効果を提供するために十分なCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の量に関する。様々な文脈で本明細書において使用される有効量はまた、疾患の症候の発生を遅延させるため、疾患の症候の経過を変化させるため（例えば、非限定的な、疾患の症候の進行を緩徐化すること）、または疾患の症候を逆転させるために十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般的に実行可能でない。しかし、任意の所与の場合について、当業者は、日常的な実験法だけを用いて適切な「有効量」を判定することができる。
【００６９】
有効量、毒性、および治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えばLD50（50％の集団に致死的な用量）およびED50（50％の集団に治療的に有効な用量）を判定するための手順によって判定することができる。投薬量は、使用された剤形および用いられた投与経路に応じて変動することができる。毒作用と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比LD50／ED50として表現することができる。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初は細胞培養アッセイ法から推定することができる。また、用量は、細胞培養または適切な動物モデルで判定されたIC50（すなわち、症候の最大半減阻害を達成するCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ法、例えば癌の成長、生存、および／またはとりわけ転移についてのアッセイ法によってモニタリングすることができる。投薬量は、医師によって判定されることができ、必要に応じて、観察された処置効果に好都合であるように調整することができる。
【００７０】
一部の態様では、本明細書に記載の技法は、本明細書に記載のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される担体および希釈剤には、食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの非限定的な例には、（1）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；（2）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；（3）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロースおよび酢酸セルロースのようなその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤；（8）カカオ脂および坐剤用ロウのような賦形剤；（9）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油；（10）プロピレングリコールのようなグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）のようなポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤、（23）血清アルブミン、HDLおよびLDLのような血清成分；（22）エタノールのようなC2〜C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤中に用いられる他の無毒な適合性物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤も、製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語が、本明細書において互換的に使用される。一部の態様では、担体は、活性物質、例えば本明細書に記載のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の分解を阻害する。
【００７１】
一部の態様では、本明細書に記載のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む薬学的組成物は、非経口剤形であることができる。非経口剤形の投与は、典型的には混入物に対する患者の自然防御を回避するので、非経口剤形は、好ましくは無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌することができる。非経口剤形の例には、非限定的に、すぐに注射できる溶液、薬学的に許容される注射用ビヒクル中にすぐに溶解または懸濁できる乾燥製品、すぐに注射できる懸濁剤、および乳剤が含まれる。加えて、非限定的にDUROS（登録商標）型剤形およびドーズダンピング（dose-dumping）を含む、制御放出非経口剤形を、患者に投与するために調製することができる。
【００７２】
本明細書中で開示されるCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の非経口剤形を提供するために使用することができる適切なビヒクルは、当業者に周知である。例には、無菌水；注射用水USP；食塩溶液；グルコース溶液；非限定的な塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、ならびに乳酸リンゲル注射剤などの、水性ビヒクル；非限定的なエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの、水混和性ビヒクル；ならびに非限定的なトウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの、非水性ビヒクルが、非限定的に含まれる。本明細書において開示されるCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の薬学的に許容される塩の溶解度を変化または改変する化合物も、従来の非経口剤形および制御放出非経口剤形を含む本開示の非経口剤形に組み入れることができる。
【００７３】
CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む薬学的組成物はまた、経口投与に適するように、例えば、非限定的な錠剤（非限定的に分割錠またはコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット、カプセル剤、咀嚼錠、粉末パケット（powder packet）、カシェ剤、トローチ剤、ウエハース、エアロゾルスプレー、または、非限定的なシロップ剤、エリキシル剤、水性液体中、非水性液体中、水中油型乳剤中、もしくは油中水型乳剤中の溶液もしくは懸濁液などの液剤などの、別個の剤形として製剤化することができる。そのような組成物は、開示された化合物の薬学的に許容される塩の所定量を含有し、当業者に周知の薬学的方法によって調製され得る。一般的に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。
【００７４】
従来の剤形は、一般的に製剤からの急速または即時薬物放出をもたらす。薬物の薬理学的性質および薬物動態に応じて、従来の剤形の使用は、患者の血液および他の組織中の薬物濃度に広い変動を導くことができる。これらの変動は、投与回数、作用の開始、有効性の持続期間、治療血液レベルの維持、毒性、副作用などのようないくつかのパラメーターに影響することができる。好都合なことに、制御放出製剤は、薬物の作用開始、作用持続期間、治療ウインドウ内の血漿レベル、および最高血液レベルを制御するために使用することができる。特に、薬物を過少投与すること（すなわち最小治療レベルを下回る）および薬物に対する毒性レベルを超過することのどちらからも起こる可能性がある潜在的有害作用および安全上の懸念を最小限にしながら、薬物の最大有効性が達成されることを確実にするために、制御放出または持続放出剤形または製剤を使用することができる。一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子の阻害物質は、持続性放出製剤として投与することができる。
【００７５】
制御放出薬剤は、それらの非制御放出相当物によって達成されるものを超えて薬物治療を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出製剤の使用は、最短時間で状態を治癒または制御するために用いられる最少の原体を特徴とする。制御放出製剤の利点には、（1）薬物の長期活性；（2）投薬回数の減少；（3）患者のコンプライアンスの増加；（4）より少ない総薬物の使用；（5）局所または全身副作用の軽減；（6）薬物蓄積の最小化；（7）血液レベルの変動の減少；（8）処置の有効性の改善；（9）薬物活性の増強作用減少または喪失；および（10）疾患または状態の制御速度の改善が含まれる。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
【００７６】
大部分の制御放出製剤は、所望の治療効果を即座に生じる量の薬物（活性成分）を最初に放出し、このレベルの治療効果または予防効果を長時間維持するために他の量の薬物を徐々に継続的に放出するように設計されている。体内でこの一定なレベルの薬物を維持するために、薬物は、代謝されて体から排泄される薬物量の代わりを補う速度でその剤形から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、非限定的にpH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的条件または化合物を含む様々な条件によって刺激されることができる。
【００７７】
多様な公知の制御放出または持続放出の剤形、製剤、および器具は、本開示の塩および組成物を用いた使用のために適応させることができる。例には、非限定的に、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185B1号に記載されたものが含まれる。これらの剤形を使用して、所望の放出プロファイルを様々な比率で提供するために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性メンブラン、浸透圧システム（例えばOROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA））、またはそれらの組み合わせを使用しながら1種または複数種の活性成分の低速放出または制御放出を提供することができる。
【００７８】
本明細書において記載される方法はさらに、例えば組み合わせ治療の一部として、第2の作用物質および／または処置を対象に行う段階を含むことができる。第2の作用物質および／または処置は、化学療法および／または放射線療法および／または外科手術を含むことができる。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「化学療法」は、癌細胞の成長、生存、および／または転移を減らすかまたは減少させる物質を表す。化学療法は、毒素、小分子、および／またはポリペプチドを含むことができる。第2の作用物質および／または処置の非限定的な例には、放射線療法、外科手術、ゲムシタビン、シスプラスチン（cisplastin）、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethiylenethiophosphoramide）およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosurea）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ1IおよびカリケアマイシンオメガI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照されたい）；ダイネマイシンAを含むダイネマイシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルチノフィリン、クロモマイシン（chromomycini）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）であるドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラ��イシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）のような代謝拮抗薬；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（anti-adrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクォン；エルフォルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサマイトシン（ansamitocin）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン（pirarubicin）；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリン（verracurin）A、ロリジン（roridin）Aおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばTAXOL（登録商標）であるパクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、Cremophor不含ABRAXANE（登録商標）であるパクリタキセルアルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）、およびTAXOTERE（登録商標）であるドキセタキセル（doxetaxel）（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル（chloranbucil）；GEMZAR（登録商標）であるゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（商標）であるビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Camptosar, CPT-11）（5-FUお���びロイコボリンと一緒のイリノテカンの治療方式を含む）；トポイソメラーゼ阻害物質RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン処置方式（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb（商標））；細胞増殖を減少させるPKC-α阻害物質、Raf阻害物質、H-Ras阻害物質、EGFR阻害物質（例えばエルロチニブ（Tarceva（登録商標）））およびVEGF-A阻害物質、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれることができる。
【００８０】
加えて、処置方法はさらに、放射線または放射線療法の使用を含むことができる。さらに、処置方法はさらに、外科的処置の使用を含むことができる。
【００８１】
特定の態様では、本明細書に記載のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む組成物の有効用量は、患者に1回投与することができる。特定の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む組成物の有効用量は、患者に反復して投与することができる。全身投与のために、対象に、例えば0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、またはそれ以上などの、CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む組成物の治療量を投与することができる。
【００８２】
一部の態様では、初回処置方式の後に、処置は、より少ない頻度ベースで投与することができる。例えば、3ヶ月間の隔週処置の後に、処置を1ヶ月に1回、6ヶ月、もしくは1年、またはそれ以上繰り返すことができる。本明細書に記載の方法による処置は、マーカーレベルまたは状態の症候を、例えばCTC-Cレベルを、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上低下させることができる。
【００８３】
本明細書において記載される組成物の投薬量は、医師によって判定され、必要に応じて観察された処置の効果に適合するように調整されることができる。処置の期間および回数に関して、処置が治療上の利益をいつ提供しているかを判定するため、ならびに投薬量を増加させるか減少させるか、投与回数を増加させるか減少させるか、処置を中断するか、処置を再開するか、または処置方式に他の変更を加えるかどうかを判定するために、熟練の臨床家が対象をモニタリングすることが典型的である。CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質に対する対象の感受性のようないくつかの臨床要因に応じて、投薬スケジュールは、1週間に1回から毎日まで変動することができる。所望の活性化の用量または量は、一度に、または部分用量に、例えば2〜4つの部分用量に分割して、投与することができ、ある期間にわたり、例えば1日にわたり適切な間隔でまたは他の適切な計画で投与することができる。一部の態様では、投与は、慢性的、例えば、数週間または数ヶ月にわたり1日に1回または複数回の投与および／または処置であることができる。投薬および／または処置スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月、またはそれ以上にわたり、毎日、1日2回、1日3回、または1日4回もしくはそれ以上の投与である。CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を含む組成物は、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間かけて投与することができる。
【００８４】
本明細書において記載される方法によるCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の投与のための投薬量範囲は、例えば、CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の形式、その有効性、および本明細書に記載の状態の症候、マーカー、または指標の望ましい低下度、例えば症候（例えばCTC-Cレベル）について望ましい低下パーセンテージに依存する。投薬量は、有害副作用を引き起こすほど大量であるべきではない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、および性別により変動し、当業者によって判定されることができる。投薬量はまた、任意の合併症の事象中に個別の医師によって調整されることができる。
【００８５】
例えば本明細書において記載される状態の処置における、または本明細書に記載の応答を誘導するためのCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の有効性（例えばCTC-Cレベルの低下）は、当業者によって判定されることができる。しかし、例えば本明細書に記載の方法による処置の後に、少なくとも10％だけ、本明細書に記載の状態の徴候または症候の1つまたは複数が有益なように変わるか、他の臨床的に許容される症候が改善もしくは回復さえするか、または所望の応答が誘導される場合に、処置は、その用語が本明細書において使用される限りで「有効な処置」と見なされる。有効性は、例えば、本明細書に記載の方法により処置される状態のマーカー、指標、症候、および／もしくは発生率、または適切な任意の他の測定可能なパラメーター、例えば転移および／もしくCTC-Cのレベルを測定することによって評価することができる。有効性はまた、入院、または医学的介入の必要によって評価されるような、個体の悪化がないこと（すなわち疾患の進行が止まること）によって測定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。処置には、個体または動物における疾患の任意の処置が含まれ（一部の非限定的な例には、ヒトまたは動物が含まれる）、ならびに（1）疾患を阻害すること、例えば症候（例えば疼痛もしくは炎症）の悪化を防止すること；または（2）疾患の重症度を軽減すること、例えば症候の退行を引き起こすことが含まれる。疾患の処置のための有効量は、それを必要とする対象に投与した場合に、その疾患に対して、その用語が本明細書において定義されるように結果として有効な処置をもたらす十分な量を意味する。作用物質の有効性は、状態の身体的指標または所望の応答（例えば転移）を評価することによって判定することができる。そのようなパラメーターの任意の1つまたはパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、投与および／または処置の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書に記載の状態の動物モデルで、例えばマウスモデルにおける癌の処置で評価することができる。実験的動物モデルを使用する場合、処理の有効性は、マーカー、例えば転移および／またはCTC-Cレベルにおける統計的に有意な変化が観察された場合に証明される。
【００８６】
所与の用量のCTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の評価を可能にするインビトロアッセイ法および動物モデルアッセイ法が、本明細書において提供される。非限定的な例として、CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の投与の効果は、CTCおよび／または普通の癌細胞と比較してCTC-Cのレベルを測定することによって評価することができる。そのようなアッセイ法のためのプロトコールの非限定的な例は以下の通りである。CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質の存在下または非存在下で癌細胞をVybrant（商標）細胞間接着アッセイ法に供し、接着を判定する。
【００８７】
