(57)【要約】  本発明は、高解像度融解技術を用いるIBV、CSFV及びNDVの株の弁別及び特徴付け並びに新規な株の同定方法に関する。本発明はまた、そのような方法で使用されるプライマー及びキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、IBVの株を特徴付けるプロセス又は方法：
a）IBV株からIBV cDNAを作製する工程；
b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程であって、該プライマー対がIBVゲノムのS1遺伝子に特異的である、前記工程；
c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及び
d）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該IBV株を特徴付ける工程。
【請求項２】
プライマー対が、配列番号：29に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：30に示す配列を有するリバースプライマーを含む、請求項1に記載のプロセス又は方法。
【請求項３】
IBV株が、793/B株、マサチューセッツ株、QX様株、IBNC90株、D274株、アイオワ株、アーカンソー株、オランダ52株、コネチカット46株、ビューデットUS株、カリフォルニア株、ジリン株、ホルテ株、HK株、D41株、DE072株、スペイン/92/35株、及びエジプト/F/03株から成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
IBV株のS1配列が、約95％の配列同一性を有する1つ以上のIBV S1配列とアラインメントしない新規なIBV株を同定する工程をさらに含む、請求項1に記載のプロセス又は方法。
【請求項５】
新規なIBV株を単離する工程をさらに含む、請求項4に記載のプロセス又は方法。
【請求項６】
感染動物とワクチン接種動物とを弁別する（DIVA）手段を提供する、請求項1−5のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項７】
IBV株がワクチン型株又は該動物に感染した野生型株であるか否かを同定する工程をさらに含む、請求項6に記載のプロセス又は方法。
【請求項８】
リアルタイムPCRが、a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）55℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、e）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を含む、請求項1−7のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項９】
以下を含む、IBV株の検出用キット：
a）配列番号：29に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：30に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、
b）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書。
【請求項１０】
配列番号：29又は配列番号：30に示す配列を有するHRM分析のためのポリヌクレオチド又はプライマー。
【請求項１１】
以下の工程を含む、CSFVの株を特徴付けるプロセス又は方法：
a）CSFV株からCSFV cDNAを作製する工程；
b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程であって、該プライマー対がCSFVゲノムのNS5B又は3’NTR領域に特異的である、前記工程；
c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及び
d）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該CSFV株を特徴付ける工程。
【請求項１２】
プライマー対が、配列番号：8に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：9に示す配列を有するリバースプライマーを含む、請求項11に記載のプロセス又は方法。
【請求項１３】
CSFV株が、ALD株、中国株（C株）、GPE株（日本株）、C/HVRI株（中国由来、遺伝子型1.1）、リエムス株（中国由来）、アルフォート187株、アメス株、マルガリータ株、ベーカー株、ニューヨーク株、パーデュー115株、パデルボーン株、スプレダ株、オレゴン株、シンガー株、オスロス株、モレダン株、及びフリッタース株から成る群から選択される、請求項11又は12に記載のプロセス又は方法。
【請求項１４】
CSFV株のNS5B又は3’NTR配列が、約95％の配列同一性を有する1つ以上のIBV S1配列とアラインメントしない新規なCSFV株を同定する工程をさらに含む、請求項11に記載のプロセス又は方法。
【請求項１５】
新規なCSFV株を単離する工程をさらに含む、請求項14に記載のプロセス又は方法。
【請求項１６】
感染動物とワクチン接種動物とを弁別する（DIVA）手段を提供する、請求項11−15のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項１７】
CSFV株がワクチン型株又は該動物に感染した野生型株であるか否かを同定する工程をさらに含む、請求項16に記載のプロセス又は方法。
【請求項１８】
リアルタイムPCRが、a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）55℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、e）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を含む、請求項11−17のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項１９】
以下を含む、CSFV株の検出用キット：
a）配列番号：8に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：9に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、
b）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書。
【請求項２０】
配列番号：8又は配列番号：9に示す配列を有するHRM分析のための単離ポリヌクレオチド又はプライマー。
【請求項２１】
以下の工程を含む、NDVの株を特徴付けるプロセス又は方法：
a）IBV株からNDV cDNAを作製する工程；
b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程であって、該プライマー対がNDVゲノムのF、NP、P、M、HN又はL遺伝子に特異的である、前記工程；
c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及び
d）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該NDV株を特徴付ける工程。
【請求項２２】
プライマー対が、配列番号：17に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：18に示す配列を有するリバースプライマー、又は配列番号：31に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：32に示す配列を有するリバースプライマーを含む、請求項21に記載のプロセス又は方法。
【請求項２３】
NDV株が、アビニュー株、ラソタ株、MVP-ムクテスワー株、ND-B1株、韓国ダルグバン株、ハーツ33株、エセックス’70株、135/93株、617/83株、34/90株、ビューデットC株、D26株、MC110株、及び1154/98株から成る群から選択される、請求項21又は22に記載のプロセス又は方法。
【請求項２４】
NDV株のF、NP、P、M、HN又はL配列が、約95％の配列同一性を有する1つ以上のNDV F、NP、P、M、HN又はL配列とアラインメントしない新規なNDV株を同定する工程をさらに含む、請求項21に記載のプロセス又は方法。
【請求項２５】
新規なNDV株を単離する工程をさらに含む、請求項24に記載のプロセス又は方法。
【請求項２６】
感染動物とワクチン接種動物とを弁別する（DIVA）手段を提供する、請求項21−25のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項２７】
NDV株がワクチン型株又は該動物に感染した野生型株であるか否かを同定する工程をさらに含む、請求項26に記載のプロセス又は方法。
【請求項２８】
リアルタイムPCRが、a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）60℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、e）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を含む、請求項21−27のいずれか1項に記載のプロセス又は方法。
【請求項２９】
以下を含む、NDV株の検出用キット：
a）配列番号：17に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：18に示す配列を有するリバースプライマー、又は配列番号：31に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：32に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、
b）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書。
【請求項３０】
配列番号：17、18、31又は32に示す配列を有するHRM分析のためのポリヌクレオチド又はプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は米国仮特許出願61/738,688（2012年12月18日出願）の優先権を主張する。
本発明は、高解像度融解技術を用いるIBV、CSFV及びNDVの株の弁別及び特徴付け並びに新規株の同定方法に関する。本発明はまた、そのような方法で使用されるプライマー及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特異的なDNA又はポリヌクレオチドをin vitroで増幅する方法を提供するプライマー伸長反応であり、特定のDNA配列の数千から数百万のコピーを生じる。PCRは、今や医学的及び生物学的研究室で多様な用途で用いられる一般的でしばしば欠くことのできない技術である。前記用途には、配列決定のためのDNAクローニング、DNA基準系統発生、遺伝子の機能分析；遺伝病の診断；遺伝子フィンガープリントの同定；並びに伝染病の検出及び診断が含まれる。基本的なPCRのいくつかの変型には、定量的リアルタイムPCR（qPCR又はRT-PCR）、対立遺伝子特異的PCR、非対照PCR、ホットスタートPCR、逆転写PCR、多重PCR、ネステッドPCR、ライゲーション媒介PCR、配列間特異性PCR、熱非対照インターレースPCR及びタッチダウンPCRが含まれる。これらのPCRの変型は、種々の目的のために極めて多様な使用を提供する。例えば、一ヌクレオチド多形性（SNP）（DNAの一塩基相違）は対立遺伝子特異的PCRによって同定でき、qPCRは、PCR反応で増幅されたコピーの数の決定で非常に高度の厳密性を提供できる（Bartlett et al.,“A Short History of the Polymerase Chain Reaction”, PCR Protocols, 2003）。
最近、高処理変異スキャンのための新規な分子技術として高解像度融解（HRM）が付加された（Zhou, L., et al., Clin. Chern. 51, 1770-1777, 2005）。HRMを用いる変異決定は、二本鎖DNAと相互作用する蛍光染料の存在下での上昇温度曝露時におけるDNAの解離に基づく（例えばUS7,387,887、US7,582,429を参照されたい）。当業界では多数の適切な染料が開示されている。変異の存在は、DNAヘテロ二本鎖の形成とその後に続く融解の仕方に変化を生じる。したがって、この“変異スキャン”技術は、標的遺伝子から誘導したPCRアンプリコンにおける配列多様化の存在を検出する。HRM実験では、サンプルDNAは先ず初めに高解像度融解染料の存在下でリアルタイムPCRを介して増幅される。そのような染料の主要な例はWO2008/052742に開示されている。PCRの後、同じリアルタイム装置で連続的融解実験を実施し、対応する遺伝子スキャンソフトを用いて分析して配列変種を同定する。
【０００３】
