(57)【要約】  本発明は、遺伝的な編集ツール及び遺伝子工学の方法の分野である。これは、特定の遺伝子疾患、特に、ハンチントン病のようないわゆる「トリプレットリピート病」の原因である、染色体中の反復性の高いモチーフを短縮するために設計されたレアカットヌクレアーゼの操作に関する。本発明は、反復モチーフを短縮する方法、反復障害を受けた遺伝子の反復モチーフを短縮するために使用するレアカットエンドヌクレアーゼ、それをコードするポリヌクレオチド及びベクター、並びに、得られる医薬組成物を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復障害を受けた遺伝子中のポリヌクレオチド反復を短縮するために、細胞中で使用するレアカットエンドヌクレアーゼであって、反復配列を特異的に切断するために操作されたものであり、反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識することを特徴とする、レアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項２】
配列反復に隣接する少なくとも１０核酸塩基にわたる標的配列、及び、反復配列内の少なくとも５核酸塩基にわたる標的配列を認識する、請求項１に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項３】
反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識する結合ドメインと、反復配列内を切断するエンドヌクレアーゼドメインとを含むキメラエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記結合ドメインが、操作されたＴＡＬＥ、ＭＢＢＢＤ又はＺＦ結合ドメインである、請求項３に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記エンドヌクレアーゼドメインが、Ｉ−ＴｅｖＩ、ＮｕｃＡ、ＣｏｌＥ７又はＦｏｋ−１からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがＣａｓ９であって、ここで、前記標的配列の認識が、前記標的配列とハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡによって得られる、請求項１に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記標的配列が、配列番号１〜配列番号３からなる群から選択される配列内に存在する、請求項１に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項８】
配列番号８、１０及び１５と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項９】
反復疾患の治療又は予防のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項１０】
ハンチントン病を治療又は予防するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレアカットエンドヌクレアーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのレアカットエンドヌクレアーゼ、又は、請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
生細胞へ反復障害を受けた遺伝子配列内の反復配列を短縮させる方法であって、
（ａ）反復配列に隣接する領域を含む標的配列を選択し；
（ｂ）前記標的配列に結合することができ、かつ前記標的配列を切断することができるレアカットエンドヌクレアーゼを提供し；
（ｃ）前記細胞へ、前記レアカットエンドヌクレアーゼを導入し；
その結果、前記ＤＮＡ結合ヌクレアーゼが反復配列内の切断を誘導し、前記反復配列の短縮を行う修復工程を誘導する、方法。
【請求項１５】
前記反復配列の短縮を行う修復工程が、ＳＳＡ（一本鎖アニーリング）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のものである、請求項１５に記載の細胞の遺伝子配列内の反復配列を短縮させる方法。
【請求項１７】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのレアカットエンドヌクレアーゼ、又は、請求項１３に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
【請求項１８】
哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の単離細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子編集ツール及びその使用の分野である。特定の遺伝性疾患、特に、ハンチントン病などのいわゆる「トリプレットリピート病」の起源である、染色体中の高反復モチーフを短縮するために設計されたレアカットエンドヌクレアーゼの技術に関する。本発明は、反復モチーフを短縮する方法、反復障害を受けた遺伝子中の反復モチーフを短縮するために使用するレアカットエンドヌクレアーゼ、それをコードするポリヌクレオチド及びベクター、並びに、得られた医薬組成物を包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１９９０年代初頭以来、不安定なヌクレオチド（マイクロサテライト）反復の拡大、特にトリヌクレオチド反復が、特定のヒト疾患の新たな潜在的な突然変異メカニズムとして同定された。長年にわたり、いくつかの追加の進行性及び神経筋疾患が、トリヌクレオチド反復の挿入又は重複のいずれか、並びに、不安定なテトラ−、ペンタ−、ヘキサヌクレオチド、及びそれより長い反復に起因することが同定された（Ｍｉｒｋｉｎ  ２００７）。このポリヌクレオチド反復の挿入又は重複は、タンパク質の機能欠損、障害につながる機能のＲＮＡ毒性の増加又は機能のタンパク質毒性の増加を誘導しうる。このような障害の例としては、ハンチントン病、遺伝性運動失調、脆弱Ｘ症候群、遺伝性筋ジストロフィーに共通の筋緊張性ジストロフィー、優性遺伝性運動失調群、及び、ごく最近としては、前頭側頭型認知症／筋萎縮性側索硬化症の高頻度の原因であるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子中の不安定なヘキサヌクレオチドリピートを含んでいる（（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｒｅｎｔｏｎ，  Ｍａｊｏｕｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）（総説（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を参照）。
【０００３】
ほとんどの反復拡張障害の治療の選択肢は、非常に限られている。様々な神経変性疾患のために想定されている最も魅力的な治療戦略の一つは、遺伝子治療である。実際に、拡大した反復の発現を遮断するためのいくつかの戦略が開発されている。特に、細胞内のＲＮＡ干渉技術を用いた変異体遺伝子をサイレンシングが、タンパク質又はＲＮＡの毒性作用を防止するために実用化されている（Ｗａｎｇ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｍａｃｈｉｄａ，Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００６；ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。しかし、基本的にはＲＮＡ干渉の設計は、正常配列と反復拡大配列との区別できず、変異体及び野生型遺伝子の両方を、同時に減少させる（Ｃａｐｌｅｎ，Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。しかしながら、ハンチンチンタンパク質は広範に発現しており、脳における神経機能及び生存に必要とされる（Ｄｕｙａｏ，Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；  Ｄｒａｇａｔｓｉｓ，Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。このように、影響しない野生型タンパク質の発現を残す一方で、変異遺伝子の特異的発現を低減することが重要である。
【０００４】