所与の投薬組み合わせの有効性も、動物モデルにおいて、例えば癌のマウスモデルにおいて評価することができる。例えば、癌細胞を免疫不全マウスの乳房脂肪パッド内に注射し、CTC-Cマーカー遺伝子阻害物質を投与し、腫瘍の成長（および／またはCTC-Cレベル）を測定する。
【００８８】
キットは、試料中のCTC-Cレベルを特異的に検出および／または測定するための、少なくとも1種の試薬、例えば抗体試薬を含み、本明細書に記載の方法またはアッセイ法を行うためのユニットとして起用、流通、または販売される、任意の製品（例えばパッケージまたは容器）である。キットおよび本明細書に記載の方法が癌（例えば乳癌）の診断および／または処置のために使用される場合、CTC-Cレベルが増大している対象、例えば転移のリスクが増加している対照の少なくとも約20％、少なくとも約40％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、または100％において陽性の結果が得られるように、CTC-C検出プローブまたはシステムを選択することができる。
【００８９】
一部の態様では、固体支持体上でCTC-Cマーカー遺伝子、例えばJUPと特異的に結合する本明細書に記載の少なくとも第1の抗体試薬を含み、かつ検出可能な標識を含む、試料中のCTC-Cを検出するためのキットが、本明細書において記載される。一部の態様では、キットは、CTC-Cマーカー遺伝子と特異的に結合する本明細書に記載の少なくとも第2の抗体試薬をさらに含むことができ、第1および第2の抗体試薬は、単一のポリペプチド分子に同時に結合することができる。一部の態様では、抗体試薬は、試料中に存在するマーカー遺伝子ポリペプチドのサンドイッチイムノアッセイ検出を可能にするように設定することができる。一部の態様では、サンドイッチイムノアッセイ法は、ELISA、側方流動イムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、ディップスティックイムノアッセイ法、尿ディップスティックイムノアッセイ法などを含むことができる。
【００９０】
一部の態様では、CTC-Cマーカー遺伝子、例えばJUPと特異的に結合する少なくとも第1の核酸プライマーおよび／またはプローブを含む、試料中のCTC-Cを検出するためのキットが、本明細書において記載される。一部の態様では、プライマーおよび／またはプローブはさらに、検出可能なレベルを含み、かつ／または固体支持体上にコンジュゲーションされることができる。
【００９１】
本明細書において記載される方法およびアッセイ法にCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが使用される場合、遺伝子の発現レベルを、同種の非癌性試料におけるマーカーの発現レベルまたは本明細書記に載の別の参照値もしくは参照標準と比較することができる。
【００９２】
本明細書において記載されるキットは、任意で、本明細書に記載の方法およびアッセイ法を行うために有用な追加的な構成要素を含むことができる。例として、キットは、プローブを標的（プローブが特異的に結合する）と結合させるために適した流体（例えば緩衝液）、1つまたは複数の試料区画、本明細書に記載の方法の性能を記載する教材、血液試料（例えば参照として）などを含むことができる。キットはさらに、試料、例えば血液試料中の標的を濃縮するための装置および／または試薬を含むことができる。
【００９３】
好ましくは、本明細書において開示される方法およびアッセイ法を用いて使用するための診断キットは、CTC-Cおよび／またはCTC-Cマーカー遺伝子発現産物用の検出試薬を内蔵する。そのような検出試薬は、標的に特異的な試薬に加えて、例えば緩衝溶液、標識または洗浄液などを含む。さらに、キットは、キットの較正のためまたは内部対照として使用することができる、ある量の公知の標的を含む可能性がある。そのための診断キットはまた、二次抗体などの二次アフィニティーリガンド、検出色素、および当業者に公知の検出方法の実施に必要な任意の他の適切な化合物または液体のような副成分を含むことができる。そのような成分は、当業者に公知であり、行われる検出方法に応じて変動し得る。追加的に、キットは、使用説明書を含む場合があり、かつ／または得られた結果の妥当性に関する情報を提供し得る。
【００９４】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される一部の用語および語句の意味を下に提供する。特に述べない限りまたは文脈から暗に意味されない限り、以下の用語および語句は、下に提供される意味を含む。特定の態様の記載を助けるために定義が提供されるが、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は、請求された本発明を限定することを意図するものではない。特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書において提供されるその定義との間に、見かけの矛盾がある場合には、本明細書内で提供された定義が優先されるものとする。
【００９５】
便宜上、本書類、すなわち本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語をここに集める。
【００９６】
「減少する」、「低下している」、「低下」、または「阻害する」という用語は、本明細書において全て、統計的に有意な量だけの減少を意味するために使用される。一部の態様では、「低下する」、「低下」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には参照レベル（例えば所与の処置の非存在下）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含む可能性がある。本明細書において使用される場合、「低下」または「阻害」は、参照レベルと比較した完全な阻害または低下を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較した100％阻害である。減少は、好ましくは所与の障害を有さない個体についての正常範囲内として許容されるレベルまで下がることができる。
【００９７】
「増加している」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、本明細書において全て、統計的に有意な量だけの増加を意味するために使用される。一部の態様では、「増加している」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、または少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは最大で100％の増加もしくは10〜100％の間の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍への増加、または2倍から10倍もしくはそれ以上の間への任意の増加を意味する可能性がある。マーカーまたは症候に関連して、「増加」は、そのようなレベルにおける統計的に有意な増加である。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、およびサカナ、例えばマス、ナマズおよびサケが含まれる。一部の態様では、対象は哺乳類、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００９９】
好ましくは、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、癌の動物モデルに相当する対象として好都合に使用することができる。対象は、雄または雌であることができる。
【０１００】
対象は、処置を必要とする状態（例えば、癌）またはそのような状態に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されているか、あるいは該状態または該合併症を患っているもしくは有すると特定されており、かつ任意で、癌または癌に関係する1つもしくは複数の合併症に対する処置を既に受けたことのある、対象であることができる。あるいは、対象は、癌または癌に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されたことのない対象であることができる。例えば、対象は、癌または癌に関係する1つもしくは複数の合併症に関する1つまたは複数のリスク因子を示している対象、またはリスク因子を示していない対象であることができる。
【０１０１】
特定の状態に対する処置を「必要とする対象」は、その状態を有する対象、その状態を有すると診断された対象、またはその状態を発生するリスクがある対象であることができる。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「癌」または「腫瘍」という用語は、身体器官および身体システムの正常な機能発揮を妨害する、制御されない細胞成長を表す。癌または腫瘍を有する対象は、対象の体に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する対象である。この定義には、良性および悪性の癌、ならびに潜伏腫瘍または微小転移が含まれる。それらの本来の位置から転移して生体器官に播種する癌は、罹患器官の機能悪化により、最終的には対象の死に至る可能性がある。上皮癌は、例えば、癌腫；腺癌；基底細胞癌；扁平上皮癌；大細胞癌；小細胞癌；結腸直腸腺癌；肺癌；乳癌；前立腺癌；結腸癌；直腸癌；膵臓癌；腎臓癌；卵巣癌；胃癌；腸癌；口腔癌；食道癌；口唇癌；膀胱癌；子宮頸癌；皮膚癌；肝細胞癌；および腎細胞癌から成る群より選択することができる。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「発現レベル」は、細胞または試料中に存在する所与の遺伝子によってコードされるmRNA分子および／またはポリペプチド分子の数を表す。発現レベルは、参照レベルと比較して増加または低下している可能性がある。
【０１０４】
「作用物質」という用語は、一般的に、普通は存在しないか、または細胞、組織、もしくは対象に投与されるレベルでは存在しない、任意の実体を表す。作用物質は、非限定的にポリヌクレオチド；ポリペプチド；小分子；および抗体またはその抗原結合性断片を含む群より選択することができる。ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAであることができ、1本鎖または2本鎖であることができ、例えばポリペプチドをコードする核酸および核酸類似体を含む群より選択することができる。ポリペプチドは非限定的に、関心対象の機能を保持する天然のポリペプチド、突然変異ポリペプチドまたはそれらの断片であることができる。作用物質のさらなる例には、非限定的に、核酸アプタマー、ペプチド-核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、有機または無機小分子；糖類；オリゴ糖；多糖；生体高分子、ペプチド模倣薬；核酸類似体および誘導体；細菌、植物、真菌、または哺乳類細胞もしくは組織のような生物学的材料から作製される抽出物、および天然または合成組成物が含まれる。作用物質は、細胞と接触し、その効果を誘導する媒質に適用することができる。あるいは、作用物質をコードする核酸配列が細胞内に導入され、それが転写され、ひいては細胞内での核酸および／またはタンパク質の環境刺激の産生を招く結果として、作用物質は細胞内にあることができる。一部の態様では、作用物質は、非限定的に合成非タンパク質性実体および天然非タンパク質性実体を含む、任意の化学物質、実体または部分である。特定の態様では、作用物質は、例えば、マクロライド、レプトマイシンおよびその関連天然産物または類似体を含む、非置換または置換のアルキル、芳香族、または複素環部分より選択される化学部分を有する小分子である。作用物質は、所望の活性および／もしくは性質を有することが公知であることができ、または多様な化合物のライブラリーより選択することができる。本明細書において使用される場合、「小分子」という用語は、「天然産物様」である化合物を表すことができるが、「小分子」という用語は、「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ小分子は、典型的には、数個の炭素-炭素結合を含み、かつ約50ダルトン超だが約5000ダルトン（5kD）未満の分子量を有することを特徴とする。好ましくは、小分子は、3kD未満、いっそうより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。場合によっては、小分子は、700ダルトンまたはそれ未満の分子量を有することが好ましい。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、「化学療法剤」という用語は、異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置に治療的有用性を有する、任意の化学剤または生物学的剤を表す。そのような疾患には、腫瘍、新生物および癌、ならびに、過形成性成長を特徴付とする疾患が、含まれる。これらの剤は、癌細胞が連続増殖のために依存している細胞活性を阻害するように機能することができる。全ての態様のある局面では、化学療法剤は、細胞周期阻害物質または細胞分裂阻害物質である。本発明の方法に有用な化学療法剤の部類には、アルキル化剤／アルカロイド剤、代謝拮抗物質、ホルモンまたはホルモン類似体、およびその他の抗悪性腫瘍薬が含まれる。これらの剤の大部分は、癌細胞に直接または間接的に有毒である。一態様では、化学療法剤は、放射性分子である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry et al. , Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed. 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer D S, Knobf M F, Durivage H J (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照されたい）。一部の態様では、化学療法剤は、細胞毒性化学療法剤の可能性がある。本明細書において使用される「細胞毒」という用語は、細胞の機能を阻害または阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を表す。この用語は、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、および、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などでそれらの断片および／または変異体を含む毒素を含むことが意図される。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって相互に結合された一連のアミノ酸残基を示す。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関わらず、改変アミノ酸（例えばリン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを表す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合に比較的大型のポリペプチドに関して使用され、一方で「ペプチド」という用語は、多くの場合に小型ポリペプチドに関して使用されるが、これらの用語の使用は、当技術分野において重複する。遺伝子産物およびその断片を表す場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前記の他の等価物、変異体、断片、および類似体が含まれる。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、「抗体」は、自然に抗体を産生する任意の種から得られようと、または組換えDNA技法によって創出されようと；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されようと、IgG、IgM、IgA、IgD、もしくはIgE分子またはその抗原特異的抗体断片（非限定的に、Fab、F（ab'）2、Fv、ジスルフィド結合型Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合型scfv、二重特異性抗体を含む）を表す。
【０１０８】
本明細書において記載される場合、「抗原」は、抗体物質上の結合部位によって結合される分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドによって結合され、インビボ抗体応答を生じる能力がある。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、もしくは他の分子、またはそれらの部分であることができる。「抗原決定基」という用語は、抗原結合性分子によって、より詳細には該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原と特異的に結合する、ポリペプチドを表す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。一部の態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書においてVHと略す）および軽（L）鎖可変領域（本明細書においてVLと略す）を含むことができる。別の例では、抗体は、2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F（ab'）2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体（dAb）断片（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるde Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照されたい））ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ）の構造特徴を有することができる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）を含む任意の供給源由来および霊長類化抗体であることができる。抗体にはまた、ミディボディー（midibody）、ヒト化抗体、キメラ抗体などが含まれる。
【０１１０】
VH領域およびVL領域はさらに、「フレームワーク領域」（「FR」）と名付けられた、より保存性の高い領域によって分散された「相補性決定領域」（「CDR」）と名付けられた超可変領域に細分することができる。フレームワーク領域およびCDRの程度は、正確に定義されている（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照されたい）。VHおよびVLのそれぞれは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序で配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【０１１１】
本明細書において互換的に使用される「抗原結合性断片」または「抗原結合性ドメイン」という用語は、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持する完全長抗体の1つまたは複数の断片を表すために使用される。完全長抗体の「抗原結合性断片」という用語内に包含される結合性断片の例には、（i）Fab断片、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片；（ii）F（ab'）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片；（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHまたはVLドメインからなるdAb断片（その全体が参照により本明細書に組み入れられるWard et al., (1989) Nature 341:544-546）；ならびに（vi）特異的抗原結合性官能性を保持する、単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。本明細書において使用される場合、「特異的結合」という用語は、第1の実体が、標的ではない第3の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第2の標的実体に結合する、2つの分子、化合物、細胞、および／または粒子の間の化学的相互作用を表す。一部の態様では、特異的結合は、第3の非標的実体に対する親和性の少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍であるか、またはそれを上回る、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性を表すことができる。
【０１１２】
追加的に、および本明細書において記載される場合、組換えヒト化抗体はさらに、ヒトにおける治療に関して潜在的免疫原性を減少させる一方で、機能的活性を維持するように最適化することができる。これに関して、機能的活性は、本明細書に記載される組換え抗体またはその抗体試薬に関連する1つまたは複数の公知の機能的活性を示す能力のあるポリペプチドを意味する。そのような機能的活性には、例えば、JUPに結合する能力が含まれる。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはその類似体のユニットを組み入れている任意の分子、好ましくはポリマー分子を表す。核酸は、1本鎖または2本鎖のいずれかであることができる。1本鎖核酸は、変性2本鎖DNAの1つの核酸鎖であることができる。あるいは、それは、任意の2本鎖DNA由来でない1本鎖核酸であることができる。一局面では、核酸は、DNAであることができる。別の局面では、核酸はRNAであることができる。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
【０１１４】
アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞および組織のような様々な分子標的に特異的に結合する、短い合成1本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの核酸小分子は、タンパク質または他の細胞標的と特異的に結合する能力のある二次および三次構造を形成することができ、本質的に抗体の化学的等価物である。アプタマーは、高度に特異的で、サイズが比較的小さく、非免疫原性である。アプタマーは、一般的に、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）として公知のバイオパニング方法より選択される（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるEllington et al. Nature. 1990;346(6287):818-822; Tuerk et al., Science. 1990;249(4968):505-510; Ni et al., Curr Med Chem. 2011;18(27):4206-14）。任意の所与の標的に対するアプタマーを生成させる方法は、当技術分野において周知である。例えばアプタマー-siRNAキメラおよびアプタマーで標的を定められたナノパーティクル療法を用いた前臨床研究は、癌およびHIVのマウスモデルにおいて非常に好結果であった（Ni et al., Curr Med Chem. 2011;18(27):4206-14）。
【０１１５】
所与の遺伝子の発現阻害物質は、阻害性核酸であることができる。一部の態様では、阻害性核酸は、阻害性RNA（iRNA）である。2本鎖RNA分子（dsRNA）は、RNA干渉（RNAi）として公知の、高度に保存された調節メカニズムで遺伝子発現を遮断することが示されている。本明細書に記載の阻害性核酸には、30ヌクレオチド長またはそれ未満、すなわち15〜30ヌクレオチド長、一般的に19〜24ヌクレオチド長の領域を有するRNA鎖（アンチセンス鎖）が含まれることができ、その領域は、標的化されたmRNA転写物の少なくとも部分に実質的に相補的である。これらのiRNAの使用は、mRNA転写物の標的化分解を可能にし、標的の発現および／または活性の減少を招く。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「iRNA」という用語は、本用語が本明細書において定義されるRNAを含有し、かつ、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）経路を介するRNA転写物の標的化切断を仲介する、作用物質を表す。一態様では、本明細書に記載のiRNAは、JUPの発現および／または活性の阻害を引き起こす。特定の態様では、細胞を阻害物質（例えばiRNA）と接触させることは、細胞における標的mRNAレベルに、iRNA非存在の細胞で見られる標的mRNAレベルから少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、100％を含むそれ以下の低下を招く。
【０１１７】
一部の態様では、iRNAはdsRNAであることができる。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成するに足る十分に相補的な2つのRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現の間に形成されるmRNA配列に由来することができる。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、その結果、2本の鎖は適切な条件下で混ぜ合わされると、ハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成する。一般的に、二重鎖構造は、長さが、15個以上30個以下の塩基対であり、より一般的には18個以上25個以下の塩基対であり、なおより一般的には19個以上24個以下の塩基対であり、最も一般的には19個以上21個以下の塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さが、15個以上30個以下のヌクレオチドであり、より一般的には18個以上25個以下のヌクレオチドであり、なおより一般的には19個以上24個以下のヌクレオチドであり、最も一般的には19個以上21個以下のヌクレオチドである。一部の態様では、dsRNAは長さが15個以上20個以下のヌクレオチドであり、他の態様では、dsRNAは長さが25個以上30ヌクレオチド個以下のヌクレオチドである。当業者が認識するように、切断のために標的化されたRNAの標的領域は、最も多くの場合に、より大きなRNA分子、多くの場合にmRNA分子の部分である。該当する場合、mRNA標的の「部分」は、RNAiによって指令される切断（すなわちRISC経路による切断）ついての基質であるに足る長さの、mRNA標的の連続配列である。9塩基対と短い二重鎖を有するdsRNAは、一部の状況下で、RNAiによって指令されるRNA切断を仲介することができる。最も多くの場合に、標的は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長である。
【０１１８】
なお別の態様では、iRNAのRNA、例えばdsRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に改変される。本発明において特徴とされる核酸は、これによって参照により本明細書に組み入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されている方法のような、当技術分野において十分に確立された方法によって合成および／または改変され得る。改変には、例えば（a）末端改変、例えば5'末端改変（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など）、3'末端改変（コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆結合など）、（b）塩基改変、例えば安定化塩基、不安定化塩基、もしくはパートナーの拡張レパートリーと塩基対合する塩基との置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基、（c）糖改変（例えば、2'位もしくは4'位で）または糖の置換、および（d）ホスホジエステル結合の改変または置換を含む骨格の改変が含まれる。本明細書に記載の態様において有用なRNA化合物の具体例には非限定的に、改変骨格を含むRNAまたは天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが含まれる。改変骨格を有するRNAには、とりわけ、骨格にリン原子を有さないRNAが含まれる。本明細書のために、時に当技術分野において参照される、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない改変RNAも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。特定の態様では、改変RNAは、そのヌクレオシド骨格にリン原子を有する。
【０１１９】
改変RNA骨格には、例えば、通常の3'-5'結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシドユニットの隣接対が3'-5'から5'-3'に、または2'-5'から5'-2'に連結した逆極性を有するものを含むことができる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。上記リン含有結合の調製を教示している代表的な米国特許には、非限定的に、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,687,808号；同第4,469,863号；同第4,476,301号；同第5,023,243号；同第5,177,195号；同第5,188,897号；同第5,264,423号；同第5,276,019号；同第5,278,302号；同第5,286,717号；同第5,321,131号；同第5,399,676号；同第5,405,939号；同第5,453,496号；同第5,455,233号；同第5,466,677号；同第5,476,925号；同第5,519,126号；同第5,536,821号；同第5,541,316号；同第5,550,111号；同第5,563,253号；同第5,571,799号；同第5,587,361号；同第5,625,050号；同第6,028,188号；同第6,124,445号；同第6,160,109号；同第6,169,170号；同第6,172,209号；同第6,239,265号；同第6,277,603号；同第6,326,199号；同第6,346,614号；同第6,444,423号；同第6,531,590号；同第6,534,639号；同第6,608,035号；同第6,683,167号；同第6,858,715号；同第6,867,294号；同第6,878,805号；同第7,015,315号；同第7,041,816号；同第7,273,933号；同第7,321,029号；および米国再発行特許第39464号が含まれる。
【０１２０】
骨格中にリン原子を含まない改変RNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合との混合、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環性ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合型のN、O、S、およびCH2混合構成要素部分を有するその他が含まれる。上記オリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許には、非限定的に、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,034,506号；同第5,166,315号；同第5,185,444号；同第5,214,134号；同第5,216,141号；同第5,235,033号；同第5,64,562号；同第5,264,564号；同第5,405,938号；同第5,434,257号；同第5,466,677号；同第5,470,967号；同第5,489,677号；同第5,541,307号；同第5,561,225号；同第5,596,086号；同第5,602,240号；同第5,608,046号；同第5,610,289号；同第5,618,704号；同第5,623,070号；同第5,663,312号；同第5,633,360号；同第5,677,437号；および同第5,677,439号が含まれる。
【０１２１】
iRNAにおける使用に適するかまたはその使用のために考えられている他のRNA模倣体では、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチドユニットの骨格が、新規な基と置換される。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示された、そのようなオリゴマー性一化合物であるRNA模倣体は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物において、RNAの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は、保持され、かつ骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、非限定的に、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,539,082号；同第5,714,331号；および同第5,719,262号が含まれる。PNA化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
【０１２２】
本発明において特徴とされる一部の態様には、ホスホロチオエート骨格を有するRNA、およびヘテロ原子骨格、特に上記に参照された米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[メチレン（メチルイミノ）またはMMI骨格として公知]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--および--N(CH3)--CH2--CH2--[天然のホスホジエステル骨格は--O--P--O--CH2--と表される]および上記に参照された米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドが含まれる。一部の態様では、本明細書において特徴とされるRNAは、上記に参照された米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１２３】
改変RNAはまた、1つまたは複数の置換糖部分を含むことができる。本明細書において特徴とされるiRNA、例えばdsRNAは、2'位に、OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルの1つを含むことができ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な改変には、nおよびmが1から約10である、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が含まれる。他の態様では、dsRNAは、2'位に、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールもしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、iRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはiRNAの薬力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基の1つを含む。一部の態様では、改変は、2'-メトキシエトキシ（2'-O-（2-メトキシエチル）または2'-MOEとしても公知の2'-O--CH2CH2OCH3）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわちアルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的な改変は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち本明細書後述の実施例に記載される2'-DMAOEとしても公知のO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても公知）、すなわち本明細書後述の実施例にも記載される2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2である。
【０１２４】
他の改変には、2'-メトキシ(2'-OCH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)および2'-フルオロ(2'-F）が含まれる。類似の改変は、iRNAのRNA上の他の位置、3'末端ヌクレオチド上または2'-5'連結dsRNA中の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位でも行うことができる。iRNAはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。改変糖構造の調製を教示している代表的な米国特許には非限定的に、米国特許第4,981,957号；同第5,118,800号；同第5,319,080号；同第5,359,044号；同第5,393,878号；同第5,446,137号；同第5,466,786号；同第5,514,785号；同第5,519,134号；同第5,567,811号；同第5,576,427号；同第5,591,722号；同第5,597,909号；同第5,610,300号；同第5,627,053号；同第5,639,873号；同第5,646,265号；同第5,658,873号；同第5,670,633号；および同第5,700,920号が含まれ、それらの中のいくつかは、本出願と同じ人の所有であり、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２５】
iRNAはまた、核酸塩基（当技術分野においてしばしば単に「塩基」と称される）の改変または置換を含むことができる。本明細書において使用される場合、「未改変」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。改変核酸塩基には、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザ（daaza）アデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されたもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されたこれら、およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されたものが含まれる。これらの核酸塩基の中のいくつかは、本発明において特徴とされるオリゴマー性化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6および0-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃だけ増加させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにいっそう詳細には2'-O-メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合、例示的な塩基置換である。
【０１２６】
上述の改変核酸塩基および他の改変核酸塩基の中のいくつかについての調製を教示している代表的な米国特許には、非限定的に、上述の米国特許第3,687,808号、ならびにそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,845,205号;同第5,130,30号；同第5,134,066号；同第5,175,273号；同第5,367,066号；同第5,432,272号；同第5,457,187号；同第5,459,255号；同第5,484,908号；同第5,502,177号；同第5,525,711号；同第5,552,540号；同第5,587,469号；同第5,594,121号、同第5,596,091号；同第5,614,617号；同第5,681,941号；同第6,015,886号；同第6,147,200号；同第6,166,197号；同第6,222,025号；同第6,235,887号；同第6,380,368号；同第6,528,640号；同第6,639,062号；同第6,617,438号；同第7,045,610号；同第7,427,672号；および同第7,495,088号、ならびに同様に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,750,692号が含まれる。
【０１２７】
iRNAのRNAは、1つまたは複数のロックド核酸（LNA）を含むように改変することもできる。ロックド核酸は、リボース部分が2'炭素と4'炭素を結合している余分な架橋を含む改変リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを3'-エンド構造コンフォメーションに効果的に「ロック」する。siRNAへのロックド核酸の付加は、血清中でのsiRNAの安定性を増加させ、オフターゲット効果を低下させることが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleid Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示している代表的な米国特許には、非限定的に、それぞれがその全体で参照により本明細書に組み入れられる以下が含まれる：米国特許第6,268,490号；同第6,670,461号；同第6,794,499号；同第6,998,484号；同第7,053,207号；同第7,084,125号；および同第7,399,845号。
【０１２８】
本発明において特徴とされるiRNAのRNAの別の改変は、活性、細胞分布、薬物動態特性、またはiRNAの細胞取り込みを増強する1つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートをRNAに化学的に連結することを伴う。そのような部分には、非限定的に、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、チオエーテル、例えばベリル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）のような脂質部分が含まれる。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「回復」という用語は、目的が疾患または障害、例えば癌に関連する状態の進行または重症度を逆転させること、緩和すること、回復すること、阻害すること、緩徐化すること、または停止することである治療的処置を表す。「処置すること」という用語は、癌に関連する状態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症候を軽減または緩和することを含む。処置は、一般的に、1つまたは複数の症候または臨床マーカーが軽減した場合は「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低下したかまたは休止した場合は「有効」である。すなわち、「処置」には、症候またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想される症候と比較した、症候の進行または悪化の一時停止または少なくとも緩徐化も含まれる。有益なまたは望ましい臨床結果には、非限定的に、検出可能であろうと検出不可能であろうと、1つもしくは複数の症候の緩和、疾患の程度の縮小、病状の安定化（すなわち悪化していない）状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、病状の回復もしくは好転、寛解（部分寛解もしくは全寛解）、および／または死亡率の減少が含まれる。疾患の「処置」という用語には、疾患の症候または副作用からの解放を提供することも含まれる（緩和処置を含む）。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば製薬工業において一般に使用される担体と組み合わせた活性物質を表す。「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適し、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を有さずに、合理的なリスク対便益比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を表す。