古典的なブタ熱（CSF）（以前は豚コレラとして知られていた）は、非常に伝染性の強い家畜豚及び野生豚が罹患する多臓器出血性疾患であり、世界的に養豚産業に損失をもたらし、陸生動物衛生規約（OIE, 2007）にしたがえば国際獣疫事務局に通知されるべき疾患である。原因因子は古典的ブタ熱ウイルス（CSFV）である。前記ウイルスはエンベロープを有し、プラスセンスの一本鎖RNAウイルスであり、フラビウイルス科（Flaviviridae）のペスチウイルス（Pestivirus）属に分類される。遺伝子レベルでは、CSFVは、E2及びNS5B遺伝子の部分配列を基準にして遺伝子型1、2及び3に分類できる。各遺伝子型はさらにいくつかの下位遺伝子型に分類でき、前記はそれぞれ1.1、1.2及び1.3；2.1、2.2及び2.3；並びに3.1、3.2、3.3及び3.4と称される（Paton et al., Vet Microbiol. 73:137-157, 2000）。アジアでは、CSFの流行は普遍的であり、遺伝子型1、2及び3がアジアの数カ国で単離されている。
【０００４】
CSFVは急性、亜急性及び慢性のブタの疾患を引き起こすことができ、重大な経済的損失を引き起こして世界的に養豚産業に大きな脅威を与える。CSFの管理には根絶又はワクチン接種が必要とされ、先進国では根絶が好ましい管理方法である（例えば欧州連合（EU）は、感染豚の屠殺に起因する多大な損失量に資金を提供している）。他方のワクチン接種は、発展途上国（例えば中国）の主要な管理方法である。豚コレラの家兎継代ウイルス（HCLV）（C株としても知られている）は、1950年代中頃に開発され、中国及び多くの国で広く用いられている（Moorman et al., J Virol. 70:763-770, 1996）。HCLVによる大規模ワクチン接種は、ワクチン免疫ブタ群でのCSFVの野生型とHCLV株との識別を困難にする（Van Oirshot, Vet Microbiol 96:367-384, 2003）。臨床的症状に達しないか又は無症状のCSFV感染が普遍的になり（Moennig et al., Vet. J. 165, 11-20, 2003；Tu, Virus Res. 81, 29-37, 2001）、農夫及び獣医師による野生型CSFV感染の識別を困難にし、一般的な検出アッセイによる検出（例えばウイルス単離、抗原捕捉ELISA及び抗体試験）を不能にする。
【０００５】
多様な診断アッセイが開発されている。しかしながらそれらにはいずれも限界がある。ウイルス単離は結果の確認に6−12日を要し、ELISAは非常に鋭敏とは言えずしばしば偽陰性結果を生じ、リアルタイムPCRはより迅速で鋭敏であるが交差夾雑の高いリスクによる限界がある。もっとも重要なことには、これらのアッセイはいずれもCSFVのワクチン株と野生型とを識別できない。以前に、野生型CSFVを“リエムス（Riems）”ワクチン株と識別するリアルタイムRT-PCRアッセイがEUで確立され（Leifer et al., J. Virol. Methods 158, 114-122, 2009；Leifer et al., J. Virol. Methods 166, 98-100, 2010；Leifer et al., J. Gen. Virol. 91, 2687-2697, 2010）、さらに野生型と韓国の‘K-LOM’ワクチン株のCSFVとを弁別するアッセイが開発された（Cho et al., Can J Vet Res 70:226-229, 2006）。中国では、二工程リアルタイムRT-PCRアッセイ（プローブ結合部位におけるヌクレオチド相違を基に野生型CSFVをHCLV株ワクチンから識別する）及び一工程リアルタイムRT-PCRアッセイ（wt-rRT-PCR）（野生型の変異を検出するために小溝結合（MGB）プローブを用いる）が報告された。
種々のCSFVワクチン株が種々の国で（例えば“リエムス”はEUで、“K-LOM”は韓国で、“HCLV”は中国で）投与されているので、普遍的な検出アッセイが全ての国で使用できる可能性は低い。したがって、実施が可能で容易であり、さらに古典的ブタ熱について野生型とワクチン型との識別のために結果の解釈が容易なアッセイの開発が希求される。
【０００６】
伝染性気管支炎（IB）は全ての国の家禽産業で蔓延している疾患であり、発生率はほとんどの区域で100％に達する。前記は経済的にもっとも重要な疾患である。幼若鶏では、呼吸性疾患又は腎炎が死亡、体重増加の低下、及び加工時の廃棄勧告（condemnation）をもたらすが、一方で産卵齢のニワトリでは、当該疾患は無症状であり、産卵減少及び異常卵を生じる（Ignjatovic et al., Archives of Virology, 2006）。IBの集団発生はワクチン接種鶏群で続いており、その理由は主として、前記がIBVの種々の血清型、亜型又は変種（S1遺伝子のヌクレオチド点変異、挿入、欠失又は組換えによって生じる）によって引き起こされていると考えられることにある。
原因因子、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）はコロナウイルス科（Coronaviridae）に属する。前記はエンベロープを有するプラスセンスの一本鎖RNAウイルスであり、長さが27.6kbのゲノムサイズを有する。最初の20kbはウイルスRNA依存RNAポリメラーゼ及びプロテアーゼをコードする。全ゲノムは5’から3’方向に以下のような少なくとも10のオープンリーディングフレーム（ORF）を有する：5’-1a-1b-S(S1, S2)-3a,b,c(E)-M-5a,b-N-ポリ(A)-3’。前記は4つの構造タンパク質をコードし、スパイク糖タンパク質（S）、膜糖タンパク質（M）、リン酸化ヌクレオキャプシドタンパク質（N）及び小さな膜タンパク質（E）を含む（Mardani et al., Arch Virol. 155(10):1581-6, 2010）。
【０００７】
IBVは最初米国で1930年に報告され、それ以来、アメリカ（Johnson and Marquardt, Avian Dis. 19:82-90, 1975）、ヨーロッパ（Capua et al., Zentralbl Veterinarmed B. 41:83-89, 1994；Cavanagh and Davis, Arch Virol 130:471-476, 1993；Gough et al., Vet Rec. 130:493-494, 1992）、アジア（Wang et al., Avian Dis 41:279-282, 1997）及びオーストラリア（Ignjatovic and McWaters, J Gen Virol. 72:2915-2922, 1991；Lohr, Avian Dis. 20:478-482, 1976）の4大陸全体で報告されている。マレーシアでは、この疾患の蔓延についてはほとんど分かっていない。IB疾患の最初の報告は1967年初めであり、この疾患は軽度でワクチン接種は正当とは思われなかった（Chong et al., Second symposium on Scientific and Technological Research in Malaysia and Singapore, pp73-83, 1967；Aziz et al., The 8th Veterinary Association Malaysia Scientific Congress, 23-25th August 1996, Ipoh, pp76-78）。少なくとも1979年以来変種が存在し（Lohr, Proceedings of the 1st International Symposium on Infectious Bronchitis, EF Kaleta & U. Heffels - Redmann (Eds), pp 70-75, 1988；de Wit et al. Avian Pathology. 40(3):223-235, 2011）、高死亡率の腎症-腎炎症候群を引き起こすよりビルレントな株が初めて1980年に報告された（Heng et al., Kajian Veterinar. 12:1-8, 1980；Aziz 1996）。マレーシアのIBDに関連する最近の刊行物は2000、2004及び2009年にさかのぼり、1995年以来の変種腎病原性IBV株の臨床報告を含んでいる（Maizan, Proceeding 12th FAVA and 14th VAM congress, 28-28 August 2002, pp116；Yap M.L et al. Proceeding VAM Congress 1-4 September. , 2000；Arshad et al.  J. Vet. Malaysia. 14 (1&2): 322002；Balkis et al.  Proceedings VAM Congress 2004, Zulperi et al. Virus Genes. 38:383-391, 2009）。
【０００８】
世界中でいくつかの異なるIBV血清型及び遺伝子型が同定され、新規な変種がなお出現し続けている。これら新規な変種の1つはOX様IBである。IB-OXは2004年以来流布し報告された（Liu & Kong, Avian pathology, 33:321-327, 2004）。QXと同定されるウイルスはもっぱら種々の形態の腎臓病変に付随する。他の研究者はまた類似の株を中国で報告している（Liu et al., J of Gen Virol, 86:719-725, 2005）。2007年に、Cuipingら（Vet. Microbio., 122:71, 2007）はLiuら（2005）が提示したデータを確認し、2003年から2005年の間にワクチン接種及び非接種鶏群から腎病原性株の単離を報告した。同様な発見がまたロシア及びヨーロッパの他の部分で報告されている（Bochkov et al., Avian Pathology, 35:379-393, 2006; Landman et al., Proceedings of the 14th World Veterinary Poultry Congress, 22-26 August, 2005, Istanbul, Turkey, pp369）。
種々のIBVワクチン株が種々の国で投与されているので、普遍的な検出アッセイが全ての国で使用できる可能性は低い。したがって、実施が可能で容易であり、さらに伝染性気管支炎（IB）について野生型とワクチン型との識別のために結果の解釈が容易なアッセイの開発が希求される。
【０００９】
徹底的なワクチン接種プログラムにもかかわらず、ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、世界中の商業的養鶏場の不変の脅威であり続けている。NDVはモノネガウイルス目（Mononegavirales）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、アブラウイルス属（Avulavirus）のメンバーである。前記はエンベロープを有するウイルスであり、マイナスセンスの非分割一本鎖RNAゲノム（15,586ヌクレオチドから成る）を有する。前記ゲノムは、6つの遺伝子（核タンパク質（NP）、リンタンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、融合糖タンパク質（F）、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）、糖タンパク質及び大ポリメラーゼタンパク質（L））を含む。NDVで見出される6つの遺伝子のうち、前記の2つの膜タンパク質（Fタンパク質及びHNタンパク質）はそのビルレンスの決定にもっとも重要である。
【００１０】
近年のリアルタイムPCR方法の確立は、多様な感染性因子の分子診断に顕著な発展をもたらし、野外の獣医師及び農夫のために迅速で正確な結果に必要な疾患診断の所要時間を急速に短縮させた。いくつかの異なるTaqManプローブ又はSYBRグリーンを用いるNDV検出及び遺伝子型弁別用リアルタイムPCRアッセイのために、多くのPCRアッセイが記載されている（Wise et al., J. Clin Microbiol, 42:329-338, 2004）。Tanら（J. Virol Method, 160:149-156, 2009）は、NDV遺伝子型の検出及び弁別用のSYBRグリーンIリアルタイムPCRを記載した。しかしながら、このアッセイは種々のNDV遺伝子型の検出のために種々のプライマー対を要求し、NDVの3つの遺伝子型の弁別のために融解ピークの分析に強く依存する。SYBRグリーンIアッセイは、他のリアルタイム検出様式と比べて確立するための費用効果が最も高くかつ容易な形態のリアルタイムPCRである。しかしながら、主要な欠点は、染料分子が、非特異的PCR生成物又はプライマー-ダイマーを含む反応混合物に存在する一切の二本鎖DNAと結合するということである。したがって、NDV試験の迅速で明確な結果のために従来の分子診断方法には改善の余地がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、IBV、CSFV又はNDVの株を特徴付ける方法又はプロセスに関し、前記は以下の工程を含む：a）ウイルス株からcDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対は該ウイルスゲノムの遺伝子又は領域に特異的である）；c）リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物について高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びd）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該ウイルス株を特徴付ける工程。IBVのための遺伝子はS1遺伝子であり得る。NDVのための遺伝子はF、NP、P、M、HN又はL遺伝子であり得る。CSFVのための領域は4つの構造遺伝子（C、Erns、E1及びE2）又は8つの非構造タンパク質（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5B）得あり得る。