近年、ジンクフィンガータンパク質は、ハンチントン病の原因であるハンチンチン遺伝子のポリトリヌクレオチド反復に結合するように設計された。ジンクフィンガーは、短い反復配列と比較して、好ましくは反復拡大したハンチンチン遺伝子を抑制するための最適な立体構造を得るための適切なリンカーを有する長鎖へと鎖状に連結された。この戦略は、野生型遺伝子と比較して変異体遺伝子発現をより効率的に抑制することができる。しかしながら、その抑制は、遺伝子治療のタンパク質レベルを減少させるのに十分であるかどうかは知られていない（Ｇａｒｒｉｇａ−Ｃａｎｕｔ，Ａｇｕｓｔｉｎ−Ｐａｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ、国際出願：国際公開第２０１３／１３０８２４号）。
【０００５】
以前の研究（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）は、反復配列内での切断事象の誘導が、トリヌクレオチド反復配列の短縮と関連していたことを示唆しており、それは、２つの異なるメカニズムによって説明され得る：（１）ブレークの両端は、テンプレートに侵入するために利用可能であるが、それらは、テンプレートに相同の反復配列を運搬するので、テンプレート内の任意の場所に侵入することが可能である；又は、（２）一端のみがテンプレートに侵入し、新たに合成された鎖はそのテンプレートから外れるが、反復を含む他端とアニールすることが可能である（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。しかし、ゲノム内の高頻度の反復配列が原因で、該反復配列に特異的となるように設計された、操作されたＤＮＡ結合ヌクレアーゼは、ヒトゲノム全体のいくつかの位置で、オフサイト突然変異誘発を誘導する可能性がある。したがって、所望のゲノム位置の反復配列のみを切断する能力が非常に望ましい。
【０００６】
上記の弱点を克服するために、本発明者らは、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼを使用して、拡大したポリヌクレオチド反復の数を減少させ、一方でゲノムの完全性及び補正された遺伝子の機能は維持する、遺伝子治療戦略を開発した。この戦略は、主に、トリプレット反復障害に関連する反復配列を特異的に標的とするゲノム配列の選択を伴うＤＮＡ結合ヌクレアーゼの設計に依存している。
【発明の概要】
【０００７】
一般的な態様において、本発明は、好ましくは、反復疾患を受けた特定の遺伝子における、ポリヌクレオチド反復を短縮するために使用するレアカットエンドヌクレアーゼに関する。特に、レアカットエンドヌクレアーゼは、反復配列を特異的に切断するように操作されており、該レアカットエンドヌクレアーゼは反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識することを特徴とする。本発明は、特定の領域の高度に反復したモチーフ内の短縮を誘導するために使用されるレアカットエンドヌクレアーゼを設計する方法に関する。好ましくは、該レアカットエンドヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼが特異的に選択された標的配列に結合して、反復配列を切断するように、反復配列に隣接する領域を含む配列を標的とする。反復配列の切断は、特定の遺伝子内の反復配列の短縮へと導く修復プロセスを誘導し、このように、おおよそ野生型の構成へと拡張した反復配列を減少することを誘導する。好ましくは、該レアカットエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡが反復配列に隣接する領域を含む標的配列にハイブリダイズすることを特徴とする反復配列を特異的に切断するＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体である。好ましくは、該レアカットエンドヌクレアーゼは、モジュ−ル型ＤＮＡ結合ヌクレアーゼであって、ＴＡＬＥ、ＭＢＢＢＤ、エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合したジンクフィンガー（ＺＦ）ドメイン等のＤＮＡ結合ドメインを含んでいる。該ＤＮＡ結合ヌクレアーゼは、単量体又は二量体として作用しうる。二量体のＤＮＡ結合ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの触媒ドメインに融合した反復配列に隣接する配列に結合可能な第一のDNA結合ドメイン、及び、ヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した反復配列に結合可能な第二のＤＮＡ結合ドメインを含む（図１を参照）。二量体として作用する該ヌクレアーゼ触媒ドメインは、好ましくは、ＦｏｋＩ触媒ドメインである。本発明のレアカットエンドヌクレアーゼは、高度に反復したモチーフ領域を短縮することによって、ハンチントン病等の反復疾患を治療又は予防するために特に適している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】反復配列を特異的に切断するために操作されたＴＡＬＥヌクレアーゼの略図。
【図２】反復配列を特異的に切断するように操作された二量体ＴＡＬＥヌクレアーゼの使用の概略図。一方のＴＡＬＥヌクレアーゼハーフドメインは、反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識するように操作され、他方のＴＡＬＥヌクレアーゼハーフドメインは、二量体ＴＡＬＥヌクレアーゼが反復配列を切断するように、反復配列内の標的配列を認識するように操作されている。反復配列の切断は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）プロセス等の修復プロセスを誘発し、その結果、反復の短縮を生じる。
【図３】反復配列を特異的に切断するように操作された単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼの使用の概略図。反復配列を特異的に切断するよう操作された単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼは、反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識する。反復配列の切断は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）プロセス等の修復プロセスを誘発し、その結果、反復の短縮を生じる。
【図４】反復配列を特異的に切断するように操作されたＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体の使用の概略図。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体が反復配列を切断するように、反復配列に隣接する領域を含む標的配列を特異的に認識するように操作されている。反復配列の切断は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）プロセス等の修復プロセスを誘発し、その結果、反復の短縮を生じる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
表１：２つのＴＡＬＥＮ対が標的とする配列のリスト。反復配列に隣接するＴＡＬＥＮが標的とする１６塩基対配列（位置Ｔ０は省略されている）には下線が引かれている。
【００１０】
表２：以前記載されている（国際ＰＣＴ出願  国際公開第２００４／０６７７３６及び  （Ｅｐｉｎａｔ，  Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３；  Ｃｈａｍｅｓ，  Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ａｒｎｏｕｌｄ，  Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｒｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６））３７℃における発明者らの酵母ＳＳＡアッセイでのＴＡＬＥＮの活性。−は、検出可能な活性が無いことを表す。＋は弱い活性を示す。＋＋は高い活性を表す。ｎ．ａ．は使用可能なデータがないことを示す。
【００１１】
本発明の説明
本明細書に特異的に定義しない限り、使用される全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、及び分子生物学の分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１２】