【０１３１】
本明細書において使用される場合、「投与すること」という用語は、所望の部位に少なくとも部分的な作用物質送達を招く方法または経路によって本明細書において開示される化合物を対象内に配置することを表す。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置を招く任意の適切な経路によって投与することができる。
【０１３２】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を表し、一般的に標準偏差の2倍（2SD）またはそれ以上の差を意味する。
【０１３３】
操作実施例または特に記載した場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表現する全ての数は、全ての場合に「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。パーセンテージと共に使用される場合の「約」という用語は、±1％を意味することができる。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、組成物、方法、その方法または組成物に不可欠なその各々の構成要素に関連して使用されるものの、不可欠であろうとなかろうと明示されていない要素の包含に対してオープンである。
【０１３５】
「からなる」という用語は、態様のその説明に挙げられていない、いかなる要素も排除する、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各々の構成要素を表す。
【０１３６】
本明細書において使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要な要素を表す。本用語は、その態様の基本的および新規または機能的な特徴に実質的に影響しない要素の存在を許容する。
【０１３７】
単数の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という用語は、特に文脈に明確に示されていない限り、複数への言及を含む。同様に、「または、もしくは」という語は、特に文脈に明確に示されていない限り、「および、ならびに」を含むことを意図する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の方法および材料を本開示の実行または検査に使用することができるものの、適切な方法および材料が下に記載される。略語「e.g.]は、ラテン語exempli gratia由来であり、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「e.g.」は、「例えば」という用語と同義である。
【０１３８】
細胞生物学および分子生物学における一般用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition（Merck Research Laboratories出版）2006(ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology（Blackwell Science Ltd出版）1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X（Jones & Bartlett Publishing出版）2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference（VCH Publishers, Inc.出版）1995 (ISBN 1-56081-569-8)およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsに見出すことができる。
【０１３９】
特に述べない限り、本発明は、例えば全てがそれらの全体で参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995);またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney、出版社: Wiley-Liss; 5th edition (2005)、Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)に記載の標準的な手順を用いて行われた。
【０１４０】
他の用語は、本明細書において本発明の様々な局面の説明の中で定義される。
【０１４１】
本出願全体を通して引用された参照文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む全ての特許および他の刊行物は、例えば本明細書に記載の技法に関連して用いられ得る、そのような刊行物に記載された方法論を説明および開示するために、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日前に、それらの開示について単に提供される。この点についていずれも、本発明者らが先行発明または任意の他の理由に基づいてこのような開示に先立つ権利がないという承認として解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表現に関する全ての陳述は、本出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についてのいかなる承認も構成するものではない。
【０１４２】
本開示の態様の説明は、網羅的であることも、開示された正確な形式に開示を限定することも意図しない。本開示の具体的な態様および実施例が例証のために本明細書に記載されるものの、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な等価の改変が可能である。例えば、方法の段階または機能が所与の順序で提示されるものの、代替的な態様が、異なる順序で機能を遂行する場合があり、または機能は、実質的に同時に遂行され得る。本明細書において提供される開示の教示は、適宜他の手順または方法に適用されることができる。本明細書に記載の様々な態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。開示の局面を必要に応じて改変して、上記参照および出願の組成、機能、および概念を用いて、本開示のなおさらなる態様を提供することができる。そのうえ、生物学的機能的等価性の考慮により、種類または量における生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質の構造に幾分の変化を加えることができる。詳細な説明に照らして本開示にこれらおよび他の変化を加えることができる。そのような改変は、全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１４３】
前記の態様のいずれかの具体的な要素を、他の態様における要素と組み合わせるまたは置換することができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点がこれらの態様に関連して記載されたものの、他の態様もそのような利点を示す場合があり、本開示の範囲内に入るために、全ての態様が必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０１４４】
本明細書において記載される技術は、以下の実施例によってさらに例証されるが、それらの実施例は、決してさらに限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４５】
本明細書において記載される技術の一部の態様は、以下の番号付き項目のいずれかにより定義することができる。
1. 癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階；および
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加していない場合に、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階
を含む、癌を処置する方法。
2. 対照レベルと比較して増加しているCTCクラスターのレベルを有すると判定された対象において、転移を防止するかまたは減らすための処置を行う段階
を含む、癌を処置する方法。
3. 対照レベルと比較して増加していないCTCクラスターのレベルを有すると判定された対象において、転移を防止するかまたは減らすための処置を行わない段階をさらに含む、項目2に記載の方法。
4. 前記癌が乳癌または上皮癌である、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
5. 前記転移を防止するかまたは減らすための処置が、
項目15〜19のいずれかに記載の方法；化学療法；放射線療法；または腫瘍の除去
からなる群より選択される、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
6. 処置を行わない段階が、治療的介入なしでモニタリングする臨床アプローチを含むことができる、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
7. 前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
項目1〜6のいずれかに記載の方法。
8. 前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、項目7に記載の方法。
9. 前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目7または8に記載の方法。
10. 前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目7〜9のいずれかに記載の方法。
11. 前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
12. 前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
13. 増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
14. 増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目1〜13のいずれかに記載の方法。
15. 表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、癌転移を処置する方法。
16. 前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階が、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与する段階を含む、項目15に記載の方法。
17. 前記阻害性核酸がsiRNAである、項目16に記載の方法。
18. 前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、項目15〜17のいずれかに記載の方法。
19. 前記癌が乳癌または上皮癌である、項目15〜18のいずれかに記載の方法。
20. 癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階
を含む、アッセイ法。
21. 前記癌が乳癌または上皮癌である、項目20に記載のアッセイ法。
22. 前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
項目20または21に記載のアッセイ法。
23. 前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、項目22に記載のアッセイ法。
24. 前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目20〜23のいずれかに記載のアッセイ法。
25. 前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目20〜24のいずれかに記載のアッセイ法。
26. 前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、項目20〜25のいずれか1に記載のアッセイ法。
27. 前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、項目20〜26のいずれかに記載のアッセイ法。
28. 増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目20〜27のいずれかに記載のアッセイ法。
29. 増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目20〜28のいずれかに記載のアッセイ法。
30.癌を有する対象から得られた試料中の末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを測定する段階；
該CTCクラスターのレベルが対照レベルと比較して増加している場合に、該癌の転移のリスクが増加していると該対象を判定する段階
を含む、対象の転移のリスクが増加しているかどうかを判定する方法。
31. 前記癌が乳癌または上皮癌である、項目30に記載の方法。
32. 前記CTCクラスターのレベルが、前記対象から得られた前記試料中のCTCクラスター（CTC-C）マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、
該CTC-Cマーカー遺伝子が、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子である、
項目30または31に記載の方法。
33. 前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、項目32に記載の方法。
34. 前記試料中の末梢循環腫瘍細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目30〜33のいずれかに記載の方法。
35. 前記対象から得られた癌細胞における前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルが測定される、項目30〜34のいずれかに記載の方法。
36. 前記CTCクラスターのレベルがHBCTC-チップを用いて測定される、項目30〜35のいずれかに記載の方法。
37. 前記対象が、癌のための処置を必要とする対象である、項目30〜36のいずれかに記載の方法。
38. 増加したCTCクラスターのレベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目30〜37のいずれかに記載の方法。
39. 増加したプラコグロビン発現レベルが、前記対照レベルより少なくとも1.5倍高いレベルである、項目30〜38のいずれかに記載の方法。
40. 癌を有する対象における末梢循環腫瘍細胞（CTC）クラスターのレベルを低下させる方法であって、表2、3、または4の一覧表より選択される遺伝子であるCTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階を含む、方法。
41. 前記CTC-Cマーカー遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる段階が、CTC-Cマーカー遺伝子阻害性核酸を投与する段階を含む、項目40に記載の方法。
42. 前記阻害性核酸がsiRNAである、項目41に記載の方法。
43. 前記CTC-Cマーカー遺伝子がプラコグロビンである、項目40〜42のいずれかに記載の方法。
44. 前記癌が乳癌または上皮癌である、項目40〜43のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０１４６】
実施例1：末梢循環腫瘍細胞クラスターは乳癌転移のオリゴクローナルな前駆体である
末梢循環腫瘍細胞のクラスター（CTC-クラスター）は、上皮癌を有する患者において観察されているが、転移過程に果たすそれらの役割は依然として分かりにくい。乳癌患者におけるCTC-クラスターの存在は、転移性の進行増加と直接相関することが本明細書において実証されている。マウスモデルにおいて、CTC-クラスターの転移能および単独CTCの転移能が評価され、CTC-クラスターの転移性が単独CTCの48.9倍であると判定された。そのうえ、生体内イメージングおよびインビボフローサイトメトリーを適合させて、CTC-クラスターが原発性腫瘍由来のオリゴクローナルなユニットであると、およびそれらが単独CTCよりも血流からのより速いクリアランス速度に関連すると判定された。乳癌患者において対応するCTC-クラスター対単独CTCのRNAシーケンシングから、CTC-クラスター関連転写物の同定が可能になった。これらのうち、細胞間接合部タンパク質であるプラコグロビンが、CTC-クラスター形成および乳癌の転移に必要なことが見出された。したがって、原発性腫瘍における高いプラコグロビン発現は、患者の無転移生存率の低下と関連する。要約すれば、本明細書に記載のデータは、CTC-クラスターがオリゴクローナルな転移前駆体であること、およびプラコグロビン阻害を介したそれらの破壊が、乳癌の転移拡散を減少させることを示している。
【０１４７】
緒言
乳癌は、骨、肺、肝臓および脳などの重要器官への転移で頂点に達する不均一な疾患であり、一般的に、転移は、圧倒的多数の癌関連死の原因となる（1）。血行性転移の現行モデルは、血流中への単独の原発性腫瘍細胞の血管内侵入から始まり、循環中での生存、遠隔部位への血管外漏出および定着の連続段階に基づく（2）。末梢循環腫瘍細胞（CTC）は、多数の上皮癌で検出されており（3）、癌における初期の播種事象を理解するための鍵を握っている。興味深いことに、CTCの数は患者における転移性病変の数を大きく上回り、CTC間で細胞階層を示しており、大部分のCTCが血流中で死滅する可能性が高く、わずかな割合だけが生存可能な転移性前駆細胞に相当することを示している。乳房CTC内の転移性プールの同定およびその分子的特徴決定は、本発明者らの乳癌の転移の理解力を磨く潜在性があり、転移性ヒト腫瘍を処置するための新薬を開発させることができる。
【０１４８】
本発明者らによる最近の驚くべき観察は、癌を有する患者の循環中からCTCのクラスター（CTC-クラスター）が同定されたことであった（4、5）。本明細書において、乳癌患者の試料、マウスモデルおよび次世代シーケンシングの組み合わせを用いて、乳房CTC-クラスターが、乳房CTC内の転移性前駆細胞集団を大いに代表すること、およびCTC-クラスターの破壊が転移拡散の減少と関連することが実証される。
【０１４９】
結果
患者におけるCTC-クラスターの存在は転移進行と相関する。乳癌の転移および疾患進行に果たすCTC-クラスターの役割は、以前に研究されていなかった。本明細書において、複数の時点（データポイント合計265個に対応）の間に乳癌患者79人の血液から単独CTCおよびCTC-クラスターを捕捉および計数するためにマイクロ流体ヘリンボーン（HB）CTC-チップ（4）を使用した。乳房CTCの捕捉は、EpCAM、上皮成長因子受容体（EGFR）およびヒト上皮成長因子受容体2（HER2）に対する抗体カクテルを用いて達成した。次に、抗広域スペクトルサイトケラチン（CK）を用いてチップを染色してCTCを同定し、抗CD45を用いて白血球（WBC）の混入を評価した（データは示さず）。最初に、患者79人のうち54人からCTCを同定した（図1A）。第二に、CTC陽性患者54人中7人が、複数の時点にわたる高計数のCTC-クラスターの存在を特徴としていることを観察した（図1A）。残りの患者47人は、1つの時点のみにCTC-クラスターが存在するか、または全ての時点にわたりCTC-クラスターが全く非存在であるかのいずれかを特徴としていた（図1A）。
【０１５０】
無増悪生存期間（PFS）のデータを、CTC計数のために考慮された時間枠内で疾患が進行した患者について得た（表1）。CTC-クラスターが豊富な患者は、単独CTCが豊富な患者よりも迅速に転移へ進行することが見出された（平均無増悪生存期間は、CTC-クラスターが豊富な患者について76.1日であり、単独CTCが豊富な患者について160.6日であった）（図1Bおよび（表1）。これらの結果は、乳癌患者においてCTC-クラスターの存在がより速い転移拡散および疾患進行に関連することを示している。
【０１５１】
CTC-クラスターは単独CTCと比較して増加した転移能を有する。乳癌マウスモデルを用いて、単独CTCおよびCTC-クラスターの両方の転移能を精査および定量した。このために、MDA-MB-231細胞の肺転移変異体（LM2）をGFP-ルシフェラーゼで標識したものの単層培養から開始して、単独細胞の懸濁物およびクラスター化した細胞（細胞2から約30個の範囲のクラスター）の懸濁物を生成させるインビトロアッセイ法を開発した（6）。第二に、単独細胞（LM2-SC）またはクラスター（LM2-CL）として調製されたLM2細胞200,000個を免疫欠損マウスの尾静脈に注射した。興味深いことに、LM2-SCおよびLM2-CLの両方が等しい効率で肺に到達した（0日目）（データは示さず）。しかし、LM2-SCは、注射されると肺において大規模なアポトーシスを受けたのに対して、LM2-CLは、アポトーシスに対する有意に高い抵抗性およびより速い成長速度を示した（データは示さず、ならびに図2Aおよび6A）。加えて、LM2-CLを注射されたマウスは、全生存率が低下した（平均生存期間は、LM2-CLマウス＝12.7週間に対してLM2-SCマウス＝15.7週間）（図6B）。
【０１５２】
