(57)【要約】  標的細菌を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、１セットの標的細菌を感染することができるファージに試料を曝露することを含み、マーカーをコードする異種性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌はリステリアを含む。いくつかの実施形態において、標的細菌は全てリステリアである。さらに、マーカーをコードする異種性核酸配列を含む組換えリステリアファージが提供され、特に、このようなファージの組み合わせ、及びこのようなファージを含む製品は有用である。
2016517687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を提供すること；
第１セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第１マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第１の種類のファージに前記試料を曝露すること；
第２セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第２マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第２の種類のファージに前記試料を曝露すること；及び
該曝露された試料の中の第１マーカーと第２マーカーの存在についてアッセイすること
を含む、標的細菌を検出する方法。
【請求項２】
前記試料中の第１マーカーの検出が、該試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の第２マーカーの検出が、該試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１マーカーと第２マーカーが同じであり、前記試料中のマーカーの検出が該試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも２種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも３種を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも４種を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
一つの属の細菌がリステリアである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも１種の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも２種の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも３種の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも４種の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
種が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
種が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的細菌が、リステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
標的細菌が、リステリア・イノキュアの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リステリア・イノキュアの少なくとも４種類の対立遺伝子型が、１１、２２、３７、及び５６である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスの少なくとも１９種類のリボタイプを備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
リステリア・モノサイトゲネスの少なくとも１９種類のリボタイプが、ＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リステリア・ゼーリゲリの少なくとも４種類の対立遺伝子型が、３、２０、２４、及び３５である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リステリア・ウェルシメリの少なくとも４種類の対立遺伝子型は、１５、２７、３２、及び８９である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも２種を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも３種を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌が、共通して少なくとも４種を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１セットの標的細菌が、同じ属の全てのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
第２セットの標的細菌が、同じ属の全てのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
標的細菌の全てがリステリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
標的細菌が、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｚｏｐｆｉｉ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の細菌、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｏａｅ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ）、セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、ハフニア属種（Ｈａｆｎｉａ  ｓｐ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属種（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、及び腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
第３セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第３マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第３の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
方法において使用される少なくとも１種類のファージが、Ａ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４４、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
方法において使用される全ての種類のファージが、Ａ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４４、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
第１マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
第１マーカーがルシフェラーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ルシフェラーゼが配列番号２に対して少なくとも７０％同一である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の種類のファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ルシフェラーゼが配列番号４に対して少なくとも７０％同一である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
第１の種類のファージが、ＬＰ４０：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第２マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
第２マーカーがルシフェラーゼである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ルシフェラーゼが配列番号２に対して少なくとも７０％同一である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第２の種類のファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ルシフェラーゼが配列番号４に対して少なくとも７０％同一である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
第２の種類のファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１の種類のファージと第２の種類のファージに対して試料を同時に曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
試料が環境試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
第１マーカーが試料中に検出され、該試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
第２マーカーが試料中に検出され、該試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
第１マーカーと第２マーカーが同じであり、該マーカーが試料中に検出され、該試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
環境試料に対するアッセイの偽陽性率が、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
環境試料に対するアッセイの偽陰性率が、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
試料が、ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
標的細菌に感染することができるファージに試料を曝露する前の一時期に該試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
試料を提供すること；
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される上記組換えリステリアファージに試料を曝露すること；及び
曝露された試料中の該マーカーの存在についてアッセイすること
を含む、標的細菌を検出する方法。
【請求項６０】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１と組換えＰ１００から選択される組換えリステリアファージに試料を曝露することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
試料中のマーカーの検出が該試料中のリステリアの存在を表す、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも１つの種の該試料における存在を表す、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも１つの種の該試料における存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも１種類のリステリアファージが、リステリア・イノキュアｓｉｇＢ対立遺伝子型１１、２２、３７、及び５６に感染することができる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備え、試料中の前記マーカーの検出が、リステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプの存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのリボタイプＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリｓｉｇＢ対立遺伝子型３、２０、２４、及び３５を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、試料中のマーカーの検出が、リステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリｓｉｇＢ対立遺伝子型１５、２７、３２及び８９を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
標的細菌が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも２つの種を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
標的細菌が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも３つの種を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
標的細菌が、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、及びリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）から選択されるリステリア属の少なくとも４つの種を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
標的細菌が、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｚｏｐｆｉｉ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の細菌、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｏａｅ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ）、セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、ハフニア属種（Ｈａｆｎｉａ  ｓｐ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属種（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、及び腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含まない、請求項５９に記載の方法。
【請求項７８】
標的細菌の全てがリステリアである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７９】
マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項８０】
マーカーがルシフェラーゼである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ルシフェラーゼが配列番号２に対して少なくとも７０％同一である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ルシフェラーゼが配列番号４に対して少なくとも７０％同一である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
ファージが、ＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
試料が環境試料である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８６】
マーカーが試料中に検出され、試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す、請求項５９に記載の方法。
【請求項８７】
環境試料に対するアッセイの偽陽性率が、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８８】
環境試料に対するアッセイの偽陰性率が、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８９】
試料がファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される、請求項５９に記載の方法。
【請求項９０】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージが、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。
【請求項９１】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９２】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９３】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、該マーカーを産生する、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９４】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュアｓｉｇＢ対立遺伝子型１１、２２、３７、及び５６を含む、請求項９３に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９５】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備える、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９６】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・モノサイトゲネスのリボタイプＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄを含む、請求項８９に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９７】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９８】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ゼーリゲリｓｉｇＢ対立遺伝子型３、２０、２４、及び３５を含む、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項９９】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える、請求項９１に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１００】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・ウェルシメリｓｉｇＢ対立遺伝子型１５、２７、３２及び８９を含む、請求項９９に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０１】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも２つの種を含む、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０２】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも３つの種を含む、請求項９５に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０３】
リステリアファージの標的細菌が、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ、リステリア・ロコウルティ、及びリステリア・ウェルシメリを含む、請求項９６に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０４】
リステリアファージの標的細菌が、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｚｏｐｆｉｉ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の細菌、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｏａｅ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ）、セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、ハフニア属種（Ｈａｆｎｉａ  ｓｐ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属種（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、及び腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含まない、請求項９０に記載の組換えリステ��アファージ。
【請求項１０５】
リステリアファージの標的細菌の全てがリステリアである、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０６】
マーカーがスクリーニング可能なマーカーである、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０７】
マーカーがルシフェラーゼである、請求項１０６に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０８】
ルシフェラーゼが配列番号２に対して少なくとも７０％同一である、請求項１０７に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１０９】
ファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、及びＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項１０８に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１０】
ルシフェラーゼが配列番号４に対して少なくとも７０％同一である、請求項１０７に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１１】
ファージが、ＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ及びＬＰ１２５：：ｎｌｕｃから選択される、請求項１１０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１２】
配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージが、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。
【請求項１１３】
ファージが、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される、請求項１１２に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１４】
配列番号４に対して少なくとも７０％同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、該組換えリステリアファージは組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される、組換えリステリアファージ。
【請求項１１５】
ファージが、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される、請求項１１４に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１６】
組換えファージが、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下の偽陽性率で環境試料中に標的細菌を検出する、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１７】
組換えファージが、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下の偽陰性率で環境試料中に標的細菌を検出する、請求項９０に記載の組換えリステリアファージ。
【請求項１１８】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物、のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分
を含む、組成物。
【請求項１１９】
１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも２種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される組換えリステリアファージを含む組成物。
【請求項１２１】
ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物、のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物、のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液
を含む、製品。
【請求項１２４】
１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む溶液を備える容器を含む、請求項１２３に記載の製品。
【請求項１２５】
マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも２種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される組換えリステリアファージ、及び
ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物、のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液
を含む、製品。
【請求項１２６】
１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０を含む溶液を備える容器を含む、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
異なる細菌種の複数の液体培養試料をファージに曝露すること、及び
ファージが該複数の異なる細菌種に感染するか判定すること
を含む、ファージの標的細菌を特定する方法。
【請求項１２８】
ファージが複数の異なる細菌種に感染するか判定することは、試料における細胞の透明化の測定を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
試料における細胞の透明化が、該試料中の細菌種がファージの標的細菌であることを表す、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ファージが第１マーカーをコードする異種性核酸配列を備え、ファージが複数の異なる細菌種に感染するか判定することが複数の試料中の該マーカーの存在についてアッセイすることによる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
試料中のマーカーの検出が、試料中の細菌種がファージの標的細菌であることを表す、請求項１３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２０１３年３月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６１／８０５９１７号の優先権と利益を主張し、その内容の全体を本明細書に援用する。
【０００２】
序論
細菌の汚染混入と感染は公衆衛生及び他の多くの領域における重大な問題である。それ故、医療、獣医療、農業、食品加工、工業及び他の状況において細菌を検出するための方法と試薬が有益である。実際に、年間の世界中の細菌インビトロ診断市場は１００億ドルを超えている。
【０００３】
食物媒介性細菌性疾患は人間の健康に対して重大な脅威をもたらしており、米国において年間に約７６００万件もの疾病例、３２５，０００件もの入院例、及び５，０００件もの死亡例の原因になっていると推定されている。
【０００４】
例えば、１９９６年にあるジュース製造会社により大腸菌が混入したジュースが一般に発売され、１人が死亡し、６６人が病気になった。その会社は１５０万ドルの罰金を支払い、リコールだけで６５０万ドルの費用をその会社に負わせた。２００６年にはカリフォルニア州が起源の汚染されたホウレンソウに由来する大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の大発生により２０５人が病気になり、３人が死亡した。２０１１年には７月、８月、及び９月にコロラド州が起源のカンタロープメロンに由来するリステリア症の大発生により３０人が死亡した。それは米国疾病管理予防センターが１９７０年代に伝染病の大発生の追跡を開始して以来、死亡数に関して２番目に致命的と記録された米国での伝染病の大発生である。２０１２年の別のカンタロープメロンのリコールからその食物供給品は未だに安全ではないことが示唆され、汚染混入を特定するためにその食物供給品を検査する追加の方法と試薬の一般的で広範な必要性が強調されている。
【０００５】
別の例はウシの乳房の炎症、牛乳生産量の減少、及び牛乳の品質の低下を引き起こす細菌細胞が原因の感染症である牛乳房炎である。この病状は細菌である黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・アガラクティア（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）によって引き起こされる。西洋世界におけるこの牛乳生産量の減少と品質の低下だけで年間に３７億ドルの財政的損失の原因になると示唆されている。
【０００６】
別の例は世界中で財政的損失の原因となる細菌である牛結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）である。例えば、２００５年にはミシガン州の小さな牧場で５５頭の牛からなる群れのうちの１２頭の牛が牛結核について陽性と検査された。その牧場は強制的に全ての群れの牛と全ての群れの豚を処分させられた。牛の結核検査は動物が２日間にわたって収容されることを必要とし、検査は５％の確率で偽陽性である。多くの場合に全ての群れが隔離又は処分される必要がある。年間の世界中の財政的損失は３０億ドルと推定されている。
【０００７】
結核は世界中の死亡例の主因である。世界人口の三分の一が結核を引き起こす細菌である結核菌に感染している。毎日２５，０００人の人々が感染し、５，０００人の人々がその疾患のために死亡する。さらに、主に不充分な診断のために結核菌の多剤耐性株が出現しつつあり、世界的な流行病の発生としての結核の再興が現実的な脅威となっている。結核診断薬の年間の世界中の市場は１８億ドルと推定されている。
【０００８】
ＭＲＳＡは一般的な細菌である黄色ブドウ球菌の薬剤耐性型であり、米国では２５０万人の人々によって保有されている。ＭＲＳＡ細菌の性質のため、保有者は健康な個体であり得、それでもやはり非常に伝染性であり得る。その細菌は非常に伝染性であり、接触によって広まる。全ての感染例の約８６％が病院内において生じており、これらの感染例は２０％の死亡率を有している。この細菌は治療するのに標準的な費用よりも平均して２１，０００ドルの費用がかかり、米国において年間に約１９，０００人の人々を殺している。
【０００９】
リステリア・モノサイトゲネスはヒトと動物において侵襲性疾患を引き起こし得る細胞内病原体である。ヒトリステリア症感染例の約９９％が食物媒介性のようである。リステリア・モノサイトゲネスは様々な生鮮食品及び加工食品から単離されているが、大半のヒトリステリア症感染例がこの病原体の汚染混入後の増殖を許すＲＴＥ食品の消費によって引き起こされているようである。リステリア症は米国における年間約５００件の死亡例の原因であると推定されており、公知の食物媒介性病原体に起因する年間の死亡例の２８％を占め、サルモネラ感染症が原因の死亡例に次いで第２位である。
【００１０】