本発明の実施は、他に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を採用し、それは、当該分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡＵＳＵＢＥＬ，  ２０００，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４６８３１９５号明細書；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；  Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）  ａｎｄ  Ｖｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；及び、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照すること。
【００１３】
ポリヌクレオチド反復を短縮するために使用する操作されたレアカットエンドヌクレアーゼ
本発明は、特異的に反復配列を認識し、切断することができるレアカットエンドヌクレアーゼに関する。オフサイト標的化を回避するために、本発明者らは、反復配列を特異的に切断するレアカットエンドヌクレアーゼを操作するものであって、該レアカットエンドヌクレアーゼは、反復配列に隣接する領域を含む標的配列を認識することを特徴としている。反復配列の切断は、好ましくは反復障害を受けた遺伝子中に存在する、ポリヌクレオチド反復の短縮を導く修復プロセスを誘発する。特定の実施形態において、本発明は、特異的に反復配列を切断するレアカットエンドヌクレアーゼを操作する方法に関する。特に、該方法は、以下の工程を含む：（ａ）反復配列に隣接する領域を含む標的配列を選択すること；（ｂ）該標的配列を認識し、反復配列を切断することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを操作すること。
【００１４】
本発明の標的配列は、染色体、エピソーム、ミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノム等の細胞小器官ゲノム、又は、例えば感染ウイルスゲノム、プラスミド、エピソーム、トランスポゾン等の遺伝物質の本体に独立して存在しうる遺伝物質中に存在しうる。標的核酸配列は、遺伝子のコード配列中、例えば、リーダー配列、トレーラー配列若しくはイントロン等の転写される非コード配列中、又は、コード配列の上流又は下流のいずれかの非転写配列内に存在しうる。核酸標的配列は、該標的の一つの鎖の５’から３’の配列により定義される。特に、標的配列は、反復配列の一部とそれに隣接する配列を含む。
【００１５】
反復配列は、トリヌクレオチド反復であり得、しかし、テトラ−、ペンタ−、又はヘキサヌクレオチドでもありうる。非限定的な例としては、該反復配列は、（ＣＧＣ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＣＴＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＡＴＴＣＴ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎであり得、ここで、ｎが、１〜２００００、好ましくは、１０〜１５０００、好ましくは、２０以上を含み得る（総説を参照：（Ｏｒｒ  ａｎｄ  Ｚｏｇｈｂｉ  ２００７））。該標的配列は、少なくとも３、好ましくは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドを含む反復配列の一部を含む。
【００１６】
反復配列に隣接する領域は、レアカットエンドヌクレアーゼによって特異的に認識されるのに十分長くする必要がある。反復配列に隣接する領域は、少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１５ヌクレオチドを含む。より好ましい実施形態において、該隣接配列は、５〜１０個のヌクレオチドを含む。隣接配列は、反復配列に対して５’又は３’領域に存在しうる。該標的配列は、好ましくは、不安定なリピートの拡大が神経障害を引き起こしうる遺伝子配列内に存在する。非限定的な例として、該遺伝子配列は、以下からなる群から選択することができる：（ＣＧＧ）ｎ反復単位を含む脆弱Ｘ精神遅滞１遺伝子（ＦＭＲ１、ＭＩＭ番号：３０９５５０、ＮＧ＿００７５２９．１）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列；  （ＣＣＧ）ｎ反復単位を含む脆弱Ｘ精神遅滞２遺伝子（ＦＭＲ２、ＭＩＭ番号：３００８０６、ＮＧ＿０１６３１３．１）の５’ＵＴＲ配列、（ＧＡＡ）ｎ反復単位を含むフリードライヒ失調症１遺伝子（ＦＲＤＡ、ＭＩＭ番号：６０６８２９、ＮＧ＿００８８４５．２）の第１イントロン；  （ＣＴＧ）ｎ反復単位を含む筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ遺伝子（ＤＭＰＫ、ＭＩＭ番号６０５３７７、ＮＧ＿００９７８４．１）の３’ＵＴＲ配列；  （ＣＣＴＧ）ｎ反復単位を含むジンクフィンガー９遺伝子（ＺＮＦ９、ＭＩＭ番号：６０２６６８、ＮＧ＿０１１９０２．１）の第１イントロン；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むアタキシン８（ＡＴＸＮ８、ＭＩＭ番号：６１３２８９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ６４１２５４．１）；  （ＣＴＧ）ｎ反復単位を含むアタキシン８反対鎖（ＡＴＸＮ８ＯＳ、ＭＩＭ番号：６０３６８０、ＮＲ＿００２７１７．２）；  （ＣＡＧＴ）ｎ反復単位を含むアタキシン１０遺伝子（ＡＴＸＮ１０、ＭＩＭ番号：６１１１５０、ＮＧ＿０１６２１２．１）のイントロン９；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むタンパク質ホスファターゼ２調節サブユニットＢベータ遺伝子（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＭＩＭ番号：６０４３２５、ＮＧ＿０１１５７０．１）の５’ＵＴＲ配列；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ、ＭＩＭ番号：６１３００４、ＮＧ＿００９３７８．１）のＮ末端；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むアタキシン１（ＡＴＸＮ１、ＭＩＭ番号：６０１５５６、ＮＧ＿０１１５７１．１）；  （ＣＡＧ）ｎ反復を含むアタキシン２（ＡＴＸＮ２；ＭＩＭ番号：６０１５１７、ＮＧ＿０１１５７２．１）；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むアタキシン３（ＡＴＸＮ３、ＭＩＭ番号：６０７０４７、ＮＧ＿００８１９８．１）；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むカルシウムチャネル電位依存性Ｐ／Ｑ型α−１Ａサブユニット遺伝子（ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＭＩＭ番号：６０１０１１、ＮＣ＿００００１９．９）のエクソン４７；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むアタキシン７（ＡＴＸＮ７、ＭＩＭ番号：６０７６４０、ＮＧ＿００８２２７．１）；  （ＣＡＧ）ｎ及び／又は（ＣＡＡ）ｎ反復単位を含むＴＡＴＡボックス結合タンパク質遺伝子（ＴＢＰ、ＭＩＭ番号：６００７５、ＮＧ＿００８１６５．１）；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含む脊髄及びアンドロゲン受容体遺伝子（ＡＲ、ＭＩＭ番号：３１３７００、ＮＧ＿００９０���４．２）のエクソン１；  （ＣＡＧ）ｎ反復単位を含むアトロフィン１遺伝子（ＡＴＮ１、ＭＩＭ番号：６０７４６２、ＮＧ＿００８０４７．１）及びその相同体。
【００１７】
より好ましい実施形態では、該標的配列は、ハンチンチンタンパク質をコードする配列（配列番号１）内、好ましくは、ハンチンチンタンパク質のN末端部をコードする配列内（配列番号２）にて選択されるものであって、より好ましくは、標的配列は、配列番号３内にて選択される。
【００１８】
「レアカットエンドヌクレアーゼ」 (rare-cutting endonuclease)とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸の間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型又は変異体酵素を意味する。レアカットエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さ１０〜４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常、長さが１０〜３５塩基対の範囲の核酸標的部位を認識する。本発明のエンドヌクレアーゼは、さらに「標的配列」と呼ばれる、特異的なポリヌクレオチド配列における核酸を認識して切断する。レアカットエンドヌクレアーゼは、特異的なポリヌクレオチド配列において認識し、一本鎖又は二本鎖ブレーク (break)を認識し、生成することができる。