より大きく臨床的に関連する設定では、同所性異種移植モデルを用いて、腫瘍由来乳房CTC-クラスターおよび単独CTCの転移能を定量した。第一に、緑色蛍光タンパク質（LM2-GFP）またはmCherry（LM2-mCherry）のいずれかを発現するようにLM2細胞を遺伝子操作した。次に、LM2-GFP細胞とLM2-mCherry細胞を1：1に混合し、免疫欠損マウスの乳房脂肪パッド内に注射した。腫瘍が発生した場合に、単独CTCおよび単独CTCに由来する転移は、GFP陽性またはmCherry陽性のいずれかであると推論された。対照的に、CTC-クラスターおよびCTC-クラスターに由来する転移は、GFP陽性LM2細胞およびmCherry陽性LM2細胞の両方によって形成される。原発性乳房腫瘍の形成から5週間で、LM2-GFP細胞およびLM2-mCherry細胞が原発性腫瘍部位において1：1の分布を保持したことが免疫組織化学（IHC）染色によって確認された（データは示さず）。単独CTCおよびCTC-クラスターを抗EpCAM抗体および抗EGFR抗体で機能付与されたHB-CTCチップを用いて、捕捉および定量した。同時に、マウスの肺を抗GFP抗体および抗mCherry抗体で染色し、GFP陽性またはmCherry陽性の病巣数（単独CTC由来）およびGFPおよびmCherry陽性の病巣数（CTC-クラスター由来）を定量した（データは示さず）。マウス1匹あたり平均2,486個のCTCを観察し、そのうち2.4％が多色CTC-クラスターであった（図2B）。著しくは、マウス1匹あたり平均323個の肺病巣を計数し、そのうち52.9％がCTC-クラスター由来であった（図2B）。単独CTCおよびCTC-クラスターの数で肺転移データを正規化し、LM2異種移植モデルにおいてCTC-クラスターが単独CTCの48.9倍転移性が高いと結論した（図2C）。
【０１５３】
CTC-クラスターは、血流からの高いクリアランス速度に関連する、原発性腫瘍由来のオリゴクローナルなユニットである。マウス同所性異種移植モデルにおけるCTC-クラスターの多色性は、CTC-クラスターが不均一なユニットであり、増殖中の単独CTCに由来しないことを示している（データは示さず）。しかし、下記：(a）単独CTCが複数凝集することで、CTC-クラスターが循環中で形成されること；および(b）CTC-クラスターがHB-CTCチップのアーチファクトであることを除外するために、LM2-GFP細胞とLM2-mCherry細胞との1：1混合物を注射されたマウスにおける原発性腫瘍部位の生体内イメージングを行った（上記）。同所性注射の5週間後に、原発性腫瘍塊に隣接する流出血管をイメージングしたが、流出血管では、初期の血管内侵入事象を観察することができ、血管内侵入部位と焦点面の間の距離が非常に短いため、単独CTCが循環中で凝集する可能性が最も低い。著しくは、生きた動物において多色CTC-クラスターが初期に血管内侵入する多数の事象および複数の単独CTCを検出した（データは示さず）。
【０１５４】
次に、それらのオリゴクローン性を考えると、CTC-クラスターは、小さな毛細血管（例えば肺の毛細血管）内で捕らえられる可能性が単独CTCよりも高く、したがって血流からのクリアランス速度がより速いことに関連すると推論した。インビボフローサイトメトリー（IVFC）を用いて、免疫欠損マウスの尾静脈に注射されたLM2-SCまたはLM2-CLのクリアランス速度を測定した。特に、各マウスにおいて循環しているDiD標識LM2-SCまたはLM2-CLを耳血管からリアルタイムで合計55分間検出した。LM2-CLはLM-SCよりも速く浄化されることが見出されたが、これは、凝集した細胞の方が小さな毛細血管中に捕らえられる可能性が高いことを示唆している（図3）。まとめると、これらの結果は、CTC-クラスターが原発性腫瘍由来のオリゴクローナルなユニットであること、ならびにそれらが血流からのより速いクリアランス速度および小さな毛細血管中に捕らえられる傾向と関連することを示している。
【０１５５】
乳癌患者由来の対応するCTC-クラスターおよび単独CTCのRNAシーケンシングによりCTC-クラスター関連遺伝子が明らかとなる。CTC-クラスターが単独CTCよりも高い転移能を保持するという本明細書に記載の知見を考えると、同じ患者からの対応する単独CTCと比較して、CTC-クラスターでは特異的遺伝子セットが高度に発現されたかどうかを問うた。このために、転移性疾患を有する乳癌患者10人から血液標本を収集し、本発明者らが最近開発した抗原非依存的negCTC-iチップを用いてCTC濃縮生成物を得た（7）。特に、negCTC-iチップは、サイズに基づく流体力学的選別によって血液試料から赤血球（RBC）、血小板および血漿タンパク質を枯渇させ、続いてCD45抗原およびCD66b抗原の両方の免疫磁気標的化によって白血球を枯渇させる（7）。次に、a）CTCに対する抗体である、Alexa488蛍光団コンジュゲーション型の抗EpCAM、抗EGFR、抗HER2、抗CDH11および抗METならびにb）白血球（WBC）に対する抗体である、テキサスレッド蛍光団コンジュゲーション型の抗CD45、抗CD14および抗CD16を用いて、結果として生じたCTC濃縮溶液に生細胞染色を行った（図4A）。この手順により、混入物WBC（赤に標識）および赤血球（RBC、未標識）に対して単独CTCおよびCTC-クラスター（緑に標識）の同定が可能になった（データは示さず）。マイクロマニピュレーターを用いて、各試料について単独CTCをCTC-クラスターに対して個別に単離し、CTC由来RNAをRNAシーケンシングに供した。乳癌患者10人から得られた合計29個の試料（単独CTCのプール15個およびCTC-クラスター14個）について正規化発現プロファイルを得た。RNAレベルで混入物であるWBCのマーカーの高発現を示した試料を分析から除外した。教師なし階層的クラスタリングによると、単独CTC試料とCTC-クラスター試料との間で大域的な遺伝子発現レベルに明らかな差異は示されなかった（図4Bおよび7）が、このことは、患者間の差がCTC-クラスターと単独CTCとの間の患者内遺伝子発現の変化に打ち勝っていたことを示していた。
【０１５６】
各患者について、各CTC-クラスター試料に対する各単独CTC試料の遺伝子発現データを比較して、CTC-クラスター関連遺伝子31種の一覧表を作成した（患者内比較の70％超でq＜0.01、log2FC＞1）（図4Cおよび9）。CTC-クラスターにおいて上方制御された転写物の上位の中に、アルマジロファミリータンパク質の一メンバーであり、かつデスモソームおよび接着結合の重要な構成要素であるプラコグロビンがあった（JUP）（図4C、4D、および9）（8-10）。以前に、プラコグロビンは、悪性腫瘍に対してプラスの役割とマイナスの役割の両方を果たすことが示されている。例えば、形質転換ラット腎臓上皮細胞におけるプラコグロビンの過剰発現は、調節されない成長、病巣形成およびc-Myc活性化を促進する（11）。ヒト扁平上皮癌細胞において、プラコグロビンは、生存促進遺伝子Bcl-2の活性化を介してアポトーシスの阻害、調節されない成長および病巣形成を引き起こすことが示された（12）。それに応じて、プラコグロビンの突然変異が、ホルモン不応性前立腺癌で報告されており、これらは、プラコグロビンの核内蓄積およびBcl-2の発現増加と同時に発生する（13）。しかし、限局性前立腺癌では、プラコグロビンプロモーターのヘテロ接合性の喪失および過剰メチル化が報告されている（13）。プラコグロビンの発現が、転移性疾患を有する患者由来の乳房CTC-クラスターにおいてタンパク質レベルで確認された（データは示さず）。これらの結果は、単独CTCと比較した場合に、乳房CTC-クラスターが遺伝子のサブセットの上方制御を特徴とすること、およびプラコグロビンのような細胞間接合部タンパク質がそれらの形成および維持に関与することを示している。
【０１５７】
プラコグロビンはCTC-クラスター形成および乳癌転移に必要である。乳癌患者の原発性乳房腫瘍生検および骨転移生検におけるプラコグロビン発現レベルを、高いCTC-クラスター計数と対応付けて評価した。詳細には、プラコグロビンの染色を内皮細胞マーカーCD31と組み合わせて、プラコグロビンの高発現が血管の近くで起こったかどうかを検討した。「高プラコグロビン」領域と「低プラコグロビン」領域の両方が血管の隣に局在して、原発性腫瘍細胞は、種々のレベルでプラコグロビンを発現することが見出された（データは示さず）。それに一致して、「高プラコグロビン」発現細胞と「低プラコグロビン」発現細胞の両方が転移病巣において観察されたが（データは示さず）、これは、原発性腫瘍においてCTC-クラスターが「高プラコグロビン」領域から生じ、循環している間に高レベルのプラコグロビンを発現し、転移部位でその発現を保持している可能性があることを示している。
【０１５８】
非形質転換ヒト乳房上皮細胞（HMECおよびMCF10A）ならびにヒト乳癌細胞（MDA-MB-231-LM2、BT474、MCF7、T47D、BT549、BT20およびZR-75-1）のパネルにおける細胞間接着のためのプラコグロビンの必要性を判定した。全ての細胞系にプラコグロビンshRNA（プラコグロビンsh1およびsh2）をレンチウイルスでトランスダクションすることによって安定的なプラコグロビンのノックダウンを達成した（図8A）。Vybrant（商標）細胞間接着アッセイ法を行い、細胞間接着のためのプラコグロビンの必要性は、正常な乳房細胞よりも乳癌細胞の方が高いことが観察された（図5A）。そのうえ、単層培養物においてプラコグロビンをノックダウンすると、非形質転換乳房上皮細胞ではなく、乳癌細胞で細胞コロニーの破壊が観察されたが（データは示さず）、これは、非腫瘍性細胞が細胞間接着メカニズムを追加的な／異なるサブセットの遺伝子に依存し得るという仮説を支持している（14、15）。
【０１５９】
対照shRNAまたはプラコグロビンshRNAを発現しているLM2-ルシフェラーゼ細胞を免疫欠損マウスの乳房脂肪パッド内に注射し、腫瘍の成長およびCTCの存在度を測定した。プラコグロビンを30日間ノックダウンしても、腫瘍の成長速度も（図5Bおよび8B）、原発性腫瘍由来の単独CTCの総数も変化しなかった（図5C）。しかし、腫瘍由来CTC-クラスターの数は、対照マウスと比較してLM2-プラコグロビンshRNA担腫瘍マウスにおいて有意に減少した（図5Cおよび8B）。並行して、マウス肺の生物ルミネセンスイメージングを行い、プラコグロビンのノックダウンがLM2腫瘍の転移能を低下させたことが観察された。詳細には、LM2-プラコグロビンshRNA担腫瘍マウスにおいて転移性肺腫瘍量の約80％の低下が観察された（図5D）。最後に、プラコグロビンレベルがCTC-クラスターの形成および転移に重要な役割を果たす可能性があるという観察を考慮して、乳癌患者1353人のコホートにおいて、患者の原発性腫瘍におけるプラコグロビン発現レベルに応じて「低プラコグロビン」および「高プラコグロビン」に分類し、無遠隔転移生存期間を評価した。原発性腫瘍が高レベルのプラコグロビンを発現していた患者は、「低プラコグロビン」の相手方よりも速い疾患進行に関連したことが見い出された（図5E）。
【０１６０】
これらのデータは、原発性腫瘍内の「高プラコグロビン」領域が血流中にオリゴクローナルCTC-クラスターを脱落させる可能性があることを示している（図5F）。したがって、乳癌動物モデルにおいて、プラコグロビン枯渇による腫瘍由来CTC-クラスターの破壊は、転移性腫瘍量を減少させる。要約すれば、CTC-クラスターがCTC内の高転移性集団に相当すること、およびCTC-クラスターの標的化が乳癌の転移拡散を減少させるために有効であり得ることが本明細書において実証されている。
【０１６１】
考察
異なる起源の癌を有する患者からCTC-クラスターが観察されているものの（4、16）、転移過程へのそれらの寄与は、これまでに検討されなかった。本研究において、患者における乳房CTC-クラスターの存在が無増悪生存期間の減少と相関すること、およびCTC-クラスターがCTC内の高転移性集団に相当することが実証されている。そのうえ、CTC-クラスターは、見たところオリゴクローナルな性質であり、かつ細胞間接合メディエーターであるプラコグロビンの高発現を特徴とする原発性腫瘍領域から生じたと考えられる。動物モデルにおいて、原発性腫瘍におけるプラコグロビンのノックダウンは、腫瘍由来CTC-クラスター数および肺転移を減少させる。
【０１６２】
本明細書において記載されるRNAシーケンシングデータから、プラコグロビンを含むCTC-クラスター関連転写物のセットの同定に至った。CTC-クラスター形成へのプラコグロビンの寄与を解明した。
【０１６３】
乳房CTC-クラスターのオリゴクローナル性は、乳癌を有する患者において運動性の単独CTCの「能動的」転移メカニズムに加えて、「受動的」転移プログラムが関連する可能性があることを強調している。プラコグロビンのような細胞間接合部タンパク質を高発現する、原発性腫瘍内の区域は、腫瘍塞栓が血流内に侵入する見込みを高め得る。そのため、CTC-クラスターは、(a）循環している間に高いプラコグロビン発現を保持し、(b）小さな血管中に捕らえられ、単独CTCよりも速い速度で循環から浄化される可能性が高く、(c）肺、骨、肝臓および／または他の転移部位のような異質な環境によって誘導されるアポトーシスストレスに対する抵抗性がより高い。
【０１６４】
CTC-クラスターが乳癌におけるオリゴクローナル転移性前駆体であり、プラコグロビンのノックダウンを介したCTC-クラスターの破壊が乳癌の転移拡散を減少させる証拠を、本明細書において記載する。CTC-クラスターならびに細胞間接合および転移能を持続させるそれらのシグナル伝達メカニズムの臨床的関連性によって、転移性乳房腫瘍の処置のための新規な治療標的が可能になる。
【０１６５】
方法
末梢循環腫瘍細胞の捕捉および同定。Massachusetts General HospitalでIRBのプロトコール（05-300）により患者にインフォームドコンセントを行った後に、CTC分析用の血液標本を得た。血液最大20mlをEDTAバキュテナー中に採取した。採血から4時間以内に血液約3mlをHB-CTC-チップにより処理するか、または血液6〜12mlをCTC-iチップにより処理した。マウス研究のために、血液を心臓穿刺により回収し、血液約1mlをHB-CTC-チップにより処理した。
【０１６６】
HB-CTC-チップをMassachusetts General Hospital Cancer Center/ BioMEMS Resource Facilityの現場で製造した。以前に記載されたように（5）、それぞれ10μg/mlのビオチン化抗体抗EpCAM（R&D Systems）、抗EGFR（セツキシマブ、Lilly）および抗HER2（R&D Systems）のカクテルを用いてチップを機能付加した。HB-CTC-チップ上に捕捉された細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した。次に、固定された細胞をPBS中の1％NP40で透過処理し、3％ヤギ血清／2％BSAでブロッキングし、抗広域スペクトルサイトケラチン（Abcam）、抗CD-45（Abcam）、抗プラコグロビン（Sigma Aldrich）およびDAPIで免疫染色した。あるいは、GFPまたはmCherryを発現している捕捉された細胞をPBSで洗浄し、直接イメージングした。BioView Ltd.自動イメージングシステム（Billerica, MA）を使用して染色陽性細胞をスクリーニングした。正立蛍光顕微鏡（Eclipse 90i, Nikon, Melville, NY）を用いて高解像度の像を得た。
【０１６７】
以前に記載されたようにCTC-iチップを設計および製作した（7）。処理前に、全血試料をビオチン化抗体抗CD45（R&D Systems）および抗CD66b（AbD Serotec、社内でビオチン化）に曝露し、次にDynabeads（登録商標）MyOne（商標）ストレプトアビジンT1（Invitrogen）と共にインキュベーションして白血球の磁気標識および枯渇を達成した（7）。Alexa488コンジュゲーション型抗体である抗EpCAM（Cell Signaling Technology）、抗EGFR（Cell Signaling Technology）、抗Met（Cell Signaling Technology）、抗カドヘリン11（R&D Systems）および抗HER2（Biolegend）を有する溶液中で、CTC濃縮生成物を染色してCTCを同定し、同様にテキサスレッドコンジュゲーション型抗体である抗CD45（BD Biosciences）、抗CD14（BD Biosciences）および抗CD16（BD Biosciences）を用いて、混入している白血球を同定した。
【０１６８】
無転移生存期間および全生存期間の評価。Massachusetts General Hospitalの患者からの臨床データに基づくカプラン-マイヤー生存曲線をXLStat（商標）ソフトウェア（Addinsoft）で作成した。乳癌患者における「高プラコグロビン（Plakoglogin）」に対する「低プラコグロビン」無遠隔転移生存期間のために、本発明者らは、KMプロットリソースを使用した（World Wide Web上のwww.kmplot.comから入手可能）（17）。
【０１６９】
単一細胞顕微操作。CTC濃縮産物を35mmペトリ皿中に収集し、Nikon Eclipse Ti（商標）倒立蛍光顕微鏡を用いて注意深く見た。無傷の細胞形態、Alexa488陽性染色およびテキサスレッド染色の欠如に基づき、単独CTCおよびCTC-クラスターを同定した。Eppendorf TransferMan（登録商標）NK2マイクロマニピュレーター上の10μm移送チップを用いて、標的細胞を個別に顕微操作し、RNA保護溶解緩衝液（10×PCR緩衝液II、25mM MgCl2、10％NP40、0.1M DTT、SUPERase-In、Rnアーゼ阻害物質、0.5uM UP1プライマー、10mM dNTPおよびヌクレアーゼ不含水）が入ったPCRチューブ中に放出し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。
【０１７０】
単一細胞の増幅およびシーケンシング。CTCから抽出されたRNA試料を氷上で解凍し、70℃で90秒間インキュベーションした。cDNAを産生するために、試料を逆転写マスターミックス（1×体積あたりRNアーゼ阻害物質0.05uL、T4遺伝子32タンパク質0.07uL、およびSuperScript III逆転写酵素0.33uL）で処理し、サーモサイクラー上で50℃において30分間および70℃で15分間インキュベーションした。遊離のプライマーを除去するために、EXOSAPミックス1.0uLを各試料に添加し、それを37℃で30分間インキュベーションし、80℃で25分間不活性化した。次に、マスターミックス（1×体積あたり10×PCR緩衝液II 0.6uL 、25mM MgCl2 0.36uL、100mM dATP 0.18uL、ターミナルトランスフェラーゼ 0.3uL、RNアーゼH 0.3uL、およびH2O 4.26uL）中に入れて37℃で15分間インキュベーションし、70℃で10分間不活性化することによって、各試料中のcDNAに3'-ポリA尾部を付加した。各試料を4つに分割し、マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液2.2uL、2.5mMの各dNTP 1.76uL、100uM UP2プライマー 0.066uL、50mM MgSO4 0.88uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ0.44uL、およびH2O 13.654uL）中に入れて95℃で3分間、50℃で2分間、および72℃で10分間インキュベーションすることによって第2鎖cDNAを合成した。マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液 4.1uL、50mM MgSO4 1.64uL、2.5mMの各dNTP 4.1uL、100uM AUP1プライマー 0.82uL、100uM AUP2プライマー 0.82uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ 0.82uL、およびH2O 6.7uL）を用いてPCR増幅（95℃で3分間、次に95℃で30秒間、67℃で1分間、および72℃で6分6秒間を20サイクル）を行った。各試料の4回の反応物をプールし、QIAGEN PCR Purification Kit（商標）（Cat. No 28106）を使用して精製し、EB緩衝液50uL中に溶離させた。qPCRを用いて遺伝子Gapdh、ActB、Ptprc（CD45）、Krt8、Krt18、Krt19、およびPdx1について検査することによって試料を選択した。各試料を再度4つに分割し、マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液 9uL、50mM MgSO4 3.6uL、2.5mMの各dNTP 13.5uL、100uM AUP1プライマー0.9uL、100uM AUP2プライマー0.9uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ1.8uL、およびH2O 59.1uL）を用いて、第2ラウンドのPCR増幅（98℃で3分間、67℃で1分間、および72℃で6分6秒間を9サイクル）を行った。試料をプールし、Agencourt AMPure XP（商標）ビーズを用いて精製し、1×low TE緩衝液40uL中に溶離させた。
【０１７１】