本発明はまたそのような方法で使用されるプライマー及びキットを提供する。
以下の詳細な説明（例示として提供するが本記載の特定の実施態様にのみ本発明を制限しようとするものではない）は、添付の図面と一緒にして最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】各DNA及びタンパク質配列に割り当てられた配列番号を示す表である。
【図１Ｂ】図１A続き。
【図２】IBVのためのリアルタイムPCRの感受性アッセイを表示する。
【図３】特異性を示すIB-QXの増幅曲線を表示する。
【図４】特異性を示すIB-QXの融解ピークを表示する。
【図５】IB-QXのS1配列及びblastの結果を表示する。
【図６】配列比較の結果を示す。
【図７】IBV株の配列同一性パーセンテージを示す。
【図８】IB-QX、IBnC90、Mass及び793/B株のHRM分析を表示する。
【図９】IB-QX及びIBnC90株のHRM分析を表示する。
【図１０】LBK株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１１】VRI株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１２】Pestiffa株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１３】MVP株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１４】QYHC株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１５】ZBC株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１６】YSC株（CSFV）の配列及びblastの結果の説明である。
【図１７】CSFVの野生型及びワクチン型のHRM分析を表示する。
【図１８】種々のワクチン型CSFVのHRM分析を表示する。
【図１９】野生型CSFV及びワクチン型CSFVのヌクレオチド配列アラインメントを示す。
【図２０】NDVワクチン株のHRM分析を表示する。
【図２１Ａ】NDV株のヌクレオチド配列アラインメントを表示する。
【図２１Ｂ】図２１A続き。
【図２２】NDV株のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２３】23A:NDV株間におけるヌクレオチドレベルの配列同一性を示す。            23B：NDV株間におけるアミノ酸レベルの配列同一性を示す。
【図２４】NDVワクチン株及び野生型株のHRM分析を表示する。
【図２５】ベロジェニック/メゾジェニック株とレントジェニック株を識別するNDV株のHRM分析を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示及び特に特許請求の範囲では以下のことを特記する：例えば“comprises（含む）”、“comprised（含まれた）”、“comprising（含んでいて）”などの用語は、米国特許法においてそれらに帰される意味を有することができる。例えばそれらは“includes（含む）”、“included（含まれた）”、“including（含んでいて）”などを意味することができる。さらに、例えば“consisting essentially of（本質的に〜から成っていて）”、及び“consists essentially of（本質的に〜から成る）”のような用語は、米国特許法においてそれらに帰された意味を有することができ、例えばそれらは、明確に列挙されていない成分を許容するが、先行技術で見出されているか又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を与える成分は排除する。
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、さらに適切な場合には単数形で用いられる用語はまた複数形を含み、逆もまた同様である。単数形の用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“または”という語も、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“および”を含むことが意図される。“または”という語は、個々のリストの任意の1つのメンバーを意味し、当該リストのメンバーの任意の組み合わせもまた含む。
【００１４】
“動物”という用語は、本明細書では全ての哺乳動物、鳥類及び魚類を含むために用いられる。本明細書で用いられる動物は以下から成る群から選択できる：ウマ科の動物（例えばウマ）、イヌ科の動物（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ科の動物（例えばライオン、トラ、イエネコ、野生ネコ、他の大型のネコ類および、他のネコ科の動物（チーター及びオオヤマネコを含む））、ウシ科の動物（例えばウシ）、ブタ類（例えばブタ）、ヒツジ属の動物（例えばヒツジ、ヤギ、ラマ、バイソン）、鳥類（例えばニワトリ、アヒル、ガン、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー、及びヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿類、メガネザル、有尾猿類、テナガザル、無尾猿類）、ヒト及び魚類。“動物”という用語にはまた、全ての発育段階（胚及び胎児期を含む）の個々の動物が含まれる。
“ポリペプチド”及び“タンパク質”という用語は互換的に用いられ、連続するアミノ酸残基のポリマーを指す。
【００１５】
“核酸”、“ヌクレオチド”及び“ポリヌクレオチド”という用語は互換的に用いられ、RNA、DNA、cDNA又はcRNA及び前記の誘導体（例えば改変された骨格を含むもの）を指す。本発明は、本明細書に記載するものに相補的な配列を含むポリヌクレオチドを提供することは理解されよう。本発明で意図される“ポリヌクレオチド”にはフォワード鎖（5’から3’）及び相補性リバース鎖（3’から5’）の両方が含まれる。本発明のポリヌクレオチドは種々の方法で（例えば化学的合成、遺伝子クローニングなどにより）調製され、多様な形態（例えば線状、分枝状、一本鎖若しくは二本鎖、又は前記のハイブリッド、プライマー、プローブなど）を有することができる。
“ゲノムDNA”又は“ゲノム”という用語は互換的に用いられ、宿主生物の遺伝させることができる遺伝子情報を指す。ゲノムDNAは核のDNA（染色体DNAとも称される）を含むが、色素体（例えば葉緑体）及び他の細胞内小器官（例えばミトコンドリア）のDNAも含まれる。本発明で意図されるゲノムDNA又はゲノムはまたウイルスのRNAを指す。RNAはプラス鎖RNAでもマイナス鎖RNAでもよい。本発明で意図される“ゲノムDNA”という用語は、本明細書に記載するものに対し相補的な配列を含むゲノムDNAを含む。“ゲノムDNA”という用語はまた、メッセンジャーRNA（mRNA）、相補性DNA（cDNA）及び相補性RNA（cRNA）を指す。本明細書で用いられる“ゲノムRA（核酸）”にはRNA、mRNA、cRNA、DNA及びcDNAが含まれる。
【００１６】
“遺伝子”という用語は、生物学的機能と結びついた任意のポリヌクレオチドセグメントを指すために広く用いられる。したがって、遺伝子又はポリヌクレオチドは、ゲノム配列の場合のようにイントロン及びエクソンを含むか、またはcDNAの場合のようにコード配列（例えばオープンリーディングフレーム（ORF）（前記は開始コドン（メチオニンコドン）から始まり停止シグナル（終止コドン）で終了する）のみを含む。遺伝子及びポリヌクレオチドはまた、それらの発現を調節する領域（例えば転写開始、翻訳及び転写終了）を含むことができる。したがって以下も含まれる：プロモーター及びリボソーム結合領域（一般的には、これらの調節エレメントはコード配列又は遺伝子の開始コドンのほぼ60から250ヌクレオチド上流に位置する（Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.））、転写ターミネーター（一般的には、ターミネーターはコード配列又は遺伝子の終止コドンのほぼ50ヌクレオチド下流内に位置する（Ward C K et al.））。遺伝子又はポリヌクレオチドはまた、mRNA若しくは機能的RNAを発現するか又は特定のタンパク質をコードする核酸フラグメントも指し、調節配列を含む。
本明細書で用いられる“異種DNA”という用語は、異なる生物、例えば異なる細胞タイプ又はレシピエントとは異なる種に由来するDNAを指す。前記用語はまた、宿主DNAの同じゲノム上のDNA又はそのフラグメントも指すが、この場合、当該異種DNAはその本来の位置とは異なるゲノムの領域に挿入される。
種々の核酸塩基の略語にはグアニン（G）、チミジン（T）、アデニン（A）及びシトシン（C）が含まれる。
【００１７】
“PCR”という用語はポリメラーゼ連鎖反応を指し、前記は一コピー又は数コピーのDNAを一般的なサーモサイクラーの手段によって指数関数的に増幅させる方法である。PCRはまた、増幅DNAの可視化のためにゲル電気泳動工程を必要とする一般的DNAコピー増幅方法を指す。
“リアルタイムPCR”は、DNAコピーの増幅及び蛍光レベルの検出によるリアルタイムでのDNA増幅の追跡監視が可能な上級PCR方法を指す。当該方法はゲル電気泳動を必要とせず、より短時間でより正確な結果を提供する。
“アンプリコン”という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応の方法論を用いて増幅又は増加させることができるポリヌクレオチドの部分を指す。
“高解像度融解（HMR）”という用語は、二本鎖DNAサンプルにおける変異、多形性及び遺伝的相違の検出のための技術を指す。前記は、産（Idaho Technology, Us）学（University of Utah、US）共同研究の結果として2002年に導入された比較的新しい方法である（Reed et al. 2007）。高解像度融解は、DNAサンプルが温度の上昇にしたがって二本鎖DNA（dsDNA）から一本鎖DNA（ssDNA）に遷移するときのそれらの解離態様にしたがって該DNAサンプルを特徴付けるために用いられる。該技術によってDNAサンプルは温度上昇に付され、二本鎖（dsDNA）から一本鎖形（ssDNA）へのそれらの解離の詳細が記録される。該装置は、以前の方法よりもはるかに最適で厳密な温度で蛍光シグナルを収集して、新規な適用の可能性を創出する。
【００１８】
HRM分析は二本鎖DNAサンプルで実施される。典型的には、HRM分析の前にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が実施され、問題の変異が存在するDNA領域を増幅する。増幅されるこの領域はアンプリコンとして知られる。PCRの後で、HRM分析が開始される。当該プロセスは、50℃周辺から95℃周辺までのアンプリコンDNAの加温である。このプロセスの間のどこかの時点でアンプリコンの融解温度に達し、DNAの2つの鎖が分離し又は“融解”分離する。HRMの本質はこのプロセスをリアルタイムで追跡監視することである。これは、特異的に二本鎖DNAに結合し、さらに結合したときに明るい蛍光を発する蛍光染料を用いることによって達成される。二本鎖DNAが存在しないときには、当該染料は結合するべきものをもたず、低レベルの蛍光を発するだけである。HRM分析の開始時には、数十億のコピーのために高レベルの蛍光がサンプルに存在する。しかしサンプルが加熱されてDNAの2つの鎖が融解分離するにつれ、二本鎖DNAの存在が減少し、したがって蛍光は低下する。HRM機器はこのプロセスを記録し、融解曲線として知られるグラフ（温度に対して蛍光レベルを示す）としてこれらデータをプロットする。当該HRM機器はこのプロセスを“高解像度”で追跡監視する能力を有し、融解曲線における相違を正確に記述し、したがって変異が存在するか否かを同定することを可能にする。
本明細書で用いられる“プライマー”という用語はオリゴヌクレオチド又は短い一本鎖核酸を指し、前記は、別の一本鎖分子の相補性部分とのハイブリダイゼーションに際して、DNAポリメラーゼ活性を有する酵素によって媒介される重合化（例えばPCR）開始の起点として機能する。
【００１９】