【００１９】
本発明に係るレアカットエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。最近、ＩＩ型原核生物のＣＲＩＳＰＲ（クラスター定間隔ショートパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ））適応免疫系（総説を参照（Ｓｏｒｅｋ，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３））から、ＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；  Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；  Ｃｏｎｇ，Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；  Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を基礎とした、新しいゲノム工学ツールが開発されている。ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＡＳ）システムは、細菌で最初に発見され、外来ＤＮＡ、ウイルス又はプラスミドに対する防御として機能する。ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム工学は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる、短い配列モチーフにしばしば隣接する標的配列を選択することにより、最初は進行する。標的配列の選択に続き、この標的配列に相補的な特異的ｃｒＲＮＡが操作される。ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムで必要とされるトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと対になり、提供されるＣａｓ９タンパク質に結合した。Ｃａｓ９は、分子アンカーとして機能し、ｔｒａｃＲＮＡとｃＲＮＡの塩基対形成を促進する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。この三元複合体において、二重のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造は、同族の標的配列にエンドヌクレアーゼＣａｓ９を導くガイドＲＮＡとして機能する。本発明において、ガイドＲＮＡは、反復配列に隣接する領域を含む標的配列にハイブリダイズすることができる。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的の認識は、標的配列とｃｒＲＮＡ間の相同性に対する標的配列をスキャンすることによって開始される。標的配列−ｃｒＲＮＡの相補性に加えて、ＤＮＡのターゲティングは、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−ＰＡＭ）の存在を必要とする。二重ＲＮＡと標的配列との間のペアリング後、Ｃａｓ９は、その後、ＰＡＭモチーフの３塩基上流で、平滑末端二本鎖切断を導入する（Ｇａｒｎｅａｕ，Ｄｕｐｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。本発明によれば、二重ＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）と反復配列に隣接する領域を含む標的配列とのハイブリダイゼーションに続き、Ｃａｓ９は反復配列を切断する（図４参照）。
【００２０】
レアカットエンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼの名称で知られているホーミングエンドヌクレアーゼでもあり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術でよく知られている（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さ１２〜４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は、長さ１４〜４０ｂｐ対の範囲でＤＮＡ標的部位を認識する。本発明のホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、又はＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当しうる。本発明の好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩ変異型でありうる。「変異体」エンドヌクレアーゼ、すなわち、自然に自然界には存在せず、遺伝子工学的に又はランダム突然変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼによって認識されるものとは異なるDNA配列に結合することができる（国際出願  国際公開第２００６／０９７８５４号を参照）。
【００２１】
該レアカットエンドヌクレアーゼは、モジュール型ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ又はキメラエンドヌクレアーゼでありうる。キメラエンドヌクレアーゼ又はモジュ−ル型ＤＮＡ結合ヌクレアーゼとは、エンドヌクレアーゼの少なくとも一つの触媒ドメイン、及び、核酸標的配列を特定する少なくとも一つのＤＮＡ結合ドメイン又はタンパク質を含む、任意の融合タンパク質を意味する。
【００２２】
ＤＮＡ結合ドメインは、一般に、二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチドを認識する少なくとも１つのモチーフを含む、独立して折り畳まれたポリペプチドタンパク質ドメインによって形成されたRNA又はＤＮＡ結合ドメインである。該核酸結合ドメインは、好ましくは、標的配列と名付けられる特異的な核酸配列を認識する。そのようなポリペプチドの多くは当技術分野において記載され、特異的な核酸配列に結合する能力を有する。このような結合ドメインは、非限定的な例としては、ヘリックスターンヘリックスドメイン、ロイシンジッパードメイン、翼状ヘリックスドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＨＭＧボックスドメイン、免疫グロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン又は操作されたジンクフィンガードメインをしばしば含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来するものであって、ここで、配列特異性は、ザントモナス又はラルストニア細菌タンパク質に由来する一連の３３〜３５アミノ酸反復によって駆動される。これらの反復は、塩基対との相互作用を特定する２つのアミノ酸の位置によって、本質的に異なっている（Ｂｏｃｈ，Ｓｃｈｏｌｚｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９；  Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ２００９）。ＤＮＡ標的中の各塩基対は、単一反復によって接触されており、反復の２つの変異アミノ酸（いわゆる、反復可変ジペプチド、ＲＶＤ）の結果、特異性を有する。ＴＡＬＥ結合ドメインは、さらに、標的配列の第一のチミン塩基（Ｔ0）の要件を担当するＮ末端トランスロケーションドメイン、及び、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣ末端ドメインを含んでもよい。ＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、一般に、ＴＡＬＥ反復配列を複数備えた、操作されたコアＴＡＬＥ骨格に相当し、それぞれの反復は、ＴＡＬＥ認識部位のそれぞれのヌクレオチド塩基に対して特異的なＲＶＤを含んでいる。本発明において、該コア骨格の各ＴＡＬＥ反復配列は、３０〜４２アミノ酸からなり、より好ましくは３３又は３４であって、ここで、ポジション１２及び１３に位置する２つの重要なアミノ酸（いわゆる、反復可変ジペプチド（ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）、ＲＶＤ）は、該ＴＡＬＥ結合部位配列の１ヌクレオチドの認識を仲介する；等価な２つの重要なアミノ酸は、３３又は３４アミノ酸長より伸びたＴＡＬＥ反復配列にて、特別に１２及び１３以外のポジションに配置することができる。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したＲＶＤは、Ｃを認識するためにはＨＤ、ＴＡＬＥを認識するためにはＮＧ、Ａを認識するためにはＮＩ、Ｇ又はＡを認識するためにはＮＮである。別の実施形態では、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対するその特異性を調節するために、特に、この特異性を高めるために、重要なアミノ酸１２及び１３は変異されうる。他のアミノ酸残基により、任意の２０種類の天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸の誘導体が意図される。