シーケンシングライブラリーの構築。Covaris S2（商標）システムを用いてDNAを剪断するために、1×low TE緩衝液および剪断緩衝液1.2uLを各試料に添加した。剪断プログラムの条件は。6サイクル、浴温度5℃、浴温度限界15℃、デューティサイクル10％、強度5、100サイクル／バースト、および60秒間を含む。次に、マスターミックス（1×体積あたり5×反応緩衝液40uL、10mM dNTP 8uL、末端ポリッシング酵素1 8uL、末端ポリッシング酵素2 10uL、およびH2O 14uL）を用いて室温で30分間試料を末端ポリッシングした。Agencourt AMPure XP（商標）ビーズ0.5×体積を用いて500bpよりも大きなDNA断片を除去した。上清を別々のチューブに移した。200〜500bpのDNA産物をサイズ選択するために、0.3×体積のビーズを添加し、試料を70％ EtOHで2回洗浄した。low TE緩衝液36uL中に生成物を溶離させた。マスターミックス（1×体積あたり5×反応緩衝液10uL、10mM dATP 1uL、およびA-テーリング酵素I 5uL）で処理することによって、サイズ選択された各DNAにdA尾部を付加し、68℃で30分間インキュベーションし、室温に冷却した。シーケンシング用の各DNA試料を標識および識別するために、5500 SOLiD Fragment Library Enzyme Module（4464413）を使用してバーコードアダプター（5500 SOLiD 4464405）をDNAに連結した。バーコードを付けた後に、Agencourt AMPure XP（商標）ビーズを用いて試料を2回精製し、low TE緩衝液22uL中に溶離させた。1ラウンドのPCR増幅（95℃で5分間の次に、95℃で15秒間、62℃で15秒間、および70℃で1分間を12サイクル、次に70℃で5分間）の後に、AMPure XP（商標）ビーズを用いてライブラリーを精製した。最終的に、連結されたDNAの量を定量するために、SOLiD（商標）Library TaqMan（商標）定量キットを使用してqPCRを行った。次に、完成したバーコード付きライブラリーを、テンプレートビーズ調製物を用いたエマルションPCRに供し、ABI 5500XL（商標）でシーケンシングした。
【０１７２】
シーケンシングデータの解析。100万あたりのリード数（rpm）の判定：no-novel-juncs引数セットと共にtophatおよびbowtie1を使用して、カラースペースのリードを、World Wide Web上のgenome.ucsc.eduにあるhg19 knownGeneテーブルによって定義されたヒトゲノムバージョンhg19およびトランスクリプトームと整列させた。整列しなかったリードまたはゲノム中の複数の位置に整列したリードを放棄した。genome.ucsc.eduからのhg19テーブルknownToLocusLinkを使用して、可能であれば、遺伝子のエクソンに対してリードが整列された、該遺伝子に対して整列された各リードをマッピングした。各遺伝子に対するリード数は、その遺伝子に対してマッピングされたリードの数であった。任意の遺伝子に対してマッピングされたリードの総数でこの数を割り、100万倍にして100万あたりのリード（rpm）数を形成させた。アライメントが3'に偏っているため、rpkmよりもむしろrpmを使用した。
【０１７３】
クラスタリング：最小1の、rpm行列の最も小さな正の数をrpm行列に加算して0を除去した。次に結果を対数変換した。次に結果にメディアンポリッシュ（median polish）を行った。上位2000の標準偏差と共に行（遺伝子に対応する）を保持し、行の残りを捨てた。1からPearson相関係数を差し引いた値に等しい距離尺度を用いた平均連結法で凝集型階層的クラスタリングを使用して、結果をクラスタリングした。
【０１７４】
教師つき差次的遺伝子発現：同じ患者からの良質な単独細胞とクラスター試料との各対について、Bioconductor DEGseq（商標）パッケージ（18）バージョン1.10.0のDEGexp関数を使用して、「MARS」に設定されたメソッドおよびBenjamini-Hochbergを使用して算出されたq値を用いて、FDRのq値および正規化変化倍率を算出した。各対および方向について（例えば、単独細胞に対して上方向のクラスター）、そのq値が0.01未満でその変化倍率が2を超えた場合には遺伝子をヒットと見なした。次に、各方向について、対の70％またはそれ以上についてヒットであった遺伝子を考慮した。
【０１７５】
マウス実験。施設内のガイドラインを遵守して全てのマウス実験を行った。尾静脈実験について、NOD SCIDガンマ（NSG）マウス（Jackson Labs）にLM2細胞2×105個を注射し、IVIS（登録商標）Lumina II（商標）（Caliper LifeSciences）でモニタリングした。CTC-クラスターの転移能評価および生体内イメージングのために、LM2-GFP細胞2×106個およびLM2-mCherry細胞2×106個を1：1混合し、PBS中のフェノールレッド不含50％基底膜マトリックス（BD Biosciences）100μl中に懸濁し、NSGマウスに同所性注射した。腫瘍発生の5週間後に生体内イメージングおよびCTC数測定（enumeration）のための採血を行った。プラコグロビンノックダウン実験のために、PBS中のフェノールレッド不含50％基底膜マトリックス100μl中にLM2-CTRLまたはLM2-プラコグロビンshRNA細胞1×106個を懸濁し、NSGマウスに同所性注射した。CTC数測定用および肺転移の分析用の採血を腫瘍発生の4週間後に行った。
【０１７６】
生体内イメージングおよびインビボフローサイトメトリー。生体内イメージングのために、マウスを1.3％イソフルランで麻酔し、乳房腫瘍を外科的に露出させて視覚アクセスを提供した。マウスをモーター駆動ステージに載せ、腫瘍部位に2％メトセルロース（Methocel 2％, OmniVision）を#1カバーガラスと共に適用した。原発性腫瘍のすぐ隣および原発性腫瘍内の排出血管をビデオレート共焦点顕微鏡でスキャンした（19）。イメージングに適切な位置を判定し、ビデオレートムービーを記録した。GFPおよびmCherryタンパク質をそれぞれ491nmおよび561nmのレーザーで励起し、共焦点ピンホールならびにそれぞれ528±18nmおよび593±20nm帯域フィルターを備える光電子増倍管（R3896, Hamamatsu Photonics）によって蛍光を検出した（19）。635nmレーザーおよび第3の光電子増倍管を使用して共焦点反射チャンネルも記録した。反射チャンネルは、外因性造影剤の導入なしに、流れている血管を描写させた。
【０１７７】
インビボフローサイトメトリーのために、DiD標識LM2細胞を静脈内に養子移入し、末梢循環中から検出した（20）。DiDを635nmレーザーによって励起させ、光電子増倍管を使用して695±27.5nm帯域フィルターで検出した。LM2-SCおよびLM2-CLについての循環動態を、MATLAB（商標）（Mathworks）を用いて定量した。
【０１７８】
免疫組織化学。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したマウス原発性LM2腫瘍および肺転移、ならびにヒト原発性腫瘍および対応する転移性病変を切片にし、抗体である抗切断されたカスパーゼ3（Cell Signaling Technology）、抗GFP（Cell signaling Technology）、抗mCherry（Abcam）、抗プラコグロビン（Sigma Aldrich）および抗CD31（Abcam）を用いて4℃で一晩染色した。GFP／mCherryおよびプラコグロビン／CD31の二重染色を、EnVision（商標）G／2二重染色システム（Dako）を用いて行った。全ての標本をヘマトキシリン（Hematoxilyin）で対比染色した。全組織の画像をScanScope（商標）（Aperio）で取得した。
【０１７９】
細胞培養および試薬。HMEC、MCF10A、BT474、MCF7、T47D、BT549、BT20およびZR-75-1細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、製造業者の説明書に準じて増殖させた。10％ウシ胎仔血清（Life Technologies）を補充したDMEM（Life Technologies）中でMDA-MB-231 LM2細胞を増殖させた。尾静脈注射用の単独LM2細胞（LM2-SC）またはLM2クラスター（LM2-CL）を産生させるために、集密度80％で単層成長しているLM2細胞をトリプシン（Life Technologies）と共に1分間インキュベーションして、浮遊LM2-CLを産生させた。次に、LM2-CLを2つの別々のディッシュの中に等しく配分した。2つのディッシュの一方の中で、ピペッティングによりLM2-CLを機械的に解離させて、LM2-SC2の単独細胞懸濁液を産生させた。
【０１８０】
Vybrant（登録商標）細胞間接着アッセイキット（Invitrogen）を用いて製造業者の説明書に準じて細胞間接着アッセイ法を行った。
【０１８１】
GFP-ルシフェラーゼ発現性プラスミドをC. Ponzetto（University of Torino, Italy）から得た。mCherryを発現しているプラスミドをAddgeneから購入した。プラコグロビンTRC shRNAをThermo Scientificから購入した。レンチウイルスパッケージングベクター（Addgene）を使用して293T細胞（ATCC）をトランスフェクションし、レンチウイルス粒子を産生させた。標的細胞系の感染は、8μg/mlポリブレン（Thermo Scientific）を含有する成長培地中に入れてMOI＝10で一晩行った。
【０１８２】
（表１）単独CTCが豊富な乳癌患者およびCTC-クラスターが豊富な乳癌患者に関する無増悪生存期間、年齢、腫瘍サブタイプ、および突然変異状態
2016536303.tif 000006
【０１８３】
参照文献
2016536303.tif 000007
2016536303.tif 000008
2016536303.tif 000009
【０１８４】
実施例2
デスモソームおよび接着結合の遺伝子は、例えばCTC細胞と比較してCTC-C細胞において上方制御されている（図10A〜10D）。
【０１８５】
実施例3：末梢循環腫瘍細胞クラスターは乳癌転移のオリゴクローナルな前駆体である
要約
末梢循環腫瘍細胞クラスター（CTCクラスター）は、癌を有する患者の血液中に存在するが、それらの転移への寄与は、詳細には明らかにされていない。タグ付き乳房腫瘍を有するマウスモデルを使用して、CTCクラスターが、血管内凝集事象ではなく、オリゴクローナルな腫瘍細胞のグループ化から生じることが本明細書において実証されている。単独CTCと比較して循環中に低頻度であるものの、CTCクラスターは23〜50倍高い転移能を有する。乳癌を有する患者において、個別の血液試料内で対応付けられたCTCクラスターおよび単独CTCの1細胞解像度RNAシーケンシングから、細胞接合部構成要素であるプラコグロビンが高度に差次的に発現されていることが特定される。マウスモデルでは、プラコグロビンのノックダウンはCTCクラスターの形成を打ち消し、肺転移を抑制する。乳癌患者では、CTCクラスターの存在度および高い腫瘍プラコグロビンレベルの両方が、有害転帰を意味する。したがって、CTCクラスターは、プラコグロビン依存性細胞間接着により一緒に繋がり合った原発性腫瘍細胞の多細胞性グループ化に由来し、それらは、低頻度であるものの、癌の転移拡散に大きく寄与する。
【０１８６】
緒言
典型的には骨、肺、肝臓、および脳への乳癌の転移拡散は、圧倒的多数の癌関連死の原因となる（Nguyen et al., 2009）。本発明者らの上皮癌転移の理解は、主にマウスモデルから得られたものであり、原発性腫瘍内で個別細胞の上皮-間葉転換（EMT）が起こり、それらの細胞の血流内侵入に至り、血流内でのそのような末梢循環腫瘍細胞（CTC）が生存し、最終的にそれらが遠隔部位で血管外漏出し、そこで間葉-上皮転換（MET）が起こり、その結果、それらが上皮転移性沈着物として増殖するという一連の連続段階を伴うと考えられている（Hanahan and Weinberg, 2011）。EMTは、実際に循環中のヒト乳癌細胞において実証されているものの（Yu et al., 2013）、転移を開始するためのEMTの要件は議論されている（Ledford, 2011; Tarin et al., 2005）。提唱された代替的なモデルは、腫瘍由来微小塞栓が原発性腫瘍から分離し、遠位毛細血管中に詰まり、そこで塞栓が転移成長を開始することを含む（Fidler, 1973; Liotta et al., 1976; Molnar et al., 2001）。多様な技術プラットフォームを使用して、本発明者らおよび他者は、実際に、転移性上皮癌を有する患者の循環内から癌細胞2〜50個の範囲のCTCクラスターを検出した（Cho et al., 2012; Fidler, 1973; Molnar et al., 2001; Stott et al., 2010; Yu et al., 2013）。
【０１８７】
癌転移の研究は、「種子対土壌（seed versus soil）」の概念を転移傾向の鍵となる決定因子として強調している（Fidler, 2003）。このモデルは、増殖特性および浸潤特性を付与している腫瘍細胞内の突然変異型遺伝的推進力の重要性を、転移成長を促進し得る遠隔器官の微小環境、すなわち「ニッチ」の重要性と対応付けている。しかし、単独CTCおよびCTCクラスターの物理的特徴もまた、特に上皮腫瘍細胞が細胞接着の喪失および血流中の剪断力に耐え抜く能力に影響するので、転移傾向に寄与し得、すなわち癌細胞である「種子」間の種々の生存シグナルが重要であり得る。例えば、マウス内因性膵臓癌モデルにおいて、非標準Wntシグナル伝達がCTC内で高まり、そこでアノイキスを抑制すると見られ（Yu et al., 2012）、一方で皮下腫瘍異種移植モデルでは、微小塞栓内の腫瘍細胞と間質細胞との混合物が、間質由来生存シグナルに寄与し得る（Duda et al., 2010）。
【０１８８】
CTCは、大多数の上皮癌から検出されており、CTCは、血流を通過する際に捕捉された癌細胞に相当する（Alix-Panabieres and Pantel, 2013; Yu et al., 2011）。そのため、CTCは、癌の血液媒介播種を仲介する重要な経路を理解するための鍵を握っているが、そのことは、大量の原発性または転移性腫瘍集団の分析によって容易には明らかにならない場合がある。血流中に能動的に侵入した癌細胞由来の割合に対する腫瘍血管系の不全の結果として受動的に脱落した癌細胞由来の割合を含む、原発性腫瘍からCTCの生成に至る要因は未知である。血流中のCTC数は、正常血液細胞と比較して極めて希少であるものの、患者における転移性病変数をはるかに超えており、それは、圧倒的多数のCTCが血流中で死滅し、わずかな割合だけが生存可能な転移前駆体に相当することを示している。接着依存性生存シグナルを喪失した上皮細胞は、血流中で大部分のCTCが出会う可能性のある運命であるアノイキスを急速に受ける。間葉転換、間質由来因子、または持続性上皮細胞間接合のいずれかが、このアポトーシスの結末を弱める生存シグナルを提供し得ることは、これに関連する（Duda et al., 2010; Mani et al., 2008; Robson et al., 2006; Yu et al., 2012）。ヒトの癌に対するこれらの様々なメカニズムの寄与を精査することは、血流から個別のCTCを単離し、これらを詳細な分子解析に供する能力を必要とする。
【０１８９】
正常な血液細胞中に非存在の腫瘍特異的エピトープ、サイズ、密度、および電気機械的性質のようなそれらの物理的特性の変動を利用するか、または未精製の血液細胞調製物にハイスループットイメージングを適用することによる、CTC捕捉のための複数の技法が開発されている（総説についてはYu et al., 2011を参照されたい）。進行転移癌を有する患者においてさえも、CTCが極めて希少であり（正常血液細胞10億個あたりCTC 1個と推定されている）、それらがアポトーシスを受け得るという事実は、それらの分析を技術的制約に依存させた。本発明者らは、低剪断性であるがそれでもハイスループットな未処理全血のインテロゲーション（interrogation）という利点を有し、詳細な分子解析に適した高濃縮未固定CTCを提供する、一連のマイクロ流体デバイスを導入した（Nagrath et al., 2007; Ozkumur et al., 2013; Stott et al., 2010）。これらのうち、ヘリンボーン（HBCTCチップ）は、CTCを捕捉する抗体コーティングされたデバイス壁に向かって細胞を導く乱流のマイクロ流体流動を発生するために、マイクロ流体チャンバーの天井内の溝を用いる（Stott et al., 2010）。このデバイスは、その高度に効率的な設計から大型のCTCクラスターの初期検出が可能であり、核酸抽出のためにオンチップでの細胞溶解を必要とし、したがって濃縮されているが不均一な分析用CTC集団を提供する（Yu et al., 2012, 2013）。
【０１９０】
対照的に、本発明者らの最近記載されたnegCTC-iチップは、血液標本からの赤血球および白血球の高度に効率的な枯渇を達成し、タグなしCTCおよび小型CTCクラスターを溶液として回収し、その溶液中で1細胞RNAシーケンシング用にそれらを顕微操作することができる（Ozkumur et al., 2013）。本明細書に記載の実験は、インビボフローサイトメトリーおよび次世代RNAシーケンシングと共にこれらのデバイスの両方を用いて、転移性乳癌を有する患者およびマウス腫瘍モデルの両方からCTCをインテロゲートする（interrogate）。本明細書において記載されるようにマウスモデルを使用すると、CTCクラスターが原発性腫瘍細胞のオリゴクローナル塊から得られ、CTCクラスターは、単独の循環乳癌細胞と比較して、希少であるが非常に高転移性の適格なCTCサブセットを構成する。ヒト乳房CTCクラスターのRNAシーケンシングによって、プラコグロビンが、原発性腫瘍内において不均一なパターンで発現される腫瘍細胞クラスター化の鍵となるメディエーターとして同定される。マウスモデルにおけるプラコグロビン発現のノックダウンは、CTCクラスターの形成を抑制し、転移拡散を減少させる。
【０１９１】
結果
内因性CTCクラスターは単独CTCと比較して高い転移能を有する
単独CTCと比較したCTCクラスターの起源および機能的特性を定義するために、腫瘍細胞の組成、血流を通したCTCの移行、および転移性沈着物をモニタリングおよび定量できるマウスモデルを用いた。最初に、内因性CTCの生成および原発性同所性腫瘍異種移植片からの転移を検査するためのモデルを樹立した。単独CTCに対するCTCクラスターの転移傾向を検査するため、およびCTCクラスターが初代腫瘍細胞からのオリゴクローナルなグループ化からか、それとも個別の腫瘍細胞のクローン後代から発生するかどうかを判定するために、これらの実験を計画した。MDA-MB-231ヒト乳癌細胞の肺転移性変異体であるMDA-MB-231-LM2（LM2）細胞（Minn et al., 2005）を遺伝子操作して、緑色蛍光タンパク質（LM2-GFP）またはmCherry（LM2-mCherry）のいずれかを発現させ、これらの差次的にタグ付けされた細胞の1：1混合物を免疫欠損（NSG）マウスの乳房脂肪パッド内に注射した。予想通り、5週間後に明白な原発性乳房腫瘍が観察され、IHC染色により確認されたように、これらは、等しい配分のLM2-GFPタグ付き細胞およびLM2-mCherryタグ付き細胞を保持した（データは示さず）。単独CTCまたはクラスター化したCTCの存在のために、終末放血を用いて担腫瘍動物の血液を採取し、転移性沈着物の分析のために同時に肺を回収した。CTCの数測定に加えて、クローンに由来するCTCクラスターは、GFPまたはmCherryのいずれかを一律に発現し、一方で原発性腫瘍由来の細胞凝集物は、2つのマーカーに関して不均一であると推論した（図11A）。マウス1匹（n＝5匹）あたり平均2,486のCTC事象を観察し、そのうち平均65（2.6％）がCTCクラスターであり、2,421（97.4％）が単独CTCであった（図11Bおよび17A）。事実上、全て（91％）のCTCクラスターが、GFPおよびmCherryについて二重陽性であった。マウス1匹あたり平均5.6個（9％）のCTCクラスター（クラスター1個あたり細胞3個未満を有する）が、2種のマーカーの一方のみを発現している細胞から構成され、これは、原発性腫瘍においてGFP／mCherry発現細胞の1：1混合物であることを考えると予想される確率に一致する（図11Bおよび17B）。したがって、CTCクラスターは、血管内の単独腫瘍細胞の増殖に起因せず、その代わりに、最もありそうには原発性腫瘍塊内の隣接細胞の凝集を表すように見える（下記参照）。
【０１９２】
CTC分析と同時に、抗GFP抗体および抗mCherry抗体を用いて肺における転移性沈着物を、数および組成の両方について分析した（図11Bおよび17A）。CTCクラスターにおけるGFP染色とmCherry染色との分布を考えると、単独CTC由来の転移性腫瘍は単一のマーカーが陽性である一方で、CTCクラスター由来の転移性腫瘍はGFPおよびmCherryの両方について染色されると推論した（図11A）。マウス1匹（n＝5匹）あたり平均323個の肺病巣が同定され、そのうち171個（53％）が多色であったので、CTCクラスター由来であった。それと比較して単独CTCの単色派生物は152個（47％）であった（図11Bおよび17A）。単独CTCおよびCTCクラスターの数で肺転移の数および分布を正規化すると、CTCクラスターは単独CTCよりも転移性沈着物を生じる可能性が50倍高いと算出された（図11C）。したがって、CTCクラスターは乳癌の同所性マウスモデルにおいて単独CTCよりもずっと希少であるものの、CTCクラスターは肺における転移腫瘍量に等しく寄与している。
【０１９３】
（1）オリゴクローナルなCTCクラスターが、単独CTCの血管内凝集ではなく、血管系への原発性腫瘍細胞塊の断片化から生じること、および（2）オリゴクローナルな肺転移が、複数の単独CTCによる転移部位の再播種ではなく、CTCクラスターから生じることをさらに検証するために、免疫欠損マウスの右乳房脂肪パッド内にLM2-GFP細胞を、左脂肪パッド内にLM2-mCherry細胞を注射する第2シリーズの同所性マウス異種移植実験を行った（図11D）。注射の5週間後に、マウスは、2種の独立した、差次的にタグ付けされた腫瘍を有し、CTCの分析のために血液を、転移性沈着物の数測定のために肺を回収した。予想通り、循環中の単独CTCは、GFPおよびm-Cherryタグ付き原発性腫瘍からの等しい寄与を実証した。しかし、以前の多重タグ付き単一腫瘍モデルとは異なり、2つの独立した個別タグ付き腫瘍を有するマウスにおいて圧倒的多数のCTCクラスター（96％）は単色であり、GFP陽性原発性腫瘍またはmCherry陽性原発性腫瘍からの寄与は等しかった（図11Eおよび17A）。したがって、圧倒的多数のCTCクラスターは、個別の原発性腫瘍由来であり、CTCクラスターの重大な供給源としての単独CTCの血管内凝集は排除される。
【０１９４】