微生物汚染混入を検出するための方法とシステムが存在する。そのような方法とシステムは、汚染された可能性がある試料をその試料が収集される環境から取り出し、検査室環境にその試料を移し、そこで数時間から数日の範囲の長期の時間にわたる濃縮と増殖のために培養環境にその試料が置かれる必要があるといったことをはじめとする多くの欠点に悩まされている。さらに、これらの検査室はしばしば現場から遠く離れた所にあるので多くの場合に検査室への試料の輸送に遅れがでる。一旦濃縮されると、高価な装置、伝統的な培養方法、ＰＣＲ及び他の方法を用いて試料が分析されるのが典型的である。したがって、現行の過程は多くの場合に試料抽出と結果との間に大きな時間のずれを含み、その時間の間に試料抽出された条件が変化したかもしれず、例えば、患者の感染症を診断するために、又は製造された多くの食品の汚染混入に対処するためにそのアッセイの結果を利用することができない。したがって、新しい検査法と試薬が有用である。
【００１１】
ファージは細菌と古細菌をファージ自身の複製手段として使用する自然界で進化したウイルスである。ファージは自身を宿主微生物に結合し、自身の遺伝物質を宿主に注入することにより複製を行い、その宿主細胞にそのファージを数十倍から数千倍まで複製させる。溶菌ファージと呼ばれる幾つかのファージは宿主微生物を破裂させ、それにより他の微生物を探すために子孫ファージを環境中に放出する。親ファージによる微生物の感染、子孫ファージを産生するための微生物中でのファージの繁殖（増加）、及び溶菌後の子孫ファージの放出についての総ファージ複製時間はファージ、微生物、及び環境条件に応じて数分ほどの短い時間であり得る。
【００１２】
ファージが感染する細菌の存在を示すためにそのファージを使用する方法のことが記載されている。これらの方法では細菌を含む試料がその細菌に特異的なファージと共に培養される。そのファージはその細菌に感染し、その中で複製して測定可能な信号を生じる。検出及び特定の手段として感染した細菌から放出された子孫ファージの検出を活用する方法もある。そのような方法では親ファージが細菌への感染に成功しなければ子孫ファージは産生されない。さらに他の方法はファージ全体よりもファージ遺伝子産物の検出に依存している。例えば、ファージが宿主細菌への感染に成功するとルシフェラーゼを産生するルシフェラーゼレポーターファージのことが記載されている。次にそのルシフェラーゼによって、検出されると試料中の宿主細菌の存在を表す光が作り出される。他の方法は特定のバクテリオファージによる宿主細菌の溶菌性感染の成功の後に放出される細菌破片の検出に依存している。遺伝子操作ファージによりコードされる異種性遺伝子産物を検出する方法を細菌診断薬に使用することができるという示唆にもかかわらず、細菌の汚染混入を検出する検査室外設定ではその技術は未だに用いられていない。
【００１３】
種と亜種の両方のレベルで細菌の汚染混入を特定し、追跡する能力が流行株を追跡し、多くの他の設定の中でも食品加工工場内及び最終製品内の汚染混入についての疫学データを収集する手段としてますます重要になっている。種レベルでの細菌株の特定は主に生化学的証拠に基づいている。亜種の決定はあまり定義されておらず、統一的な決定方法は存在しない。亜種の決定には複数の方法が存在するが、４つの方法、すなわち、血清型分類、ファージ型分類、パルスフィールドゲル電気泳動、及びリボタイピングが共通して用いられている。これらの４つの方法は全て制約に悩まされており、各システムで下位群内の特定の種を分類することができるが、この分類は必ずしもその下位群の全てのメンバーが構成メンバー内の特徴を共有することを保証するわけではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ファージベース細菌検出方法の特異度と感度は部分的には遺伝子操作バクテリオファージの宿主範囲によって決定される。ファージベース細菌検出システムの有用性は、その方法に使用されるファージの所定の宿主範囲の存在をはじめとする幾つかの要因に依存する。本開示は標的微生物セットを限定する所定の宿主範囲を有する遺伝子操作ファージを提供することによりこれらの必要性と他の必要性を満たす。本開示は標的微生物の宿主範囲を共に限定する遺伝子操作ファージセットも提供する。その遺伝子操作ファージとそれらのファージセットは、例えば、標的微生物を検出する方法において有用である。本開示のこれらの態様及び他の態様を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様では本開示は標的微生物を検出する方法を提供する。その微生物は古細菌又は細菌であり得る。
【００１６】
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、第１セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第１マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第１の種類のファージに前記試料を曝露すること、第２セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第２マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第２の種類のファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の第１マーカーと第２マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では前記試料中の第１マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では前記試料中の第２マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第１マーカーと第２マーカーは同じであり、前記試料中のそのマーカーの検出はその試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
【００１７】
幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも２種を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも３種を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも４種を含む。幾つかの実施形態ではその一つの属の細菌はリステリアである。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも１種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも２種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも３種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも４種の細菌を含む。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）及びリステリア・ウェルシメリから選択される。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される。
【００１８】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・イノキュアのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は１１、２２、３７、及び５６である。
【００１９】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスの少なくとも１９種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネスのそれらの少なくとも１９種類のリボタイプはＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄである。
【００２０】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ゼーリゲリのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は３、２０、２４、及び３５である。
【００２１】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ウェルシメリのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は１５、２７、３２、及び８９である。
【００２２】
幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では第２セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では標的細菌は１つより多くの属のメンバーを含む。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも１つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
【００２３】
幾つかの実施形態では本方法は、第３セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第３マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第３の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第４セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第４マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第４の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第５セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第５マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第５の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第６セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第６マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第６の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第７セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第７マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第７の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第８セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第８マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第８の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第９セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第９マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第９の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、１０以上のセットの標的細菌に感染することができ、且つ、１０以上のマーカーをコードする異種性核酸配列を備える１０以上の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの３種類以上のマーカーの全てが異なる。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの３種類以上のマーカーの全てが同じである。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらのマーカーのうちの２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、又は９種類が同じである。
【００２４】
幾つかの実施形態では本方法において使用される少なくとも１種類のファージがＡ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４４、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される。幾つかの実施形態では本方法において使用される全ての種類のファージがＡ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４４、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される。
【００２５】
幾つかの実施形態では第１マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第１マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。
【００２６】
幾つかの実施形態では第１の種類のファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃ、及びそれらのファージの派生株から選択される。幾つかの実施形態では第１の種類のファージはＬＰ４０：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【００２７】
幾つかの実施形態では第２マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第２マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。
【００２８】
幾つかの実施形態では第２の種類のファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では第２の種類のファージはＬＰ４０：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【００２９】
幾つかの実施形態では本方法は前記試料をＡ５１１：：ｎｌｕｃ、Ｐ１００：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃと接触させることを含む。幾つかの実施形態では本方法は前記試料をＡ５１１：：ｎｌｕｃ及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃと接触させることを含む。幾つかの実施形態では本方法は前記試料をＡ５１１：：ｎｌｕｃ、ＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃと接触させることを含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では本方法は第１の種類のファージと第２の種類のファージに対して前記試料を同時に曝露することを含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
【００３２】
幾つかの実施形態では第１マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第２マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第１マーカーと第２マーカーは同じであり、そのマーカーが前記試料中に検出され、その試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
【００３３】
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。
【００３４】
幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
【００３５】
幾つかの実施形態では本方法は、標的細菌に感染することができる前記ファージに前記試料を曝露する前の一時期に前記試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では本方法は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１と組換えＰ１００から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出はその試料の中のリステリアの存在を表す。
【００３７】
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種のその試料における存在を表す。
【００３８】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種のその試料における存在を表す。
【００３９】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記少なくとも１種類のリステリアファージはリステリア・イノキュアｓｉｇＢ対立遺伝子型１１、２２、３７、及び５６に感染することができる。
【００４０】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプの存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄを含む。
【００４１】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリｓｉｇＢ対立遺伝子型３、２０、２４、及び３５を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリｓｉｇＢ対立遺伝子型１５、２７、３２及び８９を含む。
【００４３】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも２つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも３つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも４つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも１つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレ���トコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。
【００４４】
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【００４５】
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
【００４６】
幾つかの実施形態では前記マーカーが前記試料中に検出され、前記試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。
【００４７】
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
【００４８】
別の態様では本開示はマーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージを提供する。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージは組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記マーカーを産生する。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアｓｉｇＢ対立遺伝子型１１、２２、３７、及び５６を含む。
【００５０】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄを含む。
【００５１】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリｓｉｇＢ対立遺伝子型３、２０、２４、及び３５を含む。
【００５２】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリｓｉｇＢ対立遺伝子型１５、２７、３２及び８９を含む。
【００５３】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも２つの種を含む。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも３つの種を含む。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリを含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも１つが含まれない。幾���かの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌の全てがリステリアである。
【００５４】
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。
【００５５】
幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、及びＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ及びＬＰ１２５：：ｎｌｕｃから選択される。
【００５６】
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備え、前記組換えリステリアファージは組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。
【００５７】
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは配列番号４に対して少なくとも７０％同一であるルシフェラーゼをコードする異種性核酸配列を備え、前記組換えリステリアファージは組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージはＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【００５８】
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下の偽陽性率で環境試料中に標的細菌を検出する。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下の偽陰性率で環境試料中に標的細菌を検出する。
【００５９】
別の態様では本開示は組換えリステリアファージを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態ではその組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む。幾つかの実施形態ではその組成物は１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態ではその組成物はＡ５１１：：ｎｌｕｃ、Ｐ１００：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。幾つかの実施���態ではその組成物はＡ５１１：：ｎｌｕｃ及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。幾つかの実施形態ではその組成物はＡ５１１：：ｎｌｕｃ、ＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。
【００６０】
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも２種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記組成物は、ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分をさらに含む。幾つかの実施形態ではその組成物は１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む。
【００６１】
別の態様では本開示は製品を提供する。幾つかの実施形態ではその製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液を備える。幾つかの実施形態では前記製品は、１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む溶液を備える容器を含む。幾つかの実施形態では前記製品はＡ５１１：：ｎｌｕｃ、Ｐ１００：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。幾つかの実施形���では前記製品はＡ５１１：：ｎｌｕｃ及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。幾つかの実施形態では前記製品はＡ５１１：：ｎｌｕｃ、ＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、及びＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む。
【００６２】
幾つかの実施形態では前記製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも２種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及び、ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液を備える。幾つかの実施形態では前記製品は、１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む溶液を備える容器を含む。
【００６３】
別の態様では本開示はファージの標的微生物を特定する方法を提供する。それらの標的微生物は細菌又は古細菌であり得る。幾つかの実施形態では本方法は、異なる細菌種の複数の液体培養試料をそのファージに曝露すること、及びそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することを含む。幾つかの実施形態ではそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することはそれらの試料における細胞の透明化の測定を含む。幾つかの実施形態では試料における細胞の透明化はその試料の中の細菌種がそのファージの標的細菌であることを表す。
【００６４】
幾つかの実施形態では前記ファージは第１マーカーをコードする異種性核酸配列を備える。幾つかの実施形態ではそのファージがそれらの複数の異なる細菌種に感染するか判定することはそれらの複数の試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることによる。幾つかの実施形態では試料中の前記マーカーの検出はその試料の中の細菌種がそのファージの標的細菌であることを表す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ｃｐｓ遺伝子配列のアラインメントを示す図である。
【図２】図１に記載のｃｐｓ遺伝子によりコードされるタンパク質配列のアラインメントを示す図である。
【図３】挿入されているホタルルシフェラーゼ・コード配列のアラインメントを示す図である。
【図４】挿入されているＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ・コード配列のアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本明細書において別途定義されない限り、本開示に関連して使用されている科学用語と技術用語は当業者によって共通して理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形のものを含み、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学、及びハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、及びそれらの技術は当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられる命名法及び技術である。本明細書において引用されるある特定の参照文献及び他の文書は参照により明示的に本明細書に援用される。さらに、本明細書において引用される全てのＧｅｎｂａｎｋ及び他の配列データベースの記録物はここに参照により本明細書に援用される。矛盾がある場合には定義をはじめとして本明細書が優先される。材料、方法、及び実施例は例示のみを目的としており、限定的であることを意図していない。
【００６７】
本開示の方法と技術は概して当技術分野においてよく知られており、且つ、別途指示されない限り本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的参照文献及びより特定的な参照文献において記載される従来法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年、及び２００２年に増補）；Ｔａｙｌｏｒ及びＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ（２００３年）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、フリーホールド、ニュージャージー州；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第ＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６年）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照されたい。ファージに適用可能な多くの分子生物学と遺伝学の技術がＣｌｏｋｉｅら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻及び第２巻（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第５０１巻及び第５０２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州（２００９年）に記載されており、その文献をここに参照により本明細書に援用する。
【００６８】
本開示は、インターネット上で公開されているある特定のアミノ酸配列及び核酸配列の配列データベースエントリー（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ又はＧＥＮＥＢＡＮＫの記録物）、並びにインターネット上の他の情報について言及する。当業者は配列データベースエントリーをはじめとするインターネット上の情報は時々更新されること、及び、例えば、特定の配列に言及するために使用される参照番号が変わり得ることを理解する。インターネット上の配列情報又は他の情報の公開データベースに言及する場合はそのような変更が起こり得ること、及びインターネット上の特定の実施形態の情報が行き来できることが理解される。当業者はインターネット上で検索することにより同等の情報を見つけることができるので、インターネットのウェッブページのアドレス又は配列データベースのエントリーに対する言及が、問題の情報を利用できることと問題の情報が公に普及していることの証拠となる。
【００６９】