【００２４】
ＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、通常、８〜３０のＴＡＬＥ反復配列を含む。より好ましくは、本発明の該コア骨格は、８〜２０のＴＡＬＥ反復配列を含む；また、より好ましくは１５ＴＡＬＥ反復配列である。それはまた、該ＴＡＬＥ反復配列のセットのＣ末端に位置する２０個のアミノ酸からなる追加の単一切断ＴＡＬＥ反復配列、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ反復配列を含む。本発明のＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、好ましくは、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択される核酸配列を含む。別の実施形態では、該設計されたＴＡＬＥ結合ドメインは、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択される核酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００２５】
他の操作されたＤＮＡ結合ドメインは、モジュール式塩基対塩基（ｂａｓｅ−ｐｅｒ−ｂａｓｅ）特異的核酸結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１７８３）である。該ＭＢＢＢＤは、新たに同定されたタンパク質、すなわち、最近シークエンスされた内部共生真菌  バークホルデリア  リゾキシニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  Ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ）のゲノム由来の、ＥＡＶ３６＿ＢＵＲＲＨ、Ｅ５ＡＷ４３＿ＢＵＲＲＨ、Ｅ５ＡＷ４５＿ＢＵＲＲＨ及びＥ５ＡＷ４６＿ＢＵＲＲＨタンパク質から、例えば、作製されうる。ＭＢＢＢＤタンパク質は、塩基特異的である、約３１〜３３個のアミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールは、ザントモナスＴＡＬＥ共通反復と４０％未満の配列同一性を示すものであって、一方で、それらは、それ以上のポリペプチドの配列変動を示す。それらを一緒に組み合わせた場合、これらのモジュールポリペプチドは、ザントモナスＴＡＬ−ヌクレアーゼと全く同様の方法で、特定の核酸配列を標的とすることが可能である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、該ＤＮＡ結合ドメインは、１０〜３０個のモジュール、好ましくは、１６〜２０個のモジュールを含む、操作されたＭＢＢＢＤ結合ドメインである。バークホルデリア及びザントモナス由来の上記タンパク質とは異なるドメイン（モジュール、Ｎ及びＣ末端）は、特異的な核酸配列に対する結合特性を有する新規なタンパク質又は骨格を操作するのに有用である。特に、操作されたＭＢＢＢＤの付加的なＮ末端及びＣ末端ドメインは、非限定的な例として、天然のＴＡＬＥ様ＡｖｒＢｓ３、ＰｔｈＸｏ１、ＡｖｒＨａｈ１、ＰｔｈＡ、Ｔａｌ１ｃから得ることができる。
【００２７】
「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」又は「ＭＢＢＢＤヌクレアーゼ」は、典型的にはエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）又はＭＢＢＢＤ結合ドメイン由来のＤＮＡ結合ドメインとを融合して得られる操作されたタンパク質を指す。このような触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメイン、より好ましくは例えばＩ−ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮＵＣＡ及びＦｏｋ−Ｉなどの、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、該ヌクレアーゼは、単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＭＢＢＢＤヌクレアーゼである。単量体ヌクレアーゼは、国際公開第２０１２／１３８９２７に記載されたＩ−ＴｅｖＩの触媒ドメインと操作されたＤＮＡ結合ドメインとの融合物のような、特異的に認識し及び切断するための二量体化を必要としないヌクレアーゼである（図３参照）。別の特定の実施形態では、該レアカットエンドヌクレアーゼは、二量体ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＭＢＢＢＤヌクレアーゼであって、好ましくは、ＦｏｋＩに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む（図１参照）。該二量体ヌクレアーゼは、反復配列内における切断事象を誘導するように、反復配列に隣接する領域を含む標的配列に結合する能力を有する第一のDNA結合ヌクレアーゼと、反復配列内の標的配列に結合する能力を有する第二のDNA結合ヌクレアーゼとを含む（図２参照）。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、既に記載されており、遺伝子標的化及び遺伝子改変を刺激するために使用されている（Ｂｏｃｈ，Ｓｃｈｏｌｚｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９；  Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ２００９；  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。このような操作されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）（セレクティス、８ルー・デ・ラ・クロワジャリー、７５０１３パリ、フランス）にて市販されている。
【００２８】
別の態様において、本発明はまた、本明細書で開示されたレアカットエンドヌクレアーゼに関するものであって、好ましくは、上記の方法によって得られるレアカットエンドヌクレアーゼに関する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％同一性を有するレアカットエンドヌクレアーゼに関する。
【００２９】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明の上記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１６からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する。
【００３０】
ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、又は、昆虫宿主細胞のトランスフェクション用のバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、又は、哺乳動物宿主細胞のトランスフェクション用のレンチウイルスのようなプラスミド若しくはウイルスベクター）であってもよい。
【００３１】