本明細書で用いられるように、“抗原”又は“免疫原”という用語は、特異的な免疫応答を宿主動物で誘発する物質を意味する。抗原は、生物体全体（殺滅、弱毒又は生）；生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物に提示されたとき免疫応答を誘発することができるDNAの断片又はフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。また別には、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質又はペプチド”という用語には、いったん宿主に投与されたら、前記タンパク質に対して液性及び／又は細胞性タイプの免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性を有するポリペプチドが含まれる。好ましくは、該タンパク質フラグメントは、タンパク質全体と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは少なくとも1つのエピトープ又は抗原決定基を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。本明細書で用いられるように、“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、完全長配列のタンパク質、そのアナローグ又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載した免疫学的応答を誘引するタンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当分野で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66（Glenn E. Morris, Ed., 1996）。例えば、線状エピトープは、例えば固相上で多数のペプチド（前記ペプチドは当該タンパク質分子の部分に一致する）を同時に合成し、前記ペプチドがなお固相に結合している間に抗体と前記ペプチドを反応させることによって決定することができる。そのような技術は当分野で公知であり、例えば以下に記載されている：米国特許4,708,871号; Geysen et al. 1984; Geysen et al. 1986。同様に、立体的エピトープは、アミノ酸の空間配座を例えばX線結晶学及び二次元核磁気共鳴によって決定することにより容易に同定することができる。
【００２０】
“免疫原性タンパク質又はペプチド”という用語はさらに、当該ポリペプチドが機能して本明細書に定義する免疫学的応答を生じるかぎり、当該配列に対する欠失、付加及び置換もまた意図する。“保存的変化”という用語は、あるアミノ酸残基の生物学的に類似する別の残基による置換、又はコードされるアミノ酸残基が変化しないか若しくは生物学的に類似する別の残基であるような核酸配列内のヌクレオチドの置換を意味する。これに関して、特に好ましい置換は、一般的には性質として保存的、すなわちアミノ酸のあるファミリー内で生じる置換であろう。例えばアミノ酸は一般的に以下の4つのファミリーに分けられる：（1）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。保存的変化の例には以下が含まれる：ある疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）による別の疎水性残基の置換、又はある極性残基による別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換など）、又はあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸（生物学的活性に大きな影響をもたない）による保存的取替え。したがって、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、当該タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義範囲内である。これらの改変によって生成されるポリペプチドの全てが本明細書に含まれる。“保存的変化”という用語はまた非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、ただし置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた非置換ポリペプチドと免疫反応することを条件とする。
【００２１】
ある組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、対象の組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答の宿主における発生である。通常は、“免疫学的応答”には、1つ以上の以下の作用（ただしこれらに限定されない）が含まれる：抗体、B細胞、ヘルパーT細胞及び／又は細胞傷害性T細胞（これらは対象の組成物又はワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に誘導される）の産生。好ましくは、新規感染に対する抵抗性が強化されるか、及び／又は疾患の臨床的重篤度が軽減されるように、宿主は治療的又は防御的免疫学的応答を示すであろう。そのような防御は、通常は感染宿主が示す症状の緩和又は欠如、回復期間の短縮、及び／又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって示されるであろう。
長さがNヌクレオチドのゲノムのための可能なウイルス変種の数は、4つの異なるヌクレオチドが存在するので4Nの変種が可能である。例えば、長さがわずかに300ヌクレオチドのゲノムに対しては10180の異なる変種が存在する（Martin A. Nowak and Robert McCredie May Virus Dynamics ,Oxford University Press）。RNAウイルス集団のゲノム配列はコンセンサス又は平均的配列周辺でクラスターを形成しているが、各ゲノムは異なっている。特定の変異を有する稀少ゲノムは選別事象に生き残り、したがって当該変異は全ての子孫ゲノムで見出されるであろう。偽似種理論は、ウイルスは単なるランダム変異の寄せ集めではなく、相互作用しあう変種群であると予測する（Vincent Racaniello 2009）。
【００２２】
変種には対立遺伝子変種が含まれる。“対立遺伝子変種”という用語は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし、天然の集団（例えばウイルス種又は亜種）内に存在する多形性を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。そのような天然の対立遺伝子変種は典型的にはポリヌクレオチド又はポリペプチドに1−5％の多様性を生じ得る。対立遺伝子変種は、多数の異なる種で問題の核酸配列を配列決定することによって同定できる。前記は、ハイブリダイゼーションプローブを用い、それらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を識別することによって実施できる。任意のかつ全てのそのような核酸多様化並びにその結果のアミノ酸多形性又は多様化（前記は天然の対立遺伝子多様化の結果であり、問題の遺伝子の機能的活性を変化させない）は、本発明の範囲内であることが意図される。
配列に関して“同一性”という用語は、例えば2つの配列の短い方の配列のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割った、同一ヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を指し、ここで2つの配列のアラインメントはウィルバーとリップマンのアルゴリズム（Wilbur and Lipman）にしたがって決定できる。2つのアミノ酸配列の配列同一性若しくは配列類似性、又は2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ベクター（Vector）NTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA）を用いて決定できる。RNA配列がDNA配列と類似する、又は前記とある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等価とみなされる。したがって、RNA配列は本発明の範囲内であり、DNA配列中のチミジン（T）をRNA配列中のウラシル（U）と等価であるとみなすことによってDNA配列から誘導することができる。
【００２３】
IBV
本発明のある実施態様は以下の工程を含むIBVの株を特徴付けるプロセス又は方法を提供する：a）動物から単離したIBV株からIBV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はIBVゲノムのS1遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びd）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該IBV株を特徴付ける工程。
該フォワード及びリバースプライマーは、既知IBV株のS1遺伝子のポリヌクレオチド配列をアラインメントしS1遺伝子の保存領域を比較することによって選択できる。該実施態様のある特徴では、フォワードプライマーは配列番号：29に示すポリヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号：30に示すポリヌクレオチド配列を有する。
S1遺伝子はスパイクを有する（S）糖タンパク質として知られている。S1サブユニットは血清型特異的配列及び抗原性エピトープ（ウイルス中和抗体を誘発する）を保持する。IBVの種々の血清型、サブタイプ又は変種は、S1遺伝子のヌクレオチド点変異、挿入、欠失又は組換え（前記はワクチン接種鶏群におけるIB集団発生の原因である）よって生じたと考えられた（Zhou et al. J. Vet Med. B51, 147-152, 2004）。S1糖タンパク質のヌクレオチド配列は、IBV株間の血清型の違いを決定するために一般的に用いられる（Kwon et al. Avian Dis. 1993）。
【００２４】
HRM曲線分析は製造業者の指示にしたがって実施できる。例えば、いくつかの製造業者が高解像度DNA融解分析で使用される装置を提供している（例えばApplied Biosystems (ABI)、Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Idaho Technology、Roche及びStratagene）。さらにまた、当該アッセイを実施するために市場で入手可能ないくつかの飽和染料もまた存在する（例えば、LCGreen(商標)(Idaho Technology Inc.)、Syto9(商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)、EvaGreen(商標)(Bioturn)及びLightCycler(商標)480 ResoLight Dye (Roche, Indianapolis, IN)（Vossen RHAM et al. Human Mutation 30 (6), 2009））。
リアルタイムPCRは以下のパラメーター：a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）55℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、及びe）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を用いて実施でき、その後に融解曲線分析（95℃で1秒間、65℃で15秒間及び持続的に95℃）及び45℃で30秒間の冷却が続く。
本発明の方法を用いて既知のIBV株を特徴付けさらに識別することができる。既知のIBV株には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：793/B株、マサチューセッツ株、QX様株、IBNC90株、D274株、アイオワ株、アーカンソー株、 オランダ52株、コネチカット46株、ビューデット（Beaudette）US株、カリフォルニア株、ジリン（Jilin）株、ホルテ（Holte）株、HK株、D41株、DE072株、スペイン/92/35株、エジプト/F/03株、及び世界的に見出される他の株。
【００２５】
本発明はまた新規なIBV株の同定を提供し、前記IBVの配列は緊密な相同性を有する1つ以上のIBV配列のいずれともアラインメントしない。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したIBV株からIBV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はIBVゲノムのS1遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；d）該HRM曲線を分析及び比較する工程；及びe）新規なIBV株を同定する工程。したがって、HRM曲線分析によって同定される新規なIBV株は、該アンプリコンの配列を決定し、該IBVアンプリコン配列を既知のIBV配列とアラインメントすることによってさらに特徴付けることができる。新規なIBV株は、既知のIBV配列のいずれかと約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、又は約99％の配列同一性を有することができる。前記配列はヌクレオチド配列でもアミノ酸配列（アンプリコン配列の翻訳）でもよい。
【００２６】
本方法の実施態様の別の特徴は、感染動物とワクチン接種動物との間の弁別（DIVA）のための手段を提供する。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したIBV株からIBV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はIBVゲノムのS1遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びd）該HRM曲線を分析及び比較して、該cDNAがワクチン型株又は動物に感染した株に由来するか否かを決定する工程。