本ファージ、組成物、方法、及び他の実施形態を開示及び説明する前に本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定的であることを意図していないことが理解されるべきである。本明細書及び添付されている特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈から別途明確に指示されない限り複数形の指示物を含むことを留意すべきである。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的又は開放的であり、その他の引用されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外しない。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内というよりもむしろ人工的環境において、例えば、試験管又は反応容器において、細胞培養において、ペトリ皿等において生じる事象を指す。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「インビボ」という用語は生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内で生じる事象を指す。それにもかかわらず、微生物内で少なくとも部分的にインビボで生じるアッセイは、例えばそのアッセイの一部が培養中のその微生物の体外で生じる場合にはインビトロで生じ得る。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、（１）物質又は物体が（自然界であるにしても、実験環境にあるにしても）最初に産生されたときにその物質又は物体と結合している成分の少なくとも幾つかより分離されている、及び／又は（２）人の手によって作製、調製、及び／又は製造されているその物質又は物体を指す。単離された物質及び／又は物体は、それらの物質及び／又は物体と最初に結合している他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれより多くの割合から分離され得る。幾つかの実施形態では単離された因子は約８０％より多くの割合で、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％より多くの割合で純粋である。本明細書において使用される場合、物質が他の成分を実質的に含んでいない場合、その物質は「純粋」である。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「ペプチド」という用語は短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸未満のアミノ酸を含むポリペプチド、より典型的には約３０アミノ酸未満のアミノ酸を含むポリペプチドを指す。本明細書において使用される場合、その用語は構造的機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣する類似物及び模倣物を包含する。
【００７５】
「ポリペプチド」という用語は天然と非天然の両方のタンパク質、並びにそれらのタンパク質の断片、突然変異体、誘導体、及び類似物を包含する。ポリペプチドは単量体性又は多量体性であり得る。さらに、ポリペプチドはそれぞれ１つ以上の明確な活性を有する様々なドメインを含み得る。疑義を回避するため、「ポリペプチド」は２アミノ酸よりも長いあらゆる長さであり得る。
【００７６】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、そのタンパク質又はポリペプチドの起源又は由来のために（１）そのタンパク質又はポリペプチドの本来の状態でそのタンパク質又はポリペプチドに付随する天然結合成分と結合していないタンパク質又はポリペプチド、（２）他の細胞物質の存在に関して判断され得る純度について、自然界で見られない純度で存在する（例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を含まない）タンパク質又はポリペプチド、（３）他の種の細胞によって発現されるタンパク質又はポリペプチド、又は（４）自然界で生じない（例えば、自然界で見られるポリペプチドの断片である、又は自然界で見られないアミノ酸類似体又は誘導体、又は標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学合成されたポリペプチド、又はあるポリペプチドが自然状態で生じる細胞と異なる細胞系で合成されたそのポリペプチドは、そのポリペプチドの自然状態で結合する成分から「単離」される。単離により、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いてポリペプチド又はタンパク質は自然状態で結合する成分を実質的に含まないようにもされ得る。これまで定義されたように、「単離された」はそのように記載されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はオリゴペプチドが、それが合成される細胞から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド断片」という用語は全長型ポリペプチド、例えば、天然のタンパク質と比較して欠失、例えば、アミノ末端欠失及び／又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。一実施形態ではそのポリペプチド断片はその断片のアミノ酸配列が天然の配列の対応する部分と同一である連続的配列である。断片は典型的には少なくとも５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、又は１０アミノ酸の長さであり、又は少なくとも１２アミノ酸、１４アミノ酸、１６アミノ酸、又は１８アミノ酸の長さであり、又は少なくとも２０アミノ酸の長さであり、又は少なくとも２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、又は４５アミノ酸の長さであり、又は少なくとも５０アミノ酸又は６０アミノ酸の長さであり、又は少なくとも７０アミノ酸の長さである。
【００７８】
「融合タンパク質」という用語は異種性アミノ酸配列に結合しているポリペプチド又は断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は２種類以上の異なるタンパク質に由来し得る２つ以上の所望の機能性要素を含むように構築され得るので有用である。融合タンパク質は目的のポリペプチドの少なくとも１０個の連続アミノ酸、又は少なくとも２０個又は３０個のアミノ酸、又は少なくとも４０個、５０個、又は６０個のアミノ酸、又は少なくとも７５個、１００個、又は１２５個のアミノ酸を含む。その融合タンパク質に含まれる異種性ポリペプチドは通常は少なくとも６アミノ酸の長さであり、又は少なくとも８アミノ酸の長さであり、少なくとも１５アミノ酸、２０アミノ酸、又は２５アミノ酸の長さである。ＩｇＧ  Ｆｃ領域などの大き目のポリペプチド及びさらには緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）クロモフォア含有タンパク質などのタンパク質全体を含む融合体は特に有用である。融合タンパク質は、ポリペプチド又はその断片をコードする核酸配列を異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列とインフレームで構築し、次にその融合タンパク質を発現することにより組換え的に作製され得る。あるいは、融合タンパク質はポリペプチド又はその断片を別のタンパク質に架橋することにより化学的に作製され得る。
【００７９】
本明細書において使用される場合、あるタンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有している場合にそのタンパク質はその第２のタンパク質に対する「相同性」を有する、又はその第２のタンパク質と「相同」である。あるいは、あるタンパク質と第２のタンパク質が類似のアミノ酸配列を有している場合にそのタンパク質はその第２のタンパク質に対する相同性を有する。（したがって、「相同性タンパク質」という用語は２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有していることを意味すると定義される。）本明細書において使用される場合、２つの領域のアミノ酸配列の間の（特に予想される構造的類似性に関しての）相同性は機能の類似性を意味するものと解釈される。
【００８０】
タンパク質又はペプチドに関して「相同性」が使用されるとき、同一ではない残基位置が多くの場合に保存的アミノ酸置換によって異なっていることが理解される。「保存的アミノ酸置換」はあるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を持つ別のアミノ酸残基により置換されているアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性をあまり変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により相互に異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性度はその置換の保存的性質のために上方に調節されて補正され得る。この調節を行うための手段は当業者によく知られている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第２４巻：３０７〜３１頁、及び第２５巻：３６５〜８９頁を参照されたい。
【００８１】
次の６つのグループは相互に保存的代替物であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）セリン、トレオニン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン；４）アルギニン、リシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、及び６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【００８２】
ポリペプチドの配列相同性もパーセント配列同一性と称され、通常は配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ウィスコンシン州マジソン５３７０５、９１０ユニバーシティー・アヴェニューにあるウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）の配列分析ソフトウェアパッケージを参照されたい。タンパク質分析ソフトウェアは保存的アミノ酸置換をはじめとする様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられている相同性の尺度を使用して類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連するポリペプチド、例えば、異なる種の生物に由来する相同性ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのタンパク質の突然変異型タンパク質との間で配列相同性又は配列同一性を決定するために初期パラメーターと共に使用され得る「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。
【００８３】
様々な生物に由来する大多数の配列を含むデータベースに対して特定のポリペプチド配列を比較するときの例となるアルゴリズムはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）；Ｇｉｓｈ及びＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．誌、第３巻：２６６〜２７２頁（１９９３年）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、第２６６巻：１３１〜１４１頁（１９９６年）；Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）；Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．誌、第７巻：６４９〜６５６頁（１９９７年））というコンピュータープログラムであり、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））である。
【００８４】
ＢＬＡＳＴｐの例となるパラメーターは、期待値：１０（初期値）、フィルター：ｓｅｇ（初期値）、ギャップを開けるためのコスト：１１（初期値）、ギャップを延長するためのコスト：１（初期値）、最大アラインメント：１００（初期値）、ワードサイズ：１１（初期値）、記載数：１００（初期値）、ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、又は少なくとも約２０残基、又は少なくとも約２４残基、又は少なくとも約２８残基であり、又は約３５残基を超える。多種多様な生物の配列を含むデータベースを検索するときはアミノ酸配列を比較することが有用であり得る。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は当技術分野において知られているｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムにより判断され得る。例えば、ＧＣＧ第６．１版中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用してポリペプチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡはクエリー配列とサーチ配列との間で最も良く重なる領域のアラインメントとパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、第１８３巻：６３〜９８頁（１９９０年）。例えば、アミノ酸配列の間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ第６．１版において提供されたときのＦＡＳＴＡの初期パラメーター（２のワードサイズとＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）と共にＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
【００８５】
幾つかの実施形態では多量体性分子（例えば、ポリペプチド配列又は核酸配列）は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である場合に相互に「相同」であると見なされる。幾つかの実施形態では多量体性分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％類似している場合に相互に「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必ず少なくとも２つの配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）の間の比較を指す。幾つかの実施形態では２つのヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸からなる少なくとも１つの範囲について少なくとも約５０％同一である、少なくとも約６０％同一である、少なくとも約７０％同一である、少なくとも約８０％同一である、又は少なくとも約９０％同一である場合にそれらのヌクレオチド配列は相同であると見なされる。幾つかの実施形態では相同ヌクレオチド配列は少なくとも４〜５個の一義的に特定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力を特徴とする。相同であると見なされるヌクレオチド配列については相互に対するこれらのアミノ酸の同一性とおおよその間隔の両方が考慮されねばならない。６０ヌクレオチド未満の長さのヌクレオチド配列の幾つかの実施形態では相同性は、少なくとも４〜５個の一義的に特定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力によって判定される。幾つかの実施形態では２つのタンパク質配列が少なくとも約２０アミノ酸からなる少なくとも１つの範囲について少なくとも約５０％同一である、少なくとも約６０％同一である、少なくとも約７０％同一である、少なくとも約８０％同一である、又は少なくとも約９０％同一である場合にそれらのタンパク質は相同であると見なされる。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「修飾型誘導体」は、一次構造配列においては基準ポリペプチド配列に対して実質的に相同であるが、例えば、インビボ又はインビトロでの化学的及び生化学的な修飾を含む、又はその基準ポリペプチド中に見出されないアミノ酸を組み込んでいるポリペプチド又はそれらの断片を指す。そのような修飾には、当業者によって容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識、及び様々な酵素的修飾が含まれる。ポリペプチドを標識するための様々な方法、及び様々な置換物、又はそのような目的に有用な標識は当技術分野においてよく知られており、125１、32Ｐ、35Ｓ、及び3Ｈなどの放射性同位体、標識された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び標識されたリガンドに対する特定の結合対メンバーとして機能することができる抗リガンドを含む。標識の選択は必要とされる感度、プライマーとの結合のし易さ、安定性の要件、及び利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年、及び２００２年に増補）を参照されたい。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド突然変異体」又は「突然変異タンパク質」は、基準タンパク質又はポリペプチド、例えば、天然型タンパク質又は野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再構成又は置換を配列に含むポリペプチドを指す。突然変異タンパク質は１つ以上のアミノ酸点置換であって、ある位置の一つのアミノ酸が別のアミノ酸に変化しているアミノ酸点置換、基準タンパク質の配列の中での１つ以上の挿入及び／又は欠失であって、１つ以上のアミノ酸がそれぞれ挿入又は欠失されている挿入及び／又は欠失、及び／又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端のどちらか、又は両方におけるアミノ酸配列の短縮を有し得る。突然変異タンパク質は基準タンパク質と比較して同じ生物活性、又は異なる生物活性を有し得る。
【００８８】
幾つかの実施形態では突然変異タンパク質は、例えば、その対照基準ポリペプチド又はタンパク質に対して少なくとも７０％の全体的な配列相同性を有する。幾つかの実施形態では突然変異タンパク質は野生型タンパク質又はポリペプチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％の全体的な配列相同性を有する。他の実施形態では突然変異タンパク質は少なくとも９５％配列同一性、又は９８％、又は９９％、又は９９．５％又は９９．９％の全体的な配列同一性を示す。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「組換え型」は、（１）天然環境から取り出されている、（２）遺伝子が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と関係していない、（３）自然界では結合していないポリヌクレオチドに機能的に結合している、又は（４）自然界で生じない生体分子、例えば、遺伝子又はタンパク質を指す。「組換え型」という用語はクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成されるポリヌクレオチド類似体、又は異種性システムによって生物学的に合成されるポリヌクレオチド、並びにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び／又はｍＲＮＡに関して使用され得る。したがって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、そのタンパク質がその細胞中に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成される場合は組換え型である。ファージが組換え生体分子を含む場合はそのファージは「組み換え型」である。したがって、例えば、限定されないが、ファージのゲノムが組換え核酸配列を含む場合はそのファージは組み換え型である。
【００９０】
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」、又は「核酸配列」という用語は少なくとも１０塩基長の多量体型のヌクレオチドを指す。その用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ又は合成ＲＮＡ）、並びに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然型ヌクレオシド間結合、又はそれらの両方を含むＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含む。核酸はあらゆる位相幾何学的構造をとることができる。例えば、核酸は一重鎖、二重鎖、三重鎖、四重鎖、部分二重鎖、分岐型、ヘアピン型、環状、又はパドロック構造であり得る。核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びに前記の核酸の合成型及び混合型重合体のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得る。それらの核酸は、当業者によって容易に理解されるように、化学的又は生化学的に修飾されてもよく、又は非天然型ヌクレオチド塩基又は誘導体型ヌクレオチド塩基を含んでもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然型ヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体による置換；無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）、有電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラーレン等）、キレーター、アルキレーター、及び修飾型結合（例えば、αアノマー核酸等）などのヌクレオチド間修飾が含まれる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当技術分野において知られており、例えば、分子骨格中のリン酸結合がペプチド結合によって置き換えられているものがそのような分子に含まれる。他の修飾には、例えば、リボース環が「ロックド」核酸中に見出される修飾のような架橋部分又は他の構造を含む類似体が含まれ得る。
【００９１】
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合型重合体は細胞外で作製されたものであり、例えば、化学的に合成されたものである。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「核酸断片」という用語は全長型基準ヌクレオチド配列と比較して欠失、例えば、５’末端欠失又は３’末端欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では核酸断片は、その断片のヌクレオチド配列が天然型配列の対応する位置について同一である連続的配列である。幾つかの実施形態では断片は少なくとも１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、又は２５ヌクレオチド長、又は少なくとも２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１１０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１３０ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、又は１５０ヌクレオチド長である。幾つかの実施形態ではある核酸配列の断片はオープン・リーディング・フレーム配列の断片である。幾つかの実施形態ではそのような断片はオープン・リーディング・フレームヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の（本明細書において定義される）ポリペプチド断片をコードする。
【００９３】
本明細書において使用される場合、ある生物（ファージを含む）のゲノム中の内在性核酸配列（又はその配列のコード化タンパク質産物）は、この内在性核酸配列の発現が変化するように異種性配列がその内在性核酸配列に隣接して配置されている場合に本明細書において「組換え型」と見なされる。この状況では異種性配列は、その異種性配列自体が内在性（同じ宿主細胞又はその子孫に由来する）であるか、又はその異種性配列が外来性（異なる宿主細胞又はその子孫に由来する）であるかどうかにかかわらず、自然界ではその内在性核酸配列に隣接していない配列である。例えば、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然型プロモーターを（例えば相同組換えにより）あるプロモーター配列で置き換えることができ、そうしてこの遺伝子は変化した発現パターンを有する。この遺伝子はもう、自然界でその遺伝子に隣接する配列のうちの少なくとも幾つかより分離されているので、「組換え型」になる。
【００９４】
核酸は、自然界でゲノム中の対応する核酸に起こらないあらゆる修飾をその核酸が含む場合にも「組換え型」と見なされる。例えば、ある内在性コード配列が人為的に、例えば、ヒトによる介入によって導入された挿入、欠失又は点突然変異を含む場合にその内在性コード配列は「組み換え型」と見なされる。「組換え型核酸」は非相同部位において宿主細胞染色体に組み込まれている核酸、及びエピソームとして存在する核酸コンストラクトも含む。ファージに関して、「組換え型ファージゲノム」は人為的に、例えば、ヒトによる介入によって導入された挿入、欠失又は点突然変異を含むファージゲノムである。
【００９５】
本明細書において使用される場合、基準核酸配列の「縮合変異体」という言葉は、標準的な遺伝暗号に従って翻訳されてその基準核酸配列から翻訳されたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列を包含する。「縮合オリゴヌクレオチド」又は「縮合プライマー」という用語は、必ずしも配列が同一ではないが、１つ以上の特定の区域内で相互に相同である標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。
【００９６】
核酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」又は「同一である」という用語は、２つの配列が最も一致するように整列させられると同一であるそれらの２つの配列の中の残基を指す。配列同一性比較の長さは少なくとも約９ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、及びさらにより典型的には少なくとも約３６ヌクレオチド以上の長さにわたってよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野において知られている多種多様なアルゴリズムが存在する。例えば、ウィスコンシン州マジソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）のウィスコンシンパッケージ・第１０．０版中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡはクエリー配列とサーチ配列との間で最も良く重なる領域のアラインメントとパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、第１８３巻：６３〜９８頁（１９９０年）。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ第６．１版において提供されたときのＦＡＳＴＡの初期パラメーター（６のワードサイズとスコアリングマトリックス用のＮＯＰＡＭファクター）と共にＦＡＳＴＡを使用して、又はＧａｐの初期パラメーターと共にＧａｐを使用して決定され得る。あるいは、配列はＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）；Ｇｉｓｈ及びＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．誌、第３巻：２６６〜２７２頁（１９９３年）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、第２６６巻：１３１〜１４１頁（１９９６年）；Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）；Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．誌、第７巻：６４９〜６５６頁（１９９７年））、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））を使用して比較され得る。
【００９７】
核酸又はその断片に言及するとき、「実質的な相同性」又は「実質的な類似性」という用語は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を入れて別の核酸（又はその核酸の相補鎖）と最適になるように整列させると上で考察したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＧａｐなどのよく知られている配列同一性についてのどのアルゴリズムで測定されてもヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％にヌクレオチド配列同一性が存在することを表している。
【００９８】
あるいは、核酸又はその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で別の核酸に、別の核酸の鎖に、又は別の核酸の相補鎖にハイブリダイズするときに実質的な相同性又は実質的な類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の背景での「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は様々な物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基構成、相補的領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件によって影響を受ける。当業者はどのようにこれらのパラメーターを変えてハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するか知っている。