特定の実施形態では、別の核酸配列は、２Ａペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含んだ１ポリヌクレオチド又はベクターに含まれうる。ピコルナウイルスのアフトウイルスサブグループで同定された２Ａペプチドは、コドンでコードされる２つのアミノ酸間のペプチド結合を形成することなく、あるコドンから隣のコドンへとリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ２００１；  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｌｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１；  Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；  Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）参照）。「コドン」は、一つのアミノ酸残基へとリボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ（又はＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３つのヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドがフレーム内にある２Aオリゴペプチド配列によって分離されている場合、ｍＲＮＡ中の単一の連続オープンリーディングフレームから２つのポリペプチドが合成される。このようなリボソームスキップ機構は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のためのいくつかのベクターで使用されることが知られている。
【００３２】
当業者は、遺伝コードの同義性の観点から、かなりの配列変化がこれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現用に、好ましくは、ヒト細胞における発現用に、コドン最適化される。コドン最適化とは、所定の種の高発現する遺伝子で一般的にまれなコドン対象配列を、所定の種で高発現する遺伝子で一般的に高頻度に存在するコドンへと置換することを指し、そのようなコドンは、置換されたコドンとしてアミノ酸をコードする。
【００３３】
反復障害を受ける反復配列を短縮する方法
別の態様において、本発明はまた、生細胞中へ反復障害を受けた遺伝子配列内の反復配列を短縮する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）反復配列に隣接する領域を含む標的配列の選択すること；（ｂ）該標的配列に結合し、反復配列を切断することができる少なくとも１つのレアカットエンドヌクレアーゼの提供すること；（ｃ）レアカットエンドヌクレアーゼを該細胞へと導入すること、及び、（ｄ）レアカットエンドヌクレアーゼを遺伝子配列へと接触させ、その結果、レアカットエンドヌクレアーゼが反復配列を切断し、反復配列の切断を行う修復工程を誘導すること。好ましい実施形態では、該修復工程は、一本鎖アニーリング（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）（ＳＳＡ）である。一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、同じ方向に向けられた２つの反復配列間において切断がなされる場合、開始される工程である。一本鎖領域は、相補鎖が互いにアニールできるように、反復配列に伸展するブレークに隣接して形成される。このアニールした中間体は、一本鎖尾部を消化して遊離させ、ギャップを充填するアニール工程によって処理されうる。特定の実施形態において、当該方法は、細胞内で、本発明の標的配列に結合することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現することを包含する。より特定の実施形態において、当該方法は、上述のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを細胞へと形質転換すること、及び、該細胞へ該ポリヌクレオチドを発現することを含む。
【００３４】
上記の方法は、細胞中にレアカットエンドヌクレアーゼを導入することを含む。非限定的な例として、レアカットエンドヌクレアーゼを、一プラスミド性ベクターにコードされた導入遺伝子として導入することができる。該プラスミドベクターはまた、該ベクターが導入された細胞の同定及び／又は選択するために提供される選択マーカーを含むことができる。
【００３５】
ポリペプチドは、細胞内に該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入した結果として、細胞内のイン・サイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成することができる。あるいは、該ポリペプチドは、細胞外で製造した後、そこに導入することができる。細胞へポリヌクレオチド構築物を導入する方法は当技術分野で公知であり、非限定的な例としては、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込む安定な形質転換法、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込まない一過性形質転換法、及び、ウイルス媒介法を含む。該ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどにより細胞に導入してもよい。例えば、一過性形質転換法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション又は微粒子銃を含む。該ポリヌクレオチドは、細胞内で発現される観点から、ベクター、より好ましくはプラスミド又はウイルスに含まれていてもよい。
【００３６】
本発明はまた、上記段落に記載の方法で得られる感受性のある単離された細胞又は細胞株にも関する。特に、該単離された細胞は、上述の、少なくとも一つのレアカットエンドヌクレアーゼを含む。別の実施形態では、該単離された細胞は、反復拡張配列の減少を含む。好ましい実施形態では、該単離された細胞は、哺乳動物細胞である。
【００３７】
適用
別の態様では、本発明に係る該レアカットエンドヌクレアーゼは、不安定な反復拡大に起因する疾患を治療又は予防するために使用することができるものであって、非限定的な例として：脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、脆弱ＸE症候群（ＦＲＡＸＥ）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）、脆弱Ｘ−関連振戦運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）などのＣＡＧリピート病、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症１型、歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、マシャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２、脊髄小脳失調症６型及び脊髄小脳失調７型がある。本発明のレアカットエンドヌクレアーゼは、好ましくは、ハンチントン病を治療するために使用される。該レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ウイルスベクターを使用して（インビボで）被験体に直接投与することができる。該レアカットエンドヌクレアーゼは、全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用によって投与することができる。あるいは、該レアカットエンドヌクレアーゼは、インビトロで細胞を処置するために使用することができ、次いで、修飾された細胞は、通常、ベクターを取り込んだ細胞の選択した後（エクスビボ）、被験者に投与される。
【００３８】
本発明はまた、反復配列に特異的な本発明のレアカットエンドヌクレアーゼを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、細胞内の特異的な反復配列を短縮するために使用することができる。医薬的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、並びに、組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、利用可能な医薬組成物の適切な製剤は多種多様である。
【００３９】
本発明の方法及び組成物は、インビトロ及びインビボモデル、例えば、反復障害の動物モデルの設計と実装に有用であり、これらの障害の研究を可能にする。インビトロモデルに適した非限定的な例としては、線維芽細胞を含む任意の生物由来の細胞又は細胞株が含まれる。動物モデルに使用する好適な動物の非限定的な例としては、無脊椎動物（線虫、ショウジョウバエ）、げっ歯類（例えば、ラット又はマウス）、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）が含まれる。
【００４０】
定義
以上の説明において、多くの用語が広範囲に使用されている。以下の定義は、本実施形態の理解を容易にするために提供される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１以上を意味してもよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、値が、値を決定するために使用される方法に対する誤差の固有の変動、又は実験間に存在する変動を含むことを示す。