二重担腫瘍マウスで観察された非常に少ない割合のCTCクラスターが、多色であった（CTCクラスターの4％、CTC全事象の0.12％に相当）（図11Eおよび17A）。並外れて希少であるものの、2つの独立した腫瘍由来のそのようなCTCクラスターの存在は、単独CTCの珍しい血管内凝集、または以前に報告された「腫瘍再播種」現象による2つの原発性腫瘍内での癌細胞の混合のいずれかから生じ得る（Kim et al., 2009）（データは示さず）。後者の仮説に一致して、GFPタグ付き原発性腫瘍内の細胞の3％〜5％がmCherry陽性であり、mCherry標識腫瘍内の細胞の3％〜5％がGFP陽性であったことが見出された（データは示さず）。希少な多色CTCクラスターに加えて、肺から低い割合（8％）の多色腫瘍が観察された（図11Eおよび17A）。これらの転移性病変は、希少な多色CTCクラスターまたは複数の単独CTCによる転移性病変の再播種のいずれかに起因する可能性もある。
【０１９５】
2つのLM2マウス異種移植実験から得られた知見を、第2のマウス由来乳癌細胞系である4T1で確認した（図17Cおよび17D）。LM2の結果に一致して、同所性乳房腫瘍内の4T1-GFP細胞と4T1-mCherry細胞との1：1混合物は、圧倒的に多色のCTCクラスターを生成し（90％）、一方で、GFPまたはmCherryのいずれかで標識された2つの別々の原発性4T1腫瘍は、単色のCTCクラスターを産生した（87％）。これらの観察はさらに、CTCクラスターが、単一腫瘍由来のオリゴクローナルな断片として生じることを支持している（図17C）。4T1由来肺転移の数および色分布を単独CTCおよびCTCクラスターの存在度に対して正規化すると、単独CTCと比較してCTCクラスターでは転移適格性が23倍に増加すると算出されたが（図17D）、これは、LM2細胞実験から得られた50倍への増加に匹敵する推定値である。まとめると、これら2種のマウス腫瘍モデルは、CTCクラスターが、循環中から検出された全てのCTC事象のわずか2％〜5％を構成するが、それらの劇的に高まった転移能（単独CTCの23〜50倍）は、同所性乳癌モデルにおける全ての転移性病変の約半数に寄与することを示している。
【０１９６】
クラスター化した癌細胞は肺への播種後のアポトーシスに対して単独細胞よりも抵抗性が高い
インビトロアッセイ法を作製し、それにより、本発明者らは、GFP-ルシフェラーゼタグ付きLM2細胞の培養物から単独細胞またはクラスター化した細胞（2〜30個）のいずれかの懸濁液を得られるようになった（拡大実験手順を参照されたい）。単独細胞（LM2-SC）またはクラスター（LM2-CL）のいずれかとして調製されたLM2細胞200,000個を、免疫欠損マウスの尾静脈に注射し、次にマウスをルシフェラーゼに基づく連続イメージングに供した（図12A）。生物ルミネセンスおよびGFP免疫組織化学（IHC）染色の両方によって示されるように、LM2-SC細胞およびLM2-CL細胞の両方が等しい効率で肺に到達した（0日目）（図12A）。しかし、その後数日にわたり、切断型カスパーゼ3についての染色によって実証される大規模なアポトーシスを細胞が受けると共に、LM2-SCの肺のシグナルは徐々に減少した（図12B）。対照的に、LM2-CLの肺シグナルは、血管内接種後に継続し、細胞はアポトーシスに抵抗性を示し、腫瘍はより急速に拡大した（図12A、12B、および2A）。最終的に、2種のLM2派生物のいずれかの尾静脈注射に供されたマウスにおいて、肺腫瘍は成長したが、クラスター化した細胞の注射は、LM2-SCについて15.7週間に対してLM2-CLについて12.7週間と、全生存期間の減少を招いた（p＜0.016）（図6B）。2種の追加的な乳癌細胞系であるBT474および4T1の尾静脈注射を用いて、単独癌細胞に対してクラスター化した癌細胞についてアポトーシスおよび肺における転移に速度の差があることが確認された（図18A〜18C）。
【０１９７】
インビボフローサイトメトリーを用いたCTCクラスターおよび単独CTCの循環クリアランス速度の算出
腫瘍細胞のクラスターは、それらが狭いチャンネルを通って進む際にかなりの柔軟性を示し得、毛細血管床自体は、大きな多細胞構造を移行させる不均等な血管直径または副経路を有し得る。しかし全体的に、CTCクラスターは、単独CTCよりも肺および遠位器官の小さな毛細血管の中で捕らえられる可能性が高い。したがって、循環中のCTCクラスターの定常状態レベルが低いことは、それらのクリアランス速度が非常に高い場合には、かなり高い生成速度を反映し得る。実際に単独CTCよりもCTCクラスターの方が血流からのクリアランス速度が速いかどうかを検査するために、親油性カルボシアニン膜色素DiDで標識されたLM2-SC細胞およびLM2-CL細胞を免疫欠損マウスの尾静脈に注射後、それらの細胞をインビボフローサイトメトリー（IVFC）を用いてモニタリングした（図13）。IVFCの設定でCTCの最適な検出を達成するようにDiDを選択した。各マウスにおいて耳血管内で循環しているDiD標識細胞をリアルタイムで合計55分間検出した。注射されたLM2-CL細胞は、LM2-SCよりも少なくとも3倍速く浄化された（半減期はLM2-CLについて6〜10分に対してLM2-SCについて25〜30分）（図3）。まとめると、これらの観察は、血流中のCTCについての循環時間を定義し、CTCクラスターのより短い循環半減期は、それらが、遠位器官の毛細血管内でのそれらのより迅速な捕捉と一致する（Liotta et al., 1976）。
【０１９８】
乳癌を有する患者および前立腺癌を有する患者におけるCTCクラスターの存在は予後不良と相関する
マウスモデルにおけるCTCクラスターの起源および転移能を特徴決定したので、癌を有する患者におけるそれらの特性を研究することに着手した。最初に、進行性の転移性乳癌を有する患者の血液中におけるCTCクラスターの臨床的重要性を試験するために、19ヶ月間にわたり複数の時点で採取された、合計79人の患者からの血液標本中のそれらの存在を測定した。Massachusetts General Hospitalc Cancer CenterでのIRB承認研究に、エストロゲン受容体陽性サブタイプ（n＝49）、HER2陽性サブタイプ（n＝13）、トリプルネガティブ（n＝17）サブタイプの乳癌を有する女性を含む患者を募集した（合計：265データポイント）。これらの実験のために、大型および小型CTCクラスターの両方の捕捉に高度に効率的なHBCTC-チップを用いた（Stott et al., 2010）。一緒になって上皮乳房CTCおよび間葉乳房CTCの両方を効率的に捕捉する、上皮細胞接着分子（EpCAM）ならびに系列マーカーである上皮成長因子受容体（EGFR）およびヒト上皮成長因子受容体2（HER2／ErbB2）を標的化する抗体の組み合わせをマイクロ流体チャンバーにコーティングした（Yu et al., 2013）。乳癌を有する患者からの全血3mlを処理した後に、チップ上に捕捉されたCTCを、広域スペクトルサイトケラチン（CK）に対する抗体で染色してCTCを同定し、白血球マーカーCD45に対する抗体で染色して白血球（WBC）の混入を評価した（データは示さず）。患者79人中54人（68％）からCTCを同定した。CTCを有する患者のうち、3人（5.6％）が、3つ超の時点にわたり明らかなCTCクラスターを有し、一方で16人（29.6％）が、1〜3つの時点中にCTCクラスターを有し、35人（64.8％）が検出可能なクラスターを有さなかった（図14A）。CTCクラスターの存在を無増悪生存期間（PFS）と共に、そのようなデータが入手可能であった全ての患者について算出した（n＝30）。注目すべきは、治療の開始から処置担当の臨床家（CTCの結果は知らせない）による中断までの時間としてPFSを算出し、臨床測定がCTCの単離時間枠内に入った場合にのみ、PFSのデータ解析を行った。CTCクラスターが1〜3つの時点中に見つかった患者について平均無増悪生存期間134.8日および単独CTCのみを有する患者について160.5日であったのと比較して、3つ超の時点にわたりCTCクラスターを有した患者は、平均無増悪生存期間32.6日を有した（p＝0.0002）（図14B）。したがって、進行性転移性乳癌を有する患者の間であっても、CTCクラスターの連続的な存在は有害臨床転帰と関連している。
【０１９９】
進行性乳癌を有する患者における比較的短い進行時間を考えると、より長い臨床経過を有する患者におけるCTCクラスターと予後不良との間の相関関係を試験しようと努めた。53ヶ月をかけて複数の時点（合計：202データポイント）で採取された血液標本を用いて、前立腺癌を有する合計64人の患者からCTCの数を測定した。前立腺特異抗原（PSA）および前立腺特異的膜抗原（PSMA）に対する抗体のカクテルを用いた染色によって前立腺癌患者におけるCTCを視覚化し；抗CD45染色を用いて白血球を除外した（Miyamoto et al., 2012）。64人中48人の患者（75％）からCTCが検出された。CTCクラスターは、試料48個中6個（12.5％）に存在した（図14C）。このコホートにおいて、少なくとも1つの時点でCTCクラスターが存在することは、劇的により短い全生存期間と強く相関した（単独CTCを有する患者について平均生存期間が930.1日であったのに対して、CTCクラスターを有する患者については115.8日であった；p＝0.00001）（図14D）。これらの結果は、ヒトの癌の進行におけるCTCクラスターの関連性を示している。
【０２００】
乳癌を有する患者から精製された対応するCTCクラスターおよび単独CTCの1細胞解像度RNAシーケンシング
同じ血液標本から単独CTCおよびCTCクラスターの両方を捕捉できることは、個別の患者に対応させた発現プロファイルにおける差を検索する1細胞解像度RNAシーケンシングを行うことを可能にした。これらの実験のために、微量のテンプレートから次世代RNAシーケンシングを行うための最適化プロトコールと一緒に、タグなしCTCの単離および1細胞操作を可能にするnegCTC-iチップを適用した（Ozkumur et al., 2013; Tang et al., 2010）。転移性乳癌を有する患者10人からの血液標本をRBCならびにCD45陽性およびCD66b陽性WBCのマイクロ流体枯渇に供し、最終産物中にタグなしの単独CTCおよび小型CTCクラスターを残した（Ozkumur et al., 2013）。未固定の腫瘍細胞をEpCAM、HER2、および間葉マーカーCDH11の細胞表面発現について染色し（Alexa488コンジュゲーション型）、CD45、CD14、およびCD16に対する抗体で対比染色して、混入白血球を同定した（テキサスレッドコンジュゲーション型）（図4A）。マイクロマニピュレーターを用いて個別のCTCクラスター（クラスター1個あたり細胞3個という中央値）を単離し、同じ標本からの単独CTCの数的に対応するプールと比較し、続いて次世代RNAシーケンシング（SOLiD 5500XL）を行った（図4A）。乳癌患者10人から単離された合計29試料（単独CTCのプール15個およびCTCクラスター14個）について正規化発現プロファイルを得た。
【０２０１】
RNAシーケンシングデータの教師なし階層的クラスタリングによると、単独CTCおよびCTCクラスターの両方が起点の患者に近接してクラスタリングして、それらの間で大域的な遺伝子発現レベルに明らかな差異は示されなかった（図4B）。原発性腫瘍細胞由来としてのCTCクラスターの顕微鏡的外観と一致して、T細胞、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、内皮細胞、または線維芽細胞を含む他の細胞型のRNAシグネチャーは同定されなかった（図19）。血小板に対するマーカーが、単独CTCおよびCTCクラスターの両方に存在したが、これは、循環中の癌細胞に血小板が接着することが公知であることに一致した。各患者について、CTCクラスターの遺伝子発現データを単独CTCと比較し、異なる患者にわたり共通のCTC-クラスター関連遺伝子31種の一覧表を作成した（全ての患者内比較の70％超でq＜0.01、log2FC＞1）（図4C、4D、および9）。CTC-クラスターに豊富な遺伝子の中から転移の潜在的推進因子を同定するために、ER陽性乳癌、HER2陽性乳癌、およびトリプルネガティブ乳癌を有する患者1,956人のコホートでの原発性腫瘍標本におけるそれらの過剰発現と臨床転帰との間の相関関係を検定した。候補CTCクラスター遺伝子の間で、プラコグロビンは、単独CTCと比較してCTCクラスターでそれが高レベルで過剰発現（219倍）すること、および原発性腫瘍におけるその発現が無遠隔転移生存期間の有意な減少と関連した（p＝0.008）という事実が独特であった（図4D、5E、および20）。したがって、より詳細な分析のためのCTC-クラスターで豊富な転写体として、プラコグロビンを選択した。
【０２０２】
プラコグロビン（JUP）は、アルマジロファミリータンパク質の一メンバーであり、デスモソームおよび接着結合の重要な構成要素であり（Aktary and Pasdar, 2012）、それは、多様な悪性疾患にプラスとマイナスの役割の両方を果たすことが報告されている（Hakimelahi et al., 2000; Kolligs et al., 2000; Shiina et al., 2005）。プラコグロビンRNAの上方制御と共に、デスモソームおよび接着結合の両方の複数の構成要素が、CTCクラスターにおいて有意に濃縮されていた（図10A〜10D）。RNAシーケンシングの結果に一致して、プラコグロビンタンパク質の発現が、乳癌患者からの対応する単独CTCではなく、複数のCTCクラスターにおいて確認された（データは示さず）。CTCクラスターは、プラコグロビンおよびE-カドヘリンを含む上皮細胞接合部の構成要素を発現する一方で、一部の間葉マーカーもそのようなクラスターで上方制御される場合があるが、これは、血流中でTGFj3に富む血小板と接着することに関連し得る効果である（Labelle et al., 2011; Yu et al., 2013）。対応する原発性腫瘍生検および転移性腫瘍生検が、この患者から入手可能であり：プラコグロビンの発現は、原発性乳房腫瘍および転移性乳房腫瘍の両方で顕著に不均一であり、高発現の病巣に、検出可能なタンパク質を有さない領域が散在していた（図15）。したがって、プラコグロビンは細胞間接合部の鍵となる構成要素である一方で、それが原発性腫瘍内で多様な発現レベルであることは、プラコグロビンがCTCクラスターへの前駆体を構成し得る密着性細胞群を画定し得る可能性をもたらしている。
【０２０３】
プラコグロビンはCTCクラスターの形成に必要でありかつ乳癌転移に寄与する
CTCクラスターに関連するプラコグロビン発現の機能的結果を定義するために、多様な培養条件下での細胞間接着を測定するための蛍光発生色素を用いるインビトロアッセイ法（Vybrant）を適用した（El Khoury et al., 1996）。レンチウイルス介在性の安定的なプラコグロビンノックダウン後に、7つの乳癌細胞系（MDA-MB-231-LM2、BT474、MCF7、T47D、BT549、BT20、およびZR-75-1）を、2つの非形質転換ヒト乳房上皮細胞（HMECおよびMCF10A）と比較した。shRNA介在性のラコグロビン抑制は、単層として成長した乳癌系7つ中6つの細胞間接触の破壊をトリガーした一方で、2つの非形質転換乳房上皮細胞のいずれにも検出可能な効果を有さなかった（p＜0.04）（図3Aおよび8A）。したがって、正常な上皮細胞よりも乳癌細胞の方が、プラコグロビン介在性細胞接合に大きく依存する場合があり、正常な上皮細胞は、細胞間結合の形成に追加的または代替的な経路から利益を得る場合がある（Alford and Taylor-Papadimitriou, 1996; Cavallaro and Christofori, 2004）。
【０２０４】
これらの観察をインビボで拡張するために、プラコグロビンshRNAまたは非標的対照のいずれかをGFP-ルシフェラーゼタグ付きのLM2細胞およびBT474細胞に導入し、免疫抑制マウスの尾静脈への注射用に、これらを単独細胞（SC）またはクラスター（CL）として調製した。本明細書上記の結果に一致して、SC条件と比較してCL条件下で調製された場合に、対照shRNAを発現しているLM2およびBT474細胞の両方が、肺において劇的に高い残留性を示した。対照的に、CL条件に関わらず、LM2細胞およびBT474細胞の両方でのプラコグロビンのノックダウンによって、クラスターは単独細胞に解離したが、これは、これらの細胞における細胞間接着にプラコグロビンが必要となることに一致する。プラコグロビンのノックダウン後に、LM2およびBT474の両方のCLおよびSC調製物の尾静脈接種は、肺転移数の低下を生じる点で類似していた（図16）。したがって、プラコグロビンのノックダウンは、クラスター化した癌細胞を生成するために必要な細胞間相互作用を打ち消すことによって、血管内直接注射後にそれらが肺病巣を産生する潜在性を減少させる。
【０２０５】
最終的に、対照shRNAまたはプラコグロビンshRNAのいずれかを発現しているLM2-GFP-ルシフェラーゼ細胞を免疫欠損マウスの乳房脂肪パッド内に注射して、腫瘍成長および腫瘍由来CTCを測定することによって、同所性異種移植片を作製した。プラコグロビンのノックダウンは、最大30日間測定された原発性腫瘍の成長速度も変化させず（図5Bおよび8B）、原発性腫瘍由来の単独CTCの総数にも影響しなかった（図5C）。顕著には、腫瘍由来CTCクラスターの数は、対照マウスと比較してLM2プラコグロビンshRNA発現腫瘍を有するマウスにおいて有意に減少した（図5C）。並行して、マウス肺の生物ルミネセンスイメージングから、プラコグロビンが抑制されている原発性腫瘍を有するマウスについて肺結節が顕著に80％減少したことが実証された（図5D）。
【０２０６】
まとめると、これらのデータによって、原発性腫瘍内のプラコグロビン発現領域が、凝集した腫瘍細胞、すなわちCTCクラスターを産生し、それが血流中に脱落し、そこの遠隔部位でCTCクラスターが急速な浄化および高い転移能を示すというモデルが示される（図5F）。細胞間接合部を破壊して、例えば乳癌の転移拡散を減少させることによって、CTCクラスターを治療的に標的化することができることが、本明細書において考慮されている。
【０２０７】
考察
乳癌を有する患者およびマウスモデルの両方にマイクロ流体CTC分離技法を適用することによって、血行性転移の、著しいがあまり理解されていない特徴であるCTCクラスターが、本明細書において記載されるように特徴決定された。CTCクラスターは、様々な起源の癌に生じる。大部分のクラスターは、比較的小さいものの、一部は、数十の腫瘍細胞を含み、それらが正常な毛細血管を通ってどのように進むのかという疑問を提起している。インビボフローサイトメトリー研究は、クラスターが単独CTCよりも速やかに循環から浄化されることを示している。それにもかかわらず、これらのクラスター内の凝集細胞が構造的に変形可能であることおよび循環内での血管シャントの存在が、これらのサブセットを循環させ得る。遠位組織内でのクラスターの急速な浄化は、それらの潜在的に高い細胞生存性と一緒になって、それらの劇的に増強した転移能の基礎となり得る。再構成マウスモデルにおけるCTCクラスターの転移傾向の増加は、CTCクラスターが豊富な乳癌および前立腺癌患者の予後不良と一緒になって、癌の血行性拡散にこれらの細胞凝集物が果たす重要な役割を裏付けている。
【０２０８】
マウスにおける細胞のタギングおよび混合研究に基づくと、ほぼ全てのCTCクラスターが、単一の遊走細胞の後代に由来するというよりも、むしろオリゴクローナル起源であると考えられる。本研究は、CTCクラスターの重大な原因としてCTCの血管内凝集を除外し、代わりにそれらが単一の腫瘍に由来することを実証している。
【０２０９】
興味深いことに、原発性腫瘍内の細胞性病巣内でプラコグロビンが高発現であることは、これらの病巣が最終的に循環に入るクラスターの起源を画定している可能性を提起している。マウス再構成モデルにおいて、原発性腫瘍を構成する細胞におけるプラコグロビンのノックダウンは、腫瘍形成自体を抑制するのでなく、循環におけるCTCクラスターの生成を打ち消し、肺における転移性沈着物数を大きく減少させる。
【０２１０】
本明細書に記載の腫瘍細胞の転移能を増強する特異的転写物の同定は、癌の血行性拡散を抑制する治療戦略を可能にし、これは、困難であるが重大な目標である。今まで、転移遺伝子の候補が、主にマウス腫瘍モデルから得られた。EMTの誘導因子のようないくつかが、乳癌上皮細胞の遊走特性を変化させ、幹細胞様特性を付与する（Mani et al., 2008）。ヒト乳癌CTCにおいて、本発明者らは、最近、定量RNA-インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、間葉転写物がCTCに顕著に濃縮されていることを実証した（Yu et al., 2013）。EMTに関連する全般性遊走特性に加えて、マウスにおける組織特異的向性研究によって、肺（例えば、エピレギュリン、CXCL1、SPARC、およびMMP2）（Minn et al., 2005）、脳（例えば、COX2、HBEGF、およびST6GALNAC5）（Bos et al., 2009）、および骨（主にSrc活性化によって推進される）（Zhang et al., 2009）への乳癌転移に関与する遺伝子サブセットが同定された。乳癌を有する患者から得られた乳房CTCにおける候補遺伝子をインテロゲートしている最近の研究から、EpCAM、CD44、CD47、およびMETの同時発現が、増加した転移能を有するサブセットを同定することが示唆された（Baccelli et al., 2013）。これらの候補転移遺伝子は、単独CTCと比較してCTCクラスターで上方制御されなかった。
【０２１１】