【００９９】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は特定の条件セットの下で特定のＤＮＡハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）より約２５℃下で実施される。「ストリンジェントな洗浄」は特定の条件セットの下で特定のＤＮＡハイブリッドのＴｍより約５℃低い温度で実施される。Ｔｍは標的配列の５０％が完全に合致するプローブにハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（１９８９年）、９．５１頁を参照されたい。本明細書における目的のためには「ストリンジェントな条件」は、液相ハイブリダイゼーションについて６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣが３．０ＭのＮａＣｌと０．３Ｍのクエンサンナトリウムを含む）、１％ＳＤＳ中、６５℃で８〜１２時間にわたり、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間にわたる水性（すなわち、ホルムアミドを含まない）ハイブリダイゼーションとして定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションはハイブリダイズする配列の長さとパーセント同一性をはじめとする多数の因子に応じて様々な速度で起こることが当業者によって理解される。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」は機能的に結合しているコード配列の発現に影響するポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象、及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセッシングシグナル、細胞質性ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列（例えば、リボソーム結合部位）、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望によりタンパク質分泌を向上させる配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物ではそのような制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在することが発現にとって必須であるあらゆる成分を最少でも包含するものとされ、また、存在することが有利である追加的成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を包含し得る。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「機能的に結合した」又は「機能可能的に結合した」発現制御配列は、目的の遺伝子を制御するためにその発現制御配列がその目的の遺伝子と連続的である結合、並びに目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は遠位で作用する発現制御配列を指す。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」はベクターが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、プラスミドはその他のＤＮＡ区域をライゲートさせることができる環状二重鎖ＤＮＡループを一般的に指すが、プラスミドにはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅又は制限酵素による環状プラスミドの処理により生じたものなどの直鎖状二重鎖分子も含まれる。他のベクターにはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターではその他のＤＮＡ区域をウイルスゲノムにライゲートすることができる（下でより詳細に考察する）。ある特定のベクターはそれらのベクターが導入されている宿主細胞で自律複製を行うことができる（例えば、宿主細胞で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムと共に複製される。また、ある特定のベクターはそれらのベクターが機能的に結合している遺伝子の発現を行うことができる。そのようなベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「組換え型宿主細胞」（又は単に「組換え型細胞」又は「宿主細胞」）という用語は組換えベクターなどの組換え核酸が導入されている細胞を指すものとする。幾つかの例では「細胞」という言葉はある種の細胞を表す名前によって置き換えられる。例えば、「組換え型微生物」は微生物宿主細胞である組換え宿主細胞である。そのような用語は特定の対象細胞を指すばかりではなく、そのような細胞の子孫も指すことが理解されるべきである。突然変異か環境の影響のどちらかに起因して後続の世代においてある特定の改変が生じ得るのでそのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があり得るが、それでも本明細書において使用される「組換え型宿主細胞」、「組換え型細胞」、及び「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は培養されている単離細胞又は細胞株であり得、又は生体組織又は生物中に存在する細胞であり得る。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「バクテリオファージ」は細菌に感染するウイルスを指す。同様に、「アーケオファージ」は古細菌に感染するウイルスを指す。「ファージ」という用語は両方のタイプのウイルスを指すために使用されるが、ある特定の例では文脈によって示されるようにバクテリオファージ又はアーケオファージを特異的に指すための簡略表記として使用される場合もあり得る。バクテリオファージとアーケオファージは宿主生合成機構の幾つか、又は全てを使用することにより細菌／古細菌内部で複製する細胞内絶対寄生生物（すなわち、細菌に感染するウイルス）である。様々なバクテリオファージ及びアーケオファージが様々な物質を含有し得るが、それらのファージは全て核酸とタンパク質を含有し、ある特定の状況下で脂質膜中に封入され得る。ファージに応じてその核酸はＤＮＡ又はＲＮＡのどちらかであり得るが、両方であることはなく、様々な形態で存在し得る。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、「異種性核酸配列」は、通常は起こらない配置によってゲノム中の場所に配置されているあらゆる配列である。異種性核酸配列は自然界では特定の細菌／古細菌及び／又はファージ内に生じない配列を含む場合があり得、又は異種性核酸配列は、自然界で細菌／古細菌及び／又はファージ内に見出されるが、ゲノム中の正常では生じない位置に配置されている配列だけを含む場合があり得る。幾つかの実施形態ではその異種性核酸配列は天然ファージ配列ではなく、幾つかの実施形態ではその異種性核酸配列は異なるファージに由来するものではあるが、天然ファージ配列であり、さらに他の実施形態ではその異種性核酸配列は開始ファージのゲノム中で自然に生じる配列ではあるが、その後にその配列が自然界では生じない別の部位に移動し、その新しい部位においてその配列を異種性配列にする前記配列である。
【０１０６】
「開始ファージ」又は「開始ファージゲノム」は自然環境又は人為的環境から単離された遺伝子工学で改変されていないファージ、又はそのようなファージのゲノムである。
【０１０７】
「組換え型ファージ」又は「組換え型ファージゲノム」はファージへの異種性核酸配列の挿入により遺伝的に改変されているゲノムを含むそのファージ、又はそのファージのゲノムである。幾つかの実施形態では開始ファージのゲノムはゲノムの所定の位置に異種性核酸配列を導入する組換えＤＮＡ技術により改変される。幾つかの実施形態では異種性配列は、その配列の導入に対応して内在性ファージゲノムヌクレオチドを失わずに導入される。言い換えると、開始ファージゲノム中で塩基Ｎ１とＮ２が隣接している場合に異種性配列がＮ１とＮ２の間に挿入される。したがって、結果生じた組換えゲノムではその異種性配列の両側にヌクレオチドＮ１とＮ２がある。幾つかの事例では異種性配列が挿入され、内在性ヌクレオチドがその外来性配列によって取り除かれるか、又は置き換えられる。例えば、幾つかの実施形態では取り除かれる内在性配列の幾らか、又は全体の代わりに外来性配列が挿入される。幾つかの実施形態では外来性配列の挿入部位から遠位にあるファージゲノム中の位置から内在性配列が取り除かれる。
【０１０８】
「ファージ宿主細胞」は子孫ファージ粒子を産生するためにファージが感染することができる細胞である。
【０１０９】
「機能的に結合した」又は「機能可能的に結合した」発現制御配列は目的のコード配列の発現を制御するためにその目的のコード配列と発現制御配列が連続的である結合、並びにそのコード配列の発現を制御するためにトランス又は遠位で作用する発現制御配列のことを指す。
【０１１０】
「コード配列」又は「オープン・リーディング・フレーム」はポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチドの配列である。そのコード配列の両末端は開始コドンと終止コドンである。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」という用語は機能的に結合しているコード配列の発現に影響するポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象、及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセッシングシグナル、細胞質性ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列（例えば、リボソーム結合部位）、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望によりタンパク質分泌を向上させる配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物ではそのような制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在することが発現にとって必須である全ての成分を最少でも内包するものとされ、また、存在することが有利である追加的成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を内包し得る。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「ファージゲノム」は天然のファージゲノム及びそれらの派生物を含む。概して（必ずというわけではないが）、それらの派生物は親として同じ宿主の中で増殖する能力を有する。幾つかの実施形態では天然ファージゲノムと派生ファージゲノムとの間の唯一の違いはそのゲノムが直鎖状である場合はそのファージゲノムの少なくとも一端からの、又はそのゲノムが環状である場合はそのゲノム中の少なくとも一点からのヌクレオチドの欠失とヌクレオチドの付加のうちの少なくとも一方である。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「標的細菌」は検出可能な出力物を産生するファージが感染することができる細菌である。例えば、検出可能な出力物は細胞溶解を含む。したがって、ファージによる細菌細胞の溶解は、それらの細菌細胞はそのファージの「標的細菌」であることを示している。検出可能な出力物の別の例はファージによる細菌細胞の感染後のマーカーの発現である。適切なマーカーにはＲＮＡ及びポリペプチドが含まれる。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「マーカー」には選択可能及び／又はスクリーニング可能マーカーが含まれる。本明細書において使用される場合、「選択可能マーカー」は、そのマーカーを発現しない類似の細胞の増殖を阻害又は促進する薬剤であって、存在するときはその増殖を阻害し、存在しないときはその増殖を促進する前記薬剤が存在しても、存在していなくても増殖する能力をそのマーカーを有する細胞に与えるマーカーである。そのような細胞はそれらの細胞の選択可能マーカーの発現のために「選択可能表現型」を有していると言うこともできる。例えば、アンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）はその遺伝子を有し、且つ、発現する細胞にアンピシリンが存在するときに増殖する能力を与える（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，  Ｊ．Ｇ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、１９７８年８月；第７５巻（第８号）：３７３７〜３７４１頁を参照のこと）。他の非限定的な例にはクロラムフェニコール、カナマイシン、及びテトラサイクリンに対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。他のマーカーにはＵＲＡ３、ＴＲＰ及びＬＥＵが含まれ、それらはそれぞれ前記ウラシル、トリプトファン、及びロイシンが存在しないときの増殖を可能にする。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「スクリーニング可能マーカー」は、そのマーカーを発現する細胞を特定する基礎として使用され得る検出可能な標識である。そのような細胞はそれらの細胞のスクリーニング可能マーカーの発現のために「スクリーニング可能表現型」を有していると言うこともできる（概して、選択可能マーカーの遺伝子産物が、そのマーカーを発現する細胞に選択可能性を付与するその遺伝子産物の機能と無関係にそのマーカーを発現する細胞を特定する基礎として使用され得るかぎりにおいて、選択可能マーカーはスクリーニング可能マーカーとして機能することもできる）。組換えファージによってコードされ、且つ、差次的に検出され得るあらゆる分子がスクリーニング可能マーカーとして機能し得る。スクリーニング可能マーカーは核酸分子又はその部分、例えば、一重鎖又は二重鎖であるＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり得る。あるいは、スクリーニング可能マーカーはタンパク質又はその部分であり得る。適切なタンパク質マーカーには検出可能な反応産物の形成に対して触媒作用を及ぼす酵素が含まれる。一例はルシフェラーゼ又は変異体、例えばｌｕｘＡＢなどの化学発光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼである。別の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素である。発光シグナルを生成するために使用されるタンパク質は２つの広範なカテゴリー、すなわち、直接的に光を発生するタンパク質（ルシフェラーゼ及び関連タンパク質）及び化学的カスケードの一部として間接的に光を発生するために使用されるタンパク質（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）に分類される。生物学研究において使用されている最も一般的な生物発光タンパク質はイクオリンとルシフェラーゼである。前者のタンパク質はオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来し、溶液中のカルシウム濃度を決定するために使用され得る。ルシフェラーゼファミリーのタンパク質は広範囲の実験目的に適合させられている。ホタル及びウミシイタケ由来のルシフェラーゼは生物学研究において最も一般的に使用される。これらのタンパク質は２つの別個の機能ドメインに遺伝学的に分離されてもいて、それらのタンパク質が接近して共局在するときにのみ光を発生する。これらのタンパク質の両方の様々な発光スペクトルシフト型突然変異誘導体が過去１０年にわたって作製されている。これらは生細胞内での多色画像撮影と共局在のために使用されている。化学発光シグナルを生成するために使用される他のグループのタンパク質はペルオキシダーゼとホスファターゼである。ペルオキシダーゼは光を発生する反応においてルミノールを酸化する過酸化物を生成する。これらのうちで最も広範に使用されているものはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、ホースラディッシュペルオキシダーゼはウエスタンブロットとＥＬＩＳＡにおける検出のために広範に使用されている。同様に使用されている２つ目のグループのタンパク質はアルカリホスファターゼであり、アルカリホスファターゼは基質分子からリン酸を取り除き、その分子を不安定化し、光を発することになるカスケードを開始する。
【０１１６】
他の適切なスクリーニング可能マーカーには蛍光タンパク質が含まれる。蛍光タンパク質には青色／ＵＶ蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、青緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、及びｍＷａｓａｂｉ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、及びｍＯｒａｎｇｅ２）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、及びｍＲｕｂｙ）、赤外蛍光タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びＮｉｒＦＰ）、近ＩＲ蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、及びｉＲＦＰ）、ロング・ストロークシフトタンパク質（例えば、ｍＫｅｉｍａ  Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、及びＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光励起性蛍光タンパク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、及びＰＡＴａｇＲＦＰ）、光変換性蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、及びＰＳｍＯｒａｎｇｅ）、及び光切換え性蛍光タンパク質（例えば、Ｄｒｏｎｐａ）が含まれるが、これらに限定されない。記載された例に対する幾つかの変異体と代替物も当業者によく知られており、適切な用途において置き換えられ得る。
【０１１７】
他の適切なマーカーにはエピトープが含まれる。例えば、抗体又は他の結合分子によって検出され得るエピトープを含むタンパク質はスクリーニング可能マーカーの例である。エピトープを認識する抗体はシグナル生成部分に（例えば化学発光タンパク質又は蛍光タンパク質の共有結合により）直接的に結合され得るし、又は例えばシグナル生成部分に直接的に結合されている二次抗体などの少なくとも１つのその他の結合試薬を使用して検出され得る。幾つかの実施形態ではエピトープがファージ又は標的微生物のタンパク質中に存在しないので試料中のそのエピトープの検出は、そのエピトープを含むタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えファージによる感染後にその微生物によってそのエピトープを含むタンパク質が産生されたことを示している。他の実施形態ではそのマーカーは自然界で標的微生物又はファージ中に存在するタンパク質の中の精製タグであり得る。例えば、そのタグ（例えば、６−Ｈｉｓタグ）を使用して他の細菌タンパク質又はファージタンパク質からその異種性タンパク質を精製することができ、次に例えば抗体を使用してその精製タンパク質を検出することができる。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、「環境試料」は実験室細胞培養環境以外のあらゆる環境から得られた試料である。一般に、必ずというわけではないが、環境試料は、ａ）細菌細胞の最大限の増殖及び／又は代謝を支援しない温度、ｂ）細菌細胞の最大限の増殖及び／又は代謝を支援しない栄養プロファイル、及びｃ）アッセイに使用されるファージの標的細菌ではない細菌細胞のうちの少なくとも１つを含む環境から取得される。幾つかの実施形態では環境試料中に存在する細菌の幾らか、又は全ては代謝的活性状態にない。限定されないが、環境試料は工業プラント、食品加工工場、獣医療供給源、食品、家畜、医療環境及び医療面、学校、福祉センター、クルーズ船、他の狭い宿舎、及び家から取得され得る。
Ａ．組換えファージ
【０１１９】
本開示はファージ宿主範囲を評価する新規方法を提供する。それらの方法は実施例に記載される一組のファージの標的細菌を明らかにするために使用された。その分析の結果としてファージＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、ＬＰ１４３、Ａ５１１、及びＰ１００が遺伝子操作用に選択された。それらの実施例はマーカーをコードする異種性核酸配列を含む組換え型のファージＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、ＬＰ１４３、Ａ５１１、及びＰ１００の作製について述べている。それらの実施例において示されているように、それらのファージは、本願を通してさらに開示されるように、例えば標的細菌を検出するのに有用である。
【０１２０】
したがって、本開示はマーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージを提供する。幾つかの実施形態ではその組換えファージは、ＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、ＬＰ１４３、Ａ５１１、及びＰ１００から選択される少なくとも１つのファージの少なくとも１ｋｂのゲノム領域に対して実質的な相同性を備える少なくとも１ｋｂの領域を含むゲノムを備える。幾つかの実施形態ではその相同性領域は少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、又はそれより多くを備える。幾つかの実施形態ではその相同性領域は前記組換えリステリアファージのゲノム全体である。幾つかの実施形態ではその実質的な相同性はその相同性領域にわたる少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性である。
【０１２１】
本開示はファージＬＰ４０のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６）、ＬＰ４８のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号８）、ＬＰ９９のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１０）、ＬＰ１０１のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１２）、ＬＰ１２４のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１４）、ＬＰ１２５のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１６）、ＬＰ１４３のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１８）、Ａ５１１のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２０）、及びＰ１００のｃｐｓ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２２）を提供する。したがって、幾つかの実施形態では本開示は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、並びにそれらの突然変異タンパク質から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を備える前記組換えリステリアファージを提供する。
【０１２２】
本開示はファージＬＰ４０のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号５）、ＬＰ４８のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号７）、ＬＰ９９のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号９）、ＬＰ１０１のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号１１）、ＬＰ１２４のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号１３）、ＬＰ１２５のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号１５）、ＬＰ１４３のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号１７）、Ａ５１１のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号１９）、及びＰ１００のｃｐｓ遺伝子のオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列（配列番号２１）も提供する。したがって、幾つかの実施形態では本開示は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージであって、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、並びにそれらの配列に対する実質的な相同性を備える核酸配列から選択される核酸配列を備える前記組換えリステリアファージを提供する。
【０１２３】
幾つかの実施形態では前記マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージはスクリーニング可能マーカーを備える。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号１を備える核酸配列又は配列番号１に対する実質的な相同性を備える核酸配列によってコードされる。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは、ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される少なくとも１つのファージに対して実質的な相同性を備えるゲノムを含むファージから選択される。
【０１２４】
幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号３を備える核酸配列又は配列番号３に対する実質的な相同性を備える核酸配列によってコードされる。幾つかの実施形態ではその組換えリステリアファージはＬＰ：：０４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージは、ＬＰ：：０４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される少なくとも１つのファージに対して実質的な相同性を備えるゲノムを含むファージから選択される。
【０１２５】
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする前記異種性核酸配列は、前記組換えファージゲノムにおいて少なくとも１つの調節性配列であって、そのファージゲノムにとってこれもまた異種性であるその調節性配列に機能的に結合している。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、専らそのファージゲノムにとって異種性である調節性配列によって制御される。
【０１２６】
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする前記異種性核酸配列は前記組換えファージゲノムにおいてそのファージゲノムにとって内在性である少なくとも１つの調節性配列に機能的に結合している。言い換えると、マーカーをコードする前記異種性核酸配列は、マーカーをコードする前記異種性核酸配列が配置されている開始ファージゲノム中の位置のために内在性調節性配列に機能的に結合している。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、専らそのファージゲノムにとって内在性である調節性配列によって制御される。幾つかの実施形態では標的細菌におけるマーカーをコードする前記異種性核酸配列の発現は、そのファージゲノムにとって内在性である調節性配列によって部分的に制御され、且つ、そのファージゲノムにとって異種性である調節性配列によって部分的に制御される。
【０１２７】
幾つかの実施形態では前記マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えリステリアファージはマーカーをコードする１つより多くの異種性核酸配列を備える。幾つかの実施形態ではその組換えファージはマーカーをコードする同じ核酸配列の複数のコピー（すなわち、同じマーカーをコードするコピー）を備える。幾つかの実施形態ではその組換えファージはマーカーをコードする１種類より多くの核酸配列のコピー（すなわち、異なるマーカーをコードする少なくとも２つのコピー）を備える。幾つかの実施形態ではそれらの１つより多くのコピーが組換えファージゲノム中の隣接する位置に配置される。他の実施形態ではそれらの１つより多くのコピーのうちの少なくとも１つ（最大で全て）が組換えファージゲノム中の隣接しない位置に配置される。
【０１２８】
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは少なくとも１００塩基、少なくとも２００塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、少なくとも７００塩基、少なくとも８００塩基、少なくとも９００塩基、少なくとも１．０キロ塩基（ｋｂ）、少なくとも１．１ｋｂ、少なくとも１．２ｋｂ、少なくとも１．３ｋｂ、少なくとも１．４ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．６ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．８ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．１ｋｂ、少なくとも２．２ｋｂ、少なくとも２．３ｋｂ、少なくとも２．４ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも２．６ｋｂ、少なくとも２．７ｋｂ、少なくとも２．８ｋｂ、少なくとも２．９ｋｂ、少なくとも３．０ｋｂ、少なくとも３．１ｋｂ、少なくとも３．２ｋｂ、少なくとも３．３ｋｂ、少なくとも３．４ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも３．６ｋｂ、少なくとも３．７ｋｂ、少なくとも３．８ｋｂ、少なくとも３．９ｋｂ、少なくとも４．０ｋｂ、少なくとも４．５ｋｂ、少なくとも５．０ｋｂ、少なくとも５．５ｋｂ、少なくとも５．５ｋｂ、少なくとも６．０ｋｂ、少なくとも６．５ｋｂ、少なくとも７．０ｋｂ、少なくとも７．５ｋｂ、少なくとも８．０ｋｂ、少なくとも８．５ｋｂ、少なくとも９．０ｋｂ、少なくとも９．５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、又はそれ以上である。幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは５００塩基以下、１．０ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、２．０ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、３．０ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、４．０ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、５．０ｋｂ以下、５．５ｋｂ以下、６．０ｋｂ以下、６．５ｋｂ以下、７．０ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、８．０ｋｂ以下、８．５ｋｂ以下、９．０ｋｂ以下、９．５ｋｂ以下、又は１０．０ｋｂ以下である。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は、ファージゲノムよってコードされ、且つ、そのファージゲノムを含むファージ粒子によってパッケージされ得る最大の長さの異種性核酸配列よりも短い長さを備える。
【０１２９】
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列の長さは１００塩基から５００塩基まで、２００塩基から１，０００塩基まで、５００塩基から１，０００塩基まで、５００塩基から１，５００塩基まで、１ｋｂから２ｋｂまで、１．５ｋｂから２．５ｋｂまで、２．０ｋｂから３．０ｋｂまで、２．５ｋｂから３．５ｋｂまで、３．０ｋｂから４．０ｋｂまで、３．５ｋｂから４．５ｋｂまで、４．０ｋｂから５．０ｋｂまで、４．５ｋｂから５．５ｋｂまで、５．０ｋｂから６．０ｋｂまで、５．５ｋｂから６．５ｋｂまで、６．０ｋｂから７．０ｋｂまで、６．５ｋｂから７．５ｋｂまで、７．０ｋｂから８．０ｋｂまで、７．５ｋｂから８．５ｋｂまで、８．０ｋｂから９．０ｋｂまで、８．５ｋｂから９．５ｋｂまで、又は９．０ｋｂから１０．０ｋｂまでである。
【０１３０】
幾つかの実施形態では前記組換えファージのゲノムの全長に対する前記異種性核酸配列の長さの比率は少なくとも０．０５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１５、少なくとも０．２０、又は少なくとも０．２５である。幾つかの実施形態では対応する開始ファージのゲノムの長さに対する前記組換えファージのゲノムの長さの比率は少なくとも１．０５、少なくとも１．１０、少なくとも１．１５、少なくとも１．２０、又は少なくとも１．２５である。
【０１３１】
幾つかの実施形態では前記異種性核酸配列は内在性開始ファージゲノム配列を失わずに開始ファージゲノムに挿入される。幾つかの実施形態では挿入された異種性核酸配列は内在性開始ファージゲノム配列と置き換わる。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さよりも短い量の内在性ゲノム配列と置き換わる。したがって、そのような実施形態では組換えファージゲノムの長さは開始ファージゲノムの長さよりも長い。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さよりも長い量の内在性ゲノム配列と置き換わる。したがって、そのような実施形態では組換えファージゲノムの長さは開始ファージゲノムの長さよりも短い。幾つかのそのような実施形態では前記異種性核酸配列は前記異種性核酸配列の長さと等しい量の内在性ゲノム配列と置き換わる。
【０１３２】
幾つかの実施形態では異種性オープン・リーディング・フレームによってコードされるタンパク質又はポリペプチドは、ファージ宿主細胞内に存在するプロテアーゼによる切断を低減させるために改変される。例えば、計算アルゴリズムを使用して既知のプロテアーゼ切断部位を特定することができ、これらの部位を除去するために保存的置換を用いてそのオープン・リーディング・フレームの配列を改変することができる。あるいは、ファージ宿主細胞内又はファージ宿主細胞の培養物内に存在する少なくとも１種類のプロテアーゼに対する上昇した抵抗性を有する産物をコードするように部位特異的突然変異形成を用いてそのオープン・リーディング・フレーム配列を発展させる。
【０１３３】
本開示は本開示の組換えファージから得られる単離核酸も提供する。幾つかの実施形態ではその単離核酸は本開示の組換えファージの単離ゲノムである。幾つかの実施形態ではその単離核酸は、本開示の組換えファージの全ゲノム未満の断片であってその組換えファージのゲノムの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を備える前記断片を含む。幾つかの実施形態ではその単離核酸は、本開示の組換えファージの全ゲノム未満の断片であってそのファージゲノムの少なくとも２０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、又は少なくとも５ｋｂを備える前記断片を含む。幾つかの実施形態ではその単離核酸はこの段落において開示された断片に対して相同である断片を含む。