【００４３】
−ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、一文字コードに応じて本明細書中に指定され、例えば、ＱはＧｌｎ又はグルタミン残基を意味し、ＲはＡｒｇ又はアルギニン残基を意味し、ＤはＡｓｐ又はアスパラギン酸残基を意味する。
【００４４】
−アミノ酸置換は、一つのアミノ酸残基を他と置換することを意味し、例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基をグルタミン残基に置換することが、アミノ酸置換である。
【００４５】
−ヌクレオチドは、以下のように指定されている：一文字コードは、ヌクレオシドの塩基を指定するために使用される：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、ｒはｇ又はａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄはｇ、ａ又はｔを表し、ｖはｇ、ａ又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ又はｃを表し、ｈはａ、ｔ又はｃを表し、ｎはｇ、a、ｔ又はｃを表す。
【００４６】
−本明細書で使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などのヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、並びに、連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されたフラグメントを意味する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドである単量体（例えばＤＮＡやＲＮＡのような）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、又は両者の組み合わせで構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基と、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基、又は、エーテル若しくはエステルとして官能化できる糖との置換を含む。さらに、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体など立体的かつ電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、又は他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体によって連結することができる。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかでありうる。
【００４７】
−「遺伝子」とは、遺伝の基本単位を意味し、染色体に沿って直線的に配列されたＤＮＡ部分から構成され、特定のタンパク質又はタンパク質の部分をコードする。遺伝子は、典型的には、プロモーター、５’非翻訳領域、一つ以上のコード配列（エクソン）、任意のイントロン、３’非翻訳領域を含む。遺伝子はさらに、ターミネーター、エンハンサー及び／又はサイレンサーを含んでもよい。
【００４８】
−用語「切断」は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破壊を指す。切断は、これらに限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含む様々な方法によって開始されうる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの切断は、平滑末端又は千鳥状末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄｓ）のいずれかの産生をもたらしうる。
【００４９】
−「触媒ドメイン」とは、該酵素の活性部位を含む酵素のタンパク質ドメイン又はモジュールを意味している。活性部位は、基質の触媒作用が発生する該酵素の一部を意味する。酵素（それらの触媒ドメインではない）は、それらが触媒する反応に従って分類及び命名されている。酵素委託番号（ＥＣ番号）は、それらが触媒する化学反応に基づく、酵素に対する数分類１０方式である。
【００５０】
−本発明によれば、「相同な」とは、アミノ酸の第一の配列に関して、該第一のアミノ酸配列と少なくとも６０％又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有し、同様の生物学的活性を有する任意のアミノ酸配列を意味する。
【００５１】
配列相同性は、当業者の分野で一般的に使用される任意の方法によって同定することができる。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを二つの配列間の同一性を計算するために使用してもよく、ＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マジソン、ウィスコンシン州）の一部として利用できるＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含み、例えば、デフォルトの設定で使用することができる。
【００５２】
−「同一性」とは、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中の位置が同じ塩基で占められる場合、分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置における同一又は一致するヌクレオチド数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを二つの配列間の同一性を計算するために使用してもよく、ＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マジソン、ウィスコンシン州）の一部として利用できるＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含み、例えば、デフォルトの設定で使用することができる。
【００５３】
−「ハイブリダイゼーション配列」は、標準的な低ストリンジェントの条件下で、他のオリゴヌクレオチドの一つにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの配列の一部を意味する。このような条件とは、例えば、２５％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液を含有する緩衝液； pH7.0、５×デンハルト、１ｍM ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡ + ２０〜２００ｎｇ／ｍＬの試験するプローブ（約２０〜２００ｎｇ／ｍＬ)を使用しての、室温、２時間であり得る。これは、文献において提供されるように、配列内の相補的塩基の数、及び、室温におけるＧ−Ｃ含有量を用いて、ハイブリダイゼーションの標準的な計算によって予測することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーション配列は、鎖間のワトソン−クリック塩基対合に依存する２つの核酸鎖間の相互の相補性に従った相補であり、すなわち、アデニンとチミン（Ａ−Ｔ）ヌクレオチド及びグアニンとシトシン（ＧＣ）ヌクレオチド間の固有の塩基対合である。正確な塩基対形成は、標準及び修飾ヌクレオシドの間の塩基対合、及び、修飾ヌクレオシド官の塩基対合を含むワトソン−クリック対合と等しいものであり、修飾ヌクレオシドは、ワトソン−クリック塩基対合に沿った適切な標準ヌクレオシドへ置換することができる。一本鎖オリゴヌクレオチドの相補配列は、反応条件下で、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドの間の特異的及び安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。
【００５４】
−「送達ベクター」又は「送達ベクター（複数）」は、接触した細胞（すなわち、「接触している」）の中に入れるため、細胞内又は細胞内コンパートメントへ、本発明で必要な薬剤／化学物質及び分子（タンパク質又は核酸）を送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターを意図している。限定されるものではないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な転写ベクターを含む。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子（遺伝子、タンパク質）、又は、プラスミドのような他のベクター、ディアトス社で開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」又は「送達ベクター（複数）」は、トランスフェクションを実施するための送達する方法を意図している。