本研究は、一方（CTCクラスター）が他方（単独CTC）と比較して非常に高い転移能を有する、末梢循環腫瘍細胞の2つの別個の集団を比較することによって、転移のメディエーターを同定している。先進のマイクロ流体CTC単離技法（Ozkumur et al., 2013）の開発により、転移性疾患を有する患者の血流中でヒト乳癌細胞が一時的に循環する場合に、それらの細胞のそのような詳細な研究を行うことが可能になった。1細胞解像度RNAシーケンシングによって、個別の乳癌患者からの対応するCTCクラスターおよび単独CTCの間で発現パターンが非常に高レベルに一致することが実証された。転写調節因子（XBP1）、シグナル伝達分子（AGR2およびHER3）、およびプラコグロビンを含む、有意に多様な発現を有するいくつかの候補遺伝子を同定した（図9）。本発明者らは、高いプラコグロビン発現と乳癌患者における有害転帰との間の臨床的関連性が原因で、本研究の焦点をプラコグロビンの機能的特徴決定に合わせたものの、追加的なCTC-クラスター関連遺伝子が、それらの生成およびそれらの転移能に関与する可能性がある。マウスモデルにおけるCTCクラスター生成と転移性腫瘍形成との両方を抑制しているプラコグロビンノックダウンの顕著な結果は、この遺伝子産物が腫瘍播種の主な決定因子であることを示している。プラコグロビンは、接着結合とデスモソームとの両方に寄与し、接着結合では、E-カドヘリンのC-末端細胞内ドメインが、3-カテニンまたはプラコグロビンのいずれかと相互排他的に相互作用し、それが、今度はアクチン結合タンパク質であるa-カテニンと結合する（Harris and Tepass, 2010）。デスモソームでは、デスモコリンおよびデスモグレインの細胞内ドメインが、プラコフィリンおよびプラコグロビンと相互作用し、それが、今度は中間フィラメント結合タンパク質であるデスモプラキンと結合する（Garrod and Chidgey, 2008）。したがって、プラコグロビンは、接着結合およびデスモソームの両方の重大な構成要素であり、これは、腫瘍細胞における細胞間接着へのプラコグロビンの独特な寄与の根底となり得る役割である。プラコグロビンは、異なる状況で癌遺伝子および腫瘍抑制因子の両方として意味づけられているものの（Ha-kimelahi et al., 2000; Kolligs et al., 2000; Shiina et al., 2005）、そのどちらとしても、本明細書に提唱されたモデルに入っておらず、代わりに、腫瘍細胞が分離して循環中に入る際に腫瘍細胞に追加の転移能を付与する細胞間テザーとして機能している。興味深いことに、追加的な接着メカニズムによって利益を受け得る非形質転換乳房上皮細胞の細胞間結合に対する、プラコグロビンのノックダウンが及ぼす影響はずっと少ない。この差次的効果は、治療的介入の機会を提供し得る。
【０２１２】
要約すれば、乳癌および前立腺癌患者ならびにマウスモデルの両方における本発明者らのCTC研究は、CTCクラスターを癌転移の重要なメディエーターとして示すものである。これらは、単独の遊走性CTCと共存し、循環中でそれらの比較的小さな数をはるかに超える転移性腫瘍量に寄与している。腫瘍細胞が凝集して原発性腫瘍から剥離し、それらが血流中で生存する場合にそれらの粘着性を維持するする能力は、癌の血液媒介播種における新規の潜在的に標的化可能な段階を特定し得る。
【０２１３】
実験手順
CTCの捕捉および同定
Massachusetts General Hospitalで治験審査委員会（IRB）のプロトコール（05-300）により患者にインフォームドコンセントを行った後に、CTC分析用の血液標本を得た。血液最大20mlをEDTAバキュテナー中に採取した。採血から4時間以内に血液3mlをHBCTC-チップにより処理するか、または血液6〜12mlをnegCTC-iチップにより処理した。
【０２１４】
マウス研究のために、血液を心臓穿刺により回収し、血液1mlをHBCTC-チップにより処理した。
【０２１５】
HBCTC-チップをMassachusetts General Hospital Cancer Center／BioMEMS Resource Facilityの現場で製造した。患者の試料およびマウス異種移植片について、それぞれ10mg/mlの、EpCAMに対するビオチン化抗体（R&D Systems）、EGFRに対するビオチン化抗体（セツキシマブ、Lilly）、およびHER2に対するビオチン化抗体（R&D Systems）のカクテルを用いて、以前に記載されたようにチップを機能付加した（Yu et al., 2013）。4T1マウス乳房腫瘍細胞について、マウスEpCAMに対する抗体（BioLegend）およびEGFRに対する抗体（セツキシマブ、Lilly）のカクテルでチップを機能付加した。前立腺癌を有する患者から試料を、記載されるように処理した（Miyamoto et al., 2012）。negCTC-iチップを、以前に記載されたように設計および製作した（Ozkumur et al., 2013）。
【０２１６】
腫瘍発生アッセイ法
施設内のガイドラインを遵守して全てのマウス実験を行った。尾静脈実験について、NOD SCIDガンマ（NSG）マウス（Jackson Labs）にLM2細胞2×105個、BT474細胞4×105個、または4T1細胞2×105個を注射し、IVIS Lumina II（Caliper LifeSciences）でモニタリングした。CTCクラスターの転移能評価のために、LM2-GFP（または4T1-GFP）細胞2×106個およびLM2-mCherry（または4T1-mCherry）細胞2×106個を、別々に調製するか、または1：1混合し、PBS中のフェノールレッド不含50％基底膜マトリックス（BD Biosciences）100ml中に懸濁し、NSGマウスに同所性注射した。腫瘍発生の4週間後にCTC数測定のための採血を行った。プラコグロビンノックダウン実験のために、PBS中のフェノールレッド不含50％基底膜マトリックス100ml中にLM2-CTRL細胞またはLM2-プラコグロビンshRNA細胞1×106個を懸濁し、NSGマウスに同所性注射した。CTC数測定および肺転移の分析用の採血を腫瘍発生の4週間後に行った。
【０２１７】
RNAシーケンシングデータの解析
100万あたりのリード数（rpm）の判定：no-novel-juncs引数セットと共にtophatおよびbowtie1を使用して、カラースペースのリードを、genome.ucsc.eduからのヒトゲノムバージョンhg19およびhg19 knownGeneテーブルによって定義されるトランスクリプトームと整列させた。整列しなかったリードまたはゲノム中の複数の位置に整列したリードを放棄した。genome.ucsc.eduからのhg19テーブルknownToLocusLinkを使用して、可能であれば、整列させた各リードを、そのエクソンに対してリードが整列させた遺伝子に対してマッピングした。各遺伝子に対するリード数は、その遺伝子に対してそのようにマッピングされたリードの数であった。任意の遺伝子に対してマッピングされたリードの総数でこの数を割り、100万倍にして100万あたりのリード（rpm）数を形成させた。本発明者らは、アライメントが30に偏っていると気付いたため、本発明者らはrpkmよりもむしろrpmを使用した。
【０２１８】
アクセッション番号
本書類で報告されたシーケンシングデータに対するGene Expression Omnibusアクセッション番号はGSE51827である。
【０２１９】
参照文献
2016536303.tif 000010
2016536303.tif 000011
2016536303.tif 000012
【０２２０】
拡張実験手順
CTCの捕捉および同定
HBCTC-チップ上に捕捉された細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した。次に、固定された細胞をPBS中の1％NP40で透過処理し、3％ヤギ血清／2％BSAでブロッキングし、広域スペクトルサイトケラチンに対する抗体（Abcam）、前立腺特異抗原に対する抗体（DAKO）、前立腺特異的膜抗原に対する抗体（N. Banderから入手）、CD-45に対する抗体（Abcam）、プラコグロビンに対する抗体（Sigma Aldrich）、およびDAPIに対する抗体で免疫染色した。あるいは、チップ上に捕捉された、GFPまたはmCherryを発現している細胞をPBSで洗浄し、直接イメージングした。BioView（商標）Ltd.自動イメージングシステム（Billerica, MA）を使用して染色陽性細胞を検出した。正立蛍光顕微鏡（Eclipse 90i, Nikon, Melville, NY）を用いて高解像度の像を得た。
【０２２１】
以前に記載されたようにnegCTC-iチップを設計および製作した（Ozkumur et al., 2013）。処理前に、全血試料をCD45およびCD66bに対するビオチン化抗体（それぞれR&D SystemsおよびAbD Serotec、社内でビオチン化）に曝露し、次にDynabeads MyOne（商標）ストレプトアビジンT1（Invitrogen）と共にインキュベーションして白血球の磁気標識および枯渇を達成した（Oz-kumur et al., 2013）。EpCAM（Cell Signaling Technology）、カドヘリン11（R&D Systems）およびHER2（Biolegend）に対するAlexa488コンジュゲーション型抗体を有する溶液中で、CTC濃縮産物を染色してCTCを同定し、CD45（BD Biosciences）、CD14（BD Biosciences）およびCD16（BD Biosciences）に対するテキサスレッドコンジュゲーション型抗体を用いて混入している白血球を同定した。
【０２２２】
無転移生存期間および全生存期間の評価
Massachusetts General Hospitalの患者からの臨床データに基づくカプラン-マイヤー生存曲線をXLStat（商標）ソフトウェア（Addinsoft）で作成した。乳癌患者における「高プラコグロビン」に対する「低プラコグロビン」の無遠隔転移生存期間について（および他のCTC-クラスター関連遺伝子について）、本発明者らは、以下の特徴を有する公的に入手可能なヒト原発性乳癌遺伝子発現データセットおよびそれらの中の試料を同定した：(a）無遠隔転移生存期間の情報が入手可能であったこと、(b）ネオアジュバント処置の証拠がなかったこと、(c）遺伝子発現を測定するために使用されたプラットフォームが、少なくとも10,000種の転写物を測定したこと、(d）患者1人について複数の試料があった場合、1つのみを使用したこと、(e）前述の基準を満たすデータセット中に試料が少なくとも40個あったこと。以下のデータセットを使用した（Bos et al., 2009; Chanrion et al., 2008; Chin et al., 2006; Desmedt et al., 2007; Li et al., 2010; Loi et al., 2008; Ma et al., 2004; Minn et al., 2005, 2007; Schmidt et al., 2008; Sotiriou et al., 2006; van 't Veer et al., 2002; van de Vijver et al., 2002; Wang et al., 2005）。各データセットについて、本発明者らは、プラコグロビンについて全てのプローブまたはプローブセットを同定し、データセットの試料にわたり最大の標準偏差を有するものを使用した。各データセットについて、本発明者らは、試料のプラコグロビン発現がそのデータセットに関するプラコグロビン発現の上位3位以内に入った場合には、その試料を「高プラコグロビン」と特徴決定し、その他の場合は「低プラコグロビン」と特徴決定した。次に、本発明者らは、カプラン-マイヤープロットを作成し、全てのデータセットからの試料についての無遠隔転移生存期間の情報および「高プラコグロビン」対「低プラコグロビン」の分類を用いてログランク両側p値を算出した。
【０２２３】
単一細胞顕微操作
CTC濃縮産物を35mmペトリ皿中に収集し、Nikon Eclipse（商標）Ti倒立蛍光顕微鏡を用いて注意深く見た。無傷の細胞形態、Alexa488陽性染色およびテキサスレッド染色の欠如に基づき、単独CTCおよびCTCクラスターを同定した。Eppendorf TransferMan（商標）NK2マイクロマニピュレーター上の10mm移送チップを用いて標的細胞を個別に顕微操作し、RNA保護溶解緩衝液（10×PCR緩衝液II、25mM MgCl2、10％NP40、0.1M DTT、SUPERase-In、Rnアーゼ阻害物質、0.5uM UP1プライマー、10mM dNTPおよびヌクレアーゼ不含水）が入ったPCRチューブ中に放出し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。
【０２２４】
単一細胞のRNA増幅およびシーケンシング
CTCから抽出されたRNA試料を氷上で解凍し、70℃で90秒間インキュベーションした。cDNAを生成させるために、試料を逆転写マスターミックス（1×体積あたりRNアーゼ阻害物質0.05uL、T4遺伝子32タンパク質0.07uL、およびSuperScript III（商標）逆転写酵素0.33uL）で処理し、50℃で30分間および70℃で15分間サーモサイクラー上でインキュベーションした。遊離のプライマーを除去するために、EXOSAP（商標）ミックス1.0uLを各試料に添加し、それを37℃で30分間インキュベーションし、80℃で25分間不活性化した。次に、マスターミックス（1×体積あたり10×PCR緩衝液II 0.6uL、25mM MgCl2 0.36uL、100mM dATP 0.18uL、ターミナルトランスフェラーゼ 0.3uL、RNアーゼH 0.3uL、およびH2O 4.26uL）中に入れて37℃で15分間インキュベーションし、70℃で10分間不活性化することによって、各試料中のcDNAに3'-ポリA尾部を付加した。各試料を4つに分割し、マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液 2.2uL、2.5mMの各dNTP 1.76uL、100uM UP2プライマー 0.066uL、50mM MgSO4 0.88uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ0.44uL、およびH2O 13.654uL）中に入れて95℃で3分間、50℃で2分間、および72℃で10分間インキュベーションすることによって、第2鎖cDNAを合成した。マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液 4.1uL、50mM MgSO4 1.64uL、2.5mMの各dNTP 4.1uL、100uM AUP1プライマー0.82uL、100uM AUP2プライマー0.82uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ0.82uL、およびH2O 6.7uL）を用いて、PCR増幅（95℃で3分間、次に95℃で30秒間、67℃で1分間、および72℃で6分6秒間が20サイクル）を行った。各試料の4回の反応物をプールし、QIAGEN PCR Purification Kit（Cat. No 28106）を使用して精製し、EB緩衝液50uL中に溶離させた。qPCRを用いて遺伝子Gapdh、ActB、Ptprc（CD45）、Krt8、Krt18、およびKrt19について検査することによって試料を選択した。各試料を再度4つに分割し、マスターミックス（1×体積あたり10×ハイフィデリティーPCR緩衝液9uL、50mM MgSO4 3.6uL、2.5mMの各dNTP 13.5uL、100uM AUP1プライマー0.9uL、100uM AUP2プライマー0.9uL、Platinum Taq DNAポリメラーゼ1.8uL、およびH2O 59.1uL）を用いて、第2ラウンドのPCR増幅（98℃で3分間、67℃で1分間、および72℃で6分6秒間を9サイクル）行った。試料をプールし、Agencourt AMPure XPビーズを用いて精製し、1×low TE緩衝液40uL中に溶離させた。
【０２２５】
シーケンシングライブラリー構築
Covaris S2（商標）システムを用いてDNAを剪断するために、1×low TE緩衝液および剪断緩衝液1.2uLを各試料に添加した。剪断プログラムの条件は、6サイクル、浴温度5℃、浴温度限界15℃、デューティサイクル10％、強度5、100サイクル／バースト、および60秒間を含む。次に、マスターミックス（1×体積あたり5×反応緩衝液40uL、10mM dNTP 8uL、末端ポリッシング酵素1 8uL、末端ポリッシング酵素2 10uL、およびH2O 14uL）を用いて室温で30分間試料を末端ポリッシングした。Agencourt AMPure XP（商標）ビーズ0.5×体積を用いて500bpよりも大きなDNA断片を除去した。上清を別々のチューブに移した。200〜500bpのDNA産物をサイズ選択するために、ビーズ0.3×体積を添加し、試料を70％ EtOHで2回洗浄した。low TE緩衝液36uL中に生成物を溶離させた。マスターミックス（1×体積あたり5×反応緩衝液10uL、10mM dATP 1uL、およびA-テーリング酵素I 5uL）で処理することによって、サイズ選択された各DNAにdA尾部を付加し、68℃で30分間インキュベーションし、室温に冷却した。シーケンシング用に各DNA試料を標識および識別するために、5500 SOLiD Fragment Library Enzyme Module（4464413）を使用してバーコードアダプター（5500 SOLiD 4464405）をDNAに連結した。バーコードを付けた後に、Agencourt AMPure XP（商標）ビーズを用いて試料を2回精製し、low TE緩衝液22uL中に溶離させた。1ラウンドのPCR増幅（95℃で5分間の次に、95℃で15秒間、62℃で15秒間、および70℃で1分間を12サイクル、次に70℃で5分間）の後に、AMPure XPビーズを用いてライブラリーを精製した。最終的に、連結させたDNAの量を定量するために、SOLiD Library TaqMan（商標）定量キットを使用してqPCRを行った。次に、完成したバーコード付きライブラリーを、テンプレートビーズ調製物を用いたエマルションPCRに供し、ABI 5500XL（商標）でシーケンシングした。
【０２２６】
RNAシーケンシングデータの解析
クラスタリング：rpm行列の最小1で最も小さな正の数をrpm行列に加算して0を除去した。次に結果を対数変換し、メディアンポリッシュを行った。上位2000の標準偏差と共に行（遺伝子に対応する）を保持し、行の残りを捨てた。1からPearson相関係数を差し引いた値に等しい距離尺度を用いた平均連結法で凝集型階層的クラスタリングを使用して、結果をクラスタリングした。
【０２２７】
教師つき差次的遺伝子発現：RNAレベルで混入WBCマーカーの高発現およびCTCマーカーの無発現を示した試料を分析から除外した。同じ患者からの単独CTC試料とCTCクラスター試料との各対について、本発明者らは、Bioconductor DEGseq（商標）パッケージバージョン1.10.0のDEGexp関数を使用して（Wang et al., 2010）、「MARS」に設定されたメソッドおよびBenjamini-Hochbergを用いて算出されたq値を用いて、FDRのq値および正規化変化倍率を算出した。各対および方向について（例えば、単独CTC細胞に対して上方向のCTCクラスター）、そのq値が0.01未満でその変化倍率が2を超えた場合には遺伝子をヒットと見なした。次に、本発明者らは、各方向について対の70％またはそれ以上についてヒットであった遺伝子を考慮した。デスモソーム（それぞれ接着結合）のメタジーンを、DEGseq（商標）によって判定された、デスモソーム（それぞれ接着結合）マーカー遺伝子にわたるCTCクラスターと単独CTCとの間の正規化log2変化倍率の平均と定義した。
【０２２８】
インビボフローサイトメトリー
DiD標識した単独LM2細胞またはクラスター化LM2細胞を静脈内に養子移入し、末梢循環中から検出した（Novak et al., 2004）。注目すべきは、シグナルの誤解釈を避けるために、異なる動物に単独LM2細胞およびクラスター化LM2細胞を別々に注射した。DiDを635nmレーザーによって励起させ、光電子増倍管を使用して695±27.5nm帯域フィルターで検出した。LM2-SCおよびLM2-CLについての循環動態を、MATLAB（商標）（Mathworks）を用いて定量した。
【０２２９】
免疫組織化学
ホルマリン固定およびパラフィン包埋したマウス異種移植片原発性腫瘍、肺転移、ならびにヒト原発性腫瘍および対応する転移性病変を切片にし、切断したカスパーゼ3に対する抗体（Cell Signaling Technology）、GFPに対する抗体（Cell signaling Technology）、mCherryに対する抗体（Abcam）、プラコグロビンに対する抗体（Sigma Aldrich）、およびCD31に対する抗体（Abcam）を用いて4℃で一晩染色した。GFP／mCherryおよびプラコグロビン／CD31の二重染色を、EnVisionG／2二重染色システム（Dako）を用いて行った。全ての標本をヘマトキシリで対比染色した。全組織の画像をScanScope（商標）（Aperio）で取得した。
【０２３０】
細胞培養および試薬
HMEC、MCF10A、BT474、MCF7、T47D、4T1、BT549、BT20およびZR-75-1細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、製造業者の説明書に準じて増殖させた。10％ウシ胎仔血清（Life Technologies）を補充したDMEM（Life Technologies）中でMDA-MB-231 LM2細胞を増殖させた。尾静脈注射用の単独細胞またはクラスターのBT474、4T1またはLM2細胞を生成するために、集密度80％で単層成長している細胞をトリプシン（Life Technologies）と共に1分間インキュベーションして、浮遊クラスターを生成させた。次に、クラスターを2つの別々のディッシュの中に等しく配分した。2つのディッシュの一方の中で、ピペッティングによりクラスターを機械的に解離させて、単独細胞懸濁液を生成させた。
【０２３１】
Vybrant（商標）細胞間接着アッセイキット（Invitrogen）を用いて製造業者の説明書に準じて細胞間接着アッセイ法を行った。
【０２３２】
mCherryを発現しているプラスミドをAddgeneから購入した。プラコグロビンTRC shRNAをThermo Scientificから購入した。レンチウイルスパッケージングベクター（Addgene）を使用して293T細胞（ATCC）をトランスフェクションし、レンチウイルス粒子を産生させた。標的細胞系の感染は、8mg/mlポリブレン（Thermo Scientific）を含有する成長培地中に入れてMOI＝10で一晩行った。
【０２３３】
補足的参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2016536303.tif 000023
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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