Ｂ．組換えファージ作製方法
【０１３４】
当技術分野において知られているあらゆる方法を使用して開始ファージから遺伝的に改変されたファージを作製することができる。例えば、米国特許第５８２４４６８号明細書は遺伝的に改変されたファージの作製方法を開示している。ここに参照により本明細書に援用される２０１２年９月２６日出願の同時係属出願番号第１３／６２７０６０号明細書に代替的方法が開示されている。
【０１３５】
実施例５は組換えファージを作製する新規の方法について記載している。時にはこの方法を本明細書においてファージ感染工学技術（ＰＩＥ）と呼ぶ。この方法によりファージゲノムのあらゆる所望の位置に異種性核酸配列を挿入することが可能になる。ＰＩＥ法はファージ宿主細胞に形質転換されるファージ・ターゲティングベクター（ＰＴＶ）を活用する。ＰＴＶはファージゲノムに挿入される異種性核酸配列（マーカーをコードするオープン・リーディング・フレーム等）を備える。その異種性核酸配列の両側には所望の挿入部位に隣接する上流相同性領域と下流相同性領域がある。幾つかの実施形態では前記ベクター中のそれらの相同性領域は開始ファージゲノムでは直接的に隣接する。そのような実施形態により内在性ファージ配列を失わずにそのファージゲノムへその異種性核酸配列を挿入することが可能になる。幾つかの実施形態では前記ベクター中のそれらの相同性領域は、前記ベクターに含まれていない開始ファージゲノムのある領域の両側にある。そのような実施形態によりその挿入部位において開始ファージゲノムの領域を欠失してそのファージゲノムへその異種性核酸配列を挿入させることが可能になる。そのような実施形態により、例えば、置換配列による内在性ファージ配列の置換が可能になる。幾つかの実施形態では欠失される開始配列と置換配列は配列相同性、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれより高い相同性を示す。
【０１３６】
前記上流相同性領域、下流相同性領域、及び異種性核酸配列がベクター内で組み合わされてＰＴＶが作製される。適切なベクターの一例はｐＭＫ４である。しかしながら、当業者はこの目的のために使用することができる多数の適切なベクターを知っている。そのプラスミドは大腸菌などのあらゆる適切な宿主において単離され得る。確認された後にそのプラスミドはファージ宿主細胞に形質転換される。多数のリステリアファージに有用なそのような細胞の一例はリステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ−ｅである。
【０１３７】
ファージ宿主へのＰＴＶの形質転換が成功したところで形質転換ファージ宿主細胞を開始ファージと共培養することで最初の組換えを実施した。
【０１３８】
組換えが起きたか評価するため、前記異種性核酸配列を備える組換えファージを特定するあらゆる適切な方法を使用して前記感染体をアッセイする。ＰＣＲは利用することができる１つの方法である。あるいは、前記異種性核酸配列がオープン・リーディング・フレームを含む場合、生じたファージが感染した細胞の培養物の中でそのオープン・リーディング・フレームによりコードされる転写物の存在、コードされる遺伝子産物の存在、又はコードされる遺伝子産物の機能性読み出し物をスクリーニングして組換えファージを特定することができる。
Ｃ．ファージ標的細菌
【０１３９】
細菌の存在を検出するために本開示の組換えファージを使用することができる。標的細菌の検出は、その組換えファージが標的細菌に結合し、ファージゲノムをその標的細菌に移入する能力、及びマーカーをコードする前記異種性核酸配列のその細菌による発現に基づく。したがって、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージを使用して標的細菌を検出する方法の特異度は、そのファージへの曝露後にそのマーカーの発現を維持する細菌種の範囲に基づいている。時にはそのファージへの曝露後にそのマーカーの発現を維持する細菌種の範囲を本明細書においてそのファージの「宿主範囲」と呼ぶ。時には前記ファージの宿主範囲を構成する細菌種のセットを本明細書においてそのファージの「標的細菌」と呼ぶ。
【０１４０】
本開示は、ファージ宿主範囲を評価し、したがって、ファージの標的細菌を明らかにする新規の方法を提供する。ある特定の実施形態では本方法は液体培養物中で候補細菌種をファージに曝露することを含む。その培養物中の細菌のそのファージによる感染と溶解を反映する培養物の透明化を引き起こすそのファージの能力は、その培養物中の細菌がそのファージの標的細菌であることの指標である。実施例において示されているように、この方法は驚くべきことにファージの真のファージ宿主範囲を評価する上で先行技術であるプレートベース・プラークアッセイよりも正確である。本明細書の幾つかの実施形態ではファージの「宿主範囲」又はファージの「標的細菌」は液体培養ベースのアッセイにおいてファージが透明化することができる細菌セットに基づいて定義される。
【０１４１】
前記液体培養法は先行技術方法に対する改良であり、多数の目的にとって非常に有用である一方で、その方法は、標的細菌を検出するために組換えファージを使用する方法の全ての態様を実現することがない。そのような方法はその組換えファージが標的細菌に結合し、そのファージゲノムをその標的細菌に移入する能力、及びマーカーをコードする前記異種性核酸配列のその細菌による発現に依存する。したがって、たとえファージが特定の細菌細胞種の液体培養物を溶解することができないとしても、それでもそのファージがその細菌種に結合し、ファージゲノムをその標的細菌に移入し、そうしてマーカーをコードする異種性核酸配列のその細菌による発現を引き起こすことがあり得る。実際には、実施例によって示されるように、組換えファージへの曝露後にある種の細菌における前記マーカーの存在を検出するアッセイは、幾つかの実施形態では液体ベース宿主範囲アッセイなんかよりも感度が高い。したがって、本明細書の幾つかの実施形態ではファージの「宿主範囲」又はファージの「標的細菌」は、１）マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージを提供すること、２）そのファージに試料を曝露すること、及び３）その曝露試料における前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む過程により定義される。時にはこの種のアッセイを本明細書において概して「マーカー宿主範囲アッセイ」と呼ぶ。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはｍＲＮＡの検出を含む方法による。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはマーカータンパク質の直接的検出を含む方法、例えば、抗体を使用する方法による。幾つかの実施形態では前記曝露試料における前記マーカーの存在についてのアッセイはマーカータンパク質の機能的検出を含む方法による。例えば、そのマーカータンパク質がルシフェラーゼである場合にその曝露試料はルシフェリンに曝露してよく、光の発生をアッセイすることができる。この方法は本明細書において開示されるあらゆる種類のマーカーに適合することができ、当業者はマーカーのその検出方法の多数の変法が用いられ得ることを理解する。
【０１４２】
ある特定の可変事項により、ある特定の条件下でファージの宿主範囲を改変することができる。一定の細菌増殖を維持し、したがって、最大のバクテリオファージ感染性を維持する条件は、細菌の検出方法が有用である環境ではめったに見出されない。貧栄養環境と微生物間の競争のために細菌は荒々しい変わりゆく状況に迅速に適応できることを強いられる。増殖と飢餓の連続的なサイクルからなる特定の生活様式は一般に祝宴（ｆｅａｓｔ）と飢餓（ｆａｍｉｎｅ）と呼ばれる。細菌は栄養が少ない苛酷な環境を生き延びるためにより抵抗力がある栄養細胞を産生することから複雑な発生プログラムまでの多種多様な機構を発展させている。ある特定の細菌種は、飢餓状態の延長の結果として「より良い時期」が来るまで、すなわち、好ましい増殖条件が回復され、それらの増殖条件によって好ましい感染条件が回復するまで、増殖と死の連続的なサイクルが起こる活動的な非増殖状態に入る。
【０１４３】
バクテリオファージの感染性はバクテリオファージがコードするテールファイバー認識タンパク質の特異度ばかりではなく、存在する環境条件によっても部分的に決定される。その環境条件にはバクテリオファージが認識することができる細菌の代謝状態が含まれるが、これに限定されない。さらに、その環境条件にはそのファージが細菌に接触したときにそのバクテリオファージとその細菌が経験する環境の化学的組成と物理的組成が含まれる。限定されないが、ｐＨ、浸透圧、温度、流動学的性質及びその他などの溶液の環境的因子全てが細菌に感染するバクテリオファージの能力に影響を及ぼし得る。
【０１４４】
これらの可変事項を考慮するため、液体透明化宿主範囲アッセイ及びマーカー宿主範囲アッセイにおいて細菌試料をファージに曝露するステップは限定的な条件下で実施され得る。それらの限定的な条件は、限られた持続時間、限られた温度、並びにａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物の中の少なくとも１つが存在することのうちの少なくとも１つを含み得る。
【０１４５】
幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物はグルコース、マンノース、及びマルトースなどの糖から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、グルコースと比較して、必ずというわけではないが、消費されるとモル当たりより多くのモル数のＮＡＤＰＨを生成することができるペントースリン酸経路によって分解されるカルボキシ糖から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、限定されないが、□□ケトグルタレート、Ｄ−リンゴ酸、又はピルビン酸などの中央代謝に絡む化合物から選択される。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物は、必ずというわけではないが、環境中で潜在的に弱くなった状態又は損傷を受けた状態で存在する細胞に浸透圧の保護を与えることができるグリセロール及び他の炭水化物系浸透圧保護材（又は他の浸透圧保護材）から選択される。幾つかの実施形態ではグリセロールはファージ感染の効率を上げる体積排除材として機能する。幾つかの実施形態では前記炭水化物及び関連の化合物はアミノエタノールなどの糖アルコールから選択される。
【０１４６】
幾つかの実施形態では前記窒素含有化合物はアンモニア、他のアミノ酸基礎的要素、及び遊離アミノ酸から選択される。前記遊離アミノ酸はゲノムにコードされるあらゆる標準的アミノ酸又はあらゆる非標準的アミノ酸であり得る。幾つかの実施形態では前記アミノ酸はグルタミン酸とグルタミンから選択される。幾つかの実施形態では前記アミノ酸は分岐鎖アミノ酸から選択される。幾つかの実施形態では前記窒素含有化合物はプロピオン酸などの分岐型アミノ酸の分解産物から選択される。
【０１４７】
幾つかの実施形態では前記核酸及び関連の化合物はヌクレオチド、ヌクレオシド、デオキシヌクレオチド、及びデオキシヌクレオシドから選択される。幾つかの実施形態では前記核酸及び関連の化合物はイノシンなどのヌクレオチド生成経路の代謝物から選択される。
【０１４８】
幾つかの実施形態では前記脂質化合物は脂肪酸及び関連の化合物から選択される。ツイーン２０、４０、及び８０はエステル加水分解されると脂肪酸に変換され、それらを使用することもできる。幾つかの実施形態では前記脂質化合物はレシチン及び関連の化合物から選択される。
【０１４９】
幾つかの実施形態では前記無機化合物は、例えば、チオサルフェートなどの塩から選択される。
【０１５０】
幾つかの実施形態では前記有機化合物は脂肪族化合物、芳香族化合物、複素環化合物、及び非生物起源高分子から選択される。
【０１５１】
幾つかの実施形態では前記の少なくとも１つの化合物が次のものから選択される。
化合物                          ＣＡＳ番号
１，２−プロパンジオール        ５７−５５−６
２−アミノエタノール            １４１−４３−５
グルクロン酸アミド              ３７８９−９７−７
チラミン                        ６０−１９−５
ｂ−フェニルエチルアミン        １５６−２８−５
Ｌ−アスパラギン酸              ３７９２−５０−５
Ｌ−プロリン                    １４７−８５−３
Ｄ−アラニン                    ３３８−６９−２
Ｄ−セリン                      ３１２−８４−５
Ｌ−グルタミン酸                ６１０６−０４−３
Ｌ−アスパラギン                ７０−４７−３
Ｄ−アスパラギン酸              １７８３−９６−６
Ｌ−グルタミン                  ５６−８５−９
Ｇｌｙ−Ａｓｐ
Ｄ−トレオニン                  ６３２−２０−２
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ                  ７４１２−７８−４
Ｌ−セリン                      ５６−４５−１
Ｌ−トレオニン                  ７２−１９−５
Ｌ−アラニン                    ５６−４１−７
Ａｌａ−Ｇｌｙ                  ６８７−６９−４
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ                  ７０４−１５−４
Ｌ−アラビノース                ８７−７２−９
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン  ７５１２−１７−６
Ｄ−ガラクトース                ５９−２３−４
Ｄ−トレハロース                ９９−２０−７
Ｄ−マンノース                  ３４５８−２８−４
ズルシトール                    ６０８−６６−２
Ｄ−ソルビトール                ５０−７０−４
グリセロール                    ５６−８１−５
Ｌ−フコース                    ２４３８−８０−４
Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロールリン酸  ３３２５−００−６
Ｄ−キシロース                  ５８−８６−６
Ｄ−マンニトール                ６９−６５−８
Ｄ−グルコース−６−リン酸      ３６７１−９９−６
Ｄ−リボース                    ５０−６９−１
Ｌ−ラムノース                  ３６１５−４１−６
Ｄ−フルクトース                ５７−４８−７
ａ−Ｄ−グルコース              ５０−９９−７
マルトース                      ６９−７９−４
Ｄ−メリビオース                ５８５−９９−９
チミジン                        ５０−８９−５
ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド    ３３９６−９９−４
ａ−Ｄ−ラクトース              ６３−４２−３
ラクツロース                    ４６１８−１８−２
ショ糖                          ５７−５０−１
ウリジン                        ５８−９６−８
Ｄ−グルコース−１−リン酸      ５６４０１−２０−８
Ｄ−フルクトース−６−リン酸    ２６１７７−８６−６３７２５０−８５−４
ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド      ７０９−５０−２
アドニトール                    ４８８−８１−３
マルトトリオース                １１０９−２８−０
２’−デオキシアデノシン        １６３７３−９３−６
アデノシン                      ５８−６１−７
ｍ−イノシトール                ８７−８９−８
Ｄ−セロビオース                ５２８−５０−７
イノシン                        ５８−６３−９
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン  ７７７２−９４−３
Ｄ−プシコース                  ５５１−６８−８
Ｌ−リキソース                  １９４９−７８−６
Ｄ−サッカリン酸                ５７６−４２−１
コハク酸                        ６１０６−２１−４
Ｄ−グルクロン酸                １４９８４−３４−０
Ｄ−グルコン酸                  ５２７−０７−１
Ｄ，Ｌ−乳酸                    ３１２−８５−６
ギ酸                            １４１−５３−７
Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン  ２７８２−０７−２
Ｄ，Ｌ−リンゴ酸                ６９１５−１５−７
酢酸                            １２７−０９−３
Ｄ−グルコサミン酸              ３６４６−６８−２
ａ−ケトグルタル酸              ２２２０２−６８−２
ａ−ケト酪酸                    ２０１３−２６−５
ｍ−酒石酸                      １４７−７３−９
ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン  ２１４６１−８４−７
ａ−ヒドロキシ酪酸              １９０５４−５７−０
クエン酸                        ６１３２−０４−３
フマル酸                        １７０１３−０１−３
ブロモコハク酸                  ９２３−０６−８
プロピオン酸                    １３７−４０−６
ムチン酸                        ５２６−９９−８
グリコール酸                    ７９−１４−１
グリオキシル酸                  ５６３−９６−２
トリカルバリル酸                ９９−１４−９
アセト酢酸                      ３４８３−１１−２
モノ−メチルスクシネート        ３８７８−５５−５
Ｄ−リンゴ酸                    ６３６−６１−３
Ｌ−リンゴ酸                    １３８−０９−０
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸      １５６−３８−７
ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸      ６２１−３７−４
ピルビン酸                      １１３−２４−６
Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン  １６６８−０８−２
Ｄ−ガラクツロン酸              ９１５１０−６２−２
ピルビン酸メチル                ６００−２２−６
ツイーン２０                    ９００５−６４−５
ツイーン４０                    ９００５−６６−７
ツイーン８０                    ９００５−６５−６
【０１５２】
宿主範囲アッセイにおいて検出される宿主範囲を改変する別のアプローチは細菌試料を前記ファージに曝露する前にその細菌を前処理することである。これにより、感染自体に用いられる条件から細菌細胞の状態（及び、おそらくはファージ感染に対するその細菌細胞の感受性）を改変するように指定されたステップを分けることが可能になる。例えば、前保温ステップの間に代謝速度を上昇させることができ、それによって次にファージによる細菌細胞の感染後の透明化又はマーカーの産生に影響する複製機能、転写機能、及び翻訳機能のうちの少なくとも１つを向上させることができる。さらに、そのような保温期間は表面受容体の発現又は細菌の細胞壁の組成も変化させることがあり得、それによってファージが増殖的にその細菌に感染することができるかどうかを変更することもできる。
【０１５３】
したがって、幾つかの実施形態では細菌試料をファージ宿主範囲アッセイのために前記ファージに曝露する前に代謝促進条件で培養する。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はそれらの細胞において細胞分裂を促進する。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はそれらの細胞において細胞分裂を促進しない。幾つかの実施形態ではそれらの細胞の代謝促進条件への曝露はファージによる細菌細胞の感染後の透明化又はマーカーの産生に影響する複製機能、転写機能、及び翻訳機能のうちの少なくとも１つを促進する。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、「代謝促進条件」は、微生物が感染とファージ生活環の維持、及び／又はファージのゲノム中の異種性核酸配列によってコードされるマーカー遺伝子産物の発現後の感染を許容する微生物の代謝状態の発生を促進する条件である。幾つかの実施形態では代謝促進条件への曝露前のその微生物は感染とファージ生活環の維持を許容しない。他の実施形態では代謝促進条件への曝露前のその微生物は、対数期条件下で培養される相当する微生物と比較してその微生物の感染への感受性とファージ生活環の維持を低下させる代謝状態にある。そのような実施形態では代謝促進条件へのその微生物の曝露は、その微生物の感染への感受性とファージ生活環の維持を上昇させる。幾つかの実施形態では代謝促進条件は許容的な温度、ｐＨ、Ｐｏ2、及び栄養の組合せのうちの少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態では標的微生物は代謝促進条件下で少なくとも１回の細胞分裂を行う。幾つかの実施形態では標的微生物は代謝促進条件下で少なくとも１回の細胞分裂を行わない。
【０１５５】
幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージと接触する前に代謝促進条件に曝露される。幾つかのそのような実施形態ではその試料はその後にファージと接触する前に代謝促進条件から取り除かれ、他の実施形態ではその試料はファージと接触するときに代謝促進条件下で維持される。幾つかの実施形態ではその試料は第１期間にわたって第１セットの代謝促進条件に曝露され、その後で第２セットの代謝促進条件に移される。幾つかの実施形態では前記試料が第２セットの代謝促進条件下で維持されている間に前記組換えファージが前記試料に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に５分から２４時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に５分から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に１０分から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に２０分から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に３０分から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に１時間から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に２時間から６時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に２時間から１２時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に３時間から１２時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に６時間から１２時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料はその試料がファージに接触する前に１２時間から２４時間までにわたって代謝促進条件に曝露される。幾つかの実施形態では前記試料は少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、又は少なくとも２時間にわたって代謝促進条件に曝露される。
【０１５６】
この節に記載される条件の少なくとも１つの実施形態の下で宿主範囲分析を実施することにより、標的細菌の検出方法にとって有用なレベルの感度及び／又は選択性を提供する条件を明らかにすることができる。幾つかの実施形態ではその宿主範囲分析に使用される条件は、他の背景において標的細菌を検出するためにそれらのファージを使用するときの（すなわち、環境試料を検査するときの）そのファージを使用する標的細菌の検出方法にも使用される。
Ｄ．標的細菌の検出方法
【０１５７】
本開示の組換えファージは標的微生物の検出に有用である。本開示は例となる組換えファージを提供し、且つ、その他の組換えファージの作製方法を提供する。本開示はある特定の開示された組換えファージの標的細菌も明らかにし、且つ、あらゆる組換えファージをはじめとするあらゆるファージの標的細菌を特定する方法も提供する。したがって、本開示により組換えファージを使用して標的微生物を検出する方法が可能になる。数ある中でも前記組換えファージの標的細菌の詳細な特徴解析を可能にすることにより、ある特定の実施形態では本開示は先行技術において利用可能ではなかった有用な方法を提供する。
【０１５８】
前記方法は広範囲に適用可能であり、本開示の教示を考慮すると当業者はあらゆる種類の古細菌及び／又は細菌を検出するために前記方法をどのように適用するか理解する。幾つかの実施形態ではその古細菌はユリアーキオータである。幾つかの実施形態ではその古細菌はクレンアーキオータである。幾つかの実施形態ではその細菌は放線菌門、アクウィフェクス門、アルマティモナス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、ディノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フゾバクテリウム門、ゲマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミセス門、プロテオバクテリア門、スピロケータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門から選択される系統のメンバーである。幾つかの実施形態ではその細菌はバシラス属、リステリア属、スタフィロコッカス属から選択される少なくとも１種類のフィルミクテス門である。幾つかの実施形態ではその細菌はアシドバシラス属（Ａｃｉｄｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロモナス属、バークホルデリア属、ナイセリア属、シュワネラ属、シトロバクター属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、クレブシエラ属、クライベラ属、モーガネラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エルシニア属、コクシェラ属、リケッチア属、レジオネラ属、アビバクテリウム属（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属、パスツレラ属、アシネトバクター属、モラクセラ属、シュードモナス属、ビブリオ属、キサントモナス属から選択される少なくとも１種類のプロテオバクテリア門である。幾つかの実施形態ではその細菌はマイコプラズマ属、スピロプラズマ属、及びウレアプラズマ属から選択される少なくとも１種類のテネリクテス門である。
【０１５９】
本明細書において開示されるファージと方法を使用して検出される食物の一般的な汚染混入細菌には、限定されないが、サルモネラ属、大腸菌（限定されないが、病原性大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、志賀毒素生産性大腸菌、大腸菌Ｏ２６、Ｏ大腸菌１１１、大腸菌Ｏ１０３、大腸菌Ｏ１２１、大腸菌Ｏ４５及び大腸菌Ｏ１４５を含む）、大腸菌群（限定されないが、シトロバクター属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、セラチア属を含む）、シゲラ属、リステリア属、クロストリジウム属（ボツリヌス菌及びウェルシュ菌を含む）、ビブリオ属（ビブリオ・コレラ及びビブリオ・バルニフィカスを含む）、腸内細菌科、スタフィロコッカス属（黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を含む）バシラス属（セレウス菌を含む）、カンピロバクター属（カンピロバクター・ジェジュニを含む）、シュードモナス属、ストレプトコッカス属、アシネトバクター属、クレブシエラ属、カンピロバクター属、及びエルシニア属が含まれる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、第１セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第１マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第１の種類のファージに前記試料を曝露すること、第２セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第２マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第２の種類のファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の第１マーカーと第２マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では前記試料中の第１マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では前記試料中の第２マーカーの検出はその試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第１マーカーと第２マーカーは同じであり、前記試料中のそのマーカーの検出はその試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
【０１６１】
幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも２種を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも３種を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は独立して細菌の一つの属のうちの少なくとも４種を含む。幾つかの実施形態ではその一つの属の細菌はリステリアである。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも１種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも２種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも３種の細菌を含む。幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌は共通して少なくとも４種の細菌を含む。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）及びリステリア・ウェルシメリから選択される。幾つかの実施形態ではそのリステリア属の種はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択される。
【０１６２】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュアの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・イノキュアのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は１１、２２、３７、及び５６である。