本発明のある実施態様は、配列番号：29又は配列番号：30に示す配列を有する単離ポリヌクレオチド又はプライマーを提供する。
本発明の別の実施態様はIBV株を検出するためのキットを提供し、前記キットは、a）配列番号：29に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：30に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、及びb）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書を含む。
【００２７】
CSFV
本発明のある実施態様はCSFVの株を特徴付けるプロセス又は方法を提供し、前記は以下の工程を含む：a）動物から単離したCSFV株からCSFV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はCSFVゲノムのNS5B又は3’NTR領域に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びd）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該CSFV株を特徴付ける工程。
該フォワード及びリバースプライマーは、既知CSFV株のNS5B又は3’NTR領域のポリヌクレオチド配列をアラインメントし、NS5B又は3’NTR領域の保存領域を比較することによって選択できる。該実施態様のある特徴では、フォワードプライマーは配列番号：8に示すポリヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号：9に示すポリヌクレオチド配列を有する。
NS5BはRNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子である。3’NTR領域は該ウイルスゲノムの3’非翻訳領域である。以前の研究は（Pan et al., J Vet Diag Inv, 2008）、CSFVの野生型には存在しない明瞭なTリッチ挿入物部位をCSFVワクチン型の3’NTRに示し、このことは、両遺伝子を野生型とワクチン株とを弁別する適切な遺伝子マーカーにする。
【００２８】
HRM曲線分析は製造業者の指示にしたがって実施できる。
リアルタイムPCRは以下のパラメーター：a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）55℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、及びe）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を用いて実施でき、その後に融解曲線分析（95℃で1秒間、65℃で15秒間及び持続的に95℃）及び45℃で30秒間の冷却が続く。
本発明の方法を用いて既知のCSFV株を特徴付けさらに識別することができる。既知のCSFV株には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ALD株、中国株（C株）、GPE株（日本株）、 C/HVRI株（中国由来、遺伝子型1.1)、リエムス（Riems）株（中国由来）、アルフォート（Alfort）187株、アメス（Ames）株、マルガリータ(Margarita)株、ベーカー(Baker)株、ニューヨーク(New York)株、パーデュー（Purdue）115株、パデルボーン（Paderborn）株、スプレダ（Spreda）株、オレゴン(Oregon)株、シンガー（Singer）株、オスロス（Osloss）株、モレダン（Moredun）株、及びフリッタース（Frijters）株、及び文献で見出すことができる他の株。
【００２９】
本発明はまた新規なCSFV株の同定を提供し、前記CSFVの配列は緊密な相同性を有する1つ以上のCSFV配列のいずれともアラインメントしない。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したCSFV株からCSFV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はCSFVゲノムのNS5B又は3’NTRに特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；d）該HRM曲線を分析及び比較する工程；及びe）新規なCSFV株を同定する工程。したがって、HRM曲線分析によって同定される新規なCSFV株は、該アンプリコンの配列を決定し、該CSFVアンプリコン配列を既知のCSFV配列とアラインメントすることによってさらに特徴付けることができる。新規なCSFV株は、既知のCSFV配列のいずれかと約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、又は約99％の配列同一性を有することができる。前記配列はヌクレオチド配列でもアミノ酸配列（アンプリコン配列の翻訳）でもよい。
【００３０】
本方法の実施態様の別の特徴は、感染動物とワクチン接種動物との間の弁別（DIVA）のための手段を提供する。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したCSFV株からCSFV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はCSFVゲノムのNS5B又は3’NTR領域に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びc）該HRM曲線を分析及び比較して、該cDNAがワクチン株又は動物に感染した株に由来するか否かを決定する工程。
本発明のある実施態様は、配列番号：8又は配列番号：9に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の実施態様はCSFV株を検出するためのキットを提供し、前記キットは、a）配列番号：8に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：9に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、及びb）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書を含む。
【００３１】
NDV
本発明のある実施態様はNDVの株を特徴付けるプロセス又は方法を提供し、前記は以下の工程を含む：a）動物から単離したNDV株からNDV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はNDVゲノムのF、NP、P、M、HN又はL遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及び
d）該HRM曲線を分析及び比較し、それによって該NDV株を特徴付ける工程。
該フォワード及びリバースプライマーは、既知のNDV株のF遺伝子、又はNP遺伝子、又はP遺伝子、又はM遺伝子、又はHN遺伝子、又はL遺伝子のポリヌクレオチド配列をそれぞれアラインメントし、F遺伝子、又はNP遺伝子、又はP遺伝子、又はM遺伝子、又はHN遺伝子、又はL遺伝子の保存領域を比較することによって選択できる。本実施態様のある特徴では、フォワードプライマーは配列番号：17又は31に示すポリヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号：18又は32に示すポリヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
融合（F）タンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合の媒介に必要であり、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質は細胞との付着及び細胞からの放出に必要である（Phillips, et al., Arch. Virol, 143:1993-2002, 1998; Tan et al., Arch. Virol, 155:63-70, 2010）。NDV株は、3つの遺伝子型、高度にビルレント（ベロジェニック）、中間（メゾジェニック）又は非ビルレント（レントジェニック）に分類される。伝統的には、NDVの遺伝子型はもっとも一般的には配列決定及びアミノ酸配列分析によって識別される。ベロジェニック及びメゾジェニック株のFタンパク質切断部位のコンセンサス配列は112(R/K)RQ(R/K)RF117であり、レントジェニックなF切断部位のコンセンサス配列は112(G/E)(K/R)Q(G/E)RL117である。最近の発見（Samal S et al. J. Gen. Virol. 2011）は、F切断部位の114位におけるグルタミンから塩基性残基アルギニン（R）への変更はウイルス複製を低下させ、さらにウイルス子孫を弱毒化させることを報告した。当該文献はまた、118位のイソロイシン（I）がバリンに置換されたとき病原性がさらに低下することを報告した。
HRM曲線分析は製造業者の指示にしたがって実施できる。
リアルタイムPCRは以下のパラメーター：a）95℃で3秒間の最初の変性、b）95℃で1分間の変性、c）60℃で1分間のアニーリング、d）72℃で1分間の伸長、及びe）b）からd）の工程の45回の繰り返しの工程を用いて実施でき、その後に融解曲線分析（95℃で1秒間、65℃で15秒間及び持続的に95℃）及び45℃で30秒間の冷却が続く。
【００３３】
本発明の方法を用いて既知のNDV株を特徴付け識別することができる。既知のNDV株には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アビニュー（Avinew）株、ラソタ（LaSota）株、MVP-ムクテスワー（Mukteswar）株、ND-B1株、韓国ダルグバン（Dalguban）株、ハーツ（Herts）33株、エセックス’（Essex’）70株、135/93株、617/83株、34/90株、ビューデットC（Beaudette C）株、D26株、MC110株、1154/98株、及び文献で報告され得る他のもの。
本発明はまた新規なNDV株の同定を提供し、前記NDVの配列は緊密な相同性を有する1つ以上のNDV配列のいずれともアラインメントしない。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したNDV株からNDV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はNDVゲノムのF、NP、P、M、HN又はL遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；d）該HRM曲線を分析及び比較する工程；及びe）新規なNDV株を同定する工程。したがって、HRM曲線分析によって同定される新規なNDV株は、該アンプリコンの配列を決定し、該NDVアンプリコン配列を既知のNDV配列とアラインメントすることによってさらに特徴付けることができる。新規なNDV株は、既知のNDV配列のいずれかと50％未満、60％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、90％未満、91％未満、92％未満、93％未満、94％未満、95％未満、96％未満、97％未満、98％未満、又は99％未満の配列同一性を有することができる。前記配列はヌクレオチド配列であり得る。前記配列はまたアミノ酸配列（該アンプリコン配列の翻訳）であり得る。
【００３４】
本方法の実施態様の別の特徴は、感染動物とワクチン接種動物との間の弁別（DIVA）のための手段を提供する。前記方法は以下の工程を含む：a）動物から単離したNDV株からNDV cDNAを作製する工程；b）該cDNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマー対に暴露してアンプリコンを得る工程（該プライマー対はNDVゲノムのF、NP、P、M、HN又はL遺伝子に特異的である）；c）該リアルタイムPCR直後に該アンプリコンを含む二本鎖生成物に対して高解像度融解（HRM）曲線分析を実施する工程；及びd）該HRM曲線を分析及び比較して、それによって該cDNAがワクチン株又は動物に感染した株に由来するか否かを決定する工程。
本発明のある実施態様は、配列番号：17、18、31又は32に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の実施態様はNDV株を検出するためのキットを提供し、前記キットは、a）配列番号：17に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：18に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、又は配列番号：31に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号：32に示す配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対、並びにb）リアルタイムPCRを実施するためのパラメーター及び条件を記載した指示書を含む。