【００５５】
−用語「ベクター」又は「ベクター（複数）」は、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。本発明において、「ベクター」は、これらに限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は、染色体、非染色体、半合成若しくは合成核酸からなる線状若しくは環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む。好ましいベクターは、自律複製（エピソームベクター）及び／又はそれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の適切なベクターは、当業者に公知であって、市販されている。
【００５６】
−ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス等のマイナス鎖RNAウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルス等のプラス鎖RNAウイルス、及び、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス、を含む。他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例としては、トリ白血病−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルス、を含む（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
【００５７】
−細胞又は細胞（複数）は、任意の原核生物又は真核生物の生細胞、インビトロ培養用のこれらの生物由来の細胞株、動物又は植物起源の初代細胞を意味する。
【００５８】
−「初代細胞」又は「初代細胞（複数）」とは、生体組織（すなわち、生検材料）から直接取得され、インビトロ生育用に確立されることを目的とした細胞であって、連続腫瘍形成する又は人工的に不死化した細胞株と比較して、ほとんど集団倍加を起こさず、それゆえ、それらの由来とする組織の主要な機能的な構成要素及び特性をより表している。これらの細胞は、このように、それらが参照するインビボの状態に対するより価値あるモデルを表す。
【００５９】
本発明の枠において、「真核細胞」は、真菌、植物又は動物細胞、又は、以下に列挙する生物由来であり、かつ、インビトロ培養のために確立された細胞株をいう。
【００６０】
より好ましくは、動物細胞は、ヒト属、ラッタス属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ダニオ（Ｄａｎｉｏ）属、イヌ属、ネコ属、ウマ属、サルモ属、タイヘイヨウサケ属、ガルス属、シチメンチョウ属、ショウジョウバエ属、線虫属である。より好ましくは、動物細胞は、ホモサピエンス種、ラット種、ハツカネズミ種、イノシシ種、ウシ種、ゼブラフィッシュ種、ハイイロオオカミ種、ネコ種、ウマ種、ライセイヨウサケ種、ニジマス種、ニワトリ種、シチメンチョウ種、キイロショウジョウバエ種、線虫種である。
【００６１】
本発明においては、細胞は、哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、又は、インビトロ培養用に生体組織から直接採取した細胞株、又は、生体組織から直接採取してインビトロ培養用に確立した初代細胞であってもよい。非限定的な例として、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃａｃｏ２細胞、Ｕ２−ＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＤＧ４４細胞、Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞、ＭＲＣ５細胞、ＩＭＲ９０細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、Ｈｕ−ｈ７細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、Ｍｏｌｔ４細胞からなる群から選択することができる。また、本発明の範囲には、幹細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）も包含する。
【００６２】
すべてのこれらの細胞株は、細胞株モデルを提供することための本発明の方法によって改変されうる。
【００６３】
−本明細書で使用される用語「被験体」は、非ヒト霊長類及びヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
【実施例】
【００６４】
ＴＡＬＥ骨格におけるＲＶＤ配列コレクションのクローニング
これらの実験で使用される２つのＴＡＬＥ骨格（ｐＣＬＳ９３０３及びｐＣＬＳ９３１２、配列番号４及び５）は、Ｃ末端及びＮ末端ドメインの間に、二つのＢｓｍＢＩ制限部位を含んでいる。反復トリヌクレオチドに隣接する領域を標的とする個々の反復配列（配列番号６〜７）は、受信プラスミド用にＩＩ型制限酵素ＢｓｍＢＩを使用し、挿入されるＲＶＤ配列用にＢｂｖＩ及びＳｆａＮＩを使用して、ｐＣＬＳ９３０３にサグクローニングし、ｐＣＬＳ９９８４とｐＣＬＳ１６７１５へと誘導した（配列番号８をコードした配列番号９、及び、配列番号１０をコードした配列番号１１）。反復トリヌクレオチドを標的とする個々の反復配列（配列番号１４）は、受信プラスミド用にＩＩ型制限酵素ＢｓｍＢＩを使用し、挿入されるＲＶＤ配列用にＢｂｖＩ及びＳｆａＮＩを使用して、ｐＣＬＳ９９９６にサグクローニングし、ｐＣＬＳ９９９６を誘導した（配列番号１５をコードする配列番号１６）。各個々のクローンの単クローンのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより評価した。
【００６５】
酵母におけるＴＡＬＥヌクレアーゼ活性
ＴＡＬＥＮ（商標）  ＤＮＡ標的配列を含む２つの酵母標的レポータープラスミドを前述のように構築した（国際ＰＣＴ出願  国際公開２００４／０６７７３６号、及び、Ｅｐｉｎａｔ，Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３；  Ｃｈａｍｅｓ，Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５；  Ａｒｎｏｕｌｄ，Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｒｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＴＡＬＥＮ（商標）ペア（ｐＣＬＳ９９８４／ｐＣＬＳ９９９６及びｐＣＬＳ１６７１５／ｐＣＬＳ９９９６）は、以前記載されている（国際ＰＣＴ出願  国際公開２００４／０６７７３６号、及び、Ｅｐｉｎａｔ，Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３；  Ｃｈａｍｅｓ，Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５；  Ａｒｎｏｕｌｄ，Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｒｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６）我々の酵母ＳＳＡアッセイにおいて、両方の標的（配列番号１２〜１３、表１）に対して、３７℃及び３０℃で試験した。それらの標的に対するＴＡＬＥＮ（商標）切断活性レベルを、表２に示す。
【００６６】
【表１】
2016535594.tif 000002
【００６７】
【表２】
2016535594.tif 000003
【００６８】
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【図１】
2016535594.tif 000004
【図２】
2016535594.tif 000005
【図３】
2016535594.tif 000006
【図４】
2016535594.tif 000007
【配列表】
2016535594000001.app
【国際調査報告】
2016535594.tif 000008
2016535594.tif 000009
2016535594.tif 000010
2016535594.tif 000011