【０１６３】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスの少なくとも１９種類のリボタイプを備える。幾つかの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネスのそれらの少なくとも１９種類のリボタイプはＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄである。
【０１６４】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ゼーリゲリのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は３、２０、２４、及び３５である。
【０１６５】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・ウェルシメリの少なくとも４種類の対立遺伝子型を備える。幾つかの実施形態ではリステリア・ウェルシメリのそれらの少なくとも４種類の対立遺伝子型は１５、２７、３２、及び８９である。
【０１６６】
幾つかの実施形態では第１セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では第２セットの標的細菌は同じ属の全てのメンバーである。幾つかの実施形態では標的細菌の全てがリステリアである。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも１つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
【０１６７】
幾つかの実施形態では本方法は、第３セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第３マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第３の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第４セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第４マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第４の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第５セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第５マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第５の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第６セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第６マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第６の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第７セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第７マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第７の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第８セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第８マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第８の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、第９セットの標的細菌に感染することができ、且つ、第９マーカーをコードする異種性核酸配列を備える第９の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では本方法は、１０以上のセットの標的細菌に感染することができ、且つ、１０以上のマーカーをコードする異種性核酸配列を備える１０以上の種類のファージに前記試料を曝露することをさらに含む。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの３種類以上のマーカーの全てが異なる。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらの３種類以上のマーカーの全てが同じである。３種類以上のファージを利用する幾つかの実施形態ではそれらのマーカーのうちの２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、又は９種類が同じである。
【０１６８】
幾つかの実施形態では本方法において使用される少なくとも１種類のファージがＡ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される。幾つかの実施形態では本方法において使用される全ての種類のファージがＡ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３、及びそれらの派生株から選択される。
【０１６９】
幾つかの実施形態では第１マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第１マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。
【０１７０】
幾つかの実施形態では第１の種類のファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃ、及びそれらのファージの派生株から選択される。幾つかの実施形態では第１の種類のファージはＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【０１７１】
幾つかの実施形態では第２マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では第２マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。
【０１７２】
幾つかの実施形態では第２の種類のファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では第２の種類のファージはＬＰ４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【０１７３】
幾つかの実施形態では本方法は第１の種類のファージと第２の種類のファージに対して前記試料を同時に曝露することを含む。
【０１７４】
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
【０１７５】
幾つかの実施形態では第１マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第２マーカーが前記試料中に検出され、その試料中の標的細菌の第２セットの細菌の存在を表す。幾つかの実施形態では第１マーカーと第２マーカーは同じであり、そのマーカーが前記試料中に検出され、その試料中の第１セットの標的細菌と第２セットの標的細菌のうちの少なくとも一方の細菌の存在を表す。
【０１７６】
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。
【０１７７】
幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
【０１７８】
幾つかの実施形態では本方法は、標的細菌に感染することができる前記ファージに前記試料を曝露する前の一時期に前記試料を代謝促進条件下でインキュベートすることをさらに含む。
【０１７９】
ある特定の実施形態では本方法は試料を提供すること、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露すること、及びその曝露された試料の中の前記マーカーの存在についてアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では本方法は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１と組換えＰ１００から選択される前記組換えリステリアファージに前記試料を曝露することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出はその試料の中のリステリアの存在を表す。
【０１８０】
幾つかの実施形態では前記組換えリステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種のその試料における存在を表す。
【０１８１】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種を含む。幾つかの実施形態では前記試料中の前記マーカーの検出は、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも１つの種のその試料における存在を表す。
【０１８２】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・イノキュアの１１、２２、３７、及び５６から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記少なくとも１種類のリステリアファージはリステリア・イノキュアｓｉｇＢ対立遺伝子型１１、２２、３７、及び５６に感染することができる。
【０１８３】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプを備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・モノサイトゲネスのＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄから選択される少なくとも１種類のリボタイプの存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・モノサイトゲネスのリボタイプＤＵＰ−１０１４２、ＤＵＰ−１０３０Ａ、ＤＵＰ−１０３０Ｂ、ＤＵＰ−１０３８Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ａ、ＤＵＰ−１０３９Ｂ、ＤＵＰ−１０３９Ｃ、ＤＵＰ−１０４２Ａ、ＤＵＰ−１０４２Ｂ、ＤＵＰ−１０４２Ｃ、ＤＵＰ−１０４３Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ａ、ＤＵＰ−１０４４Ｂ、ＤＵＰ−１０４４Ｅ、ＤＵＰ−１０４５Ｂ、ＤＵＰ−１０５２Ａ、ＤＵＰ−１０５３Ａ、ＤＵＰ−１０６２Ａ、及びＤＵＰ−１０６２Ｄを含む。
【０１８４】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ゼーリゲリの３、２０、２４、及び３５から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ゼーリゲリｓｉｇＢ対立遺伝子型３、２０、２４、及び３５を含む。
【０１８５】
幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型を備え、前記試料中の前記マーカーの検出はリステリア・ウェルシメリの１５、２７、３２、及び８９から選択される少なくとも１種類のｓｉｇＢ対立遺伝子型の存在を表す。幾つかの実施形態では前記リステリアファージの標的細菌はリステリア・ウェルシメリｓｉｇＢ対立遺伝子型１５、２７、３２及び８９を含む。
【０１８６】
幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも２つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも３つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌はリステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ、リステリア・イワノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・グレイ、リステリア・マルティイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍａｒｔｈｉｉ）、リステリア・ロコウルティ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｏｃｏｕｒｔｉ）、及びリステリア・ウェルシメリから選択されるリステリア属の少なくとも４つの種を含む。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科のうちの少なくとも１つが含まれない。幾つかの実施形態では標的細菌にはセレウス菌、バシラス・メガテリウム、枯草菌、エンテロコッカス・デューランス、エンテロコッカス・ファセイウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、腸内連鎖球菌、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ）、クルチア・ギブソニイ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、クルチア・ゾッフィー、ロドコッカス・エクイ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレ���トコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ガロイティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ブフネリ、ラクトバシラス・ラクトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、ラクトバシラス・ファーメンタム、ミクロコッカス・ルツエス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｕｅｓ）、シュードモナス・プロトジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｏｇｅｎｓ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アエロモナス属の種、セラチア・リクファシエンス、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・リクファシエンス、バシラス科の細菌、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ、シュードモナス属の種、シュードモナス・フラギ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、セラチア属の種、セラチア・グリメシイ、ハフニア属の種、セラチア・プロテアマキュランス、シュードモナス・フロレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クリセオバクテリウム属の種、シュードモナス・フラギ、及び腸内細菌科が含まれない。
【０１８７】
幾つかの実施形態では前記マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。幾つかの実施形態では前記マーカーはルシフェラーゼである。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態ではそのルシフェラーゼは配列番号４に対して少なくとも７０％同一である。幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ、ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ、Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ、及びＰ１００：：ｆｆｌｕｃから選択される。幾つかの実施形態では前記ファージはＬＰ：：４０：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ、ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ、Ａ５１１：：ｎｌｕｃ、及びＰ１００：：ｎｌｕｃから選択される。
【０１８８】
幾つかの実施形態では前記試料は環境試料である。
【０１８９】
幾つかの実施形態では前記マーカーが前記試料中に検出され、前記試料中の標的細菌の第１セットの細菌の存在を表す。
【０１９０】
幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陽性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では環境試料に対するそのアッセイの偽陰性率は５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。幾つかの実施形態では前記試料は前記ファージに曝露される前に代謝促進条件に曝露される。
【０１９１】
幾つかの実施形態では前記試料は曝露試料中のマーカーの存在についてのアッセイが実施される前に一定の時間にわたってファージに曝露される。幾つかの実施形態ではその時間は１分から２４時間まで、５分から１２時間まで、５分から６時間まで、５分から３時間まで、５分から２時間まで、５分から１時間まで、５分から５０分まで、５分から４０分まで、５分から３０分まで、５分から２０分まで、又は５分から１０分までである。幾つかの実施形態ではその時間は１時間から２時間まで、１時間から４時間まで、又は２時間から４時間までである。幾つかの実施形態ではその時間は少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、又は少なくとも１時間である。
【０１９２】
幾つかの実施形態では曝露試料中のマーカーの存在についてのアッセイが実施される前に曝露試料中のあらゆるファージ及び／又はファージの部分が実質的に除去される。
【０１９３】
本開示の方法の幾つかの実施形態では前記方法は陽性対照及び陰性対照のうちの少なくとも一方に対して検査試料中のマーカーの検出レベルを比較することをさらに含む。陽性の結果及び／又は陰性の結果を定義することを目的としてそのアッセイを校正するために陽性対照及び／又は陰性対照を使用することができる。
Ｅ．組成物
【０１９４】
ある特定の実施形態では本明細書において提供されるファージ宿主範囲のアッセイ方法により、先行技術によって提供されない感度限界でのファージの宿主範囲の特徴解析が可能になり、したがって、ファージの標的細菌の限定が可能になる。それらの方法、及びそれらの方法によって特徴解析されるファージの１つの使用法は、標的細菌を検出する系において一緒に使用することができるファージの有用な組合せを特定することである。幾つかの実施形態ではそのような系はファージを個別に提供し、その後でアッセイ前、又はアッセイ中にそれらのファージが混合される。あるいは、そのような系はファージの有用な混合物、例えば、アッセイにおいて使用される緩衝液の中に提供されるファージを備える。幾つかの実施形態ではファージの有用な組合せを備える組成物はまた、必ずそのアッセイ中に作製される。したがって、本開示はファージを含む組成物も提供する。
【０１９５】
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージであって、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージ、及びａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む。幾つかの実施形態ではその組成物は１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む。
【０１９６】
幾つかの実施形態では前記組成物は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも２種類の組換えリステリアファージであって、組換えＡ５１１及びその派生株、組換えＰ１００及びその派生株、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４４及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される前記組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記組成物は、ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分をさらに含む。幾つかの実施形態ではその組成物は１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む。
【０１９７】
幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される少なくとも２種類の組換えリステリアファージを含む。幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えＬＰ０４０及びその派生株、組換えＬＰ０４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される少なくとも３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、又はそれより多くの組換えリステリアファージを含む。
Ｆ．製品
【０１９８】
幾つかの実施形態ではマーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類の組換えリステリアファージを含む前記系又は組成物は製品の形で提供される。そのような製品は、例えば、標的細菌を検出するアッセイを実施するために一緒に使用することができる他の成分と組み合わさった、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える少なくとも１種類のｎａｎｔリステリアファージを提供する手段として有用である。幾つかの実施形態では前記製品は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える前記の少なくとも１種類の組換えリステリアファージを含む少なくとも１つの容器を備える。
【０１９９】
幾つかの実施形態では前記製品は、組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される少なくとも２種類の組換えリステリアファージを含む少なくとも１つの容器を備える。幾つかの実施形態では前記系又は組成物は組換えＬＰ４０及びその派生株、組換えＬＰ４８及びその派生株、組換えＬＰ９９及びその派生株、組換えＬＰ１０１及びその派生株、組換えＬＰ１２４及びその派生株、組換えＬＰ１２５及びその派生株、並びに組換えＬＰ１４３及びその派生株から選択される少なくとも３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、又はそれより多くの組換えリステリアファージを含む。前記製品が１種類より多くのファージを含む幾つかの実施形態では、それらのファージの全てが別々の容器に提供される。他の実施形態ではそれらのファージのうちの２種類以上が一つの容器の中で組み合わされて提供される。
【０２００】
幾つかの実施形態では前記製品は、ａ）炭水化物及び関連の化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、ｂ）少なくとも窒素含有化合物から選択される化合物、ｃ）少なくとも核酸及び関連の化合物から選択される化合物、ｄ）少なくとも脂質から選択される化合物、ｅ）少なくとも１種類の無機化合物、及びｆ）少なくとも１種類の有機化合物のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液をさらに備える。幾つかの実施形態では前記製品は、１，２−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グルクロン酸アミド、チラミン、ｂ−フェニルエチルアミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｄ−トレオニン、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ａ−グリセロール、ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、ａ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、ａ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、ａ−Ｄ−ラクトース、ラクツロセム（ｌａｃｔｕｌｏｓｅｍ）  ショ糖、ウリジン、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−フルクトース−６−リン酸、ｂ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２’−デオキシアデノシン、アデノシン、ｍ−イノシトール、Ｄ−セロビオース、イノシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、Ｄ−サッカリン酸、コハク酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、ギ酸、Ｄ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、酢酸、Ｄ−グルコサミン酸、ａ−ケトグルタル酸、ａ−ケト酪酸、ｍ−酒石酸、ａ−ヒドロキシグルタル酸−ｇ−ラクトン、ａ−ヒドロキシ酪酸、クエン酸、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、トリカルバリル酸、アセト酢酸、モノ−メチルスクシネート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ｇ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、ピルビン酸メチル、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８０のうちの少なくとも１つを含む溶液を備える容器を含む。幾つかの実施形態では前記製品中に存在する少なくとも１種類の組換えリステリアファージは少なくとも１種類の非ファージ性成分を含む溶液の中に存在する。他の実施形態ではそのファージと溶液は別々に提供されており、例えば、使用者によって混合され得る。
【実施例】
【０２０１】
次の実施例は本明細書において開示される本発明のある特定の実施形態の利用方法をさらに充分に説明するように働く。これらの実施例は例示目的で提供されており、本発明本明細書において開示される本発明の真の範囲を限定するように働くべきではない。
【０２０２】
実施例１：リステリアパネル
多種多様な組合せのリステリア種と亜種を含む細菌株パネルがリステリアファージの特徴解析のために選択された。そのパネルは食品加工工場及び食品小売り店舗をはじめとする様々な地理的ニッチェ及び環境的ニッチェから単離された株を含む。その細菌株パネル内の多様性を最大にするために充分に地理的に離れた食品加工環境から細菌株を得ることに特に考慮を払った。
【０２０３】
最初に構築されたパネルは２７２種類のリステリア単離株を含み、４つの主要な種のリステリア（リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イノキュア、リステリア・ウェルシメリ及びリステリア・ゼーリゲリ）を代表している（表１）。そのパネルは、一般的にそのデータの亜種に対する意味のある外挿を可能にする充分な包括深度を確実にするために各種の中に様々な亜種の代表的な単離株を含む。その細菌パネル用の株の選択は食品環境内の、及びヒト疾患と関係する特定の株の出現率に基づいた。食品小売店の環境スクリーニングは最も一般的に特定されるリステリア亜種を特定するために対立遺伝子型解析を用い、その環境スクリーニングによって、ある特定の対立遺伝子型が多くの場合に特定された種の集団の中で非常に代表的であることが明らかにされた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔ誌、第７４巻、６３〜７７頁（２０１１年）；Ｓａｕｄｅｒｓ，  Ｂ．Ｄ．ら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、第７８巻、４４２０〜４４３３頁（２０１２年））。食品及びヒト疾患に由来する単離株を代表する最も一般的なリボタイプのそれぞれにつき１０種類のリステリア・モノサイトゲネス株をコレクション用に選択した。これらの集団は大いに重複しており、出現率について強力な相関を有しており、したがって、食品加工工場において特定するのに最も有用な株である。ヒト疾患及び食品加工工場において単離されたリボタイプに基づくリステリア・モノサイトゲネス株の包括範囲を見ると、構築されたパネルはそれぞれ約８６％と９１％の包括度を表す。各リステリア・モノサイトゲネスリボタイプから１０株を選択する目的は、グループ内の多様性の確認を可能にしてリステリア・モノサイトゲネス種の合理的に完全な包括を確実にすることであった。
【０２０４】
リステリア・モノサイトゲネスを越えて拡大し、且つ、その属の中の他の種を包括するため、追加的な種と亜種の多様性を考慮して前記パネル用の追加の株を選択した。食品加工工場において一般的に特定される種と亜種に再度焦点を置いた。リステリア・ウェルシメリ、リステリア・イノキュア及びリステリア・ゼーリゲリの最も一般的な対立遺伝子型のそれぞれを代表する１０種類の単離株を選択した。構築されたパネルはＳａｕｎｄｅｒｓらによって特定されたリステリア・イノキュアの９６％、リステリア・ゼーリゲリの９８％、及びリステリア・ウェルシメリリボタイプの１００％を含み、リステリア属を正確に表す。したがって、構築されたリステリア宿主パネルは、リステリア属に対するあらゆるバクテリオファージの宿主範囲分析用のツールとして機能する。したがって、このパネルを使用してあらゆる所与のファージの標的細菌を明らかにすることができる。
【０２０５】
そのパネルのメンバーの属、種、及び亜種が表１に提供されている。
【０２０６】
【表１Ａ】
2016517687.tif 000003
【０２０７】
【表１Ｂ】
2016517687.tif 000004
【０２０８】
【表１Ｃ】
2016517687.tif 000005
【０２０９】
【表１Ｄ】
2016517687.tif 000006
【０２１０】
【表１Ｅ】
2016517687.tif 000007
【０２１１】
【表１Ｆ】
2016517687.tif 000008
【０２１２】
【表１Ｇ】
2016517687.tif 000009
【０２１３】
【表１Ｈ】
2016517687.tif 000010
【０２１４】
【表１Ｉ】
2016517687.tif 000011
【０２１５】
【表１Ｊ】
2016517687.tif 000012
【０２１６】
実施例２：プレートベースのファージ宿主範囲アッセイ
所与のバクテリオファージの宿主範囲を定量化するため、通常はバクテリオファージ産生に使用される株であるそのバクテリオファージ用の基準株に対してそのバクテリオファージの所与の単離株に対するプラーク形成効率を標準化した。プラーク形成効率を決定するためにはそのファージの希釈シリーズを作製し、各宿主に対して力価測定する。本明細書において報告される研究の前にはこれはファージ宿主範囲分析の標準的方法であった。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（２００１年）を参照されたい。
【０２１７】
前記リステリア細菌株パネルを使用して特定のバクテリオファージの宿主範囲を決定した。これを行うため、検査される各リステリア株の培養を５ｍｌのＬＢＬ１の中で始め、撹拌振盪機において３０℃で一晩培養し、そして１６時間増殖させた。各細菌宿主株について３０μｌの１６時間培養物を２７０μｌの新しいＬＢＬ１培地と混合した。各細胞希釈物に４ｍｌのＬＢＬ１軟質寒天を加えて１００ｍｍのペトリディッシュ中のＬＢＬ１寒天に上層した。その軟質寒天上層を室温で冷やして固化させた。さらに、宿主範囲単離株と同様に基準株（Ａ５１１とＰ１００用のＦＳＬ  Ｆ６−３６７）を処理した。ＬＢＬ１培地中の前記バクテリオファージの１０倍希釈シリーズを１０-1から１０-8まで調製した。前記バクテリオファージの各希釈物の５μｌを軟質寒天上層にスポットし、その液体を吸収させ、その後でそのプレートを３０℃で１６時間保温した。保温後に各希釈シリーズに存在するプラークを計数し、前記基準株に対して比較して各宿主範囲単離株についてのプラーク形成効率を提供した。その宿主範囲は、その基準株に対して比較した、実験宿主で観察された力価のパーセンテージとして表された。基準株の１０％を超えるプラーク形成効率を示す細菌株（表２、濃い灰色の影）は宿主範囲内にあると見なした。基準株の１０％未満であるが、０．０１％を超えるプラーク形成効率を示す細菌株（表２、明るい灰色の影）はそのファージに対する感受性が弱いと見なした。基準株の０．０１％未満のプラーク形成効率を示す細菌株（表２、影無し）はファージの宿主範囲外と見なした。検査された細菌株の多くについて見られた現象は文献中及び当技術分野において「過剰細胞殺滅」（ＥＣＫ）と説明されているものであった（表２、黒色）。例えば、Ｓｈａｗら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、１９８３年；第５６巻（第１号）：７５〜８３頁）を参照されたい。高いファージ濃度で菌叢を完全に透明化するが、しかしながらその後の希釈で透明化されなかったときにある株が特定のファージについてＥＣＫを示すと定義した。