【００３５】
免疫原性組成物及びワクチン
本発明はまたIBV、CSFV又はNDVの新規な株を単離することを提供する。新規なウイルスを単離する方法は当業者には周知である（例えば以下の文献中のプロトコルを参照されたい：Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1991, John Wiley and Sons, New York；Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）。
したがって、本発明はさらに新規なIBV、CSFV又はNDVを含む免疫原性組成物又はワクチンを包含する。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、ウイルス培養若しくは調製物（例えば不活化又は弱毒化されてある）又はウイルスの抗原若しくは免疫原を含むことができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンはさらに、1つ以上の医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤を含むことができる。
【００３６】
医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤は当業者には周知である。例えば医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤は、0.9％NaCl溶液（例えば生理食塩水）又はリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法のために用いることができる他の医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤には、ポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからin vitroで発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。有利には、該担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤はトランスフェクションを容易にするか、及び／又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善することができる。用量又は用量体積は一般的記載として本明細書で考察するが、当業界の情報と併せて本開示の熟読により当業者は煩雑な試験を実施することなく前記を決定できよう。
【００３７】
医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、ビヒクル又はアジュバントは油中水エマルジョンでもよい。適切な油中水エマルジョンの例には油を基剤とした油中水ワクチンエマルジョンが含まれ、前記は4℃で安定かつ液状であり以下を含む：6から50v/v％の抗原含有水相、好ましくは12から25 v/v％、50から94 v/v％の油相（前記は全部が又は一部分が非代謝性油（例えば鉱物油（例えばパラフィン油））及び／又は代謝性油（例えば植物油、又は脂肪酸、ポリオール若しくはアルコールエステル）を含む）、0.2から20p/v％の界面活性剤（好ましくは3から8p/v％）。後者は全部若しくは一部分が又は混合物としてポリグリセロールエステル（前記ポリグリセロールエステルは、好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシンオレエートである）、またはポリオキシエチレンリシン油又は他の水素添加ポリオキシエチレンリシン油である。油中水エマルジョンで用いることができる界面活性剤の例には、エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（TWEEN80(商標)）（AppliChem社（Cheshire, CT）から入手できる）及びソルビタンエステル（例えばソルビタンモノオレエート（SPAN80(商標)）、Sigma Aldrich（ST. Louis, MO）から入手できる）が含まれる。さらにまた、油中水エマルジョンに関しては米国特許6,919,084号（例えば実施例8）もまた参照されたい。いくつかの実施態様では、抗原含有水相は、1つ以上の緩衝剤を含む食塩水溶液を含む。適切な緩衝溶液の例はリン酸緩衝食塩水である。ある実施態様では、油中水エマルジョンは水/油/水三重エマルジョンである（例えば米国特許6,358,500号を参照されたい）。他の適切なエマルジョンの例は米国特許7,371,395号に記載されている。
【００３８】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンは、1つ以上の医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、ビヒクル又はアジュバントを含むか又は本質的に前記から成り得る。本発明の実施で使用される適切な担体又はアジュバントは以下である：（1）アクリル又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導ポリマー、（2）免疫刺激性配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al. 1996；WO98/16247）、（3）水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”（M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995）の147ページに記載）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載）、（4）第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質、例えばDDA、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン、又は（8）本出願に引用され、参照により含まれる任意の文書類で考察される他のアジュバント、又は（9）前記の任意の組み合わせ若しくは混合物。
本発明をこれから以下の非限定的な例によってさらに記述する。
実施例
下記Sambrookらの文献に記載されている標準的な分子生物学技術が本実験で用いられた：J. Sanbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989。
【実施例１】
【００３９】
IBVのHRM分析
2011年に種々の農場及び地域から合計56サンプルが、当施設（Vet Food Agro Diagnostics (M) Sdn. Bhd.）に日常的IBV診断のために付託された。受託された器官サンプルは肺、腎臓、盲腸扁桃、気管、及びプールされた器官に及ぶ。これらの器官はIBウイルスを保持すると疑われ、特異的ウイルスの検出及び確認のために送られてきた。これらのサンプルを全てホモゲナイズし、本実験では逆転写酵素PCR及びリアルタイムPCRによって試験した。
核酸抽出はトリゾール（Trizol）LS試薬（Invitrogen, USA）を用いて製造業者の標準的なプロトコルにしたがって実施した。
Mass及び793/Bの検出のための多重逆転写酵素（RT）PCR
以前に記載された方法（Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605, 1999）に由来する、S1遺伝子配列を基準にする多重法を、IBVの2つの型（793/B及びマサチューセッツ）の検出及び弁別に用いた。オリゴヌクレオチド（プライマー）配列は以下のとおりであった：XCE2-a：CTCTATAAACACCCTTACA（配列番号：1）； XCE2-b：CACTGGTAATTTTTCAGATGG（配列番号：2）（RT PCR工程）；XCE3-：CAGATTGCTTACAACCACC（配列番号：3）；BCE1+： AGTAGTTTTGTGTATAAACCA（配列番号：4）；DCE1+；ATACAATTATATCAAACCAGC（配列番号：5）； MCE1+：AATACTACTTTTACGTTACAC（配列番号：6）（ネステッド工程）（Adzhar et al., Avian Pathology, 25:817-836, 1996；Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605,1999）。反応条件は、逆転写酵素工程45℃で1時間、72℃で10分、前記に続く最初の変性工程の94℃で5分であった。増幅工程は94℃で1分、50℃で1.5分、72℃で2分を30回繰り返し、前記の後に72℃で2分の伸長が続いて。ネステッド工程は以下の条件で実施した：最初の変性が94℃で5分、増幅は94℃で1分、50℃で1.5分及び72℃で2分を合計30回、前記の後に最後の伸長が72℃で10続き、4℃で維持した。
IB-OXの検出のための一段階RT-qPCR
リアルタイムPCRは以下の反応体積で実施した：10μLのSensiFAST SYBRグリーンマスターミックス、0.8μLの20pmolフォワードプライマー（CTTATGCAGTAGTCAA）（配列番号：29）及びリバースプライマー（CACGTGGAATCATGCCTGTTAT）（配列番号：30）、0.2μLの逆転写酵素、0.4μLのRNAse阻害剤、4μLの鋳型、及び3.8μLのddH2O。リアルタイムPCR反応はライトサイクラー（LightCycler）480リアルタイムPCR装置（Roche, Germany）で実施した。反応条件は、逆転写酵素工程が45℃で10分、続いて最初の変性工程が94℃で2分であった。増幅工程は94℃で5秒、50℃で10秒及び伸長が72℃で5秒であった。融解曲線分析プロフィールは95℃で3秒、58℃で1分及び95℃で持続、前記に続いて45℃で30秒の冷却であった。
IBN-C90及びIB-QXを弁別するためのHRMアッセイ
アッセイは、IBのS1遺伝子の超可変領域を増幅する上記に記載したものと同じプライマー対（配列番号：29及び配列番号：30）を用いることによって確立された。アッセイは以下から成っていた：1μLの高度飽和蛍光染料（EvaGreen）、12.5μLのマスターミックス（Sensimix, Bioline）、2μLの25mM MgCl2、0.5μLのプライマー対、鋳型及びPCRグレードの水。サンプルを384ウェルのマイクロウェルプレートにロードし、リアルタイムPCR機器（LightCycler 480, Roche）でPCR増幅に付した。サーマルサイクリング反応は最初の変性（95℃で3秒）から成っていた。増幅は、変性（95℃で1分）、アニーリング（48℃で1分）及び伸長（72℃で1分）から成っていた。PCRの直ぐ後に高解像度融解曲線分析が続いた。サンプルの弁別は、既知の陽性コントロールを用い、それらの融解プロフィールと比較することによって達成された。
妥当性確認
RTリアルタイムPCRの感度：
参照物質の全ての濃度をUV分光光度計によって測定した。濃度は10pg/μLに対して標準化した。アッセイがもはや標的生物を検出できなくなるまで（検出シグナル無し）、終末点希釈（10倍連続希釈）を用いた。
特異性：
試験の特異性は、5つの他の生物（IBV 793/B、IBV Mass、IBD、NDV、CAV、レオウイルス）に対してプロトコルを試験することによって調べた。
配列決定：
配列決定（直接配列決定）のためのサンプルを商業的配列決定施設に送付した。PCRクリーンナップ及びゲル精製は製造業者（Analytik Jena, Germany）のプロトコルに基づいて実施した。得られた結果を参照物質の確認のためにBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）で分析した。
結果
試験した56サンプルのうち15（26.6％）が793/B株について陽性で、56のうち9（16％）がマサチューセッツ株について陽性であった。56のうち32（57％）がQX-様株について陽性で、56事例のうち18（32％）（以前にIBについて陰性と報告された）は、再試験したときにIB-QXについて陽性と判明した。
IB-QXの特異的検出についてのリアルタイムPCRアッセイの有効性確認
感度：
図2は、最初の濃度が10ng/μLのアッセイの感度を示す。最終希釈レベルの18.48で得られた閾値を基準にして、このアッセイは非常に感度が高く、100agの低濃度でウイルスを検出し得ると概算される。
増幅曲線−IB-QX（特異性）：
アッセイの特異性を他の近縁な生物（例えばIBマサチューセッツ、IB-793/B、NDV、IBV及びトリニューモウイルス（APV））を用いて試験した。図3は特異性アッセイから得られた増幅曲線を示す。
融解ピーク（Tm）−IB-QX（特異性）：
アッセイの特異性を他の近縁な生物（例えばIBマサチューセッツ、IB-793/B、NDV、IBV及びAPV）を用いて試験した。図4は特異性アッセイから得られた融解ピークを示す。
配列決定分析による確認：
IB-QX株のS1遺伝子を表すPCR生成物の配列を決定した。該配列は図5に示されている（配列番号：7）。この配列を用いGenBankのデータベース（NCBI）をBLASTで分析した。BLASTの結果のスクリーンショット及びBLAST分析によって決定されたヌクレオチド配列スコア一覧は図5に示されている。このBLAST分析によって、PCR分析から得られた融解ピーク及びバンドはIB-QXであることが確認される。