【０２１８】
前記プレートベースの宿主範囲決定により、リステリア単離株ライブラリーに対するＡ５１１及びＰ１００の宿主範囲を大まかに見積もることが可能になる。細菌株ライブラリー中の検査した２７２株のうち６７株と１２０株がそれぞれＡ５１１とＰ１００によるプラーク形成を維持した（表２）。この方法の最大の制約は、所与のバクテリオファージについてライブラリー全体を処理するために必要な時間の長さ、及びＥＣＫ現象のために全宿主範囲を決定することができないことであった。バクテリオファージＡ５１１及びＰ１００について、検査した宿主範囲パネルの中の２７２種類の細菌株のうちそれぞれ１１７株と４２株がＥＣＫを示し、したがって、これらの株の宿主範囲について何の情報ももたらさなかった。さらに、ＥＣＫ現象を考慮すると、及びプレート上で増殖する細菌と液体培養物中で増殖する細菌との間の一般的な差異のため、宿主範囲を決定するための前記プレートベースの方法は液体ベースの利用法についての宿主範囲を表さない場合があり得ると仮定した。
【０２１９】
実施例３：液体培養ファージ宿主範囲アッセイ
プレートベース宿主範囲法においてＡ５１１とＰ１００の両方によって示された過剰細胞殺滅（ＥＣＫ）現象の出現率により、そのプレートベースがどちらかのファージの宿主範囲を決定するのに有用であり得たほど有用ではないことが示される。それらの欠陥を克服するために新規の液体ベース宿主範囲アッセイを開発した。その液体ベース宿主範囲アッセイは、バクテリオファージを含む、又は含まない培養物の光学密度を比較することにより特定の細菌単離株に感染するファージの能力が決定されるエンドポイントアッセイである。
【０２２０】
ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上でリステリア宿主パネル株コレクション（表１）の培養を始め、２ｍｌの９６ディープウェルディッシュ中の１ｍｌのＢＨＩ液の中に単一性コロニーを接種し、滅菌通気性滅菌膜で覆い、３０℃で１６時間培養した。それらの９６ウェルプレートの１６時間培養物の各々を３００μｌの平底光学９６ウェルプレート中の１９８μｌのＬＢＬ１中に１：１０，０００の割合で希釈し、その後で１×１０5ｐｆｕの前記バクテリオファージ又は等量のＬＢＬ１のどちらかを前記９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。バクテリオファージと細菌細胞の希釈物のこの濃度は、各ウェルにおいて１の感染多重度（ＭＯＩ）に近づくものであった。前記ファージ又は対照の添加後にそれらのプレートを５０ｒｐｍで振盪しながら２６℃で１６時間保温した。プレートを９６ウェルプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｅｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）中に設置し、撹拌振盪することによりプレートを３秒間撹拌して培養から沈降した細胞を再懸濁した。その撹拌の後に各ウェルの光学密度を６００ｎｍ（ＯＤ６００）波長光において測定した。バクテリオファージが存在するときのその細菌単離株のＯＤ６００の非感染細菌単離株培養物に対する比率を尺度として使用して細菌株の感染効率を決定した。０．４以下の比率を有する細菌株（表２、濃い灰色の影）はそのバクテリオファージによる感染に対する感度が高いと見なした。
【０２２１】
前記液体ベース宿主範囲アッセイにより細菌株パネル中の２７２株のうちのＡ５１１とＰ１００に対して感受性を有する１９２細菌株と１５３細菌株が特定された（表２）。このデータは、Ａ５１１がその宿主範囲パネルのおよそ７０％に感染することができ、Ｐ１００がおよそ５８％に感染することができることを示している。前記液体ベースの宿主範囲と対照的に、Ａ５１１とＰ１００についてそれぞれあるプラーク形成効率を示す６２細菌株と１２０細菌株が前記プレートベース宿主範囲法により特定された。前記プレートベース宿主範囲法で特定された株のうち、わずかに８株のＡ５１１感受性細菌株と３株のＰ１００感受性細菌株が液体ベースの透明化アッセイにおいて透明化を示さなかった。その液体ベースアッセイはエンドポイントアッセイであり、バクテリオファージ感染と細菌細胞増殖との間の反応速度論的相互作用を表しているので上昇した細胞増殖速度を有するある特定の細菌株はその株が感染に対して感受性を有するとしても培養物を飽和させることが可能であり得、このことにより、プラークベースのアッセイにおいて特定される少数の株が液体アッセイにおいて特定されなかった理由を説明することができる。
【０２２２】
前記プレートベース宿主範囲アッセイにおいてＥＣＫ表現型を示す株についてのデータを収集する能力のため、前記液体ベース宿主範囲アッセイにより特定されるその他の株が存在した。この表現型を示す多数の株がＡ５１１とＰ１００の宿主範囲に関する大量の未知の情報をもたらした。前記液体ベースアッセイは前記プレートベース宿主範囲法の最大の欠点のうちの１つであるＥＣＫ現象を排除してしまった。２つの要因がＥＣＫの欠如に寄与した。第一に、前記液体ベースアッセイにおいて使用されるファージの濃度は前記プレートベース宿主範囲アッセイにおいてＥＣＫを示したファージの濃度よりも低い設定濃度である。第二に液体感染体内のバクテリオファージの非局在性濃度と低いＭＯＩにより細菌細胞とバクテリオファージとの間の相互作用数が減少する。その限定的相互作用により非生産性遭遇の可能性が低下し、重複感染、すなわち、細胞の複数のバクテリオファージによる感染が減少する。ＥＣＫを排除することによりあるバクテリオファージに対する特定の細菌細胞の感受性を測定するための感度が実質的に上昇し、その感度によりリステリア属の種の中のあるバクテリオファージの宿主範囲をより正確に表した。
【０２２３】
前記液体ベース宿主範囲アッセイはバクテリオファージの宿主範囲を決定するためのプレートベースの系を使用する先行方法に対して実質的な進歩を示した。プレートベースの方法以外のフォーマットでこれらのバクテリオファージを培養する能力について報告する先行文献は無かった。バクテリオファージの宿主範囲を決定するスピードが前記液体ベース宿主範囲アッセイを実行することができるスピードのために前記パネルが構築されたときの７〜１０日から数時間の作業時間までに増加することからも前記液体フォーマットは有用である。さらに、宿主感受性を採点するハイスループット性によって、以前にはあり得なかった複数のバクテリオファージ宿主範囲の同時決定が可能になった。複数のバクテリオファージを同時処理する能力により、細菌培養生理と培地ロットの間の変動を最小限にして複数のバクテリオファージをより直接的に比較することが可能になった。まとめると、増加したスピードと直接的なバクテリオファージ特徴解析により本明細書に記載される複数のファージの迅速な処理とバクテリオファージ遺伝子操作の優先順位付けが可能になった。また、前記液体ベース宿主範囲アッセイにより、プレートベース宿主範囲アッセイと比較して、予測される製品における潜在的なバクテリオファージの機能決定をより正確に表すことが可能になった。増加したスピード、より直接的な比較を行う能力、及び最終製品についてより直接的な方法でバクテリオファージの機能性を評価する能力の組合せのため、ほとんどの状況において前記プレートベース宿主範囲法よりも前記液体ベース宿主範囲アッセイが著しく有用なものになる。
【０２２４】
Ｐ１００とＡ５１１のバクテリオファージからなるカクテルの効力を特定の株に感染する前記バクテリオファージのそれぞれの能力により決定することができる。Ｐ１００とＡ５１１からなるカクテルによる宿主パネルの感染は個別の宿主範囲の外挿から予期される追加の宿主範囲を示している。感染中におけるルシフェラーゼの最適生産に必要とされるバクテリオファージ濃度に関する観察に基づき、感染に単一性のバクテリオファージが使用されるにしても、多重ファージカクテルが使用されるにしても、添加されるバクテリオファージの濃度を１×１０7という一定の総ファージ濃度に維持した。Ａ５１１とＰ１００からなるそのカクテルは構築されたパネルの７４％の包括度を示し、一方で個々のバクテリオファージはそれぞれ７０％と５５％の包括度を示す（表２）。そのパネルのこの包括度の上昇は、それらのファージが大いに重複する包括範囲を有する一方でＰ１００感染に感受性を有する組の株がＡ５１１の株に完全には含まれないという面から生じている。個々の液体ベースの宿主範囲からバクテリオファージカクテルの機能を外挿する能力は、より完全なカクテルを構築するために遺伝子操作される新しいバクテリオファージを特定及び優先順位付けするための強力なツールを提供する。
【０２２５】
環境試料から集められた試料に対するＰ１００とＡ５１１からなるバクテリオファージカクテルの機能を構築された宿主パネルから厳密に推測することはできない。環境検査における試料採取部位は細菌の多種多様な集団を表しており、多くの場合に個々の場所に存在するリステリア属の１つより多くの種又は亜種を有する。地理及び起源について多様な食品加工工場における環境試料採取により、第三者検査室において培養ベースの検出方法を用いてリステリアについて陽性と確認された３１試料が特定された。これらの３１種類の陽性試料のうち１０試料が複数のリステリア種又は亜種を含んでいた。Ａ５１１とＰ１００のカクテルはそれらの３１種類の陽性試料のうちの２４種類（７７％）を検出することができた。前記液体ベースの宿主範囲の結果と採取されたそれらの環境試料との間の相関より、より完全にリステリア属を包括するためにバクテリオファージカクテルをさらに繰返し作製することが可能になり、且つ、前記液体ベース宿主範囲法の有用性が検証された。
【０２２６】
実施例４：その他のリステリアファージの宿主範囲の特徴解析
リステリア宿主株パネルの構築と迅速な液体ベース宿主範囲アッセイの開発により追加のバクテリオファージの迅速なスクリーニングが可能になり、リステリア属の包括範囲を増加させることになるバクテリオファージが特定された。前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて２５種類の追加のバクテリオファージが前記宿主パネルに対してスクリーニングされ、非感染対照と比較した透明化に基づいて宿主感受性について分析された。そのデータが表３に提示されている。株が０．４以下の比率を示している（濃い灰色の影）場合、それらの株は宿主範囲内であると見なした。その培養物のＯＤ６００の決定時に培養培地又は培養プレートの吸光度について補正せず、したがって、０．０９という比率は感染により完全に透明化した培養物を構成した。様々なリステリア株によって得られた最大ＯＤ６００値の変化のため、所与のバクテリオファージに対して感受性を有するリステリア株を示すために０．４という保守的な比率を選択した。０．４を超えるＯＤ６００比率を有する株は宿主範囲外にあると見なした（表３、影無し）。有用な宿主パネル包括度を提供し、ファージ・ターゲティングベクターの開発に適したゲノム配列利用可能性を有し、且つ、形質転換を最も受けやすいリステリアの株であるリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ−ｅ株に感染することが可能であるという基準に基づき、アッセイされたこれらの２５種類のバクテリオファージから７種類のバクテリオファージを遺伝子操作に進むために選択した。
【０２２７】
Ａ５１１及びＰ１００に加えて選択された７種類のバクテリオファージはＬＰ４４、ＬＰ４０、ＬＰ４８、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ１４３であった。前記リステリア宿主株パネルの７８％超を包括するアッセイされた個々のファージは無い。まとめると、それらのバクテリオファージは液体ベース宿主範囲アッセイでアッセイされると前記宿主株パネルのおよそ９２％を包括する（表３）。この組合せアプローチにより、環境試料コレクション中のリステリアの存在についての信頼できる判定を提供するための必要なリステリア種の包括度を提供するバクテリオファージカクテルの構築が可能になる。
【０２２８】
２つの異なる遺伝的積載物であるホタルルシフェラーゼとナノルシフェラーゼで前記ファージのゲノムを操作した後にこれらのファージの宿主範囲を再検査してそれらのゲノム改変がそれらのファージの適応性に影響していないこと、又は標的細菌に感染するそれらのファージの能力を損ねていないことを確かめた。感染におけるバクテリオファージの混合の結果を検討するため、前記液体ベース宿主範囲アッセイを用いてファージ感染の組合せ効果を検査した。これらの感染のため、前記カクテル内のそれぞれ等量のファージからなる１×１０5ｐｆｕ（すなわち、二成分ファージカクテルがそれぞれについて５×１０4ｐｆｕの２つの構成ファージからなる）という一定の濃度でファージの終濃度が維持された。
【０２２９】
実施例５：リステリアファージの操作
組換えファージを作製するために新しいファージ遺伝子操作方法を開発した。時にはこの方法を本明細書においてファージ感染工学技術（ＰＩＥ）と呼ぶ。この方法によりファージゲノムのあらゆる所望の位置に異種性核酸配列を挿入することが可能になる。挿入用に選択された最初の部位はＬｏｅｓｓｎｅｒら（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第６２巻：１１３３〜１１４０頁）において使用された部位であり、主要キャプシドタンパク質遺伝子ｃｐｓの下流であった。ホタルルシフェラーゼのコード配列（配列番号１）又はＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼのコード配列（配列番号３）をこの場所に挿入した。
【０２３０】
ＰＩＥ法は所望の挿入部位の直ぐ上流及び下流の約１ＫＢのファージ配列（上流相同性領域（ＵＨＲ）及び下流相同性領域（ＤＨＲ）と呼ぶ）が両側にあるルシフェラーゼ遺伝子配列を含むファージ・ターゲティングベクターＰＴＶを使用する。これらの挿入物のそれぞれは、組み立てを容易にするために２０ｂｐの相同性を加えつつ所望のアンプリコンを増幅するＰＣＲプライマーを使用して作製された。ＧｅｎｅＡｒｔシームレス・アッセンブリー・キット（ライフテクノロジーズ社）を使用してプラスミドを構築した。それらの３種類の挿入物（ＵＨＲ、ｌｕｃ、ＤＨＲ）をＳｍａＩとＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で制限消化されたグラム陽性／グラム陰性シャトルベクターｐＭＫ４中に組み込んだ。
【０２３１】
Ａ５１１ファージゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋで入手可能である（ＮＣ＿００９８１１）。Ａ５１１ファージはＡＴＣＣから入手することができる（ＰＴＡ−４６０８（商標））。
【０２３２】
ＰＩＥ法を用いてＡ５１１のｃｐｓ遺伝子の終止コドンの直後、ゲノム配列の塩基４６，６９５と塩基４６，６９６の間にホタルルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１）を挿入した。そのファージゲノムから欠失された配列は無かった。リボソーム結合部位を含む１６ｂｐ配列（ＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴ）をホタルルシフェラーゼ遺伝子の始まり（ＡＴＧ）の前に配置した。
【０２３３】
ファージＡ５１１を遺伝子操作するため、「ｐＭＡＫ  ｕｐｆ」オリゴと「ｐＭＡＫ  ｕｐｒ」オリゴを使用してｃｐｓ遺伝子の１２７６塩基を増幅し、「Ａ５１１  ＵＨＲ」断片を形成した。「ｐＭＡＫ  ｌｕｃｆ」プライマーと「ｐＭＡＫ  ｌｕｃｒ」プライマーを使用してルシフェラーゼ遺伝子を増幅し、「Ａ５１１  ｌｕｃ」断片を作製した。「ｐＭＡＫ  ｌｕｃｆ」プライマーはまた、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にリボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ）を付け加えた。「ｐＭＡＫ  ｄｎｆ」と「ｐＭＡＫ  ｄｎｒ」を使用してｃｐｓ終止コドン直後の１１４０ｂｐを増幅し、「Ａ５１１  ＤＨＲ」と名付けた。
【０２３４】
製造業者の指示に従ってＧｅｎｅＡｒｔシームレス・アッセンブリー・キットを使用してＳｍａＩ／ＰｓｔＩで制限消化されたｐＭＫ４にこれらの３つのアンプリコンを組み込んだ。一度、大腸菌中に単離されたところでそのプラスミドの配列を解析して正確な増幅と構築を検証した。検証されたところでそのプラスミドをリステリア・モノサイトゲネス株ＥＧＤ−ｅに形質転換し、ＢＨＩ−クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で選択した。
【０２３５】
ＰＴＶのＥＧＤ−ｅへの形質転換に成功したところで最初の組換えを実施する。一晩培養したＡ５１１：：ＦＦ  ＰＴＶ含有ＥＧＤ−ｅの培養物を１：１００に希釈し、０．１のＯＤ６００まで増殖させた。その後にこの培養物を希釈して０．０２のＯＤ６００まで戻し、２ｍｌの体積中に１ｅ５ｐｆｕ／ｍｌの野生型Ａ５１１ファージと混合した。この感染体を５０ｒｐｍで撹拌して３０℃で一晩培養した。
【０２３６】
組換えが生じたか評価するために次の日に前記感染体をアッセイした。まず、残っているあらゆる細胞を殺滅し、且つ、ＰＴＶにより作製されるバックグラウンド・ルシフェラーゼを破壊するために溶菌液とクロロホルムを混合した。前記ファージはクロロホルム耐性であり、それはバクテリオファージに共通の形質である。４（体積／体積）％のＣＨＣｌ３を溶菌液に添加し、ボルテックス混合し、遠心し、そして上清を回収した。一晩培養したＥＧＤ−ｅの培養物の１：１０希釈物を組換え溶菌液に添加して（９０μｌの細胞希釈物、１０μｌのファージ溶解液）試験感染を行った。細胞を使用せずに対照感染を設定した。それらの感染体を３０℃で３時間静置培養し、その後にＧｌｏｍａｘ  ２０／２０上で発光についてアッセイした。２０μｌの感染体を１００μｌのＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ・アッセイ試薬（ＮａｎｏＬｕｃファージについては２０μｌの溶菌液と２０μｌのＮａｎｏＧｌｏ）と混合し、その後に１０秒の積分時間（ＮａｎｏＧｌｏについては１秒）を用いて読み込んだ。組換え溶菌液は光を発生し、その溶菌液の中に組換えファージが存在することを示した。
【０２３７】
前記組換えファージを濃縮及び単離するため、前記組換え溶菌液中に存在する野生型ファージからその組換えファージを分離する必要があった。連続的な希釈と分割を用いた。入力ファージの１０倍希釈物を用いて溶菌液を作製し、ルシフェラーゼ活性についてそれらの溶菌液をアッセイすることにより組換えファージの存在についてスクリーニングを行った。
【０２３８】
組換え効率は１：１ｅ５〜１：１ｅ６であると推定された。純粋な組換え溶菌液を単離するため、（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第６２巻：１１３３〜１１４０頁）に記載される方法を次のように改変した。初期組換え溶菌液の力価を測定した。それぞれ１ｅ６、１ｅ５、及び１ｅ４ｐｆｕ／ｍｌのその組換え溶菌液を用いて２０本の１ｍｌの溶菌液を用意した。すなわち、ＯＤ０．０２の１ｍｌのＥＧＤ−ｅに１ｅＸのファージを加えて５０ｒｐｍ、３０℃で一晩培養した。翌日、上記のように各溶菌液についてＣＨＣｌ３処理を行った。それらの溶菌液を使用して上記のように感染体を用意した。Ｇｌｏｍａｘ  ２０／２０上で各溶菌液をアッセイした（ＦＦについて２０μｌの感染体と１００μｌの試薬、ｎｌｕｃについて２０μｌの感染体と２０μｌのＮａｎｏＧｌｏ）。その目的は、感染すると発光を示す最少の数のファージで作製される溶菌液を確認することであった。この溶菌液が特定されたところでその溶菌液の力価を測定し、１ｅ３、１ｅ２及び１ｅ１ｐｆｕ／ｍｌを有する溶菌液を用意した。１ｅ２個のファージで作製された発光性溶菌液が単離されたところで単一性プラークを得るためにこの溶菌液を蒔いた。プラークを選んでＳＭ緩衝液中に入れた。これらの「浸漬物」をｄＨ２Ｏ中に１：１０で希釈し、ルシフェラーゼ遺伝子とファージ配列との間の組換え接合部の存在を調べるために「ＤＢＯＮＯ３６０」と「ＤＢＯＮ０３６１」を使用するＰＣＲによりアッセイした。
【０２３９】
Ｐ１００ファージゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋで入手可能である（ＤＱ００４８５５）。Ｐ１００はＡＴＣＣから入手することができる（ＰＴＡ−４３８３（商標））。
【０２４０】
Ｐ１００のルシフェラーゼ挿入部位も同じｃｐｓ遺伝子の下流であった。Ｐ１００におけるホタルルシフェラーゼ挿入の部位はＰ１００ゲノム配列の塩基１３，１９６と塩基１３，１９７の間である。
【０２４１】
次のことを例外としてＡ５１１と同様にしてＰ１００を遺伝子操作した。「ｐＭＡＫ  ｄｎｆ」プライマーと「ｐＭＡＫ  ｄｎｒ  Ｐ１００」プライマーを使用して「Ｐ１００  ＤＨＲ」断片を増幅した。プラークを選んで１００μｌのＳＭ緩衝液に入れることにより一個の組換えプラークを特定した。この浸漬物の１０μｌを５０μｌのルシフェリンと混合し、前記ルミノメーター上で発光を確認した。陽性物を特定するこの方法を後の組換えファージ単離において活用した。
【０２４２】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＡ５１１：：ｆｆｌｕｃについて記載された方法を使用して次のファージ、すなわち、ＬＰ４８、ＬＰ１２４、ＬＰ１２５、ＬＰ９９、ＬＰ１０１、ＬＰ１４３を遺伝子操作した。
【０２４３】
ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を使用して次のファージ、すなわち、Ａ５１１、Ｐ１００、ＬＰ４０、ＬＰ１２４及びＬＰ１２５を遺伝子操作した。
【０２４４】
次のＰＣＲ断片を増幅することによりＡ５１１：：ｎｌｕｃ用のＰＴＶを構築した。Ａ５１１溶菌液を鋳型として使用して、ｐＭＡＫ  ｕｐｆオリゴとＤＢＯＮ０３５６オリゴを使用してＵＨＲ断片を生成し、ＤＢＯＮ０３５９オリゴとｐＭＡＫ  ｄｎｒオリゴを使用してＤＨＲ断片を増幅した。ＰｒｏｍｅｇａプラスミドｐＮＬ１．１を鋳型として使用してＤＢＯＮ０３５７オリゴとＤＢＯＮ０３５８オリゴを使用してＮａｎｏＬｕｃ断片を増幅した。構築法とその後のＰＩＥ法は記載した構築法及びＰＩＥ法と同様であった。
【０２４５】
ｐＭＡＫ  ｄｎｒオリゴよりもむしろｐＭＡＫ  ｄｎｒ  Ｐ１００オリゴを使用してＤＨＲ断片を増幅することを例外として、Ｐ１００：：ｎｌｕｃ用のＰＴＶと遺伝子操作をＡ５１１：：ｎｌｕｃと同様に実施した。
【０２４６】
次の変更によりＬＰ１２４、ＬＰ１２５、及びＬＰ４０用のＰＴＶをＡ５１１：：ｎｌｕｃと同様に構築した。プラスミドのより効率的な構築を可能にするため、ＤＢＯＮ０３５９オリゴとＤＢＯＮ０３８２オリゴを使用して増幅されるＤＨＲ断片はより短いものであった。また、２つの追加の終止コドン（ＴＡＡＴＡＡ）をこれらのファージのｃｐｓ遺伝子の直ぐ下流に付加することにより挿入部位を改変した。追加のプライマーＤＢＯＮ０３７９とＤＢＯＮＯ３８０を作製することによりこれらの６塩基が付加された。ｐＭＡＫ  ｕｐｆオリゴとＤＢＯＮＯ３８０オリゴを使用してこれらのファージ用のＵＨＲ断片を増幅した。ＤＢＯＮ０３７９オリゴとＤＢＯＮ０３５８オリゴを使用してＮａｎｏＬｕｃ断片を増幅した。
【０２４７】
ＰＩＥ法において次のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０２４８】
ｐＭＡＫ  ｕｐｆ：
ＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＣＣＴＡＧＡＣＧＡＣＣ
【０２４９】
ｐＭＡＫ  ｕｐｒ：
ＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴ
【０２５０】
ｐＭＡＫ  ｌｕｃｆ：
ＡＡＡＡＣＧＴＴＣＡＴＡＧＣＡＡＣＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴ
【０２５１】
ＭＡＫ  ｌｕｃｒ：
ＡＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣ
【０２５２】
ｐＭＡＫ  ｄｎｆ：
ＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＡＴ
【０２５３】
ｐＭＡＫ  ｄｎｒ：
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＡＡＴＧ
【０２５４】
ｐＭＡＫ  ｄｎｒ  Ｐ１００：
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧ
【０２５５】
ＤＢＯＮＯ３６０：ＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴ
【０２５６】
ＤＢＯＮ０３６１：ＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＣＣ
【０２５７】
ＤＢＯＮ０３５６：
ＴＣＴＴＣＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣ
【０２５８】
ＤＢＯＮ０３５７：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴ
【０２５９】
ＤＢＯＮ０３５８：
ＡＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣ
【０２６０】
ＤＢＯＮ０３５９：
ＧＣＧＡＡＣＧＣＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡＡＡ
【０２６１】
ＤＢＯＮ０３７９：
ＡＡＡＡＣＧＴＴＣＡＴＡＧＣＡＡＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣ  ＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴ
【０２６２】
ＤＢＯＮＯ３８０：
ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＧ
【０２６３】
ＤＢＯＮ０３８２：
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＧ。
【０２６４】
その後の実験において、前記方法に対して幾つかの改変を行った。多くの場合にＰＴＶの構築中にＤＨＲ断片が構築されたプラスミドから失われていることが明らかになった。これは、ＤＢＯＮ０３８２オリゴを利用して使用する断片の長さを短くすることにより克服された。
【０２６５】
改変アプローチにおいて、前記組換え溶菌液の力価を決定した後に時には次のように濃縮工程を実施し、その濃縮工程を用いてＮａｎｏＬｕｃファージを作製した。
【０２６６】
ＰＩＥ溶菌液を２００μｌの体積で培養するために９６ウェルマイクロタイタープレートを使用した。ＦＦ溶菌液については１ｅ６ｐｆｕ／溶菌液（５ｅ６ｐｆｕ／ｍｌ）の濃度で９６本の溶菌液、１ｅ５ｐｆｕ／溶菌液の濃度で９６本の溶菌液、及び１ｅ４ｐｆｕ／溶菌液の濃度で９５本の溶菌液を作製することが最初のステップであった。ＮａｎｏＬｕｃファージについては前記組換え溶菌液の組換え効率が著しく高いこと、及び１ｅ０ｐｆｕ／溶菌液まで下げた希釈物を使用することができることがわかった。５０ｒｐｍで撹拌して３０℃で一晩培養することによりこれらの溶菌液を作製した。適切なルシフェラーゼアッセイシステム（ｆｆ又はＮａｎｏＧｌｏ）を使用してそれらの溶菌液をアッセイした。新しい細胞を感染させるためにそれらの溶菌液を使用する代わりに、溶菌液自体のバックグランドシグナルが組換えファージの存在の指標であることがわかった。
【０２６７】
最少の数のファージから作製される溶菌液が特定されたところでその溶菌液を使用して、より少ないファージを使用する新しい９６ウェル溶菌液を用意した。１：１０〜１：１００という適切な組換え頻度が達成されたところでそれらのファージを寒天プレート上に蒔いて上に記載されるように単一性プラークを単離した。
【０２６８】
これらの方法を使用してｆｆルシフェラーゼをコードする異種性オープン・リーディング・フレーム又はＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼをコードするオープン・リーディング・フレームのどちらかを備える組換えファージを作製した。それらの遺伝子操作ファージにおけるその挿入された積載物と周囲の配列の完全性を確認するため、ＰＣＲにより断片を増幅し、配列を解析した。この断片はその挿入された配列にまたがり、ｃｐｓ遺伝子から始まり、ホタル遺伝子又はＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を越え、下流配列にわたる。ＤＢＯＮ０３９８オリゴとｐＭＡＫ  ｕｐｒオリゴを使用して完全長ｃｐｓ遺伝子もＰＣＲ増幅した：
【０２６９】
ＤＢＯＮ０３９８：ＴＧＣＴＡＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＧＡＡ．
【０２７０】
ＤＢＯＮ０２７３オリゴ、ＤＢＯＮ０３９８オリゴ、及びｐＭＡＫ  ｕｐｒオリゴを使用してその遺伝子の配列を解析した。
【０２７１】
次のプライマーを使用してＰＣＲ断片を増幅した。
【０２７２】
ＤＢＯＮ０２７３：ＴＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＣＡＧＴＡＧＧＧＧＴ；及び
【０２７３】
ＤＢＯＮ０３８２：
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＧ。
【０２７４】
次のオリゴを使用してＮａｎｏＬｕｃファージの配列を解析した。
【０２７５】
ＤＢＯＮ０２７３；
【０２７６】
ＤＢＯＮ０３８２；
【０２７７】
ＤＢＯＮ０３６１：ＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＣＣ；
【０２７８】
ＤＢＯＮＯ３６０：ＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴ；
【０２７９】
ＤＢＯＮ０３６２：ＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧ、及び
【０２８０】
ＤＢＯＮ０３６３：ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＣＧＣ。
【０２８１】
次のオリゴを使用してホタルファージの配列を解析した。
【０２８２】
ＤＢＯＮ０２７３；
【０２８３】
ＤＢＯＮ０３８２；
【０２８４】
ＤＢＯＮＯ３６０；
【０２８５】
ＤＢＯＮ０３６１；
【０２８６】
ＤＢＯＮ０２７４：ＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣ；
【０２８７】
ＤＢＯＮ０１５１：ＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＧＣ；及び
【０２８８】
ＤＢＯＮ０１５２：ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡ。
【０２８９】
Ｇｅｎｅｗｉｚ社によってシーケンシングが実施された。Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアパッケージを使用してアラインメントを行い、各ファージについてコンセンサス配列を作製した。
【０２９０】
次の遺伝子操作したファージが作製され、挿入部位領域の配列が上に記載されるように解析されている。
【０２９１】
挿入されたホタルルシフェラーゼを含むファージ：
【０２９２】
ＬＰ４８：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２３）；
【０２９３】
ＬＰ９９：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２４）；
【０２９４】
ＬＰ１０１：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２５）；
【０２９５】
ＬＰ１２４：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２６）；
【０２９６】
ＬＰ１２５：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２７）；
【０２９７】
ＬＰ１４３：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２８）；
【０２９８】
Ａ５１１：：ｆｆｌｕｃ（配列番号２９）；及び
【０２９９】
Ｐ１００：：ｆｆｌｕｃ（配列番号３０）。
【０３００】
挿入されたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを含むファージ：
【０３０１】
ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ（配列番号３１）；
【０３０２】
ＬＰ１２５：：ｎｌｕｃ（配列番号３２）；
【０３０３】
Ａ５１１：：ｎｌｕｃ（配列番号３３）；
【０３０４】
Ｐ１００：：ｎｌｕｃ（配列番号３４）。
【０３０５】
挿入されたホタルルシフェラーゼ・コード配列を備える前記ファージの挿入部位領域が図３において整列している。各配列は次の部分を含む。
【０３０６】
【表２】
2016517687.tif 000013
【０３０７】
挿入されたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ・コード配列を備える前記ファージの挿入部位領域が図４において整列している。各配列は次の部分を含む。
【０３０８】
【表３】
2016517687.tif 000014
【０３０９】
各ファージのｃｐｓオープン・リーディング・フレームとコードされるタンパク質は次の通りである。
【０３１０】
【表４】
2016517687.tif 000015
【０３１１】
ｃｐｓ遺伝子配列が図１において整列しており、タンパク質配列が図２において整列している。前記の遺伝子操作したファージのｃｐｓ遺伝子は比較的に高い程度の相同性を示している。
【０３１２】
上に記載される方法を用いて上記のファージの全てを遺伝子操作した。部分的ゲノム配列により、ＬＰ４８、ＬＰ１２４、及びＬＰ１２５用のＰＴＶを作製するためにＡ５１１に使用されるプライマーを使用することができることが示された。ＬＰ９９、ＬＰ１０１又はＬＰ１４３のときにはゲノム配列が利用可能ではなかった。Ａ５１１  ＰＴＶプライマーを使用してＰＴＶ構築用の適切な断片をＡ５１１と同様に増幅することができた。このことはそれらのファージにまたがるｃｐｓ遺伝子領域の間の相同性を反映している。ルシフェラーゼ遺伝子挿入部位はＡ５１１：：ｆｆｌｕｃと同じ場所（ｃｐｓ遺伝子終止コドンＴＡＡの後）であった。
【０３１３】
実施例６：リステリアファージ混合物の宿主範囲の特徴解析
２つの異なる遺伝的積載物であるホタルルシフェラーゼとナノルシフェラーゼで前記ファージのゲノムを操作した後にこれらのファージの宿主範囲を再検査してそれらのゲノム改変がそれらのファージの適応性に影響していないこと、又はリステリア株宿主パネルにわたる包括度を提供するそれらのファージの能力を損ねていないことを確かめた。遺伝子操作ファージを前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて検査し、非改変型バクテリオファージと比較した。それらの遺伝子操作バクテリオファージは非改変型野生型と比較してそれらのファージの宿主範囲の変化を示さなかった（表４）。
【０３１４】
バクテリオファージの個々の宿主範囲プロファイルを組み合わせるとリステリア属の必要な包括度を提供するそれらのバクテリオファージが特定されたことにより、それらのファージが混合感染において使用されるときに期待される相加的包括度を提供するかどうかという疑問、又は感染における追加のバクテリオファージの存在が感受性株に感染する単一のバクテリオファージの能力を低下させるかどうかという疑問が生じた。このことを検討するために前記液体ベース宿主範囲アッセイにおいて透明化をもたらすバクテリオファージカクテルの能力についてバクテリオファージの混合物（カクテル）を検査した。これらの感染のため、前記カクテル内のそれぞれ等量のファージからなる１×１０5ｐｆｕ（すなわち、二成分ファージカクテルがそれぞれについて５×１０4ｐｆｕの２つの構成ファージからなる）という一定の濃度でファージの終濃度が維持された。カクテル（二成分、三成分、又は四成分バクテリオファージカクテルのいずれか）中のバクテリオファージの組合せが宿主範囲の喪失を引き起こすことはなく、個々のバクテリオファージの宿主範囲の予期される相加的効果をもたらした（表４）。遺伝子操作されたホタルルシフェラーゼ発現バクテリオファージとＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼ発現バクテリオファージの両方が遺伝子操作されていないバクテリオファージと比べて変化した液体ベースの宿主範囲を有しなかったので、前記バクテリオファージの相加的効果はそれらのゲノム改変と無関係であった。
【０３１５】
実施例７：マーカーベースの宿主範囲に対する液体ベースの宿主範囲の比較
活発に増殖する培養物を透明化するバクテリオファージの能力は、前記バクテリオファージが特定の株に感染する能力に加えて、特定の株の増殖速度及びバクテリオファージの複製速度をはじめとする多数の要因によって決定される。したがって、本明細書において開示される液体培養法において使用される培養物透明化測定出力値は、マーカーをコードする異種性核酸配列を備える組換えファージに細菌株を曝露し、且つ、マーカー産生についてアッセイすることにより決定され得る宿主範囲よりも限定的である可能性がある。そのようなマーカーの一例はルシフェラーゼである。したがって、前記液体ベース宿主範囲アッセイと感染ベースのルシフェラーゼ検出アッセイの両方によって宿主範囲をＬＰ１２４：ｎｌｕｃファージについて決定した。感染ベースのアッセイを実施するため、リステリア宿主パネル株コレクションの培養をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で始め、２ｍｌの９６ディープウェルディッシュ中の１ｍｌのＢＨＩ液の中に単一性コロニーを接種し、滅菌通気性滅菌膜で覆い、３０℃で１６時間培養した。それらの９６ウェルプレートの１６時間培養物の各々を１９８μｌのＢＨＩの中に１：１０，０００の割合で希釈した。感染のため、１２．５μｌの前記培養希釈物を不透明の発光リーダープレート中の１×１０7ｐｆｕ／ｍｌの濃度の１２．５μｌのＬＰ１２４：ｎｌｕｃに添加して混合し、３０℃で３時間保温した。３時間後に製造業者の推奨に従ってＰｒｏｍｅｇａ  ＮａｎｏＧｌｏ反応を用いてＰｒｏｍｅｇａ  Ｇｌｏｍａｘ９６ウェルプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。
【０３１６】
表５は前記の２つの方法によって決定された宿主範囲を示している。非感染培養物のＯＤ６００に対する感染培養物ＯＤ６００の比率が０．４未満である場合に株が透明化アッセイについて宿主範囲内にあると見なした。ルシフェラーゼ検出ベースの宿主範囲について、アッセイ株を高ＲＬＵ株（表５、濃い灰色の影）、中ＲＬＵ株（表５、明るい灰色の影）、及び低ＲＬＵ株（表５、影無し）の３つのカテゴリーに階層化した。そのアッセイの成績に基づき、ＲＬＵ測定値が１０，０００ランダム・ライト・ユニット（ＲＬＵ）を超える（表５、明るい灰色の影）場合に株が前記バクテリオファージの宿主範囲内にあると見なした。このルシフェラーゼ活性カットオフ値は細菌アッセイにおいて有用なレベルの感度を特徴づけるので使用された。前記液体ベースの宿主範囲透明化のこれらの基準に基づくと、ＬＰ１２４は検査したリステリア株の５０．５％（２７６株のうちの１４０株）を透明化することにより広い宿主範囲を示す。ルシフェラーゼ検出アッセイにより、検査したリステリア株の７８．２％（２７６株のうちの２１６株）が高ＲＬＵレベルを示した。
【０３１７】
リステリア宿主パネルの培養物を透明化するＬＰ１２４：：ｎｌｕｃの能力とＲＬＵ出力値との間の比較により、マーカー発現を使用して測定された宿主範囲が前記液体ベースの宿主範囲を使用して限定された宿主範囲よりも広いことが示される。このことは幾つかの理由によるものであり得た。第一に、感染によって透明化されないが、光を発する細菌株は、前記バクテリオファージが感染し、複製する能力に勝る増殖速度を有する場合があり得る。この場合では非感染細胞の数がその培養物中のバクテリオファージに勝るので、その株が完全にそのバクテリオファージに負けることは決してない。第二に、そのバクテリオファージは最初の感染ステップ（すなわち、結合、ＤＮＡの注入、及びウイルスタンパク質の翻訳）を行うことができるが、感染過程（すなわち、ビリオンの構築、細胞からの放出）を完了することができない場合があり得る。バクテリオファージの生活環を別々のステップに分けることができるので、バクテリオファージは、培養物を透明化することなく、又は追加的なバクテリオファージを産生することなく、ファージがコードするタンパク質、この場合はルシフェラーゼを産生することができる。バクテリオファージを産生することなくルシフェラーゼを産生するその他の株はバクテリオファージの宿主範囲の古典的な定義の中に当てはまらない一方で、マーカーをコードする異種性核酸配列を備えるファージを使用して標的細菌を検出する方法において問題となる宿主範囲はマーカー産生を維持する種類の細菌であるので、それらの株は本開示の目的に適した宿主範囲の定義に含まれる。前記遺伝子操作バクテリオファージを使用すると観察されるこの増加した宿主範囲はその遺伝子操作過程の有利な副産物であり、リステリア宿主パネル用に演繹的にその宿主範囲を決定することはできない。
【０３１８】
液体ベースの培養物のバクテリオファージが透明化することができない細菌株においてそのバクテリオファージが光を発する能力によって生じる１つの可能性がある懸念は、他の標的外細菌属も遺伝子操作ファージの存在下でルシフェラーゼを産生することができることである。これらの細菌種は、バクテリオファージ感染に応答してバクテリオファージを産生することができないため、これらのファージの宿主範囲内にあると見なされなかった。しかしながら、前記遺伝子操作ファージによる感染の初期段階を検出するための上昇した感度の結果、少なくとも理論的には、例えば液体培養法を使用して宿主と特定されていない細菌の株においてマーカー（この場合はルシフェラーゼであり、発光によってアッセイされる）が産生されることになり得る。この問題に対応するため、リステリアに密接に関連する細菌種のパネルを構築した（表６）。このパネルは系統学的にリステリアに類似の他のグラム陽性生物から構成された。これらの株が前記遺伝子操作バクテリオファージの存在下で発光することができるか判定するため、それらの種の各々を適切な培養条件下で１６時間培養した（表６）。それらの株を１０5ｃｆｕ／ｍｌの濃度にまで希釈し、次に９０μｌの細胞を１×１０7ｐｆｕ／ｍｌのバクテリオファージカクテルの１０μｌと混合し、３０℃で３時間培養した。その後、標準的プロトコルを使用してルシフェラーゼの存在についてそれらの反応を測定した。検査された細菌種の中で検出可能なレベルのＲＬＵを有したものは無く（表６）、前記バクテリオファージが透明化しない株においてＲＬＵを示すそれらのバクテリオファージの能力は、バクテリオファージレポーターベースアッセイの精度を低下させる厳密な意味での標的外効果ではないことを示した。
【０３１９】
第二の問題は、アッセイにおいてリステリア細菌種と非リステリア細菌種が共存するときに系統学的にリステリアに類似のこれらの細菌種がリステリアを検出する前記遺伝子操作バクテリオファージの感度を低下させるかどうかということであった。この可能性を検討するため、関連の細菌種を上記のように培養し、１０5ｃｆｕ／ｍｌの濃度にまで希釈した。リステリア株の培養をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で始め、５ｍｌのＢＨＩ液の中に単一性コロニーを接種し、３０℃で１６時間培養した。一晩培養した培養物を新しい０．５×ＢＨＩ培地の中に１：５の割合で希釈し、撹拌振盪機において２００ｒｐｍで振盪して３０℃で２時間培養した。２時間後にその培養物の１０倍段階希釈物を作製した。前記検査を実施するため、全体で約１０ｃｆｕを表すはずである前記リステリア段階希釈物の１０μｌを２０μｌの潜在的に阻害性の細菌種及び１０μｌのバクテリオファージカクテル（Ａ５１１：：ｎｌｕｃ／ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ／Ｐ１００：：ｎｌｕｃ）と混合し、その混合物を３０℃で３時間保温した。その保温後に、示唆されたようにＰｒｏｍｅｇａ  Ｇｌｏｍａｘ  ２０／２０ルミノメーターとＰｒｏｍｅｇａ  ＮａｎｏＧｌｏ反応を用いてルシフェラーゼの存在についてその反応をアッセイした。これらのアッセイにより、１０4大きい数の競合性細菌が存在する中でリステリアを検出する能力の低下は存在しないことが示され（表６）、そのアッセイの感度は試料中の非標的細菌の存在によって影響されないことが示された。
【０３２０】
細菌のこの選択は環境試料採取中に存在し得る細菌の限定的なセットであり、それらの細菌の全てを表してはいなかった。前記バクテリオファージカクテルの感度と精度を低下させ得るより包括的な細菌種試料を作製するため、食品加工工場から環境試料を採取し、環境スワッブから細菌種を単離して前記アッセイの成績に対するこれらの種の影響を測定した。存在する細菌種を単離するため、ブレインハートインフュージョン寒天又はＲ２Ａ寒天の両方に環境試料を蒔き、３０℃で一晩培養した。コロニーの形態に基づいてそれらのプレート上に存在する細菌を特定し、ＢＨＩ寒天プレート上で純化のための培養を始めた。それらの細菌種の純粋培養物をＢＨＩ培地中に３０℃で１６時間培養した。それらの培養物を１０5ｃｆｕ／ｍｌの濃度まで希釈し、前記バクテリオファージカクテルが存在する中でのルシフェラーゼの産生と前記バクテリオファージカクテルによるリステリア感染の阻害の両方について上記のように検査した。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方から構成される細菌種のうち、前記バクテリオファージの存在下でどのようなルシフェラーゼの産生でも示すものは無かった（表７）。さらに、採取試料が存在する中でのリステリアの培養によってどのようなルシフェラーゼの産生の低下も示すことができず、環境的に採取された細菌によって前記アッセイの感度又は精度は低下しないことが示された。
【０３２１】
実施例８：ファージ組成物の設計
前記液体ベース宿主範囲アッセイと比較して前記ＲＬＵベースのルシフェラーゼ検出アッセイにより観察された宿主範囲の増加により、バクテリオファージの宿主範囲の間の差異を識別するための新規の方法が明らかにされた。さらに、ファージ宿主範囲を評価する手段としての前記ＲＬＵベースのルシフェラーゼ検出アッセイにより、標的細菌を検出する方法の条件に類似の条件の下で遺伝子操作バクテリオファージにより特定された標的細菌を非常に正確に評価することが可能になる。この情報を使用することができる一つの方法は、有用な累積的宿主範囲を有するファージ混合物を作製するために組み合わせることができるファージの有用な組合せを特定することである。
【０３２２】
バクテリオファージカクテル中にＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含むことの相加的効果を判定するため、リステリア宿主範囲パネルの一部についてＡ５１１：：ｎｌｕｃとＬＰ１２４：：ｎｌｕｃの間でＲＬＵベースのルシフェラーゼ検出アッセイを比較した。ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃはＡ５１ｌ：ｎｌｕｃ（９６株のうち３７株を検出、３８．５％）と比較して広いＲＬＵベースの宿主範囲（９６株のうち７７株を検出、８０．２％）を有した（表８）。また、ＬＰ１２４：ｎｌｕｃは９６株のうちの７３株（７６％）においてＡ５１１：ｎｌｕｃと比較して１００倍より高いＲＬＵ値をもたらす。ＬＰ１２４：ｎｌｕｃ感染体に由来するこの増加したＲＬＵ出力値は、Ａ５１１とＬＰ１２４：ｎｌｕｃの両方を含むバクテリオファージカクテルがＡ５１１：ｎｌｕｃ単独よりも高い感度と精度を有することを予測する。
【０３２３】
Ａ５１１とＰ１００が存在する中でもたらされるＲＬＵのレベルをＬＰ１２４：：ｎｌｕｃが上昇させるかどうか検討するため、二成分ファージカクテル（Ａ５１１：：ｎｌｕｃ／Ｐ１００：：ｎｌｕｃ）と三成分ファージカクテル（Ａ５１１：：ｎｌｕｃ／Ｐ１００：：ｎｌｕｃ／ＬＰ１２４：：ｎｌｕｃ）の両方で感染させられた試料の間でＲＬＵ値を比較した。このことを検討するため、ＵＶＭ培地中で培養した１ｍｌの複合環境試料を遠心分離により沈降させた。上清を除去し、１×１０7の総バクテリオファージ濃度の１００μｌの前記二成分ファージカクテル又は前記三成分ファージカクテルのどちらかの中に細胞を再懸濁し、３０℃で培養した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＮａｎｏＧｌｏ試薬とＰｒｏｍｅｇａ  ２０／２０ルミノメーターを使用することによりＲＬＵレベルを測定した。リステリア宿主パネルについては、前記二成分ファージカクテルよりも前記三成分ファージカクテルが存在するときに環境試料は高いレベルのＲＬＵを示した（表９）。その感染のＲＬＵ出力値のこの増加は、Ｐ１００：：ｎｌｕｃとＡ５１１：：ｎｌｕｃだけに対してＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを存在させることによる明らかな利点を示している。
【０３２４】
前記二成分ファージカクテルと比較した前記三成分ファージの増加した宿主範囲と上昇したＲＬＵ出力値により、環境試料に対する有用な包括度がＡ５１１：：ｎｌｕｃとＬＰ１２４：：ｎｌｕｃのカクテルによりもたらされることが示唆された。食品加工工場に関係するリステリアを特定する前記カクテルの能力を判定するため、米国内の様々な食品加工工場において環境試料採取を実施した。これらの食品加工工場は水産物加工工場、乳加工工場、食肉加工工場、及び農産物加工工場を代表し、それらの加工工場の所在地について地理的に様々であった。環境採取を実施した後で改変ＵＳＤＡ単離法を用いてそれらの環境試料中に存在するリステリアを単離した。それらのリステリアの培養をＢＨＩ寒天プレート上で始め、単一性コロニーを使用して２ｍｌのディープウェルディッシュ中の１ｍｌの０．５×ＢＨＩ培地に接種し、滅菌通気性膜で覆い、３０℃で１６時間培養した。播種した９６ウェルの１６時間培養物の各々を１９８μｌのＢＨＩ中に１：１０，０００の割合で希釈した。感染のため、１２．５μｌの前記培養希釈物を不透明の発光リーダープレート中の１×１０7ｐｆｕ／ｍｌの総バクテリオファージ濃度のＡ５１１：：ｎｌｕｃとＬＰ１２４：：ｎｌｕｃを含む１２．５μｌのバクテリオファージカクテルに添加して混合し、３０℃で３時間保温した。３時間後に製造業者の推奨に従ってＰｒｏｍｅｇａ  ＮａｎｏＧｌｏ反応を用いてＰｒｏｍｅｇａ  Ｇｌｏｍａｘ９６ウェルプレートリーダーを使用して発光レベルを検出した。同時に液体ベース宿主範囲アッセイを実施して培養物透明化に対してそのＲＬＵ出力値を比較した。
【０３２５】
前記液体ベース宿主範囲アッセイに基づき、前記バクテリオファージカクテルは１００株のうちの２５株（２５％）において細菌培養物を透明化することができた。透明化のこのレベルの低下は、リステリア宿主範囲パネル内の検査された一般的な研究室単離株と比較して速い環境的に単離された株の増殖速度に起因する。ＲＬＵベース宿主範囲アッセイにより１００株のうちの７５株（７５％）が特定された（表１０）。これらの環境試料は複雑な微生物学的群落を代表しており、環境試料当たり複数のリステリア単離株を有した。これらの微生物学的群落内にリステリアの複数の株が存在することにより前記アッセイの感度が改善される。この例ではスポンジを使用して環境試料を採取しており、それらのスポンジを培地と共に最大で２４時間まで保温し、その後でアリコットを取出し、検出する細菌集団の存在又は不在についてそのアリコットをアッセイした。同じ環境試料から特定された個々のリステリア株を特定する前記バクテリオファージカクテルの能力に基づくと、Ａ５１１とＬＰ１２４：ｎｌｕｃからなる前記バクテリオファージカクテルにより５７個のうち４８個（８４．２％）のリステリア陽性スポンジを検出することができると予想された。その環境スポンジを培地中で保温し、且つ、前記アッセイを用いてその濃縮試料の試料を検査すると、Ａ５１１とＬＰ１２４：ｎｌｕｃを含む前記バクテリオファージカクテルは５７個のうち４９個（８５．９％）のリステリア陽性スポンジを検出することができた。この感度の上昇は、前記バクテリオファージカクテルに対して感受性を有するリステリア株を検出する前記アッセイの感度は、前記バクテリオファージカクテルの宿主範囲内のものをはじめとする複数のリステリア株の存在のために低下しないことを示している。
【０３２６】
【表５Ａ】
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【０３２７】
【表５Ｂ】
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【０３２８】
【表５Ｃ】
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【０３２９】
【表５Ｄ】
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【０３３０】
【表５Ｅ】
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【０３３１】
【表５Ｆ】
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【０３３２】
【表５Ｇ】
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【０３３３】
【表６Ａ】
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【０３３４】
【表６Ｂ】
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【０３３５】
【表６Ｃ】
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【０３３６】
【表６Ｄ】
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【表６Ｅ】
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【０３３８】
【表６Ｆ】
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【０３３９】
【表６Ｇ】
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【０３４０】
【表７Ａ】
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【０３４１】
【表７Ｂ】
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【０３４２】
【表７Ｃ】
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【０３４３】
【表７Ｄ】
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【０３４４】
【表７Ｅ】
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【０３４５】
【表７Ｆ】
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【０３４６】
【表７Ｇ】
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【０３４７】
【表８Ａ】
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【０３４８】
【表８Ｂ】
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【０３４９】
【表８Ｃ】
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【０３５０】
【表８Ｄ】
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【０３５１】
【表８Ｅ】
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【０３５２】
【表８Ｆ】
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【０３５３】
【表８Ｇ】
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【０３５４】
【表９Ａ】
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【０３５５】
【表９Ｂ】
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【０３５６】
【表９Ｃ】
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【表９Ｅ】
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【０３５９】
【表９Ｆ】
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【０３６０】
【表９Ｇ】
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【０３６１】
【表１０Ａ】
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【０３６２】
【表１０Ｂ】
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【０３６３】
【表１０Ｃ】
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【０３６４】
【表１０Ｄ】
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【０３６５】
【表１０Ｅ】
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【０３６６】
【表１０Ｆ】
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【０３６７】
【表１０Ｇ】
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【０３６８】
【表１０Ｈ】
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【０３６９】
【表１１Ａ】
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【０３７０】
【表１１Ｂ】
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【０３７１】
【表１１Ｃ】
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【０３７２】
【表１１Ｄ】
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【０３７３】
【表１１Ｅ】
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【０３７４】
【表１１Ｆ】
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【０３７５】
【表１１Ｇ】
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【０３７６】
【表１１Ｈ】
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【０３７７】
【表１２Ａ】
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【０３７８】
【表１２Ｂ】
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【０３７９】
【表１２Ｃ】
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【０３８０】
【表１２Ｄ】
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【０３８１】
【表１２Ｅ】
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【０３８２】
【表１２Ｆ】
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【０３８３】
【表１２Ｇ】
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【０３８４】
【表１３】
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【０３８５】
【表１４】
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【０３８６】
【表１５Ａ】
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【０３８７】
【表１５Ｂ】
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【０３８８】
【表１５Ｃ】
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【０３８９】
【表１６】
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【０３９０】
【表１７Ａ】
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【０３９１】
【表１７Ｂ】
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【０３９２】
【表１７Ｃ】
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【０３９３】
【表１７Ｄ】
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【０３９４】
【表１８Ａ】
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【０３９５】
【表１８Ｂ】
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【０３９６】
【表１８Ｃ】
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【０３９７】
【表１８Ｄ】
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【０３９８】
【表１８Ｅ】
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【０３９９】
【表１８Ｆ】
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【０４００】
【表１８Ｇ】
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【０４０１】
【表１８Ｈ】
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【０４０２】
【表１８Ｉ】
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【０４０３】
【表１８Ｊ】
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【０４０４】
【表１８Ｋ】
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【０４０５】
【表１８Ｌ】
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【０４０６】
【表１８Ｍ】
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【０４０７】
【表１８Ｎ】
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【０４０８】
【表１８Ｏ】
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【０４０９】
【表１８Ｐ】
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【０４１０】
【表１８Ｑ】
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【０４１１】
【表１８Ｒ】
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【０４１２】
本発明は、その特定の実施形態を参照して説明したが、様々な変更を行うことができ、均等物が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく置換されていてもよいことは、当業者によって理解されるべきである。加えて、多くの修飾が、本発明の目的、精神及び範囲に、特定の状況、材料、物質の粗製、プロセス、プロセスステップまたはステップを適合させるようにされてもよい。すべてのこのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図２−１】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【国際調査報告】
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