以前に報告されたジ腎病原性IB（MH5365/95）とGenbankの配列との比較を実施し、BLASTの結果のスクリーンショット及びBLAST分析によって決定されたヌクレオチド配列スコア一覧は図6に示されている。このBLAST分析によって、1995年に単離された腎病原性株は、タイで発見された最近のIB株と近縁であることが確認される。図7は、以前に単離されたマレーシアのIB事例（MH5365/95及びv9/04）に対する7つの近縁配列の配列同一性マトリックスを示す。
図8はIB-QX、IBnC90、Mass及び793/Bを比較するHRM分析を示す。図9はIB-QX及びIBnC90を比較/検出するHRM分析を示す。
IB-QXは維持されていたアーカイブサンプルから首尾よく検出された。試験したサンプルの26.8％が変種株（793/B株）について陽性で、16％が古典的IB（マサチューセッツ）について陽性であったが、一方、試験した57％が新規なQX様株（2004年以来循環している）について陽性であった。56事例のうち18（32％）（以前にIBについて陰性と報告された）は、再試験したときIB-QXについて陽性と判明した。コントロールの欠如及びQX株のための検出方法の欠如のために、2011年のIB事例のいくつかは陰性と間違って報告された。そこから発して、IB-QXを正確に検出する方法が、以前に刊行された論文から首尾よく改変された（H. J. Geerligs et al., Avian Pathology, 40(1):93-102, 2011）。3時間の通常的なPCRから54分のリアルタイムPCRアッセイ（わずか100ag/μLの核酸を検出できる）に方法を改変する変更が行われた。しかしながら、当該方法は高度に感受性で特異的であるが、新規なQX検出アッセイには限界があることが予想された。なぜならば、前記は家禽標本に存在し得る他の株を検出できず、IB株のいくつかの異なる型を同時に検出することもできないからである。
これらの結果が示すように、遺伝子スキャンニングソフトを利用する高解像度融解アッセイ（HRM）は、S1遺伝子の超可変領域を基準にして一ヌクレオチド相違の識別を可能にし、図8に示すように同時に4つの株を検出することができる（793/B、Mass、QX 及びIBnC90）。当該アッセイを実施して2つの株（QX及びIBnC90）を比較する可能性もまた図9に示されている。
【実施例２】
【００４０】
CSFVのHRM分析
この実験では、多様な野生型及びワクチン型のCSFV株を用いた。野生型株には、LBKと標識したアーカイブ保持サンプル及びVRIと標識したアーカイブ保持サンプル（LBKウイルスによるブタ-ブタチャレンジに由来する）が含まれていた。ワクチン型株には、Pestiffa（生ワクチン、C株）、MVP（生ワクチン、GPE株）、QYHC（生ワクチン）ZBC（生ワクチン）、YST（生ワクチン）、YSC（生ワクチン）が含まれていた。
逆転写酵素工程：
CSFの相補性DNAを作製する逆転写酵素工程を以下のように実施した：このアッセイはCSFV配列のNS5B及び3’NTR領域（ラピン化（lapinized）CSFVワクチン株に固有のTリッチ挿入物部位を包含する）を増幅するプライマーセットを用いることによって確立された。プライマーセットは以下のとおりである：フォワードプライマー5’-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3’（配列番号：8）（Y＝C又はT、R＝A 又はG）及びリバースプライマー5’-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’（配列番号：9）（Pan et al., 2008）。リアルタイムPCR混合物は以下から成っていた：10μLのSYBRグリーンマスターミックス（Bioline）、1.6μLの対応するプライマーセット（10μM）、0.2μLの逆転写酵素、0.4μLのRNAse阻害剤、及び各反応につき20μLの最終体積とするために3.8μLのPCRグレードの水。該PCR混合物を384ウェルマイクロプレートでLC480リアルタイムPCR装置（LC480, Roche）にてリアルタイムPCR増幅に付した。
CSFVの遺伝子型を識別するCSFV HRM曲線分析：
サンプルをHRM分析に付した。アッセイは以下から成っていた：1μLの高度飽和蛍光染料（EvaGreen）、12.5μLのHMRマスターミックス（Sensimix, Bioline）、2μLの25mM MgCl2、1μLのプライマー対（5μM）、2μLの鋳型及びPCRグレードの水。逆転写酵素工程で用いられるプライマー対と同じプライマー対（配列番号：8及び配列番号：9）をHRMアッセイに用いた。該プライマー対の固有性は、前記は野生型株について367bp及びワクチン型株について379bpのアンプリコンサイズを生じるであろうということである（前記は野生型とワクチン型株との厳密な識別を非常に明白にする）。サンプルを384ウェルのマイクロウェルプレートにロードし、リアルタイムPCR機器（LightCycler 480, Roche）でPCR増幅に付した。サーマルサイクリング反応は最初の変性（95℃で3秒）から成っていた。増幅は、変性（95℃で1分）、アニーリング（48℃で1分）及び伸長（72℃で1分）から成っていた。PCRの直ぐ後に高解像度融解曲線分析が続いた。遺伝子型の弁別は、既知の陽性コントロールを用い、それらの融解プロフィールと比較することによって達成された。
ヌクレオチド配列分析：
配列アッセンブリー及びヌクレオチド配列分析は、多様なバイオインフォーマティクスソフト、例えば多重配列アラインメント用ClustalX/W及びBioedit 7.0（Sequence Alignment Editor version 7.0.5.2, Tom Hall, US）を用いて実施した。全ての配列をGenbankデータベース（NCBI）に対してBLAST分析（blastn）に付した。
LBK配列（配列番号：10）及びblastの結果は図10に示されている。PCRは367bpのPCR生成物を生じた。LBKの配列決定及びblastの結果によってLBKは野生型ALD株であることが確認された。
VRI配列（配列番号：11）及びblastの結果は図11に示されている。PCRは367bpのPCR生成物を生じた。VRIの配列決定及びblastの結果によってVRIは野生型ALD株であることが確認された。
Pestiffa配列（配列番号：12）及びblastの結果は図12に示されている。PCRは379bpのPCR生成物を生じた。Pestiffaの配列決定及びblastの結果によって、前記はワクチン株、“中国”株（C株）に属することが確認された。
MVP配列（配列番号：13）及びblastの結果は図13に示されている。PCRは379bpのPCR生成物を生じた。MVPの配列決定及びblastの結果によって、前記はワクチン株GPE、日本株に属することが確認された。
QYHC配列（配列番号：14）及びblastの結果は図14に示されている。PCRは379bpのPCR生成物を生じた。QYHCの配列決定及びblastの結果によって、前記はワクチン株C/HVRI〈中国由来〉遺伝子型1.1に属することが確認された。
ZBC配列（配列番号：15）及びblastの結果は図15に示されている。PCRは379bpのPCR生成物を生じた。ZBCの配列決定及びblastの結果によって、前記はワクチン株C/HVRI〈中国由来〉遺伝子型1.1に属することが確認された。
YSC配列（配列番号：16）及びblastの結果は図16に示されている。PCRは379bpのPCR生成物を生じた。YSCの配列決定及びblastの結果によって、前記はワクチン株リエムス、中国株に属することが確認された。
CSFVのHRM曲線分析の結果：
本HRMアッセイは、ワクチン型（Pestiffa）と野生型株（LBK/VRI）とを弁別及び分類することができた。（図17）。該ヌクレオチド配列アラインメントの部分は、ワクチン型のTリッチ挿入物及び野生型におけるその欠失を示し、当該欠失は野生型（LBK）とワクチン型（Pestiffa）株の弁別をそれぞれ可能にする（図17）。該HRMアッセイはまた種々のワクチン型を弁別及び分類することができた（図18）。野生型（LBK）及びワクチン型（Pestiffa、ZBC、YSC、QYHC及びMVP）のヌクレオチド配列アラインメントの部分は、ワクチン型のTリッチ挿入物の種々のサイズ及び野生型におけるその欠失を示し、前記は野生型（LBK/VRI）とワクチン型（Pestiffa）株の弁別を可能にする（図19）。
妥当性確認−感度及び特異性：
アッセイ感度は、10ng/μLの最初のウイルス濃度を連続希釈することによって調べられた。得られた閾値を基準にして、この試験は感度が高く、100agの低濃度で標的を検出し得ると概算される。アッセイの感度は、他のブタウイルス（例えばPCV2、PRRS、パルボウイルス、SIV）を用いて試験された。我々の分析は、当該プライマー対はこれらの他のウイルスを増幅せずCSFVの検出に特異的であることを示した。
本実験は、このアッセイは、プライマー対が野生型（367bp）及びワクチン型（379bp）について異なるアンプリコンサイズを生じることができるので固有であることを示している。高解像度融解を核酸配列決定と併用するこの分析によって、本アッセイは野生型とワクチン型株の迅速な検出及び弁別を可能にすることが確認される。
【実施例３】
【００４１】
NDVのHRM分析
マレーシアの14の養鶏場で古典的NDV臨床徴候を示す動物から器官サンプルを収集した。前記サンプルは、気管、脳、骨髄、肺、腎、脾、小腸、リンパ節、盲腸扁桃、ファブリキウス嚢、前胃、肝、心、胸線及び器官プールから成っていた。トリゾールLS試薬（Invitrogen, USA）を用い製造業者の標準的なプロトコルにしたがうことによってこれら器官サンプルを核酸抽出に付した。リアルタイムPCRは以前に記載された方法を改変して確立された。リアルタイムPCR混合物は、10μLのSYBRグリーンマスターミックス、対応するプライマーセット、及び各反応につき20μLの最終体積とするためのPCRグレードの水から成っていた。該PCR混合物を384ウェルマイクロプレートでLC480リアルタイムPCR装置（LC480, Roche）にてリアルタイムPCR増幅に付した。融解ピーク及び融解曲線は、当該装置とともに提供されたアブソルートクォントソフト（Absolute Quant Software）を用いて観察された。
配列決定、アミノ酸配列分析及び系統発生樹構築
ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質遺伝子の増幅のために以下のプライマーセットを用いた：5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3'（フォワード）（配列番号：17）、5'-CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3'（リバース）（配列番号：18）。PCRプロトコルは以前に記載された方法を改変して確立された（Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010）。リアルタイムPCR混合物は、10μLのSYBRグリーンマスターミックス、対応するプライマーセット、及び各反応につき20μLの最終体積とするためのPCRグレードの水から成っていた。該PCR混合物を384ウェルマイクロプレートでLC480リアルタイムPCR装置（LC480, Roche）にてリアルタイムPCR増幅に付した。融解ピーク及び融解曲線は、当該装置とともに提供されたアブソルートクォントソフトを用いて観察された。サーマルプロフィールは以下のように設定した：95℃で3秒の前変性、続いて95℃の1分変性、56℃の1分アニーリング及び72℃の1分伸長の45回繰り返し。融解曲線分析をPCR生成物の特異性測定のために実施した。PCRサイクリング後に、サンプルを95℃で1秒さらに65℃で15秒加熱し、続いて直線的遷移速度で持続的に95℃に加熱した。リアルタイムPCRサイクルはライトサイクラー480（Roche(商標)）を用いて実施した。
同じプライマーセットを配列決定に用いた。予想されるアンプリコンサイズのPCR生成物を、PCRクリーンナップゲル抽出キットを製造業者（Analytik Jena, Germany）のプロトコルにわずかな改変を加えて用いることによって精製した。NDVの融合タンパク質遺伝子の配列決定は、ビッグダイターミネーター（BigDye Terminator）v3.1サイクルシークェンシングキットを用い商業的配列決定施設で実施された。全ての陽性事例が本物のニューカッスル病ウイルスであることを確認するために、当該配列のベーシックローカルアラインメント検索ツール（BLAST）検索をGenbankデータベースで実施した。当該配列の編集及びアッセンブリーは、バイオエディット配列アラインメントエディター（BioEdit Sequence Alignment Editor）バージョン7.0.5.2（Tom Hall, US）を用いて実施された。配列アラインメントはクラスタルX（ClustalX）を用いて実施された。系統発生樹は距離基準近隣結合法（distance-based neighbor joining method）を用いてメガ5ソフト（Mega 5 software, Biodesign Institute, Tempe, Arizona）により構築し、ブートストラップ法を用いアラインメントを1000回繰り返して計算することによって評価した。配列同一性マトリックスは、バイオエディット配列アラインメントエディターバージョン7.0.5.2（Tom Hall, USA）を用いて作製した。
DIVA（感染型v.s.ワクチン型弁別）アッセイ
陽性NDVサンプルをDIVAアッセイに付した。DIVAアッセイは以下のプライマーセットを用いることによって確立された：フォワードプライマー5’-CTG CCA CTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3’（配列番号：31、I＝イノシン）、リバースプライマー5’-CCT TGG TGA ITC TAT CCG IAG G-3’（配列番号：32、I＝イノシン）（前記プライマーセットはNDVの融合タンパク質の超可変領域を増幅する）。該アッセイは以下から成っていた：10μLの高度飽和蛍光染料マスターミックス（Roche）、2μLの25mM MgCl2、0.5μLのプライマー対、鋳型及びPCRグレードの水。サンプルを384ウェルのマイクロウェルプレートにロードし、リアルタイムPCR機器（LightCycler 480, Roche）でPCR増幅に付した。サーマルサイクリング反応は最初の変性（95℃で3秒）から成っていた。増幅は、変性（95℃で1分）、アニーリング（60℃で1分）及び伸長（72℃で1分）から成っていた。PCRの直ぐ後に高解像度融解曲線分析が続いた。真のNDVウイルス単離株対ワクチン株の弁別は、陽性コントロールとしてワクチンを用い、それらの融解曲線シグナチャーを比較することによって達成された。
高解像度融解（HRM）曲線分析によるNDV遺伝子型の弁別
陽性NDVサンプルをHRMアッセイに付した。HRMアッセイは、NDVの融合タンパク質を増幅するプライマーセット（配列番号：17及び配列番号：18）を用いることによって確立された。アッセイは以下から成っていた：10μLの高度飽和蛍光染料マスターミックス（Roche）、2μLの25mM MgCl2、0.5μLのプライマー対、鋳型及びPCRグレードの水。サンプルを384ウェルのマイクロウェルプレートにロードし、リアルタイムPCR機器（LightCycler 480, Roche）でPCR増幅に付した。サーマルサイクリング反応は最初の変性（95℃で3秒）から成っていた。増幅は、変性（95℃で1分）、アニーリング（60℃で1分）及び伸長（72℃で1分）から成っていた。PCRの直ぐ後に高解像度融解曲線分析が続いた。NDV遺伝子型の弁別は、陽性コントロールとして既知の陽性NDV遺伝子型を用い、それらの融解曲線シグナチャーを比較することによって達成された。アッセイの確認は、陽性NDV単離株を配列決定することによって実施された。
有効性の確認
ISO17025及びMIQE（定量的リアルタイムPCR実験刊行物についての最小限情報（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments））に基づく典型的な有効性確認は、試験されるべき8つのパラメーターを有する（分析感度、特異性、反復性、回収、再現性、頑丈性/堅固性、及び純度/濃度）。アッセイ開発の完了時にプロトコルの簡単な有効性確認を実施し、その分析感度、特異性の識別、並びに配列決定及びアミノ酸の配列分析による確認を行った。
分析感度：
本実験の目的は、検出限界(LOD)/検出可能な問題の標的因子の最低濃度を決定することである。参照物質の全ての濃度をUV分光光度計で測定した。濃度は10pg/μLに対して標準化した。アッセイがもはや標的生物を検出できなくなるまで（検出シグナル無し）、終末点希釈（10倍連続希釈）を用いた。
特異性：
本実験の目的は、他の感染性因子の存在下で問題の標的因子を検出する本アッセイの特異性を評価することである。試験の特異性は、5つの他の生物（伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファビリキウス嚢病ウイルス、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、トリニューモウイルス)に対して該プロトコルを試験することによって調べた。このパラメーターに合格するためには、アッセイは同じ検出シグナル（融解ピーク）を生じるべきではなく、又は他の生物に対して検出シグナルを一切生じてはならない。本方法は、他の細菌叢の存在下ですら問題の標的因子のみを検出するために十分に特異的でなければならない。
配列決定及びアミノ酸配列分析：
このパラメーターは上記に記載したように処理された。
結果
サンプル採取
14全ての農場のサンプルがNDVについて陽性であることが判明した。
配列決定、アミノ酸配列分析、系統発生樹構築
BLAST分析は、全ての配列サンプルが、Genbankの他の配列と比較したとき真のNDV事例であることを示した。14のマレーシアNDV単離株の融合（F）遺伝子のアミノ酸配列分析は、単離株のうちの11がベロジェニックウイルスに、3つがレントジェニックに分類されることを示した。11のベロジェニック株は、112R-R-R-K-R-F117（配列番号：33）のF切断部位モチーフを有し、一方、レントジェニック株の2つは112G-R-Q-G-R-L117（配列番号：34）のF切断部位モチーフを有するが、1つの配列はF2タンパク質のC-末端に112G-K-Q-G-R-L117（配列番号：35）のF切断部位モチーフ及びF1タンパク質のN-末端のアミノ酸117位にフェニルアラニン（F）残基を有していた（Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010）。系統発生分析によって、11のマレーシア単離株は遺伝子型VIIdとともに緊密なクラスターを生成し、1つのマレーシア単離株は遺伝子型Iと一緒に分類され、我々の単離株のうち2つは遺伝子型IIとともに分類されることが示された。分類されて遺伝子型VIIdを形成する11のマレーシア単離株のうち、10（F1、F2、F3、F4、F9、F10、F11、F12、F13、F14）は、2004−2005年及び2007年のニューカッスル病集団発生の原因である他のマレーシア単離株（以前にUPMの研究者が報告した）と97.9から98.7％の配列同一性の類似性を有していた。これらの単離株の全てがインドネシア株（cocktoo/14698/90）と91−92％の類似性を有していた。遺伝子型VIIdとともに分類されたマレーシア単離株の1つ（F8）は中国株（Ch/2000）と96.1％の類似性を有していた。この実験の3つのレントジェニック株のうち、2つ（F5、F6）はラソタ株（遺伝子型2）と97.4−97.5％のヌクレオチド配列類似性有していたが、一方、1つの単離株（F7）はUlster/67株とほぼ88.8％のヌクレオチド配列類似性を有していた。
DIVA（感染型対ワクチン型の弁別）アッセイ
全ての陽性マレーシア単離株に対するDIVAアッセイによって、それらはアビニュー又はラソタと全く関係がないことが示された（図24）。本アッセイは、当該装置とともに供給された遺伝子スキャンニングソフトを用いて分析された。当該ソフトのクラスターアルゴリズムは、全ての融解曲線の標準化を可能にし、続いて前記ソフトは同じ融解シグナチャーを有する全てのサンプル及びデータのクラスターを生成する。
高解像度融解（HRM）曲線分析によるNDV遺伝子型の弁別
NDV遺伝子型を識別するHRMアッセイは、遺伝子スキャンニング分析及びアミノ酸配列分析と相関性を示した（図25）。上記に記載したDIVAアッセイと同様に、Rocheの同じ遺伝子スキャンニングソフトがデータの分析に用いられた。14のマレーシアNDV単離株の融合（F）遺伝子のアミノ酸配列分析は、前記単離株のうち11がベロジェニックウイルスに、3つがレントジェニックに分類されることを示した。この11のベロジェニック株は112 R-R-R-K-R-F 117（配列番号：33）のF切断部位モチーフを有し、一方、レントジェニック株の2つは112 G-R-Q-G-R-L 117（配列番号：34）のF切断部位モチーフを有し、1つの配列はF2タンパク質のC-末端に112G-K-Q-G-R-L117（配列番号：35）のF切断部位モチーフ及びF1タンパク質のN-末端のアミノ酸117位にフェニルアラニン（F）残基を有していた。
妥当性確認
このアッセイは総反応体積20μLについて0.05agでも検出することができた。プライマーはNDV F遺伝子に特異的であり、この方法論に記載した他の生物とは全く関係がなかった。
HRMを用いたさらなるNDVワクチンの分析
さらなるNDVワクチン株をHRMによって分析した。これらのワクチンには以下が含まれる：アビニュー（Merial Limited）、クローン30（Intervet）、KBNP-ダルグバン（KBNP, Korea）、ND-B1（Merial Limited）、及びムクテスワー（Mukteswar）（Malaysian Vaccine Pharmaceuticals）。
アッセイは以下から成っていた：1μLの高度飽和蛍光染料マスターミックス、2μLの25mM MgCl2、12.5μLのHMRマスターミックス、1μLのプライマー対（配列番号：31及び32）、鋳型及びPCRグレードの水。サンプルを384ウェルのマイクロウェルプレートにロードし、リアルタイムPCR機器（LightCycler 480, Roche）でPCR増幅に付した。サーマルサイクリング反応は最初の変性（95℃で3秒）から成っていた。増幅は、変性（95℃で1分）、アニーリング（56℃で1分）及び伸長（72℃で1分）から成っていた。PCRの直ぐ後に高解像度融解曲線分析が続いた。
HRMアッセイは試験したワクチン型を弁別することができた（図20）。NDVのこの5つのワクチン型株の全ゲノムのヌクレオチド配列アラインメントの一部分が図21に示されている。多様なヌクレオチド相違がウイルスゲノムの全体を通して観察できる（前記相違が融解曲線の差異の理由である）。NDVの5ワクチン型株の融合タンパク質遺伝子のアミノ酸配列の多重アラインメントは図22に示されている。同様に多様な相違が種々の部位で観察できる。
ワクチン型NDVの全ゲノムの配列同一性マトリックス及びワクチン型NDVの融合（F）タンパク質のアミノ酸の配列同一性マトリックスは図23に示されている。
これらの結果は、HRM（高解像度融解）分析は、各ワクチン型についてそのものだけのグループに当該融解曲線を明確に分類できることを示した。5つのワクチン型の全ゲノム配列及び融合タンパク質遺伝子のアミノ酸配列の多重アラインメントは、ゲノム全体にわたる多数の部位における種々のヌクレオチド多様化を示した。これら5つの実験で、KBNPワクチン型は、ヌクレオチド4500位から4506位に6ヌクレオチドの挿入“CGTACG”を示した。試験した他のワクチンのいずれもこの配列をもたなかった。KBNPはラソタ株の組換え体（KBNP-C4152R2L）であると報告されている。前記組換え体では、融合（F）及びヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子は、F切断モチーフを112RRQKR116（配列番号：45）から112GRQAR116（配列番号：46）に変異させることによってVIIdウイルス遺伝子型由来のF及びHN遺伝子で入れ替えられている。前記6ヌクレオチド配列は、マーカーとしての“6のルール”を破壊することなく、弱毒化のためにマトリックスタンパク質とF遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入された（Cho et al., Clinical and Vaccine Immunology, 15(10):1572-9, 2008）。これはKBNPワクチンとアビニューとを識別するための良好なマーカーとして機能する。同様に、他のワクチンもHRMによるワクチン型識別を可能にするヌクレオチド相違を多様な部位に有する。
同一性マトリックスツールによる全ウイルスゲノムのための配列のスコア付けによって、アビニューとNDクローン30（Intervet）との間に99％、アビニューとムクテスワー（MVP）との間に87.7％、アビニューとKBNP（Korea Dalguban）との間に94.9％、及びアビニューとND-B1（Merial）との間に99.5％の類似性が示された。
同一性マトリックスツールによる当該ワクチン型の融合タンパク質遺伝子のためのアミノ酸配列のスコア付けによって、アビニューとNDクローン30（Intervet）との間に99％、アビニューとムクテスワー（MVP）との間に88.9％、アビニューとKBNP（Korea Dalguban）との間に88.6％、及びアビニューとND-B1（Merial）との間に99％の類似性が示された。
このスコア付けマトリックスは、NDVウイルス間の非類似性は、ヌクレオチド非類似性に基づいてアビニューとムクテスワー（MVP）との間では12.7％で、さらにその融合タンパク質遺伝子のアミノ酸配列非類似性に基づいてアビニューとKBNP（Korea Dalguban）との間では11.4％で及びアビニューとムクテスワー（MVP）との間では11．1％で変動すると示唆している。
有効性確認を実施して本アッセイを評価し、本アッセイは感度及び特異性に関してその意図する使用に適合することが見出された。
これらの結果はさらに、本HRMアッセイは固有の融解曲線を生じて各ワクチン型を明瞭に同定することができることを示した。
【図７】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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